SK3542000A3 - Nucleic acid coding ligand april, a vector, a host cell, method for preparing ligand april, a polypeptide of ligand april, a pharmaceutical composition and an antibody, and use thereof - Google Patents

Nucleic acid coding ligand april, a vector, a host cell, method for preparing ligand april, a polypeptide of ligand april, a pharmaceutical composition and an antibody, and use thereof Download PDF

Info

Publication number
SK3542000A3
SK3542000A3 SK354-2000A SK3542000A SK3542000A3 SK 3542000 A3 SK3542000 A3 SK 3542000A3 SK 3542000 A SK3542000 A SK 3542000A SK 3542000 A3 SK3542000 A3 SK 3542000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
april
ligand
seq
sequence
receptor
Prior art date
Application number
SK354-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Jurg Tschopp
Original Assignee
Apotech R & D Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Apotech R & D Sa filed Critical Apotech R & D Sa
Publication of SK3542000A3 publication Critical patent/SK3542000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka nového ligandu a polypeptidov, ktoré sú členmi rodiny nádorového nekrotického faktora. Nový ligand sa nazval APRÍL, čo je skratka pre A Proliferation Inducing Ligand, t.j. ligand indukujúci proliferáciu. Tieto proteíny a ich receptory majú protinádorové a/alebo imunoregulačné využitie. Okrem toho bunky s transfekovanými génmi pre tieto nové ligandy sa môžu využiť v génovej terapii na liečenie nádorov, sutoimunitných a zápalových ochorení alebo dedičných genetických porúch, a protilátky blokujúce tieto proteíny môžu mať imunoregulačné využitie.
Doterajší stav techniky
Cytokíny príbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF) sú mediátormi hostiteľskej obrannej a imunitnej regulácie. Členovia tejto proteínovej rodiny sa vyskytujú vo forme ukotvenej na bunkovú membránu, kde pôsobia lokálne prostredníctvom vzájomného kontaktu medzi bunkami; alebo sa vyskytujú ako vylučované proteíny schopné difundovať k vzdialenejším cieľom. Paralelná rodina receptorov ukazuje na to, že prítomnosť týchto proteínov spôsobuje iniciáciu bunkovej smrti alebo bunkovej proliferácie a diferenciácie cieľového tkaniva. V súčasnosti rodina TNF ligandov a receptorov obsahuje najmenej 13 známych párov receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R, LT-α/β:LT-p-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27, OX40L:OX40 a 4-1BBL:4-1BB, trance/rankL:Light a Tweak. Sekvencie DNA kódujúce tieto ligandy vykazujú identitu v 25 až 30%, a to dokonca aj v prípade najväčšej príbuznosti, hoci príbuznosť na úrovni sekvencie aminokyselín je približne 50%.
Určujúcou črtou tejto rodiny cytokínových receptorov je extracelulárna doména bohatá na cysteín, ktorú objavili pri molekulovom klonovaním dvoch rôznych receptorov TNF (I)'. Táto génová ' rodina kóduje glykoproteíny s vlastnosťami transmembránových proteínov typu I s extracelulárnou väzbovou doménou viažucou ligand a jednou transmembránovou doménou s cytoplazmatickým úsekom, ktorý sa podieľa na aktivácii bunkových funkcií. Úsek bohatý na cysteín, ktorý je súčasne väzbovým úsekom pre ligand, má centrálnu doménu z husto spojených disulfidových mostíkov, ktorá sa niekoľkokrát opakuje, čo závisí na konkrétnom člene rodiny. Väčšina receptorov má štyri domény, hoci sú aj receptory iba s tromi doménami alebo naopak zasa so šiestimi.
Proteíny z rodiny TNF ligandov sú charakteristické na svojom N-konci krátkym úsekom hydrofilných aminokyselín, ktorý často obsahuje niekolko arginínových alebo lyzínových zvyškov, ktoré zrejme slúžia ako sekvencie na zastavenie prenosu. Potom majú transmembránový úsek a extracelulárny úsek s premenlivou dĺžkou, ktorý oddeľuje doménu viažucu receptor na C-kcnci od bunkovej membrány. Tento úsek sa niekedy nazýva stopka. Väzbový úsek C-konca predstavuje väčšiu časť proteínu a často, aj keď nie vždy, obsahuje glykozylačné miesta. Tieto gény nemajú klasické signálne sekvencie charakteristické pre membránové proteíny typu I, skôr zodpovedajú membránovým proteínom typu II, ktoré majú C-koniec zasahujúci mimo bunku a krátky N-koniec zasahujúci do cytoplazmy. V niektorých prípadoch, ako sú TNF a LT-α, sa môže objaviť v priebehu skorého opracovania proteínu štiepenie v úseku stopky a ligand potom existuje predovšetkým v sekretovanej forme. Avšak väčšina ligandov sa vyskytuje v membránovej forme a sprostredkováva lokalizovaný prenos signálov.
Štruktúra týchto ligandov sa získala kryštalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Štruktúra TNF a lymfotoxínu alfa (LT-α) je sendvičová, t.j. skladá sa z dvoch antiparalelných βskladaných listov s jelly roll alebo Greek key'’ topológiou(11).
Odchýlka rms medzi zvyškami reťazcov Ca a β je 0,61 C, čo umožňuje domnievať sa, že majú vysoký stupeň podobnosti ich molekulárnej topografie. Štrukturálnou črtou, ktorá zjavne vyplýva z molekulárnych štúdií CD40L, TNF a LT-α, je tendencia týchto ligandov vytvárať oligomérne komplexy. Pre oligomérnu štruktúru je charakteristické vytváranie väzbových miest pre receptor v mieste spojenia medzi susednými podjednotkami, čím sa vytvára multivalentný ligand. Analýzou kryštálovej štruktúry sa skúmala kvartérna štruktúra CD40L, TNF a LF-α a ukázalo sa, že CD40L, TNF a LF-α existujú ako triméry. Mnoho aminokyselín konzervatívnych pre tieto ligandy sa vyskytuje práve v oblasti úsekov kostry štruktúry β-listu. Je pravdepodobné, že základná sendvičová štruktúra je zachovaná u všetkých týchto molekúl, pretože časti týchto sekvencií kostry sú zachované medzi rôznymi členmi celej rodiny. Kvartérna štruktúra sa zrejme tiež udržuje, pretože konformácia podjednotiek pravdepodobne tiež ostáva podobná.
Členovia rodiny TNF môžu ďalej byť najlepšie charakterizovaní ako hlavné prepínače v imunitnom systéme na riadenie prežívania buniek a tiež bunkovej diferenciácie. V súčasnosti sú známe iba dva sekretované cytokíny, a síce TNF a LF-α, na rozdiel od väčšiny ostatných členov rodiny TNF zakotvených v membráne. Zatial čo membránové formy TNF sa dobre charakterizovali a pravdepodobne majú jedinečnú biologickú funkciu, funkciou sekretovaných TNF je všeobecná signalizácia poplachu bunkám vzdialeným od miesta vyvolávačej udalosti. Sekrécia TNF môže znásobiť udalosť vedúcu k dobre známym zmenám vo výstelke ciev a v bunkách v mieste zápalu. Na rozdiel od toho členovia TNF rodiny viazaní na membránu predávajú signál prostredníctvom receptorov typu TNF iba bunkám v priamom kontakte. Napr. pomocné T-bunky poskytujú pomoc sprostredkovanú CD40 iba tým B-bunkám, s ktorými sa dostanú do priameho kontaktu prostredníctvom interakcií TCR. Podobné obmedzenia na bezprostredný bunkový kontakt sa týkajú schopnosti indukovať bunkovú smrť pri dobre preskúmanom systéme Fas.
Ligandy TNF sa môž u rozdeliť do troch skupín na základe ich schopnosti indukovať bunkovú smrť (pozri tab. III). V prvej skupine sú ligandy TNF, Fas a TRAIL, ktoré môžu účinne indukovať bunkovú smrť v mnohých bunkových líniách a ich receptory majú väčšinou kanonické smrtiace domény. Pravdepodobne ligand DR-3 (TrAMP/WSL-1) by patril do tejto kategórie. Druhú skupinu tvoria také ligandy, ktoré spúšťajú slabší signál obmedzený iba na niektoré typy buniek. Do tejto druhej skupiny patrí napr. TWEAK, ligand CD30 a Σία1β2. Zaujímavou otázkou je, ako členovia tejto skupiny môžu spúšťať mechanizmus vedúci k bunkovej smrti, keď nemajú kanonickú smrtiacu doménu. Neprítomnosť tejto domény vedie k domnienke, že existuje ešte iný slabší spôsob signalizácie v mechanizme bunkovej smrti. Do poslednej skupiny patria tí členovia, ktorí nie sú schopní prenášať žiadny signál spôsobujúci bunkovú smrť. Ale pravdepodobne členovia všetkých skupín môžu pôsobiť antiproliferačne na niektoré typy buniek ako následok indukcie diferenciácie, ako napr. CD40 (Funakoshi a kol., 1994).
Rodina TNF sa v poslednom čase dramaticky rozrástla a obsahuje teraz 11 rôznych signálnych dráh zahrnujúcich reguláciu imunitného systému. Rozsiahle expresné modely TWEAK a TRAIL ukazujú, že v tejto rodine existuje značná funkčná variabilita, doteraz nerozpoznaná. To vyniklo predovšetkým novým objavom dvoch receptorov, ktoré ovplyvňujú replikačnú schopnosť vírusu Rousovho sarkómu a vírusu Herpes simplex, a tiež významnými objavmi, že TNF má antivirusovú aktivitu a vírus kiahní kóduje vejíčkové TNF receptory (Brojasch a kol., 1996, Montgomery a kol., 1996, Smith 1994, Vassali 1992). TNF je mediátor septického šoku a kachexie(111) a zúčastňuje sa regulácie vývoja hematopoetických buniekílvl. Zdá sa, že hrá hlavnú úlohu ako mediátor v zápalovej reakcii a v obrane proti bakteriálnym, vírusovým a parazitárnym infekciám(vl, a navyše má zrejme protinádorovú aktivitu(vl). TNF sa podieľa tiež na rôznych autoimunitných ochoreniach|vll). TNF je vytváraný rôznymi typmi buniek, napr. sú to makrofágy, fibroblasty, T-bunky a cytotoxické NK-bunky (natural killer) <V111). TNF sa viaže na dva rôzne receptory, z ktorých každý pôsobí prostredníctvom odlišných špecifických signálnych molekúl vo vnútri bunky, čo výsledné spôsobuje odlišné účinky TNF(1X). TNF môže existovať jednak vo forme viazanej na membránu, ale aj ako voľný sekretovaný cytokín(x).
LT-α má s TNF mnoho spoločných aktivít, ako napr. väzbu na TNF receptory'*11, ale na rozdiel od TNF je sekretovaný hlavne aktivovanými T-bunkami a niektorými β-lymfoblastoidnými nádormi(X11). Heteromérny komplex LT-α a LT-β je komplex viazaný na membránu, kde sa viaže na LT-β receptory(xlll). Systém LT (t.j. LT s receptorom LT-R) sa podieľa na vývoji periférnych lymfoidných orgánov, pretože genetické narušenie LT-β spôsobuje poruchy T- a B-buniek v slezine a vymiznutie lymfatických uzlín!xiv!. Systém LT-β sa tiež podieľa na bunkovej smrti u niektorých línií adenokarcinómových bunieklxvl.
Fas-L, ďalší člen rodiny TNF, je exprimovaný prednostne na aktivovaných T-bunkách(xvl). Indukuje smrť buniek nesúcich príslušný receptor, nádorových buniek a buniek infikovaných HIV, a to mechanizmom, ktorý je známy ako programovaná bunková smrť alebo apcptózaIxvl11. Okrem toho je známe, že nedostatok Fas alebo Fas-L spôsobuje lymfoproliferatívne poruchy, čo potvrdzuje úlohu systému ľas v regulácii imunitnej odpovede(xvlll). Fas systém sa tiež podieľa na poškodení pečene v dôsledku chronickej infekcie vírusovej hepatitídy 1x1x1 a na autoimunitnej odpovedi u pacientov infikovaných s HIV(XX). Systém Fas sa tiež zúčastňuje deštrukcie T-buniek u pacientov infikovaných s HIV(XX1).
TRAIL, ďalší člen tejto rodiny, sa zrejme tiež podieľa na bunkovej smrti mnoho rôznych transformovaných bunkových línií rôznorodého pôvodu(XX11).
CD40-L, ďalší člen rodiny TNF, je exprimovaný na povrchu Tbuniek a indukuje reguláciu B-buniek nesúcich CD4O(XX1L1). Okrem toho je známe, že zmeny v géne pre CD40-L sú príčinou choroby známej ako syndróm hyper-IgM viazanej na X<xxlv|. Systém CD40 je tiež spojený s mnohými rôznymi autoimúnnymi chorobami<xxv) a CD40L má tiež antivírusové vlastnosti<XXV1). Aj keď sa systém CD40 sa tiež podieľa na záchrane apoptotických B bunieklxxvll), u iných buniek ako imunitného typu indukuje apoptózu(XXV111'. Mnohí ďalší lymfocytárni členovia rodiny TNF sa podieľajú na kostimulácii(xxix).
Všeobecne sa môže zhrnúť, že členovia rodiny TNF hrajú základnú regulačnú úlohu v riadení imunitného systému a v aktivácii akútneho obranného systému hostiteľa. Vzhľadom na súčasný pokrok v ovplyvňovaní členov rodiny TNF s cieľom terapeutického prospechu je pravdepodobné, že členovia tejto rodiny môžu poskytnúť jedinečné prostriedky proti chorobám. Niektoré ligandy rodiny TNF môžu priamo indukovať apoptotickú smrť mnohým transformovaných buniek, napr. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata 1997). Aktivácia receptora Fas a zrejme aj TNF a CD30 môžu indukovať bunkovú smrť netransformovaných lymfocytov, čo môže mať dôležitú imunoregulačnú funkciu (Amakawa a kol., 1996, Nagata 1997, Sytwu a kol., 1996, Zheng a kol., 1995). Všeobecne je známe, bunková smrť sa spustí po agregácii smrtiacich domén, ktoré sú umiestnené na strane receptorov TNF. Tieto smrtiace domény organizujú usporiadanie rôznych zložiek signálnej transdukcie, čo nakoniec spôsobuje aktiváciu celej kaskády (Nagata 1997). Niektoré receptory neobsahujú kanonické smrtiace domény, napr. receptor ΣΤβ a CD30 (Browning a kol., 1996, Lee a kol., 1996) a napriek tomu môžu indukovať bunkovú smrť, aj keď podstatne slabšie. Tieto receptory pravdepodobne fungujú primárne tak, že indukujú bunkovú diferenciáciu a bunková smrť je aberantným dôsledkom u niektorých transformovaných bunkových línií, aj keď celý obrázok je doteraz nejasný, pretože na základe štúdie s myšami CD30 null sa predpokladá smrtiaca úloha v negatívnej selekcii v týmuse (Amakawa a kol., 1996). Na rozdiel od toho, prenos signálov inými dráhami, ako je napr. práve prostredníctvom CD40, je vyžadovaný na udržiavanie a prežívanie buniek. Z uvedeného vyplýva teda potreba charakterizovať ďalších členov rodiny TNF a poskytnúť tak ďalšie prostriedky na liečenia chorôb a ovplyvňovanie imunitného systému.
