PT1034298E - Humanização de anticorpo murino - Google Patents

Description

ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Humanização de anticorpo murino"

Campo técnico

Este invento refere-se à humanização de anticorpos murinos.

Antecedentes do invento

Os anticorpos compreendem normalmente duas cadeias pesadas unidas uma à outra por ligações dissulfureto e duas cadeias leves ligadas a uma cadeia pesada correspondente por uma ligação dissulfureto. Partindo de uma extremidade de cada cadeia pesada, existe um domínio variável seguido de vários domínios constantes. De modo idêntico, cada cadeia leve possui um domínio variável numa extremidade, mas apenas um único domínio constante na sua outra extremidade. Há dois tipos de cadeia leve, que são designados por cadeias lambda (λ) e capa (k) . Não foi encontrada nenhuma diferença funcional entre os anticorpos que possuem cadeias leves À ou κ. A razão dos dois tipos de cadeia leve, contudo, varia de espécie para espécie. Nos ratinhos, a razão k:à é de 20:1, enquanto nos seres humanos é de 2:1.

Os domínios variáveis das cadeias leve e pesada estão alinhados, tal como acontece com o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante da cadeia pesada. Os domínios constantes das cadeias leves e pesadas não estão directamente envolvidos na ligação do anticorpo ao antigénio. São os domínios variáveis que formam o local de ligação do antigénio dos anticorpos. A constituição geral de cada domínio das cadeias leve e pesada compreende uma estrutura de quatro regiões, cujas sequências são relativamente conservadas, ligada por três regiões determinantes da complementaridade (CDR de "complementarity determining regions"). As quatro regiões de estrutura utilizam uma conformação de folha beta, e as CDR formam voltas que ligam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha beta. As CDR são mantidas próximas umas das outras pelas regiões de 2 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ estrutura e, juntamente com as CDR do outro domínio, contribuem para a formação do local de ligação do antigénio.

Embora os antigénios de superfície celular das células tumorais sejam os alvos tradicionais da terapia do cancro orientada por anticorpos, uma das principais limitações na terapia dos tumores sólidos é a fraca acessibilidade dos antigénios tumorais aos anticorpos que circulam na corrente sanguínea. 0 denso empacotamento das células tumorais e a pressão intersticial elevada no núcleo do tumor constituem barreias físicas formidáveis.

Uma solução para o problema da baixa penetração dos anticorpos nos tumores sólidos seria atacar as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos do tumor, em vez das células tumorais em si. Embora possa ser difícil visar especificamente a vasculatura do tumor maduro, isto é, sem destruir o tecido saudável, certas estratégias promissoras têm como objectivo a inibição da neovascularização. A neovascularização, também denominada angiogénese, é induzida por citocinas que são segregadas a partir das células tumorais e depende da migração e invasão das células vasculares, processos que são regulados pelas moléculas de adesão celular (CAM de "cell adhesion molecules") e pela protease. Estas moléculas são actualmente consideradas alvos potenciais dos inibidores angiogénicos. Neste sentido, a integrina vascular ανβ3 foi recentemente identificada como um marcador dos vasos sanguíneos angiogénicos. Ver Brooks, P.C. et al. (1994), REQUIREMENT OF INTEGRIN ανβ3 FOR ANGIOGENESIS, Science 264, 569-571. Além disso, foi demonstrado que o anticorpo monoclonal de ratinho (AcM) LM609 dirigido contra a integrina ανβ3 foi capaz de suprimir a angiogénese, indicando que a integrina ανβ3 tem um papel crítico na angiogénese.

Foi adicionalmente demonstrado que o anticorpo LM609 promove selectivamente a apoptose das células vasculares que foram estimuladas para sofrer angiogénese. Ver Brooks, P.C. et al. (1994), INTEGRIN ανβ3 ANTAGONISTS PROMOTE TUMOR REGRESSION BY INDUCING APOPTOSIS OF ANGIOGENIC BLOOD VESSELS, Cell 79, 1157-1164. Estas constatações sugerem que a 3

ΕΡ 1 034 298/PT integrina ανβ3 poderá ser um alvo e o anticorpo LM609 uma ferramenta para o diagnóstico e a terapia do cancro.

De facto, o anticorpo LM609 não só impediu o crescimento de tumores humanos histologicamente distintos, implantados nas membranas corioalantóides de embriões de galinha, como também induziu a sua regressão. Ver Cell 79, 1157-1164. Utilizando um modelo clinicamente mais relevante do crescimento de tumores, verificou-se que o anticorpo LM609 bloqueou o crescimento do cancro da mama humano num modelo quimérico ratinho SCID/humano. De modo importante, o anticorpo LM609 não só bloqueou o crescimento do tumor, como também inibiu a metástase dos carcinomas da mama examinados. Ver Brooks et al. (1995) ANTI-INTEGRIN ανβ3 BLOCKS HUMAN BREAST CÂNCER GROWTH AND ANGIOGENESIS IN HUMAN SKIN, J. Clin. Invest. 96, 1815-1822.

Os resultados de Brooks et al. são consistentes com estudos anteriores que sugeriram que a angiogénese contribui para a disseminação metastática das células dos tumores mamários. Ver Weidner, N. et al. (1991) TUMOR ANGIOGENESIS AND METASTASIS: CORRELATION IN INVASIVE BREAST CARCINOMA, N. Engl. J. Med. 324, 1-8; e Weidner, N. et al. (1992) TUMOR ANGIOGENESIS: A NEW SIGNIFICANT AND INDEPENDENT PROGNOSTIC INDICATOR IN EARLY-STAGE BREAST CARCINOMA, J. Natl. Câncer Inst. 84, 1875-1887.

Nos últimos anos, surgiram indicações de que existem duas vias de angiogénese dependentes de citocinas e que estas são definidas pela sua dependência de integrinas vasculares distintas. Ver Friedlander, M. et al. (1995) DEFINITION OF TWO ANGIOGENIC PATHWAYS BY DISTINCT AV INTEGRINS, Science 270, 1500-1502. Os resultados dos estudos de Friedlander et al. mostram que o anticorpo LM609 anti-avp3 bloqueou a angiogénese em resposta a bFGF e TNFa, mas teve pouco efeito sobre a angiogénese induzida por VEGF, TGFa ou o éster de forbol PMA. Em contraste, o anticorpo P1F6 anti-a^s bloqueia a angiogénese induzida por VEGF, TGFa e o éster de forbol PMA, ao passo que tem efeitos mínimos sobre aquela induzida por bFGF ou TNFa. 4 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ É, pois, concebível que os tumores que mostram menos susceptibilidade aos anticorpos anti-oívP3 possam segregar citocinas que promovem a angiogénese de uma forma dependente de 0(νβ5· Em conjunto, ambos os anticorpos anti-cxvP3 e anti-OG^s são ferramentas promissoras para o diagnóstico e a terapia do cancro.

Os anticorpos monoclonais de ratinho como LM609, contudo, são extremamente imunogénicos nos seres humanos, o que limita a sua potencial utilização na terapia do cancro, especialmente quando é necessária uma administração repetida. Para reduzir a imunogenicidade dos anticorpos monoclonais de ratinho, criaram-se anticorpos monoclonais quiméricos, em que os domínios Ig variáveis de um anticorpo monoclonal de ratinho são fundidos com os domínios Ig constantes humanos. Ver Morrison, S.L. et al. (1984) CHIMERIC HUMAN ANTIBODY MOLECULES; MOUSE ANTIGEN-BINDING DOMAINS WITH HUMAN CONSTANT REGION DOMAINS, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6841-6855; e Boulianne, G.L. et al. (1984) PRODUCTION OF A FUNCTIONAL CHIMAERIC MOUSE/HUMAN ANTIBODY, Nature 312, 643-646. Este processo é normalmente designado por "humanização" de um anticorpo.

Em geral, os anticorpos monoclonais quiméricos conservam a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal de ratinho e exibem interaeções melhoradas com as células efectoras humanas. Este facto resulta numa citotoxicidade celular dependente de anticorpos melhorada, que se presume seja uma das formas de eliminação das células tumorais com recurso a anticorpos monoclonais. Ver Morrison, S.L. (1992) IN VITRO ANTIBODIES: STRATEGIES FOR PRODUCTION AND APPLICATION, Ann. Rev. Immunol. 10, 239-265. Embora alguns anticorpos monoclonais quiméricos se tenham revelado menos imunogénicos nos seres humanos, os domínios Ig variáveis murinos ainda podem conduzir a uma resposta anti-ratinho significativa nos seres humanos. Ver Bruggemann, M. et al. (1989) THE IMMUNOGENICITY OF CHIMERIC ANTIBODIES. J. Exp. Med. 170, 2153-2157. Por conseguinte, para fins terapêuticos, poderá ser necessário humanizar totalmente um anticorpo monoclonal murino mediante a alteração de ambos os domínios Ig variáveis e constantes. 5

ΕΡ 1 034 298/PT A Patente U.S. 5,565,332 descreve métodos para produzir anticorpos com mais caracteristicas humanas face a um anticorpo parental, utilizando cadeias leves humanas naive. A humanização total é exequível através da introdução das seis CDR dos domínios Ig variáveis das cadeias leve e pesada de ratinho nas regiões de estrutura apropriadas dos domínios Ig variáveis humanos. Esta técnica de enxerto de CDR (Riechmann, L. et al. (1988) RESHAPING HUMAN ANTIBODIES FOR THERAPY, Nature 332, 323) tira partido da constituição conservada dos domínios Ig variáveis, em que as quatro regiões de estrutura (FR1-FR4) servem de armação para sustentar as voltas das CDR que são os contactos principais com o antigénio. A Patente U.S. n.° 5,502,167, concedida a Waldmann et al., descreve um "anticorpo humanizado" que possui as voltas das CDR LCDR1 a LCDR3 e HCDR1 a HCDR3 de YTH 655(5)6, um anticorpo monoclonal IgG2b de rato, enxertadas num anticorpo dirigido contra células T humanas.

Uma desvantagem da técnica de enxerto de CDR, contudo, é o facto de aminoácidos das regiões de estrutura poderem contribuir para a ligação do antigénio, assim como aminoácidos das voltas das CDR poderem influenciar a associação dos dois domínios Ig variáveis. Para manter a afinidade do anticorpo monoclonal humanizado, a técnica de enxerto de CDR assenta na escolha correcta das regiões de estrutura humanas e na mutagénese dirigida de aminoácidos individuais auxiliada por modelação computacional do local de ligação do antigénio (por exemplo, Co, M.S. et al. (1994) A HUMANIZED ANTIBODY SPECIFIC FOR THE PLATELET INTEGRIN gpllb/lla, J.Immunol. 152, 2968-2976). Foram referidas várias humanizações com êxito de anticorpos monoclonais de ratinho por meio de desenho racional. Entre eles estão vários anticorpos monoclonais que são dirigidos para integrinas humanas e têm uma potencial aplicação clínica. Ver J. Immunol. 152, 2968-2976; Hsiao, K.C. et al. (1994) HUMANIZATION OF 60.3, AN ANTI-CD18 ANTIBODY; IMPORTANCE OF THE L2 LOOP, Protein Eng. 7, 815-822; e Poul, M.A. et al. (1995) INHIBITION OF T CELL ACTIVATION WITH A HUMANIZED ΑΝΤΙΘΕΤΑ 1 INTEGRIN CHAIN mAb, Mol. Immunol. 32, 101-116. 6 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

Os ratinhos transgénicos em termos de imunoglobulinas humanas fornecem uma alternativa promissora à humanização de anticorpos monoclonais de ratinho. Ver, por exemplo, Fishwild, D.M. et al. (1996) HIGH-AVIDITY HUMAN IgGx M0N0CL0NAL ANTIBODIES FROM A NOVEL STRAIN OF MINILOCUS TRANSGENIC MICE, Nature Biotechnology 14, 845-851. Em resposta à imunização, estes ratinhos expressam anticorpos monoclonais humanos, aos quais se pode aceder através de tecnologia convencional de hibridomas.

As estratégias de desenho racional em engenharia de proteínas têm sido confrontadas pelas estratégias de selecção in vitro, que se baseiam principalmente em bibliotecas de apresentação em fagos. Ver Clackson, T. & Wells, J.A. (1994) IN VITRO SELECTION FROM PROTEIN AND PEPTIDE LIBRARIES, TIBTECH 12, 173-184. Em particular, a selecção e evolução in vitro de anticorpos derivados a partir de bibliotecas de apresentação em fagos tornou-se uma ferramenta poderosa. Ver Burton, D.R. & Barbas III, C.F. (1994) HUMAN ANTIBODIES FROM COMBINATORIAL LIBRARIES, Adv. Immunol. 57, 191-280; e Winter, G. et al. (1994) MAKING ANTIBODIES BY PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455. O desenvolvimento de tecnologias para produzir repertórios de genes de anticorpos humanos, e a apresentação dos fragmentos dos anticorpos codificados na superfície de bacteriófagos filamentosos forneceu um meio para produzir anticorpos humanos directamente. Os anticorpos produzidos pela tecnologia de fagos são produzidos como fragmentos de ligação ao antigénio - geralmente fragmentos Fv ou Fab - em bactérias e, deste modo, não possuem as funções efectoras. As funções efectoras podem ser introduzidas por uma de duas estratégias: os fragmentos podem ser manipulados para produzir quer anticorpos completos para expressão em células de mamífero quer fragmentos de anticorpos biespecíficos com um segundo local de ligação capaz de desencadear uma função efectora.

Tipicamente, o fragmento Fd (VH-CH1) e a cadeia leve (VL-CL) dos anticorpos são clonados separadamente por PCR e recombinados aleatoriamente em bibliotecas combinatórias de apresentação em fagos, que podem depois ser seleccionadas em 7

ΕΡ 1 034 298/PT termos da ligação a um antigénio particular. Os fragmentos Fab são expressos na superfície do fago, isto é, estão ligados fisicamente aos genes que os codificam. Assim, a selecção dos fragmentos Fab por meio da ligação ao antigénio co-selecciona as sequências que codificam os fragmentos Fab, as quais podem ser subsequentemente amplificadas. Por meio de vários ciclos de ligação ao antigénio e reamplificação, um procedimento denominado "panning", os fragmentos Fab específicos para o antigénio são enriquecidos e, finalmente, isolados.

Em 1994, foi descrita uma abordagem para a humanização de anticorpos denominada "selecção orientada". A selecção orientada utiliza o poder da técnica de apresentação em fagos para a humanização de anticorpos monoclonais de ratinho. Ver Jespers, L.S. et al. (1994) GUIDING THE SELECTION OF HUMAN ANTIBODIES FROM PHAGE DISPLAY REPERTOIRES TO A SINGLE EPITOPE OF AN ANTIGEN, Bio/Technology 12, 899-903. Para isto, o fragmento Fd do anticorpo monoclonal de ratinho pode ser apresentado em combinação com uma biblioteca de cadeias leves humanas, e a biblioteca de fragmentos Fab híbridos resultante pode depois ser seleccionada com o antigénio. O fragmento Fd murino fornece, deste modo, um molde para orientar a selecção.

Subsequentemente, as cadeias leves humanas seleccionadas são combinadas com uma biblioteca de fragmentos Fd humanos. A selecção da biblioteca resultante fornece fragmentos Fab inteiramente humanos.

Para a humanização total de anticorpos monoclonais murinos, o presente invento utiliza uma combinação única de enxerto de CDR e selecção orientada. O anticorpo anti-integrina produzido é útil para o diagnóstico e a terapia do cancro.

Sumário do invento A humanização de um anticorpo monoclonal de ratinho é obtida através de uma combinação de selecção orientada e enxerto de CDR. O termo "humanizado", tal como aqui e nas reivindicações anexas utilizado, significa que pelo menos uma 8

ΕΡ 1 034 298/PT cadeia de um anticorpo monoclonal de ratinho inclui uma região de um anticorpo monoclonal humano.

Um anticorpo monoclonal de ratinho humanizado é produzido por construção de uma biblioteca de cadeias pesadas ou de cadeias leves de anticorpo humano, em que cada uma destas cadeias inclui um domínio variável e possui a sequência de aminoácidos de pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) que é a CDR de uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo de ratinho correspondente, seguida de combinação da biblioteca assim construída com uma cadeia complementar de um anticorpo que se liga a um antigénio pré-seleccionado. Deste modo, a cadeia complementar juntamente com uma cadeia humana presente na biblioteca construída forma um par de cadeia leve e cadeia pesada numa biblioteca resultante de pares de cadeias humanizados. Em seguida, um par de cadeia leve e cadeia pesada humanizado particular é seleccionado a partir da biblioteca de pares humanizados, utilizando a cadeia complementar referida acima.

Um anticorpo monoclonal de ratinho também pode ser humanizado por construção de uma biblioteca de cadeias leves humanas, em que cada cadeia leve inclui pelo menos o seu domínio variável e a sequência de aminoácidos de pelo menos uma CDR de uma cadeia leve de ratinho, e uma biblioteca de cadeias pesadas humanas, em que cada uma destas cadeias pesadas inclui pelo menos o seu domínio variável e a sequência de aminoácidos de pelo menos uma CDR de uma cadeia pesada murina. A cadeia pesada normalmente não possui mais de cerca de 200 resíduos de aminoácidos de comprimento.

Uma cadeia leve humana possuindo uma CDR murina é seleccionada a partir da biblioteca construída de cadeias leves humanas, utilizando uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga a um antigénio pré-seleccionado. A biblioteca construída de cadeias pesadas é combinada com a cadeia leve humana possuindo uma CDR murina seleccionada para produzir uma biblioteca humanizada de pares de cadeia leve e cadeia pesada, em que cada uma delas contém pelo menos uma CDR murina. Em seguida, um par de cadeia leve e cadeia pesada com CDR murina é seleccionado a partir da biblioteca humanizada 9 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ acima referida, utilizando a cadeia leve humana com CDR murina seleccionada. A sequência de construção das bibliotecas acima referidas não é critica.

De preferência, somente a volta da região determinante de complementaridade 3 da cadeia leve (LCDR3) do anticorpo monoclonal é enxertada na cadeia leve humana. De modo idêntico, é preferido que apenas a volta HCDR3 seja enxertada no fragmento da cadeia pesada humana (CP). A selecção quer da cadeia leve humana quer da cadeia pesada humana com a CDR de ratinho enxertada é preferencialmente efectuada mediante a utilização de uma cadeia complementar murina/humana quimérica como molde.

No processo de enxerto de CDR numa cadeia leve humana, a cadeia leve humana é clonada e depois os clones são aleatoriamente recombinados para formar uma biblioteca, como seja uma biblioteca combinatória de apresentação em fago. 0 mesmo método pode ser seguido para efectuar o enxerto na cadeia pesada humana.

Por conseguinte, num primeiro aspecto, o invento disponibiliza um método de produção de um anticorpo monoclonal de ratinho humanizado que compreende as etapas de: (a) construção de uma primeira biblioteca de cadeias leves ou pesadas humanizadas, em que cada uma das referidas cadeias possui uma sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de uma cadeia leve ou pesada de ratinho correspondente, e em que cada uma das referidas cadeias inclui um domínio variável de origem humana; (b) combinação da primeira biblioteca construída de cadeias leves ou pesadas humanizadas da etapa (a) com uma cadeia complementar de um anticorpo que se liga a um antigénio pré-seleccionado, de modo que a cadeia complementar juntamente com uma cadeia humanizada presente na biblioteca construída forma um par de cadeias leve e pesada numa biblioteca de pares humanizados, em que a cadeia complementar é uma cadeia murina/humana quimérica; 10

ΕΡ 1 034 298/PT (c) selecção a partir da biblioteca de pares humanizados da etapa (b) de um par particular de cadeias leve e pesada humanizado utilizando a referida cadeia complementar, em que o referido par de cadeias leve e pesada humanizado é seleccionado em relação a ligação ao referido antigénio pré-seleccionado; (d) construção de uma segunda biblioteca de cadeias leves ou pesadas humanizadas, em que cada cadeia possui uma sequência de aminoácidos da CDR3 de uma cadeia leve ou pesada de ratinho correspondente e em que cada uma das referidas cadeias inclui um domínio variável; em que as cadeias da referida segunda biblioteca de cadeias leves ou pesadas de anticorpo humanizadas são a cadeia leve ou pesada complementar das referidas cadeias leves ou pesadas de anticorpo humanizadas da primeira biblioteca da etapa (a), de modo que uma biblioteca é uma biblioteca de cadeias leves e a outra biblioteca é uma biblioteca de cadeias pesadas; (e) isolamento de uma cadeia leve ou pesada a partir do par de cadeias leve e pesada humanizado de ligação ao antigénio da etapa (c) e combinação da referida cadeia de ligação ao antigénio com cadeias da referida segunda biblioteca da etapa (d) , de modo que a cadeia de ligação ao antigénio juntamente com as cadeias presentes na biblioteca construída da etapa (d) formam um par de cadeias leve e pesada numa biblioteca de pares humanizados; e (f) selecção a partir da biblioteca de pares humanizados da etapa (e) de um par de cadeias leve e pesada humanizado que se liga ao referido antigénio pré-seleccionado.

Numa concretização preferida do método de acordo com o primeiro aspecto, a biblioteca humanizada da etapa (a) contém cadeias leves e a cadeia complementar da etapa (b) é uma cadeia pesada.

Numa concretização adicional preferida do método de acordo com o primeiro aspecto do invento, a biblioteca humanizada da etapa (a) contém cadeias pesadas e a cadeia complementar da etapa (b) é uma cadeia leve. 11 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ É igualmente preferido ο método de acordo com o primeiro aspecto em que a cadeia pesada é um fragmento Fd.

Num segundo aspecto, o invento refere-se a um método de humanização de um anticorpo monoclonal de ratinho que compreende as etapas de: (a) construção de uma biblioteca de cadeias leves humanizadas, em que cada uma das referidas cadeias leves compreende pelo menos o seu domínio variável e possui uma sequência de aminoácidos da CDR3 de uma cadeia leve de ratinho; (b) selecção a partir da biblioteca construída de cadeias leves humanizadas de uma cadeia leve humana possuindo uma CDR3 de ratinho, em que a selecção compreende a utilização de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga a um antigénio pré-seleccionado, em que a cadeia pesada é uma cadeia murina/humana quimérica e em que a referida cadeia leve humana possuindo uma CDR3 murina é seleccionada em relação a ligação a um antigénio pré-seleccionado; (c) construção de uma biblioteca de cadeias pesadas humanizadas, em que cada uma das referidas cadeias pesadas compreende pelo menos o seu domínio variável e possui uma sequência de aminoácidos da CDR3 de uma cadeia pesada de ratinho; (d) combinação da biblioteca construída de cadeias pesadas humanizadas com a cadeia leve humanizada seleccionada para produzir uma biblioteca humanizada de pares de cadeias leve e pesada, em que cada uma contém uma CDR3 de ratinho; e (e) selecção a partir da biblioteca humanizada da etapa (d) de um par de cadeias leve e pesada utilizando a cadeia leve humana seleccionada, em que o referido par de cadeias leve e pesada é seleccionado em relação a ligação ao antigénio pré-seleccionado . É também disponibilizada uma concretização preferida do segundo aspecto, em que o método compreende adicionalmente 12

ΕΡ 1 034 298/PT converter o par de cadeias leve e pesada seleccionado no anticorpo completo.

Outra concretização preferida do segundo aspecto refere-se ao método de acordo com o segundo aspecto do invento, em que apenas uma região determinante de complementaridade três de uma cadeia leve do anticorpo LM609 está presente na cadeia leve humana. É também preferido um método de acordo com o segundo aspecto do invento, em que apenas uma região determinante de complementaridade três de uma cadeia pesada do anticorpo LM609 está presente na cadeia pesada humana.

Além disso, o invento refere-se a uma concretização preferida do método de acordo com o segundo aspecto do invento, em que a cadeia pesada é Fd.

Na concretização acima referida, é preferido que o Fd se j a: um membro do grupo que consiste em um fragmento de cadeia pesada murina/humana quimérica e um fragmento de cadeia pesada murina de molde; uma cadeia pesada murina/humana quimérica; ou um fragmento de cadeia pesada murina de molde.

Breve descrição das figuras A FIGURA 1 é uma ilustração esquemática que mostra a sequência das etapas nas técnicas combinadas de enxerto de CDR e selecção orientada para formar o fragmento Fab humanizado.

As FIGURAS 2a e 2b mostram as sequências de aminoácidos de Vx e VK, respectivamente, do anticorpo monoclonal de ratinho LM609. Os dois aminoácidos N-terminais (Leu)(Glu) de Vx e (Glu)(Leu) de VK, codificados pelos locais de clonagem no vector CTCGAG (Xhol) e GAGCTC (Saci), respectivamente, são artificiais. As voltas das CDR estão sublinhadas. 13 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ AS FIGURAS 3a a 3e ilustram o alinhamento das sequências de aminoácidos de VK do anticorpo LM609 murino (linha superior completa de cada grupo de sequências) e de seis VK humanos seleccionados (1-6). As regiões de estrutura (FR1-3) e as voltas das CDR (CDR1-2) estão separadas. Os traços (-) indicam aminoácidos idênticos. É de salientar que devido às porções de enxerto de LCDR3 de FR3, a CDR3 completa e a FR4 completa são idênticas em VK do anticorpo LM609 de ratinho e nos VK humanos seleccionados. Por conseguinte, estas duas sequências não estão ilustradas. A FIGURA 4 representa uma comparação das sequências de três fragmentos humanos seleccionados e das sequências de quatro fragmentos humanos não seleccionados com as sequências originais das voltas de LCDR1 e LCDR2 de ratinho. AS FIGURAS 5a a 5f são gráficos que ilustram a ligação da integrina ανβ3 humana presente na superfície celular pelos clones de LM609 humanizado 2, 4, 7, 11, 24 e pelo anticorpo de controlo, respectivamente. A curva A indica células de hamster CS-1 não transfectadas; a curva B indica células de hamster CS-1 transfectadas com ADNc de β5 humana (essencialmente a mesma curva que a curva A na FIGURA 5f); e a curva C indica células de hamster CS-1 transfectadas com ADNc de β3 humana. A FIGURA 6 é um gráfico de barras que mostra a reactividade cruzada do anticorpo LM609, dos clones 2, 4, 7, 11, 24 e do anticorpo de controlo, respectivamente. As colunas representam a média de valores em triplicado, em que as colunas à esquerda indicam a ligação à integrina humana ανβ3, as colunas centrais indicam a ligação à integrina humana anbP3 e as colunas à direita indicam a ligação do fundo. As barras de erro indicam os desvios padrão. A FIGURA 7 é uma ilustração esquemática do processo de optimização de uma extensão de quatro aminoácidos na região determinante de complementaridade três de uma cadeia leve (LCDR3) e na região determinante de complementaridade três de uma cadeia pesada (HCDR3). 14 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

As FIGURAS 8a e 8b são ilustrações interrompidas das sequências de aminoácidos de VL de um anticorpo de ratinho em comparação com as sequências de aminoácidos de cinco versões de clones humanizados representados pelas letras de grupo A (clones 10, 11 e 37), e B (clones 7, 8 e 22), C (clones 4, 31 e 36), D (clones 24, 34, 35 e 40) e E (clone 2), que estão combinados.

As FIGURAS 8c a 8e são ilustrações interrompidas das sequências de aminoácidos de VH de um anticorpo de ratinho em comparação com as sequências de aminoácidos de cinco versões de clones humanizados representados pelas letras de grupo A (clones 10, 11 e 37), B (clones 7, 8 e 22), C (clones 4, 31 e 36), D (clones 24, 34, 35 e 40) e E (clone 2).

Descrição de uma concretização preferida 0 presente invento é susceptivel de concretizações sob muitas formas diferentes. Uma concretização preferida do invento está descrita abaixo.

Clonagem do ADNc do anticorpo monoclonal murino LM609

Partindo de uma linha de células de hibridoma de LM609 (Designação ATCC HB 9537), o ARN total foi preparado a partir de 108 células de hibridoma de LM609 utilizando um kit de isolamento de ARN (Stratagene, La Jolla, CA) . A transcrição inversa e a amplificação por reacção da polimerase em cadeia (PCR) das sequências que codificam o fragmento Fd e a cadeia κ foram efectuadas essencialmente como descrito em "Combinatorial immunoglobulin libraries in phage 1" (Methods 2, 119 (1991)) por A.S. Kang et al.

Os produtos de PCR que codificam o fragmento Fd e a cadeia κ foram cortados com Xhol/Spel e Sacl/Xbal, respectivamente, e ligados sequencialmente no vector fagemideo pComb3H adequadamente digerido. Os produtos de ligação foram introduzidos na estirpe de E. coli XLl-Blue por electrotransformação, e as etapas subsequentes decorreram como descrito em "Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site" (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 7978-7982) por C.F. Barbas III et al. , 15

ΕΡ 1 034 298/PT para produzir fagos que apresentam Fab na sua superfície. Os fagos foram seleccionados por "panning" contra a integrina ανβ3 imobilizada. Após dois ciclos de "panning", os clones isolados foram analisados quanto a expressão do fragmento Fab de LM609. O sobrenadante das culturas induzidas com IPTG foi testado quanto a ligação à integrina ανβ3 imobilizada por meio de um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), utilizando anticorpo de cabra anti-F(ab')2 de ratinho conjugado com fosfatase alcalina como anticorpo secundário. A sequência de cada fragmento Fd e a sequência que codifica cada cadeia κ dos clones positivos foi determinada por sequenciação de ADN.

Amplificação das sequências de cadeias leves e fragmentos Fd humanos O ARN total foi preparado a partir da medula óssea de cinco dadores (Poietic Technologies; Germantown, MD) utilizando reagente TRI (Molecular Research Center;

Cincinnati, OH) e foi subsequentemente purificado por precipitação com cloreto de lítio. Ver Sambrook, J. et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. O ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit "SUPERSCRIPT Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis" com iniciadores oligo(dT) (Life Technologies; Gaithersburg, MD). Os cinco ADNc de primeira cadeia gerados foram submetidos a reacções de amplificação por PCR separadas.

As sequências de VK de cada um dos ADNc de primeira cadeia foram amplificadas em oito reacções separadas através da combinação de quatro iniciadores directos e dois iniciadores inversos (ver a lista abaixo). As sequências de Vx foram amplificadas em nove reacções separadas, utilizando nove iniciadores directos e um iniciador inverso (ver a lista abaixo). As sequências de aminoácidos de V\ e VK, incluindo a porção sublinhada das voltas das CDR, estão apresentadas nas FIGURAS 2a e 2b, respectivamente (ver também SEQ ID NO:44 e SEQ ID NO:45, respectivamente).

As sequências de VH (ver SEQ ID NO: 56) foram amplificadas em quatro reacções, utilizando quatro 16 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ iniciadores directos e um iniciador inverso (ver a lista abaixo). Todas as amplificações foram realizadas em condições de PCR normalizadas usando a enzima Taq polimerase (Pharmacia/ Uppsala, Suécia). Enquanto os iniciadores directos hibridam com sequências que codificam os aminoácidos N-terminais das várias famílias VK, V\ e VH/ os iniciadores inversos hibridam com uma sequência que codifica os aminoácidos C-terminais da FR3 de VK, νλ ou VH/ respectivamente, que são extremamente conservados. A lista de iniciadores utilizados para a amplificação das sequências de anticorpo humano inclui: Iniciadores directos para VK: HSCK1 - F SEQ ID NO:3 HSCLam6 SEQ ID NO: 14 HSCK24 - F SEQ ID NO:4 HSCLam7 0 SEQ ID NO: 15 HSCK3 - F SEQ ID NO:5 HSCLam7 8 SEQ ID NO: 16 HSCK5 - 5 SEQ ID NO:6 HSCLam9 SEQ ID NO: 17 Iniciadores inversos para VK: Iniciador inverso para VÀ: BKFR3UN SEQ ID NO:7 BLFR3UN SEQ ID NO: 18 BK2FR3UN SEQ ID NO:8 Iniciadores directos VH : Iniciadores directos para νλ: HFVH1-F SEQ ID NO: 19 HSCLamla SEQ ID NO:9 HFVH2-F SEQ ID NO: 20 HSCLamlb SEQ ID NO:10 HFVH35-F SEQ ID NO: 21 HSCLam2 SEQ ID NO:11 HFVH4-F SEQ ID NO: 22 HSCLam3 SEQ ID NO:12 Iniciador inverso para VH: HSCLam4 SEQ ID NO:13 BFR3UN SEQ ID NO: 23

Construção de um fragmento Fd murino/humano quimérico por fusão de VH de LM609 com CH1 humana O fagemídeo pComb3H contendo as sequências do fragmento Fab de LM609 foi utilizado como molde para a amplificação da 17

ΕΡ 1 034 298/PT sequência que codifica o fragmento N-terminal FR1 a FR3 de VH de LM609 pelo par de iniciadores de PCR PELSEQ (SEQ ID NO:24)/BFR3UN (SEQ ID NO:25). O iniciador directo PELSEQ híbrida com a sequência "leader" pelB a montante da sequência que codifica o fragmento Fd em pComb3H. O iniciador inverso BFR3UN híbrida com uma sequência que codifica oito aminoácidos C-terminais da FR3 de VH, que são extremamente conservados (SEQ ID NO:26), e difere em um aminoácido da sequência de aminoácidos correspondente de VH de LM609 (SEQ ID NO:27).

