KR101021124B1 - Ｔａｃｉ-면역글로불린 융합 단백질 - Google Patents

Abstract

가용성 리셉터와 같은, 종양괴사인자 리셉터와 그것의 리간드의 결합을 방해하는 분자는 기초적 연구에서 그리고 치료제로서의 유용성이 증명되었다. 본 발명은 개선된 가용성 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드-상호작용제(TACI) 리셉터를 제공한다.

Description

ＴＡＣＩ-면역글로불린 융합 단백질{TACI-IMMUNOGLOBULIN FUSION PROTEINS}

본 발명은 일반적으로 종양괴사인자 리셉터 부분 및 면역글로불린 부분을 포함하는 개선된 융합 단백질에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 개선된 TACI-면역글로불린 융합 단백질에 관한 것이다.

사이토카인은 많은 세포 종류의 성장 및 분화 조절을 포함하여, 여러 가지의 생물학적 효과를 매개하는 작은 가용성 단백질이다(Arai 등, Annu. Rev. Biochem. 59:783(1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311(1991); Paul 및 Seder, Cell 76:241(1994) 참조). 사이토카인 그룹을 구성하는 단백질은 인터류킨, 인터페론, 콜로니자극인자, 종양괴사인자, 및 다른 조절성 분자를 포함한다. 예를 들어, 사람 인터류킨-17은 인터류킨-6, 세포내 유착분자 1, 인터류킨-8, 과립구 마크로파지 콜로니자극인자, 및 프로스타글란딘 E2의 발현을 자극하는 사이토카인이며, CD34+ 조혈 선구물질의 호중구로의 우선적인 성숙에서 역할을 한다(Yao 등, J. Immunol. 155:5483(1995); Fossiez 등, J. Exp. Med. 183:2593(1996)).

사이토카인에 결합하는 리셉터는 전형적으로 높은 친화성으로 사이토카인에 결합하고 이 결합 사건을 어떤 리셉터 서브유닛의 세포질의 일부분들을 통해 세포로 형질도입(transduce)하는 하나 이상의 인테그랄 멤브레인 단백질로 이루어진다. 사이토카인 리셉터는 그것들의 세포외 리간드 결합 도메인들의 유사성을 기초로 하여 몇 가지 부류로 분류된다. 예를 들어, 인터페론 효과의 결합 및/또는 형질도입을 초래하는 리셉터 사슬은 특징적인 200 잔기 세포외 도메인을 기초로 하는 타입 II 사이토카인 리셉터 패밀리의 구성원이다.

면역반응 동안 일어나는 세포 상호작용은 종양괴사인자 리셉터(TNFR) 패밀리를 포함하여, 세포 표면 리셉터의 몇몇 패밀리의 구성원들에 의해 조절된다. TNFR 패밀리는 다수의 인테그랄 멤브레인 당단백질 리셉터들로 구성되며, 이 중 많은 것은 그것들 각각의 리간드와 함께 상이한 조혈 세포 계통들 간의 상호작용을 조절한다(Cosman, Stem Cells 12:440(1994); Wajant 등, Cytokine Growth Factor Rev. 10:15(1999); Yeh 등, Immunol. Rev. 169:284(1999); Idriss, Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:184(2000) 참조).

한 그러한 리셉터는 트랜스멤브레인 활성제 및 CAML-상호작용제인 TACI이다 (von Bulow 및 Bram, Science 228:138(1997); Bram 및 von Bulow, 미국특허 No. 5,969,102(1999)). TACI는, Jurkat 세포에서 과발현되었을 때 NF-AT 활성화의 공동-유도제인 세포내 소포에 위치된 인테그랄 멤브레인 단백질인 멤브레인 결합 리셉터이며, 이것은 두개의 시스테인-부화 위-반복체(pseudo-repeat)를 함유하는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 CAML(칼슘-조정제 및 시클로필린 리간드)와 상호작용하는 세포질 도메인을 가진다. TACI는 B 세포 및 T 세포 서브셋과 관련된다. TACI를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 그것의 상응하는 아미노산 서열은 본원에서 각각 SEQ ID NO:1 및 2로 제공된다.

TACI 리셉터는 종양괴사인자(TNF) 리간드 패밀리의 두 구성원에 결합한다. 한 리간드는 ZTNF4, "BAFF", "뉴트로킨-α", "BLyS", "TALL-1", 및 "THANK"로서 여러 가지로 지정된다(Yu 등, 국제공보 No. WO 98/18921(1998); Moore 등, Science 285:269(1991); Mukhopadhyay 등, J. Biol. Chem. 274:15978(1999); Schneider 등, J. Exp. Med. 189:1747(1999); Shu 등, J. Leukoc. Biol. 65:680(1999)). ZTNF4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3으로 제공된다. 나머지 리간드는 "ZTNF2", "APRIL" 및 "TNRF 사멸 리간드-1"으로 지정된다(Hahne 등, J. Exp. Med. 188:1185(1998); Kelly 등, Cancer Res. 60:1021(2000)). ZTNF2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4로 제공된다. 또 두 리간드는 모두 B 세포 성숙 리셉터(BCMA)에 의해 결합된다(Gross 등, Nature 404:995(2000)). BCMA의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:27로 제공된다.

종양괴사인자 리셉터의 증명된 생체내 활성은 이 리셉터가 가용성 형태일 임상적 가능성을 예시한다. TACI 리셉터의 가용성 형태는 면역글로불린 융합 단백질로서 발생되었다. 초기 버전은 저-발현 이종성 단백질을 가져왔다. 이종성성은 TACI 아미노 말단에서, Fc 카르복실 말단에서, 그리고 TACI 자루 영역(stalk region) 내에서 관찰되었다. 따라서 제약학적으로 유용한 TACI 리셉터 조성물에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 치료 화합물로서 적합한 개선된 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 제공한다.

1. 개론

하기 설명된 대로, 본 발명은 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드-상호작용제(TACI)-면역글로불린 융합 단백질, 및 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 조성물을 종양 세포에 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 저해하는 방법을 제공한다. 그러한 조성물은 생체외 배양된 세포에 투여될 수 있다. 또는 달리, 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 및 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물일 수 있으며, 제약 조성물은 종양을 가진 피험자에게 투여될 수 있다. 피험자는 포유류 피험자일 수 있다. 제약 조성물의 투여는, 예를 들어 포유류 피험자에서 B 림프구의 증식을 저해할 수 있다.

또한, 본 발명은 TACI-면역글로불린을 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 ZTNF4 활성을 저해하는 방법을 제공한다. ZTNF4 활성은 다양한 질환 및 장애에 관련될 수 있다. 예를 들어, TACI-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물은 전신홍반루프스, 중증 근무력증, 다발경화증, 인슐린의존당뇨병, 크론병, 류마티스관절염, 여러관절-진행 소아 류마티스관절염, 및 건선관절염과 같은 자가면역질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 또는 달리, TACI-면역글로불린을 포함하는 제약 조성물은 천식, 기관지염, 폐공기종, 및 말기 신부전과 같은 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, TACI-면역글로불린을 포함하는 제약 조성물은 사구체신염, 혈관염, 신장염, 아밀로이드증, 및 신우신장염과 같은 신장 질환, 또는 신생물, 만성림프모구백혈병, 다발골수종, 비호지킨림프종, 이식후면역증식병, 및 경쇄감마글로불린병증과 같은 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 어떤 경우, ZTNF4 활성은 T 세포와 관련될 수 있다. 또한, TACI-면역글로불린을 포함하는 제약 조성물은 면역억제, 이식거부, 이식편대숙주병, 및 염증에 관련된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, TACI-면역글로불린을 포함하는 제약 조성물은 염증을 감소시키는데, 및 관절통, 부기, 빈혈, 및 패혈쇼크를 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체 및 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 포유류 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류 피험자에서 ZTNF4의 혈중 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 제약 조성물의 투여가 포유류 피험자의 혈액에서 ZTNF4의 혈중 수준을 감소시킨다. 실례로, 그러한 제약 조성물의 투여는, 제약 조성물의 투여 전 ZTNF4의 혈중 수준과 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 10 내지 60%, 적어도 20 내지 50%, 또는 적어도 30 내지 40%까지 ZTNF4의 혈중 수준을 감소시킬 수 있다. 당업자는 ZTNF4의 혈중 수준을 측정할 수 있다. 예가 되는 방법들이 실시예 4 및 실시예 5에 설명된다.

하기 설명된 대로, 예가 되는 TACI-면역글로불린 융합 단백질은

(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30에서 154의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 단편으로 구성되며, (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 34에서 66, 및 (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 71에서 104 중 적어도 하나를 포함하고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나와 결합하는 TACI 리셉터 부분, 및

(b) 면역글로불린의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 부분

을 포함한다.

적합한 TACI 리셉터 부분은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 34에서 66, 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 71에서 104를 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 34에서 104를 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30에서 110의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30에서 110으로 구성된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

TACI-면역글로불린 융합 단백질의 면역글로불린 부분은 사람 중쇄 불변 영역과 같은 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. IgG1 중쇄 불변 영역이 적합한 중쇄 불변 영역의 한 예이다. 예가 되는 IgG1 중쇄 불변 영역은 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 단편이다. 이 IgG1 Fc 단편은 야생형 IgG1 Fc 단편 또는 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 단편과 같은, 돌연변이 IgG1 Fc 단편일 수 있다. 한 전형적인 TACI-면역글로불린 융합 단백질은 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

본원에 설명된 TACI-면역글로불린 융합 단백질은 2량체와 같은 다량체일 수 있다.

또한, 본 발명은 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 예가 되는 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:53으로 제공된다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30에서 154의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편으로 구성되며, (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 34에서 66, 및 (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 71에서 104 중 적어도 하나를 포함하고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나와 결합하는 TACI 가용성 리셉터를 포함한다. 추가의 TACI 가용성 리셉터는 본원에서 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 위한 적합한 TACI 리셉터 부분으로 설명된다. 더욱이 TACI 가용성 리셉터는 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 위해 설명된 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명의 이들 및 다른 양태들은 하기 상세한 설명 및 도면을 참조하여 분명해질 것이다. 게다가 다양한 참고자료들이 하기 확인된다.

2. 정의

다음의 설명에서 많은 용어들은 광범하게 사용된다. 다음의 정의는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.

본원에 사용된 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 발생된 단편, 및 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 어느 것에 의해 발생된 단편으로 간주한다. 핵산 분자는 자연-발생 뉴클레오티드(DNA 및 RNA 같은), 또는 자연-발생 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, 자연-발생 뉴클레오티드의 α-거울상이성질체 형태), 또는 이 두 가지의 조합인 단량체들로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 부분들 및/또는 피리미딘 또는 푸린 염기 부분들에 변화를 가질 수 있다. 당 변형은, 예를 들어 하나 이상의 히드록실기를 할로겐, 알킬기, 아민, 및 아지도기로 대체하는 것을 포함하거나, 또는 당들이 에테르 또는 에스테르로서 기능화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 부분이 아자-당 및 탄소고리 당 유사체와 같은, 입체적으로 또는 전자적으로 유사한 구조로 대체될 수 있다. 염기 부분의 변형 예들은 알킬화된 푸린 및 피리미딘, 아실화된 푸린 및 피리미딘, 또는 다른 잘 알려진 헤테로고리 치환기들을 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 그러한 결합의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다. 또한, 용어 "핵산 분자"는 소위 말하는 "펩티드 핵산"을 포함하는데, 이것은 폴리아미드 백본에 부착된 자연-발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함하는 것이다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다.

용어 "핵산 분자의 보체"는 상보성 뉴클레오티드 서열을 가지며, 기준 뉴클레오티드 서열과 비교하여 역으로 배향된 핵산 분자로 간주한다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3'(SEQ ID NO:57)은 5' CCCGTGCAT 3'(SEQ ID NO:58)에 대해 상보성이다.

용어 "콘티그"는 다른 핵산 분자와 동일하거나 상보하는 서열의 연속 스트레치를 갖는 핵산 분자를 나타낸다. 연속 서열은 그것들의 전부에서 또는 핵산 분자의 부분적 스트레치를 따라 주어진 핵산 분자 스트레치와 "오버랩"된다.

용어 "축퇴 뉴클레오티드 서열"은 폴리펩티드를 암호화하는 기준 핵산 분자와 비교하여 하나 이상의 축퇴 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 축퇴 코돈은 상이한 뉴클레오티드 트리플렛을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기를 암호화한다(즉, GAU 및 GAC 트리플렛은 각각 Asp를 암호화한다).

용어 "구조 유전자"는 메신저 RNA(mRNA)로 전사되는 핵산 분자로 간주하며, 이것은 그 후 특이적 폴리펩티드에 특징적인 아미노산 서열로 변역된다.

"분리된 핵산 분자"는 유기체의 게놈 DNA에 통합되지 않은 핵산 분자이다. 예를 들어, 성장인자를 암호화하며 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 DNA 분자는 분리된 DNA 분자이다. 분리된 핵산 분자의 다른 예는 유기체의 게놈에 통합되지 않은 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 특정한 종들로부터 분리된 핵산 분자는 그 종들의 염색체의 완전한 DNA 분자보다 더 작다.

"핵산 분자 구성물"은 단일- 또는 이중-가닥 핵산 분자이며, 이것은 사람의 개입을 통해 자연에 존재하지 않는 배열로 조합되고 병치된 핵산 세그먼트들을 함유하도록 변형된다.

"선형 DNA"는 자유로운 5' 및 3' 단부를 갖는 비-원형 DNA 분자를 나타낸다. 선형 DNA는 플라스미드와 같은 폐원 DNA 분자로부터 효소 절단 또는 물리적 파괴에 의해 제조될 수 있다.

"상보성 DNA(cDNA)"는 효소 역전사효소에 의해 mRNA 주형으로부터 형성된 단일-가닥 DNA 분자이다. 전형적으로, mRNA의 일부분들에 상보하는 프라이머가 역전사의 개시를 위해 사용된다. 또한, 당업자는 용어 "cDNA"를 사용하여 그러한 단일-가닥 DNA 분자 및 그것의 상보성 DNA 가닥으로 구성된 이중-가닥 DNA 분자를 언급한다. 또한, 용어 "cDNA"는 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론으로 간주한다.

"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 디렉트하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 부위에 가까운 쪽의, 유전자의 5' 비-코딩 영역에 위치된다. 전사 개시에서 기능하는 프로모터들 내의 서열 요소들은 주로 공통 뉴클레오티드 서열들을 특징으로 한다. 이들 프로모터 요소들은 RNA 중합효소 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소((DSE: McGehee 등, Mol. Endocrinol. 7:551(1993)), 고리 AMP 반응 요소(CRE), 혈청 반응 요소(SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47(1990)), 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE), 및 다른 전사 인자들에 대한 결합 부위들, 예를 들어 CRE/ATF(O'Reilly 등, J. Biol. Chem. 267:19938(1992)), AP2(Ye 등, J. Biol. Chem. 269:25728(1994)), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253(1993)) 및 8량체 인자들을 포함한다(일반적으로, Watson 등, Molecular Biology of the Gene, 4판.(The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), 그리고 Lemaigre 및 Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994) 참조). 만일 프로모터가 유도성 프로모터라면 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 반대로, 만일 프로모터가 구성성 프로모터라면 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다.

"핵심 프로모터"는 TATA 상자 및 전사의 시작을 포함하여, 프로모터 기능을 위한 필수적인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이 정의에 의하면, 핵심 프로모터는 활성을 증진시키거나 또는 조직 특이적 활성을 부여할 수 있는 특이적 서열들의 부재하에 검출가능한 활성을 가질 수도 그렇지 않을 수도 있다.

"조절 요소"는 핵심 프로모터의 활성을 조정하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 조절 요소는 특정한 세포, 조직, 또는 세포기관에서 배타적으로 또는 우선적으로 전사를 가능하게 하는 세포 인자들과 결합하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이들 종류의 조절 요소는 통상 "세포-특이적", "조직-특이적" 또는 "세포기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자에 관련된다.

"인핸서"는 전사 시작 부위에 관한 인핸서의 거리 또는 배향과 무관하게 전사의 능률을 증가시킬 수 있는 조절 요소 종류이다.

"이종성 DNA"는 주어진 숙주 세포 안에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 분자 또는 DNA 분자들의 집단으로 간주한다. 특정한 숙주 세포에 이종성성인 DNA 분자는 그 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되지 않는 한 숙주 세포 종들로부터 유래된 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 전사 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 세그먼트에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 암호화하는 비-숙주 DNA 세그먼트를 함유하는 DNA 분자가 이종성 DNA 분자로 간주된다. 반대로, 이종성 DNA 분자는 외인성 프로모터와 작동가능하게 연결된 내인성 유전자를 포함할 수 있다. 다른 실례로서, 야생형 세포로부터 유래된 유전자를 포함하는 DNA 분자가, 만일 그 DNA 분자가 야생형 유전자를 결여한 돌연변이 세포로 도입된다면 이종성 DNA로 간주된다.

"폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기들의 폴리머이며, 자연적으로 또는 합성적으로 생성되었는지는 무관하다. 약 10 아미노산 잔기 미만의 폴리펩티드는 통상 "펩티드"라고 한다.

"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 또한, 단백질은 탄수화물 기들과 같은 비-펩티드 성분들을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환기는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 추가될 수 있으며, 세포의 종류에 따라 변할 것이다. 단백질은 그들의 아미노산 백본 구조에 관하여 본원에서 정의되며, 탄수화물기와 같은 치환기는 일반적으로 명시되지 않지만 그럼에도 불구하고 있을 수 있다.

비-숙주 DNA 분자에 의해 암호화된 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종성" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.

"통합된 유전자 요소"는 이 요소가 사람의 조작을 통해 세포로 도입된 후 숙주 세포의 염색체에 결합된 DNA 세그먼트이다. 본 발명 내에서, 통합된 유전자 요소는 전기천공 또는 다른 기술에 의해 세포로 도입된 선형 플라스미드로부터 가장 흔하게 유래된다. 통합된 유전자 요소는 원래 숙주 세포에서부터 그것의 자손까지 전해진다.

"클로닝 벡터"는 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지와 같은 핵산 분자이며, 이것은 숙주 세포에서 자발적으로 복제하는 능력을 가진다. 클로닝 벡터는 전형적으로, 벡터의 본질적인 생물학적 기능의 손실 없이 확정가능한 방식으로 핵산 분자의 삽입을 허용하는 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 함유할 뿐만 아니라, 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 확인 및 선택에 사용하기에 적합한 마커 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라시클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.

"발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 암호화하는 핵산 분자이다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 및 전사 터미네이터를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어하에 있으며, 그러한 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결된 것이다"라고 한다. 유사하게, 만일 조절 요소가 핵심 프로모터의 활성을 조정한다면, 조절 요소 및 핵심 프로모터는 작동가능하게 연결된 것이다.

"재조합 숙주"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터와 같은 이종성 핵산 분자를 함유하는 세포이다. 본 내용에서, 재조합 숙주의 예는 발현 벡터로부터 TACI-Fc 융합 단백질을 생성하는 세포이다.

"통합 형질전환체"는 이종성 DNA가 세포의 게놈 DNA에 통합된 재조합 숙주 세포이다.

"융합 단백질"은 적어도 2개 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현된 혼성 단백질이다. 예를 들어, TACI-면역글로불린 융합 단백질은 TACI 리셉터 부분 및 면역글로불린 부분을 포함한다. 본원에 사용된 "TACI 리셉터 부분"은 ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나에 결합하는 TACI 리셉터의 세포외 도메인의 일부분이다. 문구 "면역글로불린 부분"은 면역글로불린의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드로 간주한다. 예를 들어, 면역글로불린 부분은 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 용어 "TACI-Fc" 융합 단백질은, 면역글로불린 부분이 면역글로불린 중쇄 불변 영역 C_H2 및 C_H3을 포함하는 TACI-면역글로불린 융합 단백질로 간주한다.

용어 "리셉터"는 생체활성 분자인 "리간드"에 결합하는 세포-관련 단백질을 나타낸다. 이런 상호작용은 세포 상에서 리간드의 효과를 매개한다. TACI 리셉터 결합에 대한 내용에서, 문구 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 리셉터와 경쟁적으로 결합하는 리간드의 능력으로 간주한다. 예를 들어, ZTNF4는 TACI 리셉터와 특이적으로 결합하며, 이것은 검출가능하게 표지된 ZTNF4와 표지되지 않은 ZTNF4 간의 TACI 리셉터에 대한 경쟁을 관찰함으로써 알 수 있다.

리셉터는 멤브레인 결합된 시토졸 또는 핵; 단량체(예를 들어, 티로이드 자극 호르몬 리셉터, 베타-아드레날린 리셉터) 또는 다량체(예를 들어, PDGF 리셉터, 성장 호르몬 리셉터, IL-3 리셉터, GM-CSF 리셉터, G-CSF 리셉터, 에리트로포에틴 리셉터 및 IL-6 리셉터)일 수 있다. 멤브레인-결합된 리셉터는 신호 번역에 전형적으로 수반되는 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 다수-도메인 구조를 특징으로 한다. 어떤 멤브레인-결합 리셉터에서 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 이펙터 도메인은 완전한 기능성 리셉터를 포함하는 개별 폴리펩티드들에 위치된다.

일반적으로, 리간드와 리셉터의 결합은 리셉터에 입체구조적 변화를 가져오며, 이것은 이펙터 도메인과 세포 내의 다른 분자(들) 간의 상호작용을 일으켜서, 차례로 세포 대사의 변화를 가져온다. 리셉터-리간드 상호작용에 주로 연계된 대사 사건들은 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 고리 AMP 생성 증가, 세포 칼슘 대사, 멤브레인 지질 대사, 세포 유착, 이노시톨 지질 가수분해 및 인지질 가수분해를 포함한다.

용어 "분비 신호 서열"은, 더 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 폴리펩티드가 합성되는 세포의 분비 경로를 통해 더 큰 폴리펩티드를 디렉트하는 펩티드("분비 펩티드")를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다. 더 큰 폴리펩티드는 통상 분비 경로를 통한 수송 동안 절단되어 분비 펩티드가 제거된다.

"분리된 폴리펩티드"는 자연에 있는 폴리펩티드에 관련된 탄수화물, 지질 또는 다른 단백질성 불순물과 같은, 세포 성분 오염으로부터 본질적으로 자유로운 폴리펩티드이다. 전형적으로, 분리된 폴리펩티드 제제는 고도로 정제된 형태, 즉 적어도 약 80% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 95% 순도, 95% 이상의 순도, 또는 99% 이상의 순도의 폴리펩티드를 함유한다. 특정한 단백질 제제가 분리된 폴리펩티드를 함유하는지 알 수 있는 한 방식은 단백질 제제의 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)-폴리아미드 겔 전기영동 및 이 겔의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 후 단일 밴드의 출현에 의한 것이다. 그러나, 용어 "분리된"은 이량체와 같은 다른 물리적 형태의 동일한 폴리펩티드 또는 다른 식으로 글리코실화되거나 유도된 형태의 존재를 배제하지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "아미노-말단" 및 "카르복실-말단"은 폴리펩티드 내의 위치를 나타낸다. 내용이 허용하는 경우, 이들 용어는 근접한 위치나 관련 위치를 나타내기 위해 폴리펩티드의 특정한 서열 또는 위치를 참조하여 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드 내의 기준 서열에 대해 카르복실-말단에 위치된 어떤 서열은 기준 서열의 카르복실 말단에 근접하여 위치하지만, 완전한 폴리펩티드의 카르복실 말단에서도 그럴 필요는 없다.

용어 "발현"은 유전자 생성물의 생합성으로 간주한다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 변역을 수반한다.

본원에 사용된 용어 "스플라이스 변이체"는 유전자로부터 전사된 RNA의 다른 형태들을 나타낸다. 스플라이스 변화는 전사된 RNA 분자 안의 다른 스플라이싱 부위들의 사용을 통해 자연적으로 일어나거나, 또는 덜 흔하지만 개별적으로 전사된 RNA 분자들 사이에서 일어나며, 동일한 유전자로부터 전사된 몇 가지 mRNA들을 가져올 수 있다. 스플라이스 변이체는 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드들을 암호화할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 용어 스플라이스 변이체는 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드를 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "면역조정제"는 사이토카인, 줄기세포 성장인자, 림프독소, 공동-자극 분자, 조혈인자, 및 이들 분자의 합성 유사체를 포함한다.

용어 "보체/항-보체 쌍"은 적합한 조건하에서 비-공유 결합된 안정한 쌍을 형성하는 비-동일한 부분들을 나타낸다. 예를 들어, 비오틴 및 아비딘(또는 스트렙트아비딘)이 보체/항-보체 쌍의 원형 구성원들이다. 다른 전형적인 보체/항-보체 쌍들은 리셉터/리간드 쌍, 항체/항원(또는 헵텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍들을 포함한다. 보체/항-보체 쌍의 후속 해리가 바람직한 경우, 보체/항-보체 쌍은 바람직하게 10⁹M^-1 미만의 결합 친화성을 가진다.

"항체 단편"은 F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab 등과 같은 항체의 일부분이다. 구조와 무관하게 항체 단편은 완전한 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원과 결합한다.

또한, 용어 "항체 단편"은 경쇄 가변 영역으로 구성된 폴리펩티드들과 같은, 특이적 항원에 결합하는 합성 또는 유전조작된 폴리펩티드를 포함한다. "Fv" 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결되는 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 초가변(hypervariable) 영역을 의태하는 아미노산 잔기들로 구성된 최소 인식 유닛으로 구성된다.

"키메라 항체"는 설치류 항체로부터 유래된 거변 도메인 및 상보성 결정 영역을 함유하는 재조합 단백질이며, 이 항체 분자의 나머지는 사람 항체로부터 유래된다.

"사람화된 항체"는 뮤린 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역이 뮤린 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 사람 가변 도메인으로 이동된 재조합 단백질이다.

본언에 설명된 "치료제"는 항체 부분에 콘쥬게이트되어 치료에 유용한 콘쥬게이트를 생성하는 분자 또는 원자이다. 치료제의 예들은 약물, 독소, 면역조정제, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 또는 염료, 및 방사성동위원소를 포함한다.

"검출가능한 표지"는 항체 분자에 콘쥬게이트되어 진단에 유용한 분자를 생성하는 분자 또는 원자이다. 검출가능한 표지의 예들은 킬레이터, 광활성제, 방사성동위원소, 형광제, 상자성 이온, 및 다른 마커 분자들을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "친화성 택"은 제 2 폴리펩티드에 부착되어 제 2 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하거나 또는 제 2 폴리펩티드의 기질에의 부착을 위한 부위를 제공할 수 있는 폴리펩티드 세그먼트이다. 원리적으로, 항체 또는 다른 특이적 결합체가 이용될 수 있는 어떤 펩티드 또는 단백질이 친화성 택으로 사용될 수 있다. 친화성 택은 폴리-히스티딘 트랙, 단백질 A(Nilsson 등, EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson 등, Methods Enzymol. 198:3(1991)), 글루타티온 S 트랜스페라제 (Smith 및 Johnson, Gene 67:31(1988)), Glu-Glu 친화성 택(Grussenmeyer 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952(1985)), 섭스턴스 P, FLAG 펩티드(Hopp 등, Biote-chnology 6:1204(1988)), 스트렙트아미딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다.

"네이키드 항체"는 항체 단편에 반대되는 전항체이며, 이것은 치료제와 콘쥬게이트되지 않는다. 네이키드 항체는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 모두 포함할 뿐만 아니라, 키메라 및 사람화된 항체와 같은 어떤 재조합 항체들을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "항체 성분"은 전항체 및 항체 단편을 모두 포함한다.

"면역콘쥬게이트"는 항체 성분과 치료제 또는 검출가능한 표지의 콘쥬게이트이다.

"표적 폴리펩티드" 또는 "표적 펩티드"는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이며, 이것은 종양 세포, 또는 감염제 항원을 지닌 세포와 같은, 표적 세포 상에서 발현된다. T 세포는 표적 폴리펩티드 또는 표적 펩티드에 대한 주요 조직적합 복합 분자에 의해 나타나게 된 펩티드 에피토프를 인식하며, 전형적으로 표적 세포를 용해하거나 또는 다른 면역 세포를 표적 세포의 부위로 모집함으로써 표적 세포를 죽인다.

"항원 펩티드"는 주요 조직적합 복합 분자와 결합하여 T 세포에 의해 인식되는 MHC-펩티드 복합체를 형성함으로써 T 세포에의 노출시 세포독성 림프구 반응을 유발하는 펩티드이다. 따라서, 항원 펩티드는 적합한 주요 조직적합 복합 분자에 결합하여, 항원에 결합하거나 항원을 발현하는 표적 세포에 대해 세포 용해 또는 특이적 사이토카인 방출과 같은 세포독성 T 세포 반응을 유발할 수 있다. 항원 펩티드는 항원을 나타내는 세포 또는 표적 세포 상에서 클래스 I 또는 클래스 II의 주요 조직적합 복합 분자에 결합될 수 있다.

진핵세포에서 RNA 중합효소 II는 구조 유전자의 전사를 촉매하여 mRNA를 생성한다. 핵산 분자는 RNA 중합효소 II 주형(여기서, RNA 전사체는 특이적 mRNA의 서열에 상보하는 서열을 가진다)을 함유하도록 디자인될 수 있다. RNA 전사체는 "안티센스 RNA"라고 명명되며, 안티센스 RNA를 암호화하는 핵산 분자는 "안티센스 유전자"라고 명명된다. 안티센스 RNA 분자는 mRNA 분자에 결합할 수 있으며, 그 결과 mRNA 번역의 저해를 가져온다.

표준 분석 방법의 부정확성으로 인해 폴리머의 분자량 및 길이는 대략적인 값으로 이해된다. 그러한 값이 "약" X 또는 "대략" X로 표현될 때, X라는 서술된 값은 ±10%까지 정확하다고 이해될 것이다.

3. TACI-면역글로불린 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 생성

도 1은 사람 TACI의 예보된 아미노산 서열을 제공한다(폰 벌로 및 브람, 사이언스 278:138(1997)). 이 TACI 폴리펩티드는 다음의 예보된 요소들을 함유한다: (a) 종양괴사인자 리간드 결합 도메인들의 특징인 두개의 시스테인-부화 위-반복체 구조, (b) 리간드 결합 도메인과 트랜스멤브레인 도메인 사이에 주재하는 62 아미노산의 "자루 영역", (c) 20 아미노산 트랜스멤브레인 도메인 및 (d) 127 아미노산 세포내 도메인. 이 아미노산 서열은 예보된 소수성 아미노 말단 신호 서열을 함유하지 않는다.

자생 리간드:자생 리셉터 상호작용의 저해제로서 사용되는 가용성 형태의 사람 TACI를 만들기 위해서, TACI 세포외 도메인 - 사람 면역글로불린 Fc 융합 단백질이 발생되었다. 입수가능한 사람 TACI 서열이 스타팅 포인트로서 융합 단백질 분자의 디자인에 사용되었다(von Bulow 및 Bram, Science 278:138(1997)). "TACI-Fc4"로 지정된 이 초기 구성물은 TACI 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1에서 154, 및 하기 설명된 변형된 사람 Fc 영역을 포함했다. 가능한 많은 자루 영역을 포함시키면서 동시에 예보된 트랜스멤브레인 도메인의 어떤 가능한 부분은 포함시키지 않기 위해서 잔기 154의 융합 포인트가 선택되었다.

자생 TACI 폴리펩티드는 아미노 말단 신호 서열을 함유하지 않으므로, 알려지지 않은 형태의 TACI-Fc 융합 단백질을 발생시키기 위해서 아미노 말단 신호 서열이 TACI에 추가되었다. 신호 서열은 사람 조직 플라스미노겐 활성제로부터 변형된 프레-프로 서열이었다. 변형은 신호 펩티다제 절단 및 푸린 프로테아제-특이적 프로세싱을 증진시키기 위해 포함되었으며, 이런 이유 때문에 이 서열은 "최적화된 tPA(otPA) 리더"로서 언급된다. otPA 서열(SEQ ID NO:25)이 하기 예시되며 변형된 아미노산 잔기는 음영처리된다. 재조합 TACI-Fc 융합 단백질 코딩 서열이 중국 햄스터 난소 세포로 트랜스펙트(transfect)된 발현 벡터에 삽입되었다.

트랜스펙트 중국 햄스터 난소 세포는 TACI-Fc4 단백질을 약 0.3pg/세포/일의 낮은 수준으로 생성했다. 염소 항-사람 IgG Fc 항혈청을 사용한 TACI-Fc 단백질의 웨스턴블롯 분석은 두개의 밴드를 드러냈는데, 한 밴드는 대략 48kDa의 예상 크기보다 더 적었다. 정제된 단백질의 아미노산 서열 분석은, 더 적은 밴드가 TACI 자루 영역 내의 다양한 부위들에서의 TACI 융합 단백질 절단을 반영한다는 것을 드러냈다. SEQ ID NO:2에 관하여, 주요 말단들은 아미노산 잔기 118 및 123에서 발견되었지만, 단백질은 또한 아미노산 위치 110, 139, 및 141에서도 절단되었다.

자루 영역의 절단에 의해 야기된 이종성성에 더하여, 이종성성은 또한 아미노 및 카르복실 말단들에서 관찰되었다. SEQ ID NO:2에 관하여, 주요 아미노 말단들은 아미노산 잔기 1, 10, 및 13에서 발견되었다. 카르복실 말단의 차이는 재조합 면역글로불린과 면역글로불린 융합 단백질의 자연적 이종성성을 반영하며, 이것은 카르복실-말단-암호화된 리신 잔기의 완전한 제거를 포함한다. 이종성성의 다른 소스는 Fc 암호화된 면역글로불린 C_H2 도메인에 부착된 탄수화물 구조의 가변성에서 발견되었다.

관찰된 이종성성을 다루기 위해서 새로운 버전의 TACI-Fc가 발생되었다. TACI 부분에 다음의 변화들 중 적어도 하나를 포함한 구성물이 디자인되었다: (1) TACI 자루 영역의 일부분들이 결실됨, (2) TACI 자루 영역의 일부가 BCMA 자루 영역의 일부로 대체됨, (3) 위치 119의 아르기닌 잔기가 돌연변이되어 가능한 푸린 절단 부위가 제거됨, (4) 위치 121의 글루타민 잔기가 돌연변이되어 가능한 푸린 절단 부위가 제거됨, (5) 위치 122의 아르기닌 잔기가 돌연변이되어 가능한 푸린 절단 부위가 제거됨, (6) 위치 123 및 142의 아미노산 잔기가 뮤린 TACI의 상응하는 위치들에서 발견된 아미노산 잔기로 돌연변이됨, (7) 사람 otPA 신호 서열이 사람 중쇄 가변 영역 신호 서열로 대체됨, (8) 위치 29의 발린 잔기가 메티오닌으로 돌연변이되고, otPA 신호 서열이 아미노 말단 위치에서 이 잔기와 연결됨, 및 (9) otPA 신호 서열이 아미노 말단 위치에서 위치 30의 알라닌 잔기와 연결됨.

또한, 변형은 면역글로불린 부분으로 도입되었다. 5가지 부류의 면역글로불린, IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE가 더 고등한 척추동물에서 확인되었다. IgG, IgD 및 IgE 단백질은 특징적으로 두개의 동일한 중쇄 및 두개의 동일한 경쇄로 구성된 이황화 연결된 이종성4량체이다. 전형적으로, IgM은 5량체 같은 4량체로서 발견되며 반면에 IgA는 2량체 같은 4량체로서 발생한다.

IgG는 그것이 통상 혈장에서 발견된 두번째로 가장 풍부한 단백질로서 존재하기 때문에 주요 부류에 포함된다. 사람에서 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 지정된 4개의 하위부류로 구성된다. 도 2에 나타낸 대로, 각 면역글로불린 중쇄는 주어진 하위부류에서 불변하는 불변 영역 단백질 도메인(C_H1, 경첩, C_H2 및 C_H3)로 구성된 불변 영역을 지닌다. IgG 부류의 중쇄 불변 영역은 그리스문자 기호 γ로 확인된다. 예를 들어, IgG1 하위부류의 면역글로불린은 γ1 중쇄 불변 영역을 함유한다.

Fc 단편 또는 Fc 도메인은 이황화 연결된 중쇄 경첩 영역, C_H2 및 C_H3 도메인으로 구성된다. 면역글로불린 융합 단백질에서, IgG1 하위부류의 Fc 도메인이 면역글로불린 부분으로 주로 사용되는데, IgG1이 혈청 단백질들 중 어느 것보다 가장 긴 혈청 반감기를 가지기 때문이다. 긴 혈청 반감기는 동물 연구 및 가능한 사람 치료 사용을 위한 바람직한 단백질 특징일 수 있다. 게다가, IgG1 하위부류는 항체 매개 이펙터 기능을 수행하는 가장 강한 능력을 지닌다. 면역글로불린 융합 단백질에서 가장 유용할 수 있는 주된 이펙터 기능은, IgG1 항체가 항체 의존적 세포 세포독성을 매개하도록 하는 능력이다. 한편 이것은 길항제로서 주로 기능하는 융합 단백질에 대해서는 바람직하지 않은 기능일 수 있다. IgG1 하위부류의 항체 불변 영역-매개 활성에 중요한 특이적 아미노산 잔기가 몇개 확인되었다. 따라서 이들 특이적 아미노산의 포함 또는 배제는 특이적 면역글로불린 불변 영역-매개 활성의 포함 또는 배제를 허용한다.

변형된 사람 IgG1 Fc의 6가지 버전이 Fc 융합 단백질을 만들기 위해서 발생되었다. 사람 γ1 Fc 영역을 함유하는 융합 단백질의 편리한 클로닝을 위해 Fc-488이 디자인되었는데, 그것은 야생형 사람 면역글로불린 γ1 불변 영역을 주형으로 사용하여 구성되었다. 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기로 인한 가능한 해로운 효과에 대한 걱정으로, 면역글로불린 경쇄 불변 영역과 통상 이황화 결합하는 시스테인(SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 24)을 세린 잔기로 대체하기로 결정했다. 앞으로의 DNA 조작을 용이하게 하기 위해, EU 인덱스 위치 218(SEQ ID NO:의 아미노산 잔기 22)을 암호화하는 코돈에 추가의 변화를 도입하여 BglII 제한 효소 인식 부위를 도입했다. 이들 변화는 PCR 프라이머 상에서 암호화된 PCR 생성물로 도입되었다. BglII 부위의 위치로 인해 그리고 Fc 경첩 영역을 완성하기 위해서, EU 인덱스 위치 216 및 217(SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 20 및 21)에 대한 코돈이 융합 단백질 파트너 서열에 결합되었다.

Fc4, Fc5 및 Fc6은 FcγRI 결합 및 상보성 C1q 결합을 감소시킴으로써 Fc에 의해 매개된 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. Fc4는 Fc-488에 도입되었던 것과 동일한 아미노산 치환을 함유한다. 추가의 아미노산 치환이 가능한 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키기 위해 도입되었다. 구체적으로, 3개의 아미노산 치환을 도입하여 FcγRI 결합을 감소시켰다. 이들은 EU 인덱스 위치 234, 235 및 237에 있는 치환이다(SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 38, 39 및 41). 이들 위치에서의 치환은 FcγRI와의 결합을 감소시키는 것으로 나타났다(Duncan 등, Nature 332:563 (1998)). 또한, 이들 아미노산 치환은 FcγRIIa 결합 및 FcγRIII 결합을 감소시킬 수 있다(Sondermann 등, Nature 406:267 (2000); Wines 등, J. Immunol. 164:5313 (2000)).

몇몇 그룹이 상보성 C1q 결합 및 이어지는 상보성 고정에서 EU 인덱스 위치 330 및 331(SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 134 및 135)의 관련성을 설명하고 있다(Canfield 및 Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Tao 등, J. Exp. Med. 178:661 (1993)). 이들 위치에서의 아미노산 치환을 Fc4에 도입하여 상보성 고정을 감소시켰다. Fc4의 C_H3 도메인은 정지 코돈을 제외하고는 상응하는 야생형 폴리펩티드에서 발견된 것과 동일하며, 이 정지 코돈은 TGA를 TAA로 변화시켜 dam과 E. coli 균주에서 클론된 DNA가 성장할 때의 가능한 dam 메틸화 부위를 제거했다.

Fc5에서 EU 인덱스 위치 218의 아르기닌 잔기는 리신으로 다시 돌연변이되었는데, 이 특정한 Fc를 함유하는 융합 단백질에서는 BglII 클로닝 계획이 사용되지 않았기 때문이다. Fc5 서열의 나머지는 Fc4에 대한 상기 설명과 일치한다.

Fc6은 카르복실 말단 리신 코돈이 제거되었다는 것을 제외하고는 Fc5와 동일하다. 성숙한 면역글로불린의 C-말단 리신은 주로 B 세포로부터의 분비 전 번역 후에 성숙한 면역글로불린으로부터 제거되거나 또는 혈청 순환 동안 제거된다. 결과적으로, C-말단 리신 잔기는 전형적으로 혈중 항체 상에서 발견되지 않는다. 상기 Fc4 및 Fc5에서처럼 Fc6 서열의 정지 코돈은 TAA로 변화되었다.

Fc7은 C_H2 도메인에 위치된 EU 인덱스 위치 297의 아미노산 치환을 제외하고는 야생형 γ1 Fc와 동일하다. EU 인덱스 위치 Asn-297(SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 101)은 N-연결 탄수화물 부착 부위이다. N-연결 탄수화물은 탄수화물 구조에 있는 가능한 뱃치-대-뱃치 변화로 인해 재조합 발현된 단백질에 가능한 변화성 소스를 도입한다. 이런 가능한 변화성을 제거하려는 시도에서, Asn-297을 글루타민 잔기로 돌연변이시켜 그 잔기 위치에서 N-연결 탄수화물의 부착을 방지했다. 또한, 잔기 297의 탄수화물은 FcγRIII과의 Fc 결합에 연루된다(선더먼 등, Nature 406:267 (2000)). 따라서 탄수화물의 제거는 융합 단백질을 함유하는 재조합 Fc7과 일반적인 FcγR들의 결합을 감소시킬 것이다. 상기와 같이 Fc7 서열의 정지 코돈은 TAA로 돌연변이되었다.

Fc8은 EU 인덱스 위치 220(SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 24)의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 대체되었다는 것을 제외하고는 SEQ ID NO:6에 나타낸 야생형 면역글로불린 γ1 영역과 동일하다. 이 돌연변이는 면역글로불린 경쇄 불변 영역과 통상 이황화 결합하는 시스테인 잔기를 제거했다.

예가 되는 TACI-Fc 구성물이 표 1에 설명된다.

[표 1]

a SEQ ID NO:2의 아미노산 서열에 관한 아미노산 서열의 위치, 돌연변이, 및 결실에 대한 정보가 괄호 안에 제공된다.

b SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1에서 154를 포함한다.

c SEQ ID NO:2(TACI)의 아미노산 잔기 1에서 104 및 SEQ ID NO:27(BCMA)의 아미노산 42에서 54를 이 구성물은 포함한다.

TACI-Fc 단백질은 재조합 중국 햄스터 난소 세포에 의해 생성되고 분리되어, 웨스턴블롯 분석 및 아미노산 서열 분석을 사용하여 분석되었다. 놀랍게도, TACI 폴리펩티드의 N-말단에서부터 처음 29 아미노산의 결실은 중국 햄스터 난소 세포에 의한 TACI-Fc 융합 단백질의 생성에서 10배 증가를 가져왓다. 또한, 이 결실은 전길이 자루 영역의 절단을 감소시켰다. 게다가, TACI 자루 영역 내의 절단이 TACI 자루 영역을 자름(truncate)으로써, 또는 다른 아미노산 서열(예를 들어, BCMA 자루 영역의 아미노산 서열) 내의 TACI 자루 영역으로 대체함으로써 억제되었다.

실시예 4에 설명된 대로, TACI-Fc 구성물의 기능성 분석은 융합 단백질 TACI (d1-29)-Fc5, FACI (d1-29, d107-154)-Fc5, FACI (d1-29, d111-154)-Fc5, 및 FACI (d1-29, d120-154)-Fc5가 ZTNF4에 대해 유사한 결합 친화성을 가진다는 것을 나타낸다. 그러나, TACI (d1-29)-Fc5, FACI (d1-29, d111-154)-Fc5, 및 FACI (d1-29, d120-154)-Fc5 구성물은 FACI (d1-29, d107-154)-Fc5 구성물보다 TACI-Fc의 몰 당 더 많은 ZTNF4와 결합하는 것으로 나타난다. 의도된 사용(즉, 치료용, 진단용, 또는 연구용)에 따라서, 고용량 또는 저용량 FACI-Fc 융합 단백질이 사용될 수 있다. 게다가, 고용량 및 저용량 TACI-Fc 융합 단백질의 조합은 ZTNF2 또는 ZTNF4의 적정을 가능하게 한다.

본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30에서 106, SEQ ID NO:2의 30에서 110, SEQ ID NO:2의 30에서 119, 또는 SEQ ID NO:2의 30에서 154로 구성된 TACI 리셉터 부분을 포함하는 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 고찰한다. 또, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 31에서 106, SEQ ID NO:2의 31에서 110, SEQ ID NO:2의 31에서 119, 또는 SEQ ID NO:2의 31에서 154로 구성된 TACI 리셉터 부분을 포함하는 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 포함한다.

더 일반적으로, 본 발명은 TACI 리셉터 부분이 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30에서 154로 구성되고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나와 결합하는 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 포함한다. 그러한 단편은 시스테인-부화 위-반복체 영역을 포함하며, 선택적으로 시스테인-부화 위-반복체 영역의 아미노-말단 위치에 주재하는 N-말단 세그먼트, 및 시스테인-부화 위-반복체 영역의 카르복실-말단 위치에 주재하는 자루 세그먼트 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 적합한 시스테인-부화 위-반복체 영역은 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 34에서 66, 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 71에서 104 중 적어도 하나를 포함하거나, (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 34에서 66 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 71에서 104를 모두 포함하거나, 또는 (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 34내지 104를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

SEQ ID NO:2에 관하여 적합한 N-말단 세그먼트는 다음을 포함한다: 아미노산 잔기 33, 아미노산 잔기 32에서 33, 아미노산 잔기 31에서 33, 및 아미노산 잔기 30에서 33. 적합한 자루 세그먼트는 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 105에서 154 중 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, SEQ ID NO:2에 관하여 자루 세그먼트는 다음으로 구성될 수 있다: 아미노산 잔기 105, 아미노산 잔기 105에서 106, 아미노산 잔기 105에서 107, 아미노산 잔기 105에서 108, 아미노산 잔기 105에서 109, 아미노산 잔기 105에서 110, 아미노산 잔기 105에서 111, 아미노산 잔기 105에서 112, 아미노산 잔기 105에서 113, 아미노산 잔기 105에서 114, 아미노산 잔기 105에서 115, 아미노산 잔기 105에서 116, 아미노산 잔기 105에서 117, 아미노산 잔기 105에서 118, 아미노산 잔기 105에서 119, 아미노산 잔기 105에서 120, 아미노산 잔기 105에서 121, 아미노산 잔기 105에서 122, 아미노산 잔기 105에서 123, 아미노산 잔기 105에서 124, 아미노산 잔기 105에서 125, 아미노산 잔기 105에서 126, 아미노산 잔기 105에서 127, 아미노산 잔기 105에서 128, 아미노산 잔기 105에서 129, 아미노산 잔기 105에서 130, 아미노산 잔기 105에서 131, 아미노산 잔기 105에서 132, 아미노산 잔기 105에서 133, 아미노산 잔기 105에서 134, 아미노산 잔기 105에서 135, 아미노산 잔기 105에서 136, 아미노산 잔기 105에서 137, 아미노산 잔기 105에서 138, 아미노산 잔기 105에서 139, 아미노산 잔기 105에서 140, 아미노산 잔기 105에서 141, 아미노산 잔기 105에서 142, 아미노산 잔기 105에서 143, 아미노산 잔기 105에서 144, 아미노산 잔기 105에서 145, 아미노산 잔기 105에서 146, 아미노산 잔기 105에서 147, 아미노산 잔기 105에서 148, 아미노산 잔기 105에서 149, 아미노산 잔기 105에서 150, 아미노산 잔기 105에서 151, 아미노산 잔기 105에서 152, 아미노산 잔기 105에서 153, 및 아미노산 잔기 105에서 154.

추가의 적합한 자루 세그먼트는 BCMA 자루 영역(즉, SEQ ID NO:27의 아미노산 잔기 42에서 54) 중 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 자루 영역은 SEQ ID NO:27에 관하여 다음으로 구성될 수 있다: 아미노산 잔기 42, 아미노산 잔기 42에서 43, 아미노산 잔기 42에서 44, 아미노산 잔기 42에서 45, 아미노산 잔기 42에서 46, 아미노산 잔기 42에서 47, 아미노산 잔기 42에서 48, 아미노산 잔기 42에서 49, 아미노산 잔기 42에서 50, 아미노산 잔기 42에서 51, 아미노산 잔기 42에서 52, 아미노산 잔기 42에서 53, 및 아미노산 잔기 42에서 54.

더 일반적으로 자루 세그먼트는 2 내지 50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.

본원에 설명된 융합 단백질의 면역글로불린 부분은 면역글로불린의 적어도 한 불변 영역을 포함한다. 바람직하게, 면역글로불린 부분은 사람 면역글로불린의 세그먼트를 나타낸다. 사람 면역글로불린 서열은 야생형 아미노산 서열, 또는 상기 논의된 아미노산 돌연변이 중 적어도 하나를 갖는 변형된 야생형 아미노산 서열일 수 있다.

또한, 사람 면역글로불린 아미노산 서열은 기지의 동종이인자형 결정인자의 특징인 하나 이상의 돌연변이들을 가짐으로써 야생형과 달라질 수 있다. 표 2에서 사람 IgGγ1 불변 영역의 동종이인자형 결정인자들을 나타낸다(Putman, The Plasma Proteins, Vol. V, page 49-140 (Academic Press, Inc. 1987)). EU 인덱스 위치 214, 356, 358 및 431은 기지의 IgGγ1 동종이인자형을 정의한다. 위치 214는 IgGγ1 불변 영역의 C_H1 도메인 안에 있으므로 Fc 서열 내에는 주재하지 않는다. SEQ ID NO:6의 야생형 Fc 서열은 G1m(1) 및 G1m(2)-동종이인자형을 포함한다. 그러나, TACI-Fc 단백질의 Fc 부분은 이들 동종이인자형들의 어떤 조합을 반영하도록 변형될 수 있다.

[표 2]

본원에 개시된 TACI-Fc 단백질의 예들은 사람 IgG1 불변 영역을 포함한다. 그러나 적합한 면역글로불린 부분들은 또한 면역글로불린 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM 중 어느 것으로부터의 중쇄 불변 영역과 같은, 적어도 한 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드들을 포함한다. 유리하게, 야생형 IgG1 또는 야생형 IgG3과 비교하여, 야생형 IgG2 또는 야생형 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 부분들은 감소된 이펙터 기능을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 설명된 TACI 리셉터 부분, 및 알부민 또는 β2-마크로글로불린 중 어느 하나를 포함하는 융합 단백질을 고찰한다.

ZTNF2 또는 ZTNF4에 결합하는 다른 종류의 리셉터 융합 단백질은 BCMA-면역글로불린 융합 단백질이다. BCMA 부분이 SEQ ID NO:27의 아미노산 잔기 1에서 48로 구성된 BCMA-Fc4 융합 단백질을 사용하여 연구가 수행되었다. 놀랍게도, 마우스에서의 약물동력학 연구는 BCMA-Fc4 융합 단백질이 약 101시간의 반감기를 가진다는 것을 드러냈으며, 반면 TACI-Fc 단백질은 25시간의 반감기를 가졌다. 따라서 BCMA-면역글로불린 융합 단백질의 투여가 어떤 임상적 환경에서 바람직할 수 있다. 더욱이 TACI-면역글로불린과 BCMA-면역글로불린 융합 단백질의 조합이 어떤 상태를 치료하는데 유리할 수 있다. 이런 조합치료법은 TACI-면역글로불린 및 BCMA-면역글로불린 융합 단백질을 투여함으로써, 또는 TACI-면역글로불린 및 BCMA-면역글로불린 융합 단백질의 이종성2량체를 투여함으로써 달성될 수 있다.

ZTNF4에 결합하는 다른 종류의 리셉터 융합 단백질은 "Ztnfr12"로 지정된 리셉터의 세포외 도메인을 포함하는 면역글로불린 융합 단백질이다. Ztnfr12 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 각각 SEQ ID NO:59 및 SEQ ID NO:60으로 제공된다. 적합한 Ztnfr12 리셉터 부분은 SEQ ID NO:60의 아미노산 잔기 1에서 69, 또는 SEQ ID NO:60의 아미노산 잔기 19에서 35를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 융합 단백질은 단일 사슬 폴리펩티드, 2량체, 3량체, 또는 다수 2량체 또는 3량체의 형태를 가질 수 있다. 2량체는 동종2량체 또는 이종성2량체일 수 있으며, 3량체는 동종3량체 또는 이종성3량체일 수 있다. 이종성2량체의 예들은 BCMA-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 TACI-면역글로불린 폴리펩티드, Ztnfr12-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 TACI-면역글로불린 폴리펩티드, 및 Ztnfr12-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 BCMA-면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다. 이종성3량체의 예들은 2개의 BCMA-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 TACI-면역글로불린 폴리펩티드, 2개의 Ztnfr1-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 TACI-면역글로불린 폴리펩티드, 2개의 Ztnfr12-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 BCMA-면역글로불린 폴리펩티드, BCMA-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 2개의 TACI-면역글로불린 폴리펩티드, Ztnfr12-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 2개의 TACI-면역글로불린 폴리펩티드, Ztnfr12-면역글로불린 폴리펩티드를 갖는 2개의 BCMA-면역글로불린 폴리펩티드, 및 TACI-면역글로불린 폴리펩티드, BCMA-면역글로불린 폴리펩티드 및 Ztnfr12-면역글로불린 폴리펩티드의 3량체를 포함한다.

그러한 융합 단백질에서, TACI 리셉터 부분은 SEQ ID NO:2의 다음 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 아미노산 잔기 30에서 154, 아미노산 잔기 34에서 66, 아미노산 잔기 71에서 104, 아미노산 잔기 47에서 62, 및 아미노산 잔기 86에서 100. BCMA 리셉터 부분은 SEQ ID NO:27의 다음 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 아미노산 잔기 1에서 48, 아미노산 잔기 8에서 41, 및 아미노산 잔기 21에서 37. Ztnfr12 리셉터 부분은 SEQ ID NO:60의 다음 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 아미노산 잔기 1에서 69, 및 아미노산 잔기 19에서 35.

융합 단백질은 예가 되는 TACI-Fc 분자를 구성하는데 사용된 PCR 방법을 사용하여 생성될 수 있으며, 이것은 실시예에서 설명된다. 그러나, 당업자는 다른 표준 접근법을 사용할 수도 있다. 예를 들어, TACI, BCMA, Ztnfr12, 또는 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 본원에 개시된 서열을 기초로 한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 사람 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 기술은 표준 기술이며 잘 확립되어 있다(예를 들어, Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology, 3판, page 4-1에서 4-6 (John Wiley & Sons 1995)("Ausubel(1995)"); Wu 등, Methods in Gene Biotechnology, page 33-41 (CRC Press, Inc. 1997)("WU(1997)"); Ausubel(1995) page 5-1에서 5-6; WU(1997) page 307-327 참조).

또는, 면역글로불린 융합 단백질을 구성하는 분자는 상호 준비자극(priming)된 긴 올리고뉴클레오티드와 본원에 설명된 뉴클레오티드 서열을 사용하여 핵산 분자를 합성함으로써 얻어질 수 있다(예를 들어, Ausubel(1995) page 8-8에서 8-9 참조). 중합효소연쇄반응을 사용하는 확립된 기술은 적어도 2Kb 길이의 DNA 분자를 합성하는 능력을 제공한다(Adang 등, Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot 등, PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon 등, "합성 유전자의 빠른 구성을 위한 중합효소연쇄반응의 사용," Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR 프로토콜: 현재 방법 및 적용, White(ed), pages 263-268 (Humana Press, Inc. 1993), 및 Holowachuk 등, PCR Methods Appl. 4:299 (1995)).

또한, 본 발명의 핵산 분자는 포스포라미다이트법과 같은 프로토콜을 사용하는 "유전자 머신"으로 합성될 수 있다. 만일 화학적으로 합성된 이중-가닥 DNA가 유전자 또는 유전자 단편의 합성과 같은 적용을 위해 필요하다면, 각 보체 가닥이 개별적으로 만들어진다. 짧은 유전자(60 내지 80 염기쌍)의 생성은 기술적으로 간단하며, 보체 가닥들을 합성한 후 그것들을 아닐링함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 더 긴 유전자(>300 염기쌍)의 생성에 대해서는 특별한 전략이 필요할 수 있는데, 화학적 DNA 합성 동안 각 사이클의 커플링 능률이 좀처럼 100%가 되지 않기 때문이다. 이런 문제를 극복하기 위해서, 합성 유전자(이중-가닥)가 20 내지 100 뉴클레오티드 길이인 단일-가닥 단편으로부터 모듈 형태로 조립된다. 폴리뉴클레오티드 합성에 대한 리뷰는, Glick 및 Pasternak, Molecular Biotechnology, 재조합 DNA의 원리 및 적용 (ASM Press 1994), Itakura 등, Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), 및 Climie 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990)를 참조한다.

4. TACI-면역글로불린 폴리펩티드의 생성

본 발명의 폴리펩티드는 종래의 기술에 따라 재조합 숙주 세포에서 생성될 수 있다. CACI-면역글로불린-암호화 서열을 발현하기 위해서, 이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터에서의 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 후 숙주 세포로 도입되어야 한다. 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열에 더하여, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 발현 벡터를 지닌 세포의 선택에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다.

진핵 세포에서 외래 단백질의 생성에 적합한 발현 벡터는 전형적으로, (1) 박테리아 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선택을 제공하는 박테리아 복제 기원 및 항생물질 내성 마커를 코딩하는 원핵 DNA 요소; (2) 프로모터와 같은 전사의 개시를 제어하는 진핵 DNA 요소; 및 (3) 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사체의 프로세싱을 제어하는 DNA 요소를 함유한다.

또, 발현 벡터는 이종성 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 디렉트하는 분비 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 TACI-면역글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 어떤 분비된 유전자로부터 유래된 분비 서열을 포함할 수 있다. 상기 논의된 대로 한 적합한 신호 서열은 tPA 신호 서열이다. 전형적인 tPA 신호 서열은 SEQ ID NO:25에 의해 제공된다. 다른 적합한 신호 서열은 뮤린 26-10 V_H 신호 서열이다. 뮤린 26-10 항체는, 예를 들어 Near 등, Mol. Immunol. 27:901 (1990)에 설명된다. 뮤린 26-10 V_H 신호 서열의 예가 되는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:61 및 SEQ ID NO:65로 각각 제공된다. SEQ ID NO:62는 뮤린 26-10 V_H 신호 서열을 포함하는 TACI-Fc5 융합 단백질의 아미노산 서열을 개시한다.

본 발명의 TACI-면역글로불린 단백질은 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 예들은, 아프리카 녹색원숭이 신장 세포(Vero; ATCC CRL 1587), 사람 배아 신장 세포(293-HEK; ATCC CRL 1573), 아기햄스터 신장 세포(BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개과의 신장 세포(MDCK; ATCC CCL34), 중국 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44(Chasin 등 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), 래트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 래트 간종양 세포(H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-형질전환(transform)된 원숭이 신장 세포(COS-1; ATCC CRL 1650) 및 뮤린 배아 세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다.

포유류 숙주에 대해서, 전사 및 번역 조절 신호는 바이러스 소스, 예를 들어 아데노바이러스, 소과의 파필로마 바이러스, 유인원 바이러스 등으로부터 유래될 수 있으며, 이들에서 조절 신호는 높은 수준의 발현을 갖는 특정한 유전자와 관련된다. 또한, 적합한 전사 및 번역 조절 서열은 포유류 유전자, 예를 들어 액틴, 콜라겐, 미오신, 및 메탈로티오네인 유전자로부터 얻어질 수 있다.

전사 조절 서열은 RNA 합성의 개시를 디렉트하는데 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 적합한 진핵 프로모터는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자 프로모터(해머 등, J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), 헤르페스 바이러스 TK 프로모터(맥나이트, Cell 31:355 (1982)), SV40 초기 프로모터(베노이스트 등, Nature 290:304 (1981)), Rous 육종 바이러스 프로모터(고먼 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)), 시토메갈로바이러스 프로모터(포에킹 등, Gene 45:101(1980)), 및 마우스 유방종양 바이러스 프로모터를 포함한다(일반적으로, 에치베리, "포유류 세포 배양물에서 조작된 단백질의 발현," Protein Engineering: 원리 및 연습, 클리랜드 등, pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) 참조). 프로모터와 인핸서의 한 유용한 조합이 척수증식성 육종 바이러스 프로모터 및 사람 시토메갈로바이러스 인핸서에 의해 제공된다.

또는 달리, 만일 원핵 프로모터가 진핵 프로모터에 의해 조절된다면, 박테리오파지 T3 RNA와 같은 원핵 프로모터가 포유류 세포에서 TACI-면역글로불린 단백질의 생성을 제어하는데 사용될 수 있다(Zhou 등, Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990), 및 Kaufman 등, Nitcl. Acids Res. 19:4485 (1991)).

발현 벡터는 인산칼슘 트랜스펙션, 리포솜-매개 트랜스펙션, 미세투사-매개 송달, 전기천공 등을 포함하는 여러 가지 표준 기술을 사용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 트랜스펙트된 세포는 숙주 세포 게놈에 안정하게 통합된 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하도록 선택되어 증식될 수 있다. 우성 선택성 마커를 사용하여 진핵 세포로 벡터를 도입하는 기술 및 그러한 안정한 형질전환체를 선택하는 기술은, 예를 들어 Ausubel(1995) 및 Murray(ed.), 유전자 전달 및 발현 프로토콜(Humana Press 1991)에 의해 설명된다.

예를 들어, 한 적합한 선택성 마커는 항생물질 네오마이신에 대한 내성을 제공하는 유전자이다. 이 경우 선택은 G-418 등과 같은 네오마이신-타입 약물의 존재하에 수행된다. 또한, 선택 시스템을 사용하여 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시킬 수 있는데, 이런 과정을 "증폭"이라고 한다. 증폭은 낮은 수준의 선택제의 존재하에 트랜스펙턴트를 배양한 후, 선택제의 양을 증가시켜 도입된 유전자의 생성물을 높은 수준으로 생성하는 세포를 선택함으로써 수행된다. 적합한 증폭용 선택성 마커는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 디히드로폴레이트 환원효소이다. 다른 약물 내성 유전자(예를 들어, 히그로마이신 내성, 다수-약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스페라제)도 사용될 수 있다. 또는 달리, 녹색 형광 단백질과 같은 변경된 표현형을 도입하는 마커, CD4, CD8, 클래스 I MHC, 태반 알칼리성 포스파타제와 같은 세포 표면 단백질을 사용하여, FACS 분류 또는 자기비드 분리 기술과 같은 수단에 의해 트랜스펙트되지 않은 세포로부터 트랜스펙트된 세포를 가려낼 수 있다.

또한, TACI-면역글로불린 폴리펩티드는 바이러스 송달 시스템을 사용하여 배양된 포유류 세포에 의해 생성될 수 있다. 이런 목적을 위한 전형적인 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함한다. 이중-가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스는 이종성 핵산의 송달을 위한 현재 가장 잘 연구된 유전자 전달 벡터이다(리뷰를 위해 Becker 등, Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), 및 Douglas 및 Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997) 참조). 아데노바이러스 시스템의 이점은 상대적으로 큰 DNA 삽입체의 수용, 높은 역가까지 성장하는 능력, 광범한 포유류 세포 종류를 감염시키는 능력, 및 상이한 프로모터들을 함유하는 다수의 이용가능한 벡터들과 함께 사용하는 것을 허용하는 유연성을 포함한다.

아데노바이러스 게놈의 일부분들을 결실시킴으로써 이종성 DNA의 더 큰 삽입체(7kb까지)가 수용될 수 있다. 이들 삽입체는 직접 라이게이션 또는 공동-트랜스펙트 플라스미드와의 동종 재조합에 의해 바이러스 DNA에 결합될 수 있다. 바이러스 벡터로부터 본질적 E1 유전자를 제거하는 것은 선택사항이며, 이것은 E1 유전자가 숙주 세포에 의해 제공되지 않는다면 복제에 대한 무능력을 가져온다. 아데노바이러스 벡터-감염된 사람 293 세포(ATCC No. CRL-1573, 45504, 54405)는, 예를 들어 유착 세포로서 또는 상대적으로 높은 세포 밀도로 현탁 배양물 중에서 성장되어 상당한 양의 단백질을 생성할 수 있다(Garnier 등, Cytotechnol. 15:154 (1994) 참조).

당업자는 포유류 세포를 사용하여 본원에 설명된 융합 단백질을 생성하는 적합한 발현 벡터를 고안할 수 있다. 실시예 4는 한 발현 벡터의 특징을 설명한다. 다른 예로서, 발현 벡터는 사람 시토메갈로바이러스 인핸서의 일부를 포함하는 비시스트론(bicistronic) 발현 카세트, 척수증식성 육종 바이러스 프로모터, 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 폴리오바이러스 내부 리보솜 진입 부위, 뮤린 디히드로폴레이트 환원효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 SV40 폴리 A 추가 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID NO:69의 뉴클레오티드 서열은 시토메갈로바이러스 인핸서/척수증식성 육종 바이러스 LTR 프로모터 구성물을 나타내며, 여기서 시토메갈로바이러스 인핸서는 뉴클레오티드 1에서 407까지 연장된다. 음성 대조표준 영역이 없는 척수증식성 육종 바이러스 LTR 프로모터는 SEQ ID NO:69의 뉴클레오티드 408에서 뉴클레오티드 884까지 연장된다. 음성 대조표준 영역이 없는 척수증식성 육종 바이러스 LTR 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:70으로 제공된다.

실시예 1은 재조합 단백질 트랜스젠의 발현을 디렉트하는 시토메갈로바이러스 프로모터, 면역글로불린 인트론, 및 조직 플라스미노겐 활성제 신호 서열을 포함하는 발현 벡터를 설명한다. 한 적합한 면역글로불린 인트론은 뮤린 26-10 V_H 인트론이다. SEQ ID NO:66은 뮤린 26-10 V_H 인트론의 예가 되는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 발현 벡터는 TACI-면역글로불린 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치된 5' 미번역 영역(UTR)을 또한 포함할 수 있다. 적합한 5'-UTR은 뮤린 26-10 V_H 유전자로부터 유래될 수 있다. SEQ ID NO:63은 유용한 자생 뮤린 26-10 V_H 5'-UTR의 뉴클레오티드 서열을 개시하며, SEQ ID NO:64는 3' 단부에서 최적화된 뮤린 26-10 V_H 5'-UTR의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

실례로서, SEQ ID NO:67은 다음의 요소들을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다: 자생 뮤린 26-10 V_H 5'-UTR(뉴클레오티드 1에서 51), 뮤린 26-10 V_H 신호 서열(뉴클레오티드 52에서 97, 및 182에서 192), 뮤린 26-10 V_H 인트론(뉴클레오티드 98에서 181), 및 Fc5 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(뉴클레오티드 436에서 1131). SEQ ID NO:68의 뉴클레오티드 서열은 자생 서열을 최적화된 뮤린 26-10 VH 5'-UTR(뉴클레오티드 1에서 51)로 치환했기 때문에 SEQ ID NO:67과 다르다.

또한, TACI-면역글로불린 단백질은 조류, 진균, 곤충, 효모 또는 식물 세포와 같은 더 고등한 진핵 세포에서 발현될 수 있다. 바쿨로바이러스 시스템이 클론된 유전자를 곤충 세포로 도입하는 효과적인 수단을 제공한다. 적합한 발현 벡터는 오토그라파 칼리포미카 다핵 폴리헤드로시스 바이러스를 기초로 하며, 초파리 열 쇼크 단백질(hsp) 70 프로모터, 오토그라파 칼리포미카 핵 폴리헤드로시스 바이러스 중간체-초기 유전자 프로모터(ie-1) 및 지연된 초기 39K 프로모터, 바쿨로바이러스 p10 프로모터, 및 초파리 메탈로티오네인 프로모터와 같은 잘 알려진 프로모터를 함유한다. 재조합 바쿨로바이러스를 제조하는 두번째 방법은 Luckow에 의해 설명된 트랜스포존-기초 시스템을 이용한다(Luckow 등, J. Virol. 67:4566 (1993)). 이 시스템은 전달 벡터를 이용하며 BAC-대-BAC 키트(Life Technologies, Rockville, MD)로 판매된다. 이 시스템은 전달 벡터 PFASTBAC(Life Technologies)를 이용하며, 이것은 TACI-면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 "bacmid"라고 불리는 큰 플라스미드로서 E. coli 안에 유지된 바쿨로바이러스 게놈으로 이동시키는 Tn7 트랜스포존을 함유한다. Hill-Perkins 및 Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning 등, J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), 및 Chazenbalk, 및 Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995) 참조. 여기에 더하여, 전달 벡터는 발현된 TACI-면역글로불린 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단에서 에피토프 택, 예를 들어 Glu-Glu 에피토프 택을 암호화하는 DNA와의 프레임내 융합체를 포함할 수 있다. 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 TACI-면역글로불린 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 전달 벡터가 E. coli에서 형질전환되고, 재조합 바쿨로바이러스를 표시하는 중절된 lacZ 유전자를 함유하는 bacmid로 스크린된다. 다음에, 재조합 바쿨로바이러스 게놈을 함유하는 bacmid DNA가 통상적인 기술을 사용하여 분리된다.

예가 되는 PFASTBAC 벡터는 상당한 정도로 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리헤드린 프로모터가 제거되고, 바쿨로바이러스 감염에서 더 일찍 발현되는 바쿨로바이러스 염기성 단백질 프로모터(Pcor, p6.9 또는 MP 프로모터라고도 알려짐)로 치환될 수 있으며, 이것은 분비된 단백질을 발현하는데 유리하다고 알려져 있다(예를 들어, Hill-Perkins 및 Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning 등, J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), 및 Chazenbalk 및 Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995) 참조). 그러한 전달 벡터 구성물에서, 짧거나 긴 버전의 염기성 단백질 프로모터가 사용될 수 있다. 더욱이 전달 벡터는 곤충 단백질로부터 유래된 분비 신호 서열과 함께 구성될 수 있다. 예를 들어, 엑디스테로이드 글루코실트랜스페라제(EGT), 벌꿀 멜리틴(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), 또는 바쿨로바이러스 gp67(PharMingen: San Diego, CA)로부터의 분비 신호 서열이 그러한 구성물에서 사용될 수 있다.

재조합 바이러스 또는 bacmid는 숙주 세포를 트랜스펙트하는데 사용된다. 적합한 곤충 세포는 IPLB-Sf-21로부터 유래된 셀라인들, Sf9(ATCC CRL 1711), Sf21AE, 및 Sf21(Invitrogen Corporation; San Diego, CA)와 같은 Spodoptera frugiperda 번데기 난소 셀라인, 뿐만 아니라 초파리 Schneider-2 세포, 및 Trichoplusia ni로부터 유래된 HIGH FIVEO 셀라인(Invitrogen)을 포함한다(미국특허 No. 5,300,435). 상업적으로 입수가능한 무혈청 배지가 이 세포들을 성장시키고 유지하는데 사용될 수 있다. 적합한 배지는 Sf9 세포에 대해 Sf900 II^TM(Life Technologies) 또는 ESF 921^TM(Expression Systems); T. ni 세포에 대해 Ex-cellO405^TM(JRH Biosciences, Lenexa, KS) 또는 Express FiveO^TM(Life Technologies)이다. 재조합 바이러스가 사용될 때, 세포는 전형적으로 대략 2-5 x 10⁵ 세포 접종 밀도에서 1-2 x 10⁶ 세포 밀도까지 성장되며, 이 때 재조합 바이러스 스톡이 0.1 내지 10, 더 전형적으로는 3 근처의 감염 다중도(MOI)로 첨가된다.

바쿨로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 생성하는 확립된 기술은 Bailey 등, "바쿨로바이러스 벡터의 조작" Methods in Molecular Biology, Volume 7: 유전자 전달 및 발현 프로토콜, Murray, page 147-168(The Humana Press, Inc. 1991), Patel 등, "바쿨로바이러스 발현 시스템" DNA 클로닝 2: 발현 시스템, 2판, Glover 등, page 205-244(Oxford University Press 1995), Ausubel (1995) page 16-37에서 16-57, Richardson, 바쿨로바이러스 발현 프로토콜(The Humana Press, Inc. 1995), 및 Lucknow, "곤충 세포 발현 기술" Protein Engineering: 원리 및 연습, Cleland 등, page 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)에 의해 제공된다.

또한, 효모 세포를 포함하는 진균 세포가 본원에 설명된 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여 특히 관심 있는 효모 종들은 Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastors, 및 Pichia methanolica를 포함한다. 효모에서의 발현을 위한 적합한 프로모터는 GALL(갈락토즈), PGK(포스포글리세레이트 키나제), ADH(알콜 디히드로지나제), AOXI(알콜 산화효소), HIS4(히스티디놀 디히드로지나제) 등으로부터의 프로모터를 포함한다. 많은 효모 클로닝 벡터들이 디자인되었으며 쉽게 입수할 수 있다. 벡터는 효모에서 상동성 재조합을 수행하기 위한 필수 요소들을 이용하는 구성물들을 발생시키도록 디자인될 수 있다(예를 들어, Raymond 등, BioTechniques 26:134 (1999)). 예를 들어 그러한 발현 벡터는 S. cerevisiae에서의 선택 및 복제에 필요한 URA3 및 CEN-ARS(자발적으로 복제하는 서열) 서열을 포함할 수 있다. 다른 적합한 벡터는 YIp-기초 벡터, 예를 들어 YIp5, YRp 벡터, 예를 들어 YRp17, YEp 벡터, 예를 들어 YEp13 및 YCp 벡터, 예를 들어 YCp19를 포함한다. 외인성 DNA로 S. cerevisiae를 형질전환하고 이들 세포로부터 재조합 폴리펩티드를 생성하는 방법은, 예컨대 Kawasaki, 미국특허 No. 4,599,311, Kawasaki 등, 미국특허 No. 4,931,373, Brake, 미국특허 No. 4,870,008, Welch 등, 미국특허 No. 5,037,743, 및 Murray 등, 미국특허 No. 4,845,075에 의해 개시된다. 형질전환된 세포는, 통상 약물 내성 또는 특정 영양물(예컨대, 로이신)의 부재하에 성장하는 능력인 선택성 마커에 의해 결정된 표현형에 의해 선택된다. Saccharomyces cerevisiae에 사용되는 적합한 벡터 시스템은 Kawasaki 등(미국특허 No.4,931,373)에 개시된 POT1 벡터 시스템이며, 이것은 형질전환된 세포가 글루코스-함유 배지에서의 성장에 의해 선택되는 것을 허용한다. 효모에서 사용되는 추가의 적합한 프로모터 및 터미네이터는 당분해 효소 유전자로부터의 것들(예를 들어, Kawasaki, 미국특허 No. 4,599,311, Kingsman 등, 미국특허 No. 4,615,974, 및 Bitter, 미국특허 No. 4,977,092 참조), 및 알콜 디히드로지나제 유전자를 포함한다. 또한, 미국특허 No. 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936 및 4,661,454 참조.

Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyverornyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii 및 Candida maltosa를 포함하는 다른 효모들을 위한 형질전환 시스템이 본 분야에 공지되어 있다. 예로서, Gleeson 등, J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) 및 Cregg, 미국특허 No. 4,882,279 참조. McKnight 등의 미국특허 No. 4,935,349의 방법에 따라 Aspergillus 세포가 이용될 수 있다. Acremonium chrysogenum를 형질전환하는 방법은 Sumino 등의 미국특허 No. 5,162,228에 개시된다. Neurospora를 형질전환하는 방법은 Lambowitz의 미국특허 No. 4,486,533에 개시된다.

예를 들어, 재조합 단백질의 생성을 위한 숙주로서 Pichia methanolica의 사용은 Raymond, 미국특허 No.5,716,808, Raymond, 미국특허 No. 5,736,383, Raymond 등, Yeast 14:11-23 (1998), 및 국제공보 No. WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, 및 WO 98/02565에 개시된다. P. methanolica를 형질전환하는데 사용되는 DNA 분자는 통상 이중-가닥, 원형 플라스미드로 제조될 것이며, 이것은 형질전환 정에 선형으로 되는 것이 바람직하다. P. methanolica에서의 폴리펩티드 생성에 대해서, 프라스미드의 프로모터 및 터미네이터는 P. metlianolica 알콜 이용 유전자(AUG1 또는 AUG2)와 같은 P. methanolica 유전자의 것일 수 있다. 다른 유용한 프로모터는 디히드록시아세톤 신타제(DHAS), 포르메이트 디히드로지나제(FMD), 및 카탈라제(CAT) 유전자의 것들을 포함한다. DNA와 숙주 염색체의 결합을 용이하게 하기 위해서 숙주 DNA 서열의 양 단부에 위치된 플라스미드의 전체 발현 세그먼트를 갖는 것이 바람직하다. P. methanolica에 사용되는 적합한 선택성 마커는 P. methanolica ADE2 유전자이며, 이것은 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제(AIRC; EC 4.1.1.21)를 암호화하고, ade2 숙주 세포가 아데닌의 부재하에 성장하는 것을 허용한다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대규모 산업 공정에 대해서, 두 메탄올 이용 유전자(AUG1 및 AUG2)가 결실된 숙주 세포가 사용될 수 있다. 분비된 단백질의 생성에 대해서, 숙주 세포는 액포 프로테아제 유전자(PEP4 및 PRB1)에 결함이 있을 수 있다. 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 P. methanolica 세포로 도입하는 것을 용이하게 하기 위해 전기천공을 사용한다. 2.5 내지 4.5kV/cm, 바람직하게 약 3.75kV/cm의 전기장 강도, 및 1 내지 40ms, 가장 바람직하게 약 20ms의 시간 상수(t)를 갖는 지수적으로 줄어드는 펄스 전기장을 사용하는 전기천공에 의해 P. methanolica 세포가 형질전환될 수 있다.

또한, 발현 벡터는 식물 원형질체, 완전한 식물 조직, 또는 분리된 식물 세포로 도입될 수 있다. 식물 조직으로 발현 벡터를 도입하는 방법은 Agrobacterium tunlefaciens으로 식물 조직을 직접 감염시키거나 또는 공동-배양하는 것, 미세투사-매개 송달, DNA 주사, 전기천공 등을 포함한다. 예로서, Horsch 등, Science 227:1229 (1985), Klein 등, Biotechnology 10:268 (1992), 및 Miki 등, "식물로 외래 DNA를 도입하는 과정" 식물 분자생물학 및 생물기술의 방법, Glick 등, page 67-88 (CRC Press, 1993) 참조.

또는 달리, TACI-면역글로불린 단백질은 원핵 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 원핵 숙주에서 TACI-면역글로불린 폴리펩티드를 생성하는데 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, T4, T3, Sp6 및 T7 중합효소를 인식할 수 있는 프로모터들, 박테리오파지 람다 P_R 및 P_L 프로모터, E. coli의 trp, recA, 열 쇼크, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA, 및 lacZ 프로모터, B. subtilis 프로모터, Bacillus의 박테리오파지 프로모터, Streptomyces 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터, 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제 유전자의 CAT 프로모터를 포함한다. 원핵 프로모터는 Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson 등, Molecular Biology of the Gene, 4판 (Benjamin Cummins 1987), 및 Ausubel 등(1995)에 의해 재고되었다.

적합한 원핵 숙주는 E.coli 및 Bacillus subtilus를 포함한다. 적합한 E.coli 균주는 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH1OB/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, 및 ER1647을 포함한다(예를 들어, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) 참조). 적합한 Bacillus subtilus 균주는 BR151, YB886, MI119, MI120, 및 B170을 포함한다(예를 들어, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985) 참조).

E. coli와 같은 박테리아에서 TACI-면역글로불린 단백질을 발현시킬 때, 폴리펩티드는 세포질 중에, 전형적으로는 불용성 과립으로서 보유될 수 있거나, 또는 박테리아 분비 서열에 의한 주변세포질 공간으로 디렉트될 수 있다. 전자의 경우, 세포가 용해되며, 과립이 회수되고, 예를 들어 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 유레아를 사용하여 변성된다. 다음에, 변성제를 희석시킴에 의해, 예를 들어 유레아 용액과 환원 및 산화 글루타티온의 조합에 대해 투석하고, 이어서 완충 식염수 용액에 대해 투석함으로써, 변성된 폴리펩티드가 다시 접히고 2량체화될 수 있다. 후자의 경우, 폴리펩티드는 세포를 파괴하여(예를 들어, 초음파처리 또는 삼투 쇼크에 의해) 주변세포질 공간의 내용물을 방출시키고 단백질을 회수함에 의해 가용성이며 기능성인 형태로 주변세포질 공간으로부터 회수될 수 있으며, 이로써 변성 및 재접힘에 대해 필요성이 제거된다.

원핵 숙주에서 단백질을 발현하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, Williams 등, "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," DNA Cloning 2: Expression Systems, 2판, Glover 등(eds.), page 15 (Oxford University Press 1995) Ward 등 "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley Liss, Inc. 1995), 및 Georgiou "Expression of Proteins in Bacteria" Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland 등(eds.), page 101(John Wiley & Sons, Inc. 1996) 참조).

박테리아, 효모, 곤충, 및 식물 세포로 발현 벡터를 도입하는 표준 방법은, 예를 들어 Ausubel(1995)에 의해 제공된다.

포유류 세포 시스템에 의해 생성된 외래 단백질을 발현하고 회수하는 일반적 방법은, 예를 들어 Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland 등(eds.), page 163(Wiley-Liss, Inc. 1996)에 의해 제공된다. 박테리아 시스템에 의해 생성된 단백질을 회수하는 표준 기술은, 예를 들어 Grisshammer 등, "Purification of over-produced proteins from E. coli cells" DNA Cloning 2: Expression Systems, 2판, Glover 등(eds.), page 59-92(Oxford University Press 1995)에 의해 제공된다. 바쿨로바이러스 시스템으로부터 재조합 단백질을 분리하는 확립된 방법은 Richardson(ed.) Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995)에 의해 설명된다.

대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드는 배타적 고체상 합성, 부분적 고체상 합성, 단편 축합 또는 고전적 용액 합성에 의해 합성될 수 있다. 이들 합성 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart 등, "Solid Phase Peptide Synthesis"(2판)(Pierce Chemical Co. 1984), Bayer 및 Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton 등, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach(IRL Press 1989), Fields 및 Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volume 289(Academic Press 1997), 및 Lloyd-Williams 등, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins(CRC Press, Inc. 1997) 참조). 또한, "자생적 화학 라이게이션" 및 "발현된 단백질 라이게이션"과 같은, 화학 총합성 전략의 변형들도 표준 방법이다(예를 들어, Dawson 등, Science 266:776(1994), Hackeng 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845(1997), Dawson, Methods Enzymol. 287:34(1997), Muir 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705(1998) 및 Severinov 및 Muir, J. Biol. Chem. 273:16205(1998) 참조).

5. TACI-면역글로불린 융합 단백질의 분석

TACI-면역글로불린 융합 단백질의 기능이 ZTNF4 또는 ZTNF2에 결합하는 융합 단백질의 능력을 평가하기 위한 여러 가지의 접근법들을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 실시예 4는 ZTNF4 결합 친화성 및 결합 용량을 측정하는 방법을 제공한다.

또는 달리, TACI-면역글로불린 융합 단백질은, Gross 등의 국제공보 No. WO 00/40716에 의해 설명된 대로 가용성 ZTNF4에 의한 사람 B 세포의 자극을 저해하는 능력에 의해 특성화될 수 있다. 간단히 말해서, 사람 B 세포가 제조자의 지시에 따라 CD19 자기비드 및 VarioMacs 자기분리시스템(Miltenyi Biotec Auburn, CA)을 사용해 말초혈 단핵세포로부터 분리된다. 정제된 B 세포는 가용성 ZTNF4(25ng/ml) 및 재조합 사람 IL-4(10ng/ml Pharmingen)와 혼합되고, 세포들은 둥근바닥 96웰 플레이트 위에 웰 당 1x10⁵ 세포로 평판된다.

가용성 TACI-면역글로불린 단백질은 약 5㎍/ml 내지 6ng/ml로 희석되고, 5일간 B 세포와 인큐베이션될 수 있는데, 4일째에 웰 당 1μCi 3H-티미딘으로 하룻밤 동안 펄싱한다. 대조표준으로서 TACI-면역글로불린 단백질은 또 ZTNF4 없이 B 세포 및 IL-4와 인큐베이션될 수 있다. 플레이트는 Packard 플레이트 수확기를 사용하여 수확되고 Packard 리더를 사용하여 계수된다.

이런 일반적 접근법을 사용하여 3가지 TACI-Fc 융합 단백질을 시험할 수 있다. 모든 융합 단백질이 B 세포 증식을 저해하지는 않았지만, 구성물 TACI(d1-29, d111-154)-Fc5 및 TACI(d1-29,d120-154)-Fc5는 TACI(d1-29, d107-154)-Fc5 보다 더 효능 있었다.

잘 확립된 동물 모델을 이용하여 어떤 질환 상태에서 TACI-면역글로불린 단백질의 생체내 효능이 시험된다. 예를 들어, TACI-면역글로불린 단백질은, SLE(전신홍반루프스)의 모델로 사용하는 MRL-lpr/lpr 또는 NZB x NZW F1 유사유전자형 마우스 계통 같은, 많은 자가면역질환 동물 모델에서 시험될 수 있다. 그러한 동물 모델은 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Cohen 및 Miller (Eds.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook(Academic Press, Inc. 1994) 참조).

뉴질랜드 흑색(NZB) 마우스와 뉴질랜드 흰색(NZW) 마우스의 교배 자손은 사람의 SLE와 매우 유사한 자발적 형태의 SLE를 발생시킨다. NZBW로 공지된 자손 마우스는 1개월이 되자 T 세포에 대한 IgM 자가항체를 발생하기 시작하며, 5개월 내지 7개월까지는 항-DNA 자가항체가 우세한 면역글로불린이다. 폴리클로날 B 세포 과잉활성은 자가항체의 과생성을 가져온다. 이들 자가항체, 특히 단일-가닥 DNA에 대해 디렉트된 것들의 침착은 사구체신염의 발병과 관련되며, 이것은 단백뇨, 질소혈증, 및 신부전으로 인한 사망에 따라 임상적으로 명백하다.

신부전은 자발 SLE에 걸린 마우스 및 NZBW 계통에서 주된 사망 원인이며, 이 과정은 만성적이고 폐쇄적이다. 이 질환은 수컷보다 암컷에서 더욱 빠르고 심하며, 수컷이 406일간 생존한 것에 비하여 암컷은 단지 평균 245일간 생존한다. 암컷 마우스의 대부분은 7개월 내지 9개월까지 증상(단백뇨)이 있지만, 일부는 더 어리거나 더 늙어서 증상을 나타낼 수 있다. NZBW 마우스에서 보이는 치명적 면역 신장염은 사람 SLE에서 보이는 사구체신염과 매우 유사하며, 이것이 자발 뮤린 모델을 가능한 SLE 치료제의 시험을 위한 매우 매력적인 모델로 만든다(Putterman 및 Naparstek, "Murine Models of Spontaneous Systemic LupusErythematosus," Auto-immune Disease Models: A Guidebook, page 217-234(Academic Press, Inc., 1994); Mohan 등 J. Immunol. 154:1470(1995); 및 Daikh 등 J. Immunol. 159:3104(1997)).

Gross 등의 국제공보 No. WO 00/40716에 설명된 대로, 평균적으로 B 세포 자가항체 생성이 NZBW 마우스에서 높은 수준일 거라고 여져질 때, TACI-면역글로불린 단백질이 NZBW 마우스에 투여되여, 5주간에 걸쳐 B 세포에 대한 단백질의 억제 효과가 모니터될 수 있다. 간단히 말해서, 100마리의 8주령 암컷(NZB x NZW)F1 마우스를 15마리씩 6 그룹으로 나눌 수 있다. 치료 전에 마우스는 뇨 단백질에 대해 1달에 1회 모니터되고, CBC 및 혈청 보관을 위해 혈액이 채취된다. 자가항체의 존재에 대해 혈청이 스크린될 수 있다. 뇨단백이 사구체신염의 확인 징후이므로, 뇨 단백질 수준이 연구 과정 내내 규칙적인 간격으로 계량봉(dipstick)에 의해 모니터된다. 마우스가 대략 5개월 되면 치료를 시작할 수 있다. 마우스는 5주 동안 주 3회씩 부형제(인산 완충 식염수) 만의 복강내 주사를 받거나, 또는 사람 TACI-면역글로불린(대조표준 단백질) 또는 TACI-면역글로불린 단백질(예를 들어, 투약량 당 20 내지 100㎍ 시험 단백질)의 복강내 주사를 받는다.

혈액은 치료 중에 2번 수집되며 치료 후 적어도 2번 수집될 것이다. 뇨단백에 대한 뇨 계량봉 값 및 체중이 치료 시작 후 2주마다 측정된다. 혈액, 뇨 계량봉 값 및 체중이 안락사시에 수집된다. 형광 활성화 세포 정렬 분석 및 조직학을 위해 비장 및 흉선을 나눈다. 또한, 턱밑침샘, 창자간막림프절 사슬, 쓸개를 갖는 간엽, 맹장 및 대장, 위, 소장, 췌장, 우측 신장, 부신, 기관 및 식도를 갖는 혀, 심장 및 폐가 조직학을 위해 수집된다.

실험용 알레르기 뇌척수염을 위한 뮤린 모델이 면역-매개 질환의 메카니즘, 및 가능한 치료적 중재 방법을 조사하기 위한 도구로서 사용되었다. 이 모델은 사람 다발경화증과 유사하며, 미엘린 염기성 단백질 또는 단백지질 단백질과 같은 신경단백질(neuroprotein)에 대한 T 세포 활성화의 결과로서 탈미엘린화를 야기한다. 항원 접종은 CD4+, 클래스 II MHC-제한 T 세포(Th1)의 유발을 가져온다. 실험용 알레르기 뇌척수염에 대한 프로토콜의 변화는 이 모델의 급성, 만성-재발성 변이체, 또는 수동-전달 변이체를 야기할 수 있다(Weinberg 등, J. Immunol. 162:1818 (1999); Mijaba 등, Cell. Immunol. 186:94(1999); 및 Glabinski, Meth. Enzym. 288:182(1997)).

Gross 등의 국제공보 No. WO 00/40716은 실험용 알레르기 사구체신염에 관련된 증상의 개선에서 TACI-면역글로불린 단백질의 효능을 평가하기 위한 한 접근법을 설명한다. 간단히 말하면, 25마리의 암컷 PLxSJL F1 마우스(12주령)에게 프로인드 완전 애주번트 중에 제조된 항원(미엘린 단백지질 단백질 PLP, 잔기 139-151) 125㎍/마우스의 피하 주사가 제공된다. 마우스는 5마리씩 5 그룹으로 나눠진다. 백일해 독소(400ng)의 복강내 주사가 0일 및 2일째에 제공된다. 그룹들은 TACI-면역글로불린 단백질을 1x, 10x, 또는 100x 용량으로 제공받으며, 한 그룹은 부형제만을 받고 한 그룹은 치료를 받지 않는다. 예방 치료법은 0일째에 시작하고, 중재 치료법은 7일째에, 또는 임상적 징후의 개시에서 시작한다. 질환의 징후, 체중 감소, 및 마비는 대략 10 내지 14일에서 나타나며 약 1주일간 지속된다. 동물은 매일 체중을 수집하고 그들의 증상 정도에 해당하는 임상 점수를 정함에 의해 평가된다. 실험용 알레르기 사구체신염의 임상적 징후는 접종하고 10 내지 14일 내에 나타나서 대략 1주일간 지속된다. 연구 마지막에 모든 동물은 과량의 가스로 안락사되고 검시된다. 뇌 및 척주가 조직학을 위해 수집되거나 또는 mRNA 분석을 위해 냉동된다. 체중 및 임상 점수 데이타는 개체 및 군에 따라 도면으로 작성된다.

콜라겐-유발 관절염 모델에서 마우스는 사람 류마티스관절염과 매우 유사한 만성 염증관절염을 발생시킨다. 콜라겐-유발 관절염은 유사한 면역학적 및 병리학적 특징들을 류마티스관절염과 공유하므로, 이것은 가능한 사람 항-염증 화합물을 스크리닝하는 이상적인 모델이다. 콜라겐-유발 관절염 모델을 사용하는데 있어 다른 이점은 발병 메카니즘이 알려져 있다는 것이다. 타입 II 콜라겐에 대한 T 및 B 세포 에피토프가 확인되었으며, 면역-매개 관절염에 관련된 다양한 면역학적(지연-형 과민 및 항-콜라겐 항체) 및 염증(사이토카인, 케모카인, 및 기질-분해 효소) 파라미터가 결정되었고, 모델들에서 시험 화합물 효능을 평가하는데 사용될 수 있다(Wooley, Curr.Opin.Rheum. 3:407(1999); Williams 등, Immunol. 89:9784(1992); Myers 등, Life Sci. 61:1861(1997); 및 Wang 등, Immunol. 92:8955(1995)).

Gross 등의 국제공보 No. WO 00/40716은 콜라겐-유발 관절염에 관련된 증상의 개선에서 TACI-면역글로불린 단백질의 효능을 평가하는 방법을 설명한다. 간단히 말하면, 8주령 수컷 DBA/1J 마우스(Jackson Labs)들이 그룹 당 5마리씩 그룹으로 나눠지고, 1mg/ml 콜라겐(병아리 또는 소 기원) 50 내지 100㎕를 3주 간격으로 2번 피하 주사로 제공받는다. 한 대조표준은 콜라겐 주사를 받지 않는다. 1차 주사는 프로인드 완전 애주번트 중에 제조되고, 2차 주사는 프로인드 불완전 애주번트 중에 제조된다. TACI-면역글로불린 단백질은 2차 주사시에 또는 2차 주사 전에 예방적으로, 또는 동물이 적어도 24시간 지속되는 2가지 이상의 임상 점수를 나타낸 후에 투여된다. 동물은 2차 콜라겐 주사 후, 통상 2 내지 3주 내에 관절염 증상을 나타내기 시작한다. 예를 들어, TACI-Fc, 대조표준 단백질, 사람 IgFc, 또는 인산 완충 식염수(부형제)가 2차 주사 전 7일 전(D-7)에 시작하여 예방적으로 투여된다. 단백질은 100㎍ 투여될 수 있는데, 200㎕ 복강내 주사로서 1주에 3번 제공되고 4주간 계속된다.

콜라겐-유발 관절염 모델에서 질환의 정도는 각 발에서 캘리퍼스를 사용하여 발두께를 측정하고 각 발에 대한 임상 점수를 정하여 평가된다. 예를 들어, 임상 점수 "0"은 정상 마우스를, 점수 "1"은 하나 이상의 발가락이 염증을 일으킨 것을, 점수 "2"는 발의 가벼운 염증을, 점수 "3"은 발의 중간 정도의 염증을, 점수 "4"는 발의 심한 염증을 나타낸다. 질환이 정해진 기간 동안, 통상 7일 동안 정착된 후에 동물은 안락사된다. 발이 조직학 또는 mRNA 분석을 위해 수집되고, 혈청이 면역글로불린 및 사이토카인 분석을 위해 수집된다.

중증 근무력증은 뮤린 모델이 이용될 수 있는 다른 자가면역질환이다. 중증 근무력증은 니코틴 아세틸콜린 리셉터에 대해 디렉트된 자가항체의 생성을 수반하는 신경근육 전달의 장애이다. 이 질환은 활동 중 이상 쇠약 및 피로를 포함하는 임상적 특징을 갖는 후천적 또는 유전적 질환이다.

중증 근무력증의 뮤린 모델이 확립되었다(Christadoss 등, "Establishment of a Mouse Model of Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravid Pathogenesis for Immune Intervention," Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi 및 Bixler(Eds.), page 195-199(1995)). 실험용 자가면역 중증 근무력증은 아세틸콜린 리셉터에 대한 항체의 존재를 특징으로 하는 항체 매개 질환이다. 이들 항체는 리셉터를 파괴하여 결함 있는 신경근육 전기 임펄스를 가져오고, 그 결과 근육이 약화된다. 실험용 자가면역 중증 근무력증 모델에서 마우스는 니코틴 아세틸콜린 리셉터로 면역화된다. 중증 근무력증의 임상 징후들은 2차 면역 후 수 주 후에 분명해진다. 실험용 자가면역 중증 근무력증은, 방사성면역분석에 의한 아세틸콜린 리셉터 항체의 혈청 수준의 측정(Christadoss 및 Dauphinee, J. Immunol. 136:2437(1986); Lindstrom 등 Methods Enzymol. 74:432(1981)), 근육 아세틸콜린 리셉터의 측정, 또는 근전도검사(Coligan 등, Protocols in Immunology. Vol. 3, page 15.8.1(John Wiley & Sons, 1997))를 포함하여, 몇 가지 방법에 의해 평가된다.

실험용 자가면역 중증 근무력증에 대한 TACI-면역글로불린의 효과는 B6 마우스에서 진행중인 임상 중증 근무력증 동안 융합 단백질을 투여함에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 100마리의 B6 마우스가 0일 및 30일에 프로인드 완전 애주번트 중의 20㎍ 아세틸콜린 리셉터로 면역화된다. 아세틸콜린 리셉터로 두번째 접종한 후 마우스 중 대략 40 내지 60%가 중간 정도(2등급) 내지는 심한(3등급) 임상 중증 근무력증을 나타낼 것이다. 2등급 및 3등급 임상 질환을 가진 마우스들이 3 그룹(동일한 등급을 갖도록)으로 나눠지고, 칭량되며(약해진 마우스는 음식 및 물을 소비하기 어려우므로 또한 체중을 잃는다), 혈청이 채취된다(전-치료 항-아세틸콜린 리셉터 항체 및 동형 수준을 위해). 4주 동안 주 3회씩, A 그룹에는 인산 완충 식염수가 복강내 주사되고, B 그룹에는 대조표준 단백질(100㎍)로서 사람 IgG-Fc가 복강내 주사되며, C 그룹에는 TACI-Fc 100㎍이 주사된다. 마우스는 임상 근육 약화에 대해 주 2회 스크린되며 칭량되고, 치료의 개시 후 15일 및 30일 후에 혈청이 채취된다. 전혈을 15일째에 수집하여 마커 B220 및 CD5를 사용한 형광 활성화 세포 정렬기 분석에 의해 T/B 세포비를 결정한다. 생존한 마우스들은 치료 개시 후 30일 내지 40일에 죽이고, 후에 근육 아세틸콜린 리셉터를 추출하여 중증 근무력증의 일차적 병리인 근육 아세틸콜린 리셉터의 손실을 결정할 수 있도록 그들의 사체를 냉동한다(예를 들어, Coligan 등(Eds.) Protocols in Immunology. Vol. 3, page 15.8.1(John Wiley & Sons, 1997) 참조).

마우스 근육 아세틸콜린 리셉터에 대한 혈청 항체는 확립된 방사성멱역분석에 의해 결정될 수 있으며, 항-아세틸콜린 리셉터 항체 동형들(IgM, IgG1, IgG2b 및 IgG2c)는 ELISA에 의해 측정된다. 그러한 방법은 공지되어 있다. 진행중인 임상 중증 근무력증, 항-아세틸콜린 리셉터 항체 및 동형의 수준, 및 근육 아세틸콜린 리셉터 손실에 대한 TACI-면역글로불린의 효과가 결정된다.

대략 100마리의 마우스가 0일 및 30일째에 프로인드 완전 애주번트 중의 20㎍ 아세틸콜린 리셉터로 면역화될 수 있다. 임상 중증 근무력증을 가진 마우스들은 4 그룹으로 나눠진다. 4주 동안 주 3회씩, A 그룹은 100㎍ 대조표준 Fc로 복강내 주사되고, B 그룹은 20㎍ 대조표준 Fc로 주사되고, C 그룹은 100㎍ TACI-Fc로 주사되고, D 그룹은 20㎍ TACI-Fc로 주사된다. 치료 시작 전, 그리고 시작 후 15일 및 30일 후에 마우스가 칭량되고 혈청이 채취된다. 상기 설명된 대로 항-아세틸콜린 리셉터 항체 및 동형들에 대해 혈청이 시험된다. 또한, 근육 아세틸콜린 리셉터 손실이 측정될 수 있다.

TACI-면역글로불린 융합 단백질의 다른 적합한 분석들은 당업자에 의해 결정될 수 있다.

6. TACI-면역글로불린 콘쥬게이트의 생성

본 발명은 화학적으로 변형된 TACI-면역글로불린 조성물을 포함하며, 여기서 TACI-면역글로불린은 폴리머와 연결된다. 전형적으로, 폴리머는 TACI-면역글로불린 콘쥬게이트가 생리학적 환경과 같은 수성 환경에서 침전하지 않도록 수용성이다. 적합한 폴리머의 예는, 아실화를 위한 활성 에스테르, 또는 알킬화를 위한 알데히드와 같은 1개의 반응기를 갖도록 변형된 것이다. 이런 방식에서 중합도는 조절될 수 있다. 반응성 알데히드의 예는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 또는 모노-(C₁-C₁₀) 알콕시, 또는 그것들의 아릴옥시 유도체들이다(예를 들어, Harris 등, 미국특허 No. 5,252,714 참조). 폴리머는 분기형 또는 비-분기형일 수 있다. 더욱이, 폴리머들의 혼합물이 TACI-면역글로불린 콘쥬게이트를 생성하는데 사용될 수 있다.

치료법에 사용되는 TACI-면역글로불린 콘쥬게이트는 제약학적으로 허용되는 수용성 폴리머 부분들을 포함할 수 있다. 적합한 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시-PEG, 모노-(C₁-C₁₀) 알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데히드, 비스-숙시니미딜 카르보네이트 PEG, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐알콜, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 다른 탄수화물-기제 폴리머를 포함한다.

TACI-면역글로불린 콘쥬게이트의 한 예는 TACI-면역글로불린의 N-말단에 부착된 TACI-면역글로불린 부분 및 폴리알킬 옥시드 부분을 포함한다. PEG가 한 적합한 폴리알킬 옥시드이다. 실례로서, TACI-면역글로불린은 PEG로 변형될 수 있는데, 이 과정은 "PEG화(PEGylation)"로 알려져 있다. TACI-면역글로불린의 PEG화는 본 분야에 공지된 PEG화 방법들 중 어느 것에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, EP 0 154 316, Delgado 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249(1992), Duncan 및 Spreafico, Clin.Pharmacokinet. 27:290(1994) 및 Francis 등, Int. J. Hematol. 68:1(1998) 참조). 예를 들어, PEG화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 다른 접근법에서, TACI-면역글로불린 콘쥬게이트는, PEG의 말단 히드록시 또는 아미노기가 활성화된 링커로 대체된, 활성화 PEG를 축합시켜 형성된다(예를 들어, Karasiewicz 등, 미국특허 No. 5,382,657 참조).

아실화에 의한 PEG화는 전형적으로 PEG의 활성 에스테르 유도체와 TACI-면역글로불린 폴리펩티드의 반응을 필요로 한다. 활성화 PEG 에스테르의 예는 N-히드록시숙신이미드로 에스테르화된 PEG이다. 본원에 사용된 용어 "아실화"는 아미드, 카르바메이트, 우레탄 등의 종류의 TACI-면역글로불린과 수용성 폴리머 간의 결합을 포함한다. 아실화에 의해 PEG화된 TACI-면역글로불린을 제조하는 방법은 전형적으로, (a) 하나 이상의 PEG기가 TACI-면역글로불린에 부착하는 조건하에서 TACI-면역글로불린 폴리펩티드와 PEG를 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함한다. 일반적으로, 아실화 반응의 최적 반응 조건은 알려진 파라미터 및 원하는 결과에 의거하여 결정될 것이다. 예를 들어, PEG:TACI-면역글로불린의 비가 클수록 폴리PEG화된 TACI-면역글로불린 생성물의 퍼센트도 커진다.

아실화에 의한 PEG화 생성물은 전형적으로 폴리PEG화된 TACI-면역글로불린 생성물이며, 여기서 리신 ε-아미노기가 아실 연결기에 의해 PEG화된다. 연결 결합의 예는 아미드이다. 전형적으로, 반응 조건에 따라서 더 높은 PEG화도를 갖는 어떤 종들이 형성될 수도 있지만, 결과의 TACI-면역글로불린은 적어도 95%가 모노-, 디-, 또는 트리-PEG화될 것이다. PEG화된 종들은 투석, 한외여과, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 표준 정제 방법을 사용하여 콘쥬게이트되지 않은 TACI-면역글로불린 폴리펩티드로부터 분리될 수 있다.

알킬화에 의한 PEG화는 일반적으로 환원제의 존재하에 PEG의 말단 알데히드 유도체와 TACI-면역글로불린을 반응시키는 것을 포함한다. PEG기는 -CH₂-NH기에 의해 폴리펩티드에 부착될 수 있다.

모노-PEG화 생성물을 생성하기 위한 환원성 알킬화에 의한 유도체화는 유도체화에 이용가능한 상이한 종류의 1차 아미노기들의 반응성 차이를 이용한다. 전형적으로, 반응은 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노기와 N-말단 잔기의 α-아미노기 간의 pKa 차이를 이용하도록 허용하는 pH에서 수행된다. 그러한 선택적 유도체화에 의해 알데히드와 같은 반응성 기를 함유하는 수용성 폴리머의 단백질에의 부착이 조절된다. 폴리머와의 콘쥬게이션은 리신 측쇄 아미노기 같은 다른 반응성 기들의 유의한 변형 없이 단백질의 N-말단에서 우세하게 일어난다. 본 발명은 TACI-면역글로불린 모노폴리머 콘쥬게이트의 실질적으로 균질한 제제를 제공한다.

모노폴리머 TACI-면역글로불린 콘쥬게이트 분자의 실질적으로 균질한 집단을 생성하기 위한 환원성 알킬화는, (a) TACI-면역글로불린의 아미노 말단에서 α-아미노기의 선택적 변형을 허락하는 적합한 pH에서 환원성 알킬화 조건하에 TACI-면역글로불린 폴리펩티드와 반응성 PEG를 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 환원성 알킬화에 사용되는 환원제는 수용액에서 안정해야 하며, 환원성 알킬화의 초기 과정에서 형성된 시프 염기(Schiff base) 만을 환원시킬 수 있어야 한다. 환원제의 예들은 나트륨 보로히드리드, 나트륨 시아노보로히드리드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란을 포함한다.

모노폴리머 TACI-면역글로불린 콘쥬게이트의 실질적으로 균질한 집단을 위해서, 환원성 알킬화 반응 조건은 TACI-면역글로불린의 N-말단에 수용성 폴리머 부분의 선택적 부착을 허락하는 것들이다. 그러한 반응 조건은 일반적으로 N-말단에서 리신 아미노기들과 α-아미노기 간의 pKa 차이들을 제공한다. 또한, pH가 사용되는 폴리머 대 단백질의 비에 영향을 미친다. 일반적으로, 만일 pH가 낮다면 N-말단 α-기의 반응성이 보다 덜하기 때문에 단백질에 대해 더 과량의 폴리머가 바람직할 것이다. 만일 pH가 높다면 더 많은 반응성 기들이 이용가능하기 때문에 폴리머:TACI 면역글로불린은 클 필요가 없다. 전형적으로, pH는 3 내지 9 또는 3 내지 6의 범위 내일 것이다.

고려되는 다른 요인은 수용성 폴리머의 분자량이다. 일반적으로, 폴리머의 분자량이 높을수록 더 적은 수의 폴리머 분자가 단백질에 부착될 수 있다. PEG화 반응에 대해 전형적인 분자량은 약 2kDa 내지 약 100kDa, 약 5kDa 내지 약 50kDa, 또는 약 12kDa 내지 약 25kDa이다. 수용성 폴리머 대 TACI-면역글로불린의 몰비는 일반적으로 1:1 내지 100:1의 범위이다. 전형적으로, 수용성 폴리머 대 TACI-면역글로불린의 몰비는 폴리PEG화에 대해 1:1 내지 20:1, 모노PEG화에 대해 1:1 내지 5:1일 것이다.

폴리펩티드 및 수용성 폴리머 부분들을 포함하는 콘쥬게이트를 생성하는 일반적인 방법은 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Karasiewicz 등, 미국특허 No. 5,382,657, Greenwald 등 미국특허 No. 5,738,846, Nieforth 등, Clin. Pharmacol. Ther. 59:636(1996), Monkarsh 등, Anal. Biochem. 247:434 (1997) 참조).

본 발명은 본원에 설명된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 고찰한다. 그러한 조성물은 담체를 더 포함할 수 있다. 담체는 종래의 유기 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예들은 물, 완충용액, 알콜, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 참깨기름, 옥수수기름 등을 포함한다.

7. TACI-면역글로불린 폴리펩티드의 분리

본 발명의 폴리펩티드는 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산에 관하여 적어도 약 80% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 90% 순도 또는 95% 이상의 순도까지 정제되며, 감염 및 발열 병인을 함유하지 않을 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 제약학적으로 순수한 상태로 정제될 수 있으며, 이것은 99.9% 이상의 순도를 말한다. 어떤 제제에서 정제된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기운의 다른 폴리펩티드를 실질적으로 함유하지 않는다.

분별 및/또는 종래 정제 방법이 합성 TACI-면역글로불린 폴리펩티드, 및 재조합 숙주 세포로부터 정제된 재조합 TACI-면역글로불린 폴리펩티드의 제제들을 얻는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 황산암모늄 침전 및 산 또는 카오트로프 추출이 샘플들의 분별에 사용될 수 있다. 전형적인 정제 단계들은 히드록시아파타이트, 크기 배제, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함한다. 적합한 크로마토그래피 매질은 유도된 덱스트란, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 특제 실리카 등을 포함한다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 적합하다. 전형적인 크로마토그래피 매질은 페닐, 부틸, 또는 옥실기로 유도된 매질들, 예를 들어 페닐-세파로스 FF(Pharmacia), 토요펄 부틸 650(TosoHaas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로스(Pharmacia) 등; 또는 폴리아크릴 수지, 예를 들어 암베르크롬 CG 71(Toso Haas) 등을 포함한다. 적합한 고체 지지체는 유리비드, 실리카-기제 수지, 셀룰로스계 기제, 아가로스 비드, 교차결합 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 교차결합 폴리아크릴아미드 수지 등을 포함하며, 이것들은 그것들이 사용되는 조건하에서 불용성이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분들에 의한 단백질의 부착을 허용하는 반응성 기들로 변형될 수 있다.

커플링 화학의 예들은 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학을 위한 카르복실 및 아미노 유도체들을 포함한다. 이들 및 다른 고체 매질이 잘 알려져 있고 본 분야에서 광범하게 사용되며 상업 공급원으로부터 입수가능하다. 폴리펩티드 분리 및 정제를 위한 특정한 방법의 선택은 루틴 디자인의 문제이며 선택된 지지체의 성질에 의해 일부 결정된다. 예를 들어, Affinity Chromatography: Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology 1988), 및 Doonan, Protein Purification Protocols(The Humana Press 1996) 참조.

TACI-면역글로불린 분리 및 정제에서 추가의 변화는 당업자에 의해 고안될 수 있다. 예를 들어, 항-TACI 또는 항-Fc 항체가 면역친화성 정제에 의해 다량의 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 특정한 성질의 외삽에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 고정 금속이온 흡착 크로마토그래피(IMAC)가 폴리히스티딘 택을 포함하는 것들을 포함하여, 히스티딘-부화 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 간략하게, 먼저 2가 금속이온으로 겔이 하전되어 킬레이트를 형성한다(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1(1985)). 히스티딘-부화 단백질들이 사용된 금속이온에 따라서 이 매질에 상이한 친화성으로 흡착될 것이고, 경쟁적 용리법에 의해 pH를 저하시키면서 용리되거나, 또는 강한 킬레이팅제의 사용에 의해 용리될 것이다. 다른 정제 방법은 렉틴 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 크로마토그래피, 및 이온교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 단백질의 정제를 포함한다(M. Deutscher, Meth. Enzymol. 182:529(1990)).

또한, TACI-면역글로불린 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 상기 설명된 화학 합성을 통해 제조될 수 있다. TACI-면역글로불린 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체일 수 있고; 글리코실화 또는 비-글리코실화될 수 있고; PEG화 또는 비-PEG화될 수 있고; 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. TACI-면역글로불린 융합 단백질은 비-글리코실화, 글리코실화, 또는 TACI 부분 또는 면역글로불린 부분 안에서만 글리코실화될 수 있다. 면역글로불린 부분은 사람 항체, 키메라 항체, 또는 사람화된 항체로부터 얻어질 수 있다.

8. TACI-면역글로불린 폴리펩티드의 치료적 사용

TACI-면역글로불린 단백질은 ZTNF4 또는 ZTNF2에 결합하여 이들 리간드와 외인성 TACI 또는 BCMA 리셉터의 결합을 방지함에 의해 면역 시스템을 조정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 충분한 양의 TACI 또는 BCMA 리셉터를 결여하거나, 또는 ZTNF4 또는 ZTNF2를 과잉 생성하는 피험자에서 TACI-면역글로불린 단백질의 사용을 포함한다. 이들 분자는 치료를 필요로 하는 어떤 피험자에도 투여될 수 있으며, 본 발명은 수의과 및 사람에서의 치료적 사용을 모두 고찰한다. 피험자의 예들은 농장 동물, 가축, 및 사람 환자와 같은 포유류 피험자를 포함한다.

TACI-면역글로불린 폴리펩티드는 자가면역질환, B 세포 암들, 면역조정, IBD 및 어떤 항체-매개 병증(예를 들어, ITCP, 중증 근무력증 등), 신장 질환, 간접 T 세포 면역반응, 이식거부, 및 이식편대숙주병의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 면역밤응 동안 B 세포 반응을 특이적으로 조절하도록 표적화될 수 있다. 추가하여, 본 발명의 폴리펩티드는 B 세포 발생, 다른 세포들의 발생, 항체 생성, 및 사이토카인 생성을 조정하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 ZTNF4의 증식 효과를 중화함으로써 T 및 B 세포 교통을 조정할 수 있다.

본 발명의 TACI-면역글로불린 폴리펩티드는, ZTNF4 폴리펩티드의 증가가 관련되는 형질세포 백혈병, 만성 또는 급성 림프모구백혈병과 같은 전-B 또는 B 세포 백혈병, 다발골수종, 형질세포 골수종, 내피세포 골수종 및 거대세포 골수종과 같은 골수종, 및 비호지킨림프종과 같은 림프종을 치료하기 위해 ZTNF4의 효과를 중화시키는데 유용하다.

ZTNF4는 CD8+ 세포, 단핵세포, 수지상세포, 활성화 단구세포에서 발현되며, 이것은 어떤 자가면역질환에서 세포독성 T 세포가 ZTNF4의 과잉 생성을 통해 B 세포 생성을 자극할 수 있다는 것을 나타낸다. B-림프구의 작용을 선택적으로 차단하는 면역억제제 단백질이 질환을 치료하는데 사용될 것이다. 자가항체 생성은 몇몇 자가면역질환에서 공통적이며, 조직 파괴 및 질환 악화에 기여한다. 또한, 자가항체는 면역복합 침착 합병증의 발생을 가져오며, 신부전, 신경통 증상 및 사망을 포함하여, 전신홍반성루프스의 많은 증상을 가져온다. 또한, 세포 반응에 독립적으로 항체 생성을 조정하는 것이 많은 질환 상태에서 유리할 것이다. 또, B 세포는 류마티스관절염의 관절염성 면역글로불린 분비에서 어떤 역할을 하는 것으로 나타났다. 이와 같이, ZTNF4 항체 생성의 저해는 중증 근무력증, 류마티스관절염, 여러관절-진행 소아 류마티스관절염, 및 건선관절염과 같은 자가면역질환의 치료에서 유리할 것이다. B-림프구의 작용을 선택적으로 차단 또는 중화하는 TACI-면역글로불린 단백질과 같은 면역억제제 치료제가 그러한 목적에 유용할 것이다.

본 발명은 말기 신장 질환(이것은 자가면역질환과 관련된 수도 그렇지 않을 수도 있다)과 관련하여 B 세포의 작용을 선택적으로 차단 또는 중화하는 TACI-면역글로불린 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 그러한 방법은 면역 신장 질환을 치료하는데 유용할 것이다. 그러한 방법은 사구체신염, IgA 신장병증 또는 버거스병, IgM 신장병증, 구드패스츄어병, 감염-후 사구체신염, 사이질증식성 질환, 만성 림프모구백혈병, 최소 변화 콩팥증후군과 같은 질환들에 관련된 사구체신염을 치료하는데 유용할 것이다. 또한, 그러한 방법은 루푸스, 여러관절염, 헤노흐-쇤라인 자반증, 피부경화증, HIV-관련 질환, 아밀로이드증 또는 용혈요독증후군과 같은 질환들에 관련된 2차 사구체신염 또는 혈관염을 치료하는 치료적 용도로서 사용될 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 만성 신우신장염, 진통제 남용, 콩팥석회증, 다른 병인들로 인한 신장병증, 신석증, 또는 만성 또는 급성 사이질신장염에 관련된 사이질신장염 또는 신우신장염을 치료하는 치료적 용도의 일부로서 유용할 것이다.

또한, 본 발명의 방법은 신장동맥협착 또는 폐색 및 콜레스테롤 색전증 또는 신장 색전증을 포함하여, 고혈압 또는 대혈관 질환의 치료에서 TACI-면역글로불린 단백질의 사용을 포함한다.

또한, 본 발명은 신장 또는 비뇨기 신생물, 다발골수종, 림프종, 경쇄 신장병증 또는 아밀로이드증의 치료를 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 천식 또는 기관지염 및 폐공기종과 같은 다른 만성 기도 질환들의 치료를 위해 TACI-면역글로불린 단백질을 사용하여 활성화된 B 세포를 차단 또는 저해하는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 설명된 TACI-면역글로불린 단백질은 쉐그렌증후군을 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 면역억제에서 사용하기 위해, 특히 이식편대숙주병 및 이식거부를 위한 것과 같은 치료적 사용을 위해, TACI-면역글로불린 단백질을 사용하여 이펙터 T 세포를 저해 또는 중화하는 방법이 제공된다. 더욱이, TACI-면역글로불린 단백질은 인슐린의존당뇨병(IDDM) 또는 크론병과 같은 자가면역질환의 치료를 위한 치료 프로토콜에서 유용할 것이다. 본 발명의 방법은 만성 염증질환을 치료하는데, 특히 관절통, 부기, 빈혈 및 다른 관련된 증상들을 저하시키는데, 뿐만 아니라 폐혈쇼크를 치료하는데 있어서 추가의 치료적 가치를 가질 것이다.

잘 확립된 동물 모델이 어떤 질환 상태에서 본 발명의 TACI-면역글로불린 단백질의 생체내 효능을 시험하는데 이용될 수 있다. 특히, TACI-면역글로불린 단백질은, SLE(전신홍반루프스)의 모델로 사용하는 MRL-lpr/lpr 또는 NZB x NZW F1 유사유전자형 마우스 계통 같은, 많은 자가면역질환 동물 모델에서 시험될 수 있다. 그러한 동물 모델은 본 분야에 공지되어 있다.

뉴질랜드 흑색(NZB) 마우스와 뉴질랜드 흰색(NZW) 마우스의 교배 자손은 사람의 SLE와 매우 유사한 자발적 형태의 SLE를 발생시킨다. NZBW로 공지된 자손 마우스는 1개월이 되자 T 세포에 대한 IgM 자가항체를 발생하기 시작하며, 5개월 내지 7개월까지는 항-DNA 자가항체가 우세한 면역글로불린이다. 폴리클로날 B 세포 과잉활성은 자가항체의 과생성을 가져온다. 이들 자가항체, 특히 단일-가닥 DNA에 대해 디렉트된 것들의 침착은 사구체신염의 발병과 관련되며, 이것은 단백뇨, 질소혈증, 및 신부전으로 인한 사망에 따라 임상적으로 명백하다. 신부전은 자발 SLE에 걸린 마우스 및 NZBW 계통에서 주된 사망 원인이며, 이 과정은 만성적이고 폐쇄적이다. 이 질환은 수컷보다 암컷에서 더욱 빠르고 심하며, 수컷이 406일간 생존한 것에 비하여 암컷은 단지 평균 245일간 생존한다. 암컷 마우스의 대부분은 7개월 내지 9개월까지 증상(단백뇨)이 있지만, 일부는 더 어리거나 더 늙어서 증상을 나타낼 수 있다. NZBW 마우스에서 보이는 치명적 면역 신장염은 사람 SLE에서 보이는 사구체신염과 매우 유사하며, 이것이 자발 뮤린 모델을 가능한 SLE 치료제의 시험을 위한 매우 매력적인 모델로 만든다

실험용 알레르기 뇌척수염(EAE)을 위한 뮤린 모델이 면역-매개 질환의 메카니즘, 및 가능한 치료적 중재 방법을 조사하기 위한 도구로서 사용되었다. 이 모델은 사람 다발경화증과 유사하며, 미엘린 염기성 단백질(MBP) 또는 단백지질 단백질(PLP)과 같은 신경단백질에 대한 T 세포 활성화의 결과로서 탈미엘린화를 야기한다. 항원 접종은 CD4+, 클래스 II MHC-제한 T 세포(Th1)의 유발을 가져온다. EAE에 대한 프로토콜의 변화는 이 모델의 급성, 만성-재발성 변이체, 또는 수동-전달 변이체를 야기할 수 있다.

콜라겐-유발 관절염(CIA) 모델에서 마우스는 사람 류마티스관절염(RA)과 매우 유사한 만성 염증관절염을 발생시킨다. CIA는 유사한 면역학적 및 병리학적 특징들을 RA와 공유하므로, 이것은 가능한 사람 항-염증 화합물을 스크리닝하는 이상적인 모델이다. CIA를 사용하는데 있어 다른 이점은 발병 메카니즘이 알려져 있다는 것이다. 타입 II 콜라겐에 대한 T 및 B 세포 에피토프가 확인되었으며, 면역-매개 관절염에 관련된 다양한 면역학적(지연-형 과민 및 항-콜라겐 항체) 및 염증(사이토카인, 케모카인, 및 기질-분해 효소) 파라미터가 결정되었고, 모델들에서 시험 화합물 효능을 평가하는데 사용될 수 있다.

중증 근무력증(MG)은 뮤린 모델이 이용될 수 있는 다른 자가면역질환이다. MG는 니코틴 아세틸콜린 리셉터(AChR)에 대해 디렉트된 자가항체의 생성을 수반하는 신경근육 전달의 장애이다. MG는 활동 중 이상 쇠약 및 피로를 포함하는 임상적 특징을 갖는 후천적 또는 유전적 질환이다. MG의 뮤린 모델이 확립되었다. 실험용 자가면역 중증 근무력증(EAMG)은 AChR에 대한 항체의 존재를 특징으로 하는 항체 매개 질환이다. 이들 항체는 리셉터를 파괴하여 결함 있는 신경근육 전기 임펄스를 가져오고, 그 결과 근육이 약화된다. EAMG 모델에서 마우스는 니코틴 아세틸콜린 리셉터로 면역화된다. MG의 임상 징후들은 2차 면역 후 수 주 후에 분명해진다. EAMG는 방사성면역분석에 의한 AChR 항체의 혈청 수준의 측정, 근육 AChR의 측정, 또는 근전도검사를 포함하여, 몇 가지 방법에 의해 평가된다.

