KR20200128026A - 항-muc1 항체 및 il-15를 포함하는 융합 단백질 작제물 - Google Patents

항-muc1 항체 및 il-15를 포함하는 융합 단백질 작제물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 항원 MUC1에 대한 항체 및 IL-15를 포함하는 융합 단백질 작제물에 관한 것이다. 특히, 융합 단백질 작제물은 암 부위에서 NK 세포 및 T 세포를 활성화시킨다.

Description

항-MUC1 항체 및 IL-15를 포함하는 융합 단백질 작제물
본 발명은 항체 분야에 관한 것이다. 암 항원에 대한 항체 및 사이토카인의 융합 단백질이 제공된다. 특히, 융합 단백질은 암 항원 MUC1에 결합하여 암 부위에서 IL-15 부분을 통해 T 세포 및 자연 살해 세포를 활성화시킨다. 융합 단백질 작제물의 설계는 제공된 특정 환경에서 강한 항원 결합 및 높은 면역 세포 활성화와 함께 특히 종양 부위의 고도로 특이적인 표적화에서 명백한 이점을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이들 융합 단백질 작제물의 치료적 및 진단적 용도에 관한 것이다.
사이토카인은 면역 반응을 조절하기 때문에 항암 치료를 위한 유망한 약물이다. 사이토카인은 면역계의 세포가 서로 소통하여 표적 항원에 대한 조정된 반응을 생성하도록 하는 분자 메신저이다. 면역계의 많은 형태의 소통은 직접적인 세포-세포 상호작용을 통해 발생하지만, 사이토카인의 분비는 다각적이고 효율적인 방식으로 면역 신호전달의 신속한 전파를 가능하게 한다.
사이토카인은 종양 부위에서 면역 효과기 세포 및 간질 세포를 직접 자극하고, 세포독성 효과기 세포에 의한 종양 세포 인지를 향상시킨다. 다수의 동물 종양 모델 연구에서 사이토카인이 광범위한 항-종양 활성을 가지고 있는 것으로 입증되었으며, 이는 암 요법을 위한 다수의 사이토카인-기반 접근법으로 번역되었다. 최근 몇 년 동안 GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하는 다수의 사이토카인이 관찰되었고, 진행된 암 환자를 위한 임상 시험에 들어갔다. 항-종양 면역을 촉진하는 데 있어서 IL-10 및 TGF-β와 같은 억제성 사이토카인의 중화를 지원하는 전임상 연구가 진행 중이다.
특히, 인터루킨-15(IL-15)는 암 요법을 위한 매력적인 사이토카인이다. IL-15는 효과기 면역 반응을 자극하는 사이토카인이다. 이는 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포의 발달, 활성화 및 증식을 유도한다. IL-15 및 이의 IL-15 수용체 α-사슬은 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포에서 발현되고, 효과기 면역 세포 상의 IL-2 수용체 β- 공통 γ-사슬(IL2Rβγc) 복합체에 결합한다. IL-15는 시험관 내 및 생체 내에서 공통 종양 표적화 항체와 함께 사용되는 경우 높은 수준의 항-종양 세포독성을 유도한다. 그러나, 사이토카인의 투여는 종종 효과적인 조절인자로서의 이의 사용을 방지하는 용량 제한 독성에 의해 방해된다.
이를 고려하여, IL-15와 같은 사이토카인의 종양 부위에 대한 효과적인 표적화가 당 분야에 필요하다. 안전하고 효과적인 면역사이토카인 요법을 위한 전제조건으로서 고도로 특이적인 종양 표적화가 필요하다.
본 발명자는 인터루킨 15가 이를 항-MUC1 항체와 조합함으로써 종양 부위에 효과적이고 특이적으로 표적화될 수 있음을 발견하였다. TA-MUC1은 정상 세포에는 사실상 부재하는 종양 마커 MUC1 상의 신규한 탄수화물 / 단백질 혼합 에피토프이다. TA-MUC1은 상이한 기원의 상피암 사이에서 광범위한 분포를 나타내고, 전이 및 암 줄기 세포에도 존재하며, 이는 이의 광범위한 치료 잠재성을 뒷받침한다. 항암 항원 MUC1 및 IL2Rβγc의 동시 결합은 종양 부위에서 직접 NK 및 T 세포의 활성화 및 증식을 가능하게 한다. 본 발명자는 이제 MUC1에 특이적인 항체 및 IL-15를 포함하는 융합 단백질이 암세포를 효과적으로 표적화하고, 상기 암세포에 대해 NK 및 T 세포 반응을 유도한다는 것을 증명할 수 있었다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 융합 단백질 작제물에 관한 것이다:
(i) MUC1에 특이적으로 결합하는 항체 모듈, 및
(ii) IL-15 모듈.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질 작제물을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 또한, 제3 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 및 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터가 제공되며, 제4 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
제5 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질 작제물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제6 양태에 따르면, 본 발명은 의약에 사용하기 위한, 특히, 암 또는 감염의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 장점 및 양태는 하기 기재 및 첨부된 청구항으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 출원의 바람직한 구현예를 나타내는 하기 기재, 첨부된 청구항, 및 특정 예는 단지 예시로서 제공되는 것이 이해되어야 한다. 개시된 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은 하기를 읽음으로써 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
정의
본원에서 사용되는 하기 표현은 일반적으로 이들이 사용되는 문맥이 달리 나타내는 경우를 제외하고는 바람직하게는 하기 기재되는 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 표현 "포함하다"는 이의 문자상의 의미 외에도 또한 표현 "~을 필수적으로 포함하는" 및 "~로 구성되는"을 포함하며, 특별히 이를 나타낸다. 따라서, 표현 "포함하다"는 특별히 나열된 요소를 "포함하는" 주제가 추가의 요소를 포함하지 않는 구현예뿐만 아니라 특별히 나열된 요소를 "포함하는" 주제가 추가의 요소를 포함할 수 있고/있거나 확실히 포함하는 구현예를 나타낸다. 마찬가지로, 표현 "갖는다"는 표현 "포함하다"로 이해되어야 하며, 또한 표현 "~을 필수적으로 포함하는" 및 "~로 구성되는"을 포함하고, 이들을 특별히 언급한다. 가능한 경우, 용어 "~을 필수적으로 포함하는"은 특히 주제가 필수적으로 포함하는 특별히 나열된 요소에 더하여 주제가 20% 이하, 특히 15% 이하, 10% 이하 또는 특히 5% 이하의 추가 요소를 포함하는 구현예를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 조합 또는 하나 이상의 폴리펩티드 및 하나 이상의 다른 분자 또는 이온을 포함하는 복합체를 나타낸다. 단백질은 천연 발생 아미노산뿐만 아니라 인공 아미노산 중 임의의 것을 함유할 수 있으며, 생물학적 또는 합성 기원일 수 있다. 단백질의 폴리펩티드(들)는 천연적으로(번역 후 변형) 또는 합성적으로, 예를 들어, 당화, 아미드화, 카르복실화, 하이드록실화 및/또는 인산화에 의해 변형될 수 있다. 폴리펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함하나, 임의의 특정 길이일 필요는 없으며; 이러한 용어는 임의의 크기 제한을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 적어도 50개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 150개의 아미노산을 포함한다.
용어 "융합 단백질 작제물"은 상이한 천연 발생 단백질로부터 유래된 2개 이상의 폴리펩티드가 인공적으로 조합되어 하나의 단백질을 형성하는 단백질을 나타낸다. 상이한 폴리펩티드는 특히 상기 상이한 폴리펩티드를 포함하는 하나의 폴리펩티드 사슬을 형성하기 위해 서로 융합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질" 및 "단백질 작제물"은, 특정 구현예에서, 동일한 종류의 단백질 또는 단백질 작제물의 집단 각각을 나타낸다. 특히, 집단의 모든 단백질 또는 단백질 작제물은 단백질 또는 단백질 작제물을 규정하기 위해 사용된 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 집단 내의 모든 단백질 또는 단백질 작제물은 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
용어 "항체"는 특히, 디설파이드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단백질을 나타낸다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개 또는 - IgM- 또는 IgE-타입의 항체의 경우- 4개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 CH4)을 포함하며, 제1 불변 도메인 CH1은 가변 영역에 인접하여 힌지 영역에 의해 제2 불변 도메인 CH2에 연결될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 단지 하나의 불변 도메인으로만 구성된다. 가변 영역은 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)이라 불리는 과변이 영역과, 이들 사이사이에 위치한 프레임워크 영역(framework region; FR)이라 불리는 더욱 보존된 영역으로 더욱 세분화될 수 있으며, 각각의 가변 영역은 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 중쇄 불변 영역은 γ-, δ-, α-, μ- 또는 ε-타입 중쇄와 같은 임의의 타입일 수 있다. 바람직하게는, 항체의 중쇄는 γ-사슬이다. 또한, 경쇄 불변 영역은 또한, κ- 또는 λ-타입 경쇄와 같은 임의의 타입일 수 있다. 바람직하게는, 항체의 경쇄는 κ-사슬이다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포)와 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는, 예를 들어, 인간화, 인간 또는 키메라 항체일 수 있다.
항체의 항원 결합 부분은 일반적으로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 전장 또는 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; 2개의 Fab 단편을 포함하며, 이들 각각은 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 동일한 항원에 결합하는, 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; 및 VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편을 포함한다.
특히, 항체의 "Fab 부분"은 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL) 및 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 제1 도메인(CH1 및 CL)을 포함하는 항체의 부분을 나타낸다. 항체가 이들 영역 모두를 포함하지 않는 경우, 용어 "Fab 부분"은 단지 항체에 존재하는 영역 VH, VL, CH1 및 CL의 부분을 나타낸다. 바람직하게는, "Fab 부분"은 항체의 항원 결합 활성을 함유하는 파파인으로 천연 항체를 분해함으로써 획득되는 단편에 상응하는 항체의 일부를 나타낸다. 특히, 항체의 Fab 부분은 항원 결합 부위 또는 이의 항원 결합 능력을 포함한다. 바람직하게는, Fab 부분은 적어도 항체의 VH 영역을 포함한다.
특히, 항체의 "Fc 부분"은 중쇄 불변 영역 2, 3 및 -해당되는 경우- 4(CH2, CH3 및 CH4)를 포함하는 항체의 부분을 나타낸다. 특히, Fc 부분은 이들 영역 중 각각 2개를 포함한다. 항체가 이들 영역 모두를 포함하지 않는 경우, 용어 "Fc 부분"은 단지 항체에 존재하는 영역 CH2, CH3 및 CH4의 부분을 나타낸다. 바람직하게는, Fc 부분은 적어도 항체의 CH2 영역을 포함한다. 바람직하게는, "Fc 부분"은 항체의 항원 결합 활성을 함유하지 않는 파파인으로 천연 항체를 분해함으로써 획득되는 단편에 상응하는 항체의 부분을 나타낸다. 특히, 항체의 Fc 부분은 Fc 수용체에 결합할 수 있으며, 따라서, 예를 들어, Fc 수용체 결합 부위 또는 Fc 수용체 결합 능력을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "항체" 및 "항체 작제물"은, 특정 구현예에서, 동일한 종류의 항체 또는 항체 작제물의 집단 각각을 나타낸다. 특히, 집단의 모든 항체 또는 항체 작제물은 항체 또는 항체 작제물을 규정하기 위해 사용된 특징을 나타낸다. 특정 구현예에서, 집단 중의 모든 항체 또는 항체 작제물은 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 사용되는 용어 "항체"는 또한 상기 항체의 단편 및 유도체를 포함한다. 항체의 "단편 또는 유도체"는, 특히, 상기 항체로부터 유래하고 상기 항체와 동일한 항원, 특히, 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 단백질 또는 당단백질이다. 따라서, 본원에서 항체의 단편 또는 유도체는 일반적으로 기능성 단편 또는 유도체를 나타낸다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체의 단편 또는 유도체는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체 또는 이의 유도체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 단편의 예는 (i) 각각 중쇄 및 경쇄의 제1 불변 도메인 및 가변 영역으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; (iii) 중쇄의 제1 불변 도메인 CH1 및 가변 영역으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 Fv 단편; (v) 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된 Fv 단편인 scFv 단편; (vi) 함께 공유적으로 연결된 2개의 Fv 단편으로 구성된 (Fv)2 단편; (vii) 중쇄 가변 도메인; 및 (viii) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 회합이 분자내에서는 발생하지 않으며 단지 분자간에서만 발생할 수 있는 방식으로 함께 공유적으로 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 다중체(multibody)를 포함한다. 특히, 항체의 유도체는 모 항체와 동일한 항원에 결합하나, 유래되는 모 항체와는 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 항체 단편 및 유도체는 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 획득된다.
표적 아미노산 서열이 그 전체 길이에 걸쳐 참조 아미노산 서열의 상응하는 부분과 적어도 75%, 더욱 바람직하게는, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 공유하는 경우, 표적 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열에 "상응"하거나 이로부터 "유래"된다. "상응하는 부분"은, 예를 들어, 표적 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역 1(FRH1)이 참조 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역 1에 상응함을 의미한다. 특정 구현예에서, 참조 아미노산 서열로부터 "유래"되거나 이에 "상응"하는 표적 아미노산 서열은 그 전체 길이에 걸쳐 참조 아미노산 서열의 상응하는 부분과 100% 상동성이거나, 특히 100% 동일하다. 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 "상동성" 또는 "동일성"은 바람직하게는 본 발명에 따라 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 또는 상동성 또는 동일성이 규정되는 서열에 상응하는 참조 서열의 상응하는 부분의 전체 길이에 걸쳐 결정된다. 특히, 특이적 CDR 서열 또는 특이적 가변 영역 서열과 같은 하나 이상의 아미노산 서열에 의해 규정되는 모 항체로부터 유래된 항체는 CDR 서열 또는 가변 영역 서열과 같은 아미노산 서열을 갖는 항체이며, 이는 모 항체의 각각의 아미노산 서열에 대해 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동이거나 동일하며, 특히 동일하다. 특정 구현예에서, 모 항체로부터 유래된 항체(즉, 이의 유도체)는 모항체와 동일한 CDR 서열을 포함하나, 가변 영역의 나머지 서열은 상이하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 또한 다가 및 다중특이적 항체, 즉, 동일한 에피토프에 각각 결합하는 2개 초과의 결합 부위를 갖는 항체 작제물 및 제1 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위 및 제2 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위, 및 선택적으로, 심지어 추가의 에피토프에 결합하는 추가의 결합 부위를 갖는 항체 작제물을 나타낸다.
"특이적 결합"은 바람직하게는 항체와 같은 제제가 그것에 특이적인 에피토프와 같은 표적에 또 다른 표적에 대한 결합 대비 더욱 강하게 결합하는 것을 의미한다. 만약 어떤 제제가 제2 표적에 대한 해리 상수(Kd)보다 낮은 해리 상수를 갖는 제1 표적에 결합한다면, 그 제제는 제2 표적 대비 제1 표적에 더욱 강하게 결합한다. 바람직하게는, 제제가 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수는 제제가 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수보다 100배, 200배, 500배 초과 또는 1000배 초과로 더 낮다. 또한, 용어 "특이적 결합"은 특히 적어도 106 M-1, 바람직하게는 적어도 107 M-1, 더욱 바람직하게는 적어도 108 M-1의 친화 상수 Ka를 갖는 결합 파트너 간의 결합 친화성을 나타낸다. 특히, 특정 항원에 특이적인 항체는 적어도 106 M-1, 바람직하게는 적어도 107 M-1, 더욱 바람직하게는, 적어도 108 M-1의 Ka를 갖는 친화성으로 상기 항원에 대해 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 예를 들어, 특히 용어 "항-MUC1 항체"는 MUC1에 특이적으로 결합하는 항체를 나타내며, 바람직하게는 적어도 106 M-1, 바람직하게는 적어도 107 M-1, 더욱 바람직하게는, 적어도 108 M-1의 Ka를 갖는 친화성으로 MUC1에 결합할 수 있다.
본원에 언급된 바와 같은 "항체 모듈"은 항체로부터 유래되며, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 작제물을 나타낸다. 특히, 항체 모듈은 적어도 하나, 특히, 2개의 항체 중쇄 및 선택적으로 적어도 하나, 특히, 2개의 항체 경쇄를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원 결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있으나, 천연 항체의 모든 요소를 포함하지 않는 항체로부터 유래되는 폴리펩티드 작제물을 나타낸다. 특히, 항원 결합 단편은 항체의 불변 도메인의 일부 또는 모두를 포함하지 않으며, 2개 대신 단지 하나의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
특히, "항원 결합 부위"는 적어도 하나의 항체 가변 영역, 예를 들어, 항체 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 부위는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역은 항원 스캐폴드, 특히 CH1 도메인 및 CL 도메인을 사용하여 서로 배열될 수 있고/있거나 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 항원 결합 부위는 단일 사슬 가변 영역 단편(scFv)이다.
"IL-15"는 사이토카인 인터루킨 15, 특히 인간 인터루킨 15를 나타낸다. IL-15는 N 말단 신호 펩티드로 발현되는 4개의 α-헬릭스 번들 단백질이다. 성숙 IL-15에서, 신호 펩티드는 절단되고, 단백질은 당화되고, 약 14-15 kDa의 질량을 갖는다. IL-15는 IL-15 수용체 α 사슬, 특히 이의 스시(sushi) 도메인, 및 IL-2 수용체 β-사슬 및 공통 인터루킨 수용체 γ-사슬(공통 γ-사슬)의 복합체에 결합한다.
용어 "MUC1"은 뮤신-1로도 공지된 단백질 MUC1, 다형 상피 뮤신(PEM) 또는 암 항원 15-3, 특히, 인간 MUC1을 나타낸다. MUC1은 뮤신 패밀리의 구성원이며, 막 결합된 당화된 인단백질을 인코딩한다. MUC1은 당화로 250-500 kDa로 증가되는 120-225 kDa의 코어 단백질 질량을 갖는다. 이는 세포의 표면을 넘어 200-500 nm로 확장된다. 단백질은 막횡단 도메인에 의해 많은 상피 세포의 정점 표면에 고정된다. 세포외 도메인은 20개 아미노산 가변 수 직렬 반복(variable number tandem repeat; VNTR) 도메인을 포함하며, 반복부의 수는 상이한 개체에서 20 내지 120개로 다양하다. 이들 반복부는 세린, 트레오닌 및 프롤린 잔기가 풍부하며, 이는 심한 O-당화를 허용한다. 특정 구현예에서, 용어 "MUC1"은 종양-관련 MUC1("TA-MUC1")을 나타낸다. TA-MUC1은 암 세포에 존재하는 MUC1이다. 이러한 MUC1은 이의 훨씬 높은 발현 수준, 이의 국소화 및 이의 당화에 있어서 비-암세포에 존재하는 MUC1과 상이하다. 특히, TA-MUC1은 암 세포의 전체 세포 표면 위에 무극으로 존재하는 반면, 비-암 세포에서 MUC1은 엄격하게 정점의 발현을 가지며, 따라서, 전신 투여된 항체에 대해 접근할 수 없다. 또한, TA-MUC1은 톰슨-프라이덴리히(Thomsen-Friedenreich) 항원 알파(TFα)와 같은 신규한 탄수화물 종양 항원 및 MUC1 단백질 백본 상의 신규한 펩티드 에피토프를 노출시키는 이상 O-당화를 갖는다.
톰슨-프라이덴리히 항원 알파 또는 코어-1로도 불리는 "TFα"는 이당류 Gal-ß1,3-GalNAc를 나타내며, 이는 암종 세포에서 단백질의 하이드록시 아미노산 세린 또는 트레오닌에 알파-아노머 입체형태로 O-글리코시드 연결된다.
본 발명에 따른 "글리칸의 상대량"은 항체 제조물 또는 항체를 포함하는 조성물 중의 항체에 각각 부착된 글리칸의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 나타낸다. 특히, 글리칸의 상대량은 항체에 포함되며, 따라서, 항체 제조물 또는 항체를 포함하는 조성물 중의 항체의 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 나타낸다. 글리칸 100%는 항체 제조물 또는 항체를 포함하는 조성물 중의 항체 각각에 부착된 글리칸 모두를 나타낸다. 예를 들어, 10%의 푸코스를 보유하는 글리칸의 상대량은 항체를 포함하는 조성물로서, 항체에 포함되고, 따라서, 상기 조성물 중의 항체 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 10%가 푸코스 잔기를 포함하는 반면, 항체에 포함되며, 따라서, 상기 조성물 중의 항체 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 90%가 푸코스 잔기를 포함하지 않는, 조성물을 나타낸다. 100%를 나타내는 상응하는 참조량의 글리칸은 조성물 중의 항체에 부착된 모든 글리칸 구조물, 또는 모든 N-글리칸, 즉, 조성물 중의 항체의 아스파라긴 잔기에 부착된 모든 글리칸 구조물, 또는 모든 복합체-타입 글리칸일 수 있다. 참조 군의 글리칸 구조물은 일반적으로, 명시적으로 표시되거나 당업자에 의해 환경으로부터 직접 유도가능하다.
용어 "N-당화"는 단백질의 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기에 부착된 모든 글리칸을 나타낸다. 이들 아스파라긴 잔기는 일반적으로 아미노산 서열 Asn - Xaa - Ser/Thr을 갖는 N-당화 부위의 부분이며, 여기에서, Xaa는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 마찬가지로, "N-글리칸"은 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기에 부착된 글리칸이다. 용어 "글리칸", "글리칸 구조물", "탄수화물", "탄수화물 사슬" 및 "탄수화물 구조물"은 일반적으로 본원에서 동의어로 사용된다. N-글리칸은 일반적으로 2개의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기 및 3개의 만노스 잔기로 구성된 공통의 코어 구조를 가지며, 구조 Manα1,6-(Manα1,3-)Manβ1,4-GlcNAcβ1,4-GlcNAcβ1-Asn를 가지며, Asn은 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기이다. N-글리칸은 3개의 상이한 유형, 즉, 복합체-타입 글리칸, 하이브리드-타입 글리칸 및 고 만노스-타입 글리칸으로 세분화된다.
본원에 제공된 수, 특히 특정 당화 특성의 상대량은 바람직하게는 대략적인 수로 이해되어야 한다. 특히, 수는 바람직하게는 10%까지 높고/높거나 낮을 수 있고, 특히 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%까지 높고/높거나 낮을 수 있다.
