CN1342202A - 可溶性受体br43×2和应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了可溶性分泌肿瘤坏死因子受体多肽、编码该多肽的多核苷酸和相关的组合物和方法。该多肽含有一个与其它肿瘤坏死因子受体例如跨膜激活物和CAML－相互作用物(TACI)同源的富含半胱氨酸的重复单位。该多肽可以用于检测配体、拮抗剂和激动剂。该多肽还可以应用于调节B细胞活化的方法中。

Description

可溶性受体BR43×2和应用方法
发明背景
在免疫应答过程中发生的细胞相互作用由几种细胞表面受体家族，包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的成员所调节。该TNFR家族由多种膜内在糖蛋白受体组成，其中许多联合它们的各自配体调节不同的造血细胞系之间的相互作用(Smith等，细胞和病毒蛋白质的TNF受体超家族：激活、共同刺激和死亡(The TNF Receptor Superfamily of Cellular andViral Proteins：Activation，Costimulation and Death)，76：959-62，1994；Cosman，干细胞(Stem Cells)12：440-55，1994)。
一个这样的受体是跨膜激活物及CAML-相互作用物TACI(von Bülow和Bram，科学(Science)228：138-41，1997；和WIPO公开文本WO98/39361)。TACI是一个膜结合受体，具有一个含两个富含半胱氨酸假重复的细胞外结构域、一个跨膜域和一个与CAML(钙调节物和亲环蛋白配体)相互作用的细胞质结构域，TACI是一个膜内在蛋白，位于细胞内小泡上，当在Jurkat细胞中超量表达时是NF-AT激活的辅诱导物。TACI与B细胞和一种T细胞亚型相关。von Bulow和Bram(同上)报道，TACI的配体是未知的。
已发现本发明的多肽，即仅具有一个富含半胱氨酸假重复的TACI同种型(BR43×2)、TACI和相关的B细胞蛋白质BCMA(Gras等，国际免疫学(Int.Immunol.)17：1093-106，1995)，可以结合目前称作neutrokineα(WIPO公开文本，WO98/18921)、BlyS(Moore等，科学，285：260-3，1999)、BAFF(Schneider等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)189：1747-56，1999)、TALL-1(Shu等，白细胞生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)65：680-3，1999)或THANK(Mukhopadhyay等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)274：15978-81，1999)的TNF配体ztnf4。因而，BR43×2、TACI和BCMA对于调节ztnf4的活性，尤其是调节B细胞的激活，将是有用的。
为此，本发明提供用于调节ztnf4或其它BR43×2、TACI或BCMA配体的活性的蛋白质治疗法、相关的组合物和方法，以及从本文中本领域技术人员将明了的其它用途。
发明概述
一个方面，本发明提供在哺乳动物中抑制ztnf4活性的方法，包括施用一定量的选自下组的化合物：a)含有BR34×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；c)含有BCMA胞外域的多肽；d)含有SEQ ID NO：10的序列的多肽；e)与SEQ ID NO：2的多肽特异结合的抗体或抗体片段；f)与SEQ ID NO：4的多肽特异结合的抗体或抗体片段；g)与SEQ ID NO：6的多肽特异结合的抗体或抗体片段；h)与SEQ ID NO：8的多肽特异结合的抗体或抗体片段；i)与SEQ ID NO：10的多肽特异结合的抗体或抗体片段；k)SEQ ID NO：4的多肽；l)SEQ ID NO：6的第1-166位氨基酸残基；和m)SEQ ID NO：8的第1-150位氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述化合物是由通过肽键连接在一起的第一部分和第二部分组成的融合蛋白，所述第一部分含有选自下组的多肽：a)含有SEQ ID NO：8的序列的多肽；b)含有SEQ ID NO：2第25-58位氨基酸残基的多肽；c)含有SEQ ID NO：6第34-66位氨基酸残基的多肽；d)含有SEQ ID NO：6第71-104位氨基酸残基的多肽；e)含有SEQ ID NO：6第25-104位氨基酸残基的多肽；f)含有SEQ ID NO：8第8-37位氨基酸残基的多肽；g)含有SEQ ID NO：8第41-88位氨基酸残基的多肽；h)含有SEQ ID NO：8第8-88位氨基酸残基的多肽；而所述第二部分含有另一多肽。在另一个实施方案中，该第一部分还含有选自下组的多肽：a)SEQ ID NO：2第59-120位氨基酸残基；b)SEQ ID NO：6第105-166位氨基酸残基；和c)SEQ ID NO：8第89-150位氨基酸残基。在另一个实施方案中，该第一部分选自：a)含有BR43×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；和c)含有BCMA胞外域的多肽。在一个相关实施方案中，该第一部分选自：a)SEQ ID NO：4的多肽；b)SEQ ID NO：6的第1-154位氨基酸残基；和c)SEQ ID NO：8的第1-48位氨基酸残基。在另一个相关实施方案中，该第二部分是免疫球蛋白的重链恒定区。
在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段选自：a)多克隆抗体；b)鼠单克隆抗体；c)来源于b)的人源化抗体；和d)人单克隆抗体。在一个相关实施方案中，该抗体片段选自F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小识别单位。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是灵长类动物。
在另一个实施方案中，所述ztnf4活性与B淋巴细胞相关。在另一个有关的实施方案中，该ztnf4活性与激活的B淋巴细胞相关。在又一实施方案中，该ztnf4活性与静息的B淋巴细胞相关。在另一个实施方案中，该ztnf4活性与抗体的产生相关。在一个有关的实施方案中，该抗体的产生与自身免疫病相关。在一个有关的实施方案中，所述自身免疫病是系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化症或类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，该ztnf4活性与哮喘、支气管炎或肺气肿相关。在又一实施方案中，该ztnf4活性与末期肾衰竭相关。在又一实施方案中，该ztnf4活性与肾疾病相关。在一个有关的实施方案中，该肾疾病是肾小球肾炎、脉管炎、肾炎或肾盂肾炎。在又一实施方案中，该肾疾病与肾瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病(light chain neuropathy)或淀粉样变相关。在另一个实施方案中，该ztnf4活性与效应T细胞相关。在一个有关的实施方案中，该ztnf4活性与调节免疫应答相关。在又一实施方案中，该活性与免疫抑制相关。在又一实施方案中，免疫抑制与移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎症相关。在另一个实施方案中，该活性与自身免疫病相关。在一个有关的实施方案中，该自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病或Crohn氏病。在另一个实施方案中，该ztnf4活性与炎症相关。在一个有关的实施方案中，该炎症与关节疼痛、肿胀、贫血、败血症性休克相关。在另一个方面，本发明提供用于抑制BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合(receptor-ligand engagement)的方法，包括施用一定量的上述化合物。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与B淋巴细胞相关。在另一个有关的实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与激活的B淋巴细胞相关。在又一实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与静息的B淋巴细胞相关。
在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与抗体的产生相关。在一个有关的实施方案中，该抗体的产生与自身免疫病相关。在一个有关的实施方案中，该所述自身免疫病是系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化症或类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与哮喘、支气管炎或肺气肿相关。在又一实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与末期肾衰竭相关。在又一实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与肾疾病相关。在一个有关的实施方案中，该肾疾病是肾小球性肾炎、脉管炎、肾炎或肾盂肾炎。在又一实施方案中，该肾疾病与肾瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病或淀粉样变相关。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与效应T细胞相关。在一个有关的实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与免疫应答的调节相关。在又一实施方案中，该活性与免疫抑制相关。在又一实施方案中，免疫抑制与移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎症相关。在另一个实施方案中，该活性与自身免疫病相关。在一个有关的实施方案中，该自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病或Crohn氏病。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与炎症相关。在一个有关的实施方案中，该炎症与关节疼痛、肿胀、贫血、败血症性休克相关。
在另一个方面，本发明提供编码SEQ ID NO：2的多肽的分离多核苷酸分子。还提供SEQ ID NO：1的分离多核苷酸分子。在一个有关实施方案中，提供含有以下可操作地连接的元件的表达载体：转录启动子、以上描述的多核苷酸分子和转录终止子。在另一个实施方案中，该表达载体还含有可操作地与所述多核苷酸分子连接的分泌性受体-配体啮合序列。本发明还提供其中导入了上述表达载体的培养细胞，其中所述培养细胞表达所述多核苷酸片段所编码的所述多肽。本发明还提供制备多肽的方法，包括：培养其中已导入了上述表达载体的细胞；籍此所述细胞表达所述多核苷酸分子编码的所述多肽；和回收所述表达多肽。本发明还提供具有SEQ ID NO：2的序列的分离多肽。在一个有关的实施方案中，该多肽与可药用载体(vehicle)组合在一起。
附图简述
图1显示了BR34×2、TACI(vonBülow和Bram，同上)(SEQ ID NO：6)、BCMA(Gfas等，同上)(SEQ ID NO：6)和BR43×1(SEQ ID NO：7)之间的多氨基酸序列比对。图中标出了该富含半胱氨酸假重复和跨膜结构域。
图2显示了可溶性I125-ztnf4与稳定的BHK转染子所表达的TACI和BCMA结合的斯卡查德图分析。
图3A显示了ztnf4辅助激活人B淋巴细胞以增殖并分泌免疫球蛋白。
图3B显示了培养9天后，从有IL4或IL4+IL5时用可溶性ztnf4刺激的B细胞获得的上清液中，所测量到的IgM和IgG水平。
图4显示了在存在IL-4的情况下用可溶性ztnf4或对照蛋白(泛素)体外刺激5天的人外周血B细胞。测试了纯化的TACI-Ig、BCMA-Ig和对照Fc对ztnf4特异性增殖的抑制。
图5A显示了从产生SLE特性的ztnf4转基因动物获得的结果。
图5B显示了用针对CD5、CD4和CD8的抗体染色的ztnf4转基因动物的淋巴结、脾和胸腺细胞。
图5C显示了6-23周龄转基因ztnf4动物的血清中总的IgM、IgG和IgE水平。
图5D显示了在ztnf4转基因动物的肾切片中所鉴定到的肾小球中淀粉样沉积和肾小球膜增厚。
图5E显示了ztnf4转基因小鼠中的效应T细胞。
图6A和B显示了从ZNBWF1小鼠和MRL/lpr/lpr小鼠血清中获得的与SLE的发生相关的ztnf4水平升高。
图7显示了在研究期间出现蛋白尿的NZBWF1小鼠的百分数。
图8显示了与ZNBWF1和MRL/lpr/lpr小鼠的血清相比，通过ELISA测定的ztnf4转基因小鼠和对照同窝出生幼仔的抗dsDNA水平。
通过参考以下详细说明书，本发明的这些和其它方面将是明显的。发明详述
在阐述本发明之前，阐明下文中用到的某些术语的定义可能对于本发明的理解将是有帮助的。
亲和标记物：在本文中用于指能够与第二多肽结合从而为该第二多肽的纯化或检测作准备，或为该第二多肽与基质的结合提供位点的多肽片段。原则上，任何可以获得其抗体或其它特异性结合剂的肽或蛋白质均可以用作亲和标记物。亲和标记物包括聚组氨酸序列、A蛋白(Nilsson等，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法(Methods Enzymol.)198：3，1991)、谷胱苷肽S-转移酶(Smith和Johnson，基因(Gene)67：31，1988)、Glu-Glu亲和标记物(Grussenmeyer等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：7952-4，1985)、P物质、FlagTM肽(Hopp等，生物技术(Biotechnology)6：1204-10，1988)、链霉亲和素结合肽、或其它抗原表位或结合域。一般参见Ford等，蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)2：95-107，1991。编码亲和标记物的DNA可以从供应商处获得(例如PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)。
等位变体：是指占据同一个染色体座位的一个基因的两种或多种不同形式中的任意一种。等位变异通过突变自然发生，并可导致种群内的表型多态现象。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)，也可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位变体”在本文中还用于指由一个基因的等位变体编码的蛋白质。也包括由于等位变异而与参考氨基酸序列不同的来自同一物种的相同蛋白质。等位变异是指在编码指定蛋白质的基因中个体之间天然存在的差异。
氨基端和羧基端：在本文中用以指示多肽和蛋白质中的位置。在上下文允许的地方，对于多肽或蛋白质的一个特定序列或部分这些术语用以指示邻近或相对位置。例如，在一个蛋白质中位于一个参考序列羧基端的某个序列，其位置与该参考序列的羧基端接近，但不一定位于该完整蛋白质的羧基端。
互补物/抗互补物对(complement/anti-complement pair)；是指在适当条件下形成一个非共价连接的稳定对的不相同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉亲和素)是一个互补物/抗互补物对的原型成员。其它典型的互补物/抗互补物对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对等等。当期望该互补物/抗互补物对随后发生解离时，该互补物/抗互补物对优选具有＜10-9M的结合亲和力。
重叠群：是指具有一段与另一个多核苷酸毗连的相同或互补序列的多核苷酸。毗连序列被称为与一段指定的多核苷酸序列完全地或沿该多核苷酸的部分序列“重叠”。例如，多核苷酸序列5’-ATGGCTTAGCTT-3’的代表性重叠群是5’-TAGCTTgagtct-3’和3’-gtcgacTACCGA-5’。
多核苷酸分子的互补物：是指与参考序列相比具有互补的碱基和相反取向的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG3’与5’CCCGTGCAT3’互补。
简并核苷酸序列或简并序列：是指(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)包括了一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(例如，GAU和GAC三联体均编码Asp)。
表达载体：线性或环状DNA分子，其含有与为其转录提供条件的其它片段可操作连接并编码目的多肽的片段。这些其它片段可以包括启动子与终止子序列、和任选的一个或多个复制原点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或可以同时含有两者的元件。
同种型：是指可以由不同基因或由相同基因通过不同拼接产生的一种蛋白质的不同形式。在某些情况中，同种型在运输活性、发育中的表达时间、组织分布、细胞内定位或这些性质的组合上不同。
分离的多核苷酸：是指该多核苷酸已从其天然遗传环境中被取出，并因此不含有其它外来的或不想要的编码序列，而且其以适合在遗传工程蛋白质生产系统中应用的形式存在。这些分离的分子是那些从其天然环境中分离出来的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含有通常与其相连的其它基因，但可以包括天然存在的5’和3’非翻译区例如启动子和终止子。相连区域的鉴定对于本领域的普通技术人员是明了的(见例如，Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。
分离的多肽或蛋白质：是在非其天然环境的情况下，例如在脱离血液和动物组织的情况下存在的多肽或蛋白质。在一种优选形式中，该分离的多肽基本不含有其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。优选提供高度纯化形式的多肽，即纯度大于95％，更优选纯度大于99％的多肽。当在本文中使用时，该术语“分离的”并不排除存在另一种物理形式的相同多肽，例如二聚体或其它的糖基化或衍生形式。
可操作地连接：当应用于核苷酸片段时，术语“可操作地连接”指这些片段被排列起来，以致它们可以为了预期的目的，例如在启动子中起始转录并沿着编码片段向终止子前进，而协调地发挥功能。
直向同源物(ortholog)：是指从一个物种获得的多肽或蛋白质，其是另一个物种的多肽或蛋白质的功能对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
多核苷酸：是指从5’向3’末端进行阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以是从天然来源分离的、体外合成的、或是从天然和合成分子的组合制备的。多核苷酸的大小以碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)表示。在上下文允许时，后两个术语可以描述单链或双链多核苷酸。当该术语应用于双链分子时，其用以指整个长度，并应理解为与术语“碱基对”相同。本领域技术人员会知晓，双链多核苷酸的两条链可以在长度上稍有不同，并且它们的末端可以由于酶切的缘故而是交错的；因此在双链多核苷酸分子中并非所有核苷酸都是配对的。这些非配对末端一般长度不超过20个nt。
多肽：是通过肽键连接起来的氨基酸残基的聚合物，而不论其是天然产生的还是合成产生的。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常被称作“肽”。
启动子：是指含有提供用于RNA聚合酶的结合和转录起始的DNA序列的基因部分。启动子序列通常但并不总是存在于基因的5’非编码区中。
蛋白质：是含有一或多条多肽链的大分子。蛋白质还可以含有非肽成分，例如糖基。可以通过产生蛋白质的细胞向蛋白质添加糖和其它非肽取代基，而且这些糖和其它非肽取代基随着细胞类型的不同而改变。蛋白质在本文中根据其氨基酸主链结构来定义；一般说来取代基例如糖基并不指明，但可以存在。
受体：与生物活性分子(“配体”)结合并介导配体对细胞的作用的细胞相关蛋白质，或该蛋白质的多肽亚基。配体与受体的结合导致受体的变化(并在某些情况中，导致受体的多聚化，即相同或不同的受体亚基的连接)，从而引起受体的一个或多个效应域和细胞内的一个或多个其它分子之间发生相互作用。这些相互作用接着导致该细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用连接的代谢事件包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、细胞增殖、环AMP产生的增加、细胞钙的转移、膜脂的转移、细胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。BR43×2具有TNF受体的特性，本文将对此作更为详细的讨论。
分泌信号序列：编码如下多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为一个更大多肽的成分指导该更大多肽通过合成该更大多肽的细胞的分泌途径。该更大多肽通常在通过该分泌途径的运输过程中被裂解除去该分泌肽。
可溶性受体：不与细胞膜结合的受体多肽。可溶性受体最普遍的是缺乏跨膜域和细胞质域的配体结合受体多肽。可溶性受体可以含有额外的氨基酸残基，例如为纯化该多肽提供条件或为该多肽与基质的结合提供位点的亲和标记物。许多细胞表面受体具有天然存在的可溶性对应物，该对应物经蛋白水解产生，或从另外一种拼接形式的mRNA翻译产生。当受体多肽缺乏足够的跨膜和细胞内多肽片段以分别提供膜锚定或信号转导时，它们被认为基本上没有这些片段。
通过粗略的分析方法(例如凝胶电泳)测定的聚合物的分子量和长度应理解为是近似值。当该值以“大约”X或“近似”X表示时，所描述的X值应理解为准确至±10％。
本文所引用的所有文献均以参考文献的形式完整地并入。
本发明部分基于对受体TACI的一种同种型，即一个1192bp DNA序列(SEQ ID NO：1)和其相应多肽序列(SEQ ID NO：2)的发现。该同种型被命名为BR43×2。BR43×2的可溶性形式公开于SEQ ID NO：4，该多核苷酸编码SEQ ID NO：3中的可溶性受体。本发明编码BR43×2受体的多核苷酸和多肽最初是采用人类RPMI 1788文库和N-或C-端FLAG-标记、生物素-或FITC-标记的目前被称为neutrokineα(WIPOWO98/18921)、Blys(Moore等，同上)、BAFF(Schneider等，同上)、TALL-1(Shu等，同上)或THANK(Mukhopadhyay等，同上)的肿瘤坏死因子配体ztnf4，通过信号诱捕克隆(signal trap cloning)鉴定的，这在本文中有更为详细的描述。通过配体结合鉴定阳性库，然后将其分解成单个克隆，分离该cDNA并测序。该BR43×2的推导氨基酸序列(显示于SEQ ID NO：2)与已知肿瘤坏死因子受体的比较揭示，BR34×2是TACI的同种型，仅具有一个保守性差的富含半胱氨酸的假重复。
结构上，该TNF受体家族的特征在于，细胞外部分由历史上称作“富含半胱氨酸的假重复”的几个组件构成。一个原型TNFR家族成员具有相继向右排列的4个这样的假重复，每一个长大约29-43个残基。一个典型的假重复具有6个半胱氨酸残基。由于尽管它们看上去似乎来源于一个共同的祖先组件，但又并非完全重复：#1、#2、#3和#4假重复具有相互区别的特征性序列特征，因此被称作假重复。p55 TNF受体的晶体结构显示，每一个假重复都相应于一个折叠域，而且所有的4个假重复均折叠成相同的四级结构，并通过二硫键在内部结合在一起。
TACI含有两个富含半胱氨酸的假重复(von Bülow和Bram，同上)，与该TNF受体家族的其它成员相比第一个在结构上是保守的，而第二个的保守性较差。本发明的BR43×2同种型缺少TACI的第一个富含半胱氨酸的假重复，仅保留了第二个保守性较差的重复单位。
对SEQ ID NO：2所示BR43×2的推导氨基酸序列进行的序列分析揭示存在一个如下成熟蛋白质，该蛋白质具有一个含有一富含半胱氨酸假重复(SEQ ID NO：2的第25-58位残基)的胞外域(SEQ ID NO：2的第1-120位残基)、一个跨膜域(SEQ ID NO：2的第121-133位残基)和一个细胞质域(SEQ ID NO：2的第134-247位残基)。BR34×2的该富含半胱氨酸的假重复具有6个保守的半胱氨酸残基(SEQ ID NO：2的第25、40、43、47、54和58位残基)、一个保守的天门冬氨酸残基(SEQ ID NO：2的第34位残基)和两个保守的亮氨酸残基(SEQ ID NO：2的第36和37位残基)，并与TACI(SEQ ID NO：6)的第一个富含半胱氨酸的假重复享有46％的一致性，与BCMA(SEQ ID NO：8)的富含半胱氨酸的假重复享有35％的一致性(图1)。该富含半胱氨酸假重复可以用以下基序来表示：CX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]C(SEQ ID NO：10)，
其中C表示半胱氨酸残基、Q表示谷氨酰胺残基、E表示谷氨酸残基、K表示赖氨酸残基、N表示天冬酰胺残基、R表示精氨酸残基、D表示天门冬氨酸残基、H表示组氨酸残基、S表示丝氨酸残基、Y表示酪氨酸残基、F表示苯丙氨酸残基、W表示色氨酸残基、L表示亮氨酸残基、I表示异亮氨酸残基、V表示缬氨酸残基和X表示除了半胱氨酸之外的任何天然存在的氨基酸残基。方括号“[]”内的氨基酸残基表示在该位置所允许的氨基酸残基变异。括号“{}”内的数目表示在该位置所允许的氨基酸残基数。
本发明还提供SEQ ID NO：10所给出的长度在32-40个氨基酸残基的可溶性多肽。
SEQ ID NO：4的第1-120位残基所示可溶性BR43×2受体含有一个富含半胱氨酸假重复(SEQ ID NO：4的第25-58位残基)，而且缺少SEQID NO：2中所示的BR43×2的跨膜和细胞质域。
本领域的技术人员将明了，这些域的边界是大约的，其基础是与已知蛋白质的比对和对蛋白质折叠的预测。这些性质揭示，由SEQ ID NOs：1和3的DNA序列编码的受体是TNF受体家族的一个成员。
利用预测可以检测BR43×2表达的针对BR43×1的核苷酸探针所进行的mRNA组织分布的Northern印迹和斑点印迹分析，显示在脾、淋巴结、CD19+细胞中有表达，在混合的淋巴细胞反应细胞、Daudi和Raji细胞中有弱表达。采用逆转录酶PCR，仅在B细胞中检测到BR43×1，而在激活的T细胞中未检测到BR43×1，这与以前针对TACI所报道的(von Bülow和Bram，同上)相同。采用与相应的TACI序列100％重叠的BR43×2探针，在脾、淋巴结和小肠、胃、唾液腺、阑尾、肺、骨髓、胎儿的脾、CD19+细胞和Raji细胞中检测到TACI和BR43×2。
采用Northern印迹分析，在小肠、脾、胃、结肠、阑尾、淋巴结、气管和睾丸中检测到BCMA。在腺淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和腮腺瘤中也检测到BCMA，在CD8+、CD19+、MLR细胞、Daudi、Raji和Hut78细胞中检测到微弱的BCMA。
还采用鼠ztnf4(SEQ ID NO：19)进行了Northern印迹分析，与人类TACI、BCMA和BR43×2相同，鼠ztnf4的表达主要在脾和胸腺中被检测到。鼠ztnf4还在肺中表达，并且在皮肤和心脏中检测到微弱表达。
本发明还提供编码本文所公开的BR43×2多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本领域的技术人员将很容易明了，鉴于遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可以有相当大的序列变异。SEQ ID NO：11是包括了编码SEQ ID NO：4可溶性BR43×2多肽的所有DNA的一个简并DNA序列。同样，SEQ ID NO：12是包括了编码SEQ ID NO：2 BR43×2多肽的所有DNA的一个简并DNA序列。本领域技术人员应明了，通过用U取代T，SEQ ID NO：12简并序列还提供了编码SEQ ID NO：4的所有RNA序列。因此，含有SEQ ID NO：11的第1-360位核苷酸、SEQ ID NO：12的第1-741位核苷酸、和它们的RNA等同物的编码BR43×2多肽的多核苷酸是本发明所考虑到的。表1列出了SEQ ID NOs：11和12中使用的单字母密码，以指示简并核苷酸的位置。“解析(resolution)”是指由密码字母所指示的核苷酸。“互补”是指互补核苷酸的密码。例如Y密码指示C或T，而它的互补R指示A或G，A与T互补，G与C互补。
          表1核苷酸  解析 互补 解析A        A    T    TC        C    G    GG        G    C    CT        T    A    AR        AG   Y    CTY        CT   R    AGM        AC   K    GTK        GT   M    ACS        CG   S    CGW        AT   W    ATH        ACT  D    AGTB        CGT  V    ACGV        ACG  B    CGTD        AGT  H    ACTN        ACGT N    ACGT
表2列出了SEQ ID NOs：11和12中使用的简并密码子，其包括了对于一个给定氨基酸的所有可能密码子。
                  表2氨基酸   单字母密码    密码子                      简并密码子Cys        C     TGC TGT                            TGYSer        S     AGC AGT TCA TCC TCG TCT            WSNThr        T     ACA ACC ACG ACT                    ACNPro        P     CCA CCC CCG CCT                    CCNAla        A     GCA GCC GCG GCT                    GCNGly        G     GGA GGC GGG GGT                    GGNAsn        N     AAC AAT                            AAYAsp        D     GAC GAT                            GAYGlu        E     GAA GAG                            GARGln        Q     CAA CAG                            CARHis        H     CAC CAT                            CAYArg        R     AGA AGG CGA CGC CGG CGT            MGNLys        K     AAA AAG                            AARMet        M     ATG                                ATGIle        I     ATA ATC ATT                        ATHLeu        L     CTA CTC CTG CTT TTA TTG            YTNVal        V     GTA GTC GTG GTT                    GTNPhe        F     TTC TTT                            TTYTyr        Y     TAC TAT                            TAYTrp        W     TGG                                TGGTer        .     TAA TAG TGA                        TRRAsn|Asp       B                                        RAYGlu|Gln       Z                                        SAR任何       X                                        NNN
本领域的普通技术人员都将明了，在确定代表编码每一个氨基酸的所有可能密码子的简并密码子时，引入了某种多义性。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)在某些情况中可编码精氨酸(AGR)，而精氨酸的简并密码子(MGN)在某些情况中编码丝氨酸(AGY)。在编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间也存在类似的关系。因此，该简并序列所包括的一些多核苷酸可能编码变异的氨基酸序列，但通过参考SEQ ID NOs：2和4的氨基酸序列本领域的普通技术人员能够轻易地鉴别出这些变异序列。按本文所描述的方法能够很容易地对变异序列的功能性进行测试。
本领域的普通技术人员还应明了，不同的物种会表现出“偏倚密码子使用”。一般参见Grantham等，核酸研究(Nuc.Acids Res.)8：1893-912.1980；Haas等，当代生物学(Curr.Biol.)6：315-24，1996；Wain-Hobson等，基因(Gene)13：355-64，1981；Grosjean和Fiers，基因18：199-209，1982；Holm，核酸研究14：3075-87，1986；Ikemura，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)158：573-97，1982。本文所用术语“偏倚密码子使用”或“偏倚密码子”是本领域的一个术语，指在某种物种的细胞中最为频繁使用的蛋白质翻译密码子，由此产生对编码每一种氨基酸的一种或几种可能密码子的偏好(见表2)。例如，苏氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物细胞中ACC是最为常用的密码子；在其它物种中，例如昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，可能偏好不同的Thr密码子。可以通过本领域已知的多种方法将一个特定物种的偏倚密码子引入本发明的多核苷酸中。在重组DNA中引入偏倚密码子序列可以例如通过使蛋白质的翻译在特定细胞类型或物种中更为有效而增强蛋白质的产生。因此，SEQ ID NOs：11和12中公开的简并密码子序列可以充当模板，用于优化多核苷酸在本领域常用的和本文所公开的多种细胞类型和物种中的表达。可以对含有偏倚密码子的序列进行测试，优化其在各种物种中的表达，并按本文公开的方法测试其功能性。
BR43×2的富含半胱氨酸的假重复中高度保守的氨基酸可以用作鉴定新家族成员的工具。例如，可以采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，从获自各种组织材料或细胞系的RNA，扩增编码上述细胞外配体结合域的序列。尤其是，从BR43×2序列设计的高度简并引物对于该目的是有用的。
在本发明的优选实施方案中，分离的多核苷酸将与相似大小的SEQ IDNO：3区域，或其互补序列在严紧条件下杂交。一般地，严紧条件选择为低于一定离子强度和pH下该特异序列的热解链温度(Tm)大约5℃。Tm是(在一定的离子强度和pH下)有50％的目标序列与完全匹配的探针发生杂交时的温度。典型的严紧条件是：pH7，盐浓度高达大约0.03M，而且温度至少大约60℃。
正如前面提及的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。用于分离DNA和RNA的方法是本领域所熟知的。尽管DNA也可以采用来自其它组织的RNA来制备或作为基因组DNA来分离，但一般优选从RPMI 1788细胞、PBMNC、静息或激活的转染B细胞或扁桃体组织分离RNA。可以采用盐酸胍提取，之后通过CsCl梯度离心分离来制备总RNA(Chirgwin等，生物化学(Biochemistry)18：52-94，1979)。采用Aviv和Leder的方法(美国国家科学院院刊69：1408-12，1972)，从总RNA制备poly(A)+RNA。采用已知方法从Poly(A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。然后通过例如杂交或PCR鉴定并分离编码BR43×2多肽的多核苷酸。
本领域技术人员应明了，SEQ ID NOs：1和3中公开的序列仅代表该人类基因的一个等位基因，而且可以预料存在等位变异和其它种拼接。SEQID NOs：1和3中所示DNA序列的等位变体，包括那些含有沉默突变的等位变体和那些其中的突变导致氨基酸序列改变的等位变体，均属于本发明的范围之内，同样，SEQ ID NOs：2和4的等位变体蛋白质也属于本发明的范围。这些序列的等位变体和拼接变体可以根据本领域已知的标准程序通过探测来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库来克隆。
本发明还提供与SEQ ID NOs：2和4的多肽以及它们的物种直向同源物基本同源的分离的BR43×2多肽。术语“基本同源”在本文中用以指与SEQ ID NOs：2和4中所示序列或它们的直向同源物有50％、优选60％、更优选至少80％的序列一致性的多肽。这些多肽将更优选与SEQ ID NO：2或其直向同源物至少90％一致，最优选95％或更高一致。序列一致性百分数通过常规方法测定。见例如Altschul等，Bull.Math.Bio.48：603-66，1986和Henikoff和Henikoff，美国国家科学院院刊89：10915-9，1992。简要地说，采用10的断缺区空缺罚分、1的断缺区延伸罚分，和表3所显示的Henikoff和Henikoff(同上)“blosum 62”评分矩阵(氨基酸用标准的单字母密码表示)，比对两个氨基酸序列以优化比对分数。然后按如下公式计算一致性百分数：
Figure A0080442500271
                      表3A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  VA 4R-1  5N-2  0  6D-2 -2  1  6C 0 -3 -3 -3  9Q-1  1  0  0 -3  5E-1  0  0  2 -4  2  5G 0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6H-2  0  1 -1 -3  0  0 -2  8I-1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  4L-1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4K-1  2  0 -1 -3  1  1 -2 -1 -3 -2  5M-1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  1  2 -1  5F-2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0  0 -3  0  6P-1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7S 1 -1  1  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4T 0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  5W-3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2 11Y-2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  2  7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4多核苷酸分子的序列一致性采用上述公开的比率通过相似方法测定。
基本同源的蛋白质和多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸替代、缺失或添加。这些改变优选在性质上是较小的，即保守氨基酸替代(见表4)和其它不显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的替代；小的缺失，典型的是1至大约30个氨基酸的缺失；和小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端的甲硫氨酸残基、不超过大约20-25个残基的小接头肽或亲和标记物。含有亲和标记物的多肽可以进一步在BR43×2多肽和该亲和标记物之间含有一个蛋白水解切割位点。优选的该位点包括凝血酶切割位点和Xa因子切割位点。
             表4
      保守性氨基酸替代
碱性的：    精氨酸
            赖氨酸
            组氨酸
酸性的：    谷氨酸
            天门冬氨酸
极性的：    谷氨酰胺
            天冬酰胺
疏水的：    亮氨酸
            异亮氨酸
            缬氨酸
芳香族的：  苯丙氨酸
            色氨酸
            酪氨酸
小的：      甘氨酸
            丙氨酸
            丝氨酸
            苏氨酸
            甲硫氨酸
除了这20个标准氨基酸之外，还可以用非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸，6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)来替代本发明BR43×2多肽的氨基酸残基。可以用有限量的非保守氨基酸、非遗传密码子编码的氨基酸和人造氨基酸来替代BR43×2多肽的氨基酸残基。本发明的蛋白质还可以含有非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4-亚甲基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氢吡啶羧酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸(2-azaphenylalanine)、3-氮杂-苯丙氨酸、4-氮杂-苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质的几种方法是本领域已知的。例如，可以采用应用了化学氨酰化抑制型tRNA抑制无义突变的一种体外系统。用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。在含有大肠杆菌(E.coli.)S30提取物以及可从商业途径获得的酶和其它试剂的无细胞系统中，对含有无义突变的质粒进行转录和翻译。通过层析纯化蛋白质。见例如Robertson等，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)113：2722，1991；Ellman等，酶学方法(MethodsEnzymol.)202：301，1991；Chung等，科学259：806-9，1993；和Chung等，美国国家科学院院刊90：10145-9，1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制型tRNA，在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：19991-8，1996)。在第三种方法中，在缺少待被置换的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)但存在期望的非天然存在氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)的情况下，培养大肠杆菌细胞。该非天然氨基酸取代其天然对应物掺入蛋白质中。见Koide等，生物化学(Biochem.)33：7470-6，1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转变成非天然存在的种类。化学修饰可以和定点诱变结合起来，以进一步扩展替代的范围(Wynn和Richards，蛋白质科学(Protein Sci.)2：395-403，1993)。
可以用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸、和人造氨基酸替代BR43×2的氨基酸残基。
本发明BR43×2多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的程序鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-5，1989)。将单个丙氨酸突变引入该分子的每一个残基位置，然后测试所获得的突变分子的生物学活性(例如提供在免疫应答期间B细胞应答的降低、自身抗体产生的抑制或降低)，以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。也参见Hilton等，生物化学杂志271：4699-708，1996。生物学相互作用位置即配体结合部分例如该富含半胱氨酸的假重复，还可以通过物理分析核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术所测定的结构，以及对推测的接触位置的氨基酸进行突变来确定。见例如de Vos等，科学255：306-12，1992；Smith等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309：59-64，1992。必需氨基酸的身份还可以从与相关TNFR家族成员例如TACI和BCMA的同源性的分析推断出来。
只要保留保守的半胱氨酸、天门冬氨酸和亮氨酸残基并且不打乱高级结构，还可以在BR43×2的富含半胱氨酸的假重复中进行其它的氨基酸替代。优选参考其它的富含半胱氨酸的假重复的序列来进行BR43×2的富含半胱氨酸假重复中的替代。SEQ ID NO：10是一个一般性的富含半胱氨酸假重复，其显示了基于这种比对能够允许的氨基酸替代。在该域中的替代受本文所提及的限制的制约。
采用已知的诱变和筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Saueer(科学241：53-7，1988)或Bowie和Sauer(美国国家科学院院刊86：2152-6，1989)公开的方法，能够进行多个氨基酸替代并对它们进行检测。简而言之，这些作者公开了如下方法，该方法用于同时使多肽的两个或多个位置随机化、筛选功能性多肽、之后对诱变多肽测序，以确定在每一个位置所能够允许的替代谱。其它能够应用的方法包括噬菌体展示(例如Lowman等，生物化学30：10832-7，1991；Ladner等，美国专利5，223，409；Huse，WIPO公开文本WO 92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，基因46：145，1986；Ner等，DNA 7：127，1988)。
按照Stemmer，自然370：389-91，1994，Stemmer，美国国家科学院院刊91：10747-51，1994和WIPO公开文本WO 97/20078中所公开的方法，通过DNA改组可以制备本文公开的BR43×2 DNA和多肽序列的变体。简而言之，通过亲本DNA的随机片断化，之后采用PCR进行重新组装，获得随机引入的点突变，然后通过体外同源重组，产生变体DNA。可以通过采用亲本DNA家族，例如来自不同物种的等位变体或DNA，改动该技术，以向该程序中引入额外的可变性。通过选择合乎需要的突变并同时筛去有害改变，选择或筛选期望活性，之后进行更多轮的诱变和分析，从而可以实现序列的快速“进化”。
以上公开的诱变方法可以和检测宿主细胞中克隆诱变多肽活性的大批量自动筛选方法联合。可以从该宿主细胞回收编码活性多肽(例如，提供免疫应答期间B细胞应答的降低、自身抗体产生的抑制或降低)的诱变DNA分子，并采用现代装置对其进行快速测序。这些方法使得可以快速地确定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并且可以应用于未知结构的多肽。
采用以上所讨论的方法，本领域的普通技术人员能够鉴定和/或制备多种与SEQ ID NO：2的第1-120位残基或其等位变体基本同源的，并且保留了野生型蛋白质的B细胞抑制特性的多肽。这些多肽可以包括来自肿瘤坏死因子受体超家族其它成员的额外氨基酸或域、或亲和标记物等等。含有TNFR超家族其它成员的功能域的BR43×2多肽或融合结构，构成了表现出改变的B细胞抑制能力的杂合肿瘤坏死因子受体。
本发明还提供来自其它物种的对应受体和多核苷酸(直向同源物)。这些物种包括但不限于哺乳动物、鸟类、两栖动物、爬行动物、鱼类、昆虫、和其它脊椎和无脊椎动物种类。尤其有意义的是来自其它哺乳动物物种，包括鼠、猪、绵羊、牛、犬、猫、马的BR43×2受体和其它灵长类动物的受体。可以采用本发明提供的信息和组合物联合常规的克隆技术，克隆人类BR43×2受体的直向同源物。例如，可以采用从表达该受体的组织或细胞类型获得的mRNA，克隆cDNA。mRNA的适合来源可以通过使用从本文所公开的序列设计的探针探测Northern印迹来鉴定。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。然后可以通过各种方法，例如通过用基于本文公开序列的完整或部分人cDNA或一或多套简并探针进行探测，分离编码受体的cDNA。还可以采用PCR和根据本文所公开的序列设计的引物，克隆cDNA。在再一种方法中，可以采用该cDNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对该受体的抗体检测目的cDNA的表达。相似的技术也可以应用于分离基因组克隆。
本发明的受体多肽，包括全长受体多肽、可溶性受体多肽、多肽片段、和融合多肽，均可以根据常规技术在基因工程化宿主细胞中制备。适合的宿主细胞是能够用外源DNA转化或转染并且能够培养生长的那些细胞类型，包括细菌、真菌细胞、和培养的高等真核细胞。优选真核细胞，尤其是多细胞生物的培养细胞。用于操作克隆的DNA分子并将外源DNA导入各种宿主细胞中的技术公开于Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，Cold SpringHarbor，NY，1989；和Ausubel等编，当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987。
一般地，将编码BR43×2多肽的DNA序列和其表达所必需的其它遗传元件，一般包括转录启动子和终止子，在表达载体中可操作地连接在一起。该载体一般还将含有一个或多个选择标记和一个或多个复制原点，当然本领域技术人员将明了在某些系统中选择标记可以在不同的载体上提供，而且外源DNA的复制可以通过整合在宿主细胞的基因组中来实现。启动子、终止子、选择标记、载体和其它元件的选择是属于本领域普通技术水平的常规设计。许多这样的元件在文献中均有描述，并且可以通过供应商获得。
为了指导BR43×2多肽进入宿主细胞的分泌途径，在表达载体中提供一个分泌信号序列(又称作信号序列、前导序列、前原序列或前序列)。该分泌信号序列可以是BR43×2多肽的分泌信号序列，或可以来源于另一种分泌蛋白质(例如t-PA)或从头合成。该分泌信号序列以符合正确阅读框的形式与BR43×2 DNA序列连接，并且所处位置将可以指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的DNA序列的5’端，但某些信号序列可以被放置在目的DNA序列的别处(见例如Welch等，美国专利5,037,743；Holland等，美国专利5,143,830)。
在本发明中，培养的哺乳动物细胞是适合的宿主。用于将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，细胞(Cell)14：725，1978；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学(SomaticCell Genetics)7：603，1981；Graham和Van der Eb，病毒学(virology)52：456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMBOJ.1：841-45，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，同上)、和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等，焦点(Focus)15：73，1993；Ciccarone等，焦点15：80，1993)。重组多肽在培养的哺乳动物细胞中的产生公开于，例如Levinson等，美国专利4,713,339；Hagen等，美国专利4,784,950；Palmiter等，美国专利4,579,821；和Ringold，美国专利4,656,134。适合的培养哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651)、BHK(ATCC CRL 1632)、BHK 570(ATCC CRL 10314)、293(ATCCCRL 1573；Graham等，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)36：59-72，1977)、Jurkat(ATCC CRL-8129)、BaF3(来源于小鼠骨髓的白介素-3依赖性前淋巴样细胞系，见Palacios和Steinmetz，细胞41：727-34，1985；Mathey-Prevot等，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)6：4133-5，1986)和中国仓鼠卵巢细胞系(例如CHO-K1；ATCC CCL 61)。其它适合的细胞系是本领域已知的，可以从公共保藏处例如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland获得。一般地，优选强转录启动子，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。见，例如美国专利4,956,288。其它适合的启动子包括那些来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利4,579,821和4,601,978)和腺病毒的主要晚期启动子。
一般采用药物筛选来选择插有外源DNA的培养哺乳动物细胞。这些细胞通常被称作“转染子”。在有选择剂的情况中培养并能够将目的基因传递给其后代的细胞被称为“稳定转染子”。优选的选择标记是编码抗生素新霉素抗性的基因。在存在新霉素类药物例如G-418或类似物的情况下进行筛选。还可以应用选择系统以增加目的基因的表达水平，该方法称作“扩增”。扩增按以下方式进行：在有低水平的选择剂的情况下培养转染子、之后增加选择剂的量，以选择产生高水平的导入基因产物的细胞。优选的可扩增选择标记是赋予氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶。还可以使用其它药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多药物抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。可以采用引入表型改变的其它一些标记，例如绿色荧光蛋白、或CD4、CD8、I型MHC等细胞表面蛋白质、胎盘碱性磷酸酶，以便通过FACS分拣术或磁珠分离技术等手段从未转染细胞中分拣出转染细胞。
也可以采用其它高等真核细胞作为宿主，这包括植物细胞、昆虫细胞和鸟类细胞。毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为载体用于植物细胞中基因表达的综述参见Sinkar等，生物科学杂志(J.Biosci.)(Bangalore)11：47-58，1987。昆虫细胞的转化和外源多肽在其中的产生公开于Guarino等，美国专利5,162,222和WIPO公开文本WO94/06463。可以用通常来源于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。见King和Possee，杆状病毒表达系统：实验室指南(The Baculovirus ExpressionSystem：A Laboratory Guide)，London，Chapman&Hall；O’Reilly等，杆状病毒表达载体：实验室手册(Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual)，纽约，Oxford University Press，1994；和Richardson编，杆状病毒表达实验指南，分子生物学方法(BaculovirusExpressio Protocols.Methods in Molecular Biology)，Totowa，NJ，Humana Press，1995。制备重组BR43×2杆状病毒的第二种方法利用Luckow所描述的基于转座子的系统(Luckow等，病毒学杂志(J.Virol.)67：4566-79，1993)。该系统利用了转移载体，在Bac-to-BacTM试剂盒(LifeTechnologies，Rockville，MD)中有该系统出售。该系统利用含有Tn7转座子的转移载体pFastBaclTM(Life Technologies)，以使编码BR43×2多肽的DNA移动至以称为“杆粒”的大质粒形式在大肠杆菌中维持的杆状病毒基因组中。见Hill-Perkins和Possee，普通病毒学杂志71：971-6，1990；Bonning等，普通病毒学杂志75：1551-6，1994；和Chazenbalk和Rapoport，生物化学杂志270：1543-9，1995。此外，转移载体可以包括一个在表达的BR43×2多肽的C-或N-端带有编码表位标记物的DNA的符合阅读框的融合物，所述表位标记物例如Glu-Glu标记物(Grussenmeyer等，美国国家科学院院刊82：7952-4，1985)。采用本领域已知的技术，将含有BR43×2的转移载体转化至大肠杆菌中，然后筛选含有指示重组杆状病毒的中断lacZ基因的杆粒。采用普通技术分离含有该重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，并用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的细胞，例如sf9细胞。随后制备表达BR43×2的重组病毒。通过本领域通常使用的方法制备重组病毒原液。
采用该重组病毒感染宿主细胞，典型的是来源于秋粘虫草地夜蛾的细胞系。一般参见Glick和Pasternak，分子生物技术：重组DNA的原理和应用(Molecular Biotechnology：Principles and Applications)，ASMPress，Washington，D.C.，1994。另一个适合的细胞系是来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的High FiveOTM细胞系(Invitrogen)(美国专利#5,300,435)。采用商业可获得的无血清培养基培养和维持这些细胞。对于sf9细胞，适合的培养基是sf900 IITM(Life Technologies)或ESF921TM(Expression Systems)；而对于粉纹夜蛾细胞，适合的培养基是Ex-cell0405TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或Express FiveOTM(LifeTechnologies)。使这些细胞从大约2－5×105个细胞的接种密度生长至1-2×106个细胞的密度，此时以0.1-10，更典型的是接近3的感染复数(MOI)加入重组病毒原液。在可获得的实验室手册中一般都有该使用程序的描述(King和Possee，同上；O’Reilly等，同上；Richardson，同上)。随后可以采用本文所描述的方法从上清中纯化该BR43×2多肽。
真菌细胞，包括酵母细胞，也可以用于本发明。在这点上尤其有意义的酵母种类包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和Pichia methanolica。用外源DNA转化酿酒酵母细胞并从其中制备重组多肽的方法公开于例如Kawasaki，美国专利4,599,311；Kawasaki等，美国专利4,931,373；Brake，美国专利4,870,008；Welch等，美国专利5,037,743；和Murray等，美国专利4,845,075。通过选择标记确定的表型，通常是药物抗性或在缺乏特定营养物(例如亮氨酸)时的生长能力，选择转化的细胞。用于酿酒酵母的一个优选载体系统是Kawasaki等公开的POT1载体系统(美国专利4,931,373)，该系统允许通过在含有葡萄糖的培养基中的生长来选择转化细胞。用于酵母的适合启动子和终止子包括那些来自糖酵解酶基因(见例如Kawasaki，美国专利4,599,311；Kingsman等，美国专利4,615,974；和Bitter，美国专利4,977,092)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也参见美国专利4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454。用于其它酵母，包括多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母、Pichia methanolica、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和Candida maltosa，的转化系统是本领域已知的。见例如Gleeson等，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)132：3459-65，1986和Cregg，美国专利4,882,279。可以根据McKnight等，美国专利4,935,349的方法应用曲霉属(Aspergillus)细胞。Sumino等，美国专利5,162,228公开了用于转化Acremonium chrysogenum的方法。Lambowitz，美国专利4,486,533公开了用于转化链孢霉属(Neurospora)的方法。
例如，Pichia methanolica作为宿主在制备重组蛋白质中的应用公开于Raymond，美国专利5,716,808；Raymond，美国专利5,736,383；Raymond等，酵母(Yeast)14：11-23，1998；和国际公开文本WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565。用于转化P.methanolica的DNA分子通常制备成双链环状质粒，并优选在转化之前将其线性化。对于在P.methanolica中制备多肽，优选质粒中的启动子和终止子是P.methanolica基因，例如P.methanolica的醇利用基因(AUG1或AUG2)的启动子和终止子。其它有用的启动子包括二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了有利于该DNA整合至宿主染色体中，优选使质粒的完整表达片段在两个末端被宿主DNA序列所包围。用于Pichia methanolica的优选选择标记是P.mehanolica编码5-氨基咪唑核苷酸羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)的ADE2基因，该基因允许ade2宿主细胞在缺少腺嘌呤的情况下生长。对于大规模的工业程序，可能期望使甲醇的使用最小化，这时优选采用其中两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)均已缺失的宿主细胞。对于分泌蛋白质的制备，优选液泡蛋白酶(vacuolor protease)基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主细胞。采用电穿孔促使含有编码目的多肽的DNA的质粒导入P.methanolica细胞中。优选采用具有2.5-4.5kv/cm，优选大约3.75kv/cm的场强度，和1-40毫秒，最优选大约20毫秒的时间常数(t)的按指数规律衰减的脉冲电场，通过电穿孔转化P.methanolica细胞。
在本发明中，原核宿主细胞，包括大肠杆菌、芽孢杆菌属和其它属的菌株，也是有用的宿主细胞。用于转化这些宿主并在其中表达克隆的外源DNA序列的技术是本领域所熟知的(见例如Sambrook等，同上)。当在细菌例如大肠杆菌中表达BR43×2多肽时，可以将该多肽典型地作为不溶性颗粒保留在细胞质中，或可以通过细菌分泌序列指导其进入周质间隙。在前一种情况下，裂解细胞，并回收这些颗粒，然后采用例如异硫氰酸胍或尿素进行变性。之后可以通过稀释该变性剂，例如通过对尿素溶液以及还原型和氧化型谷胱甘肽的组合物进行透析，然后对缓冲盐溶液透析，使该变性多肽重新折叠并二聚化。在后一种情况中，可以通过如下步骤从周质间隙中以可溶性的功能形式回收该多肽：破坏细胞(例如通过超声或渗透震扰)以释放出周质间隙的内容物并回收该蛋白质，由此避免了对变性和重折叠的需要。
根据常规程序在含有营养物和对于所选宿主细胞的生长所必需的其它成分的培养基中，培养转化或转染的宿主细胞。多种适合培养基，包括已知成分培养基和复杂培养基，是本领域已知的，并且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基还可以含有生长因子或血清等成分。生长培养基一般通过例如药物选择，或表达载体上或共转染至宿主细胞中的选择标记所弥补的必需营养物的缺乏，对含有外来添加DNA的细胞进行选择。在含有充足碳源、氮源和痕量营养物的培养基中大约25℃-35℃培养P.methanolica细胞。通过常规手段，例如振荡小摇瓶或喷射(sparge)发酵罐，给液体培养物提供足够的通气量。对于P.methanolica，一种优选的培养基是YEPD(2％D-葡萄糖、2％BactoTM蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，MI)、1％BactoTM酵母提取物(Difco Laboratories)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸)。
表达的重组BR43×2多肽(或嵌合或融合BR43×2多肽)可以采用分级分离和/或常规纯化方法和介质纯化。优选提供高纯度形式的本发明蛋白质或多肽，即大于95％的纯度、更优选大于99％的纯度。硫酸铵沉淀和酸或离液剂提取可以被用于样品的分级分离。典型的纯化步骤可以包括羟基磷灰石、大小排阻、FPLC和反向高效液相层析。适合的阴离子交换介质包括葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特级硅胶等的衍生物。优选PEI、DEAE、QAE和Q的衍生物，尤其优选DEAE Fast-FlowSepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的层析介质包括那些用苯基、丁基或辛基衍生的介质，例如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharosse(Pharmacia)等等；或聚丙烯树脂，例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。适合的固相支持物包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂以及在其使用的条件下不会溶解的同类物质。可以用允许蛋白质通过氨基、羧基、巯基、羟基和/或糖类部分附着的活性基团来修饰这些支持物。偶联化学的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀亚胺活化、环氧化物活化、巯基活性、酰肼活化、和用于碳二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。这些和其它固相介质是本领域所熟知和广泛应用的，并可以从供应商处获得。用于使受体多肽与支持介质结合的方法是本领域所熟知的。具体方法的选择是一项常规设计，其部分取决于所选支持物的性质。见例如亲和层析：原理和方法(Affinity Chromatography：Principle&Methods)，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，瑞典，1988。
可以利用其物理性质分离本发明的多肽。例如，可以采用固定化的金属离子吸附(IMAC)层析纯化富含组氨酸的蛋白质，包括那些含有聚组氨酸标记物的蛋白质。简而言之，首先用二价金属离子挂载凝胶以形成螯合物(Sulkowski，生物化学进展(Trends in Biochem.)3：1-7，1985)。富含组氨酸的蛋白质将被吸附在该基质上，吸附亲和力随着所用金属离子的不同而不同，然后通过竞争性洗脱、降低pH或使用强鏊合剂将其洗脱下来。其它纯化方法包括通过凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白质(酶学方法，第182卷，“蛋白质纯化指导(Guide to ProteinPurification)”，M.Deutscher(编)，Acad.Press，San Diego，1990，第529-39页)。在本发明的其它实施方案中，可以构建目的多肽与亲和标记物(例如，麦芽糖结合蛋白、FLAG-标记物(Asp Tyr Lys Asp Asp AspAsp Lys(SEQ ID NO：13))、Glu-Glu标记物(Glu Glu Tyr Met Pro MetGlu(SEQ ID NO：14))、免疫球蛋白域)的融合物，以便于纯化。
可以有利地采用蛋白质的重折叠(和任选重氧化)过程。优选将该蛋白质纯化至＞80％的纯度，更优选＞90％的纯度，甚至更优选＞95％的纯度，尤其优选该蛋白质处于药用纯的状态，即就污染的大分子，尤其是其它蛋白质和核酸而言纯度大于99.9％，而且不含有感染性和致热性试剂。优选地，纯化的蛋白质基本上不含有其它蛋白质，尤其是动物来源的其它蛋白质。
BR43×2多肽或其片段也可以通过化学合成制备。BR43×2多肽可以是单体或多体；糖基化的或非糖基化的；PEG化(pegylated)或非PEG化的；而且可以包括或不包括起始甲硫氨酸残基。BR43×2多肽的实例包括长度在32-40个残基之间，具有符合如下基序的氨基酸序列：XXCX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]CXX(SEQ ID NO：10)，并且服从本文所描述的限制的多肽。
BR43×2多肽可以通过全部固相合成、部分固相方法、片段缩合或经典的溶液合成方式合成。优选通过固相肽合成，例如按Merrifield，美国化学协会杂志85：2149，1963所描述的方法，制备该多肽。该合成用α-氨基端受保护的氨基酸来进行。具有不稳定侧链的三功能氨基酸也用适合的基团保护起来，以避免在该多肽的组装期间发生不需要的化学反应。选择性地除去该α-氨基保护基团以允许在该氨基端继续随后的反应。用于除去该α-氨基保护基团的条件并不除去该侧链保护基团。
该α-氨基保护基团是已知在逐步多肽合成领域中有用的那些基团。包括酰基类保护基团(例如甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳基类保护基团(例如生物素基)、芳香氨基甲酸酯(urethane)类保护基团(例如苄氧基羰基(Cbz)、取代的苄氧基羰基和9-芴甲氧基羰基(Fmoc))、脂肪族氨基甲酸酯保护基团(例如，t-丁氧基羰基(tBoc)、异丙氧基羰基、环己基氧基羰基)和烷基类保护基团(例如苯甲基、三苯甲基)。优选的保护基团是tBoc和Fmoc。
所选择的侧链保护基团必须在偶联期间保持完整，并且在氨基端保护基团的脱保护期间或在偶联情况中不会被除去。该侧链保护基团还必须能在合成完成后能够在不改变最终多肽的反应条件下被除去。在tBoc化学中，三功能氨基酸的侧链保护基团大多数是以苯甲基为基础的。在Fmoc化学中，它们大多数是以叔丁基或三苯甲基为基础的。
在tBoc化学中，优选的侧链保护基团对于精氨酸是甲苯磺酰基，对于天门冬氨酸是环己基，对于半胱氨酸是4-甲基苄基(和乙酰氨基甲基)，对于谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸是苄基，对于组氨酸是苄氧基甲基(和二硝基苯基)，对于赖氨酸是2-Cl-苄氧基羰基，对于色氨酸是甲酰基，对于酪氨酸是2-溴苄基。在Fmoc化学中，优选的侧链保护基团对于精氨酸是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)或2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，对于天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺和组氨酸是三苯甲基，对于天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是叔丁基，对于赖氨酸和色氨酸是tBoc。
对于磷酸肽的合成，可以直接或在组装后掺入磷酸基团。在直接掺入策略中，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸上的磷酸基在Fmoc化学中可以通过甲基、苄基或叔丁基来保护，而在tBoc化学中可以通过甲基、苄基或苯基来保护。在Fmoc化学中，还可以采用直接掺入没有对磷酸保护的磷酸酪氨酸。在组装后掺入策略中，在固相上用二叔丁基-、二苄基-、或二甲基-N，N’-二异丙基-亚磷酰胺衍生化丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的未保护羟基基团，然后通过叔丁基氢过氧化物进行氧化。
固相合成通常通过α-氨基保护的(侧链保护的)氨基酸与适合的固相支持物偶联从羧基端开始进行。当与氯甲基、氯三苯甲基或羟甲基树脂附着时，形成酯键，并且所获多肽将在C端具有游离的羧基基团。或者，当采用酰胺树脂例如二苯甲基胺或对二苯甲基胺树脂(对于tBoc化学)和Rink酰胺或PAL树脂(对于Fmoc化学)时，形成酰胺键，而且所获多肽将在C端具有氨甲酰基。这些树脂，无论是以聚苯乙烯-或是聚酰胺为基础的还是聚乙二醇接枝的，带有或不带柄或接头的，以及带有或不带有第一个附着氨基酸的，均可以从商业途径获得，它们的制备描述于Stewart等，“固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)”(第二版)，(Pierce Chemical公司，Rockford，IL，1984)；和Bayer和Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3，1986；和Atherton等，固相肽合成：实践方法(Solid Phase Peptide Synthesis：APractical Approach)，IRL Press，Oxford，1989。
采用各种活化剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)和羰基二咪唑(CDI)，将C端氨基酸(如果必需的话侧链和α-氨基基团受到保护)附着在羟甲基树脂上。该C端氨基酸可以以其铯四甲基铵盐(cesium tetramethylammonium salt)的形式，或在有三乙基胺(TEA)或二异丙基乙基胺(DIEA)存在时，直接与氯甲基或氯三苯甲基树脂结合。第一个氨基酸和酰胺树脂的结合与在偶联反应过程中的酰胺键形成相同。
在与树脂支持物结合后，依据保护化学(例如tBoc、Fmoc)采用各种试剂去除α-氨基保护基团。Fmoc的去除程度可以在300-320nm或通过电导池监测。除去α-氨基保护基团后，将剩余的被保护氨基酸按要求的序列逐步地进行偶联，以获得期望序列。
有多种活化试剂可以用于该偶联反应，包括DCC、DIPCDI、六氟磷酸2-氯-1，3-二甲基酰亚铵(dimethylimidum)(CIP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)-膦(BOP)和它的吡咯烷类似物(PyBOP)、六氟磷酸溴-三吡咯烷-膦(PyBrOP)、六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)(HBTU)和它的四氟硼酸盐类似物(TBTU)或它的吡咯烷类似物(HBPyU)、六氟磷酸0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(HATU)和它的四氟硼酸盐类似物(TATU)或它的吡咯烷类似物(HAPyU)。在偶联反应中使用的最普通催化添加剂包括4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HODhbt)、N-羟基苯并三唑(HOBt)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)。每一种被保护的氨基酸均过量使用(＞2.0当量)，并且偶联常常在N-甲基吡咯烷酮(NMP)或在DMF、CH2Cl2或它们的混合物中进行。偶联反应的完成程度可以通过例如Kaiser等(分析生物化学(Anal.Biochem.)34：595，1970)所描述的茚三酮反应在每一个阶段进行监测。
在完成期望肽的完全组装之后，用带有适当清除剂的试剂裂解肽-树脂。通常Fmoe肽用带有清除剂(例如H2O、乙二硫醇(ethanedithiol)、酚和苯硫基甲烷)的TFA进行裂解和去保护。tBoc肽通常采用液体HF在-5℃至0℃作用1-2个小时来进行裂解和去保护，该反应使得多肽从树脂上裂解下来并除去大多数侧链保护基团。清除剂，例如苯甲醚、二甲硫和对甲苯硫酚，通常与液体HF一起使用，以防止在裂解过程中形成的阳离子对多肽中的氨基酸残基进行烷基化和酰基化。在HF裂解前需要通过DMF中的哌啶和苯硫基分别将色氨酸的甲酰基和组氨酸的二硝基苯基除去。可以通过乙酸汞(II)除去半胱氨酸的乙酰氨基甲基，或者是通过碘、三氟乙酸铊(III)或四氟硼酸银将其除去并同时将半胱氨酸氧化成胱氨酸。用于tBoc肽裂解和去保护的其它强酸包括三氟甲磺酸(TFMSA)和三甲基硅烷三氟乙酸酯(TMSOTf)。
本发明还提供各种其它多肽融合物和含有一个或多个多肽融合物的相关多聚体蛋白质。可以将可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽表达为带有一个含有两个恒定区结构域但缺少可变区的免疫球蛋白重链恒定区(典型的是Fc片段)的融合物。制备这些融合物的方法公开于美国专利5,155,027和5,567,584。这些融合物典型的是作为多聚体分子进行分泌的，其中Fc部分相互之间形成二硫键，而两个非Ig多肽彼此紧接排列。可以在遗传工程细胞中表达免疫球蛋白-BR43×2(TACI或BCMA)多肽融合物，以产生多种多聚体BR43×2类似物。可以将辅助功能域与BR43×2(TACI或BCMA)多肽融合，使其导向特定细胞、组织或高分子。还可以按本文所讨论的采用毒素来制备融合物。以此方式，可以将多肽和蛋白质定向，用于治疗或诊断目的。BR43×2多肽可以和两个或更多个部分融合，例如用于纯化的亲和标记物和靶向功能域。多肽融合物还可以含有一个或多个切割位点，尤其是在域之间。见，Tuan等，Connect.Tiss.Res.34：1-9，1996。该类型的融合物还可以用于例如从溶液中亲和纯化相关配体、作为体外分析工具、在体外通过特异滴定配体阻断信号、与细胞表面配体结合、或作为BR43×2的体内拮抗剂并通过施用阻断配体的刺激作用。对于在分析试验中的应用，可以将该融合蛋白质通过Fc区与支持物结合，并应用在ELISA中。
本发明还提供用于和亲和标记物或标签形成融合蛋白的可溶性BR43×2受体和多肽片段。可溶性BR43×2-亲和标记物融合蛋白可以用于例如鉴定BR43×2配体、以及天然配体的激动剂和拮抗剂。采用标记的可溶性BR43×2，通过荧光免疫细胞计量术或免疫组织化学可鉴定表达该配体、激动剂或拮抗剂的细胞。该可溶性融合蛋白在研究该配体在组织或特异细胞系上的分布，和提供对受体/配体生物学的理解方面是有用的。
为了纯化配体、激动剂或拮抗剂，在有利于受体/配体结合的条件下(典型的是接近生理的温度、pH和离子强度)，将BR43×2-Ig融合蛋白加入至含有该配体、激动剂或拮抗剂的样品中。然后通过与固定在固相支持物(例如不溶性树脂珠)上的A蛋白质混合，分离该受体/配体复合物。然后采用常规化学技术，例如用盐或pH梯度，洗脱该配体、激动剂、拮抗剂。在另一个可替代的方法中，将该融合蛋白本身结合在固相支持物上，并按上述进行结合和洗脱。用于将受体多肽固定在固相支持物上的方法是本领域已知的，这些固相支持物例如琼脂糖、交联琼脂糖、玻璃、纤维素树脂、硅基树脂、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺、或在使用条件下稳定的类似材料的颗粒。用于多肽与固相支持物连接的方法是本领域已知的，包括胺类化学、溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、和酰肼活化。所获介质一般被制成柱形，然后将含有配体的液体流过该柱一或多次，以允许配体与该受体多肽结合。然后采用盐浓度、离液剂(MnCl2)、或pH的改变破坏配体一受体结合，以洗脱该配体。
为了指导该可溶性受体导出宿主细胞，将该可溶性受体DNA与编码分泌肽如t-PA分泌肽的第二个DNA片段连接在一起。为了有利于该分泌受体域的纯化，可以在该受体多肽上融合一个N-或C-端突出片段如亲和标记物、或可以获得其抗体或其它特异结合剂的另一种多肽或蛋白质。
表达本发明的功能性可溶和膜结合受体的细胞可以用于筛选分析试验中。本领域已知多种适合的分析试验。这些试验以检测靶细胞中的生物学应答为基础。与对照值相比代谢上的改变指示测试化合物是否调节BR43×2所介导的代谢。一个这样的分析试验是细胞增殖分析试验。在有或无测试化合物时培养细胞，然后通过例如测量含氚胸苷的掺入，或通过基于溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)的代谢降解的比色分析法，检测细胞的增殖(Mosman，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)65：55-63，1983)。另一种替代分析方案采用经进一步改造表达报道基因的细胞。将该报道基因与响应该受体相连途径的启动子元件连接在一起，然后该试验检测该报道基因的转录激活。易于在细胞提取物中分析的许多报道基因是本领域已知，例如大肠杆菌的lacZ、氯霉素乙酰转移酶(CAT)和血清效应元件(SRE)(见例如Shaw等，细胞(Cell)56：563-72，1989)。优选的这类报道基因是萤光素酶基因(de Wet等，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)7：725，1987)。萤光素酶基因的表达可以采用本领域已知的方法通过萤光来检测(例如Baumgartner等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：29094-101，1994；Schenborn和Goiffin，Promega Notes 41：11，1993)。萤光素酶活性分析试剂盒可以从商业途径获得，例如从Promega公司，Madison，WI获得。可以采用该类型的靶细胞系来筛选化学制品文库、细胞条件培养基、真菌培养液、土壤样品和水样品等。例如，可以在靶细胞上对一系列细胞条件培养基样品进行分析，以鉴定产生配体的细胞。然后用阳性细胞制备处于哺乳动物表达载体中的cDNA文库，将此cDNA文库分成多个库(pool)，转染宿主细胞并表达。然后分析来自转染细胞的培养基样品，然后再次对这些库进行划分、再转染、继代培养，并再次分析阳性细胞以分离编码该配体的克隆eDNA。
还可以有利地利用一种使用了结合配体的受体(或抗体、互补物/抗互补物对的一个成员)或其结合片段，以及商业途径可获得的生物传感器装置(BIAcoreTM，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)的分析系统。该受体、抗体、互补物/抗互补物对的成员或片段被固定在受体芯片的表面上。该装置的应用公开于Karlsson，免疫方法杂志145：229-40，1991和Cunningham和Wells，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)234：554-63，1993。例如，采用胺或巯基化学，将BR43×2多肽、片段、抗体或互补物/抗互补物对的成员与流动吸收池中和金箔结合的葡聚糖纤维共价连接。使测试样品流经该吸收池。如果样品中存在配体、表位、或相对的互补物/抗互补物对成员时，其将分别与固定化的受体、抗体或成员结合，造成介质折射率的改变，这可以以金箔表面胞质团共振(surfaceplasmon resonance)的改变来检测。该系统允许确定结合和解离速率(on-and off-rates)，由此可以计算出结合亲和力，并对结合的化学计量进行估算。结合配体的受体多肽还可以用于本领域已知的其它分析系统。这些系统包括用于测定结合亲和力的斯卡查德分析(见Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-72，1949)和量热分析试验(Cunningham等，科学253：545-48，1991；Cunningham等，科学245：821-25，1991)。
图2显示了可溶性I125-ztnf4与TACI和BCMA结合的斯卡查德图分析，并且在表7中和TNFR家族其它成员的结合常数作了比较。
                           表7
配体       Kd M   细胞来源   参考文献
TNFa高     7.14E-11     HL-60     a
TNFa低     3.26E-10     HEP-2     a
TNFa高     2.00E-10     HL-60     b
CD27L     3.70E-10     MP-1     c
CD27L     8.30E-09     MP-1     c
CD40L     5.00E-10     EL40.5     d
CD40L     1.00E-09     EBNA     d
(125I-CD40)
4-1BBL     1.16E-09     Biocore     e
抗41BBmab     4.14E-10     Biocore     e
可溶性ztnf4     1.11E-09     TACI-BHK
可溶性ztnf4     1.25E-09     BCMA-BHK
a Hohmann等，生物化学杂志264：14927-34，1989b Manna和Aggarwal，生物化学杂志273：33333-41，1998c Goodwin等，细胞73：447-56，1993d Armitage等，自然357：80-82，1992e Shuford等，J.Exp.Med.186：47-55，1997
作为受体，BR43×2多肽的激活可以通过硅基生物传感器微生理功能测定仪(microphysiometer)对与受体结合及随后的生理学细胞反应相关的细胞外酸化速率或质子外排的测量来确定。一个典型装置是Molecular Devices(Sunnyvale，CA)所制造的CytosensorTMMicrophysiometer。各种细胞反应，例如细胞增殖、离子转运、能量产生、炎症反应、调节和受体激活等，均可以通过该方法测量。见例如McConnell等，科学257：1906-12，1992；Pitchford等，酶学方法228：84-108，1997；Arimilli等，免疫学方法杂志212：49-59，1998；VanLiefde等，欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)346：87-95，1998。该微生理功能测定仪能够用于分析粘附或非粘附真核或原核细胞。通过测量细胞培养基中一段时间内细胞外的酸化改变，该微生理功能测定仪直接测量了细胞对各种刺激包括BR43×2多肽的激动剂、配体或拮抗剂的反应。优选将该微生理功能测定仪用于与不表达BR43×2多肽的对照真核细胞进行比较测量表达BR43×2的真核细胞的反应。表达BR43×2的真核细胞包含按本文所述通过转染BR43×2产生的响应调节BR43×2的刺激物的细胞；或天然表达BR43×2的细胞，例如来源于脾脏组织的表达BR43×2的细胞。通过细胞外的酸化改变测量的差异，例如表达BR43×2的细胞相对于对照在反应上的增加或降低，是对BR43×2所介导的细胞反应的一种直接测量。而且，可以在多种刺激物作用下分析这些BR43×2介导的反应。采用该微生理功能测定仪，还提供了一种鉴定BR43×2多肽的激动剂和拮抗剂的方法，包括：提供表达BR43×2多肽的细胞，在没有测试化合物的条件下培养该细胞的第一部分，在有测试化合物的条件下培养该细胞的第二部分，并检测该细胞第二部分相对于该细胞第一部分在细胞反应上的改变，例如增强或降低。细胞反应的改变表现为可测量的细胞外酸化速率的改变。采用该方法可以快速鉴定BR43×2多肽的拮抗剂和激动剂。
可溶性BR43×2在研究配体在组织或特异细胞系上的分布，和提供对受体/配体生物学的理解方面是有用的。还可以将TNF受体对其配体的特异性用作破坏携带配体的靶细胞的一种机制。例如，可以将毒性化合物与BR43×2可溶性受体或BR43×2融合物偶联。毒性化合物的例子包括失活靶细胞的放射性药物；化疗剂例如阿霉素、柔红霉素、氨甲蝶呤和环磷酰胺；毒素例如篦麻毒素、白喉毒素、假单孢菌外毒素A和相思豆毒蛋白；和细胞毒性T细胞表面分子的抗体。
通过FACS分析(流式细胞计量和分拣术(Flow Cytometry andSorting)，Melamed等编，Wiley-Liss，1990；以及免疫荧光和细胞分拣术，当代免疫学实验指南(Immunofluorescence and Cell Sorting.Current Protocols in Immunology)，第1卷，Coligan等编，John Wiley&Son，1997)，已发现ztnf4(5ng/ml)可以与BR43×2(SEQ ID NO：2)、TACI(SEQ ID NO：6)、BCMA(SEQ ID NO：8)和BR43×1(SEQ ID NO：9)结合。采用FACS分析，FITC标记的可溶性ztnf4还表现出，尤其是与PBMNC、扁桃体细胞中的B淋巴细胞，以及与B细胞淋巴瘤细胞系(Ra.ji细胞，伯基特氏人淋巴瘤，ATCC CCL86)、Ramos(伯基特氏淋巴瘤细胞系，ATCC CRL-1596)、Daudi(伯基特氏人淋巴瘤，ATCC CCL213)和RPMI1788(一种B淋巴细胞细胞系，ATCC CCL-156)的特异结合。未观察到与HL-60(ATCC一种前髓细胞，ATCC CCL-240)的结合。通过用针对B细胞特异分子包括CD19、IgD、IgM和CD20的抗体进行的共染色，验证了与来自PBMNC和扁桃体细胞的B细胞的结合特异性。ztnf4与CD40L的相似性提示存在比所观察到的更广的组织分布。例如，采用细胞因子增殖和T细胞增殖分析在单核细胞、树突细胞和纯化的T细胞上检测到ztnf4的亲和性，而在检测的任何其它类型细胞上均未能检测到ztnf4的结合或任何其它的生物学影响。因此，由该配体和受体导致的对B细胞的特异性提示，该配体和受体对于自身免疫、B细胞癌症、免疫调节、IBD和诸如ITCP、重症肌无力等的任何抗体介导病变、肾疾病、间接T细胞免疫应答、移植排斥、移植物抗宿主疾病的研究和治疗是有用的。
在体外，ztnf4表现出对B细胞的激活，导致B细胞增殖、抗体产生和激活标记的上调(例如参见下文)。这些作用可能需要IL-4或其它细胞因子的共刺激，或经过B细胞抗原受体或其它激活B细胞的细胞表面受体例如CD40的刺激。其它肿瘤坏死因子配体，例如gp39和TNFβ，也刺激B细胞增殖。因此，可以在免疫应答期间将本发明的多肽定向以特异调节B细胞应答，抑制激活的B细胞，而不影响其它细胞群体，这在疾病的治疗中是有利的。此外，本发明的多肽还可以用于调节B细胞发育、其它细胞的发育、抗体的产生和细胞因子的产生。BR43×2多肽还可以用于诱导细胞凋亡和/或细胞的无变应性。本发明的多肽还可以通过中和ztnf4的增殖作用调节T和B细胞的通讯。可以进行生物测定和ELISA以测量在有可溶性BR43×2、TACI和/或BCMA时细胞对ztnf4的反应。其它测定试验包括测量细胞因子产生的改变作为一种细胞反应量度的那些试验(见例如当代免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)，John E.Coligan等编，NIH，1996)，以及测量其它的细胞反应，包括抗体同种型、单核细胞激活、NK细胞形成、抗原呈递细胞的功能、细胞凋亡的试验。
本发明的BR43×2多肽可以通过中和ztnf4的作用，用于治疗前B细胞白血病或B细胞白血病例如浆细胞白血病、慢性或急性淋巴细胞白血病；骨髓瘤例如多发性骨髓瘤、浆细胞性骨髓瘤、内皮细胞性骨髓瘤和巨细胞性骨髓瘤；以及淋巴瘤例如与ztnf4多肽的增加相关的非Hodgkins淋巴瘤。在用于抑制肿瘤发展和存活的治疗方案中可溶性BR43×2将是有用的成分。
Northern印迹分析显示，CD8+细胞、单核细胞、树细胞(dendrocyte)、激活的单核细胞中表达ztnf4。这提示，在某些自身免疫疾病中，细胞毒性T细胞可能通过过量产生ztnf4刺激了B细胞的产生。选择性阻断B淋巴细胞作用的免疫抑制蛋白质在治疗疾病中将是有用的。对于几种自身免疫病而言自体抗体(autoantibody)的产生是很普通的，其促进了组织的破坏和疾病的恶化。自体抗体还能够导致免疫复合物沉积并发症的发生，和引起包括肾衰竭、神经痛症状和死亡在内的许多系统性红斑狼疮症状。调节独立于细胞应答的抗体产生在许多疾病状态中也是有益的。在类风湿性关节炎中B细胞还表现出在引起关节炎的(arthritogenic)免疫球蛋白的分泌中起作用(Korganow等，免疫(immunity)10：451-61，1999)。因而，在重症肌无力和类风湿性关节炎等自身免疫病的治疗中，ztnf4对抗体产生的抑制将是有益的。免疫抑制治疗方法，例如选择性阻断或中和B淋巴细胞作用的可溶性BR43×2，将可以用于这些目的。为了验证本发明的BR43×2可溶性受体多肽的这些能力，采用本领域已知的和本文所描述的分析试验来评价这些BR43×2多肽。
本发明提供应用BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗体、激动剂或拮抗剂选择性阻断或中和与终末期肾脏病(其与自身免疫病可能相关或不相关)相关的B细胞作用的方法。这些方法对于治疗免疫性肾疾病是有用的。这些方法对于治疗与如下疾病相关的肾小球肾炎也将是有用的，这些疾病例如膜性肾病、IgA肾病或Berger氏疾病、IgM肾病、Goodpasture氏疾病、感染后肾小球肾炎、肾小球膜增生疾病(mesangioproliferative disease)、最小改变肾病综合征(minimalchange nephrotic syndrome)。对于治疗与如下疾病相关的继发性肾小球性肾炎或脉管炎，这些方法还可以作治疗性应用，这些疾病例如狼疮、多动脉炎、Henoch-Schonlein病、硬皮病、HIV相关的疾病、淀粉样变性病或溶血性尿毒症综合征。对于治疗与慢性肾盂肾炎、止痛剂滥用、肾钙沉着症、其它药剂引起的肾病、肾结石、或慢性或急性间质性肾炎相关的间质性肾炎或肾盂肾炎，本发明的这些方法也可以用作治疗应用的一部分。
本发明的这些方法还包括应用BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗体、激动剂或拮抗剂治疗包括肾动脉狭窄或闭塞和胆固醇栓或肾栓在内的高血压疾病或大血管(large vessel)疾病。
本发明还提供用于诊断和治疗肾肿瘤或泌尿道肿瘤(urologicalneoplasm)、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病或淀粉样变性病的方法。
本发明还提供使用BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗体、激动剂或拮抗剂阻断或抑制激活的B细胞，以治疗哮喘和其它慢性呼吸道疾病例如支气管炎和肺气肿的方法。
本发明还提供使用BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗体、激动剂或拮抗剂抑制或抵消效应T细胞应答，用于免疫抑制，尤其是对于移植物抗宿主疾病和移植排斥等的治疗的方法。还可以在免疫应答的调节，尤其是淋巴细胞的激活和调节方面找到其它的用途。BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗体、激动剂或拮抗剂在治疗免疫缺陷的疗法中将是有用的。BR43×2、TACI或BCMA多肽、融合物、抗体、激动剂或拮抗剂在用于治疗诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和Crohn氏病等自身免疫病的治疗方案中将是有用的。本发明的方法对于治疗慢性炎症疾病，尤其是减轻关节疼痛、肿胀、贫血和其它相关症状，以及治疗败血症性休克将也具有治疗价值。
可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽和融合蛋白对于免疫应答的作用可以通过以下方式来测定：给经抗原免疫并随后注射过ztnf4的动物使用本发明的多肽，并根据本领域的已知方法测量抗体同种型的产生、包括迟发性过敏反应和体外增殖在内的B和T细胞应答、和细胞因子的产生。
因此，本发明提供在哺乳动物中抑制ztnf4活性的方法，包括给所述动物施用一定量的选自下组的化合物：a)SEQ ID NO：4的多肽；b)SEQ IDNO：8的多肽；c)融合蛋白；d)SEQ ID NO：6第1位至166位氨基酸残基的多肽；e)SEQ ID NO：8第1位至150位氨基酸残基的多肽；f)与SEQ IDNO：4的多肽特异结合的抗体或抗体片段；和g)与SEQ ID NO：10的多肽特异结合的抗体或抗体片段。融合蛋白的例子包括可溶性BR43×2(SEQ IDNO：4)、TACI(SEQ ID NO：6的第1-166位氨基酸残基)或BCMA(SEQ IDNO：8的第1-150位氨基酸残基)与另一多肽，优选免疫球蛋白重链恒定区Fc片段的融合物。同样地，本发明提供抑制BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合的方法。
这些方法在ztnf4活性与激活的B淋巴细胞相关的地方，以及对于治疗前B细胞或B细胞癌症将尤其有用。这些方法在ztnf4活性与抗体的产生，尤其是与自身免疫病例如系统性红斑性狼疮、重症肌无力或类风湿性关节炎相关的抗体产生相关的地方也将是有用的。
本发明还提供BR43×2激动剂和拮抗剂。鉴定为BR43×2激动剂的化合物对于体外和体内调节靶细胞的增殖和发育是有用的。例如，激动剂化合物单独或联合其它细胞因子和激素可以用作已知成分细胞培养基的成分。因此，激动剂在特异调节培养中携带BR43×2的B淋巴细胞的生长和/或发育方面是有用的。激动剂和拮抗剂还可以用于研究B淋巴细胞的效应子功能、尤其是B淋巴细胞的激活和分化。拮抗剂可以用作研究配体-受体相互作用性质的研究试剂。
鉴定为BR43×2拮抗剂的化合物也可用于加强体液免疫应答。在对抗感染性疾病包括细菌、病毒、原生动物和寄生虫感染中，B细胞应答是重要的。抗感染性微生物的抗体能够通过结合抗原使病原体固定，随后发生补体介导的溶解或细胞介导的攻击。BR43×2拮抗剂将起到增强体液应答的作用，并且对于有患感染性疾病危险的个体将是一种有用的治疗剂，或可以用作疫苗接种的补充。
本发明还提供或者与BR43×2多肽，或者与BR43×2多肽结合的配体结合的拮抗剂，籍此抑制或消除BR4×2的功能。这些BR43×2拮抗剂将包括抗体；与BR43×2多肽或其配体结合的寡核苷酸；保留了与该受体结合的能力但又不导致配体或受体的信号传导的天然或合成BR43×2配体类似物。这些类似物可以是肽或肽样化合物。与BR43×2多肽结合并阻止信号传导的天然或合成小分子也被认为是拮抗剂。因而，BR43×2拮抗剂可以用作治疗剂以治疗阻断来自BR43×2受体或配体的信号对治疗有益的某些疾病。拮抗剂可以用作研究配体-受体相互作用性质的研究试剂。在转化的B细胞系包括EBV诱导的和自发的伯基特氏淋巴瘤和几种B细胞骨髓瘤上有BR43×2的表达。在B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤的治疗中抑制BR43×2的功能将是有用的。BR43×2可溶性受体或抗体等BR43×2拮抗剂可以在治疗上用以调节肿瘤的发展进程。
激动剂和拮抗剂的活性可以通过确定受体/配体啮合效力的活性测定试验来确定。制备表达BR43×2、并共表达高水平的NfkB、NFAT-1和AP-1报道基因结构的稳定转染B细胞系，例如Baf3(一种鼠源前B细胞系，Palacios和Steinmetz，同上；和Mathey-Prevot等，同上)。还以相似方式在Jurkat和其它B淋巴瘤细胞系中制备了表达TACI和BCMA的细胞系。发现ztnf4使信号传导经过了这些结构中的报道基因。可溶性BR43×2和抗体可以用以测量结合。
用于分析本发明蛋白质的体内方法涉及病毒递送系统。用于该目的的病毒实例包括腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒和腺相关病毒(AAV)。腺病毒是一种双链DNA病毒，是目前用于异源核酸递送的研究最深入的基因转移载体(综述参见Becker等，细胞生物学方法(Meth.Cell Biol.)43：161-89，1994；和Douglas和Curiel，科学和医学(Science&Medicine)4：44-53，1997)。腺病毒系统提供了几个优点：腺病毒能够(i)容纳相对大的DNA插入片段；(ii)生长至高滴度；(iii)感染广谱的哺乳动物细胞类型；并且(iv)与含有不同启动子的大量可获得的载体一起使用。而且，由于腺病毒在血流中是稳定的，所以能够通过静脉注射来施用。
通过缺失腺病毒基因组的各部分，能够容纳较大的异源DNA插入片段(高达7kb)。这些插入片段可以通过直接连接或通过与共转染的质粒同源重组掺入到病毒DNA中。在一个示例性系统中，从病毒载体中缺失了必需E1基因，除非通过宿主细胞(人293细胞系是一个示例)提供该E1基因否则该病毒将不会复制。当给完整动物进行静脉内施用时，腺病毒主要靶向肝脏。如果腺病毒递送系统带有E1基因缺失，则该病毒在宿主细胞中不能复制。然而，宿主的组织(例如肝脏)将表达和加工(如果存在信号序列的话，并分泌)该异源蛋白质。在高度血管化的肝脏中分泌的蛋白质将进入血液循环，并且能够确定其对感染动物的作用。
腺病毒系统还可以用于体外产生蛋白质。通过在细胞不会进行快速分裂的条件下培养腺病毒感染的非293细胞，该细胞能够在较长的时间内产生蛋白质。例如，在细胞工厂中使BHK细胞生长至汇合，然后将其暴露给编码目的分泌蛋白质的腺病毒载体。然后在允许感染细胞存活几周但又不显著发生细胞分裂的无血清条件下培养细胞。或者，可以在悬浮培养中以相对高的细胞密度培养腺病毒载体感染的293S细胞，以产生相当多量的蛋白质(见Garnier等，细胞技术(Cytotechnol.)15：145-55，1994)。使用任一种操作，均可以从细胞培养上清液中重复分离出表达的分泌异源蛋白质。在感染的293S细胞的生产操作中，还可以有效地获得非分泌蛋白质。
可以利用建立好的动物模型体内测试在某些疾病状态中本发明可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽的有效性。尤其是，可以在许多自身免疫病动物模型，例如用作SLE(系统性红斑性狼疮)模型的MRL-lpr/lpr或NZB×NZW F1同类小鼠品系中，体内测试可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽和多肽片段。这些动物模型是本领域已知的，见例如自身免疫病模型：指南(Autoimmune Disease Models A Guidebook)，Cohen和Miller编，Academic Press。新西兰黑鼠(NZB)和新西兰白鼠(NZW)之间的杂交后代出现与人类SLE极为相象的自发形式SLE。该后代小鼠称为NZBW，在1月龄时开始产生对抗T细胞的IgM自体抗体，并且到5-7月龄时，Ig抗DNA自体抗体是主要的免疫球蛋白。多克隆B细胞的活动过强导致自体抗体的过度产生。这些自体抗体，尤其是针对单链DNA的自体抗体的沉积与在临床上表现为蛋白尿、氮血和肾衰竭死亡的肾小球肾炎的发生相关。在自然性SLE感染的小鼠中，肾衰竭是最主要的死亡原因，在NZBW品系中，该过程是慢性和不明显的。该疾病在雌性中比在雄性中发展更快而且更为严重，平均存活仅245天，而相比较雄性平均存活406天。尽管许多雌性小鼠到7-9月龄时表现出症状(蛋白尿)，但一些会在年龄更小或更大时出现症状。在NZBW小鼠中观察到的致命性免疫肾炎与人类SLE中所观察到的肾小球性肾炎极为相似，使得该自发性鼠模型对于测试可能的SLE治疗剂具有很大的吸引力(Putterman和Naparstek，自发性系统性红斑狼疮的鼠模型(Murine Models of Spontaneous SystemicLupus Erythematosus)，自身免疫病模型：指南，第14章，第217-34页，1994；Mohan等，免疫学杂志(J.Immunol.)154：1470-80，1995；和Daikh等，免疫学杂志159：3104-08，1997)。给这些小鼠施用可溶性TACI-IG、BR43×2-Ig、BCMA-Ig或其它可溶性融合蛋白质，以评价TACI、BR43×2或BCMA改善症状和改变病程的有效性，这将在以下实施例部分进行描述。
实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型已用作研究免疫所介导疾病的机制和可能的治疗干预方法的工具。该模型与人类多发性硬化症相似，并且由于针对神经蛋白例如髓鞘碱性蛋白(MBP)或蛋白脂质蛋白(PLP)的T细胞激活而产生脱髓鞘。用抗原接种导致CD4+、II型MHC限制性T细胞(Th1)的诱导产生。对产生EAE的方法进行修改可以产生该模型的急性、慢性-复发或被动传递变体形式(Weinberg等，免疫学杂志162：1818-26，1999；Mijaba等，细胞免疫学(Cell Immunol.)186：94-102。1999；和Glabinski，酶学方法288：182-90，1997)。给这些小鼠施用可溶性TACI-IG、BR43×2-Ig、BCMA-Ig或其它可溶性融合蛋白质，以评价TACI、BR43×2或BCMA改善症状和改变病程的有效性，这将在以下实施例部分进行描述。
在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠产生与人类类风湿性关节炎(RA)极为相似的慢性炎症性关节炎。由于CIA与RA具有相似的免疫学和病理学特征，所以这使得该模型成为筛选潜在的人类抗炎症化合物的理想模型。采用该CIA模型的另一个优点是发病机理是已知的。已经鉴定了II型胶原蛋白上的T和B细胞表位，并且确定了与免疫介导的关节炎有关的各种免疫学(迟发型超敏反应和抗胶原蛋白抗体)和炎症(细胞因子、趋化因子、和基质降解酶)参数，并且这些参数可以用于评价测试化合物在这些模型中的有效性(Wooley，Curr.Opin.Rheum.3：407-20，1999；Williams等，免疫学(Immunol.)89：9784-788，1992；Myers等，生命科学(Life Sci.)61：1861-78，1997：和Wang等，免疫学92：8955-959，1995)。给这些小鼠施用可溶性TACI-IG、BR43×2-Ig、BCMA-Ig或其它可溶性融合蛋白质，以评价TACI、BR43×2或BCMA改善症状和改变病程的有效性，这将在以下实施例部分进行描述。
给小鼠注射卵白蛋白并用在支气管中引起与哮喘相似的哮喘性反应的抗原经鼻进行再次刺激后，可以产生支气管感染例如哮喘的模型。给这些小鼠施用可溶性TACI-IG、BR43×2-Ig、BCMA-Ig或其它可溶性融合蛋白质，以评价TACI、BR43×2或BCMA改善症状和改变病程的有效性，这将在以下实施例部分进行描述。
在体模型的另一个应用包括对所述动物进行抗原刺激(antigenchallenge)，之后施用可溶性BR43×2(TACI)或其配体ztnf4并测量T和B细胞应答。
T细胞依赖性和T细胞不依赖性免疫应答可以按Perez-Melgosa等，免疫学杂志163：1123-7，1999中所描述的方法进行测量。
可以在接受了规划的抗原攻击(例如，卵白蛋白或胶原蛋白)之后施用了BR43×2、TACI或BCMA多肽或可溶性Ig-融合物的动物中引起免疫应答，以测量对B细胞应答的影响。
可以将药代动力学研究与放射性标记的可溶性BR43×2、TACI或BCMA多肽或融合物联合使用，以确定这些多肽在体内的分布和半衰期。此外，还可使用动物模型确定体内可溶性BR43×2、TACI或BCMA对肿瘤和肿瘤发展的影响。
本发明还提供BR43×2、TACI或BCMA多肽作为替代标记(survogatemarker)在自身免疫病、肾疾病、B和T细胞疾病中的应用。可以抽取这些患者的血液，然后可以在血液中检测BR43×2、TACI或BCMA可溶性受体和它们的配体。
本发明还提供抗体。可以采用例如含有目的多肽的表达载体的产物或从天然来源分离的多肽作为抗原来获得针对BR43×2或具有SEQ ID NO：8氨基酸序列的肽的抗体。与BR43×2或具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的肽“特异性结合”的抗体尤其有用。如果抗体与BR43×2多肽或SEQ ID NO：8的多肽、肽或表位结合的结合亲和力(Ka)为106M-1或更高，优选107M-1或更高，更优选108M-1或更高，最优选109M-1或更高，则该抗体被认为是特异性结合。抗体的结合亲和力可以由本领域的普通技术人员通过例如斯卡查德分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660，1949)容易地确定。适合的抗体包括与BR43×2，尤其是BR43×2的胞外域(SEQ ID NO：2的第1-120位氨基酸残基)结合的抗体，和那些与具有SEQ ID NO：10之氨基酸序列的多肽结合的抗体。
抗BR43×2抗体可以采用带有抗原性BR43×2表位的肽和多肽来制备。本发明带有抗原性表位的肽和多肽含有SEQ ID NO：2中的至少9个，优选15至大约30个氨基酸的序列。然而，含有本发明氨基酸序列更大的部分，如含有30-50个氨基酸，或高达并包括本发明多肽之完整氨基酸序列的任何长度的肽或多肽对于诱导与BR43×2结合的抗体也是有用的。理想的是，对携带表位的肽的氨基酸序列进行选择以便在水溶液中提供相当大的可溶性(即，该序列包括相对亲水的残基，而优选避免疏水残基)。亲水肽可以由本领域的技术人员从疏水性分布图预测，见例如Hopp和Woods(美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)78：3824-8，1981)以及Kyte和Doolittle(分子生物学杂志157：105-142，1982)。而且，含有脯氨酸残基的氨基酸序列对于抗体的产生也可能是期望的。
针对重组BR43×2蛋白质或从天然来源分离的BR43×2的多克隆抗体可以采用本领域技术人员熟知的方法来制备。见，例如Green等，“多克隆抗血清的制备(Production of Polyclonal Antisera)”，免疫化学实验指南(Immunochemical Protocols)(Manson编)，第1-5页(HumanaPress 1992)；和Williams等，“采用质粒载体在大肠杆菌中表达外源蛋白以及特异性多克隆抗体的纯化(Expression of foreign proteins inE.coli using plasmid vectors and purificaion of specificpolyclonal antibodies)”，DNA克隆2：表达系统(DNA Cloning2：Expression Systems)，第2版，Glover等(编)，第15页(OxfordUniversity Press 1995)。BR43×2多肽的免疫原性可以通过使用佐剂例如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂来增强。对于免疫有用的多肽还包括融合多肽，例如BR43×2或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果该多肽部分是“类半抗原”，则可以将该部分有利地结合或连接到大分子载体(例如匙孔血蓝蛋白(KIH)、牛血清白蛋白(BSA)、或破伤风类毒素)上用于免疫。
尽管多克隆抗体典型的是在动物例如马、奶牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、仓鼠、豚鼠、山羊或绵羊上产生的，本发明的抗BR43×2抗体也可以来源于非人的灵长类动物抗体。用于在狒狒中产生诊断上和治疗上有用的抗体的一般技术可以参见例如Goldenberg等，国际专利申请WO91/11465，和Losman等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)46：310，1990。还可以在转基因动物例如转基因绵羊、奶牛、山羊或猪中产生抗体，并可以在酵母和真菌中以修饰的形式以及在哺乳动物和昆虫细胞中表达抗体。
作为替代方法，可以制备抗BR43×2的单克隆抗体。可以通过本领域技术人员已知的方法获得针对特异抗原的啮齿类动物单克隆抗体(见例如Kohler等，自然256：495，1975，Coligan等(编)，当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)，第1卷，第2.5.1-2.6.7(John Wiley&Sons 1991)；Pieksley等，“制备针对大肠杆菌中表达的蛋白质的单克隆抗体(Production of monoclonal antibodies againstproteins expressed in E.coli)“，DNA克隆2：表达系统，第2版，Glover等(编)，第93页(Oxford University Press 1995))。
简而言之，单克隆抗体可以通过如下步骤获得：给小鼠注射含有BR43×2基因产物的组合物，通过取出血清样品验证抗体产生的存在，取出脾脏以获得B淋巴细胞，将该B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆该杂交瘤，选择产生针对该抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对该抗原的抗体的克隆，并从杂交瘤培养物中分离抗体。
此外，本发明的抗BR43×2抗体还可以来源于人单克隆抗体。人单克隆抗体是从经改造应答抗原攻击产生特异性人类抗体的转基因小鼠中获得的。在该技术中，人类重链和亲链座位的元件被引入到来源于含有定向破坏的内源性重链和亲链座位的胚胎干细胞系的小鼠品系中。该转基因小鼠能够合成特异针对人类抗原的人类抗体，并且该小鼠可以用于制备分泌人类抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠获得人类抗体的方法描述于例如Green等，Nat.Genet.，7：13，1994；Lonberg等，自然368：856，1994，和Taylor等，Int.Immun.6：579，1994。
可以通过各种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离并纯化单克隆抗体。这些分离技术包括A蛋白琼脂糖凝胶(Sepharose)亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析(见例如Coligan，第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页；Baines等，“免疫球蛋白G(IgG)的纯化(Purification ofImmunoglobulin G(IgG))”，分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)，第10卷，第79-104页(The Humana Press公司，1992))。
对于具体应用，可能期望制备抗BR43×2抗体的片段。这些抗体片段可以通过例如该抗体的蛋白水解来获得。通过常规方法对完整抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，能够获得抗体片段。作为一个说明例子，可以通过胃蛋白酶酶切抗体以提供一个表示为F(ab’)2的5S片段，从而产生抗体片段。该片段能够采用硫醇还原试剂作进一步裂解，以产生3.5S的Fab’一价片段。任选地，该裂解反应可以采用二硫键断裂产生的巯基的封闭基团来进行。作为一种替代方法，采用胃蛋白酶进行酶解直接产生两个一价Fab片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如Goldenberg，美国专利4,331,647；Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89：230，1960；Porter，Biochem.J.73：119，1959；Edelman等，酶学方法，第1卷，第422页(Academic Press 1967)；和Coligan，同上。
还可以采用其它裂解抗体的方法，例如分离重链以形成一价轻-重链片段、进一步裂解片段、或其它酶学、化学或遗传学技术，只要该片段能与完整抗体所识别的抗原结合即可。
例如，Fv片段含有VH和VL链的连接。正如Inbar等，美国国家科学院院刊69：2659，1972中所描述的，这种连接可以是非共价的。或者是，这些可变链可以通过分子间二硫键连接起来，或通过化学物质例如戊二醛形成交联(见例如Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437，1992)。
Fv片段可以含有通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白质(scFv)通过构建含有编码通过一个寡核苷酸连接起来的VH和VL区的DNA序列的结构基因来制备。将该结构基因插入表达载体中，随后将该表达载体导入宿主细胞例如大肠杆菌中。该重组宿主细胞合成一条以接头肽连接了这两个V区的单链多肽。制备scFvs的方法描述于例如Whitlow等，方法：酶学方法手册(Methods：A Companion to Methods inEnzymology)2：97，1991，也参见Bird等，科学242：423，1988；Ladner等，美国专利4,946,778；Pack等，Bio/Technology 11：1271，1993；和Sandhu，同上。
作为一个说明例子，可以通过将淋巴细胞体外暴露于BR43×2多肽，并(例如，通过采用固定化的或标记的BR43×2蛋白质或肽)选择噬菌体或相似载体中的抗体展示文库来获得scFv。编码具有潜在BR43×2多肽结合域的多肽的基因可以通过筛选噬菌体上展示的(噬菌体展示)或细菌例如大肠杆菌上展示的随机肽文库来获得。可以有多种方法来获得编码该多肽的核苷酸序列，例如通过随机诱变和随机多核苷酸合成来获得。这些随机肽展示文库可以用于筛选与已知靶标相互作用的肽，所述已知靶标可以是蛋白质或多肽例如配体或受体、生物学的或合成的大分子、或有机或无机物质。产生和筛选这些随机肽展示文库的技术是本领域已知的(Ladner等，美国专利5,223,409；Ladner等，美国专利4,946,778；Ladner等，美国专利5,403,484；Ladner等，美国专利5,571,698；和Kay等，肽和蛋白质的噬菌体展示(Phage Display of Peptides andProteins)(Academic Press公司，1996))，并且随机肽展示文库和用于筛选这些文库的试剂盒都可以从商业途径，例如从Clontech(Palo Alto，CA)、Invitrogen公司(San Diego，CA)、New England Biolabs公司(Beverly，MA)、和Pharmacia LKB Biotechnology公司(Piscataway，NJ)获得。随机肽展示文库可以采用本文所公开的BR43×2序列来筛选，以鉴定与BR43×2结合的蛋白质。
抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单元”)可以通过构建编码目的抗体的CDR的基因来获得。例如可以通过聚合酶链式反应从产生抗体的细胞的RNA合成该可变区来制备这些基因(见例如Larrick等，方法：酶学方法手册2：106，1991)；Courtenay-Luck，“单克隆抗体的遗传操作(Genetic Manipulation ofMonoclonal Antibodies)”，单克隆抗体：制备、改造和临床应用(Monoclonal Antibodies：Production，Engineering and ClinicalApplication)，Ritter等(编)，第166页(Cambridge University Press1995)；和Ward等，“抗体的遗传操作和表达(Genetic Manipulation andExpression of Antibodies)”，单克隆抗体：原理和应用(MonoclonalAntibodies：Principles and Applications)，Birch等(编)，第137页(Wiley-Liss公司1995))。
作为替代方法，抗BR43×2抗体可以来源于“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体是通过将来自小鼠免疫球蛋白重和轻可变链的小鼠互补决定区转移至人类可变区中产生的。然后在小鼠对应部分的构架区中替换成人类抗体的典型残基。应用来源于人源化单克隆抗体的抗体成分避免了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术描述于例如Orlandi等，美国国家科学院院刊86：3833，1989。制备人源化单克隆抗体的技术描述于例如Jones等，自然321：522，1986；Carter等，美国国家科学院院刊89：4285，1992；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437，1992；Singer等，免疫杂志(J.Immun.)150：2844.1993；Sudhir(编)，抗体工程手册(Antibody Engineering Protocols)(Humana Press公司1995)；Kelley，“工程化治疗抗体(EngineeringTherapeutic Antibodies)”，蛋白质工程：原理和实践(ProteinEngineering：Principles and Practice)“，Cleland等(编)，第399-434页(John Wiley&Sons公司，1996)；和Queen等，美国专利5,693,762(1997)。
多克隆抗独特型抗体可以采用标准技术通过用抗BR43×2的抗体或抗体片段免疫动物来制备。见例如Green等，“多克隆抗血清的制备(Production of Polyclonal Antisera)”，分子生物学方法：免疫化学实验指南(Methods in Molecular Biology：Immunochemical Protocols)，Manson(编)，第1-12页(Humana Press 1992)。也参见Coligan，同上，第2.4.1-2.4.7页。或者，可以采用抗BR43×2的抗体或抗体片段作为免疫原，并利用以上描述的技术来制备单克隆抗独特型抗体。作为另一种替代方法，可以采用上面所描述的技术制备人源化抗独特型抗体或非人灵长类动物的抗独特型抗体。制备抗独特型抗体的方法描述于例如Irie，美国专利5,208,146；Greene等，美国专利5,637,677；以及Varthakavi和Minocha，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)77：1875，1996。
本文中抗体或多肽还可以直接或间接地与药物、毒素、放射性核素等结合，而且这些结合物可以用于体内诊断或治疗应用。例如，本发明的多肽或抗体可以用于鉴定或治疗表达相应抗互补分子(例如分别是受体或抗原)的组织或器官。更具体地，可以将BR43×2多肽或抗BR43×2抗体、或它们的生物活性片段或部分与可检测的或细胞毒性的分子偶联，并递送给具有表达该抗互补分子的细胞、组织或器官的哺乳动物。
适合的可检测分子可以直接或间接地与多肽或抗体连接，它们包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制物、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等。适合的细胞毒性分子可以直接或间接地与多肽或抗体连接，它们包括(例如，直接与多肽或抗体连接的，或通过鏊合部分间接连接的)细菌或植物的毒素(例如白喉毒素、假单孢菌外毒素、篦麻毒素、相思豆毒蛋白等)，以及治疗性放射核素例如碘-131、铼-188或钇-90。多肽或抗体还可以与细胞毒性药物例如阿霉素结合。对于可检测分子或细胞毒性分子的间接连接，可以将该可检测分子或细胞毒性分子与互补物/抗互补物对的一个成员结合，而另一个成员与多肽或抗体部分结合。为了这些目的，生物素/链霉亲和素是一个典型的互补物/抗互补物对。
可溶性BR43×2多肽或BR43×2的抗体可以直接或间接地与药物、毒素、放射性核素等结合，而且这些结合物可以用于体内诊断或治疗应用。例如，本发明的多肽或抗体可以用于鉴定或治疗表达相应抗互补分子(例如分别是受体或抗原)的组织或器官。更具体地，可以将BR43×2多肽或抗BR43×2抗体、或它们的生物活性片段或部分与可检测的或细胞毒性的分子偶联，并递送给具有表达该抗互补分子的细胞、组织或器官的哺乳动物。
适合的可检测分子可以直接或间接地与多肽或抗体连接，它们包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制物、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等。适合的细胞毒性分子可以直接或间接地与多肽或抗体连接，它们包括(例如，直接与多肽或抗体连接的，或通过鏊合部分间接连接的)细菌或植物的毒素(例如白喉毒素、假单孢菌外毒素、篦麻毒素、相思豆毒蛋白等)，以及治疗性放射核素例如碘-131、铼-188或钇-90。多肽或抗体还可以与细胞毒性药物例如阿霉素结合、对于可检测分子或细胞毒性分子的间接连接，可以将该可检测分子或细胞毒性分子与互补物/抗互补物对的一个成员结合，而另一个成员与多肽或抗体部分结合。为了这些目的，生物素/链霉亲和素是一个典型的互补物/抗互补物对。
这些多肽-毒素融合蛋白或抗体/片段-毒素融合蛋白可以用于定向的细胞或组织抑制或消融(例如以治疗癌细胞或组织)。或者，如果该多肽具有多个功能域(即，激活域或配体结合域，加上导向域)，则仅包括该导向域的融合蛋白可适合于指导可检测分子、细胞毒性分子或互补分子达到目的细胞或组织类型。当具有唯一一个该域的融合蛋白包括一个互补分子时，抗互补分子可以与可检测分子或细胞毒性分子结合。因此该域-互补分子融合蛋白代表了用于一般抗互补分子-可检测/细胞毒性分子结合物的细胞/组织特异性递送的一般导向载体。本文所描述的生物活性多肽或抗体结合物可以通过静脉内、动脉内或管内方式递送，或可以在期望的作用位置局部引入。
可以制备针对His或FLAGTM标记的可溶性BR43×2多肽的抗体。还可以制备针对大肠杆菌所产生的MBP融合蛋白质的抗体。或者，这些多肽可以包括带有人类Ig的融合蛋白。尤其是，可以将含有针对His标记的或FLAGTM标记的可溶性BR43×2的多肽抗体的抗血清用于通过免疫组织化学对人或灵长类动物组织进行的BR43×2组织分布分析。这些可溶性BR43×2多肽还可以用于免疫小鼠，以便产生针对可溶性人类BR43×2多肽的单克隆抗体。针对可溶性人类BR43×2多肽的单克隆抗体还可以用于模拟配体/受体偶联，从而导致该配体/受体对的激活或失活。例如，已经阐明，交联的抗可溶性CD40单克隆抗体给经抗IgM或LPS亚最佳激活的B细胞提供了刺激信号，从而导致增殖和免疫球蛋白的产生。这些相同单克隆抗体在溶液中使用时可充当拮抗剂阻断受体的激活。BR43×2的单克隆抗体可以用于确定该BR43×2/BR43×2-配体对在通过组织分布研究鉴定的特异细胞谱系上的分布、调节和生物学相互作用。
本发明还提供分离和纯化的BR43×2、TACI和BCMA多核苷酸探针或引物。这些多核苷酸探针可以是RNA或DNA。DNA可以是cDNA或基因组DNA。多核苷酸探针是单链或双链DNA或RNA，一般是合成的寡核苷酸，但也可以从克隆的cDNA或基因组序列产生，并且其一般将含有至少16个核苷酸，更通常为17个核苷酸至25个或更多个核苷酸，有时为40-60个核苷酸，而且在一些情况中是一个相当大的部分、区域或甚至是完整的BR43×2基因或cDNA。探针和引物一般是合成的寡核苷酸，但也可以从克隆的cDNA或基因组序列或它的互补序列产生。尽管可以使用稍短的探针(14-17个核苷酸)，但分析探针一般长至少20个核苷酸。PCR引物长至少5个核苷酸，优选15或更多个nt，更优选20-30个nt。当基因的一个小区域是分析的靶标时，可以使用短的多核苷酸。对于基因的总体分析，多核苷酸探针可以含有完整的外显子或更多。可以采用本领域熟知的技术，用可从许多途径例如Molecular Probes公司(Eugene，OR)和/Amersham公司(Arlington Heights，IL)购买获得的例如酶、生物素、放射性核素、荧光团、化学发光物、顺磁颗粒等，对探针进行标记以提供可检测信号。用于构建探针的优选区域包括配体结合区、富含半胱氨酸的假重复、信号序列等。用于制备多核苷酸探针的技术和杂交技术是本领域已知的，见例如Ausubel等编，当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons公司，NY，1991。
可以在诊断系统中应用BR43×2、TACI和BCMA多肽和抗体，以检测BR43×2、TACI和BCMA以及BR43×2、TACI和BCMA的配体多肽例如ztnf4的存在。来源于这些检测方法的信息将提供对于BR43×2多肽在多种疾病中的意义的理解，并且将可以在BR43×2水平改变显著的疾病中用作诊断工具。BR43×2、TACI和BCMA受体多肽水平的改变可能指示了包括癌症、自身免疫病和感染性疾病在内的病理状况。
在一个基本的分析试验中，在促进探针和靶BR43×2、TACI或BCMA RNA种类之间的碱基配对的温度和离子强度条件下，将单链探针分子与分离自生物学样品的RNA一起孵育。从杂交的分子中分离出未结合探针后，检测杂种分子的量。
成熟的RNA检测杂交方法包括Northern分析和斑点/狭缝印迹杂交(见例如Ausubel，同上；和Wu等(编)，“RNA水平上的基因表达分析(Analysis of Gene Expression at the RNA Level)”，基因生物技术方法(Methods in Gene Biotechnology)，第225-239页(CRC Press公司，1997))。可以用放射性同位素例如32P或35S对核酸探针进行可检测标记。作为替代方法，可以用非放射性杂交方法检测BR43×2 RNA(见例如Isaac(编)，用非放射性探针分析核酸的实验操作(Protoeols forNucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes)，Humana Press公司，1993)。典型的是通过生色或化合发光底物的酶转化，实现非放射性检测。说明性的非放射性部分包括生物素、荧光素和地高辛配基。
BR43×2、TACI和BCMA寡核苷酸探针对于体内诊断也是有用的。作为一种说明，可以给对象施用18F标记的寡核苷酸，并通过正电子发射断层扫描进行观察(Tavitian等，自然医学(Nature Medicine)4：467，1998)。
许多诊断程序利用聚合酶链式反应(PCR)来增加检测方法的灵敏度。用于实施PCR的标准技术是熟知的(一般参见Mathew(编)，人类分子遗传学实验手册(Protocols in Human Molecular Genetics)(HumanaPress公司，1991)；White(编)，PCR操作：当前方法和应用(PCR Protocols：Current Methods and Applications)(Humana Press公司，1993)；Cotter(编)，癌症的分子诊断(Molecular Diagnosis of Cancer)(Humana Press公司，1996)；Hanausek和Walaszek(编)，肿瘤标记手册(Tumor MarkerProtocols)(Humana Press公司，1998)；Lo(编)，PCR的临床应用(Clinical Applications of PCR)(Humana Press公司，1998)；和Meltzer(编)，生物分析中的PCR(PCR in Bioanalysis)(Humana Press公司，1998))。可以设计PCR引物扩增编码特定BR43×2域或基序，例如BR43×2、TACI或BCMA的富含半胱氨酸的假重复的序列。
用于诊断分析的一种PCR变体是逆转录酶-PCR(RT-PCR)。在RT-PCR技术中，从生物样品分离RNA，逆转录成cDNA，并将该cDNA与BR43×2的引物一起孵育(见例如Wu等(编)，“通过PCR快速分离特异cDNA或基因(Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR)”，基因生物技术方法，CRC Press公司，第15-28页，1997)。然后采用标准技术进行PCR并分析产物。
作为举例说明，采用例如上述的硫氰酸胍细胞裂解程序，从生物学样品中分离RNA。或者，可以采用固相技术从细胞裂解物中分离mRNA。可以采用随机寡核苷酸、短的dT同聚物、或BR43×2、TACI或BCMA的反义寡聚物，和该分离的RNA引发逆转录反应。寡聚dT引物具有扩增能够提供对照靶序列的各种mRNA核苷酸序列的优点。采用两个典型长至少5个碱基的侧翼寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应扩增BR43×2、TACI或BCMA序列。
PCR扩增产物可以采用各种方法检测。例如，PCR产物可以通过凝胶电泳分级分离，并通过溴化乙啶染色观察。或者，可以将分级分离的PCR产物转移到膜上，用可检测的标记BR43×2探针杂交，并通过放射自显影检查。其它的可替代方法包括应用地高辛配基标记的脱氧核糖核酸三磷酸以提供化学发光检测，和应用C-TRAK比色分析。
另一种方法是实时定量PCR(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Ct.)。使由寡核苷酸和连接的报道及猝灭染料组成的荧光探针在正向和反向引物之间特异退火。利用Taq DNA聚合物的5’内切核酸酶活性，将该猝灭染料和报道染料分离，并产生序列特异性信号而且随着扩增的增加该信号增强。可以在PCR反应期间持续地监测和定量该荧光强度。
检测BR43×2、TACI或BCMA表达的另一种方法是循环探针技术(cycling probe technology，CPT)，其中单链DNA靶标与过量的DNA-RNA-DNA嵌合探针结合形成复合物，用RNase H切割该RNA部分，并检测切割的嵌合探针的存在(见例如Beggs等，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)34：2985，1996；和Bekkaoui等，生物技术(Biotechniques)20：240，1996)。用于检测BR43×2、TACI或BCMA序列的另一些方法可以利用基于核酸序列的扩增(NASBA)、通过交叉杂交进行的模板协同扩增(CATCH)和连接酶链式反应(LCR)等方法(见例如Marshall等，美国专利5,686,272(1997)；Dyer等，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)60：161，1996；Ehricht等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)243：358，1997；和Chadwick等，病毒学方法杂志70：59，1998)。其它标准方法是本领域技术人员已知的。
BR43×2、TACI和BCMA的探针和引物还可以用于检测和定位组织样品中BR43×2、TACI或BCMA的基因表达。该原位杂交的方法是本领域技术人员所熟知的(见例如Choo(编)，原位杂交实验操作(In SituHybridization Protocols)，Humana Press公司，1994；Wu等(编)，“通过放射性原位杂交(RISH)分析细胞DNA或mRNA的丰度(Ahalysis ofCellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In SituHybridization(RISH))”，基因生物技术方法(Methods in GeneBiotechnology)，CRC Press公司，第259-278页，1997；Wu等(编)，“通过荧光原位杂交定位DNA或mRNA的丰度(Localization of DNA orAbundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization(RISH))”，基因生物技术方法，CRC Press公司，第279-289页，1997)。
其它的多种诊断方法是本领域技术人员所熟知的(见例如Mathew(编)，人类分子遗传学实验操作(Protocols in Human MolecularGenetics)，Humana Press公司，1991；Coleman和Tsongalis，分子诊断学(Molecular Diagnostics)，Humana Press公司，1996；和Elles，遗传性疾病的分子诊断(Molecular Diagnosis of Genetic Diseases)，Humana Press公司，1996)。
此外，这些多核苷酸探针还可以用于与各条染色体上的对应序列杂交。BR43×2基因的染色体鉴定和/或作图可以提供关于基因功能与疾病的关系的有用信息。许多作图技术是本领域技术人员可以利用的，例如体细胞杂种和荧光原位杂交(FISH)作图。一种优选的方法是辐射杂种作图(radiation hybrid mapping)。辐射杂种作图是一种开发用于构建哺乳动物染色体的高分辨连续图谱的体细胞遗传学技术(Cox等，科学250：245-50，1990)。部分或全部的基因序列信息使得可以设计适合与染色体辐射杂种作图系列(panels)一起使用的PCR引物。可以得到从商业途径可获得的覆盖整个人类基因组的辐射杂种作图系列，例如Stanford G3 RH系列和GeneBridge 4 RH系列(Research Genetics公司，Huntsville，AL)。这些系列使得能够对目的区域中的基因、序列标志位点(STSs)和其它非多态性和多态性标记进行基于PCR的快速染色体定位和排序。这包括在新发现的目的基因和以前已作图的标记之间建立直接成比例的物理距离。基因位置的精确信息能够应用于多个方面，包括：1)确定序列是否是已存在的重叠群的部分，并获得以各种形式例如YAC-、BAC-或cDNA克隆存在的其它周围遗传序列，2)为表现出与相同染色体区域连锁的可遗传疾病，提供可能的候选基因，和3)用于交叉参照模式生物例如小鼠，这可能有利于帮助确定特定基因所可能具有的功能。
染色体定位还可以采用STSs来实现。STS是人类基因组中独一无二的一种DNA序列，可以用作特定染色体或染色体区域的参考点。STS可以通过能够用于聚合酶链式反应中以在所有其它基因组序列存在的情况下特异检测该位点的寡核苷酸引物对来确定。由于STS仅以DNA序列为基础，所以在数据库中，例如序列标志位点数据库(dbSTS)，GenBank(National Center for Biological Information，National Institutesof Health，Bethesda，MD，http：//www.nebi.nlm.nih.gov)中，能够对它们进行完全地描述，并且可以用目的基因序列对它们进行检索以获得包含在这些短基因组标志STS序列中的作图数据。
本发明还提供用于其它诊断应用的试剂。例如，BR43×2基因、含有BR43×2 DNA或RNA的探针、或它们的子序列可以用于确定该BR43×2基因是否存在于特定染色体上，或是否发生了突变。在BR43×2基因座位处的可检测到的染色体畸变包括但不限于非整倍性、基因拷贝数的改变、插入、缺失、限制性位点的改变和重排。这些畸变可以发生在编码序列内、内含子内、或包括上游启动子和调节区域的侧翼序列内，而且可以表现为编码序列内的物理改变或基因表达水平的改变。
一般地，这些诊断方法包括步骤：(a)从患者获得遗传样品；(b)将该遗传样品与上面所公开的多核苷酸探针或引物，在该多核苷酸将与互补多核苷酸序列杂交的条件下一起孵育，以产生第一反应产物；和(iii)将此第一反应产物和对照反应产物进行比较。该第一反应产物和该对照反应产物之间的差异指示患者的遗传异常。本发明所用遗传样品包括基因组DNA、cDNA和RNA。该多核苷酸探针或引物可以是RNA或DNA，并且将含有SEQ ID NO：3的一部分、SEQ ID NO：1的互补序列、或它们的RNA等同物。在这点上适合的分析方法包括本领域人员已知的分子遗传技术，例如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、应用PCR技术或连接链式反应的短串联重复(STR)分析(Barany，PCR方法和应用(PCR Methods andApplications)1：5-16，1991)、核糖核酸酶保护实验、和本领域已知的其它遗传连锁分析技术(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，Chest 108：255-65，1995)。核糖核酸酶保护实验(见例如Ausubel等，同上，第4章)包括用RNA探针与患者的RNA样品杂交，之后将反应产物(RNA-RNA杂交分子)暴露于RNase。RNA的杂交区域受到保护而不被消化。在PCR分析试验中，将患者的遗传样品与多核苷酸引物对一起孵育，然后扩增和回收两个引物之间的区域。回收产物大小和数量的改变指示了患者中存在突变。另一种可以采用的基于PCR的技术是单链构象多态性(SSCP)分析(Hayashi，PCR方法和应用，1：34-8，1991)。
可以采用反义方法学以抑制BR43×2、TACI或BCMA的基因转录，以便抑制B细胞的发育和与其它细胞的相互作用。设计与BR43×2、TACI或BCMA编码多核苷酸(例如SEQ ID NO：3中所示的多核苷酸)的片段互补的多核苷酸，以便和编码BR43×2、TACI或BCMA的mRNA结合并抑制该mRNA的翻译。可以采用这些反义多核苷酸抑制细胞培养物中或受试对象中的BR43×2、TACI或BCMA编码基因的表达。
还可以制备经改造表达BR43×2、TACI或BCMA的的小鼠，称作“转基因小鼠”，和制备表现出BR43×2、TACI或BCMA功能完全缺失的小鼠，称作“敲除小鼠”(Snouwaert等，科学257：1083，1992；Lowell等，自然366：740-42，1993；Capecchi，科学244：1288-92，1989；Palmiter等，Annu Rev Genet.20：465-99，1986)。例如，广泛地或仅在组织特异性或组织限定性启动子下超量表达BR43×2、TACI或BCMA的转基因小鼠可以用于确定超量表达是否会产生表型。例如，野生型BR43×2、TACI或BCMA多肽、多肽片段或它们的突变体的超量表达可能改变正常的细胞过程，导致如下表型，该表型可鉴定与BR43×2、TACI或BCMA的表达功能性相关的组织，并且可以指示BR43×2、TACI或BCMA或它们的激动剂或拮抗剂的治疗靶标。例如，一种改造的优选转基因小鼠是超量表达可溶性BR43×2、TACI或BCMA的转基因小鼠。而且，该超量表达可以导致显示与人类疾病相似的表型。相似地，敲除BR43×2、TACI或BCMA的小鼠可以用于确定在体内绝对需要BR43×2的部位。敲除小鼠的表型预示了BR43×2、TACI或BCMA拮抗剂(例如本文所描述的)在体内所可能具有的作用。可以采用人类BR43×2、TACI或BCMA的cDNA来分离小鼠BR43×2、TACI或BCMA的mRNA、cDNA和基因组DNA，随后将它们用于制备敲除小鼠。这些小鼠可以用于研究体内系统中BR43×2、TACI或BCMA基因和它们编码的蛋白质，并可以用作相应人类疾病的体内模型。而且，类似地可以将指向本文所述BR43×2、TACI或BCMA的BR43×2、TACI或BCMA反义多核苷酸或核酶的转基因表达用于上述的转基因小鼠。
根据常规方法，药用有效量的本发明BR43×2、TACI或BCMA多肽可以和可药用载体一起制成用于经肠胃外、口、鼻、直肠、局部或经皮肤等途径施用的制剂。制剂还可以包括一或多种稀释剂、填料、乳化剂、防腐剂、缓冲液、赋形剂等等，并且可以以例如液体、粉末、乳剂、栓剂、脂质体、经皮贴剂(transdermal patch)和片剂等形式提供。也可以将缓慢或延长释放系统，包括任何各种生物聚合物(基于生物学的系统)、应用脂质体的系统、和聚合物递送系统，和本文所述的组合物一起使用，以提供连续或长期的BR43×2多肽或拮抗剂源。这些缓释系统可以应用于例如口服、局部和肠胃外用制剂中。术语“可药用载体”是指不干扰活性成分生物学活性的有效性并且对于宿主或患者无毒的载体介质。本领域的实据人员可以以适当方法，并依据例如公开于Remington：药物科学和实践(Remington：The Science and Pratice of Parmacy)(Gennaro编，Mack Publishing公司，Easton PA，第19版，1995年)中的公认经验，配制本发明的化合物。
本文所用BR43×2、TACI或BCMA多肽、激动剂或拮抗剂的“药用有效量”是足以诱导期望生物学结果的量。该结果可以是疾病的病征、症状、或病因的减轻，或任何其它期望的生物学系统改变。例如，BR43×2、TACI或BCMA多肽的有效量将提供症状的主观减轻或临床医师或其它有资格的观察者指出的客观可鉴定的改善。例如，BR43×2、TACI或BCMA多肽或可溶性融合物的该有效量将提供免疫应答期间B细胞应答的降低、自体抗体产生的抑制或降低、与SLE、MG或RA相关的症状的抑制或减轻。BR43×2、TACI或BCMA的有效量将降低外周血中B细胞的百分数。该BR43×2、TACI或BCMA多肽的有效量能够随着待治疗的疾病或症状的不同而有很大的变化。待施用的多肽的量和在制剂中的浓度取决于所选择的载体、施用的途径、具体多肽的效能、患者的临床状况、制剂中该化合物的副作用和稳定性。因此，临床医师将依据对于该治疗患者或相似患者的临床经验，采用在制剂中含有适当浓度的适当配方以及施用的制剂量。这些量将部分取决于待治疗的具体疾病、患者的年龄、体重和一般健康情况，以及本领域技术人员明了的其它因素。典型地一个剂量将在0.1-100mg/kg对象的范围内。对于具体化合物的剂量可以从体外或离体研究以及实验动物研究来确定。在体外或离体情况下发现有效的化合物浓度为动物研究提供了指导，其中对剂量进行计算以便在作用位置提供相似浓度。
本发明进一步通过以下非限制性实施例进行说明。
                   实施例
                   实施例1
                BR43×2的鉴定
采用分泌诱捕方法从RPMI阵列文库(array library)中克隆TACI的工。采用20个96孔板将RPMI 1788(激活的B细胞系)文库排成阵列。每个孔中含有大约100个大肠杆菌菌落，每个菌落含有一种cDNA克隆。采用TomTech Quadra 9600在96孔板中小量制备DNA。然后将该分离的DNA集合成120个库(pool)，每个代表1600个克隆。用这些库转染Cos-7细胞，并接种在12孔板中。在92μl无血清DMEM培养基(500ml DMEM中有55mg丙酮酸钠、146mg L-谷氨酰胺、5mg转铁蛋白、2.5mg胰岛素、1μg硒和5mg胎球蛋白)中将3μl库DNA和5μl LipofectAMINE混合，室温孵育30分钟，之后加入400μl无血清DMEM培养基。将该DNA-LipofectAMINE混合物加在接种于12孔组织培养板中的220,000个Cos-7细胞/孔上，并在37℃孵育5个小时。孵育后，向每孔加入500μl 20％FBS DMEM培养基(500ml DMEM中有100ml FBS、55mg丙酮酸钠、146mgL-谷氨酰胺)，并孵育细胞过夜。
采用生物素化的FLAG标记ztnf4进行该分泌诱捕筛选。用PBS冲洗所述细胞并用PBS中的1.8％甲醛固定15分钟。然后用TNT(H2O中0.1MTris-HCl、0.15M NaCl、和0.05％Tween-20)洗涤细胞。用PBS中的0.1％Triton-X渗透细胞15分钟，之后在TNT中洗涤一次。用TNB(0.1MTris-HCl、0.15M NaCl、和0.5％的封闭试剂)和NEN RenaissanceTSA-Direct试剂盒(NEN，Boston，MA)，根据厂家说明书封闭细胞1个小时。用TNT洗涤细胞，并用抗生物素蛋白封闭15分钟，然后用生物素(Vector Labs产品号#SP-2001)封闭，之间用TNT进行洗涤。细胞在TNB中和1μg/ml ztnf4/Flag/生物素一起孵育1小时，之后用TNT洗涤一次。然后在TNB中用1∶300链霉亲和素-HRP(NEN)稀释物孵育细胞1个小时，并用TNT洗涤。用在稀释缓冲液(NEN)中1∶50稀释的荧光素酪胺试剂检测杂交，并孵育4.4分钟，之后用TNT洗涤。用TNT中1∶5稀释的Veetashield Mounting Media(Vector Labs，Burlingame，CA)保存细胞。
采用FITC滤光器通过荧光显微镜观察这些细胞。有12个库是ztnf4结合阳性。将D8库(代表1600个克隆)分解，并分离了单一的ztnf4结合阳性克隆(D8-1)。测序分析揭示，D8-1克隆含有一个编码TACI同种型的多肽序列，该序列中TACI的第一个半胱氨酸丰富的假重复Phe21-Arg67被替换成仅一个氨基酸残基色氨酸。该同种型被命名为BR43×2，其多核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1中。
                        实施例2
            淋巴细胞和单核细胞中BR43×1的探测
采用逆转录酶PCR在T和B细胞及单核细胞中探测BR43×1的表达。采用寡核苷酸引物ZC19980(SEQ ID NO：15)和ZC19981(SEQ ID NO：16)筛选CD19+、CD3+和单核细胞的cDNA以鉴定BR43。该逆转录酶反应的实施条件是：94℃ 3分钟；之后30个循环，每个循环为94℃ 30秒、68℃ 2分钟和72℃ 1分钟；之后72℃延伸7分钟。仅在B细胞中检测到具有预期大小720bp的条带，而在激活的T细胞中没有检测到，这与利用抗体对TACI进行的分析的报道一致(yon Bulow和Bram，同上)。
                    实施例3
        采用BR43配体ztnf4进行的B细胞增殖分析
将含有1×108个采集的冷冻外周血单核细胞(PBMCs)的小管迅速在37℃水浴中融化，并于50ml管中重悬在25ml B细胞培养基(Iscove氏修改的Dulbecco培养基、10％热失活胎牛血清、5％L-谷氨酰胺、5％Pen/Strep)中。采用台盼蓝(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)测试细胞的生活力。将10μl Ficoll/Hypaque Plu铺在细胞悬浮液下(PharmaciaLKB Biotechnology公司，Piscataway，NJ)，1800rpm离心30分钟，并在关闭制动的情况下停止。然后取出界面层，并转移至一个新的50ml管中，用PBS补充至终体积40ml，并在打开制动的情况下1200rpm离心10分钟。采用台盼蓝测试分离的B细胞的生活力。将该B细胞重悬在B细胞培养基中，终浓度为1×106个细胞/ml，并以180μl/孔接种在96孔U型底培养板(Falcon，VWR，Seattle，WA)中。
向这些细胞加入下列刺激物之一以使终体积达到200ml/孔：
单独的10倍稀释形式1mg-1ng/ml的可溶性FLAG标记ztnf4-4sCF或ztnf4-4sNF，或者加上稀释在NaH2CO3(pH9.5)中的10μg/ml抗IgM(羊抗人IgM)(Southern Biotechnology Associates公司，Birmingham，AL)；或者加上10μg/ml抗IgM和10ng/ml重组人类IL4(稀释在PBS和0.1％BSA中)。此外，还测试了其它细胞因子例如IL-3和IL-6以及可溶性CD40(sCD40)抗体(Pharmingen，San Diego，CA)。作为对照，细胞与0.1％牛血清白蛋白(BSA)和PBS、10μg/ml抗IgM或10μg/ml抗IgM和10ng/ml IL4(或其它细胞因子)一起孵育。然后在保持湿度的孵育器中37℃孵育这些细胞72个细胞。收获前16小时，向所有的孔中加入1μCi3H胸苷。将这些细胞收集在一个96孔过滤板中(UniFilter GF/C，Packard，Meriden，CT)，在此板上采用细胞收获器(Packard)收获细胞，并根据厂家说明书收集。将这些板在55℃干燥20-30分钟，并用一种不透明的板密封物将孔底封上。向每一个孔中加入0.25ml闪烁液(Microscint-O，Packard)，并采用高计数微板闪烁计数器(TopCount MicroplateScintillation Counter)(Packard)对该板读数。
为了测量在对纯化B细胞进行刺激之后响应各种B细胞有丝分裂原IgG产生的诱导，按所描述的方法制备细胞并孵育9天。收集细胞上清液以测定IgG的产生。
为了测量在对纯化B细胞进行刺激之后响应各种B细胞有丝分裂原细胞表面标记的激活，按上述方法制备细胞并仅孵育48个小时。通过FACS分析测量细胞表面标记。
表5总结了用各种B细胞有丝分裂原刺激的人类纯化B细胞的增殖：
           表5
刺激物           增殖系数
ztnf4              1.5
ztnf4+IL4           9.9
ztnf4+抗IgM+IL4    15.8
观察到ztnf4与IL4、IL3(10μg/ml)和IL6(10μg/ml)对B细胞增殖的协同影响。当采用sCD40时观察到B细胞信号传导增加了两倍。
表6总结了在对纯化B细胞进行刺激之后响应各种B细胞有丝分裂原IgG产生的诱导(ng/ml)。
      表6刺激物              对照   ztnf4抗IgM                3     7.5抗IgM+IL-4           13    32抗IgM+IL-4+IL-5      10    45
在仅用ztnf4、或与抗IgM或抗IgM+IL-4一起刺激纯化的B细胞之后，观察到细胞表面激活标记的增加。在存在最佳或次最佳T细胞有丝分裂原时，对PBMNC的增殖没有影响。而且，在纯化的单核细胞中响应LPS的刺激也没有观察到对TNFα产生的影响。
图3显示了可溶性ztnf4对人类B淋巴细胞的共刺激，以使其增殖并分泌免疫球蛋白。图3A显示了在单独存在IL-4、和存在IL-4及抗IgM、抗CD40或抗CD19时，响应可溶性ztnf4(25ng/ml)的刺激，在培养5天后纯化的人类外周血B细胞的增殖。图3B显示在培养9天后，从在有IL-4或IL-4+IL-5时可溶性ztnf4刺激的人类B细胞获得的上清液中测量到的IgM和IgG水平。
这些结果提示，可溶性ztnf4是一种B细胞激活分子，其与其它B细胞刺激物协同作用，而单独的作用弱。可溶性ztnf4促进B细胞的增殖和Ig的产生。粘附分子、共刺激分子和激活受体的上调提示起到促进B细胞的APC功能的作用。
图4显示了在存在10ng/ml IL-4时可溶性ztnf4(25ng/ml)或对照蛋白(泛素)在体外5天内对人类外周血B细胞的刺激。测试了纯化的TACI-Ig、BCMA-Ig或对照Fc对可溶性ztnf4特异性增殖的抑制。
                        实施例4
        采用ztnf4结合选择TACI和BCMA转化的BHK细胞
通过转染子库的稀释克隆选择表达高水平TACI蛋白质的BHK细胞。在结合缓冲液(PBS，2％BSA，0.02％NaN3)中将1μg/ml生物素化ztnf4和转染子细胞(2×105)一起冰上孵育30分钟。用结合缓冲液洗涤细胞2次，然后与SA-PE(Caltag)(结合缓冲液中的1∶1000稀释物)一起在冰上孵育30分钟。然后在结合缓冲液中洗涤细胞2次，并重悬在结合缓冲液中，然后通过FACS(FACS Vantage，Becton Dickinson)进行读数。选择与TNF4具有最高结合的克隆。
通过用生物素化的ztnf4对表达BCMA的转染子库进行表面标记，选择表达高水平BCMA蛋白质的BHK细胞。接着在FACS Vantage(BectonDickinson)上通过链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE Caltag Burlingame，CA)无菌分拣FL2中的明亮细胞。然后筛选ztnf4结合的这些单集落。
                实施例5
                组织分布
探测人类多组织Northern印迹(MTN I，MTN II和MTN III；Clontech)，以确定人类BR43×2和TACI表达的组织分布。大约500bp的PCR来源探针(SEQ ID NO：21)是采用BR43×2(SEQ ID NO：1)作为模板，寡核苷酸ZC20061(SEQ ID NO：22)和ZC20062(SEQ ID NO：23)作为引物扩增的。该序列与TACI的同源区域一致。该扩增按如下进行：94℃1.0分钟，1个循环；94℃30秒、60℃30秒和72℃30秒，30个循环；之后72℃10分钟，1个循环。通过琼脂糖凝胶电泳观察该PCR产物，并采用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)根据厂家说明书纯化该500bp PCR产物。采用MULTIPRIME DNA标记试剂盒(Amersham，Arlington Heights，IL)根据厂家说明书放射性标记该探针。采用NUCTRAP推进柱(push column)(Stratagene)纯化探针。采用EXPRESSHYB(Clontech)溶液预杂交，并作为Northern印迹的杂交溶液。杂交采用106cpm/ml的标记探针65℃过夜进行。然后在2×SSC和0.1％SDS中室温洗涤这些印迹，之后在0.1×SSC和0.1％SDS中50℃洗涤两次。在脾、淋巴结和小肠中检测到大约1.5kb的转录本。
对人类多组织Northern印迹(MTN I、MTN II和MTN III；Clontech)进行探测，以确定人类BCMA表达的组织分布。大约257bp的PCR来源探针(SEQ ID NO：24)是采用Daudi细胞的cDNA作为模板，寡核苷酸ZC21065(SEQ ID NO：25)和ZC21067(SEQ ID NO：26)作为引物扩增的。该扩增按如下进行：94℃ 1.0分钟，1个循环；94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 30秒，35个循环；之后72℃ 10分钟，1个循环。通过琼脂糖凝胶电泳观察该PCR产物，并采用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)根据厂家说明书纯化该257bp PCR产物。采用MULTIPRIME DNA标记试剂盒(Amersham，Arlington Heights，IL)根据厂家说明书放射性标记该探针。采用NUCTRAP推进柱(Stratagene)纯化探针。采用EXPRESSHYB(Clontech)溶液预杂交，并作为Northern印迹的杂交溶液。杂交采用106cpm/ml的标记探针65℃过夜进行。然后在2×SSC和0.1％SDS中室温洗涤这些印迹，之后在0.1×SSC和0.1％SDS中50℃洗涤两次。在胃、小肠、淋巴结、气管、脾和睾丸中检测到大约1.2kb的转录本。
含有经8种管家基因标化的来自各种组织的RNA的RNA Master DotBlots(Clontech)也用TACI探针(SEQ ID NO：21)或BCMA探针(SEQ IDNO：24)按上述进行了杂交探测。在脾、淋巴结、小肠、胃、唾液腺、阑尾、肺、骨髓和胎儿脾中观察到BR43×2/TACI的表达。在小肠、脾、胃、结肠、淋巴结和阑尾中检测到BCMA的表达。
按上述方法用Br43×2/TACI探针(SEQ ID NO：21)或BCMA探针(SEQID NO：24)探测了人类肿瘤系列印迹V(Invitrogen公司，San Diego，CA)和人类淋巴瘤印迹(Invitrogen)。在非Hodgkin氏淋巴瘤和腮腺肿瘤中发现相应于TACI的一个1.5kb转录本。在腺淋巴瘤、非Hodgkin氏淋巴瘤和腮腺肿瘤中发现与BCMA相应的一个1.2kb转录本。
采用异硫氰酸胍(Chirgwin等，生物化学(Biochemistry)18：52-94，1979)及之后的CsCl离心步骤从CD4+、CD8+、CD19+和混合的淋巴细胞反应细胞(CellPro，Bothell，WA)制备总RNA。采用寡聚d(T)纤维素层析分离Poly(A)+RNA(Aviv和Leder，美国国家科学院院刊69：1408-12，1972)。然后按以下进行Northern印迹分析。
每种poly A+RNA大约2mg在2.2M甲醛/磷酸盐缓冲液(50mM Na2HPO4，50mM NaH2PO4，50mm NaOAc，1mM EDTA和2.2M甲醛)中变性，并在甲醛/磷酸盐缓冲液中通过1.5％琼脂糖微型凝胶(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)电泳分离。将该RNA过夜吸印在nytran滤膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)上，并在STRATALINKERUV交联仪(StratageneCloning Systems)中对该滤膜进行UV交联(1,200 mJoules)，然后在80℃干烤一个小时。
用TACI探针(SEQ ID NO：21)或BCMA探针(SEQ ID NO：24)探测这些印迹。仅在CD19+细胞中检测到代表TACI的1.5kb条带。在CD8+、CD19+和MLR细胞中微弱检测到代表BCMA的1.2kb转录本。
用来自K-562细胞(类红细胞，ATCC CCL243)、HUT78细胞(T细胞，ATCC TIB-161)、Jurkat细胞(T细胞)、DAUDI(伯基特氏人类淋巴瘤，Clontech，Palo Alto，CA)、RAJI(伯基特氏人类淋巴瘤，Clontech)和HL60(单核细胞)的poly(A)RNA制备印迹，在这些印迹上按上述方法进行了Northern印迹分析。用TACI探针(SEQ ID NO：21)或BCMA探针(SEQ ID NO：24)探测这些印迹。在Raji细胞中检测到相应于TACI的一个1.5kb转录本。在Daudi、Raji和Hut 78细胞中检测到相应于BCMA的一个1.2kb转录本。
采用基于PCR的筛选，鉴定表达人或鼠TACI和人BCMA的组织。根据厂家说明书筛选人和鼠Rapid-ScanTM基因表达系列(OriGeneTechnologies公司，Rockville，MD)。设计寡核苷酸引物ZC24200(SEQ IDNO：27)和ZC24201(SEQ ID NO：28)，以横跨一个外显子接合处并产生相应于鼠TACI的一个272bp片段。在脾、胸腺、肺、乳房、心脏、肌肉、皮肤、肾上腺、胃、小肠、脑、卵巢、前列腺和胚胎中检测到表达。在许多组织中检测到～500和800bp的其它条带。
设计寡核苷酸引物ZC24198(SEQ ID NO：29)和ZC24199(SEQ IDNO：30)，以横跨一个外显子接合处并产生相应于人类TACI的一个204bp片段。在脾、脑、心脏、肝、结肠、肺、小肠、肌肉、胃、睾丸、胎盘、唾液腺、肾上腺、胰腺、前列腺、外周血淋巴细胞和骨髓中检测到表达。
设计寡核苷酸引物ZC24271(SEQ ID NO：31)和ZC24272(SEQ IDNO：32)，以横跨一个外显子接合处并产生相应于人类BCMA的一个329bp片段。在脑、脾、结肠、肺、小肠、胃、卵巢、睾丸、唾液腺、肾上腺、胰腺、前列腺、外周血淋巴细胞、骨髓和胎儿肝中检测到表达。
设计寡核苷酸引物ZC24495(SEQ ID NO：33)和ZC24496(SEQ IDNO：34)以横跨一个外显子接合处，产生相应于鼠BCMA的一个436bp片段。在肝中检测到表达。
                        实施例6
            TACI-Ig和BCKA-Ig融合载体的制备Igγ1 Fc4片段的构建
为了制备TACI-Ig融合蛋白，修改人类IgG1的Fc区(铰链区及CH2和CH3区)，以便除去Fc的受体(FcgRI)和补体(Clq)结合功能。人类IgG1Fc的该修饰版本称作Fc4。
通过PCR采用寡聚体引物ZC10，134(SEQ ID NO：43)和ZC10，135(SEQID NO：44)，从人类胎儿肝文库(Clontech)分离该Fc区。采用PCR在该Fc区中引入突变以降低FcgRI的结合。根据Baum等(EMBO J.13：3992-4001，1994)，将该FcgRI结合位点(Leu-Leu-Gly-Gly)突变为Ala-Glu-Gly-Ala(SEQ ID NO：45的第38-41位氨基酸残基)，以降低FcR1的结合(Duncan等，自然332：563-4，1988)。采用寡核苷酸引物ZC15，345(SEQ ID NO：46)和ZC15，347(SEQ ID NO：47)引入该突变。在50μl终体积中，加有570ng IgFc模板、5μl 10×Pfu反应缓冲液(Stratagene)、8μl 1.25mM dNTPs、31μl dH2O、2μl 20mM ZC15，345(SEQID NO：46)和ZC15，347(SEQ ID NO：47)。加入等体积的矿物油，并将该反应物加热至94℃1分钟。加入Pfu聚合酶(2.5个单位，Stratagene)，之后进行25个循环，每个循环为：94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟，之后72℃延伸7分钟。电泳该反应产物，并检测相应于约676bp预期大小的条带。从凝胶上切下该条带，用QIAGEN QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据厂家说明书进行回收。
还用PCR引入Ala至Ser(SEQ ID NO：45的第134位氨基酸残基)和Pro至Ser(SEQ ID NO：45的第135位氨基酸残基)的突变，以降低补体Clq的结合和/或补体的固定(Duncan和Winter，自然332：788，1988)，以及引入终止密码子TAA。采用FcγRI结合位点突变的IgFc序列作为模板进行两个第一轮反应。50μl终体积加有1μl FcγRI结合位点突变的IgFc模板、5μl 10×Rfu反应缓冲液(Stratagene)、8μl 1.25mMdNTPs、31μl dH2O、2μl 20mM ZC15，517(SEQ ID NO：48)(一个起始于SEQID NO：45第26位核苷酸的5’引物)和2μl 20mM ZC15，530(SEQ ID NO：49)(一个起始于SEQ ID NO：45第405位核苷酸互补链的3’引物)。第二个反应含有20mM的寡核苷酸引物ZC15，518(SEQ ID NO：50)(起始于SEQ IDNO：45第388位核苷酸的5’引物)和ZC15，347(SEQ ID NO：47)(3’引物)的原液各2μl，以引入Ala至Ser的突变、Xba I限制性位点和终止密码子。加入等体积的矿物油，并将反应物加热至94℃ 1分钟。加入Pfu聚合酶(2.5个单位，Stratagene)，之后进行25个循环，每个循环为：94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃2分钟，之后72℃延伸7分钟。电泳该反应产物，并检测分别相应于~370bp和~395预期大小的条带。从凝胶上切下这些条带，用QIAGEN QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据厂家说明书进行回收。进行第二轮反应以将上述片段连接起来，并加上5’BamHI限制性位点。50ul终体积中加有30μl dH2O、8μl 1.25mM dNTPs、5μl 10×Pfu聚合酶反应缓冲液(Stratagene)和两个第一次的两个PCR产物各1μl。加入等体积的矿物油，并将反应物加热至94℃ 1分钟。加入Pfu聚合酶(2.5个单位，Stratagene)，之后进行5个循环，每个循环为：94℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟。将温度再次提升到94℃，加入20mM的ZC15，516(SEQ ID NO：51)(起始于SEQ ID NO：45第1位核苷酸的5’引物)和ZC15，347(SEQ ID NO：47)原液各2μl，之后进行25个循环，每个循环为：94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分钟，最终72℃延伸7分钟。采用凝胶电泳观察部分反应产物。检测到相应于预期大小的一个789bp条带。TACI-Fc4和BCMA-Fc4表达载体的构建
通过在酵母中同源重组构建含有TACI-Fc4和BCMA-Fc4融合蛋白的表达质粒。采用PCR分离包括SEQ ID NO：5第15位核苷酸至第475位核苷酸的多核苷酸序列的TACI cDNA片段。用于产生该TACI片段的两个引物是：(1)含有40bp的5’载体侧翼序列和相应于该TACI片段氨基端的17bp的引物(SEQ ID NO：52)；(2)相应于侧翼Fc4序列的40bp 3’末端和相应于该TACI片段羧基端的17bp(SEQ ID NO：53)。100μl终体积中加有10ngTACI模板、10μl 10×Taq聚合酶反应缓冲液(Perkin Elmer)、8μl 2.5nMdNTPs、78μl dH2O、20mM寡核苷酸引物SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53贮液各2μl、和Taq聚合酶(2.5个单位，Life Technology)。加入等体积的矿物油，并将该反应物加热至94℃2分钟，之后进行25个循环，每个循环为：94℃ 30秒、65℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分钟，之后72℃延伸5分钟。
采用PCR分离包括SEQ ID NO：7第219位核苷酸至第362位核苷酸的多核苷酸序列的BCMA cDNA片段。用于该BCMA片段制备的两个引物是：含有40bp的5’载体侧翼序列和相应于该BCMA片段氨基端的17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO：54)；以及含有相应于侧翼Fc4序列的40bp 3’末端和相应于该BCMA片段羧基端的17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO：55)。100μl终体积中加有10ng BCMA模板、10μl 10×Taq聚合酶反应缓冲液(Perkin Elmer)、8μl 2.5mM dNTPs、78μl dH2O、20mM寡核苷酸引物SEQID NO：54和SEQ ID NO：55贮液各2μl。加入等体积的矿物油，并将该反应物加热至94℃ 2分钟，之后进行25个循环，每个循环为：94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分钟，之后72℃延伸5分钟。
以相似方式构建各用于TACI和BCMA融合结构的含有编码Fc4片段的cDNA的片段。对于TACI，用于Fc4片段产生的两个引物是(上游和下游)：含有40bp 5’TACI侧翼序列和相应于该Fc4片段氨基端17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO：56)；以及含有相应于侧翼载体序列的40bp 3’末端和相应于该Fc4片段羧基端17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO：57)。对于BCMA，用于Fc4片段产生的上游引物是含有40bp 5’BCMA侧翼序列和相应于该Fc4片段氨基端17bp的寡核苷酸引物(SEQ ID NO：58)。用于BCMA结构的Fc4的下游引物与所描述的用于TACI-Fc4的相同(SEQ IDNO：57)。
100μl终体积中加有10ng上述Fc4模板、10μl 10×Taq聚合酶反应缓冲液(Perkin Elmer)、8μl 2.5nM dNTPs、78μl dH2O、对于TACI 20mM寡核苷酸SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57贮液各2μl、而对于BCMA 20mM寡核苷酸SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：57贮液各2μl、及Taq聚合酶(2.5个单位，Life Technology)。加入等体积的矿物油，并将该反应物加热至94℃ 2分钟，之后进行25个循环，每个循环为：94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分钟，之后72℃延伸5分钟。
为了分析，上述每个100μl PCR反应物各取10μl在0.8％LMP琼脂糖凝胶(Seaplaque GTG)上1×TBE缓冲液中电泳。每个PCR反应物剩余的90μl通过加入5μl 1M NaCl和250μl无水乙醇进行沉淀。用SmaI切割质粒pZMP6，以使其在多接头处线性化。质粒pZMP6来源于质粒pCZR199(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA，ATCC#98668)，是含有如下表达盒的一种哺乳动物表达载体，该表达盒带有CMV立即早期启动子、一个来自小鼠免疫球蛋白重链座位可变区的共有序列内含子、用于插入编码序列的多个限制性位点、一个终止密码子和一个人类生长激素终止子。该质粒还具有一个大肠杆菌的复制原点、一个带有SV40启动子、增强子和复制原点、一个DHFR基因和SV40的终止子的哺乳动物选择标记表达单元。通过用CMV立即早期启动子和该开放阅读框5’末端的Kozac序列替换掉金属硫蛋白启动子，从pCZR199构建载体pZMP6。
100μl感受态酵母细胞(酿酒酵母)与10μl含有TACI或BCMA胞外域和适用于和它们进行重组的Fc4 PCR片段各大约1μg、以及100ng SmaI消化的pZMP6载体的溶液混合，然后转移至0.2cm电穿孔杯中。以0.75kV(5kY/cm)、∞ohms、25μF，电脉冲该酵母/DNA混合物。向每个杯加入600μl1.2M山梨糖醇，并将两个300μl等分试样中的酵母铺在URA-D平板上，30℃进行孵育。
大约48小时后，将来自单个平板的Ura+酵母转化体重悬在1ml H2O中，短暂离心以沉淀该酵母细胞。将该细胞沉淀重悬在1ml裂解缓冲液(2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris pH8.0、1mM EDTA)中。将500μl该裂解混合物加入含有300μl酸洗涤过的玻璃珠和200μl酚-氯仿的Eppendorf管中，涡旋1分钟，中间间隔两或三次，之后在Eppendorf离心机中以最大速度离心5分钟。将300μl水相转移到一个新管子中，用600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA，之后4℃离心10分钟。将该DNA沉淀重悬在100μl H2O中。
用0.5-2ml酵母DNA制备物和40μl DH10B细胞转化电感受态大肠杆菌细胞(DH10B，GibcoBRL)。在2.0kV，25mF和400ohms下电脉冲这些细胞。电穿孔后，1ml SOC(2％细菌培养用蛋白胨(Difco，Detroit，MI)，0.5％酵母提取物(Difco)，10mM NaCl，2，5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)以250μl的等分试样铺在4个LB AMP平板上(LB培养基(Lennox)，1.8％细菌培养用琼脂(Difco)，100mg/L氨苄青霉素)。
通过限制性消化验证插入片段的存在并证实各种DNA序列均彼此正确地连接在一起，以鉴定含有TACI-Fc4或BCMA-Fc4的正确表达结构的单克隆。对阳性克隆的插入片段进行序列分析。采用Qiagen Maxi试剂盒(Qiagen)根据厂家说明书较大规模地分离质粒DNA。
                    实施例7
        TACI-Fc4和BCMA-Fc4的哺乳动物表达
将BHK570细胞(ATCC CRL-10314)铺在10cm的组织培养皿中，并使其在DMEM/FBS培养基(DMEM，Gibco/BRL高葡萄糖(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)，5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，1mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，1mM丙酮酸钠(Gibco BRL))中，37℃、5％CO2下过夜生长至大约50-70％汇合。然后在无血清(SF)培养基制品(DMEM，10mg/ml转铁蛋白，5mg/ml胰岛素，2mg/ml胎球蛋白，1％L-谷氨酰胺和1％丙酮酸钠)中，用质粒TACI-Fc4/pZMP6或BCMA-Fc4/pZMP6以及LipofectamineTM(Gibco BRL)转染细胞。在15ml管中用SF培养基稀释TACI-Fc4/pZMP6或BCMA-Fc4/pZMP6至640μl总终体积。取35μl LipofectamineTM(Gibco BRL)和605μl SF培养基混合。向所述DNA混合物中加入该LipofectamineTM混合物，并使其在室温孵育大约30分钟。向该DNA：LipofectamineTM混合物加入5ml SF培养基。用5ml SF培养基冲洗所述细胞一次，吸出，然后加入该DNA：LipofectamineTM混合物。37℃孵育细胞5个小时，然后向每个平板加入6.4ml的DMEM/10％FBS、1％PSN培养基。将这些平板37℃孵育过夜，然后次日用新鲜的5％FBS/EMEM培养基替换该DNA：LipofectamineTM混合物。在转染后第5天，将细胞分开部分放入T-162摇瓶，于选择培养基(DMEM/5％FBS，1％L-GLU，1％NaPyr)中培养。转染后大约10天，用胰蛋白酶消化来自每个转染的两个150mm培养皿的氨甲蝶呤抗性集落，集合这些细胞并接种在一个T-162摇瓶中，然后转移至大规模培养。
                    实施例9
                ztnf4的转基因表达
采用成年能生育雄性(B6C3f1)、青春期前的能育雌性(B6C3f1)、切除了输精管的雄性(B6D2f1)和成年能育雌性(B6D2f1)(所有均来自Taconic Farms，Germantown，NY)，制备表达ztnf4基因的转基因动物。采用妊马血清促性腺激素(Sigma，St.Louis，MO)和人类的绒毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))，使青春期前的能育雌性超数排卵。随后用成年能育雄性与该超数排卵的雌性交配，并通过阴道栓的存在与否验证交配。
在手术镜(Leica MZ12 Stereo Microscope，Leica，Wetzlar，德国)下收集受精卵。然后在已经于5％CO2、5％O2和90％N2，37℃孵育过的透明质酸酶和Whitten氏W640培养基(表8；所有试剂均可从SigmaChemical公司获得)中洗涤这些卵。在显微注射前将卵储存在37℃/5％CO2孵箱中。
               表8WHITTEN氏640培养基
          mgs/200ml   mgs/500mlNaCl          1280        3200KCl           72          180KH2PO4      32          80MgSO4-7H2O  60          150葡萄糖        200         500乳酸钙        106         265青霉素G       15          37.5硫酸链霉素    10          25NaHCO3       380         950丙酮酸钠      5           12.5H2O          200ml       500ml500mM EDTA    100μl      250μl5％酚红       200μl      500μlBSA           600         1500
采用寡核苷酸引物SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37，通过PCR扩增编码全长人类TACI配体Blys(SEQ ID NO：35)的858bp开放阅读框，以便引入最佳起始密码子和侧翼5’PmeI和3’AscI位点。将该PmeI/AscI片段亚克隆至pKF024中，pKF024是一种B和/或T细胞限制性转基因载体，含有Ig Em增强子(来自pEmSRd的690bp NotI/XbaI；Bodrug等，EMBO J.13：2124-30，1994)、Ig Vh启动子(来自pJH1X(-)的536bpHincII/XhoI片段；Hu等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)177：1681-90，1993)、SV40的16S内含子(来自pEmSR的171bp XhoI/HindIII片段)、一个PmeI/AscI多接头、和人类生长激素基因的聚腺苷酸化信号(627bpSmaI/EcoRI片段；Seeburg，DNA 1：239-49，1982)。通过NotI消化和琼脂糖凝胶纯化从质粒骨架中分离出该转基因插入片段，并基本上按前人所述对来自上述B6C3F1Tac小鼠交配的受精卵进行显微注射，并移植至假孕雌性动物中(Malik等，分子细胞生物学(Molec.Cell.Biol.)15：2349-58，1995)。
将受体动物成对地放回笼中，使其怀孕19-21天。出生后，经过产后19-21天辨别性别并断奶，然后用干净的剪刀将尾剪断，获得0.5cm活检组织(用于基因型分析)
采用可从商业途径获得的试剂盒(DNeasy 96 Tissue试剂盒；Qiagen，Valencia，CA)，依据厂家说明书，从剪下的尾部小块制备基因组DNA。采用针对该转基因载体的人类生长激素(hGH)3’UTR部分所设计的引物，通过PCR分析基因组DNA。引物ZC17251(SEQ ID NO：38)和ZC17252(SEQ IDNO：39)扩增一个368碱基对的hGH片段。采用该人类序列所特有的区域(从人类和小鼠的生长激素3’UTR DNA序列的比对鉴定的)，以保证该PCR反应不扩增小鼠序列。此外，还可以和该hGH引物一起使用与载体序列杂交并扩增该cDNA插入片段的引物ZC17156(SEQ ID NO：40)和ZC17157(SEQ ID NO：41)。在这些实验中，来自该转基因阳性动物的DNA产生两个条带，一个是相应于该hGH 3’UTR片段的368碱基对条带，而一个是相应于该cDNA插入片段的具有可变大小的条带。
一旦证实动物是转基因的(TG)，则通过将一只TG雌性和一只野生型雄性、或一只TG雄性和一只或两只野生型雌性动物放置在一起，使TG动物与近交系回交。幼崽出生并断奶后，区分性别，并剪下它们的尾用于基因型分析。
为了检查活体动物中转基因的表达，对存活的活检组织进行实验。采用RNA溶液杂交实验或在ABI Prism 7700(PE Applied Biosystems公司，Foster City，CA)上根据厂家说明书进行的实时PCR，分析每个转基因的mRNA表达水平。细胞的制备和流式细胞计量术
分析不同年龄的起始小鼠。为了淋巴组织的流式细胞计量术(FACS)分析，通过采用研钵和研棒在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中仔细破碎股骨和胫骨以分离骨髓(BM)细胞。将细胞重悬起来，通过被动沉降除去骨碎片，然后以1000×g沉淀细胞。通过在两块载玻片之间挤压完整组织，获得脾细胞、胸腺细胞、或淋巴结细胞，然后和用于BM的操作一样，将细胞重悬起来然后沉淀。在染色前，将细胞重悬在FACS洗涤缓冲液(FACSWB)(Hank氏平衡盐溶液，1％BSA，10mM Hepes，pH7.4)中，浓度为20×106个细胞/ml。为了染色，将1×106个细胞转移到5ml管中，并用1mlFACS WB洗涤，然后1000×g进行沉淀。然后在有饱和量的适当FITC、PE和/或TriColor(TC)结合的mAbs时，在100ml总体积的FACS WB中将细胞于冰上孵育20分钟。用1.5ml WB洗涤细胞，沉淀，然后重悬在400mlWB中，并在FACSCalibur流式细胞仪上采用CellQuest软件(BectonDickinson，Mountain View，CA)进行分析。用于前面(FSC)和侧面(SSC)光散射的探测器设定在线性范围上，而所有的三个荧光通道(FL-1，FL-2和FL-3)均采用对数探测器。
每个实验均采用单个颜色染色的细胞群校正FL通道之间的光谱重叠。将所有未过阈值的(ungated)细胞收集到盘上，然后采用CellQuest软件分析数据。通过基于FSC对SSC分布图的电子阈值(electronicallygating)数据，排除RBC和死细胞。
异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗CD8单克隆抗体(mAb)(克隆53-6.7)和藻红素(Phycoerthyrin)(PE)结合的抗CD4(克隆RM4-5)、抗CD5(克隆53-7.3)、抗CD19(克隆1D3)、和抗多配体蛋白聚糖(克隆281-2)mAb购自PharMingen(San Diego，CA)。TriColor(TC)结合的抗CD45R/B220 mAb(克隆RA3-6B2)购自Caltag。
在淋巴区室中超量表达ztnf4的转基因小鼠出现外周B细胞数量增加、浆细胞增加和血清免疫球蛋白水平的提高。这些转基因动物在脾脏、淋巴结和胸腺中有增加数量的B200+细胞。数量增加的脾B细胞包括常规B-2细胞和正常情况下稀少的B-1细胞群。一般，B-1细胞主要限于腹膜腔和其它体腔，产生低亲和力的自反应性抗体，并通常与自身免疫病例如系统性红斑狼疮SLE的发生相关。
年龄较大的转基因动物产生自体抗体，出现系统性红斑性狼疮的特征：蛋白尿和硬化的肾小球。
图5A显示了，按下述制备的，用抗B220-TC染色并通过流式细胞计量术分析的脾(上图)、肠系膜淋巴结(中图)和骨髓(下图)的单细胞悬浮物。通过B220+细胞的百分数乘以血细胞计数器所计数的肝细胞(台盼蓝染色细胞除外)总数，计算每种组织中B220+细胞的数量。每个柱代表从单个ztnf4转基因(Tg，阴影柱)或非TG同窝出生仔畜(空白柱)对照小鼠获得的数据。
图5B显示了从ztnf4 TG(左侧图)或非TG同窝出生仔畜(右侧图)的淋巴结(上排)、脾(中排)和胸腺(底排)分离的细胞，该细胞用针对所示分子(DC5、CD4和CD8)的mAb染色，然后通过流式细胞计量术进行分析。对显示的数据进行限定以排除死细胞和RBC。
图5C显示了6-23周龄范围的ztnf4转基因小鼠的血清中总的IgG、IgM和IgE水平。
图5D显示了与对照同窝出生仔畜的正常肾小球相比，ztnf4转基因小鼠的H&E染色肾切片中鉴定的肾小球淀粉样沉积和肾小球系膜增厚。
图5E显示了ztnf4转基因小鼠中效应T细胞的增加，类似于Mackay等的报道(实验医学杂志(J.Exp.Med.)190：1697-1710，1999)。
将可溶性TACI(BR43×2)或BCMA-Ig融合物注射入超量表达ztnf4的转基因小鼠中。通过流式细胞计量术(FACS)分析淋巴组织，鉴定脾、淋巴结和胸腺中B220+B细胞数量的任何改变。
                    实施例10
                直接结合ELISA
开发了一种直接结合ELISA，以对体外可溶性TACI-Ig或可溶性BCMA-Ig结合ztnf4和抑制ztnf4的生物学活性的能力进行特性分析。
用ELISA A缓冲液(0.1M Na2HCO3 pH9.6，0.02％NaN3)中的1μg/ml羊抗人Ig(Jackson Labs，Bar Harbor，MA)包被96孔板，并于4℃孵育过夜。TACI、BCMA和作为对照的不相关的TNF受体如ztnfr10(SEQ IDNO：42)从10μg/ml作5倍稀释，滴定至320ng/ml加一个零，然后和2.5、0.5或0.1μg/ml生物素化的ztnf4或作为阴性对照的卵白蛋白共孵育，并在室温孵育1小时。
然后将该共孵育的受体-生物素化配体混合物加至羊抗人Ig包被的96孔板中。然后用ELISA C(500μl Tween 20(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO.)，200mg NaN3，PBS，终体积1升)洗涤这些板，并用Superblock(Pierce，Rockford，IL)封闭。然后将板在37℃孵育2个小时。
用ELISA C再一次洗涤这些板，之后加入100μl/孔存在于ELISA B(5或10μg BSA(Sigma)分别构成1％或2％BSA，250μl Tween 20(Sigma)，100mg NaN3，磷酸缓冲盐溶液pH7.2(PBS，Sigma)，终体积为500ml；或者，该缓冲液可以由ELISA C缓冲液中的1％或2％BSA构成。)中的1∶10,000 neutr-抗生物素蛋白-HRP。然后用OPD室温10分钟显色这些板，并于492处进行读数。
                    实施例11
                生物学活性分析试验
开发一种生物学活性分析试验，以测量可溶性TACI-FC对可溶性ztnf4引起的人B细胞刺激的抑制。采用CD19磁珠和VarioMacs磁性分离系统(Miltenyi Biotec Auburn，CA)根据厂家说明书，从外周血单核细胞(PBMNC)中分离B细胞。纯化的B细胞与可溶性ztnf4(25ng/ml)及重组人IL-4(10ng/ml Pharmingen)混合，并(一式三份)以每孔1×105个细胞接种在圆形底96孔板中。
将可溶性TACI-FC从5μg/ml稀释至6ng/ml，并与所述B细胞一起孵育5天，在第4天每孔用1μCi 3H胸苷(Amersham)处理过夜。作为对照，将可溶性TACI-FC在没有ztnf4时与B细胞和IL-4一起孵育。
采用Packard平板采集器收获平板中的细胞，然后采用Packard读数器计数。在体外，TACI-Ig可溶性受体以剂量依赖方式抑制可溶性ztnf4刺激B细胞增殖的能力。10倍摩尔过量的TACI-Ig完全抑制在存在IL-4时人B细胞响应可溶性ztnf4的增殖。
                      实施例12
                    ORIGIN分析试验
采用电化学发光试验，确定相对于正常个体患有疾病病症(例如SLE、类风湿性关节炎等)的患者中ztnf4的水平。从在ORIGIN缓冲液(Igen，Gaithersburg，MD)中制备的10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml和0ng/ml可溶性人ztnf4制备标准曲线。在ORIGIN缓冲液中稀释血清样品。标准品和样品与在Origin分析缓冲液(IGEN)中稀释至1μg/ml的生物素化兔抗人ztnf4-NF BV抗体、和在Origin分析缓冲液(IGEN)中稀释至1μg/ml的ruthenylated兔抗人ztnf4-NF BV多克隆抗体，于室温一起孵育2个小时。孵育后，涡旋混合样品，并向每一个标准品和样品中加入50μl/管0.4mg/ml链霉亲和素Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)，然后室温孵育30分钟。然后涡旋混合样品，并在Origin分析器(Igen)上根据厂家说明书对样品读数。该Origin分析试验以电化学发光为基础，在ECL中产生一个结果输出信息-这是什么，它如何作用以及这告诉了你什么。
在来自已发展到肾小球肾炎和自身免疫病晚期的NZBWE1/J和MRL/Mpj-Faslpr小鼠的血清样品中检测到升高水平的ztnf4。
                     实施例13
            自发性SLE模型中的可溶性TACI-Ig
NZBW小鼠在大约7-9月龄时出现自发性SLE的症状。当平均而言B细胞自体抗体的产生在NZBW小鼠中被认为处于高水平时，在5周时间内给NZBW小鼠施用TACI-Fc，并监测其对B细胞的抑制作用。
将100只8周龄的雌性(NZB×NZW)F1小鼠(Jackson实验室)分成6组，每组15只小鼠。处理前，每月一次监测小鼠尿中的蛋白质，并且抽血用于构建CBC和血清库。筛选存在自体抗体的血清。由于蛋白尿是肾小球肾炎的标志信号，因此在研究过程中每隔一定时间间隔以量杆监测尿中的蛋白质水平。处理前称重动物。当小鼠大约5月龄时开始给药。5周每周3次给小鼠腹膜内注射单纯的载体(PBS)或人IgG-FC(对照蛋白质)或TACI-FC4(测试蛋白质)。
组别(每组5只小鼠) 处理 剂量
1 未处理对照
2 单纯的载体
3 人IgG-FC  20μg
4 人IgG-FC  100μg
5 人TACI-FC4  20μg
6 人TACI-FC4  100μg
在给药期间两次收集血液，并在给药后进行至少两次收集。在给药开始后每两周测量蛋白尿的尿量杆值和体重。在安乐死时，收集血液、尿量杆值和体重值。称取脾、胸腺、肝及胆囊、左肾、和脑的重量。脾和胸腺均分成两份用于FACS分析和组织学分析。下颌下唾液腺、肠系膜淋巴结链、肝叶及胆囊、盲肠及大肠、胃、小肠、胰腺、右肾、肾上腺、舌及气管和食道、心脏、与肺也被收集用于组织学分析。
图6显示了NZBWF1和MRL/lpr/lpr小鼠的血清中与SLE的发生相关的ztnf4水平升高。图6A的上图显示，68只10-40周龄范围内的NZBWF1小鼠和10周及30周龄的NZB/B小鼠中，ztnf4血清水平与年龄相关。中图显示，与对照NZB/B小鼠相比，NZBWF1小鼠中与三个范围，即痕量-20mg/dl(T-30)、100-300ng/dl和200mg/dl，的蛋白尿的相关性。下图显示，与对照NZB/B小鼠相比，NZBWF1小鼠中ztnf4水平与各种效价的抗ds DNA抗体的关系。
图6B显示了在23只18-24周龄范围内的MRL/lpr/lpr小鼠和10只11周龄的对照MRL/MpJ小鼠上获得相似关系。
图7显示了尿分析结果。如果量杆读数≥100mg/dl，则认为小鼠患有蛋白尿。(A)PBS，(B)人IgG FC，100mg，(C)人IgG FC，20mg，(D)人TACI-IgG，100mg，和(E)人TACI-IgG，20mg。用可溶性TACI-IgG融合物处理的小鼠表现出蛋白尿的减少。
对处理动物的外周血分析揭示，在处理开始后两周，与FC(20和100mg)和PBS处理的小鼠比较，TACI-Fc处理小鼠(20和100mg)的白血细胞和淋巴细胞计数降低。对处理开始后6周(施用最后一次处理后两周)抽取的外周血进行的FAC分析(淋巴细胞作为阈值)显示，样品中存在的B细胞百分数剧烈降低。在施用最后一次处理后5周B细胞水平仍在下降，但不剧烈。表9提供了每一个处理组中小鼠的平均值(和标准差)(表9)。在进入处理的两周也观察到外周血中B细胞百分数的下降。
                             表9
     处理                  2周        5周
  ％B细胞      ％T细胞      ％B细胞
     PBS   26.05  (6.52)   67.05  (6.80)   20.83  (3.14)
  100mg FC   23.34  (5.77)   68.23  (7.30)   25.04  (8.07)
  20mg FC   24.09  (6.26)   65.27  (7.18)   18.96  (6.42)
  100mg TACI-FC   11.07  (5.03)   79.06  (6.71)   14.79  (4.76)
  20mgT ACI-FC   16.37  (7.27)   69.72  (8.90)   19.14  (5.27)
                            实施例14
                    正常小鼠中的可溶性TACI-Ig
给Blab/C小鼠施用TACI-FC，以监测其对正常小鼠的影响。将60只8周龄雌性Balb/C小鼠(HSD)分成12组，每组5只小鼠。处理前，称重小鼠并取血用于CBC和血清库的构建。第1-9组接受12天每天腹膜内注射(IP)单纯的载体(PBS)或人IgG-FC(对照蛋白质)或TACI-FC4(测试蛋白质)，并在第14天处死。第10-11组接受两周每周3次IP注射，并第14天处死。
组别(每组5只) 处理  剂量
 1 人TACI-FC4  200mg
 2 人TACI-FC4  100mg
 3 人TACI-FC4  20μg
 4 人TACI-FC4  5μg
 5 人FC4  200μg
 6 人FC4  100mg
 7 人FC4  20mg
 8 人FC4  5mg
 9 单纯的载体  与所用的量相同
 10 人TACI-FC4  100mg
 11 人FC4  100mg
 12 未处理对照
在第7天和第12天收集血液。在安乐死时，收集血液并称体重。称取脾、胸腺、和脑的重量。脾和胸腺均分成两份用于FACS分析和组织学分析。皮肤、脾、肠系膜LN链、下颌下唾液腺、卵巢、子宫、子宫颈、膀胱、肠系膜淋巴结链、肝叶及胆囊、盲肠及大肠、胃、小肠、胰腺、右肾、肾上腺、舌及气管和食道、心脏、胸腺、大腿肌肉、左和右股、脑也将被收集用于组织学分析。
按实施例13所描述的，与FC4或PBS单纯处理的并经CBC或FACS分析的那些样品相比，在第7天(通过CBC)和12天(采用FACS)，观察到取自所有TACI-FC4处理样品的外周血细胞中B细胞百分数显著降低。此外，第14天与取自FC4处理小鼠的相比，取自TACI-FC4处理动物的脾中B细胞减少将近50％。
                        实施例15
                     抗dsDNA ELISA
通过高水平的抗双链DNA抗体表征自身免疫。为了测量超量表达ztnf4的转基因小鼠和NZBW小鼠中的抗dsDNA抗体水平，开发了一种ELISA分析。用聚L-赖氨酸(Sigma)(20μl/ml，在0.1M Tris缓冲液pH7.3中)以75μl/孔包被96孔微滴定板(Nunc)，并室温孵育过夜。之后在dH2O中洗涤该板，并用聚dAdT(Sigma)(20μl/ml，0.1M Tris缓冲液pH7.3中)以75μl/孔进行包被，然后室温孵育60分钟。然后用dH2O洗涤该板，并用Tris缓冲液中的2％BSA(Sigma)室温封闭30分钟，之后在dH2O中作最后的洗涤。
从实施例10所述ztnf4转基因小鼠和实施例11所述NZBW小鼠采取血清样品。将该血清样品1∶50稀释在Tris缓冲液内的1％BSA/2％BGG(Calbiochem)中。然后以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200和1∶6400(50μl/孔)将这些稀释样品滴定在该包被板中，并室温孵育90分钟。
然后在dH2O中洗涤板，并以50μl/孔加入1％BSA/2％BGG中1∶1000稀释的羊抗鼠IgG-Fc-HRP(Cappel)。室温孵育该板60分钟。在dH2O中洗涤板5次，并用OPD(1片/10ml Novo D，以100μl/孔铺板)显色。用100μl/孔1N H2S04终止显色，并在492nm处读取OD值。
图8显示了，与NZBWF1(32周龄)和MRL/lpr/lpr(19周龄)小鼠的血清中检测到的抗dsDNA水平相比，两只ztnf4转基因小鼠(23周龄)、两只非转基因同窝出生仔畜中的抗dsDNA水平。
                     实施例16
            自发性ELE模型中的可溶性TACI-Ig
给25只雌性PLxSJL F1小鼠(12周龄，Jackson实验室)每只皮下注射配制在弗氏完全佐剂中的125μg抗原(髓鞘蛋白脂质蛋白，PLP，139-151位残基)。将这些小鼠分成5组，每组5只小鼠。在第0天和第2天腹膜内注射百日咳毒素(400ng)。给一些组施用1倍、10倍或100倍剂量的TACI、BCMA或BR43×2，一组接受单纯的载体，而一组不接受处理。预防治疗将在第0天开始，干涉治疗将在第7天开始或在临床症状出现时开始。疾病的症状、体重的减轻、和瘫痪出现在大约第10-14天，并持续大约1周。通过称量体重和指定一个符合症状程度的临床评分，每天对动物进行评价。EAE的临床症状出现在接种的第10-14天内，并持续大约1周。在该研究结束时，通过给予过量气体，以安乐死方式处死所有动物，并进行尸体剖检。收集脑和脊柱用于组织学分析，或冷冻用于mRNA分析。就个体和组对体重和临床评分数据进行作图。临床评分
0正常
0.5弱，尾紧张度可能降低但并非没有
1尾软(当在尾基部捡起小鼠时，不能提起尾部)
2尾软，腿无力(不能提起尾，能够用后腿直立但腿颤抖)
3局部麻痹(不能用腿蹲，用后腿以划动方式行走)
4麻痹(不能移动后腿，当试图行走时拖曳着腿)
5四肢麻痹(前腿麻痹或以转圈的方式行走，可能有头部倾斜)
6垂死(完全麻痹，不能获取食物或水，处死动物)
                        实施例17
            TACI-FC和类风湿性关节炎的CIA模型
将8周龄雄性DBA/1J小鼠(Jackson实验室)分组，每组5只小鼠，相隔3周给这些小鼠两次皮下注射50-100μl 1mg/ml胶原蛋白(鸡或牛来源的)。一个对照将不接受胶原蛋白注射。第一次注射物配制在弗氏完全佐剂中，而第二次注射物配制在弗氏不完全佐剂中。在第二次注射时或之前，或在动物出现持续至少24个小时的2或更高临床评分后，预防性施用TACI-FC。在第二次胶原蛋白注射后，通常在2-3周内，动物开始表现出关节炎的症状。通过采用测径器测量爪的厚度并对每个爪给定一个临床评分(0-3)，从每个爪评价疾病的程度。临床评分：0正常，1一个或多个趾红肿，2轻微的爪发炎，3中度的爪发炎，4严重的爪发炎。在疾病确立一段时间后安乐处死动物。收集爪用于组织学分析或mRNA分析，并收集血清用于免疫球蛋白和细胞因子分析。
                        实施例18
                     TACI抗体的中和
用肽huztnf4-1SAGIAKLEEGPELQLAIPRE(SEQ ID NO：59)或huztnf4-2SFKRGSALEEKENKELVKET(SEQ ID NO：60)，免疫2只雌性新西兰白兔，制备多克隆抗肽抗体。这些肽是采用Applied Biosystems型431A肽合成仪(Applied Biosystems公司，Foster City，CA)，根据厂家说明书合成的。然后用顺丁烯二酰亚胺激活，使这些肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)结合。给所述兔每只最初腹膜内(ip)注射200μg配制在弗氏完全佐剂中的肽，之后每三周加强腹膜内注射100μg配制在弗氏不完全佐剂中的肽。施用第二次加强注射(总共3次注射)后7-10天，抽取动物血液，并收集血清。然后加强免疫动物，并每三周抽取动物血液。
采用1μg/ml用于制备抗体(SEQ ID NOs：59和60)的肽作为抗体靶标，通过ELISA滴定检测定性分析ztnf4肽特异性兔血清。针对huztnf4-1肽(SEQ ID NO：59)的2只兔血清具有以1∶1E5(1∶100000)稀释度与它们的特异肽结合的滴度。针对huztnf4-2肽(SEQ ID N0：60)的2只兔血清具有以1∶5E6稀释度与它们的特异肽结合，以及以1∶5E6稀释度与重组的全长蛋白质(杆状病毒中制备的N端FLAG标记ztnf4(huztnf4s-NF-Bv)和BHK细胞中制备的C端FLAG标记ztnf4)结合的滴度。
利用以每克CNBR-SEPHAROSE 10mg特异肽(SEQ ID NO：59或60)制备的CNBR-SEPHAROSE 48蛋白柱(Pharmacia LKB)，从兔血清亲和纯化该ztnf4肽特异性多克隆抗体，之后在PBS中20倍透析过夜。采用1μg/ml适当肽抗原或重组全长蛋白质(huztnf4-NF-Bv)作为抗体的靶标，通过ELISA滴定检测定性分析ztnf4特异性抗体。该兔抗huztnf4-1亲和纯化抗体对于其特异性抗原(huztnf4-1肽，SEQ ID NO：59)的检测下限(LLD)为5ng/ml的稀释液。该兔抗huztnf4-2亲和纯化抗体对于其特异性抗原(huztnf4-2肽，SEQ ID NO：60)的检测下限(LLD)为0.5ng/ml的稀释液。该兔抗huztnf4-2亲和纯化抗体对于重组蛋白huztnf4s-NF-Bv的检测下限(LLD)为5ng/ml的稀释液。
还制备小鼠单克隆抗体，并就对生物素标记可溶性ztnf4的抑制作用的抑制对其进行了选择。该TACI单克隆抗体(248.14，248.23或246.3)没有一个阻断ztnf4与BCMA的结合。当条件培养基被稀释至1∶243时，单克隆248.23降低10ng/ml ztnf4-生物素的结合至大约50％，而在未稀释的培养基中降低结合至大约2倍。在1∶243-1∶181的条件培养基稀释液中单克隆246.3降低10ng/ml ztnf4-生物素的结合至大约50％，而在未稀释的培养基中降低结合5倍。
从前文所述，应理解，尽管为了举例说明的目的本文对本发明的具体实施方案进行了描述，但可以进行多种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明除了受所附权利要求的限制外，不受其它限制。

Claims (63)

1.在哺乳动物中抑制ztnf4活性的方法，包括给所述哺乳动物施用一定量的选自下组的化合物：
a)含有BR43×2的胞外域的多肽；
b)含有TACI的胞外域的多肽；
c)含有BCMA的胞外域的多肽；
d)含有SEQ ID NO：10的序列的多肽；
e)与SEQ ID NO：2的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
f)与SEQ ID NO：4的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
g)与SEQ ID NO：6的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
h)与SEQ ID NO：8的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
i)与SEQ ID NO：10的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
k)SEQ ID NO：4的多肽；
l)SEQ ID NO：6的第1-166位氨基酸残基；和
m)SEQ ID NO：8的第1-150位氨基酸残基。
2.根据权利要求1的方法，其中所述化合物是由通过肽键连接在一起的第一部分和第二部分组成的融合蛋白，所述第一部分含有选自下组的多肽：
a)含有SEQ ID NO：8的序列的多肽；
b)含有SEQ ID NO：2第25-58位氨基酸残基的多肽；
c)含有SEQ ID NO：6第34-66位氨基酸残基的多肽；
d)含有SEQ ID NO：6第71-104位氨基酸残基的多肽；
e)含有SEQ ID NO：6第25-104位氨基酸残基的多肽；
f)含有SEQ ID NO：8第8-37位氨基酸残基的多肽；
g)含有SEQ ID NO：8第41-88位氨基酸残基的多肽；
h)含有SEQ ID NO：8第8-88位氨基酸残基的多肽；且
所述第二部分含有另一多肽。
3.根据权利要求2的方法，其中所述第一部分还含有选自下组的多肽：
a)SEQ ID NO：2第59-120位氨基酸残基；
b)SEQ ID NO：6第105-166位氨基酸残基；和
c)SEQ ID NO：8第89-150位氨基酸残基。
4.根据权利要求2的方法，其中所述第一部分选自：
a)含有BR43×2胞外域的多肽；
b)含有TACI胞外域的多肽；和
c)含有BCMA胞外域的多肽。
5.根据权利要求2的方法，其中所述第一部分选自：
a)SEQ ID NO：4的多肽；
b)SEQ ID NO：6的第1-154位氨基酸残基；和
c)SEQ ID NO：8的第1-48位氨基酸残基。
6.根据权利要求2的方法，其中所述第二部分是免疫球蛋白的重链恒定区。
7.根据权利要求1的方法，其中所述抗体或抗体片段选自：
a)多克隆抗体；
b)鼠单克隆抗体；
c)来源于b)的人源化抗体；和
d)人单克隆抗体。
8.根据权利要求7的方法，其中所述抗体片段选自：F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小识别单元。
9.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是灵长类动物。
10.根据权利要求1的方法，其中所述ztnf4活性与B淋巴细胞相关。
11.根据权利要求1的方法，其中所述ztnf4活性与活化的B淋巴细胞相关。
12.根据权利要求1的方法，其中所述ztnf4活性与静息的B淋巴细胞相关。
13.根据权利要求1的方法，其中所述ztnf4活性与抗体的产生相关。
14.根据权利要求13的方法，其中所述抗体的产生与自身免疫病相关。
15.根据权利要求14的方法，其中所述自身免疫病是系统性红斑性狼疮、重症肌无力、多发性硬化症或类风湿性关节炎。
16.根据权利要求1的方法，其中所述ztnf4活性与哮喘、支气管炎或肺气肿有关。
17.根据权利要求1的方法，其中所述ztnf4活性与末期肾衰竭相关。
18.根据权利要求1的方法，其中所述ztnf4活性与肾疾病相关。
19.根据权利要求18的方法，其中所述肾疾病是肾小球肾炎、脉管炎、肾炎或肾盂肾炎。
20.根据权利要求1的方法，其中所述与肾瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病或淀粉样变性病相关。
21.根据权利要求1的方法，其中所述ztnf4活性与效应T细胞相关。
22.根据权利要求21的方法，其中所述ztnf4活性与调节免疫应答相关。
23.根据权利要求21的方法，其中所述活性与免疫抑制相关。
24.根据权利要求21的方法，其中所述免疫抑制与移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎症相关。
25.根据权利要求24的方法，其中所述活性与自身免疫病相关。
26.根据权利要求25的方法，其中所述自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病或Crohn氏病。
27.根据权利要求26的方法，其中所述ztnf4活性与炎症相关。
28.根据权利要求27的方法，其中所述炎症与关节疼痛、肿胀、贫血或败血症性休克相关。
29.用于抑制BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合的方法，包括施用一定量的选自下组的化合物：
a)含有BR43×2胞外域的多肽；
b)含有TACI胞外域的多肽；
c)含有BCMA胞外域的多肽；
d)含有SEQ ID NO：10的序列的多肽；
e)与SEQ ID NO：2的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
f)与SEQ ID NO：4的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
g)与SEQ ID NO：6的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
h)与SEQ ID NO：8的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
i)与SEQ ID NO：10的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
j)与SEQ ID NO：18的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
k)与SEQ ID NO：20的多肽特异结合的抗体或抗体片段；
k)SEQ ID NO：4的多肽；
l)SEQ ID NO：6的第1-166位氨基酸残基；和
m)SEQ ID NO：8的第1-150位氨基酸残基。
30.根据权利要求29的方法，其中所述化合物是由通过肽键连接在一起的第一部分和第二部分组成的融合蛋白，所述第一部分含有选自下组的多肽：
a)含有SEQ ID NO：8的序列的多肽；
b)含有SEQ ID NO：2第25-58位氨基酸残基的多肽；
c)含有SEQ ID NO：6第34-66位氨基酸残基的多肽；
d)含有SEQ ID NO：6第71-104位氨基酸残基的多肽；
e)含有SEQ ID NO：6第25-104位氨基酸残基的多肽；
f)含有SEQ ID NO：8第8-37位氨基酸残基的多肽；
g)含有SEQ ID NO：8第41-88位氨基酸残基的多肽；
h)含有SEQ ID NO：8第8-88位氨基酸残基的多肽；且
所述第二部分含有另一种多肽。
31.根据权利要求30的方法，其中所述第一部分还含有选自下组的多肽：
a)SEQ ID NO：2的第59-120位氨基酸残基；
b)SEQ ID NO：6的第105-166位氨基酸残基；和
c)SEQ ID NO：8的第89-150位氨基酸残基。
32.根据权利要求30的方法，其中所述第一部分选自：
a)含有BR43×2胞外域的多肽；
b)含有TACI胞外域的多肽；和
c)含有BCMA胞外域的多肽。
33.根据权利要求30的方法，其中所述第一部分选自：
a)SEQ ID NO：4的多肽；
b)SEQ ID NO：6的第1-154位氨基酸残基；和
c)SEQ ID NO：8的第1-48位氨基酸残基。
34.根据权利要求30的方法，其中所述第二部分是免疫球蛋白的重链恒定区。
35.根据权利要求29的方法，其中所述抗体或抗体片段选自：
a)多克隆抗体；
b)鼠单克隆抗体；
c)来源于b)的人源化抗体；和
d)人单克隆抗体。
36.根据权利要求35的方法，其中所述抗体片段选自：F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小识别单元。
37.根据权利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与B淋巴细胞相关。
38.根据权利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与活化的B淋巴细胞相关。
39.根据权利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与静息的B淋巴细胞相关。
40.根据权利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与抗体的产生相关。
41.根据权利要求29的方法，其中所述抗体的产生与自身免疫病相关。
42.根据权利要求41的方法，其中所述自身免疫病是系统性红斑性狼疮、重症肌无力、多发性硬化症或类风湿性关节炎。
43.根据权利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与哮喘、支气管炎或肺气肿有关。
44.根据权利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与末期肾衰竭相关。
45.根据权利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与肾疾病相关。
46.根据权利要求45的方法，其中所述肾疾病是肾小球肾炎、脉管炎、肾炎或肾盂肾炎。
47.根据权利要求29的方法，其中所述受体-配体啮合与肾瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病或淀粉样变性病相关。
48.根据权利要求29的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与效应T细胞相关。
49.根据权利要求48的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与免疫应答的调节相关。
50.根据权利要求49的方法，其中所述受体-配体啮合与与免疫抑制相关。
51.根据权利要求50的方法，其中所述免疫抑制与移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎症相关。
52.根据权利要求50的方法，其中所述受体-配体啮合与自身免疫病相关。
53.根据权利要求52的方法，其中所述自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病或Crohn氏病。
54.根据权利要求50的方法，其中所述BR43×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与炎症相关。
55.根据权利要求54的方法，其中所述炎症与关节疼痛、肿胀、贫血或败血症性休克相关。
56.编码SEQ ID NO：2的多肽的分离多核苷酸分子。
57.SEQ ID NO：1的分离的多核苷酸分子。
58.含有以下可操作地连接的元件的表达载体：
转录启动子；
根据权利要求56的多核苷酸分子；和
转录终止子。
59.根据权利要求58的表达载体，其还含有可操作地与所述多核苷酸分子连接的分泌性受体-配体啮合序列。
60.已导入了根据权利要求58的表达载体的培养细胞，其中所述培养细胞表达所述多核苷酸片段所编码的所述多肽。
61.制备多肽的方法，包括：
培养其中已导入了根据权利要求58的表达载体的细胞；
籍此所述细胞表达所述多核苷酸分子所编码的所述多肽；和
回收所述表达多肽。
62.具有SEQ ID NO：2的序列的分离多肽。
63.与可药用载体组合在一起的权利要求62的多肽。
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