KR20170109529A - Cd3 엡실론 및 bcma에 대응하는 양특이성 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반 항체 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 BCMA 및 인간 CD3ε의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체를 제공한다. 이러한 양특이성 항체는 다발성 골수종과 같은 형질 세포 질환을 치료하는 약제로서 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 CD3ε 및 BCMA에 대응하는 새로운 양특이성 항체, 그의 제조 및 용도에 관한 것이다.
BCMA로도 알려진 인간 B 세포 성숙 표적(B cell maturation target); TR17_HUMAN, TNFRSF17(UniProt Q02223)은 분화 형질 세포에서 우선적으로 발현하는 종양 괴사 수용체 상과의 한 구성원이다(Laabi et al. 1992; Madry et al. 1998). BCMA는 비-당화 III형 막관통 단백질이고, 이는 B 세포 성숙, 성장 및 생존에 관련된다. BCMA는 TNF 상과의 두 리간드의 수용체다: BCMA에 대해 고친화성 리간드인 APRIL(증식-유도 리간드), 및 BCMA에 대해 저친화성 리간드인 B 세포 활성인자 BAFF(THANK, BlyS, B 림프구 자극인자, TALL-1 및 zTNF4). APRIL 및 BAFF는 구조적 유사함, 및 중복되지만 명확한 결합 특이성을 보인다. 음성조절자 TACT 또한 BAFF 및 APRIL 둘 모두에 결합한다. BCMA 및/또는 TACI에 APRIL 및 BAFF의 배위결합은 전사인자 NF-κB를 활성화시키고, 그리고 생존촉진(pro-survival) Bcl-2군의 구성원(family member)(예: Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1)의 발현 및 세포자멸촉진(pro-apoptotic) 구성원(예: Bid, Bad, Bik, Bim, 등)의 하향 조절을 증가시키고, 그러므로 세포자멸을 억제하고 생존을 촉진한다. 이 병행된 작용은 B 세포 분화, 증식, 생존, 및 항체 생산을 촉진한다(Rickert RC et al., Immunol Rev (2011) 244 (1): 115-133에서 보고된 대로).
T-림프구의 TCR/CD3 복합체는 CD3 표지 감마(γ), 델타(δ), 엡실론(ε), 제타(ζ), 및 에타(η)의 불변 소단위(invariant subunit)를 가진 세포 표면에서 공동발현(coexpressed)하는 TCR 알파(α)/베타(β) 또는 TCR 감마(γ)/델타(δ) 헤테로다이머로 구성된다. 인간 CD3은 UniProt P07766 하에 기술된다(CD3E_HUMAN). 선행기술에서 기술된 항CD3 항체(anti CD3 antibody)는 SP34이다(Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34는 영장류 및 인간 CD3 모두와 반응한다. SP34는 PharMingen에서 구할 수 있다. 선행기술에서 더 기술된 항CD3 항체는 UCHT-1이다(WO2000041474 참조). 선행기술에서 더 기술된 항CD3 항체는 BC-3이다(Fred Hutchinson Cancer Research Institute; used in Phase I/II trials of GvHD, Anasetti et al., Transplantation 54: 844(1992)). WO2014056783은 동일한 CDR, VH 및 VL을 가진 본 발명의 항CD3 항체를 언급한다.
최근 매우 다양한 재조합 양특이성 항체 형식(format)이, 예를 들어 IgG 항체 형식 및 단쇄 도메인을, 예를 들어, 융합하는 것으로 개발되었다(Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16 참조). 가변 도메인 VL 및 VH, 또는 불변(constant) 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 대체된 양특이성 항체는 WO2009080251 및 WO2009080252에 기술된다.
'노브-인투-홀(knobs-into-holes)'으로 알려진 잘못 짝지어진(mispaired) 부산물의 문제를 피하는 접근법은 접촉 경계면을 변경하기 위해 CH3 도메인에 돌연변이를 도입하는 것으로 두 개의 다른 항체 중쇄가 짝을 짓게 하는 것을 목표로 한다. 하나의 사슬에서 '홀(hole)'을 만들기 위해 부피가 큰(bulky) 아미노산이 짧은 곁사슬을 가진 아미노산으로 대체된다. 반대로, '노브(knob)'를 만들기 위해 큰 곁사슬을 가진 아미노산은 다른 CH3 도메인에 도입된다. 이러한 두 개의 중쇄를(그리고 이 중쇄 모두에 적절한, 본 발명에 따른 용도를 위한 두 개의 일반 경쇄) 공동 발현시킴으로서, 고효율(high yield)의 헤테로다이머 형성('노브-홀') 대(對) 호모다이머 형성('홀-홀' 또는 '노브-노브')이 관측되었다(Ridgway JB, Presta LG, Carter P; 및 WO1996027011). 헤테로다이머의 비율은 파지 디스플레이(phage display) 접근법을 사용해 두 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면을 리모델링하고 그리고 헤테로다이머를 안정시키기 위해 이황화 다리를 도입하는 것으로 더 증가시킬 수 있다(Merchant A.M, et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Aτwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., J Mol. Biol. 270 (1997) 26-35). 노브-인투-홀 기술을 위한 새로운 접근법은 예를 들어 EP 1870459A1에 기술되었다. 이 형식은 매우 매력적으로 보이긴 하지만, 임상쪽으로의 진행을 나타내는 데이터가 현재로서는 존재하지 않는다. 이 전략의 하나의 중요한 제약은 잘못 짝지어지는 것과 불활성 분자의 형성을 방지하기 위해서는 두 개의 모항체의 경쇄가 동일해야 한다는 것이다. 그러므로 이 기술은 두 표적에 대응하는 재조합, 양특이성 항체를 제1 표적 및 제2 표적에 대응하는 두 개의 항체로부터 시작하여 쉽게 개발하는데 적합하지 않은데, 이러한 항체 및/또는 본 발명에 따른 용도를 위한 일반 경쇄가 최적화되어야 하기 때문이다. Xie, Z., et al, J Immunol. Methods 286 (2005) 95-101은 FC 부분을 위해 scFv를 노브-인투-홀 기술과 결합하여 사용하는 양특이성 항체의 형식을 언급한다. WO2012116927 및 WO2010145792는 CH1 및 CL 도메인을 교환하는 것을 언급한다. WO2009080254는 양특이성 항체를 생산하기 위한 노브 인 홀 구성을 언급한다. WO 2006093794는 헤테로다이머 단백질 결합 구성(binding compositions)과 관련된 것이다. WO199937791은 다용도 항체 유도체를 기술한다. Morrison, S.L., et al., J. Immunol. 160 (1998) 2802-2808은 가변 영역 도메인 교환이 IgG의 기능적 특성에 미치는 영향을 언급한다.
WO 201302362는 헤테로다이머(heterodimerized) 폴리펩티드와 관련된 것이다. WO201312733은 헤테로다이머 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 관련된 것이다. WO2012131555는 가공된(engineered) 헤테로다이머 면역글로불린과 관련된 것이다. EP 2647707은 가공된 헤테로-다이머 면역글로불린과 관련된 것이다. WO2009080251, WO 2009080252, WO 2009080253, WO 2009080254 및 Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191은 교차 도메인(domain crossover)을 가진 이가의 양특이성 IgG 항체와 관련된 것이다. BCMA에 대응하는 항체는, 예를 들어 Gras M-P. et al. Int Immunol. 7 (1995) 1093-1106, WO200124811, WO200124812, WO2010104949 및 WO2012163805에 기술된다. BCMA에 대응하는 항체 및 림프종 및 다발성 골수종의 치료를 위한 그의 용도는, 예를 들어 WO2002066516 및 WO2010104949에 언급된다. WO2013154760은 BCMA 인식 모이어티(recognition moiety) 및 T-세포 활성화 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)와 관련된 것이다.
Ryan, MC et al., Mol. Cancer Ther. 6 (2007) 3009-3018은 형질 세포 암을 위해 BCMA를 표적하는 것과 관련된 것이다. 항체 SG1과 리간드 차단활동(blocking activity)은 네이키드 항체(naked antibodies) 또는 항체-약물 결합체(ADC)로서 다발성 골수종(MM) 세포계의 세포독성을 촉진시킬 수 있다. 억제 BCMA 항체인 SG1은 시험관에서 투여량(dose)-의존 방식으로 핵인자-κB의 APRIL-의존 활성화를 차단한다. SG1의 세포독성은 FcγRIIIA 결합을 강화하는 Fc 돌연변이와 또는 이것 없이 키메라화(chimerization)한 이후 네이키드 항체로서 분석되었다. 라이언은 APRIL의 BCMA로의 결합을 크게 억제하지 않는 항체 SG2 또한 언급한다. 그러나 SG2는 BCMA 양성 골수종 세포계에 대응하는 약물 결합체의 세포독성 활동으로서 측정된 SGI보다 20배 높은 IC50 값을 보였다. 라이언은 BCMA 항체가 APRIL-의존 NF-κB 활성화, 자연 살해 세포-매개 ADCC 활동에 의한 종양 세포 용해의 촉진, 및 ACD에 의한 세포독성의 유도를 포함하는 복수의 메커니즘을 통해 골수종 세포계에 작용할 수 있단 결론을 내린다.
CD3 및 BCMA에 대응하는 양특이성 항체는 WO2007117600, WO2009132058, WO2012066058, WO2012143498, 및 WO2013072415에 언급된다. WO2014122143 및 WO2014122144는 BCMA에 대응하는 항체 및 CD3에 대응하는 양특이성 항체, 그리고 본 발명에도 기술된 특정 CDR 및 가변 도메인을 포함하는 BCMA를 기술한다. SEQ ID NO:2의 가변 경쇄 VL 및 CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L을 포함하는 VL은 본 명세서에 항CD3 항체의 경쇄로서 언급된다.
Klein Ch., et al., mAbs 4:6, 653-663; 2012는 일반 경쇄와 결합된 노브-인투-홀(KiH) 기술을 언급한다. Merchant AM. Et al., Nature Biotech 16, 677-681 (1998)은 동일한 경쇄 및 리모델된 중쇄를 가진 양특이성 항체와 관련된 것이다. Weidle UH et al.은 하나의 경쇄를 공유하지만 그럼에도 별개의 특이성을 가진 두 개의 결합체를 결합하는 "일반 경쇄(common light chain)" 원칙을 사용하여 L-사슬이 잘못 짝지어지는 것을 방지하는 것과 관련된 것이다. WO2007147901, WO2013184761, 및 WO2014124326 또한 일반 경쇄 기술과 관련된 것이다. WO2014140248은 BCMA 및 CD3ε에 결합하는 양특이성 항체를 언급한다. huBCMA를 위한 상기 양특이성 항체의 Kd 값은 나노몰 이하의(subnanomolar) 범위에 있었다. 상기 양특이성 항체는 종양 이종 이식 모델에서 치료 효과를 보였다. WO 2013/072406은 BCMA 및 CD3ε에 결합하는 양특이성 항체를 언급한다. huBCMA를 위한 상기 양특이성 항체의 Kd 값은 나노몰 이하의 범위에 있었다. 상기 항체는 인간 BAFF-수용체 및 TACI와 교차 반응하지 않았고, 효과기 T 세포를 BCMA-발현 표적으로 전가하는 것으로(redirecting) 세포독성 활동을 보였다. 상기 양특이성 항체는 종양 이종 이식 모델에서 치료 효과를 보였다.
따라서, 잘못 짝지어지는 경쇄 없이 고효율로 생산될 수 있고, 간단하게 정제될 수 있고, 그리고 BCMA에 고친화성을 보이고 BCMA-양성 세표를 사멸하는 CD3ε 및 BCMA에 대응하는 양특이성 항체가 필요한 실정이다.
본 발명의 발명자들은 WO2014122143 및 WO2014122144에 기술된 인간 BCMA 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에 사용되는 항-CD3 항체(CH2527)의 경쇄가 그러한 양특이성 항체에 일반 경쇄로서 사용될 수 있음을 인식했다.
본 발명은 CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, 및 SEQ ID NO:8의 CDR3L을 포함하는 일반 항체 경쇄, 및 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함하는 CD3 결합 부분의 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 BCMA(이하 "BCMA"로도 명명) 및 인간 CD3ε(이하 "CD3"으로도 명명)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 본 발명에 따라 상기 일반 항체 경쇄 내에 일반 가변 경쇄 도메인 VL인 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 항체에 관련된 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 본 발명에 따라 SEQ ID NO:29의 일반 경쇄를 포함하는 항체에 관련된 것이다.
본 발명은 인간 BCMA(이하 "BCMA"로도 명명) 및 인간 CD3(이하 "CD3"으로도 명명)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에서 일반 경쇄로서 사용하기 위한, CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, 및 SEQ ID NO:8의 CDR3L을 포함하는 항체 경쇄에 관련된 것이고, 여기서 CD3 결합 부분의 중쇄는 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 인간 BCMA 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에서 일반 경쇄로서 사용하기 위한, 가변 경쇄 도메인 VL로서 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 항체 경쇄에 관련된 것이고, 여기서 CD3 결합 부분의 중쇄는 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 인간 BCMA 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에서 일반 경쇄로서 사용하기 위한 SEQ ID NO:29의 항체 경쇄에 관련된 것이고, 여기서 CD3 결합 부분의 중쇄는 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함한다.
본 발명은 인간 BCMA(이하 "BCMA"로도 명명) 및 인간 CD3(이하 "CD3"으로도 명명)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에서 일반 경쇄로서 사용하기 위한, CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, 및 SEQ ID NO:8의 CDR3L을 포함하는 항체 경쇄에 관련된 것이고, 여기서 CD3 결합 부분의 중쇄는 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함한다. 바람직하게는, 사용된 상기 항체 경쇄는 가변 경쇄 도메인 VL인 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 사용된 상기 항체 경쇄는 SEQ ID NO:29의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 인간 BCMA 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에 관련된 것이고, 여기서 CD3 결합 부분의 중쇄는 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함하고, CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, 및 SEQ ID NO:8의 CDR3L을 포함하는 항체 경쇄는 일반 경쇄이다.
바람직하게는, 본 발명은 인간 BCMA 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에 관련된 것이고, 여기서 CD3 결합 부분의 중쇄는 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함하고, 그리고 가변 경쇄 도메인 VL인 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 항체 경쇄는 일반 경쇄이다.
바람직하게는 본 발명은 CD3 결합 부분의 중쇄가 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함하고 그리고 SEQ ID NO:29의 항체 경쇄가 일반 경쇄인 것을 특징으로 하는 인간 BCMA 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에 관련된 것이다.
바람직하게는 CD3 결합 부분의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 VH인 SEQ ID NO:1의 VH를 포함한다.
본 발명에 따른 일반 경쇄의 불변 경쇄 CL는 카파 또는 람다 유형이고, 바람직하게는 카파형이다.
바람직하게는 BCMA 결합 부분의 중쇄는 CDR로서 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 세트를 포함한다:
a) SEQ ID NO:18의 CDR1H, SEQ ID NO:21의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:24의 CDR3H(pSCHLI333 세트),
b) SEQ ID NO:19의 CDR1H, SEQ ID NO:22의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:25의 CDR3H(pSCHLI372 세트),
c) SEQ ID NO:20의 CDR1H, SEQ ID NO:23의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:26의 CDR3H(pSCHLI373 세트),
d) SEQ ID NO:35의 CDR1H, SEQ ID NO:36의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:37의 CDR3H(83A10 세트).
바람직하게는 BCMA 결합 부분의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 VH로서 SEQ ID NO:15, 16, 17 또는 34의 VH(83A10)를 포함한다.
바람직하게는 친화성 설정(setup) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 500nM 또는 그 이하의 농도에 인간 BCMA Fc 융합이 있을 때 25nM의 항체 농도에서 측정된 상기 양특이성 항체의 인간 BCMA로의 친화성은 200nM이거나 그 이하다.
바람직하게는 상기 양특이성 항체의 BCMA-양성 H929 세포(ATCC CRL-9068)를 사멸시키는 효능(EC50)은, 전가된 T-세포 사멸 LDH 방출 분석에서 인간 PBCM 및 H929 세포가 24h에 10:1의 E:T 비율일 때, 100nM 또는 그 이하의 농도에서 사용될 때, 2nM 또는 그 이하로 측정된다.
바람직하게는 친화성 설정 표면 플라즈몬 공명 분석에서 500nM 또는 그 이하의 농도에 인간 BCMA Fc 융합이 있을 때 25nM의 항체 농도에서 측정된 상기 BCMA 결합 부분의 인간 BCMA로의 친화성은, 경쇄가 SEQ ID NO:29의 것이고, 인간 IgG1형의 항체에서 측정되었을 때 200nM 또는 그 이하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 양특이성 항체는 CD3에 특이적으로 결합하는 항체의 하나의 Fab 단편(이후 "CD3-Fab"으로도 명명), 및 BCMA 및 Fc 부분(part)에 특이적으로 결합하는 항체의 하나의 Fab 단편(이후 "BCMA-Fab"으로도 명명)으로 이루어지고, 상기 CD3-Fab 및 상기 BCMA-Fab은 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 상기 CD3-Fab 및 상기 BCMA-Fab은 본 발명에 따른 용도를 위한 상기 일반 경쇄를 포함한다(도 1a).
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 양특이성 항체는 두 개의 BCMA-Fab, 하나의 CD3 Fab 및 하나의 Fc 부분으로 이루어지고, 제1 BCMA-Fab 및 상기 CD3-Fab은 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 제2 BCMA-Fab은 그의 C-말단으로 상기 제1 BCMA-Fab의 N-말단에 연결된다. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 본 발명에 따른 용도를 위해 일반 경쇄를 포함한다(도 1b).
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 양특이성 항체는 두 개의 BCMA-Fab 및 하나의 Fc 부분으로 이루어지고, 상기 BCMA-Fab은 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 상기 CD3-Fab은 그의 C-말단으로 상기 BCMA-Fab의 N-말단에 연결된다. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 본 발명에 따른 용도를 위해 일반 경쇄를 포함한다(도 1c).
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 양특이성 항체는 하나의 CD3-Fab 및 하나의 BCMA Fab으로 이루어지고, 이는 그의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분 및 BCMA-Fab의 경첩부위에 연결되고, 이는 그의 C-말단으로 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결된다. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 본 발명에 따른 용도를 위해 일반 경쇄를 포함한다(도 1d).
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 양특이성 항체는 하나의 BCMA-Fab 및 하나의 CD3 Fab으로 이루어지고, 상기 BCMA Fab은 그의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 상기 CD3-Fab은 그의 C-말단으로 상기 BCMA-Fab의 N-말단에 연결된다. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 본 발명에 따른 용도를 위해 일반 경쇄를 포함한다(도 1e).
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 양특이성 항체는 두 개의 BCMA-Fab으로 이루어지고, 제1 BCMA-Fab은 그의 C-말단을 통해 제2 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되고, 그리고 상기 제2 BCMA-Fab은 그의 C-말단을 통해 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결된다. 상기 CD3-Fab 및 두 개의 BCMA-Fab 모두 본 발명에 따른 용도를 위해 일반 경쇄를 포함한다(도 1f).
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 양특이성 항체는 하나의 BCMA-Fab 및 하나의 CD3 Fab으로 이루어지고, 상기 BCMA-Fab은 그의 C-말단으로 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결된다. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 본 발명에 따른 용도를 위해 일반 경쇄를 포함한다(도 1g).
본 발명에 따른 항체의 바람직한 구체예는 하나의 CD3-Fab, 및 하나의 BCMA-Fab 및 하나의 Fc 부분으로 이루어지고, 상기 CD3-Fab 및 상기 BCMA-Fab은 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위 및 제2 BCMA에 연결되고, 이는 그의 C-말단으로 CD3-Fab의 N-말단에 연결된다. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 본 발명에 따른 용도를 위해 일반 경쇄를 포함한다(도 1b 및 1c). 특히 바람직한 것은 BCMA-Fab-Fc-CD3-Fab-BCMA-Fab을 포함하는 양특이성 항체이고, 상기 BCMA-Fabs 및 상기 CD3-Fab 모두 본 발명에 따른 용도를 위해 일반 경쇄를 포함한다(도 1b). 특히 바람직한 것은 BCMA-Fab 모두 중쇄 CDR로서 항체 pSCHLI333의 CDRH, 또는 VH로서 pSCHLI333의 VH를 포함하는 것이다. 더 바람직하게는 BCMA-Fab 모두 중쇄 CDR로서 항체 pSCHLI372의 CDRH, 또는 VH로서 pSCHLI372의 VH를 포함하는 것이다. 더 바람직하게는 BCMA-Fab 모두 중쇄 CDR로서 항체 pSCHLI373의 CDRH, 또는 VH로서 pSCHLI373의 VH를 포함하는 것이다. 더 바람직하게는 BCMA-Fab 모두 중쇄 CDR로서 항체 83A10의 CDR, 또는 VH로서 83A10의 VH를 포함하는 것이다.
Fab 단편은 선행기술에 따른 적절한 링커(linker) 사용에 의해 화학적으로 함께 연결된다. 바람직하게는 (Gly4-Ser1)3 링커(SEQ ID NO:38) 또는 GGGGSGGGGS 링커(SEQ ID NO:39)가 사용된다(Desplancq DK et al., Protein Eng. 1994 Aug;7(8):1027-33 and Mack M. et al., PNAS July 18, 1995 vol. 92 no. 15 7021-7025). 두 개의 Fab 단편 사이의 연결은 중쇄 사이에 행해진다. 그러므로 제1 Fab 단편의 CH1의 C-말단은 제2 Fab 단편의 VH의 N-말단에 연결된다. Fab 단편 및 Fc 부분 사이의 연결은 본 발명에 따라 CH1 및 CH2 사이의 연결로서 행해진다.
BCMA에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 Fab 단편 및 제2 Fab 단편은 바람직하게는 동일한 항체로부터 유도되고 그리고 바람직하게는 CDR 서열, 가변 도메인 서열 VH 및 VL 및 불변 도메인 서열 CH1 및 CL이 동일하다. 바람직하게는 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체의 제1 Fab 단편 및 제2 Fab 단편의 아미노산 서열이 동일하다. 바람직하게는 BCMA 항체는 항체 pSCHLI333, pSCHLI372 또는 pSCHLI373의 CDR 서열을 포함하는 항체, 항체 pSCHLI333, pSCHLI372 또는 pSCHLI373의 VH 서열, 또는 항체 pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373, 또는 83A10의 VH 및 CH1 서열을 포함하는 항체이다.
바람직하게는 상기 양특이성 항체가 Fab 단편 및 Fc 부분으로서, 하나 이하의 항-CD3 항체의 Fab 단편, 둘 이하의 항-BCMA 항체의 Fab 단편, 및 하나 이하의 Fc 부분, 바람직하게는 인간 Fc 부분을 포함한다. 바람직하게는 항-BCMA 항체의 제2 Fab 단편이 그의 C-말단을 통해 항-CD3 항체의 Fab 단편의 N-말단 또는 Fc 부분의 경첩부위에 연결된다. 바람직하게는 연결이 BCMA-Fab의 CH1 및 CD3-Fab의 VH 사이에 행해진다.
그러한 본 발명에 따른 바람직한 항체는 다음의 폴리펩티드의 중쇄 및 경쇄 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) SEQ ID NO:15의 VH, 및 SEQ ID NO:2의 VL(pSCHLI333 세트),
b) SEQ ID NO:16의 VH, 및 SEQ ID NO:2의 VL(pSCHLI372 세트),
c) SEQ ID NO:17의 VH, 및 SEQ ID NO:2의 VL(pSCHLI373 세트),
d) SEQ ID NO:34의 VH, 및 SEQ ID NO:2의 VL(83A10 세트).
바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 또한 시노몰구스 BCMA에 특이적으로 결합하는 것을 더 특징으로 한다.
바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, SEQ ID NO: 3, 4 및 5의 중쇄 CDR을 각자 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 포함하는 가변 도메인 VH, 및 항-CD3ε 항체의 SEQ ID NO: 6, 7 및 8의 경쇄 CDR을 각자 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 포함(CDR MAB CD3 CH2527-VL7)하는 가변 도메인 VL을 포함한다. 바람직하게는 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 항체 부분은 가변 도메인이 SEQ ID NO:1 및 2의 것(VHVL MAB CD3 CH2527-VL7)인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, 중쇄 CDR SEQ ID NO:18의 CDR1H, SEQ ID NO:21의 CDR2H, SEQ ID NO: 24의 CDR3H를 포함하는 가변 도메인 VH를 포함하고, 그리고 경쇄 CDR SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, SEQ ID NO: 8의 CDR3L을 포함하는 가변 도메인 VL을 포함(CDR MAB pSCHLI333)하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, 중쇄 CDR SEQ ID NO:19의 CDR1H, SEQ ID NO:22의 CDR2H, SEQ ID NO: 25의 CDR3H를 포함하는 가변 도메인 VH를 포함하고, 그리고 경쇄 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, SEQ ID NO: 8의 CDR3L을 포함하는 가변 도메인 VL을 포함(CDR MAB pSCHLI372)하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, 중쇄 CDR SEQ ID NO:20의 CDR1H, SEQ ID NO:23의 CDR2H, SEQ ID NO: 26의 CDR3H를 포함하는 가변 도메인 VH를 포함하고, 그리고 경쇄 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, SEQ ID NO: 8의 CDR3L을 포함하는 가변 도메인 VL을 포함(CDR MAB pSCHLI373)하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, 중쇄 CDR SEQ ID NO:35의 CDR1H, SEQ ID NO:36의 CDR2H, SEQ ID NO: 37의 CDR3H를 포함하는 가변 도메인 VH를 포함하고, 그리고 경쇄 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, SEQ ID NO: 8의 CDR3L을 포함하는 가변 도메인 VL을 포함(CDR MAB 83A10)하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, SEQ ID NO: 15의 VH를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, SEQ ID NO: 16의 VH를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, SEQ ID NO: 17의 VH를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 부분은, 바람직하게는 Fab 단편은, SEQ ID NO: 34의 VH를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 본 발명은 인간 BCMA 및 인간 CD3ε의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체와 관련된 것이고, 이는 다음의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다:
i) SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, 및 SEQ ID NO:29(세트 1),
ii) SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, 및 SEQ ID NO:31(세트 2), 및
iii) SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:32, 및 SEQ ID NO:33(세트 3).
| SEQ ID NO: | ||||
| BCMA 항체 | VH | CDR1H | CDR2H | CDR3H |
| pSCHLI333 | 15 | 18 | 21 | 24 |
| pSCHLI372 | 16 | 19 | 22 | 25 |
| pSCHLI373 | 17 | 20 | 23 | 26 |
| 83A10 | 34 | 35 | 36 | 37 |
표 1: 항BCMA 항체의 항체 서열
| 구성요소 | SEQ ID NO: |
| BCMA pSCHLI333 VH_CH1 x CD3 VH_CH1 Fc 노브 LALA PG | 27 |
| BCMA pSCHLI333 HC 홀 LALA PG | 28 |
| CD3 (BCMA) hum IgG1 LC (일반 경쇄) | 29 |
| BCMA pSCHLI372 VH_CH1 x CD3 VH_CH1 Fc 노브 LALA PG | 30 |
| BCMA pSCHLI372 HC 홀 LALA PG | 31 |
| BCMA pSCHLI373 VH_CH1 x CD3 VH_CH1 Fc 노브 LALA PG | 32 |
| BCMA pSCHLI373 HC 홀 LALA PG | 33 |
표 2: 구성요소의 서열
| SEQ ID NO: | ||||||||
| CH2527-VL7 | VH | VL | CDR1H | CDR2H | CDR3H | CDR1L | CDR2L | CDR3L |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
표 3: 항-CD3 항체의 서열
다음의 (2+1) Fc-함유 항-BCMA/항-CD3 TCB CLC를 만들기 위해서, 상기의 표 2에 기재된 각자의 "구성요소(building blocks)"/서열 ID가 필요했다:
pSCHLI333-TCB: 27, 28, 29 x3
pSCHLI372-TCB: 29 x3, 30, 31
pSCHLI373-TCB: 29 x3, 32, 33.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 BCMA에 고친화성 및 저응집을 보인다.
본 발명은 각자 중쇄 및 경쇄 세트를 부호화하는 핵산 세트에 관한 것이기도 하다.
바람직하게는 IgG1 아강의 불변의 무거운 영역(constant heavy regions) CH2/CH3을 포함하는 본 발명에 따른 양특이성 항체는 FcR 및 C1q 결합을 방지하고 그리고 ADCC/CDC를 최소화하기 위해 돌연변이 L234A, L235A 및 P239G(카바트(Kabat)에 따른 번호표기)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이점은 본 발명의 그러한 항체가 순전히 T-세포 전가/활성화의 강력한 메커니즘에 의해 상기 항체의 종양세포 사멸 효능을 매개(mediate)하는 것이다. 보체계 및 FcR을 발현하는 작동세포에 영향을 미치는 것과 같은 작용의 부가적인 메커니즘을 방지하고 그리고 부작용의 위험이 감소된다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 1mg/kg 체중(BW)의 투약량을 정맥 내에(i.v.) 또는 피하에(s.c.) 또는 복강 내에(i.p.) 일주일에 두 번 또는 일주일에 한번 투여하는, 바람직하게는 0.5mg/kg BW의 투약량을 i.v.로 또는 i.p.로 또는 s.c.로 일주일에 두 번 또는 일주일에 한번 투여하는, 바람직하게는 0.1mg/kg BW의 투약량을 i.v.로 또는 i.p.로 또는 s.c.로 일주일에 두 번 또는 일주일에 한번 투여하는, 바람직하게는 0.05mg/kg BW의 투약량을 i.v.로 또는 i.p.로 또는 s.c.로 일주일에 두 번 또는 일주일에 한번 투여하는, 바람직하게는 0.01mg/kg BW의 투약량을 i.v.로 또는 i.p.로 또는 s.c.로 일주일에 두 번 또는 일주일에 한번 투여하는, 바람직하게는 5㎍/kg BW의 투약량을 i.v.로 또는 i.p.로 또는 s.c.로 일주일에 두 번 또는 일주일에 한번 투여하는, 다발성 골수종 이종 이식 모델(예: NCI-H929 세포 또는 RPMI8226 세포 또는 U266B1 세포 또는 L-363 세포를 사용한 이종 이식)에서 70% 이상의, 바람직하게는 85% 이상의, 바람직하게는 100%에 가까운 종양 성장 억제를 보이는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 쥐에서 제거 반감기(elimination half-life), 바람직하게는 시몰구스 원숭이의 24시간 이상, 바람직하게는 3일 또는 그 이상을 특징으로 하고, 바람직하게는 반감기는 일주일에 두 번 또는 한 번 투여하는 이종 이식 모델에서 효과적인 투약량에 대해 측정된다.
종양 세포에 있는 표적 그리고 CD3에 결합하고 (scFv)2 분자 형식을 가지는 양특이성 항체는 1 내지 4시간의 굉장히 짧은 제거 반감기를 가진다. (scFv)2 양특이성 CD19xCD3 항체 블리나투모맙을 사용한 임상 시험에서, 이 화합물은 몇 주 몇 달 동안 환자가 들고 다닌 펌프를 통해 투여되어야 했다(Topp et al. J Clin Oncol 2011; 29(18): 2493-8). 일주일에 두 번 또는 일주일에 한 번 iv 또는 sc 투여와 비교했을 때, 펌프를 통해 투여하는 치료는 환자에게 상당히 편하지 못하고 그리고 훨씬 더 위험하다(예: 펌프의 고장, 카테테르의 문제).
바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 NCI-H929 세포(ATCC® CRL-9068™)에 결합하는 것에 대해 500nM 또는 그 이하의 EC50 값을, 바람직하게는 350nM 또는 그 이하의 EC50 값을, 바람직하게는 100nM 또는 그 이하의 EC50 값을 보이는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 1nM 이하의, 바람직하게는 0.5nM의, 바람직하게는 0.1nM 및 그 이하의 EC50을 가진 인간 T-세포가 있을 때는 NCI-H929 종양 세포의 전가된 사멸(redirected killing)을 야기하는 능력을 특징으로 한다.
양특이성 항체의 안정성은 실제 조건 및 임상 적용에서 영향받을 수 있다. 최근 항체 가공의 발전에 불구하고, 일부 재조합 단백질 및 분자 형식(예: scFV 단편)은 스트레스 조건하에 다른 것보다 더 쉽게 변성하고 그리고 응집체를 형성하는 경향이 있다(Worn and Pluckthun. J Mol Biol 2001; 305, 989-1010). 본 발명에 따른 항체는 37℃에서, 바람직하게는 40℃에서, 표준 제제 완충제(standard formulation buffer)에 10일 동안, 바람직하게는 2주까지, 바람직하게는 4주까지 보관된 상기 항체가, -80℃에서 동일한 제제 완충제에 동일한 기간 동안 보관된 항체와 비교했을 때, 고분자량(high molecular weight(HMW)) 종 및/또는 저분자량(LMW) 종 및/또는 단량체 내용물에서 결과적으로 10% 이상의 변화(Δ), 바람직하게는 5% 이상의 변화(Δ)를 보이지 않는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 인간 T 세포가 있을 때 다발성 골수종 환자에 원발성 골수종 세포의 전가된 사멸을 야기하는 능력을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 또 다른 중쇄의 CH3 도메인이 하나의 경계면(interface)에서 만나고, 이것이 항체 CH3 도메인 사이에 오리지널 경계면(original interface)을 이루는 것을 특징으로 하고; 상기 경계면은 양특이성 항체의 형성을 촉진하기 위해 변경되며, 상기 변경은 다음을 특징으로 한다:
a) 양특이성 항체 내에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 오리지널 경계면과 만나는 또 다른 중쇄의 CH3 도메인의 오리지널 경계면 내에서 아미노산 잔기가 더 큰 곁사슬 부피를 가진 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공동(cavity)에 위치할 수 있는(positionable) 융기를 또 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내에 생성하도록 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고, 그리고
b) 양특이성 항체 내에서 제1 CH3 도메인의 오리지널 경계면과 만나는 제2 CH3 도메인의 오리지널 경계면 내에서 아미노산 잔기가 더 작은 곁사슬 부피를 가진 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제1 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 위치할 수 있는 공동을 제2 CH3 도메인의 경계면 내에 생성하도록 또 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경된다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 더 큰 곁사슬 부피를 가진 상기 아미노산 잔기가 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 더 작은 곁사슬 부피를 가진 상기 아미노산 잔기가 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 CH3 도메인 모두 각각의 CH3 도메인의 부합하는 위치에 아미노산으로서 시스테인(C)의 도입에 의해 더 변경되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 두 개 모두의 중쇄 중 하나의 불변 중쇄 도메인 CH3이 불변 중쇄 도메인 CH1로 대체되고; 그리고 또 다른 불변 중쇄 도메인 CH3이 불변 경쇄 도메인 CL로 대체되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게 본 발명에 따른 항체는 시노몰구스 BCMA에도 특이적으로 결합하는 것 또한 특징으로 한다.
또 다른 본 발명의 구체예는 본 발명에 따른 항체의, 바람직하게는 본 발명에 따른 구성요소의, 아미노산 서열을 부호화하는 하나 또는 그 이상의 핵산이다.
또 다른 본 발명의 구체예는 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
또 다른 본 발명의 한 구체예는 다음의 단계를 포함하는 본 발명에 따른 양특이성 항체의 조제 방법이다:
a) 본 발명에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄를 부호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 변형시키고,
b) 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건하에 숙주 세포를 배양하고, 그리고
c) 상기 배양으로부터 상기 항체 분자를 회수한다.
또 다른 본 발명의 한 구체예는 본 발명에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄를 부호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포다.
또 다른 바람직한 본 발명의 한 구체예는 본 발명에 따른 항체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다.
또 다른 본 발명의 한 구체예는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 진단 조성물이다.
또 다른 본 발명의 한 구체예는 치료가 필요한 환자를 치료하기 위한 방법이고, 이는 본 발명에 따른 양특이성 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 본 발명의 한 구체예는 약제로서의 용도를 위해 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물이다. 또 다른 바람직한 본 발명의 한 구체예는 형질 세포 질환을 치료하는 약제로서의 용도를 위해 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물이다. 또 다른 바람직한 본 발명의 한 구체예는 다발성 골수종을 치료하는 약제로서의 용도를 위해 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물이다. 또 다른 본 발명의 한 구체예는 다발성 골수종과 같은 형질 세포 질환 또는 BCMA를 발현하는 그 외의 B-세포 질환을 치료하기 위한 본 발명에 따른 항체이다. 다발성 골수종은 골수 구획(compartment)에서의 단일클론 증식 및 이상 형질 세포의 축적을 특징으로 하는 B-세포 악성 종양(malignancy)이다. 다발성 골수종은 동일한 IgG 유전자 재배열 및 체세포 초돌연변이를 가진 순환 클론(circulating clonal) B 세포와도 관련된다. 다발성 골수종은 미결정유의성 단일클론성 감마글로불린혈증(MGUS)이라 불리는 무증상의 전암상태에서 발생하고, 저수치(low levels)의 골수 형질 세포 및 단일클론 단백질을 특징으로 한다. 다발성 골수종 세포는 저율로 증식한다. 다발성 골수종은 복수의 구조적 염색체 변화(multiple structural chromosomal changes)(예: 불균형 전위)의 점진적 발생(progressive occurrence)으로부터 야기된다. 다발성 골수종은 악성 형질 세포 및 골수 미세환경(예: 정상 골수 간질세포)의 상호작용을 수반한다. 활성(active) 다발성 골수종의 임상증상은 단일클론 항체 스파이크(spike), 골수에 과잉 밀집하는 형질 세포, 골용해 병변 및 파골세포의 과자극으로부터 야기된 골파괴를 포함한다(Dimopulos & Terpos, Ann Oncol 2010; 21 suppl 7: vii143-150). 형질 세포를 수반하는, 즉 BCMA를 발현하는, 또 다른 B-세포 질환은 루푸스로도 알려진 전신성 홍반성 루푸스(SLE)이다. SLE는 신체 어느 부분이라도 영향을 미칠 수 있는 전신성 자가면역 질환이고, 면역 체계가 신체 자신의 세포 및 조직을 공격하여 만성 염증 및 조직 손상을 야기하는 것으로 나타난다. 이는 항체-면역 복합체가 촉발시키고 면역 반응을 더 일으키게 야기하는 제3형 과민 반응이다(Inaki & Lee, Nat Rev Rheumatol 2010; 6: 326-337). 또 다른 바람직한 본 발명의 한 구체예는 전신성 홍반성 루푸스를 치료하는 약제로서의 용도를 위해 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물이다.
도 1은 다음과 같이 명시된 대로 Fc 부분을 가진 또는 가지지 않은 Fab 단편(CD3 및 BCMA에 특유한)만을 포함한 양특이성 이가항체 및 삼가항체를 도시한다: (A) Fab BCMA-Fc-Fab CD3; (B) Fab BCMA-Fc-Fab CD3-Fab BCMA; (C) Fab BCMA-Fc-Fab BCMA-Fab CD3; (D) Fc-Fab CD3-Fab BCMA; (E) Fc-Fab BCMA-Fab CD3; (F) Fab CD3-Fab BCMA-Fab BCMA; (G) Fab CD3-Fab BCMA. 바람직하게는, LC가 잘못 짝지어지는 것을 방지하고 부산물을 줄이기 위해, Fab CD3 및 Fab CDMA의 LC는 동일하다(일반 LC). Fab CD3 및 Fab BCMA는 유연한 링커로 서로에게 연결된다.
도 2는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 감지된 TACI에 대한 BCMA IgG 항체의 결합 부족(lack of binding)을 나타낸다. 곡선 1은 기준(reference) 채널과 일치하고, 곡선 2는 결합이 발생하는 채널(결합 채널) 및 곡선 2-1은 삭감된(subtracted) 신호(결합 채널 - 기준 채널)이고, 이는 결합이 이루어짐에 의한 신호를 뜻한다. SPR 결합 분석은 pSCHLI372 IgG가 인간 TACI 수용체에 결합하지 않았음을 명확하게 입증했다(실시예 4 참고).
도 3은 BCMA-TCB CLC의 생산 및 정제를 나타낸다. 단백질 A(PA) 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 정제 단계가 (A) pSCHLI333-TCB CLC, (B) pSCHLI372-TCB CLC, (C) pSCHLI373-TCB CLC에 적용된 이후의, 최종 단백질 조제의 CE-SDS 그래프(비-감소된(위) 및 감소된(아래))이다. 세 분자 모두 도 1b에 기재된 것의 분자 형식이다(실시예 6 참조).
도 4는 유동 세포 분석법에 의한 BCMAhi-양성 H929 세포에 BCMA-TCB CLC 항체의 결합을 나타낸다. BCMA-TCB CLC 항체의 평균 형광 강도는 항체 농도(0.12 내지 500nM)의 함수로 나타냈다(plotted); H929 세포(A) 그리고 KN45 세포(B)에 (A) pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC를 나타냈다. DP47-TCB는 100nM 이하의 농도에서 BCMA에 결합하지 않은 음성 대조(negative control) TCB이다(실시예 7 참조).
도 5는 유동 세포 분석법에 의해 측정된 CD3-양성 저캇(Jurkat) T 세포에 BCMA-TCB CLC 항체의 결합을 나타낸다. 저캇 T 세포에 결합하는 BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC)의 평균 형광 강도는 항체 농도의 함수로 나타냈다. 100nM 이하의 농도에서 BCMA-음성 및 CD3-음성 MKN45 세포에 결합하지 않는다(실시예 8 참조).
도 6은 유동 세포 분석법에 의해 감지된 H929 세포가 있을 때 BCMA-TCB CLC 항체에 의해 매개된(mediated by) T-세포 활성화를 나타낸다. 48시간의 배양 이후 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 조기 활성 마커(early activation marker) CD69 및 후기(late) 활성 마커 CD25의 발현 정도이다. pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC 항체는 BCMA-양성 표적 세포가 있을 때 농도-의존 및 특정 방식으로 CD69 및 CD25의 상향조절을 유도한다. E:T 비율은 10 PBMC:1 H929 세포로 사용되었다; 세포는 CD69 및 CD25 상향 조절의 측정 전에 48시간 동안 배양되었다. 음정 대조 TCB인 DP47-TCB는 T-세포 활성화를 유도하지 않았다. 대표적인 결과는 두 개의 독립된 실험으로부터 구했다(실시예 9 참조).
도 7은 BCMA-TCB CLC 항체가 BCMAhi-양성 H929 골수종 세포의 T-세포 전가된 사멸을 유도하는 것을 비색(colorimetric) LDH 방출 분석에 의해 감지된 것을 나타낸다. BCMA-TCB CLC 항체 pSCHLI372-TCB CLC(A, B) 및 pSCHLI373-TCB CLC(A)가 BCMAhi-양성 H929 골수종 세포의 농도-의존 사멸을 유도하는 것이 LDH 방출에 의하여 측정되었다. BCMA에는 결합하지 않지만 CD3에만 결합하는 음성 대조 TCB인 DP47-TCB는 H929 세포 사멸을 유도하지 않았다. E:T 비율은 10 PBMC:1 H929 세포로 사용되었다; 세포는 LDH 방출 측정 전에 24시간 동안 배양되었다. 대표적인 결과는 세 개의 독립된 실험으로부터 구했다(실시예 10 참조).
도 8은 BCMA-TCB CLC 항체가 BCMAmed /lo-양성 U266 골수종 세포의 T-세포 전가된 사멸을 유도하는 것을 비색) LDH 방출 분석에 의해 감지된 것을 나타낸다. BCMA-TCB CLC 항체 pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC가 BCMAmed /lo-양성 U266 골수종 세포의 농도-의존 사멸을 유도하는 것이 LDH 방출에 의하여 측정되었다. BCMA에는 결합하지 않지만 CD3에만 결합하는 음성 대조 TCB인 DP47-TCB는 H929 세포 사멸을 유도하지 않았다. E:T 비율은 10 PBMC:1 U266 세포로 사용되었다; 세포는 LDH 방출 측정 전에 24시간 동안 배양되었다. 대표적인 결과는 두 개의 독립된 실험으로부터 구했다(실시예 11 참조).
도 9는 유동 세포 분석법에 의해 측정된, 자가(autologous) 골수 침윤성 T-세포(환자의 골수천자액 전체)가 있을 때, 항-BCMA/항-CD3 T-세포 양특이성 항체에 의해 유도된 다발성 골수종 환자의 골수 골수종 형질 세포의 전가된 T-세포 용해를 나타낸다. 아넥신-V 음성 골수종 형질 세포의 퍼센트를 측정하고 TCB 농도에 대해 나타냈다(plotted against). 환자의 골수종 형질 세포의 농도-의존 및 특정 용해는 관찰하였으나 가장 높은 시험된 TCB 항체의 농도의 대조-TCB를 사용한 악성 골수 형질 세포의 용해는 관찰하지 않았다. pSCHLI372-TCB CLC는 생존가능(viable)(아넥신-V 음성) 골수종 형질 세포의 농도-의존 감소가 반영하는 대로 환자 골수 골수종 형질 세포의 사멸을 유도한다. 대표적인 실험은 환자 001에 실행되었다(실시예 12 참조).
도 2는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 감지된 TACI에 대한 BCMA IgG 항체의 결합 부족(lack of binding)을 나타낸다. 곡선 1은 기준(reference) 채널과 일치하고, 곡선 2는 결합이 발생하는 채널(결합 채널) 및 곡선 2-1은 삭감된(subtracted) 신호(결합 채널 - 기준 채널)이고, 이는 결합이 이루어짐에 의한 신호를 뜻한다. SPR 결합 분석은 pSCHLI372 IgG가 인간 TACI 수용체에 결합하지 않았음을 명확하게 입증했다(실시예 4 참고).
도 3은 BCMA-TCB CLC의 생산 및 정제를 나타낸다. 단백질 A(PA) 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 정제 단계가 (A) pSCHLI333-TCB CLC, (B) pSCHLI372-TCB CLC, (C) pSCHLI373-TCB CLC에 적용된 이후의, 최종 단백질 조제의 CE-SDS 그래프(비-감소된(위) 및 감소된(아래))이다. 세 분자 모두 도 1b에 기재된 것의 분자 형식이다(실시예 6 참조).
도 4는 유동 세포 분석법에 의한 BCMAhi-양성 H929 세포에 BCMA-TCB CLC 항체의 결합을 나타낸다. BCMA-TCB CLC 항체의 평균 형광 강도는 항체 농도(0.12 내지 500nM)의 함수로 나타냈다(plotted); H929 세포(A) 그리고 KN45 세포(B)에 (A) pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC를 나타냈다. DP47-TCB는 100nM 이하의 농도에서 BCMA에 결합하지 않은 음성 대조(negative control) TCB이다(실시예 7 참조).
도 5는 유동 세포 분석법에 의해 측정된 CD3-양성 저캇(Jurkat) T 세포에 BCMA-TCB CLC 항체의 결합을 나타낸다. 저캇 T 세포에 결합하는 BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC)의 평균 형광 강도는 항체 농도의 함수로 나타냈다. 100nM 이하의 농도에서 BCMA-음성 및 CD3-음성 MKN45 세포에 결합하지 않는다(실시예 8 참조).
도 6은 유동 세포 분석법에 의해 감지된 H929 세포가 있을 때 BCMA-TCB CLC 항체에 의해 매개된(mediated by) T-세포 활성화를 나타낸다. 48시간의 배양 이후 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 조기 활성 마커(early activation marker) CD69 및 후기(late) 활성 마커 CD25의 발현 정도이다. pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC 항체는 BCMA-양성 표적 세포가 있을 때 농도-의존 및 특정 방식으로 CD69 및 CD25의 상향조절을 유도한다. E:T 비율은 10 PBMC:1 H929 세포로 사용되었다; 세포는 CD69 및 CD25 상향 조절의 측정 전에 48시간 동안 배양되었다. 음정 대조 TCB인 DP47-TCB는 T-세포 활성화를 유도하지 않았다. 대표적인 결과는 두 개의 독립된 실험으로부터 구했다(실시예 9 참조).
도 7은 BCMA-TCB CLC 항체가 BCMAhi-양성 H929 골수종 세포의 T-세포 전가된 사멸을 유도하는 것을 비색(colorimetric) LDH 방출 분석에 의해 감지된 것을 나타낸다. BCMA-TCB CLC 항체 pSCHLI372-TCB CLC(A, B) 및 pSCHLI373-TCB CLC(A)가 BCMAhi-양성 H929 골수종 세포의 농도-의존 사멸을 유도하는 것이 LDH 방출에 의하여 측정되었다. BCMA에는 결합하지 않지만 CD3에만 결합하는 음성 대조 TCB인 DP47-TCB는 H929 세포 사멸을 유도하지 않았다. E:T 비율은 10 PBMC:1 H929 세포로 사용되었다; 세포는 LDH 방출 측정 전에 24시간 동안 배양되었다. 대표적인 결과는 세 개의 독립된 실험으로부터 구했다(실시예 10 참조).
도 8은 BCMA-TCB CLC 항체가 BCMAmed /lo-양성 U266 골수종 세포의 T-세포 전가된 사멸을 유도하는 것을 비색) LDH 방출 분석에 의해 감지된 것을 나타낸다. BCMA-TCB CLC 항체 pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC가 BCMAmed /lo-양성 U266 골수종 세포의 농도-의존 사멸을 유도하는 것이 LDH 방출에 의하여 측정되었다. BCMA에는 결합하지 않지만 CD3에만 결합하는 음성 대조 TCB인 DP47-TCB는 H929 세포 사멸을 유도하지 않았다. E:T 비율은 10 PBMC:1 U266 세포로 사용되었다; 세포는 LDH 방출 측정 전에 24시간 동안 배양되었다. 대표적인 결과는 두 개의 독립된 실험으로부터 구했다(실시예 11 참조).
도 9는 유동 세포 분석법에 의해 측정된, 자가(autologous) 골수 침윤성 T-세포(환자의 골수천자액 전체)가 있을 때, 항-BCMA/항-CD3 T-세포 양특이성 항체에 의해 유도된 다발성 골수종 환자의 골수 골수종 형질 세포의 전가된 T-세포 용해를 나타낸다. 아넥신-V 음성 골수종 형질 세포의 퍼센트를 측정하고 TCB 농도에 대해 나타냈다(plotted against). 환자의 골수종 형질 세포의 농도-의존 및 특정 용해는 관찰하였으나 가장 높은 시험된 TCB 항체의 농도의 대조-TCB를 사용한 악성 골수 형질 세포의 용해는 관찰하지 않았다. pSCHLI372-TCB CLC는 생존가능(viable)(아넥신-V 음성) 골수종 형질 세포의 농도-의존 감소가 반영하는 대로 환자 골수 골수종 형질 세포의 사멸을 유도한다. 대표적인 실험은 환자 001에 실행되었다(실시예 12 참조).
본 명세서에서 사용된 "표적"이란 용어는 BCMA 또는 CD3을 뜻한다. "제1 표적 및 제2 표적"은 제1 표적으로 CD3 그리고 제2 표적으로 BCMA를 뜻하거나 또는 제1 표적으로 BCMA 그리고 제2 표적으로 CD3을 뜻한다.
본 명세서에서 사용된 "BCMA"란 용어는 BCMA로도 알려진 인간 B 세포 성숙 표적(maturation target)과 관련된 것이다; TR17_HUMAN, TNFRSF17(UniProt Q02223)은 분화 형질 세포에서 우선적으로 발현하는 종양 괴사 수용체 상과의 구성원이다. UniProt에 의하면 BCMA의 세포외 도메인은 아미노산 1 내지 54(또는 5 내지 51)로 이루어진다. 본 명세서에서 사용된 "BCMA에 대응하는 항체, 항BCMA 항체"란 용어는 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체와 관련된 것이다.
본 명세서에서 사용된 "CD3ε 또는 CD3"이란 용어는 UniProt P07766(CD3E_HUMAN)에 기술된 인간 CD3ε과 관련된 것이다. "CD3에 대응하는 항체, 항CD3 항체"란 용어는 CD3ε에 결합하는 항체와 관련된 것이다. 바람직하게는 상기 항체가 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 각자 SEQ ID NO: 3, 4 및 5의 중쇄 CDR을 포함하는 가변 도메인 VH 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 각자 SEQ ID NO: 6, 7 및 8의 경쇄 CDR을 포함하는 가변 도메인 VL을 포함한다. 바람직하게는 상기 항체가 SEQ ID NO:1(VH) 및 SEQ ID NO:2(VL)의 가변 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "CD3에 대응하는 항체, 항CD3 항체"란 용어는 CD3에 특이적으로 결합하는 항체와 관련된 것이다.
"CD3 또는 BCMA에 특이적으로 결합"은 항체가 CD3 또는 BCMA를 표적하는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성을 가지고 CD3 또는 BCMA(표적)에 결합할 수 있는 항체를 뜻한다. 일부 구체예에서는, 항-CD3 또는 BCMA 항체가 관련 없는, 비-CD3 또는 비-BCMA 단백질에 결합하는 정도는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR), 예를 들어 Biacore®, 효소-결합 면역흡착 검사(ELISA) 또는 유동 세포 분석법(FACS)에 의해 측정된 상기 항체의 CD3 또는 BCMA와의 결합과 비교했을 때, 약 10배, 바람직하게는 >100배 이하이다. 바람직하게는 CD3 또는 BCMA에 결합하는 항체는 10-8M 또는 그 이하의, 바람직하게는 10-8M부터 10-13M까지의, 바람직하게는 10-9M부터 10-13M까지의 해리상수(Kd)를 가진다. 바람직하게는 항-CD3 및/또는 항-BCMA는 다른 종으로부터의, 바람직하게는 인간 및 시노몰구스 중에, CD3 및 BCMA 중에 보존된(conserved) CD3 및/또는 BCMA의 항원결정기에 결합한다. "CD3 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체" 또는 "본 발명에 따른 항체"는 두 개의 표적 모두에 결합하는 것에 대한 개별 정의를 뜻한다. BCMA(또는 BCMA 및 CD3)에 특이적으로 결합하는 항체는 그 외 인간 항원에는 결합하지 않는다. 그러므로 ELISA에서, 그러한 관련 없는 표적에 대한 0D 값은 특정 분석의 검출한계와 동일하거나 그 이하일 것이며, 바람직하게는 > 0.3 ng/mL, 또는 플레이트-바운드(plate-bound)-BCMA 없이 또는 핵산전달감염되지 않은(untransfected) HEK293 세포를 가진 대조 샘플의 0D 값과 동일하거나 그 이하일 것이다.
본 명세서에서 사용된 "CD3ε 또는 CD3 결합 부분"이란 용어는 CD3에 특이적으로 결합하는 항체의 Fab 단편에 둘러싸인 VH 및 CH1으로 이루어진 항체 중쇄 및 VL 및 CL로 이루어진 항체 경쇄의 조합과 관련된 것이다. 본 발명에 따른 양특이성 항체에서 경쇄로서 일반 경쇄를 포함하는 CD3 결합 부분, "CD3 결합 부위"는 바람직하게는 한 번 결합된다(incorporated).
본 명세서에서 사용된 "BCMA 결합 부분"이란 용어는 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체의 Fab 단편에 둘러싸인 VH 및 CH1으로 이루어진 항체 중쇄 및 VL 및 CL로 이루어진 항체 경쇄의 조합과 관련된 것이다. 본 발명에 따른 양특이성 항체에서 경쇄로서 일반 경쇄를 포함하는 BCMA 결합 부분, "BCMA 결합 부위"는 바람직하게는 한 번 또는 두 번 결합된다.
바람직하게 본 발명에 따른 항체는 NCI-H929 세포(ATCC® CRL-9068™)에 결합하는 것에 대해 500nM 또는 그 이하의 EC50 값을, 바람직하게는 350nM 또는 그 이하의 EC50 값을, 바람직하게는 100nM 또는 그 이하의 EC50 값을 보이는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 항체는 U266(ATCC® TIB-196TM) 세포에 결합할 수 있는 능력을 특징으로 한다.
바람직한 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 T 세포에 결합할 수 있는 능력을 특징으로 한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 항체는 HEK-세포에 일시적으로 발현하는 시노몰구스 원숭이 BCMA에 결합할 수 있는 능력을 특징으로 한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 BCMA를 발현하는 종양 세포가 있을 때 CD4+ 및 CD8+ T-세포 활성화를 유도시키는 능력을 특징으로 한다.
바람직하게 본 발명에 따른 항체는 인간 T 세포가 있을 때 1nM 이하의, 바람직하게는 0.5nM, 바람직하게는 0.1nM 및 그 이하의 EC50으로 NCI-H929 종양 세포의 전가된 사멸을 유도시키는 능력을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용된 "항체"라는 용어는 단일클론 항체를 뜻한다. 항체는 두 쌍의 "경쇄"(LC) 및 "중쇄"(HC)(이러한 경쇄(LC)/중쇄 쌍은 본 명세서에서 LC/HC로 줄여 썼다)로 이루어진다. 그러한 항체의 경쇄 및 중쇄는 여러 개의 도메인으로 이루어진 폴리펩티드이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 줄여 썼다) 및 중쇄 불변(constant) 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3(항체의 급(class) IgA, IgD, 및 IgG) 및 선택적으로 중쇄 불변 도메인 CH4(항체의 급 IgE 및 IgM)를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 VL 및 경쇄 불변 도메인 CL을 포함한다. 가변 도메인 VH 및 VL은 상보성 결정 영역(CDR)이라 일컬어지는 고변이 영역으로 더 세분화될 수 있고, 골격 부위(framework regions)(FR)라 일컬어지는 더 보존된 영역이 그 사이사이에 배치된다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음의 순서로 배열된 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 "불변 도메인"은 항체가 표적에 결합하는 것에 직접적으로 관련되진 않지만 다양한 작용기 기능을 보인다.
본 명세서에 사용된 "항체의 경쇄"는 N-말단으로부터 C-말단으로의 방향에, VL-CL로 줄여 쓰는, 경쇄 가변 도메인(VL), 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 명세서에 사용된 "항체의 중쇄"는 N-말단으로부터 C-말단으로의 방향에 중쇄 가변 도메인(VH) 및 중쇄 불변 도메인 1(CH1)을 포함하는 폴리펩티드이다.
헤테로다이머화(heterodimerization)를 시행하기 위한 CH3-변형에 대한 여러 접근법이 존재하고, 이는 예를 들어 WO96/27011, WO98/050431, EP1870459, WO2007/110205, WO2007/147901, WO2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012058768, WO2013157954, WO2013096291에 상세히 기술되어 있다. 일반적으로 모든 접근법에서 각각의 CH3 도메인(또는 그를 구성하는 중쇄)이 더 이상 그 자체로 호모다이머화(homodimerize)할 수 없고, 강제로 상호 보완적인 가공된 다른 CH3 도메인과 헤테로다이머화하도록(제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인이 헤테로다이머화하고, 그리고 두 개의 제1 CH3 도메인 또는 두 개의 제2 CH3 도메인 사이에 호모다이머가 형성되지 않도록) 제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인 모두 상호 보완 방식으로 가공된다. 바람직한 본 발명의 한 구체예에서, (본 발명에 따른 항체가 중쇄에 있는 CH3 도메인을 포함하는 경우) 본 발명에 따른 다중특이성 항체의 CH3 도메인은 "노브-인투-홀(knob-into-holes)" 기술로 변경될 수 있고, 이 기술은 예를 들어 WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; and Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681; WO98/ 050431에 여러 실시예와 함께 상세히 기술되어 있다. 이 방법에서 두 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이 두 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 모두의 헤테로다이머화를 증가시키기 위해 변경된다. 두 개의 CH3 도메인(중쇄의 것) 각각 "노브(knob)"일 수 있고, 남은 것은 "홀(hole)"일 수 있다.
그러므로 본 발명의 한 구체예에서 본 발명에 따른 상기 항체는(각각의 중쇄에 CH3 도메인을 포함하고) a) 항체의 제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 및 b) 항체의 제2 중쇄의 제2 CH3 도메인이 각각 항체 CH3 도메인 사이에 오리지널 경계면(interface)을 이루는 경계면에서 만나는 것 또한 특징으로 하고, 상기 경계면은 본 발명에 따른 항체의 형성을 촉진하기 위해 변경되며, 상기 변경은 다음을 특징으로 한다:
i) 본 발명에 따른 항체 내에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 오리지널 경계면과 만나는 또 다른 중쇄의 CH3 도메인의 오리지널 경계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 큰 곁사슬 부피를 가진 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공동(cavity)에 위치할 수 있는(positionable) 융기를 또 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내에 생성하도록 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고, 그리고
ii) 본 발명에 따른 항체 내에서 제1 CH3 도메인의 오리지널 경계면과 만나는 제2 CH3 도메인의 오리지널 경계면 내에서 아미노산 잔기가 더 작은 곁사슬 부피를 가진 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제1 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 위치할 수 있는 공동을 제2 CH3 도메인의 경계면 내에 생성하도록 또 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경된다.
바람직하게는 더 큰 곁사슬 부피를 가진 상기 아미노산 잔기가 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 측면에서는, 모든 CH3 도메인 사이에 이황화 다리가 형성될 수 있도록 각각의 CH3 도메인의 부합하는 위치에 아미노산으로서 시스테인(C)의 도입에 의해 모든 CH3 도메인이 더 변경된다.
헤테로다이머화를 시행하기 위한 CH3-변형을 다른 기술들은 본 발명의 대안으로 고려되고, 예를 들어 WO96/27011, WO98/050431, EP1870459, WO2007/110205, WO2007/147901, WO2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012/058768, WO2013/157954, WO2013/157953, WO2013/096291에 기술된다.
한 구체예에서 본 발명에 따른 항체는 IgG2 아이소타입(isotype)의 것이고 WO2010/129304에 기술된 헤테로다이머화 접근법이 대안으로 사용될 수 있다.
"항체"라는 용어는, 예를 들어, 쥐 항체, 인간 항체, 키메라(chimeric) 항체, 인간화(humanized) 항체 그리고, 특유의 성질을 유지하는 한, 유전자 공학에 의해 생성된 항체(변이 또는 돌연변이 항체)를 포함한다. 특히 바람직한 것은 인간 또는 인간화 항체이고, 특히 재조합 인간 또한 인간화 항체이다. 본 명세서에 사용된 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"이란 용어는 하나의 아미노산 조성물의 항체 분자의 제제를 뜻한다.
