CN103476433A - 改良的免疫疗法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物和(b)工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体的组合,其用于治疗有此需要的个体中的疾病。进一步提供了包含所述组合的药物组合物及其使用方法。
Description
发明领域
本发明一般涉及免疫治疗。更具体地,本发明关注将抗原靶向性免疫缀合物和Fc工程化的抗体组合用作免疫治疗剂。另外,本发明涉及包含所述免疫缀合物和抗体的组合的药物组合物以及在疾病治疗中使用其的方法。
发明背景
在多种临床背景中经常期望选择性破坏个体细胞或特定细胞类型。例如,特定地破坏肿瘤细胞而留下完整和未受损的健康细胞和组织是癌症治疗的首要目的。
实现此目的的一种有吸引力的方式是通过诱导针对肿瘤的免疫应答,使得免疫效应器细胞如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。效应器细胞可由各种刺激物激活,包括许多经由结合其在免疫细胞表面上的受体来诱导信号传导事件的细胞因子。例如,刺激细胞毒性T细胞和NK细胞的增殖和激活的白介素-2(IL-2)等已被批准用于治疗转移性肾细胞癌和恶性黑色素瘤。然而,快速的血液清除以及肿瘤特异性的缺乏需要系统性施用高剂量的细胞因子以实现肿瘤位点处浓度足够高的细胞因子来激活免疫应答或发挥抗肿瘤效果。这些高系统性水平的细胞因子能引起严重毒性和不良反应,如对于IL-2也是这样的情况。因此,为了在癌症治疗中使用,期望将细胞因子特定地投递到肿瘤或肿瘤微环境。这可以通过将细胞因子缀合至特异于肿瘤抗原的靶向模块(例如抗体或抗体片段)来实现。此类免疫缀合物的另一个优点是它们相比于未经缀合的细胞因子的延长的血清半衰期。它们在较低剂量时能使肿瘤位点处的免疫刺激活性最大化并同时保持系统性副作用最小的能力使得细胞因子免疫缀合物成为最佳的免疫治疗剂。
激活效应器细胞的另一种方式是经由免疫球蛋白的Fc部分或包含Fc区的重组融合蛋白对其表面上激活Fc受体的衔接。抗体的所谓的效应器功能(由其Fc区介导)在基于抗体的癌症免疫治疗中是一种重要的作用机制。当结合于细胞表面的抗体与NK细胞上的Fc受体相互作用时,触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性,其为通过NK细胞对抗体包被的靶细胞(例如肿瘤细胞)的破坏。NK细胞表达FcγRIIIa(CD16a),其识别IgG1或IgG3亚类的免疫球蛋白。其它效应器功能包括抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC),而且其随着抗体的类和亚类而变化,因为不同的免疫细胞类型拥有识别不同型和亚型的免疫球蛋白重链恒定域(例如α、δ、γ、ε或μ重链恒定域,其分别对应于IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类抗体)的不同的Fc受体组。已采用各种策略来提高抗体的效应器功能。例如,Shields等(J BiolChem9(2),6591-6604(2001))显示,在Fc区位置298、333和/或334处的氨基酸(残基的EU编号)取代改进抗体对FcγIIIa受体的结合和ADCC。具有Fc区中的氨基酸修饰并展现出改进的Fc受体结合和效应器功能的另外的抗体变体记载于例如美国专利No.6,737,056、WO2004/063351和WO2004/099249。或者,可以通过改变抗体的糖基化来获得增加的Fc受体结合和效应器功能。IgGl型抗体(在癌症免疫治疗中最普遍使用的抗体)在Fc区的每个CH2域中具有Asn297处保守的N-连接的糖基化位点。附接于Asn297的两个复杂的双触角(biantennary)寡糖埋在CH2域之间,从而形成与多肽主链的广泛接触,并且它们的存在对于抗体介导包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在内的效应器功能是必要的(Lifely等,Glycobiology5,813-822(1995);Jefferis等,Immunol Rev163,59-76(1998);Wright和Morrison,Trends Biotechnol15,26-32(1997))。蛋白质工程研究显示,FcγR与IgG CH2域的较低铰链区相互作用(Lund等,J Immunol157,4963-69(1996))。然而,FcγR结合还需要CH2区中存在寡糖(Lund等,J Immunol157,4963-69(1996);Wright和Morrison,Trends Biotech15,26-31(1997)),这表明寡糖和多肽两者直接促成相互作用位点或者需要寡糖来维持有活性的CH2多肽构象。因此,作为一种手段可以探索对寡糖结构的修饰以增加IgG1和FcγR之间相互作用的亲和力,以及提高IgG1抗体的ADCC活性。等(Nat Biotechnol17,176-180(1999)和美国专利No.6,602,684(WO99/54342)(其内容通过提述完整据此并入)显示,在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中过表达β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII),一种催化等分的寡糖的形成的糖基转移酶,显著提高在那些细胞中生成的抗体的体外ADCC活性。生产细胞系中GnTIII的过表达产生富含等分的寡糖的抗体,该寡糖一般还是非岩藻糖基化的并且是杂合类型。如果除了GnTIII以外,甘露糖苷酶II(ManII)也在生产细胞系中过表达,那么获得富含等分、非岩藻糖基化的复合类型的寡糖的抗体(Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006))。如相比于具有未经修饰多糖的抗体的,两种类型的抗体均显示强烈增加的ADCC,但仅其中大多数N-多糖为复杂类型的抗体能诱导显著的补体依赖性细胞毒性(Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006))。提高活性的关键因素似乎是从寡糖核心最内部的N-乙酰葡糖胺残基消除岩藻糖,这改进IgG Fc域对FcγRIIIa的结合(Shinkawa等,J Biol Chem278,3466-3473(2003))。用于生成具有降低的岩藻糖基化的抗体的另外的方法包括,例如在α(1,6)-岩藻糖基转移酶缺陷型宿主细胞中表达(Yamane-Ohnuki等,Biotech Bioeng87,614-622(2004);Niwa等,J Immunol Methods306,151-160(2006))。
尽管通过使用游离的细胞因子、免疫缀合物或工程化的抗体在抗癌免疫治疗中有所成就,但在癌症疗法中继续需要新的有效且安全的治疗选择。
发明概述
本发明人已发现,将这两种策略组合用于局部免疫细胞激活,即通过细胞因子免疫缀合物并通过工程化为具有增加的效应器功能的抗体同时刺激效应器细胞,极大地改进抗癌免疫疗法的功效。
因此,本发明提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个实施方案中,所述效应器模块是细胞因子。在一个实施方案中,所述细胞因子选自下组:IL-2、GM-CSF、IFN-α和IL-12。在一个具体的实施方案中,所述效应器模块是IL-2。在另一个实施方案中,所述效应器模块是IL-12。在另一个具体的实施方案中,所述IL-2效应器模块是突变的IL-2效应器模块,其包含至少一个氨基酸突变(特别是氨基酸取代),相比于未突变的IL-2效应器模块,该突变消除或降低突变的IL-2效应器模块对IL-2受体α亚基的亲和力但保留该突变的IL-2效应器模块对中亲和力IL-2受体的亲和力。在一个特定的实施方案中,所述突变的IL-2效应器模块包含在选自对应于人IL-2残基42、45和72的位置的一个、两个或三个位置处的一个、两个或三个氨基酸取代。在一个更特定的实施方案中,所述突变的IL-2效应器模块包含在对应于人IL-2残基42、45和72的位置处的三个氨基酸取代。在一个甚至更特定的实施方案中,所述突变的IL-2效应器模块是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G的人IL-2。在某些实施方案中,所述突变的IL-2效应器模块另外包含在对应于人IL-2的位置3的位置处的氨基酸突变,其消除IL-2的O-糖基化位点。在一个特定的实施方案中,所述突变的IL-2效应器模块包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述效应器模块是单链效应器模块。
在一个实施方案中,所述抗原结合模块是抗体或抗体片段。在一个实施方案中,效应器模块与抗原结合模块共有氨基或羧基末端肽键。在一个实施方案中,抗原结合模块选自Fab分子和scFv分子。在一个实施方案中,抗原结合模块是Fab分子。在另一个实施方案中,抗原结合模块是scFv分子。在一个实施方案中,所述免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块。在一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块独立地选自Fab分子和scFv分子。在一个实施方案中,第一和第二抗原抗原结合模块的每一个均为Fab分子。在另一个实施方案中,第一和第二抗原抗原结合模块的每一个均为scFv分子。在一个实施方案中,效应器模块与第一抗原结合模块共有氨基或羧基末端肽键,而第二抗原结合模块与效应器模块或第一抗原结合模块共有氨基或羧基末端肽键。在一个实施方案中,效应器模块与第一抗原结合模块共有氨基末端肽键,并与第二抗原结合模块共有羧基末端肽键。在一个实施方案中,免疫缀合物基本由通过一种或多种接头序列连接的效应器模块以及第一和第二抗原结合模块组成。在一个特定的实施方案中,免疫缀合物包含效应器模块(特别是单链效应器模块)以及第一和第二Fab分子,其中所述效应器模块在其氨基末端氨基酸处连接至第一Fab分子的重链或轻链的羧基末端,并且其中所述效应器模块在其羧基末端氨基酸处连接至第二Fab分子的重链或轻链的氨基末端。
在某些实施方案中,所述抗原结合模块针对肿瘤细胞上呈现的或肿瘤细胞环境中的抗原。在一个特定的实施方案中,抗原结合模块针对选自下组的抗原:成纤维细胞活化蛋白(FAP)、生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纤连蛋白的外域B(Extra Domain B)(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑色素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在一个实施方案中,提高的效应器功能选自下组:升高的对激活Fc受体的结合、提高的ADCC、提高的ADCP、提高的CDC和增加的细胞因子分泌。在一个实施方案中,提高的效应器功能是升高的对激活Fc受体的结合。在一个特定的实施方案中,激活Fc受体选自下组:FcγRIIIa、FcγRI和FcRγIIa。在一个实施方案中,激活Fc受体是FcγRIIIa。在一个实施方案中,提高的效应器功能是提高的ADCC。在一个实施方案中,提高的效应器功能是升高的对激活Fc受体的结合和提高的ADCC。
在一个实施方案中,通过在Fc区中引入一个或多个氨基酸突变来工程化抗体。在一个特定的实施方案中,所述氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施方案中,通过对Fc区中糖基化的修饰来工程化抗体。在一个特定的实施方案中,对Fc区中糖基化的修饰是Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例,如与未经工程化的抗体相比的。在一个甚至更特定的实施方案中,Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例至少为20%,优选至少为50%,最优选至少为70%的Fc区中无岩藻糖基化的寡糖。在另一个特定的实施方案中,对Fc区中糖基化的修饰是Fc区中增加的等分寡糖比例,如与未经工程化的抗体相比的。在一个甚至更特定的实施方案中,Fc区中增加的等分寡糖比例为至少20%,优选至少50%,且最优选Fc区中至少70%的等分寡糖。在又一个特定的实施方案中,对Fc区中糖基化的修饰是Fc区中增加的等分、无岩藻糖基化寡糖比例,如与未经工程化的抗体相比的。优选地,抗体在Fc区中具有至少约25%、至少约35%或至少约50%的等分的、无岩藻糖基化寡糖。在一个具体的实施方案中,将抗体工程化为具有Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例,如与未经工程化的抗体相比的。Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例使得抗体具有提高的效应器功能,特别是提高的ADCC。在一个具体的实施方案中,无岩藻糖基化寡糖是等分、无岩藻糖基化的寡糖。
在一个实施方案中,所述抗体是全长IgG类抗体,特别是IgG1亚类抗体。在某些实施方案中,抗体针对肿瘤细胞上呈现的抗原。在一个特定的实施方案中,抗体针对选自下组的抗原:CD20、表皮生长因子受体(EGFR)、HER2、HER3、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、c-Met、含CUB域的蛋白1(CDCP1)、癌胚抗原(CEA)和黑色素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在一个具体的实施方案中,抗体是工程化为相比于未经工程化的抗体具有Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例的抗CD20抗体。合适的抗CD20抗体记载于WO2005/044859,其通过提述完整并入本文。在另一个具体的实施方案中,所述抗体是工程化为相比于未经工程化的抗体具有Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例的抗EGFR抗体。合适的抗EGFR抗体记载于WO2006/082515和WO2008/017963,其各自通过提述完整并入本文。在一个别的具体的实施方案中,所述抗体是工程化为相比于未经工程化的抗体具有Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例的抗IGF-1R抗体。合适的抗IGF-1R抗体记载于WO2008/077546,其通过提述完整并入本文。在又一个具体的实施方案中,所述抗体是工程化为相比于未经工程化的抗体具有Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例的抗CEA抗体。合适的抗CEA抗体记载于PCT公开号WO2011/023787,其通过提述完整并入本文。在再一个具体的实施方案中,所述抗体是工程化为相比于未经工程化的抗体具有Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例的抗HER3抗体。合适的抗HER3抗体记载于PCT公开号WO WO2011/076683,其通过提述完整并入本文。在再一个具体的实施方案中,所述抗体是工程化为相比于未经工程化的抗体具有Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例的抗CDCP1抗体。合适的抗CDCP1抗体记载于PCT公开号WO WO2011/023389,其通过提述完整并入本文。在一个实施方案中,将抗体工程化为相比于未经工程化的抗体在Fc区中具有修饰的糖基化,其通过在具有改变的一种或多种糖基转移酶活性的宿主细胞中生成该抗体。
在一个实施方案中,将抗体工程化为相比于未经工程化的抗体在Fc区中具有增加的无岩藻糖基化寡糖比例,其通过在具有升高的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)活性的宿主细胞中生成该抗体。在一个具体的实施方案中,宿主细胞另外具有升高的α-甘露糖苷酶II(ManII)活性。在另一个实施方案中,将抗体工程化为相比于未经工程化的抗体在Fc区中具有增加的无岩藻糖基化寡糖比例,其通过在具有降低的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中生成该抗体。
在一个实施方案中,所述疾病是可通过刺激效应器细胞功能治疗的病症。在一个实施方案中,所述疾病是细胞增殖病症。在一个具体的实施方案中,所述疾病是癌症。在一个特定的实施方案中,癌症选自下组:肺癌、结肠直肠癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、头和颈癌、卵巢癌、脑癌、淋巴瘤、白血病和皮肤癌。在一个实施方案中,所述个体是哺乳动物。在一个具体的实施方案中,所述个体是人。
在另一个方面,本发明提供药物组合物,其在药学可接受的载体中包含(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,和(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体。
本发明还涵盖(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,和(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体在制备用于治疗个体中疾病的药物中的用途。
本发明还提供治疗个体中疾病的方法,包括对所述个体以治疗有效量施用以下的组合:(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,和(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体。
本发明还提供刺激个体中效应器细胞功能的方法,包括对所述个体以能有效刺激效应器细胞功能的量施用以下的组合:(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,和(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体。
在一个进一步的方面,本发明提供意图用于治疗疾病的试剂盒,其在相同或分开的容器中包含(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体,和(c)任选地,包含印刷说明书的包装插页,其指导将所述组合治疗用作治疗疾病的方法。
理解依照本发明的药物组合物中使用的免疫缀合物和抗体、用途、方法和试剂盒可以单独地或组合地纳入在前述段落中关于可用于本发明的抗体和免疫缀合物所描述的任意特征。
附图简述
图1。在人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549中测试TNC A2靶向性的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab,将其i.v.注射到SCID-人FcγRIII转基因小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于生腱蛋白C的A2域是阳性的。数据显示,2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合相比于单独的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab就增强的中值存活而言介导更好的功效(见实施例1)。
图2。在人结直肠LS174T细胞系中测试TNC A2靶向性的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab,将其脾内注射到SCID小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于生腱蛋白C的A2域是阳性的。数据显示,2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab的组合相比于单独的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab就增强的中值和总体存活而言介导更好的功效(见实施例2)。
图3。在人肾细胞系ACHN中测试FAP靶向性3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab,将其肾内注射到SCID小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于FAP是阳性的。数据显示,3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合相比于单独的3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab在SCID小鼠中产生协作性增强的中值和总体存活(见实施例3)。
图4。在人肾细胞系ACHN中测试FAP靶向性3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab,将其肾内注射到SCID-人FcγRIII转基因小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于FAP是阳性的。数据显示,3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合相比于单独的3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab就总体存活而言介导更好的功效(见实施例4)。
图5。在人套细胞淋巴瘤细胞系Z13中测试TNC A2靶向性的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗CD20GlycoMab,将其i.v.注射到SCID-人FcγRIII转基因小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于TNC A2是阳性的。数据显示,2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗CD20-GlycoMab的组合相比于单独的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗CD20-GlycoMab协作性增强中值和总体存活(见实施例5)。
