JP4880155B2 - Ａｐｒｉｌレセプター（ｂｃｍａ）およびその使用 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、癌を処置する方法に関する。本発明の方法は、特定の腫瘍壊死薬剤（ＴＮＦ）アンタゴニストの投与を包含する。
【０００２】
（発明の背景）
サイトカインの腫瘍壊死薬剤（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーは、ますます拡大しつつある重要な生物学的機能に関与する。ＴＮＦファミリーの各々のメンバーは、レセプタータンパク質の並列のファミリーの１つ以上のメンバーに結合することによって作用する。ついで、これらのレセプターは、広汎な生理学的応答および発生学的応答を誘導するように細胞内シグナル伝達を行う。これらのレセプターシグナルの多くは、細胞の運命に影響し、そしてしばしば末期分化を誘発する。細胞分化の例としては、増殖、成熟、移動および死が挙げられる。
【０００３】
ＴＮＦファミリーメンバーは、ＩＩ型膜結合タンパク質であり、短い細胞内Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞表面の外側に存在するＣ末端レセプター結合ドメインを有する。いくつかの場合、そのタンパク質の細胞外部分が切断されて離され、サイトカインの分泌形態を生成する。膜結合型タンパク質は、おそらくそのレセプターとの細胞接触媒介相互作用を介して局所的に作用する一方で、分泌形態は、循環または分散させる能力を有し、それゆえ遠距離部位において作用し得る。膜結合型形態および分泌形態の両方は三量体として存在し、そしてレセプタークラスター化を容易にすることによってそのシグナルをレセプターに伝達すると考えられる。
【０００４】
ＴＮＦレセプタータンパク質ファミリーは、１つ以上のシステインリッチ細胞外ドメインを有することによって特徴付けられる。各々のシステインリッチ領域は、ジスルフィド結合コアドメインを形成し、これは、リガンド結合ポケットを形成する三次元構造に寄与する。このレセプターは、Ｉ型膜結合型タンパク質であり、ここでは、細胞外ドメインがＮ末端、続いて膜貫通ドメインおよびＣ末端細胞内ドメインによってコードされる。細胞内ドメインは、レセプターシグナル伝達を担う。いくつかのレセプターは、細胞内「死ドメイン」を含み、これは、細胞アポトーシスをシグナル伝達し得、そしてこれらは、細胞氏の強力なインデューサーであり得る。別のクラスのレセプターは、細胞死を弱く誘導し得、これらは死ドメインを欠くようである。第三のクラスのレセプターは、細胞死を誘導しない。すべてのクラスのレセプターは、細胞型または他のシグナルの発生に依存して細胞死の代わりに細胞増殖または細胞分化をシグナル伝達し得る。
【０００５】
ＴＮＦファミリー活性の多能性の性質において十分に研究された例は、主要なメンバーであるＴＮＦである。ＴＮＦは、膜結合型サイトカインとして存在し得、または切断および分泌され得る。両方の形態が２つのＴＮＦレセプターであるＴＮＦ−Ｒ５５およびＴＮＦ−Ｒ７５に結合する。もともとは、ＴＮＦが腫瘍細胞を直接殺傷する能力にもとづいて記載されたが、ＴＮＦはまた、広汎な免疫プロセスを制御し、これには、急性炎症反応を誘導すること、およびリンパ組織ホメオスタシスの維持が含まれる。二重の役割に起因して、このサイトカインは、種々の病理的設定において役割を果たし得、アゴニストおよびアンタゴニストの両方の試薬が疾患の改変薬剤として開発されている。例えば、ＴＮＦおよびＬＴα（これはまた、ＴＮＦレセプターを通じてシグナル伝達する）は、癌のための処置において使用されており、特に、四肢の肉腫のような周辺部位に存在するがんの処置において使用されている。この設定において、レセプターを介したサイトカインによる直接にシグナル伝達は、腫瘍細胞死を誘発する（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ，１９９６、Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ ７：９３−１２４）。
【０００６】
免疫学的設定において、ＴＮＦレセプターシグナル伝達をブロックする薬剤（例えば、抗ＴＮＦ ｍＡｂ、可溶性ＴＮＦ−Ｒ融合タンパク質）を使用して、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患のような疾患が処置されている。これらの病理において、ＴＮＦは、細胞増殖およびエフェクター機能を誘導するように機能し、それにより、自己免疫疾患を悪化させ、そしてこの設定において、そのレセプターへのＴＮＦの結合をブロックすることにより、治療的効果を有する（Ｂｅｕｔｌｅｒ，１９９９．Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２６ Ｓｕｐｐｌ ５７：１６−２１）。
【０００７】
より最近になって発見されたリガンド／レセプター系が類似の操作に受け入れ可能であるようである。ＬＴαとヘテロトリマーを形成するＴＮＦファミリーメンバーであるリンホトキシンβ（ＬＴβ）は、ＬＴβ−Ｒに結合する。ＬＴβ−Ｒを発現するいくつかの腺がん腫瘍細胞は、アゴニスト性抗ＬＴβ−Ｒ ｍＡｂで処置されるときに、殺傷または分化され得る（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８３：８６７−８７８）。免疫学的設定において、抗ＬＴβ ｍＡｂまたは可溶性ＬＴβ−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が炎症性腸疾患の発生を、おそらく樹状細胞およびＴ細胞の相互作用に影響を与えることによって、ブロックし得る（Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．１９９８、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１５：１４６４−１４７５）。
【０００８】
ＴＲＡＩＬ系はまた、癌治療としての可能性を有する。ＴＲＡＩＬは、多数の膜結合型レセプターおよび可溶性レセプターと相互作用する。これらのレセプターの２つＴＲＡＩＬ−ＲｌおよびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（これらはまた、ＤＲ４およびＤＲ５とも呼ばれる）は、死を誘発するシグナルを腫瘍細胞に伝達するが、死を誘発しないさらなるＴＲＡＩＬレセプターを発現する正常細胞には伝達しない。これらのさらなるレセプターは、デコイとして機能すると考えられている。腫瘍細胞を殺傷するための可溶性ＴＲＡＩＬの使用は、腫瘍細胞以外の正常細胞におけるデコイレセプターの選択的発現に依存する（Ｇｕｒａ，１９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：７６８）．
腫瘍細胞はそれ自体がしばしば、免疫認識またはエフェクター機能をブロックする、種々のデコイレセプターを発現する。実際、いくつかの腫瘍は、ＴＲＡＩＬデコイレセプターを過剰発現し、ＴＲＡＩＬ媒介性死を回避するようである（Ｓｈｅｉｋｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：４１５３−４１５９）。これは、いくつかの設定において抗腫瘍薬剤としてのＴＲＡＩＬの有用性を制限する。類似の観察が、肺癌細胞および結腸癌細胞によって過剰発現される、ＦＡＳ−Ｌに対するデコイレセプターについてなされており（Ｐｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｎａｔｕｒｅ ３９６：６９９−７０３）、そしてＩＬ−１レセプターアンタゴニストについてもなされている（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ａｎｎ．Ｎ Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４０：３３８−３５１）。デコイレセプターはまた、宿主防御機構から宿主細胞を保護するために、ウイルスゲノムによって使用される。
【０００９】
ＡＰＲＩＬ（増殖誘発リガンド（Ａ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ））は、ＴＮＦファミリーのタンパク質のあらたなメンバーである。ＡＰＲＩＬ発現および機能の研究によって、このタンパク質が腫瘍細胞によって利用されて迅速な増殖を誘発することが示唆されている。可溶性ＡＰＲＩＬタンパク質で処置されたかまたはＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍細胞株は、インビトロで迅速に増殖する。免疫不全マウスに移植された、ＡＰＲＩＬでトランスフェクトされた細胞は、腫瘍のように迅速に増殖する。最後に、ヒト腫瘍細胞は、高レベルのＡＰＲＩＬメッセンジャーＲＮＡを発現するが、正常な組織は発現しない。これらの観察によって、ＡＰＲＩＬは、腫瘍細胞によっても発現されるレセプターに結合し、オートクラインまたはパラクラインでの腫瘍細胞活性化を設定する。さらに、ＡＰＲＩＬは、他の疾患の状況において作用し、その結果、ＡＰＲＩＬ経路の活性化またはブロックがさらなる有用性を有することが可能である。例えば、ＡＰＲＩＬの過小発現または過剰発現は、発生欠損において役割を果たし得る。なぜなら、発生はしばしば、細胞増殖と細胞死との間の慎重に制御されたバランスによって特徴付けられるからである。同様に、ＡＰＲＩＬは、細胞増殖性疾患において作用し得、その結果、いくつかの自己免疫疾患（例えば、狼瘡）または細胞集団が迅速に拡大する炎症性疾患（例えば、細菌敗血症）との関連で生じる。
【００１０】
ＴＮＦおよびＴＮＦレセプターファミリーメンバーのアゴニストおよびアンタゴニストの疾患改変薬剤としての公知の有用性に基づいて、ＡＰＲＩＬ経路は、それ自体が、薬物開発の重要な標的として代表する。このことは、癌治療について特に当てはまる。なぜなら、腫瘍細胞は、ＡＰＲＩＬを生成および利用して、自分自身の増殖を抑制するようであり、そしてそれゆえＡＰＲＩＬ経路のデコイレセプターまたは他のアンタゴニストを生成しないようであるからである。従って、ＡＰＲＩＬ経路は、例えば、腫瘍デコイレセプターによって阻害され得る、ＴＲＡＩＬ経路ともＦＡＳ−Ｌ経路とも特有に異なる。
【００１１】
癌についての現在の処置は、多くの腫瘍型について、貧弱な効力、生存率に対する低い印象、重症副作用を生じる毒性、またはそれらの組み合わせに起因して不適切である。従って、重症副作用を誘導することなく、効力を提供し得る癌増殖を処置するためのさらなる方法を、同定および開発するための必要性が存在する。従って、抗ＡＰＲＩＬ ｍＡＢ、抗ＡＰＲＩＬレセプター ｍＡｂ、可溶性ＡＰＲＩＬレセプター−Ｉｇ融合タンパク質、天然のアンタゴニスト、低分子アンタゴニスト、および化学的、薬学的または他のアンタゴニストを含む、ＡＰＲＩＬ経路のアンタゴニスト有用である。
【００１２】
この目的のために、本発明者らは、ＡＰＲＩＬに対するレセプターとして、Ｂ細胞媒介性タンパク質（ＢＣＭまたはＢＣＭＡ）を同定した。
【００１３】
（発明の要旨）
出願人は、ＢＣＭＡが腫瘍壊死薬剤であるＡＰＲＩＬのレセプターであることを見出した。ＡＰＲＩＬは、ＷＯ９９／１２９６５において以前に記載されたのと同じ分子であり、これは、本明細書において参考として援用される。ＡＰＲＩＬレセプターは、本明細書において以後「ＡＰＲＩＬ−Ｒ」と称される。本発明は、癌を有するかまたはその危険のある哺乳動物種の処置のための方法、およびそれにおいて使用するための薬学的調製物に関する。そのような被験体としてはすでに癌に罹患した被験体、または癌治療をすでに受けた被験体が挙げられる。
【００１４】
本発明の方法および組成物は、癌治療薬剤である特定の薬剤（本明細書においてＡＰＲＩＬ−Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＡＰＲＩＬ−Ｒ抗体を含む）と称される）が、本明細書において定義される癌を発生する危険があるか、または癌処置を必要とする被験体において使用され得るという発見を部分的に利用する。
【００１５】
本発明の癌治療薬剤は、選択された薬剤に適合する任意の投与経路によって投与され得、そしてその投与経路に適切な任意の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。好ましい投与経路は、非経口であり、特に、静脈内、腹腔内および嚢内である。処置はまた、好ましくは、外来患者として長期にわたり行われる。この癌治療剤の一日投薬量は、０．０１−１０００μｇ／ｋｇ体重の範囲、およびより好ましくは約１０−３００μｇ／ｋｇ体重の範囲と予期されるが、正確な投薬量は、使用される特定の癌治療薬剤および特定の被験体の医学的状態および履歴に依存して、変動する。
【００１６】
本発明の処置は、哺乳動物の身体から形質転換した細胞の実質的なクローン集団（コロニー）を消失させるにおいて、またはもっとも一般的に腫瘍と称される、コロニーの増殖を抑制もしくは弱毒化するために有用である。それ自体、それらは、寿命を延長するにおいて、および癌の危険にあるか、またはすでに癌に罹患した被験体の生命の品質を維持するにおいて有用である。
【００１７】
（詳細な説明）
（定義）
請求される本発明の主題をより明確および簡潔に指摘するために、以下の定義を、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語について提供する。
【００１８】
本発明は、今度は、以下の詳細な説明を参照して記載される。その中で以下の定義が包含される。
【００１９】
用語「ＡＰＲＩＬレセプター」または「ＡＰＲＩＬ−Ｒ」とは、本明細書において使用されるとき、ネイティブ配列のＡＰＲＩＬ−ＲおよびＡＰＲＩＬ−Ｒ改変体を包含する。ＡＰＲＩＬ−Ｒは、種々の供給源（例えば、マウスまたはヒトの組織型または別の供給源）から単離され得るか、または組換えもしくは合成の方法によって調製され得る。用語ＡＰＲＩＬ−Ｒは、腫瘍壊死ファミリーメンバーＡＰＲＩＬまたはそのホモログもしくはフラグメントに結合し得るポリペプチドをさらにいう。ＡＰＲＩＬ−Ｒの例は、ＢＣＭＡである。
【００２０】
用語「ＢＣＭＡ」または「ＢＣＭ」とは、以下に記載されるようなＢ細胞成熟のための新規タンパク質をいう：Ｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：１０９３−１１０６，「ＢＣＭＡｐ ：ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｔｕｒｅ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」；Ｙ．Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２），ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，３８９７−３９０４，「Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅ ＢＣＭ ｏｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １６ ｉｓ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｇｅｎｅ ｂｙ ａ ｔ （４； １６） （ｑ２６； ｐｌ３） ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍａｌｉｇｎａｎｔＴ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ」。
「ネイティブ配列ＡＰＲＩＬ−Ｒ」とは、天然に由来するＡＰＲＩＬ−Ｒと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。そのようなネイティブ配列ＡＰＲＩＬ−Ｒは、天然から単離され得るか、または組換えもしくは合成の手段によって生成され得る。ネイティブ配列ＡＰＲＩＬ−Ｒは、天然に存在する、短縮形態かまたは分泌形態のＡＰＲＩＬ−Ｒ（例えば、例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶性形態）、ＡＰＲＩＬ−Ｒの天然に存在する改変体形態（例えば、選択的スプライシング形態）および天然に存在する対立遺伝子変異体をいう。本発明の１つの実施形態において、ネイティブ配列ＡＰＲＩＬ−Ｒは、配列番号８のアミノ酸１〜１８４を含む、成熟または全長のネイティブ配列ＡＰＲＩＬ−Ｒポリペプチド、あるいはそのフラグメントである。
【００２１】
「ＡＲＰＩＬ−Ｒ細胞外ドメイン」または「ＡＰＲＩＬ−Ｒ ＥＣＤ」とは、ＡＰＲＩＬ−Ｒの膜ドメインおよび細胞質ドメインを本質的に含まない形態のＡＰＲＩＬ−Ｒをいう。通常、ＡＰＲＩＬ−Ｒ細胞外ドメインは、１％未満のそのような膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有し、そして好ましくは、０．５％未満のそのようなドメインを有する。必要に応じて、ＡＰＲＩＬ−Ｒ ＥＣＤは、配列番号８のアミノ酸残基１〜５１または１〜５２または１〜５３を含む。好ましい実施形態において、ＡＰＲＩＬ−ＥＣＤは、配列番号８のアミノ酸残基４〜５１、またはより好ましくは、配列番号８のアミノ酸残基８〜５１を包含する。当業者には、本発明のＡＰＲＩＬ−Ｒポリペプチドの膜貫通ドメインは、その型の疎水性ドメインを同定するについて当該分野において慣用的に使用される基準に従って同定される。膜貫通ドメインの正確な境界は、変動し得るが、最もおそらく、本明細書において具体的に言及されたドメインのいずれかの末端の５アミノ酸以内である。
【００２２】
「ＡＰＲＩＬ−Ｒ改変体」とは、全長ネイティブ配列ＡＰＲＩＬ−Ｒについて配列番号５に示される推定アミノ酸配列を有するか、またはＡＰＲＩＬ−Ｒ ＥＣＤ配列を有する、ＡＰＲＩＬ−Ｒと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有すると以下に定義されるような活性ＡＰＲＩＬ−Ｒを意味する。そのようなＡＰＲＩＬ−Ｒ改変体としては、例えば、ＡＰＲＩＬ−Ｒポリペプチドであって、配列番号８の配列の末端またはＣ末端において１つ以上のアミノ酸残基が付加、または欠失されているものが挙げられる。通常、ＡＰＲＩＬ−Ｒ改変体は、少なくとも約８０％または８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を、配列番号８のアミノ酸配列に対して有する。
【００２３】
「百分率（パーセント）（％）アミノ酸配列同一性」とは、本明細書において同定される、ＡＰＲＩＬ−Ｒ配列に関して、配列を整列し、そして必要に応じてギャップを導入して、最大の百分率配列同一性を達成し、配列同一性の部分として任意の保存置換を考慮した後の、ＡＰＲＩＬ−Ｒにおけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率と定義される。百分率アミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、例えば、公に利用可能なコンピュータソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を用いた、当該分野の技術範囲内にある、種々の方法において達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大の整列を達成するに必要な任意のアルゴリズムを含め、整列を測定するための適切なパラメータを決定し得る。
【００２４】
用語「エピトープタグ化」とは、本明細書において使用されるとき、ＡＰＲＩＬ−Ｒを含むキメラポリペプチド、またはそのドメイン配列であって、「タグポリペプチド」に融合されたものをいう。タグポリペプチドは、抗体が作成され得るエピトープか、または何らかの他の薬剤によって同定され得るエピトープを提供するに十分であるが、ＡＰＲＩＬ−Ｒの活性には干渉しないように十分短い残基を有する。このタグポリペプチドは、好ましくはまた、その抗体が実質的に他のエピトープとは交叉反応しないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、概して、少なくとも６アミノ酸残基、そして通常約８アミノ酸残基と約５０アミノ酸残基との間を有する（好ましくは、約１０残基〜約２０残基である）。
【００２５】
「単離された」とは、本明細書において開示される種々のポリペプチドを記載するために使用され、その天然の環境の成分から同定され、そして分離され、そして／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、そのポリペプチドについて診断または治療上の使用を代表的に妨害し、そして酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい実施形態において、そのポリペプチドは、以下にまで精製される：（１）Ｎ末端の少なくとも１５残基を得るに十分な程度、またはスピンカップ配列決定機の使用によるアミノ酸配列決定するに十分な程度、あるいは（２）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて非還元または還元の条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥでの均質の程度。単離されたポリペプチドとしては、組換え細胞内のインサイチュのポリペプチドが挙げられる。なぜなら、ＡＰＲＩＬ−Ｒの天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００２６】
用語「抗体」は、その最も広義な意味で使用され、そして具体的には単一のＡＰＲＩＬ−Ｒモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗ＡＰＲＩＬ−Ｒ抗体組成物を包含する。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用され、実質的に均質な抗体（すなわち、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異体を除き、その集団を含む個々の抗体が同一である）の集団から得られる抗体をいう。
【００２７】
ポリペプチドの「精製された調製物」または「実質的に純粋な調製物」とは、本明細書において使用され、天然においてはそれに付随する他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、そのポリペプチドはまた、それを精製するために使用される他の物質（例えば、抗体、マトリクスなど）からも分離されている。
【００２８】
用語「処置する」、「処置」および「治療」とは、本明細書において使用され、治癒のための治療、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）のための治療および予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）のための治療をいう。
【００２９】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、本明細書において互換的に使用される。
【００３０】
本明細書中に使用される場合「生物学的に活性な」は、直接または間接的に実行され得るインビボ活性またはインビトロ活性を有することを意味する。ＡＰＲＩＬ−Ｒの生物学的に活性なフラグメントは、例えば、レセプターの活性部位と７０％のアミノ酸相同性、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し得る。レセプターに関する同一性または相同性は、本明細書において、配列番号８のＡＰＲＩＬ−Ｒ残基に対して同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として規定される。
【００３１】
本明細書中に使用される場合、用語「哺乳動物」は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウスおよびネコを含む哺乳動物として分類される任意の動物をいう。本発明の好ましい実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００３２】
本発明の実施には、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の範囲内である。このような技術は文献中に記載される。
【００３３】
ここで詳細に、本発明の好ましい実施形態に対する参照がなされる。本発明は、Ｂ細胞および非Ｂ細胞の増殖および成熟をもたららす（特にこれらが腫瘍細胞に関連する場合）ためのＡＰＲＩＬ−ＲおよびＡＰＲＩＬ−Ｒ関連分子の使用に関する。本発明はまた、免疫関連障害に必要とされるような免疫系の応答をもたらすためのＡＰＲＩＬ−ＲおよびＡＰＲＩＬ−Ｒ関連分子の使用に関する。さらに、本発明は、遺伝子治療法を介するＡＰＲＩＬ−ＲまたはＡＰＲＩＬ−Ｒ関連遺伝子の使用を通じた癌および免疫障害の処置を含む。
【００３４】
本発明の配列で形質転換された宿主によって産生されるＡＰＲＩＬ−Ｒおよびそのホモログ、または既知のアミノ酸配列から産生されるＡＰＲＩＬ−Ｒおよびそのホモログ、ならびに当該分野で公知のプロセスによって精製されるネイティブなＡＰＲＩＬ−Ｒは、抗癌、抗腫瘍および免疫調節適用に関する種々の方法において有用である。これらはまた、他の疾患に向けられる治療および方法において有用である。
【００３５】
本発明の別の局面は、ＡＰＲＩＬ−Ｒをコードする単離された核酸によってコードされるポリペプチドの「アンチセンス」治療における使用に関する。本明細書中に使用される場合、「アンチセンス」治療は、コードされるタンパク質の発現を阻害するように（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）、細胞状態の下で目的のリガンドをコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体の、投与またはインサイチュ生成をいう。結合は、従来の塩基対相補性により得るか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖への結合の場合、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介し得る。一般的に、「アンチセンス」治療は、当該分野で一般的に使用される技術範囲をいい、そしてオリゴヌクレオチド配列の特異的結合に依存する任意の治療が挙げられる。
【００３６】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、発現プラスミドとして送達され得、この発現プラスミドは、細胞中で転写される場合、Ｋａｙリガンドをコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であるＲＮＡを産生する。あるいは、アンチセンス構築物は、エキソビボで生成されるオリゴヌクレオチドプローブであり得る。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは改変されたオリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは、内因性ヌクレアーゼに耐性であり従ってインビボで安定である。アンチセンスオリゴヌとしての使用のための例示的な核酸分子は、ホスホラミデートアナログ、ホスホチオエートアナログ、およびメチルホスホネートアナログのＤＮＡである（例えば、第５，１７６，９９６号；第５，２６４，５６４号；および第５，２５６，７７５号を参照のこと）。さらに、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築するための一般的な手段は、例えば、Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎら（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９−２６６８（これらは、詳細に本明細書中に参考として援用される）によって概説される。
【００３７】
上記のように、本発明のＡＰＲＩＬ−ＲはＴＮＦレセプターファミリーのメンバーである。タンパク質、そのフラグメントまたはホモログは、広範な治療適用および診断適用を有し得る。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、ＡＰＲＩＬ（本明細書中に参考として援用されるＷＯ９９／１２９６４中に以前記載されたポリペプチド）と特異的に相互作用する。しかし、本明細書中に開示されるペプチドおよび方法は、ＡＰＲＩＬ−Ｒまたはそのフラグメントと特異的に相互作用する分子の同定を可能にする。
【００３９】
特定の実施形態において、本願発明は、ＡＰＲＩＬへ結合する能力を有するＡＰＲＩＬ−Ｒ由来のペプチドを使用する方法を含む。ＡＰＲＩＬ−Ｒのフラグメントは、いくつかの方法（例えば、組換え的にか、ＰＣＲによってか、タンパク質分解消化、または化学合成によって）で産生され得る。ポリペプチドの内部フラグメントまたは末端フラグメントは、１つ以上のヌクレオチドを、このポリペプチドをコードする核酸の１つの末端または両末端から除去することによって作製され得る。変異誘発されたＤＮＡの発現は、ポリペプチドフラグメントを産生する。
【００４０】
ポリペプチドフラグメントはまた、従来のメリーフィールド固相ｆ−ｍｏｃまたはｔ−ｂｏｃ化学のような当該分野で公知の技術を用いて、化学合成され得る。例えば、本発明のペプチドおよびＤＮＡ配列は、フラグメントの重複を伴わずに所望の長さのフラグメントへ任意に分けられ得るか、または所望の長さの重複フラグメントへ分けられ得る。これらのような方法は、以下により詳細に記載される。
【００４１】
（可溶性形態のＡＰＲＩＬ−Ｒの作製）
可溶性形態のＡＰＲＩＬ−Ｒは、しばしば、効果的にシグナルを伝達し得、それ故に、天然の膜形態を目下模倣する薬物として投与され得る。本明細書中に主張されるＡＰＲＩＬ−Ｒは可溶性サイトカインとして自然に分泌されることは可能であるが、そうでない場合、分泌を強いるためにその遺伝子を再操作し得る。可溶性分泌形態のＡＰＲＩＬ−Ｒを作製するために、ＤＮＡレベルでＮ末端膜貫通領域、および軸領域のいくらかの部分を除去して、これらを選択された発現系において有効なタンパク質分解性切断を可能にするＩ型リーダー配列あるいはＩＩ型リーダー配列で置換する。当業者は、分泌発現構築物中に保持される軸領域の量を変更して、リガンド結合特性および分泌効率の両方を最適化し得る。例えば、全ての可能な軸の長さを含む構築物（すなわち、Ｎ末端短縮）が調製されて、その結果アミノ酸１〜５２で開始するタンパク質が生じ得る。最適な長さの軸配列は、この型の分析から生じる。
【００４２】
（ＡＰＲＩＬ−Ｒと反応性の抗体の作製）
本発明はまた、本願発明のＡＰＲＩＬ−Ｒまたはそのコレセプターと特異的に反応する抗体を含む。抗タンパク質／抗ペプチドの抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコール（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）によって作製され得る。マウス、ハムスターまたはウサギのような哺乳動物は、免疫原性形態のペプチドを用いて免疫され得る。タンパク質またはペプチドに免疫原性を与えるための技術としては、当該分野で周知のキャリアへの結合または他の技術が挙げられる。
【００４３】
ＡＰＲＩＬ−Ｒまたはそのコレセプターの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫の進行は、血漿または血清中の抗体検出によってモニターされ得る。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを抗原としての免疫原を共に使用して、抗体レベルを評価し得る。
