KR20010023893A

KR20010023893A - 성장 효과가 있는 단백질 ａｐｒｉｌ

Info

Publication number: KR20010023893A
Application number: KR1020007002577A
Authority: KR
Inventors: 취오프주르크
Original assignee: 베레이, 헨리; 아포테크 알 앤드 디 에스에이
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2001-03-26
Also published as: HUP0004611A2; EP1027431A2; IL134537A0; WO1999012965A3; HUP0004611A3; SK3542000A3; NO20001242L; CN1195849C; CZ294615B6; BR9812634A; US20060084148A1; NZ503850A; EE200000147A; PL339463A1; TR200000669T2; US20050112596A1; CN1270632A; WO1999012965A2; CZ2000869A3; IS5378A

Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자 계열(TNF)의 신규 구성원인 APRIL, 변형된 APRIL 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

Description

성장 효과가 있는 단백질 ＡＰＲＩＬ{APRIL-A NOVEL PROTEIN WITH GROWTH EFFECTS}

종양 괴사 인자(TNF) 관련 시토킨은 숙주 방어 및 면역 조절의 매개인자이다. 이 계열의 구성원은 세포 대 세포 접촉을 통해서 국부적으로 작용하거나 또는 더 원거리에 있는 표적으로 확산할 수 있는 분비 단백질로서 막 고착된 형태로 존재한다. 대등한 계열의 수용체는 표적 조직내 세포 사멸 또는 세포 증식 및 분화의 개시를 유도하는 이들 분자의 존재에 대해 신호를 보낸다. 현재, 리간드 및 수용체의 TNF 계열로는 13개 이상의 인식된 수용체-리간드 쌍, 예컨대 TNF:TNF-R, LT-α:TNF-R, LT-α/β:LT-β-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27, OX40L:OX40, 4-1BBL:4-1BB, 트란스(trance)/랭크(rank) L:라이트(Light) 및 트윅(Tweak) 등이 있다. 이들 리간드를 암호화하는 DNA 서열은 최대의 관련이 있는 경우라도 동일성은 겨우 약 25∼약 30% 이지만, 아미노산 관련도는 약 50%이다.

이 계열의 시토킨 수용체에 있어서 명백한 특징은 2개의 특징적인 TNF 수용체의 분자 클로닝으로 최초로 밝혀진 시스테인 풍부 세포외 도메인에서 발견된다ⁱ. 이 계열의 유전자는 세포 기능의 활성화에 관여하는 세포질 영역과 단일 막 스패닝(spanning) 영역 및 세포외 리간드 결합 도메인이 있는 I형 경막 단백질의 당단백질 특성을 암호화한다. 시스테인 풍부 리간드 결합 영역에는 치밀하게 밀착된 디설피드 결합 코어 도메인이 나타나는데, 이 도메인은 특정 계열의 구성원에 따라 수회 반복된다. 대부분의 수용체는 4개의 도메인을 보유하지만, 3개 정도로 적은 수의 도메인을 보유하거나 또는 6개 정도의 많은 수의 도메인을 보유할 수도 있다.

TNF 계열내 리간드의 단백질은, 종지 전달 서열로서 작용하는 것으로 생각되는 여러 리신 또는 아르기닌 잔기를 종종 함유하는 정상적으로 짧은 친수성 아미노산의 짧은 N-말단 스트레치를 특징으로 한다. 그 다음에는 경막 영역 및 가변 길이의 세포외 영역이 있는데, 세포외 영역은 막과 C-말단 수용체 결합 도메인 사이에을 중재한다. 이 영역은 때로는 "병(柄)부(stalk)"라고 부른다. C-말단 결합 영역은 그 단백질의 대부분을 차지하며, 항상은 아니지만 흔히 글리코실화 부위를 포함한다. 이들 유전자에는 I형 막 단백질, II형 막 단백질의 고전 신호 서열 특성이 결핍되어 있으며 C 말단 도메인은 세포외에 위치하고 짧은 N 말단 도메인은 세포질내에 존재한다. TNF 및 LT-α와 같이 일부 경우에는, 단백질 프로세싱 초기 과정에서 병부 영역내 절단이 발생할 수 있으며, 그 후 리간드는 주로 분비된 형태로 발견된다. 그러나, 대부분의 리간드는 막 형태로 존재하여 국재적 신호를 매개한다.

이들 리간드의 구조는 TNF, LT-α 및 CD40L의 결정학 분석으로 명확히 특성규명되어 있다. TNF 및 림포톡신-α(LT-α)는 모두 "젤리 롤" 또는 그리스 양식 형태학(Greek key topology)를 보유한 2개의 역평행 β-주름 시이트의 샌드위치 구조를 갖고 있다ⁱⁱ. Cα 및 Cβ 잔기 사이의 rms 편차는 0.61C인데, 이는 분자 형태학에서의 고도의 유사도를 나타내는 것이다. CD40L, TNF 및 LT-α의 분자 연구로부터 밝혀진 구조적 특징은 올리고머 복합체로의 회합 성향이다. 올리고머 구조의 본질은 다가 리간드를 형성하는 인접 서브유닛사이의 연결부에 수용체 결합 부위를 형성하는 것이다. TNF, CD40L 및 LT-α의 4차 구조는 결정 구조의 분석에 의해 삼량체로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 상이한 리간드 사이에 보존적인 다수의 아미노산이 골격(scaffold) β시이트의 스트레치내에 있다. 이들 분자 중에는 모두 기본 샌드위치 구조가 보존되는 것으로 보이는데, 그 이유는 골격 서열의 일부가 각종 계열의 구성원에 걸쳐 보존되기 때문이다. 또한, 서브 유닛 형태가 유사하게 남아있을 가능성이 있기 때문에 4차 구조는 유지될 수 있다.

TNF 계열 구성원을 가장 적절히 표현하자면, 세포 생존 및 분화를 제어하는 면역계 중의 주요 스위치라고 할 수 있다. 현재 기타의 주로 막 고착형 TNF 계열의 구성원과는 대조적으로 TNF 및 LTα만은 분비 시토킨으로 알려져 있다. TNF의 막 형태는 특성규명되어 있고 고유의 생물학적 역할이 있을 가능성이 있는 반면, 분비형 TNF는 촉발 작용의 부위로부터 더 이격되어 있는 세포에 대해 일반적인 경고 신호로서 작용한다. 따라서, TNF 분비는 세포의 염증 상태 및 맥관구조 내면에서의 잘 알려진 변화를 유도하는 현상을 증폭시킬 수 있다. 대조적으로,이 계열의 막 결합된 구성원은 직접 접촉하고 있는 세포에만 TNF형 수용체를 통해 신호를 보낸다. 예를 들어, T 세포는 동기원의 TCR 상호작용을 통해서 직접 접촉하는 B 세포에만 CD40 매개된 "보조작용"을 제공한다. 세포 사멸을 유도하는 능력에 대한 유사한 세포-세포 접촉 제한은, 충분히 연구되어 있는 Fas계에도 적용된다.

TNF 리간드는 세포 사멸을 유도하는 능력을 기초로하여 3개의 그룹으로 나눌 수 있다(표 3). 제1 군은 TNF, Fas 리간드 및 TRAIL로 여러 주에서 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있고, 이의 수용체는 아마도 우수한 표준 사멸 도메인을 갖는 것 같다. 아마도 DR-3(TRAMP/WSL-1)에 대한 리간드는 모두 이 카테고리에 포함될 것이다. 제2 군은 일부 세포 유형에만 한정된 약한 사멸 신호를 촉발하는 리간드로서, 예로는 TWEAK, CD30 리간드 및 LTα1β2가 있다. 흥미로운 사실은, 이 군의 구성원들이 표준 사멸 도메인의 부재하에 세포 사멸을 촉발하는 방식으로, 이는 별도의 보다 약한 사멸 신호 메카니즘이 존재한다는 것을 암시한다. 마지막으로, 제3 군은 사멸 신호를 효과적으로 전달할 수 없는 구성원들로 되어 있다. 아마도, 상기 모든 군은 CD40과 같이 일부 세포 유형에 대해 증식 억제 효과가 있어, 그 결과 세포 분화를 유도하는 것 같다(Funakoshi et al., 1994).

TNF 계열은 최근 몇년 동안 급격히 증가하여 면역계의 조절과 관련된 11개 이상의 상이한 신호 발생 경로를 포함한다. TWEAK 및 TRAIL의 다양한 발현 패턴은 이 계열에 포함되지 않는 더 많은 작용성 변형체가 있음을 시사하는 것이다. 이러한 측면은 라우스 육종 및 헤르페스 심플렉스 바이러스가 복제하는 능력에 영향을 주는 2개의 수용체의 발견 뿐 아니라 TNF가 항바이러스 활성을 보유하고 폭스 바이러스가 유인성 TNF 수용체를 암호화한다는 역사적 관찰 결과에서 최근 강조되었다(Brojatsch et al., 1996; Montgomery et al., 1996; Smith, 1994; Vassalli, 1992). TNF는 패혈증 쇼크 및 악액질의 매개인자이며ⁱⁱⁱ, 조혈 세포 형성의 조절에 관여한다^iv. TNF는 항종양 활성^vi뿐 아니라 박테리아, 바이러스 및 기생충 감염^v에 대한 염증 및 방어의 매개인자로서 중요한 역할을 나타낸다. TNF는 여러 자가면역 질병에도 관련되어 있다^vii. TNF는 대식세포, 섬유아세포, T 세포 및 천연 킬러 세포를 비롯한 여러 유형의 세포가 생성할 수 있다^viii. TNF는 2개의 다른 수용체에 결합하는데, 각각은 특정 세포내 신호 발생 분자를 통해서 작용하며, 따라서 상이한 TNF 효과를 초래한다^ix. TNF는 막 결합 형태로서 또는 가용성 분비 시토킨으로서 존재할 수 있다^x.

LT-α는 TNF와 여러 가지 활성, 즉 TNF 수용체에 대한 결합 활성^xi을 공유하지만, TNF와는 달리 활성화된 T 세포 및 일부 β-림프아구양 종양에 의해 주로 분비되는 것으로 보인다^xii. LT-α 및 LT-β의 헤테로량체 복합체는 LT-β 수용체에 결합하는 막 결합 복합체이다^xiii. LT계(LTs 및 LT-R)는 말초 림프구 기관의 형성과 관련되어 있는 것으로 보이는데, 그 이유는 LT-β의 유전자 파열이 비장내 T 및 B 세포의 분열과 림프절의 부재를 유도하기 때문이다^xiv. LT-β계는 일부 아데노암종 세포주의 세포 사멸과 관련이 있다^xv.