图6。在人肾细胞系ACHN中测试FAP靶向性28H1Fab-IL-2-Fab免疫缀合物(包含缺乏对CD25的结合的IL-2四重突变体(qm))以及抗EGFR GlycoMab,将其肾内注射到SCID-人FcγRIII转基因小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于FAP是阳性的。数据显示,28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合相比于单独的28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab就增强的中值存活而言介导更好的功效(见实施例6)。
图7。用存在于溶液(A)或包被于细胞皿(B)的IL-2(阿地白介素(Proleukin))、28H1Fab-IL2-Fab或28H1Fab-IL2qm-Fab预处理48小时的PBMC对肿瘤细胞杀伤的增加(E:T=10:1,4小时)。值代表相比于未经处理的PBMC在杀伤中增加的百分比(见实施例8)。
图8。在不同浓度的抗EGFR GlycoMab的存在下,用57nM FAP靶向性28H1Fab-IL2-Fab或28H1Fab-IL2qm-Fab预处理45小时或未经预处理的PBMC的总体A549肿瘤细胞杀伤(E:T=10:1,4小时)(见实施例8)。
图9。在与单独的抗EGFR GlycoMab(A)或Erbitux(B)(5或500ng/ml)、或与不同浓度的IL-2(阿地白介素)、28H1Fab-IL2-Fab或28H1Fab-IL2qm-Fab组合温育后,ADCC期间通过PBMC的IFN-γ释放。将A549细胞用作靶细胞(E:T=5:1,21小时;见实施例8)。
图10。在与不同浓度的IL-2(阿地白介素)、28H1Fab-IL2-Fab或28H1Fab-IL2qm-Fab温育后,对A549肿瘤细胞的不依赖于抗体的杀伤期间通过PBMC的IFN-γ释放(E:T=5:1,21小时;见实施例8)。
发明详述
在第一个方面,本发明提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用于治疗有此需要的个体中的疾病。
本发明还提供治疗个体中疾病的方法,包括对所述个体以治疗有效量施用(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合。
本发明还提供刺激个体中效应器细胞功能的方法,其包括对所述个体以能有效刺激效应器细胞功能的量施用(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合。
定义
除非在下文另外定义,术语在本文中的使用如本领域中一般使用的。
如本文中使用的,术语“免疫缀合物”指包含至少一个效应器模块和至少一个抗原结合模块的多肽分子。在某些实施方案中,所述免疫缀合物包含至少一个效应器模块和至少两个抗原结合模块。依照本发明的具体的免疫缀合物基本由通过一种或多种接头序列连接的一个效应器模块和两个抗原结合模块组成。可以通过如本文中描述的多种相互作用并以多种配置将抗原结合模块连接至效应器模块。
如本文中使用的,术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施方案中,抗原结合模块能指导其附接的实体(例如效应器模块或第二抗原结合模块)到达靶位点,例如到达特定类型的肿瘤细胞或携有抗原决定簇的肿瘤间质。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。特定的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中,抗原结合模块可以包含抗体恒定区,如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任意一种:α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括任意以下2种同种型中的任意一种:κ和λ。
如本文中使用的,术语“对照抗原结合模块”指如无其他抗原结合模块和效应器模块而存在的一种抗原结合模块。例如,当将本发明的Fab-IL2-Fab免疫缀合物与对照抗原结合模块比较时,对照抗原结合模块是游离的Fab,其中该Fab-IL2-Fab免疫缀合物和游离的Fab分子均能特异性结合相同的抗原决定簇。
如本文中使用的,术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义,并且指抗原结合模块与之结合从而形成抗原结合模块-抗原复合物的多肽大分子上的位点(例如氨基酸的连续区段或由不同的非连续氨基酸区构成的构象配置)。可用的抗原决定簇可见于例如,肿瘤细胞表面上、病毒感染的细胞的表面上、其它患病细胞的表面上、游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中。
“特异性结合”意指此结合对于抗原是选择性的,并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特异性抗原决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术,例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000)),以及传统的结合测定法来测量(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。
术语“抗[抗原]抗体”和“结合[抗原]的抗体”指能够以充足的亲和力结合相应抗原的抗体,从而可以将该抗体在靶向抗原中用作诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中,抗[抗原]抗体对不相关蛋白质的结合程度低于该抗体对抗原的结合的约10%,如例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中,结合[抗原]的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。理解上文定义还适用于结合抗原的抗原结合模块。
如本文中使用的,使用关于抗原结合模块等的术语“第一”和“第二”以便于区分有超过一个的每种模块类型的情况。除非明确地如此陈述,这些术语的使用不意图赋予免疫缀合物的特定次序或取向。
如本文中使用的,术语“效应器模块”指例如经由信号转导或其它细胞途径影响细胞活性的多肽,例如蛋白质或糖蛋白。因此,本发明的效应器模块可以与从细胞膜外传递信号的受体介导的信号传导联合,从而调控具有一种或多种针对该效应器模块的受体的细胞中的应答。在一个实施方案中,效应器模块能引发具有一种或多种针对该效应器模块的受体的细胞中的细胞毒性应答。在另一个实施方案中,效应器模块能引发具有一种或多种针对该效应器模块的受体的细胞中的增殖性应答。在另一个实施方案中,效应器模块能引发具有针对该效应器模块的受体的细胞中的分化。在另一个实施方案中,效应器模块能改变具有针对该效应器模块的受体的细胞中内源性细胞蛋白质的表达(即上调或下调)。效应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。效应器模块可与抗原结合模块以多种配置联合从而形成免疫缀合物。
如本文中使用的,术语“细胞因子”指介导和/或调节生物学或细胞功能或过程(例如免疫、炎症和造血作用(hematopoiesis))的分子。术语“细胞因子”用于本文包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单核因子”和“白介素”。有用的细胞因子的例子包括但不限于GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。特定的细胞因子是IL-2和IL-12。术语“细胞因子”用于本文还意为包括细胞因子类似物,其在相应的野生型细胞因子的氨基酸序列中包含一处或多处氨基酸突变,如例如记载于Sauvé等,ProcNatl Acad Sci USA88,4636-40(1991);Hu等,Blood101,4853-4861(2003)和美国专利公开No.2003/0124678;Shanafelt等,Nature Biotechnol18,1197-1202(2000);Heaton等,Cancer Res53,2597-602(1993)和美国专利No.5,229,109;美国专利公开No.2007/0036752;WO2008/0034473;WO2009/061853;或本文上下文的IL-2类似物。
如本文中使用的,术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在一个实施方案中,效应器模块是单链效应器模块。单链效应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。当效应器模块是细胞因子且感兴趣的细胞因子通常天然发现为多聚体时,此多聚体细胞因子的每个亚基由效应器模块的单链连续编码。因此,可用的单链效应器模块的非限制性例子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。
如本文中使用的,术语“对照效应器模块”指未缀合的效应器模块。例如,当将如本文中描述的IL-2免疫缀合物与对照效应器模块比较时,该对照效应器模块是游离的、未缀合的IL-2。类似地,例如当将IL-12免疫缀合物与对照效应器模块比较时,该对照效应器模块是游离的、未缀合的IL-12(例如作为异型二聚体蛋白质存在,其中p40和p35亚基仅共有二硫键)。
如本文中使用的,术语“效应器模块受体”指能特异性结合效应器模块的多肽分子。例如,当IL-2是效应器模块时,结合IL-2分子(例如包含IL-2的免疫缀合物)的效应器模块是IL-2受体。类似地,例如当IL-12是免疫缀合物的效应器模块时,效应器模块受体是IL-12受体。当一种效应器模块特异性结合超过一种受体时,所有特异性结合该效应器模块的受体均为该效应器模块的“效应器模块受体”。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,并且涵盖各种抗体结构,只要它们展现出期望的抗原结合活性且包含免疫球蛋白的Fc区或等同于Fc区的区域,所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用,指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。
“天然抗体”指天然存在的具有各种结构的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白,其由二硫键连接的两条等同的轻链和两条等同的重链构成。从N末端至C末端,每条重链具有可变区(VH,也称为可变重域或重链可变域),接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3,也称为重链恒定区)。类似地,从N末端至C末端,每条轻链具有可变区(VL,也称为可变轻域或轻链可变域),接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可以分成称为kappa(κ)和lambda(λ)的两型之一。
“抗体片段”指完整抗体以外的分子,其包含完整抗体的一部分,其中所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、单域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。对于某些抗体片段的综述,参见Hudson等,Nat Med9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);亦参见WO93/16185;和美国专利No.5,571,894和5,587,458。对包含抢救(salvage)受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的论述,参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的。参见,例如EP404,097;WO1993/01161;Hudson等,NatMed9,129-134(2003);和Hollinger等,Proc Natl Acad Sci USA90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat Med9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的重链可变域的所有或部分,或者抗体的轻链可变域的所有或部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段,包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生,如本文中描述的。
术语“抗原结合域”指包含特异性结合抗原的部分或全部并与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称为抗体可变区)提供。特定地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变域”指牵涉将抗体结合至抗原的抗体重链或轻链的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见,例如Kindt等,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的,术语“高变区”、“HVR”指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常,天然的四链抗体包含六个HVR;三个在VH中(H1、H2、H3),三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了VH中CDR1为例外以外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补性决定区”(CDR),并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)且由Chothia等,J MolBiol196:901-917(1987)描述,其中定义包括在彼此比较时的重叠的氨基酸残基或其子集。然而,应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的各参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列情况下,本领域技术人员能常规确定哪些残基包含特定CDR。
表1。CDR定义1
CDR | Kabat | Chothia | AbM2 |
VH CDR1 | 31-35 | 26-32 | 26-35 |
VH CDR2 | 50-65 | 52-58 | 50-58 |
VH CDR3 | 95-102 | 95-102 | 95-102 |
VL CDR1 | 24-34 | 26-32 | 24-34 |
VL CDR2 | 50-56 | 50-52 | 50-56 |
VL CDR3 | 89-97 | 91-96 | 89-97 |
1表1中所有CDR定义的编号均依照由Kabat等提出的编号惯例(见下文)。
2如表1中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还定义针对可变区序列的编号系统,其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员能够明确地将此“Kabat编号”系统分配到任何可变区序列,而无需依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文中使用的,“Kabat编号”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence ofProteins of Immunological Interest"(1983)提出的编号系统。除非另外说明,对抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号均依照Kabat编号系统。
序列表的多肽序列(即SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9等)并不依照Kabat编号系统编号。然而,本领域中普通技术人员完全能将序列表的序列编号转变成Kabat编号。
“框架”或“FR”指可变域残基中除高变区(HVR)残基以外的残基。可变域的FR一般由4个FR域组成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此,HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体的“类”指其重链具有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且其中数种可以进一步分成亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“Fc区”用于本文定义免疫球蛋白重链的C末端区域,其至少含有恒定区的一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以稍微变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自重链的Cys226或Pro230延伸至羧基末端。然而,可以存在或不存在Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)。除非另外在本文中指出,Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号依照EU编号系统(也称为EU指数),如记载于Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991的。
“等同于免疫球蛋白Fc区的区域”意图包括免疫球蛋白Fc区的天然存在的等位变体,以及具有产生取代、添加或缺失但基本不降低该免疫球蛋白介导效应器功能(如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)的能力的变更的变体。例如,可以从免疫球蛋白Fc区的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸,而没有生物学功能的实质性损失。可以依照本领域中已知的一般原则来选择这类变体以对活性具有最小的影响(参见,例如Bowie等,Science247,1306-10(1990))。
术语“效应器功能”在述及抗体时指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的由抗原呈现细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞激活。
如本文中使用的,术语“效应器细胞”指在其表面展现效应器模块受体例如细胞因子受体和/或Fc受体的淋巴细胞群体,经由该受体它们结合效应器模块例如细胞因子和/或抗体的Fc区,并有助于破坏靶细胞例如肿瘤细胞。效应器细胞可以例如介导细胞毒性或噬菌细胞性效应。效应器细胞包括但不限于,效应器T细胞如CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞、γδT细胞、NK细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。根据它们的受体表达模式,可以有不同的效应器细胞子集,即(a)表达针对特定效应器模块的受体但无Fc受体,且由本发明的免疫缀合物而非抗体刺激的细胞(例如表达IL-2受体的T细胞);(b)表达Fc受体但无针对特定效应器模块的受体,且由本发明的抗体而非免疫缀合物刺激的细胞;和(c)表达Fc受体和针对特定效应器模块的受体,并同时由本发明的抗体和免疫缀合物刺激的细胞(例如表达FcγIII受体和IL-2受体的NK细胞)。
如本文中使用的,术语“工程化、经工程化的”视为包括对肽主链的任意操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰,以及这些办法的组合。特定地具有前缀“糖-”的“工程化”以及术语“糖基化工程化”包括对细胞糖基化体系的代谢工程化,包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外,糖基化工程化包括突变和细胞环境对糖基化的作用。在一个实施方案中,糖基化工程化是糖基转移酶活性中的变更。在一个具体的实施方案中,工程化导致变更的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。糖基化工程化可以用于获得“具有提高的GnTIII活性的宿主细胞”(例如经过操作以表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)活性的多肽的宿主细胞),“具有提高的ManII活性的宿主细胞”(例如经过操作以表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽的宿主细胞),或“具有降低的α(1,6)岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞”(例如经过操作以表达降低水平的α(1,6)岩藻糖基转移酶的宿主细胞)。
如本文中使用的,术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任意组合来实现最终构建体,只要最终构建体拥有期望的属性,例如对Fc受体的降低的结合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基末端缺失和氨基酸插入。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如Fc区的结合属性,特别优选非保守性的氨基酸取代,即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过遗传工程化以外的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也是可用的。
关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数,包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而,就本文中目的而言,使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成%氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创建,并且源代码已与用户文档提交到美国版权局(U.S.CopyrightOffice),Washington D.C.,20559,其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得,或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作系统,包括digitalUNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下,给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或可称为给定的氨基酸序列A具有或包含对/与/相对给定的氨基酸序列B的特定%氨基酸序列同一性)如下计算:
100倍的分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在对A和B的程序比对中评为相同匹配的氨基酸残基数,而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是,当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时,A对B的%氨基酸序列同一性将不等于B对A的%氨基酸序列同一性。除非另外特定说明的,本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞,包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同,但可以含有突变。本文中包括具有与原始转化细胞中所筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变后代。宿主细胞是可用于生成用于本发明的抗体和免疫缀合物的任意类型的细胞系统。在一个实施方案中,将宿主细胞工程化为允许生成具有经修饰的寡糖的抗体。在某些实施方案中,已将宿主细胞操作为表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些实施方案中,还将宿主细胞操作为表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物的培养细胞如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞,或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等,而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
如本文中使用的,术语“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基以β-1,4连接添加到N-连接的寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽。这包括展现出的酶活性类似于但不需要等同于β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的融合多肽,依照国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB),β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III也称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶(EC2.4.1.144),如在特定的生物学测定法中测定的,有或无剂量依赖性。在确实存在剂量依赖性的情况中,其不需要与GnTIII的等同,而是相比于GnTIII基本类似于在给定活性中的剂量依赖性(即,候选多肽将展现出相对于GnTIII更高的活性或不低于超过约25倍,而且优选地不低于超过约10倍的活性,且最优选地,不低于超过约3倍的活性)。在某些实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是融合多肽,其包含GnTIII的催化域和异源高尔基(Golgi)居住多肽的高尔基定位域。特定地,高尔基定位域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位域,最特定地是甘露糖苷酶II的定位域。或者,高尔基定位域选自下组:甘露糖苷酶I的定位域、GnTII的定位域和α1,6核心岩藻糖基转移酶的定位域。用于生成这类融合多肽并使用它们来生成具有提高的效应器功能的抗体的方法在WO2004/065540、美国临时专利申请No.60/495,142和美国专利申请公开No.2004/0241817中披露,其完整内容通过提述明确并入本文。
如本文中使用的,术语“高尔基定位域”指高尔基居住多肽的氨基酸序列,其负责将多肽锚定到高尔基体内的位置。一般地,定位域包含酶的氨基末端“尾部”。
如本文中使用的,术语“具有ManII活性的多肽”指能够催化N-连接的寡糖的分支GlcNAcMan5GlcNAc2甘露糖中间物中末端1,3-和1,6-连接的α-D-甘露糖残基的水解的多肽。这包括展现出的酶活性类似于但不需要等同于高尔基体α-甘露糖苷酶II的活性的多肽,依照国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB),α-甘露糖苷酶II也称为甘露糖基寡糖1,3-1,6-α-甘露糖苷酶II(EC3.2.1.114)。
“激活Fc受体”是一种Fc受体,其在衔接抗体的Fc区之后,引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件。激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种通过免疫效应器细胞导致抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其片段特异性结合的细胞,该结合一般经由Fc区N末端的蛋白质部分。如本文中使用的,术语“提高/增加的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制,以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体,在给定的时间内裂解的靶细胞数目的增加,和/或通过ADCC机制,实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解所需要的靶细胞周围介质中抗体浓度中的降低。ADCC中的增加相对于由同一类型的宿主细胞生成的相同抗体所介导的ADCC,所述抗体使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(其为本领域技术人员已知的),但未经过工程化。例如,由通过本文中描述的方法工程化为具有改变的糖基化模式(例如表达糖基转移酶GnTIII或其它糖基转移酶)的宿主细胞生成的抗体所介导的ADCC的提高,是相对于由同一类型的未工程化宿主细胞生成的相同抗体所介导的ADCC。
“具有提高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体”意指一种具有提高的ADCC的抗体,如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的。一种接受的体外ADCC测定法如下:
1)该测定法使用已知表达由抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞;
2)该测定法使用人外周血单核细胞(PBMC)作为效应器细胞,其从随机选择的健康供体的血液分离;
3)该测定法依照以下方案实施:
i)使用标准的密度离心规程分离PBMC,并以5x106个细胞/ml重悬于RPMI细胞培养基中;
ii)通过标准的组织培养方法生长靶细胞,从存活大于90%的指数生长阶段收获,在RPMI细胞培养基中清洗,用100微居里51Cr标记,并用细胞培养基清洗2次,并以105个细胞/ml的密度重悬于细胞培养基中;
iii)将100微升的上文的最终靶细胞悬液转移至96孔微滴定板的每个孔中;
iv)在细胞培养基中将抗体从4000ng/ml系列稀释至0.04ng/ml,并将50微升的所得抗体溶液添加至96孔微滴定板中的靶细胞,以一式三份测试覆盖上文整个浓度范围的各种抗体浓度;
v)对于最大释放(MR)对照,在含有经标记靶细胞的板中3个另外的孔接受50微升非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的2%(V/V)水性溶液,而非抗体溶液(上文第iv点);
vi)对于自发性释放(SR)对照,在含有经标记靶细胞的板中3个另外的孔接受50微升RPMI细胞培养基而非抗体溶液(上文第iv点);
vii)然后将96孔微滴定板以50xg离心1分钟并在4℃温育1小时;
viii)将50微升PBMC悬液(上文第i点)添加至各孔以得到25:1的效应器:靶细胞比率,并将板在5%CO2空气下置于培养箱中于37℃达4小时;
ix)收获来自各孔的无细胞上清液,并使用γ计数器量化实验释放的放射性(ER);
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x100对每一抗体浓度计算特定裂解的百分比,其中ER是对该抗体浓度量化的平均放射性(见上文第ix点),MR是对MR对照(见上文第v点)量化的平均放射性(见上文第ix点),而SR是对SR对照(见上文第vi点)量化的平均放射性(见上文第ix点);
4)“提高/增加的ADCC”定义为在上文测试的抗体浓度范围内观察到的特定裂解的最大百分比中的增加,和/或实现上文测试的抗体浓度范围内观察到的特定裂解最大百分比的一半所需要的抗体浓度中的降低。ADCC中的增加相对于用上文测定法测量的、由相同抗体介导的ADCC,所述抗体由相同类型的宿主细胞生成,使用本领域技术人员已知的相同的标准生产、纯化、配制和储存方法,但未经过工程化。
如本文中使用的,“组合(combination)”(及其语法变体如“组合(combine或combining)”涵盖依照本发明的免疫缀合物和抗体的组合,其中免疫缀合物和抗体在相同或不同的容器中、在相同或不同的药学配制剂中,是一起或分开、同时或顺序以任何次序施用的,并由相同或不同的路径施用,只要该免疫缀合物和抗体能同时在体内施加其生物学影响,即同时刺激效应器细胞。例如,组合”依照本发明的免疫缀合物和抗体可以意指首先施用在特定药学配制剂中的免疫缀合物,接着施用在另一药学配制剂中的抗体,或者也可以反过来进行。
一种药剂的“有效量”指引起其所施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。
一种药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的一种药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。治疗有效量的数种活性成分的组合可以是治疗有效量的每一种活性成分。或者,为了降低由治疗导致的副作用,治疗有效量的数种活性成分的组合可以是有效产生加性、超加性(superadditive)或协作效应的各活性成分的量,并且其组合是治疗有效的,但当单独使用它们时可以低于一种或数种活性成分的治疗量。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于,驯养的动物(例如母牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特定地,所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的,且不含对会施用该配制物的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制备物。
“药学可接受的载体”指指药物配制物中活性成分以外的成分,其对受试者是无毒的。药学可接受的载体包括但不限于,缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的,“治疗/处理(treatment)”(及其语法变体如“治疗/处理(“treat”或“treating”))指试图改变所治疗个体中疾病的自然进程的临床干预,其可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于,预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中,本发明的组合用于延迟疾病的发生或延缓病症的发展。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书,其含有关于适应证、使用、剂量、施用、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这类治疗产品的警告。
免疫缀合物
可用于本发明的免疫缀合物是包含至少一个效应器模块和至少一个抗原结合模块的多肽分子。
可以通过将效应器模块化学缀合至抗原结合模块,或通过将效应器模块和抗原结合模块表达为融合蛋白来制备免疫缀合物(参见,例如Nakamura和Kubo,Cancer80,2650-2655(1997);和Becker等,Proc Natl Acad Sci USA93,7826-7831(1996))。对于本发明中的使用,一般优选表达为融合蛋白的免疫缀合物。因此,在某些实施方案中,效应器模块与抗原结合模块共有氨基或羧基末端肽键(即免疫缀合物是融合蛋白)。在这类免疫缀合物中,效应器模块可以例如融合至免疫球蛋白重链或轻链。特别可用于本发明的是包含抗体片段如Fab或scFv分子作为抗原结合模块的免疫缀合物。例示性抗体片段/细胞因子免疫缀合物记载于例如Savage等,Br J Cancer67,304-310(1993);Yang等,Mol.Immunol.32,873-881(1995);PCT公开WO2001/062298A2;美国专利No.5,650,150;PCT公开WO2006/119897A2;和PCT公开WO99/29732A2。
在一个实施方案中,效应器模块是单链效应器模块。在一个实施方案中,效应器模块是细胞因子。在一个实施方案中,免疫缀合物包含至少两个抗原结合模块。免疫缀合物的抗原结合模块和效应器模块包括那些在本文中上文和下文详细描述的。免疫缀合物的抗原结合模块可以针对多种靶分子(例如在肿瘤细胞或肿瘤间质上表达的蛋白质分子上的抗原决定簇)。本文中描述了抗原结合模块的非限制性例子。特别有用的如本文中描述的免疫缀合物展现出一种或多种以下特性:高作用特异性、降低的毒性和/或改进的稳定性,特别是相比于靶向相同的抗原决定簇且携带相同效应器模块的具有不同配置的免疫缀合物的。用于本发明的特定免疫缀合物还记载于PCT公开号WO2011/020783,其完整内容通过提述并入本文。
免疫缀合物形式
记载于PCT公开号WO2011/020783的免疫缀合物包含至少两个抗原结合域。如此,在一个实施方案中,免疫缀合物包含至少第一效应器模块以及至少第一和第二抗原结合模块。在一个实施方案中,第一效应器模块是单链效应器模块。在一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块独立地选自下组:scFv分子和Fab分子。在一个具体的实施方案中,第一和第二抗原结合模块的每一个是Fab分子。在另一个实施方案中,第一和第二抗原结合模块的每一个是scFv分子。在一个特定的实施方案中,第一效应器模块与第一抗原结合模块共有氨基或羧基末端肽键,而第二抗原结合模块与以下任一种共有氨基或羧基末端肽键:i)第一效应器模块或ii)第一抗原结合模块。在一个具体的实施方案中,免疫缀合物基本由第一单链效应器模块以及第一和第二抗原结合模块组成。在一个甚至更具体的实施方案中,第一和第二抗原结合模块中的每一个是Fab分子。
在一个实施方案中,第一效应器模块与第一抗原结合模块共有羧基末端肽键,并且还与第二抗原结合模块共有氨基末端肽键。在另一个实施方案中,第一抗原结合模块与第一效应器模块(特别是单链效应器模块)共有羧基末端肽键,并且还与第二抗原结合模块共有氨基末端肽键。在另一个实施方案中,第一抗原结合模块与第一效应器模块(特别是单链效应器模块)共有氨基末端肽键,并且还与第二抗原结合模块共有羧基末端肽键。
在一个实施方案中,效应器模块(特别是单链效应器模块)与第一重链可变区共有羧基末端肽键,并且还与第二重链可变区共有氨基末端肽键。在另一个实施方案中,效应器模块(特别是单链效应器模块)与第一轻链可变区共有羧基末端肽键,并且还与第二轻链可变区共有氨基末端肽键。在另一个实施方案中,第一重链或轻链可变区通过羧基末端肽键连接第一效应器模块(特别是单链效应器模块),并且还通过氨基末端肽键连接第二重链或轻链可变区。在另一个实施方案中,第一重链或轻链可变区通过氨基末端肽键连接第一效应器模块(特别是单链效应器模块),并且还通过羧基末端肽键连接第二重链或轻链可变区。
在一个具体的实施方案中,效应器模块(特别是单链效应器模块)与第一Fab重链或轻链共有羧基末端肽键,并且还与第二Fab重链或轻链共有氨基末端肽键。在另一个实施方案中,第一Fab重链或轻链与第一单链效应器模块共有羧基末端肽键,并且还与第二Fab重链或轻链共有氨基末端肽键。在其它实施方案中,第一Fab重链或轻链与第一单链效应器模块共有氨基末端肽键,并且还与第二Fab重链或轻链共有羧基末端肽键。
在一个实施方案中,免疫缀合物至少包含与一个或多个scFv分子共有氨基末端的第一效应器模块,而且其中第一效应器模块还与一个或多个scFv分子共有羧基末端肽键。在一个具体的实施方案中,效应器模块是单链效应器模块。
在另一个实施方案中,免疫缀合物包含至少第一效应器模块(特别是单链效应器模块)以及第一和第二抗原结合模块,其中每一个抗原结合模块包含在其羧基末端氨基酸处连接至包含免疫球蛋白恒定域的恒定区的scFv分子,而且其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基末端氨基酸处连接至第一效应器模块的氨基末端氨基酸,并且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。在一个具体的实施方案中,恒定区独立地选自下组:IgGCH1、IgG CH2、IgG CH3、IgG Cκ、IgG Cλ和IgE CH4域。在一个实施方案中,第一抗原结合模块的免疫球蛋白域经由二硫键共价连接至第二抗原结合模块的免疫球蛋白域。在一个实施方案中,至少一个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的羧基末端。在另一个实施方案中,至少一个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的氨基末端。在另一个实施方案中,至少两个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的氨基末端。
在一个特定的实施方案中,免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块,其各自包含在其羧基末端氨基酸处连接包含IgG CH1域的恒定区的scFv分子,其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基末端氨基酸处连接至第一效应器模块(特别是单链效应器模块)的氨基末端氨基酸,而且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。免疫缀合物的第二抗原结合模块还可以在其羧基末端氨基酸处连接至第二效应器模块的氨基末端氨基酸。在一个实施方案中,第二效应器模块是单链效应器模块。
在一个特定的实施方案中,免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块,其各自包含在其羧基末端氨基酸处连接包含IgG Cκ域的恒定区的scFv分子,其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基末端氨基酸处连接至第一效应器模块(特别是单链效应器模块)的氨基末端氨基酸,而且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。免疫缀合物的第二抗原结合模块还可以在其羧基末端氨基酸处连接至第二效应器模块的氨基末端氨基酸。在一个实施方案中,第二效应器模块是单链效应器模块。
在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块,其各自包含在其羧基末端氨基酸处连接包含IgE CH4域的恒定区的scFv分子,其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基末端氨基酸处连接至第一效应器模块(特别是单链效应器模块)的氨基末端氨基酸,而且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。免疫缀合物的第二抗原结合模块还可以在其羧基末端氨基酸处连接至第二效应器模块的氨基末端氨基酸。在一个实施方案中,第二效应器模块是单链效应器模块。
在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块,其各自包含在其羧基末端氨基酸处连接IgE CH3域的scFv分子,其中第一抗原结合模块在其羧基末端氨基酸处连接至第一效应器模块(特别是单链效应器模块)的氨基末端氨基酸,而且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。免疫缀合物的第二抗原结合模块还可以在其羧基末端氨基酸处连接至第二效应器模块的氨基末端氨基酸。在一个实施方案中,第二效应器模块是单链效应器模块。
在另一个实施方案中,免疫缀合物包含第一和第二效应器模块以及第一和第二抗原结合模块,其中每个抗原结合模块包含在其重链或轻链羧基末端氨基酸处连接至IgG1CH3域的Fab分子,而且其中每个IgG1CH3域在其相应的羧基末端氨基酸处连接至效应器模块之一的氨基末端氨基酸,并且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。在一个具体的实施方案中,第一和/或第二效应器模块是单链效应器模块。在一个别的实施方案中,抗原结合模块的IgG1CH3域可以由二硫键连接。在另一个实施方案中,至少一个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的IgG1CH3域的羧基末端。在另一个实施方案中,至少一个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的IgG1CH3域的氨基末端。在另一个实施方案中,至少两个二硫键位于第一和第二抗原结合模块的IgG1CH3域的氨基末端。
在一些实施方案中,免疫缀合物包含一个或多个位于效应器模块和抗原结合模块之间的蛋白水解切割位点。可以直接或经由本文中描述的或本领域中已知的各种接头来连接免疫缀合物的组分(例如抗原结合模块和/或效应器模块),所述接头尤其是包含一个或多个氨基酸(通常约2-20个氨基酸)的肽接头。合适的、非免疫原性的接头肽包括,例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n接头肽,其中n一般是介于1和10之间的数字,通常介于2和4之间。
抗原结合模块
本发明的免疫缀合物的抗原结合模块一般是结合特异性抗原决定簇并能指导其所附接的实体(例如效应器模块或第二抗原结合模块)到达靶位点,例如到达特定类型的肿瘤细胞或具有该抗原决定簇的肿瘤间质的多肽分子。免疫缀合物能结合例如在肿瘤细胞表面上、病毒感染的细胞表面上、其它患病细胞的表面上、游离于血液血清中和/或胞外基质(ECM)中的抗原决定簇。肿瘤抗原的非限制性例子包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环素(cyclophilin)b、结肠直肠有关的抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-zeta链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如MAGE-A1,MAGE-A2,MAGE-A3,MAGE-A4,MAGE-A5,MAGE-A6,MAGE-A7,MAGE-A8,MAGE-A9,MAGE-A10,MAGE-A11,MAGE-A12,MAGE-Xp2(MAGE-B2),MAGE-Xp3(MAGE-B3),MAGE-Xp4(MAGE-B4),MAGE-C1,MAGE-C2,MAGE-C3,MAGE-C4,MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如GAGE-1,GAGE-2,GAGE-3,GAGE-4,GAGE-5,GAGE-6,GAGE-7,GAGE-8,GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白(catenin)、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤样结肠息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein,APC)、胞衬蛋白(fodrin)、连接蛋白(Connexin)37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人乳头状瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、以及c-erbB-2。病毒抗原的非限制性例子包括流感病毒血凝素、Epstein-Barr病毒LMP-1、丙肝病毒E2糖蛋白、HIV gp160和HIV gp120。ECM抗原的非限制性例子包括多配体聚糖(syndecan)、类肝素酶(heparanase)、整联蛋白、骨桥蛋白(osteopontin)、link、钙粘蛋白、层粘连蛋白、EGF型层粘连蛋白、凝集素、纤连蛋白、notch、生腱蛋白和matrixin。本发明的免疫缀合物能结合细胞表面抗原的下列特定的非限制性例子:FAP、Her2、EGFR、IGF-1R、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR有关的异型多聚体)、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD25(IL-2受体α链)、CD30(细胞因子受体)、CD33(骨髓细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R(IL6受体)、CD20、MCSP、c-Met、含CUB域的蛋白1(CDCP1)和PDGFβR(β血小板衍生的生长因子受体)。
在某些实施方案中,抗原结合模块针对肿瘤细胞上呈现的或肿瘤细胞环境中的抗原。在一个特定的实施方案中,抗原结合模块针对选自下组的抗原:成纤维细胞活化蛋白(FAP)、生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纤连蛋白的外域B(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑色素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在一个实施方案中,本发明的免疫缀合物包含两个或更多个抗原结合模块,其中这些抗原结合模块的每一个特异性结合相同的抗原决定簇。在另一个实施方案中,本发明的免疫缀合物包含两个或更多个抗原结合模块,其中这些抗原结合模块的每一个特异性结合不同的抗原决定簇。
所述抗原结合模块可以是保留对抗原决定簇的特异性结合的任何类型的抗体或其片段。在一个实施方案中,抗原结合模块是抗体或抗体片段。抗体片段包括但不限于,VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗体、双抗体、三抗体和四抗体(参见例如Hudson和Souriau,Nature Med9,129-134(2003))。特别可用的抗体片段是Fab片段和scFv片段。因此,在一个实施方案中,抗原结合模块选自Fab分子和scFv分子。在一个实施方案中,抗原结合模块是Fab分子。在另一个实施方案中,抗原结合模块是scFv分子。
在一个实施方案中,免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个特异于纤连蛋白的外域B(EDB)的抗原结合模块。在另一个实施方案中,免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个能与单克隆抗体L19竞争对EDB表位的结合的抗原结合模块。参见,例如PCT公开WO2007/128563A1(通过提述完整并入本文)。在又一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中自L19单克隆抗体衍生的第一Fab重链与IL-2分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与自L19单克隆抗体衍生的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在再一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中自L19单克隆抗体衍生的第一Fab重链与IL-12分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与自L19单克隆抗体衍生的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在另一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中自L19单克隆抗体衍生的第一Fab重链与IFNα分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与自L19单克隆抗体衍生的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在再一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中自L19单克隆抗体衍生的第一Fab重链与GM-CSF分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与自L19单克隆抗体衍生的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在一个别的实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中自L19单克隆抗体衍生的第一scFv与IL-2分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与自L19单克隆抗体衍生的第二scFv共有羧基末端肽键。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物包含SEQ ID NO:91的多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个实施方案中,免疫缀合物包含自L19单克隆抗体衍生的Fab轻链。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:92至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在又一个实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:98至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在再一个实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:92至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:99至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在再一个实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:92至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:100至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在再一个实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:92至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:101至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在再一个实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:92至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,多肽例如通过二硫键共价连接。
在一个实施方案中,本发明的免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个特异于生腱蛋白的A1域(TNC-A1)的抗原结合模块。在另一个实施方案中,免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个能与单克隆抗体F16竞争对TNC-A1表位的结合的抗原结合模块。参见,例如PCT公开WO2007/128563A1(通过提述完整并入本文)。在一个实施方案中,免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个特异于生腱蛋白的A1和/或A4域(TNC-A1或TNC-A4或TNC-A1/A4)的抗原结合模块。在另一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于生腱蛋白的A1域的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFNα分子或GM-CSF分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于生腱蛋白的A1域的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在又一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于生腱蛋白的A1域的第一Fab重链与IL-2分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于生腱蛋白的A1域的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在一个别的实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于生腱蛋白的A1域的第一scFv与IL-2分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于生腱蛋白的A1域的第二scFv共有羧基末端肽键。在一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体,以及与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物包含与SEQ ID NO:95至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:105至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在又一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:115至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两条多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:115至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两条多肽序列或其保留有功能性的变体。
在一个实施方案中,免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个特异于生腱蛋白的A2域(TNC-A2)的抗原结合模块。在另一个实施方案中,所述免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于生腱蛋白的A2域的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFNα分子或GM-CSF分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于生腱蛋白的A2域的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在又一个实施方案中,所述免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于生腱蛋白的A2域的第一Fab重链与IL-2分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于生腱蛋白的A2域的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:73,SEQ IDNO:75,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:85。在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:74,SEQ IDNO:76,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:84。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79,SEQ IDNO:81,SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:85,并且包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:78,SEQID NO:80,SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:84。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:117,SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:122。在一个更特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119,并且包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:122。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:117以及SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:122至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列,或其保留有功能性的变体。在又一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:118以及SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的2种多肽序列,或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的2种多肽序列,或其保留有功能性的变体。
在一个实施方案中,免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个特异于成纤维细胞激活的蛋白质(FAP)的抗原结合模块。在另一个实施方案中,所述免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于FAP的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFNα分子或GM-CSF分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于FAP的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在又一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于FAP的第一Fab重链与IL-2分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于FAP的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在另一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于FAP的第一Fab重链与IL-12分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于FAP的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35,SEQ IDNO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:53,SEQ IDNO:55,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:69。在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:34,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:52,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:68。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ IDNO:15,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQ IDNO:33,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:49,SEQ IDNO:51,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:67和SEQ IDNO:69,而且包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:16,SEQ IDNO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:52,SEQ IDNO:54,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:68。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110和SEQID NO:111。在又一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:116。在一个更特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体:SEQ IDNO:103,SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108,而且包含与SEQ ID NO:113至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体:SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111,而且包含与SEQID NO:112至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在一个别的特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:114至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在又一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:116至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在再一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:113至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在又一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:112至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在再一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:112至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。在又一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ IDNO:111和SEQ ID NO:112至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的两种多肽序列或其保留有功能性的变体。
