CZ299819B6 - Farmaceutické kompozice obsahující protilátky specifické pro rozpustný BAFF - Google Patents

Abstract

Rešení se týká farmaceutických prípravku obsahujících protilátky specifické pro rozpustný BAFF nebojejich aktivní fragment. Farmaceutické kompozice jsou užitecné pri lécení autoimunitních onemocnení, poruch proliferace B lymfocytu a imunosupresivních onemocnení, zejména onemocnení zpusobeného HIV.

Description

Farmaceutické kompozice obsahující protilátky specifické pro rozpustný BAFF

Oblast techniky

Předkládaný vynález se.týká použití protilátky specifické pro BAFF nebo fragmentu této protilátky pro výrobu farmaceutické kompozice užitečné při léčení autoimunitních onemocnění, poruch proliferace B lymfocytů a imunosupresívních onemocnění, zejména onemocnění způsobeného HIV. Ligand označovaný BAFF, faktor aktivující B-lymfocyty patřící do rodiny TNF cytokinů, může modifikovat expresi B-lymfocytů a imunoglobulinů. Tento protein a jeho receptor by mohly být využity při protinádorových nebo imunoregulačních aplikacích a také k léčení nemocí se sníženou imunitou jako je HIV. Specificky tento ligand a jeho blokující činidlo mohou hrát roli ve vývoji hypertenze a s ní souvisejících nemocí. Kromě' toho buňky transfekované genem pro tento ligand mohou být použity v genové terapii nádorových onemocnění autoimunit15 nich nemocí nebo dědičných genetických poruch zasahujících B-lymfocyty, Blokující činidlo, jako jsou např. rekombinantní varianty nebo protilátky specifické k ligandu nebo jeho receptorů, by mohly být případně využity pro imunoregulační aplikace. K příkladům zamýšleného použití BAFF jakožto stimulátoru B-lymfocytů při nemocech se sníženou imunitou patří použití u pacientů s orgánovou transplantací (např. transplantací kostní dřeně) nebo pacientů zotavujících se z léčení rakoviny ke stimulaci produkce B lymfocytů. Také přichází v úvahu použití BAFF jako adjuvans a kostimulátoru ke zvýšení nebo obnově hladiny B-lymfocytů na přibližně normální hladinu.

Dosavadní stav techniky

Cytokiny příbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF, „Tumor Necrosis Factor“) jsou mediátory hostitelské obranné a imunitní regulace. Členové této rodiny se vyskytují ve formě ukotvené na buněčnou membránu, kdy působí lokálně prostřednictvím vzájemného kontaktu mezi buňkami, nebo se vyskytují jako vylučované proteiny, které jsou schopné difundovat ke vzdálenějším cílům. Paralelní rodina receptorů upozorňuje na výskyt těchto molekul vedoucí k iniciaci buněčné smrti nebo buněčné proliferace a diferenciace v cílové tkáni. V současnosti rodina TNF ligandu a receptorů obsahuje nejméně 11 známých párů receptor-ligand: TNF:TNFR, LT-a:TNF-R, LT-a/3:LT-f3-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27,

OX40LOX40 a 4-lBBL:4-lBB. Sekvence DNA kódující tyto ligandy vykazují identitu pouze ve 25 % až 30 %, a to dokonce i v případě největší příbuznosti, ačkoliv příbuznost na úrovni sekvence aminokyselin je přibližně 50%.

Bylo zjištěno, že určujícím rysem této rodiny cytokinových receptorů je extraeelulární doména bohatá na cystein, která byla objevena při molekulovém klonování dvou odlišných receptorů TNF. Tato genová rodina kóduje glykoproteiny s vlastnostmi transmembránových proteinů typu I s extraeelulární doménou vážící ligand, jednou transmembránovou doménou a cytoplazmatickým úsekem, který se podílí na aktivaci buněčných funkcí. Úsek vázající ligand, bohatý na cystein, má centrální doménu z hustě navázaných disulfidových můstků, která se, v závislosti na konkrétním čtenu rodiny, několikrát opakuje. Většina receptorů má čtyři domény, ačkoliv jsou i receptoiy pouze se třemi doménami nebo naopak zase se šesti doménami.

Proteiny z rodiny TNF ligandu jsou charakteristické na svém N-konci krátkým úsekem normálně krátkých hydrofilních aminokyselin, který často obsahuje několik lysinových nebo argininových zbytků, které zřejmě slouží jako stop-sekvence přenosu. Pak následuje transmembránový úsek a extraeelulární úsek proměnné délky, který odděluje doménu vázající receptor na C-konci od buněčné membrány. Tento úsek se někdy nazývá ..stopka“. C-koncový vazebný úsek představuje větší část proteinu a často, i když ne vždy, obsahuje glykosylační místa. Tyto geny postrádají klasické signální sekvence charakteristické pro membránové proteiny typu I, spíše odpovídají membránovým proteinům typu 11, které mají C-konec zasahující mimo buňku a krátký N-konec

- ICZ 299819 Bó ležící v cytoplazmě. V některých případech, jako jsou např. TNF a LT-α, se může objevit v průběhu časného opracování proteinu štěpení v úseku „stopky“ a ligand pak existuje především v secemované formě. Avšak většina ligandů se vyskytuje v membránové formě a zprostředkovává tak lokalizovaný přenos signálů.

Struktura těchto ligandů byla rozpoznána krystalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Struktura TNF a lymfotoxinu alfa (LT-α) je „sendvičová“, tj. skládají se ze dvou antiparalelních β-skládaných listů s topologií tzv. meandru („Greek key“ nebo ,jelly roli“). Odchylka rms mezi zbytky řetězců Ca a β je 0,61 C, což vede k domněnce o vysokém stupni podobnosti jejich mole10 kulami topografie. Strukturálním rysem, který zjevně vyplývá z molekulárních studií CD40L, TNF a LT-α, je tendence těchto ligandů vytvářet oligomemí komplexy. Oligomerní struktuře je vlastní vytváření vazebných míst pro receptor v místě spojení mezi sousedními podjednotkami, čímž se vytváří multivalentní ligand. Analýzou krystalové struktury se zkoumala kvartémí struktura TNF, CD40L a LT-α, a ukázalo se, že CD40L, TNF a LT-α existují jako trimery. Mnoho aminokyselin konzervativních pro tyto ligandy se vyskytuje právě v oblasti úseků kostry struktury β—listu. Je pravděpodobné, že základní sendvičová struktura je zachována u všech těchto molekul, neboť části těchto sekvencí kostry jsou zachovány mezí různými členy celé rodiny. Kvartémí struktura se zřejmě také udržuje, neboť konformace podjednotek pravděpodobně také zůstává podobná.

2°. ..

Členy rodiny TNF mohou být nejlépe popsány jako hlavní přepínače v imunitním systému, které řídí přežívání buněk a diferenciaci. V současnosti jsou známy pouze dva secemované cytokiny, a sice TNF a LT-α, na rozdíl od většiny ostatních členů rodiny TNF zakotvených v membráně. Zatímco membránové formy TNF byly dobře charakterizovány a pravděpodobně mají jedinečnou biologickou funkci, funkcí secemovaných TNF je všeobecná signalizace „poplachu“ buňkám vzdáleným od místa události, která příslušnou událost vyvolala. Sekrece TNF může znásobit událost vedoucí k dobře známým změnám ve výstelce cév a v buňkách v místě zánětu. Naproti tomu členy TNF rodiny vázané na membránu předávají signál prostřednictvím receptorů typu TNF pouze buňkám v přímém kontaktu. Tak např. pomocné T-lymfocyty poskytují „pomoc“ zprostředkovanou CD40 pouze takovým B-lymfocytům, se kterými se dostanou do přímého kontaktu prostřednictvím interakcí TCR. Podobná omezení na bezprostřední buněčný kontakt se týkají schopnosti indukovat buněčnou smrt u dobře prozkoumaného systému Fas.

Zdá se, že ligandy TNF je možné rozdělit do třech skupin na základě jejich schopnosti indukovat buněčnou smrt. V první skupině jsou ligandy TNF, Fas a TRAIL, které mohou účinně indukovat buněčnou smrt v mnoha buněčných liniích a jejich receptory mají většinou kanonické „smrtící“ domény. Pravděpodobně ligand k DR-3 (TRAMP/WSL-1) by patřil také do této kategorie. Další skupinu tvoří takové ligandy, které spouštějí slabší „smrtící“ signál omezený jen na některé buněčné typy, příklady této třídy jsou TWEAK, ligand CD30 a LTalb2. Zajímavou otázkou je, jak členy této skupiny mohou spouštět mechanismus vedoucí k buněčné smrti, když nemají kanonickou „smrtící“ doménu. Nepřítomnost této domény vede k domněnce, že existuje jiný způsob slabší signalizace v mechanismu buněčné smrti. A nakonec do poslední skupiny patří ty členy, které nejsou schopny přenášet žádný „smrtící“ signál. Ale pravděpodobně členy všech skupin mohou působit antiproliferačně na některé typy buněk jako následek indukce diferenciace, jako např. CD40 (Funakoshi et al,, 1994).

Rodina TNF se dramaticky rozrostla v poslední době a obsahuje nyní 11 různých signálních drah zahrnujících regulaci imunitního systému. Obecně rozšířené expresní profily TWEAK a TRAIL ukazují, že v této rodině existuje ještě značná funkční variabilita, dosud nerozpoznaná. To vyniklo zejména novým objevem dvou receptorů, které ovlivňují replikační schopnost viru Rousova sarkomu a viru Herpes simplex, a také historicky významnými objevy, že TNF má antivirovou aktivitu a virus neštovic kóduje „vějičkové“ TNF receptory (Brojatsch et al., 1996, Montgomery et al„ 1996, Smith 1994, Vassalli 1992).

-2QZ 299819 Bó

TNF je mediátor septického šoku a kachexie a účastní se regulace vývoje hematopoetických buněk. Zdá se, že hraje hlavní roli jako mediátor v zánětlívé reakci a v obraně proti bakteriálním, virovým a parazitárním infekcím, a navíc má zřejmě protinádorové účinky. TNF se podílí také na různých autoimunitních chorobách. TNF je produkován různými typy buněk, např. to jsou mak5 rofágy, fibroblasty, T-lymfocyty a NK-lymfocyty („natural killer“). TNF se váže na dva různé receptory, z nichž každý působí prostřednictvím odlišných specifických signálních molekul uvnitř buňky, což výsledně vede k odlišným účinkům TNF. TNF může existovat jednak ve formě vázané na membránu, ale i jako rozpustný secemovaný cytokin.

io LT-α sdílí s TNF mnoho společných aktivit, jako např. vazbu na TNF receptory, ale na rozdíl od TNF je secemován hlavně aktivovanými T-lymfocyty a některými β-lyrofoblastoidními nádory. Heteromemí komplex LT-cx a LT-β je komplex vázaný na membránu, který se váže na LT-β receptor. Systém LT (tj. LT s receptorem LT-R) se podílí na vývoji periferních lyrofatických orgánů, neboť genetické narušení LT-β vede k poruchám T- a B-lymfocytů ve slezině a k absenci lyrofatických uzlin. Systém LT-β se také podílí na buněčné smrti u některých adenokarcinomových buněčných linií.

Fas-L, další člen rodiny TNF, je exprimován přednostně na aktivovaných T-lyrofocytech. Indukuje smrt buněk nesoucích příslušný receptor, nádorových buněk a buněk infikovaných HIV, a sice mechanismem,.který je znám jako programovaná buněčná smrt neboli apoptóza. Kromě toho je známo, že nedostatek Fas nebo Fas-L vede k lyrofoproliferativním poruchám, což potvrzuje roli systému Fas v regulaci imunitní odpovědi. Fas systém se také. podílí na poškození jater v důsledku chronické infekce virové hepatitidy a na autoimunitní reakci u pacientů infikovaných HIV. Systém Fas se také účastní destrukce 1-lyinfocytň u pacientů infikovaných HIV, TRAIL, další člen této rodiny, se zřejmě také podílí na buněčné smrti mnoha různých transformovaných buněčných linií různého původu.

CD40-L, další člen rodiny TNF, je exprimován na povrchu T-lymfocytů a indukuje regulaci Blymfocytů nesoucích CD40. Kromě toho je známo, že změny v genu pro CD40-L jsou příčinou nemoci známé jako syndrom hyper-IgM vázané na X, Systém CD40 je také spojen s mnoha různými auto imunitním i chorobami a CD40-L má také známé antivirové vlastnosti. Ačkoliv se systém CD40 podílí také na obnově apoptických B-lymfocytů, u jiných buněk než buněk imunitního systému indukuje apoptózu. Mnohé další lyrofocytámí členy rodiny TNF se podílej i na kostimulaci.

Obecně lze shrnout, že členy rodiny TNF hrají základní regulační roli v řízení imunitního systému a v aktivaci akutního obranného systému hostitele. Vzhledem k současnému pokroku v ovlivňování členů rodiny TNF s cílem terapeutického prospěchu je pravděpodobné, že členy této rodiny mohou poskytnout jedinečné prostředky pro léčení nemocí. Některé ligandy rodi40 ny TNF mohou přímo indukovat apoptickou smrt mnohých transformovaných buněk, např. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata, 1997, 88 Cell 355-365). Aktivace receptorů Fas a zřejmě i TNF a CD30 mohou indukovat buněčnou smrt netransformovaných lymfocytů, což může mít důležitou imunoregulační funkci (Amakawa et al., 1996, 84 Cell 551-562, Nagata, 1997, 88 Cell 355-365, Sytwu et al., 1996, Zheng et al,, 1995, 377 Nátuře 348-351). Obecně je známo, že buněčná smrt se spustí po agregaci „smrtících“ domén, které jsou umístěny na čytoplazmatické straně receptorů TNF. Tyto „smrtící“ domény organizují různé složek signální transdukce, což nakonec vede k aktivaci celé kaskády (Nagata, 1997, 88 Cell 355-365). Některé receptory postrádají kanonické „smrtící“ domény, např. receptor LTb a CD30 (Browning et al., 1996, Lee et al., 1996), presto mohou indukovat buněčnou smrt, i když podstatně slaběji. Tyto recepto50 ry pravděpodobně fungují primárně tak, že indukují buněčnou diferenciaci a buněčná smrt je aberantním důsledkem u některých transformovaných buněčných linií, ačkoliv celý obrázek je dosud nejasný, neboť na základě studie s myšmi „CD30 null“ se předpokládá smrtící role v negativní selekci v brzlíku (Amakawa et al., 1996, 84 Cell 551-562). Naproti tomu, přenos signálů jinými drahami, jako např. právě prostřednictvím CD40, je vyžadován pro udržování a přežívání buněk. Z výše uvedeného vyplývá tedy potřeba identifikovat a charakterizovat další

-3CZ 299819 B6 molekuly, které jsou členy rodiny TNF, a tím poskytnout další prostředky k léčení nemocí a ovlivňování imunitního systému.

Původci v předkládaném vynálezu charakterizovali funkční vlastnosti nového ligandu z rodi5 ny TNF cytokinů. Nový ligand, nazvaný BAFF (odvozeno z“B-cell Activating Factor belongig to TNF family“), je exprimován T-lymfocyty a dendritickými buňkami za účelem kostimulace B-lymfocytů a hraje zřejmě důležitou roli v kontrole funkce B-lymfocytů. Kromě toho původci připravili transgenní myši nadměrně exprimující BAFF řízený promotorem specifickým pro játra. Tyto myši mají nadměrný počet zralých B-lymfocytů, spontánní reakce germinálních center, secemují autoprotilátky a mají vysoké počty plazmatických buněk v sekundárních lymfatiekýeh orgánech a depozity Ig v ledvinách.

Podstata vynálezu

V předkládané přihlášce se popisuje užití ligandu BAFF, blokujících činidel a protilátek stimulaci, nebo inhibici růstu k ligandu, B-lymfocytů buďto pro a sekrece imunoglobulinů. Vynález může být využit pro terapeutické aplikace při mnohých nemocech, jak bude ještě dále podrobněji diskutováno, a také ke zjišťování informací o imunitním systému a procesech vněm a také kjejich ovlivňování. Vynález může být dále využít ke stimulaci nebo inhibici růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů. Molekuly asociované s BAFF, jak popisuje předkládaný vynález, mohou být využity při léčení autoimunitních nemocí, poruch souvisejících s proliferaci a zráním B-lymfocytů, regulací BAFF a záněty. Popisuje se zde také regulace nebo prevence hypertenze a nemocí souvisejících s hypertenzí renální a kardiovaskulární tkáně.

Další vlastnosti a výhody vynálezu budou uvedeny dále, a budou zřejmé z popisu vynálezu nebo z realizace vynálezu. Předmět vynálezu a jeho další výhody budou specificky dosaženy metodami zvláště uvedenými v popisu, nárocích a také výkresech.

Předkládaný vynález, tak, jak je zde v celé šíři popsán, v souladu se zde popsanými výhodnými provedeními, se týká způsobu ovlivnění růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů podáváním přípravků obsahujících různé ligandy BAFF a příbuzné molekuly.

Konkrétně je předmětem vynálezu použití protilátky specifické pro rozpustný BAFF nebo aktiv35 ního fragmentu této protilátky pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení autoimunitního onemocnění.

Dalším předmětem vynálezu je použití protilátky specifické pro rozpustný BAFF nebo aktivního fragmentu této protilátky pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení lymfoproliferativní poruchy B lymfocytů.

A dále je předmětem vynálezu také použití protilátky specifické pro rozpustný BAFF nebo aktivního fragmentu této protilátky pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení imunosupresivního onemocnění.

Aještě dalším předmětem vynálezu je použití podle nároku 3, kdy imunosupresivní onemocnění je způsobeno HIV.

V přihlášce se popisuje také stimulace růstu B-lymfocytů užitím BAFF nebo aktivních fragmentů polypeptidu. Polypeptid může být buďto samotný nebo s ligandem CD40 nebo s anti-myší protilátkou.

Dále se popisuje i stimulace růstu a zrání B-lymfocytů stimulovaných dendritickými buňkami užitím ligandu BAFF nebo jeho aktivních fragmentů. A opět se polypeptid může užít buďto samotný, nebo s ligandem CD40 nebo s anti-μ protilátkou..

-4CZ 299819 B6

Také se zde popisuje, že byla užita činidla blokující BAFF a receptor BAFF k inhibici růstu Blymfocytů a sekrece imunoglobulinů. Tato činidla mohou být neoperativní rekombinantní BAFF, protilátky specifické k BAFF, nebo protilátky specifické k receptoru BAFF. Popisuje se také použití BAFF, molekul příbuzných BAFF a činidel blokujících BAFF k léčení hypertenze, nemocí souvisejících s hypertenzí, nemocí imunity, autoimunitních nemocí, zánětů a lymfoproliterativních poruch B-lymfocytů.

Předkládaná přihláška popisuje také použití BAFF a molekul příbuzných BAFF jako agonistů nebo antagonistů k ovlivnění imunitní reakce prostřednictvím ovlivnění růstu a/nebo zrání Blymfocytů a sekrece imunoglobulinů.

Popisují se zde i rozpustné konstrukty obsahující BAFF, které mohou být užity přímo ke spuštění farmakologické události zprostředkované BAFF. Takové události mohou mít bezprostředně pros15 pěšný terapeutický účinek při léčení rakoviny, nádorů nebo při ovlivňování imunitního systému při léčení imunologických onemocnění.

Provedení předkládaného vynálezu se týkají protilátek namířených proti BAFF, které mohou být použity např. při léčení rakoviny nebo při ovlivňování imunitního systému při léčení imunologic20 kých onemocnění.

Vynálezu se týká také genové terapie s využitím genů pro BAFF.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují volitelně farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans, plnidla a další farmaceuticky přijatelné složky, a mohou se podávat jakýmkoliv způsobem v oboru známým.

Jak výše uvedený všeobecný opis vynálezu, tak i následující k vysvětlení podrobný vynálezu, popis který včetně příkladů slouží je definován připojenými patentovými nároky.

Připojené obrázky slouží k lepšímu porozumění vynálezu a tvoří nedílnou součást popisu, jsou uvedeny proto, aby ilustrovaly vybraná provedení vynálezu a společně s popisem slouží k objasnění principu vynálezu,

Přehled obrázků na výkresech

Obr. l(A) znázorňuje predikovanou aminokyselinovou sekvenci lidského [SEKVENCE ID. C. í] a myšího BAFF [SEKVENCE ID. Č. 2], Predikovaná transmembránová doména (TMD, čárko40 váná čára), potenciální místa N-glykosylace (hvězdičky) a přirozená místa „opracování“ lidského BAFF (šipky) jsou znázorněna. Dvojitá čára nad hBAFF ukazuje sekvenci získanou Edmanovým odbouráváním opracované formy BAFF. Obr. 1(B) ukazuje srovnání extracelulámích proteinových sekvencí BAFF [SEKVENCE ID. Č. 3] a některých členů rodiny TNF ligandů [SEKVENCE ID, Č. 4 (hAPRIL); SEKVENCE ID. Č. 5 (hTNF alfa); SEKVENCE ID. Č. 6 (hFasL); SEKVENCE ID. Č. 7 (hLT alfa); SEKVENCE ID. Č. 8 (hRANKL)]. Identické a homologní aminokyselinové zbytky jsou uvedeny v černých a šedých rámečkách. Obr. 1(C) znázorňuje dendrogram ligandů TNF rodiny.

Obr. 2 je schéma rekombinantního BAFF. Obr. 2(A) představuje schéma rekombinantního kons50 truktu BAFF. Rozpustné rekombinantní proteiny BAFF začínají aminokyselinou Leu₈₃ a Gln^ byly exprimovány jako fúze s k N-koncové značce Flag a spojovací sekvenci (linkeru) 6 aminokyselin. Dlouhá forma je v T~lymfocytech 293 štěpena mezi aminokyselinami Arg_!33 a Ala_l34 (šipka) a vzniká tak opracovaná forma BAFF. Asn₁₂₄ a Asn₂₄₂ patří ke kanonickým sekvencím pro N-glykosylaci. N-vázaný glykan přítomný na Asn]₂4 je znázorněn jako

Y. TMD: transmembránová doména. Obr. 2B: Ošetření rekombinantního BAFF peptid N-glyka-5CZ 299819 Bó názou F (pNGase F). Koncentrované supernatanty obsahující BAFF a APRÍL s Flag značkou byly deglykosylovány a analyzovány Westernovým přenosem (Western blot) užitím polyklonální protilátky anti-BAFF nebo anti-Flag M2, jak je uvedeno. Všechny pásy kromě opracovaného BAFF reagovaly také s antí-FIag M2 (údaje neuvedeny). Obr. 2(C): Opracování BAFF plné délky na rozpustnou formu. Buňky 293T byly přechodně transformovány BAFF plné délky, Transfekované buňky a jejich koncentrované supernatanty byly analyzovány Westernovým přenosem pomocí polyklonálních anti-BAFF protilátek. Na gel byly naneseny supernatanty odpovídající desetinásobku množství buněk. Obr. 2(D): Vylučovací chromatografie („size exclussion“) rozpustné formy BAFF na koloně Superdex-200. Koncentrované supernatanty obsahující roz10 pustný BAFF/krátký byly frakcionovány na koloně Superdex-200 a eluované frakce byly analyzovány Westernovým přenosem užitím protilátky anti-Flag M2. Na levé straně jsou uvedeny molekulové hmotnosti (kDa) markeru/standardu pro SDS-PAGE a nahoře pro vylučovací chřomatografíi.

Obr. 3 ukazuje expresi BAFF. Obr. 3 (A): North emové přenosy (Northern blot) (2 pg póly A+ RNA v každé dráze) různých lidských tkání hybridizovány se sondou „antisense“ BAFF mRNA. Obr. 3(B): Reverzní transkripce a amplifikace BAFF, alfa řetězce reeeptoru IL-2 a aktinu z RNA T-lymfocytů purifikovaných z krve v různých okamžicích aktivace PHA, krevních buněk negativních v E-rozetách (B-lymfocyty a monocyty), nezralých dendritických buněk zís20 kaných in vitro, buněk 293 a buněk 293 sterilně transfekovaných BAFF plné délky (293-BAFF). Kontrolní amplifikace byly provedeny bez přidání cDNA. Alfa řetězec reeeptoru IL-2 byl amplifikován jako markér aktivace T-lymfocýtů,

Obr. 4 ukazuje vazbu BAFF na zralé B-lymfocyty. Obr. 4(A): Vazba rozpustného BAFF na buněčné linie BJAB a Jurkat a purifikované buňky CD19+ z pupečníkové krve. Buňky byly obarveny uvedeným množstvím (ng/50 μΐ) Flag-BAFF a analyzovány průtokovou cytometrií. Obr. 4(B): Vazba rozpustného BAFF na PBL. PBL byly obarveny anti-CD8-FITC nebo antiCD19-FITC (horizontální osa) a Flag-BAFF s M2-biotinem a avidin-PE (vertikální osa). V kontrolách byl vynechán Flag-BAFF.

Obr, 5 ukazuje, že BAFF kostimuluje proliferaci B-lymfocytů. Obr. 5(A): Povrchová exprese BAFF u trvale transformovaných buněk 293. Buňky 293-BAFF a buňky 293 divokého typu byly obarveny monoklonální protilátkou anti-BAFF mAb 43,9 a analyzovány průtokovou cytometrií. Obr. 5(B): Kostimulace PBL buňkami 293-BAFF. PBL (10⁵/jamka) byly inkubovány s 15 000 buňkami 293 fixovanými glutaraldehydem (293 divokého typu nebo 293-BAFF) za přítomnosti či absence protilátky proti reeeptoru B-lymfocytů (anti-μ). Fixované buňky 293 samy inkorporovaly 100 cpm. Obr. 5(C): Na dávce závislá kostimulace proliferace PBL rozpustným BAFF za přítomňósti anti-μ. Proliferace byla určována po 72 hodinách inkubace inkorporací [³H]-thymidinu. Kontroly obsahovaly buňky ošetřené samotným BAFF, tepelně denaturova40 ným BAFF nebo protilátkou irelevantního isotypu místo anti-μ. Obr. 5(D): Srovnání (ko)stimu1 ač nich účinků sCD40L a sBAFF na proliferaci PBL. Experiment byl proveden stejně jak je popsáno pro panel C. Obr. 5(E): BAFF kostimuluje sekreci Ig z preaktivovaných lidských Blymfocytů. Purifikované B-lymfocyty CD 19+ byly aktivovány kokultivací s T-lymfocyty EL-4 a supernatanty aktivovaných T-lymfocytů po 5 až 6 dnů, pak reizolovány a kultivovány dalších

7 dnů pouze v samotném médiu (-) nebo v médiu obsahujícím 5% supernatanty aktivovaných Tlymfocytů (T—SUP) nebo směs cytokinu (IL-2, IL—4, IL-10). Sloupce představují průměrné hodnoty koncentrace imunoglobulinů v kulturách bez nebo s 1 pg/ml BAFF. Jsou uvedeny průměr ± směrodatná odchylka (SD) jakožto „násobek zvýšení“: 1,23 + 0,11 pro samotné médium a 2,06 ±0,18 pro supernatanty T-lymfocytů (4 pokusy) a 1,45 ± 0,06 pro ÍL-2, IL—4 a IL-10 (2 pokusy). Pokusy byly provedeny s B-lymfocyty periferní krve (3 pokusy) nebo B-lymfocyty pupečníkové krve (I pokus: 2,3násobné zvýšení se supernatanty T-lymfocytů, l,5násobné zvýšení s IL-2, IL—4 a IL-10), Obr. 5(F): Závislost účinku BAFF na dávce v kultuře se supernatanty T-lymfocytů, uvedených v panelu D. Ukázána je průměrná hodnota ± směrodatná odchylka ze 3 pokusů.

-6CZ 299819 B6

Obr. 6 ukazuje, že BAFF působí jako kofaktor při proliferaci B-lymfocytů, Proliferace lidských B-lymfocytů periferní krve byla měřena na samotných PBL (500 cpm), za přítomnosti samotného ligandu BAFF, za přítomnosti samotné kozí anti-myší(mu) protilátky, a za přítomností ligan5 du BAFF s anti-mu. Kombinace ligandu BAFF s anti-mu významně zvyšovala proliferaci PBL s rostoucí koncentrací BAFF, což podporuje charakteristiku BAFF jako kofaktoru.

Obr. 7 demonstruje zvýšení počtu B-lymfocytů u BAFF Tg myší. Obr. 7(A): Zvýšený počet lymfocytů u BAFF Tg myší. Graf srovnává 12 kontrolních myší (levý panel) s 12 myšmi BAFF Tg i o (pravý panel). Počty lymfocytů jsou na grafu uvedeny jako kroužky a počty granuloctů (zahrnující neutrofily, eosinofily, basofily) jako kosočtverečky. Obr. 7(B): Zvýšený počet B-lymfocytů v PBL u BAFF Tg myší. PBL byly pro FACS analýzu obarveny jak anti-B220-FITC, tak i antiCD4-PE a sledovány na živých buňkách pomocí „forward side“ rozptylu. Jsou uvedena procenta lymfocytů pozitivních na CD4 a B220. Je ukázána jedna kontrolní myš (vlevo) a dvě

BAFF Tg myši (vpravo) a tyto výsledky byly reprezentativní pro 7 zvířat analyzovaných v každé skupině. Obr. 7(C): FACS analýza poměru B- a T-lymfocytů v PBL. Rozdíl mezi kontrolními zvířaty a myšmi BAFF Tg v (A) a (C) byly statisticky významné (P<0,001). Obr. 7(D); Zvýšení exprese MHC třídy II na B-Iymfocytech z PBL myší BAFF Tg. Exprese MHC třídy II byla analyzována FACS. Obr. 7(E): Zvýšení exprese BcI-2 na B-Iymfocytech z PBL myší BAFF Tg.

Exprese Bcl-2 byla měřena intracytoplazmatickým barvením a buňky byty analyzovány FACS. Jak v (D) tak v (E) byly živé buňky indikovány „forward side“ rozptylem. Čtyři kontrolní zvířata (bílé úsečky) a čtyři BAFF Tg myši jsou ukázány a reprezentují alespoň 12 zvířat analyzovaných v každé skupině. MFI: průměrná hodnota intenzity fluorescence. Rozdíl mezí kontrolními zvířaty a BAFF Tg myšmi byl statisticky významný (p <0,005). Obr. 7(F); Zvýšená exprese efektoro25 vých T-lymfocytů u myší BAFF Tg. PBL byly obarveny anti-CD4-<yc hrome, anti-CD44~FITC a anti-L se(ektin-PE. Ukázány jsou buňky indikované jako CD4+. Uvedena jsou také procenta buněk CD44^hl/L selektin¹⁰. Je ukázána jedna kontrolní myš (vlevo) a dvě transgenní BAFF Tg (vpravo) reprezentující alespoň 8 zvířat analyzovaných v každé skupině.

Obr. 8 ukazuje zvětšený kompartment B-lymfocytů ve slezině, ale nikoliv v kostní dřeni transgenních myší BAFF Tg. Obr. 8(A): FACS barvení zralých B-lymfocytů užitím jak antí-IgMFITC, tak i anti-B220-PE, ve slezině (horní panel), kostní dřeni (střední panel) a MLN (spodní panel). Jsou uvedena procenta zralých B-lymfocytů B220+/IgM, Obr. 8(B): FACS barvení preB-lymfocytů (B220+/CD43-) a pro-B-lymfocytů (B220+/CD43+) v kostní dřeni simultánním užitím anti-CD43-ITC, anti-B220-Cychrome a anti-IgM-PE. Ukázány jsou buňky vymezené na populaci lgM negativní. Uvedena jsou procenta pre-B-lymfocytů (B220+/CD43-) a pro-Blymfocytů (B220+/CD43+). Na všech obrázcích (A a B) jsou ukázány jedna kontrolní myš (vlevo) a dvě myší BAFF Tg (vpravo) a výsledky reprezentují 7 zvířat analyzovaných v každé skupině.

' 40

Obr. 9 ukazuje zvýšené hladiny Ig, RF a CIC u myší BAFF Tg. Obr. 9(A): SDS-PAGE analýza séra ze 2 kontrolních myší (-) a 4 BAFF Tg myší (+) vedle sebe s uvedeným množstvím purifikovaného myšího IgG pro srovnání. Intenzita albuminového pásuje podobná ve všech drahách, což ukazuje ve všech vzorcích bylo na gel naneseno stejné množství materiálu.

Analýza, založená na testu ELISA, celkového myšího Ig (B), RF (C) a CIC (D) v séru 19 kontrolních myší (bílé sloupečky) a 21 transgenních myší BAFF Tg (černé sloupečky). Při nedostatku vhodné kontroly pro RF byl titr (log se základem 2) definován jako ředění séra poskytující OD 3x vyšší než pozadí. Množství CIC bylo definováno jako množství PAP nutné k vytvoření OD shodné s OD pro testované sérum. Rozdíly mezi kontrolními a BAFF Tg myšmi byly statisticky významné (p < 0,001 v (B) a (C), p< 0,003 v (D)).

Obr, 10 ukazuje přítomnost autoproti látek anti-ssDNA a anti-dsDNA u některých BAFF Tg myší.

-7CZ 299819 B6

Obr. 10(A): ELISA analýza anti-ssDNA autoprotilátek 19 kontrolních myší (šedé sloupečky) a 21 transgenních myší BAFF Tg (černé sloupečky).

Obr. 10(B) : ELISA analýza anti-ssDNA autoprotilátek u 5 vykazujících hladiny anti-ssDNA kontrolních myší a 5 zvířat autoprotilátek v (A).

Obr. 10(C): Parafínové řezy ledvin z kontrolní myši (vlevo) a BAFF Tg myši (vpravo) obarvené kozím anti-myším lg s HRP. Depozity lg jsou ukázány jako hnědé zabarvení. Tyto obrázky jsou reprezentativní pro 6 analyzovaných myší BAFF Tg.

Obr. 11 ukazuje zvětšené Peyerovy pláty u myší BAFF. Fotografie Peyerových plátů (ukázány io šipkou) v tenkém střevu kontrolní myši (vlevo) a myši BAFF Tg (vpravo). Obrázek je reprezentativní pro alespoň 12 myší utracených v každé skupině. Zvětšeno 5x.

Obr. 12 ukazuje narušenou organizaci B- a T-lymfocytů, intenzivní reakce germinálních center, snížený počet dendritických buněk a zvýšený počet plazmatických buněk ve slezině

BAFF Tg myši.

Kontrolní myši jsou ukázány na A, C, E a G a BAFF Tg na B, D, F a H. B-lymfocyty jsou modré a T-lymfocyty hnědé (A a B). Germinální centra jsou ukázána šipkou (C a D). U kontrolních myší je vidět pouze několik reziduálních germinálních center (C). Dendritické buňky pozitivní na CDllc jsou hnědé a vyskytují se v zóně T-lymfocytů, spojovacích kanálcích a marginální zóně (E). Jen velmi málo jich je přítomno u BAFF Tg myší (F). Plazmatické buňky pozitivní na Syndecan-I byly detekovatelné pouze v červené dřeni BAFF Tg myší (H), ale nikoliv kontrolních myší(G). Tyto obrázky jsou reprezentativní pro alespoň 12 BAFF Tg a 12 kontrolních myší, které byly analyzovány. Zvětšení bylo lOOx pro všechny obrázky s výjimkou C a D, kde bylo 50x. B: folikuly B-lymfocytů, T: PALS, WP: bílá dřeň, RP: červená dřeň.

Obr. 13 ukazuje narušenou organizaci B- a T-lymfocytů, velký počet intenzivní reakce germinálních center a ptazmatických buněk v MLN BAFF Tg myší.

Kontrolní myš je ukázána na A, C, E a G a BAFF Tg myš je ukázána na B, D, Fa H. Imunohistochemická analýza byla provedena jak je popsáno u obr. 6. Barvení B- a T-lymfocytů je ukázáno na A a B, germinálních center naC a D, dendritických buněk na E.a F a plazmatických buněk na G a H. GC: germinální centra. Zvětšení lOOx.

Následující popis se týká především podrobného popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu. V předkládané přihlášce se popisuje zejména užití BAFF a příbuzných molekul k ovlivnění růstu a zrání B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů. Dále se zde popisuje užití BAFF a příbuzných molekul k ovlivnění reakce imunitního systému, které je vynuceno nemocemi souvisejícími s imunitou._; Vynález týká léčení rakoviny.a imunologických onemocnění užitím BAFF nebo příbuzných genů v genové terapii.

Ligand BAFF a jeho homology produkované v hostiteli/příjemci transformovaném sekvencemi podle vynálezu, a také nativní BAFF purifíkovaný metodami, které jsou odborníkovi známy, nebo aminokyselinové sekvence, jsou připravený užitečné ze známé pro různé protirakovinné, protinádorové a imunitu regulující aplikace. Mohou být také užitečné při terapii jiných nemocí.

V přihlášce se popisuje i použití polypeptidu kódovaného izolovanou nukleovou kyselinou kódující ligand BAFF v “antisense“ terapii. Termín „antisense“ terapie se v předkládané přihlášce týká podávání nebo in šitu vytváření oligonukleotidů nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují v normálních buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA kódující požadovaný ligand, a tak inhibují expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují transkripci a/nebo translaci.

Zmíněná vazba je zprostředkována konvenční komplementaritou párů bází nebo např. v případe vazby na duplexy DNA může jít o vazbu prostřednictvím specifických interakcí v hlavním zářezu dvoušroubovicové DNA. Obecně se „antisense“ terapie týká celé řady technik v oboru užívaných a patří sem v podstatě jakákoliv terapie založená na specifické vazbě olígonukleotidových sekvencí.

-8CZ 299819 B6 „Antisense“ konstrukt může být podáván např. ve formě expresního plazmidu, který transkripcí v buňce vytvoří RNA, která je komplementární k buněčné mRNA kódující BAFF nebo alespoň k její části. Alternativně může být „antisense konstrukt také oligonukleotidová sonda připravená ex vivo. Takové oligonukleotidové sondy jsou výhodně modifikované oligonukleotidy, které jsou rezistentní k endogenním nukleázám ajsou proto stabilní in vivo. Příkladem takových molekul nukleových kyselin vhodných jako „antisense oligonukleotidy jsou fosforamidátové, fosfothioátové a metylfosfonátové analogy DNA (viz patenty US 5 176 996, US 5 264 564 a US 5 256 775). Kromě toho obecný postup konstrukce oligomerů vhodných pro „antisense tera10 pii byly přehledně uvedeny např. v publikacích Van Der Krol et al, 1988, Biotechniques 6: 958976, a Stem et al., 1988, Cancer Res. 48: 2659-2668.

Ligand BAFF

Ligand BAFF podle předkládaného vynálezu, jak již bylo diskutováno výše, členem rodiny TNF, a byl popsán v mezinárodní patentové přihlášce PCT/US98/19037 (publikované jako WO 99/12964). Protein sám, nebo jeho fragmenty či homology, má široké možnosti terapeutického a diagnostického použití.

Ligand BAFF se vyskytuje zejména ve slezině a v lymfocytech periferní krve, což ukazuje na regulační roli v imunitním systému. Srovnání sekvence ligandu BAFF podle vynálezu s ostatními členy lidské rodiny TNF ukazuje značnou strukturní podobnost. Všechny tyto proteiny sdílejí několik úseků konzervativních sekvencí v extracelulámí doméně.

Ačkoliv není dosud známa přesná trojrozměrná struktura ligandu podle vynálezu, lze predikovat, že jakožto člen rodiny TNF sdílí určité strukturní charakteristiky s ostatním členy rodiny.

Nové polypeptidy podle předkládaného vynálezu specificky reagují s receptorem, který dosud nebyl identifikován. Avšak peptidy a způsoby podle předkládaného vynálezu umožňují identifi30 kovat receptory, které specificky reagují s ligandem BAFF nebo jeho fragmenty.

Určitá provedení podle předkládaného vynálezu se týkají peptidů odvozených z ligandu BAFF, které mají schopnost vázat se na jeho receptory. Fragmenty ligandu BAFF je možné připravit různými způsoby, např. rekombinantní technologií, pomocí PCR, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidu mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo několika nukleotidů z jednoho nebo zobou konců nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Fragmenty polypeptidu lze tak připravit expresí mutované DNA.

Polypeptidové fragmenty se mohou také chemicky syntetizovat obvyklým způsobem metodou známou jako Merriffieldova syntéza na pevné fází užívající f-moc nebo t-boc. Např, peptidy a. sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je možné v podstatě libovolně rozdělit na fragmenty požadované délky, které se nepřekrývají, nebo na překrývající se fragmenty požadované délky. Příslušné metody jsou podrobněji popsány v následujícím textu.

Příprava rozpustných forem ligandu BAFF

Rozpustné formy ligandu BAFF mohou být velmi účinné v přenosu signálu a mohou tudíž být podávány jako lék, který napodobuje přirozenou membránovou formu. Je možné, že ligand BAFF podle předkládaného vynálezu je přirozeně secemován jako rozpustné eytokiny, ale pokud tomu tak není, je možné modifikovat gen metodami genového inženýrství tak, aby se zesílila sekrece. Pro přípravu rozpustné secernované formy BAFF je třeba odstranit na úrovni DNA Nkoncový transmembránový úsek a některé úseky „stonku“ a nahradit je vedoucí sekvencí typu I nebo alternativně vedoucí sekvencí typu II, která umožní účinné proteolytické štěpení ve vybraném hostitelském systému. Odborník je schopen měnit rozsah „stonkových“ úseků ponechaných v expresním konstruktu tak, aby bylo dosaženo optimálních vazebných vlastnosti k receptorů a

-9CZ 299819 B6 sekreční účinnosti. Tak např. lze připravit konstrukty obsahující všechny možné délky „stonku“, a sice zkracováním N-konce, takže vzniknou proteiny, které budou začínat např. aminokyselinou 81 až 139. Tímto typem analýzy lze stanovit optimální délku sekvence „stonku“.

Příprava protilátek reaktivních s ligandem BAFF

Předkládaný vynález se také týká protilátek specificky reagujících s ligandem BAFF nebo jeho receptorem, Antiséra typu anti-proteín/anti-peptid nebo monoklonální protilátky lze připravit standardními způsoby (viz např. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlowand Lané (eds.), Cold ío Spring Harbor press, 1988). Savec jako např. myš, křeček nebo králík, se může imunizovat imunogenní formou peptidu. Způsoby, jak učinit protein nebo peptid imunogenním, např. tím, že je konjugován s nosičem, nebo jiné způsoby, jsou v oboru známy,

Imunogenní Část ligandu BAFF nebo jeho receptorů může být podána společně s adjuvans. Pos15 tup imunizace je možné monitorovat pomocí detekce titru protilátek v plazmě nebo séru. Standardní test ELIS A nebo jiné imunotesty se mohou použít s imunogenem coby antigenem k hodnocení hladin protilátek.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou protilátky imunospecifické pro antigenní determinanty ligandu BAFF nebo jeho receptorů (tj. antigenní determinanty polypeptidu se sekvencí id. č. 2, popsané v PCT/US98/19037 (WO99/12964), která je vložena formou odkazu v plném rozsahu), nebo pro blízce příbuzný lidský nebo savčí, jiný než lidský, homolog (s homologií 70, 80 nebo 90 %, nejvýhodněji s homologií alespoň 95 %). V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátky anti- BAFF nebo anti-BAFF-receptor v podstatě nereagují zkříženě (tzn, reagují pouze specificky) s proteinem, který je např. méně než z 80 % homologní se sekvencí id. č. 2 nebo 6 popsanou v PCT/US98/19037 (WO99/12964), výhodně méně než z 90% a nejvýhodněji méně než z 95% homologní se sekvencí id. č. 2 popsanou v PCT/US98/19037 (WO 99/12964). Označením, že „v podstatě nereagují zkříženě“ se míní to, že protilátka má vazebnou afinitu k nehomolognímu proteinu menší než 10 %, výhodněji menší než 5 % a ještě výhodněji menší než 1 %, vazebné afinity k proteinu se sekvencí id. č. 2, která byla popsána ve výše zmíněné PCT/US98/19037 (WO99/12964).

Termín „protilátka“ se v této přihlášce užívá ve významu, který zahrnuje i fragmenty protilátky, které také specificky reagují s BAFF nebo jeho receptory. Protilátky lze fragmentovat pomocí obvyklých způsobů, které jsou v oboru známy, a možnosti využití fragmentů lze pak testovat stejnými způsoby jak bylo popsáno pro celé protilátky. Tak např. fragmenty F(ab')₂ je možné připravit působením pepsinu. Výsledný fragment se pak může ošetřit tak, aby se redukovaly disulfidické můstky, čímž vznikne fragment Fab'. K protilátkám podle předkládaného vynálezu dále patří bispecifické a chimérické molekuly, které mají aktivitu namířenou proti BAFF (aktivita anti-BAFF) nebo proti, receptorů BAFF (aktivita anti-receptor BAFF). Takže pro blokování BAFF nebo receptorů BAFF je možné využít jak monoklonálních, tak polyklonálních protilátek (Ab) namířených proti BAFF, nádorovému ligandu ajejich receptorům, a také je možné užít protilátkové fragmenty jako např. Fab’ nebo F(ab')₂ k zablokování činnosti ligandu a příslušného receptorů.

Různé formy protilátek je možné připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Wínter a Milstein, Nátuře 349: 293-299, 1991). Např. je možné konstruovat takové chimérické protilátky, kde vazebná doména pro antigen z protilátky zvířete je spojena s lidskou konstantní doménou (Cabilly et al., patent US 4 816 567). Chimérické protilátky redukují imunitní reakci vyvola50 nou zvířecím protilátkami, kdyžjsou použity v klinických aplikacích u lidí.

Kromě toho rekombinantní „humanizované“ protilátky, rozpoznávající BAFF nebo jeho receptor mohou být syntetizovány. Humanizované protilátky jsou chimérické protilátky, které obsahují většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy sekvence zodpovědné za specifickou vazbu k antigenu. Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje příslušná protilát-10CZ 299819 B6 ka a odstraní se z ní část variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenů. Úsek vážící antigen pocházející ze Zvířete se pak klonuje do vhodného místa genu lidské protilátky, ze kterého byl odstraněn úsek vážící antigen. Humanizované protilátky minimalizují použiti heterologních (tj. mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách, a tak snižují pravděpodobnost vyvolání imunitní reakce u léčeného pacienta.

Různé třídy rekombinantních protilátek se mohou vytvářet také tak, že se připraví chimérické nebo humanizované protilátky obsahující variabilní domény a lidské konstantní domény (CH1, CH2 a CH3) izolované z různých tříd imunoglobulínů. Tak např. se mohou připravit rekombi10 nantním způsobem protilátky se zvýšenou valencí vazebných míst pro antigen, a to tak, že se klonuje vazebné místo pro antigen do vektoru nesoucího konstantní úsek řetězce lidské protilátky (Arulandam et al., J, Exp. Med. 177: 1439-1450, 1993,).

Kromě toho lze použít standardní techniky rekombinantní DNA pro modifikaci vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejích antigeny tím, že se změní zbytky aminokyselin v blízkosti vazebného místa pro antigen. Vazebná afinita pro antigen u humanizované protilátky se může zvýšit mutagenezi založenou na modelování molekul (Quenn et af, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10 029-33, 1989).

Příprava analogů: Příprava modifikovaných DNA sekvencí a peptidových sekvencí

Analogy BAFF podle vynálezu se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího BAFF sekvencí aminokyselin, nebo způsobem, který nezahrnuje aminokyselinovou sekvenci, nebo oběma způsoby. K jiným modifikacím než je modifikace sekvence patří chemická derivatizace BAFF, a to jak in vitro, tak in vivo. K modifikacím nezahrnujícím změny sekvence patří změny v acetylaci, mety láci, fosforylaci, karboxy láci nebo glykosylaci, přičemž tento výčet není omezující,

K výhodným analogům BAFF patří jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od SEKVENCE ID. Č. 2 popsané v PCT/US98/19037 (WO99/12964) jednou nebo několika konzer30 vativními substitucemi, delecemi nebo inzercemi aminokyselin, které nenarušují biologickou aktivitu BAFF. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, např. substituce v rámci následujících skupin: valin-glycin, glycin-alanin, valin-isoleucin-leucin, kyselina asparagová-kyselina glutamová, asparagin-glutamin, serin threonin, lystn-arginin a fenylalanin-tyrosin.

Materiály a metody použité ve vynálezu

Monoklonální protilátka anti-Flag M2, biotinylovaná protilátka ^:anti-Flag M2 a protilátka antiFlag M2 navázaná na agarózu byly zakoupeny od firmy SIGMA. Reagencie pro buněčné kultury byly získány od firmy Life Sciences (Basel, Switzerland) a Biowhittaker (Walkersville, MD). Rozpustný lidský Flag-značený APRÍL (zbytky Kn₀-L₂₅o) byl produkován v buňkách 293 jak bylo již popsáno (10, ll). FITC-značené protilátky anti-CD4, antÍ-CD8 a anti-CD19 byly zakoupeny od firmy Pharmingen (San Diego, CA). Kozí F(ab')₂ specifická pro fragment Fc_5g lidského IgM byla zakoupena od firmy Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Sekundární protilátky byly získány buďto od Pharmingen, nebo od Jackson ImmunoResearch a byly použity v ředěních doporučených výrobcem.

Buňky 293 T (12) lidských embryonálních ledvin a fibroblastové buněčné linie (viz tab. 1) byly udržovány v médiu DMEM obsahujícím 10% tepelně inaktivované fetální telecí sérum (FCS).

Buňky 293 T (12) lidských embryonálních ledvin byly udržovány v médiu DMEM-živná směs F12 (1:1) doplněném 2% FCS. Linie T-lymfocytů, B-lymfocytů a makrofágů (viz tab. 1) byly udržovány v médiu RPMI doplněném 10% FCS. Buňky Molt-4 byly kultivovány v médiu podle íscoveho doplněném 10% FCS. Epitelové buněčné Itnie byly kultivovány v médiu MEM-alfa obsahujícím 10% FCS, 0,5 mM neesenciální aminokyseliny, 10 mM Na-Hepes a 1 mM Na55 pyruvát. Buňky HUVEC byly udržovány v médiu Ml99 doplněném 20% FCS, 100 pg/ml epite-11 CZ 299819 B6 liáíního růstového faktoru (Collaborative Research, ínotech, Dottikon, Switzerland) a 100 pg/ml sodné soli heparinu (Sigma). Všechna média obsahovala antibiotika penicilín a streptomycin. Leukocyty periferní krve (PBL) byly izolovány z heparinem ošetřené krve zdravých dospělých dobrovolníků užití centrifugace v gradientu Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden) a pak byly kultivovány v médiu RPMI s 10% FCS.

T-lymfocyty byly získány z neadherujících PBL rozetováním s ovčími červenými krvinkami ošetřenými neuraminidázou a oddělením od nerozetujících buněk (hlavně B-lymfocytů a monocytů) centrifugací v gradientu Ficoll-Paque. Purifikované T-lymfocyty byly aktivovány 24 hodin s fytohemaglutininem (Sigma) (1 pg/ml), opláchnuty a kultivovány v RPMI s 10% FCS a 20 U/ml of IL-2. Monocyty CD 14+ byly purifíkovány metodou magnetického třídění buněk užitím protilátky anti-CD14, mikroperliček potažených kozí anti-myší protilátkou a zařízení Minimacs™ (Miltenyi Biotech), a pak kultivovány v přítomnosti GM-CSF (800 U/ml, Leucomax®, Essex Chemie, Luzern, Switzerland) and IL-4 (20 ng/ml Lucerna Chem, Luzem,

Switzerland) po dobu 5 dnů, pak další 3 dny s GM-CSF, IL-4 a TNF (200 U/ml, Bender, Vienna, Austria), aby se získaly CD83+, poulace buněk podobných dendritickým buňkám. Lidské Blymfocyty v čistotě >97 % byly izolovány z periferní krve nebo pupečníkové krve pomocí magnetických perliček s anti-CD19 (M450, Dynal, Oslo, Norway) jak bylo již popsáno (13).

Analýza Northemovým přenosem („Northern Biot“)

Analýza northemovým přenosem byla provedena pomocí komerčně dostupných membrán s přenesenou RNA z lidských tkání „Human Multiple Tissue Northern Blots Γ, II“ (Clontech katalog, č. 7 760-1 a 7 759-1). Membrány byly hybridizovány v hybridizačním roztoku (50% formamid, 2,5x Denhardtův roztok, 0,2% SDS, lOmM EDTA, 2xSSC, 50mM NaH₂PO₄, pH 6,5, 200 gg/ml sonikované DNA lososího spermatu) 2 hodiny při 60 °C. Antisense RNA sondy obsahující nukleotidy odpovídající aminokyselinám 136 až 285 hBAFF byly tepelně denaturovány a přidány do čerstvého denaturačního roztoku v množství 2 x 10⁶ cpm/ml. Membrána byla hybridizována 16 hodin v 62 °C, opláchnuta jednou ve 2xSSC, 0,5% SDS (30 minut v 25 °C), jednou v 0,lxSSC, 0,1% SDS (20 minut v 65 °C) a pak exponována v -70 °C na rentgenový film.

Charakterizace BAFF cDNA cDNA lidského BAFF byla obsažena v několika EST klonech (např. klony č. T87299 a

AA166695 v GenBank) získaných z knihoven fetálních jater a sleziny a ovariálního karcinomu. 5'-koncová část cDNA byla získána metodou 5-RACE-PCR amplifikace (Marathon-Ready cDNA, Clonetech, Palo Alto, CA) s oligonukleotidy API a JT1013:

(5’-ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC-3’) [SEKVENCE ID. Č. 9] užitím dodané cDNA knihovny ze sloučených lidských leukocytů jako templátu, jak bylo doporučeno výrobcem. Výs40 ledný PCR produkt byl klonován do vektoru PCR-0 blunt (ínvitrogen, NV Leek, The Netherlands) a pak subklonován jako EcoRÍ/Pstl fragment do vektoru pT7T3 Pac (Pharmacia) obsahujícího EST klon T87299. cDNA hBAFF plné délky byla tedy získána kombinací 5' a 3' fragmentů s využitím vnitřního místa Pstl v BAFF. Sekvenci bylo v databázi GenBank přiřazeno přístupové číslo AF116456.

Částečná sekvence myšího BAFF velikosti 617 bp byla obsažena ve dvou částečně se překrývajících EST klonech (AA422749 a AA254047). PCR fragment zahrnující nukleotidy 158 až 391 této sekvence byl použit jako sonda pro screening cDNA knihovny z myší sleziny (Stratagene, La Jolla, CA).

Exprese rekombinantního BAFF hBAFF plné délky byl amplífikován užitím oligonukleotidů JT1069: (5’-GACAAGCTTGCCACCATGGATGAGTCCACA-3') [SEKENCE ID. Č. 10] a JT637:

(5-ACTAGTCACAGCAGTTTCAATGC-3' [SEKVENCE ID. Č. 11],

-12CZ 299819 B6

Produkt PCR byl klonován do vektoru “PCR-0 blunt“ a znovu subklonován jako HindíII/EcoRI fragment do savčího expresního vektoru PCR-3. Krátká verze rozpustného BAFF (aminokyseliny Q136-L285) byla amplífikována užitím oligonukleotidů JT636;

(5'-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3' [SEKVENCE ID. Č. 12] a JTÓ37.

Dlouhá verze rozpustného BAFF (aminokyseliny L83 L285) byla získána z BAFF plné délky využitím vnitřního Pstl místa. Rozpustný BAFF byl znovu subklonován jako Pstl/EcoRI fragment za signální peptid hamaglutininu a sekvenci Flag do modifikovaného vektoru PCR-3, a io jako Pstl/Spel fragment do modifikovaného bakteriálního expresního vektoru pQEló v souladu se čtecím rámcem s N-koncové sekvence Flag (14). Konstrukty byly sekvencovány z obou stran.

Založení stabilních linií buněk 293 exprimujících krátkou rozpustnou formu BAFF nebo BAFF plné délky a exprese a purifikace rekombinantního rozpustného BAFF z baktérií a savčích buněk 293 byla provedeno jak jíž bylo popsáno (14,15).

>5

PCR spřažena s reverzní transkripcí

Celková RNA extrahovaná z T-lymfocytů, B-lymfocytů, nezralých dendritických buněk získaných in vitro, buněk 293 divokého typu a 293 -BAFF (plné délky) byla reverzně transkribována užitím systému Ready to Go (Pharmacia) podle instrukcí výrobce. CDNA pro BAFF a β-aktin byly detekovány pomocí PCR amplifikace s Taq DNA polymerázou (kroky vždy po 1 minutě v 94 °C, 55 °C a 72 °C, 30 cyklů) užitím oligonukleotidových primerů specifických pro BAFF: TT1.322:

5'-GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC-3' [SEKVENCE ID. Č. 13] a JT1323:

5'-CAATTC ATCCCCA AAGACATGGAC-3' [SEKVENCE ID. Č. 14];

a specifických pro alfa-retězec receptorů IL-2: TT 1368: 5-TCGGAACACAACGAAACAAGTC-3' [SEKVENCE ID. Č. 15] a JT 1369: 5'-CTTGTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3' [SEKVENCE ID. Č. 16]; pro β-aktin: 5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3' [SEKVENCE ID. Č. 17] a

5’ GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3' [SEKVENCE ID. Č. 18],

Gelová permeační chromatografie

Buňky 293T byly přechodně transfekovány krátkou formou rozpustného BAFF a kultivovány v médiu Optimem bez séra po 7 dnů. Kondiciované supematanty byly koncentrovány 20x, smíchány s vnitřním standardem katalázou a ovalbuminem a naneseny na kolonu Supeřdex200 HR10/30, Proteiny byly eluovány PBS při průtoku 0,5 ml/min a frakce (0,25 ml) byly precipítovány trichloroctovou kyselinou analyzovány Westernovým přenosem užitím protilátky antiFlag M2. Kolona byla kalibrována standardními proteiny: ferritin (440 kDa), kataláza (232 kDa), aldoláza(158 kDa), hovězí sérový albumnin (67 kDa), ovalbuniin (43 kDa), chyrootrypsinogen A (25 kDa) a ribonukleáza A (13,7 kDa).

Ošetření působením enzymu PNGase F

Vzorky byly zahřátý ve 20 μΐ 0,5% SDS, 1% 2-merkaptoethanol 3 minuty v 95 °C pak ochlazeny, a byl přidán 10%Nonidet P-40 (2 μΐ), 0,5 M fosforečnan sodný, pH7,5 (2 μΐ) a Peptid Nglykanáza F (125 jednotek/μΙ, 1 μΐ, kontroly bez enzymu). Vzorky byly inkubovány 3 hodiny ve 37 °C před analýzou Westernovým přenosem.

-13CZ 299819 B6

Edmanovo sekvencování

Buňky 293T byly přechodně transfekovány dlouhou formou rozpustného BAFF a kultivovány v médiu Optimem bez séra po 7 dnů. Kondiciované supernatanty byly koncentrovány 20x, frak5 cionovány na SDS-PAGE a přeneseny na polyvinylidendifluoridovou membránu (BioRad Labs, Hercules, CA) jak bylo již dříve popsáno (16), a pak byly sekvencovány na zařízení pro sekvencování v plynné fázi ABI120A (perkin Elmer, Foster City, CA) spojeném s analyzátorem ABI 120A, (Perkin Elmer) vybaveným fenylthiohydantoinovou kolonou C18 2,lx250mM. Data byla analyzována užitím softwaru ABI 610 (Perkin Elmer).

io

Protilátky

Polyklonální protilátky byly připraveny imunizací králíků (Eurogentec, Seraing, Belgíum) rekombinantním rozpustným BAFF. Slezina potkanů imunizovaných stejným antigenem byla fúzována s buňkami x63Ag8.653 myšího myelomu a hybridomy pak byly testovány na BAFFspecifické IgG. Jedna z těchto protilátek, a sice 43.9, byl imunoglobulin IgG2a specificky rozpoznávající hBAFF,

Buňky byly obarveny v 50 μΐ FACS pufru (PBS, 10% FCS, 0,02% NaN₃) s 50 ng (nebo uvede20 ným množstvím) krátké formy rozpustného hBAFF značeného Flag po 20 min ve-4 °C a pak anti-FlagM2 (1 pg) a sekundární protilátkou. Monoklonální protilátka Anti-BAFF 43.9 byla použita v množství 40 pg/ml. Pro dvoubarevnou FACS analýzu byly lymfocyty periferní krve obarveny rozpustným BAFF/dlouhý značeným Flag (2 pg/ml), po kterém následovala biotinylovaná anti-Flag M2 (1/400) a PE-značený streptavidin (1/100), a nakonec buďto FITC-značená anti-CD4, anti-CD8,nebo anti-CD 19.

Proliferační test PBL

Leukocyty periferní krve byly inkubovány v96jamkových destičkách (10⁵ buněk/jamka ve

100 μΐ RPMI s 10% FCS) 72 hodin buďto bez, nebo se 2 μg/ml kozí protilátky proti lidskému μřetězci (SIGMA) nebo kontrolní F(ab')₂ a s uvedenou koncentrace nativního nebo povařeného rozpustného BAFF/dlouhý. Buňkám byl podán pulz [³H]thyroidinu (1 pCi/jamka) dalších 6 hodin a pak byly buňky sklizeny. Inkorporace [³H]thymidinu byla monitorována kapalinovým scintilačním počítačem. V některých pokusech byl rekombinantní rozpustný BAFF nahrazen buňka35 mi 293 trvale transfekovanými BAFF plné délky (nebo buňkami 293 divokého typu jako kontrola), které byly fixovány 5 minut v 1% paraformaldehydu ve 25 °C. Test byl proveden jak bylo již dříve popsáno (17). V dalších pokusech byly z PBL izolovány buňky CD 19+ pomocí magnetických perliček a zbývající buňky CD 19- byly ozářeny (3 000 rad) před rekonstitucí s buňkami CD19+, Proliferační test s sBAFF byl proveden stejně jak bylo popsáno výše.

Test aktivace B-lymfocytů

Purifikované B-lymfocyty byly aktivovány v systému EL-4 kultury, jak bylo již popsáno dříve (13).

Stručně popsáno, 10⁴ B-lymfocytů bylo smícháno s 5 x 10⁴ ozářených buněk z thymu myši (klon B5) a kultivováno 5 až 6 dnů ve 200 μΐ média obsahujícího 5 %(obj.) supematantu z kultury lidských T-lymfocytů (10⁶/ml), které byly aktivovány 48 hodin PHA (1 pg/ml) nebo PMA (1 ng/ml). B-lymfocyty pak byly znovu izolovány pomocí anti-CD19 perliček a kultivovány dalších 7 dnů (5 x 10⁴ bunčk ve 200 μΙ/dvě nebo tri opakování kultury na 96jamkových destičkách s plochým . dnem) v samotném médiu nebo v médiu s 5% supematantem T-lymfocytů, nebo s 50 ng/ml IL-2 (dar od Glaxo Institute for Molecular Biology, Geneva) a 10 ng/ml IL-4 a IL—10 (Peprotech, London, UK), a sice za přítomnosti nebo absence sBAFF. Protilátka anti-Flag M2 byla přidána

-14CZ 299819 B6 v koncentraci 2 pg/ml a sama neměla žádný účinek. IgM, IgG a IgA byly kvantitativně stanoveny v supematantech z kultur metodou ELISA, jak již bylo popsáno (13).

Lidský BAFF byl identifikován jakožto možný nový člen rodiny TNF ligandů na základě sek5 venční homologie screeningem veřejně přístupných databází užitím zlepšeného vyhledávacího profilu (18). CDNA kódující úplný protein velikosti 285 aminokyselin (aa) byla získána kombinací EST klonů (pokrývajících 3'-koncový úsek) s fragmenty amplifikovanými pomocí PCR(5koncový úsek). Absence signálního peptidu vede k domněnce, že BAFF je membránový protein typu Π, což je typické pro ligandy rodiny TNF. Protein má predikovanou cytoplazmatickou io doménu 46 aa, hydrofobní transmembránový úsek a extracelulámí doménu z 218 aa obsahující dvě potenciální místa pro N-glykosylaci (viz obr. 1A). Sekvence extracelulámí domény BAFF vykazuje nejvyšší homologíi s APRÍL (33% aminokyselinová identita, 48% homologie), zatímco identita s ostatními členy rodiny jako je TNF, FasL, LTa, TRAIL nebo RANKL je menší než 20% (viz obr. 1B, C). Myší klon cDNA izolovaný z knihovny ze sleziny kóduje mírně delší pro15 tein (309 aa) obsahující inzerci mezi transmembránovým úsekem a prvním z několika β-řetězců, které vytvářej í vazebnou doménu pro receptor u všech členů rodiny TNF ligandů (19). Tato ektodoména bohatá na β-řetězce je téměř identická u myšího a lidského BAFF (86% identita, 93% homologie), což ukazuje, že gen BAFF je v evoluci silně konzervativní (viz obr. 1A).

Ačkoliv členy TNF rodiny jsou syntetizovány jakožto ligandy vložené do membrány, často je pozorováno štěpení v oblasti „stonku“ mezi transmembránovou doménou a vazebnou doménou pro receptor. Tak např. TNF nebo FasL jsou odštěpeny z buněčné povrchu působením metaloproteináz(20, 21). Při produkci různých forem rekombinantního BAFF v buňkách 293T bylo zjištěno, že rekombinantní rozpustná forma BAFF velikosti 32 kDa (aa 83-285, sBAFF/dlouhý), obsahující kromě vazebné domény pro receptor úplný úsek stonku a N-koncovou značku Flag, byla extenzívně opracovávána na malé fragmenty 18 kDa (viz obr. 2A, B). Ke štěpení docházelo v úseku stonku, neboť fragmenty byly detekovatelné pouze protilátkami namířenými proti kompletní doméně interakce s receptorem, ale nikoliv anti-Flag protilátkami (data nejsou ukázána). Bylo také zjištěno, že pouze N-124 (lokalizovaný v úseku stonku) byl glykosylován, a nikoliv

N242 (lokalizovaný na počátku F-β-li stu), jelikož molekulová hmotnost neopraco váného sBAFF/dlouhý byla snížena ze 32 kDa na 30 kDa odstraněním N-vázaných cukrů po ošetření PNGázou F, zatímco vyštěpený 18 kDa fragment byl k tomuto působení necitlivý. Analýza sekvence peptidu 18 kDa skutečně ukázala, že ke štěpení dochází mezi R133 a A134 (obr. 1A). R133 leží na konci polybazického úseku, který ke konzervativní pro člověka (R-N-K-R) a myš (R-N-R-R). K otestování toho, zda štěpení nebylo pouhým artefaktem při expresi rozpustné, přirozeně se nevyskytující formy BAFF, byl BAFF plné délky, vázaný na membránu, exprimován v buňkách 293T (obr. 2C). Úplný BAFF velikosti 32 kDa a také několik molekul s vyšší, molekulovou hmotností (zřejmě šlo o nedisociované dimery a trimery) bylo pozorováno v buněčných extraktech, ale více než 95 % BAFF získaného ze supematantů odpovídalo opraco40 váné formě velikosti 18 kDa, což ukazuje, že BAFF je opracováván i když je syntetizován jako ligand vázaný na membránu.

Byl zkonstruován rozpustný BAFF (Q136-L285, sBAFF/krátký), jehož aminokyselinová sekvence začíná 2 aa „downstream“ od místa štěpení (obr. 1B). Jak bylo predikováno, Flag-značka navázaná na N-konec této rekombinantní molekuly nebyla odstraněna (data neuvedena), což umožnilo její purifikaci užitím afinitní kolony s anti-Flag. Pro ověření správného složení (prostorové struktury) byl puntíkovaný sBAFF/krátký analyzován gelovou filtrací, kdy se eluoval protein se zjevnou molekulovou hmotností 55 kDa (obr. 2D). To, že sBAFF/krátký se správně uspořádal do homotrimeru (3 x 20 kDa) je v souladu s kvartémí strukturou ostatních členů

TNF rodiny (19). Nakonec neopracovaný sBAFF/dlouhý byl lehce exprimován v baktériích, což ukazuje, že štěpení je specifické pro eukaryotické buňky.

Northemová analýza BAFF ukázala, že BAFF mRNA velikosti 2,5 kb se vyskytovala ve velkém množství ve slezině a PBL (obr. 3 A). V thymu, srdci, placentě, tenkém střevu a plicích byla jen slabá exprese. Tato omezená distribuce vede k předpokladu, že buňky v lyrofatických tkáních

-15CZ 299819 B6 jsou hlavním zdrojem BAFF. Pomocí PCR analýzy bylo zjištěno, že BAFF mRNA je přítomna v T-lyrofocytech a dendritických buňkách pocházejících z monocytů periferní krve, ale není v B-lyrofocytech (obr. 3B). Dokonce naivní, nestimulované T-lymfocyty exprimují alespoň nějakou BAFF mRNA.

V databázi bylo nalezeno místo se sekvenční adresou („sequence tagged sítě“, STS, SHGC36171) obsahující lidskou sekvenci BAFF. Toto místo leží na lidském chromozómu 13, v intervalu délky 9 cM mezi markéry D13S286 a D13S1315. Na cytogenetické mapě tento interval odpovídá 13q32—34. Ze známých členů rodiny TNF ligandů byl pouze RANKL (Trance) lokalizován na tomto chromozómu (22), i když značně vzdálen od BAFF (13q 14).

Aby mohl ligand maximálně projevit své biologické účinky, je pravděpodobné, že receptor BAFF(BAFF-R) bude exprimován na stejných nebo sousedních buňkách přítomných v lyrofatické tkáni. Užitím rekombinantního sBAFF jakožto nástroje ke specifickému stanovení exprese

BAFF-R pomocí FACS byly skutečně zjištěny vysoké hladiny exprese receptoru v různých liniích B-lymfocytů jako jsou buňky Ráji Burkittova lymfomu a buňky BJAB (obr. 4A, tab. 1), Naproti tomu buněčné linie T-Iymfocytů, fibroblastového, epitelového a endotelového původu, byly všechny negativní. Velmi slabé obarvení bylo pozorováno u linie monocytů THP-1, což však může být způsobeno vazbou na Fc receptory. Takže se zdá, že exprese BAFF-R je omezena na linie B-lymfocytů. Dvě testované , myší linie B-lymfocytů byly negativní při užití lidského BAFF jako sondy, ačkoliv slabá vazba byla pozorována u myších splenocytů (data neuvedena). Přítomnost BAFF-R na B-lymfocytech byla podpořena analýzou lymfocytů periferní krve a pupečníkové krve. Zatímco T-lymfocyty CD8+ a CD4+ postrádají BAFF-R (obr. 4B, ostatní data neuvedena), silné obarvení bylo pozorováno na B-lymfocytech CD 19+ (obr. 4A a 4B), což ukazuje, že BAFF-R je exprimován na všech B-lymfocytech v krvi, včetně naivních a paměťových B-lymfocytů.

Jelikož je BAFF vázaný na B-lymfocyty pocházející z krve, byly provedeny pokusy ke zjištění, zdaje ligand schopen přenášet signály pro stimulaci nebo inhibici růstu. Lymfocyty periferní krve (PBL) byly stimulovány anti-IgM (μ) protilátkami společně s fixovanými buňkami 293 trvale exprimujícími povrchový BAFF (obr. 5A). Hladina inkorporace [³H]thyroidinu indukovaná samotnou antí-μ se nezměnila v přítomnosti kontrolních buněk, ale byla dvakrát zvýšena v přítomnosti buněk transfekovaných BAFF (obr. 5B). Byla pozorována také na dávce závislá proliferace B-lymfocytů, když byly buňky transfekované BAFF nahrazeny purifikovaným sBAFF (obr. 5C), což ukazuje na to, že BAFF nevyžaduje uchycení v membráně, aby mohl projevit svou aktivitu. V tomto experimentálním uspořádání proliferace indukovaná sCD40L vyžadovala koncentrace přesahující 1 pg/ml, ale byla méně závislá na přítomnosti anti-μ, než zprostředkovaná BAFF (obr. 5D). Když byly purifikovaňé B-lymfocyty CD 19+ kokultivovány s ozářenými autologními CD19-PBL, kostimulace proliferace nebyla BAFF ovlivněna, což uka40 zuje, že příjem [³H]thymidinu byl způsoben hlavně proliferací B-lymfocytů a nikoliv nepřímou stimulací buněk jiného typu (data neuvedena). Pozorovaná odpověď proliferace B-lymfocytů na BAFF byla plně závislá na přítomnosti anti-μ protilátek, což ukazuje, že BAFF působí jako kostimulátor proliferace B-lymfocytů.

Pro výzkum možných účinků BAFF na sekreci imunoglobulinu byly purifikovaňé B-lymfocyty z periferní krve nebo pupečníkové krve preaktivovány kokultivací s T-lymfocyty EL-4 v přítomnosti směsí cytokinů ze supematantu T-lymfocytů stimulovaných PHA/PMA (23). Tyto B-lymfocyty byly znovu izolovány v čistotě 98 % a v přítomnosti BAFF a cytokinů z aktivovaných T-lymfocytů vykazovaly dvojnásobné zvýšení v sekreci Ig v sekundární kultuře so při srovnání s cytokiny samotnými. Velmi slabý účinek byl pozorován v nepřítomnosti exogenních cytokinů, a mírný účinek (1,5 x) byl pozorován v přítomnosti rekombinantních cytokinů 1L2JL-M a IL-10 (obr. 5E, F).

Biochemická analýza BAFF je také v souladu s typickou homotrimemí strukturou členů TNF rodiny. BAFF vykazuje nejvyšší homologii v této rodině ligandů s APRÍL, který byl nedávno původci charakterizován jako ligand stimulující růst různých nádorových buněk (11). Na rozdíl od TNF a LTp, což jsou členové se stejně velkou homologií (33 %) a jejichž geny jsou na chromozómu 6, APRÍL a BAFF nejsou shromážděny na stejném chromozómu. APRÍL je lokalizován na chromozómu 17 (J.L.B., nepublikováno) a BAFF leží na distálním ramenu chromozómu 13 (13q34). Abnormality v tomto lokusu byly charakterizovány u Burkittova lyrofomu jako druhý nejčastější defekt (24) vedle translokace genu myc do Ig lokusu (25). Vezme-li se v úvahu vysoká hladina exprese BAFF-R na všech analyzovaných buněčných liniích Burkittova lymfomu (viz tab. 1), vyvolává to zajímavou možnost, že u některých Burkittových lymfomů mohlo dojít k deregulaci exprese BAFF a tím ke stimulaci růstu autokrinním způsobem.

io

Role B-lymfocytů specifických k antigenu v průběhu různých stadii imunitní reakce je silně závislá na signálech od pomocných T-lymfocytů a antigen prezentujících buněk, jako jsou dendritické buňky, a kontaktech s nimi (20). B-lymfocyty dostávají tyto signály nejdříve na počátku nebo v průběhu imunitní reakce, kdy vstupují do interakce s T-lymfocyty na okrajích folikulů B15 lymfocytů v lymfatických tkáních, což vede k jejich protiferaci a diferenciaci na buňky vytvářející protilátky s nízkou afinitou (18). Současně některé antigenně-specifické B-lymfocyty také migrují do folikulů B-lymfocytů a přispívají tak k vytváření germinálních center, dalších míst, kde B-lymfocyty proliferuj í, ale také afinitně dozrávají a vytvářejí paměťové B-lymfocyty a vysokoafinitní plazmatické buňky (19).

Bylo prokázáno, že signály spouštěné dalším členem rodiny TNF, a sice CD40L, jsou kritické pro funkci B-lymfocytů v mnohých krocích imunitní reakce závislé na T-lymfocytech. Avšak několik studií jasně ukázalo, že interakce CD40L/CD40 nezodpovídá za všechnu pomoc pro Blymfocyty ze strany na kontaktu závislých T-lymfocytů. A skutečně, T-lymfocyty deficitní na

CD40L izolované z “knock-out“ myší (s vyřazenou funkcí příslušného genu) nebo pacientů s syndromem hyper-lgM vázaným na X byly schopny úspěšně indukovat proliferaci B-lymfocytů a jejich diferenciaci na plazmatické buňky. Studie s užitím blokujících protilátek proti CD40L ukázaly, že podskupina B-lymfocytů pozitivních na povrchový IgD, izolovaných z lidských tonsil, proliferuje a diferencuje se v reakci na aktivované T-lymfocyty, a to způsobem nezávislým na CD40. Bylo ukázáno, že i další členy TNF rodiny, jako je např. TNF vázaný na membránu a CD30L, se podílejí na stimulaci B-lymfocytů nezávislé na CD40 a povrchových. Ig. Podobně jako výsledky s BAFF, bylo také ukázáno, že B-lymfocyty deficitní na CD40 mohou být stimulovány k proliferaci a diferenciaci na plazmatické buňky pomocnými T-lymfocyty, dokud jsou současně spouštěny povrchové Ig receptory. BAFF stejně jako CD30L a CD40L je exprimován T-lymfocyty, ale jeho originalita spočívá v expresi dendritickými buňkami a také ve vysoce specifické lokalizaci receptoru BAFF na B-lymfocytech, na rozdíl od CD40, CD30 a TNF receptorů, jejich exprese byla popsána u mnoha různých buněk. Tato pozorování podporují nezávislou a specifickou funkcí na B-lymfocytech indukovanou BAFF.

Bylo zjištěno, že BAFF kostimuluje proliferaci B-lymfocytů z krve a současně zesíťuje receptory B-lymfocytů, a to nezávisle na CD40 signalizaci, což podporuje úlohu BAFF v indukci růstu a zrání B-lymfocytů indukovaných T-lymfocyty a dendritickými buňkami. Kromě toho při použití B-lymfocytů pozitivních na CD 19 diferencujících se in vitro na preplazmatické buňky/GCpodobné B-lymfocyty (14) byl pozorován kostimulační účinek BAFF na sekreci Ig B-lymfocyty v přítomnosti supematantu z aktivovaných T-lymfocytů nebo směsi IL-2, IL-4 a IL-10. Je zajímavé, že kostimulační účinek byl silnější v přítomnosti supematantu zaktivovaných T-lymfocytů než v přítomnosti směsi cytokinů, což vede k představě, jsou zde další rozpustné faktory secemované aktivovanými T-lymfocyty, které se podílejí na produkci protilátek se synergickým účinkem s BAFF nebo BAFF samotného. Je tudíž možné, že BAFF aktivně přispívá k diferen50 ciaci těchto GC-podobných B-lymfocytů na plazmatické buňky.

Je jasné, že BAFF poskytuje in vitro signál jak naivním B-lymfocytům, tak i GC-určeným Blymfocytům. Zda se toto pozorování projevuje v průběhu normální imunitní reakce nebo ne, je třeba vyzkoumat ve vhodných in vivo experimentech.

.

- 17 CZ 299819 B6

Biologické reakce indukované BAFF u B-lymfocytů jsou odlišné od reakcí na CD40L, neboť proliferace vyvolaná CD40L je méně závislá na kostimulaci anti-μ (17) (viz také obr. 5D). Kromě toho CD40L může působit proti apoptickým signálům v B-lyrofocytech po interakci s receptory B-lymfocytů (29), zatímco BAFF není schopen zachránit B-lymfocyty linie Ramos od apoptózy zprostředkované anti-μ, přestože buňky Ramos exprimují BAFF-R (tab. 1; F. M. a J. L. B,, nepublikovaná pozorování). Je tudíž pravděpodobné, že CD40L a BAFF plní odlišné funkce. V této souvislosti stojí za povšimnutí, že BAFF nereaguje s žádným ze 16 testovaných rekombinantních receptorů rodiny TNF včetně CD40 (P. S. a J. T., nepublikovaná pozorování),

Růst B-lymfocytů byl účinně kostimulován rekombinantním rozpustným BAFF postrádajícím transmembránovou doménu. Tato aktivita byla v kontrastu s několika jinými členy rodiny TNF, které jsou aktivní pouze jako lígandy vázané na membránu jako např. TRAIL, FasL a CD40L. Rozpustné formy těchto ligandů mají malou biologickou aktivitu, která může být zvýšena jejich zesítěním, což napodobí ligandy vázané na membránu (15), Naproti tomu zesítění Flag-znacené15 « ho sBAFF s anti-Flag protilátkami nebo použití membránově vázaného BAFF epxrimovaného na povrchu epitelových buněk nezvyšuje již mitogenní aktivitu BAFF, což naznačuje, že působí systémově jako secemovaný cytokin, podobně jako TNF. To je v souladu s pozorováním, že polybazická sekvence přítomná ve „stonku“ BAFF působí jako substrát pro proteázy. Podobné polybazické sekvence se také vyskytují v odpovídající lokalizaci jak APRÍL, tak TWEAK, pri20 tom pro oba existují důkazy o proteolytickém opracování proteinu (30) (N. H. a J. T., nepublikovaná pozorování). Přestože proteáza zodpovědná za takové štěpení ještě nebyla nalezena, je nepravděpodobné, že by to byla metataloproteináza zodpovědná za odštěpení membránově vázaného TNF, jelikož se jejich preferenční sekvence úplně liší (21) .Multibazické motivy v BAFF (R-N-K-R), APRÍL (R-K-R-R) a Tweak (R-P-R-R) připomínají minimální signál pro štěpení furinu (R-X-K/R-R), kterýje prototypem rodiny proproteinkonvertáz (31).

Při realizaci předkládaného vynálezu, pokud není výslovně uvedeno jinak, byly užity obvyklé metody buněčné biologie, buněčných kultur, molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie a imunologie, které jsou odborníkům známy. Tyto metody byly popsá30 ny v odborné literatuře. Viz např. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent 4,683,195 (Mullis et al.); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.),

1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Cells and Enzyroes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzyroology, Volumes 154 and 155 (Wuetal., eds), Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors foř Mámmalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos, eds,), T987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and

Walker, eds.), Academie Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu a nijak předkládaný vynález neomezují.

Příklady provedení vynálezu

V příkladech l až 6 byly použity experimentální postupy, které budou v následující části popsá50 ny.

Konstrukt DNA pro přípravu transgenní myši s myším BAFF (BAFF Tg myš)

Jak lidská tak i myší sekvence cDNA byty již popsány (Schneider et al., 1999), PCR fragment kódující úplný myší BAFF byl připraven metodou RT-PCR. První řetězec cDNA byl syntetizo-18CZ 299819 B6 ván z polyA+ RNA z plic myši (Clontech, Palo Alto, CA) užitím oligo dT podle pokynů výrobce (GibcoBRL, Grand Island, NY). Reakční směs pro obsahovala 1 x pfu buffer (Stratagene, La Jola, CA), 0,2 mM dNTPs, 10% DMSO, 12,5 pM primeiy, 5 jednotek Pfu enzyrou (Stratagene) a následující oligonukleotidové primery obsahující restrikční místo Notí:

5-TAAGAATGCGGCCGCGGAATGGATGAGTCTGCAAA-3' [SER. ID. Č. 19] a 5'~TAAGAATGCGGCCGCGGGATCACGCACTCCAGCAA-3' [SEK. ID. Č. 20].

Templát byl amplifikován ve 30 cyklech: 94 °C, 1 minuty, 54 °C, 2 minuty a 72 °C, 3 minuty, po kterých následovala 10 minut extenze ve 72 °C. Tato sekvence odpovídá nukleotidům 214 až ío 1171 sekvence AF119383 v GenBank, PCR fragment byl štěpen enzymem Notí a pak klonován do modifikovaného vektoru pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fragment obsahující myší BAFF byl vyštěpen enzymem Xbal, aby bylo možné vložit sekvenci polyA místa z SV40. Tento fragment byl pak klonován vektoru založeného na pUC, kam byla připojena také promotorová sekvence. Promotor, tupý fragment BglII-Notl obsahující lidský ApoE enhancer a promotor AAT (alfa anti-trypsin) byl purifíkován z plazmidu klonu 540B (laskavý dar od Dr. Katherine Parker ponder, Washington University, St. Louis, MO). Fragment EcoRV/BglII byl purifíkován z výsledného vektoru a použit k vytvoření transgenní myši. Injikované potomstvo myší z křížení samice CS7BL6J x samec DBA/2J FI (BDFr) bylo zpětně kříženo s myšmi CS7BL/6. Techniky mi kro injekcí a příprava transgenních myší byly již dříve popsány (Mcknights et al, 1983).

Analytické metody

Vzorky séra byly analyzovány redukující SDS-PAGE na lineárním 12,5% gelu. Celková RNA z myších jater byla připravena a analyzována Northemovým přenosem užitím izolační soupravy od firmy promega (Madison, WI) podle pokynů výrobce. mRNA specifická pro transgen BAFF byla detekována užitím sondy zahrnující SV40 polyA konec transgenního konstruktu a byla získána štěpením modifikovaného vektoru pCEP4 Xbal a BamHI. Sonda rozpoznávala pás velikosti 1,8 až 2 Kb odpovídající mRNA transgenu BAFF. PCR analýza DNA z ocasu BAFF Tg myši (myš transgenní na BAFF) byla provedena užitím 12,5 pM následujících oligonukleotido30 vých primerů:

5’-OČAGTTTCACAGCGATGTCCT-3' [SEKVENCE ID. Č. 21] a 5'-OTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3' [SEKVENCE ID. Č. 22] v reakci obsahující IX Taq polyroerázový pufr (Stratagene), 0,2 nm dNTPs, 10% DMSO a 5 jednotek Taq polymerázy (Stratagene). Úsek 719 bp z transgenu byl amplifikován v 35 cyklech:

94 °C, 30 sekund, 54 °C, 1 minuta a 72 °C, 1,5 minuty, následovaných extenzí 10 minut v 72 °C.

Přítomnost proteinu v moči myší byla měřena užitím detekčních proužků Multistix 10 SG pro analýzu moči (Báyer Corporation, Diagnostics Division, Elkhart, IN).

Analýza „Cell-dyne“ a cytofluorimetrická analýza (FACS)

Diferenciální počty bílých krvinek (WBC) v čerstvé krvi s EDTA jako antikoagulans byly stanoveny užitím zařízení Abbott Cell Dyne 3500 (Chicago, II.). Pro FACS analýzu byly použity potkanní anti-myší protilátky značené fluoresceinem (FITC), Cy-chrom- a ťykoerythrinem (PE):

anti-B220, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD43, anti~lgM, anti-CDS, anti-CD2S, anti-CD24, antiCD38, anti-CD21, anti-CD44, anti-L-selektin a souprava křečci anti-Bcl-2/kontrolní křečěí Ig byl zakoupen od firmy Pharmingen (San Diego, CA).

Příprava myších a lidských BAFF značených Flag v rekombinantních £. coli nebo savčích buň50 kách byla již dříve popsána (Schneider et al., 1999). Všechny protilátky byly použity podle instrukcí výrobce: PBL byly purifíkovány z krve myší následujícím postupem: Krev byla odebrána do mikrozkumavek obsahujících EDTA a 1/2 naředěna PBS. 500 μΐ naředěné krve se pak naneslo na vrchol 1 ml Ficollu (Celardane, Homby, Ontario, Canada) ve 4ml skleněných kyvetách a gradient byl připraven při 2000 rpm po 30 minut při teplotě místnosti, mezifáze obsahující lymfocyty byla odebrána a dvakrát promyta PBS před barvením pro FACS.

-19CZ 299819 B6

Slezina, kostní dřeň a mezenterické lymfatické uzliny byly rozdrceny na suspenze jednotlivých buněk v médiu RPMI (Life Technologies, lne., Grand Island, NY) promyty pufrem FACS (PBS s 2% fetálním telecím sérem (JRH Bioscienees, Lenexa, KS)). Buňky byly nejdříve resuspendo5 vány ve FACS pufru doplněném o následující blokující činidla: 10 pg/ml lidského Ig (Sandoz, Basel, Switzerland) a 10 qg/ml anti-myší Fc blokující protilátky (Pharm in gen), a pak inkubovány 30 minut na ledu před barvením pomocí fluorochromem značených protilátek. Všechny protilátky byly naředěny FACS pufrem s blokujícími činidly popsaným výše. Vzorky byly analyzovány cytofluorometrem FACScan (Becton Dickinson).

Detekce celkového Ig myší a revmatoidního faktoru v myším séru pomocí ELISA testu

ELISA destičky (Corning glass works, Corning, NY) byly potaženy kozí protilátkou anti-myší celkový Ig (Southem Biotechnolog Associates, lne. Birmirigham, AL) při inkubaci přes noc ve

4 °C v roztoku 10gg/ml této protilátky v 50mM bikarbonátovém pufru pH 9,6. Destičky byly třikrát opláchnuty v PBS/0,1% Tween a blokovány inkubací přes noc v 1% roztoku želatiny v PBS. Na destičku se přidalo 100 μΙ/jamka sériového nebo standardního ředění séra na 30 minut při 37 °C, Myší Ig byl detekován užitím 100 μΙ/jamka roztoku 1 gg/ml protilátky anti-myší celkový Ig značené alkalickou fosfatázou (AP) (Southem Biotechnolog Associates, lne. Birming20 ham; ÁL). Po třech opláchnutích v PBS/0,1% Tween byla vyvolán enzymatická reakce užitím 10pg/ml p-nitrofenylfosfátu (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) v 10% diethanolaminu. Reakce byla zastavena přidáním 100 μΐ 3N NaOH/jamka. Optická denzita (O.D.) byla měřena při 405 nm spektrofotometrem od firmy Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Standardní křivky byly připraveny pomocí purifikovaného myšího Ig získaného od firmy Southem Biotechnology

Associates. V případě detekce revmatoidního faktoru (RF) byly destičky potaženy normálním kozím Ig Ig (Jackson ImmunoResearch laboratories, lne., West Grove, PA) místo kozího antimyšího Ig a detekce myšího Ig byla provedena stejně jak bylo popsáno výše. Detekce isotypů myších Ig v testu RF byla provedena užitím AP-značených protilátek proti myšímu IgA, IgM, IgG2a, IgG2b a IgG3, a standardní křivky byly připraveny pomocí purifikovaných myších IgA,

IgM, IgG2a, IgG2b a IgG3 (Southern Biotechnology Associates lne.). Všechna statistická srovnání byla provedena analýzou rozptylu.

Detekce cirkulujících imunitních komplexů (CIC) a precipitace kiyoglobulínů v myším séru

Test byl proveden postupem již dříve publikovaným (Juneetal.,' 1979; Singh a Tingle, 1982) s následujícími modifikacemi:

ELISA destičky (Corning glass works) byly potaženy inkubací přes noc ve 4 °C v roztoku s 5 μΙ/ml lidské Clq (Quidel, San Diego, CA) v 50mM bikarbonátovém pufru s pH 9,6. Destičky byly 3x opláchnuty PBS/0,1% Tween. Bylo přidáno 50 μΙ/jamka 0,3 M EDTA a 50 μΙ/jamka sériového ředění séra nebo roztoku se známou koncentrací standardního imunitního komplexu („peroxidáza-anti-myší peroxidáza“ (PAP) od firmy DAKO (Carpinteria, CA). Destičky pak byly inkubovány 30 minut ve 37 °C. Pak byly 3x opláchnuty v PBS/0,1% Tween. Myší Ig v imunitních komplexech byl detekován užitím 100 μΙ/jamka roztoku 1 μg/ml protilátky anti45 myší Ig značené alkalickou fosfatázou (AP) (Southem Biotechnolog Associates, lne. Birmingham, AL) jak bylo již výše popsáno pro ELISA test. Kryoglobuliny byly detekovány inkubací myšího séra naředěného 1/15 vodou ve 4 °C přes noc a precipitáty byly hodnoceny vizuálně.

Testy na protilátky proti dvouřetězcové DNA (dsDNA) a jednořetězcové DNA (ssDNA)

Testy na anti-ssDNA byly provedeny užitím destiček NUNC-ImmunoPlate MaxiSorp plates (NUNC A/S, Denmark). Destičky byly přes noc ve 4 °C potaženy nejdříve 100 qg/ml methylovaného BSA (Calbochem Corp., La Jolla, CA), pak 50 pg/ml DNA z telecího thymu čistoty I. stupně (Sigma, St. Louis, MO). DNA z telecího thymu byla nejdříve fragmentována sonikací a

-9Ω CZ 299819 B6 pak před použitím naštěpena Sl nukleázou. Pro test na anti-ssDNA byla DNA povařena 10 minut a pak schlazena na ledu. Po blokování bylo přidáno sériové ředění vzorků séra a destičky se inkubovaly 2 hodiny při teplotě místnosti. Autoprotilátky byly detekovány pomocí kozí anti-myší IgG-ΑΡ (Sigma) a reakce byla detekována stejně jak bylo popsáno výše pro ELISA test. Standardní křivky byly získány užitím známého množství monoklonální protilátky antiDNA 205, která je specifická jak pro ssDNA tak i dsDNA (Datta et al., 1987).

Immunohistochemie io Slezina a lymfatické uzliny byla zmrazený v zalévacím médiu O.C.T. (Miles, Elkhart, IN) a nařezány v kryotomu. Řezy o tloušťce 7 až 10 pm byly usušeny a fixovány v acetonu. Všechny inkubace s protilátkami (pg/ml) byly prováděny 1 hodinu při teplotě místnosti ve zvlhčované komoře po naředění v roztoku TBS-A (0,05M Tris, 0,15MNaCt, 0,05% (obj.) Twéen-20, 0,25% BSA), opláchnuty TBS-B (0,05M Tris, 0,15MNaCl, 0,05% Tween-20) a fixovány 1 minutu v metha15 nolu před zahájením enzyroatické reakce. Aktivity křenové peroxidázy (HRP) a alkalické fosfatázy (AP) byly vyvinuty užitím substrátových tablet diaminobenzidinu (DAB) (Sigma) a 5bromo-4-chloro-3-indolylfosfát/tetrazoliová nitromodř (BCIP/NBT, Pierce, Rockford, IL). Obarvené řezy byly nakonec fixovány 5 minut v methanolu a obarveny Giemsovým barvením (Fluka, Buchs, Switzerland). Biotinem značené potkanní protilátky anti-B220, anti-CDllc, anti20 syndekan-1 a neznačené potkanní protilátky anti-CD4, anti-CD8a a anti-CD8p byly zakoupeny od firmy Pharmingen, Biotinem značený aglutinin zpodzemnice olejně (PNA) byl získán od Vector Laboratories (Burlingame, CA). (HRP)-značená myší anti-potkanní lg a (HRP)-streptavidin byly zakoupeny od Jackson ImmunoResearch Laboratories, lne. a AP-značený streptavidin od Southern Biotechnology Associates, lne. V případě imunohistoehemické analýzy ledvinné tkáně na detekci depozitů lg byly použity parafinové řezy, po odstranění parafinu byly blokovány užitím naředěného koňského séra od firmy Vector (Burlingame, CA), a pak obarveny kozí anti-. myší lg s HRP od Jackson Immunoresearch. Detekce byla provedena stejně jak bylo popsáno výše,

Příklad 1

BAFF transgenní (BAFF Tg) myši zakladatelské generace mají abnormální fenotyp.

V transgenních myších byl exprimován myší BAFF plné délky užitím promotoru alfa-1 antitrypsinu specifického pro játra se zesilovačem ApoE. Verze s plnou délkou byla vybrána S očekáváním, že BAFF bude buďto štěpen a působit systémově, nebo se udrží ve formě vázané na membránu, takže bude možné pozorovat abnormality na játrech^ což by mohlo poskytnout vodítko k funkci. Bylo získáno 13 zakladatelských pozitivních myší s transgenem BAFF (viz tab. 2). Čtyři z těchto myší uhynuly jako mladé. Rutinní patologické vyšetření bylo provedeno na myších č. 811 a 816 (tab. 2). U těchto myší nebyly patrny žádné příznaky infekce, avšak byly pozorovány kardiovaskulární a renální abnormality obdobné změnám pozorovaným při silné hypertenzi (Fu, 1995) (tab. 2). Řezy tkáně ledvin barvené hematoxylinem a eosinem (H&E-barvení) z myši 816 ukázaly, že morfologie glomerulů u této myši byla abnormální, zatímco zbytek ledvinné tkáně byl normální (data neuvedena). Mnohé z BAFF transgenních myší měly proteinurii (Tab. 2), Imunohistoehemické vyšetření zmražených řezů sleziny z myši 816 ukázalo abnormální a extenzivní barvení B-lymfocytů a redukované barvení T-lymfocytů a toto pozorování bylo potvrzeno i u potomstva (viz dále a obr. 12).

Užitím dvoubarevné FACS analýzy byl vypočten poměr % B-lymfocytů pozitivních na B220 k % T-lymfocytů pozitivních na CD4. Tento poměr byla 2 až 7 x vyšší u zakladatelských BAFF transgenních myší než u kontrolních BDF1 negativních myší (tab. 2), což znamená nárůst populace B-lymfocytů u BAFF Tg myší, Bylo vybráno 9 z těchto zakladatelských myší k vytvoření různých linií transgenních myší (tab. 2). Žádná ze zbývajících zakladatelských BAFF Tg myší ani z potomstva žádné známky špatného zdravotního stavu měsíce po uhynutí zakladatelští CZ 299819 B6 kých myší č. 696, 700, 811 a 816, takže možné vysvětlení je, že tyto 4 myši exprimovaly vyšší hladiny BAFF, což mohlo způsobit jejich uhynutí. Nadměrní exprese („overexpression“) v játrech byla potvrzena Northemovou analýzou (data neuvedena). U všech BAFF Tg myší vyšetřených histologicky nevykazovala játra žádné abnormality, což ukazuje, že lokální nadměr5 ná exprese BAFF nevyvolává žádné imunologické nebo patologické událostí. ELISA test pro myší BAFF nebyl k dispozici, avšak původci ukázaly, že 2 % sérum z BAFF Tg myší, avšak nikoliv z kontrolních myší, blokovalo vazbu rozpustného myšího BAFF značeného Flag a pocházejících ze savčích buněk na buňky BJAB. Kromě toho 5% sérum z BAFF Tg myší, avšak nikoliv z kontrolních myší, zvyšovalo proliferaci lidských B-lymfocytů z PBL v přítomnosti anti-μ (data neuvedena). Na základě těchto údajů lze odvodit, že v krvi BAFF Tg myší je přítomno podstatné množství rozpustného BAFF.

Příklad 2

Periferní lymfocytóza je BAFF Tg myší způsobena zvýšeným počtem B-lymfocytů

U populace transgennch myší bylo zjištěno, že mají více lymfocytů v krvi ve srovnání s kontrolními negativními zvířaty, a dosahují počtu až 13 000 lymfocytů/1 μΐ krve (obr, 7 A). Naproti tomu .počet granulocytů v 1 μΐ krve byl jak u BAFF transgenních, tak kontrolních myší v mezích normy (obr. 7A). Jelikož FACS analýza lymfocytů periferní krve (PBL) u 18 BAFF Tg myší pocházejících ze 6 různých zakladatelských BAFF Tg myší užitím protilátek antí-CD4 a antiB220 ukázala zvýšení poměru BÍT (obr, 7B a 7C), zvýšená hladina B-lymfocytů byla způsobena expanzí subpopulace B-lymfocytů. A podobně, využitím této metody, výpočty absolutních počtů cirkulujících T-lymfocytů CD4 ukázalo 50% snížení této subpopulace T-lymfocytů u BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolními zvířaty, a to samé bylo pozorováno pro subpopulaci T-lymfocytů CD8 (data neuvedena). Všechny B-z PBL BAFF Tg myší měly zvýšenou expresi MHC třídy II a Bcl-2 ve srovnání s B-lymfocyty kontrolních myší (obr. 7D a 7E), což ukazuje na jistou míru aktivace B-lymfocytů u BAFF Tg myší. T-lymfocyty v krvi BAFFTgmyŠí neexprimují časné aktivační markéry CD69 nebo CD2S, avšak 40 až 56 % T-lymfocytů CD4 nebo CD8 byly aktivované efektorové T-lymfocyty s fenotypem CD44^hl, L-selektin^l0, zatímco u kontrolních myší tento fenotyp představuje jen 8 až 12 % (obr. 7F). Takže BAFF Tg myši vykazovaly jasné příznaky B-lymfocytózy a globální aktivace B-lymfocytů společně s alteracemi T-lymfocytů.

Příklad 3

Expandované kompartmenty B-lymfócytů jsou složeny že zralých buněk

Ke zjištění toho, zda overexprese BAFF u transgenních myší byla ovlivňovala kompartment Blymfocytů centrálně v kostní dřeni a periferně v sekundárních lymfatíckých orgánech byla technikou FACS vyšetřena slezina, kostní dřeň a mezenterické lymfatické uzliny ze sedmi BAFF Tg myší a sedmi kontrolních myší pocházejících ze čtyřech různých zakladatelských myší. Kompartment zralých B-lymfocytů byl analyzován barvením oběma protilátkami anti-B220 a anti-ígM.

Dvě reprezentativní BAFF Tg myši a jedna kontrolní myš jsou ukázány na obr. 8. Kompartment zralých B-lymfocytů (IgM+, B220+) byl zvětšen jak ve slezině, tak i v mezenterických lymfatíckých uzlinách (obr. 8A, horní a spodní panel). Analýza kompartmentů B-lymfocytů B220+/IgM+ (obr. 7A, střední panel) nebo proB buněk (CD43+/B220+) a preB buněk (CD43/B220+) v kostní dřeni (obr. 8B) ukázala, že BAFF Tg myši a kontrolní myši byly podobné. Tato data ukazují, že overexprese BAFF ovlivňuje proliferaci periferních zralých B-lymfocytů, avšak nikoliv prekurzorů B-lymfocytů v kostní dřeni. FACS analýza subpopulaci B-lymfocytů ve slezině ukázala zvýšený podíl marginální zóny (MZ) B-lymfocytů u BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolními zvířaty (tabulka 3). Populace folikulámích B-lymfocytů zůstala proporcionální jak u BAFF Tg myší, tak u kontrolních myší, zatímco frakce nově vytvářených B-lymfocytů byla u

BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolou mírně zvýšena (tab. 3). Tento výsledek byl také potvrzen

-22CZ 299819 B6 na B-lymfbcytech B220+ ze sleziny užitím protilátek anti-CD3B versus anti-CD24 a anti-IgM versus anti-IgD a analýzou populace MZ B-lymfocytů na fenotyp CD3 8^h,/CD24+ a IgM^/IgD¹⁰, jak bylo již publikováno (Olíver et al., 1997) (data neuvedena). Imunohistochemická analýza užitím protilátky anti-myší IgM ukázala expanzi oblasti „IgM-bright“ MZ B-lymfocytů ve slezině BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolou (data neuvedena). Všechny B-lymfocyty B220+ z BAFF Tg myší exprimovaly vyšší hladiny MHC třídy 11 (tab. 3) a Bcl-2 (data neuvedena) ve srovnání s B-lymfocyty sleziny kontrolních zvířat, což ukazuje, že B-lymfocyty ve slezině a také B-lymfocyty z PBL jsou v aktivovaném stavu.

to

Příklad 4

BAFF Tg myši mají vyšší hladinu celkového ímunogíobulinu, revmatoidního faktoru a cirkulujících imunitních komplexů v séru

Zvětšený kompartment B-lymfocytů u BAFF Tg myší vede k předpokladu, že hladina celkových Ig v krvi u těchto myší může být také zvýšena. SDS-PAGE analýza séra z BAFF Tg myší a kontrolních zvířat ukázala, že pásy těžkých a lehkých řetězců Ig jsou přinejmenším lOx intenzivnější u 3 ze 4 BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolním séra (obr. 9A). Podobně test ELISA séra

BAFF Tg myší ukázal významně vyšší hladinu celkového Ig ve srovnání s kontrolními zvířaty (obr. 9B).

I přes vysoké hladiny pozorované v SDS-PAGE, mimořádně vysoké hladiny Ig detekované ELISA testem u některých myší, např. 697-5, 816-8-3 a 823-20, vyvolaly podezření na přítom25 nost revmatoidního faktoru (RF) v séru nebo autoprotilátek proti antigenním determinantám Fc fragmentu Ig (Jefferis, 1995). Tyto protilátky mohou vázat kozí anti-myší Ig použitý k potažení ELISA destiček a dávat tudíž chybně vysoké hodnoty. ELISA destičky byly proto potaženy normálním irelevantním kozím Ig a vazba Ig z BAFF Tg myši na normální kozí Tg byla měřena. Obr. 9C ukazuje, že sérum z většiny BAFF Tg myší obsahuje Ig reagující s normálním kozím Ig, zatímco pouze 2 z celkem 19 kontrolních myší vykazovaly reaktivitu ve stejném testu. Tyto RF byly hlavně protilátky isotypu IgM, IgA a IgG2a (data neuvedena).

Přítomnost RF může být spojena s přítomností vysokých hladin cirkulujících imunitních komplexů (CIO) a kryoglobulinů v krvi (Jefferis, 1995). K ověření toho, zda BAFF Tg myši mají či nemají abnormální hladiny CIC v séru, byl u 21 BAFF Tg myší analyzovaných: výše pro detekci CIC užit vazebný test založený na Clq. Pouze 5 BAFF Tg myší mělo významně vyšší hladiny CIC ve srovnání s kontrolními myšmi, nicméně tato zvířata odpovídala těm, která měla nejvyšší hladiny celkového Ig a revmatoidního faktoru (obr. 9D).^: Bylo také pozorováno vytváření precipitátů, když bylo sérum z BAFF Tg myší naředěno 1/15 vodou, na rozdíl od séra kontrolních myší, což ukazuje na přítomnost kryoglobulinů u těchto myší (data neuvedena). Takže kromě hyperplázie B-lymfocytů vykazují BAFF Tg myši také silnou hyperglobulinémii spojenou s výskytem RF a CIC.

Příklad 5

Některé BAFF Tg myši mají vysoké hladiny autoprotilátek proti jednořetězcové (ss) DNA a proti dvouřetězcové (ds) DNA

Na počátku byly pozorovány abnormality ledvin připomínající nemoc jako lupus u dvou ze čtyřech zakladatelských myší (viz tab. II). Přítomnost anti-DNA protilátek byla popsána také u pacientů se SLE nebo u myší s nemocí podobnou SLE (SWRxNZB)Fl (SNF1) myší (Dattaet al., 1987). Hladina anti-ssDNA protilátek byla detekována u BAFF Tg myší, u kterých byla před tím nalezena nej vyšší hladina celkového Ig v séru (obr. 10 A). Bylo analyzováno sérum dvou

BAFF Tg myší negativních na protilátky proti ssDNA'(697-5 a 816-1-1) a tří transgenních myší

-23CZ 299819 Bó secemujících protilátky anti-ssDNA (820-14, 816-8-3 a 820-7) na přítomnost protilátek antidsDNA současně s pěti kontrolními zvířaty. BAFF Tg myši secemovaly také antí-dsDNA protilátky, avšak hladiny sekrece ne vždy korelovala s hladinou protilátek anti-ssDNA, jako např. v séru BAFF Tg myši č. 697-5, které neobsahovalo detekovatelnou hladinu protilátek anti5 ssDNA a přitom bylo jasně pozitivní na přítomnost protilátek anti-dsDNA (obr. 10B). Takže BAFF Tg myši vykazující nejsilnější hyperglobulinémii secemovaly patologické hladiny antiDNA autoprotilátek. Kromě toho byly u těchto myší, což také připomíná problémy spojené s lupusem, detekovány depozity imunoglobulinů v ledvinách, a sice ze šesti analyzovaných BAFF Tg myší (obr. 10C), tří nescemovaly detekovatelnou hladinu anti-DNA protilátek (data ío neuvedena).

Příklad 6

BAFF Tg myši mají zvětšené folikuly B-lymfocytů, četná germinální centra, snížený počet dendritických buněk a zvýšený počet plazmatických buněk jak ve slezině, tak v mezenterických lymfatických uzlinách (MLN)

BAFF Tg myši měly zvětšené sleziny, MLN (data neuvedena) a Peyerovy pláty (obr. 11). Imu20 nohistochemické vyšetření ukázalo přítomnost zvětšených fol i kůlů B-lymfocytů a redukované lymfatické pláty periferních arterií (PALS nebo oblastí T-lymfocytů) u BAFF Tg myší (obr. 12B). Je zajímavé, že pouze několik germinálních center bylo pozorováno neimunizovaných kontrolních myších (což bylo typické pro tuto skupinu), a ty, které se vyskytovaly, byly jen malé (obr. 12C), zatímco u BAFF Tg myší se vyskytovala četná germinální centra, když nebyly

25, imunizované (obr. 12D). Barvení užitím anti-CDlIc na dendritické buňky v zóně T-lymfocytů á marginální zóně kontrolních myší (obr. 12E) bylo výrazně redukované u BAFF Tg myší (obr. 12F). Plazmatické buňky pozitivní na syndecan-1 byly téměř nedetekovatelné ve slezině kontrolních myší (obr. 12G), i když červená dřeň BAFF Tg myší byla silně pozitivní na syndecan-1 (obr. 12H). Velmi podobná pozorování, byla učiněna pro MLN (obr. 13), v MLN myší BAFF Tg byly oblasti B-lymfocytů výrazně zvětšeny (obr. 13B) na rozdíl od normálních uzlin, kde byly folikuly B-lymfocytů snadno rozpoznatelné v periferii uzliny pod pouzdrem s typickou parakortikální oblastí T-lymfocytů (obr. 13A). MedulaMLN z BAFF Tg myší byla zaplněna buňkami pozitivními na syndekan-1, což jsou zřejmě plazmatické buňky (obr. 13H), Závěrem lze shrnout, že výsledky analýzy sekundárních lymfatických orgánů u BAFF Tg myší byly zcela konzistentní s fenotypem expandovaných B-lymfocytů vykazujícím četné buněčné abnormality a intenzivní imunitní aktivitu.

Seznam citované literatury

I. Smith et al. (1994) Cell 76:959-962.

2. Vassalli (1992) Annu. Rev. Immunol, 10:411-452.

3. De Togni et al. (1994) Science 264:703-707.

4. Koni et al. (1997) Immunity 6:491-500.

5. Amakawa et al. (1996) Cell 84:551-562.

6. Russell et al. (1993) Proč. Nati. Acad Sci. USA 90:4 409-4 413.

7. Zheng et al. (1995) Nátuře 377:348-351,

8. van Kooten and Banchereau (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:330-337.

9. Stuber and Strober (1996)7 Exp. Med. 183:979-989.

10. Schneider et al. (1997)7. Biol. Chem. 272:18 827-18 833.

II. Hahne et al. (1998)7 Exp. Med. 188: 1185-1190.

12. Hahne et al. (1996) Science 274:1363-1366.

13. Grimaitre et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:199-205.

14. Thome et al. (1997) Nátuře 386:517-521.

*24CZ 299819 B6

15. Schneider etal. (1998)7Exp. Med. 187:1205-1213.

16. Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem. 262:10 035-10 038.

17. Armitage et al. (1992) Nátuře 357:80-82.

18. Bucher et al. (1996) Computer Chem. 20:3-24.

19. Banner et al. (1993) Cell 73:431-445.

20. Nagata (1997) Cell 88:355-365.

21. Black etal. (1997)385:729-733.

22. Wong et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:25 190-25 194.

23. Kindler and Zubler. (1997) J. Immunol. 159:2 085-2 090. io 24. Sonoki et al. (1995) Leukemia 9:2 093-2 099.

25. Magrath, I. (1990) Adv Caneer Res 55:133-270.

26. Garside et al. (1998) Science 281:96-99.

27. MacLennan etal. (1997) Immunol. Rev. 156:53-66.

28. Dubois etal. (1997). J. Exp. Med. 185:941-951.

29. Tsubata et al, (1993) Nátuře 364:645-648.

30. Chicheportiche et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:32 401-32 410.

31. Nakayama(1997) Biochem. J. 327:625-635.

32. Jefferis, R. (1995). Rhewnatoid factors, B celíš and immunoglobulin genes. Br. Med. Bull. 57,312-331.

33, Schneider et al. (1999) J. Exp. Med. 189, 1747-1756.

34. Mcknights etal. (1983) Cell34, 335-341.

35. Dattaetal. (1987)7 Exp. Med. 165, 1252-1261.

-25CZ 299819 B6

Seznam sekvencí <140> PCT/US00/01788 <14Í> 2000-01-25 <150> 60/143,228 <151> 1999-07-09 <150> 60/117,169 <151> 1999-01-25 <160> 22 <170> Páténtln Ver. 2.0 <210> 1 <2Í1> 218 <212> PRT <213> HOrno sapiens <400> 1

Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu GÍn Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu

5 10 15

Lýs Lys Arg Glu Glu· Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro

25 30

Arg Lys Glu Ser Pro Sér Val Leu Leu Sér Cys Cys Leu Thr Val Val 35 40 45

Ser Phe Tyr Gin Val Alá Ala Leu Gin Gly Asp Leu Ala Ser Leu-Arg 50 55 60

Ala Glu Leu Gin Glý His His Ala Glu Lýs Leu Pro Ala Gly Alá Lýs

70 75 80

Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gin Asn Ser

90 95

Arg Asn Lys Arg Ala Val Gin Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gin Asp

100

105

110

Cys

Leu

Gin

Leu

Ile

Ála

Asp

Ser

Glu

Thr

Pro

Thr

Ile

Gin

Lys

Gly

115

120

125

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

Pro

Trp

Leu

Leu

Sér

Phe

Lys

Arg

Gly

Ser

Ala

130

135

140

Léu

Tyr

Gly

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Ásp

Lys^

Thr

Tyr

Ala

Met

Gly

HiS

145

150

155

160

Leu

Ile,

Gin

Arg

Lys

Lys

Val

His

Val

Phé

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

165

170

175

Val

Thr

Leu

Phe

Arg

Cys

iie

Gin

Asn.

Leu

Glu

Glu

Gly

Asp

Glu

Leu

180

185

190

Gin

Léu

Ala

Ile

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

tle

Ser

Leu

Asp

Gly

Asp

195

200

205

Val

Thr

Phe

Phe

Gly

Ala

Leu

Lýs

Leu

Léu

210 215

.1 <210> 2 <211> 232 <2Í2:> PRT

<213> Myš
<400> 2
Met	Asp Glu	Ser Ala Lys Thr	Leu	Pro	Pro Pró Cys	Leu	Cys	Phe:	Cys
1		5			10			15
Ser	Glu Lys	Gly Glu Asp Meť	Lys	Vál	Gly Tyr Asp	Pro	Ile	Thr	Pro
		20		25			30
Gin	Lys Glu	Glu Gly Ala Val	Leu	Leu	Ser Ser Ser	Phe	Thr	Ala	Mét
	35		40			45

Ser Leu Tyr Gin Leu Ala Ala Leu Gin Ala Ásp Leu Mét Asn Leu Arg 50 55 60

Met Glu Leu Gin Ser Tyr Arg Gly Sér Ala Thr Pro Ala Ala Ala Lýs

70 75 60

Leu Leu Thr Pró Ala Ala Pro Arg Pro His Asn Ser Ser Arg Gly His

90 95

-27CZ 299819 Bó 'J

Arg

Asn

Arg

Arg

Ala

Phe

Pro

Gly

Pro

Glu

Glu

Thr

Glu

Gin

Asp

Val

100

105.

110

Asp

Leu

Ser

Ala

Pro

Pro

Ala

Leu

Arg

Asn

Ile

Ile

Gin

Asp

cys

Leu

115

120

125

Gin

Léu

Ile

Ala

Asp

Ser

Asp

Thr

Pro

Thr

Ile

Arg

Lys

Gly

Thr

Tyr

1,30:

135

140

Thr

Phe

Val

Pro

Trp.

Leu

Leu

Šer

Phe

Lys

Arg

Gly

Asň

Ala

Leu

Tyr

145

150

155

160

Ser

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Ašp

Pro

Ile

Phe

Ala

Met

Gly

His

Val

Ile

165

-

1,70

175

Gin

Arg

Lys

Lys

Val

His

Val

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

180

185

190

Leu

Phe

Arg

Cys

Ile

Gin

Asn

Leu

Glu

GlU

Gíy

Asp

Glu

Ile

Gin

Leu

195

200

205

Ala

Ile:

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

Ile

Ser

Arg

Asn

Gly

Asp

Ásp

Thr

210

215

220

Phe

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

Leu

'7

1Ϊ

225 230 <210> 3 <211> 102 <212> PRT

<213> Homo sapiens
<400> 3.
Val Thr	Gin	Asp Čys	Leu Gin	Leu,	Ile	Ala Asp Ser	Glu Thr	Pro	Ťhr
1		5'				10		15
Ile Gin	Lys	Gly Ser	Tyr Thr	Phe	Val	Pro Trp Leu	Leu Šer	Phe	Lys
		20			25		30
Arg Gly	Ser	Ala Leu	Glu Glu	Lys	Tyr	Gly Gin Val	Leu Tyr	Thr	Asp
	35			40			45

Lys Thr Tyr Ala Met Gly Hiš Leu Ile Gin Arg Lys Lys Val His Val 50 55 60

Phe Gly Asp Glu Leu Ser Asn Asn Šer Cys Tyr Ser Ala :Gly Ile Ala . 65 70 75 80

-28CZ 299819 B6

Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gin Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn 85 90 95

Ala Gin Ile Ser Leu Asp 100 <210> 4 <211> 96.

<212> PRT <213> Homo sápiens <400> 4

Lys

Gin

His

Ser

Val Leu

His

Leu

Val

Pro Ile

Asn

Ala Thr

Ser

Lys

1

5

10

15

Asp

Asp

Ser·

Asp

Vál Thr

Glu

Val

Met

Trp Gin

Pro

Ala Leu

Arg

Arg

20

25

30

Gly

Arg

Gly

Letí

Gin Ala

Gin

Tyr

Ser

Gin Val

Leu

Phe Gin

Asp

Val

35

40

45

Thr

Ph®

Thr

Met

Gly Gin

Val

Val

Ser

Arg Glu'

Gly

Gin Gly

Arg

Ala

50

55

60

Tyr

Asn.

Ser

Cys

Tyr Ser

Ala

Gly

Val

Phe His

LeU

His Gin

Gly

Asp

65

70

75

80

Ile

Leu

Ser

Val

Ile Ile

Pro

Arg

Ala

Arg Ala

Lys

Leu Asn

Leu

Ser

90 95 <210> 5 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Ser Asp Lys Pro Val Ala His; Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly 1 5 10 15'

Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly 20 25 30

-29CZ 299819 B6

Val	Tyr	Ser	GÍn	Val LéU	Phe	Lys Gly	Gin	Gly Cys	Pro	Ser	Thr His
		35				40;·			45
Val	LéU	Leu	Ťhr	His Thr	Ile	Ser Arg	Ile	Ala Val	Ser	Tyr	Gin Thr
	50				55			60
Glu	Gly	Ala	Glu	Ala Lys	Pro	Trp Tyr	Glu	Pro Ile	Tyr	Leu	Gly Gly
65				70				75			80
Val	Phe	Gin	Leu	Glu Lys	Gly	Ásp Arg	Leu	Ser Ala	Glu	Ile	Asn Arg
				85			90				95
Pro	Asp	Tyr	Lěu	Asp Phe	Alá	Glu

100 <210> 6 <211> 97

<212> PRT <213> fibmo sapiens <40 Ó> 6
Glu 1	Leu	Arg Lys Val 5	Alá His Leu Thr Gly Lys 10	Ser	Asn	Ser	Arg 15	Ser
Met	Pro	Leu Glu Trp 20	Glu Asp Thr Tyr Gly 25	Ile	Vál	Leu	Leu 30	Ser	Gly
Val’	Lys	Tyr Ser Lys 35	Val Tyr Phe Arg Gly 40	Gin	Ser	Cys 45	Ash	Asn	Leu
Pro	Leu 50	Ser His Lys	Val Tyr Met Arg Asn 55	Ser	Lys 60	Tyr	Pro	Gin	Met
Trp 65	Ala	Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val 70	Phe Asn 75	Leu Thr	Seř	Ala 80
Asp	His	Leu Tyr Val 85	Asn Val Ser Glu Leu 90	Šer	Leu	Vál	Asn	Phe 95	Glu

Glu <210> 7 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens

- 3ΩCZ 299819 B6 <400> 7

Thr

Leu

Lys

Pro'

Ala,

Ala

His

Leu

Ile

Gly

Ašp

Pro

Sér

Lys;

Glň

Asn

1

5

10

15

Ser

Leu

Leu

Trp

Arg

Áía

Asn

Thr

Ašp

Arg

Ala

-Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

20

25,

30

Phe

Ťyr

Ser

Gin

Val

Val.

Phe

Šer

Gly

Lys

Ala

Tyr

Ser

Pro

Lys

Ala

35

40

45

Thr

Ser

Ser

Pro,

Leu

Tyr

Leu

Ala

His

Glu

Val

Gin

Leu

Phe

Šer

Ser

50

5.5

60

Gin

Tyr

Pro

Phe;

Pro

Trp

Leu

His

Ser

Met

Tyr

His

Gly

Ala.

Ala

Phe.

65

70

75

80

Gin

Leu

Thr

Gin

Gly

Asp

Gin

Leu

Set

Thr

His

Thr

Asp

Gly

Ile

Pro

85

90

95

His

Leu

Val

Leu

Ser

Phe

100 <210> 8 <2ll> 1Ó9 <212> PRT <213> Homó sapiens <4ÓÓ> 8

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe Ala His

Leu

Thr

Ile ,

Asn

Ala

Thr

Ásp

Ile

Pro

1

5

10

15

Ser

Gly

Ser

His

Lys Val Šer

Leu

Ser

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

20

25

3.0.

Trp

Gly

Lys

Ile

Ser Asn Met

Tyr

Ala

Asn

Ile

Gýs

Phe

Arg

His

His

35

40

45

Glu

Thr

Ser

Gly

Asp Leu Ala

Thř

Glu

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr·

50.

55

60

Val

Thr

Lys

Thr

Ser Ile Lys

ile

Pro

Šer

Glu

Phe>

His

Phe

Tyr

Ser

65

70

75

80

Tle

Asn

Val.

Gly

Gly Phe Phe

Lys

Leu

Arg

Ser

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

90 95

-31 CZ 299819 B6

Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin

100

105 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 actgtttctt ctggáccctg aacggc 26 <210> 10 <2il> 30 <2l2> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gacaagcttg ccaccatgga tgactccaca <21O> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 actagtcaca gcagtttcaa tgc 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctgcagggtc cagaagaaac ag <210> .13 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggagaaggca actccagtca gaac 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens

-32CZ 299819 B6 <400> 14 caattcatcc ccaaagacát ggac 24 <210> 15 <211* 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <4Q0> 15 tcggaacaca acgaaácáag tc 22 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 cttctccttc acctggaaac tgactg 26 <210* 17 <211> 19 <212* DNA <213> Homo sapiens , <400* 17 ggcatcgtga tggačtccg - 19 <210> 18 <211* 19 <212* DNA <213> Homo sapiens <400* 18 gctggaaggt ggácagcga 19 <210> 19 <211* 35 <212* DNA <213* Homo sapiens <400* 19 taagaátgcg gccgcggaat ggatgagtct gcaáa 35 <210> 20 <211> 35 <212* DNA <213> Homo sapiens

-33CZ 299819 B6

<400> 20 fcaagaatgcg gccgcgggat cacgča.ctcč agcaa	35
<210> 21 <211> 21. <212> DNA <213> Hóiíio sapiens <400> 21 gcagtttcač agcgatgtcc t	21
<210> 22 <211> 21 <212^ DNA <2l3> Homo sapiexis <400> 22 gtctccgttg cgtgaaatct g	21

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   10 1. Použití protilátky specifické pro rozpustný BAFF nebo aktivního fragmentu této protilátky pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení autoimunitního onemocnění.
2. 2. Použití protilátky specifické pro rozpustný BAFF nebo aktivního fragmentu této protilátky pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení lymfoproliferativní poruchy B lymfocytú.
3. 3. Použití protilátky specifické pro rozpustný BAFF nebo aktivního fragmentu této protilátky pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení imunosupresivního onemocnění,
4. 4. Použití podle nároku 3, kdy imunosupresivní onemocnění je způsobeno HtV.