DE60005135T2

DE60005135T2 - Lösliche rezeptoren br43x2 und verfahren zu deren therapeutischen verwendung

Info

Publication number: DE60005135T2
Application number: DE60005135T
Authority: DE
Inventors: A. Jane GROSS; Wenfeng Xu; Karen Madden; P. David YEE
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2020-01-08
Also published as: NO333915B1; EP1354598A2; NO20111595L; CN101518648A; EP1354598A3; EA200100621A1; EP1642972A1; PL209535B1; HU230024B1; CZ20012465A3; ATE437227T1; JP5021117B2; WO2000040716A3; PL364817A1; JP2003525861A; EA007471B1; NO20013316D0; ATE249517T1; SK288176B6; EP1642973B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Zelluläre Wechselwirkungen, die während einer Immunantwort auftreten, werden durch Mitglieder von zahlreichen Familien von Zelloberflächenrezeptoren gesteuert, eingeschlossen die Tumornecrosefaktor-Rezeptor-Familie (TNFR-Familie). Die TNFR-Familie besteht aus einer Anzahl integraler Membran-Glykoproteinrezeptoren, von denen viele in Verbindung mit ihren jeweiligen Liganden Wechselwirkungen zwischen verschiedenen hematopoietischen Zelllinien steuern (Smith et al, The TNF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins: Activation, Costimulation and Death, 76: 959–62, 1994; Cosman, Stem Cells 12: 440–55, 1994).
Ein solcher Rezeptor ist der TACI, der Transmembranaktivator und CAML-Interactor (von Bülow und Bram, Science 228: 138–41, 1997, wie auch die WIPO-Veröffentlichung WO 98/39361). Bei dem TACI handelt es sich um einen membrangebundenen Rezeptor mit einer extrazellulären Domäne, enthaltend zwei cystein-reiche Pseudo-Repeats, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne, die mit dem CAML wechselwirkt (Calciummodulator und Cyclophilin-Ligand), einem integralen Membranprotein, das auf intrazellulären Vesikeln angeordnet ist, bei dem es sich um einen Co-Induktor der NF-AT-Aktivierung handelt, wenn es in Jurkat-Zellen überexprimiert ist. Der TACI ist mit B-Zellen und einer Untergruppe von T-Zellen assoziiert. Von Bülow und Bram (ibid.) berichten, dass der Ligand für den TACI nicht bekannt ist.
Es wurde gefunden, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, eine TACI-Isoform mit nur einem cystein-reichen Pseudo-Repeat (BR43x2), TACI und ein verwandtes T-Zell-Protein, BCMA (Gras et al., Int. Immunol. 17: 1093–106, 1995) an den TNF-Liganden ztnf4 binden, auch bekannt als Neutrokin α (WIPO-Veröffentlichung WO 98/18921), BlyS (Moore et al., Science, 285: 260–3, 1999), BAFF (Schneider et al., J. Exp. Med. 189: 1747–56, 1999), Tall-1 (Shu et al., J. Leukoc. Biol. 65: 680–3, 1999) oder THANK (Mukhopadhyay et al. J. Biol. Chem. 274: 15978–81, 1999). Als solches wären BR43x2, TACI und BCMA zum Steuern der Aktivität von ztnf4 und insbesondere der Aktivierung von B-Zellen geeignet.
In dieser Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung Proteine als therapeutische Mittel für die Modulation der Aktivität von ztnf4 oder anderen BR43x2-, TACI- oder BCMA-Liganden, verwandte Zubereitungen und Verfahren wie auch andere Anwendungen bereit, die Fachleuten aus den hier gegebenen Lehren ersichtlich sein werden.
Dementsprechend stellt in einem ersten Aspekt die Erfindung bereit die Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren der ztnf4-Aktivität in einem Säuger, worin die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BR43x2; b) einem löslichen Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von TACI; c) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BCMA; d) einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 10; e) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 bindet; f) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 4 bindet; g) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 6 bindet; h) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 8 bindet; i) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 10 bindet; k) einem Polypeptid der SEQ ID Nr. 4; 1) den Aminosäureresten 1-166 der SEQ ID NR. 6; und m) den Aminosäureresten 1-150 der SEQ ID Nr. 8.
In einer Ausführungsform stellt die Verbindung ein Fusionsprotein dar, bestehend aus einem ersten Teil und einem zweiten Teil, verbunden über eine Peptidbindung, wobei der erste Teil ein Polypeptid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 8; b) einem Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste 25-58 der SEQ ID Nr. 2; c) einem Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste 34-66 der SEQ ID Nr. 6; d) einem Polypeptid, umfassen die Aminosäurereste 71-104 der SEQ ID Nr. 6; e) einem Polypeptid, umfassen die Aminosäurereste 25-104 der SEQ ID Nr. 6; f) einem Polypeptid, umfassen die Aminosäurereste 8-37 der SEQ ID Nr. 8; g) einem Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste 41-88 der SEQ ID Nr. 8; h) einem Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste 8-88 der SEQ ID Nr. 8; und der zweite Anteil ein weiteres Polypeptid umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst der erste Teil weiterhin ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) den Aminosäureresten 59-120 der SEQ ID Nr. 2; b) den Aminosäureresten 105-166 der SEQ ID Nr. 6; und c) den Aminosäureresten 89-150 der SEQ ID Nr. 8. In einer anderen Ausführungsform ist der erste Teil ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BR43x2; b) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von TACI; und c) einem Polypeptid, umfassen die extrazelluläre Domäne von BCMA. In einer verwandten Ausführungsform ist der erste Anteil ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid der SEQ ID Nr. 4; b) den Aminosäureresten 1-154 der SEQ ID Nr. 6; und e) den Aminosäureresten 1-48 der SEQ ID Nr. B. In einer anderen, verwandten Ausführungsform ist der zweite Anteil ein konstanter Bereich einer schweren Kette eines Immunglobulins.
In einer anderen Ausführungsform ist der Antikörper oder das Antikörperfragment ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem polyklonalen Antikörper; b) einem monoklonalen Antikörper der Maus; e) einem humanisierten Antikörper, abgeleitet aus b); und d) einem mensch lichen monoklonalen Antikörper. In einer verwandten Ausführungsform ist das Antikörperfragment ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus F(ab'), Fab', Fab, Fv, scFv. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Säuger um einen Primaten.
Bei einer anderen Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit B-Lymphozyten assoziiert. In einer anderen, verwandten Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit aktivierten B-Lymphozyten assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit ruhenden B-Lymphozyten assoziiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit der Antikörperproduktion assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform ist die Antikörperproduktion mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform handelt es sich bei der Autoimmunerkankung um den systemischen Lupus erythematodes, die Myasthenia gravis, die Multiple Sklerose oder die rheumatoide Arthritis. Bei einer anderen Ausführungsform ist die ztnf4-Ativität mit Asthma, Bronchitis oder Emphysemen assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit dem Nierenversagen im Endstadium assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit einer Nierenerkrankung assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform handelt es sich bei der Nierenerkrankung um die Glomerulonephritis, Vasculitis, Nephritis oder Pyelonephritis. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die Nierenerkrankung mit Nierenneoplasmen, multiplen Myolomen, Lymphomen, der leichten Kettenneuropathie oder der Amyloidose assoziiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit Effektor-T-Zellen assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit dem Moderieren oder Modulieren einer Immunantwort assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die Aktivität mit der Immunsuppresison assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die Immunsuppression mit der Transplantatabstoßung, mit Graft-versus-Host-Erkrankungen oder Entzündungen assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die Aktivität mit Autoimmunerkrankungen assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform handelt es sich bei der Autoimmunerkrankung um den Insulin-abhängigen Diabetes Mellitus oder Morbus Crohn. Bei einer anderen Ausführungsform ist die ztnf4-Aktivität mit Entzündungen assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform ist die Entzündung assoziiert mit Gelenkschmerzen, Schwellungen, Anämie oder dem septischen Schock. In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung bereit ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren des Eingreifens von ztnf4 in den BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor, welches Medikament eine Menge einer Verbindung wie oben beschrieben umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit B-Lymphozyten assoziiert. Bei einer anderen verwandten Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit aktivierten B-Lymphozyten assoziiert. Bei noch einer anderen Ausfüh rungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit ruhenden B-Lymphozyten assoziiert.
Bei einer anderen Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit der Antikörperproduktion assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform ist die Antikörperproduktion mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform handelt es sich bei der Autoimmunerkrankung um den systemischen Lupus erythematodes, die Myasthenia gravis, Multiple Sklerose oder die rheumatoide Arthritis. Bei einer anderen Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit Asthma, Bronchitis oder Emphysemen assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit dem Nierenversagen im Endstadium assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit einer Nierenerkrankung assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform handelt es sich bei der Nierenerkrankung um die Glomerulonephritis, Vasculitits, Nephritis oder Pyelonephritis. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die Nierenerkrankung mit renalen Neoplasmen, multiplen Myelomen, Lymphomen, der leichten Ketten-Neuropathie oder der Amyloidose assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit Effektor-T-Zellen assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit dem Moderieren oder Modulieren einer Immunantwort assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die Aktivität mit der Immunsuppression assoziiert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist die Immunsuppression mit Transplantatabstoßung, Graft-versus-Host-Erkrankungen oder Entzündungen assoziiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist die Aktivität mit Autoimmunerkrankungen assoziiert. Bei einer verwandten Ausführungsform handelt es sich bei der Autoimmunerkrankung um den Insulin-abhängigen Diabetes mellitus oder Morbus Crohn. Bei einer anderen Ausführungsform ist das BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Ligand-Eingreifen mit Entzündungen assoziiert. In einer verwandten Ausführungsform ist die Entzündung mit Gelenkschmerzen, Schwellungen, Anämie oder dem septischen Schock assoziiert.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Polynukleotidmolekül bereit, kodierend ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 2. Ebenfalls bereitgestellt wird ein isoliertes Polynukleotidmolekül der SEQ ID Nr. 1. In einer verwandten Ausführungsform wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, umfassend die folgenden, operativ miteinander verbundenen Elemente: einen Transkriptionspromoter, ein wie oben beschriebenes Polynukleotidmolekül und einen Transkriptionsterminator. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor zusätzlich eine sekretorische Sequenz für das Eingreifen von Rezeptor/Ligand, operativ verbunden mit dem Polynukleotidmolekül. Ebenfalls bereitgestellt wird eine kultivierte Zelle, in die ein wie oben beschriebener Expressionsvektor eingeführt worden ist, worin die kultivierte Zelle das von dem Polynukleotidsegment kodierte Polypeptid exprimiert. Die Erfindung stellt weiterhin bereit ein Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids, umfassend: Kultivieren einer Zelle, in die ein wie oben beschriebener Expressionsvektor eingeführt worden ist, wodurch die Zelle das von dem Polynukleotidmolekül kodierte Polypeptid exprimiert, und Rückgewinnen des exprimierten Polypeptids. Die Erfindung stellt außerdem bereit ein isoliertes Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 2. In einer verwandten Ausführungsform befindet sich das Polypeptid in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt eine mehrfache Aminosäuresequenzausrichtung bzw. ein mehrfaches Aminosäuresequenzalignment zwischen BR43x2, TACI (von Bülow und Bram, ibid.) (SEQ ID Nr. 8), BCMA (Gras et al., ibid) (SEQ ID Nr. 6) und BR43x1 (SEQ ID Nr. 9). Die cystein-reichen Pseudo-Repeats und die Transmembrandomäne sind angemerkt.
2 zeigt eine Scatchard-Plot-Analyse der Bindung von löslichem I¹²⁵-ztnf4 an TACI und BCMA, exprimiert von stabilen BHK-Transfektanten.
3a zeigt, dass ztnf4 menschliche B-Lymphozyten zum Proliferieren und zur Sekretion von Immunglobulin co-aktiviert.
3b zeigt in Überständen gemessene Level an IgM und IgG, erhalten aus mit löslichem ztnf4 stimulierten B-Zellen in Anwesenheit von IL-4 oder IL-4 + IL-5 nach neun Tagen in Kultur.
4 zeigt menschliche B-Zellen des peripheren Blutes, stimuliert mit löslichem ztnf4 oder Kontrollprotein (Ubiquitin) in Anwesenheit von IL-4 für fünf Tage in vitro. Gereinigtes TACI-Ig, BCMA-Ig und Fc zur Kontrolle wurden auf die Inhibition der ztnf4-spezifischen Proliferation getestet.
5a zeigt die Ergebnisse aus ztnf4-transgenen Tieren, die die charakteristischen Merkmale des SLE entwickelt hatten.
5b zeigt Lymphknoten-, Milz- und Thymuszellen aus ztnf4-transgenen Tieren, gefärbt mit Antikörpern gegen CD5, CD4 und CD(.
5c zeigt Gesamt-IgM-, -IgG- und -IgE-Level in Serum aus transgenen ztnf4-Tieren im Alter von 6 bis 23 Wochen.
5d zeigt die Amyloidablagerungen und verdickten Mesangien von Glomeruli, die in Nierenschnitten aus ztnf4-transgenen Tieren identifiziert wurde.
5e zeigt Effektor-T-Zellen in ztnf4-transgenen Mäusen.
6a und b zeigen erhöhte ztnf4-Level in Serum, erhalten von ZNBWF1-Mäusen und MRL/1pr/1pr-Mäusen, die mit der Entwicklung des SLE korrelieren.
7 zeigt den Prozentsatz der NZBWF1-Mäuse, die im Verlauf der Untersuchung eine Proteinurie entwickeln.
8 zeigt Anti-dsDNS-Level mittels ELISA aus ztnf4-trangsenen Mäusen und Wurfgenossen als Kontrolle, im Vergleich zu Serum aus ZNBWF1- und MRL/1pr/1pr-Mäusen.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung ersichtlich.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Vor Beschreibung der Erfindung könnte es für ein Verständnis derselben hilfreich sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke, die im Folgenden verwendet werden sollen, darzustellen:
Affinitätsmarker: wird hierin verwendet, um ein Polypeptidsegment zu bezeichnen, das an ein zweites Polypeptid angeheftet werden kann, um für die Reinigung oder Detektion des zweiten Polypeptids zu sorgen oder Stellen für die Anheftung des zweiten Polypeptids an ein Substrat bereitzustellen. Im Allgemeinen kann jedes Peptid oder Protein, für das ein Antikörper oder ein anderes spezifisches Bindungsmittel verfügbar ist, als Affinitätsmarker verwendet werden. Affinitätsmarker schließen eine Polyhistidinfolge, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), die Glutathion-S-Transferase (Smith und Johnson, Gene 67: 31, 1988), in Glu-Glu-Affinitätsmarker (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952–4, 1985), die Substanz P, Flag^TM-Peptid (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204–10, 1988), Streptavidin-Binduttgspeptide oder ein anderes antigenisches Epitop oder eine Bindungsdomäne ein (siehe im Allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991). Affinitätsmarker kodierende DNS' sind von kommerziellen Herstellern erhältlich (beispielsweise Phamacia Biotech, Piscataway, NJ).
Allelische Variante: Jede von zwei oder mehr alternativen Formen eines Gens, die denselben chromosomalen Ort besetzt. Allelische Variationen entstehen natürlich über Mutation und können zu einem phenotypischen Polymorphismus innerhalb von Populationen führen. Genmutationen können still sein (d. h. keine Änderung im kodierten Polypeptid) oder können Polypeptide mit einer geänderten Aminosäuresequenz kodieren. Der Ausdruck „allelische Variante" wird hierin auch benutzt, um ein Protein zu bezeichnen, das von der allelischen Variante eines Gens kodiert wird. Ebenfalls umfasst ist dasselbe Protein aus derselben Spezies, das sich von einer Referenzaminosäuresequenz aufgrund der allelischen Variation unterscheidet. Die allelische Variation bezieht sich auf die natürlicherweise auftretenden Unterschiede zwischen Individuen hinsichtlich der Gene, die ein gegebenes Protein kodieren.
aminoterminal und carboxyterminal: werden hierin verwendet, um Positionen innerhalb eines Polypeptids und Proteins zu bezeichnen. Wo es der Kontext gestattet, werden diese Ausdrücke unter Bezugnahme auf eine spezielle Sequenz oder einen Teil eines Polypeptids oder Proteins genutzt, um die Nähe oder relative Position zu bezeichnen. Beispielsweise ist eine bestimmte Sequenz, die carboxyterminal bezüglich einer Bezugssequenz in einem Protein angeordnet ist, proximal zum Carboxy-Terminus der Referenzsequenz angeordnet, befindet sich jedoch nicht notwendigerweise am Carboxy-Terminus des vollständigen Proteins.
Komplement/Anti-Komplement-Paar: bezeichnet nicht identische Einheiten, die ein nicht kovalent assoziiertes, stabiles Paar unter geeigneten Bedingungen bilden. Beispielsweise sind Biotin und Avidin (oder Streptavidin) prototypische Elemente eines Komplement/Anti-Komplement-Paars. Andere beispielhafte Komplement/Anti-Komplement-Paare schließen Rezeptor/Liganden-Paare, Antikörper/Antigen- (oder Hapten oder Epitop)-Paare, Sense/Antisense-Polynukleotidpaare und dergleichen ein. Wo die anschließende Dissoziation des Komplement/Anti-Komplement-Paares erwünscht ist, weist das Komplement/Anti-Komplement-Paar vorzugsweise eine Bindungsaffinität von < 10^–9 M auf.
Contig: bezeichnet ein Polynukleotid, das eine kontinuierliche Folge einer identischen oder komplementären Sequenz zu einem anderen Polynukleotid aufweist. Von fortlaufenden Sequenzen wird gesagt, dass diese mit einer gegebenen Folge einer Polynukleotidsequenz entweder in ihrer Gesamtheit oder entlang eines Teilstückes des Polynukleotids überlappen. Beispielsweise sind repräsentative Contigs für die Polynukleotidsequenz 5'-ATGGCTTAGCTT-3' 5'-TAGCTTgagtct-3' und 3'-gtcgacTACCGA-5'.
Komplemente von Polynukleotidmolekülen: bezeichnen Polynukleotidmoleküle mit einer komplementären Basensequenz und umgekehrter Orientierung im Vergleich zu einer Referenzsequenz. Beispielsweise ist die Sequenz 5'-ATGCACGGG-3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT-3'.
Degenerierte Nukleotidsequenz oder degenerierte Sequenz: bezeichnete eine Sequenz an Nukleotiden, die eines oder mehrere degenerierte Codons umfasst (im Vergleich zu einem Referenzpolynukleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert). Degenerierte Codons enthalten andere Triplets von Nukleotiden, kodieren jedoch denselben Aminosäurerest (beispielsweise kodieren die Triplets GAU und GAC jeweils Asp).
Expressionsvektor: ein DNS-Molekül, linear oder zirkulär, das ein Segment umfasst, kodierend ein interessierendes Polypeptid, operativ verbunden mit weiteren Segmenten, die für dessen Transkription sorgen. Solche weiteren Segmente können Promotor- und Terminatorsequenzen umfassen, wie auch wahlweise einen oder mehrere Replikationsursprünge, eine oder mehrere selektierbare Marker, einen Enhancer, ein Polyadenylierungssignal und dergleichen. Expressionsvektoren werden allgemein von Plasmid- oder viraler DNS abgeleitet oder können Elemente von beiden enthalten.
Eine Isoform bezieht sich auf unterschiedliche Formen eines Proteins, die aus verschiedenen Genen oder aus demselben Gen durch alternierendes Splicing erzeugt werden können. In einigen Fällen unterscheiden sich die Isoformen hinsichtlich ihrer Transportaktivität, der Expressionszeit in der Entwicklung, der Gewebeverteilung, der Anordnung in der Zelle oder einer Kombination dieser Eigenschaften.
Ein isoliertes Polypeptid bezeichnet, dass das Polynukleotid aus seiner natürlichen genetischen Umgebung entfernt worden ist und somit frei ist von anderen äußeren oder unerwünschten kodierenden Sequenzen, und damit in einer Form vorliegt, geeignet für die Anwendung in gentechnischen Proteinproduktionssystem. Solche isolierten Moleküle sind diejenigen, die aus ihrer natürlichen Umgebung abgetrennt sind, und schließen cDNS und genomische Klone ein. Isolierte DNS-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie üblicherweise assoziiert sind, können jedoch natürlich auftretende 5'- und 3'-nicht translatierte Bereiche wie Promoter und Terminatoren umfassen. Die Identifizierung von assoziierten Bereichen wird dem Fachmann offensichtlich sein (siehe beispielsweise Dynan und Tijan, Nature 316: 774–78, 1985).
Ein isoliertes Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein, das sich in einem anderen Zustand als seiner natürlichen Umgebung findet, wie getrennt von Blut und tierischem Gewebe. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs. Es ist bevorzugt, das Polypeptid in hoch gereinigter Form, d. h. zu über 95% rein, stärker bevorzugt über 99% rein bereitzustellen. Wenn in diesem Zusammenhang verwendet, schließt der Ausdruck „isoliert" nicht die Anwesenheit desselben Polypeptids in alternativen physikalischen Formen wie Dimeren oder alternativ glykosylierten oder derivatisierten Formen aus.
Operativ verbunden: wenn auf Nukleotidsegmente angewandt, zeigt der Ausdruck „operativ verbunden" an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie zusammen bzw. konzertiert hinsichtlich der intendierten Zwecke funktionieren, beispielsweise beginnt die Transkription im Promoter und schreitet durch das kodierende Segment zum Terminator hin fort.
Ortholog: bezeichnet ein Polypeptid oder Protein, erhalten aus einer Spezies, bei dem es sich um das funktionale Gegenstück zu einem Polypeptid oder Protein aus einer anderen Spezies handelt. Sequenzunterschiede unter Orthologen sind das Ergebnis der Speziesbildung.
Polynukleotid: bezeichnet ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer von Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidenbasen, abgelesen vom 5'- zum 3'-Ende. Die Polynukleotide schließen RNS und DNS ein und können aus natürlichen Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination von natürlichen und synthetischen Molekülen hergestellt werden. Die Größen von Polynukleotiden werden in Basenpaaren (abgekürzt „bp"), Nukleotiden („nt") oder Kilobasen („kb") angegeben. Wo es der Kontext gestattet, können die letzteren beiden Ausdrücke Polynu kleotide beschreiben, die einzelsträngig oder doppelsträngig sind. Wenn der Ausdruck auf doppelsträngige Moleküle angewandt wird, soll dieser die Gesamtlänge bezeichnen und ist als Äquivalent zum Ausdruck „Basenpaare" zu verstehen. Der Fachmann wird erkennen, dass die zwei Stränge eines doppelsträngigen Polynukleotids sich leicht hinsichtlich der Länger unterscheiden können und dass die Enden derselben als Ergebnis der enzymatischen Spaltung versetzt sein können. Somit brauchen nicht alle Nukleotide in einem doppelsträngigen Polynukleotidmolekül gepaart zu sein. Solche ungepaarten Enden werden im Allgemeinen eine Länge von 20 nt nicht überschreiten.
Ein Polypeptid ist ein Polymer von Aminosäureresten, verbunden über Peptidbindungen, sei es natürlich oder synthetisch erzeugt. Polypeptide von weniger als etwa 10 Aminosäureresten werden üblicherweise als „Peptide" bezeichnet.
Ein Promoter bezeichnet ein Teil eines Gens, enthaltend DNS-Sequenzen, die für die Bindung der RNS-Polymerase und die Initiation der Transkription sorgen. Promotersequenzen finden sich üblicherweise jedoch nicht immer in den 5'-nicht kodierenden Bereichen von Genen.
Ein Protein ist ein Makromolekül, umfassend eine oder mehrere Polypeptidketten. Ein Protein kann auch nicht peptidische Komponenten wie Kohlenhydratgruppen enthalten. Kohlenhydrate und andere nicht peptidische Substituenten können zu einem Protein durch die Zelle, in der das Protein erzeugt wird, zugefügt werden und werden mit dem Typus der Zelle variieren. Proteine werden hierin hinsichtlich ihrer Aminosäurerückratstrukturen definiert; Substituenten wie Kohlenhydratgruppen sind im Allgemeinen nicht spezifiziert, können jedoch trotzdem vorhanden sein.
Rezeptor: ein zellassoziiertes Protein oder eine Polypeptiduntereinheit eines solchen Proteins, die an ein bioaktives Molekül (den „Liganden") bindet und die Wirkung des Liganden auf die Zelle vermittelt. Die Bindung von Ligand an Rezeptor führt zu einer Änderung im Rezeptor (und in einigen Fällen zur Rezeptormultimerisierung, d. h. Assoziierung von identischen oder unterschiedlichen Rezeptoruntereinheiten), die zu Wechselwirkungen zwischen der oder den Effektordomän(en) des Rezeptors und (einem) anderen Molekülen) in der Zelle führt. Diese Wechselwirkungen führen wiederum zu Änderungen des Metabolismus der Zelle. Metabolische Ereignisse, die an Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen gebunden sind schließen die Gentranskription, die Phosphorylierung, die Dephosphorylierung, die Zellproliferation, eine Erhöhung der zyklischen AMP-Produktion, die Mobilisierung von zellulärem Calcium, die Mobilisierung von zellulärem Calcium, die Mobilisierung von Membranlipiden, die Zelladhesion, die Hydrolyse von Inositollipiden und die Hydrolyse von Phospholipiden ein. BR43x2 hat die Eigenschaften eines TNF-Rezeptors, wie hierin detaillierter diskutiert.