在一个实施方案中,免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个特异于黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)的抗原结合模块。在另一个实施方案中,所述免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于MCSP的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFNα分子或GM-CSF分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于MCSP的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在又一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于MCSP的第一Fab重链与IL-2分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于MCSP的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQID NO:87或SEQ ID NO:90的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体,而且包含与SEQID NO:87或SEQ ID NO:90的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:86的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列,而且包含与SEQ ID NO:87的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列。在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:88的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列,而且包含与SEQ ID NO:87的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:125至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列,或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:127至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列,或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ IDNO:123或SEQ ID NO:125至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体,而且包含与SEQ IDNO:124或SEQ ID NO:127至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:123至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体,而且包含与SEQ ID NO:124至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,本发明的免疫缀合物包含与SEQ ID NO:125至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体,而且包含与SEQ ID NO:124至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多肽序列或其保留有功能性的变体。
在一个实施方案中,免疫缀合物包含至少一个,通常两个或更多个特异于癌胚抗原(CEA)的抗原结合模块。在另一个实施方案中,所述免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于CEA的第一Fab重链与IL-2分子、IL-12分子、IFNα分子或GM-CSF分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于CEA的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在又一个实施方案中,免疫缀合物包含一种多肽序列,其中特异于CEA的第一Fab重链与IL-2分子共有羧基末端肽键,而后者相应地与特异于CEA的第二Fab重链共有羧基末端肽键。在一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:154的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体。在另一个特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:155的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体。在一个更特定的实施方案中,免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:154的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体,而且包含与SEQ ID NO:155的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留有功能性的变体。
本发明的抗原结合模块包括那些包含与SEQ ID NO3-127中列出的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的序列(包括其功能片段或其变体)的抗原结合模块。本发明还涵盖包含具有保守性氨基酸取代的SEQ ID NO3-127的序列的抗原结合模块。理解在SEQ ID NO91、93、94、95、96、102、103、104、105、106、108、109、110、111、117、118、119、123和125的序列中,人IL-2的序列(见SEQ ID NO:1)可由IL-2类似物(analogon),特别是本文中描述的突变体IL-2的序列(见SEQ ID NO:2)替换。
免疫缀合物的效应器模块
用于本发明的效应器模块一般是例如经由信号转导途径影响细胞活性的多肽。因此,可用于本发明的免疫缀合物效应器模块可以与从细胞膜外传递信号的受体介导的信号传导联合,从而调控细胞中的应答。例如,免疫缀合物的效应器模块可以是细胞因子。在一个具体的实施方案中,效应器模块是如本文中定义的单链效应器模块。在一个实施方案中,本发明免疫缀合物的一种或多种效应器模块(通常为单链效应器模块)是选自下组的细胞因子:IL-2、GM-CSF、IFN-α和IL-12。在一个实施方案中,效应器模块是IL-2。在另一个实施方案中,免疫缀合物的一种或多种单链效应器模块是选自下组的细胞因子:IL-8、MIP-1α、MIP-1β和TGF-β。
在一个实施方案中,免疫缀合物的效应器模块,特别是单链效应器模块,是IL-2。在一个特定的实施方案中,IL-2效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答:激活的T淋巴细胞中的增殖、激活的T淋巴细胞中的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、激活的B细胞中的增殖、激活的B细胞中的分化、天然杀伤(NK)细胞中的增殖、NK细胞中的分化、通过激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌、和NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)抗肿瘤细胞毒性。在某些实施方案中,IL-2效应器模块是包含至少一个氨基酸突变的突变体IL-2效应器模块,相比于未突变的IL-2效应器模块,该氨基酸突变降低或消除突变体IL-2效应器模块对IL-2受体α亚基(也称为CD25)的亲和力但保留该突变体IL-2效应器模块对中亲和力IL-2受体(由IL-2受体的β和γ亚基组成)的亲和力。在一个实施方案中,氨基酸突变是氨基酸取代。在一个特定的实施方案中,突变体IL-2效应器模块包含在选自对应于人IL-2残基42、45和72的位置的一个、两个或三个位置处的一个、两个或三个氨基酸取代。在一个更特定的实施方案中,突变体IL-2效应器模块包含在选自对应于人IL-2残基42、45和72的位置处的三个氨基酸取代。在一个甚至更特定的实施方案中,突变体IL-2效应器模块是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G的人IL-2。在一个实施方案中,突变体IL-2效应器模块另外在对应于人IL-2残基3的位置处包含氨基酸突变,其消除IL-2的O-糖基化位点。具体地,所述另外的氨基酸突变是由丙氨酸残基替换苏氨酸残基的氨基酸取代。包含氨基酸取代T3A、F42A、Y45A和L72G的四重突变体(QM)IL-2的序列显示于SEQ ID NO:2。合适的突变体IL-2分子更详细地记载于欧洲专利申请号EP11153964.9。
可用作免疫化合物中的效应器模块的突变体IL-2分子可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过缺失、取代、插入或修饰制备。遗传方法可以包括对编码DNA序列的位点专一性诱变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸变化能通过例如测序来验证。在此方面,天然IL-2的核苷酸序列已由Taniguchi等(Nature302,305-10(1983))描述,并且编码人IL-2的核酸可从公共保藏处如美国典型培养物保藏中心(Rockville MD)获得。人IL-2的例示性序列显示于SEQ ID NO:1。取代或插入可以涉及天然以及非天然的氨基酸残基。氨基酸修饰包括公知的化学修饰方法如添加或除去糖基化位点或碳水化合物附接等。
在一个实施方案中,免疫缀合物的效应器模块,特别是单链效应器模块,是GM-CSF。在一个特定的实施方案中,GM-CSF效应器模块能引发粒细胞、单核细胞或树突细胞中的增殖和/或分化。在一个实施方案中,免疫缀合物的效应器模块,特别是单链效应器模块,是IFN-α。在一个特定的实施方案中,IFN-α效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答:抑制受病毒感染的细胞中的病毒复制和上调主要组织相容性复合物I(MHC I)的表达。在另一个特定的实施方案中,IFN-α效应器模块能抑制肿瘤细胞中的增殖。在一个实施方案中,免疫缀合物的效应器模块,特别是单链效应器模块,是IL-12。在一个特定的实施方案中,IL-12效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答:NK细胞中的增殖、NK细胞中的分化、T细胞中的增殖和T细胞中的分化。在一个实施方案中,免疫缀合物的效应器模块,特别是单链效应器模块,是IL-8。在一个特定的实施方案中,IL-8效应器模块能引发嗜中性粒细胞中的趋化性。在一个实施方案中,免疫缀合物的效应器模块,特别是单链效应器模块,是MIP-1α。在一个特定的实施方案中,MIP-1α效应器模块能引发单核细胞和T淋巴细胞中的趋化性。在一个实施方案中,免疫缀合物的效应器模块,特别是单链效应器模块,是MIP-1β。在一个特定的实施方案中,MIP-1β效应器模块能引发单核细胞和T淋巴细胞中的趋化性。在一个实施方案中,免疫缀合物的效应器模块,特别是单链效应器模块,是TGF-β。在一个特定的实施方案中,TGF-β效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答:单核细胞中的趋化性、巨噬细胞中的趋化性、激活的巨噬细胞中IL-1表达的上调以及激活的B细胞中IgA表达的上调。
抗体
可用于本发明的抗体包括结合特定抗原决定簇例如特定肿瘤细胞抗原,且包含Fc区的抗体或抗体片段。在某些实施方案中,所述抗体针对肿瘤细胞上呈现的抗原。可用于本发明的抗体的特定靶抗原包括在肿瘤细胞表面表达的抗原,包括但不限于细胞表面受体如表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)和血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、二肽基肽酶IV(CD26、DPPIV)、FAP、HER2/neu、HER-3、E-钙粘蛋白、CD20、黑色素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、c-Met、含CUB域的蛋白-1(CDCP1)和鳞状细胞癌抗原(SCCA)。
在一个特定的实施方案中,所述抗体针对选自下组的抗原:CD20、表皮生长因子受体(EGFR)、HER2、HER3、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、癌胚抗原(CEA)、c-Mett、含CUB域的蛋白-1(CDCP1)和黑色素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。在一个实施方案中,所述抗体是针对选自下组的两种或更多种抗原的多特异性抗体:CD20、表皮生长因子受体(EGFR)、HER2、HER3、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、癌胚抗原(CEA)、c-Met、含CUB域的蛋白-1(CDCP1)和黑色素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
可用于本发明的特定抗CD20抗体是人源化的、IgG类II型抗CD20抗体,其具有鼠B-Ly1抗体的结合特异性(Poppema和Visser,Biotest Bulletin3,131-139(1987))。特别可用的是人源化的、IgG类II型抗CD20抗体,其包含:
a)在重链可变域中,SEQ ID NO:128的CDR1、SEQ ID NO:129的CDR2和SEQ ID NO:130的CDR3,以及
b)在轻链可变域中,SEQ ID NO:131的CDR1、SEQ ID NO:132的CDR2和SEQ ID NO:133的CDR3。
具体地,所述抗体的重链可变区框架(FR)FR1、FR2和FR3是由VH1_10人种系序列编码的人FR序列,所述抗体的重链可变区FR4是由JH4人种系序列编码的人FR序列,所述抗体的轻链可变区FR FR1、FR2和FR3是由VK_2_40人种系序列编码的人FR序列,而且所述抗体的轻链可变区FR4是由JK4人种系序列编码的人FR序列。
可用于本发明的一种更具体的抗CD20抗体包含SEQ ID NO:134的重链可变域和SEQ ID NO:135的轻链可变域。
这类抗CD20抗体记载于WO2005/044859,其通过提述完整并入本文。
可用于本发明的特定抗EGFR抗体是人源化的、IgG类抗体,其具有大鼠ICR62抗体的结合特异性(Modjtahedi等,Br J Cancer67,247-253(1993))。特别可用的是人源化的、IgG类抗EGFR抗体,其包含:
a)在重链可变域中,SEQ ID NO:136的CDR1、SEQ ID NO:137的CDR2和SEQ ID NO:138的CDR3,以及
b)在轻链可变域中,SEQ ID NO:139的CDR1、SEQ ID NO:140的CDR2和SEQ ID NO:141的CDR3。
可用于本发明的一种更具体的抗EGFR抗体包含SEQ ID NO:142的重链可变域和SEQ ID NO:143的轻链可变域。
这类抗EGFR抗体记载于WO2006/082515和WO2008/017963,其各自通过提述完整并入本文。
其它可用于本发明的合适的人源化IgG类抗EGFR抗体包括cetuximab/IMC-C225(记载于Goldstein等,Clin Cancer Res1,1311-1318(1995))、panitumumab/ABX-EGF(记载于Yang等,Cancer Res59,1236-1243(1999),Yang等,Critical Reviews inOncology/Hematology38,17-23(2001))、nimotuzumab/h-R3(记载于Mateo等,Immunotechnology3,71-81(1997);Crombet-Ramos等,Int JCancer101,567-575(2002),Boland&Bebb,Expert Opin Biol Ther9,1199-1206(2009))、matuzumab/EMD72000(记载于Bier等,Cancer ImmunolImmunother46,167-173(1998),Kim,Curr Opin Mol Ther6,96-103(2004))和zalutumumab/2F8(记载于Bleeker等,J Immunol173,4699-4707(2004),Lammerts van Bueren,PNAS105,6109-6114(2008))。
可用于本发明的特定的抗IGF-1R抗体记载于WO2005/005635和WO2008/077546(其各自的完整内容通过提述完整并入本文),并且抑制胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和胰岛素样生长因子-2(IGF-2)对胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的结合。
可用于本发明的抗IGF-1R抗体优选为单克隆抗体还有嵌合抗体(人恒定域)、人源化抗体,特别优选全人抗体。可用于本发明的特定的抗IGF-1R抗体与抗体18竞争结合人IGF-1R,即它们于抗体18结合相同的IGF-1R表位,其记载于WO2005/005635。具体的抗IGF-1R抗体的特征还在于对IGF-1R的亲和力为10-8M(KD)或更低,特别是约10-9至10-13M,而且优选地,显示出没有对胰岛素结合胰岛素受体的可检出的浓度依赖性抑制。
可用于本发明的特定抗IGF-1R抗体包含具有以下序列的互补性决定区(CDR):
a)包含SEQ ID NO:144或146的CDR1、CDR2和CDR3作为CDR的抗体重链;
b)包含SEQ ID NO:145或147的CDR1、CDR2和CDR3作为CDR的抗体轻链。
具体地,可用于本发明的抗IGF-1R抗体包含SEQ ID NO:41的抗体重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO:42的抗体轻链可变域氨基酸序列,或者SEQ ID NO:43的抗体重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO:44的抗体轻链可变域氨基酸序列。
可用于本发明的具体的抗IGF-1R抗体可从杂交瘤细胞系<IGF-1R>HUMAB-克隆18和<IGF-1R>HUMAB-克隆22获得,其保藏在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),Germany),分别的保藏号DSM ACC2587和DSM ACC2594下。
其它可用于本发明的合适的抗IGF-1R抗体为例如全人IgG1单抗cixutumumab/IMC-A12(记载于Burtrum等,Cancer Res63,8912-21(2003);Rowinsky等,Clin Cancer Res13,5549s-5555s(2007)、全人IgG1单抗AMG-479(记载于Beltran等,Mol Cancer Ther8,1095-1105(2009);Tolcher等,J ClinOncol27,5800-7(2009))、人源化IgG1单抗MK-0646/h7C10(记载于Goetsch等,Int J Cancer113,316-28(2005);Broussas等,Int J Cancer124,2281-93(2009);Hidalgo等,J Clin Oncol26,abstract3520(2008);Atzori等,J Clin Oncol26,abstract3519(2008))、人源化IgG1单抗AVE1642(记载于Descamps等,Br JCancer100,366-9(2009);Tolcher等,J Clin Oncol26,abstract3582(2008);Moreau等,Blood110,abstract1166(2007);Maloney等,Cancer Res63,5073-83(2003))、全人IgG2单抗figitumumab/CP-751,871(Cohen等,Clin Cancer Res11,2063-73(2005);Haluska等,Clin Cancer Res13,5834-40(2007);Lacy等,J ClinOncol26,3196-203(2008);Gualberto&Karp,Clin Lung Cancer10,273-80(2009)、全人IgG1单抗SCH-717454(记载于WO2008/076257或Kolb等,PediatrBlood Cancer50,1190-7(2008))、2.13.2.单抗(记载于US7,037,498(WO2002/053596))或全人IgG4单抗BIIB022。
可用于本发明的特定的抗CEA抗体是人源化的、IgG类抗体,其具有鼠PR1A3抗体的结合特异性(Richman和Bodmer,Int J Cancer39,317-328(1987))。特别可用的是人源化的、IgG类抗CEA抗体,包含:
a)在重链可变域中,SEQ ID NO:148的CDR1、SEQ ID NO:149的CDR2和SEQ ID NO:150的CDR3,以及
b)在轻链可变域中,SEQ ID NO:151的CDR1、SEQ ID NO:152的CDR2和SEQ ID NO:153的CDR3。
可用于本发明的一种更具体的抗CEA抗体包含SEQ ID NO:154的重链可变域和SEQ ID NO:155的轻链可变域。
这类抗CEA抗体记载于PCT公开号WO2011/023787,其通过提述完整并入本文。
可用于本发明的特定的抗HER3抗体是人源化的、IgG类抗体,如Mab205.10.1、Mab205.10.2和Mab205.10.3,特别是Mab205.10.2,其记载于PCT公开号WO2011/076683。
可用于本发明的特定的抗CDCP1抗体是自CUB4抗体(保藏号DSM ACC2551(DSMZ)衍生的人源化的、IgG类抗体,如记载于PCT公开号WO2011/023389的。
