UA74798C2 - Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами - Google Patents

Abstract

Винахід належить до медицини і стосується способу лікування карцином у ссавця за допомогою поліпептиду, який протидіє взаємодії між APRIL та його рецепторами. Вказаний спосіб включає введення вказаному ссавцеві терапевтично ефективної кількості композиції, що містить поліпептид, який має амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 % з послідовністю, яка представлена амінокислотами 1-184 в SEQ ID NО:8, або його фрагменти.

Description

Опис винаходу

Даний винахід в основному відноситься до способів лікування ракового захворювання. Способи включають 2 введення деяких антагоністів фактора некрозу пухлин (ТМЕ).

Члени сімейства фактора некрозу пухлин (ТМЕ), що відносяться до цитокінів, беруть участь у кількості ключових біологічних функцій, що постійно збільшується. Кожний член сімейства ТМЕ діє при зв'язуванні з одним або більше членами відповідного сімейства рецепторних білків. У свою чергу дані рецептори передають сигнали внутрішньоклітинно для індукції широкого ряду фізіологічних або реакцій у відповідь, що відносяться до 70 розвитку. Багато рецепторних сигналів впливають на долю клітин і часто "запускають" кінцеву диференціацію.

Приклади клітинної диференціації включають проліферацію, дозрівання, міграцію і загибель.

Члени сімейства ТМЕ представляють пов'язані з мембраною білки типу ІІ, що мають короткий внутрішньоклітинний М-кінцевий домен, трансмембранний домен і С-кінцеві зв'язуючі рецептор домени, які лежать на зовнішній клітинній поверхні. У деяких випадках позаклітинна дільниця білка відщеплюється, 12 створюючи секретовану форму цитокіну. Незважаючи на те, що пов'язані з мембраною білки діють локально, ймовірно, через опосередковану клітинами контактну взаємодію з їх рецепторами, секретовані форми володіють потенційною можливістю циркулювати або дифундувати, отже, можуть діяти на віддаленні. Як пов'язані з мембраною, так і секретовані форми знаходяться у вигляді тримерів, і вважають, що вони передають свій сигнал рецепторам, сприяючи утворенню рецепторних кластерів. 20 Сімейство рецепторних білків ТМЕ характеризується наявністю одного і більше багатих цистеїном доменів.

Кожний багатий цистеїном домен утворює пов'язану Через дисульфідний зв'язок ядерний домен, який бере участь у створенні трьохмірної структури, яка утворює зв'язуючу ліганд "кишеню". Рецептори є пов'язаними з мембраною білками типу І, в яких позаклітинний домен кодується М-кінцем, потім трансмембранним доменом і

С-кінцевим внутрішньоклітинним доменом. Внутрішньоклітинний домен відповідальний за передачу сигналу с 25 рецептором. Деякі рецептори включають внутрішньоклітинний "домен загибелі", який може передавати клітинам (3 сигнал про апоптоз, і вони можуть являти собою ефективні індуктори загибелі клітин. Інша група рецепторів може в слабкій мірі індукувати загибель; виявляється, що вони втрачають "домен загибелі". Третя група рецепторів не індукує загибель клітин. Всі групи рецепторів можуть передавати сигнали про проліферацію або диференціацію клітин замість загибелі, в залежності від типу клітин або наявності інших сигналів. со 30 Добре вивченим прикладом плюрипотентної природи активності сімейства ТМЕ є номінантний член, ТМЕ. ТМЕ дз може існувати у вигляді пов'язаного з мембраною цитокіну або може бути відщеплений і секретований. Обидві форми зв'язуються з двома ТМЕ-рецепторами, ТМЕ-К55 і ТМЕ-К75. Спочатку описаний за його здатністю в безпосередньо вбивати пухлинні клітини, ТМЕ також регулює велику множину імунних процесів, включаючи -«ф індукцію гострих запальних реакцій, а також підтримку гомеостазу в лімфоїдних тканинах. Внаслідок того, що 35 даний цитокін може грати подвійну роль в різних патологічних процесах, були розроблені агоністи і антагоністи в як модифікатори захворювання. Наприклад, ТМЕ і ЇТ у (який також передає сигнали через ТМЕ-рецептори) використали для лікування ракових захворювань, особливо з периферичною локалізацією, таких, як лімбічна саркома. При даному процесі безпосередня передача сигналів цитокінами через рецептор індукує загибель « пухлинних клітин |Аддагмаї! апа Маїйага|ап, 1996. Єиг СуюКіпе Меїм/ 7:93-124|. З7З

У імунологічних процесах агенти, які блокують передачу сигналів через ТМЕ-рецептори (наприклад, с анти-ТМЕ-тАБ, розчинні злиті ТМЕ-К-білки), використали для лікування захворювань, подібних ревматоїдному "з артриту і запальному захворюванню кишечнику. При цих патологіях ТМЕ діє, індукуючи клітинну проліферацію і ефекторну функцію, загострюючи тим самим аутоїмунне захворювання, і в цьому процесі блокування зв'язування

ТМЕ з його рецептором(ами) має терапевтичну користь (ІВешег, 1999. У). Кпештаїйо! 26 Зи,ррі. 57:16-211. -І 15 Виявилося, що відкрита нещодавно система ліганд/рецептор піддається аналогічній регуляції.

Лімфотоксин-бета (І Тр), член сімейства ТМЕ, який утворює гетеродимери з І То, зв'язується з ІТ Д-К. Деякі т» пухлинні клітини аденокарциноми, які експресують ІТ Д-К, можуть загинути або зазнати диференціації при -1 обробці агоністичними анти-ЇТр-к-тАБ |Вгом/піпу еї аї., 1996. 9. Ехр. Мей. 183:867-878). Було показано в імунологічний процесах, що анти-ЇТр-тАБ або розчинний злитий ГТр-К-Ід-білок може блокувати розвиток со запальних захворювань кишечнику, можливо, діючи на взаємодію дендритних клітин і Т-клітин |Маскау еї аї., с 1998. Савігоепіегоїоду 115:1464-1475).

Система ТКАЇ!. також має потенційну можливість застосування як протипухлинної терапії. ТКАЇЇ. взаємодіє з рядом пов'язаних з мембраною і розчинних рецепторів. Два з цих рецепторів, ТКА -К1 і ТКА! -К2 (також 5Б названі ОКА і ОК5) передають загибель, індукуючи сигнали пухлинним клітинам, але не нормальним клітинам, які експресують додаткові ТКАЇЇ -рецептори, які не індукують загибель. Вважають, що ці додаткові рецептори (Ф) функціонують як пастки. Застосування розчинного ТКАЇЇ. для знищення пухлинних клітин засноване на виборчій ка експресії рецепторів-пасток в нормальній, але не пухлинній тканині |(Сига, 1997. Зсіепсе 277:7681.

Пухлинні клітини самі по собі часто експресують різні рецептори-пастки, які блокують імунне розпізнавання 60 або ефекторні функції. Дійсно, деякі пухлини гіперекспресують рецептори-пастки ТКАЇЇ, ймовірно, для того, щоб уникнути опосередкованої ТКАЇЇ загибелі |Зйпеїки сеї аїЇ., 1999. Опсодепе 18:4153-4159). Це обмежує застосовність ТКАЇЇ. як протипухлинного агента при деяких процесах. Подібні спостереження були зроблені відносно рецептора-пастки для ЕАЗ-Ї, який гіперекспресується в пухлинних клітинах легень і ободової кишки

ІРІЧі еї аїЇ., 1998. Маїшге 396:699-703), і для антагоніста ІІЇ-1-рецептора ІМапіомапі еї аЇ.,, 1998. Апп. МУ 65 Асад. 5еї. 840:338-351). Рецептори-пастки також використовуються вірусними геномами для захисту заражених клітин хазяїна від захисних механізмів хазяїна.

АРКІЇ. (ліганд, що індукує проліферацію) є новим членом ТМЕ-сімейства білків. На основі досліджень з експресії і функціонування АРКІЇ. можна передбачити, що цей білок використовується пухлинними клітинами для індукції швидкої проліферації. Лінії пухлинних клітин, оброблені розчинним АРКІЇ-білком, або трансфіковані

КДНК АРМІЇ, швидко ростуть в умовах іп мйго. Трансфіковані АРКІЇ клітини, імплантовані мишам з імунодефіцитом швидко ростуть у вигляді пухлин. Нарешті, людські пухлинні клітини, але не нормальна тканина, експресують високі рівні МРНК АРКІГ. На основі цих спостережень можна передбачити, що АРКІЇ. зв'язується з рецептором, який також експресується пухлинними клітинами, приводами до аутокринної або паракринної активації пухлинних клітин. Крім того, можливо, що АРКІ!. діє при інших хворобливих станах так, що активування 70 або блокування шляху з участю АРКІГЇ. буде мати додаткову застосовність. Наприклад, знижена або підвищена експресія АРКІЇ може грати роль в аномаліях розвитку, оскільки розвиток також часто характеризується ретельно регульованим балансом між проліферацією клітин і загибеллю клітин. Аналогічно АРКІЇ. може діяти при захворюваннях, пов'язаних з проліферацією клітин таких, які виникають при деяких аутоімунних захворюваннях (наприклад, вовчаку) або при запальних захворюваннях, де відбувається швидке збільшення 7/5 Клітинних популяцій (наприклад, бактеріальний сепсис).

Засновуючись на популярності використання агоністів і антагоністів ТМЕ і членів сімейства ТМЕ-рецепторів як модуляторів захворювання, шлях з участю АРКІЇ. сам по собі представляє важливу мішень для розробки лікарських препаратів. Це особливо вірне для лікування ракових захворювань, оскільки, як виявилося, пухлинні клітини продукують і використовують АРКІГЇ. для підтримки їх власного зростання і, отже, мало ймовірно, що вони 2о продукують рецептори-пастки або інші антагоністи шляху з участю АРКІЇ. Таким чином, шлях з участю АРКІЇ. унікально відрізняється, наприклад, від шляхів з участю ТКАЇЇ або РА5Б-Ї, яким можна перешкоджати за допомогою пухлинних рецепторів-пасток.

Види лікування ракових захворювань, що існують в цей час, є неадекватними для багатьох типів пухлин за рахунок слабкої ефективності, незначного впливу на виживаність, токсичності, яка викликає важкі побічні сч ов ефекти, або їх комбінацій. Отже, є потреба в ідентифікації і розробці додаткових способів лікування розвитку ракових захворювань, які можуть забезпечити ефективність, не викликаючи важких побічних ефектів. Отже, і) антагоністи шляху з участю АРКІГЇ, включаючи анти-АРКІЇ -птАбБз, анти-АРКІГ. рецепторні-тАбрз», розчинні АРКІЇ. рецепторні-Ід злиті білки, природні антагоністи, невеликі молекули-антагоністи і хімічні, фармацевтичні або інші антагоністи будуть корисними. со зо Для цієї мети заявники ідентифікували опосередкований В-клітинами білок (ВСМ або ВСМА) як рецептор

АРБІЇ.. іа

Заявники встановили, що ВСМА є рецептором для фактора некрозу пухлин, АРКІЇ. АРКІЇ. представляє ту ж М молекулу, описану раніше в М/О9912965, яка включена тут для відома. АРКІЇ -рецептор визначений надалі як "АРКІС-К". Даний винахід направлений на способи лікування і фармацевтичні препарати для застосування з « з5 Метою лікування видів ссавців, що вже мають ракове захворювання або при ризику його розвитку. Дані суб'єкти ча включають суб'єктів, вже уражених раковим захворюванням, або які вже піддавались протипухлинній терапії.

