MXPA01007464A

MXPA01007464A - Baff, inhibidores del mismo y su uso en la modulacion de la respuesta de celula b.

Info

Publication number: MXPA01007464A
Application number: MXPA01007464A
Authority: MX
Inventors: Jeffrey Browning
Original assignee: Apoxis Sa
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2003-06-06
Also published as: EE05699B1; KR100834809B1; HUP0105283A3; WO2000043032A2; DE60004635D1; AU3214200A; EA006108B1; JP2002535285A; HK1040628A1; TR200102147T2; PT1415659E; SI1146892T1; CA2360062A1; KR20010105331A; EP2319527A2; JP2009102326A; JP4955642B2; PT1146892E; HUP0105283A2; DE60004635T2

Abstract

La presente invencion, proporciona metodos para el tratamiento o prevencion de trastornos asociados con la expresion de BAFF, que comprenden BAFF y fragmentos del mismo, anticuerpos, agonistas y antagonistas.

Description

BAFF, INHIBIDORES DEL MISMO Y SU USO EN LA MODULACIÓN DE LA RESPUESTA DE CÉLULAS B CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al uso de un ligando BAFF, que es un factor activador de células B que pertenece a la Familia de Necrosis Tumoral (B cell activating factor belonging to the tumoral necrosis family, BAFF, respetando las siglas en inglés) y a sus agentes bloqueadores, para estimular o inhibir la expresión de células B e inmunoglobulinas. Esta proteina y su receptor pueden tener aplicaciones contra el cáncer y/o inmunorreguladoras, asi como usos para el tratamiento de trastornos inmunosupresores tales como HIV. Específicamente, el ligando y sus agentes bloqueadores pueden desempeñar una función en el desarrollo de hipertensión y trastornos relacionados. Además, las células transfectadas con el gen de este ligando, se pueden usar en terapia de genes para el tratamiento de tumores, enfermedades autoinmunitarias o trastornos genéticos hereditarios que involucran a las células B. Los agentes bloqueadores, tales como variantes recombinantes o anticuerpos específicos contra el ligando o su receptor, pueden tener aplicaciones inmunorreguladoras también. Está Ref: 131624 - - contemplado el uso del BAFF como estimulador de células B para enfermedades inmunosupresoras incluyendo, por ejemplo, usos para pacientes que han sido sometidos a trasplante de órganos (i.e., trasplante de médula ósea), asi como recuperación de tratamientos contra el cáncer para estimular la producción de células B. El uso de BAFF como adyuvante y/o como coestimulador para reforzar y/o restaurar los niveles de células B hasta los niveles aproximadamente normales, también queda contemplado. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las citocinas relacionadas con el factor de necrosis tumoral (TNF, respetando las siglas en inglés) , son mediadores de las defensas del huésped y la inmunorregulación. Existen miembros de esta familia en formas ancladas a la membrana, que actúan localmente a través del contacto de célula con célula, o en forma de proteínas secretadas capaces de difundirse hacia blancos más distantes. Una familia paralela de receptores señala la presencia de estas moléculas, lo cual causa el inicio de la muerte celular o la proliferación y diferenciación celular en el tejido blanco. Actualmente, la familia TNF de ligandos y receptores tiene cuando menos 11 pares reconocidos de receptor-ligando, incluyendo: TNF; TNF-R, LT-a: TNF-R; LT-a/ß: LT-ß-R; FasL: Fas; CD40L: CD40; CD30L:CD30; CD27L:CD27; OX40L:OX40 y 4-1BBL: 4-1BB . Las - secuencias de ADN que codifican para estos ligandos sólo tienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 30% de identidad en incluso los casos más relacionados, aunque la relación de aminoácidos es de aproximadamente 50%. La característica que define a esta familia de receptores de citocina se encuentra en el dominio extracelular rico en cisteina inicialmente revelado por la clonación molecular de dos distintos receptores de TNF. Esta familia de genes codifica para glucoproteinas características de las proteínas transmembranales de tipo I, con un dominio de unión de ligando extracelular, una sola región de porción membranal y una región citoplasmética involucrada en la activación de funciones celulares. La región de unión al ligando rica en cisteina exhibe un puente de disulfuro muy apretado ligado al dominio de núcleo, el cual, dependiendo del miembro particular de la familia, se repite múltiples veces. Gran parte de los receptores tienen cuatro dominios, aunque pueden haber tres de ellos o como máximo seis. Las proteínas de la familia TNF de ligandos están caracterizadas por un tramo N-terminal corto, normalmente compuesto por aminoácidos hidrofilicos, que a menudo contiene varios residuos lisina o arginina que se cree que sirven como secuencias de transferencia de parada. Después sigue una región transmembranal y una región extracelular - - de longitud variable, que separa al dominio de unión al receptor C-terminal de la membrana. Esta región a veces se denomina como el "tallo". La región de unión C-terminal comprende el bulto de la proteina y a menudo, pero no siempre, contiene sitios de glucosilación. Estos genes carecen de las secuencias de señal clásicas características de las proteínas de membrana tipo I, de las proteínas de membrana tipo II cuyo extremo C-terminal yace por fuera de la célula y del dominio N-terminal corto que reside en el citoplasma. En algunos casos, e.g. TNF y LT-a, puede ocurrir un rompimiento en la región del tallo en una fase temprana durante el procesamiento de la proteina y el ligando, entonces, se encuentra principalmente en forma secretada. Sin embargo, la mayoría de los ligandos existen en una forma membranal, con señales localizadas de mediación. La estructura de estos ligandos ha sido bien definida por análisis cristalográficos de TNF, LT-a y CD40L. Tanto el TNF como la linfotoxina-a (LT-a) están estructurados en forma de emparedado con dos hojas de tipo ß antiparalelas, con una topología de "rollo de gelatina" o llave griega. La derivación de rms entre los residuos Ca y ß es de 0.61 C, lo cual sugiere un alto grado de similitud en su topografía molecular. Una característica estructural que emerge de estudios moleculares entre CD40L, TNF y LT-a es su tendencia a ensamblarse en forma de complejos oligoméricos. Intrínsecamente a la estructura oligomérica, está la formación del sitio de unión al receptor en la unión entre las subunidades vecinas, creando un ligando polivalente. Se ha demostrado que las estructuras cuaternarias de TNF, CD40L y LT-a existen en forma de trímeros, mediante el análisis de sus estructuras cristalinas. Muchos de los aminoácidos conservados entre los diferentes ligandos están en tramos de la porción de plataforma de la hoja ß. Es probable que la estructura en emparedado básica se conserve en todas estas moléculas, ya que porciones de estas 'secuencias de plataforma se conservan a través de diversos miembros de la familia. La estructura cuaternaria también se puede mantener, puesto que la conformación de subunidades es probable que permanezca similar. Los miembros de la familia TNF se pueden describir mejor como emparedados en el sistema inmunitario que controlan la supervivencia y diferenciación celular. Actualmente sólo se reconocen al TNF y LT-a como citocinas secretadas, lo cual contrasta con los demás miembros predominantemente membranales de la familia TNF. Mientras que una forma membranal de TNF se ha caracterizado y es - probable que tenga funciones biológicas únicas, el TNF secretado funciona como una señal de alarma general para células distantes al sitio en el que se inició el evento. Asi pues, la secreción de TNF puede amplificar un evento, lo cual causa los cambios descritos en el revestimiento vascular y el estado inflamatorio de las células. En contraste, los miembros de la familia unidos a la membrana envían señales a través de receptores de tipo TNF sólo a células con las que entran en contacto directo. Por ejemplo, las células T proporcionan una "ayuda" mediada por CD40 sólo a aquellas células B que entran en contacto directo a través de interacciones TCR conocidas. Al bien estudiado sistema FAS, se le aplican también limitaciones similares de contacto célula-célula sobre la capacidad de inducir la muerte celular. Parece ser que se pueden segregar los ligandos TNF en tres grupos, basándose en su capacidad de inducir la muerte celular. Primeramente, el TNF, el ligando Fas y la molécula TRAIL pueden inducir eficientemente . la muerte celular en muchas lineas celulares y sus receptores es muy probable que tengan buenos dominios de muerte canónica. Presumiblemente, el ligando de DR-3 (TRAMP/WSL-1 ) también caerla en esta categoría. Después están aquellos ligandos que disparan una señal de muerte más débil, limitado a unos cuantos tipos de células y TWEAK, ligando CD30 y LTalb2 son - - ejemplos de esta clase. El hecho de cómo este grupo puede disparar la muerte celular en ausencia de un dominio de muerte canónica, es una pregunta interesante y sugiere que existe un mecanismo de señal de muerte más débil y que está por separado. Por último, existen aquellos miembros que no pueden propagar de manera eficiente una señal de muerte. Probablemente todos los grupos pueden tener efectos antiproliferativos sobre algunos tipos de células, como consecuencia a la inducción de la diferenciación celular, e.g. CD40. Funakoshi et al . (1994). La familia TNF ha crecido drásticamente en años recientes para abarcar cuando menos 11 diferentes rutas de señalamiento que participan en la regulación del sistema inmunitario. Los extensos patrones de expresión de TWEAK y TRAIL indican que todavía existe más variedad funcional por ser descubierta en esta familia. Este aspecto recientemente ha sido resaltado por el descubrimiento de dos receptores que afectan la capacidad del virus del sarcoma de Rous y del virus del herpes simple para replicarse, asi como por las observaciones históricas de que el TNF tiene actividad antiviral y virus de la varicela que codifican para receptores de TNF de señuelo. Brojatsch et al . (1996); Montgomery et al . (1996); Smith et al . (1994), 76 Cell 959-962; Vassalli et al . (1992), 10 Immunol . 411-452.

- - El TNF es un mediador del choque séptico y de la caquexia y participa en la regulación del desarrollo de células hematopoyéticas. Parece desempeñar una función principal como mediador de la inflamación y como defensa contra infecciones bacterianas, virales y parasitarias, al igual que tiene actividad antitumoral. El TNF también participa en diferentes enfermedades autoinmunitarias. Éste puede ser producido por varios tipos de células, incluyendo macrófagos, fibroblastos, células T y células mortíferas naturales. El TNF se une a dos diferentes receptores, cada uno de los cuales actúa a través de moléculas de señalización intracelulares especificas, obteniéndose de esta manera los diferentes efectos del TNF. Éste puede existir en forma unida a la membrana o en una forma soluble como citocina secretada. El LT-a comparte muchas actividades con el TNF, i.e. la unión a los receptores de TNF, pero a diferencia de éste, parece ser secretado principalmente por células T activadas y algunos tumores ß-linfoblastoides . El complejo heteromérico de LT-a y LT-ß es un complejo de unión a membrana que se une al receptor LT-ß. El sistema LT (LTs y LT-R) parece estar involucrado en el desarrollo de los órganos linfoides periféricos, ya que la alteración genética del LT-ß causa la desorganización de las células T - - y B en el bazo y una ausencia de ganglios linfáticos. El sistema LT-ß también participa en la muerte celular de algunas lineas celulares de adenocarcinoma. Fas-L, que es otro miembro de la familia TNF, se expresa predominantemente en células T activadas. Induce la muerte de células portadoras de su receptor, incluyendo células tumorales y células infectadas por HIV, mediante un mecanismo que se conoce como muerte celular programada o apoptosis. Además, las deficiencias de Fas o Fas-L pueden causar trastornos linfoproliferativos, lo cual confirma la función del sistema Fas en la regulación de las respuestas inmunitarias. El sistema Fas también participa en el daño al higado resultante de la infección por hepatitis crónica y la autoinmunidad en pacientes infectados por HIV. El sistema Fas también está involucrado en la destrucción de células T en pacientes infectados por HIV. TRAIL, otro miembro de esta familia, también parece participar en la muerte de una amplia variedad de lineas celulares transformadas de diversos orígenes. CD40-L, que es otro miembro de la familia TNF, se expresa en células T e induce la regulación de células B portadoras de CD40. Además, las alteraciones en el gen CD40-L dan como resultado una enfermedad conocida como síndrome hiper-IgM ligado a X. El sistema CD40 también participa en diferentes enfermedades autoinmunitarias y se - - sabe que CD40-L tiene propiedades antivirales. Aunque el sistema CD40 participa en el rescate de células B apoptóticas, en células no inmunitarias induce la apoptosis. Muchos miembros linfocitarios adicionales de la familia TNF también participan en la coestimulación. En general, los miembros de la familia TNF desempeñan funciones reguladoras fundamentales en el control del sistema inmunitario y en la activación de sistemas de defensa aguda en el huésped. Dado el actual progreso en la manipulación de los miembros de la familia TNF para beneficio terapéutico, es probable que los miembros de esta familia puedan proporcionar mecanismos únicos para el control de enfermedades. Algunos de los ligandos de esta familia pueden inducir directamente la muerte apoptótica de muchas células transformadas, e.g. LT, TNF, el ligando Fas y TRAIL. NAgata (1997) 88 Cell 355-365. La activación de Fas y posiblemente TNF y el receptor CD30 pueden inducir la muerte celular en linfocitos no transformados, lo cual podria desempeñar una función inmunorreguladora. Amaka a et al . (1996) 84 Cell 551-562; Nagata (1997) 88 Cell 355-365; Sytwu et al . (1996); Zheng et al . (1995) 377 Nature 348-351. En general, la muerte se dispara después de la agregación de los dominios de muerte que residen en el lado citoplasmático de los receptores TNF. El dominio de muerte orquesta el ensamblaje de varios - - componentes de transducción de señal, que dan como resultado la activación de la cascada de la caspasa. Nagata (1997) 88 Cell 355-365. Algunos receptores carecen de dominios de muerte canónica, e.g. el receptor Ltb y CD30 (Browning et al . (1996); Lee et al . (1996)) todavía pueden inducir la muerte celular, aunque más débilmente. Es probable que estos receptores funcionen principalmente para inducir la diferenciación celular y la muerte es una consecuencia aberrante en algunas lineas celulares transformadas, aunque este cuadro todavía no está claro ya que estudios de CD30 proveniente de ratones nuil sugieren una función de muerte en la selección negativa en el timo. Amakawa et al . (1996) 84 Cell 551-562. Por el contrario, la señalización a través de otras rutas, tales como CD40, es necesaria para mantener la supervivencia celular. Asi pues, existe la necesidad de identificar y caracterizar moléculas adicionales que sean miembros de la familia TNF, proporcionando de esta manera mecanismos adicionales para controlar enfermedades y manipular el sistema inmunitario. En la presente invención se caracterizan las propiedades funcionales de un nuevo ligando de la familia de citocinas TNF. El nuevo ligando, denominado BAFF (factor activador de células B perteneciente a la familia TNF; B cell activating factor belonging to the TNF familiy) , respetando sus siglas en inglés), parece ser - - expresado por células T y células dendriticas para el propósito de coestimular células B y, por lo tanto, podria desempeñar una función importante en el control de la función de las células B. Además, se han generado ratones transgénicos que sobreexpresan BAFF bajo el control de un promotor especifico de higado. Estos ratones tienen un número excesivo de células B maduras, presentan reacciones espontáneas del centro germinal, secretan autoanticuerpos y presentan altos números de células plasmáticas en órganos linfoides secundarios y deposición de inmunoglobulinas (Ig) en los riñones. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con lo anterior, la presente invención se refiere al uso de ligandos BAFF, agentes bloqueadores y anticuerpos contra el ligando, para estimular o inhibir el crecimiento de células B y la secreción de inmunoglobulinas. La presente invención se puede utilizar para aplicaciones terapéuticas en numerosas enfermedades y trastornos, tal como se describirá con mayores detalles más adelante, asi como para obtener información acerca del sistema inmunitario y sus procesos, y manipularlo. Además, la presente invención se puede utilizar como método para estimular o inhibir el crecimiento de células B y la secreción de inmunoglobulinas. Las moléculas asociadas a BAFF, tal como - - se describe en la presente invención, también pueden tener utilidad en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, trastornos relacionados con la proliferación y maduración de células B, regulación del ligando BAFF e inflamación. La presente invención puede participar en la regulación o prevención de hipertensión y trastornos relacionados con la hipertensión de tejido renal y cardiovascular. En la descripción que se presenta a continuación, se establecerán características y ventajas adicionales de la presente invención, las cuales en parte serán evidentes por la descripción, o se pueden aprender mediante la práctica de la presente invención. Los objetivos y otras ventajas de la presente invención se establecerán y se podrán llevar a cabo por los métodos particularmente señalados en la descripción escrita y en las reivindicaciones, asi como en los dibujos anexos. Asi pues, para lograr éstas y otras ventajas y, de conformidad con los propósitos de la presente invención tal como se presenta en sus modalidades y se describe ampliamente aqui, la invención incluye un método para afectar el crecimiento de células B y la secreción de inmunoglobulinas, mediante la administración de varios ligandos BAFF y moléculas relacionadas. La presente invención también contempla la - - estimulación del crecimiento de células B a través del uso de ligandos BAFF o fragmentos activos del polipéptido. El polipéptido se puede usar solo o con un ligando CD40 ó un anticuerpo antimurino. En otras modalidades, la presente invención se refiere a métodos para estimular el crecimiento de células B inducido por células dendriticas y su maduración, mediante el uso de ligandos BAFF o fragmentos activos de VAGG. Una vez más, el polipéptido se puede usar solo o con un ligando CD40 ó anticuerpos anti-µ. En otras modalidades, se han utilizado agentes bloqueadores de BAFF y del receptor BAFF para inhibir el crecimiento de células B y la secreción de inmunoglobulinas. Estos agentes pueden ser inoperables, BAFF recombinante, anticuerpos específicos contra BAFF, anticuerpos específicos contra el receptor de BAFF o una molécula contra el ligando de BAFF. En todavía otras modalidades, la presente invención se refiere al uso de BAFF, moléculas relacionadas con BAFF y agentes bloqueadores de BAFF para el tratamiento de la hipertensión, trastornos relacionados con la hipertensión, trastornos inmunitarios, enfermedades autoinmunitarias, inflamación y trastornos linfoproliferativos de células B„ La presente invención abarca el uso de BAFF y - - moléculas relacionadas con BAFF como agonistas o antagonistas para afectar las respuestas inmunitarias mediante un efecto sobre el crecimiento y/o la maduración de células B y la secreción de inmunoglobulinas. La presente invención se refiere, en otras modalidades, a construcciones solubles que comprenden BAFF que pueden ser utilizadas para disparar directamente eventos farmacológicos mediados por BAFF. Tales eventos pueden tener beneficios terapéuticos útiles en el tratamiento de cáncer, tumores o en la manipulación del sistema inmunitario para el tratamiento de enfermedades inmunológicas . Adicionalmente, en otras modalidades, la presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra el ligando BAFF, que se pueden utilizar, por ejemplo, para el tratamiento de cánceres y la manipulación del sistema inmunitario para el tratamiento de enfermedades inmunológicas . En todavía otras modalidades, la presente invención se refiere a métodos de terapia de genes, en los cuales se emplean los genes que codifican para BAFF. Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención, opcionalmente, pueden incluir vehículos farmacéuticamente aceptables, adyuvantes, rellenadores u otras composiciones farmacéuticas y se pueden administrar - - en cualquiera de numerosas formas o vias conocidas en la técnica. Debe entenderse que la descripción general anterior y la descripción detallada que se presenta a continuación, son de ejemplo y explicativas, y tienen la intención de proporcionar una mayor explicación de la presente invención tal como fue reivindicada. Los dibujos anexos se incluyen para proporcionar un mejor entendimiento de la invención y se incorporan en la presente y constituyen parte de la presente descripción, ilustrando varias modalidades de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los fundamentos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 (A) ilustra la secuencia de aminoácidos predicha del BAFF humano y murino. El dominio transmembranal predicho (DTM, linea punteada) , los sitios de glucosilación N-ligada potenciales (estrellas) y el sitio de procesamiento natural del BAFF humano (flecha) estén indicados. La linea doble por arriba de hBAFF, indica la secuencia obtenida mediante la degradación de Edman del BAFF procesado. (B) ilustra una comparación de la secuencia de proteina extracelular de BAFF y algunos miembros de la familia de ligandos TNF. Los residuos idénticos y homólogos están representados en negro y en - - recuadros sombreados, respectivamente. (C) ilustra el dendrograma de los ligandos de la familia TNF. La Figura 2 es una caracterización esquemática de BAFF recombinante (A) representación esquemática de construcciones de BAFF recombinante. Las BAFF recombinantes solubles comienzan en Leu83 y Gln?36 y se expresan fusionadas con una marca Flag N-terminal y un ligador de 6 aminoácidos. La forma larga se rompe entre los residuos Argi33 y Ala?34 (flecha) en células T 293, para obtener una forma procesada de BAFF. Asni24 y Asn242 pertenecen a los sitios consensúales de N-glucosilación. El glicano N-ligado presente en Asn?24, se muestra como una Y. DTM: dominio transmembranal. (B) tratamiento con el péptido N-glicanasa F (PNGasa F) del BAFF recombinante. Sobrenadantes concentrados que contenían BAFF con la marca Flag y APRIL se desglucosilaron y se analizaron por inmunoelectrotransferencia tipo Western (Western blot) empleando anticuerpos policlonales contra BAFF o anticuerpos anti-Flag M2, tal como se indica. Todas las bandas excepto BAFF procesado también reaccionaron con anticuerpos anti-Flag M2 (datos no mostrados) . (C) el BAFF de longitud completa se procesa en una forma soluble. Se transfectaron transitoriamente células T 293 con BAFF de longitud completa. Las células transfectadas y sus sobrenadantes concentrados se analizaron por - - inmunoelectrotransferencia tipo Western, empleando anticuerpos policlonales anti-BAFF. Los sobrenadantes correspondientes a 10 x de la cantidad de células, se colocaron en el gel. (D) cromatografía de exclusión de tamaño de BAFF soluble en Superdex-200. Se fraccionaron sobrenadantes concentrados que contenían BAFF soluble/corto en una columna Superdex-200 y las fracciones eluidas se analizaron por inmunoelectrotransferencia tipo Western empleando un anticuerpo anti-Flag M2. Las posiciones de migración de los marcadores de masa molecular (en kDa) se indican en el lado izquierdo para Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS) y en la parte superior de la figura para la cromatografía de exclusión de tamaño. La Figura 3 ilustra la expresión de BAFF (A) análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Northern (Northern blot) (2 µg poli A + ARN por carril) de varios tejidos humanos se probaron con ARNm antisentido de BAFF. (B) amplificación con transcriptasa inversa de BAFF, cadena alfa del receptor de IL-2 y actina proveniente de ARN de células T sanguíneas purificadas, a varios puntos de tiempo después de una activación con PHA, células sanguíneas negativas para la formación de rosetas E (células B y monocitos), células dendriticas inmaduras derivadas in vi tro, células 293 y células 293 transfectadas en - condiciones estériles con BAFF de longitud completa (293-BAFF) . Se realizaron amplificaciones de control en ausencia de ADNc. La cadena alfa del receptor de IL-2 se amplificó como marcador de ia activación de células T. La Figura 4.ilustra la unión de BAFF a células B maduras. (A) unión de BAFF soluble a las lineas celulares BJAB y Jurkat, y a células CD19+ purificadas de médula. Las células se tiñeron con la cantidad indicada (en ng/50 µL) de Flag-BAFF y se analizaron por citometria de flujo. (B) unión de BAFF soluble a linfocitos de sangre periférica (LSP) . Se tiñeron LSPs con anticuerpos anti-CD8-FITC o con anti-CD19-FITC (eje de las abscisas) y con Flag-BAFF más M2-biotina y avidina-PE (eje de las ordenadas) . El Flag-BAFF fue omitido en los controles. La Figura 5 ilustra la coestimulación de BAFF sobre la proliferación de células B. (A) expresión de superficie de BAFF en células 293 transfectadas de manera estable. Se tiñeron células 293-BAFF y 293 de tipo silvestre con anticuerpos monoclonales anti-BAFF mAb 49.9 y se analizaron por citometria de flujo. (B) coestimulación de LSPs por células 293-BAFF. Se incubaron LSPs (105/pozo) con 15,000 células 293 fijadas con glutaraldehido (293 wt ó 293-BAFF) en presencia o ausencia de un anticuerpo contra el receptor de células B (anti-µ) . Las células 293 fijadas por si solas incorporaron 100 cpm. (C) coestimulación - - dependiente de dosis de la proliferación de LSP por BAFF soluble, en presencia de anticuerpos anti-µ. La proliferación se determinó después de 72 horas de incubación, mediante la incorporación de [3H]-timidina. Los controles incluyen células tratadas con BAFF solo, con BAFF desnaturalizado al calor o con un isotipo irrelevante de anticuerpos en vez de anticuerpos anti-µ. (D) comparación de los efectos (co) estimuladores de sCD40L y sBAFF sobre la proliferación de LSP. El experimento se llevó a cabo de la manera descrita en el panel C. (E) BAFF coestimula la secreción de Ig de células B humanas preactivadas . Se activaron células B CD19* purificadas cocultivándolas con células T EL-4 y sobrenadantes de células T activadas durante 5 a 6 dias, después se aislaron las células y se cultivaron durante otros 7 dias en presencia solamente de medio de cultivo (-) o con medio que contenia 5% de sobrenadante de células T activadas (T-SUP) o una mezcla de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10) . Las columnas representan los promedios de las concentraciones de Ig para cultivos con o sin 1 µg/mL de BAFF. Los promedios ±desviación estándar (DE) en términos de "veces de incremento" fueron de 1.23 ± 0.11 para el medio solamente; 2.06 ± 0.18 para el medio con sobrenadante de células T (4 experimentos) y 1.45 ± 0.06 para el medio con IL-1, IL-4 e IL-10 (2 experimentos) . Estos se realizaron con sangre periférica - - (3 experimentos) o con células B de médula (un experimento; incremento de 2.3 veces con sobrenadantes de células T, incremento de 1.5 veces con IL-2, IL-4 e IL-10). (F) curva de dosis-respuesta del efecto de BAFF sobre cultivos con sobrenadantes de células T, tal como se muestra en el panel D. Se reporta el promedio ±DE de 3 experimentos. La Figura 6 ilustra que BAFF actúa como cofactor para la proliferación de células B. La proliferación de LSP humanos se midió sola (500 cpm) , en presencia de ligando BAFF solo, en presencia de anticuerpo de cabra antimurino (mu) y con ligando BAFF y anti-mu. La combinación de anti-mu y BAFF elevó significativamente la proliferación de LSP a medida que la concentración de BAFF se incrementaba, lo cual sugiere características del BAFF como cofactor. La Figura 7 ilustra el incremento del número de células B en ratones BAFF Tg. (A) la cuenta de linfocitos se incrementa en ratones BAFF Tg. La gráfica compara 12 animales control compañeros de carnada (panel de la izquierda) con 12 ratones BAFF Tg (panel de la derecha) . Las cuentas de linfocitos se muestran con circuios y las de granulocitos (incluyendo neutrófilos, eosinófilos, basófilos) con diamantes. (B) incremento de la proporción de células B en LSP de ratones BAFF Tg. Se tiñeron LSP con anti-B220-FITC y anti-CD4-PE para análisis SCAF - (seleccionador de células activado por fluorescencia) y se introdujo en células vivas utilizando el dispersador lateral de avance. Están indicados los porcentajes de células positivas para CD4 y B220. Se muestran un ratón de control (izquierda) y dos ratones BAFF Tg (derecha) y los resultados fueron representativos de 7 animales analizados en cada grupo. (C) Análisis por SCAF de la relación de células B con respecto a, células T en LSP. La diferencia entre los animales control y los ratones BAFF Tg en (A) y (C) fue estadísticamente significativa (P<0.001). (D) Incremento de la expresión de MHC clase II en células B en LSP de ratones BAFF Tg. La expresión de MHC clase II fue analizada por SCAF. (E) Incremento de la expresión de Bcl-2 en células B de LSP de ratones BAFF Tg. La expresión de Bcl-2 se midió por tinción intracitoplasmática y las células se analizaron por SCAF. En ambas figuras (D) y (E) , las células vivas se introdujeron en el dispersador lateral de avance. Se muestran 4 animales control compañeros de carnada (barras blancas) y 4 ratones BAFF Tg y son representativos de cuando menos 12 animales analizados para cada grupo. IFP: intensidad de fluorescencia promedio. la diferencia entre los animales control y los ratones BAFF Tg fue estadísticamente significativa (P<0.005). (F) Incremento de la expresión de células T - - efectoras en ratones BAFF Tg. Se tiñeron LSP con anticuerpos anti-CD4-Cycromo, anti-CD44-FITC y anti-L selectina-PE. Se muestran las células CD4+ inyectadas. Se indican los porcentajes de células CD44hl/L-selectinalc . Se muestra un ratón de control (izquierda) y dos ratones BAFF Tg (derecha) y los resultados son representativos de 8 animales analizados en cada grupo. La Figura 8 ilustra el incremento de compartimentos de células B en el bazo, pero no en médula ósea de ratones BAFF Tg. (A) tinción de SCAF para células B maduras empleando anticuerpos anti-IgM-FITC y anti-B220-PE en bazo (panel superior) , médula óqea (panel medio) y Ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) (panel inferior) . Se indican los porcentajes de células B220+/IgM+ células B maduras. (B) tinción de SCAF para células preB (B220+/CD43-) y células proB (B220+/CD43+) en médula ósea, empleando anticuerpos anti-CD43-FITC y anti-B220-Cy-cromo y anti-IgM-PE simultáneamente. Se muestran las células inyectadas en la población negativa para IgM. Están indicados los porcentajes de células preB (B220+/CD43-) y células proB (B220+/CD43+ ) . Para todas las figuras (A y B) se muestra un ratón control (izquierda) y dos ratones BAFF Tg (derecha) y los resultados son representativos de 7 animales analizados - - por cada grupo. La Figura 9 ilustra el incremento de los niveles de Ig, RF y CIC en ratones BAFF Tg. (A) EGPA-DSS de dos sueros control (-) y 4 sueros de ratones BAFF Tg (+ ) lado a lado, indicando la cantidad de IgG murina purificada como referencia. La intensidad de la banda de albúmina es similar en todos los carriles, lo cual indica que el material cargado en el gel es equivalente para cada muestra. Análisis basado en ELISA de la Ig murina total (B) , RF (C) y CIC (D) en suero de 19 animales control compañeros de camada (barras blancas) y 21 ratones BAFF Tg (barras negras) . En ausencia de un control RF apropiado, el titulo para RF (log base 2) se define como la dilución de suero que da una lectura de D.O. 3 veces más alta que la del fondo. La cantidad de CIC se define como la cantidad de PAP requerido para generar una DO equivalente a la obtenida con el suero probado. La diferencia entre los animales control y los ratones BAFF Tg fue estadísticamente significativa (P<0.001 en (B) y (C) , P<0.003 en (D) ) . La Figura 10 ilustra la presencia de autoanticuerpos anti-ADNuc (ADN de una sola cadena) y anti-ADNdc (ADN de doble cadena) en algunos ratones BAFF Tg. (A) análisis por ELISA de autoanticuerpos anti-ADNuc en 19 animales control compañeros de camada (barras - - grises) y 21 ratones BAFF Tg (barras negras) . (B) análisis por ELISA de autoanticuerpos anti-ADNuc en 5 animales control compañeros de camada y los 5 animales que muestran niveles de autoanticuerpos anti-ADNuc de (A) . (C) cortes emparafinados de riñon de un ratón control (izquierda) y de un ratón BAFF Tg (derecha), teñidos con antisuero de cabra anti-Ig-HRP murina. El depósito de Ig se muestra con una tinción café. Estas ilustraciones son representativas de 6 ratones BAFF Tg analizados . La Figura 11 ilustra placas de Peyer agrandadas en ratones BAFF Tg. Fotografía de placas de Peyer (indicadas con una flecha) del intestino delgado de un ratón control (izquierda) y de un ratón BAFF Tg (derecha) . Estas fotografías son representativas de cuando menos 12 ratones sacrificados por cada grupo. Amplificación 5X . La Figura 12 ilustra la organización alterada de células T y B, intensas reacciones del centro germinal, un número disminuido de células dendriticas y un número incrementado de células plasmáticas en el bazo de ratones BAFF Tg. Se muestra un ratón control en A, C, E y G y un BAFF Tg en B, D, F y H. Las células B son azules y las - - células T de color café (A y B) . Se muestran centros germinales con una flecha (C y D) . Se observan sólo unos cuantos centros germinales residuales en el ratón control (C) . Las células dendriticas CDllc positivas son de color café y aparecen en la zona de células T, en los canales de puente y en la zona marginal (E) . Muy pocas están presentes en ratones BAFF Tg (F) . Las células plasmáticas Syndecan-1 positivas sólo fueron detectables en pulpa roja de ratones BAFF Tg (H) , pero no en ratones control (G) . Estas fotografías son representativas de cuando menos 12 ratones BAFF Tg analizados y 12 ratones control.

La amplificación es 100X para todas las fotos, excepto C y D, las cuales fueron amplificadas a 50X. B: folículo de células B, T: HLAP (hojas linfoides arteriolares periféricas), PB : pulpa blanca, PR: pulpa roja. La Figura 13 ilustra la organización alterada de células T y B, intensas reacciones del centro germinal y un gran número de células plasmáticas en GLM de ratones BAFF Tg. El ratón control se muestra en A, C, E y G y el ratón BAFF Tg se muestra en B, D, F y H. La inmunohistoquimica se realizó de la manera descrita en la Figura 6. La tinción de células T y B se muestra en A y B, de los centros germinales en C y D, de las células - dendriticas en E y F y de las células plasmáticas en G y H. CG: centro germinal. Amplificación 100X. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ahora se hará referencia con detalle a las modalidades actualmente preferidas de la presente invención. La presente invención se refiere al uso de BAFF y de moléculas relacionadas con BAFF para afectar el crecimiento y maduración de células B y la secreción de inmunoglobulinas. La presente invención se refiere al uso de BAFF y moléculas relacionadas con BAFF para afectar las respuestas del sistema inmunitario, tal como sea necesario, inducidas por trastornos relacionados con el mismo. Adicionalmente, la presente invención incluye el tratamiento de cáncer y trastornos inmunitarios mediante el uso de un gen BAFF o un gen relacionado con BAFF, mediante métodos de terapia de genes. El ligando de BAFF y homólogos del mismo producidos por huéspedes transformados con las secuencias de la presente invención, asi como BAFF nativo purificado por los procesos conocidos en la técnica o producido a partir de secuencias de aminoácidos conocidas, son útiles en una variedad de métodos para aplicaciones contra el cáncer, antitumorales e inmunorreguladoras. También son útiles en terapia y métodos dirigidos contra otras enfermedades.

- - Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del polipéptido codificado por el ácido nucleico aislado que codifica para el ligando BAFF en una terapia "antisentido". Tal como se utiliza en la presente, el término terapia "antisentido" se refiere a la administración o a la generación in si tu de oligonucleótidos o derivados de los mismos, que se hibridizan específicamente, en condiciones celulares, con el ARNm celular y/o ADN que codifica para el ligando de interés, de manera que se inhiba la expresión de la proteina codificada, í.e. mediante la inhibición de la transcripción y/o de la traducción. La unión puede ser mediante complementariedad de pares de bases convencionales o, por ejemplo, en el caso de la unión a ADN dúplex, a través de interacciones especificas en la abertura principal de la doble hélice. En general, el término terapia "antisentido" se refiere a un rango de técnicas generalmente empleadas en este campo e incluye cualquier terapia que se base en la unión especifica a secuencias de oligonucleótidos. Una construcción antisentido de la presente invención se puede administrar, por ejemplo, en forma de un plásmido de expresión, el cual, cuando se transcribe en la célula, produce ARN complementario a cuando menos una porción del ARNm celular que codifica para el ligando Kay.

- - Alternativamente, la construcción antisentido puede ser una sonda oligonucleotidica generada ex vi vo . Tales sondas oligonucleotidicas de preferencia son oligonucleótidos modificados resistentes a nucleasas endógenas y, por lo tanto, estables in vi vo . Algunas moléculas de ácido nucleico de ejemplo para utilizarse como oligonucleótidos antisentido, son los fosforamidatos, fosfotioatos y análogos de metilfosfonato de ADN (véase, e.g., Patente Norteamericana No. US 5,176,996; Patente Norteamericana No. 5,264,564 y Patente Norteamericana No. 5,256,775). Adicionalmente, se han revisado enfoques generales para la construcción de oligómeros útiles en la terapia antisentido, por ejemplo, por Van Der Krol et al . (1988) Bi otechniques 6:958-976 y Stein et al . (1988) Cáncer Res 48:2659-2668, las cuales se incorporan específicamente en la presente como referencia. C. LIGANDO BAFF El ligando BAFF de la presente invención, tal como se describió anteriormente, es un miembro de la familia TNF y se describe en la solicitud PCT No. PCT/US98/19037 (W099/12964) y se incorpora en la presente, en su totalidad, como referencia. La proteina, fragmentos u homólogos de la misma pueden tener un amplio rango de aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. El ligando BAFF está presente principalmente en - - el bazo y en linfocitos de sangre periférica, lo cual indica una función reguladora en el sistema inmunitario. La comparación de las secuencias del ligando BAFF reivindicadas con otros miembros de la familia TNF humana, revela una considerable similitud estructural. Todas las proteínas comparten varias regiones de conservación de secuencia en el dominio extracelular. Aunque la estructura tridimensional precisa del ligando reivindicado se desconoce, se predice que, como miembro de la familia TNF, podria compartir ciertas características estructurales con otros miembros de la familia. Los nuevos polipéptidos de la presente invención interactúan específicamente con un receptor, el cual todavía no ha sido identificado. Sin embargo, los péptidos y métodos descritos en la presente, hacen posible la identificación de receptores que interactúan específicamente con el ligando BAFF o fragmentos del mismo. La invención reivindicada en ciertas modalidades, incluye métodos para utilizar péptidos derivados del ligando BAFF que tienen la capacidad de unirse a sus receptores. Se pueden producir fragmentos del ligando BAFF de diversas maneras, e.g., por métodos recombinantes, por reacción en cadena catalizada por polimerasa (RCP) , por digestión proteolitica o por síntesis química. Se pueden - - generar fragmentos internos o terminales de un polipéptido al remover uno o más nucleótidos de un extremo o de ambos extremos de un ácido nucleico que codifica para el polipéptido. La expresión del ADN mutagenizado produce fragmentos polipeptidicos. Los fragmentos polipeptidicos también se pueden sintetizar químicamente empleando técnicas conocidas en este campo, tales como la química f-moc ó t-boc de fase sólida de Merrifield. Por ejemplo, los péptidos y secuencias de ADN de la presente invención se pueden dividir arbitrariamente en fragmentos de una longitud deseada, sin traslapamiento de los fragmentos, o se pueden dividir en fragmentos de una longitud deseada que se traslapan. Estos métodos se describen con mayores detalles más adelante. Generación de Formas Solubles de un Ligando BAFF Las formas solubles del ligando BAFF a menudo pueden servir como señales efectivas y por lo tanto se pueden administrar como un fármaco que no imita la forma membranal natural. Es posible que el ligando BAFF reivindicado en la presente sea secretado naturalmente en forma de citocina soluble; sin embargo, si no lo es, el gen se puede someter a reingenieria para forzar su secreción. Para crear una forma soluble secretada del ligando BAFF, se pueden remover a nivel de ADN las regiones transmembranales N-terminales y una porción de la región de tallo y se reemplazan por una secuencia lider tipo I o alternativamente una secuencia lider tipo II, la cual permitirá un rompimiento proteolitico eficiente en el sistema de expresión seleccionado. Un técnico en la materia podria variar la cantidad de región de tallo retenida en la construcción de expresión por secreción, para optimizar tanto las propiedades de unión al receptor como la eficiencia de la secreción. Por ejemplo, se podrían preparar construcciones que contengan todas las posibles longitudes de tallo, i.e. truncaciones N-terminales, de tal modo que se obtendrían proteínas que iniciaran en los aminoácidos del 81 al 139. La secuencia de longitud de tallo óptima seria el resultado de este tipo de análisis. E. Generación de Anticuerpos que Reaccionan con el Ligando BAFF La presente invención también incluye anticuerpos que reaccionan específicamente con el ligando BAFF reivindicado o sus receptores. Se pueden preparar antisueros antiproteina/antipéptido o anticuerpos monoclonales mediante los protocolos estándar (véase por ejemplo, Antibodi es : A Labora tory Manual ed. por Harlos y Lañe (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Una mamífero tal como un ratón, un hámster o un conejo, se puede inmunizar - - con una forma inmunogénica del péptido. Las técnicas para conferirle inmunogenicidad a una proteina o péptido, incluyen la conjugación con vehículos u otras técnicas conocidas en este campo. Una porción inmunogénica del ligando BAFF o sus receptores, se puede administrar en presencia de un adyuvante. El progreso de la inmunización se puede supervisar mediante la detección de los títulos de anticuerpos en plasma o suero. Se puede utilizar la técnica de ELISA estándar u otros inmunoensayos, utilizando el inmunógeno como antigeno para evaluar los niveles de anticuerpos . En una modalidad preferida, los anticuerpos objeto son inmunoespecificos para determinantes antigénicos del ligando BAFF o sus receptores (e.g., determinantes antigénicos de un polipéptido de la SEQ ID NO: 2, en donde dicha secuencia se describe en la Solicitud Internacional PCT número PCT/US98/19037 (W099/12964) y se incorpora en su totalidad, en la presente) o un homólogo humano o de mamífero no humano estrechamente relacionado (e.g., con 70, 80 ó 90 por ciento de homología, de preferencia 95 por ciento de homología) . En todavía otra modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo anti-ligando BAFF o anti-receptor del ligando BAFF no presenta una reacción cruzada sustancial (i.e., reaccionar específicamente) con - una proteina que tenga, e.g., menos del 80 por ciento de homología con las SEQ ID NOS: 2 ó 6, en donde dicha secuencia es como la descrita en la Solicitud Internacional PCT número PCT/US98/19037 (W099/12964) y se incorpora en su totalidad en la presente; de preferencia menos del 90 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 2 tal como la secuencia descrita en la Solicitud Internacional PCT número PCT/US98/19037 (W099/12964) y se incorpora en su totalidad en la presente; y más preferiblemente menos del 95 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 2, en donde dicha secuencia es tal como la descrita en la Solicitud Internacional PCT número PCT/US98/19037 (W099/12964) y se incorpora en su totalidad en la presente. El término "no presenta una reacción cruzada sustancial" tal como se utiliza en la presente, significa que el anticuerpo tiene una afinidad de unión por una proteina no homologa, que es menor del 10 por ciento, de preferencia menor del 5 por ciento y todavía más preferiblemente menor del 1 por ciento de afinidad de unión por una proteina de la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia es como la descrita en la Solicitud Internacional PCT número PCT/US98/19037 (W099/12964) y se incorpora en su totalidad en la presente. El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente, incluye fragmentos de anticuerpos que también reaccionan específicamente con el ligando BAFF o sus - - receptores. Los anticuerpos se pueden fragmentar utilizando las técnicas convencionales y los fragmentos se pueden seleccionar por su utilidad de la misma manera que la anteriormente descrita para los anticuerpos completos. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab')2 mediante el tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante, se puede tratar para reducir los puentes de disulfuro, para producir fragmentos Fab' . Los anticuerpos de la presente invención además tienen el propósito de incluir moléculas bioespecificas y quiméricas que tengan actividad anti-ligando BAFF o anti-receptor de ligando BAFF. Asi pues, se pueden usar tanto anticuerpos monoclonales como anticuerpo.s policlonales (Ab) dirigidos contra el ligando BAFF, contra el ligando tumoral y sus receptores, y fragmentos de anticuerpo tales como Fab' y F(ab')2, para bloquear la acción del ligando y su respectivo receptor. También se pueden preparar varias formas de anticuerpos empleando las técnicas estándar de ADN recombinante. Winter y Milstein (1991) Nature 349:293-299, que se incorpora específicamente en la presente como referencia. Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos quiméricos en los que el dominio de unión al antigeno de un anticuerpo animal se liga a un dominio constante humano, (e.g. Cabilly et al . Patente Norteamericana No. 4,816,567, - - la cual se incorpora en la presente como referencia) . Los anticuerpos quiméricos pueden reducir las respuestas inmunogénicas observadas inducidas por anticuerpos animales cuando se utilizan en tratamientos clínicos humanos. Además, se pueden sintetizar "anticuerpos humanizados" recombinantes que reconocen al ligando BAFF o sus receptores. Los anticuerpos humanizados son quimeras que comprenden principalmente secuencias de IgG humana en las cuales las regiones responsables de la unión especifica al antigeno han sido insertadas. Se inmunizan animales con el antigeno deseado, los anticuerpos correspondientes se aislan y la porción de las secuencias de región variable responsables de la unión especifica al antigeno se remueven. Después, las regiones de unión al antigeno derivadas del animal se clonan en la posición apropiada en genes de anticuerpos humanos en los cuales las regiones de unión al antigeno han sido eliminadas. Los anticuerpos humanizados minimizan el uso de secuencias heterólogas (i.e., interespecies) en anticuerpos humanos y., de esta manera, es menos probable que induzcan respuestas inmunitarias en el sujeto tratado. La construcción de diferentes clases de anticuerpos recombinantes, también se puede lograr preparando anticuerpos quiméricos o humanizados que comprenden dominios variables y dominios constantes humanos - - (CH1, CH2, CH3) aislados de diferentes clases de inmunoglobulinas. Por ejemplo, los anticuerpos que incrementan la valencia de los sitios de unión al antigeno se pueden producir de manera recombinante al clonar el sitio de unión al ant;igeno en vectores portadores de las regiones humana: cadena constante. Arulanandam et al . (1993) J. Exp . Med. 177:1439-1450, que se incorpora en la presente como referencia. Además, se pueden usar técnicas de ADN recombinante estándar para alterar las afinidades de unión de los anticuerpos recombinantes con sus antigenos, mediante la alteración de residuos de aminoácido en la vecindad de los sitios de unió al antigeno. La afinidad de unión al antigeno de un anticuerpo humanizado, se puede incrementar por mutagénesis basada en modelado molecular. Queen et al . (1989) Proc . Na t 'l Acad. Sci . 86:10029-33, la cual se incorpora en la presente como referencia. F. Generación de Análogos: Producción de ADN Alterado y Secuencias Peptidicas Los análogos del ligando BAFF pueden diferir del ligando BAFF de origen natural en la secuencia de aminoácidos o de maneras que no involucren a las secuencias, o ambas. Las modificaciones que no son de secuencia incluyen la derivación química in vi vo o in vi tro del ligando BAFF. Algunas modificaciones que no son de - - secuencia incluyen, pero no se limitan a, cambios en la acetilación, metilación, fosforilación, carboxilación o glucosilación. Los análogos preferidos incluyen fragmentos biológicamente activos del ligando BAFF cuyas secuencias difieren de la secuencia presentada en la SEQ ID NO: 2, dicha secuencia tal como se describe en la Solicitud PCT número PCT/US98/19037 (W099/12964) y se incorpora en su totalidad en la presente, por una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o por una o más sustituciones de aminoácidos no conservadoras, deleciones o inserciones, que no eliminan la actividad del ligando BAFF. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen la sustitución de un aminoácido por otro de características similares, e.g. sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. G. Materiales y Métodos de la Invención El anticuerpo monoclonal anti-Flag M2, el anticuerpo biotinado anti-Flag M2 y el anticuerpo anti-Flag M2 acoplado con agarosa, se compraron en Sigma. Los reactivos para cultivo celular se obtuvieron en Life Sciences (Basel, Suiza) y Biowhittaker (Walkersville, MD) .