일반적으로, TACI-면역글로불린 단백질의 투여 용량은 피험자의 나이, 체중, 키, 성별, 일반 의학적 상태 및 이전의 의학적 병력과 같은 요인들에 따라서 변할 것이다. 전형적으로, 약 1pg/kg 내지 10mg/kg(제제의 양/피험자의 체중) 범위 내의 TACI-면역글로불린 단백질 용량을 수용자에게 제공하는 것이 바람직하지만, 처한 상황에 따라 더 적거나 더 많은 용량이 투여될 수도 있다.

TACI-면역글로불린 단백질은 국소 카테터를 통한 관류에 의하거나, 또는 직접적인 병변내 주사에 의해, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하내, 흉막내, 수막강내로 피험자에 투여될 수 있다. 주사에 의해 치료용 단백질을 투여할 때, 투여는 연속 주입에 의하거나, 또는 단일 또는 다수의 볼루스에 의할 수 있다.

추가의 투여 경로는 경구, 점막-멤브레인, 허파, 및 경피를 포함한다. 경구 송달은 폴리에스테르 마이크로스피어(microsphere), 제인 마이크로스피어, 프로티노이드 마이크로스피어, 폴리시아노아크릴레이트 마이크로스피어, 및 지질-기제 시스템(예를 들어, DiBase 및 Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Protei-ns", Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren(eds.), page 255-288(Plenum Press 1997))에 적합하다. 비강내 송달의 가능성이 이러한 방식의 인슐린 투여에 의해서 예시된다(예를 들어, Hinchcliffe 및 Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199(1999) 참조). TAGI-면역글로불린을 포함하는 건성 또는 액체 입자가 제조될 수 있고, 건조-분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기, 또는 분무기에 의해서 흡입될 수 있다(예를 들어, Pettit 및 Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235(1999). 이러한 접근법은 에어로졸화 인슐린을 폐로 송달하는 손에 잡히는 전기 흡입기인 AEPX 당뇨병 관리 시스템에 의해서 예시된다. 연구는 48,000kDa 크기의 단백질이 저진동수 초음파의 도움으로 치료 농도로 피부를 통해 송달되었다는 것을 밝혀냈으며, 이는 경피 투여의 가능성을 예시한다(Mitragotri 등, Science 269:850(1995)). 전기천공을 사용한 경피 송달은 TACI-면역글로불린 단백질의 투여에 대한 또 다른 수단을 제공한다(Potts 등, Pharm. Biotechnol. 10:213(1997)).

TACI-면역글로불린 단백질을 포함하는 제약 조성물은 치료용 단백질을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합물로 조합함으로써 약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 알려진 방법에 따라서 조제될 수 있다. 조성물의 투여가 수용자 환자에 의해서 내성이 있다면, 조성물은 "약학적으로 허용가능한 담체"로 말하여진다. 살균 인산 완충 식염수는 약학적으로 허용가능한 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체가 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판(Mack Publishing Company 1995) 참조.

치료의 목적으로, TACI-면역글로불린 단백질은 치료적 유효량으로 환자에 투여된다. 투여되는 양이 생리적으로 유의하다면 TACI-면역글로불린 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체가 "치료적 유효량"으로 투여된 것이라고 말한다. 약제의 존재가 수용자 환자의 생리학에 검출가능한 변화를 야기한다면, 약제는 생리학적으로 유의하다. 예를 들어, 약제의 존재가 염증 반응을 경감시켰다면, 염증을 치료하기 위해 사용된 약제는 생리학적으로 유의하다. 또 다른 예로서, 약제의 투여가 많은 수의 종양 세포의 감소, 감소된 전이, 고상 종양 크기의 감소, 또는 증가된 종양 괴사를 초래한다면, 종양 세포의 성장을 억제하기 위해 사용된 약제는 생리학적으로 유의하다. 더욱이, 약제의 투여가 혈중 항-이중-가닥 DNA 항체의 감소, 또는 열, 관절통, 홍반피부병변, 또는 전신홍반루푸스의 다른 특징 중 적어도 어느 하나의 감소를 초래한다면 전신홍반루푸스를 치료하기 위해 사용된 약제는 생리학적으로 유의하다. TACI-면역글로불린 단백질이 치료적 유효량으로 투여된다는 일반적인 지표의 한 예는 피험자에의 투여 후에, ZTNF4(BLyS)의 혈중 수준이 감소한다는 것이다.

TACI-면역글로불린 단백질을 포함하는 제약 조성물은 액체 형태, 에어로졸, 또는 고체 형태로 제공될 수 있다. 액체 형태는 주사가능한 용액 및 경구 현탁액으로 예시된다. 대표적인 고체 형태는 캡슐, 정제, 및 조절-방출 형태를 포함한다. 후자의 형태는 미소체세포 펌프 및 임플란트에 의해서 예시된다(Brener 등, Pharm. Biotechnol. 10:239(1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", Drug Delivery Syntems, Ranade and Hollinger(eds.), page 95-123(CRC Press 1995); Bremer 등, "Protein Delivery with Infusion Pumps", Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren(eds.), page 239-254(Plenum Press 1997); Yewey 등 "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant, " Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren(eds.), page 93-117(Plenum Press 1997)).

리포솜은 정맥내, 복강내, 포막내, 근육내, 피하내, 또는 경구 투여, 흡입, , 또는 비강내 투여로 피험자에 치료 폴리펩티드를 송달하는 어떤 수단을 제공한다. 리포솜은 수성 분획을 둘러싸고 있는 하나 이상의 지질 이중층으로 이루어지는 현미경적 소포이다(일반적으로, Bakker-Woundenbert 등, Eur.J.Clin.Microbiol. Infect. Dis. 12(증보판1):S61(1993), Kim, Drugs 46:618(1993) 및 Ranade, "Site-Specific Drgu Delivery Using Liposomes as Carriers, " Drgu Delivery Systems, Rande and Hollinger(eds.), page 3-24(CRC Press 1995)). 리포솜은 세포 멤브레인과 구성에서 유사하고, 결과적으로 리포솜은 안전하게 투여될 수 있고, 생물학적으로 분해가능하다. 제조 방법에 따라서, 리포솜은 단층판 또는 다층판일 수 있고, 리포솜은 크기면에서 0.02㎛ 내지 10㎛ 이상의 직경으로 다양할 수 있다. 다양한 약제가 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다: 소수성 약제는 이중층으로 분배되고, 친수성 약제는 내부 수성 공간 내에 분배된다(예를 들어, Machy 등, Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987), 및 Ostro 등, American J. Hosp. Pharm 46:1576(1989) 참조). 더욱이, 리포솜 크기, 이중층의 수, 지질 조성 뿐만 아니라, 리포솜의 전하 및 표면 특징을 다양하게 함으로써 캡슐화된 약제의 치료적 이용가능성을 조절하는 것이 가능하다.

리포솜은 실제로 어떤 형태의 세포에도 흡착되어 캡슐화된 약제를 성방성 방출시킬 수 있다. 대안으로, 흡착된 리포솜은 식균세포에 의해서 엔도시토시스될 수 있다. 엔도시토시스 후에 리포솜 지질이 리소좀 간 분해되어 캡슐화된 약제를 방출한다(Scherphof 등, Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368(1985)). 정맥내 투여 후에 작은 리포솜(0.1 내지 10㎛)은 전형적으로 간과 비장 내에 1차적으로 위치한 세망내피계 세포에 의해서 흡수되는 반면에, 3.0㎛ 이상의 리포솜은 허파 내에 축적된다. 세망내피계 세포에 의한 작은 리포솜의 선택적인 흡수는 화학치료제를 마크로파지 및 간 종양으로 송달하는데 사용되었다.

세망내피계는 많은 용량의 리포솜 입자로의 포화, 또는 제약학적 수단에 의한 선택적인 마크로파지 불활성화를 포함하는 몇가지 방법으로 우회될 수 있다 (Claassen 등, Biochim. Biophys. Acta 802:428(1984)). 게다가, 리포솜 멤브레인으로의 글리코리피드- 또는 폴리에틸렌 글리콜-유도된 인지질의 통합은 세망내피계 에 의해서 유의하게 감소된 흡수를 초래하는 것으로 나타났다(Allen 등, Biochim. Biophys. Acta 1068:133(1991); Allen 등, Biochim. Biophys. Acta 1150:9(1993)).

인지질 조성을 다양화하거나, 또는 리포솜으로 리셉터 또는 리간드를 삽입시키는 것에 의해서 특정 세포 또는 기관에 표적화하는 리포솜이 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 높은 함량의 비이온성 계면활성제로 제조된 리포솜이 간에 표적화하기위해 사용되었다(Hayakawa 등 일본특허번호 04-244,018; Kato 등 Biol. Pharm. Bull. 16:690(1993)). 메탄올에서 콩두유 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡실화 수소화 캐스톨 오일(HCO-60)을 혼합하고, 진공상태 하에서 혼합물을 농축시킨 다음에, 물과 함께 혼합물을 복원시켜 제제를 제조하였다. 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)과의 콩두유-유래된 스테릴글루코시드 혼합물(SG) 및 콜레스테롤(Ch)의 리포솜 제제가 간에 표적화되는 것으로 밝혀졌다(Shimizu 등, Biol. Pharm. Bull. 20:881(1997)).

대안으로, 다양한 표적화 리간드가 리포솜 표면, 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 전달 단백질에 결합될 수 있다. 예를 들어, 리포솜은, 간세포 표면에서 배타적으로 발현되는 아시아로글리코단백질(갈락토스) 리셉터를 표적화하기 위해서, 분기형 갈락토실 지질 유도체로 변형될 수 있다(Kato 및 Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287(1997); Murahashi 등, Biol. Pharm. Bull. 20:259(1997). 유사하게, Wu 등, Hepatology 27:772(1998)은 아시아로페투인으로 리포솜을 표지화하는 것은 단축된 리포솜 플라스마 반감기와 간세포에 의한 아시아로페투인-표지된 리포솜의 증가된 흡수를 유도한다는 것을 보여준다. 한편, 분기형 갈락토실 지질 유도체를 포함하는 리포솜의 간 축적은 아시아로페투인의 예비주사로 저해될 수 있다(Murahashi 등, Biol. Pharm. Bull. 20:259(1997)). 폴리아코니틸화 사람 혈청 알부민 리포솜은 간세포에 대하여 리포솜을 표적화하는 또 다른 접근법을 제공한다(Kamps 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681(1997)). 더욱이, Geho 등, 미국특허 No. 4,603,044 는 간의 특정화된 대사세포와 회합된 간담즙 리셉터에 대한 특이성을 가지는 간세포-디렉트 리포솜 소포 송달 시스템을 기술한다.

조직 표적화에 대한 더욱 일반적인 접근법에서, 표적 세포를, 표적 세포에 의해서 발현된 리간드에 특이적인 비오틴화 항체로 예비표지시켰다(Harasym 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99(1998)). 무항체의 플라스마를 제거한 후에, 스트렙트아비딘-콘쥬게이션된 리포솜을 투여한다. 다른 접근법에서, 표적화 항체를 직접 리포솜에 부착한다(Harasym 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99(1998)).

TACI-면역글로불린 단백질은 미세캡슐화의 표준 기술을 사용하여 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다(예를 들어, Anderson 등, Infect. Immun. 31:1099(1981), Anderson 등, Cancer Res. 50:1853(1990), 및 Cohen 등, Biochim. Biohys. Acta 1063:95(1991), Alving 등 "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis(ed.), page 317(CRC Press 1993), Wassef 등, Meth. Enzymol. 149:124(1987) 참조). 상기 언급된 대로, 치료적으로 유용한 리포솜은 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 폴리(에틸렌글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen 등, Biochim. Biophys. Acta 1150:9(1993)).

치료 단백질을 전신에서 높은 수준으로 유지하기 위해 분해가능한 폴리머 마이크로스피어가 설계되었다. 마이크로스피어를 폴리(락티드-코-글리코리드)(PLG), 폴리무수물, 폴리(오르토에스테르)와 같은 분해가능한 폴리머, 생분해가능하지 않은 에틸비닐아세테이트 폴리머로부터 제조하였다. 여기서, 단백질은 폴리머 내에 포착된다(Gombotz 및 Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332(1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger, page 51-93(CRC Press 1995); Roskos and Maskewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren(eds.), page 45-92(Plenum Press 1997); Bartus 등, Science 281:11619(1998)); Putney 및 Burke, Nature Biotechnology 16:153(1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548(1998)). 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-코팅된 나노스피어가 또한 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 담체를 제공한다(예를 들어, Gref 등, Pharm. Biotechnol. 10:167(1997)).

상기 개시된 대로, 본원 발명은 또한 폴리펩티드가 폴리머와 결합된 화학적으로 변형된 TACI-면역글로불린 단백질을 고려한다.

다른 제형은, 예를 들어, Ansel 및 Popovich, 제약학적 제형 및 약물 송달 시스템, 제5판(Lea&Febiger 1990), Gennaro(ed.) 레밍톤의 약학 과학, 제19판(Mack Publishing Company 1995), 및 Ranade 및 Hollinger, 약물 송달 시스템(CRC Press 1996)에 나타난 대로 당업자에 의해서 고안될 수 있다.

예시된 대로, 제약 조성물은 TACI-면역글로불린 단백질을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서 제공될 수 있다. 치료용 폴리펩티드는 단일 또는 다수의 용량에 해당하는 주사가능한 용액의 형태로, 또는 주사전에 재공성되어지는 무균 분말로서 공급될 수 있다. 대안으로, 이러한 키트는 치료용 폴리펩티드의 투여를 위한 건조-분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기, 또는 분무기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 더욱이 제약 조성물의 지시 및 용법에 대한 서면 정보를 포함한다. 더욱이, 이러한 정보는 TACI-면역글로불린 단백질 조성물이 TACI 리셉터 부분 또는 면역글로불린 부분 중 어느 하나에 대하여 공지된 과민성을 가진 환자에게는 금기시 된다는 처방전을 포함할 수 있다.

9. TACI-면역글로불린 뉴클레오티드 서열의 치료적 용도

본원발명은 치료를 필요로 하는 피험자에 융합 단백질을 제공하기 위하여, TACI-면역글로불린 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 사용을 포함한다. 수의과 치료적 이용 또는 사람 치료적 이용을 위해서, 이러한 핵산 분자가 상기에 논의된 바와 같은 장애 또는 질환을 가지는 환자에 투여될 수 있다. 앞에 논의된 한 예로서, TACI-면역글로불린 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 전신홍반루푸스의 장기 치료에 사용될 수 있다.

TACI-면역글로불린을 발현하는 재조합 숙주 세포의 사용, TACI-면역글로불린을 암호화하는 네이키드 핵산의 송달, TACI-면역글로불린을 암호화하는 핵산 분자를 가진 양이온성 지질 담체의 사용, 및 재조합 레트로바이러스, 재조합 아데노-관련 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 및 재조합 단순 헤르페스 바이러스와 같은 TACI-면역글로불린을 발현하는 바이러스의 사용을 포함하는, 피험자로 TACI-면역글로불린 유전자의 도입을 위한 많은 접근법이 있다(예를 들어, Mulligan, Science 260:926(1993), Rosenberg 등, Science 242:1575(1988), LaSalle 등, Science 259:988(1993), Wolff 등, Science 247: 1465(1990), Breakfield 및 Deluca, The New Biologist 3:203(1991)). 생체외 접근법에서, 예를 들어, 피험자로부터 TACI-면역글로불린 유전자를 발현하는 벡터로 트랜스펙션된 세포를 분리하고, 다시 피험자에 이식시킨다.

TACI-면역글로불린 유전자의 발현에 영향을 미치기 위해, 발현벡터는 TACI-면역글로불린 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 핵심 프로모터, 및 선택적으로 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 유전자 전사를 조절하도록 구성된다. 발현 벡터에 대한 일반적인 요구는 상기에 기재된다.

대안으로, TACI-면역 글로불린 유전자는 예를 들어, 아데노바이러스 벡터(예를 들어, Kass-Eisler 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11498(1993), Kolls 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:21591994), Li 등, Hum. Gene Ther. 4:403(1993), Vincent 등, Nat. Genet. 5:130(1993), 및 Zabner 등, Cell 75:207(1993)), 아데노바이러스-회합 바이러스 벡터(Flotte 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10613/(1993)), 세밀키 포레스트 바이러스 및 신드비스 바이러스와 같은 알파바이러스(Hertz 및 Huang, J. Vir. 66: 857(1992), Raju 및 Huang, J. Vir. 65:2501(1991), 및 Xiong 등, Science 243:1188(1989)), 헤르페스 바이러스 벡터(예를 들어, 미국특허 No. 4,769,331, 4,859,587, 5,288,641 및 5,328,688), 파브로바이러스 벡터(Koering 등, Hum. Gene Therp. 5:457(1994)), 폭스 바이러스 벡터(Ozaki 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653(1993), Panicali 및 Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:4927(1982)), 카나리 폭스 바이러스 또는 바시니아 바이러스와 같은 폭스 바이러스(Fisher-Hoch 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:317(1989), 및 레트로바이러스(예를 들어, Baba 등, J. Neurosurg 79:729(1993), Ram 등, Cancer Res. 53:83(1993), Takamiya 등, J. Neurosci. Res 33:493(1992), Vile 및 Hurt, Cancer Res. 53:962(1993), Vile 및 Hurt, Cancer Res. 53:3860(1993), 및 Anderson 등, 미국특허 No. 5, 399, 346)을 사용하여 송달될 수 있다. 다양한 구체예에서, 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 그 자체 또는 바이러스 입자가 하기에 기술된 본 발명의 방법 및 조성물에 이용될 수 있다.

한 시스템의 예로서, 아데노바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스는 이종성성 핵산 분자의 송달에 대하여 잘 특징화된 유전자 전달 벡터이다(개관을 위해, Becker 등, Meth. Cell Biol. 43:161(1994); Douglas 및 Curiel, Science & Medicine 4:44(1997)). 아데노바이러스 시스템은 (i) 상대적으로 큰 DNA 삽입체를 수용하는 능력, (ii) 높은 역가로 배양될 수 있는 능력, (iii) 광범위한 포유류 세포 종류를 감염시킬 수 있는 능력, 및 (iv) 어디에나 있는 조직 특이적이며 조절성인 프로모터를 포함하는 많은 상이한 프로모터들과 함께 사용될 수 있는 능력을 포함하는 몇몇의 이점을 제공한다. 추가적으로, 아데노바이러스는 혈류에서 안정하기 때문에 정맥내 주사에 의해서 투여될 수 있다.

아데노바이러스 게놈의 일부분이 결실된 아데노바이러스 벡터를 사용하여, 삽입체가 직접적인 라이게이션 또는 공동-트랜스펙션된 플라스미드와의 상동성 재조합에 의해서 바이러스 DNA 내로 통합된다. 대표적인 시스템에서, 필수 E1 유전가가 바이러스 벡터로부터 결실되고, 숙주 세포에 의해서 E1 유전자가 제공되지 않는다면, 바이러스는 복제되지 않을 것이다. 완전한 동물에 정맥내로 투여될 때, 아데노바이러스는 일차적으로 간을 표적으로 한다. E1 유전자 결실을 가진 아데노바이러스 송달 시스템이 숙주 세포에서 복제될 수 없지만, 숙주의 조직은 암호화된 이종성성 단백질을 발현하고 프로세싱할 것이다. 상응하는 유전자가 분비 신호 서열을 포함한다면, 숙주 세포가 또한 이종성성 단백질을 분비할 것이다. 분비된 단백질은 이종성성 유전자를 발현하는 조직으로부터 혈중으로 진입할 것이다(예를 들어, 매우 혈관화된 간).

더욱이, 바이러스 유전자의 다양한 결실을 함유하는 아데노바이러스 벡터는 벡터에 대한 면역 반응을 감소 또는 제거시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 아데노바이러스는 E1-결실이고, 추가적으로 E2A 또는 E4의 결실을 함유한다(Lusky 등 J. Virol. 72:2022(1998); Raper 등, Human Gene Therapy 9:671(1998)). E2b의 결실은 면역 반응을 감소시키는 것으로 보고되었다(Amalfitano 등, J. Virol. 72:926 (1998)). 전체 아데노바이러스 게놈을 결실시킴에 의해서, 이종성성 DNA의 매우 큰 삽입체가 수용될 수 있다. 모든 바이러스 유전자가 결실된 소위 "무기력한" 아데노바이러스의 생성은 이종성성 DNA의 큰 삽입체의 삽입에 대하여 특히 유리하다(리뷰를 위해서, Yeh. 및 Perricaudet, FASEB J. 11:615(1997) 참조).

치료용 유전자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스의 높은 역가의 스톡은 표준 방법을 사용하여 감염된 포유류 세포로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 재조합 단순 헤르페스 바이러스는 Brandt 등, J. Gen. Virol. 72:2043(1991), Herold 등, J. Gen. Virol. 75:1211(1994), Visalli 및 Brandt, Virology 185:419(1991), Grau 등, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:2474(1989), Brandt 등, J. Virol. Meth. 36:209(1992), 및 Brown 및 MacLean(eds.), HSV Virus Protocols(Humana Press 1997)에 개시된 대로 베로(Vero) 세포에서 제조될 수 있다.

대안으로, TACI-면역글로불린 유전자를 포함하는 발현 벡터는 생체내에서 리포솜을 사용하는 리포펙션에 의해서 피험자의 세포에 도입될 수 있다. 합성 양성자 지질는 마커를 암호화하는 유전자의 생체내 트랜스펙션에 대한 리포솜을 제조하는데 사용될 수 있다(Felgner 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987); Mackey 등, Proc. Nat's Acad. Sci. USA 85:8027(1998)). 생체내 특정 기관으로 외인성 유전자를 도입하기 위한 리포펙션의 사용은 어떤 실제적인 이점을 가진다. 리포솜은 특정 세포 형태로의 직접적인 트랜스펙션에 사용될 수 있고, 이것은 특히 췌장, 간, 신장, 및 뇌와 같은 세포 이종성성을 가지는 조직에서 유리하다. 지질은 표적화를 위해서 다른 분자에 화학적으로 결합될 수 있다. 표적화된 펩티드(예를 들어, 호르몬 또는 신경전달물질), 항체와 같은 단백질, 또는 비-펩티드 분자는 화학적으로 리포솜에 결합될 수 있다.

전기천공은 투여의 또 다른 방식이다. 예를 들어, Aihara 및 Miyazaki, Nature Biotechnology 16:867(1998)은 근육으로의 유전자 전달에 대한 생체내 전기천공의 사용을 입증했다.

일반적으로, 재조합 바이러스와 같은 TACI-면역글로불린 뉴클레오티드 서열을 가지는 치료 벡터를 포함하는 조성물의 투여량은 피험자의 나이, 체중, 성별, 일반적인 의학 상태 및 이전의 의학 병력과 같은 요인들에 따라서 달라질 것이다. 치료용 벡터의 적당한 투여 경로는 정맥내 주사, 동맥내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 종양내 주사, 및 종양을 포함하는 강 내로의 주사를 포함한다. 예를 들어, Horton 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:1553(1999)는 인터페론-α를 암호화하는 플라스미드 DNA의 근육내 주사가 뮤린 모델에서 일차 종양 및 전이 종양에 대한 효능 있는 항종양 효과를 나타낸다는 것을 증명하였다.

바이러스 벡터, 비바이러스 벡터, 또는 바이러스 및 비-바이러스 벡터의 조합을 포함하는 본원 발명의 조성물은 벡터 또는 바이러스는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합물 내에 조합됨으로써, 약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 알려진 방법에 따라서 조제될 수 있다. 상기 언급된 대로, 인산 완충 식염수와 같은 조성물의 투여가 수용자 피험자에 내성이 있을 때, 이 조성물은 "약학적으로 허용가능한 담체"라고 말한다. 다른 적합한 담체가 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판(Mack Publishing Co. 1995), 및 Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7판(MacMillan Publish-ing Co. 1985)).

치료의 목적으로, 치료용 유전자 발현 벡터, 또는 이러한 벡터를 포함하는 재조합 바이러스, 및 약학적으로 허용가능한 담체가 치료적 유효량으로 피험자에 투여된다. 투여된 양이 생리적으로 유의할 때, 발현 벡터(또는 바이러스)와 약학적으로 허용가능한 담체의 조합은 "치료적 유효량"으로 투여된다고 말한다. 약제의 존재가 수용자 피험자의 생리학에 검출가능한 변화를 초래한다면 약제는 생리학적으로 유의하다. 예를 들어, 약제의 존재가 염증 반응을 경감시킨다면, 염증을 치료하기 위해 사용된 약제는 생리학적으로 유의하다. 다른 예로서, 약제의 투여가 종양 세포수의 감소, 감소된 전이, 고상 종양 크기의 감소, 또는 증가된 종양 괴사를 초래한다면, 종양 세포의 성장을 저해하기 위해 사용된 약제는 생리학적으로 유의하다.

치료용 유전자 발현 벡터 또는 재조합 바이러스로 치료된 피험자가 사람일때, 치료법은 바람직하게는 체세포 유전자 치료법이다. 즉, 치료용 유전자 발현 벡터 또는 재조합 바이러스로의 사람의 바람직한 치료는 사람 생식세포의 일부분을 형성하여 연속적인 발생으로 전달될 수 있는 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 과정을 수반하지 않는다(즉, 사람 생식세포 유전자 치료법).

10. 트랜스제닉 마우스의 제조

트랜스제닉 마우스는 모든 조직에서, 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 조절 요소의 조절하에서 TACI 면역글로불린 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 과발현시키도록 유전자 조작될 수 있다. 이러한 TACI-면역글로불린 융합 단백질의 과발현체는 과발현으로 인한 표현형을 특성화하는데 사용될 수 있고, 트랜스제닉 동물은 과량의 TACI 단백질에 의해서 유발된 사람 질환에 대한 모델로서 기능할 수 있다. TACI-면역글로불린 융합 단백질을 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 또한 더욱 큰 동물의 젖 또는 혈액에서 TACI-면역글로불린 융합 단백질의 생성에 대한 생체반응인자 모델을 제공한다. 트랜스제닉 마우스를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Jacob, "Expressioin and Knockout of Interferons in Transgenic Mice" Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob(ed.), page 111-124(Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky 및 Robl, Strategies in Transgenic Animal Science(ASM Press 1995), 및 Abbud 및 Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernadez and Hoeffler(eds.), page 367-397(Academic Press, Inc. 1999)).

예를 들어, TACI-면역글로불린 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 트랜스제닉 마우스를 생성하는 방법은 성숙한 생식능력을 가진 수컷(종마) (B6C3f1, 생후 2 내지 8개월(Taconic Farms, Germantown, NY)), 정관절제 수술한 수컷(비-종마)(B6D2f1, 생후 2 내지 8개월(Taconic Farms)), 사춘기 전의 생식능력이 있는 암컷(제공자)(B6CD2f1, 생후 4 내지 5개월(Taconic Farms)), 및 성숙한 생식능력이 있는 암컷(수용자)(B6D2f1, 생후 2 내지 4개월(Taconic Farms))으로 시작할 수 있다. 도너를 1주일 동안 적응시킨 후, 임신한 암말의 혈청 성선자극 호르몬(Sigma Chemical Company; St. Louis, MO)IP 를 마우스 당 약 8IU 로 주사하고, 46-47시간 후에, 사람 융모성 성선자극 호르몬(hCG(Sigma))을 마우스당 8IU 복강내 주사하여 과배란을 유도하였다. 제공자를 종마와 교배시키고 계속적으로 호르몬을 주입하였다. 배란은 일반적으로 hCG 주입후 13시간 내에 일어난다. 교배 다음날 아침에 질전의 존재로 교미를 확인한다.

수정란을 수술용 스코프로 수집한다. 수란관을 수집하고 수정란을 히알루로니다아제(Sigma)를 함유하는 뇨분석 슬라이드로 방출시켰다. 수정란을 히알루로니다아제에서 한번 세척하고, 37℃에서 5% CO₂, 5% O₂, 및 90% N₂와 함께 인큐베이션된 Whitten's W640 배지에서 2번 세척하였다(예를 들어, Menino 및 O'Claray, Biol. Reprod. 77:159(1986), 및 Dienhart 및 Downs, Zygote 4:129(1996)에 개시된 대로임). 그 다음, 수정란을 미세주사 전까지 37℃/5% CO₂ 인큐베이터에 저장하였다.

서열을 암호화하는 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 함유하는 10 내지 20㎍ 의 플라스미드 DNA 를 미량주사를 위해, 선형화하고, 겔-정제하고, ㎕ 당 최종 농도 5-10ng의 농도로 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 0.25mM EDTA(pH 8.0)에서 재현탁하였다. 예를 들어, 서열을 암호화하는 TACI-면역글로불린 융합 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1에서 29, 및 111에서 154, 및 Fc5 면역글로불린 부분이 결실된 TACI 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.

따뜻한 CO₂-평형화 미네랄 오일로 덮힌 소량의 W640 배지에 함유된 저장된 수정란에 플라스미드 DNA를 미세주사하였다. DNA를 주사 바늘로 빼내어(0.75mm 내경, 1mm 외경 보로실리케이트 유리 모세관으로부터 뽑아냄), 각각의 란에 주사하였다. 각 란에 주사 바늘로 1 또는 2개의 1배체 전핵을 침투시켰다.

피코리터의 DNA를 전핵에 주사하고, 핵과 접촉시키지 않고 주사 바늘을 빼내었다. 모든 란에 주사되어질 때까지 과정을 반복한다. 성공적으로 미세주사된 란을 37℃/5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 저장하는 동안 미리 가스로 채워진 W640 배지로 채워진 기관 조직-배양 접시에 옮긴다.

다음날, 2세포 배아를 의사 임신 수용자로 옮긴다. 정관절제된 비-종마와 교미시킨 다음, 교미 전(plug)의 존재로 수용체를 확인한다. 수용자를 마취시킨 다음 좌 배측부를 면도하고 수술용 현미경으로 옮긴다. 피부와 흉곽으로 외곽선이 만들어진 복부 영역의 중간부 내의 근육벽, 새들, 및 뒷다리, 무릎과 비장 사이의 중간에 작은 절개부위를 만든다. 생식기관을 작은 수술용 드레이프 상에 꺼낸다. 지방패드를 수술용 드레이프 위에 팽팽하게 펼치고, 갓태어난 세레파인(serrefine) (Roboz, Rockville, MD)을 지방패드에 놓고, 기관이 다시 미끄러지는 것을 방지하면서, 마우스 등에 왼쪽으로 걸리도록 한다.

미네랄 오일을 함유하는 미세한 전달 피펫으로 W640과 공기방울을 교체한 다음에, 전날의 주사로부터 얻은 12-17개의 건강한 2세포 배아를 수용체로 옮겼다. 팽창한 팽대부가 놓이고 팽대부와 활액낭 사이에 수란관을 고정시키고, 팽대부 또는 활액낭이 찢어지지 않도록 하면서, 28g 바늘로 활액낭 근처에 수란관 내의 홈을 만든다.

피펫을 수란관의 홈으로 옮기고, 배아에 불어넣어, 첫번째 공기 방울이 피펫을 빠져나가도록 하였다. 지방패드를 부드럽게 복막 내에 밀어넣고, 생식 기관에 닿도록 하였다. 한번의 봉합으로 복막벽을 메우고, 창상클립으로 피부를 메웠다. 마우스가 최소한 4시간 동안 37℃ 슬라이드 온열기에서 회복되었다.

수용자는 쌍으로 우리로 돌려보내어 19-21일간 임신을 허용하였다. 출생 후에, 젖을 떼기 전에 19-21일 산후를 허용한다. 막 젖을 뗀 것은 자웅을 감별하여 별개의 성별 우리에 놓았고, (유전자형결정에 사용된) 0.5cm 바이옵시는 소독한 가위로 꼬리를 제거한다.

게놈 DNA를 예를 들어, 제조자의 지시에 따른 QIAGEN DNEASY 키트를 사용하여 꼬리를 잘라 제조한다. 게놈 DNA 는 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 또는 동일한 플라스미드 내에 도입된 선택가능한 마커를 증폭시키도록 유전자조작된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해서 분석된다. 동물이 트랜스제닉인 것이 확인된 다음에, 트랜스제닉 암컷을 야생형 수컷과, 또는 트랜스제닉 수컷을 하나 또는 2마리의 야생형 암컷과 둠으로써 근친교계가 되도록 교잡시킨다. 새끼는 태어나서 젖을 떼었을 때, 성별이 분리되고, 그들의 꼬리는 유전자형결정을 위해 절단되었다.

생존한 동물에서 트랜스진의 발현을 체크하기 위하여, 부분절개술을 수행하였다. 수술용 샘플은 자이포이드(zyphoid) 과정 하에서 상부 복막 바로 아래에 만들어졌다. 무균술을 사용하여, 흉골 아래에 작은 1.5-2cm 절개를 하였고, 간의 좌측엽을 꺼내었다. 4-0 실크를 사용하여, 하부엽이 체강외로 빠져나오지 않도록 하부엽의 둘레에 타이를 만들다. 흡수성 덱손(Dexon)(American Cyanamid; Wayne, N. J.)의 제2의 루프를 제1의 타이에 인접하게 배치시키는 동안에 비외상 클램프가 타이를 고정시키기 위해 사용되었다. 덱손 타이로 말단 컷팅을 하고 약 100mg의 절개된 간조직을 무균 페트리 접시에 놓는다. 절개된 간 절개물을 14ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브에 옮기고, 액체 질소에서 빠르게 동결시킨 다음 드라이아이스에서 저장했다. 수술 부위를 봉합과 창상클립으로 봉하고, 수술 후 24시간 동안 37℃ 가열 패드 위에 동물 우리를 놓았다. 동물을 수술후 매일 체크하고, 창상클립을 수술 후 7-10일에 제거하였다. TACI-면역글로불린 융합 단백질 mRNA의 발현 수준을 RNA 용액 혼성화 분석 또는 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 각 트랜스제닉 마우스에 대하여 검사하였다.

상기에 기술된 일반적인 접근법을 사용하여, 젖 내에서 TACI-면역글로불린 융합 단백질의 유의한 수준을 발현하는 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. 특정한 경우, 서열을 암호화하는 TACI-면역글로불린 융합 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1에서 29, 및 111에서 154, 및 Fc5 면역글로불린 부분이 결실된 TACI 폴리펩티드를 암호화하였다.

그러므로, 일반적으로 기술된, 본 발명은 예시의 방식으로 제공되고, 본 발명을 제한할 의도가 아닌, 다음의 실시예를 참고하여 더욱 용이하게 이해될 것이다.

본 발명에 의하면, 치료 화합물로서 적합한 개선된 TACI-면역글로불린 융합 단백질을 제공할 수 있다.

도 1은 사람 TACI의 아미노산 서열을 나타낸다. 시스테인-부화 위-반복체의 위치는 음영으로 트랜스멤브레인 도메인은 박스로 자루 영역은 점선으로 나타낸다.
도 2는 IgG1 하위부류에 속한 면역글로불린의 모형도이다. C_L: 경쇄 불변 영역; C_H1, C_H2, C_H3: 중쇄 불변 영역 ; V_L: 경쇄 가변 영역; V_H: 중쇄 가변 영역; CHO: 탄수화물; N: 아미노 말단; C: 카르복실 말단.
도 3A, 3B, 3C 및 3D는 야생형 사람 γ1 불변 영역 Fc 아미노산 서열과 변이체 Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 및 Fc8의 비교를 나타낸다. 사람 γ1 불변 영역의 C_H1 도메인은 Fc의 일부분이 아니므로 나타내지 않는다. 경첩 영역(hinge region), C_H2 및 C_H3 도메인의 위치를 나타낸다. 경쇄 불변 영역(LC) 및 중쇄 불변 영역(HC)과의 이황화 결합에 통상 연루되는 Cys 잔기를 나타낸다. 기호 "."은 그 위치에서 야생형과 동일함을 나타내며, "***"은 카르복실 말단의 위치를 나타내고, Fc6의 카르복실 말단과 나머지 Fc 버전들의 차이를 예시한다. 아미노산 위치는 EU 인덱스 위치에 의해 나타낸다.
도 4는 ¹²⁵I-ZTNF4와 다양한 TACI-Fc 구성물들의 특이적 결합을 나타낸다. TACI-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 맨처음 29개 아미노산 잔기들을 결여한 TACI 부분을 가졌다. 융합 단백질 중 하나는 완전한 자루 영역을 갖는 TACI 부분(TACI (d1-29)-Fc5)을 가진 반면 TACI-Fc 융합 단백질 중 3개는 자루 영역에서 다양한 결실을 갖는 TACI 부분들(TACI (d1-29, d107-154)-Fc5; TACI (d1-29, d111-154)-Fc5; TACI (d1-29, d120-154)-Fc5)을 가졌다. 상세한 실험은 실시예 4에 설명된다.

실시예 1

TACI-Fc 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 제조

Gross 등, Nature 404:995(2000)에 의해서 개시된 대로 ZTNF4 에 대한 리셉터의 발현 클로닝동안에 사람 TACI 를 암호화하는 핵산 분자를 얻었다. TACI-Fc 발현 구조체에 함유된 코딩 서열은 표준 기법을 사용하여(예를 들어, Horton 등, Gene 77:61(1989) 참조), PCR을 중첩시킴으로써 생성하였다. 사람 TACI cDNA 및 Fc cDNA 를 PCR 증폭을 위한 개시 주형으로 사용하였다. PCR 프라이머를 설계하여 바람직한 코딩 서열 5' 및 3' 말단을 얻었고, 이러한 코딩 서열이 발현 벡터에 용이하게 삽입되도록 제한 효소 인식 부위를 도입하였다. TACI-Fc 코딩 서열을 기능성 뮤린 디히드로폴레이트 환원효소 유전자를 함유한 발현 벡터내로 삽입시켰다. 어떤 발현 벡터는 또한 재조합 단백질 트랜스진의 발현을 지시하기 위한 시토메갈로바이러스 프로모터, 면역글로불린 인트론, 조직 플라스미노겐 활성제 신호 서열, 내부 리보솜 도입 서열, 트랜스펙션된 세포의 표면 선택을 위한 결실된 CD8 시스트론, 및 효모 세포에서 플라스미드의 성장을 위한 효모 발현 요소를 함유한다.

TACI-Fc 융합 단백질을 생성하기 위해 사용된 한 접근법은 TACI-Fc4 를 제조하기 위해 사용된 방법에 의해서 예시된다. 다른 TACI-Fc 융합 단백질을 포유류 발현 벡터로 TACI-Fc 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하고, 포유류 세포에 발현 벡터를 도입함에 의해서 생성하였다.

A. Igγ1 Fc4 단편 제조

TACI-Fc4 융합 단백질을 제조하기 위해, Fcγ1 리셉터(Fcγ1)와 보체(C1q) 결합 기능을 제거하여, 사람 IgG1의 Fc 영역(경첩 영역 및 CH₂ 및 CH₃ 도메인)을 변형시켰다. 사람 IgG1 Fc 의 변형된 버전을 "Fc4"로 명명하였다.

올리고 프라이머 5' ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC 3'(SEQ ID NO:7) 및 5' GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG 3'(SEQ ID NO:8)을 사용하여 사람 태아의 간 라이브러리(Clontech) PCR 로부터 Fc 영역을 분리하였다. FcγRI 결합을 감소시키기 위해서 PCR 에 의해서 Fc 영역내에 돌연변이를 도입하였다. FcγR1 결합을 감소시키기 위해서 FcγRI 결합 부위(Leu-Leu-Gly-Gly; EU 인덱스 위치 234에서 237에 해당하는, SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 38에서 41)를 Ala-Glu-Gly-Ala로 돌연변이화하였다(예를 들어, Duncan 등, Nature 332:563 (1998); Baum 등, EMBO J. 13:3992(1994)). 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C3'(SEQ ID NO:9) 및 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3'(SEQ ID NO:10)을 사용하여 돌연변이를 도입하였다. 최종 부피 50㎕에 570 ng 의 IgFc 주형, 5㎕ 의 10×Pfu 반응 완충액(Stratagene), 8㎕의 1.25mM dNTP, 31㎕의 증류수, 2㎕의 20mM 올리고뉴클레오티드 프라이머를 첨가하였다. 동량의 미네랄 오일을 첨가하였고, 반응액을 1분동안 94℃까지 가열하였다. Pfu 중합효소(2.5유닛, Stratagene)를 첨가하고 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분동안 25 순환시킨 다음, 72℃에서 7분 연장시켰다. 반응 생성물을 전기천공에 의해서 분획하고, 예견된 크기의 약 676 염기쌍에 해당하는 밴드를 검출하였다. 겔에서 밴드를 제거하고, 제조자의 지시에 따라서, QIAGEN QIAquickTM 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 회수하였다.

보체 C1q 결합 또는 보체 고정을 감소시키기 위해서, Ala 를 Ser으로(EU 인덱스 위치 330에 해당하는 SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 134), 그리고 Pro 를 Ser으로의(EU 인덱스 위치 331에 해당하는 SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 135) 돌연변이를 도입하기 위하여 PCR 을 사용하였다(Duncan 및 Winter, Nature 332:788(1988)). 주형으로서 FcγRI 결합면-돌연변이화된 IgFc 서열을 사용하여 2번의 첫 순환 반응을 수행하였다. 최종 부피 50㎕에 1㎕의 FcγRI 결합 부위 돌연변이화된 IgFc 주형, 5㎕ 의 10×Pfu 반응 완충액(Stratagene), 8㎕의 1.25mM dNTP, 31㎕의 증류수, 2㎕의 20mM 5' GGTGGCCGGCT CCCAGATCCC TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAAACTCAC 3'(SEQ ID NO:11), SEQ ID NO:5 의 뉴클레오티드 36에서의 5'프라이머 개시제, 및 2㎕의 20mM 5' TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3'(SEQ ID NO:12), SEQ ID NO:5 의 뉴클레오티드 405 의 보체에서의 3'프라이머 개시제를 첨가하였다. 제2의 반응액은 Ala 의 Ser 으로의 돌연변이를 도입하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' TCCAACAAAGCCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC3'(SEQ ID NO:13), SEQ ID NO:5 의 뉴클레오티드 388에서의 5' 프라이머 개시제 및 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTCCTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3'(SEQ ID NO:14), 3'프라이머, XbaI 제한 부위 및 정지 코돈의 20mM 스톡을 각각 2㎕ 함유하였다. 동량의 미네랄 오일을 첨가하였고, 반응액을 1분동안 94℃까지 가열하였다. Pfu 중합효소(2.5유닛, Stratagene)를 첨가하고 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분동안 25 순환시킨 다음, 72℃에서 7분 신장시켰다. 반응 생성물을 전기천공에 의해서 분획하고, 예견된 크기에 해당하는 밴드, 약 370 내지 약 395 염기쌍 각각을 검출하였다. 겔에서 밴드를 제거하고, 제조자의 지시에 따라서, QIAGEN QIAquickTM 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 회수하였다.

상기 단편을 연결시키고, 5'BamHI 제한 부위 및 사람 면역글로불린 JBL 2'C_L 중쇄 가변 영역으로부터의 신호 서열을 첨가하기 위하여 제2의 순환 반응을 수행하였다(Cogne 등, Eur. J. Immunol. 18:1485(1988)). 최종 부피 50㎕에 30㎕의 증류수, 8㎕의 1.25mM dNTP, 5㎕의 10× Pfu 중합효소 반응 완충액(Stratagene) 및 각각 1㎕의 2개의 제1의 PCR 생성물을 첨가하였다. Pfu 중합효소(2.5유닛, Stratagene)를 첨가하고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분동안 5 순환시켰다. 주형을 다시 94℃로 하여, 20mM 스톡의 각각 2㎕의 5'GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3'(SEQ ID NO:14), SEQ ID NO:5 의 뉴클레오티드 1 에서의 5' 프라이머 개시제, 및 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3'(SEQ ID NO:10)을 첨가한 후에 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분동안 25 순환시키고, 72℃에서 7분 연장시켰다. 반응액의 일부분을 겔 전기천공를 사용하여 가시화하였다. 예견된 크기에 해당하는 789 염기쌍 밴드가 검출되었다.

B. TACI-Fc 발현 벡터 제조

효모에서 상동성 재조합에 의해서 TACI-Fc4 융합 단백질에 대한 코딩 영역을 포함하는 발현 플라스미드를 제조하였다. SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 14 내지 뉴클레오티드 475 의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 TACI cDNA 의 단편을 PCR 을 사용하여 분리하였다. TACI 단편의 제조에 사용된 2개의 프라이머는 (1) 40 염기쌍의 5' 벡터 플랭킹 서열 및 TACI 단편의 아미노 말단에 해당하는 17 염기쌍을 함유하는 프라이머(5' CTCAGCCAGG AAATCCATGC CGAGTTCAGA CGCTTCCGTA GAATGAGTGG CCTGGGCCG 3' : SEQ ID NO:15); (2) 플랭킹 Fc4 서열에 해당하는 3'말단의 40 염기쌍 및 TACI 단편의 카르복실 말단에 해당하는 17 염기쌍(5' GCATGTGTGA GTTTTGTCTGAAGATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG 3' :SEQ ID NO:16)이었다. 최종 부피 100㎕에 10ng 의 TACI 주형, 10㎕ 의 10×Taq 중합효소 반응 완충액(Perkin Elmer), 8㎕의 2.5nM dNTP, 78㎕의 증류수, 각 2㎕의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 20mM 스톡, 및 Taq 중합효소(2.5유닛, Life Technology)를 첨가하였다. 동량의 미네랄 오일을 첨가하고 2분동안 94℃로 가열시킨 다음, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분동안 25 순환시킨 다음, 72℃에서 5분 연장시켰다.

Fc4 단편을 암호화하는 cDNA 를 함유하는 단편을 유사한 방식으로 제조하였다. Fc4 단편의 제조에 사용된 2개의 프라이머는(상류 및 하류), 40 염기쌍의 5'TACI 플랭킹 서열 및 Fc4 단편의 아미노 말단에 해당하는 17 염기쌍(5' GCACAGAGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCTCCCGGGGCTG AAGGAGCCCA GATCTTCAGA 3': SEQ ID NO:7)을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및 플랭킹 벡터 서열에 해당하는 40 염기쌍의 3'말단 및 Fc4 단편의 카르복실 말단에 해당하는 17 염기쌍(5' GGGGTGGGTA CAACCCCAGA GCTGTTTTAA TCTAGATTATTTACCCGGAG ACAGGG3': SEQ ID NO:18)을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머였다. 최종 부피 100㎕에 상기에 개시된 10ng 의 Fc4 주형, 10㎕ 의 10×Taq 중합효소 반응 완충액(Perkin Elmer), 8㎕의 2.5nM dNTP, 78㎕의 증류수, 각 2㎕의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 20mM 스톡, 및 Taq 중합효소(2.5유닛, Life Technology)를 첨가하였다. 동량의 미네랄 오일을 첨가하고 2분동안 94℃로 가열시킨 다음, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분동안 25 순환시킨 다음, 72℃에서 5분 연장시켰다.

분석을 위해서, 상기에 개시된 각각의 100㎕의 10㎕를 1×TBE 완충액을 가진 0.8% LMP 아가로스 겔상에 전개하였다. 각 PCR 반응액의 잔여 90㎕를 5㎕의 1M 염화나트륨 및 250㎕의 절대 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 플라스미드 pZMP6 를 SmaI 로 절단하여 폴리링커로 선형화하였다. 플라스미드 pCZR199(American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC#98668)로부터 유래된 플라스미드 pZMP6은 시토메갈로바이러스 즉시형 초기 프로모터, 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역으로부터의 공통 인트론, 코딩 서열의 삽입을 위한 다수의 제한 부위, 정지 코돈 및 사람 성장 호르몬 터미네이터를 함유한다. 플라스미드는 또한 E.coli 복제 기원, SV40 프로모터를 가지는 포유류 선택성 마커 발현 유닛, 인핸서 및 복제 기원, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 SV40 터미네이터를 가진다. 메탈로티오네인 프로모터를 시토메갈로바이러스 즉시형 초기 프로모터와 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에서 코작(Kozac) 서열로 대체하여 pCZR199로부터 벡터 pZMP6을 제조하였다.

수용능이 있는 효모 세포(S. cerevisiae)의 100㎕를 약 1μg 의 TACI 세포외 도메인 및 Fc4 PCR 단편, 및 100ng 의 SmaI 분해된 pZMP6 벡터를 함유하는 10㎕와 조합하고, 0.2cm 전기천공 큐베트에 옮겼다. 효모/DNA 혼합물을 0.75kV(5kV/cm), ∞옴스, 25μF에서 일렉트로펄스시켰다. 각 큐베트에 600㎕의 1.2M 소르비톨을 첨가하였고, 효모를 2개의 300㎕ 알리쿼트로 URA-D 플레이트에 플레이팅한 후, 30℃ 인큐베이션하였다.

48시간 후에, 단일 플레이트로부터 Ura+ 효모 형질전환체를 1㎖ 물에서 재현탁시키고, 잠깐동안 와동시켜서 효모 세포를 펠렛으로 하였다. 세포 펠렛을 1㎖ 용균 완충액(2% Triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA)에서 재현탁하였다. 500 ㎖의 용균 혼합물을 300㎕ 산 세척 유리 비드와 200㎕ 페놀-클로로폼을 함유하는 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 첨가하고, 2 또는 3 시간 간격으로 1분동안 와동시킨 다음, 에펜도르프 원심분리기에서 최대속도로 5분동안 회전시켰다. 300㎕ 의 수상을 새 튜브에 옮기고, DNA 를 600㎕의 에탄올로 침전시킨 다음, 4℃에서 10분동안 원심분리하였다. DNA 펠렛을 100㎕의 물에 재현탁하였다.

전기수용능 있는 E.coli 세포(DH10B, GibcoBRL)의 형질전환을 0.5-2ml 효모 DNA 샘플과 40㎕의 DH10B 세포로 수행하였다. 세포를 20kV, 25mF 및 400 옴스에서 일렉트로펄스시켰다. 전기천공후에, 1ml의 SOC(2% Bacto-Tryptone(Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모 추출물(Difco), 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂ , 10mM MgSO₄, 20mM 글루코스)를 4개의 LB AMP 플레이트(LB 브로스(Lennox), 1.8% Bacto-아가 (Difco), 100mg/L 암피실린)상에 250㎕ 알리쿼트로 플레이팅하였다.

삽입체의 존재를 입증하고 다양한 DNA 서열이 서로 정확하게 연결되었다는 것을 확인하기 위하여 제한 분해에 의해서 TACI-Fc4 의 발현 구조체를 수집하여 저장하는 각각의 클론을 확인하였다. 양성 클론 삽입체가 서열분석되었다. 더욱 큰 크기의 플라스미드 DNA 를 제조자의 지시에 따른 Qiagen Maxi 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다.

C. Fc5, Fc6 및 Fc7의 구성

Fc5에서, EU 인덱스 위치 218에서 Arg잔기는 Lys 잔기로 다시 변화하였다, 야생형 사람 Ig γ1은 이 위치에서 리신을 함유한다. 간단히는, Fc5를 암호화하는 핵산 분자를 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCA 3' (SEQ ID NO:19) 및 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID NO:20)을 사용하여 제조하였다. PCR증폭의 조건은 다음과 같았다. 50㎕의 최종부피에 236ng의 Fc4 주형, 5㎕의 10 Pfu 반응 완충액 (Stratagene), 4㎕의 2.5mM dNTPs, 1㎕의 20μM의 각 올리고뉴클레오티드, 및 1㎕의 Pfu 중합효소(2.5 단위, Stratagene)을 첨가하였다. 증폭 열 프로파일은 2분간 94℃, 15초간 94℃에서 5 사이클, 20초간 42℃, 45초간 72℃, 15초간 94℃에서 20사이클, 1분 20초간 72℃, 이어서 72℃에서 7분 연장으로 구성되었다. 반응생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분별하였고, 약 718개 염기쌍의 예상된 크기에 해당하는 밴드가 검출되었다. 밴드를 겔로부터 절개하고 QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 회수하였다.

Fc6는 카르보닐 말단 리신 코돈이 제거된 것을 제외하고는 Fc5와 동일하다. 상기 Fc4 및 Fc5에서와 같이, Fc6서열에서의 중지 코돈은 TAA로 변화되었다. Fc6는 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACATGCCCA 3' (SEQ ID NO:19) 및 5'GGCGCGCCTC TAGATTAACCCGGAGACAGG GAGAGGC 3' (SEQ ID NO:21)을 사용하여 Fc5를 암호화한 주형 DNA로부터 발생되었다.

Fc7은 C_H2 도메인에 위치된 EU 인덱스 위치 Asn 297에서의 아미노산 치환을 제외하고는 야생형 γ1 Fc와 동일하다. Asn 297은 그 잔기 위치에서 N-연결된 탄수화물의 부착을 방지하기 위해 Gln잔기로 돌연변이되었다. 상기와 같이, Fc7서열에서 중지코돈은 TAA로 변화되었다. Fc7은 주형으로서 야생형 사람 IgGγ1 Fc cDNA를 사용하고 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3'(SEQ ID NO:22)와 5' GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT 3'(SEQ IC NO:23)을 사용하여 Fc7의 5' 절반을 발생시키고, 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA 3'(SEQ ID NO:24)와 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID NO:20)을 사용하여 Fc7의 3' 절반을 발생시켰다. 두가지 PCR 생산물을 합하고 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3'(SEQ ID NO:22)와 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID NO:20)을 사용하여 증폭하였다.

모든 결과된 PCR 생산물을 겔 정제하고, 클로닝하고, DNA 서열분석에 의해 증명하였다.

D. 아미노-절단된 TACI-Fc 융합단백질의 구성

TACI-Fc의 4개의 아미노말단 절단된 버전을 발생시켰다. 4개 모두 SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 번호 30에 융합된 변형된 사람 조직 플라스미노겐 활성제 신호 서열 (SEQ ID NO:25)를 가졌다. 그러나, 4개의 단백질은 Fc5가 SEQ ID NO:2의 TACI 아미노산 서열에 융합된 지점의 위치가 달랐다. 표3은 4개의 융합 단백질의 구조의 개요이다.

[표 3]

단백질 암호화 발현 카세트를 표준기술(예를 들면, Horton et al., Gene 77: 61 (1989) 참조)을 사용하여 중첩 PCR에 의해 발생시켰다. TACI를 암호화하는 핵산 분자와 Fc5를 암호화하는 핵산 분자를 PCR 주형으로서 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표4 및 표5에 확인되어 있다.

[표 4]

[표 5]

PCR 증폭의 제1 라운드는 4개의 아미노말단 절단된 버전의 각각에 대한 두개의 반응으로 구성되었다. 두 반응은 각 버전에 대해 한 반응에서는 5' 및 3'TACI 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 다른 반응에서는 5' 및 3'Fc5 올리고뉴클레오티드를 사용하여 따로따로 수행하였다. 제1 라운드 PCR 증폭의 조건은 다음과 같았다. 25 ㎕ 최종부피에 대략 200 ng 주형 DNA, 2.5㎕ lOx Pfu 반응 완충액(Stratagene), 2㎕의 2.5mM dNTPs, 0.5㎕의 20μM 각 5'올리고뉴클레오티드 및 3'올리고뉴클레오티드, 및 0.5㎕ Pfu 중합효소(2.5 단위, Stratagene)를 첨가하였다. 증폭 열 프로파일은 3분간 94℃, 15초간 94℃에서 35 사이클, 15초간 50℃, 2초간 72℃, 이어서 72℃에서 7분 연장으로 구성되었다. 반응생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분별하였고, 예상된 크기에 해당하는 밴드를 겔로부터 절개하고 QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit(Qiagen)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 회수하였다.

제2 라운드의 PCR 증폭 또는 중첩 PCR 증폭 반응을 DNA 주형으로서 제1 라운드 PCR로부터 겔 정제된 단편을 사용하여 수행하였다. 제2 라운드 PCR 증폭의 조건은 다음과 같았다. 25 ㎕ 최종부피에 대략 10 ng 주형 DNA, 각각의 TACI 단편 및 Fc5 단편, 2.5㎕ lOx Pfu 반응 완충액(Stratagene), 2㎕의 2.5mM dNTPs, 0.5㎕의 20μM 각 ZC24,903 (SEQ ID NO:40) 및 ZC24,946 (SEQ ID NO:20) 및 5㎕ Pfu 중합효소(2.5 단위, Stratagene)를 첨가하였다. 증폭 열 프로파일은 1분간 94℃, 15초간 94℃에서 35 사이클, 15초간 55℃, 2분간 72℃, 이어서 72℃에서 7분 연장으로 구성되었다. 반응생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분별하였고, 예상된 크기에 해당하는 밴드를 겔로부터 절개하고 QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit(Qiagen)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 회수하였다.

아미노 말단 절단된 TACI-Fc PCR 생산물을 Invitrogen의 ZEROBLUNT TOPO PCR Cloning Kit를 사용하여 제조자의 권장 프로토콜을 따라 따로따로 클로닝하였다. 표6은 이들 TACI-Fc 구성물의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 확인한다.

[표 6]

뉴클레오티드 서열을 증명한 후, 아미노 말단 절단된 TACI-Fc 융합물의 4가지 버전의 각각을 포함하는 플라스미드를 FseI 및 AscI로 분해하여 아미노산 암호화 세그먼트를 방출하였다. FseI-AscI 단편을 CMV 프로모터 및 V40 폴리 A 세그먼트를 함유하는 포유류 발현 벡터에 결합시켰다. 발현 벡터를 하기한 바와 같이중국산 햄스터 난소 세포에 도입하였다.

실시예 2

중국산 햄스터 난소세포에 의한 TACI-Fc단백질의 생산

TACI-Fc 발현 구성물을 사용하여, 엘렉트로포레이션을 거쳐, 동물 무단백질 배지에서 성장한, 현탁에 적합하게 한 (suspension-adapted) 중국산 햄스터 난소(CHO) DG44 세포를 트랜스펙션하였다(Urlaub et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12 : 555 (1986)). CHO DG44세포는 디히드로폴레이트 환원효소 염색체 위치 모두에서의 삭제로 인해 기능성 디히드로폴레이트 환원효소 유전자를 결핍한다. 메토트렉세이트의 증가된 농도의 존재하에서 세포의 성장은 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 발현구성물상의 연결된 재조합 단백질-암호화 유전자의 증폭을 가져온다.

CHO DG44 세포는 PFCHO 배지(JRH Biosciences, Lenexa, KS), 4 mM L-글루타민(JRH Biosciences), 및 lx 히포탄자인-티미딘 보충물(Life Technologies)를 통과시켰고 세포를 120 RPM에서 회전 진탕기 플랫폼상에서 코닝 진탕 플라스크내에서 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 세포를 선형화된 발현 플라스미드를 가지고 따로따로 트랜스펙션 하였다. 멸균을 확실하게 하기 위하여, Eppendorf관에서 200㎍의 플라스미드 DNA를 20㎕의 전단시킨 연어정자 담체 DNA (5' → 3'Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml), 22㎕의 3M NaOAc (pH 5.2), 및 484 ㎕의 100% ethanol (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA)과 합함으로써 25분간 얼음상에서 1회 에탄올 침전 단계를 수행하였다. 인큐베이션후, 관을 4℃ 냉방에 놓인 미세원심분리기에서 14,000 RPM에서 원심분리하였고, 상청액을 제거하고 펠릿을 70% 에탄올 0.5㎖로 2회 세척하고 풍건하였다.

CHO DG44 세포를, DNA 펠릿을 건조시키는 동안 25㎖ 원추형 원심분리관에서 900 RPM에서 5분간 10⁶개(16.5㎖)의 총 세포를 원심분리함으로써 제조하였다. CHO DG44 세포를 총 부피 300㎕의 PFCHO 성장배지에 현탁시키고, 0.4 cm 전극 갭을 갖는 Gene-Pulser Cuvette(Bio-Rad)에 놓았다. DNA를, 대략 50분의 건조시간후, 500㎕의 PFCHO 성장배지에 현탁시키고 큐베트내의 세포에 첨가하여 총 부피가 800㎕를 초과하지 않도록 하고 기포형성을 감소시키기 위해 실온에서 5분간 방치해 두었다. 큐베트를 0.296 kV (킬로볼트) 및 0.950 HC(고 커패시턴스)에서 BioRad Gene Pulser II 장치 세트에 놓고 곧 바로 전기천공하였다.

세포를 실온에서 5분간 인큐베이션한 후 CoStar T-75 플라스크에서 20 ㎖ 총 부피의 PFCHO 배지에 놓았다. 플라스크를 37℃ 및 5% CO₂ 에서 48시간동안 두고 그때 트립판 블루 배타를 이용하여 혈구계에 의해 세포 수를 세고 200 mM 메토트렉세이트(Cal Biochem)을 함유하고 히포탄자인-티민 보충물이 없는 PFCHO 선택배지에 넣었다.

메토트렉세이트 선택 과정의 회수시, 분비된 TACI-Fc 단백질을 포함하는 조건 배지를 웨스턴 블롯 분석으로 시험하였다.

실시예3

TACI-Fc 단백질의 구조 분석

특정 경우에,분석 전에 TACI-Fc 융합 단백질을 분석전에 정제하였다. 중국 햄스터 난소 배양 유래 조건 배지를 0.22 Fm 필터를 멸균 여과하였고 TACI-Fc 단백질을 단백질A 칼럼에서 획득하였다. 단백질A 결합 물질을 분리하고 최종 정제를 위해서 S-200 크기 배제 컬럼을 통과하였다. TACI-Fc 단백질의 구조적 안정성을 평가하기 위해서 웨스턴 블롯 분석을 조절된 세포 배지와 정제된 단백질에서 수행한다. 간략하게, 단백질과 상청액 샘플을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼고 퍼옥시다아제 콘쥬케이트된 염소 항-마우스 IgG2a (Boehringer Mannheim) 또는 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 특이적 항혈청(Pierce)을 사용하여 TACI-Fc 단백질을 검출하였다.

아미노기 말단 아미노산 서열 분석을 Perkin Elmer Applied Biosystems Division(Foster City, CA) 유래 476A 및 494 단백질 서열 시스템에서 수행하였다.

단백질 서열화를 수행하기 위해서 Applied Biosystems Model 610A 데이타 분석 시스템, 즉 버전 2.la(Applied Biosystems, Inc.)을 사용하여 데이터 분석을 하였다. 대부분의 공급물과 시약은 Applied Biosystems, Inc. 제품을 사용한다.

실시예 4

TACI-Fc 단백질의 구조 분석

4개의 TACI-Fc 단백질과 ZTNF4가 결합하는 특성을 검사하기 위해서 2가지 방법을 사용하였다. 한 방법으로 ¹²⁵ I~표지된 ZTNF4에 결합하기 위해서 TACI-Fc 구성물이 TACI-코팅된 플레이트와 경쟁하는 능력을 측정한다. 두번째 방법으로 높은 농도의 ¹²⁵I-표지된 ZTNF4을 각 TACI-Fc 구성물과 배양하고 침전된 ZTNF4-TACI-Fc 복합체와 관련된 방사능을 측정하였다. TACI-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 첫번째 29 아미노산 잔기가 결실된 TACI 부분을 가진다.

융합 단백질의 하나에는 완전한 자루 영역 TACI(dl-29)-Fc5이 있는 TACI 부분이 있다. TACI-Fc 융합 단백질 3개에는 자루 영역에서 다양하게 결실된 TACI 부분들(TACI(d1-29,d107-154)-Fc5; TACI(d1-29, d111-154)-Fc5; TACI(d1-29,d120-154)-Fc5이 있다.

A. 경쟁적 결합 분석

ZTNF4는 표준 방법에 따라서 요도비드(Pierce)로 방사성화된다. 간략하게, ZTNF4 50ug을 단일 요도비드를 사용하여 ¹²⁵14mCi로 요오드화였다. 반응을 0.25% 소혈청 알부민 용액으로 퀀칭시켰다. PD-10 칼럼(Pierce)를 사용하여 젤여과로 ¹²⁵I를 제거하였다. 탈염단계 전 및 후에 트리클로로아세트산 침전으로 ^l25I-ZTNF4 제제의 특이적 방사능을 결정하였다

"TACI-N"로 지정된 TACI 수용체의 N 말단 단편(0.1ug/ml에서 100u.l)을 96-웰 플레이트에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양한다. 플레이트를 세척하고, 슈퍼블락(Pierce)으로 차단하고, 다시 세척했다. 0~11.5ng/ml 농도에서 TACI-Fc 구성물을 ¹²⁵I-ZTNF4(20ng/ml)와 혼합하고 TACI-N으로 입혀진 플레이트에서 37℃, 2시간동안 배양하였다. 대조구는 용액에 TACI-N을 포함하거나 TACI-Fc가 결핍되어 있다. 배양 후에 플레이트를 씻고 계산하였다. 각 측정은 3회 반복하였다.

TACI-Fc 구성물은 100 ng/ml 또는 그 이상의 농도에서 ^l25I-ZTNF4 결합을 완전히 저해하였음을 각 결과는 나타낸다. TACI-Fc 단백질, TACI(d1-29)-Fc5, TACI (d1-9,d111-154)-Fc5, 그리고 TACI(d1-29, d120-154)-Fc5는 TACI-Fc 구성물보다 더 효과적인 저해제이다. Fc 단편은 결합을 방해하지 않았다. 세 실험의 각 구성물에 대해서 IC₅₀ 값을 계산하였다. 구성물들의 평균값은 TACI(d1-29)-Fc5: 2.07nM; TACI(d1-29,d107-154)-Fc5: 4.95nM; TACI(d1-29, d111-154)-Fc5: 2.31nM; 및 TACI(d1-29, d120-154)-Fc5: 2.21 nM 이다.

B. 용액 결합 분석

0.05 nM 농도에서 각 TACI-Fc 구성물은 0.4pM 에서 1.5nM ¹²⁵I-ZTNF4와 함께 전체 부피 0.25 ml/튜브에서 상온에서 30분간 배양하였다. 판소빈(Staph A)현탁액을 각 튜브에 첨가하고 15분 후에 샘플을 분리하고 2번 씻어서 펠렛을 계산하였다.

130nM 표지되지 않은 ZTNF4을 ¹²⁵I-ZTNF4/TACI-Fc 혼합액에 첨가하여 비특이적 결합을 결정한다. 표지되지 않은 ZTNF4이 있을 때 ¹²⁵I-ZTNF4의 각 농도에서 결합된 전체 cpm으로부터 결합된 cpm을 빼서 특이적 결합을 계산한다. 각 측정은 3회 반복하였다. 결합 상수는 GraphPad Prism 소프트웨어(MacIntosh v. 3.0)을 사용하여 계산한다.

도4는 ¹²⁵I-ZTNF4이 다양한 TACI-Fc 구성물에 특이적으로 결합하는 것을 예로 든 것이다. 결합은 각 구성물과 함께 포화에 이른 것처럼 보이고 TACI(d1-29, d107-154)-Fc5와 비교해서 구성물 TACI(d1-29)-Fc5, TACI(d1-29, d111-154)-Fc5, TACI(d1-29, d120-154)-Fc5에 대해 특이적으로 결합을 잘 한다. Bmax 및 Kd 값을 계산하고 결과를 표7에 요약하였다.

[표 7]

실시예 5

혈중 ZTNF4의 측정

전기화학발광 분석을 사용하여 질환 상태를 가진 개체(예를 들어 SLE, 관절염과 같은)의 ZTNF4 수준을 결정한다. 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.01 ng/ml에서 사람 ZTNF4으로부터 제조한 표준 곡선와 0ng/ml을 ORIGIN 완충액(Igen, Gaithersburg, MD)에서 제조한다. 혈청 샘플을 ORIGIN 완충액에서 희석한다. 오리진 분석 완충액(IGEN)에서 1㎍/ml로 희석된 바이오틸레이트된 토끼 항-사람 ZTNF4-NF BV 혈청과 오리진분석 완충액(IGEN)에서 1㎍g/ml로 희석된 루테닐화된 토끼 항-혈청 ZTNF4-NF BV 폴리클로날 항체에서 표준과 샘플을 상온에서 2시간동안 배양한다. 배양 후 샘플을 혼합하고 0.4 mg/ml 스트렙트아비딘 다이나비드(Dynal, Oslo, Norway)을 각 기준과 50Al/tube 샘플에 첨가하고 상온에서 30분동안 배양한다. 제조자 설명에 따라서 샘플을 혼합하고 샘플을 오리진 분석기(Igen)에서 읽었다. 전기화학발광에 따라서 오리진 분석을 하고 ECL에서 판독한다. 한 연구에서, 사구체신염과 자가면역질환의 진전된 단계까지 진행한 NZBWF1/J와 MRL/Mpj-Fas^lpr 마우스 혈청 샘플의 ZTNF4 수준이 높았다.

정상 개체의 혈중 수준과 상대적으로, SLE 환자 혈액에서 ZTNF4 수준을 평가하는데 오리진 분석을 사용하였다. 10 ng/ml,1 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.01 ng/ml and 0 ng/ml의 용해적 사람 10 ng/ml,1 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.01 ng/ml and 0 ng/ml에서 제조한 샘플 곡선를 오리진 완충액(Igen)에서 제조하였다. 모든 환자 샘플을 25㎕ 최종 농도로 3반복으로 수행한다. 오리진 분석 완충액(IGEN)에서 1ug/ml로 희석된 포착 항체, 바이오틸화된 토끼 항-사람 ZTNF4-NF BV 폴리클로날 항체와 오리진 분석 완충액(IGEN)에서 1ug/ml로 희석된 루테닐화된 토끼 항-사람 ZTNF4-NF BV 폴리클로날 항체와 함께 표준과 샘플을 상온에서 2시간동안 배양한다. 배양후에 샘플을 혼합하고 0.4mg/ml 스트렙트아비딘 다이나비즈(Dynal)을 50ul/튜브에 있는 표준과 샘플에 첨가한 후 상온에서 30분동안 배양한다. 제조자의 설명서에 따라서 샘플을 혼합하고 오리진 1.5 분석기(Igen)을 사용하여 분석하였다.

이 분석은 28개의 정상 대조 샘플과 SLE로 진단된 20명의 환자의 샘플을 포함한다. 정상적 대조 혈청 수여자와 비교하여 SLE로 진단된 환자의 혈청의 ZTNF4의 수준이 높았다. ZTNF4 수준은 임의의 사람 기준 혈청 샘플과 비교하여 환자나 대조 샘플의 ZTNF4의 수준보다 몇 배 증가된 것으로 계산되었다. 28개의 대조 샘플의 평균은 사람 기준 샘플의 1.36배이고 20 SLE 샘플 샘플의 평균은 4.92이다. 20명의 SLE 환자중 7명이 대조 샘플의 평균의 2배인 ZTNF4 수준을 나타냈고 1명은 대조 평균보다 2배 이상의 수준을 보였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (66)

1. 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드-상호작용제(TACI)-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 의약에 있어서, 상기 TACI-면역글로불린 융합 단백질은
   (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30 내지 154로 이루어지고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나에 결합하는 TACI 리셉터 부분, 및
   (b) 면역글로불린의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 부분
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양 세포의 증식 저해용 의약.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 의약은 TACI-면역글로불린 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 포함하고, 상기 약제학적 조성물은 종양을 갖는 포유류 대상에 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 세포의 증식 저해용 의약.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 투여는 상기 포유류 대상내의 B 림프구의 증식을 저해하는 것을 특징으로 하는 종양 세포의 증식 저해용 의약.
4. 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드-상호작용제(TACI)-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 의약에 있어서, 상기 TACI-면역글로불린 융합 단백질은
   (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30 내지 154로 이루어지고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나에 결합하는 TACI 리셉터 부분, 및
   (b) 면역글로불린의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 부분
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자가면역 질환의 치료용 의약.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신홍반루프스, 중증 근무력증, 다발경화증, 인슐린 의존 당뇨병, 크론병, 류마티스관절염, 다관절-진행 소아 류마티스관절염 및 건선관절염로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료용 의약.
6. 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드-상호작용제(TACI)-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 의약에 있어서, 상기 TACI-면역글로불린 융합 단백질은
   (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30 내지 154로 이루어지고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나에 결합하는 TACI 리셉터 부분, 및
   (b) 면역글로불린의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 부분
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신장 질환의 치료용 의약.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 신장 질환은 말기 신부전증, 사구체신염, 혈관염, 신장염, 아밀로이드증 및 신우신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 신장 질환의 치료용 의약.
8. 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드-상호작용제(TACI)-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 의약에 있어서, 상기 TACI-면역글로불린 융합 단백질은
   (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30 내지 154로 이루어지고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나에 결합하는 TACI 리셉터 부분, 및
   (b) 면역글로불린의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 부분
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역억제, 이식거부, 이식편대숙주병, 염증, 관절통, 부기, 빈혈 및 패혈쇼크 관련 질환 또는 장애의 치료용 의약.
9. 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드-상호작용제(TACI)-면역글로불린 융합 단백질을 포함하는 의약에 있어서, 상기 TACI-면역글로불린 융합 단백질은
   (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30 내지 154로 이루어지고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나에 결합하는 TACI 리셉터 부분, 및
   (b) 면역글로불린의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 부분
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신생물(neoplasm), 만성림프모구백혈병, 다발골수종, 비호지킨림프종, 이식후면역증식병 및 경쇄감마글로불린병증으로 이루어진 군에서 선택되는 장애의 치료용 의약.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분은 중쇄 불변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분은 사람 중쇄 불변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 중쇄 불변영역은 IgG1 중쇄 불변영역인 것을 특징으로 하는 의약.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 중쇄 불변영역은 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 단편인 것을 특징으로 하는 의약.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 중쇄 불변영역은 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc 단편인 것을 특징으로 하는 의약.
15. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TACI-면역글로불린 융합 단백질은 2량체인 것을 특징으로 하는 의약.
16. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약은 시험관내(in vitro) 배양된 세포에 투여되는 것을 특징으로 하는 의약..
17. (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 30 내지 154로 이루어지고, ZTNF2 또는 ZTNF4 중 적어도 하나에 결합하는, 트랜스멤브레인 활성제 및 칼슘 조정제 및 시클로필린 리간드-상호작용제(TACI) 리셉터 부분, 및
    (b) 면역글로불린의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분은 중쇄 불변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분은 사람 중쇄 불변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 중쇄 불변영역은 IgG1 중쇄 불변영역인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 중쇄 불변영역은 C_H2 및 C_H3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 단편인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 중쇄 불변영역은 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 IgG1 Fc 단편인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
23. 제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 2량체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
24. 제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 삭제
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52. 삭제
53. 삭제
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55. 삭제
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66. 삭제

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