Por PCR de sobreposição (ver McArn Horton, R. & Readington Pease, L. (1991) RECOMBINATION AND MUTAGENESIS OF DNA SEQUENCES USING PCR IN DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, ed. M.J. McPherson, IRL Press, Oxford, UK, pp. 217-247), o produto PELSEQ/BFR3UN foi fundido com um fragmento de PCR que codifica a HCDR3 (SEQ ID NO:l) de LM609 acoplada à FR4 de VH e ao domínio CH1 completo do anticorpo anti-gpl20 humano b8. Este fragmento tinha sido amplificado pelo par de iniciadores de PCR CR501 (SEQ ID NO:28)/CR301 (SEQ ID NO:29). O iniciador directo CR501 codifica uma união sintética dos nove aminoácidos C-terminais de FR3, dos oito aminoácidos que formam a HCDR3 (SEQ ID NO:l) de LM609 e dos seis aminoácidos N-terminais da FR4 de b8. A FR4 de b8 é uma escolha preferida porque é idêntica à FR4 de VH de LM609, com excepção do aminoácido C-terminal, que é A para LM609 e S para b8. A sobreposição de 24 pb de CR501 e BFR3UN permitiu fundir os produtos de PCR correspondentes por PCR de sobreposição. O iniciador directo CR301 híbrida com uma sequência que codifica a extremidade C de CH1 e introduz um local Spel que permite a união do produto de PCR com a ORF do gene III em pComb3H. O produto da reacção de PCR de sobreposição foi cortado com Xhol/Spel, ligado no fagemídeo pComb3H adequadamente digerido e a sequência correcta foi confirmada por sequenciação de ADN.

Substituição da cadeia leve de LM609 por uma cadeia leve humana que contém a LCDR3 de LM609

Utilizando PCR de sobreposição, as sequências humanas amplificadas que codificam o fragmento N-terminal FR1 a FR3 18 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ de VK e νλ foram fundidas com fragmentos de PCR que codificam a LCDR3 (SEQ ID NO: 2) de LM609 acoplada à FR4 de VK ou νλ humano e ao domínio CK ou Ca humano. Dois fragmentos κ foram gerados pelos pares de iniciadores de PCR CR503 (SEQ ID NO:30)/T7B (SEQ ID NO:31) e CR508 (SEQ ID NO:32)/T7B, utilizando a sequência do anticorpo anti-gpl20 bll em pCorob3 como molde.

Os iniciadores directos CR503 e CR508 codificam uma união sintética de oito aminoácidos C-terminais da FR3 de VK humano (SEQ ID NO:33 ou SEQ ID NO:34), os nove aminoácidos que formam a LCDR3 (SEQ ID NO: 2) de LM609 e os sete aminoácidos N-terminais da FR4 de bll. A FR4 de bll é a escolha preferida, pois é idêntica à FR4 de VK de LM609, com excepção do terceiro aminoácido N-terminal e C-terminal, que é G e T em LM609 versus Q e A em bll. A sobreposição de 23 pb de CR503 com BKFR3UN e de CR508 com BK2FR3UN permitiu fundir os produtos de PCR correspondentes por PCR de sobreposição. O iniciador inverso T7B híbrida com uma sequência de pComb3 a jusante da sequência que codifica a cadeia leve. Um fragmento λ foi gerado pelo par de iniciadores de PCR CR510 (SEQ ID NO:35)/CLext (SEQ ID NO: 36), utilizando ADNc de primeira cadeia actuado por CLext da medula óssea humana como molde. 0 iniciador directo CR510 codifica uma união sintética de sete aminoácidos C-terminais da FR3 de V\ humano (SEQ ID NO:37), os nove aminoácidos que formam a LCDR3 de LM609 e os sete aminoácidos N-terminais da FR4 de νλ humano (SEQ ID NO:38). A sobreposição de 21 pb de CR510 com BLFR3UN permitiu fundir os produtos de PCR correspondentes por PCR de sobreposição. O iniciador inverso CLext híbrida com a extremidade 3' da sequência que codifica o Ca humano e introduz um local Xbal.

As sequências que codificam as cadeias leves produzidas foram cortadas com Sacl/Xbal e ligadas no fagemídeo pComb3H adequadamente digerido, que continha o fragmento Fd murino/humano quimérico. A electrotransformação dos produtos de ligação na estirpe de E. coli ER 2537 (New England Biolabs; Beverly, MA) resultou numa biblioteca de cadeias 19 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ leves consistindo em 1,5 x 108 transformantes independentes. A sequenciação de ADN revelou a correcta reunião dos fragmentos fundidos.

Efectuaram-se quatro ciclos de "panning" contra integrina humana ανβ3 imobilizada essencialmente como descrito em "High-affinity self-reactive human antibodies by design and selection: targeting the integrin ligand binding site" (Proc. Natl. Acad. Scí. USA 90, 10003-10007 (1993)) por C.F. Barbas, III et al., utilizando 200 ng de proteína em 25 μΐ de tampão de metais (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5; NaCl 137 mM; KC1 1 mM; MgCl2 1 mM; CaCl2 1 mM; MnCl2 1 mM) para revestimento, Tween 20 a 0,05% em TBS para lavagem e tripsina numa concentração de 10 mg/ml em TBS para eluição. As etapas de lavagem foram incrementadas de 5 no primeiro ciclo, para 10 no segundo ciclo e 15 no terceiro e quarto ciclos. A "pool" de fagos produzida em cada ciclo foi monitorizada por ensaio ELISA com fago.

Após o quarto ciclo, os fagos foram produzidos a partir de clones isolados e testados quanto a ligação à integrina ανβ3 imobilizada por ensaio ELISA com fago. As sequências que codificam as cadeias leves dos clones positivos foram analisadas por sequenciação do ADN, utilizando o iniciador OMPSEQ (SEQ ID NO:39) que híbrida com a sequência "leader" ompA a montante da sequência que codifica a cadeia leve em pComb3H.

Substituição do fragmento Fd de LM609 por um fragmento Fd humano que contém a região determinante de complementaridade três da cadeia pesada (HCDR3) de LM609

Fundiram-se três fragmentos de PCR por PCR de sobreposição numa etapa. Utilizando os fagemídeos seleccionados a partir do ensaio de "panning" das cadeias leves como molde, o Fragmento 1 foi amplificado com o par de iniciadores de PCR RSC-F (SEQ ID NO:40)/lead-B (SEQ ID NO:41). Enquanto o iniciador directo RSC-F híbrida com uma sequência a montante da sequência que codifica a cadeia leve, o iniciador inverso lead-B híbrida com uma sequência a montante da sequência que codifica o fragmento Fd. As 20

ΕΡ 1 034 298/PT sequências humanas amplificadas que codificam o fragmento FR1 a FR3 de VH (ver acima) foram utilizadas como Fragmento 2. O Fragmento 3 foi amplificado com o par de iniciadores de PCR CR501/HIgGl-B (SEQ ID 42), utilizando o fragmento Fd murino/humano híbrido (ver acima) como molde. O iniciador inverso HIgGl-B híbrida com a extremidade 3' da sequência que codifica CH1. Utilizando a sobreposição de 21 pb de lead-B com os iniciadores HFVH-F e a sobreposição de 24 pb de BFR3UN com CR501, os três fragmentos foram fundidos e amplificados com o par de iniciadores de PCR RSC-F/RSC-B (SEQ ID NO:43). O iniciador inverso RSC-B sobrepõe-se a HIgGl-B. RSC-F e RSC-B introduzem dois locais Sfil assimétricos.

Para manter uma complexidade elevada, efectuaram-se reacções de PCR separadas para cada fagemídeo seleccionado a partir do ensaio de "panning" das cadeias leves (Fragmento 1) e para cada uma das cinco "pools" de fragmentos VH derivadas das cinco fontes de ADNc de primeira cadeia (Fragmento 2). Os fragmentos gerados que codificam as cadeias leves humanas seleccionadas ligadas a fragmentos Fd humanos foram cortados com Sfil e ligados no vector fagemídeo pComb3H adequadamente digerido, gerando uma biblioteca de 3 x 107 transformantes independentes. A sequenciação de ADN revelou a correcta união dos fragmentos de ADN fundidos. Efectuaram-se quatro ciclos de "panning" contra integrina humana ανβ3 imobilizada exactamente conforme descrito para o ensaio de "panning" das cadeias leves. A "pool" de fagos produzida em cada ciclo foi monitorizada por ensaio ELISA com fago. Após o quarto ciclo, as sequências que codificam a cadeia leve e o fragmento Fd foram isoladas a partir dos fagemídeos seleccionados por digestão com Sfil e subclonadas no vector de expressão compatível pPhoA-H6HA.

Os Usados de clones individuais crescidos em meio desprovido de fosfatos foram analisados quanto a ligação a integrina ανβ3 imobilizada por ELISA, utilizando anticorpo de cabra anti-F(ab')2 humano conjugado com fosfatase alcalina (Pierce) como anticorpo secundário. As sequências que codificam a cadeia leve e o fragmento Fd dos clones positivos 21 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ foram analisadas por sequenciação de ADN, utilizando os iniciadores OMPSEQ e PELSEQ, respectivamente.

Resultados

Clonagem do ADNc de LM609

Partindo de células de hibridoma que expressam LM609, os ADNc que codificam fragmentos Fd cadeia λ e cadeias κ completas foram clonados por PCR. Os produtos de PCR foram clonados no fagemideo pComb3H, que é derivado de pComb3, e manipulados para facilitar a expressão de fragmento Fab na superfície do fago filamentoso M13. Os fagos que apresentam fragmento Fab de LM609 foram seleccionados por "panning" contra a integrina ανβ3, e as sequências de ADNc correspondentes foram determinadas. O fragmento Fab solúvel de LM609, purificado a partir de E. coli, foi analisado, verificando-se através de ELISA que se ligava especificamente à integrina ανβ3· A abordagem para a humanização sequencial de LM609 através de uma combinação de selecção orientada e enxerto de CDR está ilustrada na FIGURA 1. Para a selecção da cadeia leve humana, o fragmento Fd de ratinho é substituído por um fragmento Fd quimérico constituído por VH murino ligado a CH1 humano, para estabilizar o fragmento Fab híbrido da primeira etapa de selecção através da interacção de dois domínios constantes humanos correspondentes, CK e CH1. Uma estabilização do fragmento Fab híbrido também estabiliza o local de ligação do antigénio. A selecção orientada é iniciada por substituição da cadeia leve κ de LM609 por uma biblioteca de cadeias leves κ e λ humanas que continham a volta da LCDR3 de LM609 enxertada. As bibliotecas de fagos correspondentes que apresentam fragmentos Fab híbridos são depois seleccionadas por meio de quatro ciclos de "panning" contra a integrina ανβ3 imobilizada. Embora o número produzido não aumente de ciclo para ciclo, a análise da "pool" de fagos produzida em cada ciclo quanto a ligação à integrina ανβ3, por meio de ensaio ELISA com fago, revela um sinal crescente. Após o quarto ciclo, os fagos são produzidos a partir de clones e 22 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ testados quanto a ligação à integrina ανβ3 através de ensaio ELISA com fago.

Embora a maioria destes clones forneça sinais que revelam a existência de alguma ligação acima do fundo, no presente caso, seis clones forneceram sinais muito fortes (ver FIGURAS 3a a 3e) . A análise da sequência de ADN destes clones revelou 3 sequências de cadeia leve diferentes. Duas sequências de cadeia leve encontradas em cinco dos seis clones positivos diferem apenas em quatro aminoácidos, isto é, são 96% idênticas. A terceira sequência de cadeia leve partilha uma identidade de cerca de 80% com as outras duas. Contudo, esta sequência tinha duas partes, em que cada uma delas podia ser alinhada com linhas germinais de diferentes famílias VK, pelo que é provável que tenha surgido por "crossing-over" durante a reacção de PCR, um artefacto que aparentemente ocorre com frequência na amplificação de sequências de anticorpos.

Em referência às FIGURAS 3a a 3e, a análise dos seis VK humanos revelou dois grupos de sequências da cadeia κ muito relacionadas. Além disso, as voltas da CDR1 da totalidade dos seis VK humanos seleccionados, que se crê desempenharem um papel na montagem de VK e νλ, assemelham-se à região correspondente de VK de LM609. Isto indica que o V\ molde de LM609 juntamente com o antigénio de LM609, a integrina humana ανβ3, efectuaram uma selecção de cadeias κ humanas que estão relacionadas com a cadeia κ de LM609. O facto de não se terem encontrado sequências repetidas poderá indicar que a volta da LCDR3 de LM609 enxertada, que é idêntica em todas as cadeias κ humanas seleccionadas, é essencialmente responsável pela contribuição da cadeia κ de LM609 para a ligação do antigénio.

Esta suposição é apoiada por duas observações adicionais. Primeiro, a abordagem de humanização inicial baseou-se em bibliotecas das cadeias κ humanas originais. Quatro ciclos de "panning" seleccionaram uma cadeia κ humana repetida com uma sequência relacionada com a cadeia κ de LM609. Contudo, o fragmento Fab híbrido correspondente pareceu ligar-se apenas fracamente à integrina humana ανβ3· Por conseguinte, a volta da LCDR3 de LM609 foi enxertada nas 23

ΕΡ 1 034 298/PT bibliotecas de cadeias κ humanas e, embora estimada apenas de forma aproximada a partir de ELISA, a ligação do correspondente fragmento Fab híbrido seleccionado à integrina humana ανβ3 melhorou.

Segundo, os fagos escolhidos foram seleccionados por meio de dois ciclos adicionais de "panning" contra integrina humana ανβ3 imobilizada. Mais uma vez, aqueles solúveis derivados dos fagemídeos seleccionados foram analisados quanto a ligação a integrina humana ανβ3 imobilizada por ensaio ELISA. Desta vez, verificou-se que a totalidade dos 20 clones analisados se ligou especificamente. Contudo, a sequenciação de 16 clones revelou a ausência de sequências repetidas. Parece, assim, que um certo número de sequências de cadeias κ humanas diferentes, que contêm a volta da LCDR3 de LM609, pode substituir a cadeia κ de LM609 sem muita diferença na ligação à integrina humana ανβ3. Acredita-se que esta constatação é importante para a aplicação terapêutica do LM609 humanizado.

Devido à variabilidade alotípica das sequências, os anticorpos humanizados podem ser neutralizados pelo sistema imunitário do doente após injecções repetidas. Este problema é evitado mediante a utilização de anticorpos humanizados com idênticas propriedades de ligação do antigénio, mas sequências de aminoácidos diferentes para administrações repetidas.

Tal como acontece com a cadeia leve do anticorpo LM609 original, cada uma das cadeias leves seleccionadas é uma cadeia leve κ. Além disso, um rastreio das bases de dados revelou que elas são derivadas da mesma linha germinal, nomeadamente DPK-26, pertencente à família VK6. Isto aponta no sentido de uma selecção forte destas sequências, porque a família VK6 não é encontrada com frequência em anticorpos humanos. Uma razão óbvia para esta selecção forte é a existência de uma similaridade de sequência relativamente elevada entre as cadeias leves humanas seleccionadas e a cadeia leve murina original.

Em referência à FIGURA 4, para efeitos de comparação, escolheram-se aleatoriamente quatro clones da biblioteca que 24 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ não foram seleccionados e determinaram-se as sequências das suas cadeias leves. As três cadeias leves humanas seleccionadas usadas na comparação consistem em onze aminoácidos na LCDR1, o comprimento da LCDR1 murina original, ao passo que apenas uma das quatro cadeias leves humanas não seleccionadas partilhou o mesmo comprimento de LCDR1 com a sequência murina original (ver FIGURA 4).

Adicionalmente, ambas as LCDR1 e LCDR2 das cadeias leves humanas seleccionadas são muito similares à sequência de ratinho correspondente. 0 aminoácido C-terminal da região de estrutura 2 da sequência da cadeia leve murina original, uma lisina (Lys) , ilustrada dentro de parêntesis na FIGURA 4, é um aminoácido invulgar nesta posição e, por conseguinte, poderá estar envolvido na formação do local de ligação do antigénio. De modo interessante, todas as sequências das cadeias leves humanas seleccionadas contêm uma lisina nesta posição, enquanto todas as sequências não seleccionadas contêm ai uma tirosina (Tyr) . Na verdade, a família VK6 é a única família VK humana que contém uma lisina nessa posição.

No seu conjunto, estas indicações mostram que o VH molde de ratinho mais o antigénio seleccionaram sequências de VK humanos que estão relacionadas com a sequência de VK murino original. Três clones provenientes da selecção das cadeias leves, possuindo uma ligação à integrina ανβ3 mais fraca que os seis clones discutidos acima, mas ainda uma ligação significativa acima do fundo, também foram analisados através de sequenciação de ADN. Estas análises revelaram três sequências de νλ não relacionadas que, juntamente com as sequências de VK seleccionadas, com excepção daquela que teve origem no artefacto de "crossing-over" durante a reacção de PCR, foram utilizadas como moldes na humanização da cadeia pesada de LM609.

Com base na estratégia de humanização descrita acima, geraram-se cinco versões humanizadas do anticorpo monoclonal LM609 anti-integrina humana ανβ3· As cinco versões foram reveladas através da análise de sequência de 14 clones humanizados que se ligam a ανβ3· Em referência às FIGURAS 8a e 8b, as sequências de aminoácidos de um VL de ratinho (SEQ 25

ΕΡ 1 034 298/PT ID NO:45) são comparadas com as sequências de aminoácidos da versão A e das versões combinadas (ou grupos) B, C, D e E.

De modo idêntico, as FIGURAS 8c a 8e comparam as sequências de aminoácidos de um VH de ratinho (SEQ ID NO: 56) com as sequências de aminoácidos das cinco versões (ou grupos) A-E. Quatro destas versões, representadas pelos clones 7, 8 e 22 (grupo B); 4, 31 e 36 (grupo C); 24, 34 e 40 (grupo D); e 2 (grupo E), são muito relacionadas em termos de sequência de aminoácidos. O grupo de sequências BCDE nas FIGURAS 8a e 8b representa as quatro versões que partilham um domínio VL idêntico (SEQ ID NO:49). A identidade da sequência de aminoácidos dos seus domínios VH (SEQ ID NOS:50-53), os quais são todos derivados da linha germinal DP-65 ou da linha DP-78 muito relacionada, é de pelo menos 90% para cada uma das versões.

Em contraste, a versão cinco inclui os clones 10, 11 e 37 (A) e representa uma versão humanizada com um domínio VH (SEQ ID NO: 54) que é derivado de uma família de linhas germinais diferente. Esta versão humanizada também contém um domínio VL diferente (SEQ ID NO:55), que é, contudo, 95% idêntico e derivado da mesma linha germinal. As linhas germinais foram determinadas por alinhamento das sequências de ácido nucleico, utilizando o software DNAPLOT disponibilizado pela Directoria de Sequências do Gene V Humano VBASE do MRC Centre for Protein Engineering.

Ao preservar as sequências das regiões determinantes de complementaridade originais, como as sequências de LCDR3 (SEQ ID NO: 2) e de HCDR3 (SEQ ID NO:l) de LM609, a estratégia de humanização descrita assegura a conservação dos epitopos. A conservação dos epitopos é uma exigência crítica na humanização dos anticorpos, especialmente no caso de LM609. O anticorpo monoclonal murino LM609 anti-integrina humana ανβ3 e bloqueador da função liga-se a um epitopo não linear ainda não identificado que envolve ambas as cadeias polipeptídicas av e β3. De modo importante, ao ligar-se a este epitopo, o anticorpo LM609 induz a apoptose nas células vasculares que expressam ανβ3, uma característica única entre alguns dos anticorpos monoclonais murinos anti-integrina humana ανβ3. O LM609 não reconhece a integrina humana relacionada 0ίι^β3· 26 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

Qualquer reactividade cruzada com a οίιη>β3 humana, que é expressa nas plaquetas, exclui o uso de LM609 como ferramenta na terapia do cancro.

As cinco versões humanizadas de LM609, os clones 2, 4, 7, 11 e 24, que haviam sido seleccionadas por meio de ligação a integrina humana ανβ3 imobilizada e, portanto, potencialmente desnaturada, foram testados quanto a ligação a integrina humana nativa ανβ3 expressa na superfície celular. Para tal, a ligação de LM609 humanizado a células de hamster CS-1 não transf ectadas e a células de hamster CS-1 transfectadas com o ADNc quer de β3 humana quer de β5 humana foi analisada por citometria de fluxo. Tal como o anticorpo LM609 murino, mas em contraste com um anticorpo de controlo, todas as cinco versões humanizadas de LM609 mostraram uma ligação específica às células de hamster CS-1 transfectadas com o ADNc de β3 humana (ver FIGURAS 5a-5f). A potencial reactividade cruzada do anticorpo LM609 humanizado com a integrina humana <21^3 foi analisada por ELISA. Enquanto o anticorpo Fab-9 com uma reactividade cruzada conhecida se ligou a ambas as integrinas humanas imobilizadas ανβ3 e οίιΐόβ3, não foi detectada nenhuma reactividade cruzada nem para o LM609 murino nem para as suas cinco versões humanizadas (ver FIGURA 6).

Assim, todas as indicações apontam no sentido de uma conservação do epitopo através do processo de humanização de LM609. A maturação por afinidade é uma etapa extremamente relevante na engenharia de anticorpos destinados a aplicações terapêuticas. Ao aumentar a afinidade para o alvo, a concentração de um anticorpo in vivo que é necessário atingir para ele ser eficaz em termos de terapia é reduzida. Além de diminuir o custo da terapia com anticorpos, as concentrações baixas eficazes in vivo ajudarão a reduzir a possibilidade de uma resposta imunitária. A estratégia de "CDR walking" para a maturação por afinidade de anticorpos foi descrita em outra publicação e é conhecida na técnica relevante. Para a maturação por 27

ΕΡ 1 034 298/PT afinidade do anticorpo LM609 humanizado, escolheu-se uma optimização sequencial de LCDR3 e HCDR3 (ver FIGURA 7) . A região aleatorizada em ambas as CDR foi confinada a um trecho de quatro aminoácidos que mostrou possuir a variabilidade mais elevada em sequências de anticorpo humano. Ver Kabat, E.A. et al. (1991) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S. Dept of Health and Human Services, Washington, D.C. Utilizando dopagem com NNK (Barbas, C.F. et al. (1994) IN VITRO EVOLUTION OF A NEUTRALIZING HUMAN ANTIBODY TO HIV-1 TO ENHANCE AFFINITY AND BROADEN STRAIN CROSS-REACTIVITY, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 3809-3813), a aleatorização de quatro codões resulta em 324 ou lxlO6 sequências nucleotidicas diferentes. Com base nisto e assumindo uma distribuição de Poisson (Clackson, T. & Wells, J.A. (1994) IN VITRO SELECTION FROM PROTEIN AND PEPTIDE LIBRARIES, Trends in Biotechnol. 12, 173-184), são necessários 5xl06 transformantes independentes para uma biblioteca completa com uma confiança de 99%. Para cada uma das cinco versões humanizadas de LM609, geraram-se bibliotecas independentes de LCDR3 aleatorizadas. O número de transformantes independentes em cada biblioteca situou-se bem acima de 5xl06 (ver Procedimentos experimentais, abaixo). Obtiveram-se dez sequências de LCDR3 completamente diferentes quando dois clones de cada uma das cinco bibliotecas foram analisados por sequenciação de ADN. As três bibliotecas que foram baseadas nos clones de LM609 humanizado 2, 4 e 24, que contêm cadeias leves idênticas e cadeias pesadas muito relacionadas derivadas da linha germinal DP-65, foram combinadas. Correspondendo às sequências das suas linhas germinais subjacentes, as três bibliotecas remanescentes foram designadas por DPK-26ranLCDR3/DP-10, DPK-26ranLCDR3/DP-65 e DPK-26ranLCDR3/DP-78. Estas três bibliotecas foram seleccionadas em paralelo.

