ES2379977T3

ES2379977T3 - Proteínas de fusión de taci-inmunoglobulina

Info

Publication number: ES2379977T3
Application number: ES09168970T
Authority: ES
Inventors: Mark W Rixon; Jane A Gross
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2012-05-07
Anticipated expiration: 2022-05-20
Also published as: KR20090080570A; EP1436003B3; EP1436003A4; EP2116259A1; HRP20030948A2; NO337295B1; HRP20030948B1; EP1436003A2; JP2009232856A; KR101021124B1; ES2334772T3; ATE542545T1; PL366760A1; RS20120253A1; US7501497B2; DE60234202D1; PT2116259E; US8524232B2; AU2002305646B2; HK1137659A1

Abstract

Una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina para su uso en la inhibición de la proliferación de células tumorales, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende: (a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2; (ii) residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y (iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2; en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y (b) un resto de inmunoglobulina.

Description

Proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a proteínas de fusión mejoradas que comprenden un resto de receptor de factor de necrosis tumoral y un resto de inmunoglobulina. En particular, la presente invención se refiere a proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina mejoradas como se definen en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

Las citocinas son proteínas pequeñas solubles que median en una variedad de efectos biológicos que incluyen la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células (véase, por ejemplo, Arai y col., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul y Seder, Cell 76:241 (1994)). Las proteínas que constituyen el grupo de las citocinas incluyen interleucinas, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral y otras moléculas reguladoras. Por ejemplo, la interleucina-17 humana es una citocina que estimula la expresión de la interleucina-6, molécula de adhesión 1 intracelular, interleucina-8, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y expresión de la prostaglandina E2, y desempeña una función en la maduración preferencial de precursores hematopoyéticos CD34+ en neutrófilos (Yao y col., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez y col., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).

Los receptores que se unen a citocinas están normalmente compuestos por una o más proteínas integrales de membrana que se unen a la citocina con alta afinidad y transducen este acontecimiento de unión a la célula mediante las porciones citoplásmicas de ciertas subunidades de receptor. Los receptores de citocinas se han agrupado en varias clases basándose de similitudes en sus dominios de unión a ligando extracelular. Por ejemplo, las cadenas de receptores responsables de la unión y/o transducción del efecto de interferones son miembros de la familia de receptores de citocinas de tipo II, basados en un dominio extracelular de 200 residuos característico.

Las interacciones celulares que se producen durante una respuesta inmunitaria están reguladas por miembros de varias familias de receptores de la superficie celular que incluyen la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR). La familia de TNFR consiste en varios receptores de glicoproteínas integrales de membrana muchos de las cuales, conjuntamente con sus ligandos respectivos, regulan interacciones entre diferentes linajes de células hematopoyéticas (véanse, por ejemplo, Cosman, Stem Cells 12:440 (1994); Wajant y col., Cytokine Growth Factor Rev. 10:15 (1999); Yeh y col., Immunol. Rev. 169:283 (1999); Idriss y Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:184 (2000)).

Un receptor tal es TACI, interactor de activador transmembrana y de CAML (von Bülow y Bram, Science 228: 138 (1997); Bram y von Bülow, patente de EE.UU. nº 5.969.102 (1999)). El TACI es un receptor unido a membrana que tiene un dominio extracelular que contiene dos pseudo-repeticiones ricas en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico que interacciona con CAML (modulador de calcio y ligando de ciclofilina), una proteína integral de membrana localizada en vesículas intracelulares que es un coinductor de la activación de NF-AT cuando se expresa en exceso en células Jurkat. TACl está asociado a linfocitos B y un subconjunto de linfocitos T. Las secuencias de nucleótidos que codifican TACI y su secuencia de aminoácidos correspondiente se proporcionan en este documento como SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente

El receptor de TACI se une a dos miembros de la familia de ligando del factor de necrosis tumoral (TNF). Un ligando se designa de forma muy diversa ZTNF4, “BAFF”, “neutrocina-a”, “BlyS”, “TALL-1” y “THANK” (Yu y col., publicación internacional nº WO98/18921 (1998), Moore y col., Science 285:269 (1999); Mukhopadhyay y col., J. Biol. Chem. 274:15978 (1999); Schneider y col., J. Exp. Med. 189:1747 (1999); Shu y col., J. Leukoc. Biol. 65:680 (1999)). La secuencia de aminoácidos de ZTNF4 se proporciona como SEC ID Nº: 3. El otro ligando se ha designado “ZTNF2”, “APRIL” y “ligando 1 de muerte de TNRF” (Hahne y col., J. Exp. Med. 188:1185 (1998); Kelly y col., Cancer Res. 60:1021 (2000)). La secuencia de aminoácidos de ZTNF2 se proporciona como SEC ID Nº: 4. Ambos ligandos también están unidos por el receptor de maduración de linfocitos B (BCMA) (Gross y col., Nature 404:995 (2000)). La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de BCMA se proporcionan como SEC ID Nº: 26 y SEC ID Nº: 27, respectivamente.

Las actividades in vivo demostradas de los receptores del factor de necrosis tumoral ilustran el potencial clínico de las formas solubles del receptor. Se han generado formas solubles del receptor de TACI como proteínas de fusión de inmunoglobulina. Las versiones iniciales produjeron proteína heterogénea de baja expresión. La heterogeneidad se observó en el extremo amino de TACI, en el extremo carboxilo de Fc y en la región del tallo de TACI. Por tanto, existe una necesidad de composiciones de receptores de TACI farmacéuticamente útiles.

El documento WO 00/40716 describe el receptor soluble BR43x2 y procedimientos de uso del mismo para terapia. El documento WO 01/81417 describe el uso de TACl como agente antitumoral.

La presente invención proporciona una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina para su uso en la inhibición de la proliferación de células tumorales, para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, para su uso en el tratamiento de asma, bronquitis o enfisema, para su uso en el tratamiento de enfermedad renal, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a inmunosupresión, rechazo de injerto, enfermedad de injerto frente a huésped, inflamación, dolor de articulaciones, hinchazón, anemia y choque séptico, o para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado de neoplasia, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, enfermedad linfoproliferativa postrasplante y gammapatía de cadenas ligeras, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i): residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii): residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.

La invención también proporciona un procedimiento in vitro para inhibir la proliferación de células tumorales que comprende administrar a dichas células tumorales una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TA-CI)-inmunoglobulina en el que la proteína de fusión de TACIinmunoglobulina comprende:

(i): residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii): residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

(b) un resto de inmunoglobulina.

La invención proporciona además una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina en la que la proteína de fusión de TACIinmunoglobulina comprende:

(i): residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii): residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

(b) un resto de inmunoglobulina;

y en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina consiste en o comprende una forma secretada de una cualquiera de SEC ID Nº: 50, 52, 54 ó 56.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de TACI humano. Las localizaciones de las pseudorepeticiones ricas en cisteína están indicadas sombreadas, el dominio transmembrana está recuadrado y la región del tallo se indica por marcas numeradas. La Figura 2 es un diagrama esquemático de una inmunoglobulina de la subclase IgG1. CL: región constante de la cadena ligera; CH1, CH2, CH3: regiones constantes de las cadenas pesadas; VL: región variable de la cadena ligera; VH: región variable de la cadena pesada; CHO: hidrato de carbono; N: extremo amino; C: extremo carboxilo. Las Figuras 3A, 3B, 3C y 3D muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos de Fc de la región constante y1 humana natural con variantes Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 y Fc8. El dominio CH1 de la región constante y1 humana no es parte de Fc y, por tanto, no se muestra. Se indica la localización de la región bisagra, los dominios CH2 y CH3. Se indican los residuos Cys normalmente implicados en los enlaces disulfuro con la región constante de la cadena ligera (LC) y la región constante de la cadena pesada (HC). Un símbolo “.” indica identidad con el tipo natural en esa posición, mientras que “***” indica la localización del extremo carboxilo, e ilustra la diferencia en el extremo carboxilo de Fc6 con respecto a las otras versiones de Fc. Las localizaciones de aminoácidos están indicadas por posiciones del índice EU. La Figura 4 muestra la unión específica de 125I-ZTNF4 a diversas construcciones de TACI-Fc. Las proteínas de fusión de TACI-Fc tuvieron restos de TACI que carecieron de los 29 primeros residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2. Una de las proteínas de fusión tuvo un resto de TACI con una región del tallo intacta (TACI (d1-29)-Fc5), mientras que tres de las proteínas de fusión TACI-Fc tuvieron restos de TACI con diversas deleciones en la región del tallo (TACI (d1-29, d107-154)-Fc5; TACI (d1-29, d111-154)-Fc5; TACI (d1-29, d120-154)-Fc5). Los detalles experimentales se describen en el Ejemplo 4.

Descripción detallada de la invención

1. Visión general

Como se describe más adelante, la presente invención proporciona proteínas de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina, y usos de las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la presente invención proporciona inhibir la proliferación de células tumorales usando una composición que comprende proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina como se definen en las reivindicaciones. Una composición tal puede administrarse a células cultivadas in vitro. Alternativamente, la composición puede ser una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina, y la composición farmacéutica puede ser para administración a un sujeto que tiene un tumor. El sujeto puede ser un sujeto mamífero. La administración de la composición farmacéutica puede inhibir, por ejemplo, la proliferación de linfocitos B en un sujeto mamífero.

La presente memoria descriptiva proporciona inhibir la actividad de ZTNF4 en un mamífero usando una composición que comprende una TACI-inmunoglobulina como se define en las reivindicaciones. La actividad de ZTNF4 puede asociarse a diversas enfermedades y trastornos. Por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina puede usarse para tratar una enfermedad autoinmunitaria tal como lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil de evolución poliarticular y artritis psoriásica. Alternativamente, una composición farmacéutica que comprende una TACI-inmunoglobulina puede usarse para tratar un trastorno tal como asma, bronquitis, enfisema e insuficiencia renal terminal. Una composición farmacéutica que comprende una TACI-inmunoglobulina también puede usarse para tratar enfermedad renal tal como glomerulonefritis, vasculitis, nefritis, amiloidosis y pielonefritis, o un trastorno tal como neoplasia, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, enfermedad linfoproliferativa postrasplante y gammapatía de cadenas ligeras. En ciertos casos, la actividad de ZTNF4 puede asociarse a linfocitos T. Una composición farmacéutica que comprende una TACI-inmunoglobulina también puede usarse para tratar una enfermedad o trastorno asociado a inmunosupresión, rechazo de injerto, enfermedad de injerto frente a huésped e inflamación. Por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende una TACI-inmunoglobulina puede usarse para disminuir inflamación y para tratar trastornos tales como dolor de articulaciones, hinchazón, anemia y choque séptico.

La presente memoria descriptiva describe reducir los niveles de ZTNF4 en sangre en circulación en un sujeto mamífero que comprende administrar al sujeto mamífero una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina, en el que la administración de la composición farmacéutica reduce el nivel en circulación de ZTNF4 en la sangre del sujeto mamífero. Como ilustración, la administración de una composición farmacéutica tal puede reducir los niveles de ZTNP4 en sangre en circulación al menos el 10%, al menos el 20%, al menos del 10 al 60%, al menos el 20 al 50%, o al menos del 30 al 40%, en comparación con el nivel de ZTNP4 en sangre antes de la administración de la composición farmacéutica. Aquellos expertos en la materia pueden medir niveles de ZTNF4 en circulación. Procedimientos ilustrativos se describen en el Ejemplo 4 y el Ejemplo 5.

Como se describe más adelante, las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina ilustrativas comprenden:

(a): un resto del receptor de TACI que consiste en la secuencia de aminoácidos de residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2, residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2, y (ii) residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2, y en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4, y

(b): un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.

Restos del receptor de TACI incluyen: polipéptidos que comprenden los residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2 y los residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2; polipéptidos que comprenden los residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2; polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2.

El resto de inmunoglobulina de una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina puede comprender una región constante de la cadena pesada tal como una región constante de la cadena pesada humana. Una región constante de la cadena pesada de IgG1 es un ejemplo de una región constante de la cadena pesada adecuada. Una región constante de la cadena pesada de IgG1 ilustrativa es un fragmento Fc de IgG1 que comprende los dominios CH2 y CH3. El fragmento Fc de IgG1 puede ser un fragmento Fc de IgG1 natural o un fragmento Fc de IgG1 mutada, tal como el fragmento Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 33. Una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina a modo de ejemplo es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 54.

Las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina descritas en este documento pueden ser multímeros tales como dímeros.

La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina. Una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica una proteína de fusión de TACIinmunoglobulina se proporciona por SEC ID Nº: 53.

La presente memoria descriptiva describe receptores solubles de TACI que consisten en un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2 en la que el receptor soluble de TACI comprende al menos uno de (i) residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2, y

(ii) residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2, y en el que el receptor soluble de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4. Otros receptores solubles de TACI se describen en este documento como restos del receptor de TACI adecuados para las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina. Además, los receptores solubles de TACI pueden usarse en procedimientos descritos para las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos. Además, a continuación se identifican diversas referencias.

2. Definiciones

En la siguiente descripción, varios términos se usan extensivamente. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de la invención.

Como se usa en este documento, “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligación, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se producen naturalmente (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen naturalmente (por ejemplo, formas a-enantioméricas de nucleótidos que se producen naturalmente), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcares incluyen, por ejemplo, sustitución de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden estar funcionalizados como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede reemplazarse con estructuras estérica y electrónicamente similares tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos muy conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden ligarse por enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. El término “molécula de ácido nucleico” también incluye los llamados “ácidos nucleicos peptídicos” que comprenden bases de ácidos nucleicos que se producen naturalmente o modificadas unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser tanto monocatenarios como bicatenarios.

El término “complemento de una molécula de ácido nucleico” se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y orientación inversa con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' (SEC ID Nº: 57) es complementaria a 5' CCCGTGCA 3' (SEC ID Nº: 58).

El término “cóntigo” denota una molécula de ácido nucleico que tiene una extensión contigua de secuencia idéntica o complementaria a otra molécula de ácido nucleico. Se dice que las secuencias contiguas se “solapan” una extensión dada de una molécula de ácido nucleico tanto en su extensión completa como a lo largo de una extensión parcial de la molécula de ácido nucleico.

El término “secuencia de nucleótidos degeneradas” denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados con respecto a una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

El término “gen estructural” se refiere a una molécula de ácido nucleico que es transcrita en ARN mensajero (ARNm) que luego se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Una “molécula de ácido nucleico aislada” es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que ha sido aislada de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.

Una “construcción de moléculas de ácido nucleico” es una molécula de ácido nucleico tanto monocatenaria como bicatenaria que ha sido modificada por intervención humana para contener segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición que no existe en la naturaleza.

“ADN lineal” denota moléculas de ADN no circular que tienen extremos 5' y 3' libres. El ADN lineal puede prepararse a partir de moléculas de ADN circulares cerradas tales como plásmidos, por digestión enzimática o rotura física.

“ADN complementario (ADNc)” es una molécula de ADN monocatenario que se forma a partir de un molde de ARNm por la enzima transcriptasa inversa. Normalmente se emplea un cebador complementario a las porciones de ARNm para la iniciación de la transcripción inversa. Aquellos expertos en la materia también usan el término “ADNc” para referirse a una molécula de ADN bicanaterio que consiste en una molécula de ADN monocatenario de este tipo y su hebra de ADN complementaria. El término “ADNc” también se refiere a un clon de una molécula de ADNc sintetizado a partir de un molde de ARN.

Un “promotor” es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Normalmente, un promotor se localiza en la región no codificante 5' de un gen, proximal al sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan en la iniciación de la transcripción se caracterizan frecuentemente por secuencias de nucleótidos consenso. Estos elementos promotores incluyen sitios de unión a ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de la diferenciación (DSE; McGehee y col., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de respuesta a AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta a suero (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE) y sitios de unión para otros factores de transcripción tales como CRE/ATF (O'Reilly y col., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)), AP2 (Ye y col., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, proteína de unión a elementos de respuesta a cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) y factores octámeros (véanse, en general, Watson y col., eds., Molecular Biology of the Gene, 4ª ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). Si un promotor es un promotor inducible, entonces la tasa de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. A diferencia, la tasa de transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen promotores represibles.

Un “promotor mínimo” contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función del promotor que incluyen la caja TATA y el inicio de la transcripción. Por esta definición, un promotor mínimo puede o puede no tener actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden potenciar la actividad o conferir actividad específica de tejido.

Un “elemento regulador” es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor mínimo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une a factores celulares permitiendo la transcripción exclusivamente o preferencialmente en células, tejidos u orgánulos particulares. Estos tipos de elementos reguladores están normalmente asociados a genes que se expresan de un modo “específico de célula”, “específico de tejido” o “específico de orgánulo”.

Un “potenciador” es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficiencia de la transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador con respecto al sitio de inicio de la transcripción.

“ADN heterólogo” se refiere a una molécula de ADN, o a una población de moléculas de ADN, que no existe naturalmente dentro de una célula huésped dada. Moléculas de ADN heterólogo para una célula huésped particular pueden contener ADN derivado de especies de la célula huésped (es decir, ADN endógeno), siempre y cuando ese ADN huésped se combine con ADN no huésped (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no huésped que codifica un polipéptido operativamente ligado a un segmento de ADN huésped que comprende un promotor de la transcripción se considera que es una molécula de ADN heterólogo. En cambio, una molécula de ADN heterólogo puede comprender un gen endógeno operativamente ligado a un promotor exógeno. Como otra ilustración, se considera que una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula natural es ADN heterólogo si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen natural.

Un “polipéptido” es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, tanto si se produce naturalmente como sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos se denominan comúnmente en lo sucesivo “péptidos”.

Una “proteína” es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos tales como grupos hidrato de carbono. Los hidratos de carbono y otros sustituyentes no peptídicos pueden añadirse a una proteína por la célula en la que la proteína se produce, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en este documento en términos de sus estructuras de esqueletos de aminoácidos; sustituyentes tales como grupos hidrato de carbono son generalmente no especificados, pero sin embargo pueden estar presentes.

Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN no huésped es un péptido o polipéptido “heterólogo”.

Un “elemento genético integrado” es un segmento de ADN que ha sido incorporado en un cromosoma de una célula huésped después de que el elemento se introdujera en la célula por manipulación humana. Dentro de la presente invención, los elementos genéticos integrados se derivan lo más comúnmente de plásmidos linealizados que se introducen en las células por electroporación u otras técnicas. Los elementos genéticos integrados son pasados de la célula huésped original a su progenie.

Un “vector de clonación” es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse autónomamente en una célula huésped. Los vectores de clonación normalmente contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de un modo determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, además de secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores normalmente incluyen genes que proporcionan resistencia a tetraciclina o resistencia a ampicilina.

Un “vector de expresión” es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula huésped. Normalmente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La expresión génica se sitúa normalmente bajo el control de un promotor, y se dice que un gen tal está “operativamente ligado a” el promotor. Similarmente, un elemento regulador y un promotor mínimo están operativamente ligados si el elemento regulador modula la actividad del promotor mínimo.

Un “huésped recombinante” es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga tal como un vector de clonación o vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de un huésped recombinante es una célula que produce una proteína de fusión TACI-Fc de un vector de expresión.

“Transformantes integrativos” son células huésped recombinantes en las que el ADN heterólogo se ha integrado en el ADN genómico de las células.

Una “proteína de fusión” es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende un resto del receptor de TACI y un resto de inmunoglobulina. Como se usa en este documento, un “resto del receptor de TACI” es una parte del dominio extracelular del receptor de TACI que se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4. El término un “resto de inmunoglobulina” se refiere a un polipéptido que comprende una región constante de una inmunoglobulina. Por ejemplo, el resto de inmunoglobulina puede comprender una región constante de la cadena pesada. El término proteína de fusión de “TACI-Fc” se refiere a una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina en la que el resto de inmunoglobulina comprende las regiones constantes de la cadena pesada de la inmunoglobulina, CH2 y CH3.

El término “receptor” denota una proteína asociada a célula que se une a una molécula bioactiva llamada un “ligando”. Esta interacción media en el efecto del ligando sobre la célula. En el contexto de unión al receptor de TACI, el término “se une específicamente a” o “unión específica” se refiere a la capacidad del ligando para unirse competitivamente al receptor. Por ejemplo, ZTNF4 se une específicamente al receptor de TACI, y esto puede mostrarse observando la competencia por el receptor de TACI entre ZTNF4 detectablemente marcado y ZTNF4 sin marcar.

Los receptores pueden estar unidos a membrana, ser citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona estimulante tiroidea, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona de crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6). Los receptores unidos a membrana se caracterizan por una estructura multidominio que comprende un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio efector intracelular que normalmente participa en la transducción de señales. En ciertos receptores unidos a membrana, el dominio de unión a ligando extracelular y el dominio efector intracelular se localizan en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo.

En general, la unión de ligando a receptor produce un cambio conformacional en el receptor que produce una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula(s) en la célula, que a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los acontecimientos metabólicos que frecuentemente están ligados a las interacciones receptor-ligando incluyen transcripción de genes, fosforilación, desfosforilación, aumento en la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de lípidos de la membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos.

El término “secuencia señal secretora” denota una secuencia de ADN que codifica un péptido (un “péptido secretor”) que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor por una ruta secretora de una célula en la que se sintetiza. El polipéptido mayor se escinde comúnmente para eliminar el péptido secretor durante el tránsito por la ruta secretora.

Un “polipéptido aislado” es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes tales como hidrato de carbono, lípido u otras impurezas proteináceas asociadas al polipéptido en la naturaleza. Normalmente, una preparación de polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, es decir, al menos aproximadamente el 80% de pureza, al menos aproximadamente el 90% de pureza, al menos aproximadamente el 95% de pureza, superior al 95% de pureza, o superior al 99% de pureza. Una forma para mostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es por la aparición de una única banda tras la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida de la preparación de proteína y tinción con Coomassie Brilliant Blue del gel. Sin embargo, el término “aislado” no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas.

Los términos “extremo amino” y “extremo carboxilo” se usan en este documento para denotar posiciones dentro de polipéptidos. Si el contexto lo permite, estos términos se usan con referencia a una secuencia particular o porción de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia posicionada en el extremo carboxilo con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está localiza proximal al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

El término “expresión” se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción de ARNm en uno o más polipéptidos.

El término “variante de corte y empalme” se usa en este documento para denotar formas alternativas de ARN transcritas de un gen. La variación de corte y empalme se produce naturalmente mediante el uso de sitios de corte y empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o menos comúnmente entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede producir varios ARNm transcritos del mismo gen. Las variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. El término variante de corte y empalme también se usa en este documento para denotar un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme de un ARNm transcrito de un gen.

Como se usa en este documento, el término “inmunomodulador” incluye citocinas, factores de crecimiento de citoblastos, linfotoxinas, moléculas co-estimuladoras, factores hematopoyéticos y análogos sintéticos de estas moléculas.

El término “par de complemento/anticomplemento” denota restos no idénticos que forman un par estable no covalentemente asociado bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de una par de complemento/anticomplemento. Otros pares de complemento/anticomplemento a modo de ejemplo incluyen pares de receptor/ligando, pares de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítope), pares de polinucleótidos sentido/antisentido y similares. Si se desea la posterior disociación del par de complemento/anticomplemento, el par de complemento/anticomplemento tiene preferentemente una afinidad de unión inferior a 109 M-1.

Un “fragmento de anticuerpo” es una parte de un anticuerpo tal como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une al mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

El término “fragmento de anticuerpo” también incluye un polipéptido sintético o uno genéticamente manipulado que se une a un antígeno específico tal como polipéptidos que consisten en la región variable de la cadena ligera, fragmentos “Fv” que consisten en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, moléculas de polipéptido monocatenarias recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un ligador de péptidos (“proteínas de scFv”) y unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable.

Un “anticuerpo quimérico” es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones determinantes de la complementariedad derivados de un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo se deriva de un anticuerpo humano.

“Anticuerpos humanizados” son proteínas recombinantes en las que las regiones determinantes de la complementariedad murinas de un anticuerpo monoclonal se han transferido de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina murina a un dominio variable humano.

Como se usa en este documento, un “agente terapéutico” es una molécula o átomo que está conjugado con un resto de anticuerpo para producir un conjugado, que es útil para terapia. Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o colorantes, y radioisótopos.

Una “marca detectable” es una molécula o átomo que puede conjugarse con un resto de anticuerpo para producir una molécula útil para diagnóstico. Ejemplos de marcas detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otros restos marcadores.

El término “marca de afinidad” se usa en este documento para denotar un segmento de polipéptido que puede unirse a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, como marca de afinidad puede usarse cualquier péptido o proteína para el que un anticuerpo u otro agente de unión específica esté disponible. Las marcas de afinidad incluyen una extensión de polihistidina, proteína A (Nilsson y col., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson y col., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67: 31 (1988)), marca de afinidad por Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp y col., Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de unión a estreptavidina u otro epítope antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford y col., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Las moléculas de ADN que codifican marcas de afinidad están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Un “anticuerpo desnudo” es un anticuerpo completo, a diferencia de un fragmento de anticuerpo, que no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen tanto anticuerpos policlonales como monoclonales, además de ciertos anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos quiméricos y humanizados.

Como se usa en este documento, el término “componente de anticuerpo” incluye tanto un anticuerpo completo como un fragmento de anticuerpo.

Un “inmunoconjugado” es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o una marca detectable.

Un “polipéptido diana” o un “péptido diana” es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epítope y que se expresa sobre una célula diana tal como una célula tumoral, o una célula que lleva un antígeno de agente infeccioso. Los linfocitos T reconocen epítopes de péptidos presentados por una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor a un polipéptido diana o péptido diana y normalmente lisan la célula diana o reclutan otras células inmunitarias al sitio de la célula diana, destruyendo así la célula diana.

Un “péptido antigénico” es un péptido que se unirá a una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor para formar un complejo de MHC-péptido que es reconocido por un linfocito T, induciéndose así una respuesta de linfocitos citotóxicos tras la presentación al linfocito T. Por tanto, los péptidos antigénicos pueden unirse a una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor apropiada e inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos tal como lisis de células o liberación de citocinas específicas contra la célula diana, que se une a o expresa el antígeno. El péptido antigénico puede unirse en el contexto de una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor de clase I o clase II sobre una célula presentadora de antígeno o sobre una célula diana.

En eucariotas, la ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir ARNm. Una molécula de ácido nucleico puede diseñarse para contener un molde de ARN polimerasa II en el que el transcrito de ARN tiene una secuencia que es complementaria a la de un ARNm específico. El transcrito de ARN se llama un “ARN antisentido” y una molécula de ácido nucleico que codifica el ARN antisentido se llama un “gen antisentido”. Las moléculas de ARN antisentido pueden unirse a moléculas de ARNm, produciendo una inhibición de la traducción de ARNm.

Debido a la imprecisión de los procedimientos analíticos convencionales, se entiende que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros son valores aproximados. Cuando un valor de este tipo se expresa como “aproximadamente” X, el valor establecido de X se entenderá que es preciso ± 10%.

3. Producción de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de TACI-inmunoglobulina

La Figura 1 proporciona la secuencia de aminoácidos predicha de TACI humano (von Bülow y Bram, Science

278:138 (1997)). El polipéptido de TACI contiene los siguientes elementos predichos: (a) dos estructuras de pseudorepetición ricas en cisteína características de dominios de unión al ligando del factor de necrosis tumoral, (b) una “región del tallo” de 62 aminoácidos que reside entre los dominios de unión a ligando y el dominio transmembrana,

(c) un dominio transmembrana de 20 aminoácidos y (d) un dominio intracelular de 127 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos no contiene una secuencia señal del extremo amino hidrófoba predicha.

Con el fin de crear una forma soluble de TACI humano para su uso como un inhibidor de la interacción de ligando nativo:receptor nativo se generó una proteína de fusión de dominio extracelular de TACI - Fc de inmunoglobulina humana. La secuencia de TACI humano disponible se usó como punto de partida para diseñar la molécula de la proteína de fusión (von Bülow y Bram, Science 278:138 (1997)). Esta construcción inicial, designada “TACI-Fc4”, incluyó los residuos de aminoácidos 1 a 154 del polipéptido de TACI y una región de Fc humana modificada, descrita más adelante. Se eligió el punto de fusión del residuo 154 con el fin de incluir tanto de la región del tallo de TACI como fuera posible mientras que no se incluyera ninguna porción potencial del dominio transmembrana predicho.

Como el polipéptido de TACI nativo no contiene una secuencia señal del extremo amino, se añadió secuencia señal del extremo amino a TACI con el fin de generar una forma secretada de la proteína de fusión de TACI-Fc. La secuencia señal fue una secuencia prepro modificada de activador de plasminógeno de tejido humano. Las modificaciones se incluyeron para potenciar la escisión de la peptidasa señal y el procesamiento específico de la proteasa furina y por este motivo esta secuencia se ha denominado en lo sucesivo el “conductor de tPA optimizado (tPAo)”. La secuencia de tPAo (SEC ID Nº: 25) se ilustra a continuación; los residuos de aminoácidos modificados están sombreados. La secuencia codificante de la proteína de fusión de TACI-Fc recombinante se insertó en un vector de expresión, que se transfectó en células de ovario de hámster chino.

Las células de ovario de hámster chino transfectadas produjeron la proteína TACI-Fc4 a un bajo nivel de aproximadamente 0,3 pg/célula/día. El análisis de transferencia Western de la proteína de TACI-Fc con antisueros de Fc de cabra dirigidos contra IgG humana reveló dos bandas, una banda era más pequeña que el tamaño esperado de aproximadamente 48 kDa. El análisis de las secuencias de aminoácidos de proteínas purificadas reveló 15 que la banda más pequeña reflejaba la escisión de proteínas de fusión de TACI en diversos sitios dentro de la región del tallo de TACI. Con referencia a SEC ID Nº: 2, los extremos principales se encontraron en los residuos de aminoácidos 118 y 123, aunque las proteínas también se escindieron en las posiciones de aminoácidos 110, 139 y

141.

Además de la heterogeneidad producida por la escisión en la región del tallo, la heterogeneidad también se observó

20 en los extremos amino y carboxilo. Con referencia a SEC ID Nº: 2, los extremos amino principales se encontraron en los residuos de aminoácidos 1, 10 y 13. Diferencias en el extremo carboxilo reflejan la heterogeneidad natural de las inmunoglobulinas recombinantes y las proteínas de fusión de inmunoglobulina, que incluyen la eliminación incompleta del residuo de lisina codificado en el extremo carboxilo. Otra fuente de heterogeneidad se encontró en la naturaleza variable de la estructura de hidratos de carbono unida al dominio CH2 de la inmunoglobulina codificada

25 por Fc.

Se generaron nuevas versiones de TACI-Fc para tratar la heterogeneidad observada. Se diseñaron construcciones que incluyeron al menos una de las siguientes variaciones en el resto de TACI: (1) se delecionaron porciones de la región del tallo de TACI, (2) una parte de la región del tallo de TACI se sustituyó por una parte de la región del tallo de BCMA, (3) el residuo de arginina en la posición 119 se mutó para eliminar un posible sitio de escisión de furina, 30 (4) el residuo de glutamina en la posición 121 se mutó para eliminar un posible sitio de escisión de furina, (5) el residuo de arginina en la posición 122 se mutó para eliminar un posible sitio de escisión de furina, (6) el residuo de aminoácido en las posiciones 123 y 142 se mutó a residuos de aminoácidos encontrados en posiciones correspondientes de TACI murino, (7) la secuencia señal de tPA humano se sustituyó con una secuencia señal de la región variable de la cadena pesada humana, (8) el residuo de valina en la posición 29 se mutó a metionina, y la

35 secuencia señal de tPAo se unió en una posición del extremo amino a este residuo, y (9) la secuencia señal de tPAo se unión en una localización del extremo amino al residuo de alanina en la posición 30.

También se introdujeron modificaciones en el resto de inmunoglobulina. Se han identificado cinco clases de inmunoglobulina, IgG, IgA, IgM, IgD y IgE, en vertebrados superiores. Las proteínas IgG, IgD y IgE son heterotetrámeros ligados característicamente por disulfuro que consisten en dos cadenas pesadas idénticas y dos

40 cadenas ligeras idénticas. Normalmente, la IgM se encuentra como un pentámero de un tetrámero, mientras que IgA se produce como un dímero de un tetrámero.

IgG comprende la clase principal, ya que normalmente existe como la segunda proteína más abundante encontrada en el plasma. En seres humanos, la IgG consiste en cuatro subclases, designadas IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Como se muestra en la Figura 2, cada cadena pesada de la inmunoglobulina posee una región constante que consiste en

45 dominios de proteínas de la región constante (CH1, bisagra, CH2 y CH3) que son invariables para una subclase dada. Las regiones constantes de las cadenas pesadas de la clase de IgG se identifican con el símbolo griego y. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la subclase IgG1 contienen una región constante de la cadena pesada y1.

El fragmento Fc, o dominio Fc, consiste en las regiones bisagra de la cadena pesada unidas por disulfuro, los dominios CH2 y CH3. En proteínas de fusión de inmunoglobulina, los dominios Fc de la subclase IgG1 se usan frecuentemente como resto de inmunoglobulina, debido a que IgG1 tiene la mayor semivida en suero de cualquiera de las proteínas del suero. La larga semivida en suero puede ser una característica de proteínas deseable para estudios animales y posible uso terapéutico humano. Además, la subclase IgG1 posee la capacidad más fuerte para llevar a cabo funciones efectoras mediadas por anticuerpos. La función efectora primaria que puede ser más útil en una proteína de fusión de inmunoglobulina es la capacidad de un anticuerpo IgG1 para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Por otra parte, esto podría ser una función no deseable para una proteína de fusión que funciona principalmente como un antagonista. Se han identificado varios de los residuos de aminoácidos específicos que son importantes para la actividad mediada por la región constante del anticuerpo en la subclase IgG1. Por tanto, la inclusión o exclusión de estos aminoácidos específicos permite la inclusión o exclusión de actividad mediada por región constante de inmunoglobulina específica.

Se generaron seis versiones de un Fc de IgG1 humana modificado para crear proteínas de fusión de Fc. Se diseñó Fc-488 para la clonación conveniente de una proteína de fusión que contiene la región Fc de y1 humana, y se construyó usando la región constante y1 de inmunoglobulina humana natural como molde. La preocupación por los posibles efectos perjudiciales debidos a un residuo de cisteína sin aparear condujeron a la decisión de sustituir la cisteína (residuo de aminoácido 24 de SEC ID Nº: 6) que normalmente se liga por disulfuro con la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina con un residuo de serina. Se introdujo otro cambio en el codón que codifica la posición de índice EU 218 (residuo de aminoácido 22 de SEC ID Nº: 6) para introducir un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BglII para facilitar futuras manipulaciones de ADN. Estos cambios se introdujeron en el producto de PCR codificado por los cebadores de PCR. Debido a la localización del sitio BglII y con el fin de completar la región bisagra Fc, los codones para las posiciones de índice EU 216 y 217 (residuos de aminoácidos 20 y 21 de SEC ID Nº: 6) se incorporaron en las secuencias de los componentes de la proteína de fusión.

Fc4, Fc5, y Fc6 contienen mutaciones para reducir funciones efectoras mediadas por Fc reduciendo la unión a FcyRI y la unión a C1q del complemento. Fc4 contiene las mismas sustituciones de aminoácidos que se introdujeron en Fc-488. Se introdujeron otras sustituciones de aminoácidos para reducir las posibles funciones efectoras mediadas por Fc. Específicamente, se introdujeron tres sustituciones de aminoácidos para reducir la unión a FcyRI. Éstas son las sustituciones en las posiciones de índice EU 234, 235 y 237 (residuos de aminoácidos 38, 39 y 41 de SEC ID Nº: 6). Se ha mostrado que las sustituciones en estas posiciones reducen la unión a FcyRI (Duncan y col., Nature

332:563 (1988)). Estas sustituciones de aminoácidos pueden también reducir la unión a FcyRIIa, además de la unión a FcyRIII (Sondermann y col., Nature 406:267 (2000); Wines y col., J. Immunol. 164:5313 (2000)).

Varios grupos han descrito la relevancia de las posiciones de índice EU 330 y 331 (residuos de aminoácidos 134 y 135 de SEC ID Nº: 6) en la unión a C1q del complemento y posterior fijación del complemento (Canfield y Morrison,

J. Exp. Med. 173:1483 (1991); Tao y col., J. Exp. Med. 178:661 (1993)). Las sustituciones de aminoácidos en estas posiciones se introdujeron en Fc4 para reducir la fijación del complemento. El dominio CH3 de Fc4 es idéntico al encontrado en el polipéptido natural correspondiente, excepto por el codón de terminación, que se cambió de TOA a TAA para eliminar un posible sitio de metilación dam cuando el ADN clonado se cultiva en dam más cepas de E. coli.

En Fc5, el residuo de arginina en la posición del índice EU 218 se mutó de nuevo a lisina debido a que el esquema de clonación de BglII no se usó en proteínas de fusión que contenían este Fc particular. El resto de la secuencia de Fc5 coincide con la descripción anterior para Fc4.

Fc6 es idéntico a Fc5, excepto en que se ha eliminado el codón de lisina del extremo carboxilo. La lisina del extremo C de inmunoglobulinas maduras se elimina frecuentemente de las inmunoglobulinas maduras después de la traducción antes de la secreción de linfocitos B, o se elimina durante la circulación en suero. Por consiguiente, el residuo de lisina del extremo C normalmente no se encuentra en los anticuerpos en circulación. Como en Fc4 y Fc5 anteriormente, el codón de terminación en la secuencia de Fc6 se cambió a TAA.

Fc7 es idéntico a y1 de Fc natural, excepto por una sustitución de aminoácidos en la posición del índice EU 297 localizada en el dominio CH2. La posición del índice EU Asn-297 (residuo de aminoácido 101 de SEC ID Nº: 6) es un sitio de unión de hidrato de carbono ligado a N. El hidrato de carbono ligado a N que introduce una posible fuente de variabilidad en una proteína recombinantemente expresada debido a posibles variaciones de lote a lote en la estructura del hidrato de carbono. En un intento por eliminan esta posible variabilidad, Asn-297 se mutó a un residuo de glutamina para evitar la unión del hidrato de carbono ligado a N en esa posición de residuo. El hidrato de carbono en el residuo 297 también participa en la unión de Fc a FcyRIII (Sondermann y col., Nature 406:267 (2000)). Por tanto, la eliminación del hidrato de carbono no debe disminuir la unión de Fc7 recombinante que contiene proteínas de fusión con FcyR en general. Como antes, el codón de terminación en la secuencia de Fc7 se mutó a TAA.

Fc8 es idéntico a la región y1 de la inmunoglobulina natural mostrada en SEC ID Nº: 6, excepto que el residuo de cisteína en la posición del índice EU 220 (residuo de aminoácido 24 de SEC ID Nº: 6) se sustituyó con un residuo de serina. Esta mutación eliminó el residuo de cisteína que normalmente se liga por disulfuro con la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina.

En la Tabla 1 se describen construcciones de TACI-Fc ilustrativas.

Tabla 1

Construcciones de proteínas de fusión de TACI-Fc ilustrativas

Secuencia de TACIa: Versión de Fc

TACIb: Fc4

TACIb: Fc5

TACIb: Fcy1

TACI (d107-154): Fc5

TACI (R119Q): Fc4

TACI (1-104)-BCMA (42-54)c: Fc5

TACI (d143-150): Fc5

TACI (R142G, d143-150): Fc5

TACI (R119G, Q121P, R122Q, S123A): Fc5

TACI(R119G, R122Q): Fc5

TACI (d1-28, V29M): Fc6

TACI (d1-29): Fc6

TACI (d1-29): Fc5

TACI (d1-29, d107-154): Fc5

TACI (d1-29, d111-154): Fc5

TACI (d1-29, d120-154): Fc5

a Se proporciona información sobre localizaciones, mutaciones y deleciones de secuencias de aminoácidos entre paréntesis en referencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2. b Incluye los residuos de aminoácidos 1 a 154 de SEC ID Nº: 2. c Esta construcción incluye los residuos de aminoácidos 1 a 104 de SEC ID Nº: 2 (TACI) y los aminoácidos 42 a 54 de SEC ID Nº: 27 (BCMA).

Las proteínas de TACI-Fc se produjeron por células de ovario de hámster chino recombinantes, se aislaron y se analizaron usando análisis de transferencia Western y análisis de secuencias de aminoácidos. Sorprendentemente, 5 la deleción de los 29 primeros aminoácidos del extremo N del polipéptido de TACI produjo un aumento de diez veces en la producción de proteínas de fusión de TACI-Fc por células de ovario de hámster chino. Esta deleción también redujo la escisión de la región del tallo de longitud completa. Además, la escisión dentro de la región del tallo de TACI se suprimió tanto por truncación de la región del tallo de TACI como por sustitución de la región del tallo de TACI dentro de otra secuencia de aminoácidos (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la región del tallo de

10 BCMA).

Como se describe en el Ejemplo 4, los análisis funcionales de construcciones de TACI-Fc indican que las proteínas de fusión TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d107-154)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 y TACI (d1-29, d120,154)-Fc5 tienen afinidades de unión similares por ZTNF4. Sin embargo, las construcciones TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 parecen unirse más a ZTNF4 por mol de TACI-Fc que la construcción 15 TACI (d1-29, d107-154)-Fc5. Dependiendo del uso previsto (es decir, terapéutico, diagnóstico o investigación), pueden emplearse tanto proteínas de fusión TACI-Fc de alta capacidad como de baja capacidad. Además, una combinación de proteínas de fusión TACI-Fc de alta capacidad y de baja capacidad permite la valoración de ZTNF2

o ZTNF4.

La presente invención contempla proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina que comprenden un resto del

receptor de TACI que consiste en los residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2, o 30 a 154 de SEC ID Nº:

2. La presente memoria descriptiva también describe proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina que comprenden un resto del receptor de TACI que consiste en los residuos de aminoácidos 31 a 106 de SEC ID Nº: 2, 31 a 110 de SEC ID Nº: 2, 31 a 119 de SEC ID Nº: 2, o 31 a 154 de SEC ID Nº: 2.

Más generalmente, la presente invención incluye proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina en las que el resto del receptor de TACI consiste en un fragmento de residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 21 como se define en las reivindicaciones y en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4. Tales fragmentos comprenden una región de pseudo-repeticiones rica en cisteína, y opcionalmente pueden incluir al menos uno de un segmento del extremo N que reside en una posición del extremo amino con respecto a la región de pseudo-repeticiones rica en cisteína y un segmento del tallo que reside en una posición el extremo carboxilo con respecto a la región de pseudo-repeticiones rica en cisteína. Regiones de pseudo-repeticiones ricas en cisteína adecuadas incluyen polipéptidos que: (a) comprenden al menos uno de los residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2 y los residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2, (b) comprenden ambos residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2 y los residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2, o (c) comprenden los residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2.

Segmentos del extremo N adecuados incluyen los siguientes con referencia a SEC ID Nº: 2: residuo de aminoácido 33, residuos de aminoácidos 32 a 33, residuos de aminoácidos 31 a 33 y residuos de aminoácidos 30 a 33. Segmentos del tallo adecuados incluyen uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos 105 a 154 de SEC ID Nº: 2. Por ejemplo, el segmento del tallo puede consistir en los siguientes con referencia a SEC ID Nº: 2: residuo de aminoácido 105, residuos de aminoácidos 105 a 106, residuos de aminoácidos 105 a 107, residuos de aminoácidos 105 a 108, residuos de aminoácidos 105 a 109, residuos de aminoácidos 105 a 110, residuos de aminoácidos 105 a 111, residuos de aminoácidos 105 a 112, residuos de aminoácidos 105 a 113, residuos de aminoácidos 105 a 114, residuos de aminoácidos 105 a 115, residuos de aminoácidos 105 a 116, residuos de aminoácidos 105 a 117, residuos de aminoácidos 105 a 118, residuos de aminoácidos 105 a 119, residuos de aminoácidos 105 a 120, residuos de aminoácidos 105 a 121, residuos de aminoácidos 105 a 122, residuos de aminoácidos 105 a 123, residuos de aminoácidos 105 a 124, residuos de aminoácidos 105 a 125, residuos de aminoácidos 105 a 126, residuos de aminoácidos 105 a 127, residuos de aminoácidos 105 a 128, residuos de aminoácidos 105 a 129, residuos de aminoácidos 105 a 130, residuos de aminoácidos 105 a 131, residuos de aminoácidos 105 a 132, residuos de aminoácidos 105 a 133, residuos de aminoácidos 105 a 134, residuos de aminoácidos 105 a 135, residuos de aminoácidos 105 a 136, residuos de aminoácidos 105 a 137, residuos de aminoácidos 105 a 138, residuos de aminoácidos 105 a 139, residuos de aminoácidos 105 a 140, residuos de aminoácidos 105 a 141, residuos de aminoácidos 105 a 142, residuos de aminoácidos 105 a 143, residuos de aminoácidos 105 a 144, residuos de aminoácidos 105 a 145, residuos de aminoácidos 105 a 146, residuos de aminoácidos 105 a 147, residuos de aminoácidos 105 a 148, residuos de aminoácidos 105 a 149, residuos de aminoácidos 105 a 150, residuos de aminoácidos 105 a 151, residuos de aminoácidos 105 a 152, residuos de aminoácidos 105 a 153 y residuos de aminoácidos 105 a 154.

Segmentos del tallo adecuados adicionales incluyen uno o más aminoácidos de la región del tallo de BCMA (es decir, residuos de aminoácidos 42 a 54 de SEC ID Nº: 27). Por ejemplo, un segmento del tallo puede consistir en los siguientes con referencia a SEC ID Nº: 27: residuo de aminoácido 42, residuos de aminoácidos 42 a 43, residuos de aminoácidos 42 a 44, residuos de aminoácidos 42 a 45, residuos de aminoácidos 42 a 46, residuos de aminoácidos 42 a 47, residuos de aminoácidos 42 a 48, residuos de aminoácidos 42 a 49, residuos de aminoácidos 42 a 50, residuos de aminoácidos 42 a 51, residuos de aminoácidos 42 a 52, residuos de aminoácidos 42 a 53 y residuos de aminoácidos 42 a 54.

Más generalmente, un segmento del tallo puede consistir en dos a 50 residuos de aminoácidos.

El resto de inmunoglobulina de una proteína de fusión descrita en este documento comprende al menos una región constante de una inmunoglobulina. Preferentemente, el resto de inmunoglobulina representa un segmento de una inmunoglobulina humana. La secuencia de inmunoglobulina humana puede ser una secuencia de aminoácidos natural, o una secuencia de aminoácidos natural modificada que tiene al menos una de las mutaciones de aminoácidos tratadas anteriormente.

La secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina humana también puede variar de la natural teniendo una o más mutaciones características de un determinante alotípico conocido. La Tabla 2 muestra los determinantes alotípicos de la región constante de IgGy1 humana (Putman, The Plasma Proteins, vol. V, páginas 49 a 140 (Academic Press, Inc. 1987)). Las posiciones de índice EU 214, 356, 358 y 431 definen los alotipos de IgGy1 conocidos. La posición 214 está en el dominio CH1 de la región constante de IgCy1 y, por tanto, no reside dentro de la secuencia de Fc. La secuencia de Fc natural de SEC ID Nº: 6 incluye los alotipos Glm (1) y Glm(2-). Sin embargo, el resto de Fc de una proteína de TACI-Fc puede modificarse para reflejar cualquier combinación de estos alotipos.

Tabla 2

Los ejemplos de proteína de TACI-Fc desvelada en este documento comprenden regiones constantes de IgG1 humana. Sin embargo, restos de inmunoglobulina adecuados también incluyen polipéptidos que comprenden al

5 menos una región constante tal como una región constante de la cadena pesada de cualquiera de las siguientes inmunoglobulinas: IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE y IgM. Ventajosamente, restos de inmunoglobulina derivados de IgG2 natural o IgG4 natural ofrecen función efectora reducida en comparación con IgG1 natural o IgG3 natural. La presente memoria descriptiva describe proteínas de fusión que comprenden un resto del receptor de TACI, como se ha descrito anteriormente, y tanto albúmina como �2-macroglobulina.

10 Otro tipo de proteína de fusión de receptor que se une a ZTNF2 o ZTNF4 es una proteína de fusión de BCMAinmunoglobulina. Se han realizado estudios con una proteína de fusión de BCMA-Fc4 en la que el resto de BCMA consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 48 de SEC ID Nº: 27. Sorprendentemente, estudios farmacocinéticos en ratones revelaron que la proteína de fusión de BCMA-Fc4 tenía una semivida de aproximadamente 101 horas, mientras que una proteína de TACI-Fc tenía una semivida de 25 horas. Por tanto, la administración de una proteína

15 de fusión de BCMA-inmunoglobulina puede preferirse en cierta práctica clínica. Además, una combinación de proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina y de BCMA-inmunoglobulina puede ser ventajosa para tratar ciertas afecciones. Esta terapia de combinación puede lograrse administrando proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina y BCMA-inmunoglobulina, o administrando heterodímeros de proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina y de BCMA-inmunoglobulina.

20 Otro tipo de proteína de fusión de receptor que se une ZTNF4 es una proteína de fusión de inmunoglobulina que comprende un dominio extracelular de un receptor designado “Ztnfr12”. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de Ztnfr12 se proporcionan como SEC ID Nº: 59 y SEC ID Nº: 60, respectivamente. Restos del receptor de Ztnfr12 adecuados incluyen polipéptidos que comprenden los residuos de aminoácidos 1 a 69 de SEC ID Nº: 60,

o residuos de aminoácidos 19 a 35 de SEC ID Nº: 60.

25 Las proteínas de fusión de la presente invención pueden tener la forma de polipéptidos monocatenarios, dímeros, trímeros o múltiples dímeros o trímeros. Los dímeros pueden ser homodímeros o heterodímeros, y los trímeros pueden ser homotrímeros o heterotrímeros. Ejemplos de heterodímeros incluyen un polipéptido de TACIinmunoglobulina con un polipéptido de BCMA-inmunoglobulina, un polipéptido de TACI-inmunoglobulina con un polipéptido de Ztnfr12-inmunoglobulina, y un polipéptido de BCMA-inmunoglobulina con un polipéptido de Ztnfr12

30 inmunoglobulina. Ejemplos de heterotrímeros incluyen un polipéptido de TACI-inmunoglobulina con dos polipéptidos de BCMA-inmunoglobulina, un polipéptido de TACI-inmunoglobulina con dos polipéptidos de Ztnfr12inmunoglobulina, un polipéptido BCMA-inmunoglobulina con dos polipéptidos de Ztnfr12-inmunoglobulina, dos polipéptidos de TACI-inmunoglobulina con un polipéptido BCMA-inmunoglobulina, dos polipéptidos de TACIinmunoglobulina con un polipéptido Ztnfr12-inmunoglobulina, dos polipéptidos de BCMA-inmunoglobulina con un

35 polipéptido de Ztnfr12-inmunoglobulina y un trímero de un polipéptido de TACI-inmunoglobulina, un polipéptido de BCMA-inmunoglobulina y un polipéptido de Ztnfr12- inmunoglobulina.

En tales proteínas de fusión, el resto del receptor de TACI puede comprender al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 2: residuos de aminoácidos 30 a 154, residuos de aminoácidos 34 a 66, residuos de aminoácidos 71 a 104, residuos de aminoácidos 47 a 62 y residuos de aminoácidos 86 a 100. El resto 40 de receptor de BCMA puede comprender al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº:

27: residuos de aminoácidos 1 a 48, residuos de aminoácidos 8 a 41 y residuos de aminoácidos 21 a 37. El resto de receptor de Ztnfr12 puede comprender al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº:

60: residuos de aminoácidos 1 a 69 y residuos de aminoácidos 19 a 35.

Las proteínas de fusión pueden producirse usando los procedimientos de PCR usados para la construcción de las moléculas de TACI-Fc ilustrativas que se describen en los ejemplos. Sin embargo, aquellos expertos en la materia pueden usar otros enfoques convencionales. Por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de TACI, BCMA, Ztnfr12 o inmunoglobulina pueden obtenerse cribando ADNc humano o bibliotecas genómicas usando sondas de polinucleótidos basadas en secuencias desveladas en este documento. Estas técnicas son convencionales y están bien establecidas (véase, por ejemplo, Ausubel y col. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3ª edición, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) (“Ausubel (1995)”); Wu y col., Methods in Gene Biotechnology, páginas 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) (“Wu (1997)”); Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327)).

Alternativamente, las moléculas para construir proteínas de fusión de inmunoglobulina pueden obtenerse sintetizando moléculas de ácido nucleico usando oligonucleótidos largos de cebado mutuo y las secuencias de nucleótidos descritas en este documento (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 8-8 a 8-9). Las técnicas establecidas usando la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad para sintetizar moléculas de ADN de al menos dos kilobases de longitud (Adang y col., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot y col., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon y col., “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes”, en Methods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993) y Holowachuk y col., PCR Methods Appl

4:299 (1995)).

Las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento también pueden sintetizarse con “máquinas de genes” usando protocolos tales como el procedimiento de fosforamidito. Si se requiere ADN bicatenario sintetizado químicamente para una aplicación tal como la síntesis de un gen o un fragmento de gen, entonces cada hebra complementaria se prepara por separado. La producción de genes cortos (60 a 80 pares de bases) es técnicamente sencilla y puede llevarse a cabo sintetizando las hebras complementarias y luego hibridándolas. Sin embargo, para la producción de genes más largos (>300 pares de bases), pueden requerirse estrategias especiales debido a que la eficiencia de acoplamiento de cada ciclo durante la síntesis de ADN química es raramente el 100%. Para vencer este problema, los genes sintéticos (bicatenarios) se ensamblan en forma modular a partir de fragmentos monocatenarios que tienen de 20 a 100 nucleótidos de longitud. Para revisiones sobre la síntesis de polinucleótidos véase, por ejemplo, Glick y Pastarnak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura y col., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), y Climie y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA

87:633 (1990).

4. Producción de polipéptidos de TACI-inmunoglobulina

Los polipéptidos de la presente invención pueden producirse en células huésped recombinantes siguiendo las técnicas convencionales. Para expresar una secuencia codificante de TACI-inmunoglobulina, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido debe estar operativamente ligada a secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión y luego introducirse en una célula huésped. Además de las secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores y potenciadores, los vectores de expresión puede incluir secuencias reguladoras de la traducción y un gen marcador que sea adecuado para la selección de células que llevan el vector de expresión.

Vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína extraña en células eucariotas normalmente contienen (1) elementos de ADN procariota que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN eucariota que controlan la iniciación de la transcripción tal como un promotor; y (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de transcritos, tales como una secuencia de terminación/poliadenilación de la transcripción.

Los vectores de expresión también pueden incluir secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia secretora que dirige el polipéptido heterólogo a la ruta secretora de una célula huésped. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica TACI-inmunoglobulina y una secuencia secretora derivada de cualquier gen secretado. Como se ha tratado anteriormente, una secuencia señal adecuada es una secuencia señal de tPA. Una secuencia señal de tPA a modo de ejemplo se proporciona por SEC ID Nº: 25. Otra secuencia señal adecuada es una secuencia señal de 26-10 VH murina. El anticuerpo 26-10 murino se describe, por ejemplo, por Near y col., Mol. Immunol. 27:901 (1990). Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos ilustrativos de una secuencia señal de 26-10 VH murina se proporcionan por SEC ID Nº: 61 y SEC ID Nº: 65, respectivamente. SEC ID Nº: 62 desvela la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de TACI-Fc5 que comprende una secuencia señal de 26-10 VH murina.

Las proteínas de TACI-inmunoglobulina de la presente invención pueden expresarse en células de mamífero. Ejemplos de células huésped adecuadas de mamífero incluyen células de riñón de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células renales embrionarias humanas (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de hámster bebé (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin y col., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células pituitarias de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) células de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).

Para un huésped mamífero, las señales reguladoras de la transcripción y la traducción pueden derivarse de fuentes víricas tales como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus simio o similares, en las que las señales reguladoras están asociadas a un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Las señales reguladoras de la transcripción y la traducción adecuadas también pueden obtenerse de genes de mamífero tales como genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneína.

Las señales reguladoras de la transcripción incluyen una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de ARN. Promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor del gen de la metalotioneína I de ratón (Hamer y col., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), el promotor TK del virus del herpes (McKnight, Cell 31:355 (1982)), el promotor temprano del SV40 (Benoist y col., Nature 290:304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (Gorman y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), el promotor del citomegalovirus (Foecking y col., Gene 45:101 (1980)) y el promotor del virus de tumor de mama de ratón (véase, generalmente, Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture”, en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). Una combinación útil de un promotor y potenciador se proporciona por un promotor del virus del sarcoma mieloproliferativo y un potenciador del citomegalovirus humano.

Alternativamente, un promotor procariota, tal como el promotor de la T3 ARN polimerasa de bacteriófago, puede usarse para controlar la producción de proteínas de TACI-inmunoglobulina en células de mamífero si el promotor procariota está regulado por un promotor eucariota (Zhou y col., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990), y Kaufman y col., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).

Un vector de expresión puede introducirse en células huésped usando una variedad de técnicas convencionales que incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por liposomas, administración mediada por microproyectiles, electroporación y similares. Las células transfectadas pueden seleccionarse y propagarse para proporcionar células huésped recombinantes que comprenden el vector de expresión establemente integrado en el genoma de la célula huésped. Técnicas para introducir vectores en células eucariotas y técnicas para seleccionar tales transformantes estables usando un marcador de selección dominante se describen, por ejemplo, por Ausubel (1995) y por Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991).

Por ejemplo, un marcador de selección adecuado es un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, la selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina tal como G-418 o similares. Los sistemas de selección también pueden usarse para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un procedimiento denominado en lo sucesivo “amplificación”. La amplificación se lleva a cabo cultivando transfectantes en presencia de un bajo nivel de agente selectivo de colorante y luego aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador de selección amplificable adecuado es la dihidrofolato-reductasa, que confiere resistencia a metrotrexato. También pueden usarse otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina-acetiltransferasa). Alternativamente, los marcadores que introducen un fenotipo alterado tal como proteína verde fluorescente, o proteínas de la superficie celular tales como CD4, CD8, MHC de clase I, fosfatasa alcalina placentaria, pueden usarse para clasificar células transfectadas de células no transfectadas por medios tales como clasificación por FACS o tecnología de separación por perlas magnéticas.

Los polipéptidos de TACI-inmunoglobulina también pueden producirse por células de mamífero cultivadas usando un sistema de administración vírico. Virus a modo de ejemplo para este fin incluyen adenovirus, virus del herpes, virus de la variolovacuna y virus adenoasociados (AAV). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es actualmente el vector de transferencia de genes mejor estudiado para la administración de ácido nucleico heterólogo (para una revisión véanse Becker y col., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Las ventajas del sistema de adenovirus incluyen la acomodación de insertos de ADN relativamente grandes, la capacidad de cultivar a alto título, la capacidad para infectar una amplia gama de tipos de células de mamífero y la flexibilidad que permite usar un gran número de vectores disponibles que contienen diferentes promotores.

Delecionando porciones del genoma del adenovirus pueden acomodarse insertos más grandes (hasta 7 kb) de ADN heterólogo. Estos insertos pueden incorporarse en el ADN vírico por ligación directa o por recombinación homóloga con un plásmido co-transfectado. Una opción es delecionar el gen E1 esencial del vector vírico, que produce la incapacidad de replicar a menos que el gen E1 se proporcione por la célula huésped. Las células 293 humanas infectadas por el vector de adenovirus (nº de ATCC CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, pueden cultivarse como células adherentes o en cultivo en suspensión a densidad de células relativamente alta para producir cantidades significativas de proteína (véase Garnier y col., Cytotechnol. 15:145 (1994)).

Los expertos en la materia pueden idear vectores de expresión adecuados para producir las proteínas de fusión descritas en este documento con células de mamífero. El Ejemplo 4 describe características de un vector de expresión. Como otro ejemplo, un vector de expresión puede comprender un casete de expresión bicistrónico que incluye una parte del potenciador del citomegalovirus humano, el promotor del virus del sarcoma mieloproliferativo, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, los sitios de entrada ribosómica interna del poliovirus, una secuencia de nucleótidos que codifica la dihidrofolato-reductasa murina, seguido de la secuencia de adición de poli-A a SV40. La secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 69 muestra una construcción del potenciador del citomegalovirus/promotor LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo en la que el potenciador del citomegalovirus se extiende del nucleótido 1 a 407. El promotor LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo, ausente la región de control negativo, se extiende del nucleótido 408 al nucleótido 884 de SEC ID Nº: 69. Una secuencia de nucleótidos para el promotor LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo sin la región de control negativo se proporciona en SEC ID Nº: 70.

El Ejemplo 1 describe un vector de expresión que comprende un promotor del citomegalovirus para dirigir la expresión del transgén de la proteína recombinante, un intrón de inmunoglobulina y una secuencia señal del activador tisular del plasminógeno. Un intrón de inmunoglobulina adecuado es un intrón 26-10 VH murino. SEC ID Nº: 66 proporciona una secuencia de nucleótidos ilustrativa de un intrón 26-10 VH murino. Un vector de expresión también puede incluir una región sin traducir en 5' (UTR) localizada en la dirección 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de TACI-inmunoglobulina. Una 5'-UTR adecuada puede derivarse del gen de 26-10 VH murino. SEC ID Nº: 63 desvela la secuencia de nucleótidos de una 5'-UTR de 26-10 VH murina nativa útil, mientras que SEC ID Nº: 64 muestra la secuencia de nucleótidos de una 5'-UTR de 26-10 VH murina que se ha optimizado en el extremo 3'.

Como ilustración, SEC ID Nº: 67 proporciona una secuencia de nucleótidos que incluye los siguientes elementos: una 5'-UTR de 26-10 VH murina nativa (nucleótidos 1 a 51), una secuencia señal de 26-10 VH murina (nucleótidos 52 a 97, y 182 a 192), un intrón de 26-10 VH murino (nucleótidos 98 a 181), una secuencia de nucleótidos que codifica un resto de TACI (nucleótidos 193 a 435) y una secuencia de nucleótidos que codifica un resto Fc5 (nucleótidos 436 a 1131). La secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 68 se diferencia de SEC ID Nº: 67 debido a la sustitución de la secuencia nativa con una 5'-UTR de 26-10 VH murina optimizada (nucleótidos 1 a 51).

Las proteínas de TACI-inmunoglobulina también pueden expresarse en otras células eucariotas superiores tales como células aviares, fúngicas, de insecto, de levadura o vegetales. El sistema de baculovirus proporciona un medio eficiente para introducir genes clonados en células de insecto. Vectores de expresión adecuados se basan en el virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (Ac-MNPV), y contienen promotores muy conocidos tales como el promotor 70 de la proteína de choque térmico (hsp) de Drosophila, el promotor del gen temprano inmediato del virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (ie-1) y el promotor 39K temprano retardado, promotor p10 del baculovirus y el promotor de la metalotioneína de Drosophila. Un segundo procedimiento de preparación de baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow y col., J. Virol. 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa en el kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido de TACIinmunoglobulina en un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado un “bácmido”. Véase Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning y col., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), y Chazenbalk, y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en marco con ADN que codifica una marca de epítope en el extremo C o N del polipéptido de TACIinmunoglobulina expresado, por ejemplo, una marca de epítope Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985)). Usando una técnica conocida en la técnica, un vector de transferencia que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de TACI-inmunoglobulina se transforma en E. coli, y se criba para bácmidos, que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinante. El ADN de bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aísla luego usando técnicas comunes.

El vector PFASTBAC ilustrativo puede modificarse a un grado considerable. Por ejemplo, el vector de la poliedrina puede eliminarse y sustituirse con el promotor de la proteína básica del baculovirus (también conocida como promotor de Pcor, p6.9 o MP) que se expresa tempranamente en la infección por baculovirus, y se ha mostrado que es ventajosa para expresar proteínas secretadas (véase, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning y col., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). En tales construcciones de vectores de transferencia puede usarse una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, pueden construirse vectores de transferencia con secuencias señal secretoras derivadas de proteínas de insecto. Por ejemplo, en tales construcciones puede usarse una secuencia señal secretora de ecdisteroide-glucosiltransferasa (EGT), melitina de la abeja mielera (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) o baculovirus gp67 (PharMingen: San Diego, CA).

El virus o bácmido recombinante se usa para transfectar células huésped. Células huésped de insecto adecuadas incluyen líneas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, una línea celular de ovario de pupa de Spodoptera frugiperda tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE y Sf2 1 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), además de células Schneider-2 de Drosophila, y la línea celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente de EE.UU. nº 5.300.435). Pueden usarse medios libres de suero comercialmente disponibles para cultivar y para mantener las células. Medios adecuados son Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células de T. ni. Si se usa virus recombinante, las células se cultivan normalmente a partir de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células a una densidad de 1-2 x 106 células en el momento en el que se añade una cepa vírica recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, más normalmente próxima a

3.

Técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus se proporcionan por Bailey y col., “Manipulation of Baculovirus Vectors”, en Methods in Molecular Biology, volumen 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), por Patel y col., “The baculovirus expression system” en DNA Cloning 2: Expression System, 2ª edición, Glover y col. (eds.), páginas 205244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) y por Lucknow, “Insect Cell Expression Technology” en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col. (eds.), página 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).

También pueden usarse células fúngicas, que incluyen células de levadura, para expresar los genes descritos en este documento. Especies de levadura de particular interés a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Promotores adecuados para la expresión en levadura incluyen promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato-cinasa), ADH (alcohol-deshidrogenasa), AOX1 (alcohol-oxidasa), HIS4 (histidinol-deshidrogenasa) y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación de levadura y están fácilmente disponibles. Puede diseñarse un vector para generar construcciones que utilizan los elementos necesarios para llevar a cabo la recombinación homóloga en levadura (véase, por ejemplo, Raymond y col., BioTechniques 26:134 (1999)). Por ejemplo, un vector de expresión tal puede incluir secuencias de URA3 y CEN-ARS (secuencia de replicación autónoma) requeridas para la selección y replicación en S. cerevisiae. Otros vectores adecuados incluyen vectores basados en YIp tales como YIp5, vectores de YRp tales como YRp17, vectores de YEp tales como YEp13 y vectores de YCp tales como YCp19. Los procedimientos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de estas células se desvelan, por ejemplo, Kawasaki, por la patente de EE.UU. nº 4.599.311, Kawasaki y col., patente de EE.UU. nº 4.931.373, Brake, patente de EE.UU. nº 4.870.008, Welch y col., patente de EE.UU. nº 5.037.743, y Murray y col., patente de EE.UU. nº 4.845.075. Se seleccionan células transformadas por fenotipo determinado por el marcador de selección, comúnmente resistencia a fármaco o la capacidad para crecer en ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina). Un sistema de vector adecuado para su uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vector POT1 desvelado por Kawasaki y col. (patente de EE.UU. nº 4.931.373), que permite seleccionar células transformadas por crecimiento en medios que contienen glucosa. Promotores y terminadores adecuados adicionales para su uso en levadura incluyen aquellos de genes de enzimas glicolíticas (véanse, por ejemplo, Kawasaki, patente de EE.UU. nº 4.599.311, Kingsman y col., patente de EE.UU. nº 4.615.974 y Bitter, patente de EE.UU. nº 4.977.092) y genes de alcohol-deshidrogenasa. Véanse también las patentes de EE.UU. nº 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 y 4.661.454.

En la técnica se conocen sistemas de transformación para otras levaduras, que incluyen Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véanse, por ejemplo, Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) y Cregg, patente de EE.UU. nº 4.882.279. Pueden utilizarse células de Aspergillus según los procedimientos de McKnight y col., patente de EE.UU. nº 4.935.349. Los procedimientos para transformar Acremonium chrysogenum se desvelan por Sumino y col., patente de EE.UU. nº 5.162.228. Los procedimientos para transformar Neurospora se desvelan por Lambowitz, patente de EE.UU. nº 4.486.533.

Por ejemplo, el uso de Pichia methanolica como huésped para la producción de proteínas recombinantes se desvela por Raymond, patente de EE.UU. nº 5.716.808, Raymond, patente de EE.UU. nº 5.736.383, Raymond y col., Yeast 14:11-23 (1998), y en las publicaciones internacionales nº WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para su uso en transformar P. methanolica se prepararán comúnmente como plásmidos circulares bicatenarios que se linealizan preferentemente antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, el promotor y el terminador en el plásmido pueden ser los de un gen de P. methanolica tal como un gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen aquellos de los genes de dihidroxiacetona-sintasa (DHAS), formiato-deshidrogenasa (FMD) y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma huésped se prefiere tener todo el segmento de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN huésped. Un marcador de selección adecuado para su uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica que codifica fosforibosil-5aminoimidazol-carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), y que permite que células huésped ade2 crezcan en ausencia de adenina. Para procedimientos industriales a gran escala en los que se desea minimizar el uso de metanol pueden usarse células huésped en las que se delecionan ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas secretadas, las células huésped pueden ser deficientes en genes de la proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). Se usa electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Las células de P. methanolica pueden transformarse por electroporación usando un campo eléctrico pulsado exponencialmente decreciente que tiene una intensidad de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferentemente de aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, lo más preferentemente aproximadamente 20 milisegundos.

También pueden introducirse vectores de expresión en protoplastos vegetales, tejidos vegetales intactos o células vegetales aisladas. Los procedimientos para introducir vectores de expresión en tejido vegetal incluyen la infección directa o co-cultivo de tejido vegetal con Agrobacterium tumefaciens, administración mediada por microproyectiles, inyección de ADN, electroporación y similares. Véanse, por ejemplo, Horsch y col., Science 227:1229 (1985), Klein y col., Biotechnology 10:268 (1992) y Miki y col., “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants” en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick y col., (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).

Alternativamente, las proteínas de TACI-inmunoglobulina pueden expresarse en células huésped procariotas. Promotores adecuados que pueden usarse para producir polipéptidos de TACI-inmunoglobulina en un huésped procariota son muy conocidos para los expertos en la materia e incluyen promotores que pueden reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PL de bacteriófago lambda, los promotores trp, recA, de choque térmico, lacUV5, tac, Ipp-lacSpr, phoA y lacZ de E. coli, promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, el promotor int de bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322 y el promotor CAT del gen de cloranfenicol acetiltransferasa. Los promotores procariotas han sido revisados por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson y col., Molecular Biology of the Gene, 4ª ed. (Benjamin Cummins 1987) y por Ausubel y col. (1995).

Huéspedes procariotas adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilus. Cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Cepas adecuadas de Bacillus subtilus incluyen BR151, YB886, MI119, MI120 y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, “Bacillus Cloning Methods” en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).

Si se expresa una proteína de TACI-inmunoglobulina en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede conservarse en el citoplasma, normalmente como gránulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el caso anterior, las células se lisan y los gránulos se recuperan y se desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. Entonces, el polipéptido desnaturalizado puede renaturalizarse y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis contra una disolución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido de diálisis contra una solución salina tamponada. En este último caso, el polipéptido puede recuperarse del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional rompiendo las células (mediante, por ejemplo, sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviándose así la necesidad de desnaturalización y renaturalización.

Procedimientos para expresar proteínas en huéspedes procariotas son muy conocidos para los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Williams y col., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies” en DNA Cloning 2: Expression systems, 2ª edición, Glover y col., (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward y col., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies” en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) y Georgiou, “Expression of Proteins in Bacteria” en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col., (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

Procedimientos convencionales para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levadura, de insecto y vegetales se proporcionan, por ejemplo, por Ausubel (1995).

Procedimientos generales para expresar y recuperar proteína extraña producida por un sistema de células de mamífero se proporcionan, por ejemplo, por Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture” en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col., (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Técnicas convencionales para recuperar la proteína producida por un sistema bacteriano se proporcionan, por ejemplo, por Grisshammer y col., “Purification of over-produced proteins from E. coli cells” en DNA Cloning 2: Expression systems, 2ª edición, Glover y col., (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Los procedimientos establecidos para aislar proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus se describen por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).

Como alternativa, los polipéptidos de la presente invención pueden sintetizarse mediante síntesis en fase sólida exclusiva, procedimientos en fase sólida parcial, condensación de fragmentos o síntesis por disolución clásica. Estos procedimientos de síntesis son muy conocidos para los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart y col., “Solid Phase Peptide Synthesis” (2ª edición), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton y col., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields y Colowick, “Solid-Phase Peptide Synthesis”, Methods in Enzymology, volumen 289 (Academic Press 1997), y Lloyd-Williams y col., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Las variaciones en las estrategias de síntesis química totales, tales como “ligadura química nativa” y “ligadura de proteínas expresadas” también son convencionales (véanse, por ejemplo, Dawson y col., Science 266:776 (1994), Hackeng y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol.

287: 34 (1997), Muir y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998) y Severinov y Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)).

5. Ensayos de proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina

La función de las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina puede examinarse usando una variedad de enfoques para evaluar la capacidad de las proteínas de fusión para unirse a ZTNF4 o ZTNF2. Como ilustración, el Ejemplo 4 proporciona procedimientos para medir la afinidad de unión y capacidad de unión a ZTNF4.

Alternativamente, las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina pueden caracterizarse por la capacidad para inhibir la estimulación de linfocitos B humanos por ZTNF4 soluble como se describe por Gross y col., publicación internacional nº WO00/40716. Brevemente, linfocitos B humanos se aíslan de células mononucleares de la sangre periférica usando perlas magnéticas CD19 y el sistema de separación magnética VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) según las instrucciones del fabricante. Los linfocitos B purificados se mezclan con ZTNF4 soluble (25 ng/ml) e IL-4 humana recombinante (10 ng/ml Pharmingen), y las células se siembran sobre placas de 96 pocillos de fondo redondo a 1 x 105 células por pocillo.

Las proteínas de TACI-inmunoglobulina solubles pueden diluirse de aproximadamente 5 !g/ml a aproximadamente 6 ng/ml, e incubarse con los linfocitos B durante cinco días, pulsando durante la noche en el día cuatro con 1 !Ci de 3H-timidina por pocillo. Como control, la proteína de TACI-inmunoglobulina también puede incubarse con linfocitos B e IL-4 sin ZTNF4. Las placas se recogen usando el recolector de placas Packard y se cuentan usando el lector de Packard.

Este enfoque general se usó para examinar tres proteínas de fusión de TACI-Fc. Aunque todas las proteínas de fusión inhibieron la proliferación de linfocitos B, las construcciones TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 fueron más potentes que TACI (d1-29, d107-154)-Fc5.

Están disponibles modelos animales bien establecidos para probar la eficacia in vivo de proteínas de TACIinmunoglobulina en ciertos estados de enfermedad. Por ejemplo, las proteínas de TACI-inmunoglobulina pueden probarse en varios modelos animales de enfermedad autoinmunitaria tales como cepas de ratón congénitas MRLlpr/lpr o NZB x NZW F1 que sirven de modelo de LES (lupus eritematoso sistémico). Tales modelos animales se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Cohen y Miller (Eds.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc. 1994).

Las crías de un cruce entre ratones negros de Nueva Zelanda (NZB) y blancos de Nueva Zelanda (NZW) desarrollan una forma espontánea de LES que se parece mucho a LES en seres humanos. Los ratones hijo, conocidos como NZBW, empiezan a desarrollar autoanticuerpos IgM contra linfocitos T al mes de edad, y a los cinco a siete meses de edad, los autoanticuerpos anti-ADN son la inmunoglobulina dominante. La hiperactividad de linfocitos T policlonales conduce a una producción en exceso de autoanticuerpos. La deposición de estos autoanticuerpos, particularmente aquellos dirigidos contra ADN monocatenarios, está asociada al desarrollo de glomerulonefritis, que se manifiesta clínicamente como proteinuria, azoemia y muerte de insuficiencia renal.

La insuficiencia renal es la causa principal de muerte en ratones afectados con LES espontánea, y en la cepa de NZBW, este proceso es crónico y restrictivo. La enfermedad es más rápida y grave en hembras que en machos, con supervivencia media de sólo 245 días con respecto a 406 días para los varones. Aunque muchos de los ratones hembra serán sintomáticos (proteinuria) a los siete a nueve meses de edad, algunos pueden ser mucho más jóvenes

o mayores cuando desarrollan síntomas. La nefritis inmunitaria mortal en los ratones NZBW es muy similar a la glomerulonefritis observada en LES humano, haciendo que este modelo murino espontáneo sea muy atractivo para probar el potencial de agentes terapéuticos para LES (Putterman y Naparstek, “Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus” en Autoimmune Disease Models: A Guidebook, páginas 217-234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan y col., J. Immunol. 154:1470 (1995); y Daikh y col., J. Immunol. 159:3104 (1997)).

Como se describe por Gross y col., publicación internacional nº WO00/40716, las proteínas de TACIinmunoglobulina pueden administrarse a ratones NZBW para monitorizar su efecto supresor sobre linfocitos B durante el periodo de cinco semanas cuando se cree que, de promedio, la producción de autoanticuerpos de linfocitos B está a altos niveles en ratones NZBW. Brevemente, 100 ratones hembra de 8 semanas de edad (NZB x NZW)F1 pueden dividirse en seis grupos de 15 ratones. Antes del tratamiento, los ratones se monitorizan una vez al mes para proteína en orina, y se extrajo sangre para bancos de CBC y de suero. El suero puede cribarse para la presencia de autoanticuerpos. Debido a que la proteinuria es el signo distintivo de la glomerulonefritis, los niveles de proteína en orina se monitorizan por tiras reactivas a intervalos regulares durante el transcurso del estudio. El tratamiento puede empezar cuando los ratones tienen aproximadamente cinco meses de edad. Los ratones reciben inyecciones intraperitoneales de vehículo solo (solución salina tamponada con fosfato) o proteína de TACIinmunoglobulina humana (proteína de control) o de TACI-inmunoglobulina (por ejemplo, 20 a 100 !g de proteína de prueba por dosis) tres veces a la semana durante cinco semanas.

La sangre se recoge dos veces durante el tratamiento, y se recogerá al menos dos veces tras el tratamiento. Los valores de las tiras reactivas de orina para proteinuria y los pesos corporales se determinan cada dos semanas después de empezar el tratamiento. Se recogen sangre, valor de tiras reactivas de orina y peso corporal en el momento de la eutanasia. El bazo y el timo se dividen para análisis de citometría de flujo activada por fluorescencia e histología. También se recogen glándulas salivales submandibulares, la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos, lóbulo del hígado con vesícula biliar, intestino ciego y grueso, estómago, intestino delgado, páncreas, riñón derecho, glándula suprarrenal, lengua con tráquea y esófago, corazón y pulmones para la histología.

Se han usado modelos murinos para encefalomielitis alérgica experimental como herramienta para investigar tanto los mecanismos de enfermedad inmunomediada como los procedimientos de posible intervención terapéutica. El modelo se parece a esclerosis múltiple humana, y produce desmielinización como resultado de la activación de linfocitos T para neuroproteínas tales como proteína básica de mielina, o proteína de proteolípido. La inoculación con antígeno conduce a la inducción de CD4+, linfocitos T restringidos al MHC de clase II (Th1). Los cambios en el protocolo para encefalomielitis alérgica experimental pueden producir variantes agudas, de recaída crónica o de transferencia pasiva del modelo (Weinberg y col., J. Immunol. 162:1818 (1999); Mijaba y col., Cell. Immunol. 186: 94 (1999); y Glabinski, Meth. Enzym. 288:182 (1997)).

Gross y col., publicación internacional nº WO00/40716, describen un enfoque para evaluar la eficacia de proteínas de TACI-inmunoglobulina en la mejora de síntomas asociados a encefalomielitis alérgica experimental. Brevemente, a 25 ratones PLxSJL F1 hembra (12 semanas de edad) se les administra una inyección subcutánea de 125 !g/ratón de antígeno (proteína de proteolípido de mielina, PLP, residuos 139-151), formulada en adyuvante completo de Freund. Los ratones se dividen en cinco grupos de cinco ratones. Se administran inyecciones intraperitoneales de toxina de pertussis (400 ng) en el día 0 y 2. A los grupos se les administra una dosis de 1x, 10x o 100x de proteína de TACI-inmunoglobulina, un grupo recibirá vehículo solo, y un grupo no recibirá tratamiento. La terapia de prevención empieza el día 0, la terapia de intervención empieza el día 7, o en la aparición de signos clínicos. Los signos de enfermedad, pérdida de peso y la parálisis se manifiestan en aproximadamente 10 a 14 días, y duran durante aproximadamente una semana. Los animales se evalúan diariamente recogiendo pesos corporales y asignando una puntuación clínica que se corresponde con el grado de sus síntomas. Los signos clínicos de encefalomielitis alérgica experimental aparecen en el plazo de 10 a 14 días desde la inoculación y persisten durante aproximadamente una semana. Al final del estudio, todos los animales se sacrifican por sobredosis de gas y se les practica la autopsia. El cerebro y la columna vertebral se recogen para histología o se congelan para análisis de ARNm. Los datos de peso corporal y puntuación clínica se representan por individuo y por grupo.

En el modelo de artritis inducida por colágeno, los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se parece mucho a artritis reumatoide humana. Como la artritis inducida por colágeno comparte características inmunológicas y patológicas similares con la artritis reumatoide, esto hace que sea un modelo ideal para el cribado de posibles compuestos antiinflamatorios humanos. Otra ventaja de usar el modelo de artritis inducido por colágeno es que los mecanismos de patogénesis son conocidos. Se han identificado epítopes de linfocitos T y B en el colágeno de tipo II, y se han determinado diversos parámetros inmunológicos (hipersensibilidad de tipo retardado y anticuerpo anticolágeno) e inflamatorios (citocinas, quimiocinas y enzimas de degradación de la matriz) relacionados con la artritis inmunomediada, y pueden usarse para evaluar la eficacia de compuestos de prueba en los modelos (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407 (1999); Williams y col., Immunol. 89:9784 (1992); Myers y col., Life Sci. 61:1861 (1997); y Wang y col., Immunol. 92:8955 (1995)).

Gross y col., publicación internacional nº WO00/40716, describen un procedimiento para evaluar la eficacia de proteínas de TACI-inmunoglobulina en la mejora de síntomas asociados a artritis inducida por colágeno. En resumen, ratones DBA/1J macho de de 8 semanas de edad (Jackson Labs) se dividen en grupos de cinco ratones/grupo y se les administran dos inyecciones subcutáneas de 50 a 100 !l de 1 mg/ml de colágeno (origen de pollo o bovino), a intervalos de tres semanas. Un control no recibe inyecciones de colágeno. La primera inyección se formula en adyuvante completo de Freund, y la segunda inyección se formula en adyuvante incompleto de Freund. La proteína de TACI-inmunoglobulina se administra profilácticamente en o antes de la segunda inyección, o después de que el animal desarrolle una puntuación clínica de dos o más que persiste al menos 24 horas. Los animales empiezan a mostrar síntomas de artritis tras la segunda inyección de colágeno, normalmente en el plazo de dos a tres semanas. Por ejemplo, pueden administrarse TACI-Fc, una proteína de control, IgFc humana o solución salina tamponada con fosfato (vehículo) profilácticamente empezando siete días antes de la segunda inyección (día -7). Las proteínas pueden administrarse a 100 !g, administrarse tres veces a la semana como una inyección intraperitoneal de 200 !l, y se continúa durante cuatro semanas.

En el modelo de artritis inducida por colágeno, el grado de enfermedad se evalúa en cada pata usando un calibrador para medir el espesor de la pata y asignando una puntuación clínica a cada pata. Por ejemplo, una puntuación clínica de “0” indica un ratón normal, una puntuación de “1” indica que uno o más dedos de la pata están inflamados, una puntuación de “2” indica inflamación leve de la pata, una puntuación de “3” indica inflamación moderada de la pata y una puntuación de “4” indica inflamación grave de la pata. Los animales se sacrifican después de haberse establecido la enfermedad durante un periodo fijo de tiempo, normalmente siete días. Las patas se recogen para histología o análisis de ARNm, y el suero se recoge para ensayos de inmunoglobulina y citocinas.

La miastenia grave es otra enfermedad autoinmunitaria para la que están disponibles modelos murinos. La miastenia grave es un trastorno de transmisión neuromuscular que implica la producción de autoanticuerpos dirigidos contra el receptor nicotínico de acetilcolina. Esta enfermedad es adquirida o heredada con características que incluyen debilidad anormal y fatiga de esfuerzo.

Se ha establecido un modelo murino de miastenia grave (Christadoss y col., “Establishment of a Mouse Model of Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravis Pathogenesis for Immune Intervention” en Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi and Bixler (Eds.), páginas 195-199 (1995)). La miastenia grave autoinmune experimental es una enfermedad mediada por anticuerpos caracterizada por la presencia de anticuerpos para el receptor de acetilcolina. Estos anticuerpos destruyen el receptor conduciendo a impulsos eléctricos neuromusculares defectuosos, produciendo debilidad muscular. En el modelo de miastenia grave autoinmune experimental, los ratones se inmunizan con el receptor nicotínico de acetilcolina. Los signos clínicos de miastenia grave se vuelven evidentes semanas después de la segunda inmunización. La miastenia grave autoinmune experimental se evalúa por varios procedimientos que incluyen medición de niveles en suero de anticuerpos receptores de acetilcolina por radioinmunoensayo (Christadoss y Dauphinee, J. Immunol. 136:2437 (1986); Lindstrom y col., Methods Enzymol. 74:432 (1981)), medición del receptor de acetilcolina muscular, o electromiografía (Coligan y col. (Eds.), Protocols in Immunology, vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).

El efecto de TACI-inmunoglobulina sobre la miastenia grave autoinmune experimental pueden determinarse administrando proteínas de fusión durante miastenia grave clínica en curso en ratones B6. Por ejemplo, 100 ratones B6 se inmunizan con 20 !g de receptor de acetilcolina en adyuvante completo de Freund los días 0 y 30. Aproximadamente del 40 al 60% de los ratones desarrollará miastenia grave clínica de moderada (grado 2) a grave (grado 3) después del refuerzo con receptor de acetilcolina. Los ratones con enfermedad clínica de grado 2 y 3 se dividen en tres grupos (con grados iguales de debilidad) y se pesan (los ratones con debilidad también pierden peso, ya que tienen dificultad para consumir alimentos y agua) y se sangran para suero (para anticuerpo anti-receptor de acetilcolina y nivel de isotipo antes del tratamiento). El grupo A se inyecta I.P con solución salina tamponada con fosfato, el grupo B se inyecta intraperitonealmente con IgG-Fc humana como proteína de control (100 !g) y el grupo C se inyecta con 100 !g de TACI-Fc tres veces a la semana durante cuatro semanas. Los ratones se criban para la debilidad muscular clínica dos veces a la semana y se pesan y se sangran para suero 15 y 30 días después del comienzo del tratamiento. La sangre completa se recoge el día 15 para determinar la relación de linfocitos T/B por análisis de citometría de flujo activada por fluorescencia usando marcadores B220 y CD5. Los ratones supervivientes se sacrifican 30 a 45 días después del inicio del tratamiento, y sus cuerpos muertos se congelan para la posterior extracción de receptor de acetilcolina muscular para determinar la pérdida de receptor de acetilcolina muscular, la patología primaria en miastenia grave (véase, por ejemplo, Coligan y col. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).

Los anticuerpos en suero para el receptor de acetilcolina muscular de ratón pueden determinarse por un radioinmunoensayo establecido, y los isotipos de anticuerpos anti-receptor de acetilcolina (IgM, IgG1, IgG2b y IgG2c) se miden por ELISA. Tales procedimientos son conocidos. Se determinan los efectos de TACIinmunoglobulina sobre la miastenia grave clínica en curso, el anticuerpo anti-receptor de acetilcolina y el nivel de isotipo, y la pérdida de receptor de acetilcolina muscular.

Aproximadamente 100 ratones pueden inmunizarse con 20 !g de receptor de acetilcolina en adyuvante completo de Freund en el día 0 y 30. Los ratones con miastenia grave clínica se dividen en cuatro grupos. El grupo A se inyecta intraperitonealmente con 100 !g de Fc de control, el grupo B se inyecta con 20 !g de Fc de control, el grupo C se inyecta con 100 !g de TACI-Fc y el grupo D se inyecta con 20 !g de TACI-Fc tres veces a la semana durante cuatro semanas. Los ratones se pesan y se sangran para suero antes y 15 y 30 días después del inicio del tratamiento. El suero se prueba para anticuerpo anti-receptor de acetilcolina e isotipos como se ha descrito anteriormente. También puede medirse la pérdida de receptor de acetilcolina muscular.

Los expertos en la materia pueden determinar otros ensayos adecuados de proteínas de fusión de TACIinmunoglobulina.

6. Producción de conjugados de TACI-inmunoglobulina

La presente memoria descriptiva describe composiciones de TACI-inmunoglobulina químicamente modificadas en las que un polipéptido de TACI-inmunoglobulina está ligado a un polímero. Normalmente, el polímero es soluble en agua de manera que el conjugado de TACI-inmunoglobulina no precipita en un entorno acuoso tal como un entorno fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es uno que ha sido modificado para tener un único grupo reactivo, tal como un éster activo para la acilación, o un aldehído para la alquilación. De esta forma puede controlarse el grado de polimerización. Un ejemplo de un aldehído reactivo es propionaldehído de polietilenglicol, o mono-alcoxi (C1-C10), o derivados de ariloxi del mismo (véase, por ejemplo, Harris y col., patente de EE.UU. nº 5.252.714). El polímero puede estar ramificado o sin ramificar. Además, puede usarse una mezcla de polímeros para producir conjugados de TACI-inmunoglobulina.

Los conjugados de TACI-inmunoglobulina usados para terapia pueden comprender restos de polímero solubles en agua farmacéuticamente aceptables. Polímeros solubles en agua adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-alcoxi (C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinilpirrolidona)-PEG, tresilmonometoxi-PEG, propionaldehído de PEG, bis-succinimidilcarbonato-PEG, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico), dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en hidratos de carbono. PEG adecuados pueden tener un peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60.000 que incluyen, por ejemplo, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado de TACI-inmunoglobulina también puede comprender una mezcla de tales polímeros solubles en agua.

Un ejemplo de un conjugado de TACI-inmunoglobulina comprende un resto de TACI-inmunoglobulina y un resto de poli(óxido de alquilo) unido al extremo N de la TACI-inmunoglobulina. El PEG es un poli(óxido de alquilo) adecuado. Como ilustración, la TACI-inmunoglobulina puede modificarse con PEG, un procedimiento conocido como “PEGilación”. La PEGilación de TACI-inmunoglobulina puede llevarse a cabo por cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, el documento EP 0 154 316, Delgado y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994) y Francis y col., Int J Hematol 68:1 (1998)). Por ejemplo, la PEGilación puede realizarse por una reacción de acilación o por una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva. En un enfoque alternativo, conjugados de TACI-inmunoglobulina se forman condensando PEG activado, en el que un grupo hidroxi o amino del extremo de PEG se ha sustituido con un ligador activado (véase, por ejemplo, Karasiewicz y col., patente de EE.UU. nº 5.382.657).

La PEGilación por acilación normalmente requiere hacer reaccionar un derivado de éster activo de PEG con un polipéptido de TACI-inmunoglobulina. Un ejemplo de un éster de PEG activado es PEG esterificado con Nhidroxisuccinimida. Como se usa en este documento, el término “acilación” incluye los siguientes tipos de enlaces entre TACI-inmunoglobulina y un polímero soluble en agua: amida, carbamato, uretano y similares. Los procedimientos para preparar TACI-inmunoglobulina PEGilada por acilación comprenderán normalmente las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido de TACI-inmunoglobulina con PEG (tal como un éster reactivo de un aldehído derivado de PEG) en condiciones por las que uno o más grupos PEG se unen a TACI-inmunoglobulina, y (b) obtener el (los) producto(s) de reacción. Generalmente, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán basándose en parámetros conocidos y resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relación de PEG:TACI-inmunoglobulina, mayor será el porcentaje de producto de TACI-inmunoglobulina poliPEGilado.

El producto de PEGilación por acilación es normalmente un producto de TACI-inmunoglobulina poliPEGilado, en el que los grupos £-amino de lisina se PEGilan por un grupo de enlace acilo. Un ejemplo de un enlace de conexión es una amida. Normalmente, la TACI-inmunoglobulina resultante estará mono-, di-, o tri-pegilada al menos el 95%, aunque pueden formarse algunas especies con mayores grados de PEGilación dependiendo de las condiciones de reacción. Las especies PEGiladas pueden separarse de polipéptidos de TACI-inmunoglobulina sin conjugar usando procedimientos de purificación convencionales tales como diálisis, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares.

La PEGilación por alquilación generalmente implica hacer reaccionar un derivado de aldehído terminal de PEG con TACI-inmunoglobulina en presencia de un agente reductor. Los grupos PEG pueden unirse al polipéptido por un grupo -CH2-NH.

La derivatización por alquilación reductora para producir un producto mono-PEGilado aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios disponibles para la derivatización. Normalmente, la reacción se realiza a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos £-amino de los residuos de lisina y el grupo a-amino del residuo del extremo N de la proteína. Por tal derivatización selectiva se controla la unión de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído a una proteína. La conjugación con el polímero se produce predominantemente en el extremo N de la proteína sin modificación significativa de otros grupos reactivos tales como los grupos amino de la cadena lateral de lisina. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de conjugados de monopolímeros de TACIinmunoglobulina.

La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de molécula de conjugado de TACI-inmunoglobulina monopolimérico puede comprender las etapas de: (a) hacer reaccionar un polipéptido de TACI-inmunoglobulina con un PEG reactivo bajo condiciones de alquilación reductoras a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo a-amino en el extremo amino de la TACI-inmunoglobulina, y (b) obtener el (los) producto(s) de reacción. El agente reductor usado para la alquilación reductora debe ser estable en disolución acuosa y puede reducir sólo la base de Schiff formada en el procedimiento inicial de alquilación reductora. Agentes reductores ilustrativos incluyen borohidruro de sodio, sodio, dimetilamina-borano, trimetilamina-borano y piridina-borano.

Para una población sustancialmente homogénea de conjugados de TACI-inmunoglobulina monopoliméricos, las condiciones de la reacción de alquilación reductora son aquellas que permiten la unión selectiva del resto de polímero soluble en agua al extremo N de TACI-inmunoglobulina. Tales condiciones de reacción proporcionan generalmente diferencias de pKa entre los grupos amino de lisina y el grupo a-amino en el extremo N. El pH también afecta la relación de polímero con respecto a proteína que va a usarse. En general, si el pH es menor, se deseará un mayor exceso de polímero con respecto a proteína debido a que cuanto menos reactivo sea el grupo a del extremo N, más polímero se necesitará para lograr condiciones óptimas. Si el pH es mayor, polímero:TACI-inmunoglobulina no necesita ser tan grande debido a que están disponibles más grupos reactivos. Normalmente, el pH se encontrará dentro del intervalo de 3 a 9, o 3 a 6.

Otro factor a considerar es el peso molecular del polímero soluble en agua. Generalmente, cuanto mayor sea el peso molecular del polímero, menor será el número de moléculas de polímero que pueden unirse a la proteína. Para las reacciones de PEGilación, el peso molecular es aproximadamente a aproximadamente 100 kDa, aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 12 kDa a aproximadamente 25 kDa. La relación molar de polímero soluble en agua con respecto a TACI-inmunoglobulina estará generalmente en el intervalo de 1:1 a 100:1. Normalmente, la relación molar de polímero soluble en agua con respecto a TACIinmunoglobulina será 1:1 a 20:1 para la poliPEGilación, y 1:1 a 5:1 para la monoPEGilación.

Los procedimientos generales para producir conjugados que comprenden un polipéptido y restos de polímeros solubles en agua se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Karasiewicz y col., patente de EE.UU. nº 5.382.657, Greenwald y col., patente de EE.UU. nº 5.738.846, Nieforth y col., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh y col., Anal. Biochem. 247:434 (1997)).

La presente memoria descriptiva describe composiciones que comprenden un péptido o polipéptido descrito en este documento. Tales composiciones pueden comprender adicionalmente un vehículo. El vehículo puede ser un vehículo orgánico o inorgánico convencional. Ejemplos de vehículos incluyen agua, disolución de tampón, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz y similares.

7. Aislamiento de polipéptidos de TACI-inmunoglobulina

Los polipéptidos de la presente invención pueden purificarse a al menos aproximadamente el 80% de pureza, a al menos aproximadamente el 90% de pureza, a al menos aproximadamente el 95% de pureza, o superior al 95% de pureza con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes infecciosos y pirógenos. Los polipéptidos de la presente invención también pueden purificarse a un estado farmacéuticamente puro que es superior al 99,9% de pureza. En ciertas preparaciones, el polipéptido purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal.

Pueden usarse procedimientos de fraccionamiento y/o de purificación convencionales para obtener preparaciones de polipéptidos de TACI-inmunoglobulina sintéticos, y polipéptidos de TACI-inmunoglobulina recombinantes purificados a partir de células huésped recombinantes. En general, la precipitación con sulfato de amonio y la extracción con ácido o caótropo pueden usarse para el fraccionamiento de muestras. Etapas de purificación a modo de ejemplo pueden incluir hidroxiapatita, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. Medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especializados y similares. Son adecuados derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Medios cromatográficos a modo de ejemplo incluyen aquellos medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo tales como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticulada, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada y similares que son insolubles en las condiciones en que van a usarse. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de hidrato de carbono.

Ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con Nhidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida y derivados de carboxilo y amino para químicas de acoplamiento a carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son muy conocidos y ampliamente usados en la materia, y están disponibles de proveedores comerciales. La selección de un procedimiento particular para el aislamiento y la purificación de polipéptidos es objeto del diseño rutinario y se determina en parte por las propiedades del soporte elegido. Véanse, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) y Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996).

Variaciones adicionales en el aislamiento y la purificación de TACI-inmunoglobulina pueden ser creados por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos anti-TACI o anti-Fc para aislar grandes cantidades de proteína por purificación por inmunoafinidad.

Los polipéptidos de la presente invención también pueden aislarse por explotación de propiedades particulares. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina que incluyen aquellas que comprenden marcas de polihistidina. Brevemente, un gel se carga primero con iones de metal divalente para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán a esta matriz con afinidades diferentes que dependerán del ión metálico usado, y se eluirán por elución competitiva, reducción del pH o uso de agentes quelantes fuertes. Otros procedimientos de purificación incluyen purificación de proteínas glicosiladas por cromatografía de afinidad con lectina, cromatografía con proteína A y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol.

182:529 (1990)).

Los polipéptidos de TACI-inmunoglobulina o fragmentos de los mismos también pueden prepararse por síntesis química, como se ha descrito anteriormente. Los polipéptidos de TACI-inmunoglobulina pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; PEGilados o no PEGilados; y pueden o pueden no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial. Una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina puede estar no glicosilada, glicosilada o glicosilada sólo en el resto de TACI o en el resto de inmunoglobulina. El resto de inmunoglobulina puede obtenerse a partir de un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

8. Usos terapéuticos de polipéptidos de TACI-inmunoglobulina

Las proteínas de TACI-inmunoglobulina pueden usarse para modular el sistema inmunitario uniendo ZTNF4 o ZTNF2 y, por tanto, previniendo la unión de estos ligandos a receptores de TACI o BCMA endógenos. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe el uso de proteínas de TACI-inmunoglobulina para un sujeto que carece de una cantidad adecuada de receptores de TACI o BCMA, o que produce un exceso de ZTNF4 o ZTNF2. Estas moléculas pueden administrarse a cualquier sujeto en necesidad de tratamiento, y la presente invención contempla usos terapéuticos tanto veterinarios como humanos. Sujetos ilustrativos incluyen sujetos mamíferos tales como animales de granja, animales domésticos y pacientes humanos.

Los polipéptidos de TACI-inmunoglobulina pueden usarse para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, cánceres de linfocitos B, inmunomodulación, EII y cualquier patología mediada por anticuerpos (por ejemplo, ITCP, miastenia grave y similares), enfermedad renales, respuesta inmunitaria a linfocitos T indirecta, rechazo de injerto y enfermedad de injerto frente a huésped. Los polipéptidos de la presente invención pueden elegirse como diana para regular específicamente las respuestas de linfocitos B durante la respuesta inmunitaria. Adicionalmente, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para modular el desarrollo de linfocitos B, el desarrollo de otras células, producción de anticuerpos y producción de citocinas. Los polipéptidos de la presente invención también pueden modular la comunicación de linfocitos T y B neutralizando los efectos proliferativos de ZTNF4.

Los polipéptidos de TACI-inmunoglobulina de la presente invención pueden ser útiles para neutralizar los efectos de ZTNF4 para tratar leucemias de linfocitos B precursores o de linfocitos B tales como leucemia de células plasmáticas, leucemia linfocítica crónica o aguda, mielomas tales como mieloma múltiple, mieloma de células plasmáticas, mieloma endotelial y mieloma de células gigantes y linfomas tales como linfoma no Hodgkin, a los cuales está asociado un aumento en los polipéptidos de ZTNF4.

ZTNF4 se expresa en células CD8+, monocitos, células dendríticas, monocitos activados, que indica que, en ciertos trastornos autoinmunitarios, los linfocitos T citotóxicos podrían estimular la producción de linfocitos B mediante la producción en exceso de ZTNF4. Las proteínas inmunodepresoras que bloquean selectivamente la acción de linfocitos B serían útiles en el tratamiento de enfermedad. La producción de autoanticuerpos es común a varias enfermedades autoinmunitarias y contribuye a la destrucción de tejidos y a la exacerbación de enfermedad. Los autoanticuerpos también pueden conducir a la aparición de complicaciones en la deposición de complejos inmunes y conducen a muchos síntomas de lupus eritematoso sistémico, que incluyen insuficiencia renal, síntomas neurálgicos y muerte. La modulación de la producción de anticuerpos independiente de respuesta celular también sería beneficiosa en muchos estados de enfermedad. También se ha mostrado que los linfocitos B desempeñan una función en la secreción de inmunoglobulinas artritogénicas en artritis reumatoide. Como tal, la inhibición de la producción de anticuerpos para ZTNF4 sería beneficiosa en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como miastenia grave, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil de evolución poliarticular y artritis psoriásica. Los agentes terapéuticos inmunosupresores tales como proteínas de TACI-inmunoglobulina que bloquean o neutralizan selectivamente la acción de linfocitos B serían útiles para tales fines.

La invención proporciona usos que emplean proteínas de TACI-inmunoglobulina como se define en las reivindicaciones para bloquear o neutralizar selectivamente las acciones de linfocitos B en asociación con enfermedad renales terminales que pueden o pueden no asociarse a enfermedades autoinmunitarias. Tales usos también serían útiles para tratar enfermedades renales inmunológicas. Tales usos serían útiles para tratar glomerulonefritis asociada a enfermedades tales como nefropatía membranosa, nefropatía por IgA o enfermedad de Berger, nefropatía por IgM, enfermedad de Goodpasture, glomerulonefritis postinfecciosa, enfermedad mesangioproliferativa, leucemia linfoide crónica, síndrome nefrótico con cambio mínimo. Tales usos también servirían de aplicaciones terapéuticas para tratar glomerulonefritis secundaria o vasculitis asociada a tales enfermedades como lupus, poliarteritis, Henoch-Schonlein, esclerodermia, enfermedades relacionadas con el VIH, amiloidosis o síndrome urémico hemolítico. Los usos de la presente invención también serían útiles como parte de una aplicación terapéutica para tratar nefritis intersticial o pielonefritis asociada a pielonefritis crónica, abuso de analgésicos, nefrocalcinosis, nefropatía producida por otros agentes, nefrolitiasis o nefritis intersticial crónica o aguda.

Los usos descritos en este documento también incluyen el uso de proteínas de TACI-inmunoglobulina en el tratamiento de enfermedades hipertensivas o de vasos grandes que incluyen estenosis de la arteria renal u oclusión y émbolos por colesterol o émbolos renales.

La presente invención también proporciona tratamiento de neoplasias renales o urológicas, mielomas múltiples, linfomas, neuropatía o amiloidosis de la cadena ligera, como se define en las reivindicaciones.

La invención también proporciona bloquear o inhibir linfocitos B activados usando proteínas de TACIinmunoglobulina como se define en las reivindicaciones para el tratamiento de asma y otras enfermedades de las vías respiratorias crónicas tales como bronquitis y enfisema. Las proteínas de TACI-inmunoglobulina descritas en este documento también pueden usarse para tratar síndrome de Sjögren.

También se proporcionan usos para inhibir o neutralizar una respuesta de linfocitos T efectores usando proteínas de TACI-inmunoglobulina para su uso en inmunosupresión, en particular para uso terapéutico tal como para enfermedad de injerto frente a huésped y rechazo de injerto. Además, las proteínas de TACI-inmunoglobulina serían útiles en protocolos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) y enfermedad de Crohn. La presente invención tiene valor terapéutico adicional para tratar enfermedades inflamatorias crónicas, en particular para reducir dolor de articulaciones, hinchazón, anemia y otros síntomas asociados, además de tratar choque séptico.

Están disponibles modelos animales bien establecidos para probar la eficacia in vivo de proteínas de TACIinmunoglobulina de la presente invención en ciertos estados de enfermedad. En particular, las proteínas de TACIinmunoglobulina pueden probarse in vivo en varios modelos animales de enfermedad autoinmunitaria tales como cepas de ratón congénitas MRL-lpr/lpr o NZB x NZW F1 que sirven de modelo de LES (lupus eritematoso sistémico). Tales modelos animales se conocen en la técnica.

Las crías de un cruce entre ratones negros de Nueva Zelanda (NZB) y blancos de Nueva Zelanda (NZW) desarrollan una forma espontánea de LES que se parece mucho a LES en seres humanos. Los ratones hijo, conocidos como NZBW, empiezan a desarrollar autoanticuerpos IgM contra linfocitos T al mes de edad, y a los 5-7 meses de edad, Ios autoanticuerpos Ig anti-ADN son la inmunoglobulina dominante. La hiperactividad de linfocitos B policlonales conduce a la producción en exceso de autoanticuerpos. La deposición de estos autoanticuerpos, particularmente aquellos dirigidos contra ADN monocatenario, está asociada al desarrollo de glomerulonefritis, que se manifiesta clínicamente como proteinuria, azoemia y muerte de insuficiencia renal. La insuficiencia renal es la causa principal de muerte en ratones afectados con LES espontánea, y en la cepa de NZBW, este proceso es crónico y restrictivo. La enfermedad es más rápida y grave en hembras que en machos, con supervivencia media de sólo 245 días con respecto a 406 días para los varones. Aunque muchos de los ratones hembra serán sintomáticos (proteinuria) a los 7-9 meses de edad, algunos pueden ser mucho más jóvenes o mayores cuando desarrollan síntomas. La nefritis inmunitaria mortal en los ratones NZBW es muy similar a la glomerulonefritis observada en LES humano, haciendo que este modelo murino espontáneo sea útil para probar el potencial de agentes terapéuticos para LES.

Se han usado modelos de ratón para encefalomielitis alérgica experimental (EAE) como herramienta para investigar tanto los mecanismos de enfermedad inmunomediada como los procedimientos de posible intervención terapéutica. El modelo se parece a esclerosis múltiple humana, y produce desmielinización como resultado de la activación de linfocitos T para neuroproteínas tales como proteína básica de mielina (MBP), o proteína de proteolípido (PLP). La inoculación con antígeno conduce a la inducción de CD4+, linfocitos T restringidos al MHC de clase II (Th1). Los cambios en el protocolo para EAE pueden producir variantes agudas, de recaída crónica o de transferencia pasiva del modelo.

En el modelo de artritis inducida por colágeno (AIC), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se parece mucho a la artritis reumatoide humana (AR). Como la AIC comparte características inmunológicas y patológicas similares con AR, esto hace que sea un modelo ideal para el cribado de posibles compuestos antiinflamatorios humanos. Otra ventaja de usar el modelo de AIC es que los mecanismos de patogénesis son conocidos. Se han identificado epítopes de linfocitos T y B en el colágeno de tipo II, y se han determinado diversos parámetros inmunológicos (hipersensibilidad de tipo retardado y anticuerpo anti-colágeno) e inflamatorios (citocinas, quimiocinas y enzimas de degradación de la matriz) relacionados con la artritis inmunomediada, y pueden usarse para evaluar la eficacia de compuestos de prueba en los modelos.

La miastenia grave (MG) es otra enfermedad autoinmunitaria para la que están disponibles modelos murinos. La MG es un trastorno de transmisión neuromuscular que implica la producción de autoanticuerpos dirigidos contra el receptor nicotínico de acetilcolina (AChR). La MG es adquirida o heredada con características que incluyen debilidad anormal y fatiga de esfuerzo. Se ha establecido un modelo de ratón de MG. La miastenia grave autoinmune experimental (MGAE) es una enfermedad mediada por anticuerpos caracterizada por la presencia de anticuerpos para AChR. Estos anticuerpos destruyen el receptor conduciendo a impulsos eléctricos neuromusculares defectuosos, produciendo debilidad muscular. En el modelo de MGAE, los ratones se inmunizan con el receptor nicotínico de acetilcolina. Los signos clínicos de MG se vuelven evidentes semanas después de la segunda inmunización. La MGAE se evalúa por varios procedimientos que incluyen medición de niveles en suero de anticuerpos AChR por radioinmunoensayo, medición de AChR muscular o electromiografía.

Generalmente, la dosificación de proteína de TACI-inmunoglobulina administrada variará dependiendo de factores tales como edad del sujeto, peso, altura, sexo, condición médica general e historia médica previa. Normalmente se desea proveer al receptor de una dosificación de proteína de TACI-inmunoglobulina que esté en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal de sujeto), aunque también puede administrarse una menor o mayor dosificación según dicten las circunstancias.

La administración de una proteína de TACI-inmunoglobulina a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, por perfusión por un catéter regional, o por inyección intralesional directa. Si se administran proteínas terapéuticas mediante inyección, la administración puede ser por infusión continua o por bolos únicos o múltiples.

Vías de administración adicionales incluyen oral, a la membrana mucosa, pulmonar y transcutánea. La administración por vía oral es adecuada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinoides, microesferas de policianoacrilato y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, “Oral Delivery of Microencapsulated Proteins” en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). La viabilidad de una administración intranasal se ejemplifica por un modo tal de administración insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe y Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Pueden prepararse partículas secas o líquidas que comprenden TACI-inmunoglobulina e inhalarse con la ayuda de dispersadores de polvo seco, generadores de aerosol líquido o nebulizadores (por ejemplo, Pettit y Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Este enfoque se ilustra por el sistema de control de la diabetes AERX, que es un inhalador electrónico de mano que administra insulina aerosolizada a los pulmones. Los estudios han mostrado que proteínas de hasta 48.000 kDa han sido administradas a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonidos de baja frecuencia, que ilustra la viabilidad de la administración transcutánea (Mitragotri y col., Science 269:850 (1995)). La administración transdérmica usando electroporación proporciona otro medio para administrar una proteína de TACI-inmunoglobulina (Potts y col., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).

Una composición farmacéutica que comprende una proteína de TACI-inmunoglobulina puede formularse según procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un “vehículo farmacéuticamente aceptable” si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. Solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados son muy conocidos para aquellos en la materia. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995).

Para los fines de terapia, las proteínas de TACI-inmunoglobulina se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una proteína de TACI-inmunoglobulina y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran en una “cantidad terapéuticamente eficaz” si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativa si su presencia produce un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria. Como otro ejemplo, un agente usado para inhibir el crecimiento de células tumorales es fisiológicamente significativo si la administración del agente produce una disminución en el número de células tumorales, disminución de metástasis, una disminución en el tamaño de un tumor sólido, o aumento de la necrosis de un tumor. Además, un agente usado para tratar lupus eritematoso sistémico es fisiológicamente significativo si la administración del agente produce una disminución de anticuerpos anti-ADN bicatenario en circulación, o una disminución en al menos uno de los siguientes síntomas: fiebre, dolor de articulaciones, lesiones eritematosas de la piel u otras características de lupus eritematoso sistémico. Un ejemplo de una indicación general de que una proteína de TACI-inmunoglobulina se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz es que, tras la administración a un sujeto, hay una disminución en los niveles de ZTNF4 en circulación (BLyS).

Una composición farmacéutica que comprende una proteína de TACI-inmunoglobulina puede proporcionarse en forma líquida, en un aerosol o en forma sólida. Formas líquidas se ilustran por disoluciones inyectables y suspensiones orales. Formas sólidas a modo de ejemplo incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. La última forma se ilustra por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer y col., Pharm. Biotechnol.

10:239 (1997); Ranade, “Implants in Drug Delivery” en Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer y col., “Protein Delivery with Infusion Pumps” en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey y col., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant” en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)).

Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto intravenosamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutáneamente, o por administración por vía oral, inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas de lípidos que rodean los compartimentos acuosos (véase, generalmente, Bakker-Woudenberg y col., Eur.

J. Clin. Microbiol Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) y Ranade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers” en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y, como resultado, los liposomas pueden administrarse con seguridad y son biodegradables. Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilaminares o multilaminares, y los liposomas pueden variar en tamaño con diámetros que oscilan de 0,02 !m a más de 10 !m. Una variedad de agentes pueden estar encapsulados en liposomas: reparto de agentes hidrófobos en las bicapas y reparto de agentes hidrófilos dentro del (de los) espacio(s) acuosos(s) interno(s) (véase, por ejemplo, Machy y col., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), y Ostro y col., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño del liposoma, el número de bicapas, composición de lípidos, además de las características de carga y superficie de los liposomas.

Los liposomas pueden adsorberse a prácticamente cualquier tipo de célula y luego liberar lentamente el agente encapsulado. Alternativamente, un liposoma absorbido puede ser endocitado por células que son fagocíticas. La endocitosis va seguida de degradación intralisosómica de lípidos liposómicos y liberación de los agentes encapsulados (Scherphof y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 !m) son normalmente absorbidos por células del sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente en el hígado y el bazo, mientras que los liposomas superiores a 3,0 !m se depositan en el pulmón. Esta captación preferencial de liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha usado para administrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado.

El sistema reticuloendotelial puede ser sorteado por varios procedimientos que incluyen saturación con grandes dosis de partículas de liposomas, o inactivación de macrófagos selectivos por medios farmacológicos (Claassen y col., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Además, se ha mostrado que la incorporación de fosfolípidos derivatizados de glicolípidos o polietilenglicoles a membranas de liposomas produce una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

Los liposomas también pueden prepararse para elegir como diana células u órganos particulares variando la composición de los fosfolípidos o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, los liposomas preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico se han usado para elegir como diana el hígado (Hayakawa y col., patente japonesa 04-244.018; Kato y col., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, a-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío y luego reconstituyendo la mezcla con agua. También se ha mostrado que una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) elige como diana el hígado (Shimizu y col., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).

Alternativamente, diversos ligandos de elección de diana pueden unirse a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, hidratos de carbono, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas pueden modificarse con derivados de galactosil-lípido de tipo ramificado para elegir como diana receptores de asialoglicoproteínas (galactosa) que se expresan exclusivamente sobre la superficie de células del hígado (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull,

20:259 (1997)). Similarmente, Wu y col., Hepatology 27:772 (1998), han mostrado que el marcado de liposomas con asialofetuína condujo a una semivida acortada en plasma de liposomas y potenció enormemente la captación de liposoma marcado con asialofetuína por hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosil-lípido de tipo ramificado puede inhibirse mediante preinyección de asialofetuína (Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humana poliaconitilados proporcionan otro enfoque para elegir como diana liposomas para células del hígado (Kamps y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Además, Geho y col., patente de EE.UU. nº 4.603.044, describen un sistema de administración de vesículas dirigido a hepatocitos que tiene especificidad por receptores hepatobiliares asociados a las células metabólicas especializadas del hígado.

En un enfoque más general para elegir como diana tejido, las células diana están premarcadas con anticuerpos biotinilados específicos para un ligando expresado por la célula diana (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Después de la eliminación del plasma del anticuerpo libre se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otro enfoque, los anticuerpos que eligen diana se unen directamente a liposomas (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).

Las proteínas de TACI-inmunoglobulina pueden encapsularse dentro de liposomas usando técnicas convencionales de microencapsulación de proteínas (véanse, por ejemplo, Anderson y col., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson y col., Cancer Res. 50:1853 (1990) y Cohen y col., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving y col., “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies” en Liposome Technology, 2ª edición, vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef y col., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como se ha observado anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados de lípidos de poli(etilenglicol) (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

Se han diseñado microesferas de polímero degradables para mantener altos niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianhídridos, poli(orto-ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables en los que las proteínas están atrapadas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery” en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery” en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus y col., Science 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Las nanoesferas recubiertas de polietilenglicol (PEG) también pueden proporcionar vehículos para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref y col., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)).

La presente memoria descriptiva describe proteínas de TACI-inmunoglobulina químicamente modificadas en las que el polipéptido está ligado a un polímero, como se ha tratado anteriormente.

Los expertos en la materia pueden idear otras formas farmacéuticas como se muestra, por ejemplo, por Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5ª edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995), y por Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Como ilustración, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse como un kit que comprende un recipiente que comprende una proteína de TACI-inmunoglobulina. Los polipéptidos terapéuticos pueden proporcionarse en forma de una disolución inyectable para dosis únicas o múltiples, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Alternativamente, un kit tal puede incluir un dispersador de polvo seco, generador de aerosol líquido

o nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico. Un kit tal puede comprender adicionalmente información por escrito sobre las indicaciones y uso de la composición farmacéutica. Además, tal información puede incluir un comunicado de que la composición de proteína de TACI-inmunoglobulina está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida a tanto el resto del receptor de TACI como el resto de inmunoglobulina.

9. Usos terapéuticos de secuencias de nucleótidos de TACI-inmunoglobulina

La presente memoria descriptiva describe el uso de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina para proporcionar estas proteínas de fusión a un sujeto en necesidad de tal tratamiento. Para uso terapéutico veterinario o uso terapéutico humano, tales moléculas de ácido nucleico pueden administrarse a un sujeto que tiene un trastorno o enfermedad, como se ha tratado anteriormente. Como un ejemplo tratado anteriormente, las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina pueden usarse para tratamiento a largo plazo de lupus eritematoso sistémico.

Hay numerosos enfoques para introducir un gen de TACI-inmunoglobulina a un sujeto, que incluyen el uso de células huésped recombinantes que expresan TACI-inmunoglobulina, administración de ácido nucleico desnudo que codifica TACI-inmunoglobulina, uso de un vehículo de lípido catiónico con una molécula de ácido nucleico que codifica TACI-inmunoglobulina y el uso de virus que expresan TACI-inmunoglobulina, tal como retrovirus recombinantes, virus adenoasociados recombinantes, adenovirus recombinantes y virus del herpes simple recombinantes (véanse, por ejemplo, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg y col., Science 242:1575 (1988), LaSalle y col., Science 259:988 (1993), Wolff y col., Science 247:1465 (1990), Breakfield y Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)). En un enfoque ex vivo, por ejemplo, las células se aíslan de un sujeto, se transfectan con un vector que expresa un gen de TACI-inmunoglobulina y luego se trasplantan al sujeto.

Con el fin de efectuar la expresión de un gen de TACI-inmunoglobulina se construye un vector de expresión en el que una secuencia de nucleótidos que codifica un gen de TACI-inmunoglobulina está operativamente ligado a un promotor mínimo, y opcionalmente un elemento regulador, para controlar la transcripción génica. Los requisitos generales de un vector de expresión se han descrito anteriormente.

Alternativamente, un gen de TACI-inmunoglobulina puede administrarse usando vectores víricos recombinantes que incluyen, por ejemplo, vectores adenovíricos (por ejemplo, Kass-Eisler y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11498 (1993), Kolls y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:215 (1994), Li y col., Hum Gene Ther. 4:403 (1993), Vincent y col., Nat. Genet. 5:130 (1993) y Zabner y col., Cell 75:207 (1993)), vectores de virus asociados a adenovirus (Flotte y col., Proc. Nat'l Acad Sci USA 90:10613 (1993)), alfa-virus tales como el virus del bosque Semliki y el virus Sindbis (Hertz y Huang, J. Vir. 66:857 (1992), Raju y Huang, J. Vir. 65:2501 (1991) y Xiong y col., Science 243:1188 (1989)), vectores de virus del herpes (por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.769.331, 4.859.587, 5.288.641 y 5.328.688), vectores de parvovirus (Koering y col., Hum. Gene Therap. 5:457 (1994)), vectores de poxvirus (Ozaki y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), Panicali y Paoletti, Proc. Nat'l Acad Sci. USA 79:4927 (1982)), poxvirus tales como poxvirus del canario o virus de la variolovacuna (Fisher-Hoch y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA

86:317 (1989) y Flexner y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86 (1989)) y retrovirus (por ejemplo, Baba y col., J. Neurosurg 79:729 (1993), Ram y col., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiya y col., J. Neurosci. Res 33:493 (1992), Vile y Hart, Cancer Res. 53:962 (1993), Vile y Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993) y Anderson y col., patente de EE.UU. nº 5.399.346). Dentro de diversas realizaciones puede utilizarse tanto el propio vector vírico como una partícula vírica que contiene el vector vírico en los procedimientos y composiciones descritos más adelante.

Como ilustración de un sistema, el adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es un vector de transferencia de genes bien caracterizado para la administración de una molécula de ácido nucleico heteróloga (para una revisión véanse Becker y col., Meth Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). El sistema de adenovirus ofrece varias ventajas que incluyen: (i) la capacidad de acomodar insertos de ADN relativamente grandes, (ii) la capacidad de cultivar a alto título, (iii) la capacidad de infectar una amplia gama de tipos de células de mamífero y (iv) la capacidad de usarse con muchos promotores diferentes que incluyen promotores ubicuos, específicos de tejido y regulables. Además, los adenovirus pueden administrarse mediante inyección intravenosa, debido a que los virus son estables en la circulación sanguínea.

Usando vectores de adenovirus en los que las porciones del genoma del adenovirus están delecionadas, los insertos se incorporan en el ADN vírico por ligación directa o por recombinación homóloga con un plásmido cotransfectado. En un sistema a modo de ejemplo, el gen E1 esencial está delecionado del vector vírico, y el virus no se replicará a menos que el gen E1 sea proporcionado por la célula huésped. Si se administra intravenosamente a animales intactos, el adenovirus elige principalmente el hígado como diana. Aunque un sistema de administración adenovírico con una deleción del gen E1 no puede replicarse en las células huésped, el tejido de huésped expresará y procesará una proteína heteróloga codificada. Las células huésped también secretarán la proteína heteróloga si el gen correspondiente incluye una secuencia señal secretora. Las proteínas secretadas entrarán en la circulación a partir del tejido que expresa el gen heterólogo (por ejemplo, el hígado altamente vascularizado).

Además, los vectores adenovíricos que contienen diversas deleciones de genes víricos pueden usarse para reducir

o eliminar respuestas inmunitarias al vector. Tales adenovirus están delecionados en E1, y además contienen deleciones de E2A o E4 (Lusky y col., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper y col., Human Gene Therapy 9:671 (1998)). También se ha informado que la deleción de E2b reduce respuestas inmunitarias (Amalfitano y col., J. Virol. 72:926 (1998)). Delecionando todo el genoma del adenovirus pueden acomodarse insertos muy largos de ADN heterólogo. La generación de los llamados adenovirus “cobardes”, en los que todos los genes víricos están delecionados, son particularmente ventajosos para la inserción de grandes insertos de ADN heterólogo (para una revisión véase Yeh. y Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997)).

Pueden obtenerse cepas de alto título de virus recombinantes que pueden expresar un gen terapéutico a partir de células de mamífero infectadas usando procedimientos convencionales. Por ejemplo, el virus del herpes simple recombinante puede prepararse en células Vero como se describe por Brandt y col., J. Gen. Virol. 72:2043 (1991), Herold y col., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli y Brandt, Virology 185:419 (1991), Grau y col., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:2474 (1989), Brandt y col., J. Virol. Meth. 36:209 (1992) y por Brown y MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997).

Alternativamente, un vector de expresión que comprende un gen de TACI-inmunoglobulina puede introducirse en una célula de sujeto por lipofección in vivo usando liposomas. Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner y col., Proc. Nat'l Acad Sci. USA 84:7413 (1987); Mackey y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)). El uso de lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. Los liposomas pueden usarse para dirigir la transfección a tipos de células particulares, que es particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular tal como el páncreas, hígado, riñón y cerebro. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con el fin de marcado. Los péptidos (por ejemplo, hormonas o neurotransmisores), proteínas tales como anticuerpos o moléculas de no péptido elegidos como diana pueden acoplarse químicamente a liposomas.

La electroporación es otro modo de administración alternativo. Por ejemplo, Aihara y Miyazaki, Nature Biotechnology

16:867 (1998), han demostrado el uso de electroporación in vivo para la transferencia de genes en músculo.

En general, la dosificación de una composición que comprende un vector terapéutico que tiene una secuencia de ácidos de nucleótido de TACI-inmunoglobulina tal como un virus recombinante variará dependiendo de factores tales como la edad del sujeto, peso, altura, sexo, condición médica general e historia médica previa. Vías de administración adecuadas de vectores terapéuticos incluyen inyección intravenosa, inyección intraarterial, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección intratumoral e inyección en una cavidad que contiene un tumor. Como ilustración, Horton y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96: 1553 (1999), demostraron que la inyección intramuscular de ADN de plásmido que codifica interferón a produce potentes efectos antitumorales sobre tumores primarios y metastásicos en un modelo murino.

Una composición que comprende vectores víricos, vectores no víricos o una combinación de vectores víricos y no víricos de la presente invención puede formularse según procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que los vectores o virus se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se observa anteriormente, se dice que una composición, tal como solución salina tamponada con fosfato, es un “vehículo farmacéuticamente aceptable” si su administración puede ser tolerada por un sujeto receptor. Otros vehículos adecuados son muy conocidos para aquellos expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª ed. (Mack Publishing Co. 1995) y Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7ª ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)).

Para los fines de terapia, un vector de expresión génico terapéutico, o un virus recombinante que comprende un vector tal, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, se administran a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de un vector de expresión (o virus) y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra en una “cantidad terapéuticamente eficaz” si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia produce un cambio detectable en la fisiología de un sujeto receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria. Como otro ejemplo, un agente usado para inhibir el crecimiento de células tumorales es fisiológicamente significativo si la administración del agente produce una disminución en el número de células tumorales, disminución de la metástasis, una disminución en el tamaño de un tumor sólido, o aumento de la necrosis de un tumor.

Si el sujeto tratado con un vector de expresión génico terapéutico o un virus recombinante es un ser humano, entonces la terapia es preferentemente terapia génica de células somáticas. Es decir, el tratamiento preferido de un ser humano con un vector de expresión génico terapéutico o un virus recombinante no conlleva introducir en células una molécula de ácido nucleico que pueda formar parte de una línea germinal humana y pasarse a generaciones sucesivas (es decir, terapia génica de la línea germinal humana).

10. Producción de ratones transgénicos

Pueden manipularse ratones transgénicos para expresar en exceso secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina en todos los tejidos, o bajo el control de un elemento regulador específico de tejido o preferido por tejido. Estos productores en exceso de proteínas de fusión de TACIinmunoglobulina pueden usarse para caracterizar el fenotipo que resulta de la expresión en exceso, y los animales transgénicos pueden servir de modelos para enfermedad humana producida por la proteína del receptor de TACI en exceso. Los ratones transgénicos que expresan en exceso proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina también proporcionan biorreactores modelo para la producción de proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina en la leche o sangre de animales más grandes. Los procedimientos para producir ratones transgénicos son muy conocidos para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Jacob, “Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice” en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky y Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995) y Abbud y Nilson, “Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice” en Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez y Hoeffler (eds.), páginas 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)).

Por ejemplo, un procedimiento para producir un ratón transgénico que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina puede empezar con machos fértiles adultos (sementales) (B6C3f1, 2 a 8 meses de edad (Taconic Farms, Germantown, NY)), machos vasectomizados (estériles) (B6D2f1, 2 a 8 meses, (Taconic Farms)), hembras fértiles prepubescentes (donantes) (B6C3f1, 4 a 5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras fértiles adultas (receptores) (B6D2f1, 2 a 4 meses, (Taconic Farms)). Los donantes se aclimatan durante una semana y luego se inyectan LP con aproximadamente 8 UI/ratón de gonadotropina de suero de yegua preñada (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) y, 46-47 horas después, 8 UI/ratón de gonadotropina coriónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para inducir superovulación. Los donantes se aparean con sementales posteriormente a las inyecciones de hormona. La ovulación se produce generalmente en el plazo de 13 horas desde la inyección con hCG. La copulación se confirma por la presencia de un tapón vaginal a la mañana siguiente al apareamiento.

Los óvulos fecundados se recogen bajo un microscopio quirúrgico. Se recogen los oviductos y los óvulos son liberados en portaobjetos de análisis de orina que contienen hialuronidasa (Sigma). Los óvulos se lavan una vez en hialuronidasa y dos veces en medio W640 de Whitten (descrito, por ejemplo, por Menino y O'Claray, Biol. Reprod.

77:159 (1986) y Dienhart y Downs, Zygote 4:129 (1996)) que ha sido incubado con 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2 a 37ºC. Entonces, los óvulos se almacenan en una estufa de incubación a 37ºC/5% de CO2 hasta la microinyección.

Diez a veinte microgramos de ADN de plásmido que contiene una secuencia codificante de proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina se linealizan, se purifican en gel y se resuspenden en Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 0,25 mM (pH 8,0), a una concentración final de 5-10 nanogramos por microlitro para microinyección. Por ejemplo, las secuencias codificantes de proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina pueden codificar un polipéptido de TACI con deleción de los residuos de aminoácidos 1 a 29 y 111 a 154 de SEC ID Nº: 2, y un resto de inmunoglobulina Fc5.

El ADN de plásmido es microinyectado en óvulos recolectados contenidos en una gota de medio W640 revestido de aceite mineral equilibrado con CO2 caliente. El ADN entra en una aguja de inyección (sacada de un capilar de vidrio de 0,75 mm de DI, 1 mm de DE de borosilicato vidrio) y se inyecta en óvulos individuales. Cada óvulo es penetrado con la aguja de inyección, en uno o los dos pronúcleos haploides.

Los picolitros de ADN se inyectan en los pronúcleos y la aguja de inyección se extrae sin ponerse en contacto con los nucléolos. El procedimiento se repite hasta que se inyectan todos los óvulos. Los óvulos satisfactoriamente microinyectados se transfieren a una placa de cultivo de tejido de órgano con medio W640 previamente gasificado para el almacenamiento durante la noche en una estufa de incubación a 37ºC/5% de CO2.

Al día siguiente, los embriones de dos células se transfieren a receptores pseudopreñadas. Los receptores se identifican por la presencia de tapones de copulación, después de copular con estériles vasectomizados. Los receptores se anestesian y se rasuran sobre el lado izquierdo dorsal y se transfieren a un microscopio quirúrgico. Se hace una pequeña incisión en la piel y por la pared del músculo en el centro del área abdominal trazada por la caja torácica, la montura y la pata trasera, a mitad de camino entre la rodilla y el bazo. Los órganos reproductores se extraen del cuerpo sobre un pequeño paño quirúrgico. La bola adiposa se estira sobre el paño quirúrgico, y una grapilla para bebés (Roboz, Rockville, MD) se une a la bola adiposa y se deja colgando sobre la espalda del ratón, previniendo que los órganos se deslicen de nuevo.

Con una fina pipeta de transferencia que contiene aceite mineral seguido de alternar W640 y burbujas de aire, 12-17 embriones de dos células sanos de la inyección del día previo se transfieren al receptor. Se localiza la ampolla hinchada y sujetando el oviducto entre la ampolla y la bolsa se hace una hendidura en el oviducto con una aguja de 28 g próxima a la bolsa, asegurándose de no rasgar la ampolla o la bolsa.

La pipeta se transfiere a la hendidura en el oviducto, y los embriones se hinchan, dejando que la primera burbuja de aire escape de la pipeta. La bola adiposa se empuja suavemente en el peritoneo, y se deja que los órganos reproductores se deslicen dentro. La pared peritoneal se cierra con una sutura y la piel se cierra con un clip para heridas. Los ratones se recuperan en un calentador de portaobjetos a 37ºC durante un mínimo de cuatro horas.

Los receptores se devuelven a las jaulas en pares y se dejan 19-21 días de gestación. Después del nacimiento se dejan 19-21 días después del parto antes del destete. Los animales destetados son sexados y se ubican en jaulas separadas por sexo y una biopsia de 0,5 cm (usada para el genotipado) se corta de la cola con tijeras limpias.

Se prepara ADN genómico a partir de los cortes de cola usando, por ejemplo, un kit QIAGEN DNEASY siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico se analiza por PCR usando cebadores diseñados para amplificar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina o un gen del marcador de selección que se introdujo en el mismo plásmido. Después de confirmarse que los animales eran transgénicos, se retrocruzan en una cepa endogámica colocando una hembra transgénica con un macho natural, o un macho transgénico con una o dos hembras naturales. Cuando nacen las crías y se destetan, los sexos se separan y sus colas se cortan para el genotipado.

Para comprobar la expresión de un transgén en un animal vivo se realiza una hepatectomía parcial. Se hace una preparación del campo quirúrgico del abdomen superior directamente por debajo de la apófisis xifoides. Usando técnica estéril se hace una pequeña incisión de 1,5-2 cm debajo del esternón y el lóbulo lateral izquierdo del hígado se extrae del cuerpo. Usando seda 4-0 se hace un lazo alrededor del lóbulo inferior asegurándolo fuera de la cavidad del cuerpo. Se usa una pinza atraumática para sujetar el lazo mientras que un segundo bucle de Dexon absorbible (American Cianamid; Wayne, N.J.) se coloca proximal al primer lazo. Se hace un corte distal a partir del lazo Dexon y aproximadamente 100 mg del tejido de hígado extirpado se colocan en una placa de petri estéril. La sección de hígado extirpada se transfiere a un tubo de fondo redondo de polipropileno de 14 ml y se congela criogénicamente en nitrógeno líquido y luego se guarda sobre nieve carbónica. El sitio quirúrgico se cierra con sutura y clips para heridas y la jaula del animal se sitúa sobre una almohadilla de calentamiento a 37ºC durante 24 horas posoperativamente. El animal se comprueba diariamente posoperativamente y los clips para heridas se quitan 7-10 días después de la cirugía. El nivel de expresión de ARNm de proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina se examina para cada ratón transgénico usando un ensayo de hibridación en disolución de ARN o reacción en cadena de la polimerasa.

Usando el enfoque general descrito anteriormente se han producido ratones transgénicos que expresan niveles significativos de proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina en leche. En este caso particular, la secuencia codificante de la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina codificó un polipéptido de TACI con deleción de los residuos de aminoácidos 1 a 29 y 111 a 154 de SEC ID Nº: 2, y un resto de inmunoglobulina Fc5.

Por tanto, la presente invención, generalmente descrita, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1

Construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de TACI-Fc

Las moléculas de ácido nucleico que codifican TACI humano se obtuvieron durante la clonación por expresión de los receptores para ZTNF4 como se describe por Gross y col., Nature 404:995 (2000). Las secuencias codificantes contenidas en las construcciones de expresión de TACI-Fc se generaron por PCR de solapamiento usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Horton y col., Gene 77:61 (1989)). Se usaron ADNc de TACI humano y ADNc de Fc como moldes de partida para las amplificaciones por PCR. Los cebadores de PCR se diseñaron para dar los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante deseados y para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para facilitar la inserción de estas secuencias codificantes en los vectores de expresión. Las secuencias codificantes de TACI-Fc se insertaron en vectores de expresión que indujeron un gen de dihidrofolato-reductasa murino funcional. Un vector de expresión también contuvo un promotor del citomegalovirus para dirigir la expresión del transgén de la proteína recombinante, un intrón de inmunoglobulina, una secuencia señal del activador tisular del plasminógeno, una secuencia de entrada ribosómica interna, un cistrón CD8 delecionado para la selección superficial de células transfectadas y elementos de expresión en levadura para el crecimiento del plásmido en células de levadura.

Un enfoque que se usó para producir proteínas de fusión TACI-Fc se ilustra mediante el procedimiento usado para la construcción de TACI-Fc4. Otras proteínas de fusión de TACI-Fc se produjeron insertando secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión de TACI-Fc en un vector de expresión de mamífero, e introduciendo ese vector de expresión en células de mamífero.

A. Construcción de fragmentos de Fc4 de Ig y1

Para preparar la proteína de fusión de TACI-Fc4, la región Fc de IgG1 humana (la región bisagra y los dominios CH2 y CH3) se modificó para eliminar el receptor de Fcy1 (FcyRI) y las funciones de unión a complemento (C1q). Esta versión modificada de Fc de IgG1 humana se designó “Fc4”.

La región Fc se aisló de una PCR de la biblioteca de hígado fetal humano (Clontech) usando los cebadores de oligonucleótidos 5' ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC 3' (SEC ID Nº: 7) y 5' GGCAGTCGCT AGATCATTTA CCCG-GAGACA GGGAG 3' (SEC ID Nº: 8). Las mutaciones dentro de la región Fc se introdujeron por PCR para reducir la unión a FcyRI. El sitio de unión a FcyRI (Leu-Leu-Gly-Gly; residuos de aminoácidos 38 a 41 de SEC Nº: 6, que se corresponden con las posiciones de índice EU 234 a 237) se mutó a Ala-Glu-Gly-Ala para reducir la unión a FcyR1 (véanse, por ejemplo, Duncan y col., Nature 332:563 (1988); Baum y col., EMBO J. 13:3992 (1994)). Los cebadores de oligonucleótido 5' CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C 3' (SEC ID Nº: 9) y 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGA-GACAGGG A 3' (SEC ID Nº: 10) se usaron para introducir la mutación. A un volumen final de 50 !l se añadieron 570 ng de molde de IgFc, 5 !l de 10x tampón de reacción Pfu (Stratagene), 8 !l de dNTP 1,25 mM, 31 !l de agua destilada, 2 !l de cebadores de oligonucleótidos 20 mM. Se añadió un volumen igual de aceite mineral y la reacción se calentó a 94ºC durante 1 minuto. Se añadió Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene) seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, seguido de una extensión de 7 minutos a 72ºC. Los productos de reacción se fraccionaron por electroforesis y se detectó la banda correspondiente al tamaño predicho de aproximadamente 676 pares de bases. Esta banda se escindió del gel y se recuperó usando un kit de extracción en gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

La PCR también se usó para introducir una mutación de Ala a Ser (residuo de aminoácido 134 de SEC ID Nº: 6, que se corresponde con la posición del índice EU 330) y Pro a Ser (residuo de aminoácido 135 de SEC ID Nº: 6, que se corresponde con la posición del índice EU 331) para reducir la unión de C1q al complemento o la fijación al complemento (Duncan y Winter, Nature 332:788 (1988)). Se realizaron dos reacciones de la primera ronda usando las secuencias de IgFc mutadas lateralmente de unión a FcyRI como molde. A un volumen final de 50 !l se añadió 1 !l de molde de IgFc mutado en el sitio de unión a FcyRI, 5 !l de 10x tampón de reacción Pfu (Stratagene), 8 !l de dNTP 1,25 mM, 31 !l de agua destilada, 2 !l de 5' GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAAA CTCAC 3' (SEC ID Nº: 11) 20 mM, un cebador de 5' que empieza en el nucleótido 36 de SEC ID Nº: 5 y 2 !l de 5' TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3' (SEC ID Nº: 12) 20 mM, un cebador de 3' que empieza en el complemento del nucleótido 405 de SEC ID Nº: 5. La segunda reacción contuvo 2 !l de cada una de las disoluciones madre 20 mM de los cebadores de oligonucleótidos 5' TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC 3' (SEC ID Nº: 13), un cebador de 5' que empieza en el nucleótido 388 de SEC ID Nº: 5 y 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEC ID Nº: 14), un cebador de 3', para introducir la mutación de Ala a Ser, sitio de restricción XbaI y codón de terminación. Se añadió un volumen igual de aceite mineral y las reacciones se calentaron a 94ºC durante 1 minuto. Se añadió Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene) seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 2 minutos, seguido de una extensión de 7 minutos a 72ºC. Los productos de reacción se fraccionaron por electroforesis y se detectaron las bandas correspondientes a los tamaños predichos, aproximadamente 370 y aproximadamente 395 pares de bases respectivamente. Las bandas se escindieron del gel y se extrajeron usando un kit de extracción en gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

Se realizó una segunda reacción de la ronda para unir los fragmentos anteriores y añadir el sitio de restricción 5' BamHI y una secuencia señal de la región variable de la cadena pesada JBL 2'CL de inmunoglobulina humana (Cogne y col., Eur. J. Immunol. 18:1485 (1988)). A un volumen final de 50 !l se añadieron 30 !l de agua destilada, 8 !l de dNTP 1,25 mM, 5 !l de 10x tampón de reacción de Pfu polimerasa (Stratagene) y 1 !l de cada uno de los dos primeros dos productos de PCR. Se añadió un volumen igual de aceite mineral y la reacción se calentó a 94ºC durante 1 minuto. Se añadió Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene) seguida de 5 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos. La temperatura se llevó de nuevo a 94ºC y se añadieron 2 !l de cada una de las disoluciones madre 20 mM de 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEC ID Nº: 14), un cebador de 5' que empieza en el nucleótido 1 de SEC ID Nº: 5, y 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEC ID Nº: 10), seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos, y una extensión de 7 minutos final a 72ºC. Una parte de la reacción se visualizó usando electroforesis en gel. Se detectó una banda de 789 pares correspondiente al tamaño predicho.

B. Construcción de vectores de expresión de TACI-Fc4

Se construyeron plásmidos de expresión que comprenden una región codificante para la proteína de fusión de TACI-Fc4 mediante recombinación homóloga en levadura. Un fragmento de ADNc de TACI se aisló usando PCR que incluyó la secuencia de polinucleótidos del nucleótido 14 al nucleótido 475 de SEC ID Nº: 1. Los dos cebadores usados en la producción del fragmento de TACI fueron: (1) un cebador que contiene 40 pares de bases de la secuencia flanqueante del vector de 5' y 17 pares de bases correspondientes al extremo amino del fragmento de TACI (5' CTCAGCCAGG AAATCCATGC CGAGTTGAGA CGCTTCCGTA GAATGAGT-GG CCTGGGCCG 3'; SEC ID Nº: 15); (2) 40 pares de bases del extremo 3' correspondientes a la secuencia de Fc4 flanqueante y 17 pares de bases correspondientes al extremo carboxilo del fragmento de TACI (5' GCATGTGTGA GTTTTGTCTG AA-GATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG 3', SEC ID Nº: 16). A un volumen final de 100 !l se añadieron 10 ng de molde de TACI, 10 !l de tampón de reacción de 10x Taq polimerasa (Perkin Elmer), 8 !l de dNTP 2,5 nM, 78 !l de agua destilada, 2 !l de cada una de las disoluciones madre 20 mM de los cebadores de oligonucleótido y Taq polimerasa (2,5 unidades, Life Technology). Se añadió un volumen igual de aceite mineral y la reacción se calentó a 94ºC durante 2 minutos, seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, seguido de una extensión de 5 minutos a 72ºC.

El fragmento que contenía el ADNc que codifica el fragmento Fc4 se construyó de un modo similar. Los dos cebadores usados en la producción del fragmento Fc4 fueron (en la dirección 5' y en la dirección 3') un cebador de oligonucleótidos que contiene 40 pares de bases de la secuencia flanqueante de TACI en 5' y 17 pares de bases correspondientes al extremo amino del fragmento Fc4 (5' GCACAGAGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCT CCCGGGGCTG AAGGAGCCCA GATCTTCAGA 3'; SEC ID Nº: 17); y un cebador de oligonucleótidos que contiene 40 pares de bases del extremo 3' correspondientes a la secuencia del vector flanqueante y 17 pares de bases correspondientes al extremo carboxilo del fragmento Fc4 (5' GGGGTGGGTA CAAC-CCCAGA GCTCTTTTAA TCTAGATTAT TTACCCGGAG ACAGGG 3'; SEC ID Nº: 18). A un volumen final de 100 !l se añadieron 10 ng del molde de Fc4 descrito anteriormente, 10 !l de 10x tampón de reacción de Taq polimerasa (Perkin Elmer), 8 !l de dNTP 2,5 nM, 78 !l de agua destilada, 2 !l de cada una de las disoluciones madre 20 mM de los oligonucleótidos y Taq polimerasa (2,5 unidades, Life Technology). Se añadió un volumen igual de aceite mineral y la reacción se calentó a 94ºC durante 2 minutos, luego 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, seguido de una extensión de 5 minutos a 72ºC.

Se ejecutaron diez microlitros de cada uno de los 100 !l de reacciones de PCR descritos anteriormente sobre un gel de agarosa LMP al 0,8% (Seaplaque GTG) con 1x tampón TBE para análisis. El resto de los 90 !l de cada reacción de PCR se precipitó con la adición de 5 !l de cloruro sódico 1 M y 250 !l de etanol absoluto. El plásmido pZMP6 se escindió con SmaI para linealizarlo en el poliligador. El plásmido pZMP6 se derivó del plásmido pCZR199 (Colección americana de cultivos tipo, Manassas, VA, ATCC nº 98668) y es un vector de expresión de mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor temprano inmediato del citomegalovirus, un intrón consenso de la región variable del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificantes, un codón de terminación y un terminador de la hormona de crecimiento humano. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión del marcador de selección de mamífero que tiene un promotor, potenciador y origen de replicación de SV40, un gen de dihidrofolatoreductasa y el terminador de SV40. El vector pZMP6 se construyó a partir de pCZR199 por sustitución del promotor de la metalotioneína con el promotor temprano inmediato del citomegalovirus y las secuencias de Kozac en el extremo 5' del marco de lectura abierto.

Cien microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) se combinaron con 10 !l que contenían aproximadamente 1 !g del dominio extracelular de TACI y los fragmentos de PCR de Fc4, y 100 ng de vector pZMP6 digerido con SmaI, y se transfirieron a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Las mezclas de levadura/ADN se electropulsaron a 0,75 kV (5 kV/cm), 0 ohm, 25 !F. A cada cubeta se añadieron 600 !l de sorbitol 1,2 M y la levadura se sembró en dos alícuotas de 300 !l sobre placas de URA-D y se incubaron a 30ºC.

Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ de una única placa se resuspendieron en 1 ml de agua y se centrifugaron brevemente para sedimentar las células de levadura. El sedimento de células se resuspendió en 1 ml de tampón de lisis (2% de Triton X-100, 1% de SDS, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Se añadieron quinientos microlitros de la mezcla de lisis a un tubo Eppendorf que contenía 300 !l de perlas de vidrio lavadas con ácido y 200 !l de fenol-cloroformo, se agitaron dos o tres veces con vórtex durante intervalos de 1 minuto, seguido de una centrifugación de 5 minutos en una centrífuga de Eppendorf a velocidad máxima. Trescientos microlitros de la fase acuosa se transfirieron a un tubo nuevo y el ADN se precipitó con 600 !l de etanol, seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se resuspendió en 100 !l de agua.

La transformación de células E. coli electrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) se realizó con 0,5-2 ml de preparación de ADN de levadura y 40 !l de células DH10B. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 mF y 400 ohm. Tras la electroporación, 1 ml de SOC (2% de Bacto-Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% de extracto de levadura (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, 20 mM glucosa) se sembraron en alícuotas de 250 !l sobre cuatro placas LB AMP (caldo LB (Lennox), 1,8% de Bacto-Agar (Difco), 100 mg/l de ampicilina).

Los clones individuales que albergaban la correcta construcción de expresión para TACI-Fc4 se identificaron por digestión por restricción para verificar la presencia del inserto y para confirmar que las diversas secuencias de ADN se habían unido correctamente entre sí. El inserto de clones positivos se sometió a análisis de secuencias. El ADN de plásmido a mayor escala se aísla usando el kit Qiagen Maxi (Qiagen) según instrucciones del fabricante.

C. Construcción de Fc5, Fc6 y Fc7

En Fc5, el residuo de Arg en la posición del índice EU 218 se cambió de nuevo a un residuo Lys. La Ig y1 humana natural contiene una lisina en esta posición. Brevemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican Fc5 se produjeron usando los cebadores de oligonucleótidos 5' GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCA 3' 5 (SEC ID Nº: 19) y 5' TAATT-GGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEC ID Nº: 20). Las condiciones de la amplificación por PCR fueron del siguiente modo. A un volumen final de 50 !l se añadieron 236 ng de molde de Fc4, 5 !l de 10 x tampón de reacción Pfu (Stratagene), 4 !l de dNTP 2,5 mM, 1 !l de 20 !M de cada uno de los oligonucleótidos y 1 !l de Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene). El perfil de amplificación térmica consistió en 94ºC durante 2 minutos, 5 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 42ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 45

10 segundos, 20 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 1 minuto 20 segundos, seguido de una extensión de 7 minutos a 72ºC. El producto de reacción se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa y se detectó la banda correspondiente al tamaño predicho de aproximadamente 718 pares de bases. La banda se escindió del gel y se recuperó usando un kit de extracción en gel QIAGEN QIAquick (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

Fc6 es idéntico a Fc5, excepto que se ha eliminado el codón de lisina del extremo carboxilo. Como en Fc4 y Fc5

15 anteriormente, el codón de terminación en la secuencia de Fc6 se cambió a TAA. Fc6 se generó a partir de ADN mensajero que codificó Fc5 usando los cebadores de oligonucleótidos 5' GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA 3' (SEC ID Nº: 19) y 5' GGCGCGCCTC TAGATTAACC CGGAGACAGGGAGAGGC 3' (SEC ID Nº: 21).

Fc7 es idéntico a Fc de y1 natural, excepto por una sustitución de aminoácidos en la posición del índice EU Asn 297

20 localizada en el dominio CH2. Asn 297 se mutó a un residuo de Gln para evitar la unión de hidrato de carbono ligado a N en esa posición de residuo. Como antes, el codón de terminación en la secuencia de Fc7 se cambió a TAA. Fc7 se generó por PCR de solapamiento usando un ADNc de Fc de IgGy1 humana natural como molde y los cebadores de oligonucleótidos 5' GAGCCCAAATCTT-GCGACAAAACTCACA 3' (SEC ID Nº: 22) y 5' GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT 3' (SEC ID Nº: 23) para generar la mitad de 5' de Fc7, y los

25 cebadores de oligonucleótidos 5' CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA 3' (SEC ID Nº: 24) y 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEC ID Nº: 20) para generar la mitad de 3' de Fc7. Los dos productos de PCR se combinaron y se amplificaron usando los cebadores de oligonucleótidos 5' GAGCCCAAATCTT-GCGACAAAACTCACA 3' (SEC ID Nº: 22) y 5‘TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEC ID Nº: 20).

30 Todos los productos de PCR resultantes se purificaron en gel, se clonaron y se verificaron por análisis de secuencias de ADN.

D. Construcción de proteínas de fusión de TACI-Fc aminotruncadas

Se generaron cuatro versiones truncadas del extremo amino de TACI-Fc. Las cuatro tuvieron una secuencia señal del activador de plasminógeno de tejido humano modificada (SEC ID Nº: 25) fusionada con el residuo de aminoácido

35 número 30 de SEC ID Nº: 2. Sin embargo, las cuatro proteínas se diferenciaron en la localización del punto en el que Fc5 se fusionó con la secuencia de aminoácidos de TACI de SEC ID Nº: 2. La Tabla 3 resume las estructuras de las cuatro proteínas de fusión.

Tabla 3

Proteínas de fusión de TACI

Designación de TACI-Fc: Residuos de aminoácidos de TACI

TACI (d1-29)-Fc5: 30 a 154 de SEC ID Nº: 2

TACI (d1-29, d107-154)-Fc5: 30 a 106 de SEC ID Nº: 2

TACI (d1-29, d111-154)-Fc5: 30 a 110 de SEC ID Nº: 2

TACI (d1-29, d120-154)-Fc5: 30 a 119 de SEC ID Nº: 2

40 Los casetes de expresión que codifican la proteína se generaron por PCR de solapamiento usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Horton y col., Gene 77:61 (1989)). Como moldes de PCR se usaron una molécula de ácido nucleico que codifica TACI y una molécula de ácido nucleico que codifica Fc5. Los cebadores de oligonucleótidos se identifican en las Tablas 4 y 5.

Tabla 4

Cebadores de oligonucleótidos usados para producir proteínas de fusión de TACI

Designación de TACI-Fc: Designaciones de oligonucleótidos

5'TACI: 3' TACI 5' Fc5 3'Fc5

TACI (d1-29)-Fc5: ZC24,903 ZC24,955 ZC24,952 C24,946

TACI (d1-29, d107-154)-Fc5: ZC24,903 ZC24,951 ZC24,949 ZC24,946

TACI (d1-29, d111-154)-Fc5: ZC24,903 ZC28,978 ZC28,979 ZC24,946

TACI (d1-29, d120-154)-Fc5: ZC24,903 ZC28,981 ZC28,980 ZC24,946

Tabla 5

Secuencias de oligonucleótidos

Cebador: Secuencia de nucleótidos SEC ID Nº

ZC24,903: 5' TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3' 40

ZC24,955: 5'TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA3' 41

ZC24,952: 5' TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3' 42

ZC24,946: 5' TAATTGGCGCGCGTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' 20

ZC24,951: 5' TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3' 43

ZC24,949: 5' ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3' 44

ZC28,978: 5'TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3' 45

ZC28,979: 5' CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 46

ZC28,981: 5' TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3' 47

ZC28,980: 5' GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 48

5 La primera ronda de amplificaciones por PCR consistió en dos reacciones para cada una de las cuatro versiones truncadas del extremo amino. Las dos reacciones se realizaron por separado usando los oligonucleótidos de TACI de 5' y 3' en una reacción y los oligonucleótidos de Fc5 de 5' y 3' en otra reacción para cada versión. Las condiciones de la primera ronda de amplificación por PCR fueron del siguiente modo. A un volumen final 25 !l se añadieron aproximadamente 200 ng de ADN mensajero, 2,5 !l de 10 x tampón de reacción Pfu (Stratagene), 2 !l de

10 dNTP 2,5 mM, 0,5 !l de 20 !M de cada oligonucleótido de 5' y oligonucleótido de 3' y 0,5 !l de Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene). El perfil de amplificación térmica consistió en 94ºC durante 3 minutos, 35 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 50ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 2 minutos, seguido de una extensión de 2 minutos a 72ºC. Los productos de reacción se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa, y las bandas correspondientes a los tamaños predichos se escindieron del gel y se recuperaron usando un kit de extracción en gel QIAGEN

15 QIAQUICK (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

La segunda ronda de amplificación por PCR, o reacción de amplificación por PCR de solapamiento, se realizó usando los fragmentos purificado en gel de la primera ronda PCR como molde de ADN. Las condiciones de la segunda ronda de amplificación por PCR fueron del siguiente modo. A un volumen final 25 !l se añadieron aproximadamente 10 ng de ADN mensajero de cada uno del fragmento de TACI y del fragmento Fc5, 2,5 !l de 10 x 20 tampón de reacción Pfu (Stratagene), 2 !l de dNTP 2,5 mM, 0,5 !l de 20 !M de cada uno de ZC24,903 (SEC ID Nº: 40) y ZC24,946 (SEC ID Nº: 20) y 0,5 !l de Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene). El perfil de amplificación térmica consistió en 94ºC durante 1 minuto, 35 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 2 minutos, seguido de una extensión de 2 minutos a 72ºC. Los productos de reacción se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa, y las bandas correspondientes a los tamaños predichos se escindieron del gel y se 25 recuperaron usando un gel de extracción en gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

Cada una de las cuatro versiones de los productos de PCR de TACI-Fc truncacas del extremo amino se clonaron por separado usando el kit de clonación ZEROBLUNT TOPO PCR de Invitrogen siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. La Tabla 6 identifica las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de estas construcciones de TACI-Fc.

Tabla 6

Secuencias de variantes de TACI-Fc

Designación de TACI-Fc: SEC ID Nº

Nucleó: tido Aminoácido

TACI (d1-29)-Fc5: 49 50

TACI (d1-29, d107-154)-Fc5: 51 52

TACI (d1-29, d111-154)-Fc5: 53 54

TACI (d1-29, d120-154)-Fc5: 55 56

Después de identificarse las secuencias de nucleótidos, los plásmidos que comprendían cada una de las cuatro versiones de las fusiones de TACI-Fc truncadas del extremo amino se digirieron con FseI y AscI para eliminar los segmentos que codificaban aminoácidos. Los fragmentos de FseI - AscI se ligaron a un vector de expresión de

10 mamífero que contenía un promotor del CMV y un segmento poli A de SV40. Los vectores de expresión se introdujeron en células de ovario de hámster chino como se describe más adelante.

Ejemplo 2

Producción de proteínas de TACI-Fc por células de ovario de hámster chino

Las construcciones de expresión de TACI-Fc se usaron para transfectar, por electroporación, células DG44 de

15 ovario de hámster chino (CHO) adaptadas en suspensión cultivadas en medio libre de proteínas animales (Urlaub y col., Sam. Cell. Molec. Genet. 12:555 (1986)). Las células DG44 de CHO carecen de un gen de dihidrofolatoreductasa funcional debido a deleciones en ambas localizaciones cromosómicas de la dihidrofolato-reductasa. El crecimiento de las células en presencia de concentraciones elevadas de metrotrexato produce la amplificación del gen de dihidrofolato-reductasa y el gen codificado por la proteína recombinante ligada sobre la construcción de

20 expresión.

Las células DG44 de CHO se sometieron a pases en medio PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-glutamina 4 mM (JRH Biosciences) y 1x suplemento de hipertanxina-timidina (Life Technologies), y las células se incubaron a 37ºC y 5% de CO2 en matraces con agitación Corning a 120 rpm en un plataforma de agitación rotatoria. Las células se transfectaron por separado con plásmidos de expresión linealizados. Para garantizar la esterilidad se realizó una 25 única etapa de precipitación con etanol sobre hielo durante 25 minutos combinando 200 !g de ADN de plásmido en un tubo de Eppendorf con 20 !l de ADN de vehículo de esperma de salmón cortado (5' � 3' Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml), 22 !l de NaOAc 3 M (pH 5,2) y 484 !l de etanol al 100% (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA). Después de la incubación, el tubo se centrifugó a 14.000 rpm en una microcentrífuga dispuesta en una habitación fría a 4ºC, el sobrenadante se eliminó y el sedimento se lavó dos veces con 0,5 ml de etanol al 70% y se dejó que se secara al

30 aire.

Las células DG44 de CHO se prepararon mientras que el sedimento de ADN se secaba centrifugando 106 células totales (16,5 ml) en un tubo de centrífuga cónico de 25 ml a 900 rpm durante 5 minutos. Las células DG44 de CHO se resuspendieron en un volumen total de 300 !l de medio de crecimiento PFCHO y se dispusieron en una cubeta Gene-Pulser con una separación entre electrodos de 0,4 cm (Bio-Rad). El ADN, después de aproximadamente 50

35 minutos de tiempo de secado, se resuspendió en 500 !l de medio de crecimiento PFCHO y se añadió a las células en la cubeta de manera que el volumen total no superara 800 !l y se dejó que se asentaran a temperatura ambiente durante 5 minutos para disminuir la formación de burbujas. La cubeta se colocó en una unidad BioRad Gene Pulser II a 0,296 kV (kilovoltios) y 0,950 AC (alta capacitancia) y se electroporó inmediatamente.

Las células se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente antes de disponerse en 20 ml de volumen total de medio

40 PFCHO en un matraz T-75 de CoStar. El matraz se colocó a 37ºC y 5% de CO2 durante 48 horas cuando entonces las células se contaron por hemocitómetro utilizando exclusión con azul de tripano y se dispusieron en medio de selección PFCHO sin suplemento de hipertanxina-timidina y que contenía metrotrexato 200 mM (Cal Biochem).

Tras la recuperación del procedimiento de selección con metrotrexato, el medio acondicionado que contenía las proteínas de TACI-Fc secretadas se examinó por análisis de transferencia Western.

Ejemplo 3

Análisis estructural de proteínas de TACI-Fc

En ciertos casos, las proteínas de fusión TACI-Fc se purificaron parcialmente antes del análisis. El medio acondicionado de cultivos de ovario de hámster chino se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 !m y la proteína de TACI-Fc se capturó sobre una columna de proteína A. El material unido a la proteína A se eluyó y se pasó sobre una columna de exclusión de tamaño S-200 para la purificación final.

El análisis de transferencia Western se realizó en tanto medio de células acondicionado como en proteína purificada para evaluar la estabilidad estructural de las proteínas de TACI-Fc. Brevemente, las muestras de proteína o sobrenadante se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y las proteínas de TACI-Fc se detectaron usando antisueros específicos de Fc de cabra dirigidos contra IgG2a de ratón conjugada con peroxidasa (Boehringer Mannheim) o de cabra dirigidos contra IgG humana conjugada con peroxidasa (Pierce).

Los análisis de las secuencias de aminoácidos del extremo amino se realizaron en sistemas secuenciadores de proteínas modelos 476A y 494 de Perkin Elmer Applied Biosystems Division (Foster City, CA). Los análisis de datos se realizaron con el sistema de análisis de datos modelo 610A de Applied Biosystems para la secuenciación de proteínas, versión 2.1a (Applied Biosystems, Inc.). La mayoría de los proveedores y reactivos usados fueron de Applied Biosystems, Inc.

Ejemplo 4

Análisis funcional de proteínas de TACI-Fc

Se usaron dos enfoques para examinar las características de unión de cuatro proteínas de TACI-Fc a ZTNF4. Un enfoque midió la capacidad de las construcciones de TACI-Fc para competir con las placas recubiertas con TACI por la unión de ZTNF4 marcado con 125I. En el segundo enfoque, concentraciones crecientes de ZTNF4 marcado con 125I se incubaron con cada una de las construcciones de TACI-Fc, y se determinó la radiactividad asociada a los complejos de ZTNF4-TACI-Fc precipitados. Las proteínas de fusión de TACI-Fc tuvieron restos de TACI que carecieron de los 29 primeros residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2. Una de las proteínas de fusión tuvo un resto de TACI con una región del tallo intacta (TACI (d1-29)-Fc5), mientras que tres de las proteínas de fusión de TACI-Fc tuvieron restos de TACI con diversas deleciones en la región del tallo (TACI (d129, d107-154)-Fc5; TACI (d1-29, d111-154)-Fc5; TACI (d1-29, d120-154)-Fc5).

A. Ensayo de unión competitivo

ZTNF4 se radioyodó con perlas de yodo (Pierce) siguiendo procedimientos convencionales. Brevemente, 50 !g de ZTNF4 se yodaron con 4 mCi de 125I usando una única perla de yodo. La reacción se inactivó con una disolución de albúmina de suero bovino al 0,25% y el 125I libre se eliminó por filtración en gel usando una columna PD-10 (Pierce). La radiactividad específica de preparaciones de 125I-ZTNF4 se determinó por precipitación con ácido tricloroacético antes y después de la etapa de desalación.

Un fragmento del extremo N del receptor de TACI, designado “TACI-N”, se añadió a placas de 96 pocillos (100 !l a 0,1 !g/ml) y se incubó durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron, se bloquearon con Superblock (Pierce) y se lavaron de nuevo. Las construcciones de TACI-Fc, a diversas concentraciones que oscilan de 0 a 11,5 ng/ml, se mezclaron con una concentración fija de 125I-ZTNF4 (20 ng/ml) y se incubaron durante 2 horas a 37ºC sobre la placa recubierta con TACI-N. Lo controles contuvieron tanto TACI-N en disolución como carecieron de TACI-Fc. Después de la incubación, las placas se lavaron y se contaron. Cada determinación se realizó por triplicado.

Los resultados mostraron que todas las construcciones de TACI-Fc inhibieron completamente la unión de 125I-ZTNF4 a concentraciones de aproximadamente 100 ng/ml o superiores. Las proteínas de TACI-Fc, TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 fueron inhibidores más eficaces que la construcción de TACI-Fc, TACI (d1-29, d107-154)-Fc5. Un fragmento Fc solo no inhibió la unión. Los valores de CI50 se calcularon para cada construcción en tres experimentos. Los valores promedio para las construcciones fueron: TACI (d1-29)-Fc5: 2,07 nM; TACI (d1-29, d107-154)-Fc5: 4,95 nM; TACI (d1-29, d111-154)-Fc5: 2,31 nM; y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5: 2,21 nM.

B. Ensayo de unión en disolución

A una concentración de 0,05 nM, cada construcción de TACI-Fc se incubó con 125I-ZTNF4 0,4 pM a 1,5 nM durante 30 minutos a temperatura ambiente en un volumen total de 0,25 ml/tubo. Se añadió una suspensión de Pansorbin (Staph A) a cada tubo y después de 15 minutos las muestras se centrifugaron, se lavaron dos veces y los sedimentos se contaron. La unión no específica se determinó mediante la adición de ZTNF4 sin marcar 130 nM a la mezcla de 125I-ZTNF4/TACI-Fc. La unión específica se calculó restando las cpm unidas en presencia de ZTNF4 sin marcar de las cpm totales unidas a cada concentración de 125I-ZTNF4. Cada determinación se realizó por triplicado. Las constantes de unión se calcularon usando el software Graph-Pad Prism (MacIntosh v. 3.0).

La Figura 4 ilustra la unión específica de 125I-ZTNF4 a las diversas construcciones de TACI-Fc. Pareció que la unión se aproximaba a la saturación con cada construcción, y fue significativamente mayor para las construcciones TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5, TACI (d1-29, dT20-154)-Fc5 en comparación con la unión de TACI (d129, d107-154)-Fc5. Se calcularon los valores de Bmáx y Kd, y los resultados se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7

Unión de 125I-ZTNF4 a construcciones de TACI-Fc

Construcción de TACI-Fc: Kd (nM) Bmáx (nM)

TACI (d1-29)-Fc5: 0,134 0,023

TACI (d1-29, d107-154)-Fc5: 0,121 0,010

TACI (d1-29, d111-154)-Fc5: 0,115 0,018

TACI (d1-29, d120-154)-Fc5: 0,092 0,021

Ejemplo 5

Medición de ZTNF4 en circulación

Los niveles de ZTNF4 en individuos con una afección por enfermedad (tal como, por ejemplo, LES, artritis

10 reumatoide) con respecto a individuos normales se determinaron usando un ensayo de electroquimioluminiscencia. Una curva estándar preparada a partir de ZTNF4 humano soluble a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml y 0 ng/ml se preparó en tampón ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD). Las muestras de suero se diluyeron en tampón ORIGIN. Los patrones y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas con anticuerpo de conejo dirigido contra ZTNF4-NF BV humano biotinilado diluido a 1 !g/ml en tampón de ensayo Origin (IGEN) y

15 anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra ZTNF4-NF BV humano diluido a 1 !g/ml en tampón de ensayo Origin (IGEN). Tras la incubación, las muestras se agitaron con vórtex y se añadieron 0,4 mg/ml de estreptavidina Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) a cada uno de los patrones y las muestras a 50 !l/tubo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces, las muestras se agitaron con vórtex y las muestras se leyeron en un analizador Origin (Igen) según las instrucciones del fabricante. El ensayo Origin se basa en

20 electroquimioluminiscencia y produce una lectura en ECL. En un estudio se detectó un nivel elevado de ZTNF4 en las muestras de suero de ratones tanto NZBWF1/J como MRI/Mpj-Fas1pr, que han avanzado a fases avanzadas de glomerulonefritis y enfermedad autoinmunitaria.

El ENSAYO ORIGIN también se usó para medir niveles de ZTNF4 en la sangre de pacientes con LES con respecto a niveles en circulación en individuos normales. Una curva estándar preparada a partir de ZTNF4 humano soluble a 25 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml y 0 ng/ml se preparó en tampón ORIGIN (Igen). Todas las muestras de paciente se ejecutaron por triplicado con un volumen final de 25 !l. Los patrones y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas con un anticuerpo de captura, anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra ZTNF4-NF BV humano biotinilado, diluido a 1 !g/ml en tampón de ensayo Origin (IGEN) y un anticuerpo de detección, anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra ZTNF4-NF BV humano rutenilado, diluido a 1 !g/ml en

30 tampón de ensayo Origen (IGEN). Tras la incubación, las muestras se agitaron con vórtex y se añadieron 0,4 mg/ml de estreptavidina Dynabeads (Dynal) a cada uno de los patrones y las muestras a 50 !l/tubo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces, las muestras se agitaron con vórtex y se analizaron usando un analizador Origin 1.5 (Igen) según las instrucciones del fabricante.

Este ensayo incluyó 28 muestras de control normales y muestras de 20 pacientes diagnosticados con LES. Se

35 observaron niveles elevados de ZTNF4 en el suero de pacientes diagnosticados con LES en comparación con donantes de suero de control normal. Los niveles de ZTNF4 se calcularon como un aumento en veces de niveles de ZTNF4 en las muestras de paciente o de control con respecto a una muestra de suero de referencia humana arbitraria. El promedio de las 28 muestras de control fue 1,36 veces con respecto a la muestra de referencia humana y el promedio de las 20 muestras de pacientes con LES fue 4,92. Siete de los 20 pacientes con LES tuvieron niveles

40 de ZTNF4 que estuvieron dos veces por encima del promedio de las muestras de control, mientras que sólo hubo un individuo de control que tuvo un nivel superior a dos veces con respecto al promedio de control.

La memoria descriptiva describe a continuación la realización R1 a la realización R44:

R1. El uso de una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la preparación de un medicamento para inhibir la

45 proliferación de células tumorales, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a): un resto del receptor de TACI que consiste en un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2, en el que el resto del receptor de TACI comprende al menos uno de (i) residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2, y (ii) residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2, y en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4, y

R2. El uso de R1, en el que el resto del receptor de TACI comprende los residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2 y los residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2.

R3. El uso de R1, en el que el resto del receptor de TACI comprende los residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2.

R4. El uso de R1, en el que el resto del receptor de TACI tiene la secuencia de aminoácidos de residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2

R5. El uso de R1, en el que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de la cadena pesada.

R6. El uso de R5, en el que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de la cadena pesada humana.

R7. El uso de R6, en el que la región constante de la cadena pesada es una región constante de la cadena pesada de IgG1.

R8. El uso de R7, en el que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende dominios CH2 y CH3.

R9. El uso de R8, en el que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 33.

R10. El uso de R9, en el que proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 54.

R11. El uso de R1, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero.

R12. El uso de R1, en el que la composición se administra a células cultivadas in vitro.

R13. El uso de R1, en el que la composición es una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y en el que la composición farmacéutica se administra a un sujeto mamífero que tiene un tumor.

R14. El uso de R13, en el que la administración de la composición farmacéutica inhibe la proliferación de linfocitos B en el sujeto mamífero.

R15. El uso de una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales en un sujeto mamífero, en el que la proteína de fusión de TACIinmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 54.

R16. El uso de R15, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero.

R17. Una proteína de fusión que comprende:

(a): un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2, en el que el resto del receptor de TACI comprende al menos uno de (i) residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2, y (ii) residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2, y en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4, y

R18. La proteína de fusión de R17, en la que el resto del receptor de TACI comprende los residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2 y los residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2.

R19. La proteína de fusión de R17, en la que el resto del receptor de TACI comprende los residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2.

R20. La proteína de fusión de R17, en la que el resto del receptor de TACI tiene la secuencia de aminoácidos de residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2

R21. La proteína de fusión de R17, en la que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de la cadena pesada.

R22. La proteína de fusión de R21, en la que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de la cadena pesada humana.

R23. La proteína de fusión de R22, en la que la región constante de la cadena pesada es una región constante de la cadena pesada de IgG1.

R24. La proteína de fusión de R23, en la que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende los dominios CH2 y CH3.

R25. La proteína de fusión de R24, en la que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 33.

R26. La proteína de fusión de R25, en la que proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 54.

R27. La proteína de fusión de R17, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero.

R28. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de R17.

R29. La molécula de ácido nucleico de R28, en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 53.

R30. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 54.

R31. La composición farmacéutica de R30, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero.

R32. El uso de una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la preparación de un medicamento para reducir niveles en sangre en circulación de ZTNF4 en un sujeto mamífero, en el que la proteína de fusión de TACIinmunoglobulina comprende:

(a): un resto del receptor de TACI que consiste en un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2, en el que el resto del receptor de TACI comprende al menos uno de (i) residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2, y (ii) residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2, y en el que el resto del receptor de TACI se une a ZTNF4, y

R33. El uso de R32, en el que el resto del receptor de TACI comprende los residuos de aminoácidos 34 a 66 de SEC ID Nº: 2 y los residuos de aminoácidos 71 a 104 de SEC ID Nº: 2.

R34. El uso de R32, en el que el resto del receptor de TACI comprende los residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2.

R35. El uso de R32, en el que el resto del receptor de TACI tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2

R36. El uso de R32, en el que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de la cadena pesada.

R37. El uso de R36, en el que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de la cadena pesada humana.

R38. El uso de R37, en el que la región constante de la cadena pesada es una región constante de la cadena pesada de IgG1.

R39. El uso de R38, en el que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende los dominios CH2 y CH3.

R40. El uso de R39, en el que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 33.

R41. El uso de R40, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 54. R42. El uso de R32, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero. R43. El uso de una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de

5 calcio y ligandos de ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la preparación de un medicamento, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 54.

R44. El uso de R43, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero. LISTA DE SECUENCIAS 10 <110> ZymoGenetics, Inc.

<120> Proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina

<130> 01-20PC

<150> 60/293.343

<151> 24/05/2001 15 <160> 70

<170> FastSEQ para Windows version 3.0

<210> 1

<211> 1377

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (14)...(892)

<400> 1

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 285

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 250

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 762

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (7)...(759)

<400> 5

<210> 6

<211> 251

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 7

atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac 44

<210> 8

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 8 ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag 35

<210> 9

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 9 ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc c 51

<210> 10

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 10 ggattctaga ttatttaccc ggagacaggg a 31

<210> 11

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 11 ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac 55

<210> 12

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 12 tgggagggct ttgttgga 18

<210> 13

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 13 tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc 42

<210> 14

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 14 ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg 57

<210> 15

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 15 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59

<210> 16

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 16 gcatgtgtga gttttgtctg aagatctggg ctccttcagc cccgggag 48

<210> 17

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 17 gcacagaggc tcagaagcaa gtccagctct cccggggctg aaggagccca gatcttcaga 60

<210> 18

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 18 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag acaggg 56

<210> 19

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 19 gagcccaaat cttcagacaa aactcacaca tgccca 36

<210> 20

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 20 taattggcgc gcctctagat tatttacccg gagaca 36

<210> 21

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 21 ggcgcgcctc tagattaacc cggagacagg gagaggc 37

<210> 22

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 22 gagcccaaat cttgcgacaa aactcaca 28

<210> 23

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 23 5 gtacgtgctt tggtactgct cctcccgcgg ctt 33

<210> 24

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 24 cagtaccaaa gcacgtaccg tgtggtca 28

<210> 25 15 <211> 35

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Conductor de tPA optimizado.

20 <400> 25

<210> 26

<211> 995

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (219)...(770)

<400> 26

<210> 27

<211> 184

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28 5 <211> 762

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

10 <221> CDS

<222> (7)...(759)

<400> 28

<210> 29

<211> 251

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 29

<210> 30

<211> 762

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

<221> CDS

<222> (7)...(759)

<210> 31

<211> 251

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 31

<210> 32

<211> 762

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

<221> CDS

<222> (7)...(759)

<210> 33

<211> 251

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 33

<210> 34

<211> 759

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

<221> CDS

<222> (7)...(756)

<210> 35

<211> 250

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 35

<210> 36

<211> 762

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

<221> CDS

<222> (7)...(759)

<210> 37

<211> 251

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 37

<210> 38

<211> 762

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

10 <400> 30

10 <400> 32

10 <400> 34

10 <400> 36

<220>

<223> Resto de inmunoglobulina modificado.

<221> CDS

<222> (7)...(759)

10 <400> 38

<210> 39

<211> 251

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 39

<210> 40

<211> 29 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 40 tattaggccg gccaccatgg atgcaatga 29

<210> 41

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 41 tgaagatttg ggctccttga gacctggga 29

<210> 42

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 42 tcccaggtct caaggagccc aaatcttca 29

<210> 43

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 43 tgaagatttg ggctcgttct cacagaagta 30

<210> 44

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 44 atacttctgt gagaacgagc ccaaatcttc a 31

<210> 45

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 45 tttgggctcg ctcctgagct tgttctcaca 30

<210> 46

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 46 ctcaggagcg agcccaaatc ttcagaca 28

<210> 47

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 47 tttgggctcc ctgagctctg gtggaa 26

<210> 48

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de PCR.

<400> 48 gagctcaggg agcccaaatc ttcagaca 28

<210> 49

<211> 1214

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión.

<221> CDS

<222> (17) ... (1192)

<400> 49

<210> 50

<211> 392

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión.

<400> 50

<210> 51

<211> 1070

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión.

<221> CDS

<222> (17)...(1048) 10 <400> 51

<210> 52

<211> 344

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión.

<400> 52

<210> 53

<211> 1082

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión.

<221> CDS

<222> (17)...(1060) 10 <400> 53

<210> 54

<211> 348

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión.

<400> 54

<210> 55

<211> 1109

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión.

<221> CDS

<222> (17)...(1090) 10 <400> 55

<210> 56

<211> 357

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión.

<400> 56

<210> 57

<211> 9

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos ilustrativa.

<400> 57

atgcacggg 9 10 <210> 58

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos ilustrativa.

<400> 58 cccgtgca 9

<210> 59

<211> 586

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (27)...(578)

<400> 59

<210> 60

<211> 184

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia señal de 26-10 VH.

<400> 61

10 <210> 62

<211> 332

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Proteína de fusión.

<400> 62

<210> 63

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> 26-10 VH 5' UTR.

<400> 63

<210> 64

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5 <220>

<223> 26-10 VH 5' UTR modificada.

<400> 64 aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactgccac c 51

<210> 65 10 <211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia señal de 26-10 VH. 15 <221> CDS

<222> (1)...(57)

<400> 65

<210> 66 20 <211> 84

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Intrón de 26-10 VH. 25 <400> 66

<210> 67

<211> 1135

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial <220>

<223> Proteína de fusión.

<400> 67

5 <210> 68

<211> 1135

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Proteína de fusión.

<400> 68

<210> 69

<211> 884

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de potenciador del CMV/promotor del MPSV LTR.

<400> 69

10 <210> 70

<211> 455

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Promotor del MPSV LTR sin la región de control negativo.

<400> 70

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina para su uso en la inhibición de la proliferación de células tumorales, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.
2.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según la reivindicación 1, en la que la administración es a un sujeto mamífero que tiene un tumor.
3.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según la reivindicación 2, en la que dicha inhibición comprende inhibir la proliferación de linfocitos B en el sujeto mamífero.
4.

Una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.
5.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según la reivindicación 4, en la que dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en miastenia grave, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide juvenil de evolución poliarticular y artritis psoriásica.
6.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según la reivindicación 4, en la que dicha enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico.
7.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según la reivindicación 4, en la que dicha enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.
8.

Una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina para su uso en el tratamiento de asma, bronquitis o enfisema, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.
9. Una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina para su uso en el tratamiento de enfermedad renal, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.
10.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según la reivindicación 9, en la que dicha enfermedad renal se selecciona del grupo que consiste en insuficiencia renal terminal, glomerulonefritis, vasculitis, nefritis, amiloidosis y pielonefritis.
11.

Una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a inmunosupresión, rechazo de injerto, enfermedad de injerto frente a huésped, inflamación, dolor de articulaciones, hinchazón, anemia y choque séptico, en la que la proteína de fusión de TACl-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID NO-2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.
12. Una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado de neoplasia, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, enfermedad linfoproliferativa postrasplante y gammapatía de cadenas ligeras, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.
13.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según cualquier reivindicación precedente, en la que dicha proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina consiste en o comprende una proteína de fusión de TACl-Fc; preferentemente en la que dicha proteína de fusión de TACl-Fc es una proteína de fusión de Fc de inmunoglobulina humana.
14.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho resto de inmunoglobulina consiste en la región bisagra de la cadena pesada de la inmunoglobulina ligada por disulfuro y los dominios CH2 y CH3.
15.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según cualquier reivindicación precedente, en la que el resto de inmunoglobulina es un resto Fc de inmunoglobulina IgG1.
16.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho resto de inmunoglobulina consiste en o comprende un resto Fc de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 o Fc8; preferentemente en la que dicho resto de inmunoglobulina consiste en o comprende un resto Fc5 de inmunoglobulina.
17.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según cualquier reivindicación precedente, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina consiste en o comprende una forma secretada de una cualquiera de SEC ID Nº: 50, 52, 54 ó 56.
18.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según cualquier reivindicación precedente, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 50, 52, 54 ó 56, en la que se ha eliminado la secuencia

conductora de tPA (tPAo) optimizada (SEC ID Nº: 25).
19.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para su uso según cualquier reivindicación precedente, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero.
20.

Un procedimiento in vitro para inhibir la proliferación de células tumorales que comprende administrar a dichas células tumorales una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.
21. Una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACl)-inmunoglobulina, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina;

y en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina consiste en o comprende una forma secretada de una cualquiera de SEC ID Nº: 50, 52, 54 ó 56.
22.

La proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina según la reivindicación 21, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 50, 52, 54 ó 56, en la que se ha eliminado la secuencia conductora de tPA optimizada (tPAo) (SEC ID Nº: 25).
23.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según la reivindicación 21 o la reivindicación
22.
24. Un procedimiento para preparar una proteína de fusión de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina TACI-inmunoglobulina, comprendiendo dicho procedimiento expresar una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína de fusión, en el que dichas secuencias de ácidos nucleicos están operativamente ligadas a una secuencia reguladora que controla la expresión transcripcional en un vector de expresión; en el que dicha proteína de fusión comprende:

(a) un resto del receptor de interactor de activador transmembrana y de moduladores de calcio y ligandos de ciclofilina (TACI), en el que el resto del receptor de TACI consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

residuos de aminoácidos 34 a 104 de SEC ID Nº: 2;

(ii)

residuos de aminoácidos 30 a 110 de SEC ID Nº: 2; y

(iii) residuos de aminoácidos 30 a 154 de SEC ID Nº: 2;

en el que el resto del receptor de TACI se une a al menos uno de ZTNF2 o ZTNF4; y

(b) un resto de inmunoglobulina.
25.

El procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina consiste en o comprende una proteína de fusión de TACl-Fc.
26.

El procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicha proteína de fusión TACl-Fc es una proteína de fusión de Fc de inmunoglobulina humana.
27.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24-26, en el que dicho resto de inmunoglobulina

consiste en la región bisagra de la cadena pesada de la inmunoglobulina ligada por disulfuro y los dominios CH2 y CH3.
28.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24-27, en el que el resto de inmunoglobulina es un resto Fc de inmunoglobulina IgG1.
29.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24-28, en el que dicho resto de inmunoglobulina consiste en o comprende un resto Fc de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en Fc4, Fc5, Fc6, Fc7

o Fc8; preferentemente en el que dicho resto de inmunoglobulina consiste o comprende un resto Fc5 de inmunoglobulina.
30.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24-29, en el que la proteína de fusión de TACIinmunoglobulina consiste en o comprende una forma secretada de una cualquiera de SEC ID Nº: 50, 52, 54 ó 56.
31.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24-30, en el que la proteína de fusión de TACIinmunoglobulina consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 50, 52, 54 ó 56, y en la que se ha eliminado la secuencia conductora de tPA (tPAo) optimizada (SEC ID Nº: 25).
32.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24-31, en el que dicho procedimiento comprende expresar la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión en una célula huésped; preferentemente en el que dicha célula huésped es una célula de ovario de hámster chino.
33.

El procedimiento según la reivindicación 32, en el que la célula de ovario de hámster chino carece de un gen de dihidrofolato-reductasa funcional.
34.

El procedimiento según la reivindicación 32 o la reivindicación 33, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina se transfecta en la célula huésped en forma de un vector de expresión.
35.

El procedimiento según la reivindicación 34, en el que el vector de expresión comprende un plásmido de expresión; preferentemente en el que el plásmido de expresión comprende un promotor del CMV y un segmento poli A de SV40.
36.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 32-35, en el que el crecimiento de las células huésped en presencia de concentraciones elevadas de metrotrexato produce la amplificación del gen de dihidrofolatoreductasa y la secuencia de nucleótidos ligada que codifica la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina.