CZ20021169A3 - Použití antagonisty APRIL-R pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení nemocí spojených s nežádoucí buněčnou proliferací - Google Patents

Description

Vynález najde uplatnění především při léčení rakoviny, farmaceutické přípravky podle vynálezu umožňují podávání určitých antagonistů nádorového nekrotického faktoru TNF (tumor-necrosis factor).

Dosavadní stav techniky

Cytokiny z rodiny nádorových nekrotických faktorů (TNF) se účastní celé řady pochodů týkajících se kritických biologických funkcí. Každý cytokin z rodiny TNF funguje tak, že se váže na jeden či více členů z paralelní rodiny receptorových proteinů. Tyto receptory následně vyvolávají intracelulární signál, který se projeví vznikem širokého spektra fyziologických nebo vývojových odpovědí. Mnohé z receptorových signálů ovlivní osud buňky a velmi často slouží jako spouštěcí mechanismus terminální diferenciace. Příklady buněčné diferenciace zahrnují proliferaci, maturaci, migraci a buněčnou smrt.

Cytokiny z rodiny TNF jsou membránově vázané proteiny typu II, které mají krátkou intracelulární N-koncovou doménu, transmembránovou doménu a C-koncovou doménu pro vazbu receptorů na povrchu buňky. V některých případech jsou extracelulární části proteinů odštěpeny, čímž se vytváří sekreční forma cytokinů. Zatímco membránově vázané proteiny působí lokálně, pravděpodobně zprostředkovávají buněčný kontakt pomocí interakcí buněk s jejich receptory, sekreční • · · · · · » · · » · · · ·

-2formy mají schopnost cirkulovat nebo difundovat a takto mohou působit i ve vzdálených místech. Jak membránově vázané, tak sekretované formy existují ve formě trimerů a předpokládá se, že vyvolávají signál na receptorech usnadněním jejich shlukování (clustering).

Rodina TNF receptorových proteinů je charakterizována přítomností jedné nebo více na cystein bohatých extracelulárních domén. Z těchto na cystein bohatých domén vznikají jádra pevně vázaná disulfidovými vazbami, která přispívají k udržení trojrozměrné struktury při tvorbě kapsy pro vazbu ligandu. Receptory jsou membránově vázané proteiny typu I, kde extracelulární doména je tvořena určena Nkoncocovou částí proteinu, následuje transmembránová doména a C-koncová intracelulámí doména. Intracelulámí doména je zodpovědná za přenos signálu z receptoru do nitra buňky. Některé receptory obsahují intracelulámí doménu smrti (death domain), jejíž signál může vyprovokovat buněčnou apoptózu. Tyto domény tedy mohou být silnými induktory buněčné smrti. Další třída receptorů může vyvolat buněčnou smrt jen velmi slabě; chybí jim pravděpodobně „doména smrti. Třetí typ receptorů nemůže vyvolat buněčnou smrt vůbec. Všechny třídy receptorů mohou v závislosti na typu buňky nebo výskytu dalších signálů produkovat místo signálů vedoucích ke smrti buňky signály pro proliferaci nebo diferenciaci buněk.

Velmi dobře prostudovaným příkladem mnohočetného charakteru aktivity cytokinů z rodiny TNF je přímo faktor TNF, podle kterého byla celá třída pojmenována. TNF může existovat jako membránově vázaný cytokin, nebo může být odštěpen a sekretován. Obě formy se váží ke dvěma TNF receptorům, a to TNF-R55 a TNF-R75. Původně byl TNF popsán na základě své schopnosti přímo usmrtit rakovinné buňky. TNF také kontroluje širokou škálu imunitních procesů, včetně indukce akutních zánětlivých reakcí. Uplatňuje se též při

-3·· · · · · · · 4 4 · · 4 444 4444 4

4·· · 4 4 444

4 44 444 44 4444 patologických připraveny,

Díky svojí při různých byly také agonistických, tak ovlivňující průběh zachování homeostázy v lymfatických tkáních, duální roli se tento cytokin uplatňuje procesech. Z tohoto důvodu jak na bázi jeho antagonistických účinků, prostředky nemoci. Například TNF a LTa (který rovněž přenáší signál přes TNF receptory) byly použity k léčbě rakovin, zvláště potom těch typů, které se vyskytují na periferních místech, jako jsou například sarkomy končetin. V těchto případech přímé předání signálu cytokinů pomocí receptorů indukovalo smrt rakovinných buněk (Aggarwal a Natarajan, 1996. Eur Cytokine Netw 7: strana 93 až 124) .

V imunologických pokusech byly použity látky blokující přenos signálu přes TNF receptor (například monoklonální protilátky proti TNF, rozpustné fúzní proteiny s TNF-R) k léčení nemocí, jako je revmatická artritida a zánětlivé nemoci střev. V těchto patologických stavech totiž TNF funguje jako induktor buněčné proliferace a efektorové funkce, a proto u zhoršujícího se autoimunitního onemocnění je terapeuticky velmi výhodné zablokovat vazbu TNF k jeho receptorům (Beutler,1999. J. Rheumatol. 26, Suppl 57: strana 16 až 21).

Poměrně nedávno objevená dvojice ligand/receptor se jeví být vhodným modelem pro podobné manipulace. Lymfotoxin β (LTp), další cytokin z rodiny TNF, který tvoří heterotrimery s LTa, se váže k LTp-R. Některé nádorové buňky adenokarcinomu, které exprimují LTP~R, mohou být zahubeny nebo diferencovány, jestliže se ošetří agonistickou monoklonální protilátkou proti LT3~R (Browning a další, 1996. J. Exp. Med 183: strana 867 až 878). V imunologických pokusech bylo dále prokázáno, že monoklonální protilátka proti LTp nebo rozpustný fúzní protein LTP-R-Ig mohou blokovat vývoj zánětlivé nemoci střev, pravděpodobně

ovlivněním interakce dendritických buněk a T buněk (Mackay a další, 1998. Gastroenterology 115:1464 až 1475).

K léčbě rakoviny lze také použít systém TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand). TRAIL interaguje s řadou membránově vázaných i rozpustných receptorů. Dva z těchto receptorů, TRAIL-R1 a TRAIL-R2 (také nazývané DR4 a DR5), zprostředkují přenos signálu pro buněčnou smrt do rakovinných, ale nikoli normálních buněk. Normální buňky totiž exprimují další TRAIL receptory, které buněčnou smrt neindukují a kompetují tak o vazbu TRAIL. Předpokládá se, že tyto přídavné receptory fungují jako kompetitivní „klamné receptory (decoy) ligandu TRAIL. Užití rozpustného ligandu TRAIL k usmrcení rakovinných buněk je založeno na selektivní expresi těchto kompetitivních „klamných (decoy) receptorů na normálních nikoliv však na rakovinných buňkách (Gura,1997 Science 277: strana 768).

Rakovinné buňky samy často exprimují rozmanitou paletu kompetitivních „klamných receptorů, které blokují imunitní rozpoznávání nebo efektorové funkce. Skutečně, některé tumory exprimují klamné TRAIL receptory ve velkém množství, zjevně proto, aby se vyhnuly buněčné smrti zprostředkované systémem TRAIL (Sheikh a další,1999, Oncogene 18: strana 4153 až 4159) . Tento poznatek omezuje v některých případech užití TRAIL jako protirakovinné látky. Obdobná zjištění byla učiněna ohledně klamného receptoru pro FAS-L, který je silně exprimován v rakovinných buňkách plic a střeva (Pitti a další, 1998, Nátuře 396: strana 699 až 703), a také pro antagonistů receptoru IL-1 (Mantovani a další, 1998. Ann. NY Acad. Sci. 840: strana 338 až 351). Klamné receptory byly nalezeny rovněž ve virových genomech, pravděpodobně proto, aby byly infikované hostitelské buňky ochráněny před obrannými mechanismy hostitele.

•« · «*· · · · · · · · · ·· ·· · · ♦ · · ♦ · 2

4« « ··«·· · 4 I • » · · « · · C · 9 ♦ • * · ·· · 4 · ♦ »♦ · ·» ··· ·· ····

-5APRIL (A Proliferation Inducing Ligand) je nový člen rodiny TNF proteinů. Studie exprese a funkce ligandů APRÍL přinesly poznatky o tom, že tento protein je využíván nádorovými buňkami k vyvolání rychlé proliferace. Nádorové buněčné linie ošetřené rozpustným proteinem APRÍL nebo transfikované pomocí APRÍL cDNA rostou rychleji in vitro.

Buňky transfikované cDNA kódující ligand APRÍL, které byly implantovány imunodeficientním myším, rychle rostly a vytvořily nádor. Také lidské nádorové buňky, ale nikoli buňky normální tkáně, exprimují vysoké hladiny APRÍL mRNA.

Tato pozorování vedou k závěru, že ligand APRÍL se váže na receptor, který je také exprimován nádorovými buňkami, čímž se vyvolá autokrinní či parakrinní aktivace nádorové buňky.

Kromě toho lze předpokládat, že ligand APRÍL působí i na při dalších onemocněních, čímž otevírají další možnosti využití ovlivnění této signální dráhy. Například nízká exprese nebo vysoká exprese ligandů APRÍL hraje důležitou roli ve vývojovém poškození, jelikož vývoj je často charakterizován velmi přísně kontrolovanou rovnováhou mezi buněčnou proliferací a buněčnou smrtí. Obdobně, APRÍL může hrát roli v nemocech spojených s buněčnou proliferací, které se mohou vyskytovat ve spojení s některými autoimunitními nemocemi (například lupenkou) nebo u zánětlivých nemocí, kde se buněčné populace velmi rychle množí (například bakteriální sepse) .

V závislosti na známém užití agonistů a antagonistů cytokinů TNF a členů rodiny receptorů TNF jako možných modulátorů nemoci, signální dráha ligandů APRÍL reprezentuje velmi důležitou oblast pro výzkum a vývoj léků. Tyto léky by byly obzvlášť vhodné pro terapií rakoviny, jelikož u rakovinných buněk je známo, že produkují a využívají ligand APRÍL k podpoře svého vlastního růstu, a proto je nepravděpodobné, že by tvořily „klamné (decoy) receptory nebo jiné antagonisty signální dráhy ligandů APRÍL. Tak se

4 4 4 4 4 4

4444 4 4 4

4 4 4 4 4 4

444 4· 4444

-6signální dráha ligandu APRÍL unikátně odlišuje například od signálních drah ligandů TRAIL nebo FAS-L, jejichž terapeutické využití je znemožněno expresí „klamných nádorových receptorů.

Léčení rakoviny známá ze stavu techniky nevyhovují pro různé druhy nádorů vzhledem ke své malé účinnosti, malému vlivu na přežití pacienta, vykazované toxicitě, vedlejším účinkům nebo kombinaci výše uvedených nevýhod. Je proto důležité nalézt a vyvinout další způsoby léčby rakovinného bujení, které by byly dostatečně účinné bez vyvolání vážných vedlejších účinků. K tomuto účelu by mohly být využity antagonisté signální dráhy ligandu APRÍL, včetně monoklonálních protilátek proti ligandu APRÍL, protilátek proti receptoru APRÍL, rozpustných fúzních proteinů receptoru APRÍL s protilátkou (APRIL-R-Ig), přirozených antagonistů, malých molekulárních antagonistů a dalších antagonistů, připravených pomocí farmaceutických, nebo chemických postupů .

Jedním z výstupů vynálezu je identifikace proteinu vyskytujícího se na B buňkách (B cell mediated protein - BCM nebo BCMA), který slouží jako receptor pro ligand APRÍL.

Podstata vynálezu

Autoři vynálezu objevili, že BCMA je receptorem pro nádorový nekrotický faktor, APRÍL. APRÍL je totožný s molekulou popsanou v dokumentu WO 99 12965, viz seznam referencí. Pro receptor ligandu APRÍL je dále v textu užíváno označení „APRIL-R. Vynález se vztahuje ke způsobu léčení a farmaceutickým přípravkům užívaným pro léčení různých druhů savců, kteří mají rakovinu nebo mají zvýšené riziko jejího

-7výskytu. Tyto subjekty zahrnují subjekty již postižené rakovinou, nebo ty, které již podstoupily rakovinnou terapii.

Ve vynálezu jsou definované způsoby léčby a přípravky podle vynálezu, které využívají fakt, že jisté terapeuticky využitelné látky, definované zde jako antagonisté APRIL-R, včetně například protilátek proti APRIL-R, lze využít k léčení subjektů s rizikem vývoje rakoviny, tak jak již bylo uvedeno a dále je možné je využít k léčbě rakoviny.

Terapeutické prostředky podle vynálezu mohou být podávány všemi možnými způsoby, které odpovídají vybranému

prostředku a mohou být	připraveny ve	formě spolu
s farmaceuticky přijatelným určitý způsob podávání.	nosičem,	který	je vhodný pro
Preferované způsoby	podávání	j sou	parenterální,

zvláště potom intravenosní, intraperitoneální a intrakapsulární. Léčení lze provádět po dostatečně dlouhou dobu na ambulantní bázi. Předpokládá se, že denní dávky protirakovinného terapeutického přípravku se budou pohybovat v rozsahu 0,01 až 1000 pg/kg tělesné hmotnosti, ve výhodném provedení potom mezi 10 až 300 pg/kg tělesné hmotnosti. Je samozřejmé, že se přesné denní dávky budou měnit v závislosti na užitém protirakovinném terapeutickém prostředku a na okamžitém fyzickém stavu pacienta a průběhu onemocnění.

Způsoby léčení podle vynálezu jsou použitelné pro odstranění podstatné části klonální populace (kolonie) transformovaných buněk z organismu savce, nebo k potlačení či zeslabení růstu kolonií, které jsou běžně považované za nádory. Jako takové jsou prostředky podle vynálezu a způsob jejich užití použitelné pro prodloužení života a zlepšení kvality života u pacientů s rizikem výskytu rakoviny, či s již probíhající rakovinou.

« · « · · · · · ·

-8Popis obrázků

Obrázek 1 znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (Sekvence id.č.:1) cDNA pro myší APRÍL a odvozenou aminokyselinovou sekvenci (Sekvence id.č.:3) vloženou ve vektoru pCCM213.10 pro expresi v Píchia pastoris. Podtržená část představuje epitop myc a aminokyseliny odvozené od FasL. Šipkami je označen začátek kódující sekvence pro extracelulární doménu ligandů APRÍL.

Obrázek 2 znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (Sekvence id.č.:4) a od ni odvozenou aminokyselinovou sekvenci (Sekvence id.č.: 6) pro konstrukt FLAG-lidský APRÍL ve vektoru pro expresi v savčích buňkách (PS429). Mapa znázorňuje signální sekvenci (aminokyseliny 1 až 15); epitop FLAG (aminokyseliny 16 až 23) a počátek kódující sekvence pro extracelulární doménu lidského APRÍL (od 32 aminokyseliny do konce).

Obrázek 3A znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (Sekvence id.č.: 7) a od ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci (Sekvence id.č.: 8) klonu o úplné délce pro lidský BCMA. Obrázek 3B znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (Sekvence id.č.:ll) plazmidu pJST538, obsahujícího fúzní konstrukt lidského APRIL-R-hlgGFc a odvozenou aminokyselinovou sekvenci (Sekvence id.č.: 12). Konstrukt má následující strukturu: signální peptid z myší Ig kappa cDNA (nukleotidy 1 až 66, aminokyseliny 1 až 22) , doména bohatá na cysteiny z lidského BCMA je orámována (nukleotidy 70 až 222, aminokyseliny 24 až 74), lidská IgGl je kódována nukleotidy 226 až 909 (odpovídá aminokyselinám 76 až 302). Na místa spojení domén (zbytek 23 a 75) byly vloženy „bezproblémové * · ♦ · < · ··♦

-9aminokyseliny. Šipkou je označeno místo, na kterém pravděpodobně dochází k odštěpení fúzního peptidu.

Obrázek 4 znázorňuje vazbu komplexu ligandu myc-myší APRÍL k myší B-buněčné lymfomové linii A20. Tři nezávislé pokusy prokázaly specifickou vazbu APRÍL k buňkám A20 ve srovnání s A) neobarvenými buňkami a buňkami obarvenými jen R1532, B) buňkami obarvenými RANKL-L a R1532 a C) buňkami označenými pomocí APRÍL a irelevantním králičím sérem.

Obrázek 5 znázorňuje vazbu komplexu myc-myší APRÍL k lidským B buňkám lymfomové linie RÁJI. Ve dvou nezávislých pokusech se prokázala specifická vazba APRÍL na RÁJI buňky ve srovnání s A) nebarvenými buňkami a buňkami obarvenými jen R1532, buňkami obarvenými RANK-1 a R1532 a B) buňkami označenými pomocí APRÍL a irelevantním králičím sérem.

Obrázek 6 ukazuje, že vazba APRÍL k buňkám A20 (A) a buňkám RÁJI (B) je kompetitivně ovlivněna užitím rozpustného proteinu BAFF nebo rozpustného proteinu BCMA-Ig.

Obrázek 7 znázorňuje vazbu komplexu FLAG-lidský APRÍL k různým buněčným liniím: A) buňky A20, B) buňky HT29, C) buňky NIH3T3. Specifická vazba je prokázána detekcí pomocí biotinylované monoklonální protilátky M2 proti epitopu FLAG ve srovnání s vazbou irelevantní isotypově shodné kontrolní monoklonální protilátky nebo bez přidání fúzního proteinu FLAG-APRIL.

• · ·9 · · fr · * · · ··

9« · fr*· 4 « 4 · • · 4 4 · · · · 4 · * ·· * ·4 »·· «· fr···

-10Obrázek 8 znázorňuje imunoprecipitaci myc-mAPRIL pomocí fúzního proteinu BCMA-Fc. Horní levý panel ukazuje specifické imunoprecipitace hBMCA-Fc/myc-mAPRIL a pozitivní kontroly OPG-Fc/Rank-1. Dolní panely ukazují, že ve všech reakcích bylo užito stejné množství proteinu.

Obrázek 9 znázorňuje pokusy s různými formáty ELISA testu, které dokumentují, že fúzní ligand FLAG-hAPRIL váže fúzní protein hBCMA-Fc. Různé fúzní proteiny Fc-receptor byly použity jako potah na mikrotitrační ELISA desky a vázaly ligandy s připojenou částí FLAG. A) Detekce vazby ligandů prokázala, že pouze ligandy APRÍL a hBAFF se specificky váží na desky potažené hBCMA-Fc (levá část obrázku), ale nikoli na desky potažené hCD40-Fc (pravá část). Na obrázku 9A-2 je ještě znázorněna vazba dalších ligandů na desky potažené BCMA-Fc (vlevo) , CD40-Fc (uprostřed) a kombinace obou grafů (napravo). Obrázek 9B-1) Titrace pomocí různých dávek proteinu APRIL-507 a muBAFF-657 na deskách potažených BCMAFc-739 nebo TNFR2-492 prokázala, že ELISA signál detekovaný po vazbě APRÍL nebohBAFF na hBCMA-Fc je lineárně závislý na množství přidaného proteinu. Obrázek 9B-2) Titrace TNFal97 na deskách potažených BCMA-Fc-739 nebo TNFR2-FC-492. Obrázek 9B-3) Titrace hAPRIL-429 na deskách potažených BCMA-Fc-739 nebo TNFR2-FC-492.

Obrázek 10 znázorňuje imunoprecipitaci FLAG-hAPRIL a FLAGhBAFF pomocí fúzního proteinu hBMCA-Fc. Horní čtyři panely dokumentují, že pro imunoprecipitaci bylo použito vždy stejné množství proteinu, zatímco dolní panely dokumentují, že hAPRIL a hBAFF jsou imunoprecipitovány hBCMA-Fc, ale nikoli hTRAIN-Fc.

-114 9 9 4

4 4 44

94

9 9 4

9 ·

9 9

4· 44 4 9

Obrázek 11 znázorňuje analýzu vazby fúzních proteinů mycmAPRIL, FLAG-hBAFF a FLAG-mBAFF na hBMCA pomocí zařízení BiaCore.

Obrázek 12 znázorňuje vazbu ligandu APRÍL k BCMA transfikovaným buňkám. Buňky 293EBNA byly transfikovány plazmidem tak, aby exprimovaly hBCMA úplné délky. Buňky byly sklizeny o 48 hodin později v pufru s 5 mM EDTA a obarveny pomocí ligandu myc-mAPRIL o koncentracích 0, 40, 200, 1000 a 5000 mg/ml. Ligand byl detekován králičím antisérem proti ligandu APRÍL (R1532) a konjugátem anti-králičí protilátky s PE. Panel A znázorňuje, že intenzita barvení je závislá na dávkování. Panel B znázorňuje, že při užití rozpustného proteinu BCMA-Ig intenzita barvení vzhledem k pozadí klesá .

Obrázek 13 znázorňuje růst 5χ10^δ buněk NIH3T3 implantovaných podkožně do imunodeficientních (Nu/Nu) myší ošetřených kontrolními činidly nebo fúzním proteinem BCMA-Ig. V tomto modelu buňky NIH3T3 tvoří fibrosarkom.

Obrázek 14 znázorňuje růst 8xl0⁵ buněk lidského karcinomu tlustého střeva SW480 imunodeficientních (Nu/Nu) činidly nebo fúzním proteinem hBCMA -Ig.

implantovaných podkožně do myší ošetřených kontrolními

Obrázek 15A znázorňuje růst lidského karcinomu tlustého střeva HT29 implantovaného podkožně do imunodeficientních (Nu/Nu) myší ošetřených kontrolními činidly nebo fúzním proteinem hBCMA -Ig. Vpravé části jsou znázorněny objemy nádorů jednotlivých myší ke 42 dni. Obrázek 15B znázorňuje ti ti tt 8tt · • titi · ti · · ti ti ti ti tititi ·· ti··· titi ti ·· · · · titi ti···

-12růst lidského karcinomu plic A54 9 implantovaného podkožně do imunodeficientnich (Nu/Nu) myší ošetřených kontrolními činidly nebo fúzním proteinem hBCMA -Ig.

Příklady provedení vynálezu

Definice pojmů

Z důvodu jasnějšího a přesnějšího popsání předmětu vynálezu, jsou specifické pojmy používané v dalším popisu vynálezu a následujících patentových nárocích vysvětleny v následujících definicích.

Vynález je v dalším textu podrobně popsán pomocí literárních odkazů, ve kterých jsou zahrnuty následující pojmy:

Termín „receptor APRÍL nebo „APRIL-R užívaný v dalším textu zahrnuje nativní sekvenci APRIL-R a sekvenci variant APRIL-R. APRIL-R lze izolovat z různých zdrojů, jako jsou různé typy myších či lidských tkání, nebo z jiného zdroje, či jej lze připravit rekombinantními či syntetickými postupy. Termín APRIL-R se dále vztahuje na polypeptid, který je schopný vazby k různým členům rodiny nádorových nekrotických faktorů, k ligandu APRÍL, nebo jeho homologům či fragmentům. Příkladem ligandu APRÍL je BCMA.

Termín „BCMA nebo „BCM se vztahuje k novému proteinu, který se účastní maturace B buněk, tak jak je to popsánu Grasem a dalšími(1995), International Immunology 7: strana 1093 až 1106, BCMAp: an integrál membrane protein in the Golgi apparatus of human mature B lymphocytes; Y. Laabim a dalšími (1992), EMBO J. , 11: strana 3897 až 3904, A new gene BCM on Chromosome 16 is fused to the interleukin • 44 ·

4 4 4 Φ Φ 4

44444 44 4

444 4 4 4 Φ ♦

4 4 4 4« • 4 «·4 4« 4444

4 4

4 4

Φ · 4 φ 4 •4 *

-132 gene by a t (4;16) (q26:pl3) translocation in a malignant T cell lymphoma.

„Nativní sekvence receptoru APRIL-R zahrnuje polypeptid mající stejnou aminokyselinovou sekvenci jako APRIL-R, odvozenou z přirozeně se vyskytující sekvence. Takováto nativní sekvence receptoru APRIL-R může být izolována z přirozeně se vyskytujícího materiálu, nebo může být připravena pomocí rekombinantních nebo syntetických postupů. Nativní sekvence receptoru APRIL-R může být přirozeně se vyskytující sekvence APRIL-R ve zkrácené formě, nebo v sekretované formě (to znamená v rozpustných formách, obsahujících například sekvenci extracelulární domény), dále v přirozeně se vyskytujících variantních formách (to znamená alternativně sestříhaných formách) a dále v přirozeně se vyskytujících formách alelických variant APRIL-R. Ve výhodném provedení vynálezu je nativní sekvence APRIL-R, maturovaná nativní sekvence o úplné délce pro polypeptid APRIL-R , obsahující aminokyseliny 1 až 184 ze Sekvence id.č.: 8 nebo její fragmenty.

Termínem „extracelulární doména APRIL-R neboli „APRIL-R ECD se rozumí forma receptoru APRIL-R , která je v podstatě prostá transmembránových a cytoplazmatických domén vyskytujících se v receptoru APRIL-R, Zpravidla extracelulární doména receptoru APRIL-R neobsahuje více než 1% aminokyselinových zbytků z transmembránových a cytoplazmatických domén a ve výhodném provedení obsahuje méně než 0,5% transmembránových a cytoplazmatických zbytků. Obvykle obsahuje APRIL-R ECD aminokyselinové zbytky 1 až 51, nebo 1 až 52, či 1 až 53 ze Sekvence id.č.:8. Ve výhodném provedení APRIL-ECD obsahuje aminokyselinové zbytky 4 až 51 ze Sekvence id.č.: 8, nebo v ještě výhodnějším provedení aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze Sekvence id.č.:8. Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že transmembránová doména identifikovaná v polypetidu APRIL-R podle vynálezu

-14• fe · * · ·

999· ·· fefe ♦ * fe » fe 9 9 9 9 9

9 fe «««fefe fefe 9 fefefe fefefe · fe fe fe fe fefefe fefe · fefefe •fe · ·· fe·· fefe fefefe· byla identifikována pomocí rutinních kriterií, která se používají v daném oboru pro identifikaci tohoto typu hydrofobní domény. Přesné ohraničení transmembránové domény se může lišit, ale s největší pravděpodobností nebude rozdíl větší než 5 aminokyselinových zbytků na každém konci vyznačené domény.

Termínem „varianta APRIL-R se rozumí aktivní receptor APRIL-R, tak jak je definován dále v textu, který má alespoň 80% identitu aminokyselinové sekvence s receptorem APRIL-R, jehož dedukovaná aminokyselinová sekvence úplné délky pro nativní APRIL-R je uvedena v Sekvenci id.č.: 5, nebo se sekvencí APRIL-R ECD. Takovéto varianty APRIL-R zahrnují například polypeptidy APRIL-R, do kterých byl přidán na karboxy konci Sekvence id.č.: 8 jeden nebo více aminokyselinových zbytků, nebo tyto zbytky byly odstraněny. Zpravidla varianta APRIL-R má alespoň 80% nebo 85% identitu aminokyselinové sekvence, ve výhodném provedení vynálezu alespoň 90% identitu aminokyselinové sekvence, v ještě výhodnějším provedení alespoň 95% identitu aminokyselinové sekvence s aminokyselinovou sekvencí podle Sekvence id.č.: 8.

Procenta (%) identity aminokyselinové sekvence ve vztahu k sekvencím receptoru APRIL-R podle ve vynálezu, se definují jako procenta aminokyselinových zbytků ve studované sekvenci, která jsou identická s aminokyselinovými zbytky v sekvenci receptoru APRIL-R, a to po zarovnání (alignmentu) sekvencí a případném doplnění mezer (je-li to třeba k dosažení maximální procentuální shody), kdy se jako část identické sekvence neuvažují žádné konzervativní substituce. Zarovnání (alignment) sekvencí pro stanovené percentuální shody aminokyselinových sekvencí lze provést několika odborníkům známými způsoby, například užitím veřejně dostupných počítačových programů jako je BLAST, ALIGN nebo programu Megalign (DNASTAR). Odborníci daného oboru určí

-15·· φφφφ ·· ·* φ φ φφφ φφφφ φ φ φφφ·· φφ φ ·· · ·· ··· ·· φφφφ odpovídající parametry pro provedení porovnání, včetně potřebných algoritmů, kterými lze provést porovnání přes celou délku srovnávaných sekvencí.

Termín „epitope tagged - „připojený epitop, je-li užíván v dalším textu, se vztahuje k chimernímu polypeptidu obsahujícímu receptor APRIL-R, nebo jeho doménu, které jsou připojeny k polypetidové značce („tag-polypeptide) . Polypeptidová značka obsahuje dostatek aminokyselinových zbytků, které tvoří epitop, proti kterému lze vytvořit protilátku, nebo kterou lze identifikovat pomocí nějakého jiného činidla, avšak je dostatečně krátká, že neinterferuje s aktivitou receptoru APRIL-R. Ve výhodném provedení polypeptidová značka je dostatečně jedinečná, takže protilátka proti ní nereaguje křížově s dalšími epitopy. Vhodná polypeptidová značka obvykle obsahuje alespoň 6 aminokyselinových zbytků a obvykle obsahuje mezi 8 až 50 aminokyselinovými zbytky (ve výhodném provedení 10 až 20 zbytků).

Termínem „izolovaný se v dalším textu při popisu různých polypeptidů rozumí polypeptid, který je identifikován a oddělen a/nebo izolován od komponent běžných v místě jeho přirozeného výskytu. Kontaminující komponenty přirozeně se vyskytujícího v místě původu peptidu představují materiál, který obvykle interferuje s diagnostickým nebo terapeutickým užitím polypeptidu. Mohou to být enzymy, hormony a další rozpuštěné látky proteinové či neproteinové povahy. Ve výhodném provedeni vynálezu lze polypeptid čistit (1) do stupně, který je dostačující k určení alespoň 15 aminokyselinových zbytků na N-konci nebo k určení interní aminokyselinové sekvence pomocí aminokyselinového sekvenátoru („spinning cup sequenator) nebo (2) do stupně, který je dostačující k tomu, aby polypeptid putoval jako jediný proužek na SDS-PAGE za redukujících či neredukujících podmínek s použitím Coomassie

-1600 «000 ·> 9999 ·0 ·0 • · 0 0 0 0 0 0 0 0 • · 0 9 9 9 99 9 9 · *00 · · 0 · 0 0

0 00 0*0 ·0 0000 modři, či ve výhodném provedení po barvení stříbrem. Izolovaný polypeptid zahrnuje polypeptid in sítu v rekombinantních buňkách, jestliže v něm není přítomna alespoň jedna část přirozeného prostředí receptoru APRIL-R. Zpravidla se však izolovaný polypeptid připravuje pomocí alespoň jednoho purifikačního kroku.

proti APRIL-R (polyepitopové)

Termín „protilátka se používá v nej širším smyslu a obvykle pokrývá jednotlivé monoklonální protilátky proti receptoru APRIL-R (včetně agonisty, antagonisty a neutralizačních protilátek) a dále protilátkové kompozice se specifitou proti několika epitopům Termínem monoklonální protilátka se v dalším textu rozumí protilátka získaná z populace značně homogenních protilátek, to znamená, že jednotlivé protilátky obsažené v populaci jsou identické, až na možný výskyt přirozeně se vyskytujících mutací, které mohou být přítomny v malých množstvích.

Termín „vyčištěný preparát či „značně načištěný preparát polypeptidu, který je užíván v dalším textu, znamená polypeptid, který je oddělen od dalších proteinů, lipidů a nukleových kyselin, se kterými se přirozeně vyskytuje. Ve výhodném provedení je polypeptid také oddělen od dalších látek, například protilátek, matrice a tak dále, které byly použity k jeho čištění. .

Termíny „ošetření, léčba a terapie užívané v textu se vztahují na termíny léčebná terapie, profylaktická terapie a preventivní terapie.

Termíny „peptidy, proteiny a polypeptidy se užívají v textu zaměnitelně.

Termín „biologicky aktivní užívaný v textu , znamená in vivo či in vitro aktivitu, která se může projevit buď přímo, či nepřímo. Biologicky aktivní fragmenty recpetoru • 44 44*4 44 44 * 4 4 4 4 4 4 4

4*444 44 · ♦»* 44·· 4

4* • 4 4·· 44 4444

-17APRIL-R mohou mít například 70% aminokyselinovou homologii s aktivním místem receptorů, ve výhodném provedení alespoň 80% homologii a v ještě výhodnějším provedení alespoň 90% homologii. Identita nebo homologie s příslušným receptorem je definovaná jako procento aminokyselinových zbytků v sekvenci aktivního místa, které jsou identické se sekvencí receptorů APRIL-R tak, jak je uvedena v Sekvenci id. č.:8.

Termínem „savec se rozumí jakékoliv zvíře klasifikované jako savec včetně člověka, krav, koní, psů, myší a koček. Ve výhodném provedení vynálezu je savcem člověk.

Pokud není uvedeno jinak vyžaduje provedení vynálezu znalost běžných technik buněčné biologie, kultivace buněk in vitro, molekulární biologie, transgeneze eukaryotických buněk, mikrobiologie, technik rekombinantní DNA a imunologických technik, odborníků v příslušných popsány v literatuře.

v rozsahu, který je běžný u oborech. Takové techniky jsou

Dále budou podrobněji popsána výhodná provedení vynálezu. Vynález popisuje použití receptorů APRIL-R a molekul podobných receptorů APRIL-R při ovlivňování růstu a dozrávání B-lymfocytů a respektive jiných lymfocytů, a zejména při jejich maturaci proti nádorovým buňkám. Vynález dále popisuje použití receptorů APRIL-R a molekul podobných receptorů APRIL-R pro ovlivnění imunitní odpovědi, například při autoimunitních onemocněních a dalších poruchách imunitního systému. Dále vynález popisuje použití genu pro APRIL-R nebo podobného genu pro léčbu rakoviny a poruch imunitního systému pomocí genové terapie.

Receptor APRIL-R a jeho homology produkované hostitelskými buňkami transformovanými geny podle vynálezu, jakož i nativní receptor APRIL-R purifikovaný způsoby známými ze stavu techniky, nebo syntetizovaný pomocí známých

-18•« 100 0 aminokyselinových sekvencí, je vhodný pro léčbu různých druhů rakoviny a imunitních onemocnění. Dále je tento ligand rovněž vhodný pro terapii a další způsoby boje s dalšími nemocemi.

Vynález dále popisuje použití nukleové kyseliny, kódující receptor APRIL-R v antisense terapii. Termínem antisense terapie se zde rozumí přímé podání nebo in šitu vznik takových oligonukleotidů a jejich derivátů, které specificky hybridizují v buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA, která kóduje požadovaný ligand. V důsledku této hybridizace dojde k inhibicí exprese kódovaného proteinu, to jest k inhibici translace a/nebo transkripce. Povaha této vazby může být konvenční komplementarita baží, například o speciální případy vazby nebo může jít oligonukleotidů dvoušroubovice.

k hluboké drážce (major groove)

DNA

Obvykle se antisense terapií rozumí skupina metod známých ze současného stavu techniky zahrnující jakoukoliv terapii založenou na specifické vazbě sekvence oligonukleotidů.

Antisense konstrukt podle vynálezu může být podán například ve formě expresního plazmidu, který po expresi v buňce produkuje RNA komplementární k té části buněčné mRNA, která kóduje Kay-ligand. Popřípadě může být antisense konstrukt tvořen oligonukleotidovou sondou připravenou ex vivo. Vhodnými oligonukleotidovými sondami jsou modifikované oligonukleotidy, který jsou odolné proti účinku endogenních nukleáz a jsou tudíž poměrně stabilní v podmínkách in vivo. Příkladem vhodné modifikované nukleové kyseliny použitelné v antisense terapii jsou fosforamidáty, fosfothioáty a methylfosfonáty (viz například patenty č: 5.176.996; 5.264.564 a 5.256.775). Dále byly postupy pro přípravu oligomerů použitelných v antisense terapii shrnuty na

0Λ tttt • · 4 · · · »

-194 4 *tt ·

4 · * 44·· • «· 4*4 4« 4444 příklad v publikaci van Der Krola a dalších, (1988) Biotechniques 6: strana 958 až 975; a Steina a dalších, (1988) Cancer Res 48: strana 2659 až 2668.

Výše popsaný receptor APRIL-R podle vynálezu je členem skupiny receptorů příbuzných TNF. Tento protein, jeho fragmenty nebo jejich homology mohou mít široké léčebné a diagnostické použití.

Polypeptidy podle vynálezu specificky interagují s ligandem APRÍL, bílkovinou dříve popsanou v dokumentu WO99/12964, který je uveden v seznamu referencí. Peptidy a způsoby podle vynálezu umožňují identifikovat molekuly, které specificky interagují s receptorem APRIL-R nebo jeho fragmenty.

V jednom z provedení vynálezu jsou popsány způsoby použití peptidů odvozených od receptorů APRIL-R, které mají schopnost vázat ligand APRÍL. Fragmenty receptorů APRIL-R mohou být připraveny několika způsoby, například rekombinantními technikami pomocí PCR, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty studovaného polypeptidů mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo více nukleotidů z jednoho nebo obou konců nukleové kyseliny, která tento polypeptid kóduje. Expresí mutované DNA pak vznikají fragmenty tohoto polypeptidů.

Poiypeptidové fragmenty mohou být rovněž syntetizovány chemicky za použití způsobů známých ze stavu techniky. Takovým chemickým postupem je například konvenční Merrifieldova syntéza na pevné fázi s použitím esterů f-moc nebo t-boc. Peptidy a DNA sekvence podle vynálezu mohou být například libovolně rozděleny na vzájemně se nepřekrývající fragmenty požadované délky, nebo na fragmenty, které mají navzájem určitý překryv. Způsoby, jakými toho lze dosáhnout, jsou níže popsány podrobněji.

-20• φ ··« · • *

Příprava rozpustných forem receptorů APRIL-R

Rozpustné formy receptorů APRIL-R mohou často efektivně přenášet signál a mohou být proto aplikovány jako lék, který napodobuje v účinku přirozenou membránovou formu. Je možné že receptor APRIL-R popisovaný ve vynálezu je přirozeně sekretován jako rozpustný cytokin, nicméně pokud tomu tak není, lze sekrece dosáhnout pomocí genového inženýrství. Rozpustnou sekreční formu receptorů APRIL-R lze připravit odstraněním DNA kódující N-koncové transmembránové oblasti a některé části peptidové „stopky (stalk region) a jejich nahrazením sekvencemi, které kódují signální peptidy typu I popřípadě typu II, tak, aby ve vybraném expresním systému došlo k jejich správnému proteolytickému štěpení. Zkušený odborník dokáže optimalizovat velikost ponechané části peptidové „stopky tak, aby bylo dosaženo maximální vazby ligandů a zároveň účinnosti sekrece. Například mohou být připraveny konstrukty obsahující všechny možné delece takže vzniknou peptidy začínající Z analýzy tohoto typu pak vyplyne v N-terminalní oblasti, aminokyselinou 1 až 52.

optimální délka N-terminální sekvence.

Příprava protilátek reagujících s receptorem APRIL-R

Vynález dále popisuje protilátky specificky reagující s receptorem APRIL-R nebo jeho koreceptory. Antisérum nebo monoklonální protilátky proti tomuto proteinu, případně peptidů mohou být připraveny podle známých standardních protokolů (viz například Antibodies: A Laboratory Manual, editoři Harlow a Lané (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1988)) . Savci jako například myši, křečci nebo králíci mohou být imunizováni imunogenní formou peptidů. Mezi způsoby zvyšujícími imunogenitu proteinů, nebo peptidů, patří ·« ·««· »· ·*·* ·9 99 • · » · · * · · ♦ · • 4 * ««··« · · 4 » 4 · 4* 4 4 4 4

Μ 4 ·» ·♦· »4 9999

-21navázání na nosič, nebo další, odborníkům dobře známé, způsoby.

Imunogenní část receptoru APRIL-R, nebo jeho koreceptorů, může být podávána spolu s vhodným adjuvans (látkou zvyšující účinek antigenů). Imunizaci lze kontrolovat testováním titru protilátek v plazmě nebo séru.

K tomuto účelu lze použít standardní ELISA test nebo jiné imunoenzymatické testy.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou protilátky podle vynálezu specifické pro antigenní determinanty receptoru APRIL-R nebo jeho koreceptory, například jsou specifické k antigenním determinantám polypeptidu podle Sekvence id. č.:8, nebo k lidským nebo jiným savčím peptidům které jsou s tímto lidským peptidem blízce příbuzné (vykazují například 70, 80 nebo 90 % homologii, ve výhodném provedení alespoň 95 % homologii). V ještě dalším výhodném provedení vynálezu protilátky proti receptoru APRIL-R nebo proti jeho koreceptorům nevykazují žádnou podstatnou křížovou reaktivitu (tj . jsou specifické) s proteinem který má například nižší než 80% homologii se Sekvencí id. č.:8; ve výhodném provedení nevykazují křížovou reaktivitu s proteinem, který má nižší než 90 % homologii se Sekvencí id. č.:8; a v ještě výhodnějším provedení vynálezu nereagují s proteinem, který má nižší než 95% homologii s proteinem jehož sekvence odpovídá Sekvenci id. č.:8.

„Podstatnou křížovou reaktivitou se rozumí, že daná protilátka má k nehomolognímu proteinu vazebnou afinitu, která je nižší než 10 %, ve výhodném provedení nižší než 5 % a v ještě výhodnějším provedení vynálezu nižší než 1 % vazebné afinity k proteinu jehož sekvence odpovídá Sekvence id č.: 8.

Termínem „protilátka se v dalším textu rozumí jak vlastní protilátky, tak i jejich fragmenty, které specificky

949· • 0 ·0

0« 0 0*0 000* 00 0 0···· 0 0 0 0 00 0 0 * 000 « 0 • 00 ·· 0 000 00 · 0« 000 ·0 0000

-22reagují s receptorem APRIL-R. Fragmenty protilátek mohou být připraveny konvenčními způsoby známými ze stavu techniky a jejich účinnost může být testována stejným způsobem jako výše popsaná účinnost celých protilátek. Například fragmenty F(ab)₂ mohou být připraveny štěpením protilátek pepsinem. Ve výsledném F(ab)₂ fragmentu mohou být chemicky zredukovány disulfidové můstky, čímž vzniknou F(ab) fragmenty. Mezi protilátky podle vynálezu dále patří takové protilátky bispecifické a chimerní molekuly, které mají vazebnou afinitu k receptoru APRIL-R nebo ke koreceptoru APRÍL. Jak monoklonální a polyklonální protilátky (Ab) proti receptoru APRIL-R a jeho koreceptorům, tak i protilátkové fragmenty F(ab) a F(ab)₂ mohou být použity pro zablokování funkce APRIL-R a příslušných koreceptoru.

Různé formy protilátek mohou být také připraveny pomocí standardních způsobů genového inženýrství (Winter a Milstein, Nátuře 349: strana 293 až 299 (1991), viz seznam referencí). Mohou tak být například zkonstruovány chimérické protilátky, ve kterých je antigen vazebná doména ze zvířecí protilátky spojena s lidskou konstantní oblastí (Cabilly a další, patent U.S.A. 4.816.567, viz seznam referencí). Chimérické protilátky mohou při použití v klinické léčbě lidských pacientů vyvolávat slabší nežádoucí imunitní odpověď, než jakou u lidských pacientů vyvolávají protilátky zvířecí.

Kromě toho mohou být syntetizovány rekombinantní humanizované protilátky rozpoznávající receptor APRIL-R nebo jeho koreceptory. Humanizované protilátky jsou chiméry skládající se z větší části lidské IgG, do které byly vloženy oblasti odpovědné za specifickou vazbu antigenů. Zvířata jsou nejprve imunizována požadovaným antigenem, poté se izolují odpovídající protilátky a odebere se část sekvence variabilní oblasti odpovědná za specifickou vazbu antigenů.

»· ♦ ··· oto «to·¹» '·*· ·« · · · » · « « a to · « · · ··· ·· · ··· ·· ·<·· ·· · ·· ··· »· ····

		-23-
Antigen-vazebné	oblasti	odvozené	ze zvířecích
protilátek	jsou poté	nakloňovány	do odpovídajícího místa
v genu pro	lidskou	protilátku,	ve kterém byla dříve
odstraněna	antigen	vazebná	oblast.	Při použití

humanizovaných protilátek se minimalizují heterologní (tj . mezidruhové) sekvence obsažené v dané lidské protilátce, čímž se snižuje riziko vyvolání nepříznivé imunitní odpovědi v pacientovi.

Lze rovněž připravit různé třídy rekombinantních chimérických nebo humanizovaných protilátek tím, že se použijí zvířecí variabilní domény a lidské konstantní oblasti (CH1, CH2, CH3) z protilátek různých tříd. Protilátky se zvýšenou valencí místa pro vazbu antigenu mohou být připraveny například s využitím genového inženýrství tak, že se příslušná místa pro vazbu antigenu nakloňují do vektorů nesoucích lidské konstantní oblasti, (viz Arulanandam a další, J. Exp. Medicine 177: strana 1439 až 1450 (1993)).

Kromě toho mohou být standardní způsoby rekombinantní DNA použity pro změnu vazebné afinity rekombinantních protilátek k příslušným antigenům. Takovéto změny afinity lze dosáhnout pozměněním aminokyselinových zbytků v nejbližším okolí místa pro vazbu antigenu. Afinitu vazebných míst humanizované protilátky lze také být zvýšit cílenou mutagenezí založenou na molekulárním modelování, (Queen a další, Proč. Nati. Acad. Sci. 86: strana 10029 až 10033 (1989)).

Příprava analogů: Produkce pozměněných peptidových a DNA sekvencí

Analogy receptorů APRIL-R se mohou lišit od přirozeně se vyskytující formy receptorů APRIL-R v aminokyselinové

-24*· *··· ·· ···· ·· ·· • ♦ ···· · · φ · « · · · · ··* · · · • · · ·· · · · · • Φ · ·Φ ··* φφ ···· sekvenci, ve vlastnostech nezávislých na sekvenci, nebo v obojím. Modifikace nezávislé na sekvenci zahrnují in vivo nebo in vitro chemickou derivatizaci receptoru APRIL-R. Mezi takovéto modifikace mimo jiné patří změny v acetylaci, methylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.

Výhodné analogy podle vynálezu zahrnují receptory APRIL-R popřípadě jejich biologicky aktivní fragmenty, jejichž aminokyselinová sekvence se liší od sekvence popsané v Sekvenci id. č.: 8 jednou nebo více konzervativními záměnami aminokyselin, nebo jednou nebo více nekonzervativními záměnami, delecemi nebo inzercemi, které však nezpůsobí ztrátu vazebné aktivity vzhledem k ligandu APRÍL. Mezi konzervativní záměny typicky patří mutace jedné aminokyseliny za jinou s podobnými chemickými vlastnostmi, například náhrady aminokyselin uvnitř následujících skupin: valin, glycin; glycin, alanin; valin, isoleucin, leucin; kyselina asparagová, kyselina glutamová; asparagin, glutamin; serin, threonin; lysin, arginin; respektive fenylalanin, tyrosin.

Gen pro receptor APRIL-R o úplné délce (Sekvence id. č.:8) nebo jeho části mohou být použity jako hybridizační sondy pro skríning cDNA knihovny, například pro izolaci dalších genů, které mají požadovanou sekvenční identitu s genem pro receptor APRIL-R podle Sekvence id. č.: 6. Nukleotidové sekvence kódující receptor APRIL-R mohou být dále použity ke zkonstruování hybridizační sondy pro mapování genů kódujících APRIL-R a pro genetickou analýzu jednotlivců s genetickými poruchami. Mohou být navrženy takové hromadné testy, které budou sloužit nalezení sloučenin napodobujících biologickou aktivitu receptoru APRIL-R. Takové hromadné testy mohou být založeny na metodice adaptovatelné na masové multiparalelní zpracování (high-throughput) chemických knihoven, což je zvláště vhodné pro identifikaci malých molekul - potenciálních léčiv. Mezi « 0

-250 0 0 0 0 0 0 00 0 00000 · 0

00 0 000 00 β 00 00 0 00 0000 malé molekuly vhodné pro toto testování patří syntetické organické nebo anorganické sloučeniny. Nukleové kyseliny kódující receptor APRIL-R nebo jeho deriváty mohou být rovněž použity pro vytvoření transgenních nebo „knock-outovaných zvířat, která jsou dále výhodná ve vývoji a skríningu terapeuticky vhodných látek, včetně například léčiv proti rakovině.

Receptor APRIL-R a jeho homology produkované hostitelskými buňkami transformovanými sekvencí podle vynálezu jakož i nativní receptor APRIL-R purifikovaný způsobem známým ze stavu techniky, nebo nasyntetizovaný na základě známé aminokyselinové sekvence je použitelný v mnoha aplikacích v boji proti rakovině.

V jednom z provedení vynálezu je popsán způsob léčby savčího organismu postiženého nežádoucí proliferaci buněk založený na podání účinného množství terapeutické kompozice obsahující antagonistu receptoru APRIL-R. V tomto způsobu se antagonistou receptoru APRIL-R rozumí polypeptid, který zabraňuje interakci mezi ligandem APRÍL a odpovídajícím receptorem nebo receptory podaný spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Ve výhodném provedení vynálezu je tímto odpovídajícím receptorem ligandu APRÍL na povrchu cílových buněk antigen BCMA.

Způsob podle vynálezu může být použit s libovolným antagonistou APRIL-R, který obsahuje polypeptid zabraňující interakci mezi ligandem APRÍL a příslušným receptorem nebo receptory. Příkladem těchto antagonistů receptoru APRIL-R jsou, mimo jiné, rozpustný polypeptid APRIL-R, včetně rozpustného antigenů BCMA (kromě jiného); rozpustné chimérické molekuly APRIL-R, jako je například fúzní protein BCMA-IgG-Fc a homology protilátek proti receptoru APRIL-R, • tititi • ti · ti · ti · · · ti • ti ti ti · tititi · · · ··· ·· · ··· •ti ti titi ··· ·· ····

-26kromě jiných například monoklonální protilátka proti molekule BCMA.

Způsob podle vynálezu může být použit v boji proti jakýmkoliv poruchám a onemocněním spojeným s nežádoucí buněčnou proliferaci. Způsob podle vynálezu může být především použit pro léčbu nádorových buněk exprimujících ligand APRÍL a/nebo jeho receptor APRIL-R (to jest antigen BCMA).

Příklady rakovinných onemocnění u nichž je buněčná proliferace modulována ligandem APRÍL mohou být identifikovány in vitro změřením koncentrace mRNA kódující ligand APRÍL a/nebo receptor APRIL-R (tj . antigen BCMA) v knihovně vytvořené z buněk pocházejících z nádorových tkání. Takové nádorové tkáně, ve kterých je vysoce exprimován ligand APRÍL a/nebo receptor APRIL-R (tj. antigen BCMA) jsou vhodnými kandidáty na léčbu.

Jiným způsobem vyhledání nádorových tkání vhodných pro léčbu podle vynálezu je hledání ve veřejných a soukromých databázích (např. v databázi firmy Incyte), přičemž se pro prohledávání použije například úplná cDNA sekvence genu pro lidský ligand APRÍL.

Tímto způsobem bylo prokázáno, že mRNA pro ligand APRÍL je exprimována ve velkém množství typů nádorů, mimo jiné například v liniích uvedených v tabulce 1:

Tabulka 1

Knihovna Popis buněčná linie z tumoru prostaty, LNCaP, CA 50M, neošetřená, TIGR buněčná linie z tumoru T-lymfocytů, lymfom, TIGR buněčná linie z tumoru vaječníků, papilární serózní

-27·· ···· ·· ···· ο· ·· • · · · · · · * · fe

Λ fe fe · · · · · ·· · • ·· ··· fefefe· fe fefefe fefe · · · fe fefe · fefe fefefe fefe ····

cystadenoCA

buněčná linie z tumoru plic, mw/adenoCA, COPD, 47M

buněčná linie z rakoviny prsu, adenoCA, 46F, SUB, m/BRSTNOT33

buněčná linie z ganglionu, dorsální kořen, cervikální aw/lymfom, 32M, NORM

buněčná linie z nádoru mozku, frontální neuronální neoplázie, 32M

buněčná linie z tumoru prostaty, adenoCA, 59M, SUB, m/PROSNOSTl9

buněčná linie z nádoru tlustého střeva, hepatická fexura, adenoCA, 55M. SUB, m/COLATMTOI

buněčná linie z nádoru pankreasu, TIGR

buněčná linie z nádoru paraganglionu, paraganglioma. aw/ledvinové buňky, CA, 46M

buněčná linie z nádoru prsu, mw/duktální CA, 43F, mBRSTTUTl6

buněčná linie z tumoru ledvin, ledvinová buňka CA, 51F

buněčná linie z nádoru močového měchýře, mw/TC CA, CA in šitu, 60M. m/BLADTUT 04

buněčná linie z nádoru dělohy, endometrial, F, TIGR

buněčná linie z nádoru prostaty, BPH. mw/adenoCA, PIN, 59M

buněčná linie z nádoru plic, mw/adeno CA, 53M, m/LUNGTUTl7

buněčná linie z nádoru kostí, MG-63, osteo SAR, obr. buňka.

-28• · «· • · 4 · · 4 ·· 4444

M/F, pool, RP

buněčná linie z nádoru mozku, čelní kůra mozková, aw/plicní CA, 77M.

buněčná linie z nádoru tlustého střeva, adenoCA, NORM. SUB, CGAP

buněčná linie z nádoru plic, dlaždicová buňka CA, 57M

buněčná linie z nádoru plic, mw/adeno CA, 63M

buněčná linie z nádoru prostaty, AH mw/adeno CA, 50M, m/PROSTUTOl

buněčná linie z tumoru B-lymfocytů periferní krve, CLL, pool, NORM, 3'CGAP

buněčná linie z nádoru tlustého střeva, adenoCA, pool, NORM 3/5' CGAP

buněčná linie z nádoru ledvin, mw/ledvinová buňka CA, 8,53F, pool, NORM

buněčná linie z nádoru vaječníků, dermoid. Cysta, 22F

buněčná linie z nádoru tlustého střeva, adenoCA, NORM, 3' CGAP

buněčná linie z nádoru tlustého střeva. adenoCA, 3', CGAP

buněčná linie z nádoru prostaty, BPH, mw/adenoCA, 70M. SUB

buněčná linie z nádoru vaječníků, mets tlusté střevo adenoCA, 58F

buněčná linie z nádoru dělohy, myometrium. mw/leiomyoma. 43F

buněčná linie z nádoru tenkého střeva, ileum, mw/CLC. 2F

buněčná linie z nádoru lymfatických uzlin, peripankreatický, aw/pancreatický adenoCA 65 M

buněčná linie z nádoru vaječníků, aw/leiomyomata. 36F, NORM

buněčná linie z nádoru plic, mw/ karcinoid vřetenových (spindle) buněk, 62F

buněčná linie z nádoru plic tumor, dlaždicová buňka CA 50M

buněčná linie z nádoru mozku tumor, menigioma, 36M

nádorová buněčná linie, adenoCA, 65F, m/PANCNOT08

buněčná linie z nádoru plic, mw/endobronchialní karcinoid, 33M

buněčná linie z nádoru nadledvinek, mw/pheochromocytoma. 43F, m/ADRETUT07

buněčná linie z nádoru předního mozku, meningioma, 50M

buněčná linie z nádoru ledvin, pool, NORM, 3' CGAP

buněčná linie z nádoru prsu, mw/lobulární CA, 67F

buněčná linie z nádoru plic, mw/mets osteoSAR, aw/pleura mets. 58M, NORM

buněčná linie z nádoru prostaty. adenoCA, 59M. SUB, m/PROSNOU 9

buněčná linie z nádoru tenkého střeva tumor, ileum, mets endometrialní adenoCA, 64F

buněčná linie z nádoru vaječníků, adenoCA, 58F

buněčná linie z nádoru prsu, NF breast disease. 46F

buněčná linie z nádoru předního mozku, mets hypernefroma,

-30• · · ♦ · · • · to a · · a · · «

58M

buněčná linie z nádoru ledvin, Wilms, pool, WM/WN

buněčná linie z nádoru plic, mw/mets thyroid CA, 79M, m/LUNGTUT02

buněčná linie z nádoru plic, mets thyroid CA, 79M, m/LUNGTUT03

buněčná linie z nádoru příštitných tělísek, adenoma. M/F, NORM, WM

buněčná linie z nádoru slinivky, anaplastický CA, 45F

buněčná linie z nádoru vaječníků, mw/mucinózní cystadenoCA, 43F, m/OVARTUTOl

buněčná linie z nádoru plic, dlaždicová buňka CA, pooled. NORM, CGAP

buněčná linie z nádoru prsu, adenoCA, 46F, m/BRSTNOTl7

buněčná linie z nádoru dělohy , mw/leiomyoma, aw/tlusté střevo, adenoCA, 45F

buněčná linie z nádoru plic, mw/adenoCA, aw/node, diafragm mets, 63F

buněčná linie z nádoru prsu, adenoCA, 46F, m/BRSTNOT33

buněčná linie z nádoru prostaty, adenoCA, 66M, m/PROSNOT15, PROSDINOl

buněčná linie z nádoru prsu, adenoCA, 54F, m/BRSTNOT03

buněčná linie z nádoru zárodečných buněk, pool, SUB, 3' CGAP

buněčná linie z nádoru kostní dřeně, tibia, aw/mets

• · ! • · 9 alveolární rhabdomyo SAR. 16M buněčná linie z nádoru prostaty. AH. mw/adeno CA, 57M, m/PROSTUTOl buněčná linie z nádoru prsu, PF změny, mw/adeno CA, 43F. m/BRSTTUTOl buněčná linie z nádoru dělohy tumor, serózní papilární CA, F, pooled, 3' CGAP buněčná linie z nádoru vaječníků, mucinózní cystadeno CA, 43F, m/OVARNOT03 j buněčná linie z nádoru prsu, PF změny. mw/adenoCA, intraduktální CA, 43F buněčná linie z nádoru prsu, mw/duktální CA, CA in šitu, aw/uzliny mets, 63F buněčná linie z neuroganglionu, ganglioneuroma, 9M buněčná linie z nádoru slinivky , adenoCA, 3' CGAP buněčná linie z nádoru dělohy, endometrialní adenoCA, F, pool. 3' CGAP buněčná linie z nádoru plic, neuroendokrinní karcinoid, pool, NORM, 3' CGAP

Antagonisté receptorů APRIL-R podle vynálezu používaní při léčbě onemocnění spojených s nežádoucí buněčnou proliferací, zvláště pak při léčbě nádorů, inhibují výhodně růst nádorových buněk z více než 10 %, 20 %, 30 % nebo 40 % a nej výhodněji z více než 50%. Antagonisty receptorů APRIL-R lze získat pomocí skríningu (viz Příklad 6) . Antagonisté receptorů APRIL-R tak mohou být například vybráni na základě aktivity inhibující růst (z více než 10%, 20%, 30%, 40% nebo • 4 ·

-32tt 44 · 4

50%) buněk lidského karcinomu tlustého střeva HT2 9 nebo buněk lidského karcinom plic A549 (viz například popis k obrázku 15).

Další provedení vynálezu popisuje způsoby inhibice růstu B-lymfocytů a buněk nepříbuzných B-lymfocytům (non-B cell), inhibice růstu B-lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami a dozrávání a tvorby protilátek za použití polypeptidů APRIL-R.

Vynález dále popisuje způsob použití receptorů APRIL-R při léčbě autoimunitních kardiovaskulární chorob, proliferace B-lymfocytů, onemocnění, zvýšeného tlaku, onemocnění ledvin, poruch imunosupresivních onemocnění, transplantací orgánů, zánětů a při léčbě HIV. Vynález dále popisuje způsoby použití léčiv potlačujících, zesilujících nebo pozměňujících imunitní odpověď organismu, přičemž tohoto pozměnění je dosaženo ovlivněním signální dráhy mezi receptorem APRIL-R a jeho ligandem.

Vynález dále popisuje farmaceutické kompozice obsahující polypeptid APRIL-R a farmaceuticky přijatelný excipient. Vhodné nosiče pro polypeptid APRIL-R jsou popsány například v knize „Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, 1950, Mack Publishing Co., editorů Osla a dalších. V typickém provedení vynálezu se v přípravku použije příslušné množství farmaceuticky přijatelné soli tak aby vznikl izotonický přípravek.

Mezi vhodné nosiče patří například pufry jako je fyziologický roztok, Ringerův roztok a glukózový sirup. Ve výhodném provedení vynálezu je pH roztoku v rozmezí cca pH=5 až 8, ve výhodnějším provedení je pH v rozmezí od 7,4 do 7,8. Dalšími vhodnými nosiči jsou přípravky umožňující dlouhodobé uvolňování jako například semipermeabilní matrice z hydrofobních polymerů. Takové matrice mohou být zformovány do lipozómů, filmů nebo mikročástic. Odborníkům je zřejmé, • · · · • · • · a • · · ♦ · · « · · · · · · « • · · · « ·

-33že pro určité aplikace mohou být vhodnější určité nosiče, v závislosti například na způsobu podání léku a na koncentraci polypeptidu APRIL-R, který má být pacientovi aplikován.

Přípravek může být aplikován injekčně (například nitrožilně, intraperitoneálně, subkutánně, intramuskulárně) nebo jiným způsobem, jako například infuzí, tak, aby byla zajištěna potřebná dávka účinné látky v krevním řečišti pacienta.

Pokud není uvedeno jinak, vyžaduje provedení vynálezu znalost běžných technik buněčné biologie, kultivace buněk in vitro, molekulární biologie, mikrobiologie, technik rekombinantní DNA, proteinové biochemie a imunologických technik v rozsahu, který je běžný u odborníků v příslušných oborech. Takové techniky jsou popsány v literatuře, viz například Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, editoři Sambrook, Fritsch a Maniatis) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, svazky I a II (editor D. N. Glover), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (editor M. J. Gait), 1984; patent Spojených států č. 4,683,195 (Mullis a další), Nucleic Acid Hybridization (editoři B. D. Hames a S. J. Higgins) 1984; Transcription and Translation (editoři B. D, Culture of Animal Cells

Hames a S. J. Higgins), 1984; (editor R. I. Freshney), nakladatelství Alan R. Liss, lne. , 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, svazky 154 a 155 (Wu a další), Academie Press, New York; Gene Transfer

H. Miller a Μ. P. Laboratory Press; Molecular Biology

Vectors for Mammalian Cells (editoři J Calos), 1987, Cold Spring Harbor

Immunochemical Methods in Cell and (editoři Mayer a Walker), Academie Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, svazky I až IV (editoři φφ »*·»

-34D. Μ. Weir and C. C. Blackwell), 1986; Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Příklady provedení vynálezu

V příkladech byla použita následující metodika

Metodika

Klonování a exprese fúzního proteinu myšího ligandu APRÍL s epitopem myc (CCM776) v Pichia pastoris

Expresní vektor pCCM213.10 byl zkonstruován na základě plazmidu PDR004 (H98 muAPRIL se „stopkou ligandu superFAS navázanou na N-konci spolu s epitopem FLAG), ze kterého byla vyštěpena sekvence kódující myší ligand APRÍL (muAPRIL) pomocí enzymů Sací a Notl.

Syntetické oligonukleotidy LTB-559 a 560 vytvářejí linker s místy Xhol a Sací, který dále obsahuje a párovací signální peptid, epitop myc a motiv KEL z ligandu FAS. Fragment muAPRIL byl spolu s linkerem vložen ligací do XholNotl míst v plazmidu pCCM211, což je expresní plazmid pro Pichia pastoris.

Plazmid pCCM213.10 byl poté linearizován enzymem Stul, elektroporován do buněk kmene GS115 (his4-) a vyset na plotny s minimálním médiem obsahujícím dextrózu (D-(+)-glukózu). HIS4 transformanti byli testováni na expresi proteinu tak, že jedna kolonie byla přeočkována do bohatého média (BMGY: pufrované komplexní médium s glycerolem), ve kterém bylo buňkám umožněno růst po dobu 48 hodin při teplotě 30°C. Kultura byla poté zcentrifugována

-35·· 9 99 9 ··

9 9 9 9 • 0 · 9 · 9 0 a buněčná peleta byla resuspendována v poměru 1:5 v bohatém médiu pro indukci s obsahem 1,5 % methanolu (BMMY: pufrované komplexní médium s methanolem) . Buňky byly dva dny indukovány při teplotě 30°C a poté byly supernatanty analyzovány pomocí SDS-PAGE a byla stanovena přítomnost proteinu muAPRIL. Proteiny byly nejprve nespecificky obarveny Coomassie modří a poté specificky ve Western blotu monoklonální protilátkou proti epitopu myc 9E10. Bylo přitom prokázáno, že kmen CCM776 produkuje dostatečné množství glykosylovaného fúzního proteinu muAPRIL-H98 s připojeným epitopem myc.

Purifikace proteinu mAPRIL s epitopem myc

Protein mAPRIL s epitopem myc sestávající z celkem 149 aminokyselin byl exprimován v buňkách Pichia pastoris. Tento protein má izoelektrický bod roven 7,45. 175 ml supernatantu buněk Pichia pastoris bylo přes noc dialyzováno proti lOmM Tris pufru o pH=6,8. Poté byl dialyzovaný supernatant nanesen na 20 ml SP kolonu. Kolona byla extenzivně promyta lOmM Tris-HCl pufrem o pH= 6,8 a obsah byl eluován 250 mM NaCl v PBS. Druhý krok purifikace byl proveden pomocí gelové filtrace na koloně S300. Frakce obsahující protein myc-APRIL získané z 20 mililitrové SP kolony byly zakoncentrovány centrifugací na konečný objem 7 ml. Podle spektrofotometrického měření a Coomassie obarveného elektroforetického gelu činil výtěžek po gelové filtraci 8 mg proteinu myc-APRIL. Byl rovněž proveden Western blot pomocí myší moklonální protilátky 9E10 (protilátka proti epitopu myc) dokazující, že epitop myc nebyl poškozen purifikačním postupem. Sekvenací N-koncové oblasti bylo potvrzeno, že purifikovaný protein je skutečně protein mycmAPRIL.

·· 00 « ♦ 0

-360 · 0 0 0· t 0 0 • · 0 0 * 0 «00

Purifikace fúzního proteinu lidského peptidu APRÍL s epitopem FLAG.

Plazmid ps429 (následně přejmenovaný na pl448) byl použit pro transientní transfekci T-lymfocytů 293. Transfekce byla provedena pomocí lipofektaminu (Gibco-BRL) a bezsérového média. Plazmid, který je založen na savčím expresním vektoru PCR3 (Invitrogen) kóduje receptor-vazebnou doménu lidského ligandu APRÍL s N-terminalním peptidem, která je po expresi uvolňována do kultivačního média. Fúzní protein s epitopem FLAG byl purifikován z bezsérového média pomocí afinitní kolony s monoklonální protilátkou proti FLAG epitopu a potom eluován pomocí přebytku čistého peptidu FLAG. Purifikace byla provedena podle instrukcí výrobce (Kodak).

Purifikace fúzního proteinu HBMCA-Fc

Buňky 293 byly transientně transfikovány vektorem kódujícím fúzní protein HBMCA-Fc. Kultivační médium z buněk 293 exprimujících fúzní hBCM-Fc bylo naneseno na afinitní kolonu s proteinem A. Protein byl eluován 25 mM fosfátovým pufrem, lOOnM NaCl, pH=7,8, po které následovala neutralizace 1/20 objemu 0,5 M NaPO₄ pH=8,6. Na základě absorbance při 280 nm byly vybrány frakce, které byly dále analyzovány elektroferézou SDS-PAGE za redukujících a neredukujících podmínek. Poté byl ještě pomocí western blotu identifikován purifikovaný protein. Z 500 ml média byly vyizolovány 3 mg proteinu.

Myší ligand mAPRIL s epitopem myc se váže na různé buněčné linie ve FACS analýze

450 ng/ml purifikovaného polypeptidu myc-mAPRIL bylo navázáno na studovanou buněčnou linii ve 100 μΐ PBS/2%FBS * 4

V ·

-37• 4 444· • · · 4 ·

44 * 4 4 4 • « *

4 4 • · 4 »· 4444 (fetálního telecího séra) s přídavkem Fc blokujícího agens (FcBlock, 20 pg/ml, Pharmingen) a s purifikovanou lidskou IgG (10 pg/ml, Sandoz). Navázání bylo provedeno 1 hodinovou inkubací na ledu. Navázání polypeptidu myc-mAPRIL bylo detekováno pomocí specifického králičího antiséra proti myšímu ligandu APRÍL (1:500) a konjugátu oslí anti-králičí IgG s fluorescein-isothiokyanátem (FITC, Jackson). Buněčné linie A20, Ráji, NIH3T3 a HT29 byly udržovány v médiích podle doporučení dodavatele (ATCC Bethesda, Maryland). Buňky BJAB byly kultivovány v médiu RPMI pufrovaném pomocí HEPES s přídavkem 10% FBS a L-glutaminem. V kompetitivních testech bylo k 1 pg/ml konkurenčního proteinu přidáváno vždy po 450 ng/ml myšího ligandu APRÍL s epitopem myc (mycmAPRIL) .

Příklad 1: Identifikace vazby ligandu APRÍL k receptoru APRIL-R pomocí testu na plotně

V tomto příkladu byla testována vazba BCMA s ligandem APRÍL.

V imunoprecipitačním experimentu byla potvrzena vazba BCMA a ligandu APRÍL. V tomto experimentu byly použity rozpustné formy obou fúzních proteinů hBCMA-Fc a myc-mAPRIL.

Do média obsahujícího 10 % FBS byly za pokojové teploty na 0,5 hodiny vloženy fúzní proteiny hBCMA-Fc a LTBR-Fc s různými TNF ligandy: myc-mAPRIL; myc-CD40L a mycRANKL. Fc proteiny byly 1 až 2 hodiny inkubovány s partikulemi s navázaným proteinem A, třikrát promyty 1 ml PBS a analyzovány imunoblotem s myší moklonální protilátkou 9E10 (protilátka proti epitopů myc) . Blot byl vyvolán se substrátem pro zesílenou chemiluminescenci.

-38♦ ti ti ti • ti • ti ti ti ti ti ti· titi • ♦ ti ti ti * · • ti ti ti tititi • ti titititi

V tomto experimentu byly úspěšně detekovány imunoprecipitáty myc-APRIL a hBCMA-Fc, z čehož lze usuzovat na to, že BCMA interaguje s ligandem APRÍL specificky na rozdíl od dalších TNF ligandu (myc-CD-40L a myc-RANKL), které neměly schopnost navázat se na BCMA. Myc-APRIL se zároveň neváže na LTBR-Fc.

Stejná membrána byla odbarvena a opětovně oblotována konjugátem křenové peroxidázy s protilátkou proti lidským imunoglobulinům. Bylo prokázáno, že v obou imunoprecipitátech bylo použito stejné množství LTBR-Fc i BCMA-Fc.

Příklad 2: Specifická interakce fúzních proteinů hBCMA-Fc a FLAG-hAPRIL

ELISA analýza: ELISA desky byly přes noc potaženy fúzním proteinem receptor-Fc (hBCMA-Fc-739 nebo hTNFR2-Fc-492) o koncentraci 1 pg/ml v uhličitanovém pufru o pH=9,6, inkubace probíhala při teplotě 4°C. Potažené desky byly za pokojové teploty 2 hodiny blokovány pufrem PBS s 5% odtučněným sušeným mlékem a 0,5% Tweenem 20.

Byla připravena postupně ředěná řada ligandu (s faktorem 2 mezi jednotlivými ředěními) ve 100 μΐ blokovacího pufru (TNFa-197 od lOOOng/ml, muBAFF-657 od lOOOng/ml, hAPRIL-507 od 2000 ng/ml (neaktivní), hAPRIL-429 z 5x koncentrovaného média). Po inkubaci s ligandy byla plotna promyta pufrem PBS s 0,5 % Tweenem 20 a byla přidána monoklonální protilátka M2 proti epitopu FLAG o koncentraci 0,5 pg/ml v ředícím pufru.

·· ··· ·

-39• to ···· ·· toto·· • · • ···

Navázaná protilátka byla poté detekována konjugátem PO s anti-myší protilátkou 1/2000 a enzymaticky vyvolána substrátem OPD.

Imunoprecipitačni experimenty: buňky 293T byly transfikovány uvedeným expresním plazmidem (Rec-Fc nebo FLAG-ligand) a vysety na 9 cm plotny. Transfikované buňky byly ponechány 5 dní v 8 ml média Optimem (Gibco-BRL) . Imunoprecipitace byla provedena smícháním 200 μΐ média nasyceného jednotlivými receptor s 200 μΐ média nasyceného jednotlivými ligandy a se 400 μΐ pufru PBS a s 10 μΐ ProtGSepharosy. Tato směs byla 1 hodinu otáčena na rotační třepačce, 4x promyta 1 ml PBS a nakonec povařena v 50 μΐ vzorkového pufru (+DTT). Do každé elektroforetické stopy bylo naneseno 20 μΐ z jednotlivých imunoprecipitací. Výsledky byly detekovány imunoblotem s monoklonální protilátkou M2 proti epitopu FLAG (Sigma, St Louis, Missouri) a s konjugátem PO (1/2000). Bloty byly rovněž s protilátkou proti lidským kultivačního média bylo přesráženo MeOH/CHCls/lysozymem. Tato směs byla poté povařena ve vzorkovém pufru (s přídavkem DTT) a na elektroforézu bylo naneseno 20 μΐ mixu. Výsledky byly detekovány imunoblotem s monoklonální protilátkou M2 proti epitopu FLAG a s konjugátem PO s anti-myší protilátkou (1/2000).

s anti-myší protilátkou vyvolány konjugátem PO IgG: 100 μΐ nasyceného

Příklad 3: Vazba ligandu myc-mAPRIL; hKayL-440 (hBAFF) a

FLAG-mBAFF k receptorům hBCMA-Ig, hLT-R-Ig, nebo hp80 TNFR-Ig

Všechny experimenty byly provedeny při teplotě 25°C a při průtokové rychlosti 10 μΐ za minutu.

·«« ·

-40Každý experiment byl proveden v pufru HBS (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% detergentů P20, pH=7,4). Stejný roztok byl použit jak pro naředění vzorku, tak i pro vlastní promýván! měřící cely v průběhu experimentu (running buffer).

Nejprve byl povrch čipu CM5 (BIACORE, Inc. ) aktivován N-hydroxysukcinimidem/N-ethyl-N¹ -(3-diethylaminopropyl)karbodiimid hydrochloridem (BIACORE). 20 μΐ hBCMA-Ig; 15 μΐ hLT-R05-Ig a 10 μΐ hp80 TNFrR, vše naředěné na 30 g/ml v 10 mM kyselině octové bylo poté blokováno nejprve jednou 30 μΐ a poté ještě jednou 15 μΐ etanolamin hydrochloridem (pH=8,5). Výsledkem byl čip potažený receptory o hustotě 1600-3700 rezonančních jednotek (RU) . Čip byl regenerován 20 μΐ lmM kyseliny mravenčí. Toto potahování bylo zopakováno celkem pětkrát tak, aby bylo dosaženo reprodukovatelné a stabilní úrovně základního signálu.

Vlastní experiment byl proveden tak, že vždy 100 μΐ roztoku ligandů myc-mAPRIL, hKayL-440, a FLAG-mBAFF naředěných na 30 pg/ml v ředicím pufru bylo vstříknuto na povrch čipu. Ihned po aplikaci ligandu byl čip promyt 500 μΐ ředicího pufru. Mezi jednotlivými experimenty byl povrch regenerován aplikací 20 μΐ lmM kyseliny mravenčí; po které následovala další aplikace 15 μΐ kyseliny mravenčí. Po regeneraci byl čip ekvilibrován ředicím pufrem.

Příklad 4: Příprava rozpustných forem receptorů

K vytvoření inhibitoru receptorů využitelného u lidí je třeba znát sekvenci cDNA kódující extracelulární doménu receptorů. Za pomoci známé myší cDNA sekvence je možné prohledat lidskou cDNA knihovnu a najít tak cDNA pro lidskou formu extracelulární domény receptorů. Obdobné manipulace

44

4 4

4

-414« »4-44 • · · • * ·

4 4 • 4 ·

4

4444

4 4

4 4 4 4

4 4

4 4

4· 444

4444 jsou odborníkům v oboru velmi dobře známy. Z lidské cDNA sekvence pak lze navrhnout oligonukleotidové primery pro PCR a amplifikovat tak extracelulární doménu receptorů aniž by byla přítomna oblast transmembránová a intracelulámí. V typickém provedení lze zahrnout většinu aminokyselin, které se nacházejí mezi poslední disulfidickými můstky propojenou „TNF doménou a transmembránovou doménou. Je možné měnit velikost „stonku (stalk region) a tím optimalizovat účinnost výsledného rozpustného receptorů. Tímto způsobem amplifikovaná DNA je rovnou navržena tak, aby obsahovala vhodná restrikční místa pro klonování do různých vektorů umožňujících expresi proteinu ve fůzi s Ckoncovým Ig. Eventuelně je možné na 3'konec vložit stop signál a připravit tak solubilní formu receptorů bez toho, aby byl použit postup využívající chímérní bílkoviny s Ig. Výsledné vektory mohou být exprimovány ve většině biotechnologicky využívaných systémů, t j . v kvasinkách, ve hmyzích buňkách, bakteriích i v savčích buňkách. Existují příklady pro všechny typy exprese. Ke konstruktu je možné připojit různé lidské Fc domény tak, aby bylo možné v závislosti na účelu optimalizovat či eliminovat reakce s FcR a komplemetem. Za účelem selektivně odstranit interakce s FcR či s komplementem či připojení N-koncově vázaných cukrů k Fc doméně lze eventuelně použít mutované formy těchto Fc oblastí.

Příklad 5: Příprava protilátek s agonistickým či antagonistickým účinkem:

Výše popsané rozpustné formy receptorů mohou být využity k imunizaci myší a k přípravě monoklonálních protilátek obvyklými způsoby. U výsledných monoklonálních protilátek testovaných ELISA metodou může být dále testováno, zda jsou ·· ·· • «* · · • · * ♦ · · • · · ·· ·«··

-42·« »·4· »* Μ·* • * · # · · · · • Φ · • « · ·· ··· vhodné pro použití jako agonisté. Protilátky při různých in vitro buněčných testech mohou být v rozpustné formě či imobilizované na plastikovém podkladě. Smrt buněk z buněčné linie HT29 je vhodným a často používaným systémem, který je citlivý na signalizaci zprostředkovanou mnoha TNF receptory. Nemá-li tato buněčná linie příslušný receptor, mohou být buňky HT29 stabilně transfikovány úplnou (full length) cDNA pro tento receptor, tak, aby se umožnilo provedení testů cytotoxicity. Tyto buňky mohou být popřípadě též použity v „Cytosenzorickém přístroji čímž lze určit, zda aktivace receptoru může vyvolat změny pH, které jsou typické pro probíhající signalizaci. Signalizace přes receptory z rodiny TNF je v takovémto uspořádání a za použití dané metody snadno měřitelná a není přitom ani nutné znát aktuální biologické pochody spouštěné TNF receptorem. Monoklonální protilátky s agonistickým účinkem by byly uzpůsobeny pro klinické použití v humánní medicíně. Obdobný postup může rovněž být použit k popsání monoklonální protilátky s antagonistickým účinkem. Tyto monoklonální protilátky jsou definovány tak, že nemají agonistický účinek, inhibují však interakce receptoru s ligandem. To je prokázáno ELISA testem, vazebnou studií či pomocí přístroje BIAcore. Indukce sekrece chemokinů v různých buňkách jako odpověď na vazbu protilátky s agonistickým účinkem může být základem dalších testů.

Příklad 6: Testování inhibitorů interakce receptoru s ligandem

Za použití fúzního proteinu mezi jakýchkoliv kombinatorických molekuly, které váží receptor. inhibovat interakci receptoru receptorem knihovnách

Schopnost s ligandem a Ig je možné v přímo hledat těchto molekul může být dále • 4 4·

4· «

-4344 ··♦· ···*

4 4 4 44

4 testována pomocí ELISA testu za použití rozpustného ligandů a fúzního proteinu mezi receptorem a Ig. Takováto ELISA může být užita přímo ke zjišťování přítomnosti inhibičních složek v různých knihovnách přírodních produktů atd. Receptor může být transfikován do buněčné linie jako například HT29 za účelem vytvořit biologický test (v tomto případě test cytotoxicity), který by pak byl základem pro vlastní screening.

Příklad 7: Inhibice růstu nádorů in vivo

Účinnost fúzního proteinu BCMA-Ig při inhibici růstu nádorů in vivo byla testována na různých nádorových buněčných liniích. Při těchto pokusech byly použity imunodeficientní myši (Nu/Nu) bez thymu jimž byly subkutánně podány nádorové buňky. Agresivně rostoucí buněčná linie SW480 byla aplikována v dávce 8 χ 10⁵ buněk ve 100 pl sterilního PBS bez pyrogenů. Byla ponechána jedna neošetřená kontrolní skupina (n=5), zatímco dalším skupinám bylo podáno 100 pg kontrolní protilátky (n=6) nebo 100 pg fúzního proteinu BCMA-Ig (n=6). Protilátky byly aplikovány těsně před implantací nádorových buněk, a poté byla dávka opakována vždy po 7 dnech. Průměr nádoru byl měřen mikrometrem a jeho objem vypočítán za použití vzorce V = 4/3rir³.

Buňky SW480 z nádoru tlustého střeva rostou v myších Nu/Nu velmi rychle a hmatatelné nádory byly detekovány během 10 dnů. Po 24 dnech byl průměrný objem kontrolního nádoru 0,3 cm³, zatímco průměrný objem nádorů u myší ošetřených fúzním proteinem BCMA-Ig byl 0,19 cm³, což znamená 46% redukci velikosti nádoru. Dále byly použity buňky HT29, rovněž z nádoru tlustého střeva, které v myších Nu/Nu také rostou agresivně. Pro tento experiment bylo subkutánně

-44aplikováno lxlO⁶ buněk ve 100 μΐ sterilního PBS bez pyrogenů. Dávkovači režim protilátek odpovídal režimu použitému u buněk SW480. Hmatatelné nádory byly objeveny po 7 dnech. V kontrolních skupinách většina nádorů rostla velmi rychle. Po 42 dnech byl průměrný objem nádoru v kontrolních skupinách (neošetřené myši a myši ošetřené kontrolní protilátkou , n=12) 0,485 cm³, zatímco průměrná velikost nádorů ve skupině ošetřené fúzní proteinem BCMA-Ig (n=5) byla 0,095 cm³, tzn. menší o 80 %. Po 50 dnech bylo 30 % myší v kontrolní skupině klasifikováno jako terminální stádium, vzhledem k velikosti nádoru přesahující 1,5 cm³ a experiment byl zastaven. Naproti tomu žádná z myší ze skupiny ošetřené fúzním proteinem BCMA-Ig nebyla klasifikována jako terminální. Výsledky experimentu shrnuje tabulka 2.

Tabulka 2. Objemy nádorů a úmrtnost po aplikaci buněk HT29 po 50 dnech trvání experimentu.

kontrolní zvířata	(neošetřená	a zvířata ošetřená	fúzním proteinem
ošetřená kontrolní	protilátkou)	BCMA-Ig
objem nádoru	terminální	objem nádoru	terminální
	stádium		stádium
0,22	-	0, 11	-
0,22	-	0,32	-
0,35	-	0,13	-
0, 61	-	0,56	-
0,73	-	0, 33	-
1,74	+

-45*· • · • · • · • · ·· <··· *

···· • · • ··· • · · • 9 ·*· •r »» • · · • · • · · • · · *· ··€

2,53	+
1,51	+
0, 90
0,44
0, 32
1,92	-
prům.:0,96	%: 30	prům.:0,29	%:0

Z tabulky vyplývá, že došlo k 70% snížení objemu nádorů a je dále jasně patrný významný účinek ošetření fúzním proteinem BCMA-Ig na nádory odvozené od buněčné linie HT29.

Buněčná linie A549 z plicního tumoru roste pomaleji než výše popsané linie z nádorů tlustého střeva. Při pokusech s touto buněčnou linií bylo myším subkutánně implantováno lxlO⁶ buněk ve 100 μΐ sterilního PBS bez pyrogenů. Protilátky byly dávkovány stejně jako ve výše popsaných příkladech. Hmatatelné nádory byly detekovány přibližně 20 dní po implantaci nádoru. 50 dní po implantaci byl průměrný objem nádoru 0,2 cm³ u kontrolních skupin (neošetřené myši a myši ošetřené kontrolní protilátkou; n=16) zatímco průměrný objem nádoru ve skupině ošetřené fúzním proteinem BCMA-Ig (n=7) byl 0,1 cm³, tzn. byla pozorována 50% inhibice růstu nádoru. Ve skupině myší ošetřených fúzním proteinem BCMA-Ig mělo po 50 dnech 57% myší nádor menší než 0,1 cm³, zatímco z kontrolních myší mělo takto malý nádor jen 6 %. 60 dní po implantaci nádoru vzrostl průměrný objem nádoru v kontrolní skupině na 0,3cm³. Naproti tomu průměrný objem nádoru ve skupině myší

-46• · · · • ·

ošetřených fúzním proteinem BCMA-Ig byl menší než 0,2 cm³ (0,188).

Myší buněčná linie NIH3T3 roste rovněž pomaleji než linie z nádorů tlustého střeva. Při pokusech s touto buněčnou linií bylo myším subkutánně implantováno 5xl0⁶ buněk ve 100 μΐ sterilního PBS bez pyrogenů. Protilátky byly dávkovány stejně jako ve výše popsaných příkladech. Buňky NIH3T3 tvoří po subkutánní implantaci do Nu/Nu myší zhoubný nádor vazivové tkáně (fibrosarkom). Hmatatelné nádory byly detekovány přibližně 4 týdny po implantaci nádoru. U myší z kontrolních skupin (n=ll) tyto nádory narostly v průběhu dalších 10 dnů do průměrné velikost 0,136 cm³. Naproti tomu nádory u myší ošetřených fúzním proteinem BCMA-Ig (n=5) dosáhly objemu pouze 0,03cm³, tj. došlo k 78% snížení nádorové zátěže. 48 dní po implantaci nádoru činil průměrný objem nádoru v kontrolních skupinách 1,6 cm³, zatímco průměrný objem nádoru u myší ošetřených fúzním proteinem BCMA-Ig 0,8cm³, tj . bylo dosaženo 50% snížení objemu nádoru. Po 52 dnech od implantace bylo 82% (9 z 11) myší v kontrolních skupinách klasifikováno jako terminální stádium s nádorem větším než l,5cm³, tzn. že ještě naživu zůstalo pouze 18% zvířat.

Naproti ve skupině ošetřené fúzním proteinem BCMA-Ig mělo pouze 40% myší (3 z 5) nádor takového objemu, že musely být usmrceny. 60 % zvířat tak zůstalo naživu po celou dobu trvání experimentu. Popsané výsledky jsou shrnuty v tabulce

3.

Výsledky popisující časový průběh růstu nádorových buněk NIH3T3 jsou znázorněny na obrázku 13. Výsledky popisující časový průběh růstu nádorových buněk SW480 jsou znázorněny na obrázku 14. Výsledky popisující časový průběh růstu nádorových buněk HT29 a diagram zachycující stav jednotlivých zvířat 42 dní po implantaci nádoru jsou • · · · • · • · · · · ·

-47znázorněny v obrázku 15A. Výsledky popisující růst nádorové linie A549 u jednotlivých zvířat v 50 a 60 dni po implantace nádoru jsou znázorněny na obrázku 15B.

Tabulka 3: Přežití myší po aplikaci NIH3T3 buněk

% přežití	38	Dny po implantaci nádoru
42	48	52
Kontrola	100	90	64	18
BCMA-Ig	100	100	80	60

Výsledky inhibice růstu nádoru odvozeného od linie NIH3T3 viz obrázek 13. Výsledky inhibice růstu nádoru odvozeného od linie SW480 viz obrázek 14. Výsledky inhibice růstu nádoru odvozeného od linií HT29 a A549 jsou uvedeny na obrázku 15.

Příklad 8: BCMA-IgG způsobuje u normálních myší snížení počtu B lymfocytů

Osm týdnů staré samičky myší BALB/c byly zakoupeny od Jacksonových laboratoří (Bar Harbor, Maine).

Myším (3 myši na skupinu) bylo intreritoneálně aplikováno buď PBS nebo 400 pg fúzního proteinu lidského BCMA s hulgGI (hBCMA-Ig, protein byl získán od Teresy Cachero, Biogen), nebo 400 pg purifikované lidské IgG (HulgG, Sandoz, Basilej, Švýcarsko). Aplikace byla proveden ve dnech -8, -5, -1 a +2. Myším bylo nultého dne podáno

100 pl 10% suspenze ovčích červených krvinek (SRBC, Colorado sérum company, Denver, Colorado).

• ♦ • ·· ·

-48Myši byly usmrceny a byla jim srdeční punkcí odebrána krev do mikrozkumavky s EDTA. Červené krvinky byly lyžovány v hypotonickém pufru. Krev byla rovněž odebrána bez přídavku EDTA pro přípravu séra. Suspenze jednotlivých buněk byly připraveny ze sleziny a mezenterických lymfatických uzlin (MLN) a opět byly červené krvinky lyžovány hypotonickým pufrem. Průtoková cytometrie byla provedena za použití PE-konjugátů protilátek proti CD45R/B220, antisyndekan/CD138 a anti-B7.2, a FITC-konjugátů proti IgM a proti CD45R/B220. Všechny monoklonální protilátky byly zakoupeny od společnosti Pharmingen (San Diego, Kalifornie). Fc receptory byl zablokovány 15 minutovou inkubací s 10 pg/ml pufru Fc-block (Pharmingen) na ledu, po které následovalo přidání konjugátů monoklonálních protilátek s PE a FITC a 20 až 30 minutová inkubace na ledu. Buňky byly jednou promyty a suspendovány v 0,5% roztoku paraformaldehydu.

Data byla naměřena na průtokovém cytometru FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornie) a analyzována za použití software CELLQuest™ (Becton Dickinson).

Po ošetřením fúzním proteinem hBCMA-Ig došlo k přibližně 50% snížení počtu B lymfocytů v periferní krvi a ve zkoumaných periferních lymfoidních orgánech. B220^high IgM^l0W B buňky tvořily 23,4 % a 21,5 % buněk v kontrolních skupinách ošetřených PBS respektive HulgG, kdežto u myší ošetřených fúzním proteinem hBCMA-Ig představovaly tyto buňky pouze 9,9 % všech buněk. Plazmatické buňky (syndecan/CD138+) vykazovaly rovněž mírné snížení. Tyto buňky tvořily 5,7 % respektive 4,8 % buněčné populace u kontrolních skupin ošetřených PBS respektive HulgG ve srovnání s 3,9 % u myší ošetřených fúzním proteinem hBCMA Ig. U molekuly B7.2 došlo ke zvýšení koncentrace na 3,1 % respektive 4,5 % z buňek B220+ u zvířat ošetřených PBS

-49respektive HulgG ve srovnání s 1,9 % u myší ošetřených hBCMA-Ig.

V slezinách došlo k výraznému snížení počtu buněk B220^high po aplikaci fúzního proteinu hBCMA-Ig (18,8% buněk) ve srovnání s 36,7 % a 40 % buněk po aplikaci PBS a HulgG. Tento pokles byl pozorován jak u subpopulací IgM^high tak i u IgM^low (viz tabulka 1). Nebyla pozorována žádná změna v nově vzniklé subpopulací B buněk ve slezině, B220^lowIgM^high (údaje nejsou uvedeny). Plazmatické buňky (syndecan/CD138+) vykazovaly pouze mírné snížení z 3,3% a 3,4% z buněk ve slezinách kontrolních zvířat po aplikaci PBS respektive HulgG, na 2,4% ze všech buněk ve slezinách myší jimž byl podán fúzní protein hBCMA-Ig.

Rovněž v mezenterických uzlinách (MLN) došlo k poklesu počtů B220+ B-lymfocytů z 26,7 % respektive 35,8 % naměřených u kontrolních zvířat jimž byl aplikován PBS respektive HulgG na 14,1 % po aplikaci hBCMA-Ig. Data z těchto měření jsou shrnuta v tabulce 3.

Snížené procento B7.2+ B lymfocytů v krvi a plazmatických buněk v krvi a slezině myší ošetřených fúzním proteinem hBCMA-Ig po imunizaci ovčími krvinkami (SRBC) lze vysvětlit tím, že dochází k inhibici aktivace a/nebo dozrávání B lymfocytů, a popřípadě ke zrychlené eliminaci aktivovaných B lymfocytů.

Jen velmi malé procento antigen-specifických B buněk je aktivováno a schopno odpovědět na přítomnost antigenu, v tomto případě SRBC.

• · · · • * • · · · · ·

-50Tabulka 3: populace B-lymfocytů u myší ošetřených fúzním proteinem hBCMA-Ig, PBS a HulgG.

Krev	B220high IgMl0W	Syndecan	B7.2/ B220low
PBS	23,4 ± 5,7	5,7 ± 1,5	3,1 ± 0,5
HulgG	21,5 ± 4,5	4,8 ± 0,9	4,5 ± 1,0
Hbcma-Ig	9,9 ± 1,8	3,9 ± 0,6	1,9 ± 0,5
Slezina	B220high IgMlow	B220high IgM+	Syndecan
PBS	27,8 ± 1,6	11,9 ± 1,6	3,3 ± 0,8
HulgG	30,5 + 2	11,8 ± 1,0	3,4 ± 0,7
Hbcma-Ig	10,6 + 0,2	8,4 ± 0,2	2,4 ± 0,2
MLN	B220 +
PBS	26,7
HulgG	35,8 ±3,3
Hbcma-Ig	14,1 ± 5,9

Myši byly ošetřeny tak, jak bylo popsáno v metodice, data jsou vyjádřena v procentech ± standardní odchylka.

Protože aplikace fúzního protein hBCMA-Ig měla za následek tak dramatickou redukci v počtech B buněk ve všech testovaných tkáních (cca 50% redukci), zdá se, že se aktivita fúzního proteinu hBCMA-Ig rovněž zaměřuje proti klidovým, zralým B lymfocytům.

Z toho lze vyvozovat, že fúzní protein BCMA může být použit jako léčivo s klinickým využitím u nemocí způsobených B lymfocyty. Mezi tyto nemoci lze zahrnout autoimunitní onemocnění jako například systémový lupus erythematodes, • · 0 0 0 0 00 0 0 ·· 0 0 · 0 0 · 0 ·

0 00000 00 ·

-51myastenii gravis, autoimunitní hemolytickou anémii, idiopatickou trombocytopenii, tečkovité krvácení pod kůží (purpuru), anti-fosfolipidový syndrom, Chagovu chorobu, Basedowova chorobu (exoftalmickou strumu), Wegenerovu granulomatózu, nodózní polyarteritidu a rychlou progresivní glomeluronefritidu. Toto léčivo má rovněž využití při léčbě onemocnění způsobených plazmatickými buňkami jako je například mnohonásobný myelom, Waldenstromova makroglobulinemie, primární amyloidóza nebo amyloidóza asociovaná s imunocyty, moklonální gammopathie neurčitého významu (MGUS). Léčivo by mohlo najít rovněž využití při léčbě onkologických onemocnění jako jsou karcinomy B buněk, leukemie a lymfomy.

Odborníkům je zřejmé, že mohou být provedeny různé modifikace a variace v polypeptidech, přípravcích a způsobech podle vynálezu, aniž by došlo ke změně podstaty vynálezu nebo jeho rozsahu. Všechny takové modifikace jsou zahrnuty ve vynálezu jehož rozsah je dán následujícími nároky.

• » • · · · · ·

-52• to · to to to ··*· • · · · · • · • · to · · · ·

SEZNAM SEKVENCI <210> 1 <211> 736 <212> DNA <213> jnyg <400> 1 ccaaacgatg agatttcctt caatttttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt 60 agctgctcca gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt 120 catcggttac tcagatttag aaggggattt cgacgttgct gtttťgccat tttccaacag 180 cacaaataac gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga 240 aggggtatct ctcgagaaaa gagaacaaaa actcatttct gaggaagatc tgaataaaga 300 gctccactca gtcctgcatc ttgttccagt taacattacc tccaagaact ctaacgtgac 360 agaggtgatg tggcaačcag tacttaggcg tgggagaagc ctggaagccc acggagacat 420 tgtacgagtc tgggacactg gaatttatct gctctatagt caagtcctgt ttcatgatgt 480 gactttcaca atgggtcagg tggtatctcg ggaaggacaa gggagaagag aaactctatt 340 ccgatgtatc agaagtatgc cttctgatcc tgaccgtgcc tacaatagct cctacagtgc 600 aggtgtcttt catttacatc aaggggatat tatcactgtc aaaattccac gaccaaacgc 660 aaaacttagc ctttctccgc atggaacatt cctggggttt gtgaaactat gagcggccgc 720 gaattaattc gcctta * ~ 735 <210> 2 <211> 736 <212> DNA <213> myš !

<400> 2 ggtttgctac tctaaaggaa gttaaaaatg acgtcaaaat aagcgtcgta gaaggcgtaa 60 tcgacgaggt cagttgtgat gttgtcttct actttgccgt gtttaaggcc gacttcgaca 120 gtagccaatg agtctaaatc ttcccctaaa gctacaacga caaaacggta aaaggttgtc 180 gtgtttattg cccaataaca aatatttatg atgataacgg tcgtaacgac gatttcttct 240 tccccataga gagctctttt ctcttgtttt tgagtaaaga ctccttctag acttatttct 300 cgaggtgagt caggacgtag aacaaggtca attgtaatgg aggttcctga gactgcactg 360 tctccactac accgttggtc atgaatccgc accctctccg gacctccggg tccctctgta 420 acatgctcag accctgtgac cttaaataga cgagatatca gtccaggaca aagtactaca 480 ctgaaagtgt tacccagtcc accatagagc ccttcctgtt ccctcttctc tttgagataa 540 ggctacatag tcttcatacg gaagactagg actggcacgg atgttatcga cgatgtcacg 600 tccacagaaa gtaaatgtag ttcccctata atagtgacag ttttaaggtg cccgtttgcg 660 ttttgaatcg gaaagaggcg taccttgtaa ggaccccaaa cactttgata ctcgccggcg 720 cttaattaag cggaat 736 • ti ti ti ti · titi titititi • · ·

-53<210> 3 <211> 234 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

Ile

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

£

Ser

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Π-», -v

Ar a

Gin

Ile

20

25

30

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

Ile

Gly

lyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

35

40

45

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

50

55

60

Phe

Ile

Asn

Thr

Thr

Ile

Ala

Ser

Ile

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

65

70

75

80

Ser

Leu

Glu

Lys

Arg

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

Glu

85

90

95

Lys

Leu

His

Ser

Val

Leu

His

Leu

Val

Pro

Val

Asn

Ile

Thr

Ser

100

105

110

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Thr

Glu

Val

Met

Trp

Gin

Pro

Val

Leu

Arg

Arg

Gly

115

120

125

Arg

Gly

Leu

Glu

Ala

Gin

Gly

Asp

Ile

Val

Arg

Val

Trp

Asp

Thr

Gly

130

135

140

Ile

Tyr

Leu

Leu

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

Phe

His

Asp

Val

Thr

Phe

145

150

155

160

Thr

Met

Gly

Gin

Val

Val

Šer

Arg

Glu

Gly

Gin

Gly

Arg

Arg

Glu

Thr

165

170

17 5

Leu

Phe

Arg

Cys

Ile

Arg

Ser

Met

Pro

Ser

Asp

Pro

Asp

Arg

Ala

Tyr

180

185

190

Asn

Ser

Cys

Tyr

Ser

Ala

Gly

Val

Phe

His

Leu

His

Gin

G-y

Asp

Ile

195

200

205

Ile

Thr

Val

Lys

Ile

Pro

Ara

Ala

Asn

Ala

Lys

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

210

215

22 0

His

Gly

Thr

Phe

Leu

Gly

Phe

Val

Lys

Leu

225

230

<210> 4 <211> 542 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 4 ttaatcaaaa acaaagacga actctgtcct aggtgatgtg tccgaatcca ctttcaccat gatgtataag gtgtcttcca aacttaacct cc catggctatc tgacgataaa gcacctggtt acaaccagct ggatgctgga gggtcaggtg aagtatgccc tttacaccaa ctctccacat atctacctca ggacccggac cccattaacg cttaggcgtg gtttatctgc gtgtctcgag tcccacccgg ggggatattc ggaaccttcc tcctcctgtt agatgcagct ccacctccaa ggagaggcct tgtatagcca aaggccaagg accgggccta tgagtatcat tggggtttgt caccactgtg gcagaaacaa ggatgact.cc acaggcccaa ggtcctgttt aaggcaggag caacagctgc aattccccgg gaaactgtga cggggcgatt aagaagcagc catgtgacag ggatatagtg caagacgtga actctsttcc tatagcgcac gcaagggcga tctagagggc

6C·

I2C

18C

240

300

360

420

480

540

542 *444

<210> <211> <212> <213>	5 542 DNA homo	sapiens
<400>	5
aattagtttc	acaccgatag	tagatggagt	aggaggacaa	gtggcgacat	gcccccrtaa
tgttti	scgco	acrgctacrc	cctgggcctc	tccacgtcga	cgtcrttctc
taagacagca	cgtggaccaa	gggtaattgc	carggagarr	cctactcacg	z zacacícíc
tccactacac	cgtcagtcga	aaatccgcac	cctctccgga	tgtccgggtt	c;:a:a:cac
agacttaggt	cctacaacct	caaatagacg	acatstcggt	ccaggacaáa	retccgcacc
aaaagtggta	cccagtccac	cacagagccc	ttccggttcc	ttccgtcctc	tgaga ta agg
ctacatattc	ttcatacggg	aaagtgggcc	tggcccggat	gttgtcaacg	atatcgcgcc
cacaaaaggt	aaatatggtt	cccc:acasg	actcacagta	ttaagggccc	GGcíCCCCC-
ttgaa S9	ttgga	cagaggtgca	ccttggaagg	accccaaaca	ctttgacact	acacCwCzco
<210>	6
<211>	172
<212>	PRT
<213>	homo	sapiens

i ε c 24C 3ο: 3 6 C »1 tJl I) <400> 6

Met

Ala

Iie

Ile

Τ'/r

Leu

Ile

Leu

Leu

Phe

'Thv

Al a

V 51

Aro

Glv

A.sp

Λ

5

10

15

Tyr

Lys

Asp

Aso

Asp

Asp

Lvs

Gly

Pro

Gly

Gin

Val

Git.

Leu

Gin

Lys

20

25

30

Gin

Lys

Lvs

Gin

E i. s

Ser

Val

Leu

Ets

Leu

Val

Prc

“ Ί Λ

-cr

Ala

rnVfc

35

40

45

Ser

Lvs

Asp

Asp

Ser

Asd

Val

Thr

Glu

Val

Met

Trp

Gin

Pro

Ala

Leu

50

55

60

Axg

-Arg

Gly

Ara

Gly

Leu

Gin

Ala

Gin

r v

Tvr

Gly

Val

Arg

Iie

Gin

€5

70

75

80

Asp

Ala

Gly

Val

Tvr

Leu

Leu

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

Phe

Gin

Asd

Val

85

90

95

Thr

Phe

Thr

Met

Gly

Gin

Val

Val

Ser

Aro

Glu

Gly

Gin

Glv

Arg

Gin

100

105

110

Glu

Thr

Leu

Phe

Arg

Cys

Ile

Arg

Ser

Met

Pro

Ser

His

Pro

Asp

Are

115

120

125

Ala

Tyr

Asn

Ser

Cys

Tyr

Ser

Ala

Glv

Val

Phe

EiS

Leu

_J - q

Z’“' v. ΌΧΠ

Gly

130

135

140

Asp

Iie

Leu

Ser

Val

Ile

Ile

Pro

Ara

Ara

Arg

Ala

x^y s

Leu

Asn

Leu

145

150

155

160

Ser

Pro

His

Gly

Thr

Phe

Leu

Gly

Phe

Val

Lys

Leu

-5544 444

4 4

4 4 ··

4· ·4 4

4 4 ·

<210> 7 <211> 555 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 atgttgcaga Cggctgggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgct 60 tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgttat 120 tgtaatgcaa gtgtgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cgattctctg gacctgtttg 180 ggactgagct taataatttc tttggcagtt ttcgtgctaa tgtttttgct aaggaagata 240 agctctgaac cattaaagga cgagtttaaa aacacaggat caggtctcct gggcatggct 300 aacattgacc tggaaaagag caggactggt gatgaaatta ttcttccgag aggcctcgag 360 tacacggtgg aagaatgcac ctgtgaagac tgcatcaaga gcaaaccgaa ggtcgactct 420 gaccattgct ttccactccc agctatggag gaaggcgcaa ccattcttgt caccacgaaa 480 acgaatgact attgcaagag cctgccagct gctttgagtg ctacggagat agagaaatca 540 atttctgcta ggtaa 555 <210> 8 <211> 184 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8

Met

Leu

Gin

Met

Ala

Gly

Gin

Cys

Ser

Gin

Asn

Glu

Tyr

Phe

Asp

Ser

1

5

10

15

Leu

Leu

His

Ala

Cys

Ile

Pro

Cys

Gin

Leu

Arg

Cys

Ser

Ser

Asn

Thr

20

25

30

Pro

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

A.rg

Tyr

Cys

Asn

Ala

Ser

Val

Thr

r.SS

Ser

35

40

45

Val

Lys

Gly

Thr

Asn

Ala

Ile

Leu

Trp

Thr

Cys

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

50

55

60

Ile

Ile

Ser

Leu

Ala

Val

Phe

Val

.Leu

Met

Phe

Leu

Leu

Arg

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Ser

Glu

Pro

Leu

Lys

Asp

Glu

Phe

Lys

Asn

Thr

Gly

Ser

Glv

Leu

85

90

95'

Leu

Gly

Met

Ala

Asn

Ile

Asp

Leu

Glu

Lys

Ser

Arg

ΤΠ2Γ

Gly

Asp

Glu

100

105

110

Ile

Ile

Leu

Pro

Arg

Gly

Leu

Glu

Tyr

Thr

Val

Glu

Glu

Cys

Thr

Cys

115

120

125

Glu

Asp

Cys

Ile

Lys

Ser

Lys

Pro

Lys

Val

Asp

Ser

Asp

His

Cys

Phe

130

135

140

Pro

Leu

Pro

Ala

Met

Glu

Glu

Gly

Ala

Thr

Ile

Leu

Val

Thr

Thr

Lys

145

150

155

160

Thr

Asn

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ser

Leu

Pro

Ala

Ala

Leu

Ser

Ala

Thr

Glu

165

170

175

Ile

Glu

Lys

Ser

Ile

Ser

Ala

Arg

180

·· ···« ·· to ··· toto· toto ·· t to to t ·*·· to· to· • · · to • · · to to · · · • · · to

-56<210> 9 <211> 483 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 9 gttgaagcta caagaagatt atgaggagga gattgtacag tcgcaataac attacgttca 60 cactggttaa gtcactttcc ttgcttacac taagagaccc ggacaaaccc tgactcgaat 120 tattaaagaa accgtcaaaa gcacgattac aaaaacgatt ccttctattc gagacttggt 180 aatttcctgc tcaaattttt gtgtcctagt ccagaggacc cgtaccgatc gtaactggac 240 cttttctcgt cctgaccact actttaacaa gaaggctctc cggagctcat gtgccacctt 300 cttacgtgga cacttctgac gtagttctcg tttggcttcc agctgagact ggtaacgaaa 360 ggtgagggtc gatacctcct tccgcgttgg taagaacagt ggtgctcttg cttactgata 420 acgttctcgg acggtcgacg aaactcacga tgcctctatc tctttagtta aagacgatcc 480 act 483 <210> 10 <211> 483 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 10 caacttcgat gctcctctaa tactcctcct ctaacacgtc agcgttattg caatgcaagt 60 gtgaccaatC cagcgaaagg aacgaacgcg attctctgga cctgtttccc actgagctta 120 ataatttctt cggcagtttt cgcgctaatg tttttgctaa ggaagacaag ctccgaacca 180 ttaaagaacg actttaaaaa cacaggacca ggtcccocgg gcacggccaa caccgacccg 240 gaaaagagca ggaccggtga tgaaaccact cotccgagag gcctcgagca caccgtggaa 300 gaacacacct gcgaagaccg catcaagaac aaacccaagg tcgactccga ccactgcctc 360 ccacccccag cc&tgaagga aggcgcaacc attcttgtca ccacgaaaac gaatcactac 420 cgcaagagcc tgccagccgc cttgagcgct acggacatag agaaatcaat ctccgctagg 480 taa 483 <210> 11 <211> 906 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 11 atggagacag acacactcct gttatgggtg ctgctcctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgtcacga tgttgcagat ggctgggcag tgctcccaaa acgaatattt tcacagtttg 120 ttgcatgctt acataccttg tcaacttcga tgttcttcta atactcctcc rctaacatgc 180 cagcgttatt gtaatgcaag tgtgaccaat tcagtcaaag gagtcgacaa aactcacaca 240 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggccaccgt cagtcttcct cttcccccca 300 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 360 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactcgtacg tggacggcgt ggaggtgcat 420 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 480 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 540 'aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaac ccaaagggca gccccgagaa 600 ccacaggtgt acaccccgcc cccatcccgg gatgacctga ccaagaacca ggtcagcctg 660 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc cacatogccg tggagtggga aagcaatggg 720 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct ccčgtgttgg actccgacgg ctccttcttc 780 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 840 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc 900 gggaaa 906 ····

-57·· ···· • Φ ·♦·· * · • · ♦ · <210? 12 <211> 302 <212> PRT <213> horao sapiens <400> 12

Met

Glu

Thr

Asp

Thr

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Pro

1

5

10

15

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Val

Thr

Met

Leu

Gin

Met

Ala

Gly

Gin

Cys

Ser

20

25

30

Gin

Asn

Glu

Tyr

Phe

Asp

Ser

Leu

Leu

His

Ala

Cys

Ile

Pro

Cys

Gin

35

40

45

Leu

Arg

Cys

Ser

Ser

Asn

Thr

Pro

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

Arg

Tyr

Cys

50

55

60

Asn

Ala

Ser

Val

Thr

Asn

Ser

Val

Lys

Gly

Val

Asp

Lys

Thr

His

Thr

65

70

75

80

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

85

90

95

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

100

105

110

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Ast>

Pro

Glu

Val

115

120

125

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

130

135

140

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

145

150

155

160

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

165

170

175

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

180

185

190

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

TÁ V

Leu

Pro

Pro

195

200

205

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

210

215

220

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

225

230

235

240

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Τγϊγ

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

245

250

255

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

260

265

270

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

CVS

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

275

280

285

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

290

295

300

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití antagonisty APRIL-R pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení nemocí spojených s nežádoucí buněčnou proliferaci, přičemž antagonista APRIL-R obsahuje polypeptid, který antagonizuje interakci mezi APRÍL a jeho receptorem nebo receptory.
2. 2. Použití podle nároku 1, kdy antagonista APRIL-R je vybrán ze skupiny obsahující:

   a) rozpustný polypeptid APRIL-R,

   b) rozpustnou chimérickou molekulu obsahující rozpustný polypeptid APRIL-R fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí, a

   c) homolog protilátky anti-APRIL-R.
3. 3. Použití podle nároku 2, kdy rozpustný polypeptid APRIL-R je vybrán ze skupiny obsahující:

   a) variantu polypeptidu APRIL-R mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu s nativní sekvencí polypeptidu APRIL-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze sekvence id. č. 8, nebo její fragment,

   b) variantu polypeptidu APRIL-R mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu s aminokyselinovými zbytky 1 až 52 ze sekvence id. č. 8, nebo její fragment, a

   c) polypeptid APRIL-R obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze sekvence id. č. 8, nebo jeho fragment.

   to * ·· ·* ** toto ·<· ··· · · · « • ••to to · ··· to · * • to ··· ·· ··> · * • to·· ' ·· ·· *· ·· ····

   -594. Použití podle nároku 2, kdy rozpustná chimérická molekula obsahuje rozpustný polypeptid APRIL-R vybraný ze skupiny obsahující:

   a) variantu polypeptidu APRIL-R mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu s nativní sekvencí polypeptidu APRIL-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze sekvence id. č.8, nebo její fragment,

   b) variantu polypeptidu APRIL-R mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu s aminokyselinovými zbytky 1 až 52 ze sekvence id. č. 8, nebo její fragment, a

   c) polypeptid APRIL-R obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze sekvence id. č. 8 (obr. 3A), nebo jeho fragment, fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí.

   5. Použití podle nároku 4, kdy heterologní aminokyselinová sekvence je z domény IgG Fc imunoglobulínu.

   6. Použití podle nároku 4, kdy heterologní aminokyselinová sekvence je ze signální sekvence sekretovaného proteinu.

   7. Použití podle nároku 2, kdy homolog protilátky proti APRIL-R obsahuje protilátku, která se váže na polypeptid APRIL-R vybraný ze skupiny obsahující:

   ΦΦΦΦ φφφφ φφφ* φφφ φφφ φφφφ • φφφ φ φ φφφ φ φ · • φ φφφ φφ φφφ φ φ φ φφ φφφφ φφφ «φφφ ·· ·· ·· φφ φφφφ

   -60a) variantu polypeptidu APRIL-R mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu s nativní sekvencí polypeptidu APRIL-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze sekvence id. č. 8, nebo její fragment, alespoň 80% identitu

   b) variantu polypeptidu APRIL-R mající aminokyselinovou sekvenční s aminokyselinovými zbytky 1 až 52 ze sekvence id. č. 8, nebo její fragment, a

   c) polypeptid APRIL-R obsahující aminokyselinové zbytky

   8 až 41 ze sekvence id. č.

   nebo jeho fragment.

   8. Použití dvou nebo více antagonistů pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení nemocí spojených s nežádoucí buněčnou proliferaci, přičemž alespoň dva z antagonistů obsahují

   a) prvního antagonistů APRIL-R, který antagonizuje interakci mezi APRÍL a BCMA, a

   b) druhého antagonistů APRIL-R, který antagonizuje interakci mezi APRÍL a jeho dalším receptorem nebo receptory jinými než BCMA.

   9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kdy nežádoucí proliferace buněk je karcinom.

   10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kdy nemoc spojená s nežádoucí proliferaci buněk je rakovina.

   44 44 44 «4 ··
4. 4 4* 4 4 4 4444

   4 444 4 4 ··· 44 * • 44 4444 444

   4444 44 44 44 4* 4444

   -6111. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kdy nemoc je nemocí savce, výhodně člověka.

   12. Použití antagonisty APRIL-R pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení karcinomu, jehož proliferace je modulována APRÍL, přičemž antagonista APRIL-R obsahuje polypeptid, který antagonizuje interakci mezi APRÍL a APRIL-R.

   13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, kdy karcinom je vybrán ze skupiny obsahující humánní plicní karcinom, karcinom tlustého střeva, karcinom prsu, karcinom prostaty a další karcinomy, jejichž proliferace je modulována APRÍL.