Sekretorische Signalsequenz: Eine DNS-Sequenz, die ein Polypeptid (ein „sekretorisches Peptid") kodiert, das als Komponente eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid durch einen sekretorischen Stoffwechselweg einer Zelle dirigiert, in der es synthetisiert wird. Das größere Polypeptid wird im Allgemeinen gespalten, um das sekretorische Peptid zu entfernen, und zwar während des Durchtritts durch den sekretorischen Stoffwechselweg.
Löslicher Rezeptor: ein Rezeptorpolypeptid, das nicht an eine Zellmembran gebunden ist. Lösliche Rezeptoren sind in meist üblicher Weise Liganden-bindende Rezeptorpolypeptide, denen Transmembran- und cytoplasmatische Domänen fehlen. Lösliche Rezeptoren können zusätzliche Aminosäurereste umfassen, wie Affinitätsmarker, die für die Reinigung des Polypeptids sorgen oder Stellen für die Anheftung des Polypeptids an ein Substrat bereitstellen. Viele Zelloberflächenrezeptoren haben natürlich auftretende lösliche Gegenstücke, die durch Proteolyse erzeugt oder aus alternativ gesplicten mRNS-Molekülen translatiert werden. Man sagt, dass Rezeptorpolypeptide im Wesentlichen frei von transmembranen und intrazellulären Polypeptidsegmenten sind, wenn sie ihnen ausreichende Anteile dieser Segmente fehlen, um eine Membranverankerung bzw. die Signaltransduktion bereitzustellen.
Von Molekulargewichten und Längen von Polymeren, die über unpräzise analytische Methoden bestimmt werden (beispielsweise die Gelelektrophorese), ist zu verstehen, dass es sich um angenäherte Werte handelt. Wenn ein solcher Wert als „in etwa" X oder „ungefähr" X angegeben wird, ist der angegebene Wert von X als auf ±10% akkurat zu verstehen.
Alle hierin zitierten Literaturstellen werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung einer 1192 bp DNS-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) und der entsprechenden Polypeptidsequenz (SEQ ID Nr. 2), bei der es sich um eine Isoform des Rezeptors TACI handelt. Die Isoform wurde mit BR43x2 bezeichnet. Eine lösliche Form von BR43x2 wird in SEQ ID Nr. 4 offenbart, das den löslichen Rezeptor kodierende Polynukleotid in SEQ ID Nr. 3. Wie hierin detaillierter beschrieben wird, wurden die den BR43x2-Rezeptor kodierenden Polynukleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung anfänglich über Signalfallenklonieren unter Anwendung einer menschlichen RPMI-1788-Datenbank und des N- oder C-terminal FLAG-gemarkerten, Biotin- oder FITC-gemarkerten Tumornekrosefaktorliganden ztnf4 identifiziert, nun bekannt als Neutrokin α (WIPO WO98/18921), BlyS (Moore et al., ibid.), BAFF (Schneider et al., ibid.), TALL-1 (Shu et al., ibid.) oder THANK (Mukhopadhyay et al., ibid.). Positive Pools wurden mittels Ligandenbindung identifiziert, auf einzelne Klone zerlegt, die cDNS isoliert und sequenziert. Ein Vergleich der BR43x2 abgeleiteten Aminosäuresequenz (wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt) mit den bekannten Tumornecrosefaktor-Rezeptoren zeigte an, dass es sich bei BR43x2 um eine Isoform von TACI handelt mit einem einzigen, schlecht konservierten, cystein-reichen Pseudo-Repeat.
Strukturell ist die TNF-Rezeptorfamilie gekennzeichnet durch einen extrazellulären Teil, bestehend aus einigen Modulen, die historisch als „cystein-reiche Pseudo-Repeats" bezeichnet werden. Ein prototypisches Mitglied der TNFR-Familie weist vier dieser Pseudo-Repeats auf, jeder etwa 29-43 Reste lang, einer direkt nach dem anderen. Ein typischer Pseudo-Repeat weist 6 Cysteinreste auf. Sie werden als Pseudo-Repeats bezeichnet, da sie, obwohl sie von einem gemeinsamen Modul als Vorfahr abzustammen scheinen, sich nicht exakt wiederholen: Die Pseudo-Repeats Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4 weisen charakteristische Sequenzmerkmale auf, die sie voneinander unterscheiden. Die Kristallstruktur des p55-TNF-Rezeptors hat gezeigt, dass jeder Pseudo-Repeat einer Faltungsdomäne entspricht und dass alle vier Pseudo-Repeats in dieselbe Tertiärstruktur gefaltet sind, zusammengehalten intern über Disulfidbindungen.
TACI enthält zwei cystein-reiche Pseudo-Repeats (von Bülow und Bram, ibid.), von denen der erste bezüglich seiner Struktur bei anderen Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie konserviert ist und der zweite weniger konserviert ist. Der BR43x2-Isoform der vorliegenden Erfindung fehlt der erste cystein-reiche Pseudo-Repeat von TACI und sie behält nur den zweiten, weniger konservierten Repeat bei.
Eine Sequenzanalyse einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von BR43x2, wie sie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, zeigt die Anwesenheit eines reifen Proteins mit einer extrazellulären Domäne (die Reste 1-120 der SEQ ID Nr. 2), die einen cystein-reichen Pseudo-Repeat (Reste 25-58 der SEQ ID Nr. 2) enthält, eine Transmembrandomäne (Reste 121-133 der SEQ ID Nr. 2) und einer cytoplasmatischen Domäne (Reste 134-247 der SEQ ID Nr. 2) an. Der cystein-reiche Pseudo-Repeat von BR43x2 weist sechs konservierte Cysteinreste (die Reste 25, 40, 43, 47, 54 und 58 der SEQ ID Nr. 2), einen konservierten Asparaginsäurerest (Rest 34 der SEQ ID Nr. 2) und zwei konservierte Leucinreste (die Reste 36 und 37 der SEQ ID Nr. 2) auf und ist zu 46% mit dem ersten cystein-reichen Pseudo-Repeat von TACI (SEQ ID Nr. 6) und zu 35% mit dem cystein-reichen Pseudo-Repeat von BCMA (SEQ ID Nr. 8) (1) identisch. Der cystein-reiche Pseudo-Repeat lässt sich durch das folgende Motiv darstellen:
worin C den Aminosäurerest Cystein, Q Glutamin, E Glutaminsäure, K Lysin, N Asparagin, R Arginin, D Asparinsäure, H Histidin, S Serin, Y Tyrosin, F Phenylalanin, W Tryptophan, L Leucin, I Isoleucin, V Valin und X jeden natürlich auftretenden Aminosäurerest, ausgenommen Cystein, darstellt. Die Aminosäurereste in eckigen Klammern „[]" zeigen die gestattete Aminosäurevariation an dieser Position an. Die Anzahl in den Klammern „{}" zeigt die Anzahl der gestatteten Aminosäurereste an dieser Position an.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem lösliche Polypeptide von 32-40 Aminosäureresten Länge bereit, wie sie in der SEQ ID Nr. 10 dargestellt sind.
Der lösliche BR43x2-Rezeptor, wie durch die Reste 1-120 der SEQ ID Nr. 4 dargestellt, enthält einen cystein-reichen Pseudo-Repeat (die Reste 25-58 der SEQ ID Nr. 4) und ihm fehlen die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne von BR43x2, wie in der SEQ ID Nr. 2 beschrieben.
Fachleute werden erkennen, dass diese Domängrenzen Schätzwerte sind und auf Ausrichtungen bzw. Alignments mit bekannten Proteinen und Vorhersagen der Proteinfaltung beruhen. Diese Merkmale zeigen an, dass der von der DNS-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 und 3 kodierte Rezeptor ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie ist.
Northern-blot und Dot-Blot-Analysen der Gewebeverteilung der den Nukleotidsonden auf BR43x1 entsprechenden mRNS, von denen vorhergesagt wird, dass sie die BR43x2-Expression detektieren, zeigten Expression in Milz, Lymphknoten, CD19+-Zellen, schwach in gemischten Lymphozyten-Reaktionszellen, Daudi- und Raji-Zellen. Unter Anwendung der reversen Transkriptase-PCR wurde BR43x1 nur in B-Zellen und nicht in aktivierten T-Zellen detektiert, was für TACI berichtet worden war (von Bülow und Bram, ibid.). Unter Anwendung einer BR43x2-Sonde, die zu 100% mit der entsprechenden TACI-Sequenz überlappt, wurden TACI und BR43x2 in Milz, Lymphknoten und Dünndarm, Magen, Speicheldrüsen, Appendix, Lunge, Knochenmark, fötaler Milz, CD19⁺-Zellen und Raji-Zellen detektiert.
Unter Anwendung der Northern-blot-Analyse wurde BCMA in Dünndarm, Milz, Magen, Darm, Blinddarm, Lymphknoten, Trachea und Hoden detektiert. BCMA wurde ebenfalls in Adenolymphomen, non-Hodgkin-Lymphomen und Parotis-Tumor detektiert, schwach detektiert in CH8⁺-, CD19⁺-, MRL-Zellen, Daudi-, Raji- und Hut 78-Zellen.
Eine Northern-blot-Analyse wurde ebenfalls unter Anwendung von ztnf4 aus Maus (SEQ ID Nr. 19) durchgeführt, und wie bei menschlichem TACI, BCMA und BR43x2 wurde die Expression des ztnf4 aus Maus hauptsächlich in Milz und Thymus detektiert. Ztnf4 aus Maus wurde auch in der Lunge exprimiert und eine schwache Expression wurde in Haut und Herz detektiert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem bereit Polynukleotidmoleküle, eingeschlossen DNS- und RNS-Moleküle, die die hierin offenbarten BR43x2-Polypeptide kodieren. Fachleute werden leicht erkennen, dass im Hinblick auf die Degeneration des genetischen Codes beachtliche Sequenzvariationen unter diesen Polynukleotidmolekülen möglich sind. Bei der SEQ ID Nr. 11 handelt es sich um eine degenerierte DNS-Sequenz, die alle DNS-Moleküle umfasst, die das lösliche BR43x2-Polypeptid der SEQ ID Nr. 4 kodieren. Gleichermaßen handelt es sich bei der SEQ ID Nr. 12 um eine degenerierte DNS-Sequenz, die alle DNS-Moleküle umfasst, die das BR43x2-Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 kodieren. Fachleute werden erkennen, dass die degenerierte Sequenz der SEQ ID Nr. 12 auch alle RNS-Sequenzen bereitstellt, die die SEQ ID Nr. 4 kodieren, und zwar durch Ersetzen von U für T. Somit werden BR43x2-Polypeptid-kodierende Polynukleotide, umfas send Nukleotid 1 bis Nukleotid 360 der SEQ ID Nr. 11, die Nukleotide 1-741 der SEQ ID Nr. 12 und deren RNS-Äquivalente von der vorliegenden Erfindung angestrebt. Die Tabelle 1 stellt die Ein-Buchstaben-Kodierungen dar, die in der SEQ ID Nr. 11 und 12 zum Bezeichnen der degenerierten Nukleotidpositionen verwendet werden. „Auflösungen" sind die Nukleotide, die durch einen Codebuchstaben bezeichnet sind. „Komplement" zeigt den Code für das oder die komplementären Nukleotide an. Beispielsweise bezeichnet der Code Y entweder C oder T und bezeichnet sein Komplement R, A oder G, wobei A komplementär zu T und G komplementär zu C ist.
Tabelle 1
Die in den SEQ ID der Nummern 11 und 12 genutzten degenerierten Codons, umfassend alle möglichen Codons für eine gegebene Aminosäure, sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Ein Fachmann wird erkennen, dass bei der Bestimmung eines degenerierten Codons einige Mehrdeutigkeit eingeführt wird, welches degenerierte Codon alle möglichen, jede Aminosäure kodierende Codons repräsentiert. Beispielsweise kann das degenerierte Codon für Serin (WSN) in einigen Fällen Arginin (AGR) und kann das degenerierte Codon für Arginin (MGN) in einigen Fällen Serin (AGY) kodieren. Eine ähnliche Beziehung besteht zwischen den Codons für Phenylalanin und Leucin. Somit können einige von der degenerierten Sequenz umfasste Polynukleotide geänderte Aminosäuresequenzen kodieren, der Fachmann kann solche geänderten bzw. varianten Sequenzen jedoch leicht unter Bezugnahme auf die Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 2 und 4 identifizieren. Variante Sequenzen lassen sich leicht, wie hierin beschrieben, auf ihre Funktionalität testen.
Ein Fachmann wird ebenfalls erkennen, dass unterschiedliche Spezies eine „bevorzugte Codon-Verwendung" haben können (im Allgemeinen siehe Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893–912, 1980; Haas et al., Curr. Biol. 6: 315–24, 1996; Wain-Hobson et al., Gene 13: 355–64, 1981; Grosjean und Fiers, Gene 18: 199–209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075–87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573–97, 1982). Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck „bevorzugte Codon-Verwendung" oder „bevorzugte Codons" ein Terminus Technicus, der sich auf Proteintranslationscodons bezieht, die am Häufigsten in Zellen einer bestimmten Spezies genutzt werden, wodurch eines oder wenige repräsentative der möglichen Codons, die jede Aminosäure kodieren (siehe Tabelle 2), favorisiert werden. Beispielsweise kann die Aminosäure Threonin (Thr) durch ACA, ACC, ACG oder ACT kodiert werden, ist jedoch in Säugerzellen ACC das am üblichsten verwendete Codon. In anderen Spezies, beispielsweise Insektenzellen, Hefen, Viren oder Bakterien, können andere Thr-Codons bevorzugt sein. Bevorzugte Codons für eine spezielle Spezies können in die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung über eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren eingeführt werden. Die Einführung bevorzugter Codonsequenzen in rekombinante DNS kann beispielsweise die Produktion des Proteins fördern, indem die Proteintranslation effizienter in einem speziellen Zelltyp oder einer speziellen Spezies gemacht wird. Daher dienen die degenerierten Codonsequenzen, die in den SEQ ID der Nummern 11 und 12 offenbart sind, als Template oder Matrize für ein Optimieren der Expression von Polynukleotiden in verschiedenen Zelltypen und Spezies, die üblicherweise im Stand der Technik verwendet und hierin offenbart sind. Bevorzugte Codons-enthaltende Sequenzen können getestet und für die Expression in verschiedenen Spezies optimiert werden, und können auf die Funktionalität getestet werden, wie hierin offenbart.
Die hochkonservierten Aminosäuren im cystein-reichen Pseudo-Repeat von BR43x2 können als Werkzeug genutzt werden, um neue Familienmitglieder zu identifizieren. Beispielsweise kann die reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) zum Amplifizieren von Sequenzen genutzt werden, welche die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne, oben beschrieben, kodieren, und zwar aus RNS, erhalten von einer Vielzahl von Gewebequellen oder Zelllinien. Insbesondere sind hochdegenerierte Primer, die aus BR43x2-Sequenzen designed wurden, für diesen Zweck nützlich.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden isolierte Polynukleotide an Bereiche ähnlicher Größe der SEQ ID Nr. 3 oder an eine dazu komplementäre Sequenz unter Stringenzbedingungen hybridisieren. Im Allgemeinen werden Stringenzbedingungen gewählt, so dass sie etwa 5°C unterhalb der Schmelztemperatur (T_m) für die spezifische Sequenz bei definierter Ionenstärke und pH liegen. Die T_m ist diejenige Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenzen an eine perfekt passende Probe hybridisieren. Typische Stringenzbedingungen sind diejenigen, in denen die Salzkonzentration bis zu etwa 0,03 M bei pH 7 beträgt und die Temperatur mindestens etwa 60°C beträgt.
Wie zuvor angemerkt, umfassen die isolierten Polynukleotide der vorliegenden Erfindung DNS und RNS. Verfahren zum Isolieren von DNS und RNS sind im Stand der Technik wohl bekannt. Es ist im Allgemeinen bevorzugt, RNS aus RPMI 1788-Zellen, PBMNCs, ruhenden oder aktivierten, transfizierten B-Zellen oder Mandelgewebe zu isolieren, obwohl DNS auch unter Anwendung von RNS in anderen Geweben hergestellt oder als genomische DNS isoliert werden kann. Die Gesamt-RNS kann unter Anwendung der Guanidin/HCL-Extraktion, gefolgt durch Isolierung mittels Zentrifugation in einem CsCl-Gradienten hergestellt werden (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52–94, 1979). Eine Poly(A)⁺-RNS wird aus der Gesamt-RNS unter Anwendung des Verfahrens von Aviv und Leder hergestellt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408–12, 1972). Eine komplementäre DNS (cDNS) wird aus der Poly(A)⁺-RNS unter Anwendung bekannter Verfahren hergestellt. BR43x2-Polypeptide kodierende Polynukleotide werden anschließend identifiziert und isoliert, beispielsweise mittels Hybridisierung oder PCR.
Fachleute werden erkennen, dass die in den SEQ ID der Nummern 1 und 3 offenbarten Sequenzen ein einzelnes Allel des menschlichen Gens repräsentieren, und dass allelische Variationen und alternatives Splicen zu erwarten sind. Allelische Varianten der in den SEQ ID der Nummern 1 und 3 gezeigten DNS-Sequenzen, eingeschlossen diejenigen, die stille Mutationen enthalten, und diejenigen, in denen Mutationen zu Änderungen der Aminosäuresequenz führen, sind im Bereich der vorliegenden Erfindung, wie auch Proteine, die allelische Varianten der SEQ ID der Nummern 2 und 4 darstellen. Allelische Varianten und Splicevarianten dieser Sequenzen können kloniert werden, indem man cDNS oder genomische Datenbanken aus verschiedenen Individuen oder Geweben gemäß im Stand der Technik bekannter Standardverfahren sondiert.
Die Rezeptorpolypeptide der vorliegenden Erfindung, eingeschlossen Rezeptorpolypeptide voller Länge, lösliche Rezeptorpolypeptide, Polypeptidfragmente und Fusionspolypeptide, können in gentechnisch veränderten Wirtszellen gemäß herkömmlicher Techniken erzeugt werden. Geeignete Wirtszellen sind diejenigen Zelltypen, die mit exogener DNS transformiert oder transfiziert und in Kultur gezogen werden können, und schließen Bakterien, Pilzzellen und kultivierte höhere eukaryontische Zellen ein. Eukaryontische Zellen, insbesondere kultivierte Zellen mehrzelliger Organismen sind bevorzugt. Techniken für die Manipulation klonierter DNS-Moleküle und für die Einführung exogener DNS in eine Vielzahl von Wirtszellen sind von Sambrook et al. offenbart, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, NY, 1989; wie auch von Ausubel et al., als Herausgeber, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
Im Allgemeinen wird eine ein BR43x2-Polypeptid kodierende DNS-Sequenz operativ mit anderen genetischen Elementen verbunden, die für ihre Expression erforderlich sind, allgemein umfassend einen Transkriptionspromoter und Terminator, und zwar in einem Expressionsvektor.
Der Vektor wird auch üblicherweise einen oder mehrere selektierbare Marker und einen oder mehrere Replikationsursprünge enthalten, obwohl Fachleute erkennen werden, dass in bestimmten Systemen selektierbare Marker auf separaten Vektoren bereitgestellt werden können und dass für die Replikation der exogenen DNS durch Integration in das Wirtszellgenom gesorgt werden kann. Die Wahl von Promotern, Terminatoren, selektierbaren Markern, Vektoren und anderen Elementen ist Gegenstand von Routinedesigns, die sich im Können des Durchschnittsfachmanns befinden. Viele solche Elemente sind in der Literatur beschrieben worden und sind aus kommerziellen Quellen erhältlich.
Um ein BR43x2-Polypeptid in den sekretorischen Stoffwechselweg einer Wirtszelle zu dirigieren, wird im Expressionsvektor eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als Signalsequenz, Leadersequenz, Prepro-Sequenz oder Pre-Sequenz) bereitgestellt. Die sekretorische Signalsequenz kann diejenige des BR43x2-Polypeptids sein oder kann von anderen sekretierten Proteinen abgeleitet sein (beispielsweise t-PA) oder kann de novo synthetisiert werden. Die sekretorische Signalsequenz wird im richtigen Leserahmen an die BR43x2-DNS-Sequenz gebunden und positioniert, um das neu synthetisierte Polypeptid in den sekretorischen Stoffwechselweg der Wirtszelle zu dirigieren. Sekretorische Signalsequenzen befinden sich üblicherweise 5' der das interessierende Polypeptid kodierenden DNS-Sequenz, obwohl bestimmte Signalsequenzen an anderer Stelle in der interessierenden DNS-Sequenz positioniert sein können (siehe beispielsweise Welch et al., US-Patent der Nummer 5 037 743; Holland et al., US-Patent der Nummer 5 143 830).
Kultivierte Säugerzellen sind geeignete Wirte innerhalb der vorliegenden Erfindung. Verfahren zur Einführung exogener DNS in Säugerwirtszellen schließen die Calciumphosphatvermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), die Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841–45, 1982), die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al., ibid.) und die Liposomen-vermittelte Transfektion (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993) ein. Die Erzeugung rekombinanter Polypeptide in kultivierten Säugerzellen ist beispielsweise von Levinson et al., US-Patent 4 713 339; Hagen et al., US-Patent Nr. 4 784 950, Palmiter et al., US-Patent 4 579 821; und Ringold, US-Patent Nr. 4 656 134 offenbart. Geeignete kultivierte Säugerzellen schließen ein COS-1 (ATCC Nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC Nr. CRL 1651), BHK (ATCC Nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC NR. CRL 10314), 293 (ATCC NR. CRL 1573, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59–72, 1977), Jurkat-Zellen (ATCC Nr. CRL 8129), BaF3 (eine Interleukin 3-abhängige prelymphoide Zelllinie, abgeleitet vom Knochenmark der Maus; siehe Palacios und Steinmetz, Cell 41: 727–34, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133–5, 1986) und Ovarzellen des chinesischen Hamsters (Chinese Hamster Ovary) (beispielsweise CHO-K1; ATCC Nr. CCL 61) als Zelllinien. Weitere geeignete Zelllinien sind im Stand der Technik bekannt und von öffentlichen Hinterlegungsstellen wie der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich. Im Allgemeinen sind starke Transkriptionspromotoren wie Promotoren von SV-40 oder dem Cytomegalovirus bevorzugt (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 956 228). Andere geeignete Promotoren schließen diejenigen aus Metallothioneingenen (US-Patent der Nummern 4 579 821 und 4 601 978) und den hauptsächlichen späten Promoter aus dem Adenovirus (adenovirus major late promoter) ein.
Um auf kultivierte Säugerzellen zu selektieren, in die Fremd-DNS insertiert worden ist, wird im Allgemeinen die Wirkstoffselektion genutzt. Solche Zellen werden üblicherweise als „Transfektanten" bezeichnet. Zellen, die in Anwesenheit des Selektionsmittels kultiviert worden sind und das interessierende Gen an ihre Nachkommenschaft weitergeben können, werden als „stabile Transfektanten" bezeichnet. Ein bevorzugter selektierbarer Marker ist das Gen, welches die Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin kodiert. Die Selektion erfolgt in Anwesenheit einer Droge vom Neomycin-Typ wie G-418 oder dergleichen. Selektionssysteme können auch genutzt werden, um den Expressionslevel des interessierenden Gens zu erhöhen, ein Verfahren, das als „Amplifikation" bezeichnet wird. Die Amplifikation erfolgt durch Kultivieren von Transfektanten in Anwesenheit eines niedrigen Levels an Selektionsmittel und anschließendes Erhöhen der Menge an Selektionsmittel, um auf Zellen zu selektieren, die höhere Level des Produkts von den eingeführten Genen erzeugen. Ein bevorzugter, amplifizierbarer, selektierbarer Marker ist die Dihydrofolatreductase, die Resistenz gegen Methotrexat verleiht. Andere Wirkstoff-Resistenz-Gene (beispielsweise Hygromycinresistenz, Mehrfachresistenzen, Puromycin-Acetyltransferase) können ebenfalls eingesetzt werden. Alternative Marker, die einen geänderten Phenotyp einführen, wie grün fluoreszierendes Protein, oder Zelloberflächenproteine wie CD4, CD8, Klasse I-MHC, plazentale alkalische Phosphatase können zum Sortieren transfizierter Zellen aus nicht transfizierten Zellen über Mittel wie das FACS-Sortieren oder Trenntechnologien auf Basis magnetischer Kügelchen genutzt werden.
Andere höhere eukaryontische Zellen können ebenfalls als Wirte genutzt werden, eingeschlossen Pflanzenzellen, Insektenzellen und Vogelzellen. Die Verwendung des Agrobacterium rhizogenes als Vektor zum Exprimieren von Genen in Pflanzenzellen ist in einer Übersicht von Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47–58, 1987, dargestellt worden. Die Transformation von Insektenzellen und die Produktion von Fremdpolypeptiden in diesen wurde offenbart von Guarino et al., US-Patent der Nummer 5 162 222 und in der WIPO-Veröffentlichung WO 94106463. Insektenzellen können mit rekombinanten Baculoviren infiziert werden, üblicherweise abgeleitet von Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) (siehe King und Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press, 1994; und Herausgeber Richardson, Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995). Ein zweites Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten BR43x2-Baculovirus nutzt ein Transposon-basiertes System, beschrieben von Luckow (Luckow et al., J. Virol. 67: 4566–79, 1993). Dieses System, das Transfervektoren nutzt, wird im Bac-to-Bac^TM-Kit (Life Technologies, Rockville, MD) vertrieben. Dieses System nutzt einen Transfervektor, pFastBac1^TM (Life Technologies), enthaltend ein Tn7-Transposon, um die DNS, die das BR43x2-Polypeptid kodiert, in ein Baculovirusgenom, gehalten in E. Coli als ein als „Bacmid" bezeichnetes, großes Plasmid, zu überführen (siehe Hill-Perkins und Possee, J. Gen. Virol. 71: 971–6, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551–6, 1994; und Chazenbalk und Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543–9, 1995). Zusätzlich können Transferektoren eine Fusion im Leserahmen mit DNS, kodierend einen Epitop-Marker am C- oder N-Terminus des exprimierten BR43x2-Polypeptids enthalten, beispielsweise einen Glu-Glu-Epitop-Marker (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952–4, 1985). Unter Anwendung einer im Stand der Technik bekannten Technik wird ein BR43x2 enthaltender Transfervektor in E. Coli transformiert und auf Bacmide gesichtet, die ein unterbrochenes lacZ-Gen enthalten, das rekombinante Baculoviren anzeigt. Die das rekombinante Baculovirusgenom enthaltende Bacmid-DNS wird isoliert, unter Anwendung herkömmlicher Techniken, und zum Transfizieren von Spodoptera frugiperda-Zellen, beispielsweise Sf9-Zellen genutzt. Rekombinante Viren, die BR43x2 exprimieren, werden anschließend erzeugt. Rekombinante virale Stammpräparationen können über herkömmlich im Stand der Technik verwendete Verfahren hergestellt werden.
Der rekombinante Virus wird zum Infizieren von Wirtszellen genutzt, typischerweise einer Zelllinie, abgeleitet von der Herbstlarve Spodoptera fugiperda (siehe im Allgemeinen Glick und Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNS, ASM Press, Washington D. C., 1994). Eine andere geeignete Zelllinie ist die High FiveO^TM-Zelllinie (Invitrogen), abgeleitet von Trichoplusia ni (US-Patent 5 300 435). Im Handel erhältliche, serumfreie Medien werden zum Züchten und Halten der Zellen genutzt. Geeignete Medien sind SF900 II^TM (Life Technologies) oder ESF 921^TM (Expression Systems) für die Sf9-Zellen, sowie ExcellO405^TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) oder Express FiveO^TM (Life Technologies) für die T. ni-Zellen. Die Zellen werden ausgehend von einer Impfdichte von etwa 2–5 × 10⁵ Zellen auf eine Dichte von 1–2 × 10⁶ Zellen gezogen, zu welchem Zeitpunkt eine Stammlösung rekombinanter Viren in einer Multiplizität der Infektion (MOI = multiplicity of infection) von 0,1 bis 10, typischerweise in der Nähe von 3 zugesetzt wird. Die angewandten Verfahren sind allgemein beschrieben in erhältlichen Laborhandbüchern (King und Possee, ibid.; O'Reilly et al., ibid.; Richardson, ibid.). Die anschließende Reinigung des BR43x2-Polypeptids aus dem Überstand kann unter Anwendung der hierin beschriebenen Methoden erzielt werden.
Pilzzellen, eingeschlossen Hefezellen, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung genutzt werden. In dieser Hinsicht besonders interessante Hefespezies schließen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Pichia inethanolica ein. Verfahren zum Transformieren von S. cerevisiae-Zellen mit exogener DNS und zur Erzeugung von rekombinanten Polypeptiden aus denselben sind beispielsweise offenbart von Kawasaki, US-Patent 4 599 311, Kawasaki et al., US-Patent Nr. 4 931 373, Brake, US-Patent Nr. 4 870 008; Welch et al., US-Patent 5 037 743 und Murray et al., US-Patent Nr. 4 845 075. Transformierte Zellen werden über den mittels selektierbarem Marker bestimmten Phenotyp selektiert, üblicherweise eine Wirkstoffresistenz oder die Fähigkeit, in Abwesenheit eines speziellen Nährstoffes (beispielsweise Leucin) zu wachsen. Ein für die Verwendung in Saccharomyces cerevisiae bevorzugt verwendetes Vektorsystem ist das POT1-Vektorsystem, offenbart von Kawasaki et al. (US-Patent Nr. 4 931 373), welches die Selektion der transformierten Zellen durch Wachstum in Glukose-enthaltenden Medien gestattet. Geeignete Promoter und Terminatoren zur Verwendung in Hefen schließen diejenigen der Glykolyse-Enzym-Gene (siehe beispielsweise Kawasaki, US-Patent der Nummer 4 599 311; Kingsman et al., US-Patent Nr. 4 615 974; und Bitter, US-Patent Nr. 4 977 092) wie auch die Alkoholdehydrogenase-Gene ein (siehe auch die US-Patent der Nummern 4 990 446; 5 063 154; 5 139 936 und 4 661 454). Transformationssysteme für andere Hefen, eingeschlossen Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromuces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii und Candida maltosa sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459–65, 1986 und Cregg, US-Patent der Nr. 4 882 279). Aspergillus-Zellen können gemäß den Verfahren von McKnight et al., US-Patent der Nr. 4 935 349 genutzt werden. Verfahren zum Transformieren von Acremonium chrysogenum sind von Sumino et al., US-Patent der Nummer 5 162 228 offenbart. Verfahren zum Transformieren von Neurospora sind offenbart von Lambowitz, US-Patent der Nummer 4 486 533.
Beispielsweise ist die Verwendung von Pichia methanolica als Wirt für die Erzeugung von rekombinanten Proteinen offenbart von Raymond, US-Patent der Nummer 5 716 808, Raymond, US-Patent der Nummber 5 736 383, Raymond et al., Yeast 14: 11–23, 1998 und in den internationalen Veröffentlichungen der Nummern WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 und WO 98/02565. DNS-Moleküle zur Verwendung beim Transformieren von P. methanolica werden üblicherweise als doppelsträngige, zirkuläre Plasmide hergestellt, die vorzugsweise vor der Transformation linearisiert werden. Für die Polypeptidproduktion in P. methanolica ist es bevorzugt, dass der Promoter und der Terminator im Plasmid diejenigen des P. methanolica-Gens sind, wie die P. methanolica-Alkoholnutzungsgene (AUG1 oder AUG2). Andere geeignete Promotoren schließen diejenigen des Dihydroxyacetonsynthasegens (DHAS), des Formiatdehydrogenasegens (FMD) und des Katalasegens (CAT) ein. Um die Integration der DNS in das Wirtschromosom zu erleichtern, ist es bevorzugt, das gesamte Expressionssegment des Plasmids an beiden Enden durch Wirts-DNS-Sequenzen flankiert zu haben. Ein bevorzugter selektierbarer Marker zur Verwendung in Pichia methanolica ist das ADE2-Gen aus P. methanolica, das die Phosphoribosyl-5-aminoimidazol-Carboxylase (AIRC; EC 4.1.1.21) kodiert, welches den ADE2-Wirtszellen gestattet, in Abwesenheit von Adenin zu wachsen. Für industrielle Prozesse im großen Maßstab, wo es wünschenswert ist, die Verwendung von Methanol zu minimieren, ist es bevorzugt, Wirtszellen zu nutzen, in denen beide Methanolnutzungsgene (AUG1 und AUG2) deletiert sind. Für die Produktion von sekretierten Proteinen sind Wirtszellen, denen es an vakuolären Proteasegenen (PEP4 und PRB1) mangelt, bevorzugt. Die Elektroporation wird zum Erleichtern der Einführung eines Plasmids, enthaltend DNS, kodierend ein Polypeptid von Interesse, in P. methanolica-Zellen genutzt. Es ist bevorzugt, P. methanolica-Zellen durch Elektroporation zu transformieren unter Anwendung eines exponentiell abfallenden, gepulsten elektrischen Feldes mit einer Feldstärke von 2,5 bis 4,5 kV/cm, vorzugsweise etwa 3,75 kV/cm und einer Zeitkonstanten (t) von 1 bis 40 Millisekunden, am meisten bevorzugt etwa 20 Millisekunden.
Prokaryontische Wirtszellen, eingeschlossene Stämme der Bakterien Escherichia coli, Bacillus oder anderer Genera, sind ebenfalls geeignete Wirtszellen innerhalb der vorliegenden Erfindung. Techniken zur Transformierung dieser Wirte und zum Expimieren darin klonierter Fremd-DNS-Sequenzen sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., ibid). Beim Exprimieren eines BR43x2-Polypeptids in einem Bakterium wie E. coli kann das Polpeptid im Cytoplasma zurückgehalten werden typischerweise als unlösliche Körnchen, oder kann in den periplasmatischen Raum über eine bakterielle Sekretionssequenz dirigiert werden. Im ersteren Fall werden die Zellen lysiert und die Körnchen (Granula) gewonnen und beispielsweise unter Anwendung von Guanidinisothiocyanat oder Harnstoff denaturiert. Das denaturierte Polypeptid kann anschließend rückgefaltet und dimerisiert werden durch Verdünnung des Denaturierungsmittels wie über Dialyse gegen eine Harnstofflösung und eine Kombination von reduziertem und oxidiertem Glutathion, gefolgt von Dialyse gegen eine gepufferte Salzlösung. Im letzeren Fall kann das Polypeptid aus dem periplasmatischen Raum in einer löslichen und funktionalen Form gewonnen werden, indem man die Zellen aufbricht (beispielsweise über Ultraschall oder osmotischen Schock), um den Inhalt des periplasmatischen Raumes freizusetzen und das Protein zurückzugewinnen, wodurch sich die Denaturierung und Rückfaltung erübrigen.
Transformierte oder transfizierte Wirtszellen werden gemäß üblicher Prozeduren in einem Kulturmedium, enthaltend Nährstoffe und andere für das Wachstum der gewählten Wirtszellen erforderliche Komponenten, kultiviert. Eine Vielzahl von geeigneten Medien, eingeschlossen definierte Medien und komplexe Medien, sind im Stand der Technik bekannt und schließen im Allgemeinen eine Kohlenstoffquellen, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralien ein. Medien können auch solche Komponenten wie Wachstumsfaktoren oder Serum je nach Bedarf enthalten. Das Wachstumsmedium wird im Allgemeinen auf Zellen selektieren, welche die exogen zugesetzte DNS enthalten, beispielsweise über Wirkstoffselektion oder Mangel an einem essentiellen Nährstoff, der durch den selektierbaren Marker komplementiert wird, der auf dem Expressionsvektor getragen wird oder in die Wirtszelle co-transfiziert wird. P. methanolica-Zellen werden in einem Medium kultiviert, umfassend adäquate Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelemente, bei einer Temperatur von etwa 25°C bis 35°C. Flüssige Kulturen werden über konventionelle Mittel wie Schütteln kleiner Flaschen oder das Durchperlen von Fermentoren mit einer ausreichenden Belüftung versorgt. Ein bevorzugtes Kulturmedium für P. methanolica ist YEPD (2% D-Glukose, 2% Bacto^TM-Pepton (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto^TM-Hefeextrakt (Difco Laboratories), 0,004% Adenin und 0,006% L-Leucin).
Exprimierte rekombinante BR43x2-Polypeptide (oder Chimere oder Fusions-BR43x2-Polypeptide) können unter Anwendung der Fraktionierung und/oder herkömmlicher Reinigungsmethoden und Medien gereinigt werden. Es ist bevorzugt, die Proteine oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung in hoch gereinigter Form bereitzustellen, d. h. zu über 95% rein, stärker bevorzugt über 99% rein. Die Amoniumsulfatfällung und Säure oder chaotrophe Extraktion können zur Fraktionierung von Proben genutzt werden. Beispielhafte Reinigungsschritte können einschließen Hydroxylapatit, Größenausschlußchromatographie, FPLC und Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Geeignete Anionenaustauschmedien schließen derivatisierte Dextrane, Agarose, Zellulose, Polyacrylamid, spezielle Silicate und dergleichen ein. PEI, DEAE, QAE und Q-Derivate sind bevorzugt, wobei die DEAE-Fast-Flow-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) besonders bevorzugt ist. Beispielhafte Chromatographiemedien schließen diejenigen Medien ein, die mit Phenyl-, Butyl- oder Octylgruppen derivatisiert sind, wie Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopear1-Butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) und dergleichen; oder Polyacrylharze, wie Amberchrom CG 71 (Toso Haas) und dergleichen. Geeignete feste Träger schließen Glaskügelchen, Harze auf Silicabasis, zellulosische Harze, Agaroskügelchen, quervernetzte Agarosekügelchen, Polystyrolkügelchen, quervernetzte Polyacrylamidharze und dergleichen ein, die unter den Bedingungen unlöslich sind, in denen sie genutzt werden sollen. Diese Träger können mit reaktiven Gruppen modifiziert werden, die eine Anheftung von Proteinen über Aminogruppen, Carboxylgruppen, Sulfhydrylgruppen, Hydroxylgruppen und/oder Kohlenhydrateinheiten gestatten. Beispiele für Kupplungschemien schließen ein die Cyanogen/Bromid-Aktivierung, die N-Hydroxysuccinimid-Aktivierung, die Exoxid-Aktivierung, die Sulfhydryl-Aktivierung, die Hydrazid-Aktivierung und Carboxyl- und Aminoderivate für Carbodiimid-Kupplungschemien. Diese und andere feste Medien sind wohl bekannt und werden im Stand der Technik weit verbreitet verwendet, und sie sind von kommerziellen Herstellern erhält lich. Verfahren für die Anbindung von Rezeptorpolypeptiden an Trägermedien sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die Wahl eines speziellen Verfahrens ist eine Maßnahme des Routinedesigns und wird zum Teil durch die Eigenschaften des gewählten Trägers bestimmt (siehe beispielsweise Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1988).
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch Ausnutzung ihrer physikalischen Eigenschaften isoliert werden. Beispielsweise kann die immobilisierte Metallionenadsorptionschomatographie (IMAC) zum Reinigen Histidin-reicher Proteine genutzt werden, einschließlich derjenigen, die einem Polyhistidin-Marker umfassen. Kurz gesagt, wird ein Gel zunächst mit divalenten Metallionen zur Bildung eines Chelats beladen (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1–7, 1985). Histidin-reiche Proteine werden auf dieser Matrix mit unterschiedlichen Affinitäten in Abhängigkeit vom verwendeten Metallion adsorbieren und werden durch kompetitive Elution, Absenkung des pH oder die Anwendung starker Chelatbildner eluiert. Andere Verfahren zur Reinigung schließen die Reinigung auf glykosylierte Proteine mittels Lektinaffinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie ein (Methods in Enzymol., Band 182, „Guide to Protein Purification", Herausgeber: M. Deutscher, Acad. Press, San Diego, 1990, Seiten 529–539). In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann eine Fusion des interessierenden Polypeptids und eines Affinitätsmarkers (beispielsweise eines Maltose-bindenden Proteins, eines FLAG-tags (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID Nr. 13)), eines Glu-Glu-Markers (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEQ ID Nr. 14)), einer Immunglobulindomäne) konstruiert werden, um die Reinigung zu erleichtern.
Prozeduren zur Proteinrückfaltung (und wahlweise zur Rückoxidation) können vorteilhafterweise genutzt werden. Es ist bevorzugt, das Protein auf > 80% Reinheit, stärker bevorzugt auf > 90% Reinheit, sogar noch stärker bevorzugt > 95% Reinheit zu reinigen, und insbesondere bevorzugt ist ein pharmazeutisch reiner Zustand, d. h. größer als 99,9% Reinheit, bezogen auf kontaminierende Makromoleküle, insbesondere andere Proteine und Nukleinsäuren, und frei von infektiösen und pyrogenen Mitteln.
Vorzugsweise ist ein gereinigtes Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere anderen Proteinen tierischen Ursprungs.
BR43x2-Polypeptide können auch über chemische Synthese hergestellt werden. Beispielhafte BR43x2-Polypeptide schließen Polypeptide mit einer Länge von 32-40 Resten mit einer Aminosäuresequenz ein, entsprechend dem Motiv: XXCX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2} C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF}CXX (SEQ ID Nr. 10), und unterliegen den hierin beschriebenen Einschränkungen.
Die BR43x2-Polypeptide können über ausschließliche Festphasensynthese, teilweise Festphasenverfahren, Fragmentkondensierung oder klassische Lösungssynthese synthetisiert werden. Die Polypeptide werden vorzugsweise durch Festphasenpeptidsynthese hergestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Vielzahl anderer Polypeptidfusions- und verwandter multimerischer Proteine bereit, umfassend eine oder mehrere Polypeptidfusionen. Ein lösliches BR43x2-,TACI- oder BCMA-Polypeptid kann als eine Fusion mit einem konstanten Bereich einer schweren Kette eines Immunglobulins, typischerweise einem F_c-Fragment, exprimiert werden, das zwei Domänen des konstanten Bereichs enthält und dem der variable Bereich fehlt. Methoden zur Herstellung solcher Fusionen sind offenbart in den US-Patenten der Nummern 5 155 027 und 5 567 584. Solche Fusionen werden typischerweise als multimerische Moleküle sekretiert, worin die F_c-Anteile durch Disulfidbrücken aneinander gebunden sind und zwei nicht-Ig-Polypeptide in enger Nachbarschaft zueinander angeordnet sind. Immunglobulin-BR43x2 (TACI oder BCMA)-Polypeptidfusionen können in gentechnisch hergestellten Zellen exprimiert werden, um eine Vielzahl von multimerischen BR43x2-Analoga zu erzeugen. Hilfsdomänen können an die BR43x2 (TACI oder BCMA)-Polypeptide fusioniert werden, um diese auf spezifische Zellen, Gewebe oder Makromoleküle zu richten. Fusionen können auch unter Anwendung von Toxinen wie hierin diskutiert, hergestellt werden. Auf diesem Wege können Polypeptide und Proteine für therapeutische oder diagnostische Zwecke zielgerichtet werden. Ein BR43x2-Polypeptid kann an zwei oder mehr Einheiten fusioniert werden, wie einem Affinitäts-Marker für die Reinigung und eine zielrichtenden Domäne. Polypeptidfusionen können auch eine oder mehrere Spaltstellen enthalten, insbesondere zwischen Domänen (siehe Tuan et al., Connect. Tiss. Res. 34: 1–9, 1996).
Die Erfindung stellt außerdem lösliche BR43x2-Rezeptoren und -Polypeptidfragmente bereit, geeignet zur Bildung von Fusionsproteinen mit Affinitätsmarkern oder Labeln. Lösliche BR43x2-Affinitätsmarker-Fusionsproteine werden beispielsweise zum Identifizieren von BR43x2-Liganden wie auch von Agonisten und Antagonisten der natürlichen Liganden genutzt. Unter Anwendung von markiertem, löslichen BR43x2 lassen sich Zellen, die den Liganden, Agonisten oder Antagonisten exprimieren, mittels Fluoreszenzimmuncytometrie oder Immunhistochemie identifizieren. Die löslichen Fusionsproteine sind zum Untersuchen der Verteilung des Liganden auf Geweben oder spezifischen Zelllinien nützlich und um Einsicht in die Rezeptor/Liganden-Biologie bereitzustellen.
Um Liganden, Agonisten oder Antagonisten zu reinigen, wird ein BR43x2-Ig-Fusionsprotein einer den Liganden, Agonisten oder Antagonisten enthaltenden Probe unter Bedingungen zugesetzt, die die Rezeptor/Liganden-Bindung erleichtern (typischerweise nahezu physiologische Temperaturen, pH und Ionenstärke). Der Rezeptor/Ligand-Komplex wird anschließend von der Mischung unter Verwendung von Protein A abgetrennt, das auf einem festen Träger immobilisiert ist (beispielsweise unlöslichen Harzkügelchen). Der Ligand, Agonist, Antagonist wird anschließend unter Anwendung herkömmlicher chemischer Techniken wie mit einem Salz- oder pH-Gradienten eluiert. Alternativ kann das Fusionsprotein selbst an einen festen Träger gebunden werden, wobei die Bindung und Elution wie oben durchgeführt werden. Die resultierenden Medien werden im Allgemeinen in Form einer Säule konfiguriert sein, und Fluide, enthaltend den Liganden, werden durch die Säule ein- oder mehrmals durchgeführt, um es dem Liganden zu gestatten, an das Rezeptor-Polypeptid zu binden. Der Ligand wird anschließend unter Anwendung von Änderungen der Salzkonzentration, chaotropher Mittel (MnCl₂) oder pH zum Aufbrechen der Ligand/Rezeptor-Bindung eluiert.
Um den Export des löslichen Rezeptors aus der Wirtszelle zu dirigieren, wird die DNS des löslichen Rezeptors an ein zweites DNS-Segment, kodierend ein sekretorisches Peptid wie ein t-PA-sekretorisches Peptid, gebunden. Um die Reinigung dieser sekretierten Rezeptordomäne zu erleichtern, kann eine N- oder C-terminale Verlängerung wie ein Affinitätsmarker oder ein anderes Polypeptid oder Protein, für das ein Antikörper oder ein anderes spezifisches Bindungsmittel verfügbar ist, an das Rezeptorpolypeptid fusioniert werden.
Scatchard Plot-Analysen für die Bindung von löslichem I¹²⁵-ztnf4 an TACI und BCMA sind in 2 gezeigt und werden mit den Bindungskonstanten anderer Mitglieder der TNFR-Familie in Tabelle 7 verglichen.
Tabelle 7
Es wurde gefunden, dass ztnf4 (5 ng/ml) an BR43x2 (SEQ ID Nr. 2), TACI (SEQ ID Nr. 6), BCMA (SEQ ID Nr. 8) und BR43x1 (SEQ ID Nr. 9) bindet, und zwar mittels FACS-Analyse (Durchflusszytometrie und Sortierung, Melamed et al., als Herausgeber, Wiley-Liss, 1990, und Immunfluoreszenz und Zellsortierung, Current Protocols in Immunology, Band 1, Herausgeber Coligan et al., John Wiley & Son, 1997). Es konnte auch gezeigt werden, dass FITC-gemarkertes, lösliches ztnf4 spezifisch unter anderem an B-Lymphozyten in PBMNCs, Mandelzellen, an B-Zell-Lymphom-Zelllinien (Raji, Burkitt's human lymphoma, ATCC CCL86), Ramos (Burkitt's-Lymphom-Zelllinie ATCC CRL-1596), Daudi (Burkitt's human Lymphom, ATCC CCL213) und RPMI-1788 (eine B-Lymphozyten-Zelllinie, ATCC CCL-156) bindet, und zwar unter Anwendung der FACS-Analyse. Keine Bindung wurde mit HL-60 beobachtet (ATCC: eine promyelocytische Zelllinie, ATCC CCL-240). Die Spezifizität für die Bindung an B-Zellen aus PBMNC und Mandelzellen wurde durch Co-Färbung mit Antikörpern gegen B-zellspezifische Moleküle, eingeschlossen CD19, IgD, IgM und CD20, bestätigt. Die Ähnlichkeit von ztnf4 zu CD40L legte eine breitere Gewebsverteilung als die beobachtete nahe. Die Affinität von ztnf4 wurde auf Monocyten, dendritischen Zellen und gereinigten T-Zellen unter Anwendung der Cytokinproliferation und T-Zell-Proliferationstests beispielsweise getestet und es konnte keine Bindung von ztnf4 oder kein anderer biologischer Effekt auf jede andere getestete Zelltype festgestellt werden. Daher legt die Spezifizität für B-Zellen von Ligand und Rezeptor nahe, dass sie für die Untersuchung und Behandlung der Autoimmunität, von B-Zell-Krebsen, der Immunmodulation, von IBD und aller Antikörper-vermittelten Pathologien, beispielsweise ITCP, der Myasthenia gravis und dergleichen, von Nierenerkrankungen, von indirekten T-Zell-Immunantworten, der Transplantatabstoßung, der Graft-versus-Host-Erkrankung nützlich sind.