용어 "핵산"은 단일-가닥 및 이중-가닥의 핵산과 리보핵산 뿐만 아니라 데옥시리보핵산을 포함한다. 이는 천연 발생 뿐만 아니라 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 메틸화, 5'-캡핑(capping) 및/또는 3'-캡핑에 의해 천연적으로 또는 합성적으로 변형될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 특히 그 내부로 도입된 코딩 핵산 서열의 발현을 가능하게 하고 조절할 수 있는 핵산 작제물을 나타낸다. 발현 카세트는 프로모터, 리보좀 결합 부위, 인핸서 및 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 다른 조절 요소들을 포함할 수 있다. 발현 카세트의 정확한 구조는 종(species) 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등과 같이, 각각 전사 및 번역의 개시와 관련된 5'-비전사 서열과 5'- 및 3'-비번역 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 5'-비전사 발현 조절 서열은 작동 가능하게 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 카세트는 또한 인핸서 서열이나 업스트림 활성인자 서열(upstream activator sequence)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "프로모터"는 발현될 핵산 서열의 업스트림(5')에 위치하며 RNA-중합효소에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 나타낸다. "프로모터"는 유전자의 전사 조절과 관련된 추가 인자에 대한 인식 및 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵생물 또는 진핵생물 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 또한, 프로모터는 "유도성(inducible)", 즉 유도제에 반응하여 전사를 개시할 수 있거나, 만약 전사가 유도제에 의해 조절되지 않는다면 "항시성(constitutive)"일 수 있다. 유도성 프로모터의 조절하에 있는 유전자는, 유도제가 없으면 발현되지 않거나 단지 적은 정도로 발현된다. 유도제의 존재 하에서 상기 유전자는 켜지거나(switched on) 전사 수준이 증가된다. 이는 일반적으로 특정한 전사 인자의 결합에 의해 매개된다.
용어 "벡터"는 본원에서 가장 일반적인 의미로 사용되며, 핵산으로 하여금, 예를 들어, 원핵생물 및/또는 진핵생물 세포 내로 도입되어, 적절한 경우, 유전체 내로 통합될 수 있도록 해주는 핵산의 임의의 중간 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제되고/되거나 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 유전체를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "플라스미드"는 일반적으로 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외(extrachromosomal) 유전 물질의 작제물, 보통 환형 DNA 듀플렉스에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "숙주 세포"는 외인성 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 용어 "숙주 세포"는 원핵생물(예를 들어, E. 콜리(E. coli)) 또는 진핵생물 세포(예를 들어, 포유류 세포, 특히 인간 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 특히 바람직한 것은 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 또는 영장류로부터의 세포와 같은 포유류 세포이다. 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래될 수 있으며, 1차 세포 및 세포주를 포함한다. 핵산은 단일 카피 또는 2 이상의 카피의 형태로 숙주 세포 내에 존재할 수 있으며, 일 구현예에서, 숙주 세포 내에서 발현된다.
본 발명에 따르면 용어 "환자"는 인간, 비인간 영장류 또는 다른 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이와 같은 포유류 또는 마우스 및 랫트와 같은 설치류를 의미한다. 특히 바람직한 구현예에서, 환자는 인간이다.
본 발명에 따르면 용어 "암"은 특히 백혈병, 정상피종, 흑색종, 암종, 기형종, 림프종, 육종, 중피종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상샘암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장암(intestinal cancer), 간암, 결장암, 위암, 장암(intestine cancer), 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 이비인후과(ear, nose and throat, ENT)암, 유방암, 전립선암, 방광암, 자궁암, 난소암 및 폐암, 및 이들의 전이를 포함한다. 본 발명에 따르면 용어 암은 또한 암 전이를 포함한다.
"종양"은 잘못 조절된 세포성 증식에 의해 형성된 세포군 또는 조직군을 의미한다. 종양은 구조적 구성 및 정상 조직과의 기능적 협력의 부분적이거나 완전한 결핍을 나타낼 수 있으며, 보통 양성 또는 악성일 수 있는 뚜렷한 조직 덩어리를 형성한다.
"전이(metastasis)"는 암 세포 본래의 부위로부터 신체의 다른 부분으로의 암 세포의 확산을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며, 보통은 1차 종양으로부터 암 세포의 분리, 신체 순환(body circulation)으로의 진입 및 신체의 다른 곳의 정상 조직 내에서 성장하도록 자리를 잡는 것을 포함한다. 종양 세포가 전이되었을 때, 새로운 종양은 2차 종양 또는 전이성 종양이라 불리며, 이들의 세포는 보통 본래의 종양 세포와 유사하다. 이는, 예를 들어, 유방암이 폐로 전이되면 2차 종양은 비정상 폐 세포가 아니라 비정상 유방 세포로 구성됨을 의미한다. 그러면, 상기 폐의 종양은 전이성 유방암으로 불리며, 폐암으로 불리지 않는다.
용어 "약학적 조성물"은 특히 인간 또는 동물에 투여하기에 적합한 조성물, 즉, 약학적으로 허용되는 성분을 함유하는 조성물을 나타낸다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 활성 화합물 또는 이의 염 또는 프로드러그와 함께 담체, 희석제 또는 약학적 부형제, 예를 들어, 완충제, 보존제 및 긴장성 조절제를 포함한다.
본원에 기재된 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 본원에 제공된 제목은 본 발명의 다양한 양태 또는 구현예의 제한이 아니며, 전체로서의 명세서에 대한 언급으로 해석될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 방법의 경우 특정 단계를 포함하는 것으로서 또는 조성물의 경우 특정 성분을 포함하는 것으로서 본원에 기술된 주제는 각각의 단계 또는 성분으로 구성된 주제를 나타낸다. 본원에 기재된 바람직한 양태 및 구현예를 선택하고 조합하는 것이 바람직하며, 바람직한 구현예의 각각의 조합으로부터 발생하는 특정 주제는 또한 본 발명의 개시 내용에 속한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 IL-15 또는 이의 변이체가 MUC1을 표적으로 하는 항암 항체에 융합된 융합 단백질 작제물의 개발에 기초한다. 확립된 항-MUC1 항체는 종양 관련 MUC1에 결합하고, 세포독성 면역 세포를 모집하고 활성화시킴으로써 이의 항암 활성을 발휘한다. 면역 세포, 특히 자연 살해 세포(NK 세포)의 결합 및 활성화는 항체 Fc 부분과 면역 세포 상의 Fcγ 수용체, 특히 FcγRIIIa의 상호작용을 통해 달성된다. 활성화시, 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC)이 개시된다. 이를 고려하여, 본 발명자는 이들 항체에 IL-15 또는 IL-15와 IL-15 수용체 α-사슬의 스시 도메인의 조합물을 부착시킴으로써 확립된 항-MUC1 항체의 효능을 추가로 개선시켰다. IL-15는 NK, NKT 및 T 세포의 발달, 활성화 및 증식을 유도하는 사이토카인이다.
본 발명자는 항-MUC1 항체 PankoMab 및 IL-15의 융합 작제물이 면역 세포를 효과적으로 활성화시키고 동원하고, 종양 세포의 용해를 유도하는 것을 입증할 수 있었다. 활성의 미세 조정은 천연 당화를 보유하고 Fc 수용체와 상호작용할 수 있거나, 당화 부위의 결실에 의해 비활성화되는 항체의 활성 또는 비활성 Fc 부분을 사용하여 달성될 수 있다. 또한, IL-15의 활성은 또한 고유 IL-15 또는 이의 수용체에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는 돌연변이된 버전을 사용할 뿐만 아니라 IL-15 수용체 α 서브유닛의 스시 도메인과 조합함으로써 제어될 수 있다. 일반적으로, 스시 도메인이 없는 고유 IL-15에 융합된 기능적 Fc 부분을 갖는 항-MUC1 항체는 높은 항-종양 활성, 낮은 표적외 활성 및 긴 순환 반감기를 갖는 유리한 약동학 거동과 함께 표적 결합 활성의 최상의 균형, 강한 기능성 및 안전성을 제공하였다.
또한, 본 발명자는 IL-15가 상이한 위치, 예를 들어, 중쇄 C 말단, 경쇄 C 말단 및 경쇄 N 말단에서 항-MUC1 항체에 융합될 수 있음을 제시하였으며, 이는 모두 기능적 융합 작제물을 제공하였다. 놀랍게도, IL-15를 항체 중쇄의 C 말단에 융합시키는 경우 최상의 활성뿐만 아니라 약동학 및 약역학 파라미터가 획득되었다.
이를 고려하여, 본 발명은 하기를 포함하는 융합 단백질 작제물을 제공한다:
(i) MUC1에 특이적으로 결합하는 항체 모듈, 및
(ii) IL-15 모듈.
항-MUC1 항체 모듈
MUC1에 특이적으로 결합하는 항체 모듈(항-MUC1 항체 모듈)은 MUC1의 에피토프에의 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 모듈은 MUC1의 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 2개, 특히, 정확히 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 이들 항원 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있으며, 특히, 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체 모듈의 항원 결합 부위는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-MUC1 항체 모듈은 적어도 하나의 항체 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 모듈은 2개의 항체 중쇄를 포함한다. 특히, 항체 중쇄는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, 항체 중쇄는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하나, CH1 도메인을 포함하지 않는다. 추가의 구현예에서, 중쇄의 하나 이상의 불변 도메인은 다른 도메인, 특히, 유사한 도메인, 예를 들어, 알부민에 의해 대체될 수 있다. 항체 중쇄는 γ-, α-, ε-, δ- 및 μ-사슬을 포함하는 임의의 타입일 수 있으며, 바람직하게는 γ1-, γ2-, γ3- 및 γ4-사슬을 포함하는 γ-사슬, 특히, γ1-사슬이다. 따라서, 항체 모듈은 바람직하게는 IgG-타입 항체 모듈, 특히, IgG1-타입 항체 모듈이다.
바람직한 구현예에서, 항체 모듈은 Fc 영역을 포함한다. 항체 모듈은 특히 도메인 VH, CH1, 힌지 영역, CH2 및 CH3를 각각 포함하는 2개의 중쇄, 및 도메인 VL 및 CL을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는, 전체 항체일 수 있다. 특히, 항체 모듈은 하나 이상의 인간 Fcγ 수용체, 특히, 인간 Fcγ 수용체 IIIA에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 모듈은 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않거나 유의하게 결합하지 않는다. 이들 구현예에서, 특히, 항체 모듈은 CH2 도메인에서 당화 부위를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 항체 모듈의 중쇄는 C 말단 리신 잔기, 예를 들어, γ1 항체 중쇄에 대해 인간 유전자에 의해 인코딩된 C 말단 리신을 포함하지 않는다. 또한, 일부 구현예에서, 중쇄의 C 말단에서 마지막 3개의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 결실되고/되거나 치환될 수 있다. 예를 들어, 마지막 2개 또는 마지막 3개의 아미노산이 결실될 수 있거나, 예를 들어, 리신을 알라닌으로, 글리신을 알라닌 또는 세린으로 또는 프롤린을 류신으로 치환시키거나, 이들의 조합으로 C 말단 서열 PGK가 돌연변이될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "중쇄" 및 "CH3"은 상기 결실 및/또는 돌연변이를 포함하는 버전을 포함한다.
특히, 항체 모듈은 적어도 하나의 항체 경쇄, 특히, 2개의 항체 경쇄를 추가로 포함한다. 특히, 항체 경쇄는 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함한다. 항체 경쇄는 κ-사슬 또는 λ-사슬일 수 있으며, 특히, κ-사슬이다. 특정 구현예에서, 항체 모듈은 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함한다.
대안적 구현예에서, 항체 모듈은 항체 경쇄를 포함하지 않는다. 이들 구현예에서, 항체 모듈의 항체 중쇄는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 경쇄 가변 영역은 중쇄의 N 말단에 융합되거나, 중쇄 가변 영역에 C 말단 삽입된다. 펩티드 링커는 경쇄 가변 영역을 중쇄의 나머지 부분과 연결하기 위해 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체 모듈은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 가변 영역은, 예를 들어, 펩티드 링커에 의해 서로 공유적으로 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 모듈은 특히 N 말단에서 C 말단으로의 방향으로 항체 중쇄 가변 영역, 펩티드 링커 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 특히, 항체 모듈은 단일 사슬 가변 단편(scFv)일 수 있다.
항-MUC1 항체 모듈은 MUC1의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 에피토프는 MUC1에 특이적일 수 있으며, 즉, 이는 다른 분자에 존재하지 않거나, 이는 다른 분자에서도 발견되는 에피토프일 수 있다.
특정 구현예에서, 항체 모듈은 당화-의존적 방식으로 MUC1에 결합한다. 특히, 항체 모듈은 당화되는 경우, 특히, 세포외 일렬 반복부에서 당화되는 경우 MUC1에 더 강하게 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 모듈은 N-아세틸 갈락토사민(Tn), 시알릴 α2-6 N-아세틸 갈락토사민(sTn), 갈락토스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF) 또는 갈락토스 ß1-3(시알릴 α2-6) N-아세틸 갈락토사민(sTF)으로, 바람직하게는 Tn 또는 TF로 O-당화되는 경우, MUC1에 더 강하게 결합한다.
특정 구현예에서, 항체 모듈은 MUC1의 세포외 일렬 반복부에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특히, 항체 모듈은 상기 일렬 반복이 트레오닌 잔기에서 N-아세틸 갈락토사민(Tn), 시알릴 α2-6 N-아세틸 갈락토사민(sTn), 갈락토스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF) 또는 갈락토스 ß1-3(시알릴 α2-6) N-아세틸 갈락토사민(sTF)으로, 바람직하게는 Tn 또는 TF로 당화되는 경우, 더 강하게 결합한다. 바람직하게는, 탄수화물 모이어티는 α-O-글리코시드 결합에 의해 트레오닌 잔기에 결합된다.
특정 구현예에서, 항체 모듈은 아미노산 서열 PDTR(SEQ ID NO:19) 또는 PDTRP(SEQ ID NO:20)를 포함하는 MUC1의 일렬 반복 도메인에서 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 에피토프에 대한 결합은 바람직하게는, 상기 기재된 바와 같이, 당화 의존적이며, 특히 상기 기재된 탄수화물 모이어티가 각각 서열 PDTR 또는 PDTRP(SEQ ID NO:19 및 20)의 트레오닌 잔기에 부착되는 경우, 결합이 증가된다.
특정 구현예에서, 항체 모듈은 종양-관련 MUC1 에피토프(TA-MUC1)에 특이적으로 결합한다. TA-MUC1 에피토프는 특히 종양 세포에는 존재하지만, 정상 세포에는 존재하지 않으며/거나, 종양 세포에 존재하는 경우 숙주 순환에서 항체에 의해서만 접근가능하지만, 정상 세포에 존재하는 경우 그렇지 않은, MUC1의 에피토프를 나타낸다. 상기 기재된 에피토프, 특히, MUC1의 일렬 반복 도메인에 존재하는 에피토프는 종양-관련 MUC1 에피토프일 수 있다. 특정 구현예에서, TA-MUC1 에피토프를 발현하는 세포에의 항체 모듈의 결합은 정상적인 비-종양 MUC1을 발현하는 세포에의 결합보다 더 강하다. 바람직하게는, 상기 결합은 적어도 1.5배 더 강하거나, 바람직하게는 적어도 2배 더 강하거나, 적어도 5배 더 강하거나, 적어도 10배 더 강하거나 적어도 100배 더 강하다. 특히, TA-MUC1은 이의 세포외 일렬 반복 영역에서 적어도 하나의 N-아세틸 갈락토사민(Tn) 또는 갈락토스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF)으로 당화된다. 특정 구현예에서, 항체 모듈은 N-아세틸 갈락토사민(Tn) 또는 갈락토스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF)을 포함하는 TA-MUC1의 세포외 일렬 반복 영역에서 이러한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특히, 상기 에피토프는 MUC1 일렬 반복의 적어도 하나의 PDTR 또는 PDTRP(SEQ ID NO:19 또는 20) 서열을 포함하며, 바람직하게는 α-O-글리코시드 결합을 통해 N-아세틸 갈락토사민 (Tn) 또는 갈락토스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF)으로 PDTR 또는 PDTRP(SEQ ID NO:19 또는 20) 서열의 트레오닌에서 당화된다. TA-MUC1 결합에 있어서, 항체 모듈은 바람직하게는 당화된 MUC1 종양 에피토프에 특이적으로 결합하여, 결합 강도가 동일한 길이 및 동일한 펩티드 서열의 비-당화된 펩티드에의 결합과 비교하여, 적어도 2배, 바람직하게는 4배 또는 10배, 가장 바람직하게는 20배 증가된다.
하기에서, TA-MUC1에 특이적으로 결합하는 항체 모듈의 특정 구현예가 기재된다.
특정 구현예에서, 항체 모듈은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하거나, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H1, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에 따르면, 항체 모듈에 존재하는 중쇄 가변 영역(들)은 SEQ ID NO:7, 8 또는 9의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 하나와 적어도 75%, 특히, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 모듈의 중쇄 가변 영역은 (i) 일련의 CDR로서, CDR-H1이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2가 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖고, CDR-H3가 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖거나, CDR-H1이 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2가 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖고, CDR-H3가 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는, 일련의 CDR을 포함하며; (ii) SEQ ID NO:7, 8 및 9 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
항체 모듈은 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 포함하거나, SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1, SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 항체 모듈에 존재하는 경쇄 가변 영역(들)은 SEQ ID NO:16, 17 또는 18의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 하나와 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 모듈의 경쇄 가변 영역은 (i) 일련의 CDR로서, CDR-L1이 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖고, CDR-L2가 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖고, CDR-L3가 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖거나, CDR-L1이 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖고, CDR-L2가 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖고, CDR-L3가 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 갖는, 일련의 CDR을 포함하며; (ii) SEQ ID NO:16, 17 및 18 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 항체 모듈은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나, 특히, 2개의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나, 특히, 2개의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 모듈은 상기 기재된 서열 중 하나 이상을 포함하는 항체로부터, 예를 들어, WO 2004/065423호 및 WO 2011/012309호에 기재된 바와 같이, 특히 키메라 또는 인간화된 버젼의 항체 PankoMab으로부터 또는 항체 가티포투주맙(Gatipotuzumab)으로부터 유래된다.
CDR-H2가 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖고/갖거나 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO:8 또는 9의 아미노산 서열을 갖는 항체 모듈은 중쇄 가변 영역 내에 N-당화 부위를 갖는다. 특정 구현예에서, 항체 분자는 중쇄 가변 영역 내에 상기 N-당화 부위를 제거하는 돌연변이를 포함한다. 특히, SEQ ID NO:3의 위치 8 및/또는 SEQ ID NO:9의 위치 57의 아미노산 잔기는 각각 Asn을 제외한 임의의 다른 아미노산 잔기, 특히 Gln 또는 Ala에 의해 치환된다. 따라서, 특정 구현예에서, 항체 모듈에 존재하는 중쇄 가변 영역(들)은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H1, SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 포함한다. 특히, 항체 모듈에 존재하는 중쇄 가변 영역(들)은 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 하나와 적어도 75%, 특히, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 모듈의 중쇄 가변 영역(들)은 (i) 일련의 CDR로서, CDR-H1이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2가 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖고, CDR-H3가 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는, 일련의 CDR을 포함하고; (ii) SEQ ID NO:34 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 특히 SEQ ID NO:33의 위치 8 및 SEQ ID NO:34의 위치 57의 아미노산 잔기는 아스파라긴을 제외한 임의의 아미노산 잔기, 특히 글루타민 또는 알라닌이다. 또한, 이들 구현예에서, 항체 모듈에 존재하는 경쇄 가변 영역(들)은 특히 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 포함한다. 특히, 항체 모듈에 존재하는 경쇄 가변 영역(들)은 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 하나와 적어도 75%, 특히, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 항체 모듈의 경쇄 가변 영역(들)은 (i) 일련의 CDR로서, CDR-L1이 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖고, CDR-L2가 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖고, CDR-L3가 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는, 일련의 CDR을 포함하고; (ii) SEQ ID NO:18 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
IL-15 모듈
융합 단백질 작제물의 IL-15 모듈은 IL-15의 활성 중 하나 이상을 포함한다. 특히, IL-15 모듈은 IL-2 수용체 β- 공통 γ-사슬 복합체 및/또는 IL-15 수용체 α 사슬에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, IL-15 모듈은 IL-15 또는 이의 단편, 특히 인간 IL-15 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, IL-15 모듈은 인간 IL-15를 포함하고, 특히 이로 구성된다.
특정 구현예에서, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 서열 또는 이로부터 유래된 서열을 포함한다. 특히, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 서열과 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 이로 구성된다. 추가 구현예에서, IL-15 모듈은 상기 서열의 단편, 특히 길이가 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개의 아미노산의 단편을 포함한다. 특히, 단편은 IL-2 수용체 β- 공통 γ-사슬 복합체 및/또는 IL-15 수용체 α 사슬에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.
IL-15 모듈은 수용체 결합을 증가시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 Asn72에 상응하는 아미노산 위치에서 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환을 포함할 수 있다. IL-15 모듈이 SEQ ID NO:21의 서열 또는 이로부터 유래된 서열을 포함하는 구현예에서, 수용체 결합을 증가시키는 돌연변이는 N72D이다. 대안적 구현예에서, IL-15 모듈은 수용체 결합을 감소시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 Ile67에 상응하는 아미노산 위치에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환을 포함할 수 있다. IL-15 모듈이 SEQ ID NO:21의 서열 또는 이로부터 유래된 서열을 포함하는 구현예에서, 수용체 결합을 감소시키는 돌연변이는 I67E이다. IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 Asn79에 상응하는 아미노산 및/또는 Asn112에 상응하는 아미노산에서 당화될 수 있다.
특정 구현예에서, IL-15 모듈은 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. IL-15 수용체 α 사슬은 특히 인간 IL-15 수용체 α 사슬이다. 특정 구현예에서, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편은 IL-15, 특히 인간 IL-15에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, IL-15 모듈은 IL-15 수용체 α 사슬, 특히 인간 IL-15 수용체 α 사슬의 세포외 도메인 또는 이의 일부만을 포함하거나 이로 구성되는 IL-15 수용체 α 사슬의 단편을 포함한다. 특히, IL-15 수용체 α 사슬의 단편은 IL-15 수용체 α 사슬, 특히 인간 IL-15 수용체 α 사슬의 스시 도메인만을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 구현예에서, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:22의 서열 또는 이로부터 유래된 서열을 포함하는 IL-15 수용체 α 사슬의 단편을 포함한다. 특히, IL-15 수용체 α 사슬의 단편은 SEQ ID NO:22의 서열과 적어도 75%, 특히 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, IL-15 수용체 α 사슬의 단편은 상기 서열의 단편, 특히 길이가 적어도 50개, 적어도 55개 또는 적어도 60개의 아미노산의 단편을 포함한다. 특히, 단편은 IL-2 수용체 β- 공통 γ-사슬 복합체 및/또는 IL-15에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.
IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편은 IL-15 또는 이의 단편과 동일한 폴리펩티드 사슬의 일부일 수 있거나, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편 및 IL-15 또는 이의 단편은 상이한 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 바람직한 구현예에서, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편 및 IL-15 또는 이의 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬의 일부이다. 이들 구현예에서, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편은 IL-15 또는 이의 단편의 N 말단 또는 C 말단, 특히 이의 N 말단에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편은 펩티드 링커, 특히 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 링커를 통해 IL-15 또는 이의 단편에 융합된다.
특정 구현예에서, IL-15 모듈뿐만 아니라 전체 융합 단백질 작제물은 IL-15에 결합할 수 있는 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편을 포함하지 않는다.
특정한 특정 구현예에서, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 인간 IL-15를 포함하고, 특히 이로 구성된다. 대안적 구현예에서, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 인간 IL-15를 포함하고, 특히 이로 구성되며, 위치 67의 이소류신 잔기는 글루탐산으로 치환된다. 또 다른 구현예에서, IL-15 모듈은 펩티드 링커를 통해 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 인간 IL-15의 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 인간 IL-15 수용체 α 사슬 단편을 포함하고, 특히 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 인간 IL-15가 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:21과 적어도 90%, 특히 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고/갖거나, 인간 IL-15 수용체 α 사슬 단편이 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:22와 적어도 90%, 특히 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 제외하고는 IL-15 모듈은 이들 설계 중 임의의 것을 가지며, 여기서 IL-15 모듈은 IL-2 수용체 β- 공통 γ-사슬 복합체에 특이적으로 결합한다.
융합 단백질 작제물
융합 단백질 작제물은 적어도 하나의 항-MUC1 항체 모듈 및 적어도 하나의 IL-15 모듈을 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 적어도 2개, 특히 정확하게는 2개의 IL-15 모듈을 포함한다. IL-15 모듈은 동일하거나 상이할 수 있으며, 특히 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 IL-15 모듈은 항체 모듈의 중쇄의 C 말단에 융합된다. 이에 또한 또는 대안적으로, 적어도 하나의 IL-15 모듈은 항체 모듈의 경쇄의 C 말단에 융합된다.
융합 단백질 작제물이 2개의 IL-15 모듈을 포함하는 특정 구현예에서, 항체 모듈은 또한 2개의 중쇄를 포함하고, IL-15 모듈 각각은 항체 모듈의 상이한 중쇄의 C 말단에 융합된다. 융합 단백질 작제물이 2개의 IL-15 모듈을 포함하는 대안적 구현예에서, 항체 모듈은 또한 2개의 경쇄를 포함하고, IL-15 모듈 각각은 항체 모듈의 상이한 경쇄의 C 말단에 융합된다. 융합 단백질 작제물이 2개의 IL-15 모듈을 포함하는 추가의 대안적 구현예에서, 항체 모듈은 또한 2개의 경쇄를 포함하고, IL-15 모듈 각각은 항체 모듈의 상이한 경쇄의 N 말단에 융합된다.
IL-15 모듈은 펩티드 결합을 통해 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 간접적으로 항체 모듈에 융합될 수 있다. 직접 융합은 IL-15 모듈의 서열이 이들 2개의 서열 사이에 임의의 중간 아미노산 없이 항체 모듈의 서열을 직접 따르는 구현예를 나타낸다. 펩티드 링커를 통한 융합은 항체 모듈의 서열과 IL-15 모듈의 서열 사이에 하나 이상의 아미노산이 존재하는 구현예를 나타낸다. 이들 하나 이상의 아미노산은 항체 모듈과 IL-15 모듈 사이에 펩티드 링커를 형성한다.
펩티드 링커는 원칙적으로 항체 모듈과 IL-15 모듈을 연결하기에 적합한 임의의 수의 아미노산 및 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 15개 또는 적어도 20개의 아미노산을 포함한다. 추가 구현예에서, 펩티드 링커는 50개 이하, 바람직하게는 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 25개 이하 또는 20개 이하의 아미노산을 포함한다. 특히, 펩티드 링커는 10 내지 30개의 아미노산, 특히 20 또는 30개의 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 글리신 및 세린 잔기로 구성된다. 글리신 및 세린은 2 대 1, 3 대 1, 4 대 1 또는 5 대 1(글리신 잔기의 수 대 세린 잔기의 수)의 비율로 펩티드 링커에 존재할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 4개의 글리신 잔기 다음에 1개의 세린 잔기, 특히 이러한 서열의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 반복의 서열을 포함할 수 있다. 특정 예는 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31), 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 2개 반복, 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 3개 반복, 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 4개 반복 및 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 6개 반복을 포함하거나 이로 구성되는 펩티드 링커이다. 특히, 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 2, 3 또는 4개의 반복으로 구성되는 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 항체 모듈의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 2, 3 또는 4개의 반복을 포함하는 펩티드 링커 및/또는 IL-15 또는 이의 단편과 IL-15 모듈의 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편 사이에 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 4개 또는 6개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함한다. 추가 구현예에서, 펩티드 링커는 서열 PAPAP(SEQ ID NO:32), 특히 이러한 서열의 3 또는 6개의 반복을 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 항체 모듈의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 PAPAP(SEQ ID NO:32)의 3 또는 6개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함한다.
다른 구현예에서, 펩티드 링커는 인간에서 면역원성 잠재성이 없거나 단지 작은 서열, 바람직하게는 인간 서열 또는 천연 발생 서열인 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 펩티드 링커 및 인접한 아미노산은 면역원성 잠재성을 나타내지 않거나, 단지 작은 면역원성 잠재성을 나타낸다. 상기 기재된 바와 같은 펩티드 링커는 또한 하나의 항원 결합 단편에 존재하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 같은 융합 단백질 작제물의 다른 요소를 연결하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, IL-15 모듈은 펩티드 링커를 통해 항체 모듈의 중쇄의 C 말단에 융합된다. 이들 구현예에서, 펩티드 링커는 이의 N 말단에 추가 아미노산 잔기, 특히 프롤린 잔기, 아스파테이트 잔기 또는 알라닌 잔기를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체 중쇄의 마지막 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기는 결실되고/되거나 돌연변이될 수 있다. 특정 예는 펩티드 링커가 이의 N 말단에 추가의 프롤린 잔기 또는 아스파테이트 잔기를 포함하는 융합 단백질 작제물; 펩티드 링커가 이의 N 말단에 추가의 알라닌 잔기를 포함하고, 항체 중쇄의 마지막 아미노산 잔기가 결실된 융합 단백질 작제물; 및 항체 중쇄의 마지막 2개의 아미노산 잔기가 결실된 융합 단백질 작제물을 포함한다. 이들 구현예에서, 펩티드 링커는 특히 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 2, 3 또는 4개의 반복 또는 아미노산 서열 PAPAP(SEQ ID NO:32)의 3 또는 6개의 반복을 포함한다.
특히, 융합 단백질 작제물은 항체 작제물이다. 항체 작제물은 MUC1의 에피토프에 특이적으로 결합하나, 또 다른 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 추가 항원 결합 부위를 포함하지 않는다. 대안적 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 다른 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 추가 항원 결합 부위를 포함한다. 이들 추가 항원 결합 부위는 융합 단백질 작제물 내의 어느 곳에나 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 항원 결합 부위는 항체 모듈의 항체 경쇄 또는 중쇄의 C 또는 N 말단에 융합된 항원 결합 단편에 존재한다. 특히, 항체 모듈이 2개의 항체 경쇄를 포함하는 경우, 하나 이상의 항원 결합 단편, 특히 하나의 추가 항원 결합 단편은 항체 모듈의 항체 경쇄 각각의 C 또는 N 말단, 특히 C 말단에 융합될 수 있다. 이들 추가 항원 결합 단편은 동일하거나 상이할 수 있으며, 특히 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이들 구현예에서, IL-15 모듈은 바람직하게는 항체 모듈의 항체 중쇄(들)의 C 말단에 융합된다. 또한, 항체 모듈이 2개의 항체 중쇄를 포함하는 경우, 하나 이상의 추가 항원 결합 단편, 특히 하나의 추가 항원 결합 단편은 항체 모듈의 항체 중쇄 각각의 C 말단에 융합될 수 있다. 이들 추가 항원 결합 단편은 동일하거나 상이할 수 있으며, 특히 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이들 구현예에서, IL-15 모듈은 바람직하게는 항체 모듈의 항체 경쇄(들)의 C 말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 추가의 항원 결합 단편은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 가변 영역은, 예를 들어, 펩티드 링커에 의해 서로 공유적으로 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가의 항원 결합 단편은 특히 N 말단에서 C 말단으로의 방향으로 항체 중쇄 가변 영역, 펩티드 링커 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 특히, 추가의 항원 결합 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)일 수 있다.
추가의 항원 결합 부위는 임의의 항원, 특히 종양-관련 항원 또는 면역 세포의 체크포인트 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항원의 적합한 예는 CD3, EGFR, HER2, PD-1, PD-L1, CD40, CEA, EpCAM, CD7, CD28, GITR, ICOS, OX40, 4-1BB, CTLA-4, TFa, LeY, CD160, Galectin-3 및 Galectin-1으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 추가 항원 결합 단편은 CD3에 특이적으로 결합한다. 특히, 추가의 항원 결합 단편은 CD3에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 가변 영역 단편(scFv)이다. 추가 항원 결합 단편은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특히, 추가 항원 결합 단편은 CD3ε에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 추가 항원 결합 단편은 특히 CD3δ와의 복합체인 경우에만 입체형태 의존적 방식으로 CD3ε에 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, CD3에 특이적으로 결합하는 추가 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-H1, SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에 따르면, 추가 항원 결합 단편에 존재하는 중쇄 가변 영역(들)은 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 하나와 적어도 75%, 특히, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은 (i) 일련의 CDR로서, CDR-H1이 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2가 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 갖고, CDR-H3가 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는, 일련의 CDR을 포함하고; (ii) SEQ ID NO:26 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
CD3에 특이적으로 결합하는 추가 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR-L1, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 추가 항원 결합 단편에 존재하는 경쇄 가변 영역(들)은 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열 또는 상기 서열 중 하나와 적어도 75%, 특히, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역은 (i) 일련의 CDR로서, CDR-L1이 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖고, CDR-L2가 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖고, CDR-L3가 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는, 일련의 CDR을 포함하고; (ii) SEQ ID NO:30 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, CD3에 특이적으로 결합하는 추가 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나, 특히, 하나의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나, 특히, 하나의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 이에 컨쥬게이션된 하나 이상의 추가 제제를 포함한다. 추가 제제는 융합 단백질 작제물에 대한 컨쥬게이션에 적합한 임의의 제제일 수 있다. 하나 초과의 추가 제제가 융합 단백질 작제물에 존재하는 경우, 이들 추가 제제는 동일하거나 상이할 수 있으며, 특히 모두 동일하다. 융합 단백질 작제물에 대한 추가 제제의 컨쥬게이션은 당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 추가 제제는 특히 융합 또는 화학적 커플링에 의해 공유적으로, 또는 융합 단백질 작제물에 비-공유적으로 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 제제는 특히 링커 모이어티를 통해 융합 단백질 작제물에 공유적으로 부착된다. 링커 모이어티는 추가 제제를 융합 단백질 작제물에 부착시키기에 적합한 임의의 화학적 존재물일 수 있다.
특정 구현예에서, 추가 제제는 단백질의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드 또는 단백질은 특히 항체 모듈의 폴리펩티드 사슬 또는 IL-15 모듈의 폴리펩티드 사슬에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 제제는 항체 모듈의 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 C 또는 N 말단에 융합된다. 항체 모듈이 2개의 항체 경쇄를 포함하는 구현예에서, 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 제제는 2개의 항체 경쇄 각각의 C 또는 N 말단, 특히 C 말단에 융합될 수 있다. 항체 모듈이 2개의 항체 중쇄를 포함하는 구현예에서, 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 제제는 2개의 항체 중쇄 각각의 C 말단에 융합될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질은 동일하거나 상이할 수 있으며, 특히 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질인 이러한 추가 제제의 적합한 예는 사이토카인, 케모카인, 항체 모듈, 항원 결합 단편, 효소 및 상호작용 도메인으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
추가의 제제는 바람직하게는 질병, 특히, 암의 치료, 진단, 예후 및/또는 모니터링에 유용하다. 예를 들어, 추가의 제제는 방사성핵종, 화학요법제, 검출가능한 라벨, 독소, 세포용해 성분, 면역조절제, 면역이펙터 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
융합 단백질 작제물의 당화
항-MUC1 항체 모듈은 하나 이상의 항체 중쇄에서 CH2 도메인을 포함할 수 있다. IgG 타입의 천연 인간 항체는 CH2 도메인에서 N-당화 부위를 포함한다. 항체 모듈에 존재하는 CH2 도메인은 N-당화 부위를 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 항체 모듈에 존재하는 CH2 도메인은 N-당화 부위를 포함하지 않는다. 특히, 항체 모듈은 IMGT/Eu 넘버링 시스템에 따라 위치 297에 상응하는 중쇄의 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하지 않는다. 예를 들어, 항체 모듈은 중쇄에서 Ala297 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 바람직하게는 Fcγ 수용체에의 결합, 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 항체-의존적 세포 식세포작용(ADCP) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 통해 강하게 감소된 유도 능력을 갖거나 유도 능력이 완전하게 결여된다. 특히 이와 관련하여 강하게 감소된 능력은 CH2 도메인 내에 N-당화 부위를 포함하고, 인간 세포주 또는 CHO 또는 SP2/0 세포주에서의 생성에 의해 획득될 수 있는 것과 같은 공통 포유동물 당화 패턴, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 당화 패턴을 갖는 동일한 융합 단백질 작제물과 비교하여 10% 이하, 특히 3% 이하, 1% 이하 또는 0.1% 이하의 활성으로의 감소를 나타낸다.
CH2 도메인에서의 N-당화 및 당화 패턴의 존재 또는 부재를 통해, 융합 단백질 작제물에 의한 T 세포 및 NK 세포의 활성화 및 융합 단백질 작제물의 세포독성이 제어될 수 있다. CH2 도메인에서 당화 없이도, 면역 세포는 융합 단백질 작제물의 IL-15 모듈에 의해 종양 부위에서 활성화된다. CH2 당화를 이용하여, 면역 세포 활성화가 증가되고, 감소된 푸코실화를 갖는 당화 패턴을 이용하여, 면역 세포 활성화가 더욱 더 현저해진다.
대안적 구현예에서, 항체 모듈에 존재하는 CH2 도메인은 N-당화 부위를 포함한다. 이러한 당화 부위는 특히 IMGT/Eu 넘버링 시스템에 따라 중쇄의 아미노산 위치 297에 상응하는 아미노산 위치에 있으며, 아미노산 서열 모티브 Asn Xaa Ser/Thr을 가지며, 여기에서, Xaa는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. Asn297에서 N-연결된 당화는 포유동물 IgG에서 뿐만 아니라 다른 항체 아이소형의 상동 영역에서 보존된다. 가변 영역에 존재할 수 있는 선택적인 추가적 아미노산 또는 다른 서열 변형으로 인해, 이러한 보존된 당화 부위의 실제 위치는 항체의 아미노산 서열에서 달라질 수 있다. 바람직하게는, 항체 모듈에 부착된 글리칸은 바람직하게는 적어도 하기 구조를 포함하는 바이안테너리 복합체 타입 N-연결된 탄수화물 구조이다:
Asn - GlcNAc - GlcNAc - Man - (Man - GlcNAc)2
상기 식에서, Asn은 항체 모듈의 폴리펩티드 부분의 아스파라긴 잔기이며; GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며, Man은 만노스이다. 말단 GlcNAc 잔기는 갈락토스 잔기를 추가로 보유할 수 있으며, 이는 선택적으로 시알산 잔기를 보유할 수 있다. 추가의 GlcNAc 잔기(양분된 GlcNAc로 명명됨)는 폴리펩티드에 가장 가까운 Man에 부착될 수 있다. 푸코스는 Asn에 부착된 GlcNAc에 결합될 수 있다.
융합 단백질 작제물은 다량의 코어 푸코스 또는 소량의 코어 푸코스를 갖는 항체 모듈의 CH2 도메인에서 당화 패턴을 가질 수 있다. CH2 도메인에서 감소된 양의 푸코실화는 ADCC를 유도하는 융합 단백질 작제물의 능력을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대적 양은 조성물 중 항체 모듈의 CH2 도메인에 부착된 글리칸의 전체량의 40% 이하, 특히, 30% 이하 또는 20% 이하이다. 대안적 구현예에서, 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대적 양은 조성물 중 항체 모듈의 CH2 도메인에 부착된 글리칸의 전체량의 적어도 60%, 특히, 적어도 65% 또는 적어도 70%이다.
항-MUC1 항체 모듈의 CH2 도메인 내의 당화 부위의 존재 또는 부재 및 상기 당화 부위에서의 글리칸 구조 내의 푸코스의 존재 또는 부재를 통해, 항체 모듈의 Fc 부분을 통해 ADCC를 유도하는 융합 단백질 작제물의 능력 및 상기 ADCC 유도의 강도가 제어될 수 있다. T 세포 및 NK 세포에 의해 매개되는 세포독성은 이미 종양 부위에서 상기 면역 세포의 증식 및 활성화에 의해 개시된다. 이는 종양 세포에 결합하고, 융합 단백질 작제물을 종양 부위에 위치시키는 항-MUC1 항체 모듈, 및 T 세포 및 NK 세포의 증식 또는 활성화를 유도하는 IL-15 모듈에 의해 달성된다. T 세포 및 NK 세포에 의해 매개되는 바와 같은 전체 세포독성 활성은 항체 모듈의 Fc 부분의 당화 및 추가로 상기 당화에서 푸코실화의 양을 감소시킴에 의해 증가될 수 있다. Fc-당화, 특히 낮은 푸코실화를 이용하여, NK 세포에 의해 매개되는 ADCC는 추가로 향상된다. 특정 적용에서, ADCC 활성의 미세 조정이 중요하다. 따라서, 특정 상황에서, 항체 모듈의 CH2 도메인에 당화 부위가 없는 융합 단백질 작제물, 항체 모듈의 CH2 도메인에 당화 부위를 갖고 다량의 푸코실화를 갖는 융합 단백질 작제물, 또는 항체 모듈의 CH2 도메인에 당화 부위를 갖고 소량양의 푸코실화를 갖는 융합 단백질 작제물이 가장 유리할 수 있다.
특정 구현예에서, IL-15 모듈은 당화된다. 특히, IL-15 모듈은 SEQ ID NO:21의 Asn79 및/또는 Asn112에 상응하는 아미노산에서 당화될 수 있다.
융합 단백질 작제물은 바람직하게는 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된다. 융합 단백질 작제물의 생성에 사용된 숙주 세포는 항체 생성에 사용될 수 있는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 특히 진핵생물 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포이다. 예시적인 숙주 세포는 효모 세포, 예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포주, 곤충 세포, 예를 들어, SF9 및 SF21 세포주, 식물 세포, 조류 세포, 예를 들어, EB66 오리 세포주, 설치류 세포, 예를 들어, CHO, NS0, SP2/0 및 YB2/0 세포주, 및 인간 세포, 예를 들어, HEK293, PER.C6, CAP, CAP-T, AGE1.HN, Mutz-3 및 KG1 세포주를 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 인간 혈액 세포주, 특히, 인간 골수성 백혈병 세포주에서 재조합적으로 생성된다. 융합 단백질 작제물의 생성에 사용될 수 있는 바람직한 인간 세포주는 물론 적합한 생성 절차는 WO 2008/028686 A2호에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 NM-H9D8, NM-H9D8-E6 및 NM-H9D8-E6Q12로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 골수성 백혈병 세포주에서의 발현에 의해 획득된다. 이들 세포주는 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen; DSMZ)(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE) by Glycotope GmbH, Robert-R
Figure pct00001
ssle-Str. 10, 13125 Berlin (DE))에 부다페스트 조약의 요건에 따라 수탁 번호 DSM ACC2806(NM-H9D8; 2006년 9월 15일 기탁됨), DSM ACC2807(NM-H9D8-E6; 2006년 10월 5일 기탁됨) 및 DSM ACC2856(NM-H9D8-E6Q12; 2007년 8월 8일 기탁됨)로 기탁되었다. NM-H9D8 세포는 높은 정도의 시알릴화, 높은 정도의 양분형 GlycNAc, 높은 정도의 갈락토실화 및 높은 정도의 푸코실화을 갖는 당화 패턴을 제공한다. NM-H9D8-E6 및 NM-H9D8-E6Q12 세포는 푸코실화 정도가 매우 낮다는 것을 제외하고, NM-H9D8 세포의 패턴과 유사한 당화 패턴을 제공한다. 기타 적합한 세포주는 K562로서, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 존재하는 인간 골수종 백혈병 세포주(ATCC CCL-243)는 물론 상기 언급된 것으로 부터 유래된 세포주를 포함한다.
추가 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 CHO 세포주, 특히 CHO dhfr- 세포주, 예를 들어, ATCC No. CRL-9096의 세포주에서 재조합적으로 생성된다.
핵산, 발현 카세트, 벡터, 세포주 및 조성물
추가의 양태에서, 본 발명은 융합 단백질 작제물을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 상기 핵산의 핵산 서열은 융합 단백질 작제물을 인코딩하기에 적합한 임의의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 그러나, 바람직하게는 핵산 서열은 핵산이 발현되는 숙주 세포 또는 유기체의 특정 코돈 사용, 특히 인간 코돈 사용에 적어도 부분적으로 적합화된다. 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 이중-가닥 DNA, 예를 들어, cDNA 또는 단일-가닥 RNA, 예를 들어, mRNA일 수 있다. 이는 하나의 연속 핵산 분자일 수 있거나, 이는 수개의 핵산 분자로 구성될 수 있으며, 이들 각각은 융합 단백질 작제물의 상이한 부분을 코딩한다.