Para melhorar a selecção dos mutantes LCDR3 de maior afinidade, utilizou-se uma selecção "off-rate" (selecção com base na velocidade de dissociação) em fase sólida (Yang, W.P. et al. (1995) CDR WALKING MUTAGENESIS FOR THE AFFINITY MATURATION OF A POTENT HUMAN ANTI-HIV-1 ANTIBODY INTO THE PICOMOLAR RANGE, J. Mol Biol. 254, 392-403). Em cinco ciclos subsequentes de selecção, adicionaram-se 20 pg de IgG LM609 ao poço com 200 ou 50 ng de integrina humana ανβ3 28 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ imobilizada, após incubação dos fagos e lavagem. Depois de 24 horas à temperatura ambiente, o poço foi novamente lavado e os fagos ligados eluidos com tripsina. Esta etapa de selecção "off-rate" é discutida no parágrafo seguinte.

As interacções das proteínas são caracterizadas por parâmetros termodinâmicos e cinéticos. Enquanto a constante de afinidade (Ka = kon/koff) é uma constante de equilíbrio, as constantes de velocidade de associação (kon) e de dissociação (kQff) são mais relevantes para os processos in vivo que estão para lá do equilíbrio. Ver Williams, A.F. (1991) OUT OF EQUILIBRIUM, Nature 352, 473-474. De facto, para terem lugar in vivo, as interacções com uma afinidade elevada, isto é, valores de Ka elevados, ainda assentam numa associação rápida, isto é, valores de kon elevados. Os anticorpos estão sujeitos a uma selecção cinética baseada na ligação rápida aos antigénios-alvo, em paralelo com uma selecção termodinâmica da ligação de afinidade elevada para permitir tempo suficiente para a clearance do antigénio. Ver Foote, J. & Milstein, C. (1991) KINETIC MATURATION OF AN IMMUNE-RESPONSE, Nature 352, 530-532. Uma interacção anticorpo/antigénio típica com um valor de Ka na gama de 109 ET1 associa-se rapidamente com um valor de kon na gama de 105 a 106 M_1s_1 e dissocia-se lentamente com um valor de kQff na gama de 1CT3 a IO”4 s”1. Uma selecção "off-rate" para maturação por afinidade, isto é, koff decrescente, requer uma consideração da semivida das interacções anticorpo/antigénio, que é dada por ti* = ln2/koff. Uma interacção anticorpo/antigénio com koff = lxlO”4 s”1 possui uma semivida de cerca de 2 horas. Uma constante de dissociação dez vezes menor, isto é, k0ff = lxlCT5 s”1, resulta numa semivida dez vezes mais longa, ou seja, cerca de 20 horas. Estas semividas longas limitam a selecção "off-rate" no nosso protocolo de maturação por afinidade. Utilizando um quadro temporal razoável, os anticorpos com constantes de dissociação abaixo de lxlO”6 s”1 não podem ser enriquecidos mesmo após múltiplos ciclos de selecção. Contudo, utilizando um protocolo similar, foi seleccionado um anticorpo contra gpl20 com um valor de k0ff na gama de 1CT6 s”1. A constante de afinidade correspondente encontrava-se na gama de 1011 M”1, uma melhoria de mais de 400x em relação ao anticorpo parental. 29 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

Analisaram-se oito clones de cada uma das três bibliotecas independentemente seleccionadas por sequenciação de ADN. As sequências de LCDR3 estão apresentadas na Tabela 1 abaixo. Verificou-se uma forte selecção no sentido de uma sequência consenso que está muito relacionada com a sequência oriqinal. Todos os 24 clones analisados contêm uma serina (Ser) na Posição 91 e uma qlutamina (Gin) na Posição 92 da reqião aleatorizada. Os aminoácidos correspondentes na LCDR3 parental são a serina (Ser) e a asparaqina (Asn) , respectivamente. De modo interessante, todos os três codões da serina do código genético NNK (TCT, TCG e ACT) são encontrados na Posição 91. A Posição 94, um triptofano (Trp) na LCDR3 parental, foi re-seleccionada em 22 dos 24 clones. Dois clones contêm em vez disso uma histidina (His). Somente a Posição 93 revela uma maior diversidade. A serina original (Ser) é substituída por um aminoácido aromático ou hidrofóbico, seja ele a fenilalanina (Phe-13/24), o triptofano (Trp-6/24), a valina (Val-3/24), a tirosina (Tyr-1/24) ou a histidina (His-1/24). A análise das sequências da cadeia pesada revelou que não ocorreu contaminação cruzada entre as três bibliotecas independentemente seleccionadas. Todos os oito clones seleccionados a partir da biblioteca DPK-26ranLCDR3/DP-65, que continha a "pool" das sequências que codificam as três cadeias pesadas muito relacionadas derivadas da linha germinal DP-65, foram idênticos e derivaram do clone de LM609 humanizado 24. A sequência de LCDR3 conservada aponta no sentido de um epitopo extremamente definido na integrina humana ανβ3· Embora a ligação à integrina humana ανβ3 nativa na superfície celular ainda necessite de ser provada, um desvio do epitopo no sentido da integrina humana ανβ3 desnaturada é improvável. As "pools" de fagos seleccionadas foram analisadas quanto a ligação à integrina humana ανβ3 por meio de ensaio ELISA com fago e em competição com IgG LM609. Estas análises sugerem uma constante de dissociação significativamente mais baixa dos clones seleccionados em comparação com LM609, bem como LM609 humanizado. A substituição da serina original na Posição 3 por um resíduo aromático poderá dar origem a uma nova interacção hidrofóbica com um forte impacto na afinidade global. 30

ΕΡ 1 034 298/PT TABELA 1

Mutantes LCDR3 seleccionados

Posição de Kabat1 91 92 93 94 LM60 9 Ser Asn Ser Trp Ser Gin Trp Trp Biblioteca DPK-26ranLCDR3/DP-102 Ser Gin Trp Trp Ser Gin Trp Trp Ser Gin Trp Trp Ser Gin Vai Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Phe His Ser Gin Phe His Ser Gin Phe Trp Biblioteca DPK-26ranLCDR3/DP-653 Ser Gin Phe Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Trp Trp Biblioteca DPK-26ranLCDR3/DP-784 Ser Gin Trp Trp Ser Gin Vai Trp Ser Gin Vai Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Phe Trp Ser Gin Tyr Trp Ser Gin His Trp ver Kabat et al. (1991) 2 baseada no clone de LM609 humanizado 11 3 baseada nos clones de LM609 humanizado 2, 4 e 24 4 baseada no clone de LM609 humanizado 7 31 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

Procedimentos experimentais

Materiais 0 anticorpo IgG LM609 purificado a partir de culturas de hibridoma foi fornecido pelo Dr. David A. Cheresh. A integrina humana ανβ3 e a integrina humana ογ^β3 provieram de fontes descritas em HIGH-AFFINITY SELF-REACTIVE HUMAN ANTIBODIES BY DESIGN AND SELECTION: TARGETING THE INTEGRIN LIGAND BINDING SITE, Barbas III, C.F. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 10003-10007. As células de hamster CS-1 não transf ectadas e as células de hamster CS-1 transfectadas com o ADNc quer de β3 humana quer de β5 humana foram obtidas do Dr. David A. Cheresh (Filardo, E.J. et al. (1995) REQUIREMENT OF THE NPXY MOTIF IN THE INTEGRIN β3 SUBUNIT CYTOPLASMIC TAIL FOR MELANOMA CELL MIGRATION IN VITRO AND IN VIVO, J. Cell Biol. 130, 441-450) e mantidas em meio RPMI suplementado com soro fetal de vitelo (SFV) a 5%, a 37°C em 7% CO2.

Expressão em E. coli de fragmento Fab solúvel de LM609 humanizado

Após os ensaios de "panning" das bibliotecas de fagos, a inserção Sfil da "pool" de fagemídeos de LM609 humanizado seleccionada foi clonada no vector de expressão pPhoA-H6HA de E. coli (ver Rader, C. & Barbas III, C.F. (1997) PHAGE DISPLAY OF COMBINATORIAL ANTIBODY LIBRARIES, Curr. Opín. Biotechnol. 8, 503-508) para a detecção de espécies que se ligam a ανβ3. A determinação da sequência de 14 clones revelou cinco versões de LM609 humanizado diferentes, representadas pelos clones 2, 4, 7, 11 e 24. Os ADNc destes clones foram cortados por digestão com Sacl/Spel e ligados no vector pComb3H cortado com Sacl/Nhel, removendo assim o ADNc que codifica um fragmento do gene III de pComb3H e permitindo a produção de fragmento Fab solúvel ('ver Rader, C. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 503-508). Os produtos de ligação

foram electrotransformados na estirpe de E. coli XLl-Blue. A produção de Fab foi induzida por adição de isopropil^-D-tiogalactopiranósido como descrito (Barbas III, C.F. et al. (1991) ASSEMBLY OF COMBINATORIAL ANTIBODY LIBRARIES ON PHAGE 32

ΕΡ 1 034 298/PT SURFACES: THE GENE III SITE, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 7978-7982).

ELISA

As integrinas humanas ανβ3 e anbp3 foram aplicadas como revestimento, durante 90 minutos a 37°C, numa placa de 96 poços (Costar n.° 3690), numa concentração de 60 ng/25 μΐ de tampão de metais (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5/ NaCl 137 mM; KC1 1 mM; MgCl2 1 mM; CaCl2 1 mM; MnCl2 1 mM) por poço. Após bloqueio com 150 μΐ de BSA a 3% em TBS durante 1 hora a 37 °C, adicionaram-se ao poço 25 μΐ dos sobrenadantes em bruto das culturas crescidas durante a noite da estirpe de E. coli XL1-Blue expressando o fragmento Fab solúvel de LM609 ou de LM609 humanizado e incubou-se durante 2 horas a 37°C. A ligação de cada um dos sobrenadantes aos poços revestidos com as integrinas humanas ανβ3 e οίιη>β3, assim como aos poços não revestidos, mas bloqueados foi analisada em triplicado. Como controlo positivo, utilizaram-se 25 μΐ de 50 ng/μΐ de Fab-9 purificado, um anticorpo que se liga a ambas as integrinas humanas ανβ3 e cq^3 (Barbas III et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 10003-10007), e como controlo negativo, utilizaram-se 25 μΐ de meio de cultura bacteriano simples. Após lavagem extensa com água da torneira, adicionaram-se ao poço 25 μΐ de uma diluição de 1:2.000 de anticorpo de cabra anti-F(ab')2 de ratinho ou de anticorpo de cabra anti-F(ab')2 humano conjugado com fosfatase alcalina (Pierce n.° 31324 ou n.° 31312, respectivamente) em BSA a 1% em TBS e incubou-se durante 1 hora a 37°C. Após outra lavagem extensa com água da torneira, adicionaram-se 50 μΐ de substrato da fosfatase alcalina (5 mg de p-nitrofenilfosfato de dissódio hexa-hidratado (Sigma n.° 104-105) dissolvido em 5 ml de dietanolamina a 10%, MgCl2 1 mM, NaN3 3 mM, pH 9,8) ao poço. A placa foi analisada com um leitor de ELISA (Molecular Devices) após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente.