본 명세서에 사용된 "양특이성 항체" 및 "본 발명에 따른 항체"는 두 쌍의 중쇄 및 경쇄(HC/LC) 중 하나는 BCMA에 특이적으로 결합하고 다른 하나는 CD3에 또는 바람직하게는 CD3 및 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체를 뜻한다. 본 명세서에 사용된 "-가(價)(valent)"는 항체 분자에 있는 특정 수의 결합 부위가 있음을 의미한다. 본 발명에 따른 이가항체는 두 개의 결합 부위, CD3을 위해 하나, BCMA를 위해 하나를 가진다. 그런 의미로, "삼가(trivalent)"란 용어는 본 발명에 따른 항체에 세 개의 결합 부위가 있음을 나타내고, 이 중 둘은 BCMA를 위한 결합 부위이고 하나는 CD3을 위한 결합 부위이다.
포유류 항체 중쇄의 유형이 다섯 개 있고, 이는 다음의 그리스 문자로 표시된다: α, δ, ε, γ, 및 μ(Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology. 5th ed., Garland Publishing). 존재하는 중쇄의 유형은 항체의 급을 정의한다; 이러한 사슬은 각자 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체에서 발견된다(Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4th ed., Thomson Learning). 특유의 중쇄는 크기 및 구성에 대해 다르다; α 및 γ는 약 450개의 아미노산을 포함하고, μ 및 ε는 약 550개의 아미노산을 가진다. 각각의 중쇄는 두 개의 영역, 불변 영역 및 가변 영역을 가진다. 불변 영역은 같은 아이소타입의 항체에서 모두 동일하지만, 다른 아이소타입의 항체에선 다르다. 중쇄 γ, α 및 δ는 세 개의 불변 도메인 CH1, CH2, 및 CH3(일렬로)으로 이루어진 불변 영역, 및 부가적인 유연성을 위한 경첩부위를 가진다(Woof J, Burton D Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99); 중쇄 μ 및 ε은 네 개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3, 및 CH4로 이루어진 불변 영역을 가진다(Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology. 5th ed., Garland Publishing). 중쇄의 가변 영역은 각각 다른 B 세포에 의해 생산된 항체에서 다르지만, 하나의 B 세포 또는 B 세포 클론에 의해 생산된 항체 전부에 대해서는 동일하다. 각각의 중쇄의 가변 영역은 길이가 약 110개의 아미노산이고 하나의 항체 도메인으로 이루어진다.
본 명세서에서 사용된 "일반 경쇄"는 본 발명에 따른 양특이성 항체에 사용되는 유일한 경쇄이다. 포유류엔 단 두 가지 유형의 경쇄만이 있고, 이는 람다(λ) 및 카파(κ)로 불린다. 경쇄는 두 개의 연속적인 도메인을 가진다: 하나의 불변 도메인 CL 및 하나의 가변 도메인 VL. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217 아미노산이다. 바람직하게는 경쇄가 카파(κ) 경쇄고, 그리고 불변 도메인 CL는 바람직하게는 카파(κ) 경쇄(불변 도메인 CK)로부터 유도된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 인간 도메인이다.
본 발명에 따른 "항체"는 어느 급(예: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 바람직하게는 IgG 또는 IgE), 또는 아강(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 바람직하게는 IgG1)의 것일 수 있고, 이에 의해 본 발명에 따른 이가 양특이성 항체가 유도되는 항체 모두 동일한 아강(예: IgG1, IgG4 및 기타 같은 종류의 것, 바람직하게는 IgG1)의 Fc 부분을 가지고, 바람직하게는 동일한 동종이형(예: 백인종(Caucasian))의 것이다.
본 명세서에 사용된 "항체의 Fab 단편"은 항원에 결합하는 항체에 있는 단편이다. 항체의 Fab 단편은 두 쌍의 도메인으로 이루어진다. 야생형 항체에서 이는 각각의 중쇄(CH1 및 VH) 및 경쇄(CL 및 VL)의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다. 본 발명에 따르면 야생형 항체에서 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄 도메인 쌍의 도메인은 화학적으로 연결되지 않았고, 그러므로 scFv(단쇄 가변 단편)가 아니다.
"항체의 Fc 부분"이란 표현은 본 기술분야의 숙련자에게는 잘 알려진 표현이고 항체의 파파인 절단을 기반으로 정의된다. 본 발명에 따른 항체는 Fc 부분, 바람직하게는 인간 근원으로부터 그리고 바람직하게는 인간 불변 영역의 그 외 모든 부분으로부터 유도된 Fc 부분을 포함한다. 항체의 Fc 부분은 보체활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관련된다. 항체가 보체계에 미치는 영향은 특정 조건에 의해 결정되고, C1q와의 결합은 Fc 부분에서의 정의된 결합부위에 의해 야기된다. 그러한 결합부위는 선행기술에 공지되어있고, 예를 들어 Lukas, TJ., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., MoI. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., MoI. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434에 의해 기술된다. 그러한 결합부위는, 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329이다(카바트의 EU 인덱스에 따른 번호표기, 아래 참조). 아강 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 보통 보체활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 보이는 반면, IgG4는 보체계를 활성화시키지 않고, C1q를 결합시키지 않고 그리고 C3을 활성화시키지 않는다. 바람직하게는 Fc 부분은 인간 Fc 부분이다. 바람직하게 Fc 부분은 인간 IgG1Fc 부분이다. 바람직하게 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1 Fc 부분에서 Pro329의 글리신 또는 아르기닌으로의 아미노산 치환 및/또는 L234A 및 L235A 치환, 바람직하게는 Pro329의 글리신으로의 그리고 L234A 및 L235A 치환을 포함한다.
바람직하게 본 발명에 따른 항체는 Fc 부분으로서 야생형 인간 IgG Fc 영역의 Fc 변이를 포함하고, 상기 Fc 변이는 위치 Pro329에서의 아미노산 치환 및 적어도 하나의 아미노산 치환을 더 포함하고, 여기에서 잔기는 카바트의 EU 인덱스에 따라 번호가 표기되고, 그리고 상기 항체가, 야생형 IgG Fc 영역을 포함하는 항체와 비교했을 때, 인간 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA 및/또는 FcγRIA에 대해 감소된 친화성을 보이고, 그리고 항기 항체에 의해 유도된 ADCC가 적어도 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 항체에 의해 유도된 ADCC의 20%로 감소된다. 특성 구체예에서 본 발명에 따른 항체에 있는 야생형 인간 Fc 영역의 Pro329는 글라이신 또는 아르기닌 또는, Fc의 프롤린329 및 FcγRIII의 트립토판 잔기 Trp 87 및 Tip 110 사이에 형성된 Fc/Fcγ 수용체 경계면 내의 프롤린 샌드위치를 파괴하기 충분하게 큰 아미노산 잔기로 치환된다(Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 July 2000)). 본 발명의 또 다른 측면에서는 Fc 변이에서 또 다른 적어도 하나의 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, 또는 P331S이고, 그리고 또 다른 구체예는 또 다른 적어도 하나의 아미노산 치환은 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A(류신 234가 알라닌으로 치환됨을 나타냄) 및 L235A 또는 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E이라 한다. 그러한 Fc 변이는 WO2012130831에 상세하게 기술된다.
"키메라 항체"라는 용어는 일반적으로 재조합 DNA 기법에 의해 조제된, 하나의 근원 또는 종(species)으로부터의 가변 영역을, 즉 결합영역을, 그리고 다른 근원 또는 종으로부터 유도된 불변 영역을 포함하는 항체를 뜻하다. 쥣과(murine) 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 의해 포함되는 "키메라 항체"의 다른 바람직한 형태는 불변 영역이, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 대한, 본 발명에 따른 성질을 생성하기 위해 원래의 항체로부터 변형되거나 또는 변경된 것이다. 그러한 키메라 항체는 "클래스-전환(class-switched) 항체"라고도 불린다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 부호화하는 DNA 조각 및 면역글로불린 불변 영역을 부호화하는 DNA 조각을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 본 발명의 기술분야에 공지된 종래의 재조합 DNA 및 유전자 전달감염 기법을 수반한다. 예를 들어, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent Nos. 5,202,238 and 5,204,244 참조.
"인간화 항체"란 용어는 부모(parent) 면역글로불린의 것과 비교했을 때 다른 특이성의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 골격 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 변형된 항체를 뜻한다. 바람직한 구체예에서, "인간화 항체"를 조제하기 위해 뮤린 CDR이 인간 항체의 골격 부위 안으로 이식된다. 예를 들어, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270 참조. 특히 바람직한 CDR은 키메라 항체에 대해 앞서 기재된 표적을 인식하는 서열을 나타내는 것과 일치한다. 본 발명에 의해 포함되는 "인간화 항체"의 다른 형태는 불변 영역이, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 대한, 본 발명에 따른 성질을 생성하기 위해 원래의 항체로부터 추가적으로 변형되거나 또는 변경된 것이다.
본 명세서에 사용된 "인간 항체"란 용어는 인간 생식세포계열(germ line) 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불면 영역을 가진 항체를 포함하도록 의도되었다. 인간 항체는 본 발명이 속한 기술분야에 공지되었다(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는, 면역조치를 했을 때, 내인 면역글로불린 생산의 부재에서 인간 항체의 전체 레퍼토리 또는 셀렉션(selection)을 생산할 수 있는 유전자 이식(transgenic) 동물(예: 쥐)에서도 생산될 수 있다. 그러한 생식세포계열 돌연변이 쥐에서의 인간 생식세포계열 면역글로불린 유전자 배열(gene array)의 이식은 표적 접종(target challenge)을 했을 때 인간 항체의 생산을 야기한다(예: Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40 참조). 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리(phage display libraries)에서도 생산될 수 있다(Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. MoI. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. MoI. Biol. 222 (1991) 581-597). 인간 단일클론 항체의 조제를 위한 Cole et al. and Boerner et al.의 기법 또한 사용 가능하다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본 발명에 따른 키메라 항체 및 인간화 항체에 대해 이미 언급된 바와 같이, 본 명세서에서 사용된 "인간 항체"라는 용어는 불변 영역이, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합에 대한, 본 발명에 따른 성질을 생성하기 위해, 예를 들어 "클래스 전환"에 의해, 즉 Fc 부분의 변경 또는 돌연변이(예를 들어 IgG1으로부터 IgG4로 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 변형된 항체 또한 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "재조합 인간 항체"란 용어는, NSO 또는 CHO 세포 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대한 유전자 이식 동물의 세포와 같은 숙주 세포로부터 분리된 항체 또는 숙주 세포 내로 핵산전달감염된 재조합 발현 벡터를 사용해 발현된 항체와 같이, 재조합 방법에 의해 조제, 발현, 생성, 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함하도록 의도되었다. 그러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태의 가변 영역 및 불변 영역을 가진다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 체내 체세포 초돌연변이를 겪었다. 그러므로 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 그리고 그에 관련된데 반하여, 체내 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리에 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용된 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(VL), 중쇄의 가변 영역(VH))은 항체를 표적에 결합시키는데에 직접적으로 관련된 각각의 경쇄 및 중쇄 쌍을 나타낸다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반 구조를 가지고 그리고 각각의 도메인은, 서열이 폭넓게 보존되고, 세 개의 "고변이 부위"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결된 네 개의 골격(FR) 부위를 포함한다. 골격 부위는 β-시트 입체형태를 채용하고 그리고 CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프(loop)를 형성할 수 있다. 각각의 체인에 있는 CDR은 골격 부위에 의해 3차원 구조로 유지되고, 그리고 다른 사슬의 CDR과 함께 표적 결합부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CD3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하고, 그러므로 또 다른 본 발명의 목적을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 "고변이 부위" 또는 "항체의 표적-결합 영역"은 표적-결합의 원인이 있는 항체의 아미노산을 뜻한다. 고변이 부위는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격(framework)" 또는 "FR" 부위는 본 명세서에 정의된 고변이 부위 외의 가변 도메인 영역이다. 그러므로 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단으로부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다. 각각의 사슬에 있는 CDR은 그러한 골격 아미노산에 의해 나뉜다. 특히, 중쇄의 CDR3은 표적 결합에 가장 많이 기여하는 영역이다. CDR 및 골격 부위는 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)의 표준 정의에 따라 결정된다.
"항원결정기"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 어느 폴리펩티드 결정인자(determinant)를 포함한다. 특정 구체예에서, 항원결정기 결정인자는 아미노산, 설탕(sugar) 곁사슬, 포스포릴, 또는 술포닌과 같은 분자의 화학적 활성 표면 분류를 포함하고, 그리고 어떤 구체예에서는, 특정 3차원 구조적 특징, 및 또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 항원결정기는 항체에 의해 결합된 표적의 영역이다.
본 발명에 따른 양특이성 항체의 조제를 위해서 각각의 경쇄 및 중쇄를 부호화하는 별개의 벡터 또는 다른 적절한 양의 벡터가 사용되었을 수 있다. 그러한 벡터는 숙주 세포를 전환시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "핵산 또는 핵산 분자"란 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하도록 의도되었다. 핵산 분자는 외가닥(single-stranded)이거나 이중가닥(double-stranded)일 수 있지만, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다.
본 명세서에 사용된 대로 "세포", "세포계", 및 "세포 배양"이란 표현은 교대해서 쓰이고 그리고 그러한 모든 명칭은 후대(progeny)를 포함한다. 그러므로, "형질전환주" 및 "형질전환 세포"란 단어는 이식(transfers)의 횟수에는 상관없이 1차 대상 세포(primary subject cell) 및 그로부터 유도된 배양을 포함한다. 또한, 고의적인 또는 의도하지 않은 돌연변이 때문에 모든 후대가 DNA 내용에 있어 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해하고 있다. 원래 형질전환 세포에서 검사된 대로 동일한 기능 또는 생물학적 활동을 가진 변이 후대(variant progeny)는 포함된다. 확실한 명칭이 의도된 곳은 맥락을 보면 명확할 것이다.
본 명세서에서 사용된 "형질전환"이란 용어는 숙주 세포 안으로 벡터/핵산을 이식하는 절차를 뜻한다. 강력한 세포벽 장벽이 없는 세포가 숙주 세포로 사용된다면, 핵산전달감염은, 예를 들어 Graham and Van der Eh, Virology 52 (1978) 546ff가 기술한 인산칼슘 침전법에 의해 이행된다. 그러나 핵주입(nuclear injection) 의해 또는 원형질융합과 같은 세포 안에 DNA를 도입하는 다른 방법 또한 사용될 수 있다. 원핵세포 또는 상당한 세포벽 구성을 포함하는 세포가 사용된다면, 예를 들어 핵산전달감염의 한 방법은 Cohen SN, et al, PNAS 1972, 69 (8): 2110-2114가 기술한 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리이다.
형질전환을 사용한 항체의 재조합 생산은 선행기술에 공지되어있고, 예를 들어 Makrides, S. C, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, RJ., MoI. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., et al., Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880의 리뷰 기사(review articles) 그리고 US6331415 및 US4816567에서도 기술된다.
본 명세서에서 사용된 대로 "발현"은 핵산이 mRNA 안으로 전사되는(transcribed) 과정 및/또는 전사된 mRNA(전사물(transcript)로도 불림)가 그 뒤에 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는(translated) 과정을 뜻한다. 전사물 및 부호화된 폴리펩티드는 종합적으로 유전자 산물이라 불린다. 폴리뉴클레오티드가 유전체 DNA로부터 유도된다면, 진핵세포에서의 발현은 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 포함할 수 있다.
"벡터"는 핵산 분자, 특히 자기 재생하는 것이고, 이는 삽입된 핵산 분자를 숙주세포 안으로 그리고/또는 사이로 이식한다. 이 용어는 주로 세포 안으로 DNA 또는 RNA의 삽입(예를 들어 염색체 통합)을 위해 기능하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA의 복제를 위해 기능하는 벡터의 복제, 그리고 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 기술된 기능을 하나 이상 제공하는 벡터 또한 포함된다.
"발현 벡터"는 적절한 숙주 세포 안으로 도입되었을 때 폴리펩티드로 전사되고 그리고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 체계"는 보통 구하고자 하는 발현 산물을 산출하기 위해 기능할 수 있는 발현 벡터로 구성되는 적합한 숙주 세포를 뜻한다.
본 발명에 따른 양특이성 항체는 바람직하게는 재조합 방법에 의해 생산된다. 그러한 방법은 선행기술에 공지되어 있고, 그리고 원핵 세포 및 진핵 세포에서의 단백질 발현과 그 다음 항체 폴리펩티드의 분리 및 보통 약학적으로 허용 가능한 순도로 정제하는 것을 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 부호화하는 핵산은 표준 방법에 의해 발현 벡터 안으로 삽입된다. 발현은 CHO 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 이스트, 또는 대장균 세포, 및 세포(상청(supernatant) 또는 용해 뒤의 세포)로부터 회수된 항체와 같은 적절한 원핵 및 진핵 숙주 세포에서 실시된다. 양특이성 항체는 전체 세포에, 세포 용해질에, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태에 있을 수 있다. 정제는 알칼리/SDS 처리, 칼럼 크로마토그래피 및 본 발명이 속한 기술분야에 공지된 그 외 방법을 포함한 표준 기법으로 다른 세포의 구성요소 또는 다른 오염물을, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질을, 제거하기 위해 실시된다. Ausubel, F., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 참조.
NSO 세포에서의 발현은, 예를 들어, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; and Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270에 기술된다. 일과성 발현은, 예를 들어, Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9에 기술된다. 가변 도메인의 클로닝은 Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; and Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87에 기술된다. 바람직한 일과성 발현 체계(HEK293)는 Schlaeger, E.- J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 및 Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199에 기술된다.
원핵생물에 적합한 제어 염기순서(control sequences)는, 예를 들어, 촉진자(promoter)를 포함하고, 선택적으로 작동 염기순서(operator sequence), 및 리보솜 결합부위를 포함한다. 진핵 세포는 촉진자, 증강자(enhancer) 및 아데닐중합체형성 신호를 활용하는 것으로 알려졌다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계(functional relationship)에 놓였을 때 "사용 가능하게(operably) 연결"된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비리더(secretory leader)에 대한 DNA는, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질(preprotein)로서 발현한다면, 폴리펩티드에 대한 DNA에 사용 가능하게 연결된다; 촉진자 또는 증강자는, 서열의 전사에 영향을 미친다면, 코드화 서열(coding sequence)에 사용 가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합부위는, 번역을 가능하게 하기 위해 배치된다면, 코드화 서열에 사용 가능하게 연결된다. 일반적으로, "사용 가능하게 연결"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고(contiguous), 그리고, 분비리더의 경우, 인접하고 해독틀(reading frame)에 있다. 그러나 증강자는 인접하지 않아도 된다. 연결은 편리한 제한 부위(restriction site)에서의 결찰에 의해 이루어진다. 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴틀레오티드 연결기(adaptor) 또는 링커가 관례에 부합되게 사용된다.
양특이성 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 겔 전기 영동법, 투석, 또는 친화크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 과정으로 배지로부터 적합하게 분리된다. 단일클론 항체를 부호화하는 DNA 또는 RNA는 종래의 과정을 사용하여 손쉽게 분리되고 배열된다(sequenced). 하이브리도마 세포는 그러한 DNA 및 RNA의 근원의 역할을 할 수 있다. 분리되고 나면, DNA는 발현 벡터 안으로 삽입될 수 있고, 이는 그 다음에 숙주 세포에서 재조합 단일클론 항체의 합성을 얻기 위해, 자연적으로는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 HEK293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 안으로 핵산전달감염시킨다.
T 세포 양특이성(TCB) 결합체(binder)는 세포 사멸에 굉장히 높은 농도/종양-세포-수용체-점유(occupancy) 의존 효능을 가지고(예: 시험관 내 세포 사멸 분석에서의 EC50은 서브(sub)- 또는 낮은 피코몰 범위에 있다; Dreier et al. Int J Cancer 2002), T 세포 양특이성 결합체(TCB)는 종래의 단일특이성 항체보다 훨씬 낮은 투약량으로 주어진다. 예를 들어, 블리나투모맙(CD19xCD3)은 급성 림프성 백혈병의 치료를 위해 5 내지 15㎍/m2/day(즉 단 0.035 내지 0.105 mg/m2/week)의, 또는 비호지킨 림프종의 치료를 위해 60㎍/m2/day의 지속적인 정맥 내 투약량으로 주어지고, 그리고 이러한 투약량에서의 혈청 농도는 0.5 내지 4ng/ml 범위에 있다(Klinger et al., Blood 2012; Topp et al., J Clin Oncol 2011; Goebeler et al. Ann Oncol 2011). TCB의 낮은 투약량이 환자들에게 높은 효능을 가할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 항체는 피하 투여가 가능하고, 임상 환경에서(바람직하게는 0.25 내지 2.5mg/m2/week 범위의 투약량으로) 바람직할 것으로 예상된다. 이러한 낮은 농도/투약량/수용체 점유에서도, TCB는 상당한 부작용을 야기할 수 있다(Klinger et al., Blood 2012). 그러므로 종양 세포 점유/적용 범위를 제어하는 것이 대단히 중요하다. 본 발명에 따른 항체의 또 다른 이점은 Fc 부분을 포함하는 것에 근거하고, 이는 제거 반감기를 12일까지 또는 그 이상 증가시키고, 그리고 환자가 들고 다니는 펌프로 정맥 내 그리고 지속적인 투여 요구되는 Fc 부분을 가지지 않은 TCB(예: 블리나투모맙)와 비교했을 때, 일주일에 한 번 또는 두 번의 투여할 수 있는 기회를 제공한다.
CD19xCD3 T-세포 양특이성(TCB) 항체 블리나투모맙에 있어서 재발/난치성 급성 림프성 백혈병(ALL)을 가진 환자에서 80%까지의 반응률이 나타났다. ALL에 대해, 다발성 골수종 및 그 외 형질 세포 질병에 대해서는 아직 많은 의학수요(medical need)가 있다. 오늘날 할 수 있는 모든 치료에도 불구하고, 다발성 골수종 환자의 약 60%는 첫 진단으로부터 5년 후 이미 사망한 후다. 다발성 골수종 환자를 위한 효과적인 치료가 아직 필요한 실정이다.
본 발명에 따른 항체는, 예를 들어 블리나투모맙 및 공개된 BCMAxCD3 TCB 항체에 특유의 특색 및 이점을 가진다:
- 긴 제거 반감기(몇 시간 대신 며칠)
- 편리한 일주일의 두 번 또는 한 번의 투여(몇 주/몇 달 동안 환자가 들고 다녀야하는 펌프로 투여하는 대신)
- BCMAxCD3 TCB의 높은 안정성 및 낮은 응집을 제공하는 분자 형식 및 구조
- 본 발명에 따른 일반 경쇄를 사용하는 것으로, 그리고 올바른 중쇄 짝짓기(pairing)를 향상시키기 위해, 바람직하게는 노브 인투 홀 기법을 사용하는 것으로, 예를 들어 보체계와의 그리고/또는 FcR을 가진 작용기와의 상호작용으로부터 잠재적인 부작용을 방지하기 위해 바람직하게는 Fc의 CH3에서의 Pro 329 및 L234A 및 L235A 아미노산 치환으로, 고품질의 제조를 가능하게 하고 정제할 수 있게 하기 위한 분자 구조의 최적화.
본 발명의 특정 구체예가 아래에 열거되었다:
1. 인간 BCMA(이하 "BCMA"로도 명명) 및 인간 CD3ε(이하 "CD3"로도 명명)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체로, 일반 항체 경쇄를 포함하고, CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, 및 SEQ ID NO:8의 CDR3L, 그리고 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H을 포함하는 CD3 결합 부분의 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 것.
2. 구체예 1에 있어서, 일반 경쇄 도메인 VL인 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 항체.
3. 구체예 1 또는 2에 있어서, SEQ ID NO:29의 일반 경쇄를 포함하는 항체.
4. 구체예 1 내지 3의 어느 한 구체예에 있어서, CD3 결합 부분의 중쇄가 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H을 포함하고, 그리고 가변 경쇄 도메인 VL로서 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 항체 경쇄가 일반 경쇄인 것을 특징으로 하는 항체.
5. 구체예 1 내지 4의 어느 한 구체예에 있어서, CD3 결합 부분의 중쇄가 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H을 포함하고, 그리고 SEQ ID NO:29의 항체 경쇄가 일반 경쇄인 것을 특징으로 하는 항체.
6. 구체예 1 내지 5의 어느 한 구체예에 있어서, CD3 결합 부분의 가변 중쇄 도메인 VH로서 SEQ ID NO:1의 VH를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
7. 인간 BCMA 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체로, BCMA 결합 부분의 CDR로서:
a) SEQ ID NO:18의 CDR1H, SEQ ID NO:21의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:24의 CDR3H,
b) SEQ ID NO:19의 CDR1H, SEQ ID NO:22의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:25의 CDR3H,
c) SEQ ID NO:20의 CDR1H, SEQ ID NO:23의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:26의 CDR3H,
d) SEQ ID NO:35의 CDR1H, SEQ ID NO:36의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:37의 CDR3H,
로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 것.
8. 구체예 1 내지 6의 어느 한 구체예에 있어서, BCMA 결합 부분의 CDR로서:
a) SEQ ID NO:18의 CDR1H, SEQ ID NO:21의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:24의 CDR3H(pSCHLI333 세트),
b) SEQ ID NO:19의 CDR1H, SEQ ID NO:22의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:25의 CDR3H(pSCHLI372 세트),
c) SEQ ID NO:20의 CDR1H, SEQ ID NO:23의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:26의 CDR3H(pSCHLI373 세트),
d) SEQ ID NO:35의 CDR1H, SEQ ID NO:36의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:37의 CDR3H(83A10 세트)
로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
9. 구체예 1 내지 8의 어느 한 구체예에 있어서, BCMA 결합 부분의 가변 중쇄 도메인 VH로서 SEQ ID NO:15, 16, 17 또는 34(83A10)의 VH를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
10. 구체예 1 내지 9의 어느 한 구체예에 있어서, 친화성 설정(setup) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 500nM 또는 그 이하의 농도에 인간 BCMA Fc 융합이 있을 때 25nM의 항체 농도에서 측정된 상기 양특이성 항체의 인간 BCMA로의 친화성은 200nM이거나 그 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
11. 구체예 1 내지 10의 어느 한 구체예에 있어서, 상기 양특이성 항체의 BCMA-양성 H929 세포(ATCC CRL-9068)를 사멸시키는 효능(EC50)이, 전가된 T-세포 사멸 LDH 방출 분석에서 인간 PBCM 및 H929 세포가 24h에 대해 10:1의 E:T 비율일 때, 100nM 또는 그 이하의 농도에서 사용될 때, 2nM 또는 그 이하로 측정되는 것을 특징으로 하는 항체.
12. 구체예 1 내지 11의 어느 한 구체예에 있어서, 친화성 설정 표면 플라즈몬 공명 분석에서 500nM 또는 그 이하의 농도에 인간 BCMA Fc 융합이 있을 때 25nM의 항체 농도에서 측정된 상기 BCMA 결합 부분의 인간 BCMA로의 친화성은, 경쇄가 SEQ ID NO:29의 것이고, 인간 IgG1형의 항체에서 측정되었을 때 200nM 또는 그 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
13. 구체예 1 내지 12의 어느 한 구체예에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 항체의 하나의 Fab 단편, 및 BCMA 및 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 항체의 하나의 Fab 단편으로 이루어지고, 상기 CD3-Fab 및 상기 BCMA-Fab은 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 상기 CD3-Fab 및 상기 BCMA-Fab은 일반 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 양특이성 항체(도 1a).
14. 구체예 1 내지 12의 어느 한 구체예에 있어서, 두 개의 BCMA-Fab, 하나의 CD3 Fab 및 Fc 부분으로 이루어지고, 제1 BCMA-Fab 및 상기 CD3-Fab은 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 제2 BCMA-Fab은 그의 C-말단으로 상기 제1 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 항체. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 상기 일반 경쇄를 포함한다(도 1b).
15. 구체예 1 내지 12의 어느 한 구체예에 있어서, 두 개의 BCMA-Fab 및 Fc 부분으로 이루어지고, 상기 BCMA-Fab은 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 상기 CD3-Fab은 그의 C-말단으로 하나의 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 항체. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 상기 일반 경쇄를 포함한다(도 1c).
16. 구체예 1 내지 12의 어느 한 구체예에 있어서, 하나의 CD3-Fab 및 하나의 BCMA Fab으로 이루어지고, 이는 그의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분 및 BCMA-Fab의 경첩부위에 연결되고, 이는 그의 C-말단으로 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 항체. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 상기 일반 경쇄를 포함한다(도 1d).
17. 구체예 1 내지 12의 어느 한 구체예에 있어서, 하나의 BCMA-Fab 및 하나의 CD3 Fab으로 이루어지고, 상기 BCMA Fab은 그의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 상기 CD3-Fab은 그의 C-말단으로 상기 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 항체. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 상기 일반 경쇄를 포함한다(도 1e).
18. 구체예 1 내지 12의 어느 한 구체예에 있어서, 두 개의 BCMA-Fab으로 이루어지고, 제1 BCMA-Fab은 그의 C-말단을 통해 제2 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되고, 그리고 상기 제2 BCMA-Fab은 그의 C-말단을 통해 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 항체. 상기 CD3-Fab 및 두 개의 BCMA-Fab 모두 상기 일반 경쇄를 포함한다(도 1f).
19. 구체예 1 내지 12의 어느 한 구체예에 있어서, 하나의 BCMA-Fab 및 하나의 CD3 Fab으로 이루어지고, 상기 BCMA-Fab은 그의 C-말단으로 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결된 것을 특징으로 하는 항체. 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab은 상기 일반 경쇄를 포함한다(도 1g).
20. 구체예 1 내지 19의 어느 한 구체예에 있어서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 또 다른 중쇄의 CH3 도메인이 하나의 경계면(interface)에서 만나고, 이것이 항체 CH3 도메인 사이에 오리지널 경계면(original interface)을 이루는 것을 특징으로 하고; 상기 경계면은 상기 양특이성 항체의 형성을 촉진하기 위해 변경되며,
a) 양특이성 항체 내에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 오리지널 경계면과 만나는 또 다른 중쇄의 CH3 도메인의 오리지널 경계면 내에서 아미노산 잔기가 더 큰 곁사슬 부피를 가진 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공동(cavity)에 위치할 수 있는(positionable) 융기를 또 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내에 생성하도록 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고, 그리고
b) 양특이성 항체 내에서 제1 CH3 도메인의 오리지널 경계면과 만나는 제2 CH3 도메인의 오리지널 경계면 내에서 아미노산 잔기가 더 작은 곁사슬 부피를 가진 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제1 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 위치할 수 있는 공동을 제2 CH3 도메인의 경계면 내에 생성하도록 또 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되는 것을 특징으로 하는 항체.
21. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 양특이성 항체의 조제 방법으로,
a) 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄를 부호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 변형시키고,
b) 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건하에 숙주 세포를 배양하고, 그리고
c) 상기 배양으로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄를 부호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
23. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
24. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체 또는 구체예 23에 따른 약학적 조성물을 약제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.
25. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체 또는 구체예 23에 따른 약학적 조성물을 다발성 골수종과 같은 형질 세포 질환의 치료에 약제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.
26. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체 또는 구체예 28에 따른 약학적 조성물을 다발성 골수종의 치료에 약제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.
27. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체 또는 구체예 28에 따른 약학적 조성물을 다발성 골수종 또는 BCMA를 발현하는 그 외 B-세포 질환과 같은 형질 세포 질환의 치료에 약제로서 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.
28. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 있어서, 인간 IgG1 Fc 부분에서 Pro329의 글리신 또는 아르기닌으로의 아미노산 치환 및/또는 L234A 및 L235A 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
29. 구체예 1에 따른 양특이성 항체에 일반 경쇄 용도의 항체 경쇄로서, 상기 양특이성 항체가 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체인 것을 특징으로 하는 항체 경쇄.
30. 인간 BCMA(이하 "BCMA"로도 명명) 및 인간 CD3(이하 "CD3"으로도 명명)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에서 경쇄로서 CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, 및 SEQ ID NO:8의 CDR3L을 포함하고, CD3 결합 부분의 중쇄가 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 경쇄의 사용.
31. 구체예 30에 있어서, 상기 경쇄가 가변 경쇄 도메인 VL로서 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
32. 구체예 30 또는 31에 있어서, 상기 경쇄가 경쇄로서 SEQ ID NO:29의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
33. 인간 BCMA(이하 "BCMA"로도 명명) 및 인간 CD3(이하 "CD3"으로도 명명)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에서 일반 경쇄로서 사용하기 위하여 CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, 및 SEQ ID NO:8의 CDR3L을 포함하고, CD3 결합 부분의 중쇄가 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 경쇄.
34. 구체예 33에 있어서, 가변 경쇄 도메인 VL로서 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 경쇄.
35. 구체예 33 또는 34에 있어서, 인간 BCMA 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체에서 일반 경쇄로서 사용하기 위하여 SEQ ID NO:29의 가변 경쇄를 포함하고, CD3 결합 부분의 중쇄가 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 경쇄.
36. 구체예 1 내지 20의 어느 한 구체예에 따른 항체에서 일반 경쇄로서 사용하게 위한 구체예 33 내지 35의 어느 한 구체예에 따른 항체 경쇄.
하기의 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되었고, 본 발명의 진종한 범위는 첨부된 청구항에 제시된다. 본 발명의 정신에서 벗어나지 않고도 제시된 절차를 수정할 수 있는 것으로 이해된다.
재료 및 일반적인 방법
재조합 DNA 기법
DNA를 조작하기 위해 Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기술된 대로 표준적 방법이 사용되었다. 분자의 생물학적 시약은 제조자의 설명서에 따라 사용되었다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적인 정보는 다음에서 제공된다: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242. 항체 사슬의 아미노산은 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)에 따라 번호를 표기하고 그로 나타낸다.
유전자 합성
a) 얻고자 한 유전자 조각은 화학합성에 의해 만들어진 올리고뉴클레오티드로부터 조제되었다. 단일 엔도뉴클레아제 제한 분열 부위(singular restriction endonuclease cleavage sites)가 측면에 배치된 600 내지 1800bp 길이의 유전자 조각은 PCR 증폭을 포함하는 올리고뉴틀레오티드의 어닐링(annealing) 및 결찰(ligation)에 의해 만들어지고 그 뒤에, 예를 들어 Kpnl/ Sad 또는 Ascl/Pacl을 pPCRScript®(Stratagene) 기반 pGA4 클론 벡터(cloning vector)로, 표시된 제한 부위를 통해 클론되었다. 아클론(subcloned) 유전자 조각의 DNA 서열은 DNA 서열 결정법(DNA seqeuncing)에 의해 확인되었다. 유전자 합성 조각은 Geneart/Life Technologies(Regensburg, Germany)에서 주어진 설명서에 따라 주문하였다.
b) 필요에 의해 얻고자 한 유전자 조각은 적절한 견본(template)을 사용한 PCR에 의해 또는 합성 올리고뉴틀레오티드 및 자동 유전자 합성에 의하 PCR 산물로부터 Geneart AG(Regensburg, Germany)에 의해 합성되었다. 단일 엔도뉴클레아제 제한 분열 부위가 측면에 배치된 유전자 조각은 추가 분석을 위해 표준 발현 벡터 또는 서열결정 벡터 안에 클론되었다. 플라스미드 DNA는 시판되고 있는 플라스미드 정제 키트를 사용하여 형질전환 박테리아로부터 정제되었다. 플라스미드 농도는 UV 분광학에 의해 측정되었다. 아클론 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열결정에 의해 확인되었다. 유전자 조각은 각자의 발현 벡터안에 서브-클론(sub-cloning)될 수 있도록 적합한 제한 부위를 가지게 설계되었다. 필요로 하다면, 단백질 코드화 유전자는 진핵세포에서의 분비를 위한 단백질을 표적하는 리더 펩티드를 위해 5'-말단 DNA 서열 부호화(5'-end DNA sequence coding)를 가지게 설계되었다.
DNA 서열 확인(determination)
DNA 서열은 이중 가닥 서열결정에 의해 확인되었다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
Clone Manager(Scientific & Educational Software) 소프트웨어 패키지 버전 9.2가 서열 지도화(mapping), 분석, 주해(annoation) 및 도해화(illustration)를 위해 사용되었다.
발현 벡터
a) 항-BCMA 항체 발현 벡터의 생성을 위해, 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역은 포유류 세포계에서의 발현에 대해 최적화된 각자의 포괄적인 수용자(generic recipient) 발현 벡터 안에 사전-삽입된(pre-inserted) 인간 IgG1 불변 중쇄 또는 인간 IgG1 불변 경쇄와 함께 프레임에 서브클론되었다(subcloned in frame). 항체 발현은 5' UTR가 뒤잇는 CMV 증강자 및 MPSV 촉진자, 인트론 및 Ig 카파 MAR 요소(Ig kappa MAR element)를 포함하는 키메라 MPSV 촉진자에 의해 유도된다. 전사는 CDS의 3' 말단에서 합성 폴리A(polyA) 신호 서열에 의해 종료된다. 모든 벡터는 진핵세포에서의 분비를 위한 단백질을 표적하는 리더 펩티드를 위해 5'-말단 DNA 서열 부호화를 가진다. 추가적으로 각각의 벡터는 EBV EBNA 발현 세포에서의 에피솜 플라스미드 복제를 위한 EBV OriP 서열을 포함한다.
b) BCMAxCD3 양특이성 항체 벡터의 생성을 위해, IgG1 유래 양특이성 분자는 두 개의 별개의 항원 결정인자 CD3 및 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 두 개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 항원 결합 모이어티는 중쇄 및 경쇄로 구성된 Fab 단편이고, 각각 가변 및 불변 영역을 포함한다. Fab CD3 및 Fab BCMA의 경쇄는, LC가 잘못 짝지어지는 것을 방지하기 위해, 동일하다. 양특이성 분자 설계는 CD3에 대해 일가이고, BCMA에 대해 이가이고, 내부의 Fab의 N-말단에 하나의 Fab 단편이 융합된다(2+1). 양특이성 분자는 분자가 긴 반감기를 가지기 위해 Fc 부분을 포함했다. 상기 구성은 도 1에 도식적으로 제공된다; 상기 구성의 바람직한 서열은 SEQ ID NO 29 내지 31에 기재되어 있다. 분자는 포유류 발현 벡터와 함께 부유액(suspension)에서 성장하는 HEK293 EBNA 세포의 폴리머-기반 동시-핵산전달감염(cotransfection)으로 생산되었다. 2+1 Fab-IgG 구성의 제조를 위해, 세포는 1:1:2:1 비율(중쇄: 변형된 중쇄: 경쇄: 변형된 경쇄 = 1:1:2:1; 비율 표준 항체:중쇄: 경쇄 = 1:1)로 부합하는 발현 벡터로 핵산전달감염되었다.
세포 배양 기법
표준 세포 배양 기법은 Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.에 기술된 대로 사용되었다.
HEK293
세포(
HEK293
-
EBNA
시스템)에서의 일과성 발현
양특이성 항체는 부유액에서 배양된 HEK293-EBNA 세포에 있는 각자의 포유류 발현 벡터의 일과성 폴리머-기반 공동핵산전달감염에 의해 발현되었다. 핵산전달감염 하루 전에 HEK293-EBNA 세포는 Ex-Cell 매체에서 1.5 Mio 생존가능(Mio viable) 세포/mL로 심어졌고(seeded), L-글루타민의 6mM으로 보충되었다. 최종 생산량의 매 mL마다 2.0 Mio 생존가능 세포가 원심분리되었다(210 x g에서 5분). 상청액(supernatant)은 흡입되었고(aspirated) 그리고 세포는 CD CHO 매체의 100㎕에 재부유(respended)되었다. 최종 생산량의 매 mL에 대한 DNA는 1㎍의 DNA(비율 양특이성 항체 생산: 변형된 중쇄: 경쇄: 변형된 경쇄 = 1:1:2:1; 비율 표준 항체: 중쇄: 경쇄 = 1:1)를 100㎕의 CD CHO 매체에 혼합하는 것으로 조제되었다. 0.27㎕의 PEI 용액(1mg/mL)을 추가한 뒤 혼합물은 15초동안 볼텍스되었고(vortexed) 10분동안 상온에 놔두었다. 10분 후, 재부유된 세포 및 DNA/PEI 혼합물이 합쳐졌고 그리고 적적할 용기로 옮기고 이는 진탕기(shaking device)에 배치한다(37℃, 5% CO2). 3시간의 배양시간 후 6mM L-글루타민으로 보충된 800㎕의 Ex-Cell 매체, 1.25mM 밸프로산 및 12.5% Pepsoy(50g/L)가 최종 생산량의 매 mL마다 첨가되었다. 24시간 후, 70㎕의 유입 용액(feed solution)이 최종 생산량의 매 mL마다 첨가되었다. 7일 후 또는 세포 생존력이 70%이거나 또는 그보다 낮을 때, 세포는 원심 분리 및 무균여과에 의해 상청액으로부터 분리되었다.
단백질 측정
항체 농도는 항체의 0.1% 용액의 흡광도의 이론값을 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하는 것으로 측정되었다. 이 값은 아미노산 서열에 기반하고 GPMAW 소프트웨어(Lighthouse data)로 계산되었다.
SDS-PAGE
NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템(Invitrogen) 제조자의 설명서에 따라 사용되었다. 특히, 10% 또는 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 겔(pH 6.4) 및 NuPAGE® MES(NuPAGE® 항산화제 러닝 완충제(runnig buffer) 첨가제를 가진, 환원된 겔) 또는 MOPS(비-환원 겔) 러닝 완충제가 사용되었다.
단백질 정제
항체는 사이즈 배제 크로마토그래피의 단계인, 친화력 단계 및 하나의 연마(polishing) 단계로 정제되었다.
