HU230024B1 - Oldható BR43x2 receptor és felhasználásának módja - Google Patents

Description

Az immunválasz során fellépő ceiiuláns kölcsönhatásokat a sejtfelszíni receptorok különböző családjainak a tagjai sza zák, beleértve a tumor nekrózis faktor receptor {THFR) csak A TNFR család számos integrális membrán glikoprotein re torból áll. amik közül számos, a megfelelő ligandnmával esőnhatásokat (South és mtsai: The Receptor Superfamíly r, Costteulation and

Cosmam Stem Ceös 12, 440-455 (1994)).

Az egyik ilyen receptor a TAGI, transzmembrán aktivátor és CAMLhnterafctor (von Bülow és Bram; Science 228, 138-141 (1997); WO 98/39361 WfPO publikációt A TAGI egy r ránhoz kötött receptor, aminek van egy extracelluláris ami tartalmaz két eiszteinhen gazdag pszeudöősmétlődesi, t és egy eitopiazmaükus domént, ami a CAML-lel (kalcium-modulátor és cikiofílín ligandnm). egy·’ integrális membránfehérjével, ami az Lntracellulárís vezikulumokban található, és az NF-AT aktiválás egy ko~ inducere, ha Jurkat sejtekben túlexpresszáljük. A. TAGI a B~ sejtekhez és a T-sejtek egy alcsoportjához kapcsolódik, von Bülow és Bram leírták, hogy a TAGI líganduma nem ismert (von

z es Bra

197);

publikáció).

A jelen találmány szerinti polípeptidekröL amik lehetnek a. egy izotermája, aminek csak egy cisztemhen gazdag

13x2) van, a TACi-ről, és egy rokon B-sejt fe~ & BCMA-rÓl (Gras és rntsai: Int. Immunot 17, 1093-1106 (1995)1, kiderítették, hogy· kötődnek a TNF Ugandámhoz. a ztn:(4-hez, ami ismert neutrokin α néven (WÖ 98/18921 számú WIPO Publikáció]. BLys néven (Moore és rntsai; Science 285, 260-263 (1999)], BAF.F néven (Sehneider és rntsai; J, Exp. Med. 189, 1747-1756 (1999)], TALL-l néven ]8hu és rntsai: ék Leukoc, Biok 65, 680-683 (1999)) vagy THÁNE néven lyukhopadhay és rntsai: Journal of Bíological Cbemístry 274, 15978-15981 (1999)]. A BR43x2, a TACI és a BCMA mint olyan, jöl használható a ztnf4 aktivitásának a szabályozására, pontosabban a

B-seáek akhválasara.

?a fúziós fehérje alkalmazása emlősökben asztma, t, r könnyű lánc neuropátia, amiloidozís. membrános nefropátia, IgA. nefropátia, Berger betegség, Goodpastnre betegség, fertőzés utáni glomerulonefritisz, mesangioproli ferativ betegség, minimális változása nefrotikus tünet vagy hipushoz kapcsolódó glornerufonefrítisz vagy vaszkulitisz BR43x2, TAGI vagy BCMA receptor-ztnf4 kapcsolódás gátlása útján történő kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, ahol az említett fehérje egy első részből és egy második részből amelyeket egy peptidkőtés tart össze, és ahol az első rész a 6, sz. vencia 25-104 amínosavaiből áll és a második rész egy immunglobulin neUez

A találmány tárgyát képezi továbbá egy izolált pölínnkleotid molekula, amely a 2, sz, szekvenciával rendelkező polipeptidet kódolja.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy olyan izolált poHakleotid molekula, amely az I. sz, szekvenciával rendelkezik.

A találmány tárgya továbbá egy expresszíós vektor, amely az alábbi, működőképesen kapcsolt elemekei tartalmazza: egy- transzkripciős promoter; egy polinukleotid molekula és egy transzkripciós termiBátor,

A találmány tárgya továbbá egy tenyésztett sejt, amelybe egy a találmány szerinti expresszíos vektort viszünk be, amely tenyésztett sejt az említett polinukleotid által kódolt említett polípepddet expreszSzintén a találmány tárgyát képezi egy polipeptid előállítására szolgáló eljárás, amelynek során, az alábbi lépéseket bájtjuk végre: egy olyan sejtet tenyésztünk,, amelybe egy a találmány szerinti expressziós vektort vittünk be, amelynek hatására az említett sejt az említett polínukleotid által kódolt említett po jük az expresszit polipepíideb

Szintén a találmány tárgyát expresszaija, es /érzi egy olyan amely a 2. sz.

indával

A találmány tárgya továbbá egy gyógyászati készítmény, amely egy a 2, sz, szekvenciával vagy a 4. sz. szekvenciává] rendelkező polipeptídhez specifikusan kötődő antitestet vagy antitest-fragmenst tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt

Szintén a találmány tárgyát képezi egy a 2. sz. szekvenciával vagy a 4, sz. szekvenciával rendelkező poiipeptidhez specifikusan kötődő antitest vagy antilest-íragmens alkalmazása emlősökben asztma, bronchilis, emfizéma, végső fázisban lévő veseelégtelenség, renális neoplazmák, többszörös míelőmák, limfőmák» könnyű lánc neuropátia, amíloídőzís, gyulladás, membrános nefropátia, IgA nefropátia, fcterger he»»ség, IgM nefropátia, Goodpasíure betegség, fertőzés utáni glomerulonefritisz, mesa.ngloprolíferaiív betegség, minimális változású nefrotikus tünet vagy lupushoz kapcsolódó másodlagos glomerulonefritísz vagy vaszkuiitisz BR43x2, TACI vagy BCMA reeepfor-ztnf4 kapcsolódás gátlása utján történő kezelésére vagy autoímmun-betegségekkel összefüggő· antitest termelés, vagy effektor T-sejtek BR43x2, TAGI vagy receptor-ztnf4 kapcsolódás inhibíálása utján történő gátlására szoí| gyógyszerkészítmény előállítására, ahol az említett g gába foglalja a graft kilökődéssel, gra.ft-verSus-ho.st betegséggel autoimmun betegséggel vagy gyulladással kapcsolatos immunszup

Szintén a találmány tárgyát képezi egy a 6. sz. szekvenciával vagy a 20; sz. szekvenciával rendelkező polipeptidhez specifikusan kötődő antitest vagy antitest-fragmens alkalmazása emlősökben asztma, bronchitis vagy emSzéma TACI reeeptor~ztn(4 kapcsolódás s történő kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

Az egyik megvalósítási mód szerint az ellenanyagot vagy ei nyag fragmenst az alábbi csoportból választhatjuk ki: aj poliklonálís ellenanyag; bj rágcsáló monoklonálís ellenanyag; ej a bl-ből származó humanizált ellenanyag; és d) humán monoklonálís ellenanyag. Egy ro~ megvalósítási mód szerint az ellenanyag fragmenst az alábbi előválasztjuk. ki: F(áb'), Fíab), Fab\ Fab, Fv, scFv és nhnitnáSs

felismerési egység, Egy másik megváló sitási mód szerint az ** megví tási mód szerint a ztef4 aktivitás az ellenanyag-termeléshez kapcsolódik. Egy rokon megvalósítási mód szerint az ellenanyag-termelés az autoimmun betegséghez kapcsolódik, Egy rokon megvalósítási mód szerint az említett autoimmun betegség a szisztémás lupus erythematosus, súlyos izomgyengeség, szklerózis multiplex vagy reumás arthritis, Egy másik megvalósítási mód szerint a ztnf4 aktivitás asztmához, bronchuiszhez vagy emfízémáboz kt φ*** «φ * φ « * * » φ'* * φ

Φ χ » Φ φφ φφ #

szerint a s ? veseelékteienségbez ka mód szerint a zi rokon megvalósítási mód szerint a vese ritisz, vaszkuliiisz, neírttisz valósítási mód szerint a vesebetegseg a vese , a timiomaknoz, a

isolódik, E^ másik megt szerint a ztní4 aktivitás eifekíor Trokon mesvalősitási mód szerint a ztní4 aktivitás az immunválasz moderálásához kapcsolódik. Egy még további megvalósítási mód szerint az aktivitás ímmunszuppresszióboz kapcsolódik. Egy további megvalósítási mód szerint az immunszuppressziő graft kilökéshez, graft-versus-host betegséghez vagy gyűlmód szerint az *y rokon megvalósítási mód szerint az autoimmun betegség inzulto-függő diabet.es mellhús, vagy Crohn betegség. Egy további megvalósítási mód szerint a ztnf4 aktivitás gyulladáshoz kapcsolódik. Egy rokon megvalósítási mód szerint a gyulladás az izületi fájdalomhoz, duzzadáshoz, anémiához vagy szeptikus sokkhoz kapcsolódik, Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány targya eljárás a szerep-vállalásának gátlására, azzal jellemezve, hogy egy vegyin létből az előzőkben ismertetett módon i mennyiséget

sze a

« * fefe«r« *> fe fe fe * fe fe fe fe » fe fe * fefe ♦ fe φχχ««φφ» ♦ Φ W X «♦*« κ· φ χ* »* *

BR43x2, TACI vagy BCMA receptor-iig£ vált B limföcitákhoz kapcsolódik, 'Egy még további rokon megvalósítási mód szerint a BR43x2, TACI vagy BCMA receptor-ligándnm szerepvállalás pihenő B timfoellákhoz kapcsolódik.

Okon megvalósítási mód szerint a

Cl vas

Egy még tóval;

megvalósítási mód szerint az említett, autoimmun betegség a szisztémás lupus erylhematosís». súlyos izomgyengeség, szklerózis multiplex vagy reumás arthritis, Egy í a

szerepvállalás utolsó

Egy további megvalósítási mód

1. szé-

hoz vagy amúgy másik megvalósítási mód szerint a tégte,lensé szerint a vállalá mód szerint a aeíritlsz va<y rint a veseoetegseg a vese mákhoz, a limíómákfeoz, a könnyű lánc loídózíshez kapcsol

BR43x2, TACI vagy' BCMA receptor-ligandum szerepvállalás az effektor T-sejtekhez kapcsolódik. Egy' rokon megvalósítási mód szerint a BE43x2, TACI vagy BCMA receptor-ligandum szerepvám:

az immunv;

további megvalósítási mód szerint az aktivitás az immunszuppresszíóhoz kapcsolódik, Egy további megvalósítási mód szerint az immunszuppresszió graft kilökéshez, graft-versus-host betegishoz kapcsolódik. Egy másik megvalósítási

-a,— vagy gy »·/·

X «( ν * ' * ♦: x » * x ¢, « $ « »Φ#» « « * » ** mód szerint az immunszuppresszió autoimmun csolódik. Egy rokon megvalósítási mód szerint az autoimmun betegség inzulin-függő diabetes mellhús, vagy Crohn betegség. Egy további megvalósítási mód szerint a BR43x2. TÁCI vagy ~-Iigandum szerepvállalás

rokon megvalósítási mód szerint a gyulladás az izületi hoz, duzzadáshoz, anémiához vagy szeptikus sokkhoz kapcsoióA j ami a 2. számú s;

A leien találmány megfelelő izo szerint a sz

ód szermt az expressziős máz még egy szekréciós receptor-hgandnm szerepvállalási szekvenciát, működés szempontjából az említett polinukleotid rnole>e egy előzőkben ismertetett expressztós vektort juttattunk be, és az említett tenyésztett sejt expresszálja az említett pohpeptidet, amit az említett polínukieotid szegmens ködői, A jelen találmány tárgya továbbá eljárás egy kulához tenyésztett sejt,

ι, azzal jellemezve, mázzuk: tenyésztünk e^y sejtet amibe az előzőkben ismertetett s vektort ne; ennek következtében az en az tett sejt az említett polínukle tidet expresszálja; majd kinyerjük az

X « XX» φ «« * « « » * X * « ♦ * « * ·** * * χ*Ο *»*» * * * ♦ **/* * χ *» ** * tidet. A jelen találmány tárgya továbbá egy izolált: polípeptíd, aminek a szekvenciáját a 2. számú szekvenciavázlaton mutató be. Egy rokon megvalósítási mód szerint a poíípeptid a pol w nyógyászatílag elfogadható hordozóval van kombinálva.

a aminosav a BR43x2, TAGI (von Bülow és Bram: Science 228, 138-141 (1997): WÖ 98/3936! WIPÖ publikáció) (6. számú szekvenciák a BCMÁ IGras es mtsai: Int, immunot 17, 1093-1106 (1995}) ίθ> számú szekvencia) és a BR43xl között. A ciszteh

A 2. ábrán az oldható ¹²®ϊ-ζίηί4a stabil BHK transzfekSeafchard j A 3A> ál

St xan szaporodása és immunglobulin szekréciója látható.

A 3B. ábrán áz IgM és IgG szinteket mutatjuk he Olyan felülúszókban mérve, amiket ínterleukín-4 vagy interleukln-4 + interleukm-o jelenlétében oldható ztnf4-gyel stimulált B-sejtek termelnek, kilencnapos tenyésztés után.

A 4. ábrán interleu.km~4 vagy interleukln-5 jelenlétében humán oldható ztnfA-gye! vagy kontroll fehérjével (ubfouiiin) stimulált perifériális vér B~sejtek láthatók, ötnapos tenyésztés után.

Az 5A. ábrán az SLE jellemzőivel rendelkező ztnf4 transzig £ eredmények la zm^</? rokesomő, :ő. CD elleni ellenanyagokkal festve.

származó nyiCD4 és

Áz 5C, ábrán 6-23 hetes, franszgénikus ztnf4 állatok szé< *·* 9

¢. Φ X 9 *

Φ Φ * Φ « *

Φφ» ΦΦΧ* X * * < Κ«4«

Φ » ΦΦ Φ* rumában mért, összJ es

Az 5D. ábrán ztní'4 transzgenikus állatok vese-metszeteiben srulust rnesangium látható.

Az 5E, ábrán zb iása es a

A 6A. és 6B, ábrán megnövekedett ztní4 szintek iáum 2N8WF1 egerekből és MRL Zlpr/lpr egerekből kapott szérumban.

szintek Iá

Á 7, ábrán az f a vizsgálat során

A 8, ábrán az ELISA-val mért anti '4 irt es kontroll alom utoooknan, a és MRL /Ipr/lpr egerek szérumával összehasonlítva.

az alábbi, részletes leírás megismerése után.

az alábbiakban használt néha

Az „affinitás jelölés” szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan polipeptid szegmens, ami egy második polipeptidhez kapcsolható, hogy ezzel a második polipeptid tisztítását vagy kimutatását tudjuk biztosítani, vagy a második polípeptidnek egy kapcsolódási helyet biztosit egy szabsztráthoz. Elsősorban olyan vagy tehene használható anmitas feledésként, amihez eyv

vág, vagy más specifikus kötő ágens hozzáférhető, Affinitás jelölés lehet egy polihisztidin szegmens, protein A íNilsson és mtsai: EMBO Journal 4, 1075 (19851; Mílsson és mtsai; Methods

X Φ ϊΟ jeioies ín Enzymology 198, 3 (199Dk a glutaüon S transzferáz {Smith and ^Johnson: Gene 87, 31 (Grusseomeyer és mtsai; Proeeedtngs of the B

Sciences, USA 82, 7952-7934 (1985)1; a substance P, a Flag'^ peptid (Hopp és mtsai; Síotechnology 8, 1204-1210 (19881). a kötő fehérje, vagy más antigén epitop vagy kötő és mtsai; Protein Expression and Pnríííeation 2, 95-

Az „allélvariáns szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy génnek két vagy több alternatív formája, amik ugyanazt a kromoszórnális fókuszt foglalják el. Az allélvariáoió természetes .körül(amikor a kódolt pepiidben nincs változás), vág aminosav szekvenciával rendelkező Az allélvariáns szakkifejezést a t<

fehérje leírására is használjuk, amit egy gén allélvariánsa Ide tartoznak az ugyanabból a fejből származó azonos amik egy allélvariáció következtében eltérnek egy referencia aminosav szekvenciátok Az allélvariáns természetes körülmények között az egyedekben előforduló különbségekre utal, egy adott fehérjét kódoló génben.

Az ,,N-terminálís’' vagy „C-terminális szakkifejezés a továbbiakban a polipeptidekben különböző pozíciókat jelöl, Ahol a szövegkörnyezet megengedi, ott ezeket a szakkifejezéseket egy polipeptíd egy bizonyos szekvenciájára vagy részére való hivatkozásként használjuk:, hogy ezzel közelséget, vagy relatív pozíciót

X

X

Xmeg. Ha például egy adott szekvencia egy pej:

terminális pozícióban van egy referencia szekvenciához viszonyítva, akkor ez azt jelenti, bogy közel van a referencia szekvencia C-terminálísához, de nem szükséges, hogy a * φ * * * * * *

Φ»«* »♦** *««« χ

X φ φ #* *φ r φ ♦*

A „contig

egy részén, Például az b'-ATOGCTTAGCTT-S' pchnukleoüd szekvencia reprezentatív „izomig-ja az S'-TAGCTTgagtetdK és a 3'gtcgaclACGGA-5A

Az „egy polinukleotid molekula komplementjei s s, ami

menzés iel egy olyan tei bázispár szekvenciával rendelkezik, és a referencia szekvenciához viszonyítva fordított az orientációja, Például az 5' » * ♦*** *·» s » JJfr .« X Φ Φ « « φ » ο «X * *

X««« **»* X * Φ * *»£* « « 9# «< * emeuter az 5 ' CCCGTGCAT 3 szekvenciával

3' szekvencia kom ple me nijer ’

szekvenciával ossz ciójű a bázls-sze vencia

A Regenerált

t tartalmaz (g molekulával összehasonlítva) lentid

...... (azaz egy és fordított a Például az 5-ATGCACGGG-3' szekaz 5 a CCCGTGCAT-3' szekvenciával.

a szakkifejezés ami egy vagy több d

?.ptidet kódoló, referencia v A merált

ittft., de ugyanazt az amrnosav esőes a

ere használjuk, legyen az lineáris vagy c van egy⁷ olyan szegmens, ami egy számunkra tídet kódok működés szempontjából tövé mensekhez kapcsolva, amik biztosítják a t

ÍS

Ilyen szegmens és termínátor van

és tartalmazhat egy vagy több rephkácíos origót, egy vagy' több szelekciós markért, fckozót. egy poliadenilezési szignált, stb. Az expresszíos vektorok általában plazmid vagy vitális BNS-ből származnak, vagy tartalmazhatják mindkettőnek az elemeit.

Az „izoforma” szakkifejezés egy fehérje különböző formáit jelenti, amik különböző génekről, vagy ugyanarról a génről keletkeznek, de alternatív illesztéssel. Néhány esetben az izoíbrmák-

φφφ* φφ φ « * φ φ * φφφφ φφφ * * χ φ Φ: *

Φ Φ Φ Φ . φ

Φ Φ «· χ >Χί* $* Φ* * során, a szöveti eloszlás, a sejtben való lokalizációja, vagy ezt áfeiezés azt jelenti, ncw a

ereden genetikai környezetéből, és így mentes más külső vagy nemkivánt kódoló szekvenciától, és /an alakban van, hogy alkalmas fehériék génsebészeti úton való előállítására ilyen és ts

A jelen találmány szerinti izolált DNS más, olyan génektől, amikkel normális körülmények ózott kapcsolatban állnak, de tartalmazhatnak természetben előforduló S és 32 nem~transzlálódó régiókat, azaz

, valamint genomíá-

ra evidens IDvnan és Tij

szama·

vagy fehérje, ami a található, azaz nem v<

vagy egy olyan en részesített megvalósítási

létől eltérő környezether ív szerint az izo mentes más polipepbdektöl, főleg más, állati >1, Az az előnyös, ha a pobpeptldeket erősen , azaz 95%~nái naa' nas r az „izolált;' szakkííeje· a szövegösszefüggésben használjuk zés nem zárja ki, hogy ugyanaz a mában, azaz például dímerek formájában, allernatíve lezett formában, vagy valamilyen származék formájában legyen * « fc fc

Α fc*fcfc

->-κ *·* χ χ ♦ ♦ fc

Λ fc: fc φ * 9 99 ΑΛ .* 9* *

A „működés szempontjából kapcsolt” szakkifejezés, ba DNS szegmensekre vonatkozik, akkor azt jelzi, hogy a szegmensek úgy vannak elrendezve, hogy céljuk eléréséhez összehangoltan működnek, azaz például a transzkripció a promoterben íníeiálődík, majd a kódoló szegmensen keresztül a termínátoríg folytatódik.

oitm, vagy előállíthatok természetes és szintetikus molekulák

(rövidítve „bp”), nukleotidokban font”) vagy ki sl a szövegkörnyezet lehetővé teszi, ott az

Ha a szakkifejezé kólákra alkalmazzuk, akkor a teljes hosszúságot jelenti, és megállapodás szerint ekvivalens a „bázispárok” szakkifejezéssel, A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy egy kétszálú pciinukieotid két szálának a hossza enyhén eltérhet egymástól, és a végeik az enzhnatikus hasítás nem mindegyik nukleoüdnak tehet hossza általában nem haladja A „polipepii Hmerje, amit yen pár n a 20 nukleotidoi.

jelentése aminosav csoportok össze, fügéét χ φ: **«·» 9<r * » φ: * Φ « 4 $ ί β Φ * ** ♦ *

Φ&Χ* Κ*ψφ Φ Φβ * «*«* « Φ *4 >4 » hogy természetes közegből izoláljuk, vagy szintetikusan állítjuk elő. A körülbelül 10 aminosav

biztosítják az jel tv Á gének 5' nem kódoló A „fehérje” tid láncot tartalmaz. A 1 ís, azaz és egyéb, nem bériéhez a fehérje előállítása

L, mint nem

A „receptor* ez ks arat e és sse a le

egy

g aktív molekulához fa „1 a Hganduranak a sejtre gy tását. A. hganduranak a receptorhoz való kötődése a rec konformációs változását eredményezi (és néhány esetben a receptor raultmierízációját, azaz az azonos vagy’· eltérő receptor alegységek asszociációi áth arai kölcsönhatásokat okoz a sejtben az effektor doméníekl és más molekulájuk) között. Ezé csönhatások viszont a sejt metabohzmusának változását nyezik. A raetabolízmus események közé, amik a receptor-lteí

*)φφ* *Φ * φ « * «

X -φφ Φ X

Φ χ * Φ**Φ «-Φ <* * dum kölcsönhatásokhoz kapcsolódnak, tartozhat a gén transzkripeiö, a íoszforllezés, a deíoszforilezés. a sejtszaporodás, a ciklikus AMP termelés, a sejt: kalciumlartalmának mobilizálása, a membrán Hpidek mobilizálása, a sejttapadás, az mozit hpidek hidrolízise és a foszfolipidek hidrolízise. A BR84x2 a TNF reeep-

sítják a polípepüdnek egy szubsztráthoz, vagy immunglobulin konstans régió szekvenciákhoz való kapcsolódását. Számos sejtfelszíni receptornak van természetben előforduló, oldható partnere, amik proteolízlssel keletkeznek. Az oldható receptor polipeptidekrö! azt mondják, hogy lényegében mentesek a transzmembrán és mtracellulárls polipeptid szegmensektől, ha azoknak a szegmenseknek elég nagy része hiányzik belőlük, amik a membránba való rögzüléshez vagy szignál transzdukκ Φ **«♦ « φ φ φ ♦ Φ <Β » * > φ « Α* * »

Φ *** # Λ φφ « « * * **Λ*

Φ φ ·$* Φ* *

A poltoerek pontatlan analitikai módszerekkel (azaz például gélele ktroforézissel) meghatározott molekulasúlya és hossza nyilvánvalóan hozzávetőleges érték. Ha egy ilyen értéket úgy fejezünk ki, hogy „körülbelül Xb vagy „hozzávetőleg X, akkor az X deklarált értéke & 10%-os

Az összes idézett szekvencia (1. számú szekvencia) és az ennek megfelelő szekvencia (2. számú s ízesen ami a meg, az oldha-

at es a receptort kódoló szermti poiipeptid

<máivá még az N-tennmalisán vagy C-terminális FLAG-jelzett, bioimnál vagy FlTC-vel jelzett ztní4 tumor nekrőzis faktor ligandumot ami ma nentroktn α néven WO98Z18921), BLvs néven [Moore és mtsai: Science 281 283 (1999)1, BAFF néven LSchneider és mtsai: J, Exp, Med, 189, 1747-1756 (19991), TALL-1 néven (Shu és mtsai: J, Leukoc, Biot >adbav és mtsai;

névén

Journal of Bioiogical Chemístry 274, 15978-15 ismert, A pozitív pool-okat ligandnm-kötődéssel azonosítottuk, szét, a cDN8-f 1 náJ

2.43x2 k aduk a 2, számú

n. ammosav szekvenCíc avázlaton) összehasonlítva « Φ Λ* *

V St * * « *

Φ ·* I « * φ $**>»««* * yj>* * * * **#* ρ ΙΟ

Ismert tumor nekrózis faktor receptorokkal azt láthatjuk, a l AG ága, egyetlen gyengén ciszteinfoen gazdag pszeudo-ismétlödéssel rendelkezik,

A TNF receptor-családot strukturálisan egy extracellularis rész jellemez, ami számos modulból áll, ezeket nevezik a történelmileg kialakult „ciszlemben gazdag pszeudo-ismétlődésnek.

TNF családtag négy ilyen pszeudo-ismétlődéssel

isik után, kgy tartalmaz, . Ezeket azért nevezik et úgy tűnik, hogy ezek e_; me pszeudo-ísmédodések olyan j

és 6 cisztein csoportot

gokkal rendelkeznek, amik megkülönböztetik ősi módúiból szárma, A #l, #2, #3 és #4 es szekvencia- tulajdonsa -

-ismétlődés egy hajtogatási doménnek felel sg> és mind a négy pszeudo-ismétlddés ugyanazt a tercier struktúrát veszi fel,

A TACI két ciszteinfoen ga máz ivón Bülow és Bram:

93/39361 WIPÖ publikáció], az első a TNF receptorcsalád más tagjainak megfelelő struktúrában konzerválódott, a második kevésbé konzerválódott:. A jelen találmány szerinti BR43x2 Izoformából hiányzik a TAGI első ciszteinfoen gazdag pszeudo-ismétlödése, és csak a második, kevésbé konzerválódott ismétlődés maradt meg.

A BR43x2 egy kikövetkeztetett aminosav szekvenciája (lásd a 2, számú szekvenciavázlatot) egy érett fehérje jelenlétére utal, ami tartalmaz egy extracellulárís dómént (a 2, számú szekvencia

X- 9 Φ > Λ 3 # * * jí <τ # « . * £ »«Φ» >*** ·* _α **£*

1-120. csoportjai), ami tartalmaz egy eiszteinben gi.

pszeudo-ismétlödést (a 2. számú szekvencia 25-38-as cs egy'· transzmembrán doniént (a 2. számú szekvencia 121-133-as csoportjai), és egy citoplazmatikus domént (a 2. számú szekvencisztein csoportot (a 2. számú szekvencia 25., 40., 43., 47,, 54. és 58. számú csoportjai), egy konzerválódott aszparaginsav eső(a 2. számú szekvencia 34, számú csoportja), és 2 konzert lenem csoportot (a 2. számú szekvencia 36, és 37. ja), és 46%-os azonosságot mutat a TACI (6.

számú szekvencia) első ciszteinben gazdag pszeudo-ísmétlővel, valamint 35%-os azonosságot mutat a BCMA (8. számú eia) 11, ábra) ciszteinben

A ciszteinben

MQEKNRDHSigEPC {Ö-2MYFWIYFW] DXLLX {2} C f XCX {3} CX {6-8} CX (2) (YF) C (10, számú szekvencia), amiben € jelentése cisztein aminosav, Ö jelentése gluiamin, E jelentése glutaminsav, K jelentése lizln, N jelentése aszparagin, Y jelentése tirozin, F jelentése fenílalanin, W jelentése triptoíán, L jelentése leucin, I jelentése ízoleucín, V jelentése valin és X jelentése bármelyek természetes aminosav, a cisztein kivételével, A szögletes zárójelben ,4 flevő aminosav csoportok az adott lehetséges ammosavakat mutálják, A kapcsos zárójel számok az adott pozícióban lehetséges aminosavak számát mutr ,;n „{ 7'levö sav

a a 32-40 aminoeptídek, a 10. számú szekvencia.vázlatnak megfelelően.

« « « « « β

X .< » Λ .4 9 9 φ **«* »»♦» ». « « * «««» * φ Λ* «♦ X

Az oldható BR43x2 receptor, amit a 4. számú szekvencia 1120-as csoportjai reprezentálnak, tartalmaz egy ciszteinben gazdag pszeudo-ismétlődést (a 4, számú szekvencia 25-28-as csoportjaik és hiányoznak belőle a BR43x2 transzmembrán és tematikus doménjel, a 2. számú szekvenciavázlatban leírt

A szakterületen jártas szakember számára nyilvárm hogy ezek a doménhatárok csak közelítöek, és az Ismert ke) való Illesztésen, valamint a fehérje tekeredés megj® alapul. Ezek a tulajdonságok azt jelzik, hogy az I. számú vencia és a 3, számú szekvencia által kódolt receptor a TNF receptorcsalád tagja.

ki lehet vele mutatni a BR43X2 expresszioját - megtelelő mRNS mutatja, hogy van expresszíó a lépben, a nyirokcsomóban, a gyenge expresszlő van a kevert bmibeita

áeiók Egy •áz láncreakció használatával a BR43x:l.et csak a B-sei ben lehetett kimutatni, az aktivált T-sejtekben nem, amit a 7ACIra leírtak ivón Bülow és Braun Science 228, 138-141 (1997); WO yan próbát használva, ami ns-osan atíeö a m. lő TACt szekvenciával, a TACI-t és a BR43x2~í ki lehetett mutatni a lépben, a nyirokcsomóban és a vékonybélben, a gyomorban, nyálmirígyben, a vakbélben, a tüdőben, a csontvelőben, a magzati lépben, a CD 1.94 sejtekben és a

Northern biot tál a BCMA-t ki lehetett mutatni a vékonybélben, a lépben, a vastagbélben, a vakbélben, a nyirokcsomó21 * χ «« β β * » * « >

* * « ♦ «β * ♦ ***« »«*« * X > * X*«β ♦ X «?fc ♦« » bán, a hörgőkben és a herékben- A BCMA-i: kí lehetett mutatni adenolimfómában, nem-Hodgkln lirnfómában és parolid tumorban, gyengén ki lehetett mutatni CD8-h CDI94 és MLR sejtekben, Daudí, Raji és Hűt 78 sejtekben.

az itt ismertetett B.R43x2 oonoeotio fen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a degenerációja következtében jelentős szekvencia-variáció lehetséges ezek között a pohnukleoüd molekulák között, A 11. számú szekvencia egy degeneráh DNS szekvencia, and magában foglalja az összes olyan DNS~t, ami a 4. számú

12, számú szekvencia egv degeneráh

ami magaa 2, számú szekvenja az összes olyarí DNS-t, ,_ö,delő oldható BR43x2 j öle ten jártas szakember számára nyiivánva degeneráh szekvencia megadja az összes amik a 4, számú szekvenciát kódolják, ha a a T-ket. Tehát a jelen találmány tárgyát képezik azok a pohpeptidet kódoló polínnkleotldok, amik tartalmazzák a 11. számú szekvencia 1-380-as nukleoddjait, a 12. számú szekvencia l-741~es nukleoddjait és ezek RNS ekvivalensei. Az 1. táblázatban a 11. és 12. számú szekvenciában használt egybe tűs kódok láthatók, a degeneráh nukleotíd pozíciók jelölésére. A „feloldások az egy ködbe füvei jelzett nukleotidok. A ,,1 ment” szakkifejezés a komplementer ozía/no _a2 y vagy vagy T-t jelöl, és

a 12. számú

rom

Φ « ΦΦΧΦ φφ φ » Κ Φ » Φ φ ♦ Φ Φ κ Φ + φ

Κ4Φ« ΦΦ«« Φ φ φ * φφ»

Φ Φ ΦΦ φφ Φ vagy' G-t jelöl, ahol A komplementer a T-vel, valamint G komplementer a C-vel.

Φ Φ ír * ** :« * Φ Φ * * Φφ Φ * χ Φ: * χ ♦ χ •X XX φΧ * β

Φ:Φ:«

Nukleotid

I. Táblázat Feloldás

A	A	T		T
C	C	G		G
G	G	C		C
T	T	A		A
R	AZG	¥		GZT
¥	C/T	R		AZG
M	A/C	K		GZT
K	GZT	M		A/C
S	C/G	S		CZG
w	AZT	w		AZT
Π o	AZCZT	D		AZG/T
B	CZ GZT	V		AZCZG
¥	AZCZG	B		CZGZT
D	AZGZT	H		AZC/T
N	AZCZGZT	N	A	,/C/GZT
A 11.	és 12. számú í	szekvenciában	használt	degener

aminosav összes (séges kodonokat. amik tartalmazzák, a 2. táblázatban mulatjuk be

Φ Φ Φ

Φ φ

Φ Φ Φ * φ *♦ Φ χ

Φ φ 8 Φ ΦΦφΑ

ΦΦ ΦΦ * * * φ «Φ ΦΦΦ ΦΦΦΦ

2, Táblázat (folyt,)
Ámino- j sav 1	Eg^űs	Ködönök		cxiv í i í
Tyr j	y	TAC TAT	TAY |
w	w	TGG	TGG 1
Tér j	-	TAA TAG TGA	TRR
Asn/Asp )	B
*Glu/Gte™|	ΊΓ		..
1	X

hogy egy deáenc

A szakterületen jártas szakember számára t kodon meghatározásakor, amt az egyes aminosavakat kódoló összes lehetséges kod ont képviseli, bizonyos kétértelműség kerül a rendszerbe, Például a szerte degenerált kodonja (WSN) bizonyos körülmények között kódolhat argínint 3RX és az arginín degenerált kodonja (MGN) bizonyos körül· között szerint kódol (AGY), Hasonló kapcsolat létezik a degenerált szekvenciában levő polinukleoiid kódolhat variáns aminosav szekvenciákat, de a szakterületen jártas szakember könnyen azonos!thai ilyen szekvenciákat, a 2, és 4, számú székveneiavázlaion bemutatott aminosav szekvencia alapján, A variáns szekvenciák funkcionalitása könnyen tesztelhető az alábbiakban ismertetett módon.

A szakterületen jártas szakember számára nyilván való az is, hogy különböző fajoknak különböző a „kodonhasznosiiása” (Grantham és mtsai: Nueleic Aeids Research 8, 1893-1912 11980): Haas és mtsai: Curr.. Bioi. 6, 315-324 11996); WainHobson és mtsai: Gene 13, 355-364 (1981): Grosjean és Flers:

» φ Φ»ΧΦ fe* « * 9 9 « fe fe ♦ ♦' ♦ fe fe fefe fe »

Xfefefe fefe fefe fe fe fe fe fefe XX fe fe fefe: xfe fe

Gene 18, 199-209 (1982); Hóim: Mueleie Acids Research .14, 3075-3087 (1988): íkemura: Journal of Molecular Biology 158, 573-597 (19821). A továbbiakban a „kodonhasznositás vagy „előnyben részesített kodonok szakkifejezés azokra a fehérje transzlációs kodonokra vonatkozik, amiket egy adott faj >an használnak, azaz az egyes aminosavakat kódoló :őzül egyet vagy néhányat favorizálnak (lásd a 2, zatot). Például a treonin amínosavat (Thr) az ACA, az

ACC, az ACC vagy az AC az ACC a le a rovarsejtem ciesz más ia_s de az e

használt , vírusok v<

előnyben, Egy adott ismert 1 ík, azaz más és

szerinti juttatása a rekombináns DMS-be termelődését, a fehérje transzlációját

cta szolgai icmpiatkent a po nosan használó és az pusokban és fajokban valóábbí&kban ismertetett különböző seittí részesített kodonokat tartalmazó szekvenciák tesztelhetek. és optimalizálhatok, hogy miképpen expresszáiódnak a különböző falókban, és az alábbiakban ismertetett módon vizsgálhaljnk funkcionalitásukat.

