ES2829499T3 - Método para la selección de anticuerpos contra BCMA - Google Patents

Método para la selección de anticuerpos contra BCMA

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Ekkehard Moessner
Ralf Hosse
Oliver Ast
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Marina Bacac
Tanja Fauti
Christian Klein
Pablo Umana
Samuel Moser
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Abstract

Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de maduración de células B humanas (BCMA) y CD3, en donde el anticuerpo biespecífico comprende una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo que se une específicamente a BCMA, la cadena pesada comprende una CDR1H de SEQ ID NO: 39, una CDR2H de SEQ ID NO: 49 y una CDR3H de SEQ ID NO: 59 y la cadena ligera comprende una CDR1L de SEQ ID NO: 69, una CDR2L de SEQ ID NO:79 y una CDR3L de SEQ ID NO: 89.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la selección de anticuerpos contra BCMA
La presente descripción se refiere a un método para la selección de anticuerpos contra BCMA, nuevos anticuerpos contra BCMA, su fabricación y uso.
Antecedentes de la invención
La diana de maduración de las células B humanas, también conocida como BCMA; TR17_HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), es un miembro de la superfamilia de receptores de necrosis tumoral que se expresa preferentemente en células plasmáticas diferenciadas [Laabi et al. 1992; Madry et al. 1998]. BCMA es una proteína transmembrana de tipo III no glicosilada, que está implicada en la maduración, el crecimiento y la supervivencia de las células B. BCMA es un receptor para dos ligandos de la superfamilia TNF: APRIL (un ligando inductor de proliferación), el ligando de alta afinidad de BCMA y el factor de activación de células B BAFF, el ligando de baja afinidad de BCMA (THANK, BlyS, estimulador de linfocitos B, TALL-1 y zTNF4). APRIL y BAFF muestran similitud estructural y superposición, pero una especificidad distinta por el receptor. El regulador negativo TACI también se une tanto a BAFF como a APRIL. La unión coordinada de APRIL y BAFF a BCMA y/o TACI activa el factor de transcripción NF-kB y aumenta la expresión de los miembros de la familia prosupervivencia Bcl-2 (p. ej., Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1) y la regulación a la baja de factores proapoptóticos (p. ej. Bid, Bad, Bik, Bim, etc.), inhibiendo así la apoptosis y promoviendo la supervivencia. Esta acción combinada promueve la diferenciación, proliferación, supervivencia y producción de anticuerpos de las células B (como se revisa en Rickert RC et al., Immunol Rev (2011) 244 (1): 115­ 133).
Los anticuerpos contra BCMA se describen, p. ej., en Gras M-P. et al. Int Immunol. 7 (1995) 1093-1106, WO200124811, WO200124812, WO2010104949 y WO2012163805. Los anticuerpos contra BCMA y su uso para el tratamiento de linfomas y mieloma múltiple se mencionan, p. ej., en WO2002066516 y WO2010104949. WO2013154760 se refiere a receptores de antígenos quiméricos que comprenden un resto de reconocimiento de BCMA y un resto de activación de células T.
Ryan, MC et al., Mol. Cancer Ther. 6 (2007) 3009-3018 se refieren a anticuerpos anti BCMA con actividad de bloqueo de ligando que podrían promover la citotoxicidad de líneas celulares de mieloma múltiple (MM) como anticuerpos desnudos o como conjugados anticuerpo-fármaco. Ryan mostró que SG1, un anticuerpo contra BCMA inhibidor, bloquea la activación del factor nuclear kB dependiente de APRIL de una manera dependiente de la dosis in vitro. Ryan también mencionó que el anticuerpo SG2 inhibía la unión de APRIL a BCMA de manera no significativa.
En el pasado reciente se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos biespecíficos recombinantes, p. ej., mediante la fusión de, p. ej., un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena única (véase, p. ej., Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16). Los anticuerpos biespecíficos en donde los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí se describen en WO2009080251 y WO2009080252.
Un enfoque para eludir el problema de los subproductos mal emparejados, que se conoce como "botón en ojal", tiene como objetivo forzar el emparejamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpos diferentes mediante la introducción de mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfaz de contacto. En una cadena, los aminoácidos voluminosos se reemplazaron por aminoácidos con cadenas laterales cortas para crear un "ojal". A la inversa, los aminoácidos con cadenas laterales grandes se introdujeron en el otro dominio CH3, para crear un "botón". Al coexpresar estas dos cadenas pesadas (y dos cadenas ligeras idénticas, que tienen que ser apropiadas para ambas cadenas pesadas), se observaron altos rendimientos de formación de heterodímeros ('botón-ojal') frente a la formación de homodímeros ('ojal-ojal' o 'botón-botón') (Ridgway JB, Presta LG, Carter P; y WO1996027011). El porcentaje de heterodímero podría aumentarse aún más remodelando las superficies de interacción de los dos dominios CH3 utilizando un enfoque de presentación en fagos y la introducción de un puente disulfuro para estabilizar los heterodímeros (Merchant A.M, et al, Nature Biotech 16 (1998) 677 -681; Aíwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35). Se describen nuevos enfoques para la tecnología de botón en ojal, p. ej., en EP 1870459A1. Aunque este formato parece muy atractivo, actualmente no se dispone de datos que describan la progresión hacia la clínica. Una limitación importante de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parentales deben ser idénticas para evitar el emparejamiento incorrecto y la formación de moléculas inactivas. Por lo tanto, esta técnica no es apropiada para desarrollar fácilmente anticuerpos biespecíficos recombinantes contra dos dianas a partir de dos anticuerpos contra la primera y la segunda diana, ya sea tienen que optimizarse bien las cadenas pesadas de estos anticuerpos y/o las cadenas ligeras idénticas. Xie, Z., et al, J Immunol Methods 286 (2005) 95-101 se refiere a un formato de anticuerpo biespecífico que usa scFv en combinación con la tecnología de botón en ojal para la parte FC.
El complejo TCR/CD3 de los linfocitos T consiste en un heterodímero bien TCR alfa (a)/beta (p) o TCR gamma (Y)/delta (8) coexpresado en la superficie celular con las subunidades invariantes de CD3 etiquetadas gamma (y), delta (8), épsilon (£), zeta (Z) y eta (n). El CD3e humano se describe en UniProt P07766 (CD3E_HUMAN).
Un anticuerpo anti CD3e descrito en el estado de la técnica es SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 reacciona con CD3 tanto de primates como de seres humanos. SP34 está disponible en Pharmingen. Otro anticuerpo anti CD3 descrito en el estado de la técnica es UCHT-1 (véase, WO2000041474). Otro anticuerpo anti CD3 descrito en el estado de la técnica es BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; utilizado en ensayos de Fase I/II de GvHD, Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 difiere de UCHT-1 y BC-3 en que SP-34 reconoce un epítopo presente únicamente en la cadena £ de CD3 (véase, Salmeron et al., (1991) J. Immunol. 147: 3047) mientras que UCHT-1 y BC-3 reconocen un epítopo al que contribuyen las cadenas £ y y. La secuencia de un anticuerpo con la misma secuencia que el anticuerpo SP34 se menciona en WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010037837 y WO2010037838. Una secuencia que es un 96 % idéntica a VH del anticuerpo SP34 se menciona en US8236308 (WO2007042261). Las secuencias de VH y VL de otro anticuerpo con las mismas secuencias que las de SP34 se muestran en las SEQ ID NO:7 y 8.
Los anticuerpos biespecíficos contra CD3 y BCMA se mencionan en WO2007117600, WO2009132058, WO2012066058, y WO2012143498.
Las funciones efectoras mediadas por células de los anticuerpos monoclonales (como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)) pueden mejorarse por ingeniería de su composición de oligosacáridos en Asn297 como se describe en Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; y US6602684. WO1999054342, WO2004065540, WO2007031875, y WO2007039818, Hristodorov D, Fischer R, Linden L., Mol Biotechnol. 2012 oct 25. (Epub) también se refieren a la ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular mediada por Fc.
Además, varios residuos de aminoácidos en la región bisagra y en el dominio CH2 influyen en las funciones efectoras mediadas por células de los anticuerpos monoclonales (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)] Chemical Immunology, 65, 88 (1997)]. Por lo tanto, la modificación de dichos aminoácidos puede potenciar las funciones efectoras mediadas por células. Dichas modificaciones de anticuerpos para aumentar las funciones efectoras mediadas por células se mencionan en EP1931709, WO200042072 y comprenden sustituciones en la parte Fc en la o las posiciones de aminoácidos 234, 235, 236, 239, 267, 268, 293, 295, 324, 327, 328, 330 y 332. Otras modificaciones de anticuerpos para aumentar las funciones efectoras mediadas por células se mencionan en EP1697415 y comprenden el reemplazo de aminoácidos de las posiciones de aminoácidos EU 277, 289, 306, 344 o 378 con un aminoácido cargado, un aminoácido polar o un aminoácido no polar.
Los formatos de anticuerpos y formatos de anticuerpos biespecíficos multiespecíficos también son pepcuerpos (WO200244215), Nuevo Receptor de Antígeno ("NAR") (WO2003014161), dímeros diacuerpo-diacuerpo "TandAbs" (WO2003048209), scFv modificado con óxido de polialquileno (US7150872), anticuerpos de conejo humanizados (WO2005016950), dominios sintéticos de inmunoglobulina (WO2006072620), diacuerpos covalentes (WO2006113665), flexicuerpos (WO2003025018), anticuerpos con dominio único, dAb (WO2004058822), vacicuerpo (WO2004076489), anticuerpos con marco de primate del nuevo mundo (WO2007019620), conjugado anticuerpofármaco con enlazadores escindibles (WO2009117531), anticuerpos IgG4 con eliminación de la región bisagra (WO2010063785), anticuerpos biespecíficos con dominios CH3 semejantes a IgG4 (WO2008119353), anticuerpos de camélidos (US6838254), nanocuerpos (US7655759), diacuerpos CAT (US5837242), scFv2 biespecífico dirigido frente al antígeno diana y Cd 3 (US7235641),), plAnticuerpos sIgA (US6303341), minicuerpos (US5837821), IgNAR (US2009148438), anticuerpos con regiones bisagra y Fc modificadas (US2008227958, US20080181890), anticuerpos trifuncionales (US5273743), triomabs (US6551592), troicuerpos (US6294654).
Resumen de la invención
La presente invención y las realizaciones de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
La descripción comprende un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a BCMA, caracterizado porque la unión de dicho anticuerpo en una concentración de 6,25nM no se reduce por 140 ng/ml de APRIL murino en más de un 10 %, preferiblemente no se reduce en más de un 1 % medido en un ensayo ELISA como DO a 450 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza porque la unión de dicho anticuerpo en una concentración de 50nM no se reduce por 140 ng/ml de APRIL murino en más de un 10 %, medido en un ensayo ELISA como DO a 450 nm, en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL.
Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza por mostrar un valor de CE50 para la unión de anticuerpos anti-BCMA a células H929 (ATCC® CRL-9068™) de 15 nM o menor.
a) la unión de dicho anticuerpo no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 20 % medido en un ensayo ELISA como DO a 405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL,
b) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 %, en comparación con APRIL, y
c) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB sin APRIL en más de un 20 %, en comparación con sin dicho anticuerpo.
La descripción se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a BCMA humano, caracterizado porque a) la unión de dicho anticuerpo no se reduce por 100 ng/ml de APRIL y no se reduce por 100 ng/ml de BAFF en más de un
20 % medido en un ensayo ELISA como DO a 405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL o BAFF respectivamente,
b) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 %, en comparación con APRIL solo,
c) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 20 %, en comparación con BAFF solo, y
d) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB sin BAFF y APRIL en más de un 20 %, en comparación con sin dicho anticuerpo.
Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión d
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dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 15 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL, en más de un 20 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL en más de un 15 %, medido en dicho ELISA.
Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión d
Figure imgf000004_0002
dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL y no se reduce por 100 ng/ml de BAFF en más de un 15 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL y no se reduce por 1.000 ng/ml de BAFF, en más de un 20 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL y no se reduce por 1.000 ng/ml de BAFF en más de un 15 %, medido en dicho ELISA.
Preferiblemente, el anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 15 %. Preferiblemente, el anticuerpo según la invención no altera la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 15 %. Preferiblemente, el anticuerpo según la invención no altera la activación de NF-kB sin APRIL y BAFF en más de un 15 %.
Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza porque su unión a BCMA no se reduce por APRIL y preferiblemente no se reduce por BAFF en más de un 25 %, preferiblemente no más de un 20 %, preferiblemente no más de un 10 %, medido como unión de dicho anticuerpo en una concentración de 5nM, preferiblemente 50nM, y preferiblemente 140nM a células NCI-H929 (ATCC® CRL-9068™) en presencia o ausencia de APRIL o respectivamente BAFF en una concentración de 2,5|jg/ml en comparación con la unión de dicho anticuerpo a células NCI-H929 sin APRIL o BAFF respectivamente.
Preferiblemente, el anticuerpo según la invención se caracteriza además porque se une también específicamente a BCMA de cinomolgo.
El anticuerpo es un anticuerpo biespecífico con un Fc o sin un Fc que incluye fragmentos variables de cadena única (scFv) tales como los acopladores de células T biespecíficos, diacuerpos o scFv en tándem, un mimético de anticuerpo tal como DARPins, un anticuerpo monoespecífico desnudo o un conjugado de anticuerpo-fármaco. Preferiblemente, un anticuerpo biespecífico se une específicamente a BCMA y CD3.
La descripción se refiere además a un método para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a BCMA humano, caracterizado por seleccionar un anticuerpo que se une específicamente a BCMA humano si
a) la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 20 % medido en un ensayo ELISA como DO a 405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL,
b) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 %, en comparación con APRIL, y
c) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB sin APRIL en más de un 20 %, en comparación con sin dicho anticuerpo.
Preferiblemente, el método se caracteriza porque se selecciona un anticuerpo que no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 15 %. Preferiblemente, el método se caracteriza porque se selecciona un anticuerpo que no altera la activación de NF-kB sin APRIL en más de un 15 %.
Preferiblemente, el método se caracteriza porque se selecciona un anticuerpo si, además, la unión de dicho anticuerpo a BCMA de cinomolgo y humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 20 % medido en un ensayo ELISA como DO a 405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL.
Preferiblemente, el método se caracteriza además porque se selecciona un anticuerpo si la unión de dicho anticuerpo a BCMA de cinomolgo y humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 15 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el método se caracteriza además porque se selecciona un anticuerpo si la unión de dicho anticuerpo a BCMA de cinomolgo y humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL y no se reduce por 1.000 ng/ml, en más de un 20 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el método se caracteriza además porque se selecciona un anticuerpo si la unión de dicho anticuerpo a BCMA de cinomolgo y humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL en más de un 15 %, medido en dicho ELISA.
La descripción se refiere además a un método para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a BCMA humano, caracterizado por seleccionar un anticuerpo que se une específicamente a BCMA humano si
a) la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL y no se reduce por 100 ng/ml de BAFF en más de un 20 % medido en un ensayo ELISA como DO a 405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL o BAFF respectivamente,
b) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 %, en comparación con APRIL solo,
c) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 20 %, en comparación con BAFF solo, y
d) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB sin BAFF y APRIL en más de un 20 %, en comparación con sin dicho anticuerpo.
Preferiblemente, el método se caracteriza porque se selecciona un anticuerpo que no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 15 %. Preferiblemente, el método se caracteriza porque se selecciona un anticuerpo que no altera la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 15 %. Preferiblemente, el método se caracteriza porque se selecciona un anticuerpo que no altera la activación de NF-kB sin APRIL y BAFF en más de un 15 %. Preferiblemente, el método se caracteriza porque se selecciona un anticuerpo que se une específicamente a BCMA de cinomolgo y humano.
Preferiblemente, el método se caracteriza porque se selecciona un anticuerpo si, además, la unión de dicho anticuerpo a BCMA de cinomolgo y humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL y no se reduce por 100 ng/ml de BAFF en más de un 20 % medido en un ensayo ELISA como DO a 405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL o BAFF respectivamente. Preferiblemente, el método se caracteriza además porque se selecciona un anticuerpo si la unión de dicho anticuerpo a BCMA de cinomolgo y humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL y no se educe por 100 ng/ml de BAFF en más de un 15 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el método se caracteriza además porque se selecciona un anticuerpo si la unión de dicho anticuerpo a BCMA de cinomolgo y humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL y no se reduce por 1.000 ng/ml, en más de un 20 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el método se caracteriza además porque se selecciona un anticuerpo si la unión de dicho anticuerpo a BCMA de cinomolgo y humano no se reduce por
1.000 ng/ml de APRIL y no se reduce por 1.000 ng/ml de BAFF en más de un 15 %, medido en dicho ELISA.
La descripción se refiere además a un método para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a BCMA humano, caracterizado porque se selecciona un anticuerpo, caracterizado porque su unión a BCMA no se reduce por APRIL y preferiblemente no se reduce por BAFF en más de un 25 %, preferiblemente no más de un 20 %, preferiblemente no más de un 10 %, medido como unión de dicho anticuerpo en una concentración de 5nM, preferiblemente 50nM, y preferiblemente 140nM a células NCI-H929 (ATCC® c Rl-9068™) en presencia o ausencia de APRIL y preferiblemente BAFF en una concentración de 2,5|jg/ml en comparación con la unión de dicho anticuerpo a células NCI-H929 sin APRIL y preferiblemente BAFF.
Tomando como base la descripción, es posible generar anticuerpos según la invención contra BCMA, conjugados anticuerpo-fármaco contra BCMA y anticuerpos biespecíficos contra BCMA y una diana adicional en diferentes formatos con o sin una porción Fc conocida en el estado de la técnica (véase, p. ej., anteriormente en "antecedentes de la invención"), fragmentos variables de cadena única (scFv) tales como acopladores de células T biespecíficos, diacuerpos, scFv en tándem y miméticos de anticuerpos tales como DARPins. Los formatos de anticuerpos biespecíficos son bien conocidos en el estado de la técnica y, p. ej., también se describen en Kontermann RE, mAbs 4:2 1-16 (2012); Holliger P., Hudson PJ, Nature Biotech.23 (2005) 1126-1136 y Chan AC, Carter PJ Nature Reviews Immunology 10, 301-316 (2010) y Cuesta AM et al., Trends Biotech 28 (2011) 355-362.
Se describe un anticuerpo biespecífico contra las dos dianas CD3e humano (denominado también como "CD3") y el dominio extracelular de BCMA humano (denominado también como "BCMA"), caracterizado por comprender como anticuerpo contra BCMA un anticuerpo anti-BCMA según a la invención.
La invención se refiere preferiblemente a un anticuerpo biespecífico contra BCMA y CD3, caracterizado porque a) la unión de dicho anticuerpo no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 20 % medido en un ensayo ELISA como DO a 405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL,
b) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 %, en comparación con APRIL, y
c) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB sin APRIL en más de un 20 %, en comparación con sin dicho anticuerpo.
Se describe un anticuerpo biespecífico contra BCMA y CD3, caracterizado porque
a) la unión de dicho anticuerpo no se reduce por 100 ng/ml de APRIL y no se reduce por 100 ng/ml de BAFF en más de un
20 % medido en un ensayo ELISA como DO a 405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL o BAFF respectivamente,
b) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 %, en comparación con APRIL solo,
c) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 20 %, en comparación con BAFF solo, y
d) dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB sin BAFF y APRIL en más de un 20 %, en comparación con sin dicho anticuerpo.
El anticuerpo biespecífico contra BCMA y CD3 se caracteriza preferiblemente por comprender un anticuerpo anti BCMA según la invención y un anticuerpo anti CD3, en donde
a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a uno de dichas dianas; y
b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a la otra de dichas dianas, en donde los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CHl se reemplazan entre sí.
Preferiblemente, el dominio variable VH comprende las CDR de cadena pesada de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 como respectivamente CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y el dominio variable VL comprende las CDR de cadena ligera de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 como respectivamente, CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de la porción de anticuerpo anti CD3e del anticuerpo biespecífico.
Preferiblemente, dicho anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque los dominios variables de la porción de anticuerpo anti CD3e tienen la SEQ ID NO:7 y 8.
Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un dominio variable VH que comprende las CDR de cadena pesada de las SEQ ID NO: 37 a 45, 47 a 55, 57 a 65 como respectivamente CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y un dominio variable VL que comprende las CDR de cadena ligera de las SEQ ID NO: 67 a 75, 77 a 85, 87 a 95 como respectivamente CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo anti BCMA. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque el dominio variable VH se selecciona del grupo de las SEQ ID NO: 17 a 25 y el dominio variable VL se selecciona del grupo de las SEQ ID NO: 27 a 35 respectivamente.
Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:37, una CDR2H de SEQ ID NO:47, una CDR3H de SEQ ID NO: 57 y una CDR1L de SEQ ID NO:67, una CDR2L de SEQ ID NO:77, una CDR3L de SEQ ID NO: 87. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:38, una CDR2H de SEQ ID No :48, una CDR3H de SEQ ID NO: 58 y una CDR1L de SEQ ID NO:68, una CDR2L de SEQ ID NO:78, una CDR3L de SEQ ID NO: 88. Preferiblemente, el anticuerpo según la invención se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:39, una CDR2H de SEQ ID NO:49, una CDR3H de SEQ ID NO: 59 y una CDR1L de SEQ ID NO:69, una CDR2L de SEQ ID NO:79, una CDR3L de SEQ ID NO: 89. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:40, una CDR2H de SEQ ID NO:50, una CDR3H de SEQ ID NO: 60 y una CDR1L de SEQ ID NO:70, una CDR2L de SEQ ID NO:80, una CDR3L de SEQ ID NO: 90. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción, que se une específicamente a BCMA humano, se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:41, una CDR2H de SEQ ID NO:51, una CDR3H de SEQ ID NO: 61 y una CDR1L de SEQ ID NO:71, una CDR2L de SEQ ID NO:81, una CDR3L de SEQ ID NO: 91. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:42, una CDR2H de SEQ ID NO:52, una CDR3H de SEQ ID NO: 62 y una CDR1L de SEQ ID NO:72, una CDR2L de SEQ ID NO:82, una CDR3L de SEQ ID NO: 92. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:43, una CDR2H de SEQ ID NO:53, una CDR3H de SEQ ID NO: 63 y una CDR1L de SEQ ID NO:73, una CDR2L de SEQ ID NO:83, una CDR3L de SEQ ID NO: 93. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:44, una CDR2H de SEQ ID NO:54, una CDR3H de SEQ ID NO: 64 y una CDR1L de SEQ ID NO:74, una CDR2L de SEQ ID NO:84, una CDR3L de SEQ ID NO: 94. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:45, una CDR2H de SEQ ID NO:55, una CDR3H de SEQ ID NO: 65 y una CDR1L de SEQ ID NO:75, una CDR2L de SEQ ID NO:85, una CDR3L de SEQ ID NO: 95.
Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 25 y/o porque comprende un VL seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 27 a 35.
Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 17 y un VL de SEQ ID NO: 27. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 18 y un VL de SEQ ID NO: 28. Preferiblemente, el anticuerpo según la invención se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 19 y un VL de SEQ ID NO: 29. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 20 y un VL de SEQ ID NO: 30. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 21 y un VL de SEQ ID NO: 31. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 22 y un VL de SEQ ID NO: 32. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 23 y un VL de SEQ ID NO: 33. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 24 y un VL de SEQ ID NO: 34. Preferiblemente, el anticuerpo según la descripción se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 25 y un VL de SEQ ID NO: 35.
En un caso adicional de la descripción, un anticuerpo se caracteriza porque comprende una CDR1H de SEQ ID NO:46, una CDR2H de SEQ ID NO:56, una CDR3H de SEQ ID NO: 66 y una CDR1L de SEQ ID NO:76, una CDR2L de SEQ ID NO:86, una CDR3L de SEQ ID NO: 96. En un caso adicional de la descripción, un anticuerpo se caracteriza porque comprende un VH de SEQ ID NO: 26 y un VL de SEQ ID NO: 36. La unión del anticuerpo MAB 13A7 se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 20 % medido en un ensayo ELISA.
Preferiblemente, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se encuentran cada uno en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 del anticuerpo; en donde dicha interfaz se altera para promover la formación del anticuerpo biespecífico, en donde la alteración se caracteriza porque:
a) el dominio CH3 de una cadena pesada se altera, de manera que dentro de la interfaz original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecífico, se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un volumen mayor de cadena lateral, generando así una protuberancia dentro de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede posicionar en una cavidad dentro de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada y
b) el dominio CH3 de la otra cadena pesada se altera, de manera que dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico, se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral, generando así una cavidad dentro de la interfaz del segundo dominio CH3 dentro de la que se puede posicionar una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3.
Preferiblemente, dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza porque dicho residuo de aminoácido que tiene un volumen mayor de cadena lateral se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).
Preferiblemente, dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza porque dicho residuo de aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).
Preferiblemente, dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza porque ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3.
Preferiblemente, dicho anticuerpo biespecífico se caracteriza porque uno de los dominios de cadena pesada constante CH3 de ambas cadenas pesadas se reemplaza por un dominio de cadena pesada constante CH1; y el otro dominio de cadena pesada constante CH3 se reemplaza por un dominio de cadena ligera constante CL.
La invención se refiere además a un anticuerpo según la invención, que comprende una parte Fc modificada que induce la muerte celular de un 20 % o más de células de una preparación de células que expresan BCMA después de 24 horas a una concentración de dicho anticuerpo de 100 nM por ADCC con respecto a un control en condiciones idénticas usando el mismo anticuerpo con la parte Fc parental como control. Dicho anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo desnudo.
Preferiblemente, el anticuerpo según la invención es un anticuerpo con una cantidad de fucosa del 60 % o menos de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297 (véase, p. ej., US20120315268).
Un caso adicional de la descripción es un método para la preparación de un anticuerpo según la descripción que comprende las etapas de
a) transformar una célula huésped con
b) vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo según la descripción,
c) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo; y
d) recuperar dicha molécula de anticuerpo de dicho cultivo.
Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo biespecífico según la invención que comprende las etapas de
e) transformar una célula huésped con
f) vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a la primera diana
g) vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a la segunda diana, en donde los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí;
h) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo; y
i) recuperar dicha molécula de anticuerpo de dicho cultivo.
Un caso adicional de la descripción es una célula huésped que comprende vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo según la descripción. Un caso adicional de la descripción es una célula huésped que comprende vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a la primera diana y vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a la segunda diana, en donde los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como un medicamento.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como un medicamento en el tratamiento de trastornos de las células plasmáticas.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como un medicamento en el tratamiento del mieloma múltiple.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como un medicamento en el tratamiento del lupus eritematoso sistémico.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención, que incluye un anticuerpo monoespecífico, un anticuerpo desnudo con ADCC potenciada, un conjugado de anticuerpo-fármaco o un anticuerpo biespecífico para su uso como un medicamento en el tratamiento de rechazos mediados por anticuerpos.
Preferiblemente, un anticuerpo según la invención puede usarse para el tratamiento de trastornos de las células plasmáticas como mieloma múltiple MM u otros trastornos de las células B que expresan BCMA. El MM es una malignidad de las células B caracterizada por una expansión monoclonal y acumulación de células plasmáticas anormales en el compartimento de la médula ósea. El MM también implica células B clonales circulantes con el mismo reordenamiento del gen de IgG e hipermutación somática. El MM surge de una afección premaligna asintomática llamada gammapatía monoclonal de importancia desconocida (MGUS), caracterizada por niveles bajos de células plasmáticas de la médula ósea y una proteína monoclonal. Las células de MM proliferan a baja velocidad. El MM es el resultado de una aparición progresiva de múltiples cambios cromosómicos estructurales (p. ej., traslocaciones desequilibradas). El MM implica la interacción mutua de las células plasmáticas malignas y el microambiente de la médula ósea (p. ej., células estromales normales de la médula ósea). Los signos clínicos del MM activo incluyen pico de anticuerpos monoclonales, células plasmáticas que superpueblan la médula ósea, lesiones óseas líticas y destrucción ósea como resultado de la sobreestimulación de los osteoclastos (Dimopulos y Terpos, Ann Oncol 2010; 21 supl 7: vii143-150). Otro trastorno de las células B que implica a las células plasmáticas, es decir, que expresan BCMA, es el lupus eritematoso sistémico (SLE), también conocido como lupus. El SLE es una enfermedad autoinmune sistémica que puede afectar cualquier parte del cuerpo y se representa con el sistema inmune atacando las células y tejidos del propio cuerpo, lo que resulta en inflamación crónica y daño tisular. Es una reacción de hipersensibilidad de Tipo III en la que los complejos inmunes de anticuerpos precipitan y provocan una respuesta inmune adicional (Inaki y Lee, Nat Rev Rheumatol 2010; 6: 326-337).
Una realización adicional de esta invención es un anticuerpo según la invención para el tratamiento del rechazo de aloinjerto mediado por anticuerpos que implica células plasmáticas y aloanticuerpos, incluyendo el rechazo mediado por anticuerpos agudo y crónico (AMR). El AMR agudo se caracteriza por una disfunción del injerto que ocurre durante días y es el resultado de anticuerpos específicos del donante preformados o de novo desarrollados después del trasplante. Ocurre en aproximadamente el 5-7 % de todos los trasplantes de riñón y causa el 20-48 % de los episodios de rechazo agudo entre los pacientes de prueba cruzada positivos presensibilizados (Colvin y Smith, Nature Rev Immunol 2005; 5 (10): 807-817). La histopatología en pacientes con AMR agudo a menudo revela inflamación de las células endoteliales, infiltración neutrofílica de glomérulos y capilares peritubulares, trombos de fibrina, edema intersticial y hemorragia (Trpkov et al. Transplantation 1996; 61 (11): 1586-1592). El AMR puede identificarse por tinción con C4d u otros métodos mejorados de detección de anticuerpos en biopsias de aloinjertos. Otra forma de AMR también se conoce como lesión crónica del aloinjerto, que también implica anticuerpos específicos del donante, pero se manifiesta en meses e incluso años después del trasplante. Se ve como glomerulopatía por trasplante (también conocida como glomerulopatía crónica por aloinjerto) en biopsias renales y se caracteriza por expansión mesangial glomerular y duplicación de la membrana basal capilar (Regele et al. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (9): 2371-2380). Las manifestaciones clínicas varían desde pacientes que son asintomáticos en los estadios tempranos hasta presentar proteinuria en rango nefrótico, hipertensión y disfunción del aloinjerto en los estadios avanzados. La progresión de la enfermedad puede ser bastante rápida, especialmente con el AMR agudo en curso, lo que da como resultado el fracaso del injerto en unos meses (Fotheringham et al. Nephron - Clin Pract 2009; 113 (1): c1-c7). La prevalencia de la glomerulopatía por trasplante en biopsias de pacientes varía entre el 5 % a 1 año al 20 % a los 5 años (Cosio et al. Am J Transplant 2008; 8: 292-296).
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo desnudo según la invención para su uso como un medicamento.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención con función efectora incrementada para su uso como un medicamento.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención con función efectora disminuida para su uso como un medicamento.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención como anticuerpo biespecífico para su uso como un medicamento.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención como conjugado con un agente terapéutico (conjugado con fármaco), p. ej., con un agente citotóxico o radiomarcaje para su uso como un medicamento.
Una realización preferida adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención como diacuerpo para su uso como un medicamento.
Los inventores reconocieron que un anticuerpo según la invención (Mab de BCMA), preferiblemente un anticuerpo monoespecífico con glicoingeniería en Fc (preferiblemente un anticuerpo desnudo) que 1) no bloquea ni incrementa la activación de NF-kB dependiente de APRIL, 2 ) no bloquea ni incrementa la activación de NF-kB dependiente de BAFF, y 3) no induce la activación de NF-kB sin BAFF y APRIL evita que la eficacia del Mab de BCMA para erradicar las células tumorales positivas para BCMA en pacientes con m M no se vea afectada negativamente por la concentración de APRIL y BAFF en el suero o en el tumor. Además, como el Mab de BCMA no induce la activación de NF-kB sin BAFF y APRIL, 1) no se produce la activación y el incremento de la supervivencia de células tumorales con respuesta positiva para BCMA; 2) la internalización del receptor también puede no ocurrir, lo que podría reducir la eficacia de BCMA-Mab. Debido a que la eficacia de los anticuerpos generalmente aumenta con el la ocupación del tumor/concentración de anticuerpo, el resultado con un anticuerpo contra BCMA distinto de un anticuerpo anti BCMA según esta invención podría tener una variabilidad considerable en la eficacia entre pacientes (p. ej., menos eficacia global).
Con respecto a los anticuerpos biespecíficos contra BCMA y CD3, los inventores reconocen que un anticuerpo biespecífico contra BCMA y capaz de unirse específicamente a un antígeno de células T activador (BCMA-TCB) que 1) no bloquea o incrementa la activación de NF-kB dependiente de APRIL, 2) preferiblemente no bloquea o incrementa la activación de NF-kB dependiente de BAFF, y 3) no induce la activación de NF-kB sin APRIL y preferiblemente sin BAFF evita que la eficacia de BCMA-TCB para erradicar células tumorales positivas para BCMA en pacientes con MM se vea afectada negativamente por la concentración de APRIL y BAFF en el suero o en el tumor (véanse las figuras 1 y 2 y las descripciones de las figuras 1 y 2). Además, como BCMA-TCB no induce la activación de NF-kB sin APRIL y preferiblemente sin BAFF, no se produce la activación ni el incremento de la supervivencia de las células tumorales con respuesta positiva a BCMA en el caso en el que BCMA-TCB, por cualquier razón, no mate a las células tumorales, p. ej., al no unirse a CD3 sino solo a las células tumorales. Además, puede que tampoco se produzca la intemalización del receptor, lo que podría reducir la eficacia de BCMA-TCB. Debido a que la eficacia de los anticuerpos generalmente aumenta con la ocupación del tumor/concentración de TCB, el resultado con un BCMA-TCB sin un anticuerpo de BCMA según esta invención podría tener una variabilidad considerable en la eficacia entre pacientes (p. ej., menor eficacia global, véanse también las Figuras 1 y 2).
Preferiblemente, el anticuerpo según la invención en el caso de anticuerpos biespecíficos de células T se administra una o dos veces a la semana, preferiblemente mediante administración subcutánea (p. ej., preferiblemente en el rango de dosis de 0,25 a 2,5, preferiblemente a 25 mg/m2/semana). Debido a las actividades de citotoxicidad superiores del anticuerpo según la invención, se puede administrar al menos en la misma magnitud del rango de dosis clínica (o incluso menor) en comparación con los anticuerpos monoespecíficos convencionales o los anticuerpos biespecíficos convencionales que no son biespecíficos de células T (es decir, no se unen a CD3 en un brazo). Se prevé que para un anticuerpo según la invención se prefiere la administración subcutánea en el entorno clínico (p. ej., en el rango de dosis de 1 a 100 mg/m2/semana). Además, en pacientes con niveles elevados de APRIL y BAFF en suero (p. ej., pacientes con mieloma múltiple) puede que no sea necesario aumentar la dosis de un anticuerpo según esta invención ya que puede no verse afectado por la competición de ligandos. Por el contrario, puede ser necesario incrementar las dosis para otros anticuerpos anti-BCMA que bloquean/compiten con ligandos en estos pacientes. Otra ventaja del anticuerpo según la invención es una semivida de eliminación de aproximadamente 1 a 12 días lo que permite la administración al menos una o dos veces/semana.
Preferiblemente, el anticuerpo según la invención en el caso de anticuerpos monoespecíficos desnudos/no conjugados con ADCC aumentada es un anticuerpo con propiedades que permiten un tratamiento de una/dos veces a la semana por la ruta intravenosa pero preferiblemente por administración subcutánea (p. ej., una dosificación en el rango de 200-2.000 mg/semana durante 4 semanas). Debido a actividades superiores de ADCC y de depleción celular de los anticuerpos modificados por glicoingeniería frente a los anticuerpos convencionales (p. ej., el anticuerpo anti-CD20 modificado por glicoingeniería GA101 es 25 veces más potente que el anti-CD20 Rituximab en términos de CE50 para el ensayo de ADCC y 2 veces más potente en términos de depleción absoluta de células B; Mossner et al. Blood 2010; 115 (22): 2293-4402)), los anticuerpos modificados por glicoingeniería se administran al menos en la misma magnitud del rango de dosis clínica (o incluso menor) en comparación con los anticuerpos monoespecíficos convencionales. Por ejemplo, Rituximab (anti-CD20) se administra en una infusión lenta de 375 mg/m2/semana durante 4 u 8 semanas para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin recidivante/refractario (información de prescripción completa de RITUXAN® (Rituximab), Genentech, Inc., 2012). Debido a que los anticuerpos modificados por glicoingeniería pueden ejercer una alta eficacia en pacientes a dosis determinadas (Salles et al. Blood 2012; 119 (22): 5126-5132), se prevé que para un anticuerpo según la invención es posible la administración subcutánea y se prefiere en el entorno clínico (p. ej., en el rango de dosis de 100 - 1.000 mg/m2/semana, dependiendo de las indicaciones de la enfermedad). Además, en pacientes con niveles elevados de APRIL y BAFF en suero (p. ej., pacientes con mieloma múltiple), puede que no sea necesario aumentar la dosis de un anticuerpo según esta invención (p. ej., anticuerpo no bloqueante/competidor de ligando) ya que puede no verse afectado por la competición de ligandos. Por el contrario, puede ser necesario aumentar las dosis para otros anticuerpos anti-BCMA bloqueantes/competidores con ligandos en esos pacientes, lo que hace que la administración subcutánea sea técnicamente más desafiante (p. ej., farmacéutica). Otra ventaja del anticuerpo según la invención se basa en la inclusión de una porción Fc, que se asocia a una semivida de eliminación de ~12 días y permite la administración al menos una vez o dos veces/semana.
Un caso preferido adicional de la descripción es una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo según la descripción.
La invención se refiere además a un anticuerpo que se une específicamente a BCMA humano, caracterizado porque la unión de dicho anticuerpo no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 20 % medido en un ensayo ELISA como DO a
405 nm en comparación con la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano sin APRIL, dicho anticuerpo no altera la activación de n F-kB dependiente de APRIL en más de un 20 %, en comparación con APRIL solo, y dicho anticuerpo no altera la activación de NF-kB sin APRIL en más de un 20 %, en comparación con sin dicho anticuerpo. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 100 ng/ml de APRIL en más de un 15 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL en más de un 20 %, medido en dicho ELISA. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza además porque la unión de dicho anticuerpo a BCMA humano no se reduce por 1.000 ng/ml de APRIL en más de un 15 %, medido en dicho ELISA.
Preferiblemente, el anticuerpo según la invención no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 15 %. Preferiblemente, el anticuerpo según la invención no altera la activación de NF-kB sin APRIL en más de un 15 %.
La DO se puede medir a 405 nm o 450 nm (preferiblemente, con los mismos resultados relativos, comparación sin APRIL o BAFF). Según la invención, la DO puede medirse con APRIL o BAFF humano o murino (preferiblemente, con los mismos resultados relativos, comparación sin APRIL o BAFF). La invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a BCMA humano.
Descripción de las figuras
Figura 1. Propiedades de unión superiores de un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando frente a un anticuerpo anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando; o un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando que contiene TCB frente a un anticuerpo anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando que contiene TCB en células BCMA unidas a placa mediante ELISA. En este gráfico, concentraciones crecientes (es decir, 10, 100, 1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF soluble representativas de los niveles encontrados en la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple no alteran la unión de un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando o anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando que contiene TCB a BCMA unido a placas (línea continua). Por el contrario, las concentraciones altas (es decir, 100 ng/mL hasta 1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF soluble representativas de los niveles encontrados en la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple reducen la unión de un anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando o anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando que contiene TCB a BCMA unido a placas (línea de puntos). La concentración de los anticuerpos anti-BCMA o anti-BCMA que contiene TCB con diferentes propiedades es preferiblemente una concentración que varía de 0,1 pM a 200 nM al variar los niveles circulantes de APRIL o BAFF adicionales de 1 ng/mL (normal sano) a 100 ng/mL (MM, sangre) y más alto (MM, tumor en médula ósea).
Figura 2. Potencia superior en la citotoxicidad de células T redirigida de células de MM que expresan BCMA mediada por un anticuerpo biespecífico de células T que contiene un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando frente a un anticuerpo anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando en un ensayo de liberación de LDH. En este gráfico, concentraciones crecientes (es decir, 10, 100, 1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF soluble representativas de los niveles encontrados en la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple no alteran la potencia letal de un anticuerpo biespecífico de células T que contiene un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando específico para células de MM que expresan BCMA (línea continua). Por el contrario, las concentraciones altas (es decir, 100 ng/mL hasta 1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF soluble representativas de los niveles encontrados en la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple disminuyen la potencia letal de un anticuerpo biespecífico de células T que contiene un anticuerpo anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando específico para células de MM que expresan BCMA (línea de puntos). La concentración de biespecíficos de células T con anticuerpo anti-BCMA con diferentes propiedades es preferiblemente una concentración que varía de 0,1 pM a 200 nM al variar los niveles circulantes de APRIL o BAFF adicionales de 1 ng/mL (normal sano) a 100 ng/mL (MM, sangre) y más alto (MM, tumor en médula ósea).
Figura 3. Expresión de BCMA en líneas celulares de mieloma múltiple. Incremento de la intensidad de fluorescencia mediana después de la unión de concentraciones crecientes del anticuerpo anti-BCMA (de 0,3 a 10 pg/mL) a células H929 como se detecta por citometría de flujo.
Figura 4. Unión de anticuerpos anti-BCMA en células de mieloma múltiple positivas para BCMA. Intensidad de fluorescencia media para clones de IgG anti-BCMA representada en función de las concentraciones de anticuerpo anti-BCMA (de 0,2 a
40 pg/mL); (A) clones 13C2, 17A5, 83A10 en células H929, (B) clones 13C2, 17A5, 83A10 en células MKN45, (C) clones 13A4, 13D2, 14E1, 13A7, 14B11 en células H929 (D) clones 13A4, 13D2, 14E1, 13A7, 14B11 en células MKN45.
Figura 5. ELISA de competición. Se muestran los resultados de ELISA de la unión de 7 clones de Fab anti-BCMA seleccionados (13C2, 17A5, 83A19, 13A4, 13D2, 29B11, 13A7), a concentraciones saturantes de 500 o 1.000 nM, a BCMA humano inmovilizado en presencia de un rango de concentración de APRIL murino (de 1,56 a 100 nM). En caso de no competición, las señales permanecen constantes dentro de la variabilidad del ensayo a través del rango de concentración y las señales en presencia de APRIL murino son comparables a las de los pocillos de control donde no se añadió APRIL murino. En caso de competición, se mide una reducción de la señal dependiente de la concentración.
Figura 6. Competición de unión por FACS. Competición de A-APRIL con anticuerpos anti-BCMA detectada por citometría de flujo. Intensidad de fluorescencia mediana relativa de A-APRIL (señal FITc ) usado a una concentración de 1.000 ng/mL detectada en función de las concentraciones (1, 16 y 40 pg/mL) de los clones de anticuerpos anti-BCMA 13A4, 13D2, 14E1, 14B11 en células H929. La intensidad de fluorescencia mediana tras la unión de A-APRIL en presencia del control de isotipo se fijó en uno; las otras señales se normalizaron con respecto a este. La detección de la unión de APRIL a células H929 positivas para BCMA en presencia de anticuerpos anti-BCMA se midió mediante un anticuerpo conjugado con fluorocromo anti-HA.
Figura 7. Competición de unión por FACS. Competición de anticuerpos anti-BCMA con A-APRIL detectada por citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia mediana relativa del anticuerpo anti-BCMA (señal Alexa.Fluor 647) usado a una concentración de 40 pg/mL para clones de anticuerpos anti-BCMA 13A4, 13C7, 13D2, 14B11, 17A5, 83A10 en células RPMI detectada en ausencia o presencia de A-APRIL 1.000 ng/mL. La intensidad de fluorescencia mediana después de la unión de anticuerpos anti-BCMA en ausencia de A-APRIL se fijó en uno; las otras señales respectivas al anticuerpo anti-BCMA en presencia de A-APRIL se normalizaron con respecto a este. La detección de anticuerpos anti-BCMA que se unen a células RPMI positivas para BCMA en presencia de A-APRIL se midió mediante un anticuerpo conjugado con fluorocromo anti-Fc humano.
Figura 8. Competición de anticuerpos anti-BCMA con A-APRIL después de la incubación simultánea detectada por citometría de flujo. Se midieron (A) la señal de intensidad de fluorescencia media y de fluorescencia relativa (señal de Alexa.Fluor 647) de clones del anticuerpo anti-BCMA 14B11, 13D2, 13A4, 17A5 y 83A10 a la concentración de 20 |jg/mL en presencia o ausencia de 2,5 jg/m L de A-APRIL o (B) la señal de intensidad de fluorescencia media y de fluorescencia relativa de A-APRIL (señal de FITC) a una concentración de 2,5 jg/m L de A-APRIL y el clon de anticuerpo anti-BCMA 83A10 (20 jg/mL) (señal de Alexa.Fluor 647). La detección de anticuerpo anti-BCMA en presencia de A-APRIL con anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC se normalizó con respecto a la señal del clon de anticuerpo anti-BCMA en ausencia de A-APRIL. La detección de A-APRIL en presencia del clon de anticuerpo anti-BCMA con el anticuerpo anti-HA conjugado con Alexa.Fluor 647 se normalizó con respecto a la señal de A-APRIL en presencia del control de isotipo.
Descripción detallada de la invención
El término "BCMA, el BCMA diana, BCMA humano" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a la diana de maduración de células B humanas, también conocida como BCMA; TR17_HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), que es un miembro de la superfamilia de receptores de necrosis tumoral que se expresa preferentemente en células plasmáticas diferenciadas. El dominio extracelular de BCMA consiste, según UniProt, en los aminoácidos 1-54 (o 5­ 51). El término "anticuerpo contra BCMA, anticuerpo anti BCMA" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de BCMA.
"Que se une específicamente a BCMA" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse al BCMA diana con una afinidad suficiente como para que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico para tomar como diana BCMA. En algunas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo anti-BCMA a una proteína no relacionada con y distinta de BCMA es aproximadamente 10 veces preferiblemente >100 veces menor que la unión del anticuerpo a BCMA medida, p. ej., por resonancia de plasmón superficial (SPR), p. ej., Biacore®, inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) o citometría de flujo (FACS). Preferiblemente, el anticuerpo que se une a BCMA tiene una constante de disociación (Kd) de 10'8 M o menos, preferiblemente de 10'8 M a 10'13 M, preferiblemente de 10'9 M a 10'13 M. Preferiblemente, el anticuerpo anti-BCMA se une a un epítopo de BCMA que se conserva entre los BCMA de diferentes especies, preferiblemente entre seres humanos y cinomolgos. "Anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD3 y BCMA" se refiere a una definición respectiva para la unión a ambas dianas. Un anticuerpo que se une específicamente a BCMA (o BCMA y CD3) no se une a otros antígenos humanos. Por lo tanto, en un El iSa , los valores de DO para dichas dianas no relacionadas serán iguales a o menores del límite de detección del ensayo específico, preferiblemente > 0,3 ng/mL, o iguales a o menores de los valores de DO de las muestras control sin BCMA unido a las placas o con células HEK293 no transfectadas.
El término "APRIL" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a APRIL murino truncado recombinante (aminoácidos 106-241; Np_076006). APRIL se puede producir como se describe en Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18).
El término "BAFF" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a BAFF humano truncado recombinante (UniProt Q9Y275 (TN13b_HUMAN) que se puede producir como se describe en Gordon, 2003 (Biochemistry; 42 (20): 5977-5983). Preferiblemente, se usa un BAFF etiquetado con His según la invención. Preferiblemente, el BAFF etiquetado con His se produce clonando un fragmento de ADN que codifica los residuos de BAFF 82-285 en un vector de expresión, creando una fusión con una etiqueta His N-terminal seguida de un sitio de escisión de trombina, expresando dicho vector y escindiendo la proteína recuperada con trombina.
Los anticuerpos anti-BCMA se analizan mediante ELISA para determinar su unión a BCMA humano usando BCMA unido a placas en presencia y ausencia de APRIL y/o BAFF. Para este ensayo, se usa una cantidad de BCMA unido a placas preferiblemente de 1,5 jg/mL y concentración o concentraciones que varían de 0,1 pM a 200 nM de anticuerpo anti-BCMA. Un anticuerpo de BCMA para el que no se inhibe su unión a BCMA según la invención es un anticuerpo anti BCMA "que no inhibe la unión de APRIL y/o BAFF a BCMA humano en un ensayo ELISA ".
El término "NF-kB" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a p50 de NF-kB recombinante (número de acceso (P19838). La actividad de NF-kB se mide mediante un ELISA de unión a ADN de un extracto de células de MM NCI-H929 (CRL-9068™). Las células de MM NCI-H929, no tratadas o tratadas con 0,1 jg/m L de TNF-a, 1.000 ng/mL de BAFF truncado tratado con calor HT, 1.000 ng/mL de BAFF truncado, 0,1 pM a 200 nM de control de isotipo, y con o sin 0,1 pM a 200 nM de anticuerpos anti-BCMA se incuban durante 20 min. La actividad de NF-kB se ensaya usando un ELISA funcional que detecta la señal quimioluminiscente de p65 unido a la secuencia consenso de NF-kB (US6150090).
Un anticuerpo que no bloquea la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más un 20 % y no reduce la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 % y no aumenta la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 % se considera que "no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL" en más de un 20 % en comparación con la activación de NF-kB inducida por APRIL sin un anticuerpo según la invención (grupo de control); el 20 % representa la variabilidad estándar media entre experimentos. Preferiblemente, un anticuerpo según la invención no altera la activación de NF-kB dependiente de APRlL en más de un 15 %.
Un anticuerpo que no bloquea la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 20 % y no reduce la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 20 % y no aumenta la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 20 % se considera que "no altera la activación de NF-kB dependiente de BAFF" en más de un 20 % en comparación con la activación de NF-kB inducida por BAFF sin un anticuerpo según la invención (grupo de control); el 20 % representa la variabilidad estándar media entre experimentos. Preferiblemente, un anticuerpo según la invención no altera la activación de NF-kB dependiente de BAFF en más de un 15 %.
Un anticuerpo que no bloquea la activación de NF-kB sin APRIL y BAFF en más de un 20 % y no reduce la activación de NF-kB sin APRIL y BAFF en más de un 20 % y no aumenta la activación de NF-kB sin APRIL y BAFF en más de un 20 % se considera que "no altera la activación de NF-kB sin APRIL y BAFF" en más de un 20 % en comparación con la activación de NF-kB inducida por APRIL sin un anticuerpo según la invención (grupo de control); el 20 % representa la variabilidad estándar media entre experimentos. Preferiblemente, un anticuerpo según la invención no altera la activación de NF-kB sin APRIL y BAFF en más de un 15 %.
Además, si un anticuerpo según la invención se usa en gran exceso, preferiblemente hasta 500 nM o 1.000 nM, la unión de dicho anticuerpo no se reduce por 100ng/ml de APRIL y preferiblemente por BAFF en más de un 20 % y no altera la activación de NF-kB dependiente de APRIL en más de un 20 %, con y sin APRIL y preferiblemente con y sin BAFF en más de un 20 %.
El término "diana adicional" tal y como se usa en la presente memoria significa preferiblemente CD3e. El término "primera diana y segunda diana" significa bien CD3 como primera diana y BCMA como segunda diana o significa BCMA como primera diana y CD3 como segunda diana.
El término "CD3e o CD3" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a CD3e humano descrito en UniProt P07766 (CD3E_HUMAN). El término "anticuerpo contra CD3e, anticuerpo anti CD3e" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a CD3e. Preferiblemente, el anticuerpo comprende un dominio variable VH que comprende las CDR de cadena pesada de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 como CDR1, c DR2 y CDR3 de cadena pesada respectivamente y un dominio variable VL que comprende las CDR de cadena ligera de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 como c DR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, respectivamente. Preferiblemente, el anticuerpo comprende los dominios variables de la SEQ ID NO:7 (VH) y SEQ ID NO:8 (VL).
El término "anticuerpo" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo consiste en dos pares de una "cadena ligera" (LC) y una "cadena pesada" (HC) (dichos pares de cadena ligera (LC)/cadena pesada se abrevian en la presente memoria como LC/h C). Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de dichos anticuerpos son polipéptidos que consisten en varios dominios. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende los dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3 (clases de anticuerpos IgA, IgD e IgG) y opcionalmente el dominio constante de cadena pesada CH4 (clases de anticuerpos IgE e IgM). Cada cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera VL y un dominio constante de cadena ligera CL. Los dominios variables VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los "dominios constantes" de la cadena pesada y de la cadena ligera no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a una diana, pero exhiben varias funciones efectoras.
El término "anticuerpo" incluye, p. ej., anticuerpos de ratón, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos modificados genéticamente (anticuerpos variantes o mutantes) siempre que se conserven sus propiedades características. Son especialmente preferidos los anticuerpos humanos o humanizados, especialmente como anticuerpos humanos o humanizados recombinantes.
El término "anticuerpo biespecífico" tal y como se usa en la presente memoria se refiere preferiblemente a un anticuerpo en el que uno de los dos pares de cadena pesada y cadena ligera (HC/LC) se une específicamente a CD3 y el otro se une específicamente a BCMA. El término también se refiere a otros formatos de anticuerpos biespecíficos según el estado de la técnica, preferiblemente a anticuerpos monocatenarios biespecíficos.
El término "anticuerpo desnudo", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a BCMA, que comprende una parte Fc y que no está conjugado con un agente terapéutico, p. ej., con un agente citotóxico o radiomarcaje. El término "anticuerpo conjugado, conjugado de fármaco", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a BCMA y que está conjugado con un agente terapéutico, p. ej., con un agente citotóxico o radiomarcaje.
El término "anticuerpo monocatenario biespecífico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una cadena polipeptídica única que comprende preferiblemente dos dominios de unión, uno que se une específicamente a BCMA y el otro que se une específicamente preferiblemente a CD3. Cada dominio de unión comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo ("región VH"), en donde la región VH del primer dominio de unión se une específicamente a la molécula de CD3, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente a BCMA. Los dos dominios de unión están opcionalmente unidos entre sí mediante un espaciador polipeptídico corto. Un ejemplo no limitante de un espaciador polipeptídico es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) y repeticiones del mismo. Cada dominio de unión puede comprender adicionalmente una región variable de una cadena ligera de anticuerpo ("región VL"), la región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo, estando unidas entre sí a través de un enlazador polipeptídico, lo suficientemente largo como para permitir que la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión se emparejen entre sí de manera que, juntas, puedan unirse específicamente a los respectivos dominios de unión primero y segundo (véase, EP0623679). Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos también se mencionan, p. ej., en Choi BD et al., Expert Opin Biol Ther. 2011 jul;11(7):843-53 y Wolf E. et al., Drug Discov Today. 2005 sep 15;10(18):1237-44.
El término "diacuerpo" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un pequeño fragmento de anticuerpo bivalente y biespecífico que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL) conectada por un enlazador peptídico que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena (Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772). Esto fuerza el emparejamiento con los dominios complementarios de otra cadena y promueve el ensamblaje de una molécula dimérica con dos sitios de unión de antígeno funcionales. Para construir diacuerpos biespecíficos de la invención, los dominios V de un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-BCMA se fusionan para crear las dos cadenas VH(CD3)-VL(BCMA), VH(BCMA)-VL(CD3). Cada cadena por sí misma no puede unirse al antígeno respectivo, pero recrea los sitios de unión al antígeno funcionales del anticuerpo anti-CD3 y del anticuerpo anti-BCMA al emparejarse con la otra cadena. Las dos moléculas scFv, con un enlazador entre el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera que es demasiado corto para la dimerización intramolecular, se coexpresan y se autoensamblan para formar moléculas biespecíficas con los dos sitios de unión en extremos opuestos. A modo de ejemplo, las regiones variables que codifican los dominios de unión para BCMA y CD3, respectivamente, pueden amplificarse mediante PCR a partir de construcciones de ADN obtenidas como se describe, de modo que puedan clonarse en un vector como pHOG, como se describe en Kipiriyanov et al., J. Immunol, Methods, 200, 69 - 77 (1997a). A continuación, las dos construcciones de scFV se combinan en un vector de expresión en la orientación deseada, por lo que el enlazador VH-VL se acorta para evitar el plegado inverso de las cadenas sobre sí mismas. Los segmentos de ADN están separados por un codón de PARADA y un sitio de unión al ribosoma (RBS). El RBS permite la transcripción del ARNm como un mensaje bicistrónico, que es traducido por los ribosomas en dos proteínas que interaccionan de forma no covalente para formar la molécula de diacuerpo. Los diacuerpos, como otros fragmentos de anticuerpos, tienen la ventaja de que pueden expresarse en bacterias (E. coli) y levaduras (Pichia pastoris) en forma funcional y con altos rendimientos (hasta Ig/l).
El término "scFV en tándem", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de Fv de cadena única (es decir, una molécula formada por la asociación de los dominios variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, VH y VL, respectivamente) como se describe, p. ej., en WO 03/025018 y WO 03/048209. Dichas moléculas de Fv, que se conocen como TandAbs®, comprenden cuatro dominios variables de anticuerpos, en los que (i) bien los dos primeros o los dos últimos de los cuatro dominios variables se unen intramolecularmente entre sí dentro de la misma cadena formando un scFv de unión al antígeno en la orientación VH/VL o VL/VH (ii) los otros dos dominios se unen intermolecularmente con los dominios VH o VL correspondientes de otra cadena para formar los pares VH/VL de unión al antígeno. En una realización preferida, como se sugiere en WO 03/025018, los monómeros de dicha molécula de Fv comprenden al menos cuatro dominios variables de los cuales dos dominios vecinos de un monómero forman una unidad scFv VH-VL o VL-VH de unión a antígeno.
El término "DARPins" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula de repetición de anquirina biespecífica como se describe, p. ej., en US 2009082274. Estas moléculas se derivan de proteínas anquirinas naturales, que se pueden encontrar en el genoma humano y son uno de los tipos más abundantes de proteínas de unión. Un módulo de biblioteca de DARPin se define por secuencias de proteínas de repetición de anquirina naturales, usando 229 repeticiones de anquirina para el diseño inicial y otras 2.200 para el refinamiento posterior. Los módulos sirven como bloques de construcción para las bibliotecas de DARPin. Los módulos de la biblioteca se asemejan a las secuencias del genoma humano. Una DARPin se compone de 4 a 6 módulos. Como cada módulo tiene un tamaño de aprox. 3,5 kDa, el tamaño de una DARPin promedio es 16-21 kDa. La selección de ligantes se realiza mediante presentación en ribosomas, que carece completamente de células y se describe en He M y Taussig MJ., Biochem Soc Trans. 2007, nov;35(Pt 5):962-5.
El término "acoplador biespecífico de células T" son proteínas de fusión que consisten en dos fragmentos variables de cadena única (scFv) de diferentes anticuerpos, o secuencias de aminoácidos de cuatro genes diferentes, en una sola cadena peptídica de aproximadamente 55 kilodaltons. Uno de los scFv se une a las células T a través del receptor de CD3 y el otro a un BCMA.
Hay cinco tipos de cadenas pesadas de anticuerpos de mamíferos indicadas por letras griegas: a, 8, £, y y H (Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology. 5a ed., Garland Publishing). El tipo de cadena pesada presente define la clase de anticuerpo; estas cadenas se encuentran en los anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente (Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4a ed., Thomson Learning). Las distintas cadenas pesadas difieren en tamaño y composición; a y y contienen aproximadamente 450 aminoácidos, mientras que p y £ tienen aproximadamente 550 aminoácidos.