Способи і композиції за даним винаходом відбуваються частково внаслідок відкриття того, що деякі агенти, які являють собою агенти для лікування ракових захворювань, визначені тут як антагоністи АРКІ-К, включаючи, наприклад, анти-АРКІЇ -К-антитіла, можна застосовувати для лікування суб'єктів при ризику розвитку ракового « 0 захворювання, як тут визначено, або при необхідності лікування ракового захворювання. в с Терапевтичні агенти для лікування ракового захворювання можна вводити будь-яким шляхом введення, який

Й сумісний з вибраним агентом, і можуть бути представлені з будь-яким фармацевтично прийнятним носієм, який а відповідає шляху введення. Переважними шляхами введення є парентеральні і, зокрема, внутрішньовенний, внутрішньоочеревинний і внутрішньосуглобний. Лікування також переважно провести протягом тривалого періоду часу амбулаторно. Вважається, що добові дози агентів для лікування ракового захворювання будуть -І знаходитися в межах приблизно 0,01-100Омкг/кг маси тіла, і більш переважно приблизно 10-30Омкг/кг маси тіла, хоча точні дози будуть варіювати в залежності від конкретного агента, що використовується для лікування о ракового захворювання і конкретного стану суб'єкта і анамнезу. -І Лікування за даним винаходом придатне для знищення в основному клональної популяції (колонії) 5о трансформованих клітин в організмі ссавця або придушення або ослаблення зростання колонії, яку звичайно се) відносять як до пухлини. Як такі вони придатні для продовження життя і для підтримки якості життя у суб'єктів с при ризику виникнення або вже уражених раковим захворюванням.

На Фігурі 1 показана послідовність (ЗЕО ІЮ МО:1) нуклеїнової кислоти КДНК мишачого АРКІЇ. і на основі її амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МОЗ) у вигляді карти у векторі РОССМ213.10. Представлене підкресленим є тус-епітопом і амінокислотами з Равзі. Початок послідовності, що кодує позаклітинний домен АРКІГЇ., вказаний стрілками.

Ф) На Фігурі 2 показана послідовність (ЗЕО І МО:4) нуклеїнової кислоти і на основі її амінокислотна ка послідовність (ЗЕО ІЮ МО:б) конструкції РІГ АС-людського АРКІГЇ. для експресії в клітинах ссавців. Карта вказує сигнальну послідовність (1-15); РІ Асб-епітоп (АА 16-23) і початок послідовності, що кодує позаклітинний домен бо людського АРКІЇГ. (32-кінець).

На Фігурі ЗА показана послідовність (ЗЕО ІЮ МО:7) нуклеїнової кислоти і амінокислотна послідовність (ЗЕО

ІЮО МО:8) повної довжини людського ВСМА. На Фігурі ЗВ показана послідовність (ЗЕО ІЮ МО:11) нуклеїнової кислоти руЗТ538, плазміди, що кодує людську злиту конструкцію АРКІЇ -К-ПІДО с, і на основі її амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:12). 65 На Фігурі 4 показано зв'язування тус-мишачого АРКІЇ з мишачою В-клітинною лімфомою лінії А20О. У трьох окремих дослідах була показана наявність специфічного зв'язування АРКІЇ. з клітинами А20 у порівнянні з А)

незабарвленими клітинами і клітинами, забарвленими тільки К1532, В) клітинами, забарвленими КАМКІ-Ї. і

К1532 і С) клітинами, забарвленими АРКІЇ, і невідповідною кролячою сироваткою.

На Фігурі 5 показано зв'язування тус-мишачого АРКІЇ з людською В-клітинною лімфомою лінії КАХ. У двох окремих дослідах була показана наявність специфічного зв'язування АРКІЇ. з клітинами КАШІ у порівнянні з А) незабарвленими клітинами і клітинами, забарвленими тільки К1532, і клітинами, забарвленими КАМК-1 і К1532 і

В) клітинами, забарвленими АРКІЇ, і невідповідною кролячою сироваткою.

На Фігурі 6 показано, що зв'язування АРКІЇ з клітинами А2О (А) і клітинами КАШІ (В) є конкурентним з використанням розчинного білка ВАРЕЕ або розчинного білка ВСМА-1І9. 70 На Фігурі 7 показано зв'язування РІ Аб-людського АРКІЇ з клітинами різних ліній: А) клітинами А20, В) клітинами НТ29, С) клітинами МІНЗТЗ. Специфічне зв'язування показане з використанням детекції біотинільованих анти-! АбС-тАБ М2 у порівнянні зі зв'язуванням, що спостерігається з невідповідними ізотипними контрольними тАЬь і без додавання РІ АС-АРКІЇ..

На Фігурі 8 показана імунопреципітація тус-іпАРКІЇ. з використанням злитого ВСМА-ЕРс-білка. Верхня ліва /5 панель показує специфічну НВМСА-Рс/тус-тАРКІЇ. і позитивну контрольну імунопреципітації у порівнянні з верхніми правими негативними контролями. У нижніх панелях показано, що кількості навантаженого білка були еквівалентними.

На Фігурі 9 показані досліди з ЕГІЗА, що демонструють, що РГАС-п АРКІЇ зв'язується зі злитим

НВСМА-Рс-білком. Різні рецепторні злиті Ес-білки наносили на планшети для ЕЇ І5А і зв'язували з РІ Аб-міченими Ллігандами. А) Детектування пов'язаних лігандів виявило, що тільки АРКІЇ. Її НВАРЕ специфічно зв'язуються з

НВСМА-Ес, але не НСО40-Ес. В) Титрування дози, що показує, що сигнал ЕЇ ІЗА, виявлений після зв'язування

НАРКІЇ або пВАРЕ на покритих АВСМА-Рс планшетах, мав лінійну залежність по відношенню до кількості доданого білка.

На Фігурі 10 показана імунопреципітація РІ АС-ПАРКІЇ і РГАС-пВАРЕ злитим АВСМА-Рс-білком. Верхні 4 сч об панелі показують еквівалентність білкових навантажень при кожній реакції імунопреципітації, в той час, як нижні панелі показують, що ПАРКІГЇ. і нВАРЕ імунопреципітувались НВСМА-Ес, але не НТКАЇМ-Ес. і)

На Фігурі 11 показаний аналіз ВіаСоге зв'язування тус-тАРКІЇ, РГАС-НВАРЕ і РГАС-тпВАРЕЕ з НВСМА,

ПІ Тбета-рецептором або АИТМЕ-К80 або контролем, що показує специфічне зв'язування тільки з НВСМА.

На Фігурі 12 показано зв'язування АРКІЇ з трансфікованими ВСМА клітинами. Клітини 293ЕВМА со зо трансфікували плазмідою, яка експресує повну довжину ПВСМА. Клітини збирали через 48год. з використанням 5ММ ЕДТА і забарвлювали тус-ПАРКІЇ.. Панель А показує, що міра фарбування залежить від дози. Панель В Ме показує, що фарбування знижувалося до фонового рівня з використанням розчинного білка ВСМА-1Ід. М

На Фігурі 13 показане зростання клітин МІНЗТЗ, імплантованих підшкірно мишам з імунодефіцитом (Ми/Ми), оброблених контрольними реагентами або білююм ВСМА-Ід. На даній моделі клітини МІНЗТЗ утворюють « фібросаркому. ча

На Фігурі 14 показане зростання людської карциноми ободової кишки ЗУУ480, імплантованої підшкірно мишам з імунодефіцитом (Ми/Ми), оброблених контрольними реагентами або злитим білком АВСМА-19.

На Фігурі 15А показане зростання людської карциноми ободової кишки НТ29, імплантованої підшкірно мишам з імунодефіцитом, оброблених контрольними реагентами або злитим білком АВСМА-1Ід. На Фігурі 158 показане «

Зростання людської карциноми легень А549, імплантованої підшкірно мишам з імунодефіцитом (Ми/ми), з с оброблених контрольними реагентами або злитим білком АВСМА-19.

Визначення ;» Для того, щоб більш чітко і стисло з'ясувати суть заявленого винаходу, надаються наступні визначення спеціальних термінів, використаних в подальшому описі і прикладеній формулі винаходу.

Далі винахід буде описаний при зверненні до подальшого докладного опису, в який включені наступні -І визначення:

Терміни "АРКІЇ-рецептор" або "АРКІЇ-К", що використовуються тут, включають природну послідовність пи АРКЕІЇ-К і варіанти АРКІ-К. АРКІЇ-К можна виділити з різних джерел таких, як типи мишачих або людських -І тканин або з іншого джерела, або одержати рекомбінантними або синтетичними методами. Крім того, термін

АРКІЇ-К додатково відноситься до поліпептиду, який здатний зв'язуватися з членом сімейства фактора некрозу се) пухлини, АРКІГ,, або його гомологами, або фрагментами. Прикладом АРКІ--К є ВСМА. с Термін "ВСМА" або "ВСМ" відноситься до нового білка для дозрівання В-клітин, як описано у |Огаз еї аї. (1995), Іпіегпайопа! Іттипоіоду, 7:1093-1106, "ВСМАр" ап іпіедгаї тетргапе ргоївіп іп (Ше доїді аррагацшв ої питап таїйцге В ІутрПосуїез; У. І аабі еї а). (1995), ЕМВО .., 11, 3897-3904, "А пем депе ВСМ оп Спготозоте дв 16 ів Тизей Юю (Пе іпіепецкіп 2 депе Бу а 1 (4; 16) (д26: різ) ігапзіосаноп іп а таїдпапі Т сеї Путрпота!"). "Природна послідовність АРКІЇ-К" включає поліпептид, що має таку ж амінокислотну послідовність, як (Ф) АРРІЇ-К, виділений з природи. Подібну природну послідовність АРКІЇ-К можна виділити з природних джерел ка або можна одержати рекомбінантними або синтетичними методами. Природна послідовність АРКІЇ-К може представляти усічені або секретовані форми АРКІЇ-К (тобто розчинні форми, що включають, наприклад, бо послідовність позаклітинного домену), що є в природних умовах, варіантні форми (наприклад, альтернативно сплайсовані форми), що є в природних умовах, і природні алельні варіанти АРКІЇ-К. У одному втіленні винаходу природна послідовність АРКІЇ-К є зрілою або природною послідовністю поліпептиду АРКІЇ-К повної довжини, що включає амінокислоти 1-184 за ЗЕО ІО МО:8, або його фрагмента. "Позаклітинний домен АРКІ-К" або "АРКІЇ-К ЕСО" відноситься до форми АРКІЇ-К, яка в основному вільна 65 від трансмембранного або цитоплазматичного доменів АРКІЇ-К. Звичайно позаклітинний домен АРКІЇ-К буде включати менше 195 таких трансмембранного і цитоплазматичного доменів і переважно буде мати менше 0,590 таких доменів. Необов'язково АРКІЇ-К ЕСО буде включати амінокислотні залишки 1-51 або 1-52, або 1-53 ЗЕО

ІО МО:8. У переважному втіленні АРКІ--ЕСО включає амінокислотні залишки 4-51 за 5ЕО ІЮ МО:8 або більш переважно амінокислотні залишки 8-41 за 5ЕО ІЮО МО:8. Фахівцям в даній області, очевидно, зрозуміло, що трансмембранний домен, встановлений для поліпептиду АРКІЇ-К за даним винаходом, ідентифікований відповідно до критеріїв, що звичайно використовуються в даній області для ідентифікації даного типу гідрофобних доменів. Точні межі трансмембранного домену можуть варіювати, але найбільш ймовірно не більш, ніж приблизно на 5 амінокислот з кожного кінця домену, детально вказаного тут. "Варіант АРКІЇ-К" означає активний АРКІЇ-К, як визначено нижче, що має ідентичність амінокислотної 76 послідовності щонайменше на 8095 з АРКІЇ-К, що має виведену амінокислотну послідовність, показану в ЗЕО ІЮ

МО:5 для повної довжини природної послідовності АРКІЇ-К, або з послідовністю АРКІЇ-К ЕСО). Подібні варіанти

АРКІЇ-К включають, наприклад, поліпептиди АРКІЇ-К, в яких один або більш амінокислотних залишків вставлені або видалені в кінці або на С-кінці послідовності за ЗЕО ОО МО:8. Звичайно варіант АРКІЇ/-К буде мати ідентичність амінокислотної послідовності щонайменше приблизно на 8095 або 8595, більш переважно /5 Їдентичність амінокислотної послідовності щонайменше приблизно на 9095 і ще більш переважно ідентичність амінокислотної послідовності щонайменше на 9595 з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:8. "Процент (95) ідентичності амінокислотної послідовності по відношенню до послідовностей АРКІЇ-К, ідентифікованих тут, визначається як процент амінокислотних залишків в послідовності-кандидатові, які співпадають з амінокислотними залишками в послідовності АРКІЇ-К, після розташування послідовностей і го введення "проломів", якщо необхідно, для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовності і без урахування будь-яких консервативних заміщень як частини ідентичності послідовності. Розташування з метою визначення процента ідентичності амінокислотної послідовності можна досягнути різними шляхами, які відомі фахівцям в даній області, наприклад, з використанням широко доступного комп'ютерного програмного забезпечення такого, як програмне забезпечення ВІ А5Т, АГІОМ або Меодаїдп (ОМАЗТАК). Фахівці в даній сч

Області можуть визначити відповідні параметри для визначення розташування, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для максимального розташування на повній довжині послідовностей, які порівнюються. (8)

Термін "мічений епітоп", коли тут використовується, відноситься до химерного поліпептиду, що включає

АРІ -К, або послідовність його домену, злиті з "міченим поліпептидом". Мічений поліпептид має достатню кількість залишків для забезпечення епітопу, проти якого можна одержати антитіла, або який може бути со зо ідентифікований якимсь іншим агентом, який, до того ж, є досить коротким, щоб не заважати активності АРКІЇ -К.

Мічений поліпептид переважно також є досить унікальним в тому плані, що антитіла в основному не реагують б» перехресно з іншими епітопами. Відповідні мічені епітопи звичайно включають щонайменше 6 амінокислотних М залишків і звичайно приблизно від 8 до приблизно 50 амінокислотних залишків (переважно приблизно від 10 до приблизно 20 залишків). « "Виділений", коли використовується для опису різних поліпептидів, розкритих тут, означає поліпептид, який ї- був ідентифікований і виділений і/або витягнутий з компонента його природного оточення. Забруднюючими компонентами його природного оточення є речовини, які звичайно будуть заважати діагностичним або терапевтичним застосуванням поліпептиду, і можуть включати ферменти, гормони і інші білкові і не білкові розчинені речовини. У переважних втіленнях поліпептид повинен бути очищеним (1) до міри, достатньої для « одержання щонайменше 15 залишків М-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням з с секвенатора з чашкою, що обертається, або (2) до гомогенності при проведенні ЗО5-РАСЕ в невідновлюючих і невідновлюючих умовах з використанням Кумасі синього або, переважно, срібного забарвлення. Виділений з поліпептид включає поліпептид іп зіш всередині рекомбінантних клітин, оскільки щонайменше один компонент з природного оточення АРКУ -К не буде бути присутнім. Однак, звичайно виділений поліпептид буде одержаний щонайменше з однією стадією очищення. -І Термін "антитіло" використовується в самому широкому значенні і, зокрема, включає окремі моноклональні антитіла проти АРКІЇ-К (включаючи агоністичні, антагоністичні і нейтралізуючі антитіла) і композиції на ве основі анти-АРКІЇ -К-антитіл з поліепітопною специфічністю. Термін "моноклональне антитіло", в тому значенні, -І як він тут використовується, відноситься до антитіла, одержаного з популяції в основному гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком можливих мутацій, що мають місце і, в природних умовах, які можуть бути присутніми в мінорних кількостях. с "Очищений препарат" або "в основному очищений препарат" поліпептиду, в тому значенні, як цей термін тут використовується, означає поліпептид, який відділений від інших білків, ліпідів і нуклеїнових кислот, з якими він знаходиться в природних умовах. Переважно поліпептид також відділений від інших речовин, наприклад, антитіл, матриксів і т.д., які використовуються для його очищення.

Терміни "проведення лікування", "лікування" і "терапія", в тому значенні, як вони тут використовуються,

Ф) відносяться до лікувальної терапії, профілактичної терапії і превентивної терапії. ка Терміни "пептиди", "білки" і "поліпептиди" використовуються тут рівнозначно. "Біологічно активний", в тому значенні, як цей термін тут використовується, означає той, що володіє во активністю іп мімо або іп мійго, яка може здійснюватися прямо або опосередковано. Біологічно активні фрагменти можуть мати, наприклад, 7095 амінокислотну гомологію з активним сайтом рецептора, більш переважно щонайменше 8095 і найбільш переважно 90905 гомологію. Ідентичність або гомологія по відношенню до рецептора визначається тут у вигляді процента амінокислотних залишків в послідовності-кандидатові, які ідентичні залишкам АРКІЇ-ЕК в ЗЕО ІЮ МО:8. 65 Термін "ссавець", в тому значенні, як він тут використовується, відноситься до будь-якої тварини, віднесеної до ссавця, включаючи людей, корів, коней, собак, мишей і кішок. У переважному втіленні винаходу ссавець є людиною.

У практиці даного винаходу будуть використовуватися, якщо не указано інакше, звичайні методи клітинної біології культивування клітин, молекулярної біології, трансгенної біології, мікробіології, рекомбінантної

ДНК і імунології, які відомі в даній області. Такі методи описані в літературі.

Далі будуть детально представлені переважні втілення даного винаходу. Даний винахід відноситься до використання АРКІЇ-К і пов'язаних з АРКІЇ-К молекул для впливу на зростання і дозрівання В-клітин і клітин, що не відносяться до В-клітин, особливо, якщо вони відносяться до пухлинних клітин. Винахід також відноситься до використання АРКІЇ-К і пов'язаних з АРКІЇ-К молекул для впливу на відповіді імунної системи, що є 70 необхідним при порушеннях, пов'язаних з імунною системою. Крім того, винахід включає лікування ракового захворювання і імунних порушень за допомогою використання АРКІЇ-К або пов'язаного з АРКІЇ-К гена за допомогою методів генної терапії.

АРРІЇ--К і його гомологи, продуковані хазяями, трансформованими послідовностями за винаходом, а також нативний АРКІЇ-К, очищений способами, відомими в даній області, або одержаний з відомих амінокислотних 7/5 послідовностей, придатні в різних способах протиракових, протипухлинних і імунорегуляторних застосувань.

Вони також придатні при терапії і способах, направлених на інші захворювання.

Інший аспект винаходу відноситься до застосування поліпептиду, кодованого виділеною нуклеїновою кислотою, що кодує АРКІІ-К, в "антисмисловій" терапії. У тому значенні, як цей термін тут використовується, "антисмислова" терапія відноситься до введення або продукції іп зйи олігонуклеотидів або їх похідних, які 2о специфічно гібридизують в клітинних умовах з клітинною мРНК і/або ДНК, що кодує ліганд, який цікавить, для того, щоб інгібувати експресію кодованого білка, тобто шляхом інгібування транскрипції і/або трансляції.

Зв'язування може відбуватися на основі комплементарності пар основ або, наприклад, у разі зв'язування з

ДНК-дуплексами за допомогою специфічних взаємодій в основному жолобку подвійної спіралі. В основному "антисмислова" терапія відноситься до ряду методів, як правило, що використовуються в даній області, і сч ов Включає будь-яку терапію, засновану на специфічному скріпленні з олігонуклеотидними послідовностями. "Антисмислову" конструкцію за даним винаходом можна доставити, наприклад, у вигляді експресуючої і) плазміди, яка, при транскрипції в клітині, продукує РНК, яка є комплементарною щонайменше до частини клітинної МРНК, яка кодує Кау-ліганд. Альтернативно "антисмислова" конструкція може бути олігонуклеотидним зондом, який одержують ех мімо. Такі олігонуклеотидні зонди переважно являють собою модифіковані со

Зо Оліго-нуклеотиди, які стійкі до ендогенних нуклеаз і тому стабільні в умовах іп мімо. Прикладами молекул нуклеїнових кислот для використання як "гантисмислових" олігонуклеотидів є фосфорамідатні, фосфотіоатні і Ме метилфосфонатні аналоги ДНК |дивись, наприклад, патенти США 5176996, 5264564 і 5256775). Крім того, є М огляд із загальних підходів до конструювання олігомерів, придатних для "антисмислової" терапії, наприклад, у

ЇМап Оег КтоЇ еї аїЇ. (1988) Віоїесппіднез 6:958-976; і (ейп еї а). (1988) Сапсег Кез 48:2659-2668), « з5 спеціально включених тут для відома. ча

АРК -К за винаходом, як обговорювалося вище, є членом сімейства ТМЕ-рецепторів. Білок, його фрагменти або гомологи можуть мати широкі терапевтичні і діагностичні застосування.

Поліпептиди за винаходом специфічно взаємодіють з АРКІЇ, поліпептидом, раніше описаним в УУО99/12964, включеної тут для відома. Однак пептиди і способи, розкриті тут, створюють можливість для ідентифікації « молекул, які специфічно взаємодіють з АРКІ--К або його фрагментами. з с Заявлений винахід в деяких втіленнях включає способи застосування пептидів, похідних АРКІЇ-К, які володіють здатністю зв'язуватися з АРКІЇ. Фрагменти АРКІЇ-К можна одержати декількома шляхами, ;» наприклад, рекомбінацією, з допомогою ПЛР, протеолітичним розщепленням або хімічним синтезом. Внутрішні або кінцеві фрагменти поліпептиду можна одержати видаленням одного або більше нуклеотидів з одного кінця або обох кінців нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид. Експресія ДНК, що мутувала, дає фрагменти -І поліпептиду.

