EA006108B1 - Способы стимуляции и ингибирования роста в-клеток, продуцирования иммуноглобулинов и коррекции нарушений, связанных с baff-лигандом, у животного - Google Patents

Abstract

Данное изобретение связано со способами стимуляции и ингибирования роста В-клеток и со способами лечения или предупреждения нарушений, связанных с экспрессией BAFF-лиганда, с применением BAFF-лиганда и его активных фрагментов и антител, специфичных в отношении BAFF-лиганда.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к применению лиганда, ΒΆΡΈ-β-клеток активирующего фактора, принадлежащего к семейству факторов некроза опухолей, и его блокирующих агентов либо для стимуляции, либо для ингибирования экспрессии В-клеток и иммуноглобулинов. Этот белок и его рецептор могут иметь противораковые и/или иммунорегуляторные применения, а также применения для лечения нарушений иммуносупрессии, таких как ВИЧ. Конкретно, этот лиганд и блокирующие его агенты могут играть роль в развитии гипертонии и родственных ей нарушений. Кроме того, клетки, трансфицированные геном этого лиганда, могут быть использованы в генной терапии для лечения опухолей, аутоиммунных заболеваний или наследственных генетических нарушений, в которых принимают участие В-клетки. Блокирующие агенты, такие как рекомбинантные варианты или антитела, специфичные для этого лиганда или его рецептора, могут также иметь иммунорегуляторные применения. Обсуждается применение ВАТТ в качестве стимулятора В-клеток для иммуносупрессивных заболеваний, в том числе, например, применения для пациентов, подвергающихся трансплантации органов (например, трансплантата костного мозга), а также восстановления после лечения рака для стимуляции продукции В-клеток. Также обсуждается применение ВАТТ в качестве адъюванта и/или костимулятора для обладания или восстановления уровней В-клеток приблизительно до нормальных уровней.

Предпосылки изобретения

Родственные фактору некроза опухолей (ΤΝΕ) цитокины являются медиаторами защитных сил организма и иммунной регуляции. Члены этого семейства существуют в мембраносвязанной форме, действуя локально через межклеточные контакты, или в виде секретируемых белков, способных диффундировать к более отдаленным мишеням. Параллельное семейство рецепторов сигнализирует о присутствии этих молекул, приводя к инициации смерти клеток или клеточной пролиферации и дифференцировки в ткани-мишени. В настоящее время ΤΝΕ-семейство лигандов и рецепторов имеет по меньшей мере 11 известных пар рецептор-лиганд, включающих в себя ΤΝΕ:ΤΝΕ-Β; ΤΤ-α:ΤΝΕ-Κ.; ΕΤ-α/βΒΤ-β-Κ.; РакЬ:Рак; С040Ь:С040; СО30Ь:СО30; СО27Ь:СО27; ОХ40Ь:ОХ40 и 4-1ВВЬ:4-1ВВ. Последовательности ДНК, кодирующие эти лиганды, имеют только приблизительно 25-30% идентичность даже в наиболее родственных случаях, хотя степень гомологии аминокислот составляет приблизительно 50%.

Определяющий признак этого семейства рецепторов цитокинов обнаружен в богатом цистеином внеклеточном домене, первоначально выявленном молекулярным клонированием двух различных ΤΝΕрецепторов. Это семейство генов кодирует гликопротеины, характерные для трансмембранных белков типа I, с внеклеточным лиганд-связывающим доменом, одним простирающимся через мембрану районом и цитоплазматическим районом, участвующим в активации клеточных функций. Богатый цистеином лиганд-связывающий район обнаруживает прочно связанный, имеющий дисульфидные связи внутренний (коровый) домен, который в зависимости от конкретного члена семейства повторяется многократно. Большинство рецепторов имеют четыре домена, однако, их может быть как три, так и шесть.

Белки в семействе ΤΝΡ-лигандов характеризуются коротким Ν-концевым отрезком обычно коротких гидрофильных аминокислот, часто содержащих несколько остатков лизина или аргинина, которые, как считают, служат в качестве стоп-транспортных последовательностей. Далее следует трансмембранный домен и внеклеточный домен вариабельной длины, который отделяет С-концевой рецепторсвязывающий домен от мембраны. Этот район иногда называют стеблем (ножкой). Сконцевой связывающий район содержит основную массу белка и часто, но не всегда, содержит сайты гликозилирования. Эти гены не имеют классических сигнальных последовательностей, характерных для мембранных белков типа I, мембранных белков типа II с С-концом, лежащим вне клетки, и коротким Νконцевым доменом, находящимся в цитоплазме. В некоторых случаях, например в случае ΤΝΡ и ΤΤ-α, расщепление в районе «стебля» может происходить рано во время процессинга белка, и в этом случае лиганд обнаруживают первично в секретируемой форме. Однако большинство лигандов существуют в мембранной форме, опосредующей локализованную передачу сигнала.

Структура этих лигандов была определена кристаллографическим анализом ΤΝΕ, ΤΤ-α и СО40Ь. Как ΤΝΕ, так и лимфотоксин-α (ΤΤ-α) имеют структуру сэндвича из двух антипараллельных βскладчатых структур с топографией «рулета с джемом» или греческого ключа. Вш8 (среднеквадратичное) отклонение между Сα- и β-остатками составляет 0,61 С, что предполагает высокую степень сходства в их молекулярной топографии. Структурным признаком, обнаруживаемым на основе молекулярных исследований СЭ40Т. ΤΝΕ и ΤΤ-α, является склонность к сборке в олигомерные комплексы. Внутренним относительно этой олигомерной структуры является образование сайта связывания рецептора в месте соединения между соседними субъединицами, создающими мультивалентный лиганд. Анализ кристаллических структур показал, что четвертичные структуры ΤΝΕ, СЭ40Т и ΤΤ-α существуют в виде тримеров. Многие из аминокислот, консервативных между различными лигандами, находятся в отрезках каркасного β-листа. Возможно, что эта основная сэндвич-структура сохраняется во всех этих молекулах, так как части этих каркасных последовательностей являются консервативными у многочисленных членов этого семейства. Эта четвертичная структура может быть также сохранена, поскольку конформация субъединиц, вероятно, остается сходной.

- 1 006108

Члены ΤΝΕ-семейства могут быть лучше всего описаны как основные переключатели в иммунной системе, регулирующие как выживание, так и дифференцировку клеток. Только ΤΝΕ и ЬТ-α признаются в настоящее время в качестве секретируемых цитокинов в противоположность другим, преимущественно мембраноприкрепленным членам ΤΝΕ-семейства. В то время как мембранная форма ΤΝΕ была хорошо охарактеризована и, вероятно, играет уникальную роль в биологии, секретируемый ΤΝΕ функционирует в качестве передачи общего сигнала тревоги клеткам, более удаленным от сайта запускающего события. Таким образом, секреция ΤΝΕ может усиливать событие, приводя к хорошо описанным изменениям выстилки сосудистой сети и продуцируя состояние клеток при воспалении. В противоположность этому мембраносвязанные члены этого семейства передают сигналы через рецепторы типа ΤΝΕ только к клеткам, находящимся в прямом контакте. Например, Т-клетки обеспечивают СЭ40-опосредованную «помощь» только В-клеткам, приведенным в прямой контакт через родственные ΤСΚ.-взаимодействия. Сходные ограничения межклеточных контактов, влияющие на способность индуцировать смерть клеток, относятся к хорошо изученной Нак-системе.

По-видимому, можно разделить лиганды ΤΝΕ на три группы на основе их способности индуцировать смерть клеток. Во-первых, ΤΝΕ, Нак-лиганд и ΤΚ.ΑΤΤ могут эффективно индуцировать смерть клеток во многих линиях, и их рецепторы, наиболее вероятно, имеют хорошо канонизированные домены смерти. Предположительно, лиганд к ΌΚ.-3 (ΤΚ.ΆΜΡ/Ψ8Τ-1) также относится к этой категории. Затем имеются такие лиганды, которые запускают более слабый сигнал смерти, ограниченный небольшим числом типов клеток, и ΤΑΕΛΚ. СЭ30-лиганд и ΕΤ;·ι1Ε2 являются примерами этого класса. Как эта группа может запускать смерть клеток в отсутствие канонического домена смерти является представляющим интерес вопросом и предполагается, что существует отдельный механизм передачи более слабого сигнала смерти. Наконец, имеются члены, которые не могут эффективно доставлять сигнал смерти. Возможно, все группы могут оказывать антипролиферативное действие на некоторые типы клеток вследствие индукции дифференцировки клеток, например, СЭ40. ЕииакокЫ с1 а1. (1994).

ΤΝΕ-семейство выросло драматически в последние годы и включает в себя по меньшей мере 11 различных путей передачи сигналов, участвующих в регуляции иммунной системы. Широкое распространение экспрессии ΤΑΕΛΚ и ΤΚ.ΆΙΤ указывает на то, что должно быть открыто еще большее функциональное разнообразие в этом семействе. Этот аспект особенно выдвинулся на передний план недавно при обнаружении двух рецепторов, которые влияют на способность вируса саркомы Рауса и простого герпеса реплицироваться, а также на основе исторических наблюдений, что ΤΝΕ обладает антивирусной активностью и поксвирусы кодируют ΤΝΕ-рецепторы-ловушки. Вго)а1кс11 с1 а1. (1996); МоШдотету с1 а1. (1996); 8тп11 с1 а1. (1994), 76 Се11 959-962; УаккаШ с1 а1. (1992), 10 1ттипо1. 411-452.

ΤΝΕ представляет собой медиатор септического шока и кахексии и участвует в регуляции развития гематопоэтических (кроветворных) клеток. Он, по-видимому, играет главную роль в качестве медиатора воспаления и защиты против бактериальных, вирусных и паразитарных инфекций, а также обладает противоопухолевой активностью. ΤΝΕ участвует также в различных аутоиммунных заболеваниях. ΤΝΕ может продуцироваться несколькими типами клеток, в том числе макрофагами, фибробластами, Тклетками и природными клетками-киллерами. ΤΝΕ связывается с двумя различными рецепторами, каждый из которых действует через специфические молекулы внутриклеточной передачи сигналов, приводя тем самым к различным эффектам ΤΝΕ. ΤΝΕ может существовать либо в мембраносвязанной форме, либо в виде растворимого секретируемого цитокина.

ΤΤ-α разделяет многие активности ΤΝΕ, например связывание с рецепторами ΤΝΕ, но в противоположность ΤΝΕ, по-видимому, секретируется первично активированными Т-клетками и некоторыми βлимфобластоидными опухолями. Гетеромерный комплекс ΤΤ-α и ΤΤ-β является мембраносвязанным комплексом, который связывается с рецептором ΤΤ-β. ΤΤ-система (ΤΤ и ΤΤ-Κ.), по-видимому, участвует в развитии периферических лимфоидных органов, поскольку генетическое разрушение ΤΤ-β ведет к дезорганизации Т- и В-клеток в селезенке и отсутствию лимфатических узлов. ΤΤ-β-система участвует также в смерти клеток некоторых линий клеток аденокарциномы.

Рак-Т, другой член ΤΝΕ-семейства, экспрессируется преимущественно на активированных Тклетках. Он индуцирует смерть клеток, несущих его рецептор, в том числе опухолевых клеток и ВИЧинфицированных клеток, по механизму, известному как запрограммированная смерть клеток или апоптоз. Кроме того, недостаток либо Гак, либо Так-Т может приводить к лимфопролиферативным нарушениям, что подтверждает роль Вак-системы в регуляции иммунных реакций. Так-система участвует также в повреждении печени в результате хронической инфекции гепатита и в аутоиммунной реакции у ВИЧинфицированных пациентов. Бак-система участвует также в деструкции Т-клеток у ВИЧ-пациентов. ΤΚ.ΆΙΤ, другой член этого семейства, по-видимому, также участвует в смерти большого разнообразия трансформированных клеточных линий различного происхождения.

СО40-Т, другой член ΤΝΕ-семейства, экспрессируется на Т-клетках и индуцирует регуляцию СЭ40несущих В-клеток. Кроме того, изменения в гене СЭ40-Т приводят к заболеванию, известному как Хсвязанный гипер-1дМ-синдром. СЭ40-система участвует также в различных аутоиммунных заболеваниях, и известно, что СЭ40-Т обладает антивирусными свойствами. Хотя СЭ40-система участвует в спасе

- 2 006108 нии апоптотических В-клеток, в неиммунных клетках она индуцирует апоптоз. Многие дополнительные лимфоцитарные члены ΤΝΡ-семейства также участвуют в костимуляции.

Обычно члены ΤΝΡ-семейства имеют фундаментальную регуляторную роль в контроле иммунной системы и активации острых систем защитных сил хозяина. В условиях существующего прогресса в манипулировании членами ΤΝΡ-семейства в терапевтических целях представляется вероятным, что члены этого семейства могут обеспечить уникальные средства для борьбы с заболеванием. Некоторые из лигандов этого семейства могут непосредственно индуцировать апоптотическую смерть многих трансформированных клеток, например ЬТ, ΤΝΡ, Рак-лиганд и ТВЛ1Ь. Nада1а (1997) 88 Се11 355-365. Активация Рак и, возможно, ΤNΡ и СО30-рецептора может индуцировать смерть клеток в ^трансформированных лимфоцитах, что может выполнять иммунорегуляторную функцию. Атакаета е! а1. (1996) 84 Се11 551562; №1да1а (1997) 88 Се11 355-365; 8у1ети е! а1. (1996); Ζ^η§ е! а1. (1995) 377 Мпиге 348-351. Обычно смерть запускается после агрегации доменов смерти, которые находятся на цитоплазматической стороне ΤΝΡ-рецепторов. Домены смерти сопровождают сборку различных компонентов передачи сигнала, которые приводят к активации каскада каспазы. N ада 1а (1997) 88 Се11 355-365. Некоторые рецепторы не содержат канонических доменов смерти, например ΕΤ-β-рецептор и СЭ30 (Вгоетшпд е! а1. (1996); Ьее е! а1. (1996)), но все-таки могут индуцировать смерть клеток, хотя более слабо. По-видимому, эти рецепторы действуют первично, индуцируя клеточную дифференцировку, и смерть является отклоняющимся от нормы следствием в некоторых трансформированных клеточных линиях, хотя эта картина является неясной, так как исследования на СЭ30-нуль-мышах предполагают роль смерти в негативном отборе в тимусе. Атакаета е! а1. (1996) 84 Се11 551-562. Напротив, передача сигнала через другие пути, такие как ί.Ό40. требует сохранения выживания клеток. Таким образом, существует потребность в идентификации и характеристике дополнительных молекул, которые являются членами ΤΝΡ-семейства, с обеспечением тем самым дополнительных средств контроля заболевания и манипулирования иммунной системой.

В данной заявке авторы характеризуют функциональные свойства нового лиганда ΤΝΡ-семейства цитокинов. Этот новый лиганд, названный ВАРЕ (фактор активации В-клеток, принадлежащий ΤΝΡсемейству), по-видимому, экспрессируется Т-клетками и дендритными клетками для костимуляции Вклеток и, следовательно, может играть важную роль в регуляции функции В-клеток. Кроме того, авторы получили трансгенных мышей с повышенной экспрессией ВАТТ под контролем специфического для ткани печени промотора. Эти мыши имеют избыточные количества зрелых В-клеток, спонтанные реакции герминативных (зародышевых) центров, секретируют аутоантитела и имеют повышенное количество плазматических клеток во вторичных лимфоидных органах и отложение 1д в почках.

Сущность изобретения

Таким образом, данное изобретение относится к применению ВАЕЕ-лигандов, блокирующих агентов и антител против этого лиганда либо для стимуляции, либо для ингибирования роста В-клеток и секреции иммуноглобулина. Заявленное изобретение может быть использовано для терапевтических применений при многочисленных заболеваниях и нарушениях, как обсуждается более подробно ниже, а также для получения информации об иммунной системе и ее процессах и манипулирования иммунной системой и ее процессами. Кроме того, данное изобретение может быть использовано в качестве способа стимуляции или ингибирования роста В-клеток и секреции иммуноглобулинов. ВАРЕ-ассоциированные молекулы, описанные в данном изобретении, могут также иметь применение при лечении аутоиммунных заболеваний, нарушений, связанных с пролиферацией и созреванием В-клеток, регуляцией ВАЕЕлиганда и воспалением. Данное изобретение может быть использовано в регуляции или предупреждении гипертонии и связанных с гипертонией нарушений почечной и сердечно-сосудистой ткани.

Дополнительные признаки и преимущества данного изобретения будут представлены в описании, которое следует ниже, и отчасти будут с очевидностью вытекать из этого описания, или могут быть выявлены при помощи применения на практике данного изобретения. Цели и преимущества данного изобретения будут реализованы и достигнуты при помощи способов, конкретно указанных в приведенном описании и формуле изобретения, а также в прилагаемых чертежах.

Таким образом, для достижения этих и других преимуществ и в соответствии с целью данного изобретения, воплощенных в примерах и широко описанных здесь, данное изобретение включает в себя способ воздействия на рост В-клеток и секрецию иммуноглобулинов посредством введения различных ВАЕЕ-лигандов и родственных молекул.

В данном изобретении рассматривается также возможность стимуляции роста В-клеток посредством использования ВАРЕ-лигандов или активных фрагментов полипептида. Полипептид может быть использован либо отдельно, либо в сочетании с СЭ-40-лигандом или антимышиным антителом.

В других вариантах данное изобретение относится к способам стимуляции индуцированного дендритными клетками роста и созревания В-клеток посредством применения ВАΡЕ-лигандов или активных фрагментов ВАГГ. Здесь также этот полипептид может быть использован либо отдельно, либо в сочетании с СЭ-40-лигандом или анти-р-антителами.

В других вариантах блокирующие агенты ВАРЕ и ВАΡЕ-рецептор использовали для ингибирования роста В-клеток и секреции иммуноглобулина. Эти агенты могут быть нефункциональным, рекомби- 3 006108 нантным ВАРЕ, ВАЕЕ-специфическими антителами, ВАЕЕ-рецептор-специфическими антителами или молекулой антитела против ВАЕЕ-лиганда (анти-ВАЕЕ-лигандом).

В других вариантах данное изобретение относится к применению ВАРЕ, родственных ВАЕЕ молекул и блокирующих ВАЕЕ агентов для лечения гипертонии, связанных с гипертонией нарушений, иммунных нарушений, аутоиммунных заболеваний, воспаления и В-клеточных лимфопролиферативных нарушений.

Данное изобретение включает в себя применение ВАЕЕ и родственных ВАЕЕ молекул в качестве либо агонистов, либо антагонистов в индукции иммунных реакций посредством влияния на рост и/или созревание В-клеток и секрецию иммуноглобулина.

Данное изобретение относится в других вариантах к растворимым конструкциям, содержащим ВАЕЕ, которые могут быть использованы для прямого запуска опосредованных ВАЕЕ фармакологических событий. Такие события могут иметь ценные терапевтические преимущества в лечении рака, опухолей или манипулировании иммунной системой для лечения иммунологических заболеваний.

Кроме того, в других вариантах заявленное изобретение относится к антителам, направленным против ВАЕЕ-лиганда, которые могут быть использованы, например, для лечения рака и манипулирования иммунной системой для лечения иммунологического заболевания.

В других вариантах данное изобретение относится к способам генной терапии с использованием генов ВАЕЕ.

Фармацевтические препараты данного изобретения могут, в случае необходимости, включать в себя фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, наполнители или другие фармацевтические композиции и могут вводиться в любой из многочисленных форм или любым из многочисленных способов, известных в данной области.

Должно быть понятно, что как предыдущее общее описание, так и нижеследующее подробное описание являются примерными и приведенными для объяснения и предназначены для обеспечения дополнительного объяснения заявленного изобретения.

Сопутствующие чертежи включены для обеспечения дополнительного понимания данного изобретения и входят в это описание и составляют его часть, иллюстрируют несколько вариантов данного изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов данного изобретения.

Описание чертежей

На фиг. 1(А) изображена предсказанная аминокислотная последовательность ВАЕЕ человека |8ЕО ГО N0: 1] и мыши |8Е0 ГО N0: 2]. Показаны предсказанный трансмембранный домен (ΤΜΌ, пунктирная линия), потенциальные сайты Ν-связанного гликозилирования (звезды) и сайт природного процессинга ВАЕЕ человека (стрелка). Двойная линия над 11ВАЕЕ указывает последовательность, полученную деградацией методом Эдмана процессированной формы ВАЕЕ.

На фиг. 1(В) изображены в сравнении внеклеточная белковая последовательность ВАЕЕ |8Е0 ГО N0: 3] и таковые некоторых членов семейства Т№-лигандов |8Е0 ГО N0: 4 (ЪАРШЬ); 8Е0 ГО N0: 5 (ЙТ№ альфа); 8ЕО ГО N0: 6 (ЬЕакЬ); 8ЕО ГО N0: 7 (ЬЬТ альфа); 8ЕО ГО N0: 8 (ЪΒАNΚ^)]. Идентичные и гомологичные остатки представлены черными и обведенными штрихами блоками соответственно.

На фиг. 1(С) изображена дендограмма лигандов ТОТ-семейства.

Фиг. 2 является схематической характеристикой рекомбинантного ВАЕЕ.

(A) - схематическое представление рекомбинантных конструкций ВАЕЕ. Растворимые рекомбинантные ВАЕЕ, начинающиеся при Ьеи₈₃ и С1И1₃₆, экспрессируются слитыми с ^концевой Е1ад-меткой и линкером из 6 аминокислот. Длинная форма расщепляется между Агд₁₃₃ и А1а₁₃₄ (стрелка) в 293 Тклетках, давая процессированную форму ВАЕЕ. А8Щ₂₄ и А§и₂₄₂ относятся к консенсусным сайтам N гликозилирования. ^связанный гликан присутствующий на А5П₁₂₄, показан в виде Υ. ΤΜΌ: трансмембранный домен.

(B) - обработка пептид-№глюканазой Е ^N6;·!^ Е) рекомбинантного ВАЕЕ. Концентрированные супернатанты, содержащие Е1ад-меченные ВАЕЕ и АРВГО, дегликозилировали и анализировали при помощи Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных анти-ВАЕЕ-антител или анти-Е1ад М2, как указано. Все полосы, за исключением процессированного ВАЕЕ, реагировали также с анти-Е1ад М2 (данные не показаны).

(C) - полноразмерный ВАЕЕ процессируют до растворимой формы. 293Т-клетки временно трансфицировали полноразмерным ВАЕЕ. Трансфицированные клетки и их концентрированные супернатанты анализировали Вестерн-блоттингом с использованием поликлональных анти-ВАЕЕ-антител. Супернатанты, соответствующие 10 х количество клеток, наносили на гель.

(Ό) - гель-фильтрация растворимого ВАЕЕ на Супердексе-200. Концентрированные супернатанты, содержащие растворимый ВАЕЕ/короткий, фракционировали на колонке Супердекса-200 и элюированные фракции анализировали Вестерн-блоттингом с использованием анти-Е1ад М2-антитела. Положения миграции маркеров молекулярной массы (в кДа) указаны слева для электрофореза в ДСН-ПААГ и в верхней части фигуры для гель-фильтрации.

На фиг. 3 изображена экспрессия ВАЕЕ.

- 4 006108 (A) - нозерн-блоты (2 мкг поли А' РНК на дорожку) различных тканей человека зондировали антисмысловой мРНК ВАЕЕ.

(B) - амплификация с использованием обратной транскриптазы ВАЕЕ, альфа-цепи рецептора 1Ь-2 и актина из РНК очищенных Т-клеток крови в различных временных точках ФГА-активации, Ерозеткообразующие отрицательные клетки крови (В-клетки и моноциты), полученные ίη νίίτο незрелые дендритные клетки, 293-клетки и 293-клетки, стерильно трансфицированные полноразмерным ВАЕЕ (293-ВАЕЕ). Контрольные амплификации проводили в отсутствие добавленной кДНК. Альфа-цепь 1Ь-2рецептора амплифицировали в качестве маркера активации Т-клеток.

На фиг. 4 изображено связывание ВАЕЕ со зрелыми В-клетками.

(A) - связывание зрелого ВАЕЕ с клеточными линиями В1АВ и 1шка1 и с очищенными СЭ19'клетками пуповинной крови. Клетки окрашивали указанным количеством (в нг/50 мкл) Е1ад-ВАЕЕ и анализировали проточной цитометрией.

(B) - связывание растворимого ВАЕЕ с РВЬ. РВЬ окрашивали анти-СП8-ЕГТС или анти-СО19-ЕГТС (горизонтальная ось) и Е1ад-ВАЕЕ плюс М2-биотин и авидин-ФЭ (вертикальная ось). Е1ад-ВАЕЕ опускали в контролях.

На фиг. 5 изображена костимуляция ВАЕЕ пролиферации В-клеток.

(A) - поверхностная экспрессия ВАЕЕ в стабильно трансфицированных 293-клетках. 293-ВАЕЕ и 293-клетки дикого типа окрашивали тАЬ 43,9 анти-ВАЕЕ и анализировали проточной цитометрией.

(B) - костимуляция РВЬ 293-ВАЕЕ-клетками. РВЬ (10⁵/лунка) инкубировали с 15000 фиксированными глутаровым альдегидом 293-клетками (293-клетками дикого типа или 293-ВАЕЕ-клетками) в присутствии или в отсутствие антитела против В-клеточного рецептора (анти-μ). Фиксированные 293-клетки отдельно включали 100 имп/мин.

(C) - зависимая от дозы костимуляция пролиферации РВЬ растворимым ВАЕЕ в присутствии анти-μ. Пролиферацию определяли после 72 ч инкубации с использованием включения [³Н]-тимидина. Контроли включают в себя клетки, обработанные только ВАЕЕ, денатурированным нагреванием ВАЕЕ, или посторонним антителом не относящегося к делу изотипа вместо анти-μ.

(Ό) - сравнение (ко)стимулирующих эффектов 8СО40Ь и кВАЕЕ на пролиферацию РВЬ. Эксперимент проводили, как описано в панели С.

(Е) - ВАЕЕ костимулирует секрецию Гд предактивированных В-клеток человека. Очищенные СЭ19' В-клетки активировали сокультивированием с Т-клетками ЕЬ-4 и супернатантами активированных Тклеток в течение 5-6 дней, затем повторно выделяли и культивировали в течение дополнительных 7 дней в присутствии только среды (-) или содержащих 5% активированных Т-клеток супернатантов (Т-8ИР) или смеси цитокинов (ГЬ-2, ГЬ-4, ГЬ-10). Столбцы означают средние величины концентраций Гд для культур с 1 мкг/мл ВАЕЕ или без него. Средние величины ± 8Ό в значении «увеличения в указанное число раз» были 1,23 ± 0,11 для среды только, 2,06 ± 0,18 с супернатантами Т-клеток (4 эксперимента) и 1,45 ± 0,06 с ГЬ-2, ГЬ-4 и ГЬ-10 (2 эксперимента). Эксперименты проводили с периферической кровью (3 эксперимента) или В-клетками пуповинной крови (один эксперимент; 2,3-кратное увеличение с Т-клеточными супернатантами, 1,5-кратное увеличение с ГЬ-2, ГЬ-4 и ГЬ-10).

(Е) - кривая доза-ответ для действия ВАЕЕ в культурах с Т-клеточными супернатантами, как показано в панели Ό. Среднее ± 8Ό для 3 экспериментов.

Фиг. 6 показывает, что ВАЕЕ действует как кофактор для пролиферации В-клеток. Пролиферацию РВЬ человека измеряли отдельно (500 имп/мин), в присутствии только ВАЕЕ-лиганда, в присутствии только козьих антимышиных антител (пи) и как с ВАЕЕ-лигандом, так и с антимышиными антителами. Комбинация антимышиного антитела и ВАЕЕ значимо повышала пролиферацию РВЬ по мере увеличения концентрации ВАЕЕ, что предполагает наличие кофакторных свойств ВАЕЕ.

На фиг. 7 изображено повышенное количество В-клеток в ВАЕЕ-Тд-мышах.

(A) Повышенное количество лимфоцитов в ВАЕЕ-Тд-мышах. На этой диаграмме сравниваются 12 контрольных однопометных мышей (левая панель) с 12 ВАЕЕ-Тд-мышами (правая панель). Число лимфоцитов показано кружками, а гранулоцитов (в том числе нейтрофилов, эозинофилов, базофилов) - ромбами.

(B) Повышенная доля В-клеток в РВЬ из ВАЕЕ-Тд-мышей. РВЬ окрашивали как анти-В220-ЕГТС, так и анти-СЭ4-ФЭ для ЕАС8-анализа и устанавливали дискриминационные окна в клеточном сортере на живых клетках с использованием прямого рассеивателя. Показаны проценты СО4- и В220положительных клеток. Показаны одна контрольная мышь (слева) и две ВАЕЕ-Тд-мыши (справа), и результаты были репрезентативными результатами 7 животных, анализируемых в каждой группе.

(C) ЕАС8-анализ соотношения В-клеток к Т-клеткам в РВЬ. Различие между контрольными животными и ВАЕЕ-Тд-мышами на (А) и (С) были статистически значимыми (Р<0,001).

(Ό) Увеличенная экспрессия МНС класса ГГ на В-клетках из РВЬ ВАЕЕ-Тд-мышей. Экспрессию МНС класса ГГ анализировали при помощи ЕАС8.

(Е) Увеличенная экспрессия Вс1-2 в В-клетках из РВЬ ВАЕЕ-Тд-мышей.

- 5 006108

Экспрессию Вс1-2 измеряли внутрицитоплазматическим окрашиванием, и клетки анализировали при помощи РАС8.

Как в (Ό), так и в (Е) дискриминационные окна в клеточном сортере на живых клетках устанавливали на прямом рассеивателе (рассеивающем вперед). Показаны четыре контрольные одно пометные мыши (белые столбцы) и 4 ВАРР-Тд-мыши, и они являются репрезентативными по меньшей мере для 12 животных, анализируемых для каждой группы. МР1 (среднее интенсивности флуоресценции). Различие между контрольными животными и ВАРР-Тд-мышами было статистически значимым (Р<0,005).

(Р) Увеличенная экспрессия эффекторных Т-клеток у ВАРР-Тд-мышей. РВЬ окрашивали анти-СЭ4СусНготе, анти-СЭ44-ПТС и анти-Ь-селектин-ФЭ. Показаны клетки с установкой дискриминационного окна на СЭ4⁺-клетки. Показаны проценты СЦ44^Ь1/Е-селектин^1о-клеток (Ιίί = высокий, 1о = низкий). Показаны одна контрольная мышь (слева) и две ВАРР-Тд-мыши (справа), и результаты являются репрезентативными результатами для 8 животных, анализируемых в каждой группе.

На фиг. 8 изображены компартменты В-клеток в селезенке, но не в костном мозгу ВАРР-Тд-мышей.

(A) РАС8-окрашивание на зрелые В-клетки с использованием анти-1дМ-Р1ТС и анти-В220-ФЭ в селезенке (верхняя панель), костном мозгу (средняя панель) и ΜΕΝ (мезентериальных лимфатических узлах) (нижняя панель). Показаны проценты В220+/1дМ+ зрелых В-клеток.

(B) РАС8-окрашивание на пре-В-клетки (В220+/СЭ43-) и про-В-клетки (В220+/СЭ43+) в костном мозгу с использованием анти-СЦ43-Р1ТС, анти-В220-Су-сйтоте и анти-1дМ-ФЭ одновременно. Показаны клетки с установкой дискриминационного окна на 1дМ-отрицательную популяцию. Показаны проценты пре-В-клеток (В220+/СЭ43-) и про-В-клеток (В220+/СЭ43+).

Для всех фигур (А и В) показаны одна контрольная мышь (слева) и две ВАРР-Тд-мыши (справа), и результаты являются репрезентативными для 7 животных, анализируемых для каждой группы.

На фиг. 9 изображены повышенные уровни 1д, РР (РФ) и С1С (ЦИК) у ВАРР-Тд-мышей.

(А) Электрофорез в ДСН-ПААГ двух контрольных сывороток (-) и 4 сывороток из ВАРР-Тд-мышей (+) бок о бок с указанным количеством очищенного мышиного 1дС для ссылки. Интенсивность полосы альбумина является одинаковой во всех дорожках, указывая, что материал, нанесенный на гель, является эквивалентным для каждой пробы.

Анализ на основе ЕЫ8А общего мышиного 1д (В), РР (РФ) (С) и С1С (ЦИК) (Ό) в сыворотках 19 контрольных однопометных животных (белые столбцы) и 21 ВАРР-Тд-мыши (черные столбцы). В отсутствие правильного РР-контроля титр (основание логарифма 2) для РР определяют как разведение сывороток, дающее в 3 раза более высокие Θ.Ό., чем Θ.Ό. фона. Количество С1С определяют как количество РАР (пероксидаза-мышиное антитело против пероксидазы), требующееся для получения Θ.Ό., эквивалентного Θ.Ό., полученному с тестируемой сывороткой. Различие между контрольными животными и ВАРР-Тд-мышами было статистически значимым (Р<0,001 в (В) и (С), Р<0,003 в (Ό)).

На фиг. 10 изображено присутствие аутоантител анти-ккДНК и анти-бкДНК (против одноцепочечной ДНК и против двухцепочечной ДНК) у некоторых ВАРР-Тд-мышей.

(A) Анализ ЕЫ8А аутоантител анти-ккДНК у 19 контрольных однопометных мышей (серые столбцы) и 21 ВАРР-Тд-мыши (черные столбцы).

(B) Анализ ЕЬ18А аутоантител анти-ккДНК у 5 контрольных однопометных мышей и 5 животных, показывающих уровни аутоантител анти-ккДНК из (А).

(C) Парафиновые срезы почек из контрольной мыши (слева) и ВАРР-Тд-мыши (справа), окрашенные козьим антимышиным 1д-НРР. Депонирование 1д видно по коричневому окрашиванию. Эти картины являются репрезентативными для 6 анализированных ВАРР-Тд-мышей.

На фиг. 11 показаны увеличенные пейеровы бляшки у ВАРР-Тд-мышей.

Фотография пейеровых бляшек (показанных стрелкой) в тонкой кишке контрольной мыши (слева) и ВАРР-Тд-мыши (справа). Эта картина является воспроизводимой по меньшей мере у 12 мышей, умерщвленных в каждой группе. Увеличение 5Х.

На фиг. 12 показаны разрушенные Т- и В-клеточные образования, сильные реакции герминативных (зародышевых) центров, уменьшенное число дендритных клеток и увеличенное число плазматических клеток в селезенке ВАРР-Тд-мышей.

Контрольная мышь показана на А, С, Е и С, а ВАРР-Тд-мышь - на В, Ό, Р и Н. В-клетки - синие, а Т-клетки - коричневые (А и В). Зародышевые центры показаны стрелкой (С и Ό). Только небольшое число зародышевых центров наблюдается у контрольных мышей (С). СЭ11с-положительные дендритные клетки коричневые и видны в зоне Т-клеток, в мостиковых каналах и в маргинальной зоне (Е). Очень мало зародышевых центров присутствует в ВАРР-Тд-мышах (Р). Синдекан-1-положительные плазматические клетки обнаруживаются только в красной пульпе селезенки ВАРР-Тд-мышей (Н), но не у контрольных животных (С).

Эти картины являются воспроиводимыми по меньшей мере у 12 анализированных ВАРР-Тд-мышей и 12 контрольных мышей. Увеличение 100Х для всех картин, кроме С и Ό, где увеличение составляет 50Х. В: В-клеточный фолликул. Т: РАЬ8, \¥Р: белая пульпа, РР: красная пульпа.

На фиг. 13 изображены разрушенные Т- и В-клеточные образования, усиленная реакция герминативных (зародышевых) центров и большое число плазматических клеток у МЬ-Ν ВАРР-Тд-мышей.

- 6 006108

Контрольная мышь показана на А, С, Е и С, а ВАЕЕ-Тд-мышь - на В, Б, Е и Н. Иммуногистохимию проводили, как описано на фиг. 6. Окрашивание Т- и В-клеток показано на А и В, зародышевые центры на С и Б, дендритные клетки - на Е и Е и плазматические клетки - на С и Н. СС: зародышевый центр. Увеличение 100Х.

Подробное описание изобретения

Теперь будут описаны подробно предпочтительные в настоящее время варианты данного изобретения. Изобретение относится к применению ВАЕЕ и родственных ВАЕЕ молекул для воздействия на рост и созревание В-клеток и секрецию иммуноглобулина. Данное изобретение относится к применению ВАЕЕ и родственных ВАЕЕ молекул для индукции ответов иммунной системы, которые необходимы в случае заболеваний, связанных с нарушениями иммунного ответа.

Кроме того, данное изобретение связано с лечением рака и нарушений иммунного ответа путем применения ВАЕЕ или родственного ВАЕЕ гена с помощью методов генной терапии.

ВАЕЕ-лиганд и его гомологи, продуцируемые хозяевами, трансформированными последовательностями согласно изобретению, а также нативный ВАЕЕ, очищенный с использованием способов, известных в данной области, или полученный из известных аминокислотных последовательностей, применимы в многочисленных способах для противоракового, противоопухолевого и иммунорегуляторного приложений. Они применимы также в терапии и в способах, относящихся к лечению других заболеваний.

Другой аспект данного изобретения относится к применению полипептида, кодируемого выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей ВАЕЕ-лиганд, в антисмысловой терапии. Применяемый здесь термин антисмысловая терапия относится к введению или генерированию ίη кйи олигонуклеотидов или их производных, которые специфически гибридизуются во внутриклеточной среде с клеточными мРНК и/или ДНК, кодирующими представляющий интерес лиганд, так, чтобы ингибировать экспрессию кодируемого белка, например, путем ингибирования транскрипции и/или трансляции. Это связывание может осуществляться за счет обычной комплементарности пар оснований или, например, в случае связывания с ДНК-дуплексами, через специфические взаимодействия в большой бороздке двойной спирали. В общем, антисмысловой терапией называют ряд способов, обычно используемых в данной области, и она включает в себя любую терапию, которая основана на специфическом связывании с олигонуклеотидными последовательностями.

Антисмысловая конструкция согласно изобретению может быть доставлена, например, в виде экспрессионной плазмиды, которая при транскрипции в клетке продуцирует РНК, которая комплементарна по меньшей мере части клеточной мРНК, которая кодирует Кау-лиганд. Альтернативно, антисмысловой конструкцией может быть олигонуклеотидный зонд, который генерируется ех νίνο. Такие олигонуклеотидные зонды предпочтительно являются модифицированными олигонуклеотидами, которые устойчивы к эндогенным нуклеазам и, следовательно, являются стабильными ίη νίνο. Примерами молекул нуклеиновых кислот для применения в качестве антисмысловых олигонуклеотидов являются фосфоамидатные, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (см., например, патент США 5176996; патент США 5264564 и патент США 5256775).

Кроме того, общие подходы к конструированию олигомеров, применимых в антисмысловой терапии, были даны в обзорах, например Уап Бег Кго1 е1 а1., (1988) Вю1ес111ш.|иек 6:958-976; и 81е1п е1 а1. (1988) Сапсег Век 48:2659-2668, специально включенных здесь в качестве ссылки.

С. ВАЕЕ-лиганд.

ВАЕЕ-лиганд согласно данному изобретению, как обсуждалось выше, является членом ΤΝΡсемейства и описан в заявке РСТ с номером РСТ/ϋδ 98/19037 (АО 99/12964), включенной здесь в качестве полной ссылки. Этот белок, его фрагменты или гомологи могут иметь широкие терапевтические и диагностические применения.

ВАЕЕ-лиганд присутствует прежде всего в селезенке и в лимфоцитах периферической крови (РВЬ), что строго указывает на его регуляторную роль в иммунной системе. Сравнение заявленных последовательностей ВАЕЕ-лиганда с другими членами ΤΝΡ-семейства человека выявляет значительное структурное сходство. Все эти белки имеют несколько общих районов консервативных последовательностей во внеклеточном домене.

Хотя точная трехмерная структура заявленного лиганда неизвестна, прогнозируется, что как член ΤΝΡ-семейства он может иметь определенные структурные характеристики, общие с другими членами этого семейства.

Новые полипептиды данного изобретения специфически взаимодействуют с рецептором, который еще не был идентифицирован. Однако пептиды и способы, описанные здесь, позволяют идентифицировать рецепторы, которые специфически взаимодействуют с ВАЕЕ-лигандом или его фрагментами.

Заявленное изобретение в некоторых вариантах включает в себя способы применения пептидов, произведенных из ВАЕЕ-лиганда, которые обладают способностью связываться с их рецепторами. Фрагменты ВАЕЕ-лигандов могут быть получены несколькими путями, например рекомбинантным, при помощи ПЦР, путем протеолитического расщепления или химического синтеза. Внутренние или концевые фрагменты полипептида могут быть получены удалением одного или нескольких нуклеотидов из одного

- 7 006108 или обоих концов нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид. Экспрессия мутагенизированной ДНК дает фрагменты полипептида.

Фрагменты полипептида могут быть также химически синтезированы с использованием способов, известных в данной области, таких как общепринятый твердофазный химический способ Меррифилда с использованием защитных групп £-тос или ΐ-Ьос. Например, пептиды и последовательности ДНК согласно изобретению могут быть произвольно разделены на фрагменты нужной длины без перекрывания фрагментов или разделены на перекрывающиеся фрагменты желаемой длины. Такие способы описаны более подробно ниже.

Генерирование растворимых форм ВАГГ-лиганда

Растворимые формы ВАЕЕ-лиганда часто могут быть эффективны в передаче сигнала и, следовательно, могут вводиться в качестве лекарственного средства, которое имитирует природную мембранную форму. Возможно, что заявленный здесь ВАЕЕ-лиганд природно секретируется в виде растворимых цитокинов, но если это не происходит, можно заново сконструировать ген для усиления секреции. Для создания растворимой секретируемой формы ВАГЕ-лиганда удаляют на уровне ДНК Ν-концевые трансмембранные районы и некоторую часть района стебля и заменяют их лидерной последовательностью типа I или альтернативно лидерной последовательностью типа II, которая создаст возможность эффективного протеолитического расщепления в выбранной системе экспрессии. Квалифицированный специалист мог бы варьировать длину района стебля, сохраняемую в секретируемой экспрессионной конструкции для оптимизации как свойств связывания с рецептором, так и эффективности секреции. Например, конструкции, содержащие любую возможную длину стебля, в частности укороченные на Ν-конце конструкции, можно было бы получить таким образом, что полученные в результате белки, могли бы начинаться с аминокислот 81-139. Таким образом, можно было бы получить последовательность стебля оптимальной длины.

Е. Генерирование антител, реактивных с ВАГЕ-лигандом.

Данное изобретение включает в себя также антитела, специфически реактивные с заявленным ВАГЕ-лигандом или его рецепторами. Антибелковые/антипептидные антисыворотки или моноклональные антитела могут быть получены согласно стандартным протоколам (см., например, АибЬоб1е8: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 еб. Ьу Наг1о\\' аиб Ьапе (Со1б 8рппд НагЬог Ргезз: 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомячок или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой этого пептида. Способы придания иммуногенности белку или пептиду включают в себя конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные в данной области.

Иммуногенная часть ВАГЕ-лиганда или его рецепторов может быть введена в присутствии адъюванта. Прогрессирование иммунизации может быть подвергнуто мониторингу путем регистрации титров антител в плазме или сыворотке. Стандартный ЕЫ8А или другие иммуноанализы могут быть использованы с иммуногеном в качестве антигена для оценки уровней антител.

В предпочтительном варианте рассматриваемые антитела являются иммуноспецифическими в отношении антигенных детерминант ВАЕЕ-лиганда или его рецепторов (например, антигенных детерминант полипептида 8Еф ΙΌ N0: 2, указанная последовательность описана в заявке РСТ с номером РСТ/И8 98/19037 (\У0 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки) или близкородственных гомологов человека или млекопитающего, не являющегося человеком (например, имеющих процент гомологии 70, 80 или 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% гомологии). В дополнительном предпочтительном варианте данного изобретения антитела против ВАЕЕ-лиганда или против рецептора ВАЕЕлиганда, по существу, не реагируют перекрестно (т. е. реагируют специфически) с белком, который, например, менее чем на 80% гомологичен указанной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2 или 6, описанной в заявке РСТ/И8 98/19037 (\У0 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки; предпочтительно менее чем на 90% гомологичен указанной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2, описанной в заявке РСТ/И8 98/19037 (\У0 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки, и наиболее предпочтительно менее чем на 95% гомологичен указанной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2, описанной в заявке РСТ/И8 98/19037 (\У0 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки. По существу перекрестно не реагирует означает, что это антитело имеет аффинность связывания в отношении негомологичного белка менее 10%, более предпочтительно менее 5% и даже более предпочтительно менее 1% аффинности связывания в отношении белка указанной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 2, описанной в заявке РСТ/И8 98/19037 (\У0 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки.

Применяемый здесь термин антитело включает в себя фрагменты антитела, которые также специфически реактивны с ВАЕЕ-лигандом или его рецепторами. Антитела могут быть фрагментированы с использованием общепринятых способов, и фрагменты могут быть подвергнуты скринингу на применимость таким же образом, как описано выше для целых антител. Например, Е(аЬ')₂-фрагменты могут быть получены обработкой антитела пепсином. Полученный Е(аЬ')₂-фрагмент может быть обработан для уменьшения числа дисульфидных мостиков с получением ЕаЬ'-фрагментов. Подразумевается, что антитела согласно изобретению дополнительно включают в себя биоспецифические и химерные молекулы, имеющие активность против ВАЕЕ-лиганда или против рецептора ВАЕЕ-лиганда. Таким образом, как моноклональные, так и поликлональные антитела (АЬ) против ВАЕЕ-лиганда, Титог-лиганда и их рецеп

- 8 006108 торов, и фрагменты антител, такие как ЕаЬ' и Е(аЬ')₂, могут быть использованы для блокирования действия этого лиганда и его соответствующего рецептора.

Различные формы антител могут быть также получены с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК. Статья Аш!ег апб Μίΐδίοίη (1991) Ыа1иге 349:293-299 специально включена здесь в качестве ссылки. Например, могут быть сконструированы химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен из антитела животного связан с константной областью иммуноглобулина человека (например, СаЬШу е! а1., И8 ра!еп! 4816567, включенный здесь в качестве ссылки). Химерные антитела могут ослаблять наблюдаемые иммуногенные реакции, вызываемые антителами животных, при клиническом применении на человеке.

Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные «гуманизированные антитела», которые узнают ВАЕЕ-лиганд или его рецепторы. Гуманизированные антитела являются химерами, содержащими в основном последовательности 1дС человека, в которые были встроены районы, ответственные за специфическое связывание антигена. Животных иммунизируют желаемым антигеном, соответствующие антитела выделяют и часть последовательностей вариабельной области, ответственных за связывание специфического антигена, удаляют. Затем полученные у животного районы связывания антигена клонируют в соответствующее местоположение генов антител человека, в которых были делетированы районы связывания антигена. Гуманизированные антитела позволяют минимизировать использование гетерологичных (например, межвидовых) последовательностей в антителах человека и, следовательно, они с меньшей вероятностью вызывают иммунные реакции при введении субъекту.

Конструирование различных классов рекомбинантных антител может также выполняться посредством получения химерных или гуманизированных антител, содержащих вариабельные домены и константные домены человека (СН1, СН2, СН3), выделенные из различных классов иммуноглобулинов. Например, антитела с увеличенными валентностями сайтов связывания антигена могут быть рекомбинантно получены клонированием антиген-связывающего сайта в векторы, несущие константные области цепи (иммуноглобулина) человека. Статья Аги1апапбат е! а1. (1993) 1. Ехр. Меб., 177: 1439-1450 включена здесь в качестве ссылки.

Кроме того, стандартные способы рекомбинантных ДНК могут быть использованы для изменения связывающих аффинностей рекомбинантных антител с их антигенами путем изменения аминокислотных остатков вблизи антиген-связывающих сайтов. Антиген-связывающая аффинность гуманизированного антитела может быть увеличена посредством мутагенеза на основе молекулярного моделирования. Публикация фиееп е! а1., (1989) Ргос. Ыаб. Асаб. 8сг 86:10029-33 включена здесь в качестве ссылки.

Е. Получение аналогов; получение измененных последовательностей ДНК и пептидов.

Аналоги ВАЕЕ-лиганда могут отличаться от природно встречающегося ВАЕЕ-лиганда в аминокислотной последовательности или иным образом, который не затрагивает последовательности, или же и тем, и другим. Не относящиеся к последовательности модификации включают в себя ш νίνο или ш νίΐτο химическую дериватизацию ВАЕЕ-лиганда. Не относящиеся к последовательности модификации включают в себя, не ограничиваясь ими, изменения ацетилирования, метилирования, фосфорилирования, карбоксилирования или гликозилирования.

Предпочтительные аналоги включают в себя биологически активные фрагменты ВАЕЕ-лиганда, последовательности которых отличаются от последовательности, даваемой в указанной в 8Еф ΙΌ N0: 2 последовательности, описанной в заявке с номером РСТ/и8 98/19037 (АО 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки, одной или несколькими консервативными заменами аминокислот или одной или несколькими неконсервативными заменами аминокислот, делециями или инсерциями, которые не устраняют активность ВАЕЕ-лиганда. Консервативные замены обычно включают в себя замену одной аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками, например замены в пределах следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.

С. Материалы и способы данного изобретения.

Использовали моноклональное антитело анти-Е1ад М2, биотинилированное антитело анти-Е1ад М2 и антитело анти-Е1ад М2, связанное с агарозой, марки 8щта. Реагенты для культуры клеток приобретали в Ь1Ее 8с1епсе§ (Ва§е1, 8\\йхег1апб) и Вю\\'1Ш1акег (Аа1кег5УЙ1е. ΜΌ). Е1ад-меченный АРКбЬ человека (остатки Кц₀-Ь₂₅₀) получали в 293-клетках, как описано (10, 11). Е1ТС-меченные антитела анти-СЭ4, антиΟΌ8 и анти-СЭ19 приобретали в Рйагтшдеп (8ап О1едо, СА). Козьи Е(аЬ')₂, специфичные для Γαμфрагмента 1дМ человека, приобретали в 1аск§оп 1ттипоК.е8еагсй (Ае§! Сгоме, РА). Вторичные антитела получали либо из Рйагтшдеп, либо из 1аск§оп 1ттипоК.е8еагсй и использовали в рекомендуемых разведениях.

293 Т (12)-клетки и линии фибробластных клеток почек эмбриона человека (табл. 1) поддерживали в ΌΜΕΜ, содержащей 10% инактивированную нагреванием фетальную телячью сыворотку (ФТС). 293клетки почек эмбриона человека поддерживали в ΌΜΕΜ-питательной смеси Е12 (1:1), дополненной 2% ФТС. Т-клеточные линии, В-клеточные линии и линии макрофагальных клеток (табл. 1) выращивали в ΚΓΜΙ, дополненной 10% ФТС. Клетки Μο1!-4 культивировали в среде Гсоу, дополненной 10% ФТС. Линии эпителиальных клеток выращивали в среде МЕМ-альфа, содержащей 10% ФТС, 0,5 мМ не

- 9 006108 незаменимых аминокислот, 10 мМ Ыа-Нерек и 1 мМ Ыа-пирувата. НИУЕС (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) поддерживали в среде М199, дополненной 20% ФТС, 100 мкг/мл фактора роста эпителиальных клеток (Со11аЫогабте Кекеагсй, 1по1ее11. ΩοΟίΚοη. 8\\йхег1апб) и 100 мкг/мл натриевой соли гепарина (8фта). Все среды содержали антибиотики пенициллин и стрептомицин. Лейкоциты периферической крови выделяли из гепаринизированной крови здоровых взрослых волонтеров посредством центрифугирования в градиенте Рацие-фиколла (Рйагтас1а, Ирр5а1а, 8^ебеп) и культивировали в КРМ1, 10% ФТС.

Т-клетки получали из неприкрепленных РВЬ розеткообразованием с обработанными нейраминидазой эритроцитами овцы и отделяли от не образующих розеток клеток (в основном В-клеток и моноцитов) центрифугированием в градиенте Рацие-фиколла. Очищенные Т-клетки активировали в течение 24 ч фитогемагглютинином (ФЭ) (8фта) (1 мкг/мл), промывали и культивировали в КРМ1, 10% ФТС, 20 Е/мл 1Ь-2. СИ 14* моноциты очищали путем магнитного сортинга клеток с использованием анти-СЭ14антител микрогранул, покрытых козьими антимышиными антителами и устройства М1штас8™ (МШепу1 Вю1ес11) и культивировали в присутствии СМ-С8Е (800 Е/мл, Ьеисотах®, Еккех СИет1е, Ьихет, 8\\йхег1апб) и 1Ь-4 (20 нг/мл, Ьисегпа Сйет, Ьихет, 8\\йхег1апб) в течение 5 дней, затем - в присутствии СМС8Е, 1Ь-4 и ΤΝΕΌΌ (200 Е/мл, Вепбег, У1еппа, АиЛпа) в течение дополнительных 3 дней для получения СО83*, популяции клеток, подобных дендритным клеткам. В-клетки человека со степенью чистоты >97% выделяли, как описано (13), из периферической крови или крови пуповины с использованием покрытых анти-СЭ19 магнитных гранул (М450, Цупа1, Ок1о, Νοητήν).

Нозерн-блот-анализ.

Нозерн-блот-анализ проводили с использованием Нозерн-блотов I и II многочисленных тканей человека (С1оп1ес11 #7760-1 и #7759-1). Мембраны инкубировали в растворе для гибридизации (50% формамид, 2,5 х ИепЕагб!, 0,2% ДСН, 10 мМ ЭДТА, 2 х 88С, 50 мМ ЫаН₂РО₄, рН 6,5, 200 мкг/мл обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося) в течение 2 ч при 60°С. Зонд антисмысловой ДНК, содержащий нуклеотиды, соответствующие аминокислотам 136-285 ИВАЕЕ, денатурировали нагреванием и добавляли при 2 х 10⁶ имп/мл в свежий раствор для гибридизации. Мембрану гибридизовали 16 ч при 62°С, промывали один раз в 2 х 88С, 0,05% ДСН (30 мин при 25°С), один раз в 0,1 х 88С, 0,1% ДСН (20 мин при 65°С) и экспонировали при -70°С на рентгеновских пленках.

Характеристика кДНК ВАРЕ.

Частичная последовательность кДНК ВАЕЕ человека содержалась в нескольких ΕδΤ-клонах (маркерных экспрессирующихся последовательностях) (например, с номерами доступа банка генов Т87299 и АА166695), полученных из библиотек фетальной печени и селезенки и рака яичников. 5'-фрагмент этой кДНК получали амплификацией 5'-КАСЕ-РСК. (ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК) (Мага1йоп-Кеабу сИЫА, С1оп1есй, Ра1о Айо, СА) с олигонуклеотидами АР1 и ΙΤ1013 (5'АСТСТТТСТТСТССАСССТСААСССС-3') |8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9] с использованием библиотеки кДНК, полученной из пула лейкоцитов человека в качестве матрицы, как рекомендовано изготовителем. Полученный ПЦР-продукт клонировали в РСК-0-ЫиЩ (1пуйгодеп, ЫУ Ьеек, Тйе Ые1йег1апб§) и субклонировали в виде ЕсоК1/Р8Й-фрагмента в вектор рТ7Т3 Рас (Рйагтаиа), содержащий Е8Т-клон Т87299. Таким образом, полноразмерную кДНК ВАЕЕ человека получали объединением 5'- и 3'-фрагментов с использованием внутреннего РкЦ-сайта ВАЕЕ. Этой последовательности был дан номер доступа СепВапк АЕ116456.

Частичная последовательность 617 п.н. мышиного ВАЕЕ содержалась в двух перекрывающихся Е8Т-клонах (АА422749 и АА254047). ПЦР-фрагмент, охватывающий нуклеотиды 158-391 этой последовательности, использовали в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК селезенки мыши (81га!адепе, Ьа 1о11а, СА).

Экспрессия рекомбинантного ВАЕЕ.

Полноразмерный ИВА ЕЕ амплифицировали с использованием олигонуклеотидов ТГ1069 (5'САСААССТТСССАССАТССАТСАСТССАСА-3') |8ЕО ГО ΝΟ: 10] и ТГ637 (5'АСТАСТСАСАССАСТТТСААТСС-δ') |8ЕО ГО ΝΟ: 11]. ПЦР-продукт клонировали в РСК-0-Ыип1 и повторно субклонировали в виде НтбШ/ЕсоК1-фрагмента в экспрессирующий вектор млекопитающих РСК-3. Короткую версию растворимого ВАЕЕ (аминокислоты О136-Е285) амплифицировали с использованием олигонуклеотидов ТГ636 (5'-СТССАСССТССАСААСАААСАС-3') |8ЕО ГО ΝΟ: 12] и ТГ637. Длинную версию растворимого ВАЕЕ (аминокислоты Е83-Ь285) получали из полноразмерного ВАЕЕ с использованием внутреннего Ркб-сайта. Растворимые ВАЕЕ повторно субклонировали в виде РШ/ЕсоК1фрагментов после сигнального пептида гемагглютинина и Е1ад-последовательности модифицированного вектора РСК-3 и в виде РШ/8ре1-фрагментов в модифицированный бактериальный экспрессирующий вектор рОЕ16 в рамке считывания с Ν-концевой Е1ад-последовательностью (14). Конструкции секвенировали на обеих цепях. Установление стабильных линий 293-клеток, экспрессирующих короткую растворимую форму или полноразмерный ВАЕЕ, и экспрессию и очистку рекомбинантного растворимого ВАЕЕ из клеток бактерий и 293-клеток млекопитающих выполняли, как описано (14, 15).

ПЦР с обратной транскриптазой.

Тотальную РНК, экстрагированную из Т-клеток, В-клеток, ш νίίτο полученных незрелых дендритных клеток, 293-клеток дикого типа и клеток 293-ВАЕЕ (полноразмерный), обратно транскрибировали с

- 10 006108 использованием системы Кеабу ΐο Со (РИаттас1а) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК БАРР и β-актина регистрировали при помощи ПЦР-амплификации с ДНК-полимеразой Тад (стадии 1 мин каждая при 94°С, 55°С и 72°С в течение 30 циклов) с использованием специфических олигонуклеотидов: для ВАРР, ^Т1322 5'-ССАСААСССААСТССАСТСАСААС-3' [8Ер ГО N0: 13] и ^Т1323 5'СААТТСАТССССАААСАСАТССАС-3' |8ЕР) ГО N0: 14]; для альфа-цепи ГО-2-рецептора, ЛТ1368 5'ТСССААСАСААССАААСААСТС-3' |8ЕР) ГО N0: 15] и 1Т1369 5'-СТТСТССТТСАССТС

САААСТСАСТС-3' |8ЕР) ГО N0: 16]; для β-актина, 5'-СССАТССТСАТССАСТССС-3' |8ЕР) ГО N0: 17] и 5'-ССТССААССТССАСАСССА-3' |8ЕР) ГО N0: 18].

Гель-фильтрация.

293Т-клетки временно трансфицировали короткой формой растворимого ВАРР и выращивали в бессывороточной среде 0рбтет в течение 7 дней. Кондиционированные супернатанты концентрировали в 20 раз, смешивали с внутренними стандартами каталазой и овальбумином и наносили на колонку 8ирегбех-200 НК10/30. Белки элюировали в ЗФР при 0,5 мл/мин и фракции (0,25 мл) осаждали трихлоруксусной кислотой и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Р1ад М2. Колонку калибровали стандартными белками: ферритином (440 кДа), каталазой (232 кДа), альдолазой (158 кДа), бычьим сывороточным альбумином (67 кДа), овальбумином (43 кДа), химотрипсиногеном А (25 кДа) и рибонуклеазой А (13,7 кДа).

Обработка пептид-Ы-глюканазой Р.

Пробы нагревали в 20 мкл 0,5% ДСН, 1% 2-меркаптоэтаноле в течение 3 мин при 95°С, затем охлаждали и дополняли 10% нонидетом Р-40 (2 мкл), 0,5 М фосфатом натрия, рН 7,5 (2 мкл) и пептид-Иглюканазой Р (125 единиц/мкл, 1 мкл, или без фермента в контролях). Пробы инкубировали в течение 3 ч при 37°С перед анализом с использованием Вестерн-блоттинга.

Секвенирование по Эдману.

293-Т-клетки временно трансфицировали длинной формой растворимого ВАРР и выращивали в бессывороточной среде 0рбтет в течение 7 дней. Кондиционированные супернатанты концентрировали в 20 раз, фракционировали электрофорезом в ДСН-ПААГ и блоттировали на поливинилидендифторидную мембрану (ВюКаб ЬаЬк, Негеи1е5. СА), как описано ранее (16), и затем секвенировали с использованием секвенатора с газовой фазой (АВ1 120А, Регкт Е1тег, РоЧег Сйу, СА), соединенного с анализатором (АВ1 120 А, Регкт Е1тег), снабженным колонкой фенилтиогидантоина С18 2,1 х 250 мм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения АВ1 610 (Регкт Е1тег).

Антитела.

Поликлональные антитела получали путем иммунизации кроликов (Ецтодеп1ес, 8еташд, Ве1дшт) рекомбинантным растворимым ВАРР. Селезенку крыс, иммунизированных тем же самым антигеном, сливали с мышиными миеломными клетками х63Ад8.653 и гибридому подвергали скринингу на ВАРРспецифические 1дС. Одним из этих моноклональных антител, 43.9, является 1дС2а, который специфически узнает ИБАРР.

Клетки окрашивали в 50 мкл РАС8-буфера (ЗФР, 10% ФТС, 0,02% №N3) 50 нг (или указанным количеством) Р1ад-меченного короткого растворимого ИВАРР в течение 20 мин при 4°С, с последующей обработкой антителом анти-Р1ад М2 (1 мкг) и вторичным антителом. Моноклональное анти-ВАРРантитело 43,9 использовали при 40 мкг/мл. Для двухцветного РАС8-анализа лимфоциты периферической крови окрашивали РЬАС-меченным растворимым ВАРР/длинным (2 мкг/мл), затем биотинилированным анти-Р1ад М2-антителом (1/400) и ФЭ-меченным стрептавидином (1/100), затем либо Р1ТС-меченным анти-СЭ4, анти-СЭ8, либо анти-СБ19.

Анализ пролиферации лейкоцитов периферической крови (РВЬ).

Лейкоциты периферической крови инкубировали в 96-луночных планшетах (10⁵ клеток на лунку в 100 мкл КРМ1, дополненной 10% ФТС) в течение 72 ч в присутствии или в отсутствие 2 мкг/мл козьего антитела против μ-цепи человека (81дта) или контроля Р(аЬ')₂ и с указанной концентрацией нативного или прокипяченного растворимого ВАРР/длинного. Клетки кратковременно метили (пульс-метка) в течение еще 6 ч |³Н] тимидином (1 мкКи на лунку) и собирали. Включение |³Н]тимидина регистрировали при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика. В некоторых экспериментах рекомбинантный растворимый ВАРР заменяли 293-клетками, стабильно трансфицированными полноразмерным ВАРР (или 293-клетками дикого типа в качестве контроля), которые фиксировали в течение 5 мин при 25°С в 1% параформальдегиде. Анализ проводили, как описано (17). В дополнительных экспериментах СГО19'клетки выделяли из РВЬ с магнитными гранулами, а оставшиеся СЭ19^--клетки облучали (3000 рад) перед воссоединением с СГО19'-клетками. Затем проводили анализ пролиферации с растворимым ВАРР, как описано выше.

Анализ активации В-клеток.

Очищенные В-клетки, как было описано (13), активировали в культуральной системе ЕЬ-4. Вкратце, 10⁴ В-клеток, смешанных с 5 х 10⁴ облученных мышиных клеток тимомы ЕЬ-4 (клона В5), культивировали в течение 5-6 дней в 200 мкл среды, содержащей 5% об./об. культуральных супернатантов Тклеток человека (10⁶/мл), которые были активированы в течение 48 ч с использованием ФГА (1 мкг/мл) и

- 11 006108

ФМА (1 нг/мл). Затем В-клетки повторно выделяли с использованием анти-СП19-гранул и культивировали в течение дополнительных 7 дней (5 χ 10⁴ клеток в 200 мкл, в двух или трех повторах культур в плоскодонных 96-луночных планшетах) только в среде или в среде, дополненной 5% супернатантами Тклеток, или с 50 нг/мл 1Ь-2 (любезный подарок из бывшего Института молекулярной биологии С1ахо, Сепеуа) и 10 нг/мл каждого из 1Ь-4 и 1Ь-10 (Рсрго1се11. Ьопбоп, ИК), в присутствии или в отсутствие кВАЕЕ. Добавляли антитело анти-Над М2 при концентрации 2 мкг/мл, которое само по себе воздействия не оказывало. 1дМ, 1дС и 1дА в культуральных супернатантах определяли количественно, как описано (13), при помощи анализов ЕЫ8А.

ВАРЕ человека идентифицировали по гомологии последовательности в качестве возможного нового члена семейства ΤΝΕ-лигандов при скрининге общественных баз данных с использованием поиска улучшенного профиля (18). кДНК, кодирующую полный белок из 285 аминокислот, получали объединением ΕδΤ-клонов (охватывающих З'-район) с фрагментом (5'-районом), амплифицированным при помощи ПЦР. Отсутствие сигнального пептида предполагало, что ВАРЕ был мембранным белком типа II, что является типичным для членов семейства ΤΝΕ-лигандов. Этот белок имел предсказанный цитоплазматический домен из 46 аминокислот, гидрофобный трансмембранный район и внеклеточный домен из 218 аминокислот, содержащий два потенциальных сайта Ν-гликозилирования (фиг. 1А). Последовательность внеклеточного домена ВАЕЕ показывает самую высокую степень гомологии с АРК1Ь (33% идентичности аминокислот, 48% гомология), тогда как идентичность с другими членами этого семейства, такими как ΤΝΕ, ЕакЬ, ЬТа, ТК.А1Ь или ΚΆΝΚΕ, ниже 20% (фиг. 1В, С). Клон кДНК мышиного ВАЕЕ, выделенный из библиотеки селезенки, кодировал несколько более длинный белок (309 аминокислот) вследствие вставки между трансмембранным районом и первой из нескольких β-цепей, которые составляют рецепторсвязывающий домен во всех членах ΤΝΕ-лигандов (19). Этот богатый β-цепями эктодомен является почти идентичным в мышином и человеческом ВАЕЕ (86% идентичность, 93% гомология), что предполагает, что ген ВАЕЕ был высококонсервативным во время эволюции (фиг. 1А).

Хотя члены ΤΝΕ-семейства синтезируются как вставленные в мембрану лиганды, часто наблюдается расщепление в районе стебля (ножки) между трансмембранным и рецептор-связывающим доменом. Например, ΤΝΕ или ЕакЬ легко отщепляются от поверхности клеток металлопротеиназами (20, 21). Хотя в 293Т-клетках продуцируется несколько форм рекомбинантного ВАЕЕ, авторы отмечают, что рекомбинантная растворимая форма 32 кДа ВАЕЕ (аминокислоты 83-285, кВАЕЕ/длинный), содержащая полный район стебля и Ν-концевую Е1ад-метку, кроме рецептор-связывающего домена, подвергались интенсивному процессингу до меньшего фрагмента в 18 кДа (фиг. 2 А, В). Расщепление имело место в районе стебля, поскольку этот фрагмент регистрировался только с помощью антител, индуцированных против полного домена ВАЕЕ, взаимодействующего с рецептором, но не с анти-Е1ад-антителами (данные не показаны). Также было выявлено, что только Ν124 (локализованный в стебле), но не Ν242 (локализованный в начале Ι-β-складчатой структуры) был гликозилирован, так как молекулярная масса непроцессированного кВАЕЕ/длинного уменьшалась с 32 до 30 кДа при удалении Ν-связанных углеводов пептидΝ-глюканазой Е, в то время как расщепленная форма 18 кДа была нечувствительной к этой обработке. Анализ пептидной последовательности фрагмента в 18 кДа действительно показал, что расщепление происходит между К.133 и А134 (фиг. 1А). К133 лежит в конце многоосновного района, который является консервативным между человеческим (Κ-Ν-К-К) и мышиным (Κ-Ν-К-К). Для тестирования того, не является ли расщепление лишь артефактом экспрессии растворимых, неприродных форм ВАЕЕ, мембраносвязанный полноразмерный ВАЕЕ экспрессировали в 293Т-клетках (фиг. 2С). Полный ВАЕЕ в 32 кДа и некоторые молекулярные частицы более высокой молекулярной массы (возможно, соответствующие недиссоциированным димерам и тримерам) легко определялись в клеточных экстрактах, но более 95% ВАЕЕ, извлеченного из супернатанта, соответствовали процессированной форме 18 кДа, что указывает на то, что ВАЕЕ процессировался также при синтезе в виде мембраносвязанного лиганда.

Конструировали растворимый ВАЕЕ (ОЕ36-Е285, кВАЕЕ/короткий), последовательность которого начиналась на 2 аминокислоты справа от сайта процессинга (фиг. 1В). Как предсказано, Е1ад-метка, присоединенная к Ν-концу этой рекомбинантной молекулы, не удалялась (данные не показаны), что позволяет ее очистку при помощи анти-Е1ад-аффинной колонки. Для испытания его на правильность укладки очищенный &ВАЕЕ/короткий анализировали гель-фильтрацией, при которой этот белок элюировался при средней молекулярной массе 55 кДа (фиг. 2Ό). кВАЕЕ/короткий правильно собирается в гомотример (3 χ 20 кДа) в соответствии с четвертичной структурой других членов ΤΝΕ-семейства (19). Наконец, непроцессированный кВАЕЕ/длинный легко экспрессировался в бактериях, что указывает на то, что событие расщепления было специфическим для эукариотических клеток.

Нозерн-блот-анализ ВАЕЕ выявил, что мРНК ВАЕЕ 2,5 т.п.н. была обильной в селезенке и РВЬ (фиг. 3А). Вилочковая железа, сердце, плацента, тонкая кишка и легкое обнаружили слабую экспрессию. Это ограниченное распределение предполагало, что клетки, присутствующие в лимфоидных тканях, были основным источником ВАЕЕ. Посредством ПЦР-анализа авторы нашли, что мРНК ВАЕЕ присутствовала в Т-клетках и происходящих из моноцитов периферической крови дендритных клетках, но не в В

- 12 006108 клетках (фиг. 3В). Даже не подвергнутые воздействию нестимулированные Т-клетки, по-видимому, экспрессируют некоторое количество мРНК ΒΑΡΡ.

Меченный последовательностью сайт (8Т8, 8НСС-36171) был обнаружен в базе данных: этот сайт включал в себя ΒΆΡΡ-последовательность человека. Сайт картирован на хромосоме 13 человека, в интервале 9сМ между маркерами Ό138286 и Ό1381315.

На цитогенетической карте этот интервал соответствует 13с.|32-34. Из известных членов семейства ΤΝΡ-лигандов только ΚΑΝΚΕ (Тгапсе) был локализован в этой хромосоме (22), хотя достаточно далеко от ΒΑΡΡ (13ς14).

Для того чтобы этот лиганд проявил максимальные биологические эффекты, по-видимому, было необходимо, чтобы ΒΆΡΡ-рецептор (ΒΑΡΡ-К) экспрессировался либо на тех же самых клетках, либо на соседних клетках, присутствующих в лимфоидных тканях. С использованием рекомбинантного δΒΑΡΡ в качестве инструмента для специфического определения экспрессии ΒΑΡΡ-К при помощи РАС8 авторы действительно обнаружили высокие уровни экспрессии рецептора в различных линиях В-клеток, таких как Кар и Β1ΑΒ лимфомы Беркита (фиг. 4А, табл. 1). В противоположность этому, все клеточные линии Т-клеток фибробластного, эпителиального и эндотелиального происхождения были отрицательными. Очень слабое окрашивание наблюдали с линией моноцитов ТНР-1, которая, однако, могла быть ответственной за связывание Рс-рецептора. Таким образом, экспрессия ΒΑΡΡ-К, по-видимому, ограничена Вклеточными линиями. Испытанные В-клеточные линии двух мышей были отрицательными при использовании ΒΑΡΡ человека в качестве зонда, хотя слабое связывание наблюдали на мышиных спленоцитах (данные не показаны). Присутствие ΒΑΡΡ-К на В-клетках было подтверждено анализом лимфоцитов пуповинной и периферической крови. В то время как СЭ8' и СЭ4⁺ Т-клетки не содержали ΒΑΡΡ-К (фиг. 4В и неприведенные данные), обильное окрашивание наблюдали на СЭ19' В-клетках (фиг. 4А и 4В), что указывало на то, что ΒΑΡΡ-К экспрессируется на всех В-клетках крови, в том числе не подвергнутых воздействию и обладающих памятью на антиген.

Поскольку ΒΑΡΡ связан с происходящими из крови В-клетками, проводили эксперименты для определения того, могли бы этот лиганд доставлять стимулирующие или ингибирующие рост сигналы. Лимфоциты периферической крови (ΡΒΕ) стимулировали антителами анти-1дМ (μ) вместе с фиксированными 293-клетками, стабильно экспрессирующими поверхностный ΒΑΡΡ (фиг. 5А). Уровни включения [³Н]тимидина, индуцированные только анти-μ, не изменялись в присутствии контрольных клеток, но увеличивались в два раза в присутствии ΒΑΡΡ-трансфицированных клеток (фиг. 5В). Зависимую от дозы пролиферацию ΡΒΕ получали также при замене ΒΑΡΡ-трансфицированных клеток очищенным δΒΑΡΡ (фиг. 5С), что указывало на то, что ΒΑΡΡ не требует прикрепления к мембране для проявления его активности. В этой структуре эксперимента пролиферация индуцировалась требуемыми концентрациями 8СО40Ь, превышающими 1 мкг/мл, но была менее зависимой от присутствия анти-μ, чем пролиферация, опосредованная ΒΑΡΡ (фиг. 5Ό). При сокультивировании очищенных СЭ19' В-клеток с облученными аутологичными СЭ19^- ΡΒΕ костимуляция пролиферации под действием ΒΑΡΡ не изменялась, что свидетельствовало о том, что поглощение [³Н]тимидина было в основном обусловлено пролиферацией Вклеток, а не опосредованной стимуляцией другого типа клеток (данные не показаны). Наблюдаемая пролиферация В-клеток в ответ на ΒΑΡΡ была полностью зависимой от присутствия анти-р-антител. что указывало на то, что ΒΑΡΡ функционировал в качестве костимулятора пролиферации В-клеток.

Для исследования возможного действия ΒΑΡΡ на секрецию иммуноглобулинов очищенные Вклетки периферической или пуповинной крови предварительно активировали сокультивированием с Тклетками ЕЬ-4 в присутствии смеси цитокинов из супернатантов ФГА/ФМА-стимулированных Т-клеток (23). Эти В-клетки повторно выделяли со степенью чистоты 98%, и они давали двукратное увеличение секреции 1д во время вторичного культивирования в присутствии ΒΑΡΡ и цитокином активированных Тклеток, в сравнении с уровнем секреции в присутствии одних только цитокинов. Очень умеренное действие имело место в отсутствие экзогенных цитокинов, и промежуточное действие (в 1,5 раза) наблюдали в присутствии рекомбинантных цитокинов 1Ь-2, 1Б-4 и 1Б-10 (фиг. 5Е, 5Ρ).

Биохимический анализ ΒΑΡΡ также согласуется с типичной гомотримерной структурой членов ΤΝΡ-семейства. Среди этого семейства лигандов ΒΑΡΡ проявляет самый высокий уровень сходства последовательности с ΑΡΚΙΕ, который авторы недавно охарактеризовали как лиганд, стимулирующий рост различных опухолевых клеток (11). В отличие от ΤΝΡ и ЬТа, которые являются двумя членами семейства с одинаково высокой степенью гомологии (33% идентичность) и гены которых связаны с хромосомой 6, ΑΡΚΙΕ и ΒΑΡΡ не кластеризованы на одной и той же хромосоме. ΑΡΚΙΕ локализован на хромосоме 17 (Ι.Ε.Β., неопубликованные данные), тогда как ΒΑΡΡ картирован на дистальном плече хромосомы 13 человека (13μ34). Отклонения в этом локусе характеризуются в случае лимфомы Беркитта в качестве второго наиболее частого дефекта (24), кроме транслокации тус гена в локус 1д (25). С учетом высоких уровней экспрессии ΒΑΡΡ-К на всех анализируемых клеточных линиях лимфомы Беркитта (см. табл. 1) поднимается вопрос об интригующей возможности того, что некоторые лимфомы Беркитта могут иметь нарушенную регуляцию экспрессии ΒΑΡΡ, стимулируя таким образом рост аутокринным образом.

- 13 006108

Роль антиген-специфических В-лимфоцитов во время различных стадий иммунной реакции сильно зависит от сигналов и контактов из Т-хелперных клеток и антигенпредставляющих клеток, таких как дендритные клетки (20). В-лимфоциты сначала получают эти сигналы на ранних стадиях иммунной реакции, когда они взаимодействуют с Т-клетками в краевой зоне В-клеточных фолликулов в лимфоидной ткани, что приводит к их пролиферации и дифференцировке в клетки, продуцирующие антитела с низкой аффинностью (18). В то же самое время некоторые антиген-специфические В-клетки мигрируют также к В-клеточному фолликулу и способствуют образованию зародышевых центров, другого сайта пролиферации В-клеток, но также аффинному созреванию и генерированию памяти В-клеток и высокоаффинных плазматических клеток (19).

Было показано, что сигналы, запускаемые другим членом суперсемейства ΤΝΕ СО40Ь, являются решающими для функции В-лимфоцитов на многих стадиях зависимой от Т-клеток иммунной реакции. Однако ряд исследований ясно показал, что взаимодействие 0Ό40Τ/ί.Ό40 не является ответственным за всю контактзависимую помощь Т-клеток в отношении В-клеток. Действительно, было показано, что СО40Ь-недостаточные Т-клетки, выделенные у мышей нокаут или у пациентов с Х-связанным гипер^М-синдромом, успешно индуцируют пролиферацию В-клеток и их дифференцировку в плазматические клетки. Исследования с использованием блокирующих антител против СО40Ь показали, что субпопуляция положительных в отношении поверхностного ЦО В-клеток, выделенная из миндалин человека, пролиферирует и дифференцируется в ответ на активированные Т-клетки СО40-независимым образом. Было показано, что другие члены ΤΝΕ-семейства, такие как мембраносвязанные ΤΝΕ и СП30Ь, участвуют в независимой от 0Ό40 и поверхностного Ц стимуляции В-клеток. Подобно результатам авторов данного изобретения, полученным с ВАТТ, было показано, что СЭ40-дефицитные В-клетки могут быть стимулированы к пролиферации и дифференцировке в плазматические клетки хелперными Т-клетками до тех пор, пока рецепторы поверхностных Ц запускаются в одно и то же время. ВАТТ, также как СО30Ь и СП40Ь, экспрессируется Т-клетками, но его оригинальность состоит в его экспрессии дендритными клетками, а также в высокоспецифической локализации его рецептора на В-клетках, в противоположность ί.Ό40, СЭ30 и ΤNТ-рецептору, экспрессия которого была описана на многих различных клетках. Это наблюдение предполагает независимые и специфические ВАТТ-индуцируемые функции на Вклетках.

В поддержку роли ВАТТ в индуцированном Т-клетками и дендритными клетками росте и потенциальном созревании В-клеток авторы обнаружили, что ВАТТ костимулирует пролиферацию полученных из крови В-клеток одновременно со сшиванием В-клеточных рецепторов и, следовательно, независимо от передачи сигнала 0Ό40. Кроме того, с использованием СП19-положительных В-клеток, дифференцированных ίη νίίτο в подобные предшественникам плазматических клеток/СС В-клетки (14), авторы наблюдали костимулирующее действие ВАТТ на секрецию Ц этими В-клетками в присутствии супернатанта от активированных Т-клеток или смеси ГТ-2, ГТ-4 и ГЬ-10. Интересно, что костимулирующее действие было более сильным в присутствии супернатанта активированных Т-клеток в сравнении со смесью цитокинов, что предполагает, что дополнительные растворимые факторы, секретируемые Т-клетками, участвуют в продуцировании антител, которые могут действовать синергично с ВАТТ или же могут дополнять действие ВАТТ. Таким образом, возможно, что ВАТТ активно способствует дифференцировке СС-подобных В-клеток в плазме.

Ясно, что ВАТТ может передавать сигнал как в не подвергнутых воздействию В-клетках, так и в СС-коммитированных В-клетках ίη νίίτο. Будет ли это наблюдение соблюдаться во время нормального иммунного ответа или не будет, должно быть проверено надлежащими экспериментами ίη νίνο.

Биологические ответные реакции, индуцируемые ВАТТ в В-клетках, отличаются от реакций СП40Ь, так как пролиферация, запускаемая СП40Ь, была менее зависимой от костимула анти-μ (17) (и фиг. 5Ό). Кроме того, СО40Ь может противостоять апоптотическим сигналам в В-клетках после того, как займет рецептор В-клеток (29), тогда как ВАТТ не способен спасти В-клеточную линию Ваток от антиμ-опосредованного апоптоза, несмотря на тот факт, что клетки Ваток действительно экспрессируют ВАТТ-В (табл. 1; и ТЬ.В., неопубликованные наблюдения). Таким образом, вероятно, что СО40Ь и ВАТТ выполняют различные функции. В этом отношении заслуживает внимания то, что ВАТТ не взаимодействовал ни с одним из испытанных 16 рекомбинантных рецепторов ΤΝΓ-семейства, в том числе СЭ40 (Р.8. и Ι.Τ., неопубликованные наблюдения).

Рост В-клеток эффективно костимулировался рекомбинантным ВАТТ, лишенным трансмембранного домена. Эта активность отличается от таковой нескольких членов ΤΝΓ-семейства, которые являются активными только в виде мембраносвязанного лиганда, таких как 'ГВАЮ, ТакЬ и СО40Ь. Растворимые формы этих лигандов обладали слабой биологической активностью, которую можно было усилить их перекрестным сшиванием, имитированием посредством этого мембраносвязанного лиганда (15). В противоположность этому, перекрестное сшивание Т1ад-меченного кВАТТ с анти-Т1ад-антителами или использование мембраносвязанного ВАТТ, экспрессируемого на поверхности эпителиальных клеток, дополнительно не усиливало митогенную активность ВАТТ, что предполагает, что он может действовать системно в виде секретируемого цитокина, подобно ΤΝΡ.

- 14 006108

Это согласуется с наблюдением, что полиосновная последовательность, присутствующая в стебле БАРР, выступала в качестве субстрата для протеазы. Подобные полиосновные последовательности присутствуют также в соответствующих положениях как в АРШЬ, так и ТХУЕАК. и для каждого из них имеется доказательство протеолитического процессинга (30) (Ν.Η. и РТ.. неопубликованное наблюдение). Хотя протеазу, ответственную за расщепление, еще следует определить, она вряд ли является металлопротеиназой, ответственной за высвобождение мембраносвязанного ΤΝΡ, так как их расщепляемые последовательности полностью отличаются друг от друга (21). Полиосновные мотивы в В АРР (Β-Ν-Κ-Β), АРК1Ь (В-К-В-В) и Тетеак (В-Р-В-В) напоминают минимальный сигнал расщепления для фурина (В-ХК/В-В), прототипа семейства пропротеинконвертазы (31).

При реализации данного изобретения будут использованы, если нет иных указаний, общепринятые способы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК, белковой химии и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации специалистов в данной области. Такие способы описаны в литературе. См., например. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2^пй еййюп (8атЬгоок, РгНксН апй Машайк, ейк.), Со1й 8рппд НатЬот ЬаЬога!огу Ргекк, 1989; ΩΝΛ С1ошпд, Уокцпек I апй II (Ό.Ν. С1оует, ей.), 1985; Ойдопис1еоййе 8уп1Век15, (М.1. Сай, ей.), 1984; и.8. Ра!еп1 №. 4683195 (МцШк е! а1.); №с1ек Ас1й НуЬпй|/а1юп (Β.Ό. Натек апй 8.1. Шддшк, ейк.), 1984; Тгапкспрйоп апй Ттапк1а1юп (Β.Ό. Натек апй 8.1. Шддтк, ейк.), 1984; СиЙите оГ Ашта1 Се11к (Β.Ι. Ртекйпеу, ей.), А1ап В. Ыкк, 1пс., 1987; ЕптоЫШхей Се11к апй Еп/утек, 1ВЬ Ргекк, 1986; А Ргасйса1 Сшйе Ю Мо1еси1аг С1ошпд (В. РегЬа1), 1984; Ме1йойк ш Епхуто1оду, Уо1итек 154 апй 155 (\Уи е! а1., ейк). Асайетк Ргекк, №\ν Уогк; Сепе ТгапкГег УесЮгк Гог Маттайап Се11к (1.Н. Мй1ег апй М.Р. Са1ок, ейк.), 1987, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬотакгу; 1ттипосйетка1 МеИойк т Се11 апй Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апй ^а1кег, ейк.). Асайетк Ргекк, Ьопйоп, 1987; НапйЬоок оГ Ехрептеп! 1ттипо1оду, Уо1итек Ι-Ιν (ΌΜ. ^е(г апй С.С. В1аск\се1к ейк.), 1986; Матри1а!тд !1е Мойке ЕтЬгуо, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогакгу Ргекк, 1986.

Следующие примеры приведены для иллюстрации данного изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его.

Примеры

В примерах 1-6 использованы следующие экспериментальные процедуры.

ДНК-конструкция для получения содержащих мышиный ВАРР трансгенных мышей (ВАРР-Тдмышей).

кДНК-последовательности как мышей, так и человека были описаны ранее (8сйпе1йет е! а1., 1999). ПЦР-фрагмент, кодирующий полноразмерный мышиный ВАРР, генерировали посредством ОТ-ПЦР. Первую цепь кДНК синтезировали из полиА+ (С1оп1есй, Ра1о А1!о, СА) с использованием олиго йТ в соответствии с протоколом изготовителя (С1ЬсоВВЬ, Сгапй 1к1апй, ΝΥ). ПЦР-реакция содержала 1 х РГибуфер (8!та!адепе, Ьа 1о1а, СА), 0,2 мМ йЭТР, 10% ДМСО, 12,5 пМ праймеры, 5 единиц РГи-фермента (81та1адепе) и следующие праймеры с сайтами рестрикции №П 5'-ТААСААТССССССССССА АТССАТСАСТСТССААА-3' |8ЕС ΙΌ ΝΟ: 19] и 5'-ТААСААТСССССССССССАТСАСССАС ТССАССАА-3' |8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20]. Матрицу амплифицировали в течение 30 циклов при 94°С в течение 1 мин, 54°С в течение 2 мин и 72°С в течение 3 мин, с последующим 10-минутным удлинением при 72°С. Эта последовательность соответствует нуклеотидам 214-1171 реестра банка генов АР119383. ПЦРфрагмент расщепляли №Й и затем клонировали в модифицированный вектор рСЕР4 (1пуйтодеп, Саг1кЬай, СА). Фрагмент, содержащий мышиный ВАРР, удаляли ХЬа1 для включения последовательности сайта присоединения полиА 8ν40. Этот фрагмент клонировали в вектор на основе рИС, где была добавлена промоторная последовательность. Промотор, затупленный Вд12-№Й-фрагмент в 1 т.п.н., содержащий энхансер АроЕ человека и ААТ-промотор (промотор альфа-антитрипсина) очищали из плазмидного клона 540В (подарок доктора КаШеппе Рагкег Ропйег, \Уак1нпд1оп ИшуеткИу, 8ΐ. Ьошк, МО). ЕсоВ^Вд12-фрагмент очищали из конечного вектора и использовали для получения трансгенных мышей. Инъецированного потомка мышей Р1 (ВИР1) (самка С57ВЬ/61 х самец ИВАШ) обратно скрещивали с мышами С57ВЬ/6. Способы микроинъекции и получения трансгенных мышей были описаны ранее (МскшдЫк е! а1., 1983).

Аналитические методы.

Пробы сыворотки подвергали восстанавливающему электрофорезу в ДСН-ПААГ с использованием линейного 12,5% геля. Тотальную РНК из печени мышей получали и обрабатывали для Нозерн-блотанализа с использованием набора для выделения из Рготеда (Майкоп, XVI) в соответствии с указаниями изготовителя. ВАРР-трансгенспецифическую мРНК регистрировали с помощью зонда, охватывающего полиА-хвост 8ν40 трансгенной конструкции, и получали путем расщепления модифицированного вектора рСЕР4 ХЬа1 и ВатН1. Этот зонд узнает полосу 1,8-2 кДа, соответствующую мРНК из ВАРРтрансгена. ПЦР-анализ хвостовой части ДНК из ВАРР-Тд-мышей проводили с использованием 12,5 пМ следующих праймеров:

5'-ССАСТТТСАСАСССАТСТССТ-3' |8ЕС ΙΌ ΝΟ: 21] и 5'-СТСТСССТТСССТСАААТСТС-3' |8ЕО ΙΌ ΝΟ: 22] - в реакции, содержащей 1 х буфер для полимеразы Тад (81та1адепе), 0,2 нМ й№ТР, 10% ДМСО и 5 единиц полимеразы Тад (8!та!адепе). 719 п.н. трансгена амплифицировали в течение 35 цик

- 15 006108 лов при 94°С в течение 30 с, 54°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1,5 мин, с последующим 10минутным удлинением при 72°С.

Присутствие белков в моче мыши измеряли с использованием полосок с реагентами (стрипов) МиШкйх 108С для анализа мочи (Вауег Согрогабоп, Б1адпокбск Όίνίκίοη, Е1ккаг1, ΙΝ).

Анализ клеточных популяций (Се11-буп) в крови и цитофлуориметрический анализ (ЕАС8) (анализ с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции).

Дифференциальный подсчет числа клеток свежей цельной крови, обработанной ЭДТА против коагуляции цельной крови определяли с использованием прибора АЬЬо1 Се11 Бупе 3500 (СЫсадо, 1Ь). Для ЕАС8-анализа использовали флуоресцеин (Е1ТС)-, Су-сЬготе- и фикоэритрин (ФЭ)-меченные крысиные антимышиные антитела; анти-В220, анти-СБ4, анти-СБ8, анти-СБ43, анти-1дМ, анти-СБ5, анти-СБ25, анти-СБ24, анти-СБ38, анти-СБ21, анти-СБ44, анти-Ь-селектин и набор анти-Вс1-2 хомячка/контрольный 1д хомячка фирмы РЬагштдеп (8ап Б1едо, СА). Получение рекомбинантной Е. сой, а также происходящих из клеток млекопитающих человеческого и мышиного Е1ад-меченного ВАЕЕ описано ранее (8сЬпе1бег е1 а1., 1999). Все антитела использовали в соответствии с описаниями изготовителя. РВЬ очищали из крови мыши следующим образом: кровь мыши собирали в микропробирки, содержащие ЭДТА, и разводили 1/2 ЗФР. Пятьсот мкл разведенной крови наносили на поверхность 1 мл фиколла (Се1агбапе, НогпЬу, ОШапо, Сапаба) в стеклянной пробирке на 4 мл, градиент центрифугировали при 2000 об./мин в течение 30 мин при комнатной температуре, и поверхность раздела, содержащую лимфоциты, собирали и промывали дважды в ЗФР перед ЕАС8-окрашиванием. Селезенку, костный мозг и мезентериальные лимфатические узлы растирали в суспензию отдельных клеток в среде ВРМ1 (Ы£е ТесЬпо1од1ек, 1пс., Сгапб 1к1апб, ΝΥ) и промывали в ЕАС8-буфере (ЗФР, дополненном 2% фетальной телячьей сывороткой (ЖН Вюкшепсек, Ьепеха, К8). Клетки сначала суспендировали в ЕАС8-буфере, дополненном следующими блокирующими реагентами: 10 мкг/мл 1д человека (8апбох, Ваке1, 8\\'Цхег1апб) и 10 мкг/мл антимышиного блокирующего Ес-антитела (РЬагттдеп) и инкубировали 30 мин на льду перед окрашиванием меченными флуорохромом антителами. Все антитела разводили в ЕАС8-буфере с указанным выше блокирующим реагентом. Пробы анализировали с использованием цитофлуориметра ЕАС8сап (Вес1оп Бккткоп).

Регистрация общего мышиного 1д и ревматоидных факторов в сыворотках мышей с использованием ЕЬ18А-анализов.

ЕЬ18А-планшеты (Согшпд д1акк теогкк, Согшпд, ΝΥ) покрывали в течение ночи при 4°С раствором 10 мкг/мл козьих антител против общего мышиного 1д (8ои111егп В1о1есЬпо1оду Аккос1а1ек, 1пс., В1гтшдЬат, АЬ) в 50 мМ натрий-бикарбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали 3 раза ЗФР/0,1% Твин и блокировали в течение ночи 1% желатином в ЗФР. Сто мкл на лунку серийных разведений сыворотки или стандартных разведений добавляли к планшетам и выдерживали в течение 30 мин при 37°С. Мышиные 1д детектировали с использованием 100 мкл на лунку раствора 1 мкг/мл меченных щелочной фосфатазой (АР) козьих антител против общего мышиного 1д (8ои111егп В1о1есЬпо1оду Аккос1а1ек) в течение 30 мин при 37°С. После последней промывки 3 раза ЗФР/0,1% Твин ферментативную реакцию проявляли с использованием раствора 10 мкг/мл паранитрофенилфосфата (ВоеЬппдег МаппЬет, 1пб1апаро11к, ΙΝ) в 10% диэтаноламине. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 3н. №1ОН на лунку. Оптическую плотность (О.Б.) измеряли при 405 нм с использованием спектрофотометра из Мо1еси1аг Бег1сек (8иηηуνа1е, СА). Стандартные кривые получали с использованием очищенного мышиного 1д, полученного из 8ои111егп Вю1ес11по1оду Аккос1а1ек. В случае регистрации ревматоидных факторов (ВЕ) планшеты покрывали нормальным козьим 1д (1асккоп 1ттипоВекеагсЬ 1аЬога1опек, 1пс., Аек1 Сгоге, РА) вместо козьих антител против мышиного 1д, и регистрацию мышиного 1д выполняли, как описано выше. Регистрацию мышиных изотипов в ВЕ-анализе выполняли с использованием меченных щелочной фосфатазой (АР) козьих антител против мышиных 1дА, 1дМ, 1дС2а, 1дС2Ь и 1дС3, а также очищенных мышиных 1дА, 1дМ, 1дС2а, 1дС2Ь и 1дС3 для стандартных кривых (8ои111егп Вю1ес11по1оду Аккос1а1ек, 1пс.). Все статистические сравнения выполняли с использованием дисперсионного анализа.

Регистрация циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и преципитация криоглобулинов в сыворотках мышей.

Этот анализ проводили, как описано ранее (1ипе е1 а1., 1979; 8тдЬ апб Тшд1е, 1982), со следующими модификациями: ЕЬ18А-планшеты (Согшпд д1акк теогкк) покрывали в течение ночи при 4°С 5 мкг/мл С1с.| человека (0шбе1, 8ап Б1едо, СА) в 50 мМ натрийбикарбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали 3 раза ЗФР/0,1% Твин. Пятьдесят мкл на лунку 0,3 М ЭДТА добавляли к этим планшетам плюс 50 мкл на лунку серийных разведений сыворотки или растворов известных концентраций стандартного иммунного комплекса (пероксидаза-мышиное антитело против пероксидазы (РАР) из БАКО (Сагрт1епа, СА)). Планшеты инкубировали 30 мин при 37°С. Планшеты промывали 3 раза смесью ЗФР/0,1% Твин. Мышиный 1д в иммунных комплексах детектировали с использованием 100 мкл на лунку раствора 1 мкг/мл меченного щелочной фосфатазой (АР) козьего антитела против мышиного 1д (8ои111егп Вю1ес11по1оду Аккос1а1ек, 1пс.), как описано выше для анализов ЕЬ18А. Криоглобулины детектировали инкубированием в течение ночи при 4°С мышиной сыворотки, разведенной водой 1/15, и преципитаты оценивали визуально.

- 16 006108

Анализ антител против двухцепочечной (бе) и одноцепочечной (ее) ДНК.

Анализ анти-ееДНК проводили с использованием планшетов ЦиЦСбтшипо Р1а1е Мах18огр (ΝυΝί.’ А/8, Эептагк). Планшеты покрывали в течение ночи при 4°С сначала 100 мкг/мл метилированного БСА (С.’а1Ыос11ет Согр., Ьа 1о11а, СА), затем 50 мкг/мл ДНК тимуса теленка, степень чистоты Г (81дта, 81. Боше, МО). ДНК тимуса теленка подвергали сдвиговым силам посредством обработки ультразвуком и затем расщепляли нуклеазой 81 перед использованием. Для анализа анти-ееДНК эту ДНК кипятили в течение 10 мин и охлаждали на льду перед использованием. После блокирования серийные разведения проб сывороток добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Аутоантитела детектировали козьими меченными щелочной фосфатазой (АР) антителами против мышиного ГдС (81дта) и проявляли, как описано выше для анализов ЕЫ8А. Стандартные кривые получали с использованием известных количеств моноклонального антитела 205 против ДНК, которое является специфичным как для ееДНК, так и для беДНК (Иайа е1 а1., 1987).

Иммуногистохимия.

Селезенку и лимфатические узлы замораживали в среде для заливки препаратов О.С.Т. (Мбее, Е1к11ай, ГЦ) и монтировали для приготовления срезов в криостате. Срезы толщиной 7-10 мкм сушили и фиксировали в ацетоне. Все инкубации антител (10 мкг/мл) выполняли в течение 1 ч при комнатной температуре в увлажненном боксе после разведения в забуференном Трис солевом растворе А (ТВ8-А, 0,05 М Трис, 0,15 М ЦаС1, 0,05% Твин-20 (об./об.), 0,25% БСА), промывали в ТВ8-В (0,05 М Трис, 0,15 М №1С'1, 0,05% Твин-20) и фиксировали 1 мин в метаноле перед инициацией ферментативной реакции. Активности пероксидазы хрена (НКР) и щелочной фосфатазы (АР) проявляли с использованием набора с субстратом в виде таблетки диаминобензидина (ИАВ) (81дта) и смеси 5-бром-4-хлор-3индолилфосфата/нитрокрасителя тетразолиевого синего (ВСГР/ЦВТ, Р1егсе, КоскЕогб, ГЬ) соответственно. Окрашенные срезы тканей в конце концов фиксировали 5 мин в метаноле и контрастно окрашивали с использованием 61етеа (Е1ика, Виске, 8\\йхег1апб). Меченные биотином антитела крысиный анти-В220, анти-СИИс, антисиндекан-1, а также немеченые крысиный анти-СО4, анти-СЭ8а и анти-СИ8в приобретали у Рбагтшдеп. Меченный биотином агглютинин земляного ореха (РЦА) получали в Уес1ог ЬаЬога1обее (Вигбпдате, СА). Меченное пероксидазой хрена мышиное антитело против крысиного Гд и меченный пероксидазой хрена стрептавидин приобретали в 1аскеоп ГттипоКеееагск 1аЬога1опее. Гпс., а АРмеченный стрептавидин - в 8ои1йегп Вю1ес11по1оду Аееос1а1:ее, Гпс. В случае иммуногистохимии на ткани почки для обнаружения отложений Гд использовали парафиновые срезы, удаляли из них парафин и блокировали их с использованием разведенной лошадиной сыворотки из Уес1ог (Вигбпдате, СА) с последующим окрашиванием НКР-козьими антителами против мышиного Гд из 1аскеоп ГттипоКеееагск. Детектирование выполняли, как описано выше.

Пример 1. ВАЕЕ-трансгенные (ВАЕЕ-Тд) мыши-основатели имеют отклоняющийся от нормы фенотип.

Полноразмерный мышиный ВАЕЕ экспрессировали в трансгенных мышах с использованием специфичного для печени промотора альфа-1-антитрипсина с энхансером АРО Е. Выбирали полноразмерную версию ожидания, что ВАЕЕ мог быть либо расщепленным и действовать системно, либо, что если бы он сохранялся в мембраносвязанной форме, наблюдались бы локальные специфичные для печени отклонения, возможно, обеспечивающие ключ к разгадке функции. Авторы получили 13 мышейоснователей, положительных в отношении ВАЕЕ-трансгена (табл. 2). Четверо из этих мышей умерли в молодом возрасте. Обычную патологию выполняли на мышах 811 и 816 (табл. 2). Не было явной инфекции у этих мышей, однако, сердечно-сосудистые и почечные отклонения были заметными, и они были сходны с отклонениями, описанными в случаях тяжелой гипертонии (Ей, 1995) (табл. 2). Окрашенные гематоксилином и эозином (Н&Е) срезы тканей почек основателя 816 показали, что морфология почечных клубочков у этой мыши была патологической, в то время как остальная ткань почки казалась нормальной (данные не показаны). Многие ВАЕЕ-трансгенные мыши-основатели имели протеинурию (табл. 2). Иммуногистохимия на замороженных срезах тканей селезенки мыши 816 выявила аномальное и сильное окрашивание В-клеток и уменьшенное окрашивание Т-клеток, и это наблюдение подтверждалось у потомства (см. ниже, фиг. 12).

С использованием двухцветного ЕАС8-анализа рассчитывали отношение % В220-положительных В-клеток на % СИ4-положительных Т-клеток. Это отношение было в 2-7 раз более высоким у ВАЕЕ-Тдмышей-основателей в сравнении с контрольными отрицательными ВИЕ1-мышами (табл. 2), что предполагает увеличение популяции В-клеток у ВАЕЕ-Тд-мышей. Авторы выбрали девять из этих мышейоснователей для генерирования различных линий трансгенных мышей, подчеркнутых в табл. 2. Ни одна из остальных ВАЕЕ-Тд-мышей-основателей или полученное из них потомство не обнаружили никаких признаков ухудшения состояния здоровья в течение месяцев после ранней смерти основателей 696, 700, 811 и 816, что предполагает, что эти 4 мыши, возможно, экспрессировали более высокие уровни ВАЕЕ, которые вызвали их смерть. Сверхэкспрессия ВАЕЕ в печени трансгенных мышей была подтверждена Нозерн-блот-анализом (данные не показаны). У всех ВАЕЕ-Тд-мышей, испытанных гистологически, в печени не обнаружили отклонений от нормы: это указывает на то, что локальная сверхэкспрессия ВАЕЕ не индуцировала никаких иммунологических или патологических явлений. ЕЬГ8А-анализ на мышиный

- 17 006108

ВЛЕЕ не проводился, однако, авторы показали, что 2% сыворотка из ВАΡЕ-Τд-мышей, но не из контрольных мышей, блокировала связывание полученного из клеток млекопитающего мышиного растворимого Иад-меченного ВАΡЕ с клетками В1АВ. Кроме того, 5% сыворотка ВАΡЕ-Τд-мышей, но не контрольных мышей, увеличивала пролиферацию В-клеток человека из РВЬ в присутствии анти-μ (данные не показаны). Эти данные предполагают, что существенные количества растворимого ВАΡΡ присутствуют в крови ВАΡЕ-Τд-мышей.

Пример 2. Периферический лимфоцитоз у ВАΡЕ-Τд-мышей происходит за счет повышенного количества В-клеток.

Было обнаружено, что популяция трансгенных мышей имеет больше лимфоцитов в крови в сравнении с контрольными отрицательными однопометными животными: их количество достигает таких высоких величин как 13000 лимфоцитов/мкл крови (фиг. 7А). В противоположность этому, число гранулоцитов на мкл крови как у ВАΡЕ-Τд-мышей, так и у контрольных мышей оставалось в нормальных пределах (фиг. 7А). Поскольку БАС8-анализ с использованием антител анти-СО4 и анти-В220 клеток периферической крови (РВЬ) 18 ВАΡЕ-Τд-мышей, потомков шести различных мышей-основателей, показал увеличенные отношения В/Т (фигуры 7В и 7С), повышенные уровни лимфоцитов были результатом увеличенной субпопуляции В-клеток. Подобным образом с использованием этого способа расчет абсолютного количества циркулирующих в кровотоке СЭ4 Т-клеток выявил 50% уменьшение этой популяции Тклеток у ВЛЕЕ-Τд-мышей в сравнении с контрольными мышами, и то же самое наблюдение было сделано в отношении субпопуляции СЭ8 Т-клеток (данные не показаны). Все В-клетки из РВЬ ВАΡЕ-Τдмышей имели увеличенную экспрессию МНС класса II и Вс1-2 в сравнении с В-клетками из контрольных мышей (фиг. 7Ω и 7Е соответственно), что указывало на некоторый уровень активации В-клеток в РВЬ ВАΡЕ-Τд-мышей. Т-клетки в крови ВАΡЕ-Τд-мышей не экспрессировали маркеры ранней активации СЭ69 или СЭ25, однако, 40-56% СЭ4 или СЭ8 Т-клеток были активированными эффекторными Тклетками с фенотипом ί.Ό44^ι, Ь-селектин¹⁰ против только 8-12% у контрольных однопометных мышей (фиг. 7Ρ). Таким образом, ВАΡЕ-Τд-мыши явно обнаруживают признаки В-клеточного лимфоцитоза и глобальную активацию В-клеток наряду с изменениями Т-клеток.

Пример 3. Увеличенные компартменты В-клеток состоят из зрелых клеток.

Для того чтобы выяснить, действовала ли сверхэкспрессия ВАΡЕ у трансгенных мышей на Вклеточный компартмент центрально в костном мозге и периферически во вторичных лимфоидных органах, авторы с использованием БАС8 исследовали в общей сложности селезенку, костный мозг и мезентериальные лимфатические узлы семи ВАΡЕ-Τд-мышей и семи контрольных однопометных мышей, полученных от четырех различных мышей-основателей. Компартмент зрелых В-клеток анализировали окрашиванием как антителами анти-В220, так и антителами анти-1дМ. Две репрезентативные ВАΡЕ-Τдмыши и одна репрезентативная контрольная однопометная мышь показаны на фиг. 8. Компартмент зрелых В-клеток (1дМ+, В220+) был увеличен как в селезенке, так и в мезентериальных лимфатических узлах (фиг. 8А, верхняя и нижняя панели соответственно). Анализ компартментов В220+/1дМ+ В-клеток (фиг. 7А, средняя панель) или про-В-клеток (СЭ43+/В220+) и пре-В-клеток (СЭ43-/В220+) в костном мозге (фиг. 8В) показал, что ВАΡЕ-Τд-мыши и контрольные однопометные мыши были сходными. Эти данные показывают, что сверхэкспрессия ВАΡЕ действует на пролиферацию зрелых В-клеток на периферии, но не на предшественники В-клеток в костном мозге. Анализ при помощи БАС8 субпопуляций Вклеток в селезенке выявил увеличенную долю маргинальной зоны (ΜΖ) В-клеток у ВЛЕЕ-Τд-мышей в сравнении с контрольными мышами (табл. 3). Популяция фолликулярных В-клеток оставалась пропорциональной как у ВАΡЕ-Τд-мышей, так и у контрольных мышей, тогда как фракция вновь образованных В-клеток слегка уменьшалась у ВАΡЕ-Τд-мышей (табл. 3). Этот результат был подтвержден также на В220⁺ В-клетках селезенки с использованием анти-СО38-антител вместо анти-СО24-антител и анти-1дМ вместо анти-1дО-антител и анализа на ί.Ό38^ι/ί.Ό24' и 1дМ^Н|/1дО¹⁰ для популяции В-клеток ΜΖ, соответственно, как описано ранее (ОНуег е! а1., 1997) (данные не показаны). Иммуногистохимический анализ с использованием антитела против мышиного 1дМ обнаружил расширение 1дМ-яркой зоны В-клеток ΜΖ в селезенке ВАΡЕ-Τд-мышей в сравнении с контрольными мышами (данные не показаны). Все В220⁺ Вклетки селезенки ВАΡЕ-Τд-мышей экспрессировали также более высокие уровни МНС класса II (табл. 3) и Вс1-2 (данные не показаны) в сравнении с В-клетками селезенки из контрольных мышей, что указывает на то, что В-клетки селезенки, как и В-клетки из РВЬ, находятся в активированном состоянии.

Пример 4. ВАΡЕ-Τд-мыши имеют более высокий общий уровень иммуноглобулинов, ревматоидных факторов и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке.

Увеличенный компартмент В-клеток у ВАΡЕ-Τд-мышей предполагал, что уровень общего Ц в крови этих животных может быть также увеличенным. Электрофорез в ДСН-ПААГ сыворотки ВАΡЕ-Τдмышей и контрольных однопометных мышей показал, что полосы тяжелой и легкой цепей ЦС были по меньшей мере в 10 раз более сильными у 3 из 4 ВАΡЕ-Τд-мышей в сравнении с контрольными сыворотками (фиг. 9А). Подобным образом, ЕЫ8А-определение на сыворотках ВАΡЕ-Τд-мышей показало значимо более высокий уровень общего Ц в сравнении с его уровнем у контрольных мышей (фиг. 9В).

Несмотря на высокие уровни, наблюдаемые при электрофорезе в ДСН-ПААГ, чрезмерно высокие уровни !β, наблюдаемые при анализе ЕЫЗА у некоторых мышей, например 697-5, 816-8-3 и 823-20, за

- 18 006108 ставили авторов заподозрить присутствие ревматоидных факторов (ВЕ) в этих сыворотках или аутоантител, направленных против антигенных детерминант на Ес-фрагменте 1д6 (1еГГеп8, 1995). Эти антитела могли бы связываться с козьими антителами против мышиного 1д, используемого для покрытия ЕЫ8Апланшетов, и давать ложные высокие величины. ЕЫ8А-планшеты покрывали нормальным (не относящимся к делу) козьим 1д и измеряли связывание ВАЕЕ-Тд-1д с нормальным козьим 1д. На фиг. 9С показано, что сыворотки большинства из ВАЕЕ-Тд-мышей содержали 1д, реагирующий с нормальным козьим 1д, тогда как только две из 19 контрольных мышей обнаружили реактивность в том же самом анализе. Эти ВЕ были в основном изотипами 1дМ, 1дА и 1дО2а (данные не показаны).

Присутствие ВЕ может быть связано с присутствием высоких уровней циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и криоглобулина в крови (1еГГеп8, 1995). Для выяснения того, имеют ли ВАЕЕ-Тдмыши аномальные уровни ЦИК в сыворотке, использовали анализ связывания на основе С1с.| для детектирования ЦИК у 21 ВАЕЕ-Тд-мыши, анализируемых выше. Только 5 ВАЕЕ-Тд-мышей обнаружили значимо более высокие уровни ЦИК в сравнении с контрольными мышами, тем не менее эти мыши соответствовали животным, имеющим наиболее высокие уровни тотального 1д и ревматоидных факторов (фиг. 9Ό). Авторы также наблюдали образование преципитата при разведении сывороток ВАЕЕ-Тд-мышей водой 1/15 (в отличие от контрольных сывороток), что указывает на присутствие криоглобулина у этих мышей (данные не показаны). Таким образом, кроме гиперплазии В-клеток ВАЕЕ-Тд-мыши проявляют тяжелую гиперглобулинемию, связанную с ВЕ и ЦИК.

Пример 5. Некоторые ВАЕЕ-Тд-мыши имеют высокие уровни аутоантител против одноцепочечной (88) и двухцепочечной (бе) ДНК.

Первоначально авторы наблюдали патологии почек, напоминающие подобное волчанке заболевание, у двух из мышей-основателей (табл. II). Присутствие аутоантител против ДНК было также ранее описано у пациентов с красной волчанкой (8ЕЕ) или у имеющих подобное волчанке заболевание мышей (8^В х N78) Е1 (8№1) (Иаба е! а1., 1987). Уровни аутоантител анти-88ДНК детектировали у ВАЕЕ-Тдмышей, которые показали ранее наивысший уровень общего сывороточного 1д (фиг. 10 А). Авторы анализировали сыворотку двух ВАЕЕ-Тд-мышей, отрицательных при анализе на антитела против одноцепочечной ДНК (697-5 и 816-1-1), и трех трансгенных мышей, секретирующих антитела против одноцепочечной ДНК (820-14, 816-8-3 и 820-7), на присутствие антител против двухцепочечной ДНК параллельно с пятью контрольными однопометными мышами. ВАЕЕ-Тд-мыши также секретировали анти-б8ДНК, однако уровни секреции не всегда коррелировали с уровнем анти-88ДНК-антител, так как сыворотка ВАЕЕ-Тд-мыши 697-5, которая не содержала детектируемых уровней анти-88ДНК-антител, была явно положительной в отношении присутствия анти-б8ДНК (фиг. 10В). Таким образом, ВАЕЕ-Тд-мыши, обнаруживающие наиболее тяжелую гиперглобулинемию, секретируют патологические уровни аутоантител против ДНК. Кроме того и также подобно проблеме с заболеванием, подобным волчанке, авторы детектировали отложения иммуноглобулина в почках у шести анализированных ВАЕЕ-Тд-мышей (фиг. 10С), три из этих мышей не секретировали детектируемые уровни антител против ДНК (данные не показаны).

Пример 6. ВАЕЕ-Тд-мыши имеют увеличенные фолликулы В-клеток, многочисленные зародышевые центры, уменьшенное число дендритных клеток и увеличенное количество плазматических клеток как в селезенке, так и в мезентериальных лимфатических узлах (МЬЦ).

ВАЕЕ-Тд-мыши имели большие селезенки, Μ^N (данные не показаны) и пейеровы бляшки (фиг. 11). Иммуногистохимия показала присутствие увеличенных фолликулов В-клеток и уменьшенные периферические артериолярные лимфоидные пласты (зону РАИЗ или Т-клеток) у ВАЕЕ-Тд-мышей (фиг. 12В). Интересно, что небольшое число зародышевых центров наблюдали у неиммунизированных контрольных однопометных мышей (и это является типичным для этой колонии в целом), и они были представлены небольшими центрами (фиг. 12С), тогда как ВАЕЕ-Тд-мыши обладали многочисленными зародышевыми центрами в отсутствие иммунизации (фиг. 12Ό). Окрашивание при помощи анти-СИИс на дендритные клетки в зоне Т-клеток и в маргинальной зоне контрольных мышей (фиг. 12Е) было значительно уменьшенным у ВАЕЕ-Тд-мышей (фиг. 12Е). Синдекан-1-положительные плазматические клетки были почти недетектируемыми в селезенке контрольных однопометных мышей (фиг. 120), но красная пульпа ВАЕЕ-Тд-мышей была сильно положительной в отношении синдекана-1 (фиг. 12Н). Очень сходные наблюдения были сделаны для Μ^N (фиг. 13). В Μ^N ВАЕЕ-Тд-мышей зоны В-клеток были драматически расширенными (фиг. 13В) в противоположность нормальному узлу, где фолликулы В-клеток легко распознаются на периферии узла ниже капсулы с типичной паракортикальной зоной Т-клеток (фиг. 13А). Сердцевина Μ^N ВАЕЕ-Тд-мышей заполнена синдекан-1-положительными клетками, которые предположительно являются плазматическими клетками (фиг. 13Н). В заключение, анализ вторичных лимфоидных органов у ВАЕЕ-Тд-мышей согласуется с экспансивным фенотипом В-клеток, при котором обнаруживаются множественные клеточные аномалии и усиленная иммунная активность.

Ссылки

1. 8тйЬ е! а1. (1994) Се11 76:959-962

2. Уа88а111 (1992) Аппи. Веу. 1ттипо1. 10:411-452

3. Эе Тодт е! а1. (1994) 8с1епсе 264:703-707

- 19 006108

4. Кош е! а1. (1997) 1штипйу 6:491-500

5. Атакама е! а1. (1996) Се11 84:551-562

6. Викке11 е! а1. (1993) Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ά. И8А 90:4409-4413

7. /йепд е! а1. (1995) ХаИие 377:348-351

8. Уап Коо!еп апб Вапсйегеаи (1997) Сигг. Θρίη. 1ттипо1. 9:330-337

9. 8!иЬег апб 81гоЬег (1996). 1. Εχρ. Меб. 183:979-989

10. 8сЬпе1бег е! а1. (1997) 1. Вю1. Сйет. 272:18827-18833

11. Найпе е! а1. (1998) 1. Εχρ. Меб. 188:1185-1190

12. Пайне е! а1. (1996) 8аепсе 274:1363-1366

13. Обтайте е! а1. (1997) Еиг. 1. 1ттипо1. 27:199-205

14. Шоте е! а1. (1997) ХаИие 386:517-521

15. 8сйпе1бег е! а1. (1998) 1. Εχρ. Меб. 187:1205-1213

16. Ма!кибайа, Р. (1987) 1. Вю1. Сйет. 262:10035-10038

17. Агтйаде е! а1. (1992) ΝηΙιιΐΌ 357:80-82

18. Висйег с! а1. (1996) Сотρи!е^ Сйет. 20:3-24

19. Ваппег е! а1. (1993) Се11 73:431-445

20. Хада!а (1997) Се11 88:355-365

21. В1аск е! а1. (1997) ХаИие 385:729-733

22. \\'опд е! а1. (1997) 1. Вю1. Сйет. 272:25190-25194

23. Кшб1ег апб 2иЬ1ет. (1997) Пттипо1. 159:2085-2090

24. 8опок1 е! а1. (1995) Ьеикет1а 9:2093-2099

25. Мадгабт I. (1990) Абу Сапсег Век 55:133-270

26. 6агк1бе е! а1. (1998) 8с1епсе 281:96-99

27. МасЬеппап е! а1. (1997) 1ттипо1. Веу. 156:53-66

28. ОиЬо1к е! а1. (1997). 1. Εχρ. Меб. 185:941-951

29. Τ^ώη!;·! е! а1. (1993) Ыа!иге 364:645-648

30. СЫсйеρоή^сйе е! а1. (1997) 1. Вю1. Сйет. 272:32401-32410

31. Ыакауата (1997) Вюскет. 1. 327:625-635

32. кйейк, В. (1995). Вйеита!о1б £ас!огк, В се11к апб 1ттипод1оЬи1ш депек. Вг. Меб.Ви11.51, 312-331

33. 8сйпе1бег е! а1. (1999) 1. Εχρ. Меб. 189, 1747-1756

34. Мскшдй!к е! а1. (1983) Се11 34, 335-341

35. Оайа е! а1. (1987) 1. Εχρ. Меб. 165,1252-1261

- 20 006108

Таблица 1

Экспрессия МАКСН-К в клетках различных линий
Тип клеток	Линии клеток	связывание МАЯСН	Особые примечания
Клетки наподобие эпителиальных	НТ-29	-	Аденокарцинома кишечника
	А375	-/+	Меланома
	МСР-7	-	Аденокарцинома молочной железы
	МЕ260	-	Меланома
	СО5	+	Клетки почки обезьяны
Фибробласты	λνΐ-38	-	Легкие
	Нз-68	-	Крайняя плоть
	Нз-27	-	Крайняя плоть
Эндотелиальные клетки	НиУЕС	-	Пупочная вена
Макрофаги/ МОНОЦИТЫ	ТНР-1	-/+	Моноцит
Т -клеточные линии	МоН-4	-	Лимфобластная лейкемия
	НШ-78	-	Кожная лимфома
	1игка(	-	Лимфобластная лейкемия
В-клегочные линии	В1АВ	+++	Лимфома Беркитта
	№та1а\¥а	++	Лимфома Беркитта
	ОаисН	+/-	Лимфома Беркитта ΕΒΝ А+ УСА+
	Катоз	++	Лимфома Беркитта ЕВУ-
	Кар	+++	Лимфома Беркитта
	ЛУОУЕ	+	Лимфома Беркитта
	8ΚΨ.64	++	1§М-секретирующие ЕВУ+
	ΚΡΜΙ1788	+++	Периферическая кровь, 1§М-секретирующие
	ΙΜ-9	+++	секретирующие лимфобластный
	N037	+++	лимфобластный ЕВУ+
Линии мышиных клеток	\УЕНБ-231	-	В-клеточная лимфома
	А20	-	В-клеточная лимфома

Поверхностную экспрессию МАКСИ определяли, используя РАС8-анализ с помощью ЕЪАС-мечеяного МАЯСН, как описано в ‘Материалах и Методах”

- 21 006108

Таблица 2

Список ВАЕЕ-трансгенных мышей-основателей

Количество мышей	Протеинурия 1	Β/Τ”
690 самок0	Νϋ	2
696 самцов с	Νϋ	Νϋ
697 самок	-Н-+	Νϋ
700 самцовс	Νϋ	Νϋ
802 самца	++	4.6
804 самки	.+++	5.4
807 самок	ΝΟ	4
810 самцов	+++	7.8
811 самцов **	ΝΟ	ΝΟ
813 самцов	+	5.4
816 самок **	++	Νϋ
820 самцов	++	3
823 самца	++	23
Контроль	+/-	1.5
самок ΒϋΡΙ
Контроль	+/-	2.5
самцов ΒϋΓΙ

* Протеинурию определяли при помощи медицинских регистрирующих полосок, погружаемых в мышиную мочу, и обозначали следующим образом: - отсутствие протеинурии, +/- следы, +(30мг/дл), ++ (100мг/дл), +++ (300 мг/дл),++++(>2000 мг/дл). ^ь В/Г: отношение % В-клеток к % Т-клеток в лимфоцитах периферической крови, определяемое РАС8-анализом с помощью РЕ-меченных анги-В220 и ГГГС- меченных анти-СЕ)4 антител боиЫе δώηίη^.

^с Ранняя острая гибель ^а Отсутствие трансгенного перехода у потомства, ' Сердечно-сосудистые и почечные аномалии, наблюдаемые при аутопсии.

^г Мыши, умерщвленные ввиду наличия крови в моче. После анализа Н&Е-окрашенных срезов всех тканей были обнаружены сердечные, почечные и артериальные аномалии. Увеличение популяции В-клеток селезенки, определяемое иммуногистохимически на замороженных срезах селезенки с помощью биотин-меченного антимышиного В220 и ангимышиного СЕ)4, и последующего меченного щелочной фосфатазой стрептавидина и меченного пероксидазой хрена антикрысиного 1§.

Подчеркнутые животные-основатели использовались для разведения

ΝΟ: не определяли

- 22 006108

Таблица 3

Повышенная экспрессия МНС класса II на В-клетках и увеличенное содержание В-клеток в М2 селезенки ВАРР-Тд-мышей

	Уровень экспрессии МНС класса П на В220+ В-клетка х (МП)	% фолликулярных В-клеток (В220+/1еМ*7СО21л)	%В-клегок βΜΖ (822071^30321111)	% вновь образованных В-клеток (Β220:ΐ&ΜίΌ321111)
Контрольные мьппи
816-1-10	170	45	6	12
802-21	1029	48	10.5	9
823-1	1240	39	9	6.5
ВаГС-Те-мыши
802-6	1707	49	18	5.9
820-7	1900	39	23	6.3
816-1-1	2088	40	23	5.8

Спленоциты анализировали методом РАС8 на популяции В22СГ Представлен показательный эксперимент МН: средняя интенсивность флуоресценции

Claims (31)

1. Способ стимуляции роста В-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент;

(б) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и анти-μ-антитело;

(в) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и СО40-лиганд и (г) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и анти-СО40-лиганд.

2. Способ стимуляции продуцирования иммуноглобулинов в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент;

(б) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и анти-μ-антитело;

(в) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и СО40-лиганд и (г) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и анти-СО40-лиганд.

3. Способ совместной стимуляции роста В-клеток и продуцирования иммуноглобулинов в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, включающей в себя (а) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент;

(б) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и анти-μ-антитело;

(в) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и СО40-лиганд и (г) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и анти-СО40-лиганд.

4. Способ стимуляции индуцированного дендритными клетками роста и созревания В-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент;

(б) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и анти-μ-антитело;

(в) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и СО40-лиганд и (г) ВАРР-лиганд или его активный фрагмент и анти-СО40-лиганд.

5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому ВАРР-лиганд представляет собой растворимый ВАРР-лиганд.

6. Способ по п.5, согласно которому растворимый ВАРР-лиганд представляет собой рекомбинантный ВАРР-лиганд.

7. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому анти-СО40-лиганд представляет собой моноклональное антитело.

8. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому указанное животное является млекопитающим.

9. Способ по п.8, согласно которому млекопитающее является человеком.

- 23 006108

10. Способ ингибирования роста В-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) анти-ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(б) рекомбинантный, нефункциональный ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(в) антитело, специфичное в отношении ВАЕЕ-лиганда, или его активный фрагмент и (г) антитело, специфичное в отношении рецептора ВАЕЕ-лиганда или его эпитопа.

11. Способ ингибирования продукции иммуноглобулинов в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) анти-ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(б) рекомбинантный, нефункциональный ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(в) антитело, специфичное в отношении ВАЕЕ-лиганда, или его активный фрагмент и (г) антитело, специфичное в отношении рецептора ВАЕЕ-лиганда или его эпитопа.

12. Способ совместного ингибирования роста В-клеток и продуцирования иммуноглобулинов в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) анти-ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(б) рекомбинантный, нефункциональный ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(в) антитело, специфичное в отношении ВАЕЕ-лиганда, или его активный фрагмент и (г) антитело, специфичное в отношении рецептора ВАЕЕ-лиганда или его эпитопа.

13. Способ ингибирования индуцированного дендритными клетками роста и созревания В-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) анти-ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(б) рекомбинантный, нефункциональный ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(в) антитело, специфичное в отношении ВАЕЕ-лиганда, или его активный фрагмент и (г) антитело, специфичное в отношении рецептора ВАЕЕ-лиганда или его эпитопа.

14. Способ по любому из пп.10-13, согласно которому анти-ВАЕЕ-лиганд представляет собой растворимый анти-ВАЕЕ-лиганд.

15. Способ по п.14, согласно которому растворимый анти-ВАЕЕ-лиганд представляет собой рекомбинантный анти-ВАЕЕ-лиганд.

16. Способ по любому из пп.10-13, согласно которому антитело, специфичное в отношении ВАЕЕлиганда, является моноклональным антителом.

17. Способ лечения аутоиммунного заболевания, связанного с ВАЕЕ-лигандом, у животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(б) ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент и анти-ц-антитело;

(в) ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент и СО40-лиганд;

(г) ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент и анти-СО40-лиганд;

(д) анти-ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(е) рекомбинантный, нефункциональный ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(ж) антитело, специфичное в отношении ВАЕЕ-лиганда, или его активный фрагмент и (з) антитело, специфичное в отношении рецептора ВАЕЕ-лиганда или его эпитопа.

18. Способ лечения нарушения, связанного с ВАЕЕ-лигандом, у животного, предусматривающий введение в организм животного терапевтически эффективного количества вектора, содержащего ген, кодирующий соединение, выбранное из группы, содержащей (а) ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(б) ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент и анти-μ-антитело;

(в) ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент и СО40-лиганд;

(г) ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент и анти-СО40-лиганд;

(д) анти-ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(е) рекомбинантный, нефункциональный ВАЕЕ-лиганд или его активный фрагмент;

(ж) антитело, специфичное в отношении ВАЕЕ-лиганда, или его активный фрагмент и (з) антитело, специфичное в отношении рецептора ВАЕЕ-лиганда или его эпитопа.

19. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому ВАЕЕ-лиганд представляет собой растворимый ВАЕЕ-лиганд.

20. Способ по п.19, согласно которому растворимый ВАЕЕ-лиганд представляет собой рекомбинантный ВАЕЕ-лиганд.

- 24 006108

21. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому анти-СО40-лиганд представляет собой моноклональное антитело.

22. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому анти-ВАТТ-лиганд представляет собой растворимый анти-ВАТТ-лиганд.

23. Способ по п.22, согласно которому растворимый анти-ВАТТ-лиганд представляет собой рекомбинантный анти-ВАТТ-лиганд.

24. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому антитело, специфичное в отношении ВАТТлиганда, представляет собой моноклональное антитело.

25. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому антитело, специфичное в отношении рецептора ВАТТ-лиганда, представляет собой моноклональное антитело.

26. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении ВАТТ-лиганда, или его активного фрагмента.

27. Способ коррекции, супрессии или изменения иммунного ответа, основанного на передаче сигнала между ВАТТ-лигандом и рецептором ВАТТ-лиганда, предусматривающий введение животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении ВАТТ-лиганда, или его активного фрагмента.

28. Способ ингибирования воспаления у животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении ВАТТ-лиганда, или его активного фрагмента.

29. Способ ингибирования воспаления у животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении рецептора ВАТТ-лиганда или его эпитопа.

30. Способ регуляции развития гематопоэтических клеток у животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества ВАТТ-лиганда или его активного фрагмента.

31. Способ коррекции, супрессии или изменения иммунного ответа у животного, основанного на передаче сигнала между ВАТТ-лигандом и рецептором ВАТТ-лиганда, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении ВАТТ-лиганда или его активного фрагмента.