Von ztnf4 wurde gezeigt, dass es B-Zellen aktiviert, was zur B-Zell-Proliferation, Antikörperproduktion und Aufregulation von Aktivierungsmarkern in vitro führt (siehe die Beispiele unten). Diese Effekte können die Co-Stimulierung über IL-4 oder andere Cytokine oder die Stimulierung durch den B-Zell-Antigenrezeptor oder andere Zelloberflächenrezeptoren erfordern, die B-Zellen aktivieren, d. h. CD40. Andere Tumornekrosefaktorliganden wie gp39 und TNFβ stimulie ren die B-Zell-Proliferation ebenfalls. Somit können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung zielgerichtet werden, um spezifisch B-Zell-Antworten zu regulieren, aktivierte B-Zellen während der Immunantwort zu inhibieren, ohne andere Zellpopulationen zu beeinträchtigen, was vorteilhaft bei der Behandlung von Erkrankungen ist. Zusätzlich könnten die Polypeptide der vorliegenden Erfindung genutzt werden, um die B-Zell-Entwicklung, die Entwicklung anderer Zellen, die Antikörperproduktion und die Cytokinproduktion zu modulieren. BR43x2-Polypeptide können auch bei der Induktion der Apoptose und/oder von Anenergie innerhalb von Zellen Anwendung finden. Polypeptide der vorliegenden Erfindung könnten auch die T- und B-Zell-Kommunikation modulieren, indem sie die proliferativen Wirkungen von ztnf4 neutralisieren. Bioassys und ELISAs sind verfügbar, um die zelluläre Antwort auf ztnf4 in Anwesenheit von löslichem BR43x2, TACI und/oder BCMA zu messen. Andere Tests schließen diejenigen ein, die Änderungen der Cytokinproduktion als ein Maß der zellulären Antwort messen (siehe beispielsweise, Current Protocols in Immunology, Herausgeber John E. Coligan et al., NIH, 1996). Tests zur Messung anderer zellulärer Antworten, eingeschlossen der Antikörperisotypen, die Monocytenaktivierung, die NK-Zell-Bildung, die Funktion Antigen präsentierender Zellen, und die Apoptose.
BR43x2-Polypeptide der vorliegenden Erfindung wären bei der Herstellung eines Medikaments zur Neutralisierung der Wirkungen von ztnf4 nützlich, um pre-B- oder B-Zell-Leukämien wie die Plasmazellleukämie, die chronische oder akute lymphozytische Leukämie, Myelome wie multiple Myelome, Plasmazellmyelome, endotheliale Myelome und Riesenzellmyelome zu behandeln, wie auch Lymphome wie das non-Hodgkins-Lymphom, mit dem ein Anstieg der ztnf4-Polypeptide assoziiert ist. Lösliches BR43x2 wäre eine nützliche Komponente in einem Medikament zur Inhibition der Tumorprogression und des Überlebens.
Die Norther-Blot-Analyse zeigte, dass ztnf4 in CD8⁺-Zellen, Monocyten, Dendrocyten, aktivierten Monocyten exprimiert wird. Dies legt nahe, dass in einigen Autoimmunstörungen cytotoxische T-Zellen die B-Zell-Produktion durch Überschußproduktion an ztnf4 stimulieren könnten. Immunsupprimierende Proteine, die selektiv die Wirkung von B-Lymphozyten blockieren, wären bei der Behandlung der Erkrankung nützlich. Die Autoantikörperproduktion ist zahlreichen Autoimmunerkrankungen gemeinsam und trägt zur Gewebezerstörung und Verschlimmerung der Erkrankung bei. Autoantikörper können auch zum Auftreten von Immunkomplex-Abscheidungs-Komplikationen führen und können zu vielen Symptomen des systemischen Lupus erythomatodes führen, eingeschlossen das Nierenversagen, neuralgische Symptome und Tod. Die Modulation der Antikörperproduktion, unabhängig von der zellulären Antwort, wäre auch in vielen Erkrankungszuständen wohltuend. Es wurde auch gezeigt, dass B-Zellen eine Rolle bei der Sekretion von arthritogenen Immunglobulinen in der rheumatoiden Arthritis spielen (Korganow et al., Immunity 10: 451–61, 1999). Als solches wäre die Inhibition der ztnf4-Antikörperproduktion bei der Be handlung von Autoimmunerkrankungen wie der Myasthenia gravis und der rheumatoiden Arthritis vorteilhaft. Immunsupprimierende Therapeutika wie lösliches BR43x2, die selektiv die Wirkung von B-Lymphozyten blockieren oder neutralisiern, wären für solche Zwecke geeignet. Um diese Fähigkeiten in den löslichen BR43x2-Rezeptor-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zu verifizieren, wurden BR43x2-Polypeptide unter Anwendung im Stand der Technik bekannter und hierin beschriebener Verfahren bewertet.
Die Erfindung stellt bereit Methoden unter Anwendung von BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptiden, -Fusionen, -Antikörpern, -Agonisten oder -Antagonisten zum selektiven Blockieren oder Neutralisieren der Wirkungen von B-Zellen in Verbindung mit Nierenerkrankungen im Endstadium, die von Autoimmunerkrankungen ggf. begleitet sein können. Solche Verfahren wären auch zur Behandlung von immunologischen Nierenerkrankungen nützlich. Solche Methoden wären zur Behandlung der Glomerulonephritis nützlich, assoziiert mit Erkrankungen wie der Membrannephropathie, der IgA-Nephropathie oder der Berger'schen Erkrankung, der IgM-Nephropathie, dem Goodpasture Syndrom, der nachinfektiösen Glomerulonephritis, mesangioproliverativen Erkrankungen, der Lipoidnephrose. Solche Methoden könnten auch als therapeutische Anwendungen dienen zur Behandlung der sekundären Glomerulonephritis oder Vaskulitis, verbunden mit solchen Erkrankungen wie Lupus, Polyarteritis, dem Schönlein-Henoch-Syndrom, der Sclerodermie, HIV-bezogenen Erkrankungen, der Amyloidose oder dem hämolytisch urämischen Syndrom. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung wären auch geeignet als Teil einer therapeutischen Anwendung zur Behandlung der interstitiellen Nephritis oder Pyelonephritis, verbunden mit der chronischen Pyelonephritis, dem Analgesica-Missbrauch, einer Nephrocalcinose, von anderen Mitteln verursachten Nephropathien, der Nephrolithiasis oder der chronischen oder akuten interstitiellen Nephritis.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung umfassen auch die Verwendung von BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptiden, -Fusionen oder -Antikörpern, -Agonisten oder -Antagonisten in der Behandlung von Bluthochdruck oder Erkrankungen der großen Gefäße, eingeschlossen der renalen Arterienstenose oder Okklusion und der Cholesterienembolie oder renalen Embolie.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Methoden für die Diagnose und Behandlung von renalen oder urologischen Neoplasmen, multiplen Mylelomen, Lymphomen, der leichten Kettenneuropathie oder der Amyloidose bereit.
Die Erfindung stellt außerdem bereit Methoden zum Blockieren oder Inhibieren von aktivierten B-Zellen unter Anwendung von BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptiden, -Fusionen, -Antikörpern, -Agonisten oder -Antagonisten zur Behandlung von Asthma oder anderen chronischen Atemwegserkrankungen wie Bronchitis und Emphysemen.
Ebenfalls bereitgestellt werden Methoden zum Inhibieren oder Neutralisieren einer Effektor-T-Zellantwort unter Anwendung von BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptiden, -Fusionen, -Antikörpern, -Agonisten oder -Antagonisten zur Verwendung in der Immunsuppression, insbesondere zur therapeutischen Verwendung für Graft-versus-Host-Erkrankungen und die Transplantatabstoßungen. Weitere Anwendungen würden sich in der Steuerung der Immunantwort finden, insbesondere der Aktivierung und Steuerung von Lymphozyten. BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptide, -Fusionen, -Antikörper, -Agonisten oder -Antagonisten wären für Therapien zur Behandlung von Immunschwächen nützlich. BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptide, -Fusionen, -Antikörper, -Agonisten oder -Antagonisten wären in therapeutischen Protokollen für die Behandlung solcher Autoimmunerkrankungen wie dem insulinabhängigen Diabetis mellitus (IDDM) und Morbus Crohn nützlich. Methoden der vorliegenden Erfindung hätten zusätzlich therapeutischen Wert zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen, insbesondere zur Linderung von Gelenkschmerz, Schwellungen, Anämie oder anderen assoziierten Symptomen wie auch zur Behandlung des septischen Schocks.
Die Wirkung von löslichem BR43x2- TACI- oder BCMA-Polypeptiden und – Fusionsproteinen auf Immunantworten kann durch Verabreichung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung an mit Antigen immunisierten Tieren nach Injektion von ztnf4 und Messen der Antikörper-Isotypen-Produktion und der B- und T-Zell-Antworten gemessen werden, eingeschlossen die Hyperempfindlichkeit von verzögertem Typ und die in vitro-Proliferation und Cytokinproduktion, und zwar gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren.
Die vorliegende Erfindung stellt daher bereit die Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren der ztnf4-Aktivität bei einem Säuger, worin die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid der SEQ ID Nr. 4; b) einem Polypeptid der SEQ ID Nr. 8; c) einem Fusionsprotein; d) einem Polypeptid der SEQ ID Nr. 6 von Aminosäurerest 1 bis Rest 166; e) einem Polypeptid der SEQ ID Nr. 8 von Aminosäurerest 1 bis Rest 150; f) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 4 bindet; und g) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 10 bindet. Beispiele für Fusionsproteine schließen ein Fusionen von löslichem BR43x2 (SEQ ID Nr. 4), TACI (von Aminosäurerest 1 bis Rest 166 der SEQ ID Nr. 6) oder BCMA (von Aminosäurerest 1 bis Rest 150 der SEQ ID Nr. 8) mit anderen Polypeptiden, vorzugsweise einem F_c-Fragment eines konstanten Bereichs einer schweren Kette eines Immunglobulins. Die Erfindung stellt gleichermaßen ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments bereit zum Inhibieren des BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor/Liganden-Eingreifens.
Solche Methoden wären insbesondere nützlich, wo die ztnf4-Aktivität mit aktivierten B-Lymphozyten assoziiert ist, und zur Behandlung von pre-B-Zell- oder B-Zell-Krebsen. Solche Methoden wären auch nützlich dort, wo die ztnf4-Aktivität mit Antikörperproduktion assoziiert ist. Insbesondere der Antikörperproduktion, assoziiert mit Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodes, der Myasthenia gravis oder der rheumatoiden Arthritis.
Das Adenovirus-System kann auch zur Proteinproduktion in vitro genutzt werden. Indem man mit dem Adenovirus infizierte non-293-Zellen unter Bedingungen kultiviert, unter denen sich die Zellen nicht schnell teilen, können die Zellen Proteine für verlängerte Zeitspannen produzieren. Beispielsweise werden BHK-Zellen in Zellbaterien zur Konfluenz gezogen, anschließend an den adenoviralen Vektor exponiert, der das sekretierte Protein von Interesse kodiert. Die Zellen werden dann unter serumfreien Bedingungen gezogen, was es infizierten Zellen gestattet, für zahlreiche Wochen zu überleben, ohne signifikante Zellteilung. Alternativ können die mit dem Adenovirus infizierten 293S-Zellen in Suspensionskultur bei relativ hoher Zelldichte gezogen werden, um signifikante Mengen an Protein zu erzeugen (siehe Garnier et al., Cytotechnol. 15: 145–55, 1994). Mit jedem Protokoll kann ein exprimiertes, sekretiertes, heterologes Protein wiederholt aus dem Zellkulturüberstand isoliert werden. Innerhalb des Produktionsprotokolls mit infizierten 2935-Zellen können nicht sekretierte Proteine ebenfalls effektiv erhalten werden.
Es sind wohl etablierte Tiermodelle verfügbar, um die in vivo-Effizienz der löslichen BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptide der vorliegenden Erfindung bei bestimmten Erkrankungszuständen zu testen.
Eine Immunantwort in Tieren, die einer regelmäßigen Antigenherausforderung unterworfen werden (beispielsweise Ovalbumin oder Collagen), gefolgt von der Verabreichung von BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptiden oder löslichen Ig-Fusionen, kann ausgeführt werden, um die Wirkung auf die B-Zell-Antwort zu messen.
Pharmacokinetische Untersuchungen können in Verbindung mit radiomarkierten, löslichen BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptiden oder -Fusionen genutzt werden, um die Verteilung und die Halblebensdauer solcher Polypeptide in vivo zu bestimmen. Zusätzlich können Tiermodelle genutzt werden, um die Wirkungen von löslichem BR43x2, TACI oder BCMA auf Tumore und die Tumorentwicklung in vivo zu bestimmen.
Ebenfalls bereitgestellt wird die Anwendung von BR43x2-,TACI- oder BCMA-Polypeptiden als Surrogatmarker für Autoimmunerkrankungen, Nierenerkrankungen, B- und T-Zellerkrankungen. Man kann solche Patienten bluten lassen, und die löslichen BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptoren und deren Liganden können im Blut detektiert werden.
Die Erfindung stellt außerdem bereit Verwendungen von Antikörpern bei der Herstellung von Medikamenten. Antikörper gegen BR43x2 oder Peptide mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 8 können beispielsweise unter Verwendung des Produkts eines Expressionsvektors, enthaltend das interessierenden Polypeptid, oder eines aus einer natürlichen Quelle isolierten Polypeptids erhalten werden. Besonders geeignete Antikörper „binden spezifisch" an BR43x2 oder Peptide mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 10. Antikörper werden als spezifisch bindend betrachtet, wenn der Antikörper an ein BR34x2-Polypeptid oder ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 8, Peptid oder Epitop mit einer Bindungsaffinität (K_a) von 10⁶M^–1 oder darüber, vorzugsweise 10⁷M^–1 oder darüber, stärker bevorzugt 10⁸M^–1 oder darüber und am meisten bevorzugt 10⁹M^–1 oder darüber bindet. Die Bindungsaffinität eines Antikörpers lässt sich leicht von einem Fachmann beispielsweise mittels der Scatchard-Analyse bestimmen (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660, 1949). Geeignete Antikörper schließen Antikörper ein, die an BR3x2 binden, insbesondere die extrazelluläre Domäne von BR43x2 (die Aminosäurereste 1-120 der SEQ ID Nr. 2), wie auch diejenigen, die an Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 10 binden.
Anti-BR43x2-Antikörper lassen sich unter Anwendung antigener BR43x2-Epitop-tragender Peptide und Polypeptide herstellen. Antigene Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthalten eine Sequenz von mindestens 9, vorzugsweise zwischen 15 bis etwa 30 Aminosäuren, enthalten in der SEQ ID Nr. 2. Peptide oder Polypeptide, enthaltend einen größeren Anteil an Aminosäuresequenz der Erfindung, enthaltend 30-50 Aminosäuren oder jede Länge bis zu und in einschließlich der gesamten Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung, sind jedoch ebenfalls für die Induktion von Antikörpern nützlich, die an BR43x2 binden. Es ist wünschenswert, dass die Aminosäuresequenz des Epitop-tragenden Peptids so gewählt ist, dass sie wesentliche Löslichkeit in wässrigen Lösungsmitteln bereitstellt (d. h. die Sequenz umfasst relativ hydrophile Reste, während die hydrophoben Reste vorzugsweise vermieden werden). Hydrophile Peptide können vom Fachmann aus einer Hydrophobizitätsauftragung vorhergesagt werden (sie beispielsweise Hopp und Woods (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824–8, 1981) und Kyte und Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105–142, 1982)). Darüber können Aminosäuresequenzen, die Prolinreste enthalten, ebenfalls wünschenswert für die Antikörperproduktion sein.
Polyklonale Antikörper gegen rekombinantes BR43x2-Protein oder gegen aus natürlichen Quellen isoliertes BR43x2 können unter Anwendung dem Fachmann wohl bekannter Verfahren hergestellt werden (siehe beispielsweise Green et al., „Production of Polyclonal Antisera", in: Immunochemical Protocols (Herausgeber Manson), Seiten 1-5 (Humana Press 1992) und Williams et al., „Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", in: DNA Cloning 2: Expression Systmes, zweite Auflage, Herausgeber Glover et al., Seite 15 (Oxford University Press 1995)). Die Immunogenizität eines BR43x2-Polypeptids lässt sich durch die Anwendung eines Adjuvans wie Alum (Aluminiumhydroxid) oder dem vollständigen oder unvollständigen Freund'schen Adjuvans steigern. Für die Immunisierung nützliche Polypeptide schließen auch Fusionspolypeptide ein wie Fusionen von BR43x2 oder einem Teil desselben mit einem Immunglobulinpolypeptid oder mit einem Maltose-bindenden Protein. Das Polypeptid als Immunogen kann ein Molekül voller Länge oder ein Teil desselben sein. Falls der Polypeptidteil „Hapten-ähnlich" ist, kann ein solcher Anteil vorteilhafterweise an einen makromolekularen Träger gebunden oder mit diesem verknüpft sein (wie einem Nacktschneckenhemocyanin (KLH = keyhole limpet hemocyanin), Rinderserumalbumin (BSA) oder einem Tetanustoxoid) für die Immunisierung.
Obwohl polyklonale Antikörper typischerweise in Tieren wie Pferden, Kühen, Hunden, Hühnern, Ratten, Mäusen, Kaninchen, Hamstern, Meerschweinchen, Ziegen oder Schafen gezogen werden, kann ein Anti-BR43x2-Antikörper der vorliegenden Erfindung auch von einem Antikörper eines subhumanen Primaten abstammen. Allgemeine Techniken zum Auslösen diagnostisch und therapeutisch geeigneter Antikörper in Pavianen findet sich beispielsweise in Goldenberg et al., internationale Patentveröffentlichung der Nummer WO 91/11465 undin Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310, 1990. Antikörper können auch in transgenen Tieren wie transgenen Schaften, Kühen, Ziegen oder Schweinen gezogen werden und können in Hefe und Pilzen in modifizierter Form wie auch in Säuger- und Insektenzellen exprimiert werden.
Alternativ können monoklonale Anti-BR43x2-Antikörper erzeugt werden. Monoklonale Antikörper aus Nagern gegen spezifische Antigene können über Fachleuten bekannte Verfahren erhalten werden (siehe beispielsweise Kohler et al., Nature 256: 495, 1975, Coligan et al. (Herausgeber) Current Protocols in Immunology, Band 1, Seiten 2.5.1–2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley et al., „Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli" in: DNA Cloning 2: Expression Systems, zweite Auflage, Herausgeber Glover et al., Seite 93 (Oxford University Presss 1995)).
Kürzer gesagt, lassen sich monoklonale Antikörper durch Injizieren von Mäusen mit einer Zusammensetzung erhalten, umfassend ein BR43x2-Genprodukt, Verifizieren der Anwesenheit von Antikörperproduktion durch Entnehmen einer Serumprobe, Entfernen der Milz zum Erhalt von B-Lymphozyten, Fusionieren der B-Lymphozyten mit Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomen, Klonieren der Hybridomen, Selektieren von positiven Klonen, die Antikörper gegen das Antigen erzeugen, Kultivieren der Klone, die Antikörper gegen das Antigen erzeugen, und Isolieren der Antikörper aus den Hybridomkulturen.
Zusätzlich kann ein Anti-BR43x2-Antikörper der vorliegenden Erfindung von einem humanen monoklonalen Antikörper abgeleitet werden. Humane monoklonale Antikörper lassen sich aus transgenen Mäusen erhalten, die gentechnisch verändert wurden, um spezifisch humane Antikörper in Antwort auf eine antigene Herausforderung zu produzieren. Bei dieser Technik werden Elemente der menschlichen schweren und leichten Kettenloci in Stämme von Mäusen induziert, die von embryonalen Stammzelllinien abgeleitet sind, die zielgerichtete Aufbrüche der endogenen schweren Ketten und leichten Kettenloci enthalten. Die transgenen Mäuse können humane Antikörper spezifisch für humane Antigene synthetisieren, und die Mäuse können genutzt werden, um humane Antikörper sekretierende Hybridome zu erzeugen. Verfahren zum Erhalt humaner Antikörper aus transgenen Mäusen sind beispielsweise beschrieben von Green et al., Nat. Genet. 7: 13, 1994, Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994 und Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994.
Monoklonale Antikörper lassen sich aus Hybridomkulturen über eine Vielzahl wohl etablierter Techniken isolieren und reinigen. Solche Isolationstechniken schließen ein die Affinitätschromatographie mit Protein A-Sepharose, die Größen-Ausschlußchromatographie und die Ionenaustauschchromatographie (siehe beispielsweise Coligan auf den Seiten 2.7.1–2.7.12 und den Seiten 2.9.1–2.9.3; Baines et al., „Purification of Immunglobulin G (IgG)" in: Methods in Molecular Biology, Band 10, Seiten 79–104 (The Humana Press, Inc. 1992)).
Für spezielle Anwendungen kann es wünschenswert sein, Fragmente von Anti-BR43x2-Antikörpern herzustellen. Solche Antikörperfragmente können beispielsweise über proteolytische Hydrolyse des Antikörpers erhalten werden. Antikörperfragmente können durch Pepsin- oder Papain-Verdauung von ganzen Antikörpern über konventionelle Methoden erhalten werden. Zur Veranschaulichung können Antikörperfragmente hergestellt werden durch enzymatische Spaltung von Antikörpern mit Pepsin, um ein 5S-Fragment, bezeichnet als F(ab')₂, bereitzustellen. Dieses Fragment kann weiter gepalten werden unter Anwendung eines Thiol-reduzierenden Mittels, um 3,5S monovalente Fab'-Fragmente bereitzustellen. Wahlweise kann die Spaltungsreaktion unter Anwendung einer blockierenden Gruppe für die Sulfhydrylgruppen durchgeführt werden, die aus der Spaltung der Disulfidbindungen resultieren. Als Alternative erzeugt eine enzymatische Spaltung unter Anwendung von Pepsin zwei monvalente Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment direkt. Diese Methoden sind beispielsweise beschrieben von Goldenberg, US-Patent der Nummer 4 331 647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman et al., in: Methods in Enzymology, Band 1, Seite 422 (Academic Press 1967) und von Coligan, ibid.
Andere Spaltverfahren für Antikörper wie die Trennung von schweren Ketten zur Bildung von monovalenten leichten-schweren-Ketten-Fragmenten, die weitere Spaltung von Fragmenten oder andere enzymatische, chemische oder genetische Techniken können ebenfalls genutzt werden, so lange die Fragmente an das Antigen binden, das vom intakten Antikörper erkannt wird.
Beispielsweise umfassen Fv-Fragmente eine Assoziation von V_H- und V_L-Ketten. Diese Assoziation kann nicht kovalent sein, wie beschrieben von Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972. Alternativ können die variablen Ketten durch eine intermolekulare Disulfidbindung verbrückt oder durch Chemikalien wie Glutaraldehyd vernetzt sein (siehe beispielsweise Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992).
Die Fv-Fragmente können V_H- und V_L-Ketten enthalten, die über einen Peptidlinker verbunden sind. Diese einzelkettigen Antigen-bindenden Proteine (scFv) werden durch Konstruieren eines Strukturgens hergestellt, umfassend DNS-Sequenzen, welche die V_H- und V_L-Domänen kodieren, die von einem Oligonukleotid verbunden sind. Das Strukturgen wird in einen Expressionsvektor insertiert, der anschließend in eine Wirtszelle wie E. coli eingeführt wird. Die rekombinanten Wirtszellen synthetisieren eine einzelne Polypeptidkette mit einem Linkerpeptid, das die zwei V-Domänen verbrückt. Methoden zur Produktion von scFv's sind beispielsweise beschrieben von Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97, 1991, siehe auch Bird et al., Science 242: 423, 1988, Ladner et al., US-Patent der Nummer 4 946 778, Pack et al., Bio/Technology 11: 1271, 1993 und Sandhu, ibid.
Als Veranschaulichung kann ein scFV durch Exposition von Lymphozyten an BR43x2-Polypeptid in vitro und Selektieren von Antikörperpräsentationsbibliotheken in Phagen oder ähnlichen Vektoren (beispielsweise durch Anwendung von immobilisierten oder markiertem BR43x2-Protein oder -peptid) erhalten werden. Gene, kodierend Polypeptide mit möglichen BR43x2-Polypeptid-bindenden Domänen, können durch Sichten von statistischen Peptidbibliotheken erhalten werden, die auf Phagen (Phagenpräsentation) oder auf Bakterien wie E. coli präsentiert werden. Nukleotidsequenzen, kodierend die Polypeptide, können auf eine Anzahl von Wegen erhalten werden wie über die statistische Mutagenese und die statistische Polynukleotidsynthese. Diese statistischen Peptide präsentierende Bibliotheken können genutzt werden, um auf Peptide zu sichten, die mit einem bekannten Ziel wechselwirken, bei dem es sich um ein Protein oder Polypeptid wie einen Liganden oder Rezeptor, ein biologisches oder synthetisches Makromolekül oder organische oder anorganische Substanzen handeln kann. Techniken zum Erzeugen und Sichten solcher statistische Peptide präsentierender Datenbanken sind im Stand der Technik bekannt (siehe Ladner et al., US-Patent der Nummer 5 223 409, Ladner et al., US-Patent der Nummer 4 946 778, Ladner et al., US-Patent der Nummer 5 403 484, Ladner et al., US-Patent der Nummer 5 571 698 und Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc., 1996)) und statistische Peptide präsentierende Bibliotheken und Kits zum Sichten solcher Bibliotheken sind im Handel erhältlich beispielsweise von Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) und Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Statistische Peptide präsentierende Bibliotheken können unter Anwendung der hierin offenbarten BR43x2-Sequenzen gesichtet werden, um Proteine zu identifizieren, die an BR43x2 binden.