Фрагменти поліпептиду також можна синтезувати хімічним шляхом з використанням методів, відомих в даній ве області, таких, як звичайний спосіб Мерріфілда з використанням ї-тос-або і-рос в твердій фазі. Наприклад, -І пептиди і послідовності ДНК за даним винаходом можна довільно розділити на фрагменти бажаної довжини без 5о перекриття фрагмента або розділити на фрагменти бажаної довжини, що перекриваються. Способи такі, як ці, се) описані більш детально нижче. с Одержання розчинних форм АРКІЇ-К

Розчинні форми АРК1І-К часто можуть ефективно передавати сигнали, і, отже, їх можна вводити як лікарський препарат, який вже імітує природну мембранну форму. Можливо, що заявлені тут АРКІЇ-К Секретуються в природних умовах у вигляді розчинних цитокінів, однак, якщо немає, то можна переконструювати ген для вимушеної секреції. Для створення розчинної секретованої форми АРКІЇ-К необхідно видалити на рівні

Ф) ДНК Мі-кінцеві трансмембранні області і деяку дільницю стовбурової області і замінити їх лідерною ка послідовністю типу І і, альтернативно, лідерною послідовністю типу ІЇ, що дозволить протікати ефективному розщепленню у вибраній експресуючій системі. Фахівці в даній області можуть змінювати розміри стовбурової во області що залишилася в експресуючій конструкції для секреції з метою оптимізації як властивостей зв'язування ліганду, так і ефективності секреції. Наприклад, конструкції, що включають всі можливі стовбурові довжини, тобто М-кінцеве усікання, можна приготувати таким чином, що вийдуть білки, що починаються з амінокислот 1-52. З даного типу аналізу будуть одержані стовбурові послідовності з оптимальною довжиною.

Одержання антитіл, реагуючих з АРКІІ-К 65 Винахід також включає антитіла, специфічно реагуючі із заявленим АРКІЇ-К і його корецепторами.

Антибілок/антипептид-антисироватку або моноклональні антитіла можна одержувати стандартними методами дивись, наприклад, Апіродіев: А І арогаїогу Мапиа! ед. ру Нагіож апа І апе (Соїй Зргіпд Нагрог Ргезв: 1988)|.

Ссавця, такого як миша, хом'ячок і кролик, можна імунізувати імуногенною формою пептиду. Методи для надання імуногенності білку або пептиду включають кон'югацію на носіях або інші методи, добре відомі в даній області.

Імуногенну дільницю АРКІ-К або його корецепторів можна вводити в присутності ад'юванта. За протіканням імунізації можна простежувати за встановленням титрів антитіл в плазмі або сироватці. Можна використати стандартні ЕГІЗА або інші імуноаналізи з імуногеном як антигеном для оцінки рівнів антитіл.

У переважному втіленні цільові антитіла є імуноспецифічними для антигенних детермінант АРК -К або його 70 корецепторів, наприклад, антигенних детермінант поліпептиду за ЗЕО ІЮО МО:8 або тісно пов'язаного людського або надлюдського гомолога ссавців (наприклад, на 70, 80 або 9095 гомологічного, більш переважно на 9595 гомологічногод. У ще одному переважному втіленні даного винаходу анти-АРКІІ-К або антн-АРКІЇ -корецептори-антитіла значною мірою не реагують перехресно (тобто реагують специфічно) з білком, який, наприклад, менше, ніж на 8095 гомологічний по відношенню до ЗЕО ІЮ МО:8, переважно менше, ніж у75 На 9095 гомологічний по відношенню до ЗЕО ІЮ МО:8 і найбільш переважно менше, ніж на 9595 гомологічний по відношенню до ЗЕО ІЮ МО:8. Вираз "значною мірою не реагують перехресно" означає, що антитіло має афінність зв'язування для негомологічного білка, яка складає менше 1095, більш переважно менше 595 і навіть більш переважно менше 195 афінності зв'язування для білка за ЗЕО ІЮ МО:8.

Термін "антитіло", в тому значенні, як він тут використовується, призначений для включення його фрагментів, які також є специфічно реагуючими з АРКІІ-К або його рецепторами. Антитіла можуть бути фрагментовані з використанням звичайних методів, і фрагменти піддані скринінгу на застосовність таким же чином, як описано вище для суцільних антитіл. Наприклад, Е (ар) 5-фрагменти можна одержати обробкою антитіла пепсином. Одержаний Е (ар)»-Фрагмент можна обробити для відновлення дисульфідних зв'язків з одержанням Ра 1.фрагментів. Антитіла за даним винаходом додатково призначені для включення Га біоспецифічних і химерних молекул, що володіє анти-АРКІ--К- або анти-АРКІ-корецептори-активністю. Таким чином, як моноклональні, так і поліклональні антитіла (АБ), направлені проти АРКІЇ-К і їх корецепторів, і і9) фрагменти антитіл такі, як Рар'ї Р(аб)» можна використати для блокування дії АРКІЇ-К і його відповідних корецепторів.

Різні форми антитіл можна також приготувати з використанням стандартних методів рекомбінантної ДНК ее) |ММіпіег апа Міївівїп, Маїшге 349:293-299 (1991), спеціально включений тут для відома). Наприклад, можна сконструювати химерні антитіла, в яких домен зв'язування антигену з антитіла тварини пов'язаний з людським б константним доменом Інаприклад, Сабійу еї аіІ., патент США Мо4816567, включений тут для зведення). Химерні ч- антитіла можуть знизити імуногенні відповіді, що спостерігаються на антитіла тваринного походження, коли використовуються в клініці для лікування людини. М

Крім того, можна синтезувати рекомбінантні "гуманізовані антитіла", які розпізнають АРКІЇ-К або його - корецептори. "Гуманізовані" антитіла є химерами, що включають в основному людські послідовності Ідс, в які вставлені області, відповідальні за специфічне зв'язування з антигеном. Тварин імунізують бажаним антитілом, виділяють відповідні антитіла і видаляють дільницю послідовностей варіабельної області, відповідальної за « специфічне зв'язування з антигеном. Області зв'язування антигену від тварин потім клонують у відповідне 70 положення генів людських антитіл, в яких видалені області зв'язування антигену. "Гуманізовані" антитіла 8 с зводять до мінімуму застосування гетерологічних (тобто міжвидових) послідовностей в людських антитілах і, ц таким чином, малоймовірно, що вони будуть викликати імунні відповіді у обробленого суб'єкта. "» Конструкцію різних груп рекомбінантних антитіл також можна провести приготуванням химерних або "гуманізованих" антитіл, що включають варіабельні домени і людські константні домени (СНІ, СН2, СНЗ),

Виділені з різних класів імуноглобулінів. Наприклад, антитіла з підвищеними валентностями сайту зв'язування -І антигену можна одержати рекомбінантним методом при клонуванні сайту зв'язування антигену у вектори, що несуть людські константні області ланцюгів (Агшапападат еї аї!., У. Ехр. Мед. 177:1439-1450 (1993), включений ть тут для відома). -І Крім того, звичайні методи рекомбінантної ДНК можна використати для зміни афінності зв'язування рекомбінантних антитіл з їх антигенами зміною амінокислотних залишків в оточенні сайтів зв'язування антигену. іш Афінність зв'язування антигену "гуманізованого" антитіла може бути підвищена мутагенезом, заснованим на (Че молекулярному моделюванні (Очцееп еї аї., Ргос. Май. Асай. Зеї. 86:10029-33 (1989)), включений тут для відома.

Одержання аналогів: продукція змінених ДНК і пептидних послідовностей

Аналоги АРКІЇ-К можуть відрізнятися від того, що є в природних умовах АРКІЇ-К за амінокислотною послідовністю або іншим властивостям, не пов'язаним з послідовністю, або за обома. Не пов'язані з послідовністю модифікації включають хімічну дериватизацію АРКІЇ-К іп мімо або іп мійго. Не пов'язані з іФ) послідовністю модифікації включають, але не обмежуються змінами внаслідок ацетилювання, метилювання, ко фосфорилювання, карбоксилювання або глікозилювання.

Переважні аналоги включають біологічно активні фрагменти АРКІ-К, чиї послідовності відрізняються від бо послідовності, представленої в ЕС ІЮ МО:8, однією або більше консервативною заміною амінокислот або однією або більше неконсервативною заміною амінокислот, делеціями або вставками, які не приводять до втрати активності АРКІЇ -ліганду. Консервативні заміни звичайно включають заміну однієї амінокислоти на іншу з однаковими властивостями, наприклад, заміни всередині наступних груп: валін, гліцин; гліцин, аланін; валін, ізолейцин, лейцин; аспарагінова кислота, глутамінова кислота; аспарагін, глутамін; серин, треонін; лізин, 65 аргінін; і фенілаланін, тирозин.

Застосування

Повну довжину гена АРКІЇІ-К (ЗЕО ІЮО МО:8) або його дільниці можна використати як зонди гібридизації для бібліотеки кДНК для виділення, наприклад, ще інших генів, які володіють бажаною ідентичністю послідовності по відношенню до послідовності АРКІЇ-К, розкритої в ЗЕБО ІЮО МО:6. Нуклеотидні послідовності, що кодують

АРЕІЇ-К, також можна використати для конструювання зондів гібридизації з метою картування гена, який кодує

АРРІГ-К, і для генетичного аналізу індивідуумів з генетичними порушеннями. Скринінг може бути побудований таким чином, щоб знайти основні сполуки, які наслідують біологічну активність АРКІГ-К. Подібний скринінг буде включати тести, призначені для скринінгу з високою пропускною спроможністю хімічних бібліотек, роблячи їх особливо придатними для ідентифікації невеликих молекул, кандидатів для лікарських препаратів. 70 Передбачувані невеликі молекули включають синтетичні органічні або неорганічні сполуки. Нуклеїнові кислоти, які кодують АРКІЇ-К або його модифіковані форми, можна також використати для одержання або трансгенних тварин, або "сконструйованих" тварин, які в свою чергу, придатні при розробці і скринінгу терапевтичних корисних реагентів, включаючи, наприклад, реагенти проти ракового захворювання.

АРРІІ--К і гомологи, одержані від хазяїв, трансформованих послідовностями за винаходом, а також нативний

АРКМКІЇ-К, очищений способами, відомими в даній області, або одержаний за відомими амінокислотними послідовностями, є придатними в різних способах протиракових застосувань.

У одному втіленні винаходу забезпечується спосіб лікування ссавця від стану, пов'язаного з небажаною проліферацією клітин, призначенням ссавцеві терапевтично ефективної кількості композиції, що включає антагоніст АРКІІЇ-К, де антагоніст АРКІЇ-К містить поліпептид, який протидіє взаємодії між АРКІЇ-К і його спорідненим рецептором або рецепторами, з фармакологічно прийнятним наповнювачем.

У переважному втіленні спорідненим рецептором АРКІГЇ. на поверхні клітини є ВСМА.

Спосіб можна використати з будь-яким антагоністом АРКІЇ-К, який має поліпептид, який протидіє взаємодії між АРКІГ!. і його спорідненим рецептором або рецепторами. Приклади антагоністів АРКІЇ-К включають, але не обмежуються розчинним поліпептидом АРКІЇ-К, включаючи але не обмежуючись розчинним ВСМА; розчинними сч об химерними молекулами АРКІЇ-К, включаючи, але не обмежуючись ВСМА-ІдОс-Бс, і гомологами антн-АРКІЇ-К-аїгагтіа, включаючи, але не обмежуючись анти-ВСМА моноклональним антитілом. (8)

Спосіб за винаходом можна використати при будь-якому стані, пов'язаному з небажаною проліферацією клітин. Зокрема, способи за даним винаходом можна використати для обробки пухлинних клітин, яких експресують АРКІ!. і/або АРКІІ-К (тобто ВСМА). со зо Приклади ракових захворювань, де проліферація клітин модулюється під дією АРКІЇ, можна тестувати при визначенні в умовах іп міго рівня мРНК, АРКІЇ. і/або АРКІІЇ-К (тобто ВСМА), експресованої в бібліотеках Ме пухлинних тканин. Бібліотеки пухлинних тканин, в яких є висока експресія МРНК АРКІГЇ. і/або АРКІЇ-К (тобто М

ВСМА) будуть кандидатами. Альтернативно, можна провести скринінг кандидатів при пошуку в загальнодоступних або приватних базах даних (тобто база даних Іпсуїе) за допомогою, наприклад, повної -

Зб ДОВЖИНИ послідовності КДНК АРКІГЇ.. З використанням цих методів було встановлено, наприклад, що експресія ї-

МРНК АРКІГЇ. виявлена у великому ряді типів пухлин, включаючи, але не обмежуючись такими, знайденими в таблиці 1 нижче:

Таблиця 1

Опис бібліотеки «

Лінія пухлини простати І МСарг, СА, 5ОМ, нелікована, ТІК з с Т-лімфоцитарна пухлина, лімфома, ТІК

Пухлина яєчника, папілярна серозна цистаденосСА з Легеня, тму/аденоСА, СОРО, 47М

Пухлина молочної залози, аденоСА, 46Е, БОВ, т/"ВКЗ5ТМОТЗЗ3

Ганглій, дорсальний корінь, цервікальний, ам// лімфома, 32М, МОКМ -І Пухлина мозку, лобна, нейронна неоплазма, 32М

Пухлина простати, аденоСА, 59М, БВ, т/"РКОЗМО5Т19 пи Пухлина ободової кишки, печінковий вигин, аденоСА, 55М, 50ИВ, т/СОЇ АТМТОЇ -І Пухлина підшлункової залози, ТІСК

Пухлина параганглію, парагангліома, ам//нирковоклітинна СА, 46М се) Молочна залоза, тм/ проточна СА, 4З3Е, т/"«ВКАЗТТОТ16 с Пухлина нирки, нирковоклітинна СА, 51Е

Сечовий міхур, тиу/ТССА, СА іп зйши, бОМ, т/ВГАОТИТО4

Пухлина матки, ендометріальна, Е, ТІК

Простата, ДГП, тму/аденосСА, РІМ, 59М

Легеня, тм/аденоСА, 5З3М, т ОМОТОТ17 (Ф) Кісткова пухлина /лінія, МО-63, осТеозАкК/гігантоклітинна, М/Е, пул, КР ка Мозок, лобна кора, ат/ легенева СА, 77М

Пухлина ободової кишки, аденосСА, МОКМ, ЗОВ, СОАР во Пухлина легень, плоскоклітинна СА, 57М

Легеня, тм/аденоСА, 63М

Простата, АН, тим/аденоСА, 5ОМ, т/РКОЗТИТОЇ

Периферична кров, В-лімфоцити, СІ, пул, МОКМ, З'ЄСАР

Пухлина ободової кишки, аденоСА, пул, МОКМ, 3/5 СО АР 65 Нирка, тж/нирковоклітинна СА, 8,53 Е, пул, МОКМ

Яєчник, дермоїдна кіста, 22Е

Пухлина ободової кишки, аденосСА, МОКМ, З'ЄСАР

Пухлина ободової кишки, аденосСА, З'ЄСАР

Простата, ДГП, тиу/аденоСА, 7ОМ, ЗИВ

Пухлина яєчника, метастази аденоСА ободової кишки, 58Е

Матка, міометрій, ту/лейоміома, 43Е

Тонкий кишечник, клубова кишка, тм/СИОС, 25Е

Лімфатичний вузол, періпанкреатичний, ам// підшлункової залоза аденоСА, 65М

Яєчник, ам/лейоміома, З6Е, МОМ 70 Легеня, тм/веретеноклітинна карцинома, 62Е

Пухлина легені, шюскоклітинна СА, 5ОМ

Пухлина мозку, менінгиома, З6бМ

Пухлина, аденосА, 65Е, т/ РАМСМОТ 0 8

Пухлина, тм/ендобронхіальна карциноїдна пухлина, З3ЗМ

Надниркова, тжм/феохромоцитома, 4З3Е, т"АОКЕТИТО7

Пухлина мозку, лобна, менінгіома, 5 ОМ

Пухлина нирки, ракове захворювання з чітким типом клітин, пул, МОКМ, З'ЄСАР

Молочна залоза, тм/часточкова СА, 67 Е

Легеня, тм/метастаз осТео5АК, ам/плевральні метастази, 5Д8М, МОКМ

Пухлина простати, аденоСА, 59М, БВ, т/"РКОЗМОТ!9

Пухлина тонкого кишечнику, клубова кишка, метастази ендометріальної аденосА, 64 ЕЕ

Пухлина яєчника, аденоСА, 58Е

Молочна залоза, захворювання молочної залози МЕ, 46Е

Пухлина мозку, лобна, метастази гіпернефроми, 58М сч

Пухлина нирки, УМітв, пул, УУМЛЛ/М

Легеня, тм/метастаз СА щитовидної залози, 79М, тЛ. ОМОТИОТО2 (8)

Пухлина легені, метастази СА щитовидної залози, 79М, т//. ОМОМОтТОЗ

Пухлина паращитової залози, аденома, М/Е, МОКМ, ММ

Пухлина підшлункової залози, анапластична СА, 45Е со зо Яєчник, тм/муцинозна цистаденоСА, 4З3Е, т/ОМАКТИТОЇ

Пухлина легені, плоскоклітинна СА, пул, МОКМ, СОАР Ме)

Пухлина молочної залози, аденоСА, А6Е, т/"ВКЗ5ТМОТ17 М

Матка, тмж/лейоміома, ам/аденоСА ободової кишки, 45Е

Легеня, тим/аденосСА, ам/вузловий, діафрагмальні метастази, б63Е «

Пухлина молочної залози, аденоСА, А6Е, т/"ВКЗТМОТЗЗ3 ї-

Пухлина простати, аденосСА, 66М, т/РКОЗМОТ15, РКОЗОІМО1

Пухлина молочної залози, аденоСА, 54Е, т/"ВКЗТМОТОоЗ

Ембріональна пухлина, пул, ЗОВ, З'ЄСАР

Кістковий мозок, велика гомілкова кістка, аму/метастаз альвеолярної рабдоміо АК, 16М «

Простата, АН, тм/аденоСА, 57М, т/РКО5БТИТО4 з с Молочна залоза, РЕ зміни, тиу/аденоСА, 55Е, т/"ВК5ТТОТОЇ . Пухлина матки, серозна папілярна СА, Е, пул, ЗСОАР и? Пухлина яєчника, муцинозна цистаденоСА, 4З3Е, т/"ЮОМАКМОТОЗ

Молочна залоза, РЕ зміни, ту/аденоСА, внутрішньопроточна СА, 43Е

Молочна залоза, тм/проточний СА, СА іп зйи, ам/метастаз лімфатичних вузлів, 62Е -І Пухлина нейроганглію, гангліоневрома, УМ

Пухлина підшлункової залози, аденосСА, З'ЄСАР пи Пухлина матки, ендометріальна аденосА, Е, пул, З'ССАР -І Пухлина легені, нейроендокринна карциноїдна пухлина, пул, МОКМ, З'ЄСАР

СА - карцинома; ЗАК - саркома ік Антагоністи АРКІЇ-К, як об'єкт винаходу, використовуються при лікуванні станів, пов'язаних з небажаною с проліферацією клітин, зокрема, при лікуванні пухлин, переважно інгібують зростання пухлинних клітин більш, ніж на 1095, 2095, 3095 або 4095 і найбільш переважно більш, ніж на 5095. Антагоністи АРКІЇ-К одержують в результаті скрінингу (дивись, наприклад, обговорення в прикладі 6). Наприклад, антагоністи АРКІЇ-К можна 5Б відібрати на основі активності інгібувати зростання (тобто більш, ніж на 1095, 2095, ЗО95, 4095 або 5095) карциноми ободової кишки НТ29 людини або карциноми легень А549 людини (дивись, наприклад, обговорення (Ф) на Фігурі 15), які походять відповідно з пухлини ободової кишки і легені. ка Інше втілення винаходу забезпечує способи інгібування зростання В-клітин і клітин, що не відносяться до

В-клітин, індукованого дендритними клітинами зростання В-клітин і дозрівання або продукції імуноглобулінів у бо тварини з використанням поліпептиду АРКІЇ-К.

В іншому втіленні винахід забезпечує способи застосування АРКІЇ-К при лікуванні аутоїмунних захворювань, гіпертензії, серцево-судинних порушень, ниркоподібних порушень, В-клітинних лімфо-проліферативних порушень, імуносупресорних захворювань, при трансплантації органів, запалення і захворювання, пов'язаного з вірусом імунодефіциту людини. Також включені способи застосування агентів для лікування, придушення або 65 зміни імунної відповіді, що включає шляхи передачі сигналів між АРКІГ-К і його лігандом.

Даний винахід також забезпечує фармацевтичні композиції що включають поліпептид АРКІЇ-К і фармацевтично прийнятний наповнювач. Відповідні носії для поліпептиду АРКІЇ-К, наприклад, і їх композиції, описані в (Кетіпдіоп' РНагтасеціїсаї Зсіепсев, 16" ед., 1980, Маск Рибіїзпіпу Со., едйей Бу Озіо еї а!) Як правило, в композиції використовується відповідна кількість фармацевтичної прийнятної солі для того, щоб зробити композицію ізотонічною. Приклади носія включають буфери такі, як фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин декстрози. Значення рН розчину переважно дорівнює від приблизно 5 до приблизно 8, і більш переважно від приблизно 7,4 до приблизно 7,8. Додаткові носії включають препарати для безперервного вивільнення такі, як напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, коли матриці знаходяться у вигляді частинок, що мають певну форму, наприклад, ліпосом, плівок або мікрочастинок. Фахівцям в даній 70 області, очевидно, буде зрозуміло, що деякі носії будуть більш переважними в залежності, наприклад, від шляху введення і концентрації поліпептиду АРКІЇ-К, який вводиться.

Введення можна здійснювати ін'єкцією (наприклад, внутрішньовенною, внутрішньоочеревинною, підшкірною, внутрішньом'язовою) або іншими способами такими, як інфузія, для забезпечення доставки в кров'яне русло в ефективній формі.

У практиці даного винаходу будуть використовуватися, якщо не указано інакше, звичайні методи клітинної біології культивування клітин, молекулярної біології, мікробіології, рекомбінантної ДНК, хімії білків і імунології, які відомі фахівцям в даній області. Ці методи описані в літературі. Дивись, наприклад,

ІМоїесціаг Сіопіпд:; А Іарогагу Мапиа), 279 еайіоп. (Затргоок, Егйвспй ап Мапіаїйів, едв.), Соїй Зргіпд

Нагрог Іарогаїгу Ргез5, 1989; ОМА Сіопіпд: МоЇштевз ! апа ПИ (О.М. СіІомег, еа.), 1985; Оіідописіео(іде Зупіпезів (М.9У.Заїї, ед.), 1984; патент США Мо4683195 (Миїййв еї а1/.); Мисівіїс Асіа НуБгідігайоп (В.О. Натезв апа 5.9. Ніддіпв, едв.), 1984; Тгапвсгірйоп апа Тгапвіайоп (В.О. Натевз апа 5.). Нідодіп5, еав.), 1984;

Сийиге ої Апіта! СеїЇв (К.І. ЕРгезппеу, ей.). АІап К. І ів5, Іпс., 1987; Іттобійгей СеїЇїв апа Епгутевз, ІК.

Ргезв, 1986; А Ргасіїса! Сціде о Моїіесшаг Сіопіпуд (В. Реграї), 1984; Меїйоаз іп Епгутоіоду, Моїштевз 154 апа 155 (УУч еї аї., едз.), Асадетіс Ргез5, Мем Могк: Сепе Тгапвїег Месіогв ог Маттаїйап Сеїйв (9).Н. Мійег апа Ге!

М.Р. Саїов, еаз.), 1987; Сода Зргіпд Нагброг І арогаїгу: Іттипоспетіса! Меїйподз іп СеїЇ апа Моіесшіаг Віоіоду о (Мауег апа УмаїКег, едз».), Асадетіс Ргезв, І опдоп, 1987; НапароокК ої Ехрегітепі Іттипоіоду, Моїштез 1-ІМ (О.М.

МУеїг апа С.С. ВіаскмеїЇ, едв.), 1986; Мапіршіайпд (бе Моизе Етьгуо, Соїа Зргіпд Нагбог І арогаїгу Ргезз, 19861.

Наступні приклади надані для ілюстрації даного винаходу, і їх не треба розглядати, як такі, що обмежують його. с

Приклади

У прикладах, розкритих нижче, використали наступні методи. Ф

Методи -

Клонування і експресія тус-міченого мишачого АРКІГ (ССМ776) в Рісніа равіогів

Експресуючий вектор рССМ213.10 конструювали, взявши РОКОО4 (НОВ тиАРКІЇ з включаючим вищий З

ЕАб-ліганд "стовбуром", сполученим з М-кінцем разом з РІ Асб-епітоп-міткою) і вирізавши кодуючу послідовність /-Їче ти АРКІЇ. з Зас І в Мої). Синтетичні олігонуклеотиди І ТВ-559 і 560 утворюють лінкер Хпо-1-Засі, який включає лідерну послідовність з альфа-чинником схрещування, тус-епітоп-мітку, а також мотив КЕЇ з РАз-ліганду.

Фрагмент тиАРКІЇ. і лінкер лігували в сайтах Хпо-1-Мої! в рсст211, що експресує плазміди Ріспіа разіогів. «

РСОСМ213.10 лінеаризували 5ШІ, піддавали електропорації в штам 55115 (Пів4-) і висівали в мінімальному середовищі, що містить декстрозу. НІЗ4-трансформанти аналізували на експресію білка посівом одиничної - с представницької колонії в збагачене середовище (ВМОУ: забуферене, складне середовище, що містить а гліцерин) і давали можливість рости до щільності протягом 48год. при 302. Культури центрифугували і клітинні -» осадки ресуспендували (1:5) в збагаченому індукційному середовищі, що містить 1,590 метанолу (ВММУ: забуферене, складне середовище, що містить метанол). Через двоє діб індукції при 302С, супернатанти піддавали ЗЮО5-РАСЕ і оцінювали на присутність тиАРКІЇ. Фарбування Кумассі і вестерн-блотінг (з - анти-птус-тАБОЕ10) показували, що один штам, ССМ776, продукував адекватні кількості глікозильованої форми їз білка тус-міченого НОВ тиАРКІЇ.

Очищення тус-тАРКІ!. - Мус-тАРКІГ, білок з 149 амінокислот, експресували в ріспіа. Даний білок має ізоелектричну точку 7,45. со 20 175мл супернатанту ріспіа діалізували проти 10мММ Тріс буфера, рН 6,8 протягом ночі і потім пропускали через колонку ЗР місткістю 20мл. Колонку ретельно промивали 10мММ Трис-НСІ буфером, рН 6,8 і елюювали 250ММ со масі в РВ5. Другу стадію очищення проводили з використанням колонкової гель-фільтрації (5300).

Фракції, що містять тус-АРКІЇ, з колонки 5Р місткістю 20мл концентрували центрифугуванням до об'єму 7мл.

Після гель-фільтрації заявники одержували 8мг тус-АРКІЇ, який детектували за оптичною щільністю і забарвленим Кумасі гелем. Заявники також провели вестерн-блотінг з використанням мишачих моноклональних о антитіл 9Е10 (анти-тус), в якому було показано, що тус-мітка була інтактною після стадій очищення. М-кінцева послідовність підтверджувала, що очищений білок відповідає тус-тАРКІЇ.. де Очищення РІ Аб-людського АРКІЇ.

Плазміду рз429(в подальшому названу р1448) використали для тимчасової трансфекції клітин 2931 з 60 використанням ліпофектаміну (Сірсо-Вгі) і середовища, що не містить сироватку. Плазміду, яку конструювали в експресуючому векторі ссавців РСОКЗ (Іпмйгодеп), кодує домен зв'язування рецептора людського АРКІЇ, з

М-кінцевим білком в клітинному культуральному середовищі. Білок РІ АС-АРКІГЇ. виділяли з середовища, що не містить сироватку, з використанням колонки з анти-РГЇАбС-тАБ М2 і надлишку пептиду ЕГАС, слідуючи рекомендаціям виробника (Кодак). б5 Очищення НСВСА-Ес

НВСМА-Рс тимчасово трансфікували в клітини 293. Кондиціоноване середовище від клітин 293 з гіперекспресією НВСМ-Ес наносили на колонку з білком А. Білок елюювали з використанням 25мММ фосфатного 10О0нмМ Масі, рН 2,8 з подальшою нейтралізацією 1/20 об'єму 0,5М МаРси, рН 8,6. Відібрані за оптичною щільністю при 280нм фракції піддавали БО5-РАСЕ у відновлюючих і невідновлюючих умовах і вестерн-блотінгу

Для ідентифікації очищеного білка. З Х00мл кондиціонованого середовища було одержано Змг білка.

Мус-тАРКІ!. зв'язується з різними клітинними лініями в аналізі ЕАС5 45Онг/мл очищеного тус-тАРКІЇ. зв'язували з клітинними лініями в 100мкл РВБЗ/290ЕВСяРсо-блокувати реагенти (ЕсВіоск (Ф 20мкг/мл (РНпаптіпдеп) і очищеного людського дО (Ф 1Омкг/мл (Западо) на льоду протягом 1Тгод. Позитивне зв'язування виявляли з використанням специфічної кролячої антимишачої до АРКІЇ. /о антисироватки (1:500) Її ослиног антикролячого ІДС-РІТС (Часквоп). Клітинні лінії А20О, Ка), МІНЗТЗ ї НТ29 підтримували в середовищі, як запропоновано постачальником (АТСС Веїйезаа, МО). Клітини ВОАВ культивували в НЕРЕ5-забуференому середовищі КРМІ з додаванням 1095 ЕВ5 і І -глутаміну. У конкурентних тестах додавали 45Онг/мл тус-мишачого АРКІГ!. з мкг/мл конкурентного білка.

Приклад 1: Детектування зв'язування АРКІЇ. з АРКІЇ-К з використанням тесту чашок

У даному прикладі аналізували зв'язок ВСМА з АРКІЇ.

Для того, щоб тестувати, наскільки ВСМА зв'язується з АРКІЇ, заявники провели дослід на коїмунопреципітацію. У даному прикладі використали розчинні білки АНИВСМА-Ес і тус-тАРКІЇ..

НВСМА-Рс і ГТЬК-Бс додавали з різними ТМЕ-лігандами: тус-іпАРКІЇ; тус-СО40Ї і тус-КАМКІ в середовище, що містить 1095 ЕВС, на 1/2год. при кімнатній температурі. Рс-білки зв'язували з гранулами, го навантаженими білком А, протягом 1-2год., промивали три рази їмл РВ5, аналізували імуноблотінгом з мишачими о моноклональними 9Е10 (анти-тус) антитілами і виявляли з використанням посиленої хемілюмінесценції.

Заявники виявляли тус-АРКІГ. в імунопреципітатах НВСМА-Ес, що вказує на те, що ВСМА взаємодіє з АРКІЇ. специфічним чином, оскільки інші ТМЕ-ліганди, тус-СО40Ї і тус-КАМКІ. не володіли здатністю зв'язуватися з сч ВСМА. Мус-АРКІЇГ. не зв'язується з СТЬК-Го.

Ту ж мембрану очищали і повторно ставили блотінг з анти-пІС-НЕР для того, щоб показати, що ту ж кількість і)

ЇТЬК-Ес з ВСМА-Ес використали в імунопреципітатах.

Приклад 2:

У даному прикладі описується, що АНІВСМА-Ес взаємодіє з РІ АОС-ПАРКІЇ.. со зо Аналіз ЕГІЗА: покриті рецепторними злитими Ес-більками планшети (НВСМА-Рс-739 або НТМЕК2-Ес-492) з концентрацією мкг/мл в карбонатному буфері, рН 9,6 протягом ночі, при 492С. Блокували протягом 2год. при Ме кімнатній температурі з використанням РВ5Б/595 знежиреного сухого молока/0,59о Твіна-20. Готували двократне ча послідовне розведення лігандів в 100мкл блокуючого буфера (ТМРа-197 з 100Онг/мл, тиВАРЕ-657 з 100Онг/мл,

ПАРКІІ-507 з 200Онг/мл (неактивний), ПАРКІЇ-429 з п'ятикратно концентрованого середовища). Після в інкубування з лігандами планшет промивали РВЗ/590 Твін-20 і зондували 0,5мкг/мл анти-РАСб-тАБ М2 вбуфері Кк. для розведення. Антитіла детектували з використанням анти-мишачих-РО 1/2000 з ензиматичним виявленням (ОРО).

Досліди на імунопреципітацію: клітини 2937 трансфікували вказаною експресуючою плазмідою (Кес-Ес або

ЕГАсС-ліганд) в чашці діаметром Осм. Трансфіковані клітини залишали на 5 діб в вмл середовища Оріїтет « 40. (Зібсо-ВК). Імунопреципітацію проводили при змішуванні 200мкл кондиціонованого середовища, що містить с кожний рецептор, з 200мкл кондиціонованого середовища, що містить кожний ліганд, - 400мкл РВЗ ж 1Омкл й Ргоїб-сефарози. Все це обертали протягом год. на роторі, 4 рази промивали мл РВ5, потім кип'ятили в 5Омкл «» буфера для зразка (401). 2О0мкл з кожної реакції імунопреципітації наносили доріжку. Оцінку результатів блотінгу проводили за допомогою 1мкг/мл анти-ГРІ АсС-тАбБ М2 (Зідта, 5 І оці МО) і антимишачими-РО (1/2000).

Також блотінг перевіряли з антилюдськими-РО: 100мкл кондиціонованого середовища осаджували сумішшю -і Меон/сСнНеїі»з/лізоцим. Цю суміш кип'ятили в бОмкл буфера для зразка («О1Т) і 20мкл навантажували. Оцінку блотінгу проводили з анти-РІ АбС-тАБ М2 (мкг/мл) і анти-мишачими-РО (1/2000). те Приклад 3: -І У даному прикладі описується зв'язування тус-тАРКІЇ; НпКауї -440 (пВАРЕРЕ) і ЕГАб-пВАРЕ з яНВСМА-!1д, 5о 0 ПСТ-К-Ід або прво ТМЕК-19. Всі досліди проводили при 252С зі швидкістю потоку 1Омкл/хв. о Кожний дослід проводили з використанням НВ5 буфера (10мММ НЕРЕБЗ, 150мМ Масі, 0,00595 с поверхнево-активних речовини Р2О при рН 7,4). Цей же розчин використали як елююючий буфер і як розріджувач для проб.

Спочатку поверхню чипів сМ5 активували

М-гідрокси-сукцинімід/М-етил-М'-(З-діетиламінопропіл)-карбодіїмідом гідрохлоридом (ВіАсоге). 20мкл. пВСМА-!Ід, 15мкл пІ.Т-КОБ-Ід і 1Омкл пр8вОо-ТМЕК, розбавлені до ЗОмкг/мл 10ММ оцтовою кислотою, потім блокували один о раз ЗОмкл і повторно 15мкл етанол-аміну-НСІ (рН 8,5). Це призводило до поверхневої щільності 1600-3700 ко резонансних одиниць (КО). Чипи регенерували 20мкл 1мММ мурашиної кислоти. Ці видалення повторювали п'ять разів для встановлення і стабільного фону, що відтворюється. 60 Для досліду 100мкл тус-тАРКІГ, нКауї -400 і Р АС-тВАРЕРЕ, кожного, розбавляли до ЗОмкл/мл буфером для розбавлення і наносили по поверхні чипів. Відразу ж після кожного нанесення чипи промивали 500мкл буфера для розбавлення. Поверхню регенерували між дослідами нанесенням 20мкл 1їмММ мурашиної кислоти, потім ще нанесенням 15мкл мурашиної кислоти. Після регенерації чипи врівноважували буфером для розведення.

Приклад 4: одержання розчинних форм рецептора 65 Для приготування інгібітору рецептора для застосування у людей необхідна послідовність КДНК позаклітинного домену людського рецептора. Якщо мишача форма відома, бібліотеки людської КДНК можна легко піддати скринінгу з використанням послідовності мишачої кДНК і подібні маніпуляції звичайно проводять в даній області. З послідовністю людської КДНК можна приготувати олігонуклеотидні праймери для ампліфікації в

ПЛР позаклітинного домену рецептора при відсутності трансмембранного і внутрішньоклітинного доменів. Як правило, він включає велику частину амінокислот між останнім пов'язаним дисульфідним зв'язком "ТМЕ-доменом" і трансмембранним доменом. Можна змінювати кількість включеної "стовбурової" області для оптимізації активності одержаного розчинного рецептора. Дану ампліфіковану дільницю потрібно перебудувати для включення відповідних сайтів рестрикції для надання можливості клонування в різні С-кінцеві Ід-злиті химерні вектори. Альтернативно можна вставити стоп-сигнал в 3'-кінці і приготувати розчинну форму рецептора 70 без повторного сортінгу для використання Ід-злитої химери. Одержані вектори можна експресувати в більшості систем, що використовуються в біотехнології, включаючи дріжджі, клітини комах, клітини бактерій і ссавців, і існують приклади для всіх типів експресії. Можна приєднати різні людські Ес-домени для оптимізації або елімінації ЕСК і комплементарних взаємодій за бажанням. Альтернативно можна використати форми даних

Ес-доменів, які мутували, для виборчого видалення ГСК або комплементарних взаємодій або приєднання 7/5 М-пов'язаних цукрів до Го-домену, який має деякі переваги.

Приклад 5: одержання агоністичних або антагоністичних антитіл

Вищеописані розчинні форми рецепторів можна використати для імунізації мишей і приготування моноклональних антитіл звичайними методами. Одержані тАб»з, які ідентифікуються ЕГІЗА, можна потім піддати скринінгу на агоністичну активність або у вигляді розчинних антитіл, або імобілізованих на пластмасі в різних клітинних тестах іп міго. Часто загибель клітинної лінії НТ29 представляє відповідну систему, яка чутлива до передачі сигналів через багато які ТМЕ-рецептори. Якщо дана лінія не має рецептор, що цікавить, повну довжину даного рецептора можна стабільно трансфікувати в лінію НТ29 для того, щоб надати можливість протікати тесту на цитотоксичність. Альтернативно, ці клітини можна використати в апараті Суїозепвог для оцінки того, наскільки активація рецептора може спричиняти зміну рН, що свідчить про передачу сигналу. Сімейство сч дб ТМЕ-рецепторів передає сигнали в такому форматі, і для даного методу не потрібно знати, які дійсні біологічні події "запускаються" рецептором. Агоністичні тАбрз слідує "туманізувати" перед використанням в клініці. Цей і) метод можна також використати для визначення антагоністичних тАбрз». Подібні тАбБрз будуть визначатися за відсутністю атомістичної активності і здатності інгібувати взаємодії рецептор-ліганд, що простежується ЕП ІЗА, класичними методами зв'язування або ВіАсоге. Нарешті, індукція секреції хемокінів різними клітинами у со зо відповідь на атомістичне антитіло може бути тестом для скрінингу.

Приклад 6: скринінг інгібіторів взаємодії рецептор-ліганд. Ме

Використовуючи рецепторний-Ід-злитий білок, можна тестувати комбінаторні бібліотеки на молекули, які ї- можуть безпосередньо зв'язуватися з рецептором. Потім дані молекули можна тестувати в ЕЇІЗА з використанням рецепторного-Ід-злитого білка і розчинної форми ліганду на здатність інгібувати взаємодію « рецептор-ліганд. ЕГІЗА можна безпосередньо використати для скрінингу бібліотек різних природних продуктів і ї- т.д. на інгібуючі сполуки. Рецептор можна трансфікувати в клітинну лінію таку, як лінія НТ29, для постановки біологічного тесту (в цьому випадку за цитотоксичністю), який потім може дати тест для скрінингу.

Приклад 7: інгібування зростання пухлин іп мімо

Ефективність ВСМА-Ід як антагоніста зростання пухлин тестували з використанням ряду різних ліній « пухлинних клітин в умовах іп мімо. Для цих досліджень використали безтімусних мишей (Ми/Ми) з імунодефіцитом пла) с і пухлинні клітини імплантували підшкірно. Для пухлинної лінії ЗМУ480, яка володіє агресивним зростанням, ц заявники імплантували 8 х10? клітин в 100мкл не утримуючого пірогенів, стерильного РВ5. Одну контрольну "» групу залишили необробленою (п-5), в той час як іншим групам ввели 10Омкг контрольного-Ід (п-6) і 10Омкг

ВСМА-ЇІ9 (п-6). Введення почали безпосередньо перед імплантацією з подальшим введенням кожні 7 діб.

Діаметр пухлин визначали мікрометром, і обчислювали об'єм з використанням формули об'єм - 4/ЗПг3. -| Карцинома ободової кишки 5УУ480 росте дуже швидко на моделі мишей Ми/Ми, і пальповані пухлини їз виявляли через 10 діб. Через 24 діб середній об'єм пухлин в контролі становив 0,3см З, в той час середній об'єм пухлин у мишей, оброблених ВСМА-Ід, дорівнював 0,19см?, зниження пухлинного навантаження на 4695. 7 Карцинома ободової кишки НТ29 також росте агресивно на моделі мишей Ми/Ми. Для цих дослідів 1х109 клітин (се) 20 в'100мкл не утримуючого пірогенів, стерильного РВЗ5 імплантували підшкірно і схема введення була аналогічною описаній для ЗМУ480. Пальповані пухлини виявляли через 7 діб, і в контрольних групах велика частина пухлин со росла дуже швидко. Через 42 діб середній об'єм пухлин в контрольних групах (необроблені і оброблені контрольним-ід, п-12) дорівнював 0,485см?, в той час, як середній розмір пухлин в обробленій ВСМА-1Ід групі (п-5) становив 0,095см?, зниження пухлинного навантаження на 8095. Через 50 діб 3095 мишей в контрольній групі були оцінені, як такі, що знаходяться на термінальній стадії за рахунок розміру пухлин більше 1,5см З, і (Ф, дослід був зупинений. У протилежність контрольній групі 096 мишей в групі, обробленій ВСМА-1І9, було оцінено, ка як такі, що знаходяться на термінальній стадії. Ці результати представлені в таблиці 2. о в» 1010 дв т» 00110009 0,35 - из -

є 1111111 ма 1711111

ПИ Кк СЯ ПЕН КОНЯ ПО ав

ПИлОЕ т ПОЛЕ КОНЯ ПО ев вм ва то ва

Вона показує 7095 зниження об'єму пухлини і достовірний вплив на смертність на моделі зростання пухлини

Нта29 з використанням обробки ВСМА-19.

Лінія карциноми легені АБ49 росте повільніше, ніж лінії карциноми ободової кишки, описані вище. Для цієї клітинної лінії заявники імплантували 1 х109У клітин в 10Омкл не утримуючого пірогенів, стерильного РВЗ і обробляли з використанням схеми, описаної вище. Пальповані пухлини виявляли приблизно через 20 діб після імплантації. Через 50 діб після імплантації пухлин середній об'єм пухлин в контрольних групах (необроблені і оброблені контрольним Ід; п-16) становив 0,2см", в той час, як середній об'єм в групі, обробленій ВСМА-Ід (п-7) дорівнював 0,1смУ, зниження об'єму пухлин на 5095. У групі, обробленій ВСМА-І9, у 5796 мишей об'єм пухлин був менше 0,1см? через 50 діб, в той час, як тільки 6965 контрольних оброблених мишей зберігали таке невелике пухлинне навантаження. Через 60 діб після імплантації пухлин середній об'єм пухлин в контрольній групі збільшувався до 0,Зсм?. У протилежність середній об'єм пухлин в групі, обробленій ВСМА-Ід, складав як і раніше менше 0,2см? (0,188). сч 29 Для мишачої лінії МІНЗТЗ, яка також росте повільніше, ніж лінії карциноми ободової кишки, заявники Го) імплантували 5х1059 клітин в 100мкл не утримуючого пірогенів, стерильного РВЗ і обробляли, як описано вище.

Клітини МІНЗТЗ утворювали фібросаркому при підшкірній імплантації у мишей Ми/Ми. Через 4 тижні виявляли пальповані пухлини, і в контрольних групах (п-11) ці пухлини зростали протягом подальших 10 діб до об'єму, що со зр досягає середнього значення 0,136бсм З, У протилежність об'єм пухлин в групі, обробленій ВСМА-І9 (п-5), досягав значення тільки 0,0Зсм 3. 7895 зниження пухлинного навантаження. На 48 добу після імплантації б середній об'єм пухлин в контрольних групах досягав 1,бсм У, в той час, як середній об'єм пухлин в групі, - обробленій ВСМА-1Ід, дорівнював тільки 0,8см?У, 5095 зниження об'єму пухлин. До 52 доби 8295 (9/11) тварин в «т контрольних групах було оцінено, як такі, що знаходяться на термінальній стадії, засновуючись на об'ємі 32 пухлин, який складав більше 1,5смУ, тільки 1895 тварин залишалося живими. У протилежність 4095 (2/5) тварин в - групі, обробленій ВСМА-Ід, мало пухлини такого об'єму, що їх необхідно було вбити, живими залишалося ще 6090 тварин. Ці результати представлені в таблиці 3. їх 2 з с 0 днполятмплантаці, щ ; Контоль 010090 |в 18

Всмаля ло лою во | во -і Дані, що показують зростання пухлин МІНЗТЗ протягом часу, представлені на Фігурі 13. Дані, що показують ї» зростання пухлин ЗМУ480 протягом часу, представлені на Фігурі 14. Дані, що показують зростання пухлин НТ29 протягом часу, і діаграма розсіювання, що показує окремих тварин на 42 добу після імплантації пухлини, -і представлена на Фігурі 15А. Дані, що показують зростання пухлин А5б49 у окремих тварин на 50 і 60 добу після с 50 імплантації, представлені на Фігурі 158.

Дані з інгібування зростання пухлин для лінії пухлинних клітин МІНЗТЗ представлені на Фігурі 13. Дані з і42) інгібування зростання пухлин для лінії пухлинних клітин 5УУ480 представлені на Фігурі 14. Дані з інгібування зростання пухлин для лінії пухлинних клітин НТ29 і АБ549 представлені на Фігурі 15.

Приклад 8: ВСМА-Ід спричиняє зниження кількості В-клітин у нормальних мишей

Мишей ВАЇ В/с самиць у віці восьми тижнів одержували з даскзгоп І арогайгу (Ваг Нагброг, МЕ). о Миші (З групи) одержували внутрішньоочеревинно або РВ5, з 400мкг людського злитого білска ВСМА-пПИЇДСІ (НВСМА-1І9) (від Тегеза Саснего, Віодеп) або 40О0мкг очищеного людського Іде (Нидс) (Западог, Вазеї!, Швейцарія) іме) на дні -8, -5, -1 Її 2. Миші одержували 100мкл 1095 суспензії овечих еритроцитів (ЗКВС) (СоЇогадо Зегит

Сотрапу, Оепмег, СО) на 0 день. бо При розкритті при пункції серця збирали кров в пробірки, що містять ЕДТА, і еритроцити лізували в гіпотонічному буфері. Кров також збирали без ЕДТА для приготування сироватки. Готували окремі клітинні суспензії з селезінки і брижових лімфатичних вузлів (МІ М) і еритроцити лізували в гіпотонічному буфері.

Проводили проточну цитометрію з використанням РЕ-кон'югованих анти-СО45К/8220, анти-синдекан/сО138 і анти-87.2 і ФІТЦ-кон'югованого анти-ІдМ і анти-СО45К/8220-антитіло. Все тАбБз одержували від Рпагтіпдеп (Зап 65 ВБіведо, СА). Стисло, Рс-рецептори блокували 1Омкг/мл Ес-блоку (Рпагтіпдеп) протягом 15бхв. на льоду з подальшим додаванням РЕ- і ФІТЦ-кон'югованих тАбрз», і інкубували на льоду протягом 20-3Охв. Клітини промивали 1 раз і суспендували в 0,595 параформальдегіді. Дані з флуоресценції клітин одержували на проточному цитометрі РАСзЗсСаїїригтм (Весіоп ОісКіпвоп, Зап дове, СА) і аналізували з використанням програмного забезпечення СЕЇ | Оцевітм (Весіоп Оіскіпвоп).

Після обробки НВСМА-Ід було відмічено приблизно 5095 зниження кількості В-клітин в периферичній крові і в досліджених периферичних лімфоїдних органах. В2говисокі | |дмнизькі В-клітини складали відповідно 23,495 і 21,595 клітин у мишей, оброблених РВ5 і Нидо, в той час, як дана популяція становила тільки 9,995 клітин у мишей, оброблених ЯНВСМА-І9д. Виявилося, що число плазматичних клітин (синдекан/СО138ж) було декілька знижено при відповідно 5,795 і 4,895 в крові мишей, оброблених РВЗ і Нидс, у порівнянні з 3,995 у мишей, 70 оброблених АВСМА-І9д. Молекула В7.2 позитивно регулювалася відповідно при 3,195 і 4,595 В220-- клітин у мишей, оброблених РВ5 і Нидо, у порівнянні з 1,995 у мишей, що одержали обробку АВСМА-19.

У селезінці кількість В22овисоких.-В-клітин була помітна нижче у мишей, оброблених АВСМА-1І9, і дорівнювало 18,895 у порівнянні з відповідно 36,795 і 40956 у мишей, оброблених РВ5З і Ниїдо. Дане зниження спостерігали в обох ІдімМ високих | Ідмнизьких субпопуляціях (дивись таблицю 1). Не було змін в кількості щойно утворених

В-клітин в селезінці, В22овисоких || низьких (Дані не представлені). Виявилося, що кількість плазматичних клітин (синдекан/СО138-) була декілька знижена при відповідно 3,395 і 3,495 в селезінці мишей, оброблених РВ5 і

Нидо, у порівнянні з 2,495 у мишей, що одержали АВСМА-19.

У МІМ було встановлене зниження В220-- В-клітин при 14,195 у мишей, оброблених АВСМА-1І9, у порівнянні з уй відповідно 26,795 і 35,895 у мишей з обробкою РВ5 і НиЇдо. Дані представлені в таблиці 4. с 5 о со зо й

Брик 00000010 м

Забуферений фосфатом фізіологічний розчин(РВ) 2671111 « вює 1111 вяя1 всмаша 77711111 11111111 ї-

Мишей обробляли, як описано в розділі "Матеріали і методи", і дані представлені у вигляді процента стандартне відхилення «

На основі зниженого рівня В7.2- В-клітин в крові і плазматичних клітин в крові і селезінці мишей, оброблених НВСМА-І9, після імунізації ЗЕВС, можна передбачити, що є інгібування активації і/або дозрівання но) с В-клітин і потенційно підвищена елімінація активованих В-клітин. Дуже невеликий процент антиген-специфічних з» В-клітин буде активуватися і давати відповідь на будь-який антиген, і в цьому випадку на 5КВС. Внаслідок того, що обробка АНВСМА-Ід приводить до такого помітного зниження процента В-клітин у всіх досліджених тканинах, на 5095, виявилося, що активність АВСМА-Ід розповсюджується також на зрілі В-клітини, що знаходяться в спокої. це. Отже, очікується, що злитий ВСМА-білок можна використати як лікувальний препарат з клінічним їз застосуванням при опосередкованих В-клітинами захворюваннях. Захворювання будуть включати такі, які є аутоїмунними за своєю природою, такими, як системний червоний вовчак, важка, псевдопаралітична міастенія, це. аутоїмунна гемолітична анемія, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура, антифосфоліпідний синдром, хвороба

Ге) 20 Чагаса, хвороба Грейвса, грануломатоз Вегенера, поліартеріїт нодозний і швидко прогресуючий гломерулонефрит. Терапевтичний агент буде також мати застосування при порушеннях, пов'язаних з со плазматичними клітинами, таких, як множинна мієлома, макроглобулінемія Вальденстрема, захворювання, пов'язане з важким ланцюгом імуноглобулінів, первинний або пов'язане з імуноцитами амілоїдоз, моноклональна гамапатія невизначеного значення (МШОИЗ). Онкологічні мішені будуть включати В-клітинну карциному, лейкемію 29 | лімфому.

Ф! Фахівцям в даній області, очевидно, буде зрозуміло, що можна зробити різні модифікації і варіації в поліпептидах, композиціях і способах за винаходом, не змінюючи суті або об'єму винаходу. Таким чином, о мається на увазі, що даний винахід включає модифікації і варіації даного винаходу за умови, що вони співпадають з об'ємом прикладеної формули винаходу і її еквівалентами. 6о Список послідовностей

Claims (1)

1. Формула винаходу бо 1. Спосіб лікування раку у ссавця, де ракові клітини експресують ліганд, який індукує проліферацію (АРКІУ), при цьому вказаний спосіб включає введення вказаному ссавцеві терапевтично ефективної кількості композиції, що містить щонайменше один із наступних компонентів: а) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 95 з послідовністю, яка представлена амінокислотами 1-184 в ЗЕО ІЮО МО:8, при цьому поліпептид здатний зв'язуватися з АРКІЇ ; Б) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на 80 95 з послідовністю, яка представлена амінокислотами 1-52 в ЗЕО ІЮ МО:8, при цьому поліпептид здатний зв'язуватися з АРКІЇ; с) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка представлена амінокислотами 8-41 в 5ЕО ІЮ МО:8, при цьому поліпептид здатний зв'язуватися з АРКІЇ; а) антитіло, направлене проти 5ЕО ІЮ МО:8. 70 2. Спосіб за п. 1, в якому поліпептид, визначений в а), Б) або с), додатково містить сигнальну послідовність секретованого білка.

   3. Спосіб за п. 1, в якому поліпептид, визначений в а), Б) або с), додатково містить Ес-домен імуноглобуліну.

   4. Спосіб за п. 3, в якому імуноглобулін являє собою дос.

   5. Спосіб за п. 4, в якому імуноглобулін являє собою імуноглобулін людини.

   6. Спосіб за п. 5, в якому поліпептид містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:12.

   7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, в якому ракові клітини являють собою карциному.

   8. Спосіб за п. 7, в якому карцинома вибрана з групи, що складається з карциноми легені, карциноми ободової кишки, карциноми простати та карциноми молочної залози.

   9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, в якому ссавець є людиною. се що о (ее) Зо Ф ча «І - -

   с . а -І т» -І (се) со ко бо б5