Cada cadena pesada tiene dos regiones, la región constante y la región variable. La región constante es idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, pero difiere en los anticuerpos de diferente isotipo. Las cadenas pesadas y, a y 8 tienen una región constante compuesta por tres dominios constantes CH1, CH2 y CH3 (en una línea), y una región de bisagra para mayor flexibilidad (Woof J, Burton D Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99); las cadenas pesadas p y £ tienen una región constante compuesta por cuatro dominios constantes CH1, CH2, CH3 y CH4 (Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology. 5a ed., Garland Publishing). La región variable de la cadena pesada difiere en los anticuerpos producidos por diferentes células B, pero es la misma para todos los anticuerpos producidos por una sola célula B o clon de células B. La región variable de cada cadena pesada tiene aproximadamente 110 aminoácidos de longitud y está compuesta por un solo dominio de anticuerpo.
En los mamíferos, solo hay dos tipos de cadenas ligeras, que se denominan lambda (A) y kappa (k). Una cadena ligera tiene dos dominios sucesivos: un dominio constante CL y un dominio variable VL. La longitud aproximada de una cadena ligera es de 211 a 217 aminoácidos. Preferiblemente, la cadena ligera es una cadena ligera kappa (k), y el dominio constante CL se deriva preferiblemente de una cadena ligera kappa (k) (el dominio constante CK).
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición única de aminoácidos.
Los "anticuerpos" según la invención pueden ser de cualquier clase (p. ej., IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, preferiblemente IgG o IgE) o subclase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, preferiblemente IgG1), por lo que ambos anticuerpos, a partir de los cuales se deriva el anticuerpo bivalente biespecífico según la invención, tienen una parte Fc de la misma subclase (p. ej., IgG1, IgG4 y similares, preferiblemente IgG1), preferiblemente del mismo alotipo (p. ej., caucásico).
Una "parte Fc de un anticuerpo" es un término bien conocido por el experto en la técnica y definido sobre la base de la escisión de anticuerpos con papaína. Los anticuerpos según la invención contienen como parte Fc, preferiblemente una parte Fc derivada de origen humano y preferiblemente todas las demás partes de las regiones constantes humanas. La parte Fc de un anticuerpo está implicada directamente en la activación del complemento, la unión de C1q, la activación de C3 y la unión del receptor de Fc. Si bien la influencia de un anticuerpo en el sistema del complemento depende de ciertas condiciones, la unión a C1q está causada por sitios de unión definidos en la parte Fc. Dichos sitios de unión son conocidos en el estado de la técnica y se describen, p. ej., por Lukas, TJ., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. y Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; y EP 0307 434.
Dichos sitios de unión son, p. ej., L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat, véase más adelante). Los anticuerpos de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3 suelen mostrar activación del complemento, unión de C1q y activación de C3, mientras que IgG4 no activa el sistema del complemento, no se une a C1q y no activa a c 3. Preferiblemente, la parte Fc es una parte Fc humana.
Preferiblemente, un anticuerpo según la invención comprende una variante de Fc de una región Fc de IgG humana de tipo salvaje, comprendiendo dicha variante de Fc una sustitución de aminoácido en la posición Pro329 y al menos una sustitución de aminoácido adicional, en donde los residuos están numerados según el índice EU de Kabat, y en donde dicho anticuerpo muestra una afinidad reducida por el FcyRIIIA y/o FcyRIIA y/o FcyRI humano en comparación con un anticuerpo que comprende la región Fc de IgG de tipo salvaje, y en donde la ADCC inducida por dicho anticuerpo se reduce al menos un
20 % de la ADCC inducida por el anticuerpo que comprende una región Fc de IgG humana de tipo salvaje. En una realización específica, la Pro329 de una región Fc humana de tipo salvaje en el anticuerpo según la invención se sustituye con glicina o arginina o un residuo de aminoácido lo suficientemente grande como para destruir el sándwich de prolina dentro de la interfaz Fc/receptor Fcy, que se forma entre la prolina329 del Fc y los residuos de triptófano Trp 87 y Tip 110 de FcyRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 de julio de 2000)). En un aspecto adicional de la invención, la al menos una sustitución de aminoácido adicional en la variante de Fc es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S y aún en otra realización dicha al menos una sustitución de aminoácido adicional es L234A y L235A de la región Fc de IgG1 humana o S228P y L235E de la región Fc de IgG4 humana. Dichas variantes de Fc se describen con detalle en WO2012130831.
Por "función efectora", tal y como se usa en la presente memoria, se quiere decir un evento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor de o ligando Fc. Las funciones efectoras incluyen, pero no están limitadas a, ADCC, ADCP y CDC. Por "célula efectora", tal y como se usa en la presente memoria, se entiende una célula del sistema inmune que expresa uno o más receptores de Fc y media una o más funciones efectoras. Las células efectoras incluyen, pero no están limitadas a, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células asesinas naturales (NK) y células T y§, y pueden ser de cualquier organismo, incluidos, pero no limitado a, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Por "biblioteca" se entiende en la presente memoria un conjunto de variantes de Fc en cualquier forma, que incluye, pero no está limitado a, una lista de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, una lista de sustituciones de ácidos nucleicos o aminoácidos en posiciones variables, una biblioteca física que comprende ácidos nucleicos que codifican las secuencias de la biblioteca, o una biblioteca física que comprende las proteínas variantes de Fc, ya sea en forma purificada o sin purificar.
Por "receptor gamma de Fc" o "FcyR" tal y como se usa en la presente memoria se quiere decir cualquier miembro de la familia de proteínas que se unen a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificado sustancialmente por los genes de FcyR. En los seres humanos, esta familia incluye, pero no está limitada a, FcyRI (CD64), incluidas las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), incluidas las isoformas FcYRIIa (incluidos los alotipos H131 y R131), FcYRIIb (incluidos FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), incluidas las isoformas FcYRIIIa (incluidos los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (incluidos los alotipos FcYRIIb-NA1 y FcYRIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), así como cualquier FcyR o isoformas o alotipos de FcyR humanos no descubiertos todavía. Un FcyR puede ser de cualquier organismo, incluidos, pero no limitado a, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Los FcyR de ratón incluyen, pero no están limitados a, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16)y FcyRIII-2 (CD16-2), así como cualquier FcyR o isoformas o alotipos de FcyR de ratón no descubiertos todavía.
"Variante de Fc con función efectora aumentada", tal y como se usa en la presente memoria, significa una secuencia de Fc que difiere de una secuencia de Fc parental en virtud de al menos una modificación de aminoácido o se refiere a otras modificaciones como enmienda de la glicosilación en, p. ej., Asn279 que aumentan las funciones efectoras. Dichas modificaciones se mencionan, p. ej., en Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991 , J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, //77muno/ Lett 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178- 4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200: 16-26; Idusogie et al., 2001 , J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001 , J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; US5624821; US5885573; US6194551; WO200042072; WO199958572. Dichas modificaciones de Fc también incluyen, según la invención, glicoformas modificadas por ingeniería de la parte Fc. Por "glicoforma modificada por ingeniería", tal y como se usa en la presente memoria, se quiere decir una composición de carbohidratos que se acopla de forma covalente a un polipéptido Fc, en donde dicha composición de carbohidratos difiere químicamente de la de un polipéptido Fc parental. Las glicoformas modificadas por ingeniería se pueden generar mediante cualquier método, por ejemplo, mediante el uso de cepas de expresión modificadas por ingeniería o variantes, mediante la coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo D1-4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), mediante la expresión de un polipéptido Fc en varios organismos o líneas celulares de varios organismos, o mediante la modificación del o de los carbohidratos después de que se haya expresado el polipéptido Fc. Los métodos para generar glicoformas modificadas por ingeniería se conocen en la técnica y se mencionan en Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) US6602684; WO200061739; WO200129246; WO200231140; WO200230954; tecnología Potelligent™ (Biowa, Inc., Princeton, N.J.); tecnología de ingeniería de glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza)). La glicoforma modificada por ingeniería se refiere típicamente a la composición diferente de carbohidratos u oligosacáridos respecto a la del polipéptido Fc parental.
Los anticuerpos según la invención que comprenden una variante de Fc con función efectora aumentada muestran una alta afinidad de unión al receptor de Fc gamma III (FcyRIII, CD 16a). La alta afinidad de unión a FcyRIII denota que la unión está mejorada para CD16a/F158 al menos 10 veces en relación con el anticuerpo parental (95 % de fucosilación) como referencia expresada en células huésped CHO, tales como células CHO d G44 o CHO K1, o/y la unión se mejora para CD16a/V158 al menos 20 veces en relación con el anticuerpo parental medido por Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) usando CD 16a inmovilizado a una concentración de anticuerpo de 100 nM. La unión a FcyRIII puede aumentarse mediante métodos según el estado de la técnica, p. ej., modificando la secuencia de aminoácidos de la parte Fc o la glicosilación de la parte Fc del anticuerpo (véase, p. ej., EP2235061). Mori, K et al., Cytotechnology 55 (2007)109 y Satoh M, et al., Expert Opin Biol Ther. 6 (2006) 1161-1173 se refieren a una línea CHO con el gen FUT8 inactivado (a-1,6-fucosiltransferasa) para la generación de anticuerpos afucosilados.
La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir, una región de unión, de una fuente o especie y al menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, usualmente preparada mediante técnicas de ADN recombinante. Se prefieren los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de "anticuerpos quiméricos" englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante ha sido modificada o cambiada de la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente en lo que respecta a la unión de C1q y/o la unión al receptor de Fc (FcR). Dichos anticuerpos quiméricos también se denominan "anticuerpos de clase cambiada". Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica que son muy conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes de EE. UU. Nos.
5.202.238 y 5.204.244.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que el marco o las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR) se han modificado para comprender la CDR de una inmunoglobulina de diferente especificidad en comparación con la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferida, se injerta una CDR murina en la región marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado". Véase, p. ej., Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Otras formas de "anticuerpos humanizados" englobados por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente de la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente en lo que respecta a la unión de C1q y/o la unión al receptor de Fc (FcR).
El término "anticuerpo humano", tal y como se usa en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, MA, y van de Winkel, J.G, Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). También es posible producir anticuerpos humanos en animales transgénicos (p. ej., ratones) que son capaces, después de la inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulinas endógenas. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos (véase, p. ej., Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M. et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). También es posible producir anticuerpos humanos en bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom, H.R y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Como ya se ha mencionado para anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, el término "anticuerpo humano" tal y como se usa en la presente memoria también comprende dichos anticuerpos que se modifican en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o la unión a FcR, p. ej., por "cambio de clase", es decir, cambio o mutación de partes de Fc (p. ej., de IgG1 a IgG4 y/o mutación IgG1/IgG4).
El término “anticuerpo humano recombinante”, tal y como se usa en la presente memoria, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan a través de medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula huésped tal como una célula NSO o CHO o de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en forma reordenada. Los anticuerpos humanos recombinantes según la invención han sido sometidos a hipermutación somática in vivo. Así, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)) tal y como se usa en la presente memoria, denota cada uno de los pares de cadenas ligeras y pesadas que están implicados directamente en la unión del anticuerpo según la invención. Los dominios de cadenas ligeras y pesadas variables humanas tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de la complementariedad, CDR). Las regiones marco adoptan una conformación de lámina p y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de láminas p. Las CDR en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional mediante las regiones marco y forman, junto con las CDR de la otra cadena, el sitio de unión. Las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de la unión de los anticuerpos según la invención y, por lo tanto, proporcionan un objeto adicional de la invención.
Los términos "región hipervariable" o "porción de unión a la diana de un anticuerpo" cuando se usan en la presente memoria se refieren a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a la diana. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de las "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las regiones "marco" o "FR" son aquellas regiones del dominio variable diferentes a los residuos de la región hipervariable tal como se define en la presente memoria. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden desde el extremo N al extremo C los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, Cd R3 y FR4. Las CDR de cada cadena están separadas por dichos aminoácidos marco. Especialmente, CDR3 de la cadena pesada es la región que más contribuye a la unión a la diana. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
El dominio de cadena pesada constante CH1 por el que se reemplaza el dominio de cadena pesada CH3 puede ser de cualquier clase de Ig (p. ej., IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), o subclase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2).
El dominio de cadena ligera constante CL por el que se reemplaza el dominio de cadena pesada CH3 puede ser del tipo lambda (A) o kappa (k), preferiblemente del tipo kappa (k).
El término "diana" o "molécula diana" tal y como se usa en la presente memoria se usa de manera intercambiable y se refiere a BCMA humano. Con respecto a los anticuerpos biespecíficos, el término se refiere a BCMA y la segunda diana. Preferiblemente, con respecto a los anticuerpos biespecíficos, el término se refiere a BCMA y CD3.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de unirse de manera específica a un anticuerpo. En determinadas realizaciones, el determinante de epítopos incluye agrupamientos de moléculas en la superficie químicamente activas, tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo o sulfonilo y, en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de una diana a la que se une un anticuerpo.
En general, existen dos vectores que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo según la invención. Con respecto a un anticuerpo biespecífico, existen dos vectores que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de dicho anticuerpo que se unen específicamente a la primera diana y otros dos vectores que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de dicho anticuerpo que se unen específicamente a la segunda diana. Uno de los dos vectores codifica la cadena ligera respectiva y el otro de los dos vectores codifica la cadena pesada respectiva. Sin embargo, en un método alternativo para la preparación de un anticuerpo según la invención, solo un primer vector que codifica la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo que se une específicamente a la primera diana y solo un segundo vector que codifica la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo que se une específicamente a la segunda diana puede usarse para transformar la célula huésped.
El término "ácido nucleico o molécula de ácido nucleico", tal y como se usa en la presente memoria, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
Tal y como se usan en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de manera intercambiable y todas dichas designaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria objeto y los cultivos derivados de la misma sin importar el número de transferencias. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a mutaciones inadvertidas o deliberadas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la célula originalmente transformada. Cuando se pretenden designaciones distintas, resultará claro a partir del contexto.
El término "transformación" tal y como se usa en la presente memoria, se refiere al proceso de transferencia de un vector/ácido nucleico en una célula huésped. Si se utilizan células sin barreras de pared celular formidables como células huésped, la transfección se lleva a cabo, p. ej., mediante el método de precipitación con fosfato cálcico como se describe por Graham y Van der Eh, Virology 52 (1978) 546ff. Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir ADN en células, tales como por inyección nuclear o por fusión de protoplastos. Si se utilizan células procariotas o células que contienen construcciones sustanciales de pared celular, p. ej., un método de transfección es el tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio como se describe por Cohen Sn , et al, PNAS 1972, 69 (8): 2110­ 2114.
La producción recombinante de anticuerpos usando transformación es bien conocida en el estado de la técnica y se describe, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S. C, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, RJ., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., et al., Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880, así como en US6331415 y US4816567.
Tal y como se usa en la presente memoria, "expresión" se refiere al proceso mediante el cual un ácido nucleico se transcribe en ARNm y/o al proceso por el cual el ARNm transcrito (también denominado como transcrito) se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente producto génico. Si el polinucleótido deriva de ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el corte y empalme del ARNm.
Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, en particular autorreplicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada en y/o entre las células huésped. El término incluye vectores que funcionan principalmente para la inserción de ADN o ARN en una célula (p. ej., integración cromosómica), replicación de vectores que funcionan principalmente para la replicación de ADN o ARN y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. También se incluyen vectores que proporcionan más de una de las funciones descritas.
Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula huésped adecuada, se puede transcribir y traducir en un polipéptido. Un "sistema de expresión" normalmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar para rendir un producto de expresión deseado.
Los anticuerpos según la invención se producen preferiblemente por medios recombinantes. Dichos métodos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el posterior aislamiento del polipéptido del anticuerpo y habitualmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de proteínas, se insertan los ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas o fragmentos de las mismas en vectores de expresión mediante métodos estándar. La expresión se realiza en células huésped procariotas o eucariotas apropiadas tales como células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células de levadura o E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante o células después de la lisis). Los anticuerpos biespecíficos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. La purificación se realiza con el fin de eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, p. ej., otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, cromatografía en columna y otros bien conocidos en la técnica. Véase Ausubel, F., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987).
La expresión en células NS0 se describe, p. ej., por Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; y Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria se describe, p. ej., por Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. La clonación de dominios variables se describe por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK293) se describe por Schlaeger, E.- J. y Christensen, K., en Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y por Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.
Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de poliadenilación.
Los anticuerpos se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxiapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN o ARN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como una fuente de dicho ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN se puede insertar en vectores de expresión, que se transfectan entonces en células huésped tales como células HEK293, células CHO, o células de mieloma que no producen de otra manera la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.
Las variantes (o mutantes) de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo según la invención se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante síntesis de nucleótidos. Sin embargo, dichas modificaciones se pueden realizar solo en un rango muy limitado, p. ej., como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características del anticuerpo mencionadas anteriormente, tales como el isotipo de IgG y la unión a la diana, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.
Los ligantes biespecíficos de células T (TCB) tienen una potencia que depende mucho de la concentración/ocupación de los receptores de las células tumorales sobre la muerte celular (p. ej., CE50 en ensayos de muerte celular in vitro en el rango subpicomolar o picomolar bajo; Dreier et al. Int J Cancer 2002), los ligantes biespecíficos de células T (TCB) se administran en dosis mucho más bajas que los anticuerpos monoespecíficos convencionales. Por ejemplo, blinatumomab (CD19xCD3) se proporciona a una dosis intravenosa continua de 5 a 15 |jg/m2/día (es decir, solo 0,35 a 0,105 mg/m2/semana) para el tratamiento de la leucemia linfocítica aguda o 60 jg /m 2/día para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin, y las concentraciones séricas a estas dosis están en el rango de 0,5 a 4 ng/ml (Klinger et al., Blood 2012; Topp et al., J Clin Oncol 2011; Goebeler et al. Ann Oncol 2011). Como las dosis bajas de TCB pueden ejercer una alta eficacia en los pacientes, se prevé que para un anticuerpo según la invención la administración subcutánea es posible y preferida en los entornos clínicos (preferiblemente en el rango de dosis de 0,25 a 2,5 mg/m2/semana). Incluso a estas bajas concentraciones/dosis/ocupaciones de receptor, el TCB puede causar considerables eventos adversos (Klinger et al., Blood 2012). Por tanto, es crítico controlar la ocupación/cobertura de las células tumorales. En pacientes con niveles altos y variables de APRIL y BAFF en suero (p. ej., pacientes con mieloma múltiple, Moreaux et al. 2004; Blood 103 (8): 3148-3157), el número de TCB unidos a las células tumorales resp. a la ocupación de células tumorales puede verse considerablemente influido por APRIL/BAFF. Pero al usar dicho anticuerpo de esta invención, la ocupación de células tumorales respectivamente eficacia/seguridad puede que no sea necesario aumentar la dosis de un anticuerpo según esta invención, ya que dicho anticuerpo puede no verse influido por la competición de ligando APRIL/BAFF. Otra ventaja del anticuerpo según la invención se basa en la inclusión de una porción Fc, que aumenta la semivida de eliminación a ~12 días y permite al menos administraciones de una o dos veces/semana en comparación con los TCB sin una porción de Fc (p. ej., blinatumomab) que deben proporcionarse por vía intravenosa y continuamente con una bomba portada por los pacientes.
Tabla 1
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Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar el entendimiento de la presente invención, el verdadero alcance de la cual se establece en las reivindicaciones adjuntas.
Materiales y métodos generales
Se proporciona información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas. en: Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpos se numeran y mencionan de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).
Técnicas de ADN recombinante
Se usaron métodos estándar para manipular el ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos de biología molecular se utilizaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Se proporciona información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., NIH Publication No. 91-3242. Síntesis génica
Los segmentos de genes deseados se preparan a partir de oligonucleótidos producidos por síntesis química. Los segmentos génicos de 600 - 1800 pb de longitud, que están flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares, se ensamblan por hibridación y ligación de oligonucleótidos, incluida la amplificación por PCR, y posteriormente se clonan a través de los sitios de restricción indicados, p. ej., Kpnl/Sad o Ascl/Pacl en un vector de clonación pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene). Las secuencias de ADN de los fragmentos de genes subclonados se confirman mediante secuenciación de ADN. Los fragmentos de síntesis génica se ordenan de acuerdo con especificaciones dadas en Geneart (Regensburg, Alemania).
Determinación de la secuencia de ADN
Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciación de doble cadena.
Análisis de secuencias de ADN y proteínas y gestión de los datos de las secuencias
Se usa el paquete de software de GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) versión 10.2 y el paquete de Infomax Vector NT1 Advance versión 8.0 para la creación, mapeo, análisis, anotación e ilustración de las secuencias.
Vectores de expresión
a) Para la expresión de los anticuerpos descritos, se aplican las variantes de plásmidos de expresión para expresión transitoria (p. ej., en células HEK293 EBNA o HEK293-F) basadas en una organización de ADNc con un promotor CMV-Intrón A o en una organización genómica con un promotor CMV.
Además del casete de expresión de anticuerpos, los vectores contenían:
- un origen de replicación que permite la replicación de este plásmido en E. coli, y un gen de p-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli.
La unidad de transcripción del gen del anticuerpo se compone de los siguientes elementos:
- sitio o sitios de restricción únicos en el extremo 5' - el potenciador temprano inmediato y el promotor del citomegalovirus humano,
- seguido de la secuencia del Intrón A en el caso de la organización de ADNc,
- una región no traducida 5' de un gen de anticuerpo humano,
- una secuencia señal de cadena pesada de inmunoglobulina,
- la cadena de anticuerpo humano (de tipo salvaje o con intercambio de dominios) bien como ADNc o como organización genómica con una organización exón-intrón de inmunoglobulina
- una región no traducida 3' con una secuencia señal de poliadenilación, y
- sitio o sitios de restricción únicos en el extremo 3'.
Los genes de fusión que comprenden las cadenas de anticuerpos descritas como se describe a continuación se generan mediante PCR y/o síntesis génica y se ensamblan con métodos y técnicas recombinantes conocidos mediante la conexión de los segmentos de ácido nucleico correspondientes, p. ej., usando sitios de restricción únicos en los vectores respectivos. Las secuencias de ácido nucleico subclonadas se verifican mediante secuenciación de ADN. Para transfecciones transitorias, se preparan cantidades mayores de los plásmidos mediante preparación de plásmidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).
b) Generación de vectores de expresión de anticuerpos y antígenos
Las secuencias de ADN de la región variable de las cadenas pesada y ligera se subclonaron en marco con la cadena pesada constante de IgG1 humana o la cadena ligera constante de IgG1 humana preinsertada en el vector de expresión de mamífero receptor respectivo. La expresión del anticuerpo fue dirigida por un promotor quimérico de MPSV que comprende un potenciador de CMV y un promotor de MPSV seguido de una UTR 5', un intrón y un elemento MAR kappa. La transcripción finaliza con una secuencia señal sintética de poliA en el extremo 3' del c Ds . Todos los vectores llevan una secuencia de ADN en el extremo 5' que codifica un péptido líder que dirige a las proteínas para su secreción en células eucariotas. Además, cada vector contiene una secuencia de OriP de EBV para la replicación del plásmido episomal en células que expresan EBNA de EBV.
Los antígenos que se han usado para las campañas de selección de presentación en fagos y para caracterizar las propiedades de unión de los anticuerpos seleccionados se expresaron a partir de vectores de expresión de antígenos de mamíferos con secuencias de ADN preinsertadas que codifican etiquetas C-terminales. Se ha usado una etiqueta Avi para la biotinilación in vivo o in vitro del antígeno respectivo. Para la purificación y homo o heterodimerización del antígeno, se fusionó un Fc de IgG1 humana de tipo salvaje o Fc botón al extremo C del casete de expresión del antígeno. La expresión del antígeno fue dirigida por un promotor de MPSV quimérico que comprende un potenciador de CMV y un promotor de MPSV seguido de una UTR 5', un intrón y un elemento MAR kappa. La transcripción finalizó mediante una secuencia señal poliA sintética en el extremo 3' del CDS. Todos los vectores llevan una secuencia de ADN en el extremo 5' que codifica un péptido líder que dirige a las proteínas para su secreción en células eucariotas. Además, cada vector contiene una secuencia de OriP de EBV para la replicación del plásmido episomal en células que expresan EBNA de EBV.
Técnicas de cultivo celular
Las técnicas de cultivo celular estándar se usan como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
Expresión transitoria en células HEK293
Los anticuerpos biespecíficos se expresan mediante cotransfección transitoria de los respectivos plásmidos de expresión en células HEK293-EBNA que crecen de forma adherente o en células HEK293-F que crecen en suspensión como se describe a continuación.
a) Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-EBNA
Los anticuerpos biespecíficos se expresan mediante cotransfección transitoria de los respectivos plásmidos de expresión (p. ej., que codifican la cadena pesada y pesada modificada, así como la correspondiente cadena ligera y ligera modificada) en células HEK293-EBNA (línea celular de riñón embrionario humano 293 que expresa la diana nuclear del virus de Epstein-Barr; número de depósito de la American type culture collection ATCC # c RL-10852, Lote 959218) que crecen de forma adherente cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con FCS al 10 % con una cantidad ultra baja de IgG (suero de ternera fetal, Gibco), L-glutamina 2 mM (Gibco) y 250 pg/ml de Geneticina (Gibco). Para la transfección, se usa el reactivo de transfección FuGENE™ 6 (Roche Molecular Biochemicals) en una relación de reactivo FuGENE™ (pl) a ADN (pg) de 4:1 (que varía de 3:1 a 6:1).
Las proteínas se expresan a partir de los respectivos plásmidos usando una relación molar de plásmidos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada (modificadas y de tipo salvaje) de 1:1 (equimolar) que varía de 1:2 a 2:1, respectivamente. Las células se alimentan en el día 3 con L-glutamina ad 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. Los sobrenadantes de los cultivos celulares que contienen anticuerpos biespecíficos se recogen desde el día 5 al 11 después de la transfección por centrifugación y se almacenan a -200 °C. Se proporciona información general sobre la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas, p. ej., en células HEK293 en: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.
b) Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F
Los anticuerpos biespecíficos se generan mediante transfección transitoria de los respectivos plásmidos (p. ej., que codifican la cadena pesada y pesada modificada, así como la correspondiente cadena ligera y ligera modificada) usando el sistema HEK293-F (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células HEK293-F (Invitrogen) que crecen en suspensión en un matraz de agitación o en un fermentador agitado en medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) sin suero se transfectan con una mezcla de los cuatro plásmidos de expresión y 293fectina o fectina (Invitrogen). Para un matraz de agitación de 2 L (Corning), las células HEK293-F se siembran a una densidad de 1,0 x 106 células/mL en 600 mL y se incuban a 120 rpm, 8 % de CO2. Al día siguiente, las células se transfectan a una densidad celular de aprox. 1,5 x 106 células/mL con aprox. 42 mL de mezcla de A) 20 mL de Opti-MEM (Invitrogen) con 600 pg de ADN plasmídico total (1 pg/mL) que codifica la cadena pesada o pesada modificada, respectivamente, y la cadena ligera correspondiente en una relación equimolar y B) 20 ml de Opti-MEM 1,2 mL de 293 fectina o fectina (2 pl/mL). Según el consumo de glucosa, se añade una disolución de glucosa durante el transcurso de la fermentación. El sobrenadante que contiene el anticuerpo secretado se recoge después de 5-10 días y los anticuerpos se purifican directamente del sobrenadante o el sobrenadante se congela y almacena.
Determinación de proteínas
La concentración de proteínas de los anticuerpos y derivados purificados se determina determinando la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácidos según Pace et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423.
Determinación de la concentración de anticuerpos en los sobrenadantes
La concentración de anticuerpos y derivados en los sobrenadantes de los cultivos celulares se estima mediante inmunoprecipitación con perlas de agarosa con Proteína A (Roche). Se lavan 60 pL de perlas de agarosa con Proteína A tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1 %). Posteriormente, se aplican de 1­ 15 ml de sobrenadante del cultivo celular a las perlas de agarosa con Proteína A preequilibradas en TBS-NP40. Después de incubar durante 1 h a temperatura ambiente, las perlas se lavan en una columna de filtro Ultrafree-MC (Amicon] una vez con 0,5 mL de TBS-NP40, dos veces con 0,5 mL de disolución salina tamponada con fosfato 2x (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 mL de Na-citrato 100 mM pH 5,0. El anticuerpo unido se eluye mediante la adición de 35 pl de tampón de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen). La mitad de la muestra se combina con el agente reductor de muestras NuPAGE® o se deja sin reducir, respectivamente, y se calienta durante 10 min a 70 °C. Consecuentemente, se aplican 5-30 pl a una NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12 % (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducida y tampón MES con aditivo de tampón de ejecución antioxidante NuPAGE® (Invitrogen) para SDS-PAGE reducida) y se tiñe con azul de Coomassie.
La concentración de anticuerpos y derivados en los sobrenadantes de los cultivos celulares se mide cuantitativamente mediante cromatografía de HPLC de afinidad. Brevemente, los sobrenadantes de los cultivos celulares que contienen anticuerpos y derivados que se unen a la Proteína A se aplican en una columna Applied Biosystems Poros A/20 en KH2PO4200 mM, citrato de sodio 100 mM, pH 7,4 y se eluyen de la matriz con NaCl 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2,5 en un sistema de HPLC 1100 de Agilent. La proteína eluida se cuantifica mediante absorbancia UV e integración de las áreas de los picos. Un anticuerpo IgG1 estándar purificado sirvió como estándar.