- - El polipéptido APRIL humano soluble marcado con Flag (residuos Kno-L25o) fue producido en células 293 de la manera descrita (10, 11) . Los anticuerpos anti-CD4 marcado con FITC, anti-CD8 y anti-CD19 se compraron en Pharmingen (San Diego, CA) . El suero de cabra F(ab')2 especifico del fragmento Fcsµ de la IgM humana, se compró en Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) . Los anticuerpos secundarios se obtuvieron en Pharmingen o en Jackson ImmunoResearch y se utilizaron a las diluciones recomendadas. Se mantuvieron células de riñon embrionario humana 293 T (12) y lineas celulares de fibroblastos (Tabla 1) en medio DMEM que contenia 10% de suero fetal de ternera (SFT) inactivado por calor. Las células 293 de riñon embrionario humano se mantuvieron en medio DMEM-nutriente, mezcla F12 (1:1) suplementado con 2% de SFT. Se hicieron crecer lineas de células T, lineas de células B y lineas de células de macrófagos (Tabla 1) en medio RPMI suplementado con 10% de SFT. Se cultivaron células Molt-4 en medio de Iscove suplementado con 10% de SFT. Se hicieron crecer lineas de células epiteliales en medio MEM-alfa conteniendo 10% de SFT, aminoácidos no esenciales 0.5 mM, Na-Hepes 10 mM y piruvato de Na 1 mM. Se mantuvieron células HUVEC en medio M199 suplementado con 20% de SFT, 100 µg/mL de factor de crecimiento de células epiteliales (Collaborative - Research, Inotech, Dottikon, Suiza) y 100 µg/mL de sal sódica de heparina (Sigma) . Todos los medios contenían los antibióticos penicilina y estreptomicina. Se aislaron leucocitos de sangre periférica de sangre heparinizada de voluntarios adultos sanos, por la técnica de Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) en un gradiente de centrifugación y se cultivaron en medio RPMI con 10% de SFT. Se obtuvieron células T de LSP no adherentes por la técnica de formación de rosetas con eritrocitos de carnero tratados con neuraminidasa y se separaron de las células no formadoras de rosetas (en su mayoría células B y monocitos) por la técnica de Ficoll-Paque de gradiente de centrifugación. Las células T purificadas se activaron por 24 horas con fitohemaglutinina (Sigma) (1 µg/mL), se lavaron y se cultivaron en RPMI, 10% SFT, 20 U/mL de IL-2. Se purificaron monocitos CD14+ mediante selección magnética de células, empleando anticuerpos anti-CD14, microcuentas revestidas con suero de cabra anti-murino y un dispositivo Minimacs™ (Miltenyi Biotech) y se cultivaron en presencia de FEC-GM (factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos) (800 U/mL, Leucomax®, Essex Chemie, Lucerna, Suiza) e IL-4 (20 ng/mL, Lucerna Chem, Lucerna, Suiza) , durante 5 dias, después con FEC-GM, IL-4 y TNF (200 U/mL, Bender, Viena, Austria) , por un periodo adicional de 3 - - dias, para obtener una población de células similares a dendriticas CD83+. Se aislaron células B humanas con >97% de pureza de sangre periférica o de sangre de cordón umbilical, empleando cuentas magnéticas ant?-CD19 (M450, Dynal, Oslo, Noruega), de la manera descrita (13). Análisis de Inmunoelectrotransferencia tipo Northern (Northern blot) El análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Northern se llevó a cabo empleando Northern blots I y II de Tejidos Múltiples Humanos (Clontech #7760-1 y #7759-1) . Las membranas se incubaron en solución de hibridación (50% de formamida, 2.5 x Denhardt, 0.2% SDS, AEDT 10 mM, 2 x SSC, NaH2po4 50 mM, pH 6.5, 2 0 µg/mL de ADN de esperma de salmón sonicado) durante 2 horas a 60°C. Una sonda de ARN antisentido que contenia los nucleótidos correspondientes a los aminoácidos del 136 al 285 de hBAFF, se desnaturalizó por calor y se agregó a razón de 2 x 106 cpm/mL en solución de hibridación fresca. La membrana se hibridizó durante 16 h a 62°C, se lavó una vez con 2 x SSC, 0.05% de SDS (30 min a 25°C), una vez con 0.1 x SSC, 0.1% de SDS (20 min a 65°C) y se expuso a -70°C a películas de rayos X. Caracterización de ADNc de BAFF Una secuencia parcial de ADNc de BAFF humano estaba contenida en varias clonas EST (e.g., GenBank, números de acceso T87299 y AA166695) derivadas de - bibliotecas de higado y bazo fetales y de cáncer ovárico. La porción 5' del ADNc fue obtenida mediante 5' -RACE-PCR (Marathon-Ready cDNA, Conetech, Palo Alto, CA) realizando la amplificación con oligonucleótidos API y JT1013 (5'-ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC-3' ) [SEQ ID NO: 9], empleando la biblioteca de ADNc proporcionada por una mezcla de leucocitos humanos como plantilla, de la manera recomendada por el fabricante. El producto resultante de la RCP se clonó en RCP-0 blunt (Invitrogen, NV Leek, Los Paises Bajos) y se subclonó en forma de un fragmento £coRI/PstI en el vector pT7T3 Pac (Pharmacia) conteniendo la clona EST T87299. Por lo tanto, se obtuvo ADNc de hBAFF de longitud completa mediante la combinación de los fragmentos 5' y 3', empleando el sitio interno PstI de BAFF. A la secuencia se le asignó el número de acceso de GenBank AF116456. Una secuencia parcial de 617 pb de BAFF murino estaba contenida en dos clonas EST traslapadas (AA422749 y AA254047) . Se utilizó un fragmento de RCP de nucleótidos del 158 al 391 de esta secuencia, como sonda para seleccionar una biblioteca de ADNc esplénico murino (Stratagene, La Jolla, CA) . Expresión de BAFF Recombinante Se amplificó hBAFF de longitud completa utilizando los oligonucleótidos JT1069 (5'-GACAAGCTTGCCACCATGGATGACTCCACA-3' ) [SEQ ID NO: 10] y JT637 (5'-ACTAGTCACAGCAGTTTCAATGC-3' ) [SEQ ID NO: 11]. El producto de RCP se clonó en RCP-0 blunt y fue vuelto a subclonar en forma de un fragmento HindIII/£coRI en el vector de expresión mamífero PCR-3. Una versión corta del BAFF soluble (aminoácidos del Q136 al L285) se amplificó empleando los oligonucleótidos JT636 (5'-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3' ) [SEQ ID NO: 12] y JT637. Se obtuvo una versión larga de BAFF soluble (aa L83-L285) a partir del BAFF de longitud completa, empleando el sitio interno PstI. Se volvieron a subclonar BAFF solubles en forma de fragmentos PstI/£coRI detrás del péptido de señal de hemaglutinina y la secuencia Flag de un vector PCR-3 modificado y, como fragmentos PstI/Spel, en un vector de expresión bacteriano pQE16 modificado, dentro del marco de lectura, con una secuencia Flag N-terminal (14). Las construcciones se secuenciaron en ambos filamentos. El establecimiento de lineas de células 293 estables que expresan la forma soluble corta o el BAFF de longitud completa, y la expresión y purificación de BAFF soluble recombinante a partir de bacterias y células 293 de mamíferos, se llevó a cabo de la manera descrita (14, 15). RCP de Transcriptasa Inversa Se extrajo ARN total de células T, células B, células dendriticas inmaduras derivadas in vi tro, células 293 wt y células 293-BAFF (de longitud completa) , se sometió a una transcripción inversa utilizando el sistema Ready to Go (Pharmacia) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se detectaron ADNc de BAFF y de ß-actina por amplificación por RCP con ADN Taq polimerasa (etapas de 1 minuto cada una a 94°C, 55°C y 72°C durante 30 ciclos), empleando oligonucleótidos específicos: para BAFF, JT1322 5' -GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC-3' [SEA 13] y JT1323 5'-CAATTCATCCCCAAAGACATGGAC-3' [SEQ ID NO: 14]; para el receptor de la cadena alfa de IL-2, JT1368 5'-TCGGAACACAACGAAACAAGTC-3' [SEQ ID NO: 15] y JT1369 5'-CTTCTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3' [SEQ ID NO: 16]; para ß-actina, 5' -GGCATCGTGATGGACTCCG-3' [SEQ ID NO: 17] y 5'-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3' [SEQ ID NO: 18]. Cromatografía de Permeación en Gel Se transfectaron transitoriamente células 293T con la forma corta del BAFF soluble y se hicieron crecer en medio Optimem sin suero durante 7 dias. Los sobrenadantes condicionados se concentraron 20 x, se mezclaron con estándares internos de catalasa y ovoalbúmina, y se cargaron en una columna Superdex-200 HR10/30. Las proteínas se eluyeron con PBS a razón de 0.5 mL/min y las fracciones (0.25 mL) se precipitaron con ácido tricloroacético y se analizaron por inmunoelectrotransferencia tipo Western (Western blot) , - - empleando el anticuerpo anti-Flag M2. La columna se calibró con proteínas estándar: ferritina (440 kDa), catalasa (232 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina sérica bovina (67 kDa), ovoalbúmina (43 kDa), quimiotripsinógeno A (25 kDa) y ribonucleasa A (13.7 kDa). Tratamiento con PNGasa F Se calentaron muestras en 20 µL de SDS al 0.5%, 2-mercaptoetanol al 1% durante 3 minutos a 95°C, después se enfriaron y se suplementaron con 10% de Nonidet P-40 (2 µL) , fosfato de sodio 0.5M pH 7.5 (2 µL) y péptido N-glicanasa F (125 unidades/µL, 1 µL, o sin enzima en los controles) . Las muestras se incubaron durante 3 horas a 37°C antes de someterlas a un análisis por Western blot. Secuenciación de EDMAN Se transfectaron transitoriamente células 293 T con la forma larga de BAFF soluble y se hicieron crecer en medio Optimem sin suero durante 7 dias. Los sobrenadantes condicionados se concentraron 20 x, se fraccionaron por EGPA-DSS y se sometieron a inmunoelectrotransferencia en una membrana de difluoruro de polivinilideno (BioRad Labs, Hercules, CA) de la manera previamente descrita (16) y después se secuenciaron empleando un secuenciador de fase gaseosa (ABI 120A, Perkin Elmer, Foster City, CA) acoplado con un analizador (ABI 120A, Perkin Elmer) , equipado con una columna de feniltiohidantonia C18 2.1 x 250 mm. Los datos se analizaron mediante software ABI 610 (Perkin Elmer) . Anticuerpos Se generaron anticuerpos policlonales en conejos inmunizados (Eurogentec, Seraing, Bélgica) con BAFF soluble recombinante. El bazo de ratas inmunizadas con el mismo antigeno se fusionó con células de mieloma murino x63Ag8.653 y los hibridomas se seleccionaron en busca de IgGs especificas de BAFF. Uno de estos anticuerpos monoclonales, el 43.9, es una IgG2a que reconoce específicamente al hBAFF. < Se tiñeron células en 50 µL de solución reguladora SCAF (PBS, 10% de SFT, 0.02% NaN3) con 50ng (o la cantidad indicada) de hBAFF soluble corto marcado con Flag, durante 20 min a 4°C, seguido por un anticuerpo anti-Flag M2 (1 µg) y un anticuerpo secundario. El anticuerpo monoclonal 43.9 anti-BAFF se utilizó a 40 µg/mL. Para el análisis SCAF de dos colores, se tiñeron linfocitos de sangre periférica con BAFF soluble marcado con Flag/largo (2 µg)mL), seguido por un anticuerpo anti-Flag M2 (1/400) y PE marcado con estreptavidina (1/100), seguido por anti-CD4 marcado con FITC, anti-CD8 ó anti-CD19. Ensayo de Proliferación de LSP Se incubaron linfocitos de sangre periférica en placas de 96 pozos (105 células/pozo en 100 µL de RPMI - - suplementado con 10% de SFT) durante 72 horas en presencia o ausencia de 2 µg/mL de suero de cabra anti-cadena' µ humana (Sigma) o un anticuerpo control (F(ab')2 y con la concentración indicada de BAFF soluble/largo nativo o hervido. Las células se pulsaron durante 6 horas adicionales con [3H]timidina (1 µCi/pozo) y se cosecharon. La incorporación de la [3H]timidina se monitoreó mediante una cuenta de centelleo en medio liquido. En algunos experimentos, el BAFF soluble recombinante fue reemplazado por células 293 transfectadas de manera estable con BAFF de longitud completa (o células 293 wt como control), las cuales hablan sido fijadas durante 5 minutos a 25°C con paraformaldehido al 1%. El ensayo se realizó de la manera descrita (17). En experimentos adicionales, se aislaron células CD19+ de LSP con cuentas magnéticas y las células CD19~ restantes fueron irradiadas (3000 rads) antes de la reconstitución con células CD19T. Después se realizó el ensayo de proliferación con sBAFF, de la manera anteriormente descrita. - Ensayo de Activación de Células B Se activaron células B purificadas en el sistema de cultivo EL-4 de la manera descrita (13) . Brevemente, 104 células B se mezclaron con 5 x 104 células EL-4 de timoma murino irradiadas (clona B5) , se cultivaron durante 5-6 dias en 200 µL de medio conteniendo 5% v/v de - - sobrenadante de cultivo de células T humanas (lOV L) que hablan sido activadas durante 48 horas con PHA (1 µg/mL) y PMA (1 ng/mL) . Después, las células B se volvieron aislar con cuentas anti-CD19 y se cultivaron durante otros 7 dias (5 x 10" células en 200 µL, cultivo por duplicado o triplicado en placas de 96 pozos de fondo plano) , en medio solo o en medio suplementado con 5% de sobrenadante de células T o con 50 ng/mL de IL-2 (gentilmente proporcionada por el anterior Glaxo Institute for Molecular Biology, Genova) y 10 ng/mL de IL-4 y de IL-10 (Peprotech, Londres, GB) , en presencia o ausencia de sBAFF. El anticuerpo anti-Flag M2 fue agregado a una concentración de 2 µg/mL y no tuvo efecto por si mismo. La IgM, IgG e IgA se cuantificaron en los sobrenadantes de los cultivos por ensayos de ELISA, de la manera descrita (13) . El BAFF humano se identificó por homología de secuencia como un posible nuevo miembro de la familia de ligandos de TNF, mientras que se investigó en bases de datos públicas utilizando un perfil de investigación mejorado (18). Se obtuvo un ADNc que codifica para la proteina completa de 285 aminoácidos (aa) mediante la combinación de clonas EST (abarcando la región 3' ) con un fragmento (región 5') amplificado por RCP. La ausencia de un péptido de señal sugiere que el BAFF es una proteina de membrana tipo II que es tipica de los miembros de la - - familia de ligandos TNF. La proteina tiene un dominio citoplasmático predicho de 46 aa, una región transmembranal hidrofóbica y un dominio extracelular de 218 aa que contiene dos sitios potenciales de N-glucosilación (Fig. ÍA) . La secuencia . del domino extracelular de BAFF, demuestra la homología más alta con APRIL (33% de identidad de aminoácidos, 48% de homología) , mientras que la identidad con otros miembros de la familia, tales como TNF, FasL, LTa, TRAIL o RANKL, está por debajo del 20% (Figs. IB, C) . La clona de ADNc de BAFF murino aislada de una biblioteca de bazo, codificó para una proteina ligeramente más larga (309 aa) , debido a una inserción entre la región transmembranal y la primera de varias cadenas ß, lo cual constituye al dominio de unión al receptor en todos los miembros de ligandos TNF (19). Este ectodominio rico en cadena ß es casi idéntico en el BAFF murino y el humano (86% de identidad, 93% de homología), lo cual sugiere que el gen BAFF ha sido altamente conservado durante la evolución (Fig. ÍA) . Aunque los miembros de la familia TNF se sintetizan como ligandos insertados a la membrana, el rompimiento de la región de tallo entre la región transmembranal y el dominio de unión al receptor, frecuentemente se observa. Por ejemplo, el TNF ó el FasL se desprenden fácilmente de la superficie celular utilizando metaloproteinasas (20, 21) . Mientras que se producen varias formas de BAFF recombinante en células 293T, se observó que una forma recombinante soluble de 32 kDa del BAFF (aa del 83 al 285, sBAFF/largo) , que contenia la región de tallo completa y una marca Flag N-terminal en adición al domino de unión al receptor, se procesaba extensamente hasta un fragmento menor de 18 kDa (Figs. 2A, B) . El rompimiento ocurrió en la región del tallo, puesto que el fragmento era detectable sólo con anticuerpos dirigidos contra el dominio de interacción del receptor completo de BAFF, pero no con anticuerpos anti-Flag (datos no mostrados) . También se reveló que sólo N124 (localizado en el tallo) pero no N242 (localizado en la entrada de la F-hoja ß) estaba glucosilado, puesto que la masa molecular del sBAFF no procesado/largo se redujo de 32 kDa a 30 kDa al remover los carbohidratos N-ligados con PNGasa F, mientras que la molécula de 18 kDa no fue sensible a este tratamiento. El análisis de secuencia de péptidos del fragmento de 18 kDa, de hecho demostró que el rompimiento ocurría entre R133 y A134 (Fig. ÍA) . R133 yace en el extremo de una región polibásica que está conservada en humanos (R-N-K-R) y ratones (R-N-R-R) . Para probar si el rompimiento no era únicamente un artefacto de la expresión de formas de BAFF solubles no naturales, se expresó BAFF de - longitud completa, unido a la membrana, en células 293T (Fig. 2C) . El BAFF completo de 32 kDa y algunas de las especies de masa molecular superior (probablemente correspondiendo a dimeros y trímeros no disociados) , fueron fácilmente detectables en extractos celulares, pero más del 95% del BAFF recuperado del sobrenadante, correspondía a la forma procesada de 18 kDa, lo cual indica que BAFF también fue procesado cuando se sintetizó en forma de ligando unido a la membrana. Un BAFF soluble se procesó por ingeniería genética (Q136-L285, sBAFF/corto) cuya secuencia empezaba 2 aa cadena abajo del sitio de procesamiento (Fig. IB) . Tal como fue predicho, la marca Flag unida al extremo N-terminal de esta molécula recombinante, no fue removida (datos no mostrados) , lo cual permitió su purificación mediante una columna de afinidad anti-Flag. Para probar su plegamiento correcto, el sBAFF/corto purificado se analizó por filtración en gel, en donde la proteina eluyó a una masa molecular aparente de 55 kDa (Fig. 2D) . El sBAFF/corto se ensambla correctamente en un homotrimero (3 x 20 kDa) , lo cual concuerda con la estructura cuaternaria de otros miembros de la familia TNF (19) . Finalmente, el sBAFF/largo no procesado se expresó fácilmente en bacterias, lo cual indica que el evento de rompimiento fue especifico para células eucarióticas.

- - El análisis de Northern blot del BAFF reveló que el ARNm de BAFF de 2.5 kb era abundante en el bazo y en LSPs (Fig. 3A) . Las células de timo, corazón, placenta, intestino delgado y pulmón mostraron una expresión débil. Esta distribución restringida sugiere que las células de tejidos linfoides fueron la fuente principal del BAFF. Mediante un análisis por RCP, se encontró que el ARNm de BAFF estaba presente en células T y en células dendriticas derivadas de monocitos de sangre periférica, pero no en células B (Fig. 3B) . Incluso células T ingenuas no estimuladas parecieron expresar algo de ARNm de BAFF. Una secuencia con un sitio marcado (STS, SHGC-36171) se encontró en la base de datos que incluía a la secuencia de BAFF humano. El mapa de este sitio se encuentra en el cromosoma 13 humano, en un intervalo 9cM entre los marcadores D13S286 y D13S1315. En el mapa citogenético, este intervalo corresponde a 13q32-34. De los miembros de la familia TNF conocidos, sólo RANKL (Trance) ha sido localizado en este cromosoma (22), aunque muy distante al BAFF (13ql4) . Con el fin de que el ligando ejerza sus efectos biológicos máximos, es probable que el receptor de BAFF (BAFF-R) se exprese en las mismas células o en células vecinas presentes en tejidos linfoides. Empleando sBAFF recombinante como herramienta para determinar - específicamente la expresión de BAFF-R por SCAF, se encontraron altos niveles de expresión del receptor en varias lineas de células B, tales como células de linfoma de Burkitt, células Raji y BJAB (Fig. 4A, Tabla 1). En contraste, las lineas de células T, fibroblásticas, epiteliales y endoteliales fueron negativas. Se observó una tinción muy débil en la linea de monocitos THP-1, lo cual, sin embargo, puede deberse a la unión del receptor Fc. Asi pues, la expresión de BAFF-R parece estar restringida a lineas de células B. Las dos lineas de células B murinas probadas fueron negativas empleando BAFF humano como sonda, aunque se observó una unión débil en esplenocitos murinos (datos no mostrados) . La presencia de BAFF-R en células B fue corroborada mediante un análisis de linfocitos de sangre periférica y de cordón umbilical.

Mientras que las células T CD8+ y CD4" carecían de BAFF-R (Fig. 4B y datos no mostrados), se observó una tinción abundante en células B CD19+ (Figs. 4A y 4B) , lo cual indica que BAFF-R se expresa en todas las células B de la sangre, incluyendo las células B ingenuas y las de memoria. Puesto que el BAFF se une a células B derivadas de la sangre, se realizaron experimentos para experimentar si el ligando podia enviar señales estimulantes o inhibidoras del crecimiento. Se estimularon linfocitos de sangre periférica (LSP) con anticuerpos anti-IgM (µ) junto con células 293 fijadas que expresaban de manera estable BAFF de superficie (Fig. 5A) . Los niveles de incorporación de [3H]timidina inducidos por el anti-µ solo no fueron alterados por la presencia de células control, pero se incrementaron al doble en presencia de células transfectadas con BAFF (Fig. 5B) . También se obtuvo una proliferación de LSP dependiente de la dosis cuando se reemplazaron las células transfectadas con BAFF por células sBAFF purificadas (5C) , lo cual indica que BAFF no requiere de unirse a la membrana para ejercer su actividad. En esta etapa experimental, la proliferación inducida por sCD40L requirió concentraciones que excedían de 1 µg/mL, pero fue menos dependiente de la presencia de anti-u que la mediada por BAFF (Fig. 5D) . Cuando se cocultivaron células B CD19+ purificadas con LSP CD19" autólogos irradiados, la coestimulación de la proliferación por BAFF no fue afectada, lo cual demuestra que la incorporación de [3H]timidina se debió principalmente a la proliferación de células B y no a una estimulación indirecta de otro tipo de células (datos no mostrados) . La proliferación de células B observada en respuesta a BAFF fue completamente dependiente de la presencia de anticuerpos anti-µ, lo cual indica que BAFF funcionó como coestimulador de la proliferación de células B. Para investigar un posible efecto de BAFF sobre - - la secreción de inmunoglobulinas, se preactivaron células B de sangre periférica o de cordón cocultivándolas con células T EL-4 en presencia de una mezcla de citocinas proveniente de sobrenadantes de células B estimuladas con PHA/PMA (23) . Estas .células se aislaron nuevamente hasta un 98% de pureza y se obtuvo un incremento del doble en la secreción de Ig durante un cultivo secundario en presencia de BAFF y citocinas de células T activadas, en comparación con las citocinas solas. Ocurrió un efecto muy modesto en ausencia de citocinas exógenas y un efecto intermedio (1.5 veces) se observó en presencia de citocinas recombinantes IL-2, IL-4 e IL-10 (Figs. 5E, F) . El análisis bioquímico de BAFF también concuerda con la estructura homotrimérica tipica de los miembros de la familia TNF. Entre esta familia de ligandos, BAFF exhibe el más alto nivel de similitud de secuencia con APRIL, el cual recientemente fue caracterizado como un ligando estimulador del crecimiento de varias células tumorales (11) . A diferencia de TNF y LT que son dos miembros de la familia con una homología igualmente elevada (33% de identidad) y cuyos genes están ligados al cromosoma 6, APRIL y BAFF no están agrupados en el mismo cromosoma.

APRIL está localizado en el cromosoma 17 (J. L. B., datos no publicados) , mientras que BAFF está en el brazo distal del cromosoma humano 13 (13q34) . Las anormalidades en este locus fueron caracterizadas en linfoma de Burkitt como el segundo defecto más frecuente (24) además de la translocación que involucra al gen myc en el locus Ig (25) . Considerando los altos niveles de expresión BAFF-R en todas las lineas de células de linfoma de Burkitt analizadas (véase Tabla 1), esto hace surgir la intrigante posibilidad de que algunos linfomas de Burkitt pueden ser desrregulados por la expresión de BAFF, estimulando de esta manera el crecimiento de manera autocrina. La función de linfocitos B específicos de antigeno durante las diferentes etapas de la respuesta inmunitaria, depende mucho de señales y contactos provenientes de células T cooperadoras y células presentadoras de antigeno, tales como células dendriticas (20) . Los linfocitos B primero reciben estas señales en una etapa temprana durante la respuesta inmunitaria, cuando interactúan con células T en el borde de los folículos de células B en los tejidos linfoides, causando su proliferación y diferenciación en células formadoras de anticuerpos de baja afinidad (18) . Al mismo tiempo, algunas células B especificas de antigeno también migran hacia el folículo de células B y contribuyen no sólo a la formación de centros germinales, que son otro sitio de proliferación de células B, sino que también a la maduración de la afinidad y la generación de células B de memoria y células plasmáticas de alta afinidad (19) . Las señales disparadas por otro miembro de la superfamilia TNF CD40L, se demostró que eran criticas para la función de los linfocitos B en múltiples etapas de la respuesta inmunitaria dependiente de células T. Sin embargo, varios estudios demuestran claramente que la interacción CD40L/CD40 no explica toda la ayuda de células T dependiente del contacto para las células B. De hecho, las células T deficientes de CD40L aisladas de ratones "knock-out" o de pacientes con síndrome de hiper-IgM ligado a X o ligado al sexo, se ha demostrado que inducen exitosamente la proliferación de células B y su diferenciación en células plasmáticas. Algunos estudios que utilizaron anticuerpos bloqueadores contra CD40L, demostraron que una subpoblación de células B positivas para IgD de superficie aisladas de amígdalas humanas, proliferan y se diferencian en respuesta a las células T activadas, de manera independiente de CD40. Otros miembros de la familia TNF, tales como TNF unido a la membrana y CD30L, también se ha demostrado que participan en la estimulación de células B independiente de CD40 y de Ig de superficie. De manera similar a nuestros resultados con BAFF, se ha demostrado que células B deficientes de CD40 pueden ser estimuladas para proliferar y diferenciarse en células plasmáticas por las células T cooperadoras, en tanto que los receptores Ig de superficie sean disparados al mismo tiempo. BAFF, asi como CD30L y CD40L son expresados por las células T, pero su originalidad reside en su expresión por células dendriticas, asi como por la localización altamente especifica de su receptor en las células B, lo cual contrasta con CD40, CD30 y el receptor de TNF, cuya expresión se ha descrito en muchas células diferentes. Esta observación sugiere funciones independientes y especificas inducidas por BAFF en las células B. En apoyo a la función del BAFF en el crecimiento y maduración potencial de células B inducido por células T y células dendriticas, se encontró que el BAFF coestimula la proliferación de células B derivadas de sangre de manera concomitante con un enlace cruzado de los receptores de las células B y, de esta manera, independientemente de la señalización de CD40. Además, empleando células B positivas para CD19 diferencias in vi tro en células preplasmáticas/células B similares a CG (14), se observó un efecto coestimulador del BAFF sobre la secreción de Ig por estas células B, en presencia de un sobrenadante proveniente de células T activadas o una mezcla de IL-2, IL-4 e IL-10. De manera interesante, el efecto coestimulador fue más fuerte en presencia del sobrenadante de células T activadas cuando se comparó con la mezcla de citocinas, lo cual sugiere la presencia de factores solubles adicionales secretados por las células T activadas que participan en la producción de anticuerpos, que pueden tener un efecto sinérgico con el BAFF o BAFF adicional mismo. Por lo tanto, es posible que el BAFF contribuya activamente en la diferenciación de estas células B similares a CG en el plasma. Está claro que BAFF puede señalizar tanto células B ingenuas como células B comprometidas con CG in vi tro . El hecho de si esta observación se traducirá o no durante una respuesta inmunitaria normal, tendrá que ser investigado mediante experimentos in vi vo apropiados. Las respuestas biológicas inducidas por células B por el BAFF son distinguibles de aquellas inducidas por CD40L, ya que la proliferación disparada por CD40L fue menos dependiente del coestimulo con anticuerpos anti-µ (17) y Fig. 5D) . Además, CD40L puede contrarrestar señales apoptóticas en células B después de acoplarse con el receptor de células B (29) , mientras que BAFF no fue capaz de rescatar la linea de células B Ramos de la apoptosis mediada por anticuerpos anti-µ, a pesar del hecho de que las células Ramos expresan BAFF-R (Tabla 1; F. M y J. L. B., observaciones o publicadas). Por lo tanto, es probable que CD40L y BAFF cumplan con distintas funciones. A este respecto, es notable que BAFF no interactuó con ninguno de los 16 receptores recombinantes de la familia TNF probados, incluyendo CD40 (P.S y J.T., observaciones no publicadas). El crecimiento de células B fue coestimulado de manera efectiva con BAFF soluble recombinante que carecía del dominio transmembranal. Esta actividad contrasta con varios miembros de la familia TNF, los cuales son activos sólo como ligandos unidos a la membrana, tales como TRAIL, FasL y CD40L. Las formas solubles de estos ligandos tienen poca actividad biológica, la cual se puede intensificar mediante la formación de enlaces cruzados, imitando de esta manera el ligando unido a la membrana (15) . En contraste, los enlaces cruzados de sBAFF marcado con Flag con anticuerpos anti-Flag o el uso de un BAFF unido a la membrana expresado en la superficie de células epiteliales, no intensificaron la actividad mitogénica del BAFF, lo cual sugiere que puede actuar sistemáticamente como citocina secretada, al igual que el TNF. Esto concuerda con la observación de que una secuencia polibásica presente en el tallo de BAFF, actuó como sustrato para una proteasa. Secuencias polibásicas similares también están presentes en las correspondientes ubicaciones tanto en APRIL como en TWEAK, para las cuales existe evidencia de un procesamiento proteolitico (30) (N.H. y J. T., observaciones no publicadas) . Aunque la proteasa responsable del rompimiento todavía está por determinarse, es poco probable - que sea la metaloproteinasa responsable de la liberación del TNF unido a la membrana, ya que sus preferencia de secuencia difieren por completo (21) . Las porciones polibásicas en BAFF (R-N-K-R) , APRIL (R-K-R-R) y TWEAK (R-P-R-R) son reminiscentes de la señal de rompimiento minimo para la furina (R-X-K/R-R) , que es el prototipo de una proproteina de la familia de la convertasa (31) . La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, las técnicas convencionales de la biología celular, cultivos celulares, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas e inmunología, las cuales están dentro de los conocimientos de los técnicos en la materia. Tales técnicas se describen en la literatura científica. Véase por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N. Glover, ed. ) , 1985; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed.), 1984; Patente Norteamericana No. 4,683,195 (Mullis et al . ) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.) 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed) . Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; - Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155 (Wu et al . , eds.), Academic Press, Nueva York; Gene Transfer Vector for Mammalian Cells (J. H. Miller y M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer y Walker, eds.), Academic Press, Londres, 1987; Handboo of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención y no deberán considerarse como limitantes de la misma. EJEMPLOS Los siguientes procedimientos experimentales se utilizaron en los Ejemplos 1 a 6. Construcción de ADN para la Generación de Ratones BAFF Tg Se han descrito secuencias de ADNc humano y murino previamente (Schneider et al . , 1999). Se generó un fragmento por RCP que codifica para el BAFF murino de longitud completa, por RCP-TI . Primero, el filamento de ADNc se sintetizó a partir de poliA+ pulmonar murino (Clontech, Palo Alto, CA) utilizando oligo dT de conformidad con el protocolo del fabricante (GibcoBRL, Grand Island, NY) . La reacción de RCP contenia solución reguladora 1 x Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) , dNTPs 0.2 M, 10% de DMSO, cebadores 12.5 pM, 5 unidades de enzima Pfu (Stratagene) y los siguientes cebadores con sitios de restricción Notl (5' -TAAGAATGCGGCCGCGGAATGGATGAGTCTGCAAA-3' [SEQ ID NO: 19] y 5' -TAAGAATGCGGCCGCGGGATCACGCACTCCAGCAA-3' [SEQ ID NO: 20]. La plantilla se amplificó por 30 ciclos a 94°C durante 1 min, 54°C durante 2 min y 72°C durante 3 min, seguidos por una extensión de 10 min a 72°C. Esta secuencia corresponde a los nucleótidos del 214 al 1171 del archivo AF119383 de GenBank. El fragmento de RCP se sometió a una digestión con Notl y después se clonó en un vector pCEP4 modificado (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El fragmento que contenia BAFF murino fue removido con Xbal con el fin de incluir la secuencia del sitio de adición de poliA de SV40. Este fragmento se clonó en un vector basado en pUC, en donde se agregó la secuencia promotora. El promotor, un fragmento romo Bgl2-NotI de 1 kb, que contenia el intensificador ApoE humano y el promotor AAT (alfa antitripsina) , se purificó a partir de la clona del plásmido 540B (gentilmente proporcionado por la Dra. Katherine Parker Ponder, Washington University, St. Louis, MO) . Se purificó un fragmento EcoRV/Bgl2 a partir del vector final y se utilizó para generar ratones transgénicos. La descendencia inyectada de hembras C57BL/6J x machos DBA/2J Fl (BDF1) se retrocruzó con ratones C57BL/6. Las técnicas de microinyección y generación de ratones transgénicos ya han sido previamente descritas (Mcknight et al . , 1983). Métodos Analíticos: Se sometieron muestras de suero a un análisis por EGPA-DSS en condiciones reductoras, empleando un gel lineal al 12.5%. Se preparó ARN total de higado de ratón y se procesó por análisis de Northern blot, empleando un paquete de aislamiento de Promega (Madison, Wl) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se detectó ARNm especifico de BAFF transgénico empleando una sonda de extensión de SV40 poliA de la construcción transgénica y se obtuvo mediante la digestión del vector pCEP4 modificado con las enzimas Xbal y BamEI . La sonda reconoce una banda de 1.8-2 kDa correspondiente al ARNm del transgén BAFF. El análisis por RCP del ADN de cola de ratones BAFF Tg, se llevó a cabo empleando una concentración 1.25 pM de los siguientes cebadores 5' -GCAGTTTCACAGCCATGTCCT-3' [SEQ ID NO: 21] y 5' -GTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3 * [SEQ ID NO: 22] en una reacción que contenia solución reguladora IX Taq polimerasa (Stratene), dNTPs 0.2 nM, 10% de DMSO y 5 unidades de polimerasa Taq (Stratagene) . Se amplificó un transgén de 719 pb por 35 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 54°C durante 1 minuto y 72°C durante 1.5 minutos, seguido por una extensión de 10 minutos a 72°C. La presencia de proteínas en la orina de ratones se midió empleando las tiras reactivas Multistix 10 SG para - - urianálisis (Bayer Corporation, Diagnostics División, Elkhart, IN) . dyn Celular y Análisis Citofluorométrico (SCAF) Se llevaron a cabo cuentas de leucocitos diferenciales con sangre completa con el anticoagulante AEDT, en un aparato Cell Cyne 3500 de Abbott (Chicago, IL) . Para el análisis SCAF, se compraron anticuerpos de rata antimurinos marcados con fluoresceina (FITC)-, Cy-cromo- y fitoeritrina- (PE) : antiB220, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD43, anti-IgM, anti-CD5, anti-CD25, anti-CD24, anti-CD38, anti-CD21, anti-CD44, anti-L-selectina y un paquete de Ig de hámster anti-Bcl-2/control, en Pharmingen (San Diego, CA) . La producción de E. coli recombinante, asi como de BAFF humano y murino marcado con Flag derivado de células de mamífero, se realizó de la manera previamente descrita (Schneider et al . , 1999). Todos los anticuerpos se utilizaron de conformidad con las especificaciones del fabricante. Se purificaron LSP de sangre de ratón, se la siguiente manera: se colectó sangre de ratón e microtubos que contenían AEDT y se diluyó 1/2 con PBS. Se aplicaron 500 µL de sangre diluida sobre 1 mL de Ficoll (Celardane, Hornby, Ontario, Canadá) en un tubo de vidrio de 4 mL, la centrifugación en el gradiente se realizó a 2000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente y la interfase que contenia los linfocitos se colectó y se lavó dos veces - - con PBS antes de la tinción SCAF. Se trituraron células de bazo, médula ósea y ganglios linfáticos mesentéricos en una suspensión celular en medio RPMI (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) y se lavaron con solución reguladora SCAF (PBS suplementado con 2% de suero fetal de ternera (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ) . Primero, las células se suspendieron en solución reguladora SCAF suplementada con los siguientes agentes bloqueadores: 10 µg/mL de Ig humana (Sandoz, Basel, Suiza) y 10 µg/mL de anticuerpos bloqueadores anti-Fc murino (Pharmingen) y se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de realizar la tinción con anticuerpos marcados con fluorocromo. Todos los anticuerpos se diluyeron en solución reguladora SCAF con el reactivo bloqueador anteriormente mencionado. Las muestras se analizaron utilizando un citofluorómetro FACScan (Becton Dickinson) . Detección de Ig Murina Total y Factores Reumatoides en Suero de Ratón, por Ensayos de ELISA Placas de ELISA (Corning glass works, Corning, NY) se revistieron durante una noche a 4°C con una solución de 10 µg/mL de suero de cabra anti-Ig total murina (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, AL) en solución reguladora de bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9.6.

Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween al 0.1% y se bloquearon durante una noche con gelatina al 1% en PBS.

- - Cien µL/pozo de diluciones en serie del suero o diluciones estándar, se agregaron a las placas por 30 minutos a 37°C. La Ig murina se detectó empleando 100 µL/pozo de una solución de 1 µg/mL de un suero de cabra anti-Ig total murina marcado con .fosfatasa alcalina (AP) (Southern Biotechnology Associates) por 30 minutos a 37°C. Después del último lavado, tres veces con PBS/Tween al 0.1%, la reacción enzimática se desarrolló empleando una solución de 10 µg/mL de fosfato de p-nitrofenilo (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) en dietanolamina al 10%. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 µL de NaOH 3N/pozo. La< densidad óptica (D.O.) se midió a 405 nm utilizando un espectrofotómetro de Molecular Devices (Sunnyvale, CA) . Se obtuvieron curvas estándar empleando Ig murina purificada adquirida en Southern Biotechnology Associates. En el caso de la detección de factores reumatoides (FR), las placas se revistieron con Ig de cabra normal (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) , en vez de suero de cabra anti-Ig murina y la detección de la Ig murina se realizó de la manera anteriormente descrita. La detección de los isotipos murinos en el ensayo de FR, se realizó empleando un suero de cabra anti-IgA, IgM, IgG2a, IgG2b e IgG3 marcado con AP, asi como anticuerpos IgA, IgM, IgG2a, IgG2b e IgG3 murinos purificados, para obtener las curvas estándar (Southern Biotechnology Associates, Inc.). Todas - - las comparaciones estadísticas se realizaron por análisis de variancia. Detección de Complejos Inmunes Circulantes (CIC) y Precipitación de Crioglobulinas en Suero de Ratón El ensayo se realizó de la manera previamente descrita (June et al . , 1979; Singh y Tingle, 1982) con las siguientes modificaciones: se revistieron placas de ELISA (Corning glass works) durante una noche a 4°C co 5 µg/mL de Clq humano (Quidel, San Diego, CA) en solución reguladora de bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9.6. Las placas se lavaron 3 veces con PBS/Tween al 0.1%. Se agregaron 50 µL/pozo de AEDT 0.3M a las placas, más 50 µL/pozo de diluciones en serie del suero o diluciones de concentraciones conocidas de un complejo inmune estándar (peroxidasa murina antiperoxidasa (PAP) de DAKO (Carpintería, CA) . Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween al 0.1%. La Ig murina se detectó en los complejos inmunes empleando 100 µl/pozo de una solución de 1 µg/mL de un suero de cabra anti-Ig murina marcado con AP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) de la manera anteriormente descrita para los ensayos de ELISA. Las crioglobulinas se detectaron mediante la incubación, durante una noche a 4°C, de suero de ratón diluido 1/15 en agua y los precipitados se registraron visualmente.

- - Ensayos Anti-ADN de Doble Cadena (de) y de Una Sola Cadena ( c) Los ensayos anti-ADNuc se realizaron empleando placas NUNC-immuno Píate MaxiSorp (NUNC A/S, Dinamarca) . Las placas fueron revestidas durante una noche a 4°C, primero con 100 µg/mL de Albúmina sérica bovina (ASB) metilada (Calbiochem Corpl. La Jolla, CA) , y después con 50 µg/mL de ADN de timo de ternera grado I (Sigma, St. Louis, MO) . El ADN de timo de ternera se sometió a una sonicación y después a una digestión con nucleasa Sl, antes de su uso. Para el ensayo andi-ADNuc, el ADN se sometió a ebullición durante 10 minutos y se enfrió en hielo antes de su uso. Después de bloquear, se agregaron diluciones en serie de muestras de suero y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Los autoanticuerpos se detectaron con un suero de cabra anti-IgG murino-AP (Sigma) y se revelaron de la manera anteriormente descrita para los ensayos de ELISA. Se obtuvieron curvas estándar empleando cantidades conocidas de anticuerpos monoclonales anti-ADN 205, los cuales son específicos para ADNuc y para ADNdc (Datta et al . , 1987) . Inmunohistoquimica Se congelaron ganglios linfáticos y bazo en medio O.C.T. (Miles, Elkhart, IN) y se montaron en una crióstato para seccionar. Se deshidrataron secciones de 7 a 10 µm de - - espesor y se fijaron en acetona. Todas las incubaciones con anticuerpos (10 µg/mL) se realizaron durante 1 hora a temperatura ambiente, en una caja humidificada después de una dilución con Tris-solución salina reguladora A (TBS-A, Tris 0.05M, NaCl 0.15M, Tween-20 0.05% (v/v), ASB 0.25%), se enjuagaron con TBS-B (Tris 0.05M, NaCl 0.15M, Tween-20 0.05%) y se fijaron durante 1 minuto en metanol, antes de iniciar la reacción enzimática. Las actividades de la peroxidasa de rábano (HRP) y de la fosfatasa alcalina (AP) se desarrollaron empleando el equipo de sustratos con tabletas de diaminobencidina (DAB) de Sigma y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/nitroazul de tetrazolio (BCIP/NBT, Pierce, Rockford, IL) , respectivamente. Las secciones de tejidos teñidos, finalmente se fijaron durante 5 minutos en metanol y se contaron con la tinción de Giemsa (Fluka, buchs, Suiza) . Se compraron anticuerpos marcados con biotina anti-B220, anti-CDllc, anti-syndecan-1 de rata, asi como anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD8 de rata sin marcar, en Pharmingen. Se obtuvo aglutinina de cacahuate (PNA) marcada con biotina en los laboratorios Vector (Burlingame, CA) . Se compraron anticuerpos murinos anti-Ig de rata marcados con HRP y con HRP-estreptavidina, en Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. y se compró estreptavidina marcada con AP en Southern Biotechnology Associates, Inc. En el caso de la inmunohistoquimica en - - tejido renal, para detectar la deposición de Ig, se utilizaron secciones en parafina, se desparafinizaron y se bloquearon empleando suero de caballo diluido de Vector (Burlingame, CA) , seguido por una tinción con suero de cabra anti-Ig murina marcado con HRP de Jackson ImmunoResearch. La detección se realizó de la manera anteriormente descrita. EJEMPLO 1 Los Ratones BAFF Transgénicos (BAFF Tg) de Primera Generación Presentan un Fenotipo Anormal. Se expresó BAFF murina de longitud completa en ratones transgénicos, empleando el promotor de antitripsina alfa-1 especifico de higado,. con el intensificador APO E. La versión de longitud completa se seleccionó con la esperanza de que el BAFF se rompiera y actuara sistemáticamente o si se retenia en forma unida a la membrana, que se observaran anormalidades especificas del higado locales, posiblemente produciendo pistas funcionales. Se obtuvieron 13 ratones de primera generación positivos para el transgén BAFF (Tabla 2) . Cuatro de estos ratones murieron a una edad temprana. La patología de rutina se llevó a cabo en los ratones 811 y 816 (Tabla 2) . No hubo una infección obvia en estos ratones; sin embargo, fueron evidentes anormalidades cardiovasculares y renales y fueron similares a aquellas - - descritas en la hipertensión grave (Fu, 1995) (Tabla 2) .

Cortes de tejido renal teñidos con hematoxilina y eosina (tinción H & E) del ratón 816, demostraron que la morfología de los glomérulos en ese ratón era anormal, mientras que el resto del tejido del riñon parecía normal (datos no mostrados) . Muchos ratones BAFF transgénicos de primera generación presentaron proteinuria (Tabla 2) . La inmunohistoquimica en cortes de tejido esplénico congelados del ratón 816, reveló una tinción anormal y extensa de las células B y una reducida tinción de las células T, y esta observación fue confirmada en la progenie (véase más adelante, Figura 12) . Empleando el análisis SCAF de dos colores, se calculó la relación del % de células B positivas para B220 con respecto al % de células T positivas para CD4. Esta relación fue de dos a siete veces mayor en ratones BAFF Tg de primera generación, cuando se compararon con ratones BDF1 negativos (Tabla 2), lo cual sugiere un incremento en la población de células B en los ratones BAFF Tg. Se seleccionaron nueve de estos ratones de primera generación para generar diferentes lineas de ratones transgénicos, tal como se señala en la Tabla 2. Ninguno de los ratones BAFF Tg de primera generación restantes o la progenie, demostraron signos de enfermedad meses después de la muerte temprana de los ratones de primera generación 696, 700, 811 - - y 816, lo cual sugiere que estos 4 ratones podrían haber expresado mayores niveles de BAFF, lo cual causó su muerte. La sobreexpresión de BAFF en el higado de ratones transgénicos, fue confirmada por análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Northern (Northern blot) (datos no mostrados) . En todos los ratones BAFF-Tg examinados histológicamente, los hígados no mostraron anormalidades, lo cual indica que la sobreexpresión local de BAFF no induce ningún evento inmunológico o patológico. No se dispone de ningún ensayo de ELISA para BAFF murino; sin embargo, se demostró que el suero al 2% de ratones BAFF Tg, pero no el de ratones control, bloqueaba la unión del BAFF marcado con Flag soluble murino derivado de células de mamífero a las células BJAB. Además, el suero al 5% de ratones BAFF Tg, pero no el de los controles, incrementó la proliferación de células B humanas a partir de LSP, en presencia de anti- (datos no mostrados) . Estos datos sugieren que cantidades sustanciales de BAFF soluble están presentes en la sangre de los animales BAFF Tg. EJEMPLO 2 La Linfocitosis Periférica en Ratones BAFF Tg se Debe al Elevado Número de Células B. Se encontró que la población de ratones transgénicos tenia más linfocitos en la sangre cuando se comparó con los controles negativos, alcanzando valores tan - - altos como 13000 linfocitos/µL de sangre (Figura 7A) . En contraste, el número de granulocitos por ul de sangre en los ratones BAFF Tg y en los ratones control, permaneció dentro de los limites normales (Figura 7A) . Puesto que el análisis SCAF, empleando anticuerpos anti-CD4 y anti-B220 de linfocitos de sangre periférica (LSP) de 18 ratones BAFF Tg que provenían de seis diferentes ratones de primera generación, demostró un incremento de la relación B/T (Figuras 7B y 7C) , el elevado número de linfocitos fue el resultado de una expansión de la subpoblación de células B. De manera similar, empleando este método, el cálculo del número absoluto de células T CD4 circulantes, reveló una reducción del 50% de esta subpoblación de células T en los ratones BAFF Tg, en comparación con los ratones control, y se hizo la misma observación para la subpoblación de células T CD8 (datos no mostrados) . Todas las células B de LSP de ratones BAFF Tg presentaron un incremento en la expresión de MHC clase II y Bcl-2, cuando se compararon con células B provenientes de ratones control (Figuras 7D y 7E, respectivamente) , lo cual indica algún nivel de activación de células B en LSP de los ratones BAFF Tg. Las células T en la sangre de ratones BAFF Tg no expresan los marcadores de activación tempranos CD69 ó CD25; sin embargo, del 40 al 56% de las células T CD4 ó CD8, eran células T efectoras activadas con un fenotipo CD44hl, L-selectinalG, versus sólo - el 8 al 12% en los ratones control compañeros de camada (Figura 7F) . Por lo tanto, los ratones BAFF Tg claramente demuestran signos de linfocitosis de células B y una activación global de células B junto con alteraciones en las células T. EJEMPLO 3 Los Compartimentos de Células B Expandidos Están Compuestos de Células Maduras . Para ver si la sobreexpresión de BAFF en los ratones transgénicos afectaba los compartimentos de células B centralmente en la médula ósea y periféricamente en órganos linfoides secundarios, se examinaron por la técnica SCAF, el bazo, médula ósea y ganglios linfáticos mesentéricos de un total de siete ratones BAFF Tg y siete ratones control compañeros de camada derivadas de cuatro ratones de primera generación diferentes. El compartimento de células B maduras fue analizado mediante una tinción con anticuerpos anti-B220 y anti-IgM. Dos representantes de ratones BAFF T y un representante de los animales control compañeros de camada se muestran en la Figura 8. El compartimento de células B maduras (IgM+, B220+) se incrementó tanto en el bazo como en los ganglios linfáticos mesentéricos (Figura 8A, paneles superior e inferior, respectivamente) . El análisis de células B B220+/IgM+ (Figura 7A, panel central) o células proB (CD43+/B220+) y - - células preB (CD43-/B220+) en médula ósea (Figura 8B) , demostró que los ratones BAFF Tg y los animales control compañeros de camada fueron similares. Estos datos indican que la sobreexpresión de BAFF afecta la proliferación de las células B maduras en sangre periférica, pero no de las células B progenitoras encontradas en la médula ósea. El análisis por SCAF de las subpoblaciones de células B en el bazo, reveló un incremento en la proporción de células B de la zona marginal (ZM) en los ratones BAFF Tg, cuando se compararon con los ratones control (Tabla 3) . La población de células B foliculares permaneció proporcional en los ratones BAFF Tg y en los control, mientras que la fracción de células B recién formadas disminuyó ligeramente en los ratones BAFF Tg (Tabla 3) . Este resultado también fue confirmado en células B B220+ esplénicas, empleando anticuerpos anti-CD38 versus anti-CD24 y anticuerpos anti-IgM versus anti-IgD, y analizando CD38hl/CD24" e IgMhl/IgD10 en la población de células B de la ZM, respectivamente, de la manera previamente descrita (Oliver et al . , 1997) (datos no mostrados) . El análisis inmunohistoquimico utilizando un anticuerpo anti-IgM murina, reveló la expansión de zona brillosa por IgM en el área de células B de la ZM, en el bazo de ratones BAFF Tg, cuando se compararon con ratones control (datos no mostrados) . Todas las células B B220+ esplénicas de BAFF Tg, también expresan mayores niveles de - - MHC clase II (Tabla 3) y Bcl-2 (datos no mostrados), en comparación con células B esplénicas provenientes de ratones control, lo cual indica que las células B esplénicas, asi como las células B de LSP, están en un estado activado. EJEMPLO 4 Los Ratones BAFF Tg Presentan Altos Niveles de Inmunoglobulinas Totales, Factores Reumatoides y Complejos Inmunitarios Circulantes en el Suero. El incremento del compartimento de células B en los ratones BAFF Tg, sugirió que el nivel de Ig total en la sangre de estos animales también podria estar incrementado. El análisis por EGPA-DSS del suero de ratones BAFF Tg y animales control compañeros de camada, demostró que las bandas de IgG de las bandas pesadas y ligeras eran cuando menos diez veces más intensas en 3 de 4 ratones BAFF Tg, en comparación con los sueros control (Figura 9A) . De manera similar, una determinación por ELISA en el suero de ratones BAFF Tg, demostró niveles de Ig total significativamente más altos cuando se compararon con aquellos de los ratones control (Figura 9B) . A pesar de los altos niveles observados por EGPA-DSS, los niveles de Ig excesivamente elevados determinados por ELISA en algunos ratones, e.g., 697-5, 816-8-3 y 823-20, condujo a la sospecha de la presencia de factores - - reumatoides (FR) en el suero o de autoanticuerpos dirigidos contra determinantes antigénicos en el fragmento Fc de la IgG (Jefferis, 1995) . Estos anticuerpos podían unirse al suero de cabra anti-Ig murina empleado para revestir las placas de ELISA y dieron valores erróneamente altos. Las placas de ELISA se revistieron con Ig de cabra normal irrelevante y se midió la unión de la Ig de animales BAFF Tg a la Ig normal de cabra. La Figura 9C demuestra que los sueros de la mayoría de los ratones BAFF Tg contenían Ig que reaccionaba con la Ig normal de cabra, mientras que sólo dos de los 19 ratones control exhibieron reactividad en el mismo ensayo. Estos FR fueron principalmente de los isotipos IgM, IgA e IgG2a (datos no mostrados) . La presencia de FR se puede asociar con la presencia de altos niveles de complejos inmunitarios circulantes (CIC) y crioglobulina en la sangre (Jefferis, 1995) . Para verificar si los ratones BAFF Tg presentaban o no niveles séricos anormales de CIC, se utilizó un ensayo de unión basado en Clq para detectar CIC en los .21 ratones BAFF Tg anteriormente analizados. Sólo 5 ratones BAFF Tg mostraron niveles significativamente elevados de CIC cuando se compararon con los controles, no obstante, estos ratones correspondieron a los animales que presentaban los valores de Ig total más altos y niveles de factor reumatoide altos (Figura 9D) . También se observó la formación de - - precipitado cuando el suero de ratones BAFF Tg se diluía 1/15 en agua, pero no se observó en el suero de los controles, lo cual indica la presencia de crioglobulina en estos ratones (datos no mostrados) . Asi pues, además de la hiperplasia de células. B, los ratones BAFF Tg muestran una hiperglobulinemia grave asociada con FR y CIC. EJEMPLO 5 Algunos Ratones BAFF Tg Presentan Altos Niveles de Autoanticuerpos contra ADN de una Sola Cadena (uc) y de Doble Cadena (de) . Inicialmente, se observaron anormalidades renales que se parecen a la enfermedad lupus en dos de los ratones de primera generación (Tabla II). La presencia de autoanticuerpos anti-ADN también se ha descrito en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) o ratones (SWR x NZB)F1 (SNF1) con enfermedad similar a LES (Datta et al . , 1987) . Se detectaron niveles de autoanticuerpos anti- ADNuc en ratones BAFF Tg que previamente hablan mostrado tener altos niveles de Ig sérica total (Figura 10A) . Se analizó el suero de dos ratones BAFF Tg negativos para anticuerpos contra ADNuc (697-5 y 816-1-1) y tres ratones transgénicos que secretaban anticuerpos anti-ADNuc (820-14, 816-8-3 y 820-7) fueron positivos para la presencia de anticuerpos anti-ADNdc en paralelo con cinco animales control compañeros de camada. Los ratones BAFF Tg también - - secretaban anti-ADNdc; sin embargo, los niveles de secreción no siempre correlacionaron con los de los anticuerpos anti-ADNuc, ya que el suero del ratón BAFF Tg 697-5 no contenia niveles detectables de anticuerpos anti-ADNuc, pero que fue claramente positivo para la presencia de anticuerpos anti-ADNdc (Figura 10B) . Por lo tanto, los ratones BAFF Tg que mostraron la hiperglobulinemia grave, secretaban niveles patológicos de autoanticuerpos anti-ADN. Adicionalmente y también parecido a los problemas de trastornos similares al lupus, en estos ratones se detectaron depósitos de inmunoglobulinas en los riñones de seis ratones BAFF Tg analizados (Figura 10C) , en donde tres de estos ratones no secretaban niveles detectables de anticuerpos anti-ADN (datos no mostrados) . EJEMPLO 6 Los Ratones BAFF Tg Presentan Folículos de Células B Agrandados , Numerosos Centros Germinales , un Número Reducido de Células Dendriticas y Números Incrementados de Células Plasmáticas, Tanto en el Bazo como en los Ganglios Linfáticos Mesentéricos (GLM) . Los ratones BAFF Tg presentaron el bazo, GLM (datos no mostrados) y placas de Peyer agrandados (Figura 11) . La inmunohistoquimica demostró la presencia de folículos de células B agrandados y de hojas linfoides arteriolares periféricas (HLAP o área de células T) - - reducidas en ratones BAFF Tg (Figura 12B) . De manera interesante, se observaron pocos centros germinales en los animales control compañeros de camada no inmunizados (y es tipico de esta colonia en general) y los que se presentaron estaban pequeños (Figura 12C) , mientras que los ratones BAFF Tg poseían numerosos centros germinales en ausencia de inmunización (Figura 12D) . La tinción con anticuerpos anti-CDllc para células dendriticas en la zona de células T y en la zona marginal de los ratones control (Figura 12E) , fue considerablemente reducida en ratones BAFF Tg (Figura 12F) . Las células plasmáticas positivas para syndecan-1 fueron casi indetectables en el bazo de los animales control compañeros de camada (Figura 12G) , incluso la pulpa roja de los ratones BAFF Tg se encontró fuertemente positiva para syndecan-1 (Figura 12H) . Se hicieron numerosas observaciones similares para los GLM (Figura 13) . En los GLM de ratones BAFF Tg, las áreas de células B se expandieron drásticamente (Figura 13B) , en contraste a los ganglios normales en donde los folículos eran fácilmente reconocibles en la periferia de dichos ganglios bajo la cápsula, con una zona de células T paracortical tipica (Figura 13A) . La médula de los GLM de ratones BAFF Tg estaba llena de células positivas para syndecan-1, que presumiblemente eran células plasmáticas (Figura 13H) . En conclusión, el análisis de los órganos linfoides - secundarios en ratones BAFF Tg, fue concordante con el fenotipo de células B expandidas que muestra numerosas anormalidades celulares y una intensa actividad inmunitaria. Referencias 1. Smith et al. (1994) CeJJ 76:959-962. 2. Vassalli (1992) Annu. Rev. Immunol . 10:411-452. 3. De Togni et al. (1994) Science 264:703-707. 4. Koni et al. (1997) Immunity 6:491-500. 5. Amakawa et al. (1996) CeJl 84:551-562. 6. Russell et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA. 90:4409-4413. 7. Zheng et al. (1995) Nature 377:348-351. 8. van Kooten and Banchereau (1997) Curr. Opin. I munol . 9:330-337. 9. Stuber and Strober (1996). J. Exp. Med. 183:979-989.

. Schneider et al. (1997) J. Biol. Chem., 272:18827- 18833. 11. Hahne et al. (1998) J. Exp. Med. 188:1185-1190. 12. Hahne et al. (1996) Science 274:1363-1366. 13. Grimaitre et aJ . (1997) Eur. J. I munol . 27:199-205. 14. Thome et aJ . (1997) Nature 386:517-521. 15. Schneider et al. (1998) J. Exp. Med. 187:1205-1213. 16. Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem., 262:10035-10038. 17. Armitage et al. (1992) Nature 357:80-82. - - 18. Bucher et al. (1996) Computer Chem. 20:3-24. 19. Banner et al. (1993) Cell 73:431-445. 20. Nagata (1997) Cell 88:355-365. 21. Black et al. (1997) Nature 385:729-733. 22. Wong et al. (1997) J. Biol. Chem., 272:25190-25194. 23. Kindler and Zubler (1997) J. Immunol . 159:2085-2090. 24. Sonoki et al. (1995) Leukemia 9:2093-2099. 25. Magrath, I. (1990) Adv. Cáncer Res 55:133-270. 26. Garside et al. (1998) Science 281:96-99. 27. MacLennan et al. (1997) Immunol . Rev. 156:53-66. 28. Dubois et al. (1997) J. Exp. Med. 185:941-951. 29. Tsubata et al. (1993) Nature 364:645-648. 30. Chicheportiche et al. (1997) J. Biol. Chem., 272:32401- 32410. 31. Nakayama (1997) Biochem. J. 327:625-635. 32. Jefferis, R. (1995). Rheumatoid factors, B cells and immunoglobulin genes. Br. Med. Bull. 51, 312-331. 33. Schneider et al. (1999) J. Exp. Med. 189, 1747-1756. 34. Mcknights et al. (1983) Ceil 34, 335-341. 35. Datta et al. (1987) J. Exp. Med. 165, 1252-1261. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

- LISTADO DE SECUENCIAS <110> BIOGEN, INC. <120> AGENTES BLOQUEADORES RELACIONADOS CON BAFF Y SU USO EN LA ESTIMULACIÓN E INHIBICIÓN DE CÉLULAS B E INMUNOGLOBULINAS, EN RESPUESTAS INMUNITARIAS <130> A070PCT <140> PCT/US00/01788 <141> 2000-01-25 <150> 60/143,228 <151> 1999-07-09 <160> 22 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser lie Leu Pro 20 25 30 Arg Lys Glu £e Pro _3et Val L«=u Leu Ser Cyg Cys Leu Thr Val Val 35 40 45 Ser Fhe Tyr Gln Val Ala Ale Leu GJn Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg 50 5 60 Al Glu l-e Glí; Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Lys ñfj 70 75 80 lie Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glo Gl? Aen Ser Ser Gln Af?n Ser 85 90 9ü Arg Asn Lys Arg Al Val Glp Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp - - cys Leu Glp Leu He Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr He Gln Lys Gly 115 120 125 Ser Tyr Thr P?ie Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala 130 135 140 Leu Tyr Gly Glr. Val Leu Tyr Thr Asp Lye Thr Tyr Ala Met Gly His 145 150 155 160 Leu lie <31n Arg Lys Lys Val Hia Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu 165 170 175 Val Thr Leu Phe Arg Cys He Gln Asn Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu 180 185 190 Gln Leu Ala He Pro Arg Glu Asri Ala Gln He Ser Leu Asp Gly Asp 195 200 205 Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 210 215 <210> 2 <211 > 232 <212 > PRT <213> Murina < 400> 2 Met Asp Glu Ser Ala Lys Thr Leu Pro Pro Pro Cys Leu Cys Phe Cys 1 5 10 15 Ser Glu Lys Gly Glu Asp Met Lys Val Gly Tyr Asp Pro He Thr Pro 20 25 30 G l p Lys Glu Glu Gly Ala Val Leu Leu ser Ser Ser Phe Thr Ala fcaet. 3 5 40 45 =er Leu Tyr Glp Le? Ala Ala Leu Gln Al a Asp Leu Met Asn Leu Arg 5 D 55 60 MQt Glu Leu Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Al a Ala Ala Lys S 5 70 75 00 Lftu Leu Thr Pro Ala. Ala Pro Arg Pro His Asn Ser Ser Arg Gly His - - Arg Asn Arg Arg Ala Phe Pro Gly Pro Glu Glu Thr Glu Gln Asp Val 100 105 110 Asp Leu Ser Ala Pro Pro Ala Leu Arg Asn He He Glp Asp Cys Leu 115 120 12S Glp Leu He Ala Asp Ser Asp Thr Pro Thr He Arg Lys Gly Thr Tyr 130 135 140 Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asn Ala Leu Tyr 145 150 155 160 Ser Gln Val Leu Tyr Thr Asp Pro He Phe Ala Met Gly His Val He 165 170 175 G n Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Gl? Leu Ser Leu Val Thr 1S0 185 190 Leu Phe Arg Cye He Gln Asn Leu Glu Gl? Gly Aep Glu He Gln Leu 195 200 205 Ala He Pro Arg Glu Asp Ala Gln He Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr 210 215 220 Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 225 230 <210> 3 <211 > 102 <212 > PRT <213> Homo sapiens < 400> 3 Val Thr Glp Asp Cye Leu Gln Leu He Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr 1 5 10 15 lie Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys 20 25 30 Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Tyr Gly Glt? Val Leu Tyr Thr Asp 40 45 Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu He Glp Arg Lys Lys Val His Val 50 55 60 Phe Gly Asp Clu Leu Ser Asn Asp Ser Cys Tyx Ser Ala Gly He Ala 65 70 75 80 - - Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu Ala He Pro Arg Glu Asn 85 90 95 Ala Gln He Ser Leu Asp 100 <210> 4 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Gln Hie Ser V l Leu Has Leu Val Pro H Asn Ala Thr Ser Lys 1 5 10 li> Asp Aep Ser Asp Val Thr Clu Val Met Trp Gln Pro Ala Le Arg Arg 25 30 Gly Arg Cly Leu Gln Ala Gln Tyr Ser Gln Val Leu Phe Glp Asp Val 3 b 40 45 Thr Phe Thr Met Gl? Qln Val Val Ser Arg Glu Cly l p G l y Arg Ala 50 55 £0 Tyr Asn Ser Cye Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Glp Gly Asp 65 70 75 80 He Leu Ser Val He He Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser B5 90 95 <210> 5 <211 > 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Asp Lys Pra Val Ala His Val Val Ala Asp Pro Gln Ala Glu Gly 5 10 15 Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asp Gly 20 25 30 Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His 35 40 45 Val Leu Leu Thr His Thr He Ser Arg He Ala Val Ser Tyr Gln Thr 50 55 60 Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly 65 7D 75 80 Val Phe Gla Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu He Asn Arg 85 90 95 Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu 100 <210> 6 <211 > 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lyß Ser Asn Ser Arg Ser 1 5 10 15 Met Pro Leu Glu Trp Glu ?sp Thr Tyr Gly He Val Leu Leu Ser Gly 23 25 30 Val Lys Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu 35 40 4S Pro Leu Ser His Lys Val Tyr síet Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glp Met 50 55 60 Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asp Leu Thr Ser Ala 65 70 75 80 Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu 35 90 95 Glu <210> 7 <211> 102 <212> PRT - <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Leu Lys Pro Ala Ala His Leu He Gly Asp Pro Ser Lye Gln Asn 1 5 10 15 Ser Leu Leu Trp Arg Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly 25 30 Phe Tyr Ser G n Vsl Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala 40 45 Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser 5Q S5 60 Gln Tyr Pro Phe Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe 65 70 75 80 Gln Leu Thr Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly He Pro 85 90 55 100 <210> 8 <211 > 109 <212 > PRT <213> Homo sapiens < 400> 8 Glu Ala Glp Pro Phe Ala His Leu Thr He Asn Ala Thr Asp He Pro 1 5 10 15 Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly 20 25 30 Trp Gly Lys He Ser Asp Met Tyr Aia Aan He Cys Phe Arg His His 35 40 45 Glu Thr Ser Gly Aep Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr 50 S 60 Val Thr Lys Thr Ser He Lys He Pro Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser 65 70 75 80 He Asn Val Gly Gly Phe Phe Lyß Leu Arg Ser Gly Glu Glu He Ser He Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln 100 105 <210> 9 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 actgtttctt ctggaccctg aacggc 26 <210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 gacaagcttg ccaccatgga tgactccaca 30 <210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 actagtcaca gcagtttcaa tgc 23 <210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 12 ctgcagggtc cagaagaaac ag 22 <210> 13 <211 > 24 <212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 13 ggagaaggca actccagtca gaac 24 <210> 14 <211 > 24 <212 > ADN <213 > Homo sapiens < 400> 14 caattcatcc ccaaagacat ggac 24 <210> 15 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 tcggaacaca acgaaacaag te 22 <210> 16 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 6 cttctccttc aectggaaac tgactg 26 <210> 17 <211 > 19 <212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 17 ggcatc tga tggact cg 1 <210> 18 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 18 gctggaaggt ggacagcga 1Q <210> 19 <211> 35 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 19 taagaatgcg gccgcggaat ggafcgagtct gcaaa 35 <210> 20 <211 > 35 <212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 20 taagaatgcg gccgcgggat cacgcactcc agcaa 35 <210> 21 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 21 gcagtttcac agcgatgtcc t 21 <210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 gtctccgttg cgcgaaatct g 21 ion.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. El uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; (b) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un anticuerpo anti-µ; (c) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un ligando CD40; y (d) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y una molécula anti-ligando CD40 para la preparación de una composición farmacéutica para estimular el crecimiento de células B en un animal.
2. El uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo ; (b) un- ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un anticuerpo anti-µ; (c) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un ligando CD40; (d) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y una molécula anti-ligando CD40 para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la producción de inmunoglobulinas en un animal.
3. El uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo ; (b) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un anticuerpo anti-µ; (c) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un ligando CD40; y (d) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y una molécula anti-ligando CD40 para la preparación de una composición farmacéutica para co-estimular el crecimiento de células B y la producción de inmunoglobulinas en un animal.
4. El uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo ; (b) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un anticuerpo anti-µ; (c) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un ligando CD40; y (d) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y una molécula anti-ligando CD40 para la preparación de una composición farmacéutica para estimular el crecimiento y maduración de células B inducidos por células dendriticas
5. EL uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una molécula anti-ligando BAFF o un fragmento activo de la misma; (b) una molécula ligando BAFF inoperante, recombinante, o un fragmento activo de la misma; (c) un anticuerpo especifico contra el ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; y (d) un anticuerpo especifico contra el receptor de ligando BAFF o un epitopo del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de células B en un animal.
6. EL uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una molécula anti-ligando BAFF o un fragmento activo de la misma; (b) una molécula ligando BAFF inoperante, recombinante, o un fragmento activo de la misma; (c) un anticuerpo especifico contra el ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; y (d) un anticuerpo especifico contra el receptor de ligando BAFF o un epitopo del mismo inhibir la producción de inmunoglobulinas en un animal inhibir la producción de inmunoglobulinas en un animal.
7. El uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste, de: (a) una molécula anti-ligando BAFF o un fragmento activo de la misma; (b) una molécula ligando BAFF inoperante, recombinante, o un fragmento activo de la misma; (c) un anticuerpo especifico contra el ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; y (d) un anticuerpo especifico contra el receptor de ligando BAFF o un epitopo del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para coinhibir el crecimiento de células B y la producción de inmunoglobulinas en un animal.
8. El uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una molécula anti-ligando BAFF o un fragmento activo de la misma; (b) una molécula ligando BAFF inoperante, recombinante, o un fragmento activo de la misma; (c) un anticuerpo especifico contra el ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; y (d) un anticuerpo especifico contra el receptor de ligando BAFF o un epitopo del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento y maduración de células B inducidos por células dendríticas en un animal.
9. El uso de un inhibidor de crecimiento de células B para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la hipertensión en un animal.
10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado por que el inhibidor del crecimiento de células B se selecciona del grupo que consiste de: (a) una molécula anti-ligando BAFF o un fragmento activo de la misma; (b) una molécula ligando BAFF inoperante, recombinante, o un fragmento activo de la misma; (c) un anticuerpo específico contra el ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; y (d) un anticuerpo específico contra el receptor de ligando BAFF o un epítopo del mismo.
11. El uso de una composición que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; (b) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un anticuerpo anti-µ; (c) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un ligando CD40; (d) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y una molécula anti-ligando CD40, (e) una molécula anti-ligando BAFF o un fragmento activo de la misma; (f) una molécula ligando BAFF inoperante, recombinante, o un fragmento activo de la misma; (g) un anticuerpo específico contra el ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; y (h) un anticuerpo específico contra el receptor de ligando BAFF o un epítopo del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria
12. El uso de un vector que contiene un gen que codifica para una molécula relacionado con BAFF para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un trastorno relacionado con el ligando BAFF en un animal, caracterizado porque el gen se expresa en una célula deseada.
13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la molécula relacionada con BAFF se selecciona del grupo que consiste de: (a) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo ; (b) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un anticuerpo anti-µ; (c) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un ligando CD40; (d) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y una molécula anti-ligando CD40, (e) una molécula anti-ligando BAFF o un fragmento activo de la misma; (f) una molécula ligando BAFF inoperante, recombinante, o un fragmento activo de la misma; (g) un anticuerpo específico contra el ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; y (h) un anticuerpo específico contra el receptor de ligando BAFF o un epítopo.
14. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 a 13, caracterizado porque el ligando BAFF es un ligando BAFF soluble.
15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando BAFF soluble es un ligando BAFF recombinante.
16. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 a 15, caracterizado porque la molécula anti-CD40 es un anticuerpo monoclonal.
17. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, caracterizado porque el anti-ligando BAFF es soluble. -
18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anti-ligando BAFF soluble es un anti-ligando BAFF recombinante.
19. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, 17 y 18, caracterizado porque el anticuerpo anti-BAFF o el anticuerpo anti-receptor de BAFF es un anticuerpo monoclonal.
20. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el animal es de origen mamífero.
21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el mamífero es un humano.
22. El uso de un agente capaz de interferir con la unión de un ligando BAFF a un receptor para la preparación de una composición farmacéutica para inducir la muerte celular.
23. El uso de un agente capaz de interferir con la asociación entre ligando BAFF y su receptor para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento, supresión o alteración de una respuesta inmunitaria que involucra una señalización de ruta entre un ligando BAFF y su receptor.
24. El uso de un anticuerpo específico contra un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo o un anticuerpo específico contra un receptor de ligandoBAFF o - - un epitopé del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la inflamación.
25. El uso de un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para regular el desarrollo de células hematopoyéticas .
26. El uso de un coinhibidor del crecimiento de células B y secreción de inmunoglobulinas para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de hipertensión.
27. El uso de un coinhibidor del crecimiento de células B y de la producción de inmunoglobulinas o inhibidores del crecimiento de células B para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos cardiovasculares.
28. El uso de un coinhibidor del crecimiento de células B y producción de inmunoglobulinas o un inhibidor del crecimiento de células B para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos renales .
29. El uso de un inhibidor del crecimiento de células B para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos de linfoproliferación de células B.
30. El uso de una composición seleccionada a - - partir del grupo que consiste de : (a) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo ; (b) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un anticuerpo anti-µ; (c) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y un ligando CD40; (d) un ligando BAFF o un fragmento activo del mismo y una molécula anti-ligando CD40, (e) una molécula anti-ligando BAFF o un fragmento activo de la misma; (f) una molécula ligando BAFF inoperante, recombinante, o un fragmento activo de la misma; (g) un anticuerpo específico contra el ligando BAFF o un fragmento activo del mismo; y (h) un anticuerpo específico contra el receptor de ligando BAFF o un epítopo del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para estimular la producción de células B en el tratamiento de enfermedades inmunosupresivas .
31. El uso de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la enfermedad inmunosupresiva es VIH o asociada con un trasplante de órgano.