Navrhovalo sa, že niektorí členovia rodiny TNF by mohli prejavovať terapeutický protinádorový účinok, napr. v kombinácii s IL-2 (pozri patent US 5 425 940) . Avšak dodnes nie je úplne známy úplný a dostačujúci spôsob liečenia rakoviny. Kombinácia chemoterapie sa všeobecne používa tak vo výskume ako aj v klinickej praxi, a to a antimetabolitmi, alkylujúcimi činidlami, antibiotikami, bunkovými jedmi a pod.. Tieto lieky sa podávajú samotné alebo v kombinácii s cieľom dosiahnuť cytotoxický účinok na nádory a/alebo redukovať či eliminovať výskyt buniek rezistentných proti lieku a obmedziť vedľajšie účinky.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález sa týka polypeptidu zvaného APRÍL a rieši rad problémov vyskytujúcich sa vďaka obmedzeniam a nevýhodám doterajšieho riešenia známych zo stavu techniky. Autori objavili nový člen cytokínovej rodiny TNF a určili sekvenciu aminokyselín tak myšacieho ako aj ľudského proteínu, vrátane príslušných sekvencii DNA kódujúcich tieto proteíny. Vynález sa môže využiť na identifikáciu nových prípravkov na diagnózu a liečenie mnohých ochorení a stavov, čo je ďalej podrobnejšie opísané, a tiež na získanie ďalších informácií o imunitnom systéme a na vlastné ovplyvňovanie imunitného systému a imunitných procesov. Okrem toho sa predkladaný vynález tiež týka indukcie bunkovej smrti pri karcinóme.
Ďalšie vlastnosti a výhody predkladaného vynálezu budú opísané podrobnejšie v nasledovnom opise, pritom čiastočne z opisu vyplynú a čiastočne sa môžu rozpoznať použitím vynálezu. Ciele vynálezu a jeho výhod sa môžu dosiahnuť pomocou prípravkov a spôsobov, ktoré sú osobitne zdôraznené v opise a v patentových nárokoch, a tiež v priložených obrázkoch.
V . súlade s cieľom vynálezu, aby sa dosiahli výhody vynálezu, ako je v opise a príkladoch uskutočnenia vynálezu uvedené, vynález zahrnuje sekvencie DNA kódujúce APRÍL. Špecificky sa vynález týka sekvencie DNA kódujúcej ľudský APRÍL (sekvencia SEQ ID NO: 1) . Okrem toho sa vynález týka tiež aminokyselinovej sekvencie nového Ugandu. Aminokyselinová sekvencia APRÍL je tu uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 2. Okrem toho je tu opísaná sekvencia myšacieho APRÍL uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 3 a NO: 4. Ďalšie uskutočnenie vynálezu sa týka sekvencií, ktoré majú aspoň 50% hcmológiu so sekvenciou DNA kódujúcou 5'-koncovú väzbovú doménu pre receptor, a pritom hybridizujú so sekvenciou podľa vynálezu alebo jej fragmentom, a ktorá kóduje APRÍL so sekvenciou tu uvedenou ako sekvencia SEQ ID NO: 1 alebo proteín s podobnou biologickou aktivitou.
Niektoré uskutočnenia sa týkajú sekvencií DNA kódujúcich APRÍL, kde sekvencie sú operatívne spojené so sekvenciou kontrolujúcou expresiu. Na použitie podía vynálezu je vhodná akákoľvek sekvencia na kontrolu expresie a vhodná sekvencia môže byť odborníkom ľahko vybratá.
Predkladaný vynález sa ďalej týka rekombinantnej DNA, ktorá obsahuje sekvenciu DNA kódujúcu APRÍL alebo jej fragment, a tiež hostiteľov, ktorí majú sekvenciu APRÍL trvalo integrovanú v genóme alebo v podobe epizomálneho elementu. Podía vynálezu sa môže použiť akýkoľvek vhodný hostiteľ, ktorý sa môže ľahko vybrať odborníkom bez potreby nadmerného experimentovania.
Ďalšie uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka spôsobu prípravy v podstaté čistého APRÍL, ktorý obsahuje kroky, keď sa kultivuje transformovaný hostiteľ, a ďalej sa týka APRÍL v podstate zbaveného všetkých živočíšnych proteínov, ktoré sú s ním normálne asociované.
Vynález sa tiež týka ligandov APRÍL, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ ID NO: 2 alebo jej fragmentov či homológov. V rôznych uskutočneniach vynálezu sekvencie aminokyselín alebo DNA sekvencie APRÍL môžu obsahovať konzervatívne inzercie, delécie a substitúcie, ako bude uvedené ďalej, alebo môžu obsahovať fragmenty uvedených sekvencii.
V inom uskutočnení sa predkladaný vynález týka rozpustného konštruktu APRÍL, ktorý sa môže použiť na priame spustenie farmakologickej udalosti, ktorú sprostredkuje APRÍL. Takáto udalosť môže mať terapeutický účinok pri stimulácii rastu, v liečení rakoviny a nádorov alebo v manipulácii s imunitným systémom na liečenie imunologických ochorení. Rozpustné formy APRÍL sa môžu metódami génového inžinierstva upraviť tak, aby obsahovali ľahko rozpoznateľnú značku, a tým umožnili identifikáciu receptorov pre tieto ligandy.
Ďalšie uskutočnenia predkladaného vynálezu sa týkajú protilátok proti APRÍL a ich použitia na liečenie rakoviny, nádorov alebo na ovplyvňovanie imunitného systému pri liečení imunologických ochorení.
Ešte ďalšie uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka spôsobov génovej terapie pomocou génov pre APRÍL podía predkladaného vynálezu.
Farmaceutický prípravok podía predkladaného vynálezu môže prípadne obsahovať tiež farmaceutický prijateľný nosič, adjuvans, plnidlo alebo iné farmaceutické prípravky, a môže sa podávať akýmkoľvek spôsobom známym v odbore.
Tak predchádzajúci stručný prehľad ako aj nasledujúci podrobný opis vynálezu je treba považovať za vysvetlenie vynálezu a iba za príklady uskutočnenia vynálezu, ktoré slúžia na podrobnejšie vysvetlenie predkladaného vynálezu.
Rovnako obrázky, slúžiace na lepšie porozumenie vynálezu a tvoriace súčasť opisu vynálezu, sú určené na to, aby ilustrovali niektoré uskutočnenia vynálezu a spoločne s opisom slúžili na vysvetlenie princípu predkladaného vynálezu.
Prahľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1. A) Predpovedaná aminokyselinová sekvencia ľudského
APRÍL. Je znázornená predpovedaná transmembránová oblasť (TM, v rámčeku). Potenciálne miesta N-glykozylácie (označené hviezdičkou) a N-koniec rekombinantného rozpustného APRÍL (sAPRIL).
B) Porovnanie extracelulárnej proteínovej sekvencie APRÍL a niekoľkých ďalších členov rodiny TNF ligandov. Identické a homologické zvyšky sú označené čierne, prípadne sivo vyplneným
rámčekom, TNFa je nádorový nekrotický faktor a, LTa je
lymfotoxín a, FasL je ligand Fas (CD95), TRANCE je ligand RANK.
Obr. 2. Expresia APRÍL.
A) Analýza Northern blot (2 μς polyA+RNA v každej
dráhe) u rôznych ľudských tkanív so sondou APRÍL cDNA.
B) Expresia APRÍL mRNA v rôznych nádorových bunkových líniách: promyelocytárna Leukémia HL60, HeLa bunky3, chronická myeloidná leukémia K562, lymfoblastová leukémia Molt-4, Burkittov lymfóm Raji, koicrektálny karcinóm A459, melanóm G361.
C) Expresia APRÍL mRNA v štyroch rôznych ľudských nádoroch (T) a normálne tkanivo (N) . Pás 18S rRNA je kontrola, ktorá ukazuje zhodné nanesenie vzoriek.
D) Expresia APRÍL mRNA u primárneho karcinómu hrubého čreva. Hybridizácia in slzu odhalila nadbytok mRNA pre APRÍL u karcinómu hrubého čreva v porovnaní s normálnym črevným tkanivom. Rezy z nádorového tkaniva a priľahlého normálneho tkaniva sa hybridizovali s anti-sense cRNA APRÍL značenou 35S a ako kontrola sa hybridizovali rezy z nádorového tkaniva so sense cRNA APRÍL značenou 35S (negatívna kontrola). Horné panely sú mikrofotografie v tmavom poli, spodné panely sú zodpovedajúce mikrofotografie v svetelnom poli.
Obr. 3. APRÍL stimuluje bunkový rast.
A) Na dávke závislé zvýšenie proliferácie buniek Jurkat (ludské leukemické T-bunky), stanovené 24 hodín po pridaní rozpustného APRÍL. Ako kontroly sa použili ligand Fas (FasL), Tweak a vzorka bez ligandu (Kontrola) (ľavý panel: životaschopnosť buniek: pravý panel: inkorporácia 3H-tymidínu).
B) Vplyv vyčerpania APRÍL značeného FLAG na rast nádorových buniek. Proliferatívny účinok APRÍL značeného FLAG sa neutralizoval protilátkami anti-FLAG, ale nie protilátkami antimyc.
C) Účinok APRÍL na rýchlosť proliferácie buniek Raji (ludské B-bunky Burkittovho lymfómu), buniek A20 (myšací Blymfóm), buniek BJAB (ľudský B lymfóm), COS (psie epitelové bunky), MCF-7 (ľudský adenokarcinóm prsníka), HeLa (ľudský epiteloidný karcinóm) a ME260 (ľudský melanóm).
D) Vplyv koncentrácie teľacieho fetálneho séra na proliferáciu buniek Jurkat indukovanú APRÍL.
Obr. 4. APRÍL urýchľuje bunkový rast.
A) Charakterizácia klonov NIH-3T3 transfekovaných APRÍL. Hladiny FLAG-APRIL u rôznych klonov sa analyzovali pomocou analýzy Western blotting s protilátkou anti-FLAG. Šípka ukazuje proteín APRÍL, · vysokomolekulový proteín sa detegoval nešpecifický.
B) NIH-3T3 klony exprimujúce APRÍL rastú rýchlejšie ako kontrolné slepo transfekované klony.
C) Zrýchlený nádorový rast u klonov NIH-3T3 exprimujúcich APRÍL. Bunky NIH-3T3 (1 x 105 buniek) a bunky transfekované APRÍL (NIH-AP, 2 rôzne klony, 1 x 106 buniek) sa injikovali subkutánne nahým myšiam a monitoroval sa rast nádorov.
Obr. 5. Porovnanie ľudskej a myšacej aminokyselinovej sekvencie APRÍL ukazuje oblasť s rozsiahlou identitou u týchto dvoch proteínov. Identické zvyšky sú označené bodkou na symbolmi aminokyselín. Aminokyselinové zvyšky označené podčiarknutím potenciálne miesta B-glykozylázie. Počiatočný považuje za štartovacie miesto, avšak nedá sa vylúčiť, napr. u ľudskej sekvencie, že metionín ležiaci ďalej proti smeru transkripcie (upstream) v zhode s čítacím rámcom, môže slúžiť ako skutočné štartovacie miesto.
predstavujú metionín sa
Podrobný opis vynálezu
Opis sa bude týkať predovšetkým podrobného opisu výhodných uskutočnení predkladaného vynálezu. Predkladaný vynález sa týka sekvencií DNA, ktoré kódujú ľudský alebo myšací APRÍL, jeho fragmentov alebo homológov, a ďalej sa týka expresie týchto DNA v hostiteľoch transformovaných týmito DNA. Vynález sa ďalej týka použitia týchto DNA sekvencií a peptidov, ktoré sú týmito sekvenciami kódované. Okrem toho sa vynález týka tak ľudskej ako aj myšacej aminokyselinovej sekvencie APRÍL, alebo jej fragmentov či homológov, a ďalej sa týka farmaceutického prípravku obsahujúceho tieto sekvencie alebo z týchto sekvencií odvodeného. Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobov stimulácie bunkového rastu pomocou APRÍL, alternatívne spôsobov inhibície tumorigenézy pomocou protilátok namierených proti APRÍL alebo receptora APRÍL.
A. Definície
Termín homologický v tomto texte opisuje podobnosť medzi sekvenciami porovnávaných molekúl. Pokiaľ je istá pozícia v obidvoch porovnávaných sekvenciách obsadená rovnakou bázou alebo aminokyselinou, napr. ak je rovnaká pozícia v každej z dvoch molekúl obsadená adenínom, potom sú tieto molekuly homologické v danej pozícii. Homológia medzi dvoma sekvenciami vyjadrená v percentách je funkcia počtu zhodných, čiže homologických pozícií, ktoré obsahujú obe sekvencie, delená počtom všetkých porovnávaných pozícií a vynásobená 100. Napr. ak u dvoch sekvencií je 6 pozícií z 10 zhodných alebo homologických, potom tieto sekvencie majú 60% homológiu. Alebo napr. dve sekvencie
ATTGCC a TATGGC majú 50% homológiu. Všeobecne sa uskutočňuje porovnanie tak, že sekvencie sú k sebe navzájom priložené, aby poskytli maximálnu homológiu.
Termín rakovina označuje akúkoľvek poruchu typu neoplázie, vrátane takých bunkových ochorení ako napr. rakovina renálnych buniek, Kaposiho sarkóm, chronická leukémia, rakovina prsníka, sarkóm, karcinóm vaječníka, rakovina konečníka, rakovina krku, mastocytóm, rakovina pľúc, adenokarcinóm prsníka, karcinóm dlaždicových buniek hltana a rakoviny zažívacieho traktu a žalúdka. Výhodne je rakovina leukémia, mastocytóm, melanóm, lymfóm, adenokarcinóm prsníka a karcinóm dlaždicových buniek hltanu.
Termíny purifikovaný preparát alebo v podstate čistý preparát polypeptidov slúži na označenie polypeptidu, ktorý sa oddelil od ostatných proteínov, lipidov a nukleových kyselín, s ktorými sa spoločne prirodzene vyskytuje. Výhodne je purifikovaný polypeptid oddelený tiež od iných látok ako napr. protilátok alebo matrixu, ktoré sa použili na čistenie.
Termín transformovaný hostiteľ zahrnuje akýchkoľvek hostiteľov so sekvenciou, t.j. sekvenciou APRÍL, trvalo integrovanú do aenómu.
Termín ošetrenie alebo liečenie sa tu používa na akékoľvek terapeutické ošetrenie, napr. podávanie terapeutického činidla alebo látky, napr. lieku.
Termín v podstate čistá nukleová kyselina, napr. v podstate čistá DNA, znamená nukleovú kyselinu, ktorá 1) nie je bezprostredne spojená s jednou alebo dvoma sekvenciami (jedna na 5'-konci a jedna na 3'-konci), napr. kódujúcimi sekvenciami, s ktorými susedí v prirodzene sa vyskytujúcom genóme príslušného organizmu, z ktorého nukleová kyselina pochádza, alebo 2) je v podstate bez sekvencií nukleových kyselín, ktoré sa vyskytujú v organizme, z ktorého uvedená nukleová kyselina pochádza. Tento termín zahrnuje teda napr. rekombinantnú DNA vloženú do vektora, napr. do genómovej DNA prokaryotického alebo eukaryotického organizmu, alebo ktorá existuje ako samostatná molekula (napr. cDNA alebo fragment endonukleáz) nezávislá na iných sekvenciách DNA. V podstate čistá DNA tiež zahrnuje rekombinantnú DNA, ktorá je súčasťou hybridného génu kódujúceho APRÍL.
Termíny peptidy, proteíny a polypeptidy sa používajú navzájom zameniteľným spôsobom.