Eine andere Form eines Antikörperfragments ist ein Peptid, kodierend für einen einzelnen die Komplementarität bestimmenden Bereich (CDR = complementarity-determining region). CDR- Peptide („minimale Erkennungseinheiten") können durch Konstruktion von Genen erhalten werden, die den CDR eines interessierenden Antikörpers kodieren. Solche Gene werden beispielsweise durch Anwendung der Polyerasekettenreaktion hergestellt, um den variablen Bereich aus RNS einer Antikörper-produzierenden Zelle zu synthetisieren (siehe beispielsweise Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991), Courtenay-Luck, „Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in: Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Herausgeber: Ritter et al., Seite 166 (Cambridge University Press 1995), und Ward et al., „Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in: Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Herausgeber: Birch et al., Seite 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995)).
Alternativ kann ein Anti-BR43x2-Antikörper von einem „humanisierten" monoklonalen Antikörper abgeleitet werden. Humanisierte monoklonale Antikörper werden durch Transferieren von die Komplementarität bestimmenden Bereichen der Maus aus schweren und leichten variablen Ketten von Maus-Immunglobulin in eine menschliche variable Domäne erzeugt. Typische Reste von menschlichen Antikörpern werden anschließend im Rahmenbereich der murinen Gegenstücke ersetzt. Die Verwendung von Antikörperkomponenten, abgeleitet von humanisierten monoklonalen Antikörpern, vermeidet mögliche Probleme, die mit der Immunogenizität von konstanten Bereichen der Maus assoziiert sind. Allgemeine Techniken zum Klonieren variabler Domänen von Maus-Immunglobulin sind beispielsweise beschrieben von Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989. Techniken zur Erzeugung humanisierter monoklonaler Antikörper sind beispielsweise beschrieben worden von Jones et al., Nature 321: 522, 1986, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992, Singer et al., J. Immun. 150: 2844, 1993, Sudhir (Herausgeber), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc., 1995), Kelley, „Engineering Therapeutic Antibodies", in: Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (Herausgeber), Seiten 399–434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) und von Queen et al., US-Patent der Nummer 5 693 762 (1977).
Polyklonale anti-idiotypische Antikörper lassen sich durch Immunisierung von Tieren mit Anti-BR43x2-Antikörpern oder Antikörperfragmenten unter Verwendung von Standardtechniken herstellen (siehe beispielsweise Green et al., „Production of Polyclonal Antisera", in: Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (Herausgeber), Seiten 1–12 (Humana Press, 1992). Siehe auch Coligen, ibid. auf den Seiten 2.4.1–2.4.7). Alternativ lassen sich monoklonale anti-idiotypische Antikörper unter Verwendung von Anti-BR43x2-Antikörpern oder -Antikörperfragmenten als Immunogene mit den Techniken herstellen, die oben beschrieben wurden. Als andere Alternative können humanisierte anti-idiotypische Antikörper oder anti-idiotypische Antikörper von subhumanen Primaten unter Anwendung der oben beschriebenen Techniken hergestellt werden. Methoden für die Produktion anti-idiotypischer Antikörper sind beispielsweise be schrieben von Irie, US-Patent der Nummer 5 208 146, Greene et al., US-Patent der Nummer 5 637 677, und Varthakavi und Minocha, J. Gen. Virol. 77: 1875, 1996.
Antikörper und Polypeptide können hierin auch direkt oder indirekt an Wirkstoffe, Toxine, Radionuklide und dergleichen konjugiert sein, und diese Konjugate können für die in vivo-Diagnostik oder therapeutische Anwendungen benutzt werden. Beispielsweise können Polypeptide oder Antikörper der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren oder zur Behandlung von Geweben oder Organen genutzt werden, die ein entsprechendes anti-komplementäres Molekül exprimieren (beispielsweise Rezeptor bzw. Antigen). Genauer können die BR34x2-Polypeptide oder Anti-BR43x2-Antikörper oder bioaktive Fragmente oder Teile derselben an detektierbare oder cytotoxische Moleküle gekuppelt und an einen Säuger übermittelt werden mit Zellen, Geweben oder Organen, die das anti-komplementäre Molekül exprimieren.
Geeignete detektierbare Moleküle können direkt oder indirekt an das Polypeptid oder den Antikörper angeheftet werden und schließen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszente Marker, chemolumineszente Marker, magnetische Teilchen und dergleichen ein. Geeignete cytotoxische Moleküle können direkt oder indirekt an das Polypeptid oder den Antikörper angeheftet werden und schließen bakterielle oder Pflanzentoxine (beispielsweise Diphtheriatoxin, Pseudomonas-Exotoxin, Ricin, Abrin und dergleichen) wie auch therapeutische Radionuklide wie Jod-131, Rhenium-188 oder Yttrium-90 ein (entweder direkt an das Polypeptid oder den Antikörper angeheftet oder indirekt angeheftet über Mittel wie eine chelierende Einheit zum Beispiel). Polypeptide oder Antikörper können auch an cytotoxische Wirkstoffe wie Adriamycin konjugiert sein. Für die indirekte Anheftung eines detektierbaren oder cytotoxischen Moleküls kann das detektierbare oder cytotoxische Molekül mit einem Element eines komplementären/antikomplementären Paars konjugiert werden, wobei das andere Element an das Polypeptid oder den Antikörperteil gebunden ist. Für diese Zwecke ist Biotin/Streptavidin ein beispielhaftes Paar aus Komplementär/Antikomplement.
Lösliche BR43x2-Polypeptide oder Antikörper gegen BR43x2 können direkt oder indirekt an Wirkstoffe, Toxine, Radionuklide und dergleichen konjugiert werden, und diese Konjugate können für die Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen für die Anwendung in vivo genutzt werden. Beispielsweise können Polypeptide oder Antikörper der vorliegenden Erfindung genutzt werden, um Gewebe oder Organe zu behandeln, die ein entsprechendes antikomplementäres Molekül exprimieren (beispielsweise Rezeptor bzw. Antigen). Genauer können BR43x2-Polypeptide oder Anti-BR43x2-Antikörper oder bioaktive Fragmente oder Teile derselben an cytotoxische Moleküle gekuppelt und an einen Säuger übermittelt werden mit Zellen, Geweben oder Organen, die das anti-komplementäre Molekül exprimieren.
Geeignete cytotoxische Moleküle können direkt oder indirekt an das Polypeptid oder den Antikörper angeheftet werden und schließen bakterielle oder Pflanzentoxine (beispielsweise Diphteriatoxin, Pseudomonas-Endotoxin, Ricin, Abrin und dergleichen) wie auch therapeutische Radionuklide wie Jod-131, Rhenium-188 oder Yttrium-90 ein (entweder direkt an das Polypeptid oder den Antikörper angeheftet oder indirekt angeheftet mittels einer chelierenden Einheit beispielsweise). Polypeptide oder Antikörper können auch an cytotoxische Wirkstoffe wie Adriamycin konjugiert werden. Für die indirekte Anheftung eines cytotoxischen Moleküls kann das cytotoxische Molekül mit einem Element eines komplementären/antikomplementären Paares konjugiert sein, wobei das andere Element an das Peptid oder den Antikörperteil gebunden ist. Für diese Zwecke ist Biotin/Streptavidin ein exemplarisches Paar aus Komplement/Antikomplement.
Solche Polypeptid/Toxin-Fusionsproteine oder Antikörper/Fragment-Toxin-Fusionsproteine können für die zielgerichtete Zell- oder Gewebsinhibition oder -ablation verwendet werden (beispielsweise um Krebszellen oder -gewebe zu behandeln). Alternativ kann dann, wenn das Polypeptid mehrere funktionale Domänen aufweist (d. h. eine Aktivierungsdomäne oder eine Ligandbindende Domäne plus eine zielrichtende Domäne), ein nur die zielrichtende Domäne umfassendes Fusionsprotein zum Zielrichten eines detektierbaren Moleküls, eines cytotoxischen Moleküls oder eines komplementären Moleküls an eine Zelle oder einen Gewebetyp von Interesse geeignet sein. In Fällen, in denen die Domäne des Fusionsproteins ein komplementäres Molekül umfasst, kann das anti-komplementäre Molekül an ein detektierbares oder cytotoxisches Molekül konjugiert sein. Solche Fusionsproteine aus Domäne komplementärem Molekül stellen somit einen generischen zielrichtenden Träger für die Zell/Gewebe-spezifische Übermittlung von generischen Konjugaten aus anti-komplementär/cytotoxischem Molekül dar. Die hierin beschriebenen Konjugate aus bioaktivem Polypeptid oder Antikörper können intravenös, intraarteriell oder intraduktal übermittelt werden oder können lokal an dem intendierten Wirkort eingeführt werden.
Antikörper können gegen lösliche BR43x2-Polypeptide hergestellt werden, die His- oder FLAG^TM-gemarkert sind. Antikörper können auch gegen von E. coli erzeugte MBP-Fusionsproteine hergestellt werden. Alternativ können solche Polypeptide ein Fusionsprotein mit einem menschlichen Ig einschließen. Insbesondere können Antiseren, enthaltend Polypeptidantikörper gegen His-gemarkerte oder FLAG^TM-gemarkerte lösliche BR43x2, genutzt werden bei der Analyse der Gewebsverteilung von BR43x2 mittels Immunhistochemie aus Gewebe aus Mensch oder Primat. Diese löslichen BR43x2-Polypeptide können auch zur Immunisierung von Mäusen genutzt werden, um monoklonale Antikörper gegen ein lösliches menschliches BR43x2-Polypeptid zu erzeugen. Monoklonale Antikörper gegen ein lösliches menschliches BR43x2-Polypeptid können auch genutzt werden, um die Liganden/Rezeptor-Kupplung nachzuahmen, was zu einer Aktivierung oder Inaktivierung des Liganden/Rezeptor-Paares führt. Beispielsweise ist gezeigt worden, dass die Quervernetzung von monoklonalen Antikörpern gegen lösliches CD40 ein stimulierendes Signal für B-Zellen bereitstellt, die suboptimal mit Anti-IgM oder LPS aktiviert wurden, und zur Proliferation und Immunglobulinproduktion führt. Die gleichen monoklonalen Antikörper wirken als Antagonisten dann, wenn sie in Lösung genutzt werden, indem sie die Aktivierung des Rezeptors blockieren. Monoklonale Antikörper gegen BR43x2 können genutzt werden, um die Verteilung, Steuerung und biologische Wechselwirkung des BR43x2/BR43x2-Liganden-Paares auf spezifischen Zelllinien zu untersuchen, die über Gewebsverteilungsuntersuchungen identifiziert wurden.
Pharmazeutisch wirksame Mengen an BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung können mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern für die parenterale, orale, nasale, rektale, topische, transdermale Verabreichung oder dergleichen gemäß herkömmlicher Methoden formuliert werden. Die Formulierungen können weiterhin umfassen einen oder mehrere Verdünner, Füllstoffe, Emulgatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Hilfsstoffe und dergleichen und können in Formen wie Flüssigkeiten, Pulvern, Emulsionen, Zäpfchen, Liposomen, transdermalen Pflastern und Tabletten nur zum Beispiel bereitgestellt werden. Langsam oder verzögert freisetzende Übermittlungssysteme, eingeschlossen jedes einer Anzahl von Biopolymeren (biologisch basierten Systemen), Liposomen nutzende Systeme und polymerische Übermittlungssysteme können ebenfalls mit den hierin beschriebenen Zusammensetzungen genutzt werden, um eine kontinuierliche oder Langzeitquelle des BR43x2-Polypeptids oder Antagonisten bereitzustellen. Solche langsam freisetzenden Systeme sind auf Formulierungen beispielsweise für die orale, topische oder parenterale Anwendung anwendbar. Der Ausdruck „pharmazeutisch annehmbarer Träger" bezieht sich auf ein Trägermedium, das nicht mit der Wirksamkeit der biologischen Aktivität der aktiven Bestandteile interferiert und das für den Wirt oder Patienten nicht toxisch ist. Ein Fachmann kann die Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf angemessene Weise und in Übereinstimmung mit akzeptierten Praktiken formulieren, wie denjenigen, die offenbart sind in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Herausgeber Gennaro, Mack Publishing Co., Easton PA, 19. Auflage, 1995.
Wie hierin verwendet, ist eine „pharmazeutisch wirksame Menge" eines BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptids, -Angonisten oder -Antagonisten eine ausreichende Menge, um ein gewünschtes biologisches Ergebnis zu induzieren. Das Ergebnis kann die Erleichterung der Zeichen, Symptome oder Ursachen einer Erkrankung oder jede andere gewünschte Änderung eines biologischen Systems sein. Beispielsweise ist eine wirksame Menge eines BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptids eine, die entweder die subjektive Erleichterung von Symptomen oder eine objektiv identifizierbare Verbesserung bereitstellt, wie sie vom Arzt oder einem anderen qualifizierten Beobachter bemerkt wird. Beispielsweise würde solch eine wirksame Menge eines BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptids oder einer löslichen Fusion eine Abnahme der B-Zell-Antwort während der Immunantwort, die Inhibition oder Abnahme der Autoantikörperproduktion, die Inhibition oder Verringerung von Symptomen, assoziiert mit SLE, MG oder RA bereitstellen. Wirksame Mengen an BR43x2, TACI oder BCMA werden den Prozentsatz an B-Zellen im Peripherieblut vermindern. Wirksame Mengen der BR43x2-, TACI- oder BCMA-Polypeptide können breit schwanken in Abhängigkeit von der Erkrankung oder dem Symptom, die bzw. das behandelt werden soll. Die zu verabreichende Menge des Polypeptids und seine Konzentration in den Formulierungen hängt von dem gewählten Träger, der Verabreichungsroute, der Potenz des speziellen Polypeptids, dem klinischen Zustand des Patienten, den Nebenwirkungen und der Stabilität der Verbinung in der Formulierung ab. Somit wird der Arzt die angemessene Zubereitung nutzen, enthaltend die angemessene Konzentration in der Formulierung, wie auch die Menge der verabreichten Formulierung, in Abhängigkeit von klinischer Erfahrung mit dem fraglichen Patienten oder ähnlichen Patienten. Solche Mengen werden teilweise von dem speziellen zu behandelnden Zustand, dem Alter, Gewicht und der allgemeinen Gesundheit des Patienten und anderen Faktoren, die dem Fachmann ersichtlich sind, abhängen. Typischerweise wird eine Dosis im Bereich von 0,1 bis 100 mg/kg des Subjekts liegen. Dosen für spezifische Verbindungen können aus in vitro- oder ex vivo-Untersuchungen in Kombination mit Untersuchungen an Versuchstieren ermittelt werden. Konzentrationen von Verbindungen, die in vitro oder ex vivo als wirksam befunden wurden, stellen Richtlinien für Tierversuche dar, worin Dosen berechnet werden, um ähnliche Konzentrationen am Wirkort bereitzustellen.
Die Erfindung wird weiter von den folgenden Beispielen veranschaulicht.
Beispiele
Beispiel 1
Identifikation von BR43x2
Die TACI-Isoform wurde aus einer RPMI-Anordnungsbibliothek unter Anwendung des Sekretionsfallenansatzes kloniert. Eine RPMI-1788-Bibliothek (aktivierte B-Zelllinie) wurde unter Anordnung von 20 Platten mit 96 Vertiefungen angeordnet. Jede Vertiefung enthielt etwa 100 E. coli-Kolonien, wobei jede Kolonie einen cDNS-Klon enthielt. DNS-Minipräparationen wurden unter Anwendung des TomTech Quadra 9600 im Format mit 96 Vertiefungen hergestellt. Die isolierte DNS wurde anschließend in 120 Pools vereinigt, die jeweils 1600 Klone repräsentierten. Diese Pools wurden in Cos-7-Zellen transfiziert und auf Platten mit 12 Vertiefungen ausplattiert. Drei Mikroliter an Pool-DNS und 5 μl Lipofectamine wuden in 92 μl serumfreiem DMEM-Medium gemischt (55 mg Natriumpyruvat, 146 mg L-Glutamin, 5 mg Transferrin, 2,5 mg Insulin, 1 μg Selen und 5 mg Fetuin in 500 ml DMEM), bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 400 μl serumfreiem DMEM-Medium. Der DNS-Lipofectamin-Mix wurde zu 220.000 Cos-7-Zellen/Vertiefung zugesetzt, ausplattiert auf Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen und für 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 500 μl 20% FBS-DMEM-Medium (100 ml FBS, 55 mg Natriumpyruvat und 146 mg L-Glutamin in 500 ml DMEM) zu jeder Vertiefung zugesetzt und die Zellen über Nacht inkubiert.
Das Sekretionsfallensichten erfolgte unter Anwendung von biotinyliertem, FLAG-gemarkertem ztnf4. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und für 15 Minuten mit 1,8% Formaldehyd in PBS fixiert. Die Zellen wurden anschließend mit TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl und 0,05% Tween-20 in H₂O) gewaschen. Die Zellen wurden 15 Minuten lang mit 0,1% Triton-X in PBS permeiert, gefolgt von einer Waschung in TNT. Die Zellen wurden für eine Stunde mit TNB geblockt (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl und 0,5% Blockierungsmittel), und zwar unter Anwen- dung eines NEN-Renaissance^®-TSA-Direct-Kits (NEN, Boston, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Zellen wurden mit TNT gewaschen und für 15 Minuten mit Avidin und dann Biotin (Vektor Labs Katalog Nr. SP-2001) blockiert, wobei zwischendurch mit TNT gewaschen wurde. Die Zellen wurden für eine Stunde mit 1 μg/ml ztnf4/FLAG/Biotin in TNB inkubiert, gefolgt von einer TNT-Waschung. Die Zellen wurden anschließend für eine Stunde mit einer 1 : 300-Verdünnung von Streptavidin-HRP (NEN) in TNB inkubiert und mit TNT gewaschen. Hybridisierungen wurden mit einem Fluoroescein-Tyramid-Reagenz detektiert, verdünnt 1 : 50 in Verdünnungspuffer (NEN), und für 4,4 Minutenn inkubiert und mit TNT gewaschen. Die Zellen wurden mit 1 : 5 in TNT verdünntem Vectashield Mounting-Medium (Vector Labs, Burlingame, CA) konserviert.
Die Zellen wurden unter Anwendung eines FITC-Filters mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Zwölf Pools waren auf die ztnf4-Bindung positiv. Der Pool D8 (repräsentierend 1600 Klone) wurde aufgeteilt und ein einzelner Klon (D8-1), der auf die ztnf4-Bindung positiv war, wurde isoliert. Die Sequenzanalyse zeigte, dass der Klon D8-1 eine Polypeptidsequenz enthielt, die eine Isoform von TACI kodierte, worin der erste cystein-reiche Pseudo-Repeat von TACI, Phe21-Arg67, durch einen einzelnen Aminosäurerest, Tryptophan, ersetzt war. Diese Isoform wurde bezeichnet als BR43x2, wobei dessen Polynukleotidsequenz in der SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist.
Beispiel 2
Lokalisierung von BR43x1 in Lymphozyten und Monozyten
Um die BR43x1-Expression in T- und B-Zellen und Monozyten zu lokalisieren wurde die reverse Transkriptase-PCR angewandt. Oligonukleotidprimer ZC19980 (SEQ ID Nr. 15) und ZC19981 (SEQ ID Nr. 16) wurden zum Sichten von CD19⁺, CD3⁺ und Monozyten-cDNS auf BR43 genutzt. Die reverse Transkripasereaktion erfolgte bei 94°C für 3 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 68°C für 2 Minuten und 72°C für 1 Minute, gefolgt von einer 7-minütigen Verlängerung bei 72°C. Eine Bande der erwarteten Größe, 720 bp, wurden nur in B- Zellen und nicht in aktivierten T-Zellen detektiert, wie für TACI unter Verwendung von Antikörpern berichtet worden war (von Bülow und Bram, ibid).
Beispiel 3
B-Zell-Proliferationstest unter Anwendung des BR43-Liganden ztnf4
Eine Phiole, enthaltend 1 × 10⁸ gefrorene, getrennte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurde schnell in einem Wasserbad von 37°C aufgetaut und in 25 ml B-Zellmedium (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, 10% wärmeinaktiviertes fötales Rinderserum, 5 L-Glutamin, 5% Pen/Strep) in einem 50 ml Röhrchen resuspendiert. Die Zellen wurden auf Lebensfähigkeit unter Anwendung von Trypan-Blau getestet (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). 10 ml Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) wurde unter die Zellsuspension geschichtet, und man zentrifugierte 30 Minuten bei 1800 rpm und gestattete ein Anhalten mit ausgeschalteter Bremse. Die Zwischenphasenschicht wurde anschließend entfernt und in ein frisches 50 ml Röhrchen transferiert, auf ein Endvolumen von 40 ml mit PBS gebracht und für 10 Minuten bei 1200 rpm mit angeschalteter Bremse zentrifugiert. Die Lebensfähigkeit der isolierten B-Zellen wurde unter Anwendung von Trypan-Blau getestet. Die B-Zellen wurden auf eine Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml im B-Zellmedium resuspendiert und mit 180 μl/Vertiefung in einer U-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen (Falcon, VWR, Seattle, WA) ausplattiert.
Den Zellen wurde einer der folgenden Stimulatoren zugesetzt, um ein Endvolumen von 200 ml/Vertiefung zu ergeben:
Lösliches, FLAG-gemarkertes ztnf-4sCF oder ztnf-4sNF bei 10-fachen Verdünnungen von 1 mg–1 ng/ml entweder allein, mit 10 μg/ml anti-IgM (Anti-Human-IgM aus Ziege), verdünnt in NaH₂CO₃, pH 9,5 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL); oder mit 10 μg/ml anti-IgM und 10 ng/ml rekombinantem menschlichen IL4 (verdünnt in PBS und 0,1% BSA). Zusätzlich wurden andere Cytokine wie IL-3 und IL-6 wie auch ein löslicher CD40-Antikörper (sCD40) (Pharmingen, San Diego, CA) getestet. Als eine Kontrolle dienten Zellen inkubiert mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und PBS, 10 μg/ml anti-IgM oder 10 μg/ml anti-IgM und 10 ng/ml IL4 (oder der anderen Cytokine). Die Zellen wurden anschließend bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator für 72 Stunden inkubiert. 16 Stunden vor der Ernte wurde allen Vertiefungen 1 μCi ³H-Thymidin zugesetzt. Die Zellen wurden auf einer Filterplatte mit 96 Vertiefungen (Unifilter GF/C, Packard, Meriden, CT) geerntet, wo sie unter Anwendung eines Cell-Harvesters (Packard) geerntet und gemäß den Anweisungen des Herstellers gesammelt wurden. Die Platten wurden für 20–30 Minuten bei 55°C getrocknet und der Boden der Vertiefungen mit einem opaquen Plattendichter versiegelt. Zu jeder Vertiefung wurden 0,25 ml Scintillisationsfluid (Microscient-O, Packard) zugesetzt und die Platte unter Anwendung eines TopCount Microplate Scintillation Counters (Packard) (Szintillisationszählgeräts für Mikroplatten)abgelesen.
Um die Induktion der IgG-Produktion in Antwort auf die verschiedenen B-Zell-Mitogene nach Stimulation gereinigter B-Zellen zu messen, wurden die Zellen wie beschrieben hergestellt und für neun Tage inkubiert. Der Zellüberstand wurde gesammelt, um die IgG-Produktion zu bestimmen.
Um die Zelloberflächenmarkeraktivierung in Antwort auf verschiedene B-Zell-Mitogene nach Stimulation gereinigter B-Zellen zu messen, wurden die Zellen wie beschrieben hergestellt, jedoch nur 48 Stunden inkubiert. Die Zelloberflächenmarker wurden mittels FACS-Analyse gemessen.
Die Proliferation menschlicher gereinigter B-Zellen, stimuliert mit den verschiedenen B-Zell-Mitogenen, ist in Tabelle 5 zusammengefasst:
Tabelle 5
Es war eine synergistische Wirkung von ztnf4 mit IL4, IL3 (10 μg/ml) und IL6 (10 μg/ml) auf die B-Zell-Proliferation zu sehen. Eine zweifache Steigerung der B-Zell-Signalgebung war unter Anwendung von sCD40 ersichtlich.
Die Induktion der IgG-Produktion (ng/ml) in Antwort auf verschiedene B-Zell-Mitogene nach Stimulation gereinigter B-Zellen ist in Tabelle 6 zusammengefasst.
Tabelle 6
Eine Steigerung der Zelloberflächenaktivierungsmarker nach Stimulation gereinigter B-Zellen mit ztnf4 alleine, oder mit anti-IgM oder anti-IgM + IL4 war ersichtlich. Es gab keine Wirkung auf die Proliferation von PBMNC in Anwesenheit von optimalen oder suboptimalen T-Zell-Mitogenen. Ebenfalls gab es keine Wirkung auf die TNFα-Produktion in gereinigten Monozyten in Antwort auf die LPS-Stimulation.
3 zeigt die Co-Aktivierung menschlicher B-Lymphozyten mit löslichem ztnf4, um zu proliferieren und Immunglobulin zu sekretieren. 3A zeigt die Proliferation gereinigter menschlicher B-Zellen des peripheren Blutes in Antwort auf die Stimulierung mit löslichem ztnf4 (25 ng/ml) in Anwesenheit von IL-4 alleine und I1-4 mit anti-IgM, anti-CD40 oder anti-CD19 nach fünf Tagen in Kultur. 3B zeigt die Level von IgM und IgG, gemessen in den Überständen, erhalten aus menschlichen B-Zellen, stimuliert mit löslichem ztnf4 in Anwesenheit von IL-4 oder I1-4 + IL-5, nach neun Tagen in Kultur.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass lösliches ztnf4 ein B-Zell-Aktivierungsmolekül ist, das konzertiert mit anderen B-Zell-Stimuli und schwach aus sich heraus wirkt. Lösliches ztnf4 fördert die B-Zell-Proliferation und Ig-Produktion. Die Aufregulation von Adhesionsmolekülen, co-stimulierenden Molekülen und Aktivierungsrezeptoren legt eine Rolle bezüglich der Förderung der APC-Funktion von B-Zellen nahe.
4 zeigt die Stimulation von menschlichen B-Zellen des peripheren Blutes mit löslichem ztnf4 (25 ng/ml) oder einem Kontrollprotein (Ubiquitin) in Anwesenheit von 10 ng/ml IL-4 für fünf Tage in vitro. Gereinigtes TACI-Ig, BCMA-Ig oder Fc zur Kontrolle wurden auf die Inhibition der für lösliches ztnf4 spezifischen Proliferation getestet.
Beispiel 4
Selektion von TACI- und BCMA-transformierten BHK-Zellen unter Anwendung der zfif4-Bindung
Einen hohen Level an TACI-Protein exprimierende BHK-Zellen wurden durch Grenzverdünnungsklonieren eines Transfektantenpools selektiert. Transfizierte Zellen (2 × 10⁵) wurden auf Eis für 30 Minuten mit biotinyliertem ztnf4 bei 1 μg/ml in Bindungspuffer (PBS, 2% BSA, 0,02% NaN₃) inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit Bindungspuffer gewaschen, anschließend mit SA-PE (Caltag) (1 : 1000-Verdünnung in Bindungspuffer) auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden anschließend zweimal in Bindungspuffer gewaschen, in Bindungspuffer resuspendiert und mittels FACS abgelesen (FACS-Vantage, Becton Dickinson). Die Klone mit den höchsten Bindungen von TNF4 werden selektiert.
Einen hohen Level an BCMA-Protein exprimierende BHK-Zellen wurden mittels Oberflächenmarkierung der BCMA-exprimierenden Transfektantenpools mit biotinyliertem ztnf4 selektiert. Diesem folgte Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE, Caltag Burlingame, CA) und steriles Sortieren auf leuchtende Zellen in FL2 auf dem FACS-Vantage (Becton Dickinson). Die einzelnen Kolonien wurden anschließend auf die zfif4-Bindung gesichtet.
Beispiel 5
Gewebeverteilung
Northern Blots mehrerer menschlicher Gewebe (MTN I, MTN II und MTN III = Multiple Tissue Northern blot; Clontech) wurden sondiert, um die Gewebeverteilung der menschlichen BR43x2- und TACI-Expression zu ermitteln. Eine PCR-abgeleitete Sonde von etwa 500 bp (SEQ ID Nr. 21) wurde unter Anwendung von BR43x2 (SEQ ID Nr. 1) als Template und den Oligonukleotiden ZC20061 (SEQ ID Nr. 22) und ZC20062 (SEQ ID Nr. 23) als Primer amplifiziert. Diese Sequenz ist dem homologen Bereich von TACI identisch. Die Amplifikation erfolgte wie folgt: ein Zyklus bei 94°C für 1,0 Minuten, 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden, gefolgt von einem Zyklus bei 72°C für 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht und das PCR-Produkt von 500 bp unter Anwendung eines Gelextraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA) gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt. Die Sonde wurde unter Anwendung des MULTIPRIME-DNS-Markierungskits (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers radioaktiv markiert. Die Sonde wurde unter Anwendung einer NUCTRAP-Push-Säule (Stratagen) gereinigt. Eine EXPRESSHYB-Lösung (Clontech) wurde zur Vorhybridisierung wie auch als Hybridisierungslösung für die Northern Blots genutzt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 65°C unter Anwendung von 10⁶ cpm/ml an markierter Sonde. Die Blots wurden anschließend in 2X SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen in 0,1X SSC und 0,1% SDS bei 50°C. Ein Transkript von etwa 1,5 kb Länge wurde in Milz, Lymphknoten und Dünndarm detektiert.
Northern Blots mehrerer menschlicher Gewebe (MTN I, MTN II und MTN III; Clontech) wurden sondiert, um die Gewebsverteilung der menschlichen BCMA-Expression zu ermitteln. Eine PCR-abgeleitete Sonde von etwa 257 bp (SEQ ID Nr. 24) wurde unter Anwendung von Daudi-Zell-cDNS als Tamplate und den Oligonukleotiden ZC21065 (SEQ ID Nr. 25) und ZC21067 (SEQ ID Nr. 26) als Primer amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte wie folgt: Ein Zyklus bei 94°C für 1,0 Minuten, 35 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden, gefolgt von einem Zyklus bei 72°C für 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht, und das PCR-Produkt von 257 bp wurde unter Anwendung eines Gelextraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA) gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt. Die Sonde wurde unter Anwendung des MULTIPRIME-DNS-Markierungskits (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Die Sonde wurde unter Anwendung einer NUCTRAP-Push-Säule (Stratagene) gereinigt. Eine EXPRESSHYB-Lösung (Clontech) wurde für die Vorhybridisierung und als Hybridisierungslösung für die Northern Blots verwendet. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 65°C unter Anwendung von 10⁶ cpm/ml an markierter Sonde. Die Blots wurden dann in 2X SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen in 0,1X SSC und 0,1% SDS bei 50°C. Ein Transkript von etwa 1,2 kb Länge wurde in Magen, Dünndarm, Lymphknoten, Trachea, Milz und Hoden detektiert.
RNS-Master-Dot Blots (Clontech), die RNS aus verschiedenen Geweben enthielten, die auf 8 Haushaltsgene normalisiert waren, wurden ebenfalls mit entweder der TACI-Sonde (SEQ ID Nr. 21) oder der BCMA-Sonde (SEQ ID Nr. 24) sondiert und wie oben beschrieben hybridisiert. Die BR43x2-/TACI-Expression wurde beobachtet in Milz, Lymphknoten, Dünndarm, Magen, Speicheldrüse, Wurmfortsatz, Lunge, Knochenmark und fötaler Milz. Die BCMA-Expression wurde in Dünndarm, Milz, Magen, Dickdarm, Lymphknoten und Wurmfortsatz detektiert.
Ein humaner Tumor-Tafelblot V (Invitrogen Inc., San Diego, CA) und ein humaner Lymphomblot (Invitrogen) wurden wie oben beschrieben entweder mit einer BR43x2-/TACI-Sonde (SEQ ID Nr. 21) oder einer BCMA-Sonde (SEQ ID Nr. 24) sondiert. Ein 1,5 kb Transkript, entsprechend TACI, fand sich in non-Hodgkin-Lymphomen und Parotistumoren. Ein 1,2 kb Transkript, entsprechend BCMA, fand sich in Adenolymphomen, non-Hodgkin-Lymphomen und Parotistumor.
Die Gesamt-RNS aus CD4⁺, CD8⁺, CD19 und gemischten Zellen mit Lymphozytenreaktion (CellPro, Bothell, WA) (mixed lymphocyte reaction cells: MLR Zellen) wurde unter Anwendung von Guanidinisothiocyanat hergestellt (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52–94, 1979), gefolgt von einem CsCl-Zentrifugationsschritt. Die poly(A)⁺-RNS wurde unter Anwendung der Oligod(T)-Zellulose-Chromatographie isoliert (Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69: 1408–12, 1972). Die Northern-Blot-Analyse erfolgte dann wie folgt.
Etwa 2 mg jeder der poly-A⁺-RNS wurde im 2,2 M Formaldehyd/Phosphatpuffer (50 mM NaHP₂O₄, 50 mM NaHP₂O₄, 50 mM NaOAc, 1 mM EDTA und 2,2 M Formaldehyd) denaturiert und über 1,5% Agaroseminigelelektrophorese (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) in Formaldehyd/Phosphat-Puffer getrennt. Die RNS wurde über Nacht auf einen Nytranfilter (Schleicher & Schuell, Keene, NH) geblottet und der Filter mittels UV quervernetzt (1200 mJoules) und zwar in einem STRATALINKER^a UV-Quervernetzer (Stratagene Cloning Systems) und anschließend bei 80°C für eine Stunde gebacken.
Die Blots wurden entweder mit einer TACI-Sonde (SEQ ID Nr. 21) oder einer BCMA-Sonde (SEQ II) Nr. 24) sondiert. Eine Bande von 1,5 kb, repräsentierend TACI, wurde nur in CD19+-Zellen detektiert. Ein Transkript von 1,2 kb, repräsentierend BCMA, wurde schwach in CD8⁺-, CD19⁺- und MLR-Zellen detektiert.
Eine zusätzliche Northern-Blot-Analyse erfolgte auf Blots, hergestellt mit poly(A)-RNS aus K-562-Zellen (Erythroid, ATCC CCL 243), HUT78-Zellen (T-Zelle, ATCC TIB-161), Jurkat-Zellen (T-Zelle), DAUDI (Burkitts human Lymphom, Clontech, Palo Alto, CA), RAJI (Burkitts human Lymphom, Clontech) und HL60 (Monozyten) wie oben beschrieben. Die Blots wurden entweder mit einer TACI-Sonde (SEQ ID Nr. 21) oder einer BCMA-Sonde (SEQ ID Nr. 24) sondiert. Ein Transkript von 1,5 kb, entsprechend TACI, wurde in den RAJI-Zellen detektiert. Ein Transkript von 1,2 kb, entsprechend BCMA, wurde in Daudi, Raji und Hut 78-Zellen detektiert.
Ein Raster auf PCR-Basis wurde zum Identifizieren von Geweben verwendet, die menschliches oder murines TACI und menschliches BCMA exprimieren. Menschliche und murine Rapid- Scan^TM-Genexpressionstafeln (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers gesichtet. Die Oligonukleotidprimer ZC24200 (SEQ ID Nr. 27) und ZC24201 (SEQ ID Nr. 28) wurden designed, um sich über eine Exonverbindung zu erstrecken und ein Fragment von 272 bp zu erzeugen, entsprechend dem murinen TACI. Die Expression wurde in Milz, Thymus, Lunge, Brust, Herz, Muskel, Haut, Nebenniere, Magen, Dünndarm, Hirn, Ovar, der Prostata und dem Embryo detektiert. Weitere Banden von in etwa 500 und 800 bp wurden in vielen Geweben detektiert.
Die Oligonukleotidprimer ZC24198 (SEQ ID Nr. 29) und ZC24199 (SEQ ID Nr. 30) wurden designed, um sich über eine Exonverbindung zu erstrecken und ein Fragment von 204 bp zu erzeugen, entsprechend einem menschlichen TACI. Die Expression wurde detektiert in Milz, Hirn, Herz, Leber, Dickdarm, Lunge, Dünndarm, Muskel, Magen, Hoden, Plazenta, Speicheldrüse, Nebenniere, Pankreas, Prostata, Lymphozyten des peripheren Blutes und dem Knochenmark.
Die Oligonukleotidprimer ZC24271 (SEQ ID Nr. 31) und ZC24272 (SEQ ID Nr. 32) wurden designed, um sich über eine Exonverbindung zu erstrecken und ein Fragment von 329 bp zu erzeugen, entsprechend einem menschlichen BCMA. Die Expression wurde detektiert in Hirn, Milz, Dickdarm, Lunge, Dünndarm, Magen, Ovar, Hoden, Speicheldrüse, Nebenniere, Prostata, Lymphozyten des peripheren Blutes, dem Knochenark und der fötalen Leber.
Die Oligonukleotidprimer ZC24495 (SEQ ID Nr. 33) und ZC24496 (SEQ ID Nr. 34) wurden designed, um sich über eine Exonverbindung zu erstrecken und ein Fragment von 436 pb zu erzeugen, entsprechend dem BCMA der Maus. Die Expression wurde in der Leber detektiert.
Beispiel 6
Herstellung von TACI-Ig- und BCMA-Ig-Fusionsvektoren
Konstruktion eines Ig-Gammal-Fc4-Fragments
Um das TACI-Ig-Fusionsprotein herzustellen, wurde der Fc-Bereich eines menschlichen Igel (Gelenkbereich und die CH2 und CH3-Domänen) modifiziert, um den Fc-Rezeptor (FcgRI) und die Komplement-Bindungsfunktionen (CIq) zu entfernen. Diese modifizierte Version des menschlichen IgG1-Fc wurde bezeichnet als Fc4.
Der Fc-Bereich wurde aus einer menschlichen fötalen Leberbibliothek (Clontech) isoliert, und zwar mittels PCR unter Anwendung der Oligoprimer ZC10,134 (SEQ ID Nr. 43) und ZC10,135 (SEQ ID Nr. 44). Die PCR wurde genutzt, um Mutationen in den Fc-Bereich einzuführen, um die FcgRI-Bindung zu verringern. Die FcgRI-Bindungsstelle (Leu-Leu-gly-Gly) wurde zu Ala-Glu-gly-Ala mutiert (Aminosäurerest 38-41 der SEQ ID Nr. 45), und zwar gemäß Baum et al., (EMBO J. 13: 3993–4001, 1994), um die FcRI-Bindung zu verringern (Duncan et al., Nature 332: 563–4, 1988). Die Oligonukleotidprimer ZC15,345 (SEQ ID Nr. 46) und ZC15,347 (SEQ ID Nr. 47) wurden zur Einführung der Mutation verwendet. Auf ein 50 μl Endvolumen wurden 570 ng IgFc-Template, 5 μl 10X Pfu-Reaktionspuffer (Stratagene), 8 μl 1,25 mM dNTPs, 31 μl dH₂O, 2 μl 20 mM ZC15,345 (SEQ ID Nr. 46) und ZC15,347 (SEQ ID Nr. 47) zugesetzt. Ein gleiches Volumen an Mineralöl wurde zugefügt und die Reaktion für eine Minute auf 94°C erwärmt. Die Pfu-Polymerase (2,5 Einheiten, Stratagene) wurde zugesetzt, gefolgt von 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für eine Minute, gefolgt von einer 7-minütigen Verlängerung bei 72°C. Die Reaktionsprodukte wurden der Elektrophorese unterworfen und die Bande, entsprechend der vorhergesagten Größe von etwa 676 bp, wurde detektiert. Die Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und unter Anwendung eines QIAGEN QIAquick^TM-Gelextraktionskits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gewonnen.
Die PCR wurde auch genutzt, um eine Mutation von Ala in Ser (Aminosäurerest 134 der SEQ ID Nr. 45) und Pro in Ser (Aminosäurerest 135 der SEQ ID Nr. 45) einzuführen, um die Komplement-C1q-Bindung und/oder die Komplementfixierung (Duncan und Winter, Nature 332: 788, 1988) zu verringern, und das Stopcodon TAA einzuführen. Zwei Runden der ersten Reaktion erfolgten unter Anwendung der hinsichtlich der FcγRI-Bindungsstelle mutierten IgFc-Sequenz als Template. Zu einem 50 μl Endvolumen wurden zugesetzt 1 μl FcγRI-Bindungsstellen mutiertes IgFc-Template, 5 μl 10X Rfu-Reaktionspuffer (Stratagene), 8 μl 1,25 mM dNTPs, 31 μl dH₂O, 2 μl 20 mM ZC15,517 (SEQ ID Nr. 48), ein 5'-Primer, beginnend am Nukleotid 26 der SEQ ID Nr. 45, und 2 μl 20 mM ZC15,530 (SEQ ID Nr. 49), einem 3'-Primer, beginnend am Komplement des Nukleotids 405 der SEQ ID Nr. 45. Die zweite Reaktion enthielt 2 μl jeweils von 20 mM Stammlösungen der Oligonukleotidprimer ZC15,518 (SEQ ID Nr. 50), einem 5'-Primer, beginnend am Nukleotid 388 der SEQ ID Nr. 45, und ZC15,347 (SEQ ID Nr. 47), einem 3'-Primer, um die Ala nach Ser-Mutation, eine Xba I-Restriktionsstelle und das Stopcodon einzuführen. Ein gleiches Volumen an Mineralöl wurde zugesetzt und die Reaktionen für 1 Minute auf 94°C erwärmt. Pfu-Polymerase (2,5 Einheiten, Stratagene) wurde zugesetzt, gefolgt von 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 2 Minuten, gefolgt von einer 7-minütigen Verlängerung bei 72°C. Die Reaktionsprodukte wurden der Elektrophorese unterworfen und Banden, entsprechend den vorhergesagten Größen von etwa 370 bzw. etwa 395 bp, wurden detektiert. Die Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und unter Anwendung eines QIAGEN QIAquick^rm-Gelextraktionskits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Eine Reaktion der zweiten Runde erfolgte, um die obigen Fragmente zu verbinden und die 5'-Bam HI-Restriktionsstelle zuzufügen. Auf ein Endvolumen von 50 μl wurden zugesetzt 30 μl dH2O, 8 μl 1,25 mM dNTPs, 5 μl 10X Pfu-Polymerase-Reaktionspuffer (Stratagene) und 1 μl jeweils der ersten zwei PCR-Produkte. Ein gleiches Volumen an Mineralöl wurde zugesetzt und die Reaktion für 1 Minute auf 94°C erwärmt. Pfu-Polymerase (2,5 Einheiten, Stratagene) wurde zugesetzt, gefolgt von 5 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 2 Minuten. Die Temperatur wurde wieder auf 94°C gebracht und 2 μl jeweils von 20 mM Stammlösungen von ZC15,516 (SEQ ID Nr. 51), einem 5'-Primer, beginnend am Nukleotid 1 der SEQ ID Nr. 45, und ZC15,347 (SEQ ID Nr. 47) wurden zugesetzt, gefolgt von 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 2 Minuten und einer letztendlichen 7-minütigen Verlängerung bei 72°C. Ein Teil der Reaktion wurde unter Anwendung der Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Eine Bande von 789 bp, entsprechend der vorhergesagten Größe, wurde detektiert.
TACI-Fc4- und BCMA-Fc4-Expressionsvektor-Konstruktion
Expressionsplasmide, enthaltend TACI-Fc4 und BCMA-Fc4 als Fusionsproteine, wurden über homologe Rekombination in Hefe konstruiert. Ein Fragment der TACI-cDNS wurde isoliert unter Anwendung der PCR, das die Polynukleotidsequenz von Nukleotid 15 bis Nukleotid 475 der SEQ ID Nr. 5 enthielt. Die in der Produktion des TACI-Fragments genutzten Primer waren: (1) ein Primer, enthaltend 40 Basenpaare der 5'-Vektor flankierenden Sequenz und 17 Basenpaare, entsprechend dem Aminoterminus des TACI-Fragments (SEQ ID Nr. 52); (2) 40 Basenpaare des 3'-Endes, entsprechend der flankierenden Fc4-Sequenz, und 17 Basenpaare, entsprechend dem Carboxyterminus des TACI-Fragments (SEQ ID Nr. 53). Zu einem Endvolumen von 100 μl wurden zugesetzt 10 ng TACI-Template, 10 μl 10X Taq-Polymerase-Reaktionspuffer (Perkin Elmer), 8 μl 2,5 nM dNTPs, 78 μl dH₂O, 2 μl jeweils von 20 mM Stammlösungen der Oligonukleotidprimer der SEQ ID Nr. 52 und SEQ ID Nr. 53 und Taq Polymerase (2,5 Einheiten, Life Technology). Ein gleiches Volumen an Mineralöl wurde zugesetzt und die Reaktion 2 Minuten lang auf 94°C erwärmt, gefolgt von 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 65°C für 30 Sekunden, 65°C für 30 Sekunden, 72°C für 1 Minute, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72°C.
Ein Fragment der BCMA-cDNS wurde unter Anwendung der PCR isoliert, das die Polynukleotidsequenz vom Nukleotid 219 bis Nukleotid 362 der SEQ ID Nr. 7 enthält. Die zwei in der Produktion des BCMA-Fragments genutzten Primer waren ein Oligonukleotidprimer, enthaltend 40 Basenpaare der 5'-Vektor flankierenden Sequenz und 17 Basenpaare, entsprechend dem Aminoterminus des BCMA-Fragments (SEQ ID Nr. 54), und ein Oligonukleotidprimer, enthaltend 40 Basenpaare der des 3'-Endes, entsprechend der flankierenden Fc4-Sequenz, und 17 Basenpaare, entsprechend dem Carboxyterminus des BCMA-Fragments (SEQ ID Nr. 55). Auf ein 100 μl Endvolumen wurden zugegeben: 10 ng BCMA-Template, 10 μl 10X Taq-Polymerasereaktionspuffer (Perkin Elmer), 8 μl 2,5 mM dNTPs, 78 μl H₂O, 2 μl jeweils von 20 mM Stammlösungen der Oligonukleotidprimer der SEQ ID Nr. 54 und SEQ ID Nr. 55. Ein gleiches Volumen an Mineralöl wurde zugesetzt und die Reaktion zwei Minuten lang auf 94°C erwärmt, gefolgt von 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 65°C für 30 Sekunden, 72°C für 1 Minute, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72°C.
Das Fragment, enthaltend die cDNS, kodierend das Fc4-Fragment, wurde auf vergleichbare Weise konstruiert, je eines für die TACI- und BCMA-Fusionskonstrukte. Für TACI handelte es sich bei den zwei in der Produktion des Fc4-Fragments genutzten Primern (upstream und downstream) um einen Oligonukleotidprimer, enthaltend 40 Basenpaare der 5' TACI flankierenden Sequenz und 17 Basenpaare, entsprechend dem Aminoterminus des Fc4-Fragments (SEQ ID Nr. 56), und einen Oligonukleotidprimer, enthaltend 40 Basenpaare des 3'-Endes, entsprechend der flankierenden Vektorsequenz, und 17 Basenpaare, entsprechend dem Carboxyterminus des Fc4-Fragments (SEQ ID Nr. 57). Für BCMA handelte es sich bei dem upstream-Primer in der Produktion des Fc4-Fragments um einen Oligonukleotidprimer, enthaltend 40 Basenpaare der 5'-BCMA flankierenden Sequenz und 17 Basenpaare, entsprechend dem Aminosäureterminus des Fc4-Fragments (SEQ ID Nr. 58). Die downstream-Primer für das Fc4 für das BCMA-Konstrukt war derselbe, wie derjenige, der oben für TACI-Fc4 beschrieben wurde (SEQ ID Nr. 57).
Auf ein 100 μl Endvolumen wurden zugesetzt 10 ng Fc4-Template, wie oben beschrieben, 10 μl 10X Taq-Polymerasereaktionspuffer (Perkin Elmer), 8 μl 2,5 nM dNTPs, 78 μl dH₂O, 2 μl jeweils von 20 mM Stammlösungen der Oligonukleotide der SEQ ID Nr. 56 und SEQ ID Nr. 57 für TACI und der Oligonukleotide der SEQ ID Nr. 58 und SEQ ID Nr. 57 für BCMA und Taq-Polymerase (2,5 Einheiten, Life Technology). Ein gleiches Volumen an Mineralöl wurde zugesetzt und die Reaktion 2 Minuten lang auf 94°C erwärmt, anschließend 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 65°C für 30 Sekunden, 72°C für 1 Minute, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72°C.
10 Mikroliter jeder der oben beschriebenen PCR-Reaktionen ließ man auf einem 0,8 %-igen LMP-Agarosegel (Seaplaque GTG) mit 1 × TBE-Puffer für Analysezwecke laufen. Die verbleibenden 90 μl jeder PCR-Reaktion wurden mit Zusatz von 5 μl 1 M NaCl und 250 μl absolutem Ethanol ausgefällt. Das Plasmid pZMP6 wurde mit SmaI zur Linearisierung am Polylinker geschnitten. Das Plasmid pZMP6 war abgeleitet vom Plasmid pCZR199 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC Nr. 98668); und es handelt sich um einen Säugerexpressionsvektor, enthaltend eine Expressionskassette mit dem unmittelbaren frühen Promoter des CMV, einem Konsensusintron aus dem variablen Bereich des Immunglobulin-Schweren-Ketten-Locus der Maus, multiplen Restriktionsstellen für die Insertion von kodierenden Sequenzen, einem Stopcodon und einem menschlichen Wachstumshormonterminator. Das Plasmid weist auch einen Replikationsursprung aus E. coli auf, eine Expressionseinheit eines selektierbaren Säugermarkers mit einem SV40-Promoter, Enhancer und Replikaitonsursprung, ein DHFR-Gen und den SV40-Terminator. Der Vektor pZMP6 wurde aus pCZR199 durch Ersetzen des Metallothionin-Promoters durch den CMV unmittelbaren frühen Promoter und der Kozac-Sequenzen am 5'-Ende des offenen Leserahmens konstruiert.