Fas-L은 또 다른 TNF 계열의 구성원으로서, 활성화된 T 세포상에서 주로 발현된다^xvi. 프로그래밍된 세포 사멸 또는 고사로서 알려진 기작에 의해서 Fas-L은 종양 세포 및 HIV-감염된 세포를 비롯하여 그 수용체를 보유하는 세포 사멸을 유도한다^xvii. 또한 Fas 또는 Fas-L의 결함은 림프증식성 질병을 유도할 수 있는데, 이로서 면역 반응의 제어에 있어서 Fas계의 역할을 확인할 수 있다^xviii. Fas계는 간염 만성 감염으로부터 생긴 간 손상^xix및 HIV^xx감염된 환자의 자가면역에 관여한다. Fas계는 HIV 환자내 T 세포 파괴와 연관되어 있다^xxi. TNF 계열의 또 다른 일원인 TRAIL은 다양한 기원의 각종 형질전환된 세포주의 사멸과 연관이 있는 것 같다^xxii.

CD40-L은 TNF 계열의 또 다른 구성원으로서 T 세포에서 발현되고 CD-40 보유 B 세포의 조절을 유도한다^xxiii. 또한, CD40-L 유전자의 변화는 X-결합형 고IgM 증으로서 알려진 질병을 초래한다^xxiv. CD계는 여러 자가면역 질병^xxv과 관련이 있고 CD40-L은 항바이러스 특성을 보유하는 것으로 알려져있다^xxvi. CD40계는 고사 B 세포의 구제와 연관이 있지만^xxvi, 비면역 세포에서는 고사를 유도한다^xxviii. TNF 계열의 여러 추가의 림프구 구성원은 공동자극과 연관되어 있다^xxix.

일반적으로, TNF 계열의 구성원은 면역계를 제어하고 급성 숙주 방어계를 활성화시키는데 기본적인 조절 역할을 한다. 치료 유용성을 위해 TNF 계열의 구성원을 조작하는데 있어서의 현재까지 이루어진 진행 과정은, TNF 계열의 구성원이 질병을 제어하는데 고유의 수단을 제공할 수 있다는 가능성을 제공한다. 이 계열의 일부 리간드는 다수의 형질전환된 세포, 예컨대 LT, TNF, Fas 리간드 및 TRAIL의 고사 사멸을 직접 유도할 수 있다(Nagata, 1997). Fas 및 가능하게는 TNF 및 CD30 수용체 활성화는 면역조절 작용을 수행할 수 있는 비형질전환된 림프구의 세포 사멸을 유도할 수 있다(Amakawa et al., 1996; Nagata, 1997; Sytwu et al, 1996; Zheng et al., 1995). 일반적으로, 사멸은 TNF 수용체의 세포질 측에 존재하는 사멸 도메인의 어글리게이션 후에 촉발된다. 사멸 도메인은 카스파제 캐스케이드의 활성화를 초래하는 각종 신호 형질도입 성분의 회합을 조절한다(Nagata, 1997). 표준 사멸 도메인이 결핍되어 있는 일부 수용체, 예컨대 LTb 수용체 및 CD30(Browning et al., 1996; Lee et al., 1996)은 비록 약하기는 하지만 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이 수용체들은 주로 세포 분화를 유도하는 작용을 하고 일부 형질전환 세포주는 이상 결과로 사멸이 일어나는 것으로 추정되지만, 이는 흉선에서의 음성 선택에 의한 사멸 역할을 암시하는 CD30 눌 마우스에 대한 연구가 암시하듯이 명확치 않은 것이다(Amakawa et al., 1996). 역으로, CD40과 같은 기타 경로를 통한 신호는 세포 생존을 유지하는데 필요하다. 따라서, TNF 계열의 구성원인 추가의 분자를 확인 및 특성규명하여 질병을 제어하고 면역계를 조작하는데 추가의 수단을 제공할 필요가 있다.

또한, TNF 군의 특정 성분은, 예컨대 IL-2와 함께 사용시 치료적 항암 효과를 제공한다고 시사된 바 있다(예, 미국 특허 제5,425,940호). 하지만, 지금까지 알려진 암 치료법에는 완전히 만족할만한 방법이 없다. 현재 임상 및 연구에 일반적으로 사용되는 방법은, 예컨대 항대사물질, 알킬화제, 항생제, 일반 독소 등을 함께 사용하는 복합 화학치료법이다. 상기 약물은 암에 대해 세포독성 효과를 얻고(얻거나) 약물 내성 세포의 출현을 감소 또는 제거하며 부작용을 감소시키기 위한 목적으로 단독물 또는 조합물로 투여된다.

본 발명은 종양 괴사 인자 계열의 일원인 신규의 리간드와 폴리펩티드에 관한 것이다. 여기서 이 신규의 리간드는 "증식 유도 리간드(A Proliferation Inducing Ligand)"로서 April로 표시한다. 이 단백질 또는 수용체는 항암 용도 및/또는 면역조절 용도로 사용할 수 있다. 또한, 이들 신규 리간드의 유전자로 형질감염된 세포들은 종양, 자가면역 및 염증질환 또는 천성적인 유전 질환을 치료하기 위한 유전자 치료법에 이용될 수 있으며, 더 나아가 이들 단백질에 대한 항체를 차단하여 면역 조절용으로 사용하는 것도 가능하다.

도 1. (A) 인간 APRIL의 추론된 아미노산 서열. 이 서열에는 추론된 경막 영역(TM, 박스로 표시된 부분), 잠재적 N 결합된 글리코실화 부위(star) 및 재조합 가용성 APRIL(sAPRIL)의 N 말단이 표시되어 있다. (B) TNF 리간드 계열의 일부 구성원과 APRIL의 세포외 단백질 서열의 비교. 동일 잔기와 상동성 잔기는 각각 흑색 박스 및 검은 박스로 표시하였다. TNFα, 종양 괴사 인자 α; LTα, 림프독소α; FasL, Fas(CD95) 리간드; TRNACE, RANK 리간드.

도 2. APRIL의 발현. (A) APRIL cDNA로 탐침한 각종 인간 조직의 노던 블롯(레인 당 폴리 A+ RNA 2 ㎍). (B) 각종 종양 세포주인 전골수성 백혈병 HL60; HeLa Cell S3; 만성 골수 백혈병 K562; 림프아구 백혈병 Molt-4; 버킷 림프종 Raji; 결장직장 아데노암종 A459; 흑색종 G361 중에서의 APRIL mRNA 발현. (C) 4가지 다른 인간 종양(T) 및 정상 조직(N)에 있어서의 APRIL mRNA 발현. 18S rRNA 밴드를 통해 장입량이 동일함을 나타낸다. (D) 원시 결장 종양에서의 APRIL mRNA 발현. 동일계 하이브리드화를 통해 정상 결장 조직에 비해 인간 결장 종양에서 APRIL의 정보가 많은 것으로 나타났다. 결장 종양 조직 단편과 인접 정상 결장 조직을 안티센스 APRIL³⁵S 표지된 cRNA에 하이브리드시키고, 대조군으로 결장 종양 조직 단편은 센스 APRIL³⁵S 표지된 cRNA(음성 대조군)에 하이브리드시켰다. 상부 패널은 암시야 현미경사진이고, 하부 패널은 명시야 현미경사진이다.

도 3. 세포 증식을 자극하는 APRIL. (A) 가용성 APRIL의 첨가후 24 시간째 측정한 Jurkat(인간 백혈병 T 세포) 증식의 용량 의존적 증가. 대조군은 Fas 리간드(FasL), TWEAK 및 무 리간드(대조군)이다(좌측 패널, 세포 생육도; 우측 패널,³H-티미딘 병입률). (B) 종양 세포 성장에 대한 FLAG 태그된 APRIL의 면역고갈의 영향. FLAG 태그된 APRIL의 증식 효과는 항myc 항체가 아닌 항FLAG 항체에 의해 중화된다. (C) Raji(인간 버킷 림프종 B 세포), A20 세포(마우스 B 림프종), BJAB(인간 B 림프종), COS(개 상피 세포), MCF-7(인간 유방 아데노암종), HeLa(인간 상피양 암종) 및 ME260(인간 흑색종)의 증식율에 미치는 APRIL의 효과. (D) Jurkat 세포의 APRIL 유도 증식에 미치는 태내 송아지 혈청 농도의 영향.

도 4. 종양 성장을 가속화하는 APRIL. (A) APRIL 형질감염된 NIH-3T3 클론의 특성. 각 클론의 FLAG-APRIL 농도는 항FLAG 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 화살표는 APRIL 단백질을 가르키고 있다. 고분자량의 단백질이 비특이적으로 검출된다. (B) 모의 형질감염된 클론 보다 성장 속도가 빠른 APRIL 발현성 NIH-3T3 클론. (C) APRIL 발현성 NIH-3T3 클론에서 나타나는 종양 성장 증가. NIH-3T3 세포(1 x 10⁵세포) 및 APRIL(NIH-AP, 2종의 상이한 클론) 형질감염체(1 x 10⁶세포)를 누드 마우스에게 경피 주사하고 종양 성장을 관찰하였다.

도 5. 2개 단백질간의 상당한 동일성을 나타내는 인간 및 마우스 APRIL 아미노산 서열의 정렬. 동일 잔기는 상부에 점으로 표시하였다. 밑줄친 잔기는 잠재적 N 결합된 글리코실화 부위를 나타낸다. 개시 메티오닌이 출발 부위로 가능성이 있는 것으로 간주되지만, 인간 서열과 같이 상류에 있는 프레임내 메티오닌이 실제 출발 부위로 작용하는 것도 가능하다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 바람직한 양태들을 참고로 상세히 설명할 것이다. 본 발명은 인간 또는 마우스 APRIL, 이의 단편 및 상동체를 암호화하는 DNA 서열과 이들로 형질전환시킨 숙주내에서의 이들 DNA 서열의 발현에 관한 것이다. 본 발명은 이들 DNA 서열 및 이 서열이 암호화하는 펩티드의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 APRIL 또는 이의 단편에 대한 인간 및 마우스 아미노산 서열과 이 서열부터 유도되거나 또는 이 서열을 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 또한, 본 발명은 APRIL로 세포 성장을 자극하는 방법 또는 APRIL이나 이것의 수용체 지향성인 항체를 사용하여 종양형성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

A. 정의

본 명세서에서 사용된 "상동성"은 비교하고자 하는 분자 서열사이의 서열 유사성을 의미한다. 2개의 비교 서열내에서의 위치를 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛이 차지하는 경우, 예컨대 아데닌이 2개의 DNA 분자의 각각의 위치를 점유하고 있는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성이 있다. 2개의 서열 사이의 상동률은 2개의 서열이 공유하는 정합 또는 상동성 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나눈 후 100을 곱한 값의 함수이다. 예를 들어 2개의 서열내 10개 중 6개의 위치에서 정합성 또는 상동성이면, 2개의 서열은 60% 상동성이 있다. 일례로서, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로 2개의 서열을 비교할 때에는 최대 상동성이 제공되도록 정렬한다.

본 명세서에 사용된 "암"이란 용어는 예컨대 신장 세포암, 카포스 육종, 만성 백혈병, 유방암, 육종, 난소 암종, 직장암, 인후암, 흑색종, 결장암, 방광암, 비만세포암, 폐암, 유방 아데노암종, 인두 판상 세포 암종, 위장암 또는 위암과 같은 세포 질환을 비롯한 모든 신생물 질환을 의미한다. 바람직하게는, 암이 백혈병, 흑색종, 림프암, 유방 아데노암종 및 인두 판상 세포 암종인 것이다.

본 명세서에서 폴리펩티드의 "정제된 제제" 또는 "실질적으로 순수한 제제"는 자연 발생적인 기타 단백질, 지질 및 핵산에서 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는, 예컨대 항체, 매트릭스 등 정제하는데 사용된 다른 물질로부터 분리하는 것이 바람직하다.

"형질전환된 숙주"는 게놈내로 도입되어 안정하게 통합된 서열, 즉 APRIL을 암호하는 서열을 보유한 모든 숙주를 의미한다.

"처리"는 임의의 치료학적 처리, 예컨대 치료제 또는 물질(예, 약물)의 투여를 포함한다.

"실질적으로 순수한 핵산", 예컨대 실질적으로 순수한 DNA는 (1) 하나 또는 두개의 서열, 예컨대 암호 서열이 바로 인접하여 있지 않고, 핵산이 유래된 유기체의 자연 발생적 게놈내에 직접 인접하거나(즉 5' 말단에 하나 및 3' 말단에 하나) 또는 (2) 핵산이 유래된 유기체내에서 발생하는 핵산 서열이 거의 없는 핵산이다. 이 용어는 벡터, 예컨대 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스내로, 또는 원핵 세포나 진핵 세포의 게놈 DNA 내로 도입되거나, 또는 기타 DNA 서열과 무관한 별개의 분자(예, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 실질적으로 순수한 DNA는 APRIL을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

"펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환하여 사용된다.

"생물학적 활성"은 직접 또는 간접적으로 수행할 수 있는 생체내 또는 시험관내 활성이 있음을 의미한다. APRIL의 생물학적 활성 단편은 APRIL의 활성 부위에 대해, 예컨대 70% 이상의 아미노산 상동성, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상의 상동성이 있는 것일 수 있다. APRIL에 대한 동일성 또는 상동성은 서열 번호 2 또는 4의 APRIL 잔기와 동일한, 후보 서열에 있는 아미노산 잔기의 비율로서 정의한다.

본 명세서에서 "리간드"는 대체로 APRIL을 의미하는 것이다. 기타의 언급이 없으면 본 발명의 실시는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 돌연변이 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래 기법을 사용하며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기법은 문헌에 개시되어 있다.

개론

TNF 계열의 신규 성분인 APRIL에 대하여 본 명세서에 상세히 설명하겠다. 본 발명자들은 APRIL의 전사체는 정상 조직에서는 그 농도가 낮지만, 결장 암종, 전이 림프종 및 갑상선 종양 뿐 아니라 여러 종양 세포주에서는 다량의 mRNA가 검출된다는 것을 발견하였다. 또, 시험관내에서 재조합 APRIL의 첨가는 각종 세포주의 증식을 자극하였고, NIH-3T2 세포를 APRIL로 형질감염시킨 경우 누드 마우스에서의 종양 성장은 모의 형질감염체에 비하여 급격히 가속화되었다. 시험관내 및 생체내에서 APRIL이 종양 세포에 미치는 발현 및 성장 자극 효과는 APRIL이 종양발생에 관련이 있다는 것을 암시하는 것이다.

APRIL은 TNF 계열의 구성원 중에서, 종양 세포에서 다량으로 발현되고 다른 많은 종양 세포주의 성장을 자극하는 유일한 것으로 보인다. 따라서, APRIL의 역할이 종양발생인 것이 명백하다면, 이 APRIL에 대한 길항작용성 항체 또는 APRIL 수용체는 암치료의 새로운 지표가 될 것이다.

B. 본 발명의 DNA 서열

본 명세서에서 개시한 바와 같이, 본 발명의 제1 측면은 서열 번호 1에 개시된 DNA와 같이 APRIL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실질적으로 순수한(또는 재조합) 핵산 및/또는 이 핵산의 등가물을 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용된 핵산은, 예컨대 작용적으로 등가인 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 단편 및 등가물을 포함할 수 있다. 등가 뉴클레오티드 서열은 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 상이한 서열, 예컨대 대립유전자 변형체, 돌연변이 등을 포함하고, 유전자 암호의 축퇴성에 기인하여 서열 번호 1에 개시된 APRIL을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 다른 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 일반적으로 인간 서열에 대하여 기술하고 있지만, 인간과 높은 상동성이 있는 다른 종 유래의 APRIL을 암호하는 마우스 서열 역시 본 발명에 포함된다는 것은 당업자라면 충분히 이해할 것이다. 인간 단백질은 TNF 계열의 모든 특성, 즉 II형 막 단백질 조직화 및 TNF 역평행 β시이트 구조로 단백질을 중첩시키는데 관련된 서열 모티프의 보존과 같은 특성을 가지는 것으로 보인다.

본 발명의 서열을 사용하여 APRIL, 이의 단편이나 유도체와 밀접한 관련이 있는 DNA 서열의 존재에 대해 천연 및 합성 DNA의 각종 수거물을 검색하는데 유용한 일련의 DNA 프로브를 제조할 수 있다. 당업자는 본 명세서에서 APRIL라고 하면 이의 생물학적 활성 유도체, 단편 또는 상동체를 언급하는 것임을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 APRIL을 암호화하는 DNA 서열을 사용하여 이 서열로 형질전환된 각종 원핵 숙주 및 진핵 숙주에서 발현시 본 발명의 펩티드를 생성할 수 있다. 이들 펩티드는 항암 용도 및 면역 조절 용도로 사용될 수 있다. 일반적으로, 이 방법은 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된, APRIL을 암호화하는 서열을 함유하는 DNA 분자로 형질전환된 숙주를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 DNA 서열 및 재조합 DNA 분자는 각종 숙주/벡터 조합체를 사용하여 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 유용한 벡터는 염색체, 비염색체 또는 합성 DNA 서열의 분절로 구성할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 벡터내로 삽입된 APRIL DNA 서열에 작동가능하게 결합되어 DNA 서열의 발현을 제어 및 조절할 수 있는 하나 이상의 발현 제어 서열을 특징으로 한다.

또한, 각 발현 벡터내에는 본 발명의 서열을 삽입할 수 있는 각종 부위가 선택될 수 있다. 이 부위는 이를 절단하는 제한 엔도뉴클레아제로 표시되는 것이 일반적이며, 이들 부위 및 엔도뉴클레아제는 당업자라면 잘 알 수 있을 것이다. 본 발명에 유용한 발현 벡터는 소정의 DNA 단편의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 반드시 가질 필요는 없다는 것은 자명한 것이다. 대신, 벡터는 별도의 수단으로 단편을 클로닝할 수 있다. 발현 벡터, 특히 선택된 DNA 단편의 도입을 위한 부위 및 발현 제어 서열에 대한 DNA 단편의 작동가능한 결합은 각종 인자에 따라 결정한다. 이들 인자의 비제한적인 예로는, 발현하고자 하는 단백질의 크기, 숙주 세포 효소에 의한 단백분해적 붕괴에 대한 목적하는 단백질의 감수성, 특정 제한 효소에 대해 감수성인 다수의 부위, 정제 과정에서 제거되기 어려운 것으로 판명된 숙주 세포 단백질의 오염 또는 발현될 단백질과의 결합이 있다. 고려할 수 있는 추가의 인자로는 벡터 서열에 대한 개시 및 종지 코돈의 위치와 같은 발현 특성 및 당업자들이 알 수 있는 기타 인자가 있다. 본 발명의 DNA 서열에 대한 벡터 및 삽입 부위는 이들 인자의 조화를 고려하여 선택하며, 모든 선택이 목적 용도에 동일하게 효과적이지는 않다. 그러나, 이들 인자를 분석하고 특정 용도에 따라 적절한 계를 선택하여 분석하는 것은 당업자들에게는 자명할 것이다.

당업자라면 고레벨의 단백질 발현을 얻기 위해서 발현 제어 서열을 적절히 변형, 즉 코돈 치환하거나, 또는 특정 유기체가 선호하여 사용하는 특정 아미노산에 대한 코돈을 선택하여 단백질 분해를 최소화하거나 또는 글리코실화 조성을 변화시킨다. 유사하게, 시스테인을 기타 아미노산으로 변화시켜 생성, 중첩 및 안정성 문제를 단순화할 수 있다.

따라서, 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 있어 모든 숙주/발현 벡터 조합체가 동일한 효과를 나타내는 것은 아니다. 그러나, 당업자라면 숙주/발현 벡터 조합체를 특별히 선택할 수 있다. 인자로는, 예컨대 숙주 및 벡터의 적합성, DNA 서열이 암호화하는 단백질의 숙주에 대한 독성, 목적 단백질의 회수 용이성, DNA 서열의 발현 특성 및 이에 작동가능하게 결합된 발현 제어 서열, 생체안전성, 비용 및목적 단백질의 중첩, 형태 또는 기타 필요한 발현후 변형을 고려할 수 있다.

본 발명의 서열로 형질전환된 숙주가 생성한 APRIL 뿐 아니라 본 발명의 과정으로 정제하거나 또는 본 발명의 아미노산 서열로부터 생성된 천연 APRIL은 각종 조성물과 항암, 항종양 및 면역 조절 용도에 유용하다. 또한, 이들 APRIL은 기타 질병에 대한 치료 및 방법에도 유용하다.

또한, 본 발명은 비정상적인 조건하에서, 예컨대 유전자 요법 세팅에서 APRIL을 발현시키는, 본 명세서에 개시된 DNA 서열의 용도에 관한 것이다. 또한, APRIL은 이러한 용도에 적절한 프로모터의 유도하에 종양 세포에서 발현할 수 있다. 이러한 발현은 항종양 면역 반응을 증가시키거나 또는 종양의 생존에 직접 영향을 미칠 수 있다. 또한, APRIL은 국부 면역 반응을 변화시켜 기관 이식편의 생존에 영향을 줄 가능성이 있다. 이 경우, 이식편 자체 또는 그 주변 세포는 APRIL을 암호화하는 유전자 조작된 유전자로 변형된다.

본 발명의 또 다른 측면은 "안티센스" 요법에서 APRIL을 암호화하는 분리된 핵산의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 "안티센스" 요법은 목적 APRIL 서열을 암호화하는 세포 mRNA 및/또는 DNA와 세포 조건하에 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유도체를 투여 또는 동일계 생성시켜 전사 및/또는 해독을 억제하여 암호화된 단백질의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다. 결합은 종래의 염기쌍 상보성으로 이루어지거나 또는 예컨대 DNA 이중체에 대한 결합인 경우에는 이중 나선의 주요 홈내 특정 결합을 통해 이루어질 수 있다. 일반적으로, "안티센스" 요법은 당업계에 일반적으로 사용되는 기술 범위를 의미하며, 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 특이적 결합에 좌우되는 임의의 치료를 포함한다.

본 발명의 안티센스 작제물은, 예컨대 세포내 전사될 때 APRIL을 암호화하는 세포 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 RNA를 생성하는 발현 플라스미드로서 전달할 수 있다. 대안적으로, 안티센스 작제물은 생체외 생성된 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브는 내인성 뉴클레아제에 내성이 있는 변형된 올리고뉴클레오티드가 바람직하고, 따라서, 생체내에서 안정하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위한 핵산 분자의 예로는 DNA의 포스포아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체가 있다(예컨대, 5,176,996, 5,264,564, 및 5,256,775 참조). 또한, 안티센스 요법에 유용한 올리고머를 작제하는데 있어서 일반적인 방법은, 예컨대 본원에서 참고로 인용한 문헌[Van Der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976; and Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668]에 검토되어 있다.

C. APRIL 및 이의 아미노산 서열

전술한 바와 같이 APRIL은 TNF 계열의 구성원이다. 이 단백질, 이 APRIL의 단편 또는 상동체에는 광범위한 진단 및 치료적 이용 가능성이 있다.

APRIL의 정확한 3차원 구조는 해명되지 않았지만, TNF 계열의 구성원으로서 이 계열의 기타 구성원과 특정 구조적 특성을 공유할 수 있는 것으로 추정된다.

본 발명의 APRIL 서열은 인간 TNF 계열의 다른 구성원과 비교해 볼때 상당한 구조적 유사성이 있는 것으로 나타난다. 이 단백질들은 모두 세포외 도메인에서 여러 서열 보전 영역을 공유한다. APRIL 중 세포외 도메인의 전체 서열 상동성은 도 2에 도시된 바와 같이 FasL(21% 아미노산 동일성), TNFα(20%), 그 다음 LT-β, TRAIL, TWEAK 및 TRANCE(15%) 순으로 최고 상동성을 나타낸다.

본 발명의 신규 폴리펩티드는 아직 확인되지 않은 수용체와 특이적으로 상호작용한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 펩티드 및 방법으로 APRIL-리간드 또는 이의 단편과 특이적으로 상호작용하는 수용체를 확인할 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명은 수용체에 결합하는 능력이 있는 APRIL-리간드로부터 유래된 펩티드를 포함한다. APRIL의 단편은 여러 방법, 예컨대 재조합, PCR, 단백분해 또는 화학적 합성으로 생성할 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 말단 단편은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단으로부터 1 이상의 뉴클레오티드를 제거하여 생성할 수 있다. 돌연변이화된 DNA를 발현시키면 폴리펩티드 단편이 생성된다.

또한, 폴리펩티드 단편은 종래의 Merrifield 고상 f-moc 또는 t-boc 화학과 같은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 및 DNA 서열은 단편의 중첩이 없는 소정 길이의 단편으로 분할하거나, 또는 소정 길이의 중첩 단편으로 임의 분할할 수 있다. 이와 같은 방법은 후술되어 있다.

D. APRIL의 가용성 형태 생성

APRIL의 가용성 형태는 종종 효과적으로 신호를 발생하여 천연 막 형태를 모방하는 약물로서 투여할 수 있다. 본 명세서에서 청구한 APRIL은 가용성 시토킨으로서 자연적으로 분비될 수 있지만, 만일 그렇지 않다고 해도 유전자를 재조작하여 분비되게 할 수 있다. APRIL의 가용성 분비형을 형성하기 위해서는, DNA 레벨에서 N-말단 경막 영역 및 일부 병부 영역을 제거하고, 선택된 발현계에서 효과적인 단백분해 절단을 허용하는 I형 리더 서열 또는 대안적으로 II형 리더 서열로 이를 대체한다. 당업자는 분비 발현 작제물에 보유된 병부 영역의 양을 다양하게 하여 수용체 결합 특성 및 분비 효과를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 모든 가능한 병부 길이를 포함하는 작제물, 즉 N 말단 절두물을 제조하여 아미노산 81 내지 139에서 개시하는 단백질을 얻을 수 있다. 최적 길이의 병부 서열은 이 유형의 분석으로부터 얻어진다.

E. APRIL과 반응성인 항체 생성

또한, 본 발명은 APRIL 또는 이의 수용체와 특이적으로 반응하는 항체를 포함한다. 항단백질/항펩티드 항혈청 또는 모노클론 항체는 표준 프로토콜로 만들 수 있다[예컨대 Antibodies: A Laboratory Manual ed., Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). 마우스, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유류를 펩티드의 면역원성 형태로 면역화시킬 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 방법으로는 당업계에 공지된 담체에의 접합법, 또는 기타 방법이 있다.

APRIL 또는 이의 수용체의 면역원성 부분은 보조제의 존재하에 투여할 수 있다. 면역화의 발생은 혈장 또는 혈청에 존재하는 항체 역가의 검출로 모니터링할 수 있다. 항원으로서 면역원과 함께 표준 ELISA 또는 기타 면역분석법을 이용하여 항체 레벨을 평가할 수 있다.

바람직한 양태에서, 목적 항체는 APRIL 또는 이의 수용체의 항원성 결정인자, 예컨대 서열 번호 2에 기재된 폴리펩티드의 항원성 결정인자, 또는 밀접하게 관련된 인간이나 비인간 포유류 상동체(예, 70, 80 또는 90% 상동성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성)에 대해 면역특이적이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항APRIL 또는 항APRIL-수용체 항체는, 예컨대 서열 번호 2의 서열에 대해 80% 미만의 상동성, 바람직하게는 서열 번호 2의 서열에 대해 90% 미만의 상동성, 가장 바람직하게는 서열 번호 2의 서열에 대해 95% 미만의 상동성이 있는 단백질과 실질적으로 교차 반응(즉, 특이적으로 반응)하지 않는다. "실질적으로 교차 반응하지 않는다"는 것은 항체가 서열 번호 2에 기재된 단백질에 대한 결합 친화도가 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만, 더욱 더 바람직하게는 1% 미만인 비상동성 단백질에 대해 결합 친화도가 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 항체는 APRIL 또는 이의 수용체와 특이적으로 반응하는 이의 단편을 포함하고자 하는 것이다. 항체를 종래 기법으로 단편화하고, 그 단편을 전체 항체에 대해 전술한 바와 동일한 방식으로 유용성에 대해 검색할 수 있다. 예를 들어, F(ab')₂단편은 펩신으로 항체를 처리하여 생성할 수 있다. 그 결과 생성된 F(ab')₂단편을 디설파이드 가교를 환원시키는 처리를 하면 Fab' 단편을 생성할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항APRIL 활성 또는 항APRIL-수용체 활성이 있는 생체특이적인 키메라 분자를 포함한다. 따라서, APRIL 및 이의 수용체에 대해 유도된 모노클론 및 폴리클론 항체와, Fab' 및 F(ab')₂와 같은 항체 단편을 사용하여 APRIL 및 이의 각 수용체의 작용을 차단할 수 있다.

각종 형태의 항체는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 만들 수 있다[본원에서 참고로 인용된 Winter and Milstein, Nature 349:293-299 (1991)]. 예를 들어, 동물 항체로부터 유래한 항원 결합 도메인을 인간 불변 도메인에 결합시켜 키메라 항체를 작제할 수 있다[예컨대 문헌(Cabilly et al., 미국 특허 4,816,567호) 참조]. 키메라 항체는 인간 임상 치료에 사용되는 경우 동물 항체가 유발하는 관찰된 면역원성 반응을 감소시킬 수 있다.

또한, APRIL 또는 이의 수용체를 인식하는 재조합 "인간화된 항체"를 합성할 수 있다. 인간화된 항체는 특정 항원 결합을 담당하는 영역이 삽입된 대부분의 인간 IgG 서열을 포함하는 키메라이다. 당해 항원으로 동물을 면역화시키고, 해당 항체를 분리하여, 특정 항원 결합을 담당하는 가변 영역 서열의 일부를 제거한다. 동물에서 유래된 항원 결합 영역을, 항원 결합 영역이 결실된 인간 항체 유전자의 적절한 위치내로 클로닝한다. 인간화된 항체는 인간 항체내에 사용되는 이종 서열(즉, 내부 종)을 최소화하는 바, 치료 검체에 의해 면역 반응이 유발될 가능성이 적다.

상이한 부류의 면역글로불린으로부터 분리한 가변 도메인 및 인간 불변 도메인(CH1, CH2, CH3)을 포함하는 키메라 항체 또는 인간화된 항체를 제조함으로써 상이한 부류의 재조합 항체를 작제할 수도 있다. 예를 들어, 항원 결합 부위 수가 증가한 항체는 항원 결합 부위를 인간:쇄 불변부를 보유하는 벡터내로 클로닝하여 재조합적으로 생성할 수 있다[참고로 인용된 문헌(Arulanandam et al., J.Exp.Med., 177:1439-1450(1993)].

또한, 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 항원 결합 부위 부근의 아미노산 잔기를 변화시켜 항원과 재조합 항체의 결합 친화도를 변화시킬 수 있다. 인간화된 항체의 항원 결합 친화도는 분자 모델링을 기초로 한 돌연변이 유발로 증가시킬 수 있다[참고로 인용한 문헌(Queen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 86:10029-33(1989)].

F. 유사체 형성: 변화된 DNA 및 펩티드 서열의 생성

본 발명에서 청구하고 있는 APRIL-리간드의 유사체는 아미노산 서열에 있어, 또는 서열이 관련되지 않는 측면에 있어, 또는 상기 2가지 점 모두에 있어서 자연 발생적 리간드와 다를 수 있다. 비서열적 변형은 APRIL의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도체화를 포함한다. 비서열적 변형의 비제한적인 예로는, 아세틸화, 메틸화, 인산화, 카르복실화 또는 글리코실화 변화가 있다.

바람직한 유사체로는 APRIL 또는 생물학적 활성 단편을 포함하는 것으로서, 이 서열은 하나 이상의 보존성 아미노산 치환, 또는 APRIL의 생물학적 활성을 없애지 않는 하나 이상의 비보존성 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 서열 번호 2에 기재된 서열과는 다르다. 통상적으로 보존성 치환은 하나의 아미노산을, 유사한 특징이 있는 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대 다음 군내에서의 치환을 포함한다. 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소로이신, 로이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.

보존성 아미노산 치환

아미노산	코드	치환가능한 아미노산
알라닌	A	D-Ala, Gly, β-Ala, L-Cys, D-Cys
아르기닌	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
아스파라긴	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln.
아스파르트산	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
시스테인	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
글루타민	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
글루탐산	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
글리신	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Ala, Acp
이소로이신	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
로이신	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
리신	K	D-Lys, Arg, D-Arg, Homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
메티오닌	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
페닐알라닌	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp,트랜스-3, 4, 또는 5-페닐프롤린, 시스-3, 4, 또는 5-페닐프롤린
프롤린	P	D-Pro, L-I-티아졸리딘-4-카르복실산, D-1-옥사졸리딘-4-카르복실산, L-1-옥사졸리딘-4-카르복실산
세린	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
트레오닌	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
티로신	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
발린	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

유용한 돌연변이 유발 방법으로는 후술하는 PCR 돌연변이 유발법 및 포화 돌연변이 유발법이 있다. 무작위 아미노산 서열 변형체의 라이브러리는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열 세트의 합성으로 생성할 수 있다.

PCR 돌연변이 유발법

PCR 돌연변이 유발법에서, 감소된 Taq 폴리머라제 충실도를 사용하여 DNA의 클로닝된 단편내로 무작위 돌연변이를 도입할 수 있다(Leung et al., 1989, Technique 1:11-15). 이는 무작위 돌연변이를 유발하는 매우 강력하고 상대적으로 신속한 방법이다. 돌연변이화하고자 하는 DNA 영역을, Taq DNA 폴리머라제로 DNA 합성의 충실도를 감소시키는 조건하에서, 예컨대 dGTP/dATP 비율을 5로 하고 PCR 반응물에 Mn²⁺을 첨가하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시킬 수 있다. 증폭된 DNA 단편의 푸울은 적절한 클로닝 벡터내로 삽입하여 무작위 돌연변이 라이브러리를 제공할 수 있다.

포화 돌연변이 유발법

포화 돌연변이 유발법은 다수의 단일 염기 치환체를 클로닝된 DNA 단편내로 신속하게 도입시킬 수 있다(Mayers et al., 1985, Science 229:242). 이 기법은, 예컨대 시험관내 1본쇄 DNA의 화학 처리 또는 조사에 의한 돌연변이 생성 및 상보성 DNA쇄의 합성을 포함한다. 돌연변이 빈도는 처리의 경중을 조절함으로써 조정가능하며, 거의 모든 가능한 염기 치환체를 얻을 수 있다. 이 절차는 돌연변이 단편에 대한 유전자 선별을 포함하지 않기 때문에, 중성 치환체를 얻을 수 있을 뿐 아니라 작용을 변화시키는 DNA의 무작위 돌연변이 유발법으로 단백질의 중성 치환체도 제조될 수 있다. 점 돌연변이의 분포는 보존된 서열 성분 쪽으로 편중되지 않는다.

축퇴성 올리고뉴클레오티드

상동체 라이브러리는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열의 세트로부터 형성할 수 있다. 축퇴성 서열의 화학 합성은 자동화 DNA 합성기에서 수행한 다음, 합성 유전자를 적절한 발현 벡터내로 결찰시킨다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다^xxx. 이러한 기법은 기타 단백질의 지향성 진화에 사용되었다^xxxi.

비무작위 또는 지향성 돌연변이 유발법을 사용하여 특정 영역에 특정 서열 또는 돌연변이를 제공할 수 있다. 이들 기법을 사용하여, 예컨대 단백질의 공지된 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 변형체를 생성할 수 있다. 돌연변이 부위는, 예컨대 (1) 보존된 아미노산으로 먼저 치환한 다음 얻은 결과에 따라 더 많은 라디칼을 선택하거나, (2) 표적 잔기를 결실시키거나, 또는 (3) 위치된 부위에 인접하게 동일하거나 상이한 부류의 잔기를 삽입하거나, 또는 (1) 내지 (3)을 조합하여 개별적으로 또는 연속하여 변형시킬 수 있다.

알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법

알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법은 돌연변이 유발에 바람직한 위치 또는 도메인인 소정 단백질의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법이다[Cunningham 및 Wells의 문헌(Science 244:1081-1085, 1989) 참조]. 알라닌 스캐닝법에서, 표적 잔기의 기 또는 잔기를 확인하고(예, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환한다. 아미노산의 치환은 세포 안 또는 밖의 주변 수성 환경과 아미노산의 상호작용에 영향을 줄 수 있다. 치환에 대해 작용적 민감성을 나타내는 이들 도메인은, 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가 또는 기타 변형체를 도입하여 개조할 수 있다. 따라서, 아미노산 서열 변형체의 도입 부위를 미리 정하지만, 돌연변이 그 자체의 특성을 미리 정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정 부위의 돌연변이의 성능을 최적화하고자 하는 경우에는, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이법을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 소정의 단백질 서브 유닛 변형체를 목적 활성의 최적 조합에 대해 검색한다.

올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이 유발법

올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이 유발법은 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변형체를 제조하는데 유용한 방법이다[예컨대, Adelman 등의 문헌(DNA 2:183, 1983) 참조]. 간단히 요약하면, DNA 주형에 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화시켜 목적 DNA를 변화시킬 수 있다. 이 때, 주형은 목적 단백질의 비변화 또는 천연 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 또는 박테리오파지의 1본쇄 형태이다. 하이브리드화 후에, DNA 폴리머라제를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입하고 목적 단백질의 DNA에 선택된 변화를 암호화하는 주형의 완전한 제2 상보성 가닥을 합성한다. 일반적으로, 길이가 25 이상의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 최적 올리고뉴클레오티드는 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드의 어느 한쪽에 있는 주형에 완전히 상보적인 12∼15 뉴클레오티드를 보유하는 것이다. 이로서 올리고뉴클레오티드는 1본쇄 DNA 주형 분자에 적절히 하이브리드화하게된다. 올리고뉴클레오티드는 참고로 인용한 Crea 등의 문헌[Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 75:5765(1978)]에 개시된 기법을 사용하여 쉽게 합성한다.

카세트 돌연변이 유발법

변형체를 제조하는 또 다른 방법인 카세트 돌연변이 유발법은 본원에서 참고로 인용한 Wells 등의 문헌[Gene, 34:315(1985)]에 개시된 기법을 기초로 한다. 출발 물질은 돌연변이시키고자 하는 단백질 서브유닛 DNA를 포함하는 플라스미드(또는 기타 벡터)일 수 있다. 돌연변이시키고자 하는 단백질 서브 유닛 DNA내 코돈(들)을 확인한다. 확인된 돌연변이 부위(들)의 각 측면에 고유의 제한 엔도뉴클레아제 부위가 있어야 한다. 이러한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 소정의 단백질 서브 유닛 DNA내 적절한 위치에 그 부위를 도입시키는 전술한 올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이 유발법을 사용하여 제한 부위를 생성할 수 있다. 제한 부위를 플라스미드내로 도입한 후에, 플라스미드를 이들 부위에서 절단하여 선형화한다. 제한 부위 사이의 DNA 서열을 암호화하지만 목적 돌연변이(들)를 포함하는 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 표준 절차로 합성한다. 2개의 쇄를 별도로 합성하여 표준 기법으로 함께 하이브리드화한다. 이 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 카세트라고 칭한다. 이 카세트는 선형화된 플라스미드의 말단에 대응되는 3' 및 5' 말단을 가지도록 고안하여, 플라스미드에 직접 결찰시킬 수 있다. 이제 이 플라스미드는 돌연변이된 목적 단백질 서브유닛 DNA 서열을 포함하게 된다.

조합 돌연변이 유발법

조합 돌연변이 유발법을 사용하여 돌연변이체를 형성시킬 수 있다. 예컨대, 상동성 그룹 또는 기타 관련 단백질에 대한 아미노산 서열을 정렬하여, 바람직하게는 최대 상동성 확률을 높인다. 정렬된 서열의 소정 위치에서 나타나는 모든 아미노산을 선택하여 조합 서열의 축퇴성 세트를 형성할 수 있다. 변화를 가한 변형체의 라이브러리는 핵산 레벨에서 조합 돌연변이 유발로 생성하고, 변형된 유전자 라이브러리로 암호화한다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열내로 효소적으로 결찰시켜 잠재 서열의 축퇴성 세트를 개별 펩티드로서 발현가능하게 하거나, 또는 대안적으로 축퇴성 서열 세트를 포함하는 보다 큰 융합 단백질 세트로서 발현가능하게 한다.

생성된 돌연변이 유전자 생성물을 검색하는데 있어서의 각종 기법이 공지되어 있다. 대형 유전자 라이브러리를 검색하는 기법은 종종, 유전자 라이브러리를 복제성 발현 벡터내로 클로닝하는 단계, 벡터의 생성 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키는 단계 및 목적 활성의 검출, 예컨대 이 경우에는 APRIL-리간드 또는 이의 수용체에 대한 결합이 생성물을 검출하는 유전자를 암호화하는 벡터를 상대적으로 쉽게 분리하게 하는 조건하에서 유전자를 발현하는 단계를 포함한다. 하기 기재하는 각각의 기법은, 예컨대 무작위 돌연변이 유발법에 의해서 형성된 다수 서열을 검색하는데 있어서 고 작업 처리량으로 분석할 수 있다.

본 발명은 청구된 폴리펩티드 또는 이의 수용체의 단백질 결합 도메인을 환원시켜 모조물, 예컨대 펩티드 또는 비펩티드 제제를 형성한다. 펩티드 모조물은 APRIL과 이의 각 수용체의 결합을 파괴할 수 있다. 하방 세포내 단백질 또는 수용체 폴리펩티드의 분자 인식과 관련된 APRIL의 주요 잔기를 결정하고 APRIL과 수용체의 결합을 경쟁적으로 또는 비경쟁적으로 억제하는 APRIL 또는 이의 수용체 유래의 펩티드모조물을 형성할 수 있다. [예컨대 본원에서 참고로 인용한 "Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to retinoblastoma gene proetin" 유럽 특허 출원 EP-412,762A 및 EP-B31,080A].

이용가능한 정제된 재조합 APRIL을 제조함으로써, 본 발명은 정상 세포 작용, 이 경우에는 APRIL 또는 이의 수용체의 작동물질 또는 길항물질인 약물 후보를 선별하는데 사용할 수 있는 분석법을 제공한다. 일양태에서, 이 분석법은 APRIL과 이의 수용체 사이의 결합을 조절하는 화합물의 능력을 평가한다. 각종 분석 형식이 있지만, 본 발명의 견지에서 당업자라면 충분히 선택 이용할 수 있을 것이다.

화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 시험하는 여러 약물 검색 프로그램에서는, 주어진 기간동안 조사되는 화합물의 수를 최대화하기 위해서 높은 작업 처리량 분석법이 바람직하다. 정제 단백질 또는 반정제 단백질을 이용하여 실시할 수 있는 것과 같은 무세포계에서 수행되는 분석은, 시험 화합물이 매개하는 분자 표적내 변화를 급속하게 형성하여 상대적으로 쉽게 검출될 수 있다는 점에서 종종 "1차" 검색으로서 선호된다. 더구나, 시험 화합물의 세포 독성 및/또는 생체 적합성의 영향은 일반적으로 시험관내 계에서는 무시되며, 대신에 이 분석은 주로 분자 표적의 효소 특성의 변화 또는 기타 단백질과의 결합 친화도 변화에서 명백히 알 수 있는 분자 표적에 대한 약물의 효과에 주로 집중되어 있다.

APRIL에 결합하는 수용체 분리

TNF 계열의 리간드를 사용하여 수용체를 확인하고 클로닝할 수 있다. 개시된 APRIL 서열을 이용하여 수용체 결합 서열을 구성하는 세포외 도메인의 5' 말단을 마커 또는 태그 서열에 융합한 다음, 다수의 임의 발현계에서 APRIL을 분비시키는 리더 서열을 첨가한다. 이 기법의 일례는 Browning 등의 문헌[(1996) (JBC 271, 8618-8626)]에 개시되어 있으며, 여기서 LT-β 리간드는 그러한 형태로 분비되었다. VCAM 리더 서열은 짧은 myc 펩티드 태그와 LT-β의 세포외 도메인에 차례로 커플링시켰다. VCAM 서열을 사용하여 정상적으로 막 결합된 LT-β 분자를 분비시켰다. 분비된 단백질은 수용체에 결합하는 능력이 손상되지 않은 N-말단상에 myc 태그를 보유한다. 이러한 분비 단백질은 일시적으로 형질감염된 Cos 세포 또는 유사계, 예컨대 EBNA 유래 벡터, 곤충세포/바큘로바이러스, 피치아(picchia) 등에서 발현될 수 있다. 비정제 세포 상청액을 태그된 리간드의 공급원으로서 사용할 수 있다.

수용체 발현 세포는 태그된 리간드에 이 세포를 노출시켜 확인할 수 있다. 결합된 리간드를 보유한 세포는, myc 태그를 항myc 펩티드 항체(9E10)와 피코에리트린(또는 유사한 라벨)으로 표지된 항마우스 면역글로불린으로 차례로 표지하여 FACS 실험에서 확인한다. FACS 양성 세포를 쉽게 동정할 수 있으며, 이는 수용체를 암호화하는 RNA의 공급원으로 작용가능하다. 그 다음 이 RNA로부터 발현 라이브러리를 표준 기법으로 제조하고 푸울로 분리하였다. 클론의 푸울을 이용하여 적절한 숙주 세포를 형질감염시키고, 수용체 양성 형질감염된 세포에 태그된 리간드의 결합을 효소 표지된 항마우스 Ig 시약, 즉 갈락토시다제, 알카리 포스파타제 또는 루시퍼라제 표지된 항체로 결합된 myc 펩티드 태그를 표지한 다음 현미경 검사를 통해 결정하였다. 일단 양성 푸울이 확인되면, 푸울 크기는 수용체를 암호화하는 cDNA가 학인될 때까지 감소시킨다. 이 절차는 수용체를 더 용이하게 유도할 수 있으므로 마우스 또는 인간 APRIL을 사용하여 수행할 수 있다.

G. 치료 방법 및 약학 조성물

본 발명의 암 치료 방법은 환자, 바람직하게는 개, 고양이 또는 인간과 같은 포유류 숙주에게 APRIL과 이의 수용체간의 결합을 방해할 수 있는차단 제제를 포함하는 본 발명의 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 차단 제제로는 가용성 APRIL, 항APRIL 항체, 항APRIL 수용체 항체 또는 이것의 생물학적 활성 단편을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 또한, APRIL의 억제 형태는 APRIL과 이의 수용체 간의 결합을 차단하는 특성은 유지하는 한 APRIL을 돌연변이시켜 제조할 수 있다. 바람직하게는, 차단 제제는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 작제될 수 있는 수용체 IG 융합 단백질을 포함하는 것이 좋다.

이러한 본 발명의 방법은 신장 세포암, 카포스 육종, 만성 백혈병, 유방암, 육종, 난소 암종, 직장암, 인후암, 흑색종, 결장암, 방광암, 비만세포종, 폐암, 유방 아데노암종, 인두 판상 세포 암종, 위장암 또는 위암과 같은 세포 질환을 비롯한 모든 암을 치료하는 데 유용하다. 또한, 이러한 차단 제제는 종양으로 간주되지는 않는 증식 질환, 즉 공피증, 류마티스성 관절염중의 판누스 형성, 수술후 반흔 및 폐, 간 및 자궁 섬유증과 같은 세포 이상증식(과형성)의 치료에 유용하다.

본 발명의 약학 조성물은 APRIL이나 이의 수용체, 또는 이의 단편이나 모조물의 치료학적 유효량을 포함할 수 있으며, 임의로 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 약학적 유효량의 본 발명의 화합물이나 약학적 허용 염 또는 유도체를 투여하여 암 치료, 면역계 또는 이의 일부를 자극하는 방법, 특정 경우에는 억제하는 방법을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 각종 치료에 대한 기타 요법과 함께 사용할 수 있음은 당연하다.

조성물은 전신, 국소 또는 국재적 투여를 비롯하여 각종 투여 경로용으로 제형화할 수 있다. 전신 투여용으로, 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하 주사가 바람직하며, 본 발명의 조성물은 액체 용액, 바람직하게는 항크스액 또는 링거액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액내에 제형화할 수 있다. 또한, 조성물은 고체 형태로 제형화할 수 있고, 임의로 사용 직전에 재용해 또는 현탁시킨다. 동결건조된 형태도 본 발명에 포함된다.

조성물은 경구 투여하거나, 또는 경점막 또는 경피 수단으로 투여할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해서, 침투될 배리어에 적절한 침투물을 조제시 사용할 수 있다. 이러한 침투물은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 경점막 제제용로는 담즙염, 푸시드산 유도체 및 세정제가 있다. 경점막 투여에는 비강 분무 또는 좌약을 사용할 수 있다. 경구 투여용으로는, 캡슐, 정제 및 강장제와 같은 종래의 경구 투여 형태로 조성물을 제형화한다. 국소 투여용의 경우에는, 본 발명의 조성물을 당업계에 공지된 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화한다.

투여량 및 투여 섭생은 암의 종류, 환자 및 환자의 병력에 따라 달라진다. 투여량은 암을 치료, 억제 또는 암의 진행을 변화시키는데 효과적이어야 한다. 투여량은 단위 용량 또는 복수 용량 형태일 수 있다. 복수 용량의 형태가 바람직하여 이용되는 경우에, 투여 횟수는 숙주의 종류, 암 종류 및 투여량 등에 따라 달라진다. 1회 또는 치료 기간에 걸쳐 투여되는 활성 화합물의 양은 여러 인자, 예를 들어, 대상의 연령 및 크기, 치료하고자 하는 질병의 경중 및 경과, 투여 방식 및 형태와 치료 의사의 판단에 좌우된다. 그러나, 유효량은 1일 1kg당 약 0.005∼약 5 ㎎, 바람직하게는 약 0.05∼약 0.5 ㎎이다. 가장 효과적인 투여량은 환자에게 무독성이며 종양을 완전 억제하거나 종양을 소멸시키는 양이다. 당업자라면 이 범위보다 더 낮거나 또는 높은 용량 역시 유용할 수 있다는 것을 잘 알고 있다.

본 발명의 유전자 작제물은 APRIL의 작동물질 또는 길항물질 형태를 암호화하는 핵산을 전달하기 위한 유전자 요법 프로토콜의 일부로서 사용할 수 있다.

APRIL의 발현 작제물은 임의의 생물학적 유효 담체내에서, 예컨대 생체내에서 APRIL에 대한 유전자를 세포내로 효과적으로 전달할 수 있는 임의의 제제 또는 조성물로 투여할 수 있다. 세포를 직접 형질감염시킬 수 있는 바이러스 벡터내 유전자를 삽입하거나, 또는 예컨대 리포좀 또는 세포내 담체의 보조하에 플라스미드 DNA를 전달하는 방법 뿐 아니라, 유전자 작제물을 직접 주입하는 방법도 포함한다. 바이러스 벡터 전달 방법이 바람직하다.

유전자 요법 작제물의 약학 제제는 허용가능한 희석제 중의 유전자 전달계로 주로 구성될 수 있거나, 유전자 전달 매개체가 매립된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달계가 재조합 세포(예, 레트로바이러스 벡터)로부터 완전하게 생성될 수 있는 경우, 약학 제제는 유전자 전달계를 생성하는 1 이상의 세포를 포함할 수 있다.

치료용으로 사용하는 것외에, 본 발명의 올리고머는 진단 시약으로서 사용하여 이들 올리고머가 특이적으로 결합하는 표적 DNA, RNA 또는 아미노산 서열의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 또 다른 양태에서, 청구된 본 발명을 이용하여 APRIL 또는 이의 단편과의 결합 또는 물리적 회합과 같은 상호작용 능력이 있는 화학적 실체를 평가 선별할 수 있다. 이 방법은 APRIL과 화학적 실체를 접촉하는 단계, APRIL과 상호작용하는 실체의 능력을 평가하는 단계를 포함한다. 또한, APRIL은 자연 발생적 APRIL 또는 APRIL 수용체를 평가하는 방법, 뿐 아니라 APRIL 수용체와 회합 또는 결합하는 화학적 실체를 평가하는 방법에도 사용할 수 있다. APRIL 리간드-APRIL 수용체 상호작용을 차단하는 제제를 선별하기 위한 목적과 같이 수용체에 대한 APRIL 결합 검출 또는 수용체 양성 세포에 대한 APRIL 결합 검출을 용이하게 하고자 하는 경우에는 APRIL의 태그화된 형태를 사용하는 것이 좋다. 또한, APRIL 활성을 차단하는 분자를 선별하기 위한 선별 분석법에 기본적으로 성장률이 증가된 APRIL 형질감염된 세포주를 이용할 수도 있다.

특정 양태에서, 본 발명은 APRIL 및 이의 각 수용체 사이의 상호작용을 조절하는 능력이 있는 화학적 실체를 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법은 쌍이 상호작용할 수 있는 조건하에서 APRIL과 APRIL 수용체를 혼합하고, 평가하고자 하는 화학적 실체를 첨가하고 복합체의 형성 또는 용해를 검출하는 단계를 포함한다. 이 조절 제제는, 예컨대 무세포계내 활성을 시험하고, 경우에 따라 세포 또는 동물에 화합물을 투여하고 그 효과를 평가하여 시험관내에서 추가로 평가할 수 있다.

발명의 개요

따라서, 본 발명은 APRIL로 불리는 신규 폴리펩티드에 관한 것으로서, 관련 분야의 한계 및 단점으로 인한 하나 이상의 문제점을 실질적으로 해결한다. 본 발명자는 시토킨의 TNF 계열에 속하는 신규 구성원을 발견하였으며, 단백질의 인간 및 쥐의 아미노산 서열 뿐 아니라 이들 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 밝혀냈다. 청구한 본 발명을 이용하여 하기에 상세하게 설명한 여러 질병 및 증상의 신규 진단법 및 치료법을 확인할 수 있을 뿐 아니라 면역계 및 면역 과정에 관한 정보를 얻어 이를 조작할 수 있다. 또한, 본 발명은 암종의 세포 사멸 유도에 관한 것이다.

본 발명의 추가 특징 및 장점은 다음에 설명되어 있고, 부분적으로는 설명으로부터 명백히 알 수 있거나 또는 본 발명의 실시로부터 알 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 기타 장점은 개시된 상세한 설명 및 청구범위 뿐 아니라 첨부된 도면에서 특별히 지적한 조성물 및 방법으로 실현 및 달성할 수 있다.

따라서, 본 명세서에 구체화되고 광범위하게 개시된 이들 및 기타 장점을 달성하고, 본 발명의 목적에 따라서, 본 발명은 APRIL을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 서열 번호 1의 인간 APRIL을 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 신규 리간드의 아미노산 서열에 관한 것이다. 인간 APRIL의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 개시되어 있다. 또한, 본 발명자들은 서열 번호 3 및 4에 각각 기재한 쥐 APRIL의 DNA 서열 및 아미노산 서열을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 리간드의 C 말단 수용체 결합 도메인을 암호화하는 DNA 서열과 50% 이상의 상동성이 있고 본 발명의 DNA 서열 또는 단편에 하이브리드화하며, 서열 번호 1에 기재된 서열을 보유한 APRIL 또는 유사 생물 활성이 있는 단백질을 암호화하는 서열에 관한 것이다.

특정 실시 양태로서, 본 발명은 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된 APRIL을 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다. 임의의 적절한 발현 제어 서열은 본 발명에 유용하며, 당업자가 쉽게 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 APRIL 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 뿐 아니라, 게놈내로 도입되어 안정하게 통합된 APRIL 서열 또는 에피좀 성분을 보유하는 숙주에 관한 것이다. 임의의 적절한 숙주를 본 발명에 사용할 수 있으며, 당업자라면 과도한 실험없이 쉽게 선택할 수 있을 것이다.

기타 양태로서, 본 발명은 형질전환된 숙주의 배양 단계를 포함하는 실질적으로 순수한 APRIL을 생성하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 일반적으로 회합되는 동물 단백질이 거의 없는 APRIL에 관한 것이다.

본 발명은 서열 번호 2의 아미노산을 보유한 APRIL 리간드와 이의 단편 또는 상동체를 포함한다. 각종 양태에서, 아미노산 및/또는 DNA 서열은 후술하는 바와 같이 보존성 삽입부, 결실부 및 치환부를 포함하거나, 또는 상기 서열의 단편을 포함할 수 있다.

기타 양태로서, 본 발명은 APRIL 매개된 약리학 작용을 직접 촉발하는데 사용할 수 있는 APRIL을 포함하는 가용성 작제물에 관한 것이다. 이러한 작용은 성장 자극, 암, 종양 치료 또는 면역 질병을 치료하기 위한 면역계 조작에 있어서 치료적 유용성을 나타낼 수 있다. 본 발명에 기재된 리간드의 가용성 형태는 유전자적으로 재조작되어 쉽게 인식가능한 태그를 도입시킴으로써 이들 리간드에 대한 수용체를 용이하게 확인할 수 있게 한다.

또한, 기타 양태로서 본 발명은 APRIL에 대해 유도된 항체 및 암, 종양 치료 또는 면역 질병을 치료하기 위한 면역계 조작에 사용되는 용도에 관한 것이다.

또 다른 기타 양태로서, 본 발명은 본 명세서에 개시되고 청구된 APRIL에 대한 유전자를 사용한 유전자 치료법에 관한 것이다.

본 발명의 약학 제제는, 경우에 따라 약학적 허용 담체, 보조제, 충전제 또는 기타 약학 조성물을 포함할 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 다수 형태 또는 경로로 투여할 수 있다.

전술한 개설 내용 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시 및 설명적인 것으로서, 청구된 본 발명을 상세히 설명하려는 것이다.

첨부된 도면은 본 발명을 상세히 이해할 수 있도록 제공하며, 본 명세서의 일부로서 본 발명의 일부 양태를 예시하며, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.

실시예 1

APRIL을 노던 블롯 분석하여 APRIL의 발현이 약하고 몇몇 조직에만 제한적임을 발견하였다(도 2의 A). 전립선에서는 2.1 kb와 2.4 kb의 두 전사체가 발견되고 PBL에서는 1.8 kb의 보다 짧은 전사체가 발견되었다. 노던 블롯 분석은 인간 다중 조직 노던 블롯 I 및 II(클론테크 #7760-1 및 #7759-1), 인간 암 세포주 MTN 블롯(클론테크 #7757-1) 및 인간 종양 패널 블롯 V(인비트로겐 D3500-01)를 사용하여 실시하였다. 막은 ExpressHyb 하이브리드화 용액(클론테크 #8015-1) 중에서 62 ℃하에 1시간 이상 동안 항온처리하였다. 무작위 프라이밍된 cDNA 프로브(뵈링거 맨하임)는 주형으로 APRIL의 세포외 도메인에 해당하는 cDNA를 사용하여 합성하였다. 이 cDNA 프로브를 열변성시킨 뒤, 새로운 ExpressHyb 중에 1.5 x 10⁶cpm/㎖의 농도로 첨가하였다. 막을 62 ℃하에 12 내지 24 시간 동안 하이브리드하고, 0.05% SDS를 함유하는 2 x SSC로 3회 세정한 다음, -70 ℃에 노출시켰다. 이와 같이 APRIL을 노던 블롯 분석을 통해, APRIL의 발현이 약하고 몇몇 조직에서만 제한적인 것으로 나타났다. 전립선에서는 2.1 kb 및 2.4 kb의 두 전사체가 발견되는 반면, PBL에서는 1.8 kb의 보다 짧은 전사체가 발견되었다.

노출 시간을 장기화한 결과, 결장, 비장 및 췌장에서도 2.1 kb APRIL mRNA가 발견되었다(데이터는 제시 안함). 이와 같은 APRIL mRNA의 제한적 분포는 현재 EST 데이터베이스에서 입수용이한 cDNA 클론의 기원과 일치하였다. 동정된 23개의 클론 중, 단지 2개의 클론만이 정상 조직(임산부 자궁, 췌장섬)에서 유래되었다. 놀라운 것은 나머지 EST 클론(21개의 클론, 91%)이 종양이나 종양 유래 세포주에서 얻어진 cDNA 라이브러리에 존재한다는 점이다(난소 종양 11개, 전립선 종양 3개, 게슬러 윌름스 종양 1개, 결장 암종 1개, 자궁내막 종양 1개, 부갑상선 종양 1개, 췌장 종양 1개, T 세포 림프종 1개, LNCAP 아데노암종 유래 세포주 1개). 이러한 점으로부터 본 발명에서는 APRIL mRNA 발현에 대해 형질전환된 세포주를 시험하였고(도 2의 B), 역시 모든 세포주가 APRIL 2.1 kb 전사체를 강하게 발현하였다.

최고의 APRIL 특이적 신호는 결장직장 아데노암종 SW480, 버킷 림프종 Raji 및 흑색종 G361에서 검출되었다. 이러한 발견을 입증하기 위하여, 여러 종양 중의 APRIL mRNA 발현률을 측정하고 그 결과와 정상 조직의 결과를 비교하였다. APRIL mRNA는 갑상선 암종 및 림프종에서 고농도로 검출된 반면, 이의 대응 정상 조직에서는 하이브리드화 신호가 단지 약하게 발견되거나 전혀 발견되지 않았다(도 2의 C). 노던 블롯으로 분석한 다른 두 종양(부신 종양 및 이하선 종양)에서는 APRIL mRNA가 증가되지 않았다. 하지만, 인간 결장 아데노암종에서는 정상 결장 조직과 동일계내 하이브리드화로 비교했을 때 고농도의 APRIL 정보가 나타났다(도 2의 D).

APRIL의 가능한 활성을 조사하기 위하여, 아미노산 110 내지 250에 걸쳐 있는 APRIL(sAPRIL)의 가용성 세포외 도메인의 재조합 형태를 293세포에서 발현시켰다(9). 전길이 APRIL 유전자는, EcoRI 부위가 인접해 있는 특이적 5' 전진성 프라이머(5'-CCAGCCTCATCTCCTTTCTTGC-3') 및 XbaI 부위가 인접해 있는 특이적 3' 역프라이머(5'-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3')를 사용하여 EST 클론으로부터 증폭시켰다. 증폭된 단편을 EcoRI/XbaI로 절단하고 pCRIII의 변형 형태(인비트로겐) 중에 N 말단 Flag 펩티드와 프레임에 맞게 클로닝하였다(15). APRIL의 가용성 형태(sAPRIL)는 각각 PstI 및 XbaI 부위를 함유하는 2개의 프라이머(5'-AAACAGAAGAAGCAGCACTCTG-3') 및 (5'-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3')를 사용하여 제조하고, 이어서 진핵 세포에서의 단백질 분비에 유용한 HA 신호와 N 말단 Flag 에피토프를 보유하는 변형된 pCRIII 벡터 중으로 클로닝하였다(15).

실시예 2

종양 세포 및 조직에서의 광범위한 APRIL 발현으로부터 APRIL이 종양 성장과 관련이 있음을 추정하여, 정제한 재조합 Flag 태그화된 sAPRIL과 각종 종양 세포주를 항온처리하였다(10).

인간 배 293T 세포, 인간 백혈병 Jurkat T 세포, 인간 버킷 림프종 B 세포 Raji 및 흑색종 세포주를 전술한 바와 같이 성장시켰다(16, 17). 본 명세서에 기재된 다른 세포주는 미국 모식균 배양 수집소(미국 매릴랜드주 록크빌 소재)에 기탁되어 있다. 모든 세포주는 10% 태내 송아지 혈청을 보충한 RPMI 배지 또는 DMEM 배지에서 배양하였다.

최근에는 인간 FasL의 세포외 도메인(잔기 103 내지 281) 및 TRAIL(잔기 95 내지 281)의 Flag 태그화된 변형체가 개시되었다(15). Flag 태그화된 가용성 인간 TWEAK(잔기 141 내지 284)은 293 세포에서 생산되었다(P.S. manuscript in preparation). 항Flag 항체 M2는 코닥 인터내쇼날 바이오테크놀로지스에서 입수하였다. APRIL 존재하에 Jurkat T 림프종 세포의 증식은 리간드 첨가후 24시간째 생존 세포의 수(약 50%)(11)의 증가로 검출되듯이 용량에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다(도 3의 A). 세포 증식은 표시된 농도의 재조합 APRIL, TWEAK, TRAIL, FasL과 함께 웰당 50,000 세포수의 세포를 100 ㎕ 배지 중에서 항온배양하고, 24 시간 후 Celltiter 96 AQ 증식 분석법(프로메가)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 생존 세포 수를 측정하거나³H-티미딘 병입률로 생존 세포수를 측정하여 분석하였다. Flag-APRIL의 면역고갈에 대해서는 아가로스에 결합된 항Flag를 사용하였다.