Termín biologicky aktívny sa používa v zmysle mať aktivitu, buď in vitro alebo in vivo, ktorá sa prejavuje priamo alebo nepriamo. Napr. biologicky aktívny fragment APRÍL môže mať napr. 70% homológiu aminokyselinovej sekvencie s aktívnym miestom APRÍL, výhodnejšie aspoň 80% homológiu a najvýhodnejšie 90% homológiu. Identita alebo homológia vzhľadom na APRÍL je definovaná ako percento aminokyselinových zvyškov v príslušnej sekvencii, ktoré sú identické s aminokyselinovými zvyškami sekvencii PRIL uvedenými tu ako sekvencia SEQ ID NO: 2 a NO: 4.
Termín ligand sa tu všeobecne používa pre APRÍL. Uskutočnenie predkladaného vynálezu vyžaduje, pokiaľ nie je uvedené inak, použitie techník bežných v bunkovej biológii, bunkových a tkanivových kultúrach, molekulovej biológii, transgénnej biológii, mikrobiológii, techniky rekombinantnej DNA a imunologické metódy, ktoré sú v odbore známe. Takéto techniky sú opísané v príslušnej odbornej literatúre.
Úvod
APRÍL, nový člen TNF rodiny je tu opísaný podrobne. Autori vynálezu zistili, že zatiaľ čo hojnosť výskytu transkriptov APRÍL v normálnom tkanive je nízka, detegovali sa vysoké hladiny mRNA v niekoľkých nádorových bunkových líniách, a tiež v karcinómoch hrubého čreva, metastázujúcich lymfómoch a nádoroch štítnej žľazy. Ďalej sa zistilo, že in vitro pridanie rekombinantného APRÍL stimuluje proliferáciu rôznych bunkových línií. Okrem toho transfekcia APRÍL do buniek NIH-3T3 významne urýchľuje rast nádorov u nahých myší v- porovnaní s kontrolami.
Expresia a rast stimulujú účinok APRÍL na nádorové bunky in vitro a in vivo vedie k predstave, že APRÍL sa podieľa na tumorigenéze.
APRÍL sa zdá byť jedinečným medzi členmi TNF rodiny, keďže je na jednej strane hojne exprimovaný v nádorových bunkách a tiež stimuluje rast mnohých rôznych nádorových bunkových línií. Vzhľadom na zjavnú účasť APRÍL v tumorigenéze antagonistické protilátky k APRÍL alebo receptorom APRÍL poskytnú nové možnosti na liečenie rakoviny.
B. Sekvencia DNA podía vynálezu
Jedným aspektom predkladaného vynálezu je v podstate čistá (alebo . rekombinantná) nukleová kyselina, ktorá obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid APRÍL, ako je napr. sekvencia DNA tu uvedená ako je sekvencia SEQ ID NO: 1 a/alebo ekvivalenty takýchto nukleových kyselín. Termín nukleové kyselina tu zahrnuje tiež fragmenty alebo ekvivalenty, ako sú napr. sekvencie kódujúce ekvivalentné polypeptidy. Ekvivalentné nukleotidové sekvencie môžu obsahovať sekvencie, ktoré sa líšia jednou alebo niekoľkými substitúciami, adíciami alebo deléciami, ako sú napr. alelické varianty, mutácie, atď., a môže tiež obsahovať nukleotidové sekvencie, ktoré sa líšia od sekvencie kódujúcej APRÍL uvedenej tu ako sekvencia SEQ ID NO: 1, vďaka degenerácii genetického kódu.
Predkladaný vynález je opisovaný všeobecne vzhľadom na sekvenciu ludského génu, aj keď odborníkovi je zrejmé, že sa týka aj myšacej sekvencie alebo sekvencie kódujúcej APRÍL z iných biologických druhov s vysokou mierou hemológie s ľudskou sekvenciou. Ľudský proteín má, zdá sa, všetky charakteristiky rodiny TNF, t.j. usporiadanie membránového proteínu typu II z konzervatívne sekvenčné motívy podieľajúce sa na usporiadaní proteínu do štruktúry anti-paralelného β-listu, ktorá je typická pre TNF.
Sekvencie podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť na prípravu série DNA sond, ktoré sú vhodné na testovanie rôznych súborov prirodzených alebo syntetických DNA na prítomnosť sekvencií príbuzných APRÍL alebo jeho fragmenty alebo deriváty.
Odborníkovi je zrejmé, že termín APRÍL sa tu používa v takom zmysle,' že zahrnuje aj jeho biologicky aktívne deriváty, fragmenty a homológy.
Sekvencia podía predkladaného vynálezu kódujúce APRÍL sa môže využiť na expresíu peptidu podía vynálezu v rôznych prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľoch transformovaných takýmito sekvenciami. Peptidy APRÍL sa môžu použiť ako protirakovinové alebo imunoregulačné činidlá. Všeobecne to znamená, že jedným z krokov aplikácie je kultivovať hostiteľov transformovaných molekulou DNA obsahujúcou DNA obsahujúcou kódujúcu sekvenciu APRÍL, operatívne spojenú so sekvenciou riadiacou expresíu.
Sekvencie DNA a rekombinantné molekuly DNA podľa predkladaného vynálezu sa môžu exprimcvať pomocou širokého spektra kombinácií hostitel/vektor. Napr. vhodné vektory môžu obsahovať segmenty chromozómových, iných ako chromozómových, alebo syntetických sekvencií DNA. Expresné vektory podľa vynálezu sú charakteristické tým, že obsahujú aspoň jednu expresnú kontrolnú sekvenciu, ktoré je operatívne spojená so sekvenciou kódujúcou APRÍL vloženou do vektora, aby bolo možné regulovať či riadiť expresíu sekvencie DNA.
V rámci každého expresného vektora sa môžu vybrať rôzne miesta na vloženie sekvencie podía predkladaného vynálezu. Miesta sú väčšinou navrhnuté podía reštrikčných endonukleáz, ktoré v príslušnom mieste štiepia, a tieto miesta aj endonukleázy sú odborníkovi dobre známe. Odborníkovi je tiež zrejmé, že vektor na použitie podľa predkladaného vynálezu nemusí obsahovať miesta pre reštrikčné endonukleázy na vloženie požadovaného fragmentu DNA. Miesto toho sa môže fragment klonovať do vektora alternatívnym spôsobom. Výber expresného vektora, a osobitne miest vhodných na vloženie vybratého fragmentu DNA a jeho spojenia s expresnou kontrolnou sekvenciou, závisí na mnohých faktoroch. K týmto faktorom patrí napr.
veľkosť proteínu, ktorý sa má exprimovať, citlivosť tohto proteínu k proteolytickej degradácii enzýmami hostiteľskej bunky, počet miest pre príslušný reštrikčný enzým, kontaminácia alebo väzba exprimovaného proteínu proteínmi hostiteľskej bunky, ktoré sú ťažko odstrániteľné počas purifikácia a pod.. Ďalšie faktory, ktoré je potrebné vziať do úvahy, sú expresné charakteristiky ako je napr. poloha štartovacieho a terminačného kodónu vzhľadom na sekvencie vektora, a ďalšie faktory, ktoré sú odborníkovi zrejmé. Výber vektora a vhodných miest na vloženie sekvencie DNA podía predkladaného vynálezu je teda výsledkom posúdenia všetkých týchto faktorov, pričom nie všetky riešenia sú rovnako účinné pre požadované aplikácie. Ale pre odborníka je analýza všetkých týchto faktorov rutinná záležitosť a výber vhodného systému potom závisí predovšetkým na konkrétnom použití.
Odborník lahko môže modifikovať expresné kontrolné sekvencie tak, aby sa získala úroveň proteínovej expresie, napr. substitúciou kodónov alebo výberom kodónov určitých zvláštnych aminokyselín, ktoré sú prednostne využívané konkrétnym organizmom, s cielom zmenšiť proteolýzu alebo zmeniť vzorec glykozylácie. Podobne sa môžu nahradiť cysteinové zvyšky inými aminokyselinami, aby sa uľahčila produkcia alebo usporiadanie proteínu, alebo aby sa predišlo problémom so stabilitou.
Teda nie všetky kombinácie hostitel/expresný vektor fungujú s rovnakou účinnosťou čo sa týka expresie sekvencie DNA podľa predkladaného vynálezu. Avšak výber konkrétnej vhodnej kombinácie hostitel/expresný vektor sa môže odborníkom lahko uskutočniť. K faktorom, ktoré je potrebné vziať do úvahy, patrí napr. kompatibilita hostiteľa a vektora, toxicita proteínov kódovaných sekvenciami DNA vektora pre hostiteľa, ľahkosť izolácie požadovaného proteínu, expresné charakteristiky sekvencii DNA a expresných kontrolných sekvencii s nimi operatívne spojených, biologická bezpečnosť, potreba energie na usporiadanie štruktúry proteínu, forma proteínu a prípadne modifikácie požadovaného proteínu, ktoré nastávajú po expresii.
APRÍL produkovaný hostiteľmi transformovanými sekvenciami DNA podľa predkladaného vynálezu, rovnako ako natívny APRÍL purifikovaný spôsobom podía vynálezu, alebo vytvorený na základe aminokyselinovej sekvencie podľa vynálezu, sú užitočné pre rad protirakovinových, protinádorových a imunoregulačných aplikácií. Sú tiež užitočné v terapii a spôsoboch týkajúcich sa aj iných chorôb.
Predkladaný vynález sa týka tiež použitia sekvencií DNA podľa vynálezu na expresiu APRÍL v zvláštnych podmienkach, t.j. pri génovej terapii. Navyše APRÍL sa môže exprimovať v nádorových bunkách, kde je jeho expresia riadená promótormi vhodnými na tento účel. Takáto expresia môže posilniť protinádorovú imunitnú odpoveď alebo priamo ovplyvniť prežívanie nádora. APRÍL môže tiež ovplyvniť prežívanie orgánových štepov tým, že zmení lokálnu imunitnú odpoveď. V takomto prípade by sa sám štep, alebo bunky, ktoré ho obklopujú, modifikoval génom APRÍL metódami génového inžinierstva.
Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je použitie izolovanej nukleovej kyseliny kódujúcej APRÍL na tzv. antisense terapiu. Termín antisense terapia sa týka podania alebo vytvorenia in situ cligcnukleotidov alebo ich derivátov, ktoré špecificky hybridizujú (viažu sa) v normálnych bunkových podmienkach s bunkovou mRNA a/alebo DNA kódujúcou požadovaný APRÍL, aby tak inhibovali expresiu kódovaného proteínu tým, že inhibujú transkripciu a/alebo transláciu. Uvedená väzba môže byť konvenčná komplementarita bázových párov alebo napr. v prípade väzby na duplexy DNA môže ísť o väzbu prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnom (veľkom) žliabku dvojzávitnicovej DNA. Všeobecne sa antisense terapia týka celého radu techník používaných v odbore a patrí sem v podstate akákoľvek terapia založená na špecifickej väzbe oligonukleotidovej sekvencie.
Antisense konštrukt podľa predkladaného vynálezu sa môže podať napr. vo forme expresného plazmidu, ktorý pri transkripcii v bunke tvorí RNA, ktorá je komplementárna k bunkovej mRNA kódujúcej APRÍL alebo aspoň k jej časti. Alternatívne môže byť antisense konštrukt tiež oligonukleotidová sonda pripravená ex vivo. Takéto oligonukleotidové sondy sú výhodne modifikované oligonukleotidy, ktoré sú rezistentné k endogénnym nukleázam a sú preto stabilné in vivo. Príkladom takýchto molekúl nukleových kyselín vhodných ako antisense oligonukleotidy sú fosforamidátové, fosfotioátové a metylfosfonátové analógy DNA (pozri patentové prihlášky 'J.S. 5 176 996, 5 264 564 a 5 256 775). Okrem toho všeobecný postup ako konštruovať oligoméry vhodné na antisense terapiu boli prehľadne uvedené napr. v publikáciách Van Der Krol a kol., 1988, Biotechniques 6: 958-976 a Stein a kol., 1988, Cancer Res. 48: 2659-2668, ktoré sú tu zahrnuté formou odkazu.
C. APRÍL a jeho aminokyselinová sekvencia
Ako už bolo uvedené, APRÍL je členom rodiny TNF. Proteín APRÍL sám, alebo jeho fragmenty či homológy, má široké možnosti terapeutického a diagnostického použitia, ako bude podrobnejšie diskutované ďalej. Porovnanie sekvencie APRÍL s ostatnými členmi ľudskej rodiny TNF ukazuje značnú štruktúrnu podobnosť. Všetky proteíny majú niekoľko konzervatívnych úsekov v sekvencii extracelulárnej domény. Celková sekvenčná homológia extracelulárnej domény APRÍL ukazuje najvyšší stupeň homológie s fasL (21% aminokyselinová identita), TNFa (20%), LT-β (18%) a potom nasledujú TRAIL, TWEAK a TRANCE (15%).
Nový polypeptid podľa predkladaného vynálezu špecificky reaguje s receptorom, ktorý sa doteraz neidentifikoval. Avšak peptidy a spôsoby podlá predkladaného vynálezu umožňujú identifikovať receptory, ktoré špecificky reagujú s APRÍL alebo jeho fragmentmi.
Určité uskutočnenia podľa predkladaného vynálezu zahrnujú peptidy odvodené z APRÍL, ktoré majú schopnosť viazať sa na príslušné receptory. Fragmenty APRÍL sa môžu pripraviť rôznymi spôsobmi, napr. rekombina.ntnou technológiou, pomocou PCR, proteolytickým štiepením alebo chemickou syntézou. Vnútorné alebo koncové fragmenty polypeptidu sa môžu pripraviť odstránením jedného alebo niekoľkých nukleotidov z jedného alebo z obidvoch koncov nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptid. Fragmenty polypeptidu sa môžu tiež pripraviť expresiou mutovanej DNA. Polypeptidové fragmenty sa môžu tiež chemicky syntetizovať pomocou konvenčnej techniky známej ako syntéza ne pevnej fáze využívajúc konvenčné techniky známe ako syntéza na pevnej fáze, ktoré využívajú chemický postup s ochranou f-moc alebo t-boc (podlá Merrifielda). Napr. peptidy a sekvencie DNA podlá predkladaného vynálezu sa môžu v podstate ľubovoľne rozdeliť na fragmenty s požadovanou dĺžkou, ktoré sa neprekrývajú, alebo na prekrývajúce sa fragmenty s požadovanou dĺžkou. Príslušné metódy sú podrobnejšie opísané v nasledujúcom texte.
D. Príprava rozpustných foriem APRÍL
Rozpustné formy APRÍL môžu byť velmi účinné v prenose signálu a môžu sa teda podávať ako liek, ktorý napodobňuje prirodzenú membránovú formu. Je možné, že APRÍL podľa predkladaného vynálezu je prirodzene sekretovaný ako rozpustný cytokín, ale pokiaľ to tak nie je, je možné upraviť gén metódami génového inžinierstva tak, aby sa zosilnila sekrécia. Na prípravu rozpustnej sekretovanej formy APRÍL je treba odstrániť na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a niektoré úseky stopky a nahradiť ich vedúcou sekvenciou typu I alebo alternatívne vedúcou sekvenciou typu II, ktorá umožňuje účinné proteolytické štiepenie- v príslušnom hostiteľskom systéme. Odborník je schopný meniť rozsah stopkových úsekov ponechaných v expresnom konštrukte tak, aby sa dosiahli optimálne väzbové vlastnosti k receptoru a sekrečná účinnosť. Napr. odštepovaním z N-konca sa môžu pripraviť konštrukty obsahujúce všetky možné dĺžky stopky, takže vzniknú proteíny, ktoré budú začínať aminokyselinou 81 až 139. Týmto typom analýzy sa môže stanoviť optimálna dĺžka sekvencie stopky.
Ξ. Príprava protilátok reagujúcich s APRÍL
Predkladaný vynález sa tiež týka protilátok špecificky reagujúcich s APRÍL alebo jeho receptorom. Antiséra typu anti21 proteín/anti-peptid alebo monoklonálne protilátky sa môžu pripraviť štandardnými spôsobmi (pozri napr. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Press, 1988). Cicavce ako napr. myš, škrečok alebo králik, sa môžu imunizovať imunogénnou formou peptidu. Spôsoby, akými upraviť proteín alebo peptid tak, aby boli imunogénne, napr. tým, že sa konjuguje s nosičom, alebo iné spôsoby, sú v odbore známe.
Imunogénna časť APRÍL alebo jeho receptora sa môže podať spoločne s adjuvans. Postup imunizácie sa môže monitorovať pomocou detekcie titra protilátok v plazme alebo sére. Štandardný test ELISA alebo iné imunotesty sa môžu použiť s imunogénom ako antigénom na hodnotenie hladín protilátok.
Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu sú protilátky imunošpecifické pre antigénne determinanty APRÍL alebo receptor APRZL, t.j. antigénne determinanty polypeptidu so sekvenciou SEQ ID NO: 2, alebo pre blízko príbuzný ľudský alebo cicavčí, iný ako ľudský homológ (s homológiou 70, 80 alebo 90%, najvýhodnejšie aspoň 95%). V ďalšom výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu protilátky anti-APRIL alebo anti-receptor APRÍL v podstate krížcvo nereagujú (to znamená reagujú iba špecificky) s prcteíncm, ktorý je napr. menej ako na 80% homologický sc sekvenciou SEQ ID NO: 2, výhodne menej ako 90% a najvýhodnejšie menej ako'na 95% homologický so sekvenciou SEQ ID NO: 2. Tým, že v podsoate krížovo nereagujú sa myslí to, že protilátka má väzbovú afinitu k nehomologickému proteínu menšiu ako 10%, výhodnejšie menšiu ako 5% a ešte výhodnejšie menšiu ako 1% väzbovej afinity so sekvenciou SEQ ID NO: 2.
Termín protilátka sa v tomto texte používa tak, že zahrnuje aj fragmenty protilátky, ktoré tiež špecificky reagujú s APRÍL alebo ich receptorom. Protilátky sa môžu fragmentovať pomocou zvyčajných spôsobov, ktoré sú v odbore známe, a možnosti využitia fragmentov sa môže potom testovať v odbore známe, a možnosti využitia fragmentov sa môže potom testovať rovnakými spôsobmi ako sa opísalo pre celé protilátky. Napr. fragment
F(ab')2 sa môže pripraviť pôsobením pepsínu. Výsledný fragment sa potom môže opracovať tak, aby sa redukovali disulfidové mostíky, čím vznikne fragment Fab'. K protilátkam podľa predkladaného vynálezu ďalej patria biošpecifické a chimérne molekuly, ktoré majú aktivitu namierenú proti APRÍL alebo jeho receptoru. Takže na blokovanie APRÍL alebo jeho receptora sa môžu použiť tak monoklonálne ako aj polyklonálne protilátky namierené proti APRÍL a príslušnému receptoru, a tiež príslušné fragmenty ako napr. Fab' alebo F(ab')2·
Rôzne formy protilátok sa môžu pripraviť štandardnými technikami rekombinantnej DNA (Winter a Milstein, Náture 349: 293-299, 1991). Napr. sa môžu konštruovať také chimérne protilátky, kde väzbová doména pre antigén z protilátky zvieraťa je spojená s ľudskou konštantnou doménou (Cabilly a kol., patent US 4 816 567). Chimérne protilátky redukujú imunitnú odpoveď vyvolanú zvieracími protilátkami, keď sú použité v klinických aplikáciách pre ludských pacientov.
Okrem toho sa môžu syntetizovať rekombinantné humanizované protilátky, rozpoznávajúce APRÍL alebo jeho receptor. Humanizované protilátky sú chimérne protilátky, ktoré obsahujú väčšinou sekvencie ľudského IgG, do ktorých sa vložili sekvencie zodpovedné za špecifickú väzbu k antigénu. Zvieratá sa imunizujú požadovaným antigénom, potom sa izoluje príslušná protilátka a odstráni sa z nej časť variabilného úseku zodpovedná za špecifickú väzbu antigénu. Úsek viažuci antigén zo zvieraťa sa potom klonuje do vhodného miesta génu ľudskej protilátky, z ktorého sa odstránil úsek viažuci antigén. Humanizované protilátky minimalizujú použitie heterologických (t.j. medzidruhových) sekvencií v ľudských protilátkach, a tak znižujú pravdepodobnosť vyvolania imunitnej odpovede u ošetrovaného pacienta.
Rôzne triedy rekombinantných protilátok sa môžu vytvárať tiež tak, že sa pripravia chimérne alebo humanizované protilátky obsahujúce variabilné domény a ľudské konštantné domény (CH1, CH2 a CH3) izolované z rôznych tried imunoglobulínov. Napr. sa môžu pripraviť rekombinantným spôsobom protilátky so zvýšenou valenciou väzbových miest pre antigén, a to tak, že sa klonuje väzbové miesto pre antigén do vektora nesúceho konštantný úsek reťazca ľudskej protilátky (Arulandam a kol., J. Exp. Med. 177: 1439-1450, 1993).
Okrem toho sa môžu použiť techniky rekombinantnej DNA na zmenu väzbovej afinity rekombinantných protilátok s ich antigénmi tým, že sa zmenia zvyšky aminokyselín v blízkosti väzbového miesta pre antigén. Väzbová afinita pre antigén u humanizovanej protilátky sa môže zvýšiť mutagenézou založenou na molekulovom modelovaní (Quenn a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-33, 1989).
E. Vytváranie analógov: Príprava zmenených sekvencií DNA a peptidových sekvencií
Analógy APRÍL sa môžu líšiť od prirodzene sa vyskytujúceho ligandu v sekvencii aminokyselín, alebo iným spôsobom ako aminokyselinovou sekvenciou, alebo obidvoma spôsobmi. K iným modifikáciám ako je modifikácia sekvencie patrí tak in vitro ako aj in vivo chemická derivatizácia APRÍL. K týmto nesekvenčným modifikáciám patria zmeny v acetylácii, metylácii, fosforylácii, karboxylácii alebo glykozylácii, pričom tento zoznam nie je limitujúci.
K výhodným analógom patrí APRÍL alebo jeho biologicky aktívne fragmenty, ktorých sekvencie sa líšia od sekvencií tu uvedených ako sekvencia SEQ ID NO: 2, jednou alebo niekoľkými konzervatívnymi substitúciami, deléciami alebo inzerciami aminokyselín, ktoré neporušujú biologickú aktivitu APRÍL. Ku konzervatívnym substitúciám patria substitúcie jednej aminokyseliny inou aminokyselinou podobnými vlastnosťami, napr. substitúcie v rámci nasledovných skupín: valín - glycín, glycín - alanín, valín - izoleucín, kyselina asparagová - kyselina glutámová, asparagín - glutamín, serín - treonín, lyzín arginín a fenylalanín - tyrozín.
Konzervatívne zámeny aminokyselín sú prehľadne uvedené v nasledovnej tabuľke 1.
Tabuľka 1
Konzervatívne zámeny aminokyselín
Aminokyselinu kód možno nahradiť ľubovoľnou z:
Alanín A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginín R D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo- Arg, Met, D-Met, íle, D-Ile, Orn, D- -Orn
Asparagín A D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina asparágová D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cysteín C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D- -Thr
Glutamín Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kyselina glutámová E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycín G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Asp
Izoleucín I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucín L D-Leu, Val, D-Vai, Met, D-Met
Lyzín K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homoArg, Met, D-Met, íle, D-Ile, Orn, D- -Orn
Metionín M D-Met, S-Me-Cys, íle, D-Ile, Leu, D-
-Leu, Val, D-Val
Fenylalanín F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D- -His, Trp, D-Trp, trans-3,4 alebo 5- -fenylprolín, cis-3,4 alebo 5-fenyl- prolín
Prolín P D-Pro, L-l-tioazolidín-4-karboxylová kyselina, D- alebo L-l-0xazolidin-4- -karboxylová kyselina
Serín S D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D- -Met, Met(0), D-Met(0), L-Cys, D-Cys
Treonín T D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D- Met, Met(0), D-Met(0), Val, D-Val
Tyrozín Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D- -His
Valín v D-Val, Leu, D-Leu, íle, D-Ile, Met, D-Met
K užitočným metódam mutagenézy patrí mutacenéza pomocou PCR a saturačná mutagenéza, ktoré budú podrobnejšie opísané v nasledovnej časti. Tiež sa môže vytvoriť knižnica variantov náhodných sekvencií aminokyselín pomocou syntézy série degenerovaných oligonukleotidových sekvencií.
PCR mutagenéza
Pri mutagenéze pomocou PCR sa využíva malá presnosť Taq polymerázy na zavedenie náhodných mutácií do klonovaného fragmentu DNA (Leung a kol., Technique 1: 11-15, 1989). Je to veľmi účinná a pritom veľmi rýchla metóda na vnesenie náhodných mutácií. Úsek DNA, ktorý sa má mutovať, sa amplifikuje pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v podmienkach, ktoré znižujú presnosť Taq polymerázy, napr. ak je pomer dGTP/dATP približne rovný 5 a pridá sa Mn2+ do reakčnej zmesi pre PCR. Celá séria amplifikovaných fragmentov sa potom klonuje do vhodných vektorov a vytvorí sa tak knižnica náhodných mutantov.
Saturačná mutagenéza
Saturačná mutagenéza dovoľuje rýchle vnesenie veľkého počtu mutácií typu substitúcie jednej bázy do klonovaného fragmentu DNA (Mayers a kol., Science 229: 242, 1985). Táto technika zahrnuje vytvorenie mutácií, napr. chemickým opracovaním alebo a potom syntézu mutácií sa môže podstate sa môže Keďže celý tento mutovaných neutrálnymi ožiarením jednovláknovej DNA in vitro, komplementárneho reťazca DNA. Frekvencia ovplyvniť silou pôsobiaceho účinku a v dosiahnuť substitúcia všetkých možných báz.
proces nezahrnuje žiadnu genetickú selekciu fragmentov, získajú sa tak fragmenty tak s substitúciami, ako ja náhodne mutované fragmenty DNA, z ktorých sa môžu pripraviť proteíny so zmenenou funkciou. Distribúcie bodových mutácií nie je pritom nijako smerovaná na konzervatívne sekvenčné prvky.
Degenerované oligonukleotidy
Knižnica homológov sa môže pripraviť pomocou série degenerovaných oligonukleotidov. Chemická syntéza degenerovaných sekvencií sa môže uskutočniť na zariadení na automatickú syntézu DNA, a syntetické gény sa potom vložia (ligujú) do vhodného expresného vektora. Syntéza degenerovaných oligonukleotidov je spôsob v odbore dobre známylxz:<1 a tento spôsob sa už využil na cielený vývoj iných proteínov'κ:ΐκι1.
Spôsoby cielenej alebo nenáhcdnej mutagenézy sa môžu využiť na prípravu špecifických sekvencií alebo mutácií v určitých špecifických úsekoch. Tieto spôsoby sa môžu využiť na vytvorenie variantov, ktoré obsahujú delécie, inzercie alebo substitúcie aminokyselinových zvyškov v známej aminokyselinovej sekvencií proteínu. Miesta mutácií sa môžu modifikovať individuálne alebo v sériách, napr. tak, že sa 1) najskôr substituujú konzervatívnymi aminokyseliny a potom sa uskutočňujú radikálnejšie zmeny v závislosti na získaných výsledkoch, 2) deletujú sa (odstránia) cieľové zvyšky a 3) inzertujú sa (vložia) zvyšky rovnakej alebo inej triedy do susedstva príslušného miesta, alebo sa kombinujú všetky uvedené spôsoby 1 až 3.
Mutagenéza nahradzovaním alanínom
Mutagenéza nahradzovaním alanínom (alanin scanning) je metóda vhodná na identifikáciu určitých zvyškov alebo úsekov požadovaných proteínov, ktoré sú výhodné miesta alebo domény pre mutagenézu (Cunningham a Wells, Science 244: 1081-1085, 1991). Pri tejto metóde sa identifikujú zvyšky, alebo skupiny zvyškov (napr. nabité aminokyselinové zvyšky ako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahradí sa neutrálnou alebo negatívnou aminokyselinou (najvýhodnejšie alanínom alebo polyalanínom). Tieto náhrady aminokyselín môžu ovplyvniť interakciu aminokyselín s okolitým vodným prostredím vo vnútri alebo mimo bunky. Domény, u ktorých sa prejaví funkčná citlivosť na substitúcie, sa môžu ďalej spresňovať vnášaním ďalších zmien alebo zmenami už substituovaných miest. Takže zatial čo miesto na vloženie variácie aminokyselinovej sekvencie je dopredu určené, povaha mutácie sama o sebe dopredu určená nie je. Napr. na optimalizáciu účinnosti mutácie v určitom mieste je možné uskutočniť nahradzovaciu mutagenézu alanínom alebo náhodnú mutagenézu na cieľovom kodóne alebo úseku a exprimovať varianty podjednotiek požadovaného proteínu, a tie potom testovať na optimálnu kombináciu a požadovanú aktivitu.
Mutagenéza sprostredkovaná oligonukleotidmi
Mutagenéza sprostredkovaná oligonukleotidmi je metóda vhodná na prípravu substitučných, delečných a inzerčných variantov DNA (pozri napr. Adelman a kol., DNA 2: 183, 1983). Požadovaná DNA sa môže zmeniť tým, že hybridizuje s oligonukleotidom, ktorý obsahuje mutáciu DNA templátu, kde templátom je jednovláknová forma plazmidu alebo bakteriofága obsahujúca nezmenenú alebo natívnu sekvenciu DNA pre požadovaný proteín. Po hybridizácii sa použije DNA polymeráza na syntézu celého komplementárneho vlákna, takže templát potom obsahuje vložený oligonukleotidový primér a teda kóduje vybraté zmeny v DNA pre daný protein. Všeobecne sa používajú oligonukleotidy s veľkosťou najmenej 25 nukleotidov. Optimálny oligonukleotid obsahuje 12 až 15 nukleotidov, ktoré sú úplne komplementárne k templátu na obidvoch stranách od nukleotidu (prípadne nukleotidov) kódujúceho mutáciu. To zaistí, že oligonukleotid bude správne hybridizovaf s jednovláknovou templátovou DNA. Oligonukleotidy sa môžu ľahko syntetizovať spôsobmi známymi v odbore (pozri napr. Crea a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5765, 1978).
Kazetová mutagenéza
Ďalším spôsobom, ako pripraviť varianty, je kazetová mutagenéza, ktorá je založená na technike, ktorú opísali Wells a kol. (Gene 34: 315, 1985). Východiskovým materiálom je plazmid (alebo iný vektor), ktorý obsahuje DNA pre proteínovú podjednotku, ktorá sa má mutovať. Najskôr je potrebné identifikovať kodón (prípadne kodóny), ktoré sa majú v proteínovej podjednotke mutovať. Je potrebné, aby na každej strane od mutovaného miesta bolo jedinečné miesto pre reštrikčnú endonukleázu. Pokial takéto reštrikčné miesto neexistuje, je treba ho v požadovanej lokalizácii vytvoriť pomocou opísanej mutagenézy sprostredkovanej oligonukleotidom. Po vložení reštrikčných miest do plazmidu sa plazmid v týchto miestach štiepi a teda linearizuje. Potom sa štandardným spôsobom syntetizuje dvojvláknový oligonukleotid, ktorý kóduje sekvenciu DNA medzi dvoma reštrikčnými miestami a obsahuje požadovanú mutáciu. Každý oligonukleotidový reťazec sa syntetizuje samostatne a potom sa hybridizujú zase štandardným spôsobom v odbore známym. Tento dvojvláknový oligonukleotid sa nazýva kazetou. Kazeta sa pritom navrhla tak, aby obsahoval 3'-koniec a 5'-koniec kompatibilný s koncami linearizovaného plazmidu, takže sa môže priamo do plazmidu ligovať. Plazmid potom obsahuje mutovanú sekvenciu DNA požadovaného proteínu.
Kombinačná mutagenéza
Na vytvorenie mutácií sa tiež môže použiť kombinačná mutagenéza. Napr. aminokyselinové sekvencie skupiny homologických alebo inak príbuzných proteínových sekvencií sa usporiadajú tak, aby sa dosiahla maximálna homológia. Všetky sekvencie, ktoré sa objavia v danej pozícii u všetkých usporiadaných sekvencií sa vyberú a vytvorí sa z nich degenerovaný súbor kombinačných sekvencií. Kombinačnou mutagenézou sa vytvorí veľmi rôznorodá knižnica variantov na úrovni nukleových kyselín. Napr. zmes syntetických oligonukleotidov sa enzýmovo liguje do génových sekvencií tak, že degenerovaný súbor potenciálnych sekvencií je exprimovateľný ako individuálne peptidy, alebo alternatívne ako súbor dlhších fúznych proteínov obsahujúcich súbor degenerovaných sekvencií.
Rôzne techniky sú v odbore známe na skríning vytváraných mutovaných génov. Techniky na skríning velkých génových knižníc často zahrnujú klonovanie knižnice do replikovatelných expresných vektorov, transformovanie vhodných buniek výslednou knižnicou vektorov a expresiou génov v podmienkach, keď detekcia požadovanej aktivity, t.j. v tomto prípade väzbu na APRÍL alebo jeho receptor, umožňuje relatívne ľahkú izoláciu vektora kódujúceho gén, ktorého produkt sa detegoval. Každá z techník opisovaných v nasledujúcich odsekoch je vhodná na vysoko účinné a vysokokapacitné testovanie velkého množstva sekvencií vytváraných napr. technikami náhodnej mutagenézy.
Vynález ďalej poskytuje možnosť pripravovať mimetiká na redukciu proteínových väzbových domén polypeptidu APRÍL alebo jeho receptora, napr. peptidové činidlá alebo činidlá inej povahy ako peptidy. Peptidové mimetiká sú schopné narušiť väzbu APRÍL a jeho receptora. Kritické zvyšky APRÍL zúčastňujúce sa procesu molekulového rozpoznávania receptorového polypeptidu alebo príslušného následného intracelulárneho proteínu v signálnej dráhe, sa môžu určiť a použiť na prípravu peptidových mimetík. APRÍL alebo jeho receptora, ktoré kompetitívne alebo nekompetitívne inhibujú väzbu APRÍL a jeho receptora (pozri napr. Peptide inhibitors of human papilloma vírus proteín binding to retinoblastoma gene proteín, patentové prihlášky EP 412 762 A a EP 831 080 A, ktoré sú zahrnuté formou odkazov).
Tým, že predkladaný vynález poskytuje purifikovaný a rekombinantný APRÍL, poskytuje tiež metódu testovania, ktorá sa môže použiť na testovanie kandidátov liečiv, ktoré sú funkčne buď agonisty alebo antagonisty normálnej bunkovej funkcie APRÍL, alebo jeho receptora. V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu sa pomocou takéhoto testu hodnotí schopnosť mcdulovať väzbu medzi APRÍL a jeho receptorom. Odborníkovi je zrejmé, že sa môžu vytvárať rôzne varianty testov podľa predkladaného vynálezu.
V mnohých programoch na skríning liekov, ktoré sa používajú na testovanie celej knižnice zlúčenín alebo prírodných extraktov, sú požadované metódy s velkou účinnosťou a kapacitou spracovaných vzoriek, aby sa mohol maximalizovať počet zlúčenín otestovaných za jednotku času. Testy, ktoré sa uskutočňujú na bezbunkovom systéme, ako sú napr. purifikované alebo semipurifikované proteíny, sú často výhodné ako testy r.a tzv. primárny skríning, ktorý umožňuje rýchly vývoj týchto zlúčenín, pretože umožňuje relatívne ľahkú detekciu zmien molekulového ciela, ku ktorým dochádza pôsobením testovanej zlúčeniny. Avšak toxické pôsobenie na bunky a/alebo biologická dostupnosť testovanej zlúčeniny môžu zostať v takomto in vitro bez povšimnutia, pretože test je primárne zameraný na pôsobenie liečiva na molekulový cieľ, kde sa prejavuje zmenou väzbovej afinity k iným proteínom alebo zmenami enzýmových vlastností molekulového ciela.
Izolácia receptorov· viažucich APRÍL
Na identifikáciu a klonovanie receptorov sa môžu použiť ligandy rodiny TNF. Pomocou opísaných sekvencií APRÍL sa môže fúzovať 5'-koniec extracelulárnej domény, ktorý tvorí väzbovú sekvenciu pre receptor, k markerovej alebo značkovacej sekvencií a potom pridať vedúcu sekvenciu, ktorá podporí sekréciu ligandu v niektorom z mnohých možných expresných systémoch. Jeden príklad takéhoto postupu opísali Browning a kol. (JBC 271: 86188626, 1996), keď ligand LT-β sa sekretoval v takejto forme. Vedúca sekvencia VCAM sa pripojila ku krátkej značkovacej sekvencii peptidú myc s extracelulárnou doménou LT-β. Sekvencia VCAM sa použila preto, aby pomohla sekrécii molekuly LT-β, ktorá je normálne viazaná na membránu. Sekretovaný proteín si ponecháva značku myc na svojom N-konci, ktorá nijako neznižuje schopnosť viazať sa na receptor. Takýto sekretovaný proteín sa môže exprimovať buď v prechodne transfekovaných bunkách COS alebo v podobnom systéme, napr. vektoroch odvodených z EBNA, systéme hmyzích buniek a bakulovírusu alebo Pichia sp. a pod.. Ako zdroj označeného ligandu sa môže využiť nepurifikovaný bunkový supernatant.
Bunky exprimujúce receptor sa môžu identifikovať tak, že sa naviazaným ligandom sa Sc exponujú označenému ligandu. Bunky s potom identifikujú pomocou prietokovej cytometrie FACS, keď myc označí protilátkou proti peptidú myc (anti-myc, 9Ξ10) a potom fykoerytrínom (alebo podobnou značkou) značených antimyšacím imunoglobulínom. Bunky pozitívne vo FACS sa lahko identifikujú a slúžia potom ako zdroj RNA kódujúci receptor. Z tejto RNA sa potom môže pripraviť štandardným postupom expresná knižnica a rozdeliť do podskupín (pools). Tieto podskupiny sa potom transfekujú do vhodných hostiteľských buniek a väzba označeného ligandu sa transfekované bunky s receptorom sa identifikujú pomocou mikroskopického vyšetrenia potom, ako sa naviazaný myc peptid označí anti-myšacím imunoglobulínom označeným enzýmom, napr. galaktozidázou, alkalickou fosfatázou alebo luciferázou. Hneď ako sa raz identifikuje pozitívna podskupina klonov, zmenšuje sa potom veľkosť podskupín doteraz nie je identifikovaná cDNA kódujúca receptor. Celá táto procedúra sa môže uskutočniť buď s myšacím alebo ľudským APRÍL, pričom jedna z nich povedie ľahšie k receptoru.
G. Farmaceutické prípravky na liečenie chorôb súvisiacich s APRÍL
Farmaceutické prípravky podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť na liečenie rakovinových ochorení tak, že sa pacientovi, výhodne cicavcovi ako je pes, mačka alebo človek, podáva účinné množstvo prípravku podía vynálezu, ktorý obsahuje blokujúce činidlo schopné narušiť väzbu medzi APRÍL a jeho receptorom. K takýmto blokujúcim činidlám patrí rozpustný APRÍL, protilátky anti-APRIL, protilátky anti-receptor APRÍL alebo ich biologicky aktívne fragmenty, pričom tento zoznam nie je obmedzujúci. Okrem toho inhibujúca forma APRÍL sa môže pripraviť mutáciou APRÍL, pri ktorej sa uchová schopnosť blokovať spojenie medzi APRÍL a jeho receptorom. Blokujúce činidlá výhodne obsahujú fúzny proteín receptora s Ig, ktorý sa môže skonštruovať spôsobmi odborníkovi známymi.
Prípravky podía predkladaného vynálezu sú užitočné na liečenie všetkých rakovinových ochorení, ako je (pričom tento zoznam nie je obmedzujúci), napr. rakovina renálnych buniek, Kaposiho sarkóm, chronická leukémia, rakovina prsníka, sarkóm, karcinóm vaječníka, rakovina konečníka, rakovina krku, mastocytóm, rakovina pľúc, adenokarcinóm prsníka, karcinóm dlaždicových buniek hltanu a rakoviny zažívacieho traktu alebo žalúdka. Okrem toho sú tieto blokujúce činidlá užitočné na liečenie proliferatívnych chorôb, ktoré sa nezaraďujú k nádorom, t.j. bunkových hyperproliferácií (hvperplázií) , ako je napr. skleroderma, vytváranie ložísk pri reumatoidnej artritíde, jazvenie po chirurgickom zákroku a fibróza pľúc, pečene a maternice.
Farmaceutické · prípravky podľa predkladaného vynálezu obsahujú terapeuticky účinné množstvá APRÍL alebo jeho receptora, alebo ich fragmentov alebo mimetík, a prípadne obsahujú farmaceutický prijateľné nosiče a pomocné látky.
Vynález sa teda tiež týka liečenia rakoviny a spôsobov stimulácie, alebo v určitých prípadoch naopak inhibície imunitného systému, alebo jeho časti, ktoré spočívajú v podávaní farmaceutický účinného množstva zlúčeniny podía predkladaného vynálezu alebo ich farmaceutický prijateľných solí alebo derivátov. Pritom odborníkovi je zrejmé, že zlúčeniny a spôsoby podľa vynálezu sa môžu kombinovať a radom ďalších terapií.
Prípravky podľa predkladaného vynálezu sa môžu formulovať na rôzne spôsoby podávania, vrátane systémového topického alebo lokálneho podávania. Na systémové podávanie je výhodné podávanie injekčné, vrátane intramuskulárnej, intravenóznej a subkutánnej injekcie, pričom prípravok podľa predkladaného vynálezu sa môže formulovať ako vodný roztok, výhodne vo fyziologicky kompatibilnom pufri ako je napr. Hankov alebo Ringerov roztok. Okrem toho prípravok podľa predkladaného vynálezu sa môže formulovať v pevnej forme na prípadné rozpustenie alebo resuspendovanie bezprostredne pred použitím. Predkladaný vynález sa tiež týka lyofilizovaných foriem prípravku.
Prípravok podľa predkladaného vynálezu sa môže podávať tiež perorálnym, transmukozálnym alebo transdermálnym spôsobom. V prípravku na transmukozálne alebo transdermálne podávanie sa použijú vhodné látky uľahčujúce penetráciu (penetranty) vzhľadom na bariéru, ktorú je treba prekonať. Takéto penetranty sú v odbore známe a patria k nim napr. soli žlčovej kyseliny, deriváty kyseliny fusidovej a derergenty na transmukozálne podávanie. Transmukozálne podávanie sa môže uskutočňovať buď nosnou aerodisperziou (sprejom) alebo pomocou čapíkov. Na perorálne podávanie sa prípravok formuluje v zvyčajnej liekovej forme vhodnej na perorálne podávanie ako sú kapsle, tablety a toniká. Na topické podávanie môže byť prípravok vo forme masti, mazania, gélov alebo krémov, ako je v odbore všeobecne známe.
Dávky a dávkovací režim sú závislé na type rakoviny a na pacientovi a jeho anamnéze. Podávané množstvá musia byť účinné na liečenie, potlačenie alebo zmene progresie rakoviny. Môže ísť o jednotlivé alebo opakované dávky, čo je výhodné, frekvencia podávania závisí napr. na type pacienta a type choroby, veľkosti dávok atď.. Pre niektoré druhy rakoviny je účinné podávanie každý druhý deň alebo raz za tri dni. Množstvo aktívnej látky podané buď v jednej dávke alebo počas liečenia je závislé na mnohých rôznych faktoroch. Napr. na veku a veľkosti subjektu, závažnosti a priebehu ochorenia, ktoré sa lieči, spôsobe a forme podávania, a samozrejme na úsudku ošetrujúceho lekára. Avšak účinná dávka je v rozsahu 0,005 až 0,5 mg/kg/deň, výhodne 0,5 až 0,05 mg/kg/deň. Odborník sám posúdi, kedy môžu byť vhodné nižšie alebo vyššie dávky.
Génové konštrukty podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť tiež ako súčasť protokolu génovej terapie na prenos nukleových kyselín kódujúcich buď agonistické alebo antagonistické formy polypeptidu APRÍL.
Expresné konštrukty APRÍL sa môžu podávať prostredníctvom akéhokoľvek biologicky účinného nosiča, napr. akéhokoľvek farmaceutického prípravku schopného účinne preniesť in vivo gén pre APRÍL do bunky. Tento prístup znamená vložiť gén do vírusového vektora, ktorý môže priamo transfekovať bunku, alebo podľa plazmidovú DNA, napr. pomocou lipozómov, alebo nejakého vnútrobunkového nosiča, alebo môže ísť o priamu injekciu génového konštruktu. Výhodnou metódou je prenos pomocou vírusového vektora.
Farmaceutický prípravok s génovým konštruktom na génovú terapiu sa skladá v podstate zo systému na prenos génov a vhodného riedidla, alebo môže ísť o matrix umožňujúci pomalé uvoľňovanie, do ktorého sa zapustí systém prenášajúci gén. Alternatívne, pokiaľ celý systém na prenos génov sa môže pripraviť intaktný z rekombinantných buniek, napr. ako retrovírusový vektor, farmaceutický prípravok potom obsahuje jednu alebo niekolko buniek, ktoré produkujú systém na prenos génov.
Okrem použitia na terapiu sa oligoméry podlá predkladaného vynálezu môžu použiť ako diagnostické reagencie na detekciu prítomnosti či absencie cieľovej DNA, RNA alebo sekvencií aminokyselín, ku ktorým sa špecificky viažu. Iným aspektom predkladaného vynálezu je použitie na hodnotenie chemickej zlúčeniny z hľadiska ich schopnosti reagovať, t.j. napr. zlúčeniny z hľadiska ich schopnosti reagovať, t.j. napr. viazať sa, či inak fyzikálne asociovať s polypeptidom APRÍL alebo jeho fragmentmi. Spôsob obsahuje kontaktovanie chemickej látky s APRÍL a hodnotenie schopnosti látky reagovať s APRÍL. Okrem toho APRÍL podľa predkladaného vynálezu sa môže použiť v metódach na hodnotenie prirodzene sa vyskytujúcich ligandov alebo receptorov APRÍL, a tiež na hodnotenie chemických látok, ktoré sa asociujú alebo viažu s receptormi APRÍL. Niekedy je potrebné použiť označenú verziu APRÍL na uľahčenie detekcie väzby APRÍL na jeho receptor alebo buniek pozitívnych na receptor, napr. pri skríningu činidiel, ktoré blokujú interakciu medzi APRÍL a jeho receptorom. Okrem toho sa môže použiť bunkové línie transfekované APRÍL, ktoré majú zvýšenú rýchlosť rastu, ako základ pre testy na vyhľadávanie molekúl, ktoré blokujú aktivitu APRÍL.
Iný aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob hodnotenia chemickej látky z hľadiska jej schopnosti modulovať interakciu medzi APRÍL a jeho receptorom. Tento spôsob obsahuje zmiešanie APRÍL a receptora APRÍL v podmienkach, kde takáto dvojica je schopná interagovať, potom pridať chemickú látku, ktorá sa testuje a detegovať vytvorenie alebo naopak rozpad komplexu. Takéto modulujúce činidlá sa môžu ďalej hodnotiť in vitro testami, napr. testovanín ich aktivity v bezbunkovom systéme, prípadne opracovaním buniek podávaním týchto činidiel zvieratám účinkov.
týmito činidlami alebo a následným hodnotením
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Analýza APRÍL pomocou Northern blottingu ukázala, že expresia APRÍL bola veľmi slabá a obmedzená iba na niekoľko tkanív (obr. 2A) . Dva transkripty s veľkosťou 2,1 kb a 2,4 kb sa našli v prostate, zatial čo v PBL sa našiel kratší transkript s veľkosťou 1,8 kb. Analýza northernovým prenosom sa uskutočnila pomocou komerčne dostupných membrán s prenesenou RNA z ľudských tkanív Human Multiple Tissue Northern Blots I, II (Clontech katalóg, č. 7760-1 a 7759-1)., Human Cancer celí Line MTN Blot (Clontech katalóg, č. 7757-1) a Human Tumor Panel Blot V (Invitrogen, katalóg, č. D 3500-01). Membrány sa hybridizovali v hybridizačnom roztoku ExpressHyb (Clontech katalóg, č. 8015-1) najmenej 1 hodinu pri 62 °C. Sondy cDNA značené pomocou náhodných primérov (Boehringer Mannheim) s syntetizovali pomocou cDNA zodpovedajúcich extracelulárnej doméne APRÍL ako templátu. Teplotné denaturovaná sonda cDNA sa pridala c 1,5 x 106 cpm/ml do čerstvého roztoku ExpressHyb. Membrána sa hybridizovala 12 až 24 hodín pri 62 °C, trikrát opláchla v 2 x SSC s 0,05% SDS a potom exponovala pri -70 °C. Analýza APRÍL pomocou Northern blcttingu ukázala, že expresia APRÍL bol velmi slabá a obmedzená iba na niekolko tkanív (obr. 2A). Dva transkripty s veľkosťou 2,1 a 2,4 kb sa našli v prostate, zatiaľ čo v PBL sa našiel kratší transkript veľký 1,8 kb.
Pri dlhšom expozičnom čase sa objavila APRÍL mRNA veľká 2,1 kb v hrubom čreve, slezine a pankrease (dáta neuvedené). Táto obmedzená distribúcia APRÍL mRNA je v zhode s pôvodom klonov cDNA v súčasnosti dostupných v databázach EST klonov. Z 23 klonov iba dva pochádzali z normálnych tkanív (precnantr.á maternica, ostrovčeky pankreasu). Je nápadné, že zvyšok ESTklonov (21 klonov, 91%) bol prítomný v knižniciach cDNA vytvorených z nádorov alebo línií nádorových buniek (nádor vaječníka, 11; nádor prostaty, 3; Gessler-Wilmsov tumor, 1; karcinóm hrubého čreva, 1; tumor endometria, 1; nádor prištítnej žľazy, 1; nádor pankreasu, 1; T-bunkový lymfóm, 1; bunková línia pochádzajúca z adenokarcinómu LNCAP, 1) . To bolo príčinou ďalších testov transformovaných línii na expresiu APRÍL mRNA (obr. 2A) , a skutočne sa zistilo, že všetky bunkové línie silno exprimovali transkript APRÍL velký 2,1 kb.
TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3' ) EcoRI/Xbal a klonoval (Invitrogen) v súlade s
Najsilnejšie signály špecifické pre APRÍL sa detegovali v kolorektálnom adenokarcinóme SW480, v Burkittovom lymfóme Raji a melanóme G361. Na potvrdenie týchto zistení sa merala hladina expresie APRÍL mRNA v niekoľkých nádoroch a porovnala sa s normálnymi tkanivami. APRÍL mRNA sa vo veľkom množstve detegovala v karcinóme štítnej žľazy a lymfóme, zatiaľ čo v zodpovedajúcom normálnom tkanive sa našiel iba slabý hybridizačný signál (obr. 2C) . V dvoch ďalších nádoroch analyzovaných pomocou Northern blottingu (nádor nadobličky a prištítnej žľazy) nebola hladina APRÍL mRNA zvýšená. Avšak pomocou hybridizácie in situ sa zistila hojnosť APRÍL mRNA v ľudskom adenokarcinóme hrubého čreva v porovnaní s normálnym tkanivom hrubého čreva (obr. 2D).
Na preskúmanie možných aktivít APRÍL sa exprimovala rekombinantná forma rozpustnej extracelulárnej domény APRÍL (sAPRIL) obsahujúcej aminokyseliny 110 až 256 v bunkách 2S3. Gén APRÍL s plnou dĺžkou sa amplifikoval z klonu EST pomocou špecifického priameho 5'-koncového oligonukleotidového priméru s miestom EcoRI (5-CCAGCCTCATCTCCTTTCTTGC-3') a špecifického priameho 3'-koncového priméru s miestom Xbal (5'Amplifikovaný fragment sa štiepil s do modifikovanej verzie pCRIII rámcom N-koncového peptidu FLAG(15).
Rozpustná forma APRÍL ‘(sAPRIL) sa pripravila pomocou dvoch primérov 5'-AAACAGAAGAAGCAGCACTCTG-3' a
5'-TCACAGTTTCACAAACCCAGG-3' obsahujúcich miesta PstI a Xbal a potom klonovala do modifikovaného vektora pCRIII obsahujúceho tak signál HA na sekretovanie proteínu v eukaryotických bunkách ako aj N-koncový epitop FLAG<151.
Príklad 2
Značne rozšírená expresia APRÍL v nádorových bunkách a tkanivách viedla k domnienke, že APRÍL nejako súvisí s rastom nádorov a preto sa rôzne línie nádorových buniek inkubovali s purifikovaným rekombinantným sAPRIL značeným FLAG110’.
Bunkové línie ľudských embryonálnych T buniek 293, bunky ľudskej T-leukémie Jurkat a bunky ľudského Burkittovho lymfómu B-buniek Raji a melanómová bunková línia sa kultivovali ako sa už opísalo skôr116,17’. Ostatné bunkové línie spomínané v tomto opise sú deponované v Americkej zbierke mikroorganizmov (ATCC, Rockville, Maryland). Všetky bunkové línie sa kultivovali v médiu RPMI alebo DMEM doplnenom s 10% teľacím fetálnym sérom.
Nedávno sa opísali pomocou Flag označené verzie extracelulárne domény (zvyšky 103 až 281) ľudského FasL a TRAIL (zvyšky 95 až 281) (15). Rozpustný ľudský TWEAK (zvyšky 141 až 282) značený Flag sa pripravil v bunkách 293 (pozri pripravovaný rukopis). Protilátka anti-Flag M2 sa získala od firmy Kodak International Biotechnologies. Pozorovalo sa na dávke závislé zvýšenie proliferácie T-lymfómových buniek Jurkat v prítomnosti APRÍL, detegované zvýšením počtu (približne o 50%) 1111 životaschopných buniek 24 hodín po pridaní ligandu (obr. 3A) . Proliferácia buniek sa stanovila inkubovaním buniek v počte 50 000 buniek na jamku v 100 μΐ média s uvedenou koncentráciou rekombinantného APRÍL, TWEAK a FasL a potom stanovením počtu životaschopných buniek po 24 hodinách pomocou proliferačného testu Celltiter 96 AQ .(Promega) podľa návodu výrobcu súpravy alebo pomocou inkorporácie 3H-tymidínu. Na imunodepléciu FlagAPRIL sa použila anti-Flag naviazaná na agarózu.
Zvýšenie proliferácie bolo nezávislé na kostimulačných signáloch ako sú napr. protilátky anti-CD3 alebo iné cytokíny. Podía očakávania pridanie zhodne pripraveného a purifikovaného FasL k bunkám Jurkat znížilo počet životaschopných buniek, zatial čo TWEAK nemal žiadny účinok. Zvýšený počet buniek koreloval so zvýšenou (40%) inkorporáciou 3H-tymidínu u buniek opracovaných s APRÍL (obr. 3A) . Imunodeplécia v médiu obsahujúcom APRÍL značený pomocou FLAG spôsobená protilátkami anti-FLAG, ale nie protilátkami anti-myc, redukovala proliferatívny účinok (obr. 3B) , čo ukazuje, že proliferatívny účinok sa dosiahol špecificky vďaka APRÍL. Zvýšená rýchlosť proliferácie sa tiež pozorovala u niektorých B-lymfómov (ľudský RAJI, myšacie bunky A20, ale nie ľudské BJAB) a bunkových línií epitelového pôvodu, ako sú bunky COS a HeLa, a tiež melanómov (obr. 3C). Bunky karcinómu prsníka MCF-7 neodpovedali. Účinok na bunky Jurkat bol dokonca ešte výraznejší, keď sa znížilo fetálne teľacie sérum z 10% na 1% (obr. 3D).
Rekombinantný sAPRIL vytváral agregáty, čo by mohlo vysvetliť značne vysoké koncentrácie potrebné na detekciu proliferatívneho účinku sAPRIL. Bunky NIH-3T3 sa transfekovali ľudským APRÍL s plnou dĺžkou (12) a získalo sa tak niekolko klonov exprimujúcich APRÍL (obr. 4A) . Klony NIH-3T3 APRÍL sa pripravili transfekciou expresného vektora pCRIII obsahujúceho APRÍL s plnou dĺžkou značený FLAG pomocou kalciumfosfátovej metódy. Bunkové proteíny zodpovedajúce približne 2 x 10° buniek v každej dráhe sa elektroforeticky separovali na 12% polyakrylamidovom géli v prítomnosti SDS za redukujúcich podmienok a potom sa preniesli na nitrocelulózovú membránu. Analýza immunoblotting APRÍL značeného FLAG sa uskutočnila použitím 5 gg/ml potkanej monoklonálnej protilátky anti-FLAG M2 (Kodak International Biotechnologies) . Prvé protilátky sa detegovali pomocou afinitne purifikovanej oslej anti-myšacej protilátky konjugovanej s peroxidázou (Dianova, Hamburg, Nemecko), nasledovanou čhemiluminiscenčnou reakciou s využitím systému ECL (Amersham).
Je zaujímavé, že transfektanty APRÍL mali rýchlejšiu proliferáciu ako kontrolné transfektanty (obr. 4B) . Dôvodom je zrejme to, že bunky NIH-3T3 transfekované APRÍL by mohli mať rastovú výhodu in. vivo. Pokial sa bunky divého typu alebo kontrolné transfektanty NIH-3T3 injikovali nahým myšiam, pozorovali sa hmatateľné nádory po 5 až 6 týždňoch (13). Na rozdiel od toho, 2 klony buniek NIH-3T3 trvalo transfekovaných APRÍL indukovali nádory po 3 až 4 týždňoch. Po 6 týždňoch sa museli myši utratiť vzhľadom na prílišný rozsah ochorenia (obr. 4C). NIH-3T3 fibroblasty (ATCC, Rockville, Maryland, USA) a rôzne transfektanty (1 x 105 buniek) sa resuspendovali v 50 μΐ PBS a injikovali subkutánne do boku nahých myší BALB/c (Harlan, Ziest, -Holandsko). Veľkosť nádora sa merala každý tretí deň. Vybrali sa myši s rovnakým vekom (3 zvieratá v každej skupine).
Príklad 3
Izolácia receptora viažuceho APRÍL
Na identifikáciu a klonovanie receptorov sa použili ligandy rodiny TNF. Pomocou opísaných sekvencii APRÍL je možné fúzovať 5'-koniec extracelulárnej domény, ktorý tvorí väzbovú sekvenciu pre receptor, k markerovej alebo značkovacej sekvencii a potom pridať vedúcu sekvenciu, ktorá podporí sekréciu ligandu v niektorom z mnohým možných expresných systémov. Jeden príklad takéhoto postupu opísali Browning a kol. (JBC 271: 8618-8626,
1996), keď ligand LT-β sa sekretoval v takejto forme. Vedúca sekvencia VCAM sa pripojila ku krátkej značkovacej sekvencii peptidu myc s extracelulárnou doménou LT-β. Sekvencia VCAM sa použila preto, aby pomohla sekrécii molekuly LT-β, ktorá je normálne viazaná na membránu. Sekretovaný proteín sa môže exprimovať buď v prechodne transfekovaných bunkách COS alebo v podobnom systéme, napr. vektoroch odvodených od EBNA, systéme hmyzej bunky a bakulovírusu alebo Pichia sp. a pod.. Ako zdroj označeného ligandu sa môže využiť nepurifikovaný bunkový supernatant.
Bunky exprimujúce receptor sa môžu identifikovať tak, že sa exponujú označenému ligandu. Bunky s naviazaným ligandom sa potom identifikujú, pomocou prietokovej cytometrie FACS, keď sa myc označí protilátkou proti peptidu myc (anti-myc, 9E10) a potom fykoerytrínom (alebo podobnou značkou) značeným antimyšacím imunoglobulínom. Bunky pozitívne vo FACS sa ľahko identifikujú a slúžia potom ako zdroj RNA kódujúci receptor. Z tejto RNA sa potom môže pripraviť štandardným postupom expresná knižnica a rozdeliť do podskupín (pools). Tieto podskupiny klonov sa potom transfekujú do vhodných hostiteľských buniek a väzba označeného ligandu na transfekované bunky s receptorom sa identifikuje pomocou mikroskopického vyšetrenia potom, ako sa naviazaný myc peptid označeným enzýmom, napr alebo luciferázou. Ak označí anti-myšacím imunoglobulínom galaktozidázou, alkalickou fosfatázou sa už raz identifikuje pozitívna podskupina klonov, zmenšuje sa potom veľkosť podskupín dokiaľ sa neidentifikuje cDNA kódujúca receptor. Celá táto procedúra sa môže uskutočniť buď s myšacím alebo ľudským APRÍL, pričom jedna z nich privedie ľahšie k receptoru.
Odborníkovi je zrejmé, že je možné uskutočniť rôzne modifikácie prípravkov APRÍL podía predkladaného vynálezu v rámci vynálezcovskej myšlienky vynálezu. Predkladaný vynález preto zahrnuje aj takéto modifikácie a variácie, pokial spadajú do predmetu vynálezu ohraničeného nasledujúcimi nárokmi, alebo pokial ide o ekvivalentné riešenie.