A BR43x2 résziemben gazdag pszeudo-ismétlődésében levő erősen konzerválódott aminosav csoportok használhatok eszközként a család új tagjainak azonosítására. Például reverz transz« φ

V * φ β β φ

ΧΦ»Χ Φ«Κ » φ φ kriptáé polimeráz láncreakció ÍRT-PCR) használható elvan szekvenciák amplifikálására, amik az előzőkben ismerteteti extracelluláris Iigandurnkötö domént kódolják, erre a célra különböző szövetforrásokból vagy·' sejtekből izolált RNS-t használva. Pontosabban, a BR43x2 szekvenciák alapján tervezett, erősen degenerált primerek jól használhatók erre a célra.

A jelen találmány előnyben részesített megvalósítási szerint az izolált polinuklcotidok a 3. számú méretű régióihoz, vagy egy azzal

rn, a szí r a hőmérséklet körülbelül 5 °C-szal legyen alacsonyabb mint az adott specifikus szekvencia termális olvadáspontja (Tm), egy adott ionerösségnél és pH-nál. A Tm az a hőmérséklet (megadott ionerősség és pH a kiválasztott szekvencia 50%-a hibrídizálödik egy tökéletesen illeszkedő próbához. Azok a tipikus szigorú körülmények, amiknél a sőkoncentráciő maximum 0,03 mol/1, p.H-7, és a hőmérséklet legalább körülbelül 60 ^ÖC.

Amint azt az előzőkben megjegyeztük, a jelen találmány szerinti izolált polínukleotidok lehetnek DNS-ek és RNS-ek is, A DNS és az RNS izolálása jól ismert a szakterületen. Általában azt előnyben, ha az RNS-t RPMI 1788 sejtekből, PSMNCpihenő vagy aktíváit transzfektált B-sejtekből vagy mandula

SZOVi bár a DNS cdoállítható úgy is, hogy más szövetekből származó RNS-t használunk erre a célra, vagy genomiális DNS formájában izoláljuk. Az össz-RNS-t guanidlum-HCles extrakeíővah majd CsCl gradiensen való centrifugálással állíthatjuk elő íChirgwin és mtsai: Bíochcmlstry 18, 52-94 (19791], A polKAb RNS-t Avív és Leder módszerével izoláljuk az össz-1

X » $ X X « * * « x ♦ « X * χ Φ * χ Φ*χ» χ ♦ 9 * «βχ · *9 er* * vív és Leden Proceedlngs of the Natío Sciences. USA 69, 1408-1412 {1972)1, A IS) a polipAr RNS-hői izoláljuk ismert

a 1 gén egyetlen e s v· ríánsök valamint alternatív Illesztések számú szekvencu repre

a mutációk amínosav szekvm ánsai, beleértve valamint azokat

szekvencia ailélvariánsai. Ezeknek a ánsai és illesztési variánsai úgy

számu székvenciavs ezek ortológjai, A „lényegé olyan ϊζ, valamint hasonló szakkifejezést a további%-os.

osen lésére használjuk í-öS,

szekvencia azonosságot mutatnak a 2. és 4, számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciákkal, vagy⁷ azok ortológjaival. Az ;n még előnyösebben legalább azonosak, és legelőnyösebben 95 vagy' még százalékban azonosak a 2, számú szekvenciával vagy annak ortolőgjaivak A χ * * χχ Ψ » » *

Φ $ $ « ♦ V * «*#* »«** X * <· X *XS ♦ X Χ-Χ »* százalékos szekvencia-azonosságot hagyományos módszerekkel határozzuk meg lAltsehul és mtsai: Bull Math. Bio. 48, 603-81© es ings oi

Áeaderny of Sciences, USA 89, 19915-1()919 (; két aminosav szekvenciát egymáshoz .illesztőnk, hogy optimalizáljuk az illesztési értékeket, 10-es résnyilásí büntetést, 1-es rcstagulási büntetést használva, valamint ‘blosum 62” értékelési mátrixát használva ⁵ of the National Aes I, a 3, fa aminosavakaf standard egybetús azonosságot az alábbiak szerint sz

Az azonos illeszkedések összes szama sssza, plusz a ?a a két szekvencis esek számai |a hosszabb hosszabb szekv illesztése eéljábo ♦ * ## φ·.·

Λ * « * X Φ ♦ 9 9 * Φ «« X Φ ♦ $ 9 X 9 9·* ♦ * « Φ Φ ** * * « X Φ* Φ* 9

3. Táblázat

φ Φ

Φ *

9 Φ φ φ*ΦΦ φφφφ

Φ φ

ΛΦ Φ

Φ » Φ

Φφ Φ φ Φ Φ φφφφ »νκ Φ

3. Táblázat' (folyt.)

Φ * ΦΦ Φ 9 ΦΦ β * ¥ * Φ * Φ φ Φ Φ « Φ Φφ φ χ φ*φ« ΦΦΦχ χ φ λ 9 ΦΦ«χ

Φ * «-φ «**· 9.

A polínukiéotid molekulák szekvencia- azonosságát is hasonló módszerekkel határozzuk meg, az előzőkben ismertetett

A lényegében homológ fehérjéket és polipephcteket az jel·· lemzi, hogy egy vagy több amlnosav helyettesítést, deléciót vagy addíciói tartalmaznak, Ezek a változások előnyösen minor természetűek, azaz konzervatív helyettesítések (lásd a 4. táblázatot), és más olyan helyettesítések, amik nem érintik lényegesen a polipeptid térszerkezetét vagy aktivitását; kis deléeíók, tipikus esetben 1-30 amlnosav nális extenziők, azaz egy kis, maximum körülbelül 20-25 vagy egy affinitás jelölés. Tehát a lül 489-568 amínosavből álló olyan szekvenciát tartalmaznak, ann sen legalább 90%-bán, és még

C-termi -

elönyöu vagy kvencia megennél is nat tartalmazhatnak még egy és az í<sív a t mértékben azonos a 2. számú L Az affinitás jeloléí

hasítási helyet a ózott, A megfelelő helyei és a Xa. faktor hasítási

Konzervatív aminosav helyettesítések Bázikus: arginín lizín htszticlín

Savas: glutamín sav

szerín treonín

A jelen találmány szerinti fehérjék tartalmazhatnak a természetben elő nem forduló aminosav csoportokat is, Nem-természetes aminosav lehet, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk raa· gnnkat a transz-3-metÖprolin, a 2_t4-nietanoprolm, a. cisz-4hidroxíprolín, a transz-hídroxiprolin, az N-metíl-glicln, az allotreonín, a metíltreonin, a hidroxietíl-cisztein. a hMroxietdhomocíszteln, a nitroglntamín, a homoglutamin, a pipekolsav, a #» * 4 *#«« Λ » » * χ ♦ *- Φ « **:Φ ♦ ·» X Λ :♦· * * λΧ>

tiazolidin-karbonsav, a dehidroprolín, a 3- és 4-metüprolin, a 3,3-dímetilprohn, a terc-lenem, a norvalin, a 2-aza-fonilalanm, a. 3-azadeniialanín, a 4-aza-fenilatanin és a 4~flnor~fenilalanm. Számos módszer ismert a szakterületen arra, hogy nem termeszetes aminosavakal építsun tó egy ín cltro rendszer lag aoilezett szuppresszor aminosavak és a tRNS

A nonszensz és veáre, ami tartalmaz e ti használhaa nonszensz mutációkat kémiainy ' ismert

ín coli St ;bető enzimeket és más és mtsai: Journal of the American Chemical Society 113, 2722 (19911:Ellman és mtsai: Methods ín Enzymolocfv 809 (1993);

og és mtsak cos, USA 90, r szerint a transzvégre, a mutáns mRKS és a

Chung és mtsai: Science 299,

Procecdíngs of lációt kémiailag aminoacüezett szuppresszorok (Tureatti és mtsai: Journal of Biologieal Chemístry

1998 (19961). Egy harmadik módszer szerint az Escheriehia coJ sejteket a helyettesítendő természetes aminosav (azaz például íenlialanin) távollétében, de kívánt nem-természetes amínossv(ak) jelenlétében (azaz például 2-aza-fenílalanm, 3-aza~femialanm, 4aza-fenilalanin vagy 4-üuor-fenilalamn) tenyésztjük. A természetben elő nem forduló amínosavakat a természetes megfelelőjük helyett, építi be a sejt a fehérjébe (Koíde és mtsai; Biochemistry 38, 7470-7478 (1994)1. A természetben előforduló aminosav eső’í fc *»>,.·. fc « x fc Λ χ x fc * 4 » fc fc 4.x χ λ·

4x4fc fc fc fc * fc4ifc· X ** fc portok m vitro kémiai módosítással természetben elő nem forduló aminosavakká konvertálhatók, A kémiai módosítást kombinálhatjuk helyspecifífcus mutageoezisset, hogy ezzel még jobban kiterjesszük a helyettesítések tartományát (Wynn és Riehards; Protein Science 2, 395-403 (1093)1,

Korlátozott számú nern-konzervaiív aminosav, a genetikai Utal nem kódolt aminosav, nem természetes aminosav, és a ammosav szemen eio nem aminosav cs<

műim

ss es es mtsai s ammosavan a s hét azonosítani, azaz atásos muta:

: Science 244, 1081-1085 (1989) s egy-egy

mutációt viszünk be a

árnak az vizsgáljuk a biológiai aktivitását (azaz például a ligandumkötő képességét jelátvivő képességét), hogy azonosítsuk azokat az aminosav csoportokat, amik kritikusak a molekula aktivitása szempontjából (Hilton és mtsai: Journal of Biological . 271. 4699-4708 () fehérje vagy más biológiai kölcsönhatás helyeit is rozhatjuk a struktúra fizikai elemzésével, például magmágneses rezonanciával, krlszfallográfíával, elektron-diffrakcióval vagy fotoafflnitás jelöléssel, a feltételezett kontaktus pontban levő ami.nosavak mutálta fásával együtt (de Vos és mtsai: Science 255, 306312 {1992): Smith és mtsai: Journal of Moleeular Biology 224, 889-904 (1992); Wlodaver és mtsai: FBBS ketters 809, 59-64

X'X

Í1992H. Az esszenciális aminosavakat a rokon TNFR család tagjaival, azaz például a TACI- val és BCMA-val való homológia alapján is azonosíthatjuk.

További aminosav helyettesítések végezhetők el a BR43x2 eiszteínben gazdag pszeudo-ísmétlödésében, mindaddig, amíg a konzerválódott císztein, aszparagínsav és leuoin csoportok megmaradnak és a magasabbrendü struktúra nem torzul. Az az elö-

és Sauer által leírt módszerekkel [Fteídhaar-Olson és Sauer _ Bowle es dauer: Frcmeechngs o

National Áeadetny of Sciences, USA 86, 2162-2156 (108 Röviden, ezek a szerzők olyan módszereket írtak egyszerre tidbera funkcionális

tő helyettesítések spektrumát az egyes pozíciókban, Más, szintén használható módszer a fág display módszer (Lowman és mtsaí: Bíochem. 30, 10832-1083? (1991): Ladner és mtsai: 5,223,409 számú Amerikai Egyesült Államok-beií szabadalmi leírás; Huse,. WIFO Fublication WO 92/062045] valamint a régióba irányított

Φ X Λ Φ Φ «

Φ Φ Φ X φ ΦΦ Φ * χφΦχ ΦΦΦΚ φ Φ Φ » «»«>

φ φ φ» φφ φ mutagenezis LDerhyshire és mtsai; Geoe 48, 145 (1988); Ner és mtsai: DNA 7, 127 (1988».

Az ismertetett BR43x2 DNS és polipeptid szekvenciák variánsai Stemmer leírása szerint előállíthatok DNS keveréssel {Stemmer: Natúré 370, 389-391 (1994): Stemmer: Proceedíngs of the National Aeademv of Sciences, USA 91, 10747-10751 (1994); WIPO Pubheatin Wö 97/20078]. Röviden, a variáns DNS-eket in oöro homológ rekombinációval generáljuk, egv kiindulási DNS véletlenszerű fragmentálásával, majd PCR-rel való újbóli összeállításával, ami véletlenszerűen bevitt pontmutáciőkat eredményez. Ezt a technikát módosíthatjuk kiindulási DNS-ek családjának, azaz például aliélvaríánsok, vagy különböző fajokból származó DNS-ek használatával, hogy az eljárásba további variabilitást vigyünk be. A kívánt aktivlíás szelekciója vagy szűrővizsgálata, amit a mutagenezis és vizsgálatok további iterációja követ, a szekvenciák gyors „evolúcióját” eredményezi, a kívánt mutációkat kiválasztva, miközben ezzel egyídőben a káros változásokat kiszelektáljuk.

Az alábbiakban ismertetett mutagenezis módszerek kombinálhatok nagy áteresztőképességű, automatizált szűrővizsgálati módszerekkel, hogy kimutassuk a klónozott, mntagenízált polípeptideket a gazdasejtekben. Az ebből a szempontból előnyben részesített vizsgálati módszerek közé tartoznak a sej (szaporodási vizsgálatok és a bioszenzor alapú lígandumkotési vizsgálatok, amiket az alábbiakban ismertetünk. Az aktív receptorokat vagy azok részeit íazaz például ligandumkötő fragmensek, jeiáí.vívő bőmének és hasonlók! kódoló mutagenizált DNS molekulák kinyerhetők a gazdasejtekből, és modern berendezésekkel gyorsan szekvenálhatók, Ezek a módszerek lehetővé teszik az ♦ « egyes aminosav * * «>:» Μ « χχ

Jr * ♦ x > X « X « »4> » <

(«ΦΧ Φ»ΧΚ » # « X «»» ♦ ΐ Φ* Φ« * meghatározását egy számunkra érdekes polipeptidben, és ismeretlen struktúrájú po~ lipeptidekre is használhatók.

Az Itt ismertetett módszerek alkalmazásával a szakterületen jártas szakember azonosíthat és/vagy elkészíthet egy sor olyan poiipeptíd íragmenst vagy variánst, lógok aa 2. számú szekvencia 1- 120-as a vad-típusú et a tumor

más tagjs id tumor sonlókat. A TNFR

len i

B-sejt szuppresszíős képess

szármázó, megteieh es a iátok közé tartoznak, nánk magunkat, az emlős, madár, kétéltű, más gerinces vagy gerinctelen fájok. Különösen érd· fajokból - beleértve a rágcsálókat, sertést, kutyát, macskát, lovat és a főemlőst - származó j humán BR43x2 mány szerinti információkat és készítményeket a klónozást technikákkal kombinálva, A eDNS például olyan használatával klónozható, amit a receptort vagy sejttípusból nyertünk ki, A mRNS megfelelő forrásait Northern hlottal lehet azonosítani, az itt ismertetett szekvenciák ezekre korlátoz au rovar és a más

alapján tervezett útiv szövetből vagy χ χφ χ

XX Φ

Α * * χ Φ Φ

Φ X X Φ Φ Λ Φ Φ Φ

Φφφφ ΦΑβ* X X φ X »»?

Φ χ χ* χ χ Φ sejtvonalból származó mRNS-bol könyvtárat készítünk. A reecptort kódoló cDN'S-t számos különböző módszerrel Izolálhatjuk, azaz például egy teljes vagy részleges humán cDMS-í egy vagy generált oröba-esoporttal átvizsgálva, amiket az ismertetett szekvenciák alapján terveztünk, A cDNS kódolható polimeráz láncreakcióval is, az itt ismertetett szekvenciák ah használatával. Egy további módszer szer:

A jelen találmány szerinti receptor sszúságu receptor pol

külső DNS-sel transzmrmainatöR es tenyészetben szaporíthatők, ide értve a baktériumokat, a gombasejteket, és a tenyésztett magasabbrendú eukariőta jtes szervezetek tenyésztett sejtjeit, A klónozott

sejtekbe való bejuttatást technikát a szakiroda ,y vekben publikálták jSambrook és mtsai: Moleeular dng: A Laboralory Manual; 2. kiadás, Coki Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. U989h Current Protocols In Moleeular Biology, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Pnblishing és Wilevdnterseienee; New York (1987)1.