可用于本发明的例示性抗MCSP抗体记载于例如WO2006/100582。
在一个实施方案中,所述抗体是IgG类全长抗体。在一个具体的实施方案中,所述抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中,所述抗体包含人Fc区,更特定地人IgG Fc区,最特定地人IgG1Fc区。可用于本发明的抗体如上文描述的抗IGF-1R、抗EGFR和抗CD20抗体可以包含人Igγ-1重链恒定区,如在SEQID NO:156中列出的(即人IgG1亚类的抗体)。
将可用于本发明的抗体工程化为相比于未经工程化的抗体具有提高的效应器功能。在一个实施方案中,工程化为具有提高的效应器功能的抗体相比于相应的未经工程化的抗体具有提高至少2倍、至少10倍或甚至至少100倍的效应器功能。提高的效应器功能可以包括但不限于以下一种或多种:增加的Fc受体结合、增加的C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、增加的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、增加的细胞因子分泌、增加的免疫复合物介导的通过抗原呈现细胞的抗原摄取、增加的对NK细胞的结合、增加的对巨噬细胞的结合、增加的对单核细胞的结合、增加的对多形核细胞的结合、增加的诱导细胞凋亡的直接信号传导、增加的靶物结合的抗体的交联、增加的树突细胞成熟或增加的T细胞启动。
在一个实施方案中,提高的效应器功能选自下组一种或多种:增加的Fc受体结合、提高的CDC、提高的ADCC、提高的ADCP和增加的细胞因子分泌。在一个实施方案中,提高的效应器功能是对激活Fc受体的增加的结合。在一个这类实施方案中,对激活Fc受体的结合亲和力相比于相应的未经工程化的抗体提高至少2倍,特定地至少10倍。在一个特定的实施方案中,激活Fc受体选自下组FcγRIIIa、FcγRI和FcγRIIa。在一个实施方案中,激活Fc受体是FcγRIIIa。在另一个实施方案中,提高的效应器功能是提高的ADCC。在一个这类实施方案中,ADCC相比于相应的未经工程化的抗体提高至少10倍,特定地至少100倍。在另一个实施方案中,提高的效应器功能是对激活Fc受体的增加的结合和提高的ADCC。
可以通过本领域中已知的方法来测量增加的效应器功能。本文中描述了适合用于测量ADCC的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利No.5,500,362;Hellstrom等,Proc Natl Acad SciUSA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,Proc Natl Acad Sci USA82,1499-1502(1985);美国专利No.5,821,337;Bruggemann等,J Exp Med166,1351-1361(1987)。或者,可以采用非放射性的测定方法(参见,例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.MountainView,CA);和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。可用于这类测定法的效应器细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外地,可以体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,如在Clynes等,Proc Natl Acad Sci USA95,652-656(1998)中披露的。可以容易地测定对Fc受体的结合,例如通过ELISA或通过使用标准仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR),并且Fc受体如可以通过重组表达获得。依照一个具体的实施方案,通过表面等离振子共振使用T100仪(GE Healthcare)于25℃测量对激活Fc受体的结合亲和力。或者,可以使用已知表达一种或另一种特定Fc受体的细胞如表达FcγIIIa受体的NK细胞来评估抗体对Fc受体的结合亲和力。还可以实施C1q结合测定法来测定抗体能否结合C1q并因此具有CDC活性。参见,例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活,可以实施CDC测定法(参见,例如Gazzano-Santoro等,J Immunol Methods202,163(1996);Cragg等,Blood101,1045-1052(2003);以及Cragg和Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。
增加的效应器功能可能来自例如抗体Fc的糖工程化或在抗体Fc区中引入氨基酸突变。在一个实施方案中,通过在Fc区中引入一个或多个氨基酸突变将抗体工程化。在一个特定的实施方案中,氨基酸突变是氨基酸取代。在一个甚至更特定的实施方案中,氨基酸取代在Fc区的位置298、333和/或334处(对残基的EU编号)。别的合适的氨基酸突变记载于例如Shields等,J BiolChem9(2),6591-6604(2001);美国专利No.6,737,056;WO2004/063351和WO2004/099249。还可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变的Fc区。遗传方法可以包括对编码DNA序列的位点专一性诱变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸变化能通过例如测序来验证。
在另一个实施方案中,通过在Fc区中的糖基化修饰将抗体工程化。在一个特定的实施方案中,将抗体工程化为相比于未经工程化的抗体在Fc区中具有增加的无岩藻糖基化寡糖比例。抗体Fc区中增加的无岩藻糖基化寡糖比例导致该抗体具有增加的效应器功能,具体为提高的ADCC。
在一个更特定的实施方案中,抗体Fc区中至少约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%,优选至少约50%,更优选至少约70%的N-连接的寡糖是无岩藻糖基化的。无岩藻糖基化的寡糖可以是杂合或复合类型。
在另一个特定的实施方案中,将抗体工程化为相比于未经工程化的抗体在Fc区中具有增加的等分寡糖比例。在一个更特定的实施方案中,抗体Fc区中至少约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%,优选至少约50%,更优选至少约70%的N-连接的寡糖是等分的。等分的寡糖可以是杂合或复合类型。
在再一个特定的实施方案中,将抗体工程化为相比于未经工程化的抗体在Fc区中具有增加的等分的、无岩藻糖基化的寡糖比例。在一个更特定的实施方案中,抗体Fc区中至少约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%,优选至少约15%,更优选至少约25%、至少约35%或至少约50%的N-连接的寡糖是等分、无岩藻糖基化的。等分、无岩藻糖基化的寡糖可以是杂合或复合类型。
可以通过本领域中公知的方法来分析抗体Fc区中的寡糖结构,例如通过MALDI TOF质谱,如记载于Umana等,Nat Biotechnol17,176-180(1999)或Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006)的。无岩藻糖基化的寡糖百分比是缺少岩藻糖残基的寡糖相对于附接Asn297所有寡糖的量(例如复合、杂合和高甘露糖型结构),并通过MALDI TOF MS在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定。Asn297指位于Fc区中约297位(对Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基;然而,由于抗体中的微小序列变化,Asn297也可以位于297位上下游约±3个氨基酸,即介于294和300之间。类似地测定等分的,或等分无岩藻糖基化的寡糖的百分比。
在一个实施方案中,将抗体工程化为如相比于未经工程化的抗体的在Fc区中具有经修饰的糖基化,其通过在具有改变的一种或多种糖基转移酶活性的宿主细胞中生成该抗体。糖基转移酶包括β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)、β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶I(GnTI)、β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶II(GnTII)和α(1,6)-岩藻糖基转移酶。在一个特定的实施方案中,将抗体工程化为如相比于未经工程化的抗体的在Fc区中具有增加的无岩藻糖基化的寡糖比例,其通过在具有增加的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)活性的宿主细胞中生成该抗体。在一个甚至更特定的实施方案中,宿主细胞另外具有增加的α-甘露糖苷酶II(ManII)活性。可用于工程化在本发明中有用的抗体的糖工程化方法学已详细记载于Umana等,NatBiotechnol17,176-180(1999);Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006);WO99/54342(美国专利No.6,602,684;EP1071700);WO2004/065540(美国专利申请公开No.2004/0241817;EP1587921),WO03/011878(美国专利申请公开No.2003/0175884),其各自完整内容通过提述完整并入本文。使用此方法学糖工程化的抗体在本文中称为GlycoMab。
一般地,可以使用任意类型的培养的细胞系(包括在本文中论述的细胞系)来生成用于生产具有改变的糖基化模式的抗TNC A2抗体的细胞系。具体的细胞系包括CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、或杂交瘤细胞或其它哺乳动物细胞。在某些实施方案中,宿主细胞已操作为表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些实施方案中,宿主细胞还已操作为表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。在一个特定的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是融合多肽,其包含GnTIII的催化域和异源高尔基居住多肽的高尔基定位域。具体地,所述高尔基定位域是甘露糖苷酶II的高尔基定位域。用于生成这类融合多肽以及使用它们来生成具有增加的效应器功能的抗体的方法公开在Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006)和WO2004/065540中,其完整内容通过提述明确并入本文。
可以鉴定含有可用于本发明的抗体的编码序列和/或具有糖基转移酶活性多肽的编码序列,并且表达生物学活性基因产物的宿主细胞,例如通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交;存在或缺乏“标志”基因功能;评估转录水平,如通过宿主细胞中相应mRNA转录本的表达测量的;或检测基因产物,如通过免疫测定法或通过其生物学活性测量的,所述方法是本领域中公知的。能例如通过采用分别结合GnTIII或ManII的生物合成产物的凝集素来检测GnTIII或Man II活性。这类凝集素的一个例子是E4-PHA凝集素,其优先结合含有等分GlcNAc的寡糖。还能检测具有GnTIII或ManII活性的多肽的生物合成产物(即特定的寡糖结构),其通过对从糖蛋白释放的寡糖的质谱分析,所述糖蛋白是由表达所述多肽的细胞生成的。或者,可以使用测量由抗体介导的增加的效应器功能(例如增加的Fc受体结合)的功能测定法,所述抗体是由工程化为具有有GnTIII或ManII活性的多肽所生成的。
在另一个实施方案中,将抗体工程化为如相比于未经工程化的抗体的在Fc区中具有增加的无岩藻糖基化的寡糖比例,其通过在具有降低的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中生成该抗体。具有降低的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞可以是其中α(1,6)-岩藻糖基转移酶基因已被破坏或失活(例如敲除)的细胞(参见Yamane-Ohnuki等,Biotech Bioeng87,614(2004);Kanda等,Biotechnol Bioeng,94(4),680-688(2006);Niwa等,J ImmunolMethods306,151-160(2006))。
能够生成去岩藻糖基化抗体的细胞系的其它例子包括在蛋白质岩藻糖基化种缺陷性的Lec13CHO细胞(Ripka等,Arch Biochem Biophys249,533-545(1986);美国专利申请No.US2003/0157108;和WO2004/056312,尤其在实施例11)。或者,可以将可用于本发明的抗体糖工程化为在Fc区中有减少的岩藻糖残基,其依照在EP1176195A1、WO03/084570、WO03/085119和美国专利申请公开No.2003/0115614、2004/093621、2004/110282、2004/110704、2004/132140、美国专利No.6,946,292(Kyowa)中公开的技术,例如通过减小或消除用于抗体生成的宿主细胞中GDP-岩藻糖运输蛋白的活性。
可用于本发明的糖工程化的抗体还可以在生成经修饰的糖蛋白的表达系统中生成,如在WO03/056914(GlycoFi,Inc.)或WO2004/057002和WO2004/024927(Greenovation)中教导的那些。
重组方法
生成可用于本发明的抗体和免疫缀合物的方法是本领域中公知的,并且记载于例如WO2011/020783,WO2005/044859,WO2006/082515,WO2008/017963,WO2005/005635,WO2008/077546,WO2011/023787,WO2011/076683,WO2011/023389和WO2006/100582。生成多克隆抗体和单克隆抗体的确立方法还记载于,例如Harlow和Lane,"Antibodies,a laboratorymanual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988。
非天然存在的抗体或其片段可以使用固相肽合成构建、可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。免疫缀合物、抗原结合模块以及生成它们的方法还详细记载于PCT公开no.WO2011/020783,其完整内容通过提述并入本文。对于可用于本发明的免疫缀合物和抗体的重组生成,分离一种或多种编码所述免疫缀合物或抗体的多核苷酸,并将其插入到一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以容易地分离这类多核苷酸并使用常规规程测序。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体或免疫缀合物的编码序列连同适宜的转录/反应控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见,例如记载于Maniatis等,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);和Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。
可用于本发明的免疫缀合物可以从编码完整免疫缀合物的单一多核苷酸表达,或从多个(例如两个或更多个)共表达的多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性免疫缀合物。例如,抗原结合模块的重链部分可由与包含抗原结合模块轻链部分和效应器模块的免疫缀合物部分分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽将与轻链多肽联合以形成抗原结合模块。或者,在另一个例子中,抗原结合模块的轻链部分可由与包含抗原结合模块重链部分和效应器模块的免疫缀合物部分分开的多核苷酸编码。
适用于复制并支持重组蛋白质表达的宿主细胞是本领域中公知的。如适当地,可用特定的表达载体转染或转导这类细胞,并且可以生长大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐,从而获得充足量的蛋白质例如用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌,或各种真核生物细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如,可以在细菌中生成重组蛋白质,尤其在不需要糖基化时。在表达后,可以在可溶性级分中将蛋白质从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外,真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码蛋白质的载体的克隆或表达宿主,其中包括糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株,这导致生成具有部分或完全的人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech22,1409-1414(2004),和Li等,NatBiotech24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)蛋白质的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞连同使用的大量杆状病毒株,特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177;6,040,498;6,420,548;7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如,适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7);人胚胎肾系(293或293T细胞,如例如记载于Graham等,J Gen Virol36,59(1977))、幼仑鼠肾细胞(BHK)、小鼠sertoli细胞(TM4细胞,如例如记载于Mather,Biol Reprod23,243-251(1980))、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK),buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather等,Annals N.Y.Acad Sci383,44-68(1982))、MRC5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr- CHO细胞(Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980));和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物的培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等,但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核生物细胞,优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
如果所述抗体和免疫缀合物意图用于人,那么可以使用嵌合形式的抗体或抗原结合模块,其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体或抗原结合模块(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现,包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上,保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基),(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR;对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上,或(c)移植完整的非人可变域,但通过替换表面残基用类人区段来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front Biosci13,1619-1633(2008),并且还记载于例如Riechmann等,Nature332,323-329(1988);Queen等,ProcNatl Acad Sci USA86,10029-10033(1989);美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409;Jones等,Nature321,522-525(1986);Morrison等,Proc Natl Acad Sci81,6851-6855(1984);Morrison和Oi,AdvImmunol44,65-92(1988);Verhoeyen等,Science239,1534-1536(1988);Padlan,Molec Immun31(3),169-217(1994);Kashmiri等,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接);Padlan,Mol Immunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”);Dall’Acqua等,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”);和Osbourn等,Methods36,61-68(2005)以及Klimka等,Br J Cancer83,252-260(2000)(描述对FR改组的“指导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分且自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区,所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等,于Methods in Molecular Biology178,1-37(O’Brien等,ed.,人Press,Totowa,NJ,2001);和McCafferty等,Nature348,552-554;Clackson等,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段,作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。
在某些实施方案中,将可用于本发明的抗体或抗原结合模块工程化为具有增强的结合亲和力,其依照例如公开于美国专利申请公开No.2004/0132066的方法,其完整内容通过提述据此并入。能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量可用于本发明的抗体或抗原结合模块结合特异性抗原决定簇的能力,所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的制备的抗体和免疫缀合物,所述技术如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素如净电荷、疏水性、亲水性等,而且对于本领域中的技术人员将是明显的。
药物组合物
在另一个方面,本发明提供在药学可接受的载体中包含(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,和(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的药物组合物。这些药物组合物可用于例如下文描述的任一种治疗方法。
具有如本文中描述的提高的效应器功能的免疫缀合物和抗体的药物组合物通过将这类免疫缀合物和具有期望纯化程度的抗体与一种或多种任选的药学可接受载体混合以冻干制剂或水性溶液的形式制备(Remington’sPharmaceutical Sciences18th edition,Mack Printing Company(1990))。药学可接受的载体在采用的剂量和浓度对于接受者一般是无毒性的,并且包括但不限于:缓冲物如磷酸、柠檬酸和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲双铵(hexamethonium chloride);氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride);氯化苄乙铵(benzethonium chloride);酚、丁醇或苯甲醇;烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(低于约10个残基)多肽;蛋白质,如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白;亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂如EDTA;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇;形成盐的反荷离子如钠;金属复合物(例如Zn-蛋白复合物);和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体还包括间质(insterstitial)药物分散剂如可溶的中性活性的(neutral-active)透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGPs及使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968。在一个方面,sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)如软骨素酶组合。
例示性的冻干配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的,后一配制剂包含组氨酸-醋酸盐缓冲液。
本文中的药物组合物还可以含有如对于所治疗的特定适应证需要的另外的活性成分,,尤其是那些具有彼此没有不利影响的互补活性的那些活性成分。例如,如果要治疗的疾病是癌症,那么可能期望进一步提供一种或多种抗癌剂,例如化疗剂、肿瘤细胞增殖的抑制剂或肿瘤细胞凋亡的激活剂。这类活性成分以对所意图目的有效的量适宜地以组合存在。
可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合作用将活性成分俘获在制备的微胶囊中,例如在胶质投递系统(例如脂质体、清蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中分别的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸酯)微胶囊。这类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences(18thEd.Mack Printing Company,1990)。
可以制备持续释放的制备物。合适的持续释放的制备物的例子包括含抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质,该基质以成形制品例如膜或微胶囊的形式。
要用于体内施用的组合物一般是无菌的。可以容易地实现无菌性,例如通过经由过滤膜过滤。
治疗方法
可以将本文中提供的(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用于治疗方法。
在一个方面,提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用作药物。在别的方面,提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用于治疗疾病。在某些实施方案中,提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用于治疗方法。在某些实施方案中,本发明提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用于治疗患病个体的方法,包括对个体施用治疗有效量的该组合。在一个这类实施方案中,所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如如下文描述的。在别的实施方案中,本发明提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用于刺激效应器细胞功能。在某些实施方案中,本发明提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体用于刺激个体中的效应器细胞功能,包括对个体施用有效量的组合以刺激效应器细胞功能。依照上文任一实施方案的“个体”是哺乳动物,特别是人。依照上文任一实施方案的“疾病”是可通过刺激效应器细胞功能治疗的疾病。在某些实施方案中,所述疾病是细胞增殖病症,特别是癌症。
在一个别的方面,本发明提供(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合用于制造或制备药物的用途。在一个实施方案中,所述药物用于治疗疾病。在一个别的实施方案中,所述药物用于治疗疾病的方法,其包括对患病个体施用治疗有效量的该药物。在一个这类实施方案中,所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如如下文描述的。在一个别的实施方案中,所述药物用于刺激效应器细胞功能。在一个别的实施方案中,所述药物用于刺激个体中的效应器细胞功能的方法,其包括对个体施用有效刺激效应器细胞功能的量的该药物。依照上文任一实施方案的“个体”是哺乳动物,特别是人。依照上文任一实施方案的“疾病”是可通过刺激效应器细胞功能治疗的疾病。在某些实施方案中,所述疾病是细胞增殖病症,特别是癌症。
在一个别的方面,本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中,所述方法包括对患有这类疾病的个体施用治疗有效量的(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合。在一个这类实施方案中,所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种两外的治疗剂,如下文描述的。依照上文任一实施方案的“个体”是哺乳动物,特别是人。依照上文任一实施方案的“疾病”是可通过刺激效应器细胞功能治疗的疾病。在某些实施方案中,所述疾病是细胞增殖病症,特别是癌症。
在一个别的方面,本发明提供用于刺激个体中的效应器细胞功能的方法。在一个实施方案中,所述方法包括对个体施用有效量的(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合以刺激效应器功能。在一个实施方案中,个体是哺乳动物,特别是人。
在一个别的方面,本发明提供提供药物组合物用于任一种上文的治疗方法,所述药物组合物包含任一种本文中提供的(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合。在一个实施方案中,药物组合物包含本文中提供的(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物与(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体的组合以及药学可接受的载体。在另一个实施方案中,药物组合物包含任一种本文中提供的组合和至少一种另外的治疗剂,例如如下文描述的。
依照任一个上文实施方案,所述疾病是可通过刺激效应器细胞功能治疗的病症。本发明的组合可用于治疗其中刺激宿主的免疫系统有益的疾病情形,特别是其中期望增强的细胞免疫应答的状况。这些可以包括其中宿主免疫应答不足或缺陷性的疾病情形。可以施用本发明的组合的疾病情形包括,例如其中细胞免疫应答将是特异性免疫的关键机制的肿瘤或感染。可以采用本发明的组合的特定疾病情形包括癌症,特定地是肾细胞癌或黑色素瘤;免疫缺陷,特定地在HIV阳性患者、免疫受抑制的患者中,慢性感染等。在某些实施方案中,所述疾病是细胞增殖病症。在一个具体的实施方案中,所述疾病是癌症,特定地是选自下组的癌症:肺癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、头和颈癌、卵巢癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌。
本发明的组合在疗法中可以单独施用或与其它药剂一起施用。例如,本发明的组合可以与至少一种另外的治疗剂共施用。在某些实施方案中,另外的治疗剂是抗癌剂,例如化疗剂、肿瘤细胞增殖的抑制剂或肿瘤细胞凋亡的激活剂。
如本文中提供的组合疗法涵盖一起(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或分开的配制剂中)和分开地施用抗体和免疫缀合物,在分开的情况中,抗体的施用可以在免疫缀合物、另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时和/或之后发生。本发明的组合还可以与放射疗法组合。
本发明的组合(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的路径施用,包括胃肠外、肺内和鼻内,以及损伤内施用(若期望局部治疗的话)。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过相同或不同的路径施用抗体和免疫缀合物。可以通过任何合适的路径给药,例如通过注射如静脉内或皮下注射,其部分取决于施用是简短的还是长期的。各种给药时间安排包括但不限于在各时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
将以与优良医学实践一致的方式配制、给药和施用本发明的组合。在此背景中考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的投递位点、施用方法、施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。不需要但任选地将所述组合与一种或多种目前用于预防或治疗所论述病症的药剂一起配制。有效量的这类其它药剂取决于配制剂中存在的抗体和免疫缀合物的量、病症或治疗类型、以及上文论述的其他因素。这些一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径使用,或以约1至99%的本文中描述的剂量,或以经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。
为了预防或治疗疾病,抗体和免疫缀合物的合适剂量(当用在本发明的组合中时,任选地与一种或多种其它另外的治疗剂一起)将取决于待治疗疾病的类型、抗体和免疫缀合物的类型、疾病的严重程度和进程、施用组合是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体和/或免疫缀合物的响应、以及主治医师的判断。一次性或在一系列治疗中将抗体和免疫缀合物适宜地施用给患者。
根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于对患者施用的起始候选剂量,不管是例如通过一次或多次分开的施用还是通过连续输注。根据上文提到的因素,一种典型的每日剂量可能从约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于在数天或更长时间的重复施用,根据状况,一般将持续治疗直至发生对疾病症状的期望的抑制。抗体的一种例示性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。如此,可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用这类剂量,例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20、或例如约6剂的抗体)。可以施用起始较高的加载剂量继之以一剂或多剂较低剂量。例示性给药方案包括施用约4mg/kg的起始加载剂量,接着是约2mg/kg抗体的每周维持剂量。关于剂量的相同考虑也适用于要在依照本发明的组合中使用的免疫缀合物。然而,其它剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定法容易地监测此疗法的进展。
制品
在本发明的另一个方面,提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。所述制品包含一个或多个容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括,例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合物,其自身或与其它组合物组合对于治疗、预防和/或诊断状况是有效的,并且可以具有无菌的存取口(例如,容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是要用在本发明的组合中的抗体。另一种活性药剂是要用在本发明的组合中的免疫缀合物,其可以和抗体在同一种组合物和容器中,或可以以不同的组合物和容器提供。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选定的状况。
在一个方面,本发明提供意图用于治疗疾病的试剂盒,其在相同或分开的容器中包含(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,和(b)工程化为具有增加的效应器功能的抗体,以及任选地还包含(c)包含印刷说明书的包装插页,其指导将所述组合治疗用作治疗疾病的方法。此外,该试剂盒可以包含(a)其中含有组合物的第一容器,其中所述组合物包含工程化为具有增加的效应器功能的抗体;(b)其中含有组合物的第二容器,其中所述组合物包括包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物;以及任选地(c)其中含有组合物的第三容器,其中所述组合物包括另外的细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明的该实施方案中的试剂盒还可以包含包装插页,其指示该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外地,所述试剂盒还可以包含第三(或第四)容器,其包含药学可接受的缓冲液,如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料,包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解给定上文提供的一般性描述,可以实践各种其他实施方案。
通用方法
对抗体Fc区的糖工程化产生对人FcγRIII受体的增加的结合亲和力,其相应地转化成增强的ADCC诱导和抗肿瘤功效。人FcγRIII受体在巨噬细胞、嗜中性粒细胞和天然杀伤细胞(NK)、树突细胞和γδT细胞上表达。在小鼠(最广泛用于临床前功效测试的物种)中,鼠FcγRIV(人FcγRIIIa的鼠同源物)存在于巨噬细胞和嗜中性粒细胞上但不存在于NK细胞上。因此,在那些模型中未反映出使用糖工程化抗体的全部程度的任何预期改进功效。我们已生成针对人FcγRIIIa(CD16a)转基因的小鼠,其在血液、淋巴组织和肿瘤中的鼠NK细胞上展现出稳定的人CD16a表达。此外,在这些转基因小鼠血液中的未受刺激的NK细胞上的人CD16a表达水平反映在人中发现的表达水平。我们还显示,抗体治疗后肿瘤有关的NK细胞上人FcγRIIIa的下调与抗肿瘤活性相关。最后,我们显示在使用此新的小鼠株系的肿瘤模型中糖工程化抗体治疗的显著改进的功效,如相比于使用它们的人CD16阴性的同窝出生者的。
实施例1
A549肺异种移植模型
在人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549中测试TNC A2靶向性2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物(SEQ ID NO117和120)和抗EGFR GlycoMab(SEQID NOs142和143),将其i.v.注射到SCID-人FcγRIII(hCD16)转基因小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于生腱蛋白C的A2域是阳性的。A549NSCLC细胞最初从ATCC(CCL-185)获得,并在扩大后保藏于Glycart内部细胞库。在含有10%FCS(Gibco)的DMEM中,于37℃水饱和的空气中以5%CO2常规培养该肿瘤细胞系。将第8代用于移植,其存活为98%。将200μl Aim V细胞培养基(Gibco)中的每动物5x106个细胞i.v.注射到尾静脉中。将实验开始时8-9周龄的雌性SCID-FcγRIII小鼠(产于RCC,Switzerland)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P2008016)。在到达后,将动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期实施连续的健康监测。在研究日0,用5x106个A549细胞i.v.注射小鼠,随机化并称重。在肿瘤细胞注射后1周,用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次i.v.注射小鼠达3周、用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周、或用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次达3周和用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周的组合。所有小鼠均用200μl适当溶液i.v.注射。剂量在表2中指定。用PBS注射媒介物组中的小鼠,并用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFRGlycoMab或2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合注射治疗组。为了获得每200μl适当量的免疫缀合物,在必要时将储液用PBS稀释。图1显示,2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合在hCD16转基因SCID小鼠中介导更好的功效,其产生相比于单独的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab协作性增强的中值和总体存活。
表2
实施例2
LS174T结直肠异种移植模型
在人结直肠LS174T细胞系中测试TNC A2靶向性2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab,将其脾内注射到SCID小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于生腱蛋白C的A2域是阳性的。LS174T细胞(人结肠癌细胞)最初从ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心,EuropeanCollection of Cell Culture)获得,并在扩大后保藏于Glycart内部细胞库。在含有10%FCS(PAA Laboratories,Austria)、1%Glutamax和1%MEM非必需氨基酸(Sigma)的MEM Eagle培养基中培养LS174T。细胞在37℃水饱和的空气中以5%CO2培养。将体外第8代用于脾内注射,其存活为97%。在麻醉的SCID小鼠的左侧腹部部位产生一个小切口。将50μl的细胞悬液(3x106个AimV培养基中的LS174T细胞)经由正好在脾被膜下的腹部壁注射。使用钳闭合皮肤伤口。将实验开始时8-9周龄的雌性SCID小鼠(购自Taconics,Denmark)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P2008016)。在到达后,将动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期实施连续的健康监测。在研究日0,用3x106个LS174T细胞脾内注射小鼠,随机化并称重。在肿瘤细胞注射后1周,用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次i.v.注射小鼠达3周、用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周、或用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次达3周和用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周的组合。所有小鼠均用200μl适当溶液i.v.注射。剂量在表3中指定。用PBS注射媒介物组中的小鼠,并用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFRGlycoMab或2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合注射治疗组。为了获得每200μl适当量的免疫缀合物,在必要时将储液用PBS稀释。图2显示,2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合就增强的中值和总体存活而言相比于单独的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab介导更好的功效。
表3
实施例3
ACHN肾癌异种移植模型
在人肾细胞系ACHN中测试FAP靶向性3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物(SEQ ID NO102和112)和抗EGFR GlycoMab,将其肾内注射到SCID小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于FAP是阳性的。ACHN细胞(人肾腺癌细胞)最初从ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得,并在扩大后保藏于Glycart内部细胞库。在含有10%FCS的DMEM中,于37℃水饱和的空气中以5%CO2常规培养ACHN细胞。将体外第9代用于肾内注射,其存活为97.7%。在麻醉的SCID小鼠的右侧腹和腹膜壁产生一个小切口(2cm)。将50μl的细胞悬液(1x106个AimV培养基中的ACHN细胞)囊下(subcapsularly)2mm注射到肾中。使用钳闭合皮肤伤口和腹膜壁。将200μl Aim V细胞培养基(Gibco)中的每动物5x106个细胞i.v.注射到尾静脉中。将实验开始时8-9周龄的雌性SCID小鼠(购自Charles River,Sulzfeld,Germany)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P2008016)。在到达后,将动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期实施连续的健康监测。在研究日0,用1x106个ACHN细胞肾内注射小鼠,随机化并称重。在肿瘤细胞注射后1周,用3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次i.v.注射小鼠达3周、用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周、或用3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次达3周和用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周的组合。所有小鼠均用200μl适当溶液i.v.注射。剂量在表4中指定。用PBS注射媒介物组中的小鼠,并用3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab或3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合注射治疗组。为了获得每200μl适当量的免疫缀合物,在必要时将储液用PBS稀释。图3显示,3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合在SCID小鼠中产生相比于单独的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab协作性增强的中值和总体存活。
表4
实施例4
ACHN肾癌异种移植模型
在人肾细胞系ACHN中测试FAP靶向性3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab,将其肾内注射到SCID-人FcγRIII转基因小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于FAP是阳性的。ACHN细胞(人肾腺癌细胞)最初从ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得,并在扩大后保藏于Glycart内部细胞库。在含有10%FCS的DMEM中,于37℃水饱和的空气中以5%CO2常规培养ACHN细胞。将体外第11代用于肾内注射,其存活为96.7%。在麻醉的SCID小鼠的右侧腹和腹膜壁产生一个小切口(2cm)。将50μl的细胞悬液(1x106个AimV培养基中的ACHN细胞)囊下(subcapsularly)2mm注射到肾中。使用钳闭合皮肤伤口和腹膜壁。将实验开始时8-9周龄的雌性SCID-FcγRIII小鼠(GLYCART-RCC)(产于RCC,Switzerland)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P2008016)。在到达后,将动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期实施连续的健康监测。在研究日0,用1x106个ACHN细胞肾内注射小鼠,随机化并称重。在肿瘤细胞注射后1周,用3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次i.v.注射小鼠达3周、用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周、或用3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次达3周和用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周的组合。所有小鼠均用200μl适当溶液i.v.注射。剂量在表5中指定。用PBS注射媒介物组中的小鼠,并用3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物、抗EGFR GlycoMab或3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合注射治疗组。为了获得每200μl适当量的免疫缀合物,在必要时将储液用PBS稀释。图4显示,3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合就总体存活而言相比于单独的3F2Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab介导更好的功效。
表5
实施例5
Z138套细胞淋巴瘤异种移植模型
在人套细胞淋巴瘤细胞系Z138中测试TNC A2靶向性2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物和抗CD20GlycoMab(SEQ ID NO134和135),将其i.v.注射到SCID-人FcγRIII转基因小鼠中。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于TNC A2是阳性的。Z138人套细胞淋巴瘤细胞最初从Martin Dyer教授(MRC Toxicology Unit,Leicester,UK)获得,并在扩大后保藏于Glycart内部细胞库。在含有10%FCS(Gibco)的DMEM中,于37℃水饱和的空气中以5%CO2常规培养该肿瘤细胞系。将第18代用于移植,其存活为98%。将200μl Aim V细胞培养基(Gibco)中的每动物10x106个细胞i.v.注射到尾静脉中。将实验开始时8-9周龄的雌性SCID-FcγRIII小鼠(GLYCART-RCC)(产于RCC,Switzerland)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P2008016)。在到达后,将动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期实施连续的健康监测。在研究日0,用10x106个Z138细胞i.v.注射小鼠,随机化并称重。在肿瘤细胞注射后1周,用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次i.v.注射小鼠达3周、用抗CD20GlycoMab每周一次达3周、或用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物每周两次达3周和用抗CD20GlycoMab每周一次达3周的组合。所有小鼠均用200μl适当溶液i.v.注射。剂量在表6中指定。用PBS注射媒介物组中的小鼠,并用2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物、抗CD20GlycoMab或2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗CD20GlycoMab的组合注射治疗组。为了获得每200μl适当量的免疫缀合物,在必要时将储液用PBS稀释。图5显示,2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物与抗CD20GlycoMab的组合就中值和总体存活而言相比于单独的2B10Fab-IL-2-Fab免疫缀合物或抗CD20GlycoMab产生协作性增强的更好的功效。
表6
实施例6
ACHN肾癌异种移植模型
在人肾细胞系ACHN中测试FAP靶向性28H1Fab-IL2-Fab免疫缀合物和抗EGFR GlycoMab,将其肾内注射到SCID-人FcγRIII转基因小鼠中,所述FAP靶向性28H1Fab-IL2-Fab免疫缀合物包含缺乏对CD25的结合的IL-2四重突变体(qm)(SEQ ID NO:108,其中IL-2序列(SEQ ID NO:1)已被SEQ ID NO:2;和SEQ ID NO:113替换)。通过在新鲜冷冻组织上的IHC显示此肿瘤模型对于FAP是阳性的。ACHN细胞(人肾腺癌细胞)最初从ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得,并在扩大后保藏于Glycart内部细胞库。在含有10%FCS的DMEM中,于37℃水饱和的空气中以5%CO2常规培养ACHN。将体外第18代用于肾内注射,其存活为97%。在麻醉的SCID小鼠的右侧腹和腹膜壁产生一个小切口(2cm)。将50μl的细胞悬液(1x106个AimV培养基中的ACHN细胞)囊下2mm注射到肾中。使用钳闭合皮肤伤口和腹膜壁。将实验开始时8-9周龄的雌性SCID-FcγRIII小鼠(GLYCART-RCC)(产于RCC,Switzerland)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P2008016)。在到达后,将动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期实施连续的健康监测。在研究日0,用1x106个ACHN细胞肾内注射小鼠,随机化并称重。在肿瘤细胞注射后1周,用28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物每周三次i.v.注射小鼠达3周、用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周、或用28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物每周三次达3周和用抗EGFR GlycoMab每周一次达3周的组合。所有小鼠均用200μl适当溶液i.v.注射。剂量在表7中指定。用PBS注射媒介物组中的小鼠,并用28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物、抗EGFRGlycoMab或28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合注射治疗组。为了获得每200μl适当量的免疫缀合物,在必要时将储液用PBS稀释。图6显示,28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物与抗EGFR GlycoMab的组合就相比于单独的28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物或抗EGFR GlycoMab增强的中值存活而言介导更好的功效。
表7
实施例7
通过IL-2免疫缀合物体外加强NK细胞杀伤能力和NK细胞IFN-γ释放
为了测定免疫缀合物对NK细胞的影响,我们评估了在用免疫缀合物,特别是包含IL-2作为效应器模块的免疫缀合物处理时,NK细胞对肿瘤细胞的杀伤和IFN-γ释放。出于此目的,依照标准规程使用Histopaque-1077(SigmaDiagnostics Inc.,St.Louis,MO,USA)分离外周血单核细胞(PBMC)。简言之,用肝素化注射器采集来自健康志愿者的静脉血。将血液用不含钙或镁的PBS以2:1稀释,并在Histopaque-1077上分层。将梯度以450xg在室温(RT)无间断离心30分钟。收集含有PBMC的中间相并用PBS总共清洗3次(350xg接着是300xg,在RT10分钟)。
在第一项实验中,将分离的PBMC与不同浓度的IL-2(阿地白介素(阿地白介素))或IL-2免疫缀合物(FAP靶向性28H1Fab-IL2-Fab,包含野生型或四重突变体(qm)IL-2)温育。测试两种实验背景,“在溶液中”是其中将含有IL-2的构建体添加到细胞上清液,而“包被”是其中使含有IL-2的构建体结合先前包被在96-F-孔板上的FAP(500ng/孔在PBS中于4℃20h)。在加入PBMC之前,洗掉未结合的免疫缀合物。在两种情况中,将PBMC用含IL-2的构建体预处理48h,然后恢复并用于杀伤K562靶细胞,其以10:1的效应器对靶细胞比率(E:T)达4h。通过测量LDH到细胞上清液中的释放(Roche细胞毒性检测试剂盒LDH)来检测靶细胞杀伤。图7显示在用溶液中(A)或包被到细胞皿(B)的IL-2构建体预处理效应器细胞(PBMC)时,相比于未经处理的PBMC,K562肿瘤细胞杀伤中的提高。IL-2以及Fab-IL2-Fab免疫缀合物加强了PBMC杀伤靶细胞的能力。
在第二项实验中,将分离的PBMC与IL-2(阿地白介素)或IL-2免疫缀合物温育,加入细胞上清液达45h。然后,恢复PBMC并用于A549细胞的抗EGFRGlycoMab介导的ADCC,其以10:1的E:T达4h。通过测量LDH到细胞上清液中的释放(Roche细胞毒性检测试剂盒LDH)来检测靶细胞杀伤。图8显示用包含野生型(wt)或四重突变体(qm)IL-2的57nM FAP靶向性28H1Fab-IL2-Fab预处理或未经预处理的PBMC,在存在不同浓度的抗EGFR GlycoMab的情况下,对A549肿瘤细胞的总体杀伤。结果显示,能够使用免疫缀合物与GlycoMab的组合获得近乎100%的靶细胞杀伤,这是单独的任一种药剂在当前实验条件下无法实现的。包含野生型或四重突变体IL-2的两种免疫缀合物效力等同。
在另一项实验中,将分离的PBMC与两种不同浓度(5和500ng/ml)的抗EGFR GlycoMab和未经糖工程化的抗EGFR抗体(Erbitux)用在A549细胞上的ADCC测定法中,其以5:1的E:T达21h。在温育时间结束时,使用IFN-γELISA试剂盒(BD#550612)检测IFN-γ从PBMC到细胞上清液中的释放。图9显示,尽管在与单独的抗体温育后未检测到显著的IFN-γ释放,但在温育时间期间IL-2(阿地白介素)、28H1Fab-IL2-Fab或28H1Fab-IL2qm-Fab的存在强烈增强了(A)抗EGFR GlycoMab以及(B)Erbitux介导的ADCC中的IFN-γ释放。总体而言,并且特别是在较低抗体浓度(5ng/ml)和最高IL-2(免疫缀合物)浓度(1140nM)时,抗EGFR GlycoMab的IFN-γ释放高于Erbitux的。
最后,测定与IL-2(阿地白介素)、28H1Fab-IL2-Fab或28H1Fab-IL2qm-Fab但无任何抗体温育后,从PBMC的IFN-γ释放。实验条件如上文描述的。如图10中显示的,在不存在诱导ADCC的抗体的情况下,IL-2(免疫缀合物)也增强了从PBMC的IFN-γ释放。IFN-γ水平与在存在5ng/ml Erbitux情况下测量的水平是可比的(见图9B),但低于存在抗EGFR GlycoMab的情况(见图9A)。
***
尽管已通过例示和实施例在一定程度上详细描述了前述发明从而澄清理解,但描述和实施例不应理解为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容均通过提述完整明确地纳入。
Claims (26)
1.一种(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物和(b)工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体的组合,其用于治疗有此需要的个体中的疾病。
2.权利要求1的组合,其中所述效应器模块是细胞因子。
3.权利要求1或2的组合,其中所述效应器模块是选自下组的细胞因子:IL-2、GM-CSF、IFN-α和IL-12。
4.权利要求1至3中任一项的组合,其中所述效应器模块是IL-2。
5.权利要求4的组合,其中所述IL-2效应器模块是突变体IL-2效应器模块,与非突变的IL-2效应器模块相比,该突变体IL-2效应器模块包含至少一处氨基酸突变,特别是氨基酸替代,其降低或消除所述突变体IL-2效应器模块对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留所述突变体IL-2效应器模块对中等亲和力IL-2受体的亲和力。
6.权利要求1至5中任一项的组合,其中所述抗原结合模块是抗体或抗体片段。
7.权利要求1至6中任一项的组合,其中所述抗原结合模块选自Fab分子和scFv分子。
8.权利要求1至7中任一项的组合,其中所述免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块。
9.权利要求8的组合,其中所述第一和所述第二抗原结合模块之每个是Fab分子。
10.权利要求8或9的组合,其中所述效应器模块与所述第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键,且所述第二抗原结合模块与所述效应器模块或所述第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键。
11.权利要求1至10中任一项的组合,其中所述免疫缀合物包含效应器模块,特别是单链效应器模块,和第一和第二Fab分子,其中所述效应器模块在其氨基端氨基酸处与所述第一Fab分子的重链或轻链的羧基端连接,且其中所述效应器模块在其羧基端氨基酸处与所述第二Fab分子的重链或轻链的氨基端连接。
12.权利要求1至11中任一项的组合,其中所述抗原结合模块针对肿瘤细胞上或在肿瘤细胞环境中呈现的抗原。
13.权利要求1至12中任一项的组合,其中所述工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体是全长IgG类抗体,特别是IgG1亚类抗体。
14.权利要求1至13中任一项的组合,其中所述升高的效应器功能选自下组:升高的对活化Fc受体的结合、升高的ADCC、升高的ADCP、升高的CDC、和升高的细胞因子分泌。
15.权利要求1至14中任一项的组合,其中所述升高的效应器功能是升高的对活化Fc受体的结合和/或升高的ADCC。
16.权利要求1至15中任一项的组合,其中所述工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体是通过在Fc区中引入一处或多处氨基酸突变或通过在Fc区中修饰糖基化来工程化改造的。
17.权利要求1至16中任一项的组合,其中所述工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体工程化改造为与非工程化抗体相比具有增加的Fc区中非岩藻糖基化寡糖比例。
18.权利要求1至17中任一项的组合,其中所述工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体针对肿瘤细胞上呈现的抗原。
19.权利要求1至18中任一项的组合,其中所述疾病是通过刺激效应细胞功能可治疗的病症,特别是癌症。
20.权利要求1至19中任一项的组合,其中所述个体是哺乳动物,特别是人。
21.一种药物组合物,其在药学可接受载体中包含(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物和(b)工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体。
22.(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物和(b)工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体用于制造供治疗个体中的疾病用的药物的用途。
23.一种治疗个体中的疾病的方法,其包括对所述个体以治疗有效量施用(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物和(b)工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体的组合。
24.一种刺激个体中的效应细胞功能的方法,其包括对所述个体以有效刺激效应细胞功能的量施用(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物和(b)工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体的组合。
25.一种意图用于治疗疾病的试剂盒,其在同一容器或分开的容器中包含(a)包含至少一个抗原结合模块和效应器模块的免疫缀合物,(b)工程化改造为具有升高的效应器功能的抗体,和(c)任选地包含印刷说明书的包装插页,所述印刷说明书指导使用组合治疗作为治疗所述疾病的方法。
26.如本文所述的发明。
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