ZOZNAM SEKVENCIÍ
Sekvencia SEQ ID NO: 1
GGTACGAGGC TTCCTAGAGG GACTGGAACC TAATTCTCCT GAGGCTGAGG 51 GAGGGTGGAG GGTCTCAAGG CAACGCTGGC CCCACGACGG AGTGCCAGGA
101 GCACTAACAG TACCCTTAGC TTGCTTTCCT CCTCCCTCCT TTTTATTTTC
151 AAGTTCCTTT TTATTTCTCC TTGCGT AAC A ACCTTCTTCC CTTCTGC ACC 201 ACTGCCCGTA CCCTTACCCG CCCCGCCACC TCCTTGCTAC CCCACTCTTG 251 AAACCACAGC TGTTGGCAGG GTCCCCAGCT CATGCCAGCC TCATCTCCTT 301 TCTTGCTAGC CCCCAAAGGG CCTCCAGGCA ACATGGGGGG CCCAGTCAGA
351 GAGCCGGCAC TCTCAGTTGC CCTCTGGTTG AGTTGGGGGG CAGCTCTGGG
401 GGCCGTGGCT TGTGCCATGG CTCTGCTGAC CCAACAAACA GAGCTGCAGA 451 GCCTCAGGAG AGAGGTGAGC CGGCTGCAGG GGACAGGAGG CCCTCCCAG 501 AATGGGGAAG GGTATCCCTG GCAGAGTCTC CCGGAGCAGA GTTCCGATGC 551 CCTGGAAGCC TGGGAGAATG GGGAGAGATC CCGGAAAAGG GAGCAGTGC
601 TCACCCAAAA ACAGAAGAAG CAGCACTCTG TCCTGCACCT GGTTCCCATT
651 AACGCCACCT CCAAGGATGA CTCCGATGTG ACAGAGGTGA TGTGGCAACC 701 AGCTCTTAGG CGTGGGAGAG GCCTACAGGC CCAAGGATAT GGTGTCCGAA 751 TCCAGGATGC TGGAGTTTAT CTGCTGTATA GCCAGGTCCT GTTTCAAG AC 801 GTGACTTTCA CCATGGGTCA GGTGGTGTCT CGAGAAGGCC AAGGAAGGCA
851 GGAGACTCTA TTCCGATGTA TAAGAAGTAT GCCCTCCCAC CCGGACCGGG
901 CCTACAACAG CTGCTATAGC GCAGGTGTCT TCCATTTACA CCAAGGGGAT 951 ATTCTGAGTG TCATAATTCC CCGGGCAAGG GCGAAACTTA ACCTCTCTCC 1001 AC ATGG AACC TTCCTGGGGT TTGTG AAACT GTG ATTGTGT TATAAA A AGT 1051 GGCTCCCAGC TTGGAAG ACC AGGGTGGGTA CATACTGGAG AC AGCC AAG A
1101 GCTGAGTATA TAAAGGAGAG GGAATGTGCA GGAACAGAGGCATCTTCCTG
1151 GGTTTGGCTC CCCGTTCCTC ACTTTTCCCT TTTCATTCCC ACCCCCTAG A 1201 CTTTGATTTT ACGG ATATCT TGCTTCTGTT CCCCATGGAG CTCCG AATTC 1251 TTGCGTGTGT GTAGATGAGG GGCGGGGGAC GGGCGCCAGG CATTGTTCAG 1301 ACCTGGTCGG GGCCCACTGG AAGCATCCAG AACAGCACCA CCATCTTA
Sekvencia SEQ ID NO: 2
MPASSPFLLA PKGPPGNMGG PVREPALSVA LWLSWGAALG AVACAMALLT 51 QQTELQSLRR EVSRLQGTGG PSQNGEGYPW QSLPEQSSDA LEAWENGERS 101 .RKRRAVLTQK QKKQHSVLHL VPINATSKDD SDVTEVMWQP ALRRGRGLQA 151 QGYGVRIQDA GVYLLYSQVL FQDVTFTMGQ VVSREGQGRQ ETLFRCIRSM 201 PSHPDRAYŇS CYSAGVFHLH QGDILSVIIP RARAKLNLSP HGTFLGFVKL
Sekvencia SEQ ID NO: 3
GAATTCGGCA CGAGGCTCCA GGCCACATGG GGGGCTCAGT CAGAGAGCCA 51 GCCCTTTCGG TTGCTCTTTG GTTGAGTTGG GGGGCAGTTC TGGGGGCTGT
101 GACTTGTGCT GTCGCACTAC TGATCCAACA GACAGAGCTG CAAAGCCTAA 151 GGCGGGAGGT GAGCCGGCTG CAGCGGAGTG GAGGGCCTTC CCAGAAGCAG 201 GGAGAGCGCC CATGGCAGAG CCTCTGGGAG CAGAGTCCTG ATGTCCTGGA 251 AGCCTGGAAG GATGGGGCGA AATCTCGGAG AAGGAGAGCA GTACTCACCC 301 AGAAGCACAA GAAGAAGCAC TCAGTCCTGC ATCTTGTTCC AGTTAACATT 351 ACCTCCAAGG ACTCTGACGT GACAGAGGTG ATGTGGCAAC CAGTACTTAG 401 GCGTGGGAGA GGCCCTGGAG GCCCAGGGAG ACATTGTACG AGTCTGGGAC 451 ACTGGAATTT ATCTGCTCTA TAGTCAGGTC CTGTTTCATG ATGTGACTTT 501 CACAATGGGT CAGGTGGTAT CTCGGGAAGG ACAAGGGAGA AGAGAAACTC 551 TATTCCGATG TATCAGAAGT ATGCCTTCTG ATCCTGACCG TGCCTACAAT 601 AGCTGCTACA GTGCAGGTGT CTTTCATTTA CATCAAGGGG ATATTATCAC 651 TGTCAAAATT CCACGGGCAA ACGCAAAACT TAGCCTTTCT CCGCATGGAA 701 CATTCCTGGG GTTTGTGAAA CTATGATTGT TATAAAGGGG GTGGGGATTT 751 CCCATTCCAA AAACTGGCTA GACAAAGGAC AAGGAACGGT CAAGAACAGC 801 TCTCCATGGC TTTGCCTTGA CTGTTGTTCC TCCCTTTGCC TTTCCCGCTC 851 CCACTATCTG GGCTTTGACT CCATGGATAT TAAAAAAGTA GAATATTTTG 901 TGTTTATCTC CCAAAAA
Sekvencia SEQ ID NO: 4
MGGSVREPAL SVALWLSWGA VLGAVTCAVA LLIQQTELQS LRREVSRLQR 51 SGGPSQKQGE RPWQSLWEQS PDVLEAWKDG AKSRRRRAVL TQKKKKKHSV 101 LHLVPVNITS KDSDVTEVMW QPVLRRGRGP GGQGDIVRVW DTGIYLLYSQ 151 VLFHDVTFTM GQWSREGQG RRETLFRCIR SMPSDPDRAY NSCYSAGVFH
201 LHQGDIITVK IPRANAKLSL SPHGTFLGFV KL
CITOVANÁ LITERATÚRA
i. Smith et al. 1990; Kohno et al 1990; Loetscher et al 1990; Schall et al 1990.
ii. See Jones et al., 1989; Eck et al., 1992.
iii. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicíne. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A. Waage, in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicíne. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).
iv. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicíne. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 117 (1992).
v. A. Nakane, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicíne. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A.
Clark et al., in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicíne. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 303 (1992); G. E.
Grau et al., in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicíne. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329 (1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in
Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, N Y, p 371 (1992).
vi. S. Malik, in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 407 (1992).
vii. D. A. Fox, Am. J. Med.,99. 82 (1995).
viii. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Ouant. Biol.. 51, 597 (1986); G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 515 (1992).
ix. L. A. Tartaglia et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88,9292 (1991); L.A. Tartaglia and D. V. Goeddel, Immunol. Today. 13, 151 (1992).
x. B. Luettig et al., J. Immunol.. 143,4034 (1989); M. Kriegler et al., Celí. 53,45 (1988).
xi. C. F. Ware et al., in Pathwavs for Cytolysis. G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds.), Springer-Verlag, Berlín, Heidelberg, p 175-218 (1995).
xii. N. Paul et al., Ann. Rev. Immunol..6.407 (1988).
xiii. P.D. Crowe et al., Science. 264,707 (1994). (J. Browning et al., Celí. 72, 847 (1993); J. Browning et al., J. Immunol.. 154, 33 (1995).
xiv. P. De Togni et al., Science. 264,703 (1993); T.A. Banks et al., J. Immunol.. 155, 1685 (1995).
xv. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol,.143.1859 (1989): J. Browning et al., J. Exp. Med.. 183.867 (1996).
xvi. T. Suda et al., J. Immunol.. 154, 3806 (1995)(T. Suda et al., J. Immunol.. 154, 3806(1995).
xvii. B.C. Trauth et al., Science. 245,301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp. Med.. 169,1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science. 267, 1449 (1995); M. H. Falk et al., Blood. 79,3300 (1992).
xviii.F. Rieux-Laucat et al., Science. 268,1347 (1995); T. Takahashi et al., Celí. 76,969 (1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Náture, 356, 314 (1992).
xix. P. R. Galie and al„ J. Exp. Med.. 182, 1223 (1995).
xx. F. Silvestris and al., Clin. Immunol. Immunopathol.. 75, 197 (1995).
xxi. P.D. Katsikis et al., J. Exp. Med.. 181. 2029 (1995); A. D. Badley et al., J. Virol ..70. 199 (1996).
xxii. S. Wiley et al., Immunitv. 3,673 (1995).
xxiii. J. F. Gauchat et al., FEBS Lett.. 315, 259 (1993); S. Funakoshi et al., Blood. 83,2787(1994).
xxiv. R. C. Alien et al., Science. 259,990 (1993).
xxv. L. Biancone et al., Kidnev-Int..48.458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol.. 154, 1470(1995).
xxvi. J. Ruby and al., Náture Medicíne. 1,437 (1995).
xxvii. Z. Wang et al., J. Immunol.. 155,3722 (1995); A. M. Čleary and al., J. Immunol.. 155,3329 (1995).
xxviii. S. Hess and H. Engelman, J. Exp. Med..183.159 (1996).
xxix. R. G. Goodwin et al, Celí, 73,447 (1993); Goodwin et al. Eur. J. Immunol.. 23, 2631 (1993); C. A. Smith et al.. Celí, 73, 1349(1993).
xxx. See forexample, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA. Proc 3rd Cleveland Svmpos, Macromolecules. ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.
xxxi. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al.
(1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; as well as U.S. Patents Nos. 5,223,409,5,198,346, and 5,096,815.
33. M.T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D.H. Lynch and S.R. Targan. Divergent induction of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF- and ligation of Fas ligand. J, Immunol. 155:4147-4154,1995.
34. K. Agematsu, T. Kobata, F.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Mori, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B celí IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. 25: 2825-2829,1995.
35. R. Amakawa, A. Hakem, T.M. Kundig, T. Matsuyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A. Wakeham, H.-W. Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T.W. Mak. Impaired negatíve selection of T cells in Hodgkin=s disease antigén CD30-deficient mice. Celí 84: 551-562, 1996.
36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hofmann, V. Steiner, M. Thome, T. Bomand, M. Hahne, M. Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R. MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosismediating receptor with sequence homology to tumor necrosis factor receptor and fas (apo-l/CD95). Immunitv 6:79-88,1997.
37. J. Brojatsch, J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Carl. a TNFR-related protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosissarcoma viruses and mediates apoptosis. Celí 87:845-855,1996.
38. J.L. Browning, M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associated 33-kDa glycoprotein are expresed on the surface of an activated human T celí hybridoma. J. Immunol. 147: 1230-7, 1991.
39. J.L. Browning, K. Miatkowski, D.A. Griffiths, P.R.Bourdon, C. Hession, C.M. Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human lymphotoxins alpha and beta. J. Biol. Chem. 271: 8618-26. 1996.
4Ί
40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P.W. Finn and D.L. Perkins. Fas Modulation of apoptosis during negatíve selection of thymocytes. Immunitv 5:617-627,1996.
41. C.-Y.A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol. Sci. 20:465-470,1995.
42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouse macrophages of a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue which shares a short nucleotide sequence with erythropoietin mRNA. Biochim, Biophvs. Res. Comm, 209: 1076-1081, 1995.
43. A.M. Chinnaiyan, K. O=Rourke, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan,
L. Xing, R. Gentz, J. Ni and V.M. Dixit. Signál transduction by DR3 a deathdomain-containing receptor related to TNFR-1 andCD95. Science 274:990992,1996.
44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science 264: 703-7, 1994.
45. M.A. DeBenedette, N.R. Chu, K.E. Pollok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S.
Kwon and T.H.Watts. Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M12 B lymphomas by cAMP. J. Exp. Med. 181:985-992,1995.
46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W.S. Din, P.J. Smolak, R.G. Goodwin and C. A. Smith. Activation of the lymphotoxin-β receptor by cross-linking induces chemokine production and growth arrest in A375 melanoma cells. J. Immunol. 158: 1756-1762,1997.
47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Buhlmann and R.J. Noelle. Immune regulation by CD40 and its ligand gp39. Ann. Rev. Immunol. 14: 591-617, 1996.
48. H.J. Gruss, N. Boiani, D.E. Williams, R.J. Armitage, C.A. Smith and R.G. Goodwin. Pleiotropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and lymphoma celí lines. Blood 83:2045-56,1994.
49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood 85: 3378-404, 1995.
50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun, C.J. Grinham, R.Brown and S.N. Farrow. A death domain-containing receptor that mediates apoptosis. Náture 384: 372-375, 1996.
51. S. Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T celí receptor-dependent celí death of T celí hybridomas mediated by the CD30 cytoplasmic domain in association with tumor necrosis factor receptor-associated factors. J. Exp. Med. 183: 669-674, 1996.
52. R.I. Montgomery, M.S. Warner, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex vírus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Celí 87: 427-436, 1996.
53. S.Nagata. Apoptosis by death factor. Celí 88: 355-365, 1997.
54. R.M. Pitti, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J. Biol. Chem. 1996.
55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Celí 76: 95962, 1994.
56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host response to infection. Trends in Microbiol. 3: 81-88, 1994.
57. E.Strueber and W. Strober. The T cell-B celí interaction via OX40-OX40L is necessary for the T celí independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183: 979-989, 1996.
58. H.-K. Sytwú, R.S. Liblau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigen-induced programmed celí death in T celí receptor trangenic mice. Immunitv 5: 17-30, 1996.
59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Ann. Rev. Immunol. 10:411-452,1992.
60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Náture 377: 348-351, 1995.

Claims (33)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Nukleová kyselina kódujúca ligand APRÍL, ktorý obsahuje polypeptid zložený najmenej zo 102 aminokyselín.
  2. 2. Nukleová kyselina podía nároku 1, ktorá kóduje sekvenciu SEQ ID NO: 2.
  3. 3. Nukleová kyselina kódujúca ligand APRÍL alebo jeho fragment, pričom tento ligand obsahuje aminokyselinovú sekvenciu aminokyselín 1 až 55 zo sekvencie SEQ ID NO: 2.
  4. 4. Nukleová kyselina kódujúca ligand APRÍL alebo jeho fragment, pričom tento ligand obsahuje aminokyselinovú sekvenciu aminokyselín 157 až 250 zo sekvencie SEQ ID NO: 2.
  5. 5. Nukleová kyselina podía nárokov 1 až 4 kódujúca aminokyselinové substitučné analógv sekvencie SEQ ID NO: 2.
  6. 6. Nukleová kyselina podľa nároku 5, kde substitučný analóg, pokiaľ sa porovnáva so sekvenciou SEQ ID NO: 2, má s ňou najmenej 40% sekvenčnú podobnosť, a kde substitučný analóg má najmenej 80% porovnávaných cysteínových zvyškov s ligandom APRÍL.
  7. 7. Nukleová kyselina podľa nároku 5, kde substitučný analóg, pokial sa porovnáva so sekvenciou SEQ ID NO: 2, má s ňou najmenej 80% sekvenčnú podobnosť.
  8. 8. Nukleová kyselina, ktorá má nukleotidovú sekvenciu obsahujúcu
    a) sekvenciu SEQ ID NO: 1 alebo
    b) substitučný analóg sekvencie SEQ ID NO: 1, alebo
    c) alteračný analóg sekvencie SEQ ID NO: 1, alebo
    d) delečný analóg sekvencie SEQ ID NO: 1.
  9. 9. Vektor, ktorý v sebe obsahuje nukleovú kyselinu podlá nároku 1, 2, 3, 4 alebo 8 v podobe inzertu, pričom tento vektor voliteľne obsahuje expresnú kontrolnú sekvenciu operatívne spojenú s inzertom.
  10. 10. Hostiteľská bunka obsahujúca vektor podľa nároku 9.
  11. 11. Spôsob prípravy v podstate čistého APRÍL, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, keď sa kultivujú hostiteľské bunky podľa nároku 10.
  12. 12. Polypeptid ligandu APRÍL, ktorý obsahuje aspoň 102 aminokyselín.
  13. 13. Polypeptid ligandu APRÍL, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu aminokyselín 1 až 55 zo sekvencie SEQ ID NO: 2 alebo jeho fragment.
  14. 14. Polypeptid ligandu APRÍL, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu aminokyselín 157 až 250 zo sekvencie SEQ ID NO: 2 alebo jeho fragment.
  15. 15. Ligand APRÍL vybraný zo skupiny obsahujúcej:
    a) sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo
    b) aminokyselinový substitučný analóg sekvencie SEQ ID NO: 2.
  16. 16. Rozpustný polypeptid ligandu APRÍL podľa nárokov 12 až 15.
  17. 17. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo polypeptidu ligandu APRÍL podľa nárokov 12 až 15 a farmaceutický prijateľný nosič.
  18. 18. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže k polypeptidu ligandu APRÍL podía nárokov 12, 13, 14, 15 alebo 16.
  19. 19. Protilátka, ktorá blokuje väzbu polypeptidu ligandu APRÍL na polypeptid receptora APRÍL.
  20. 20. Protilátka podľa nároku 20, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid APRÍL.
  21. 21. Použitie farmaceutického prípravku podľa nárokov 17 na výrobu lieku na prevenciu alebo redukciu závažnosti autoimunitnej choroby, prevenciu alebo redukciu závažnosti imunitnej reakcie na tkanivový štep, stimuláciu alebo potlačenie imunitného systému alebo liečenie rakoviny.
  22. 22. Spôsob identifikácie receptora pre APRÍL, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, keď sa
    a) poskytne APRÍL alebo jeho fragment,
    b) APRÍL alebo jeho fragment označí detegovateľnou značkou,
    c) testujú prípravky, aby sa identifikovali receptory, ktoré sa viažu k detegovateľne značenému b).
  23. 23. Spôsob expresie APRÍL v cicavčej bunke, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje kroky, keď sa
    a) vnesie do bunky gén kódujúci APRÍL,
    b) bunkám umožní žiť v takých podmienkach, že gén sa exprimuje v cicavcovi.
  24. 24. Použitie vektora obsahujúceho gén kódujúci APRÍL na výrobu lieku na liečenie choroby súvisiacej s APRÍL u cicavcov obsahujúce
    a) vnesenie terapeuticky účinného množstva vektora do bunky,
    b) expresiu génu v bunke cicavca.
  25. 25. Použitie podľa -nároku 24, keď cicavcom je človek.
  26. 26. Použitie podľa nároku 24, keď vektorom je vírus.
    27. Použitie činidla schopného narušiť väzbu APRÍL s jeho receptorom na výrobu lieku na indukciu bunkovej smrti. 28. Použitie podľa nároku 28, ktoré ďalej obsahuje podanie interferónu-γ. 29. Použitie blokujúceho činidla schopného narušiť spoj enie
    , medzi APRÍL a jeho receptorom na prípravu lieku na liečenie, potlačenie, aktiváciu alebo zmenu imunitnej odpovede zahŕňajúcu signálnu dráhu medzi APRÍL a jeho receptorom, alebo liečenie, potlačenie alebo zmenu progresie rakoviny.
  27. 30. Použitie podlá nároku 29, kde imunitná odpoveď zahŕňa bunky ľudského karcinómu.
  28. 31. Použitie podľa nároku 29, kde blokujúcim činidlom je modifikovaná inhibujúca forma APRÍL alebo protilátky anti-APRIL alebo ich biologicky aktívne fragmenty.
  29. 32. Použitie podlá nároku 31, kde blokujúcim činidlom je » protilátka proti receptoru APRÍL.
    J
  30. 33. Použitie podľa nároku 29, kde blokujúce činidlo sa podáva pacientovi v kombinácii aspoň s jedným chemoterapeutickým činidlom.
  31. 34. Použitie podľa nároku 33, kde sa ďalej u pacienta používa ožarovanie.
  32. 35. Použitie polypeptidu ligandu APRÍL podľa nárokov 12 až 15 alebo protilátky podľa nárokov 19 až 21 na prípravu lieku na potlačenie rastu nádorových buniek, ktoré exprimujú APRÍL, ktoré obsahuje kroky, keď sa bunky uvedú do kontaktu s účinným množstvom rozpustného polypeptidu ligandu APRÍL podľa nárokov 12 až 15, alebo protilátky podľa nárokov 19 až 21.
  33. 36. Použitie polypeptidu ligandu APRÍL podľa nárokov 12 až 15 alebo protilátky podľa nárokov 19 až 21 na prípravu lieku na potlačenie rastu nádorových buniek, ktoré exprimujú polypeptid receptora APRÍL, ktoré obsahuje kroky, keď sa bunky uvedú do kontaktu s účinným množstvom rozpustného polypeptidu ligandu APRÍL podľa nárokov 12 až 15, alebo protilátky podľa nárokov 19 až 21.
SK354-2000A 1997-09-12 1998-09-11 Nucleic acid coding ligand april, a vector, a host cell, method for preparing ligand april, a polypeptide of ligand april, a pharmaceutical composition and an antibody, and use thereof SK3542000A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5878697P 1997-09-12 1997-09-12
US7938498P 1998-03-26 1998-03-26
PCT/US1998/019191 WO1999012965A2 (en) 1997-09-12 1998-09-11 April- a novel protein with growth effects

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK3542000A3 true SK3542000A3 (en) 2000-08-14

Family

ID=26738027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK354-2000A SK3542000A3 (en) 1997-09-12 1998-09-11 Nucleic acid coding ligand april, a vector, a host cell, method for preparing ligand april, a polypeptide of ligand april, a pharmaceutical composition and an antibody, and use thereof

Country Status (20)

Country Link
US (3) US20030138884A1 (sk)
EP (1) EP1027431A2 (sk)
JP (1) JP2001515712A (sk)
KR (1) KR100618492B1 (sk)
CN (1) CN1195849C (sk)
AU (1) AU759717B2 (sk)
BR (1) BR9812634A (sk)
CA (1) CA2303615A1 (sk)
CZ (1) CZ294615B6 (sk)
EA (1) EA005411B1 (sk)
EE (1) EE200000147A (sk)
HU (1) HUP0004611A3 (sk)
IL (1) IL134537A0 (sk)
IS (1) IS5378A (sk)
NO (1) NO20001242L (sk)
NZ (1) NZ503850A (sk)
PL (1) PL339463A1 (sk)
SK (1) SK3542000A3 (sk)
TR (1) TR200000669T2 (sk)
WO (1) WO1999012965A2 (sk)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7217788B2 (en) 1996-03-14 2007-05-15 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta polypeptides
US6541224B2 (en) 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
AU1700999A (en) * 1997-11-26 1999-06-15 Eli Lilly And Company Tnf ligand family gene
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
KR100834809B1 (ko) 1999-01-25 2008-06-05 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｂａｆｆ, 관련 차단제 및 면역 반응에서 ｂ 세포와면역글로불린을 촉진 및 억제하는데에 있어서 이들의 용도
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
PL207501B1 (pl) * 1999-08-17 2010-12-31 Apotech R & D Sa Zastosowanie polipeptydu BCMA oraz przeciwciała skierowanego przeciwko BCMA
WO2001025256A2 (en) * 1999-10-06 2001-04-12 University Of Utah Research Foundation Trdl-1-gamma, a novel tumor necrosis-like ligand
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
EP1259544B1 (en) 2000-02-11 2011-08-24 Biogen Idec MA Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
IL150755A0 (en) 2000-02-16 2003-02-12 Genentech Inc Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
AU2006201471B2 (en) * 2000-02-16 2009-07-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of TNF-related molecules
AU2001261557B2 (en) * 2000-05-12 2005-06-30 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
WO2001096528A2 (en) * 2000-06-15 2001-12-20 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta and epsilon
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
GB2370273A (en) * 2000-12-20 2002-06-26 Viaxxel Biotech Gmbh Compounds that affect CD83 expression
KR101021124B1 (ko) 2001-05-24 2011-03-14 지모제넥틱스, 인코포레이티드 Ｔａｃｉ-면역글로불린 융합 단백질
AU2002311976A1 (en) 2001-05-24 2002-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against tumor necrosis factor delta (april)
US7381792B2 (en) 2002-01-04 2008-06-03 Xencor, Inc. Variants of RANKL protein
WO2003057856A2 (en) 2002-01-04 2003-07-17 Xencor Dominant negative proteins and methods thereof
US7553930B2 (en) 2003-01-06 2009-06-30 Xencor, Inc. BAFF variants and methods thereof
WO2004089982A2 (en) * 2003-01-06 2004-10-21 Xencor April variants and methods thereof
CA2520097C (en) 2003-03-28 2014-10-07 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
CA2554526A1 (en) * 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
US20050186577A1 (en) 2004-02-20 2005-08-25 Yixin Wang Breast cancer prognostics
WO2005113598A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 Xencor, Inc. Tnf super family members with altered immunogenicity
CA2590461A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
JP5118037B2 (ja) 2005-08-09 2013-01-16 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｔａｃｉ融合分子を用いた異常細胞増殖の処置及び予防のための方法
ZA200801354B (en) 2005-08-09 2009-08-26 Ares Trading Sa Methods for treating B-cell malignancies using TACI-lg fusion molecule
DE602006020467D1 (de) * 2005-09-26 2011-04-14 Enzo Life Sciences Els Ag Antikörper gegen april als biomarker zur frühen prognose in lymphompatienten
EA015860B1 (ru) 2005-10-13 2011-12-30 Хьюман Дженом Сайенсиз, Инк. Способы лечения аутоиммунных заболеваний при использовании антагониста нейтрокина-альфа
AU2006318539B2 (en) 2005-11-23 2012-09-13 Genentech, Inc. Methods and compositions related to B cell assays
BRPI0711823A2 (pt) 2006-05-15 2012-01-17 Ares Trading Sa métodos para tratamento de doenças auto-imunes com uma molécula de fusão taci-ig
AU2010220421B9 (en) 2009-03-02 2015-03-05 Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. Antibodies against a proliferating inducing ligand (APRIL)
EP2542679A1 (en) * 2010-03-05 2013-01-09 Academisch Medisch Centrum bij de Universiteit van Amsterdam B-cell stimulating fusion proteins of an antigen with baff or april
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
NL2011406C2 (en) * 2013-09-06 2015-03-10 Bionovion Holding B V Method for obtaining april-binding peptides, process for producing the peptides, april-binding peptides obtainable with said method/process and use of the april-binding peptides.
EP2922394B1 (en) * 2013-09-23 2017-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene
GB201317929D0 (en) * 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
US20150143559A1 (en) * 2013-11-19 2015-05-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
NL2014108B1 (en) 2015-01-09 2016-09-30 Aduro Biotech Holdings Europe B V Altered april binding antibodies.
SI3380522T1 (sl) 2015-11-25 2024-02-29 Visterra, Inc. Molekule protitelesa proti APRIL in uporabe le-teh
AU2021370895A1 (en) 2020-10-29 2023-06-08 Industrial Polymers and Chemicals, Inc. Air filter with pathogen monitoring and inactivation
KR20240053675A (ko) 2021-08-11 2024-04-24 악소 바이오파마슈티컬 인코포레이티드 sBCMA 변이체 및 이의 FC 융합 단백질을 이용한 IgA, IgM 및/또는 IgG의 생산 감소 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5176996A (en) * 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5256775A (en) * 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5264564A (en) * 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
WO1996040774A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Biogen, Inc. Complexes of modified lymphotoxins as pharmaceutical preparations
CN1214050A (zh) * 1996-03-14 1999-04-14 人体基因组科学有限公司 人肿瘤坏死因子δ和ε
US6509170B1 (en) * 1996-03-14 2003-01-21 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human tumor necrosis factor delta
US6171787B1 (en) * 1997-06-26 2001-01-09 Abbott Laboratories Member of the TNF family useful for treatment and diagnosis of disease

Also Published As

Publication number Publication date
EP1027431A2 (en) 2000-08-16
NO20001242D0 (no) 2000-03-09
CN1270632A (zh) 2000-10-18
HUP0004611A2 (hu) 2001-04-28
IS5378A (is) 2000-02-18
CA2303615A1 (en) 1999-03-18
CN1195849C (zh) 2005-04-06
NO20001242L (no) 2000-05-11
AU9316298A (en) 1999-03-29
HUP0004611A3 (en) 2002-04-29
IL134537A0 (en) 2001-04-30
EA200000310A1 (ru) 2000-10-30
TR200000669T2 (tr) 2000-08-21
US20060084148A1 (en) 2006-04-20
US20050112596A1 (en) 2005-05-26
KR100618492B1 (ko) 2006-08-31
KR20010023893A (ko) 2001-03-26
WO1999012965A2 (en) 1999-03-18
EA005411B1 (ru) 2005-02-24
CZ2000869A3 (cs) 2000-09-13
BR9812634A (pt) 2000-08-22
JP2001515712A (ja) 2001-09-25
US20030138884A1 (en) 2003-07-24
AU759717B2 (en) 2003-04-17
NZ503850A (en) 2002-12-20
CZ294615B6 (cs) 2005-02-16
WO1999012965A3 (en) 1999-06-03
EE200000147A (et) 2001-02-15
PL339463A1 (en) 2000-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK3542000A3 (en) Nucleic acid coding ligand april, a vector, a host cell, method for preparing ligand april, a polypeptide of ligand april, a pharmaceutical composition and an antibody, and use thereof
SK3532000A3 (en) Dna sequence coding for kay ligand, method for the preparation of kay ligand, pharmaceutical composition containing said ligand and the use thereof
US7566769B2 (en) Tumor necrosis factor related ligand
EP1591530B1 (en) A tumor necrosis factor related ligand
AU774498B2 (en) A tumor necrosis factor related ligand
CZ2000867A3 (cs) Sekvence DNA kódující ligand Kay, způsob přípravy ligandu Kay a farmaceutický přípravek obsahující tento ligand
MXPA00002407A (en) April- a novel protein with growth effects
AU2003213481A1 (en) APRIL - A Novel Protein With Growth Effects

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure