KR20220122656A - Ｇｐｒｃ5ｄ-표적화 결합 도메인에 대한 항-이디오타입 항체 및 관련 조성물 및 방법 - Google Patents

Ｇｐｒｃ5ｄ-표적화 결합 도메인에 대한 항-이디오타입 항체 및 관련 조성물 및 방법 Download PDF

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seq
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KR1020227023071A
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콜린 하우스킨스
킴벌리 해링턴
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
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Abstract

항-GPRC5D 항체 모이어티, 구체적으로 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하여 재조합 수용체에 존재하는 항-GPRC5D 항체 모이어티를 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체가 제공된다. 본 개시내용은 또한 항-GPRC5D CAR T 세포와 같은 상기 재조합 수용체를 발현하는 세포를 특이적으로 식별 및/또는 선택하는데 항-이디오타입 항체를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 그러한 세포를 특이적으로 활성화하는데 항-이디오타입 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

ＧＰＲＣ5Ｄ-표적화 결합 도메인에 대한 항-이디오타입 항체 및 관련 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/945,064호(제목 “GPRC5D-표적화 결합 도메인에 대한 항-이디오타입 항체 및 관련 조성물 및 방법”)와 2020년 8월 5일에 출원된 미국 가출원 제63/061,757호(제목 “GPRC5D-표적화 결합 도메인에 대한 항-이디오타입 항체 및 관련 조성물 및 방법”)의 우선권을 주장하고, 이의 내용들은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다.　 서열 목록은 2020년 11월 21일에 생성된 735042022640SeqList.txt라는 제목의 파일로 제공되며 이의 크기는 31,026 바이트이다.　 서열 목록 내 전자 형식의 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
본 개시내용은 일부 측면에서 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member　D, GPRC5D)에 대한 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체, 즉, 항-GPRC5D 항체 모이어티에 관한 것이며, 구체적으로 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하여 재조합 수용체에 존재하는 항-GPRC5D 항체 모이어티에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 항-GPRC5D CAR T 세포와 같은 상기 재조합 수용체를 발현하는 세포를 특이적으로 식별, 검출 또는 선택하는 데 항-이디오타입 항체를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 그러한 세포를 특이적으로 활성화하는 데 항-이디오타입 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.
세포외 항체 항원 결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR) 등의 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포를 사용하는 입양 세포 요법을 위한 방법이 있다. 시험관 내 또는 생체 내에서 대상체에 대한 상기 세포의 활성을 평가하기 위한 다양한 전략이 이용 가능하다. CAR 발현 세포의 활성을 구체적으로 평가하기 위해서는 개선된 방법이 필요하다. 상기 필요를 충족시키는 시약, 조성물, 및 제조품이 제공된다.
scFv와 같은 항체 단편, 및 키메라 항원 수용체와 같은 이를 함유하는 키메라 분자를 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 제제가 본원에 제공된다. 또한, 고체 표면, 예를 들어 플레이트 또는 비드와 같이, 제제가 결합된 표면을 포함하는 것들을 포함하는, 이러한 제제를 함유하는 조성물 및 제조품이 제공된다. 또한, 본원에서 제공된 구현예들 중에서, 예컨대 CAR-발현 세포의 검출, 자극 또는 사용에서, 항체 또는 키메라 분자를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 세포 또는 요법의 검출, 사용, 조작 및/또는 자극을 위한 것을 포함하여, 이러한 제제, 조성물 및 물품의 용도 및 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공되고, 여기서 상기 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역;을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본원에 제공되고, 여기서 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본원에 제공되고, 여기서 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본원에 제공되고, 여기서 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 아미노산 서열들을 각각 포함하는, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 26의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 아미노산 서열들을 각각 포함하는, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항 GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 단일 사슬 단편은 상기 VH 영역과 상기 VL 영역 사이에 위치하는 가요성 링커를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 항원 결합 단편의 단일 사슬 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 상보성 결정 영역(CDR)의 전부 또는 일부 내의 또는 이를 포함하는 에피토프에 결합하거나 이를 인식한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 있거나 이에 포함되고/거나; 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 있거나 이에 포함되고/거나; 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 scFv는 CAR의 세포외 부분 내에 있거나 이에 포함되고/거나; 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 scFv에 결합한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 scFv는 CAR의 세포외 부분 내에 있거나 이에 포함되고/거나; 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 scFv에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 CAR은 예를 들어 서열 번호: 9에 제시된 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 scFv이거나 이를 포함하는 항원 결합 도메인을 함유하는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 CD3제타 신호 전달 도메인 및 공자극 신호 전달 도메인을 함유하는 세포내 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호 전달 도메인은 CD28의, 예컨대 인간 CD28 유래의 세포내 신호 전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호 전달 도메인은 4-1BB의, 예컨대 인간 4-1BB 유래의 세포내 신호 전달 도메인이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 CAR은 스페이서를 통해 상기 항원 결합 도메인에 연결된 막관통 도메인을 더 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 스페이서는 면역글로불린 스페이서이고, 선택적으로 상기 스페이서는 서열 번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 스페이서는 서열 번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인은, 선택적으로 인간 CD28인, CD28의 막관통 부분을 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인은 인간 CD28의 막관통 부분을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 CAR의 상기 스페이서 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 선택적으로 CD28인, CD28 또는 이의 부분에 결합하지 않거나 특이적으로 결합하지 않는다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD28 또는 이의 부분에 결합하지 않거나 특이적으로 결합하지 않는다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 선택적으로 인간 IgG1 Fc 도메인인, Fc 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 Fc 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D)에 결합하거나 이를 인식한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 작용제(agonist)이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용액 중에 있을 때 상기 CAR의 작용제이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 고정될 때 상기 CAR의 작용제이고, 선택적으로 상기 지지체 또는 정지상은 플레이트 또는 비드이다. 일부 구현예에서, 상기 지지체는 플레이트 또는 비드이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 nM인, 또는 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 nM 미만인 결합 친화도(EC50) 및/또는 해리 상수를 가진다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM인, 또는 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 미만인의 해리 상수를 가진다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화된 것이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재조합성이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론성(또는 단일 클론성)이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원 결합 단편이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, scFv 및 단일 도메인 항체 중에서 선택된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역의 상기 적어도 일부는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc의 일부를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 불변 영역은 인간 IgG로부터 유래된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및/또는 경쇄의 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc의 일부를 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 CL 도메인을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 불변 영역은 IgG 유래, 선택적으로 인간 IgG1 유래이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 불변 영역은 IgG1 유래이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 카파 경쇄 유래이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 온전한 항체 또는 전장 항체이다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는, 접합체(conjugate)가 본원에 또한 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 이종 분자 또는 모이어티는 표지(label)이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 표지는 형광 염료, 형광 단백질, 방사성 동위원소, 발색단, 금속 이온, 금 입자, 은 입자, 자성 입자, 폴리펩타이드, 효소, 스트렙타비딘, 비오틴, 발광 화합물, 및 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 이종 분자 또는 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 저분자(small molecule)이고, 이는 선택적으로 독소 또는 Strep-Tag이거나 이를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 이종 분자 또는 모이어티는 Strep-Tag이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자(들)가 또한 본원에 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자(들)는: (i) 서열 번호: 25에 제시된 상기 중쇄 가변 영역, (ii) 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 퇴화 서열(degenerate sequence)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (iv) 서열 번호: 26에 제시된 상기 경쇄 가변 영역, (v) 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자(들)는: (i) 서열 번호: 27에 제시된 중쇄, (ii) 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (iv) 서열 번호: 28에 제시된 경쇄, (v) 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄, 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 신호 서열을 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자(들)는 서열 번호: 29 내지 32로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터가 본원에 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 구현예들 중 어느 하나의 핵산 분자, 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 벡터를 포함하는, 세포가 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 적합한 숙주 세포에서 상기 구현예들 중 어느 하나의 핵산 분자(들) 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 벡터에 의해 암호화되는 중쇄 및/또는 경쇄를 발현시키는 단계 및 상기 항체를 회수하거나 단리하는 단계를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 세포를 중쇄 및/또는 경쇄가 발현되는 조건에서 배양하는 단계, 및 상기 항체를 회수하거나 단리하는 단계를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체, 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 세포를 포함하는, 조성물이 또한 본원에 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체, 및 상기 구현예들 중 어느 하나의 핵산 분자(들) 중 하나 이상, 및 선택적으로 사용 설명서를 포함하는, 키트가 또한 본원에 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 키트는 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 접합체를 고정하기 위한 시약 또는 지지체를 더 포함하되, 상기 시약 또는 지지체는 비드, 컬럼, 마이크로웰, 스틱, 필터, 스트립, 또는 용해성 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약이다.
일부 구현예에서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 상기 항-이디오타입 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포에 결합되거나 세포의 표면 상에 발현되고, 상기 (b)에서 검출하는 단계는 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 세포는 자신의 표면 상에서 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현한다.
일부 구현예에서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다.
일부 구현예에서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 세포 집단으로부터 세포를 선택하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포는 친화도-기반 분리에 의해 선택된다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 친화도-기반 분리는 유세포 분석에 의한 것이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 친화도-기반 분리는 자성 활성화 세포 분류에 의한 것이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 가역적으로 결합 또는 고정된다.
일부 구현예에서, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체와 인큐베이션하여, 자극된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 세포를 자극하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, (a) 세포 내로 CAR을 암호화하는 핵산 분자(들)를 도입하여, 투입 조성물을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 투입 조성물을 상기 CAR의 항원 수용체에 특이적으로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체와 인큐베이션하여, 세포 조성물을 생산하는 단계를 포함하는, 세포 조성물을 생산하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 (a)에서 도입은 바이러스 형질도입, 전위, 전기 천공, 또는 화학적 형질주입에 의해 상기 핵산 분자(들)를 상기 세포 내로 도입하는 것을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 트랜스포손으로 전위에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터의 전기 천공 또는 형질주입에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 단계 전에 상기 세포를 활성화하는 단계를 더 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 세포를 활성화하는 단계는 상기 세포를 CD3의 작용제와, 선택적으로 CD28의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 세포를 활성화하는 단계는 상기 세포를 작용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 CAR에 결합하여, 상기 투입 조성물 내 하나 이상의 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 조건 하에서 수행된다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 세포는 T 세포이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고체 지지체에 고정되고, 이것은 선택적으로 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약을 포함하거나 이에 접합된다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 시약에 고정되고, 이것은 선택적으로 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위이거나 이를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 (약) 적어도 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 이루어진다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 투입 조성물은 조성물 중 총 세포의 백분율로서 (약) 60% 미만, (약) 50% 미만, (약) 40% 미만, (약) 30% 미만, (약) 20% 미만 또는 (약) 10% 미만의 CAR-발현 세포를 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 산출 조성물 내 CAR 발현 세포의 수는 상기 투입 조성물 내 CAR 발현 세포의 수와 비교하여 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 또는 그 이상 증가하고/거나; 상기 산출 조성물 내 CAR 발현의 백분율은 조성물 내 총 세포와 비교하여 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 도입 및/또는 인큐베이션 전에, 상기 세포는 CAR 발현 세포에 대해 선택되거나 농축되지 않는다.
일부 구현예에서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 단리하는 단계를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체는 친화도-기반 분리에 의해 단리된다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 친화도-기반 분리는 자성-기반 분리이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에게 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포를 고갈시키는 방법이 또한 본원에 제공되며, 여기서 상기 대상체는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 투여받았다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 일어난다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 단일 사슬 단편은 scFv를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 단일 사슬 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv이고 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체, 및 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하기 위한 사용 설명서를 포함하되, 상기 사용 설명서는: 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하고/거나, 세포 집단으로부터, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 선택 또는 농축하고/거나, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 자극하는 것인, 제조품이 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약―상기 세포외 도메인 또는 이의 일부는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함함―; 및 상기 구현예들 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 구현예들 중 어느 하나의 접합체를 포함하는, 제조품이 또한 본원에 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 결합 시약은 제1 결합 시약이고, 상기 제조품은 상기 CAR의 상기 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 제2 결합 시약을 더 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 결합 시약의 상기 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부는 동일하다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 제조품은 면역분석을 이용하여 상기 결합 시약에 결합하는 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하기 위해 상기 결합 시약―선택적으로 상기 제1 및 제2 결합 시약―을 사용하기 위한 사용 설명서를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역분석은 브리지 또는 샌드위치 면역분석이고, 선택적으로 상기 샘플은 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR로 조작된 세포를 포함하는 세포 요법을 투여받은 대상체 유래이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 결합 시약―선택적으로 상기 제1 및/또는 제2 결합 시약―은 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 고체 지지체에 부착되거나 고체 지지체에 부착될 수 있고 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 다른 하나는 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 제조품은 고체 지지체를 더 포함하되, 선택적으로 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 비오틴에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 상기 고체 지지체는 스트렙타비딘-코팅된 표면을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 단일 사슬 단편은 scFv를 포함한다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 단일 사슬 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv이고 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
도 1a 및 도 1b는 항-ID 항체를 항-GPRC5D CAR 또는 대조군 CAR로 조작된 T 세포와 인큐베이션한 후 결합의 수준을 검출하여 항-GPRC5D CAR로 조작된 T 세포에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입(항-ID) 항체의 능력을 평가하는 분석의 결과를 도시한다.
도 2a-2b는, 용해성 항-ID 항체 또는 플레이트 결합 항-ID 항체와 인큐베이션된, 항-GPRC5D CAR 또는 대조군 CAR로 조작된 리포터 세포주를 사용하여, 특정 항-ID 항체의 T 세포 자극에 대한 작용성 활성을 시험한 분석의 결과를 도시한다.
도 3은 항-GPRC5D CAR을 발현하도록 조작된 1차 T 세포에 특이적으로 결합하는 후보 항-ID 항체의 능력을 시험한 분석의 결과를 도시한다.
(키메라 항원 수용체를 포함한 재조합 수용체에 존재하는 항-GPRC5D 항체 모이어티 등의) 항-GPRC5D 항체 모이어티에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 및 이의 항원 결합 단편 등의 시약이 본원에 제공된다. 항-GPRC5D CAR T 세포와 같은 표적 항체 또는 단편을 발현하는 또는 포함하는 세포를 특이적으로 식별, 선택, 및/또는 자극 및/또는 활성화하기 위한 것을 포함하여, 상기 시약의 용도 및 이의 사용 방법, 및 상기 시약을 포함하는 조성물 및 제조품이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 항체는 세포 표면 상에 결합하거나 발현하는 CAR 등의 다양한 항-GPRC5D CAR의 특이적인 식별 및/또는 선택을 위해 사용될 수 있고, 또한 CAR T 세포 등의 표적 CAR을 발현하는 세포를 특이적으로 활성화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 항-GPRC5D 항체, 또는 이로부터 유래된 항체 단편에 특이적인 항체로서, 이러한 항체로부터 유래된 가변 영역을 함유하는 항체 및 CAR, 및/또는 이에 포함된 이디오토프를 포함하는 항체가 제공된다.
일부 구현예에서, 항-GPRC5D 항체 및 이러한 항-GPRC5D 항체로부터 유래된 가변 영역을 함유하는 CAR 및/또는 그에 함유된 이디오토프를 함유하는 항-GPRC5D 항체를 포함하는, 항-GPRC5D 항체 또는 그로부터 유래된 항체 단편에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 재조합 수용체(예를 들어, CAR)에 존재하는 표적 항체를 검출, 식별, 또는 선택 또는 식별하는 능력; 표적 항체를 함유하는 세포외 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 갖는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 함유하거나 발현하는 조작된 세포의 활성을 효능작용하는 능력; 또는 예를 들어 조작된 세포에 의해 발현된 재조합 수용체에 존재하는 표적 항체의 이의 표적 항원에 대한 결합을 길항작용하거나 차단하는 능력에 근거하여 다양한 목적을 위한 시약으로서 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예컨대 항-GPRC5D CAR T 세포에 의해 또는 그 상에서 발현된 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 일부로서 표적 항체 또는 단편을 발현하거나 포함하는 조작된 세포를 특이적으로 검출하거나, 식별하거나, 또는 선택하기 위한 것을 포함한, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 용도 및 이의 사용 방법, 및 조성물 및 제조품이 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포 표면 상에 결합되거나 발현된 CAR과 같은 다양한 항-GPRC5D CAR의 특이적 식별 및/또는 선택에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항-GPRC5D 표적 항체를 함유하는 세포외 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 갖는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 함유 또는 발현하는 조작된 세포를 효능작용, 자극 또는 활성화하기 위한, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 용도 및 이의 사용 방법, 및 조성물 및 제조품이 제공된다. 상기 구현예들에서, 제공된 항-이디오타입 항체 및 이의 항원 결합 단편 중에는, 조작된 세포에 의해 또는 조작된 세포 상에서 발현된 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 세포외 도메인의 일부로서 함유된 표적 항체 또는 단편에 대한 결합이 조작된 세포를 자극하거나 활성화시키는 작용제 활성을 초래하는, 항-이디오타입 항체 및 항원 결합 단편이 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체에 구성된 표적 항체와의 결합은 재조합 수용체의 신호전달 도메인을 활성화시켜 세포에서 전사 인자 또는 다른 신호전달 분자의 활성화, 조작된 세포의 증식, 사이토카인의 생산, 세포독성 활성 또는 다른 효과기 활성으로 이어지는 다운스트림 신호전달 사건을 개시하거나 매개한다. 일부 구현예에서, 제공된 항체는 CAR T 세포와 같은 표적 CAR을 발현하는 세포를 특이적으로 자극하거나 활성화시키는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 CAR, 특히 항-GPRC5D 항체 scFv 세포외 도메인을 함유하거나 인식된 이디오타입을 함유하는 CAR을 발현하는 세포를 검출, 식별, 조작(manipulating) 및/또는 영향을 주고/거나 조작(engineering)하기 위한 통상적인 시약과 비교하여 이점을 제공한다. 특정 이용가능한 방법에서, 샘플 내 CAR 또는 CAR 발현 세포의 존재 또는 부재 또는 양(및/또는 CAR의 자극 또는 조작(manipulation))의 검출이, CAR을 암호화하는 작제물에 포함되어 따라서 그 발현을 위한 간접 또는 대리 표지자(또는 '마커') 역할을 하는 것과 같은 대리 분자(surrogate molecule)의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하여, 수행된다. 특정 이용가능한 방법에서, 검출은 예를 들어 항원-결합 영역 이외의 유사하거나 동일한 도메인을 가질 수 있는 다른 CAR과 비교하여 평가된 특정 CAR에 대해 특이적이지 않은 일반 항체 시약 및/또는 시약을 사용하여 수행되고; 예를 들어, 이러한 항체는 CAR 도메인이 유래된 종 유래의 스페이서 또는 다른 도메인을 인식하는 항-종(anti-species) 항체, 및/또는 표적 및/또는 다른 키메라 수용체의 스페이서 영역에 사용된 특정 성분을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. CAR의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 고안된 특정 이용가능한 방법에서, 검출은 CAR 불변 영역을 인식하는 제제를 사용하여 수행된다. 일부 경우에, 대리 분자 또는 표지자에 대한 시약은 또한, 대리 표지자 또는 분자가 신호 전달 도메인을 함유하지 않기 때문에 또는 신호 전달 도메인이 CAR과 상이한 신호 전달 경로를 통해 신호 전달을 매개하기 때문에, 조작된 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)의 활성화를 특이적으로 자극하거나 유도하는 데 적합하지 않을 수 있다. 특정 이용가능한 방법에서, CAR 세포는 항-CD3/CD28 인식 제제와 같은 일반적인 시약의 사용을 통해 자극된다. 특정 방법은 CAR의 재조합 리간드(예를 들어, GPRC5D-Fc)를 사용한다. 이러한 특정 상황에서의 방법들은 전적으로 만족스럽지 않을 수 있고 및/또는 특정 한계를 가질 수 있다. 일부 경우에, CAR 리간드, 예컨대 GPRC5D는, 예를 들어 복합 유세포 분석 패널에 사용하기에 또는 용해성 시약을 사용하는 작용제-매개 자극이 바람직한 경우에 항상 완전히 효과적이지 않을 수 있다. 일부 경우에, CAR 리간드, 예컨대 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc는, 예를 들어 CAR 또는 그의 포맷 또는 구조에 대한 리간드의 친화도가 특정 용도에, 예를 들어 복합 유세포 분석 패널에서 사용하기에 또는 용해성 시약을 사용하는 작용제-매개 자극이 바람직한 경우, 최적이 아닐 수 있기 때문에, 항상 완전히 효과적이지 않을 수 있다. 개선된 민감도 및/또는 선택성을 제공하는 것을 포함하여 개선된 방법 및 제제가 필요하다. 상기 필요성을 충족시키는 구현예가 본원에 제공된다.
제공된 항-이디오타입 항체 및 이의 항원 결합 단편은 일부 구현예에서 표적 항체 리간드와 관련된 낮은 결합 친화도 및/또는 표적 항체 불변 영역에 대한 항체 시약과 관련된 비-특이적 결합과 관련된 난제들을 포함하여 이러한 난제들 중 하나 이상을 극복한다. 제공된 항-이디오타입 항체는 그 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해 높은 친화도 및 특이성을 갖는 시약을 제공하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 항체는, 현재 CAR을 검출 또는 확인하기 위해 이용가능한 GPRC5D-Fc 및 다른 시약과 비교하여, 이들의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 제공된 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해 더 큰 특이성 및 결합 친화도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 제공된 방법 및 용도는 세포외 항원 결합 도메인의 일부로서 항-GPRC5D 표적 항체를 함유하는 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)의 조작된 세포 상에서의 발현을 검출하거나 정량화하기 위한 것, 또는 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)를 발현하는 조작된 세포의 기능적 활성을 평가하거나 모니터링하기 위한 것을 포함하여, 시험관 내 또는 생체외 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법 및 용도는, 대상체에서 조작된 세포를 검출하는 방법; 대상체에서 조작된 세포를 생체 내에서 자극하거나 활성화하는 방법; 또는 일부 경우에 대상체에서 조작된 세포를 생체 내에서 절제하거나 사멸시키는 방법에서를 포함하여, 항-GPRC5D 표적 항체가 세포외 도메인 내에 구성된 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 조작된 세포가 투여되었거나 투여될 대상체에 항-이디오타입 항체를 투여하는 것을 포함하는 생체 내 방법 및 용도를 포함한다. 추가로, 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 및 이의 항원 결합 단편 중에는, 표면 상에 결합되거나 발현된 키메라 수용체를 갖는 세포의 선택적 검출, 단리, 제거 및/또는 고갈(예를 들어, 항체-의존성 세포-매개 세포독성, ADCC를 통한 사멸), 및/또는 자극 또는 활성화를 가능하게 하는, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 수용체의 작용제 또는 길항제로서 선택되는 것들이 있다. 제공된 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 유래된 세포외 결합 도메인을 함유하는 CAR을 자극하는(예컨대, 활성화하는) 활성을 나타내는 항-이디오타입 항체 작용제가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 이러한 항체는 CAR-발현 세포를 생성 및 제조하는 과정에를 포함하여, 특정 CAR-발현 세포를 자극 및 증폭시키는 방법에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 및 이의 항원 결합 단편 중에는 표면 상에 결합되거나 발현된 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 갖는 세포의 선택적 자극 또는 활성화를 가능하게 하는, 세포외 도메인에 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 재조합 수용체(예컨대, CAR)의 작용제로 선택되는 것들이 있다. 일부 구현예에서, 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 유래된 세포외 결합 도메인을 함유하는 CAR을 자극하는(예컨대, 활성화하는) 활성을 나타내는 작용제인 항-이디오타입 항체가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 이러한 항체는 CAR-발현 세포를 특이적으로 자극하거나 활성화시키는 방법에 사용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는, 작용제 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 관여될 때, 조작된 세포에서 하나 이상의 다운스트림 신호전달 계단식 다단계 반응을 유도 또는 활성화하여 전사 인자의 활성화 증가, 효과기 유전자의 발현의 변경 또는 표적 단백질의 활성화 또는 억제, 세포에서 인산화 또는 탈인산화 사건, 또는 하나 이상의 효과기 기능을 야기할 수 있는 신호전달 도메인을 함유한다. 예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체를 함유하는 제공된 재조합 수용체 중에서 CD3제타 신호 전달 도메인, 일부 경우에 공자극 신호 전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 신호전달 도메인)을 갖는 세포내 도메인을 함유하는 항-GPRC5D CAR이 있다. 일부 구현예에서, 제공된 작용제 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편을 T 세포 상에서 발현된 CAR에 결합은 NF-κB 활성화, Nur77 발현의 상향 조절, 염증성 사이토카인(예를 들어, IFN-감마, TNF-알파) 생산의 유도, T 세포 증식, 및/또는 세포독성 활성 중 하나 이상을 초래한다. 예를 들어, 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이, 특정 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 항-GPRC5D 항원 결합 도메인을 함유하는 CAR-T 세포를 자극하거나 활성화시키는 작용제 활성을 나타내며, 이는 Nur77 발현(예를 들어, 리포터 분석에서 리포터 발현을 기초로 함), 사이토카인의 증식 및/또는 생산을 유도하는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 또는 활성화 방법은 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-의존적 또는 특이적인 것이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-조작된 세포를 자극 또는 활성화하는 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있으며, 예컨대, CAR-발현 세포를 생성 및 제조하는 과정을 포함하는, CAR-발현 세포를 특이적으로 자극 및 증폭하는 방법에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 또는 활성화 방법은 재조합 수용체(예를 들어, CAR)-조작된 세포의 투여를 이전에 받았던 대상체의 생체 내에서 수행될 수 있으며, 예컨대 예를 들어 조작된 세포의 피크 수가 대상체에서 관찰되거나 검출된 시점 또는 그 후에 대상체의 생체 내에서 조작된 세포의 증폭을 재활성화하거나 유도하기 위해 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중에는 대상체에서 세포의 사멸을 유도 또는 제거하는 방법에 사용될 수 있는 것이 있다. 이러한 구현예의 구체적인 측면에서, 항-이디오타입 항체는 Fc 영역을 함유하는 것이며, 예를 들어 전장 항체의 온전한 것이다. 일반적으로, Fc 영역은 NK 세포 상에서 발현되는 것과 같은 활성화 Fc 수용체(예를 들어, FcγRIII)에 대한 Fc의 결합을 통해 효과기 기능을 담당하며, 이는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 세포 상에서 발현된 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 표적 항체에 대한 제공된 항-이디오타입 항체에 의한 결합은 예를 들어 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통한 사멸에 의해 생체 내 조작된 세포의 제거 및/또는 고갈을 초래한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법 또는 용도는 대상체에게 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편을 투여한 후, 예컨대 대상체가 조작된 세포의 투여를 받은 후 일정 시점에, 생체 내에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 조작된 세포(예를 들어, CAR T-세포)의 활성이 대상체에서 더 이상 바람직하지 않은 시점에, 예를 들어, 대상체가 항염증제 또는 스테로이드에 의해 달리 해결될 수 없는 중증 독성의 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타내는 경우, 대상체에게 투여될 수 있다.
제공된 항-이디오타입 항체 및 단편을 암호화하는 핵산, 및 이들 항-이디오타입 항체 및 단편을 발현하고 생산하기 위한 재조합 세포와 같은 세포가 또한 본원에 제공된다. 항-이디오타입 항체 및 단편을 발현 또는 함유하는 세포 뿐만 아니라 항-이디오타입 항체 및 단편을 제조 및 사용하는 방법이 또한 제공된다.
본 출원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 출판물은 각각의 개별 출판물이 개별적으로 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 출판물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 부합하지 않는 경우, 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 구성을 위한 목적이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I. 항-이디오타입 항체
일부 측면에서, 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티에 결합하거나 이를 인식하는 결합 분자, 예컨대 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편(“항-ID”)이 제공된다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열 번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3; 및 서열 번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열 번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함하는 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 단편인 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체가 제공되고, 여기서 단일 사슬 단편의 VL 영역 및 VH 영역은 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 가요성 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 가변 단편(scFv)인 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체가 제공된다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 유래의 가변 도메인(Fv), 예컨대 단일 사슬 Fv(scFv)에 결합하거나 이를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 Fv의 특정 에피토프 또는 영역, 일반적으로 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 에피토프 또는 영역에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 Fv 파라토프와 중첩되는 에피토프 또는 영역에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 유래의 가변 도메인(Fv), 예컨대 단일 사슬 Fv(scFv)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 표적 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인의 일부로서 함유된 항-GPRC5D 모이어티에 결합하거나 이를 인식하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 CAR은 표적 항체 분자 또는 표적 항체의 항원 결합 단편 또는 부분을 함유하는 항원 결합 부분을 함유한다. 일부 구현예에서, 표적 CAR은 표적 항체의 VH 및 VL 사슬로부터 유래된 scFv인 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항체로부터 유래된 scFv를 함유하는 항-GPRC5D CAR에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체가 제공된다. CAR의 예시적인 특징은 하기에 추가로 설명한다.
본원에서 용어 “항체(antibody)”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 온전한 항체 및 기능성(항원-결합) 항체 단편을 포함하는 다클론 및 단클론 항체를 포함하며, 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab’)2 단편, Fab’ 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한 단일 사슬 항체 단편 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디(nanobody)) 단편을 포함한다. 상기 용어는 유전자 조작된 및/또는 달리 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디(intrabodies), 펩티바디(peptibodies), 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화 항체 및 이종 접합 항체, 다중특이성(예를 들어, 이중 특이성) 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 “항체”는 이의 기능성 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포괄한다.
용어 “항-이디오타입 항체”는 항원 결합 단편과 같은 항체의 이디오토프를 인식하고/하거나 이에 표적화되고/거나 결합하는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체를 지칭한다. 항체의 이디오토프는 항체의 상보성 결정 영역(들)(CDR), 항체의 가변 영역들, 및/또는 이러한 가변 영역의 및/또는 이러한 CDR의 일부 부분 또는 부분들, 및/또는 전술한 것들의 임의의 조합 중 하나 이상 내에 잔기들을 포함할 수 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. CDR은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 항체의 가변 영역은 중쇄 가변영역, 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합일 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 일부 단편 또는 부분은 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 내에 2개 이상, 5개 이상, 또는 10개 이상의 인접 아미노산, 예를 들어, 약 2 내지 약 100, 약 5 내지 약 100, 약 10 내지 약 100, 약 2 내지 약 50, 약 5 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 50개의 인접 아미노산을 포함하는 단편일 수 있고; 이디오토프는 아미노산의 다중 비인접 스트레치를 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 일부 단편은 가변 영역들 내에 2개 이상, 5개 이상, 또는 10개 이상의 인접 아미노산, 예를 들어, 약 2 내지 약 100, 약 5 내지 약 100, 약 10 내지 약 100, 약 2 내지 약 50, 약 5 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 50개의 인접 아미노산을 포함하는 단편일 수 있고, 일부 구현예에서 하나 이상의 CDR 또는 CDR 단편을 함유할 수 있다. CDR 단편들은 CDR 내에서 연속적인 또는 비연속적인 2개 이상, 또는 5개 이상의 아미노산일 수 있다. 따라서, 항체의 이디오토프들은 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 내에 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 CDR 단편을 함유하는 약 2 내지 약 100, 약 5 내지 약 100, 약 10 내지 약 100, 약 2 내지 약 50, 약 5 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 50개 인접 아미노산일 수 있다. 다른 구현예에서, 이디오토프들은 항체의 가변 영역, 예를 들어 CDR 부위에 위치하는 단일 아미노산일 수 있다.
일부 구현예에서, 이디오토프는 항체의 가변 부분 내의 임의의 단일 항원 결정인자 또는 에피토프이다. 일부 경우에, 항체의 실제 항원 결합 부위와 겹칠 수 있고, 다른 경우에, 항체의 항원 결합 부위 밖에 가변 영역 서열을 포함할 수 있다. 항체의 개별 이디오토프들의 세트는 일부 구현예에서 그러한 항체의 “이디오타입”으로 지칭된다.
용어 “초가변 영역(hypervariable region)” 또는 “HVR”과 동의어인 “상보성 결정 영역(complementarity determining region)” 및 “CDR”은 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 비인접 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)이 있고 각각의 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다. “프레임워크 영역(framework region)” 및 “FR”은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 전장 중쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)이 있고, 각각의 전장 경쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4)이 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” 넘버링 체계); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (“Chothia” 넘버링 체계); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745,” (“Contact” 넘버링 체계); Lefranc MP et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 (“IMGT” 넘버링 체계); 및 Honegger A and Pluckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (“Aho” 넘버링 체계)]에 기재된 것을 포함한 다수의 잘 알려진 체계 중 어느 하나를 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용된 체계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 체계는 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면 Chothia 체계는 구조 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 체계 모두에 대한 넘버링은 삽입 문자, 예를 들어 “30a”에 의해 수용되는 삽입(insertion) 및 일부 항체에서 나타나는 결실(deletion)이 있는 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이에 기반한다. 이 두 체계는 상이한 위치에 특정 삽입 및 결실(“삽입-결실(indel)”)을 배치하여 차이가 있는 넘버링이 된다. Contact 체계는 복잡한 결정 구조의 분석에 기반하며 여러 측면에서 Chothia 넘버링 체계와 유사하다.
하기 표 1은 Kabat, Chothia, 및 Contact 체계에 의해 각각 확인된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시적인 위치 경계를 열거한다. CDR-H1의 경우, Kabat 및 Chothia 넘버링 체계 둘 다를 사용하여 잔기 넘버링이 나열된다. FR들은 CDR들 사이에 위치하며, 예를 들어 FR-L1은 CDR-L1과 CDR-L2 사이에 위치하는 식이다. 도시된 Kabat 넘버링 체계는 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문에, 도시된 Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변한다.
CDR Kabat Chothia Contact
CDR-L1 L24--L34 L24--L34 L30--L36
CDR-L2 L50--L56 L50--L56 L46--L55
CDR-L3 L89--L97 L89--L97 L89--L96
CDR-H1(Kabat 넘버링1) H31--H35B H26--H32..34 H30--H35B
CDR-H1
(Chothia 넘버링2)		 H31--H35 H26--H32 H30--H35
CDR-H2 H50--H65 H52--H56 H47--H58
CDR-H3 H95--H102 H95--H102 H93--H101
1 - Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 “CDR” 또는 “상보적 결정 영역(complementary determining region)” 또는 개별 지정된 CDR(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2)은 전술한 체계 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 상보성 결정 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR(예를 들어, CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 아미노산 서열에 있는 해당 CDR의 아미노산 서열을 함유한다고 언급될 경우, 상기 CDR은 전술한 체계 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 가변 영역 내의 해당 CDR(예를 들어, CDR-H3)의 서열을 갖는다고 이해된다. 일부 구현예에서, 지정된 CDR 서열이 명시된다.
마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 FR 또는 개별 지정된 FR(들)(예를 들어, FR-H1, FR-H2)은 공지된 체계 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 프레임워크 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에, 특정 CDR, FR 또는 FR들 또는 CDR들의 식별을 위한 체계는 Kabat, Chothia, 또는 Contact 방법에 의해 정의된 바와 같이 CDR과 같이 명시된다. 다른 경우에, CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 제공된다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL) 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kindt et al . Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007)]을 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체 유래의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]을 참조한다.
제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. “항체 단편(antibody fragment)”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2; 디아바디, 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 구체적인 구현예에서, 항체는 scFv와 같은, 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질 가수 분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 합성 링커, 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것과 같이 자연적으로 발생하지 않고/거나 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성되지 않을 수 있는 배열을 포함하는 단편과 같은 재조합으로 생성된 단편이다. 일부 측면에서, 항체 단편은 scFv이다.
“인간화(humanized)” 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역(FR) 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된, 항체이다. 일부 구현예에서, 비인간 항체(예를 들어, 뮤린 항체)의 인간화된 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 비인간 종 유래의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자 유래의 프레임워크 영역(FR)을 갖는 비인간 종 유래의 항체이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 “인간화된 형태(humanized form)”는 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서, 통상적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)의 해당 잔기로 치환되어 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도가 회복되거나 개선된다. (예를 들어, 문헌[Queen, 미국 특허 번호 5,585,089 및 Winter, U.S. Pat. No. 5,225,539]을 참조한다.) 이러한 키메라 및 인간화 단클론 항체는 당업계에서 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.
특정 구현예에서, 인간화 항체는 수용자(recipient)의 중쇄 가변 영역 유래의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 가진 비인간 종 (공여체 항체), 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 중쇄 가변 영역 유래의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 해당 비인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 수용자 항체 내 또는 공여체 항체 내에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 암호화하는 핵산 서열은 비인간 항체 서열(공여체 서열)에서 각각의 CDR을 암호화하는 서열에 의해 인간(수용체) 서열의 하나 이상의 CDR 서열을 대체하도록 변경된다. 일부 구현예에서, 인간 수용체 서열(human acceptor sequence)은 상이한 유전자로부터 유래된 FR을 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 함유할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 더 상세한 정보를 위해서는 예를 들어 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 본원에 참조로 포함된, 예를 들어 문헌[Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409]을 참조한다. 일부 구현예에서, 인간화 항-이디오타입 항체가 본원에 제공된다.
구체적인 구현예에서, 항체, 예를 들어, 항-이디오타입 항체는 인간화된다. 특정 구현예에서, 항체는 임의의 적합한 알려진 수단에 의해 인간화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 이의 내부로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 통상적으로 “유입(import)” 가변 도메인으로부터 채취되는 “유입” 잔기로 종종 지칭된다. 구체적인 구현예에서, 인간화는 본질적으로 Winter 및 동료들(문헌[Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536])의 방법에 따라서, 예컨대 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환하여 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 “인간화” 항체는 실질적으로 온전 미만인 인간 가변 도메인이 비인간 종 유래의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체(미국 특허 번호 4,816,567)이다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위 유래의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
이어서, 상기 렌더링된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 인간 불변 중쇄 및 불변 경쇄 영역에 결합시킴으로써 전장 항체를 암호화하는 서열을 수득할 수 있다. 적합한 인간 불변 경쇄 서열은 카파 및 람다 불변 경쇄 서열을 포함한다. 적합한 인간 불변 중쇄 서열은 면역 자극 특성을 제공하는 IgG1 돌연변이체를 암호화하는 서열, IgG1, 및 IgG2를 포함한다. 이러한 돌연변이체는 보체 및/또는 항체 의존적 세포 세포독성을 활성화시키는 능력이 감소하고, 문헌[미국 특허 번호 5,624,821; WO 99/58572, 미국 특허 번호 6,737,056]에 기술되어 있다. 적합한 불변 중쇄는 또한 치환들 E233P, L234V, L235A, A327G, A330S, P331S 및 잔기 236의 결실을 포함하는 IgG1을 포함한다. 다른 구현예에서, 전장 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM, IgY 또는 IgW 서열을 포함한다.
적합한 인간 공여체 서열은 마우스 공여체 서열에 의해 암호화되는 펩타이드 서열과 인간 서열의 그룹, 바람직하게는 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 또는 성숙 항체 유전자에 의해 암호화되는 서열의 서열 비교에 의해 결정될 수 있다. 높은 서열 상동성을 갖는 인간 서열, 바람직하게는 결정된 가장 높은 상동성을 갖는 인간 서열은 인간화 과정을 위한 수용체 서열로서 작용할 수 있다.
인간 CDR을 마우스 CDR로 교환한 것 외에도, 인간 공여체 서열에서의 추가의 조작을 수행하여 최적화된 특성 (예컨대, 항원의 친화도)을 갖는 인간화 항체를 암호화하는 서열을 수득할 수 있다.
또한, 변경된 인간 수용체 항체 가변 도메인 서열은 또한 비인간 공여체 서열에 상응하는 경쇄 가변 영역의 위치 4, 35, 38, 43, 44, 46, 58, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 73, 85, 98 및 중쇄 가변 영역의 위치 2, 4, 36, 39, 43, 45, 69, 70, 74, 75, 76, 78, 92의 하나 이상의 아미노산을 (Kabat 넘버링 시스템에 따라서) 암호화하도록 할 수 있다(Carter and Presta, U.S. Pat. No. 6,407,213).
구체적인 구현예에서, 일반적으로 항체는 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화되는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 일부 구현예에서, 인간화 항체는 모체 서열 및 상기 모체 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용한 다양한 개념의 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용 가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 도시하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은 목적하는 항체 특성이 달성되도록 수용자 및 유입된(imported) 서열로부터 FR 잔기가 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관여한다.
구체적인 구현예에서, 인간화 항체를 만들기 위해 사용될 인간 가변 도메인, 즉 경쇄 및 중쇄 모두의 선택은 항원성을 감소시키는 데 중요할 수 있다. 소위 “최적 적합” 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 그런 후, 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크로 수용된다. 예를 들어, 문헌[Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901]을 참조한다. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 공통서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]을 참조한다.
제공된 항체 중에는 인간 항체가 있다. “인간 항체(human antibody)”는 인간 또는 인간 세포 또는 인간 항체 라이브러리를 포함하는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비인간 공급원에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 용어는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR이 비인간인 것과 같은 비인간 항원 결합 영역을 포함하는 비인간 항체의 인간화된 형태를 배제한다.
인간 항체는 항원 공격(antigenic challenge)에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 형질전환동물(transgenic animal)에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물은 통상적으로 내인성 면역글로불린 유전자 자리를 대체하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위 통합되거나 염색체 외에 존재하는 인간 면역글로불린 유전자 자리의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기 형진전환동물에서, 내인성 면역글로불린 유전자 자리는 일반적으로 불활성화되어 있다. 인간 항체는 또한 인간 레퍼토리로부터 유래된 항체 암호화 서열을 함유하는 파지 디스플레이 및 무세포 라이브러리를 포함한, 인간 항체 라이브러리로부터 유래될 수 있다.
제공된 항체 중에는 단클론 항체 단편을 포함하는 단클론 항체가 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 “단클론 항체(monoclonal antibody)”는 실질적으로 균질한 항체의 집단 내에서 또는 이로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉, 단클론 항체 제제의 생산 동안 발생하거나 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유하는 가능한 변이체(상기 변이체는 일반적으로 미미한 양으로 존재)를 제외하고 이 집단을 포함한 개별 항체는 동일하다. 통상적으로 상이한 에피토프를 겨냥하는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와는 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각 단클론 항체는 항원 상의 단일 에피토프를 겨냥한다. 상기 용어는 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다.　 단클론 항체는 하이브리도마, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 및 기타 항체 디스플레이 방법으로부터의 생성을 포함하되 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
A. 표적 항-GPRC5D 항체에 대한 항-ID 항체
일부 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체가 제공된다. 예시적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기에 제공된다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 영역을 포함하는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 scFv에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv인 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 scFv에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3; 및 서열 번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열 번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열 번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열 번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3; 및 서열 번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열 번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함하는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 표적 항-GPRC5D 항체와 동일한 이디오타입을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하기 위해, 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 표적 항-GPRC5D 항체와 결합하기 위해 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하기 위해, 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 항-GPRC5D 항체와 경쟁한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 CAR 내에 함유된 표적 항-GPRC5D 항체의 항원 결합 도메인에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 CAR 내에 함유된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체의 항원 결합 도메인에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, CAR은 섹션 II에 기술된 바와 같은 임의의 것이다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 25에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 이에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 26에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 이에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 25에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3; 및 서열 번호: 26에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4에 대해 각각 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4에 대해 각각 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4에 대해 각각 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및 FR4 서열을 함유한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4에 대해 각각 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4를 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4에 대해 각각 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4에 대해 각각 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및 FR4 서열을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4에 대해 각각 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 함유하고, VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4에 대해 각각 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4에 대해 각각 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 함유하고, VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4에 대해 각각 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4에 대해 각각 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및 FR4 서열을 함유하고, VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4에 대해 각각 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3, 및 FR4 서열을 포함한다.
상기 임의의 일부 구현예에서, VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 임의의 일부 구현예에서, VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 임의의 일부 구현예에서, VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 갖고, VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 또는 이를 인식하는 항-이디오타입 항체는 scFv 또는 디아바디 등의 단일 사슬 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 항체는 가변 중쇄(VH) 영역 및 가변 경쇄(VL) 영역과 같은 두 개의 항체 도메인 또는 영역을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함한다. 링커는 전형적으로 펩타이드 링커, 예를 들어 가요성 및/또는 용해성 펩타이드 링커이다. 링커 중에는 글리신과 세린이 풍부하고/거나 일부 경우에는 트레오닌이 풍부한 것이 있다. 일부 구현예에서, 링커는 또한 용해도를 향상시킬 수 있는 리신 및/또는 글루타메이트와 같은 하전된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 또한 하나 이상의 프롤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 온전한 항체 또는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 항-ID는 하나 이상의 불변 영역 도메인과 같은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 경쇄 불변 영역(CL) 및/또는 중쇄 불변 영역 1(CH1)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-ID는 Fc 영역과 같은 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4와 같은 인간 IgG의 Fc 영역이다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열 내에 함유된 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열 내에 함유된 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열 내에 함유된 중쇄 불변 영역에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열 내에 함유된 경쇄 불변 영역에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab’)2 단편, Fab’ 단편, Fv 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 단일 도메인 항체로 구성된 군에서 선택된다.
따라서, 2개의 항-이디오타입 항체 도메인 또는 영역, 예컨대 VH 및 VL 도메인을 연결하는 링커(들)를 전형적으로 포함하는, scFv 및 디아바디, 특히 인간 단일 사슬 단편 등의 단일 사슬 항체 단편이 제공된다. 링커는 전형적으로 펩타이드 링커, 예를 들어 가요성 및/또는 용해성 펩타이드 링커, 예컨대 글리신과 세린이 풍부한 것이다.
일부 측면에서, 글리신 및 세린(및/또는 트레오닌)이 풍부한 링커는 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 상기 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들은 적어도 (약) 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75%의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 실질적으로 전부 글리신, 세린 및/또는 트레오닌으로 구성된다. 링커는 일반적으로 약 5 내지 약 50개 아미노산 길이, 전형적으로 (약)10 내지 (약) 30개, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이이고, 일부 예에서 10 내지 25개 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 단리된 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-ID는 인간화, 재조합, 및/또는 단클론성이다. 일부 구현예에서, 항-ID는 인간의 것이다.
일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체는 인간화된 것이다. 구체적인 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 인간화 항-이디오타입 항체의 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기는 표적 항-GPRC5D 항체 비인간 CDR들로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 인간화 항-이디오타입 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.
특정 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 인간화 항-이디오타입 항체는 수용자의 중쇄 가변 영역 유래의 잔기가 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 비인간 항-이디오타입 항체의 중쇄 가변 영역 유래 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 해당 비인간 잔기로 대체된다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 상이한 유전자로부터 유래된 FR을 함유한다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 인간화 항-이디오타입 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 함유한다.
일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 인간화 항-이디오타입 항체는 비인간 공여체 서열에 상응하는 경쇄 가변 영역의 위치 4, 35, 38, 43, 44, 46, 58, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 73, 85, 98 (Kabat) 및 중쇄 가변 영역의 위치 2, 4, 36, 39, 43, 45, 69, 70, 74, 75, 76, 78, 92 (Kabat)의 하나 이상의 아미노산 잔기를 암호화하도록 만들어진 변경된 인간 수용체 항체 가변 도메인 서열을 함유한다.
특정 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체는 인간화된 것이다. 구체적인 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 인간화 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 영역 중 하나 이상을 함유한다. 일부 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 영역 중 일부 또는 전부는 하나 이상의 아미노산 변형을 함유한다. 일부 구현예에서, 변형은 비인간 아미노산 잔기를 인간 잔기로 대체한다. 구체적인 구현예에서, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상이 인간 항체의 FR 영역들 내로 삽입된다. 구체적인 구현예에서, 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3은 각각 서열 번호: 25 및 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 영역의 CDR들이다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 모두가 인간 항체의 FR들에 삽입된다. 구체적인 구현예에서, CDR 및 FR 영역은 Kabat, Chothia, AbM, 및/또는 Contact 체계에 의해 식별된 바와 같은 영역이다.
구체적인 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 모두가 인간 항체의 프레임워크 영역들에 삽입된다. 특정 구현예에서, 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체이다. 구체적인 구현예에서, 인간 항체는 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 서브클래스, 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 또는 IgA2 중 하나이다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 모두가 인간 항체의 및/또는 인간 항체 유래의 항원 결합 영역의 프레임워크 영역들에 삽입된다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체로부터 오고/거나 유래된다. 상이한 클래스의 인간 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 인간 항체의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 모두는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 갖는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 프레임워크 영역들에 삽입된다. 특정 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 인간화 항-이디오타입 항체는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 함유한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실)과 같은 하나 이상의 변형을 갖는다. 이러한 변형은 예를 들어 반감기를 향상하고, 하나 이상 유형의 Fc 수용체(receptor)에 대한 결합을 변경하고 및/또는 효과기 기능을 변경하기 위해 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 Fc 영역은 비변형된 Fc 영역에 비해 FcαR에 대한 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 갖는다. 특정 구현예에서, 인간화 항-이디오타입 항체는 비변형된 Fc 영역의 것에 비해 Fc 수용체에 대해 변경된(예를 들어, 감소된) 결합을 갖는 변형된 Fc 영역의 전부 또는 일부를 함유한다. Fc 수용체에 대한 결합을 변경시키는 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌[미국 특허 제7,217,797호 및 제7,732,570호; 및 미국 특허 출원 제2010/0143254호 및 제2010/0143254호]에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 친화도 (EC50) 및/또는 해리 상수는, 예를 들어 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 nM 이하, 예컨대 (약) 1 nM 내지 (약) 15 nM 사이, 예를 들어, (약) 5 내지 (약) 10 nM 사이이다. 특정 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 EC50은, 예를 들어 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 nM 이하, 예컨대 (약) 1 nM 내지 (약) 15 nM 사이, 예를 들어, (약) 5 내지 (약) 10 nM 사이이다. 특정 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 해리 상수는, 예를 들어 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 nM 이하, 예컨대 (약) 1 nM 내지 (약) 15 nM 사이, 예를 들어, (약) 5 내지 (약) 10 nM 사이이다. 특정 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 모이어티와 관련되지 않은 모이어티에 대한 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합의 정도는, 예를 들어 방사면역분석(RIA)에 의해 측정시 표적 항-GPRC5D 모이어티에 대한 항체의 결합의 10% 미만, 또는 (약) 10%이다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비드 또는 플레이트 등의 지지체 상에 고정될 때 표적 항-GPRC5D 항체의 항원 결합 도메인을 함유하는 CAR의 작용제이다.
표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산이 또한 제공된다. 제공된 핵산 중에는 본원에 기술된 항-이디오타입 항체를 암호화하는 것이 있다. 핵산에는 예를 들어 백본 변형을 갖는 것을 포함하여 천연 및/또는 비천연 발생 뉴클레오타이드 및 염기를 포함하는 것이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 및/또는 이의 부분(예를 들어, 사슬)을 암호화하는 핵산 분자(들)는 VH 영역을 암호화하고 서열 번호: 29에 제시된 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열, 및 VL 영역을 암호화하고 서열 번호: 30에 제시된 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 및/또는 이의 부분(예를 들어, 사슬)을 암호화하는 핵산 분자(들)는 중쇄를 암호화하고 서열 번호: 31에 제시된 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열, 및 경쇄를 암호화하고 서열 번호: 32에 제시된 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
예를 들어, 항체를 생산하기 위해, 폴리뉴클레오타이드를 함유한 벡터, 그 벡터를 함유한 숙주 세포가 또한 제공된다. 항체를 생산하는 방법이 또한 제공된다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 일 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터;를 포함한다(예를 들어, (1) 또는 (2)로 형질전환되었다). 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 본 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
예시적인 핵산 및 벡터는 서열 번호: 29-32 중 하나 이상에 제시된 서열 및 이의 CDR 암호화 부분 뿐만 아니라, 이에 대해 적어도 (약) 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는 것을 포함한다. 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항-이디오타입 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다.
B. 예시적인 특징
본원에 제공된 항-이디오타입 항체는 다양한 공지된 분석에 의해 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 식별, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다. 한 측면에서, 항-이디오타입 항체는 예를 들어 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블로팅, 및/또는 세포-기반 결합 분석을 포함한 유세포 분석에 의해 항원 결합 활성에 대해 시험되고, 예를 들어, 일부 경우에 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티를 발현하지 않는 세포를 사용한 결과와 비교하여, 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티를 제시하는 세포에 대한 항-이디오타입 항체(예를 들어, 형광 표지자에 접합되거나 표지됨)의 결합을 평가한다. 결합 친화도는 Kd 또는 EC50으로 측정할 수 있다.
제공된 임의의 항-이디오타입 항체, 예를 들어 상기 섹션 A에서 제공된 임의의 항체의 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티는 상기 섹션 A에서 제공된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체이다.
일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 모이어티에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 항-GPRC5D 모이어티에 특이적으로 결합하거나 우선적으로 결합하는(상호 교환적으로 사용됨) 것이다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 항-GPRC5D 항체에 특이적으로 결합하거나 우선적으로 결합하는(상호 교환적으로 사용됨) 것이다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 및 이의 항원 결합 단편은 특이적 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체가 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항체가 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다. 일부 구현예에서, 평형 해리 상수가 <10-7 또는 10-8 M일 때 항체가 항원에 특이적으로 결합하거나 우선적으로 결합한다고 말한다. 일부 구현예에서, 평형 해리 상수는 <10-9 M 또는 <10-10 M일 수 있다. 추가 구현예에서, 평형 해리 상수는 <10-11 M 이하일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속시간으로 결합한다면, 그 항체는 표적에 특이적으로 결합하거나 우선적으로 결합하는 것이다. 예를 들어, 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편이, 예를 들어 CAR에 함유된 비-표적 항체보다, 예를 들어 CAR에 함유된 표적 항-GPRC5D 항체와 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 회합한다면, 그 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은 표적 항-GPRC5D 항체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 것이다. 특이적 결합 또는 우선적 결합은 독점적인 결합을 (포함할 수는 있으나) 반드시 필요로 하는 것은 아님을 이해해야 한다. 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 판단하는 방법은 면역분석 및 다른 결합 분석을 포함한다.
결합 친화도를 평가하고/거나 항체가 특정 결합 파트너에 특이적으로 결합하는지 여부를 판단하는 다양한 분석법이 알려져 있다. 예컨대 당업계에 널리 알려진 다수의 임의의 결합 분석법을 이용하여, 항체의 결합 친화도를 측정하는 것은 당업자의 수준 이내이다. 다양한 결합 분석법은 알려져 있고, 본원에 기술된 것을 포함하여, 예를 들어, ELISA KD, KinExA, 유세포 분석, 및/또는 표면 플라스몬 공명 장치를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법에는 BIAcore®Octet®또는 유세포 분석을 포함하는 방법이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, BIAcore®기구를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 이용하여, 2개의 단백질 사이 복합체의 결합 동역학 및 상수를 결정할 수 있다(예를 들어, 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993; 및 미국 특허 번호 5,283,173, 5,468,614] 또는 동등물 참조). SPR은 분자가 표면에 결합하거나 표면에서 해리될 때 센서 표면의 분자 농도 변화를 측정한다. SPR 신호의 변화는 표면에 가까운 질량 농도의 변화에 정비례하여 두 분자 사이의 결합 동역학을 측정할 수 있다. 복합체에 대한 해리 상수는 완충제가 칩을 통과할 때 시간에 대하여 굴절률의 변화를 모니터링함으로써 측정할 수 있다. 하나의 단백질과 다른 단백질의 결합을 측정하기 위한 다른 적합한 분석에는 예를 들어, 효소결합면역흡착분석(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 및 방사면역분석(radioimmunoassay, RIA)과 같은 면역분석 또는 단백질의 분광학적 또는 광학적 특성의 변화를 형광, UV 흡수, 원편광 이색성(circular dichroism) 또는 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance, NMR)을 통해 모니터링함으로써 결합을 측정하는 것이 포함된다. 다른 예시적인 분석은 웨스턴 블롯, ELISA, 분석적 초원심 분리, 분광법, 유세포 분석, 염기서열 분석 및 단백질 결합의 검출을 위한 기타 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
구체적인 구현예에서, 본원에 개시된 항원 및 이의 항원 결합 단편은 비표적 항체와 비교하여 표적 항-GPRC5D 항체에 우선적으로 결합하므로, 표적 항-GPRC5D 항체에 대한 항체의 결합 친화도는 비표적 항체에 대한 항체의 결합 친화도보다 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배 더 크다. 비표적 항체는 상이한 항원(예를 들어, GPRC5D 이외)에 대한 항체를 포함하거나, 또는 표적 항-GPRC5D 항체와 상이한 하나 이상의 CDR을 함유하거나 GPRC5D의 상이한 에피토프 또는 결합 부위에 결합하는 GPRC5D에 대한 항체를 포함할 수 있다.　
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 다른 항체에 대해 최소 교차 반응성으로 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티와 상이한 항원에 대한 항체 모이어티와 교차 반응하지 않는다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티와 상이한 항-GPRC5D 항체 모이어티와 교차 반응하지 않는다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티와 상이한 항-GPRC5D 항체 모이어티와 교차 반응한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 융합 단백질, 예컨대 재조합 수용체의 일부인 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티 외부의 융합 단백질 내의 임의의 에피토프에 결합하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티는 키메라 항원 수용체(CAR)의 항원 결합 도메인이거나 이의 일부이고, 항-이디오타입 항체는 항원 결합 도메인 외부의 임의의 에피토프에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, CAR 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR에 함유된 scFv인 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D scFv의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)과 중첩하는 에피토프에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 이디오타입 항체는 scFv 외부의 CAR 내 임의의 에피토프에 결합하지 않고; 일부 구현예에서, 기준 항체에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 기준 항체는 표적 항체와 동일한 항원(예를 들어, GPRC5D)에 결합하거나 이를 인식하고/거나 표적 항체의 상응하는 프레임워크 영역(들)에 대해 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 갖는 하나 이상의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 프레임워크 영역(들)을 포함하고/거나(일부 측면에서, 하나 이상의 프레임워크 영역은 중쇄 및/또는 경쇄의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4를 포함한다); 표적 항체와 동일한 중쇄 및/또는 경쇄 v-유전자(또는 v-유전자 유용성)을 함유하고/거나 표적 항체와 동일한 v-유전자 서열로부터 유래된다. 일부 측면에서, 기준 항체는 표적 항-GPRC5D 항체이다.
일부 구현예에서, scFv인 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티를 포함하는 CAR은 scFv를 막관통 도메인에 연결하는 스페이서를 포함하고, 항-이디오타입 항체는 스페이서 내 에피토프에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 CD28로부터 유래된 서열, 예컨대 CD28 유래의 세포외 부분이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 IgG1의 Fc 도메인과 같은 Fc 도메인 내의 에피토프에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 영역이 결여된 IgG1 Fc 도메인이다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 CAR의 세포외 항원 결합 도메인에 함유된 (예를 들어, 서열 번호: 9에 제시된) 표적 항-GPRC5D scFv에 결합하거나 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 상이한 CAR과 교차 반응하지 않는다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 상이한 항-GPRC5D CAR과 교차 반응하지 않는다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D scFv와 비교하여 하나 이상의 상이한 이디오토프를 가진, 예를 들어 기준 항체의, 항-GPRC5D 항체 모이어티와 교차 반응하지 않는다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체로부터 유래된 CAR의 표적 항-GPRC5D scFv에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 모이어티는 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 표적 항-GPRC5D 항체로부터 유래되고, 항-이디오타입 항체는 상이한 항-GPRC5D 항체로부터 유래된 항-GPRC5D 항체 모이어티를 함유하는 CAR과 교차 반응하지 않는다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR의 작용제이다. 항-GPRC5D 표적 항체에 대한 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합이 CAR을 발현하는 세포(예를 들어, T 세포)의 활성을 증가시킬 때(예를 들어, 세포의 Nur77 발현 증가, 증식 증가, 사이토카인 생산(예를 들어, IFN-감마 또는 TNF알파) 증가, 및/또는 세포독성 활성 또는 다른 효과기 활성 증가) 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포외 항원 결합 도메인에 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 CAR의 “작용제”라고 말한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CAR의 세포외 항원 결합 도메인에 함유된 항-GPRC5D 표적 항체에 대한 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합은 CAR을 자극하거나 활성화할 수 있고 그에 의해 CAR을 발현하는 세포의 하나 이상의 활성을 유도하거나 매개할 수 있다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 용액 중에 있을 때, 예컨대 이디오타입 항체가 용해성이거나 비드 또는 플레이트 등의 지지체 상에 고정되지 않을 때 CAR의 작용제이다. 일부 구현예에서, 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 항-이디오타입 항체가 용액 중에 있을 때, 예컨대 항-이디오타입 항체가 용해성이거나 비드 또는 플레이트 등의 지지체 상에 고정되지 않을 때, 세포외 항원 결합 도메인에 표적 항-GPRC5D 항체를 함유하는 CAR의 작용제이다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 항-이디오타입 항체가 용액 중에 있을 때, 예컨대 항-이디오타입 항체가 용해성이거나 비드 또는 플레이트 등의 지지체 상에 고정되지 않을 때, 세포외 항원 결합 도메인에 표적 항-GPRC5D 항체를 함유하는 CAR의 작용제이다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR의 작용제이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 비드 또는 플레이트 등의 지지체 상에 고정될 때 CAR의 작용제이다. 일부 구현예에서, 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비드 또는 플레이트 등의 지지체 상에 고정될 때 표적 항체의 항원 결합 도메인을 함유하는 CAR의 작용제이다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비드 또는 플레이트와 등의 지지체 상에 고정될 때 표적 항-GPRC5D 항체의 항원 결합 도메인을 함유하는 CAR의 작용제이다. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CAR에 결합하여 또는 그렇지 않고 이와 회합하여 CAR의 활성(예를 들어, CAR을 발현하도록 조작된 세포의 T 세포 자극)을 증가시킬 수 있을 때, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 CAR의 “작용제”라고 말한다.
일부 구현예에서, 세포의 활성은 재조합 수용체(예를 들어, CAR)로 조작된 세포(예를 들어, T 세포)의 하나 이상의 기능 또는 표현형을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 세포는 표적 항-GPRC5D CAR 발현 T 세포이고 활성은 T 세포의 하나 이상의 기능 또는 표현형을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포의 기능적 활성에 대한 분석은 사이토카인 생산(예를 들어, ELISPOT 또는 ELISA에 의한), 세포내 사이토카인 염색, 세포 증식, 또는 세포독성 림프구(CTL) 분석을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, T 세포의 증식 반응은, 예를 들어, 이의 DNA로 3H-티미딘, BrdU(5-브로모-2’-데옥시우리딘) 또는 2’-데옥시-5-에티닐우리딘(EdU)의 통합에 의해 또는 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신면역조절 화합물 에스테르(carboxyfluorescein diacetate succinimmunomodulatory compoundyl ester, CFSE), CellTrace Violet, 또는 막 염료 PKH26과 같은 염료를 이용한 염료 희석 분석에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T 세포)의 기능적 활성을 평가하는 것은 표적 항-GPRC5D CAR 발현 T 세포를 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시킨 후 T 세포로부터 사이토카인 생산을 측정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 측정된 사이토카인에는 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-감마(IFNγ), 인터루킨-4(IL-4), TNF-알파(TNFα), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-12(IL-12), 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), CD107a 및/또는 TGF-베타(TGFβ)가 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 사이토카인 측정 분석법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, ELISA, 세포내 사이토카인 염색, 세포 계량 비드 어레이, RT-PCR, ELISPOT, 유세포 분석 및 관련 사이토카인에 대해 반응하는 세포가 테스트 샘플의 존재 하에 반응성(예를 들어, 증식)이 테스트되는 생체 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T 세포)의 기능적 활성을 평가하는 것은 표적 항-GPRC5D CAR 발현 T 세포를 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시킨 후 세포 표현형(예를 들어, 특정 세포 표면 표지자의 발현)을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포, 예를 들어, T 세포 요법을 위해 투여된 T 세포는 T 세포 활성화 표지자, T 세포 탈진 표지자, 및/또는 T 세포 분화 표지자의 발현에 대해 평가된다. 평가를 위한 T 세포 활성화 표지자, T 세포 탈진 표지자 및/또는 T 세포 분화 표지자에는 특정 서브세트의 T 세포, 예를 들어, CD25, CD38, 인간 백혈구 항원-DR(HLA-DR), CD69, CD44, CD137, KLRG1, CD62Llow, CCR7low, CD71, CD2, CD54, CD58, CD244, CD160, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 림프구 활성화 유전자 3 단백질(LAG-3), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 단백질 3(TIM-3), 세포 독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4), B 및 T 림프구 감쇠인자(B and T lymphocyte attenuator, BTLA) 및/또는 T-세포 면역글로불린 및 면역수용체 티로신 기반 억제성 모티프 도메인(TIGIT)에 대해 당업계에 공지된 임의의 표지자가 포함된다(예를 들어, 문헌[Liu et al., Cell Death and Disease (2015) 6, e1792] 참조). 일부 구현예에서, 평가된 세포 표면 표지자는 CD25, PD-1 및/또는 TIM-3이다. 일부 구현예에서, 평가된 세포 표면 표지자는 CD25이다.
일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 GPRC5D에 노출에 의해 또는 GPRC5D-Fc에 의해 차단되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 대한 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합은 용해성 GPRC5D에 노출에 의해 또는 GPRC5D-Fc에 의해 차단되지 않는다. 일부 구현예에서, 결합도(예를 들어, 결합의 척도로서 세포 양성 백분율, 평균 형광 강도 또는 다른 매개변수)는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 용해성 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc의 부재와 비교하여 용해성 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc의 존재 하에 표적 항-GPRC5D 항체와, 또는 세포외 결합 도메인 내에 표적 항-GPRC5D 항체를 함유하는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)로 조작된 세포와 접촉될 때, 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 실질적으로 동일한 결합은 용해성 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc의 존재 하에 결합도(예를 들어, 결합의 척도로서 세포 양성 백분율, 평균 형광 강도 또는 다른 매개변수)가 용해성 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc의 부재하의 결합의 85%, 90%, 92%, 95%, 97% 또는 100% 이상 만큼 유지된다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR의 길항제이다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체에 대한 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합은 용해성 GPRC5D에 노출에 의해 또는 GPRC5D-Fc에 의해 차단된다. 일부 구현예에서, 결합도(예를 들어, 결합의 척도로서 세포 양성 백분율, 평균 형광 강도 또는 다른 매개변수)는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 용해성 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc의 부재와 비교하여 용해성 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc의 존재 하에 표적 항-GPRC5D 항체와, 또는 세포외 결합 도메인 내에 표적 항-GPRC5D 항체를 함유하는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)로 조작된 세포와 접촉될 때, 감소되거나 줄어든다. 일부 구현예에서, 감소되거나 줄어드는 결합은 용해성 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc의 존재 하에 결합도(예를 들어, 결합의 척도로서 세포 양성 백분율, 평균 형광 강도 또는 다른 매개변수)가 용해성 GPRC5D 또는 GPRC5D-Fc의 부재하의 결합의 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하 미만으로 줄어든다는 의미이다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 특정 친화도 이상으로 표적 항-GPRC5D 모이어티, 예컨대 표적 항-GPRC5D 항체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도는 평형 해리 상수(KD)로 표시되고; 일부 구현예에서, 친화도는 EC50으로 표시된다. 특정 구현예에서, 항-GPRC5D 모이어티에 대한 항-이디오타입 항체의 결합 친화도(EC50) 및/또는 해리 상수는 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 이하, 예컨대 (약) 1 nM 내지 (약) 15 nM 사이, 예를 들어 (약) 5 내지 (약) 10 nM 사이이다. 특정 구현예에서, 항-GPRC5D 모이어티에 대한 항-이디오타입 항체의 EC50은 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 이하, 예컨대 (약) 1 nM 내지 (약) 15 nM 사이, 예를 들어 (약) 5 내지 (약) 10 nM 사이이다. 특정 구현예에서, 항-GPRC5D 항체에 대한 항-이디오타입 항체의 해리 상수는 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 이하, 예컨대 (약) 1 nM 내지 (약) 15 nM 사이, 예를 들어 (약) 5 내지 (약) 10 nM 사이이다. 일 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 모이어티와 관련되지 않은 모이어티에 대한 항-이디오타입 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역분석(RIA)에 의해 측정되는 바와 같이, 표적 항-GPRC5D 모이어티에 대한 상기 항체의 결합의 (약) 10% 이하이다. 일 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 모이어티와 관련되지 않은 모이어티에 대한 항-이디오타입 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역분석(RIA)에 의해 측정되는 바와 같이, 표적 항-GPRC5D 모이어티에 대한 상기 항체의 결합의 (약) 40%, 30%, 20%, 또는 10% 이하이다.
일부 구현예에서, 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 GPRC5D에 노출에 의해 또는 GPRC5D-Fc에 의해 차단되지 않는다. 일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 임의의 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 GPRC5D에 노출에 의해 또는 GPRC5D-Fc에 의해 차단되지 않는다.
C. 항체 생산 방법
제공된 구현예들 중 어느 것과 같은 항-이디오타입 항체의 제조 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, 항체를 암호화하는 핵산이 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 단리되고 하나 이상의 벡터에 삽입될 수 있다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 서열 분석될 수 있다.
따라서, 적합한 숙주 세포에서 본원에 제공된 바와 같은 핵산 분자(들) 또는 벡터에 의해 암호화되는 중쇄 및/또는 경쇄를 발현시키는 단계, 및 항체를 회수하거나 단리하는 단계를 포함하는, 본원에 제공된 임의의 구현예와 같은, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
원핵생물 이외에, 사상성 진균 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물은, 글리코실화 경로가 인간 세포에서의 경로와 유사하거나 이를 모방하도록 변형되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 초래하는, 진균 및 효모 균주를 포함하는 항체-암호화 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006)]을 참조한다.
폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 예시적인 진핵 세포는 COS 7 세포를 포함하는 COS 세포; 293-6E 세포를 포함하는 293 세포; CHO-S, DG44. Lec13 CHO 세포 및 FUT8 CHO 세포를 포함하는 CHO 세포; PER.C6® 세포; 및 NSO 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 중쇄 및/또는 경쇄는 효모에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 출원 공개 번호 US 2006/0270045 A1]을 참조한다. 일부 구현예에서, 특정 진핵 숙주 세포는 중쇄 및/또는 경쇄에 대해 원하는 번역후(post-translational) 변형을 만드는 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CHO 세포는 293 세포에서 생산된 동일한 폴리펩타이드보다 시알릴화 수준이 더 높은 폴리펩타이드를 생산한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 무세포계(cell-free system)에서 생산된다. 예시적인 무세포계는 예를 들어, 문헌[Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21 695-713 (2003)]에 기술되어 있다.
제공된 구현예들은 박테리아, 사상성 진균 및 효모를 포함하는 진핵 및 원핵 숙주 세포뿐만 아니라 인간 세포와 같은 포유동물 세포를 포함하는 항체 및 다른 결합 단백질을 발현 및 생산하기 위한 벡터 및 숙주 세포 및 다른 발현 시스템, 및 무세포 발현 시스템을 더 포함한다.
본원에 기술된 임의의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포에서 발현된 제공된 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은 임의의 적합한 방법에 의해 정제될 수 있다. 이러한 방법은 친화성 매트릭스 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 친화성 리간드는 표적 항-GPRC5D 항체, 또는 Fc 영역에 결합하는 제제를 포함한다. 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 항체 친화성 컬럼을 이용하여 Fc 영역에 결합하고, Fc 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체를 정제할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피, 예를 들어 부틸 또는 페닐 컬럼은 또한 항체 등의 일부 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합할 수 있다. 또한, 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피)는 항체 등의 일부 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합할 수 있다. 혼합-모드 크로마토그래피 (예를 들어, 역상/음이온 교환, 역상/양이온 교환, 친수성 상호작용/음이온 교환, 친수성 상호작용/양이온 교환 등)는 또한 항체 등의 일부 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합할 수 있다.
항-이디오타입 항체 또는 항체 모이어티는 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. “인간화(humanized)” 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된, 항체이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 “인간화된 형태(humanized form)”는 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서, 통상적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)의 해당 잔기로 치환되어 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도가 회복되거나 개선된다.
제공된 항-이디오타입 항체 또는 항체 모이어티 중에는 인간 항체가 있다. “인간 항체(human antibody)”는 인간 또는 인간 세포 또는 인간 항체 라이브러리를 포함하는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비인간 공급원에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 용어는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR이 비인간인 것과 같은 비인간 항원 결합 영역을 포함하는 비인간 항체의 인간화된 형태를 배제한다.
인간 항체는 항원 공격(antigenic challenge)에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 형질전환동물(transgenic animal)에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물은 통상적으로 내인성 면역글로불린 유전자 자리를 대체하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위 통합되거나 염색체 외에 존재하는 인간 면역글로불린 유전자 자리의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기 형진전환동물에서, 내인성 면역글로불린 유전자 자리는 일반적으로 불활성화되어 있다. 인간 항체는 또한 인간 레퍼토리로부터 유래된 항체 암호화 서열을 함유하는 파지 디스플레이 및 무세포 라이브러리를 포함한, 인간 항체 라이브러리로부터 유래될 수 있다.
D. 면역접합체
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 면역접합체(항-이디오타입 항체 면역접합체)이거나 이의 일부이며, 여기서 항-이디오타입 항체는 세포독성제 또는 이미지화 작용제(imaging agent) 등(이에 한정되지 않음)의 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학 요법제(예를 들어, 메이탄시노이드, 탁산, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 끼어들기 약물); 성장 억제제; 핵산분해 효소 등의 효소 및 이의 단편; 항생제; 저분자 독소 또는 효소 활성 독소 등의 독소;를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학 요법제 또는 화학 요법 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된다.
항-이디오타입 항체 면역접합체들 중에는 항체 약물 접합체(ADC)가 있으며, 여기서 항-이디오타입 항체는 메이탄시노이드(미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리키아마이신 또는 이의 유도체(미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998) 참조); 다우노마이신 또는 독소루비신 등의 안트라사이클린(Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002); 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 오르타탁셀 등의 탁산; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합된다.
또한, 항-이디오타입 항체 면역접합체 중에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 에루지노사 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 항체가 접합되는 것이 있다.
또한, 항-이디오타입 항체 면역접합체 중에는 항-이디오타입 항체가 방사성 원자에 접합되어 방사 접합체를 형성하는 것이 있다. 예시적인 방사성 동위원소는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
항-이디오타입 항체 및 세포독성제의 접합체는 다수의 공지된 단백질 커플링제, 예를 들어 링커를 사용하여 제조될 수 있다(문헌[Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987), WO94/11026] 참조). 상기 링커는 산-불안정 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 및 디설파이드-함유 링커와 같은 세포 내 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 “절단 가능한 링커”일 수 있다(Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); U.S. Patent No. 5,208,020).
표지(label), 예를 들어 검출 가능한 신호를 간접적으로 또는 직접적으로 생성할 수 있는 검출 가능한 표지에 부착된 항-이디오타입 항체를 포함하는 항-이디오타입 항체 면역접합체들이 또한 제공된다. 이 항-이디오타입 항체 면역접합체들은 연구 또는 진단 응용 분야에 사용될 수 있다. 상기 표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 표지는 방사선-비투과성 또는 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I 등의 방사성 동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린 등의 형광(형광단) 또는 화학발광(발색단) 화합물; 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제 또는 호스래디시 과산화효소 등의 효소; 이미지화 작용제; 또는 금속 이온일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표지는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 99Tc 또는 123I, 또는 지르코늄-89, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철 등의 핵 자기 공명(NMR) 영상화(자기 공명 영상화, MRI로도 알려짐)를 위한 스핀 표지이다. 지르코늄-89는 다양한 금속 킬레이트제에 착화될 수 있고, 예를 들어, PET 이미징을 위해 항체에 접합될 수 있다(WO 2011/056983).
검출 가능한 표지의 예로는 방사성 뉴클레오타이드, 효소, 보조효소, 형광체, 화학발광제, 발색체, 효소 기질 또는 보조인자(co-factor), 효소 억제제, 보결분자단 복합체, 자유 라디칼, 입자, 염료 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 효소의 예는 호스래디시 과산화효소, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린, 쿠마린, 알렉사488, 오레곤 그린 488, 로다민 그린, 알렉사 532, Cy3, 보디피 588/586, 알렉사586, TAMRA, 록스, 알렉사 594, 텍사스 레드, 보디피 630/650, Cy5, 알렉사647, IR 염료 680, IR 염료 680, IR 염료 700 DX, Cy5.5, 알렉사 750, IR 염료 800CW, IR 염료 800, Atto 532 및 Atto 465를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 면역접합체는 간접적으로 검출 가능하다. 예를 들어, 항-이디오타입 항체 면역접합체에 특이적이고 검출 가능한 표지를 함유하는 2차 항체를 사용하여 항-이디오타입 항체 면역접합체를 검출할 수 있다.
E. 변이체
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 본원에 기술된 항-이디오타입 항체의 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변이(예를 들어, 치환, 결실, 삽입 및/또는 돌연변이)를 포함한다. 예시적인 변이체에는 항-이디오타입 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 향상하도록 설계된 것이 포함된다. 항-이디오타입 항체의 아미노산 서열 변이체는 항-이디오타입 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 해당 변형을 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 조제될 수 있다. 이러한 변형에는 예를 들어 항-이디오타입 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 잔기에 삽입 및/또는 잔기의 치환이 포함될 수 있다. 최종 작제물(final construct)이 예를 들어 항원 결합 같은 원하는 특성을 보유한다면, 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환 중 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는, 예를 들어 본원에 기술된 항-이디오타입 항체의 서열과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 치환 돌연변이 유발 관심 부위에는 CDR 및 FR이 포함된다. 아미노산 치환은 관심 항-이디오타입 항체에 도입될 수 있고 그 생성물은 예를 들어, 유지/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 향상된 반감기, 및/또는 향상된 효과기 기능(예를 들어, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 증진하는 능력)과 같은 원하는 활성에 대해 스크리닝된다. 일부 구현예에서, 변이체 항-이디오타입 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 단편에 대한 유지되거나 개선된 결합을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변이체 항-이디오타입 항체는 비변형 항-이디오타입 항체와 비교하여 표적 항-GPRC5D 항체에 대한 결합 친화도에서 적어도 약 10% 이상(예컨대, 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000% 또는 그 이상 중 임의의 %)의 증가를 나타낸다.
일부 구현예에서, 모체 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 CDR 내의 하나 이상의 잔기는 치환된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 인간 개체에 투여 시 면역원성의 가능성을 줄이도록 서열 또는 서열 내 위치를 생식세포계열(예를 들어, 인간 생식세포계열)에서 발견되는 항체 서열과 같은 생식세포계열 서열로 되돌리기 위해 치환이 이루어진다.
일부 구현예에서, CDR “돌연변이다발점(hotspot)”, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)] 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 변경이 이루어지며, 그 결과로 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 테스트된다. 제2 라이브러리로부터 작제 및 재선택함에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 설명되어 있다. 친화도 성숙의 일부 구현예에서, 다양한 임의의 방법(예를 들어, 착오경향 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 다양성이 도입된다. 그런 후, 2차 라이브러리가 생성된다. 그런 후, 이 라이브러리는 원하는 친화도를 가진 임의 항체 변이체를 식별하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법에는 여러 CDR 잔기(예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위로 추출되는 CDR-유도 접근법이 포함된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 식별될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적이 된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 이와 같은 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에 제공된 보존적 치환)이 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 CDR 내 잔기에 접촉하는 항원의 밖에 있을 수 있다. 위에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각 CDR은 변경되지 않거나 1, 2 또는 3개 이내의 아미노산 치환을 함유한다.
아미노산 서열 삽입에는 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열 간 삽입뿐만 아니라 길이의 범위가 1개의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합이 포함된다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기가 있는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N-말단 또는 C-말단에의 융합이 포함된다.
변형
특정 구현예에서, 항체는 예를 들어, 아미노산 서열을 변경하거나 및/또는 예를 들어 특정 세포주를 사용하여 글리코실화 부위에 부착된 올리고당을 변형하여 하나 이상의 글리코실화 부위를 제거 또는 삽입하여, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
예시적인 변형, 변이체 및 세포주는 예를 들어 문헌[특허 공개 번호 US 2003/0157108, US 2004/0093621, US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 및 Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107); WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684(Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.); WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)]에 기술되어 있다.
변형된 항체 중에는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 불변 영역의 인간 Fc 영역 서열 또는 다른 부분(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 가지는 것과 같은 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 가지는 항체가 있다.
상기 변형은 예를 들어 반감기를 향상하고, 하나 이상 유형의 Fc 수용체에 대한 결합을 변경하고 및/또는 효과기 기능을 변경하기 위해 이루어질 수 있다.
변이체 중에는 “thioMAb”와 같은 시스테인 조작된 항체와 다른 시스테인 조작된 변이체가 있으며, 이 변이체에서 항체의 하나 이상의 잔기가, 예를 들어 제제(agents) 및 링커-제제(linker-agents)의 접합에 사용하기 위해 접근 가능한 부위에서 반응성 티올기를 생성하여 면역접합체를 생성하기 위해, 시스테인 잔기와 치환된다. 시스테인 조작된 항체는 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 7,855,275 및 7,521,541]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 항체는 변형되어 용해성 중합체를 포함한 추가적인 비단백질성 모이어티를 함유한다. 예시적인 중합체에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔레인, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 산화폴리프로필렌/산화에틸렌 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물 속에서의 안정성으로 인해 제조에 장점이 있을 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착된 경우 동일하거나 서로 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 항체의 향상될 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건하에서 치료에 사용될지 여부 등을 포함한 그러나 이에 한정되지는 않는 고려사항에 기반하여 결정될 수 있다.
II. 키메라 항원 수용체(CAR) 및 유전자 조작 세포
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 본원에 기재된 바와 같은, 표적 항-GPRC5D 항체로부터 유래된 항원-결합 부분을 함유하는 항-GPRC5D CAR 등의 키메라 항원 수용체(CAR)의 항원 결합 부분에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 입양 세포 요법과 관련하여 사용되는 세포와 같은 세포 상에서 발현되는 이러한 CAR에 결합한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고 이에 의해 상기 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 CAR 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 면역 세포로 유전자 조작될 때 키메라 수용체는 T 세포 활성을 조절할 수 있고, 일부 경우에, T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있으며, 이로써 예컨대 입양 세포 요법 방법에서 사용하기 위해, 생체 내 수명, 생존 및/또는 지속성이 향상된 유전자 조작된 세포가 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 표적 CAR을 발현하는 조작된 세포를 활성화, 자극 및/또는 확장시키는 것을 포함하여 이들 활성 중 하나 이상을 조절하는 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 제공된 방법에 따라 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고 이에 의해 상기 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 이종 기원인데, 즉, 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에는 정상적으로 존재하지 않으며, 예를 들어, 이는 조작되는 세포 및/또는 상기 세포가 유래된 유기체에서 보통 발견되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 천연 발생이 아니고, 예컨대 다수의 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것을 포함해, 자연에서 발견되지 않는 핵산이다. 구체적인 구현예에서, 상기 핵산은 CAR을 암호화하는 유전자를 함유한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법들은 유전자 조작된 세포를 제조 또는 준비하기 위한 하나 이상의 가공 단계와 동시에, 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 본 방법들의 가공 단계들은 다수의 세포 가공 단계 중 어느 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 가공 단계들은 하나 이상의 핵산, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 유전자를 포함하는 이종성 폴리뉴클레오타이드로 세포의 형질도입 또는 형질주입을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 레트로바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자, 예컨대 세포 내 발현을 위한 재조합 생성물을 암호화하는 것으로 형질도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 비-바이러스 핵산, 예를 들어, 에피솜 플라스미드 또는 트랜스포손으로 형질주입된다. 본 방법들은 세포의 단리, 분리, 선택, 세척, 현탁, 희석, 농축 및/또는 제형화를 위한 단계와 같은 다른 가공 단계들을 추가로 및/또는 대안적으로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 방법들은 또한 세포의 배양, 자극 또는 증폭(예를 들어, 세포의 증식 및/또는 활성화를 유도하기 위한 자극)을 위한 생체외(ex vivo) 단계를 포함할 수 있으며, 이는 일부 경우에 제공된 방법에 따라 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법들은 대상체로부터 세포를 단리하고, 세포를 제조, 가공, 배양 및/또는 조작하고, 냉동 보존 전 또는 후에 동일한 대상체에 이 세포를 재도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포, 예를 들어 1차 세포가 먼저 생물학적 샘플로부터 단리, 예컨대 선택 또는 분리되고; 선택된 세포가 형질도입을 위해 바이러스 벡터 입자와 함께 인큐베이션되고; 형질도입된 세포가 조성물로 제형화되는 순서로 수행되는 가공 단계들을 포함한다. 일부 경우에, 형질도입된 세포는 제공된 방법에 따라, 예컨대 자극 시약의 존재 하에 자극에 의해, 예컨대 생체외에서 활성화, 증폭 또는 번식된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 세포를 세척, 현탁, 희석 및/또는 농축하는 중에 하나 이상의 가공 단계를 포함할 수 있으며, 이는 분리 또는 선택 등의 단리, 형질도입, 자극, 및/또는 제형화 단계들 중 하나 이상 전에, 그 동안에, 또는 그와 동시에 또는 그 후에 일어날 수 있다.
구체적인 구현예에서, 형질주입 또는 형질도입될 세포는 하나 이상의 핵산과의 접촉 전에 단리, 선택 또는 농축되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉하기 전에 선택되지 않는다. 일부 구현예에서, 형질주입 또는 형질도입될 세포는 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉하기 전에 농축되지 않는다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포를 함유하는 조성물을 제조하는 것과 관련된 것을 포함하여 제공된 방법과 관련하여 세포를 제조, 가공 및/또는 인큐베이션하는 것과 관련하여 세포 가공 단계들 중 하나 이상은 일반적으로 원통형이고 회전축을 중심으로 회전가능한 실질적으로 강성인 챔버와 같은 원심분리 챔버의 내부 공동에서 수행될 수 있으며, 이는 다른 이용가능한 방법과 비교하여 특정 이점을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 모든 가공 단계는 동일한 원심분리 챔버에서 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 가공 단계는 동일한 유형의 다수의 원심분리 챔버와 같은 상이한 원심분리 챔버에서 수행된다. 이러한 방법은 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기술된 바와 같은 임의의 것을 포함한다.
예시적인 원심분리 챔버는 Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 챔버를 포함하며, Sepax®및 Sepax®2 시스템과 함께 사용하기 위한 챔버를 포함하고, A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버 및 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 다양한 키트를 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 가공 기기 및 캐비닛은 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2008/0171951, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/38762]에 기술되어 있고, 각각의 내용은 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 특정 공정(예를 들어, 희석, 세척, 형질도입, 제형화)에 따라, 공정에 적절한 특정 키트를 선택하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 제품 이름 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2로 BioSafe SA에서 판매되는 일회용 키트를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 시스템은 시스템 내에서 수행되는 다양한 가공 단계들의 양상들을 동작, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 기기를 포함하여 다른 기기와 함께 포함되고 그리고/또는 다른 계측기와 연관되어 배치된다. 일부 구현예에서 상기 기기는 캐비닛 내에 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 기기에는 제어 회로, 원심분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 수용한 하우징을 포함한 캐비닛이 포함된다. 예시적인 디바이스가 문헌[미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 US 2008/0171951]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 일련의 용기, 예를 들어 백, 튜브, 스톱콕, 클램프, 커넥터 및 원심분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 백과 같은 용기는 동일한 백 또는 별도의 백과 같은 동일한 용기 또는 별도의 용기에 형질도입될 또는 형질주입될 세포 및 벡터 입자(예를 들어, 바이러스 벡터 입자) 또는 비바이러스 플라스미드를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 챔버 내로 들어오는 희석제 및/또는 세척 용액 및/또는 방법 중에 성분 및/또는 조성물을 희석, 재현탁 및/또는 세척하기 위한 기타 성분 같은 배지를 함유하는, 백 같은 하나 이상의 용기를 추가로 포함한다. 용기는 시스템의 하나 이상의 위치에, 예컨대 입력 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 출력 라인에 대응하는 위치에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 폐쇄 시스템 등의 시스템은 멸균 상태이다. 일부 구현예에서, 커넥터를 통한 튜빙 라인과 용기 사이의 연결 등 시스템의 구성요소의 모든 연결은 멸균 조건 하에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 연결은 층류(laminar flow) 하에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 연결은 튜빙과 용기 사이에 멸균 용접과 같은 멸균 연결을 생성하는 멸균 연결 장치를 사용하여 이루어진다. 일부 구현예에서, 멸균 연결 장치는 멸균을 유지하기에 충분히 높은 열 조건, 예컨대 적어도 200°C, 예컨대 적어도 260°C 또는 300°C의 온도 하에서 연결을 달성한다.
일부 구현예에서, 시스템은 일회용 키트와 같은 일회용일 수 있다. 일부 구현예에서, 일회용 키트는 적어도 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상과 같은 공정 또는 공정들의 복수의 사이클에서, 예를 들어 연속 또는 반연속 방식으로 이루어지는 공정들에서 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 일회용 키트 등의 시스템은 단일 환자 유래 세포의 가공을 위해 사용된다. 방법들의 측면에서, 공정들은 동일한 원심분리 챔버에서와 같이 동일한 폐쇄 시스템에서 수행될 필요는 없지만, 상이한 원심분리 챔버에서와 같이 상이한 폐쇄 시스템 하에서 수행될 수 있으며; 일부 구현예에서, 이러한 상이한 원심 챔버들은 동일한 원심 분리기와 관련하여 배치된 것과 같이 동일한 시스템과 관련하여 배치된 방법들 내의 각각의 지점들에 있다. 일부 구현예에서, 모든 가공 단계는 폐쇄 시스템에서 수행되며, 각각의 하나 이상의 가공 단계의 전부 또는 서브세트는 동일하거나 상이한 원심분리 챔버에서 수행된다.
A. 표적 키메라 항원 수용체(CAR)
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 목적하는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 특이성을 제공하고 세포내 신호 전달 도메인에 작동가능하게 연계되거나 연결된 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인을 함유하는 표적 CAR의 세포외 도메인에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, CAR은 본원에 제공된 바와 같은 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 GPRC5D 항원(예를 들어, 종양 상에 발현된)에 대한 특이성을 제공하고 세포내 신호 전달 도메인에 작동가능하게 연계되거나 연결된 표적 항-GPRC5D 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인을 함유하는 표적 CAR의 세포외 도메인에 결합하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, CAR은 본원에 제공된 바와 같은, 예컨대 섹션 I에 기술된 바와 같은, 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체 또는 표적 항-GPRC5D 항체로부터 유래된 부분의 항체 단편을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 예를 들어 섹션 I에서 본원에 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 표적 CAR의 세포외 도메인에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 T 세포 활성화 도메인과 같은 활성화 세포내 도메인 부분이고, 1차 활성화 신호를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 효과기 기능을 촉진하기 위한 공자극 신호 전달 도메인을 함유하거나 추가로 함유한다.
일부 구현예에서, 특정 세포 유형의 표면 상에 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 표지자 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 조작된 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
특정 구현예에서, 키메라 수용체와 같은 재조합 수용체는 T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 세포질(세포내) 영역과 같은 세포질 신호 전달 도메인(상호 교환적으로 세포내 신호 전달 도메인으로도 불림), 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 성분의 세포질 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 세포질 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 신호 전달 부분)을 포함하고 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 세포내 신호 전달 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 리간드(예를 들어, 항원)에 결합하거나 이를 인식하는 세포외 리간드 결합 도메인을 더 함유한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 항원에 결합하거나 이를 인식하는 세포외 항원 인식 도메인을 함유하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 항원과 같은 리간드는 세포의 표면 상에 발현된 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR 유사 CAR이고 항원은 TCR과 마찬가지로 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원과 같은 가공된 펩타이드 항원이다.
CAR을 포함하는 예시적 항원 수용체 및 상기 수용체를 조작하고 세포 내로 도입하는 방법은 예를 들어 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 및 8,479,118 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416]에 기재된 것들 및/또는 문헌[Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 바와 같은 CAR 및 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014055668 A1]에 기재된 것을 포함한다. CAR의 예로는 전술한 간행물 중 어느 하나, 예컨대 문헌[WO2014031687, 미국 특허 번호 8,339,645, 미국 특허 번호 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호 7,446,190, 미국 특허 번호 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)]에 개시된 바와 같은 CAR이 포함된다. 또한 문헌[WO2014031687, 미국 특허 번호 8,339,645, 미국 특허 번호 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호 7,446,190 및 미국 특허 번호 8,389,282]을 참조한다.
일부 구현예에서, 입양 요법에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현되는 항원(예를 들어, 암 표지자) 및/또는 감쇠 반응을 유도하도록 의도된 항원, 예컨대 정상 또는 비질병 세포 유형 상에서 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 표지자 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 통상적으로 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 세포외 부분에 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래된 단일 사슬 항체 단편(single-chain antibody fragment, scFv)과 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CAR의 일부로서 세포 상에 발현된다. 일부 구현예에서, 세포외 항원 결합 도메인은 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 이러한 분자는 통상적으로 TCR과 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호 및 선택적으로 공자극 수용체와 조합하여 이러한 수용체를 통한 신호를 모방하거나 이와 유사할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 세포의 표면 상에 발현된 온전한 항원과 같은 GPRC5D에 결합하거나 이를 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 scFv)을 함유한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(scFv)은 본원에 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체에 함유된 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 GPRC5D이고, 항-GPRC5D 항체, 예컨대 표적 항-GPRC5D 항체 또는 표적 항-GPRC5D 항체로부터 유래된 항원 결합 단편에 의해 결합된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 인식한다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나 또는 항원 결합 부분(Fab, F(ab’)2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편(scFv))일 수 있다. 다른 구현예에서, 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택되고, 특히 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되고, 보다 특히, IgG1(예를 들어, 인간 IgG1)이다. 다른 구현예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파 또는 람다, 특히 카파에서 선택된다.
제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. “항체 단편(antibody fragment)”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 가변 중쇄(VH) 영역, scFv와 같은 단일 사슬 항체 분자 및 단일 도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 항체는 scFv와 같은, 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL) 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kindt et al . Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007)]을 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체 유래의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 본원에 기술되거나 본 기술 분야에 알려진 표적 항원들 중 어느 하나와 같이, 종양 세포 또는 암세포와 같은 표적화될 세포 또는 질병의 암 표지자 또는 세포 표면 항원과 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질 가수 분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 합성 링커, 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것과 같이 자연적으로 발생하지 않고/거나 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성되지 않을 수 있는 배열을 포함하는 단편과 같은 재조합으로 생성된 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
“인간화(humanized)” 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된, 항체이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 “인간화된 형태(humanized form)”는 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서, 통상적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)의 해당 잔기로 치환되어 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도가 회복되거나 개선된다.
CAR과 같은 키메라 수용체는 일반적으로 항체 분자(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은, 표적 항-GPRC5D 항체)의 부분과 같은 세포외 항원 결합 도메인, 일반적으로 항체의 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역, 예를 들어, scFv 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 표적 항-GPRC5D 항체로부터 유래되고, 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대 CAR, 예컨대 이의 항체 부분은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역이거나 이를 포함할 수 있는 스페이서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예를 들어, scFv와 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로 기능한다. 스페이서는 스페이서의 부재와 비교하여 항원 결합 후에 세포의 반응성 증가를 제공하는 길이의 것일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서는 (약) 12개 아미노산 길이이거나 또는 12개 이내의 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229개 아미노산, 약 10 내지 200개 아미노산, 약 10 내지 175개 아미노산, 약 10 내지 150개 아미노산, 약 10 내지 125개 아미노산, 약 10 내지 100개 아미노산, 약 10 내지 75개 아미노산, 약 10 내지 50개 아미노산, 약 10 내지 40개 아미노산, 약 10 내지 30개 아미노산, 약 10 내지 20개 아미노산, 또는 약 10 내지 15개의 아미노산을 갖는 것을 포함하고, 열거된 범위 중 임의의 종점들 사이 임의의 정수를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산, 약 119개 이하의 아미노산, 또는 약 229개 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 11에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지, CH2 및 CH3 중 하나 이상은 IgG4 또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래된다. 일부 경우에, 힌지, CH2 및 CH3은 IgG4로부터 유래된다. 일부 측면에서, 힌지, CH2 및 CH3 중 하나 이상은 키메라이고 IgG4 및 IgG2로부터 유래된 서열을 함유한다. 일부 예에서, 스페이서는 IgG4/2 키메라 힌지, IgG2/4 CH2, 및 IgG4 CH3 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 암호화된 스페이서는 (i) 서열 번호: 11에 제시된 서열; (ii) 서열 번호: 11에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열 번호: 11의 기능적 변이체; 또는 (iii) 적어도 125개 이상의 아미노산 길이인 (i) 또는 (ii)의 인접 부분이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 암호화된 스페이서는 서열 번호: 11에 제시된 서열이거나 이를 포함한다. 예시적인 스페이서는 문헌[Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687, 미국 특허 번호 8,822,647, 공개 출원 번호 US2014/0271635, WO 2019/090003 (PCT/US2018/058811), 또는 WO 2016/090320 (PCT/US2015/064112)]에 기술된 것을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이 내용들은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 신호 전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포외 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 ITAM을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 항원 인식 도메인(예를 들어, 세포외 도메인)은 일반적으로 CAR의 경우에 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통한 활성화 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 모방하는 신호 전달 성분과 같은 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 세포외 도메인(예를 들어, scFv) 및 세포내 신호 전달 도메인 사이에 연결되거나 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원 결합 성분(예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인에 연결된다.
일 구현예에서, 수용체(예를 들어, CAR)에 있는 도메인 중 하나와 자연적으로 회합하는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 상기 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택되어 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호 작용이 최소화된다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막 관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래된 것을 포함한다(즉 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함한다). 대안적으로 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린 등의 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿(triplet)이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커들, 스페이서들 및/또는 막관통 도메인(들)에 의한 것이다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인과 막관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인과 막관통은 본원에 기술된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 수용체는 막관통 도메인이 유래된 분자의 세포외 부분, 예컨대 CD28 세포외 부분을 함유한다.
세포내 신호 전달 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합으로 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 공자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 이와 유사한 것이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어 글리신 및 세린, 예를 들어 글리신-세린 더블릿(doublet)을 함유하는 것과 같은 2 내지 10개 아미노산 길이의 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호 전달 도메인 사이에 존재하고 연결을 형성한다.
일부 측면에서, T 세포 활성화는 두 종류의 세포질 신호 전달 서열, 즉 TCR을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열(1차 세포질 신호 전달 서열) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호 전달 서열)에 의해 매개되는 것으로 설명된다. 일부 측면에서, CAR은 상기 신호 전달 성분들 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
수용체(예를 들어, CAR)는 일반적으로 적어도 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 전달 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호 전달 서열을 함유하는 ITAM의 예에는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 엡실론으로부터 유래된 것이 포함된다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 신호 전달 분자(들)는 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호 전달 도메인, 이의 부분, 또는 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원 결합 부분은 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가적인 분자의 일부를 더 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체는 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 결찰시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호 전달 도메인은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 효과기 기능들 또는 반응들 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 기타 인자의 분비를 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공자극 분자의 세포내 신호 전달 도메인의 절단 부분은 예를 들어 그것이 효과기 기능 신호를 전달하는 경우 온전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 일부 측면에서 천연 맥락에서 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 상기 수용체와 협력하여 작용하는 공-수용체 및/또는 상기 분자의 임의의 유도체 또는 변이체 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열의 세포질 서열을 또한 포함한다.
천연 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공자극 신호가 필요하다. 따라서, 일부 구현예에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분이 CAR에 또한 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가의 CAR이 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 측면에서, T 세포 활성화는 두 종류의 세포질 신호 전달 서열, 즉 TCR을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열(1차 세포질 신호 전달 서열) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호 전달 서열)에 의해 매개되는 것으로 설명된다. 일부 측면에서, CAR은 상기 신호 전달 성분들 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은 공자극 수용체의 신호 전달 도메인 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 및 공자극 성분 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자로부터 유래된 세포내 도메인 또는 이의 기능적 변이체를, 예컨대 막관통 도메인과 세포내 신호 전달 도메인 사이에 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 구현예에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 또는 자극성 CAR, 공자극 CAR을 포함하며, 둘 다 동일한 세포 상에서 발현된다(WO2014/055668 참조). 일부 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극성 또는 활성화 CAR 및/또는 공자극 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 억제성 CAR(iCAR, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) 참조), 예컨대 질병 또는 병태에 특이적이고/거나 이와 관련된 것 외의 항원을 인식하는 - 이로써 질병 표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호가 예를 들어 표적외 효과를 감소시키도록 이의 리간드에 대한 억제성 CAR의 결합에 의해 감소 또는 억제되는 - CAR을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에서 하나 이상의, 예를 들어 둘 이상의 공자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 1차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CAR에는 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포내 성분들이 포함된다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 표지자를 더 포함하고/거나 CAR 또는 다른 항원 수용체를 발현하는 세포는 세포 표면 표지자와 같은 대리 표지자를 더 포함하고, 이는 수용체를 발현하기 위한 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 표지자에는 CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체, 예컨대 상기 세포 표면 수용체의 절단 버전(예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태)가 포함된다. 일부 구현예에서, 표지자를 암호화하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열(예를 들어, T2A)과 같은 링커 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 표지자 및 선택적으로 링커 서열은 문헌[특허 출원 번호 WO2014031687]에 개시된 바와 같은 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 표지자는 선택적으로 링커 서열, 예컨대 T2A 절단 가능한 링커 서열에 연결된 절단형 EGFR(tEGFR)일 수 있다. 일부 구현예에서, tEGFR은 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, tEGFR은 서열 번호: 33에 제시된 서열에 대해 (약) 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 표지자는 T 세포에서 자연적으로 발견되지 않거나 또는 T 세포 표면에서 자연적으로 발견되지 않는 분자(예를 들어, 세포 표면 단백질) 또는 이의 부분이다. 일부 구현예에서, 분자는 비자기(non-self) 분자, 예를 들어 비자기 단백질, 즉 세포가 입양으로 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 “자기(self)”로 인식되지 않는 분자이다.
일부 구현예에서, 표지자는 치료 기능을 하지 않고/거나 유전자 조작을 위한, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 표지자로서 사용되는 것 외에 다른 효과를 생성하지 않는다. 다른 구현예에서, 표지자는 치료적 분자 또는 달리 일부 원하는 효과를 나타내는 분자, 예컨대 생체 내에서 세포가 조우하게 될 리간드, 예컨대 입양 전달 및 리간드와의 조우 시 세포의 반응을 강화하고/거나 약화시키는 공자극 또는 면역 관문 분자일 수 있다.
일부 경우에, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 제1 세대 CAR은 항원 결합 시 CD3 사슬 유도 신호만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제2 세대 CAR은 상기 신호 및 공자극 신호, 예컨대 CD28 또는 CD137과 같은 공자극 수용체 유래 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제3 세대 CAR은 상이한 공자극 수용체의 다중 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 본원에 기술된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분, 예를 들어 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 본원에 기술된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일 도메인 VH 항체를 포함하고, 세포내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 측면에서, 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 신호 전달 영역 사이에 배치된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다. 세포외 도메인과 막관통은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다.　 일부 구현예에서, 세포외 도메인과 막관통은 본원에 기술된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다.　 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을, 예컨대 막관통 도메인과 세포내 신호 전달 도메인 사이에 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28의 막관통 부분이거나 이를 함유하는 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 CD28의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체와 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28의 막관통 부분이거나 이를 함유하는 막관통 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 및 4-1BB의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체와 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 수용체는 Ig 분자, 예컨대 인간 Ig 분자의 일부, 예컨대 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, 예컨대 힌지 단독 스페이서를 함유하는 스페이서를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체(예를 들어, CAR)의 막관통 도메인은 인간 CD28의 막관통 도메인 또는 이의 변이체, 예를 들어, 인간 CD28의 27개 아미노산 막관통 도메인(수탁 번호: P10747.1)이거나, 서열 번호: 12에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 12에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인이다.　
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 인간 CD28의 세포내 공자극 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부, 예컨대 이의 41개의 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL의 GG로의 치환을 갖는 상기 도메인을 포함한다.　 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 서열 번호: 34 또는 35에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 34 또는 35에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은 4-1BB 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부의 세포내 공자극 신호 전달 도메인, 예컨대 인간 4-1BB 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부의 42-아미노산 세포질 도메인(수탁 번호: Q07011.1), 예컨대 서열 번호: 13에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 13에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 인간 CD3 사슬, 선택적으로 CD3 제타 자극성 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ의 동형 단백질 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호: P20963.2) 또는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993]에 기술된 바와 같은 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다.　일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 서열 번호: 14에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 14에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 IgG의 힌지 영역 단독, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 힌지 단독, 예컨대 서열 번호 11에 제시된 힌지 단독 스페이서를 함유한다. 다른 구현예에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 37에 제시된 바와 같이 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 36에 제시된 바와 같이 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 알려진 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 가요성 링커이거나 이를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, CAR은 scFv를 포함한 항체 단편과 같은 항체, 스페이서, 예컨대 면역글로불린 분자의 부분, 예컨대 힌지 영역을 및/또는 중쇄 분자의 하나 이상의 불변 영역을 함유한 스페이서, 예컨대 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유래 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 함유한 막관통 도메인, CD28-유래 세포내 신호 전달 도메인, 및 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다.　 일부 구현예에서, CAR은 항체 또는 scFv와 같은 단편, 임의의 Ig-힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서, CD28-유래 막관통 도메인, 4-1BB-유래 세포내 신호 전달 도메인, 및 CD3 제타-유래 신호 전달 도메인을 포함한다.　
일부 구현예에서, 상기 CAR 작제물을 암호화하는 핵산 분자는 T2A 리보솜 스킵 요소 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어, CAR을 암호화하는 서열의 다운스트림을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 T 세포는 또한 (예를 들어, 동일한 작제물로부터 두 개의 단백질을 발현하도록 T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt를 암호화하는 작제물의 도입에 의해) 비-면역원성 선택 에피토프로서 절단형 EGFR(EGFRt)을 발현하도록 생성될 수 있고, 그런 후 이는 상기 세포를 검출하는 표지자로 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 8,802,374] 참조). 일부 구현예에서, 단일 프로모터는 단일 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)에서 자가-절단 펩타이드(예를 들어, 2A 서열) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 퓨린)를 암호화하는 서열에 의해 서로 분리된 (예를 들어, 대사 경로를 조절하는 데 관여하는 분자를 암호화하고 재조합 수용체를 암호화하는) 두 개 또는 세 개의 유전자를 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서, ORF는 번역 동안(2A의 경우) 또는 번역 후에 개별 단백질로 가공되는 단일 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩타이드는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합의 합성을 건너뛰도록(리보솜 스키핑) 유발할 수 있으며, 이는 2A 서열의 말단과 다음(next) 펩타이드 다운스트림 사이의 분리로 이어진다(예를 들어, 문헌[de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)] 참조). 많은 2A 요소가 당업계에 공지되어 있다. 본원에 개시된 방법 및 핵산에 사용될 수 있는 2A 서열의 예에는 문헌[미국 특허 공개 번호 20070116690]에 기술된 바와 같은 구제역 바이러스(F2A, 예를 들어, 서열 번호: 43), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어, 서열 번호: 41), 토세아 아시그나 바이러스(T2A, 예를 들어, 서열 번호: 38 또는 45) 및 돼지 테스코 바이러스-1(P2A, 예를 들어, 서열 번호: 39 또는 40)이 있으며, 하지만 이에 한정되지 않는다.
대상체에 투여되는 세포에 의해 발현되는 CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 치료하는 질병 또는 병태 또는 그 세포에서 발현되고, 그와 연관되고 및/또는 이에 특이적인 분자를 인식하거나 그 분자에 결합한다. 분자(예를 들어, 항원)에 결합(예를 들어, 특이적 결합) 시, 수용체는 일반적으로 면역 자극 신호, 예컨대 ITAM-변환 신호를 세포에 전달하여 질병 또는 병태에 표적화된 면역 반응을 촉진한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 질병 또는 병태의 또는 질병 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직에 의해 발현되는 항원에 결합하는 CAR을 발현한다. 수용체는 예를 들어 항체를 이용한 세포의 고갈 또는 제거에 사용하기 위한, CCR 또는 iCAR 또는 비-신호전달 수용체와 같은 면역 억제 또는 공자극 신호-촉진 수용체와 같은 다른 수용체일 수 있다.
B. 유전자 조작된 세포 및 세포 생산 방법
키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 중에 조작된 세포가 있다. 유전자 조작은 일반적으로 재조합 또는 조작된 성분을 암호화하는 핵산을, 예컨대 레트로바이러스 형질도입, 형질주입 또는 형질전환에 의해, 세포를 함유하는 조성물 내로 도입하는 것을 포함한다. 유전자 조작된 성분, 예를 들어 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 도입하는 다양한 방법이 널리 알려져 있으며 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스), 형질도입, 트랜스포손 및 전기 천공법을 통한 것을 포함하여 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다.
1. 유전자 조작을 위한 벡터 및 방법
또한, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 분자), 상기와 같은 CAR을 발현하도록 세포를 유전적으로 조작하기 위한 벡터 및 조작된 세포를 생산하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 CAR을 암호화하는 핵산을 함유한다. 일부 경우에, 벡터는 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터)와 같은 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어 문헌[Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조).
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식 육종바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아줄기세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 비장 병소 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV) 또는 아데노 연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류(avian) 또는 포유동물 세포 공급원으로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 gag(객), pol(폴) 및/또는 env(엔브) 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌[예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기술되어 있다.
렌티바이러스 형질도입 방법은 알려져 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기 천공법을 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌[Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437] 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위(transposition)를 통해 T 세포 내로 전달된다(예를 들어, 문헌[Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; and Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126] 참조). 면역 세포에 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법에는 인산칼슘 형질주입(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.]에 기재된 바와 같음), 원형질체 융합, 양이온성 리포솜-매개 형질주입; 텅스텐 입자 촉진 마이크로입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산스트론튬 DNA 공동 침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))이 포함된다.
재조합 생성물을 암호화하는 핵산 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터는 예를 들어, 문헌[국제 특허 출원 공개 번호: WO2014055668 및 미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 것이다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T 세포)는 증폭 중 또는 증폭 후에 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)로 형질주입될 수 있다. 원하는 수용체의 유전자 도입을 위한 상기 형질주입은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 이어서 유전자 변형 세포 집단은 초기 자극(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자극)으로부터 유리될 수 있으며, 후속적으로 제2 유형의 자극으로, 예를 들어 새로이 도입된 수용체를 통해 자극될 수 있다. 상기 제2 유형의 자극은 새로운 수용체의 프레임워크 내에서 직접 결합하는(예를 들어, 수용체 내의 불변 영역을 인지함으로써) 유전자 도입된 수용체의 펩타이드/MHC 분자, 즉 동종(교차 결합) 리간드(예를 들어, CAR의 천연 리간드) 또는 임의의 리간드(예컨대 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)]을 참조한다. 일부 구현예에서, 세포는 제공된 방법에 따라 제공된 항-이디오타입 항체로 자극된다.
일부 경우에, 세포, 예를 들어, T 세포가 활성화되는 것이 필요하지 않은 벡터를 사용할 수 있다. 일부 상기의 경우에, 세포는 활성화되기 전에 선택 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는 세포 배양 이전에 또는 이후에 조작될 수 있고, 일부 경우에는 배양의 적어도 일부와 동시에 또는 그 동안에 조작될 수 있다.
도입을 위한 추가 핵산(예를 들어, 유전자) 중에는, 예컨대 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선하기 위한 유전자; 예컨대 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 표지자를 제공하기 위한 유전자; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); and Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 유전자가 있고; 또한 우성 양성 선택 가능한 표지자를 음성 선택 가능한 표지자와 융합시켜 유래된 2작용성 선택 가능한 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[국제 출원 공보 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601 by Lupton et al.]을 참조한다. 예를 들어, 문헌[Riddell et al., 미국 특허 번호 6,040,177의 14-17열]을 참조한다.
2. 유전자 조작을 위한 세포 및 세포 제조
키메라 항원 수용체(CAR)를 함유하는 조작된 세포를 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 또한, 이러한 세포의 집단 및 이러한 세포를 함유하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물 중에는 하나 이상의 세포가 알려져 있거나, 또는 세포가 인큐베이션 또는 접촉된 하나 이상의 입자 상에 존재하는 결합 분자에 의해 인식 또는 결합될 수 있는 재조합 수용체를 발현할 가능성이 있는 세포를 함유하는 투입 조성물이 있다. 또한, 조성물 중에는, 입자의 결합 분자에 의해 결합되거나 인식되는 재조합 수용체를 함유하는 세포에 대해 농축된 조성물, 예컨대 재조합 수용체(예를 들어, 키메라 수용체)를 발현하는 세포가 조성물 중의 전체 세포 또는 특정 유형의 세포, 예컨대 T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상 퍼센트를 구성하는 조성물을 포함하여, 자극되거나 증폭된 세포를 함유하는 산출 조성물을 포함하여, 제공된 방법에 의해 생산된 조성물이 있다. 따라서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 유전자 조작된 세포가 제공된다.
조성물 중에는 예컨대 입양 세포 요법을 위한 투여용 약학 조성물 및 제형이 있다. 또한, 이러한 세포를 조작, 생산 또는 생성하는 방법, 대상체, 예를 들어 환자에게 세포 및 조성물을 투여하는 치료 방법, 및 이러한 세포를 검출, 선택, 단리 또는 분리하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 핵산은 이종 기원인데, 즉, 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에는 정상적으로 존재하지 않으며, 예를 들어, 이는 조작되는 세포 및/또는 상기 세포가 유래된 유기체에서 보통 발견되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 천연 발생이 아니고, 예컨대 다수의 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것을 포함해, 자연에서 발견되지 않는 핵산이다.
세포는 일반적으로 포유동물 세포와 같은 진핵 세포이며, 통상적으로 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프, 또는 림프성 기관으로부터 유래되며, 선천성 또는 적응성 면역 세포와 같은, 면역 계통의 세포, 예를 들어 림프구, 통상적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한 골수성 또는 림프성 세포이다. 다른 예시적인 세포에는 유도된 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)를 포함한, 다분화능 및 다능성 줄기세포와 같은 줄기세포가 포함된다.
세포는 통상적으로 대상체로부터 직접 단리되고/거나 대상체로부터 단리되고 동결된 세포와 같은 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포에는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 서브세트, 예컨대 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이의 하위 집단, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 증폭, 재순환, 국소화 및/또는 지속성 용량, 항원 특이성, 항원 수용체 유형, 특정 기관 또는 구획에의 존재, 표지자 또는 사이토카인 분비 프로필 및/또는 분화 정도에 의해 정의되는 것이 포함된다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가 조직일 수 있다. 상기 방법 중에는 기성 방법이 포함된다. 일부 측면에서, 예컨대 기성 기술에 대해, 세포는 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)와 같은 줄기세포 등과 같은 다능성 및/또는 다분화능이다. 일부 구현예에서, 본 방법들은 대상체로부터 세포를 단리하고, 세포를 제조, 가공, 배양 및/또는 조작하고, 냉동 보존 전 또는 후에 동일한 대상체에 이 세포를 재도입하는 것을 포함한다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 아형 및 하위 집단 중에는 나이브 T(naive T, TN) 세포, 효과기 T 세포(effector T cell, TEFF), 기억 T 세포 및 이의 하위-유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T(stem cell memory T, TSCM), 중심 기억 T(central memory T, TCM), 효과기 기억 T(effector memory T, TEM) 또는 말단 분화된 효과기 기억 T 세포, 종양 침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 점막 연관 불변 T(mucosa-associated invariant T, MAIT) 세포, 천연 발생 및 적응성 조절 T(regulatory T, Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 구현예에서, 세포는 자연 살해(natural killer, NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예를 들어 골수성 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고, 이에 의해 상기 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 이종 기원인데, 즉, 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에는 정상적으로 존재하지 않으며, 예를 들어, 이는 조작되는 세포 및/또는 상기 세포가 유래된 유기체에서 보통 발견되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 천연 발생이 아니고, 예컨대 다수의 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것을 포함해, 자연에서 발견되지 않는 핵산이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조 단계를 포함한다. CAR과 같은 형질전환 수용체(transgenic receptor)를 암호화하는 핵산의 도입을 위한 세포는, 생물학적 샘플, 예를 들어 대상체로부터 수득되거나 유래된 것과 같은 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 단리되는 대상체는 질병 또는 병태가 있거나 세포 요법이 필요하거나 또는 세포 요법이 투여될 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정한 치료적 개입이 필요한 인간이다.
따라서, 일부 구현예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플에는 대상체에서 직접 채취한 조직, 체액 및 기타 샘플뿐만 아니라 분리, 원심분리, 유전자 조작(예를 들어, 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척 및/또는 인큐베이션과 같은 하나 이상의 가공 단계에서 생성된 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 조직 및 장기 샘플(이들로부터 유래된 가공 샘플 포함)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 세포가 유래되거나 단리된 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 생성물이거나 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 창자, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도 또는 기타 장기 및/또는 이들로부터 유래된 세포가 포함된다. 샘플에는 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법의 맥락에서 자가 및 동종이계 공급원으로부터 유래된 샘플이 포함된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어 T 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 이종성 공급원, 예를 들어 마우스, 랫트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 준비 단계 및/또는 비친화도 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예에서, 세포는 예를 들어 원치 않는 성분의 제거, 원하는 성분의 농축, 특정 시약에 민감한 세포를 용해하거나 제거하기 위해, 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션된다. 일부 예에서, 세포는 하나 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 민감도 및/또는 내성에 기초하여 분리된다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액 유래 세포는 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포의 선택 및/또는 농축 전에, 샘플 또는 샘플 내의 세포는 추가 가공 단계 전에 휴지시키거나(rested) 또는 보류할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 (약) 2°C 내지 8°C의 온도에서 최대 48시간 동안, 예컨대 12시간, 24시간 또는 36시간 동안 유지되거나 보류된다. 특정 구현예에서, 세포는 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉하기 전에 선택 및/또는 농축되지 않는다. 일부 구현예에서, 샘플 또는 세포는 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉 또는 인큐베이션하기 전에 휴지 또는 보류될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉 또는 인큐베이션하기 전에 (약) 2°C 내지 8°C의 온도에서 최대 48시간 동안, 예컨대 12시간, 24시간 또는 36시간 동안 유지되거나 보류된다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포는, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 가공 단계를 위한 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척한다. 일부 구현예에서, 세포는 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척 용액에는 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 “플로우-쓰루(flow-through)” 원심 분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)로 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca++/Mg++이 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 이 세포는 배양 배지에서 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구를 용해시켜 말초 혈액으로부터 백혈구의 준비 및 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 표면 표지자, 예를 들어, 표면 단백질, 세포내 표지자 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표지자에 기초한 분리를 위한 임의의 알려진 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화도- 또는 면역 친화도-기반 분리이다. 예를 들어, 일부 측면에서 단리에는 하나 이상의 표지자, 통상적으로 세포 표면 표지자의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초하여, 예를 들어 상기 표지자에 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션 후 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너와 결합하지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너와 결합한 세포의 분리에 의한 세포 및 세포 집단의 분리가 포함된다.
상기 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 유지되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어서, 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 표지자에 기초하여 가장 잘 수행된다.
분리는 특정 표지자를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거로 귀결될 필요는 없다. 예를 들어, 표지자를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 상기 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하나, 상기 표지자를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재로 귀결될 필요는 없다. 마찬가지로, 표지자를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 상기 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하나, 상기 모든 세포의 완전한 제거로 귀결될 필요는 없다.
일부 예에서, 다수 라운드의 분리 단계가 수행되고, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 예컨대 각각 음성 선택을 위해 표적화된 표지자에 대해 특이적인 다수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 표지자를 발현하는 세포를 동시에 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 세포 유형이 동시에 양성 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, 예컨대 하나 이상의 표면 표지자를 높은 수준으로 발현하거나 양성인 세포와 같은 T 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 접합 자성 비드(예를 들어, DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 사용하여 양성 선택될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 세포는 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉하기 전에 CD3+, CD28+ T 세포를 증폭시키기 위해 항-CD3/항-CD28 접합 자성 비드(예를 들어, DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉하기 전에 항-CD3/항-CD28 접합 자성 비드와 접촉되지 않는다.
일부 구현예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 발현(표지자+)되거나 상대적으로 보다 높은 수준으로 발현(표지자high)된 하나 이상의 표면 표지자에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단핵구 또는 다른 백혈구, 예컨대 CD14와 같은 비-T 세포 상에서 발현되는 표지자의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하는 데 사용된다. 상기 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브(naive), 기억 및/또는 효과기(effector) T 세포 하위 집단 상에서 발현되거나 상대적으로 보다 높은 정도로 발현되는 표지자에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 예컨대 각각의 하위 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 나이브, 중심 기억, 효과기 기억 및/또는 중심 기억 줄기세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T(TCM) 세포의 농축은 효능을 증가시키기 위해, 예컨대 투여 후의 장기간 생존, 증폭 및/또는 생착을 향상하기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 상기 하위 집단에서 특히 견고하다. 문헌[Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 더욱 향상시킨다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획에 대해 농축되거나 고갈될 수 있다.
일부 구현예에서, 중심 기억 T(TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127의 양성 또는 고도의 표면 발현에 기초하고; 일부 측면에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중심 기억 T(T CM) 세포에 대한 농축은 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행되며, 이는 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택, 및 CD62L에 기초한 양성 선택을 거친다. 상기 선택은 일부 측면에서 동시에 수행되고 다른 측면에서 순차적으로 어떠한 순서로든 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 하위 집단을 제조하는 데 사용된 동일한 CD4 발현 기반 선택 단계가 CD4+ 세포 집단 또는 하위 집단을 생성하는 데 또한 사용되어, CD4 기반 분리로부터 양성 및 음성 분획 모두가 유지되고, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선택 단계 후에 본 방법의 후속 단계에서 사용된다.
구체적인 예에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은, 음성 및 양성 분획 모두가 유지되는 CD4+ 세포의 선택을 거친다. 이어서 음성 분획은 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L 또는 CCR7과 같은 중심 기억 T 세포의 표지자 특성에 기초한 양성 선택을 거치고, 여기서 양성 및 음성 선택은 어느 순서로든 수행된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별하여 나이브, 중심 기억 및 효과기 세포(effector cell)로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
일 예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리가 가능하도록 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성(또는 자성친화도) 분리 기법을 사용하여 분리되거나 단리된다(문헌[Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒHumana Press Inc., Totowa, NJ]에서 검토됨).
일부 측면에서, 분리될 세포 샘플 또는 세포 조성물은 작고, 자화 가능한 또는 자성 반응성 물질, 예컨대 자성 반응성 입자 또는 미세입자, 예컨대 상자성 비드(예를 들어, Dynabeads 또는 MACS 비드)와 함께 인큐베이션된다. 자성 반응성 물질(예를 들어, 입자)은 일반적으로 분리하기를 원하는, 예를 들어 음성 또는 양성 선택하기를 원하는 세포, 세포들 또는 세포 집단에 존재하는 분자(예를 들어, 표면 표지자)에 결합하는 결합 파트너(예를 들어, 항체)에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특이적인 결합 멤버에 결합되는 자성 반응성 물질을 포함한다. 자성 분리 방법에 사용되는 널리 알려진 많은 자성 반응 물질이 있다. 적합한 자성 입자에는 본 명세서에 참조로 통합된 문헌[Molday, 미국 특허 번호 4,452,773 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B]에 기술된 것이 포함된다. 콜로이드 크기의 입자, 예컨대 문헌[Owen 미국 특허 번호 4,795,698 및 Liberti et al., 미국 특허 번호 5,200,084]에 기술된 것이 다른 예이다.
인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 예컨대 자성 입자 또는 비드에 부착된 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합하는 2차 항체 또는 다른 시약이 샘플 내의 세포 상에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 결합하는 조건하에서 수행된다.
일부 측면에서, 샘플은 자기장에 배치되고, 이에 부착된 자성 반응성 또는 자화 가능 입자를 갖는 상기 세포는 자석에 끌려당겨지고 표지되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택의 경우, 자석에 끌려당겨진 세포가 유지되고; 음성 선택의 경우, 끌려당겨지지 않은 세포(비표지 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합이 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 상기 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가적으로 가공되거나 추가적인 분리 단계를 거친다.
특정 구현예에서, 자성 반응성 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 표지자에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포 유형 특이적 2차 항체- 또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘 코팅된 자성 입자는 비오티닐화 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자성 반응성 입자는 후속적으로 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착되어 남아있고; 일부 측면에서, 상기 입자는 환자에게 투여하기 위한 세포에 부착되어 남아있는다. 일부 구현예에서, 자화 가능 또는 자성 반응성 입자는 세포로부터 제거된다. 세포에서 자화 가능 입자를 제거하는 방법은 알려져 있고, 예를 들어 경쟁 비-표지 항체, 및 절단 가능한 링커에 접합된 자화 가능 입자 또는 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화 가능 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화도 기반 선택은 자성 활성화 세포 분류(magnetic-activated cell sorting, MACS)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통한 것이다. 자성 활성화 세포 분류(MACS) 시스템은 자화된 입자가 부착되어 있는 세포를 고순도로 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 외부 자기장을 가한 후에 비 표적 종 및 표적 종(species)이 순차적으로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포는 제자리에 유지되는 반면 부착되지 않은 종은 용리된다. 이어서, 이 제1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되어 용리가 방지된 종들은 용리 및 회수될 수 있는 상당한 방식으로 해제된다. 특정 구현예에서, 비 표적 세포는 표지되고 이종 세포 집단으로부터 고갈된다.
특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 본 방법의 단리, 세포 준비, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 디바이스 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템은 예를 들어 오류, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 폐쇄 또는 멸균 환경에서 상기 단계 각각을 수행하는 데 사용된다. 일 예에서, 시스템은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380 A1]에 기술된 바와 같은 시스템이다. 일 예에서, 시스템은 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기술된 바와 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 통합 또는 독립 언어 시스템 및/또는 자동화되거나 프로그램 가능한 방식으로 단리, 가공, 조작 및 제형화 단계 중 하나 이상, 예를 들어 모두를 수행한다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계의 결과를 프로그램, 제어, 산정하고/거나 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계의 다양한 측면을 조정할 수 있게 하는, 상기 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 측면에서, 분리 및/또는 다른 단계는 예를 들어 폐쇄 및 멸균 시스템에서 임상 규모 수준으로 세포의 자동 분리를 위해 CliniMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 구성 요소에는 통합 마이크로 컴퓨터, 자성 분리 유닛, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브가 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 통합 컴퓨터는 기기의 모든 구성 요소를 제어하고 시스템에 표준화된 순서로 반복된 절차를 수행하도록 지시한다. 일부 측면에서, 자성 분리 유닛은 이동 가능한 영구 자석 및 선택 컬럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 배관 세트 전체의 유량을 제어하고, 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충제의 흐름 제어와 세포의 지속적인 현탁을 보장한다.
일부 측면에서, CliniMACS 시스템은 멸균, 비발열성 용액에 담겨 공급되는 항체 결합 자화 가능 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 후 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서, 세포 준비 백은 배관 세트에 연결되고, 이는 차례로 완충제를 함유한 백 및 세포 수집 백에 연결된다. 배관 세트는 전치 컬럼 및 분리 컬럼을 포함한 사전 조립된 멸균 배관으로 구성되며 일회용이다. 분리 프로그램이 시작된 후, 시스템은 세포 샘플을 분리 컬럼에 자동으로 적용한다. 표지된 세포는 컬럼 내에 유지되는 반면, 표지되지 않은 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되지 않고 컬럼에 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 컬럼에 유지된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장을 제거한 후 컬럼으로부터 용리되고, 세포 수집 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, CliniMACS Prodigy 시스템에는 원심분리에 의한 세포의 자동 세척 및 분획화가 가능한 세포 가공 유닛이 구비되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템에는 공급원 세포 생성물의 거시적인 층을 식별하여 최적의 세포 분획화 종점을 결정하는 내장 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어도 포함될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리된다. CliniMACS Prodigy 시스템에는 또한 예를 들어, 세포 분화 및 증폭, 항원 로딩 및 장기 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 달성하는 통합 세포 배양 챔버가 포함될 수 있다. 입력 포트는 배지의 멸균 제거 및 보충을 가능하게 할 수 있고 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1: 72-82, 및 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9): 689-701]을 참조한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 유세포 분석을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되고, 여기서 다수의 세포 표면 표지자에 대해 염색된 세포는 유체 스트림으로 운반된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 제조 규모(FACS) 분류를 통해 수집 및 농축(또는 고갈)된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 FACS 기반 검출 시스템과 조합된 미세전자기계 시스템(microelectromechanical system, MEMS) 칩을 사용하여 수집 및 농축(또는 고갈)된다(예를 들어, 문헌[국제 출원 WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376] 참조). 두 경우 모두에서, 세포는 다수의 표지자로 표지될 수 있으며, 이는 고순도로 명확한 T 세포 서브세트의 단리를 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 표지자로 표지되어, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지 항체에 대한 결합에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 세포 표면 표지자에 특이적인 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 예를 들어 유세포 분석 검출 시스템과 조합하여 예컨대 제조 규모(FACS) 및/또는 미세전자기계 시스템(MEMS) 칩을 포함하는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)에 의해 유체 스트림에서 수행된다. 상기 방법은 다수의 표지자에 기초하여 양성 및 음성 선택을 동시에 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 준비 방법은 단리, 인큐베이션 및/또는 조작 전이든 후이든 세포를 동결하는 단계, 예를 들어, 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 이후에 동결 용액에서 현탁된다. 일부 측면에서, 알려진 임의의 다양한 동결 용액 및 매개변수가 사용될 수 있다. 일 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함한다. 이어서, 상기를 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 배지와 1:1로 희석시킨다. 이어서 세포를 일반적으로 분당 1°의 속도로 -80℃까지 동결시키고 액체 질소 저장 탱크에 기체상(vapor phase)으로 저장한다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작 전에 또는 그와 연계하여 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 육성, 자극, 활성화 및/또는 번식(propagation)을 포함할 수 있다. 인큐베이션 및/또는 조작은 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰(well), 컬럼, 관, 배관 세트, 밸브, 바이알(vial), 배양 접시, 백(bag) 또는 세포 배양 또는 육성을 위한 다른 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션된다. 상기 조건은 집단에서 세포의 증식, 증폭, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것을 포함한다.
상기 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 리간드)를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호 전달 계단식 다단계 반응을 작동시키거나 개시한다. 상기 제제는 항체, 예컨대 TCR에 특이적인 것, 예를 들어 항-CD3을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 공자극 수용체, 예를 들어 항-CD28을 자극할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 리간드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 리간드는 비드와 같은 고체 지지체 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 선택적으로, 증폭 방법은 (예를 들어, 적어도 약 0.5ng/ml 이상의 농도의) 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, IL-2 농도는 적어도 약 10단위/mL이다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 예컨대 문헌[미국 특허 번호 6,040,177 Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기술된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포는 배양-개시 조성물 배양보조 세포, 예컨대 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 첨가하고(예를 들어, 생성된 세포의 집단은 증폭될 초기 집단 중 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 이상의 PBMC 배양보조 세포를 함유하도록); 상기 배양물을 (예를 들어, T 세포 수를 증폭시키기에 충분한 시간 동안) 인큐베이션하여, 증폭된다. 일부 측면에서, 비분할 배양보조 세포는 감마-조사된(gamma-irradiated) PBMC 배양보조 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC에 약 3000 내지 3600 라드(rad) 범위의 감마선을 조사하여 세포 분열을 방지한다. 일부 측면에서, 배양보조 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃ 이상, 일반적으로 적어도 약 30℃ 이상 및 일반적으로 (약) 37℃를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션은 배양보조 세포로서 비분할 EBV 형질전환 림프아구 세포(LCL)를 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 라드 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서, LCL 배양보조 세포는 임의의 적합한 양으로 제공되며, 예컨대 LCL 배양보조 세포 대 초기 T 림프구의 비가 적어도 약 10:1 이상으로 제공된다.
III. 조성물
또한, 본원에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등의 결합 분자를 포함하는 조성물이 제공되며, 약학 조성물 및 제형이 포함된다. 또한, 본원에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 제공되며, 약학 조성물 및 제형이 포함된다. 상기 조성물 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 선택적인 허용 가능한 운반체 또는 부형제를 포함한다.
용어 “약학 제형(pharmaceutical formulation)”은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적일 수 있도록 하는 형태이고, 상기 제형이 투여되는 대상체에 허용 가능하지 않을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제(preparation)를 지칭한다.
“약학적으로 허용 가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)”는 활성 성분 외의 약학적 제형 안에 있는 성분을 지칭하고, 이는 대상체에 무독성이다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 운반체의 선택은 특정 세포, 결합 분자 및/또는 항체 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 적합한 제형이 다양하게 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화 벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 운반체는 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 사용된 용량 및 농도에서 일반적으로 수용자(recipient)에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 염화 벤잘코늄; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로 헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 마노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 설탕; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제에는 예를 들어, 구연산, 구연산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염이 포함된다. 일부 측면에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 알려져 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기술되어 있다.
일부 측면에서, 상기 조성물은 보존제들을 함유할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화 벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 운반체는 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술되어 있다. 허용 가능한 운반체는 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 염화 벤잘코늄; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로 헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 마노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 설탕; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
항체들의 제형은 동결 건조된 제형 및 수용액을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제로서, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀션, 분산액 또는 점성 조성물로 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제제는 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 보다 용이하다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 적절한 점도 범위 내에서 제형화되어 특정 조직과의 보다 긴 접촉 기간을 제공할 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있는 운반체를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적합한 운반체, 희석제 또는 멸균수, 생리식염수, 포도당, 덱스트로스 등과 같은 부형제와의 혼화제와 같은 용매에 결합 분자를 통합함으로써 제조될 수 있다. 조성물은 또한 냉동 건조될 수 있다. 조성물은 원하는 투여 경로 및 제제에 따라, 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제, 색소 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 제조를 위하여 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 포함한, 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 주사용 약학적 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.
조성물은 또한 냉동 건조될 수 있다. 조성물은 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 방부제, 향미제 및/또는 색소 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 제조를 위하여 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
생체 내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
IV. 방법 및 용도
일부 구현예에서, 하나 이상의 항-이디오타입 항체의 사용을 수반하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, CAR 또는 CAR을 발현하는 세포 등의 표적 항체를 측정 또는 검출하는 방법, 및 CAR의 활성 또는 CAR을 발현하는 세포의 활성 등 표적 항체의 활성을 변형시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, CAR 또는 CAR을 발현하는 세포 등의 표적 항체를 측정 또는 검출하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 항-이디오타입 항체는 CAR 및/또는 CAR을 발현하는 세포에 결합하고, 이를 검출하고, 식별하고, 정제하고, 선택하고, 및/또는 정량화한다. 일부 측면에서, CAR의 활성 또는 CAR을 발현하는 세포의 활성 등 표적 항체의 활성을 변형시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 항-이디오타입 항체를 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 생각되는 세포 또는 샘플과 접촉 및/또는 인큐베이션하는 하나 이상의 단계를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 항-이디오타입 항체와 표적 항체(예를 들어, CAR) 사이의 복합체의 형성이 가능한 조건 하에 조성물 또는 샘플과 처리(treated), 인큐베이션 및/또는 접촉된다. 일부 측면에서, 복합체는 CAR을 검출, 단리, 및/또는 측정하는 목적으로 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 복합체의 형성은 표적 항체(예를 들어, CAR)의 활성을, 예컨대 수용체 신호 전달 활성을 자극함으로써 변형시키거나, 일부 구현예서, CAR과 항원의 회합을 방지함으로써 표적 항체(예를 들어, CAR)의 활성에 길항작용한다. 일부 구현예에서, CAR은 본원, 예를 들어 섹션 I에 기재된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 CAR이다.
A. 검출/단리 방법
일부 구현예에서, 항체(예를 들어, 표적 항체)를 검출, 결합, 선택 및/또는 단리하기 위한, 항-이디오타입 항체들 중 하나 이상, 및/또는 이러한 항-이디오타입 항체들 중 하나 이상을 함유하는 분자들(예컨대, 접합체 및 복합체)의 사용을 수반하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 항-이디오타입 항체를 샘플 및/또는 조성물에 접촉, 인큐베이션 및/또는 노출시키는 하나 이상의 단계를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 포함하는 조성물을, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 면역접합체와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 면역접합체와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 포함하는 CAR을 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체, 또는 이의 항원 결합 단편)에 결합된 세포를, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 면역접합체와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플 및/또는 조성물은 하나 이상의 항-이디오타입 항체에 의해 결합 및/또는 인식되는 표적 항체 및/또는 이의 항원 결합 단편을 가지고/가지거나, 가질 가능성이 있고/있거나 가진 것으로 의심된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 항-이디오타입 항체에 의해 결합되는 또는 인식되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 융합 도메인을 함유하고/거나 융합 단백질이다. 특정 구현예에서, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR이다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 항체 단편)를 함유하는, CAR을 포함하는 키메라 분자 또는 접합체를 포함하는 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체) 또는 이의 항원 결합 단편에 결합 및/또는 이를 인식한다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 항체 단편)를 함유하는, CAR을 포함하는 키메라 분자 또는 접합체를 포함하는 하나보다 많은 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체) 또는 이의 항원 결합 단편에 결합 및/또는 이를 인식한다.
일부 구현예에서, 항-GPRC5D 표적 항체 또는 항원 결합 단편은 세포에 결합되거나 세포의 표면 상에 발현된다. 일부 구현예에서, 항-GPRC5D 표적 항체 또는 항원 결합 단편은 세포의 표면 상에 발현된 CAR 등의 키메라 항원 수용체(CAR)에 함유된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 줄기세포(예를 들어, iPSC) 또는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 T 세포이다. T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포, 또는 이들의 임의의 서브세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 나이브 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 연관 불변 T(MAIT) 세포, 천연 발생 및 적응성 조절 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및/또는 델타/감마 T 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 조직, 예를 들어 심장, 혈관, 침샘, 식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 창자, 결장, 직장, 시상하부, 뇌하수체, 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신, 신장, 요관, 방광, 요도, 림프계, 피부, 근육, 뇌, 척수, 신경, 난소, 자궁, 고환, 전립선, 인두, 후두, 기관(trachea), 기관지, 폐, 횡격막, 뼈, 연골, 인대 또는 힘줄로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 세포는 대상체(예를 들어, 인간 대상체) 유래 샘플로부터 단리 또는 선택되고 세포외 항원 결합 도메인에 항-GPRC5D 표적 항체를 함유하는 표적 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CAR-발현 T 세포의 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 대상체) 유래 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플로부터 T 세포(예를 들어, CD3+, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 단리 또는 선택하는 단계, 단리되어 선택된 T 세포를 (예를 들어, 항-CD3/항-CD28 시약, 예컨대 항-CD3/항-CD28 비드 (예를 들어, Dynabeads)로) 활성화시키는 단계, 및 이어서 활성화된 세포를 그의 세포외 항원 결합 도메인에 항-GPRC5D 표적 항체를 함유하는 표적 항-GPRC5D CAR을 암호화하는 벡터로 형질도입시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산될 수 있다. 일부 경우에, 형질도입된 T 세포는 CAR-발현 T 세포의 증식 또는 증폭을 위한 조건에서 하나 이상의 자극 시약 (예를 들어, 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15)의 존재 하에 추가로 인큐베이션 또는 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 표적 항-GPRC5D CAR-발현 T 세포를 함유하는 T 세포의 조성물을 제공된 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편과 결합된 T 세포를 검출 또는 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 T 세포의 조성물 중 표적 항-GPRC5D CAR-발현 T 세포의 수를 조성물 중 전체 세포 또는 전체 T 세포와 비교하여 백분율 또는 수로서 정량화 또는 결정하는 데 사용될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 표적 항체(예를 들어, CAR)는 세포 내에서 결합되거나 함유되지 않으며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적 항체는 분비된다. 특정 구현예에서, 이 항체는 세포의 표면으로부터 탈착, 제거 및/또는 용해되었다.
일부 구현예에서, 본 방법은 표적 항체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플 및/또는 조성물을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리(treating) 및/또는 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 항-이디오타입 항체를 조성물에 존재하는 표적 항체에 결합시키기 위한 허용 가능한 조건 하에, 예를 들어 항-이디오타입 항체 및 표적 항체를 함유하는 복합체를 형성한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 표적 항-GPRC5D 항체, 또는 표적 항체를 함유하는 표적 항-GPRC5D CAR을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플 및/또는 조성물을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리(treating) 및/또는 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 샘플 또는 조성물은 표적 항-GPRC5D CAR을 발현하는 세포를 함유하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 T 세포 등의 세포의 조성물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인큐베이션하는 단계는 항-이디오타입 항체를 조성물에 존재하는 표적 항-GPRC5D 항체에 결합시키기 위한 허용 가능한 조건 하에, 예를 들어 항-이디오타입 항체 및 표적 항-GPRC5D 항체를 함유하는 복합체를 형성한다.
일부 구현예에서, 샘플 및/또는 조성물은 표적 항체(예를 들어, CAR)를 함유하거나 함유하는 것으로 의심된다. 특정 구현예에서, 샘플 및/또는 조성물은 표적 항체(예를 들어, CAR)를 발현하는 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 의심된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 표적 항-GPRC5D 항체를 함유하는 세포외 항원 결합 도메인을 가진 CAR을 발현하는 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD3+ T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 표적화 항-GPRC5D CAR을 발현하는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플 또는 조성물은 예를 들어 대상체 유래의 생물학적 샘플로부터 단리된 T 세포로부터 표적 항-GPRC5D CAR을 이용하여 생체외에서 생산된 또는 조작된 T 세포의 샘플(예를 들어, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플)이다. 일부 구현예에서, 샘플 또는 조성물은 대상체, 예를 들어 표적 항-GPRC5D CAR-발현 T 세포를 함유하는 치료용 조성물의 용량을 이전에 투여받은 대상체 유래 샘플로부터 직접 수득된 표적 항-GPRC5D CAR-발현 T 세포를 함유하는 것으로 알려지거나 의심되는 샘플이다. 특정 구현예에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 구체적인 구현예에서, 샘플은 혈청 샘플 또는 혈액 샘플이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 하나 이상의 면역 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직, 또는 상피 조직 등의 조직이거나 이로부터 유래된다. 구체적인 구현예에서, 생물학적 샘플은 심장, 혈관, 침샘, 식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 창자, 결장, 직장, 시상하부, 뇌하수체, 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신, 신장, 요관, 방광, 요도, 림프계, 피부, 근육, 뇌, 척수, 신경, 난소, 자궁, 고환, 전립선, 인두, 후두, 기관(trachea), 기관지, 폐, 횡격막, 뼈, 연골, 인대 또는 힘줄로부터 오거나 유래된다. 구체적인 구현예에서, 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 채취, 수집 및/또는 수득된다. 특정 구현예에서, 샘플은 살아있는 및/또는 온전한 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 샘플은 균질물 및/또는 파괴되고/되거나 용해된 세포이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 및/또는 조직으로부터 단리된 단백질 및/또는 항체를 함유한다.
구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항체(예를 들어, CAR)와 복합체를 형성하거나 형성할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 예를 들어 CAR에 함유된 표적 항체와 복합체를 형성하거나 형성할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 복합체는, 예를 들어 조성물 또는 샘플에서, 표적 항체의 검출, 식별, 측정 및/또는 정량화를 가능하게 하기 위해, 예를 들어 검출, 측정, 정량화 및/또는 평가된다. 특정 구현예에서, 본 방법은 샘플에서 항-이디오타입 항체와 표적 항체 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계 및/또는 이러한 결합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체는 검출 가능한 표지를 함유한다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 검출 가능한 표지를 함유하는 면역접합체이다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 검출 가능한 표지를 함유하고/거나, 이에 접합, 결합, 및/또는 부착된다. 일부 구현예에서, 복합체는 항-이디오타입 항체, 예를 들어 검출 가능한 표지에 접합, 결합, 및/또는 부착된 2차 항체에 결합하고/거나 이를 인식하는 항체를 함유한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 샘플 또는 조성물에서, 표적 항체를 검출, 정량화, 및/또는 평가하는 방법은 표적 항체와 항-이디오타입 항체의 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체는 검출 가능한 표지를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 검출이 가능한 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 항체는 결합의 검출이 가능하도록 변형된다. 예를 들어, 항체는 직접적인 검출 또는 2차 제제를 통한 검출을 허용하는 검출 가능한 분자에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지는 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 염료 표지)이다. 일부 구현예에서, 표지는 친화성 표지(예를 들어, 비오틴 표지)이다. 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 표지를 부착하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 표지 및 표지 키트는 Invitrogen Corp, Carlsbad, Calif 등에서 상업적으로 입수할 수 있다. 일부 구현예에서, 표지는 검출 분석에서 호환하여 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 표지는 진단 분석에서 호환하여 사용할 수 있다. 본원에서 고려되는 표지는 형광 염료, 형광 단백질, 방사성 동위원소, 발색단, 금속 이온, 금 입자(예를 들어, 콜로이드 금 입자), 은 입자, 강한 광 산란 특성을 갖는 입자, 자성 입자(예를 들어, 자성 비드 입자, 예컨대 Dynabeads®자성 비드), 폴리펩타이드(예를 들어, FLAGTM 태그, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그 등), 과산화효소(예를 들어, 호스래디시 과산화효소) 또는 포스파타아제(예를 들어, 알칼리 포스파타아제) 등의 효소, 스트렙타비딘, 비오틴, 발광 화합물(예를 들어, 화학발광 기질), 올리고뉴클레오타이드, 특이적 결합 쌍의 멤버(예를 들어, 리간드 및 그의 수용체) 및 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 때 상기 항체를 가시화하거나 또는 검출하는 데 사용되는 관련 기술분야에 널리 알려진 다른 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 표지는 호스래디시 과산화효소이며, 이는 호스래디시 과산화효소의 존재 하에 색상 변화를 일으키는 적절한 기질을 첨가하여 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 표지는 콜로이드 금 입자이며, 이 금 입자의 응집으로 인한 용액의 색 변화를 검출함으로써 검출할 수 있다. 금 입자 표지 항체를 검출하는 다른 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다(문헌[Dykman et al. (2011) Acta Naturae. 3(2):34-55] 참조). 일부 예에서, 항체는, 본원에 제공된 1차 항체에 결합하고 그리고 검출 가능한 단백질, 예컨대 형광 프로브 또는 검출 가능한 효소, 예컨대 호스래디시 과산화효소에 커플링된 2차 항체 시약에 의한 것과 같이, 2차 시약을 사용하여 검출될 수 있다.
특정 구현예에서, 복합체는 검출 가능한 표지로 탐침 및/또는 접촉된다. 일부 구현예에서, 복합체는 유세포 분석, 면역세포화학법, 면역조직화학법, 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 등의 그러나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법 또는 수단에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포는 친화도-기반 분리, 예를 들어, 면역 친화도-기반 분리에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 친화도-기반 분리는 유세포 분석에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 친화도-기반 분리는 자성 활성화 세포 분류에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 친화도-기반 분리는 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피에 의한 것이며 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 가역적으로 결합 또는 고정된다.
일부 구현예에서, 샘플 또는 조성물은 고체 지지체 또는 고체 지지체를 포함하는 디바이스의 존재 하에 또는 그 상에서 또는 그 내에서 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편과 혼합된다. 일부 구현예에서, 샘플 또는 조성물은 하나 이상의 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편과 혼합되어 혼합물을 생성하고, 이 혼합물은 이어서 고체 지지체 또는 고체 지지체를 포함하는 디바이스에 적용된다. 본원의 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 샘플 또는 조성물과 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편의 인큐베이션을 포함한다. 하나 이상의 인큐베이션은 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 항체와 접촉시킨 후 샘플이 하나 이상의 항체와 접촉을 허용하기에 적합한 시간 동안, 예컨대 적어도 또는 적어도 약 30초, 1분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 또는 12시간 이상 동안 그러나 약 24시간 이하 동안 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉하는 단계는 (약) 0ºC 내지 약 50ºC, 예컨대 일반적으로 2ºC 내지 8ºC 또는 23ºC 내지 28ºC 또는 37ºC 내지 42ºC의 온도에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 방법들은 고체 지지체 상에 결합된 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편을 보유하고/거나 복합체의 일부가 아닌 샘플의 부분으로부터 복합체를 분리하는 조건 하에 접촉 또는 인큐베이션한 후 하나 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 접촉은 예를 들어 조성물 중 세포에 의해 발현된 CAR에 함유된 항-GPRC5D 표적 항체에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 형성하는 조건 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 결합의 검출은 단백질 표적 및 결합제(예를 들어, 항체) 사이의 결합을 검출하기 위한 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 검출 기술, 예컨대 비제한적으로 분광 광도법, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 효소결합면역흡착분석(ELISA) 등의 면역분석, 웨스턴 블롯, 자동 이미지화(automated imaging), 면역조직화학, 유세포 분석, 마이크로어레이 또는 나노어레이 등과 같은 어레이의 고처리량 스크리닝, 및 표면 플라스몬 공명에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는, 비제한적으로, 샌드위치 ELISA 또는 경쟁적 ELISA를 비롯한 효소결합면역흡착분석(ELISA) 또는 다른 유사한 면역분석; 면역조직화학(IHC); 유세포 분석 또는 웨스턴 블롯;을 포함한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 결합 분석법 또는 면역분석을 사용하여, 예를 들어 조성물 중 세포에 의해 발현된 CAR에 함유된 항-GPRC5D 표적 항체를 검출할 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 샘플 또는 조성물에서 표적 항체를 검출, 정량화 및/또는 평가하기 위한 제공된 방법은 카트리지-기반 유동 방법을 사용하여 수행된다(예를 들어, 문헌[WO 2011/128893, WO 2014/097286, WO 2014/097287, US 2014/0170678, US 2015/0330971]을 참조한다. 이들 각각의 내용은 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.) 일부 구현예에서, 카트리지-기반 유동 방법은 미세유체역학 디바이스, 예를 들어 미세유체역학 카트리지 및 카트리지 핸들링 유닛을 포함하는 디바이스를 이용하여 수행된다. 특정 측면에서, 카트리지-기반 유동 방법의 사용은 카트리지 핸들링 유닛에서 시스 유체의 특수 세정, 유지 또는 사용에 대한 필요성을 제거한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 예를 들어 본원에 제공된 항-이디오타입 항체에 의해 인식되는 항체 또는 이의 단편을 함유하는 재조합 폴리펩타이드(예를 들어, CAR)를 발현하는 세포 요법의 생성과 관련하여 제조, 분석 및/또는 품질 관리 방법의 일부로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 예를 들어 개체에서 요법에 사용하기 위해 조작된 세포에서 조작된 수용체의 발현을 검출, 분석시험 및/또는 확인하는 것을 포함하여 시험 목적을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 개체에게 투여될 CAR-T 세포의 용량을 결정하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 세포 조성물은 CAR 발현 T 세포를 생성하는 과정 중 임의의 단계에서 시험될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 세포의 샘플은 공정의 임의의 단계에서 세포 조성물로부터 수집될 수 있고, 예를 들어, 추후 시험 및/또는 분석을 위해 냉동 동결 및/또는 냉동 보존에 의해 저장될 수 있다. 시험된 조성물은 예를 들어 세포를 함유하는 것 및 약학적으로 허용 가능한 수용자 및/또는 냉동 보존제를 포함하는 약학 조성물일 수 있다.
일부 구현예에서, 카트리지-기반 유동 방법은 자동화된 방법(예를 들어, 최소한의 조작자 입력이 요구되는 방법)이다. 특정 측면에서, 자동화된 방법은 조작자 및/또는 고가 장비와 관련된 비용을 감소시킨다. 특정 측면에서, 자동화된 방법은 전통적인 분석(예를 들어, 유세포 분석)을 사용하는 것보다 수행하기 더 쉽고 빠르다. 특정 측면에서, 자동화된 방법은 샘플의 가공 시간을, 예를 들어 샘플 당 약 30 내지 40분까지 감소시킨다. 일부 구현예에서, 자동화된 방법은 전통적인 분석을 사용하여 수행되는 것보다 더 일관되고 견고하다.
일부 구현예에서, 미세유체역학 디바이스는 벤치탑 기구(benchtop instrument)이다. 특정 측면에서, 미세유체역학 디바이스의 차지하는 공간이 더 적을수록 세포 가공 또는 시험실에 디바이스를 직접 배치할 수 있다. 특정 측면에서, 방 및/또는 실험실 사이에서 이동될 필요가 있는 샘플의 양은 감소되고, 이에 의해 샘플을 옮기는 것과 관련된 정체성의 연속성 및/또는 보관의 연속성 문제를 감소시킨다.
일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 샘플 조성물 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 블리스터 구획을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 유체 혼합에 맞춰진 처리 구획을 포함하며, 상기 처리 구획은 샘플 조성물 챔버 및 블리스터와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 판독 구역을 포함하는 평가 챔버를 포함하고, 평가 챔버는 처리 챔버와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 판독 구역은 샘플이 판독 구역을 통과할 때 샘플의 분석이 가능하다.
일부 구현예에서, 샘플은 샘플 조성물 챔버 내부에 배치된다. 일부 구현예에서, 블리스터는 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 태그)에 접합된다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 카트리지 핸들링 유닛에 삽입된다. 일부 구현예에서, 카트리지 핸들링 유닛은 치료 구획에서 샘플을 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉 및/또는 혼합한다. 일부 구현예에서, 접촉 및/또는 혼합은 표적 항체(예를 들어, CAR)와 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 복합체의 형성을 유발한다.
다른 구현예에서, 샘플은 건조된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 튜브(관)에 첨가된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 태그)에 접합된다. 일부 구현예에서, 튜브(관)는 다른 건조된 시약, 예를 들어, 다른 표지 항체, 염료 또는 용해제를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 튜브(관)는 건조된 시약의 혼합 및/또는 재수화를 위해 와동하였다. 일부 구현예에서, 혼합 후 샘플은 샘플 조성물 챔버 내부에 배치된다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 카트리지 핸들링 유닛에 삽입된다.
일부 구현예에서, 카트리지 핸들링 유닛은 샘플의 개별 세포를 판독 구역을 통과해 흐르게 한다. 일부 구현예에서, 카트리지 핸들링 유닛은 표적 항체(예를 들어, CAR)에 결합된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 형광 신호를 측정한다. 일부 구현예에서, 형광 신호는 광전자 유닛을 이용하여 측정된다. 일부 구현예에서, 형광 신호는 스펙트럼 분석(spectral analysis)을 이용하여 분석된다.
일부 구현예에서, 표적 항체 또는 항원 결합 단편은 세포에 결합되거나 세포의 표면 상에 발현된다. 구체적인 구현예에서, 표적 항체(예를 들어, CAR)는 세포 내에서 결합되거나 함유되지 않으며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적 항체는 분비된다. 특정 구현예에서, 이 항체는 세포의 표면으로부터 탈착, 제거 및/또는 용해되었다.
일부 구현예에서, 표적 항체 또는 항원 결합 단편은 세포의 표면 상에 발현된 CAR 등의 키메라 항원 수용체(CAR)에 함유된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 줄기세포(예를 들어, iPSC) 또는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 예를 들어, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 연관 불변 T(MAIT) 세포, 천연 발생 및 적응성 조절 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및/또는 델타/감마 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 조직, 예를 들어 심장, 혈관, 침샘, 식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 창자, 결장, 직장, 시상하부, 뇌하수체, 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신, 신장, 요관, 방광, 요도, 림프계, 피부, 근육, 뇌, 척수, 신경, 난소, 자궁, 고환, 전립선, 인두, 후두, 기관(trachea), 기관지, 폐, 횡격막, 뼈, 연골, 인대 또는 힘줄로부터 유래된다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 표적 항체는 항-GPRC5D 항체이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 항-GPRC5D 항체는 예를 들어 섹션 I에 기술된 표적 항-GPRC5D 항체이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에, 예를 들어 섹션 I에 기술된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
B. 세포 자극에서 용도
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 작용제이고/거나 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체) 또는 이의 항원 결합 단편과 같이, 접합체를 포함한 표적 항체 또는 이를 함유한 키메라 수용체를 발현하는 세포를 자극하는 데 특이적 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, CAR-발현 또는 다른 키메라 수용체-발현 세포, 예컨대 T 세포의 자극 또는 활성화를 위해, 제공된 항-이디오타입 항체, 및 하나 이상의 이러한 항-이디오타입 항체를 함유하는 분자(예컨대, 접합체 및 복합체)의 사용을 수반하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, CAR 또는 다른 수용체는 표적 항체, 예컨대 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체), 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 유전자 조작된 T 세포를 제조하는 방법과 관련하여 사용될 수 있으며, 예컨대 표적 항체를 포함하는 CAR과 같은 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 분자가 예를 들어 형질주입, 형질도입 또는 트랜스포손-기반 접근법과 같은 핵산 전달의 비-바이러스 수단에 의해 도입된 유전자 조작된 T 세포 또는 다른 세포를 증폭시키는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 표적 항체는 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체), 또는 이의 항원 결합 단편이다. 구체적인 구현예에서, 표적 항체는 CAR(예를 들어, 항-GPRC5D CAR)이거나 이를 함유한다. 구체적인 구현예에서, 항-GPRC5D CAR은 표적 항-GPRC5D 항체 등의 항-GPRC5D 항체의 것이고/거나 이로부터 유래된 scFv를 함유한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 CAR로 형질도입된 T 세포를 포함하는 샘플을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 CAR T 세포가 활성화되거나 자극되었는지, 예컨대 CAR T 세포 내 활성화 표지자의 생존력, 증식 및/또는 발현을 평가함으로써 검출하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항체는 항-GPRC5D 항체이다. 일부 구현예에서, 표적 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 등의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 표적 항체에 결합하거나 이를 인식하는 본원에 기술된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 것을 포함하는, 세포를 자극하여 자극된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CAR에 결합하여, 투입 조성물 내 하나 이상의 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR을 발현하는 세포를 함유하는 투입 조성물을, CAR에 결합하고/하거나 이를 인식하는 항-ID 항체와 함께 인큐베이션함으로써, CAR을 발현하는 세포를 자극하거나 증폭시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항-ID 항체와 CAR 간의 결합은 CAR을 발현하는 세포의 증폭을 유도하여, 증폭된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산한다.
일부 구현예에서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에 제공되는 바와 같은 면역접합체와 접촉시키는 단계, 및 (b) 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 단리하는 단계를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체는 친화도-기반 분리에 의해 단리된다. 일부 구현예에서, 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 상기 친화도-기반 분리는 자성-기반 분리이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피이다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 하나 이상의 세포의 투입 조성물과 접촉 또는 인큐베이션되어 산출 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 입력 세포 및/또는 투입 조성물은 투입 조성물의 세포의 적어도 일부에 대한 하나 이상의 변화를 생성함으로써 투입 조성물을 산출 조성물로 전환시키는 조건 하에서 처리, 인큐베이션, 또는 접촉되거나 그렇게 되길 원하는 조성물 및/또는 복수의 세포이다. 일부 구현예에서, 입력 세포는 면역 세포의 조성물, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 함유하는 T 세포의 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 투입 조성물에서 세포의 적어도 일부는 생성된 산출 조성물에서 제공된 방법의 실시에 의해 활성화, 증폭, 및/또는 농축된다.
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 투입 조성물의 CAR 발현 세포를 증폭 또는 농축한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 인간 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 혈액, 골수, 림프, 또는 림프구 기관으로부터 유래된 세포를 함유한다. 구체적인 구현예에서, 투입 조성물은 면역계의 세포, 즉, 선천성 또는 적응성 면역 세포, 예를 들어, 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 골수성 또는 림프성 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)를 포함한, 다분화능 및 다능성 줄기세포와 같은 줄기세포를 함유한다. 구체적인 구현예에서, 투입 조성물은 CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 CD4+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 또는 CD8+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD4+ 세포 조성물이다. 구체적인 구현예에서, 투입 조성물은 CD8+ 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 본 방법 및 제제는 하나 이상의 공자극 수용체 또는 항원 수용체 또는 사이토카인 수용체와 같은 하나 이상의 천연 신호 전달 분자가 결핍되거나 하향 조절되었지만, 항-ID 항체에 의해 인식되는 키메라 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 T 세포를 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 CD28 또는 다른 공자극 분자 또는 다른 신호 전달 분자의 표면 발현에 대해 낮거나 음성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 제공된 제제 및 방법은 CD28 또는 다른 내인성 신호 전달 분자의 표면 발현을 필요로 하거나 이에 의존할 수 있는 특정 다른 활성화제 또는 자극제 또는 방법과 비교하여, 원하는 신호 및/또는 이러한 신호의 완전한 정도를 제공하고/하거나, 예를 들어 공자극 신호를 제공하고/하거나 완전한 활성화를 달성하는 특정 이점을 갖는다. 일부 구현예에서, 제공된 제제 및 방법은 항-CD3/항-CD28 시약(예를 들어, 비드)과 비교하여 이러한 측면에서 유리하고; 일부 측면에서, 제공된 항-ID 항체는 CD28 또는 다른 천연 신호전달 분자에 대해 낮거나 음성인 세포의 활성화 또는 증식과 같은 원하는 효과를 자극하거나 달성할 수 있다는 점에서 유리하다. 일부 측면에서, 항-ID 항체로 자극에 의한 CAR을 통한 신호 전달은 단일 시약만을 사용하여 CAR을 통해 1차 및 2차(공자극) 신호 모두를 초래한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 낮은 수준의 CD28 또는 다른 내인성 신호 전달 분자를 발현하는 CD3+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD28 음성이거나 다른 내인성 신호전달 분자에 대해 음성인 CD3+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-ID 항체는 낮은 수준의 CD28을 발현하는 세포 또는 CD28 음성인 세포의 활성화 및/또는 증폭을 자극한다. 일부 구현예에서, 세포는 고체 지지체에 고정되거나 결합된 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉된다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 웰 또는 플레이트, 예를 들어 세포 배양 플레이트의 표면이다. 일부 예에서, 항-ID 항체는 용해성이다. 특정 구현예에서, 세포는 세포를 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉하기 전에 항-CD3/항-CD28 접합 시약과 접촉되지 않는다.
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR을 암호화하는 뉴클레오타이드로 형질도입 또는 형질주입된 세포의 투입 조성물에 적용되거나, 접촉되거나 또는 이와 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 입력 세포를 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉하면 CAR을 발현하는 세포의 증폭 및/또는 농축을 초래한다. 구체적인 구현예에서, 입력 세포를 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉하면 CAR을 발현하지 않는 세포의 증폭 및/또는 농축을 초래하지 않는다. 구체적인 구현예에서, 입력 세포를 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉하면 CAR을 발현하는 세포의 증폭 및/또는 농축보다 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.9% 또는 적어도 99.99% 적은 CAR을 발현하지 않는 세포의 확장 및/또는 농축을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체는 낮은 형질도입 및/또는 형질주입 효율을 경험했고/거나 낮은 양의 CAR 발현 세포를 함유한 투입 조성물의 CAR 발현 세포를 증폭시키기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR을 발현하는 세포를 선택적으로 증폭 및/또는 농축한다.
일부 실시예는 항-이디오타입 항체가 다클론 자극, 예를 들어 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 자극에 의해 세포를 증폭 및/또는 농축시키는 것보다 낮은 형질도입 또는 형질주입 효율을 가지고/거나 CAR을 발현하는 낮은 양의 세포를 가진 투입 조성물의 세포를 증폭 및/또는 농축하는 데 더 효과적이다. 구체적인 구현예에서, 다클론 자극은 투입 조성물에서 CAR을 발현하는 세포 및 발현하지 않는 세포의 증폭을 초래하며, 따라서, 일부 구현예에서, 특히 투입 조성물이 낮은 수의 CAR 발현 세포를 가질 때, CAR 발현 세포를 농축하는 데 실패할 수 있다. 반대로, 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션은 CAR 발현 세포의 선택적 증폭을 초래하며, 따라서 특정 구현예에서, CAR 발현 세포의 선택적 증폭 및/또는 농축을 초래할 것이다. 일부 구현예에서, 입력 세포를 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 접촉 및/또는 처리하면 다클론 자극에 의한 것보다 CAR 발현 세포의 더 큰 농축 및/또는 증폭을 초래한다.
구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 다클론 자극에 의해 증폭 및/또는 농축된 입력 세포보다 더 적은 양의 바이러스 입자, 바이러스 벡터 입자의 카피 수 대 세포 수 비, 및/또는 감염 단위(IU)로 형질주입 및/또는 형질도입된 입력 세포와 함께 인큐베이션, 이에 적용 및/또는 접촉된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체와 인큐베이션되는 투입 조성물은 다클론 자극에 의해 증폭 및/또는 농축된 투입 조성물보다 세포 당 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60IU 적은 양으로 형질도입된 세포로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체와 인큐베이션되는 투입 조성물은 다클론 자극에 의해 증폭 및/또는 농축된 투입 조성물보다 적어도 1 x 105 IU/mL, 5 x 105 IU/mL, 1 x 106 IU/mL, 5 x 10 6 IU/mL, 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 또는 1 x 107 IU/mL 적은 바이러스 벡터 입자의 역가로 형질도입된 세포로부터 생성된다.
구체적인 구현예에서, 높은 IU/세포로 형질도입하는 것은 높은 형질도입 효율로 이어질 것이지만, 일부 구현예에서, 또한 높은 벡터 복제수(VCN)로 형질주입된 세포로 이어질 수 있고, 이는 안전성 위험을 나타낼 수 있고, 규제 기준을 충족하지 못할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 세포가 형질도입되는 IU/세포를 낮추면 형질도입 효율을 감소시킬 것이나, VCN을 낮출 것이다. 구체적인 구현예에서, 세포가 형질도입되는 IU/세포를 높이면 형질도입 효율을 증가시킬 것이나, VCN도 높일 것이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물은 항-이디오타입 항체에 의해 결합 또는 인식되는 CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 형질도입 또는 형질주입된 세포 집단, 또는 형질도입 또는 형질주입된 세포로부터 유래된 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CAR 발현 세포인 세포를 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만 함유한다. 구체적인 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 섹션 II에 기술된 바와 같이 형질주입 또는 형질도입되었다. 특정 구현예에서, 입력 세포는 표적 항-GPRC5D 항체와 같은 항-GPRC5D 항체의 및/또는 이로부터 유래된 scFv를 함유하는 항-GPRC5D CAR와 같은 항-GPRC5D CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산으로, 형질도입 또는 형질주입된 세포 집단 또는 형질도입 또는 형질주입된 세포로부터 유래된 세포를 함유한다.
구체적인 구현예에서, 투입 조성물 유래 세포를 항-이디오타입 항체로 인큐베이션, 접촉 또는 처리는 세포의 자극, 증폭 및/또는 활성화를 위한 조건에서 수행되며, 이 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포들은 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 하나의 핵산으로 형질주입 또는 형질도입되었고, 이 세포들은 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체와 접촉, 인큐베이션 또는 처리되었다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 세포가 CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입 또는 형질주입된 후에 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 또는 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 투입 조성물의 세포가 형질도입 또는 형질주입된 후, 즉시, 약 1분 이내, 약 5분 이내, 약 30분 이내, 약 1시간 이내, 약 2시간 이내, 약 4시간 이내, 약 6시간 이내, 약 8시간 이내, 약 12시간 이내, 약 24시간 이내, 약 2일 이내, 약 3일 이내, 약 4일 이내, 약 5일 이내, 약 6일 이내, 약 1주 이내, 약 2주 이내, 약 3주 이내, 약 4주 이내, 약 5주 이내, 또는 약 6주 이내에 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 용해성 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉되고/거나, 교차 결합되지 않은 항체와 접촉하고/거나 고체 지지체에 결합 또는 부착되지 않는 항체와 접촉된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 항-Id 항체에 의해 인식되는 CAR과 같은 키메라 수용체를 발현하는 세포의, 활성화 표지자 또는 사이토카인 방출 또는 생산의 상향 조절과 같은, 증식, 활성화, 자극, 사이토카인 방출 또는 다른 기능적 결과를 가져온다. 일부 측면에서, 이러한 증식 또는 다른 기능적 반응 또는 판독은 항-CD3/CD28 비드 및/또는 교차 결합된 항-CD3과 같은 T 세포의 증식을 자극하는 제제 및/또는 조건에서 세포의 인큐베이션에 의해 유도된 것과 유사하거나 더 큰 정도로 이러한 세포에서 유도된다. 일부 측면에서, 본 방법은 항-이디오타입 항체의 교차 결합하기를 수반하지 않는다. 임의의 구현예 중 일부 측면에서, 항-이디오타입 제제는 항-이디오타입 항체의 교차 결합없이 특정 증식 또는 이의 기능적 결과 또는 정도를 유도할 수 있다. 일부 측면에서, 본원의 항-이디오타입 제제는 항-Id 항체를 교차 결합시키거나 2차 제제를 사용할 필요 없이, 표적 수용체를 발현하는 T 세포 또는 다른 면역 세포의 특정 기능적 결과를 자극하거나 야기하는 능력에 이점이 있다. 일부 측면에서, 결과는 항-이디오타입 항체의 용해성 또는 플레이트-결합된 형태로 달성된다. 일부 측면에서, 결과는 비드에 결합된 항-이디오타입 항체로 달성된다.
구체적인 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 10 μg/ml 내지 100 μg/ml, 1 μg/ml 내지 1 ng/ml, 1 ng/ml 내지 1 μg/ml 내지 100 ng/ml 내지 1.0 μg/ml, 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 10 ng/ml 내지 1.0 μg/ml, 100 ng/ml 내지 10 μg/ml, 250 ng/ml 내지 10 μg/ml, 250 μg/ml 내지 1 ng/ml, 1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 250 ng 내지 약 2.5 μg/ml, 또는 1 μg/ml 내지 10 μg/ml로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고체 지지체에 고정되고, 이것은 선택적으로 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약을 포함하거나 이에 접합된다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 플레이트 또는 웰의 표면이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 시약에 고정되고, 이것은 선택적으로 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함한다. 일 예시적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 용해성 시약 상에 존재하거나 고정된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자에 결합할 수 있는 스트렙타비딘-결합 펩타이드 또는 다른 스트렙타비딘 결합 모이어티를 포함하고, 일부 경우에, 상기 용해성 시약은 비오틴과 같은 경쟁 물질의 존재 하에서 해리될 수 있다. 이러한 시스템의 예는 문헌[PCT 공개 특허 출원 번호 WO2015/158868]에 기술된 것들을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 고체 표면 또는 지지체, 예를 들어 플레이트 또는 웰에 부착된, 결합된, 코팅된 및/또는 접합된 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 고체 표면 또는 지지체를 일정 농도의 항-이디오타입 항체와 인큐베이션함으로써 고체 표면 또는 지지체에 부착, 결합, 코팅 및/또는 접합되었다. 구체적인 구현예에서, 고체 표면 또는 지지체는 10 ng/ml 내지 100 μg/ml, 100 ng/ml 내지 1.0 μg/ml, 250 ng/ml 내지 10 μg/ml, 250 ng/ml 내지 1 μg/ml, 1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 250 ng 내지 2.5 μg/ml, 또는 1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 고체 표면 또는 지지체는 250 ng/ml 내지 10 μg/ml로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 고체 표면 또는 지지체는 (약) 0.25 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1.0 μg/ml, 1.25 μg/ml, 2 μg/ml, 2.5 μg/ml, 5 μg/ml 또는 10 μg/ml의 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 적어도 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 조성물 중 총 세포의 백분율로서 (약) 60% 미만, (약) 50% 미만, (약) 40% 미만, (약) 30% 미만, (약) 20% 미만 또는 (약) 10% 미만의 CAR-발현 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 산출 조성물 내 CAR 발현 세포의 수는 투입 조성물 내 CAR 발현 세포의 수와 비교하여 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 또는 그 이상 증가하고/거나; 산출 조성물 내 CAR 발현의 백분율은 조성물 내 총 세포와 비교하여 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션하기 전에, 세포는 CAR 발현 세포에 대해 선택되거나 농축되지 않는다.
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 예를 들어 투입 조성물의 하나 이상의 세포를 증폭하기 위한, 예컨대 재조합 수용체를 발현하는 투입 조성물의 세포를 증폭하기 위한, 시간량 동안, CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물 유래 세포와 접촉 또는 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 투입 조성물 유래 세포는 항-이디오타입 항체와 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 3주, 또는 적어도 약 4주 동안 접촉, 인큐베이션, 또는 처리된다. 구체적인 구현예에서, 투입 조성물 유래 세포는 항-이디오타입 항체와 약 1일 미만, 약 2일 미만, 약 3일 미만, 약 4일 미만, 약 5일 미만, 약 6일 미만, 또는 약 12일 미만 동안 접촉, 인큐베이션, 또는 처리된다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 유래 세포는 항-이디오타입 항체와 약 1일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 7일, 또는 4일 내지 6일 동안 접촉, 인큐베이션, 또는 처리된다.
구체적인 구현예에서, 예를 들어 CAR을 발현하는 세포를 포함하는, 투입 조성물 유래 세포는 재조합 수용체를 발현하는 투입 조성물의 세포를 증폭하기 위해 실온보다 높은 온도에서 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 접촉, 또는 처리된다. 일부 구현예에서, 처리, 인큐베이션, 또는 접촉은 약 25ºC보다 높은, 에컨대 일반적으로 (약) 32ºC, 35ºC 또는 37ºC보다 높은 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 처리, 접촉, 또는 인큐베이션은 (약) 37ºC ± 2ºC의 온도에서, 예컨대 (약) 37ºC의 온도에서 수행된다.
일부 구현예에서, 산출 조성물의 세포 중 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 약 100%, 또는 100%는 CAR을 발현한다.
구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된 산출 조성물 내 CAR을 발현하는 세포의 수는 투입 조성물 내 CAR을 발현하는 세포의 수보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많다.
구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된 산출 조성물 내 CAR을 발현하는 세포의 백분율은 투입 조성물 내 CAR을 발현하는 세포의 수보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 크다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된 산출 조성물 내 CAR을 발현하는 세포의 수는 다클론 자극, 항-CD3 및 항-CD28 항체와 인큐베이션을 받은 산출 조성물의 세포의 수보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많다.
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된 산출 조성물 내 CAR을 발현하는 세포의 백분율은 다클론 자극, 항-CD3 및 항-CD28 항체와 인큐베이션을 받은 산출 조성물의 세포의 수보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 크다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된 산출 조성물 내 CAR을 발현하는 세포는 다클론 자극을 받은, 예를 들어 항-CD3 및 항-CD28 항체와 인큐베이션된 산출 조성물의 세포보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 낮은 VCN을 함유한다. 일부 구현예에서, 출력의 CAR 발현 세포의 평균 VCN은 (약) 10, 5, 4, 2.5, 1.5, 또는 1 이하이다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은, 예를 들어 개체에서 요법에 사용하기 위해 조작된 세포에서, 조작된 수용체의 발현 및/또는 효능을 시험하는 것을 포함한 시험 목적을 위해 항-이디오타입 항체, 예컨대 CAR T 세포에 의해 인식되는 항체 또는 이의 단편을 함유하는 재조합 폴리펩타이드를 발현하는 세포 요법의 생성과 관련하여, 제조, 분석 및/또는 품질 관리 방법의 일부로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 조성물은 CAR 발현 T 세포를 생성하는 과정 중 임의의 단계에서 시험될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 세포의 샘플은 공정의 임의의 단계에서 세포 조성물로부터 수집될 수 있고, 예를 들어, 추후 시험 및/또는 분석을 위해 냉동 동결 및/또는 냉동 보존에 의해 저장될 수 있다. 시험된 조성물은 예를 들어 세포를 함유하는 것 및 약학적으로 허용 가능한 수용자 및/또는 냉동 보존제를 포함하는 약학 조성물일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 생체 내에서 표적 항체(예를 들어, CAR)을 발현하는 세포를 자극한다. 특정 구현예는 CAR-T 세포 요법이 암 및 다른 질환 및 장애의 치료에 효과적이라는 것을 고려한다. 하지만, 특정 맥락에서, CAR-T 세포 요법에 대한 이용 가능한 접근법이 항상 완전히 만족스럽지 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 대상체에서 CAR 발현 세포의 노출 및 지속성은 시간이 지남에 따라 감소되거나 감소한다. 그러나, 일부 경우에, CAR 발현 세포의 노출 증가는 CAR-T 세포 요법에서 효능 및 치료 결과를 향상시킬 수 있다는 것을 관찰하였다. 따라서, 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR 발현 세포의 지속성 및/또는 증폭을 강화, 증강 및/또는 증가시키기 위해 투여된다.
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR 발현 세포를 함유하는 치료용 세포 조성물을 이전에 투여받은 대상체와 같은 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체를 대상체에게 투여하면 대상체에서 CAR 발현 세포의 재-증폭을 촉진하며, 이는 일부 경우에 항-이디오타입 항체의 투여 전 증폭의 초기 피크 수준에 도달하거나 이를 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR 발현 세포의 수준이 감소되거나 검출 가능하지 않은 때에 CAR 발현 세포의 증폭 및/또는 지속성을 조절하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체에 의해 재-증폭된 CAR 발현 세포는, 예를 들어, 항-이디오타입 항체의 투여 전 효능과 비교하여, 투여되는 대상체에서 증가된 효능을 나타낸다.
특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 대상체에서 CAR 발현 세포의 지속성을 증가시키거나 향상시킨다. 일부 구현예에서, CAR 발현 세포는 항-이디오타입 항체의 투여 후 적어도 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일, 56일, 63일, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 6개월 이상 시점에 대상체에서 검출 가능하다. 일부 측면에서, 세포에 대한 대상체의 노출 증가는 세포의 증폭 및/또는 증폭 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 발현 세포는 항-이디오타입 항체의 투여 이후 대상체에서 증폭한다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체를 투여하면 대상체의 혈액 또는 혈청 또는 다른 체액 또는 기관 또는 조직에서, DNA의 마이크로그램 당 CAR을 암호화하는 핵산의 적어도 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10,000 또는 15,000개 카피, 또는 마이크로리터 당 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 0.9개 CAR 발현 세포의 최대 농도를 초래한다. 일부 구현예에서, CAR을 발현하는 세포는 항-이디오타입 항체의 투여 후 대상체의 혈액 내 총 PBMC의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 만큼, 및/또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48, 또는 52주 동안 또는 항-이디오타입 항체의 투여 후 1, 2, 3, 4, 또는 5년 이상 동안 그러한 수준으로 검출된다. 일부 측면에서, 항-이디오타입 항체를 투여하면 예를 들어, 대상체의 혈청, 혈장, 혈액 또는 조직, 예를 들어, 종양 샘플에서 DNA 마이크로그램당 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 암호화하는 핵산의 카피수에 있어서 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배 또는 적어도 20의 증가를 초래한다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체를 투여하면 대상체에서 순환하는 CAR 발현 세포의 수를 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배, 또는 적어도 20배 증가시킨다.
일부 측면에서, 항-이디오타입 항체의 투여 후, 적어도 약 1 x 102, 적어도 약 1 x 103, 적어도 약 1 x 104, 적어도 약 1 x 105, 또는 적어도 약 1 x 106 또는 적어도 약 5 x 106 또는 적어도 약 1 x 107 또는 적어도 약 5 x 107 또는 적어도 약 1 x 108개의 CAR 발현 세포, 및/또는 마이크로리터당 적어도 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500, 또는 1000개의 CAR 발현 세포, 예를 들어, 마이크로리터당 적어도 10개가 대상체 또는 이의 체액, 혈장, 혈청, 조직 또는 구획에서, 예컨대 혈액(예를 들어, 말초 혈액), 또는 질병 부위에서 검출 가능하거나 존재한다. 일부 구현예에서, 세포의 상기 수 또는 농도는 항-이디오타입 항체의 투여 이후 적어도 약 20일, 적어도 약 40일, 또는 적어도 약 60일, 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월, 또는 적어도 2 또는 3년 동안 대상체에서 검출 가능하다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있고, 항-이디오타입 항체를 투여하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 리포솜, 마이크로입자, 및 마이크로캡슐 내에 캡슐화되어 및/또는 이에 부착되어 투여된다. 항-이디오타입 항체를 투여하는 방법은 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하며 그러나 이에 한정되지는 않는다. 항-이디오타입 항체는 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입에 의해, 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 라이닝(예를 들어, 경구, 직장 및 창자 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 예를 들어 흡입기 또는 분무기의 사용에 의한, 그리고 에어로졸화제를 사용한 제형에 의한 폐 투여도 채용될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 소포(vesicle)에, 구체적으로 리포솜(Langer, 1990, Science 249:1527-1533), 예를 들어 양이온성 리포솜(WO 98140052)에 담겨 전달된다.
일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산 분자를 세포 내로 도입하여 투입 조성물을 생성하는 단계, 및 투입 조성물을 CAR의 항원 결합 도메인에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 인큐베이션하여 세포 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 세포 조성물 생산 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 면역접합체이다. 일부 구현예에서, CAR은 GPRC5D에 결합하거나 이를 인식하는 표적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 작용제이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 길항제이다. 일부 구현예에서, 도입은 바이러스 형질도입, 전위, 전기 천공, 또는 화학적 형질주입에 의해 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 도입은 핵산 분자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 이용한 형질도입에 의해, 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용한 형질도입에 의해, 핵산 분자를 포함하는 트랜스포손을 이용한 전위에 의해, 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터의 전기 천공 또는 형질주입에 의해 세포에 핵산 분자를 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 도입하기 전에 세포를 자극 또는 활성화하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 세포를 활성화하는 단계는 세포를 CD3의 작용제와, 선택적으로 CD28의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포를 활성화하는 단계는 세포를 작용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 항-CD3/항-CD28과의 접촉의 적어도 일부 동안 및/또는 CAR을 암호화하는 핵산 도입의 적어도 일부 동안, 본 방법은 세포를 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편과 인큐베이션 또는 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CAR에 결합하여, 투입 조성물 내 하나 이상의 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포를 포함한다.
일부 상기 구현예에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고체 지지체에 고정되고, 이것은 선택적으로 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약을 포함하거나 이에 접합된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 시약에 고정되고, 이것은 선택적으로 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함한다. 일 예시적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 용해성 시약 상에 존재하거나 고정된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자에 결합할 수 있는 스트렙타비딘-결합 펩타이드 또는 다른 스트렙타비딘 결합 모이어티를 포함하고, 일부 경우에, 상기 용해성 시약은 비오틴과 같은 경쟁 물질의 존재 하에서 해리될 수 있다. 이러한 시스템의 예는 문헌[PCT 공개 특허 출원 번호 WO2015/158868]에 기술된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 적어도 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 조성물 중 총 세포의 백분율로서 (약) 60% 미만, (약) 50% 미만, (약) 40% 미만, (약) 30% 미만, (약) 20% 미만 또는 (약) 10% 미만의 CAR-발현 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 산출 조성물 내 CAR 발현 세포의 수는 투입 조성물 내 CAR 발현 세포의 수와 비교하여 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 또는 그 이상 증가하고/거나; 산출 조성물 내 CAR 발현의 백분율은 조성물 내 총 세포와 비교하여 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션하기 전에, 세포는 CAR 발현 세포에 대해 선택되거나 농축되지 않는다.
일부 구현예에서, CAR로 형질도입된 T 세포를 포함하는 샘플을 CAR을 표적화하거나 이에 결합하는 작용성 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 인큐베이션하는 단계; 및/또는 CAR T 세포의 활성화, 자극 및/또는 증폭의 존재, 부재 또는 양을 알아냄으로써 CAR-T 세포의 활성을 모니터링하는 단계를 포함하는, 표적 항-GPRC5D 항체 등의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 활성을 모니터링하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 CAR을 검증하기 위해 사용될 수 있으며, 이 경우 본 방법은 c) CAR-T 세포의 활성화, 자극 및/또는 증폭 수준에 기초하여 CAR을 검증하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR T 세포의 활성화, 자극 및/또는 증폭은 항-이디오타입 항체와의 일정 기간 인큐베이션 후 CAR T 세포에서 T 세포 활성화 표지자의 생존력, 증식 및/또는 발현을 알아냄으로써 평가된다. 일부 구현예에서, CAR T 세포의 생존력은 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션한 후 CAR로 형질도입된 총 T 세포 대비 살아있는 퍼센트를 계산함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, CAR T 세포의 증식은 항-이디오타입 항체와 인큐베이션하기 전에 CAR T 세포를 염색하는 데 사용되는 염료의 염료 희석에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 표지자의 발현은 T 세포 활성화 표지자를 인식하는 항체에 대한 염색과 함께 유세포 분석에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 표지자는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD69, CD71, CD134, CD137 및 CD154로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 1 내지 10일(예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 중 임의의 것, 예컨대 이 값들 사이의 임의의 범위)이다.
일부 구현예에서, CAR T 세포의 조제를 모니터링하는 방법이 제공되고, 상기 CAR은 표적 항-GPRC5D 항체 등의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 a) 상기 조제품의 일부를 CAR을 표적화하거나 이에 결합하는 작용성 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 인큐베이션하는 단계; 및 b) CAR T 세포의 활성화, 자극 및/또는 증폭의 존재, 부재 또는 양을 알아내는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-T 세포의 조제품은 시험하고자 하는 특정 조건에서 생산 또는 제조된 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 모니터링은 분비 분석과 관련하여, 예컨대 대상체에게 투여하기 전에 세포를 검증하기 위해 수행된다. 일부 측면에서, 본 방법은 c) CAR T 세포의 활성화 수준에 기초하여 상기 조제품을 검증하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 조제품 내 CAR T 세포의 활성화는 항-이디오타입 항체와의 일정 기간 인큐베이션 후 CAR T 세포에서 T 세포 활성화 표지자의 생존력, 증식 및/또는 발현을 알아냄으로써 평가된다. 일부 구현예에서, CAR T 세포의 생존력은 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션한 후 CAR로 형질도입된 총 T 세포 대비 살아있는 퍼센트를 계산함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, CAR T 세포의 증식은 항-이디오타입 항체와 인큐베이션하기 전에 CAR T 세포를 염색하는 데 사용되는 염료의 염료 희석에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 표지자의 발현은 T 세포 활성화 표지자를 인식하는 항체에 대한 염색과 함께 유세포 분석에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 표지자는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD69, CD71, CD134, CD137 및 CD154로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 1 내지 10일(예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 중 임의의 것, 예컨대 이 값들 사이의 임의의 범위)이다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 항-GPRC5D 항체이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 항-GPRC5D 항체는 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 표적 항-GPRC5D 항체이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에, 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
C. 세포 불활성화/고갈
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 길항제이고/거나 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체) 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 표적 항체를 발현하는 세포를 억제, 제거 및/또는 고갈(예를 들어, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 사멸)시키기 위한 특이적 활성을 나타낸다. CAR T 세포의 불활성화, 제거 및/또는 고갈을 위한, 제공된 항-이디오타입 항체, 및 하나 이상의 이러한 항-이디오타입 항체를 함유하는 분자(예컨대 접합체 및 복합체)의 사용을 수반하는 방법이 또한 제공되며, 여기서 CAR은 표적 항체, 예컨대 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체), 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 CAR로 형질도입된 T 세포를 포함하는 조성물 및/또는 샘플을 항-이디오타입 항체와 처리, 접촉, 및/또는 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 CAR T 세포가 불활성화되었는지, 예컨대 CAR T 세포 내 활성화 표지자의 생존력, 증식 및/또는 발현을 평가함으로써 검출하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 CAR T 세포의 투여를 포함하는 요법과 관련된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 항-이디오타입 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 접합체는 개체에서 CAR T 세포를 제거 및/또는 고갈(예컨대 사멸)시키는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 표적 항체는 항-GPRC5D 항체이다. 일부 구현예에서, 표적 항체는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 대상체에서 CAR 발현 세포의 수를 고갈, 삭감 및/또는 감소시키기 위해 투여된다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 CAR 발현 세포, 예를 들어 순환하는 CAR-T 세포의 양을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 100% 또는 약 100% 고갈, 삭감 및/또는 감소시킨다. 특정 구현예에서, 고갈, 삭감 및/또는 감소는 항-이디오타입 항체의 투여 전 대상체에서 CAR 발현 세포의 양과 관련이 있다. 구체적인 구현예에서, 고갈, 삭감 및/또는 감소는 항-이디오타입 항체의 투여 전 대상체에서 CAR 발현 세포의 양과 관련이 있다. 일부 구현예에서, CAR 발현 세포는 항-이디오타입 항체의 투여 이후 대상체에서 검출 가능하지 않다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 인간 또는 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, CAR T 세포를 불활성화하는 방법이 제공되고, 여기서 CAR은 표적 항-GPRC5D 항체 등의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 CAR T 세포를 포함하는 샘플을 CAR을 표적화하는 길항성 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 인큐베이션하여 샘플에서 CAR T 세포를 불활성화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 샘플에서 CAR T 세포의 활성화를 감쇄시키기에 충분한 양으로 사용된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 샘플에서 CAR T 세포를 실질적으로 불활성화하기에 충분한 양으로 사용된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션은 샘플에서 CAR T 세포의 제거 및/또는 고갈을 초래한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 샘플에서 CAR T 세포가 없어지도록 하기에 충분한 양으로 사용된다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 대상체에서 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 활성을 고갈, 삭감 및/또는 감소시키기 위해 투여된다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 자극 및/또는 활성화를 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 100% 또는 약 100% 삭감 및/또는 감소시킨다. 특정 구현예에서, 삭감 및/또는 감소는 항-이디오타입 항체의 투여 전 대상체에서 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 자극 및/또는 활성과 관련이 있다. 구체적인 구현예에서, 삭감 및/또는 감소는 항-이디오타입 항체가 투여되지 않은 대상체에서 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 자극 및/또는 활성과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 활성 및/또는 자극은 CAR 수용체 또는 CAR T 세포 활성의 하나 이상의 측면을 지칭하며, 본원에 제공된 임의의 수단을 포함하여 임의의 적합한 알려진 수단에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 활성 및/또는 자극은 항-이디오타입 항체의 투여 이후 대상체에서 검출 가능하지 않다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 인간 또는 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 항원에 대한 결합 및/또는 결합 능력을 예방, 삭감 및/또는 감소시키기 위해 투여된다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 항원 결합을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 100% 또는 약 100% 삭감 및/또는 감소시킨다. 특정 구현예에서, 삭감 및/또는 감소는 항-이디오타입 항체의 투여 전 대상체에서 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 항원에 대한 항원 결합 및/또는 결합 능력과 관련이 있다. 구체적인 구현예에서, 삭감 및/또는 감소는 항-이디오타입 항체가 투여되지 않은 대상체에서 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 항원 결합 및/또는 항원에 대한 결합 능력과 관련이 있다. 구체적인 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 인간 또는 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, CAR T 세포를 제거 및/또는 고갈(예컨대 사멸)시키는 방법이 제공되고, 여기서 CAR은 표적 항-GPRC5D 항체 등의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 CAR T 세포를 포함하는 샘플을 CAR을 표적화하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 인큐베이션하여 샘플에서 CAR T 세포를 제거 및/또는 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제거 및/또는 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 샘플에서 실질적으로 모든 CAR T 세포의 제거 및/또는 고갈을 초래하기에 충분한 양으로 사용된다.
일부 구현예에서, 개체에서 CAR T 세포 요법을 조정하는 방법이 제공되며, 여기서 CAR은 표적 항-GPRC5D 항체 등의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 CAR을 표적화하는 길항성 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개체에게 투여하여 CAR T 세포를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 개체에서 CAR T 세포의 활성화를 감쇄시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 개체에서 CAR T 세포를 실질적으로 불활성화하기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 개체에서 CAR T 세포의 제거 및/또는 고갈을 초래한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 개체에서 CAR T 세포가 없어지도록 하기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 구현예에서, 개체에서 CAR T 세포 요법을 조정하는 방법이 제공되며, 여기서 CAR은 표적 항-GPRC5D 항체 등의 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 CAR을 표적화하는 항-이디오타입 항체 면역접합체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항-이디오타입 항체 면역접합체는 세포독성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 면역접합체는 개체에서 CAR T 세포 요법을 감쇄하기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 면역접합체는 개체에서 CAR T 세포 요법을 실질적으로 중단시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 면역접합체는 개체에서 CAR T 세포가 없어지도록 하기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, 세포독성제는 화학 요법제 또는 화학 요법 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체)에 결합하거나 이를 인식하는 본원에 제공된 바와 같은 면역접합체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 세포를 고갈시키는 방법이 제공되고, 여기서 대상체는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포가 투여되었다. 일부 구현예에서, 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 일어난다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 항-GPRC5D 항체이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 항-GPRC5D 항체는 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 표적 항-GPRC5D 항체이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에, 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
D. 결합 분석 또는 방법에서 용도
키메라 항원 수용체(CAR), 예컨대 항원 결합 도메인을 함유하는 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부에 결합하는 샘플에서 분자의 존재 또는 부재를 평가하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 대상체에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 투여된 세포 요법에 대한 체액 반응 또는 항체 반응의 존재 또는 부재를 평가하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 표적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 CAR의 세포외 도메인에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 방법에서 양성 대조군으로 사용될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 본 방법은 샘플을 10 ng/ml 내지 100 μg/ml, 100 ng/ml 내지 1.0 μg/ml, 250 ng/ml 내지 10 μg/ml, 250 ng/ml 내지 1 μg/ml, 1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 250 ng 내지 2.5 μg/ml, 또는 1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 항-이디오타입 항체의 농도로 CAR의 세포외 도메인에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 농도는 250 ng/ml 내지 10 μg/ml 사이이다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 농도는 항-이디오타입 항체의 약 0.1 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1.0 μg/ml, 1.25 μg/ml, 2 μg/ml, 2.5 μg/ml, 또는 5 μg/ml이다.
일부 측면에서, 입양 세포 요법은 대상체에서 투여된 세포 및/또는 작제물에 대한 면역 반응의 발생과 연관될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 키메라 수용체에 대한 노출은 투여된 세포에 의해 발현된 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 의해 제한될 수 있으며, 이는 세포를 조기에 제거할 수 있다. B 세포 악성종양을 갖는 특정 (종종 면역손상된) 대상체에서도 입양 세포 요법에서 투여된 세포에 의해 발현된 수용체 영역에 특이적인 면역 반응이 검출될 수 있음이 관찰된다. 예를 들어, CAR로 유전자 조작된 세포를 투여한 대상체(예를 들어, 인간 대상체)는 비-인간 서열 (예를 들어, 뮤린 scFv)을 함유할 수 있는 영역을 비롯한 키메라 영역의 면역원성 영역에 대한 및/또는 키메라 수용체의 2개의 도메인 또는 부분, 예를 들어 CAR의 막관통 및 공자극 도메인 사이의 접합부를 함유하는 영역에 대한 특이적 면역 반응을 발생시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체로 조작된 세포를 포함하는 세포 요법이 투여된 대상체 유래의 샘플과 결합 시약을 접촉시키거나 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 결합 시약은 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 결합 시약과 샘플에 존재하는 항체 등의 분자(예를 들어, 결합 분자) 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계, 및/또는 상기 결합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 단계를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 접촉시키거나 인큐베이션하는 단계는 대상체 유래 샘플에 존재하는 분자에 대한 결합 시약의 결합을 허용하는 조건 하에 수행된다. 특정 측면에서, 본 방법은 임의의 기재된 바와 같은 CAR에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 양성 대조군 샘플 상에서 추가로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 시약에 대한 분자의 결합의 존재, 부재 또는 수준을 알아내는 단계는 결합 시약에 대한 결합 또는 검출과 양성 대조군 샘플의 결합 또는 검출의 비교를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 표적 항체를 포함하는 항-GPRC5D CAR을 발현하는 유전자 조작된 세포이거나 이를 포함하고, 여기서 결합 시약은 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 양성 대조군은 하위 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 결합 시약과 샘플에 존재하는 항체 등의 분자(예를 들어, 결합 분자) 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계, 및/또는 상기 결합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 접촉시키거나 인큐베이션하는 단계는 대상체 유래 샘플에 존재하는 분자에 대한 결합 시약의 결합을 허용하는 조건 하에 수행된다. 일부 측면에서, 복합체는 면역분석에 의해, 선택적으로 샌드위치 또는 브리지 분석에 의해 검출된다. 예를 들어, 면역분석은 ELISA(효소결합면역흡착분석), 화학발광, 전기화학발광, SPR(표면 플라스몬 공명)-기반 바이오센서(예를 들어, BIAcore), 유세포 분석 또는 웨스턴 블롯이다. 일부 구현예에서, 면역분석은 중규모 디스커버리이거나 이를 포함한다.
일부 측면에서, 면역분석은 샌드위치 분석 또는 브리지 분석이다. 샌드위치 또는 브리지 분석에서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 분자 또는 분자를 포함하는 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 제1 결합 시약과 분자 사이에 형성된 복합체를 제2 결합 시약과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 제2 결합 시약은 제1 결합 시약과 동일하거나 유사한 분자에 결합할 수 있는 제제이다. 일부 구현예에서, 제2 결합 시약은 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 측면에서, 제1 결합제와 제2 결합제의 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부는 동일하거나 실질적으로 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 결합 시약과 같은 결합 시약은 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있다. 제1 및/또는 제2 결합 시약과 같은 결합 시약은 검출 가능한 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지, 화학발광 표지, 전기화학발광 표지, 비색 표지(colorimetric label), 생체발광 표지 또는 방사성 표지이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 결합 시약과 같은 결합 시약은 SULFO-태그에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 결합 시약 중 적어도 하나는 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있고, 제1 및 제2 결합 시약 중 다른 하나는 고체 지지체에 부착되거나 고정된다. 일부 측면에서, 제1 결합 시약은 고체 지지체에 부착 또는 고정되거나 고체 지지체에 부착 또는 고정될 수 있다. 고체 지지체에 결합 시약을 직접적으로 또는 간접적으로 부착하는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 부착 방법은 일반적으로 고체 지지체에 대한 결합 시약의 비특이적 흡착 또는 활성화된 카르복실, 히드록실 또는 알데히드기와 같은 고체 지지체 상의 화학적 반응성 기에 대한, 전형적으로 자유 아민기를 통한 결합 시약의 공유 부착을 포함한다. 부착 방법은 또한 예컨대 스트렙타비딘 등의 포획 시약으로 고체 지지체를 코팅하거나 비오틴-표지 시약 등의 친화성 표지 결합 시약을 고체 지지체에 추가하여 친화성 표지(예를 들어, 비오틴)와 포획 시약(예를 들어, 스트렙타비딘) 사이의 상호 작용이 결합 시약을 고체 지지체에 연결하도록 결합 시약을 고체 지지체에 간접 부착하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 시약은 비오틴에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 일부 예에서, 제1 용해성 시약이 스트렙타비딘으로 코팅된 고체 지지체에 결합된다. 일부 구현예에서, 제2 결합 시약이 검출 가능 표지에, 선택적으로 SULFO-태그에, 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
구체적인 구현예에서, 샘플은 고체 표면 또는 지지체(예를 들어, 플레이트 또는 웰)에 부착, 결합, 코팅 및/또는 접합되는 제1 결합 시약과 접촉된다. 특정 구현예에서, 제1 결합 시약은 예컨대 스트렙타비딘 등의 포획 시약으로 고체 지지체를 코팅하거나 비오틴-표지 시약 등의 친화성 표지 결합 시약을 고체 지지체에 추가하여 친화성 표지(예를 들어, 비오틴)와 포획 시약(예를 들어, 스트렙타비딘) 사이의 상호 작용이 결합 시약을 고체 지지체에 연결하도록 결합 시약을 고체 지지체에 간접 부착에 의해 고체 표면 또는 지지체에 부착, 결합, 코팅, 및/또는 접합되었다. 일부 구현예에서, 샘플은 SULFO-태그에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는 제2 결합 시약과 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 제1 및/또는 제2 결합 시약은 10 ng/ml 내지 100 μg/ml, 100 ng/ml 내지 1.0 μg/ml, 250 ng/ml 내지 10 μg/ml, 250 ng/ml 내지 1 μg/ml, 1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 250 ng 내지 2.5 μg/ml, 또는 1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 항-이디오타입 항체의 농도로 사용된다. 일부 구현예에서, 고체 표면 또는 지지체는 250 ng/ml 내지 10 μg/ml로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 고체 표면 또는 지지체는 (약) 0.25 μg/ml, 0.5 μg/ml, 1.0 μg/ml, 1.25 μg/ml, 2 μg/ml, 2.5 μg/ml, 5 μg/ml 또는 10 μg/ml로 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체로 조작된 세포를 포함하는 세포 요법이 투여된 대상체 유래의 샘플은 대상체 유래의 임의의 체액 샘플이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 샘플은 전혈, 혈청 또는 혈장이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포 요법 또는 세포 용량의 투여 개시 후 (약) 1시간 내지 1년 이내에, 예컨대 (약) 6시간, 12시간, 24시간, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 이내에 대상체로부터 수득된다. 일부 측면에서, 세포 요법의 투여 개시 (약) 1개월 내지 6개월, 예컨대 2개월 내지 6개월 또는 2개월 내지 4개월에, 예를 들어 세포 요법의 투여 개시 후 약 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 후에 수득된다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 항-GPRC5D 항체이다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 항-GPRC5D 항체는 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 표적 항-GPRC5D 항체이다.
상기 임의의 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에, 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은, 표적 항-GPRC5D 항체에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
V. 제조품 또는 키트
제공된 항-이디오타입 항체 및/또는 조성물을 함유하는 제조품 또는 키트가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제조품이 제공된다. 일부 경우에, 항-이디오타입 항체는 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 결합한다. 일부 예에서, 항-GPRC5D 항체는 예를 들어 섹션 1.A에 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체이다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 항-이디오타입 항체를 함유하는 접합체가 제조품 또는 키트에 제공된다.
일부 구현예에서, 키트 또는 제조품은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항-이디오타입 항체가 결합(예컨대, 특이적으로 결합)하거나 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인 또는 세포외 도메인의 일부를 포함하는 결합 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포외 도메인은 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 표적 항-GPRC5D 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트 또는 제조품은 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하기 위한 사용 설명서를 포함하되, 상기 사용 설명서는: (i) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하고/거나, (ii) 세포 집단으로부터, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 선택 또는 농축하고/거나, (iii) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 자극하는 것이다.
일부 구현예에서, 키트 또는 제조품은 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약을 포함하고, 상기 세포외 도메인 또는 이의 일부는 본원에 제공된 바와 같은, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 면역접합체를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고, 키트 또는 제조품은 제2 결합 시약을 추가로 포함한다. 이러한 예에서, 제2 결합 시약은 제1 결합 시약과 동일 또는 유사한 분자에 결합할 수 있는 제제이다. 일부 구현예에서, 제2 결합 시약은 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 측면에서, 제1 결합제와 제2 결합제의 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부는 동일하거나 실질적으로 동일하다.
일부 구현예에서, 결합 시약, 또는 제1 및 제2 결합 시약 중 적어도 하나는 본원에 기술된 표지와 같은 표지(예를 들어, 검출 가능한 표지)에 부착된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 결합 시약 중 적어도 하나는 고체 지지체에 부착되거나, 또는 본원에 기술된 고체 지지체와 같은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있고, 제1 및 제2 결합 시약 중 다른 하나는 고체 지지체에 부착되거나 고정된다. 일부 구현예에서, 결합 시약은 키트로서 또는 면역분석(예를 들어, 샌드위치 또는 브리지 분석)과 관련하여 사용하기 위한 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 시스템의 일부로서 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 결합 시약은 고체 지지체, 선택적으로 스트렙타비딘 코팅된 고체 지지체에 결합된다. 일부 구현예에서, 제2 용해성 단백질은 검출 가능 표지에, 예컨대 SULFO-태그에, 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 키트는 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편을 더 포함한다. 일부 측면에서, 항-이디오타입 항체는 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 결합한다. 일부 예에서, 항-GPRC5D 항체는 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 양성 대조군 샘플로서 제공된다. 일부 예에서, 양성 대조군 샘플은 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인의 영역을 함유하는 제1 및 제2 용해성 단백질 또는 시약과 복합체를 형성한다.
일부 구현예에서, 키트 또는 제조품은 예를 들어 섹션 IV.A에 기술된 임의의 방법에 사용하기 위한 카트리지 디바이스를 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 샘플 조성물 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 블리스터 구획을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 유체 혼합에 맞춰진 처리 구획을 포함하며, 상기 처리 구획은 샘플 조성물 챔버 및 블리스터와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 미세유체 카트리지는 판독 구역을 포함하는 평가 챔버를 포함하고, 평가 챔버는 처리 챔버와 유체 연통한다. 일부 구현예에서, 판독 구역은 샘플이 판독 구역을 통과할 때 샘플의 분석이 가능하다.
일부 구현예에서, 블리스터는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지)에 접합된다. 일부 측면에서, 항-이디오타입 항체는 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 결합한다. 일부 예에서, 항-GPRC5D 항체는 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체이다.
일부 구현예에서, 키트 또는 제조품은 예를 들어 섹션 IV.A에 기술된 임의의 방법에 사용하기 위한 건조된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 건조된 항-이디오타입 항체는 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 표지)에 접합된다. 일부 측면에서, 건조된 항-이디오타입 항체는 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 결합한다. 일부 예에서, 항-GPRC5D 항체는 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체이다. 일부 구현예에서, 건조된 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 튜브(관)에 함유된다. 일부 구현예에서, 튜브(관)는 다른 건조된 시약, 예를 들어, 다른 표지 항체, 염료 또는 세포 용해제를 추가로 함유한다.
일부 구현예에서, 키트 또는 제조품은 제공된 임의의 방법을 수행하기 위한 시약 또는 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 2차 항체, 친화성 표지, 포획 시약, 완충제, 희석제, 신호 검출제, 필터, 바늘, 주사기, 모세관, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적, 치료적, 및 사용자 관점에서 바람직한 하나 이상의 시약 또는 다른 재료를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 항체 또는 이의 조성물 또는 하나 이상의 추가의 시약, 예를 들어 결합 시약 또는 성분을 포장하기 위한 포장 재료를 포함하는 제조품으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 용기, 병, 튜브(관), 바이알 및 키트의 성분을 분리 또는 조직화하기에 적합한 임의의 포장 재료를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 용기를 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어, 병, 바이알(예를 들어, 이중 챔버 바이알), 주사기(예를 들어, 단일 또는 이중 챔버 주사기) 및 시험관이 포함된다. 하나 이상의 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 하나 이상의 용기는 방법에 사용하기 위한 항체 또는 다른 시약(예를 들어, 결합 시약)을 포함하는 조성물을 보유한다. 본원의 제조품 또는 키트는 별도의 용기 또는 동일한 용기 내에 항체 또는 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물을 보유하는 하나 이상의 용기는 1회용 바이알 또는 다회용 바이알일 수 있고, 이는 일부 경우에 재구성된 조성물의 반복 사용을 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 적합한 희석제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 치료제 및/또는 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적, 치료적, 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
제조품은 용기 및 표지(label) 또는 용기 위의 또는 그와 연관된 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액백 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서 용기는 본원에 제공된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 함유하는 조성물을 그 자체로 또는 질병 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합하여 담는다. 일부 구현예에서, 용기는 멸균 접근 포트를 갖는다. 예시적인 용기에는 주사용 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개가 있는 것을 포함하여 정맥내 주사용 용액백, 바이알이 포함된다. 제조품은 내부에 조성물이 함유된 제1 용기를 포함할 수 있고, 여기서 조성물은 항-이디오타입 항체를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조품은 허용 가능한 완충제를 포함하는 다른 용기 또는 동일한 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및/또는 주사기와 같이 다른 재료가 추가로 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 유리(예를 들어, 제어된 기공 유리), 다당류(예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 나일론, 실리콘 및 기술된 바와 같은 결합 시약의 직접 또는 간접 부착을 위해 고체 지지체에 사용되는 본 기술 분야에 널리 알려진 다른 재료로 형성된 고체 지지체를 포함하여, 고체 지지체를 포함한다. 본원에 제공된 제조품 또는 키트에 포함된 고체 지지체는 비드, 컬럼(예를 들어, 크로마토그래피 컬럼 등), 어레이(예를 들어, 마이크로어레이, 나노어레이 등), 분석 플레이트, 카트리지, 스틱, 필터, 스트립 또는 본원에 기술된 임의의 다른 고체 지지체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 적합한 희석제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 치료제 및/또는 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적, 치료적, 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 선택적으로 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 일반적으로 항체를 기술하는 유형(tangible)의 발현, 및 선택적으로 키트에 포함된 다른 성분, 예를 들어 결합 시약, 및 기술된 바와 같은 임의의 용도 또는 방법과 함께 또는 그와 함께 항체 및/또는 다른 성분을 사용하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 설명서는 용기 상에 있거나 용기와 연관된 표지 또는 포장 삽입물로서 제공된다. 일부 구현예에서, 설명서는 조성물의 재구성 및/또는 사용을 위한 지침을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하기 위해, 예컨대 기술된 바와 같은 임의의 방법 또는 분석법에 따라 또는 그와 함께 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다. 일부 예에서, 세포 집단으로부터, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 세포를 선택하거나 농축하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다. 일부 예에서, 표적 항-GPRC5D 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 자극하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다.
일부 구현예에서, 세포 요법의 키메라 항원 수용체에 결합하는 분자, 예컨대 항체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)에 대한 체액 면역 반응에 의해 생성된 항체를 검출하기 위해 제공된 키트의 용도에 대한 설명서가 제공된다. 일부 구현예에서, 항-GPRC5D 항체(예를 들어, 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 표적 항-GPRC5D 항체) 또는 이의 항원 결합 단편인 표적 항체를 포함하는 CAR로 조작된 세포를 포함하는 세포 요법을 투여받은 대상체 유래 샘플과 결합 시약을 접촉시키기 위한 설명서가 제공되며, 여기서 결합 시약은 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 일부 측면에서, 설명서는 또한 결합 시약, 및 제1 및 제2 결합 시약 둘 모두에 결합하는 샘플 유래 분자를 포함하는 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 명시하며, 선택적으로 여기서 분자는 항체이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, GPRC5D 항체는 표적 항-GPRC5D 항체이다.
VI. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에 상기 정의를 포함하는 것이 본 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 “해당하는 형태(corresponding form)”에 대한 언급은 두 항체의 특성 또는 활성을 비교할 때, 동일한 형태의 항체를 사용하여 특성을 비교함을 의미한다. 예를 들어, 어떤 항체가 제1 항체의 해당하는 형태의 활성과 비교하여 더 큰 활성을 갖는다고 언급된 경우, 이는 상기 항체의 scFv와 같은 특정 형태가 제1 항체의 scFv 형태와 비교하여 더 큰 활성을 갖는다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 서열 목록에 제시된 것과 같은 개시된 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 “해당한다 또는 상응한다(correspond to)”는 기재는 GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 동일성을 극대화하기 위해 개시된 서열과 정렬시 확인된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 지칭한다. 서열을 정렬함으로써, 본 기술 분야의 당업자는 예를 들어 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 가이드로 사용하여 해당하는 잔기를 확인할 수 있다. 일반적으로, 해당 위치를 확인하기 위해, 아미노산 서열은 가장 높은 순서의 일치가 수득되도록 정렬된다(예를 들어 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073] 참조).
“효과기 기능(Effector functions)”은 항체 동종형에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 의미한다. 항체 효과기 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체의존 세포독성(complement dependent cytotoxicity: CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC); 식세포작용(phagocytosis); 세포 표면 수용체의 하향조절(예를 들어, B 세포 수용체); 및 B 세포 활성화 등이 포함된다.
본원에서 용어 “Fc 영역(Fc region)”은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 색인으로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
용어 “전장 항체(full length antibody)”, “온전한 항체(intact antibody)” 및 “전체 항체(whole antibody)”는 본원에 정의된 바와 같이 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
“단리된(isolated)” 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(isoelectric focusing: IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도 평가 방법의 검토에 대해서는 예를 들어, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
“단리된(isolated)” 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 이의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다.
“항-이디오타입 항체를 암호화하는 단리된 핵산(isolated nucleic acid encoding an anti-idiotype antibody)”은 단일 벡터 또는 별도의 벡터에서 상기 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자(들)를 포함하여 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다.
용어 “숙주 세포(host cell)”, “숙주 세포주(host cell line)” 및 “숙주 세포 배양물(host cell culture)”은 상호 교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 “형질전환체(transformants)” 및 “형질전환된 세포(transformed cells)”를 포함하고, 이는 1차 형질 전환된 세포 및 계대 수(number of passages)에 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, “아미노산 서열 동일성 백분율(percent (%) amino acid sequence identity)” 및 “동일성 백분율(percent identity)”은 아미노산 서열(기준 폴리펩타이드 서열)에 대하여 사용될 때, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후 기준 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어, 대상체 항체 또는 단편) 내 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 알아내기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 당업계 기술 범위 내에서 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 본 기술 분야의 당업자는 비교될 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
아미노산 치환은 폴리펩타이드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심 결합 분자(예를 들어, 항체)에 도입될 수 있고, 그 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별된다.
아미노산은 일반적으로 하기와 같은 공통적인 측쇄(side-chain) 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루신(Norleucine), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 동일한 클래스의 다른 멤버로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “벡터(vector)”는 이에 연결된 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 자신이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 “발현 벡터(expression vector)”로 지칭한다.
용어 “포장 삽입물(package insert)”은 지시, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 상기 치료 생성물의 용도와 관련한 사용 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한 치료 생성물의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 단수 형태(“a” 또는 “an”)는 “적어도 하나(at least one)” 또는 “하나 이상(one or more)”을 의미한다. 본원에 기재된 측면 및 변형은 측면(aspect) 및 변형(variation)으로 “구성되는(consisting)” 및/또는 “필수적으로 포함하여 구성되는(consisting essentially of)”을 포함하는 것으로 이해된다.
본 개시 내용 전체에서, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위 및 상기 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 내지 하한 사이 각각의 사이에 오는 값과 상기 언급된 범위에서 임의의 다르게 언급되거나 사이에 오는 값은 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 상기 더 작은 범위의 상한 내지 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로, 청구된 주제 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 청구된 주제에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에 사용된 용어 “약(about)”은 본 기술 분야의 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 “약”의 수치 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 수치 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함(설명)한다. 예를 들어, “약 X”를 지칭하는 기재는 “X”의 기재를 포함한다.
용어 “폴리펩타이드(polypeptide)” 및 “단백질(protein)”은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 제공된 항체 및 항체 사슬 및 다른 펩타이드(예를 들어, 링커)를 포함하는 폴리펩타이드는 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하여 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어들은 또한 폴리펩타이드의 발현 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩타이드는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한 천연 또는 자연 서열에 대한 변형을 함유할 수 있다. 상기 변형은 부위-지정 돌연변이 유발을 통한 것과 같이 의도적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통한 것과 같이 우발적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물(compostion)은 세포를 포함하여 둘 이상의 생성물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 표지자에 대해 “양성(positive)”이라는 진술은 특정 표지자, 통상적으로 표면 표지자가 세포 상에 또는 세포 내에 검출 가능하게 존재함을 지칭한다. 표면 표지자를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 표지자에 결합하는(예를 들어, 이 표지자에 특이적으로 결합하는) 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 표지자에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 표지자에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의해 검출 가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 표지자에 대해 “음성(negative)”이라는 진술은 특정 표지자, 통상적으로 표면 표지자가 세포 상에 또는 세포 내에 실질적으로 검출 가능하게 존재하지 않음을 지칭한다. 표면 표지자를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 표지자에 결합하는(예를 들어, 이 표지자에 특이적으로 결합하는) 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 표지자에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 표지자에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 비교하여 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의해 검출되지 않는다.
용어 “핵산 분자(nucleic acid molecule)”, “핵산(nucleic acid)” 및 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 이러한 뉴클레오타이드 중합체는 천연 및/또는 비천연 뉴클레오타이드를 함유할 수 있으며, DNA, RNA 및 PNA를 포함하나 이에 제한되지 않는다. “핵산 서열(nucleic acid sequence)”은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드의 선형 서열을 지칭한다.
VII. 예시적인 구현예
제공된 구현예 중에는 하기가 있다:
1. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 영역;을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 아미노산 서열들을 각각 포함하는, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 26의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 아미노산 서열들을 각각 포함하는, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역;을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역;을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 및/또는 경쇄의 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
9. 구현예 8에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc의 일부를 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 CL 도메인을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
10. 구현예 8 또는 구현예 9에 있어서, 상기 불변 영역은 IgG 유래, 선택적으로 IgG1 유래인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. 구현예 9 또는 구현예 10에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역은 카파 경쇄 유래인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
12. 구현예 8 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 온전한 항체 또는 전장 항체인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
15. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 항원 결합 단편인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
16. 구현예 15에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, scFv 및 단일 도메인 항체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 인간화된, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 재조합성인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 단클론인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D)에 결합하거나 이를 인식하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
23. 구현예 22에 있어서, 상기 단일 사슬 단편은 상기 VH 영역과 상기 VL 영역 사이에 위치하는 가요성 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
24. 구현예 23에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
25. 구현예 22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 상기 단일 사슬 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
26. 구현예 25에 있어서, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 상보성 결정 영역(CDR)의 전부 또는 일부 내의 또는 이를 포함하는 에피토프에 결합하거나 이를 인식하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 있거나 이에 포함되고/거나; 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
29. 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 scFv는 CAR의 세포외 부분 내에 있거나 이에 포함되고/거나; 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 scFv에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
30. 구현예 28 또는 구현예 29에 있어서, 상기 CAR은 스페이서를 통해 상기 항원 결합 도메인에 연결된 막관통 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
31. 구현예 30에 있어서, 상기 스페이서는 면역글로불린 스페이서이고, 선택적으로 상기 스페이서는 서열 번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
32. 구현예 30 또는 구현예 31에 있어서, 상기 막관통 도메인은, 선택적으로 인간 CD28인, CD28의 막관통 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
33. 구현예 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 CAR의 상기 스페이서 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 선택적으로 인간 CD28인, CD28 또는 이의 부분에 결합하지 않거나 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 선택적으로 인간 IgG1 Fc 도메인인, Fc 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
37. 구현예 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM인, 또는 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 미만인 해리 상수를 가지는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
38. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 작용제(agonist)인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
39. 구현예 38에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용액 중에 있을 때 상기 CAR의 작용제인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
40. 구현예 38에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 고정될 때 상기 CAR의 작용제이고, 선택적으로 상기 지지체 또는 정지상은 플레이트 또는 비드인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
41. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는, 접합체.
42. 구현예 41에 있어서, 상기 이종 분자 또는 모이어티는 표지(label)인 것을 특징으로 하는, 접합체.
43. 구현예 42에 있어서, 상기 표지는 형광 염료, 형광 단백질, 방사성 동위원소, 발색단, 금속 이온, 금 입자, 은 입자, 자성 입자, 폴리펩타이드, 효소, 스트렙타비딘, 비오틴, 발광 화합물, 및 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 접합체.
44. 구현예 42에 있어서, 상기 이종 분자 또는 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 저분자(small molecule)이고, 이는 선택적으로 독소 또는 Strep-Tag이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
45. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화 하는 핵산 분자(들).
46. 구현예 45에 있어서, (i) 서열 번호: 25에 제시된 상기 중쇄 가변 영역, (ii) 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (iv) 서열 번호: 26에 제시된 상기 경쇄 가변 영역, (v) 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자(들).
47.구현예 45에 있어서, (i) 서열 번호: 27에 제시된 중쇄, (ii) 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (iv) 서열 번호: 28에 제시된 경쇄, (v) 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄, 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자(들).
48. 구현예 45 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자(들)는 신호 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자(들).
49. 구현예 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 분자(들)는 서열 번호: 29 내지 32로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자(들).
50. 구현예 45 내지 49 중 어느 하나의 핵산 분자(들)를 포함하는, 벡터.
51. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 45 내지 49 중 어느 하나의 핵산 분자, 또는 구현예 50의 벡터를 포함하는, 세포.
52. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 있어서, 적합한 숙주 세포에서 구현예 45 내지 49 중 어느 하나의 핵산 분자(들) 또는 구현예 50의 벡터에 의해 암호화되는 중쇄 및/또는 경쇄를 발현시키는 단계; 및 상기 항체를 회수하거나 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
53. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 있어서, 구현예 51의 세포를 중쇄 및/또는 경쇄가 발현되는 조건에서 배양하는 단계; 및 상기 항체를 회수하거나 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
54. 구현예 52 또는 구현예 53의 방법에 의해 생산된, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
55. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체, 또는 구현예 51의 세포를 포함하는, 조성물.
56. 구현예 55에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 조성물.
57. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체, 및 구현예 45 내지 49 중 어느 하나의 핵산 분자(들) 중 하나 이상, 및 선택적으로 사용 설명서를 포함하는, 키트.
58. 구현예 57에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 접합체를 고정하기 위한 시약 또는 지지체를 더 포함하되, 상기 시약 또는 지지체는 비드, 컬럼, 마이크로웰, 스틱, 필터, 스트립, 또는 용해성 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약인 것을 특징으로 하는, 키트.
59. 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 방법에 있어서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 상기 항-이디오타입 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
60. 구현예 59에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포에 결합되거나 세포의 표면 상에 발현되고, 상기 (b)에서 검출하는 단계는 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
61. 구현예 60에 있어서, 상기 세포는 자신의 표면 상에서 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
62. 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하는 방법에 있어서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
63. 구현예 62에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 직접적으로 또는 간접적으로 표지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
64. 세포 집단으로부터 세포를 선택하는 방법에 있어서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
65. 구현예 64에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포는 친화도-기반 분리에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
66. 구현예 65에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
67. 구현예 65 또는 구현예 66에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 유세포 분석에 의한 것을 특징으로 하는, 방법.
68. 구현예 65 또는 구현예 66에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 자성 활성화 세포 분류에 의한 것을 특징으로 하는, 방법.
69. 구현예 65 또는 구현예 66에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
70. 구현예 68 또는 구현예 69에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 가역적으로 결합 또는 고정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
71. 세포를 자극하는 방법에 있어서, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체와 인큐베이션하여, 자극된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
72. 세포 조성물을 생산하는 방법에 있어서, (a) 세포 내로 CAR을 암호화하는 핵산 분자(들)를 도입하여, 투입 조성물을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 투입 조성물을 상기 CAR의 항원 수용체에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체와 인큐베이션하여, 상기 세포 조성물을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
73. 구현예 72에 있어서, 상기 (a)에서 도입은 바이러스 형질도입, 전위, 전기 천공, 또는 화학적 형질주입에 의해 상기 핵산 분자(들)를 상기 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
74. 구현예 72 또는 구현예 73에 있어서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
75. 구현예 72 또는 구현예 73에 있어서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 트랜스포손으로 전위에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
76. 구현예 72 또는 구현예 73에 있어서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터의 전기 천공 또는 형질주입에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
77. 구현예 72 내지 76 중 어느 하나에 있어서, (a) 단계 전에 상기 세포를 활성화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
78. 구현예 77에 있어서, 상기 세포를 활성화하는 단계는 상기 세포를 CD3의 작용제와, 선택적으로 CD28의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
79. 구현예 78에 있어서, 상기 세포를 활성화하는 단계는 상기 세포를 작용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
80. 구현예 72 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션은 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 CAR에 결합하여, 상기 투입 조성물 내 하나 이상의 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
81. 구현예 72 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
82. 구현예 81에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
83. 구현예 72 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고체 지지체에 고정되고, 이것은 선택적으로 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약을 포함하거나 이에 접합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
84. 구현예 72 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 시약에 고정되고, 이것은 선택적으로 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
85. 구현예 83 또는 구현예 84에 있어서, 상기 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
86. 구현예 72 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션은 (약) 적어도 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
87. 구현예 72 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 투입 조성물은 조성물 중 총 세포의 백분율로서 (약) 60% 미만, (약) 50% 미만, (약) 40% 미만, (약) 30% 미만, (약) 20% 미만 또는 (약) 10% 미만의 CAR-발현 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
88. 구현예 72 내지 87 중 어느 하나에 있어서,
상기 산출 조성물 내 CAR 발현 세포의 수는 상기 투입 조성물 내 CAR 발현 세포의 수와 비교하여 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 또는 그 이상 증가하고/거나; 상기 산출 조성물 내 CAR 발현의 백분율은 조성물 내 총 세포와 비교하여 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
89. 구현예 72 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입 및/또는 인큐베이션 전에, 상기 세포는 CAR 발현 세포에 대해 선택되거나 농축되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
90. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 방법에 있어서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
91. 구현예 90에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체는 친화도-기반 분리에 의해 단리되는 것을 특징으로 하는, 방법.
92. 구현예 91에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
93. 구현예 92에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 자성-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
94. 구현예 92에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
95. 세포를 고갈시키는 방법에 있어서, 대상체에게 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 대상체는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 투여받은 것을 특징으로 하는, 방법.
96. 구현예 95에 있어서, 상기 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 일어나는 것을 특징으로 하는, 방법.
97. 구현예 59 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 방법.
98. 구현예 97에 있어서, 상기 단일 사슬 단편은 scFv인 것을 특징으로 하는, 방법.
99. 구현예 59 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
100. 구현예 99에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv이고 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 가요성 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 방법.
101. 구현예 100에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
102. 구현예 1 내지 구현예 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 41 내지 구현예 44 중 어느 하나의 접합체, 및 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하기 위한 사용 설명서를 포함하되, 상기 사용 설명서는: 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하고/거나; 세포 집단으로부터, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 선택 또는 농축하고/거나; 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 자극하는 것인, 제조품.
103. 제조품에 있어서, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약―상기 세포외 도메인 또는 이의 일부는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함함―; 및 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 41 내지 44 중 어느 하나의 접합체를 포함하는, 제조품.
104. 구현예 103에 있어서, 상기 결합 시약은 제1 결합 시약이고, 상기 제조품은 상기 CAR의 상기 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 제2 결합 시약을 더 포함하는, 제조품.
105. 구현예 103 또는 구현예 104에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 시약의 상기 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부는 동일한 것을 특징으로 하는, 제조품.
106. 구현예 103 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 면역분석을 이용하여 상기 결합 시약에 결합하는 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하기 위해 상기 결합 시약―선택적으로 상기 제1 및 제2 결합 시약―을 사용하기 위한 사용 설명서를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역분석은 브리지 또는 샌드위치 면역분석이고, 선택적으로 상기 샘플은 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR로 조작된 세포를 포함하는 세포 요법을 투여받은 대상체 유래인 것을 특징으로 하는, 제조품.
107. 구현예 103 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 결합 시약―선택적으로 상기 제1 및/또는 제2 결합 시약―은 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는, 제조품.
108. 구현예 104 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 고체 지지체에 부착되거나 고체 지지체에 부착될 수 있고 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 다른 하나는 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는, 제조품.
109. 구현예 108에 있어서, 상기 제조품은 고체 지지체를 더 포함하되, 선택적으로 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 비오틴에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 상기 고체 지지체는 스트렙타비딘-코팅된 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
110. 구현예 102 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 제조품.
111. 구현예 110에 있어서, 상기 단일 사슬 단편은 scFv를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
112. 구현예 102 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
113. 구현예 112에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv이고 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 가요성 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 제조품.
114. 구현예 113에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
제공된 구현예 중에는 하기가 있다:
1. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역;을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
3. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 영역;을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 25의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 아미노산 서열을 각각 포함하는, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및 서열 번호: 26의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 아미노산 서열을 각각 포함하는, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역;을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. 구현예 1, 2, 및 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 구현예 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. 구현예 3 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. 구현예 10에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
12. 구현예 11에 있어서, 상기 단일 사슬 단편은 상기 VH 영역과 상기 VL 영역 사이에 위치하는 가요성 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
13. 구현예 12에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
14. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 상기 단일 사슬 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
15. 구현예 14에 있어서, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 항원 결합 단편의 상보성 결정 영역(CDR)의 전부 또는 일부 내의 또는 이를 포함하는 에피토프에 결합하거나 이를 인식하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 있거나 이에 포함되고/거나; 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
18. 구현예 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 scFv는 CAR의 세포외 부분 내에 있거나 이에 포함되고/거나; 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 scFv에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
19. 구현예 17 또는 구현예 18에 있어서, 상기 CAR은 스페이서를 통해 상기 항원 결합 도메인에 연결된 막관통 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
20. 구현예 19에 있어서, 상기 스페이서는 면역글로불린 스페이서이고, 선택적으로 상기 스페이서는 서열 번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
21. 구현예 19 또는 구현예 20에 있어서, 상기 막관통 도메인은, 선택적으로 인간 CD28인, CD28의 막관통 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
22. 구현예 19 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 CAR의 상기 스페이서 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 선택적으로 인간 CD28인, CD28 또는 이의 부분에 결합하지 않거나 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 선택적으로 인간 IgG1 Fc 도메인인, Fc 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D)에 결합하거나 이를 인식하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 작용제(agonist)인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
27. 구현예 26에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 고정될 때 상기 CAR의 작용제이고, 선택적으로 상기 지지체 또는 정지상은 플레이트 또는 비드인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM인, 또는 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 미만인 결합 친화도(EC50) 및/또는 해리 상수를 가지는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 인간화된, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 재조합성인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 단클론인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 항원 결합 단편인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
33. 구현예 32에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, scFv 또는 단일 도메인 항체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
35. 구현예 34에 있어서, 면역글로불린 불변 영역의 상기 적어도 일부는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
36. 구현예 34 또는 구현예 35에 있어서, 상기 불변 영역은 인간 IgG 유래인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
37. 구현예 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 온전한 항체 또는 전장 항체인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
38. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는, 접합체.
39. 구현예 38에 있어서, 상기 이종 분자 또는 모이어티는 표지(label)인 것을 특징으로 하는, 접합체.
40. 구현예 39에 있어서, 상기 표지는 형광 염료, 형광 단백질, 방사성 동위원소, 발색단, 금속 이온, 금 입자, 은 입자, 자성 입자, 폴리펩타이드, 효소, 스트렙타비딘, 비오틴, 발광 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 접합체.
41. 구현예 39에 있어서, 상기 이종 분자 또는 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 저분자(small molecule)이고, 이는 선택적으로 독소 또는 Strep-Tag이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
42. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자(들).
43. 구현예 42에 있어서, (i) 서열 번호: 25에 제시된 상기 중쇄 가변 영역, (ii) 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (iv) 서열 번호: 26에 제시된 상기 경쇄 가변 영역, (v) 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자(들).
44. 구현예 42에 있어서, (i) 서열 번호: 27에 제시된 중쇄, (ii) 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (iv) 서열 번호: 28에 제시된 경쇄, (v) 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄, 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자(들).
45. 구현예 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 신호 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자(들).
46. 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 분자(들)는 서열 번호: 29 내지 32로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자(들).
47. 구현예 42 내지 46 중 어느 하나의 핵산 분자(들)를 포함하는, 벡터.
48. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 42 내지 46 중 어느 하나의 핵산 분자, 또는 구현예 47의 벡터를 포함하는, 세포.
49. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 있어서, 적합한 숙주 세포에서 구현예 42 내지 45 중 어느 하나의 핵산 분자(들) 또는 구현예 47의 벡터에 의해 암호화되는 중쇄 및/또는 경쇄를 발현시키는 단계; 및 상기 항체를 회수하거나 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
50. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 있어서, 구현예 48의 세포를 중쇄 및/또는 경쇄가 발현되는 조건에서 배양하는 단계; 및 상기 항체를 회수하거나 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
51. 구현예 49 또는 구현예 50의 방법에 의해 생산된, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
52. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체, 또는 구현예 48의 세포를 포함하는, 조성물.
53. 구현예 52에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 조성물.
54. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체, 및 구현예 42 내지 45 중 어느 하나의 핵산 분자(들) 중 하나 이상, 및 선택적으로 사용 설명서를 포함하는, 키트.
55. 구현예 54에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 접합체를 고정하기 위한 시약 또는 지지체를 더 포함하되, 상기 시약 또는 지지체는 비드, 컬럼, 마이크로웰, 스틱, 필터, 스트립, 또는 용해성 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약인 것을 특징으로 하는, 키트.
56. 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 방법에 있어서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 상기 항-이디오타입 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
57. 구현예 56에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포에 결합되거나 세포의 표면 상에 발현되고, 상기 (b)에서 검출하는 단계는 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
58. 구현예 57에 있어서, 상기 세포는 자신의 표면 상에서 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
59. 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하는 방법에 있어서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
60. 구현예 59에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 직접적으로 또는 간접적으로 표지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
61. 세포 집단으로부터 세포를 선택하는 방법에 있어서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
62. 구현예 61에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포는 친화도-기반 분리에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
63. 구현예 62에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
64. 구현예 62 또는 구현예 63에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 유세포 분석에 의한 것을 특징으로 하는, 방법.
65. 구현예 62 또는 구현예 63에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 자성 활성화 세포 분류에 의한 것을 특징으로 하는, 방법.
66. 구현예 62 또는 구현예 63에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
67. 구현예 65 또는 구현예 66에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 가역적으로 결합 또는 고정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
68. 세포를 자극하는 방법에 있어서, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체와 인큐베이션하여, 자극된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
69. 세포 조성물을 생산하는 방법에 있어서, (a) 세포 내로 CAR을 암호화하는 핵산 분자(들)를 도입하여, 투입 조성물을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 투입 조성물을 상기 CAR의 항원 수용체에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체와 인큐베이션하여, 상기 세포 조성물을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
70. 구현예 69에 있어서, 상기 (a)에서 도입은 바이러스 형질도입, 전위, 전기 천공, 또는 화학적 형질주입에 의해 상기 핵산 분자(들)를 상기 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
71. 구현예 69 또는 구현예 70에 있어서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
72. 구현예 69 또는 구현예 70에 있어서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 트랜스포손으로 전위에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
73. 구현예 69 또는 구현예 70에 있어서, 상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터의 전기 천공 또는 형질주입에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
74. 구현예 69 내지 73 중 어느 하나에 있어서, (a) 단계 전에 상기 세포를 활성화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
75. 구현예 74에 있어서, 상기 세포를 활성화하는 단계는 상기 세포를 CD3의 작용제와, 선택적으로 CD28의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
76. 구현예 75에 있어서, 상기 세포를 활성화하는 단계는 상기 세포를 작용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
77. 구현예 69 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션은 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 CAR에 결합하여, 상기 투입 조성물 내 하나 이상의 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
78. 구현예 69 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
79. 구현예 78에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
80. 구현예 69 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고체 지지체에 고정되고, 이것은 선택적으로 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약을 포함하거나 이에 접합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
81. 구현예 69 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 시약에 고정되고, 이것은 선택적으로 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
82. 구현예 80 또는 구현예 81에 있어서, 상기 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
83. 구현예 69 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션은 (약) 적어도 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
84. 구현예 69 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 투입 조성물은 조성물 중 총 세포의 백분율로서 (약) 60% 미만, (약) 50% 미만, (약) 40% 미만, (약) 30% 미만, (약) 20% 미만 또는 (약) 10% 미만의 CAR-발현 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
85. 구현예 69 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 산출 조성물 내 CAR 발현 세포의 수는 상기 투입 조성물 내 CAR 발현 세포의 수와 비교하여 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 또는 그 이상 증가하고/거나; 상기 산출 조성물 내 CAR 발현의 백분율은 조성물 내 총 세포와 비교하여 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
86. 구현예 69 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입 및/또는 인큐베이션 전에, 상기 세포는 CAR 발현 세포에 대해 선택되거나 농축되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
87. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 방법에 있어서, (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
88. 구현예 87에 있어서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체는 친화도-기반 분리에 의해 단리되는 것을 특징으로 하는, 방법.
89. 구현예 88에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
90. 구현예 89에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 자성-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
91. 구현예 89에 있어서, 상기 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
92. 세포를 고갈시키는 방법에 있어서, 대상체에게 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 대상체는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 투여받은 것을 특징으로 하는, 방법.
93. 구현예 92에 있어서, 상기 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 일어나는 것을 특징으로 하는, 방법.
94. 구현예 56 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 방법.
95. 구현예 94에 있어서, 상기 단일 사슬 단편은 scFv인 것을 특징으로 하는, 방법.
96. 구현예 56 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
97. 구현예 96에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv이고 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 가요성 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 방법.
98. 구현예 97에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
99. 구현예 1 내지 구현예 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 38 내지 구현예 41 중 어느 하나의 접합체, 및 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하기 위한 사용 설명서를 포함하되, 상기 사용 설명서는: 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하고/거나; 세포 집단으로부터, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 선택 또는 농축하고/거나; 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조서물을 자극하는 것인, 제조품.
100. 제조품에 있어서, 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약―상기 세포외 도메인 또는 이의 일부는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함함―; 및 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 구현예 38 내지 41 중 어느 하나의 접합체를 포함하는, 제조품.
101. 구현예 100에 있어서, 상기 결합 시약은 제1 결합 시약이고, 상기 제조품은 상기 CAR의 상기 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 제2 결합 시약을 더 포함하는, 제조품.
102. 구현예 100 또는 구현예 101에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 시약의 상기 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부는 동일한 것을 특징으로 하는, 제조품.
103. 구현예 100 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 면역분석을 이용하여 상기 결합 시약에 결합하는 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하기 위해 상기 결합 시약―선택적으로 상기 제1 및 제2 결합 시약―을 사용하기 위한 사용 설명서를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역분석은 브리지 또는 샌드위치 면역분석이고, 선택적으로 상기 샘플은 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR로 조작된 세포를 포함하는 세포 요법을 투여받은 대상체 유래인 것을 특징으로 하는, 제조품.
104. 구현예 100 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 결합 시약―선택적으로 상기 제1 및/또는 제2 결합 시약―은 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는, 제조품.
105. 구현예 101 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 고체 지지체에 부착되거나 고체 지지체에 부착될 수 있고 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 다른 하나는 검출 가능한 표지이거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는, 제조품.
106. 구현예 105에 있어서, 상기 제조품은 고체 지지체를 더 포함하되, 선택적으로 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 비오틴에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 상기 고체 지지체는 스트렙타비딘-코팅된 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
107. 구현예 99 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 제조품.
108. 구현예 107에 있어서, 상기 단일 사슬 단편은 scFv를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
109. 구현예 99 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
110. 구현예 109에 있어서, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv이고 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 가요성 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 제조품.
111. 구현예 110에 있어서, 상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
VIII. 실시예들
하기 실시예들은 예시적인 목적으로만 포함되며 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1: 항-GPRC5D 키메라 항원 수용체에 대한 항-이디오타입 항체의 생성 및 평가
예시적인 항-GPRC5D 키메라 항원 수용체(CAR)의 scFv 부분을 인식하는 항-이디오타입 항체를 생성 및 평가하였다. 생성된 예시적인 항-이디오타입 항체의 아미노산 서열(서열 번호)을 표 E1에 나타내었다.
표 E1. 예시적인 항-이디오타입 항체 클론의 아미노산 서열(서열 번호).
Figure pct00001
A. 항-GPRC5D CAR에 대한 항-ID 항체
예시적인 항-GPRC5D 항체의 scFv 부분을 인식하는 항-이디오타입 항체(항-ID)를 생성하였다. 항-GPRC5D CAR은 항-GPRC5D 항체로부터 유래된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역(서열 번호: 10에 제시된 링커에 의해 분리되며, 각각 서열 번호: 8 및 7의 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역 서열; 서열 번호: 9에 제시된 scFv 서열을 가짐), 인간 IgG 유래 스페이서(서열 번호: 11), 인간 CD28 유래 막관통 도메인(서열 번호: 12), 인간 4-1BB 유래 세포내 신호 전달 도메인(서열 번호: 13), 및 인간 CD3 제타 유래 신호 전달 도메인(서열 번호: 14)을 갖는 항-GPRC5D scFv를 함유하였다.
마우스를 마우스 Fc에 융합된 항-GPRC5D scFv로 면역화하였다. 면역화된 마우스의 비장으로부터 면역 세포를 단리하고, 항체 생산 비장 세포를 종양 세포(예를 들어, 골수종 세포)와 융합하여 하이브리도마 융합 세포를 생산하였다. 하이브리도마 세포를 클론 증폭시키고, 상청액을 재조합 용해성 scFv-Fc에 대한 결합에 대해 ELISA 및 항-GPRC5D CAR-발현 세포에 대한 결합에 대해 유세포 분석으로 스크리닝하였다. 하이브리도마 클론 유래 상청액을 비-표적 scFv-Fc에 대한 ELISA 및 비-표적 CAR을 발현하는 세포에 대한 유세포 분석에 의해 역-스크리닝하였다. 각각의 선택된 하이브리도마 클론을 증폭시키고, 추가의 특성화를 위해 항체를 정제하였다.
B. 유세포 분석에 의한 항-GPRC5D CAR에 대한 항-이디오타입 항체의 결합 평가
항-ID 항체 클론을 항-GPRC5D CAR로 조작된 T 세포에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 평가하여, 유세포 분석에 사용하기에 적합할 수 있는 후보 클론을 식별하였다. 항-GPRC5D CAR, 또는 상이한 항원에 특이적인 비관련 대조군 CAR(대조군 CAR), 또는 비-조작된 (모체) 주르카트 세포를 발현하도록 조작된 1 x 105개 주르카트 T 세포를 4°C에서 20분 동안 Alexa Fluor®647 형광단에 접합된 10종의 항-ID 항체 클론 (클론 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10) 중 하나 2.5μg/mL와 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제로 2x 세척하고, 150μL의 FACS 완충제에 재현탁시키고, 유세포 분석을 수행하였다. 클론 1은 대조군 CAR에 대한 항-이디오타입 항체이다.
도 1a에 도시된 바와 같이, 두 번의 별도의 실험(실험 #1 및 실험 #2)에서 평균 형광 강도(MFI)를 측정하였으며, 클론 7, 8, 9 및 10이 실험된 클론 중 가장 높은 MFI를 나타내는 것으로 관찰되었다.
도 1b에 도시된 바와 같이, 클론 8은 시험된 클론 중 항-GPRC5D CAR에 대해 가장 높은 MFI를 나타내는 것으로 관찰되었고, 시험된 클론 중 대조군 CAR에 대해 가장 낮은 MFI를 나타내는 것으로 관찰되었다. 이는 클론 8이 항-GPRC5D CAR을 특이적으로 검출하는 데 사용하기에 적합한 독특한 특징을 나타낸다는 것을 입증한다.
C. 용해성 또는 플레이트-결합 항-이디오타입 항체의 T 세포 자극 작용성 활성 평가
상기 기술된 다양한 항-ID 항체 클론을 리포터 세포주를 이용하여 T 세포 자극에 대한 그들의 작용성 활성에 대해 시험하였다.
Nur77-tdTomato 녹인 리포터(knock-in reporter)를 함유하는 리포터 세포주를 생성하였으며, 여기서 tdTomato 형광 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 내인성 Nur77 유전자 자리에서 녹인(knock-in)되었다. 희귀 핵 호르몬 수용체 Nur77(Nr4a1로도 명명)은 T 세포 수용체 유래 신호의 활성화에 의해 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 분자를 통해, 유도된 즉각적인 초기 반응 유전자이다. 유전자 편집을 이용하여 유전자 파괴를 도입하고, tdTomato를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 파괴에 가까운 부위에서 상동성-의존성 수선(homology-dependent repair, HDR)에 의한 통합을 위해 표적화시킴으로써, 정지 코돈 전에 최종 엑손에서 내인성 Nur77 유전자와 틀 내(in-frame) 통합을 위해 tdTomato를 암호화하는 핵산 서열을 표적화하였다.
Nur77-tdTomato 리포터 세포주를 항-GPRC5D CAR, 또는 대조군 CAR을 발현하도록 조작하였고, 용해성 항-ID 항체 또는 플레이트-결합된 항-ID 항체와 함께 인큐베이션 후 리포터 발현을 평가하였다. 용해성 항-ID 항체를 평가하기 위해, 다중-웰 플레이트를 PBS(인산염완충식염수) 및 10% FBS(소 태아 혈청)로 밤새 블로킹하였다. 플레이트에 10% FBS를 함유한 RPMI 배지에서 10개의 항-ID 항체 클론(클론 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10) 중 하나 2.5μg/mL을 첨가하였다. 플레이트-결합된 항-ID 항체를 평가하기 위해, 다중-웰 플레이트를 PBS 중 항-ID 항체 클론 중 하나 2.5μg/mL로 4°C에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 코팅한 후, 10% FBS를 함유한 RPMI 배지로 세척하였다. 1 x 105개 Nur77-tdTomato 리포터 세포를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하였고, DAPI 염색 및 tdTomato 형광 강도에 대해 유세포 분석으로 평가하였다.
결과는 도 2a-2b에 도시되어 있다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 각각의 플레이트-결합된 항-ID 클론과 함께 인큐베이션한 결과, 대조군 CAR에 대한 항-이디오타입 항체인 클론 1을 제외하고, 항-GPRC5D CAR을 발현하는 tdTomato+ 세포의 높은 백분율을 나타내었다. 이는 클론 1을 제외한 각각의 클론이 플레이트-결합된 형태의 작용성 활성을 나타낸다는 것을 입증한다. 용해성 항-ID 클론들과의 인큐베이션은 항-GPRC5D CAR을 발현하는 tdTomato+ 세포의 더 작은 백분율을 초래하였고, 이는 이 클론들이 용해성 형태의 상대적으로 약한 작용성 활성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 플레이트 결합된 클론 2, 3, 5, 8 및 10은 대조군 CAR을 발현하는 tdTomato+ 세포의 낮은 백분율을 나타내었으며, 이는 각각의 클론에 대하여 세포의 약 5% 미만으로 관찰되었으며, 항-GPRC5D CAR을 발현하는 tdTomato+ 세포의 높은 백분율을 나타내었으며, 이는 각각의 클론에 대하여 세포의 약 85% 초과로 관찰되었다.
실시예 2: 일차 T 세포에서 후보 항-이디오타입 항체의 CAR 결합 평가
실시예 1에 기술된 예시적인 항-GPRC5D CAR을 발현하도록 조작된 T 세포에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 후보 항-이디오타입 항체(클론 8)를 평가하였다. 항-GPRC5D CAR-T 세포를 생성하기 위해, 1차 인간 T 세포를 전혈로부터 단리하고, 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15의 존재 하에 72시간 동안 항-CD3/항-CD28 자성 비드로 자극하였다. 예시적인 항-GPRC5D CAR을 암호화하는 바이러스로 회전 접종에 의한 자극 개시 후 2일 내지 3일에 T 세포를 형질도입하고, 증폭을 위한 조건에서 배양하고, 수확하고, 냉동 보존하였다.
조작 후, 5명의 건강한 공여체로부터 5 x 105개의 항-GPRC5D CAR-T 또는 모의 가공된 T 세포 분취량을 유세포 분석에 의해 CAR 발현에 대해 분석하였다. 항-ID 클론 8에 의한 CAR 결합 특이성을 시험하기 위해, 비-표적 항-BCMA CAR을 발현하도록 형질도입된 1차 T 세포에 대한 클론 8 결합을 또한 평가하였다. 비-표적 항-BCMA CAR은 항-BCMA scFv, 면역글로불린 스페이서, 인간 CD28 유래 막관통 도메인, 인간 4-1BB 유래 세포내 신호 전달 도메인 및 인간 CD3 제타 유래 신호 전달 도메인을 함유하였다.
세포를 Alexa Fluor 488에 접합된 1.25 μg/mL의 클론 8과 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석 이벤트를 FACSymphony 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 수집하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어(Treestar Inc, Ashland, OR)로 분석하였다.
도 3은 항-GPRC5D CAR-T 세포, 항-BCMA CAR-T 세포, 및 모의 가공된 T 세포에 대한 형광단-접합된 클론 8 결합에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸다. 각 샘플에 대해 나타낸 숫자는 클론 8에 결합된 세포의 백분율을 나타낸다. 도시된 바와 같이, 클론 8 결합은 예시적인 항-GPRC5D CAR를 발현하는 T 세포에 매우 특이적이었다. 샘플들 중에서, 항-GPRC5D CAR을 발현하도록 조작된 세포의 60% 넘게는 항-ID 클론 8에 의한 양성 표지를 나타냈다. 대조적으로, 0.5% 미만의 모의 가공된 T 세포 또는 항-BCMA CAR-T 세포는 양성 표지를 나타냈다.
이러한 결과는 항-ID 클론 8이 예시적인 항-GPRC5D CAR을 발현하는 일차 T 세포에 특이적으로 결합할 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 카트리지-기반 유동 시스템에서 후보 항-이디오타입 항체를 이용한 CAR 발현 측정
카트리지-기반 유동 시스템(Accellix)에서 항-GPRC5D CAR 발현을 측정하기 위한 후보 항-이디오타입 항체(클론 8)의 사용을 평가하였다. 특이성을 시험하기 위해, 클론 8 결합을 실시예 1에 기술된 예시적인 항-GPRC5D CAR을 발현하도록 형질도입된 1차 T 세포 뿐만 아니라 비-GPRC5D 표적화 CAR (CD19 또는 BCMA을 겨냥한 scFv 함유) 또는 조작된 TCR을 포함하는 비-표적 항원 수용체를 발현하도록 형질도입된 1차 T 세포에 대해 분석하였다. 카트리지-기반 유동 시스템에서 항-ID 클론 8을 사용하여 CAR 검출 빈도의 선형성을 시험하기 위해, 예시적인 항-GPRC5D CAR을 발현하는 1차 T 세포의 연속 희석된 샘플을 또한 제조하고 분석하였다.
항-GPRC5D CAR-T 세포를 생성하기 위해, 1차 인간 T 세포를 성분채집술 재료로부터 단리하고, 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15의 존재 하에 24시간 동안 항-CD3/항-CD28 자성 비드로 자극하였다. 예시적인 항-GPRC5D CAR을 암호화하는 바이러스로 회전 접종에 의한 자극 개시 후 1일에 T 세포를 형질도입하고, 증폭을 위한 조건에서 배양하고, 수확하고, 냉동 보존하였다.
시험을 위한 세포 샘플을 제조하기 위해, 냉동 보존된 항-GPRC5D CAR-T 세포 조성물을 함유하는 바이알을 해동시키고, 혼합하고, 카트리지-기반 유동 시스템을 사용하여 CAR 발현에 대해 평가하였다. 분석을 위해, 약 40μL의 세포 샘플을 형광 표지된 항-ID 클론 8을 함유하는 건조된 시약 튜브에 또는 FMO(fluorescence minus one) 대조군으로서 형광 표지된 항-ID 클론 8 항체가 없는 건조된 시약 튜브에 분배하였다. 샘플 및 FMO 대조군 건조된 시약 튜브 둘 모두 또한 다른 T 세포 표지자(예를 들어, CD3 또는 CD45)의 다중-색 유세포 분석 검출 및 생존 세포에 대한 염색을 위한 동일한 추가의 형광-표지 항체를 함유하였다. 시약 튜브를 2분 동안 펄스 와동하고, 15μL의 FMO 샘플을 유동 카트리지로 옮겼다. 이어서, 카트리지를 신호 획득 및 스펙트럼 분석을 위해 Accellix 벤치탑 기구에 삽입하였다.
모든 후속 분석을 위해, 형광 품질 조절 비드 및 죽은 세포를 배제하기 위해 세포를 게이팅하고, 전체 염색 샘플에서 생존 CD45+ 세포의 백분율로서 CD3 및 CAR 발현을 측정하였다. FMO 샘플은 CD3+CAR+ 게이트를 설정하기 위해 사용되었고, 이는 FMO 샘플에서 CAR 발현의 빈도가 약 0.07 - 0.15%(모집단%)가 되도록 조정되었다.
A. 후보 항-이디오타입 항체의 결합 특이성
예시적인 항-GPRC5D CAR에 대한 클론 8의 결합 특이성을 시험하기 위해, FMO 및 전체 염색 샘플을 상기 기술된 바와 같이 제조하고 분석하였다.
결과는 평균적으로, 예시적인 항-GPRC5D CAR을 발현하도록 조작된 생존 CD45+ 1차 T 세포의 52.94%가 시험된 샘플에 걸쳐 형광단-접합된 클론 8에 의한 양성 염색을 나타내었다는 것을 보여주었다. 대조적으로, 모의 형질도입된 또는 비-표적 항원 수용체로 형질도입된 세포는 0.5% 미만의 CAR 빈도를 나타냈다. 이러한 결과는 예시적인 항-GPRC5D CAR의 검출을 위한 항-ID 클론 8의 특이성을 입증한다.
B. 후보 항-이디오타입 항체를 이용한 CAR 검출 빈도의 선형성
선형성을 평가하기 위해, 예시적인 항-GPRC5D CAR를 발현하는 1차 T 세포를 함유하는 세포 샘플을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 FMO 및 전체 염색 샘플을 제조하고 분석하였다. 희석되지 않은 세포 샘플의 생존 CD45+ 세포 중 CD3+ 및 CD3+CAR+ 세포의 빈도를 먼저 평가하였다. 이러한 측정을 바탕으로 예상되는 CD3+ 및 CD3+CAR+ 빈도를 8개의 샘플 희석점(90%, 80%, 70%, 30%, 10%, 5%, 2% 및 1% 세포 샘플)에 대해 계산한 후, 관찰된 CD3+ 및 CD3+CAR+ 빈도에 대해 세포 샘플을 희석하여 분석하였다. 희석을 위해, CD3-고갈된, 비-CAR 발현, 냉동 보존된 성분채집술 생성물을 희석제 매트릭스로서 사용하였다. 2개의 희석 시리즈를 수행하고, 후속 분석 전에 관찰된 빈도의 평균을 냈다. CD3+ 및 CD3+CAR+ 검출의 선형성을 예상 및 관찰된 빈도의 상관관계에 기초하여 평가하였다.
표 E4는 생존 CD45+ 세포 중 CD3+ 세포의 예상 및 관찰 빈도를 나타낸다. 이러한 값을 바탕으로, 상관 계수(r2) 값은 0.999이었고, 기울기가 1.013이고 y-절편이 -1.032인 최적선(best-fit line)을 가졌다.
Figure pct00002
표 E5는 생존 CD45+ 세포 중 CD3+CAR+ 세포의 예상 및 관찰 빈도를 나타낸다. 이러한 값을 바탕으로, r2 값은 0.996이었고, 기울기가 0.9931이고 y-절편이 0.2521인 최적선(best-fit line)을 가졌다.
Figure pct00003
종합하면, 이 결과들은 후보 항-이디오타입 항체(클론 8)의 사용이 카트리지-기반 유동 시스템에서 예시적인 항-GPRC5D CAR의 발현의 특이적이고 정확한 평가를 가능하게 한다는 것을 보여준다.
실시예 4: 후보 항-ID 항체를 이용하는 생체 내 CAR-T 세포 검출
후보 항-이디오타입 항체(클론 8)의 생체 내 CAR-T 세포 검출 능력을 평가하였다. OPM-2 다발성 골수종(MM) 세포주 유래 세포를 녹색 형광 단백질 및 적색-이동 이탈리아 반딧불이 루시퍼라아제를 발현하도록 조작하였다. 수확 후, 2 x 106개의 조작된 OPM-2 세포를 꼬리 정맥을 통해 면역 결핍 마우스에 정맥내 주사하였다. 14일 후, 마우스에 예시적인 항-GPRC5D CAR을 발현하도록 조작된 약 5 x 105개, 1 x 106개, 또는 2 x 106개 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였다. CAR-T 세포 처리 후 7일, 14일, 21일 및 28일차에, 처리된 마취된 마우스로부터 안구뒤 부비강(retro-orbital sinus)을 통해 약 200μL의 혈액을 수집하였다. 이어서, 형광단-접합된 항-ID 클론 8을 포함하는 항체 칵테일로 염색하여, 투여된 CAR-T 세포의 존재에 대해 혈액 샘플을 평가하였다. 유세포 분석 이벤트를 유세포 분석기에서 수집하여 분석하였다.
표 E6은 CAR-T 세포 처리 후 7일, 14일, 21일 또는 28일차에 항-ID 클론 8을 이용하여 혈액에서 검출된 항-GPRC5D CAR 발현 세포의 평균 계수/μL를 나타낸 것이다. 처리 군 당, 표 E6에 나타낸 값은 4마리 동물에 대한 평균 및 표준 편차(SD)이다.
Figure pct00004
이러한 결과들은 후보 항-이디오타입 항체 클론 8이 생체 내에서 항-GPRC5D CAR을 발현하는 T 세포를 검출 및 정량하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해, 예를 들어 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위를 제한하려는 의도가 있는 것은 아니다. 기술된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 기재 및 가르침에서 명백해질 것이다. 상기 변형은 본 개시 내용의 진정한 범위와 정신에서 벗어나지 않고 실시될 수 있으며, 본 개시 내용의 범위에 속하도록 의도된다.
하기 표 2와 같이 서열을 제시한다:
서열
# 서열 주석
1 SHSMN CDR-H1 (Kabat)
2 SISSDSTYTYYADSVKG CDR-H2 (Kabat)
3 SGGQWKYYDY CDR-H3 (Kabat)
4 QGDSLRSYYAS CDR-L1 (Kabat)
5 GKNNRPS CDR-L2 (Kabat)
6 NSRDSSGNPPVV CDR-L3 (Kabat)
7 QVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFTFRSHSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSDSTYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGGQWKYYDYWGQGTLVTVSS 항-GPRC5D VH 사슬
8 SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNPPVVFGGGTKLTVLG 항-GPRC5D VL 사슬
9 SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNPPVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFTFRSHSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSDSTYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGGQWKYYDYWGQGTLVTVSS 항-GPRC5D scFv (VL-VH)
10 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA 링커
11 ESKYGPPCPPCP 스페이서
12 MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 막관통 도메인
13 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4-1BB-유래 세포내 공-신호 전달 서열 (aa)
14 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3-제타 유래 세포내
15 DYYMY CDR-H1 (Kabat)
16 TISDGGSYTYYPDSVKG CDR-H2 (Kabat)
17 DWNPYYGSGGGWFGY CDR-H3 (Kabat, Chothia, AbM)
18 GFTFSDY CDR-H1 (Chothia)
19 SDGGSY CDR-H2 (Chothia)
20 GFTFSDYYMY CDR-H1 (AbM)
21 TISDGGSYTY CDR-H2 (AbM)
22 KASQSVDYDGDSYMN CDR-L1 (Kabat, Chothia, AbM)
23 AASNLES CDR-L2 (Kabat, Chothia, AbM)
24 QQSNEDPFT CDR-L3 (Kabat, Chothia, AbM)
25 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLDWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDWNPYYGSGGGWFGYWGQGTLVTASA 항-ID VH 사슬
26 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK 항-ID VL 사슬
27 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLDWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDWNPYYGSGGGWFGYWGQGTLVTASAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 항-ID 중쇄
28 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 항-ID 경쇄
29 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGACTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATTGGAACCCCTACTACGGTAGTGGGGGGGGCTGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGCCTCTGCA 항-ID VH 사슬 (뉴클레오타이드)
30 GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAAC 항-ID VL 사슬 (뉴클레오타이드)
31 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGACTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATTGGAACCCCTACTACGGTAGTGGGGGGGGCTGGTTTGGTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGCCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA 항-ID 중쇄 (뉴클레오타이드)
32 GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT 항-ID 경쇄 (뉴클레오타이드)
33 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM 절단형 EGFR (tEGFR)
34 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (수탁 번호 P10747의 아미노산 180-220) 호모 사피엔스
35 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (LL이 GG로) 호모 사피엔스
36 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH3 스페이서 (aa)
37 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH2-CH3 스페이서 (aa)
38 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A 펩타이드 (aa)
39 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 펩타이드 (aa)
40 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 펩타이드 (aa)
41 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A 펩타이드 (aa)
42 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A 펩타이드 (aa)
43 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A 펩타이드 (aa)
44 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A 펩타이드 (aa)
45 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A 펩타이드
SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics, Inc. <120> ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES TO GPRC5D-TARGETED BINDING DOMAINS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS <130> 735042022640 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/945,064 <151> 2019-12-06 <150> US 63/061,757 <151> 2020-08-05 <160> 45 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 (Kabat) <400> 1 Ser His Ser Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 (Kabat) <400> 2 Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 (Kabat) <400> 3 Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 (Kabat) <400> 4 Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 (Kabat) <400> 5 Gly Lys Asn Asn Arg 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Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro 85 90 95 Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 9 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-GPRC5D scFv (VL-VH) <400> 9 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro 85 90 95 Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 115 120 125 Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160 Arg Ser His Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 195 200 205 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 10 Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Glu Met Ala 20 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 11 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 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Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 (Kabat) <400> 15 Asp Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 (Kabat) <400> 16 Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 (Kabat, Chothia, AbM) <400> 17 Asp Trp Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Trp Phe Gly Tyr 1 5 10 15 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 (Chothia) <400> 18 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 (Chothia) <400> 19 Ser Asp Gly Gly Ser Tyr 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 (AbM) <400> 20 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr 1 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gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccattc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaac 334 <210> 31 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ID Heavy chain <400> 31 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggactg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagagattgg 300 aacccctact acggtagtgg ggggggctgg tttggttact ggggccaagg gactctggtc 360 actgcctctg cagccaaaac aacagcccca tcggtctatc cactggcccc tgtgtgtgga 420 gatacaactg gctcctcggt gactctagga tgcctggtca agggttattt ccctgagcca 480 gtgaccttga cctggaactc tggatccctg tccagtggtg tgcacacctt cccagctgtc 540 ctgcagtctg acctctacac cctcagcagc tcagtgactg taacctcgag cacctggccc 600 agccagtcca tcacctgcaa tgtggcccac ccggcaagca gcaccaaggt ggacaagaaa 660 attgagccca gagggcccac aatcaagccc tgtcctccat gcaaatgccc agcacctaac 720 ctcttgggtg gaccatccgt cttcatcttc cctccaaaga tcaaggatgt actcatgatc 780 tccctgagcc ccatagtcac atgtgtggtg gtggatgtga gcgaggatga cccagatgtc 840 cagatcagct ggtttgtgaa caacgtggaa gtacacacag ctcagacaca aacccataga 900 gaggattaca acagtactct ccgggtggtc agtgccctcc ccatccagca ccaggactgg 960 atgagtggca aggagttcaa atgcaaggtc aacaacaaag acctcccagc gcccatcgag 1020 agaaccatct caaaacccaa agggtcagta agagctccac aggtatatgt cttgcctcca 1080 ccagaagaag agatgactaa gaaacaggtc actctgacct gcatggtcac agacttcatg 1140 cctgaagaca tttacgtgga gtggaccaac aacgggaaaa cagagctaaa ctacaagaac 1200 actgaaccag tcctggactc tgatggttct tacttcatgt acagcaagct gagagtggaa 1260 aagaagaact gggtggaaag aaatagctac tcctgttcag tggtccacga gggtctgcac 1320 aatcaccaca cgactaagag cttctcccgg actccgggta aa 1362 <210> 32 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ID Light chain <400> 32 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccattc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 360 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 420 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 480 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 540 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 600 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgt 654 <210> 33 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated EGFR (tEGFR) <400> 33 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 20 25 30 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 35 40 45 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 50 55 60 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 85 90 95 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 100 105 110 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 115 120 125 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 145 150 155 160 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 165 170 175 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 180 185 190 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 195 200 205 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 210 215 220 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 225 230 235 240 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 245 250 255 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 260 265 270 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 275 280 285 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 290 295 300 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 305 310 315 320 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 325 330 335 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 340 345 350 Ile Gly Leu Phe Met 355 <210> 34 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747) <400> 34 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 35 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (LL to GG) <400> 35 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 36 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hinge-CH3 spacer <400> 36 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 20 25 30 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 50 55 60 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 85 90 95 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 100 105 110 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 115 <210> 37 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hinge-CH2-CH3 spacer <400> 37 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 38 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A peptide <400> 38 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 20 <210> 39 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A peptide <400> 39 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A peptide <400> 40 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A peptide <400> 41 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 42 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A peptide <400> 42 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 43 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A peptide <400> 43 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 44 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A peptide <400> 44 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A peptide <400> 45 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro

Claims (114)

  1. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
    서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및
    서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 영역;
    을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
    서열 번호: 25의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 아미노산 서열들을 각각 포함하는, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 영역; 및
    서열 번호: 26의 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 아미노산 서열들을 각각 포함하는, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역;
    을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
    서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
    서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
    을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VH 영역은 서열 번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고;
    상기 VL 영역은 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VH 영역은 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 VL 영역은 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
    서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및
    서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역;
    을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄 및/또는 경쇄의 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc의 일부를 포함하는 중쇄 불변 영역 및/또는 CL 도메인을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 면역글로불린 불변 영역은 IgG 유래, 선택적으로 IgG1 유래인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 경쇄 불변 영역은 카파 경쇄 유래인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    온전한 항체 또는 전장 항체인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
    서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
    서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 단편인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, scFv 및 단일 도메인 항체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화된, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합성인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    단클론인, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D)에 결합하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 단일 사슬 단편은 상기 VH 영역과 상기 VL 영역 사이에 위치하는 가요성 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 상기 단일 사슬 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv)인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 상보성 결정 영역(CDR)의 전부 또는 일부 내의 또는 이를 포함하는 에피토프에 결합하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 있거나 이에 포함되고/거나;
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원 결합 도메인 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 scFv는 CAR의 세포외 부분 내에 있거나 이에 포함되고/거나;
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR의 세포외 부분 내에 포함된 또는 이에 포함된 상기 scFv에 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상기 CAR은 스페이서를 통해 상기 항원 결합 도메인에 연결된 막관통 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 스페이서는 면역글로불린 스페이서이고, 선택적으로 상기 스페이서는 서열 번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은, 선택적으로 인간 CD28인, CD28의 막관통 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 CAR의 상기 스페이서 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 선택적으로 인간 CD28인, CD28 또는 이의 부분에 결합하지 않거나 특이적으로 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 선택적으로 인간 IgG1 Fc 도메인인, Fc 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대해 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM인, 또는 (약) 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 미만인 해리 상수를 가지는 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항-GPRC5D 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 작용제(agonist)인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용액 중에 있을 때 상기 CAR의 작용제인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 고정될 때 상기 CAR의 작용제이고, 선택적으로 상기 지지체 또는 정지상은 플레이트 또는 비드인 것을 특징으로 하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는, 접합체.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 이종 분자 또는 모이어티는 표지(label)인 것을 특징으로 하는, 접합체.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 표지는 형광 염료, 형광 단백질, 방사성 동위원소, 발색단, 금속 이온, 금 입자, 은 입자, 자성 입자, 폴리펩타이드, 효소, 스트렙타비딘, 비오틴, 발광 화합물, 및 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  44. 제42항에 있어서,
    상기 이종 분자 또는 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 저분자(small molecule)이고, 이는 선택적으로 독소 또는 Strep-Tag이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 접합체.
  45. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는, 핵산 분자(들).
  46. 제45항에 있어서,
    (i) 서열 번호: 25에 제시된 중쇄 가변 영역, (ii) 서열 번호: 25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (iv) 서열 번호: 26에 제시된 경쇄 가변 영역, (v) 서열 번호: 26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역, 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
    을 포함하는, 핵산 분자(들).
  47. 제45항에 있어서,
    (i) 서열 번호: 27에 제시된 중쇄, (ii) 서열 번호: 27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 중쇄, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (iv) 서열 번호: 28에 제시된 경쇄, (v) 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 경쇄, 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 퇴화 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
    을 포함하는, 핵산 분자(들).
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자(들)는 신호 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자(들).
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 분자(들)는 서열 번호: 29 내지 32로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자(들).
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산 분자(들)를 포함하는, 벡터.
  51. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제50항의 벡터를 포함하는, 세포.
  52. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 있어서,
    적합한 숙주 세포에서 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산 분자(들) 또는 제50항의 벡터에 의해 암호화되는 중쇄 및/또는 경쇄를 발현시키는 단계; 및
    상기 항체를 회수하거나 단리하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  53. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 있어서,
    제51항의 세포를 중쇄 및/또는 경쇄가 발현되는 조건에서 배양하는 단계; 및
    상기 항체를 회수하거나 단리하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항의 방법에 의해 생산된, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  55. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체, 또는 제51항의 세포를 포함하는, 조성물.
  56. 제55항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 조성물.
  57. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체, 및 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항의 핵산 분자(들) 중 하나 이상, 및 선택적으로 사용 설명서를 포함하는, 키트.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 접합체를 고정하기 위한 시약 또는 지지체를 더 포함하되, 상기 시약 또는 지지체는 비드, 컬럼, 마이크로웰, 스틱, 필터, 스트립, 또는 용해성 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약인 것을 특징으로 하는, 키트.
  59. 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 상기 항-이디오타입 항체를 검출하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포에 결합되거나 세포의 표면 상에 발현되고, 상기 (b)에서 검출하는 단계는 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    상기 세포는 자신의 표면 상에서 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  62. 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 직접적으로 또는 간접적으로 표지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  64. 세포 집단으로부터 세포를 선택하는 방법에 있어서,
    (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 세포를 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포를 선택하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 결합된 세포는 친화도-기반 분리에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서,
    상기 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서,
    상기 친화도-기반 분리는 유세포 분석에 의한 것을 특징으로 하는, 방법.
  68. 제65항 또는 제66항에 있어서,
    상기 친화도-기반 분리는 자성 활성화 세포 분류에 의한 것을 특징으로 하는, 방법.
  69. 제65항 또는 제66항에 있어서,
    상기 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 지지체 또는 정지상에 가역적으로 결합 또는 고정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  71. 세포를 자극하는 방법에 있어서,
    표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체와 인큐베이션하여, 자극된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 세포 조성물을 생산하는 방법에 있어서,
    (a) 세포 내로 CAR을 암호화하는 핵산 분자(들)를 도입하여, 투입 조성물을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 투입 조성물을 상기 CAR의 항원 수용체에 특이적으로 결합하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체와 인큐베이션하여, 상기 세포 조성물을 생산하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서,
    상기 (a)에서 도입은 바이러스 형질도입, 전위, 전기 천공, 또는 화학적 형질주입에 의해 상기 핵산 분자(들)를 상기 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서,
    상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
  75. 제72항 또는 제73항에 있어서,
    상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 트랜스포손으로 전위에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  76. 제72항 또는 제73항에 있어서,
    상기 (a)에서 도입은 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터의 전기 천공 또는 형질주입에 의해 상기 세포에 상기 핵산 분자(들)를 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  77. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 전에 상기 세포를 활성화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서,
    상기 세포를 활성화하는 단계는 상기 세포를 CD3의 작용제와, 선택적으로 CD28의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서,
    상기 세포를 활성화하는 단계는 상기 세포를 작용성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  80. 제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 CAR에 결합하여, 상기 투입 조성물 내 하나 이상의 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  81. 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  83. 제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고체 지지체에 고정되고, 이것은 선택적으로 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약을 포함하거나 이에 접합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  84. 제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 용해성 시약에 고정되고, 이것은 선택적으로 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 가역적으로 결합될 수 있는 복수의 결합 부위이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서,
    상기 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  86. 제72항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 (약) 적어도 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  87. 제72항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투입 조성물은 조성물 중 총 세포의 백분율로서 (약) 60% 미만, (약) 50% 미만, (약) 40% 미만, (약) 30% 미만, (약) 20% 미만 또는 (약) 10% 미만의 CAR-발현 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  88. 제72항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산출 조성물 내 CAR 발현 세포의 수는 상기 투입 조성물 내 CAR 발현 세포의 수와 비교하여 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 또는 그 이상 증가하고/거나;
    상기 산출 조성물 내 CAR 발현의 백분율은 조성물 내 총 세포와 비교하여 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  89. 제72항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도입 및/또는 인큐베이션 전에, 상기 세포는 CAR 발현 세포에 대해 선택되거나 농축되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  90. 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 정제하는 방법에 있어서,
    (a) 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 단리하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 복합체는 친화도-기반 분리에 의해 단리되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  92. 제91항에 있어서,
    상기 친화도-기반 분리는 면역 친화도-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서,
    상기 친화도-기반 분리는 자성-기반 분리인 것을 특징으로 하는, 방법.
  94. 제92항에 있어서,
    상기 친화도-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  95. 세포를 고갈시키는 방법에 있어서,
    대상체에게 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 대상체는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 투여받은 것을 특징으로 하는, 방법.
  96. 제95항에 있어서,
    상기 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 일어나는 것을 특징으로 하는, 방법.
  97. 제59항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서,
    상기 단일 사슬 단편은 scFv인 것을 특징으로 하는, 방법.
  99. 제59항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  100. 제99항에 있어서,
    상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv이고 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 가요성 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서,
    상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  102. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체, 및 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하기 위한 사용 설명서를 포함하되,
    상기 사용 설명서는:
    표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하고/거나;
    세포 집단으로부터, 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 조작된 세포를 선택 또는 농축하고/거나;
    상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 자극하는 것인, 제조품.
  103. 제조품에 있어서,
    표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약―상기 세포외 도메인 또는 이의 일부는 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함함―; 및
    제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항의 접합체;
    를 포함하는, 제조품.
  104. 제103항에 있어서,
    상기 결합 시약은 제1 결합 시약이고, 상기 제조품은 상기 CAR의 상기 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 제2 결합 시약을 더 포함하는, 제조품.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 결합 시약의 상기 CAR의 세포외 도메인 또는 이의 일부는 동일한 것을 특징으로 하는, 제조품.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역분석을 이용하여 상기 결합 시약에 결합하는 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하기 위해 상기 결합 시약―선택적으로 상기 제1 및 제2 결합 시약―을 사용하기 위한 사용 설명서를 더 포함하되,
    선택적으로 상기 면역분석은 브리지 또는 샌드위치 면역분석이고, 선택적으로 상기 샘플은 상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR로 조작된 세포를 포함하는 세포 요법을 투여받은 대상체 유래인 것을 특징으로 하는, 제조품.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 시약―선택적으로 상기 제1 및/또는 제2 결합 시약―은 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는, 제조품.
  108. 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 고체 지지체에 부착되거나 고체 지지체에 부착될 수 있고 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 다른 하나는 검출 가능하게 표지되거나 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는, 제조품.
  109. 제108항에 있어서,
    상기 제조품은 고체 지지체를 더 포함하되,
    선택적으로 상기 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 비오틴에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 상기 고체 지지체는 스트렙타비딘-코팅된 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
  110. 제102항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 사슬 단편인 것을 특징으로 하는, 제조품.
  111. 제110항에 있어서,
    상기 단일 사슬 단편은 scFv인 것을 특징으로 하는, 제조품.
  112. 제102항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
  113. 제112항에 있어서,
    상기 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv이고 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 가요성 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 제조품.
  114. 제113항에 있어서,
    상기 가요성 링커는 서열 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scFv는 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조품.
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