« y <e « « X $

Φ * » * * »

Sí « « ♦ « í« « «:χ«Φ «««,» « χ « * χ* « X *<> X* szekvenciát működés szempontjából az expresszióhoz szükséges más genetikai elemekhez kapcsoljuk, ami általában lehet transzkripciós promoter és termínátor egy expressziős vektoron belül. A vektor emellett általában tartalmaz egy vagy több szelekciós mar· ációs origót, bár a szakte

Általánosságban, a BR43x2

es az

• es egy vagy r számáréi a szelekciós markert külön vektorral

Itkáciőját a gazdasejt genomjába való íntegrálődásszd lehet biztosítani. A promoterek, terminálotok, szelekciős markerek. vektorok és más elemek kiválasztása rutin dolga, ismeretei közé tartozik. Számos iiven elemet írtak le a szakiroda-

> &.

ciős bioszintézis útjára irányítsunk, egy szekréciós s venciát (ami vezérszekvencia, prepro szekvencia veneia néven is ismert) biztosítunk az expresszíős vektorban, A szekréciós szignálszekvencía lehet a BR43x2 szekréciós szíj

színse s szempontja idei a gazdasejt szekréciós bíoszlntézis útjára irányítsa. A szekréciós szignálszekvencíák a számunkra érdekes polípeptídet kódoló DNS szekvenciához viszonyítva általában 5 irányban találhatók, bár néhány szekréciós szignálszekvencia a számunkra érdekes DNS szekvenciában máshol is * β «φφφ ΦΦ X

Φ Φ « Φ » X * Φ φ Φ X *Φ Φ X φχ*φ χφφφ φ * * φ β Φφ χ φ. φφ φφ Α elhelyezkedhet (lásd például Welch és munkatársai: 5,037,743 számú Amerikai Egyesült Államok-beh szabadalmi leírás, Holland és munkatársai: 5,143,830 számú Amerikai Egyesült szabadalmi leírást a )eA te an. Az exogén DNS

megfeleld .

iques 7,

Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás;

igler és mtsal: Cell 14, 725 (1078); Corsaro és Fears Somatie Cell Geneües 7, 803 (1981): G-raham és Van dér 1

52, 456 (1973)1, az elektroporáelo (Neumann 1, 841-845 Í1OÜ2IL a in Molecuiar Bioiogy, szerkó Ausuöei es Greene Fnblíshíng és Wiley-lnterscience: Név

Foeus 15, 73 (1993); Ciecarone és mtsal: Focus 15, 80 (1993)1, és a virális vektorok (Miller és (1989); Wang és Finer: Natúré Med. 2, 714-70 hináns polipeptidek előállítását tenyészt ismertetik a szakirodalom bán (Levmson és mtsai: 4,713,33 számú Amerikai Egyesült ÁOamek-bell szabadalmi leírás; Hagen és mtsai; 4,784,950 számú Amerikai Egyesük Államok-beli és mtsal: 4,579,821 számú Amerikai 4,853,134 számú Amerikai Egyesült Allamok-beii szabadalmi leirás). A megfelelő emlős sejtek közé tartozik a COS-1 oATCC No. CRL 1850), a

-7 (ATCC No. CRL 1851), a BHK (ATCC No. CRL 1832), a . 570 (ATCC No, CRL 10314), a 293 (ATCC No, CRL 1573) és mtsai: J, Gén. Virol, 38, 5972 (1977)1, valamint az aranyborosőg petefészek sejtvonalak (azaz * φ * χ Jí Φ * * * V Φ * * X' χ :« « *φ '9 * ««χ« ««:«:♦ 9 Φ ♦ * 94Λ * 9 ** X* *

ATGC No, CCL 81), A szakterületen további sejtvonalak ismertek. és beszerezhetők a nyilvános letéti helyekről, mint például az American Type Cukoré Collection-tői íRoekville, Marylandi. Általában az erős transzkripciós promoíerekei részesítik előnyben, mint például az SV4Ö vagy citomegafovrrus promoterekeé (4,956,288 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás). Más használható promoterek származhatnak a

kés gént képesek továbbadni utódaiknak, „stabil iranszfektánsoknak” nevezik. Egy' előnyben részesített szelekciós marker a neomícin-reziszteneiát kódoló gén. A szelekciót egy neomicín-típusú hatóanyag, azaz például G-418, vagy hasonló jelenlétében hajtjuk végre, A szelekciós rendszereket arra is használhatjuk,

fokozzuk a számunkra érdekes

néven említenek. Az amphfikálást úgy hajtjuk végre, hogy a Íranszíektánsokat a szelekciós ágens a szelekciós ágens mennyiségét, hogy' kiválasszuk azokat a sejteket, amik a bevitt gének termékeit nagy mennyiségben termelik. Egy előnyben részesített, ampliükálhaiö szelekciós marker a díhidrofolát-reduktáz, ami metotrexái rezisztenciát, biztosit.

gyógyszer-r enca ger (mint a higromiein re* Φ φ χ

X ♦ φ * φ φ «

Φ «φφ «φφφ * φ

Φ Φ ΦΦ

ΦΦ *

Φ Φ *

Φφ Φ

X Φ φ· φφ zisztencia, multídrog rezisztencia, puromícin acedltranszferáz) ís használhatók. Áz alternatív markerek, amik e_;gy megváltoztatott íenotipust, mint például a zöld fluoreszcencia fehérjét, vagy sejtfelszíni fehérjéket, mint például a CD4*ek a CDB-at, az í-es osztályba tartozó MHC-t, méhlepény aikaiikus foszfatázt visznek be, arra használhatok, hogy a transzfektált sejteket elválasszuk, a nem-transzfektált se í lektől, például FACS osztályozással, va ev-

és mtsai: d.

és munkatársai foglalták össze t

varsejtek fertőzhetők rekombináns bakulovirusokkal, amik állaszármaznak {King, L, A, és Fossee, R.D.:

Expression Systems: A Laboratory Guide, London, Cha Hall; O'Eeilly, D.R. és mtsai: Baeulovfrus Expression Vectors: A Laboratorv Manual, New York, Oxford University Press (1994); Ríchardson, C.D. (szerk.); Baculovirns Expression Protocols, Methods in Moleeular Biology, Totowa, Nd. Humana Press (1995)1. A rekombináns BR43x2 bakulovfrus előállításának második módszere alkalmazza a Luckow által leírt t.ranszpozonalapú rendszert (Luckow, Y.A, és mtsai; J, VíroL 87, 4568-4579 (1993 b. Ezt a rendszert, ami transzfer vektorokat tartalmaz, a * φ * * «*** ΦΦ * X- Φ X * * « X φ »χ X Φ

X **Χ Φ*ΧΦ » X Φ Φ ί*ί* φ X ΦΦ /ΦΦ » ac-to-Bac™ kittel szerezhetjük be (Life Technologies, Rockville.

majd olyan bacmidokat keresünk, amik a rekombínáns rusra jellemző, megszakított lacZ gént tartalmaznak, náns bakulovírus genomot tartalmazó bacmiá DNS

követően előállítjuk a BR43x2-at expresszálő rekombínáns vírust, A rekombínáns vírus törzsállományokat a szakterületen általánosan használt módszerekkel állítjuk elő.

A rekombínáns vírust használjuk a gazdasejtek, tipikus esetben a sereghernyóból, a Spodppfem Jrupyocrdn-ból származó sejtvonal fertőzésére iGiíek és Fasternak' Moieeular Bíoteehnology: Príneíples and Applications of Recombínant DNA, ASM Press, Washington D.C. (1994)]. Egv· másik megfelelő sejtvoφ * » φ

XX ♦ * * 9 * * 9

Φ 9 9 «X ** xóe nal a Trkhopfesía ní-ból származó High FiveO^ sejtvonal {Invitrogen) (5,300,435 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). A kereskedelmi forgalomban levő szérnnimentes táptalajokat használjuk a sejtek növesztésére és fenntartására. Az Sí’9 sejtekhez megfelelő táptalaj lehet az SÍ9ÖÖ Π™ (Life Technologies) vagy az ESE 921™ (Expression Systems); a Trichoplusfo ni sejtekhez pedig az Ex~cel0405™ (JRH Bioscíences, Lenexa, ES), vagy- az Express FiveO™ (Lite Technologies f A használt eljárásokat ismertetik a laboratóriumi kézikönyvekben (Ring, L.A. és Possee, EXT: The Baeuiovirus Expression Systems; A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly. D.R. és mtsai; Baeuiovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford Universíty Press (1994); RJchardson. C,D. (szerkó: Baeuiovirus Expression Protoeols. Metbods in Moiecular Bíoiogy, Totowa, Nd, Humana Press ( 1995)1, A BR43x2 poiipeptid ezt köveid tisztítását a íeluiúszőből az alábbiakban ismertetett módszerekkel érhetjük el.

A jelen találmány szerinti eljárásban gombasejtek - beleértve az élesztősejteket is ~ is használhatók. Az ebből a szempontból különösen érdekes élesztőfajok közé tartozik a Saec/mrompces eereuiste, a Ptehía pnstons, és a Piehfo mathnnolfea, A Soechdmmpoos eereoísim? exogéu DNS-sel való transzformálásának, és az így transzformált sejtekkel rekombináns polipeptidek előállításának módszereit a szakirodalomban leírták (Kawasaki; 4,599,3.11 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Kawasaki és mtsai; 4,931,373 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Brake; 4.870,008 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Welch és mtsai; 5,037,743 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szaba« * «ΦΦΦ Χ-φ Φ # φ φ * * φ χ 4 4 9 φ· :φ:·φ Φ

ΦΧΦΦ ΦΦΦΦ φ * φ φ ΦΦ » * φ* φφ

Α» φ daluk leírás: Murray és mtsai: 4,845,075 számú Amerikai Egyesült Államok-beh szabadalmi leírás), A transzformáit sejteket a szelekciós marker, általában gyógyszer-rezisztencia, vagy egy adott tápanyag (leucinl hiányában való növekedési képesség által mégha tározóit íenoiípus alapján szelektáljuk, A Eneeharompees eereeislne-ben előnyben részesített vektorrendszer a Kawasaki és munkatársai által ismertetett BOTI vektor-

KiBgsman és mtsai; 4,615,974 számú Amerikai Egyesült Allamok-belí szabadalmi leírás; Bittér: 4,977,092 száméi

Í4,

Amerikai Egyesült Allamok-belí szabadalmi leírás), valamint az genáz génekből származó promoterek és termínáb 5,063.154:5,139,936 és 4,661,454 számú

Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Más élesztőkhöz, mint például a Hansontdn poh/morpha-hoz, a Líwsmebnmmnnes pombe-hoz, a föuyvorompces toeks-hoz, a eemmpees jrapíhs-hez, az bsninpo mm/dts-hoz, a pustons-hoz, a Pkrh/α methonohcu-hoz, a Pk'hkx pulOermon es a Candida mntesu-hoz használható transzformációs rendszer re tak a sí és mtsai: Journal u- a <v 132, 3459-3465 (1986); számú Amerikai Eavesült Államok-bek szabadalmi leírás), Az enphus sejteket McKníght és munkatársai módszerével hasz* * Φ««χ «« φ

Φ X Φ ♦: Φ «

Φ φ Φ Φ φ Φ:φ. φ χ

ΦΧ*Φ ΦΦΦΦ φ φ χ φ ♦»:*·»

Φ Φ χ* **. <

Hálhatjuk (4,936,349 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadaimí leírás), Az Aeremoníum chrpsopenum transzformálási módszereit Sumitomo és munkatársai publikálták (5,162,228 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). A

Neumspora transzformálási módszereit Lambowitz írta te (4,486,533 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás).

(CAT) gének promotere. Abból a célból, hogy megkönnyítsük a DNS-nek a gazdaszervezet kromoszómájába való integrációját, az az előnyös, ha a plazmid teljes expressziős rendszerét mindkét végén a gazdaszervezet DNS szekvenciái határolják, Piehin.

methunoüeu-ban az elönvben részesített szelekciós markor a

............. ............. ............. ..................

Pipáin metánnoite ADE2 génje, ami a ínszíbribozibSaminoimídazol karboxüáz (AIRC; EC 4.1,1,21) enzimet kódolja, és lehetővé teszi, hogy az ade2 gazdasejtek adenin távollétéhen növekedjenek, A nagyméretű, ipari alkalmazásokban, amikor kívánatos a metanol felhasználásának minimalizálása, az az elő48 :fe x «:«* X fe» * φ: fe fefe :fe * * fe * Ψ fe fefe fe * fe fefe fe fe fe fe» fe fe fe: fe fe fefe * fe fe' *fe ' nyos, »o gazdase m* *·*·* metanolt hasznosító gént (AUG1 és AUG21 kivágtuk, A szekretált előállításához a vakuoláris proteáz gér defíeiens gazdasejtek használata az előnyös. Elem használunk egy olyan plazmádnak a Pichiu tatására, ami a számunkra ért sazza. Az az előnyös,

és

methunol fen sej teke t exponenciális leesengésü, aminek az erőssége 2,5-4, c és az időállandó 1

söradóval transzformáljuk. 5 elektromos mezőt v/cni, el milllsze

A prokaríőta tórium, a JBueÖíus és m.

a és a bennük klónozott idegen jól ismert a szakterületen Cloning: A Laboratorv Manuai; 2, ring Harbor Press,

BR43x2 polípepiidet baktériumokban.

szervezeteknek a t

(1989)1 Ha

Eschen'ehm coli-bán expresszálunk, akkor a poii

vagy redukált és oxidált glutationnal szembeni ese jában, vagy a períplazmabkus térbe irányíthatók egy szekréciós szekvenciával. Az előző esetben a sejteket majd a szemcséket kinyerjük, és denaturáljuk, példán izoeianái vagy karbamid felhasználásával, A denaturált :k azután újra kialakítjuk a térszerkezetét, majd a denatuszer hígításával dimerizáljuk. például karbamid oldattal, ahzálás révén.

4f * Λ #· * Φ * ?, * 2 * * * * * φ « φ * ί-<Λ ^s < •Λ'» Λ» Γ ezt követi a dialízis pufferelt sóoldattal szemben. Az utóbbi esetben a polipepüd a sejtek elroncsolásával (például ultrahangos besugárzással vagy ozmotikus sokkal) oldható és funkcionális formában kinyerhető a periplazmatikus térből, aminek során a periplazmatikus tér tartalma kiszabadul, és a fehérjét kinyer tm az az 'a és a térszerkezet kialakítására,

A transzformált vagy transzfe kiált sejteket hagyományos cl teuyészttük tápanyagokat és a ges más területen, lis ammosavakat, vitaminokat és ásványi maznak. A táotalaiok, ha szükséges, ü is, mint pél szérum, szelektálja a sejteket, például valamilyen hatóanyagos esszenciális tápanyagban való defieieneiá mentái az expresszlós vektoron levő, vagy ko~í lekoiós marker, A Píchta mothanokcu sejteket olyan táptalajban tenyésztjük, ami megfelelő szénforrásokat, nitrogénforrásokat és el levegoz azaz például kis lombikok razatásávai, vagy a levegőztetésével A Píchía medmnoto előnyben részesített táptalaja az YEPD (2% D-glükóz, 2% Saeto'^ Peptone (Difco Laboratories, Detroit, köl 1% Bacto™ élesztokivonat (1 hahóratörlés), Ö,OÖ4% adenin és 0,006% lencin,

lóval, vagy egy , amit kompiesze-

•φ

X >

# χ * árts BR43x2

BR43x2 kiméra vagy fúziós pólipeptídek) frakeionálással és/vagy hagyományos tisztítási módszerekkel és közegekkel tisztíthatok. Az az előnyös, ha a jelen találmány szerinti fehérjéket vagy polierösen tisztított formában biztosítjuk, azaz J5%-nál nagyobb, előnyösen nagyobb mint 99%, Az ammónium-szuliatos kiesapás és a savas vagy kaotröp extrakeíő áonálására. A

es y szartartoznak például a feni-, butit- vagy oktiiHaas. Montgomeryvtlle, PÁL az GctyhSepharose (Pharmacia) és a hasonlók, vagy a poiíakril gyanták, azaz például az Amberchrom CG71 Í'Toso Haas) és hasonlók, A megfelelő szilárd hordozók közé tartoznak az üveggyöngyök, a szil iká (alapú gyanták, a cellulőzgyanták, az agarozgyöngyök, a kereszíköféses agarózgyöngyök, a pollsztirol » a KeresztKoteses nöiia&rnamM gvantaK es es között oiöhata dánok. Ezeket a gyón

észvagy szénhidrát egyse közé tartozik ps ti a brőmciános aktiválás, az gíg v po Uó A

5;

* X «*Ο χχ Φ * * φ Φ Φ * * * * Φ Φ ΦΦ Φ Φ '» « , « X « X » χ · X » X » » * X *χ X» « roxi szűkein imides aktiválás, az e tlválás, a hídrazid aktiválás, vs id aktiválás, a szulíhidril ak~ öá~ és amíno-szár-

más szilárd közegek a szakterületen jól ismertek é ak, kereskedelmi fór r ví

módszerei jól ismertek a módszer kiválasztása rutinszerű tervezés dolga, és ezt részben meghatározza a kiválasztott hordozd (ASlmiy Cl;

, es kompetitív elűeióva! eluálhalők, csökkentve a pH-t, vagy erős kelátképző ágenseket használva. Más tisztítási módszer lehet a

ΡΊ * lektin-affinitási kromatográfíával és ioncserélő kromatagráhával való tisztítása (Methods ín

Deutscfeer, Academie Press San Diego további megvalósítási módjai szerint a számunkra érdekes polipeptid és egy affinitás-jelölés (azaz például mai tózkötő .fehérjék, FLAG jelólés (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (13, számú szekvenciái), Glu-Glu jelölés (Glu Glu Tyr Mct Pro Met Glu 114, számú

X X XX«Í φ·χ «γ

Φ Φ: X Φ * Φ ♦ Φ * * Φ Φβ Φ Φ * * Φ Φ * * * Φ X Φ X Φ X .« Φ χ χ Φ* <.φ 4 szekvencia)), egy immunglobulin dómén) fúziója állítható elő a tisztítás megkönnyítésére.

Előnyösen a fehérje térszerkezetének újból való kialakítása (és adott esetben a reoxidáeíó) Is használható. Az az előnyös, ha a jelen találmány szerinti polipeptldeket »80%~οδ tisztaságban, még előnyösebben a:90%-os tisztaságban, és még ennél is előnyösebben a95%-os tisztaságban, és legelőnyösebben gyógyászaiilag tiszta állapotban, azaz nagyobb mint 99,9%-os tisztaságban állítjuk elő, a szennyező makromolekulák, főleg más fehérjék és nnkleinsavak szempontjából, és mentesek a fertőző és pirogén előnyösen lényegében mentes ágensektől Egy

rek vagy multimerek; £

Sállít í monomé .tek, vagy nem-glí.' ; és vagy tartalmaznak induló ént megadható

olyan polipeplidek tartoznak, amik 32-40 csí , és aminosav szekvenciájuk az alábbi motívumnak

C UMLV] XCX {3} CX {6-8} CX {2} (W) C (10. számú , és az ebben a leírásban ismertetett korlátozásoknak

találmány szerinti polípeptidek előállít,hatók fázisú szintézissel, részleges szilárd fázisú módszerekkel, fragmens kondenzációval vagy klasszikus, oldatban végzett szintézissel A polipeptideket előnyösen szilárd fázisú peptidszintézissel állítjuk elő (MerrííMd: Journal of the American Chemical Soeiety 85, 2149 (1963)1. Á szintézist olyan arnhio* X

savakkal hajtjuk végre, amik az a-amino terminálisukon védve vannak. A labilis oldalláncúkat tartalmazó trífunkeiös savakat is megfelelő csoportokkal vt a nem-kívánt kémiai reakciók összerakása során, Az coamino védőesoportot szelektíve eltávolítjuk, hogy

φ φ φ φ

X Φ Φ Φ

ΦΦΦ χ Φ φ-φ.

Φ Φ

ΦΦΦ» φφ

Φ Φ X

Φ ίχ

Φ X Φ * φφ

reakciókat az N-ter

α-amiöo vé ismert, hogy jól használhatók a tid szintézisben. Ide tartoznak az aed ul a

csoport). Az előnyben részesített vés

A kiválasztott oldallánc védoesoportoknak a kapcsolás során változatlanoknak kell maradniuk, és nem szabad leválniuk az N-lermináUs védőcsoport eltávolítása során, vagy a kapcsolás körülményei között. Az oldallánc védőcsoportoknak eltávolítjainaknak kell lenniük a szintézis befejezése után, olyan körülmények között, amik nem változtatják meg a befejezett polípeptidet. A iBoe kémiában a trífunkeiös aminosavak oldallánc védő54 φ *· * φ » Φ X Φ

Φ »Χί φ· φ «>*·:♦ φ* X

Φ Φ * X

Φ *.« 9 « '* * φ φ φΧΛ

Φ Φ φΦ Φ «λ. Az Fmoc leginkább tere-budi vagy tritil alapúak.

A tBoc kémiában az előnyben részesített oldallánc védöcsoport tozíl az argininhez, ciklohexll az aszparaginsavhoz, 4metilbenzil (és aeetamidometil) a ciszteinhez, benzil a gin tárnánsavhoz, szerbihez és treonínhoz, henziloxnnetü lés dínifrolenil) a ez, 2~Ci-benziÍomkarboml a lizinhez, farmi! a tripto-

oz és 2reszesített rán-5-szulfam! (Pbfi az r temhez, glutaminhoz és hiszt

az elonyva a 2,2,5,7,8-

szintéziséhez a foszfáté; lse utáni bevitelét is használjuk. A db a szer inén, tre öninon vagy tirozinon vas

ÍVÓ jük meg az Fmoc kémiában, illetve a tBoc kémiában metil-, benzil- vagy rendcsoporttal. Az Fmoc kémiában a foszfotirozin direkt beépítését is használhatjuk, foszfát védőcsoport használata nélkül. Abban a stratégiában, amikor a szintézis befejezése után bevitelt alkalmazzuk, a szer In, treonin vagy tírozin megvédetlen hídroxi-csoportjaiböl a szilárd fázison származékot képezünk, di-terc-but.il-, díbenzíl- vagy dimetikN.N'bndlb idroperoxiddal oxidáljuk.

A szilárd fázisú szintézist általában a C-terminális tol kezdjük, az a-amlno csoporton védett (oldalláncon is védett) amino55

savat egy megfelelő szilárd hordozóhoz kapcsolva, Észterkötés jön létre, amikor létrehozzuk a kapcsolódást a klőrmeiib,

Idórtritíh vagy hidroximetihgyantához, és a tídnek szabad karboM-csoportja lesz a C· változat szerint, ha egy amid-gyantát, azaz amin vagy pmieülbenzhidrilsmin gyantát (a tBoe kémiához) és ad vagy PÁL gyantát használunk (az FMoc kémiához), étre, és a kapott polipeptid karhoxamid csoporttal

és Athénon

közvetlenül

ant.ához ugyanaz, mint céziumdetrametilam.mómum sója ammóniám ulaí v« eiso aminosav kg az amid kötés pcsolásí ·» » fc

KS4* fc fc * # * fc * fc* .•fc fc Λ· fc « fc fc ·**. fcfc

A gyanta hordozóhoz való kapcsolódás után az o-amino védöösopórtot különböző reagensekkel eltávolítjuk, a védelmet adó kémia természetétől (azaz például (Boc, Fmoc) függően. Az Fmoc eltávolítás mértéke követhető 300-320 nm-en vagy egy vezetőképcsségi cellában, Az a-amino védőcsoport eltávolítása után a visszamaradt, megvédett aminosavakat lépésenként kapcsoljuk, a megkívánt sorrendben, azzal a céllal, hogy megkapjuk a kívánt szekvenciát.

Különböző aktiváló ágensek használhatók a kapcsolási reakciókhoz, beleértve a DCC-t, a DIPCDId, 2-klór-l,3-dímetil-

vagy pírrolidm analógját íBBPyU), az O-(7-a zol— I -Ül· 1,1,3,3 - te tramctil -uronium hexaíluorofoszfá tót í HATL0 és tetrafcoroöorát analógiát (TATU) vagy ptrrolídin analógját (HAFyUb A kapcsolási reakciókban használt legáltalánosabb katalitikus adalékanyagok közé tartozik a 4-dimetllaminopíndin d, a 3-hidröxh3,4>dihídrö-4-oxo-l,2,3-benzotriazin k és az 1-hidroxi-7-azahenzotriazoÍ (HÖAtk Mindegyik megvédett aminosavat. fölöslegben használjuk (>2,Ö ekvivalens),, és a kapcsolásokat általában N-metilpírrolidonban (NMP), vagy kapcsolási reakció lejátszódásának mértékét minden lépésben ellenőrizzük, azaz

és rntsak

Ο Λ ♦ *«!

ΦΦΦΦ Φ

X X Φ -φ * «φ Φ «

Φ « Φ -χ φΦφ Φ* ΦΧ φ <*?

·/ >

A kívánt pepiid teljes összerakása után a peptid-gyantát megfelelő gyökfögót tar talmazo reagenssel hasítjuk. As Fmöc peptideket általában gyokfogókat (azaz például vizei, etándíholk fenolt és tioanizolt) tartalmazó trlftuorecetsawal hasítjuk, A tBoc peptideket általában folyékony hidrogénfluorlddal hasítjuk és védőesoportmientesítjök 1-2 óra hosszat, -5 *C és ö °C közötti hőmérsékletem amivel a potipeptidet lehasítjuk a gyantáról és a azaz

és a phogy alkilezzék és , Á triploíán

^PAI és a trhnetílsziiil-Íritartozik a b Ouoroacetát ff'MSÖTO.

A jelen találmány tárgyát számos fúzió és rokon multimer pc:

uzióiát tar talmazzák

BCMA

val, tipikus esetben

sz lánc konstans régiófűzionáltatva expresszáltaiható, amik két konstans régió dornént tartalmaznak, és hiányzik belőlük a variábilis régió. Az ilyen fúziók tipikus esetben multimer molekulák formájában szekretálódnak, amikben az Fe

Φ

Φ X •η φ φ «: .·*· •X * φ Φ

ΦΦΧ* ΦΦΧ > * φφφφτ φ

Φ χ Φ* ' φ χ*

Φ 9 99 részeket

toztatott se zo mulömer BR43x2 analógot

Ili tani. A kisegítő ttiuk a kulekulákba irányítsuk őket. A fúziók készíthetők uránok fel

eszközeként, szignálok ín oitro blokkolására, specifikusan kítitrálva a ligaodumokat a Ugandumoknák a sejt felszínére való z, vagy BR43x2 antagon blokkolják a Rgandum s z a fúziós íáoo egy Fc hozzáköthetők egy hordozóhoz, és ELISA-ban használhatók.

lésekkel v;

fúziós fehérjéket például arra használjuk, hogy azonosítsuk a BR43x2. kgandumokat, valamint a természetes hgandurn ágon is59 .»· * * Φ X Φ «ΦΦΧ X ΦΦΧ β χ »Χ·Χ·:Φ: ΦΦ *· φ φ XX « XX *« «φ iáit és aníagönístáit A jelzett, oldható BR<3x2 felhasználásával a iígandumot, agönlstákat vagy antagonlstákat expresszáló sejteket daoreszeeneíás immuncitomehhával vagy ímmnnhisztokémiával azonosítjuk. / dómnak a szövetekben vagy s eloszlásának tanulmányozására, és a •ν' gíába való betekintésre.

A lígandum, agonisíák vagy antagonistáí, tisztításához BR43x2-íg fúziós antagonístát tartalmazó mintához, ólvan

Vf

a Iígandumot; az agonistát vs

en közel fiziológiás hő Gr-hgandum i-n és ionerősségen}, A re(ami edy szil

gyanta gyöngyökre van íme maga is egy s az el u álás t az előzőkben Ismertetett is.'

A liyandnraot. az agomsuu, > azaz például só- vagy Az alternatíva szerint a z köthető, a kötést és

Ví haszná st ei ígarózgyöngyökhöz, pohsztírol gyöngyökhöz, keresztkotéses ilamid gyantákhoz és hasonlókhoz tmmobilizáijuk araik a andó körülmények között, oldhatatlanok. A receptor polii jól ismertek a az aminkémia, a válás, az N-hídroxíszukcínbníd aktiválás, az szulfhídríl aktiválás és a hidrazid aktiválás, A a 0.1 mias, a anyagot a tálában oszlopba töltjük, és a iigandumot tartahnazó folyadékokat egyszer vagy többszöi dum kötődhessen a receptor >avaí e

vagy a va

Ahhoz, hogy az oldható receptornak a gazda portját Irányítsuk, az oldható receptor DNS-t egy réciös pepiidet azaz például egy t~PÁ szekréciós

DNS szegmenshez kapcsoljuk. Ahhoz, hogy megkönnyítsük a szekretáh receptor poUoeptíd tisztítását, a reet egv N'termmáhs vaw él-

SZUA jelen találmány szerinti funkcionális ránhoz rővizsgáiatokoan, a szakterületen számos esszé ismert. Ezek az esszék azon

Sí es a

a megcélzott

kontroll értékhez viszonyított változása jelzi, hogy egy vegyüíet befolyásolja a BR43x2 által közvetített metabolízmust. Az egyik ilyen esszé a sejtszaporodási esszé. A sejteket egy tesztvegyüíet jelenlétében vagy' távollélében tenyésztjük, és a sejtszaporodást például tríciált tímídin beépülésének mérésével, vagy a 3-(4,5-dimetíltiazol-2-íO-2,S-dtfenil tetrazohum hromid ÍMTT] LMosmaru d, Immunological Methods 65, 55-63 (1983)1 metaböhkus lebomlásán alapuló szinreakelóval mutatjuk kí, Egy alternatív esszé forma olyan sejteket használ, amiket egy riporter φ*φ φ

* * φ φ» φ

Φ * * * * «,

Φ * φ * Χ*ΦΦ φ * φφ * φ

Φχ

Φ Φ φ* gén expresszálása céljából génsebészet! módszerekkel tovább módosítottak, A riporter gén egy promoter elemhez kapcsolódik, ami reagál a receptorhoz kötött bioszintézis útra, és az esszé kimutatja a riporter gén transzkripciójának aktiválását, A szakterületen számos különböző riporter gén ismert, amik könnyén vizsgálhatok sejtkivonatokban coO aceUltranszferáz (CAT) és a szérum-válasz

: használjuk azután.

juk, A transzíekiáll újabb pool-okra való osztás, sejtek újbóli átvizsgálása után, resszálő klonális sejtvonalat.

< * >*·** φφ 8 * * Λ * * * * * Α φ· Φ Φφ φ Φ »*ΦΦ *Φ*Φ χ φ * φ ***φ * X *Φ »Φ «“ dói használhatunk egy vizsgáló rendszert, ami egy ligandum-kötő receptort (vagy egy ellenanyagot, egy kornplement/anti-komplement pár egyik tagját), vagy annak egy kötő fragmensét használja, valamíxit előnyösen egy kereskedelmi forgalomban levő bioszenzor berendezést alkalmaz (azaz BlAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, Nd), Az ilyen rect tort, ellenanyagot, egy komplement/antl-kompleraent párt vagy annak íragmensét egy receptor chip-re immobilizáljuk. Ennek a ek a használatát Karfáson valamint Cnnningham és

240 (1991); Curmingham és Wells: Journal of Molecuiar Bioiogy

vagy kink, amin- vagy kémiát menst, (1993))

za. , amiK egy ;szt-mlniát bocsátunk át a ment pár másik tagja van jelen a mintában, akkor kötődik az enanvagnoz vagy taghoz, ami a közeg ízzs., ami az aranyfílm felszíni plasmon rezonanciájának változásával mutatható ki. Ez a rendszer lehetővé feszi az on- és ofBarányok meghatározását, amiből a kötési affinitás kiszámítható, és megbecsülhető a kötés sztöchiometriája. A iígandum-kőtó receptor polipeptidek a szakterületen ismert más vizsgáló rendszerekben is használhatók.

Ilyen rendszer például a Scatchard elemzés a kötési affinitás meghatározásához (Scatchard: Ann, NY Acad, Sok 51, 660-672 (1949)1, valamint a kalorimetriás elemzések jCunmngham és * * * * X« ΦΦ χ « » φ φ φ* * « * φ φ «φ φ φ «'Λ* χ$Φί φ φ φ Φ φ β φ *' Φ 1* φβΦ * mtsai; Science 253. 545-548 (1391); Cunntngham és mtsai: Science 245. 821 -825 (1991 )i

Az oldható ^l25l-ztní4-nek a TAGI-hoz és a BCMA-hoz való kötődésének Scatchard piot elemzését a 2. példában mutatjuk be, és a 7, táblázatban összehasonlítjuk a TNFR család más tagjainak kötési konstansaival.

§4 * * ·Ύ χ * * V X -X » * * * 9 ΑΧ ' «

X φ:Ά·« Φ φ ·% $ Φ·λ ·' ”» ' «► '4f >7. táblázat

a; Hohrnan és mtsai: Journal of Biological Chemistry 264, 14927-3491989;

b: Manna és Garval: Journal of Biological Chemistry 273,

33333-41 ΠΘ98Ι c: Goodwín és mtsai: Cell 73, 447-45 (1993;

d: Armitage és mtsai: Natúré 357 80-82 (19921 e: Shuford: J. Exp. Med. 186, 47-55 (1997) int a BR43x2 poli pép 96 aktiválása szilíkonhíoszenzor mikrofiziométerrel mérhető, ami a receptor me

*Λ· $· *<· léséhez és az azt kővető fiziológiás eelldláris válaszhoz kapcsolódó extracellnlárls savasodási sebességet, vagy proton exkréciőt méri. Ilyen berendezés példán! a Cytosensor™ Microphysíomeler, amit a Molecular Devices, Sunnyvale, CA cég gyárt. Számos különböző cellulárís válasz, azaz példán! a válasz, szabályozó és receptor aktiválás és hasonlók, mérhető ezzel a módszerrel [MeConnel és rntsal: Science 257, 1906-12 és mtsai dili és mtsai: 9, (1998); Van Liefde és mtsai; Eur, J, Pharmacol, 346 87 (1998). A mikrofíziométer arra is használható, hogy vizsgg eukariöta vagy változását mérve a méri a különböző ingerekre a BR43x2 poiipeptid agonisták, ligandumait vagy antagonistást. A mlkrofizíométert előnyösen egy _t válaszainak mérésére haszeukariöta sejttel összehasonlítva, ami üdét A BR43x2-t sejtek tartoznak, ;

r a BK43X2-t, az itt ismertetett módon, ezzel olyan sejtet hozva létre, ami reagál a BR43x24. olyan s mőmirigy-szövetböl vagy PBL-ekhől származó származó sejteket. A BR43x2-t expresszáló sejtek válaszának a kontrolihoz viszonyított különbsége, amit az extracelluláris savasodás növekedésével vagy csökkenésével lehet mérni, közvetlen mértéke a

nem

c:í> <

Azingerekre, vagy , < « φ * *

Φ φ Φ X φ *♦ * * χ ΦΦ X φ XX Φ » * * » φ φ φφ ♦» *

BR43x2-vel modulált ceihdáris válaszoknak. Emellett, az. ilyen BR43x2 által modulált válaszokat számos különböző stimulálsz mellett lehet vizsgálni. Emellett, a mikrofízíométert használva és antagoeljárás biztosítható a BR43x2 nolioentid sor Pistáinak azonosítására, azzal jellemezve, hogy a pepiidet expresszálő sejteket biztosítunk, majd a sejtek egyik részét a teszt-vegyulet távollétében tenyésztjük,, a sejtek másik részét a teszt-vegyület Jelenlétében tenyésztjük, majd kinin tatjuk a sejtek második része ceiluláris válaszának növekedését vagy csökkenését a sejtek első részéhez viszonyítva. Az antagonisták és agomsták,, beleértve a BR43x2 polipeptid természetes ligándumát is, ezzel a módszerrel gyorsan azonosíthatók.

például a doxoruhlein, daunorubieín, a metoirexát és a cywxam lehetnek toxínok, azaz például ricin, dlftéría, Fseudomonos exotoxin A és abrin; és a citoszlatikus T-sejt sejtfelszíni molekuA

;1 íplow Cytometry and

Current Protocols in *

« X* fe fe φφ fe t # *

Xfe * , φ fe .1, szerk,: Coohgan és munkatársai, John Wíley and (19971) kiderült, hogy kötődik a BR43x2-bőz (2, számú szekvencia), a TACI-hoz (6,. számú szekvencia), a BCMA-hoz (8, számú szekvencia) és a BR43xI~hez (9. szánni szekvencia), FACS elemzéssel az FITC-vel jelzett, oldható ztnf4-röl ís kiderült, hogy specifikusan kötődik, többek között más dolgokhoz is, a B llmfo-

ási és T-sejt szapo-

t, és nem lehet kimutatni a ztn.f4 y bármilyen más biológiai hatást bármelyik vizsgált lnnék következtében a ligandum és a receptor Bsejtekre való specifítása azt sugallja, hogy jól használhatok az autoimmunitás, a B-sejt rákok, az immunmoduláeió, az 1BD, és bármilyen ellenanyag által közvetített patológiás állapotok, azaz például az ITCP, a miaszténía gravlsz és hasonlók, vesebetegségek, indlreM T-sejt immunválasz, graft kilökődés, graft-versushost betegség tanulmányozásában és kezelésében.

A ztní4-röl kimutatták, hogy aktiválja a B-sejteket, ami a B~ szaporodását, ellenanyag termelődését és az aktiváló marχ * φ 9 9 » χ«ΦΧ

Φχχ« ♦:'< * Φ

Φ ΦX * * <*4 ♦ * kerek erősödését eredményezi ín ukm {lásd az alábbi példákat!. Ezekhez a hatásokhoz szükség lehet ko-stimulálásra interleukin4-gyel, vagy más citokinekkel való ko-stimulálásra a B-sejt antigén receptoron vagy más sejtfelszíni receptorokon keresztül amik aktiválják a B-sej te kei. azaz például a Cf.)40-et, Más tumor

semlegesítésével Biológiai esszé és BUBA-k állnak rendelkezésre a ztní4-re adott celluláris válasz mérésére, oldható BR43x2. TACI és/vagy BCMA jelenlétében. Más esszé lehet még az, ami méri a cítokin termelés változását, ami a celluláris válasz mértéke •Current Protocols in Immunology, szerk.: John E. Cohga és munkatársai, ΝΊΗ (.1996)1 Vannak esszék, amikkel más celluláris válaszokat lehet mérni, beleértve az ellenanyag izotípust, a monoeita aktiválást, az NK sejt képződését, az antigént prezentáló sejtfunkciót, az apoptózist.

Á jelen találmány szerinti BR43x2 pokpeptidek jól használhatók lehetnek a ztnf4 hatásainak semlegesítésére a pre-B vagy

B-sejt leukémiák, azaz például a plazmasejt leukémia., krónikus * « X Φ Φ * φ χ X Φ * ΦΦ Φ χ «««$ 9 999 Φ φ * * Φ*.φΦ ' « Φ. ·Χ·Χ· φφ * vagy akiit limfocitás leukémia, mielómák. azaz például a többszörös mlelóma, a plazmasejt mielőma, az endotehalis mielómz és az ődassejt midóma; valamint límfómák, mint például a nemHodgkín limfóma kezelése során, amihez a ztníá

mennyiséi® ν' ......\ hasznos komponens lehet egy terápiás rezsimben, a tumor és a

A Northern biot elemzés azt mutatta, hogy a ztní4 expresszálődik a CDS* sejtekben, á monoeitákban, a dendroeitákfean, az aktivált monoeitákban. Ez azt sugallja, hogy néhány autoimmun rendellenességben a citotoxikus T~sejtek serkenthetik a B-sejt termelődését, a zt.nf4 fölöslegben valé :ul. Az immunszuppresszáns

nyagok vezeti előfordulásához, és a szisztémás lupus eryfhematosus számos tünetét eredményezik, beleértve a vese-elégtelenséget, a nenraigiás tüneteket és a halált. A oelluláris választól független ellenanyag termelődés befolyásolása is előnyös lehet számos B-sejtekről azt is kimutatták, hogy szerepet, az artbrítogén hnmunglöhulinok szekréciójában a reumás arthritisben IKorganov és mtsai; Immnnity 10, 451-461 U999H. Mint Ilyen, a ztníá ellenanyag termelődés gátlása hasznos lehet, autoimmun betegségek, azaz például miaszíénía.

es reumás apiás szerek, azaz pél

Az immunszuppresszáns az ol

4 ΦΦΦΦ *« * φ Φ * * * ♦ »· φ Φ « « *» * * «$«« #**Φ * »49 **?» * * *» ** * hatók lehetnek Ilyen célokra. A jelen találmány szerinti

st, fúziókat, ellenanyagokat, agonístákat vagy antagönístákat használó eljárások a végső stádiumű vesefoete vagy k<

ve;

lódnak az autoimmun beteggy: nem - kapcsolódó B-sejtek hatásának szelektív vagy neutralízálására. Az ilyen módszerek arra ís lehetnek, hogy immunológiai. vesebe teásét

Az il

glomerulonefritisz vagy vaszkulíüsz kezelésére, A jelen találmány szerinti eljárások jól használhatók lehetnek egy: terápiás alkalmazás részeként, az intem ticiális neírítlsz vagy & krónikus

X, X ΦΦ Φ

Φ φ ' φ ♦ * 9 β Φ Φ φ χ X* * *

Φ«♦* ΦΦΦΦ Φ « ♦ Φ **Χ » Φ ΦΦ ♦* * jelen találmány szerinti eljárások: vonatkoznak a BR43x2, vagy a BCMA polípeptidek, fúziók, ellenanyagok, agonísvagy antagonísták használatára magas vérnyomásos vagy -eres betegségek ~ beleértve a vese artériáiig sztenözlst vagy és koleszterines embóliákat, vaw vese

tok lehetnek azokban a terápiás protokollokban, amiket olyan autoimmun betegségek, mint az inzulinmeiiiius2 (IDDM) és Crohn betegség, kezelésében lehet használni, A jelen találmány szerinti eljárások további terápiás elönnyökkel rendelkeznek a krónikus gyulladásos betegségek, pontosabban az izületi fájdalom, a duzzadás, az anémia és más kapcsolódó tünk, valamint a szeptikus sokk kezelésében.

..4 vai fehérjék hatását az immunválaszra úgy mérhetjük meg, hogy a y szerinti poíipeptideket olyan λ vénnel immunizáltunk, majd ezt egy zt o követi, és merjük az ellenanyag izotipus termelődését, v£u« a B és T-sejt válaszokat, beleértve a késleltetett t és az in okro szaporodást, valamint a eiíokin a szakterületen ismert módszerek szerint.

mennyiseget aunntí oe egy, az gyüietbök a) a 4. számú szekvencia szerinti számú szekvencia szerinti tartózó ve-

számú szekvencia szerinti polipeptídböl az 1-188-os aminosav o e) 8. számú

150-es aminosav csoportok; f) fragmens, ami specifikusan pepuonez; és g) egy e. mens, ami specilikusan :. A fúzió;

szerinti polipeptídböl az ieöenanyag vagy ellenanyag a 4, számú szekvencia a ib. számú szekvencia sz é tartozik például az oh

us, számú szekvencia), a. TACÍ ia 6. számú szekvencia 1186-os aminosavai) vagy a BCMA (a 8. számú szekvencia 1 - 158es aminosavai} fúziói egy más előnyösen egy φ φ «·ΦΛφ; φφ Φ * φ φ « -φ * * 9 9 * Φ X* χ Φ

X Φ # * Φ X* φ 9 ♦ :* 9 Φ Φ ίΧ Χ * * 94 <9 9 immunglobulin nehéz lánc konstans régió Fc fragmenssek A találmány hasonló módon biztosít eljárást a SR43x2, TAGI vagy BCMA receptor-lígandum részvételének gátlására.

Az ilyen módszerek különösen jól használhatók akkor, ha a ztní4 aktiválás kapcsolódik aktivált B Hmíocítákhoz, valamint a pre-B-sejt vagy B-sejt rákok kezelésére. Az ilyen módszerek különösen jól használhatók lehetnek, ha a ztnf4 aktivitás kapcsolódik az ellenanyag termelődéshez. Pontosabban, az autoimmun beteg;zs azaz a szisztémás lupus erythematosishoz, z reumás

yos arthritishez

A jelen tál

a sz.

és ín íduo 1 agoazonosított vesára és a megm ráíró es ín oíuo tejiótíesenek módosítására. Példa agonista vegyületek jól használhatók önmagukban, vagy d és hormonokkal kombinálva, egy meghatározott más

an (agonistakéní azonosított v<

szintén ál használhatók a immorális immunválaszok erősítésére. A Bak a fertőző betegségek - beleértve a hakteriá'anizmusok elleni ellen;

zc iis, vn fertőző

* Φ Φ * «

•·φΛ

Φ* • * '

lizálni a patogénb oly módon, hogy kötődnek az antigénhez, által közvetített lízist vagy sejt által közvetíteti végre. Egy BR43x2 antagonista arra is szolgálhat, hogy erősítse a humorába választ, és jól használható szerként olyan egyedeknéh akiknél nagy a kockázata a egedésnek, vagy a vakcinálás kiegészítőjeként, yát képezik továbbá azok az antagoamik vagy megkötik a BR43x2 polipeptideket, vagy', egy változat szerint egy ligandumot amihez kötődnek a 5l gátolva vagy eliminátva a BR43x2 zen BR43x2 antagonísták lehetnek példánl az elle anyagok; az orván ongonuKieonaok, amik vaav a bj megtartják azt a nem eredménye-

vei öl használhatók

-receptor köicsönha tás jellemzésére. A BR43x2 transzformált Bdik, beleértve az BBV-vei indukált és »ρ· valamint számos B-sejt nhelőmát. A gátlása hasznos lehet a B-sejt límfómák vagy a többszörös

« φ $>·»<* V* φ Φ « X * ♦ ' *:··; -φί V ésében. A BR43.X.2 antagonisták - azaz például χ2 oldható receptorok vagy ellenanyagok - használhatok terápiásán, hogy befolyásoljuk a tumor progresszióját,

Az agonisták és antagonisták aktivitását aktivitási esszékkel határozhatjuk meg, amik meghatározzák a receptor/ligán dum részvétel potenciálját, A stabilan transzfektált 8a Baí3 (rágcsáló pre~B sejt vonal;

és v 6, 4133-4135 (1986)), ami á magas szintjeit ko-expresszálja az NIKE etében, NFAT-1 és AP-l sejteket készítettünk, amik exp)ák a BR43x2~L A TACI-t és a. BCMA-t expresszálő sej ivódó. Jurkat és más B limfói

sejtvonalak, azaz pé' Palacios és Steinrneiz; mtsai; Moleeular & Ce

ik a kötődés mérésére,

A jelen találmány szerinti fehérjék vizsgálatára alkalmazott, in duó megközelítési mód virálís bejuttatás! rendszereket alkalmaz, Áz ilyen célokra használható vírus lehet például az adenovírus, a herpeszvi'rus, a retrovírusok, a. vafecínia vírus és adenoasszoelált vírus. Az adenovírus (egy kéiszálú DNS vírus) a jelenleg legjobban ismert géntranszfer vektor heterológ nukleinsav bejuttatásához (T.C. Becker és mtsai; Mefh, Cell Bioi, 43, 161189 (1994); d.T. Donglas és D.T, Curiel; Science & Medicina 4, 44-53 (1997)1 Az adenovírus rendszer számos az adenovírus

befogadni; (ii) magas literi,

5; (iii) széles körben fertőzi az emlős se at: és (iv) nagys á mindenütt előforduló, a sxővet-speeífiΦ Φ Φ * * χ X X φ * Φ ♦ Φ φ: φ χ· ;*« * Φ

ΧΦΦφ Φ«ΦΡ ♦ Φ * * ΧΧ.ΦΦ φ Φ ** φφ * kus és a szabályozható promoterekét is. Emellett, mível az adenovirusok stabilan megmaradnak a véráramban, beadhatók intra vénás injekcióban.

Az adenovírus genom egyes részeinek kivágásával heterológ DNS nagyobb inszerijei (egészen 7 kíloházlsíg) akkomodál hatók. Ezeket az inszerteket a vírális DNS-be közvetlen ligálással vagy egy ko-transzíektált plazmáddal való homológ rekombinációval juttatjuk be. Az egyik, példaként megadott rendszerben az esszenciális El gént kivágjuk a vírális vektorból, és a vírus nem dkálődik, hacsak az El gént nem biztosítja a a humán 293-as sejtvén al). Ha intravénásán toknak, akkor az adenovírns legelőször a májat veszi célba.

el sarun r a fertőzött állaton,

Az acienovirus rendszer használható in orfro fehérje-előállításra is. Az adenovírussal fertőzött, nern-293 sejteket olyan körülmények között tenyésztve, amikor a sejtek nem osztódnak gyorsan, a sejtek hosszabb ideig képesek termelni a fehérjéket.

Például a osszeno-

szerumrneníes szí, hogy a sejtosztódás nélkül. Egy . A sejteket azután < ami lehetővé teszi^ az adenovírus

t Φ Φ »* Φ * Φ φ « * * Φ Φ χ

Φ * X «φφφ ί « φ-Χ· Φ vektorral fertőzött 293 sejtek viszonylag nagy sűrűségben szapovagy szuszpenziós tenyészetben is, fehérjét termelve (Garnier és

Cylotechnol. 15, 145-155 (1994b. Bármelyik kísérleti

z e :ssz isméteken Izolálható a sejttenyészet felülúszójáből, iizátumából vagy membrán-üakciőjából, az való elhelyezkedésétől függően. A fertőzött 293 sejt előállítási leirint nem-szekretálődő fehérjék, is előállíthatok van.

A jelen találmány szerinti oldható BR43x2, TAGI vágy pohpeptidek ín oíoo hatékonyság

ilyen

n. evagy in táoo, az autoimmun amik az SLE erythematosusi tekinthetők. Az lek Ismertek a szakterületen (Autoimmune s, A Gnldebook, szerk.: Cohen és Miller, Academíc Black ÍNZB) és New Zealand White (NZW) keresztezés utódai az SLE spontán formáit fejlesztik ki, amik erősen hasonlítanak az emberi SLE-re. Az utód egerek, néven ismertek, egyhónapos korukban elkezdenek és 5-7 azaz

korukban az lg immunglobulinok. A ellenanyagok túltermeie goknak a. lerakódása, kd

gok a sett niperaztivitás az auto:t. Ezeknek az auto-ellenanya/szálú v

* * « Φ * «ΦΦ « φ < *«

Μ* Φ r 9 9 *♦ Φ X ' χ **«»

X* Φ vese-eíeg^tí>i<;> ellen készültek, a glomerulonefrhisz kifejlődésével áll kapcsolatban, ami klmikailag proteínuria, azotemia és vesebetegség következtében beálló balál kifejlődésével áll kapcsolatban, A g a vezető halálok azokban az egerekben, ;n spontán kifejlődött az SLE. és az NZBW törzsben ez a folyamat krónikus és megsemmisítő. Zt betegség sokkal gyorsabb és súlyosabb nőstényekben mint hímekben, a nőstényekben az átlagos túlélés hossza 245 nap, míg a hímekben 406 nap. Míg a nőstények közül több mutat tüneteket 7-9 hónapos korára, közülük néhány lehet sokkal fiatalabb vagy idősebb is, amikor tünetek fejlődnek ki bennük. Az NBZW egerekben látható fatális immun nefritisz nagyon hasonlít a humán SLE-ben megfigyelhető glonierulöneíritiszhez, ami ezt a spontán rágcsáló modellt nagyon vonzóvá feszi a xn es

...

lg, BC & vanv más

Autoimmune Disease és mtsai; J. oí , Az és fúziós az egereknek, azzal a céllal, hogy a TACI, a a. BCMA hatékonyságát kiértékeljük a tünetek enyhítésére tása menetének megváltoztatására, az ;t ismertetjük.

kísérleti allergiás gerincvelő- és agyvelö-gyulladás egér i az ímmun-l lsét mechanizmusainak és a zereinek vizsgálatának. A modell hasonlít a humán szkleróés a betegség

zis

eredményez, a T-sejt neuroί«» »

* φ

X β X Φ ΦΧ»Φ χ * Φ ·* χ φ * φ φ φ φ· * ♦ φ érjékre, azaz például a midin bázikus fehérjére (MBP) vagy a fehérjére való aktiválódásának eredményeképpen. Az an való inokuláeió vezet a CD4*. H-es osztályú MHC-korlátozott T-sejtek (Tii 1} indukciójához. A változások az EAE propokolijában akut, krónikus visszaesést, vagy a modell passzívtranszfer variánsait eredményezhetik (Weinberg és mtsai: J, of Immunoi. 162, 1818-1826 (1999)· Mijaba és mtsai: Cell.

Immunok 1.86, 94-102 (1999); Glahínski; Methods in Enzyrnology 288. 182-196 (1997)1. Az oldható TACI-Ig. BR43x2-lg. BCMA-ig vagy más oldható és fúziós fehérjék beadását ezeknek az egereknek, azzal a céllal, hogy a TAGI, a BR43x2, vagy a BCMÁ haa tünetek emfohAsére és a hetep'séss

and nagyon az RA-hoz

reumás arthritisre ;iaí és patológiai tnia s modellé teszi a

jgenezis ze az, mechanizmusa ismert. A ΪΙ-es típusú kollagénen azonosították a

T-sejt. és B-sejt epitopokat. és immunológiai (késleltetett típusú híperszenzitivitási és a gén ellenanyag) és gyulladási (citokinek, kemokinek és mátrixenzimek} paramétereket, amik az immun-kapcsolt arthri;.ők. és használhatók a teszt-vegyufet hatékony· ésére a saganaK meg· s es

SYÍ

SO

Φ * ♦ -φ X φ ♦ * Φ » » φχ X χ

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ φ X φ, '.φ ΦφφΧ < X ΦΦ ΦΦ Φ '9788 (1992); Myers és mtsaí: Life Scí. 61. 1861 9978 Wang és mtsai: Immunoi, 92, 8955-8959 (1995)], Az old» í~lg, BR43x2-lg, BCMA-.ig vagy más oldható és fúziós beadását ezeknek az egereknek, azzal a céllal, hogy a 71, a BR43x2, vagy a BCMA hatékonyságát kiértékeljük a tüenyhítésére és a betegség lefolyása menetének megválaz asztma modelljeit úgy lehet injekciózzuk, és nazáliantigénnel, ami az asztmához has, azaz létrehozni, ha az egereket, ov, san újra stimuláljuk egy olyan s sonlő asztmatikus válás

tó BR43x2 (TACI) vagy annak és a T- valamint a B~sejt mérésé.

r az egerexnek, azzal a cellái, hogy a TAC.L a vagv a BCMA hatékonyságát kiértékeljük a tünetek megvál-

>z a szakirodalomban ismertetett módon mérhető mtsai: d. of Immunoi, 163, 1123-1127 (í 999)(,

Iszeres antigén (azaz például ovalbumín vagy kollagén] .ek kitett állatokban immunválasz váltható ki a va^y oldható Ig-fózíók losa és

Φ: Φ ΧΧΦΦ * * * φ φ * ♦ φ »

X * «Γ φ Φ Φφ φ ·9

ΦβΦΦ ΦΧΦΦ Φ φ Φ * φφφφ

Φ Φ χ* ** φ kel vagy oldható fúziókkal kapcsolatban, azzal a céllal, hogy' meghatározzuk az ilyen polipeptídek in vivő eloszlását és féléletideiét.. Továbbá állatmodellek használhatók az oldható

L TAGI vagy BCMA-nak a tumorokra, valamint a tumor in vivő fejlődésére gyakorolt hatásainak meghatározására,,

A találmány tárgyát képezi továbbá a BR43x2. TAGI vagy' BCMA polipeptídek használata, helyettesítő markerként az autoimmun betegségekben, vesebetegségekben, B- és T-sejt beteg» és a BR43x2, TAGI vagy BGMA. oldliatö rece ;aik kimutathatók a í??· ⁵

Az ilyen hetes A oldható rece

is. A. BR43x2, vagy a 8, számú szekvenciává; aminosav szekvenciával rendelkező peptidek elleni el tatok például egv expresszios vektor, ami a számunkra ér-

a megteteio aminosav tekintjük specifikusan

ez vagy a 8, számú szekveneiavázlainak megfelelő aminosav szekvenciáid pepiidhez vagy epitophoz (Któ KWmök vágy nagyobb, előnyösen ICR/moh vagy nagyobb, előnyösebben ICWmol vagy nagyobb, és msekben 1.0^/mol vagy nagyobb affinitással kötődnek, mnyag kötési affinitását a szakterületen jt er könnyen meghatározhatja, például bcatcnarö mer scatchard; Ami. NY Aead. Scl. 54, 860-672 (1949jf A megfelelő vágok közé azok tartoznak, amik kötődnek a BP^-

X fc

Λ * «fc * * fc * » fc fc *♦ ♦ * «»Κ» :«:«** X fc * ♦ fcfcfcfc

főleg a BR43x2 extracellulárís doménjéhez ía 2. számú szekvenciavázlat 1~ 120-as· amínosav csoportjaik valamint azok, amik a 10. számú s:

szekvenciával

Az. anü-BR43x2 ellenanyagok eiöáliithatők antigén BR43x2 'hordozó peptídek és polípeptidek felhasználásával. A találmány szerinti antigén epitopot hordozó peptídek és üdék tartalmaznak egy legalább kilenc, előnyösen 15-30 aminosavhöl álló szekvenciát, a 2. számú szekvenciavázlatban található amínosav szekvenciák kozni Azonban a találmány szerint aminosav szekvencia nagyobb részét tartalmazó aminosava aminosav szekvencia hosszáig beleértve a jelen találmány szerinti il. A en lárias szakember a meg (Hopp és mtsai: Proceedíngs of of Sciences, USA 78, 3324-3328 {19 öli the; Journal of Moieoular Biology 157, 105 a prolin csoportokat tartalmazó aminosav szekvenciái mintásához.

VS

Kvte és ‘bi.

vagy a nem polikionáiís ellenanyagokat a szakiészámára ismert módszerekkel lehet elő* φ * ο * ·* V Φ

ΦΦ0Χ φχ*

Φ Λ *»<[« φ* Φ ♦ Φ Φ ·Φ φ Φφ Φ φ * Φ * Φ ΦΦΦΦ *<Φ (,*· * állítani (Green és mtsai: „Production of Plyclonal Antísera, In: Immunochemtcal Protocols, 1-5, oldat szerku Manson, Humana Press (1992); Williams és mtsai: „Expression of foreign protelns in E, coli usiiig piasmíd vectors and pnriheation of spéciik:

.«melegvérű adatokat, azaz például szarvasmarhákat, kecskéket, birkákat, kutyákat, csirkéket, nyulakat, egereket és szerinti anti-ν ellenanyagból is. A diagnosztikaiiag és terápiásán hasznos nyag eioaunasanas anaianos teennmai megtaiamaton a sz dalomban (Goldenberg és mtsaí: WO 91/11465 számú nemzetközi szabadalmi leírás: Losman és mtsaí: Int, J. Cancer 46, 310 (1990Π, Az ellenanyagok előállíthatok transzgenikus állatokban Is, azaz

Λ Φ Φ’φφφ ΦΦ Φ

V X * Φ * *

Φ Φ Φ φ * Μφ Φ X

Ü Λ ««Φ* ΦΦΦΦ ♦ χ Φ *

QV» Φ φ φΦ *« * kecskében vagy sertésben, és módosított formában élesztőben vagy gombákban expresszáltathafók, ugyanúgy, mint emlős és rovarseit ekben, k is szerint monokionális anti . A specifikus antigének

-BR43x2 ellensní rágcsál > sza számara 258, 495 Π9752

i el és mtsai (s;

Iinmunology 1, 2.5,1-2.6.7 oldal, John Píckslev és mtsai; „Productíon of

In E. coli”

Systems, 2, kiadás, (Rohler és mtsai: Natúré k.b Current protocols in Sons (199.1); s against

Glover és munkatársai,

Oxford üniversi ty Press (..1995)

pozitív kiónokat, tenyésztjük az antigén ellen ellenanyagot termelő kiónokat, majd a hihrídöma tenyészetekből izoláljak az eilenaEmellett a jelen találmány szerinti anii-BR43x2 ellenanyag származhat egy humán monokionális ellenanyagból, A humán monokionális ellenanyagokat transzgenikus egerekből állítjuk elő, amiket génsebészeti módszerekkel ügy változtattunk meg, hogy egy antigénnel való ingerlésre adott válaszként specifikus humán ellenanvagokat termeljenek. Ebben a technikában a huss φ φ >»«» φφ φ

Φ Φ X Φ Φ * * φ « φ φ ♦« φ φ

ΦφΦ<Χ **Λ« Φ .Φ X Φ «**♦ φ φ *φτ φ* «

es

mán nehéz- és könnyű lánc fókusz elemeit olyan egér törzsekbe juttatjuk be, amik olyan embrionális őssejt-vonalakból származnak, amik az endogén nehéz lánc és könnyű lánc lokuszok célzott ronesolását tartalmazzák. A transzgenikus egerek a humán antigénekre specifikus humán ellenanyagokat k és az egereket arra használhatjuk, hogy humán ellenanyagot szekretáló hibrídőmákat szekre táljának. A humán ellenanyagok transzgenikus egerekből szereit a szakirodalomban már Natúré Geneties 7« 1.3 (1994); Lonherg és (1994); Taylor és mtsai:· Int. Immun, 6, «579 {1994) j.

A monoklonális ellenanyagok híbridoma láthatók és tisztíthatok, számos, jól kidolgozott technika Ilyen izolálás! technika lehet például az

Proten-A Sepharose-zal, a méretkizárásos ki es az í - gráfia (Coligán és mtsai (szerk,):

,7.1-2.7.12 oldal, John jy and Sons (1991); Baines és

M, oldal, The Humana Press, Inc. (1992)1,

Néhány specifikus felhasználáshoz kívánatos lehet az antb ellenanyagok fragmenseinek előállítása. Az gmensek előállíthatok például az ellei ével. Az ellenanyag fragmenseket hagyományos módellenanyag pepszines vagy papamos emésziét ieiriuK, hogy az

fragmensek előállíthatok az e

r pepszlnnél való enzimath b jelzésű 5S fragmenst. egy tiöl reagens

Φ φ Μ Φ Φ φ Φ « Φ Φ * * ♦ * Φ Φ Χ> * Φ ί»ΦΦ 9 Φ β « ΧΦΦφ St X ,<·* Φ·* * savai, egy 3,5S Fab monovalens fragmenst előállítva. Adott, esetben a hasítási reakciót a sznlfhidnl csoportokat blokkoló csoporttal végre, ami a diszulíid-köiések hasítását eredrnényesi. Egy másik változat szerint a pcpszinnel végzett enzímatl· kus hasítás két monovalens Fab fragmenst és egy Fc fragmenst eredményez. Ezeket a módszereket a szakirodalomban ismertetik {Goldcnberg; 4,331,847 száma Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Nisonoff és mtsai: Archives of Biochemistry

73, 119

Current il.ey and

szerint lehet nem-kovalens (lobar és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 2859 {1972)1. Egy másik változat szerint a variábilis láncok egy intermolekuláris diszulíidkötéssel kapcsolhatók, vagy vegyszerekkel, mint például glutáraidehiddel keresztkötések alakíthatók ki íSandhw. Crit. Rév,

-ή es zeket az egysz

X * φ Φ :87

Φ φ φ φ φ * • φ φ φ » «φ ♦ »

ΧΛ-φφ ΦΦΦΦ * « Φ X ΦΦφφ

Φ Φ φΦ »Φ ♦ génkötő fehérjéket. íseFV) úgy állítjuk elő, hogy létrehozunk, egy strukiürgénk ami tartalmazza, a Vh és Vr domeneket kódoló DNS szekvenciákat, és egy ohgonukleotld kapcsolja össze a két szekvenciát. A struktúrgént egy expresszlós vektorba építjük be, amit azután egy gazdasejtbe, azaz

láncot szintetizálnak, amiben össze a két V domént. Az scFv-k előállítás módszereit a szakirodalomban {Whitlow és mtsai: Methods; A Companion to in Bnzymology 2, 97 <1991.1; Bírd és mtsai; Science 242, 423 (19881; Ladner és mtsai:: 4,946,778 számú Amerikai

Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás; Faek és mtsai: Bio/Technology 11, 1271 (1993); Sandhu: Cnt Rév. Bioteohnology .12, 437 (1992)1

mutagenezissel és random ay

'e se sere,

olyan ismert azaz ami vagy egv

* Φ fefefefe ΧΦ φ

X Φ fefe 9 Φ * fe Φ 9 fe * V fe fe « Φ Φ « fe fefe fe fe Φ fe x feXfe* fe Φ fefe ** « egy biológiai vagy szintetikus makromolekula, szerves vagy szervetlen anyag; Az Ilyen random pepiid display könyvtárak létrehozásának és szűrővizsgálatának módszerei ismertek a szakíróan (Ladner és mtsai; 5,223.409 számú Amerikai Egyesült adalml leírás; Ladner és mtsai: 4,946,778 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Ladner és mtsai: 5,403,484 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Ladner és mtsai: 5,571,898 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás: Eav és mtsai:

ϊ»'·

H, és a random tárak átvizsgálására y könyvtárak, valamint az ilyen kö: tó kittek i<

>gen íné.-tói (San Díego, CA), a New En és a

, az

/ könyvtárakat az itt vizsgálhatjuk át, hogy azono-

íragmens

< meg, géneket állítunk elő.

(„minimális felismerési egység) óvv munkra érdekes ellenanyag CDR-jét kó Az ilyen géneket például úgy állítjuk elő, a variábilis régiót e ált. RNS-ről (Larríck és mtsai ángy 2, 10 ml

igy P íanere'

y-Luek; Monoclonal g and Clínícal A szerk.; Hitler és munkatársai Cambridge University

» X «»<Φ φφ X

Φ φ Φ Φ Φ V

*. ·φ * φ φ φφ φ » «ίφχ* *♦»* Α Φ Φ φ ΙνΦΦ* ' X * *>. } ΦΦ *

5); Wartí és mtsai: „Genetíc Manipnlation and msion of Antibodies”, In; Monoclonal Antibodies: Principles Applications, 137, oldal, szerk.: Bírch és munkatársai nev-Liss, Inc.. (1995((.

Egy másik változat szerint egy ahtí-BR43x2 ellenanyag egy .manvaübók A v az egér immunglobulin nehéz- és könnyű lánc variábilis láncai egér be visszük át A humán ellenanyagok

s csoportjait azután a a rágcsáló megfelelő keret- _ származó nensek használata elhárítja azokat a amik a rágcsáló Konstans re;

. A rágcsáló immungioöuiín vs

ii és mtsai: Froceedmgs of the National Aeademy of

A humanizált mar és mtsai: Natúré 321_; 522 U9S^:

V of Sciences

Cár tér és mtsai:

(1992): Sandhu; Crit. Rév. Bioíceknology 12, 437 (19922 Sláger és mtsai: d, of Immunoi, 150, 2844 (1993); Suhir (szerk.):

ΦΦ Φ

Φ « *

Φ X φ φ φ φ φφφ ' * Φ * ΦΦ Φ.

* Α * Φ *« Φ « ’ %»·♦ **♦·

s ellenanyagokat úgy állíthatunk eto, nqgy adatokat ann-BK4ák2 ellenanyagokkal vagy ellenanyag fragmensekkel. Immunizálunk, standard technikák alkalmazásával Green és mtsal; „Produetion of Plyclonal ÁniiseraE In; Methods In Moleeular Bíoiogy, Immunoohemical Protoeols, 1-12. okiak szerk.: Manson, Humana Press (1992); Coligan és rntsai (szerk.): Currení protoeols ín Immunology L 2.4.1-2,4.7 oldal.

y and Sons (1991)1. Egy másik változat szerint a monotáíis antí-ídiotípusos ellenanyagokat. anti-.BR43x2 ellenanyamint ímmunogénekkel

az elözökoen ismertetett, technikák « alternatíva az, hogy humanizált ant

már ismertették (Irie; 5,208,146 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Greene és rntsai; 5,637,677 számú Amerikai Ey leírás; Varthakavi és Mtnocha; d. Gén, Virol, 77, 1675 Áz itt említett vétlenül vagy közvetve koniugatha >z és hasonlókhoz, és ezek a konjugátumok használhatók ín oíoo dia alkalmazásokban. Péktauí a okai vagy tér ^r szerinti ellenanva-

magok, vagy az ógtahag aktív fragt vagy citotoxikus molekulákhoz * » φφφΟί - - V * * φ φ * Φ * Φ Φ Φ * Φ * **»*·»*'» *< , «»# mensei vagy részei kimutathatók kapcsolhatók, és eljuttathatók mentet molekulát / emlősbe, ami az aníi-koniplesejtekkel szövetekkel vagy

A mecíel

torokhoz, fluoreszcencia markerekhez, kermlumineszcencia markerekhez, mágneses részecskékhez és hasonlókhoz. A megfelelő eitoíoxíkus molekulák közvetlenül vagy közvetve kapcsolhatók a pokpeptidhez vagy ellenanyaghoz, ide tartoznak a bakteriális vagy növényi toxinok (azaz például a difteria toxxn, a toxln, a ricln, az aferín és a hasonlók), valamint a «Ódául a ¹³'1, a ^l8SRh vagy a

V C8. φ keresztül). A ke vagy ellenanyagok emellett cito-

vagytew a bioim és flementer párna vagy a pk közvetlenül okhoz, toxinofchoz, radioaktív izotópokhoz és 1 és ezek a konjugátuxnok használhatók in i?(oo diagnosz>an. Például a lelet

Φ '6 szerinti ehenanyagok va hogy azonosítsuk vagy szerveket, amik a

lek arra azokat a szöveteket: vagy ;gieieio un«-Komplementer molekulát (például receptort vagy antigént) expresszálják, Pontosabban, a olineotidek vagy az anti-BR43x2 ellenanyagok, vagy ,,„av fragmensei vagy részei kimutathatók v; eitotoxikus molekulákhoz kapcsolhatók, és el ami az anti- molekulát c;

A megfelelő kimutatható molekulák közvetlenül vagy vetve kapcsolhatok a poiípepiidekhez vagy ellenanyagokhoz, a radioaktív izotópokhoz, az enzimekhez, kofaklor okhoz, inhibitorokhoz, fluoreszcencia markerekhez, kcmilurnineszcencia mar:·, mágneses részecskékhez és hasonlókhoz. Á megfelelő

vas nov

, a , az aaa toxrn, a a

es a dául a vnp _a vagy ellenanyaghoz is n js i s'sam vasy a ⁹⁰Y (akár közvetlenül a csolva, akár közvetve kapcsolva, keresztüli. A kötő polípeptídek vagy ellenanyagok emellett cito· toxikus gyógyszer hatóanyagokhoz, például adriamieínhez is kon· jngálhatök, Egy kimutatható vagy

ia a a sze dementer/antí

Áz ilyen íűziös fehérjék vagy ellenanyag/fragmens-toxin fúziós fehérjék használhatók arra, hogy sejteket célozzunk meg vagy eltáyólítsunk velő'

másik változat

több funkcionális doniénnel rm aktiváló dómén vat

velük, szöveteket rákos sejtek vagy szőve szerint, ha a kezik, (azaz dómén, plusz egy célzó ami csak a célzó doniént tartalmazza, alkalmas lehet egy kimutatható molekula, egy citotoxikus molekula vagy' egy komplemenvagv szövettípusba a csak egy

. Az ilyen domén-kompát egy generikus célzó hor-

yag konjugátumok bejuttathatok intravénásán, intraartériásan vagy íntradukiálísan, vagy használhatók lokálisan a hatás ^célzott pontjába.

Az ellenanyagok u vagy

:.'hkx ook-ban készített zai. szerint az ily készített fúziós fehérjék, je tára, vagy a humán vagy főemlős szövet

fúziós fehérjék ellen. Egy máidek lehetnek humán IgG-vel a His-jelölt vagy FLAG™

z tőkém fai vizs'» χ

φ* » ·’ χ ♦ * ♦'

ΛφΦΧ ΧΦΦ* * φ

nális ellenanyagok arra is használhatók, hogy utánozzák a ligándum/receptor kapcsolódást, ami a ligaodum/reeeptor pár aktiválását vagy inaktiválását eredményezi, Kimutatták például, hogy az anti-oldhatő CD4Ö monoklonáiis ellenanyagok keresztkötése a B-sejteket (amely sejtek szub-optimálisan aktiválva vannak anti-

tartalmaz,

geners

próbák általában legalább 20 nukleotid hosszúak, bár valamivel óbák f 14-17 oh is használható ráz láncreakció primerek legalább 5 nukleotid hosszúságúak, előnyösen 15 vagy· több nukleotid, még előnyösebben 20-30 nukleotid hosszúságúak. Rövid polínukieotidok akkor használhatók, az elemzéshez a gén egy rövid régióját célozzuk meg, A gének y teljes exont vagy többet. A p hogy egy kimutatható szignált kapjunk, azaz radioaktív izotóppal, fluor ol Orrai, Remiin mineszeeneíás any

eiszteinben gazdag pszeudo-ismétlodések,. szignálszekvenciák és hasonlók. A pobnukleotíd próbák és hibridizációs technikák jól ismertek a szakterületen (C

mutatás!

származó információk

kánsak. A BR43x2. a TAGI és a BCMÁ receptor polipeptidek jelezhetnek patológiás állapotokat, beleértve a rákot, az autoimmun betegségeket és a fertőző betegségeket.