증식의 증가는 항CD3 항체 또는 다른 시토킨과 같은 동시 자극 신호와는 무관하였다. 예상한 바와 같이, 동일하게 생산되어 정제된 FasL을 Jurkat 세포에 첨가한 결과 생존 세포의 수는 감소한 반면 TWEAK는 어떤 영향도 미치지 않았다. 세포수의 증가는 APRIL 처리된 세포에 보충된(40%)³H-티미딘 병입률과 상호관련성이 있었다(도 3의 A). 항myc 항체와 달리 항FLAG 항체로 FLAG 태그화된 APRIL 함유 조정 배지를 면역고갈시킨 결과 증식 효과가 감소되었다(도 3의 B). 이것은 증식 효과가 APRIL에 의한 특이적 작용임을 시사하는 것이다. 또한, 증식률의 증가는 일부 B 림프종(인간 BJAB를 제외한 인간 Raji, 마우스 A20 세포) 및 COS와 HeLa와 같은 상피 기원의 세포주 뿐만 흑색종에서 관찰되었다(도 3의 C). 유방 종양 세포 MCF-7은 반응하지 않았다. Jurkat 세포에 미치는 효과는 태내 송아지 혈청을 10%에서 1%로 감소시킨 결과 더욱 현저하게 나타났다(도 3의 D).

재조합 sAPRIL은 응집체를 형성하고 있는데, 이것으로 sAPRIL에 의한 증식 효과를 측정하는데 다소 높은 농도가 필요하다는 것을 설명할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 NIH-3T3 세포를 전길이 인간 APRIL로 형질감염시키고(12), 여러 APRIL 발현 클론을 얻었다(도 4의 A). 인산칼슘을 이용한 형질감염법과 전길이 FLAG 태그화된 APRIL 함유 pCRIII 발현 벡터를 사용하여 NIH-3T3 APRIL 클론을 얻었다. 레인당 약 2 x 10⁶세포의 세포 단백질을, 환원 조건하에 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 분리하고, 이어서 니트로셀룰로스로 전사시켰다. FLAG 태그화된 APRIL의 면역블롯 분석은 래트 모노클론 항FLAG 항체 M2(코닥 인터내쇼날 바이오테크놀로지스) 5 ㎍/㎖을 사용하여 실시하였다. 제1 항체는 친화도 정제된 항퍼옥시다제 결합된 당나귀 항마우스 항체(독일 함부르크 소재의 Dianova 제품)를 사용하여 검출하고 그 다음 ECL 시스템(아머샴 제품)을 사용하여 화학발광성 반응으로 검출하였다.

흥미로운 것은, APRIL 형질감염체가 모의 형질감염체보다 더욱 신속하게 증식한다는 점이다(도 4의 B). 이것을 통해, 본 발명자들은 APRIL 형질감염된 NIH-3T3 세포가 생체내 성장에 유리하다고 추론하였다. 야생형 NIH-3T3 세포 또는 모의 형질감염된 NIH-3T3 세포를 누드 마우스에게 주사한 경우, 5 내지 6주후 작은 촉진가능한 종양이 관찰되었다(13). 이와 반대로, APRIL로 안정하게 형질감염된 NIH-3T3 세포 클론 2개는 모두 3 내지 4주만에 종양을 유도하였다. 6주 후, 마우스는 높은 종양 증가로 인하여 죽었다(도 4의 C). NIH/3T3 섬유아세포(미국 매릴랜드주 록크빌에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소로부터 입수용이) 및 각종 형질감염체(1 x 10⁵세포)를 PBS 50 ㎕에 현탁시키고 BALB/c 누드 마우스(네덜란드 제이스트에 소재하는 Harlan으로부터 입수)의 옆구리에 경피 주사하였다. 종양 크기는 3 일마다 측정하였다. 마우스는 대등 연령의 것을 사용하였다(1군 당 3 마리).

실시예 3

APRIL에 대한 수용체 분리

TNF 계열의 리간드를 사용하여 수용체를 확인하고 클로닝할 수 있다. 개시된 APRIL 서열을 이용하여 수용체 결합 서열을 구성하는 APRIL의 세포외 도메인의 5' 말단을 마커 또는 태그 서열에 융합한 다음, 다수의 임의 발현계에서 APRIL을 분비시키는 리더 서열을 첨가한다. 이 기법의 일례는 Browning 등의 문헌[(1996) (JBC 271, 8618-8626)]에 개시되어 있으며, 여기서 LT-β 리간드는 그러한 형태로 분비되었다. VCAM 리더 서열은 짧은 myc 펩티드 태그와 LT-β의 세포외 도메인에 차례로 커플링시켰다. VCAM 서열을 사용하여 정상적으로 막 결합된 LT-β 분자를 분비시켰다. 분비된 단백질은 수용체에 결합하는 능력이 손상되지 않은 N-말단상에 myc 태그를 보유한다. 이러한 분비 단백질은 일시적으로 형질감염된 Cos 세포 또는 유사계, 예컨대 EBNA 유래 벡터, 곤충세포/바큘로바이러스, 피치아(picchia) 등에서 발현될 수 있다. 비정제 세포 상청액을 태그된 리간드의 공급원으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않고 본 발명의 APRIL, 조성물 및 방법에 있어서 각종 변형예 및 변화예가 가능하다는 것은 당업자에게는 자명한 일이다. 따라서, 첨부된 청구범위 및 그 등가 범위에 포함되는 한 본 발명은 변형예 및 변화예를 포함한다.

서열 번호 1

서열 번호 2

서열 번호 3

서열 번호 4

Claims

APRIL 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 서열.
서열 번호 2에 기재된 서열로 본질적으로 구성되는 APRIL을 암호화하는 DNA 서열.
서열 번호 2에 기재된 서열로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드를 암호하는 것이 특징인, 서열 번호 1에 기재된 서열로 본질적으로 구성된 DNA 서열.
20개 이상의 연속적인 염기를 포함하는 서열 번호 1에 기재된 서열의 단편에 적어도 하이브리드화하고, APRIL의 활성 부위와 30% 이상 상동성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 것이 특징인 DNA 서열.
제2항에 있어서, 상기 서열이 보존성 치환, 변화 또는 결실을 보유한 서열 번호 1에 기재된 서열로 본질적으로 구성된 것이 특징인 DNA 서열.
발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된, APRIL 암호 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
제6항에 있어서, 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
제6항 또는 제7항에 기재된 재조합 DNA 분자로 형질전환된 단세포 숙주.
서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 보유한 APRIL을 암호화하는 DNA 서열.
제8항에 기재된 단세포 숙주를 배양하는 단계를 포함하여 실질적으로 순수한 APRIL을 생성하는 방법.
일반적으로 회합되는 동물 단백질이 본질적으로 제거된 APRIL.
제11항에 있어서, 서열 번호 2에 기재된 서열로 본질적으로 구성된 APRIL.
APRIL 또는 이의 활성 단편의 치료학적 유효량과 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
제13항에 기재된 약학 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 자가면역 질병의 심화를 예방 또는 감소시키는 방법.
제13항에 있어서, APRIL 또는 이의 활성 단편이 서열 번호 2에 기재된 서열 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
제13항에 기재된 약학 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 조직 이식편에 대한 면역 반응의 심화를 예방 또는 감소시키는 방법.
제13항에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 면역계를 자극하는 방법.
제13항에 기재된 약학 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 면역계를 억제하는 방법.
제13항에 기재된 약학 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 암을 치료하는 방법.
a. APRIL 또는 이의 단편을 제공하는 단계,

b. 검출가능한 표지로 상기 APRIL 또는 이의 단편을 표지하는 단계,

c. 조성물을 검색하여 단계 b의 검출가능하게 표지된 APRIL에 결합하는 수용체를 검출하는 단계를 포함하여 APRIL에 대한 수용체를 확인하는 방법.
제11항에 기재된 APRIL의 가용성 생물학적 활성 단편.
a. 서열 번호 1을 포함하는 DNA 서열;

b. a에 기재된 DNA에 하이브리드화하고 발현시 제12항에 기재된 APRIL과 40% 이상의 상동성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열로 구성된 군에서 선택된 DNA가 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
APRIL 또는 이의 수용체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 반응성이 있는 항체 제제.
제23항에 있어서, 모노클론 항체를 포함하는 항체 제제.
APRIL 또는 이의 수용체, 또는 이의 항원성 단편으로 유기체를 면역화시키는 단계를 포함하여 APRIL 또는 이의 수용체에 대해 반응성이 있는 항체 제제를 제조하는 방법.
서열 번호 1에 기재된 서열의 적어도 일부분에 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함하는, APRIL에 대한 안티센스 핵산.
제24항에 기재된 항체 제제를 포함하는 약학 조성물.
APRIL을 암호화하는 유전자를 세포내로 도입하는 단계,

유전자가 포유류내에서 발현되도록 하는 조건하에서 세포를 생육시키는 단계를 포함하여 포유류 세포내에서 APRIL을 발현시키는 방법.
a. APRIL을 암호화하는 유전자를 포함하는 치료학적 유효량의 벡터를 세포내로 도입하는 단계, 및

b. 상기 포유류 세포내에서 유전자를 발현시키는 단계를 포함하여, 포유류내 APRIL 관련 질병을 치료하는 방법.
제29항에 있어서, 포유류가 인간인 것이 특징인 방법.
제29항에 있어서, 벡터가 바이러스인 것이 특징인 방법.
수용체에 대한 APRIL의 결합을 억제할 수 있는 제제의 투여 단계를 포함하여 세포 사멸을 유도하는 방법.
제32항에 있어서, γ인터페론의 투여를 추가로 포함하는 것이 특징인 세포 사멸 유도 방법.
APRIL 및 이의 수용체 사이의 회합을 억제할 수 있는 차단 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, APRIL과 이의 수용체 사이의 신호발생 경로를 포함하는 면역 반응을 치료, 억제, 활성화 또는 변화시키는 방법.
제34항에 있어서, 면역 반응이 인간의 암종 세포와 관련있는 것이 특징인 방법.
APRIL 및 이의 수용체 사이의 회합을 억제할 수 있는 차단 제제의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 암 진행을 치료, 억제 또는 변화시키는 방법.
제36항에 있어서, 차단 제제가 APRIL의 변형된 억제성 형태, 항APRIL 항체 또는 이것의 생물학적 활성 단편인 것이 특징인 방법.
제37항에 있어서, 차단 제제가 항APRIL 수용체 항체인 것이 특징인 방법.
제36항에 있어서, 차단 제제가 1종 이상의 화학치료제와 함께 환자에게 투여되는 것이 특징인 방법.
제39항에 있어서, 상기 환자에게 방사선 요법을 실시하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 방법.