Alternativamente, la concentración de los anticuerpos y derivados en los sobrenadantes de los cultivos celulares se mide mediante Sándwich-IgG-ELISA. Brevemente, se recubren placas de microtitulación de 96 pocillos con streptavidina de alta unión StreptaWell (Roche) con 100 pL/pocillo de molécula de captura anti-IgG humana biotinilada F(ab')2<h-FcY> BI (Dianova) a 0,1 pg/mL durante 1 h a temperatura ambiente o, alternativamente, toda la noche a 4 °C y, posteriormente, se lava tres veces con 200 pL/pocillo de PBS, Tween® al 0,05 % (PBST, Sigma). Se añaden 100 pL/pocillo de una serie de dilución en PBS (Sigma) de los respectivos sobrenadantes de los cultivos celulares que contienen anticuerpo a los pocillos y se incuba durante 1-2 h en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan tres veces con
200 pL/pocillo de PBST y el anticuerpo unido se detecta con 100 pl de F(ab')2<hFcY>POD (Dianova) a 0,1 pg/mL como anticuerpo de detección durante 1-2 h en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente. El anticuerpo de detección no unido se elimina por lavado tres veces con 200 pL/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección unido se detecta mediante la adición de 100 pL de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se realiza en un espectrómetro de Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia 492 nm).
Purificación de proteínas
Las proteínas se purifican a partir de sobrenadantes de los cultivos celulares filtrados con referencia a protocolos estándar. Brevemente, los anticuerpos se aplican a una columna de Proteína A Sefarosa (GE healthcare) y se lavan con PBS. La elución de los anticuerpos se consigue a pH 2,8 seguido de la neutralización inmediata de la muestra. La proteína agregada se separa de los anticuerpos monoméricos mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare) en PBS o en histidina 20 mM, NaCl 150 mM pH 6,0. Las fracciones de anticuerpos monoméricos se combinan, se concentran si es necesario usando, p. ej., un concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), se congelan y se almacenan a
-20 °C. Parte de las muestras se proporcionan para análisis de proteínas y caracterización analítica posteriores, p. ej., mediante SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño o espectrometría de masa.
SDS-PAGE
El sistema de gel prefabricado NuPAGE® (Invitrogen) se usa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En particular, se usan geles prefabricados NuPAGE® Novex® Bis-TRIS al 10 % o al 4-12 % (pH 6,4) y un tampón de ejecución NuPAGE® MES (geles reducidos, con aditivo de tampón de ejecución antioxidante NuPAGE®) o MOPS (geles no reducidos).
Cromatografía analítica de exclusión por tamaño
La cromatografía de exclusión por tamaño para la determinación de la agregación y el estado oligomérico de los anticuerpos se realiza mediante cromatografía HPLC. Brevemente, los anticuerpos purificados con Proteína A se aplican en una columna Tosoh TSK gel G3000SW en NaCl 300 mM, KH2PO4/K2HPO450 mM, pH 7,5 en un sistema de HPLC 1100 de Agilent o en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2 x PBS en un sistema de HPLC Dionex. La proteína eluida se cuantifica mediante absorbancia UV e integración de las áreas de los picos. El estándar de filtración en gel BioRad 151-1901 sirvió como estándar.
Espectrometría de masas
La masa desglicosilada total de anticuerpos cruzados se determina y confirma mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS). Brevemente, se desglicosilan 100 pg de anticuerpos purificados con 50 mil de N-glicosidasa F (PNGaseF, ProZyme) en KH2PO4/K2HPO4 100 mM, pH 7 a 37 °C durante 12-24 h con una concentración de proteína de hasta 2 mg/ml y posteriormente se desala mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa de las respectivas cadenas pesada y ligera se determina mediante ESI-MS después de la desglicosilación y reducción. Brevemente, se incuban 50 pg de anticuerpo en 115 pl con 60 pl de TCEP IM y 50 pl de hidrocloruro de guanidina 8 M, posteriormente se desala. La masa total y la masa de las cadenas ligeras y pesadas reducidas se determinan mediante ESI-MS en un sistema Q-Star Elite MS equipado con una fuente NanoMate®.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Generación de anticuerpos anti-BCMA
Ejemplo 1A. Producción de antígenos y reactivos herramienta
Ejemplo 1A1. Dominio extracelular de BCMA humano recombinante soluble
a) El dominio extracelular de BCMA humano recombinante soluble ("BCMA ECD") se produce como se describe en Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18). Brevemente, el dominio extracelular de BCMA humano (ECD; aminoácidos 5-51; NP_001183) se amplifica con el cebador directo 5-AAGCTTGGATCCATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCC-3 (SEQ ID NO:11) incorporando un sitio BamH1 (negrita, subrayado) y un cebador inverso 5-GAATTCGCGGCCGCTCATCCTTTCACTGAATTGGTCACACTTGCATTAC-3 (SEQ ID NO:12) incorporando un codón de parada (cursiva) y un sitio NotI (negrita, subrayado) usando el clon IMAGE 687194 (Invitrogen) como molde de PCR. El producto de la PCR se clona en un vector de expresión que comprende un gen de la glutatión S-transferasa en 5' de la glutatión S-transferasa (GST), se transforma en una cepa de E. coli que comprende el gen de la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor lacUV5, y la proteína inducida se purifica a 4 °C en un ÁKTAexplorer (GE Healthcare). El sedimento celular se lisa en 1:15 p/v de tampón B-PER (Pierce) que contiene inhibidor de proteasa y lisozima. El extracto se suplementa con 1 a 2 pg/mL de ADNasa I (Sigma), se agita durante 20 min adicionales y se ajusta a pH 7,5. La proteína de fusión soluble se recoge después de centrifugar a 31.000 * g durante 20 min (Beckman) y se carga en una columna de glutatión Sefarosa 4 FF (GE Healthcare) preequilibrada con tampón B-PER. La columna se lava con 4 volúmenes de columna (CV) de tampón B-PER, 3 CV cada uno de los lavados con tampón 1 y 2 (Pierce), seguido de un lavado de columna final con 5 CV de 50 mmoles/L de Tris (pH 8,0), 0,15 moles/L de NaCl. El BCMA etiquetado con GST se eluye con 20 mmoles/L de glutatión reducido en
50 mmoles/L de Tris (pH 8,0) y se dializa frente a PBS (pH 7,4) usando un slide-A-lyzer de 3.500 MWCO (Pierce). Para la eliminación de la etiqueta GST, se trata el BCMA:GST con trombina en 50 mmoles/L de Tris (pH 8,0), 0,15 moles/L de NaCl, mientras está unido a la glutatión Sefarosa. La trombina liberada se captura entonces por una columna de benzamidina Sefarosa (GE Healthcare). El BCMA con GST escindido se eluye de la columna con 3 a 5 CV de 50 mmoles/L de Tris (pH 8,0), 0,15 moles/L de NaCl, y se dializa frente a PBS (pH 7,4). La eliminación de la trombina se confirma analizando las fracciones para determinar la actividad de la trombina usando el sustrato cromogénico S-2238 (Chromogenix, DiaPharma). La concentración de proteína se determina por A280. Todas las proteínas purificadas se analizan mediante SDS-PAGE y mediante cromatografía de exclusión por tamaño de HPLC TSK-Gel G3000SW (Tosoh Bioscience). Se produce una variante biotinilada de ECD de BCm A ("BCMA-ECD-biot") como se describe anteriormente usando los mismos procedimientos con las siguientes modificaciones. Se añade una secuencia de ADN que codifica una etiqueta Avi-His, mediante amplificación por PCR, en marco en 3' en el extremo 3' del primer producto de PCR descrito anteriormente. Este segundo producto de PCR nuevo se subclona entonces en el vector de expresión pGEX4T1 y se cotransforma entonces en bacterias junto con un vector para la expresión de la enzima BirA para la biotinilación in vivo de la etiqueta Avi. Las etapas restantes de producción y purificación se realizan como se indicó anteriormente para BCMA-ECD.
b) Los dominios extracelulares de BCMA humano, de cinomolgo y murino que se usaron como antígenos para las selecciones de presentación en fagos se expresaron transitoriamente como fusión de Fc monomérico N-terminal en células HEK EBNA y se biotiniló in vivo específicamente en el sitio mediante la coexpresión de biotina BirA ligasa en la secuencia de reconocimiento de la etiqueta avi ubicada en el extremo C de la porción Fc que lleva la cadena del receptor (cadena del botón Fc). Los dominios extracelulares de BCMA humano, de cinomolgo y murino comprendían metionina 4 a asparagina 53, metionina 4 a asparagina 52 y alanina 2 a treonina 49, respectivamente. Estos se fusionaron N-terminalmente a la bisagra de una IgG1 humana permitiendo la heterodimerización con una porción Fc de IgG1 humana no fusionada (cadena de ojal) mediante la tecnología de botón en ojal.
Ejemplo 1A2. APRIL murino recombinante truncado
a) Se produce APRIL murino recombinante truncado como se describe en Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009­ 18). Brevemente, el APRIL murino (residuos 106-241; NP_076006) se amplifica a partir del clon IMAg E 5290965 (Invitrogen) y se clona en un vector de expresión bacteriano fusionado en el extremo COOH al cebador directo específico del gen 5-ACGTTAGATCTCCACTCAGTCCTGCATCTTGTTCCAGTTAAC-3 (SEQ ID NO:13) y cebador inverso 5-AACGTTGCGGCCGCTAGTTTCACAAACCCCAGG-3 (SEQ ID NO:14) se utilizan para amplificación. Los sitios BglII y NotI (en negrita, subrayados) en los cebadores directo e inverso, respectivamente, se utilizan para clonar el fragmento de PCR resultante, un vector de expresión bacteriano fusionado en el extremo COOH a tiorredoxina. La construcción se transforma en una cepa K-12 de Escherichia coli que comprende una mutación en el gen de la tiorredoxina reductasa cultivado a 25 °C hasta A600 ~0,6, inducida con 1 mmol/L de isopropil-L-tio-p-D-galactopiranósido, y luego se cultivó toda la noche a 25 °C. La pasta de células de E. coli se resuspende y se agita a 4 °C en un 1:10 p/v de tampón de lisis B-PER que contiene inhibidores de proteasa sin EDTA completos. La mezcla se diluye entonces con tampón stock 5* hasta una concentración final de
50 mmoles/L de Tris-HCl, 0,4 moles/L de NaCl, Triton-X100 al 1 %, glicerol al 5 %, y 10 mmoles/L de imidazol (pH 8­ 9). La muestra se suplementa con lisozima, ADNasa I y 2 mmoles/L de MgCh (Sigma), se agita durante 30 min, se ajusta a
4 mmoles/L de EDTA, se agita durante 20 min y se centrifuga entonces para eliminar los restos celulares. La muestra se ajusta a 40 mmoles/L de MgChy se agita durante 30 min antes de cargarla en una columna Ni-IMAC (GE Healthcare). La columna se lava secuencialmente con 3 a 5 CV de 10 mmoles/L de imidazol en 20 mmoles/L de Tris-HCl (pH 8,0), 2 a 3 CV de Triton X-100 al 0,5 % v/v en 20 mmoles/L de Tris-HCl (pH 8,0), entonces con 5 a 10 CV de 70 mmoles/L de imidazol en 20 mmoles/L de Tris-HCl (pH 8,0). El APRIL truncado se eluye con un gradiente lineal de 70 a 500 mmoles/L de imidazol en 20 mmoles/L de Tris-HCl, glicerol al 5 % (pH 8,0). Las fracciones de proteína combinadas se dializan frente a tampón PBS que contiene
50 mmoles/L de imidazol, 0,1 moles/L de L-Arg, glicerol al 5 %, 1 mmol/L de EDTA (pH 8,0). La concentración de proteína se determina espectrofotométricamente [£280 (1 %) = 0,94].
b) El APRIL murino recombinante truncado que se usó como herramienta (competidor) para las selecciones de presentación en fagos y los ELISA se expresó transitoriamente como fusión de Fc monomérico N-terminal en células HEK EBNA. El APRIL murino comprendía histidina 106 a leucina 241. Se fusionó N-terminalmente a la bisagra de una IgG1 humana permitiendo la heterodimerización con una porción Fc de IgG1 humana no fusionada (cadena de ojal) mediante la tecnología de botón en ojal.
Ejemplo 1A3. BAFF humano recombinante truncado
El humano recombinante truncado se produce como se describe en Gordon, 2003 (Biochemistry; 42 (20): 5977-5983). Brevemente, un fragmento de ADN que codifica los residuos 82-285 de BAFF se clona en un vector pBr322 que comprende una etiqueta His en el extremo N y un sitio de escisión de trombina posterior, creando una fusión con una etiqueta de His N-terminal seguida de un sitio de escisión de trombina. Se cultiva una cepa de E. coli que comprende el gen de la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor lacUV5 hasta fase mitad de logarítmica a 37 °C en medio LB con 50 mg/L de carbenicilina y se enfría entonces hasta 16 °C antes de la inducción con IPTG 1,0 mM. Las células se recogen por centrifugación después de 12 h de crecimiento adicional y se almacenan a -80 °C. El sedimento celular se resuspende en Tris 50 mM, pH 8,0, y NaCl 500 mM y se sonica en hielo. Después de la centrifugación, el sobrenadante se carga en una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen). La columna se lava con Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM e imidazol 20 mM y luego se eluye con un gradiente escalonado en el mismo tampón con imidazol 250 mM. Se reúnen las fracciones que contienen BAFF, se añade trombina y la muestra se dializa toda la noche frente a Tris 20 mM, pH 8,0 y CaCl25 mM a 4 °C. La proteína se purifica adicionalmente en una columna monoQ (Pharmacia) y finalmente en una columna de exclusión por tamaño S-200 en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, y MgCh 5 mM.
Ejemplo 1B. Células recombinantes que expresan BCMA humano en su superficie
Las células recombinantes que expresan BCMA humano en su superficie ("células HEK293-BCMA") se generan como se describe en Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18). Brevemente, el BCMA humano de longitud completa se amplifica utilizando el cebador directo 5-GAa Tt ¿ AAGCTT GCCACCATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCC-3 (SEQ ID NO:15) incluyendo un sitio de restricción HindlII (negrita, subrayado) y una secuencia de consenso de Kozak y un cebador inverso 5-GAATTCTCTAGATTACCTAGCAGAAATTGATTTCTCTATCTCCGTAGC-3 (SEQ ID NO:16) incluyendo un codón de parada en 3' y un sitio de restricción Xbal (negrita, subrayado) usando el clon IMAGE 687194 (Invitrogen) como molde de PCR. El producto de la amplificación se clona en un vector de expresión de E. coli, que comprende el potenciador/promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (CMV), una polihistidina (6xHis) y un gen de resistencia a neomicina linealizado, transfectados en células de riñón embrionario humano 293 (HEK293). Se seleccionan aquellas células que expresan BCMA humano en su superficie, se eligen clones estables de alta expresión mediante análisis de clasificación de células activada por fluorescencia.
Ejemplo 1C. Línea celular de mieloma humano que expresa BCMA en su superficie
a) Origen de las células y condiciones de cultivo. La línea celular de MM humana NCI-H929 se adquiere de la American Type Culture Collection (ATCC CRL-9068). Las células NCI-H929 se crecen en RPMI 1640 suplementado con suero de ternera bovino fetal al 10 %, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM. U266B1 (ATCC TIB-196) una línea celular de mieloma de linfocitos B humanos cultivada en RPMI con glucosa alta, FCS al 10 %, glutamina al 1 %, piruvato de sodio al 1 %, HEPES
10 mM). RPMI 8226 (ATCC CCL-155), una línea celular de mieloma de linfocitos B humanos cultivada en DMEM, FCS al
10 %, glutamina al 1 %. MKN45 (DSMZ ACC 409), una línea celular de adenocarcinoma gástrico humano cultivada en DMEM que contiene FCS al 10 % y glutamina al 1 %. La expresión de BCMA en líneas celulares de MM se confirma mediante citometría de flujo usando anticuerpos anti-BCMA humano conjugados con fluorocromo (BD Biosciences).
b) La expresión de BCMA se evaluó en tres líneas celulares de mieloma humano (H929, RPMI-8226 y U266B1) mediante citometría de flujo. Brevemente, las células se recogieron, se lavaron, se contaron para determinar su viabilidad, se resuspendieron a 50.000 células/pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos y se incubaron con anticuerpo anti BCMA humano (Abcam, #ab54834, IgG1 de ratón) a 10 pg/ml durante 30 min a 4 °C (para evitar la internalización). Se usó IgG1 de ratón como control de isotipo (BD Biosciences, #554121). A continuación, las células se centrifugaron (5 min a 350 x g), se lavaron dos veces y se incubaron con el anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con FITC durante 30 min a 4 °C. Al final del tiempo de incubación, las células se centrifugaron (5 min a 350 x g), se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendieron en 100 ul de tampón FACS y se analizaron en un dispositivo CantoII con software FACS Diva. La Figura 3 muestra el aumento de la intensidad de fluorescencia mediana tras la unión de concentraciones crecientes del anticuerpo anti-BCMA a las células H929. La cuantificación del número de receptores de BCMA en la superficie de la membrana de las líneas celulares de mieloma H929, RPMI-8226 y U266B1 se evaluó mediante análisis QFIKIT (Dako, #K0078, siguiendo las instrucciones del fabricante).
Tabla 2: Cuantificación del número de receptores de BCMA en la superficie de la membrana de las líneas celulares de mieloma H929, RPMI-8226 y U266B1.
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Ejemplo 1D. Obtención de anticuerpos anti-BCMA mediante inmunización
Los anticuerpos anti-BCMA se generan mediante la inmunización de ratas con ECD de BCMA como se describe en Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18). Brevemente, se inmunizan ratas Sprague-Dawley por vía subcutánea con ECD de BCMA conjugado con hemocianina de lapa (aminoácidos 5-54; n P_001183) utilizando el adyuvante TiterMax® (Sigma). La conjugación de hemocianina de lapa se realiza con un residuo de lisina usando Imject mcKLHV (Pierce). Debido a la alta homología de secuencia entre las proteínas BCMA humanas y de ratón, se prefieren las ratas para la producción de anticuerpos. Las células B se recogen de bazos inmunizados y se fusionan con células de mieloma P3-X63.Ag8 usando un protocolo de fusión de polietilenglicol estándar (Goding 1996; Monoclonal antibodies: principles and practice. 3a ed. Academic Press). Los hibridomas se cultivan en medio de Dulbecco modificado de Iscove al 80 % suplementado con el clon fetal I al
10 %, 4 mmoles/L de L-glutamina, factor de clonación al 10 % y también incluye penicilina, estreptomicina e hipoxantina sódica 1x, aminopterina y timidina. El ensayo ELISA se realiza para detectar la unión de los sobrenadantes del cultivo de hibridomas a BCMA. Los hibridomas de unión a BCMA positivos se examinan adicionalmente mediante citometría de flujo para determinar la unión celular a transfectantes de BCMA (células HEK293-BCMA). Los hibridomas seleccionados se someten a dos rondas de clonación por dilución limitante y se expanden más para su purificación. Además, los anticuerpos de esos mismos hibridomas seleccionados se convierten en anticuerpos quiméricos con regiones constantes humanas mediante métodos estándar. Brevemente, los ADNc que codifican las regiones variables de la cadena pesada y ligera se amplifican mediante RT-PCR a partir del ARNm de los hibridomas y luego se unen en marco con los ADNc que codifican la región constante pesada de IgG1 humana y la región constante de cadena ligera kappa humana, respectivamente. Estos ADNc se clonan en vectores de expresión transitoria de mamíferos y el ADN plasmídico se produce en E. coli y se purifica para la transfección. Las células HEK293 se transfectan mediante un método de transfección estándar (transfección basada en fosfato cálcico) y 7 días después, los anticuerpos IgG1 se purifican a partir de los sobrenadantes del cultivo mediante cromatografía de afinidad en una columna de Proteína A seguido del aislamiento de la fracción de anticuerpo monomérico mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
Ejemplo 1E. Obtención de anticuerpos anti-BCMA a partir de una biblioteca recombinante in vitro
Ejemplo 1E1. Construcción de bibliotecas Fab genéricas
Las bibliotecas de anticuerpos genéricas en formato Fab se construyen sobre la base de genes de la línea germinal humana utilizando los siguientes emparejamientos de dominios V: cadena ligera kappa Vk3_20 con cadena pesada VH3_23 para la biblioteca DP47-3 y cadena ligera kappa Vk1_17 con cadena pesada VH1_69 para la biblioteca DP88-3. Ambas bibliotecas se aleatorizan en CDR3 de la cadena ligera (L3) y CDR3 de la cadena pesada (H3) y se ensamblan a partir de 3 fragmentos por biblioteca mediante el corte y empalme mediante PCR de extensión superpuesta (SOE). El fragmento 1 comprende el extremo 5' del gen del anticuerpo que incluye L3 aleatorizado, el fragmento 2 es un fragmento constante central que se extiende desde L3 a H3, mientras que el fragmento 3 comprende H3 aleatorizado y la porción 3' del gen del anticuerpo. Las siguientes combinaciones de cebadores se utilizan para generar fragmentos de biblioteca para la biblioteca DP47-3: fragmento 1 (LMB3-LibL1b_new), fragmento 2 (MS63-MS64), fragmento 3 (Lib2H-fdseqlong). Véase la Tabla 1 de WO2012020038. Las siguientes combinaciones de cebadores se utilizan para generar fragmentos de biblioteca para la biblioteca DP88-3: fragmento 1 (LMB3-RJH_LIB3), fragmento 2 (RJH31-RJH32) y fragmento 3 (LIB88_2-fdseqlong). Véanse las tablas 3 y 4 de WO2012020038. El protocolo de PCR para la producción de fragmentos de biblioteca incluye: 5 min de desnaturalización inicial a 94 °C; 25 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 58 °C y 1 min a 72 °C; y elongación terminal durante 10 min a 72 °C. Para la PCR de ensamblaje, se utilizan como molde las relaciones equimolares de los 3 fragmentos. El protocolo de PCR de ensamblaje incluye: 3 min de desnaturalización inicial a 94 °C; y 5 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 1 min a 58 °C y 2 min a
72 °C. En esta etapa, se añaden cebadores complementarios a la secuencia fuera de los fragmentos 1-3 y se realizan 20 ciclos adicionales antes de una elongación terminal durante 10 min a 72 °C. Después del ensamblaje de cantidades suficientes de construcciones Fab aleatorias de longitud completa, las construcciones Fab se digieren con Ncol/Notl para la biblioteca DP47-3 y con Ncol/Nhel para la biblioteca DP88-3 junto con el vector fagémido aceptor tratado de manera similar. Para la biblioteca DP47-3, se ligan 22,8 |jg de biblioteca Fab con 16,2 |jg de vector fagémido. Para la biblioteca DP88-3, se ligan
30,6 |jg de biblioteca Fab con 30,6 |jg de vector fagémido. Las ligaciones purificadas se utilizan para 68 transformaciones para la biblioteca DP47-3 y 64 transformaciones para la biblioteca DP88-3, respectivamente, para obtener las bibliotecas DP47-3 y DP88-3 finales. Las partículas de fagémidos que muestran las bibliotecas Fab son rescatadas y purificadas por purificación PEG/NaCl que se utilizará para la selección de clones Fab anti-BCMA.
Ejemplo 1E2. Selección de clones Fab anti-BCMA
a) Las selecciones se realizan frente a BCMA-ECD-biot. El antígeno se biotinila in vivo tras la expresión. Las selecciones se llevan a cabo en disolución según el siguiente protocolo: (i) unión de ~1012 partículas de fagémido de la biblioteca DP88-3 y BCMA-ECD-biot 100 nM durante 0,5 horas en un volumen total de 1 ml; (ii) captura de BCMA-ECD-biot y fago unido mediante la adición de 5,4*107 perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 minutos; (iii) lavado de las perlas usando 5*1 ml de PBS/Tween® 20 y 5*1 ml de PBS; (iv) elución de partículas de fago mediante la adición de 1 mL de TEA (trietilamina) 100 mM durante 10 minutos y neutralización mediante la adición de 500 jL de Tris/HCl 1M pH 7,4; y (v) reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica (Zymo Research), infección con fago auxiliar VCSM13 (Stratagene) y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagémido que se van a usar en rondas de selección posteriores. Las selecciones se llevan a cabo durante 3 rondas usando concentraciones constantes de BCMA-ECD-biot a 100 nM. En la ronda 2, la captura de los complejos antígeno:fago se realiza en placas de neutravidina en lugar de perlas de estreptavidina. Los ligantes específicos se identifican mediante ELISA como sigue usando: cada pocillo de las placas de neutravidina se recubre con 100 j l de BCMA-ECD-biot 100 nM. Se añaden sobrenadantes bacterianos que contienen Fab y se detectan los Fab de unión a través de sus etiquetas Flag utilizando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP. Una vez identificados, los clones anti-ECD de BCMA se expresan en bacterias en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purifican por afinidad y se caracterizan adicionalmente por análisis SPR usando un instrumento BIACORE®.
b) Los Fab anti-BCMA se establecieron mediante presentación en fagos a partir de bibliotecas de Fab sintéticos que consisten en emparejamientos de VL y VH derivados de diferentes familias de dominios V. Los clones 13C2, 17A5, 83A10, 13D2, 14B11, 14E1, 29B11 y 29F3 se generaron a partir de la sub-biblioteca Vk3_20 / VH3_23, clon 13A4 a partir de la sub-biblioteca Vk2D_28 / VH5_1 y clon 13A7 a partir de la sub-biblioteca Vk2D_28 / VH3_23, respectivamente (Tabla 3). Estas bibliotecas se basan en marcos completamente humanos con diversidad de secuencias en CDR3 de los dominios VL (3 longitudes diferentes) y VH (6 longitudes diferentes).
Tabla 3: Clones anti-BCMA y emparejamientos VL / VH respectivos
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Se realizaron rondas de selección (reconocimiento y selección biológicos) en disolución según el siguiente patrón: 1. preaclaramiento de ~ 1.012 partículas de fagémido por combinación de biblioteca en inmunotubos recubiertos con 10ug/ml de una IgG humana no relacionada para deplecionar las bibliotecas de anticuerpos que reconocen la porción Fc de los antígenos, 2. incubación de las partículas de fagémido que no se unen a Fc con BCMA biotinilado 100nM durante 0,5 h en presencia de una construcción de botón en ojal de Fc no biotinilado no relacionado 100 nM para una depleción adicional de los ligantes de Fc en un volumen total de 2ml, 3. captura del BCMA biotinilado y fago de unión específica mediante división y transferencia de la reacción de reconocimiento y selección en 16 pocilios en una placa de microtitulación pre-recubierta con neutravidina o estreptavidina durante 20 min en un agitador, 4. lavado de los pocillos respectivos 10-30x con PBS/Tween20 y 10-30x con PBS usando un lavador de placas, 5. etapa de lavado competitivo opcional mediante la adición de APRIL murino 230nM para desplazar los clones de Fab que reconocen el sitio de unión del ligando natural, seleccionando así los anticuerpos de fago que no compiten con APRIL, 6. elución de las partículas de fago mediante la adición de 125ul de TEA (trietilamina) 100mM por pocillo durante 5-10 min y neutralización mediante la adición de un volumen igual de Tris/HCl 1M pH 7.4, 7. reinfección de células de E. coli TG1 en fase logarítmica con las partículas de fago eluidas, infección con el fago auxiliar VCSM13, incubación en un agitador a 30 °C toda la noche y posterior precipitación con PEG/NaCl de las partículas de fagémido que se van a usar en la siguiente ronda de selección.
Las selecciones se llevaron a cabo durante 3 a 5 rondas usando concentraciones de antígeno constantes de 100 nM. Aparte de las campañas de selección durante las cuales solo se usó BCMA humano como antígeno, se llevaron a cabo campañas de selección adicionales durante las cuales también se usaron BCMA de cinomolgo o murino de forma alterna con BCMA humano con el fin de seleccionar anticuerpos de reacción cruzada. Además, como una alternativa a la captura basada en placas de estreptavidina, la captura de los complejos antígeno:fago se realizó mediante la adición de 5,4 * 107 perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina a la reacción de reconocimiento y selección seguido de etapas de lavado usando imanes respectivos en las condiciones descritas anteriormente.
Los ligantes específicos se identificaron mediante el cribado por resonancia de plasmón superficial de sobrenadantes de cultivos bacterianos que contienen Fab utilizando el biosensor ProteOn XPR36 de BioRad. Brevemente, después de la infección de las células de E. coli TG1 en fase logarítmica con las partículas de fago eluidas, se sembraron en placas unidades formadoras de colonias (cfu) individuales y se seleccionaron para la inoculación de cultivos de expresión de 1 ml en placas de 96 pocillos profundos. Los Fab se capturaron de los sobrenadantes en un chip ProteOn GLM que se derivatizó con 8.000 - 10.000 RU de un anti-IgG humana de cabra, anticuerpo policlonal específico del fragmento F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch, # 109-005-006) en orientación vertical. Posteriormente, se inyectaron BCMA humano, de cinomolgo y murino, así como una construcción de botón en ojal de Fc no relacionada, como analitos en orientación horizontal. Los clones que presentaron respuestas de unión significativas frente a BCMA y no se unieron a la porción Fc de los antígenos, se expresaron en bacterias en un volumen de cultivo de 0,5 litros, se purificaron por afinidad y se caracterizaron cinéticamente por análisis SPR usando un protocolo de cinética one-shot en el biosensor ProteOn XPR36 de BioRad.
Ejemplo 1F. Ensayos de unión a BCMA: resonancia de plasmón superficial
a) Para medir las afinidades de unión del anticuerpo de BCMA a BCMA inmovilizado, se realizan mediciones de resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore® 3000 (Pharmacia Biosensor). El receptor de BCMA (BCMA-ECD) se acopla al chip sensor a un nivel de 400 unidades de resonancia utilizando el protocolo de acoplamiento de amina proporcionado por el fabricante. El BCMA-ECD-biot alternativo se acopla a un chip sensor de estreptavidina, también a un nivel de 400 unidades de resonancia, utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante. En todos los experimentos, la celda de flujo 1 se utiliza como celda de referencia. Los sensogramas se registran para disoluciones de Fab que varían en concentración de 0,1 pM a 200 nM. El análisis de regresión no lineal se utiliza para calcular las constantes cinéticas y las constantes de unión simultáneamente con el uso del software del fabricante. Los clones de Fab con afinidades de unión monovalente a BCMA-ECD de < 100 nM se convierten en IgG mediante métodos estándar. Brevemente, los ADNc que codifican las regiones variables de la cadena ligera y pesada se unen en marco con los ADNc que codifican la región constante pesada de IgG1 humana y la región constante de cadena ligera kappa humana, respectivamente. Estos ADNc se clonan en vectores de expresión transitoria de mamíferos y el a Dn plasmídico se produce en E. coli y se purifica para la transfección. Las células HEK293 se transfectan mediante un método de transfección estándar (transfección basada en fosfato cálcico) y 7 días después, los anticuerpos IgG1 se purifican a partir de los sobrenadantes del cultivo mediante cromatografía de afinidad en una columna de Proteína A seguido del aislamiento de la fracción de anticuerpo monomérico mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
b) Las afinidades (KD) de los clones de Fab anti-BCMA se midieron mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25 °C con BCMA biotinilado humano, de cinomolgo y murino inmovilizado en chips NLC mediante captura de neutravidina (Tabla 4). Se inmovilizó una construcción de botón en ojal de Fc biotinilada no relacionada de una manera similar como control negativo. Inmovilización de antígenos (ligando): los antígenos recombinantes se diluyeron con PBST (fosfato 10 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) a 10 ug/ml, después se inyectaron a 40 ul/minuto durante 300s en orientación vertical. Inyección de analitos: para las mediciones de cinética one-shot, la dirección de la inyección se cambió a orientación horizontal, se inyectaron series de dilución doble de Fab purificado (rangos de concentración variables) simultáneamente a 40ul/min a lo largo de los canales 1-5, con tiempos de asociación de 200 o 300 s, y tiempos de disociación de 300 s. Se inyectó tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" para referenciar. Las constantes de la tasa de asociación (kasoc) y las constantes de la tasa de disociación (kdisoc) se calcularon con un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno en software ProteOn Manager v3.1 mediante el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de disociación en equilibro (KD) como la relación kasoc/kdisoc. La regeneración se realizó en orientación horizontal usando glicina 10mM-HCl pH 1,5 a una velocidad de flujo de 100 ul/min para un tiempo de contacto de 18s.
Tabla 4: Afinidades monovalentes de clones de Fab anti-BCMA
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c) Evaluación de la unión de anticuerpos anti-BCMA a BCMA recombinante mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) como sigue. Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de operación (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania). Se determinó la avidez de la interacción entre anticuerpos anti-BCMA y BCMA Fc(kih) recombinante (humano, de cinomolgo y murino). BCMA Fc(kih) recombinante humano, de cinomolgo y murino biotinilado se acoplaron directamente en un chip SA siguiendo las instrucciones (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización varió de 200 a 700 RU. Los anticuerpos anti-BCMA se pasaron a un rango de concentración de 2 veces (1,95 a 500 nM) con un flujo de 30 pL/minutos a través de las celdas de flujo durante 120 segundos. La disociación se monitorizó durante 180 segundos. Las diferencias de índice de refracción efectivo se corrigieron restando la respuesta obtenida en la celda de flujo de referencia. Aquí, se hizo fluir a los anticuerpos anti-BCMA sobre una superficie vacía previamente activada y desactivada como se describe en el kit de acoplamiento de amina estándar. Las constantes cinéticas aparentes se obtuvieron utilizando el software de evaluación Biacore T200 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suecia), para ajustar ecuaciones de tasa para la unión 1:1 de Langmuir por integración numérica, a pesar de la bivalencia de la interacción para fines de comparación.
También se determinó la afinidad de la interacción entre los anticuerpos anti-BCMA y el BCMA Fc(kih) humano recombinante. El anticuerpo anti-Fab humano (GE Healthcare) se acopló directamente a un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 6.500 RU. El anticuerpo anti-BCMA se capturó durante 90 segundos a 25 nM. El BCMA Fc(kih) humano recombinante se pasó en un rango de concentración de 4 veces (1,95 a 500 nM) con un flujo de 30 pL/minutos a través de las celdas de flujo durante 120 segundos. La disociación se monitorizó durante 120 segundos. Las diferencias de índice de refracción efectivo se corrigieron restando la respuesta obtenida en la celda de flujo de referencia. Aquí, Se hizo fluir el BCMA recombinante sobre una superficie con anticuerpo anti-Fab humano inmovilizado, pero en la que se había inyectado HBS-EP en lugar de anticuerpo anti-BCMA. Las constantes cinéticas se obtuvieron utilizando el software de evaluación Biacore T100 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suecia), para ajustar las ecuaciones de tasa para una unión 1:1 de Langmuir por integración numérica (Tabla 5). También se midió la unión del anticuerpo anti-BCMA 83A10 a BCMA Fc(kih) de cinomolgo recombinante y BCMA Fc(kih) murino (Tabla 6).
Tabla 5: Constantes de afinidad determinadas por el ajuste de ecuaciones de tasa para la unión 1:1 de Langmuir
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Tabla 6: Unión de BCMA Fc(kih) recombinante al anticuerpo anti-BCMA 83A10. a) BCMA Fc(kih) de cinomolgo. b) BCMA Fc(kih) murino
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Ejemplo 1G. Ensayo de señalización de BCMA: activación de NF-kB
a) Como se describe en Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18), las células NCI-H929 se lavan y se incuban en RPMI suplementado con suero fetal bovino al 0,25 % durante 24 h antes del tratamiento. Las células no se tratan o se tratan con 0,1 pg/mL de TNF-a, 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL de APRIL truncado tratado con calor HT, 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL de APRIL truncado, 0,1 pM a 200 nM de control de isotipo, o 0,1 pM a 200 nM de anticuerpos anti-BCMA durante 20 min. Para evaluar el bloqueo del ligando, las células pretratadas durante 20 min con 0,1 pM a 200 nM de anticuerpos anti-BCMA o un anticuerpo de control de isotipo se tratan con 1.000 ng/mL de APRIL truncado. Las células se recogen entonces, se lavan y se lisan con 50 mmoles/L de Tris-HCl (pH 7,5), NP40 al 1 %, 150 mmoles/L de NaCl, 1 mmol/L de EDTA, 1 mmol/L de EGTA suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. A continuación, los extractos de proteínas se analizan para determinar la actividad de NF-kB usando un kit de ensayo quimioluminiscente TransAM® (Active Motif) y la lectura de la señal luminiscente se realiza con un lector de placas Fusion HT (Packard Instruments).
b) Brevemente, las células H929 se privan de nutrientes en RPMI1640 con FCS al 0,25 % durante 24 h a 37 °C en un incubador celular. Al final del tiempo de privación de nutrientes, las células se recogieron, se contaron y se evaluó la viabilidad celular usando ViCell. Las células viables se ajustaron a 4 x 106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotaron además 30 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se preincubaron con anticuerpos anti-BCMA (15 o 50 ug/ml) o anticuerpos de control de isotipo (10, 20 y 40 ug/ml) durante 20 min en un incubador celular. Después, las células se suplementaron con 1 ug/ml de A-APRIL de ratón recombinante etiquetado con hemaglutinina (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010) durante 40 min a 37 °C. Se usó A-APRIL inactivado por calor (HI APRIL) en el ensayo para confirmar la especificidad de la señal de NFkB inducida por A-APRIL (la inactivación por calor se realizó mediante el tratamiento de A-APRIL a 60 °C durante 1 h). Al final del tiempo de incubación, las células se recogieron, se lavaron, se lisaron y se procesaron de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de extracto nuclear (Active Motif, # 40410). Los extractos de proteínas se analizaron para determinar la actividad de NF-kB utilizando un kit de ensayo Chemi TransAm© de p65 de NFkB (Active Motif, #40097) siguiendo las instrucciones del fabricante. La señal luminiscente se leyó usando el luminómetro Spectra Max M5 (Molecular Devices).
Ejemplo 1H. Cribado de anticuerpos anti-BCMA para seleccionar anticuerpos no afectados por 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL o BAFF en su unión a BCMA y que ni promueven ni bloquean la señalización a través del dominio intracelular de BCMA
La descripción se refiere a la generación de un anticuerpo anti-BCMA humano que 1) se une a BCMA humano, 2) la unión a BCMA no se ve afectada por 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL y BAFF, 3) no bloquea ni reduce >20 %, preferiblemente >15 %, o aumenta >20 %, preferiblemente >15 %, la activación de NF-kB dependiente de APRIL, 4) no bloquea ni reduce >20 %, preferiblemente >15 %, o aumenta >20 %, preferiblemente >15 %, la activación de NF-kB dependiente de BAFF, 5) no induce la activación de NF-kB por sí mismo, sin APRIL o BAFF. La Tabla 10 muestra el paradigma de cribado para la selección de un anticuerpo de BCMA con las nuevas propiedades deseadas: sin unión/bloqueo del ligando, sin competición con el ligando. Es importante destacar que se seleccionan anticuerpos cuya unión a BCMA no se bloquea por APRIL o BAFF.
Ejemplo 1H1. Unión a BCMA en células HEK293-BCMA, BCMA unido a placas o líneas celulares de mieloma múltiple positivas para BCMA (citometría de flujo y ELISA)
a) Se analizan anticuerpos anti-BCMA provenientes del enfoque de inmunización y/o del cribado de la biblioteca recombinante in vitro descrita anteriormente mediante citometría de flujo para determinar su unión a BCMA humano en células HEK293-BCMA. Brevemente, las células cultivadas se recogen, se cuentan y se evalúa la viabilidad celular utilizando el método de exclusión de azul de Tripán. Las células viables se ajustan entonces a 2 x 106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotan además 90 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añaden 10 pl de los anticuerpos anti-BCMA o el control de IgG correspondiente a los pocillos que contienen células para obtener concentraciones finales de 0,1 pM a 200 nM. Todas las construcciones y las IgG de control se utilizan a la misma molaridad. Después de la incubación durante 30 min a 4 °C, las células se centrifugan (5 min, 350 x g), se lavan con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences), se resuspenden y se incuban durante 30 min adicionales 4 °C con 12 pl/pocillo de fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con fluorocromo anti-IgG humana específica del fragmento Fcy de cabra (Jackson Immuno Research Lab; disolución de trabajo: 1:20). A continuación, las células se lavan con tampón de tinción (BD Biosciences) 120 pl/pocillo y se sedimentan por centrifugación a 350 x g durante 5 min. Se realiza una segunda etapa de lavado utilizando 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las muestras se resuspenden en 200 pl/pocillo de tampón de tinción FACS y se adquieren y se analizan utilizando un citómetro de flujo LSR II con el software FACSDiva® (BD Biosciences). La intensidad de fluorescencia media se representa gráficamente como una función de la concentración de anticuerpo anti-BCMA para obtener la curva de unión y calcular la concentración de anticuerpo efectiva para alcanzar el 50 % de la unión máxima (CE50). Los anticuerpos anti-BCMA que se unen a BCMA en células según se juzga a partir de este ensayo se seleccionan para la siguiente etapa de cribado, a saber, el ensayo de unión a BCMA de competición frente a APRIL y BAFF (etapa (Ejemplo 1H2) a continuación).
Las propiedades de los anticuerpos que muestran unión a BCMA humano en células HEK293-BCMA se confirman usando un método ELISA como lo describen Ryan et al. (2007). Brevemente, se recubren placas de 96 pocillos immunosorb con
1,5 pg/mL de GST-BCMA-ECD, se lava con PBS Tween® al 1% (PBS-T), y se bloquea con PBS-T más albúmina sérica al 1 %. Las placas recubiertas con BCMA se incuban con sobrenadantes de cultivos de hibridomas durante 2 h a temperatura ambiente, se lavan 5 veces con PBS-T y se incuban con anti-IgG de rata de cabra conjugada con peroxidasa. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, las placas se lavan, se incuban con el sustrato 3,3,5,5-tetrametilbencidina y se detienen con un volumen igual de 1 mol/L de H2SO4.
b) Los anticuerpos IgG anti-BCMA (clones 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14E1, 13A7, 14B11) se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la unión a BCMA humano en células H929 que expresan BCMA. Se utilizó MKN45 (línea celular de adenocarcinoma gástrico humano que no expresa BCMA) como control negativo. Brevemente, las células cultivadas se recogen, se cuentan y se evalúa la viabilidad celular usando ViCell. A continuación, las células viables se ajustan a 2 x106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotaron además 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con 30 pl de los anticuerpos anti-BCMA o el control de IgG correspondiente durante 30 min a 4 °C. Todos los anticuerpos anti-BCMA (y el control de isotipo) se titularon y se analizaron en un rango de concentración final entre 0,1 - 40 ug/ml. Después, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g), se lavaron con 120 pl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences), se resuspendieron y se incubaron durante 30 min adicionales a 4 °C con fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con PE conjugado con fluorocromo de cabra anti-IgG humana específico del fragmento Fc (Jackson Immuno Research Lab; 109 -116-170). Después, las células se lavaron dos veces con tampón de tinción (BD Biosciences), se fijaron usando 100 ul de tampón de fijación BD por pocillo (#BD Biosciences, 554655) a 4 °C durante 20 min, se resuspendieron en 120 pl de tampón FACS y se analizaron usando BD FACS CantoII. La Figura 4 muestra la intensidad de fluorescencia media para los clones de IgG anti-BCMA representada en función de la concentración de anticuerpo anti-BCMA; (A) clones 13C2, 17A5, 83A10 en células H929, (B) clones 13C2, 17A5, 83A10 en células MKN45, (C) clones 13A4, 13D2, 14E1, 13A7, 14B11 en células H929 (D) clones 13A4, 13D2, 14E1, 13A7, 14B11 en células MKN45. Los valores de CE50 (que indican la concentración de anticuerpo requerida para alcanzar el 50 % de la unión máxima) para la unión de los clones 13C2, 17A5, 83A10 a células H929 se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7: Valores de CE50 para la unión de anticuerpos anti-BCMA a células de mieloma múltiple H929
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Ejemplo 1H2. 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL de APRIL o BAFF no alteran la unión del anticuerpo de BCMA a BCMA humano (citometría de flujo y ELISA)
a) Los anticuerpos anti-BCMA seleccionados en la etapa (Ejemplo 1H1) anterior se analizan luego mediante citometría de flujo para determinar la unión a BCMA humano en células HEK293-BCMA en presencia y ausencia de 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL o BAFF. Las células 293-BCMA viables se ajustan a 2 x 106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotan además 90 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añaden 10 pl de los anticuerpos anti-BCMA o el control de IgG correspondiente a los pocillos que contienen células para obtener concentraciones finales de 0,1 pM a 200 nM. Todas las construcciones y las IgG de control se utilizan a la misma molaridad. Después de la incubación durante 30 min a 37 °C, en presencia y ausencia de 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL de APRIL y BAFF, respectivamente, las células se centrifugan (5 min, 350 x g), se lavan con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences), se resuspenden y se incuban durante 30 min más a
4 °C con 12 pl/pocillo de fragmento F(ab')2 AffiniPure conjugado con fluorocromo anti-IgG humana específico del fragmento Fcy de cabra (Jackson Immuno Research Lab; disolución de trabajo: 1:20). A continuación, las células se lavan con tampón de tinción (BD Biosciences) 120 pl/pocillo y se sedimentan por centrifugación a 350 x g durante 5 min. Se realiza una segunda etapa de lavado utilizando 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las muestras se resuspenden en 200 pl/pocillo de tampón de tinción FACS y se adquieren y se analizan utilizando un citómetro de flujo LSR II con el software FACSDiva® (BD Biosciences). La intensidad de fluorescencia media se representa gráficamente como una función de la concentración de anticuerpo anti-BCMA para obtener la curva de unión y calcular la concentración de anticuerpo efectiva para alcanzar el 50 % de la unión máxima (CE50). Una curva de unión se realiza en presencia de APRIL, otra en su ausencia, y lo mismo se hace para presencia y ausencia de BAFF. Aquellos anticuerpos cuya unión a BCMA no se vea afectada por 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL y tampoco se vea afectada por 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL, de BAFF se seleccionan para las siguientes etapas a continuación. Las curvas de unión representativas de los anticuerpos que no compiten con los ligandos APRIL y BAFF por la unión a BCMA y de los anticuerpos que compiten con estos ligandos por la unión a BCMA se muestran en la Figura 1.
Las propiedades de los anticuerpos que muestran unión a BCMA humano en células HEK293-BCMA en presencia de
100 ng/mL de APRIL o BAFF se confirman usando un método ELISA como lo describen Ryan et al. (2007). Brevemente, se recubren placas de 96 pocillos immunosorb con 1,5 pg/mL de GST-BCMA-ECD, se lavan con PBS Tween® al 1 % (PBS-T), y se bloquean con PBS-T más albúmina sérica al 1 %. Las placas recubiertas con BCMA se incuban con sobrenadantes de cultivos de hibridomas durante 2 h a temperatura ambiente, se lavan 5 veces con PBS-T y se incuban con anti-IgG de rata de cabra conjugada con peroxidasa. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, las placas se lavan, se incuban con el sustrato de 3,3,5,5-tetrametilbencidina y se detienen con un volumen igual de 1 mol/L de H2SO4. Para el bloqueo de ligando basado en placa, las placas se recubren con 1 pg/mL de GST-BCMA-ECD como se ha descrito anteriormente. Las placas recubiertas se preincuban con anticuerpos purificados a las concentraciones especificadas, se lavan con PBS-T y luego se incuban con 3 pg/mL de MegaAPRIL humano recombinante (Alexis Biochemicals) o BAFF humano recombinante (R&D Systems). La unión de APRIL o BAFF se detecta usando anti-FLAG conjugado con peroxidasa seguido de revelado con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina como se ha descrito anteriormente.
b) Identificación de anticuerpos o Fab anti-BCMA que no compiten con APRIL mediante ELISA. Se evaluó la unión de Fab a BCMA humano inmovilizado en presencia de concentraciones crecientes de APRIL murino. Una placa de neutravidina se recubrió con BCMA humano biotinilado 25nM (100ul/pocillo) y se incubó en un agitador durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadieron Fab purificados 500 nM o 1.000 nM para saturar el BCMA humano usado para el recubrimiento durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con PBS y se añadió APRIL murino a ocho concentraciones diferentes usando una serie de diluciones de dos veces en tampón PBS, que variaban de 0 a 100 nM, y se incubó en un agitador durante
30 min. La placa se lavó 3 veces con PBS y se añadió anticuerpo secundario anti-FLAG-HRP (1:4.000) durante 1 h. Nuevamente, la placa se lavó 3 veces con PBS y se reveló añadiendo 100ul/pocillo de BM Blue POD (Roche). La reacción se detuvo añadiendo 50ul/pocillo de H2SO4 1 M y la DO se leyó a 450 nm (referencia a 650 nm) para una lectura final de la DO450-650. Los resultados para Fab seleccionados se muestran en la Figura 5. La reducción (%) en los valores de DO medidos con los clones anti-BCMA en ausencia frente a presencia de muAPRIL 50 nM (1.000 ng/mL) o 6,25 nM (140 ng/mL) se resumen en la Tabla 8.
Tabla 8: Reducción de los valores de DO medidos (450 nm) en ausencia frente a presencia de muAPRIL
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c) Competición de A-APRIL con anticuerpos anti-BCMA detectada por citometría de flujo. La evaluación de la eventual competición entre A-APRIL y anticuerpos anti-BCMA se realizó en células H929 cuantificando la unión de A-APRIL en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpos anti-BCMA (clones 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14E1, 13A7, 14B11). Brevemente, las células cultivadas se recogieron, se contaron y se evaluó la viabilidad celular usando ViCell. Las células viables se ajustaron a 1 x106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotan además 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incuban con 30 pl de los anticuerpos anti-BCMA o el control de IgG correspondiente durante 30 min a 4 °C. Todos los anticuerpos anti-BCMA (y control de isotipo) se titulan y analizan a concentraciones finales de 1, 16 y 40 ug/ml. A continuación, las células se centrifugan (5 min, 350 x g), se lavan con 120 pl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences), se resuspenden y se incuban con 1 ug/ml de A-APRIL de ratón recombinante etiquetado con hemaglutinina (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010) durante 30 min adicionales a 4 °C. Después, las células se lavan una vez con 120 pl/pocillo de tampón FACS y se incuban con anticuerpo anti-HA conjugado con FITC (Sigma Aldrich, #H7411) durante 30 min a 4 °C. Al final del tiempo de incubación, las células se lavan con 120 pl/pocillo de tampón FACS, se fijan con 100 ul de tampón de fijación Bd por pocillo (#BD Biosciences, 554655) a 4 °C durante 20 min, se resuspenden en 80 pl de tampón FACS y se analizan usando BD FACS Fortessa. La Figura 6 muestra la intensidad de fluorescencia mediana relativa de A-APRIL (señal FITC) detectada en función de concentraciones crecientes de los clones de anticuerpos anti-BCMA 13A4, 13d 2, 14E1, 13A7, 14B11 en células H929. La intensidad de fluorescencia mediana tras la unión de A-APRIL en presencia del control de isotipo se fijó en uno; las otras señales se normalizaron respecto a este.
d) Competición de anticuerpos anti-BCMA con A-APRIL detectada por citometría de flujo. La evaluación de la eventual competición entre A-APRIL y anticuerpos anti-BCMA se realizó en células RPMI cuantificando la unión de anticuerpos anti-BCMA (clones 13A4, 13c 2, 13d 2, 14B11, 17A5, 83A10,) en presencia o ausencia de A-APRIL. Brevemente, las células cultivadas se recogieron, se contaron y se evaluó la viabilidad celular usando ViCell. Las células viables se ajustaron a 1 x 106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotaron además 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con 30 pl de los anticuerpos anti-BCMA o el control de IgG correspondiente durante 20 min a 4 °C. Todos los anticuerpos anti-BCMA y el control de isotipo se analizaron a concentraciones finales 40 ug/ml. Después, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g), se lavaron con
120 pl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences), se resuspendieron y se incubaron con 1 ug/ml de A-APRIL de ratón recombinante etiquetado con hemaglutinina (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010) durante 40 min adicionales a 4 °C. Después, las células se lavaron una vez con 120 pl/pocillo de tampón FACS y se incubaron con el anticuerpo anti-Fc humano conjugado con Alexa.Fluor 647 (Jackson Immuno Research Lab, #109-606-008) durante 30 min a 4 °C. Al final del tiempo de incubación, las células se lavaron con 120 pl/pocillo de tampón FACS, se fijaron con 100 ul de tampón de fijación BD por pocillo (#BD Biosciences, 554655) a 4 °C durante 20 min, se resuspendieron en 80 pl de tampón FACS y se analizaron usando BD FACS Fortessa. La Figura 7 muestra la intensidad de fluorescencia mediana relativa de los clones 13A4, 13C7, 13D2, 14B11, 17A5, 83A10 del anticuerpo anti-BCMA (señal de Alexa.Fluor 647) en células RPMI detectada en ausencia o presencia de 1.000 ng/mL de A-APRIL. La intensidad de fluorescencia mediana tras la unión de anticuerpos anti-BCMA en ausencia de A-APRIL se estableció en uno; las otras señales respectivas al anticuerpo anti-BCMA en presencia de A-APRIL se normalizaron respecto a este.
e) Competición de anticuerpos anti-BCMA con A-APRIL después de la incubación simultánea detectada por citometría de flujo. La evaluación de la competición eventual entre A-APRIL y anticuerpos anti-BCMA se realizó en células H9292 cuantificando la unión de anticuerpos anti-BCMA (clones 14B11, 13D2, 13A4, 17A5, 83A10) en presencia o ausencia de A-APRIL. Brevemente, las células cultivadas se recogieron, se contaron y se evaluó la viabilidad celular usando ViCell. Las células viables se ajustaron a 1 x106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotaron además 100 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con 30 pl de los anticuerpos anti-BCMA o el control IgG correspondiente y 30 pl de A-APRIL etiquetado con hemaglutinina (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010) durante 40 min a 4 °C. Todos los anticuerpos anti-BCMA y el control de isotipo se analizaron a concentraciones finales de 20 ug/ml; A-APRIL a concentraciones finales de 2,5 ug/ml. A continuación, las células se centrifugaron (5 min, 350 x g) y se lavaron con 120pl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences). Después de eso, las células se incubaron con anticuerpo anti-Fc humano conjugado con Alexa.Fluor 647 (Jackson Immuno Research Lab, #109-606-008) y anticuerpo anti-HA conjugado con FITC (Sigma Aldrich, #H7411) durante 30 min a 4 °C. Al final del tiempo de incubación, las células se lavaron con 120 pl/pocillo de tampón FACS, se fijaron con 100 ul de tampón de fijación BD por pocillo (#BD Biosciences, 554655) a 4 °C durante 20 min, se resuspendieron en 80 pl de tampón FACS y se analizaron usando BD FACS CantoII. La Figura 8A muestra la intensidad de fluorescencia media y la señal de fluorescencia relativa del clon de anticuerpo anti-BCMA (señal Alexa.Fluor 647) y la Figura 8B muestra la intensidad de fluorescencia media y la señal de fluorescencia relativa de A-APRIL (señal de FITC) y el clon del anticuerpo anti-BCMA (señal de Alexa.Fluor 647). La detección de anticuerpo anti-BCMA en presencia de A-APRIL con anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC se normalizó con respecto a la señal del clon de anticuerpo anti-BCMA en ausencia de A-APRIL. La detección de A-APRIL en presencia del clon de anticuerpo anti-BCMA con el anticuerpo anti-HA conjugado con Alexa.Fluor 647 se normalizó con respecto a la señal de A-APRIL en presencia del control de isotipo. La reducción en la unión de los clones 14B11, 13D2, 13A4, 17A5 y 83A10 de los anticuerpos anti-BCMA (20 pg/mL) en presencia de A-APRIL (2,5 pg/mL) como se detecta con anticuerpo anti-Fc humano conjugado con fluorocromo se resume en la Tabla 9.
Tabla 9: R e d u cc ió n de la un ión de los a n tic u e rp o s a n ti-B C M A a cé lu la s H 929 en p re se n c ia de A P R IL
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Ejemplo 1H3. El anticuerpo BCMA no bloquea ni aumenta la activación de NF-kB dependiente de APRIL
a) Se ensayan entonces los anticuerpos seleccionados como no competidores en la etapa (Ejemplo 1H2) anterior (es decir, su curva de unión a BCMA no se ve afectada por la presencia de 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL y tampoco se ve afectada por la presencia de 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL, de BAFF) en la etapa (Ejemplo 1H3) para determinar los efectos sobre la activación de NF-kB mediada por APRIL, BAFF y BCMA. Como ApRlL es el ligando de alta afinidad para BCMA, primero se examinan las propiedades de bloqueo o agonistas de los anticuerpos anti-BCMA sobre la señalización de APRIL. Como se describe en Ryan 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18), para verificar si los anticuerpos anti-BCMA bloquean o aumentan la señalización aguas abajo de APRIL, se lavan células de mieloma múltiple humano (MM) NCI-H929 y se incuban en RPMI libre de suero durante 24 h antes del tratamiento. Las células no se tratan o se tratan con 0,1 pg/mL de TNF-a (usado como control positivo), 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL truncado tratado con calor HT, 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL truncado, 0,1 pM a 200 nM de control de isotipo, o anticuerpos anti-BCMA 0,1 pM a 200 nM durante 20 min. Para evaluar el bloqueo de APRIL, las células pretratadas durante 20 min con 0,1 pM a 200 nM de anticuerpos anti-BCMA o un anticuerpo de control de isotipo respectivo se tratan con 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL truncado. Después, las células se recogen, se lavan, y se lisan con 50 mmoles/L de Tris-HCl (pH 7,5), NP40 al 1 %, 150 mmoles/L de NaCl, 1 mmol/L de EDTA, 1 mmol/L de EGTA suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. A continuación, los extractos de proteínas se analizan para determinar la actividad de NF-kB usando un kit de ensayo quimioluminiscente TransAM® (Active Motif) y la lectura de la señal luminiscente se realiza con un lector de placas Fusion HT (Packard Instruments).
Como la actividad de NF-kB se ensaya usando un ELISA funcional que detecta la señal quimioluminiscente de p65 unido a la secuencia consenso de NF-KB, los anticuerpos anti-BCMA que no alteran la señalización aguas abajo mediada por APRIL y la activación de NF-KB (es decir, que la señal luminiscente media detectada por ELISA en extractos nucleares de células de MM NCI-H929 tratadas con APRIL solo es similar, no se reduce ni aumenta significativamente, respecto a la de los extractos nucleares de células de MM NCI-H929 tratadas con APRIL y anticuerpos anti-BCMA) se seleccionan para las siguientes etapas a continuación.
b) Se evaluó si la unión de anticuerpos anti-BCMA (clones 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11) interfiere con la activación de NFkB inducida por APRIL, una ruta de señalización conocida aguas abajo de BCMA. Brevemente, las células H929 se privan de nutrientes en RPMI1640 con FCS al 0,25 % durante 24 h a 37 °C en un incubador celular. Al final del tiempo de privación de nutrientes, las células se recogieron, se contaron y se evaluó la viabilidad celular usando ViCell. Las células viables se ajustaron a 4 x 106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotaron además 30 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se preincubaron con anticuerpos anti-BCMA (15 o 50 ug/ml) o anticuerpos de control de isotipo (10, 20 y 40 ug/ml) durante 20 min en el incubador celular. Después, las células se suplementaron con 1 ug/ml de A-APRIL de ratón recombinante etiquetado con hemaglutinina (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010) durante 40 min a 37 °C. Se usó A-APRIL inactivado por calor (HI APRIL) en el ensayo para confirmar la especificidad de la señal de NFkB inducida por A-APRIL (la inactivación por calor se realizó mediante el tratamiento de A-APRIL a 60 °C durante 1 h). Al final del tiempo de incubación, las células se recogieron, se lavaron, se lisaron y se procesaron de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de extracto nuclear (Active Motif, # 40410). Los extractos de proteínas se analizaron para determinar la actividad de NF-kB utilizando un kit de ensayo Chemi TransAm© de p65 de NfkB (Active Motif, #40097) siguiendo las instrucciones del fabricante. La señal luminiscente se leyó usando el luminómetro Spectra Max M5 (Molecular Devices). Se midió la intensidad de la señal de luminiscencia relativa obtenida usando células H929 tratadas como se ha descrito anteriormente. La señal de luminiscencia obtenida tras la unión de A-APRIL en presencia del control de isotipo se fijó en uno; las otras señales se normalizaron respecto a este.
Ejemplo 1H4. El anticuerpo de BCMA no bloquea ni aumenta la activación de NF-kB dependiente de BAFF Los anticuerpos seleccionados como no bloqueantes y que no incrementan activación de NF-kB dependiente de APRIL en la etapa (Ejemplo 1H3) anterior se ensayan entonces en la etapa (Ejemplo 1H3) para determinar sus efectos sobre la activación de NF-kB mediada por BAFF. Como se describe en Ryan 2007, (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18), para verificar si los anticuerpos de BCMA bloquean o incrementan la señalización aguas abajo de BAFF que da lugar a la activación de NF-kB, las células de MM NCI-H929 (CRL-9068™) se lavan y se incuban en medio RPMI sin suero durante 24 h antes del tratamiento, como se describe en Ryan 2007, (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18), Las células no se tratan o se tratan con 0,1 pg/mL de TNF-a, 100 ng/mL, preferiblemente 1.000 ng/mL, de BAFF truncado tratado con calor HT, 100 ng/mL, preferiblemente
1.000 ng/mL, de BAFF truncado, 1 a 0,1 pM a 200 nM de control de isotipo, o 0,1 pM a 200 nM de anticuerpos anti-BCMA durante 20 min. Para evaluar el bloqueo de BAFF, las células pretratadas durante 20 min con 0,1 pM a 200 nM de anticuerpos anti-BCMA o un anticuerpo de control de isotipo respectivo se tratan con 1 pg/mL de BAFF truncado. Después, las células se recogen, se lavan, y se lisan con 50 mmoles/L de Tris-HCl (pH 7,5), NP40 al 1 %, 150 mmoles/L de NaCl, 1 mmol/L de EDTA, 1 mmol/L de EGTA suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. Después, los extractos de proteínas se analizan para determinar la actividad de NF-kB usando un kit de ensayo quimioluminiscente TransAM® (Active Motif) y la lectura de la señal luminiscente se realiza con un lector de placas Fusion HT (Packard Instruments). Se seleccionan los anticuerpos anti-BCMA que no alteran la señalización aguas abajo mediada por BAFF y la activación de NF-kB (es decir, que la señal luminiscente media de p65 unido a la secuencia consenso de NF-kB detectada por ELISA en extractos nucleares de células de MM NCI-H929 tratadas con BAFF solo es similar, no significativamente reducida o aumentada, al de los extractos nucleares de células de MM NCI-H929 tratadas con BAFF y anticuerpos anti-BCMA) para las siguientes etapas a continuación.
Ejemplo 1H5. El anticuerpo de BCMA no induce la activación de NF-kB por sí mismo
a) Los anticuerpos seleccionados como no bloqueantes y que no incrementan la activación de NF-kB dependiente de BAFF en la etapa (Ejemplo 1H4) anterior se ensayan entonces en la etapa (Ejemplo 1H5) para determinar sus efectos agonistas intrínsecos para mediar la activación de NF-kB. Para verificar si los anticuerpos de BCMA son agonistas e inducen la señalización aguas abajo por sí mismos, las células NCI-H929 se lavan y se incuban en medio RPMI sin suero durante 24 h antes del tratamiento. Las células no se tratan o se tratan con 0,1 pg/mL de TNF-a, 0,1 pM a 200 nM de control de isotipo o 0,1 pM a 200 nM de anticuerpos anti-BCMA durante 20 min. Después, las células se recogen, se lavan, y se lisan con
50 mmoles/L de Tris-HCl (pH 7,5), NP40 al 1 %, 150 mmoles/L de NaCl, 1 mmol/L de EDTA, 1 mmol/L de EGTA suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. A continuación, los extractos de proteínas se analizan para determinar la actividad de NF-kB usando un kit de ensayo quimioluminiscente TransAM® (Active Motif) y la lectura de la señal luminiscente se realiza con un lector de placas Fusion HT (Packard Instruments). Finalmente, se seleccionan los anticuerpos anti-BCMA que no inducen señalización aguas abajo y activación de NF-kB (es decir, que la señal luminiscente media de p65 unido a la secuencia consenso de NF-kB detectada por ELISA en extractos nucleares de células de MM NCI-H929 tratadas con anticuerpos anti-BCMA solos es similar, no significativamente aumentada, respecto a la de los extractos nucleares de células de MM NCI-H929 tratadas con anticuerpo de control de isotipo) para la producción adicional y la caracterización in vitro e in vivo. Estos representan los anticuerpos anti-BCMA que no son bloqueantes de ligandos, no compiten y no son señalizadores (véase la Tabla 10).
b) Se evaluó si la unión de anticuerpos anti-BCMA (clones 13C2, 17A5, 83A10, 13A4, 13D2, 14B11) a células H929 que expresan BCMA induce la activación de NFkB, una ruta de señalización conocida aguas abajo de BCMA. Brevemente, las células H929 se privaron de nutrientes en RPMI1640 con FCS al 0,25 % durante 24 h a 37 °C en un incubador celular. Al final del tiempo de privación de nutrientes, las células se recogieron, se contaron y se evaluó la viabilidad celular usando ViCell. Las células viables se ajustaron a 4 x 106 células por ml en tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences). Se alicuotaron además 30 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con 30 pl de los anticuerpos anti-BCMA a 100 o 350 nM (14 o 50 ug/ml) durante 20 min a 37 °C. Como controles negativos, las células se dejaron sin tratar o se incubaron con los correspondientes anticuerpos de control de isotipo IgG 100 nM
(14 ug/ml) durante 20 min a 37 °C. Como controles positivos, las células se incubaron con 1 ug/ml de A-APRIL de ratón recombinante etiquetado con hemaglutinina (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010) durante 20 min a 37 °C. Al final del tiempo de incubación, las células se recogieron, se lavaron, se lisaron y se procesaron de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit de extracto nuclear (Active Motif, # 40410). Los extractos de proteínas se analizaron para determinar la actividad de NF-kB utilizando un kit de ensayo Chemi TransAm© de p65 de NfkB (Active Motif, #40097) siguiendo las instrucciones del fabricante. La señal luminiscente se leyó usando el luminómetro Spectra Max M5 (Molecular Devices). Se midió la intensidad de la señal de luminiscencia relativa obtenida de las células H929 tratadas como se ha descrito anteriormente. La señal de luminiscencia obtenida tras la unión de A-APRIL en presencia del control de isotipo se fijó en uno; las otras señales se normalizaron respecto a este.
Tabla 10: P a ra d ig m a de c rib a d o para la se le cc ió n de a n tic u e rp o s de B C M A
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Ejemplo 1H6. El anticuerpo de BCMA tiene una reacción cruzada con el mono cinomolgo
Los anticuerpos de BCMA humano generados en el Ejemplo 1 también se ensayan para determinar su reactividad cruzada con el mono cinomolgo y su capacidad para unirse a células plasmáticas de mono cinomolgo. Brevemente, se recogen PBMC y/o aspirados de médula ósea de monos cinomolgos y las células se cultivan, se cuentan y se evalúa la viabilidad celular utilizando el método de exclusión de azul de Tripán. Las células viables se ajustan entonces a 2 x 106 células por ml en PBS que contiene BSA al 0,1 %. Se alicuotan además 90 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añaden 10 pl de anticuerpo de BCMA o el control de IgG correspondiente a los pocillos que contienen células para obtener concentraciones finales de 0,1 pM a 200 nM. Los anticuerpos de BCMA y la IgG de control se utilizan a la misma molaridad. Después de la incubación durante 30 min a 4 °C, las células se centrifugan (5 min, 350 x g), se lavan con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences), se resuspenden y se incuban durante 30 min más a 4 °C con 12 pl/pocillo de anticuerpo anti-His conjugado con fluorocromo (Lucerna) para la detección del anticuerpo de BCMA. Las células de mono cinomolgo también se tiñen con anticuerpos de CD38, CD19 y CD20 conjugados con fluorocromo. A continuación, las células se lavan mediante la adición de 120 pl/pocillo de tampón de tinción FACS y centrifugación a 350 x g durante 5 min. Se realiza una segunda etapa de lavado con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las muestras se resuspenden en 200 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, se adquieren y se analizan mediante un citómetro de flujo LSR II con software FACSDiva® (BD Biosciences). Se evalúa entonces la unión del anticuerpo de BCMA a células plasmáticas CD38+ CD19lD CD20- y la intensidad de fluorescencia media se determina centrada en cualquiera de las células plasmáticas CD38+ CD19lD CD20- o células B CD19+ totales y se representa en histogramas o gráficos de puntos.
Ejemplo 2 - Producción de anticuerpos anti-BCMA terapéuticos que no bloquean la unión del ligando (APRIL, BAFF) y no promueven ni bloquean la señalización a través del dominio intracelular de BCMA y cuya unión a BCMA no se ve afectada por 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL o por 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL, de BAFF
Si los anticuerpos seleccionados después de la etapa (Ejemplo 1H6) anterior se derivan de la selección in vitro de la biblioteca de anticuerpos recombinantes, entonces ya son anticuerpos IgG1 humanos no conjugados. Los anticuerpos seleccionados después de la etapa (Ejemplo 1H6) anterior que se derivan de la inmunización están en un formato quimérico de rata-humano y luego se humanizan preferiblemente para poder aplicarlos en terapia. En ese caso, los métodos de humanización de anticuerpos estándar se aplican transfiriendo las regiones determinantes de la complementariedad de esas regiones variables de rata a los marcos de la región variable de anticuerpos humanos. Se introducen mutaciones adicionales en las regiones variables, si es necesario, para recuperar la unión a BCMA en comparación con el anticuerpo parental quimérico.
E je m p lo 2A. P ro d u cc ió n de a n tic u e rp o s a n ti-B C M A te ra p é u tic o s
Para la producción de anticuerpos IgG1 no conjugados que median ADCC (p. ej., anticuerpo modificado por glicoingeniería) (véase el Ejemplo 3A a continuación) o anticuerpos conjugados que administran un resto de molécula pequeña citotóxica (p. ej., conjugado anticuerpo-fármaco) (véase el Ejemplo 4A a continuación), las células se cotransfectan con cuatro plásmidos, dos para la expresión de anticuerpos (uno para la expresión de la cadena pesada del anticuerpo y otro para la expresión de la cadena ligera del anticuerpo), una expresión de GnTIII y uno para la expresión de manosidasa II en una relación de 4:4:1:1, respectivamente. Las células se crecen como cultivos en monocapa adherentes en matraces T usando medio de cultivo DMEM suplementado con FCS al 10%, y se transfectan cuando están entre el 50 y el 80 % de confluencia. Para la transfección de un matraz T75, se siembran 8 millones de células 24 horas antes de la transfección en 14 ml de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (al 10 % V/V final), 250 pg/ml de neomicina, y las células se ponen a 37 °C en un incubador en una atmósfera con CO2 al 5 % toda la noche. Para cada matraz T75 que se va a transfectar, se prepara una disolución de ADN, CaCl2 y agua mezclando 47 pg de ADN del vector plasmídico total dividido en partes iguales entre los vectores de expresión de cadena ligera y pesada, 235 pl de una disolución de CaCl2 1M y añadiendo agua hasta un volumen final de 469 pl. A esta disolución, se añaden 469 pl de una disolución de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM a pH 7,05, se mezcla inmediatamente durante 10 seg y se deja que permanezca a temperatura ambiente durante 20 seg. La suspensión se diluye con 12 ml de DMEM suplementado con FCS al 2 %, y se añade al T75 en lugar del medio existente. Las células se incuban a 37 °C., CO2 al 5 % durante aproximadamente 17 a 20 horas, a continuación, el medio se reemplaza con 12 ml de DMEM, FCS al 10 %. El medio de cultivo condicionado se recoge de 5 a 7 días después de la transfección, se centrifuga durante 5 min a 1.200 rpm, seguido de una segunda centrifugación durante 10 min a 4.000 rpm y se mantiene a 4 °C.
Para la producción del anticuerpo para biespecíficos de células T (véase el Ejemplo 5 a continuación), las células se cotransfectan con dos plásmidos (uno para la expresión de la cadena pesada del anticuerpo y otro para la expresión de la cadena ligera del anticuerpo), a una relación de 1:1, respectivamente. Las células se crecen como cultivos en monocapa adherentes en matraces T usando medio de cultivo DMEM suplementado con FCS al 10%, y se transfectan cuando están entre el 50 y el 80 % de confluencia. Para la transfección de un matraz T75, se siembran 8 millones de células 24 horas antes de la transfección en 14 ml de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (al 10% V/V final), 250 pg/ml de neomicina, y las células se ponen a 37 °C en un incubador en una atmósfera con CO2 al 5 % toda la noche. Para cada matraz T75 que se va a transfectar, se prepara una disolución de ADN, CaCl2 y agua mezclando 47 pg de ADN del vector plasmídico total dividido en partes iguales entre los vectores de expresión de cadena ligera y pesada, 235 pl de una disolución de CaCh 1M y añadiendo agua hasta un volumen final de 469 pl. A esta disolución, se añaden 469 pl de una disolución de HEPES 50 mM, NaCl
280 mM, Na2HPO41,5 mM a pH 7,05, se mezcla inmediatamente durante 10 seg y se deja permanecer a temperatura ambiente durante 20 seg. La suspensión se diluye con 12 ml de DMEM suplementado con FCS al 2 %, y se añade al T75 en lugar del medio existente. Las células se incuban a 37 °C., CO2 al 5 % durante aproximadamente 17 a 20 horas, a continuación, el medio se reemplaza con 12 ml de DMEM, FCS al 10 %. El medio de cultivo condicionado se recoge de 5 a 7 días después de la transfección, se centrifuga durante 5 min a 1.200 rpm, seguido de una segunda centrifugación durante 10 min a 4.000 rpm y se mantiene a 4 °C.
Los anticuerpos secretados se purifican mediante cromatografía de afinidad de Proteína A, seguida de cromatografía de intercambio catiónico y una etapa cromatográfica final de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) intercambiando el tampón a disolución salina tamponada con fosfato y recogiendo los anticuerpos IgG1 monoméricos puros. La concentración de anticuerpo se estima usando un espectrofotómetro a partir de la absorbancia a
280 nm. Los anticuerpos se formularon en una disolución de fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina
100 mM de pH 6,7.
Ejemplo 3. Anticuerpos IgG1 no conjugados que median ADCC
Ejemplo 3A. Generación de IgG1 con Fc modificado por ingeniería
Los anticuerpos IgG1 con Fc modificado por ingeniería generados en el Ejemplo 2A no requieren una etapa adicional y están listos para el ensayo in vitro en la etapa del Ejemplo 3B.
Ejemplo 3B. Ensayo in vitro de anticuerpos IgG1 no conjugados: ADCC
La competencia ADCC de IgG1 no conjugada anti-BCMA generada en el Ejemplo 2A (véase anteriormente) hacia las células tumorales de MM, las células diana, se determina en ensayos celulares. Las PBMC humanas se utilizan como células efectoras y se preparan usando centrifugación en gradiente de densidad con tubos de preparación celular con citrato de sodio (tubos Vacutainer CPT, BD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la sangre venosa se recoge directamente en tubos Vacutainer CPT. El gradiente se centrifuga a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente (TA) sin frenos. La interfase que contiene las PBMC se recoge y se lava con PBS (50 ml por células de dos gradientes) y se recoge por centrifugación a 300 x g durante 10 minutos a TA. Después de la resuspensión del sedimento con PBS, las PBMC se cuentan y se lavan por segunda vez mediante centrifugación a 200 x g durante 10 minutos a TA. A continuación, las células se resuspenden en el medio apropiado para los procedimientos posteriores.
La relación de efector a diana utilizada para los ensayos de ADCC es 25:1 para PBMC. Las células efectoras se preparan en medio AIM-V a la concentración apropiada con el fin de añadir 50 ^l por pocillo de placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las células diana son células que expresan BCMA humano (p. ej., NCI-H929) crecidas en RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 %. Las células diana se lavan en PBS, se cuentan y se resuspenden en RPMI-1640 completo a
0,3 millones por ml con el fin de añadir 30.000 células en 100 ^l por micropocillo. Los anticuerpos se diluyen en RPMI-1640 completo, se añaden en 50 ^l a las células diana presembradas y se deja que se unan a las dianas durante 10 min a temperatura ambiente. Después, se añaden las células efectoras y la placa se incuba durante 4 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene CO2 al 5 %. La muerte de las células diana se evalúa midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células dañadas utilizando el kit de detección de citotoxicidad (Roche Diagnostics). Después de la incubación de 4 horas, las placas se centrifugan a 800 x g. Se transfieren 100 ^l de sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa transparente de 96 pocillos de fondo plano. Se añaden 100 ^l de tampón de sustrato de color del kit por pocillo. Los valores de Vmáx de la reacción de color se determinan en un lector ELISA a 490 nm durante al menos 10 min utilizando el software SOFTmax PRO (Molecular Devices). La liberación espontánea de LDH se mide a partir de pocillos que contienen solo células diana y efectoras, pero no anticuerpos. La liberación máxima se determina a partir de pocillos que contienen solo células diana y Triton X-100 al 1 %. El porcentaje de muerte específica mediada por anticuerpos se calcula de la siguiente manera: ((x-SR)/(MR-SR)*100, donde x es la media de Vmáx a una concentración de anticuerpo específica, SR es la media de Vmáx de la liberación espontánea y MR es la media de Vmáx de la liberación máxima.
Ejemplo 4. Anticuerpos conjugados que administran un resto de molécula pequeña citotóxica
Ejemplo 4A. Generación de conjugados de anticuerpo fármaco
Los anticuerpos IgG1 no conjugados que median ADCC generados en la etapa del Ejemplo 2A se sintetizan adicionalmente. Se sintetiza maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenzoil-monometil auristatina F (vcMMAF) y se conjuga con residuos de cisteína en anticuerpos IgG1 seleccionados después de la etapa (e) anterior después de la reducción con DTT como se ha descrito previamente en Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18) y Doronina 2006 (Bioconjug Chem 17: 144-24).
Ejemplo 4B. Ensayo in vitro de conjugado anticuerpo fármaco: ensayo de citotoxicidad
Las células diana de mieloma múltiple NCI-H929 que expresan BCMA se siembran en placas a 5.000 por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo en presencia o ausencia de anticuerpo o conjugados anticuerpo-fármaco y se incuban a 37 °C, CO2 al 5 %. La viabilidad celular se evalúa 96 h después de la exposición al anticuerpo o conjugados anticuerpo-fármaco usando un ensayo de viabilidad celular luminiscente (CellTiter-Glo, Promega). La lectura de la señal luminiscente se realiza utilizando un lector de placas Fusion HT (Packard Instruments). La concentración de conjugado anticuerpo-fármaco se representa entonces frente a la señal luminiscente media como una curva de dosisrespuesta. Los valores de CI50 se determinan como la concentración de conjugado anticuerpo-fármaco que da como resultado un 50 % de viabilidad celular de los pocillos de control no tratados (Prism, GraphPad).
Ejemplo 5 - Generación de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3
Ejemplo 5A. Generación de anticuerpos anti-CD3
Las siguientes secuencias de proteínas de las regiones VH y VL se utilizan para generar anticuerpos de CD3e de reacción cruzada humana y de mono cinomolgo como se describe en WO2007/042261.
H 2 C _ V H (S E Q ID N O :7 ):
E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L K L S C A A S G F T F N K Y A M N W V R Q A P G K G L E W V A R IR S K Y N N Y A T Y Y A D S V K D R F T IS R D D S K N T A Y L Q M N N L K T E D T A V Y Y C V R H G N F G N S Y IS Y W A Y W G Q G T L V T
vss
H 2 C _ V L (S E Q ID N O :8 )
Q T V V T Q E P S L T V S P G G T V T L T C G S S T G A V T S G Y Y P N W V Q Q K P G Q A P R G L IG G T K F L A P G T P A R F SG S L L G G K A A L T L S G V Q PE D E A E Y Y C A L W Y SN R W V F G G G T K L T V L
Brevemente, para biespecíficos de células T sin Fc (véase el Ejemplo 5B a continuación), los oligonucleótidos que codifican las secuencias anteriores se unen entre sí mediante PCR para sintetizar un gen que codifica un Fv monocatenario (ScFv) donde las secuencias VH y VL se unen mediante un enlazador flexible que contiene residuos de serina y glicina como se describe en WO2007/042261. Los fragmentos se unen en la orientación anti-CD3-VL anti CD3 x VH. Esto se llama el ScFv anti-CD3.
Brevemente, para el biespecífico de células T con Fc (véase el Ejemplo 5C a continuación), los oligonucleótidos que codifican las secuencias anteriores se unen entre sí mediante PCR para sintetizar los ADNc que codifican las secuencias VH y VL, respectivamente, del anticuerpo anti-CD3.
Ejemplo 5B. Generación de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 sin Fc
Ejemplo 5B1. Generación de biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3: dos proteínas de fusión scFv
Ejemplo 5B1a. Generación de ScFv anti-BCMA
Se generan fragmentos de ADNc que codifican un Fv monocatenario (ScFv) para cada uno de los anticuerpos anti-BCMA-IgG1 que no bloquean la unión del ligando (APRIL, BAFF) y no promueven ni bloquean la señalización a través del dominio intracelular de BCMA y cuya unión a BCMA no se ve afectada por 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL, de APRIL o por 100 ng/ml, preferiblemente 1.000 ng/mL, de BAFF, es decir, para los anticuerpos IgG1 humanos seleccionados después de la etapa (Ejemplo 1H6) del Ejemplo 1 anterior y para los anticuerpos IgG1 humanizados generados después de la etapa (Ejemplo 2) anterior. Esto se realiza mediante amplificación por PCR de los segmentos de ADNc que codifican las respectivas regiones VH y VL de cada anticuerpo. En cada caso, las regiones VH y VL están unidas por un enlazador de 18 aminoácidos, como se describe en WO 2004106383, usando cebadores similares a los descritos allí. Los fragmentos se clonan en la orientación VH anti-BCMA-VL anti-BCMA.
Ejemplo 5B1b. Clonación de construcciones de orientación VH anti-BCMA-VL anti-BCMA
Los ADNc que codifican anticuerpos biespecíficos anti-CD3 x anti-BCMA se generan para cada uno de los anticuerpos anti-BCMA en la etapa (Ejemplo 5B1a) anterior uniendo en marco las secuencias de los respectivos ScFv descritos en la etapa (Ejemplo 5B1a) anterior con la secuencia del ScFv anti-CD3 descrito en la etapa (Ejemplo 3A) anterior. La clonación se realiza en la orientación VH anti-CD3-VL anti CD3 x VH anti-BCMA-VL anti-BCMA. Se añade una secuencia que codifica el péptido líder de mamífero en marco a cada uno de los ADNc que codifican los anticuerpos biespecíficos anti-CD3 x anti-BCMA y cada construcción final se subclona posteriormente en un vector de expresión de mamíferos. Se usa el mismo vector y método de transfección usados para los anticuerpos IgG1 como se describe en el Ejemplo 1 anterior. Alternativamente, cada construcción final que codifica los anticuerpos biespecíficos anti-CD3 x anti-BCMA que incluyen una secuencia líder se subclona en el vector de expresión de mamíferos pEFDHFR (como se describe en WO20041106383) y los anticuerpos biespecíficos se producen como se describe a continuación en la etapa (Ejemplo 5B1c).
Ejemplo 5B1c. Expresión y caracterización del agente de unión biespecífico de cadena única
Después de la confirmación de la secuencia deseada mediante secuenciación del ADN, cada construcción obtenida en 5B1b se transfecta, p. ej., en células CHO negativas para deshidrofolato reductasa, y se expresa para caracterización como se describe en WO20041106383. Por ejemplo, para la unión a células Jurkat (ATCC) para CD3 y NCI-H929 (ATCC) para BCMA, se realiza un experimento de citometría de flujo. Las células se incuban con el sobrenadante de las células que expresan la construcción biespecífica BCMA/CD3 durante aproximadamente 1 h a 4 °C, se lavan 2x en tampón fAc S (disolución salina tamponada con fosfato que contiene suero de ternera fetal y 0,05 de azida sódica) y la construcción unida se detecta mediante la etiqueta 6xHIS incorporada en el vector de expresión pEFDHFR usando un anticuerpo de HIS, p. ej. (Dianova). Para la detección del anticuerpo anti-HIS unido, las células se lavan como se ha descrito anteriormente y se incuban, p. ej., con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con FITC (BD 550003) o con anticuerpo anti-ratón conjugado con PE (IgG) (Sigma, P8547) y se analiza, p. ej., en un FACS Canto (BD Biosciences). La actividad funcional de las construcciones se analiza entonces usando un ensayo basado en citometría de flujo después de que las construcciones hayan sido purificadas mediante un proceso de purificación de dos etapas que incluye cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) y filtración en gel como se describe en WO20041106383, pero usando una línea celular CHO transfectada con una construcción de ADN que expresa BCMA de longitud completa en la superficie.
Ejemplo 5C. Generación de formato 1 1 de biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 con Fc
El biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 se produce para los anticuerpos anti-BCMA humanos o humanizados seleccionados después de la etapa (Ejemplo 1H6). Se utilizan como materiales de partida los ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera completas de los correspondientes anticuerpos IgG1 anti-BCMA, como se describe en el Ejemplo 2, así como los ADNc de VH y VL anti-CD3 descritos en el Ejemplo 3A. Para cada anticuerpo biespecífico, están implicadas cuatro cadenas de proteínas que comprenden las cadenas pesada y ligera del correspondiente anticuerpo anti-BCMA y las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-CD3 descrito anteriormente, respectivamente. Con el fin de minimizar la formación de productos secundarios con cadenas pesadas mal emparejadas, por ejemplo, con dos cadenas pesadas del anticuerpo anti-CD3, se usa una región Fc heterodimérica mutada que lleva "mutaciones de botón en ojal" y un enlace disulfuro diseñado por ingeniería como se describe en WO2009080251 y en WO2009080252. Con el fin de minimizar la formación de productos secundarios con cadenas ligeras mal emparejadas, por ejemplo, con dos cadenas ligeras del anticuerpo anti-BCMA, se aplica un cruce de CH1 x kappa constante a las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-CD3 utilizando la metodología descrita en WO2009080251 y en WO2009080252.
Brevemente, cada anticuerpo biespecífico se produce por cotransfección simultánea de cuatro vectores de expresión de mamíferos que codifican, respectivamente: a) el ADNc de cadena ligera completa del correspondiente anticuerpo de BCMA, b) el ADNc de cadena pesada completa del correspondiente anticuerpo de BCMA que lleva las "mutaciones de ojal" en la región Fc para producir un anticuerpo heterodimérico (véanse los detalles a continuación), c) un ADNc de fusión generado por métodos de biología molecular estándar, como la PCR de empalme-solapamiento-extensión, que codifica una proteína de fusión constituida por (en orden N a C-terminal) secuencia líder secretora, VL del anticuerpo anti-CD3 descrito anteriormente y el dominio CH1 humano de un anticuerpo IgG1 y d) un ADNc de fusión generado por métodos de biología molecular estándar, como PC de empalme-solapamiento-extensión, que codifica una proteína de fusión constituida por (en orden N a C-terminal) secuencia líder secretora, VH del anticuerpo anti-CD3 descrito anteriormente, dominio kappa constante de un ADNc de cadena ligera humana, región bisagra de un anticuerpo IgG1 humano y región Fc (dominios CH2 y CH3) de un anticuerpo IgG1 humano que incluye una "mutación de botón" (véanse los detalles a continuación) en la región Fc para producir un anticuerpo heterodimérico. Cotransfección de células de mamífero y producción y purificación de anticuerpos usando los métodos descritos anteriormente para la producción de anticuerpos IgG1 humanos o humanizados (véase el Ejemplo 2). Las "mutaciones de botón en ojal" en la región Fc de IgG1 humana consisten en: T366W, conocida como la "mutación del botón"; y T366S, L368A e Y407V, conocidas colectivamente como las "mutaciones de ojal". Además, se puede incluir un disulfuro para aumentar la estabilidad y los rendimientos, así como residuos adicionales que forman puentes iónicos y aumentan los rendimientos de heterodimerización (EP 1870459A1).
Ejemplo 6 - Unión simultánea de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 a BCMA y CD3 (resonancia de plasmón superficial)
Las propiedades de unión a BCMA y CD3 de los anticuerpos biespecíficos de células T biespecíficos anti-BCMA/anti-CD3 generados en el Ejemplo 5 se analizan por la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento Biacore® T100 (Biacore AB) con HBS-EP como tampón de operación (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore). Este sistema está bien establecido para el estudio de interacciones entre moléculas. Permite una monitorización continua en tiempo real de uniones ligando/analito y, por lo tanto, la determinación de las constantes de velocidad de asociación (ka), las constantes de velocidad de disociación (kd) y las constantes en equilibrio (KD) en varios entornos de ensayo. La tecnología SPR se basa en la medición del índice de refracción cerca de la superficie de un chip biosensor recubierto de oro. Los cambios en el índice de refracción indican cambios de masa en la superficie causados por la interacción del ligando inmovilizado con el analito inyectado en disolución. Si las moléculas se unen al ligando inmovilizado en la superficie, la masa aumenta, en caso de disociación, la masa disminuye.
El anticuerpo anti-etiqueta de His de captura se inmoviliza en la superficie de un chip biosensor CM5 usando química de acoplamiento de amina. Las celdas de flujo se activan con una mezcla 1:1 de N-hidroxisuccinimida 0,1 M y 3-(N,N-dimetilamino)propil-N-etilcarbodiimida 0,1 M a una velocidad de flujo de 5 pl/min el anticuerpo anti-IgG humana se inyecta en acetato de sodio, pH 5,0 a 10 (pg/ml, lo que dio lugar a una densidad superficial de aproximadamente 12.000 unidades de resonancia (RU). Una celda de flujo de control de referencia se trata de la misma manera, pero con tampones de vehículo solo en lugar del anticuerpo de captura. Las superficies se bloquean con una inyección de etanolamina 1 M/HCl pH 8,5. Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 se diluyen en HBS-P y se inyectan a una velocidad de flujo de
5 pl/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) es de 1 min para los anticuerpos a una concentración entre 1 y 100 nM para la unión a BCm A-ECD y 1 y 200 nM para la interacción con CD3. El BCMA-ECD se inyecta a concentraciones crecientes de 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 y 100 nM, CD3 a concentraciones de 0,21, 0,62, 1,85, 5,6, 16,7, 50, 100 y 200 nM. El tiempo de contacto (fase de asociación) es de 3 min, el tiempo de disociación (lavado con tampón de operación) de 5 min para ambas moléculas a una velocidad de flujo de 30 pl/min. Todas las interacciones se realizan a 25 °C (temperatura estándar). La disolución de regeneración de cloruro de magnesio 3 M se inyecta durante 60 s a 5 pl/min de flujo para eliminar cualquier proteína unida de forma no covalente después de cada ciclo de unión. Las señales se detectan a una velocidad de una señal por segundo. Las muestras se inyectan a concentraciones crecientes. Se determinan los gráficos de SPR que muestran la tasa de la señal (es decir, la unidad de resonancia) representada frente al tiempo de contacto.
Ejemplo 7 - Unión de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 a BCMA en células de MM o CD3 en células T (citometría de flujo)
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 generados en el Ejemplo 5 también se analizan mediante citometría de flujo para determinar sus propiedades de unión a BCMA humano expresado en células de mieloma múltiple NCI-H929 o CD3 humano expresado en células T leucémicas humanas Jurkat (ATCC). Brevemente, las células cultivadas se recogen, se cuentan y se evalúa la viabilidad celular utilizando el método de exclusión de azul de Tripán. Las células viables se ajustan entonces a 2 x 106 células por ml en PBS que contiene BSA al 0,1 %. Se alicuotan además 90 j l de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añaden 10 j l del anticuerpo biespecífico de células T o el control de IgG correspondiente a los pocillos que contienen células para obtener concentraciones finales de 0,1 pM a
200 nM. Se utilizan anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 e IgG de control a la misma molaridad. Después de la incubación durante 30 min a 4 °C, las células se centrifugan (5 min, 350 x g), se lavan con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences), se resuspenden y se incuban durante 30 min más a 4 °C con 12 jl/pocillo de anticuerpo anti-His conjugado con fluorocromo (Lucerna) para la detección del anticuerpo biespecífico de células T. A continuación, las células se lavan mediante la adición de 120 jl/pocillo de tampón de tinción FACS y centrifugación a 350 x g durante 5 min. Se realiza una segunda etapa de lavado con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las muestras se resuspenden en 200 jl/pocillo de tampón de tinción FACS, se adquieren y se analizan usando un citómetro de flujo LSR II con software FACSDiva® (BD Biosciences). Se evalúa la unión de los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 a células de MM y células T y se determina la intensidad de fluorescencia media centrada en células de MM NCI-H929 que expresan BCMA o células T Jurkat que expresan CD3 y se representa en histogramas o gráficos de puntos.
Ejemplo 8 - Activación de las células T tras la unión de los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 (citometría de flujo)
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 generados en el Ejemplo 5 también se analizan mediante citometría de flujo para determinar su potencial para inducir la activación de las células T mediante la evaluación de la expresión en superficie del marcador de activación temprana CD69, o el marcador de activación tardía CD25 en células T CD4+ y CD8+ en presencia o ausencia de células de MM que expresan BCMA humano. Brevemente, las células de MM NCI-H929 que expresan BCMA se recogen con tampón de disociación celular, se cuentan y la viabilidad celular se verifica usando azul de tripán. Las células de MM viables se ajustan a 0,2 x 106 células/mL en medio RPMI-1640 completo, se pipetean
100 j l de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añaden 50 j l de las construcciones biespecíficas de células T a los pocillos que contienen células de MM para obtener una concentración final de 1 nM. La placa de 96 pocillos se aparta y se mantiene a 37 °C, CO2 al 5 % hasta nuevas manipulaciones.
Las PBMC se aíslan de sangre fresca usando centrifugación en gradiente de densidad usando tubos de preparación celular con citrato de sodio (tubos Vacutainer CPT, BD Biosciences). A continuación, las células T humanas totales se aíslan usando el kit de aislamiento de células T totales (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células T humanas totales (efectoras) se ajustan entonces a 2 x 106 células por ml en medio RPMI-1640 completo. Se añaden 50 j l de esta suspensión celular por pocillo en la placa de ensayo que ya contiene células de m M que expresan BCMA para obtener una relación final E:T de 5:1. Para ensayar si las construcciones biespecíficas de células T son capaces de activar las células T solo en presencia de células diana tumorales de MM que expresan BCMA, también se incluyen pocillos que contienen concentraciones finales en el rango de 0,1 pM a 200 nM de las moléculas biespecíficas respectivas con células efectoras pero sin células diana tumorales de Mm . Después de la incubación durante cinco días a 37 °C, CO2 al 5 %, las células se sedimentan por centrifugación (5 min, 350 x g) y se lavan dos veces con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences). La tinción de la superficie de las células efectoras con anticuerpos conjugados con fluorocromo seleccionados contra CD4, CD8, CD69 o CD25 humanos (BD Biosciences) se realiza a 4 °C durante 30 min, protegidas de la luz, en tampón de tinción FACS (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se lavan dos veces con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS, se resuspenden en 200 jl/pocillo de tampón de tinción FACS, y se adquieren y se analizan utilizando un citómetro de flujo LSRII complementado con el software FACSDiva® (BD Biosciences). La expresión de los marcadores de activación CD69 y CD25 se determina midiendo la intensidad de fluorescencia media centrada en poblaciones de células T CD4+ y CD8+ como se representa en histogramas o gráficos de puntos.
Ejemplo 9 - Proliferación de células T tras la unión de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 (dilución CFSE)
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 generados en el Ejemplo 5 también se analizan mediante citometría de flujo para determinar su potencial para inducir la proliferación de células T CD8+ o CD4+ en presencia o ausencia de células de MM que expresan BCMA humano. Brevemente, las células de MM NCI-H929 que expresan BCMA se recogen con tampón de disociación celular, se cuentan y se busca su viabilidad usando azul de tripán. Las células de MM viables se ajustan a 0,2 x 106 células por ml en medio RPMI completo, se pipetean 100 j l de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añaden 50 j l de las construcciones biespecíficas de células T a los pocillos que contienen células de MM para obtener concentraciones finales en el rango de 0,1 pM a 200 nM. La placa de pocillos se aparta y se mantiene a 37 °C, CO2 al 5 %.
Las PBMC se aíslan de sangre fresca usando centrifugación en gradiente de densidad usando tubos de preparación celular con citrato de sodio (tubos Vacutainer CPT, BD Biosciences). A continuación, las células T humanas totales se aíslan usando el kit de aislamiento de células T totales (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, las células T totales se ajustan a 1 millón de células por ml en RPMI precalentado sin suero (37 °C) y se tiñen con CFSE 1 pM a temperatura ambiente durante 6 min, protegidas de la luz. Después, el volumen de tinción se duplica mediante la adición de medio RPMI-1640 suplementado con FCS al 10 % y GlutaMax al 1 % para detener la tinción con CFSE. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 20 min más, las células se lavan tres veces con medio que contiene suero precalentado para eliminar el CFSE remanente. Las células T totales teñidas con CFSE (efectoras) se ajustan entonces a 2 x 106 células/mL en medio RPMI-1640 completo. Se añaden 50 pl de esta suspensión celular por pocillo en la placa de ensayo que ya contiene células de MM NCI-H929 que expresan BCMA para obtener una relación final E:T de 5:1. Para ensayar si las construcciones biespecíficas de células T son capaces de activar las células T solo en presencia de las células diana tumorales de MM que expresan BCMA, también se incluyen pocillos que contienen concentraciones en el rango de 0,1 pM a 200 nM de los anticuerpos biespecíficos de células T con células efectoras, pero sin células diana tumorales de Mm . Después de la incubación durante cinco días a 37 °C, CO2 al 5 %, las células se sedimentan por centrifugación (5 min, 350 x g) y se lavan dos veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS (BD Biosciences). La tinción de la superficie de las células efectoras con anticuerpos conjugados con fluorocromo seleccionados contra CD4, CD8 o CD25 (BD) humanos se realiza a 4 °C durante 30 min, protegidas de la luz, en tampón de tinción FACS según el protocolo del fabricante. Las células se lavan dos veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, se resuspenden en 200 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, y se adquieren y se analizan usando un citómetro de flujo LSR II complementado con el software FACSDiva® (BD). El porcentaje de células que no proliferan se determina centrándose en el pico de CFSE sin diluir del extremo derecho en el grupo en el que los pocillos contienen células MM que expresan BCMA y células T teñidas con CFSE pero sin los anticuerpos biespecíficos de células T, y se compara con otros grupos (pocillos) experimentales. El porcentaje de células que proliferan se mide mediante el bloqueo de todos los picos de CFSE diluidos excluyendo el pico del extremo derecho (si es observable). El nivel de proliferación de las células T CD4+ y CD8+ se determina seleccionando primero esa población y luego para observar más a fondo los picos de dilución de CFSE.
Ejemplo 10 - Producción de citocinas a partir de células T activadas tras la unión de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3
Ejemplo 10A. Producción de interferón-Y
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 generados en el Ejemplo 5 también se analizan para determinar su potencial para inducir la producción de interferón- y (IFN-y) por las células T en presencia o ausencia de células de Mm que expresan BCMA humano. Brevemente, las células de MM NCI-H929 que expresan BCMA se recogen con tampón de disociación celular, se cuentan y se busca su viabilidad usando azul de tripán. Aproximadamente 20.000 células viables por pocillo se siembran en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añade la dilución de anticuerpo respectiva para obtener concentraciones finales en el rango de 0,1 pM a 200 nM. Las IgG anti-BCMA humano y anti-CD3 ajustadas a la misma molaridad se usan como controles. Se añaden células efectoras T totales humanas para obtener una relación final E:T de 5:1. Después de 20 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, se miden los niveles de IFN-y humano en el sobrenadante mediante ELISA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de ELISA de IFN-y humano II, BD Biosciences). Los niveles de IFN-y producidos por las células T en presencia de anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 y las células de MM que expresan BCMA se miden y se representan en histogramas y se comparan con los producidos por las células T en presencia de anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 y pero sin células de MM que expresen BCMA.
Ejemplo 10B. Ensayo de liberación de citocinas (análisis CBA)
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 generados en el Ejemplo 5 también se analizan para determinar su potencial para inducir la producción de citocinas mediada por células T en presencia o ausencia de células de MM que expresan BCMA humano. Las PBMC se aíslan de sangre fresca usando centrifugación en gradiente de densidad usando tubos de preparación celular con citrato de sodio (tubos Vacutainer CPT, BD Biosciences) y se siembra una concentración final de células de 0,3 millones de células/por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Las células de MM NCI-H929 que expresan BCMA se añaden entonces para obtener una relación final E:T de 10:1, así como se añaden construcciones biespecíficas de células T y controles de IgG para obtener concentraciones finales en el rango de 0,1 pM a 200 nM, durante una incubación de 24 h a 37 °C, CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células se centrifugan durante 5 min a 350 x g y el sobrenadante se transfiere a una nueva placa de 96 pocillos de pocillos profundos para el análisis adicional. El análisis CBA se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el citómetro de flujo LSR II, utilizando el kit de citocinas Th1/Th2 humanas II (BD Biosciences) que incluye IL-2 humana, IL-4 humana, IL-6 humana, IL-10 humana, TNF-a humano e IFN-y humano. Los niveles de citocinas producidas por las células T en presencia de anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 y las células de MM que expresan BCMA se miden y se representan en histogramas y se comparan con los producidos por las células T en presencia de anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 y pero sin células de MM que expresen BCMA.
Ejemplo 11 - Citotoxicidad de células T redirigida de células de MM tras la reticulación de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 a CD3 en células T y BCMA en células de MM (ensayo de liberación de LDH)
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 generados en el Ejemplo 5 también se analizan para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por células T en células de MM que expresan BCMA tras la reticulación de la construcción mediante la unión de los restos de unión al antígeno a BCMA en las células.
Brevemente, las células diana de mieloma múltiple NCI-H929 que expresan BCMA humano se recogen con tampón de disociación celular, se lavan y se resuspenden en RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Aproximadamente, se siembran 30.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añade la dilución respectiva de la construcción para una concentración final deseada (en triplicado); las concentraciones finales varían de 0,1 pM a 200 nM. Para una comparación apropiada, todas las construcciones biespecíficas de células T y los controles se ajustan a la misma molaridad. Se añaden células T humanas totales (efectoras) a los pocillos para obtener una relación final E:T de 5:1. Cuando se utilizan PBMC humanas como células efectoras, se usa una relación final E:T de 10:1. PHA-L (Sigma) se utiliza como control positivo para la activación de las células T humanas a una concentración de 1 |jg/ml. Los grupos de control negativos están representados únicamente por células efectoras o diana. Para la normalización, la lisis máxima de las células diana de MM NCI-H929 (=
100 %) se determina mediante la incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %, que induce la muerte celular. La lisis mínima (= 0 %) está representada por células diana coincubadas con células efectoras solamente, es decir, sin ningún anticuerpo biespecífico de células T. Después de 20 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, se mide entonces la liberación de LDH de las células diana de MM apoptóticas/necróticas en el sobrenadante con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science), siguiendo las instrucciones del fabricante. El porcentaje de liberación de LDH se representa frente a las concentraciones de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 en curvas de concentración-respuesta. Los valores de CI50 se miden usando el software Prism (GraphPad) y se determinan como la concentración de anticuerpo biespecífico de células T que da como resultado un 50 % de la liberación de LDH.
Ejemplo 12 - Comparación de biespecíficos de células T que contienen un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando frente a un anticuerpo anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando sobre la potencia letal de las células de MM que expresan BCMA
En determinadas malignidades hematológicas, tal como el mieloma múltiple, el nivel de ligandos de BCMA circulantes APRIL y BAFF puede estar elevado (Moreaux et al. 2004; Blood 103 (8): 3148-3157). Por tanto, los inventores reconocen que niveles elevados de ligandos en el suero pueden interferir con la unión de anticuerpos anti-BCMA a BCMA en las células tumorales. En comparación con los donantes sanos, los niveles de APRIL circulante (el ligando de alta afinidad para BCMA) en pacientes con MM son ~100 ng/mL frente a ~10 ng/mL. Para BAFF (el ligando de baja afinidad para BCMA), los niveles pueden fluctuar de 1-1.000 ng/mL en comparación con ~3 ng/mL en donantes sanos. Cerca de las células tumorales, las concentraciones de APRIL/BAFF pueden ser incluso superiores a las medidas en suero. En ciertas enfermedades autoinmunes, tal como el lupus eritematoso sistémico, los niveles de APRIL circulante también están elevados con ~ 85 ng/mL (Koyama et al. 2005; Ann Rheum Dis 64: 1065-1067).
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 generados en el Ejemplo 5 que contienen un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando también se analizan para determinar su potencial para inducir la apoptosis mediada por células T en células de MM que expresan BCMA tras la reticulación de la construcción mediante la unión de los restos de unión al antígeno a BCMA en las células en presencia de concentraciones elevadas (es decir, 100 ng/mL a
1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF en comparación con anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 que contienen un anticuerpo anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando del mismo formato.
Como se muestra en la Figura 1, las concentraciones crecientes (es decir, 10, 100, 1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF soluble representativas de los niveles encontrados en la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple no alteran la unión de un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando a BCMA unido a placa (línea continua). Por el contrario, las altas concentraciones de APRIL o BAFF soluble representativas de los niveles (es decir, 100 ng/mL a
1.000 ng/mL) encontrados en la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple disminuyen la unión de un anticuerpo anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando a BCMA unido (línea de puntos).
Como se muestra en la Figura 2, las concentraciones crecientes (es decir, 10, 100, 1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF soluble representativas de los niveles encontrados en la sangre y la médula ósea de los pacientes con mieloma múltiple no alteran la potencia letal de un anticuerpo biespecífico de células T que contiene un anticuerpo anti-BCMA no bloqueante/no competidor con el ligando específico para células de MM que expresan BCMA (línea continua). Por el contrario, las concentraciones altas (es decir, 100 ng/mL a 1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF soluble representativas de los niveles encontrados en la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple disminuyen la potencia letal de un anticuerpo biespecífico de células T que contiene un anticuerpo anti-BCMA bloqueante/competidor con el ligando específico para células de MM que expresan BCMA (línea de puntos).
Ejemplo 12A. Propiedades de la unión de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 a células de MM que expresan BCMA con un anticuerpo anti-BCMA que no se une/bloquea al ligando, no competidor, en presencia de 10, 100, 1.000 ng/mL de APRIL o BAFF (citometría de flujo)
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 con un anticuerpo anti-BCMA que no se une/bloquea el ligando, no competidor, generados en el Ejemplo 5 se analizan mediante citometría de flujo para determinar sus propiedades de unión a BCMA humano expresado en células de mieloma múltiple NCI-H929 en presencia de 10, 100 y 1.000 ng/mL de APRIL o BAFF. Brevemente, las células cultivadas se recogen, se cuentan y se evalúa la viabilidad celular utilizando el método de exclusión de azul de Tripán. Las células viables se ajustan entonces a 2 x 106 células por ml en PBS que contiene BSA al 0,1 %. Se alicuotan además 90 pl de esta suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se añaden 10 pl del anticuerpo biespecífico de células T o el control de IgG correspondiente a los pocillos que contienen células para obtener preferiblemente concentraciones finales que varían de 0,1 pM a 200 nM. Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 e IgG de control se usan a la misma molaridad. Después de la incubación durante 30 min a 4 °C, las células se centrifugan (5 min, 350 x g), se lavan con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS que contiene BSA (BD Biosciences), se resuspenden y se incuban durante 30 min más a 4 °C con 12 pl/pocillo de anticuerpo anti-His conjugado con fluorocromo (Lucerna) para la detección del anticuerpo biespecífico de células T. A continuación, las células se lavan mediante la adición de 120 pl/pocillo de tampón de tinción FACS y centrifugación a 350 x g durante 5 min. Se realiza una segunda etapa de lavado con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las muestras se resuspenden en 200 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, se adquieren y se analizan mediante un citómetro de flujo LSR II con software FACSDiva® (BD Biosciences). Se evalúa la unión de los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 a células de MM y células T y se determina la intensidad de fluorescencia media centrada en células de MM NCI-H929 que expresan BCMA y se representa en histogramas o gráficos de puntos. La unión (p. ej., MFI) de un anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 con un anticuerpo anti-BCMA que no se une/no bloqueante de ligando, no competidor, a células de MM se compara entonces con la de un anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 con un anticuerpo anti-BCMA que se une/bloquea el ligando, competidor, en presencia de 0, 10, 100, 1.000 ng/mL de APRIL o BAFF.
Ejemplo 12B. Propiedades letales de los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 con un anticuerpo anti-BCMA que no se une/no bloqueante de ligando, no competidor, en presencia de 10, 100, 1.000 ng/mL de APRIL o BAFF: citotoxicidad de células T redirigida de células de m M que expresan BCMA (ensayo de liberación de LDH)
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 con un anticuerpo anti-BCMA que no se une/no bloqueante de ligando, no competidor, generados en el Ejemplo 5 se analizan para determinar su potencial para inducir apoptosis mediada por células T en células de MM que expresan BCMA tras la reticulación de la construcción mediante la unión de los restos de unión al antígeno a BCMA en las células, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes (es decir, 10, 100,
1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF. Brevemente, se recogen células diana de mieloma múltiple NCI-H929 que expresan BCMA humano con tampón de disociación celular, se lavan y se resuspenden en RPMi suplementado con suero bovino fetal al
10 % (Invitrogen). Se siembran aproximadamente 30.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se añade la dilución respectiva del anticuerpo biespecífico de células T preferiblemente para concentraciones fijadas en el rango de 0,1 nM a 10 nM de 1 nM (en triplicado). Para una comparación apropiada, todos los anticuerpos biespecíficos de células T y controles se ajustan a la misma molaridad. Se añaden concentraciones crecientes (es decir, 10, 100, 1.000 ng/mL) de APRIL o BAFF recombinante humano soluble a los cultivos celulares. Los pocillos sin adición de APRIL o BAFF también se incluyen en la placa como controles. A continuación, se añaden células T humanas totales (efectoras) a los pocillos para obtener una relación final E:T de 5:1. Cuando se utilizan PBMC humanas como células efectoras, se usa una relación final E:T de 10:1. Se usa PHA-L (Sigma) como control positivo para la activación de las células T humanas a una concentración de 1 pg/ml. Los grupos de control negativo están representados únicamente por células efectoras o diana. Para la normalización, la lisis máxima de las células diana de MM NCI-H929 (= 100 %) se determina mediante la incubación de las células diana con una concentración final de Triton X-100 al 1 %, que induce la muerte celular. La lisis mínima (= 0 %) está representada por células diana coincubadas con células efectoras solamente, es decir, sin ninguna construcción o anticuerpo. Después de
20 h de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, se mide entonces la liberación de LDH de las células diana de MM apoptóticas/necróticas en el sobrenadante con el kit de detección de LDH (Roche Applied Science), siguiendo las instrucciones del fabricante. El porcentaje de liberación de LDH se representa frente a las concentraciones de APRIL o BAFF en presencia de concentraciones fijadas de anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3, preferiblemente en el rango de concentración de 0,1 pM a 200 nM en curvas de concentración-respuesta. Los valores de CI50 se miden a continuación utilizando el software Prism (GraphPad). Los valores de CI50 de un anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 con un anticuerpo anti-BCMA que no se une/no bloqueante de ligando, no competidor, se comparan entonces con los de un anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 con un anticuerpo anti-BCMA que se une/bloquea el ligando, competidor, en presencia de 0, 10, 100, 1.000 ng/mL de APRIL o BAFF.
Ejemplo 13 - Evaluación de la eficacia terapéutica de anticuerpo biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 en el modelo de ratón de mieloma múltiple Vk*MYC
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 con reacción cruzada en murino se ensayan para determinar su potencial para prevenir el mieloma múltiple en ratones propensos al mieloma múltiple Vk*MYC como se describe en Chesi, 2012 (Chesi et al. 2012; Blood 120: 376-385). El mieloma múltiple es una malignidad hematológica que implica una expansión incontrolada de células plasmáticas en la médula ósea. Dado que el BCMA se expresa fuertemente en células plasmáticas malignas, planteamos la hipótesis de que un biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 sería eficaz para el tratamiento del mieloma múltiple. El modelo de ratón de mieloma múltiple Vk*MYC es altamente representativo del mieloma humano y predictivo de la respuesta al fármaco utilizado en la clínica; representa una herramienta excelente para ensayar la prueba de concepto preclínica de los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3. Brevemente, los ratones Vk*MYC obtenidos de una colaboración académica en Mayo Clinic Arizona se cruzan con ratones transgénicos con CD3£ humano (huCD3£ Tg). Las células T de ratones huCD3£ Tg x Vk*MYC expresan tanto CD3e humano como CD3£ de ratón en la superficie celular y, por lo tanto, los ratones responden a biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3. Los ratones Vk*MYC desarrollan uniformemente una gammapatía monoclonal iniciada alrededor de las 30 semanas de edad, que progresa lentamente con el tiempo, asociada con signos clínicos representativos del mieloma humano tales como anemia, osteoporosis y enfermedad renal. Los ratones se sangran periódicamente por punción en la cola y la sangre se recoge en tubos Microtainer (BD Biosciences), se deja coagular a temperatura ambiente, después se centrifuga durante 10 min a 2.300g. Los sueros se diluyen 1:2 en tampón salino normal y se analizan en un aparato de cámara QuickGel utilizando QuickGels prefabricados (Helena Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se miden la relación gamma/albúmina y las fracciones de suero mediante análisis densitométrico.
Para los estudios terapéuticos, los ratones Vk*MYC se inscriben y se asignan al azar a diferentes grupos de tratamiento. (n=5-8/grupo): por ejemplo, 1) IgG control; 2) anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3; 500 pg/kg/semana o
10 pg/ratón/semana administrados por vía intravenosa a través de la vena de la cola; 3) bortezomib 1 mg/kg/ ip en los días 1,4, 8, 11 utilizado como estándar de atención. Preferiblemente, la o las dosis de los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 pueden ser múltiples y variar entre 200 y 1.000 (pg/kg/semana. En cada grupo, al menos tres ratones maduros (>1 año de edad) vk*MYC con una relación gamma/albúmina entre 0,3-2,0, correspondiente a un componente M predominante entre aproximadamente 10-70 g/l según se mide por densitometría. La electroforesis de proteínas séricas (SPEP) se realiza el día 0 y el día 14 después del tratamiento para medir la reducción mediada por el tratamiento en el componente M como un marcador de la respuesta tumoral, como se hace en la clínica. En algunos estudios terapéuticos, ratones Vk*MYC trasplantados con un componente M de aproximadamente 10-70 g/l y una plasmacitosis de médula ósea mayor del 5 % se inscriben y se asignan a diferentes grupos de tratamiento. Se evalúa la eficacia de los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 para reducir el componente M.
Ejemplo 14 - Evaluación de la eficacia terapéutica en el modelo de ratón NZB/W propenso al lupus de lupus eritematoso sistémico
Los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 con reacción cruzada murina se ensayan para determinar su potencial para prevenir el lupus eritematoso sistémico (SLE) en el modelo NZB/W de ratones propensos, un modelo bien caracterizado (Hass et al. 2010; J Immunol 184 (9): 4789-4800). Existe evidencia acumulada que sugiere que las células plasmáticas autorreactivas juegan un papel importante en el SLE y la depleción de las células plasmáticas autorreactivas con un biespecífico de células T anti-BCMA/anti-CD3 podría ser beneficiosa para los pacientes con SLE. Brevemente, los ratones NZB y NZW se adquieren en el Jackson Laboratory y se cruzan con ratones huCD3£ Tg. Los ratones NZB x huCD3£ Tg y los ratones NZW x huCD3£ Tg se cruzan entre sí y los ratones hembra huCD3£ Tg x NZB/W de la F1 se seleccionan para estudios futuros. Los ratones se ensayan semicuantitativamente para determinar la proteinuria con tiras reactivas de Albustix (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.) cada dos semanas, y se puntúan en una escala de 0 a 4 según la concentración de proteínas (de 0 a >20 g/l). Se inscriben ratones hembra huCD3£ Tg x NZB/W de la F1 de 7-8 meses de edad en estudios terapéuticos y se asignan al azar a diferentes grupos de tratamiento. (n=16/grupo): por ejemplo, 1) IgG control; 2) anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3; 500 pg/kg/semana o 10 pg/ratón/semana administrados por vía intravenosa a través de la vena de la cola; 3) anti-BAFF 20 mg/kg/semana utilizado como estándar de cuidado. Preferiblemente, la o las dosis de los anticuerpos biespecíficos de células T anti-BCMA/anti-CD3 pueden ser múltiples y variar entre 200 y 1.000 (pg/kg/semana. Los niveles de proteína basales al inicio de los estudios terapéuticos están entre 30 y 300 mg/dL.
Los puntos finales clínicos representativos del SLE consisten en proteinuria, enfermedades renales y manifestaciones tales como glomerulonefritis, celularidad glomerular y aumento de tamaño, depósitos positivos para ácido periódico-Schiff (PAS) y aparición de autoanticuerpos en suero tales como dsADN, IgA, IgG e IgM totales medidas por ELISA.
Ejemplo 15 - Evaluación de la eficacia terapéutica en un modelo de ratón experimental de rechazo humoral agudo mediado por anticuerpos de aloinjertos renales
Los anticuerpos anti-BCMA con reacción cruzada murino obtenidos en el Ejemplo 2, preferiblemente anticuerpos IgG1 no conjugados (Ejemplo 3) y anticuerpos conjugados que administran un resto de molécula pequeña citotóxica (Ejemplo 4) se ensayan para determinar su potencial para tratar el rechazo humoral agudo mediado por anticuerpos de aloinjertos que implican células plasmáticas y aloanticuerpos en un modelo de ratón experimental de rechazo humoral agudo de aloinjertos renales como se describe en Bickerstaff, 2008 (Bickerstaff et al., Am J Pathol 2008; 173 (2): 347-357).
Ejemplo 15A. Presensibilización con injerto de piel en ratones
Los ratones C57BL/6 (H-2b) y DBA/2 (H-2d) adultos se obtienen del Jackson Laboratory. Los ratones C57BL/6 receptores se presensibilizan primero con aloinjertos de piel de ratones donantes DBA/2. Brevemente, se ponen aloinjertos de piel de espesor total (~8 x 10 mm) en los lechos de injerto preparados del flanco del receptor y se suturan en las cuatro esquinas con sutura de seda 5-0 (Ethicon). Después, el aloinjerto de piel se cubre con un vendaje protector durante 7 días. Se espera que el rechazo del injerto ocurra sobre el día 7 después del trasplante y se caracterice por una coloración oscura, formación de costras y degeneración necrótica de los injertos de piel. Los ratones receptores presensibilizados reciben posteriormente aloinjertos renales.
Ejemplo 15B. Trasplante de riñón en ratón
Los ratones presensibilizados del Ejemplo 15A se utilizan como receptores de aloinjerto renal y se inscriben en estudios terapéuticos y se asignan al azar a diferentes grupos de tratamiento (n=10/grupo): 1) IgG control; 2) anticuerpos anti-BCMA; 20 mg/kg/semana o 400 pg/ratón/semana administrados por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Como se describe en Bickerstaff et al. (2008), el riñón izquierdo del donante de los ratones DBA/2 se aísla ligando y dividiendo los vasos suprarrenales y testiculares con microsutura de seda 10-0 (Ethicon). La aorta y la vena cava inferior se movilizan en su unión, con la arteria y la vena renales izquierdas. La aorta se liga debajo del vaso renal. Se extirpa un parche de vejiga que contiene la unión ureterovesical izquierda. El injerto se perfunde in situ con 0,2 a 0,4 ml de lactato de Ringer heparinizado frío. Finalmente, el riñón con irrigación vascular y el uréter unido al parche de la vejiga se recogen en bloque. Los ratones C57BL/6 presensibilizados sirvieron como receptores de aloinjertos renales. El riñón nativo derecho del receptor se extrae inmediatamente antes del trasplante. La aorta infrarrenal y la vena cava inferior se aíslan cuidadosamente y se sujetan con pinzas. Se realiza una anastomosis terminolateral entre la vena renal del donante y la vena cava inferior del receptor utilizando suturas continuas de 10­ 0. También se realiza la anastomosis arterial entre el manguito aórtico del donante y la aorta del receptor. La perfusión instantánea del aloinjerto de riñón demuestra una anastomosis satisfactoria. Después, la reconstrucción urinaria se realiza mediante una anastomosis de vejiga a vejiga. El riñón nativo izquierdo se extrae el día 5 después del trasplante renal. La supervivencia del aloinjerto renal es seguida por exámenes diarios de la salud general del animal y la medición de los niveles de creatinina y la comparación con los de ratones normales sin tratamiento previo (p. ej., aproximadamente 20 pmoles/L). El rechazo del aloinjerto renal se considera cuando el ratón mostró signos de enfermedad (p. ej., pérdida de peso, estado moribundo, posición agachada, etc.) acompañados de niveles de creatinina superiores a
~100 pmoles/L durante dos días consecutivos; a continuación, se anestesia al receptor y se recoge el aloinjerto renal para el análisis histopatológico.
Ejemplo 15C. Análisis de aloanticuerpos circulantes
La presencia de anticuerpos o aloanticuerpos reactivos al donante está determinada por la capacidad de los sueros para unirse a esplenocitos DBA/2. La unión se detecta mediante citometría de flujo, utilizando anticuerpos de detección de cabra anti-IgG de ratón conjugados con FITC (específicos de la cadena y), anti-IgG1 de ratón de rata, anti-IgG2a de ratón de rata o anti-IgG2b de ratón de rata (BD Biosciences). La unión del anticuerpo se mide como la intensidad de fluorescencia media MFI usando esplenocitos DBA/2 como dianas para la unión de Ig. La fluorescencia de fondo se determina en experimentos de control para cada subtipo tomando el valor de MFI obtenido de la unión de cinco sueros C57BL/6 sin tratar. Los controles de tinción negativos incluyen esplenocitos más cada anticuerpo de detección.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de maduración de células B humanas (BCMA) y CD3, en donde el anticuerpo biespecífico comprende una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo que se une específicamente a BCMA, la cadena pesada comprende una CDR1H de SEQ ID NO: 39, una CDR2H de SEQ ID NO: 49 y una CDR3H de SEQ ID NO: 59 y la cadena ligera comprende una CDR1L de SEQ ID NO: 69, una CDR2L de SEQ ID NO:79 y una CDR3L de SEQ ID NO: 89.
2. El anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende una cadena pesada y ligera de un anticuerpo que se une específicamente a CD3, y en donde:
(i) los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1 de las cadenas pesada y ligera de BCMA se reemplazan entre sí; o
(ii) los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1 de las cadenas pesada y ligera de CD3 se reemplazan entre sí.
3. El anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las cadenas pesada y ligera del anticuerpo que se une específicamente a BCMA comprenden un VH de SEQ ID NO: 19 y un VL de SEQ ID NO: 29.
4. El anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende una parte Fc modificada que induce la muerte celular del 20 % o más de células de una preparación de células que expresan BCMA después de 24 horas a una concentración de dicho anticuerpo biespecífico de 100 nM por ADCC con respecto a un control en condiciones idénticas usando el mismo anticuerpo biespecífico con la parte Fc parental como control.
5. Un anticuerpo que se une específicamente a BCMA, en donde el anticuerpo comprende una CDR1H de SEQ ID NO: 39, una CDr 2h de SEQ ID NO: 49 y una CDR3H de SEQ ID NO: 59 y la cadena ligera comprende una CDR1L de SEQ ID NO: 69, una CDR2L de SEQ ID NO:79 y una CDR3L de SEQ ID NO: 89.
6. El anticuerpo según la reivindicación 5, en donde las cadenas pesada y ligera del anticuerpo que se une específicamente a BCMA comprenden un VH de SEQ ID NO: 19 y un VL de Se Q ID NO: 29.
7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 4, o el anticuerpo según la reivindicación 5 o la reivindicación 6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. El anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el anticuerpo según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso como un medicamento.
9. El anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el anticuerpo según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso como un medicamento en el tratamiento de trastornos de las células plasmáticas.
10. El anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el anticuerpo según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso como un medicamento en el tratamiento del mieloma múltiple.
11. El anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el anticuerpo según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, o la composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso como un medicamento en el tratamiento del lupus eritematoso sistémico.
12. Un método para la preparación del anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:
a) transformar una célula huésped con:
(i) vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a una primera diana; y
(ii) vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a una segunda diana, en donde los dominios variables VL y VH o los dominios constantes Cl y CH1 se reemplazan entre sí;
b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo biespecífico; y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo biespecífico de dicho cultivo,
en donde la primera diana es BCMA y la segunda diana es CD3 o la primera diana es CD3 y la segunda diana es BCMA.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2605390C2 (ru) 2011-08-23 2016-12-20 Рош Гликарт Аг Биспецифические антитела, специфичные к антигенам, активирующим т-клетки, и опухолевому антигену, и способы их применения
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
WO2014122144A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST CD3ε AND BCMA
NZ708182A (en) 2013-02-26 2019-08-30 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
TWI633891B (zh) 2013-06-04 2018-09-01 再生元醫藥公司 藉由投與ｉｌ－４ｒ抑制劑以治療過敏及增強過敏原－特異之免疫療法的方法
TWI634900B (zh) 2013-07-11 2018-09-11 再生元醫藥公司 藉由投與ｉｌ－４ｒ抑制劑治療嗜酸性食道炎的方法
GB201317928D0 (en) * 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Molecule
CA2945486A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Mcmaster University Trifunctional t cell-antigen coupler and methods and uses thereof
KR20240128110A (ko) 2014-02-28 2024-08-23 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ｉｌ-4ｒ 길항제의 투여에 의한 피부 감염의 치료 방법
MX2017001556A (es) 2014-08-04 2017-05-15 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t.
CA2963692A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
EP3023437A1 (en) * 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
LT3789402T (lt) 2014-11-20 2022-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Kompleksinė terapija, naudojant t ląsteles aktyvinančias bispecifines antigeną surišančias molekules ir pd-1 ašį surišančius antagonistus
ES2808853T3 (es) 2014-11-20 2021-03-02 Hoffmann La Roche Cadenas ligeras comunes y procedimientos de uso
EP3029068A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
PL3283106T3 (pl) 2015-04-13 2022-05-02 Pfizer Inc. Przeciwciała terapeutyczne i ich zastosowania
US10294304B2 (en) 2015-04-13 2019-05-21 Pfizer Inc. Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen
CN114634943A (zh) 2015-05-18 2022-06-17 T细胞受体治疗公司 使用融合蛋白对tcr重编程的组合物和方法
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
RS60030B1 (sr) * 2015-08-03 2020-04-30 Engmab Sarl Monoklonska antitela protiv humanog antigena sazrevanja b ćelija (bcma)
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
MA53750A (fr) 2015-08-17 2021-09-15 Janssen Pharmaceutica Nv Anticorps anti-bcma, molécules de liaison d'antigène bispécifiques qui se lient au bcma et cd3 et leurs utilisations
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
WO2017055389A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
EP4026848A1 (en) 2015-12-09 2022-07-13 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing the cytokine release syndrome
PL3400246T3 (pl) 2016-01-08 2021-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworów z dodatnim markerem cea z wykorzystaniem antagonistów wiążących oś pd-1 oraz przeciwciał dwuswoistych anty-cea/anty-cd3
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
US10781264B2 (en) 2016-02-03 2020-09-22 Amgen Research (Munich) Gmbh PSMA and CD3 bispecific T cell engaging antibody constructs
CR20180420A (es) * 2016-02-03 2018-12-05 Amgen Inc Constructos de anticuerpo biespecíficos para bcma y cd3 que se ligan a células t
SG11201806261XA (en) 2016-02-17 2018-09-27 Seattle Genetics Inc Bcma antibodies and use of same to treat cancer and immunological disorders
JP2019513347A (ja) 2016-03-04 2019-05-30 ノバルティス アーゲー 複数のキメラ抗原受容体（ｃａｒ）分子を発現する細胞およびその使用
HUE061946T2 (hu) 2016-03-22 2023-09-28 Hoffmann La Roche Proteáz-aktivált T-sejt bispecifikus molekulák
PT3436030T (pt) 2016-04-01 2022-11-18 Amgen Inc Recetores quiméricos e métodos para a sua utilização
EA201891965A1 (ru) 2016-04-01 2019-04-30 Кайт Фарма, Инк. Химерные рецепторы антигенов и т-клеточные рецепторы и способы их применения
EP3436036A4 (en) * 2016-04-01 2020-03-18 Kite Pharma, Inc. BCMA-BINDING MOLECULES AND METHOD FOR USE THEREOF
DK3443096T5 (da) 2016-04-15 2024-09-09 Novartis Ag Sammensætninger og fremgangsmåder til selektiv ekspression af kimære antigenreceptorer
MX2018016404A (es) * 2016-06-21 2019-10-15 Teneobio Inc Anticuerpos de union a cd3.
CN110267677A (zh) 2016-08-01 2019-09-20 诺华股份有限公司 使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症
EP3494138A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
MA46098A (fr) 2016-09-01 2019-07-10 Regeneron Pharma Méthodes de prévention ou de traitement de l'allergie par administration d'un antagoniste d'il-4 r
US20180064758A1 (en) * 2016-09-05 2018-03-08 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
RS65595B1 (sr) 2016-09-14 2024-06-28 Teneoone Inc Antitela koja vezuju cd3
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
WO2018067993A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for t-cell receptors reprogramming using fusion proteins
CN110167964B (zh) 2016-11-02 2023-12-01 百时美施贵宝公司 组合用于治疗多发性骨髓瘤的针对bcma和cd3的双特异性抗体和免疫药物
JP7291396B2 (ja) 2016-11-22 2023-06-15 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
US11434299B2 (en) 2016-12-21 2022-09-06 Teneobio, Inc. Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
MX2019007347A (es) * 2016-12-22 2019-12-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo anti-cd3 y moleculas que comprenden el anticuerpo.
CN108341872B (zh) * 2017-01-23 2020-05-19 科济生物医药（上海）有限公司 靶向bcma的抗体及其应用
JP2020506700A (ja) 2017-01-31 2020-03-05 ノバルティス アーゲー 多重特異性を有するキメラｔ細胞受容体タンパク質を用いた癌の治療
EP3576793A4 (en) * 2017-02-06 2021-03-31 Dana Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR ENHANCING ANTIBODY-MEDIATED RECEPTOR SIGNALING
AU2018219887B2 (en) 2017-02-08 2024-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
AU2018219348A1 (en) * 2017-02-10 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding BCMA, NKG2D and CD16
KR20240063204A (ko) 2017-02-17 2024-05-10 프레드 허친슨 캔서 센터 Bcma 관련 암 및 자가면역 장애의 치료를 위한 조합 요법
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CA3051062C (en) 2017-02-28 2023-09-26 Affimed Gmbh Tandem diabody for cd16a-directed nk-cell engagement
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
IL270415B2 (en) 2017-05-12 2024-08-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for cell engineering and their uses in immuno-oncology
US11939385B2 (en) 2017-05-16 2024-03-26 ALX Oncology Inc. Activatable antibodies and methods of use thereof
WO2018237006A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Teneoone, Inc. ANTIBODIES ONLY TO HEAVY ANTI-BCMA CHAINS
WO2018237037A2 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Teneobio, Inc. HEAVY CHAIN ANTIBODY ONLY ANTI-BCMA
US11053309B2 (en) 2017-08-04 2021-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating active eosinophilic esophagitis
US11427826B2 (en) 2017-08-11 2022-08-30 City of Hopw RNA aptamers against transferrin receptor (TfR)
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
WO2019053611A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited POLY THERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2019053613A2 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited POLY THERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER
US20200254093A1 (en) 2017-09-14 2020-08-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
TWI713843B (zh) * 2017-09-30 2020-12-21 大陸商科濟生物醫藥(上海)有限公司 標靶bcma的抗體及其應用
CA3078637A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Mcmaster University T cell-antigen coupler with y182t mutation and methods and uses thereof
AR123115A1 (es) 2017-10-18 2022-11-02 Novartis Ag Composiciones y métodos para la degradación selectiva de proteínas
CA3088095A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
EP3717907A1 (en) 2017-11-30 2020-10-07 Novartis AG Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
AU2018392088A1 (en) 2017-12-22 2020-08-13 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to CD22
CA3087061A1 (en) * 2017-12-27 2019-07-04 Teneobio, Inc. Cd3-delta/epsilon heterodimer specific antibodies
TW201930591A (zh) 2018-01-08 2019-08-01 瑞士商諾華公司 用於與嵌合抗原受體療法併用之免疫增強rna
CA3090249A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US11884733B2 (en) 2018-02-08 2024-01-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
KR20200118065A (ko) 2018-02-08 2020-10-14 제넨테크, 인크. 이중특이적 항원-결합 분자 및 이의 사용 방법
US20200399383A1 (en) 2018-02-13 2020-12-24 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
CN112119099A (zh) 2018-03-02 2020-12-22 Cdr-生物科技股份有限公司 三特异性抗原结合蛋白
US11952424B2 (en) 2018-03-30 2024-04-09 Merus N.V. Multivalent antibody
WO2019198051A2 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Affimed Gmbh Nk cell engaging antibody fusion constructs
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
WO2019213282A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
CN112105420A (zh) 2018-05-11 2020-12-18 克里斯珀医疗股份公司 用于治疗癌症的方法和组合物
SG11202009371WA (en) 2018-05-13 2020-10-29 Regeneron Pharma Methods for treating atopic dermatitis by administering an il-4r inhibitor
MX2020012286A (es) 2018-05-16 2021-04-28 Janssen Biotech Inc Metodos para tratar canceres y potenciar la eficacia de agentes terapeuticos para el redireccionamiento de celulas t.
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
EP3802611A2 (en) * 2018-06-01 2021-04-14 Novartis AG Binding molecules against bcma and uses thereof
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
WO2020047452A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN109293772B (zh) * 2018-09-25 2020-09-29 上海邦耀生物科技有限公司 靶向bcma蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物
JP2022509454A (ja) 2018-10-31 2022-01-20 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド 癌の処置法
WO2020128972A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
US20220073605A1 (en) * 2018-12-20 2022-03-10 Cedars-Sinai Medical Center Clazakizumab in the treatment of chronic antibody-mediated rejection of organ transplant
CN109678961A (zh) * 2019-01-15 2019-04-26 深圳市南科生物工程有限公司 一种基于bmca纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用
EP3924054A1 (en) 2019-02-15 2021-12-22 Novartis AG 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020165834A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
JP2022523204A (ja) 2019-02-25 2022-04-21 ノバルティス アーゲー ウイルス送達のためのメソポーラスシリカ粒子組成物
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
WO2020191346A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of il-4/il-13 pathway inhibitors and plasma cell ablation for treating allergy
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20220251152A1 (en) 2019-04-24 2022-08-11 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
WO2020222176A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
US20220323599A1 (en) * 2019-05-03 2022-10-13 Celgene Corporation Anti-bcma antibody conjugate, compositions comprising the same, and methods of making and using the same
KR20220020810A (ko) 2019-06-14 2022-02-21 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd22와 cd3에 결합하는 다중특이적 중쇄 항체
CA3147113A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating atopic dermatitis by administering an il-4r antagonist
SG11202113312VA (en) 2019-08-05 2021-12-30 Regeneron Pharma Methods for treating allergy and enhancing allergen-specific immunotherapy by administering an il-4r antagonist
KR20220041915A (ko) 2019-08-06 2022-04-01 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드 바이오제약 조성물 및 관련 방법
WO2021108661A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021104371A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. Antibodies to cd3 and bcma, and bispecific binding proteins made therefrom
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
CN111234020B (zh) * 2020-01-23 2020-10-23 和铂医药(苏州)有限公司 一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用
JP2023514727A (ja) 2020-02-21 2023-04-07 シルバーバック セラピューティックス インコーポレイテッド ネクチン－４抗体コンジュゲートおよびその使用
US20230174933A1 (en) 2020-02-27 2023-06-08 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP4110376A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
TWI838621B (zh) 2020-04-29 2024-04-11 美商泰尼歐萬公司 具有經修飾重鏈恆定區之多特異性重鏈抗體
EP4186564A1 (en) 2020-04-29 2023-05-31 Teneoone, Inc. Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
MX2022014166A (es) 2020-05-11 2022-12-02 Janssen Biotech Inc Metodos para tratar el mieloma multiple.
KR20230013258A (ko) 2020-05-19 2023-01-26 얀센 바이오테크 인코포레이티드 T 세포 재유도 치료제 및 vla-4 부착 경로 억제제를 포함하는 조성물
EP4165169A1 (en) 2020-06-11 2023-04-19 Novartis AG Zbtb32 inhibitors and uses thereof
EP4168447A1 (en) 2020-06-19 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to cd3 and cd19
KR20230027056A (ko) 2020-06-23 2023-02-27 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법
US20230257473A1 (en) 2020-06-30 2023-08-17 Teneobio, Inc. Multi-specific antibodies binding to bcma
EP4175673A1 (en) 2020-07-01 2023-05-10 ARS Pharmaceuticals Inc. Anti-asgr1 antibody conjugates and uses thereof
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
MX2023002107A (es) 2020-08-21 2023-03-15 Novartis Ag Composiciones y metodos para la generacion in vivo de celulas que expresan car.
EP4237451A1 (en) 2020-11-02 2023-09-06 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Bcma/taci antigen-binding molecules
WO2022135468A1 (zh) * 2020-12-23 2022-06-30 信达生物制药(苏州)有限公司 抗bcma×cd3双特异性抗体及其用途
JP2024509169A (ja) * 2021-03-03 2024-02-29 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート
US20240158505A1 (en) * 2021-03-26 2024-05-16 Theranotics Co., Ltd. B7-h3 antibody or antigen-binding fragment thereof, and use thereof
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
BR112023020832A2 (pt) 2021-04-08 2023-12-19 Marengo Therapeutics Inc Moléculas multifuncionais ligadas a tcr e seus usos
JP2024515793A (ja) 2021-04-27 2024-04-10 ノバルティス アーゲー ウイルスベクター生産システム
EP4347656A1 (en) 2021-05-28 2024-04-10 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapies for treating cancer
US12016923B2 (en) 2021-06-01 2024-06-25 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Claudin 18.2 T cell-antigen couplers and uses thereof
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
JP2024530643A (ja) 2021-08-03 2024-08-23 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド バイオ医薬組成物および安定同位体標識ペプチドマッピング法
JP2024531364A (ja) 2021-08-20 2024-08-29 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
EP4397685A1 (en) * 2021-09-03 2024-07-10 Novoprotein Scientififc Inc. Anti-cd3 humanized antibody
EP4412713A1 (en) 2021-10-05 2024-08-14 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd Combination therapies for treating cancer
CN118591560A (zh) 2022-01-25 2024-09-03 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 癌症的组合疗法
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
TW202409280A (zh) 2022-07-08 2024-03-01 新加坡科技研究局 Cnx抗原結合分子
WO2024050524A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for directing apolipoprotein l1 to induce mammalian cell death
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
WO2024121711A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Methods of treatment using b-cell maturation antigen antagonists

Family Cites Families (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6410516B1 (en) 1986-01-09 2002-06-25 President & Fellows Of Harvard College Nuclear factors associated with transcriptional regulation
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5273743A (en) 1990-03-09 1993-12-28 Hybritech Incorporated Trifunctional antibody-like compounds as a combined diagnostic and therapeutic agent
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
DE69535557T2 (de) 1994-12-30 2008-04-30 Planet Biotechnology, Inc., San Diego Verfahren zur herstellung von schutzproteine enthaltende immunoglobuline und ihre verwendung
GB9501079D0 (en) 1995-01-19 1995-03-08 Bioinvent Int Ab Activation of T-cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
EP0826696B1 (de) 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
EP0981548A4 (en) 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc SINGLE CHAIN PROTEINS FIXING ANTIGENS CAPABLE OF GLYCOSYLATION, PRODUCTION AND USES THEREOF
WO1999012964A2 (en) 1997-09-12 1999-03-18 Biogen, Inc. Kay - a novel immune system protein
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
ATE453712T1 (de) 1999-01-07 2010-01-15 Zymogenetics Inc Verfahren zur therapeutischen verwendung von löslichen rezeptoren br43x2
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US20020142000A1 (en) 1999-01-15 2002-10-03 Digan Mary Ellen Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
WO2001024812A1 (en) 1999-10-06 2001-04-12 N.V. Nutricia USE OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR β AND GROWTH FACTORS IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF DISEASES OF THE INTESTINAL MUCOSA
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
EP2149604A1 (en) 2000-09-08 2010-02-03 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
CA2424977C (en) 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
EP1331266B1 (en) 2000-10-06 2017-01-04 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
EP2301971A1 (en) 2001-02-20 2011-03-30 ZymoGenetics, L.L.C. Antibodies that bind both BCMA and TACI
CA2763913C (en) 2001-08-10 2014-10-28 Aberdeen University Antigen binding domains
ES2276735T3 (es) 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
ATE356149T1 (de) 2001-11-14 2007-03-15 Affimed Therapeutics Ag Bispezifische antikörper gegen cd19 und cd16 und deren verwendung
AU2003221256A1 (en) 2002-02-21 2003-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
GB0230201D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
EP2248892B1 (en) 2003-01-22 2015-04-22 Roche Glycart AG Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased FC receptor binding affinity and effector function
PT1599504E (pt) 2003-02-25 2015-03-02 Vaccibody As Anticorpo modificado
EP1629013B1 (en) 2003-05-31 2018-01-24 Amgen Research (Munich) GmbH Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody specific for epcam
JP4276000B2 (ja) 2003-06-16 2009-06-10 株式会社ブンリ サイクロン形異物分離装置
CA2533830A1 (en) 2003-08-07 2005-02-24 Epitomics, Inc. Methods for humanizing rabbit monoclonal antibodies
JP2008504002A (ja) 2003-11-12 2008-02-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド改変体、ダイマーＦｃ結合タンパク質、およびそれらに関連する方法
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
CA2554526A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
EP2330120A3 (en) 2004-06-02 2011-11-16 AdAlta Pty Ltd Binding moieties based on Shark IgNAR domains
RS50785B (sr) 2005-01-05 2010-08-31 F-Star Biotechnologische Forschungs-Und Entwicklungsges M.B.H. Domeni sintetskih imunoglobulina sa svojstvima vezivanja, konstruisani u svojstvima molekula, koji se razlikuju od regiona, koji određuju komplementarnost
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
EP1868650B1 (en) 2005-04-15 2018-10-03 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
CA2605781A1 (en) 2005-05-09 2007-04-12 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
KR20080068004A (ko) 2005-08-15 2008-07-22 아라나 테라퓨틱스 리미티드 뉴 월드 영장류 구조형성영역을 가진 조작 항체
BRPI0615397B1 (pt) 2005-08-26 2023-10-03 Roche Glycart Ag Anticorpo anti-cd20, composição farmacêutica que o contém e uso do mesmo
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
EP1940881B1 (en) * 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
CN102784392A (zh) * 2005-10-13 2012-11-21 人体基因组科学有限公司 用于治疗自身抗体阳性疾病患者的方法和组合物
WO2007117600A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Macrogenics, Inc. Combination therapy for treating autoimmune diseases
CN101466733A (zh) 2006-04-14 2009-06-24 特鲁比昂药品公司 包含免疫球蛋白铰链区和Fc效应子功能改变了的Fc区的结合蛋白
CN104497143B (zh) 2007-03-29 2020-08-25 健玛保 双特异性抗体及其制造方法
HUE040467T2 (hu) 2007-04-03 2019-03-28 Amgen Res Munich Gmbh Keresztfaj-specifikus kötõdomén
WO2008119566A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
ES2432792T5 (es) 2007-04-03 2023-01-16 Amgen Res Munich Gmbh Dominio de unión a CD3-épsilon específico de especies cruzadas
RU2490277C2 (ru) * 2007-09-26 2013-08-20 Дженентек, Инк. Новые антитела
US9266967B2 (en) * 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) * 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
CA2710912A1 (en) 2008-01-15 2009-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Afucosylated antibodies against ccr5 and their use
DK2265283T3 (da) 2008-03-18 2014-10-20 Seattle Genetics Inc Auristatin-lægemiddel-linker-konjugater
EP2283355A2 (en) 2008-04-25 2011-02-16 Zymogenetics, Inc. Levels of bcma protein expression on b cells and use in diagnostic methods
EP2352763B2 (en) 2008-10-01 2022-09-21 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens
ME02485B (me) 2008-10-01 2017-02-20 Amgen Res Munich Gmbh Bispecifično jednolančano protutijelo psmaxcd3 s međuvrsnom specifičnošću
AU2009299794B2 (en) 2008-10-01 2015-08-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
WO2010063785A2 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Genmab A/S Antibody variants having modifications in the constant region
EP2196090B1 (de) 2008-12-12 2012-02-01 Oro Clean Chemie AG Viruzides Desinfektionsmittel
LT2406284T (lt) * 2009-03-10 2016-10-10 Biogen Ma Inc. Antikūnai prieš b ląstelių subrendimo antigenus
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN102334088B (zh) 2009-07-29 2015-04-15 阿尔卑斯电气株式会社 操作装置
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CN103097417B (zh) 2010-04-20 2019-04-09 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
WO2012004811A1 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Ind-Swift Laboratories Limited Process for the preparation of 5-substsituted indole derivative
RU2584597C2 (ru) 2010-08-13 2016-05-20 Рош Гликарт Аг Антитела против а2 тенасцина с и способы их применения
WO2012066058A1 (en) 2010-11-16 2012-05-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
US20120258073A1 (en) 2011-02-10 2012-10-11 Christian Gerdes Immunotherapy
MX342034B (es) 2011-02-28 2016-09-12 Hoffmann La Roche Proteinas monovalentes que se unen a antigenos.
RU2607014C2 (ru) 2011-03-29 2017-01-10 Рош Гликарт Аг Fc варианты антитела
US9179843B2 (en) * 2011-04-21 2015-11-10 Hassan Ghaderi MOGHADDAM Method and system for optically evaluating proximity to the inferior alveolar nerve in situ
US20130101599A1 (en) 2011-04-21 2013-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bcma-based stratification and therapy for multiple myeloma patients
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
SG10201509588TA (en) 2011-05-21 2015-12-30 Macrogenics Inc CD3-Binding Molecules Capable Of Binding To Human And Non-Human CD3
EA028220B1 (ru) 2011-05-27 2017-10-31 Глаксо Груп Лимитед Иммуноконъюгат на основе белка, связывающегося с bcma (cd269/tnfrsf17), его медицинское применение и фармацевтическая композиция
PE20141521A1 (es) 2011-08-23 2014-10-25 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
RU2605390C2 (ru) 2011-08-23 2016-12-20 Рош Гликарт Аг Биспецифические антитела, специфичные к антигенам, активирующим т-клетки, и опухолевому антигену, и способы их применения
BR112014003598B1 (pt) 2011-08-23 2022-05-31 Roche Glycart Ag Molécula de ligação de antígeno biespecífica, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação de antígeno biespecífica
WO2013026837A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6060162B2 (ja) 2011-08-23 2017-01-11 ロシュ グリクアート アーゲー ２つのＦａｂフラグメントを含むＦｃ不含抗体および使用方法
CA2850818A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Genentech, Inc. Improved assembly of bispecific antibodies
TWI679212B (zh) * 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
CN104379179A (zh) 2012-04-11 2015-02-25 美国卫生和人力服务部 靶向b-细胞成熟抗原的嵌合抗原受体
ES2848732T3 (es) 2012-08-07 2021-08-11 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
EP3508503B1 (en) 2012-11-01 2022-11-02 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Antibody against cd269 (bcma)
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
WO2014122144A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST CD3ε AND BCMA
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
EP2982692A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA

Also Published As

Publication number Publication date
JP6918065B2 (ja) 2021-08-11
HK1212710A1 (zh) 2016-06-17
US20150368351A1 (en) 2015-12-24
CN104968682A (zh) 2015-10-07
ES2667420T3 (es) 2018-05-10
US10851171B2 (en) 2020-12-01
CN104968683B (zh) 2020-07-17
US20180222991A1 (en) 2018-08-09
PL2953972T3 (pl) 2021-03-08
EP3620468A1 (en) 2020-03-11
HK1212709A1 (zh) 2016-06-17
US20150376287A1 (en) 2015-12-31
JP2020023523A (ja) 2020-02-13
EP2953972B1 (en) 2020-07-08
EP2953974B1 (en) 2017-12-20
EP2953974A1 (en) 2015-12-16
JP6944573B2 (ja) 2021-10-06
US20210070873A1 (en) 2021-03-11
DK2953972T3 (da) 2020-10-12
CN104968683A (zh) 2015-10-07
JP2016507523A (ja) 2016-03-10
CN111848796A (zh) 2020-10-30
US9963513B2 (en) 2018-05-08
JP2020180158A (ja) 2020-11-05
JP6636803B2 (ja) 2020-01-29
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