단백질 A 친화 크로마토그래피를 사용
친화력 단계를 위해 상청액이 A 칼럼에 로드되고(loaded)(HiTrap® Protein A FF, 5mL, GE Healthcare) 6 CV 20mM 인산나트륨, 20mM 구연산나트륨, pH 7.5으로 평형시켰다(equilibrated). 동일한 완충제를 사용한 세척 단계 다음, 항체는 20mM 인산나트륨, 100mM 염화나트륨, 100mM 글리신, pH 3.0을 사용한 용리 단계에 의해 칼럼으로부터 용리되었다. 얻고자 하는 항체가 있는 부분은 0.5M 인산나트륨, pH 8.0(1:10)으로 즉시 중화되었고, 원심 분리에 의해 혼합되고(pooled) 농축되었다(concentrated). 이 농축물은 무균여과 되었고 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 더 가공되었다.
사이즈 배제 크로마토그래피를 사용
사이즈 배제 단계를 위해 농축된 단백질은 XK16/60 HiLoad® Superdex® 200 칼럼(GE Healthcare) 및 제제 완충제로서 Tween®20을 포함하거나 또는 이가 없는, 20mM 히스티딘, 140mM 염화나트륨, pH 6.0에 주입되었다. 단량체를 함유한 부분은 원심 분리에 의해 혼합되고, 농축되었으며, 그리고 무균 바이알 안으로 무균 여과되었다.
순도 및 단량체 함량의 측정
최종 단백질 제제의 순도 및 단량체는 25mM 인산칼륨, 125mM 염화나트륨, 200mM L-아르기닌 염산염(monohydrochloride), 0.02%(w/v) 아지드화 나트륨, pH 6.7 완충제에서 CE-SDS(Caliper LabChip® GXII 시스템 (Caliper Life Sciences)) resp. HPLC(TSKgel® G3000 SW XL 분석적인 사이즈 배체 칼럼(Tosoh))에 의해 측정되었다.
PBMC로부터
원발성 인간 pan T 세포 분리
말초혈액단핵세포(PBMC)는 현지 혈액은행 또는 건강한 인간 헌혈자의 신선혈로부터 얻은 강화된 림프구 제제(백혈구연층)를 Histopaque 밀도 원심 분리하는 것으로 조제되었다. 간단하게, 혈액은 무균 PBS로 희석되었고 Histopaque® 구배(gradient)(Sigma, H8889) 위에 조심스럽게 레이어되었다(layered). 상온에서 450 x g로 30분동안 원심 분리한 후(브레이크 스위치 꺼짐), PBMC 위에 간기를 함유한 혈장의 일부는 폐기되었다. PBMC는 새로운 50ml 팔콘 튜브로 이동되었고, 튜브는 PBS로 총 용량 50ml까지 채워진다. 혼합물은 상온에서 10분동안 400 x g로 원심 분리되었다(브레이크 스위치 켜짐). 상청액은 폐기되었고 PBMC 펠릿(pellet)은 무균 PBS로 두 차례 세척되었다(4℃에서 10분동안 350 x g 원심 분리 단계). 결과적인 PBMC 모집단은 자동적으로 산출되었고(ViCell®) 그리고 분석이 시작될 때까지 37℃, 5% C02 인큐베이터 안에 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민을 함유한 RPMI1640 매체에 보관된다.
PBMC의 T 세포 강화는 Pan T 세포 분리 키트 II(Miltenyi Biotec #130-091-156)를 제조자의 설명서에 따라 사용하는 것으로 실행되었다. 간단하게, 세포 펠릿은 1천만 세포당 40㎕ 콜드 완충제(cold buffer)(0.5% BSA, 2 mM EDTA를 가진 PBS, 무균 여과)로 희석되었고, 1천만 세포당 10㎕ 비오틴-항체 혼합체에 4℃에서 10분동안 배양되었다. 1천만 세포당 30㎕ 콜드 완충제 및 20㎕ 항-비오틴 자기구슬이 첨가되었고, 혼합물은 4℃에서 15분동안 더 배양되었다. 세포는 현재 용량의 10-20x을 더한 뒤 300 x g로 10분의 원심 분리 단계에 의해 세척되었다. 1백만 세포까지 500㎕ 완충제에 재부유되었다. 라벨되지 않은(unlabeled) 인간 pan T 세포의 자기 분리는 LS 칼럼(Miltenyi Biotec #130-042-401)을 제조자의 설명서에 따라 사용하는 것으로 실행되었다. 결과적인 T 세포 모집단은 자동으로 산출되었고(ViCell®) 그리고 분석이 시작될 때까지(24시간 이내) 37℃, 5% C02 인큐베이터 안에 AIM-V 매체에 보관된다.
PBMC로부터
원발성 인간 미접촉(naive) T 세포 분리
말초혈액단핵세포(PBMC)는 현지 혈액은행 또는 건강한 인간 헌혈자의 신선혈로부터 얻은 강화된 림프구 제제(백혈구연층)를 Histopaque® 밀도 원심 분리하는 것으로 조제되었다. PBMC의 T 세포 강화는 Miltenyi Biotec의 미접촉 CD8+ T 세포 분리 키트(#130-093-244)를 제조자의 설명서에 따라 사용하되, CD8+ T 세포의 마지막 분리 단계를 건너뛰는 것으로 실행되었다(원발성 인간 pan T 세포의 분리에 대한 설명 또한 참조).
실시예
실시예
1: 항-
BCMA
항체 생성
실시예
1.1: 항원 및 도구 시약(tool reagent) 생산
실시예
1.1.1: 재조합, 가용성, 인간
BCMA
세포외
도메인
파지 디스플레이 선택을 위해 항원으로서 사용된 인간, 시노몰구스 및 쥣과 BCMA의 세포외 도메인은 수용체 사슬(Fc 노브 사슬)을 가진 Fc 부분의 C-말단에 위치한 avi-태그(avi-tag) 인식 서열에서의 BirA 비오틴 연결효소의 공동 발현을 통해 N-말단 단량체 Fc-융합체로서 HEK EBNA 세포에 일과성 발현되고 그리고 체내 부위-특이(in vivo site-specifically) 비오틴일화(biotinylated) 되었다. 인간, 시노몰구스 및 쥣과 BCMA의 세포외 도메인은 메티오닌 4에서 아스파라긴 53, 메티오닌 4에서 아스파라긴 52, 및 알라닌 2에서 트레오닌 49를 각자 포함했다. 이들은 인간 IgG1 경첩(hinge)에 N-말단으로 융합되어, 노브-인투-홀 기술에 의해 융합되지 않은 인간 IgG1 Fc 부분(홀 사슬)과의 헤테로다이머화(heterodimerization)를 가능하게 한다.
BCMA의 세포외 도메인의 회수를 위해 다음의 길잡이(primer)가 사용되었다:
BamH1 부위(볼드체, 밑줄)를 포함하는 AAGCTTGGATCCATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCC-3(SEQ ID NO:9) 그리고
뒷길잡이(reverse primer) 5-GAATTCGCGGCCGCTCATCCTTTCACTGAATTGGTCACACTTGCATTAC-3(SEQ ID NO:10)
길잡이 5-ACGTTAGATCTCCACTCAGTCCTGCATCTTGTTCCAGTTAAC-3(SEQ ID NO:11) 및 뒷길잡이 5-AACGTTGCGGCCGCTAGTTTCACAAACCCCAGG-3(SEQ ID NO:12)
HindIII 제한 부위 (볼드체, 밑줄) 및 코자크 공통 서열(Kozak consensus sequence)을 포함하는 GAATTCAAGCTTGCCACCATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCC-3(SEQ ID NO:13) 및
뒷길잡이 5-GAATTCTCTAGATTACCTAGCAGAAATTGATTTCTCTATCTCCGTAGC-3(SEQ ID NO:14).
유전자 합성 또한 BCMA의 세포외 도메인을 얻기 위해 사용될 수 있다.
실시예
1.2: 도구로서의
BCMA
-발현 세포
실시예
1.2.1: 표면에
BCMA를
발현하는 인간 골수종
세포계
BCMA 발현은 네 개의 인간 골수종 세포계(NCI-H929, RPMI-8226, U266B1 및 L-363)에서 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. NCI-H929 세포((H929) ATCC® CRL-9068™)는 80-90% RPMI 1640에 10-20% 열-비활성화(heat-inactivated) FCS로 배양되었고 2mM L-글루타민, 1mM 피루빈산염 나트륨(sodium pyruvate) 및 50μM 메르캅토에탄올을 함유할 수 있다. RPMI-8226 세포((RPMI) ATCC® CCL-155™)는 90% RPMI 1640 및 10% 열-비활성화 FCS를 함유한 매체에서 배양되었다. U266B1((U266) ATCC® TIB-196TM) 세포는 2mM L-글루타민, 10mM HEPES, 1mM 피루빈산염 나트륨, 4500mg/L 포도당, 그리고 1500mg/L 중탄산나트륨 및 15% 열-비활성화 FCS를 함유하도록 변형된 RPMI-1640 매체에 배양되었다. L-363 세포계(Leibniz Institute DSMZ - German collection of microorganisms and cell cultures; DSMZ No. ACC 49)는 85% RPMI 1640 및 15% 열-비활성화 FCS에 배양되었다. 간단히, 세포는 수확되고, 세척되고, 생존력에 대해 계산되었고, 96-홈 둥근 바닥 판에 50,000 세포/홈으로 재부유되고, 그리고 10μg/ml 항-항체 BCMA 항체(Abcam, #ab54834, 쥐 IgG1)와 4℃에서 30분동안 배양된다(내재화 방지를 위해). 쥐 IgG1은 아이소타입 제어로서 사용되었다(BD Biosciences, #554121). 그 다음 세포는 원심 분리되고(350 x g로 5분간), 두 번 세척되고, 그리고 FITC-결합 항 쥐 2차 항체와 함께 4℃에서 30분동안 배양된다. 배양 시간이 끝나고, 세포는 원심 분리되고(350 x g로 5분간), FACS 완충제로 두 번 세척되고, 100㎕ FACS 완충제에 재부유되고 그리고 FACS Diva 소프트웨어를 실행하는 Canto®II 장치에서 분석되었다. H929, U266B1, RPMI-8226 및 L-363 골수종 세포계의 표면 막에 있는 BCMA 수용체 수의 상대적인 수량화는 QIFIKIT® 분석법에 의해 분석되었다(Dako, #K0078, 제조자의 설명서에 따라 사용됨). H929 세포는 다른 골수종 세포계보다 3.8 내지 27배까지 높은, 가장 높은 밀도로 인간 BCMA를 발현했다. BCMAmed /lo-발현 골수종 세포인 U266, 그리고 BCMAlo-발현 골수종 세포인 RPMI-8226 및 L363과 비교했을 때, H929는 BCMAhi-발현 골수종 세포계인 것으로 고려된다. 표 4는 인간 다발성 골수종 세포계의 세포 표면에 있는 상대적인 BCMA 수용체 수를 요약한다.
| 골수종 세포계 | 세포당 상대적 결합 부위 |
| H929 | 50000 |
| U266 | 13000 |
| RPMI-8226 | 2000 |
| L363 | 1800 |
표 4: NCI-H929, U266B1, RPMI-8226 및 L-363 인간 골수종 세포계의 세포 표면에 있는 BCMA 수용체 수의 수량화
실시예
1.3: 시험관 내 재조합 라이브러리로부터
BCMA
결합체 획득
실시예
1.3.1: 일반
경쇄
Fab
-라이브러리(
Fab
-Libraries)의 구성
Fab-형식의 항체 라이브러리는 인간화 항-CD3 항체 경쇄(SEQ ID NO:29) 생성에 근거하여 구성된다. 다양성은 중쇄에만 도입되었다. 여섯 개의 다른 중쇄 골격이 사용되었다: VH1-46, VH1-69, VH3-15, VH3-23, VH4-59 및 VH5-1. CDR 1, 2, 및 3은 랜덤화되고(randomized) 그리고 각각의 중쇄 라이브러리는 랜덤화되지 않은 경쇄와 결합했다. 라이브러리는 Nissim et al EMBO J. 1994 Feb 1;13(3):692-8, 및 Silacci et al. Proteomics. 2005 Jun;5(9):2340-50에 기술된 대로 생성되었다.
실시예
1.3.2: 항-
BCMA
Fab
클론 선택
항-BCMA Fab는 하나의 불변 VL 및 여섯 개의 다른 인간 VH 서열을 포함하는 합성 Fab 라이브러리의 파지 디스플레이에 의해 설정되었다.
| Fab 클론 | VL 도메인 | VH 도메인 |
| pSCHLI372 | QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:8) |
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNSGMIWVRQAPGKGLEWVGHIRSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTGGSGSFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:16) |
| pSCHLI373 | QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:8) |
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSNSWMNWVRQAPGKGLEWVGTIRQKTYGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTGGLFGYWDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17) |
표 5: 항-BCMA 클론 및 각자의 VL/VH 쌍
선택 라운드(selection round)(바이오패닝(biopanning))는 다음의 패턴을 따라 용액에서 실행되었다: 1) 항원의 Fc-부분을 인식하는 항체의 라이브러리를 고갈시키기 위해 관련없는(unrelated) 인간 IgG 10㎍/ml으로 코팅된 면역튜브(immunotubes)에 라이브러리 풀(pool)당 ~ 1012 파지미드 입자의 사전-클리어링(pre-clearing); 2) 100nM 비오틴일화 BCMA와 함께 비-Fc-결합 파지미드 입자를 총 용량 2ml에서 또 다른 Fc-결합체 고갈을 위해 100nM 관련없는 비-비오틴일화 Fc 노브-인투 홀 구성체와 함께 0.5h동안 배양; 3) 패닝(panning) 반응을 나누고 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 스트렙타비딘으로 미리 코팅된 미량 역가판의 16홈에 담아 20분동안 진탕기에 두는 것에 의한 비오틴일화 BCMA의 포획(capture) 및 파지 특이적 결합; 4) 판 세척기를 사용하여 각자의 홈을 PBS/Tween20을 가진 10-30x 및 PBS를 가진 10-30x로 세척; 5) 자연 리간드의 결합 부위를 인식하는 Fab 클론을 이동시키기 위한 230nM 쥣과 APRIL 추가에 따라 APRIL-비-경쟁 파지 항체에 대해 선택하는 선택적 경쟁(competitive) 세척 단계; 6) 각 홈당 5 내지 10분간 125㎕ 100mM TEA(트리에틸아민) 첨가에 의한 파지 입자의 용출 및 동일한 양의 1M Tris/HCl pH 7.4 첨가에 의한 중화; 7) 용출된 파지 입자를 사용한 로그 기(log-phase) 대장균 TG1 세포의 재감염(re-infection), 보조파지(helperphage) VCSM13을 사용한 감염, 하룻밤 동안 30℃에서 진탕기에 배양, 그리고 다음 선택 라운드에서 사용될 파지미드 입자의 PEG/NaCl 침전.
선택은 농도 100nM의 불변 항원을 사용해 3 내지 5 라운드 동안 이행되었다. 항원으로서 인간 BCMA만 사용된 선택 캠페인을 제외하고, 부가적인 선택 켐페인이 이행되었고, 이 동안 교차 반응을 일어킬 수 있는 항체를 선택하기 위해 시노몰구스 또는 쥣과 BCMA 또한 인간 BCMA와 교대로 사용되었다. 또한, 스트렙타비딘 판-기반 포획의 대안으로, 항원 : 파지 복합체의 포획은 5.4 x 107 스트렙타비딘-코팅 자기구슬을 패닝 반응에 첨가하고 그에 뒤이어 아래 기술된 조건하에 각자의 자석을 사용한 세척 단계에 의해 실행되었다.
특정 결합체는 BioRad의 ProteOn XPR36 바이오센서를 사용한 Fab-함유 세균배양 상청액의 표면 플라즈몬 공명-검사에 의해 식별되었다. 간단하게는, 용출된 파지 입자를 사용한 로그 기 대장균 세포의 감염 후, 단일의 집락형성단위(cfu)가 플레이트 되었고(plated) 그리고 96-깊은 홈판(deep well plates)에 1ml 발현 배양의 접종을 위해 선택된다. Fab는 수직 방향에서 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이 다클론항체(Jackson ImmunoResearch, # 109-005-006)의 8.000 - 10.000 RU로 유도체합성(derivatized)된 ProteOn® GLM 칩(chip)의 상청액으로부터 포획되었다. 그 뒤에, 인간, 시노몰구스 및 쥣과 BCMA에 더하여 관련없는 Fc 노브-인투-홀 구성체가 분석물로서 수평 방향으로 주입되었다. BCMA에 대해 상당한 결합 반응을 보이고 항원의 Fc-부분을 결합시키지 않은 클론은 0.5리터 배양량에 박테리아에 의해 발현되고, 친화성 정제되었고 그리고 BioRad's ProteOn® XPR36 바이오센서에 있는 원샷-동역학 프로토콜(one-shot-kinetics protocol)을 사용한 SPR-분석에 의해 운동으로 특징지어졌다.
실시예
2:
BCMA
결합 분석: 표면
플라즈몬
공명
표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 재조합 BCMA에 항-BCMA의 결합의 분석은 다음과 같다. 모든 SPR 실험은 25℃에서 러닝 완충제로서 HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, Biacore, Freiburg/Germany)와 함께 Biacore® T200에서 실행되었다. 항-BCMA 항체 및 재조합 BCMA Fc(kih)(인간, 시노몰구스 및 쥣과) 사이의 상호작용의 결합활성이 측정되었다(표 6 내지 8). 비오틴일화 재조합 인간, 시노몰구스 및 쥣과 BCMA(kih)는 설명서(Biacore®, Freiburg/Germany)를 따라 SA 칩에 직접적으로 연결되었다. 부동화 수준의 범위는 80에서 120 RU에 이르렀다. 항-BCMA 항체는 120초동안 흐름 실(flow cells)을 통해 30㎕/minutes의 흐름으로 4배의 농도 범위(1.95 내지 500nM)로 통과되었다. 분리는 180초동안 모니터되었다. 벌크(bulk) 반응성 지수 차이는 기준 흐름 실에서 얻은 반응을 빼는 것으로 교정되었다. 여기에서, 항-BCMA는 표준 아민 결합 키트에 기술된대로 이전에 활성화된 또는 비활성화된 빈 표면 위를 지났다. 겉보기 반응속도상수(apparent kinetic constant)는, 상호작용의 이가(bivalency)에도 불구하고 비교 목적을 위해, 수치적분법으로 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응속도식에 적합시키기(fit) 위해, Biacore® T200 Evaluation 소프트웨어(v 1.0, Biacore AB, Uppsala/Sweden)를 사용해 유도되었다.
| 분석물 | 리간드 | Kon [1/Ms] | Koff [1/s] | KD[nM] |
| pSCHLI333 anti-BCMA IgG | huBCMA Fc(kih) | 4.55E+06 | 1.13E-02 | 2.5 |
| pSCHLI333 anti-BCMA IgG | cyBCMA Fc(kih) | 9.39E+06 | 1.24E-02 | 1.3 |
| pSCHLI333 anti-BCMA IgG | muBCMA Fc(kih) | 8.26E+06 | 1.62E-01 | 19.6 |
표 6: 비교 목적만을 위한 결합활성 값(실험 1)
| 분석물 | 리간드 | Kon [1/Ms] | Koff [1/s] | KD[nM] |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | huBCMA Fc(kih) | 3.13E+05 | 2.66E-03 | 8.5 |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | cyBCMA Fc(kih) | 7.85E+05 | 3.50E-03 | 4.5 |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | muBCMA Fc(kih) | 1.30E+05 | 5.53E-01 | 42.7 |
| pSCHLI373 anti-BCMA IgG | huBCMA Fc(kih) | 1.40E+05 | 3.23E-03 | 23.0 |
| pSCHLI373 anti-BCMA IgG | cyBCMA Fc(kih) | 9.36E+04 | 9.28-04 | 9.9 |
표 7: 비교 목적만을 위한 결합활성 값(실험 2)
| 분석물 | 리간드 | Kon [1/Ms] | Koff [1/s] | KD[nM] |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | huBCMA Fc(kih) | 8.03E+05 | 2.84E-03 | 3.6 |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | cyBCMA Fc(kih) | 1.63E+06 | 4.69E-03 | 2.9 |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | muBCMA Fc(kih) | 4.69E+05 | 1.21E-02 | 25.7 |
| pSCHLI373 anti-BCMA IgG | huBCMA Fc(kih) | 9.78E+04 | 1.18E-03 | 12.1 |
| pSCHLI373 anti-BCMA IgG | cyBCMA Fc(kih) | 9.39E+04 | 7.98E-04 | 8.5 |
표 8: 비교 목적만을 위한 결합활성 값(실험 3)
항-BCMA 항체 또는 BCMA-TCB CLC 항체 및 재조합 인간 BCMA Fc(kih) 사이의 상호작용의 친화성 또한 측정되었다. 항-인간 Fab 항체(GE Healthcare)는 표준 아민 결합 키트(Biacore®, Freiburg/Germany)를 사용해 pH 5.0에서 CM5 칩에 직접적으로 연결되었다. 부동화 수준은 약 6500 RU였다. 항-BCMA 항체 또는 BCMA-TCB CLC 항체는 25nM에서 90초동안 포획되었다. 재조합 인간 BCMA Fc(kih)는 120 또는 180초동안 흐름 실을 통해 30μL/minutes의 흐름으로 4배의 농도 범위(1.95 내지 500nM)로 통과되었다. 분리는 120 또는 400초동안 모니터되었다. 벌크 반응성 지수 차이는 기준 흐름 실에서 얻은 반응을 빼는 것으로 교정되었다. 여기에서, 재조합 BCMA는 항-BCMA 항체 또는 BCMA-TCB CLC 항체 대신 HBS-EP가 주입된, 부동화 항-인간 Fab 항체를 가진 표면 위를 지났다. 반응속도상수는 수치적분법으로 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응속도식에 적합시키기 위해, Biacore® T200 Evaluation 소프트웨어(v 1.0, Biacore AB, Uppsala/Sweden)를 사용해 유도되었다(표 9).
