SK286331B6 - The use of a BCMA polypeptides and antibodies for the preparation of a pharmaceutical composition for treating a tumour cell that expresses APRIL - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález nájde uplatnenie predovšetkým pri použití antagonistov APRÍL receptora pri liečení rakoviny.

Doterajší stav techniky

Cytokíny z rodiny nádorových nekrotických faktorov (TNF) sa zúčastňujú celého radu pochodov, ktoré sa týkajú kritických biologických funkcií. Každý cytokín z rodiny TNF funguje tak, že sa viaže na jeden alebo viac členov z paralelnej rodiny receptorových proteínov. Tieto receptory následne vyvolávajú intracelulárny signál, ktorý sa prejaví vznikom širokého spektra fyziologických alebo vývinových odpovedí. Mnohé z receptorových signálov ovplyvňujú osud bunky a veľmi často slúžia ako spúšťací mechanizmus terminálnej diferenciácie. Príklady bunkovej diferenciácie zahŕňajú proliferáciu, maturáciu, migráciu a bunkovú smrť.

Cytokíny z rodiny TNF sú membránovo viazané proteíny typu II, ktoré majú krátku intracelulámu N-koncovú doménu, transmembránovú doménu a C-koncovú doménu na väzbu receptora na povrchu bunky. V niektorých prípadoch sú extraceluláme časti proteínov odštiepené, čím sa vytvára sekrečná forma cytokínov. Zatiaľ čo membránovo viazané proteíny pôsobia lokálne, pravdepodobne sprostredkovávajú bunkový kontakt pomocou interakcií buniek s ich receptormi, sekrečné formy majú schopnosť cirkulovať alebo difundovať a takto môžu pôsobiť aj na vzdialených miestach. Tak membránovo viazané ako sekretované formy existujú vo forme trimérov a predpokladá sa, že vyvolávajú signál na receptoroch uľahčením ich zhlukovania (dustering).

Rodina TNF receptorových proteínov je charakterizovaná prítomnosťou jednej alebo viacerých extracelulámych domén bohatých na cysteín. Z týchto domén bohatých na cysteín vznikajú jadrá pevne viazané disulfidickými väzbami, ktoré prispievajú na udržanie trojrozmernej štruktúry pri tvorbe kapsy na väzbu ligandu. Receptory sú membránovo viazané proteíny typu I, kde extraceluláma doména je kódovaná N-koncovou časťou proteínu, nasleduje transmembránová doména a C-koncová intraceluláma doména. Intraceluláma doména je zodpovedná za prenos signálu z receptora dovnútra bunky. Niektoré receptory obsahujú intracelulámu „doménu smrti (death domain)“, ktorej signál môže vyprovokovať bunkovú apoptózu. Tieto domény teda môžu byť silnými induktormi bunkovej smrti. Ďalšia trieda receptorov môže vyvolať bunkovú smrť len veľmi slabo; chýba im pravdepodobne „doména smrti“. Tretí typ receptorov nemôže vyvolať bunkovú smrť vôbec. Všetky triedy receptorov môžu v závislosti od typu bunky alebo výskytu ďalších signálov produkovať namiesto signálov vedúcich k smrti bunky signály na proliferáciu alebo diferenciáciu buniek.

Veľmi dobre preštudovaným príkladom pluripotentného charakteru aktivity cytokínov z rodiny TNF je priamo faktor TNF, podľa ktorého bola celá trieda nazvaná. TNF môže existovať ako membránovo viazaný cytokín, alebo môže byť odštiepený a sekretovaný. Obe formy sa viažu na obidva TNF receptory a to TNF-R55 a TNF-R75. Pôvodne bol TNF opísaný na základe svojej schopnosti priamo usmrtiť rakovinové bunky. TNF tiež kontroluje širokú škálu imunitných procesov, vrátane indukcie akútnych zápalových reakcií. Uplatňuje sa tiež pri zachovaní homeostázy v lymfatických tkanivách. Vďaka svojej duálnej úlohe sa tento cytokín uplatňuje pri rôznych patologických procesoch. Z toho dôvodu boli tiež pripravené, tak na báze jeho agonistických, ako antagonistických účinkov, prostriedky ovplyvňujúce priebeh ochorenia. Napríklad TNF a LTa (ktorý rovnako prenáša signál cez TNF receptory) sa použili na liečenie rakoviny, zvlášť potom tých typov, ktoré sa vyskytujú na periférnych miestach, ako sú napríklad sarkómy končatín. V týchto prípadoch priame predanie signálu cytokínov pomocou receptorov indukovalo smrť rakovinových buniek (Aggarwal a Natarajan, 1996. Eur Cytokine Netw 7: strana 93 až 124).

V imunologických pokusoch sa použili látky blokujúce prenos signálu cez TNF receptor (napríklad monoklonálne protilátky proti TNF, rozpustné fúzne proteíny s TNF-R) na liečenie ochorení, ako je reumatická artritída a zápalové ochorenia čriev. V týchto patologických stavoch totiž TNF funguje ako induktor bunkovej proliferácie a efektorovej funkcie, a preto pri zhoršujúcom sa autoimunitnom ochorení je terapeuticky veľmi výhodné zablokovať väzbu TNF na jeho receptory (Beutler, 1999. J. Rheumatol. 26, Suppl 57: strana 16 až 21).

Pomerne nedávno objavená dvojica ligand/receptor sa javí ako vhodný model na podobné manipulácie. Lymfotoxín β (T.Tp). cytokín z rodiny TNF, ktorý tvorí heterotriméry s LTa, sa viaže na LTfi-R. Niektoré nádorové bunky adenokarcinómu, ktoré exprimujú ΕΤβ-R, môžu byť usmrtené alebo diferencované, ak sa ošetria agonistickou monoklonálnou protilátkou proti LT3-R (Browning a ďalší, 1996. J. Exp. Med 183: strana 867 až 878). V imunologických pokusoch bolo ďalej dokázané, že monoklonálna protilátka proti ΕΓβ alebo rozpustný fúzny proteín υΤβ-R-Ig môžu blokovať vývoj zápalového ochorenia čriev, pravdepodobne ovplyvnením interakcie dendritových buniek a T buniek (Mackay a ďalší, 1998. Gastroenterology 115: 1464 až 1475).

Na liečbu rakoviny je možné tiež použiť systém TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand). TRAIL interaguje s radom membránovo viazaných aj rozpustných receptorov. Dva z týchto receptorov,

TRAIL-R1 a TRAIL-R2 (tiež nazývané DR4 a DR5), sprostredkujú prenos signálu pre bunkovú smrť do rakovinových, ale nie normálnych buniek. Normálne bunky totiž exprimujú ďalšie TRAIL receptory, ktoré bunkovú smrť neindukujú a súťažia tak o väzbu TRAIL. Predpokladá sa, že tieto prídavné receptory fungujú ako kompetitívne „klamné“ (decoy) receptory ligandu TRAIL. Použitie rozpustného ligandu TRAIL na usmrtenie rakovinových buniek je založené na selektívnej expresii týchto kompetitívnych „klamných“ (decoy) receptorov na normálnych, nie však na rakovinových bunkách (Gura, 1997 Science 277: strana 768).

Rakovinové bunky samé často exprimujú rozmanitú paletu kompetitívnych „klamných“ receptorov, ktoré blokujú imunitné rozpoznávanie alebo efektorové funkcie. Skutočne, niektoré tumory exprimujú klamné TRAIL receptory vo veľkom množstve, hlavne preto, aby sa vyhli bunkovej smrti sprostredkovanej systémom TRAIL (Sheikh a ďalší, 1999, Oncogene 18: strana 4153 až 4159). Tento poznatok obmedzuje v niektorých prípadoch použitie TRAIL ako protirakovinovej látky. Podobné pozorovania sa uskutočnili ohľadom klamného receptora pre FAS-L, ktorý je silno exprimovaný v rakovinových bunkách pľúc a čreva (Pitti a ďalší, 1998, Náture 396: strana 699 až 703) a tiež pre antagonistu receptora IL-1 (Mantovani a ďalší, 1998. Ann. NY Acad. Sci. 840: strana 338 až 351). Klamné receptory boli nájdené tiež vo vírusových genómoch, pravdepodobne preto, aby boli infikované hostiteľské bunky ochránené pred obrannými mechanizmami hostiteľa.

APRÍL (A Proliferation Inducing Ligand) je nový člen rodiny TNF proteínov. Štúdiá expresie a funkcie ligandu APRÍL priniesli poznatky o tom, že tento proteín je využívaný nádorovými bunkami na vyvolanie rýchlej proliferácie. Nádorové bunkové línie ošetrené rozpustným proteínom APRÍL alebo transfekované pomocou APRÍL cDNA rastú rýchlejšie in vitro. Bunky transfekované cDNA kódujúcou ligand APRÍL, ktoré sa implantovali imunodefícientým myšiam, rastú rýchlo ako nádory. Tiež ľudské nádorové bunky, ale nie bunky normálneho tkaniva, exprimujú vysoké hladiny APRÍL mRNA. Tieto pozorovania vedú k záveru, že ligand APRÍL sa viaže na receptor, ktorý je tiež exprimovaný nádorovými bunkami, čím sa vyvolá autokrinná alebo parakrinná aktivácia nádorovej bunky. Okrem toho možno predpokladať, že ligand APRÍL pôsobí aj pri ďalších ochoreniach, čím sa otvárajú ďalšie možnosti využitia ovplyvnenia tejto signálnej dráhy. Napríklad nízka expresia alebo vysoká expresia ligandu APRÍL má dôležitú úlohu vo vývinovom poškodení, pretože vývin je často charakterizovaný veľmi prísne kontrolovanou rovnováhou medzi bunkovou proliferáciou a bunkovou smrťou. Obdobne, APRÍL môže mať úlohu pri ochoreniach, ktoré sú spojené s bunkovou proliferáciou, ktoré sa môžu vyskytovať v spojení s niektorými autoimunitnými ochoreniami (napríklad lupienkou) alebo pri zápalových ochoreniach, kde sa bunkové populácie veľmi rýchlo množia (napríklad bakteriálna sepsa).

V závislosti od známeho použitia agonistov a antagonistov cytokínov TNF a členov rodiny receptorov TNF ako možných modulátorov ochorenia, signálna dráha ligandu APRÍL reprezentuje veľmi dôležitú oblasť pre výskum a vývoj liekov. Tieto lieky by boli obzvlášť vhodné na terapiu rakoviny, pretože o rakovinových bunkách je známe, že produkujú a využívajú ligand APRÍL na podporu svojho vlastného rastu a preto je nepravdepodobné, že by tvorili „klamné“ (decoy) receptory alebo iné antagonisty signálnej dráhy ligandu APRÍL. Tak sa signálna dráha ligandu APRÍL unikátne odlišuje napríklad od signálnych dráh ligandov TRAIL alebo FAS-L, ktorých terapeutické využitie je znemožnené expresiou „klamných“ nádorových receptorov.

Liečenie rakoviny známe zo stavu techniky nevyhovuje na rôzne druhy nádorov vzhľadom na svoju malú účinnosť, malý vplyv na prežitie pacienta, vykazovanú toxicitu, vedľajšie účinky alebo kombináciu uvedených nevýhod. Je preto dôležité nájsť a vyvinúť ďalšie spôsoby liečby rakovinového bujnenia, ktoré by boli dostatočne účinné bez vyvolania vážnych vedľajších účinkov. Na tento účel by mohli byť využité antagonisty signálnej dráhy ligandu APRÍL, vrátane monoklonálnych protilátok proti ligandu APRÍL, protilátok proti receptoru APRÍL, rozpustných fúznych proteínov receptora APRÍL s protilátkou (APRIL-R-Ig), prirodzených antagonistov, malých molekulárnych antagonistov a ďalších antagonistov, pripravených pomocou farmaceutických alebo chemických postupov.

Jedným z výstupov vynálezu je identifikácia proteínu vyskytujúceho sa na B bunkách (B celí mediated proteín - BMC alebo BMCA), ktorý slúži ako receptor pre ligand APRÍL.

Podstata vynálezu

Autori vynálezu zistili, že BMCA je receptorom pre nádorový nekrotický faktor, APRÍL. APRÍL je totožný s molekulou opísanou v dokumente WO 99 12965, pozri zoznam referencii. Pre receptor ligandu APRÍL je ďalej v texte používané označenie „APRIL-R“. Vynález sa vzťahuje na použitie antagonistov APRIL-R, ako je definované v patentovom nároku 1, na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie rôznych druhov cicavcov, ktorí majú rakovinu alebo majú zvýšené riziko jej výskytu. Tieto subjekty zahŕňajú subjekty už postihnuté rakovinou, alebo tie, ktoré už podstúpili rakovinovú terapiu.

Použitia podľa vynálezu využívajú fakt, že isté terapeuticky využiteľné látky definované ako antagonisty

APRIL-R, vrátane napríklad protilátok proti APRIL-R, je možné využiť na liečenie subjektov s rizikom vývoja rakoviny, tak ako už bolo uvedené a ďalej je možné využiť ich na liečenie rakoviny.

Terapeutické prostriedky podľa vynálezu môžu byť podávané všetkými možnými spôsobmi, ktoré zodpovedajú vybratému prostriedku a môžu byť pripravené vo forme spolu s farmaceutický prijateľným nosičom, ktorý je vhodný na určitý spôsob podávania.

Výhodné spôsoby podávania sú parenterálne, zvlášť potom intravenózne, intraperitoneálne a intrakapsuláme. Liečenie je možné uskutočňovať dostatočne dlhý čas na ambulantnej báze. Predpokladá sa, že denné dávky protirakovinového terapeutického prípravku sa budú pohybovať v rozsahu 0,01 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti, vo výhodnom uskutočnení potom medzi 10 až 300 pg/kg telesnej hmotnosti. Je samozrejmé, že sa presné denné dávky budú meniť v závislosti od použitého protirakovinového terapeutického prostriedku a od okamžitého fyzického stavu pacienta a priebehu ochorenia.

Použitie podľa vynálezu zahŕňa odstránenie podstatnej časti klonovej populácie (kolónie) transformovaných buniek z organizmu cicavca, alebo potlačenie či zoslabenie rastu kolónií, ktoré sú bežne považované za nádory. Samy osebe sú prostriedky podľa vynálezu a spôsob ich použitia použiteľné na predĺženie života a zlepšenie kvality života u pacientov s rizikom výskytu rakoviny, alebo s už prebiehajúcou rakovinou.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje sekvenciu nukleovej kyseliny (sekvenciu SEQ ID NO: 1) cDNA pre myší APRÍL a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (sekvenciu SEQ ID NO :3) vloženú vo vektore pCCM213.10 na expresiu v Pichia pas to r is. Podčiarknutá časť predstavuje epitop myc a aminokyseliny odvodené od FasL. Šípkami je označený začiatok kódujúcej sekvencie pre extracelulámu doménu ligandu APRÍL.

Obrázok 2 znázorňuje sekvenciu nukleovej kyseliny (sekvenciu SEQ ID NO:4) a od nej odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (sekvenciu SEQ ID NO:6) pre konštrukt FLAG-ľudský APRÍL vo vektore na expresiu v cicavčích bunkách (PS429). Mapa znázorňuje signálnu sekvenciu (aminokyseliny 1 až 15); epitop FLAG (aminokyseliny 16 až 23) a počiatok kódujúcej sekvencie pre extracelulámu doménu ľudského APRÍL (od 32 aminokyseliny do konca).

Obrázok 3A znázorňuje sekvenciu nukleovej kyseliny (sekvencia SEQ ID NO:7) a od nej odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (sekvencia SEQ ID NO: 8) klonu s úplnou dĺžkou pre ľudský BMCA. Obrázok 3B znázorňuje sekvenciu nukleovej kyseliny (sekvencia SEQ ID NO:11) plazmidu pJST538, obsahujúceho fuzny konštrukt ľudského APRIL-R-hlgGFc a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (sekvencia SEQ ID NO: 12). Konštrukt má nasledujúcu štruktúru: signálny peptid z myšej Ig kappa cDNA (nukleotidy 1 až 66, aminokyseliny 1 až 22), doména bohatá na cysteín z ľudského BCMA je orámovaná (nukleotidy 70 až 222, aminokyseliny 24 až 74), ľudský IgGl je kódovaný nukleotidmi 226 až 909 (zodpovedá aminokyselinám 76 až 302). Na miesta spojenia domén (zvyšok 23 a 75) boli vložené „bezproblémové“ aminokyseliny. Šípkou je označené miesto, na ktorom pravdepodobne dochádza k odštiepeniu fuzneho peptidu.

Obrázok 4 znázorňuje väzbu komplexu ligandu wyc-myší APRÍL na myšiu B-bunkovú lymfómovú líniu A20. Tri nezávislé pokusy dokázali špecifickú väzbu APRÍL na bunky A20 v porovnaní s A) nezafarbenými bunkami a bunkami zafarbenými len R1532, B) bunkami zafarbenými RANKL-L a R1532 a C) bunkami označenými pomocou APRÍL a irelevantným králičím sérom.

Obrázok 5 znázorňuje väzbu komplexu myc-myší APRÍL na ľudské B bunky lymfómovej línie RAJI. V dvoch nezávislých pokusoch sa dokázala špecifická väzba APRÍL na RAJI bunky v porovnaní s A) nezafarbenými bunkami a bunkami zafarbenými len R1532, bunkami zafarbenými RANK-1 a R1532 a B) bunkami označenými pomocou APRÍL a irelevantným králičím sérom.

Obrázok 6 ukazuje, že väzba APRÍL na bunky A20 (A) a bunky RAJI (B) je kompetitívne ovplyvnená použitím rozpustného proteínu BAFF alebo rozpustného proteínu BCMA-Ig.

Obrázok 7 znázorňuje väzbu komplexu FLAG-ľudský APRÍL na rôzne bunkové línie: A) bunky A20, B) bunky HT29, C) bunky NIH3T3. Špecifická väzba je dokázaná detekciou pomocou biotinylovanej monoklonálnej protilátky M2 proti epitopu FLAG v porovnaní s väzbou irelevantnej izopytovo zhodnej kontrolnej monoklonálnej protilátky alebo bez pridania fuzneho proteínu FLAG-APRIL.

Obrázok 8 znázorňuje imunoprecipitáciu myc-mAPRIL pomocou fuzneho proteínu BCMA-Fc. Horný ľavý panel ukazuje špecifické imunoprecipitácie hBMCA-Fc/myc-mAPRIL a pozitívne kontroly OPG-Fc/Rank-1. Dolné panely ukazujú, že vo všetkých reakciách bolo použité rovnaké množstvo proteínu.

Obrázok 9 znázorňuje pokusy s rôznymi formátmi ELISA testu, ktoré dokumentujú, že fúzny ligand FLAG-hAPRIL viaže fúzny proteín hBCMA-Fc. Rôzne fúzne proteíny Fc-receptor sa použili ako poťah na mikrotitračné ELISA platne a viazali ligandy s pripojenou časťou FLAG. A) Detekcia väzby ligandov dokázala, že iba ligandy APRÍL a hBAFF sa špecificky viažu na plame potiahnuté hBCMA-Fc (ľavá časť obrázka), ale nie na platne potiahnuté hCD40-Fc (pravá časť). Na obrázku 9A-2 je ešte znázornená väzba ďalších ligandov na platne potiahnuté BCMA-Fc (vľavo), CD40-Fc (v strede) a kombinácia oboch grafov (vpravo).

B) Dávková titrácia dokazuje, že ELISA signál detegovaný po väzbe hAPRIL alebo hBAFF na platniach potiahnutých hBCMA-Fc je lineárne závislý od množstva pridaného proteínu. Obrázok 9B-1) Titrácia pomocou rôznych dávok proteínu APRIL-507 a muBAFF-657 na platniach potiahnutých BCMA-Fc-739 alebo TNFR2-492. Obrázok 9B-2) Titrácia TNFal97 na platniach potiahnutých BCMA-Fc-739 alebo TNFR2-Fc-492. Obrázok 9B-3) Titrácia hAPRIL-429 na platniach potiahnutých BCMA-Fc-739 alebo TNFR2-Fc-492.

Obrázok 10 znázorňuje imunoprecipitáciu FLAG-hAPRIL a FLAG-hBAFF pomocou fúzneho proteínu hBMCA-Fc. Horné štyri panely dokumentujú, že na imunoprecipitáciu bolo použité vždy rovnaké množstvo proteínu, zatiaľ čo dolné panely dokumentujú, že hAPRIL a hBAFF sú imunoprecipitované hBCMA-Fc, ale nie hTRAIN-Fc.

Obrázok 11 znázorňuje analýzu väzby fuznych proteínov myc-mAPRIL, FLAG-hBAFF a FLAG-mBAFF na hBMCA pomocou zariadenia BiaCore.

Obrázok 12 znázorňuje väzbu ligandu APRÍL na BCMA transfekované bunky. Bunky 293EBNA sa transfekovali plazmidom tak, aby exprimovali hBCMA úplnej dĺžky. Bunky sa zobrali o 48 hodín neskôr s použitím pufra s 5 mM EDTA a zafarbili pomocou ligandu myc-mAPRIL“ s koncentráciami 0,40,200,1000 a 5000 mg/ml. Ligand sa detegoval králičím antisérom proti ligandu APRÍL (R1532) a konjugátom oslej anti-králičej protilátky IgG s PE. Panel A znázorňuje, že intenzita zafarbenia je závislá od dávkovania. Panel B znázorňuje, že pri použití rozpustného proteínu BCMA-Ig intenzita zafarbenia vzhľadom na pozadie klesá.

Obrázok 13 znázorňuje rast 5xl0⁶ buniek NIH3T3 implantovaných podkožné do imunodeficientných (Nu/Nu) myší ošetrených kontrolnými činidlami alebo fúznym proteínom BCMA-Ig. V tomto modeli bunky NIH3T3 tvoria fibrosarkóm.

Obrázok 14 znázorňuje rast 8xl0⁵ buniek ľudského karcinómu hrubého čreva SW480 implantovaných podkožné do imunodeficientných (Nu/Nu) myší ošetrených kontrolnými činidlami alebo fiíznym proteínom hBCMA-Ig.

Obrázok 15A znázorňuje rast ľudského karcinómu hrubého čreva HT29 implantovaného podkožné do imunodeficientných (Nu/Nu) myší, ktoré boli ošetrené kontrolnými činidlami alebo fuznym proteínom hBCMA-Ig. V pravej časti sú znázornené objemy nádorov jednotlivých myší k 42. dňu. Obrázok 15B znázorňuje rast ľudského karcinómu pľúc A549 implantovaného podkožné do imunodeficientných (Nu/Nu) myší ošetrených kontrolnými činidlami alebo fuznym proteínom hBCMA-Ig.

Opis vynálezu

Definícia pojmov

Z dôvodu jasnejšieho a presnejšieho opísania predmetu vynálezu sú špecifické pojmy používané v ďalšom opise vynálezu a nasledujúcich patentových nárokoch vysvetlené v nasledujúcich definíciách.

Vynález je v ďalšom texte podrobne opísaný pomocou literárnych odkazov, v ktorých sú zahrnuté nasledujúce pojmy:

Termín „receptor APRÍL“ alebo „APRIL-R“ používaný v ďalšom texte zahŕňa natívnu sekvenciu APRIL-R a sekvenciu variant APRIL-R. APRIL-R je možné izolovať z rôznych zdrojov, ako sú rôzne typy myších či ľudských tkanív alebo z iného zdroja, ale je ich možné pripraviť rekombinantnými či syntetickými postupmi. Termín APRIL-R sa ďalej vzťahuje na polypeptid, ktorý je schopný väzby na rôznych členov rodiny nádorových nekrotických faktorov, na ligand APRÍL alebo na jeho homológy či fragmenty. V kontexte tohto vynálezu APRIL-R je BCMA.

Termín „BCMA“ alebo „BCM“ sa vzťahuje na nový proteín, ktorý sa zúčastňuje maturácie B buniek, tak ako je to opísané Grasom a ďalšími (1995), Intemational Immunology 7: strana 1093 až 1106, „BCMAp: an integrál membráne proteín in the Golgi apparatus of human mature B lymphocytes“; Y. Laabim a ďalšími (1992), EMBO J., 11: strana 3897 až 3904, ,A new gene BCM on Chromosome 16 is fused to the interleukin 2 gene by a t(4; 16) (q26:p 13) translocation in a malignant T celí lymphoma“.

„Natívna sekvencia receptora APRIL-R“ zahŕňa polypeptid, ktorý má rovnakú aminokyselinovú sekvenciu, ako APRIL-R, odvodenú z prirodzene sa vyskytujúcej sekvencie. Takáto natívna sekvencia receptora APRIL-R sa môže izolovať z prirodzene sa vyskytujúceho materiálu, alebo môže byť pripravená pomocou rekombinantných alebo syntetických postupov. Natívna sekvencia receptora APRIL-R môže byť prirodzene sa vyskytujúca sekvencia APRIL-R v skrátenej forme, alebo v sekretovanej forme (to znamená v rozpustných formách, obsahujúcich napríklad sekvenciu extracelulámej domény), ďalej v prirodzene sa vyskytujúcich variantných formách (to znamená alternatívne zostrihaných formách) a ďalej v prirodzene sa vyskytujúcich formách alelických variantov APRIL-R. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je natívna sekvencia APRIL-R, maturovaná natívna sekvencia s úplnou dĺžkou pre polypeptid APRIL-R, obsahujúca aminokyseliny 1 až 184 zo sekvencie SEQ ID NO: 8 alebo jej fragmenty.

Termínom „extraceluláma doména APRIL-R“ alebo ,APRIL-R ECD“ sa rozumie forma receptora APRIL-R, ktorá je v podstate jednoduchá forma transmembránových a cytoplazmatických domén vyskytujú cich sa v receptore APRIL-R. Spravidla extraceluláma doména receptora APRIL-R neobsahuje viac ako 1 % aminokyselinových zvyškov z transmembránových a cytoplazmatických domén a vo výhodnom uskutočnení obsahuje menej ako 0,5 % transmembránových a cytoplazmatických zvyškov. Obvykle obsahuje APRIL-R ECD aminokyselinové zvyšky 1 až 51, alebo 1 až 52, či 1 až 53 zo sekvencie SEQ ID NO: 8. Vo výhodnom uskutočnení APRIL-ECD obsahuje aminokyselinové zvyšky 4 až 51 zo sekvencie SEQ ID NO: 8 alebo v ešte výhodnejšom uskutočnení aminokyselinové zvyšky 8 až 41 zo sekvencie SEQ ID NO: 8. Odborníkom v danom odbore je zrejmé, že transmembránová doména identifikovaná v polypeptide APRIL-R podľa vynálezu bola identifikovaná pomocou rutinných kritérií, ktoré sa používajú v danom odbore na identifikáciu tohto typu hydrofóbnej domény. Presné ohraničenie transmembránovej domény sa môže líšiť, ale s najväčšou pravdepodobnosťou nebude rozdiel väčší než 5 aminokyselinových zvyškov na každom konci vyznačenej domény.

Termínom „variant APRIL-R“ sa rozumie aktívny receptor APRIL-R, tak ako je definovaný ďalej v texte, ktorý má aspoň 80 % identitu aminokyselinovej sekvencie s receptorom APRIL-R, ktorého dedukovaná aminokyselinová sekvencia úplnej dĺžky pre natívny APRIL-R je uvedená v sekvencií SEQ ID NO: 5 alebo so sekvenciou APRIL-R ECD. Takéto varianty APRIL-R zahŕňajú napríklad polypeptidy APRIL-R, kde na konci alebo na karboxy konci sekvencie SEQ ID NO: 8 je jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov pridaných alebo odstránených. Spravidla variant APRIL-R má aspoň 80 % alebo 85 % identitu aminokyselinovej sekvencie, vo výhodnom uskutočnení vynálezu aspoň 90 % identitu aminokyselinovej sekvencie, v ešte výhodnejšom uskutočnení aspoň 95 % identitu aminokyselinovej sekvencie s aminokyselinovou sekvenciou podľa sekvencie SEQ ID NO: 8.

„Percentá (%) identity aminokyselinovej sekvencie“ vo vzťahu k sekvenciám receptora APRIL-R podľa vynálezu sa definujú ako percentá aminokyselinových zvyškov v študovanej sekvencií, ktoré sú identické s aminokyselinovými zvyškami v sekvencií receptora APRIL-R a to po porovnaní (aligmente) sekvencií a prípadnom doplnení medzier (ak je to potrebné na dosiahnutie maximálnej percentuálnej zhody), keď sa ako časť identickej sekvencie neuvažujú žiadne konzervatívne substitúcie. Porovnanie (alignment) sekvencií pre stanovené percentuálne zhody aminokyselinových sekvencií je možné uskutočniť niekoľkými odborníkom známymi spôsobmi, napríklad použitím verejne dostupných počítačových programov, ako je BLAST, ALIGN alebo programu Megalign (DNASTAR). Odborníci daného odboru určia zodpovedajúce parametre na uskutočnenie porovnávaní, vrátane potrebných algoritmov, ktorými je možné uskutočniť porovnanie cez celú dĺžku porovnávaných sekvencií.

Termín „epitope tagged“ - „pripojený epitop“, ak je používaný v ďalšom texte, sa vzťahuje na chimémy polypeptid obsahujúci receptor APRIL-R alebo jeho doménu, ktoré sú pripojené na polypeptidovú značku („Tag-polypeptide“). Polypeptidová značka obsahuje dostatok aminokyselinových zvyškov, ktoré tvoria epitop, proti ktorému je možné vytvoriť protilátku, alebo ktorú je možné identifikovať pomocou nejakého iného činidla, ale je dostatočne krátka, takže neinterferuje s aktivitou receptora APRIL-R. Vo výhodnom uskutočnení polypeptidová značka je dostatočne jedinečná, takže protilátka proti nej nereaguje krížovo s ďalšími epitopmi. Vhodná polypeptidová značka obvykle obsahuje aspoň 6 aminokyselinových zvyškov a obvykle obsahuje medzi 8 až 50 aminokyselinovými zvyškami (vo výhodnom uskutočnení 10 až 20 zvyškov).

Termínom „izolovaný“ sa v ďalšom texte pri opise rôznych polypeptidov rozumie polypeptid, ktorý je identifikovaný a oddelený a/alebo izolovaný od komponentov bežných v mieste jeho prirodzeného výskytu. Kontaminujúce komponenty v mieste prirodzeného výskytu polypeptidu predstavujú materiál, ktorý obvykle interferuje s diagnostickým alebo terapeutickým použitím polypeptidu. Môžu to byť enzýmy, hormóny a ďalšie rozpustené látky proteínovej alebo neproteínovej povahy. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je možné polypeptid čistiť (1) do stupňa, ktorý postačuje na získanie aspoň 15 aminokyselinových zvyškov na N-konci alebo internej aminokyselinovej sekvencie pomocou aminokyselinového sekvenátora („spinning cup sequenator“) alebo (2) do stupňa, ktorý postačuje na to, aby polypeptid putoval ako jediný prúžok na SDS-PAGE za redukujúcich či neredukujúcich podmienok použitím Coomassie modrej, či vo výhodnom uskutočnení po farbení striebrom. Izolovaný polypeptid zahŕňa polypeptid in situ v rekombinantných bunkách, ak v ňom nie je prítomná aspoň jedna časť prirodzeného prostredia receptora APRIL-R. Spravidla sa však izolovaný polypeptid pripravuje pomocou aspoň jedného purifikačného kroku.

Termín „protilátka“ sa používa v najširšom zmysle a obvykle pokrýva jednotlivé monoklonálne protilátky proti receptoru APRIL-R (vrátane agonistu, antagonistu a neutralizačných protilátok) a ďalej protilátkovej kompozície proti APRIL-R so špecifickou proti niekoľkým epitopom(poLyepitopové). Termínom „monoklonálna protilátka“ sa v ďalšom texte rozumie získaná protilátka značne homogénnych protilátok, to znamená, že jednotlivé protilátky obsiahnuté v populácii sú identické, až na možný výskyt prirodzene sa vyskytujúcich mutácií, ktoré môžu byť prítomné v malých množstvách.

Termín „vyčistený preparát“ či „v podstate čistý preparát“ polypeptidu, ktorý je používaný v ďalšom texte, znamená polypeptid, ktorý je oddelený od ďalších proteínov, lipidov a nukleových kyselín, s ktorými sa prirodzene vyskytuje. Vo výhodnom uskutočnení je polypeptid tiež oddelený od ďalších látok, napríklad protilátok, matrice a tak ďalej, ktoré boli použité na jeho čistenie.

Termíny „ošetrenie, liečba a terapia“ používané v texte sa vzťahujú na termíny liečebná terapia, profylaktická terapia a preventívna terapia.

Termíny „peptidy, proteíny a polypeptidy“ sa používajú v texte zameniteľné.

Termín „biologicky aktívny“ používaný v texte, znamená in vivo alebo in vitro aktivitu, ktorá sa môže prejaviť buď priamo, alebo nepriamo. Biologicky aktívne fragmenty receptora APRIL-R môžu mať napríklad 70 % aminokyselinovú homológiu s aktívnym miestom receptora, vo výhodnom uskutočnení aspoň 80 % homológiu a v ešte výhodnejšom uskutočnení aspoň 90 % homológiu. Identita alebo homológia s príslušným receptorom je definovaná ako percento aminokyselinových zvyškov v sekvencii aktívneho miesta, ktoré sú identické so sekvenciou receptora APRIL-R tak, ako je uvedená v sekvencii SEQ ID NO: 8.

Termínom „cicavec“ sa rozumie akékoľvek zviera klasifikované ako cicavec vrátane človeka, kráv, koni, psov, myší a mačiek. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je cicavcom človek.

Ak nie je uvedené inak, vyžaduje uskutočnenie vynálezu znalosť bežných techník bunkovej biológie, kultivácie buniek in vitro, molekulárnej biológie, transgenézy eukaryotických buniek, mikrobiológie, techník rekombinantnej DNA a imunologických technik, v rozsahu, ktorý je bežný u odborníkov v príslušných odboroch. Takéto techniky sú opísané v literatúre.

Ďalej budú podrobnejšie opísané výhodné uskutočnenia vynálezu. Vynález opisuje použitie receptora APRIL-R a molekúl podobných receptoru APRIL-R pri ovplyvňovaní rastu a dozrievania B-lymfocytov a iných buniek ako B-lymfocyty, najmä pokiaľ ide o ich súvis s nádorovými bunkami. Taktiež je opísané použitie receptora APRIL-R a molekúl podobných receptoru APRIL-R na ovplyvnenie imunitnej odpovede, napríklad pri autoimunitných ochoreniach a ďalších poruchách imunitného systému. Ďalej je opísané použitie génu pre APRIL-R alebo podobného génu na liečenie rakoviny a porúch imunitného systému pomocou génovej terapie.

Receptor APRIL-R a jeho homológy produkované hostiteľskými bunkami transformovanými génmi podľa vynálezu, ako aj natívny receptor APRIL-R purifikovaný spôsobmi známymi zo stavu techniky alebo syntetizovaný pomocou známych aminokyselinových sekvencii, je vhodný na liečbu rôznych druhov rakoviny a imunitných ochorení. Ďalej je tento ligand rovnako vhodný na terapiu a ďalšie spôsoby boja s ďalšími ochoreniami.

Opísané je tiež použitie nukleovej kyseliny, kódujúcej receptor APRIL-R v „antisense“ terapii. Termínom „antisense“ terapia sa rozumie priame podanie alebo in situ vznik takých oligonukleotidov a ich derivátov, ktoré špecificky hybridizujú v bunkových podmienkach s bunkovou mRNA a/alebo DNA, ktorá kóduje požadovaný ligand. V dôsledku tejto hybridizácie dôjde k inhibícii expresie kódovaného proteínu, to znamená k inhibícii translácie a/alebo transkripcie. Povaha tejto väzby môže byť konvenčná komplementarita báz, alebo môže ísť napríklad o špeciálne prípady väzby oligonukleotidu na hlbokú drážku (major groove) DNA dvojzávitnice.

Obvykle sa „antisense“ terapiou rozumie skupina metód známych zo súčasného stavu techniky zahŕňajúcich akúkoľvek terapiu založenú na špecifickej väzbe sekvencie oligonukleotidov.

Antisense konštrukt, ktorý je tu opísaný, sa môže podať napríklad vo forme expresného plazmidu, ktorý po expresii v bunke produkuje RNA komplementárnu k tej časti bunkovej mRNA, ktorá kóduje Kay-ligand. Prípadne môže byť antisense konštrukt tvorený oligonukleotidovou sondou pripravenou ex vivo. Vhodnými oligonukleotidovými sondami sú modifikované oligonukleotidy, ktoré sú odolné proti účinku endogénnych nukleáz a sú teda pomerne stabilné v podmienkach in vivo. Príkladom vhodnej modifikovanej nukleovej kyseliny použiteľnej v antisense terapii sú fosforamidáty, fosfotioáty a metylfosfonáty (pozri napríklad patenty č: 5 176 996; 5 264 564 a 5 256 775). Ďalej boli postupy na prípravu oligomérov použiteľných v antisense terapii zhrnuté napríklad v publikácii van Der Krola a ďalších, (1988) Biotechniques 6: strana 958 až 975; a Steins a ďalších, (1988) Cancer Res 48: strana 2659 až 2668.

Opísaný receptor APRIL-R podľa vynálezu je členom skupiny receptorov príbuzných TNF. Tento proteín, jeho fragmenty alebo ich homológy môžu mať široké liečebné a diagnostické použitie.

Polypeptidy podľa vynálezu špecificky interagujú s ligandom APRÍL, bielkovinou skôr opísanou v dokumente WO99/12964, ktorý je uvedený v zozname referencií. Peptidy a spôsoby podľa vynálezu umožňujú identifikovať molekuly, ktoré špecificky interagujú s receptorom APRIL-R alebo jeho fragmentmi.

Opísané sú tiež spôsoby použitia peptidov odvodených od receptora APRIL-R, ktoré majú schopnosť viazať ligand APRÍL. Fragmenty receptora APRIL-R môžu byť pripravené niekoľkými spôsobmi, napríklad rekombinantnými technikami pomocou PCR, proteolytickým štiepením alebo chemickou syntézou. Vnútorné alebo koncové fragmenty študovaného polypeptidu môžu byť pripravené odstránením jedného alebo viac nukleotidov z jedného alebo oboch koncov nukleovej kyseliny, ktorá tento polypeptid kóduje. Expresiou mutovanej DNA potom vznikajú fragmenty tohto polypeptidu.

Polypeptidové fragmenty môžu byť rovnako syntetizované chemicky s použitím spôsobov známych zo stavu techniky. Takýmto chemickým postupom je napríklad konvenčná Merrifieldová syntéza na pevnej fáze použitím f-moc alebo t-boc. Peptidy a DNA sekvencia podľa vynálezu môžu byť napríklad ľubovoľne rozdelené na vzájomne neprekrývajúce sa fragmenty požadovanej dĺžky alebo na fragmenty, ktoré majú navzájom

SK 286331 Β6 určité prekrytie. Spôsoby, akými je to možné dosiahnuť, sú opísané podrobnejšie.

Príprava rozpustných foriem receptora APRIL-R

Rozpustné formy receptora APRIL-R môžu často efektívne prenášať signál a môžu byť preto aplikované ako liek, ktorý napodobňuje účinkom prirodzenú membránovú formu. Je možné, že receptor APRIL-R opisovaný vo vynáleze je prirodzene sekretovaný ako rozpustný cytokín, ak tomu tak nie je, je možné dosiahnuť sekréciu pomocou génového inžinierstva. Rozpustnú sekrečnú formu receptora APRIL-R je možné pripraviť odstránením DNA, ktorá kóduje N-koncové transmembránové oblasti a niektoré časti peptidovej „stopky“ (stalk región) a ich nahradením sekvenciami, ktoré kódujú signálne peptidy typu I prípadne typu II tak, aby vo vybratom expresnom systéme došlo k ich správnemu proteolytickému štiepeniu. Skúsený odborník dokáže optimalizovať veľkosť ponechanej časti peptidovej „stopky“ tak, aby sa dosiahla maximálna väzba ligandu a zároveň účinnosť sekrécie. Napríklad môžu byť pripravené konštrukty obsahujúce všetky možné delécie v N-terminálnej oblasti, takže vzniknú peptidy začínajúce aminokyselinou 1 až 52. Z analýzy tohto typu potom vyplynie optimálna dĺžka N-terminálnej sekvencie.

Príprava protilátok reagujúcich s receptorom APRIL-R

Vynález ďalej opisuje použitie protilátok špecificky reagujúcich s receptorom APRIL-R. Antisérum alebo monoklonálne protilátky proti tomuto proteínu, prípadne peptidu môžu byť pripravené podľa známych štandardných protokolov (pozri napríklad Antibodies: A Laboratory Manual, editori Harlow a Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1988)). Cicavce ako napríklad myši, škrečky alebo králiky môžu byť imunizované imunogénnou formou peptidu. Medzi spôsoby zvyšujúce imunogenitu proteínov alebo peptidov patria naviazanie na nosič, alebo ďalšie odborníkom dobre známe spôsoby.

Imunogénna časť receptora APRIL-R môže byť podávaná spolu s vhodným adjuvans (látkou zvyšujúcou účinok antigénu). Imunizáciu je možné kontrolovať testovaním titra protilátok v plazme alebo sére. Na tento účel je možné použiť štandardný ELISA test alebo iné imunoenzymatické testy.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú protilátky podľa vynálezu špecifické na antigénne determinanty receptora APRIL-R alebo jeho koreceptory, napríklad sú špecifické na antigénne determinanty polypeptidu podľa sekvencie SEQ ID NO: 8 alebo k ľudským, alebo iným cicavčím peptidom, ktoré sú s týmto ľudským peptidom blízko príbuzné (majú napríklad 70, 80 alebo 90 % homológiu vo výhodnom uskutočnení aspoň 95 % homológii). V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu protilátky proti receptoru APRIL-R nemajú žiadnu podstatnú krížovú reaktivitu (t. j. sú špecifické) s proteínom, ktorý má napríklad nižšiu než 80 % homológiu so sekvenciou SEQ ID NO: 8; vo výhodnom uskutočnení nemajú krížovú reaktivitu s proteínom, ktorý má nižšiu než 90 % homológiu so sekvenciou SEQ ID NO: 8 a v ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu nereagujú s proteínom, ktorý má nižšiu než 95 % homológiu s proteínom, ktorého sekvencia zodpovedá sekvencii SEQ ID NO: 8.

„Nie podstatnou krížovou reaktivitou“ sa rozumie, že daná protilátka má na nemohomológny proteín väzbovú afinitu, ktorá je nižšia než 10 %, vo výhodnom uskutočnení nižšia než 5 % a ešte vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu nižšiu než 1 % väzbovej afinity na proteín, ktorého sekvencia zodpovedá sekvencii SEQ ID NO: 8.

Termín „protilátka“ používaný v ďalšom texte je zamýšľaný tak, že zahŕňa tak vlastné protilátky, ako aj ich fragmenty, ktoré tiež špecificky reagujú s receptorom APRIL-R. Fragmenty protilátok môžu byť pripravené konvenčnými spôsobmi známymi zo stavu techniky a ich účinnosť môže byť testovaná rovnakým spôsobom ako opísaná účinnosť celých protilátok. Napríklad fragmenty F(ab')₂ môžu byť pripravené štiepením protilátok pepsínom. Vo výslednom F(ab')₂ fragmente môžu byť chemicky zredukované disulfidové mostíky, čím vzniknú Fab' fragmenty.

Medzi protilátky podľa vynálezu ďalej patria také biošpecifické a chimérické molekuly, ktoré majú antiAPRIL-R aktivitu (proti APRIL-R). Tak monoklonálne a polyklonálne protilátky (Ab) namierené proti receptoru APRIL-R, ako aj protilátkové fragmenty Fab' a F(ab')₂ môžu byť použité na zablokovanie funkcie APRIL-R.

Rôzne formy protilátok môžu byť tiež pripravené pomocou štandardných spôsobov génového inžinierstva (Winter a Milstein, Náture 349: strana 293 až 299 (1991), pozri zoznam referencií). Môžu tak byť napríklad skonštruované chimérické protilátky, v ktorých je antigén väzbová doména zo zvieracej protilátky spojená s ľudskou konštantnou oblasťou (Cabilly a ďalší, patent U.S.A 4.816.567, pozri zoznam referencií). Chimérické protilátky môžu znížiť pozorovanú imunitnú odpoveď vyvolanú pri použití zvieracích protilátok v klinickej liečbe ľudských pacientov.

Okrem toho môžu byť syntetizované rekombinantné „humanizované protilátky“ rozpoznávajúce receptor APRIL-R. Humanizované protilátky sú chiméry, ktoré sa skladajú z väčšej časti ľudského IgG, do ktorého boli vložené oblasti zodpovedné za špecifickú väzbu antigénu. Zvieratá sú najskôr imunizované požadovaným antigénom, potom sa izolujú zodpovedajúce protilátky a odoberie sa časť sekvencie variabilnej oblasti zodpovedná za špecifickú väzbu antigénu. Antigén viažuce oblasti odvodené zo zvieracích protilátok sa po tom naklonujú do zodpovedajúceho miesta génov pre ľudskú protilátku, v ktorom sa najskôr odstránili antigén viažuce oblasti. Pri použití humanizovaných protilátok sa minimalizujú heterológne (t. j. medzidruhové) sekvencie obsiahnuté v danej ľudskej protilátke, čím sa znižuje riziko vyvolania nepriaznivej imunitnej odpovede v pacientovi.

Je rovnako možné pripraviť rôzne triedy rekombinantných chimérických alebo humanizovaných protilátok, tým, že sa použijú zvieracie variabilné domény a ľudské konštantné domény (CH1, CH2, CH3) z imunoglobulínov rôznych tried. Protilátky so zvýšenou valenciou miesta na väzbu antigénu môžu byť pripravené napríklad využitím génového inžinierstva tak, že sa príslušné miesto na väzbu antigénu naklonuje do vektorov, ktoré nesú ľudské konštantné oblasti (pozri Arulanadam a ďalší, J. Exp. Medicíne 177: strana 1439 až 1450(1993)).

Okrem toho môžu byť štandardné spôsoby rekombinantnej DNA použité na zmenu väzbovej afinity rekombinantných protilátok na príslušné antigény. Takúto zmenu afinity je možné dosiahnuť pozmenením aminokyselinových zvyškov v najbližšom okolí miesta na väzbu antigénu. Afinitu väzbových miest humanizovanej protilátky je možné tiež zvýšiť cielenou mutagenézou založenou na molekulárnom modelovaní (Queen a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: strana 10029 až 10033 (1989)).

Príprava analógov: Produkcia pozmenených peptidových a DNA sekvencií

Analógy receptora APRIL-R sa môžu líšiť od prirodzene sa vyskytujúcej formy receptora APRIL-R v aminokyselinovej sekvencií, vo vlastnostiach nezávislých od sekvencie alebo v oboch. Modifikácie nezávislé od sekvencie zahŕňajú in vivo alebo in vitro chemickú derivatizáciu receptora APRIL-R. Medzi takéto modifikácie okrem iného patria zmeny v acetylácii, metylácii, fosforylácii, karboxylácii alebo glykozylácii.

Výhodné analógy podľa vynálezu zahŕňajú receptory APRIL-R prípadne ich biologicky aktívne fragmenty, ktorých aminokyselinové sekvencie sa líšia od sekvencie opísanej v sekvencií SEQ ID NO: 8 jednou alebo viacerými konzervatívnymi substitúciami aminokyselín, alebo jednou, alebo viacerými nekonzervatívnymi substitúciami, deléciami alebo inzerciami, ktoré však nespôsobia stratu väzbovej aktivity vzhľadom na ligand APRÍL. Medzi konzervatívne zámeny typicky patria mutácie jednej aminokyseliny za inú s podobnými chemickými vlastnosťami, napríklad náhrady aminokyselín vnútri nasledujúcich skupín: valín; glycín; glycín; alanín; valín; izoleucín; leucín; kyselina asparágová; kyselina glutámová; asparagín; glutamín; serín; treonín; lyzín; arginín; respektíve fenylalanín; tyrozín.

Gén pre receptor APRIL-R úplnej dĺžky (sekvencia SEQ ID NO: 8) alebo jeho časti môžu byť použité ako hybridizačné sondy na skríning cDNA knižnice, napríklad na izoláciu ďalších génov, ktoré majú požadovanú sekvenčnú identitu s génom pre receptor APRIL-R podľa sekvencie SEQ ID NO: 6. Nukleotidové sekvencie kódujúce receptor APRIL-R sa môžu ďalej použiť na skonštruovanie hybridizačnej sondy na mapovanie génov kódujúcich APRIL-R a na genetickú analýzu jednotlivcov s genetickými poruchami. Môžu byť navrhnuté také hromadné testy, ktoré budú slúžiť na nájdenie zlúčenín, ktoré napodobňujú biologickú aktivitu receptora APRIL-R. Takéto hromadné testy môžu byť založené na metodike adaptovateľnej na masové multiparalelné spracovanie (high-throughput) chemických knižníc, čo je zvlášť vhodné na identifikáciu potenciálnych liečiv s malými molekulami. Medzi malé molekuly vhodné na toto testovanie patria syntetické organické alebo anorganické zlúčeniny. Nukleové kyseliny kódujúce receptor APRIL-R alebo jeho deriváty môžu byť rovnako použité na vytvorenie transgénnych alebo „knock-out“ zvierat, ktoré sú ďalej vhodné pri vývoji a skríningu terapeuticky vhodných látok, vrátane napríklad liečiv proti rakovine.

Receptor APRIL-R a jeho homológy produkované hostiteľskými bunkami transformovanými sekvenciou podľa vynálezu, ako aj natívny receptor APRIL-R purifikovaný spôsobom známym zo stavu techniky, alebo nasyntetizovaný na základe známej aminokyselinovej sekvencie, je použiteľný v mnohých aplikáciách v boji proti rakovine.

Jedno uskutočnenie vynálezu sa týka použitia kompozície obsahujúcej antagonistu receptora APRIL-R, pričom antagonistom receptora APRIL-R sa rozumie polypeptid, ktorý zabraňuje interakcii medzi ligandom APRÍL a zodpovedajúcim receptorom, s farmaceutický prijateľným nosičom.

Zodpovedajúcim receptorom ligandu APRÍL na povrchu cieľových buniek je antigén BCMA.

Tieto použitia využívajú antagonistu receptora APRIL-R, ktorý obsahuje polypeptid zabraňujúci interakcii medzi ligandom APRÍL a príslušným receptorom. Príkladom týchto antagonistov receptora APRIL-R sú, okrem iného, rozpustný polypeptid APRIL-R, vrátane rozpustného antigénu BCMA (okrem iného); rozpustné chimérické molekuly APRIL-R, ako je napríklad fúzny proteín BCMA-IgG-Fc a homológy protilátok proti receptoru APRIL-R, okrem iných napríklad monoklonálna protilátka proti molekule BCMA.

Spôsoby použitia podľa vynálezu zahŕňajú liečbu nádorových buniek exprimujúcich ligand APRÍL a/alebo jeho receptor APRIL-R (teda antigén BCMA).

Príklady rakovinových ochorení, v ktorých je bunková proliferácia modulovaná ligandom APRÍL môžu byť identifikované in vitro zmeraním koncentrácie mRNA, ktorá kóduje ligand APRÍL a/alebo receptor APRIL-R (t. j. antigén BCMA) v knižnici vytvorenej z buniek, ktoré pochádzajú z nádorových tkanív. Takéto nádorové tkanivá, v ktorých je vysoko exprimovaný ligand APRÍL a/alebo receptor APRIL-R (t. j. antigén

BCMA) sú vhodnými kandidátmi na liečbu.

Iný spôsob na vyhľadanie nádorových tkanív vhodných na liečbu podľa vynálezu je hľadanie vo verejných a súkromných databázach (napr. v databáze firmy Incyte), pričom sa na prehľadávanie použije napríklad úplná cDNA sekvencia génu pre ľudský ligand APRÍL.

Týmto spôsobom bolo dokázané, že mRNA pre ligand APRÍL je exprimovaná vo veľkom množstve typov nádorov, okrem iného napríklad v líniách uvedených v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Knižnica Opis

bunková línia z tumoru prostaty, LNCaP, CA 50M, neošetrená TIGR

bunková línia z tumoru T-lymfocytov, lymfóm, TIGR

bunková línia z tumoru vaječníkov, papiláma serózna cystadenoCA

bunková línia z tumoru pľúc, mw/adenoCA, COPD, 47M

bunková línia z rakoviny prsníka, adenoCA, 46F, SUB, m/BRSTNOT33

bunková línia z gangliómu, dorzálny koreň, cervikálny aw/lymfóm, 32M, NORM

bunková línia z nádoru mozgu, frontálna neuronálna neoplázia, 32M

bunková línia z tumoru prostaty, adenoCA, 59M, SUB, m/PROSNOST19

bunková línia z nádoru hrubého čreva, hepatická fexura, adenoCA, 55M.SUB, m/COLATMTOI

bunková línia z nádoru pankreasu, TIGR

bunková línia z nádoru paragangliómu, paraganglioma. aw/obličkové bunky, CA, 46M

bunková línia z nádoru prsníka, mw/duktálny CA, 43F, mBRSTTUTló

bunková línia z tumoru obličiek, obličková bunka CA, 51F

bunková línia z nádoru močového mechúra, mw/TC CA, CA in situ, 60M. m/BLADTUT 04

bunková línia z nádoru maternice, endometrial, F, TIGR

bunková línia z nádoru prostaty, BPH. mw/adenoCA, PIN, 59M

bunková línia z nádoru pľúc, mw/adeno CA, 53M, m/LUNGTUT17

bunková línia z nádoru kosti, MG-63, osteo SAR, obr. bunka. Μ/F, pool, RP

bunková línia z nádoru mozgu, čelná mozgová kôra, aw/pľúcny CA, 77M.

bunková línia z nádoru hrubého čreva, adenoCA, NORM. SUB, CGAP

bunková línia z nádoru pľúc, dlaždicová bunka CA, 57M

bunková línia z nádoru pľúc, mw/adeno CA, 63M

bunková línia z nádoru prostaty, AH mw/adeno CA, 50M, m/PROSTUTOl

bunková línia z tumoru B-lymfocytov periférnej krvi, CLL, pool, NORM, 3 'CGAP

bunková línia z nádoru hrubého čreva, adenoCA, pool, NORM 3/5'CGAP

bunková línia z nádoru obličiek, m/w obličková bunka CA, 8, 53F, pool, NORM

bunková línia z nádoru vaječníka, dermoid. Cysta, 22F

bunková línia z nádoru hrubého čreva, adenoCA, NORM, 3 'CGAP

bunková línia z nádoru hrubého čreva. adenoCA, 3', CGAP

bunková línia z nádoru prostaty, BPH, mw/adenoCA, 70M.SUB

bunková línia z nádoru vaječníkov, mets hrubé črevo adenoCA, 58F

bunková línia z nádoru maternice, myometrium.mw/leiomyoma.43F

bunková línia z nádoru tenkého čreva, ileum, mw/CLC.2F

bunková línia z nádoru lymfatických uzlín, peripankreatický, aw/pankreatický adenoCA, 65M

bunková línia z nádoru vaječníkov, aw/leiomyomata. 36F, NORM

bunková línia z nádoru pľúc, mw/karcinoid vretenových (spindle) buniek, 62F

bunková línia z nádoru pľúc tumor, dlaždicová bunka C A 50M

bunková línia z nádoru mozgu tumor, meligloma, 36M

nádorová bunková línia, adenoCA, 65F, m/PANCNOTO8

bunková línia z nádoru pľúc, mw/endobronchiálny karcinoid, 33M

bunková línia z nádoru nadobličiek, mw/pheochromocyta. 43F, m/ADRETUT07

bunková línia z nádoru predného mozgu, meningioma, 50M

bunková línia z nádoru obličiek, pool, NORM, 3' CGAP

bunková línia z nádoru prsníka, mw/lobulárna CA, 67F

bunková línia z nádoru pľúc, mw/mets osteoSAR, aw/pleura mets. 58M, NORM

bunková línia z nádoru prostaty. adenoCA, 59M. SUB, m/PROSNOT19

bunková línia z nádoru tenkého čreva tumor, ileum, mets endometriálny adenoCA, 64F

bunková línia z nádoru vaječníkov, adenoCA, 58F

bunková línia z nádoru prsníka, NF breast disease. 46F

bunková línia z nádoru predného mozgu, mets hypemefroma, 58M

bunková línia z nádoru obličiek, Wilms, pool, WM/WN

bunková línia z nádoru pľúc, mw/mets tyroid CA, 79M, m/LUNGTUT02

bunková línia z nádoru pľúc, mets tyroid CA, 79M, m/LUNGTUT03

bunková línia z nádoru príštitných teliesok, adenoma. MZF, NORM, WM

bunková línia z nádoru sliní vky, anaplastický C A, 45 F

bunková línia z nádoru vaječníkov, mw/mucinózny cystadenoCA, 43F, m/OVARTUTOl

bunková línia z nádoru pľúc, dlaždicová bunka CA, pooled. NORM, CGAP

bunková línia z nádoru prsníka, adenoCA, 46F, m/BRSTNOT17

bunková línia z nádoru maternice, mw/leiomyoma, aw/hrubé črevo, adenoCA, 45F

bunková línia z nádoru pľúc, mw/adenoCA, aw/node, diaftagm mets, 63F

bunková línia z nádoru prsníka, adenoCA, 46F, m/BRSTNOT33

bunková línia z nádoru prostaty, adenoCA, 66M, m/PROSNOT15, PROSDIN01

bunková línia z nádoru prsníka, adenoCA, 54F, m/BRSTNOT03

bunková línia z nádoru zárodočných buniek, pool, SUB, 3 'CGAP

bunková línia z nádoru kostnej drene, tibia, aw/mets alveolárna rabdomyo SAR. 16M

bunková línia z nádoru prostaty. AH. mw/adeno CA, 57M, m/PROSTUTOl

bunková línia z nádoru prsníka, PF zmeny, mw/adeno CA, 43F. m/BRSTTUTOl

bunková línia z nádoru maternice tumor, seriózny papilámy CA, F, pooled, 3 'CGAP

bunková línia z nádoru vaječníkov, mucinózne cystadeno CA, 43F, m/OVARNOT03

bunková línia z nádoru prsníka, PF zmeny. mw/adenoCA, intraduktálne C A, 43F

bunková línia z nádoru prsníka, mw/duktálny CA, CA in situ, aw/uzliny mets, 63F

bunková línia z neurogangliónu, ganglioneuroma, 9M

bunková línia z nádoru slinivky, adenoCA, 3 'CGAP

bunková línia z nádoru maternice, endometriálne adenoCA, F, pool. 3 'CGAP

bunková línia z nádoru pľúc, neuroendokrinný karcinoid, pool, NORM, 3 'CGAP

Antagonisty receptora APRIL-R podľa vynálezu, ktoré sa používajú na liečenie stavov spojených s nežiaducou bunkovou proliferáciou, zvlášť pri liečbe nádorov, inhibujú výhodne rast nádorových buniek z viac než 10 %, 20 %, 30 % alebo 40 % a najvýhodnejšie z viac ako 50 %. Antagonisty receptora APRIL-R je možné získať pomocou skríningu (pozri príklad 6). Antagonisty receptora APRIL-R sa tak môžu napríklad vybrať na základe aktivity inhibujúcej rast (z viac ako 10 %, 20 %, 30 %, 40 % alebo 50 %) buniek ľudského karcinómu hrubého čreva HT29 alebo buniek ľudského karcínómu pľúc A549 (pozri napríklad opis na obrázku 15).

V tomto dokumente sú tiež opísané spôsoby inhibície rastu B-lymfocytov a buniek iných ako B-lymfocyty (non-B celí), inhibície rastu B-lymfocytov indukovaného dendritovými bunkami a dozrievania a tvorby protilátok s použitím polypeptidu APRIL-R.

Taktiež sú opísané spôsoby použitia receptora APRIL-R pri liečbe autoimunitných ochorení, zvýšeného tlaku, kardiovaskulárnych chorôb, ochorení obličiek, porúch proliferácie B-lymfocytov, imunosupresivnych ochorení, transplantácie orgánov, zápalu a pri liečbe HIV. Ďalej sa opisujú spôsoby použitia liečiv, ktoré potláčajú, zosiľujú alebo pozmeňujú imunitnú odpoveď organizmu, pričom toto pozmenenie sa dosiahne ovplyvnením signálnej dráhy medzi receptorom APRIL-R a jeho ligandom.

Vynález ďalej opisuje farmaceutické kompozície obsahujúce polypeptid APRIL-R a farmaceutický prijateľné vehikulum. Vhodné nosiče pre polypeptid APRIL-R sú opísané napríklad v knihe „Remington's Pharmaceutical Sciences“, 16. vydanie, 1950, Mack Publishing Co., editorov Osla a ďalších. V typickom uskutočnení vynálezu sa vo formulácii použije príslušné množstvo farmaceutický prijateľnej soli tak, aby vznikla izotonická fomulácia.

Medzi vhodné nosiče patria napríklad pufre, ako je fyziologický roztok, Ringerov roztok a glukózový sirup. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je pH roztoku v rozmedzí cca pH = 5 až 8, vo výhodnejšom uskutočnení je pH v rozmedzí od 7,4 do 7,8. Ďalšími vhodnými nosičmi sú prípravky umožňujúce dlhodobé uvoľňovanie ako napríklad semipermeabilná matrica z hydrofóbnych polymérov. Takéto matrice môžu byť sformované do lipozómov, filmov alebo mikročastíc. Odborníkom je zrejmé, že na určité aplikácie môžu byť vhodnejšie určité nosiče, v závislosti napríklad od spôsobu podania lieku a od koncentrácie polypeptidu APRIL-R, ktorý má byť pacientovi aplikovaný.

Formulácia sa môže aplikovať injekčné (napríklad vnútrožilovo, intraperitoneálne, subkutánne, intramuskuláme) alebo iným spôsobom, ako napríklad infúziou takým spôsobom, aby bola zaistená potrebná dávka účinnej látky v krvnom riečišti pacienta.

Pokiaľ nie je uvedené inak, vyžaduje uskutočnenie vynálezu znalosť bežných techník bunkovej biológie, kultivácie buniek in vitro, molekulárnej biológie, mikrobiológie, techník rekombinantnej DNA, proteínovej biochémie a imunologických techník v rozsahu, ktorý je bežný u odborníkov v príslušných odboroch. Takéto techniky sú opísané v literatúre, pozri napríklad Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, editori Sambrook, Fritsch a Maniatis), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, zväzky I a II (editor D. N. Glover), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (editor M. J. Gait), 1984; patent Spojených štátov č. 4,683,195 (Mullis a ďalší), Nucleic Acid Hybridization (editori B. D. Hames a S. L Higgins) 1984; Transcription and Translation (editori B.D.Hames a S.J.Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (editor R.I. Freshney), nakladateľstvo Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, zväzky 154 a 155 (Wu a ďalší), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (editori J.H. Miller a M.P. Calos), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (editori Mayer a Walker), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, zväzky I až

IV (editori D. M. Weir and C. C. Blackwell), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V príkladoch bola použitá nasledujúca metodika

Metodika

Klonovanie a expresia fuzneho proteínu myšieho ligandu APRÍL s epitopom myc (CCM776) v Pichia pastoris

Expresný vektor pCCM213.1O sa skonštruoval na základe plazmidu PDR004 (H98 muAPRIL so „stopkou“ ligandu superFAS naviazanou na N-konci spolu s epitopom FLAG), z ktorého sa vyštiepila sekvencia kódujúca myší ligand APRÍL (muAPRIL) pomocou enzýmu Sací a Notl.

Syntetické oligonukleotidy LTB-559 a 560 vytvárajú linker s miestami Xhol a Sací, ktorý ďalej obsahuje a párovací signálny peptid, epitop myc a motív KEL z ligandu FAS. Fragment muAPRIL sa spolu s linkerom vložil ligáciou do Xhol-NotI miest v plazmide pCCM211, čo je expresný plazmid pre Pichia pastoris.

Plazmid pCCM213.10 sa potom linearizoval enzýmom Stul, elektroporoval do buniek kmeňa GS115 (his4-) a vysial na platne s minimálnym médiom obsahujúcim dextrózu (D-(+)-glukózu). HIS4 transformanty sa testovali na expresiu proteínu tak, že jedna kolónia sa preočkovala do bohatého média (BMGY: pufrované komplexné médium s glycerolom), v ktorom sa umožnilo bunkám rásť počas 48 hodín pri teplote 30 °C. Kultúra sa potom centrifugovala a bunkové pelety sa resuspendovali v pomere 1 : 5 v bohatom médiu na indukciu s obsahom 1,5 % metanolu (BMMY: pufrované komplexné médium s metanolom). Bunky sa dva dni indukovali pri teplote 30 °C a potom sa supematanty analyzovali pomocou SDS-PAGE a stanovila sa prítomnosť proteínu muAPRIL. Proteíny sa najskôr nešpecifický zafarbili Coomasie modrou a potom špecificky na Westem blote monoklonálnou protilátkou proti epitopu myc 9E10. Pritom sa dokázalo, že kmeň CCM776 produkuje dostatočné množstvo glykozylovaného fuzneho proteínu muAPRIL-H98 s pripojeným epitopom myc.

Purifikácia proteínu mAPRIL s epitopom myc

Proteín mAPRIL s epitopom myc pozostávajúci z celkom 149 aminokyselín sa exprimoval v bunkách Pichia pastoris. Tento proteín má izoelektrický bod rovnajúci sa 7,45. 175 ml supematantu buniek Pichiapastoris sa cez noc dialyzovalo oproti lOmM Tris pufra o pH=6,8. Potom sa dialyzovaný supematant naniesol na 20 ml SP kolónu. Kolóna sa extenzívne premyla 10 mM Tris-HCl pufrom s pH=6,8 a obsah sa eluoval 250 mM NaCl v PBS. Druhý krok purifikácie sa uskutočnil pomocou gélovej filtrácie na kolóne S300. Frakcie obsahujúce proteín myc-APRIL získané z 20 mililitrovej SP kolóny sa zakoncentrovali centrifugáciou na konečný objem 7 ml. Podľa spektrofotometrického merania a Coomasie zafarbeného elektroforetického gélu bol výťažok po gélovej filtrácii 8 mg proteínu myc-APRIL. Rovnako sa uskutočnil Westem blot pomocou myšej monoklonálnej protilátky 9E10 (protilátka proti epitopu myc) dokazujúci, že epitop myc nebol poškodený purifikačným postupom. Sekvenovaním N-koncovej oblasti sa potvrdilo, že purifikovaný proteín je skutočne proteín myc-mAPRIL.

Purifikácia fúzneho proteínu ľudského peptidu APRÍL s epitopom FLAG

Plazmid ps429 (následne premenovaný na p 1448) sa použil na prechodnú transfekciu T-lymfocytov 293. Transfekcia sa uskutočnila pomocou lipofektamínu (Gibco-BRL) a bezsérového média. Plazmid, ktorý je založený na cicavčom expresnom vektore PCR3 (Invitrogen) kóduje receptor-väzbovú doménu ľudského ligandu APRÍL s N-terminálnym peptidom, ktorá je po expresii uvoľňovaná do kultivačného média. Fúzny proteín s epitopom FLAG sa purifikoval z bezsérového média pomocou afinitnej kolóny s monoklonálnou protilátkou proti FLAG epitopu a potom eluoval pomocou prebytku čistého peptidu FLAG. Purifikácia sa

SK 28633í B6 uskutočnila podľa inštrukcií výrobcu (Kodak).

Purifikácia fuzneho proteínu HBMCA-Fc

Bunky 293 sa prechodne transfekovali vektorom kódujúcim fuzny proteín HBMCA-Fc. Kultivačné médium z buniek 293 exprimujúcich fuzny hBCM-Fc sa nanieslo na afinitnú kolónu s proteínom A. Proteín sa eluoval 25 mM fosfátovým pufrom, 100 nM NaCl, pH=7,8, po čom nasledovala neutralizácia 1/20 objemu 0,5 M NaPO₄ pH=8,6. Na základe absorbancie pri 280 nm sa vybrali frakcie, ktoré sa ďalej analyzovali elektroforézou SDS-PAGE za redukujúcich a neredukujúcich podmienok. Potom sa ešte pomocou westem blotu identifikoval purifikovaný proteín. Z 500 ml média sa vyizolovali 3 mg proteínu.

Myší ligand mAPRIL s epitopom myc sa viaže na rôzne bunkové línie vo FACS analýze

450 ng/ml purifikovaného polypeptidu myc-mAPRIL sa naviazalo na študovanú bunkovú líniu v 100 μΐ PBS/2 % FBS (fetálneho teľacieho séra) s prídavkom Fc blokujúceho agens (FcBlock, 20 pg/ml, Pharmingen) a s purifikovanou ľudskou IgG (10 pg/ml, Sandoz). Naviazanie sa uskutočnilo 1 hodinovou inkubáciou v ľade. Naviazanie polypeptidu myc-mAPRIL sa detegovalo pomocou špecifického králičieho antiséra proti myšiemu ligandu APRÍL (1 : 500) a konjugátu oslej anti-králičej IgG s fluoresceín-izotiokyanátom (FITC, Jackson). Bunkové línie A20, Raji, NIH3T3 a HT29 sa udržovali v médiách podľa doporučenia dodávateľa (ATCC Bethesda, Maryland). Bunky BJAB sa kultivovali v médiu RPMI pufrovanom pomocou HEPES s prídavkom 10 % FBS a L-glutamínom. V kompetitívnych testoch sa na 1 pg/ml konkurenčného proteínu pridávalo vždy po 450 ng/ml myšieho ligandu APRÍL s epitopom myc (myc-mAPRIL).

Príklad 1: Identifikácia väzby ligandu APRÍL na receptor APRIL-R pomocou testu na platni

V tomto príklade sa testovala väzba BCMA s ligandom APRÍL.

V imunoprecipitačnom experimente sa potvrdila väzba BCMA a ligandu APRÍL. V tomto experimente sa použili rozpustné formy oboch fúznych proteínov hBCMA-Fc a myc-mAPRIL.

Do média, ktoré obsahovalo 10 % FBS sa pri teplote miestnosti na 0,5 hodiny vložili fúzne proteíny hBCMA-Fc a LTBR-Fc s rôznymi TNF ligandmi: myc-mAPRIL; myc-CD40L a myc-RANKL. Fc proteíny sa 1 až 2 hodiny inkubovali s partikulami s naviazaným proteínom A, trikrát premyli 1 ml PBS a analyzovali imunoblotom s myšou monoklonálnou protilátkou 9E10 (protilátka proti epitopu myc). Blot sa vyvolal so substrátom na zosilnenú chemiluminiscenciu.

V tomto experimente sa úspešne detegovali imunoprecipitáty myc-APRIL a hBCMA-Fc, z čoho možno usudzovať, že BCMA interaguje s ligandom APRÍL špecificky na rozdiel od ďalších TNF ligandov (myc-CD-40L a myc-RANKL), ktoré nemali schopnosť naviazať sa na BCMA. Myc-APRIL sa zároveň neviaže na LTBR-Fc.

Rovnaká membrána sa zafarbila a opätovne odblotovala konjugátom chrenovej peroxidázy s protilátkou proti ľudským imunoglobulínom. Dokázalo sa, že v oboch imunoprecipitátoch sa použilo rovnaké množstvo LTBR-Fc aj BCMA-Fc.

Príklad 2: Špecifická interakcia fuznych proteínov hBCMA-Fc a FLAG-hAPRIL

ELISA analýza: ELISA platne sa cez noc potiahli fuznym proteínom receptor-Fc (hBCMA-Fc-739 alebo hTNFR2-Fc-492) s koncentráciou 1 pg/ml v uhličitanovom pufri s pH=9,6, inkubácia sa uskutočnila pri teplote 4 °C. Potiahnuté platne sa pri teplote miestnosti 2 hodiny blokovali PBS s 5 % odtučneným sušeným mliekom a 0,5 % Tweenom 20.

Postupne sa pripravil riedený rad ligandov (s faktorom 2 medzi jednotlivými riedeniami) v 100 μΐ blokovacieho pufra (TNFa-197 od 1000 ng/ml, muBAFF-657 od 1000 ng/ml, hAPRIL-507 od 2000 ng/ml (neaktívne), hAPRIL-429 z 5x koncentrovaného média). Po inkubácii s ligandmi sa platňa premyla pufrom PBS s 0,5 % Tweenom 20 a pridala sa monoklonálna protilátka M2 proti epitopu FLAG s koncentráciou 0,5 pg/ml v riediacom pufri.

Naviazaná protilátka sa potom detegovala konjugátom PO s anti-myšou protilátkou 1/2000 a enzymaticky sa vyvolala substrátom OPD.

Imunoprecipitačné exprimenty: bunky 293T sa transfekovali uvedeným expresným plazmidom (Rec-Fc alebo FLAG-ligand) a vysiali na 9 cm platne. Transfekované bunky sa ponechali 5 dni v 8 ml média Optimem (Gibco-BRL). Imunoprecipitácia sa uskutočnila zmiešaním 200 μΐ média nasýteného jednotlivými ligandmi a so 400 μΐ pufra PBS a s 10 μΐ ProtG-Sepharózy. Táto zmes sa 1 hodinu otáčala na rotačnej trepačke, 4 x premyla 1 ml PBS a nakoniec povarila v 50 μΐ vzorkového pufra (+DTT). Do každej elektroforetickej stopy sa nanieslo 20 μΐ z jednotlivých imunoprecipitácií. Výsledky sa detegovali imunoblotom s monoklonálnou protilátkou M2 proti epitopu FLAG (Sigma, St Louis, Missouri) a s konjugátom PO s anti-myšou protilátkou (1/2000). Bloty sa rovnako vyvolali konjugátom PO s protilátkou proti ľudským IgG: 100 μΐ nasýteného kultivačného média sa prezrážalo MeOH/CHCl₃/lyzozýmom. Táto zmes sa potom povarila vo vzorko vom pufri (s prídavkom DTT) a na elektroforézu sa nanieslo 20 μΐ mixu. Výsledky sa detegovali imunoblotom s monoklonálnou protilátkou M2 proti epitopu FLAG a s konjugátom PO s anti-myšou protilátkou (1/2000).

Príklad 3: Väzba ligandu myc-mAPRIL; hKayL-440 (hBAFF) a FLAG-mBAFF na receptory hBCMA-Ig, hLT-R-Ig alebo hp80 TNFR-Ig

Všetky experimenty sa uskutočnili pri teplote 25 °C a pri prietokovej rýchlosti 10 μΐ za minútu.

Každý experiment sa uskutočnil v pufri HBS (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005 % detergentu P20, pH=7,4). Rovnaký roztok sa použil tak na nariedenie vzorky, ako aj na vlastné premývanie meracej cely v priebehu experimentu (running buffer).

Najskôr sa povrch čipu CM5 (BIACORE, Inc.) aktivoval N-hydroxysukcínimid/N-etyl-N'-(3-dietylaminopropyl)karbodiimid hydrochloridom (BIACORE). 20 μΐ hBCMA-Ig; 15 μΐ hLT-R05-Ig a 10 μΐ hp80 TNFrR, všetko nariedené na 30 g/ml v 10 mM kyseline octovej sa potom blokovalo najskôr jedenkrát 30 μΐ a potom ešte jedenkrát 15 μΐ etanolamín hydrochloridom (pH=8,5). Výsledkom bol čip potiahnutý receptormi s hustotou 1600-3700 rezonančných jednotiek (RU). Čip sa regeneroval 20 μΐ 1 mM kyseliny mravčej. Toto poťahovanie sa zopakovalo celkom päťkrát tak, aby sa dosiahla reprodukovateľná a stabilná úroveň základného signálu.

Vlastný experiment sa uskutočnil tak, že vždy 100 μΐ roztoku ligandov myc-mAPRIL, hKayL-440 a FLAG-mBAFF nariedených na 30 pg/ml v riediacom pufri sa vstreklo na povrch čipu. Ihneď po aplikácii ligandu sa čip premyl 500 μΐ riediaceho pufŕa. Medzi jednotlivými experimentmi sa povrch regeneroval aplikáciou 20 μΐ lmM kyseliny mravčej; po ktorej nasledovala ďalšia aplikácia 15 μΐ kyseliny mravčej. Po regenerácii sa čip ekvilibroval riediacim pufrom.

Príklad 4: Príprava rozpustných foriem receptora

Na vytvorenie inhibítora receptora využiteľného u ľudí je potrebné poznať sekvenciu cDNA, ktorá kóduje extracelulámu doménu receptora. Pomocou známej myšej sekvencie cDNA je možné prehľadať ľudskú cDNA knižnicu a nájsť tak cDNA pre ľudskú formu extracelulámej domény receptora. Obdobné manipulácie sú odborníkom v odbore veľmi dobre známe. Z ľudskej cDNA sekvencie je potom možné navrhnúť oligonukleotidové priméry na PCR a amplifikovať tak extracelulámu doménu receptora bez toho, aby bola prítomná transmembránová a intraceluláma oblasť. V typickom uskutočnení je možné zahrnúť väčšinu aminokyselín, ktoré sa nachádzajú medzi poslednými disulfidickými mostíkmi a sú prepojené „TNF doménou“ a transmembránovou doménou. Je možné meniť veľkosť „stonky“ (stalk región) a tým optimalizovať účinnosť výsledného rozpustného receptora. Týmto spôsobom amplifikovaná DNA je rovno navrhnutá tak, aby obsahovala vhodné reštrikčné miesta na klonovanie do rôznych vektorov umožňujúcich expresiu proteínu vo fúzii s C-koncovým Ig. Eventuálne je možné na 3 'koniec vložiť stop signál a pripraviť tak rozpustnú formu receptora bez toho, aby sa použil postup, ktorý využíva chimému bielkovinu s Ig. Výsledné vektory môžu byť exprimované vo väčšine biotechnologický využívaných systémoch, t. j. v kvasinkách v hmyzích bunkách, baktériách a aj v cicavčích bunkách. Existujú príklady na všetky typy expresie. Ku konštruktu je možné pripojiť rôzne ľudské Fc domény tak, aby bolo možné v závislosti od účelu optimalizovať či eliminovať reakcie s FcR a komplementom. S cieľom selektívne odstrániť interakcie s FcR či s komplementom, alebo pripojiť N-koncovo viazané cukry na Fc doménu je možné eventuálne použiť mutované formy týchto Fc oblastí.

Príklad 5: Príprava protilátok s agonistickým či antagonistickým účinkom

Opísané rozpustné formy receptora sa môžu využiť na imunizáciu myší a na prípravu monoklonálnych protilátok obvyklými spôsobmi. Vo výsledných monoklonálnych protilátkach testovaných ELISA metódou môže byť ďalej testované, či sú vhodné na použitie ako agonisty. Protilátky pri rôznych in vitro bunkových testoch môžu byť v rozpustnej forme alebo imobilizované na plastovom podklade. Smrť buniek z bunkovej línie HT29 je vhodným a často používaným systémom, ktorý je citlivý na signalizáciu, ktorá je sprostredkovaná mnohými TNF receptormi. Ak nemá táto bunková línia príslušný receptor, môžu byť bunky HT29 stabilne transfekované úplnou (full lenght) cDNA pre tento receptor tak, aby sa umožnilo uskutočnenie testov cytotoxicity. Tieto bunky sa môžu prípadne tiež použiť v cytosenzorickom prístroji (Cytosensor apparatus), čím je možné určiť, či aktivácia receptora môže vyvolať zmeny pH, ktoré sú typické pre prebiehajúcu signalizáciu. Signalizácia cez receptory z rodiny TNF je v takomto usporiadaní a použitím danej metódy ľahko merateľná a nie je pritom ani nutné vedieť aktuálne biologické pochody spúšťané TNF receptorom. Monoklonálne protilátky s agonistickým účinkom by boli prispôsobené na klinické použitie v humánnej medicíne. Podobný postup sa môže rovnako použiť na opísanie monoklonálnej protilátky s antagonistickým účinkom. Tieto monoklonálne protilátky sú definované tak, že nemajú agonistický účinok, inhibujú však interakcie receptora s ligandom. To je dokázané ELISA testom, väzbovou štúdiou či pomocou prístroja BIAcore. Indukcia sekrécie chemokinov v rôznych bunkách ako odpoveď na väzbu protilátky s agonistickým účinkom môže byť základom ďalších testov.

Príklad 6: Testovanie inhibítorov interakcie receptora s ligandom

Použitím fuzneho pratému medzi receptorom a Ig je možné v akýchkoľvek kombinatorických knižniciach priamo hľadať molekuly, ktoré viažu receptor. Schopnosť týchto molekúl inhibovať interakciu receptora s ligandom môže byť ďalej testovaná pomocou ELISA testu použitím rozpustného ligandu a fuzneho proteínu medzi receptorom a Ig. Takáto ELISA môže byť použitá priamo na zisťovanie prítomnosti inhibičných zložiek v rôznych knižniciach prírodných produktov atď. Receptor sa môže transfekovať do bunkovej línie ako napríklad HT29 s cieľom vytvoriť biologický test (v tomto prípade test cytotoxicity), ktorý by potom bol základom na vlastný skríning.

Príklad 7: Inhibícia rastu nádorov in vivo

Účinnosť fuzneho proteínu BCMA-Ig pri inhibícii rastu nádorov in vivo sa testovala na rôznych nádorových bunkových líniách. Pri týchto pokusoch sa použili imunodeficientné myši (Nu/Nu) bez týmusu, ktorým sa subkutánne podali nádorové bunky. Agresívne rastúca bunková línia SW480 sa aplikovala v dávke 8 x 10⁵ buniek v 100 μΐ sterilného PBS bez pyrogénov. Ponechala sa jedna neošetrená kontrolná skupina (n=5), zatiaľ čo ďalším skupinám sa podalo 100 pg kontrolnej protilátky (n=6) alebo 100 pg fuzneho proteínu BCMA-Ig (n=6). Protilátky sa aplikovali tesne pred implantáciou nádorových buniek a potom sa dávka opakovala vždy po 7 dňoch. Priemer nádoru sa meral mikrometrom a jeho objem sa vypočítal použitím vzorca (V) = 4/37ΓΓ³.

Bunky SW480 z nádoru hrubého čreva rastú v myších Nu/Nu veľmi rýchlo a hmatateľné nádory sa detegovali počas 10 dní. Po 24 dňoch bol priemerný objem kontrolného nádoru 0,3 cm³, zatiaľ čo priemerný objem nádorov pri myšiach ošetrených fuznym proteínom BCMA-Ig bol 0,19 cm³, čo znamená 46 % redukciu veľkosti nádoru. Ďalej sa použili bunky HT29, rovnako z nádoru hrubého čreva, ktoré v myšiach Nu/Nu rastú tiež agresívne. Na tento experiment sa subkutánne aplikovalo lxlO⁶ buniek v 100 pl sterilného PBS bez pyrogénov. Dávkovací režim protilátok zodpovedal režimu použitému pri bunkách SW480. Hmatateľné nádory sa objavili po 7 dňoch. V kontrolných skupinách väčšina nádorov rástla veľmi rýchlo. Po 42 dňoch bol priemerný objem nádorov v kontrolných skupinách (neošetrené myši a myši ošetrené kontrolnou protilátkou, n=l 2) 0,485 cm³, zatiaľ čo priemerná veľkosť nádorov v skupine ošetrenej fuznym proteínom BCMA-Ig (n=5) bola 0,095 cm³, t. j. menšia o 80 %. Po 50 dňoch bolo 30 % myší v kontrolnej skupine klasifikovaných ako terminálne štádium, vzhľadom na veľkosť nádorov, ktoré presahujú 1,5 cm³ a experiment bol zastavený. Oproti tomu žiadna z myší zo skupiny ošetrenej fúznym proteínom BCMA-Ig nebola klasifikovaná ako terminálna. Výsledky experimentu zahŕňa tabuľka 2.

Tabuľka 2. Objemy nádorov a úmrtnosť po aplikácii buniek HT29 po 50 dňoch trvania experimentu

Kontrolné zvieratá (neošetrené a zvieratá ošetrené kontrolným Ig)	zvieratá ošetrené fuznym proteínom BCMA-Ig
Objem nádoru	Terminálne štádium	Objem nádoru	Terminálne štádium
0,22		0,11	-
0,22		0,32	-
0,35		0,13	-
0,61		0,56	-
0,73		0,33	-
1,74	+
2,53	+
1,51	+
0,90	-
0,44	-
0,32	-
1,92	-
Priemer: 0,96	%: 30	Priemer: 0,29	%; 0

Z tabuľky vyplýva, že došlo k 70 % zníženiu objemu nádorov a je ďalej jasne preukazný významný účinok ošetrenia fúznym proteínom BCMA-Ig na nádory odvodené od bunkovej línie HT29.

Bunková línia A549 z pľúcneho tumoru rastie pomalšie ako opísané línie z nádoru hrubého čreva. Pri pokusoch s touto bunkovou líniou sa myšiam subkutánne implantovalo lxl0⁶ buniek v 100 pl sterilného PBS bez pyrogénov. Protilátky sa dávkovali rovnako ako v opísaných príkladoch. Hmatateľné nádory sa detegovali približne 20 dní po implantácii nádoru. 50 dní po implantácii bol priemerný objem nádoru 0,2 cm³ pri kontrolných skupinách (neošetrené myši a myši ošetrené kontrolnou protilátkou; n=16), zatiaľ čo priemerný objem nádoru v skupine ošetrenej fuznym proteínom BCMA-Ig (n=7) bol 0,1 cm³, t. j. pozorovala sa 50 % inhibícia rastu nádoru. V skupine myší ošetrených fúznym proteínom BCMA-Ig malo po 50 dňoch 57 % my ší nádor menší ako 0,1 cm³, zatiaľ čo z kontrolných myší malo takto malý nádor len 6 %. 60 dní po implantovaní nádoru vzrástol priemerný objem nádoru v kontrolnej skupine na 0,3 cm³. Oproti tomu priemerný objem nádoru v skupine myší ošetrených fuznym proteínom BCMA-Ig bol menší ako 0,2 cm³ (0,188).

Myšia bunková línia NIH3T3 rastie rovnako pomalšie než línia z nádoru tkaniva hrubého čreva. Pri pokusoch s touto bunkovou líniou sa myšiam subkutánne implantovalo 5xl0⁶ buniek v 100 μΐ sterilného PBS bez pyrogénov. Protilátky sa dávkovali rovnako ako v opísaných príkladoch. Bunky NÍH3T3 tvoria po subkutánnej implantácii do Nu/Nu myší zhubný nádor väzivového tkaniva (fibrosarkóm). Hmatateľné nádory sa detegovali približne 4 týždne po implantácii nádoru. Myšiam z kontrolných skupín (n= 11) tieto nádory narástli v priebehu ďalších 10 dní do priemernej veľkosti 0,136 cm³. Oproti tomu nádory v myšiach ošetrených fuznym proteínom BCMA-Ig (n=5) dosiahli objem iba 0,03cm³, t. j. došlo k 78 % zníženiu nádorovej záťaže. 48 dní po implantácii nádoru bol priemerný objem nádoru v kontrolných skupinách 1,6 cm³, zatiaľ čo priemerný objem nádoru myší ošetrených fuznym proteínom BCMA-Ig 0,8 cm³, t. j. dosiahlo sa 50 % zníženie objemu nádoru. Po 52 dňoch od implantácie bolo 82 % (9 z 11) myší v kontrolných skupinách klasifikovaných ako terminálne štádium s nádorom väčším ako 1,5 cm³, t. j. že ešte nažive ostalo iba 18 % zvierat.

Oproti tomu v skupine ošetrenej fuznym proteínom BCMA-Ig malo iba 40 % myší (3 z 5) nádor takého objemu, že museli byť usmrtené. 60 % zvierat tak ostalo nažive po celý čas trvania experimentu. Opísané výsledky sú zhrnuté v tabuľke 3.

Výsledky opisujúce časový priebeh rastu nádorových buniek NIH3T3 sú znázornené na obrázku 13. Výsledky opisujúce časový priebeh rastu nádorových buniek SW480 sú znázornené na obrázku 14. Výsledky opisujúce časový priebeh rastu nádorových buniek HT29 a diagram zachytávajúci stav jednotlivých zvierat 42 dní po implantácii nádoru sú znázornené na obrázku 15A. Výsledky opisujúce rast nádorovej línie A549 jednotlivých zvierat v 50 a 60 dni po implantácii nádoru sú znázornené na obrázku 15B.

Tabuľka 3: Prežitie myši po aplikácii NIH3T3 buniek

Dni po implantácii nádoru
% prežitia	38	42	48	52
Kontrola	100	90	64	18
BCMA-Ig	100	100	80	60

Výsledky inhibície rastu nádoru odvodeného od línie NIH3T3 pozri obrázok 13. Výsledky inhibície rastu nádoru odvodeného od línie SW480 pozri obrázok 14. Výsledky inhibície rastu nádoru odvodeného od línií HT29 a A549 sú uvedené na obrázku 15.

Príklad 8: BCMA-IgG spôsobuje normálnym myšiam zníženie počtu B Iymfocytov

Osem týždňov staré samičky myší B ALB/c sa zakúpili od Jacksonových laboratórií (Bar Harbor, ME). Myšiam (3 myši na skupinu) sa intraperitoneálne aplikovalo buď PBS, alebo 400 pg purifikovaného fuzneho proteínu ľudského BCMA s hulgGI (hBCMA-Ig, proteín bol získaný od Teresy Cachero, Biogen), alebo 400 pg purifikovaného ľudského IgG (HulgG, Sandoz, Basel, Švajčiarsko). Aplikácia sa uskutočnila v dňoch -8, -5, -1 a +2. Myšiam sa v nultý deň podalo 100 μΐ 10 % suspenzie ovčích červených krviniek (SRBC, Colorado sérum company, Denver, Colorado).

Myši sa usmrtili a srdcovou punkciou sa im odobrala krv do mikroskúmavky s EDTA. Červené krvinky sa lyžovali v hypotonickom pufri. Krv sa rovnako odobrala bez prídavku EDTA na prípravu séra. Suspenzie jednotlivých buniek sa pripravili zo sleziny a mezenterických lymfatických uzlín (MLN) a opäť sa červené krvinky lyžovali hypotonickým pufrom. Prietoková cytometria sa uskutočnila použitím PE-konjugátov protilátok proti CD45R/B220, anti-syndekan/CD138 a anti-B7.2 a FITC-konjugátov proti IgM a proti CD45R/B220. Všetky monoklonálne protilátky sa zakúpili od spoločnosti Pharmingen (San Diego, Kalifornia). Fc receptory sa zablokovali 15 minútovou inkubáciou s 10 pg/ml pufra Fc-block (Pharmingen) v ľade, po ktorej nasledovalo pridanie konjugátov monoklonálnych protilátok s PE a FITC a 20 až 30 minútová inkubácia v ľade. Bunky sa jedenkrát premyli a suspendovali v 0,5 % roztoku paraformaldehydu.

Dáta sa namerali na prietokovom cytometri FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornia) a analyzovali použitím softvéru CELLQuest™ (Becton Dickinson).

Po ošetrení fúznym proteínom hBCMA-Ig došlo k približne 50 % zníženiu počtu B Iymfocytov v periférnej krvi a v skúmaných periférnych lymfoidných orgánoch. B220^hlgh IgM^low B bunky tvorili 23,4 % a 21,5 % buniek v kontrolných skupinách myší ošetrených PBS a ošetrených HulgG, kdežto pri myšiach ošetrených fuznym proteínom hBCMA-Ig predstavovali tieto bunky iba 9,9 % všetkých buniek. Plazmatické bunky (syndecan/CD138+) mali rovnako mierne zníženie. Tieto bunky tvorili 5,7 % a 4,8 % bunkovej populácie kontrolných skupín ošetrených PBS respektíve HulgG v porovnaní s 3,9 % pri myšiach ošetrených fuznym proteínom hBCMA Ig. Pri molekule B7.2 došlo k zvýšeniu koncentrácie na 3,1 % a 4,5 % z buniek B220+ pri 5 myšiach ošetrených PBS a HulgG, ako je uvedené, v porovnaní s 1,9 % pri myšiach ošetrených hBCMA-Ig.

V slezinách došlo k výraznému zníženiu počtu buniek BŽŽO'^8,1' po aplikácii fuzneho proteínu hBCMA-lg (18,8 % buniek) v porovnaní s 36,7 % a 40 % buniek po aplikácii PBS a HulgG. Tento pokles sa pozoroval tak pri subpopuláciách IgM^hlíh ako aj pri IgM^low (pozri tabuľka 1). Nepozorovala sa žiadna zmena v novo vzniknutej subpopulácii B buniek v slezine, B220^lo'^vIgM^h'^8h (údaje nie sú uvedené). Plazmatické bunky (syn10 decan/CD138+) mali iba mierne zníženie z 3,3 % a 3,4 % z buniek v slezinách kontrolných zvierat po aplikácii PBS respektíve HulgG, na 2,4 % zo všetkých buniek v slezinách myší, ktorým sa podal fúzny protein hBCMA-Ig.

Rovnako v mezenterických uzlinách (MLN) došlo k poklesu počtu B220+ B lymfocytov z 26,7 % respektíve 35,8 % nameraných kontrolným zvierám, ktorým sa aplikoval PBS respektíve HulgG na 14,1 % po apli15 kácii hBCMA-Ig. Dáta z týchto meraní sú zhrnuté v tabuľke 3.

Znížené percento B7.2+ B lymfocytov v krvi a plazmatických buniek v krvi a slezine myší ošetrených fuznym proteínom hBCMA-Ig po imunizácii ovčími krvinkami (SRBC) možno vysvetliť tým, že dochádza k inhibícii aktivácie a/alebo dozrievaniu B lymfocytov a prípadne k zrýchlenej eliminácii aktivovaných B lymfocytov.

Len veľmi malé percento antigén-špecifických B buniek je aktivované a schopné odpovedať na prítomnosť antigénu, v tomto prípade SRBC.

Tabuľka 3: Populácia B-lymfocytov myší ošetrených fuznym proteínom hBCMA-Ig, PBS a HulgG

Krv	B220high IgMl0W	Syndecan	B7.2/B220low
PBS HulgG HBCMA-Ig	23.4 ±5,7 21.5 ±4,5 9,9 ± 1,8	5.7 ± 1,5 4.8 ± 0,9 3.9 ± 0,6	3,1 ±0,5 4,5 + 1,0 1,9 + 0,5
Slezina	B220high IgM10w	B220high IgM+	Syndecan
PBS HulgG HBCMA-Ig	27,8+1,6 30.5 ± 2 10.6 ±0,2	11,9 ± 1,6 11,8 ± 1,0 8,4 ± 0,2	3,3+0,8 3.4 + 0,7 2.4 ± 0,2
MLN	B220+
PBS HulgG HBCMA-Ig	26,7 35,8 ±3,3 14,1 ±5,9

Myši boli ošetrené tak, ako sa opísalo v metodike, dáta sú vyjadrené v percentách ± štandardná odchýlka.

Pretože aplikácie fuzneho proteínu hBCMA-Ig mali za následok tak dramatickú redukciu v počtoch B buniek vo všetkých testovaných tkanivách (cca 50 % redukciu), zdá sa, že sa aktivita fuzneho proteínu hBCMA-Ig rovnako zameriava proti pokojovým, zrelým B lymfocytom.

Z toho možno vyvodiť, že fúzny protein BCMA sa môže použiť ako liečivo s klinickým využitím pri 30 ochoreniach spôsobených B lymfocytmi. Medzi tieto ochorenia je možné zahrnúť autoimunitné ochorenia, ako je napríklad systémový lupus erytemathosus, myasténia gravis, autoimunitná hemolytická anémia, idiopatická trombocytopenická purpura, antifosfolipidový syndróm, Chagaove ochorenie, Graveove ochorenie, Wegenerova granulomatóza, nodózna polyarteritída a rýchla progresívna glomeluronefntída. Toto liečivo má tiež využitie pri liečbe ochorení spôsobených plazmatickými bunkami, ako je napríklad mnohonásobný mye35 lóm, Waldenstromova makroglobulinémia, primárna amyloidóza alebo amyloidóza asociovaná s imunocytmi, monoklonálna gamapatia neurčitého významu (MGUS). Liečivo by mohlo nájsť rovnako využitie pri liečbe onkologických ochorení, ako sú karcinómy B buniek, leukémie a lymfómy.

Odborníkom je zrejmé, že sa môžu uskutočniť rôzne modifikácie a variácie v polypeptidoch, kompozíciách a spôsoboch podľa vynálezu bez toho, aby došlo k zmene podstaty vynálezu alebo jeho rozsahu. Všet40 ky takéto modifikácie sú zahrnuté vo vynáleze, ktorého rozsah je daný nasledujúcimi nárokmi.

Zoznam sekvencii <110> Apotech R & D S.A.

Biogen Inc.

<120> Receptor Apríl (BCMA) a jeho použitia <130>

A083PCT <140>

<141>

ešte nepridelené

2000-10-05 <150>

<151>

60/215688

2000-06-30 <150>

<151>

60/181807

2000-02-11 <150>

<151>

60/157933

1999-10-06 <160>

<170>

FascSEQ for Windows Version 4.0 <210>

<211>

<212>

<213>

736 DNA myšia <400>

ccaaacgatg agctgctcca catcggctac cacaaataac aggggtacct gctccactca agaggtgatg tgtacgagtc gactttcaca ccgatgtacc aggtgtcttt aaaacttagc gaattaactc agatttcctt gtcaacacta ccagatttag gggttattgt ctcgagaaaa gccctgcatc tggcaaccag cgggacactg atgggtcagg agaagtatgc catttacatc cttcctccgc gcctta caatttttac caacagaaga aaggggattt ttataaatac gagaacaaaa ttgttccagc tacttaggcg gaatttatct tggtatcccg ctcccgatcc aaggggatat atggaacatf tgcagtttta tgaaacggca cgatgttgct tactattgcc actcattcct taacatcacc tgggagaggc gctctacagt ggaaggacaa tgaccgcgcc catcactgtc cctggggctc ttcgcagcat: caaatcccgg gctttgccat agcattgctg gaggaagatc tccaaggact ctggaggccc caggtcctgt gggagaagag tacaatagcc aaaattccac gcgaaactac cctccgcatt ccgaagctgc tctccaacag ctaaagaaga tgaataaaga ctgacgtgac agggagacac ttcatgatgc aaactctatt gctacagtgc gggcaaacgc gaccggccgc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

736 <210>

<211>

<212>

<213>

736 DNA myšia <400>

ggtttgccac tcgacgaggt cccaaagaaa cagctgtgac gttaaaaacg gttgtcctct acgtcaaaat acttcgccgc aagcgtcgta gttcaaggcc

120 gtagccaatg gtgtttattg tccccataga cgaggtgagt tctccactac acatgctcag ctgaaagtgc ggctacatag tccacagaaa ttttgaatcg cttaattaag agtctaaatc cccaataaca gagctctttt caggacgtag accgttggtc accctgtgac tacccagtcc tcttcatacg gcaaatgtag gaaagaggcg cggaat cccccccaaa aatatctacg ctcttgtttt aacaaggtca atgaatccgc cttaaataga accatagagc gaagactagg ttcccctata taccttgtaa gctacaacga atgataacgg tgagcaaaga atcgtaatgg accctctccg cgagatatca ccttcctgtt actggcacgg acagcgacag ggaccccaaa caaaacggta tcgtaacgac ctccttctag aggttcctga gacctccggg gtccaggaca ccctcttctc atgttatcga ctttaaggcg cactttgata aaaggttgtc gatttcttct acttatttct gactgcactg tccctctgta aagtactaca tttgagataa cgatgtcacg cccgtttgcg ctcgccggcg

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

736 <210> 3 <211> 234 <212> PKT <213> Homo sapiens <400> 3

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

íle

Phe

Thr

Al a

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asr.

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ä— ä

Gin

20

25

30

íle

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

íle

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

3 5

40

45

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

-jČU

Leu

50

55

60

Phe

íle

Asn

Thr

Thr

íle

Ala

Ser

íle

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

65

70

75

80

Ser

Leu

Glu

Lys

Arg

Glu

Gin

Lys

Leu

íle

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

85

90

95

Lys

Glu

Leu

His

Ser

Val

Leu

His

Leu

Val

Pro

Val

Asn

íle

Thr

Ser

100

105

110

Lys

Asp

Ser

Asp

Val

Thr

Glu

Val

Met

Trp

Gin

Pro

Val

Leu

Arg

Arg

115

120

125

Gly

Arg

Gly

Leu

Glu

Ala

Gin

Gly

Asp

íle

Val

Arg

Val

Trp

Asp

Thr

130

135

140

Gly

íle

Tyr

Leu

Leu

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

Phe

His

Asp

Val

Thr

Phe

145

150

155

160

Thr

Met

Gly

Gin

Val

Val

Ser

Arg

Glu

Gly

Gin

Gly

Arg

Arg

Glu

Thr

165

170

175

Leu

Phe

Arg

Cys

íle

Arg

Ser

Met

Pro

Ser

Asp

Pro

Asp

Arg

Ala

Tvr

180

185

190

Asn

Ser

Cys

Tyr

Ser

Ala

Gly

Val

Phe

His

Leu

His

Gin

Gly

Asp

íle

195

200

205

íle

Thr

Val

Lys

íle

Pro

Ara

Ala

Asn

Ala

Lys

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

210

215

220

His

Gly

Thr

Phe

Leu

Gly

Phe

Val

Lys

Leu

225

230

<210> 4 <211> 542 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4

ttaatcaaaa	catggctatc	atccacctca	tcctcctgtt	caccgctgtg	cggggcaatt	60
acaaagacga	tgacaataaa	ggacccggac	aagcgcagcc	gcagaaacag	aagaagcagc	12 0
actctgtcct	gcacctggc c	cccattaacg	ccacctccaa	ggatgactcc	gacgucacag	180
aggtgatgtg	acaaccagct	cttaggcgtg	ggagaggcct	acaggcccaa	ggatatggcg	240
tccgaatcca	ggatgctgga	gtttatctgc	tgtatagcca	ggtcctgttt	caagacgtga	300
ctttcaccat	gggtcaggtg	gtgtctcgag	aaggccaagg	aaggcaggag	actctattcc	360
gatgtataag	aagtatgccc	tcccacccgg	accgggccta	caacagctgc	cacagcgcag	420
gtgtcttcca	tttacaccaa	ggggatattc	tgagtgccat	aattccccgg	gcaagggcga	480
aacttaacct	ctctccacat	ggaaccttcc	tggggtttgt	gaaactgtga	tctagagggc	540
CC						542
<210> 5
<211> 542
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400> 5
aaccagtttt	gtaccgatag	uagatggagt	aggaagacaa	gtgacgacac	gccccczcaa	6 0
tgtttctcct	actgctattt	cttgggcctg	^ccacgtcca	cgtctttgtc	ttsttcgtcg	-.
tgagacagga	cgnggaccaa	gggtaatcgc	ggtggaggtt	cctactgagg	czacaczgzc	lé-I
tccactacac	cgttcgtcga	aaatccgcac	ccEccccaga	tgtccggg	cctataccas	24
aggcttaggt	cc-acgacct	caaacagacg	acata^cagr.	ccaggacaaa	- — s_ cac _
gaaagcggca	cccagtccac	cacagag:-c	trscggttc:	ttccgtcrstc	tgagataagg	J 0
ctacatattc	ttcacacaaa	aoggcgggcc	tgacccggac	gttgtcgacg	a „a'zcgcg^c	ň-.
cacagaaggt	aaaLgcggtt	cccccataag	acrcacagta	cnaagogccc	cgttccogct	4 8.'.
tcgaaccgga	côgaggtcca	ccctggaagg	accccaaaca	cctcgacaz^	agar cccg	54'
ga						54_

<210> 6 <211> 172 <212> PRT <213> Womo sapiens <400* 6

Met

Ala íle

Σ -1 &

Tyr Leu

íle Leu Leu Phe

Tnr

Ala

Val

Arg Gly

Asp

5

10

5

Tyr

Lys Asp

Asd

Asp Asp

Lys

Gly

Pro

Gly

Gin

Val

Gin

Leu

Glr.

Lys

20

25

30

Gin

Lys Ľ-'S

Gin

His Ser

Val

Leu

His

Leu

v& i

p

íle

Asr.

A. la

m’r. v-

35

40

45

Ser

Lvs Asp

Asp

Ser Asp

Val

Thr

Glu

Val

Met

Trp

Glr.

Pro

Leu

50

55

60

Arg

Arg Gly

Arg

G* y Leu

Gin

Ara

Gin

Gly

<T- . v

Gly

Val

Arg

1 \ e

Glr.

65

7C

7 5

8'.

Asp

Ala osy

V Ô »

Tvr Leu

Leu

Tyr

Ser

Gin

V Ô x

Leu

Phe

Glr.

ASD

Oa _

S5

90

93’

Thr

Phe Thr

Met

Gly Gin

Val

Val

Ser

Arg

Glu

Gly

Gin

Glv

.Ara

Glr.

100

105

110

Glu

Thr Leu

Pne

Arg Cys

íle

Arg

Ser

Met

Pro

Ser

Ei s

Pro

A.SP

Arg

115

120

125

Ala

T.-r Asn

Ser

Cys Tyr

Ser

Al a

Gly

Val

P’r.e

His

Leu

His

U j. Γι

Gly

130

135

14 0

Asp

íle Leu

Ser

Val íle

Íle

Pro

Ara

r.lô

Ara

Ala

Lys

Lea

.A S n

Leu

145

150

155

160'

Ser

Pro His

Gly

Tnr Pne

Leu

Gly

phe

Val

Lys

Leu

<210> 7 <211> 555 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgttgcaga tggctgggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gctgcatgct tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgttat tgtaatgcaa gtgtgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cgattctctg gacctgtttg ggactgagcc taataatttc tttggcagtt ttcgtgctaa tgtttttgct aaggaagata agctctgaac cattaaagga cgagtttaaa aacacaggat caggtctcct gggcatggct aacattgacc tggaaaagag caggactggt gatgaaatta ttcttccgag aggcctcgag tacacggtgg aagaatgcac ctgtgaagac tgcatcaaga gcaaaccgaa ggtcgactct gaccattgct ttccactccc agctatggag gaaggcgcaa ccattcttgc caccacgaaa acgaatgacc attgcaagag cctgccagct gctttgagtg ctacggagat agagaaatca atttctgcta ggtaa <210> 8 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens

120

180

240

300

360

420

48C

540

555 <400> 8

Met

Leu

Gin

Met

Ala

Gly

Gin

Cys

Ser

Gin

Asn

Glu

Tyr

Phe

Asp

Ser

1

5

10

15

Leu

Leu

His

Ala

Cys

íle

Pro

Cys

Gin

Leu

Arg

Cys

Ser

Ser

Asr.

Thr

20

25

30

Pro

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

Arg

Tyr

Cys

Asr.

Ala

Ser

Val

Thr

zísn

Ser

35

40

45

Val

Lys

Gly

Thr

Asn

Ala

íle

Leu

Trp

Thr

Cys

Leu

Gly

^eu

Ser

Leu

50

55

60

íle

íle

Ser

Leu

Ala

Val

Phe

Val

.Leu

Met

Phe

Leu

Leu

Arg

Lys

íle

65

70

75

80

Ser

Ser

Glu

Pro

Leu

Lys

Asp

Glu

Phe

Lys

Asn

Thr

Gly

Ser

Glv

Leu

85

90

95'

Leu

Gly

Met

Ala

Asn

íle

Asp

Leu

Glu

Lys

Ser

Arg

Thr

Gly

Asp

Glu

100

105

11Ô

íle

íle

Leu

Pro

Arg

Gly

Leu

Glu

Tyr

Thr

Val

Glu

Glu

Cys

Thr

Cys

115

120

125

Glu

Asp

cys

íle

Lys

Ser

Lys

Pro

Lys

Val

Asp

Ser

Asp

His

Cys

Phe

130

135

140

Pro

Leu

Pro

Ala

Met

Glu

Glu

Gly

Ala

Thr

íle

Leu

Val

Thr

Thr

Lys

145

150

155

160

Thr

Asn

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ser

Leu

Pro

Ala

Ala

Leu

Ser

Ala

Thr

Glu

165

170

175

íle

Glu

Lys

Ser

íle

Ser

Ala

Arg

180

SK 286331 Β6 <210> 9 <211> 483 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gttgaagcta cactggttaa tattaaagaa aatttcctgc cttttctcgt cttacgtgga ggtgagggtc acgttctcgg att <210> 10 <211> 483 <212> DNA <213> Homo <400> 10 caacttcgat gtgaccaatt ataatttctt ttaaaggacg gaaaagagca aaatgcacct ccactcccag tgcaagagcc taa <210> 11 <211> 906 <212> DNA <213> Homo <400> 11 atggagacag gacgtcacga ttgcatgctt cagcgttatt tgcccaccgt aaacccaagg gtgagccacg aatgccaaga ctcaccgtcc 'aaagccctcc ccacaggtgt acctgcctgg cagccggaga ctctacagca tccgtgatgc gggaaa caagaagatt gtcactttcc accgtcaaaa tcaaattttt. cctgaccact cacttctgac gatacctcct acggtcgacg sapiens gttcttctaa cagtgaaagg cggcagtttt agtttaaaaa ggactggtga gtgaagactg ctatggagga tgccagctgc sapiens acacactcct tgttgcagat gcataccttg gtaatgcaag gcccagcacc acaccctcat aagaccctga caaagccgcg tgcaccagga cagcccccat acaccctgcc tcaaaggctt acaactacaa agctcaccgt atgaggctct atgaggagga ttgcttacac gcacgattac gtgtcctagt actttaataa gtagttctcg tccgcgttgg aaactcacga tactcctcct aacgaatgcg cgtgctaatg cacaggatca tgaaattatt catcaagagc aggcgcaacc tttgagtgcc gttatgggtg ggctgggcag tcaacttcga tgtgaccaat tgaactcctg gatctcccgg ggtcaagttc ggaggagcag ctggctgaat cgagaaaacc cccatcccgg ctatcccagc gaccacgcct ggacaagagc gcacaaccac gattgtacag taagagacct aaaaacgatt ccagaggacc gaaggctctc tttggcttcc taagaacagt tgcctctatc ctaacatgtc attc;~tgga tttttgctaa ggtctcctgg cntccgagag aaaccgaagg attcttgtca acggacatag ctgctgctct tgctcccaaa tgttcttcta tcagtgaaag gggggaccgt acccctgagg aactcgtacg tacaacagca ggcaaggagt atcrccaaag gatgagctga gacatcgccg cccgtgttgg aggtggcagc tacacgcaga tcgcaataac ggacaaaccc ccttctattc cgtaccgatt cggagctcat agctgagact ggtgcttttg tctttaatta agcgttattg cctgtttgcg ggaagataag gcatggctaa gcctcgagta tcgactctga ccacgaaaac agaaatcaat gggttccagg atgaatattt atactcctcc gagtcgacaa cagtcttcct tcacatgcgt tggacgacgt cgtaccgtgt acaagtgcaa ccaaagggca ccaagaacca tggagtggga actccgacgg aggggaacgt agagcctctc attacgttca tgactcgaat gagacttggt gtaactggac gtgccacctt ggtaacgaaa cttactgata aagacgatcc

120

180

240

300

360

420

480

483 taatgcaagt actgagctta ctctgaacca cattgacctg cacggtggaa ccaecgcttr gaacgactat ttctgctagg

12Ú 180 240 300 360 4 2 0 480 4S3 ttccactggt cgacagtttg tctaacatgt aactcacaca cttcccccca ggtggtggac ggaggtgcat ggtcagcgtc ggtctccaac gccccgagaa ggtcagcctg aagcaatgga ctccttcttc cttctcatgc cctgtctccc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

906 <210> 12 <211> 302 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Met

Glu

Thr

Asp

Thr

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Pro

1

5

10

15

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Val

Thr

Met

Leu

Gin

Met

Ala

Gly

Gin

Cys

Ser

20

25

30

Gin

Asn

Glu

Tyr

Phe

Asp

Ser

Leu

Leu

His

Ala

Cys

íle

Pro

Cys

Gin

35

40

45

Leu

Arg

Cys

Ser

Ser

Asn

Thr

Pro

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

Arg

Tyr

Cys

50

55

60

Asn

Ala

Ser

Val

Thr

Asn

Ser

Val

Lys

Gly

Val

Asp

Lys

Thr

His

Thr

65

70

75

80

Cys

Pro

Pro Cys

Pro Ala 85

Pro

Glu Leu Leu 90

Gly

Gly

Pro

Ser

val 95

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Mec

íle

Ser

Arg

Thr

Pro

100

105

110

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asd

Pro

Glu

Val

115

120

125

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

130

135

140

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Glr.

Tyr

Asn

Ser

CT.r

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

145

150

155

160

Leu

Thr

Val

Leu

His

Glr.

A.sp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

165

170

175

Lys

Val

Ser

Asr.

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

íle

Glu

Lys

Thr

íle

Ser

180

185

190

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

φ·„ „

Leu

pro

Pro

195

200

205

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

210

215

220

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

íle

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

225

230

235

240

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

245

250

255

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

260

265

270

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

275

280

285

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

dy

Lys

290

295

300

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie a) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je i) aspoň z 80 % identická so sekvenciou vyjadrenou pre aminokyselinu 1 až aminokyselinu 184 zo sekvencie SEQ ID NO:8 a ii) schopná viazať APRÍL; b) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je i) aspoň z 80 % identická so sekvenciou vyjadrenou pre aminokyselinu 1 až aminokyselinu 52 zo sekvencie SEQ ID NO:8 a ii) schopná viazať APRÍL; c) polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu, vyjadrenú pre aminokyselinu 8 až aminokyselinu 41 zo sekvencie SEQ ID NO:8; alebo d) protilátky namierené proti SEQ ID NO:8 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie nádorovej bunky, ktorá exprimuje ligand indukujúci proliferáciu (APRÍL).
2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde polypeptid (a), (b) alebo (c) ďalej obsahuje Fc doménu sekretovaného proteínu.
3. 3. Použitie podľa nároku 2, kde polypeptid (a), (b) alebo (c) ďalej obsahuje Fc doménu imunoglobulínu.
4. 4. Použitie podľa nároku 3, kde imunoglobulínomje IgG.
5. 5. Použitie podľa nároku 4, kde imunoglobulínomje ľudský imunoglobulín.
6. 6. Použitie podľa nároku 5, kde polypeptid ďalej obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 12.
7. 7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde nádorovou bunkou je karcinóm.
8. 8. Použitie podľa nároku 7, kde karcinóm je vybratý zo skupiny obsahujúcej pľúcny karcinóm, karcinóm hrubého čreva, karcinóm prostaty a karcinóm prsníka.
9. 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde nádorová bunka je u cicavca.
10. 10. Použitie podľa nároku 9, kde cicavcom je človek.