융합 단백질 작제물이 하나 초과의 상이한 아미노산 사슬, 예를 들어, 항체 모듈의 경쇄 및 중쇄로 구성되는 경우, 핵산은, 예를 들어, 바람직하게는 별도의 아미노산 사슬을 생성하기 위해 IRES 요소와 같은 조절 요소에 의해 분리된 융합 단백질 작제물의 아미노산 사슬 중 하나를 각각 코딩하는 수개의 코딩 영역을 함유하는 단일 핵산 분자일 수 있거나, 핵산은 수개의 핵산 분자로 구성될 수 있으며, 여기에서, 각각의 핵산 분자는 융합 단백질 작제물의 아미노산 사슬 중 하나를 각각 코딩하는 하나 이상의 코딩 영역을 포함한다. 융합 단백질 작제물을 인코딩하는 코딩 영역에 더하여, 핵산은 또한, 예를 들어, 다른 단백질을 코딩할 수 있거나, 코딩 영역(들)의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있거나, 핵산의 안정성 또는 다른 물리적 또는 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있거나, 전혀 기능을 갖지 않을 수 있는 추가의 핵산 서열 또는 다른 변형을 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 및 상기 핵산과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 제공한다. 또한, 발현 카세트 또는 벡터는 추가의 요소, 특히 핵산의 전사 및/또는 번역, 발현 카세트 또는 벡터의 증폭 및/또는 재생, 발현 카세트 또는 벡터의 숙주 세포 유전체 내로의 통합, 및/또는 숙주 세포에서 발현 카세트 또는 벡터의 카피 수에 영향을 미치고/거나 조절할 수 있는 요소를 포함할 수 있다. 항체를 발현시키기 위한 각각의 발현 카세트를 포함하는 적합한 발현 카세트 및 벡터는 종래 기술에 널리 공지되어 있으며, 따라서 여기에 추가의 기재는 필요하지 않다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 이는 분리된 세포 또는 조직에 포함된 세포일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 배양 세포, 특히, 1차 세포 또는 확립된 세포주의 세포, 바람직하게는 종양-유래 세포이다. 바람직하게는, 이는 박테리아 세포, 예를 들어, E. 콜리, 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 특히, S. 세레비시애(S. cerevisiae), 곤충 세포, 예를 들어, Sf9 세포, 또는 포유동물 세포, 특히, 인간 세포, 예를 들어, 종양-유래된 인간 세포, 햄스터 세포, 예를 들어, CHO, 또는 영장류 세포이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 인간 골수성 백혈병 세포로부터 유래된다. 바람직하게는, 이는 하기 세포 또는 세포주로부터 선택된다: K562, KG1, MUTZ-3 또는 이로부터 유래된 세포 또는 세포주, 또는 상기 언급된 세포 중 적어도 하나를 포함하는 세포 또는 세포주의 혼합물. 숙주 세포는 바람직하게는, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, 및 상기 숙주 세포 중 어느 하나로부터 유래된 세포 또는 세포주, 또는 상기 언급된 세포 중 적어도 하나를 포함하는 세포 또는 세포주의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 세포주 및 이들의 특성은 PCT 출원 WO 2008/028686 A2에 상세히 기재되어 있다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 특이적 당화 패턴을 갖는 글리코단백질, 특히, 항체의 발현에 최적화된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 코딩 영역에서의 코돈 사용 및/또는 발현 카세트 또는 벡터의 프로모터 및 추가의 요소는 사용된 숙주 세포 유형과 양립할 수 있고, 더욱 바람직하게는 이에 최적화된다. 바람직하게는, 융합 단백질 작제물은 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포 또는 세포주에 의해 생성된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 융합 단백질 작제물, 핵산, 발현 카세트 또는 벡터, 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 또한 이들 성분 중 하나 초과를 함유할 수 있다. 또한, 조성물은 용매, 희석제 및 부형제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 약학적 조성물이다. 이러한 구현예에서, 조성물의 성분은 바람직하게는 모두 약학적으로 허용된다. 조성물은 고체 또는 유체 조성물, 특히, -바람직하게는, 수성- 용액, 에멀젼 또는 현탁액 또는 동결건조된 분말일 수 있다.
의약에서의 용도
특히, 융합 단백질 작제물은 의약에 유용하며, 질병, 특히, 본원에 기재된 바와 같은 질병, 바람직하게는 암, 감염 및 면역결핍의 치료, 진단, 예후 및/또는 모니터링에 특히, 유용하다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 융합 단백질 작제물, 핵산, 발현 카세트 또는 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 의약에서의 용도는 질병, 예를 들어, 비정상 세포 성장과 관련된 질병, 예를 들어, 암, 감염, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생체 감염, 및 감소된 면역 활성과 관련된 질병, 예를 들어, 면역결핍의 치료, 예후, 진단 및/또는 모니터링에서의 용도이다. 바람직한 구현예에서, 질병은 암이다. 바람직하게는, 암은 난소암, 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암, 폐암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 암은 특히 결장암, 위암, 간암, 신장암, 방광암, 피부암, 자궁경부암, 전립선암, 위장암, 자궁내막암, 갑상샘암 및 혈액암으로부터 추가로 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 엡스타인 바르 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 림프구 맥락수막염 바이러스, B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의해 초래된다. 특정 구현예에서, 질병은 MUC1을 발현하는 세포를 포함하거나 이와 관련된다. 예를 들어, 치료할 암은 MUC1 양성, 즉, MUC1을 발현하는 암 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 또 다른 치료제, 특히, 또 다른 항암제와 조합되어 사용된다. 상기 추가의 치료제는 임의의 공지된 항암 약물일 수 있다. 융합 단백질 작제물과 조합될 수 있는 적합한 항암 치료제는 화학요법제, 항체, 면역자극제, 사이토카인, 케모카인 및 백신일 수 있다. 또한, 융합 단백질 작제물로의 치료는 방사선 요법, 수술 및/또는 전통적인 중국 의학과 조합될 수 있다.
특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 하기 중 하나 이상과 조합하여 암 치료에서 사용하기 위한 것이다:
(i) 세포 요법, 예를 들어, CAR-T, TCR, NK 또는 CD-기반 세포 요법;
(ii) 면역 활성화 항체, 예를 들어, 이중특이적 T 또는 NK 세포 연동자(engager) 또는 다른 면역사이토카인;
(iii) 체크포인트 항체, 예를 들어, 길항성 또는 효능성 체크포인트 항체, 예를 들어, CD3, PD-1, PD-L1, CD40, CD7, CD28, GITR, ICOS, OX40, 4-1BB, CTLA-4, CD160, Galectin-3 및 Galectin-1에 대한 항체;
(iv) 예방접종 요법;
(v) 화학요법;
(vi) EGFR, HER2, TFα, LeY, CEA 및 EpCAM에 대한 항체와 같은 ADCC-매개 모노클로날 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 종양-표적화 항체;
(vii) 예를 들어, EGFR의 억제를 통해 암세포 표면 상의 TA-MUC1을 상향 조절하는 요법.
특정 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 MUC1 및 CD3를 표적화하는 이중특이적 항체, 특히 MUC1에 특이적으로 결합하는 항체 모듈 및 CD3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 항체와 조합하여 암의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 특히, 이중특이적 항체의 MUC1에 특이적으로 결합하는 항체 모듈은 융합 단백질 작제물에 대해 본원에 기재된 바와 같고, 특히 이중특이적 항체의 CD3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편은 CD3에 특이적으로 결합하는 추가의 항원 결합 단편에 대해 본원에 기재된 바와 같다. 적합한 이중특이적 항체는, 예를 들어, WO 2018/178047호(PCT/EP2018/057721호)에 기재되어 있다.
추가 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 PD-L1에 대한 항체와 조합하여 암의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 특히, 융합 단백질 작제물 및 PD-L1에 대한 항체의 조합은 종양 세포 사멸 및/또는 면역 세포 활성화, 특히 T 세포 활성화에서 상승작용적 효과를 나타낸다. PD-L1에 대한 예시적 항체는, 예를 들어, WO 2018/178122호(PCT/EP2018/057844호)에 기재되어 있다.
추가 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 EGFR에 대한 항체와 조합하여 암의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 특히, 융합 단백질 작제물 및 EGFR에 대한 항체의 조합은 종양 세포 사멸에서 상승작용적 효과를 나타낸다. EGFR에 대한 예시적 항체는 토무조툭시맙(tomuzotuximab) 및 세툭시맙(cetuximab)이다.
추가 구현예에서, 융합 단백질 작제물은 CD40에 대한 항체와 조합하여 암의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 항-CD40 항체를 이용한 치료는 환자의 면역 세포에서 IL-15 수용체 서브유닛의 발현을 상향 조절한다. 이에 의해, 항-CD40 항체로 치료된 환자에서 융합 단백질 작제물을 이용한 면역 세포 활성화 및 종양 치료가 향상된다. CD40에 대한 예시적 항체는, 예를 들어, WO 2018/178046호(PCT/EP2018/057717호)에 기재되어 있다.
특정 구현예
하기에서, 본 발명의 특정 구현예가 기재된다.
구현예 1. 하기를 포함하는 융합 단백질 작제물:
(i) MUC1에 특이적으로 결합하는 항체 모듈(항-MUC1 항체 모듈), 및
(ii) IL-15 모듈.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 VL 도메인 및 CL 도메인을 각각 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 IgG-타입 항체 모듈, 특히, IgG1-타입 항체 모듈인 융합 단백질 작제물.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 κ-사슬을 갖는 융합 단백질 작제물.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 TA-MUC1 에피토프에 특이적으로 결합하는 융합 단백질 작제물.
구현예 7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 갖는 일련의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 SEQ ID NO:7, 8 및 9 중 어느 하나와 적어도 80% 동일한 항체 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 9. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 갖는 일련의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 10. 구현예 1 내지 6 및 9 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 SEQ ID NO:9와 적어도 80% 동일한 항체 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 11. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 갖는 일련의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 12. 구현예 1 내지 6 및 11 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 SEQ ID NO:34와 적어도 80% 동일한 항체 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 갖는 일련의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈이 SEQ ID NO:18과 적어도 80% 동일한 항체 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 IL-15 또는 이의 단편, 특히 인간 IL-15 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 16. 구현예 15에 있어서, IL-15 모듈이 전장 인간 IL-15를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 17. 구현예 15 또는 16에 있어서, 인간 IL-15가 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 작제물.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 수용체 결합을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 19. 구현예 18에 있어서, 수용체 결합을 감소시키는 돌연변이가 SEQ ID NO:21의 Ile67에 상응하는 위치에서 이소류신의 글루타메이트로의 치환인 융합 단백질 작제물.
구현예 20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 IL-2 수용체 β-사슬, 공통 γ-사슬 및 IL-15 수용체 α 사슬을 포함하는 인터루킨 수용체에 특이적으로 결합하는 융합 단백질 작제물.
구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 인간 IL-2 수용체 β-사슬, 인간 공통 γ-사슬 및 인간 IL-15 수용체 α 사슬을 포함하는 인터루킨 수용체에 특이적으로 결합하는 융합 단백질 작제물.
구현예 22. 구현예 15 내지 21 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편, 특히 인간 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 23. 구현예 22에 있어서, IL-15 수용체 α 사슬의 단편이 인간 IL-15 수용체 α 사슬의 세포외 도메인 또는 이의 일부인 융합 단백질 작제물.
구현예 24. 구현예 22에 있어서, IL-15 수용체 α 사슬의 단편이 인간 IL-15 수용체 α 사슬의 스시(sushi) 도메인 또는 이의 일부인 융합 단백질 작제물.
구현예 25. 구현예 22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편이 SEQ ID NO:22의 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 26. 구현예 22 내지 25 중 어느 하나에 있어서, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편이 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 융합 단백질 작제물.
구현예 27. 구현예 22 내지 26 중 어느 하나에 있어서, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편이 인간 IL-15 또는 이의 단편의 N-말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 28. 구현예 22 내지 27 중 어느 하나에 있어서, IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편이 펩티드 링커를 통해 인간 IL-15 또는 이의 단편에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 펩티드 링커가 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열, 특히 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 2개 이상, 특히 3 또는 4개의 반복을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 30. 구현예 29에 있어서, 펩티드 링커가 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 2, 3 또는 4개의 반복으로 구성되는 융합 단백질 작제물.
구현예 31. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 작제물.
구현예 32. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 33. 구현예 32에 있어서, SEQ ID NO:22의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열의 N 말단인 융합 단백질 작제물.
구현예 34. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 N 말단으로부터 C 말단으로 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열에 이어 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 2, 3 또는 4개의 반복에 이어 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 작제물.
구현예 35. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 돌연변이 Ile67Glu를 포함하는 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 작제물.
구현예 36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 항체 모듈의 C 말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 37. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편, 특히 IL-15 수용체 α 사슬의 세포외 도메인 또는 IL-15 수용체 α 사슬의 스시 도메인 또는 IL-15에 결합할 수 있는 이들의 단편을 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 38. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질 작제물이 항체 모듈의 상이한 중쇄의 C 말단에 각각 융합된 2개의 IL-15 모듈을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 39. 구현예 38에 있어서, 항체 모듈의 중쇄가 C 말단 리신 잔기를 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 40. 구현예 38에 있어서, 항체 모듈의 중쇄가 2개의 C 말단 잔기 글리신 및 리신을 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 41. 구현예 38에 있어서, 항체 모듈의 중쇄가 3개의 C 말단 잔기 프롤린, 글리신 및 리신을 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 42. 구현예 38 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈의 중쇄의 3개의 C 말단 잔기 프롤린, 글리신 및 리신(존재하는 경우) 중 하나 이상이 특히 류신 또는 알라닌 또는 세린에 의해 치환되는 융합 단백질 작제물.
구현예 43. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질 작제물이 항체 모듈의 상이한 경쇄의 C 말단에 각각 융합된 2개의 IL-15 모듈을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 44. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질 작제물이 항체 모듈의 상이한 경쇄의 N 말단에 각각 융합된 2개의 IL-15 모듈을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질 작제물이 항체 모듈과 IL-15 모듈 사이에 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 46. 구현예 45에 있어서, 펩티드 링커가 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열, 특히 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 2개 이상, 특히 2, 3 또는 4개의 반복을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 47. 구현예 46에 있어서, 펩티드 링커가 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 2, 3 또는 4개의 반복으로 구성되는 융합 단백질 작제물.
구현예 48. 구현예 45에 있어서, 펩티드 링커가 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열, 특히 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열의 2개 이상, 특히 3 또는 6개의 반복을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 49. 구현예 48에 있어서, 펩티드 링커가 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열의 3 또는 6개의 반복으로 구성되는 융합 단백질 작제물.
구현예 50. 구현예 45 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 링커가 추가의 N 말단 프롤린, 아스파테이트 또는 알라닌 잔기를 추가로 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 51. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질 작제물이 항체 모듈과 IL-15 모듈 사이에 펩티드 링커를 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 52. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈이 CH2 도메인 내에 N-당화 부위를 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 53. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈이 항체 중쇄의 CH2 도메인 내에 N-당화 부위를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 54. 구현예 53에 있어서, 항체 모듈이 조성물 내의 항체 모듈의 CH2 도메인에 부착된 글리칸의 전체량의 적어도 60%의 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량을 갖는, 항체 중쇄의 CH2 도메인에 당화 패턴을 갖는 융합 단백질 작제물.
구현예 55. 구현예 53에 있어서, 항체 모듈이 조성물 내의 항체 모듈의 CH2 도메인에 부착된 글리칸의 전체량의 40% 이하의 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량을 갖는, 항체 중쇄의 CH2 도메인에 당화 패턴을 갖는 융합 단백질 작제물.
구현예 56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 컨쥬게이션된 추가 제제를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 57. 구현예 56에 있어서, 추가 제제가 항체 모듈의 폴리펩티드 사슬 또는 IL-15 모듈의 폴리펩티드 사슬에 융합되는 폴리펩티드 또는 단백질인 융합 단백질 작제물.
구현예 58. 구현예 57에 있어서, 항체 모듈이 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하고, IL-15 모듈이 각각의 항체 경쇄의 C-말단에 융합되고, 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 제제가 각각의 항체 중쇄의 C-말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 59. 구현예 57에 있어서, 항체 모듈이 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하고, IL-15 모듈이 각각의 항체 중쇄의 C-말단에 융합되고, 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 제제가 각각의 항체 경쇄의 C-말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 60. 구현예 56 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 추가 제제가 사이토카인, 케모카인, 항체 모듈, 항체 결합 단편, 효소 및 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 융합 단백질 작제물.
구현예 61. 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 따른 융합 단백질 작제물을 인코딩하는 핵산.
구현예 62. 구현예 61에 따른 핵산 및 상기 핵산과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터.
구현예 63. 구현예 61에 따른 핵산 또는 구현예 62에 따른 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
구현예 64. 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 따른 융합 단백질 작제물 및 용매, 희석제 및 부형제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 약학적 조성물.
구현예 65. 의약에 사용하기 위한 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 따른 융합 단백질 작제물 또는 구현예 64에 따른 약학적 조성물.
구현예 66. 암과 같은 비정상적인 세포 성장과 관련된 질병; 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염과 같은 감염; 및 면역결핍과 같은 면역 활성 감소와 관련된 질병의 치료, 예후, 진단 및/또는 모니터링에 사용하기 위한 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 따른 융합 단백질 작제물 또는 구현예 58에 따른 약학적 조성물.
구현예 67. 구현예 66에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물로서, 암이 유방암, 결장암, 위암, 간암, 췌장암, 신장암, 혈액암, 폐암, 자궁내막암, 갑상샘암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물.
구현예 68. 구현예 66에 있어서, 감염의 치료에 사용하기 위한 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물로서, 감염이 박테리아 감염, 바이러스 감염, 바이러스 감염, 진균 감염 및 기생충 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물.
구현예 69. 하기를 포함하는 융합 단백질 작제물:
(i) 각각의 중쇄가 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 각각의 경쇄가 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하는 항-MUC1 항체 모듈; 및
(ii) 인간 IL-15를 각각 포함하는 2개의 IL-15 모듈.
구현예 70. 구현예 69에 있어서, 항체 중쇄가 각각 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 갖는 일련의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 71. 구현예 70에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈의 각각의 VH 도메인이 SEQ ID NO:34와 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 72. 구현예 70 또는 71에 있어서, SEQ ID NO:33의 위치 8 및 SEQ ID NO:34의 위치 57의 아미노산 잔기가 아스파라긴을 제외한 임의의 아미노산 잔기, 특히 글루타민 또는 알라닌인 융합 단백질 작제물.
구현예 73. 구현예 69에 있어서, 항체 중쇄가 각각 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 갖는 일련의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 74. 구현예 73에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈의 각각의 VH 도메인이 SEQ ID NO:8 또는 9와 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 75. 구현예 70 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 항체 경쇄가 각각 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 갖는 일련의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 76. 구현예 75에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈의 각각의 VL 도메인이 SEQ ID NO:17 또는 18, 특히 18과 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 77. 구현예 69에 있어서, 항체 중쇄가 각각 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 갖는 일련의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 78. 구현예 77에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈의 각각의 VH 도메인이 SEQ ID NO:7과 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 79. 구현예 77 또는 78에 있어서, 항체 경쇄가 각각 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 갖는 일련의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 80. 구현예 79에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈의 각각의 VL 도메인이 SEQ ID NO:16과 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 81. 구현예 69에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈의 각각의 VH 도메인이 SEQ ID NO:9와 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 갖는 일련의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 82. 구현예 69에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈의 각각의 VH 도메인이 SEQ ID NO:9와 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3를 갖는 일련의 중쇄 CDR 서열을 포함하고, 항체 분자가 SEQ ID NO:9의 위치 57의 아미노산 잔기에 해당하는 SEQ ID NO:3의 위치 8의 아미노산 잔기가 Asn을 제외한 임의의 다른 아미노산 잔기, 특히 Gln 또는 Ala, 특히 Gln에 의해 치환되는 효과에 대한 돌연변이를 포함하는, 융합 단백질 작제물.
구현예 83. 구현예 81 또는 82에 있어서, 항-MUC1 항체 모듈의 각각의 VL 도메인이 SEQ ID NO:18과 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 갖는 일련의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 84. 구현예 69 내지 83 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 SEQ ID NO:21과 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 85. 구현예 84에 있어서, IL-15 모듈이 SEQ ID NO:22와 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 추가로 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 86. 구현예 85에 있어서, SEQ ID NO:22와 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열의 C 말단과 SEQ ID NO:21과 적어도 80% 동일하고, 특히 100% 동일한 아미노산 서열의 N 말단 사이에 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 2, 3 또는 4개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 87. 구현예 69 내지 84 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편, 특히 IL-15 수용체 α 사슬의 세포외 도메인 또는 IL-15 수용체 α 사슬의 스시 도메인 또는 IL-15에 결합할 수 있는 이들의 단편을 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 88. 구현예 69 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 링커가 IL-15 모듈과 항체 모듈 사이에 존재하는 융합 단백질 작제물.
구현예 89. 구현예 69 내지 88 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 항체 모듈의 중쇄의 C 말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 90. 구현예 89에 있어서, 항체 모듈의 중쇄의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 4개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 91. 구현예 89에 있어서, 항체 모듈의 중쇄의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 3개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 92. 구현예 89에 있어서, 항체 모듈의 중쇄의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 2개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 93. 구현예 89에 있어서, 항체 모듈의 중쇄의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 PAPAP(SEQ ID NO:32)의 3개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 94. 구현예 89에 있어서, 항체 모듈의 중쇄의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 PAPAP(SEQ ID NO:32)의 6개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 95. 구현예 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 링커가 추가의 N 말단 프롤린, 아스파테이트 또는 알라닌 잔기를 추가로 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 96. 구현예 89 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈의 중쇄가 C 말단 리신 잔기를 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 97. 구현예 89 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈의 중쇄가 2개의 C 말단 잔기 글리신 및 리신을 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 98. 구현예 89 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈의 중쇄가 3개의 C 말단 잔기 프롤린, 글리신 및 리신을 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 99. 구현예 89 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈의 중쇄의 3개의 C 말단 잔기 프롤린, 글리신 및 리신(존재하는 경우) 중 하나 이상이 또 다른 아미노산 잔기, 특히 알라닌 또는 류신으로 치환되는 융합 단백질 작제물.
구현예 100. 구현예 69 내지 88 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 항체 모듈의 경쇄의 C 말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 101. 구현예 100에 있어서, 항체 모듈의 경쇄의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 2, 3 또는 4개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 102. 구현예 100에 있어서, 항체 모듈의 경쇄의 C 말단과 IL-15 모듈의 N 말단 사이에 아미노산 서열 PAPAP(SEQ ID NO:32)의 3 또는 6개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 103. 구현예 69 내지 88 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 항체 모듈의 경쇄의 N 말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 104. 구현예 103에 있어서, 항체 모듈의 경쇄의 N 말단과 IL-15 모듈의 C 말단 사이에 아미노산 서열 GGGGS(SEQ ID NO:31)의 2, 3 또는 4개의 반복을 포함하는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 105. 구현예 69 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 각각의 IL-15 모듈이 인간 IL-15를 포함하고, 이의 N 말단이 펩티드 링커를 통해 상이한 중쇄의 C 말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 106. 구현예 69 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 각각의 IL-15 모듈이 인간 IL-15를 포함하고, 이의 N 말단이 펩티드 링커를 통해 상이한 경쇄의 C 말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 107. 구현예 69 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 각각의 IL-15 모듈이 인간 IL-15를 포함하고, 이의 C 말단이 펩티드 링커를 통해 상이한 경쇄의 N 말단에 융합되는 융합 단백질 작제물.
구현예 108. 구현예 69 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 각각의 IL-15 모듈이 인간 IL-15를 포함하고, 이의 N 말단이 펩티드 링커를 통해 상이한 중쇄의 C 말단에 융합되고, 중쇄가 C 말단 리신 잔기를 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 109. 구현예 69 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 각각의 IL-15 모듈이 인간 IL-15를 포함하고, 이의 N 말단이 상이한 중쇄의 C 말단에 직접 융합되고, 중쇄가 C 말단 리신 잔기를 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 110. 구현예 69 내지 84 및 87 내지 109 중 어느 하나에 있어서, IL-15 모듈이 인간 IL-15로 구성된 융합 단백질 작제물.
구현예 111. 구현예 110에 있어서, 인간 IL-15가 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질 작제물.
구현예 112. 구현예 69 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈이 각각의 항체 중쇄의 CH2 도메인 내에 N-당화 부위를 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
구현예 113. 구현예 112에 있어서, 항체 모듈이 IMGT/Eu 넘버링 시스템에 따른 위치 297에 상응하는 중쇄 내의 위치에서 아스파라긴 잔기를 포함하지 않고, 특히 중쇄 내에 Ala297 돌연변이를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 114. 구현예 69 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 항체 모듈이 각각의 항체 중쇄의 CH2 도메인 내에 N-당화 부위를 포함하는 융합 단백질 작제물.
구현예 115. 구현예 114에 있어서, 항체 모듈이 항체 중쇄의 CH2 도메인 내에 당화 패턴을 갖고, 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량이 융합 단백질 작제물의 조성물 내의 항체 모듈의 CH2 도메인에 부착된 글리칸의 전체량의 적어도 60%, 특히 적어도 65% 또는 적어도 70%인 융합 단백질 작제물.
구현예 116. 구현예 114에 있어서, 항체 모듈이 항체 중쇄의 CH2 도메인 내에 당화 패턴을 갖고, 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량이 융합 단백질 작제물의 조성물 내의 항체 모듈의 CH2 도메인에 부착된 글리칸의 전체량의 40% 이하, 특히 30% 이하 또는 20% 이하인 융합 단백질 작제물.
구현예 117. 구현예 69 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 암과 같은 비정상적인 세포 성장과 관련된 질병, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염과 같은 감염 및 면역결핍의 치료에서 사용하기 위한 융합 단백질 작제물.
구현예 118. 구현예 69 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 난소암, 삼중 음성 유방암과 같은 유방암, 폐암 또는 췌장암의 치료에서 사용하기 위한 융합 단백질 작제물.
구현예 119. 구현예 1 내지 60 및 69 내지 116 중 어느 하나에 있어서, MUC1 및 CD3을 표적으로 하는 이중특이적 항체와 조합하여 암의 치료에서 사용하기 위한 융합 단백질 작제물.
구현예 120. 구현예 1 내지 60 및 69 내지 116 중 어느 하나에 있어서, PD-L1에 대한 항체와 조합하여 암의 치료에서 사용하기 위한 융합 단백질 작제물.
구현예 121. 구현예 1 내지 60 및 69 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 토무조툭시맙 또는 세툭시맙과 같은 EGFR에 대한 항체와 조합하여 암의 치료에서 사용하기 위한 융합 단백질 작제물.
구현예 122. 구현예 1 내지 60 및 69 내지 116 중 어느 하나에 있어서, CD40에 대한 항체와 조합하여 암의 치료에서 사용하기 위한 융합 단백질 작제물.
도 1은 항-MUC1 항체(αMUC1)의 중쇄의 C 말단 또는 경쇄의 C 또는 N 말단에 부착된 야생형 IL-15(IL-15wt), 수용체 결합을 감소시키는 돌연변이를 갖는 IL-15(IL-15mut) 또는 IL-15Rα 스시 도메인 및 IL-15의 조합물(IL-15sushi)을 포함하는 상이한 융합 단백질 작제물을 제시한다.
도 2는 ELISA에 의해 분석된 종양 특이성의 척도로서 당화 및 비-당화 MUC1 펩티드에 대한 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 항원 결합 특징을 예시한다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 대조군으로 사용되었다.
도 3은 흐름세포측정법에 의해 분석된 바와 같은 TA-MUC1 발현 종양 세포주 T-47D에 대한 PM-IL-15 면역사이토카인의 결합을 제시한다. αMUC1-IL-15 작제물은 표적 세포에 결합하지 않는 항체를 갖는 유사한 융합 작제물(MOPC-IL-15wt/sushi)과 비교되었다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 참조로서 사용되었다.
도 4는 흐름세포측정법에 의해 분석된 PANC-1 상의 종양 세포 발현된 TA-MUC1에 대한 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 결합을 제시한다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab) 및 관련이 없는 인간 IgG1이 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다.
도 5는 IL-15 수용체 도메인 IL-15Rα (a) 및 IL-2/IL-15Rβ (b)에 대한 PM-IL-15 면역사이토카인의 결합을 제시한다. 결합은 ELISA에 의해 분석되었다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 대조군으로 사용되었다.
도 6은 ELISA에 의해 분석된 IL15 수용체 서브유닛 IL15Rα 및 IL15Rβ에 대한 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 결합을 제시한다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 대조군으로 사용되었다.
도 7은 경쟁 알파스크린(Alphascreen) 검정에 의해 분석된 바와 같은 Fc 감마 수용체 IIIa에 대한 기능적 Fc 부분이 있거나 없는 PM-IL-15 면역사이토카인의 결합을 제시한다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 대조군으로 사용되었다.
도 8은 PBMC의 존재하에서 TA-MUC1 음성 Jurkat 세포주에 대한 PM-IL-15 면역사이토카인에 의한 천연 세포독성의 유도를 제시한다. 세포독성은 5시간 후 유로퓸 방출 검정에 의해 분석되었다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 대조군으로 사용되었다.
도 9는 융합 단백질 작제물에 의해 개시된 표적 세포에 대한 면역 세포 매개 항체-매개 세포 세포독성(ADCC)를 제시한다. NK 세포 및 T 세포를 함유하는 PBMC는 MUC1+ T47D 표적 세포의 존재하에서 상이한 αMUC1-IL-15 작제물과 함께 인큐베이션되었다. 융합 단백질 작제물의 농도에 의존하는 표적 세포의 특이적 용해가 결정되었다. IL-15가 없는 αMUC1이 대조군으로 사용되었다.
도 10은 융합 단백질 작제물에 의해 개시된 표적 세포에 대한 면역 세포 매개 ADCC를 제시한다. NK 세포 및 T 세포를 함유하는 PBMC는 MUC1+ Ovcar-3 표적 세포의 존재하에서 상이한 αMUC1-IL-15 작제물과 함께 인큐베이션되었다. 융합 단백질 작제물의 농도에 의존하는 표적 세포의 특이적 용해가 결정되었다. αMUC1-IL-15 작제물이 동등한 표적화되지 않은 대조군 작제물(MOPC-IL-15wt/sushi)과 비교되었다. IL-15가 없는 αMUC1이 대조군으로 사용되었다.
도 11은 PBMC의 존재하에서 TA-MUC1 양성 MCF-7 유방암 세포에 대한 PM-IL-15 면역사이토카인에 의한 ADCC의 유도를 제시한다. 세포독성은 24시간 후 LDH 방출 검정에 의해 분석되었다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 대조군으로 사용되었다.
도 12는 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt에 의한 TA-MUC1 발현 CaOV-3 종양 세포에 대한 세포독성의 유도를 제시한다. 상이한 공여자로부터의 PBMC가 효과기 세포로 사용되었다. 사멸은 LDH 방출 검정에 의해 결정되었다.
도 13은 PM-IL-15 면역사이토카인이 면역억제성 종양 환경을 모방하는 TA-MUC1 발현 3D 종양 구형(spheroid)으로의 면역 세포 침윤을 유도하는 것을 제시한다. 2일 동안 PBMC 및 면역사이토카인 또는 완충액 대조군으로서 PBS와 공동 배양된 구형이 처리 후의 종양 내의 CD45 또는 CD3 양성 면역 세포의 수를 결정하기 위해 면역조직화학에 의해 분석되었다.
도 14는 PM-IL-15wt 및 PM-IL-15-wt NA에 의한 TA-MUC1 발현 3D 종양 구형으로의 면역 세포 침윤의 유도를 예시한다. 2일 동안 PBMC 및 면역사이토카인, IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab) 또는 완충액 대조군으로서 PBS와 공동 배양된 구형이 처리 후의 종양 내의 CD45 또는 CD8 양성 면역 세포의 수를 결정하기 위해 면역조직화학에 의해 분석되었다.
도 15는 융합 단백질 작제물에 의한 NK 세포 (a) 및 NKT 세포 (b)의 활성화를 제시한다. NK 세포 및 NKT 세포를 함유하는 PBMC는 αMUC1-IL-15 작제물의 존재하에서 인큐베이션되었다. NK 세포 및 NKT 세포의 활성화는 CD69 발현에 의해 결정되었다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 대조군으로 사용되었다.
도 16은 융합 단백질 작제물에 의한 NK 세포 (a), NKT 세포 (b) 및 CD8+ T 세포 (c)의 증식을 제시한다. NK 세포, NKT 세포 및 CD8+ T 세포를 함유하는 PBMC는 αMUC1-IL-15 작제물의 존재하에서 인큐베이션되었다. 면역 세포의 증식은 분열된 세포의 백분율에 의해 결정되었다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 대조군으로 사용되었다.
도 17은 상이한 면역 세포 집단에 대한 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 자극 특성을 입증한다. NK 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 활성화 마커 CD25 및 CD69는 흐름세포측정법에 의해 분석되었다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab) 및 항체의 첨가가 없는 배지가 대조군으로 사용되었다.
도 18은 흐름세포측정법을 통한 활성화 마커 발현의 검출에 의해 분석된 바와 같은 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt에 의한 나이브 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 기억 및 효과기 T 세포 서브셋의 활성화를 제시한다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab) 및 항체의 첨가가 없는 배지가 대조군으로 사용되었다.
도 19는 흐름세포측정법에 의해 분석된 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt에 의한 CD4+ 및 CD8+ T 및 NK 세포 증식의 유도를 제시한다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab) 및 항체의 첨가가 없는 배지가 대조군으로 사용되었다.
도 20은 PM-IL-15 면역사이토카인과의 인큐베이션 후 건강한 공여자의 PBMC에 의한 사이토카인 방출의 유도를 제시한다. 배지, IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab) 및 OKT3가 사이토카인 방출 없음, 단지 중간의 사이토카인 방출 또는 높은 사이토카인 방출에 대한 대조군으로 사용되었다. IFN-γ 및 GM-CSF의 분비는 전기화학발광에 의해 분석되었다.
도 21은 종양 미세환경에서 면역억제 조건을 모방하기 위해 사이토카인 TGF-β을 이용한 NK 및 T 세포의 사전 처리 후 PM IL15wt NA 및 PM-IL15wt에 의한 이들 면역 세포의 재활성화를 제시한다. 면역사이토카인 또는 배지 대조군을 이용한 처리 후 NK 및 T 세포의 재활성화는 흐름세포측정법을 통해 활성화 마커를 분석함으로써 결정되었다.
도 22는 트랜스웰(transwell)-기반 화학주성 검정에서 분석된 면역 세포 서브셋에 대한 PM IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 화학주성 특성을 제시한다. 상부 챔버에서 자극 면역사이토카인 또는 표적화되지 않은 IL-15를 함유하는 하부 챔버로 이동하는 NK (a), NKT (b) 및 CD8+ T 세포 (c)의 수는 흐름세포측정법에 의해 결정되었다. 결과는 처리되지 않은 대조군과 관련된 화학주성 지수로 표현된다.
도 23은 상이한 융합 단백질 작제물의 순환 반감기를 제시한다. αMUC1-IL-15wt NA 및 αMUC1-IL-15sushi NA는 마우스에 주사되고, 이들 작제물의 혈장 농도는 8일 동안 모니터링되었다. 작제물의 계산된 순환 반감기가 제시된다.
도 24는 뮤린 모델에서 T 세포의 수에 대한 상이한 융합 단백질 작제물의 효과를 제시한다. αMUC1-IL-15wt NA 및 αMUC1-IL-15sushi NA는 마우스에 주사되고, 혈액 샘플이 투여전 및 주사 8일 후에 분석되었다. 마우스의 혈액에서 CD8+ T 세포의 수는 CD45, CD3, CD4 및 CD8에 대해 PBMC를 염색하여 결정되었다.
도 25는 C57BL/6 마우스로의 단일 용량 i.v. 주사 후 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 생체 내 약동학(PK) 거동을 제시한다. 3마리의 마우스의 그룹으로부터 ELISA에 의한 상이한 시점에서 결정된 혈청 농도가 작도 (a)될 뿐만 아니라 계산된 PK 파라미터 말단 혈청 반감기(t1/2) 및 곡선하 면적(AUC) (b)이 작도된다.
도 26은 면역사이토카인 PM-IL-15wt NA 및 PM-IL-15wt 또는 완충액 대조군으로서 PBS의 단일 용량 i.v. 투여 후 C57BL/6 마우스에서 생체 내 약역학(PD) 효과를 제시한다. 처리 유도 PD 효과는 흐름세포측정법에 의해 림프 기관 비장 및 서혜부 림프절(ingLN)에서 분석되었다. 이들 기관에서의 전체 세포의 증가는 a + d에 제시되고, 상이한 면역 세포 집단의 상대 비율은 b + e에 제시되는 반면, CD8+ T 세포, NK 세포 및 NKT 세포의 최종 선택적 확장은 c + f에 제시된다.
도 27 (a)는 도 26에 대해 기재된 것과 동일한 모델에서 흐름세포측정법에 의해 분석된 바와 같은 PBS 대조군에 비한 PM-IL-15wt NA 및 PM-IL-15wt를 이용한 단일 용량 처리에 의한 CD8+ / CD4+ Treg 비율의 증가를 제시한다. (b)는 CD8+ 집단에서 상이한 T 세포 서브셋의 상대 비율에 대한 처리의 영향을 제시한다. 비장의 CD8+ T 세포 (c) 및 NK 세포 (d)에서 ICOS, NKG2D 및 CD122(IL-2/15Rβ)의 발현은 흐름세포측정법에 의해 처리 후 결정되었다.
도 28은 면역사이토카인 또는 완충액 대조군으로서 PBS로 처리 후 이들 마우스의 혈청 샘플에서 ELISA에 의해 결정된 사이토카인 TNF-α 및 IFN-γ의 농도를 제시한다.
도 29는 말초 혈액 내의 면역 세포에 대한 PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA를 이용한 처리의 장기간 PD 효과를 제시한다. NK, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, NKT 세포, 과립구 및 단핵구의 상대 비율은 면역사이토카인 처리 전(0일) 및 처리 후(11일) 흐름세포측정법에 의해 결정되었다.
도 30은 흐름세포측정법에 의해 분석된 ZR-75-1 상의 종양 세포 발현된 TA-MUC1에 대한 상이한 PM-IL-15wt 작제물의 결합을 제시한다. IL-15가 없는 αMUC1(PankoMab)이 양성 대조군으로 사용되었다.
도 31은 ELISA에 의해 분석된 IL-15Rα 서브유닛(CD215)에 대한 상이한 PM-IL-15wt 작제물의 결합을 제시한다.
도 32는 재조합 IL-15와 비교하여 PM-IL-15-CH34GS 및 -Cκ4GS에 반응한 CTLL-2 및 KHyG-1 mCD16의 증식을 제시한다.
도 33은 상이한 면역 세포 집단에서 재조합 IL-15에 비한 PM-IL-15-CH34GS 및 -Ck4GS의 자극 특성을 입증한다. 활성화 마커 CD25는 흐름세포측정법에 의해 NK 및 CD8+ T 세포에서 분석되었다. 항체의 첨가가 없는 배지가 대조군으로 사용되었다.
도 34는 재조합 IL-15에 비한 PM-IL-15-CH34GS 및 Cκ4GS에 의한 TA-MUC1 발현 CaOV-3 종양 세포에 대한 세포독성의 유도를 제시한다. 종양 세포 사멸은 LDH 방출 검정에 의해 결정되었다.
도 35는 C57BL/6로의 단일 용량 i.v. 주사 후 PM-IL-15-CH34GS 및 -Cκ4GS의 생체 내 약동학(PK) 거동을 제시한다. 계산된 PK 파라미터는 3마리의 마우스의 그룹으로부터 제시된다(말단 혈청 반감기(t1/2) 및 곡선하 면적(AUC)).
도 36은 면역사이토카인 PM-IL-15-CH34GS 및 PM-IL-15-Cκ4GS의 단일 용량 i.v. 투여 후의 C57BL/6 마우스에서의 생체 내 약역학(PD) 효과를 제시한다. 혈액의 둘 모두의 세포 서브셋에서의 NK 및 CD8+ T 세포뿐만 아니라 CD122(IL15Rβ 서브유닛) 발현의 상대 비율이 면역사이토카인 처리 전(0일) 및 처리 후(11일) 흐름세포측정법에 의해 결정되었다.
도 37은 생체 내 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단에서 상이한 효과기 및 기억 T 세포 서브셋의 상대 비율에 대한 PM-IL-15-CH34GS 및 -Cκ4GS를 이용한 i.v. 및 s.c. 처리의 영향을 제시한다.
도 38은 TA-MUC1 양성 4T1 마우스 종양 세포가 이식된 마우스의 종양 부피 및 생존에 대한 PM-IL-15-CH34GS의 치료 효과를 제시한다.
도 39는 CaOV-3 표적 세포의 존재하에서 면역사이토카인 PM-IL-15-CH34GS와 TA-MUC1 표적화 T 세포 연동 이중특이적(PM-CD3)를 조합하는 경우 면역 세포 활성화에서 발견된 상승작용적 효과를 제시한다. CD4+ (a) 및 CD8+ (b) T 세포에 대한 활성화 마커 CD25의 치료 유도 발현은 흐름세포측정법에 의해 2일 후에 결정되었다.
도 40은 CaOV-3 표적 세포의 존재하에서 면역사이토카인 PM-IL-15wt NA 및 PM-IL-15wt와 TA-MUC1 표적화 T 세포 연동 이중특이적(PM-CD3)를 조합하는 경우 T 세포 증식에서 발견된 상승작용적 효과를 제시한다. CD4+ (a) 및 CD8+ (b) T 세포의 처리 유도 증식은 흐름세포측정법에 의해 5일 후에 결정되었다.
도 41은 면역사이토카인 PM-IL-15wt NA 또는 PM-IL-15wt와 TA-MUC1 표적화 T 세포 연동 이중특이적(PM-CD3)의 조합 처리 후의 CaOV-3 종양 세포에 대한 PBMC-매개 세포독성에서 발견된 상승작용적 효과를 제시한다. 세포독성은 LDH 방출 검정에 의해 24시간 후에 결정되었다. (a)는 절대 특이적 용해를 제시하고, (b)는 면역사이토카인 자체에 의해 유도된 용해의 공제 후의 상승작용을 추가로 강조한다. (c)는 1 또는 5 μg/mL의 면역사이토카인을 이용한 조합 처리 후 효과를 제시한다.
도 42는 대조군과 비교하여 20 nM PM-IL-15-CH34GS와 함께 2일 동안 인큐베이션 후 HSC-4 종양 세포 및 단핵구에서의 PD-L1의 발현을 제시한다.
도 43은 PM-IL-15-CH34GS와 PD-L1 표적화 항체 Bavencio®의 조합 처리 후 HSC-4 종양 세포에 대한 PBMC-매개 세포독성에서 발견된 상승작용적 효과를 제시한다. 세포독성은 LDH 방출 검정에 의해 24시간 후에 결정되었다.
도 44는 PM-IL-15-CH34GS와 PD-L1 표적화 항체 Bavencio®의 조합 처리 후 혼합 림프구 반응에서 T 세포 활성화에 대해 발견된 상승작용적 효과를 제시한다.
도 45는 PM-IL-15-CH34GS와 EGFR 표적화 항체 Erbitux® 및 CetuGEX®의 조합 처리 후 HSC-4 종양 세포에 대한 PBMC-매개 세포독성에서 발견된 상승작용적 효과를 제시한다. 세포독성은 LDH 방출 검정에 의해 24시간 후에 결정되었다.
도 46은 글리코-최적화된 항-CD40 hIgG1 항체를 이용한 처리 후 NK, NKT, CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 CD215의 발현을 제시한다.
실시예
실시예 1: MUC1 및 IL-15와 특이적으로 결합하는 융합 단백질 작제물의 생성.
MUC1 특이적 결합 부분 및 IL-15 기능 부분으로 구성된 융합 단백질 작제물을 생성시켰다. MUC1 결합 부분은 전형적인 항체 Y-형태를 갖는 인간화 전장 IgG1 항체 분자 PankoMab(가티포투주맙(gatipotuzumab))이다. 항-MUC1 항체는 CH2 도메인(PM)에 천연 당화 부위를 포함하거나, 중쇄에 N297A 돌연변이를 보유하여, 당화를 폐기한다(PM NA). CH2 도메인에서 당화가 없으면, 항체는 Fcγ 수용체에 결합하지 않으며, ADCC를 유도할 수 없다(Fc 침묵 변이체). IL-15 기능은 야생형 서열(IL-15wt) 또는 수용체 결합을 감소시키는 돌연변이 I67E(IL-15mut)를 갖는 전장 인간 IL-15의 융합에 의해 실현된다. 일 작제물에서, IL-15wt는 IL-15 수용체 α-사슬의 스시 도메인을 보유한다(IL-15sushi). 작제물의 일반 구조는 도 1에 제시된다.
표 1: 융합 단백질 작제물
Figure pct00002
이들 작제물에서, 하나의 IL-15는 (Gly4Ser)4 링커를 통해 각각의 항체 중쇄의 C 말단에 융합된다. IL-15Rα 스시 도메인(존재하는 경우)은 항체 중쇄의 C 말단과 IL-15의 N 말단 사이에 융합되고, 융합 파트너 사이에는 (Gly4Ser)4 링커가 있다.
표 2: 추가 융합 단백질 작제물
Figure pct00003
이들 작제물에서, 하나의 IL-15wt는 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)1 링커를 통해 각각의 항체 경쇄의 C 말단 또는 N 말단에 융합되거나; 하나의 IL-15는 (Gly4Ser)4 링커를 통하거나 임의의 링커 없이 직접 각각의 항체 중쇄의 C 말단에 융합되며, 여기서 중쇄의 말단 리신 잔기는 결실되었다. PankoMab은 CH2 도메인에서 당화된다. PM-IL-15-CH34GS는 표 1의 PM-IL-15wt에 해당한다.
작제물은 인간 골수성 백혈병 유래 세포주 NM-H9D8(DSM ACC2806)에서 발현되었으며, 이는 PankoMab CH2 도메인에서 약 90% 푸코실화 글리칸을 갖는 인간 당화 패턴을 갖는 작제물을 생성하였다. 추가로, 작제물은 또한 관련된 세포주 NM-H9D8-E6Q12(DSM ACC2856)에서 생성될 수 있으며, 이는 wt 작제물의 PankoMab CH2 도메인에서 약 10%의 적은 양의 푸코실화를 갖는 당화된 작제물을 생성시킬 수 있다.
표 3: 추가 융합 단백질 작제물
Figure pct00004
상기 작제물은 인간 골수성 백혈병 유래 세포주 NM-H9D8(DSM ACC2806) 및 효소 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)가 결여된 차이니즈 햄스터 난소 세포주 CHO/dhFr-에서 발현되었다. 추가로, 작제물은 또한 NM-H9D8 관련 세포주 NM-H9D8-E6Q12(DSM ACC2856)에서 생성될 수 있으며, 이는 wt 작제물의 PankoMab CH2 도메인에서 약 10%의 적은 양의 푸코실화를 갖는 당화된 작제물을 생성시킬 수 있다.
상이한 PankoMab 및 IL-15 변이체의 분석
실시예 2: 항원 결합
당화 및 비-당화 MUC1 펩티드에 대한 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 항원 결합 특징을 ELISA를 사용하여 PankoMab와 비교하였다. PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt 둘 모두는 당화된 MUC1 펩티드에 대해 PankoMab와 동등하게 결합하는 반면, 당화되지 않은 MUC1 펩티드에 대해서는 유의한 결합이 없다(도 2). 이는 둘 모두의 PM-IL15 작제물의 적절한 종양 특이성을 나타낸다.
세포 표면 TA-MUC1에 대한 PM-IL15 면역사이토카인의 상이한 변이체의 결합 특성을 TA-MUC1을 강하게 발현하는 유방암 세포주 T-47D를 사용하여 분석하였다. 종양 세포를 연속 희석으로 지정된 항체와 함께 인큐베이션하고, 결합된 항체를 피코에리트린-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG(중쇄 및 경쇄) 항체를 사용하여 검출하였다. 결합을 흐름세포측정법으로 분석하였다. 모든 PM-IL15 면역사이토카인은 부착된 IL15 변이체 또는 Fc 도메인의 당화에 관계 없이 T-47D 세포에 대한 강한 결합을 나타낸다(도 3a의 Fc 기능성 변이체, 도 3b의 Fc 침묵 변이체). 결합 특성(EC50, %최대 결합)은 PankoMab와 동일하였다. 또한, 대조군 작제물 MOPC-IL15(관계 없는 Fab 도메인)의 결합이 검출되지 않았기 때문에 PM-IL15 면역사이토카인의 결합은 TA-MUC1에 매우 특이적이었다.
세포 표면 TA-MUC1에 대한 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 결합을 TA-MUC1을 강하게 발현하는 종양 세포주 Panc-1을 사용한 흐름세포측정법에 의해 추가로 평가되었다. Panc-1 세포를 상이한 농도의 PM-IL15wt 및 PM-IL15wt NA와 함께 인큐베이션하였고, PankoMab와 비교하였다. 인간 IgG 대조군을 백그라운드 염색에 대한 대조군에 포함시켰다. 결합된 항체를 피코에리트린-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG(중쇄 및 경쇄) 항체를 사용하여 검출하였다. PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt 둘 모두는 TA-MUC1 발현 Panc-1 세포에 대한 강하고 특이적인 결합을 나타내며, 결합 특성(EC50, %max)은 PankoMab과 완전히 동일하였다(도 4).
실시예 3: IL-15 수용체 결합
IL-15 수용체에 대한 결합 특성을 ELISA에 의해 Fc 침묵 NA 변이체로 예시적으로 분석하였다. IL-15Rα 또는 IL-15Rβ(IL-2rβ, CD122) 중 어느 하나를 96-Well Maxisorp 플레이트 상에 코팅하였다. PM-IL15 면역사이토카인을 연속 희석으로 인큐베이션하고, 결합된 면역사이토카인을 퍼옥시다제-표지된 항-인간 IgG F(ab')2 단편 특이적 항체와의 인큐베이션에 의해 검출하였다. IL-15Rα에 대한 결합은 PM-IL15sushi NA에 대해서는 검출 가능하지 않았고, PM-IL15wt NA는 PM-IL15mut NA와 비교하여 높은 친화성으로 IL-15Rα에 결합한다(도 5a). IL-15Rβ에 대한 결합의 분석은 PM-IL15mut NA가 IL-15 수용체의 IL-15Rβ 사슬에 결합할 수 없음을 나타내었다(도 5b). PM-IL15sushi NA 변이체는 PM-IL15wt NA보다 IL-15Rβ에 대해 더 강한 결합을 나타내었다.
IL-15Rα(CD215) 및 IL-15Rβ(IL-2rβ, CD122)에 결합하는 PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA의 능력을 IL-15Rα 또는 IL-15Rβ의 코팅 후에 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 비교하였다. IL-15Rβ에 대한 결합의 분석은 PM-IL15wt가 PM-IL15wt NA보다 CD122에 대한 분명하게 더 강한 결합을 갖는 것을 나타내었으며, 이는 특히 NK 세포에 대한 이의 더 높은 활성을 설명할 수 있다(도 6a). IL-15Rα에 대한 결합은 둘 모두의 작제물 사이에서 동등하였다(도 6b).
실시예 4: FcγRIIIa 결합
분자 수준에서 FcγRIIIa에 대한 PM-IL15 면역사이토카인의 항체 Fc 도메인의 결합을 특성규명하기 위해, 본 발명자는 PerkinElmer의 AlphaScreen® 기술에 기초하여 FcγRIIIa(CD16a)에 대한 FcγR 결합 검정을 사용하였다. AlphaScreen® 플랫폼은 PerkinElmer의 단순 비드-기반 기술에 의존하며, 전통적인 ELISA에 대한 보다 효율적인 대안이다.
His-태깅된 FcγRIIIa(Glycotope GmbH)는 Ni-킬레이트 공여체 비드에 의해 포획된다. 시험 PM-IL15 면역사이토카인 및 토끼-항-마우스 커플링된 수용체 비드는 FcγIIIa에 대한 결합에 대해 경쟁한다. FcγRIIIa와 토끼-항-마우스 수용체 비드의 상호작용의 경우, 공여체 및 수용체 비드가 근접하게 되어, 680 nm에서 레이저 여기시 화학발광에 의한 발광을 유도한다. 최대 신호는 경쟁자 없이 달성된다. 시험 항체가 FcγRIIIa에 결합하는 경쟁의 경우, 최대 신호는 농도 의존적 방식으로 감소된다. EnSpire 2300 다중라벨 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 520-620 nm에서의 측정에 의해 화학발광을 정량화하였다. 모든 결과는 중복 샘플의 평균 ± 표준 편차로 표현되었다. 결과로서, 농도 의존적 S자형 용량-반응 곡선이 수신되었으며, 이는 상부-정점지속기, 하부-정점지속기, 기울기 및 EC50으로 정의된다.
도 7에 제시된 바와 같이, PM-IL-15wt는 PankoMab-GEX에 대한 동등한 FcγRIIIa 결합을 나타내는 반면, Fc 돌연변이된 N297A 변이체 PM-IL-15wt NA는 어떠한 FcγRIIIa 결합도 나타내지 않는다.
실시예 5: 천연 세포독성의 유도
IL-15는 면역 세포의 천연 세포독성을 향상시킬 수 있다고 기재되어 있다. PM-IL-15 면역사이토카인이 천연 세포독성을 유도할 수 있는지 시험하기 위해, 백혈병 Jurkat T 세포주를 표적 세포로서 사용하고, 건강한 공여자의 PBMC를 효과기로서 사용하였다. Jurkat 세포는 천연 세포독성에 민감하고, TA-MUC1을 발현하지 않는 것으로 기재되어 있다. 천연 세포독성 검정은 유로퓸(Eu) 방출 검정으로 수행하였다. 전기천공에 의해 Jurkat 세포에 유로퓸을 로딩하고, 검정 플레이트에 시딩하였다. 80:1의 효과기 대 표적 세포 비율의 PBMC 및 시험 면역사이토카인의 희석액을 첨가하였다. 모든 샘플을 3중으로 분석하였다. 최대 유로퓸 방출 제어(MR)를 위해, 표적 세포를 TritonX-100으로 용해시켰다. 기저 유로퓸 방출(BR)을 표적 세포 상층액을 함유하는 웰에서 측정하였다. 최종적으로, 표적 세포에 의한 자발적인 유로퓸 방출(SR)은 표적 세포만을 함유하는 대조군에 의해 해결되었다. 모든 대조군을 6중으로 분석하였다. 5시간의 인큐베이션 후, 상층액을 수확하고, 방출된 유로퓸을 DELFIA Enhancement Solution과의 인큐베이션 및 340 nm 소멸 및 61 nm 방출에서 Tecan Infinite F200 마이크로플레이트 판독기에서의 측정 후에 결정하였다.
특정 세포독성을 하기와 같이 계산하였다:
% 특이적 용해 = (실험적 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 기저 방출) x100.
도 8에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 PM-IL-15 면역사이토카인은 PankoMab에 비해 Jurkat T 세포에 대한 면역 세포의 천연 세포독성을 증가시킨다. 천연 세포독성의 유도의 강도는 IL-15 모듈에 의존하며(IL-15sushi > IL-15wt > IL-15mut), 기능적 Fc 도메인을 갖는 변이체는 Fc-침묵 변이체에 비해 더 높은 효능을 갖는다.
실시예 6: ADCC 검정 1
면역 세포 매개 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC)은 항-종양 항체의 주요 메커니즘이다. TA-MUC1을 통한 종양 세포 결합 후, 항체 작제물은 2개의 상이한 메커니즘에 의해 NK 세포 및 T 세포를 활성화시킨다. 한편으로, 항체의 Fc 영역은 면역 세포 표면 상의 Fcγ 수용체 IIIa 에 결합하고, 다른 한편으로, 작제물의 IL-15 부분은 IL-2 수용체 β-사슬 및 공통 γ-사슬에 의해 형성된 인터루킨 수용체에 결합한다. 활성화된 면역 세포는 TA-MUC1+ 종양 세포의 세포 사멸을 촉진하는 퍼포린 및 그랜자임을 함유하는 세포독성 과립을 방출한다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC) ADCC 검정은 유로퓸(Eu) 방출 검정으로 수행하였다. 80% 초과의 생활력을 갖는 3x106개의 MUC-1 발현 T47D 표적 세포를 수확하고, PBS 중에서 2회 세척하고, 100 μL 저온 유로퓸 완충액에 재현탁시켰다. 얼음 상에서의 10분 인큐베이션 후, 세포를 Amaxa Nucleofector(Lonza)로 전기천공하였다. 전기천공된 세포를 다시 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후, 이들을 검정 배지(RPMI1640 + 5%(v/v) 열-비활성화 FCS)에서 6회 세척하였다. 표적 세포를 계수하고, 검정 배지에서 5x104 세포/mL로 희석하고, 100 μL/웰을 항체 희석액 또는 배지 대조군에 첨가하였다. 10배 농축된 항체 희석액을 검정 배지에서 제조하고, 20 μL/웰을 96-웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. PBMC를 분리하고, 검정 배지에 5x106 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다. 80 μL/웰 효과기 세포를 표적 세포 및 항체 희석액 또는 배지를 함유하는 검정 플레이트로 옮겼다. 모든 샘플을 3중으로 분석하였다.
최대 유로퓸 방출 제어(MR)를 위해, 100 μL/웰 표적 세포에 80 μL/웰 배지 및 20 μL/웰 10%(v/v) TritonX-100을 보충하였다. 기저 유로퓸 방출(BR)을 100 μL 검정 배지 및 100 μL 표적 세포 상층액을 함유하는 웰에서 측정하였다. 최종적으로, 표적 세포에 의한 자발적인 유로퓸 방출(SR)은 100 μL 검정 배지 및 100 μL 표적 세포를 함유하는 대조군에 의해 해결되었다. 모든 대조군을 6중으로 분석하였다.
플레이트를 300 x g에서 간단히 원심분리하고, 표준 세포 배양 조건하에서 4-5시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 웰의 상층액에서 유로퓸 수준을 측정하기 위해, 플레이트를 5분 동안 300 x g에서 원심분리하고, 25 μL/웰 상층액을 200 μL/웰 DELFIA Enhancement Solution이 제공된 백색 96-웰 편평 바닥 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 340 nm 소멸 및 61 nm 방출에서 Tecan Infinite F200 마이크로플레이트 판독기로 형광을 측정하기 전에 10분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다.
특정 세포독성을 하기와 같이 계산하였다:
% 특이적 용해 = (실험적 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 기저 방출) x100.
% 자발적 용해 = (자발적 방출 - 기저 방출) / (최대 방출 - 기저 방출) x100.
효과기 세포로서 PBMC를 사용하여, 상이한 융합 단백질 작제물은 MUC-1 발현 종양 세포주 T47D의 표적 세포 용해를 나타내었다. 상이한 작제물의 활성은 상이한 EC50 값(절반-최대 용해를 달성하는 데 필요한 작제물의 농도)에 의해 입증된다. 예상된 바와 같이, IL-15에 더하여 IL-15Rα 스시 도메인을 포함하는 작제물은 IL-15wt 단독을 갖는 작제물보다 더 활성이 있으며, 이는 돌연변이된 IL-15 I67E를 갖는 작제물보다 더 활성이 있다(도 9 참조). 항체의 Fc 영역의 효과는 PankoMab wt와 PankoMab NA 작제물을 비교함으로써 제시된다. 놀랍게도, 항체 Fc 영역(PM-IL-15wt NA 및 PM-IL-15sushi NA)을 통한 면역 세포 활성화 없이도 매우 강한 용해 활성이 관찰될 수 있었다. 돌연변이된 IL-15를 갖는 PankoMab NA 작제물을 제외하고, 모든 작제물은 네이키드 PankoMab 항체보다 더 활성이 있었다.
융합 단백질 작제물의 항원 결합은 종양 세포에 결합하지 않는 항체를 갖는 유사한 작제물(MOPC)과 상기 작제물의 비교에 의해 입증되는 바와 같이 ADCC 효과에 중요하다. MUC-1 발현 Ovcar-3 종양 세포주를 표적 세포로서 사용하였다. MOPC 작제물은 강하게 감소된 ADCC 활성을 나타낸다(도 10 참조).
추가 ADCC 검정에서, MCF-7 세포를 표적 세포로서 사용하였다. TA-MUC1-양성 MCF-7 종양 세포를 10:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 자극되지 않은 PBMC의 첨가 전에 검정 플레이트에서 24시간 동안 성장시켰다. 지정된 농도의 면역사이토카인을 첨가하고, 종양 세포 사멸을 세포 상층액으로 방출된 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 정량화(세포독성 검출 키트(LDH), Roche)에 의해 24시간 후에 평가하였다. 표적 세포와 트리톤-X-100의 인큐베이션에 의해 최대 방출이 달성되었으며, 항체-독립적인 세포 사멸이 표적 세포 및 PBMC만 함유하고 항체를 함유하지 않는 샘플에서 측정되었다.
예상된 바와 같이, IL-15/IL-15Rα 스시 도메인을 포함하는 작제물은 IL-15wt 단독을 갖는 작제물보다 더욱 활성이 있다(도 11 참조). 놀랍게도, 항체 Fc 영역(PM-IL-15wt NA 및 PM-IL-15sushi NA)을 통한 면역 세포 활성화 없이도 강한 용해 활성이 관찰될 수 있었다. 모든 시험된 면역사이토카인은 10:1의 낮은 E:T 비율에서 적당한 ADCC 활성만을 나타내는 네이키드 PankoMab 항체보다 더 활성이 있었다.
실시예 7: ADCC 검정 2
종양 세포에 대한 세포독성은 면역 치료제에 의해 유도되어야 하는 주요 메커니즘 중 하나이다. TA-MUC1 표적화된 IL-15-기반 면역사이토카인을 사용함에 의한 종양 세포로의 IL-15의 방향은 면역 세포의 활성화로 이어지며, 추가로 그랜자임 B 및 퍼포린에 의해 종양 세포의 직접 사멸을 추가로 발생시킬 것이다. PM-IL15 면역사이토카인의 세포독성 잠재성을 평가하기 위해, TA-MUC1-양성 CaOV-3 종양 세포를 10:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 PM-IL15 면역사이토카인 및 자극되지 않은 PBMC의 첨가 전에 검정 플레이트에서 24시간 동안 성장시켰다. 종양 세포 사멸을 세포 상층액으로 방출된 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 정량화(세포독성 검출 키트(LDH), Roche)에 의해 24시간 후에 평가하였다. 표적 세포와 트리톤-X-100의 인큐베이션에 의해 최대 방출이 달성되었으며, 항체-독립적인 세포 사멸이 표적 세포 및 PBMC만 함유하고 항체를 함유하지 않는 샘플에서 측정되었다. 도 12에 제시된 바와 같이, PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt 둘 모두는 용량 의존적 방식으로 종양 세포의 효과적인 용해를 유도한다. 여러 공여자 PBMC의 분석은 PM-IL15wt NA에 비해 종양 세포 용해를 유도하는 PM-IL15wt의 더 높은 효능(더 낮은 EC50, 더 높은 최대 용해)을 나타내었다.
실시예 8: 3D 구형 모델에서의 면역 세포 모집
종양 표적화 PM-IL15 면역사이토카인의 주요 장점은 면역억제 환경을 관절 면역 반응의 실행 가능한 장소로 전환하기 위한 종양 부위에서의 면역 세포의 국소 활성화의 매개이다. 그러나, 또한 IL-15는 이의 화학주성 특성에 의해 면역 세포를 유인하는 것으로 기재된다. 면역 세포를 유인하는 PM-IL15 면역사이토카인의 잠재성을 분석하기 위해, 본 발명자는 PBMC와 3D 종양 구형의 공동-배양 검정을 확립하였다.
암 줄기세포(CSC) 표현형을 갖는 세포가 풍부한 MCF-7 유방암 세포주(MCF-7CSC-풍부로 언급됨)를 사용하였다. "고전적" MCF-7 세포주와 대조적으로, CSC-풍부 세포주는 일반적인 부착 2D 배양에서 CD44+/CD24- 및 측면 집단의 유의하게 증가된 비율을 나타내고, 3D 구형을 형성하는 능력을 갖는다. TA-MUC1+ MCF-7CSC-풍부 세포를 Corning Spheroid 마이크로플레이트에 시딩한 후 37℃에서 5% CO2의 가습 대기에서 3일 인큐베이션 단계에 의해 3D 구형을 생성시켰다. 구형 압축 및 성장을 현미경 하에서의 관찰에 의해 확인하였다. 3일에서 구형 형성 후, 건강한 공여자의 인간 PBMC뿐만 아니라 20 ng/ml PM-IL-15wt NA 및 PM-IL-15sushi NA를 첨가하고, 2일 동안 추가로 인큐베이션하였다. 3D 구형으로의 면역 세포의 침윤을 면역조직화학을 통해 분석하였다. 따라서, 구형을 수집하고, 세척하고, 포르말린으로 고정시켰다. 이후, 고정 구형을 HistoGel™(Thermo Fisher)에서 성형하고, 조직 표시 염료(Thermo Fisher)로 염색하고, 탈수시키고, 파라핀에 포매시켰다. 염색을 CD3 및 CD45에 대한 항체를 사용하는 표준 방법에 따라 3-4 μm 두께의 연속 섹션에서 수행하였다. 결합된 1차 항체를 퍼옥시다제-커플링된 검출 항체 및 기질로서 액체 디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 검출하였다. 핵을 헤마톡실린으로 대조염색시켰다.
도 13에 제시된 바와 같이, PM-IL-15wt NA 및 PM-IL-15sushi NA의 첨가는 구형 내에서 CD45+ 면역 및 CD3+ T 세포의 유의한 증가를 발생시킨다. CD45+ 면역 세포 침윤을 증가시키는 효능에서 PM-IL-15wt NA와 PM-IL-15sushi NA 사이에 차이가 없었지만, PM-IL-15sushi NA는 CD3+ T 세포를 모집하는데 더 높은 효능을 갖는다.
또한, 면역 세포를 유인하는 PM-IL-15wt 및 PM-IL-15-wt NA의 잠재성을 PBMC와 3D 종양 구형의 공동 배양 검정에서 비교하였다(상기 기재된 바와 같은 방법).
3일에서의 구형 형성 후, 건강한 공여자의 인간 PBMC뿐만 아니라 지정된 양의 PM-IL-15 면역사이토카인 또는 PankoMab을 첨가하고, 2일 동안 추가로 인큐베이션하였다. 3D 구형으로의 면역 세포의 침윤은 CD8 및 CD45로 파라핀 포매된 구형의 염색 후에 분석하였다. 결합된 1차 항체를 퍼옥시다제-커플링된 검출 항체 및 기질로서 액체 디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 검출하였다. 핵을 헤마톡실린으로 대조염색시켰다.
도 14에 제시된 바와 같이, PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA의 첨가는 구형 내에서 CD45+ 면역 및 CD8+ T 세포의 유의한 증가를 발생시키는 반면, PankoMab을 사용하여 효과가 없었다. PM-IL-15wt와 PM-IL-15wt NA 사이에 차이가 없었다.
실시예 9: 면역 세포 활성화 및 증식
융합 단백질 작제물에 의한 면역 세포의 활성화를 조사하기 위해, 48시간 후 활성화 마커 CD69의 발현을 NK 세포 및 NKT 세포에 대한 흐름세포측정법으로 분석하였다. 이를 위해, 건강한 공여자의 인간 PBMC를 48시간 동안 지정된 농도의 상이한 융합 단백질 작제물과 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후, PBMC를 수확하고, 형광 표지된 αCD4, αCD8, αCD25, αCD69, αCD56, αCD14 및 αCD19 항체로 각각 염색하였다. 생존 세포만을 분석하기 위해, DAPI(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 세포를 Attune NxT(Thermo Fisher) 흐름세포측정기에서 분석하였다. 면역 세포 활성화 외에도, PankoMab-IL-15 작제물의 또 다른 작용 메커니즘은 NK 및 T 세포 증식의 유도이다. 면역 세포 증식을 측정하기 위해, 건강한 공여자로부터의 PBMC를 CellTrace™ Violet(Thermo Fisher)으로 표지하고, 5일 동안 상이한 융합 단백질 작제물과 함께 인큐베이션하였다. 면역 세포가 증식하는 경우, CellTrace™ 염료는 증식하는 세포의 각각의 세대에 대해 희석된다. 5일 후, PBMC를 수확하고, 형광 표지된 αCD4, αCD8, αCD56, αCD14 및 αCD19 항체로 각각 염색하였다. 생존 세포만을 분석하기 위해, 7-AAD(Calbiochem)를 사용하였다. 세포를 Attune NxT(Thermo Fisher) 흐름세포측정기에서 분석하였다.
결과는 모든 융합 단백질 작제물이 NK 및 NKT 세포 활성화 및 NK, NKT 및 CD8+ T 세포 증식을 유도할 수 있음을 입증한다(도 15 및 16 참조). 활성화 및 증식의 유도 강도는 IL-15 모듈에 좌우되며(IL-15sushi > IL-15wt > IL-15mut), NK 세포의 경우, 항체 Fc 부분의 당화에 좌우된다(당화 > 비-당화).
Fc 당화를 갖거나 갖지 않는(Fc wt 및 Fc 침묵(NA) 변이체) PM-IL15 면역사이토카인의 면역 자극 특성을 또한 상세히 조사하였다. NK 세포, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 활성화를 지정된 분자와 함께 5일 동안 PBMC를 인큐베이션한 후에 분석하였다. 자극된 PBMC를 형광 표지된 αCD3, αCD4, αCD8, αCD14, αCD19, αCD25, αCD45RA, αCD56, αCD69 및 αCD197 항체로 염색하였다. 분석 전에 DAPI의 첨가에 의해 사멸 세포를 제외시켰다. 도 17에 제시된 바와 같이, PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt는 NK 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 CD25 및 CD69의 발현을 유도한 반면, PankoMab은 이러한 검정 설정에서 이들 세포 서브셋을 활성화시킬 수 없었다. 흥미롭게도, FcγR과 연동될 수 있는 작제물 PM-IL15wt는 FcγR 활성을 촉발할 수 없는 PM-IL15wt NA보다 NK 세포를 활성화하는데 더 높은 효능을 나타내었다. 그러나, PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt에 의해 유도된 T 세포에서 CD25 및 CD69의 발현은 둘 모두의 작제물 사이에서 동일하였다.
흥미롭게도, 기억 및 효과기 T 세포 서브셋의 분석은 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt가 고전적인 효과기 집단을 활성화시킬 수 있을뿐만 아니라 이러한 특정 세포 서브셋에서 CD69의 유도에 의해 나타난 바와 같이 나이브(CD45RA+ 및 CCR7+) CD4+ 및 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있음을 나타내었다(도 18). 또한, PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt 둘 모두와의 인큐베이션은 CCR7- 효과기 T 세포의 증가를 발생시켰고, 이는 PM-IL15 면역사이토카인이 효과기 세포 집단을 강화시킬 수 있음을 나타낸다.
NK 및 T 세포의 완전한 활성화는 강한 증식을 발생시킨다. 증식을 매개하는 PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt의 능력을 평가하기 위해, CellTrace™ Violet(Thermo Fisher)-표지된 PBMC를 지정된 분자와 함께 5일 동안 인큐베이션하였다. 자극된 PBMC를 형광 표지된 αCD3, αCD4, αCD8, αCD14, αCD19, αCD45 및 αCD56 항체로 염색하였다. 흐름세포측정법에 의한 분석 전에 7-AAD(Sigma-Aldrich)로 염색하여 사멸 세포를 제외하였다. PM-IL15wt NA 및 PM-IL15wt 둘 모두는 NK 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 증식을 유도한 반면, PankoMab 단독은 효과가 없었다(도 19). 면역 세포 활성화 검정의 결과와 유사하게, PM-IL15wt NA와 PM-IL15wt 사이에 T 세포 증식을 유도하는 효능에는 차이가 없었다. 그러나, PM-IL15wt는 PM-IL15wt NA보다 낮은 농도에서 NK 세포 증식을 재현 가능하게 유도하였다.
실시예 10: 사이토카인 방출
IL-15는 강력한 사이토카인이며, IL-15 처리에 의해 매개되는 잠재적 사이토카인 방출은 전임상 연구에서 고려되어야 할 문제이다. 특히, 면역 세포에 의한 IFN-γ, GM-CSF 및 MIP1-α의 분비는 IL-15 자극 후에 설명된다. 8명의 건강한 공여자의 PBMC를 검정 웰의 용액상에 첨가된 지정된 PM-IL-15 면역사이토카인과 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 UPLEX 검정 플랫폼(MSD)을 사용하여 분석하였다. IFN-γ(도 20a) 및 GM-CSF(도 20b)의 분비가 제시된다.
예상된 바와 같이, 모든 시험된 PM-IL-15 면역사이토카인은 사이토카인 방출을 유도하였고, IL-15/IL-15Rα 스시 도메인을 포함하는 작제물은 IL-15wt 단독을 갖는 작제물보다 IFN-γ(도 20a) 및 GM-CSF(도 20b)의 더 높은 분비를 유도하였다. 놀랍게도, 시험된 사이토카인의 방출에 대해 Fc 도메인의 명백한 영향은 없었다.
실시예 11: 면역억제된 세포의 활성화
고형 종양의 미세환경은 일반적으로 매우 억제성이며, 이는 상당수의 면역 치료제가 이행되는 주요 문제 중 하나이다. PM-IL15 면역사이토카인이 억제 환경을 극복하고, 억제된 면역 세포를 활성화시키는 능력을 갖는지 조사하기 위해, 건강한 공여자의 PBMC를 50ng/ml의 면역억제성 사이토카인 TGF-β와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후, PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA를 등몰 농도(572 nM)로 첨가하고, NK 세포, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 활성화를 5일의 추가 인큐베이션 후에 분석하였다. PBMC를 형광 표지된 αCD3, αCD4, αCD8, αCD25, αCD56 및 αCD69 항체로 염색하였다. 분석 전에 DAPI의 첨가에 의해 사멸 세포를 제외시켰다.
NK 세포(CD25)의 활성화는 도 21a에 제시되고, CD8+ T 세포(CD69)의 활성화는 도 21b에 제시된다. 예상되고 이전에 기재된 바와 같이, PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA는 억제되지 않은 T 세포를 동등하게 활성화시키는 반면, NK 세포는 PM-IL-15wt NA보다 PM-IL-15wt에 의해 더 강하게 활성화된다. 흥미롭게도, 둘 모두의 PM-IL-15 면역사이토카인은 또한 TGF-β에 의해 억제된 면역 세포를 활성화시킬 수 있었다. TGF-β를 이용한 처리 후 CD25 및 CD69의 발현이 감소되었으므로 TGF-β에 의한 면역 억제는 모든 분석된 세포 서브셋에서 명백하였다. 다시, PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA는 T 세포를 활성화시키는 유사한 효능을 나타내었고, 기능성 Fc 도메인을 갖는 PM-IL-15wt 작제물은 Fc 침묵 변이체 PM-IL-15wt NA에 비해 억제된 NK 세포를 자극하는데 더 높은 효능을 가졌다.
실시예 12: 화학주성
IL-15는 이의 화학주성 특성에 의해 면역 세포를 유인하는 것으로 기재된다. PM-IL-15 면역사이토카인이 여전히 화학주성으로 작용하는지 확인하기 위해, 고전적인 화학주성 검정을 설정하였다. 건강한 PBMC를 96-웰 트랜스웰 시스템(5 μm 포어 크기의 폴리카르보네이트 막, Corning Costar)의 상부 챔버에 배치하였다. 하부 챔버를 PM-IL-15 면역사이토카인이 첨가된 배지로 채웠다. 37℃에서 4시간 동안 5% CO2에서 인큐베이션 후, 이동된 면역 세포의 수를 흐름세포측정기를 사용하여 하부 챔버에서 세포를 계수하여 결정하였다. 분석 전, 세포를 형광 표지된 αCD3, αCD4, αCD8, αCD14, αCD19, αCD56 및 DAPI로 염색하였다.
임의의 자극의 첨가가 없는 대조군 웰(화학주성 지수)에 비한 지정된 PM-IL-15 면역사이토카인을 향한 NK 세포(도 22a), NKT 세포(도 22b) 및 CD8+ T 세포(도 22c)의 이동이 제시된다. PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA 둘 모두는 NK, NKT 및 CD8+ T 세포를 유인하는 높은 잠재성을 가졌다. 흥미롭게도, 기능적 Fc 도메인을 갖는 변이체 PM-IL-15wt는 PM-IL-15wt NA보다 NK 세포의 이동을 유도하는데 더 강력한 반면 NKT 및 CD8+ T 세포에 관해서는 명확한 차이는 없었다.
실시예 13: 생체 내 약동학
PM-IL-15sushi NA 및 PM-IL-15wt NA의 약동학을 분석하기 위해, C57BL/6 마우스에 200pmol 항체를 i.v. 주사하였다. 혈청을 주사 후 5분, 1시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 8일 후에 수집하였다. 혈청 샘플의 항체 역가를 결정하기 위해, Maxisorp F96 ELISA 플레이트를 밤새 0.1 M 카르보네이트 완충액(pH 9.6) 중 2 μg/ml 마우스 항-인간 Igκ 경쇄 항체로 코팅하였다. 비특이적 결합을 PBS 중 5%(v/v) 소 혈청 알부민(BSA)(BSA/PBS)으로 차단하였다. 혈청 샘플 및 표준을 1%(v/v) BSA/PBS에 희석시켰다. 샘플 인큐베이션 후, 호스라디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이션된 염소 항-인간(IgG, Fcγ 단편 특이적) 항체를 1%(v/v) BSA/PBS 중에서 1:30.000의 희석으로 사용하였다. 색 발달을 위해, TMB One Component HRP 마이크로웰 기질을 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 반응을 1.25 M 황산으로 중지시키고, 신호를 Tecan Infinite F200 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm 및 620 nm에서 측정하였다.
또한, 혈액 샘플을 투여전 및 주사 8일 후에 분석하였다. PBMC를 형광단-컨쥬게이션된 항-마우스 CD45, CD3, CD4, CD8로 염색하고, 세포를 Attune® NxT Acoustic Focusing Cytometer에서 분석하였다.
결과는 PM-IL-15wt NA에 비해 PM-IL-15sushi NA의 더 짧은 반감기를 입증한다(도 23 참조). 또한, 둘 모두의 작제물을 이용한 처리는 CD8+ T 세포의 증가를 발생시키며, PM-IL-15sushi NA를 사용하여 효과는 더욱 현저하다(도 24 참조).
PM-IL-15wt의 FcγR-결합 도메인이 PM-IL-15wt NA와 비교하여 이의 약동학적 프로파일에 영향을 미치는지 조사하기 위해, C57BL/6 마우스에 2 mg/kg의 작제물(n=3)을 i.v. 주사하였다. 혈청을 주사 후 5분, 6시간, 1일, 2일, 4일, 7일 및 11일 후에 수집하고, 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 항체 역가를 결정하였다.
도 25에 제시된 바와 같이, PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA는 C57BL/6 마우스에서 동일한 t1/2 및 유사한 전체 노출(AUC)을 나타낸다.
실시예 14: 생체 내 약역학
PM-IL-15 면역사이토카인의 약역학적 효과를 생체 내에서 추가로 조사하였다. 마우스(C57BL/6, n=3)에 2 mg/kg의 PM-IL-15wt NA 또는 PM-IL-15wt를 i.v. 주사하고, 3일에 희생시켜, 혈액, 혈청, 서혜부 림프절(ingLN) 및 비장을 수집하였다. 혈청을 사이토카인 분비에 대한 영향을 분석하기 위해 조사하였으며, 혈액 및 림프 기관으로부터의 면역 세포를 면역 세포 서브셋의 표현형 및 빈도에 대해 특성규명하였다.
3일 동안 PM-IL-15 면역사이토카인을 이용한 처리는 비장(도 26a) 및 서혜부 림프절(도 26d) 내의 세포의 전체 수의 증가를 발생시킨다. 또한, 본 발명자는 CD8+ T 세포, NK 세포 및 NKT 세포의 상대적 증가를 관찰한 반면, CD4+ T 세포 및 B 세포는 오히려 감소하였다(도 26b, e). 궁극적으로, 이는 비장 및 ingLN에서 CD8+ T 세포, NK 세포 및 NKT 세포의 선택적 확장을 발생시킨 반면(도 26c, f), B 세포 및 CD4+ T 세포의 전체 세포수는 영향을 받지 않거나(비장), 약간만 영향을 받았다(ingLN). 일반적으로, PM-IL-15wt가 NK 세포 확장을 자극하는데 더 높은 효능을 가졌다는 점을 제외하고는 PM-IL-15wt NA와 PM-IL-15wt 사이에 차이는 없었다.
3일 동안 PM-IL-15 처리에 의해 유도된 CD8+ T 세포의 선택적 확장은 비장에서의 CD8+ T 세포 대 CD4+ 조절성 T 세포(Treg)의 비율을 처음 7:1에서 10:1로 변화시켜 CD8+ T 세포의 우세를 증가시켰다(도 27a). CD8+ T 세포 집단 내에서, PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA를 이용한 처리는 나이브 세포의 상대적 감소를 발생시키고, 동시에 중앙 기억(TCM) 및 효과기(Teff) 표현형을 갖는 세포의 증가를 발생시킨다(도 27b). PM-IL-15wt와 PM-IL-15wt NA 사이에 차이가 없었다. ingLN에서 유사한 효과가 관찰되었다(제시되지 않음).
마우스 면역 세포의 표현형 특성규명은 3일 동안 PM-IL-15 면역사이토카인을 이용한 자극이 CD8+ T 세포 상에서 ICOS, NKG2D 및 놀랍게도 또한 CD122(IL-2/15Rβ)의 상향조절을 발생시키는 것을 나타내었다(도 27c). 유사하게, NKG2D 및 CD122는 NK 세포에서 상향조절되었다(도 27d). 둘 모두의 효과가 비장(본원에 제시됨) 및 ing LN(제시되지 않음)에서 명백하였다. 본 발명자는 PM-IL-15wt와 PM-IL-15wt NA 사이에 차이가 없음을 관찰하였다.
마우스의 혈청을 사이토카인 함량에 대해 3일에 추가로 분석하였다. PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA의 주사는 TNF-α 및 IFN-γ의 사이토카인 수준을 증가시켰고, PM-IL-15wt는 PM-IL-15wt NA에 비해 둘 모두의 사이토카인의 약간 더 강한 분비를 유도하였다(도 28).
최종적으로, PM-IL-15 면역사이토카인의 장기 효과를 11일에 혈액 내 면역 세포를 분석함으로써 생체 내에서 분석하였다. 더 높은 빈도의 CD8+ T 세포 및 NKT 세포가 PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA의 주사 후 혈액에서 여전히 관찰될 수 있는 반면, 더 높은 NK 세포 빈도는 PM-IL15wt로만 관찰되었다(도 29). CD4+ T 세포의 빈도는 영향을 받지 않았고, 과립구 및 단핵구의 백분율은 처리에 의해 다소 감소되었다. 이는 PM-IL-15 면역사이토카인의 단일 주사가 CD8+ T 세포, NK 세포 및 NKT 세포에 대한 장기적 효과를 유도할 수 있음을 제시한다.
상이한 PM-IL-15 작제물 설계의 분석
실시예 15: 항원 결합
세포 표면 TA-MUC1에 대한 PM-IL15 면역사이토카인의 상이한 변이체의 결합 특성을 TA-MUC1을 강하게 발현하는 유방암 세포주 ZR-75-1을 사용하여 분석하였다. 종양 세포를 연속 희석으로 지정된 항체와 함께 인큐베이션하고, 결합된 항체를 피코에리트린-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG(중쇄 및 경쇄) 항체를 사용하여 검출하였다. 결합을 흐름세포측정법으로 분석하였다. 항체의 Cκ 또는 CH3 도메인에 대한 IL-15의 부착(작제물 CH34GS, CH3oLi-oK, Cκ4GS, Cκ1GS)은 모 항체 PankoMab과 비교하는 경우 TA-MUC1에 대한 결합 특성에 영향을 미치지 않았다. 항체의 VL 영역에 대한 IL-15의 부착(작제물 VL4GS)은 TA-MUC1에 결합하는 능력을 감소시켰다(도 30).
실시예 16: IL-15 수용체 결합
IL-15 수용체 서브유닛에 대한 상이한 PM-IL-15wt 작제물의 결합 특성을 ELISA로 분석하였다. IL-15Rα(CD215)를 96-Well Maxisorp 플레이트에 코팅하였다. PM-IL15 면역사이토카인을 연속 희석으로 인큐베이션하고, 결합된 면역사이토카인을 퍼옥시다제-표지된 항-인간 IgG F(ab')2 단편 특이적 항체와의 인큐베이션에 의해 검출하였다. 모든 시험된 작제물은 CD215에 결합할 수 있었다(도 31). PM-IL-15-CH34GS는 경쇄 융합 작제물 PM-IL-15-Cκ4GS 및 PM-IL-15-Cκ1GS에 비해 CD215에 대한 우수한 결합을 나타내었다.
실시예 17: 세포 증식의 유도
IL-15는 NK 세포 및 기억 CD8+ T 세포의 생존에 중요하며, 증식을 위해 상기 사이토카인에 동일하게 의존하는 NK 또는 T 세포 기원의 여러 세포주가 존재한다. 뮤린 CTLL-2 T 세포주는 증식 검정에 의해 재조합 IL-15의 생물학적 활성을 시험하는 데 일상적으로 사용되며, 또한 자연 살해 세포 백혈병 세포주 KHYG-1 mCD16(마우스 CD16으로 형질감염된 KHYG-1)은 증식과 함께 IL-15에 반응한다. 이들 2개의 세포주를 재조합 IL-15(Miltenyi)와 비교하여 PM-IL15 작제물의 CH3- 또는 Cκ-도메인에 융합된 IL-15의 생물학적 활성을 시험하는 데 사용하였다. 재조합 IL-15는 IL-15의 적용 몰 농도로 표준화되는 경우 PM-IL-15-CH34GS 및 PM-IL-15-Cκ4GS에 비해 CTLL-2(도 32a) 및 KHYG-1 mCD16(도 32b) 세포의 증식을 유도하는데 더 높은 효능을 가졌다. 또한, PM-IL-15-CH34GS 및 PM-IL-15-Cκ4GS는 KHYG-1 mCD16 세포의 증식을 유도하는 데 동일한 활성을 가졌지만(도 32b), PM-IL-15-CH34GS는 아마도 세포주에서 IL-15R 사슬의 차별적 발현으로 인해 PM-IL-15-Cκ4GS에 비해 CTLL-2 세포의 더 강한 증식을 유도하였다(도 32a).
실시예 18: 면역 세포 활성화의 유도
PM-IL-15 CH3 또는 Cκ 융합 작제물을 일차 면역 세포를 활성화시키는 이의 효능에서 재조합 IL-15와 비교하였다. 건강한 공여자의 PBMC를 지정된 분자와 함께 5일 동안 인큐베이션하였다. 자극된 PBMC를 형광 표지된 αCD3, αCD4, αCD8, αCD14, αCD25, αCD45 및 αCD56 항체로 염색하였다. 분석 전에 DAPI의 첨가에 의해 사멸 세포를 제외시켰다. 도 33에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 분자는 NK 세포(도 33a) 및 CD8+ T 세포(도 33b)에서 CD25의 발현을 유도할 수 있었다. 다시, 검정에 존재하는 IL-15의 몰농도로 표준화되는 경우, 재조합 IL-15는 둘 모두의 PM-IL-15 작제물과 비교하는 경우 면역 세포의 활성화에서 우수하였다. 또한, PM-IL-15-CH34GS는 PM-IL-15-Cκ4GS에 비해 면역 효과기 세포의 활성화를 유도하는 데 약간 더 높은 효능을 가졌다.
실시예 19: 항-종양 세포독성의 유도
다음으로, 재조합 IL-15와 PM-IL-15 CH3 또는 Cκ 융합 작제물 사이의 유사한 차이가 종양 세포 사멸 검정에서 관찰될 수 있는지 조사하였다. 이를 위해, TA-MUC1-양성 CaOV-3 종양 세포를 10:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 PM-IL-15-CH34GS, PM-IL-15-Cκ4GS 또는 재조합 IL-15 및 자극되지 않은 PBMC의 첨가 전에 검정 플레이트에서 24시간 동안 성장시켰다. 종양 세포 사멸을 세포 상층액으로 방출된 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 정량화(세포독성 검출 키트(LDH), Roche)에 의해 24시간 후에 평가하였다. 표적 세포와 트리톤-X-100의 인큐베이션에 의해 최대 방출이 달성되었으며, 항체-독립적인 세포 사멸이 표적 세포 및 PBMC만 함유하고 항체를 함유하지 않는 샘플에서 측정되었다. 도 34에 제시된 바와 같이, PM-IL-15-CH34GS 및 -Cκ4GS 둘 모두는 CaOV-3 종양 세포의 특이적 용해를 유도하였고, 융합 CH3 융합 작제물은 이전에 관찰된 바와 같이 Cκ 융합 작제물에 비해 더 높은 활성을 나타내었다. 중요하게는, 재조합 IL-15가 NK 세포 및 CD8+ T 세포의 활성화를 유도하는 데 우수하였지만(도 33), 이는 PM-IL-15-CH34GS 및 -Cκ4GS에 대해 관찰된 바와 같은 효과적인 면역 세포 매개 종양 세포 용해로 해석되지는 않았다(도 34, PM-IL-15를 사용한 40%에 비해 약 20%의 재조합 IL-15를 사용한 최대 용해).
실시예 20: 생체 내 약동학에 대한 작제물 설계의 영향
항체의 CH3 또는 Cκ 도메인에 대한 IL-15의 융합이 이의 약동학적 프로파일에 영향을 미치는지 조사하기 위해, C57BL/6 마우스에 2 mg/kg의 작제물(n=3)을 i.v. 주사하였다. 혈청을 주사 후 5분, 6시간, 1일, 2일, 4일, 7일 및 11일 후에 수집하고, ELISA에 의해 항체 역가를 결정하였다. Maxisorp F96 ELISA 플레이트를 밤새 0.1 M 카르보네이트 완충액(pH 9.6) 중 2 μg/ml 마우스 항-인간 Igκ 경쇄 항체로 코팅하였다. 비특이적 결합을 PBS 중 5%(v/v) 소 혈청 알부민(BSA)(BSA/PBS)으로 차단하였다. 혈청 샘플 및 표준을 1%(v/v) BSA/5%(v/v) 마우스 혈청/PBS에 희석시키고, 호스라디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이션된 염소 항-인간(IgG, Fcγ 단편 특이적)을 사용하여 검출하였다. 색 발달을 위해, TMB One Component HRP 마이크로웰 기질을 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 반응을 1.25 M 황산으로 중지시키고, 신호를 Tecan Infinite F200 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm 및 620 nm에서 측정하였다.
도 35에 제시된 바와 같이, PM-IL-15-CH34GS는 PM-IL-15-Cκ4GS에 비해 C57BL/6 마우스에서 더 긴 t1/2 및 더 큰 전체 노출(AUC)을 나타내었다. 둘 모두의 작제물의 s.c. 주사 후 동일한 결과가 관찰되었다.
실시예 21: 생체 내 약역학에 대한 작제물 설계의 영향
다음으로, 생체 내에서 PM-IL-15-CH34GS 및 -Cκ4GS의 약역학적 프로파일에 차이가 또한 존재하는지 조사하였다. 마우스(C57BL/6, n=3)에 2 mg/kg의 PM-IL-15wt CH34GS 또는 Ck4GS를 i.v. 및 s.c. 주사하고, 11일에 희생시켜 혈액을 수집하였다. 혈액으로부터의 면역 세포를 형광 표지된 αCD3, αCD4, αCD8, αCD44, αCD45, αCD45R, αCD62L, αCD122 및 αNK1.1 항체를 사용하는 흐름세포측정법에 의해 표현형 및 빈도에 대해 특성규명하였다. PM-IL-15-CH34GS의 적용은 i.v. 및 s.c. 주사 후 NK 세포의 확장(2배)을 발생시키는 반면, 이 시점에서 PM-IL-15-Cκ4GS를 사용하는 NK 세포 구획에는 유의한 영향이 없었다(도 36a). 그러나, 둘 모두의 작제물의 주사는 NK 세포에서 CD122의 유사한 상향조절을 발생시켰으며, 이는 또한 Cκ4GS 작제물이 NK 세포를 연동시킬 수 있음을 의미한다(도 36c). CD8+ T 세포를 분석하는 경우, 둘 모두의 작제물은 상기 서브셋의 전체 빈도 및 CD122 발현을 증가시킬 수 있었으나, 다시 PM-IL-15-CH34GS는 PM-IL-15-Cκ4GS보다 강한 확장(1.5배) 및 CD122 상향조절(1.3배 확장)을 유도하였다(도 36b 및 d).
CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 내에서, PM-IL-15-CH34GS 및 PM-IL-15-Cκ4GS를 이용한 처리는 i.v.(도 37a 및 c) 및 s.c. 주사(도 37b 및 d) 후에 나이브 세포의 상대적 감소를 발생시키고, 동시에 중앙 기억(TCM) 및 효과기(Teff) 표현형을 갖는 세포의 증가를 발생시킨다. 또한, PM-IL-15-CH34GS는 사용된 주사 경로와 무관하게 PM-IL-15-Cκ4GS 작제물보다 CD4+ 및 CD8+ 효과기 및 기억 T 세포를 동원하는 데 우수하였다.
실시예 22: 생체 내 종양 모델에서의 치료 효능
다음으로, TA-MUC1 표적화된 IL-15 면역사이토카인이 종양 보유 마우스의 결과를 개선할 잠재성을 갖는지 분석하였다. 글리코-특이적 에피토프 TA-MUC1은 마우스에서 발견되지 않기 때문에, 마우스 유방 암종 세포주 4T1을 MUC1로 형질감염시키고, TA-MUC1을 발현하는 형질감염체 MUC1-4T1을 생체 내 연구를 위한 종양 모델로 사용하였다. 4T1 세포에서 유래된 종양은 주로 골수성-유래 억제인자 세포를 함유하는 고도로 면역억제성인 것으로 기재된다. MUC1-4T1 세포를 유방 지방 패드(mfp)에 주사하고, 1일, 8일 및 15일에 0.25 mg/kg의 PM-IL-15-CH34GS로 처리하였다. 종양 부피를 모니터링하고, 주 지침에 따라 1 cm3의 종양 부담에 도달하는 경우 마우스를 희생시켰다. 도 38a는 시간에 따른 PBS 및 PM-IL-15-CH34GS 처리된 마우스의 종양 부피를 제시하고, 화살표는 투여일을 나타낸다. 도 38b는 마우스의 생존을 나타낸다. PM-IL-15-CH34GS의 적용은 이러한 고도로 억제성인 모델에서 6마리의 마우스 중 3마리(도 38a)에서 종양 성장 지연을 발생시키며, 이는 또한 PBS 그룹에 비해 PM-IL-15-CH34GS 처리된 마우스의 더 긴 생존에 의해 반영되었다(도 38b).
PM-IL-15와 다른 치료제의 조합
실시예 23: PM-CD3와 조합된 PM-IL-15를 사용한 면역 세포의 활성화
PM-IL-15 면역사이토카인을 사용한 치료의 배후에 있는 아이디어는 면역 세포 자체를 활성화시킬 뿐만 아니라 NK 및 T 세포를 자극하여 지속적인 면역 반응을 추가로 향상시킨다는 것이다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 본 발명자는 TA-MUC1 표적화 T 세포 연동자(PM-CD3; CD3에 대한 scFv 단편이 항-TA-MUC1 항체 판코맙(Pankomab)의 중쇄의 C 말단에 융합된 이중특이적 항체)와 PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA를 조합하고, T 세포 활성화, T 세포 증식 및 세포독성을 분석하였다.
T 세포 활성화의 분석을 위해, 건강한 공여자의 PBMC를 PM-CD3의 최적이하 농도(각각 0.4 μg/ml 및 2 μg/ml)의 부재 또는 존재하에서 PM-IL-15-CH34GS와 함께 인큐베이션하였다. T 세포의 활성화를 형광 표지된 αCD4, αCD8, αCD14, αCD19, αCD25, αCD45, αCD56 및 αCD69 항체로 자극된 PBMC를 염색함으로써 2일 후에 분석하였다. 흐름세포측정법에 의한 분석 전에 DAPI의 첨가에 의해 사멸 세포를 제외시켰다.
도 39는 최적이하 농도에서 단일 요법으로서 PM-CD3가 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD25의 약간의 CD25의 발현을 유도하였음을 제시한다. PM-IL-15wt는 CaOV-3 종양 세포의 존재하에서 추가로 향상된 CD4+ T 세포에 있는 둘 모두의 T 세포 서브셋에서 CD25의 농도 의존적 증가를 유도하였다. 흥미롭게도, PM-IL-15wt와 단지 0.4 μg/ml(2 nM)의 PM-CD3의 조합은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD25의 발현을 강하게 향상시켰다. 중요하게는, 관찰된 효과는 부가적일뿐만 아니라 고도로 상승작용적이었으며, PM-CD3의 양을 2 μg/ml(10 nM)로 증가시킴으로써 추가로 향상될 수 있었다.
실시예 24: PM-CD3와 조합된 PM-IL-15를 사용한 면역 세포의 증식
PM-CD3 유도 T 세포 증식에서 PM-IL-15 면역사이토카인의 효과의 분석을 위해, 건강한 공여자의 PBMC를 1 μg/ml PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA의 부재 또는 존재하에서 PM-CD3와 함께 인큐베이션하였다. CellTrace™ Violet(Thermo Fisher)-표지된 PBMC를 지정된 분자 및 TA-MUC1 양성 CaOV-3 종양 세포와 함께 5일 동안 인큐베이션하였다. 자극된 PBMC를 형광 표지된 αCD4, αCD8, αCD14, αCD19, αCD45 및 αCD56 항체로 염색하였다. 흐름세포측정법에 의한 분석 전에 7-AAD(Sigma-Aldrich)로 염색하여 사멸 세포를 제외하였다.
PM-CD3 단독은 CaOV-3 종양 세포의 존재하에서 CD4+ T 세포(도 40a) 및 CD8+ T 세포(도 40b)의 증식을 유도할 수 있었다. 놀랍게도, PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA는 자체적으로 이 농도에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 없었지만, 이들은 고도로 상승작용적 방식으로 PM-CD3 매개 증식을 강하게 향상시켰다. PM-CD3 유도 증식을 자극하는 PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA의 효능은 동등하였다.
실시예 25: PM-CD3와 조합된 PM-IL-15의 세포독성
본 발명자는 또한 종양 세포 사멸에서 PM-IL-15 면역사이토카인 및 PM-CD3의 조합 잠재성을 평가하였다. TA-MUC1-양성 CaOV-3 종양 세포를 10:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 자극되지 않은 PBMC의 첨가 전에 검정 플레이트에서 24시간 동안 성장시켰다. 단독이거나 지정된 농도의 PM-IL-15wt 및 PM-IL-15wt NA와 조합된 PM-CD3를 첨가하였다. 종양 세포 사멸을 세포 상층액으로 방출된 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 정량화(세포독성 검출 키트(LDH), Roche)에 의해 24시간 후에 평가하였다. 표적 세포와 트리톤-X-100의 인큐베이션에 의해 최대 방출이 달성되었으며, 항체-독립적인 세포 사멸이 표적 세포 및 PBMC만 함유하고 항체를 함유하지 않는 샘플에서 측정되었다.
단일 요법으로서, PM-CD3 및 PM-IL-15 면역사이토카인은 CaOV-3 종양 세포의 약간 또는 중간 정도의 용해를 유도할 수 있었다(도 41). 놀랍게도, PM-IL-15wt 또는 PM-IL-15wt NA의 첨가는 종양 세포의 특이적 용해를 다시 부가적일뿐만 아니라 상승작용적으로 향상시켰다(도 41a 및 b). 200 nM PM-CD3에 단지 1 μg/ml PM-IL-15wt를 첨가함으로써, CaOV-3 종양 세포의 특정 용해가 34%에서 75%로 증가하였다. PM-IL-15wt NA 작제물은 약간 덜 강력하였다(최대 용해 62%). 도 41c는 조합 효과가 또한 사용된 PM-IL-15 면역사이토카인의 농도에 의존함을 제시한다. PM-IL-15wt NA의 농도를 1 μg/ml에서 5 μg/ml로 증가시킴으로써, 본 발명자는 EC50 값을 추가로 감소시키고, 종양 세포의 최대 용해를 증가시킬 수 있었다.
실시예 26: PM-IL-15 면역사이토카인과 PD-L1 또는 PD-1 표적화 요법의 조합
상기 기재된 바와 같이, PM-IL-15 면역사이토카인은 자체적으로 면역 세포의 활성화를 매개하지만, 또 다른 약물(예를 들어, 이중특이적 T 세포 연동자)에 의해 유도된 NK 및 T 세포의 반응을 향상시킬 수도 있다. PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 체크포인트 억제제는 임상에서 널리 사용되며, 따라서 시험관내 연구는 이들 제제와 TA-MUC1 표적화 IL-15 면역사이토카인의 조합에 대한 이론적 근거가 존재하는지 분석하기 위해 수행하였다. 먼저, 종양 세포 및 단핵구에서의 PD-L1 발현이 PM-IL-15-CH34GS와의 인큐베이션 후에 변경되는지 분석하였다. TA-MUC1-양성 HSC-4 혀 편평 암종 세포를 10:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 새로이 분리된 PBMC의 첨가 전에 검정 플레이트에서 24시간 동안 성장시켰다. PM-IL-15-CH34GS(20 nM) 또는 PBS를 첨가하고, 플레이트를 48시간 동안 배양하였다. 종양 세포 및 PBMC를 수확하고, PD-L1의 발현에 대해 분석하였다. 도 42에 제시된 바와 같이, PM-IL-15-CH34GS의 첨가는 HSC-4 종양 세포(도 42a) 및 단핵구(도 42b)에서 PD-L1의 발현을 유의하게 증가시켰다.
다음으로, 종양 세포 사멸 검정에서 PM-IL-15 면역사이토카인 및 PD-L1 표적화 항체 아벨루맙(Avelumab)(Bavencio®)의 조합 잠재성을 조사하였다. TA-MUC1-양성 HSC-4 종양 세포를 10:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 자극되지 않은 PBMC의 첨가 전에 검정 플레이트에서 24시간 동안 성장시켰다. 단독이거나 지정된 농도의 아벨루맙 또는 대조군으로서 hIgG1과 조합된 PM-IL-15-CH34GS를 첨가하였다. 종양 세포 사멸을 상기 기재된 바와 같이 세포 상층액으로 방출된 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 정량화에 의해 24시간 후에 평가하였다.
단일 요법으로서, PM-IL-15-CH34GS 및 아벨루맙은 HSC-4 종양 세포의 약간의 용해(약 9%)를 유도할 수 있었다(도 43). 놀랍게도, PM-IL-15-CH34GS 및 아벨루맙의 조합은 종양 세포의 특이적인 용해를 부가적일뿐만 아니라 상승작용적으로 유의하게 증가시켰다. 단지 0.8 nM의 PM-IL-15-CH34GS의 농도는 아벨루맙 단독에 의해 유도된 종양 세포 용해를 3배화하기에 충분하였다(8.9% 대 26.5%). 이러한 효과는 PM-IL-15-CH34GS의 농도를 증가시킴으로써 추가로 향상될 수 있었다(최대 관찰된 용해 54%).
시험관 내에서 T 세포를 활성화시키는 PD-1/PD-L1 체크포인트 억제제의 능력을 조사하는 또 다른 허용된 방법은 PD-L1 및 PD-1의 상호작용에 의해 면역억제 효과를 모방하기 위해 단핵구-유래 수지상 세포(moDC) 및 상이한 공여자로부터의 T 세포가 공동 인큐베이션되는 동종이형 혼합 림프구 반응(MLR)이다. 건강한 공여자의 PBMC에서 단핵구를 분리하고, 적응용 배지, GM-CSF 및 IL-4가 보충된 배지에서 단핵구를 배양하여 moDC를 생성시켰다. 7일 후, moDC를 수확하고, 1 μg/ml의 각각의 시험 항체의 존재하에서 1:10의 비율로 동종이형 T 세포와 함께 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 세포를 5일 후에 수확하고, CD8+ T 세포에서 CD25의 발현에 대해 흐름세포측정법으로 분석하였다. PM-IL-15-CH34GS 및 아벨루맙의 첨가는 대조군과 비교하여 CD25의 상향조절에 의해 결정된 CD8 T 세포 활성화의 증가를 발생시킨다(각각 5.4% 및 3.9% 증가; 도 44). 그러나, PM-IL-15-CH34GS 및 아벨루맙의 조합은 CD25의 발현을 7.1%에서 24.3%(17.2% 증가)로 증가시켰고, 이는 둘 모두의 항체의 상승작용을 암시한다.
실시예 27: PM-IL-15 면역사이토카인과 항-EGFR 치료제의 조합
다음으로, EGFR-표적화 치료제가 향상될 수 있는지 조사하였다. Erbitux®(고전적 hIgG1 세툭시맙) 및 CetuGEX®(토무조툭시맙, Glycotope의 글리코-최적화된 2세대 세툭시맙)을 실시예 19에 기재된 바와 같이 종양 세포 사멸 검정에서 PM-IL-15-CH34GS와 조합하여 시험하였다. 유사한 양의 TA-MUC1 및 EGFR(내부 분석)을 발현하는 HSC-4 종양 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 도 45에 제시된 바와 같이, CetuGEX® 단독은 Erbitux® 단독을 사용하는 것보다 높은 LDH의 농도-의존적 방출을 유도하였다. 단지 20 nM(3.5 μg/ml)의 PM-IL-15-CH34GS의 첨가는 특정 역치 농도(CetuGEX®의 경우 >0.1 ng/ml 및 Erbitux®의 경우 >1 ng/ml)에서 Erbitux® 및 CetuGEX®과 조합하여 LDH의 방출을 유의하게 증가시켰다. 이는 PM-IL-15 면역사이토카인이 상승작용적 방식으로 항-EGFR 치료에 대한 반응을 증폭시킬 잠재성을 갖는 것을 나타낸다.
실시예 28: CD40 효능제에 의한 IL-15R 발현의 상향조절
PM-IL-15 면역사이토카인에 대한 추가의 흥미로운 조합 파트너는 항-CD40 항체와 같은 다른 면역자극성 약물이다. 도 46은 미처리 세포와 비교하여 증가하는 농도의 글리코-최적화된 항-CD40 IgG1(Glycotope GmbH)와 함께 3일 동안 PBMC의 인큐베이션 후에 흐름세포측정법에 의해 분석된 NK, NKT, CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 IL-15Rα(CD215)의 발현을 제시한다. 항-CD40을 이용한 처리는 NK, NKT 및 CD8+ T 세포에서는 CD215의 상향조절을 발생시켰으나, CD4+ T 세포에서는 그렇지 않았다(도 46). 이들 데이터는 항-CD40 mAb의 존재하에서 IL-15의 교차-제시가 개선되어 IL-15-기반 면역사이토카인의 활성을 증가시킬 수 있음을 의미한다.
기탁된 생물학적 물질의 확인
세포주 DSM ACC 2806, DSM ACC 2807 및 DSM ACC 2856은 하기 표에 표시된 날짜에 Glycotope GmbH(Robert-R
Figure pct00005
ssle-Str. 10, 13125 Berlin (DE))에 의해 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE))에 기탁되었다.
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Glycotope GmbH <120> Fusion protein constructs comprising an anti-MUC1 antibody and IL-15 <130> 60 328 K <150> EP 18 159 449.0 <151> 2018-03-01 <150> EP 18 194 290.5 <151> 2018-09-13 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR H1 <400> 1 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR H1 <400> 2 Asp Ala Trp Met Asp 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR H2 <400> 3 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR H2 <400> 4 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR H3 <400> 5 His Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR H3 <400> 6 Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TA-MUC1 heavy chain variable region <400> 7 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Val Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TA-MUC1 heavy chain variable region <400> 8 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Ser Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Leu Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 heavy chain variable region <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR L1 <400> 10 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR L1 <400> 11 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR L2 <400> 12 Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR L2 <400> 13 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR L3 <400> 14 Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR L3 <400> 15 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TA-MUC1 light chain variable region <400> 16 Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 17 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TA-MUC1 light chain variable region <400> 17 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Leu Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 18 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-TA-MUC1 light chain vatiable region <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> epitope <400> 19 Pro Asp Thr Arg 1 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> epitope <400> 20 Pro Asp Thr Arg Pro 1 5 <210> 21 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-15 <400> 21 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 22 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-15Ralpha sushi domain <400> 22 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg 65 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 CDR-H1 <400> 23 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 CDR-H2 <400> 24 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr 1 5 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 CDR-H3 <400> 25 Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 heavy chain variable region <400> 26 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 CDR-L1 <400> 27 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 CDR-L2 <400> 28 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 CDR-L3 <400> 29 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 30 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 light chain variable region <400> 30 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker repeat <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker repeat <400> 32 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TA-MUC1 CDR H2 <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid <400> 33 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Xaa Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 34 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TA-MUC1 heavy chain variable region <220> <221> VARIANT <222> (57)..(57) <223> Xaa is any amino acid <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Xaa Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (19)

  1. (i) MUC1에 특이적으로 결합하는 항체 모듈, 및
    (ii) IL-15 모듈을 포함하는,
    융합 단백질 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 항체 모듈이,
    (a) 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고;
    (c) 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하고;
    (d) IgG-타입 항체 모듈, 특히 IgG1-타입 항체 모듈이고;
    (e) TA-MUC1 에피토프에 특이적으로 결합하고;
    (f) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 갖는 일련의 CDR 서열을 포함하고;
    (g) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3, SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3를 갖는 일련의 CDR 서열을 포함하고;
    (h) SEQ ID NO:9 또는 34의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나, 특히 2개의 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나, 특히 2개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 특징 중 하나 이상을 갖는,
    융합 단백질 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, IL-15 모듈이 인간 IL-15 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질 작제물.
  4. 제3항에 있어서, 인간 IL-15 또는 이의 단편이,
    (a) IL-2 수용체 β-사슬, 공통 γ-사슬 및 IL-15 수용체 α 사슬을 포함하는 인터루킨 수용체에 특이적으로 결합하고;
    (b) SEQ ID NO:21의 서열을 포함하고;
    (c) I67E와 같은 수용체 결합을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 특징 중 하나 이상을 갖는,
    융합 단백질 작제물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, IL-15 모듈이 인간 IL-15에 특이적으로 결합하는 인간 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 융합 단백질 작제물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IL-15 모듈이 IL-15에 특이적으로 결합하는 IL-15 수용체 α 사슬 또는 이의 단편을 포함하지 않는 융합 단백질 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 모듈이 항체 중쇄의 임의의 CH2 도메인 내에 N-당화 부위를 포함하는 융합 단백질 작제물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하는 하나의 항체 모듈; 및
    (ii) 하나의 IL-15 모듈이 펩티드 링커를 통해 각각의 항체 중쇄의 C 말단에 융합된 2개의 IL-15 모듈을 포함하는,
    융합 단백질 작제물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하는 하나의 항체 모듈; 및
    (ii) 하나의 IL-15 모듈이 펩티드 링커를 통해 각각의 항체 경쇄의 C 말단에 융합된 2개의 IL-15 모듈을 포함하는,
    융합 단백질 작제물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이션된 추가 제제를 포함하는 융합 단백질 작제물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 작제물을 인코딩하는 핵산.
  12. 제11항에 따른 핵산 및 상기 핵산과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터.
  13. 제11항에 따른 핵산 또는 제12항에 따른 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 작제물 및 용매, 희석제 및 부형제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 약학적 조성물.
  15. 의약에 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 작제물 또는 제14항에 따른 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항 또는 제14항에 있어서, 암과 같은 비정상적인 세포 성장과 관련된 질병, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염과 같은 감염, 및 면역결핍과 같은 면역 활성 감소와 관련된 질병의 치료, 예후, 진단 및/또는 모니터링에 사용하기 위한 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 암이 유방암, 결장암, 위암, 간암, 췌장암, 신장암, 혈액암, 폐암, 자궁내막암, 갑상샘암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 암의 치료, 예후, 진단 및/또는 모니터링에 사용하기 위한 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질 작제물이 추가 제제와 조합하여 사용되는, 의약에 사용하기 위한 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 추가 제제가 MUC1 및 CD3를 표적으로 하는 이중특이적 항체, PD-L1에 대한 항체, EGFR에 대한 항체, 및 CD40에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 의약에 사용하기 위한 융합 단백질 작제물 또는 약학적 조성물.
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