【００４４】
好ましい実施形態において、本抗体は、ＡＰＲＩＬ−Ｒまたはそのコレセプターの抗原決定基（例えば、配列番号８のポリペプチドの抗原決定基）か、または密接に関連するヒト哺乳動物ホモログもしくは非ヒト哺乳動物ホモログ（例えば、７０、８０、または９０％の相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性）に対して免疫特異的である。本発明のなおさらに好ましい実施形態において、抗ＡＰＲＩＬ−Ｒ抗体または抗ＡＰＲＩＬコレセプター抗体は、例えば、配列番号８と８０％未満の相同性であるタンパク質；好ましくは配列番号８と９０％未満の相同性であるタンパク質；および最も好ましくは配列番号８と９５％未満の相同性であるタンパク質と、実質的に交差反応しない（すなわち、特異的に反応する）。「実質的に交差反応しない」により、抗体が、配列番号８のタンパク質に対する結合親和性の、１０％未満、より好ましくは５％未満、なおより好ましくは１％未満である、非相同性タンパク質に対する結合親和性を有することが意味される。
【００４５】
本明細書中に使用される場合、用語、抗体は、ＡＰＲＩＬ−Ｒまたはそのレセプターともまた特異的に反応するそのフラグメントを含むことが意図される。抗体は、従来技術を用いて断片化され得、そしてこのフラグメントは、全抗体に関して上部に記載された様式と同じ様式で有用性に関してスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって作製され得る。生じるＦ（ａｂ’）₂フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元するために処置されて、Ｆａｂ’フラグメントを生成し得る。本発明の抗体は、抗ＡＰＲＩＬ−Ｒ活性または抗ＡＰＲＩＬコレセプター活性を有する生物特異的分子およびキメラ分子を含むことがさらに意図される。従って、ＡＰＲＩＬ−Ｒおよびこれらのコレセプターに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（Ａｂ）の両方、ならびにＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂のような抗体フラグメントは、ＡＰＲＩＬ−Ｒおよびその各コレセプターの作用をブロックするために使用され得る。
【００４６】
種々の形態の抗体がまた、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９（１９９１）（これらは、本明細書中に参考として詳細に援用される））。例えば、動物抗体由来の抗原結合ドメインがヒト定常ドメインに連結されたキメラ抗体が構築され得る（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国４，８１６，５６７号（これは、本明細書中に参考として援用される））。キメラ抗体は、ヒト臨床処置に使用される場合、動物抗体によって誘発される観察される免疫原性応答を減少し得る。
【００４７】
さらに、ＡＰＲＩＬ−Ｒまたはそのコレセプターを認識する組換え「ヒト化抗体」が合成され得る。ヒト化抗体は、ほとんどヒトＩｇＧ配列（これに、特定の抗原結合を担う領域が挿入される）を含むキメラである。動物は、所望の抗原を用いて免疫され、対応する抗体が単離され、そして特定の抗原結合を担う可変領域配列の部分が取り除かれる。次いで、動物由来の抗原結合領域が、抗原結合領域が欠失されているヒト抗体遺伝子の適切な位置へクローン化される。ヒト化抗体は、ヒト抗体中の異種（すなわち、種間）配列の使用を最小化し、従って、処置される被験体において免疫応答をおそらくほとんど誘発しない。
【００４８】
異なるクラスの組換え抗体の構築はまた、可変ドメインおよび異なるクラスの免疫グロブリンから単離されたヒト定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含む、キメラ抗体またはヒト化抗体を作製することによって達成され得る。例えば、増加した抗原結合部位価を有する抗体は、抗原結合部位をベクター（ヒト：鎖定常領域を保有する）へクローニングすることによって組換え産生され得る（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：１４３９−１４５０（１９９３）（これは、本明細書中に参考として援用される））。
【００４９】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、抗原結合部位の付近でアミノ酸残基を変更することによって、組換え抗体のその抗原との結合親和性を変化し得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づく変異誘発によって増加され得る。（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１００２９−３３（１９８９）（本明細書中に参考として援用される））。
【００５０】
（アナログの作製：変更されたＤＮＡ配列およびペプチド配列の生成）
ＡＰＲＩＬ−Ｒのアナログは、アミノ酸配列においてかもしくは配列を含まない点において、またはこれら両方において、天然に存在するＡＰＲＩＬ−Ｒと異なり得る。非配列改変としては、インビボまたはインビトロのＡＰＲＩＬ−Ｒの化学誘導体化が挙げられる。非配列改変としては、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、またはグリコシル化における変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
好ましいアナログとしては、ＡＰＲＩＬ−Ｒの生物学的に活性なそのフラグメントが挙げられ、その配列は、ＡＰＲＩＬ−リガンドの活性を破壊しない、１つ以上の保存的アミノ酸置換によってか、１つ以上の非保存的アミノ酸置換によってか、欠失または挿入によって、配列番号８に提供される配列と異なる。保存的置換としては、代表的に、類似した特徴を伴う別のアミノ酸の代わりの１つのアミノ酸の置換（例えば、以下の群内の置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン）が挙げられる。
【００５２】
（用途）
全長ＡＰＲＩＬ−Ｒ遺伝子（配列番号８）またはその部分は、例えば、配列番号６に開示されるＡＰＲＩＬ−Ｒ配列に対して所望の配列同一性を有するさらに別の遺伝子を単離するためにｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。ＡＰＲＩＬ−Ｒをコードするヌクレオチド配列がまた使用されて、ＡＰＲＩＬ−Ｒをコードする遺伝子をマッピングするためおよび遺伝的障害を有する個体の遺伝分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築し得る。スクリーニングアッセイが設計されて、ＡＰＲＩＬ−Ｒの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出し得る。このようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリーの高スループットスクリーニングを受けやすいアッセイが挙げられ、小分子薬物候補物を同定することにこの化学ライブラリーを特に適切にする。意図される小分子としては、合成有機化合物または合成無機化合物が挙げられる。ＡＰＲＩＬ−Ｒまたはその改変形態をコードする核酸がまた使用されて、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製し得、これらは次には治療的に有用な試薬（例えば、癌試薬を含む）の開発およびスクリーニングにおいて有用である。
【００５３】
本発明の配列を用いて形質転換された宿主によって産生されるかまたは公知のアミノ酸配列から産生されるＡＰＲＩＬ−Ｒおよびそのホモログ、ならびに当該分野で公知のプロセスによって精製されるネイティブなＡＰＲＩＬ−Ｒは、抗癌適用のための種々の方法において有用である。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＰＲＩＬ−Ｒアンタゴニストを含む治療有効量の組成物を薬学的に受容可能な賦形剤と共に哺乳動物に投与することによって、所望されない細胞増殖と関連する状態に対してその哺乳動物を処置する方法であり、ここで、ＡＰＲＩＬ−Ｒアンタゴニストは、ＡＰＲＩＬとそのコグネイトレセプターとの間の相互作用を拮抗するペプチドを含む。
【００５５】
好ましい実施形態において、細胞表面上のＡＰＲＩＬのコグネイトレセプターは、ＢＣＭＡである。
【００５６】
この方法は、ＡＰＲＩＬとそのコグネイトレセプターとの間の相互作用を拮抗するポリペプチドを有する任意のＡＰＲＩＬ−Ｒアンタゴニストと共に使用され得る。ＡＰＲＩＬ−Ｒアンタゴニストの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：可溶性ＡＰＲＩＬ−Ｒポリペプチド（可溶性ＢＣＭＡを含むが、これに限定されない）；可溶性キメラＡＰＲＩＬ−Ｒ分子（ＢＣＭＡ−ＩｇＧ−Ｆｃを含むが、これに限定されない）および抗ＡＰＲＩＬ−Ｒ抗体ホモログ（抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体を含むが、これに限定されない）。
【００５７】
本発明の方法は、所望されない細胞増殖と関連する任意の条件を用いて使用され得る。特に、本発明の方法は、ＡＰＲＩＬおよび／またはＡＰＲＩＬ−Ｒ（すなわち、ＢＣＭＡ）を発現する腫瘍細胞を処置するために使用され得る。
【００５８】
細胞増殖がＡＰＲＩＬによって調節される癌の例は、インビトロで腫瘍組織ライブラリー中で発現されるＡＰＲＩＬおよび／またはＡＰＲＩＬ−Ｒ（すなわち、ＢＣＭＡ）メッセージのレベルを測定することによってスクリーニングされ得る。ＡＰＲＩＬおよび／またはＡＰＲＩＬ−Ｒ（すなわち、ＢＣＭＡ）メッセージが高度に発現される腫瘍組織ライブラリーが、候補物である。あるいは、候補物検索に関して公のデータベースおよび私的なデータベース（すなわち、Ｉｎｃｙｔｅデータベース）を、例えば、全長ヒトＡＰＲＩＬ ｃＤＮＡ配列を用いてスクリーニングし得る。これらの技術を適用することによって、例えば、ＡＰＲＩＬ ｍＲＮＡ発現は大多数の腫瘍型（以下の表１中に見出されるものを含むが、これらに限定されない）で検出されたことが見出された。
【００５９】
（表１）
【００６０】
【表１】

特定の腫瘍治療における所望されない細胞増殖に関連した状態を処置する際に使用される本発明のＡＰＲＩＬ−Ｒアンタゴニストは、１０％、２０％、３０％、または４０％を超える腫瘍細胞の増殖を有利に阻害し、そして最も有利には５０％を超える腫瘍細胞の増殖を阻害する。ＡＰＲＩＬ−Ｒアンタゴニストはスクリーニングにより得られる（例えば、実施例６における考察を参照のこと）。例えば、ＡＰＲＩＬ−Ｒアンタゴニストは、結腸腫瘍および肺腫瘍にそれぞれ由来するヒト結腸癌ＨＴ２９またはヒト肺癌Ａ５４９（例えば、図１５における考察を参照のこと）に対する増殖阻害活性（つまり、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％を超える）に基いて選択され得る。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、動物におけるＢ細胞および非Ｂ細胞の増殖、樹状細胞により誘導されるＢ細胞の増殖および成熟または免疫グロブリン産生をＡＰＲＩＬ−Ｒポリペプチドを使用して阻害する方法を提供する。
【００６２】
別の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患、高血圧症、心臓血管障害、腎障害、リンパＢ細胞増殖障害、免疫抑制性疾患、臓器移植、炎症、およびＨＩＶの処置においてＡＰＲＩＬ−Ｒを使用する方法を提供する。ＡＰＲＩＬ−Ｒとそのリガンドとの間のシグナル経路を含む免疫応答を処置し、抑制し、または変化するための薬剤を使用する方法もまた含まれる。
【００６３】
本発明はまた、ＡＰＲＩＬ−Ｒポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。例えば、ＡＰＲＩＬ−Ｒポリペプチドのための適切なキャリア、およびそれらの処方物は、Ｏｓｌｏらにより編集されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載される。代表的には、適切な量の薬学的に受容可能な塩が、処方物に等張性を与えるために処方物中に使用される。キャリアの例として、生理食塩液、リンガー溶液およびデキストロース溶液などのバッファーが挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８であり、そしてより好ましくは約７．４〜約７．８である。さらなるキャリアは、さらに固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性製剤を含み、このマトリックスは、成形された物品の形態（例えば、リポソーム、フィルム、またはミクロ粒子）にある。例えば、投与経路および投与されるＡＰＲＩＬ−Ｒポリペプチドの濃度に依存して特定のキャリアが好ましいことが、当業者に明らかである。
【００６４】
投与は、注射（例えば、静脈、腹腔内、皮下、筋内）または他の方法（例えば、効果のある形態で血流への送達を確実にする注入）により達成され得る。
【００６５】
別に示さない限り、本発明の実行には、当該分野の技術範囲である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の慣習的な方法を用いる。このような技術は、文献に記載される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅ ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）、１９８４；米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ １５４および１５５（Ｗｕら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編）、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ および Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）、１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８６を参照のこと。
【００６６】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、これらの限定として解釈されるべきではない。
【００６７】
（実施例）
以下に開示される実施例において以下の方法を使用した。
【００６８】
（方法：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるｍｙｃタグマウスＡＰＲＩＬ（ＣＣＭ７７６）のクローニングおよび発現）
発現ベクターｐＣＣＭ２１３．１０を、ＰＤＲ００４（ＦＲＡＧエピトープタグと共にＮ末端に付加したスーパーＦＡＳリガンドストークを有するＨ９８ｍｕＡＰＲＩＬ）を取得することおよびＳａｃＩからＮｏｔ１までのｍｕＡＰＲＩＬコード配列を切り取ることにより構築した。合成オリゴヌクレオチドＬＴＢ−５５９およびＬＴＢ−５６０は、α接合因子リーダー配列、ｍｙｃエピトープタグ、ならびにＦＡＳリガンド由来のＫＥＬモチーフを含むＸｈｏ−１−Ｓａｃ１リンカーを形成する。ｍｕＡＰＲＩＬフラグメントおよびｍｕＡＰＲＩＬリンカーの両方をＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現プラスミドであるｐｃｃｍ２１１のＸｈｏ−１−Ｎｏｔ１部位に連結した。
【００６９】
ＰＣＣＭ２１３．１０をＳｔｕ１で直線化し、ＧＳ１１５株（ｈｉｓ４−）にエレクトロポレートし、そしてデキストロースを含む最小培地にプレートした。リッチ培地（ＢＭＧＹ：緩衝化グリセロール複合培地）において代表的な単一コロニーを接種し、そしてそれを３０℃で４８時間の密度まで増殖させることにより、ＨＩＳ４形質転換体をタンパク質発現について分析した。培養物をスパンし、そして１．５％メタノールを含む誘導リッチ培地（ＢＭＭＹ：緩衝化メタノール複合培地）に細胞ペレットを再懸濁（１：５）した。３０℃で２日間のインキュベーションの後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ｍｕＡＰＲＩＬの存在を評価した。クーマシー染色およびウェスタンブロット（抗ｍｙｃ ｍＡｂ ９Ｅ１０を用いる）は、１つの株（ＣＣＭ７７６）が、十分な量のグリコシル化された形態のｍｙｃタグＨ９８ ｍｕＡＰＲＩＬタンパク質を産生することを示した。
【００７０】
（ｍｙｃ−ｍＡＰＲＩＬの精製）
アミノ酸１４９個のタンパク質であるｍｙｃ−ｍＡｐｒｉｌをｐｉｃｈｉａで発現した。このタンパク質は７．４５の等電点を有する。１７５ｍｌのｐｉｃｈｉａ上清を透析し、そして一昼夜、緩衝液をｐＨ６．８の１０ｍＭ トリスに交換し、次に２０ｍｌのＳＰカラムを通した。カラムをｐＨ６．８の１０ｍＭ トリス−ＨＣｌで十分に洗浄し、２５０ｎ ｍＭ ＮａＣｌのＰＢＳで溶出した。精製工程の第２段階は、ゲル濾過カラム（Ｓ３００）を使用して達成した。２０ｍｌのＳＰカラムからのｍｙｃ−Ａｐｒｉｌを含むフラクションを遠心分離により７ｍｌの容量まで濃縮した。ゲル濾過の後、ＯＤおよびクーマシーゲルにより検出されたｍｙｃ−ＡＰＲＩＬの８ｍｇを回収した。また、マウスモノクローナル９Ｅ１０抗体（抗ｍｙｃ）を使用するウェスタンブロット分析を行い、ｍｙｃタグが精製工程後に無傷であることを示した。精製されたタンパク質がｍｙｃ−ｍＡｐｒｉｌと一致することをＮ末端配列で確かめた。
【００７１】
（ＦＬＡＧ−ヒト Ａｐｒｉｌの精製）
プラスミドｐｓ４２９（後にｐ１４４８と名づけられた）を使用してリポフェクタミン剤（Ｇｉｂｃｏ−Ｂｒｌ）および無血清培地を使用して２９３Ｔ細胞を過渡的にトランスフェクトした。哺乳動物発現ベクターＰＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において構築されたプラスミドは、細胞培養培地へのＮ末端タンパク質を伴うヒトＡＰＲＩＬのレセプター結合ドメインをコードする。製造者の説明書（Ｋｏｄａｋ）に従って、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ Ｍ２カラムおよび過剰の精製されたＦＬＡＧペプチドを使用してＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬタンパク質を無血清培地から精製した。
【００７２】
（ＨＢＭＣＡ−Ｆｃの精製）
ＨＢＭＣＡ−Ｆｃを２９３細胞に過渡的にトランスフェクトした。ｈＢＣＭ−Ｆｃを過剰発現する２９３細胞由来の条件培地をプロテインＡカラムに充填した。２５ｍＭリン酸１００ｎＭ ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）を使用してタンパク質を溶出し、続いて１／２０容量の０．５Ｍ ＮａＰＯ₄（ｐＨ８．６）で中和した。ＯＤ２８０に基いて選択したフラクションを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルならびに非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび精製したタンパク質を同定するためのウェスタンブロットに供した。３ｍｇのタンパク質を５００ｍｌの条件培地から回収した。
【００７３】
（ｍｙｃ−ｍＡＰＲＩＬは、ＦＡＣＳ分析において種々の細胞株と結合する） ４５０ｎｇ／ｍｌの精製したｍｙｃ−ｍＡＰＲＩＬを１００μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳ＋Ｆｃブロッキング剤であるＦｃＢｌｏｃｋ ２０μｇ／ｍｌ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および精製したヒトＩｇＧ １０μｇ／ｍｌ（Ｓａｎｄｏｚ）中で細胞株と氷上で１時間結合させた。陽性結合を特異的ウサギ抗マウスＡＰＲＩＬ抗血清（１：５００）およびロバ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用して明らかにした。細胞株Ａ２０、Ｒａｊｉ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨＴ２９を提供者（ＡＴＣＣ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）により示唆された培地中で維持した。ＢＪＡＢ細胞を１０％ＦＢＳおよびＬ−グルタミンを補充したＨＥＰＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ中で培養した。競合アッセイにおいて、４５０ｎｇ／ｍｌのｍｙｃ−マウスＡＰＲＩＬを１μｇ／ｍｌの競合タンパク質と共に添加した。
【００７４】
（実施例１：プレートアッセイを使用するＡＰＲＩＬ−Ｒに対するＡＰＲＩＬ結合の検出）
本実施例において、ＡｐｒｉｌとのＢＣＭＡ会合を試験した。
【００７５】
ＢＣＭＡがＡｐｒｉｌと会合するか否かを試験するために、共免疫沈降実験を実施した。この実験において、ｈＢＣＭＡ−Ｆｃおよびｍｙｃ−ｍＡｐｒｉｌの両可溶性タンパク質を使用した。
【００７６】
異なるＴＮＦリガンド：ｍｙｃ−ｍＡｐｒｉｌ；ｍｙｃ−ＣＤ４０Ｌおよびｍｙｃ−ＲＡＮＫＬと共にＨＢＣＭＡ−ＦｃおよびＬＹｂＲ−Ｆｃを１０％ＦＢＳを含む培地中に１／２時間室温で添加した。Ｆｃタンパク質を１〜２時間でプロテインＡビーズと結合させ、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、マウスモノクローナル９Ｅ１０（抗ｍｙｃ）抗体を用いて免疫ブロット法により分析し、そして増強した化学発光を使用して発色させた。
【００７７】
発明者らは、ｈＢＣＭＡ−Ｆｃ免疫沈降物においてｍｙｃ−ＡＰＲＩＬを検出した。このことは、他のＴＮＦリガンド、ｍｙｃ−ＣＤ４０Ｌおよびｍｙｃ−ＲＡＮＫＬはＢＣＭＡと結合する能力を有さなかったため、ＢＣＭＡが特異的な手段でＡｐｒｉｌと相互作用することを示す。ｍｙｃ−Ａｐｒｉｌは、ＬＴｂＲ−Ｆｃと会合しない。
【００７８】
同じ膜をはがし、そして抗ｈＩＧ−ＨＲＰを用いて再ブロットしてＢＣＭＡ−Ｆｃと共に同量のＬＴｂＲ−Ｆｃが免疫沈降物において使用されたことを示す。
【００７９】
（実施例２：）
本実施例は、ｈＢＣＭＡ−ＦＣがＦＬＡＧ−ｈＡＰＲＩＬと相互作用することを記載する。
【００８０】
ＥＬＩＳＡ分析：ｐＨ９．６の炭酸塩中の１μｇ／ｍｌのレセプター−Ｆｃ融合タンパク質（ｈＢＣＭＡ−Ｆｃ−７３９またはｈＴＮＦＲ２−Ｆｃ−４９２）でプレートを一昼夜４℃でコートする。ＰＢＳ／５％脱脂粉乳／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用して室温で２時間ブロックする。リガンドの倍々希釈を１００μｌのブロッキング緩衝液中で行った（ＴＮＦａ−１９７は１０００ｎｇ／ｍｌから、ｍｕＢＡＦＦ−６５７は１０００ｎｇ／ｍｌから、ｈＡｐｒｉｌ−５０７（不活性）は２０００ｎｇ／ｍｌから、ｈＡｐｒｉｌ−４２９は５倍濃縮培地から）。リガンドとインキュベーションした後、プレートをＰＢＳ０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で洗浄し、そして希釈緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ Ｍ２でプローブした。次に、抗体を抗マウスＰＯ １／２０００を使用して酵素的発色（ＯＰＤ）により検出した。
【００８１】
免疫沈降実験：２９３Ｔ細胞を９ｃｍのプレートにおいて示された発現プラスミド（Ｒｅｃ−Ｆｃまたはｆｌａｇリガンド）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、８ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で５日間置いた。２００μｌの各レセプターの条件培地を２００μｌの各リガンドの条件培地＋４００μｌのＰＢＳ＋１０μｌのＰｒｏｔＧセファロ−スと混合することにより免疫沈降を実施した。これらをホイール上で１時間回転し、１ｍｌのＰＢＳで４回洗浄し、次に５０μｌのサンプル緩衝液（＋ＤＴＴ）中で煮沸した。２０μｌの各免疫沈降物をレーン毎にロードした。明らかなブロッティングを１μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）および抗マウスＰＯ（１／２０００）を用いて行った。また、抗ヒトＰＯを用いた再プローブのブロットをチェックした：１００μｌの条件培地をＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃／リゾチームで沈降した。この混合物を５０μｌサンプル緩衝液（＋ＤＤＴ）中で煮沸し、２０μｌをロードした。明らかなブロットを抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ Ｍ２（１μｇ／ｍｌ）および抗マウスＰＯ（１／２０００）を用いて行った。
【００８２】
（実施例３：）
本実施例は、ｍｙｃ−ｍＡＰＲＩＬ；ｈＫａｙＬ−４４０（ｈＢＡＦＦ）；およびＦｌａｇ−ｍＢＡＦＦのｈＢＣＭＡ−Ｉｇ、ｈＬＴ−Ｒ−Ｔｇ、またはｈｐ８０ ＴＮＦＲ−Ｉｇへの結合を記載する。すべての実験を、２５℃で１０μｌ／ｍｌ／分の流速で行った。
【００８３】
各実験をＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０界面活性剤、ｐＨ７．４）を使用して行った。同じ溶液を実施緩衝液およびサンプル希釈液の両方に使用した。
【００８４】
最初に、ＣＭ５チップ（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）表面をＮ−ヒドロキシスクシンイミド／Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロライド（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて活性化した。次いで、２０μｌのｈＢＣＭＡ−Ｉｇ；１５μｌのｈＬＴ−Ｒ０５−Ｉｇおよび１０μｌのｈｐ８０−ＴＮＦＲ（１０ｍＭの酢酸中３０ｇ／ｍｌに希釈）を３０μｌのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で１回、そして１５μｌのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で再度ブロックした。これにより１６００〜３７００の共鳴単位（ＲＵ）の表面密度が生じた。チップを１ｍＭの蟻酸２０μｌで再生した。これら廃棄を５回繰り返し、再現可能な、そして安定なベースラインを達成した。
【００８５】
実験のために、１００μｌのｍｙｃ−ｍＡｐｒｉｌ、ｈＫａｙＬ−４４０、およびＦＬＡＧ−ｍＢＡＦＦそれぞれを希釈緩衝液で３０μｇ／ｍｌまで希釈し、そしてチップの表面上に注入した。各注入後迅速に、そのチップを５００μｌの希釈緩衝液で洗浄した。１ｍＭの蟻酸２０μｌ；続いて別の１５μｌの注入蟻酸を注入することにより、実験の間にその表面を再生した。再生後、チップを希釈緩衝液で平衡化した。
【００８６】
（実施例４：可溶性レセプター形態の生成）
ヒトに使用するためのレセプターインヒビターを形成するために、細胞外ドメインのヒトレセプターｃＤＮＡ配列が必要である。マウスの形態が既知の場合、マウスｃＤＮＡ配列を使用してヒトｃＤＮＡライブラリーを容易にスクリーンし得、そしてこのような操作は当該分野において慣用的に行われる。ヒトｃＤＮＡ配列を用いて、膜内外ドメインおよび細胞内ドメインを存在させずにレセプターの細胞外ドメインをＰＣＲ増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計し得る。代表的には、アミノ酸のほとんどを、最後のジスルフィド結合「ＴＮＦドメイン」と膜内外ドメインとの間に含む。結果物の可溶性レセプター力価を最適化するために、含まれる「ストーク（ｓｔａｌｋ）」領域の量を変化し得た。種々のＣ末端Ｉｇ融合キメラベクターへのクローニングを可能にするために、適切な制限部位を含むように、この増幅片を操作する。あるいは、３’末端に停止シグナルを挿入し、そしてＩｇ融合キメラアプローチの使用に頼ることなく、レセプターの可溶性形態を作製し得る。その結果物であるベクターは、バイオテクノロジーで使用されるほとんどの系（酵母、昆虫細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞を含む）で発現され得、そして全ての発現タイプに対して例が存在する。所望であれば、種々のヒトＦｃドメインをＦｃＲおよび補体の相互作用を最適化または排除するために付着し得る。あるいは、これらのＦｃドメインの変異形態を使用し、ＦｃＲもしくは補体の相互作用または特定の利点を有するＦｃドメインへのＮ−結合糖の付着を選択的に除去し得る。
【００８７】
（実施例５：アゴニストまたはアンタゴニスト抗体の生成：）
上記可溶性レセプター形態を使用し、マウスを免疫化し、そして従来の方法によりモノクローナル抗体を作製し得る。ＥＬＩＳＡ法により同定したその結果物であるｍＡｂｓを、種々のインビトロでの細胞アッセイにおいて、可溶性抗体としてのアゴニスト活性またはプラスチック上に固定されたアゴニスト活性のいずれかに対してさらにスクリーニングし得る。しばしば、ＨＴ２９細胞株の死が、多くのＴＮＦレセプターを介するシグナル伝達に対して感受性のある簡便な系である。この株が目的のレセプターを有さない場合、全長レセプターをＨＴ２９株に安定にトランスフェクトして、ここで細胞傷害性アッセイを行うことが可能にし得る。あるいは、このような細胞を細胞センサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）装置で使用し、レセプターの活性化が、シグナル伝達事象を示すｐＨ変化を誘発し得るか否かを評価し得る。ＴＮＦファミリーレセプターは、このような形式で良好にシグナル伝達し、そしてこの方法は、レセプターにより引き起こされる実際の生物学的事象を知ることを必要としない。アゴニストｍＡｂを臨床的使用のためヒト化する。また、この手順を使用してアンタゴニストｍＡｂを規定し得る。このようなｍＡｂは、アゴニスト活性の欠如およびＥＬＩＳＡ、古典的結合またはＢＩＡｃｏｒｅ技術によりモニターされるレセプター−リガンド相互作用阻害能により規定される。最後に、アゴニスト抗体に応答した種々の細胞によるケモカイン分泌の誘導は、スクリーニングアッセイを形成し得る。
【００８８】
（実施例６：レセプター−リガンド相互作用のインヒビターについてのスクリーニング）
レセプターＩｇ融合タンパク質を用いて、レセプターと直接的に結合し得る分子について、いずれの組み合わせライブラリーをもスクリーンし得る。次に、これらの分子を、レセプター−Ｉｇ融合タンパク質およびリガンドの可溶性形態を使用するＥＬＩＳＡ形式のアッセイにおいてレセプター−リガンド相互作用阻害能について試験し得る。このＥＬＩＳＡを直接使用して、阻害化合物について種々の天然産物ライブラリーなどをスクリーニングし得る。レセプターをＨＴ２９株などの細胞株にトランスフェクトし、次いでスクリーニングアッセイを形成し得る生物学的アッセイ（この場合、細胞傷害性）を形成し得る。
（実施例７：インビボにおける腫瘍増殖阻害）
腫瘍増殖アンタゴニストとしてのＢＣＭＡ−Ｉｇの有効性をインビボで増殖させた多数の異種腫瘍細胞株を使用して試験した。胸腺欠損（Ｎｕ／Ｎｕ）免疫不全マウスをこれらの研究のために使用し、そして腫瘍細胞を皮下に移植した。積極的に増殖するＳＷ４８０腫瘍株については、１００μｌの無パイロジェン滅菌ＰＢＳに８×１０⁵個の細胞を移植した。１つのコントロール群を非処置のまま（ｎ＝５）にし、一方、他の群には１００μｇのコントロール−Ｉｇ（ｎ＝６）タンパク質または１００μｇのＢＣＭＡ−Ｉｇ（ｎ＝６）タンパク質を投薬した。移植の直前に投薬を開始し、その後続けて７日毎に投薬した。マイクロメーターを使用して腫瘍の直径を測定し、そしてその体積を式、体積＝４／３πｒ³を使用して計算する。
【００８９】
ＳＷ４８０結腸癌の腫瘍は、Ｎｕ／Ｎｕマウスモデルを使用して非常に迅速に増殖し、そして明白な腫瘍が１０日以内に検出された。２４日後にコントロールの平均腫瘍体積は、０．３ｃｍ³であり、一方、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置した腫瘍の平均体積は、０．１９ｃｍ³であり、腫瘍負荷において４６％の減少であった。結腸癌ＨＴ２９もまた、Ｎｕ／Ｎｕモデルにおいて積極的に増殖する。これらの実験のために、１００μｌの無パイロジェン滅菌ＰＢＳ中１×１０⁶個の細胞を皮下に移植し、そして投薬レジメンはＳＷ４８０について記載の通りであった。明らかな腫瘍が７日後に検出され、そしてコントロール群においては、ほとんどの腫瘍が非常に迅速に増殖した。４２日後、コントロール群（非処置およびコントロールＩｇ処置、ｎ＝１２）における腫瘍の平均体積は、０．４８５ｃｍ³であり、一方、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置群（ｎ＝５）における平均腫瘍サイズは、０．０９５ｃｍ³であり、腫瘍負荷において８０％の減少であった。５０日後、コントロール群におけるマウスの３０％を腫瘍サイズが１．５ｃｍより大きくなったため終点として記録し、実験を中止した。コントロール群と比較して、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置群のマウスの０％を終点として記録した。これらの結果を、表２に示す。
【００９０】
【表２】

これは、腫瘍の平均体積における７０％の減少およびＢＣＭＡ−Ｉｇ処置を使用する腫瘍増殖のＨＴ２９モデルにおける死亡率への顕著な影響を示す。
【００９１】
肺癌腫瘍株Ａ５４９は上記した結腸癌株よりもゆっくりと増殖する。この細胞株について、１００μｌの無パイロジェン滅菌ＰＢＳ中に１×１０⁶個の細胞を移植し、そして前述したレジメンを使用して処置した。明白な腫瘍が移植の約２０日後に検出された。腫瘍移植５０日後、コントロール群（非処置およびコントロール−Ｉｇ処置；ｎ＝１６）における腫瘍の平均体積は０．２ｃｍ³であり、一方、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置群（ｎ＝７）における腫瘍の平均体積は０．１ｃｍ³であり、腫瘍の体積において５０％の減少であった。ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置群では、５０日後に５７％のマウスが０．１ｃｍ³より小さい腫瘍を有し、一方、コントロール処置マウスの６％のみがこのような小さな腫瘍負荷を維持した。腫瘍移植６０日後、コントロール群の腫瘍の平均体積は０．３ｃｍ³に増加した。一方、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置した群における腫瘍の平均体積は、まだ０．２ｃｍ³より小さかった（０．１８８）。
【００９２】
結腸癌株よりもよりゆっくり増殖する、マウスＮＩＨ３Ｔ３株についてもまた、本発明者らは、１００μｌ発熱物質のない滅菌ＰＢＳ中の５×１０⁶細胞を移植して、上に記載されるように処置した。ＮＩＴＨ３Ｔ３細胞は、Ｎｕ／Ｎｕマウスにおいて皮下に移植された場合、線維肉腫を形成する。４週間後、明白な腫瘍が、検出され、そしてコントロール群（ｎ＝１１）においては、これらの腫瘍は、容量が拡大し、次の１０日後で０．１３６ｃｍ³の平均サイズに達した。対照的に、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置群（ｎ＝５）における腫瘍容量だけは、０．０３ｃｍ³のサイズ（腫瘍負加量において７８％減少）に達した。腫瘍移植４８日後、コントロール群における平均腫瘍容量は、１．６ｃｍ³に達したが、一方ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置群おける平均腫瘍容量は、ほんの０．８ｃｍ³（腫瘍容量の５０％減少）であった。５２日目で、まだ生存している１８％だけの動物を残して、コントロール群における動物の８２％（９／１１）を、１．５ｃｍ³より大きい腫瘍容量に基づいて末期としてスコア付けした。対照的に、まだ生存している６０％の動物を残して、ＢＣＭＡ−Ｉｇ処置群における４０％（２／５）の動物は、屠殺されなければならないような容量の腫瘍を有した。これらの結果は、表３に表にされる。
【００９３】
【表３】

経時的なＮＩＨ３Ｔ３の増殖を示す結果を、図１３に示す。経時的なＳＷ４８０の増殖を示す結果を、図１４に示す。経時的なＨＴ２９の増殖を示す結果、および腫瘍移植後４２日の個々の動物を示す散布図を、図１５Ａに示す。腫瘍移植後５０日後および６０日後の個々の動物におけるＡ５４９腫瘍の増殖を示す結果を、図１５Ｂに示す。
【００９４】
ＮＩＨ３Ｔ３腫瘍細胞株に対する腫瘍増殖阻害の結果を、図１３に示す。ＳＷ４８０腫瘍細胞株に対する腫瘍増殖阻害の結果を、図１４に示す。ＨＴ２９腫瘍細胞株およびＡ５４９腫瘍細胞株に対する腫瘍増殖阻害の結果を、図１５に示す。
【００９５】
（実施例８：ＢＣＭＡ−ＩｇＧは、正常マウスにおけるＢ細胞の数を減少する原因となる。）
８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。
【００９６】
マウス（３／群）は、８日前、５日前、１日前および２日後に、腹腔内へＰＢＳ、４００μｇのヒトＢＣＭＡ−ｈｕＩｇＧ１（ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ）融合タンパク質（Ｔｅｒｅｓａ Ｃａｃｈｅｒｏ，Ｂｉｏｇｅｎによって提供される）、または４００μｇの精製ヒトＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）（Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のいずれかを受けた。マウスは、１００μｇの１０％ヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を０日目に受けた。
【００９７】
屠殺時、血液を、心臓穿刺を介してＥＤＴを含むチューブへ収集し、赤血球を低張緩衝液の中で溶解した。血液をまた、血清調製のためにＥＤＴＡなしで収集した。単一細胞の懸濁液を、脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から調製し、赤血球を、低張緩衝液の中で溶解した。フローサイトメトリ−を、ＰＥ結合体化抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＰＥ結合体化抗シンデカン（ｓｙｎｄｅｃａｎ）／ＣＤ１３８、ＰＥ結合体化抗Ｂ７．２、ならびにＦＩＴＣ結合体化抗ＩｇＭおよびＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０を使用して実施した。全てのｍＡｂを、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。手短に言えば、Ｆｃレセプターを、氷の上で１５分間１０μｇ／ｍｌのＦｃＢｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でブロックし、次いでＰＥ結合体化ｍＡｂおよびＦＩＴＣ結合体化ｍＡｂを添加し、そして氷の上で２０〜３０分インキュベートした。細胞を、１回洗浄し、そして０．５％のパラホルムアルデヒド内に懸濁した。細胞蛍光データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^TMフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で獲得し、そしてＣＥＬＬＱｕｅｓｔ^TMソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【００９８】
ｈＢＣＭＡ−Ｉｇでの処置後、試験した末梢血中および末梢リンパ系器官中のＢ細胞の数が約５０％減少した。Ｂ２２０^highＩｇＭ^lowＢ細胞は、ＰＢＳ処置およびＨｕＩｇＧ処置マウスにおいて、それぞれ２３．４％および２１．５％の細胞となったが、この集団は、ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスにおいてはほんの９．９％の細胞を示した。形質細胞（シンデカン／ＣＤ１３８＋）は、ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスにおける３．９％と比較して、ＰＢＳ処置およびＨｕＩｇＧ処置マウスの血液中に、それぞれ同じように５．７％および４．８％存在で、わずかに減少されたようである。Ｂ７．２分子は、ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスでの１．９％と比較して、ＰＢＳ処置およびＨｕＩｇＧ処置マウスではそれぞれ３．１％および４．５％のＢ２２０＋細胞で上流調節された。
【００９９】
脾臓において、Ｂ２２０^highＢ細胞は、ＰＢＳ処置およびＨｕＩｇＧ処置マウスにおいてそれぞれ３６．７％および４０％と比較して、ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスにおいて著しく減少し、１８．８％を示した。この減少は、ＩｇＭ^highおよびＩｇＭ^lowの分集団の両方において観察された（表１を参照のこと）。脾臓において新たに形成されたＢ細胞画分（Ｂ２２０^lowＩｇＭ^high）において観察される変化はなかった（データは示さず）。形質細胞（シンデカン／ＣＤ１３８＋）は、ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスにおける２．４％と比較して、ＰＢＳ処置およびＨｕＩｇＧ処置マウスの脾臓中に、それぞれ同じように３．３％および３．４％存在で、わずかに減少されたようである。
【０１００】
ＭＬＮは、Ｂ２２０＋Ｂ細胞において、ＰＢＳ処置およびＨｕＩｇＧ処置マウスではそれぞれ２６．７％および３５．８％と比較して、ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスでは１４．１％存在と減少を示した。このデータを、表３に要約する。
【０１０１】
【表３】

ＳＲＢＣで免疫化された後の、血液中のＢ７．２＋Ｂ細胞ならびにｈＢＣＭＡ−Ｉｇ処置マウスの血液および脾臓中の形質細胞の減少パーセンテージは、Ｂ細胞活性化および／または成熟化の阻害、ならびに活性化Ｂ細胞の潜在的に増加した排出があることを示唆する。ＳＲＢＣのこの場合において、非常に小さいパーセントの抗原特異的Ｂ細胞は、活性化され、そして任意の抗原に応答する。ｈＢＣＭＡ−Ｉｇ処置は、試験された全ての組織中のＢ細胞のパーセント（約５０％）によってこのような劇的な減少を生じるので、ｈＢＣＭＡ−Ｉｇの活性はまた、静止、成熟Ｂ細胞を標的とするようである。
【０１０２】
従って、ＢＣＭＡ融合タンパク質を、Ｂ細胞媒介疾患における臨床的適用で治療的薬物として使用し得ることを、熟考する。疾患としては、性質が自己免疫である疾患（全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーヴズ病、ヴェーゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎および急速進行性糸球体腎炎など）が挙げられる。治療的薬剤はまた、形質細胞障害（多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、原発性または免疫担当細胞関連アミロイドーシス、および未定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ））における適用を有する。腫瘍学標的としては、Ｂ細胞癌、白血病、およびリンパ種が挙げられる。
【０１０３】
当業者にとって、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明のポリペプチド、組成物および方法において種々の改変および変異がなされ得ることは、明白である。従って、本発明は、当業者が、本発明の添付される請求の範囲およびそれらと等価の範囲内に入ることを条件として、本発明の改変および変異を包含することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ベクターｐＣＣＭ２１３．１０にマッピングされるマウスＡＰＲＩＬのｃＤＮＡの核酸配列（配列番号１）およびその誘導アミノ酸配列（配列番号３）を示す。下線で示されるものは、ｍｙｃエピトープおよびＦａｓＬから誘導されるアミノ酸である。ＡＰＲＩＬ細胞外ドメインコード配列の始まりは、矢印で示される。
【図２】 図２は、哺乳動物細胞において発現するＦＬＡＧ−ヒトＡＰＲＩＬ構築物の核酸配列（配列番号４）およびその誘導アミノ酸配列（配列番号６）を示す。マップは、シグナル配列（１〜１５）；ＦＬＡＧエピトープ（ＡＡ１６〜２３）およびヒトＡＰＲＩＬ細胞外ドメインコード配列の始まり（３２〜末端）を示す。
【図３Ａ】 図３Ａは、全長ヒトＢＣＭＡの核酸配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、ｐＪＳＴ５３８（ヒトＡＰＲＩＬ−Ｒ−ｈＩｇＧＦｃ融合構築物をコードするプラスミド）の核酸配列（配列番号１１）およびその誘導アミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図４】 図４は、マウスＢ細胞リンパ種株Ａ２０へのｍｙｃ−マウスＡＰＲＩＬの結合を示す。３つの異なる実験は、Ａ）未染色細胞およびＲ１５３２のみで染色された細胞、Ｂ）ＲＡＮＫＬ−ＬおよびＲ１５３２で染色された細胞、ならびにＣ）ＡＰＲＩＬで染色された細胞、および無関係なウサギ血清と比較した、Ａ２０細胞へのＡＰＲＩＬの特異的結合を示す。
【図５】 図５は、ヒトＢ細胞リンパ種株ＲＡＪＩへのｍｙｃ−マウスＡＰＲＩＬの結合を示す。２つの異なる実験は、Ａ）未染色細胞およびＲ１５３２のみで染色された細胞、およびＲＡＮＫ−１かつＲ１５３２で染色された細胞、ならびにＢ）ＡＰＲＩＬで染色された細胞、および無関係なウサギ血清と比較した、ＲＡＪＩ細胞へのＡＰＲＩＬの特異的結合を示す。
【図６】 図６は、Ａ２０細胞（Ａ）およびＲａｊｉ細胞（Ｂ）へのＡＰＲＩＬ結合が、可溶性ＢＡＦＦタンパク質または可溶性ＢＣＭＡ−Ｉｇタンパク質を用いて競争されることを示す。
【図７】 図７は、種々の細胞株：Ａ）Ａ２０細胞、Ｂ）ＨＴ２９細胞、Ｃ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのＦＬＡＧ−ヒトＡＰＲＩＬの結合を示す。特異的結合は、ビオチン化抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ Ｍ２検出を使用して、無関係のアイソタイプコントロールｍＡｂを用いてまたはＦＬＡＧ−ＡＰＲＩＬの添加なしで見られる結合と比較して示される。
【図８】 図８は、ＢＣＭＡ−Ｆｃ融合タンパク質を使用するｍｙｃ−ｍＡｐｒｉｌの免疫沈降を示す。上の左のパネルは、特異的ｈＢＭＣＡ−Ｆｃ／ｍｙｃ−ｍＡＰＲＩＬ免疫沈降および陽性コントロールＯＰＧ−Ｆｃ／Ｒａｎｋ−１免疫沈降を示し、上の右のパネルの陰性コントロールを比較する。下のパネルは、ロードされたタンパク質の量が、等価であることを示す。
【図９】 図９は、ＦＬＡＧ−ｈＡＰＲＩＬがｈＢＣＭＡ−ｆｃ融合タンパク質に結合することを示すＥＬＩＳＡ形式実験を示す。種々のレセプター−Ｆｃ融合タンパク質が、ＥＬＩＳＡプレート上へコートされ、ＦＬＡＧ−タグ化リガンドと結合された。Ａ）ＡＰＲＩＬおよびｈＢＡＦＦのみが、ｈＢＣＭＡ−Ｆｃに特異的に結合したが、ｈＣＤ４０−Ｆｃには結合しないことを示す結合リガンドの検出。Ｂ）ｈＢＣＭＡ−Ｆｃコートプレート上へｈＡＰＲＩＬまたはｈＢＡＦＦを結合後、検出されるＥＬＩＳＡシグナルが、添加されるタンパク質の量に直線的に依存することを示す用量滴定。
【図１０】 図１０は、ｈＢＭＣＡ−Ｆｃ融合タンパク質によるＦＬＡＧ−ｈＡＰＲＩＬおよびＦＬＡＧ−ｈＢＡＦＦの免疫沈降を示す。上の４つのパネルは、免疫沈降におけるロードされたタンパク質の等価を示し、一方、下のパネルは、ｈＡＰＲＩＬおよびｈＢＡＦＦが、ｈＢＣＭＡ−Ｆｃによって免疫沈降されるが、ｈＴＲＡＩＮ−Ｆｃによって免疫沈降されないことを示す。
【図１１】 図１１は、ｍｙｃ−ｍＡＰＲＩＬ、ＦＬＡＧ−ｈＢＡＦＦ、およびＦＬＡＧ−ｍＢＡＦＦのｈＢＭＣＡ、ｈＬＴβレセプター、もしくはｈＴＮＦ−Ｒ８０への結合のＢｉａＣｏｒｅ分析を示し、またはブランクは、ｈＢＣＭＡだけへの特異的結合を示す。
【図１２】 図１２は、ＢＣＭＡトランスフェクト細胞へのＡＰＲＩＬ結合を示す。２９３ＥＢＮＡ細胞は、全長ｈＢＣＭＡを発現するプラスミドでトランスフェクトされる。細胞は、５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して４８時間後に収穫され、そしてｍｙｃ−ｎＡＰＲＩＬで染色された。パネルＡは、染色程度が用量依存であることを示す。パネルＢは、染色が、可溶性ＢＣＭＡ−Ｉｇタンパク質を使用した場合バックグランドレベルへ減少したことを示す。
【図１３】 図１３は、コントロール試薬でまたはＢＣＭＡ−Ｉｇ融合タンパク質で処置された免疫不全（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて皮下に移植されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を示す。このモデルにおいて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、線維肉腫を形成する。
【図１４】 図１４は、コントロール試薬でまたはｈＢＣＭＡ−Ｉｇ融合タンパク質で処置された免疫不全（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて皮下に移植されたヒト結腸癌ＳＷ４８０の増殖を示す。
【図１５Ａ】 図１５Ａは、コントロール試薬でまたはｈＢＣＭＡ−Ｉｇ融合タンパク質で処置された免疫不全（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて皮下に移植されたヒト結腸癌ＨＴ２９の増殖を示す。
【図１５Ｂ】 図１５Ｂは、コントロール試薬でまたはｈＢＣＭＡ−Ｉｇ融合タンパク質で処置された免疫不全（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて皮下に移植されたヒト肺癌Ａ５４９の増殖を示す。
【配列表】

Claims (10)

1. 増殖誘発リガンド（ＡＰＲＩＬ）を発現する腫瘍細胞を処置するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、以下：
   ａ．配列番号８のアミノ酸１〜アミノ酸５１に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
   ｂ．配列番号８のアミノ酸１〜アミノ酸５１に記載されるアミノ酸配列に対する抗体
   を含む、薬学的組成物。
2. 前記（ａ）のポリペプチドが、分泌タンパク質のＦｃドメインをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記（ａ）のポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃドメインをさらに含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
4. 前記免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項３に記載の記載の薬学的組成物。
5. 前記免疫グロブリンがヒトである、請求項４に記載の薬学的組成物。
6. 前記ポリペプチドがさらに配列番号１２を含む、請求項５に記載の薬学的組成物。
7. 前記腫瘍細胞が、癌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
8. 前記癌が、肺癌、結腸癌、前立腺癌、および乳癌からなる群より選択される、請求項７に記載の薬学的組成物。
9. 前記腫瘍細胞が哺乳動物に存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
10. 前記哺乳動物がヒトである、請求項９に記載の薬学的組成物。

Images