| 분석물 | 리간드 | Kon [1/Ms] | Koff [1/s] | KD[nM] |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | huBCMA Fc(kih) | 4.59E+04 | 5.23E-03 | 114 |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | cyBCMA Fc(kih) | 2.68E+04 | 7.52E-03 | 281 |
| pSCHLI372 anti-BCMA IgG | muBCMA Fc(kih) | 9.92E+04 | 1.30E-01 | 1310 |
| pSCHLI373 anti-BCMA IgG | huBCMA Fc(kih) | 4.22E+04 | 5.70E-03 | 135 |
| pSCHLI373 anti-BCMA IgG | cyBCMA Fc(kih) | 2.10E+04 | 1.12E-02 | 535 |
| pSCHLI373 anti-BCMA IgG | muBCMA Fc(kih) | 1.27E+05 | 9.19E-02 | 724 |
| pSCHLI333 anti-BCMA TCB | huBCMA Fc(kih) | 9.10E+03 | 1.49E-03 | 164 |
| pSCHLI333 anti-BCMA TCB | cyBCMA Fc(kih) | 1.44E+04 | 2.63E-03 | 183 |
| pSCHLI333 anti-BCMA TCB | muBCMA Fc(kih) | 4.83E+02 | 3.47E-03 | 7190 |
| pSCHLI372 anti-BCMA TCB | huBCMA Fc(kih) | 5.59E+04 | 3.52E-03 | 63 |
| pSCHLI372 anti-BCMA TCB | cyBCMA Fc(kih) | 4.58E+04 | 7.57E-03 | 165 |
| pSCHLI372 anti-BCMA TCB | muBCMA Fc(kih) | 1.42E+04 | 4.87E-03 | 344 |
표9: 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응속도식에 적합시키는 것으로 계산된 친화상수
실시예
3: 일반
경쇄를
사용한 이가 항-
BCMA
IgG
항체 생성
일반 경쇄의 사용이 모든 BCMA 항체에 적용될 수 있다는 가설을 확인하기 위해, 83A10-CLC 이가 BCMA 항체는, 사전에 WO/2014/122143 기술된, 이가 BCMA 항체 83A10의 자연 경쇄를 SEQ ID NO:29의 일반 경쇄로 치환하는 것으로 생성되었다. 83A10의 두 개의 중쇄 및 두 개의 일반 경쇄를 포함하는 항-BCMA 항체는 재료 및 보편적인 방법 부분에 기술된 대로 이가 IgG 항체의 생성을 위한 일반적인 기법을 사용해 생산되었다. 인간 BCMA에 대한 83A10-CLC IgG 항체의 친화성은 실시예 2에 기술된 것과 유사한 방법으로 SPR에 의해 측정되었다. 표 10은 83A10-CLC BCMA IgG 항체와의 재조합 인간 BCMA Fc(kih)의 결합을 나타낸다.
| 리간드 | 분석물 | Kon [1/Ms] | Koff [1/s] | KD[nM] |
| 83A10 CLC anti-BCMA IgG | huBCMA Fc(kih) | 8.78E+04 | 2.13E-3 | 24.3 |
표 10: 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응속도식에 적합시키는 것으로 계산된 친화상수: 83A10-CLC 항-BCMA 항체와의 재조합 인간 BCMA Fc(kih)의 결합
실시예
4:
huTACI
-R 및
huBAFF
-R에 대한 항-
BCMA
IgG
항체의 특이성 테스트
TNF-TNF-R 상과의 구성원으로서, TACI 및 BAFF 수용체는 BCMA 수용체에 각자 세포외 도메인에서 22% 및 18.5% 상동성으로 관련있다. 그러므로, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합 실험이 항-BCMA IgG 항체의 특이성을 조사하기 위해 실행되었다. 모든 SPR 실험은 25℃에서 러닝 완충제로서 HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)와 함께 Biacore® T200(GE Healthcare)에서 실행되었다. Fc 융합 huBCMA, huBAFF-R 및 huTACI-R은 표준 아민 결합 키트(GE Healthcare)를 사용해 pH 5.0에서 Biacore CM5 센서 칩의 다른 흐름 채널(flow channels)에서 높은 부동화 수준(~5000 RU)으로 화학적으로 고정되었다(immobilized). 처음에 결합이 일어나는지 확인하기 위해 항-BCMA IgG pSCHLI372에 더하여 양성 제어로서 a-huTACI-R IgG 또는 a-huBAFF-R IgG의 고농도 용액(연상시간: 80초, 분리시간: 600초, 흐름: 30μl/min)이 주입되었다. a-huTACI-R IgG가 huTACI-R에, 그에 더하여 a-huBAFF-R IgG가 huBAFF-R 그리고 항-BCMA IgG 항체가 huBCMA에 결합하는 양성 결합 사건(positive binding event)은 부동화 후에도 모든 수용체가 인식됨을 나타냈다. huBAFF-R 및/또는 huTACI-R에 빠른 운동 속도(kinetic rate)로 결합하는 항-BCMA IgG 항체에 대해서, 낮은 부동화 수준(300 RU)의 운동 파라미터(kinetic parameter)의 세심한 조사는 새로운 CM5 센서 칩에서 실행되었다. 3000 내지 93.75nM(HBS-EP에서 2배 희색) 농도의 항-BCMA IgG 항체 희석이 주입되었고(연상시간: 80초, 분리시간: 300초, 흐름: 30㎕/min), 샘플(들)은 2중(duplicate)으로 실험되었다. 재생 또한 해당될 경우, 즉 빠르고 완전 분리가 없을 때, 실행되었다. 항-BCMA IgG 항체 및 huBAFF-R 또는 huTACI-R 사이의 상호작용의 운동 평가(kinetic evaluation)는 데이터를 질량 이동을 위한 기한(term)을 포함하는 1:1 상호작용 모델에 전체 적합(global fitting) 시키는 것으로 실행되었다(Biacore T200 evaluation Version 1.0). 정상 상태 분석 또한 실행되었다. 도 2에 나타난 대로, 곡선 1은 기준 채널에 있는 신호와 일치하고, 곡선 2는 결합이 이루어지는 채널(결합 채널)과 일치하고 그리고 곡선 2-1은 삭감된(subtracted) 신호(결합 채널 - 기준 채널)이고, 이는 이 신호가 결합 사건에 의한 것임을 뜻한다. 도 2에 보여진 대로, SPR 결합 분석은 pSCHLI372 IgG가 인간 TACI 수용체에 결합하지 않았음을 명확하게 입증했다. 결합에 대한 양성 제어로서, 또 다른 BCMA IgG는 TACI 수용체에 조금, 하지만 굉장히 빠른 온-속도(on-rate) 및 오프-속도(off-rate)로 결합하는 것으로 알려졌다(데이터 기재되지 않음).
실시예
5: 항-
BCMA
/항-CD3 T 세포
양특이성
항체 생성
실시예
5.1: 항-CD3 항체
본 명세서에 사용된 "CD3ε 또는 CD3"이란 용어는 UniProt P07766(CD3E_HUMAN) 하에 기술된 인간 CD3ε과 관련된 것이다. "CD3에 대응하는 항체, 항CD3 항체"란 용어는 CD3ε에 결합하는 항체와 관련된 것이다. 바람직하게는 상기 항체는 각자 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 SEQ ID NO: 3, 4 및 5의 중쇄 CDR을 포함하는 가변 도메인 VH 및 각자 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 SEQ ID NO: 6, 7 및 8의 경쇄 CDR을 포함하는 가변 도메인 VL을 포함한다. 바람직하게는 상기 항체는 SEQ ID NO:1(VH) 및 SEQ ID NO:2(VL)의 가변 도메인을 포함한다.
앞서 기술된 항-CD3 항체는 다음의 실시예에서 사용된 T 세포 양특이성 항체를 생성하는데 사용되었다.
실시예
6:
BCMA
-
TCB
CLC
Fc
-함유(2+1) 항체 생산 및 정제
상기 양특이성 항체의 생산을 위해, 양특이성 항체는 부유액에서 배양된 HEK293-EBNA 세포에 있는 각자의 포유류 발현 벡터의 일과성 폴리머-기반 공동핵산전달감염에 의해 발현되었다. 핵산전달감염 하루 전에 HEK293-EBNA 세포는 Ex-Cell® 매체에서 1.5 Mio 생존가능 세포/mL로 심어졌고, L-글루타민의 6mM으로 보충되었다. 최종 생산량의 매 mL마다 2.0 Mio 생존가능 세포가 원심분리되었다(210 x g에서 5분). 상청액은 흡입되었고 그리고 세포는 CD CHO 매체의 100㎕에 재부유되었다. 최종 생산량의 매 mL에 대한 DNA는 1㎍의 DNA(비율 양특이성 항체 생산: 변형된 중쇄: 경쇄: 변형된 경쇄 = 1:1:2:1; 비율 표준 항체: 중쇄: 경쇄 = 1:1)를 100㎕의 CD CHO 매체에 혼합하는 것으로 조제되었다. 0.27㎕의 PEI 용액(1mg/mL)을 추가한 뒤 혼합물은 15초동안 볼텍스되었고(vortexed) 10분동안 상온에 놔두었다. 10분 후, 재부유된 세포 및 DNA/PEI 혼합물이 합쳐졌고 그리고 적적할 용기로 옮겨지고 이는 진탕기에 배치되었다(37℃, 5% CO2). 3시간의 배양시간 후 6mM L-글루타민으로 보충된 800㎕의 Ex-Cell 매체, 1.25mM 밸프로산 및 12.5% Pepsoy(50g/L)가 최종 생산량의 매 mL마다 첨가되었다. 24시간 후, 70㎕의 유입 용액이 최종 생산량의 매 mL마다 첨가되었다. 7일 후 또는 세포 생존력이 70%이거나 또는 그보다 낮을 때, 세포는 원심 분리 및 무균여과에 의해 상청액으로부터 분리되었다. 항체는 사이즈 배제 크로마토그래피의 단계인, 친화력 단계 및 하나의 연마(polishing) 단계로 정제되었다.
친화력 단계를 위해 상청액이 A 칼럼에 로드되었고(loaded)(HiTrap® Protein A FF, 5mL, GE Healthcare) 6 CV 20mM 인산나트륨, 20mM 구연산나트륨, pH 7.5으로 평형시켰다(equilibrated). 동일한 완충제를 사용한 세척 단계 다음, 항체는 20mM 인산나트륨, 100mM 염화나트륨, 100mM 글리신, pH 3.0을 사용한 용리 단계에 의해 칼럼으로부터 용리되었다. 얻고자 하는 항체가 있는 부분은 0.5M 인산나트륨, pH 8.0(1:10)으로 즉시 중화되었고, 원심 분리에 의해 혼합되고(pooled) 농축되었다. 이 농축물은 무균여과 되었고 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 더 가공되었다.
사이즈 배제 단계를 위해 농축된 단백질은 XK16/60 HiLoad® Superdex® 200 칼럼(GE Healthcare) 및 제제 완충제로서 Tween®20을 포함하거나 또는 이가 없는, 20mM 히스티딘, 140mM 염화나트륨, pH 6.0에 주입되었다. 단량체를 함유한 부분은 원심 분리에 의해 혼합되고, 농축되었으며, 그리고 무균 바이알 안으로 무균 여과되었다.
항체 농도는 항체의 0.1% 용액의 흡광도의 이론값을 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하는 것으로 측정되었다. 이 값은 아미노산 서열에 기반하고 GPMAW 소프트웨어(Lighthouse data)로 계산되었다.
최종 단백질 제제의 순도 및 단량체 함량은 25mM 인산칼륨, 125mM 염화나트륨, 200mM L-아르기닌 염산염(monohydrochloride), 0.02%(w/v) 아지드화 나트륨, pH 6.7 완충제에서 CE-SDS(Caliper LabChip® GXII 시스템 (Caliper Life Sciences)) resp. HPLC(TSKgel® G3000 SW XL 분석적인 사이즈 배체 칼럼(Tosoh))에 의해 측정되었다.
도 3은 단백질 A(PA) 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 정제 단계가 (A) pSCHLI333-TCB CLC, (B) pSCHLI372-TCB CLC, (C) pSCHLI373-TCB CLC에 적용된 이후의 최종 단백질 조제의 CE-SDS 그래프(비-감소된(위) 및 감소된(아래))를 나타낸다. pSCHLI333-TCB CLC 항체에 적용된 PA 친화성 크로마토그래피 및 SEC 정제 단계는 89.2%의 순도 및 100%의 단량체 함량(A), pSCHLI372-TCB CLC 항체에 대해 88.5%의 순도 및 100%의 단량체 함량(B), 및 pSCHLI372-TCB CLC 항체에 대해 91.8%의 순도 및 100%의 단량체 함량(C)을 야기했다. 표 11은 PA 친화성 크로마토그래피 및 SEC 정제 단계 이후 pSCHLI333-TCB CLC, pSCHLI372-TCB CLC, 및 pSCHLI373-TCB CLC 항체의 성질을 요약한다. 모든 BCMA-TCB CLC 항체에서, >88% 순도 및 100% 단량체 함량에 일관적으로 도달했다. 전체적인 결과는 생산/정제 기능에서의 이점이 일반 경쇄(CLC)를 TCB 항체에 사용하는 것으로 달성할 수 있고 그리고 굉장히 뛰어난 성장가능(developability) 성질을 가진 높은 질의 단백질 제제를 달성하는데에 단 두 정제 단계(즉 PA 친화성 크로마토그래피 및 SEC)가 필요함을 명확하게 나타낸다.
| pSCHLI333-TCB CLC | pSCHLI372-TCB CLC | pSCHLI373-TCB CLC | |
| 순도(%) | 89.2 | 88.5 | 91.8 |
| 생산량(mg/L) | 4.2 | 4.1 | 2.73 |
| 역가(mg/L) | 26.9 | 21.2 | 37.1 |
| 단량체(%) | 100 | 100 | 100 |
표 11: 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 SEC 정제 단계 이후 BCMA-TCB CLC 항체의 생산/정제 계수
실시예
7:
BCMA
-양성 다발성 골수종
세포계와의
BCMA
-
TCB
CLC
항체의 결합(유동 세포 분석법)
BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373)는 BCMAhi-발현 H929 세포에서 인간 BCMA와의 결합에 대해 유동 세포 분석법으로 분석되었다. MKN45(BCMA를 발현하지 않는 인간 위샘암종 세포계)는 음성 제어로서 사용되었다. 간단히, 배양된 세포는 수확되고, 산출되고, 그리고 세포 생존력은 ViCell을 사용해 평가되었다. 그 뒤에 생존가능 세포는 BSA-함유 FACS 스테인(Stain) 완충제(BD Biosciences)에서 매 ml당 2 x 106 세포로 조정된다. 더 나아가 이 세포 부유액의 100㎕은 둥근-바닥 96-홈 판에 각 홈에 부분표본이 되고(aliquoted) 그리고 BCMA-TCB CLC 항체 또는 해당하는 TCB 제어의 30㎕와 함께 4℃에서 30분동안 배양된다. 모든 BCMA-TCB CLC 항체(및 TCB 제어)는 적정되었고 0.12 내지 500nM 사이의 최종 농도 범위에서 분석되었다. 그 뒤에 세포는 원심 분리되고(5분, 350 x g), 120㎕/well FACS 스테인 완충제(BD Biosciences)로 세척되고, 재부유되고 그리고 플루오로크롬-결합 PE-결합 AffiniPure® F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fc 단편 특이(Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170)와 함께 4℃에서 추가 30분동안 배양된다. 그 뒤에 세포는 스테인 완충제(BD Biosciences)로 두 차례 세척되고, 각 홈당 100㎕ BD 고정 완충제(#BD Biosciences, 554655)를 사용해 4℃에서 20분동안 고정되고, 120㎕ FACS 완충제에서 재부유되고, 그리고 BD FACS CantoII®를 사용해 분석된다. 도 4에 나타낸 대로, BCMA-TCB CLC 항체의 평균 형광 강도는 항체 농도의 함수로 표시되었다; (A) H929 세포에 pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC; (B) MKN45 세포에 pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC. BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373)는 100nM 이하 농도의 BCMA-음성 및 CD3-음성 MKN45 세포에 결합하지 않았다. 해당될 경우, EC50은 Prism GraphPad®(LaJolla, CA, USA)를 사용해 계산되었고 그리고 H929 세포와의 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체의 결합에 대해 최대 결합의 50%에 도달하는데에 필요한 항체 농도를 나타내는 EC50 값은 표 12에 요약되었다.
| 항- BCMA /항-CD3 TCB 분자 | EC50(nM) | EC50( μg /ml) |
| pSCHLI372-TCB CLC | 344.8 | 65.9 |
| pSCHLI373-TCB CLC | EC50 값 없음 | EC50 값 없음 |
표 12: H929 세포와의 BCMA-TCB CLC 항체의 결합에 대한 EC50 값
실시예
8: CD3-양성
저캇
(
Jurkat
) T
세포계와의
BCMA
-
TCB
CLC
항체의 결합(유동 세포 분석법)
BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373)는 인간 백혈병 T 세포 저캇(ATCC® TIB-152)에 발현된 인간 CD3에 있어 그의 결합 특성에 대해 유동 세포 분석법으로 분석되었다. 저캇 T 세포는 10% 열-비활성화 FCS로 보충된 RPMI에서 배양되었다. 간단히, 배양된 세포는 수확되고, 산출되고, 그리고 세포 생존력은 ViCell®을 사용해 평가되었다. 그 뒤에 생존가능 세포는 0.1% BSA를 함유한 FACS 스테인 완충제(BD Biosciences)에서 매 ml당 2 x 106 세포로 조정되었다. 더 나아가 이 세포 부유액의 100㎕은 둥근-바닥 96-홈 판에 각 홈에 부분표본이 되었다. BCMA-TCB CLC 항체 또는 해당하는 TCB 제어는 0.12 내지 500nM의 최종 농도를 얻기위해 세포-함유 홈에 첨가되었다. BCMA-TCB CLC 항체 및 제어 IgG는 동일한 몰농도에서 사용되었다. 4℃에서 30분동안 배양된 후, 세포는 원심 분리되고(5분, 350 x g), 150㎕/well BSA-함유 FACS 스테인 완충제(BD Biosciences)로 두 차례 세척되고, 각 홈당 100㎕ BD 고정 완충제(#BD Biosciences, 554655)를 사용해 4℃에서 20분동안 고정되고, 120㎕ FACS 완충제에서 재부유되고, 그리고 BD FACS CantoII®를 사용해 분석되었다. T 세포와의 BCMA-TCB CLC 항체의 결합이 평가되었고 그리고 평균 형광 강도는 CD3-발현 저캇 T 세포에 게이트하여(gated on) 측정되었고 히스토그램 또는 점도표에 표시되었다. 도 5는 저캇 T 세포(A) 또는 MKN45 세포(B)에 결합하는 BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373)에 대한 평균 형광 강도를 나타내고 항체 농도의 함수로 표시되었다. CD3-양성 저캇 T 세포와의 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체의 EC50 값 및 최대 결합에는 도달하지 못했다. 아이소타입 제어 항체는 저캇 T 세포에 결합하지 않았으며 그리고 BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI333, pSCHLI372, pSCHLI373)는 100nM 이하 농도의 BCMA-음성 및 CD3-음성 MKN45 세포에 결합하지 않았다.
실시예
9:
BCMA
-
TCB
CLC
항체가 CD30-양성 T 세포 및
BCMA
-양성 다발성 골수종
세포계에
결합했을 때 인간 T 세포의 활성화
BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI372, pSCHLI373)는 인간 BCMA-발현 MM 세포가 있을 때 또는 그가 부재할 때 조기 활성화 마커(early activation marker) CD69의, 또는 후기(late) 활성화 마커 CD25의 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 표면 발현을 평가하는 것으로 그의 T 세포 활성화를 유도하는 능력에 대해 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. 간단히, BCMA-향성 H929 세포는 세포 분리 완충제로 수확되고, 산출되고 그리고 생존력에 대해 확인되었다. 세포는 변형된 RPMI-1640 매체에서 매 ml당 0.3 x 106 세포로 조정되었고, 이 세포 부유액의 100㎕는 둥근-바닥 96-홈 판의 각 홈 안으로 피펫으로 옮겨졌다(pipetted)(표시된 대로). BCMA-TCB CLC 항체의 50㎕(희석된)는 0.012pM 내지 100nM의 최종 농도를 얻기 위해 세포-함유 홈에 첨가되었다. 인간 PBMC 작용기 세포는 건강한 헌혈자의 신선혈로부터 분리되었고 변형된 RPMI-1640 매체에서 매 ml당 6 x 106 세포(생존가능)로 조정되었다. 이 세포 부유액의 50㎕는 10:1의 PBMC 대 골수종 종양세포의 최종 E:T 비율을 얻기 위해 분석 판의 각 홈에 더해졌다. BCMA-TCB CLC 항체가 인간 BCMA를 발현하는 표적 세포가 있을 때 T 세포를 특이적으로 활성화시킬 수 있었는지를 분석하기 위해, 각자 BCMA-TCB CLC 항체 분자 및 PBMC의 3 내지 10nM를 함유했지만 표적 세포는 없는 홈이 포함되었다. 37℃, 5% CO2에서 48h 배양 후, 세포는 원심 분리되고(5분, 350 x g) 그리고 150μl/well PBS 함유 0.1% BSA로 두 차례 세척되었다. CD4(쥐 IgGl,K; 클론 RPA-T4), CD8(쥐 IgGl,K; 클론 HIT8a; BD #555635), CD69(쥐 IgGl; 클론 L78; BD #340560) 및 CD25(쥐 IgGl,K; 클론 M-A251; BD #555434)에 대한 표면 염색(staining)은 공급자의 제안에 따라 4℃에서 30분동안 실행되었다. 세포는 150㎕/well PBS 함유 0.1% BSA로 두 차례 세척되었고 그리고 100㎕/well 고정 완충제(BD #554655)를 사용해 4℃에서 15분동안 고정되었다. 원심 분리 후, 샘플은 200㎕/well 0.1% BSA를 가진 PBS에 재부유되고 FACS CantoII 기계(Software FACS Diva®)를 사용해 분석되었다. 도 6은 48시간의 배양 후 조기 활성화 마커 CD69 및 후기 활성화 마커 CD25의 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 발현 정도를 나타낸다(두 개의 독립된 실험의 대표적인 결과). pSCHLI372-TCB CLC 및 pSCHLI373-TCB CLC 항체는 BCMA-양성 표적 세포가 있을 때 농도-의존 및 특이적인 방식으로 CD69 및 CD25 활성화 마커의 상향조절(up-regulation)을 유도했다. 인간 PBMC가 DP47-TCB 제어 항체로 처리됐을 때는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화가 관측되지 않았고, 이는 T 세포에 있는 CD3에 결합함에도 불구하고 TCB 항체가 BCMA-양성 표적 세포에 결합하지 않으면 T-세포 활성화가 일어나지 않음을 시사한다.
실시예
10: 항-
BCMA
/항-CD3 T 세포
양특이성
항체에 의해 유도된
BCMA
hi
-발현 H929 골수종 세포의 전가된 T-세포 세포독성(비색 LDH 방출 분석)
BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI372, pSCHLI373)는 세포에 있는 BCMA와 항원 결합 모이어티의 결합을 통해 구성체의 교차결합이 이루어졌을 때 BCMA-고발현 MM에 T-세포 매개 세포자멸사를 유도하는 그의 잠재력에서도 대해 분석되었다. 간단히, 인간 BCMA-발현 H929 다발성 골수종 표적 세포는 세포 분리 완충제로 수확되고, 10% 소태아혈청(Invitrogen)으로 보충된 RPMI로 세척되고 그에 재부유되었다. 대략 각 홈당 30,000 세포가 둥근-바닥 96-홈 판에 플레이트 되었고 그리고 얻고자 하는 최종 농도를 위해 각자의 구성체의 희석물이 첨가되었다(3중으로); 0.12pM부터 100nM의 범위의 최종 농도. 적절한 비교를 위해, 모든 TCB 구성체 및 제어는 동일한 몰 농도로 조정되었다. 인간 총(total) T 세포(작동기)는 5:1의 최종 E:T 비율을 얻기 위해 홈에 더해졌다. 인간 PBMC가 작동기 세포로서 사용됐을 때, 10:1의 최종 E:T 비율이 사용되었다. 음성 제어군은 작동기 또는 표적 세포에 의해서만 대표되었다. 인간 pan T 세포의 활성화에 대한 양성 제어로서, 1μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)이 사용되었다. 정상화(normalization)를 위해, H929 MM 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 최종 농도 1% Triton X-100과 표적 세포를 배양하여 세포 사멸을 유도하는 것으로 측정되었다. 최소 용해(= 0%)는 오직 작동기 세포와 함께, 즉 T 세포 양특이성 항체가 전혀 없이, 공동-배양된 표적 세포에 의해 대표되었다. 37℃, 5% CO2에서 20 내지 24h 또는 48h 배양 후, 세포자멸/괴사 MM 표적 세포로부터 상충액으로의 LDH 방출은 LDH 검출 키트(Roche Applied Science)로 제조자의 설명서에 따라 측정되었다. LDH 방출의 퍼센트는 BCMA-TCB CLC 항체의 농도에 대하여 농도-반응 커브로 나타냈다. EC50 값은 Prism 소프트웨어(GraphPad®)를 사용해 측정되었고 그리고 결과적으로 최대 LDH 방출의 50%가 되는 TCB 항체로서 판정되었다. 도 7에 나타낸 대로, LDH 방출에 의해 측정된 BCMA-TCB CLC 항체, pSCHLI372-TCB CLC(A, B) 및 pSCHLI373-TCB CLC(B)는 BCMA-양성 H929 골수종의 농도-의존 사멸을 유도했다. BCMA-양성 표적 세포에 결합하지 않는 DP47-TCB 제어 항체가 실험된 가장 높은 농도 100nM에서도 LDH 방출을 유도하지 않았기 때문에, H929 세포의 사멸은 특이적이었다. 표 13은 BCMA-TCB CLC 항체에 의해 유도된 BCMA-양성 H929 세포의 전가된 T-세포 사멸에 대한 EC50 값을 요약한다.
| 항- BCMA /항-CD3 TCB 분자 | EC50(pM) | EC50( μg /ml) |
| pSCHLI333-TCB CLC | 980 | 0.19 |
| pSCHLI372-TCB CLC (실험 1) | 450 | 0.08 |
| pSCHLI373-TCB CLC | 1590 | 0.31 |
| pSCHLI372-TCB CLC (실험 2) | 900 | 0.17 |
표 13: BCMA-TCB CLC 항체에 의해 유도된 H929 세포의 전가된 T-세포 사멸에 대한 EC50 값
실시예
11:
BCMA
-
TCB
CLC
항체에 의해 유도된
BCMA
med
/lo
-발현 U266 골수종 세포의 전가된 T-세포 세포독성(비색
LDH
방출 분석)
BCMA-TCB CLC 항체(pSCHLI372, pSCHLI373)는 세포에 있는 BCMA와 항원 결합 모이어티의 결합을 통해 구성체의 교차결합이 이루어졌을 때 BCMAmed /lo-발현 MM 세포에 T-세포 매개 세포자멸사를 유도하는 그의 잠재력에 대해 분석되었다. 간단히, 인간 BCMAmed /lo-발현 U266 다발성 골수종 표적 세포는 세포 분리 완충제로 수확되고, 10% 소태아혈청(Invitrogen)으로 보충된 RPMI로 세척되고 그에 재부유되었다. 대략 각 홈당 30,000 세포가 둥근-바닥 96-홈 판에 플레이트 되었고 그리고 얻고자 하는 최종 농도를 위해 각자의 구성체의 희석물이 첨가되었다(3중으로); 0.12pM부터 100nM의 범위의 최종 농도. 적절한 비교를 위해, 모든 TCB 구성체 및 제어는 동일한 몰 농도로 조정되었다. 인간 총 T 세포(작동기)는 5:1의 최종 E:T 비율을 얻기 위해 홈에 더해졌다. 인간 PBMC가 작동기 세포로서 사용됐을 때, 10:1의 최종 E:T 비율이 사용되었다. 음성 제어군은 작동기 또는 표적 세포에 의해서만 대표되었다. 인간 T 세포의 활성화에 대한 양성 제어로서, 1㎍/ml PHA-M(Sigma #L8902)이 사용되었다. 정상화를 위해, MM 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 최종 농도 1% Triton X-100과 표적 세포를 배양하여 세포 사멸을 유도하는 것으로 측정되었다. 최소 용해(= 0%)는 오직 작동기 세포와 함께, 즉 T 세포 양특이성 항체가 전혀 없이, 공동-배양된 표적 세포에 의해 대표되었다. 37℃, 5% CO2에서 20 내지 24h 배양 후, 세포자멸/괴사 MM 표적 세포로부터 상충액으로의 LDH 방출은 LDH 검출 키트(Roche Applied Science)로 제조자의 설명서에 따라 측정되었다. LDH 방출의 퍼센트는 BCMA-TCB CLC 항체의 농도에 대하여 농도-반응 커브로 나타냈다. EC50 값은 Prism 소프트웨어(GraphPad®)를 사용해 측정되었고 그리고 결과적으로 최대 LDH 방출의 50%가 되는 TCB 항체로서 판정되었다. 표 14는 BCMA-TCB CLC 항체에 의해 유도된 BCMA-양성 U266 세포의 전가된 T-세포 사멸에 대한 EC50 값을 요약한다.
| 항- BCMA /항-CD3 TCB 분자 | EC50(pM) | EC50( μg /ml) |
| pSCHLI372-TCB CLC | 5700 | 1.1 |
표 14: BCMA-TCB CLC 항체에 의해 유도된 U266 세포의 전가된 T-세포 사멸에 대한 EC50 값
실시예
12: 자가 골수 침윤성 T-세포가 있을 때 항-
BCMA
/항-CD3 T 세포
양특
이성 항체에 의해 유도된 골수 환자 골수종 형질 세포의 전가된 T-세포 세포독성(복수파라미터 유동 세포 분석법)
다발성 골수종을 위한 TCB 항체 후보의 임상 전 평가하는 동안 가장 의미 있고 그리고 중요한 시험관 내 특징 중 하나는 TCB 분자가 환자의 T 세포를 활성화 시킬 수 있는지 그리고 환자의 골수의 원발성 골수종 형질 세포의 전가된 T-세포 사멸을 유도할 수 있는지의 여부이다. 골수 골수종 형질 세포의 전가된 T-세포 사멸을 유도하는데에 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체가 미치는 영향을 평가하기 위해, 전체의(whole) 골수 흡인물은 다발성 골수종 환자로부터 EDTA-코팅된 튜브에 채취되었고 바로 사용되거나 세포 배양으로 분석되었다. 전체의 골수 샘플에 있는 작용기 세포 대 종양 세포의 비율(E:T 비율)은 유동 세포 분석법에 의해 확인되고 측정되었다. 간단히, 골수 샘플의 200㎕는 96 깊은-홈 판 안으로 옮겨졌다. 항-BCMA/항-CD3 TCB 항체 및 제어 항체 희석물은 멸균 매개에서 조제되었고 그리고 제제의 10μl는 0.01pM에서부터 30nM 범위의 최종 농도를 위해 각자의 홈에 첨가되었다. 골수-항체 부유액은 완만하게 흔드는 것으로 혼합되고, 그 뒤에 파라핀 필름으로 밀봉하여 37℃, 5% CO2에서 24 내지 72h동안 배양된다. 배양 기간 후, CD138/CD38/CD5 또는 CD2 또는 CD3/CD56/CD45/아넥신-V/BCMA를 포함하는 항체-패널에 근거하여 조제된 해당하는 FACS 항체 용액 20㎕가 96-U-바닥 판에 첨가되었다. 플루오로크롬-라벨(fluorochrome-labelled) 항체는 BD Biosciences(San Jose, CA) 및 Caltag Laboratories(San Francisco CA)에서 구입했고 그리고 사내(in-house) APC-결합 항-인간 BCMA 항체가 사용되었다. 그 뒤에 샘플은 어두운 곳에서 15분동안 상온에서 배양되고 회수하여 다색 유동 세포측정기(multicolor flow cytometer)를 사용해 분석되었다. 생존 골수종 세포는 골수종 세포 모집단 CD138+ CD38+ CD45+ CD56+/mid에 게이트한 아넥신-V 음성 발현을 평가하는 것으로 측정되었다. 그 뒤에 골수종 생존 세포의 퍼센트가 계산되었다. 항-BCMA/항-CD3 T 세포 양특이성 항체의 특정 농도에 의해 유도된 환자 골수 골수종 형질 세포의 용해의 퍼센트 또한 주어진 TCB 농도에서 아넥신-V-음성 골수종 형질 세포의 절대계수를 측정하고 그를 TCB가 없는 아넥신-V-음성 골수종 형질 세포의 절대계수에서 빼고, 그를 TCB가 없는 아넥신-V-음성 골수종 형질 세포의 절대계수로 나누는 것으로 계산되었다. 항-BCMA/항-CD3 T 세포 양특이성 항체의 특이성을 확인하기 위해, T 세포, B 세포 및 NK 세포와 같은 다른 골수 세포 유형에서의 아넥신-V 발현 또한 측정되었다. 도 9에 보여진 대로, 생존 가능 (아넥신-V 음성) 골수종 형질 세포의 농도-의존 감소에 의해 반영된 대로 pSCHLI372-TCB CLC는 환자 골수 골수종 형질 세포의 사멸을 유도한다. 골수종 세포의 전가된 용해는 낮은 nM 농도 범위에서 24h 및 72h 모두에서 관측되었다. CD3과만 결합하고 BCMA와는 결합하지 않으며 실험된 TCB 항체의 가장 높은 농도에서도 골수종 형질 세포의 세포 사멸을 유도하지 않은 제어-TCB에서는 악성 형질 세포의 용해가 관측되지 않았으므로, 거기에는 환자 골수종 형질 세포의 농도-의존 그리고 특이 용해가 있었다.
SEQUENCE LISTING
<110> ENGMAB AG
<120> BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST CD3EPSILON AND BCMA
<130> TCBCLC-PCT
<150> EP14194151.8
<151> 2014-11-20
<160> 39
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CH2527-VL7 VH
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CH2527-VL7 VL
<400> 2
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CH2527-VL7 CDR1H
<400> 3
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CH2527-VL7 CDR2H
<400> 4
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CH2527-VL7 CDR3H
<400> 5
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CH2527-VL7 CDRL1
<400> 6
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CH2527-VL7 CDR2L
<400> 7
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CH2527-VL7 CDR3L
<400> 8
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
aagcttggat ccatgttgca gatggctggg cagtgctcc 39
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gaattcgcgg ccgctcatcc tttcactgaa ttggtcacac ttgcattac 49
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
acgttagatc tccactcagt cctgcatctt gttccagtta ac 42
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
aacgttgcgg ccgctagttt cacaaacccc agg 33
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
gaattcaagc ttgccaccat gttgcagatg gctgggcagt gctcc 45
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
gaattctcta gattacctag cagaaattga tttctctatc tccgtagc 48
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> pSCHLI333 VH
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Val Gly Gln Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Tyr Pro Pro Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> pSCHLI372 VH
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly His Ile Arg Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> pSCHLI373 VH
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Arg Gln Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gly Leu Phe Gly Tyr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Gly Tyr Met Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met Ile
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Ser Trp Met Asn
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Trp Ile Tyr Pro Val Gly Gln Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
His Ile Arg Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 23
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Thr Ile Arg Gln Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Val Ser Tyr Pro Pro Ser His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Gly Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Gly Gly Leu Phe Gly Tyr Trp Asp Tyr
1 5
<210> 27
<211> 688
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSCHLI333 VH_CH1 x CD3 VH_CH1 Fc knob LALA PG
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Val Gly Gln Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Tyr Pro Pro Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
260 265 270
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
275 280 285
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
325 330 335
Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
340 345 350
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
355 360 365
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
370 375 380
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
385 390 395 400
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
405 410 415
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
420 425 430
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
435 440 445
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
450 455 460
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
465 470 475 480
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
485 490 495
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
500 505 510
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
515 520 525
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
530 535 540
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
545 550 555 560
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
565 570 575
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
580 585 590
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
595 600 605
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
610 615 620
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
625 630 635 640
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
645 650 655
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
660 665 670
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680 685
<210> 28
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSCHLI333 HC hole LALA PG
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Met Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Val Gly Gln Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Tyr Pro Pro Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 29
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 LC (CLC)
<400> 29
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
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165 170 175
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Lys
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Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
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370 375 380
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675 680 685
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<400> 38
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<223> linker
<400> 39
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1 5 10
Claims (14)
- CDR로서 SEQ ID NO:6의 CDR1L, SEQ ID NO:7의 CDR2L, 및 SEQ ID NO:8의 CDR3L을 일반 항체 경쇄(common antibody light chain)로서 포함하고, 그리고 CDR로서 SEQ ID NO:3의 CDR1H, SEQ ID NO:4의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:5의 CDR3H를 포함하는 CD3 결합 부분의 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 BCMA(이하 "BCMA") 및 인간 CD3ε(이하 "CD3")의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성(bispecific) 항체.
- 제1항에 있어서, 일반 가변 경쇄 도메인 VL로 SEQ ID NO:2의 VL을 포함하는 것을 특징으로 하는 약특이성 항체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO:29의 일반 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 양특이성 항체.
- BCMA 결합 부분의 CDR로서
a) SEQ ID NO:18의 CDR1H, SEQ ID NO:21의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:24의 CDR3H,
b) SEQ ID NO:19의 CDR1H, SEQ ID NO:22의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:25의 CDR3H,
c) SEQ ID NO:20의 CDR1H, SEQ ID NO:23의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:26의 CDR3H, 및
d) SEQ ID NO:35의 CDR1H, SEQ ID NO:36의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:37의 CDR3H,
로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 BCMA 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 양특이성 항체.
- 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, BCMA 결합 부분의 CDR로서
a) SEQ ID NO:18의 CDR1H, SEQ ID NO:21의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:24의 CDR3H,
b) SEQ ID NO:19의 CDR1H, SEQ ID NO:22의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:25의 CDR3H,
c) SEQ ID NO:20의 CDR1H, SEQ ID NO:23의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:26의 CDR3H, 및
d) SEQ ID NO:35의 CDR1H, SEQ ID NO:36의 CDR2H, 및 SEQ ID NO:37의 CDR3H,
로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 세트를 포함하는 것을 특징으로 양특이성 항체.
- 제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서, 두 개의 BCMA-Fab, 하나의 CD3 Fab 및 Fc 부분으로 구성되고, 제1 BCMA-Fab 및 상기 CD3-Fab이 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위(hinge region)에 연결되고, 그리고 제2 BCMA-Fab은 그의 C-말단으로 상기 제1 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되고, 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab이 상기 일반 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 양특이성 항체.
- 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 있어서, 두 개의 BCMA-Fab 및 Fc 부분으로 구성되고, 상기 BCMA-Fab가 그들의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 상기 CD3-Fab은 그의 C-말단으로 하나의 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되고, 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab이 상기 일반 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 양특이성 항체.
- 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서, 하나의 CD3-Fab 및 하나의 BCMA Fab으로 구성되고, 이는 그의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분 및 BCMA-Fab의 경첩부위에 연결되고, 이는 그의 C-말단으로 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결되고, 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab이 상기 일반 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 양특이성 항체.
- 제1항 내지 제8항의 어느 한 항에 있어서, 하나의 BCMA-Fab 및 하나의 CD3 Fab으로 구성되고, 상기 BCMA Fab이 그의 C-말단을 통해 상기 Fc 부분의 경첩부위에 연결되고, 그리고 상기 CD3-Fab이 그의 C-말단으로 상기 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되고, 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab이 상기 일반 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 양특이성 항체.
- 제1항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서, 두 개의 BCMA-Fab으로 구성되고, 상기 제1 BCMA-Fab이 그의 C-말단을 통해 상기 제2 BCMA-Fab의 N-말단에 연결되고, 그리고 상기 제2 BCMA-Fab이 그의 C-말단을 통해 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결되고, 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab 모두 상기 일반 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 양특이성 항체.
- 제1항 내지 제10항의 어느 한 항에 있어서, 하나의 BCMA-Fab 및 하나의 CD3 Fab으로 구성되고, 상기 BCMA Fab이 그의 C-말단을 통해 상기 CD3-Fab의 N-말단에 연결되고, 상기 CD3-Fab 및 BCMA-Fab이 상기 일반 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 양특이성 항체.
- 제1항 내지 제11항의 어느 한 항에 따른 양특이성 항체의 조제 방법으로서,
a) 제1항 내지 제11항의 어느 한 항에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄를 부호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 변형시키고;
b) 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하고; 그리고
c) 상기 배양으로부터 상기 항체 분자를 회수하는;
단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제11항의 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 다발성 골수종과 같은 형질 세포 질환을 치료하는 약제로서 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제11항의 어느 한 항에 따른 항체 또는 제13항의 약학적 조성물.
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