Citometria de fluxo A citometria de fluxo foi realizada utilizando um instrumento FACScan de Becton Dickinson. Para cada determinação, analisaram-se 5xl03 células de hamster CS-1 não transfectadas ou expressando ou β3 ou β5 humana. A coloração 33

ΕΡ 1 034 298/PT por imunofluorescência indirecta foi obtida com lisados em bruto da estirpe de E. coli XLl-Blue expressando o fragmento Fab solúvel de LM609 humanizado ou, como controlo negativo, um fragmento Fab humano não relacionado. Utilizou-se uma diluição de 1:100 de anticorpo de cabra anti-F(ab')2 humano conjugado com FITC (Jackson n.° 109-096-097) para a detecção.

Construção das bibliotecas de LCDR3

Os clones de LM609 humanizado 2, 4, 7, 11 e 24 em pPhoA-H6HA foram utilizados separadamente como molde para a mutagénese por PCR de sobreposição conforme descrito (Barbas III et al. (1994) IN VITRO EVOLUTION OF A NEUTRALIZING HUMAN ANTIBODY TO HIV-1 TO ENHANCE AFFINITY AND BROADEN STRAIN CROSS-REACTIVITY, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 3809-3813).

Os dois fragmentos necessários para este procedimento foram obtidos com os pares de iniciadores de PCR OMPSEQ (SEQ ID NO:39)/CR320 (SEQ ID NO:46) e CR520 (SEQ ID NO:47)/DPSEQ (SEQ ID NO:48), respectivamente. Os cinco ADNc resultantes com LCDR3 aleatorizada foram cortados com Sfil, ligados no vector fagemideo pComb3H adequadamente digerido e

electrotransformados na estirpe de E. coli ER 2537. Dois clones de cada uma das cinco bibliotecas foram analisados por sequenciação de ADN e revelaram possuir uma união correcta, assim como 10 sequências de LCDR3 diferentes. Antes da selecção, as bibliotecas baseadas nos clones 2, 4 e 24 (VL linha germinal DP-26; VH linha germinal DP-65) foram combinadas para fornecer uma complexidade de 6*107 transformantes independentes. As bibliotecas baseadas no clone 11 (VL linha germinal DP-26; VH linha germinal DP-10) e no clone 7 (VL linha germinal DP-26; VH linha germinal DP-78) foram mantidas separadas com uma complexidade de 3xl07 e 4xl07 transformantes independentes, respectivamente.

Selecção das bibliotecas de LCDR3

As três bibliotecas de LCDR3 foram seleccionadas separadamente por "panning" contra integrina ανβ3 imobilizada durante seis ciclos. Os ensaios de "panning" foram realizados praticamente como descrito anteriormente para a humanização de LM609. A concentração de integrina humana ανβ3 utilizada para o revestimento foi de 200 ng/25 μΐ no primeiro ao quarto 34

ΕΡ 1 034 298/PT ciclos e de 50 ng/25 μΐ no quinto e sexto ciclos. Também o número de fagos de partida ("input number of phage"), na gama de 1012 no primeiro ao quarto ciclos como habitualmente, sofreu uma redução de um factor de 10 no quinto ciclo e de um factor de 100 no sexto ciclo. Do segundo ao sexto ciclo de selecção, adicionaram-se 20 pg de IgG LM609 em 50 μΐ de tampão de metais (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5; NaCl 137 mM; KC1 1 mM; MgCl2 1 mM; CaCl2 1 mM; MnCl2 1 mM) ao poço, após a remoção do fago não ligado por meio de cinco a dez etapas de lavagem. A placa foi depois incubada durante 24 horas à temperatura ambiente (selecção "off-rate"; selecção com base na velocidade de dissociação) antes de cinco etapas de lavagem adicionais e da eluição com tripsina como descrito. Após o sexto ciclo, foram produzidos fagos a partir de clones individuais, que foram testados quanto a ligação à integrina humana ανβ3 imobilizada através de ELISA com fago, utilizando um anticorpo de ovelha anti-M13 conjugado com peroxidase de rábano (Pharmacia n.° 27-9411-01) como anticorpo secundário. As sequências que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada dos clones positivos foram analisadas por sequenciação de ADN utilizando os iniciadores OMPSEQ (SEQ ID NO:39) e PELSEQ (SEQ ID NO:24), respectivamente.

Optimização de LM609 por aleatorização de CDR

Além da humanização, o anticorpo LM609 pode ser optimizado a dois níveis: primeiro, aumentando a afinidade para ανβ3; segundo, alargando a reactividade cruzada entre espécies. Uma maior afinidade do anticorpo LM609 manipulado aumenta a potência e diminui o custo de uma possível terapia do cancro. O anticorpo monoclonal murino LM609 original já tem uma ampla reactividade cruzada entre espécies. Ele liga-se à ανβ3 humana, canina, de gato, bovina, de coelho e de pinto, mas não de ratinho. O facto de o anticorpo LM609 não reconhecer a ανβ3 do hospedeiro nos modelos murinos do cancro humano é uma preocupação importante para a aplicabilidade terapêutica do LM609. A ligação do LM609 manipulado a ambas as ανβ3 humana e murina seria uma ferramenta importante em ensaios clínicos. Os métodos in vitro para melhoria da afinidade dos anticorpos monoclonais incluem "chain shuffling" (baralhamento de 35

ΕΡ 1 034 298/PT

cadeias) (ver Marks, J.D. et al. (1992) BY-PASSING

IMMUNIZATION: BUILDING HIGH HUMAN ANTIBODIES BY CHAIN SHUFFLING, Βίο/Technology 10, 779-783). A ligação a ανβ3 pode ser adicionalmente melhorada por aleatorização subsequente das CDR, uma abordagem designada por "CDR walking" (ver

Barbas III, C.F. et al. (1994) IN VITRO EVOLUTION OF A NEUTRALIZING HUMAN ANTIBODY TO HIV-1 TO ENHANCE AFFINITY AND BROADEN STRAIN CROSS-REACTIVITY, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 3809-3813). É provável que as estratégias in vitro para a humanização e a melhoria da afinidade do anticorpo LM609 gerem simultaneamente uma reactividade cruzada com a ανβ3 murina. A selecção dirigida para o reconhecimento da ανβ3 murina é complicada pelo facto de a ανβ3 murina ainda não ter sido purificada. Contudo, sabe-se que várias linhas celulares murinas, por exemplo, NIH/3T3, expressam ανβ3 e, por conseguinte, poderão ser incluídas no procedimento de rastreio. ser A discussão precedente e os exemplos concomitantes são apresentados a título ilustrativo e não devem considerados limitativos. 36

ΕΡ 1 034 298/PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> The Scripps Research . Institute <12 0> HUMANIZAÇÃO DE ΑΝΤΙCORPO MURINO <130> TSRI 598.0 Λ o \—1 V Ainda desconhecido <141> 1998-12-04 <150> 08/986,016 <151> 1997-12-05 <1 60> 56 <17 0> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM60 9 <4 0 0> 1 His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM60 9 <4 0 0> 2 Gin Gin Ser Asn Sér Trp PrO His Thr 1 5 <210> 3 <211> 37 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM60 9 <4 0 0> 3 gggcccaggc ggccgagctc cagatgaccc agtcU <210> 4 <211> 37 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM60 9 <4 0 0> 4 gggcccaggc ggccgagctc gtgatgacyc agtctcc 37 37 37 37 ΕΡ 1 034 298/PT <210> 5 <211> 37 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 5 gggcccaggc ggccgagctc gtgwtgacrc agtctcc

<210> 6 <211> 37 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 6 gggcccaggc ggccgagctc acactcacgc agtctcc 37 <210> 7 <211> 23 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 7 cagtaataca ctgcaaaatc ttc 23 <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 8 cagtaataaa ccccaacatc ctc 23

<210> 9 <211> 40 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 9 gggcccaggc ggccgagctc gtgbtgacgc agccgccctc 40 <210> 10 <211> 40 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <4 0 0> 10 gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agccaccctc 40 43 38 ΕΡ 1 034 298/PT <210> 11 <211> 43 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <4 0 0> 11 gggcccaggc ggccgagctc gccctgactc <210> 12 <211> 46 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <4 0 0> 12 gggcccaggc ggccgagctc gagctgactc <210> 13 <211> 40 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <4 0 0> 13 gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc <210> 14 <211> 40 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <4 0 0> 14 gggcccaggc ggccgagctc atgctgactc <210> 15 <211> 40 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <4 0 0> 15 gggcccaggc ggccgagctc gggcagactc <210> 16 <211> 40 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <4 0 0> 16 46 40 40 40 gggcccaggc ggccgagctc gtggtgacyc aggagccmtc 40

ΕΡ 1 034 298/PT 39 <210> 17 <211> 40 <212> ADN <213> Hibridoma <4 0 0> 17 murino de LM609 gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agccaccttc 40 <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Hibridoma <4 0 0> 18 murino de LM609 gcagtaataa tcagcctcrt c 21 <210> 19 <211> 44 <212> ADN <213> Hibridoma <4 0 0> 19 murino de LM609 gctgcccaac cagccatggc ccaggtgcag ctggtgcagt ctgg 44 <210> 20 <211> 44 <212> ADN <213> Hibridoma <400> 20 murino de LM609 gctgcccaac cagccatggc ccagatcacc ttgaaggagt ctgg 44 <210> 21 <211> 44 <212> ADN <213> Hibridoma <400> 21 murino de LM609 gctgcccaac cagccatggc cgaggtgcag ctggtgsagt ctgg 44 <210> 22 <211> 44 <212> ADN <213> Hibridoma <400> 22 murino de LM609 gctgcccaac cagccatggc ccaggtgcag ctgcaggagt cggg 44 40

ΕΡ 1 034 298/PT

<210> 23 <211> 24 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 23 cgcacagtaa tacacggccg tgtc 24

<210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 24 acctattgcc tacggcagcc g 21

<210> 25 <211> 24 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 25 cgcacagtaa tacacggccg tgtc 24

<210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 26

Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 1 5

<210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 27

Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala l 5

<210> 28 <211> 69 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 28 gacacggccg tgtattactg tgcgcgtcat aactacggca gttttgctta ctggggccag 60 ggaaccctg 69 42 41 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

<210> 29 <211> 42 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 29 gaggaggagg aggagactag ttttgtcaca agatttgggc tc

<210> 30 <211> 73 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 30 gaagattttg cagtgtatta ctgcccaaca gagtaacagc tggcctcaca cgtttggcca 60 ggggaccaag ctg 73 murino de LM609 <210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> Hibridoma <400> 31 21 aatacgactc actatagggc g <210> 32 <211> 72 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 32

gaggatgttg gggtttatta ctgccaacag agtaacagct ggcctcacac gtttggccag 60 gggaccaagc tg 72 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 33

Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cye 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 42

ΕΡ 1 034 298/PT <400> 34

Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys 1 5

<210> 35 <211> 69 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 35 gaygaggctg· attattactg ccaacagagt aacagctggc ctcacacgtt cggcggaggg 60 accaagctg 69

<210> 36 <211> 50 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 36 agagagagag agagagagag cgccgtctag aattatgaac attctgtagg 50

<210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 37

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 1 5

<210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 38

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 1 5

<210> 39 <211> 22 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 39 aagacagcta tcgcgattgc ag 22 <210> 40 <211> 41 43 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

<212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 40 gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c 41

<210> 41 <211> 21 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 41 ggccatggct ggttgggcag c 21

<210> 42 <211> 42 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 42 gcagagccca aatcttgtga cactagtggc caggccggcc ag 42 <210> 43 <211> 41

<212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 43 gaggaggagg aggaggagcc tggccggcct ggccactagt g 41

<210> 44 <211> 130 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 44

Leu 1 Glu Glu Ser Gly Gly Gly 5 Leu Val Lys 10 Pro Gly Gly Ser Leu 15 Lys Leu Ser Cys Ala 20 Ala Ser Gly Phe Ala 25 Phe Ser Ser Tyr Asp 30 Met: Ser Trp val Arg 35 Gin Ile Pro Glu Lys 40 Arg Leu Glu Trp Val 45 Ala Lys Val Ser Ser 50 Gly Gly Gly Ser Thr 55 Tyr Tyr Leu Asp Thr 60 val Gin Gly Arg Phe 65 Thr Ile Ser Arg Asp Asn 70 Ala Lys Asn Thr Leu 75 Tyr Leu Gin Met 80 Ser Ser Leu Asn Ser 85 Glu Asp Thr Ala Met 90 Tyr Tyr Cy3 Ala Arg 95 His Asn Tyr Gly Ser 100 Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 105 Leu Val 110 Thr Val Ser Ala Ala 115 Lys Thr Thr Pro Pro 120 Ser Val Tyr Pro Leu 125 Ala Pro Gly

Ser Ala 130 44 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ

<210> 45 <211> 109 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 45

Glu 1 Leu Vai Met Thr 5 Gin Thr Pro Ala Thr 10 Leu Ser Vai Thr Pro 15 Gly Asp Ser vai Ser Leu 20 Ser Cys Arg Ala Ser 25 Gin Ser Ile ser 30 Asn His l>eu His Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Ser 40 His Glu Ser Pro Arg 45 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala 50 Ser Gin Ser Ile 55 Ser Gly Ile Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Ser Ile 75 Asn Ser Vai Glu Thr 80 Glu Asp Phe Gly Met 85 Tyr Phe Cys Gin Gin 90 Ser Asn Ser Trp Pro 95 His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105

<210> 46 <211> 57 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 46 50 57 ggtcccctgg ccaaacgtgt gaggmnnmnn mnnmnnctgt tggcagtaat acactgc

<210> 47 <211> 23 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 47 cctcaccgtt tggccagggg acc 23

<210> 48 <211> 21 <212> ADN <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 48 agaagcgtag tccggaacgt c 21

<210> 49 <211> 109 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 45 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ <400> 49

Glu Leu Vai Met Thr Gin Ser Pro Glu Phe Gin Ser Vai Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Thr Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gin Pr© Vai Phe Gly Vai Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Tyr Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Αερ Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Ser Trp Pro His Θ5 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 50 <211> 118 <212> PRT <213> Hibridoma murino de : LM60 9 <400> 50 GinVai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Ala Ser Ile Ser Arg Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile His His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ala lie Asp Thr Ser Lys Asn Gin Leu 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Thr Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Alã Vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Leu Vai Thr vai Ser Ser 115 <210> 51 <211> 118 <212> PRT <213> Hibridoma murino de : LM609 <4 0 0> 51 Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15 Thr Leu Phe Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp ile Arg His His Pro Gly Lys Gly .Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile His His Arg Ala Ala Pro Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ser Vai Asp Thr Ser Arg Asn Gin Ile 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Arg Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 52 <211> 118 46

ΕΡ 1 034 298/PT <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 52

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 GlU Ser Gly Pro Gly 10 Leu Vai Lys Pro Ser Glu 15 Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Vai Ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser 30 Ser Gly Gly Tyr Tyr 35 Trp Ser Trp Ile Arg 40 Gin His Pro Gly Lys 45 Gly Leu Glu Trp lie Gly 50 Tyr Ile His His 55 Ser Ala Gly Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Vai Thr 70 Met Ser Vai Asp Thr Ser 75 Lys Asn Gin Leu 80 Ser Leu Lys Leu Thr 85 Ser Vai Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg His 100 Asn Tyr Gly Ser Phe 105 Ala Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr

Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 53

<211> 118 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 53

Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Glu Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Ser Val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser ser 30 Gly Gly Tyr Tyr 35 Trp Ser Trp Ile Arg 40 His His Pro Gly Lys 45 Gly Leu Glu Trp Ile 50 Gly Tyr Ile His His 55 Ser Ala Gly Thr Tyr Tyr 60 Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Val Thr 70 Met Ser Ala Asp Thr Ser Lys 75 Asn Gin Leu 80 Ser Leu Lys Leu Ala 85 Ser Val Thr Ala Ala 90 Asp Thr'Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg His 100 Asn Tyr Gly Ser Phe 105 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr

Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 54 <211> 117 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 54

Gin 1 Val Gin Leu Val 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Val Arg Lys Pro Gly 15 Ser Ser Val Arg Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Gly Thr Phe Ser 30 Gly Phe Ala Val Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Arg Phe 45 Glu Trp Leu Gly Gly 50 Ile Val Ala Ser Leu 55 Gly Ser Thr Asp Tyr 60 Ala Gin Lys Phe Gin 65 Asp Lys Leu Thr Ile 70 Thr Val Asp Glu Ser Thr 75 Ala Thr Val Tyr 80 Met Glu Met Arg Asn 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg His Asn Tyr Gly 100 Val Thr Val Ser Ser Ser Phe Ala 105 Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu 115 47 ΕΡ 1 034 298/ΡΤ <210> 55 <211> 109 <212> PRT <213> Hibridoma murino ( de LM609 <400> 55 Glu Leia Val Met Thr Gin Ser Pro Glu phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Gly Asn Ser Leu His 20 25 30 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gin Pro Val Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 €0 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Ser Trp Pro His Θ5 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 56 <211> 117 <212> PRT <213> Hibridoma murino de LM609 <400> 56 Glu Val Gin Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gin lie Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val 50 55 60 Gin Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110 val Thr Val Ser Ala 115

Lisboa, 2012-01-20

Claims (12)

1. ΕΡ 1 034 298/PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção de um anticorpo monoclonal de ratinho humanizado que compreende as etapas de (a) construção de uma primeira biblioteca de cadeias leves ou pesadas humanizadas, em que cada uma das referidas cadeias possui uma sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) murina de uma cadeia leve ou pesada de ratinho correspondente e em que cada uma das referidas cadeias inclui um domínio variável humano; (b) combinação da primeira biblioteca construída de cadeias leves ou pesadas humanizadas da etapa (a) com uma cadeia complementar de um anticorpo que se liga a um antigénio pré-seleccionado, de modo que a cadeia complementar juntamente com uma cadeia humanizada presente na biblioteca construída forma um par de cadeias leve e pesada numa biblioteca de pares humanizados, em que a cadeia complementar é uma cadeia murina/humana quimérica; (c) selecção a partir da biblioteca de pares humanizados da etapa (b) de um par particular de cadeias leve e pesada humanizado utilizando a referida cadeia complementar, em que o referido par de cadeias leve e pesada humanizado é seleccionado em relação a ligação ao referido antigénio pré-seleccionado; (d) construção de uma segunda biblioteca de cadeias leves ou pesadas humanizadas, em que cada cadeia possui uma sequência de aminoácidos da CDR3 murina de uma cadeia leve ou pesada de ratinho correspondente e em que cada uma das referidas cadeias inclui um domínio variável humano; em que as cadeias da referida segunda biblioteca de cadeias leves ou pesadas de anticorpo humanizadas são a cadeia leve ou pesada complementar das referidas cadeias leves ou pesadas de anticorpo humanizadas da primeira biblioteca da etapa (a), de modo que uma biblioteca é uma biblioteca de cadeias leves e a outra biblioteca é uma biblioteca de cadeias pesadas; (e) isolamento de uma cadeia leve ou pesada a partir do par de cadeias leve e pesada humanizado de ligação ao ΕΡ 1 034 298/PT 2/3 antigénio da etapa (c) e combinação da referida cadeia de ligação ao antigénio com cadeias da referida segunda biblioteca da etapa (d) , de modo que a cadeia de ligação ao antigénio juntamente com as cadeias presentes na biblioteca construída da etapa (d) formam um par de cadeias leve e pesada numa biblioteca de pares humanizados; e (f) selecção a partir da biblioteca de pares humanizados da etapa (e) de um par de cadeias leve e pesada humanizado que se liga ao referido antigénio pré-seleccionado.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a biblioteca humanizada da etapa (a) contém cadeias leves e a cadeia complementar da etapa (b) é uma cadeia pesada.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a biblioteca humanizada da etapa (a) contém cadeias pesadas e a cadeia complementar da etapa (b) é uma cadeia leve.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeia pesada é um fragmento Fd.
5. 5. Método de humanização de um anticorpo monoclonal de ratinho que compreende as etapas de: (a) construção de uma biblioteca de cadeias leves humanizadas, em que cada uma das referidas cadeias leves compreende pelo menos um seu domínio variável humano e possui uma sequência de aminoácidos da CDR3 murina de uma cadeia leve de ratinho; (b) selecção a partir da biblioteca construída de cadeias leves humanizadas de uma cadeia leve humana possuindo uma CDR3 murina, em que a selecção compreende a utilização de uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga a um antigénio pré-seleccionado, em que a cadeia pesada é uma cadeia murina/humana quimérica e em que a referida cadeia leve humana possuindo uma CDR3 murina é seleccionada em relação a ligação a um antigénio pré-seleccionado; (c) construção de uma biblioteca de cadeias pesadas humanizadas, em que cada uma das referidas cadeias pesadas compreende pelo menos um domínio variável humano e possui uma ΕΡ 1 034 298/PT 3/3 sequência de aminoácidos da CDR3 murina de uma cadeia pesada de ratinho; (d) combinação da biblioteca construída de cadeias pesadas humanizadas com a cadeia leve humanizada seleccionada, para produzir uma biblioteca humanizada de pares de cadeias leve e pesada, em que cada uma contém uma CDR3 de ratinho; e (e) selecção a partir da biblioteca humanizada da etapa (d) de um par de cadeias leve e pesada utilizando a cadeia leve humana seleccionada, em que o referido par de cadeias leve e pesada é seleccionado em relação a ligação ao antigénio pré-seleccionado.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, compreendendo adicionalmente converter o par de cadeias leve e pesada seleccionado no anticorpo completo.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a cadeia pesada é Fd.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que Fd é um membro do grupo que consiste em um fragmento de cadeia pesada murina/humana quimérica e um fragmento de cadeia pesada murina de molde.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 5, em que apenas uma região determinante de complementaridade três de uma cadeia leve do anticorpo LM609 está presente na cadeia leve humana.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 5, em que apenas uma região determinante de complementaridade três de uma cadeia pesada do anticorpo LM609 está presente na cadeia pesada humana.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o Fd é uma cadeia pesada murina/humana quimérica.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o Fd é um fragmento de cadeia pesada murina de molde. Lisboa, 2012-01-20