EA005411B1 - Применение антитела против полипептида april для получения лекарственного препарата для лечения опухолей - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению антитела, специфично связывающегося с полипептидом индуцирующего пролиферацию лиганда (APRIL) SEQ ID NO: 2 или его растворимым фрагментом и препятствующего связыванию полипептида лиганда APRIL и полипептида рецептора APRIL, для получения лекарственного препарата для лечения, подавления или изменения роста опухолевой клетки, лечения злокачественной опухоли или лечения гиперплазии.

Description

Предпосылки к созданию изобретения

Настоящее изобретение относится к новому лиганду и полипептидам, которые являются членами семейства факторов некроза опухоли. Сокращенно этот новый лиганд обозначается как Лргй, от А РгоШёгабои Шбисшд Ыдаиб (Лиганд, индуцирующий пролиферацию). Эти белки или их рецепторы могут найти применение в качестве противоопухолевой и/или иммунорегулирующей терапии. Помимо этого, клетки, трансфицированные генами этих новых лигандов, могут применяться для генной терапии опухолей, аутоиммунных и воспалительных заболеваний или наследственных генетических нарушений, а блокирующие эти белки антитела могут применяться в качестве иммунорегуляторов.

Цитокины, относящиеся к факторам некроза опухоли (ΤΝΡ), представляют из себя медиаторы защиты и иммунной регуляции организма. Члены этого семейства прикреплены к мембранам, действуя локально путем прямого контакта клеток, или существуют в форме секретируемых белков, способных диффундировать к более отдаленным мишеням. Параллельное семейство рецепторов сигнализирует о наличии этих молекул, что приводит к инициации гибели клеток или пролиферации и дифференцировке клеток в ткани-мишени. В настоящее время в семейство лигандов и рецепторов ΤΝΡ входит, по меньшей мере, 13 установленных пар рецептор-лиганд, включая ΤΝΡ:ΤΝΡ-Ε; ΤΤ-α:ΤΝΡ-Β; ЬТ-α/β: ЬТ-β-Κ.; Ра8Ь:Ра8; ΟΌ40Ε:ΟΌ40; ΟΌ30Ε:ΟΌ30; ΟΌ27Ε:ΟΌ27; ОХ40Ь:ОХ40 и 4-1ВВЬ:4-1ВВ; 1гаисе/гаикЬ:Ь1§Ы апб Τ\\ό;·ι1<. Последовательности ДНК, кодирующие эти лиганды, идентичны только приблизительно на 25-30% даже в наиболее родственных случаях, хотя родство по аминокислотам составляет около 50%.

Определяющий признак этого семейства цитокиновых рецепторов обнаружен во внеклеточном домене, богатом цистеином, который был первоначально обнаружен путем молекулярного клонирования двух отличающихся друг от друга рецепторов ΤΝΡ.¹ Это семейство генов кодирует гликопротеины, характерные для трансмембранных белков типа I, имеющих внеклеточный домен для связывания с лигандом, единственный мембранный перекрывающий участок и цитоплазматический участок, участвующий в активировании клеточных функций. Этот участок связывания с лигандом, богатый цистеином, представляет из себя прочно связанный дисульфидным мостиком сердцевинный домен, который, в зависимости от конкретного члена семейства, многократно повторяется. Большинство рецепторов имеют четыре домена, хотя их может быть всего три или целых шесть.

Белки из семейства лигандов ΤΝΡ имеют короткую Ν-концевую последовательность обычно коротких гидрофильных аминокислот, часто содержащую несколько остатков лизина или аргинина, которые, как предполагают, служат последовательностями, останавливающими передачу. Далее следует трансмембранный участок и внеклеточный участок различной длины, который отделяет С-концевой домен связывания рецептора от мембраны. Этот участок иногда называют стеблем. С-концевой участок связывания включает массив белка и часто, но не всегда, сайты гликозилирования. У этих генов нет классической характеристики сигнальных последовательностей мембранных белков типа I, мембранных белков типа II с С-концевым доменом, лежащим снаружи клетки, и короткого Ν-концевого участка, который располагается в цитоплазме. В некоторых случаях, например, ΤΝΡ и ΕΤ-α. расщепление в районе стебля может наблюдаться на ранних стадиях преобразований белка, и лиганд затем обнаруживается главным образом в секретированной форме. Большинство лигандов, однако, существует в мембранной форме, опосредуя локализованное прохождение сигнала.

Структура этих лигандов хорошо известна благодаря кристаллографическим анализам ΤΝΡ, ΕΤ-α и СО40Б. ΤΝΡ и лимфотоксин-α (Ы-α) оба построены по типу сандвича, состоящего из двух антипараллельных листков со складкой типа β и топологией типа )с11у го11 или греческий ключ¹¹. Среднеквадратичное отклонение между остатками Сα, и β составляет 0,61 С, что предполагает высокую степень идентичности их молекулярного строения. Структурной чертой, установленной в результате молекулярных исследований СП40Ь, ΤΝΡ и ΕΤ-α, является их склонность объединяться в олигомерные комплексы. Олигомерной структуре присуще формирование сайта связывания с рецепторами в месте соединения между соседними субъединицами, образующими мультивалентный лиганд. По результатам анализа кристаллической структуры было установлено, что четвертичные структуры ΤΝΡ, СО40Б и ΕΤ-α существуют в форме тримеров. Многие аминокислоты, сохраняющиеся между различными лигандами, находятся в последовательностях составляющего основу β-листка. Вероятно, основная структура типа сандвича сохраняется во всех этих молекулах, поскольку части этих основных последовательностей сохраняются у различных членов семейства. Четвертичная структура также может поддерживаться, поскольку взаимное расположение субъединиц, как представляется, остается идентичным.

Члены семейства ΤΝΡ можно наиболее удачно охарактеризовать как главные переключатели в иммунной системе, контролирующей как выживание, так и дифференцировку клеток. Только ΤΝΡ и ΕΤ-α в настоящее время считаются секретируемыми цитокинами, в противоположность другим членам семейства ΤΝΡ, которые преимущественно прикреплены к мембранам. В то время как мембранная форма ΤΝΡ хорошо описана и, вероятно, играет уникальные биологические роли, секретируемые ΤΝΡ функционируют как главный сигнал тревоги для клеток, которые более отдалены от места пускового события. Таким образом, секреция ΤΝΡ может усиливать процессы, приводящие к хорошо описанным изменениям в выстилке сосудов и воспалительном состоянии клеток. Напротив, привязанные к мембранам члены этого

- 1 005411 семейства посылают сигналы через рецепторы типа ΤΝΓ только клеткам, находящимся в прямом контакте. Например, Т-клетки обеспечивают СЭ40-опосредованную помощь только В-клеткам, находящимся в прямом контакте через известные взаимодействия ТСН. Сходные ограничения способности индуцировать гибель клеток в силу контакта клетка-клетка относятся и к хорошо изученной системе Гак.

Представляется возможным разделение лигандов ΤΝΕ на три группы по признаку их способности индуцировать гибель клеток. Во-первых, ΤΝΕ, лиганд Гак и ΤΚΑΙΕ могут эффективно индуцировать гибель клеток многих линий, а их рецепторы, наиболее вероятно, имеют хорошие классические домены гибели. Предположительно, лиганд к ΌΚ-3 (ΤΚΑΜΡ/Ψ8Ε-1) также целиком подпадает под эту категорию. Далее, существуют лиганды, которые запускают более слабый сигнал гибели, который ограничивается несколькими типами клеток, и Τ\νΕΛΚ. лиганд СЭ30. а также Б-Ταΐ β2 являются примерами этого класса. Каким образом эта группа может запускать гибель клеток в отсутствие классического домена гибели представляет из себя интересную проблему и предполагает, что существует особый механизм более слабого сигнала клеточной гибели. И наконец, существуют члены семейства, которые не могут эффективно передавать сигнал гибели. Возможно, все эти группы могут обладать антипролиферативным действием на некоторые типы клеток после индуцирования клеточной дифференцировки, например, СЭ40 (Гипакокй1 е! а1., 1994).

За последние несколько лет численность семейства ΤΝΕ резко возросла и охватывает по меньшей мере 11 разных путей прохождения сигналов, участвующих в регуляции иммунной системы. Широко распространенная экспрессия ΤνΕΑΚ и ΤΚΑΙΕ свидетельствует о существовании еще не открытого функционального многообразия этого семейства. Этот аспект недавно был освещен особо в связи с открытием двух рецепторов, влияющих на способность вирусов саркомы Рауса и простого герпеса реплицировать, а также в связи с историческими наблюдениями, касающимися того факта, что ΤΝΕ обладает противовирусной активностью, а поксвирусы кодируют ловушку рецепторов ΤΝΕ (Вго_)а!ксй е! а1., 1996; Моп!дотегу е! а1., 1996; 8шйй, 1994; Уаккай, 1992). ΤΝΕ является медиатором септического шока и кахексии¹¹¹ и участвует в регуляции развития клеток гемопоэза.¹’ Представляется, что он играет главную роль в качестве медиатора воспаления и защиты от бактериальных, вирусных и паразитарных инфекций’, а также обладает противоопухолевой активностью.’¹ ΤΝΕ также участвует в различных аутоиммунных заболеваниях.’ ΤΝΕ может вырабатываться несколькими типами клеток, включая макрофаги, фибробласты, Т-клетки и натуральные киллеры.’¹ ΤΝΕ связывается с двумя различными рецепторами, каждый из которых действует через посредство специфичных внутриклеточных сигнальных молекул, что приводит к проявлению различных эффектов ΤΝΕ.^1Χ ΤΝΕ может существовать как в мембраносвязанной форме, так и в форме растворимого секретируемого цитокина.^х

ΕΤ-α имеет много общих с ΤΝΕ свойств, например, связывается с рецепторами ΤΝΕ^Χ1, но в отличие от ΤΝΕ, как представляется, секретируется преимущественно активированными Т-клетками и некоторыми β-лимфобластоидными опухолями.™ Гетеромерный комплекс ΕΤ-α и ΕΤ-β представляет из себя мембраносвязанный комплекс, который связывается с рецептором ΕΤ-β.^Χιη Система ΕΤ (ΕΤ и ΕΤ-Κ), как представляется, участвует в развитии периферических лимфоидных органов, поскольку генетический разрыв ΕΤ-β приводит к дезорганизации Т- и В-клеток в селезенке и их отсутствию в лимфатических узлах”’ Система ΕΤ-β участвует также в гибели клеток некоторых линий клеток аденокарциномы™

Гак-Ь, другой член семейства ΤΝΓ, экспрессируется преимущественно активированными Тклетками™¹ Он индуцирует гибель клеток, которые несут его рецептор, включая опухолевые клетки и клетки, инфицированные ВИЧ, посредством механизма, известного как запрограммированная смерть клетки, или апоптоз.™ Помимо этого, дефицит как Гак, так и Гак-Ь может приводить к лимфопролиферативным нарушениям, что подтверждает роль системы Гак в регуляции иммунных ответов.™¹ Система Гак участвует также в повреждении печени при хроническом инфекционном гепатите^Х1Х и в аутоиммунитете у ВИЧ-инфицированных пациентов.^хх Система Гак участвует также в разрушении Т-клеток у ВИЧинфицированных пациентов™¹ ΤΚΆΙΕ, другой член этого семейства, также, как представляется, участвует в гибели широкого ряда трансформированных клеточных линий различного происхождения™

ί.Ό40-Ε другой член семейства ΤΝΕ экспрессируется Т-клетками и индуцирует регуляцию Вклеток, несущих СЭ40.^ХХ| Помимо этого, изменения в гене СЭ40-Ь приводят к заболеванию, известному как Х-связанный гипер-1дМ синдром™¹’ Система СЭ40-Ь также участвует в различных аутоиммунных заболеваниях™’, а СП40-Ь, как известно, обладает противовирусными свойствами.™’¹ Несмотря на то, что система С.'Э40-Ь участвует в спасении апоптотических В-клеток,^ХХ’^п в неиммунных клетках он индуцирует апоптоз ™’^ш Многие дополнительные лимфоцитарные члены семейства З^Г также участвуют в костимуляции ™^к

В общем, члены семейства З^Г играют фундаментальные регуляторные роли при контролировании иммунной системы и активировании систем экстренной защиты хозяина. Признавая имеющийся в настоящее время прогресс в манипулировании членами семейства Τ№ с точки зрения терапевтических преимуществ, считают весьма вероятным, что члены этого семейства могут предоставить уникальное средство борьбы с болезнями. Некоторые из лигандов из этого семейства могут прямо индуцировать апоптотическую гибель многих трансформированных клеток, например, ΕΤ, ЮТ, лиганд Гак и ΤΚΙΑΕ

- 2 005411 (Нада1а, 1997). Активация рецепторов Еа§ и, возможно, ΤΝΡ и СЭ30. может индуцировать гибель нетрансформированных лимфоцитов, что может выполнять определенную иммунорегулирующую функцию (Ашакауа е! а1., 1996; №ща1а. 1997; 8у1\\и е! а1., 1996; е! а1., 1995). В целом, процесс гибели запускает агрегация доменов гибели, которые располагаются на рецепторах ΤΝΕ со стороны цитоплазмы. Домен смерти координирует согласованное действие различных преобразователей сигнала, что приводит к активации каскада каспазы Щада!а, 1997). У некоторых рецепторов нет классических доменов гибели, например, рецептор ЬТЬ и СЭ30 (Вго^шпд е! а1., 1996; Ьее е! а1., 1996) еще могут индуцировать клеточную гибель, хотя и в более слабой степени. Возможно, эти рецепторы работают, прежде всего, для индуцирования дифференцировки клеток, а гибель является аберрантным последствием в некоторых трансформированных клеточных линиях, хотя эта картина неясна, поскольку исследования на мышах, не имеющих СЭ30, предполагают роль клеточной гибели в отрицательной селекции в тимусе (Ашакага е! а1., 1996). Наоборот, для выживания клеток необходимо прохождение сигнала через другие пути, такие как ί.Ό40. Таким образом, существует потребность идентифицировать и изучить свойства других молекул, являющихся членами семейства ΤΝΤ, для того, чтобы получить дополнительное средство для контроля заболеваний и управления иммунной системой.

Было высказано предположение о том, что определенные члены семейства ΤΝΡ могут иметь преимущества в качестве терапевтических противоопухолевых агентов, например, в комбинации с 1Ь-2 (см., например, патент США № 5 425 940). Однако, в настоящее время не существует полностью удовлетворительного лечения злокачественных опухолей. Комбинированная химиотерапия широко применяется в клинике и в исследованиях, например, антиметаболиты, алкилирующие агенты, антибиотики, системные яды и т. п. Такие лекарственные средства вводят по отдельности или в комбинации, в попытке получить цитотоксический эффект в отношении злокачественных опухолей и/или сократить или устранить появление клеток, резистентных к лекарствам, а также сократить побочные эффекты.

Сущность изобретения

Соответственно, настоящее изобретение относится к новому полипептиду, называемому АРК.1Ь, который практически не имеет одной или более проблем, связанных с ограничениями и недостатками прототипов. Авторы настоящего изобретения открыли новый член семейства цитокинов ΤΝΡ и определили аминокислотную последовательность этого белка как у мыши, так и у человека, а также последовательности ДНК, кодирующие эти белки. Заявляемое изобретение может применяться для идентификации новых диагностических и терапевтических средств для лечения многочисленных заболеваний и состояний, как обсуждается более подробно ниже, а также для получения информации и управления иммунной системой и ее процессами. Помимо этого, настоящее изобретение может участвовать в индуцировании клеточной гибели в злокачественных опухолях.

Дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут перечислены в описании ниже, и частично будут понятны из этого описания или могут изучаться при практическом осуществлении настоящего изобретения. Цели и другие преимущества настоящего изобретения будут реализованы и достигнуты с помощью композиций и способов, конкретно указанных в описании и формуле изобретения настоящего документа, а также с помощью прилагаемых рисунков.

Таким образом, для достижения этих и других преимуществ, и в соответствии с целью настоящего изобретения, как это осуществлено и подробно описано в настоящем документе, настоящее изобретение включает последовательности ДНК, кодирующие АРКШ Конкретно, настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим АРК.1Ь человека (8ЕЦ ΙΌ N0: 1). Помимо этого, заявленное изобретение относится к аминокислотным последовательностям этого нового лиганда. Аминокислотная последовательность АРК.1Ь человека описана в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. Кроме того, авторы настоящего изобретения представили в настоящем документе последовательности ДНК и аминокислот для АРК.1Ь мыши, в 8Е0 ΙΌ N0: 3 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, соответственно. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательностям, которые по меньшей мере на 50% гомологичны последовательностям ДНК, кодирующим С-концевой связывающий рецептор домен этого лиганда, и при гибридизации с заявленными последовательностями ДНК или их фрагментами, и которые кодируют АРК.1Ц имеющий последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0: 1, или белок, обладающий аналогичной биологической активностью.

Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления относится к последовательностям ДНК, кодирующим АРШЦ в которых эти последовательности оперативно связаны с последовательностью контроля экспрессии. Любые последовательности контроля экспрессии пригодны для использования в заявленном изобретении и легко могут быть подобраны специалистом.

Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные ДНК, включающие последовательность, кодирующую АРШБ или его фрагменты, а также хозяев со стабильно интегрированными последовательностями АРМЬ, внедренными в их геном, или обладающих эписомальными элементами. Любой подходящий хозяин пригоден для использования в заявленном изобретении и легко может быть выбран специалистом без ненужного экспериментирования.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения практически чистых АРШБ, которые включают этап культивирования трансформированных хозяев. Еще в

- 3 005411 одних вариантах осуществления настоящее изобретение относится к АРКББ, практически не содержащему обычно связанных с ним животных белков.

Настоящее изобретение охватывает лиганды АРКББ, имеющие аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 2, а также их фрагменты или гомологи. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотные и/или ДНК последовательности могут включать консервативные вставки, делеции и замещения, как дополнительно определяется ниже, или могут включать фрагменты указанных последовательностей.

Настоящее изобретение относится в других вариантах осуществления к растворимым конструкциям, включающим АРКББ, которые могут применяться для непосредственного запуска опосредованных АРКББ фармакологических событий. Такие события могут иметь терапевтические преимущества при стимуляции роста, лечении злокачественных и иных опухолей или для управления иммунной системой с целью лечения заболеваний иммунной природы. Растворимые формы заявленных лигандов могут быть методами генной инженерии помечены любой легко распознаваемой меткой, что облегчает выявление рецепторов этих лигандов.

Помимо этого, некоторые варианты осуществления относятся к антителам против АРКББ и их применению для лечения злокачественных и иных опухолей или для управления иммунной системой с целью лечения заболеваний иммунной природы.

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам генной терапии с помощью генов ЛРШЬ, как описано и заявлено в настоящем документе.

Фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут, необязательно, включать фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, наполнители или другие фармацевтические композиции и могут вводиться в любой из многочисленных форм или с помощью любого пути, известных специалистам.

Следует понимать, что как приведенное общее описание, так и следующее ниже подробное описание представляют из себя примеры и служат для объяснения заявленного изобретения.

Прилагаемые рисунки включены в это описание для облегчения понимания настоящего изобретения в качестве составной части, иллюстрируют несколько вариантов осуществления настоящего изобретения и вместе с описанием служат для объяснения главных положений настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. (А) Предсказанная аминокислотная последовательность АРКББ человека. Обозначены: предсказанный трансмембранный участок (ТМ, в рамке), потенциальный Ν-связанный сайт гликозилирования (звездочка) и Ν-конец рекомбинантного растворимого АРК1Б (ААРК1Б). (В) Сравнение внеклеточной белковой последовательности АРКББ и некоторых членов семейства лигандов ΤΝΕ Идентичные и гомологичные остатки изображены в черном цвете и в заштрихованной рамке, соответственно. ΤΝ1;ι (фактор некроза опухолей-α), ЬТа (лимфотоксин-α), ЕакБ (лиганд Раз (ΟΌ95)), ТКА1Б. Т№ЕАК, ТКАЖ.’Е (лиганд КАА'К).

Фиг. 2. Экспрессия АРК1Б (А) Нозерн-блоттинг (2 мкг поли А⁺ РНК на образец) различных тканей человека проводился с кДНК АРКББ. (В) Экспрессия мРНК АРКББ в различных линиях опухолевых клеток: промиелоцитного лейкоза НЬ 60; НеЬа Се11 83; хронического миелолейкоза К562; лимфобластного лейкоза Мо1!-4; лимфомы Беркитта Кар; колоректальной аденокарциномы А459; меланомы 0361. (С) Экспрессия мРНК АРК1Ь в четырех различных опухолях (Т) и нормальных тканях (Ν) человека. Полоса 188 рРНК показывает равную загрузку. (Ό) Экспрессия мРНК АРК1Ь в первичном раке толстого кишечника человека. Гибридизация ίη δίΐιι обнаружила избыточное присутствие АРК1Ь при раке толстого кишечника человека по сравнению с нормальной тканью толстого кишечника. Срезы опухолевой ткани и прилегающая к ней нормальная ткань толстого кишечника были подвергнуты гибридизации на античувствительность к ³⁵8-меченной рРНК АРК1Ь и, в качестве контроля, срезы опухолевой ткани толстого кишечника были подвергнуты гибридизации на чувствительность к ³⁵8-меченной рРНК АРКГО (отрицательный контроль). Верхние панели представляют микрофотографии в темном поле, а нижние панели представляют микрофотографии в освещенном поле.

Фиг. 3. АРКГО стимулирует рост клеток. (А) Дозозависимое усиление пролиферации 1игка! лейкозных (Т-клеток человека), определенное через 24 ч после добавления растворимого АРКГО. Контролями являются лиганд Еа§ (Еа&Б), Т№ЕАК и отсутствие лиганда (Контроль) (левая панель, жизнеспособность клеток; правая панель, инкорпорация ³Н-тимидина). (В) Влияние иммунного истощения ЕБАСмеченного АРКГО на рост опухолевых клеток. Пролиферативный эффект ЕЬАО-меченного АРКГО нейтрализован анти-ЕЕАО антителами, но не анти-тус антителами. (С) Влияние АРКГО на скорость пролиферации Ка_р (В-клеток лимфомы Беркитта человека), А20 (мышиная В-лимфома), В1АВ (В-лимфома человека), С08 (эпителиальные клетки собаки), МСЕ-7 (аденокарцинома молочной железы человека), НеЬа (эпителиоидная карцинома человека) и МЕ260 (меланома человека). (Ό) Влияние концентрации сыворотки плода коровы на индуцированную АРКГО пролиферацию клеток ЛикаБ

Фиг. 4. АРКГО ускоряет рост опухоли. (А) Характеристика АРКГО-трансфицированных клонов ΝΙΉ3Т3. Уровни ЕБАС-АРК1Б в различных клонах анализировали с помощью вестерн-блоттинга с антиЕБАО антителами. Стрелка показывает на белок АРКББ, этот высокомолекулярный белок выявлен не

- 4 005411 специфическим образом. (В) Клоны ΝΙΗ-3Τ3, экспрессирующие АРШЬ, растут быстрее клонов, трансфицированных тоск. (С) Повышенный опухолевый рост клонов ΝΙΗ-3Τ3, экспрессирующих АРРТЬ. Клетки ΝΙΗ-3Τ3 (1х10⁵ клеток) и трансфектанты АРШЬ (ΝΙΗ-АР, 2 различных клона) (1х10⁶ клеток) инъецировали подкожно бестимусным мышам, и следили за ростом опухоли.

Фиг. 5. Приводятся аминокислотные последовательности АРК1Ь человека и мыши; показана существенная идентичность этих двух белков. Идентичные остатки обозначены точками поверх знаков. Подчеркнутые остатки представляют потенциальный Ν-связанный сайт гликозилирования. Начальный метионин считается вероятным стартовым сайтом, однако, возможно, что в рамке метионины, расположенные далее в последовательности, могут служить истинным стартовым сайтом, например, в последовательности человека.

Подробное описание

Ниже подробно рассматриваются предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, которые кодируют АРК1Ь человека или мыши, его фрагменты и гомологи, и к экспрессии этих последовательностей ДНК хозяином, трансформированным с их помощью. Настоящее изобретение относится к применению этих последовательностей ДНК и пептидам, которые ими кодируются. Помимо этого, настоящее изобретение охватывает аминокислотные последовательности АРРТЬ или его фрагментов у человека и мыши, а также фармацевтические композиции, включающие их или полученные из них. Настоящее изобретение относится к способам стимуляции клеточного роста с помощью АРШЬ или, альтернативно, к способам ингибирования опухолеобразования с помощью антител против АРК1Ь или рецепторов АРРТЬ.

А. Определения.

Термин гомологичная используется в настоящем документе для обозначения сходства между последовательностями сравниваемых молекул. Если позиция в двух сравниваемых последовательностях занимает один и тот же основный или аминокислотный мономер, например, если позиция в каждой из двух молекул ДНК занята аденином, то эти молекулы являются гомологичными по этой позиции. Процент гомологичности двух последовательностей представляет из себя функцию от числа пар или гомологичных позиций, общих для двух последовательностей, разделенного на число сравниваемых позиций х

100. Например, если 6 из 10 позиций в двух последовательностях парные или гомологичные, то эти две последовательности гомологичны на 60%. Например, последовательности ДНК АТТОСС и ТАТООС гомологичны на 50%. Обычно сравнение производят при выравнивании двух последовательностей, чтобы получить максимальную гомологичность.

Используемый в настоящем документе термин злокачественная опухоль относится к любому неопластическому процессу, включая такие заболевания клеток как, например, рак почки, саркома Калоши, хронический лейкоз, рак молочной железы, саркома, рак яичников, рак прямой кишки, рак горла, меланома, рак толстого кишечника, рак мочевого пузыря, мастоцитома, рак легкого, аденокарцинома молочной железы, плоскоклеточный рак глотки и гастроинтестинальный рак или рак желудка. Предпочтительно, злокачественная опухоль представляет лейкоз, мастоцитому, меланому, лимфому, аденокарциному молочной железы и плоскоклеточный рак глотки.

Очищенный препарат или практически чистый препарат полипептида в настоящем документе означает полипептид, который был отделен от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми он обычно встречается. Предпочтительно, полипептид также отделен и от других веществ, например, антител, матриц и т.п., которые применяются при его очистке.

Трансформированный хозяин в настоящем документе обозначает любого хозяина со стабильно интегрированной последовательностью, т.е., последовательностью, кодирующей АРРТЬ, внедренной в его геном.

Лечение в настоящем документе означает любое лечебное воздействие, например, введение терапевтического агента или вещества, например, лекарственного средства.

Практически чистая нуклеиновая кислота, например, практически чистая ДНК, представляет из себя нуклеиновую кислоту, обладающую одним из двух следующих качеств или ими обоими: (1) не соприкасается непосредственно с одной или обеими последовательностями, например, кодирующими последовательностями, с которыми она непосредственно соприкасается (т.е., одна на конце 5’ и одна на конце 3') в естественном геноме организма, из которого эта нуклеиновая кислота получена; (2) практически не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она встречается в организме, из которого эта нуклеиновая кислота получена. Этот термин включает, например, рекомбинантную ДНК, которую инкорпорируют в вектор, например, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует в виде отдельной молекулы (например, фрагмент кДНК или геномной ДНК, полученные с помощью ПЦР или методики рестрикции эндонуклеазы), не зависимой от других последовательностей ДНК. Практически чистая ДНК включает также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего АРРТЬ.

Термин пептиды, белки и полипептиды в настоящем документе используются взаимозаменяемым образом.

- 5 005411

Биологически активный в настоящем документе означает имеющий ίη νΐνο или ίη νίίτο активность, которая может осуществляться прямо или косвенно. Биологически активные фрагменты АРК1Ь могут иметь, например, 70% гомологичность по аминокислотному составу с активным сайтом ЛРК1Ь, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90% гомологичность. Идентичность или гомологичность применительно к АРК1Ь, как определено в настоящем документе, представляет из себя процентную долю аминокислотных остатков в последовательностикандидате, которые идентичны этим остаткам в АРК1Б 8ЕО ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 4.

Лиганд в настоящем документе целиком относится к АРШЬ. Практика настоящего изобретения применяет, если не указано иное, обычные методики клеточной биологии, клеточных культур, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые находятся в компетенции специалистов в этих областях. Такие методики описаны в научной литературе.

Введение.

ЛРК1Ь, новый член семейства ΤΝΕ, подробно описан в настоящем документе. Авторы настоящего изобретения установили, что транскрипция АРШЬ в нормальных тканях находится на низком уровне, в то время как в нескольких линиях опухолевых клеток, а также раковых опухолях толстого кишечника, метастатических лимфомах и опухолях щитовидной железы находят высокие уровни мРНК. Ιη νίίτο добавление рекомбинантного АРК1Ь стимулирует пролиферацию различных клеточных линий. Более того, трансфекция АРК1Ь в клетки ΝΙΗ-3Τ3 резко ускоряет рост опухоли у бестимусных мышей при сравнении с трансфектантами тоск. Экспрессия и стимулирующий рост эффект АРК1Ь в отношении опухолевых клеток ίη νίίτο и ίη νΐνο предполагают, что АРШЬ участвует в опухолеобразовании.

АРК1Ь, как представляется, является уникальным среди членов семейства ΤΝΕ, поскольку он экспрессируется в опухолевых клетках в избыточном количестве и стимулирует рост многих различных линий опухолевых клеток, что свидетельствует о его очевидной роли в опухолеобразовании; антагонистические антитела против АРШЬ или рецепторов АРШЬ могут создать новые подходы к лечению рака.

В. Последовательности ДНК по настоящему изобретению.

Как описано в настоящем документе, одним из аспектов настоящего изобретения является практически чистая нуклеиновая кислота, которая включает нуклеотидную последовательность, кодирующую АРК1Ь, такая как ДНК, описанная в последовательности 8Е0 ГО N0: 1, и/или эквиваленты таких нуклеиновых кислот. Используемый в настоящем документе термин нуклеиновая кислота может включать фрагменты и эквиваленты, такие как, например, последовательности, кодирующие функционально эквивалентные пептиды. Эквивалентные последовательности нуклеотидов могут включать последовательности, которые отличаются по одному или более нуклеотидных заместителей, добавлений или делеций, такие как аллельные варианты, мутации и т.п. и включают последовательности, которые отличаются от нуклеотидной последовательности, кодирующей АРК1Ь, которая представлена последовательностью 8Е0 ГО N0: 1, в силу вырожденности генетического кода.

Настоящее изобретение будет описано преимущественно относительно последовательностей человека, хотя опытный специалист поймет, что последовательности мыши или последовательности, кодирующие АРШЬ, других видов животных, обладающих высокой степенью гомологичности в отношении человека, также попадают в объем настоящего изобретения. Как представляется, человеческие белки обладают всеми характеристиками семейства Т№, т.е. организацией мембранного белка типа II и сохранением основных мотивов последовательностей, участвующих в укладке белка в свойственную Т№ антипараллельную структуру, состоящую из β-листков.

Последовательности по настоящему изобретению могут использоваться для изготовления серий ДНК-зондов, которые пригодны для скрининга различных коллекций нативных и синтетических ДНК на предмет наличия последовательностей ДНК, которые являются близкородственными к АРК1Ь или его фрагментам или производным. Опытный специалист поймет, что упоминание АРК1Ь в настоящем документе относится также к его биологически активным производным, фрагментам или гомологам.

Последовательности ДНК по настоящему изобретению, кодирующие АРИШ. могут применяться для изготовления заявленных пептидов путем экспрессии их в различных прокариотических и эукариотических хозяевах, трансформированных ими. Эти пептиды могут применяться в качестве противоопухолевых и иммунорегулирующих агентов. В общем, этот процесс включает этапы культивирования хозяина, трансформированного молекулой ДНК, содержащей последовательность, кодирующую АРК1Ь, оперативно связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию.

Последовательности ДНК и молекулы рекомбинантной ДНК по настоящему изобретению могут экспрессироваться с использованием большого разнообразия комбинаций хозяин/вектор. Например, подходящие векторы могут состоять из сегментов хромосомных, нехромосомных или синтетических последовательностей ДНК. Экспрессирующие векторы по настоящему изобретению характеризуются по меньшей мере одной последовательностью, контролирующей экспрессию, которая может быть оперативно связана с последовательностью ДНК АРШЬ, вставленной в вектор, с целью контроля и регуляции экспрессии последовательности ДНК.

Помимо этого, в каждом экспрессирующем векторе могут быть выбраны различные сайты для вставки в последовательность по настоящему изобретению. Эти сайты обычно определяются путем рест

- 6 005411 рикции эндонуклеазой, которая их разрезает, и эти сайты и эндонуклеазы также известны специалистам. Следует, разумеется, понимать, что экпрессирующий вектор, пригодный для настоящего изобретения, не нуждается в сайте рестрикции эндонуклеазы для вставки в желаемый фрагмент ДНК. Вместо этого вектор может быть клонирован в этот фрагмент альтернативными средствами. Экспрессирующий вектор и, в частности, сайт, выбранный в нем для вставки выбранного фрагмента ДНК, и его оперативное связывание с последовательностью контроля экспрессии, определяются множеством факторов. Эти факторы включают, но не ограничиваются, размер белка, который будет экспрессироваться, чувствительность желаемого белка к протеолитическому расщеплению ферментами клеток хозяина, количество сайтов, чувствительных к определенному ферменту рестрикции, контаминацию или связывание белка, который будет экспрессироваться, с белками клеток хозяина, которые, может оказаться, трудно будет удалить во время очистки. Дополнительные факторы, которые могут приниматься во внимание, включают характеристики экспрессии, такие как расположение стартового и стоп-кодона относительно векторных последовательностей, и другие факторы, которые известны опытным специалистам. Выбор вектора и места вставки для заявленных последовательностей ДНК определяются оптимальным балансом этих факторов; при этом не каждый выбор будет эффективным для желаемого применения. Однако для специалиста является обычной практикой анализ этих параметров и выбор подходящей системы в зависимости от конкретного применения.

Специалист может легко осуществлять подходящие модификации последовательностей контроля экспрессии для получения более высоких уровней экспрессии белка, т. е., замены кодонов или выбор кодонов для конкретных аминокислот, которые предпочтительно используются конкретными организмами, для минимизации протеолиза или изменения композиции гликозилирования. Подобно этому, цистеины можно заменять на другие аминокислоты для упрощения выработки, повторной укладки или проблем стабильности.

Таким образом, не все комбинации хозяин/экспрессирующий вектор функционируют с одинаковой эффективностью при экспрессировании последовательностей ДНК по настоящему изобретению. Однако конкретный выбор комбинации хозяин/экспрессирующий вектор может осуществляться специалистом. Факторы, которые должны быть приняты во внимание, включают, например, совместимость хозяина и вектора, токсичность белков, кодируемых последовательностью ДНК, для хозяина, простоту восстановления желаемого белка, характеристики экспрессии последовательностей ДНК и последовательностей контроля экспрессии, оперативно связанных с ними, биологическую безопасность, стоимость, а также укладку, форму иди другие постэкспрессионные модификации желаемого белка.

АРКТЬ, вырабатываемый хозяевами, трансформированными последовательностями по настоящему изобретению, а также нативный ЛРКТЬ, очищенный по способу настоящего изобретения, или изготовленный по заявленным последовательностям аминокислот, пригодны для множества композиций и способов для противоракового, противоопухолевого и иммунорегулирующего применения. Они пригодны также для лечения и способов применения при других заболеваниях.

Настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, описанным в настоящем документе, для экспрессии ЛРКТЬ в условиях патологии, т.е., при проведении генной терапии. Помимо этого, ЛРКТЬ может экспрессироваться в опухолевых клетках под управлением промоторов, подходящих для такого применения. Такая экспрессия может усилить противоопухолевый иммунный ответ или непосредственно воздействовать на выживание опухоли. ЛРШЬ также, вероятно, воздействует на выживание пересаженного органа путем изменения местного иммунного ответа. В этом случае сам трансплантат или окружающие его клетки следует модифицировать геном, полученным с помощью генной инженерии, который кодирует ЛРКТЬ.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей любой ЛРШЬ, в антисмысловой терапии. Используемый в настоящем документе термин антисмысловая терапия относится к введению или выработке ίη κίΐιι олигонуклеотидов или их производных, которые специфичным образом гибридизуются в условиях клетки с клеточной мРНК и/или ДНК, кодирующей нужную последовательность АРКТЬ, так, чтобы подавлять экспрессию кодируемого белка, т. е., путем ингибирования транскрипции и/или трансляции. Связывание может происходить на основе обычной комплементарности пар, или, например, в случае связывания с двойной ДНК, через специфичные взаимодействия в большой бороздке двойной спирали. В целом, антисмысловая терапия относится к ряду методик, которые обычно применяются в данной области, и включает любую терапию, которая основывается на специфичном связывании с олигонуклеотидными последовательностями.

Антисмысловая конструкция по настоящему изобретению может доставляться, например, в качестве экспрессирующей плазмиды, которая, будучи транскрибированной в клетке, производит РНК, которая является комплементарной по отношению, по меньшей мере, к части клеточной мРНК, которая кодирует АРКТЬ. Альтернативно, антисмысловая конструкция может представлять из себя олигонуклеотидный зонд, который вырабатывается ех νίνο. Такие олигонуклеотидные зонды предпочтительно представляют из себя модифицированные олигонуклеотиды, которые являются устойчивыми к эндогенным нуклеазам и, следовательно, стабильными ίη νίνο. Примерами молекул нуклеиновых кислот для применения в антисмысловых олигонуклеотидах являются фосфорамидаты, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги

- 7 005411

ДНК (см., например, 5 176 996, 5 264 564 и 5 256 775) . Помимо этого, обзоры главных подходов к конструированию олигомеров, пригодных для антисмысловой терапии, составлены Уап Эег Кго1 с1 а1., (1988) Вю1ес11пк|иек 6:958-976, и δίοίη с1 а1., (1988) Сапсег Век. 48: 2659-2668, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки.

С. ЛРКЧЬ и его аминокислотные последовательности.

ЛРКЧЬ, как обсуждалось выше, является членом семейства ΤΝΡ. Этот белок, а также фрагменты или гомологи ЛРК1Ь, могут иметь широкое терапевтическое и диагностическое применение, как обсуждается более подробно ниже.

Несмотря на то, что точная трехмерная структура АРК1Ь неизвестна, предсказывают, что как член семейства ΤΝΡ он может иметь определенные структурные характеристики, общие с другими челнами этого семейства.

Сравнение заявленной последовательности АРКРЬ с другими членами семейства ΤΝΡ человека обнаруживает значительное структурное сходство. Все эти белки имеют несколько участков консервативности последовательности во внеклеточном домене. Гомологичность всей последовательности внеклеточного домена АРК1Ь демонстрирует наивысшую гомологичность с РакЬ (21% идентичности по аминокислотам), ΤΝΡα (20%), Ι.Τ-α (18%), далее следуют ТРАП.. ТА'РАК и РИАХСЕ (15%). Фиг. 1В.

Новые полипептиды по настоящему изобретению специфично взаимодействуют с рецептором, который до сих пор не идентифицирован. Однако пептиды и способы, описанные в настоящем документе, делают возможной идентификацию рецепторов, которые специфично взаимодействуют с АРКРЬ или его фрагментами.

Заявленное изобретение в некоторых вариантах практического осуществления включает пептиды, полученные из АРКРЬ, которые обладают способностью связываться с его рецепторами. Фрагменты АРКРЬ можно изготовить несколькими способами, например, с помощью рекомбинантных методик, ПЦР, протеолитического расщепления или химического синтеза. Внутренние или терминальные фрагменты полипептида можно построить путем удаления одного или более нуклеотидов с одного конца или обоих концов нуклеиновой кислоты, которая кодирует этот полипептид. Экспрессия мутантной ДНК обеспечивает полипептидные фрагменты.

Полипептидные фрагменты можно также химически синтезировать с помощью известных методик, таких как обычный твердофазный ί-шос или 1-Ьос химический синтез МегпПе1б. Например, пептиды и последовательности ДНК по настоящему изобретению можно произвольно разделить на фрагменты нужной длины без перекрывания фрагментов или разделить на перекрывающиеся фрагменты нужной длины. Способы, подобные этим, описаны более подробно ниже.

Ό. Получение растворимых форм АРШЬ.

Растворимые формы АРКРЬ часто могут эффективно сигнализировать и, следовательно, могут вводиться в качестве лекарства, которое имитирует естественную форму мембран. Возможно естественное секретирование заявленного АРКРЬ в качестве растворимых цитокинов, однако, если этого не происходит, можно повторно преобразовать ген методами генной инженерии для того, чтобы получить секрецию. Для создания растворимой секретируемой формы АРРбЬ следует на уровне ДНК удалить Νконцевые трансмембранные участки и определенную часть стебля и заменить их последовательностью лидера типа I или, альтернативно, типа II, что сделает возможным эффективное протеолитическое расщепление в выбранной экспрессирующей системе. Опытный специалист может изменять количество оставшегося в конструкции, экспрессирующей секрецию, стеблевого участка, чтобы оптимизировать как свойства связывания с рецепторами, так и эффективности секреции. Например, могут быть изготовлены конструкции, содержащие стебли всех возможных размеров, т.е., Ν-концевые усеченные формы, таким образом, что получатся белки, величиной с 81 аминокислоты до 139 аминокислот. Оптимальную длину стеблевой последовательности можно получить благодаря этому типу анализа.

Е. Выработка антител, реагирующих с АРШЬ.

Настоящее изобретение также включает антитела, которые специфично реагируют с АРКРЬ или его рецептором. Антибелковую/антипептидную антисыворотку или моноклональные антитела можно получить с помощью стандартных методик (см., например, апйЬобЧек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, издание Наг1о\у апб Ьапе (Со1б 8ргшд НагЬог Ргекк:1988). Млекопитающие, такие как мышь, хомячок или кролик, могут быть иммунизированы иммуногенной формой пептида. Методики сообщения белку или пептиду иммуногенности включают их конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные специалистам.

Иммуногенную часть АРРТЬ или его рецептора можно вводить в присутствии адъюванта. Развитие иммунизации можно отслеживать путем выявления титров антител в плазме или сыворотке крови. Стандартный анализ ЕЫ8А или другие иммунологические анализы можно применять с использованием иммуногена как антигена для оценки уровней антител.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые антитела являются иммуноспецифичными по отношению к антигенным детерминантам АРК1Ь или его рецептора, например, антигенным детерминантам полипептида, описываемого 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, или его близкородственного человеческого или другого млекопитающего гомолога (например, 70, 80 или 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95% гомологичности). В еще одном предпочтительном варианте осуще

- 8 005411 ствления настоящего изобретения анти-АРШЬ или антитела против рецепторов АРКбЬ практически не реагируют перекрестно (т.е., реагируют специфично) с белком, который, например, менее чем на 80% гомологичен 8ЕО Ш N0: 2; предпочтительно, менее чем на 90% гомологичен 8Е0 Ш N0: 2; и, наиболее предпочтительно, менее чем на 95% гомологичен 8Е0 Ш N0: 2. Под выражением практически не реагируют перекрестно подразумевается, что антитело обладает связывающей аффинностью по отношению к негомологичному белку, которая составляет менее 10%, более предпочтительно, менее 5%, и, даже более предпочтительно, менее 1%, от связывающей аффинности белка, описываемого 8Е0 Ш N0: 2.

Термин антитело в настоящем документе включает также его фрагменты, которые также специфично реагируют с АРКбЬ или его рецептором. Антитела могут быть фрагментированы с помощью обычных методик, а фрагменты могут быть подвергнуты скринингу на пригодность теми же способами, которые описаны выше для интактных антител. Например, Е(аЬ)₂ фрагменты могут быть получены путем обработки антитела пепсином. Полученный Е(аЬ')₂ фрагмент можно обработать с целью устранения дисульфидных мостиков и получения ЕаЬ' фрагментов. Антитела по настоящему изобретению также включают биоспецифичные и химерные молекулы, обладающие анти-АРК1Ь активностью и активностью против рецепторов АРКбЬ. Таким образом, как моноклональные, так и поликлональные антитела (АЬ) против АРКбЬ и его рецептора и фрагменты антител, такие как ЕаЬ' и Е(аЬ')₂, можно применять для блокирования действия АРКбЬ и его соответствующего рецептора.

Различные формы антител также можно получить с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК. (\Уш1ег аиб Μίΐκίοίη, №1Шгс 349:293-299 (1991); включено в настоящий документ в качестве ссылки). Например, можно сконструировать химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен из антитела животного присоединен к константному домену антитела человека (например, СаЬШу е! а1., патент США № 4 816 567, включенный в настоящий документ в качестве ссылки). Химерные антитела могут редуцировать наблюдающиеся иммуногенные реакции, вызванные животными антителами при их использовании для лечения человека.

Помимо этого, могут быть синтезированы рекомбинантные гуманизированные антитела, которые распознают АРК1Ь или его рецептор. Гуманизированные антитела представляют из себя химеры, включающие преимущественно последовательности человеческого 1дС, в которые вставлены участки, ответственные за специфичное связывание с антигенами. Животных иммунизируют желаемым антигеном, выделяют соответствующие антитела и часть последовательностей вариабельного участка, ответственных за специфичное связывание с антигеном, удаляют. Антигенсвязывающие участки животного происхождения затем клонируют на подходящую позицию в генах антител человека, в которые антигенсвязывающие участки удалены. Гуманизированные антитела сводят к минимуму использование гетерологичных (т.е., межвидовых) последовательностей в человеческих антителах, и поэтому с меньшей долей вероятности вызывают иммунные реакции у субъекта, подвергаемого лечению.

Конструирование различных классов рекомбинантных антител может также осуществляться путем изготовления химерных или гуманизированных антител, включающих вариабельные домены и человеческие константные домены (СН1, СН2, СН3), выделенные из различных классов иммуноглобулинов. Например, антитела с повышенными валентностями антигенсвязывающего участка могут быть получены путем клонирования антигенсвязывающего участка в векторы, несущие цепь константных участков человека. (Аги1апапбат е! а1., 1. Ехр. Меб., 177:1439-1450 (1993), включено в настоящий документ в качестве ссылки).

Помимо этого, можно использовать стандартные методики рекомбинантной ДНК для изменения связывающего аффинитета рекомбинантных антител по отношению к их антигенам путем изменения аминокислотных остатков поблизости от антигенсвяэывающих участков. Антигенсвязывающий аффинитет гуманизированного антитела может быть повышен посредством мутагенеза на основе молекулярного моделирования. (Онеен е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сЕ, 86:10029-33 (1989); включено в настоящий документ в качестве ссылки).

Е. Получение аналогов: изготовление измененных ДНК- и пептидных последовательностей.

Аналоги АРКбЬ могут отличаться от нативных лигандов по аминокислотной последовательности или по другим факторам, которые не касаются последовательностей, или и таким и другим образом сразу. Модификации, которые не касаются последовательностей, включают получение производных АРКбЬ ίη νίνο и ίη νίίτο. Модификации, которые не касаются последовательностей, включают, но не ограничиваются, изменения в ацетилировании, метилировании, фосфорилировании, карбоксилировании или гликозилировании.

Предпочтительные аналоги включают АРКбЬ или его биологически активные фрагменты, у которых последовательности отличаются от 8Е0 Ш N0: 2, по одному или более консервативных аминокислотных замещений, или по одному или более неконсервативных аминокислотных замещений, делеций или вставок, которые не препятствуют биологической активности АРКбЬ. Консервативные замещения обычно включают замещение одной аминокислоты на другую, обладающую сходными свойствами, например, замещения в пределах следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.

- 9 005411

Консервативные замены аминокислот кислота

Цистеин кислота

Глицин

Лейцин

Лизин

Метионин

Тирозин

Ь-1-тоазолидин-4-карбоновая или Ь-1-оксазолидин фенилпролин, цис-3, 4 или 5-фенилпролин

Аланин

Аргинин

Глутамин

Изолейцин

Фенилаланин

Треонин

- 10 005411

Применение методики мутагенеза включает ПЦР-мутагенез и сатурационный мутагенез, как обсуждается более подробно ниже. Библиотеку неспецифических вариантов аминокислотных последовательностей также можно получить путем синтеза ряда вырожденных олигонуклеотидных последовательностей.

ПЦР-мутагенез.

При ПЦР-мутагенезе для интродукции несцецифических мутаций в клонированный фрагмент ДНК можно использовать сниженную привязанность Тац-полимеразы (Ьсипд с! а1., 1989, Тсс11пк.|ис 1:11-15). Это очень мощный и относительно быстрый способ интродукции неспецифических мутаций. Участок ДНК, который должен быть мутирован, можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) при условиях, снижающих привязанность синтеза ДНК Тас.| ДНК-полимеразой, например, с помощью использования соотношения дГТФ/дАТФ, равное пяти, и добавления Мп²* к ПЦР-реакции. Пул амплифицированных фрагментов ДНК может быть вставлен в подходящие клонирующие векторы для обеспечения библиотек неспецифических мутантов.

Сатурационный мутагенез.

Сатурационный мутагенез позволяет осуществить быструю интродукцию большого числа замещений единственных оснований в клонированные фрагменты ДНК (Маусгк с! а1., 1985, 8с1спсс 229:242). Эта методика включает генерацию мутаций, например, с помощью химической обработки или облучения одноцепочечной ДНК ίη νίίτο и синтеза комплементарной цепи ДНК. Частоту мутаций можно менять путем модулирования интенсивности обработки, и можно получить практически все возможные замещения оснований. Поскольку эта процедура не включает генетический отбор мутантных фрагментов, можно получить как нейтральные замещения, так и белок, изготовленный путем неспецифического мутагенеза ДНК. Распределение точечных мутаций не смещается в сторону консервативных элементов последовательности.

Вырожденные олигонуклеотиды.

Библиотеку гомологов также можно создать из ряда последовательностей вырожденных олигонуклеотидов. Химический синтез вырожденных последовательностей может осуществляться с помощью автоматического синтезатора ДНК, а синтетические гены затем сшивают с подходящим экспрессирующим вектором. Синтез вырожденных олигонуклеотидов известен специалистам™ Такие методики применяются в направленной эволюции других белков.™¹

Неспецифический или направленный мутагенеэ можно использовать для создания конкретных последовательностей или мутаций в конкретных участках. Эти методики можно использовать для создания вариантов, которые включают, например, делеции, вставки или замещения остатков в известной аминокислотной последовательности белка. Сайты для мутаций могут быть модифицированы индивидуально или сериями, например, (1) путем замещения сначала консервативными аминокислотами, а затем более радикальными вариантами, в зависимости от достигнутых результатов, (2) путем удаления нужного остатка или (3) путем вставки остатков того же или другого класса по соседству с локализованным сайтом или путем комбинаций вариантов 1-3.

Аланин-сканирующий мутагенез.

Аланин-сканирующий мутагенез является полезным способом идентификации определенных остатков или участков нужного белка, которые являются предпочтительными расположениями или доменами мутагенеза, Сипшпс|11ат апб \Мс118 (8с1спсс 244:1081-1085, 1989), включено в настоящий документ в качестве ссылки. При аланин-сканировании остаток или группа нужных остатков идентифицируют (например, заряженные остатки, такие как Агд, Акр, Ηίκ, Ьук и С1ц) и заменяют на нейтральные или отрицательно заряженные аминокислоты (наиболее предпочтительно, аланин или полиаланин). Замена аминокислот может влиять на взаимодействие аминокислот с окружающей водной средой внутри или снаружи клетки. Те домены, которые демонстрируют функциональную чувствительность к замещениям, затем могут быть выделены путем интродукции дальнейших или других вариантов на или вместо сайтов замещения. Таким образом, поскольку сайт для интродукции изменения аминокислотной последовательности предопределен, сам по себе характер мутации не нуждается в предопределении. Например, для оптимизации осуществления мутации в данном участке, аланин-сканирование или неспецифический мутагенез могут проводиться на нужном кодоне или участке, а экспрессированные варианты субъединиц нужного белка подвергаются скринингу на предмет оптимального сочетания нужной активности.

Олигонуклеотид-опосредованный мутагенез.

Олигонуклеотид-опосредованный мутагенез является применимой методикой получения вариантов ДНК с замещением, делецией и вставкой, см., например, Абс1тап с! а1. (ΌΝΑ 2:183, 1983), включено в настоящий документ в качестве ссылки. Кратко, нужную ДНК можно изменить путем гибридизации олигонуклеотида, кодирующего мутацию, до ДНК-матрицы, которая представляет из себя одноцепочечную форму плазмиды или бактериофага, содержащих неизмененную или нативную последовательность ДНК нужного белка. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза полной второй комплементарной цепи матрицы, которая, следовательно, будет включать олигонуклеотидный праймер и будет кодировать выбранное изменение в ДНК нужного белка. Обычно используются олигонуклеотиды длиной по меньшей мере в 25 нуклеотидов. Оптимальный олигонуклеотид будет иметь от 12 до 15 нуклеотидов, которые являются полностью комплементарными матрице по обе стороны нуклеотида (нуклеоти

- 11 005411 дов), кодирующего мутацию. Это гарантирует, что олигонуклеотид будет должным образом гибридизован с матричной молекулой одноцепочечной ДНК. Такие олигонуклеотиды легко синтезируются с помощью известных методик, таких как описанные Сгеа с1 а1. (Ргос. Ν;Π1. Асаб. 8ег И8А, 75:5765[1978], включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Кассетный мутагенез.

Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на методике, описанной ^е11к е1 а1. (Оепе, 34:315 [1985]), включено в настоящий документ в качестве ссылки. Исходным материалом может служить плазмида (или другой вектор), которая включает ДНК субъединицы белка, которую желательно мутировать. Кодон (кодоны) в ДНК субъединицы белка, который желательно мутировать, идентифицируют. Должен быть уникальный сайт рестрикции эндонуклеазы на каждой стороне выделенного сайта (сайтов) мутации. Если таких сайтов рестрикции не существует, их можно создать с помощью вышеописанного способа олигонуклеотид-опосредованного мутагенеза для внедрения в подходящие места желаемой ДНК субъединицы белка. После интродукции сайтов рестрикции в плазмиду ее разрезают в местах этих сайтов для выравнивания. Двухцепочечный олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между сайтами рестрикции, но содержащую нужную мутацию (мутации), синтезируют с помощью стандартных методик. Две цепи синтезируют по отдельности, а затем гибридизуют обычным способом. Этот двухцепочечный олигонуклеотид называют кассетой. В этой кассете имеются 3'- и 5'концы, которые сравнимы с концами выровненной плазмиды, таким образом, что ее можно непосредственно сшить с плазмидой. Теперь эта плазмида содержит мутантную последовательность ДНК белковой субъединицы.

Комбинаторный мутагенез.

Комбинаторный мутагенез также можно использовать для генерации мутантов. Например, аминокислотные последовательности для группы гомологов или других родственных белков выравнивают, предпочтительно, для того, чтобы способствовать наибольшей возможной гомологичности. Все аминокислоты, которые появляются на данной позиции выровненных последовательностей, могут отбираться для создания вырожденного ряда комбинаторных последовательностей. Неоднородная библиотека вариантов создается путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновой кислоты и кодируется с помощью библиотеки разнообразных генов. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов может ферментативно сшиваться с генными последовательностями, такими как вырожденный ряд потенциальных последовательностей, которые экспрессируются как отдельные пептиды, или, альтернативно, как ряд более крупных слитых белков, содержащих ряд вырожденных последовательностей.

Специалистам известно множество методик, позволяющих производить скрининг генерированных мутантных генных продуктов. Методики скрининга больших генных библиотек часто включают клонирование генной библиотеки в способные реплицироваться экспрессирующие векторы, трансформирование подходящих клеток с помощью полученной библиотеки векторов и экспрессирование генов при условиях, в которых выявление нужной активности, например, в данном случае, связывания с АРКГБ или его рецептором, облегчает относительно простое выделение вектора, кодирующего ген, чей продукт выявлялся. Каждая из методик, описанных ниже, позволяет проводить анализ для скрининга больших количеств созданных последовательностей с высокой пропускной способностью, например, с помощью методики неспецифического мутагенеза.

Настоящее изобретение предусматривает также редуцирование связывающих белок доменов заявленных полипептидов или их рецепторов, для получения миметиков, например, пептидных или непептидных агентов. Пептидные миметики способны разрывать связывание АРКГБ с его рецептором. Главные остатки АРШЬ, участвующие в молекулярном распознавании рецепторного полипептида или расположенного далее внутриклеточного белка, можно определить и использовать для создания пептидомиметиков АРКГБ или его рецепторов, которые конкурентно или неконкурентно ингибируют связывание АРКбЬ с его рецептором. (См., например, РерЬбе шЫЬйогк о£ йитап рарШота νπυκ рго!ет Ьтбтд 1о гейпоЫак1ота депе рго1еш. Европейские патентные заявки ЕР-412 762А и ЕР-В31 080А, включенные в настоящий документ в качестве ссылок).

Делая возможным получение доступного очищенного и рекомбинантного АРКГБ, настоящее изобретение предусматривает анализы, которые могут использоваться для скрининга потенциальных лекарственных средств, которые являются агонистами или антагонистами нормальной клеточной функции, в данном случае, АРКГБ или его рецептора. В одном варианте осуществления настоящего изобретения этот анализ оценивает способность соединения модулировать связывание АРКГБ и его рецептора. Подходящими являются многие форматы анализа и, в свете настоящих изобретений, они будут очевидными для специалистов в данной области знания.

Во многих программах скрининга лекарственных средств, которые испытывают библиотеки соединений и нативных экстрактов, желательны анализы с высокой пропускной способностью, чтобы за определенный период времени пропускать через анализ максимальное количество соединений. Анализы, которые проводятся в бесклеточных системах, такие, которые могут проводиться с очищенными или полуочищенными белками, часто являются предпочтительными в качестве первичного отбора, поскольку они позволяют осуществлять быструю постановку и относительно простое выявление изменения в моле

- 12 005411 кулярной мишени, которая опосредуется испытуемым соединением. Помимо этого, в системе ίη νίΐτο обычно можно игнорировать эффекты клеточной токсичности и/или биодоступности испытуемого соединения; вместо этого анализ фокусируется, прежде всего, на воздействии лекарственного средства на молекулярную мишень, что может проявляться в изменении связывающего аффинитета с другими белками или в изменении ферментативных свойств молекулярной мишени.

Выделение рецептора, связывающегося с АРК1Ь.

Лиганды семейства ТМР можно использовать для идентификации и клонирования рецепторов. Используя описанные последовательности АРШЬ, можно слить 5'-конец внеклеточного домена, который составляет связывающую рецептор последовательность, с маркером или меченой последовательностью, а затем добавить лидерную последовательность, которая будет вызывать секрецию АРК1Ь в любом количестве экспрессирующих систем. Один пример этой методики описан Βτο^ηίη§ с1 а1., (1996) (ГВС 271, 8618-8626), где лиганд ЬТ-β секретировался в такой форме. Лидерную последовательность УСАМ сдваивали в короткую тус-пептидную метку, после чего следовал внеклеточный домен ЬТ-β. Для получения секреции нормальной мембраносвязанной молекулы ЬТ-β использовали последовательность УСАМ. Секретированный белок сохранял тус-метку на Ν-конце, что не нарушало способности связываться с рецептором. Такой секретированный белок может экспрессироваться как временно трансфицированными клетками Со5. так и сходной системой, например, векторами, полученными из ΕΒNА, системой клетка насекомого/бакуловирус, рюсЫа и т.п. Неочищенный клеточный супернатант можно использовать как источник меченого лиганда.

Клетки, экспрессирующие рецептор, можно идентифицировать путем экспозиции с меченым лигандом. Клетки со связанным лигандом идентифицируют в эксперименте РАС8, помечая тус-метку антителом против тус-пептида (9Е10), а затем меченым фикоэритрином (или сходной меткой) антимышиным иммуноглобулином. РАС8-положительные клетки легко идентифицируются и служат источником РНК, кодирующей рецептор. Затем из этой РНК посредством стандартных методик можно изготовить библиотеку экспрессии и разделить ее на пулы. Пулы клонов трансфицируют в подходящую клеткухозяина и определяют связывание меченого лиганда с клетками, позитивно трансфицированными рецептором, посредством исследования под микроскопом, после мечения связанной тус-пептидной метки ферментом, меченным антимышиным 1д-реагентом, т.е., антителом, меченным галактозидазой, щелочной фосфатазой или люциферазой. После идентификации позитивного пула его размер уменьшают вплоть до идентификации кДНК, кодирующей рецептор. Эту процедуру можно выполнять как с мышиным, так и с человеческим АРМЬ, поскольку они могут более легко привести к рецептору.

С. Способы лечения и фармацевтические композиции.

Способы по настоящему изобретению для лечения злокачественной опухоли включают введение пациенту, предпочтительно, млекопитающему, такому как собака, кошка или человек, эффективного количества заявленной композиции, включающей блокирующий агент, способный препятствовать связыванию АРК1Б и его рецептора. Такие блокирующие агенты включают, но не ограничиваются, растворимый АРНГЬ, анти-АРШБ антитела, антитела против рецепторов АРК1Ь или их биологически активные фрагменты. Помимо этого, можно изготовить ингибирующую форму АРВ1Ь путем мутирования АРНГЬ, который в то же время будет обладать способностью блокировать связь между АРВ1Ь и его рецептором. Блокирующие агенты могут предпочтительно включать слитый белок рецептор-1С, который можно построить с помощью способов, известных опытным специалистам.

Способы по настоящему изобретению пригодны для лечения всех злокачественных опухолей, включая, но не ограничиваясь, такие заболевания клеток как, например, рак почки, саркома Капоши, хронический лейкоз, рак молочной железы, саркома, рак яичников, рак прямой кишки, рак горла, меланома, рак толстого кишечника, рак мочевого пузыря, мастоцитома, рак легкого, аденокарцинома молочной железы, плоскоклеточный рак глотки и гастроинтестинальный рак или рак желудка. Помимо этого, такие блокирующие агенты пригодны для лечения пролиферативных состояний, которые не считаются опухолями, т.е., клеточной гиперпролиферации (гиперплазии), такой как, например, склеродерма, образование паннусов при ревматоидном артрите, послеоперационные рубцы и фиброз легких, печени и матки.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать терапевтически эффективное количество АРШЬ или его рецептора или их фрагменты или миметики, и, необязательно, могут включать фармацевтически приемлемые носители. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам лечения рака и способам стимулирования или, в определенных случаях, ингибирования иммунной системы или ее частей, путем введения фармацевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемых солей или производных. Следует, разумеется, понимать, что композиции и способы по настоящему изобретению можно применять в комбинации с другими лекарственными средствами при различных видах лечения.

Эти композиции могут составляться для различных путей введения, включая системное, местное или локализованное введение. Для системного введения предпочтительна инъекция, включая внутримышечное, внутривенное, интраперитонеальное и подкожное введение. Для инъекции композиции по настоящему изобретению могут составляться в форме жидких растворов, предпочтительно, в физиологи

- 13 005411 чески совместимых буферах, таких как раствор Хенкса или раствор Рингера. Помимо этого, эти композиции могут составляться в твердой форме и, необязательно, повторно растворяться или суспендироваться непосредственно перед употреблением. Лиофилизированные формы также включены в настоящее изобретение.

Эти композиции могут вводиться перорально или с помощью чресслизистых или чрескожных средств. Для чресслизистого или чрескожного введения в композицию включаются пенетранты, соответствующие барьерам, через которые они должны проникать. Такие пенетранты известны и включают, например, для чресслизистого введения, желчные соли, производные фусидовой кислоты и детергенты. Чресслизистое введение может осуществляться с помощью назальных аэрозолей или с помощью суппозиториев. Для перорального введения композиции составляются в виде традиционных форм для перорального введения, таких как капсулы, таблетки и тоники. Для местного введения композиции по настоящему изобретению составляются в виде мазей, гелей или кремов, согласно известным способам.

Дозы и схемы введения будут зависеть от типа злокачественной опухоли, пациента и его анамнеза. Это количество должно быть эффективным с точки зрения лечения, подавления или изменения прогрессирования злокачественной опухоли. Дозы могут быть однократными или множественными. Если используются множественные дозы, что предпочтительно, частота введения будет зависеть, например, от типа хозяина и типа злокачественной опухоли, размера доз и т.п. При некоторых типах злокачественных опухолей или опухолевых линий, будет эффективно ежедневное введение, в то время как при других будет эффективным введение через день или через два дня на третий. Количество активного соединения, вводимое за один раз и за весь курс лечения, будет зависеть от многих факторов. Например, от возраста и веса пациента, тяжести и течения болезни, которую лечат, способа и формы введения и оценки лечащего врача. Однако эффективная доза может составлять в пределах приблизительно от 0,005 до 5 мг/кг в день, предпочтительно, приблизительно от 0,05 до 0,5 мг/кг в день. Размер дозы, которая будет наиболее эффективной, будет таким, который обеспечит отсутствие появления опухоли или полный регресс опухоли и при этом не будет токсичной для пациента. Опытному специалисту будет понятно, что полезными могут оказаться также и более низкие и более высокие дозы.

Генные конструкции по настоящему изобретению могут также использоваться как часть схемы генной терапии, для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих как агонистическую, так и антагонистическую формы АРИЕ.

Экспрессирующие конструкции АРИЕ могут вводиться в любом биологически эффективном носителе, например, любом составе или композиции, способном эффективно доставлять ген АРКЕ клеткам 1и νίνο. Подходы включают вставку гена в вирусные векторы, которые могут трансфицировать клетку непосредственно, или доставку плазмидной ДНК с помощью, например, липосом или внутриклеточных носителей, а также прямую инъекцию генной конструкции. Предпочтительными являются способы переноса с помощью вирусных векторов.

Фармацевтический препарат конструкции для генной терапии может состоять, главным образом, из системы доставки гена в приемлемом разбавителе, или может включать матрикс с замедленным высвобождением, в котором заключен носитель для доставки гена. Альтернативно, если полная система доставки гена может быть выработана в интактном виде из рекомбинантных клеток, например, ретровирусными векторами, фармацевтический препарат может включать одну или более клеток, которые вырабатывают систему доставки гена.

Помимо применения в терапии, олигомеры по настоящему изобретению можно использовать в качестве диагностических реагентов для выявления наличия или отсутствия нужной ДНК, РНК или аминокислотных последовательностей, с которыми они специфично связываются. В других аспектах заявленное изобретение может применяться для оценки химического агента на способность взаимодействовать, например, связываться или физически ассоциировать с АРКГБ или его фрагментом. Этот способ включает контактирование химического агента с АРКЕ и оценку способности химического агента взаимодействовать с АРКЕ. Помимо этого, АРКЕ можно использовать в способах оценки нативного АРКЕ или рецепторов АРКЕ, а также для оценки химических агентов, которые ассоциируют или связываются с рецепторами АРКЕ. Может быть желательным применение меченых версий АРКЕ для облегчения выявления связывания АРКЕ с его рецептором или рецептор-позитивных клеток, например, с целью скрининга агентов, которые блокируют взаимодействие лиганд АРКГБ - рецептор АРКЕ. Помимо этого, можно использовать клеточные линии, трансфицированные АРКЕ, которые имеют повышенные скорости роста, как основу для скрининга для молекул, которые блокируют активность АРКЕ.

В определенных аспектах заявленное изобретение относится к способу оценки химического агента на способность модулировать взаимодействие между АРКЕ и соответствующим ему рецептором. Этот способ включает комбинирование рецептора для АРКЕ и АРКЕ при условиях, когда эта пара может взаимодействовать, добавление химического агента, который подлежит оценке, и выявление формирования или диссоциации комплексов. Эти модулирующие агенты далее могут быть оценены ш νίίτο, например, путем тестирования их активности в бесклеточной системе, а затем, необязательно, путем введения этого соединения в клетку или животному и оценки эффекта.

- 14 005411

I. Примеры.

Пример 1.

При анализе ЛРКЧЬ с помощью нозерн-блоттинга было установлено, что экспрессия ЛРКЧЬ является слабой и ограничивается только немногими типами тканей (фиг. 2А). Два транскрипта величиной 2,1 т.п.н. и 2,4 т.п.н. были обнаружены в предстательной железе, в то время как в ЛПК обнаружили более короткий транскрипт величиной 1,8 т.п.н. Анализ нозерн-блот выполнялся с использованием Нитап МиШр1е Т188ие ЫогШегп Βίοΐδ I апб II (С1оп1ес11 #7760-1 апб 7759-1). Нитап Сапсег Се11 Ьше ΜΤΝ Βίοι С1оп1сс11 #7757-1) и Нитап Титог Рапе1 Βίοι V ([пубгодеп Ό3500-01). Мембраны инкубировали в гибридизационном растворе ЕхргеззНуЬ (С1оп1ес11 #8015-1) в течение по меньшей мере 1 ч при 62°С. Неспецифически праймированный кДНК зонд (ВоеНппдег Маппйепп) был синтезирован с использованием кДНК, соответствующей внеклеточному домену АРКбЬ, в качестве матрицы. Денатурированный нагреванием кДНК зонд добавляли в количестве 1,5х10⁶ имп./мин/мл в свежий раствор ЕхргеззНуЬ. Мембрану подвергали гибридизации в течение 12-24 ч при 62°С, промывали три раза в 2 х ХЦН (смесь хлорида и цитрата натрия), содержавшем 0,05% ДСН (додецилсульфат натрия) и подвергали действию температуры 70°С. При анализе АРМЬ с помощью нозерн-блоттинга было установлено, что экспрессия АРМЬ является слабой и ограничивается только немногими типами тканей. Два транскрипта величиной 2,1 т.п.н. и

2,4 т.п.н. были обнаружены в предстательной железе, в то время как в ЛПК обнаружили более короткий транскрипт величиной 1,8 т.п.н.

Более продолжительная экспозиция выявила мРНК АРМЬ величиной 2,1 т.п.н. в толстой кишке, селезенке и поджелудочной железе (данные не представлены). Это ограниченное распределение мРНК АРКбЬ соответствует происхождению клонов кДНК, в настоящее время доступных в базе данных Е8Т. Из 23 идентифицированных клонов только два были получены из нормальных тканей (беременной матки и панкреатических островков). Примечательно, что оставшиеся Е8Т-клоны (21 клон, 91%) были представлены в библиотеках кДНК, выделенных из опухолей и опухолевых клеточных линий (опухоль яичника, 11; опухоль предстательной железы, 3; опухоль Гесслера Вильмса, 1; рак толстого кишечника, 1; опухоль эндометрия, 1; опухоли паращитовидных желез, 1; опухоль поджелудочной железы, 1; Тклеточная лимфома, 1; клеточная линия, выделенная из аденокарциномы Б-Ж'.'АР. 1). Это навело авторов изобретения на идею проверить трансформированные клеточные линии на экспрессию мРНК АРРбЬ (фиг. 2В) и, на самом деле, все клеточные линии интенсивно экспрессировали транскрипт АРКГЬ величиной 2,1 т.п.н.

Наибольшие АРРК-специфичные сигналы были выявлены в колоректальной аденокарциноме 8^480, лимфоме Беркитта Каф и в меланоме С361. Для подтверждения этого открытия авторы настоящего изобретения определили уровни экспрессии мРНК АРШЕ в нескольких опухолях и сравнили их с нормальными тканями. мРНК АРКГЬ выявляли в избыточных количествах в карциноме щитовидной железы и в лимфоме, в то время как в соответствующих нормальных тканях обнаруживали лишь слабые или вовсе никаких сигналов гибридизации (фиг. 2С). В двух других опухолях, анализировавшихся с помощью нозерн-блоттинга (опухоли надпочечников и паращитовидных желез) уровни мРНК АРКГЬ повышены не были. Однако гибридизация ш δίΐη установила избыточное количество мРНК АРКГЬ в аденокарциноме толстого кишечника человека по сравнению с нормальной тканью толстого кишечника (фиг. 2Ό).

С целью изучения возможной активности АРКГЬ авторы настоящего изобретения экспрессировали растворимый внеклеточный домен АРКГЬ (вАРМЬ), в состав которого входят аминокислоты с 110 по 250, в 293 клетках (9). Ген АРКГЬ полной длины амплифицировали из Е8Т-клона с помощью специфичного прямого 5'-праймера, фланкированного сайтом ЕсоШ (5'-ССАОССТСАТСТССТТТСТТОС-3') и обратного 3'-праймера, фланкированного сайтом ХЬаI (5'-ТСАСАОТТТСАСАААССССАОО-3'). Амплифицированный фрагмент разрезали ЕсοКI/XЬа[ и клонировали в модифицированную версию рСКШ (I πν ί1годеп), в рамке с Ν-концевым пептидом Е1ад (15). Растворимую форму АРКЮ (зАРКШ) генерировали с помощью двух праймеров (5'-АААСАОАА6АА6СА6САСТСТО-3') и (5'-ТСАСАОТТТСАСАА АССССАОО-3'), содержавших сайт Реб и ХЬаЕ соответственно, и затем клонировали в модифицированный вектор рСКШ, содержавший как сигнал НА для секреции белка в эукариотических клетках, так и Νконцевой эпитоп Е1ад (15).

Пример 2.

Широко распространенная экспрессия АРКШ в опухолевых клетках и тканях навела авторов изобретения на мысль, что АРКШ может быть связан с ростом опухоли, и в связи с этим они инкубировали различные линии опухолевых клеток с очищенным рекомбинантным вАРКШ, меченным Е1ад (10).

Эмбриональные клетки человека 293Т, Т-клетки лейкоза бигка! человека, В-клетки лимфомы Беркитта Кар человека и клеточные линии меланомы выращивали, как описано ранее (16, 17). Другие клеточные линии, упомянутые в этой статье, описаны и хранятся в Американской коллекции типовых культур (Лшепсап Туре СиЙиге Со11есйоп) (КоскуШе, Магу1апб). Все клеточные линии культивировали в среде РРΜI или ЭМЕМ с 10% фетальной бычьей сывороткой.

Меченные Е1ад версии внеклеточного домена (остатки 103-281) ЕазЬ и ТКАбЬ человека (остатки 95281) недавно были описаны (15). Меченный Е1ад растворимый Т^ЕАК человека (остатки 141-284) вы

- 15 005411 рабатывался в 293 клетках (Р.8. рукопись готовится к печати). Анти-Р1ад антитела М2 были получены от компании Кобак !п1егпа11опа1 Вю1ес11по1още8. Усиление пролиферации клеток Т-лимфомы 1игка! в присутствии АРШЕ носило дозозависимый характер, что выявлялось по увеличению количества (приблизительно 50%) (11) жизнеспособных клеток через 24 ч после добавления лиганда (фиг. 3А). Пролиферацию клеток определяли путем инкубации клеток в количестве 30 000 на лунку в 100 мкл среды с указанными концентрациями рекомбинантного АРМЕ, Τ^ΕΛΚ, Τ^ΛΙΕ Ра&Ь и определения количества жизнеспособных клеток с помощью анализа пролиферации Се11!1!ег 96 Ар (Рготеда) спустя 24 ч, в соответствии с инструкциями производителя, или путем инкорпорации ³Н-тимидина. Для иммунного истощения Р1адАРКРЬ использовали анти-Р1ад, посаженные на агарозу.

Увеличение пролиферации не зависело от костимулирующих сигналов, таких как анти-СЭ3 антитела или другие цитокины. Как ожидалось, добавление идентичным образом изготовленного и очищенного Ра&Ь к клеткам 1игка! уменьшало количество жизнеспособных клеток, в то время как ^УЕАИ. не оказывал никакого действия. Возросшее количество клеток коррелировало с приращением (40%) инкорпорации ³Н-тимидина в обработанные АРШЕ клетки (фиг. 3А). Иммунное истощение кондиционированной среды, содержащей АРШЬ, меченный с помощью Р1ад, анти-Р1ад антителами, но не анти-тус антителами, снижало пролиферативный эффект (фиг. 3В), что указывает на то, что пролиферативный эффект был специфичным и происходил под действием АРШЬ. Ускоренные темпы пролиферации наблюдались также в некоторых В-лимфомах (Вар человека, мышиных клетках А20, но не В1АВ человека) и в клеточных линиях эпителиального происхождения, таких как С08 и НеЬа, а также в меланомах (фиг. 3С). В клетках карциномы молочной железы МСР-7 реакции не наблюдалось. Воздействие на клетки 1игка! было даже более выраженным, когда содержание фетальной бычьей сыворотки снижали с 10 до 1% (фиг. 3Ό).

Рекомбинантный кАРШЕ образует агрегаты, что может объяснить более высокие концентрации, которые требуются для выявления пролиферативного эффекта кАРШЕ. Таким образом, авторы настоящего изобретения трансфицировали клетки ΜΗ-3Τ3 человеческим АРШЕ полной длины (12) и получили несколько экспрессирующих АРКГЬ клонов (фиг. 4А). ΜΗ-3Τ3 АРШЕ клоны были установлены с помощью методики трансфекции с фосфатом кальция и АРШЬ полной длины, меченного РЕАС, который содержал экспрессирующий вектор рСКШ. Клеточные белки из приблизительно 2х10⁶ клеток на полосу разделяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле в присутствии ДСН при редуцирующих условиях и затем переносили на нитроцеллюлозу. Анализ иммунного блоттинга АРШЕ, меченного Р1ад, выполняли с использованием крысиных моноклональных анти-Р1ад антител в количестве 5 мкг/мл (Кобак Еиетабошб В1о!есЬпо1од1ек). Сначала антитела выявляли, используя очищенные по принципу аффинности антипероксидазные конъюгированные ослиные антимышиные антитела (П1апоуа, НатЬигд, Сегтапу), а затем с помощью реакции хемилюминесценции с использованием системы ЕСЬ (АтегкЕат).

Интересно, что трансфектанты АРШЕ пролиферировали быстрее, чем трансфектанты тоск (фиг. 4В). Авторы пришли к заключению, что клетки NIН-3Τ3, трансфицированные АРШЕ, также должны иметь ростовые преимущества ш у1уо. Когда клетки NIН-3Τ3 дикого типа или тоск-трансфицированные инъецировали бестимусным мышам, пальпируемые опухоли малого размера появлялись через 5-6 недель (13). Напротив, два клона клеток NIН-3Τ3, стабильно трансфицированные АРШЕ, индуцировали опухоли всего через 3-4 недели. Через 6 недель мышей вынуждены были умерщвлять из-за развития больших опухолей (фиг. 4С). Фибробласты МН-3Т3 (Атепсап Τуре Си1!иге Со11есбоп, Коскуп1е, Магу1апб) и различные трансфектанты (1х10⁵ клеток) суспендировали в 50 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером и инъецировали подкожно в область бока бестимусным мышам ВАЬВ/с (Наг1ап, Ζе^к!, №!йег1апб). Размер опухолей измеряли каждые 3 дня. Мыши подбирались по возрасту (по 3 животных в группе).

Пример 3. Выделение рецептора, связывающегося с АРКбЬ.

Лиганды семейства ΤΉΡ можно использовать для идентификации и клонирования рецепторов. Используя описанные последовательности АРШЕ, можно слить 5' конец внеклеточного домена АРШЕ, который составляет рецептор-связывающую последовательность, с маркером или последовательностьюметкой, а затем добавить лидерную последовательность, которая обеспечит секрецию АРШЕ в любой из ряда экспрессирующих систем. Один пример такой технологии описан Вго^шпд е! а1., (1996) (1ВС 271, 8618-8626), где лиганд ΕΤ-β секретировался в такой форме. Лидерную последовательность УСАМ соединяли с короткой пептидной меткой тус, а затем с внеклеточным доменом ΕΤ-β. Последовательность УСАМ используется для получения секреции молекулы ΕΤ-β, которая в норме связана с мембраной. Секретированный белок сохранял метку тус на №конце, что не нарушало его способность связываться с рецептором. Такой секретированный белок может экспрессироваться временно трансфицированными клетками Сок или подобной системой, например, полученными из ЕВNΛ векторами, системой клетка насекомого/бакуловирус, рюсЫа и т.п. Неочищенный клеточный супернатант можно использовать как источник меченого лиганда.

Клетки, экспрессирующие рецептор, можно идентифицировать путем экспозиции с меченым лигандом. Клетки со связанным лигандом идентифицируют в эксперименте РАС8, помечая тус-метку антителом против тус-пептида (9Е10), а затем фикоэритрином (или сходной меткой), меченным антимы

- 16 005411 шиным иммуноглобулином. ГАС8-положительные клетки легко идентифицируются и служат источником РНК, кодирующей рецептор. Затем из этой РНК посредством стандартных методик можно изготовить библиотеку экспрессии и разделить ее на пулы. Пулы клонов трансфицируют в подходящую клеткухозяина и определяют связывание меченого лиганда с клетками, позитивно трансфицированными рецептором, посредством исследования под микроскопом, после мечения связанной тус-пептидной метки ферментом, меченным антимышиным 1д-реагентом, т.е., антителом, меченным галактозидазой, шелочной фосфатазой или люциферазой. После идентификации позитивного пула его размер уменьшают вплоть до идентификации кДКК, кодирующей рецептор. Эту процедуру можно выполнять как с мышиным, так и с человеческим АРК1Ь, поскольку они могут более легко привести к рецептору.

Специалисту будет понятно, что можно осуществлять различные модификации и изменения АРК1Ь, композиций и способов по настоящему изобретению без отступления от идеи или рамок настоящего изобретения. Таким образом, предполагается, что настоящее изобретение включает в себя такие модификации и изменения, при условии, что они подпадают под объем заявленной формулы изобретения и ее эквивалентов.

Библиографические ссылки

ί. 8шйй е! а1., 8с1епсе 248, 1019-23 (1990); Койпо е! а1., ΡΝΑ8 87, 8331-5 (1990); Ьое!ксйег е! а1., Се11 61, 351-9 (1990); 8сйа11 е! а1., Се11 61, 361-70 (1990).

ίί. См. ,1опек е! а1., Ыа!иге, 338, 225-8 (1989); Еск е! а1., 1. Бю1. Сйет. 264, 17595-605 (1992).

ϊϊΐ. К. Τ^асеу, ш Штог №сгок1к Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤΙκιγ Етегдтд Ко1е ш Мебюте. В. Веи!1ег (Еб.), Кауеп Ргекк, ΝΥ, р 255 (1992); А. ^ааде, т ^тог Ыесгоык Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤίκίΓ Етегдтд Ко1е т Мебюте. В. Веи!1ег (Еб.), Кауеп Ргекк, ΝΥ, р 275 (1992).

ίν. Ο.Ό. Кообтап, т Штог Ыесгоык Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤΙκιγ Етегдтд Ко1е т Мебюте. В. Веибег (Еб.), Κаνеп Ргекк, ΝΥ, р 117 (1992).

ν. А. Nакапе, т ^тог ЫесгоЦк Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤΙκιγ Етегдтд Ко1е т Мебюте. В. Веи!1ег (Еб.), Κаνеп Ргекк, ΝΥ, р 285 (1992); Ι.Α. С1агк е! а1., т ^тог Ыесгоык Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤίκίΓ Етегдтд Ко1е т Мебюте. В. Веи!1ег (Еб.), Κаνеп Ргекк, ΝΥ, р 303 (1992); С.Е. Сгаи е! а1., т Τιΐ!™!· Хесгок1к Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤίκίΓ Етегдтд Ко1е т Мебюте. В. Веибег (Еб.), Κаνеп Ргекк, ΝΥ, р 329 (1992); Р-Г. Р1дие!, ίπ ^тог Ыесгоык Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤίκίΓ Етегдтд Ко1е ίπ Мебюте. В. Веи!1ег (Еб.), Κаνеп Ргекк, ΝΥ, р 341 (1992); С.Н. ^опд е! а1., ш Штог Ыесгоык Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤίοΐΓ Етегдтд Ко1е т Мебюте. В. Веибег (Еб.), Κаνеп Ргекк, ΝΥ, р 371 (1992).

νΐ. 8. Майк, ш Штог Ыесгоык Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤίκίΓ Етегдтд Ко1е т Мебюте. В. Веибег (Еб.), Κаνеп Ргекк, ΝΥ, р 407 (1992).

νΐΐ. Ό. А. Гох, Ат. 1. Меб. 99, 82 (1995).

νίίί. Ό. Соеббе1 е! а1., Со1б 8ргшд НагЬог 8утрокшт ОиапГ Вю1. 51, 597 (1986); С. Τοι-κΙ^γε ш Τυтог Ыесгоык Гас!огк. Τίκ Мо1еси1ек апб ΤίκίΓ Етегдтд Ко1е т Мебюте. В. Веибег (Еб.), Κаνеп Ргекк, ΝΥ, р. 515 (1992).

1х. Ь. А. Τа^ίад1^а е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сг И8А. 88, 9292 (1991); Ь. А. ΤηΓ(η£1ίη апб Ό. V. Соеббе1, 1ттипо1. Шбау. 13, 151 (1992).

х. В. Ьие!бд е! а1., 1. 1ттипо1. 143, 4034 (1989); М. Кпед1ег е! а1., Се11 53, 45 (1988).

х1. С. Г. \ν;·ιΐΌ е! а1., ш Рабиуаук Гог Су!о1ук1к. С. М. СпГГййк апб 1. ^Лорр (Ебк.), 8рппдег-Уег1ад, Вегйп, Не1бе1Ьегд, р. 175-218 (1995).

хи. Ν. Раи1 е! а1., Апп. Кеу. 1ттипо1. 6, 407 (1988).

χϊϊϊ. Р.Р. Сгоге е! а1., 8с1епсе. 264. 707 (1994). (1. Вгогшпд е! а1., Се11. 72, 847 (1993); 1. Вгогшпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, 33 (1995)).

χίν. Р. Эе е! а1., 8с1епсе 264, 703 (1993); Τ. А. Вапкк е! а1., 1. 1ттипо1. 155, 1685 (1995).

χν. 1. Вгогшпд апб А. К1Ьо11ш, 1. 1ттипо1., 143, 1859 (1989); 1. Вгогшпд е! а1., ЬЕхр.Меб., 183, 867 (1996).

хуг Τ. 8иба е! а1., 1. 1ттипо1., 154, 3806 (1995); Τ. 8иба е! а1., 1. 1ттипо1., 154, 3806 (1995).

хуй. В. С. Τι^!ί е! а1., 8с1епсе, 245, 301 (1989); 8. Υоπейа^а е! а1., 1. Ехр. Меб., 169, 1747 (1989); 8. Ыада1а апб Р. Со1бк!ет, 8аепсе, 267, 1449 (1995) ; М. Н. Га1к е! а1., В1ооб, 79, 3300 (1992).

хут. Г. К1еих-Ьаиса! е! а1., 8с1епсе, 268, 1347 (1995); Τ. Τакайакй^ е! а1., Се11, 76, 969 (1994); К. ^а!апаЬе-Гикипада е! а1., Ыа!иге, 356, 314 (1992).

х1х. Р. К. Са11е е! а1., 1. Ехр. Меб., 182, 1223 (1995).

хх. Г. 8буек1пк е! а1., Сбп. 1ттипо1. 1ттипораШо1. 75, 197 (1995).

хх1. Р. Ό. Ка!к1к1к е! а1., 1. Ехр. Меб., 181, 2029 (1995); А. Ό. Ваб1еу е! а1., 1. Уго1., 70, 199 (1996). ххи. 8. ^беу е! а1., 1ттипйу. 3, 673 (1995).

ххш. 1. Г. СаисНа! е! а1., ГЕВ8 Ьеб., 315, 259 (1993); 8. ГипакокЫ е! а1., В1ооб. 83, 2787 (1994). ххгу. К. С. А11еп е! а1., 8с1епсе. 259, 990 (1993).

χχν. Ь. В1апсопе е! а1., К1бпеу-1п!. 48, 458 (1995); С. Μойаπ е! а1., 1. 1ттипо1., 154, 1470 (1995). х.хуг 1. КиЬу е! а1., Ыа!иге Мебюте. 1, 437 (1995).

ххуй. Ζ. ^апд е! а1., 1. 1ттипо1., 155, 3722 (1995); А. М. С1еагу е! а1., 1. 1ттипо1., 155, 3329 (1995). ххут. 8. Некк апб Н. Епде1тап, 1. Ехр. Меб., 183, 159 (1996).

- 17 005411 χχίχ. К. О. Оооб\\Л1 е! а1., Се11, 73, 447 (1993);

Оообтеп е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 23, 2631 (1993); С. А. 8тйк е! а1., Се11, 73, 1349 (1993).

χχχ. См., например, №1гапд. 8. А. Те!гакебгоп 39, 3 (1983); 1!акига е! а1. КесотЬшап! ΩΝΛ. Ргос 3гб С1еуе1апб 8утроз. Масгото1еси1ез, еб. АО Уакон Атз!егбат: Е1зеукг рр 273-289 (1981); Накига е! а1. Аппи. Кеу. В1оскет. 53, 323 (1984); Йакига е! а1. 8с1епсе 198, 1056 (1984); 1ке е! а1. Шскк Ас1б Кез. 11, 477 (1983).

χχχί. См., например, 8со!! е! а1. 8с1епсе 249, 386-390 (1990); КоЬейз е! а1. РNΛ8 89, 2429-2433 (1992); Оеу1ш е! а1. 8с1епсе 249, 404-406 (1990); С\\аг1а е! а1. РNΛ8 87, 6378-6382 (1990); а также патенты США №№ 5223409, 5198346 и 5096815.

33. М. Т. АЬгеи-Магйп, А. У1бпсй, Ό. Η. Ьупск апб 8. К. Тагдап. Пкегдеп! шбисйоп оГ арор!оз1з апб 1Ь-8 зесгейоп шЫТ-29 се11з шгезропзе !о ЮТ-¹' апб йдайоп оГ Раз кдапб. 1. 1ттипо1. 155:4147-4154, 1995.

34. К. Адета!зи, Т. КоЬа!а, Р.-С. Уапд, Т. №1ка/а\\'а, К. ЕикизЫта, М. Кйакага, Т. Моп, К. 8идйа, С. Мопто!о апб А. Котуата. СЭ27/СЭ70 ш!егас!кп бкесйу бпуез В се11 1дО апб 1дМ зуп!кез1з. Еиг. 1. 1ттипо1. 25:2825-2829, 1995.

35. К. Атакама, А. Ηакет, Т.М. Кипб1д, Т. Ма!зиуата, б.б.Ь. 81тагб, Е. Т1ттз, А. Уакекат, Η.-У. Мййиескег, Η. Опеззег, Η. Так1то!о, К. 8сктйз, А. 8каЫшап, Р.8. ОказЫ, ЕМ. Репшпдег апб Т.У. Мак. кпракеб педайуе зе1есйоп оГ Т се11з ш Иобдкт'з б1зеазе апйдеп СЭ30-беПс1еп1 тке. Се11 84: 551-562, 1996.

36. Е-Ь. Вобтег, К. Вигепз, Р. 8скпе1бег, К. Иегтапп, V. 8!ешег, М. Ткоте, Т. Вотапб, М. Иакпе, М. 8скгое!ег, К. Вескег, А. ХУбзоп, Ь.Е. Егепск, 1Е Вго^шпд, Η.Κ МасЭопа1б, апб 1. Тзскорр. ТКАМР, а поуе1 арор!оз1з-теб1а!шд гесер!ог \\йк зециепсе кото1оду !о !итог песгоз1з Гас!ог гесер!ог 1 апб Газ (аро1/СБ95). 1ттипйу 6: 79-88, 1997.

37. 1. Вго)а1зс11, 1. №идк!оп, М.М. Ко11з, К. 2шд1ег апб ЕА.Т. Уоипд. Саг1, а Т№К-ге1а!еб рго!еш 1з а се11и1аг гесер!ог Гог су!ора!кк а\аап 1еикоз1з-загсота укизез апб теб1а!ез арор!оз1з. Се11 87:845-855, 1996.

38. ЕЬ. Вго^шпд, М.1. Апбгоктес/ апб С.Е. Уаге. ЕутркоЮут апб ап аззоаа!еб 33-кОа д1усорго!еш аге еургезеб оп !ке зигГасе оГ ап асйуа!еб китап Т се11 куЬпбота. 1. 1ттипо1. 147: 1230-7, 1991.

39. 1.Ь. Вго^шпд, К. М|а1ко\узкк Э.А. ОпГЙкз, Р.К. Воигбоп, С. Везз^!·!, С.М. АтЬгозе апб У. Ме1ег. Ргерагайоп апб скагас1еп/акоп оГ зо1иЬ1е гесотЬшап! ке!его!птепс сотр1е.\ез оГ китап ^трко^тз а1рка апб Ье!а. 1. Вю1. Скет. 271: 8618-26, 1996.

40. ЕЕ. Саз1го, ЕА. Ыз!тап, В.А. 1асоЬзоп, Υ. Уапд, Р.А. Еорех, 8. 1и, Р.У. Е1пп апб О.Ь. Регкшз. Раз Моби1а!кп оГ арор!оз1з биппд педакуе зе1ес!кп ойкутосу!ез. 1ттипйу 5: 617-627, 1996.

41. С.-Υ. А. Скеп апб А.-В. 8куи. АИ-пск е1етеп!з:

скагас1еп/акоп апб 1тройапсе ш тКЫА бедгабайоп. Тгепбз ш Вю1. 8ск 20: 465-470, 1995.

42. Υ. Скккеройкке, С. Обу апб Р. Vазза11^. 1беп!йка!кп ш тоизе тасгоркадез оГ а пе\у 4 кЬ тКЫА ргезеп! ш кета!оро1ейс бззие \\1аск зкагез а зкой пис1еойбе зециепсе νίΐΗ егу!кгоро1ейп тКЫА. Вкскет. Вшркуз. Кез. Сотт. 209: 1076-1081, 1995.

43. А.М. Скшпшуап, К. О. Кошке, О.-Ь. Υυ, К.Ш Ьуопз, М. Оагд, Ό.Κ Эиап, Ь. Хшд, К. Оепк, 1. Νί апб УМ. Όίχί!. 81дпа1 йапзбисбоп Ьу ОК3 а беа1к-боташ-соп1а1шпд гесер!ог ге1а!еб !о ТУЕК-1 апб СЭ95. 8с1епсе 274: 990-992, 1996.

44. Р. ЭеТодш е! а1. АЬпогта1 беуе1ортеп! оГ репркега1 1утрко1б огдапз ш тке бейскп! ш ^трко^^. 8скпсе 264: 703-7, 1994.

45. М.А. ОеВепебейе, Ν.Κ Ски, К.Е. Ро11ок, 1. ^Пако, У.Е. Уабе, В.8. К\\оп апб ΈΗ. Уайз. Ко1е оГ 4-1ВВ кдапб ш созйти1айоп оГ Т 1утркосу!е дго\\1к апб йз иргеди1а!кп оп М 12 В 1утркотаз Ьу сАМР. 1. Еxр. Меб. 181: 985-992, 1995.

46. М. Пед11-Езроз!1, Т. Оау1з-8тйк, У.8. Эт, Р.1. 8то1ак, К.О. Оообтеп апб С.А. 8тйк. Асйуайоп оГ !ке ^тр^^ш-Р гесер!ог Ьу сгозз-кпкшд шбисез скетокше ргобисйоп апб дго\\1к аггез! ш А375 те1апота се11з. 1. 1ттипо1. 158: 1756-1762, 1997.

47. Т.М. Роу, А. АгиГГо, 1. ВаргаИ, ЕЕ. Вик1тапп апб К.1. №е11е. 1ттипе геди1а!кп Ьу СЭ40 апб Йз кдапб др39. Апп. Кеу. 1ттипо1. 14: 591-617, 1996.

48. Η.Ε Огизз, Ν. Во1аш, Э.Е. Убкатз, К.1. Агтйаде, С.А. 8тйк апб К.О. Оообтеп. Р1ек!горк еГГес!з оГ !ке СО30 кдапб оп С^30-еxр^езз^ηд се11з апб 1утркота се11 1шез. В1ооб 83: 2045-56, 1994.

49. Η.Ε Огизз апб 8.К. Оотег. Титог песгоз1з Гас!ог кдапб зирегГатбу: шуокетеп! ш !ке ра!ко1оду оГ такдпап! 1утркотаз. В1ооб 85: 3378-404, 1995.

50. 1. Кйзоп, Т. Кауеп, Υ.-Р. Лапд, Ό.ν. Ооеббе1, К.М. О11ез, К.-Т. Рип, С.1. Оппкат, К.Вго^п апб 8.Ν. Еагго\\\ А беа!к боташ-соп!ашшд гесер!ог !ка! теб1а!ез арор!оз1з. №11иге 384: 372-375, 1996.

51. 8.Υ. Ьее, С.О. Рагк апб Υ. Скок Т се11 гесер!ог-берепбеп! се11 беа!к оГ Т се11 куЬпботаз теб1а!еб Ьу !ке СЭ30 су!ор1азтк боташ ш аззоаайоп νίΐΗ !итог песгоз1з Гас!ог гесер!ог-аззос1а!еб Гас!огз. 1. Еxр. Меб. 183: 669- 674, 1996.

52. К.1. Моп!дотегу, М.8. Уатег, В.Е Ьит апб Р.О. 8реаг. Че грез заирку укиз-1 еп!гу ш!о се11з теб1а!еб Ьу а поуе1 тетЬег оГ !ке ТИЕ/ИОЕ гесер!ог Гатбу. Се11 87: 427-436, 1996.

53. 8. №да1а. Арор!оз1з Ьу беа!к Гас!ог. Се11 88: 355-365, 1997.

- 18 005411

54. КМ. Рйй, 8.А. Магк1егк, 8. Киррей, О. Иопайие, А. Мооге апй А. Акйкепахг Гпйисйоп оГ арорЮкХ Ьу Аро-2 Ндапй, а пе\г тетЬег οί (йе (итог песгокХ ГасЮг суЮкте Гатйу. ί ΒίοΙ. Сйет, 1996.

55. С.А. 8тйй, Т. Баггай апй КС. Соой\\й1. Тйе ТОТ гесер1ог кирегГатйу оГ се11и1аг апй νίΓηΙ рго!етк: асйуайоп, сокйти1айоп, апй йеа!й. Се11 76: 959-62, 1994.

56. С.Ь. 8тйй. У1гик к1га1ед1ек Гог етакюп οί (йе йок( гекропке 1о шГесйоп. Тгепйк т МюгоЬюй 3: 8188, 1994.

57. Е. 81гиеЬег апй 81гоЬег. Тйе Т се11-В се11 1п1егасйоп νίη ОХ40-ОХ40Ь ίκ песеккагу Гог 1йе Т се11 шйерепйеп! Ьитога1 1ттипе гекропке. 1. Ехр. Мей. 183: 979-989, 1996.

58. Н.-К. 8у1\\т1, К.8. ЫЬ1аи апй Н.О. МсЭе^'Ш. Тйе го1ек оГ Бак/Аро-1 (СИ95) апй ТОТ т апйдептйисей ргодгаттей се11 йеа(й ш Т се11 гесер1ог йапдешс писе. Гттипйу 5: 17-30, 1996.

59. Р. Уакка111. Тйе ра1йорйукю1оду оГ 1итог песгок1к Гас1огк. Апп. Кет. 1ттипо1. 10: 411-452, 1992.

60. Ь. Ζΐκπβ, С. Икйег, К.Е. МШег, 1. Рексйоп, Ό.Η. Ьупсй апй М.1. Ьепагйо. Гпйисйоп оГ арор1ояк ш та!иге Т се11к Ьу (итоиг песгок1к Гас1ог. №йиге 377: 348-351, 1995.

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение антитела, специфично связывающегося с полипептидом индуцирующего пролиферацию лиганда (АРКГБ) 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 или его растворимым фрагментом и препятствующего связыванию полипептида лиганда АРКК и полипептида рецептора АРКГБ, для получения лекарственного препарата для лечения, подавления или изменения роста опухолевой клетки, лечения злокачественной опухоли или лечения гиперплазии.
2. 2. Применение по п.1, где указанная опухолевая клетка, указанная злокачественная опухоль или указанная гиперплазия вызывает экспрессию полипептида лиганда АРКГБ.
3. 3. Применение по п.1, где указанная опухолевая клетка, указанная злокачественная опухоль или указанная гиперплазия вызывает экспрессию полипептида рецептора АРКГБ.
4. 4. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело вводят в сочетании с химиотерапевтическим средством.
5. 5. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело вводят в сочетании с лучевой терапией.
6. 6. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело реактивно по отношению к полипептиду 8ЕС ΙΌ N0: 2 или его фрагменту и где указанное антитело препятствует связыванию указанного полипептида лиганда АРКГБ и полипептида рецептора АРКГБ.
7. 7. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело применяют в приготовлении лекарственного препарата для лечения гиперплазии.
8. 8. Применение по п.7, где указанная гиперплазия является следствием ревматоидного артрита.
9. 9. Применение по п.8, где указанная гиперплазия представляет собой паннус.
10. 10. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело применяют в приготовлении лекарственного препарата для лечения роста опухолевой клетки.
11. 11. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело применяют в приготовлении лекарственного препарата для лечения злокачественной опухоли.