NO337295B1

NO337295B1 - TACI-immunglobulinfusjonsproteiner, nukleinsyremolekyl som koder for dem, fremgangsmåte for fremstilling av dem, anvendelse derav, og farmasøytisk preparat som omfatter dem og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff.

Info

Publication number: NO337295B1
Application number: NO20035173A
Authority: NO
Inventors: Jane A Gross; Mark W Rixon
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2016-03-07
Also published as: EP1436003A2; NO20035173L; JP2009232856A; DK2116259T3; AU2002305646C1; HRP20030948A2; EA200301146A3; US20100183609A1; EA007275B1; US9346878B2; CN1612750A; US20110229473A1; IL158920A0; UA82830C2; WO2002094852A2; MXPA03010687A; SI2116259T1; DK1436003T3; US20090209006A1; US20100129384A1

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse gjelder generelt forbedrede fusjonsproteiner som omfatter en tumornekrosefaktorgruppe og en immunglobulingruppe. Nærmere bestemt gjelder foreliggende oppfinnelse forbedrede TACI-immunglobulinfusjonsproteiner.

Oppfinnelsens bakgrunn

Cytokiner er løselige, små proteiner som formidler en rekke biologiske virkninger, innbefattet regulering av vekst og differensiering av mange celletyper (se f.eks. Arai et al., Annu. Rev. Biochem., 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol., 3:311

(1991); Paul og Seder, Cell, 76:241 (1994)). Proteinene som inngår i cytokingruppen, omfatter interleukiner, interferoner, kolonistimulerende faktorer, tumornekrosefaktorer og andre regulatoriske molekyler. Foreksempel er humant interleukin-17 et cytokin som stimulerer ekspresjonen av interleukin-6, intracellulært adhesjonsmolekyl 1, interleukin-8, granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor og prostaglandin E2-ekspresjonen, og som spilleren rolle i den preferensielle modning av CD34<+->hematopoetiske forløperceller til nøytrofile celler (Yao et al., J. Immunol., J55:5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med., 183:2593 (1996)).

Reseptorer som binder cytokiner, er typisk oppbygd av ett eller flere integrerte membranproteiner som binder cytokinet med høy affinitet, og som overfører denne bindingsbegivenhet til cellen via de cytoplasmatiske deler av reseptorens subenheter. Cytokinreseptorer er blitt inndelt i forskjellige klasser basert på likheter i de ekstracellulære ligandbindende domener. For eksempel er reseptorkjedene som er ansvarlige for binding og/eller overføring av virkningen av interferoner, medlemmer av type II-cytokinreseptor-familien, basert på et karakteristisk ekstracellulært domene på 200 aminosyrerester.

Cellulære interaksjoner som opptrer under en immunrespons, reguleres av medlemmer av flere familier av celleoverflatereseptorer, innbefattet tumornekrosefaktorreseptor(TNFR)familien. TNFR-familien utgjøres av en rekke integrerte membranglyko-proteinreseptorer, av hvilke mange sammen med sine ligander regulerer interaksjoner mellom forskjellige hematopoetiske cellelinjer (se f.eks. Cosman, Stem Cells, .22:440

(1994); Wajant et al., Cytokine Growth Factor Rev., JO: 15 (1999); Yeh et al., Immunol. Rev., 169:283 (1999); Idriss og Naismith, Microsc. Res. Tech., 50:184 (2000)).

Én slik reseptor er TACI, transmembranaktivator og CAML-interaktør (von Bulow og Bram, Science, 278:138 (1997); Bram og von Bulow, US patentskrift nr. 5 969 102 (1999)). TACI er en membranbundet reseptor som har et ekstracellulært domene som inneholder to cysteinrike pseudorepetisjoner, et transmembrandomene og et cytoplasmatisk domene som interagerer med CAML (kalsiummodulator og syklofilinligand), et integrert membranprotein som er lokalisert i intracellulære vesikler, og som er en koinduser av NF-AT-aktivering ved overekspresjon i Jurkat-celler. TACI er forbundet med B-celler og en undergruppe av T-celler.

Nukleotidsekvenser som koder for TACI og den tilsvarende aminosyresekvens, tilveiebringes her som SEKV. ID NR.: 1 henholdsvis 2.

TACI-reseptoren binder to medlemmer av tumornekrosefaktor(TNF)ligand-familien. Én ligand betegnes om hverandre som ZTNF4, "BAFF", "nøytrokin-a", "BLyS", "TALL-1" og "THANK" (Yu et al., internasjonalt patentskrift nr. WO 98/18921 (1998), Moore et al., Science, 285:269 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747 (1999); Shu et al., J. Leukoc. Biol., 65:680

(1999)). Aminosyresekvensen til ZTNF4 gis som SEKV. ID NR.: 3. Den andre liganden er blitt betegnet "ZTNF2", "APRIL" og "TNRF-dødsligand-1" (Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185 (1998); Kelly et al., Cancer Res., 60:1021 (2000)). Aminosyresekvensen til ZTNF2 gis som SEKV. ID NR.: 4. De to ligander bindes også av B-cellemodningsreseptoren (BCMA) (Gross et al., Nature, 404:995 (2000)). Nukleotidsekvensen og aminosyresekvensen til BCMA gis som SEKV. ID NR.: 26 henholdsvis SEKV. ID NR.: 27.

De påviste aktiviteter in vivo av tumornekrosefaktorreseptorer illustrerer det kliniske potensialet av løselige former av reseptoren. Løselige former av TACI-reseptoren er blitt frembrakt som immunglobulinfusjonsproteiner. De opprinnelige versjoner førte til et heterogent protein med lav ekspresjon. Heterogeniteten ble påvist i aminoenden av TACI, i Fc-karboksylenden og i TACI-stilkområdet. Det foreligger derfor et behov for farmasøytisk anvendbare TACI-reseptorpreparater.

WO 00/40716 beskriver løselig, utsondret polypeptid og deres anvendelse til påvisning av ligander, agonister og antagonister, og i fremgangsmåter som modulerer B-celleaktivering.

WO 01/81417 beskriver TACI som et anti-humant middel.

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en transmembran aktivator og kalsium modulatorog cyklofilinligandinteraktor(TACI)-immunglobulinfusjonsprotein for fremstilling av et medikament for inhibering av proliferasjon av tumorceller, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en TACI reseptorgruppe som består av et fragment av et polypeptid som har aminosyresekvensen av aminosyrerestene 30-154 i SEKV. ID Nr: 2, hvor TACI reseptorgruppen består av en aminosyresekvens valgt fra (i) aminosyrerestene 34 til 104 av SEKV. ID Nr: 2, (ii) aminosyrerestene 30-110 i SEKV. ID Nr: 2; og (iii) aminosyrerestene 30-154 i SEKV. ID NR.: 2; og hvor TACI reseptorgruppen binder i det minste en av ZTNF2 eller ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe omfattende en konstant region av et immunglobulin.

Den foreliggende oppfinnelse gir dermed også et fusjonsprotein som omfatter: (a) en transmembran aktivator og kalsium modulatorog cyklofilinligandinteraktor-(TACI) reseptorgruppe,karakterisert vedat TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvens valgt fra: (i) aminosyrerestene 34-104 ifølge SEKV. ID Nr: 2, (ii) aminosyrerestene 30-110 av SEKV. ID Nr: 2, og (iii) aminosyrerestene 30-154 i SEKV. ID Nr: 2; hvor TACI- reseptorgruppen binder i det minste én av ZTNF2 orZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe som omfatteren konstant region av et immunglobulin.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbedrede TACI-immunglobulinfusjonsproteiner som er egnet som terapeutiske forbindelser.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser aminosyresekvensen til human-TACI. Plasseringen av de cysteinrike pseudorepetisjoner er angitt ved skravering, transmembrandomenet er innrammet, og stilkområdet er angitt med nummertegn. Figur 2 er en skjematisk fremstilling av et immunglobulin fra IgGl-underklassen. CL: lettkjedens konstante område; CHi, Cm, Cm- tungkjedens konstante områder; VL: lettkjedens variable område; VH: tungkjedens variable område; CHO: karbohydrat; N: aminoende; C: karboksylende. Figurene 3A, 3B, 3C og 3D viser en sammenligning mellom villtypeaminosyre-sekvensen til humant yl-konstant område-Fc og variantene Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 og Fc8. Cm-domenet i det humane yl-konstant område er ikke del av Fc og er derfor ikke vist. Plasseringen av hengselområdet, CH2-domenet og CH3-domenet er angitt. Cys-restene som normalt deltar i disulfidbinding til lettkjedens konstante område (LC) og tungkjedens konstante område (HC), er angitt. Et "."-symbol viser identitet med villtypen i den angjeldende posisjon, mens "<*>" angir plasseringen av karboksylenden og illustrerer forskjellen i karboksylenden til Fc6 sammenlignet med de andre Fc-versjonene. Aminosyre-plasseringene er angitt ved EU-indeksposisjoner. Figur 4 viser spesifikk binding av<125>I-ZTNF4 til forskjellige TACI-Fc-konstruksjoner. TACI-Fc-fusjonsproteinene hadde TACI-grupper som manglet de 29 første aminosyrerester i aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.: 2. Ett av fusjonsproteinene hadde en TACI-gruppe med intakt stilkområde (TACI (dl-29)-Fc5), mens tre av TACI-Fc-fusjons-proteinene hadde TACI-grupper med forskjellige delesjoner i stilkområdet (TACI (dl-29, dl07-154)-Fc5; TACI (dl-29, dlll-154)-Fc5; TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5). De eksperimentelle detaljer gis i eksempel 4. ;Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen ;1. Oversikt ;Som beskrevet nedenfor, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse transmembranaktivator og kalsiummodulator og syklofilinligandinteraktør(TACI)-immunglobulinfusjonsproteiner som definert i kravene, og anvendelse derav som definert i kravene. Foreksempel tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse for inhibering av proliferasjonen av tumorceller, som omfatter anvendelse av et preparat som omfatter et TACI-immunglobulinfusjonsprotein som definert i kravene. Et slikt preparat kan tilføres til celler som dyrkes in vitro. Preparatet kan være et farmasøytisk preparat som omfatter et farmasøytisk aksepterbart bærestoff og et TACI-immunglobulinfusjonsprotein, og det farmasøytiske preparat kan være for tilføres til et individ som har en tumor. Individet kan være et pattedyr. Tilførsel av det farmasøytiske preparat kan f.eks. inhibere proliferasjonen av B-lymfocytter i et pattedyr. ;Foreliggende beskrivelse omtaler også fremgangsmåter for inhibering av ZTNF4-aktivitet i et pattedyr, som omfatter tilførsel til pattedyret av et preparat som omfatter et TACI-immunglobulin. ZTNF4-aktiviteten kan være forbundet med forskjellige sykdommer og forstyrrelser. For eksempel kan et farmasøytisk preparat som omfatter et TACI-immunglobulinfusjonsprotein, anvendes for behandling av en autoimmun sykdom, f.eks. systemisk lupus erythematosus, myasthenia gravis, multippel sklerose, insulinavhengig diabetes mellitus, Crohns sykdom, reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt med polyartikulært forløp og psoriatisk artritt. Alternativt kan et farmasøytisk preparat som omfatter et TACI-immunglobulin, anvendes for behandling av en forstyrrelse som astma, bronkitt, emfysem og nyresvikt i sluttstadiet. Et farmasøytisk preparat som omfatter et TACI-immunglobulin, kan også anvendes for behandling av nyresykdom, f.eks. glomerulonefritt, vaskulitt, nefritt, amyloidose og pyelonefritt, eller en forstyrrelse som neoplasme, kronisk lymfocyttisk leukemi, multippelt myelom, non-Hodgkins lymfom, lymfoproliferativ sykdom etter transplantasjoner og lettkjedegammopati. I visse tilfeller kan ZTNF4-aktiviteten være forbundet med T-celler. Et farmasøytisk preparat som omfatter et TACI-immunglobulin, kan også anvendes for behandling av en sykdom eller forstyrrelse forbundet med immunsuppresjon, transplantatrejeksjon, "graft versus host"-sykdom og inflammasjon. For eksempel kan et farmasøytisk preparat som omfatter et TACI-immunglobulin, anvendes for å redusere inflammasjon og for behandling av forstyrrelser som leddsmerter, opphovning, anemi og septisk sjokk. ;Foreliggende beskrivelse omtaler også fremgangsmåter for å redusere nivået i sirkulasjonen av ZTNF4 i et pattedyr, som omfatter tilførsel til pattedyret av et farmasøytisk preparat som omfatter et farmasøytisk aksepterbart bærestoff og et TACI-immunglobulinfusjonsprotein, hvor tilførsel av det farmasøytiske preparat reduserer nivået av ZTNF4 i sirkulasjonen hos pattedyret. Som et eksempel kan tilførsel av et slikt farmasøytisk preparat redusere nivået av ZTNF4 i sirkulasjonen med minst 10 %, minst 20 %, minst 10-60 %, minst 20-50 % eller minst 30-40 %, sammenlignet med nivået av ZTNF4 i blodet før tilførsel av det farmasøytiske preparat. Fagfolk kan måle nivået av ZTNF4 i sirkulasjonen. Illustrerende fremgangsmåter beskrives i eksempel 4 og eksempel 5. ;Som beskrevet nedenfor, omfatter illustrerende TACI-immunglobulinfusjonsproteiner: (a) en TACI-reseptorgruppe som består av en aminosyresekvens valgt fra: aminosyrerest 30 til 104 i SEKV. ID NR.: 2; aminosyrerest 30 til 110 i SEKV. ID NR.: 2; og aminosyrerest 30 til 154 i SEKV. ID NR.: 2; og (b) en immunglobulingruppe som omfatter et konstant område fra et immunglobulin. ;Immunglobulingruppen i et TACI-immunglobulinfusjonsprotein kan omfatte et konstant område fra en tungkjede, f.eks. et konstant område fra en human tungkjede. Et konstant område fra en IgGl-tungkjede er et eksempel på et egnet konstant område fra en tungkjede. Et illustrerende konstant område fra en IgGl-tungkjede er et IgGl-Fc-fragment som omfatter CH2_domenet og CH3-domenet. IgGl-Fc-fragmentet kan være et IgGl-Fc-fragment av villtype eller et mutert IgGl-Fc-fragment, f.eks. Fc-fragmentet som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.: 33. Ett eksempel på et TACI-immunglobulinfusjonsprotein er et protein med en aminosyresekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.: 54. ;TACI-immunglobulinfusjonsproteinene som beskrives her, kan være multimerer, slik som dimerer. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nukleinsyremolekyler (som definert i kravene) som koder for et TACI-immunglobulinfusjonsprotein. En illustrerende nukleotidsekvens som koder for et TACI-immunglobulinfusjonsprotein, gis i SEKV. ID NR.: 53. ;Foreliggende beskrivelse omtaler også løselige TACI-reseptorer som består av et fragment av et polypeptid med aminosyresekvensen fra aminosyrerest 30 til aminosyrerest 154 i SEKV. ID NR.: 2, hvor den løselige TACI-reseptor omfatter minst én av (i) aminosyrerester 34-66 i SEKV. ID NR.: 2, og (ii) aminosyrerester 71-104 i SEKV. ID NR.: 2, og hvor den løselige TACI-reseptor binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4. Ytterligere løselige TACI-reseptorer beskrives her som egnede TACI-reseptorgrupper for TACI-immunglobulinfusjonsproteiner. Videre kan løselige TACI-reseptorer anvendes i fremgangsmåtene som beskrives for TACI-immunglobulinfusjonsproteiner. ;Disse og andre sider ved oppfinnelsen vil være åpenbare ved henvisning til den påfølgende detaljerte beskrivelse og figurene. I tillegg er forskjellige referanser angitt nedenfor. ;2. Definisjoner ;I den påfølgende beskrivelse benyttes en rekke begreper i omfattende grad. De påfølgende definisjoner gis for å lette forståelsen av oppfinnelsen. ;Som anvendt her, viser "nukleinsyre" eller "nukleinsyremolekyl" til poly-nukleotider, f.eks. deoksyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA), oligonukleotider, fragmenter dannet ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) og fragmenter dannet ved ligering, kutting, endonukleasevirkning og eksonukleasevirkning. Nukleinsyremolekyler kan bestå av monomerer som er naturlig forekommende nukleotider (f.eks. DNA og RNA), av analoger av naturlig forekommende nukleotider (f.eks. a-enantiomere former av naturlig forekommende nukleotider) eller en kombinasjon av disse. Modifiserte nukleotider kan ha endringer i sukkergruppene og/eller i pyrimidin- eller purinbase-gruppene. Sukkermodifikasjoner omfatter f.eks. erstatning av én eller flere hydroksylgrupper med halogen, alkylgrupper, aminer og azidogrupper, eller sukkere kan være funksjonalisert som etere eller estere. Videre kan hele sukkergruppen være erstattet med sterisk og elektronisk lignende strukturer, f.eks. azasukkere og karbosykliske sukker-analoger. Eksempler på modifikasjoner i en basegruppe omfatter alkylerte puriner og pyrimidiner, acylerte puriner eller pyrimidiner eller andre velkjente heterosykliske substitutter. Nukleinsyremonomerer kan være sammenkoblet via fosfodiesterbindinger eller analoger av slike bindinger. Analoger av fosfodiesterbindinger omfatter fosfortioatbindinger, fosforditioatbindinger, fosforselenoatbindinger, fosfordiselenoatbindinger, fosforanilotioat-bindinger, fosforanilidatbindinger, fosforamidatbindinger og lignende. Begrepet "nukleinsyremolekyl" omfatter også såkalte "peptidnukleinsyrer", som omfatter naturlig forekommende eller modifiserte nukleinsyrebaser koblet til en polyamidryggrad. Nukleinsyrer kan være enten enkelttrådede eller dobbelttrådede. ;Begrepet "komplement til et nukleinsyremolekyl" viser til et nukleinsyremolekyl med en komplementær nukleotidsekvens og revers orientering, sammenlignet med en referansenukleotidsekvens. For eksempel er sekvensen 5' ATGCACGGG 3' (SEKV. ID NR.: 57) komplementær til 5' CCCGTGCAT 3' (SEKV. ID NR.: 58). ;Begrepet "contig" betegner et nukleinsyremolekyl som har et kontinuerlig sekvensstrekk som er identisk med eller komplementært til et annet nukleinsyremolekyl. Kontinuerlige sekvenser sies å "overlappe" et gitt strekk av et nukleinsyremolekyl, enten fullstendig eller over et gitt område av nukleinsyremolekylet. ;Begrepet "degenerert nukleotidsekvens" betegner en nukleotidsekvens som omfatter ett eller flere degenererte kodoner, sammenlignet med et referansemolekyl som koder for et polypeptid. Degenererte kodoner inneholder forskjellige tripletter av nukleotider, men koder for samme aminosyrerest (f.eks. koder triplettene GAU og GAC begge for Asp). ;Begrepet "strukturelt gen" viser til et nukleinsyremolekyl som transkriberes til budbringer-RNA (mRNA), som så translateres til en aminosyresekvens som er karakteristisk for et gitt polypeptid. ;Et "isolert nukleinsyremolekyl" er et nukleinsyremolekyl som ikke er integrert i det genomiske DNA i en organisme. For eksempel er et DNA-molekyl som koder for en vekstfaktor som er blitt separert fra det genomiske DNA i en celle, et isolert DNA-molekyl. Et annet eksempel på et isolert nukleinsyremolekyl er et kjemisk syntetisert nukleinsyremolekyl som ikke er integrert i genomet til en organisme. Et nukleinsyremolekyl som er blitt isolert fra en gitt art, er mindre enn det fullstendige DNA-molekyl i et kromosom fra denne art. ;En "nukleinsyremolekylkonstruksjon" er et nukleinsyremolekyl, enten enkelttrådet eller dobbelttrådet, som er blitt modifisert ved menneskelig inngripen slik at det inneholder segmenter av nukleinsyre som er kombinert og sammenstilt i et arrangement som ikke foreligger i naturen. ;"Lineært DNA" betegner ikke-sirkulære DNA-molekyler med en fri 5'-ende og 3'-ende. Lineært DNA kan fremstilles fra lukkede sirkulære DNA-molekyler, f.eks. plasmider, ved enzymatisk kutting eller fysisk oppbrytning. ;"Komplementært DNA (cDNA)" er et enkelttrådet DNA-molekyl som er dannet fra et mRNA-templat med enzymet reve rst ran skri pta se. Typisk anvendes en primer som er komplementær til deler av mRNA for innledning av reverstranskripsjonen. Fagfolk benytter også begrepet "cDNA" for å betegne et dobbelttrådet DNA-molekyl som består av et slikt enkelttrådet DNA-molekyl og dets komplementære DNA-tråd. Uttrykket "cDNA" viser også til en klon av et cDNA-molekyl syntetisert fra et RNA-templat. ;En "promoter" er en nukleotidsekvens som styrer transkripsjonen av et strukturelt gen. En promoter ligger typisk i det 5'-ikke-kodende området i et gen, proksimalt til transkripsjonsstartsetet i et strukturelt gen. Sekvenselementer i promotere som fungerer ved innledning av transkripsjonen, karakteriseres ofte av konsensusnukleotid-sekvenser. Disse promoterelementene omfatter RNA-polymerasebindingsseter, TATA-sekvenser, CAAT-sekvenser, differensieringsspesifikke elementer (DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol., 7:551 (1993)), syklisk AMP-responselementer (CRE), serumrespons-elementer (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol., 1:47 (1990)), glukokortikoidrespons-elementer (GRE) og bindingsseter for andre transkripsjonsfaktorer, f.eks. CRE/ATF (0'Reilly et al., J. Biol. Chem., 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem., 269:25728 ;(1994)), SP1, cAMP-responselementbindende protein (CREB; Loeken, Gene Expr., 3:253 ;(1993)) og oktamerfaktorer (se generelt Watson et al., red., Molecular Biology of the Gene, 4. utgave (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., 1987), og Lemaigre og Rousseau, Biochem. J., 303:1 (1994)). Dersom en promoter er en induserbar promoter, øker transkripsjonshastigheten som respons på et induksjonsmiddel. I motsetning til dette reguleres transkripsjonshastigheten ikke av et induksjonsmiddel dersom promoteren er en konstitutiv promoter. Represserbare promotere er også kjent. ;En "kjernepromoter" inneholder essensielle nukleotidsekvenser for promoter-funksjonen, innbefattet TATA-boksen og transkripsjonsstart. Ved denne definisjonen kan en kjernepromoter enten ha påvisbar aktivitet i fravær av spesifikke sekvenser som kan fremme aktiviteten eller gi vevsspesifikk aktivitet, eller ikke ha det. ;Et "regulatorisk element" er en nukleotidsekvens som modulerer aktiviteten av en kjernepromoter. Et regulatorisk element kan f.eks. inneholde en nukleotidsekvens som binder cellulære faktorer som tillater transkripsjon utelukkende eller fortrinnsvis i gitte celler, vev eller organeller. Disse typene av regulatoriske elementer er normalt forbundet med gener som uttrykkes på en "cellespesifikk", "vevsspesifikk" eller "organellespesifikk" måte. ;En "enhancer" er en type regulatorisk element som kan øke transkripsjons-effektiviteten uavhengig av avstand eller orientering av enhanceren relativt til transkripsjonsstartsetet. "Heterologt DNA" viser til et DNA-molekyl eller en populasjon av DNA-molekyler som ikke naturlig foreligger i en gitt vertscelle. DNA-molekyler som er heterologe for en gitt vertscelle, kan inneholde DNA avledet fra vertscellearten (det vil si endogent DNA) så lenge som dette verts-DNA er kombinert med ikke-verts-DNA (det vil si eksogent DNA). For eksempel anses et DNA-molekyl som inneholder et ikke-verts-DNA-segment som koder for et polypeptid operativt koblet til et verts-DNA-segment som omfatter en transkripsjonspromoter, å være et heterologt DNA-molekyl. Omvendt kan et heterologt DNA-molekyl omfatte et endogent gen som er operativt koblet til en eksogen promoter. Som en annen illustrasjon anses et DNA-molekyl som omfatter et gen avledet fra en villtypecelle å være heterologt DNA dersom dette DNA-molekyl er innført i en mutant celle som mangler villtypegenet. ;Et "polypeptid" er en polymer av aminosyrerester sammenbundet med peptidbindinger, enten fremstilt naturlig eller syntetisk. Polypeptider med mindre enn ca. 10 aminosyrerester betegnes vanligvis "peptider". ;Et "protein" er et makromolekyl som omfatter én eller flere polypeptidkjeder. Et protein kan også omfatte ikke-peptidbestanddeler, f.eks. karbohydratgrupper. Karbohydrater og andre ikke-peptidbestanddeler kan være addert til et protein av cellen som proteinet er dannet i, og dette vil variere med celletypen. Proteiner er definert her ut fra deres aminosyreryggradstruktur; substituenter som karbohydratgrupper spesifiseres generelt ikke, men kan likevel foreligge. ;Et peptid eller polypeptid som kodes av et ikke-verts-DNA-molekyl, er et "heterologt" peptid eller polypeptid. ;Et "integrert genetisk element" er et DNA-segment som er blitt inkorporert i et kromosom i en vertscelle etterat elementet ble innført i cellen ved human manipulering. I foreliggende oppfinnelse er integrerte genetiske elementer vanligvis avledet fra lineariserte plasmider som innføres i cellene ved elektroporering eller andre teknikker. Integrerte genetiske elementer overføres fra den opprinnelige vertscelle til dens avkom. ;En "kloningsvektor" er et nukleinsyremolekyl, f.eks. et plasmid, et kosmid eller en bakteriofag, som har evnen til å replikeres autonomt i en vertscelle. Kloningsvektorer inneholder typisk ett eller et lite antall restriksjonsendonukleasegjenkjenningsseter som tillater innsetting av et nukleinsyremolekyl på en forutsigbar måte uten tap av en essensiell biologisk funksjon i vektoren, så vel som nukleotidsekvenser som koder for et markørgen som er egnet for anvendelse ved påvisning og seleksjon av celler som er transformert med kloningsvektoren. Markørgener omfatter typisk gener som gir tetrasyklinresistens eller ampicillinresistens. ;En "ekspresjonsvektor" er et nukleinsyremolekyl som koder for et gen som uttrykkes i en vertscelle. En ekspresjonsvektor omfatter typisk en transkripsjonspromoter, et gen og en transkripsjonsterminator. Genekspresjonen er vanligvis plassert under kontroll av en promoter, og et slikt gen sies å være "operativt koblet til" promoteren. Pa tilsvarende måte er et regulatorisk element og en kjernepromoter operativt sammenkoblet dersom det regulatoriske element modulerer aktiviteten av kjernepromoteren. ;En "rekombinant vert" er en celle som inneholder et heterologt nukleinsyremolekyl, f.eks. en kloningsvektor eller ekspresjonsvektor. I den foreliggende sammenheng er et eksempel på en rekombinant vert en celle som danner et TACI-Fc-fusjonsprotein fra en ekspresjonsvektor. "Integrative transformanter" er rekombinante vertsceller i hvilke heterologt DNA er blitt integrert i cellenes genomiske DNA. ;Et "fusjonsprotein" er et hybridprotein som uttrykkes av et nukleinsyremolekyl som omfatter nukleotidsekvenser fra minst to gener. For eksempel omfatter et TACI-immunglobulinfusjonsprotein en TACI-reseptorgruppe og en immunglobulingruppe. Som anvendt her, er en "TACI-reseptorgruppe" en del av det ekstracellulære domenet i TACI-reseptoren som binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4. Uttrykket "en immunglobulingruppe" viser til et polypeptid som omfatter et konstant område fra et immunglobulin. Immunglobulingruppen kan f.eks. omfatte en tungkjedes konstante område. Uttrykket "TACI-Fc"-fusjonsprotein viser til et TACI-immunglobulinfusjonsprotein i hvilket immunglobulingruppen omfatter immunglobulintungkjedens konstante områder CH2og CH3. ;Begrepet "reseptor" betegner et celleassosiert protein som bindes til et bioaktivt molekyl som betegnes en "ligand". Denne interaksjon formidler virkningen av liganden på cellen. I forbindelse med TACI-reseptorbinding viser uttrykket "bindes spesifikt" eller "spesifikk binding" til ligandens evne til kompetitivt å bindes til reseptoren. For eksempel bindes ZTNF4 spesifikt til TACI-reseptoren, og dette kan vises ved at det observeres konkurranse om TACI-reseptoren mellom påvisbart merket ZTNF4 og umerket ZTNF4. ;Reseptorer kan være membranbundne, cytosoliske eller nukleære, monomere (f.eks. tyreoidstimulerende hormonreseptor, beta-adrenerg reseptor) eller multimere (f.eks. PDGF-reseptor, veksthormon reseptor, IL-3-reseptor, GM-CSF-reseptor, G-CSF-reseptor, erytropoietinreseptor og IL-6-reseptor). Membranbundne reseptorer særpreges ved en flerdomenestruktur som omfatter et ekstracellulært ligandbindende domene og et intracellulært effektordomene som typisk deltar i signaloverføring. I visse membranbundne reseptorer er det ekstracellulære ligandbindende domenet og det intracellulære effektord orne net plassert på separate polypeptider som utgjør den fullstendige funksjonelle reseptor. ;Generelt fører binding av ligand til reseptor til en konformasjonsendring i reseptoren som fører til en interaksjon mellom effektordomenet og ett eller andre flere molekyler i cellen, noe som i sin tur fører til endret metabolisme i cellen. Metabolske begivenheter som ofte er koblet til reseptorligandinteraksjoner, omfatter gentranskripsjon, fosforylering, defosforylering, økt syklisk AMP-produksjon, mobilisering av cellulært kalsium, mobilisering av membranlipider, celleadhesjon, hydrolyse av inositollipider og hydrolyse av fosfolipider. ;Begrepet "sekretorisk signalsekvens" betegner en DNA-sekvens som koder for et peptid (et "sekretorisk peptid") som som bestanddel av et større polypeptid styrer det større polypeptid gjennom en sekresjonsvei i en celle i hvilken proteinet syntetiseres. Det større polypeptid spaltes vanligvis slik at det sekretoriske peptid fjernes under passasjen gjennom sekresjonsveien. ;Et "isolert polypeptid" er et polypeptid som i det vesentlige er fritt for kontaminerende cellulære bestanddeler, f.eks. karbohydrat, lipid eller andre proteinholdige urenheter som er forbundet med polypeptidet i naturen. Et preparat av et isolert polypeptid inneholder typisk polypeptidet i svært ren form, det vil si minst ca. 80 % rent, minst ca. 90 % rent, minst ca. 95 % rent, mer enn 95 % rent eller mer enn 99 % rent. En måte å vise at et gitt proteinpreparat inneholder et isolert polypeptid på, er ved at det opptrer ett enkelt bånd etter natriumdodecylsulfat(SDS)polyakrylamidgelelektroforese av protein preparatet og Coomassie Brilliant Blue-farging av gelen. Begrepet "isolert" utelukker imidlertid ikke nærvær av det samme polypeptid i alternative fysiske former, f.eks. som dimerer, eller alternativt glykosylerte eller derivatiserte former. ;Uttrykkene "aminoterminal" og "karboksylterminal" anvendes her for å betegne posisjoner i polypeptider. Dersom sammenhengen tillater dette, anvendes disse begrepene med henvisning til en gitt sekvens eller del av et polypeptid for å betegne nærhet eller relativ posisjon. For eksempel ligger en gitt sekvens som er plassert karboksylterminalt for en referansesekvens i et polypeptid proksimalt for karboksylenden i referansesekvensen, men ligger ikke nødvendigvis i det fullstendige polypeptids karboksylende. ;Uttrykket "ekspresjon" viser til biosyntese av et genprodukt. Når det f.eks. gjelder et strukturelt gen, omfatter ekspresjon transkripsjon av det strukturelle gen til mRNA og translasjon av mRNA til ett eller flere polypeptider. ;Begrepet "spleisevariant" anvendes her for å betegne alternative former av RNA transkribert fra et gen. Spleisevariasjon oppstår naturlig ved anvendelse av alternative spleiseseter i et transkribert RNA-molekyl, eller mindre vanlig mellom separat transkriberte RNA-molekyler, og kan føre til at flere mRNA transkriberes fra samme gen. Spleisevarianter kan kode for polypeptider med endret aminosyresekvens. Begrepet spleisevariant anvendes også her for å betegne et polypeptid som kodes av en spleisevariant av et mRNA som transkriberes fra et gen. ;Som anvendt her, omfatter begrepet "immunmodulator" cytokiner, stamcellevekstfaktorer, lymfotoksiner, kostimulerende molekyler, hematopoetiske faktorer og syntetiske analoger av disse molekylene. ;Begrepet "komplement-/antikomplementpar" betegner ikke-identiske grupper som danner et ikke kovalent forbundet, stabilt par under egnede betingelser. For eksempel er biotin og avidin (eller streptavidin) prototypiske medlemmer av et komple- ment-/antikomplementpar. Andre eksempler på komplement-/antikomplementpar omfatter reseptor-/ligandpar, antistoff/anti- gen(eller hapten eller epitop)par, "sense"-/"antisense"-poly-nukleotidpar og lignende. Dersom påfølgende dissosiering av komplement-/antikomplementparet er ønskelig, har komplement-/antikomplementparet fortrinnsvis en bindingsaffinitet som er lavere enn IO<9>M<1>. ;Et "antistoffragment" er en del av et antistoff, f.eks. F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab og lignende. Uavhengig av strukturen bindes et antistoffragment til det samme antigen som gjenkjennes av det intakte antistoff. ;Begrepet "antistoffragment" omfatter også et syntetisk eller genetisk modifisert polypeptid som bindes til et spesifikt antigen, f.eks. polypeptider som består av lettkjedens variable område, "Fv"-fragmenter som består av tungkjedens og lettkjedens variable områder, rekombinante enkeltkjedede polypeptidmolekyler i hvilke lettkjedens og tungkjedens variable områder er sammenbundet via en peptidlinker ("scFv-proteiner") og minimale gjenkjenningsenheter som består av aminosyrerester som etterligner det hypervariable området. ;Et "kimært antistoff" er et rekombinant protein som inneholder de variable domener og de komplementaritetsbestemmende områder avledet fra et gnagerantistoff, mens resten av antistoffmolekylet er avledet fra et humant antistoff. "Humaniserte antistoffer" er rekombinante proteiner i hvilke komplementaritetsbestemmende områder fra et monoklonalt museantistoff er blitt overført fra tungkjedens og lettkjedens variable områder i museimmunglobulinet til et humant variabelt domene. ;Som anvendt her, er et "terapeutisk middel" et molekyl eller atom som er konjugert til en antistoffgruppe slik at det dannes et konjugat som er anvendbart for behandling. Eksempler på terapeutiske midler omfatter medikamenter, toksiner, immun-modulerende midler, chelaterende midler, borforbindelser, fotoaktive midler eller fargestoffer og radioaktive isotoper. ;En "påvisbar merking" er et molekyl eller atom som kan konjugeres til en antistoffgruppe slik at det dannes et molekyl som er anvendbart for diagnose. Eksempler på påvisbar merking omfatter chelaterende midler, fotoaktive midler, radioaktive isotoper, fluorescerende midler, paramagnetiske ioner og andre markørgrupper. ;Begrepet "affinitetsmerkelapp" anvendes her for å betegne et polypeptid-segment som kan kobles til et andre polypeptid for å tillate rensing eller påvisning av det andre polypeptid eller tilveiebringe seter for tilkobling av det andre polypeptid til et støttemedium. Prinsipielt kan ethvert peptid eller protein for hvilket et antistoff eller et annet spesifikt bindingsmiddel er tilgjengelig, anvendes som affinitetsmerkelapp. Affinitetsmerkelapper omfatter et polyhistidinstrekk, protein A (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol., 198:3 (1991)), glutation S-transferase (Smith og Johnson, Gene, 67:31 (1988)), Glu-Glu-affinitetsmerkelapper (Grussenmeyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:7952 (1985)), substans P, FLAG-peptid (Hopp et al., Biotechnology, 6:1204 (1988)), streptavidinbindende peptid eller andre antigenepitoper eller bindingsdomener. Se generelt Ford et al., Protein Expression and Purification, 2:95 (1991). DNA-molekyler som koder for affinitetsmerkelapper, er tilgjengelige fra kommersielle leverandører (f.eks. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). ;Et "nakent antistoff" er i motsetning til et antistoffragment et helt antistoff som ikke er konjugert til et terapeutisk middel. Nakne antistoffer omfatter både polyklonale og monoklonale antistoffer, så vel som visse rekombinante antistoffer, f.eks. kimære og humaniserte antistoffer. ;Som anvendt her, omfatter begrepet "antistoffbestanddel" både et helt antistoff og et antistoffragment. ;Et "immunkonjugat" er et konjugat mellom en antistoffbestanddel og et terapeutisk middel eller en påvisbar merking. ;Et "målpolypeptid" eller et "målpeptid" er en aminosyresekvens som omfatter minst én epitop og som utrykkes på en målcelle, f.eks. en tumorcelle eller en celle som bærer et antigen fra et infeksiøst agens. T-celler gjenkjenner peptidepitoper som presenteres av et vevstypekompleksmolekyl overfor et målpolypeptid eller målpeptid og som typisk lyserer målcellen eller rekrutterer andre immunceller til målcellesetet, hvorved målcellen drepes. ;Et "antigent peptid" er et peptid som vil bindes til et vevstypekompleksmolekyl slik at det dannes et MHC-peptidkompleks som gjenkjennes av en T-celle, hvorved en cytotoksisk lymfocyttrespons induseres etter presentasjon overfor T-cellen. Antigene peptider kan således bindes til et egnet vevstypekompleksmolekyl og indusere en cytotoksisk T-cellerespons, f.eks. cellelysering eller frigivelse av spesifikke cytokiner mot målcellen som binder eller uttrykker antigenet. Det antigene peptid kan bindes i forbindelse med et vevstypekompleksmolekyl av klasse I eller klasse II på en antigenpresenterende celle eller på en målcelle. ;Hos eukaryoter katalyserer RNA-polymerase II transkripsjon av et strukturelt gen for dannelse av mRNA. Et nukleinsyremolekyl kan utformes slik at det inneholder et RNA-polymerase II-templat i hvilket RNA-transkriptet har en sekvens som er komplementær til sekvensen til et spesifikt mRNA. RNA-transkriptet betegnes et "antisense-RNA", og et nukleinsyremolekyl som koder for "antisense"-RNA, betegnes et "antisense- gen". "Antisense"-RNA-molekyler kan bindes til mRNA-molekyler, noe som fører til inhibering av mRNA-translasjonen. ;Grunnet unøyaktigheten i standard analytiske fremgangsmåter skal molekylvekter og lengden av polymerer forstås å være tilnærmede verdier. Dersom en slik verdi uttrykkes som "cirka" X eller "omtrent" X, skal det forstås at den angitte verdi for X er nøyaktig + 10 %. ;3. Dannelse av nukleinsvremolekvler som koder for TACI- immunalobulinproteiner ;Figur 1 gir den utledede aminosyresekvens for human-TACI (von Bulow og Bram, Science, 278:138 (1997)). TACI-polypeptidet inneholder de påfølgende utledede elementer: (a) to cysteinrike pseudorepetisjonsstrukturer som er typiske for tumornekrose-faktorligandbindende domener, (b) et "stilkområde" på 62 aminosyrer som ligger mellom de ligandbindende domener og transmembrandomenet, (c) et transmembrandomene på 20 aminosyrer, og (d) et intracellulært domene på 127 aminosyrer. Aminosyresekvensen inneholder ingen utledet hydrofob aminoterminal signalsekvens. ;For å danne en løselig form av human-TACI for anvendelse som en inhibitor av interaksjonen mellom den native ligand og den native reseptor ble et fusjonsprotein mellom det ekstracellulære TACI-domenet og humant immunglobulin-Fc fremstilt. Den tilgjengelige humane TACI-sekvens ble anvendt som utgangspunkt for utforming av fusjonsprotein-molekylet (von Bulow og Bram, Science, 278:138 (1997)). Denne utgangskonstruksjonen, som ble betegnet "TACI-Fc4", omfattet sekvensen fra aminosyrerest 1 til aminosyrerest 154 i TACI-polypeptidet og et modifisert humant Fc-område, som beskrives nedenfor. Fusjonspunktet ved aminosyrerest 154 ble utvalgt slik at mest mulig av stilkområdet i TACI inngikk, samtidig som ingen mulig del av det utledede transmembrandomenet inngikk. ;Siden nativtTACI-polypeptid ikke inneholderen aminoterminal signalsekvens, ble en aminoterminal signalsekvens addert til TACI for å danne en utskilt form av TACI-Fc-fusjonsproteinet. Signalsekvensen var en modifisert pre-pro-sekvens fra human vevsplasminogenaktivator. Modifikasjonene ble innført for å forbedre signalpeptidasespalting og furinproteasespesifikk prosessering, og av denne grunn betegnes denne sekvens som den "optimaliserte tPA(otPA)-ledersekvens". otPA-sekvensen (SEKV. ID NR.: 25) er vist nedenfor; modifiserte aminosyrerester er skravert. Den kodende sekvens for rekombinant TACI-Fc-fusjonsprotein ble innsatt i en ekspresjonsvektor som ble transfektert inn i kinesisk hamsterovarieceller. ; De transfekterte kinesisk hamsterovariecellene dannet TACI-Fc4-proteinet i liten mengde tilsvarende ca. 0,3 pg/celle/dag. Western blot-analyse av TACI-Fc-protein med antihumant IgG-Fc-antiserum fra geit viste to bånd, hvorav ett var mindre enn den forventede størrelse på ca. 48 kDa. Aminosyresekvensanalyse av rensede proteiner viste at det minste båndet gjenspeilet spalting av TACI-fusjonsproteiner i forskjellige seter i TACI-stilkområdet. Idet det henvises til SEKV. ID NR.: 2, ble hovedendene funnet ved aminosyrerester 118 og 123, selv om proteiner også ble spaltet ved aminosyreposisjonene 110, 139 og 141. ;I tillegg til heterogeniteten grunnet spalting i stilkområdet ble heterogenitet også observert i aminoenden og karboksylenden. Idet det henvises til SEKV. ID NR.: 2, ble de viktigste aminoendene funnet ved aminosyrerester 1, 10 og 13. Forskjellene i karboksylenden gjenspeiler den naturlige heterogenitet av rekombinante immunglobuliner og immunglobulinfusjonsproteiner, som omfatter ufullstendig fjerning av den karboksylterminalt kodede lysinrest. En annen kilde for heterogeniteten ble funnet i den variable natur av karbohydratstrukturen som var koblet til det Fc-kodede immunglobulin-CH2-domenet. ;Nye versjoner av TACI-Fc ble fremstilt for å korrigere den observerte heterogenitet. Det ble utformet konstruksjoner som omfattet minst én av følgende varianter i TACI-gruppen: (1) deler av TACI-stilkområdet ble delert, (2) en del av TACI-stilkområdet ble erstattet med en del av BCMA-stilkområdet, (3) argininresten i posisjon 119 ble mutert for å fjerne et mulig furinspaltingssete, (4) glutaminresten i posisjon 121 ble mutert for å fjerne et mulig furinspaltingssete, (5) argininresten i posisjon 122 ble mutert for å fjerne et mulig furinspaltingssete, (6) aminosyreresten i posisjoner 123 og 142 ble mutert til aminosyrerester som forefinnes i de tilsvarende posisjoner i TACI fra mus, (7) den humane otPA-signalsekvens ble erstattet med en signalsekvens fra en human tungkjedes variable område, (8) valinresten i posisjon 29 ble mutert til metionin, og otPA-signalsekvensen ble koblet i en aminoterminal posisjon til denne aminosyrerest, og (9) otPA-signalsekvensen ble koblet i en aminoterminal plassering til alaninresten i posisjon 30. ;Det ble også innført modifikasjoner i immunglobulingruppen. Fem klasser av immunglobuliner, IgG, IgA, IgM, IgD og IgE, er blitt påvist hos høyere vertebrater. IgG-, IgD- og IgE-proteiner er typisk disulfidsammenbundne heterotetramerer som består av to identiske tungkjeder og to identiske lettkjeder. IgM forefinnes typisk som en pentamer av en tetramer, mens IgA foreligger som en dimer av en tetramer. ;IgG utgjør hovedklassen, siden IgG normalt foreligger som det nest mest vanlige protein i plasma. Hos mennesker består IgG av fire underklasser som betegnes IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4. Som vist i figur 2, har hver immunglobulintungkjede et konstant område som består av det konstante områdes proteindomener (CHi, hengseldomene, CH2og CH3) som ikke varierer innen en gitt underklasse. Tungkjedens konstante områder i IgG-klassen betegnes med det greske symbol y. For eksempel inneholder immunglobuliner av IgGl-underklassen et konstant område i tungkjeden som betegnes yl. ;Fc-fragmentet eller Fc-domenet består av tungkjedenes disulfidsammenbundne hengselområder, CH2-domener og CH3-domener. I immunglobulinfusjonsproteiner anvendes Fc-domener fra underklasse IgGl ofte som immunglobulingruppe, siden IgGl har lengre halveringstid i serum enn noe annet serumprotein. Lang halveringstid i serum kan være en ønsket proteinegenskap for dyreforsøk og mulig terapeutisk anvendelse i mennesker. I tillegg har IgGl-underklassen den kraftigste evne til å utføre antistoff-formidlede effekto(funksjoner. Den primære effektorfunksjon som kan være mest anvendbar i et immunglobulinfusjonsprotein, er et IgGl-antistoffs evne til å formidle antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet. På den annen side kan dette være en uønsket funksjon for et fusjonsprotein som hovedsakelig fungerer som en antagonist. Flere av de spesifikke aminosyrerestene som er viktige for aktivitet som formidles av det konstante området i et antistoff fra IgGl-underklassen, er blitt påvist. Innbefattelse eller utelukkelse av disse spesifikke aminosyrene tillater derfor innbefattelse eller utelukkelse av spesifikke aktiviteter som formidles av immunglobulinets konstante område. ;Det ble dannet seks versjoner av et modifisert IgGl-Fc for dannelse av Fc-fusjonsproteiner. Fc-488 ble utformet for hendig kloning av et fusjonsprotein som inneholder det humane yl-Fc-området, og proteinet ble konstruert ved å benytte villtypen av yl-konstant område fra humant immunglobulin som templat. Bekymringer vedrørende mulige uheldige virkninger grunnet en uparet cysteinrest førte til at det ble bestemt å erstatte cysteinresten (aminosyrerest 24 i SEKV. ID NR.: 6) som normalt danner en disulfidbinding med det konstante området i immunglobulinets lettkjede med en serinrest. Nok en endring ble innført i kodonet som koder for EU-indeksposisjon 218 (aminosyrerest 22 i SEKV. ID NR.: 6) for å innføre et gjenkjenningssete for restriksjonsenzymet Sg/II for å forenkle fremtidige DNA-manipulasjoner. Disse endringer ble innført i PCR-produktet kodet av PCR-primerne. Grunnet plasseringen av Sg/II-setet, og for å fullstendiggjøre Fc-hengselområdet, ble kodoner for EU-indeksposisjonene 216 og 217 (aminosyrerester 20 og 21 i SEKV. ID NR.: 6) innført i fusjonsproteinpartnersekvensene. ;Fc4, Fc5 og Fc6 inneholder mutasjoner som reduserer effektorfunksjon ene som formidles av Fc ved at binding til FcyRI og komplement Clq reduseres. Fc4 inneholder de samme aminosyresubstitusjoner som ble innført i Fc-488. Ytterligere aminosyre substitusjoner ble innført for å redusere mulige Fc-formidlede effektorfunksjon er. Nærmere bestemt ble det innført tre aminosyresubstitusjoner for å redusere FcyRI-binding. Disse er substitusjonene i EU-indeksposisjonene 234, 235 og 237 (aminosyrerester 38, 39 og 41 i SEKV. ID NR.: 6). Substitusjoner i disse posisjonene er blitt vist å redusere bindingen til FcyRI (Duncan et al., Nature, 332:563 (1988)). Disse aminosyresubstitusjonene kan også redusere binding til FcyRIIa så vel som til FcyRIII (Sondermann et al., Nature, 406:267 ;(2000); Wines et al., J. Immunol., i64:5313 (2000)). ;Flere grupper har beskrevet betydningen av EU-indeksposisjonene 330 og 331 (aminosyrerester 134 og 135 i SEKV. ID NR.: 6) ved binding til komplement Clq og påfølgende komplementfiksering (Canfield og Morrison, J. Exp. Med., 173:1483 (1991); Tao et al., J. Exp. Med., 178:661 (1993)). Aminosyresubstitusjoner i disse posisjonene ble innført i Fc4 for å redusere komplementfiksering. CH3-domenet i Fc4 er identisk med domenet i det tilsvarende villtypepolypeptid, bortsett fra stoppkodonet som ble endret fra TGA til TAA for å fjerne et mulig dam-metyleringssete ved dyrking av det klonede DNA i dam-pluss-stammer av E. coli. ;I Fc5 ble argininresten i EU-indeksposisjon 218 mutert tilbake til lysin, siden Bg/II-kloningsskjemaet ikke ble anvendt i fusjonsproteiner som inneholdt dette spesielle Fc. Resten av Fc5-sekvensen tilsvarer beskrivelsen ovenfor for Fc4. ;Fc6 er identisk med Fc5, bortsett fra at det karboksylterminale lysinkodon er blitt fjernet. Den C-terminale lysinrest i modne immunglobuliner fjernes ofte fra modne immunglobuliner etter translasjonen før utskilling fra B-celler eller under sirkulasjon i serum. Følgelig forefinnes den C-terminale lysinrest typisk ikke i sirkulerende antistoffer. Som i Fc4 og Fc5 ovenfor ble stoppkodonet i Fc6-sekvensen endret til TAA. ;Fc7 er identisk med villtype-yl-Fc, bortsett fra en aminosyresubstitusjon i EU-indeksposisjon 297, lokalisert til CH2-domenet. EU-indeksposisjon Asn-297 (aminosyrerest 101 i SEKV. ID NR.: 6) er et sete for N-koblet karbohydrattilkobling. N-koblet karbohydrat innfører en mulig kilde for variabilitet i et rekombinant uttrykt protein grunnet mulige variasjoner i karbohydratstrukturen fra porsjon til porsjon. I et forsøk på å fjerne denne mulige variabilitet ble Asn-297 mutert til en glutaminrest for å forhindre tilkobling av N-koblet karbohydrat i denne posisjon. Karbohydratet i aminosyrerest 297 deltar også i Fc-binding til FcyRIII (Sondermann et al., Nature, 406:267 (2000)). Fjerning av karbohydratet bør derfor redusere binding av rekombinante Fc7-holdige fusjonsproteiner til FcyR generelt. Som ovenfor ble stoppkodonet i Fc7-sekvensen mutert til TAA. ;Fc8 er identisk med villtypeimmunglobulin yl-området som er vist i SEKV. ID NR.: 6, bortsett fra at cysteinresten i EU-indeksposisjon 220 (aminosyrerest 24 i SEKV. ID NR.: 6) ble erstattet med en serinrest. Denne mutasjon fjernet cysteinresten som normalt danner en disulfidbinding med det konstante området i immunglobulinlettkjeden. ;Illustrerende TACI-Fc-konstruksjoner er beskrevet i tabell 1. ; TACI-Fc-proteinene ble fremstilt i rekombinante kinesisk hamsterovarieceller, isolert og analysert ved anvendelse av Western blot-analyse og aminosyresekvensanalyse. Overraskende nok førte delesjon av de første 29 aminosyrene fra N-enden i TACI-polypeptidet til 10 gangers økning i dannelsen av TACI-Fc-fusjonsproteiner i kinesisk hamsterovariecellene. Denne delesjonen reduserte også spalting av fullengde-stilkområdet. I tillegg ble spalting innen TACI-stilkområdet undertrykt enten ved å avkorte TACI-stilkområdet eller ved å erstatte TACI-stilkområdet med en annen aminosyresekvens (f.eks. aminosyresekvensen til BCMA-stilkområdet). ;Som beskrevet i eksempel 4, viste funksjonelle analyser av TACI-Fc-konstruksjonene at fusjonsproteinene TACI(dl-29)-Fc5, TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5, TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 og TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 har tilsvarende bindingsaffinitet overfor ZTNF4. Konstruksjonene TACI(dl-29)-Fc5, TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 og TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 ser imidlertid ut til å binde mer ZTNF4 pr. mol TACI-Fc enn konstruksjonen TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5. Avhengig av den påtenkte anvendelse (f.eks. terapeutisk, diagnostisk eller forskningsmessig) kan det benyttes TACI-Fc-fusjonsproteiner med enten høy eller lav kapasitet. I tillegg tillater en kombinasjon av TACI-Fc-fusjonsproteiner med høy og lav kapasitet titrering av ZTNF2 eller ZTNF4. ;Foreliggende oppfinnelse omfatter TACI-immunglobulinfusjonsproteiner som definert i kravene som omfatter en TACI-reseptorgruppe som består av aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID NR.: 2, 30-110 i SEKV. ID NR.: 2 eller 30-154 i SEKV. ID NR.: 2. Foreliggende beskrivelse omtaler også TACI-immunglobulinfusjonsproteiner som omfatter en TACI-reseptorgruppe som består av aminosyrerester 31-106 i SEKV. ID NR.: 2, 31-110 i SEKV. ID NR.: 2, 31-119 i SEKV. ID NR.: 2 eller 31-154 i SEKV. ID NR.: 2. ;Mer generelt omtaler foreliggende beskrivelse TACI-immunglobulinfusjonsproteiner hvor TACI-reseptorgruppen består av et fragment fra aminosyrerest 30 til aminosyrerest 154 i SEKV. ID NR.: 2, og hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ;ZTNF2 og ZTNF4. Slike fragmenter omfatter et cysteinrikt pseudorepetisjonsområde og kan om ønskelig omfatte minst ett av et N-terminalt segment, som foreligger i en aminoterminal posisjon relativt til det cysteinrike pseudorepetisjonsområdet, og et stilksegment som ligger i en karboksylterminal posisjon relativt til det cysteinrike pseudorepetisjonsom rådet. Cysteinrike pseudorepetisjonsområder omfatter polypeptider som: (a) omfatter minst én av aminosyrerestene 34-66 i SEKV. ID NR.: 2 og aminosyrerester 71-104 i SEKV. ID NR.: 2, (b) omfatter både aminosyrerester 34-66 i SEKV. ID NR.: 2 og aminosyrerester 71-104 i SEKV. ID NR.: 2, eller (c) omfatter aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID NR.: 2. ;N-terminale segmenter omfatter følgende segmenter, idet det henvises til SEKV. ID NR.: 2: aminosyrerest 33, aminosyrerester 32-33, aminosyrerester 31-33 og aminosyrerester 30-33. Egnede stilksegmenter omfatter én eller flere aminosyrer fra aminosyrerest 105 til aminosyrerest 154 i SEKV. ID NR.: 2. For eksempel kan stilk-segmentet bestå av følgende, idet det henvises til SEKV. ID NR.: 2: aminosyrerest 105, aminosyrerester 105-106, aminosyrerester 105-107, aminosyrerester 105-108, aminosyrerester 105-109, aminosyrerester 105-110, aminosyrerester 105-111, aminosyrerester 105-112, aminosyrerester 105-113, aminosyrerester 105-114, aminosyrerester 105-115, aminosyrerester 105-116, aminosyrerester 105-117, aminosyrerester 105-118, aminosyrerester 105-119, aminosyrerester 105-120, aminosyrerester 105-121, aminosyrerester 105-122, aminosyrerester 105-123, aminosyrerester 105-124, aminosyrerester 105-125, aminosyrerester 105-126, aminosyrerester 105-127, aminosyrerester 105-128, aminosyrerester 105-129, aminosyrerester 105-130, aminosyrerester 105-131, aminosyrerester 105-132, aminosyrerester 105-133, aminosyrerester 105-134, aminosyrerester 105-135, aminosyrerester 105-136, aminosyrerester 105-137, aminosyrerester 105-138, aminosyrerester 105-139, aminosyrerester 105-140, aminosyrerester 105-141, aminosyrerester 105-142, aminosyrerester 105-143, aminosyrerester 105-144, aminosyrerester 105-145, aminosyrerester 105-146, aminosyrerester 105-147, aminosyrerester 105-148, aminosyrerester 105-149, aminosyrerester 105-150, aminosyrerester 105-151, aminosyrerester 105-152, aminosyrerester 105-153 og aminosyrerester 105-154. ;Ytterligere egnede stilksegmenter omfatter én eller flere aminosyrer fra BCMA-stilkområdet (det vil si aminosyrerester 42-54 i SEKV. ID NR.: 27). For eksempel kan et stilksegment bestå av følgende, idet det henvises til SEKV. ID NR.: 27: aminosyrerest 42, aminosyrerester 42-43, aminosyrerester 42-44, aminosyrerester 42-45, aminosyrerester 42-46, aminosyrerester 42-47, aminosyrerester 42-48, aminosyrerester 42-49, aminosyrerester 42-50, aminosyrerester 42-51, aminosyrerester 42-52, aminosyrerester 42-53 og aminosyrerester 42-54. ;Mer generelt kan et stilksegment bestå av fra 2 til 50 aminosyrerester. ;Immunglobulingruppen i et fusjonsprotein som beskrevet her omfatter minst ett konstant område fra et immunglobulin. Immunglobulingruppen representerer fortrinnsvis et segment av et humant immunglobulin. Den humane immunglobulinsekvens kan være en villtypeaminosyresekvens eller en modifisert villtypeaminosyresekvens som har minst én av aminosyremutasjonene som diskuteres ovenfor. ;Den humane immunglobulinaminosyresekvens kan også variere fra villtypen ved at den har én eller flere mutasjoner som er karakteristiske for en kjent allotypisk determinant. Tabell 2 viser de allotypiske determinanter for det humane IgGyl-konstante området (Putman, The Plasma Proteins, bind V, s. 49-140 (Academic Press, Inc., 1987)). EU-indeksposisjoner 214, 356, 358 og 431 definerer de kjente IgGyl-allotyper. Posisjon 214 er i Cm-domenet i det konstante området i IgGyl og ligger således ikke i Fc-sekvensen. Villtype-Fc-sekvensen ifølge SEKV. ID NR.: 6 omfatter allotypene Glm(l) og Glm(2-). Fc-gruppen i et TACI-Fc-protein kan imidlertid være modifisert slik at den gjenspeiler enhver kombinasjon av disse allotypene. ; Eksemplene på TACI-Fc-proteiner beskrevet her omfatter konstante områder fra humant IgGl. Egnede immunglobulingrupper omfatter imidlertid også polypeptider som omfatter minst ett konstant område, f.eks. et konstant område fra tungkjeden fra ethvert av følgende immunglobuliner: IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE og IgM. Immunglobulingrupper avledet fra villtype-IgG2 eller villtype-IgG4 byr på en fordelaktig redusert effektorfunksjon sammenlignet med villtype-IgGl eller villtype-IgG3. Foreliggende beskrivelse omtaler også fusjonsproteiner som omfatter en TACI-reseptorgruppe som beskrevet ovenfor og enten albumin eller (32-makroglobulin. ;En annen type reseptorfusjonsprotein som binder ZTNF2 eller ZTNF4, er et BCMA-immunglobulinfusjonsprotein. Det er blitt utført undersøkelser med et BCMA-Fc4-fusjonsprotein i hvilket BCMA-gruppen består av aminosyrerester 1-48 i SEKV. ID NR.: 27. Overraskende nok viste farmakokinetiske undersøkelser i mus at BCMA-Fc4-fusjonsproteinet hadde en halveringstid på ca. 101 timer, mens et TACI-Fc-protein hadde en halveringstid på 25 timer. Tilførsel av et BCMA-immunglobulinfusjonsprotein kan således være å foretrekke undervisse kliniske omstendigheter. Videre kan en kombinasjon av TACI-immunglobulinfusjonsprotein og BCMA-immunglobulinfusjonsprotein være fordelaktig for behandling av visse tilstander. Denne kombinasjonsbehandling kan oppnås ved tilførsel av TACI-immunglobulinfusjonsprotein og BCMA-immunglobulinfusjonsprotein eller ved tilførsel av heterodimerer av TACI-immunglobulinfusjonsprotein og BCMA-immunglobulinfusjonsprotein. ;En annen type reseptorfusjonsprotein som binder ZTNF4, er et immunglobulinfusjonsprotein som omfatter et ekstracellulært domene fra en reseptor som betegnes "Ztnfrl2". Aminosyresekvensen og nukleotidsekvensen til Ztnfrl2 gis som SEKV. ID NR.: 59 henholdsvis SEKV. ID NR.: 60. Ztnfrl2-reseptorgrupper omfatter polypeptider som omfatter aminosyrerester 1-69 i SEKV. ID NR.: 60 eller aminosyrerester 19-35 i SEKV. ID NR.: 60. ;Fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være utformet som enkeltkjedede polypeptider, dimerer, trimerer eller multimerer av dimerer eller trimerer. Dimerene kan være homodimerer eller heterodimerer, og trimerene kan være homotrimerer eller heterotrimerer. Eksempler på heterodimerer omfatter et TACI-immunglobulinpolypeptid med et BCMA-immunglobulinpolypeptid, et TACI-immunglobulinpolypeptid med et Ztnfrl2-immunglobulinpolypeptid og et BCMA-immunglobulinpolypeptid med et Ztnfrl2-immunglobulinpolypeptid. Eksempler på heterotrimerer omfatter et TACI-immunglobulinpolypeptid med to BCMA-immunglobulinpolypeptider, et TACI-immunglobulinpolypeptid med to Ztnfrl2-immunglobulinpolypeptider, et BCMA-immunglobulinpolypeptid med to Ztnfrl2-immunglobulinpolypeptider, to TACI-immunglobulinpolypeptider med et BCMA-immunglobulinpolypeptid, to TACI-immunglobulinpolypeptider med et Ztnfrl2-immunglobulinpolypeptid, to BCMA-immunglobulinpolypeptider med et Ztnfrl2-immunglobulinpolypeptid og en trimer av et TACI-immunglobulinpolypeptid, et BCMA-immunglobulinpolypeptid og et Ztnfrl2-immunglobulinpolypeptid. ;I slike fusjonsproteiner kan TACI-reseptorgruppen bestå av følgende aminosyresekvens fra SEKV. ID NR.: 2: aminosyrerester 30-154. BCMA-reseptorgruppen kan omfatte minst én av følgende aminosyresekvenser fra SEKV. ID NR.: 27: aminosyrerester 1-48, aminosyrerester 8-41 og aminosyrerester 21-37. Ztnfrl2-reseptorgruppen kan omfatte minst én av følgende aminosyresekvenser fra SEKV. ID NR.: 60: aminosyrerester 1-69 og aminosyrerester 19-35. ;Fusjonsproteiner kan fremstilles ved anvendelse av PCR-fremgangsmåtene som anvendes for konstruksjon av de illustrerende TACI-Fc-molekylene som beskrives i eksemplene. Fagfolk kan imidlertid anvende andre standardtilnærminger. Foreksempel kan nukleinsyremolekyler som koder for TACI, BCMA, Ztnfrl2 eller immunglobulinpolypeptider erholdes ved gjennomsøking av humane cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker ved anvendelse av polynukleotidprober basert på sekvenser som beskrives her. Dette er standardteknikker som er veletablerte (se for eksempel Ausubel et al. (red.), Short Protocols in Molecular Biology, 3. utgave, s. 4-1 til 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ("Ausubel ;(1995)"); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, s. 33-41 (CRC Press, Inc., 1997) ("Wu ;(1997)"); Ausubel (1995) på s. 5-1 til 5-6; Wu (1997) på s. 307-327)). ;Alternativt kan molekyler for konstruksjon av immunglobulinfusjonsproteiner erholdes ved å syntetisere nukleinsyremolekyler ved anvendelse av lange oligonukleotider som gjensidig primer hverandre og nukleotidsekvensene som beskrives her (se f.eks. Ausubel (1995) på s. 8-8 til 8-9). Etablerte teknikker som benytter ;polymerasekjedereaksjonen, gjør det mulig å syntetisere DNA-molekyler som er minst 2 kilobaser lange (Adang et al., Plant Molec. Biol., 21:1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications, 2:266 (1993); Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", i Methods in Molecular Biology, bind 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (red.), s. 263-268 (Humana Press, Inc., 1993); og Holowachuk et al., PCR Methods Appl., 4:299 (1995)). ;Nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også syntetiseres med "genmaskiner" og anvendelse av fremgangsmåter som fosforamidittfremgangsmåten. Dersom kjemisk syntetisert dobbelttrådet DNA er nødvendig for et anvendelsesområde, f.eks. for syntese av et gen eller et genfragment, fremstilles de to komplementære tråder hver for seg. Fremstilling av korte gener (60-80 basepar) er teknisk ukomplisert og kan oppnås ved å syntetisere de komplementære tråder og så hybridisere dem til hverandre. For fremstilling av lengre gener (> 300 basepar) kan det imidlertid være nødvendig med spesielle strategier, siden koblingseffektiviteten i hver syklus under kjemisk DNA-syntese sjelden er 100 %. For å overvinne dette problem oppbygges syntetiske gener (dobbelttrådede) i modulær form fra enkelttrådede fragmenter som er fra 20 til 100 nukleotider lange. For oversiktsartikler vedrørende polynukleotidsyntese, se f.eks. Glick og Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem., 53:323 (1984); og Climie et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 87:633 (1990). ;4. Fremstilling av TACI- immunglobulinpolypeptider ;Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles i rekombinante vertsceller ifølge konvensjonelle teknikker. For ekspresjon av en TACI-immunglobulin-kodende sekvens må et nukleinsyremolekyl som koder for polypeptidet, kobles operativt til regulatoriske sekvenser som kontrollerer den transkripsjonene ekspresjon i en ekspresjonsvektor, og så innføres i en vertscelle. I tillegg til transkripsjonene regulatoriske sekvenser som promotere og enhancere kan ekspresjonsvektorer omfatte translasjonene, regulatoriske sekvenser og et markørgen som er egnet for seleksjon av celler som bærer ekspresjonsvektoren. ;Ekspresjonsvektorer som er egnet for fremstilling av et fremmed protein i eukaryote celler, inneholder typisk (1) prokaryote DNA-elementer som koder for et bakterielt replikasjonsorigo og en antibiotikaresistensmarkør for å oppnå vekst og seleksjon av ekspresjonsvektoren i en bakterievert, (2) eukaryote DNA-elementer som kontrollerer initiering av transkripsjonen, f.eks. en promoter, og (3) DNA-elementer som kontrollerer prosessering av transkripter, f.eks. en transkripsjonsterminerings-/polyadenylerings-sekvens. ;Ekspresjonsvektorer kan også omfatte nukleotidsekvenser som koder for en sekretorisk sekvens som styrer det heterologe peptid inn i vertscellens sekresjonsvei. En ekspresjonsvektor kan f.eks. omfatte en nukleotidsekvens som koder for TACI-immunglobulin og en sekretorisk sekvens avledet fra et eller annet sekretert gen. Som diskutert ovenfor, er en egnet signalsekvens en tPA-signalsekvens. En eksemplarisk tPA-signalsekvens gis i SEKV. ID NR.: 25. En annen egnet signalsekvens er en 26-10 VH-signalsekvens fra mus. Museantistoffet 26-10 beskrives f.eks. av Near et al., Mol. Immunol., 27:901 (1990). En illustrerende aminosyresekvens og nukleotidsekvens foren 26-10 VH-signalsekvens fra mus gis i SEKV. ID NR.: 61 henholdsvis SEKV. ID NR.: 65. SEKV. ID NR.: 62 beskriver aminosyresekvensen til et TACI-Fc5-fusjonsprotein som omfatteren 26-10 VH-signalsekvens fra mus. ;TACI-immunglobulinproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan uttrykkes i pattedyrceller. Eksempler på egnede pattedyrceller omfatter nyreceller fra afrikansk grønn ape (Vero; ATCC CRL 1587), humane embryonale nyreceller (293-HEK; ATCC CRL 1573), hamsterungenyreceller (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), hundenyreceller (MDCK; ATCC CCL 34), kinesisk hamsterovarieceller (CHO-K1; ATCC CCL 61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet., J2:555, 1986)), rottehypofyseceller (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3-celler (ATCC CCL 2.2), rottehepatomceller (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-transformerte apenyreceller (COS-1; ATCC CRL 1650) og embryonale museceller (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). ;For en pattedyrvert kan de transkripsjonene og translasjonene regulatoriske signaler være avledet fra viruskilder som adenovirus, storfepapillomvirus, apevirus eller lignende, i hvilke de regulatoriske signaler er forbundet med et gitt gen som har fritt ekspresjonsnivå. Egnede transkripsjonene og translasjonene regulatoriske sekvenser kan også erholdes fra pattedyrgener som genet for aktin, kollagen, myosin og metallotionein. ;Transkripsjonene regulatoriske signaler omfatter et promoterområde som er tilstrekkelig til å styre initiering av RNA-syntese. Egnede eukaryote promotere omfatter promoteren fra metallotionein I-genet fra mus (Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet., 1:273 ;(1982)), TK-promoteren fra herpesvirus (McKnight, Cell, 31:355 (1982)), den tidlige SV40-promoter (Benoist et al., Nature, 290:304 (1981)), Rous-sarkomviruspromoteren (Gorman et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 79:6777 (1982)), cytomegaloviruspromoteren (Foecking et al., Gene, 45:101 (1980)), og musebrysttumorviruspromoteren (se generelt Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", i Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (red.), s. 163-181 (John Wiley & Sons, Inc., 1996)). En anvendbar kombinasjon av en promoter og enhancer tilveiebringes av en myeloproliferativ sarkomviruspromoter og en human cytomegalovirusenhancer. ;Alternativt kan en prokaryot promoter, f.eks. RNA-polymerasepromoteren fra bakteriofag T3, anvendes for kontroll av dannelsen av TACI-immunglobulinproteiner i pattedyrceller dersom den prokaryote promoter reguleres av en eukaryot promoter (Zhou et al., Mol. Cell. Biol., J0:4529 (1990), og Kaufman et al., Nucl. Acids Res., J9:4485 (1991)). ;En ekspresjonsvektor kan innføres i vertsceller ved anvendelse av en rekke standardteknikker, innbefattet kalsiumfosfattransfeksjon, liposomformidlet transfeksjon, mikroprosjektilformidlet tilførsel, elektroporering og lignende. De transfekterte cellene kan selekteres og oppformeres for erholdelse av rekombinante vertsceller som omfatter ekspresjonsvektoren stabilt integrert i vertscellegenomet. Teknikker for innføring av vektorer i eukaryote celler og teknikker for seleksjon av slike stabile transformanter ved anvendelse av en dominant seleksjonsmarkør beskrives f.eks. av Ausubel (1995) og av Murray (red.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press, 1991). ;For eksempel er én egnet seleksjonsmarkør et gen som gir resistens overfor antibiotikumet neomycin. I dette tilfellet utføres seleksjonen i nærvær av et medikament av neomycintype, f.eks. G-418 eller lignende. Seleksjonssystemer kan også anvendes for å forhøye ekspresjonsnivået for genet av interesse, en prosess som betegnes "amplifisering". Amplifisering utføres ved å dyrke transfektanter i nærvær av et lavt nivå av seleksjons-midlet og så øke mengden seleksjonsmiddel for seleksjon av celler som danner produktene fra de innførte gener i høyt nivå. En egnet amplifiserbar seleksjonsmarkør er dihydrofolat-reduktase, som gir resistens overfor metotreksat. Andre medikamentresistensgener (f.eks. hygromycinresistens, multimedikamentresistens, puromycinacetyltransferase) kan også anvendes. Alternativt kan markører som innfører en endret fenotype, f.eks. grønt fluorescerende protein, eller celleoverflateproteiner som CD4, CD8, klasse I MHC, placental alkalisk fosfatase anvendes for å sortere transfekterte celler fra ikke-transfekterte celler ved hjelp av FACS-sortering eller separasjonsteknologi basert på magnetiske kuler. ;TACI-immunglobulinpolypeptider kan også fremstilles fra dyrkede pattedyrceller ved anvendelse av et viralt tilførselssystem. Eksempler på virus for dette formål omfatter adenovirus, herpesvirus, kukoppevirus og adenoassosiert virus (AAV). Adenovirus, et dobbelttrådet DNA-virus, er for tiden den best undersøkte genoverføringsvektor for tilførsel av heterolog nukleinsyre (for en oversikt, se Becker et al., Meth. Cell Biol., 43:161 (1994), og Douglas og Curiel, Science & Medicine, 4:44 (1997)). Fordeler ved adenovirussystemet omfatter plass til relativt store DNA-innskudd, evnen til å vokse til høyt titer, evnen til å infisere et bredt utvalg av pattedyrcelletyper og en fleksibilitet som tillater anvendelse med et stort antall tilgjengelige vektorer som inneholder forskjellige promotere. ;Ved å delere deler av adenovirusgenomet kan større innskudd (opptil 7 kb) med heterologt DNA innpasses. Disse innskudd kan inkorporeres i virus-DNA ved direkte ligering eller ved homolog rekombinasjon med et kotransfektert plasmid. En mulighet er å delere det essensielle Ei-gen fra virusvektoren, noe som fører til manglende evne til å replikere med mindre El -genet tilveiebringes av vertscellen. Adenovirusvektorinfiserte humane 293-celler (ATCC nr. CRL-1573, 45504, 45505) kan f.eks. dyrkes som adherente celler eller i suspensjonskultur ved relativt høy celletetthet slik at de danner signifikante mengder protein (se Garnier et al., Cytotechnol., J5:145 (1994)). ;Fagfolk kan utforme egnede ekspresjonsvektorer for fremstilling av fusjonsproteinene som beskrives her ved hjelp av pattedyrceller. Eksempel 4 beskriver egenskaper ved én ekspresjonsvektor. Som et annet eksempel kan en ekspresjonsvektor omfatte en bicistronisk ekspresjonskassett som omfatter en del av den humane cytomegalovirusenhancer, promoteren fra myeloproliferativt sarkomvirus, en nukleotidsekvens som koder for et fusjonsprotein, de interne ribosomale inngangsseter fra poliovirus, en nukleotidsekvens som koder for dihydrofolatreduktase fra mus, fulgt av poly A-adderingssekvensen fra SV40. Nukleotidsekvensen i SEKV. ID NR.: 69 viseren cytomegalovirusenhancer/- myeloproliferativt sarkomvirus-LTR-promoterkonstruksjon i hvilken cytomegalovirus-enhanceren strekker seg fra nukleotid 1 til 407. LTR-promoteren fra myeloproliferativt sarkomvirus uten det negative kontrollområdet strekker seg fra nukleotid 408 til nukleotid 884 i SEKV. ID NR.: 69. En nukleotidsekvens for LTR-promoteren fra myeloproliferativt sarkomvirus uten det negative kontrollområdet gis i SEKV. ID NR.: 70. ;Eksempel 1 beskriver en ekspresjonsvektor som omfatter en cytomegalo-viruspromoter for styring av ekspresjonen av det rekombinante proteintransgen, et immunglobulinintron og en signalsekvens fra vevsplasminogenaktivator. Et egnet immunglobulinintron er et 26-10 VH-intron fra mus. SEKV. ID NR.: 66 gir en illustrerende nukleotidsekvens for et 26-10 VH-intron fra mus. En ekspresjonsvektor kan også omfatte et 5'-ikke-translatert område (UTR) plassert oppstrøms for nukleotidsekvensen som koder for et TACI-immunglobulinprotein. En egnet 5'-UTR kan avledes fra 26-10 VH-genet fra mus. SEKV. ID NR.: 63 beskriver nukleotidsekvensen til en egnet nativ 26-10 VH-5'-UTR fra mus, mens SEKV. ID NR.: 64 viser nukleotidsekvensen til en 26-10 VH-5'-UTR fra mus som er blitt optimalisert i en 3'-enden. ;Som en illustrasjon gir SEKV. ID NR.: 67 en nukleotidsekvens som omfatter følgende elementer: en nativ 26-10 VH-5'-UTRfra mus (nukleotider 1-51), en 26-10 VH-signalsekvens fra mus (nukleotider 52-97 og 182-192), et 26-10 VH-intron fra mus (nukleotider 98-181), en nukleotidsekvens som koder for en TACI-gruppe (nukleotider 193-435) og en nukleotidsekvens som koder for en Fc5-gruppe (nukleotider 436-1131). Nukleotidsekvensen i SEKV. ID NR.: 68 avviker fra SEKV. ID NR.: 67 ved at en optimalisert 26-10 VH-5'-UTR fra mus (nukleotider 1-51) erstatter den native sekvens. ;TACI-immunglobulinproteiner kan også uttrykkes i andre høyere eukaryote celler, f.eks. fugleceller, soppceller, insektceller, gjærceller eller planteceller. Baculovirus-systemet gir et effektivt middel for innføring av klonede gener i insektceller. Egnede ekspresjonsvektorer er basert på Autographa califomica multippelt nukleært polyhedrosevirus (ACMNPV) og inneholder velkjente promotere som varmesjokkprotein(hsp)promoteren fra Drosophila, den umiddelbart tidlige gen promoter fra Autographa califomica nukleært polyhedrosevirus (ie-1) og den forsinkede tidlige 39K-promoter, plO-promoteren fra baculovirus og metallotioneinpromoteren fra Drosophila. En annen fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant baculovirus benytter et transposonbasert system beskrevet av Luckow (Luckow et al., J. Virol., 67:4566 (1993)). Dette system, som benytter overførings-vektorer, selges i settet BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Dette system benytter en overføringsvektor, PFASTBAC (Life Technologies), som inneholder et Tn7-transposon for overføring av DNA som koder for TACI-immunglobulinpolypeptidet til et baculovirusgenom som opprettholdes i E. coli som et stort plasmid som betegnes et "bakmid." Se Hill-Perkins og Possee, J. Gen. Virol., 71:971 (1990); Bonning et al., J. Gen. Virol., 75:1551 (1994); og Chazenbalk og Rapoport, J. Biol. Chem., 270:1543 (1995). I tillegg kan overføringsvektorer omfatte en fusjon med opprettholdt leseramme med DNA som koder for en epitopmerkelapp i C- eller N-enden av det uttrykte TACI-immunglobulinpolypeptid, f.eks. en Glu-Glu-epitopmerkelapp (Grussenmeyer et al., Proe. Nat'l Acad. Sei., 82:7952 (1985)). Ved anvendelse av en teknikk kjent innen faget transformeres en overføringsvektor som inneholder en nukleotidsekvens som koder for et TACI-immunglobulinprotein, inn i E. coli, og bakteriekolonier analyseres for bakmider, som inneholder et oppbrutt lacZ-gen som viser rekombinant baculovirus. Bakmid-DNA som inneholder det rekombinante baculovirusgenom, isoleres så ved anvendelse av vanlige teknikker. ;Den illustrerende PFASTBAC-vektor kan modifiseres i betydelig grad. For eksempel kan polyhedrinpromoteren fjernes og erstattes med basisk protein-promoteren fra baculovirus (også betegnet Pcor- pro mote ren, p6.9-promoteren eller MP-promoteren), som uttrykkes tidligere i baculovirusinfeksjonen, og som har vist seg fordelaktig for ekspresjon av utskilte proteiner (se f.eks. Hill-Perkins og Possee, J. Gen. Virol., 71:971 (1990), Bonning et al., J. Gen. Virol., 75:1551 (1994), og Chazenbalk og Rapoport, J. Biol. Chem., 270:1543 (1995). I slike overføringsvektorkonstruksjoner kan en kort eller lang versjon av promoteren fra basisk protein anvendes. Videre kan det konstrueres overføringsvektorer med sekretoriske signalsekvenser avledet fra insektproteiner. For eksempel kan en sekretorisk signalsekvens fra ekdysteroidglukosyltransferase (EGT), melittin fra honningbie (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), eller gp67 fra baculovirus (PharMingen: San Diego, CA) anvendes i slike konstruksjoner. ;Det rekombinante virus eller bakmidet anvendes for transfeksjon av vertsceller. Egnede insektvertsceller omfatter celler avledet fra IPLB-Sf-21, en puppeovarie-cellelinje fra Spodoptera frugiperda, f.eks. Sf9 (ATCC CRL 1711), S/21AE og S/21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), så vel som Schneider-2-celler fra Drosophila og cellelinjen HIGH FIVEO (Invitrogen), avledet fra Trichoplusia ni (US patentskrift nr. 5 300 435). Kommersielt tilgjengelig serumfritt medium kan anvendes for oppformering og opprettholdelse av cellene. Egnede medier er Sf900 II™ (Life Technologies) eller ESF 921™ (Expression Systems) for Sf9-celler og Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) eller Express FiveO™ (Life Technologies) for T./7/'-celler. Dersom rekombinant virus anvendes, dyrkes cellene typisk fra en inokulasjonstetthet på ca. 2-5 x IO5 celler til en tetthet på 1-2 x IO6 celler, på hvilket tidspunkt en suspensjon av rekombinant virus tilsettes ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 0,1 til 10, mer typisk nær 3. ;Etablerte teknikker for fremstilling av rekombinante proteiner i baculovirus-systemer gis av Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors", i Methods in Molecular Biology, bind 7: Gene Transfer and Exspression Protocols, Murray (red.), s. 147-168 (The Humana Press, Inc., 1991); av Patel et al., "The baculovirus expression system", i DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. utgave, Glover et al. (red.), s. 205-244 (Oxford University Press, 1995); av Ausubel (1995) på s. 16-37 til 16-57; av Richardson (red.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995); og av Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", i Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. ;(red.), s. 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996). ;Soppceller, innbefattet gjærceller, kan også anvendes for ekspresjon av genene som beskrives her. Gjærarter av spesiell interesse i denne sammenheng omfatter Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris og Pichia methanolica. Egnede promotere for ekspresjon i gjær omfatter promotere fra GALI (galaktose), PGK (fosfoglyseratkinase), ADH (alkoholdehydrogenase), AOX1 (alkoholoksidase), HIS4 (histidinoldehydrogenase) og lignende. Mange gjærkloningsvektorer er blitt utformet og er lett tilgjengelige. Det kan utformes en vektor for frembringelse av konstruksjoner ved å benytte de nødvendige elementer for å oppnå homolog rekombinasjon i gjær (se f.eks. Raymond et al., BioTechniques, 26:134 (1999)). En slik ekspresjonsvektor kan f.eks. inneholde URA3- og CEN-ARS(autonomt replikerende sekvens)-sekvenser som er nødvendige for seleksjon og replikasjon i S. cerevisiae. Andre egnede vektorer omfatter Ylp-baserte vektorer som YIp5, YRp-vektorer som YRpl7, YEp-vektorer som YEpl3 og YCp-vektorer som YCpl9. Fremgangsmåter for transformasjon av S. cerevisiae- ceWer med eksogent DNA og fremstilling av rekombinante polypeptider fra disse cellene beskrives f.eks. av Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311, Kawasaki et al., US patentskrift nr. 4 931 373, Brake, US patentskrift nr. 4 870 008, Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743, og Murray et al., US patentskrift nr. 4 845 075. Transformerte celler selekteres ved fenotypen som bestemmes av seleksjonsmarkøren, vanligvis medikamentresistens eller evnen til å vokse i fravær av et gitt næringsstoff (f.eks. leucin). Et egnet vektorsystem for anvendelse i Saccharomyces cerevisiae er POT1 -vektorsystemet som beskrives av Kawasaki et al. (US patentskrift nr. 4 931 373), som tillater seleksjon av transformerte celler ved vekst i glukoseholdig medium. Ytterligere egnede promotere og terminatorer for anvendelse i gjær omfatter promotere og terminatorer fra gener for glykolytiske enzymer (se f.eks. Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311, Kingsman et al., US patentskrift nr. 4 615 974, og Bitter, US patentskrift nr. 4 977 092) og alkoholdehydrogenasegener. Se også US patentskrifter nr. 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 og 4 661 454. ;Transformasjonssystemer for andre gjærarter, innbefattet Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactisrKluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii og Candida maltosa, er kjent innen faget. Se f.eks. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., .232:3459 (1986), og Cregg, US patentskrift nr. 4 882 279. Aspergillus- ceWer kan benyttes ifølge fremgangsmåtene til McKnight et al., US patentskrift nr. 4 935 349. Fremgangsmåter for transformasjon av Acremonium chrysogenum beskrives av Sumino et al., US patentskrift nr. 5 162 228. Fremgangsmåter for transformasjon av Neurospora beskrives av Lambowitz, US patentskrift nr. 4 486 533. ;Anvendelse av Pichia methanolica som vert for fremstilling av rekombinante proteiner beskrives f.eks. av Raymond, US patentskrift nr. 5 716 808, Raymond, US patentskrift nr. 5 736 383, Raymond et al., Yeast, 14:11- 23 (1998), og i internasjonale patentskrifter nr. WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 og WO 98/02565. DNA-molekyler for anvendelse ved transformasjon av P. methanolica vil vanligvis fremstilles som dobbelttrådede, sirkulære plasmider som fortrinnsvis lineariseres før transformasjonen. For fremstilling av polypeptid i P. methanolica kan promoteren og terminatoren i plasmidet være promoter og terminator fra et P. methanolica- gen, f.eks. et alkoholutnyttelsesgen ( AUG1 eller AUG2) fra P. methanolica. Andre anvendbare promotere omfatter promotere fra genene for dihydroksyacetonsyntase (DHAS), formiatdehydrogenase (FMD) og katalase (CAT). For å muliggjøre integrasjon av DNA i vertskromosomet foretrekkes det at hele ekspresjonssegmentet i plasmidet er flankert i begge ender av verts-DNA-sekvenser. En egnet seleksjonsmarkør for anvendelse i Pichia methanolica er et >ADE2-gen fra P. methanolica, som koder for fosforibosyl-5-aminoimidazolkarboksylase (AIRC; EC 4.1.1.21), og som tillater acye2-vertsceller å vokse i fravær av adenin. For prosesser i stor industriell skala hvor det er ønskelig å minimalisere anvendelsen av metanol, kan det benyttes vertsceller i hvilke begge de to metanolutnyttelsesgenene ( AUG1 og AUG2) er delert. For fremstilling av utskilte proteiner kan vertscellene mangle vakuolære proteasegener ( PEP4 og PRB1). Elektroporering anvendes for å lette innføringen av et plasmid som inneholder DNA som koder for et polypeptid av interesse i P. methanolica- ceWer. P. methanolica- ceWer kan transformeres ved elektroporering ved anvendelse av et eksponentielt avtakende, pulset elektrisk felt med en feltstyrke på 2,5-4,5 kV/cm, fortrinnsvis ca. 3,75 kV/cm, og en tidskonstant (t) på 1-40 millisekunder, mest foretrukket ca. 20 millisekunder. ;Ekspresjonsvektorer kan også innføres i planteprotoplaster, intakte plantevev eller isolerte planteceller. Fremgangsmåter for innføring av ekspresjonsvektorer i plantevev omfatter direkte infeksjon eller samdyrking av plantevev med Agrobacterium tumefaciens, mikroprosjektilformidlet tilførsel, DNA-injeksjon, elektroporering og lignende. Se f.eks. Horsch et al., Science, 227:1229 (1985); Klein et al., Biotechnology, 10:268 (1992); og Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", i Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (red.), s. 67-88 (CRC Press, 1993). ;Alternativt kan TACI-immunglobulinproteiner fremstilles i prokaryote vertsceller. Egnede promotere som kan anvendes for fremstilling av TACI-immunglobulinpolypeptider i en prokaryot vert, er vel kjent blant fagfolk og omfatter promotere som kan gjenkjenne polymerasene T4, T3, Sp6 og T7, PR- og PL-promoteren fra bakteriofag lambda, trp-pro mote ren, reoA-promoteren, varmesjokkpromoteren, /acl/f-promoteren, tac-promoteren, /pp-/acSpr-promoteren, phoA-pro mote ren og lacZ- pro mote ren fra E. coli, promotere fra B. subtilis, promotere fra Bac/7/us-bakteriofager, Strepfom/ces-promotere, int-promoteren fra bakteriofag lambda, b/a-promoteren fra pBR322 og CAT-pro mote ren fra kloramfenikolacetyltransferasegenet. En oversikt over prokaryote promotere gis av Glick, J. Ind. Microbiol., 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4. utgave (Benjamin Cummins, 1987), Ausubel et al. (1995). ;Egnede prokaryote verter omfatter E. coli og Bacillus subtilis. Egnede stammer av E. coli omfatter BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSHI8, ER1451, og ER1647 (se f.eks. Brown (red., Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Egnede stammer av Bacillus subtilis omfatter BR151, YB886, MI119, MI120 og B170 (se f.eks. Hardy, "Bacillus Cloning Methods" i DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (red.) (IRL Press, 1985)). ;Dersom et TACI-immunglobulinprotein uttrykkes i bakterier, f.eks. E. coli, kan polypeptidet tilbakeholdes i cytoplasma, typisk som uløselige granuler, eller det kan styres til periplasmarommet via en bakteriell sekresjonssekvens. I det første tilfellet lyseres cellene, og granulene gjenvinnes og denatureres ved anvendelse av f.eks. guanidin- isotiocyanat eller urea. Det denaturerte polypeptid kan så gjenfoldes og dimeriseres ved å fortynne denatureringsmidlet, f.eks. ved dialyse mot en løsning av urea og en blanding av redusert og oksidert glutation, fulgt av dialyse mot en bufret saltløsning. I det andre tilfellet kan polypeptidet gjenvinnes fra periplasmarommet i en løselig og funksjonell form ved å oppbryte cellene (f.eks. ved ultralydbehandling eller osmotisk sjokk) for å frigi innholdet i periplasmarommet og gjenvinne proteinet, noe som fjerner behovet for denaturering og gjenfolding. ;Fremgangsmåter for ekspresjon av proteiner i prokaryote verter er vel kjent blant fagfolk (se f.eks. Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", i DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. utgave, Glover et al. (red.), s. 15 (Oxford University Press, 1995); Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", i Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, s. 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995); og Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria", i Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (red.), s. 101 (John Wiley & Sons, Inc., 1996)). ;Standardfremgangsmåter for innføring av ekspresjonsvektorer i bakterieceller, gjærceller, insektceller og plateceller gis f.eks. av Ausubel (1995). ;Generelle fremgangsmåter for ekspresjon av gjenvinning av fremmed protein danne i et pattedyrcellesystem gis f.eks. av Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", i Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. ;(red., s. 163 (Wiley-Liss, Inc., 1996). Standardteknikker for gjenvinning av protein som dannes av et bakteriesystem gis f.eks. av Grisshammer et. al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells", i DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. utgave, Glover et al. (red.), s. 59-92 (Oxford University Press, 1995). Etablerte fremgangsmåter for isolering av rekombinante proteins fra et baculovirussystem beskrives av Richardson (red.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995). ;Som et alternativ kan polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse syntetiseres utelukkende ved fastfasesyntese, fremgangsmåter i delvis fastfase, fragmentkondensering eller klassisk syntese i løsning. Disse syntesefremgangsmåtene er vel kjent blant fagfolk (se f.eks. Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1963); Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2. utgave) (Pierce Chemical Co., 1984); Bayer og Rapp, Chem. Pept. Prot., 3:3 ;(1986); Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, 1989); Fields og Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology, bind 289 (Academic Press, 1997); og Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc., 1997)). Varianter av strategier for total kjemisk syntese, f.eks. "nativ kjemisk ligering" og "uttrykt proteinligering" er også standard (se f.eks. Dawson et al., Science, 266:776 (1994); Hackeng et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 94:7845 (1997); Dawson, Methods Enzymol., 287:34 (1997); Muir et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 95:6705 (1998); og Severinov og Muir, J. Biol. Chem., 273:16205 (1998)). ;5. Analyse av TACI- immunglobulinfusionsproteiner ;Funksjonen til TACI-immunglobulinfusjonsproteiner kan undersøkes ved å anvende en rekke tilnærminger for å anslå fusjonsproteinenes evne til å binde ZTNF4 eller ZTNF2. Som en illustrasjon gir eksempel 4 fremgangsmåter for å måle bindingsaffinitet og bindingskapasitet overfor ZTNF4. ;Alternativt kan TACI-immunglobulinfusjonsproteiner karakteriseres ut fra evnen til å inhibere stimulering av humane B-celler med løselig ZTNF4, som beskrevet av Gross et al., internasjonalt patentskrift WO 00/40716. Kort beskrevet isoleres humane B-cellerfra mononukleære celler fra perifert blod ved anvendelse av magnetiske CD19-kuler og det magnetiske separasjonssystem VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Rensede B-celler blandes med løselig ZTNF4 (25 ng/ml) og rekombinant humant IL-4 (10 ng/ml, Pharmingen), og cellene utsås i 96-brønners plater med runde bunner med 1 x IO<5>celler pr. brønn. ;Løselige TACI-immunglobulinproteiner kan fortynnes fra ca. 5 \ ig/ m\ til ca. 6 ng/ml og inkuberes med B-cellene i 5 dager og pulsmerkes over natten på dag 4 med 1^Ci<3>H-tymidin pr. brønn. Som kontroll kan TACI-immunglobulinprotein også inkuberes med B-celler og IL-4 uten ZTNF4. Platene høstes ved anvendelse av en Packard-platehøster, og radioaktiviteten måles med en Packard-leser. ;Denne generelle tilnærming ble anvendt for å undersøke tre TACI-Fc-fusjonsproteiner. Selv om alle fusjonsproteinene inhiberte B-celleproliferasjonen, var konstruksjonene TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 og TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 mer aktive enn TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5. ;Veletablerte dyremodeller er tilgjengelige for analyse av in wVo-virkning av TACI-immunglobulinproteiner i visse sykdomstilstander. Foreksempel kan TACI-immunglobulinproteiner analyseres i en rekke dyremodeller for autoimmunsykdom, f.eks. de kongeniske musestammene MRL- lpr/ lpr eller NZB x NZW-F1, som fungerer som modeller for SLE (systemisk lupus erythematosus). Slike dyremodeller er kjent innen faget (se f.eks. Cohen og Miller (red.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc., 1994). ;Avkom fra en krysning av New Zealand Black(NZB)-mus og New Zealand White(NZW)-mus utvikler en spontan form for SLE som ligner svært på SLE hos mennesker. Avkommet, som betegnes NZBW, begynner å utvikle IgM-autoantistoffer mot T-celler i en alder av 1 måned, og i en alder av 5-7 måneder er anti-DNA-autoantistoffer det dominante immunglobulin. Polyklonal B-cellehyperaktivitet fører til overproduksjon av autoantistoffer. Deponering av disse autoantistoffene, særlig antistoffene rettet mot enkelttrådet DNA, er forbundet med utvikling av glomerulonefritt, som klinisk manifesterer seg som proteinuri, azotemi og død grunnet nyresvikt. ;Nyresvikt er den viktigste dødsårsak hos mus som lider av spontan SLE, og i NZBW-stammen er denne prosess kronisk og obliterativ. Sykdommen utvikles hurtigere og er mer alvorlig hos hunndyr enn hos hanndyr, med en gjennomsnittlig overlevelse på kun 245 dager sammenlignet med 406 dager for hannene. Mens mange hunnmus vil være symptomatiske (proteinuri) i en alder av 7-9 måneder, kan noen være mye yngre eller eldre når de utvikler symptomer. Den dødelige immunnefritt som observeres hos NZBW-mus, ligner svært på den glomerulonefritt som observeres ved human SLE, noe som gjør denne spontane musemodell svært attraktiv for analyse av mulige terapeutiske midler mot SLE (Putterman og Naparstek, "Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus", ;i Autoimmune Disease Models: A Guidebook, s. 217-234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan et al., J. Immunol., 154:1470 (1995); og Daikh et al., J. Immunol., J59:3104 ;(1997)). ;Som beskrevet av Gross et al., internasjonalt patentskrift WO 00/40716, kan TACI-immunglobulinproteiner tilføres til NZBW-mus for å følge den supprimerende virkning på B-celler over det tidsrom på 5 uker hvor produksjonen av B-celleautoantistoff normalt anses å være høy hos NZBW-mus. Kort beskrevet kan 100 hunnmus, 8 uker gamle (NZB x NZW)Fi, oppdeles i seks grupper, hver på 15 mus. Før behandlingen analyseres musene én gang månedlig for protein i urinen, og blod tappes for CBC og lagring av serum. Serum kan analyseres for nærvær av autoantistoffer. Siden proteinuri er det viktigste kjennetegn på glomerulonefritt, måles proteinnivået i urinen med en analysepinne regelmessig gjennom undersøkelsen. Behandlingen kan begynne når musene er ca. 5 måneder gamle. Musene gis intraperitoneale injeksjoner av kun bærestoff (kun fosfatbufret saltvann), av humant TACI-immunglobulin (kontrollprotein) eller TACI-immunglobulinprotein (f.eks. 20-100^g analyse-protein pr. dose) tre ganger ukentlig i 5 uker. ;Blod tappes to ganger i løpet av behandlingen og vil oppsamles mint to ganger etter behandlingen. Analyseverdien for proteinuri og kroppsvekten bestemmes annenhver uke etter påbegynt behandling. Blod oppsamles, og urinanalyse og kroppsvekt måles på det tidspunkt hvor musene avlives. Milt og brissel oppdeles for analyse ved fluorescensaktivert cellesortering og histologisk analyse. Submandibulære spyttkjertler, den mesenteriske lymfeknutekjede, leverlapper med galleblære, cecum og tykktarm, mage, tynntarm, bukspyttkjertel, høyre nyre, binyrekjertelen, tunge med luftrør og spiserør, hjerte og lunger oppsamles også for histologisk undersøkelse. ;Musemodeller for eksperimentell allergisk encefalomyelitt er blitt anvendt som et verktøy for å undersøke både mekanismene for immunformidlet sykdom og fremgangsmåter for mulig terapeutisk inngripen. Modellen ligner human multippel sklerose og gir demyelinering som en følge av T-celleaktivering overfor neuroproteiner som myelin basisk protein eller proteolipidprotein. Inokulering med antigen fører til induksjon av CD4<+>, klasse II-MHC-begrensede T-celler (Thl). Endringer i fremgangsmåten for eksperimentell allergisk encefalomyelitt kan gi akutte, kronisk tilbakevendende eller passive overføringsvarianter av modellen (Weinberg et al., J. Immunol., 162:1818 (1999); Mijaba et al., Cell. Immunol., 186:94 (1999); og Glabinski, Meth. Enzym., 288:182 (1997)). ;Gross et al., internasjonalt patentskrift WO 00/40716, beskriver en tilnærming for evaluering av virkningen av TACI-immunglobulinproteiner når det gjelder lindring av symptomer forbundet med eksperimentell allergisk encefalomyelitt. Kort beskrevet gis 25 PLxSJL-Fl-hunnmus (12 uker gamle) en subkutan injeksjon på 125^g/mus av antigen (myelin-proteolipidprotein, PLP, aminosyrerester 139-151), utformet i komplett Freunds adjuvans. Musene oppdeles i fem grupper med 5 mus pr. gruppe. Intraperitoneale injeksjoner av pertussistoksin (400 ng) gis på dagene 0 og 2. Gruppene gis en 1 x, 10 x eller 100 x dose av TACI-immunglobulinprotein, én gruppe gis kun bærestoff, og én gruppe behandles ikke. Forebyggende behandling begynner på dag 0, intervensjonsbehandlingen begynner på dag 7 eller etter opptreden av kliniske tegn. Tegn på sykdom, vekttap og paralyse viser seg etter ca. 10-14 dager og varer i ca. 1 uke. Dyrene analyseres daglig ved å måle kroppsvekt og gi en klinisk poengsum til omfanget av symptomer. Kliniske tegn på eksperimentell allergisk encefalomyelitt opptrer i løpet av 10-14 dager etter inokulasjonen og varer i ca. 1 uke. Etter undersøkelsens avslutning avlives alle dyr med en overdose gass og gjennomgåren nekropsi. Hjerne og ryggmarg oppsamles for histologiske undersøkelser eller nedfryses for mRNA-analyse. Kroppsvekt og kliniske poengverdier fremstilles grafisk for enkelte dyr og for grupper. ;I den kollageninduserte artrittmodell utvikler mus kronisk inflammatorisk artritt som ligner svært på human reumatoid artritt. Siden kollagenindusert artritt har ;lignende immunologiske og patologiske egenskaper som reumatoid artritt, er dette en ideell modell for analyse av mulige humane antiinflammatoriske forbindelser. En annen fordel ved å anvende den kollageninduserte artrittmodell er at mekanismene for sykdomsutviklingen er kjent. T- og B-celleepitopene på kollagen av type II er identifisert, og forskjellige immunologiske (hypersensitivitet av forsinket type og antikollagenantistoff) og inflammatoriske (cytokiner, kjemokiner og matriksdegraderende enzymer) parametere forbundet med immunformidlet artritt er blitt bestemt og kan anvendes for å anslå analyseforbindelsers virkning i modellene (Wooley, Curr. Opin. Rheum., 3:407 (1999); Williams et al., Immunol., 89:9784 (1992); Myers et al., Life Sei., 6J:1861 (1997); og Wang et al., Immunol., 92:8955 (1995)). ;Gross et al., internasjonalt patentskrift WO 00/40716, beskriver en fremgangsmåte for evaluering av virkningen av TACI-immunglobulinproteiner når det gjelder lindring av symptomer forbundet med kollagenindusert artritt. Kort beskrevet oppdeles 8 uker gamle DBA/lJ-hannmus (Jackson Labs) i grupper med 5 mus pr. gruppe og gis to subkutane injeksjoner på 50-100^1 av 1 mg/ml kollagen (fra kylling eller storfe) med 3 ukers mellomrom. Én kontroll gis ikke kollageninjeksjoner. Den første injeksjon er utformet i komplett Freunds adjuvans, og neste injeksjon er utformet i ufullstendig Freunds adjuvans. TACI-immunglobulinprotein tilføres profylaktisk samtidig med eller før den andre injeksjonen eller etter at dyret utvikler en klinisk poengsum på 2 eller mer som vedvarer i minst 24 timer. Dyrene begynner å vise symptomer på artritt etter den andre kollagen-injeksjonen, vanligvis i løpet av 2-3 uker. For eksempel kan TACI-Fc, et kontrollprotein, humant IgFc eller fosfatbufret saltvann (bærestoff) tilføres profylaktisk med begynnelse 7 dager før den andre injeksjonen (dag -7). Proteinene kan tilføres i en mengde på 100^g som gis tre ganger ukentlig som en 200^1 intraperitoneal injeksjon, og behandlingen fortsetter i 4 uker. ;I den kollageninduserte artrittmodell evalueres sykdomsomfanget i hver pote ved å anvende et skyvelær for å måle potens tykkelse og tilskrive hver pote en klinisk poengsum. En klinisk poengsum på "0" angir f.eks. en normalmus, en poengsum på "1" angir at én eller flere av tærne er inflammert, en poengsum på "2" angir mild poteinflammasjon, en poengsum på "3" angir moderat poteinflammasjon, og en poengsum på "4" angir alvorlig poteinflammasjon. Dyrene avlives etter at sykdommen har vært etablert i et gitt tidsrom, vanligvis 7 dager. Potene oppsamles for histologisk undersøkelse eller mRNA-analyse, og serum oppsamles for immunglobulinanalyse og cytokinanalyse. ;Myasthenia gravis er en annen autoimmun sykdom som musemodeller er tilgjengelige for. Myasthenia gravis er en forstyrrelse i den neuromuskulære overføring som omfatter dannelse av autoantistoffer rettet mot den nikotiniske acetylcholinreseptor. Denne sykdom er ervervet eller nedarvet med kliniske tegn som omfatter unormal svakhet og tretthet ved anstrengelser. ;Det er etablert en musemodell for myasthenia gravis (Christadoss et al., "Establishment of a Mouse Model of Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravis Pathogenesis for Immune Intervention", i Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi og Bixler (red.), s. 195-199 (1995)). Eksperimentell autoimmun myasthenia gravis er en antistofformidlet sykdom som særpreges ved nærvær av antistoffer mot acetylcholinreseptor. Disse antistoffene ødelegger reseptoren, noe som fører til defekte neuromuskulære, elektriske impulser med muskelsvakhet som følge. I den eksperimentelle modell for autoimmun myasthenia gravis immuniseres mus med den nikotiniske acetylcholinreseptor. Kliniske tegn på myasthenia gravis blir åpenbare noen uker etter annen immunisering. Eksperimentell autoimmun myasthenia gravis evalueres ved flere fremgangsmåter, innbefattet måling av serumnivået av antistoffer mot acetylcholinreseptor ved radioimmunanalyse (Christadoss og Dauphinee, J. Immunol., 136:2437 (1986); Lindstrom et al., Methods Enzymol., 74:432 (1981)), som måler acetylcholinreseptor i muskel, eller elektromyografi (Coligan et al. (red.), Protocols in Immunology, bind 3, s. 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)). ;Virkningen av TACI-immunglobulin på eksperimentell autoimmun myasthenia gravis kan bestemmes ved å tilføre fusjonsproteiner under pågående klinisk myasthenia gravis i B6-mus. Foreksempel immuniseres 100 B6-mus med 20^g acetylcholinreseptor i komplett Freunds adjuvans på dagene 0 og 30. Cirka 40-60 % av musene vil utvikle moderat (grad 2) til alvorlig (grad 3) klinisk myasthenia gravis etter forsterke ri njeksjon en med acetylcholinreseptor. Mus med klinisk sykdom av grad 2 og grad 3 oppdeles i tre grupper (med samme grad av svakhet), veies (mus med svakhet mister også vekt, siden de har problemer med å innta for og vann), og blod tappes for fremstilling av serum (formåling av antiacetylcholinreseptorantistoff og isotypenivå før behandlingen). Gruppe A injiseres intraperitonealt med fosfatbufret saltvann, gruppe B injiseres intraperitonealt med humant IgG-Fc som kontrollprotein (100^g), og gruppe C injiseres med 100^g TACI-Fc tre ganger ukentlig i 4 uker. Musene analyseres for klinisk muskelsvakhet to ganger ukentlig og veies og tappes for blod til serum 15 og 30 dager etter påbegynt behandling. Helblod oppsamles på dag 15 for bestemmelse av forholdet mellom T-celler og B-celler ved hjelp av fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse og anvendelse av markørene B220 og CD5. Over-levende mus avlives 30-45 dager etter påbegynt behandling, og skrottene nedfryses for senere ekstraksjon av acetylcholinreseptor fra muskel for bestemmelse av tap av acetylcholinreseptor i muskelvev, den viktigste patologiske tilstand ved myasthenia gravis (se f.eks. Coligan et al. (red.), Protocols in Immunology, vol. 3, s. 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)). ;Antistoffer i serum mot muskelacetylcholinreseptor fra mus kan bestemmes ved en etablert radioimmunanalyse, og isotypene av antiacetylcholinreseptorantistoff (IgM, IgGl, IgG2b og IgG2c) bestemmes ved ELISA. Slike fremgangsmåter er kjent. Virkningene av TACI-immunglobulin på pågående klinisk myasthenia gravis, antiacetylcholinreseptorantistoff og isotypenivå samt tap av acetylcholinreseptor i muskelvev bestemmes. ;Cirka 100 mus kan immuniseres med 20^g acetylcholinreseptor i komplett Freunds adjuvans på dagene 0 og 30. Mus med klinisk myasthenia gravis oppdeles i fire grupper. Gruppe A injiseres intraperitonealt med 100^g kontroll-Fc, gruppe B injiseres med 20^g kontroll-Fc, gruppe C injiseres med 100^g TACI-Fc, og gruppe D injiseres med 20^g TACI-Fc tre ganger ukentlig i 4 uker. Musene veies, og blod tappes for serum før og 15 og 30 dager etter behandlingens begynnelse. Serum analyseres for antiacetylcholinreseptorantistoff og isotyper som beskrevet ovenfor. Tap av acetylcholinreseptor i muskelvev kan også måles. ;Andre egnede analyser for TACI-immunglobulinfusjonsproteiner kan bestemmes av fagfolk. ;6. Fremstilling av TACI- immunalobulinkoniuaater ;Foreliggende beskrivelse omtaler kjemisk modifiserte TACI-immunglobulin-preparater i hvilke et TACI-immunglobulinpolypeptid er koblet til en polymer. Polymeren er typisk vannløselig slik at TACI-immunglobulinkonjugatet ikke utfelles i vandig miljø, f.eks. i fysiologisk miljø. Et eksempel på en egnet polymer er en polymer som er blitt modifisert slik at den har en enkelt reaktiv gruppe, f.eks. en aktiv ester for acylering eller et aldehyd for alkylering. På denne måten kan polymeriseringsgraden kontrolleres. Et eksempel på et reaktivt aldehyd er polyetylenglykolpropionaldehyd eller mono-CCi-CnOalkoksy- eller aryloksyderivater derav (se f.eks. Harris et al., US patentskrift nr. 5 252 714). Polymeren kan være forgrenet eller uforgrenet. Videre kan en blanding av polymerer anvendes for fremstilling av TACI-immunglobulinkonjugater. ;TACI-immunglobulinkonjugater som anvendes for behandling, kan omfatte farmasøytisk aksepterbare, vannløselige polymergrupper. Egnede vannløselige polymerer omfatter polyetylenglykol (PEG), monometoksy-PEG, mono-(C1-C10)alkoksy-PEG, aryl-oksy-PEG, poly-(N-vinylpyrrolidon)PEG, tresylmonometoksy-PEG, PEG-propionaldehyd, bis-suksinimidylkarbonat-PEG, propylenglykolhomopolymerer, en polypropylenoksid/etylen-oksidkopolymer, polyoksyetylerte polyoler (f.eks. glyserol), polyvinylalkohol, dekstran, cellulose eller andre karbohydratbaserte polymerer. Egnede PEG kan ha en molekylvekt på fra ca. 600 til ca. 60 000, innbefattet f.eks. 5 000, 12 000, 20 000 og 25 0000. Et TACI-immunglobulinkonjugat kan også omfatte en blanding av slike vannløselige polymerer. ;Ett eksempel på et TACI-immunglobulinkonjugat omfatter en TACI-immunglobulingruppe og en polyalkyloksidgruppe koblet til TACI-immunglobulinets N-ende. PEG er ett egnet polyalkyloksid. Som en illustrasjon kan TACI-immunglobulin modifiseres med PEG, en prosess som betegnes "pegylering". Pegylering av TACI-immunglobulin kan utføres ved hvilken som helst av pegyleringsreaksjonene som er kjent innen faget (se f.eks. EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249 (1992), Duncan og Spreafico, Clin. Pharmacokinet., 27:290 (1994), og Francis et al., Int. J. Hematol., 68:1 (1998)). Pegylering kan f.eks. utføres ved en acyleringsreaksjon eller ved en alkyleringsreaksjon med et reaktivt polyetylenglykolmolekyl. I en alternativ tilnærming dannes TACI-immunglobulinkonjugater ved å kondensere aktivert PEG der en terminal hydroksy- eller aminogruppe i PEG er erstattet med en aktivert linker (se f.eks. Karasiewicz et al., US patentskrift nr. 5 382 657). ;Pegylering ved acylering krever typisk å la et aktivt esterderivat av PEG reagere med et TACI-immunglobulinpolypeptid. Et eksempel på en aktivert PEG-ester er PEG forestret til N-hydroksysuksinimid. Som anvendt her, omfatter begrepet "acylering" følgende typer bindinger mellom TACI-immunglobulin og en vannløselig polymer: amid, karbamat, uretan og lignende. Fremgangsmåter for fremstilling av pegylert TACI-immunglobulin ved acylering vil typisk omfatte trinnene (a) reaksjon mellom et TACI-immunglobulinpolypeptid og PEG (f.eks. en reaktiv ester av et aldehydderivat av PEG) under betingelser ved hvilke én eller flere PEG-grupper bindes til TACI-immunglobulin, og (b) erholdelse av reaksjonsproduktet eller -produktene. Generelt vil de optimale reaksjonsbetingelser for acyleringsreaksjoner bestemmes basert på kjente parametere og ønskede resultater. For eksempel er det slik at jo høyere forholdet er mellom PEG og TACI-immunglobulin, jo høyere vil prosentandelen av polypegylert TACI-immunglobulinprodukt være. ;Produktet av pegylering ved acylering er typisk et poly-pegylert TACI-immunglobulinprodukt i hvilket e-aminogruppene i lysin er pegylert via en acylkoblingsgruppe. Et eksempel på en binding er et amid. Det resulterende TACI-immunglobulin vil typisk være minst 95 % mono-, di- eller tripegylert, selv om noen molekyler med høyere grad av pegylering kan dannes avhengig av reaksjonsbetingelsene. pegylerte molekyler kan separeres fra ikke-konjugerte TACI-immunglobulinpolypeptider ved anvendelse av standardrensefremgangsmåter som dialyse, ultrafiltrering, ionebytterkromatografi, affinitetskromatografi og lignende. ;Pegylering ved alkylering omfatter generelt å la et terminalt aldehydderivat av PEG reagere med TACI-immunglobulin i nærvær av et reduksjonsmiddel. PEG-grupper kan kobles til polypeptidet via en -CH2-NH-gruppe. ;Derivatisering via reduktiv alkylering for dannelse av et monopegylert produkt utnytter forskjellen i reaktivitet mellom forskjellige typer primære aminogrupper som er ;tilgjengelige for derivatisering. Reaksjonen utføres typisk ved en pH som tillater at det dras fordel av pKa-forskjellene mellom e-aminogruppene i lysinrestene og a-aminogruppen i den N-terminale aminosyrerest i proteinet. Ved slik selektiv derivatisering kontrolleres tilkobling av en vannløselig polymer som inneholder en reaktiv gruppe, f.eks. et aldehyd, til et protein. Konjugasjonen med polymeren opptrer hovedsakelig ved proteinets N-ende uten signifikant modifisering av andre reaktive grupper, f.eks. aminogruppene i lysinsidekjedene. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et i det vesentlige homogent preparat av TACI-immunglobulin-monopolymerkonjugater. ;Reduktiv alkylering for fremstilling av en i det vesentlige homogen populasjon av monomer-TACI-immunglobulinkonjugatmolekyl kan omfatte følgende trinn: (a) reaksjon mellom et TACI-immunglobulinpolypeptid og en reaktiv PEG under reduktive alkylerings-betingelser ved en pH som er egnet for å tillate selektiv modifisering av a-aminogruppen i TACI-immunglobulinets aminoende, og (b) erholdelse av reaksjonsproduktet eller -produktene. Reduksjonsmidlet som anvendes for reduktiv alkylering, bør være stabilt i vandig løsning og i stand til å kun redusere Schiff-basen som dannes i den innledende prosess ved reduktiv alkylering. Illustrerende reduksjonsmidler omfatter natriumborhydrid, natriumcyanborhydrid, dimetylaminboran, trimetylaminboran og pyridinboran. ;Foren i det vesentlige homogen populasjon av monopolymer-TACI-immunglobulinkonjugater er betingelsene for den reduktive alkyleringsreaksjon betingelser som tillater selektiv tilkobling av den vannløselige polymergruppe til TACI-immunglobulinets N-ende. Slike reaksjonsbetingelser utnytter generelt pKa-forskjellene mellom aminogruppene i lysin og N-endens a-aminogruppe. pH påvirker også forholdet mellom polymer og protein som bør benyttes. Generelt er det slik at dersom pH er lavere, vil det være ønskelig med et større overskudd av polymer relativt til protein, siden jo mindre reaktiv den N-terminale a-aminogruppe er, jo mer polymer er nødvendig for å oppnå optimale betingelser. Dersom pH er høyere, er det ikke nødvendig med et like stort forhold mellom polymer og TACI- immunglobulin, siden flere reaktive grupper er tilgjengelige. pH vil typisk ligge innenfor området fra 3 til 9 eller 3 til 6. ;En annen faktor å ta i betraktning er molekylvekten til den vannløselige polymer. Generelt er det slik at jo høyere polymerens molekylvekt er, jo lavere antall polymermolekyler kan tilkobles til proteinet. For pegyleringsreaksjoner er den typiske molekylvekt fra ca. 2 kDa til ca. 100 kDa, fra ca. 5 kDa til ca. 50 kDa eller fra ca. 12 kDa til ca. 25 kDa. Det molare forhold mellom vannløselig polymer og TACI-immunglobulin vil generelt ligge i området fra 1:1 til 100:1. Det molare forhold mellom vannløselig polymer og TACI-immunglobulin vil typisk være fra 1:1 til 20:1 for polypegylering og fra 1:1 til 5:1 for mono-pegylering. ;Generelle fremgangsmåter for fremstilling av konjugater som omfatter et polypeptid og vannløselige polymergrupper, er kjent innen faget. Se f.eks. Karasiewicz et al., US patentskrift nr. 5 382 657, Greenwald et. al., US patentskrift nr. 5 738 846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther., 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem., 247:434 ;(1997)). ;Foreliggende oppfinnelse omfatter farmasøytiske sammensetninger som omfatter et fusjonsprotein som definert i kraveneog et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Bærestoffet kan være et konvensjonelt organisk eller uorganisk bærestoff. Eksempler på bærestoffer omfatter vann, bufferløsning, alkohol, propylenglykol, makrogol, sesamolje, maisolje og lignende. ;7. Isolering av TACI- immunglobulinpolypeptider ;Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan renses til minst ca. 80 % renhet, til minst ca. 90 % renhet, til minst ca. 95 % renhet eller til mer enn 95 % renhet når det gjelder kontaminerende makromolekyler, fortrinnsvis andre proteiner og nukleinsyrer, og frie for infeksiøse og pyrogene midler. Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også renses til en farmasøytisk ren tilstand, det vil si mer enn 99,9 % rent. I visse preparater er det rensede polypeptid i det vesentlige fritt for andre polypeptider, fortrinnsvis andre polypeptider med opphav i dyr. ;Fraksjoneringsfremgangsmåter og/eller konvensjonelle rensefremgangsmåter kan anvendes for erholdelse av preparater av syntetiske TACI-immunglobulinpolypeptider og rekombinante TACI-immunglobulinpolypeptider renset fra rekombinante vertsceller. Generelt kan ammoniumsulfatutfelling og syreekstraksjon eller ekstraksjon med kaotrope midler anvendes for fraksjonering av prøver. Eksempler på rensetrinn kan omfatte hydroksyapatittkromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, FPLC og reversfase-høyytelsesvæskekromatografi. Egnede kromatografimedier omfatter derivatiserte dekstraner, agarose, cellulose, polyakrylamid, spesielle kiselgeler og lignende. PEI-, DEAE-, QAE- og Q-derivater er egnet. Eksempler på kromatografimedier omfatter medier derivatisert med fenyl-, butyl- eller oktylgrupper, f.eks. fenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl-butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), oktyl-Sepharose (Pharmacia) og lignende; eller polyakrylsyreresiner som Amberchrom CG 71 (Toso Haas) og lignende. Egnede faste støttemidler omfatter glasskuler, kiselgelbaserte resiner, cellulosebaserte resiner, agarosekuler, kryssbundne agarosekuler, polystyrenkuler, kryssbundne polyakryl-amidresiner og lignende som er uløselige under betingelsene som de skal anvendes ved. Disse støttemidlene kan være modifisert med reaktive grupper som tillater tilkobling av proteiner via aminogrupper, karboksylgrupper, sulfhydrylgrupper, hydroksylgrupper og/eller ka rbohyd ratg ru pper. ;Eksempler på koblingskjemi omfatter cyanogenbromidaktivering, N-hydroksy-suksinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydrylaktivering, hydrazidaktivering og karboksyl- og aminoderivater for karbodiimidbasert koblingskjemi. Disse og andre faste medier er vel kjent og hyppig anvendt innen faget og tilgjengelige fra kommersielle leverandører. Utvelgelse av en gitt fremgangsmåte for isolering og rensing av polypeptid dreier seg om rutinemessig utforming og bestemmes delvis ut fra egenskapene til det valgte støttemiddel. Se f.eks. Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, 1988); og Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press, 1996). ;Ytterligere varianter av isolering og rensing av TACI-immunglobulin kan utformes av fagfolk. For eksempel kan anti-TACI- eller anti-Fc-antistoffer anvendes for isolering av store mengder protein ved immunaffinitetsrensing. ;Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også isoleres ved å utnytte spesielle egenskaper. For eksempel kan immobilisert metallionadsorpsjons(IMAC)-kromatografi anvendes for rensing av histidinrike proteiner, innbefattet proteiner som omfatter polyhistidinmerkelapper. Kort beskrevet lades en gel først med divalente metallioner slik at det dannes et chelat (Sulkowski, Trends in Biochem., 3:1 (1985)). Histidinrike proteiner vil adsorberes til denne matriks med varierende affinitet avhengig av det anvendte metallion, og vil elueres ved konkurrerende eluering, reduksjon av pH eller anvendelse av kraftige chelateringsmidler. Andre rensefremgangsmåter omfatter rensing av glykosylerte proteiner ved lektinaffinitetskromatografi, protein A-kromatografi og ionebytterkromatografi (M. Deutscher (red.), Meth. Enzymol., 182:529 (1990)). ;TACI-immunglobulinpolypeptider eller fragmenter av disse kan også fremstilles ved kjemisk syntese, som beskrevet ovenfor. TACI-immunglobulinpolypeptider kan være monomerer eller multimerer, glykosylerte eller ikke-glykosylerte, pegylerte eller ikke-pegylerte, og de kan omfatte en innledende metioninaminosyrerest eller ikke gjøre det. Et TACI-immunglobulinfusjonsprotein kan være ikke-glykosylert, glykosylert eller glykosylert kun i TACI-gruppen eller i immunglobulingruppen. Immunglobulingruppen kan være erholdt fra et humant antistoff, et kimært antistoff eller et humanisert antistoff. ;8. Terapeutiske anvendelser av TACI- immunglobulinpolypeptider ;TACI-immunglobulinproteiner kan anvendes for å modulere immunsystemet ved at de binder ZTNF4 eller ZTNF2 og således forhindrer binding av disse ligander til endogene TACI- eller BCMA-reseptorer. Foreliggende beskrivelse omtaler således anvendelse av TACI-immunglobulinproteiner i et individ som mangler en adekvat mengde av TACI- eller BCMA-reseptorer eller som produserer et overskudd av ZTNF4 eller ZTNF2. Disse molekylene kan tilføres til ethvert individ med behov for behandling. Foreliggende oppfinnelse omfatter både veterinærmedisinsk og humanmedisinsk terapeutisk anvendelse som definert i kravene. Illustrerende individer omfatter pattedyrindivider, f.eks. gårdsdyr, husdyr og humane pasienter. ;TACI-immunglobulinpolypeptider kan anvendes for behandling av autoimmune sykdommer, B-cellecancere, immunmodulering, IBD eller enhver antistofformidlet sykdomstilstand (f.eks. ITCP, myasthenia gravis og lignende), nyresykdommer, indirekte T-celleimmunrespons, transplantatavvisning og "graft versus host"-sykdom. Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan målstyres slik at de spesifikt regulerer B-celleresponser under immunresponsen. I tillegg kan polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for modulering av B-celleutviklingen, utvikling av andre celler, antistoff produksjon og cytokinproduksjon. Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan også modulere T- og B-cellekommunikasjonen ved å nøytralisere de proliferative virkninger av ZTNF4. ;TACI-immunglobulinpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan være anvendbare for å nøytralisere virkningene av ZTNF4 for behandling av pre-B- eller B-celleleukemier, f.eks. plasmacelleleukemi, kronisk eller akutt lymfocyttisk leukemi, myelomer som multippelmyelom, plasmacellemyelom, endotelmyelom og kjempecellemyelom, og lymfomer som non-Hodgkins lymfom, for hvilke en økning i konsentrasjonen av ZTNF4-polypeptider er forbundet. ;ZTNF4 uttrykkes i CD8<+->celler, monocytter, dendrittceller og aktiverte monocytter, noe som antyder at cytotoksiske T-celler i visse autoimmune forstyrrelser kan stimulere B-celleproduksjonen via forhøyet produksjon av ZTNF4. Immunsupprimerende proteiner som selektivt blokkerer virkningen av B-lymfocytter, vil være til nytte ved behandling av sykdom. Autoantistoff produksjon er felles forflere autoimmune sykdommer og bidrar til vevsødeleggelse og forverret sykdom. Autoantistoffer kan også føre til forekomst av komplikasjoner forbundet med immunkompleksdeponering og kan føre til mange symptomer på systemisk lupus erythematosus, innbefattet nyresvikt, neuralgiske symptomer og død. En modulering av antistoffproduksjonen uavhengig av den cellulære respons vil også være fordelaktig i mange sykdomstilstander. B-celler er også blitt vist å spille en rolle ved sekresjon av artrittogene immunglobuliner ved reumatoid artritt. Således vil inhibering av ZTNF4-antistoffproduksjonen være fordelaktig ved behandling av autoimmune sykdommer som myasthenia gravis, reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt med polyartikulært forløp og psoriatisk artritt. Immunsupprimerende terapeutiske midler som TACI-immunglobulinproteiner som selektivt blokkerer eller nøytraliserer virkningen av B-lymfocytter, vil være anvendbare for slike formål. ;Oppfinnelsen tilveiebringer anvendelse som benytter TACI-immunglobulinproteiner for selektiv blokkering eller nøytralisering av virkningen av B-celler i forbindelse med nyresykdommer i siste stadium, som kan være forbundet med autoimmune sykdommer, men som ikke nødvendigvis er det. Slike fremgangsmåter vil også være anvendbare for behandling av immunologiske nyresykdommer. Slike fremgangsmåter vil være anvendbare for behandling av glomerulonefritt forbundet med sykdommer som membranøs nefropati, IgA-nefropati eller Bergers sykdom, IgM-nefropati, Goodpastures sykdom, postinfeksiøs glomerulonefritt, mesangioproliferativ sykdom, kronisk lymfoid leukemi eller "minimal-change"-nefrotisk syndrom. Slike fremgangsmåter kan også fungere som terapeutiske anvendelser for behandling av sekundær glomerulonefritt eller vaskulitt forbundet med sykdommer som lupus, polyartritt, Henoch-Schonlein, sklerodermi, HIV-forbundne sykdommer, amyloidose eller hemolytisk uremisk syndrom. Anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse vil også være nyttig som del av en terapeutisk fremgangsmåte for behandling av interstitiell nefritt eller pyelonefritt forbundet med kronisk pyelonefritt, misbruk av analgetiske midler, nefrokalsinose, nefropati forårsaket av andre midler, nefrolithiasis eller kronisk eller akutt interstitiell nefritt. ;Den foreliggende beskrivelsen omtaler også anvendelser av TACI-immunglobulinproteiner ved behandling av hypertensive sykdommer eller sykdommer i store blodkar, innbefattet renal arteriestenose eller okklusjon og kolesterolemboli eller renal emboli. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anvendelser ved behandling av renale eller urologiske neoplasier, multiple myelomer, lymfomer, lettkjedeneuropati eller amyloidose. ;Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelser ved blokkering eller inhibering av aktiverte B-celler ved anvendelse av TACI-immunglobulinproteiner for behandling av astma og andre kroniske luftveissykdommer som bronkitt og emfysem. TACI-immunglobulinproteinene som beskrives her, kan også anvendes for behandling av Sjogrens syndrom. ;Videre tilveiebringes anvendelser for inhibering eller nøytralisering av en effektor-T-cellerespons ved anvendelse av TACI-immunglobulinproteiner for bruk i immunsuppresjon, nærmere bestemt for terapeutisk anvendelse for "graft versus host"-sykdom og transplantatavvisning. Videre vil TACI-immunglobulinproteiner være anvendbare i terapeutiske fremgangsmåter for behandling av autoimmune sykdommer som insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) og Crohns sykdom. Anvendelser ifølge foreliggende oppfinnelse vil ha ytterligere terapeutisk verdi for behandling av kroniske inflammatoriske sykdommer, nærmere bestemt for å redusere leddsmerter, opphovning, anemi og andre medfølgende symptomer, så vel som for behandling av septisk sjokk. ;Veletablerte dyremodeller er tilgjengelige for å analysere virkningen in vivo av TACI-immunglobulinproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse i visse sykdomstilstander. Nærmere bestemt kan TACI-immunglobulinproteiner analyseres in vivo i en rekke dyremodeller for autoimmun sykdom, f.eks. de kongeniske musestammene MRL- lpr/ lpr eller NZB x NZW-F1, som fungerer som modeller for SLE (systemisk lupus erythematosus). Slike dyremodeller er kjent innen faget. ;Avkom fra en krysning mellom New Zealand Black(NZB)-mus og New Zealand White(NZW)-mus utvikler en spontan form for SLE som ligner svært på SLE hos mennesker. Avkommet, som betegnes NZBW, begynner å utvikle IgM-autoantistoffer mot T-celler i en alder av 1 måned, og i en alder av 5-7 måneder er Ig-anti-DNA-autoantistoffer det dominante immunglobulin. Polyklonal B-cellehyperaktivitet fører til overproduksjon av autoantistoffer. Deponering av disse autoantistoffene, særlig antistoffer rettet mot enkelttrådet DNA, er forbundet med utvikling av glomerulonefritt, som klinisk manifesterer seg som proteinuri, azotemi og død grunnet nyresvikt. Nyresvikt er den viktigste dødsårsak hos mus som lider av spontan SLE, og i NZBW-stammen er denne prosess kronisk og obliterativ. Sykdommen utvikles hurtigere og er mer alvorlig hos hunndyr enn hos hanndyr, med en gjennomsnittlig overlevelse på kun 245 dager sammenlignet med 406 dager for hannene. Mens mange hunnmus vil være symptomatiske (proteinuri) i en alder av 7-9 måneder, kan noen være mye yngre eller eldre når de utvikler symptomer. Den dødelige immunnefritt som observeres hos NZBW-mus, ligner svært på den glomerulonefritt som observeres ved human SLE, noe som gjør denne spontane musemodell anvendbar for analyse av mulige terapeutiske midler mot SLE. ;Musemodeller for eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) er blitt anvendt som et verktøy for å undersøke både mekanismene for immunformidlet sykdom og fremgangsmåter for mulig terapeutisk inngripen. Modellen ligner human multippel sklerose og gir demyelinering som en følge av T-celleaktivering overfor neuroproteiner som myelin basisk protein (MBP) eller proteolipidprotein (PLP). Inokulering med antigen fører til induksjon av CD4<+>, klasse II-MHC-begrensede T-celler (Thl). Endringer i fremgangsmåten for EAE kan gi akutte, kronisk tilbakevendende eller passive overføringsvarianter av modellen. ;I modellen for kollagenindusert artritt (CIA) utvikler mus kronisk inflammatorisk nefritt som ligner svært på human reumatoid artritt (RA). Siden CIA har visse immunologiske og patologiske egenskaper felles med RA, er dette en ideell modell for analyse av mulige humane antiinflammatoriske forbindelser. En annen fordel ved å anvende CIA-modellen er at mekanismene for sykdomsutviklingen er kjent. T- og B-celleepitopene på kollagen av type II er identifisert, og forskjellige immunologiske (hypersensitivitet av forsinket type og antikollagenantistoff) og inflammatoriske (cytokiner, kjemokinerog matriksdegraderende enzymer) parametere forbundet med immunformidlet artritt er blitt bestemt og kan anvendes for å anslå analyseforbindelsers virkning i modellene. ;Myasthenia gravis (MG) er en annen autoimmun sykdom som musemodeller er tilgjengelige for. MG er en forstyrrelse i den neuromuskulære overføring som omfatter dannelse av autoantistoffer rettet mot den nikotiniske acetylcholinreseptor (AChR). MG er en ervervet eller nedarvet sykdom med kliniske egenskaper som omfatter unormal svakhet og tretthet ved anstrengelser. En musemodell for MG er blitt etablert. Eksperimentell autoimmun myasthenia gravis (EAMG) er en antistofformidlet sykdom som særpreges ved nærvær av antistoffer mot AChR. Disse antistoffene ødelegger reseptoren og fører til defekte neuromuskulære elektriske impulser, noe som fører til muskelsvakhet. I EAMG-modellen immuniseres mus med den nikotiniske acetylcholinreseptor. Kliniske tegn på MG blir åpenbare noen uker etter annen immunisering. EAMG evalueres ved flere fremgangsmåter, innbefattet måling av serumnivået av AChR-antistoffer ved radioimmunanalyse, måling av AChR i muskel eller elektromyografi. ;Generelt vil dosen av tilført TACI-immunglobulinprotein variere, avhengig av faktorer som individets alder, vekt, høyde, kjønn, generelle medisinske tilstand og tidligere medisinske historie. Det er typisk ønskelig å tilføre mottakeren en dose av TACI-immunglobulinprotein som ligger i området fra ca. 1 pg/kg til 10 mg/kg (mengde middel/individets kroppsvekt), selv om en lavere eller høyere dose også kan tilføres, avhengig av omstendighetene. ;Tilførsel av et TACI-immunglobulinprotein til et individ kan skje intravenøst, intraarterielt, intraperitonealt, intramuskulært, subkutant, intrapleuralt, intratekalt, ved perfusjon gjennom et regionalt kateter eller ved direkte injeksjon i lesjonen. Ved tilførsel av terapeutiske proteiner ved injeksjon kan tilførselen skje ved kontinuerlig infusjon eller ved enkeltvis eller multippel bolusinjeksjon. ;Ytterligere tilførselsveier omfatter oral tilførsel, tilførsel via slimhinner, pulmonal tilførsel og transkutan tilførsel. Oral tilførsel er egnet for polyestermikrokuler, zeinmikrokuler, proteinoide mikrokuler, polycyanakrylatmikrokuler og lipidbaserte systemer (se f.eks. DiBase og Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren (red.), s. 8 255-288 (Plenum Press, 1997)). Muligheten for intranasal tilførsel eksemplifiseres ved en slik måte å tilføre insulin på (se f.eks. Hinchcliffe og Illum, Adv. Drug Deliv. Rev., 35:199 (1999)). Tørre partikler eller væskepartikler som omfatter TACI-immunglobulin, kan fremstilles og inhaleres ved hjelp av dispersjonsinnretninger for tørt pulver, flytende aerosoldannere eller nebulisatorer (se f.eks. Pettit og Gombotz, TIBTECH, 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 35:235 (1999)). Denne tilnærming illustreres ved diabetesbehandlingssystemet AERX, som er en håndholdt elektronisk inhalator som tilfører aerosolisert insulin til lungene. Undersøkelser har vist at proteiner på opptil 48 000 kDa er blitt tilført gjennom huden i terapeutiske konsentrasjoner ved hjelp av ultralyd med lav frekvens, noe som illustrerer muligheten for transkutan tilførsel (Mitragotri et al., Science, 269:850 (1995)). Transdermal tilførsel ved anvendelse av elektroporering tilveiebringer et annet middel for tilførsel av TACI-immunglobulinprotein (Potts et al., Pharm. Biotechnol., 10:213 (1997)). ;Et farmasøytisk preparat som omfatter et TACI-immunglobulinprotein, kan utformes ifølge kjente fremgangsmåter for fremstilling av farmasøytisk anvendbare preparater, hvorved de terapeutiske proteiner sammenblandes med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Et preparat sies å være et "farmasøytisk aksepterbart bærestoff" dersom tilførsel av dette kan tolereres av den mottakende pasient. Sterilt, fosfatbufret saltvann er et eksempel på et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Andre egnede bærestoffer er vel kjent blant fagfolk. Se f.eks. Gennaro (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. utgave (Mack Publishing Company, 1995). ;For behandlingsformål tilføres TACI-immunglobulinproteiner til en pasient i en terapeutisk effektiv mengde. Et TACI-immunglobulinprotein og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff sies å tilføres i en "terapeutisk effektiv mengde" dersom den tilførte mengde er fysiologisk signifikant. Et middel er fysiologisk signifikant dersom dets nærvær fører til en påvisbar endring i den mottakende pasients fysiologi. For eksempel er et middel som anvendes for behandling av inflammasjon, fysiologisk signifikant dersom dets nærvær lindrer den inflammatoriske respons. Som et annet eksempel er et middel som benyttes for å inhibere veksten av tumorceller, fysiologisk signifikant dersom tilførsel av midlet fører til et redusert antall tumorceller, redusert metastase, redusert størrelse av en fast tumor eller forhøyet nekrose av en tumor. Videre er et middel som anvendes for behandling av systemisk lupus erythematosus, fysiologisk signifikant dersom tilførsel av midlet fører til redusert mengde antidobbelttrådet DNA-antistoff i sirkulasjonen eller en reduksjon av minst ett av følgende symptomer: feber, leddsmerter, erytematøse hudlesjoner eller andre kjennetegn på systemisk lupus erythematosus. Et eksempel på en generell antydning om at et TACI-immunglobulinprotein tilføres i en terapeutisk effektiv mengde, er at det etter tilførsel til et individ er en reduksjon av ZTNF4(BLyS)-nivået i sirkulasjonen. ;Et farmasøytisk preparat som omfatter et TACI-immunglobulinprotein kan tilveiebringes i væskeform, som en aerosol eller i fast form. Væskeformer illustreres ved injiserbare løsninger og orale suspensjoner. Eksempler på faste former omfatter kapsler, tabletter og former for kontrollert frigivelse. Denne siste form illustreres ved miniosmotiske pumper og implantater (Bremer et al., Pharm. Biotechnol., 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", i Drug Delivery Systems, Ranade og Hollinger (red.), s. 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren (red.), s. 239-254 (Plenum Press, 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren (red.), s. 93-117 (Plenum Press, 1997)). ;Liposomer er et middel for tilførsel av terapeutiske polypeptider til et individ intravenøst, intraperitonealt, intratekalt, intramuskulært, subkutant eller via oral tilførsel, inhalasjon eller intranasal tilførsel. Liposomer er mikroskopiske vesikler som består av ett eller flere lipiddobbeltlag som omgir vandige avdelinger (se generelt Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 12 (suppl. 1):S61 (1993); Kim, Drugs, 46:618 ;(1993); og Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", i Drug Delivery Systems, Ranade og Hollinger (red.), s. 3-24 (CRC Press, 1995)). Liposomer ligner cellulære membraner når det gjelder sammensetning, og som en følge av dette kan liposomer tilføres trygt og er biodegraderbare. Avhengig av fremstillingsfremgangsmåten kan liposomer være unilamellære eller multilamellære, og liposomer kan variere i størrelse med en diameter som varierer fra 0,02 til mer enn 10^m. En rekke midler kan innkapsles i liposomer: hydrofobe midler fordeles i dobbeltlagene, og hydrofile midler fordeles i det indre, vandige rom (se f.eks. Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey, 1987); og Ostro et al., American J. Hosp. Pharm., 46:1576 ;(1989)). Det er videre mulig å kontrollere den terapeutiske tilgjengelighet av det innkapslede middel ved å variere liposomstørrelsen, antall dobbeltsjikt, lipidsammensetningen samt liposomenes ladning og overflateegenskaper. ;Liposomer kan adsorberes til nær sagt alle celletyper og så langsomt frigi det innkapslede middel. Alternativt kan et adsorbert liposom endocyteres av celler som er fagocytiske. Endocytose følges av intralysosomal degradering av liposomale lipider og frigivelse av de innkapslede midler (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 446:368 (1985)). Etter intravenøs tilførsel tas små liposomer (0,1-1,0^m) typisk opp av celler i retikuloendotelsystemet, hovedsakelig lokalisert til lever og milt, mens liposomer som er større enn 3,0^m, deponeres i lungen. Dette preferensielle opptak av små liposomer i cellene i retikuloendotelsystemet er blitt benyttet for tilførsel av kjemoterapeutiske midler til makrofager og til levertumorer. ;Retikuloendotelsystemet kan omgås ved flere fremgangsmåter, innbefattet metting med store doser av liposom parti kler eller selektiv makrofaginaktivering ved hjelp av farmakologiske midler (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta, 802:428 (1984)). I tillegg har innføring av glykolipid- eller polyetylenglykolderivatiserte fosfolipider i liposom-membraner blitt vist å føre til et signifikant redusert opptak av retikuloendotelsystemet (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)). ;Liposomer kan også fremstilles slik at de målstyres mot gitte celler eller organer ved å variere fosfolipidsammensetningen eller ved å innføre reseptorer eller ligander i liposomene. For eksempel er liposomer fremstilt med et høyt innhold av et ikke-ionisk, overflateaktivt middel blitt anvendt for målstyring til lever (Hayakawa et al., japansk patentskrift 04-244018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull., J6:960 (1993)). Disse preparatene ble fremstilt ved å sammenblande soyabønnefosfatidylcholin, a-tokoferol og etoksylert, hydrogenert lakserolje (HCO-60) i metanol, oppkonsentrere blandingen under vakuum og så rekonstituere blandingen med vann. En liposom utform ing av dipalmitoylfosfatidylcholin ;(DPPC) med en sterylglykosidblanding fra soyabønne (SG) og kolesterol (Ch) er også blitt vist å styres til lever (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull., 20:881 (1997)). ;Alternativt kan forskjellige målstyrende ligander bindes til liposomets overflate, f.eks. antistoffer, antistoffragmenter, karbohydrater, vitaminer og transportproteiner. Liposomer kan f.eks. modifiseres med galaktosyllipidderivater av forgrenet type for styring til asialoglykoprotein(galaktose)reseptorer, som utelukkende uttrykkes på overflaten av leverceller (Kato og Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997)). På tilsvarende måte har Wu et al., Hepatology, 27:772 (1998), vist at merking av liposomer med asialofetuin førte til forkortet halveringstid i plasma av liposomene og en kraftig økning av opptaket av asialofetuinmerket liposom ved hepatocytter. På den annen side kan leverakkumulering av liposomer som omfatter galaktosyllipidderivater av forgrenet type inhiberes ved forutgående injeksjon av asialofetuin (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997)). Liposomer med polyakonitylert humant serumalbumin byr på en annen tilnærming for målstyring av liposomer til leverceller (Kamps et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 94:11681 (1997)). Videre beskriver Geho et al., US patentskrift nr. 4 603 044 et hepatocyttrettet liposomvesikkeltilførselssystem som har spesifisitet for lever-galle-reseptorer som er forbundet med de spesialiserte metabolske cellene i lever. ;I en mer generell tilnærming til vevsstyring merkes målcellene på forhånd med biotinylerte antistoffer som er spesifikke for en ligand som uttrykkes av målcellen (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 (1998)). Etter at fritt antistoff er fjernet fra plasma, tilføres streptavidinkonjugerte liposomer. I en annen tilnærming er de målstyrende antistoffene direkte koblet til liposomer (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 ;(1998)). ;TACI-immunglobulinproteiner kan innkapsles i liposomer ved anvendelse av standardteknikker for proteinmikroinnkapsling (se f.eks. Anderson et al., Infect. Immun., 3J:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res., 50:1853 (1990); Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta, i063:95 (1991); Alving et al., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", i Liposome Technology, 2. utgave, bind III, Gregoriadis (red.), s. 317 (CRC Press, 1993); Wassef et al., Meth. Enzymol., 149:124 (1987)). Som bemerket ovenfor, kan terapeutisk anvendbare liposomer inneholde en rekke bestanddeler. Liposomer kan f.eks. omfatte lipidderivater av poly(etylenglykol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993). ;Det er blitt utformet degraderbare polymermikrokuler som opprettholder et høyt systemisk nivå av terapeutiske proteiner. Mikrokuler fremstilles fra degraderbare polymerer som poly(laktid-koglykolid) (PLG), polyanhydrider, poly(ortoestere), ikke-biodegraderbare etylvinylacetatpolymerer i hvilke proteiner innfanges i polymeren (Gombotz og Pettit, Bioconjugate Chem., 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", i Drug Delivery Systems, Ranade og Hollinger (red.), s. 51-93 (CRC Press, 1995); Roskos og Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren (red.), s. 45-92 (Plenum Press, 1997); Bartus et al., Science, 281:1161 (1998); Putney og Burke, Nature Biotechnology, J6:153 ;(1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:548 (1998)). Polyetylenglykol(PEG)-belagte nanokuler kan også fungere som bærere for intravenøs tilførsel av terapeutiske proteiner (se f.eks. Gref et al., Pharm. Biotechnol., 10:161 (1997)). ;Foreliggende beskrivelse omtaler også kjemisk modifiserte TACI-immunglobulinproteiner i hvilke polypeptidet er koblet til en polymer, som diskutert ovenfor. ;Andre doseringsformer kan utformes av fagfolk, f.eks. som vist av Ansel og Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5. utgave (Lea & Febiger, 1990), Gennaro (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. utgave (Mack Publishing Company, 1995), og Ranade og Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press, 1996). ;Som en illustrasjon kan farmasøytiske preparater leveres som et sett som omfatter en beholder som omfatter et TACI-immunglobulinprotein. Terapeutiske polypeptider kan tilveiebringes i form av en injiserbar løsning for en enkelt eller flere doser eller som et sterilt pulver som skal rekonstitueres før injeksjon. Alternativt kan et slikt sett omfatte en dispersjonsinnretning for tørt pulver, en flytende aerosoldanner eller en nebulisator for tilførsel av et terapeutisk polypeptid. Et slikt sett kan videre omfatte skriftlig informasjon vedrørende indikasjoner og anvendelse av det farmasøytiske preparat. Slik informasjon kan videre omfatte en erklæring om at TACI-immunglobulinpreparatet er kontraindikert for pasienter med kjent hypersensitivitet overfor enten TACI-reseptorgruppen eller immunglobulingruppen. ;9. Terapeutiske anvendelser av TACI- immunalobulinnukleotidsekvenser ;Foreliggende beskrivelse omtaler anvendelse av nukleinsyremolekyler som koder for TACI-immunglobulinfusjonsproteiner for tilførsel av disse fusjonsproteinene til et individ med behov for slik behandling. For veterinærmedisinsk terapeutisk anvendelse eller human terapeutisk anvendelse kan slike nukleinsyremolekyler tilføres til et individ med en forstyrrelse eller sykdom som diskutert ovenfor. Som ett eksempel diskutert tidligere kan nukleinsyremolekyler som koder for et TACI-immunglobulinfusjonsprotein, anvendes for langtidsbehandling av systemisk lupus erythematosus. ;Det finnes en rekke tilnærminger for tilføring av et TACI-immunglobulingen til et individ, innbefattet anvendelse av rekombinante vertsceller som uttrykker TACI-immunglobulin, tilførsel av naken nukleinsyre som koder for TACI-immunglobulin, anvendelse av en kationisk lipidbærer med et nukleinsyremolekyl som koder for TACI-immunglobulin og anvendelse av virus som uttrykker TACI-immunglobulin, f.eks. rekombinante retrovirus, rekombinante adenoassosierte virus, rekombinante adenovirus og rekombinante herpes simplex-virus (se f.eks. Mulligan, Science, 260:926 (1993), Rosenberg et al., Science, 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science, 259:988 (1993), Wolff et al., Science, 247:1465 (1990), Breakfield og Deluca, The New Biologist, 3:203 (1991)). I en ex wVo-tilnærming isoleres f.eks. celler fra et individ, og cellene transfekteres med en vektor som uttrykker et TACI-immunglobulingen og transplanteres så tilbake til individet. ;For å oppnå ekspresjon av et TACI-immunglobulingen konstrueres det en ekspresjonsvektor i hvilken en nukleotidsekvens som koder for et TACI-immunglobulingen, er operativt koblet til en kjernepromoter og om ønskelig et regulatorisk element for kontroll av gentranskripsjonen. De generelle krav til en ekspresjonsvektor er beskrevet ovenfor. ;Alternativt kan et TACI-immunglobulingen tilføres ved anvendelse av ;rekombinante v i ru sve kto re r, innbefattet f.eks. adenovirusvektorer (f.eks. Kass-Eisler et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 90:11498 (1993); Kolls et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 9J:215 ;(1994); Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403 (1993); Vincent et al., Nat. Genet., 5:130 (1993); og Zabner et al., Cell, 75:207 (1993)), adenovirusassosierte virusvektorer (Flotte et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 90:10613 (1993)), alfa-virus som Semliki Forest-virus og Sindbis-virus (Hertz og Huang, J., Vir., 66:857 (1992); Raju og Huang, J. Vir., 65:2501 ;(1991); og Xiong et al., Science, 243:1188 (1989)), herpesvirusvektorer (f.eks. US patentskrifter nr. 4 769 331, 4 859 587, 5 288 641 og 5 328 688), parvovirusvektorer (Koering et al., Hum. Gene Therap., 5:457 (1994)), koppevirusvektorer (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., J93:653 (1993), Panicali og Paoletti, Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 79:4927 (1982)), koppevirus, f.eks. kanarifuglkoppevirus eller kukoppevirus (Fisher-Hoch et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 86:317 (1989); og Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 569:86 (1989)), og retrovirus (f.eks. Baba et al., J. Neurosurg., 79:729 (1993); Ram et al., Cancer Res., 53:83 (1993); Takamiya et al., J. Neurosci. Res., 33:493 (1992); Vile og Hart, Cancer Res., 53:962 (1993); Vile og Hart, Cancer Res., 53:3860 (1993); og Anderson et al., US patentskrift nr. 5 399 346). I forskjellige utførelser kan enten virusvektoren selv eller en viruspartikkel som inneholder virusvektoren, anvendes i fremgangsmåtene og preparatene som beskrives nedenfor. ;Som en illustrasjon av et system er adenovirus, et dobbelttrådet DNA-virus, en godtkarakterisertgenoverføringsvektor for tilførsel av et heterologt nukleinsyremolekyl (foren oversikt, se Becker et al., Meth. Cell Biol., 43:161 (1994); Douglas og Curiel, Science & Medicine, 4:44 (1997)). Adenovirussystemet byr på flere fordeler, innbefattet (i) evnen til å omfatte relativt store DNA-innskudd, (ii) evnen til å vokse til høyt titer, (iii) evnen til å infisere et bredt utvalg av pattedyrcelletyper, og (iv) evnen til å benyttes med mange forskjellige promotere, innbefattet promotere som anvendes i alle celletyper, vevsspesifikke promotere og regulerbare promotere. I tillegg kan adenovirus tilføres ved intravenøs injeksjon siden viruset er stabilt i blodstrømmen. ;Ved anvendelse av adenovirusvektorer hvor deler av adenovirusgenomet er delert, innføres innskudd i virus-DNA ved direkte ligering eller ved homolog rekombinasjon med et kotransfektert plasmid. I et eksemplarisk system er det essensielle El-gen delert fra virusvektoren, og viruset vil ikke replikeres med mindre El-genet tilveiebringes av vertscellen. Ved intravenøs tilførsel til intakte dyr styres adenovirus hovedsakelig til leveren. Selv om et adenovirustilførselssystem med en El-gendelesjon ikke kan replikeres i vertscellene, vil vertens vev uttrykke og prosessere et kodet heterologt protein. Vertsceller vil også utskille det heterologe protein dersom det tilsvarende gen omfatter en sekretorisk signalsekvens. Utskilte proteiner vil gå inn i sirkulasjonen fra vev som uttrykker det heterologe gen (f.eks. den svært godt vaskulariserte lever). ;Videre kan adenovirusvektorer som inneholder forskjellige delesjoner av virusgener, anvendes for å redusere eller fjerne immunresponser på vektoren. Slike adenovirus er El-delerte og inneholder i tillegg delesjoner av E2A eller E4 (Lusky et al., J. Virol., 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy, 9:671 (1998)). Delesjon av E2b er også blitt rapportert å redusere immunresponsene (Amalfitano et al., J. Virol., 72:926 ;(1998)). Ved å delere hele adenovirusgenomet kan svært store innskudd av heterologt DNA inngå. Fremstilling av såkalte "gutless" adenovirus hvor alle virusgener er delert, er spesielt fordelaktig for innsetting av store innskudd med heterologt DNA (for en oversikt, se Yeh og Perricaudet, FASEB J., 11:615 (1997)). ;Lagersuspensjoner med høyt titer av rekombinant virus som kan uttrykke et terapeutisk gen, kan erholdes fra infiserte pattedyrceller ved anvendelse av standardmetoder. For eksempel kan rekombinant herpes simplex-virus fremstilles i Vero-celler, som beskrevet av Brandt et al., J. Gen. Virol., 72:2043 (1991); Herold et al., J. Gen. Virol., 75:1211 (1994); Visalli og Brandt, Virology, 185:419 (1991); Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei., 30:2474 (1989); Brandt et al., J. Virol. Meth., 36:209 (1992); og av Brown og MacLean (red.), HSV Virus Protocols (Humana Press, 1997). ;Alternativt kan en ekspresjonsvektor som omfatter et TACI-immunglobulingen, innføres i et individs celler ved lipofeksjon in vivo ved anvendelse av liposomer. Syntetiske kationiske lipider kan anvendes for fremstilling av liposomer for in wVo-transfeksjon av et gen som koder for en markør (Felgner et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 84:7413 (1987); Mackey et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 85:8027 (1988)). Anvendelse av lipofeksjon for innføring av eksogene gener i spesifikke organer in vivo har visse praktiske fordeler. Liposomer kan anvendes for å styre transfeksjonen til gitte celletyper, noe som er spesielt fordelaktig i et vev med cellulær heterogenitet, f.eks. bukspyttkjertel, lever, nyre og hjerne. Lipider kan kobles kjemisk til andre molekyler for å oppnå målstyring. Målstyrende peptider (f.eks. hormoner eller neurotransmittere), proteiner, slik som antistoffer, eller ikke-peptidmolekyler kan kobles kjemisk til liposomer. ;Elektroporering er en alternativ tilførselsmåte. For eksempel har Aihara og Miyazaki, Nature Biotechnology, J6:867 (1998), vist anvendelse av in wVo-elektroporering for tilførsel av gener til muskel. ;Generelt vil dosen av et preparat som omfatter en terapeutisk vektor med en TACI-immunglobulinnukleotidsekvens, f.eks. et rekombinant virus, variere avhengig av faktorer som individets alder, vekt, høyde, kjønn, generelle medisinske tilstand og tidligere medisinske historie. Egnede tilførselsveier for terapeutiske vektorer omfatter intravenøs injeksjon, intraarteriell injeksjon, intraperitoneal injeksjon, intramuskulær injeksjon, intra-tumoral injeksjon og injeksjon i et hulrom som inneholderen tumor. Som en illustrasjon viste Horton et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 96:1553 (1999), at intramuskulær injeksjon av plasmid-DNA som kodet for interferon-a, gav kraftige antitumorvirkninger på primære og metastatiske tumorer i en musemodell. ;Et preparat som omfatter virusvektorer, ikke-virusvektorer eller en kombinasjon av virusvektorer og ikke-virusvektorer, kan utformes ifølge kjente fremgangsmåter for fremstilling av farmasøytisk anvendbare preparater, hvorved vektorer eller virus sammenblandes med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Som bemerket ovenfor, sies en sammensetning, f.eks. fosfatbufret saltvann, å være et "farmasøytisk aksepterbart bærestoff" dersom tilførsel derav kan tolereres av et mottakende individ. Andre egnede bærestoffer er vel kjent blant fagfolk (se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. utgave (Mack Publishing Co., 1995), og Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. utgave (MacMillan Publishing Co., 1985). ;For terapeutiske formål tilføres en terapeutisk genekspresjonsvektor eller et rekombinant virus som omfatter en slik vektor og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff til et individ i en terapeutisk effektiv mengde. En blanding av en ekspresjonsvektor (eller et virus) og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff sies å tilføres i en "terapeutisk effektiv mengde" dersom den tilførte mengde er fysiologisk signifikant. Et middel er fysiologisk signifikant dersom dets nærvær fører til en påvisbar endring i et mottakende individs fysiologi. For eksempel er et middel som anvendes for behandling av inflammasjon, fysiologisk signifikant dersom dets nærvær lindrer den inflammatoriske respons. Som et annet eksempel er et middel som anvendes for inhibering av vekst av tumorceller, fysiologisk signifikant dersom tilførsel av midlet fører til et redusert antall tumorceller, redusert metastase, redusert størrelse av en fast tumor eller forhøyet nekrose av en tumor. ;Dersom individet som behandles med en terapeutisk genekspresjonsvektor eller et rekombinant virus er et menneske, er behandlingen fortrinnsvis genterapi på somatiske celler. Det vil si at den foretrukne behandling av et menneske med en terapeutisk genekspresjonsvektor eller et rekombinant virus ikke omfatter innføring av et nukleinsyremolekyl i celler som kan utgjøre en del av en human kimcellelinje og som kan overføres til de påfølgende generasjoner (det vil si genterapi av humane kimcellelinjer). ;10. Fremstillin<g>av trans<g>ene mus ;Det kan utformes transgene mus som overuttrykker nukleinsyresekvenser som koder for TACI-immunglobulinfusjonsproteiner i alle vev eller under kontroll av et vevs-spesifikt eller vevspreferensielt regulatorisk element. Disse overprodusenter av TACI-immunglobulinfusjonsproteiner kan anvendes for å karakterisere fenotypen som oppstår grunnet overekspresjonen, og de transgene dyr kan fungere som modeller for sykdom hos mennesker forårsaket av overskudd av TACI-reseptorprotein. Transgene mus som overuttrykker TACI-immunglobulinfusjonsproteiner, utgjør også bioreaktormodeller for produksjon av TACI-immunglobulinfusjonsproteiner i melk eller blod hos større dyr. Fremgangsmåter for fremstilling av transgene mus er vel kjent blant fagfolk (se f.eks. Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", i Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (red.), s. 111-124 (Academic Press, Ltd., 1994) ; Monastersky og Robl (red.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press, 1995) ; og Abbud og Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", i Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez og Hoeffler (red.), s. 367-397 (Academic Press, Inc., 1999)). ;En fremgangsmåte for fremstilling av en transgen mus som uttrykker en nukleinsyresekvens som koder for et TACI-immunglobulinfusjonsprotein, kan f.eks. ta utgangspunkt i voksne fruktbare hannmus (studs) (B6C3fl, 2-8 måneder gamle (Taconic Farms, Germantown, NY)), vasektomiserte hannmus (duds) (B6D2fl, 2-8 måneder gamle (Taconic Farms)), prepubertale fertile hunnmus (donorer) (B6C3fl, 4-5 uker gamle (Taconic Farms)) og voksne fertile hunnmus (mottakere) (B6D2fl, 2-4 måneder gamle (Taconic Farms)). Donorene akklimatiseres i 1 uke og injiseres så intraperitonealt med 8 IU/mus av gonadotropin fra serum fra drektige hopper (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), og 46-47 timer senere 8 IU/mus av humant choriongonadotropin (hCG (Sigma)) intraperitonealt for induksjon av superovulasjon. Donorer pares med "studs" etter hormon-injeksjonene. Ovulasjonen opptrer generelt i løpet av 13 timer etter hCG-injeksjonen. Kopulasjon bekreftes ved nærvær av en vaginalplugg om morgenen etter paringen. ;Befruktede egg oppsamles underet kirurgisk mikroskop. Egglederne oppsamles, og egg frigis til objektglass for urinanalyse inneholdende hyaluronidase (Sigma). Eggene vaskes én gang med hyaluronidase og to ganger med Whittens W640-medium (f.eks. beskrevet av Menino og 0'Claray, Biol. Reprod., 77:159 (1986); og Dienhart og Downs, Zygote, 4:129 (1996)) som på forhånd var blitt inkubert med 5 % C02, 5 % 02og 90 % N2ved 37 °C. Eggene lagres så i en 37 °C/5 % C02-inkubator inntil mikroinjeksjonen skal utføres. ;10-20^g plasmid-DNA som inneholder en sekvens som koder for et TACI-immunglobulinfusjonsprotein, lineariseres, renses fra gel og resuspenderes i 10 mm Tris-HCI (pH 7,4), 0,25 mM EDTA (pH 8-0), i en sluttkonsentrasjon på 5-10 ng pr. mikroliter pr. mikroinjeksjon. Sekvensene som koder for TACI-immunglobulinfusjonsprotein, kan f.eks. kode for et TACI-polypeptid med delesjon av aminosyrerester 1-29 og 111-154 i SEKV. ID NR.: 2 og en Fc5-immunglobulingruppe. ;Plasmid-DNA mikroinjiseres i høstede egg som befinner seg i en dråpe med W640-medium med varm, C02-ekvilbrert mineralolje lagt over. DNA suges inn i en injeksjonsnål (uttrukket fra et borsilikaglasskapillær med indre diameter 0,75 mm, ytre diameter 1 mm, og injiseres i enkeltegg. Hvert egg penetreres med injeksjonsnålen som føres inn i én eller begge av de haploide pronuklei. ;Noen pikoliter DNA injiseres i pronuklei, og injeksjonsnålen trekkes ut uten at den kommer i kontakt med nukleoli. Fremgangsmåten gjentas inntil alle egg er injisert. Egg som er blitt mikroinjisert med hell, overføres til en organvevsdyrkingsskål med forgasset W640-medium for lagring over natten i en 37 °C/5 % C02-inkubator. ;Neste dag overføres tocelleembryoer til pseudodrektige mottakere. Mottakerne identifiseres ved nærvær av kopulasjonsplugger etter paring med vasektomiserte hannmus. Mottakerne bedøves og barberes på den dorsale venstre side og overføres til et kirurgisk mikroskop. Et lite snitt innføres i huden og gjennom muskelveggen midt i underlivsområdet som defineres av ribbensburet, ryggen og bakbenet, midtveis mellom kne og milt. Reproduksjonsorganene bringes ut og plasseres på et lite kirurgisk klede. Fettputen strekkes ut over det kirurgiske klede, og en liten serrefine (Roboz, Rockville, MD) festes til fettputen og får henge over musens rygg, slik at organene hindres i å gli tilbake inn. ;Med en tynn overføringspipette som inneholder mineralolje, fulgt av alternerende W640 og luftbobler, overføres 12-17 friske tocelleembryoer fra forrige dags injeksjon til mottakeren. Den oppsvulmede ampulla lokaliseres mellom ampullaen og bursa, og et snitt innføres i egglederen med en 28 G kanyle nær bursa, idet forsiktighet utøves slik at verken ampulla eller bursa opprives. ;Pipetten overføres til snittet i ovidukten, og embryoene blåses inn, idet den første luftboble får unnslippe pipetten. Fettputen dyttes forsiktig inn i peritoneum, og reproduksjonsorganene får skli inn. Peritonealveggen lukkes med ett sting, og huden lukkes med en sårklype. Musene får komme seg på en 37 °C objektglassvarmer i minst 4 timer. ;Mottakerne føres tilbake til burene parvis og gjennomgår en drektighet på 19-21 dager. Etter fødselen tillates 19-21 dager postpartum før avvenningen. De avvente ungene kjønnsbestemmes og plasseres i separate dyr for hvert kjønn, og en biopsi på 0,5 cm (som anvendes for genotyping) kuttes av halen med en ren saks. ;Genomisk DNA fremstilles fra den avklipte haletippen ved anvendelse av f.eks. et QIAGEN DNEASY-sett ifølge produsentens instruksjoner. Genomisk DNA analyseres ved PCR og anvendelse av primere som er utformet slik at de amplifiserer en nukleinsyresekvens som koder for et TACI-immunglobulinfusjonsprotein eller et seleksjonsmarkørgen innført i samme plasmid. Etter at det er blitt bekreftet at dyrene er transgene, tilbake-krysses de i en innavlet stamme ved å plassere en transgen hunnmus sammen med en villtypehannmus eller en transgen hannmus med én eller to villtypehunnmus. Etter hvert som unger fødes og avvennes, separeres kjønnene, og haletippen avklippes for genotyping. ;For å kontrollere ekspresjon av et transgen i et levende dyr utføres en partiell hepatektomi. Et kirurgisk inngrep utføres i øvre abdomen direkte under zyfoidfremspringet. Ved anvendelse av steril teknikk innføres et lite snitt på 1,5-2 cm nedenfor sternum, og den venstre laterale leverlapp bringes ut. En 4-0 silketråd bindes rundt den nedre leverlapp og sikrer denne utenfor kroppshulen. En atraumatisk klemme anvendes for å holde knuten, mens en ny løkke med absorberbar Dexon (American Cyanamid, Wayne, N.J.) plasseres proksimalt for den første omsnøring. Leveren kuttes distalt for Dexon-omsnøringen, og ca. 100 mg utkuttet levervev plasseres i en steril petriskål. Den utkuttede leverdel overføres til et 14 ml polypropylenrør med rund bunn og hurtigfryses i flytende nitrogen, hvoretter den lagres på tørris. Setet for det kirurgiske inngrep lukkes ved sying og sårklyper, og dyreburet plasseres på en 37 °C varmepute i 24 timer etter operasjonen. Dyret kontrolleres daglig etter operasjonen, og sårklemmene fjernes 7-10 dager etter det kirurgiske inngrep. Ekspresjonsnivået av TACI-immunglobulinfusjonsprotein-mRNA undersøkes for hver av de transgene musene ved anvendelse av en RNA-hybridiseringsanalyse i løsning eller ved polymerasekjedereaksjonen. ;Ved anvendelse av den generelle tilnærming som er beskrevet ovenfor, er det blitt fremstilt transgene mus som uttrykker TACI-immunglobulinfusjonsprotein i signifikant nivå i melk. I dette spesielle tilfellet kodet sekvensen som kodet for TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet, for et TACI-polypeptid med delesjon av aminosyrerester 1-19 og 111-154 i SEKV. ID NR.: 2 og en Fc5-immunglobulingruppe. ;Når nå foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet generelt, vil den forstås lettere ved henvisning til de påfølgende eksempler. ;Eksempel 1 ;Konstruksjon av nukleinsyremolekyler som koder for TACI- Fc- proteiner ;Nukleinsyremolekyler som kodet for human-TACI, ble erholdt under ekspresjonskloning av reseptorene for ZTNF4, som beskrevet av Gross et al., Nature, 404:995 (2000). De kodende sekvensene som inngikk i TACI-Fc-ekspresjonskonstruksjonene, ble dannet ved overlappende PCR og anvendelse av standardteknikker (se f.eks. Horton et al., Gene, 77:61 (1989)). Humant TACI-cDNA og Fc-cDNA ble anvendt som utgangstemplater for PCR-amplifiseringene. PCR-primere ble utformet slik at de gav den ønskede kodende sekvens og innførte restriksjonsenzymgjenkjenningsseter i 5'- og 3'-enden for å lette innsetting av de kodende sekvenser i ekspresjonsvektorene. De TACI-Fc-kodende sekvenser ble innsatt i ekspresjonsvektorer som omfattet et funksjonelt dihydrofolatreduktasegen fra mus. Én ekspresjonsvektor inneholdt også en cytomegalovirus-promoterfor å styre ekspresjonen av det rekombinante proteintransgen, et immunglobulinintron, en signalsekvens fra vevsplasminogenaktivator, en intern ribosominngangssekvens, et delert CD8-cistron for overflateseleksjon av transfekterte celler og gjærekspresjon-selementer for dyrking av plasmidet i gjærceller. ;Én tilnærming som ble anvendt for fremstilling av TACI-Fc-fusjonsproteiner, er illustrert ved fremgangsmåten som ble anvendt for konstruksjon av TACI-Fc4. Andre TACI-Fc-fusjonsproteiner ble fremstilt ved å innsette nukleotidsekvenser som kodet for et TACI-Fc-fusjonsprotein i en pattedyrekspresjonsvektor og innføre vektoren i pattedyrceller. ;A. Konstruksjon av Igyl- Fc4- fraament ;For fremstilling av TACI-Fc4-fusjonsproteinet ble Fc-området i humant IgGl (hengselområdet og CH2- og CH3-domenet) modifisert, slik at bindingsfunksjonen til Fcyl-reseptor (FcyRI) og komplement (Clq) ble fjernet. Denne modifiserte versjon av humant IgGl-Fc ble betegnet "Fc4". ;Fc-området ble isolert fra et humant, føtalt leverbibliotek (Clontech) ved PCR og anvendelse av oligonukleotidprimerne 5' ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC ;TCACACATGC CCAC 3' (SEKV. ID NR.: 7) og 5' GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA ;GGGAG 3' (SEKV. ID NR.: 8). Mutasjoner i Fc-området ble innført ved PCR for å redusere FcyRI-bindingen. FcyRI-bindingssetet (Leu-Leu-Gly-Gly, aminosyrerester 38-41 i SEKV. ID NR.: 6, som tilsvarer EU-indeksposisjoner 234-237) ble mutert til Ala-Glu-Gly-Ala for å redusere FcyRI-bindingen (se f.eks. Duncan et al., Nature, 332:563 (1988); Baum et al., EMBO J., 13:3992 (1994)). Oligonukleotidprimerne 5' CCGTGCCCAG CACCTGAAGC ;CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C 3' (SEKV. ID NR.: 9) og 5' GGATTCTAGA ;TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEKV. ID NR.: 10) ble anvendt for innføring av mutasjonen. Til et sluttvolum på 50^1 ble det tilsatt 570 ng IgFc-templat, 5^1 10 x Pfu-reaksjonsbuffer (Stratagene), 8^1 1,25 mM dNTP, 31^1 destillert vann og 2^1 20 mM oligonukleotidprimere. Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 1 minutt. Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene) ble tilsatt, etterfulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder, 72 °C i 1 minutt, etterfulgt av en forlengelsesreaksjon på 7 minutter ved 72 °C. Reaksjonsproduktene ble fraksjonert ved elektroforese, og båndet som tilsvarte den forventede størrelse på ca. 676 basepar ble påvist. Dette bånd ble utskåret fra gelen og gjenvunnet ved anvendelse av et QIAGEN QIAQUICK-gelekstraksjonssett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. ;PCR ble også anvendt for innføring av en mutasjon fra Ala til Ser (aminosyrerest 134 i SEKV. ID NR.: 6, som tilsvarer EU-indeksposisjon 330) og Pro til Ser (aminosyrerest 135 i SEKV. ID NR.: 6, som tilsvarer EU-indeksposisjon 331) for å redusere komplement Clq-binding eller komplementfiksering (Duncan og Winter, Nature, 332:788 ;(1988)). To første rundes reaksjoner ble utført ved anvendelse av IgFc-sekvensen med mutert FcyRI-bindingssete som templat. Til et sluttvolum på 50^1 ble det tilsatt 1^1 IgFc-templat med mutert FcyRI-bindingssete, 5^1 10 x Pfu-reaksjonsbuffer (Stratagene), 8^1 1,25 mM dNTP, 31 t-tl destillert vann, 2^1 20 mM 5' GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCTTCAGACAAAA CTCAC 3' (SEKV. ID NR.: 11), en 5'-primer med start ved nukleotid 36 i SEKV. ID NR.: 5, og 2 fal 20 mM 5' TGGGAGGGCTTTGTTGGA 3' ;(SEKV. ID NR.: 12), en 3'-primer med start ved det komplementære nukleotid til nukleotid 405 i SEKV. ID NR.: 5. Den andre reaksjonen inneholdt 2^1 av 20 mM lagerløsning av hver av oligonukleotidprimerne 5' TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC 3' ;(SEKV. ID NR.. 13), en 5'-primer med start ved nukleotid 388 i SEKV. ID NR.: 5, og 5' ;GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEKV. ;ID NR.: 14), en 3'-primer for innføring av Ala-Ser-mutasjonen, et Xbal-restriksjonssete og et stoppkodon. Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingenene ble oppvarmet til 94 °C i 1 minutt. Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene) ble tilsatt, etterfulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 2 minutter, etterfulgt av en 7 minutters forlengelsesreaksjon ved 72 °C. Reaksjonsproduktene ble fraksjonert ved elektroforese, og bånd som tilsvarte de forventede størrelser på ca. 370 og ca. 395 basepar, ble påvist. Båndene ble kuttet ut fra gelen og ekstrahert ved anvendelse av et QIAGEN QIAQUICK-gelekstraksjonssett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. ;En ny runde med reaksjoner ble utført for å sammenkoble fragmentene ovenfor og addere 5'-6amHI-restriksjonssetet og en signalsekvens fra den humane immunglobulin-JBL-2'CL-tungkjedes variable område (Cogne et al., Eur. J. Immunol., 18: 1485 (1988)). Til et sluttvolum på 50^il ble det tilsatt 30 ^il destillert vann, 8^il 1,25 mM dNTP, 5 fil 10 x Pfu-polymerasereaksjonsbuffer (Stratagene) og 1^1 av hver av de to første PCR-produktene. Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 1 minutt. Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene) ble tilsatt, etterfulgt av 5 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 2 minutter. Temperaturen ble igjen brakt til 94 °C, og 2^1 hver av 20 mM lagerløsninger av 5' ;GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEKV. ;ID NR.: 14), en 5'-primer med start ved nukleotid 1 i SEKV. ID NR.: 5, og 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEKV. ID NR.: 10) ble tilsatt, etterfulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 2 minutter, og en avsluttende forlengelsesreaksjon på 7 minutter ved 72 °C. Et uttak av reaksjonsblandingen ble visualisert ved anvendelse av gelelektroforese. Et bånd på 789 basepar som tilsvarer den forventede størrelse, ble påvist. ;B. TACI- Fc4- ekspresionsvektorkonstruksion ;Ekspresjonsplasmider som omfattet et kodende område for TACI-Fc4-fusjonsprotein, ble konstruert ved homolog rekombinasjon i gjær. Et fragment av TACI-cDNA som omfattet polynukleotidsekvensen fra nukleotid 14 til nukleotid 475 i SEKV. ID NR.: 1, ble isolert ved PCR. De to primerne som ble anvendt ved fremstilling av TACI-fragmentet, var: (1) en primer som inneholdt 40 basepar fra den 5' flankerende sekvens i vektoren og 17 basepar som tilsvarer aminoenden av TACI-fragmentet (5' CTCAGCCAGG ;AAATCCATGC CGAGTTGAGA CGCTTCCGTA GAATGAGTGG CCTGGGCCG 3', SEKV. ID NR.: ;15); (2) 40 basepar av 3'-enden som tilsvarer den flankerende Fc4-sekvens og 17 basepar tilsvarer karboksylenden av TACI-fragmentet (5' GCATGTGTGA GTTTTGTCTG AAGATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG 3', SEKV. ID NR.: 16). Til et sluttvolum på 100^1 ble det tilsatt 10 ng TACI-templat, 10^1 10 x Taq-polymerasereaksjonsbuffer (Perkin Eimer), 8^1 2,5 nM dNTP, 78 \ i\ destillert vann, 2^1 av hver av 20 mM lagerløsning av oligonukleotidprimerne og Taq-polymerase (2,5 enheter, Life Technology). Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 2 minutter, etterfulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 65 °C i 30 sekunder, 65 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt, etterfulgt av en 5 minutters forlengelsesreaksjon ved 72 °C. ;Fragmentet som inneholdt cDNA som koder for Fc4-fragmentet, ble konstruert på tilsvarende måte. De to primerne som ble anvendt for fremstilling av Fc4-fragmentet, var (oppstrøms og nedstrøms) en oligonukleotidprimer som inneholdt 40 basepar av den 5'-TACI-flankerende sekvens og 17 basepar som tilsvarer aminoenden av Fc4-fragmentet (5' ;GCACAGAGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCT CCCGGGGCTG AAGGAGCCCA GATCTTCAGA 3', ;SEKV. ID NR.: 17) og en oligonukleotidprimer som inneholdt 40 basepar av 3'-enden som tilsvarer den flankerende vektorsekvens og 17 basepar som tilsvarer karboksylenden av Fc4-fragmentet (5' GGGGTGGGTA CAACCCCAGA GCTGTTTTAA TCTAGATTAT TTACCCGGAG ACAGGG 3', SEKV. ID NR.: 18). Til et sluttvolum på 100 ^1 ble det tilsatt 10 ng Fc4-templat som beskrevet ovenfor, 10^1 10 x Taq-polymerasereaksjonsbuffer (Perkin Eimer), 8^1 2,5 nM dNTP, 78^1 destillert vann, 2^1 av 20 mM lagerløsninger av de to oligonukleotidene og Taq-polymerase (2,5 enheter, Life Technology). Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 2 minutter, etterfulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 65 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt, etterfulgt av en 5 minutters forlengelsesreaksjon ved 72 °C. 10 \ i\ av hver av PCR-reaksjonene på 100^1 beskrevet ovenfor ble fraksjonert i en 0,8 % LMP-agarosegel (Seaplaque GTG) med 1 x TBE-buffer for analyse. De gjenværende 90^1 av hver PCR-reaksjon ble utfelt ved tilsetning av 5^1 1 M natriumklorid og 250 \ i\ absolutt etanol. Plasmid pZMP6 ble kuttet med Smal for linearisering i polylinkeren. Plasmid pZMP6 ble avledet fra plasmid pCZR199 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC nr. 98668) og er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett med den umiddelbart tidlige promoter fra cytomegalovirus, et konsensusintron fra det variable området i immunglobulintungkjedelokus fra mus, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser, et stoppkodon og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et E. co//'-replikasjonsorigo, en pattedyrseleksjonsmarkørekspresjonsenhet med en SV40-promoter, enhancerog replikasjonsorigo, et dihydrofolatreduktasegen og SV40-terminatoren. Vektoren pZMP6 ble konstruert fra pCZR199 ved å erstatte metallotioneinpromoteren med den umiddelbart tidlige promoter fra cytomegalovirus og Kozac-sekvensene i 5'-enden av den åpne leseramme. ;100 \ i\ kompetente gjærceller (S. cerevisiae) ble blandet med 10^1 inneholdende ca. 1^g av det ekstracellulære TACI-domenet og Fc4-PCR-fragmentene og 100 ng Smal-kuttet pZMP6-vektor og overført til en 0,2 cm elektroporeringskyvette. Blandingen av gjær og DNA ble elektropulset ved 0,75 kV (5 kV/cm), » ohm, 25^F. Hver ;kyvette ble tilsatt 600^1 1,2 M sorbitol, og gjærcellene ble utstrøket i to porsjoner på 300^1 på URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C. ;Etter ca. 48 timer ble Ura<+->gjærtransformantene fra en enkelt skål resuspendert i 1 ml vann og sentrifugert i kort tid for nedsentrifugering av gjærcellene. Nedsentrifugerte celler ble resuspendert i 1 ml lyseringsbuffer (2 % Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCI, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 ^il lyseringsblanding ble overført til et Eppendorf-rør inneholdende 300^1 syrevaskede glasskuler og 200^1 fenol-kloroform og vorteksbehandlet to eller tre ganger med 1 minutts mellomrom, etterfulgt av 5 minutters sentrifugering i en Eppendorf-sentrifuge ved maksimal hastighet. 300^1 av vannfasen ble overført til et nytt rør, og DNA ble utfelt med 600^1 etanol, etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble resuspendert i 100^1 vann. ;Transformasjon av elektrokompetente E. co//'-celler (DH10B, GibcoBRL) ble utført med 0,5-2 ml gjær-DNA-preparat og 40^1 DHlOB-celler. Cellene ble elektropulset ved 2,0 kV, 25 mF og 400 ohm. Etter elektroporeringen ble 1 ml SOC (2 % Bacto-Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5 % gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI2, 10 mM MgS04, 20 mM glukose) utsådd i porsjoner på 250^1 på fire LB-AMP-skåler (LB-medium) (Lennox), 1,8 % Bacto-Agar (Difco), 100 mg/l ampicillin. ;Enkeltkloner som inneholdt den korrekte ekspresjonskonstruksjon for TACI-Fc4, ble påvist ved restriksjonskutting for å bekrefte nærvær av innskuddet og for å bekrefte at de forskjellige DNA-sekvensene var sammenkoblet på korrekt måte. Innskuddet fra positive kloner ble analysert ved sekvensering. Plasmid-DNA i større skala isoleres ved anvendelse av settet Qiagen Maxi (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. ;C. Konstruksjon av Fc5, Fc6 og Fc7 ;I Fc5 ble Arg-resten i EU-indeksposisjon 218 endret tilbake til en Lys-rest. Humant villtype-Igyl inneholder lysin i denne posisjonen. Kort beskrevet ble nukleinsyremolekyler som kodet for Fc5, fremstilt ved anvendelse av oligonukleotidprimerne ;5' GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCA 3' (SEKV. ID NR.: 19) og 5' ;TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEKV. ID NR.: 20). Betingelsene for PCR-amplifiseringen var som følger. Til et sluttvolum på 50^1 ble det tilsatt 236 ng Fc4-templat, 5^1 10 x Pfu-reaksjonsbuffer (Stratagene), 4^1 2,5 mM dNTP, 1^1 av 20 mM av hvert oligonukleotid og 1^1 Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene). Temperaturprofilen for amplifiseringen bestod av 94 °C i 2 minutter, 5 sykluser bestående av 94 °C i 15 sekunder, 42 °C i 20 sekunder og 72 °C i 45 sekunder, 20 sykluser bestående av 94 °C i 15 sekunder og 72 °C i 1 minutt 20 sekunder, etterfulgt av en 7 minutters forlengelsesreaksjon ved 72 °C. Reaksjonsproduktet ble fraksjonert ved agarosegelelektroforese, og båndet som tilsvarte den forventede størrelse på ca. 718 basepar ble påvist. Båndet ble kuttet ut fra gelen og gjenvunnet ved anvendelse av et QIAGEN QIAQUICK-gelekstraksjonssett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. ;Fc6 er identisk med Fc5, bortsett fra at det karboksylterminale lysinkodon er fjernet. Som i Fc4 og Fc5 ovenfor ble stoppkodonet i Fc6-sekvensen endret til TAA. Fc6 ble frembrakt fra templat-DNA som kodet for Fc5 ved anvendelse av oligonukleotidprimerne ;5' GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA 3' (SEKV. ID NR.: 19) og 5' GGCGCGCCTC TAGATTAACC CGGAGACAGG GAGAGGC 3' (SEKV. ID NR.: 21). ;Fc7 er identisk med villtype-yl-Fc, bortsett fra en aminosyresubstitusjon i EU-indeksposisjon Asn 297 som er lokalisert i CH2-domenet. Asn 297 ble mutert til en Gln-rest for å forhindre tilkobling av N-koblet karbohydrat i denne posisjonen. Som ovenfor var stoppkodonet i Fc7-sekvensen endret til TAA. Fc7 ble frembrakt ved overlapps-PCR og anvendelse av humant villtype-IgGyl-Fc-cDNA som templat og oligonukleotidprimerne ;5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' (SEKV. ID NR.: 22) og 5' GTACGTGCTTTGG-TACTGCTCCTCCCGCGGCTT 3' (SEKV. ID NR.: 23) for frembringelse av den 5' halvpart av Fc7, og oligonukleotidprimerne 5' CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA 3' (SEKV. ID NR.: 24) og 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEKV. ID NR.: 20) for dannelse av den 3' halvpart av Fc7. De to PCR-produktene ble sammenblandet og amplifi-sert ved anvendelse av oligonukleotidprimerne 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' ;(SEKV. ID NR.: 22) og 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEKV. ID ;NR.: 20). ;Alle de resulterende PCR-produkter ble renset fra gel, klonet og bekreftet ved DNA-sekvensanalyse. ;D. Konstruksjon av aminoavkortede TACI- Fc- fusjonsproteiner ;Fire aminoterminalt avkortede versjoner av TACI-Fc ble fremstilt. Alle fire hadde en modifisert signalsekvens fra human vevsplasminogenaktivator (SEKV. ID NR.: 25) fusjonert til aminosyrerest nr. 30 i SEKV. ID NR.: 2. De fire proteinene avvek imidlertid fra hverandre når det gjaldt lokalisasjonen av punktet i hvilket Fc5 var fusjonert til TACI-aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.: 2. Tabell 3 gir en oversikt over strukturen til de fire fusjonsproteinene. ; Proteinkodende ekspresjonskassetter ble fremstilt ved overlapps-PCR og anvendelse av standardteknikker (se f.eks. Horton et al., Gene, 77:61 (1989)). Et nukleinsyremolekyl som kodet for TACI og et nukleinsyremolekyl som kodet for Fc5, ble anvendt som PCR-templater. Oligonukleotidprimerne er beskrevet i tabellene 4 og 5. ; Den første runde med PCR-amplifiseringer bestod av to reaksjoner for hver av de fire aminoterminalt avkortede versjoner. De to reaksjonene ble utført separat ved anvendelse av det 5' og det 3' TACI-oligonukleotid i én reaksjon og det 5' og det 3' Fc5-oligonukleotid i en annen reaksjons for hver versjon. Betingelsene for første runde med PCR-amplifiseringer var som følger. Til et sluttvolum på 25^1 ble det tilsatt ca. 200 ng templat-DNA, 2,5^1 10 x Pfu-reaksjonsbuffer (Stratagene), 2^1 2,5 mM dNTP, 0,5^1 av en 20 \ iM løsning av det 5' og det 3' oligonukleotid og 0,5^1 Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene). Temperaturprofilen for amplifiseringen bestod av 94 °C i 3 minutter, 35 sykluser bestående av 94 °C i 15 sekunder, 50 °C i 15 sekunder og 72 °C i 2 minutter, etterfulgt av en 2 minutters forlengelsesreaksjon ved 72 °C. Reaksjonsproduktene ble fraksjonert ved agarosegelelektroforese, og båndene som tilsvarte de forventede størrelser ble kuttet ut fra gelen og gjenvunnet ved anvendelse av et QIAGEN QIAQUICK-gelekstraksjonssett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. ;Den andre runden med PCR-amplifisering eller overlapps-PCR-amplifiseringsreaksjoner ble utført ved anvendelse av de gelrensede fragmenter fra første rundes PCR so DNA-templat. Betingelsene i den andre runde med PCR-amplifisering var som følger. Til et sluttvolum på 25^1 ble det tilsatt ca. 10 ng templat-DNA av TACI-fragmentet og Fc5-fragmentet, 2,5^1 10 x Pfu-reaksjonsbuffer (Stratagene), 2^1 2,5 mM dNTP, 0,5 fil av 20 \ iM av hver av ZC24,903 (SEKV. ID NR.: 40) og ZC24,946 (SEKV. ID NR.: 20) og 0,5^1 Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene). Temperaturprofilen for amplifiseringen bestod av 94 °C i 1 minutt, 35 sykluser bestående av 94 °C i 15 sekunder, 55 °C i 15 sekunder og 72 °C i 2 minutter, etterfulgt av en 2 minutters forlengelsesreaksjon ved 72 °C. Reaksjonsproduktene ble fraksjonert ved agarosegelelektroforese, og båndene som tilsvarte de forventede størrelser, ble kuttet ut fra gelen og gjenvunnet ved anvendelse av et QIAGEN QIAQUICK-gelekstraksjonssett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. ;Hver av de fire versjonene av aminoterminalt avkortet TACI-Fc-PCR-produkt ble klonet separat ved anvendelse av Invitrogens ZEROBLUNT TOPO PCR-kloningssett ifølge produsentens anbefalte fremgangsmåte. Tabell 6 identifiserer nukleotidsekvensen og aminosyresekvensen av disse TACI-Fc-konstruksjonene. ; Etter at nukleotidsekvensene var bekreftet, ble plasmider som omfattet hver av de fire versjonene av aminoterminalt avkortet TACI-Fc-fusionsprotein, kuttet med Fsel og Ascl for å frigi de aminosyrekodende segmenter. FseI->AscI-fragmentene ble ligert inn i en pattedyrekspresjonsvektor som inneholdt en CMV-promoter og et SV40-poly-A-segment. Ekspresjonsvektorene ble innført i kinesisk hamsterovarieceller, som beskrevet nedenfor. ;Eksempel 2 ;Fremstilling av TACT- Fc- proteiner i kinesisk hamsterovarieceller ;TACI-Fc-ekspresjonskonstruksjonene ble anvendt for transfeksjon via ;elektroporering av suspensjonsadapterte kinesisk hamsterovarie(CHO)-DG44-celler dyrket i medium fritt for dyreprotein (Urlaub et al., Som. Cell. Molec. Genet., 12:555 (1986)). CHO-DG44-celler mangler et funksjonelt dihydrofolatreduktasegen grunnet delesjon av begge de kromosomale lokalisasjoner for dihydrofolatreduktase. Dyrking av cellene i nærvær av økende konsentrasjoner av metotreksat fører til amplifisering av dihydrofolatreduktasegenet og det tilkoblede gen som koder for rekombinant protein i ekspresjonskonstruksjonen. ;CHO-DG44-celler ble passert i PFCHO-medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 4 mM L-glutamin (JRH Biosciences) med 1 x hypoksantin-tymidinsupplement (Life Technologies), og cellene ble inkubert ved 37 °C og 5 % C02i Corning-ristekolber ved ;120 rpm på en roterende risteplattform. Cellene ble transfektert separat med lineariserte ekspresjonsplasmider. For å sikre steriliteten ble ett enkelt etanolutfellingstrinn utført på is i 25 minutter ved å blande 200^g plasmid-DNA i et Eppendorf-rør med 20^1 fragmentert laksemelkebærer-DNA (5' -> 3' Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml), 22^1 3 M NaOAc (pH 5,2) og 484 \ i\ 100 % etanol (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA). Etter inkubasjonen ble røret sentrifugert ved 14 000 rpm i en mikrosentrifuge plassert i et kjølerom ved 4 °C, og supernatanten ble fjernet og nedsentrifugert materiale vasket to ganger med 0,5 ml 70 % etanol og lufttørket. ;CHO-DG44-cellene ble forberedt mens nedsentrifugert DNA ble tørket ved å sentrifugere i alt IO<6>celler (16,5 ml) i et 25 ml konisk sentrifugerør ved 900 rpm i 5 minutter. CHO-DG44-cellene ble resuspendert i et totalvolum på 300^1 av PFCHO-dyrkingsmedium og plassert i en genpulserkyvette med 0,4 cm elektrodeavstand (Bio-Rad). Etter ca. 50 minutters tørking ble DNA resuspendert i 500^1 PFCHO-dyrkingsmedium og tilsatt til cellene i kyvetten slik at totalvolumet ikke overskred 800 ul, og kyvetten ble inkubert ved romtemperatur i 5 minutter for å redusere bobledannelsen. Kyvetten ble plassert i en BioRad genpulser II-enhet innstilt på 0,296 kV (kilovolt) og 0,950 HC (høy kapasitet) og elektroporert umiddelbart. ;Cellene ble inkubert i 5 minutter ved romtemperatur før overføring til 20 ml totalvolum av PFCHO-medium i en CoStar T-75-flaske. Flasken ble plassert ved 37 °C og 5 % C02i 48 timer, hvoretter cellene ble talt i et hemocytometer ved anvendelse av trypanblåeksklusjon og overført til PFCHO-seleksjonsmedium uten hypoksantin-tymidinsupplement inneholdende 200 mM metotreksat (Calbiochem). ;Etter gjenvinning fra metotreksatseleksjonsprosessen ble det kondisjonerte medium som inneholdt utskilte TACI-Fc-proteiner, analysert ved Western-blotting. ;Eksempel 3 ;Strukturanalyse av TACI- Fc- proteiner ;I visse tilfeller ble TACI-Fc-fusjonsproteinene delvis renset før analysen. Kondisjonert medium fra kinesisk hamsterovariekulturer ble sterilfiltrert gjennom et 0,22 \ im filter, og TACI-Fc-protein ble innfanget på en protein A-kolonne. Det protein A-bundne materialet ble eluert og sendt gjennom en S-200-størrelseseksklusjonskolonne for endelig rensing. ;Western blot-analyse ble utført på både kondisjonert cellemedium og renset protein for å anslå den strukturelle stabilitet av TACI-Fc-proteinene. Kort beskrevet ble protein eller supernatantprøver overført til nitrocellulosemembraner, og TACI-Fc-proteinene ble påvist ved anvendelse av peroksidasekonjugert antimuse-IgG2a fra geit (Boehringer Mannheim) eller peroksidasekonjugert antihumant IgG-Fc-geiteantiserum (Pierce). ;Aminoterminal aminosyresekvensanalyse ble utført i modell 476A og modell 494 proteinsekvenseringssystemer fra Perkin Eimer Applied Biosystems Division (Foster City, CA). Dataanalysen ble utført med Applied Biosystems modell 610A dataanalysesystem for proteinsekvensering, versjon 2.1a (Applied Biosystems, Inc.). De fleste anvendte artikler og reagenser var fra Applied Biosystems, Inc. ;Eksempel 4 ;Funksjonell analyse av TACI- Fc- proteiner ;To tilnærminger ble anvendt for å undersøke bindingsegenskapene for fire TACI-Fc-proteiner overfor ZTNF4. Én tilnærming målte TACI-Fc-konstruksjonenes evne til å konkurrere med TACI-belagte plater for binding av<125>I-merket ZTNF4. I den andre tilnærmingen ble økende konsentrasjoner av<125>I-merket ZTNF4 inkubert med hver av TACI-Fc-konstruksjonene, og radioaktiviteten forbundet med utfelte ZTNF4-TACI-Fc-komplekser ble bestemt. TACI-Fc-fusjonsproteinene hadde TACI-grupper som manglet de første 29 aminosyrerestene i aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.: 2. Ett av fusjonsproteinene hadde en TACI-gruppe med intakt stilkområde (TACI(dl-29)-Fc5), mens tre av TACI-Fc-fusjonsproteinene hadde TACI-grupper med forskjellige delesjoner i stilkområdet (TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5; TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5; TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5). ;A. Kompetitiv bindinasanalvse ;ZTNF4 ble merket med radioaktivt jod med "Iodobeads" (Pierce) ifølge standardfremgangsmåter. Kort beskrevet ble 50^g ZTNF4 jodert med 4 mCi<125>I ved anvendelse av en enkelt "Iodobead". Reaksjonen ble stanset med en 0,25 % løsning av bovint serumalbumin, og fritt<125>I ble fjernet ved gelfiltrering gjennom en PD-10-kolonne (Pierce). Den spesifikke radioaktivitet av<125>I-ZTNF4-preparatene ble bestemt ved utfelling med trikloreddiksyre før og etter avsaltingstrinnet. ;Et N-terminalt fragment av TACI-reseptoren betegnet "TACI-N" ble tilsatt til 96-brønners plater (100^1 med 0,1 \ ig/ m\), og inkubert over natten ved 4 °C. Platene ble vasket, blokkert med Superblock (Pierce) og vasket igjen. TACI-Fc-konstruksjonene i forskjellige konsentrasjoner fra 0 til 11,5 ng/ml ble blandet med en fast konsentrasjon av<125>I-ZTNF (20 ng/ml) og inkubert i 2 timer ved 37 °C på platen belagt med TACI-N. Kontrollene inneholdt enten TACI-N i løsning eller manglet TACI-Fc. Etter inkuberingen ble platene vasket og radioaktiviteten målt. Hver bestemmelse ble utført i triplikat. ;Resultatene viste at alle TACI-Fc-konstruksjoner inhiberte binding av<1>25I-ZTNF4 fullstendig i konsentrasjoner på ca. 100 ng/ml eller høyere. TACI-Fc-proteinene TACI(dl-29)-Fc5, TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 og TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 var mer effektive inhibitorer enn TACI-Fc-konstruksjonen TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5. Et Fc-fragment alene inhiberte ikke bindingen. IC50-verdier ble beregnet for hver konstruksjon i tre eksperimenter. Gjennomsnittsverdiene for konstruksjonene var: TACI(dl-29)-Fc5: 2,07 nM; TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5: 4,95 nM; TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5: 2,31 nM; og TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5: 2,21 nM. ;B. Bindinasanalvse i løsnin<g>;Ved en konsentrasjon på 0,05 nM ble hver TACI-Fc-konstruksjon inkubert med 0,4 pM til 1,5 nM 125J<->ZTNF4 i 30 minutter ved romtemperatur i et totalvolum på 0,25 ml/rør. En Pansorbin(Staph A)-suspensjon ble tilsatt til hvert rør, og etter 15 minutter ble prøvene sentrifugert og vasket to ganger, og radioaktiviteten i nedsentrifugert materiale ble målt. Ikke-spesifikk binding ble bestemt ved tilsetning av 130 nM umerket ZTNF4 til<125>I-ZTNF4/TACI-Fc-blandingen. Spesifikk binding ble beregnet ved å subtrahere cpm bundet i nærvær av umerket ZTNF4 fra total-cpm bundet for hver konsentrasjon av<125>I-ZTNF4. Hver bestemmelse ble utført i triplikat. Bindingskonstanter ble beregnet ved anvendelse av programvaren GraphPad Prism (Macintosh v. 3.0). ;Figur 4 viser den spesifikke binding av<125>I-ZTNF4 til de forskjellige TACI-Fc-konstruksjonene. Bindingen så ut til å nå metning for hver konstruksjon og var signifikant høyere for konstruksjonene TACI(dl-29)-Fc5, TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5, ;TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 enn for TACI(d 1-29, dl07-154)-Fc5. Bmaks- og Kd-verdier ble beregnet, og resultatene er oppsummert i tabell 7. ; Eksempel 5 ;Måling av ZTNF4 i sirkulasjonen ;Nivået av ZTNF4 i individer med en sykdomstilstand (som SLE, f.eks. reumatoid artritt) relativt til normale individer ble bestemt ved anvendelse av en elektrokjemiluminescensanalyse. En standardkurve fremstilt fra løselig humant ZTNF4 ved 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml og 0 ng/ml ble fremstilt i ORIGIN-buffer (Igen, Gaithersburg, MD). Serumprøvene ble fortynnet med ORIGIN-buffer. Standarder og prøver ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer med biotinylert antihumant ZTNF4-NF-BV-antistoff fra kanin, fortynnet til 1 \ ig/ m\ i Origin-analysebuffer (IGEN), og ruthenylert polyklonalt, antihumant ZTNF4-NF-BV-antistoff fra kanin, fortynnet til 1 \ ig/ m\ i Origin-analysebuffer (IGEN). Etter inkubasjonen ble prøvene vorteksbehandlet, og 0,4 mg/ml streptavidin-"Dynabeads" (Dynal, Oslo, Norge) ble tilsatt til alle standarder og prøver med 50 \ i\/ rør og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble så vorteksbehandlet, og prøvene ble avlest i en Origin-analysator (Igen) ifølge produsentens instruksjoner. Origin-analysen er basert på elektrokjemiluminescens og gir en avlesning i ECL. I én undersøkelse ble et forhøyet nivå av ZTNF4 påvist i serumprøver både fra NZBWF1/J- og MRL/Mpj-Fas<lpr->mus som hadde utviklet fremskredne stadier av glomerulonefritt og autoimmun sykdom. ;ORIGIN-analysen ble også anvendt for å måle nivået av ZTNF4 i blodet hos SLE-pasienter relativt til nivået i sirkulasjonen hos normale individer. En standardkurve fremstilt fra løselig humant ZTNF4 ved 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml og 0 ng/ml ble fremstilt i ORIGIN-buffer (Igen). Alle pasientprøver ble analysert i triplikat med et sluttvolum på 25 ul. Standarder og prøver ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer med et innfangingsantistoff, biotinylert polyklonalt, antihumant ZTNF4-NF-BV-antistoff fra kanin, fortynnet til 1 \ ig/ m\ i Origin-analysebuffer (IGEN), og et påvisningsantistoff, ruthenylert polyklonalt, antihumant ZTNF4-NF-BV-antistoff fra kanin, fortynnet til 1 \ ig/ m\ i Origin-analysebuffer (IGEN). Etter inkubasjonen ble prøvene vorteksbehandlet, og 0,4 mg/ml streptavidin-"Dynabeads" (Dynal) ble tilsatt til standarder og prøver med 50 \ i\/ rør og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble så vorteksbehandlet og analysert ved anvendelse av en Origin 1.5-analysator (Igen) ifølge produsentens instruksjoner. ;Denne analysen omfattet 28 normale kontrollprøver og prøver fra 20 pasienter med SLE-diagnose. Forhøyet nivå av ZTNF4 ble observert i serum fra pasienter med SLE-diagnose, sammenlignet med normale kontrollserumdonorer. ZTNF4-nivået ble beregnet som antall gangers økning av ZTNF4-nivået i pasientprøve eller kontrollprøve, sammenlignet med en tilfeldig utvalgt human referanseserumprøve. Gjennomsnittet for de 28 kontrollprøvene var 1,36 ganger over den humane referanseprøve, mens gjennomsnittet for de 20 SLE-pasientprøvene var 4,92. Sju av de 20 SLE-pasientene hadde et ZTNF4-nivå som var to ganger over gjennomsnittet for kontrollprøvene, mens kun ett kontrollindivid hadde et nivå som var mer enn to ganger gjennomsnittsnivået i kontrollprøvene. *

Claims

1. Transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklofilinligand-interaktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein,karakterisert vedat TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

2. Fusjonsprotein ifølge krav 1, hvor immunglobulingruppen omfatter et konstant område.

3. Fusjonsprotein ifølge krav 2, hvor TACI-reseptorgruppen består av aminosyrerester 34 til 104 i SEKV. ID. NR. : 2, og hvor fusjonsproteinet omfatter videre et stilkområde som består av en kontinuerlig serie av 2 til 50 påfølgende aminosyrerester med start fra aminosyrerest 105 i SEKV. ID. NR. : 2.

4. Fusjonsprotein ifølge krav 2 eller 3, hvor immunglobulingruppen omfatter et tungkjede-konstant del domene.

5. Fusjonsprotein ifølge krav 4, hvor immunglobulingruppen omfatter et humant tungkjede-konstant del domene.

6. Fusjonsprotein ifølge krav 5, hvor tungkjedens konstant del er et IgGl-tungkjede konstant del domene.

7. Fusjonsprotein ifølge krav 6, hvor immunglobulingruppen er et IgGl-Fc-fragment som omfatter CH2og CH3domenene.

8. Fusjonsprotein ifølge krav 7, hvor immunglobulingruppen er et IgGl-Fc-fragment som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. : 33.

9. Fusjonsprotein ifølge krav 2, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet har en aminosyresekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. : 54.

10. Fusjonsprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 2-9, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet er en dimer.

11. Fusjonsprotein ifølge krav 1, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet består av eller omfatter en utskilt form av hvilket som helst av SEKV. ID. NR. : 50, 52, 54 eller 56.

12. Fusjonsproteinet ifølge krav 11, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet består av eller omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 50, 52, 54 eller 56, hvor den optimerte tPA (otPA) ledersekvens (SEQ ID NO: 25) har blitt fjernet.

13. Nukleinsyremolekyl, karakterisert vedat det koder for et fusjonsprotein som det et beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1, 11 og 12.

14. Nukleinsyremolekyl, karakterisert vedat det koder for et fusjonsprotein som det et beskrevet i et hvilket som helst av kravene 2-10.

15. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 14, hvor nukleinsyremolekylet har en nukleotidsekvens som omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEKV. ID. NR. : 53.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklofilinligand-interaktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å uttrykke en nukleinsyresekvens som omfatteren nukleinsyresekvens som koder for fusjonsproteinet hvor fusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet består av eller omfatter et TACI-Fc-fusjonsprotein.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, hvor TACI-Fc-fusjonsproteinet er et humant immunoglobulin Fc-fusjonsprotein.

19. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 16-18, hvor immunglobulingruppen består av disulfid-bundet-immunoglobulin tungkjede hengseldel og CH2og CH3domenene.

20. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 16-18, hvor immunglobulingruppen er en IgGl-Fc-f immunglobulingruppe.

21. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 16-18, hvor immunoglobulingruppen består av eller omfatter en Fc-immunoglobulingruppe valgt fra gruppen bestående av Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 eller Fc8; fortrinnsvis hvor immunoglobulindelen består eller omfatter en Fc5 immunoglobulindel.

22. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 16-21, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet består av eller omfatter en utskilt form av hvilket som helst av SEKV. ID. NR. : 50, 52, 54 eller 56.

23. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 16-21, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet består av eller omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 50, 52, 54 eller 56, hvor den optimerte tPA (otPA) ledersekvens (SEQ ID NO: 25) har blitt fjernet.

24. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 16-23, hvor fremgangsmåten omfatter å uttrykke nukleinsyresekvensen som koder for fusjonsproteinet i en vertscelle, fortrinnsvis hvor vertscellen er en kinesisk hamsterovarie-celle

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, hvor den kinesiske hamsterovarie-cellen mangler et fungerende dihydrofolat-reduktase gen.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 24 eller krav 25, hvor nukleotidsekvensen som koder for TACI-immunoglobulin-fusjonsproteinet blir transfektert inn i vertscellen i form av en ekspresjonsvektor.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, hvor ekspresjonsvektoren omfatter et ekspresjonsplasmid; fortrinnsvis hvor ekspresjonsplasmidet omfatter en CMV-promoter og et SV40 poly A-segmentet.

28. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 24-27, hvor veksten av vertscellene i nærvær av økte konsentrasjoner av metotreksat resulterer i amplifikasjon av dihydrofolat-reduktase-genet, og den koblede nukleotid-sekvensen som koder for TACI-immunoglobulin-fusjonsproteinet.

29. Anvendelse av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklo-filinligandinteraktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av systemisk lupus erythematosus, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

30. Anvendelse av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklo-filinligandinteraktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for inhibering av proliferasjon av tumorceller, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

31. Anvendelse ifølge krav 30, for inhibering av proliferasjon av B-lymfocytter i et pattedyr individ.

32. Anvendelse av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklo-filinligandinteraktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av myasthenia gravis, insulinavhengig diabetes mellitus, Crohns sykdom, juvenil reumatoid artritt med polyartikulært forløp eller psoriatisk artritt, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

33. Anvendelse av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklo-filinligandinteraktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av reumatoid artritt, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

34. Anvendelse av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklo-filinligandinteraktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom eller forstyrrelse forbundet med immunsuppresjon, transplantatrejeksjon, "graft versus host"-sykdom, inflammasjon, leddsmerter, opphovning, anemi og septisk sjokk, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

35. Anvendelse av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklo-filinligandinteraktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av en forstyrrelse valgt fra gruppen som består av neoplasme, kronisk lymfocyttisk leukemi, multippelt myelom, non-Hodgkins lymfom, lymfoproliferativ sykdom etter transplantasjoner og lettkjedegammopati, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

36. Anvendelse av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklo-filinligandinteraktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av astma, bronkitt eller emfysem, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

37. Anvendelse av en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklo-filinligandinteraktør(TACI)immunglobulin-fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av nyresykdom, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet omfatter: (a) en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og en syklofilin-ligandinteraktør(TACI)reseptorgruppe, hvor TACI-reseptorgruppen består av en aminosyresekvensen valgt fra gruppen bestående av: (i) aminosyrerester 34-104 i SEKV. ID. NR. : 2, (ii) aminosyrerester 30-110 i SEKV. ID. NR. : 2, og (iii) aminosyrerester 30-154 i SEKV. ID. NR. : 2, hvor TACI-reseptorgruppen binder minst én av ZTNF2 og ZTNF4, og (b) en immunglobulingruppe.

38. Anvendelse ifølge krav 37, hvor nyresykdommen er valgt fra gruppen bestående av nyresvikt i sluttstadiet, glomerulonefritt, vaskulitt, nefritt, amyloidose og pyelonefritt.

39. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-38, hvo immunglobulingruppen omfatter en konstant del domene av et immunoglobulin.

40. Anvendelse ifølge krav 39, hvor medikamentet omfatter TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, og hvor det farmasøytiske preparatet er for administrasjon til et pattedyr individ.

41. Anvendelse ifølge krav 39,karakterisert vedat den TACI-reseptorgruppen består av aminosyrerester 34 til 104 i SEKV. ID. NR. : 2, og hvor fusjonsproteinet omfatter videre et stilkområde som består av en kontinuerlig serie av 2 til 50 påfølgende aminosyrerester med start fra aminosyrerest 105 i SEKV. ID. NR. : 2.

42. Anvendelse ifølge krav 39, hvor immunglobulingruppen omfatter et tungkjede-konstant del domene.

43. Anvendelse ifølge krav 42, hvor immunglobulingruppen omfatter et humant tungkjede-konstant del domene.

44. Anvendelse ifølge krav 43, hvor tungkjedens konstant del er et IgGl-tungkjede konstant del domene.

45. Anvendelse ifølge krav 44, hvor immunglobulingruppen er et IgGl-Fc-fragment som omfatter CH2og CH3domenene.

46. Anvendelse ifølge krav 45, hvor immunglobulingruppen er et IgGl-Fc-fragment som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. : 33.

47. Anvendelse ifølge krav 44, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet har en aminosyresekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. : 54.

48. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-39, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet består av eller omfatter et TACI-Fc-fusjonsprotein; fortinnsvis hvor TACI-Fc-fusjonsproteinet er et humant immunoglobulin Fc-fusjonsprotein.

49. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-39 eller 48, hvor immunglobulingruppen består av disulfid-bundet-immunoglobulin tungkjede hengseldel og CH2og CH3domenene.

50. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-39 eller 48-49, hvor immunglobulingruppen er en IgGl-Fc-f immunglobulingruppe.

51. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-39 eller 48-50, hvor immunoglobulingruppen består av eller omfatter en Fc-immunoglobulingruppe valgt fra gruppen bestående av Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 eller Fc8; fortrinnsvis hvor immunoglobulindelen består eller omfatter en Fc5 immunoglobulindel.

52. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-39 eller 48-51, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet består av eller omfatter en utskilt form av hvilket som helst av SEKV. ID. NR. : 50, 52, 54 eller 56.

53. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-39 eller 48-52, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet består av eller omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR: 50, 52, 54 eller 56, hvor den optimerte tPA (otPA) ledersekvens (SEQ ID NO: 25) har blitt fjernet.

54. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-53, hvor TACI-immunglobulin-fusjonsproteinet er en dimer.

55. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-39 eller 41-54, hvor preparatet er til administrasjon til celler som dyrkes in vitro.

56. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 29-54, hvor administrasjonen er til et pattedyr individ.

57. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter et farmasøytisk aksepterbart bærestoff og en transmembranaktivator og en kalsiummodulator og et syklofilinligandinteraktør(TACI)-immunglobulin-fusjonsprotein, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet har en aminosyresekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. : 54.

58. Farmasøytisk preparat ifølge krav 57, hvor TACI-immunglobulinfusjonsproteinet er en dimer.