TW202411254A

TW202411254A - 結合bcma、gprc5d和cd3的多特異性抗體及其用途

Info

Publication number: TW202411254A
Application number: TW112126154A
Authority: TW
Inventors: 彭浩; 李江美; 吳國進; 郝鋒; 穩奇胡; 寧金鷹; 李鋒
Original assignee: 大陸商北京天廣實生物技術股份有限公司; 大陸商康源博創生物科技（北京）有限公司
Priority date: 2022-09-09
Filing date: 2023-07-13
Publication date: 2024-03-16

Abstract

本發明涉及一種同時標靶BCMA、GPRC5D和CD3的多特異性抗體，及其在腫瘤等疾病治療中的用途。

Description

結合BCMA、GPRC5D和CD3的多特異性抗體及其用途

多發性骨髓瘤（MM）是漿細胞惡性增殖性疾病，其疾病特徵是骨髓中的漿細胞像腫瘤細胞一樣無限制地增殖，並且大部分情況下伴有單株免疫球蛋白分泌，最終導致器官或組織損傷。例如，MM常伴有多發性溶骨性損害、高鈣血症、貧血、腎臟損害等。MM多發於中老年人，在性別分佈上有明顯差異，男性患病比例高於女性。MM約占血液系統惡性腫瘤的10-15%，是繼白血病、淋巴瘤之後第三多發的血液系統腫瘤。美國發病率為9/10萬，我國發病率約為1/10萬，並呈逐年上升趨勢。

近年來，儘管化療、蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑和CD38標靶抗體等治療方法在MM領域取得了很大進展，但相當一部分的患者對這些療法沒有反應、或反應期很短。而且，MM幾乎無法治癒，患者逐漸對既有療法產生抗性，導致復發。因此，該領域對新藥的需求仍然迫切。

當前已知可用於MM標靶療法的特異性抗原非常有限，BCMA和GPRC5D是其中的兩種。

BCMA和BCMA標靶療法 B細胞成熟抗原，又稱BCMA、CD269或TNFRSF17，是一種I型跨膜蛋白，為腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的一員。其與同為TNFR超家族的BAFF受體（BAFFR）和跨膜活化劑及鈣調親環素配體相互作用分子（TACI），在不同發育階段的B細胞存活中發揮著重要的作用（Rickert R.C et al., (2011) Immunological Reviews 244(1):115-133）。BCMA主要表現於成熟B淋巴細胞及漿細胞表面，少量表現於造血幹細胞或非造血組織。其配體包括B細胞活化因子（BAFF）和增殖誘導因子（APRIL），其中後者的BCMA親和性更高。 BCMA還在MM患者的骨髓惡性漿細胞的表面過表現。BCMA可促進惡性漿細胞在骨髓環境中的成活，惡性漿細胞的APRIL-BCMA訊號通路會促進惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡逃逸，還使其產生強效的免疫抑制分子，比如 IL-10、PD-L1 和 TGF-β（Tai Y-T et al., (2016) Blood. 127(25):3225-3236）。在大量的動物模型和人體患者中，BCMA的過表現和活化均表現出與MM進展的相關性（Tai Y-T et al., (2016) Supra; Sanchez E et al., (2016) Clin Cancer Res.22:3383-3397）。由於BCMA的選擇性表現/分佈特點，即廣泛存在於MM細胞表面，但在其他正常組織細胞上表現很低或不表現，以及BCMA的較長血清半衰期，使其成為MM和其他血漿細胞癌症的理想靶點。相比於特異表現於漿細胞卻很快從細胞表面消失的CD138，BCMA顯然是更好的MM惡性漿細胞的生物標記物。

GPRC5D和GPRC5D標靶療法 GPRC5D，即G蛋白偶聯受體家族C組5成員D，是一種C型7次跨膜受體蛋白，其配體和訊號傳導機制尚未確定。在對MM、急性白血病和彌漫性大B細胞淋巴瘤患者的骨髓樣本檢測中，發現GPRC5D是MM的標記分子（Cohen Y et al., (2013) Hematology18(6):348-351）。這種蛋白主要在具有漿細胞表型的細胞中表現，包括大多數的惡性骨髓漿細胞，且在骨髓樣本CD138 ⁺MM細胞上的表現分佈與BCMA非常相似，而在正常組織中，GPRC5D的蛋白表現僅限於毛囊（Smith EL et al., (2019) Sci Transl Med.11(485):eaau7746）。此外，MM患者中的GPRC5D mRNA表現量與遺傳畸變如Rb-1缺失以及較差的預後相關（Atamaniuk J et al., (2012) Eur J Clin Invest. 42(9):953-960）。 GPRC5D的這種選擇性表現，使得其成為有希望的漿細胞疾病例如MM的靶點。針對此靶點的雙特異性抗體JNJ-64407564目前正處於臨床試驗中。

T細胞和CD3 CD3分子是T細胞表面的一種標記分子，與T細胞受體（TCR）組成TCR-CD3複合體，在抗原識別和免疫訊號傳導過程中具有重要的作用。TCR由α和β鏈組成，或由γ和δ鏈組成，各鏈的胞內域沒有訊號轉導的功能，T細胞胞內訊號通路完全由CD3蛋白負責。CD3分子由一條γ鏈、一條δ鏈、兩條ε和兩條ζ鏈構成，在TCR/CD3複合體中形成為三個二聚體εγ、εδ、和ζζ。ε、γ和δ均為I型跨膜蛋白，具有類似免疫球蛋白胞外功能域，ε、γ、δ和ζ的胞內域共含有10個免疫受體酪胺酸活化模體（ITAM），當ITAM磷酸化後會與激酶ZAP70結合，向下游轉導T細胞活化訊號。標靶CD3的抗體可以通過與標靶疾病相關抗原（如腫瘤相關抗原）的功能基團形成雙特異性分子，建立T細胞與疾病相關抗原的物理連接，引起T細胞的活化和由T細胞介導的對疾病相關細胞的殺傷。例如，標靶CD3和腫瘤相關抗原的雙特異性抗體在拉近T細胞與腫瘤細胞後，可活化T細胞，向腫瘤細胞釋放包含有280多種蛋白的超分子攻擊粒子（SMAP）。在SMAP的核心區帶有穿孔素和顆粒酶，穿孔素可以刺穿腫瘤細胞的外膜，而顆粒酶會誘導腫瘤細胞凋亡（Š. Bálint et al., (2020) Science368(6493): 897-901）。 CD3抗體通過在T細胞表面聚集CD3，模擬TCR識別MHC-抗原肽的過程，從而活化T細胞的TCR複合體訊號通路，釋放IL-2、IFN-r和TNF-α等細胞因子，活化T細胞的增殖和分化。T細胞的增殖和分化在腫瘤治療中是一把雙刃劍，一方面可以產生更多的T細胞來殺傷腫瘤細胞，但在另一方面也會在受試者體內產生很大的毒性反應，即細胞因子釋放症候群（“CRS”）。在臨床上，與CRS相關的副作用不僅包括疲勞、嘔吐、心動過速、高血壓、背痛，還包括如癲癇發作、腦病、腦水腫、無菌性腦膜炎和頭痛的中樞神經系統（CNS）反應。例如，在CD3單特異性抗體如OKT3的治療中觀察到CRS，且被認為是抗體在體內結合Fc受體（FcR）時形成的抗體交聯而引起的（Herold KC et al., (2003) J Clin Invest. 111(3):409-418）。因此，在後續的抗體研發中，CD3抗體的Fc區經改造而呈現弱的FcR結合力，比如Tepizumab。同樣地，在標靶CD3的雙特異性或多特異性抗體的治療中，也不免出現CRS。例如，在CD19/CD3 T細胞雙特異性藥劑博納吐單抗的臨床試驗中，頻繁觀察到重度CRS和CNS毒性。對於CD3單特異性抗體的Fc區改造，並不足以改善CD3雙特異性抗體引起的CRS，因為雙特異性抗體中標靶疾病相關抗原的功能基團與靶細胞的結合會引起抗體的交聯，並從而引起T細胞釋放大量的細胞因子。

標靶GPRC5D、BCMA和CD3的三特異抗體 BCMA標靶在MM治療中表現出一定的潛力。然而，由於BCMA的表現呈現出一定的異質性，即使在同一個病人的腫瘤樣本中也並非所有腫瘤細胞都表現BCMA，導致治療反應不一，而且，膜結合BCMA會因為γ-分泌酶的作用而從細胞表面脫落，引起細胞表面BCMA量的變動（Brudno JN et al., (2018) J. Clin. Oncol 36(22):2267–2280；Laurent SA et al., (2015) Nat Commun. 6:7333）。這些問題可能可以通過同時標靶MM細胞上的另一標記分子如GPRC5D、FcRH5等來進行一定程度的緩解。然而，BCMA和GPRC5D在MM腫瘤細胞上的表現分佈存在一定的相似性，同時標靶兩者是否會帶來更持久穩定的MM腫瘤細胞結合，存在著一定的不確定性。此外，可以在該雙特異性抗體的基礎上加上CD3抗原結合域，將患者的T細胞募集到MM細胞周圍，活化T細胞消滅MM細胞。而與此同時，如上所述，CD3雙/多特異性抗體的毒性不容忽視。2021年上半年，多個BCMA×CD3雙特異抗體（AMG701、Elranatamab等）因為安全性問題暫停臨床試驗。

對於本發明中任何文件的引用，並不等同於承認這些文件是本發明的現有技術。

本發明的發明人，通過巧妙的設計，構築出了一種既有強大的腫瘤殺傷力、又引起較小毒性反應的GPRC5D×BCMA×CD3三特異性抗體，其突破和改善了目前在MM治療中CD3雙特異性抗體，包括BCMA×CD3雙抗和GPRC5D×CD3雙抗的藥效毒性平衡問題。這種多特異性抗體的構築，絕不是簡單隨意地將各種結合基團相組合，而是要考慮各結合基團之間的相互作用。在本發明抗體的構築中，不僅需要對MM上結合的腫瘤特異性抗原的種類做調整和最佳化，克服腫瘤異質性導致的殺傷逃逸，還需要減少CD3通路活化引起的細胞因子釋放，找到更好的治療窗口。

因而，在第一個方面，本發明提供一種多特異性抗體，其可以包含：

i）CD3抗原結合域、ii）BCMA抗原結合域、以及iii）GPRC5D抗原結合域。

CD3抗原結合域可以為激動型抗原結合域，其特異地結合CD3並活化CD3訊號通路。特別地，該CD3抗原結合域不結合單獨的CD3δ或CD3ε，而僅與CD3 δ&ε複合體結合。該CD3抗原結合域在游離狀態下幾乎沒有CD3訊號通路活化作用，即幾乎不會活化T細胞，而只有在多特異性抗體的另兩個抗原結合域與其各自抗原結合而呈現為“交聯”狀態時，才具有活化CD3訊號通路的能力。在一些實施方式中，CD3抗原結合域為特異結合CD3的抗體或其抗原結合部分。

BCMA抗原結合域可以結合BCMA，並任選地阻斷BCMA-APRIL結合/相互作用，即可以任選地為拮抗型的抗原結合域。特別地，該BCMA抗原結合域與靶細胞上BCMA的結合，幾乎不受環境中可溶性BCMA的影響。在一些實施方式中，BCMA抗原結合域為特異結合BCMA的抗體或其抗原結合部分。

GPRC5D抗原結合域可以與GPRC5D特異結合。在一些實施方式中，GPRC5D抗原結合域為特異結合GPRC5D的抗體或其抗原結合部分。

本發明的多特異性抗體可以包含例如1個CD3抗原結合域、1個BCMA抗原結合域、以及1個GPRC5D抗原結合域。

本發明的多特異性抗體可以為IgG樣抗體，包含Fab或Fv形式的CD3抗原結合域，Fab或Fv形式的GPRC5D抗原結合域，以及單鏈抗體（scFv）形式的BCMA抗原結合域。

在一些實施方式中，多特異性抗體可以包含i）CD3半抗體，包含重鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈可變區和任選的輕鏈恆定區，ii）GPRC5D半抗體，包含重鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈可變區、和任選的輕鏈恆定區，以及iii）scFv形式的BCMA抗原結合域，包含重鏈可變區、任選的第一接頭、和輕鏈可變區，其中，CD3半抗體和GPRC5D半抗體可以形成IgG全抗體，scFv形式的BCMA抗原結合域可以，任選地經由第二接頭，與CD3半抗體的重鏈可變區的N端、輕鏈可變區的N端、重鏈恆定區的C端、或輕鏈恆定區的C端連接。在一些實施方式中，scFv形式的BCMA抗原結合域與CD3半抗體的重鏈可變區的N端、或輕鏈可變區的N端連接。

本發明的多特異性抗體可以包含： i）第一多肽鏈，包含特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合BCMA的輕鏈可變區、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區， ii）第二多肽鏈，包含特異結合CD3的輕鏈可變區， iii）第三多肽鏈，包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區，以及 iv）第四多肽鏈，包含特異結合GPRC5D的輕鏈可變區；或者 i）第一多肽鏈，包含特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區， ii）第二多肽鏈，包含特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合BCMA的輕鏈可變區、和特異結合CD3的輕鏈可變區， iii）第三多肽鏈，包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區，以及 iv）第四多肽鏈，包含特異結合GPRC5D的輕鏈可變區，其中特異結合BCMA的重鏈可變區和特異結合BCMA的輕鏈可變區形成該BCMA抗原結合域，第一多肽鏈中特異結合CD3的重鏈可變區和第二多肽鏈中特異結合CD3的輕鏈可變區形成該CD3抗原結合域，第三多肽鏈中特異結合GPRC5D的重鏈可變區和第四多肽鏈中特異結合GPRC5D的輕鏈可變區形成該GPRC5D抗原結合域，且第一多肽鏈的重鏈恆定區與第三多肽鏈的重鏈恆定區結合在一起。

第一多肽鏈可以從N端到C端包含特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合BCMA的輕鏈可變區、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區，或從N端到C端包含特異結合BCMA的輕鏈可變區、特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區，第三多肽鏈可以從N端到C端包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區。

在一些實施方式中，多特異性抗體可以包含： i）第一多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合BCMA的重鏈可變區、第一接頭、特異結合BCMA的輕鏈可變區、第二接頭、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區，或包含特異結合BCMA的輕鏈可變區、第一接頭、特異結合BCMA的重鏈可變區、第二接頭、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區， ii）第二多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合CD3的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區， iii）第三多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區，以及 iv）第四多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合GPRC5D的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區。

或者，第一多肽鏈可以從N端到C端包含特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區，第二多肽鏈可以從N端到C端包含特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合BCMA的輕鏈可變區、和特異結合CD3的輕鏈可變區，或從N端到C端包含特異結合BCMA的輕鏈可變區、特異結合BCMA的重鏈可變區、和特異結合CD3的輕鏈可變區，第三多肽鏈可以從N端到C端包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區。

在一些實施方式中，多特異性抗體可以包含： i）第一多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區， ii）第二多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合BCMA的重鏈可變區、第一接頭、特異結合BCMA的輕鏈可變區、第二接頭、特異結合CD3的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區，或包含特異結合BCMA的輕鏈可變區、第一接頭、特異結合BCMA的重鏈可變區、第二接頭、特異結合CD3的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區 iii）第三多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區，以及 iv）第四多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合GPRC5D的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區。

BCMA抗原結合域可以為特異結合BCMA的抗體或其抗原結合部分，其重鏈可變區可以包含分別如SEQ ID NOs: 1-3所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，輕鏈可變區可以包含分別如SEQ ID NOs: 4-6所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。BCMA抗原結合域中的重鏈可變區和輕鏈可變區可以分別包含與SEQ ID NOs: 7和8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

CD3抗原結合域可以為特異結合CD3的抗體或其抗原結合部分，其重鏈可變區可以包含分別如SEQ ID NOs: 9-11所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，輕鏈可變區可以包含分別如SEQ ID NOs: 12-14所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。CD3抗原結合域中的重鏈可變區和輕鏈可變區可以分別包含與SEQ ID NOs: 15和16具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

GPRC5D抗原結合域可以為特異結合GPRC5D的抗體或其抗原結合部分，其重鏈可變區可以包含分別如SEQ ID NOs: 17-19所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，輕鏈可變區可以包含分別如SEQ ID NOs: 20-22所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。GPRC5D抗原結合域中的重鏈可變區和輕鏈可變區可以分別包含與SEQ ID NOs: 23和24具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

第一多肽鏈和第三多肽鏈中的重鏈恆定區可以為弱結合或不結合FcR的重鏈恆定區，較佳為不結合FcR的重鏈恆定區，例如人IgG1（N297A）、人IgG1（L234A+L235A）、人IgG1（L234A+L235A+P329G/A）、人IgG1（L234A+L235A+N297A）、人IgG1（L234A+L235A+N297A+P329G/A）、人IgG2（V234A+V237A）、和人IgG1（L234A+V235E）恆定區，或者人IgG4恆定區。

第一多肽鏈的重鏈恆定區、和第三多肽鏈的重鏈恆定區的其中之一，可以為帶有杵結構的重鏈恆定區，例如帶有T366W突變的人IgG1或IgG4重鏈恆定區或其功能片段。第一多肽鏈的重鏈恆定區、和第三多肽鏈的重鏈恆定區中的另一個，可以為帶有臼結構的重鏈恆定區，例如帶有T366S/L368A/Y407V突變的人IgG1或IgG4重鏈恆定區或其功能片段。在一些實施方式中，第一多肽鏈的重鏈恆定區、和第三多肽鏈的重鏈恆定區的其中之一，可以為帶有杵結構且弱結合或不結合FcR的重鏈恆定區，如帶有L234A/L235A/N297A/T366W的人IgG1重鏈恆定區，如SEQ ID NO: 25（X1=W、X2=L、X3=Y）所示。在一些實施方式中，第一多肽鏈的重鏈恆定區、和第三多肽鏈的重鏈恆定區中的另一個，可以為帶有臼結構且弱結合或不結合FcR的重鏈恆定區，如帶有L234A/L235A/N297A/T366S/L368A/Y407V的人IgG1重鏈恆定區，如SEQ ID NO: 25（X1=S、X2=A、X3=V）所示。

第二多肽鏈和/或第四多肽鏈中的輕鏈恆定區，可以為例如人γ輕鏈恆定區。在某些實施方式中，輕鏈恆定區包含SEQ ID NO: 26所示的胺基酸序列。

第一接頭和第二接頭可以是約5-30胺基酸長度的肽。在某些實施方式中，接頭可以是5-20胺基酸長度的肽。在某些實施方式中，該接頭可以是GS接頭，例如包含SEQ ID NO: 36或37所示的GS接頭。

本發明的多特異性抗體，在一些實施方式中，其第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈、和第四多肽鏈可以分別包含與i）SEQ ID NOs: 27、28、29和30，或ii）SEQ ID NOs: 27、16、29和24具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

本發明的多特異性抗體，可以i）特異結合BCMA（人和猴BCMA），結合力比現有技術抗體如EM801略好，且幾乎不受環境中可溶BCMA的影響，ii）可以結合CD3，結合力顯著低於現有技術抗體如JNJ-64407564（下文中簡稱為JNJ）和EM801，且僅在多特異性抗體結合BCMA和/或GPRC5D而呈現“交聯”狀態時，才活化CD3訊號通路，且在某些腫瘤細胞例如同時高表現BCMA和PRGC5D的腫瘤細胞的存在時，對T細胞的活化作用要弱於JNJ和/或EM801，iii）可以結合GPRC5D，且結合力與JNJ相當或略好，vi）可以在體外殺傷腫瘤細胞，且殺傷力強於JNJ和EM801，v）具有體內抗腫瘤效果，且效果顯著強於EM801，與JNJ相當，iv）在測試濃度下幾乎沒有觀察到體內毒性。

相比於現有的BCMA×CD3雙抗和GPRC5D×CD3雙抗，本發明的三特異性抗體可以更全面地殺滅BCMA ⁺腫瘤細胞、PRGC5D ⁺腫瘤細胞、和BCMA ⁺PRGC5D ⁺腫瘤細胞，更好地應對腫瘤細胞表面抗原表現的異質性問題。即，不管腫瘤細胞上BCMA和PRGC5D的表現高還是低，都能被本發明的三特異性抗體標靶和殺滅。

此外，在存在高表現BCMA和GPRC5D的腫瘤細胞的情況下，本發明多特異性抗體對T細胞的活化力要弱於JNJ和EM801；在存在GPRC5D表現高BCMA表現低的腫瘤細胞的情況下，本發明多特異性抗體對T細胞的活化力要弱於JNJ；在存在BCMA表現高GPRC5D表現低的腫瘤細胞的情況下，本發明多特異性抗體對T細胞的活化力要弱於EM801。也就是說，本發明的三特異性抗體在應對腫瘤細胞面抗原表現異質性的問題時，不僅能更全面地殺傷腫瘤細胞，而且產生的毒副作用更低。

本發明還提供編碼本發明多特異性抗體的核酸分子，以及包含該核酸的表現載體，以及包含該表現載體或該核酸整合入基因組的宿主細胞。本發明還提供使用含有上述表現載體的宿主細胞來製備多特異性抗體的方法，包括：（i）在宿主細胞中表現多特異性抗體，以及（ii）從宿主細胞或其培養物中分離多特異性抗體。

本發明還提供藥物組合物，其包含治療有效量的本發明的多特異性分子、核酸分子、表現載體、或宿主細胞，以及藥學上可接受的載體。

在第二個方面，本發明提供在受試者中治療或減緩腫瘤或癌症的方法，包括向受試者施用有效量的本發明藥物組合物。

腫瘤或癌症與BCMA和/或PRGC5D相關，包括，但不限於，多發性骨髓瘤，和其他血液系統惡性腫瘤，如漿細胞瘤、漿細胞白血病、巨球蛋白血症、孤立性骨漿細胞瘤、和髓外漿細胞瘤等。

在某些實施方式中，腫瘤或疾病為多發性骨髓瘤。

在某些實施方式中，腫瘤或疾病為多發性骨髓瘤，且骨髓瘤細胞同時高表現BCMA和GPRC5D。

在某些實施方式中，受試者為哺乳動物，特別是人。

本發明也提供本發明的多特異性抗體、核酸分子、表現載體、宿主細胞、或藥物組合物在製備一種用於治療或減緩腫瘤或癌症的藥物中的用途。

在本發明中引用或提及的所有文件（包括但不限於本文引用的所有文獻、專利、公開的專利申請）（“本發明引用文件”），在本發明引用文件中引用或提及的所有文件，以及本發明或任意本發明引用文件中提及的任何產品的製造商手冊、說明書、產品規格和產品頁，均通過引用的方式併入本發明，且可能在實施本發明時採用。更具體而言，所有參考文件均通過引用的方式併入本發明，如同各文件通過引用的方式併入。在本文中提及的任何Genbank序列通過引用的方式併入本發明。

為更好理解本發明，首先定義一些術語。其他定義則貫穿具體實施方式部分而列出。

術語“CD3”是指分化簇3，包含γ鏈、δ鏈、ε鏈和ζ鏈等。術語“CD3ε”或“CD3E”是指CD3的ε鏈。術語“CD3δ”或“CD3D”是指CD3的δ鏈。術語“CD3D&E”或“CD3δ&ε”是指δ鏈和ε鏈形成的εδ複合體。以上術語包括變體、同源物、直向同源物和平行同源物。

術語“BCMA”是指B細胞成熟抗原，大量選擇性地表現於惡性漿細胞，包括變體、同源物、直向同源物和平行同源物。“人BCMA”是指具有人胺基酸序列的BCMA蛋白，例如具有SEQ ID NO: 31所示的胺基酸序列。“猴BCMA”是指具有猴胺基酸序列的BCMA蛋白，例如具有SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列。“小鼠BCMA”是指具有小鼠胺基酸序列的BCMA蛋白，例如具有SEQ ID NO: 33所示的胺基酸序列。

術語“GPRC5D”是指G蛋白偶聯受體家族C組5成員D，是骨髓瘤細胞的標記分子，包括變體、同源物、直向同源物和平行同源物。“人GPRC5D”是指具有人胺基酸序列的GPRC5D蛋白，例如具有SEQ ID NO: 34所示的胺基酸序列。“猴GPRC5D”是指具有猴胺基酸序列的GPRC5D蛋白，例如具有SEQ ID NO: 35所示的胺基酸序列。

本文中的術語“任選的”或“任選地”是指非強制或必要地包含某組分或步驟，即在某些情況下包含某組分或步驟，在另一些情況下不包含某組分或步驟。

本文中的術語“抗體”意在包括IgG、IgA、IgD、IgE和IgM全長抗體及其任何抗原結合片段（即，抗原結合部分）。“全抗體”或“全長抗體”是指包含至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈的糖蛋白，重鏈和輕鏈由二硫鍵連接；而“半抗體”則是“全抗體”的一半，包含例如一條重鏈和一條輕鏈，重鏈和輕鏈由二硫鍵連接。各重鏈由重鏈可變區（簡稱V _H）和重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個結構域構成，即C _H1、C _H2和C _H3。各輕鏈由輕鏈可變區（簡稱V _L）和輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個結構域C _L構成。V _H和V _L區還可以劃分為稱作互補決定區（CDR）的高變區，其由較為保守的骨架區（FR）區分隔開。各V _H和V _L由三個CDR以及四個FR構成，從胺基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序排布。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括多種免疫系統細胞（例如，效應細胞）和傳統補體系統的第一組分（C1q）。本發明的抗體恆定區被涉及成具有弱結合或不結合免疫系統細胞和補體系統蛋白。已證實，抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的片段來實施，包括，但不限於，（i）Fab片段，由V _L、V _H、C _L和C _H1構成的單價片段；（ii）F（ab'） ₂片段，包含鉸鏈區二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；（iii）由V _H和C _H1構成的Fd片段；（iv）由抗體單臂V _L和V _H構成的Fv片段；（v）由V _H構成的dAb片段（Ward et al., （1989） Nature341:544-546）；（vi）分離的互補決定區（CDR）；以及（vii）奈米抗體，一種包含單可變結構域和兩個恆定結構域的重鏈可變區。本文中的“IgG樣抗體”是指保持IgG抗體的基本構型，額外添加一些基團如抗原結合域而得到的抗體。本文中重鏈恆定區的“功能片段”是指重鏈恆定區中保留有執行所需功能（例如，與另一重鏈恆定區或片段結合，與Fc受體和/或補體系統成分結合）的片段。

本文中所用的術語“激動型CD3抗體”是指能夠與CD3結合並活化或引發CD3訊號通路從而促進免疫細胞如T細胞活化和增殖等的CD3抗體。本發明的CD3抗體僅在“交聯”狀態下才激發CD3訊號通路，引起免疫細胞的活性。

本發明中的術語“交聯”是指由多特異性抗體上標靶BCMA的部分與BCMA結合、標靶PRGC5D的部分與PRGC5D結合、和/或（在具有FcR和/或補體系統成分結合力的Fc部分的情況下）Fc部分與Fc受體和/或補體系統成分結合，而引起的抗體聚集或相互作用。在體外實驗中，可以通過抗體Fc結合抗-Fc二抗而形成抗體交聯。相對的，“游離”是指抗體之間或者抗體與其他分子之間不會產生相互作用而產生二聚化或者多聚化，本發明的多特異性抗體在游離狀態下不會激發CD3訊號通路，也因而不活化免疫細胞如T細胞。

術語“拮抗型BCMA抗體”或“阻斷型BCMA抗體”是指能夠結合BCMA且能夠阻斷或抑制由BCMA與其配體如BAFF或APRIL，特別是APRIL，相互作用引發的BCMA訊號通路的抗體。拮抗型BCMA抗體可以阻斷惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡逃逸等。本發明多特異性抗體中的BCMA抗原結合域可以為拮抗型的，與BCMA結合，阻斷BCMA-APRIL結合/相互作用，且不引發BCMA訊號通路。

術語“FcR”是指在一些細胞，如B淋巴細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞等表面表現的蛋白，可以被抗體的Fc部分其結合，引發對靶細胞的吞噬和毒性等，在免疫系統中發揮重要作用。FcR包括Fcα受體、Fcε受體、和Fcγ受體，其中Fcγ受體術語免疫球蛋白超家族，是引發對微生物的吞噬作用的最重要的FcR，包括FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32A）、FcγRIIB（CD32B）、和FcγRIIIA（CD16A）等。

術語“多特異性”抗體或“多抗”是指特異性結合兩個以上（如三個）靶分子、或同一靶分子上兩個以上（如三個）不同表位的抗體。多特異性分子包括本發明中特異結合BCMA、PRGC5D和CD3的抗體。“雙特異性抗體”或“雙抗”在某些情況下是指特異性結合兩個靶分子、或一個靶分子上兩個表位的抗體。相對而言，“單特異性”抗體是指特異結合某一個靶分子，尤其是某一個靶分子上一個表位的抗體。

在本文中，“特異結合BCMA”、 “特異結合CD3”、或“特異結合PRGC5D”是指與BCMA、CD3或PRGC5D結合但是基本不與非BCMA、CD3或PRGC5D蛋白結合的抗體。較佳地，抗體以“高親和力”結合人BCMA、CD3或PRGC5D蛋白，是指K _D值為5.0 x10 ^-7M以下。

術語“基本不結合”蛋白或細胞是指，不與蛋白或細胞結合，或者不以高親和力與其結合，即結合蛋白或細胞的K _D為1.0 x 10 ^-6M以上。

術語“EC ₅₀”，又叫半最大效應濃度，是指引起50%最大效應的抗體濃度。

術語“IC ₅₀”，又稱為半抑制濃度，是指對指定的生物過程抑制一半時所需的藥物或抑制劑的濃度。

術語“受試者”包括任何人或非人動物。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳類和非哺乳類，例如非人靈長類、羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩栖類、和爬行類，儘管較佳哺乳動物，例如非人靈長類、羊、狗、貓、牛和馬。

術語“有效量”是指足以達到預期結果而用到的本發明抗體的量。術語“治療有效量”是指足以防止或減緩與疾病或病症（例如癌症）相關的症狀的本發明抗體量。治療有效量與被治療的疾病相關，其中本領域技術人員可以方便地判別出實際的有效量。

本發明的多特異性抗體具有有益特徵本發明的多特異性抗體，與現有技術抗體如JNJ和EM801相比，具有i）相當或更高的BCMA結合力，ii）相當或更高的PRGC5D結合力，iii）顯著更低的CD3結合力，vi）相當或更好的體外腫瘤殺傷力，v）相當或更好的體內腫瘤殺傷力，和/或iv）相當或更低的體內毒性。本發明的發明人通過巧妙的設計構築出的三特異性抗體，既有強大的腫瘤殺傷力、又引起較小毒性反應，可以突破和改善目前在MM治療中CD3雙特異性抗體，包括BCMA×CD3雙抗和GPRC5D×CD3雙抗，的藥效毒性平衡問題。相比於現有的BCMA×CD3雙抗和GPRC5D×CD3雙抗，本發明的三特異性抗體可以更全面地殺滅BCMA+腫瘤細胞、PRGC5D+腫瘤細胞、和BCMA ⁺PRGC5D ⁺腫瘤細胞，更好地應對腫瘤細胞表面抗原表現的異質性問題。即，不管腫瘤細胞上BCMA和PRGC5D的表現高還是低，都能被本發明的三特異性抗體標靶和殺滅。此外，在存在高表現BCMA和GPRC5D的腫瘤細胞的情況下，本發明多特異性抗體對T細胞的活化力要弱於JNJ和EM801；在存在GPRC5D表現高BCMA表現低的腫瘤細胞的情況下，本發明多特異性抗體對T細胞的活化力要弱於JNJ；在存在BCMA表現高GPRC5D表現低的腫瘤細胞的情況下，本發明多特異性抗體對T細胞的活化力要弱於EM801。也就是說，本發明的三特異性抗體在應對腫瘤細胞面抗原表現異質性的問題時，不僅能更全面地殺傷腫瘤細胞，而且產生的毒副作用更低。尤其在針對高表現BCMA和PRGC5D的腫瘤方面，本發明的多特異性抗體更具有殺傷優勢，且產生的毒副作用較低。本發明多特異性抗體中使用的單特異性抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區CDR和輕鏈可變區CDR通過Kabat編號系統確定。領域內熟知，重鏈可變區和輕鏈可變區CDR可以通過例如Chothia、IMGT、AbM或Contact編號系統/方法確定。本發明的多特異性抗體也包括雙特異性抗體。

本發明的多特異性抗體本發明的多特異性抗體可以包含：i）CD3抗原結合域、ii）BCMA抗原結合域、以及iii）GPRC5D抗原結合域。CD3抗原結合域可以為激動型抗原結合域，其特異地結合CD3並活化CD3訊號通路。BCMA抗原結合域可以結合BCMA，並任選地阻斷BCMA-APRIL結合/相互作用，即可以任選地為拮抗型的抗原結合域。GPRC5D抗原結合域可以與GPRC5D特異結合。本發明的多特異性抗體可以包含例如1個CD3抗原結合域、1個BCMA抗原結合域、以及1個GPRC5D抗原結合域。本發明的多特異性抗體可以為IgG樣抗體，包含Fab或Fv形式的CD3抗原結合域，Fab或Fv形式的GPRC5D抗原結合域，以及單鏈抗體（scFv）形式的BCMA抗原結合域。多特異性抗體可以包含i）CD3半抗體，包含重鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈可變區和任選的輕鏈恆定區，ii）GPRC5D半抗體，包含重鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈可變區、和任選的輕鏈恆定區，以及iii）scFv形式的BCMA抗原結合域，包含重鏈可變區、任選的第一接頭、和輕鏈可變區，其中，CD3半抗體和GPRC5D半抗體可以形成IgG全抗體，scFv形式的BCMA抗原結合域可以，任選地經由第二接頭，與CD3半抗體的重鏈可變區的N端、輕鏈可變區的N端、重鏈恆定區的C端、或輕鏈恆定區的C端連接。在一些實施方式中，scFv形式的BCMA抗原結合域與CD3半抗體的重鏈可變區的N端、或輕鏈可變區的N端連接。 scFv形式的BCMA抗原結合域可以從N端到C端包含重鏈可變區、任選的第一接頭、和輕鏈可變區；或輕鏈可變區、任選的第一接頭、和重鏈可變區。兩個半抗體的重鏈恆定區的其中之一，可以為帶有杵結構且弱結合或不結合FcR的重鏈恆定區，如帶有L234A/L235A/N297A/T366W的人IgG1重鏈恆定區，另一個重鏈恆定區可以為帶有臼結構且弱結合或不結合FcR的重鏈恆定區，如帶有L234A/L235A/N297A/T366S/L368A/Y407V的人IgG1重鏈恆定區。第一接頭和第二接頭可以由肽鍵連接的胺基酸構成，較佳肽鍵連接的5-30個胺基酸，其中胺基酸選自20種天然存在的胺基酸。這些胺基酸中的一種或多種可以糖基化，如本領域技術人員所瞭解的。在一個實施方式中，5-30個胺基酸可以選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天門冬胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸和離胺酸。在一個實施方式中，接頭由大部分有空鍵位阻的胺基酸構成，例如甘胺酸和丙胺酸。示例性的接頭為多聚甘胺酸，特別是多聚(Gly-Ala)、以及多聚丙胺酸。本發明中的示例性接頭可以如SEQ ID NOs: 19、20、21或22所示。接頭也可以是非肽類接頭。例如，可以使用烷基接頭，例如-NH-、-(CH ₂)s-C(O)-，其中s=2-20。這些烷基接頭還可以經任何非空間位阻基團例如低級烷基（例如C _1-6低級醯基）、鹵素（例如Cl、Br）、CN、NH ₂、苯基等進行取代。

保守修飾在另一實施方式中，本發明的多特異抗體，包含與本發明抗體存在一個或多個保守修飾的重鏈和/或輕鏈可變區序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本領域知道，一些保守序列修改不會使抗原結合性消失。本文所用的術語“保守序列修飾”是指不會顯著影響或改變抗體結合特性的胺基酸修飾。這樣的保守修飾包括胺基酸替換、添加和刪除。可以通過領域內已知的標準技術，例如點突變和PCR介導的突變，將修飾引入本發明抗體中。保守胺基酸替換是胺基酸殘基用具有相似側鏈的胺基酸殘基進行替換。具有相似側鏈的胺基酸殘基組在領域內已知。這些胺基酸殘基組包括具有鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如，天門冬胺酸、穀胺酸）、不帶電極性側鏈（例如，甘胺酸、天門冬胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、β-支鏈側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）和芳香族側鏈（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）的胺基酸。因此，本發明抗體的CDR區中的一個或多個胺基酸殘基可以用同側鏈組的其他胺基酸殘基替換，且得到的抗體可以使用本文所述的功能檢測對其進行保留功能（即，上述的功能）的測試。

基因修飾的抗體本發明的多特異性抗體，可以以具備本發明所用抗體的一個或多個V _H/V _L序列的抗體作為起始材料，製備成基因修飾的抗體。抗體可以通過修飾一個或兩個可變區（即，V _H和/或V _L）內（例如，在一個或多個CDR區和/或一個或多個骨架區）的一個或多個殘基來進行基因修飾，以改善結合親和力和/或增加與某些物種天然產生的抗體的相似性。例如，骨架區經修飾成提供人源化的抗體。此外，或者抗體可以通過修飾恆定區中的殘基進行基因修飾，例如改變抗體的效應功能。因此，本發明的多特異性抗體，其中所包含的各重鏈可變區和/或各輕鏈可變區可以包含本發明中的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3，和/或VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，但含有不同的骨架序列。

本發明的發明人發現，當抗原結合域呈現為scFv形式時，穩定性通常可能會弱於全抗體或Fab形式。因此，在本發明的一個實施方式中，為了解決BCMA抗原結合域以scFv形式應用於本發明多特異性抗體構築時可能導致的穩定性問題，基於電腦結構模擬，對BCMA重/輕鏈可變區的框架序列，例如輕鏈可變區的FR3和FR4部分的胺基酸進行了改造，以增加scFv形式的穩定性，減少聚體的形成，增加單體比例。改造前後的Fab形式和scFv形式在親和力、BCMA-APRIL阻斷活性以及抗腫瘤效果方面相當。

本發明的發明人還發現，可以通過電腦結構模擬改變BCMA重/輕鏈可變區的框架序列，例如改變框架區序列胺基酸的親疏水性，從而進一步改善多特異性抗體的成藥性，從而提高在產業上的表現量。

本發明的基因改造抗體包括在V _H和/或V _L的骨架殘基中做出基因修飾以例如改變抗體特性的那些。通常而言，這些骨架修飾用來降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或多個骨架殘基“回復突變”成相應的種系序列。更加具體而言，經歷體細胞突變的抗體可能包含不同於得到抗體的種系序列的骨架殘基。這些殘基可以通過將抗體骨架序列與得到抗體的種系序列相比較而識別出來。

另一類的骨架修飾包括對骨架區的、或者甚至一個或多個CDR區的一個或多個殘基進行突變，以去除T細胞表位，從而減少抗體的可能導致的免疫原性。該方法也稱為“去免疫化”，在美國專利公開20030153043中有更加詳細的描述。

此外，作為骨架或CDR區內修飾之外的另一種選擇，本發明的抗體可以基因改造成在Fc區包括基因修飾，通常來改變抗體的一個或多個功能特性，例如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合、和/或抗體依賴的細胞毒性。此外，本發明的抗體可以進行化學修飾（例如，可以向抗體附加一個或多個化學功能基團），或者修飾成改變其糖基化，來改變抗體的一個或多個功能特性。

在一個實施方式中，C _H1的鉸鏈區進行修飾，改變，例如增加或減少鉸鏈區的半胱胺酸殘基的數量。該方法在美國專利5,677,425中進一步描述。改變C _H1鉸鏈區的半胱胺酸殘基，來例如促進重鏈輕鏈的組裝或增加/降低抗體的穩定性。

在另一個實施方式中，對抗體的Fc鉸鏈區進行突變，以降低抗體的生物半衰期。更加具體地，將一個或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段的C _H2-C _H3連接區，從而抗體相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合而言，具有減弱的SpA結合力。該方法在美國專利6,165,745中有更詳細的描述。

在另一實施方式中，修飾抗體的糖基化。例如，可以製備去糖基化的抗體（即，抗體缺少糖基化）。可以改變糖基化，來例如增加抗體對抗原的親和性。這樣的糖化修飾可以通過例如改變抗體序列中的一個或多個糖基化位點來達成。例如，可以做出一個或多個胺基酸替換，以消除一個或多個可變區骨架糖基化位點，從而消除該位置的糖基化。這樣的去糖基化可以增加抗體對抗原的親和性。參見，例如美國專利5,714,350和6,350,861。此外，可以製備具有改變的糖基化類型的抗體，例如岩藻糖殘基量減少的低岩藻糖基抗體，或者具有增加的平分型GlcNac結構的抗體。改變的糖基化形式被證明能增加抗體的ADCC活性。這樣的糖化修飾可以通過例如在糖基化系統改變的宿主細胞中表現抗體而進行。具有改變的糖基化系統的細胞在領域中已知，且可以用作表現本發明重組抗體的宿主細胞，以製備具有改變的糖基化的抗體。例如，細胞株Ms704、Ms705和 Ms709缺少岩藻糖基轉移酶基因FUT8（α（1,6）- 岩藻糖基轉移酶），從而在Ms704、Ms705和 Ms709細胞株中表現的抗體在其糖中缺失岩藻糖。

本文抗體的另一修飾是聚乙二醇化（PEG化）。抗體可以PEG化，例如來增加抗體的生物（例如，血清）半衰期。為使抗體PEG化，抗體或其片段通常與聚乙二醇（PEG），例如PEG的反應性酯或醛類衍生物，在使一個或多個PEG基團附於抗體或抗體片段的條件下反應。

編碼本發明抗體的核酸分子在另一方面，本發明提供編碼本發明多特異抗體中如BCMA重鏈可變區-第一接頭-BCMA輕鏈可變區-第二接頭-CD3重鏈可變區-重鏈恆定區、CD3輕鏈可變區-輕鏈恆定區、PRGC5D重鏈可變區-重鏈恆定區、PRGC5D輕鏈可變區-輕鏈恆定區等的核酸分子。核酸可以存在整個細胞中，在細胞裂解液中，或處於部分純化或基本純的形式。當通過標準技術從其他細胞組分或其他污染物例如其他細胞核酸或蛋白中純化出來後，核酸是“分離的”或“基本純的”。本發明的核酸可以為例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含內含子序列。在較佳實施方式中，核酸是cDNA分子。本發明的核酸可以使用標準的分子生物學技術獲得。較佳的本發明核酸分子可以包括編碼CD3、BCMA、PRGC5D單特異性抗體的V _H和V _L序列或CDR的那些。一旦獲得了編碼V _H和V _L的DNA片段，這些DNA片段可以進一步通過標準的重組DNA技術進行操作，例如將可變區基因轉變為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼V _H或V _L的DNA片段與編碼另一蛋白的另一DNA片段，例如抗體恆定區或柔性接頭，可操作地連接。術語“可操作地連接”是指兩個DNA片段連接在一起，從而兩個DNA片段編碼的胺基酸序列都在閱讀框內。為創建scFv基因，編碼V _H和V _L的DNA片段可以可操作地與編碼柔性接頭例如編碼胺基酸序列（Gly4-Ser） ₃的另一片段連接，從而VH和VL序列可以作為連續的單鏈蛋白進行表現，其中V _H和V _L區域通過該柔性接頭連接（參見，例如Bird et al., （1988） Science242:423-426; Huston et al., （1988） Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85:5879-5883; McCafferty et al., （1990） Nature348:552-554）。對於本發明中的多特異性抗體，可以先獲得編碼CD3、BCMA、和PRGC5D抗體的CDR、VH和VL、以及接頭等的序列，然後根據所需的多特異抗體的形式來組合這些序列。例如，編碼BCMA重鏈可變區、第一接頭、BCMA輕鏈可變區、第二接頭、CD3重鏈可變區、和重鏈恆定區的序列可以按需可操作地連接在一起。

本發明抗體的製備本發明的多特異抗體的製備可以通過i）將編碼多特異抗體的各多肽鏈的序列插入一個或多個表現載體，其中一個或多個表現載體與轉錄和轉譯調控序列可操作地連接；ii）用表現載體轉導或轉染宿主細胞，以及iii）表現多肽鏈以形成本發明的多特異抗體。術語“調控序列”包括控制抗體基因轉錄或轉譯的啟動子、增強子和其他表現控制元件（例如，多腺苷酸化訊號）。表現載體可以編碼促進抗體鏈從宿主細胞分泌的訊號肽。抗體鏈基因可以複製到載體中，從而訊號肽在閱讀框內連接到抗體鏈基因的胺基端。訊號肽可以是免疫球蛋白訊號肽或異源訊號肽（即，來自非免疫球蛋白的訊號肽）。除抗體鏈基因和調控序列外，本發明的表現載體可以攜帶其他序列，例如調控載體在宿主細胞中複製的序列（例如，複製起始點）和可選擇標記物基因。例如，通常可選擇標記物基因賦予已導入載體的宿主細胞以藥物抗性，例如G418、潮黴素、或胺甲喋呤抗性。較佳的可選擇標記物基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR）基因（用於dhfr宿主細胞的胺甲喋呤選擇/擴增）和neo基因（用於G418選擇）。編碼多特異性抗體不同多肽鏈的表現載體通過標準技術轉染到宿主細胞中。多個形式的術語“轉染”包括多種常用於將外源DNA導入原核或真核宿主細胞的技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-右旋糖轉染等。儘管在原核或真核宿主細胞中表現本發明抗體在理論上是可行的，較佳抗體在真核細胞中表現，最較佳在哺乳動物宿主細胞中表現，因為真核細胞，特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能組裝並分泌適當折疊且有免疫活性的抗體。本發明可用的表現載體的例子包括但不限於質體、病毒載體、酵母人工染色體（YAC）、細菌人工染色體（BAC）、可轉化人工染色體（TAC）、哺乳動物人工染色體（MAC）和人工附加染色體（HAEC）。

藥物組合物在另一方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含本發明的一種或多種多特異性抗體、編碼多特異性抗體的核酸分子、包含該核酸分子的表現載體、和/或包含該核酸分子的宿主細胞，與藥學上可接受的載體配製在一起。組合物可以任選地包含一種或多種其他藥學上的有效成分，例如另一抗腫瘤藥物、或免疫增強藥物。本發明的藥學組合物可以與例如另一抗癌劑、或另一免疫增強劑聯合使用。藥學組合物可以包含任何數量的賦形劑。可以使用的賦形劑包括載體、表面活性劑、增稠或乳化劑、固體粘合劑、分散或混懸劑、增溶劑、染色劑、矯味劑、塗層、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、防腐劑、等滲劑及其組合。合適賦形劑的選擇和使用在Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. （Lippincott Williams & Wilkins 2003）中有教導。藥物組合物適合於經口、靜脈內、肌內、皮下、腸道外、脊柱或表皮施用（例如通過注射或推注）。基於施用途徑的不同，有效成分可以包在材料中，以保護其不受酸和可能使其失活的其他自然條件的影響。“腸道外施用”是指不同於腸道和局部外用的方式，通常通過注射進行，包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、膜內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬腦膜上和胸骨內注射和推注。或者，本發明的抗體可以通過非腸道外路徑施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻內、經口、陰道、直腸、舌下、或局部外用。較佳地，本發明的藥物組合物經口施用。藥物組合物可以為無菌水溶液或分散液的形式。它們也可以配製在微乳劑、脂質體或其他適於高濃度藥物的有序結構中。對於本發明藥物組合物的施用，具體可以由醫學工作者，如醫生，根據受試者的具體情況，如性別、年齡、過往病史等進行確定。 “治療有效量”的本發明多特異性抗體，引起疾病症狀嚴重程度的降低、或無症狀期頻率和持續時間的增加。例如，對於腫瘤患者，“治療有效量”較佳地，與對照受試者相比，將腫瘤減少至少約20%、更佳至少約40%，甚至更佳至少約60%，且更佳地至少約80%，甚至完全消除腫瘤。藥物組合物可以是緩釋試劑，包括植入體、和微膠囊遞送系統。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。在某些實施方式中，本發明的抗體以經配製，以確保合適的體內分佈。例如，為確保本發明的治療抗體穿越血腦屏障，抗體可以配製在脂質體中，其還可以額外地包含標靶功能基團，以增強對特定細胞或器官的選擇性輸送。

本發明的用途和方法本發明的藥物組合物具有多種體外和外內應用，例如可以用於腫瘤或癌症的治療和緩解。本發明的藥物組合物可以用於治療或減緩與BCMA和/或PRGC5D相關的腫瘤或癌症，包括，但不限於，多發性骨髓瘤，和其他血液系統惡性腫瘤，如漿細胞瘤、漿細胞白血病、巨球蛋白血症、孤立性骨漿細胞瘤、和髓外漿細胞瘤。本發明提供本發明藥物組合物與一種或多種其他抗體或非抗體類治療劑一起施用的聯合療法，如免疫增強劑等。本文討論的治療劑的組合可以作為在藥學可接受載體中的單一組合物同時施用，或者作為分開的組合物同時施用，其中各藥劑處於藥學可接受載體中。在另一個實施方式中，治療劑的組合可以按序施用。此外，如果進行多次聯合療法施用，且藥劑按序施用，則在各時間點的按序施用的次序可以反轉或保持相同，按序施用可以與同時施用或其任何組合相結合。

本發明的各方面和實施方式將參照附圖和以下實施例進行討論。其他方面和實施方式對於本領域技術人員是清楚的。在本文中描述的所有文獻通過引用的方式全部併入本文。儘管本發明已經結合示例性實施方式進行了描述，很多等同修改和變化在給出本發明時對於本領域技術人員是清楚的。因而，本發明的示例性實施方式是示例性的，非限制性的。可以對所述實施方式做出多種變化，而不脫離本發明的宗旨和範圍。

實施例實施例1. 穩定表現BCMA或GPRC5D的細胞株的構築使用HEK293A細胞來構築分別穩定過表現人BCMA、猴BCMA、小鼠BCMA的細胞株。簡單而言，合成編碼人BCMA、猴BCMA、小鼠BCMA（胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 31、32和33所示）的cDNA序列，並經酶切分別複製到pLV-EGFP(2A)-Puro載體（北京英茂盛業生物科技有限公司，中國）的BamH1和EcoR1酶切位點中。將得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-人BCMA、pLV-EGFP(2A)-Puro-猴BCMA、pLV-EGFP(2A)-Puro-小鼠BCMA與psPAX 和pMD2.G質體通過脂質體轉染的方式轉染到HEK293T細胞（南京科佰公司，中國）中，產生慢病毒，具體轉染方法與Lipofectamine 3000套組（Thermo Fisher Scientific，美國）說明書步驟完全一致。轉染三天後，從HEK293T細胞的細胞培養基（DMEM培養基（Cat#: SH30022.01，Gibco），補充有10%FBS（Cat#: FND500，Excell））中收穫慢病毒。然後用慢病毒轉染HEK293A細胞（南京科佰公司，中國），得到穩定表現人、猴或小鼠BCMA細胞（分別稱為HEK293A/人BCMA、HEK293A/猴BCMA、HEK293A/小鼠BCMA細胞）。轉染的HEK293A細胞培養在含有0.2 μg/ml 嘌呤毒素（Cat#: A11138-03，Gibco）的DMEM+10%FBS培養基中7天。人和猴BCMA的表現使用市售可得的BCMA抗體（PE-抗人BCMA抗體，Cat#: 357503，Biolegend，美國）通過流式分析儀經FACS分析。相似地，小鼠BCMA的表現通過市售可得的小鼠BCMA抗體（抗小鼠 BCMA抗體，Cat#: O88472，Novus，美國）經FACS確證。類似地，構築分別穩定過表現人和猴GPRC5D的HEK293T細胞株，使用分別編碼人和猴GPRC5D（胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 34和35所示）的cDNA，且使用GPRC5D抗體（GPRC5D抗體根據公開專利WO2022058445A1中的胺基酸序列10和11製備，20 μg/ml終濃度）來檢測人和猴GPRC5D的表現。

實施例2. CD3×BCMA×GPRC5D三特異性抗體的構築和表現採用BCMA:CD3:GPRC5D抗原結合域為1:1:1的不對稱全抗體組裝形式進行三特異性抗體的構築，示例性三抗的結構如圖1所示。以GS載體（具體信息見ZL200510064335.0）為表現載體，構築示例性三抗的2個半抗體MBS-314杵和MBS-314臼。其中，MBS-314杵的長鏈包含BCMA scFv-接頭-CD3抗體重鏈可變區-重鏈恆定區，胺基酸序列如SEQ ID NO: 27所示，短鏈包含CD3抗體輕鏈可變區-輕鏈恆定區，胺基酸序列如SEQ ID NO: 28所示，MBS-314臼的長鏈包含GPRC5D抗體重鏈可變區-重鏈恆定區，胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示，短鏈包含GPRC5D抗體輕鏈可變區-輕鏈恆定區，胺基酸序列如SEQ ID NO: 30所示。在標靶BCMA的scFv中，輕鏈可變區的骨架（例如第四框架區）做了一定的改造，以使scFv的結構更加穩定。全基因合成編碼MBS-314杵半抗體中的BCMA scFv-接頭-CD3抗體重鏈可變區、以及MBS-314臼半抗體中GPRC5D抗體重鏈可變區的DNA序列，利用限制性內切酶 EcoRI和 NheI分別對上述兩個片段進行雙酶切，並將酶切後的基因片段複製至含各自重鏈恆定區（胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 25（X1=W、X2=L、X3=Y）、SEQ ID NO: 25（X1=S、X2=A、X3=V）所示）的載體中，完成2個半抗長鏈全長基因表現載體的裝配。另外，全基因合成編碼MBS-314杵半抗體中CD3抗體輕鏈可變區、以及MBS-314臼半抗體中GPRC5D抗體輕鏈可變區的DNA序列，利用限制性內切酶 ClaI和 BsiWI分別對2個片段進行雙酶切，並將酶切後的基因片段複製至含輕鏈恆定區（SEQ ID NO: 26）的載體中，完成2個半抗體短鏈全長基因表現載體的裝配。分別採用 ClaI和 HindIII酶切半抗體短鏈全長基因， EcoRI和 XhoI酶切半抗體長鏈全長基因， HindIII和 EcoRI酶切pCMV-cofragment質體， ClaI和 XhoI酶切GS-載體。將回收的4個DNA片段進行連接、轉化並挑取單株進行定序，獲得含有正確序列的半抗表現載體，分別命名為MBS-314杵表現載體和MBS-314臼表現載體。採用天根無內毒素質體大提套組（Cat#:DP117，天根）提取質體。採用5 mL FreeStyle F17細胞培養基重懸質體，同時吸取3倍質體體積的轉染試劑（PEI）重懸在5 mL FreeStyle F17細胞培養基中。將PEI緩慢地加入到質體中，充分混合，室溫放置約15 min。將上述混合液加入到100 ml 293F細胞中（細胞密度為1×10 ⁶/mL）。轉染後的HEK-293F細胞在37℃、5%CO ₂的培養箱中以120 RPM轉速培養。10-12天後，收集細胞培養上清，3500 rpm離心5分鐘，並通過0.22 μm濾膜過濾除去細胞碎片。半抗體通過預平衡的protein-A親和柱（Cat#: 17040501，GE，美國）來富集純化。後用洗脫緩衝液（20 mM 檸檬酸，pH3.0-pH3.5）進行洗脫。之後，抗體保存在PBS（pH 7.0）中，並通過NanoDrop檢測抗體濃度。純化的半抗進行進一步組裝。

實施例3. CD3×BCMA×GPRC5D三特異性抗體的組裝將純化的半抗體通過體外方式進行組裝。具體地，將MBS-314杵和MBS-314臼半抗體以1:1的莫耳比混合，用Tris鹼緩衝溶液調節至pH 8.0，添加一定量的還原型穀胱甘肽溶液，在25℃反應並低速攪拌過夜。反應結束後用2 M醋酸溶液調節pH值至5.5。通過超濾去除還原劑，終止反應。裝配後的抗體調至低鹽Tris緩衝溶液（pH 8.0）中，用0.2 μm的過濾膜過濾。首先採用低鹽Tris緩衝溶液（pH8.0）平衡陰離子層析柱，然後將樣品裝載到陰離子層析柱，收集流穿組分，隨後使用低鹽Tris緩衝溶液（pH8.0）進行沖洗直至UV280趨向於基線。用醋酸溶液將收集的流穿樣品pH調至5.5。將陰離子收集的樣品用30 kDa超濾管濃縮至1 mL，用0.2 μm的過濾膜過濾。採用低濃度乙酸鹽緩衝溶液（pH 5.5）平衡陽離子層析柱，將樣品上樣到陽離子層析柱中。上樣完畢後，再用低濃度乙酸鹽緩衝溶液（pH 5.5）平衡柱子，然後進行線性梯度洗脫，0-100%高濃度醋酸鹽（pH 5.5），20 CV，收集洗脫組分。組裝好的雙抗命名為MBS314，純化後的抗體經過質譜鑒定純度高於90%，用於後續功能檢測。

實施例4. CD3×BCMA×GPRC5D與人CD3、人GPRC5D以及人BCMA的結合親和力通過捕獲法（BIAcore 8K）測定MBS314抗體與人CD3、人GPRC5D以及人BCMA的結合親和力。將鼠抗人Fc段的抗體（Cat#: BR100839，cytiva）偶聯至晶片CM5的表面。HBS-EP緩衝液（Cat#: BR-1006-69，GE Life Sciences）稀釋待測抗體至1 μg/mL，保證約100 RU抗體被抗人Fc的抗體捕獲。人BCMA抗原（Cat#:BCA-H522y，ACRO）、人CD3D&E（Cat#: CT038-H2508H，義翹神州）蛋白、以及人GPRC5D抗原（Cat#:HM05P，愷佧生物）分別用HBS-EP緩衝液稀釋至0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、和0.003900625 μg/ml。將不同濃度的各蛋白分別流經固定相表面。採用3 M MgCl ₂溶液對晶片進行再生。用 Biacore 8K控制軟體中的動力學分析 Wizard 進行動力學實驗。JNJ（GPRC5D×CD3雙特異性抗體）和EM801（BCMA×CD3雙特異性抗體）用作陽性對照，其中，JNJ根據公開專利WO2022058445A1中的胺基酸序列10、11、20、和21製備；EM801根據WO2016020332A1中的胺基酸序列43、44、45和46製備。根據 Biacore 8K評估軟體進行擬合，獲得檢測抗體對上述抗原的K _D值，總結於表1中。從表1可知，MBS314抗體與人CD3、人GPRC5D、以及人BCMA都有著很強的結合親和力。其中，針對CD3D&E複合體，MBS314相比於EM801和JNJ具有更低的結合親和力。

表1. MBS314抗體與人GPRC5D、人BCMA以及人CD3D&E的結合親和力

抗體	抗原	ka (1/Ms)	kd (1/s)	K _D(M)
JNJ	人GPRC5D	9.30E+05	3.92E-03	4.21E-09
MBS314	人GPRC5D	4.93E+05	1.74E-03	3.53E-09
MBS314	人BCMA	6.42E+05	2.83E-04	4.41E-10
EM801	人BCMA	2.28E+06	2.27E-03	9.96E-10
MBS314	人CD3D&E	3.11E+04	7.74E-03	2.49E-07
JNJ	人CD3D&E	4.44E+05	1.14E-02	2.56E-08
EM801	人CD3D&E	1.85E+05	7.57E-03	4.10E-08

實施例5. CD3×BCMA×GPRC5D三特異性抗體與HEK293A/人BCMA細胞、HEK293A/猴BCMA細胞、HEK293A/小鼠BCMA細胞、HEK293T/人GPRC5D細胞、HEK293T/猴GPRC5D細胞以及Jurkat細胞的結合力通過FACS檢測MBS314對細胞表面表現的人BCMA、猴BCMA、鼠BCMA、人GPRC5D、猴GPRC5D以及人CD3複合體的結合活性。具體地，利用胰酶消化收集生長狀態良好的HEK293A/人BCMA、HEK293A/猴BCMA、HEK293A/小鼠BCMA、HEK293T/人GPRC5D細胞、HEK293T/猴GPRC5D細胞（實施例1中製備）、以及Jurkat細胞株（南京科佰），300 g離心5 min去除培養基。PBS重懸計數後再次離心去除上清。利用2%FBS-PBS溶液重懸細胞，調整細胞濃度為4×10 ⁶個/ml。將各細胞加入U型底96孔盤中，50 μl/孔。用2%FBS-PBS稀釋檢測抗體，從40 μg/ml開始進行5倍梯度稀釋，共設置12個稀釋梯度。在上述96孔盤中加入50 μl抗體稀釋液，吹打混勻，室溫孵育1 h。2%FBS-PBS洗盤，200 μL/孔，洗滌3次。向盤中加入PE標記的山羊抗人IgG (H+L)二抗，1:500稀釋，50 μl/孔，室溫結合45 min。2%FBS-PBS洗盤，200 μL/孔，洗滌3次。最後向盤中加入150 μL 2%FBS-PBS以重懸細胞，並經流式細胞儀檢測，FlowJo軟體進行數據處理，GraphPad軟體進行數據分析，實驗結果顯示在圖2中。如圖2（A-C）所示，MBS314抗體與HEK293A/人BCMA以及HEK293A/猴BCMA細胞有很強的結合力，並且呈劑量依賴關係，但是不結合小鼠BCMA。圖2（D和E）顯示，MBS314抗體與HEK293T/人GPRC5D和HEK293T/猴GPRC5D均結合，且MBS314與人GPCR5D和猴GPCR5D結合活性都顯著高於JNJ。圖2F顯示，與JNJ相比，MBS314具有較低的CD3複合體結合活性。

實施例6. CD3×BCMA×GPRC5D三特異性抗體對T細胞的訊號活化通過以下檢測來確定本發明的三特異性抗體對T細胞訊號的活化。當該抗體結合腫瘤細胞表面的GPRC5D和/或BCMA而呈現“交聯”狀態時，其可結合JURKAT-NFAT-Luc細胞表面的CD3並活化NFAT訊號，使JURKAT-NFAT-Luc細胞分泌螢光素酶，通過檢測螢光素酶的活性，可確定由該抗體介導的T細胞活化程度。首先，使用GPRC5D和BCMA的融合瘤抗體（康源博創研發），檢測多發性骨髓瘤細胞表面的GPRC5D和BCMA表現程度，並從而挑選出GPRC5D和BCMA均高表現的細胞NCI-H929（KC-0629，康源博創）、GPRC5D高表現而BCMA低表現的細胞MOLP8（KC-0622，康源博創）、以及GPRC5D低表現BMCA高表現的細胞KMS-11（KC-0611，康源博創），進行後續的T細胞活化實驗。將上述骨髓瘤細胞（1百萬/ml、10萬/孔）懸浮於100 μl的PBS（含2%BSA）中，分別和GPRC5D融合瘤抗體或BCMA融合瘤抗體（20 μg/ml）室溫孵育半小時。離心洗滌後，向細胞加入PE-抗-小鼠二抗（1：400，biolegend，405307），離心洗滌後，懸浮細胞，加入7-AAD，流式分析腫瘤細胞的GPRC5D和BCMA的表現程度。圖3（A）示出上述三種細胞的流式分析圖。收集骨髓瘤細胞NCI-H929、MOLP8和KSM-11細胞，以及JURKAT-NFAT-LUC 細胞（康源博創，Cat#: KC-1485），400 g離心5分鐘，去除上清。用培養基（含10%FBS的RPMI1640）將細胞密度調整為~5×10 ⁵/ml。同時，抗體用培養基進行3.16倍梯度稀釋，起始濃度10 μg/ml。充分混勻細胞，在U底96孔盤中加入45 μl JURKAT-NFAT-Luc、45 μl H929、MOLP8或KSM-11細胞，以及10 μl各濃度的抗體，在37℃培養箱中培養4~6小時。之後，將細胞轉移到96孔透明平底黑壁盤，加入Bright-Glo（promega，E2610）溶液，經多模式微量盤分析儀讀取冷光值，檢測螢光素酶訊號。實驗結果如圖3（B）所示，MBS314在所有三種細胞上均能活化CD3訊號，即便腫瘤細胞上的GPRC5D或BCMA表現量較低。在腫瘤細胞同時高表現GPRC5D和BCMA時，MBS314引起的CD3訊號通路要顯著低於JNJ和EM801。

實施例7. CD3×BCMA×GPRC5D三特異性抗體的體內抗腫瘤藥效將同時表現GPRC5D和BCMA的骨髓瘤細胞MM.1S（KC-0620，康源博創）皮下注射至免疫缺陷小鼠B-NDG（百奧賽圖），同時對小鼠靜脈注射人T細胞，建立人源化小鼠腫瘤體內藥效模型。圖4（A）顯示出MM.1S細胞的GPRC5D和BCMA表現情況。在腫瘤細胞接種前約2~3個星期，復甦骨髓瘤細胞MM.1S，培養條件為RPMI-1640培養基（含10%FBS），3到4天繼代一次。腫瘤細胞接種前6天，復甦~1×10 ⁸PBMC，每1×10 ⁶細胞與20 μl CD3/CD28免疫磁珠（Cat#: 11161D，GIBCO）共培養，體外擴增T細胞約8天。在第0天，收集MM.1S腫瘤細胞，用基質膠（matrigel，GIBCO, 356234）與PBS的1:1混合物將腫瘤細胞密度調整為2.5×10 ⁷/ml，每隻NDG小鼠右側腹部皮下注射0.2 ml，即0.5×10 ⁷細胞/小鼠。第2天，收集擴增的T細胞，懸浮於含0.1% FBS和10 ng/ml IL-2 的PBS中，密度為約0.5×10 ⁸/ml。每隻小鼠尾靜脈注射0.2 ml T細胞，即約1×10 ⁷細胞。腫瘤長到50 - 100 mm ³時，即第20天時，經尾靜脈注射本發明的三特異性抗體、JNJ、EM801或PBS，劑量分別為每隻小鼠10 μg，每週注射2次，共7次。每3天測量一次腫瘤大小，直至第40天，腫瘤體積計算為=0.5×長×寬 ²。圖4（B）示出各組中小鼠個體的腫瘤大小變化。可以看出，MBS314能在小鼠體內清除腫瘤細胞，效果明顯好於EM801，與JNJ相當。

實施例8. CD3×BCMA×GPRC5D三特異性抗體對臨床腫瘤樣本的殺傷力從復發難治多發性骨髓瘤病人獲得的新鮮樣品中分離骨髓單核細胞，以5×10 ⁵/ml的密度懸浮於培養基RPMI1640（含10% FBS、1% 青黴素-鏈黴素、100 ng/ml IL-6、以及10 ng/ml IL-2）。用以上培養基稀釋抗體，起始濃度100 μg/ml，10倍梯度稀釋，共6個濃度。在U底96孔中，每孔加入90 μl細胞懸液、以及10 μl梯度稀釋後的各濃度的抗體。培養48小時後，離心去除上清，細胞重懸於100 μl FITC-抗人CD138（1:100，Biolegend，356508），冰上孵育30分鐘。離心去除抗體，對細胞加入7-AAD，FACS分析成活細胞中CD138 ⁺細胞的比例。圖5（A）示出FACS的分析圖譜，圖5（B）為數據統計圖。結果表明，MBS314對腫瘤細胞的殺傷力，比JNJ和EM801都更強。

實施例9. CD3×BCMA×GPRC5D三特異性抗體的體內毒性在野生型或CD3人源化的小鼠中，檢測本發明三特異性抗體的體內毒副作用。具體地，將9只B-hCD3EDG小鼠（CD3人源化，百奧賽圖）分成3組，將9只C57BL/6小鼠分成3組，分別經尾靜脈注射MBS314、JNJ和PBS，20 mg/kg, 每週注射2次，共注射3次。每天測量體重，計算每天相對於第0天的體重百分比，繪製體重-實驗天數相關曲線。第10天為實驗終點，對野生型和CD3人源化小鼠，抽取抗凝血50-100 μl, 做小鼠血常規，並取心、肝、脾、腎、骨髓、腦、肺、和胸腺，胰腺用刀片切取0.3-0.5 cm或更小體積見方，用10倍體積以上的10%中性福馬林液固定，做石蠟切片，HE染色觀察組織損傷。實驗結果表明，野生型小鼠和CD3人源化小鼠在注射高劑量的MBS314後，都未見體重明顯下降（圖6）以及明顯的組織損傷（結果未示出），說明MBS314沒有明顯的毒副作用。

實施例10. CD3×BCMA×GPRC5D三特異性抗體在小鼠體內的PK動力學選用10-12周齡的雌性BALB/c小白鼠，通過尾靜脈注射MBS314，3.0 mg/kg、1.0 mg/kg或0.3 mg/kg，在10分鐘、1小時、6小時、1天、3天、5天、7天和14天後採血。血樣具體地經眼眶或尾靜脈採集（採集後需做抗凝處理），每隻小鼠每次採集約0.03 ml。取10-30 μl血樣，加入4倍體積的PBS，10000 g離心5分鐘，取上清，-20℃保存備用。對ELISA盤加入50 ng/孔的BCMA-mFc（康源博創製備），4℃包被過夜。第二天，加入200 μl封閉液（2％BSA），37℃孵育2小時。之後將上述製備的血漿樣品用含2%BSA的PBS稀釋50倍、100倍和500倍；另MBS314用PBS（含2%BSA）進行3.16倍梯度稀釋，起始濃度1 μg/mL，共12個濃度，用於標準曲線的製作。向ELISA盤中分別加入50 μl血漿樣品和50 μl MBS314，37℃孵育1小時。洗滌後，加入50 μl HRP-抗人Fc（1：10000，Solarbio，SE101），37℃孵育1小時。加入ELISA顯色液，50 μl每孔，顯色，讀盤。根據標準曲線和血漿稀釋倍數，計算小時血漿中的抗體濃度。圖7示出抗體濃度的時間相關曲線，其中以3.0 mg/kg注射的MBS314在小鼠血液中的半衰期約為4.7天，1.0 mg/kg注射的為約3.18 天，而0.3 mg/kg注射的為約4.97天。該結果表明，MBS314在小鼠體內的血液半衰期為約4 - 5天。

本發明的示例性序列如下所示。

描述序列/SEQ ID NO

BCMA抗體VH-CDR1 NHIIH (SEQ ID NO: 1)

BCMA抗體VH-CDR2 YINPYPGYHGYNDKFSG (SEQ ID NO: 2)

BCMA抗體VH-CDR3 DGYYRDQDVLDY (SEQ ID NO: 3)

BCMA抗體VL-CDR1 KASQDISQYLN (SEQ ID NO: 4)

BCMA抗體VL-CDR2 YTSGLHP (SEQ ID NO: 5)

BCMA抗體VL-CDR3 QQGYALPWT (SEQ ID NO: 6)

BCMA抗體VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYPGYHGYNDKFSGRATMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYYRDQDVLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7)

BCMA抗體VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDISQYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGLHPGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEPEDEATYYCQQGYALPWTFGQGTKLTAK (SEQ ID NO: 8)

CD3抗體VH-CDR1 DFAMH (SEQ ID NO: 9)

CD3抗體VH-CDR2 GITWNSGSVGYADSVKG (SEQ ID NO: 10)

CD3抗體VH-CDR3 DRSGYGHYYYGMDV (SEQ ID NO: 11)

CD3抗體VL-CDR1 RASTSVSHNVA (SEQ ID NO: 12)

CD3抗體VL-CDR2 GASTKVT (SEQ ID NO: 13)

CD3抗體VL-CDR3 QHYINWPLT (SEQ ID NO: 14)

CD3抗體VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDFAMHWVRQAPGKGLEWVSGITWNSGSVGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRSGYGHYYYGMDVWGQGTTVTVAS (SEQ ID NO: 15)

CD3抗體VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASTSVSHNVAWYQQKPGQAPRLLIYGASTKVTGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQHYINWPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 16)

GPRC5D抗體VH-CDR1 SDYAWN (SEQ ID NO: 17)

GPRC5D抗體VH-CDR2 YISYSGSATYSPSLKS (SEQ ID NO: 18)

GPRC5D抗體VH-CDR3 GGIAGRGRWGAMDY (SEQ ID NO: 19)

GPRC5D抗體VL-CDR1 KASQNVGTNVA (SEQ ID NO: 20)

GPRC5D抗體VL-CDR2 SASYRDS (SEQ ID NO: 21)

GPRC5D抗體VL-CDR3 QQYKSYPLT (SEQ ID NO: 22)

GPRC5D抗體VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSATYSPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGIAGRGRWGAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 23)

GPRC5D抗體VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYKSYPLTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 24)

帶杵長鏈中的IgG1 Fc L234A/L235A/N297A/T366W ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLX1CX2VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLX3SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 25)，X1=W、X2=L、X3=Y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

帶臼長鏈中的IgG1 Fc L234A/L235A/N297A/T366S/L368A/Y407V SEQ ID NO: 25，X1=S、X2=A、X3=V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

κ輕鏈恆定區 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 26)

MBS314帶杵半抗體的長鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYPGYHGYNDKFSGRATMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYYRDQDVLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDISQYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGLHPGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEPEDEATYYCQQGYALPWTFGQGTKLTAKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDFAMHWVRQAPGKGLEWVSGITWNSGSVGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDRSGYGHYYYGMDVWGQGTTVTVASASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 27)

MBS314帶杵半抗體的短鏈 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASTSVSHNVAWYQQKPGQAPRLLIYGASTKVTGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQHYINWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 28)

MBS314帶臼半抗體的長鏈 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSATYSPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGIAGRGRWGAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 29)

MBS314帶臼半抗體的短鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYKSYPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 30)

人BCMA MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR (SEQ ID NO: 31)

猴BCMA MLQMARQCSQNEYFDSLLHDCKPCQLRCSSTPPLTCQRYCNASMTNSVKGMNAILWTCLGLSLIISLAVFVLTFLLRKMSSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKGRTGDEIVLPRGLEYTVEECTCEDCIKNKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCNSLSAALSVTEIEKSISAR (SEQ ID NO: 32)

小鼠BCMA MAQQCFHSEYFDSLLHACKPCHLRCSNPPATCQPYCDPSVTSSVKGTYTVLWIFLGLTLVLSLALFTISFLLRKMNPEALKDEPQSPGQLDGSAQLDKADTELTRIRAGDDRIFPRSLEYTVEECTCEDCVKSKPKGDSDHFFPLPAMEEGATILVTTKTGDYGKSSVPTALQSVMGMEKPTHTR (SEQ ID NO: 33)

人GPRC5D MYKDCIESTGDYFLLCDAEGPWGIILESLAILGIVVTILLLLAFLFLMRKIQDCSQWNVLPTQLLFLLSVLGLFGLAFAFIIELNQQTAPVRYFLFGVLFALCFSCLLAHASNLVKLVRGCVSFSWTTILCIAIGCSLLQIIIATEYVTLIMTRGMMFVNMTPCQLNVDFVVLLVYVLFLMALTFFVSKATFCGPCENWKQHGRLIFITVLFSIIIWVVWISMLLRGNPQFQRQPQWDDPVVCIALVTNAWVFLLLYIVPELCILYRSCRQECPLQGNACPVTAYQHSFQVENQELSRARDSDGAEEDVALTSYGTPIQPQTVDPTQECFIPQAKLSPQQDAGGV (SEQ ID NO: 34)

猴GPRC5D MYKDCIESTGDYFLPCDSEGPWGIVLESLAILGIVVTILLLLAFLFLMRKIQDCSQWNVLPTQLLFLLSVLGLFGLAFAFIIQLNQQTAPVRYFLFGVLFALCFSCLLAHASNLVKLVRGRVSFSWTTILCIAIGCSLLQVIIAIEYVTLIMTRGMMFVHMTPYQLNVDFVVLLVYVLFLMALTFFVSKATFCGPCENWKQHGRLIFITVLFSIIIWVVWISMLLRGNPQFQRQPQWDDPVVCIALVTNAWVFLLLYIVPELCILYRSCRQECPSQGHACPVTAYQRSFQVENQELSRDC (SEQ ID NO: 35)

接頭 GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 36） GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 37）

儘管本發明已經結合一個或多個實施方式進行了描述，應當理解的是，本發明不限於這些實施方式，且上述描述意在涵蓋包含在所附請求項的精神和範圍內的所有其他可選形式、修飾和等同物。本文中應用的文獻均通過引用的方式全部併入本文。

無

以下以示例方式給出但不意在將本發明限制於具體實施方式的具體描述，可以結合附圖更好地進行理解。圖1示出示例性GPRC5D×BCMA×CD3三特異性抗體的結構示意圖。圖2示出示例性GPRC5D×BCMA×CD3三特異性抗體（MBS314）、BCMA×CD3雙特異性抗體（EM801）、和GPRC5D×CD3雙特異性抗體（JNJ）對HEK293A/人BCMA（A）、HEK293A/猴BCMA（B）、HEK293A/小鼠BCMA（C）、HEK293T/人GPRC5D（D）、HEK293T/猴GPRC5D（E）、以及人T細胞株Jurkat（F）的結合活性。圖3示出三種多發性骨髓瘤細胞株的BCMA及GPRC5D表現的FACS分析圖（A），以及示例性GPRC5D×BCMA×CD3三特異性抗體經這三種細胞“交聯”而對Jurkat-NFAT-Luc中CD3訊號通路的活化活性（B）。圖4示出骨髓瘤MM.1S細胞的GPRC5D和BCMA表現情況（A），以及MM.1S腫瘤在經示例性GPRC5D×BCMA×CD3三特異性抗體處理的小鼠體內的生長曲線（B）。圖5示出從復發難治多發性骨髓瘤病人的新鮮樣品中分離的骨髓單核細胞，在經示例性GPRC5D×BCMA×CD3三特異性抗體處理和CD138 ⁺染色後的FACS分析圖譜（A），以及其中CD138 ⁺細胞百分比的統計圖（B）。圖6示出C57BL/6小鼠和CD3人源化小鼠在注射示例性GPRC5D×BCMA×CD3三特異性抗體後的體重變化，其中B6代表C57BL/6小鼠，CD3代表CD3人源化小鼠。圖7示出示例性GPRC5D×BCMA×CD3三特異性抗體在小鼠體內的PK動力曲線圖。

無

TW202411254A_112126154_SEQL.xml

Claims

一種多特異性抗體，包含： i）CD3抗原結合域， ii）BCMA抗原結合域，以及 iii）GPRC5D抗原結合域。
如請求項1所述的多特異性抗體，包含： i）第一多肽鏈，包含特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合BCMA的輕鏈可變區、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區， ii）第二多肽鏈，包含特異結合CD3的輕鏈可變區， iii）第三多肽鏈，包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區，以及 iv）第四多肽鏈，包含特異結合GPRC5D的輕鏈可變區；或者 i）第一多肽鏈，包含特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區， ii）第二多肽鏈，包含特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合BCMA的輕鏈可變區、和特異結合CD3的輕鏈可變區， iii）第三多肽鏈，包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區，以及 iv）第四多肽鏈，包含特異結合GPRC5D的輕鏈可變區，其中特異結合BCMA的重鏈可變區和特異結合BCMA的輕鏈可變區形成該BCMA抗原結合域，第一多肽鏈中特異結合CD3的重鏈可變區和第二多肽鏈中特異結合CD3的輕鏈可變區形成該CD3抗原結合域，第三多肽鏈中特異結合GPRC5D的重鏈可變區和第四多肽鏈中特異結合GPRC5D的輕鏈可變區形成該GPRC5D抗原結合域，且第一多肽鏈的重鏈恆定區與第三多肽鏈的重鏈恆定區結合在一起。
如請求項2所述的多特異性抗體，其中，第一多肽鏈從N端到C端包含特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合BCMA的輕鏈可變區、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區，或從N端到C端包含特異結合BCMA的輕鏈可變區、特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區，第三多肽鏈從N端到C端包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區；或者第一多肽鏈從N端到C端包含特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區，第二多肽鏈從N端到C端包含特異結合BCMA的重鏈可變區、特異結合BCMA的輕鏈可變區、和特異結合CD3的輕鏈可變區，或從N端到C端包含特異結合BCMA的輕鏈可變區、特異結合BCMA的重鏈可變區、和特異結合CD3的輕鏈可變區，第三多肽鏈從N端到C端包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區。
如請求項3所述的多特異性抗體，其中， i）第一多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合BCMA的重鏈可變區、第一接頭、特異結合BCMA的輕鏈可變區、第二接頭、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區，或包含特異結合BCMA的輕鏈可變區、第一接頭、特異結合BCMA的重鏈可變區、第二接頭、特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區， ii）第二多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合CD3的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區， iii）第三多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區，以及 iv）第四多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合GPRC5D的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區；或者 i）第一多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合CD3的重鏈可變區、和重鏈恆定區， ii）第二多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合BCMA的重鏈可變區、第一接頭、特異結合BCMA的輕鏈可變區、第二接頭、特異結合CD3的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區，或包含特異結合BCMA的輕鏈可變區、第一接頭、特異結合BCMA的重鏈可變區、第二接頭、特異結合CD3的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區 iii）第三多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合GPRC5D的重鏈可變區、和重鏈恆定區，以及 iv）第四多肽鏈，從N端到C端，包含特異結合GPRC5D的輕鏈可變區、和輕鏈恆定區。
如請求項1所述的多特異性抗體，其中， CD3抗原結合域為特異結合CD3的抗體或其抗原結合部分，其重鏈可變區包含分別如SEQ ID NOs: 9-11所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NOs: 12-14所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3， BCMA抗原結合域為特異結合BCMA的抗體或其抗原結合部分，其重鏈可變區包含分別如SEQ ID NOs: 1-3所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NOs: 4-6所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，和/或 GPRC5D抗原結合域為特異結合GPRC5D的抗體或其抗原結合部分，其重鏈可變區包含分別如SEQ ID NOs: 17-19所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NOs: 20-22所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。
如請求項5所述的多特異性抗體，其中， CD3抗原結合域中的重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含與SEQ ID NOs: 15和16具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列， BCMA抗原結合域中的重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含與SEQ ID NOs: 7和8具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，和/或 GPRC5D抗原結合域中的重鏈可變區和輕鏈可變區分別包含與SEQ ID NOs: 23和24具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
如請求項2所述的多特異性抗體，其中第一多肽鏈中的重鏈恆定區和第三多肽鏈中的重鏈恆定區為弱結合或不結合Fc受體和/或補體系統蛋白的人抗體重鏈恆定區，和/或第一多肽鏈中的重鏈恆定區和第三多肽鏈中的重鏈恆定區的其中之一帶有杵結構，另一帶有臼結構。
如請求項4所述的多特異性抗體，其中第一接頭和/或第二接頭包含SEQ ID NOs: 36和37所示的胺基酸序列。
如請求項2所述的多特異性抗體，其中第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈、和第四多肽鏈分別包含與SEQ ID NOs: 27、28、29和30具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
一種核酸分子，編碼如請求項1-9中任一項所述的多特異性抗體。
一種表現載體，包含如請求項10所述的核酸分子。
一種宿主細胞，包含如請求項10所述的核酸分子、或請求項11所述的表現載體。
一種藥物組合物，包含如請求項1-9中任一項所述的多特異性抗體、如請求項10所述的核酸分子、如請求項11所述的表現載體、或如請求項12所述的宿主細胞，以及藥學上可接受的載體。
一種如請求項13所述的藥物組合物在製備用於治療與BCMA和/或GPRC5D相關的疾病的藥物中的用途。
如請求項14所述的用途，其中與BCMA和/或GPRC5D相關的疾病為多發性骨髓瘤。