100 μl kompetenter Hefezellen (S. cerevisiae) wurden mit 10 μl vereinigt, enthaltend jeweils etwa 1 μg der TACI- oder BCMA-extrazellulären Domäne und des Fc4-PCR-Fragments, angemessen für die Rekombination mit jedem dieser, und 100 ng des mit SmaI angdauten pZMP6-Vektors, und in eine Elektroporationsküvette von 0,2 cm transferiert. Die Hefe-DNS-Mischungen wurden mit 0,75 kV (5 kV/cm), ∞ Ohm, 25 μF elektropulsiert. Jeder Küvette wurden 600 μl 1,2 M Sorbit zugesetzt und die Hefen in zwei 300 μl Aliquots auf URA-D-Platten ausplattiert und bei 30°C inkubiert.
Nach etwa 48 Stunden wurden die Ura+-Hefetransformanten aus einer einzelnen Platte in 1 ml H₂O resuspendiert und kurz zentrifugiert, um die Hefezellen zu pelletisieren. Die Zellpellets wurden in 1 ml Lysepuffer resuspendiert (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 Mikroliter der Lysemischung wurden in ein Eppendorfhütchen gegeben, enthaltend 300 μl an mit Säure gewaschenen Glaskügelchen und 200 μl Phenol-Chloroform, zwei- oder dreimal für 1-Minuten-Intervalle verwirbelt, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge bei maximaler Geschwindikeit. 300 μl der wässrigen Phase wurden in ein frisches Röhrchen transferiert und die DNS mit 600 μl Ethanol (EtOH) ausgefällt, gefolgt von Zentrifugation für 10 Minuten bei 4°C. Das DNS-Pellet wurde in 100 μl H₂O resuspendiert.
Die Transformation elektrokompetenter E. coli-Zellen (DH10B, GibcoBRL) erfolgte mit 0,5–2 ml Hefe-DNS-Präparation und 40 μl DH10B-Zellen. Die Zellen wurden bei 2,0 kV, 25 mF und 400 Ohm elektrogepulst. Nach der Elektroporation wurden 1 ml SOC (2% Bacto Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5% Hefeextrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glukose) in 250 μl Aliquots auf vier LB AMP-Platten ausplattiert (LB-Brühe (Lennox), 1,8% Bacto-Agar (Difco), 100 mg/L Ampicillin).
Einzelne Klone, die das richtige Expressionskonstrukt für TACI-Fc4 oder BCMA-Fc4 tragen, wurden mittels Restriktionsverdauung identifiziert, um die Anwesenheit des Inserts zu verifizieren und zu bestätigen, dass die verschiedenen DNS-Sequenzen richtig aneinander gebunden waren. Die Inserts positiver Klone wurden der Sequenzanalyse unterworfen. Plasmid-DNS im größeren Maßstab wird unter Anwendung des Qiagen Maxi-Kits (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers isoliert.
Beispiel 7
Säuegerexpression von TACI-Fc4 und BCMA-Fc4
BHK 570-Zellen (ATCC Nr. CRL-10314) wurden in 10 cm Gewebskulturschalen ausplattiert und man ließ diese auf etwa 50 bis 70% Konfluenz über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ in DMEM/FBS-Medium wachsen (DMEM, GibcoBRL High Glucose (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% fötales Rinderserum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM 1-Glutamin (JRH Biosciences, Len exa, KS), 1 mM Natriumpyruvat (Gibco BRL)). Die Zellen wurden anschließend entweder mit dem Plasmid TACI-Fc4/pZMP6 oder BCMA-Fc4/pZMP6 unter Anwendung von Lipofectamin^TM (Gibco BRL) in serumfreien (SF) Medienformulierungen transfiziert (DMEM, 10 mg/ml Transferrin, 5 mg/ml Insulin, 2 mg/ml Fetuin, 1% L-Glutamin und 1% Natriumpyruvat). TACI-Fv4/pZMP6 oder BCMA/Fc4/pZMP6 wurde in 15 ml Röhrchen auf ein Gesamtendvolumen von 640 μl mit SF-Medium verdünnt. 35 μl Lipofectamin^TM (Gibco BRL) wurden mit 605 μl SF-Medium gemischt. Der Lipofectamin^TM-Mix wurde dem DNS-Mix zugesetzt, und man ließ etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 5 ml SF-Medien wurden der DNS:Lipofectamin^TM-Mischung zugesetzt. Die Zellen wurden einmal mit 5 ml SF-Medium gespült, abgesaugt und die DNS:Lipofectamin^TM-Mischung zugesetzt. Die Zellen wurden für 5 Stunden bei 37°C inkubiert, dann setzte man jeder Platte 6,4 ml DMEM/10% FBS, 1% PSN-Medium zu. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und die DNS:Lipofectamin^TM-Mischung durch frisches 5% FBS/DMEM-Medium am nächsten Tag ersetzt. Am Tag 5 nach der Transfektion wurden die Zellen auf T-162-Flaschen in Selektionsmedium aufgeteilt (DMEM/5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr). Etwa 10 Tage nach Transfektion wurden zwei 150 mm Kulturplatten Methotrexat-resistenter Kolonien aus jeder Transfektion trypsiniert und die Zellen vereinigt und in eine T-162-Flasche ausplatiert und in Kulturen im großen Maßstab überführt.
Beispiel 9
Transegne Expression von ztnf4
Transgene Tiere, exprimierend ztnf4-Gene, wurden hergestellt unter Anwendung von erwachsenen, fruchtbaren Männchen (B6C3f1), vorpupertären fruchtbaren Weibchen (B6C3f1), der Vasektomie unterworfenen Männchen (B6D2f1) und erwachsenen fruchtbaren Weibchen (B6D2f1) (alle von Taconic Farms, Germantown, NY). Die vorpupertären fruchtbaren Weibchen wurden unter Anwendung von Gonadotropin aus dem Serum schwangerer Pferde (Sigma, St. Louis, MO) und von humanem Choriogonadotropin (hCG (Sigma)) superovuliert. Die superovulierten Weibchen wurden anschließend mit erwachsenen, fruchtbaren Männchen gepaart und die Kopulation durch die Anwesenheit vaginaler Pfropfen bestätigt.
Befruchtete Eier wurden unter einem chirurgischen Mikroskop (Leica MZ12 Stereomikroskop, Leica, Wetzlar, Deutschland) gesammelt. Die Eier wurden dann in Hyaluronidase und Whittens W640-Medium gewaschen (Tabelle 8; alle Reagenzien von Sigma Chemical Co. erhältlich), das mit 5% CO₂, 5% O₂ und 90% N₂ bei 37°C inkubiert worden war. Die Eier wurden bis zur Mikroinjektion in einem Inkubator bei 37°C/5% CO₂ gelagert.
Tabelle 8 WHITTENs 640-Medium
Der offene Leserahmen von 858 pb, kodierend in voller Länge den menschlichen TACI-Liganden Blys (SEQ ID Nr. 35), wurde mittels PCR so amplifiziert, um ein optimiertes Initiationscodon und flankierende 5'-PmeI und 3'-AscI-Stellen einzuführen, und zwar unter Anwendung der Oligonukleotidprimer der SEQ ID Nr. 36 und SEQ ID Nr. 37. Dieses PmeI/AscI-Fragment wurde in pKFO24 subkloniert, einem B- und/oder T-Zell-beschränkten transgenen Vektor, enthaltend den Ig Em-Enhancer (690 bp NotI/XbaI aus pEmSr; (Bodrug et al., EMBO J. 13: 2124–30, 1994)), den Ig V_h-Promoter (536 bp HincII/XhoI-Fragment aus pJH1X(–); Hu et al., J. Exp. Med. 177: 1681–90, 1993), das SV40 16S-Intron (171 bp XhoI/HindIII-Fragment aus pEmSR), einen PmeI/AscI-Polylinker und das Polyadenylierungssignal des menschlichen Wachstumshormongens (627 bp SmaI/EcoRI-Fragment; Seeburg, DNA 1: 239–49, 1982). Das transgene Insert wurde mittels NotI-Verdauung und Agarosegelreinigung aus dem Plasmidskelett getrennt und befruchtete Eier aus Paarungen der oben beschriebenen B6C3F1Tac-Mäuse wurden mikroinjiziert und in pseudoschwangere Weibchen im Wesentlichen wie zuvor beschrieben implantiert (Malik et al., Molec. Cell. Biol. 15: 2349–58, 1995).
Die Empfänger wurden in Paaren in Käfige zurückgesetzt und man gestattete 19–21 Tage Schwangerschaft. Nach der Geburt gestattete man eine Zeitspanne von 19–21 Tagen vor der Geschlechtsbestimmung und Entwöhnung und eine 0,5 cm Biopsie (verwendet für die Genotypisierung) wurde am Schwanz mit einer sauberen Schere abgeschnitten.
Genomische DNS wurde aus den Schwanzschnitten unter Anwendung eines im Handel erhältlichen Kits hergestellt (DNeasy 96 Tissue Kit; Qiagen, Valencia, CA), und zwar gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die genomische DNS wurde mittels PCR analysiert und zwar unter Anwendung von Primern designed für den menschlichen Wachstumshormon (hGH) 3'-UTR-Teil des transgenen Vektors. Die Primer ZC17251 (SEQ ID Nr. 38) und ZC17252 (SEQ ID Nr. 39) amplifizieren ein Fragment von 368 Basenpaaren von hGH. Die Verwendung eines Bereichs, einzigartig für die menschliche Sequenz (identifiziert aus einem Alignment der 3'-UTR-DNS-Sequenzen des menschlichen und murinen Wachstumshormons) stellte sicher, dass die PCR-Reaktion nicht die Maussequenz amplifizierte. Zusätzlich können die Primer ZC 17156 (SEQ ID Nr. 40) und ZC17157 (SEQ ID Nr. 41), die an Vektorsequenzen hybridisieren und das cDNS-Insert amplifizieren, zusammen mit den hGH-Primern genutzt werden. In diesen Experimenten erzeugte DNS aus Tieren, die positiv auf das Transgen waren, zwei Banden, eine Bande von 368 Basenpaaren, entsprechend den hGH 3'-UTR-Fragment, und eine Bande variabler Größe, entsprechend dem cDNS-Insert.
Sobald bestätigt war, dass die Tiere transgen (TG) waren, wurden sie in einen nativen Stamm zurückgekreuzt, indem man ein TG-Weibchen mit einem männlichen Wildtyp oder ein TG-Männchen mit ein oder zwei Wildtyp-Weibchen zusammenbrachte. Nach Geburt und Entwöhnung der Nachkommen wurden die Geschlechter getrennt und ihre Schwänze zum Genotypisieren abgeschnitten.
Um die Expression eines Transgens in einem lebenden Tier zu überprüfen, wurde eine Überlebensbiopsie durchgeführt. Die Analyse der mRNS-Expressionslevel jedes Transgens erfolgte unter Anwendung eines RNS-Lösungs-Hybridisierungstests oder der Real-Time-PCR auf einem ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), und zwar gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Zellpräparation und Flowcytometrie
Gründermäuse wurden in verschiedenen Altersstufen analysiert. Für die Flowcytometrie-Analyse (FACS) von Lymphoidgeweben wurden Knochenmarkszellen (BM-Zellen = bone marrow cells) aus Femuren und Tibien mittels vorsichtigem Aufbrechen in Phosphat-gepuffertem Kochsalz (PBS) unter Anwendung eines Mörsers und Stempels isoliert. Die Zellen wurden resuspendiert, mittles passiver Sedimentation von Knochenfragmenten befreit und bei 1000 × g pelletisiert. Splenocyten, Thymocyten oder Lymphknotenzellen wurden durch Zerquetschen von intakten Geweben zwischen Glasplatten, anschließendes Resuspendieren und Pelletisieren der Zellen wie für BM erhalten. Die Zellen wurden in FACS-Waschpuffer (FACS WB) (Hank's balanced salt solution, 1% BSA, 10 mM Hepes, pH 7,4) in einer Konzentration von 20 × 10⁶ Zellen/ml vor dem Färben resuspendiert. Zum Färben wurden 1 × 10⁶ Zellen in 5 ml Röhrchen transferiert und mit 1 ml FACS WB gewaschen, anschließend bei 1000 × g pelletisiert. Die Zellen wurden anschließend auf Eis für 20 Minuten in Anwesenheit sättigender Mengen der geeigneten an FITC-, PE- und/oder Dreifarbig (TriColor (TC))-konjugierten mAbs in einem Gesamtvolumen von 100 ml in FACS WB inkubiert. Die Zellen wurden mit 1,5 ml WB gewaschen, pelletisiert, anschließend in 400 ml WB resuspendiert und auf einem FACSCalibur Flowcytometer unter Anwendung der CellQuest-Software (Becton Dickinson, Mountain View, CA) analysiert. Detektoren für Vorwärts (FSC) und seitliche Lichtbrechung (SSC) wurden auf lineare Skala gesetzt, wogegen logarithmische Detektoren für alle drei Fluoreszenzkanäle (FL-1, FL-2 und FL-3) genutzt wurden.
Die Kompensation für die spektrale Überlappung zwischen den FL-Kanälen erfolgte für jedes Experiment unter Anwendung mit nur einer Farbe gefärbter Zellpopulationen. Alle Zellen wurden ohne Gates (Ausschlußgrenzen) auf Diskette gesammelt und die Daten unter Anwendung der CellQuest-Software analysiert. RBC (red blood cells = rote Blutkörperchen) und tote Zellen wurden mittels elektronischer Ausschlußdaten auf Basis der FSC gegenüber der SSC-Profile ausgeschlossen.
Antikörper
Ein mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) konjugierter monoklonaler Anti-CD8-Antikörper (mAb) (Klon 53-6.7) und ein Phycoerthyrin (PE) konjugierter anti-CD4-Antikörper (Klon RM4-5), ein anti-CDS-Antikörper (Klon 53-7.3), ein anti-CD19-Antikörper (Klon 1D3) und ein anti-Syndecan-Antikörper (Klon 281-2) (mAbs) wurden von PharMingen (San Diego, CA) bezogen. Der dreifarbig (TriColor (TC)) konjugierte monoklonale anti-CD45R/B220-mAb (Klon RA3-6B2) wurde von Caltag bezogen.
Transgene Mäuse, die ztnf4 in den Lymphoidkompartimenten überexprimieren, entwickeln eine gesteigerte Anzahl an peripheren B-Zellen, erhöhte Plasmazellen und erhöhte Level an Serumimmunoglobulin. Diese transgenen Tiere weisen erhöhte Anzahlen von B200+-Zellen in der Milz, den Lymphknoten und im Thymus auf. Die gesteigerte Anzahl an Milz-B-Zellen umfasst sowohl herkömmliche B-2-Zellen als auch die normalerweise seltene Population an B-1-Zellen. Im Allgemeinen sind B-1-Zellen weitgehend auf den Peritonealraum und andere Körperhöhlungen beschränkt, erzeugen gering affine selbst-reaktive Antikörper und sind oft mit der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodis SLE assoziiert worden.
Ältere transgene Tiere erzeugen Autoantikörper, entwickeln eine Proteinurie und sklerotische Glomeruli, die Eigenschaften des systemischen Lupus erythematodis.
5A zeigt Suspensionen einzelner Zellen aus der Milz (obere Tafel), mesenterischen Lymphknoten (mittlere Tafel) und Knochenmark (untere Tafel), hergestellt wie unten beschrieben, gefärbt mit anti-B220-TC und analysiert mittels Flowcytometrie. Die Anzahl der B220+-Zellen in jedem Gewebe wurde berechnet, indem man den Prozentsatz an B220+-Zellen mit der Gesamtzahl der lebenden Zellen (Tryptophanblau-Ausschluß) multiplizierte, gezählt auf einem Hämocytometer. Jeder Balken repräsentiert Daten aus einzelnen ztnf4-transgenen (Tg, schattierte Balken) oder nicht transgenen Wurfgenossen als Kontrollmäusen (offenen Balken).
5B zeigt Zellen, isoliert aus ztnf4-TG (rechte Tafel) oder nicht-TG aus demselben Wurf (linke Tafel) für Lymphknoten (obere Zeile), Milz (mittlere Zeile) und Thymus (untere Zeile), gefärbt mit mAbs gegen die angegebenen Moleküle (CDS, CD4 und CD8) und anschließend analysiert mittels Flowcytometrie. Die gezeigten Daten wurden mit Ausschlußgrenzen versehen, um tote Zellen und RBCs auszuschließen.
5C zeigt die Gesamtlevel von IgG, IgM und IgE in Serum aus ztnf4-transgenen Mäusen im Alter von 6 bis 23 Wochen.
5D zeigt die Amyloidabscheidung und das verdickte Mesangium der Glomeruli, die in H&E-gefärbten Nierenschnitten aus ztnf4-transgenen Mäusen identifiziert wurden, im Vergleich zu normalen Glomeruli aus Wurfgenossen als Kontrolle.
5E zeigt einen Anstieg hinsichtlich der Effektor-T-Zellen in ztnf4-transgenen Mäusen, vergleichbar demjenigen, der von Mackay et al. berichtet wurde (J. Exp. Med. 190: 1697–1710, 1999).
Lösliche TACI (BR43x2)- oder BCMA-Ig-Fusionen werden in ztnf4 überexprimierende transgene Tiere injiziert (IP, IM oder IV). Die Durchflußcytometrieanalyse (FACS) der Lymphoidgewebe wird zum Identifizieren jeglicher Änderungen hinsichtlich der Anzahl der B220+-B-Zellen in Milz, Lymphknoten und Thymus genutzt.
Beispiel 10
Direkter Bindungs-ELISA
Ein direkter Bindungs-ELISA wurde entwickelt, um die Fähigkeit von entweder löslichem TACI-Ig oder löslichem BCMA-Ig zu charakterisieren, zu binden und die biologische Aktivität von ztnf4 in vitro zu inhibieren.
Eine Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit 1 μg/ml anti-human-Ig der Ziege (Jackson Labs, Bar Harbor, MA) in ELISA A-Puffer (0,1 M Na₂HCO₃, pH 9,6, 0,02% NaN₃) beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. TACI, BCMA und ein nicht verwandter TNF-Rezeptor wie ztnfr10 (SEQ ID Nr. 42) als Kontrolle wurden von 10 μg/ml durch 5-fache Verdünnungen auf 320 nm/ml plus eine 0 titriert und co-inkubiert mit 2,5, 0,5 oder 0,1 μg/ml biotinyliertem ztnf4 oder Ovalbumin als negative Kontrolle und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die co-inkubierte Mischung aus Rezeptor/biotinyliertem Liganden wurde anschließend zugesetzt zu den mit dem anti-human-Ig aus Ziege beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen. Die Platten wurden dann gewaschen (ELISA C, 500 μl Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 200 mg NaN₃, PBS auf ein Endvolumen von 1 Liter) und mit Superblock (Pierce, Rockford, IL) blockiert. Die Platten wurden anschließend 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
Die Platten werden wiederum mit ELISA C gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 100 μl/Vertiefung an Neutr-Avidin-HRP bei 1 : 10.000 in ELISA B (5 oder 10 μg BSA (Sigma) für 1% bzw. 2% BSA, 250 μl Tween 20 (Sigma), 100 mg NaN₃, Phosphat-gepuffertes Kochsalz, pH 7,2 (PBS, Sigma) auf ein Endvolumen von 500 ml. Alternativ kann der Puffer zu 1% oder 2% BSA in ELISA C-Puffer formuliert werden). Die Platten werden anschließend 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit OPD entwickelt und bei 492 abgelesen.
Beispiel 11
Test auf biologische Aktivität
Ein Test auf biologische Aktivität wurde entwickelt, um die Inhibition humaner B-Zellen durch lösliches TACI-FC bezüglich der Stimulation durch lösliches ztnf4 zu messen. B-Zellen wurden isoliert aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNC) unter Anwendung von CD19-Magnetkügelchen und des Magnettrennsystems VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) gemäß den Anweisungen des Hersteller. Gereinigte B-Zellen wurden mit löslichem ztnf4 (25 ng/ml) und rekombinantem menschlichen IL-4 (10 ng/ml, Pharmingen) gemischt und (3-fach) auf Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen bei 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung ausplattiert. Lösliches TACI-FC wurde von 5 μg/ml auf 6 ng/ml verdünnt und mit den B-Zellen für 5 Tage inkubiert, wobei über Nacht an Tag 4 mit 1 μCi ³H-Thymidin (Amersham) pro Vertiefung gepulst wurde. Als Kontrolle wurde lösliches TACI-FC auch mit B-Zellen und IL-4 ohne ztnf4 inkubiert.
Die Platten wurden unter Anwendung des Packard-Plattenernters geerntet und unter Anwendung des Packard-Ablesegerätes gezählt. Der TACI-Ig-lösliche Rezeptor inhibierte die Fähigkeit von löslichem ztnf4, die B-Zell-Proliferation in vitro zu stimulieren, und zwar in dosisabhängiger Weise. Ein 10-facher molarer Überschuß von TACI-Ig inhibierte die Proliferation menschlicher B-Zellen in Antwort auf lösliches ztnf4 in Anwesenheit von IL-4 vollständig.
Beispiel 12
ORIGIN-Test (Ursprungstest)
Die Level an ztnf4 in Individuen mit einem Erkrankungszustand (wie SLE, der rheumatoiden Arthritis beispielsweise) bezogen auf normale Individuen wurden unter Anwendung eines Elektrochemolumineszenztests ermittelt. Eine Standardkurve, hergestellt aus löslichem menschlichem ztnf4 mit 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml und 0 ng/ml, wurde in ORIGIN-Puffer hergestellt (Igen, Gaithersburg, MD). Serumproben wurden in ORIGIN-Puffer verdünnt. Die Standards und die Proben wurden bei Raumtemperatur für 2 Stunden mit biotinyliertem anti-Human-ztnf4-NF-BV-Antikörper aus Kaninchen, verdünnt auf 1 μg/ml in ORIGIN-Testpuffer (IGEN), und ruthenyliertem polychlonalen anti-Human-ztnf4-NF-BV-Antikörper aus Kaninchen, verdünnt auf 1 μg/ml in ORIGIN-Testpuffer (IGEN), inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben verwirft und 0,4 mg/ml Streptavidin-Dynabeads (Dynal, Oslo, Norwegen) zu jedem der Standards und Proben in einer Menge von 50 μl/Röhrchen zugesetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden anschließend verwirbelt und auf einem ORIGIN-Analysegerät (IGEN) gemäß den Anweisungen des Herstellers abgelesen. Der Origin-Test basiert auf der Elektrochemolumineszenz und erzeugt eine Ablesung in ECL – was ist dies, wie funktioniert es und was gibt dies dir an.
Ein erhöhter Level an ztnf4 wurde in den Serumproben sowohl von NZBWF1/J- als auch MRL/Mpj-Fas^1pr-Mäusen detektiert, die in die fortgeschrittenen Stadien der Glomerulonephritis und Autoimmunerkrankung fortgeschritten waren.
Beispiel 13
Lösliches TACI-Ig in einem spontanen Modell des SLE
NZBW-Mäuse werden im Alter von etwa 7 bis 9 Monaten symptomatisch für einen spontanen SLE. TACI-Fc wurde an NZBW-Mäuse verabreicht, um dessen suppressive Wirkung auf B-Zellen über die Zeitspanne von 5 Wochen zu beobachten, wenn angenommen wird, dass sich im Mittel die B-Zell-Autoantikörperproduktion in NZBW-Mäusen auf hohem Niveau befindet.
100 8 Wochen alte Weibchen (NZB × NZW) F₁-Mäuse (Jackson Labs) wurden in 6 Gruppen zu je 15 Mäusen eingeteilt. Vor der Behandlung wurden die Mäuse einmal pro Monat auf Urin-Proteine überwacht und Blut wurde für CBC und die Serumspeicherung entnommen. Serum wird auf die Anwesenheit von Autoantikörpern gesichtet. Da die Proteinurie ein Stempelzeichen der Glomerulonephritis ist, wurden die Urinproteinlevel mittels Tauchstift in regelmäßigen Intervallen über den Verlauf der Studie hinweg beobachtet. Vor der Behandlung wurden die Tiere gewogen. Die Dosierung begann, wenn die Mäuse etwa 5 Monate alt waren. Die Mäuse erhielten intraperitoneale Injektionen von nur Träger (PBS) oder menschlichem IgG-FC (Kontrollprotein) oder TACI-Fc4 (Testprotein) dreimal pro Woche für 5 Wochen.
Blut wurde zweimal während der Dosierung gesammelt und wird mindestens zweimal nach der Dosierung gesammelt werden. Urintauchstiftwerte auf Proteinurie und Körpergewichte wurden nach Beginn des Dosierens alle zwei Wochen gemessen. Blut, Urin, Tauchstiftwerte und Körpergewicht wurden zum Zeitpunkt der Euthanasie gesammelt. Das Gewicht von Milz, Thymus, Leber mit Gallenblase, linker Niere und Hirn wurden aufgenommen. Die Milz und der Thymus wurden für die FACS-Analyse und Histologie aufgeteilt. Die submandibulären Speicheldrüsen, mesenterischen Lymphknotenketten, der Leberlobus mit Gallenblase, Cecum und Dickdarm, Magen, Dünndarm, Pankreas, rechte Niere, Nebenniere, Zunge mit Trachea und Ösophagus, Herz und Lungen werden ebenfalls für die Histologie gesammelt.
6 zeigt einen erhöhten Level an ztnf4 im Serum von NZBWF1 und MRL/1pr/1pr-Mäusen, der mit der Entwicklung von SLE korreliert. 6A, obere Tafel, zeigt die Korrelation der ztnf4-Serumlevel mit dem Alter, 68 NZBWF1-Mäuse im Alter von 10 bis 40 Wochen und 10 bzw. 30 Wochen alte NZB/B-Kontrollmäuse. Die mittlere Tafel zeigt die Korrelation mit der Proteinurie in drei Bereichen, Spuren bis 20 mg/dl (T-30), 100–300 ng/dl und 2000 mg/dl in NZBWF1-Mäusen, im Vergleich zur Kontrolle NZB/B-Mäusen. Die untere Tafel zeigt ztnf4-Level mit verschiedenen Titern von anti-dsDNS-Antikörper in NZBWF1-Mäusen im Vergleich zu NZB/B-Mäusen als Kontrolle.
6B zeigt dieselben Korrelationen an 23 MRL/1pr/1pr-Mäusen im Alter von 18–24 Wochen und zehn 11 Wochen alten MRL/MpJ-Mäusen als Kontrolle.
7 zeigt die Ergebnisse der Urinanalyse. Es wurde angenommen, dass Mäuse Proteinurie haben, falls die Tauchstiftablesung ≥ 100 mg/dl war (A) PBS, (B) menschlicher IgG-FC, 100 mg, (C) menschlicher IgG-FC, 20 mg, (D) menschlicher TACI-IgG, 100 mg, und (E) menschlicher TACI-IgG, 20 mg. Die mit der löslichen TACI-IgG-Fusion behandelten Mäuse zeigten eine Verringerung der Proteinurie.
Die Analyse des Peripherieblutes aus behandelten Tieren zeigte, dass weiße Blutzellen und Lymphozytenzellzahlen in den TACI-FC-behandelten Mäusen verringert waren (20 und 100 mg), wenn diese mit FC (20 und 100 mg) und mit PBS-behandelten Mäusen zwei Wochen nach Beginn der Behandlung verglichen wurden. Die FAC-Analyse (Lymphozytenausschluß) des peripheren Blutes, entnommen 6 Wochen nach Behandlungsbeginn (2 Wochen, nachdem die letzte Behandlung verabreicht worden war), zeigte eine dramatische Abnahme des Prozentsatzes der B-Zellen, die in den Proben vorhanden waren. B-Zell-Level waren 5 Wochen, nachdem die letzte Behandlung verabreicht worden war, noch immer im Sinken, jedoch nicht so dramatisch. Tabelle 9 stellt die Mittelwerte (und Standardabweichung) für die Mäuse in jeder Behandlungsgruppe dar (Tabelle 9). Die Abnahme des Prozentsatzes von B-Zellen im Peripherieblut wurde auch 2 Wochen in die Behandlung hinein beobachtet.
Tabelle 9
Beispiel 114
Lösliches TACI-Ig in normalen Mäusen
TACI-FC wurde an Balb/C-Mäuse verabreicht, um seine Wirkung auf normale Mäuse zu beobachten. 60 8 Wochen alte weibliche Balb/C-Mäuse (HSD) wurden in 12 Gruppen zu 5 Mäusen eingeteilt. Vor der Behandlung wurden die Mäuse gewogen und Blut für CBC und die Serumlagerung entnommen. Die Gruppen 1-9 erhielten intraperitoneale Injektionen (IP) von nur Träger (PBS) oder menschlichem IgG-FC (Kontrollprotein) oder TACI-FC4 (Testprotein) täglich für 12 Tage und wurden am 14. Tag getötet. Die Gruppen 10 und 11 erhielten IP-Injektionen dreimal pro Woche für zwei Wochen und wurden am Tag 14 getötet.
Blut wurde an den Tagen 7 und 12 gesammelt. Blut und Körpergewicht wurden am Zeitpunkt der Euthanasie gesammelt. Das Gewicht von Milz, Thymus und Hirn wurde aufgenommen. Die Milz und der Thymus wurden für die FACS-Analyse und die Histologie aufgeteilt. Haut, Milz, mesenterische Lymphknotenketten, die submandibulären Speicheldrüsen, Ovar, Uterus, Zervix, Blase, mesenterische Lymphknotenketten, Leberlobus mit Gallenblase, Cecum und Dickdarm, Magen, Dünndarm, Pankreas, rechte Niere, Nebenniere, Zunge mit Trachea und Ösophagus, Herz, Thymus, Oberschenkelmuskel, linker und rechter Femur, Hirn werden ebenfalls für die Histologie gesammelt werden.
Wie oben in Beispiel 13 beschrieben, war eine signifikante Verringerung im Prozentsatz der B-Zellen an Tag 7 (mittels CBC) und 12 (unter Anwendung von FACS) in den peripheren Blutzellen zu sehen, die von allen mit TACI-FC4-behandelten Proben genommen wurden, im Vergleich zu denjenigen, die nur mit FC4 oder PBS behandelt worden waren, und mittels CBC und FACS analysiert. Zusätzlich trat eine nahezu 50%-ige Abnahme der B-Zellen in den Milzen auf, die von Tieren entnommen wurden, die mit TACI-FC behandelt wurden, im Vergleich zu denjenigen aus mit FC4-behandelten Mäusen am Tag 14.
Beispiel 15
Anti-dsDNS-ELISA
Autoimmunität ist durch hohe Level an gegen doppelsträngige DNS gerichteten Antikörpern gekennzeichnet. Um die Level von anti-dsDNS-Antikörpern sowohl in den überexprimierenden ztnf4-transgenen Mäusen als auch den NZBW-Mäusen zu messen, wurde ein ELISA-Test entwickelt. Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Nunc) wrude mit Poly-L-Lysin (Sigma) (20 μl/ml in 0,1 M Tris-Puffer, pH 7,3) mit 75 μg-Vertiefung beschichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden anschließend in dH₂O gewaschen und mit poly dAdT (Sigma) (20 μl/ml in 0,1 M Tris-Puffer, pH 7,3) bei 75 μl/Vertiefung beschichtet und bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert. Die Platten wurden dann mit dH₂O gewaschen und mit 2% BSA (Sigma) in Tris-Puffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Endwaschung in dH₂O.
Serumproben wurden aus den ztnf4-transgenen Mäusen, beschrieben in Beispiel 10, und den NZBW-Mäusen, beschrieben in Beispiel 11, entnommen. Die Serumproben wurden 1 : 50 in 1% BSA/2% BGG (Calbiochem) in Tris-Puffer verdünnt. Die verdünnten Proben wurden anschließend mit 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400, 1 : 800, 1 : 1600, 1 : 3200 und 1 : 6400 (50 μl/Vertiefung) in die beschichtete Platte titriert und für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann in dH₂O gewaschen und ein anti-Maus-IgF-Fc-HRP der Ziege (Cappel), verdünnt auf 1 : 1000 in 1% BSA/2% BGG, mit 50 μl/Vertiefung zugesetzt.
Die Platten wurden für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden fünfmal in dH₂O gewaschen und mit OPD entwickelt, 1 Tablette/10 ml Novo D und ausplattiert in 100 μl/Vertiefung. Der Entwickler wurde mit 1 N H₂SO₄, 100 μl/Vertiefung, gestoppt und die optische Dichte bei 492 nm abgelesen.
8 zeigt die anti-ds-DNS-Level in zwei ztnf4-transgenen Mäusen (23 Wochen alt), zwei nicht transgenen Wurfgenossen, verglichen mit den Leveln, die in Serum von NZBWF1- (32 Wochen alt) und MRL/1pr/1pr-Mäusen (19 Wochen alt) detektiert wurden.
Beispiel 16
Lösliches TACI-Ig in einem spontanen Modell des ELE
25 weibliche PLxSJL-F1-Mäuse (12 Wochen alt, Jackson Labs) erhielten eine subkutane Injektion von 125 μg/Maus an Antigen (Myelinproteolipidprotein, PLP, die Reste 139-151), formuliert in vollständigem Freund's Adjuvans. Die Mäuse werden in fünf Gruppen a fünf Mäuse eingeteilt. Intraperitoneale Injektionen von Pertussis-Toxin (400 ng) werden am Tag 0 und am Tag 2 gegeben. Den Gruppen werden gegeben 1x, 10x oder 100x Dosen an TACI, BCMA oder BR43x2, eine Gruppe erhält nur Träger und eine Gruppe erhält keine Behandlung. Die Präventionstherapie wird am Tag 0 beginnen, die Interventionstherapie am Tag 7 oder mit Beginn der klinischen Anzeichen. Die Erkrankungsanzeichen Gewichtsverlust und Paralyse manifestieren sich in etwa 10–14 Tagen und dauern etwa 1 Woche. Die Tiere werden täglich durch Aufnahme der Körpergewichte und Zuordnen eines klinischen Maßstabs, entsprechend dem Ausmaß ihrer Symptome, bewertet. Klinische Anzeichen der EAE erscheinen innerhalb von 10–14 Tagen nach Inoculation und dauern maximal 1 Woche. Am Ende der Studie werden alle Tiere mittels Gasüberdosis euthanisiert und Necropsin durchgeführt. Das Hirn und das Rückgrat werden für die Histologie gesammelt oder für die mRNS-Analyse eingefroren. Körpergewicht und Daten der klinischen Bewertung werden für Einzelne und in Gruppen aufgedruckt.

Klinische Bewertung:

0	Normal
0,5	schwach, Schwanztonus kann verringert sein, fehlt jedoch nicht
1	tauber Schwanz (kann den Schwanz nicht anheben, wenn die Maus an der Schwanzbasis angehoben wird)
2	tauber Schwanz, schwache Beine (kann den Schwanz nicht anheben, kann aufrecht stehen auf den Hinterbeinen, Beine sind jedoch zittrig)
3	Parese (kann nicht mit den Beinen unter dem Körper sitzen, läuft in Paddelbewegungen mit nachziehenden Beinen)
4	Paralyse (kann die Hinterbeine nicht bewegen, zieht beim Versuch zu laufen die Beine nach)
5	Quadriplegie (Paralyse in Vorderbeinen oder Laufen in Kreismustern, kann den Kopf geneigt haben)
6	Moribund (vollständig paralysiert, kann Nahrungsmittel oder Wasser nicht erreichen, Tier wird getötet)

Beispiel 17
TACI-FC und das CIA-Modell für die rheumatoide Arthritis
8 Wochen alte männliche DBA/1J-Mäuse (Jackson Labs) werden in Gruppen von je fünf Mäusen pro Gruppe eingeteilt und erhalten zwei subkutane Injektionen von 50–100 μl an 1 mg/ml Collagen (Hühnchen oder Rind als Ursprung), in drei Wochen Intervallen. Eine Kontrolle erhält keine Collagen-Injektion. Die erste Injektion wird in vollständigen Freund's Adjuvans formuliert und die zweite Injektion wird in Freund's unvollständigem Adjuvans formuliert. TACI-FC wird prophylaktisch mit oder vor der zweiten Injektion verabreicht oder nachdem das Tier einen klinischen Maßstab von 2 oder darüber entwickelt, der mindestens 24 Stunden anhält. Die Tiere beginnen Symptome der Arthritis nach der zweiten Collagen-Injektion zu zeigen, üblicherweise innerhalb von 2 bis 3 Wochen. Das Ausmaß der Erkrankung wird in jeder Pfote durch Anwendung eines Schiebers zum Messen der Pfotendicke und Zuordnen eines klinischen Maßstabs (0-3) zu jeder Pfote bewertet. Die klinischen Maßstäbe sind: 0 = normal, 1 Zehen) entzündet, 2 milde Pfotenentzündung, 3 moderate Pfotenentzündung und 4 schwere Pfotenentzündung. Die Tiere werden euthanisiert, nachdem die Erkrankung für eine vorgegebene Zeitspanne, üblicherweise 7 Tage, etabliert worden ist. Die Pfoten werden für die Histologie oder mRNS-Analyse gesammelt und Serum wird für Immunglobulin- und Cytokintests gesammelt.
Beispiel 18
Neutralisierung von TACI-Antikörpern
Polyklonale Antipeptid-Antikörper wurden hergestellt, indem man zwei weibliche weiße Neuseeland-Kaninchen mit dem Peptid huztnf4-1 SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID Nr. 59) oder huztnf4-2 SFKRGSALEEKENKELVKET (SEQ ID Nr. 60) immunisierte. Die Peptide wurden unter Anwendung eines Peptidsynthesegeräts von Applied Biosystems Modell 431A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Die Peptide wurden anschließend an das Nacktschneckenhemocyanin (KLH) als Trägerprotein mit Maleimid-Aktivierung konjugiert. Die Kaninchen erhielten eine anfängliche intraperitoneale (ip) Injektion von 200 μg Peptid in vollständigem Freund's Adjuvans, gefolgt von verstärkenden ip Injektionen von 100 μg Peptid in unvollständigem Freund's Adjuvans alle drei Wochen. 7 bis 10 Tage nach der Verabreichung der zweiten verstärkenden Injektion (insgesamt drei Injektionen) ließ man die Tiere bluten und wurde Serum gesammelt. Die Tiere wurden anschließend verstärkt und alle drei Wochen bluten gelassen.
Die für das ztnf4-Peptid spezifischen Kaninchenseren wurden mit Hilfe einer ELISA-Titer-Überprüfung unter Anwendung von 1 μg/ml der Peptide, die zum Herstellen der Antikörper genutzt worden waren (SEQ ID Nr. 59 und 60), als Antikörperziel charakterisiert. Die zwei Kaninchenseren gegen das huzfif4-1-Peptid (SEQ ID Nr. 59) wiesen einen Titer gegen ihr spezifisches Peptid bei einer Verdünnung von 1 : 1E5 (1 : 100000) auf. Die zwei Kaninchenseren gegen das huztnf4-2-Peptid (SEQ ID Nr. 60) wiesen Titer gegen ihr spezifisches Peptid bei einer Verdünnung von 1 : 5E6 auf und gegen rekombinante Proteine voller Länge (N-Terminal mit FLAG-gemarkertes ztnf4, hergestellt in Baculovirus (huztnf4s-NF-Bv) und C-Terminal FLAG-gemarkertes ztnf4, hergestellt in BHK-Zellen) bei einer Verdünnung von 1 : 5E6.
Die ztnf4-Peptid-spezifischen polyklonalen Antikörper wurden affinitätsgereinigt aus dem Kaninchenserum, und zwar unter Anwendung von CNBr-SEPHAROSE 4B-Proteinsäulen (Pharmacia LKB), die unter Anwendung von 10 mg der spezifischen Peptide (SEQ ID der Nummern 59 oder 60) pro Gramm CNBr-SEPHAROSE hergestellt worden waren, gefolgt von 20X Dialyse in PBS über Nacht. Die ztnf4-spezifischen Antikörper wurden mit Hilfe einer ELISA-Titer-Überprüfung unter Anwendung von 1 μg/ml des geeigneten Peptidantigens oder von rekombinantem Protein voller Länge (huztnf4s-NF-Bv) als Antikörperziele charakterisiert. Die untere Nachweisgrenze (lower Limit of detection = LLD) des affinitätsgereinigten anti-huztnf4-1-Antikörpers aus Kaninchen aus seinem spezifischen Antigen (huztnf4-1-Peptid, SEQ ID Nr. 59) ist eine Verdünnung von 5 ng/ml. Die untere Nachweisgrenze (LLD) des affinitätsgereinigten anti-huztnf4-2-Antikörpers auf seinem spezifischen Antigen (huztnf4-2-Peptid, SEQ ID Nr. 60) ist eine Verdünnung von 0,5 ng/ml. Die untere Nachweisgrenze (LLD) des affinitätsgereinigten anti-huztnf4-2-Antikörpers aus Kaninchen auf dem rekombinanten Protein huztnf4s-NF-Bv ist eine Verdünnung von 5 ng/ml.
Monoklonale Antikörper der Maus wurden ebenfalls erzeugt und auf die Inhibition der Inhibition des mit Biotin markierten löslichen ztnf4 selektiert. Keiner der monoklonalen TACI-Antikörper (248.14, 248.23, 248.24 oder 246.3) blockiert die ztnf4-Bindung auf BCMA. Der monoklonale Antikörper 248.23 verringert die Bindung von 10 ng/ml ztnf4-Biotin auf etwa 50%, wenn konditioniertes Medium auf 1 : 243 verdünnt wird, und verringert die Bindung auf etwa 2x in unverdünnten Medien. Der monklonale Antikörper 246.3 verringert die Bindung von 10 ng/ml ztnf4-Biotin auf etwa 50% zwischen Verdünnungen von 1 : 243 und 1 : 181 an konditioniertem Medium und verringert die Bindung um das 5-fache in unverdünnten Medien.
Die Erfindung ist nicht eingeschränkt mit Ausnahme durch die angefügten Ansprüche.
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung eines Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BR43x2 (SEQ ID Nr. 2); b) einem löslichen Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von TACI; c) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BCMA; d) einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 10; e) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 bindet; f) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 4 bindet; g) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 6 bindet; h) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 8 bindet; i) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 10 bindet; k) einem Polypeptid der SEQ ID NR. 4; l) den Aminosäureresten 1-166 der SEQ ID Nr. 6; m) den Aminosäureresten 8-37 der SEQ ID Nr. 8; und n) den Aminosäureresten 1-48 der SEQ ID Nr. 8, bei der Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren der ztnf4-Aktivität in einem Säuger.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin der Säuger ein Primat ist.
Verwendung eines Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BR43x2 (SEQ ID Nr. 2); b) einem löslichen Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von TACI; c) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BCMA; d) einem Polypeptid, umfassend die Sequenz der SEQ ID Nr. 10; e) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 bindet; f) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 4 bindet; g) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 6 bindet; h) einem Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 8 bindet; i) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 10 bindet; j) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 18 bindet; k) einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 20 bindet; l) einem Polypeptid der SEQ ID NR. 4; m) den Aminosäureresten 1-166 der SEQ ID Nr. 6; n) den Aminosäureresten 8-37 der SEQ ID Nr. 8; und o) den Aminosäureresten 1-48 der SEQ ID Nr. 8, bei der Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren des ztnf4-Eingriffs in den BR43x2-, TACI- oder BCMA-Rezeptor.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1–3, worin die Verbindung ein Fusionsprotein ist, bestehend aus einem ersten Teil und einem zweiten Teil, verbunden über eine Peptidbindung, wobei der erste Teil ein Polypeptid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, umfassend die Sequenz aus SEQ ID Nr. 8; b) einem Polypeptid, umfassend Aminosäurereste 25-58 der SEQ ID Nr. 2; c) einem Polypeptid, umfassend Aminosäurereste 34-66 der SEQ ID Nr. 6; d) einem Polypeptid, umfassend Aminosäurereste 71-104 der SEQ ID Nr. 6; e) einem Polypeptid, umfassend Aminosäurereste 25-104 der SEQ ID Nr. 6; f) einem Polypeptid, umfassend Aminosäurereste 8-37 der SEQ ID Nr. 8; g) einem Polypeptid, umfassend Aminosäurereste 41-88 der SEQ ID Nr. 8; h) einem Polypeptid, umfassend Aminosäurereste 8-88 der SEQ ID Nr. 8; und wobei der zweite Teil ein anderes Polypeptid umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 4, worin der erste Teil zusätzlich ein Polypeptid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) den Aminosäureresten 59-120 der SEQ ID Nr. 2; b) den Aminosäureresten 105-166 der SEQ ID Nr. 6; und c) den Aminosäureresten 89-150 der SEQ ID Nr. 8.
Verwendung gemäß Anspruch 4, worin der erste Teil ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BR43x2 (SEQ ID Nr. 2); b) einem löslichen Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von TACI; und c) einem Polypeptid, umfassend die extrazelluläre Domäne von BCMA.
Verwendung gemäß Anspruch 4, worin der erste Teil ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polypeptid der SEQ ID Nr. 4; b) den Aminosäureresten 1-154 der SEQ ID Nr. 6; und c) den Aminosäureresten 1-48 der SEQ ID Nr. 8.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 4–7, worin der zweite Teil der konstante Bereich einer schweren Kette eines Immunglobulins ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8, worin der konstante Bereich einer schweren Kette eines Immunglobulins ein konstanter Bereich einer schweren Kette eines humanen Immunglobulins ist.
Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der konstante Bereich einer schweren Kette eines humanen Immunglobulins ein konstanter Bereich der schweren Kette eines humanen Immunglobulins vom Typ IgG1 ist.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 8 bis 10, worin das Medikament ein Multimer der Fusionsproteine umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 11, worin das Medikament einen konstanten Bereich einer schweren Kette eines Immunglobulins umfasst, der zwei Domänen des konstanten Bereichs enthält und dem der variable Bereich fehlt.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 1–12, worin das Medikament zur Behandlung von B-Lymphozyten bestimmt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, worin die B-Lymphozyten aktivierte B-Lymphozyten sind.
Verwendung gemäß Anspruch 13, worin die B-Lymphozyten ruhende B-Lymphozyten sind.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 1–15, worin das Medikament zur Inhibition der Antikörperproduktion bestimmt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 16, worin die Antikörperproduktion mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, worin die Autoimmunerkrankung der systemische Lupus Erythematodes, die Myasthenia Gravis, die Multiple Sklerose oder die rheumatoide Arthritis ist.
Verwendung gemäß den Ansprüche 1–18 zur Behandlung von Asthma, Bronchitis, Emphysemen und dem Nierenversagen im Endstadium.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin es sich bei der Nierenerkrankung um die Glomerulonephritis, die Vaskulitis, die Nephritis oder die Pyelonephritis handelt.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 1–20 zur Behandlung von renalen Neoplasmen, multiplen Myelomen, Lymphomen, der leichten Ketten-Neurotherapie oder der Amyloidose.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 1–21 zur Inhibition von Effektor-T-Zellen.
Verwendung gemäß Anspruch 22 zum Abmildern einer Immunantwort.
Verwendung gemäß Anspruch 22, worin die Inhibition zusätzlich eine Immunsuppression umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 24, worin die Immunsuppression mit der Transplantatabstoßung, den Graft-versus-Host-Erkrankungen (GvH-Reaktionen), einer Autoimmunerkrankung oder einer Entzündung assoziiert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, worin die Autoimmunerkrankung der insulinabhängige Diabetes Mellitus oder Morbus Crohn ist.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 1–26 zur Behandlung von Entzündungen.
Verwendung gemäß Anspruch 27, worin die Entzündung mit Gelenkschmerzen, Schwellungen, Anämie oder dem septischen Schock assoziiert ist.
Isoliertes Polynukleotidmolekül, kodierend ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 2.
Isoliertes Polynukleotidmolekül der SEQ ID Nr. 1.
Expressionsvektor, umfassend die folgenden, operativ miteinander verbundenen Elemente: einen Transkriptionspromoter; ein Polynukleotidmolekül gemäß Anspruch 29; und einen Transkriptionsterminator.
Kultivierte Zelle, in die ein Expressionsvektor gemäß Anspruch 31 eingeführt worden ist, wobei die kultivierte Zelle das von dem Polynukleotidmolekül kodierte Polypeptid exprimiert.
Verfahren zum Produzieren eines Polypeptids, umfassend: Kultivieren einer Zelle, in die ein Expressionsvektor gemäß Anspruch 31 eingeführt worden ist; wodurch die Zelle das von dem Polynukleotidmolekül kodierte Polypeptid exprimiert; und Wiedergewinnen des exprimierten Polypeptids.
Isoliertes Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 2.
Polypeptid gemäß Anspruch 34, in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zubereitung, umfassend: a) einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 bindet; b) einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der oder das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 4 bindet; c) einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 6 bindet; d) einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptid der SEQ ID Nr. 8 bindet; e) einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch an ein Polypeptider SEQ ID Nr. 10 bindet; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zubereitung gemäß Anspruch 36, worin der Antikörper oder das Antikörperfragment aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: a) einem polyclonalen Antikörper; b) einem monoclonalen Antikörper der Maus; c) einem aus b) abgeleiteten, humanisierten Antikörper; und d) einem menschlichen monoclonalen Antikörper.
Zubereitung gemäß den Ansprüchen 36 und 37, worin das Antikörperfragment ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus F(ab'), Fab, Fv, scFv.