Egy alapvető esszében egyszalu próba molekulát inkubálunk RNS-sel, izoláljuk egy hiológiaai mintából olyan hőmérsékleti és ionerősségj körülmények között, amik elősegítik a bázispárok képződését a próba és a megcélzott BR43x2, TAC1 vagy BCMA RNS fajok között, A megkötetlen molekulának a hibridizálodott molekuláktól való elválasztása után a hibridek mennyiségét kimutatjuk.

Az RNS kimutatás jól kidolgozott hibridizációs módszerei közé tartozik a Northern biot elemzés és a dot/slot biot hibridi-

aktív hibridizációs módszerrel kimutatható (Isaac iszerk.k Protocols fór Nueleic Acid Analysis by Nonrsdioaetive Probes,

Humana Press, Inc. (1993)1 Tipikus esetben a nem-radioaktív kimutatást elérhetjük kromogén vagy Remiinmineszcens szubsztrátok alkalmazásával. Az illusztratív nem-radioaktív egységek közé tartozik a biotin, a fíuoreszceih és a dígoxigenin,

A BR43x2, TAGI és BCMA oligonukleotid próbák szintén jól in atoo

(Tavítian és mtsai; Natúré Medicine 4, 467 (1998}|, φ X * ****

Számos különböző diagnosztikai eljárás számára előnyös a poltoeráz láncreakció (PCR) alkalmazása a kimutatási módszer érzékenységének növelésére.A polimeráz láncreakció végrehajtásának standard technikái jól ismertek (Mathetv (szerkó: Protocols in Humán Molecular Genetics, Humana Press, Inc.

(szerkó; PCR Protocols: Current Methods and Humana Press, Inc. (1993); Cotter (szerkó

Molecular Diaánosis

Hanausek és Walaszek (szerkó: Tumor Marker Protocols, Humana Press, Inc. (19988 ko (szerk,): Cllnical Applications of PCR Humana Press, Inc. (1998)). A polimeráz láncreakció prímereket űge tervezhetjük meg, hogy amplifíkáljanak egy olyan

(szerkó: „Rapid isolation of Speeific cDNÁ-s or Genes hy PCR⁴', 15-28. oldal, in: Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc, U 997)1. Ezután polimeráz láncreakciót hajtunk végre, és a termékeket standard technikákkal elemezzük.

Illusztrációként megadjuk, hogy RNS-t izolálunk egy bíolö-

való izolálására. Egy reverz transzkripciós reakciót indíthatunk « *

-X fc*X fc az izolált. RNS-sek random oligonukleofídokat. rövid dT homopolimer vág alva. Az olígo-d'T

2MA antíszensz oíigon

az az előnyük, hogy küldi zó rnRNS nukleotid szekvenciák amplííikálhatők, amik megfelelő kontroll eélszekveneíákat biztosítanak. A BR43x2,TÁÜl vagy BCMA szekvenciákat a polimeráz láncreakcióval ampliíikáljuk, két határoló oHgonnkleotid prímért használva, amiknek a hossza tipikus esetben legalább 5 bázis.

A polimeráz láncreakció amplífikálásí termékei! számos kümegközelítési móddal kimutathatjuk:. A polimeráz láncreció termékeit például gélelektroforézissel frakcionálhatjuk, majd etídíumbromidos festéssel láthatóvá tehetjük. Egy másik változat szerint a frakciónál! polimeráz láncreakció termékeket 'ánra viheilük át, egy kimutathatóan jelzett antoradiográfíával vízsí alternatív megközelítési dezoxirihonuklemsav trifoszfátokat használunk, hogy biztosítsuk a kemitumlneszeenciás kimutatást, valamint használjuk a C~ TRAK kolorimetriás esszét.

Egv másik megközelítési mód a valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Üti, Egy fluorigén próba, ami hozzákapcsolva tarta festéket, mind egy tnotto testeaet, specimen san ti az előrevivő és a reverz primerek közé. A Taq DNS : 5' elválasztjuk a kioltó festéktől és egy szekvencia-specifikus szignál a ami a ponmeraz íancreakeiooan egyre

,. Φ » . , «

célpont kötődik egy DN'S-RNS-DNS iplexet képezve, majd az RNS részt es Knnutatíuk a iehaskott himera pi

egy egyszam éra

Rnáz H-val lel jelenlétét (Beggs és mtsai: J. Cl in. Microbiol, 34, 2985 11996); Bekkaouí és mtsai: Biotechníques 20, 240 (1996H, A BR43x2, TACI vagy BCMA szekvenciák alternatív módszerei a következő megközelítési módokat alkalmazzák, mint például a n szekvencia alapú ampiiíikálást (NASBA), a ú szlhibridlzációval (CATCH), és a ligáz lánere11 és mtsai: 5,686,272 számú Amerikai iült Államok-beli szabadalmi leírás {19971; Dyer és mtsai: d. ViroL Methods 60, 161 (1996): Ehrícht és mtsai; European Bioehemistry 243, 358 (1997): Cbadwlek és mtsai; J. Methods 70, 59 (1998)1. Más standard módszerek is ismera szak területen lártas szakember számára.

és BCMA próbák és a BK4ÚX2 “ ” _ „ ressziö kimutatására szövetmintákban. Az Ilyen ín sku hibridizáció jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára [Choo (szerk.): In Situ Hybridízation Protocols, Humana Press, Inc, (1994); Wu és munkatársai (szerk,): „Anaivsis of Cellular or Áhundance of niRNA by Radíoaetive in sifu hybridízation O'\ 259-278. oldal, in: Methods in Gene Bioteehnology, CRC ín és

DMA or Abundanee of niRNA

): „Lőcs

Fluorescence

In: Methods in Gene

A szakterületen jártas szakember számára számos kúlönzo diagnosztikai megközelítési mód ismert (Mathew (szerk.);

*

..i« »»»» »

Protocols in Humán Moleeular Genetíes, Humana Press, Inc. (1991); Colé mán és Tsongalis; Molecular Diagnostles Humana Press, Inc, (1996); Elles: Molecular Diagnosis of Geneííc Diseases

Humana Press, Inc, (1 t az nyen ponnnkieono proöak arra is lehelnek, hogy adott kromoszómán egy hasonló szekvenciához A BR43x2 gén kromoszómálís azonosítása

mse

lójáról és betegséghez való kötődéséről. A szakterületen

y amik lefedik a teljes humán genomot, ilyen például a Stanford G3 RH Panel, és a Genebrídhe 4 RH Panel (Research Genetíes, Iné., Huntsvüle, AL). Ezek a panelek lehetővé teszik a gének, szekvencia-jelölt helyek (STS-ek) és más nem-

Φ* *

Φ ♦ *

Φφ * « * *Φ

X*

«« « φ

V-V

Φ » φ * _Λ

Φ 4 * * ¢, &ΧΦ ΦΦ* ' ' χ ' *

h)i gén pozíciójának a pontos Ismerete számos különböző esetben lehet hasznos, beleértve az alábbiakat: 1} annak meghatározása, hogy egy szekvencia része-e egy létező egybefüggő szakasznak, és további környező genetikai szekvenciák kinyerése különböző fór-

vagy cDI irmajaban, ;én biztosítása egy örökölhető betega kromoszámális régióhoz mutat kapán modellszervezetekhez, azaz hatású lehet annak mégha távaion mi lehet a tők, Egy- STS egy olyan DNS szekvencia, ami egyedi a an, es referenciapontként használható egy adott vagy kromoszóma-régióhoz. Egy STS-t egy oligo-

esy adatbázisban,

Bioloigcal Information, National ínstitute of Health, Bethescla, MD http://www.ncbknlm.nih.govk ezek átvizsgálhatok egy számunkra érdekes génszekvenciávai az ezekben a ródd genomiális ó STS szekvenciákban levő térkép adatokért.

Ai tikai alkalmazások reagensei, Pé ány ák továbbá további diagnosz-

egv ε

t vagy RNS-t, gén rajta van-e egy adott cenemjat torta tűk, miszerint a nán, vagy el * ί

Φ ♦

Φ χ Φ *

ΦΦΧ φ ΦΦΧ* $ * w:

e benne mutáció, A BR43x2 génlókusznál kimutatható kromoszómáKs aberrációk közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az aneuploidia, a gén kópiaszámának megváltozása, az inszeretök, a delécíök, a restrikciós hasítási helyek megváltozása és az átrendezések. Ezek az aberrációk előfordulhatnak a kódoló szekvenciában, az intronokban, vagy a határoló szekvenciákban, beleértve az npstream promofert és a

lehet

találmányban használható genetikai és RNS. A pollnukleotíd próba vagy vagy DNS, és tartalmazza a 3. számú szekvencia egy részét, az 1. szánni szekvencia

vagy ezeknek egy RNS ekvivalensét esszé módszerek közé tar bér számára ismert molekuláris ul a restrikciós f

a szempontom a megtelem a szakterületen jártas szakemeehnikák, azaz példás (RFLP) elemzés, a mzése polimeráz lánereafc<cíó φ

* X φφφφ φ· •V

ΦΦΦ * φ

103 φφφφ φ φ φ:

« Φ * φΦ pllcation 1 5-16 (199 ΓΗ, ribonukleáz védési esszék, és szakterületen ismert genetikai kapcsoltsági elemzés tech(Sambrook és mtsai: Molecular Qoning: A baboratory nng nai

Harbor, N.Y, (1989); Current Protocols in Molecnlar szerk,; Ausubel és mtsai, Greene Publishlng és

(Current Protocols in lar Bíology, 4, fejezet, szerk.; Ausubel és mtsai, Greene Fabbsbing és Wilev-Interscienee: New York (1987)1 tartalmazzák ami után a reakcíóterméket (RNS-RNS hibrid) Rnáz-zal hozzuk , Az RNS hibridizálédott régiói védett

Az anfíszensz módszertan: használható a BR43x2, TAGI azaz a

meg, fejlődésének és más sejtekkel való kölcsönhatásának gátlására, A BR43x2~8k TACi-t vagy BCMA-t kódoló poRnukteotíd (azaz a számú szekveneiavázlaton bemutatott dementer a

-at, TACl-t vagy ák az ilyen mRNS transzlációját. Az Ilyen anti-

a BR43x2, TAGI vagy BCMA

104 szensz

expre ssziőj ának gátlásár nyészethen vagy egy alanyban.

Létrehozhatók génsebészetileg BR43x2, TAGI vai expresszálására megváltoztatott egerek, amiket a „transzgenikus egereknek” nevezünk, valamint esen hiányzik a BR43x2, TAGI _ nevezik „knoekout egereknek” ISnouwaert és mtsai: 7, 1083 (1992); LoweU és mtsai: Na.tu.re 366, 740-742 1292 U< >5-499

sehte

Palmiter, R.D, és mtsai:

vagy BO

(vagy általánosan, szövetre s szövetre

> egér arra használroz~e fenotípus változást,

vans, es a tál vagy antagonistáí terápiás célpontja lehet. Például egy ben részesített, megváltoztatandó transzgenikns egér az, amel TAGI vagy BCMA fehérjét, A ereornenveznet, ami nas í, a I t2, TAGI vagy BC gér arra használható, hogy meghaló van-e abszolút szükség a BR43x2-re ín oíuo. A k egér fenotípusa előre jelzi a BR43x2, TAGI vagy ·χ·.

anlagonista in amo hatásait, azaz például az tetteket, A humán BR43x2, TAGI vagy BCMA cDNS _ BCMA mRNS, cDNS és azután knockout e a rágcsáló BR43x2, TAGI va az ek isme r teatő gén és az általa kódolt fehérje tanulmányozására egy endszerben, és használhatók a megfelelő emberi beteg-

elleni transzgenikus egerekben való, itt ismertetett

megnyc mos ki u bármeivíkét ó ís használhatók az itt beleértve szárend-

en,

es a íyali készítmények' g tartó forrását biztosítsuk. Az ilyen lassú kibocsátási alkalmazhatók különböző kiszerelési formákhoz, azaz *:«·> * iqó például az orális, topikálís és parerüerális alkalmazásokhoz. A „gyógyászatilag elfogadható hordozó” szakkifejezés egy olyan hordozó közegre vonatkozik, ami nem zavarja az aktív adalékanyagok biológiai aktivitásának hatékonyságát és ami nem toxikus a gazdaszervezetre vagy a betegre, A szakterületen jártas len találmány szerinti vegyületeket megfelelő és az szakember a ^^elési v4*«_Sc állíthatja elő (Remington: The Science and Practice of Pharmaey, szerkó Gennaro, Maek Publishing Co., Easton, 19,kiadás (1995)1, A továbbiakban a BR43x2, TAC1 vagy BCMA poiipeptid, agonista vagy ántagonísta „gyógyászatilag elfogadható mennyilyan mennyiség, ami elegendő a kívánt biológiai Az eredmény lehel *' lse, vagy egy moiosai

ható fúzió bír:

vagy övma ponpeptio v; a B-sejt válasz csökkenését az ímmnnvája vagy csökkentheti az autoellenanyag termelést, gátolhatja vagy csökkentheti az SLE-hez, az MG-hez vagy az RA-hoz kapcsolód tüneteket. A BR4Sx2, TAGI vagy BCMA hatékony mennyiség csökkentheti a. B-sejtek százalékos ségét a perifériális vérben. A BR43x2, TAGI vagy üdék hatékony mennyiségei széles határok között változhatnak, a kezelendő betegségtől vagy' tünettől függően. A poiipeptid mennyisége, valamint koncentrációjuk a kiszerelési

φφ

107 φ κ * φ

X Φ Φ X « φ * χ* Φ * Φ * Φ

Φ* 9 Φ - * *»/ adott, poiipeptid potenciáját ól, a beteg klinikai állapotától, és a készítményben levő vegyüiet mellékhatásaitól és stabilitásától. Tehát a klinikus alkalmazza a megfeleld készítményt, ami a megfelelő koncentrációt tartalmazza a készi'íménvhen, valamint a készítmény mennyiségét, a szóban betegekkel való klinikai tapasztalatok alapján. Bz a mennyiség részben függ a kezelendő állapot körülményeitől, a beteg korától, testsúlyától és általános egészségi állapotától, valamint más, a szakterületen jártas szakember számára evidens ;tól. Egy dózis tipikus esetben 0,1-100 mg/testsúlykg, A ve k dózisait az in okra vagy ex οίνο vizsla meg, a kísérleti állatokon végzett vizsgál kombinálva,. Az in nkro vagy ex ukm hatékonynak talált irányt szab az állatkísérletekhez, míg a úgy számítjuk ki, hogy a hatás helyén hasonló kon-

vagy

nem-í

Példák

fe fe fefe fefe «fe fe fe fe fe » * * fe fe 9 fe fe fefe fe fe »fefefe fefe»» » ♦ <Φ '*' ♦ *»* fe » fe.fe .fe* *

108 egyesítjük. amik egyenként 1600 kiónt reprezentálnak. Ezeket a poolokat azután Cos»? sejtekbe transzíektáljuk, és 12-lukas lemezekre szélesítjük,. A poolozott DNS-hől hárem mikrolitert és 5 ul LipoíéetAMIN-t keverünk össze 92 al szérummentes DM EDI (55 mg nátríumpiruvát, 146 mg L-gluiamin, 5 mg

n, 2,o mg percig adunk hozzá, A DNSkeveréket 220,000 Cos-7 sejt/luk mennyiségben észtjük 12 lukas szőve ttenyésztő lemezekre, majd 5 óra at 37 ^cC-on inka báljuk. Az ínkubálást követően 500 ul Mj-os FBS DMEM táptalajt (100 ml FBS, 55 mg nátrium és 146 mg L-glutamín 500 ml DMEM) adunk mindegyik a sejteke éjszakán át mkubáljuk,

A. szekréciós cs pda szűrővizsgálatot biotinilezett, FLAövépte, A sejteket PBS-sel öblítjük,

ug szí

Z .· es u pg ietum ooo mi

um-klorid és 0,05% Tween-20 vízben] mossuk. A sejteket 15 percig 0,1%-os, FBS-ben. készített Triton-X-szel permeabílizáljuk, majd TNT-vel mossuk. A sejteket 1 óra hosszat TNB-vel (ökl mol/1 TRIS-HCL 0,15 mol/1 nátrium-klorid és 0,5% Blokkoló reagens) blokkoljuk, egy New England. Nuclear Renaissanee ? TSA-Direct kit alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint, A TNT-vel mossuk és IS percig blokkoljuk avídmnek majd IVector Labs Cat# SP-200H közben TNT-vel mosva. A sejteket 1 óra hosszat 1 mg/ml ztnWFlag/Bíotin TNB-ben készült keverékével mossuk, majd TNT-vel mossuk. A sejteket azután 1 őrá hosszat TNB-ben készített, 1:300 higitású

109 ·χ· *

Φ Φ ♦ ♦ X » φφ φφφφ φφ <

φ ...... φ * '.·· φ * φ ;φ « φφ Φ Φ χφφφ Φ Φ ·* Φ ΦΦΦ

Φ ΦΦ φΦ ·sztreptavídin>-HRP-vel (New Engíand Nuclear) inkubáljuk, majd TNT-vel mossuk. A hibridizációkat, A hibridizációkat, hígító puh (New England Nuclear) 1:50 arányban hígított fluoreszceín reagenssel mutatjuk ki, majd 4,4 percig inkubáljuk és

TNT~vel mossuk. A sejteket TNT-ben hígított Vecíashield ia-val (Veetor Labs, Burlinkame, GA) konzerváljuk.

cencm óvá, F1TC szűrők használatával. Tizenkét pool volt pozitív a zí.ní4 tjáből. A D8 pooi-t (ez b

1), ·’*< a zt n sgv szétbontjuk, és egyetlen, klóm isre pozitív volt, A szekvenálással szekvenciát tartalmaz, ami a amiben a TACI Phe21-Arg6? első cisz te ínben gazdag étién aminosavval, a triptoíánnai az izolormát BR43x2 névvel láttuk eh aminek a polinukleotid szekvenciáját az 1. számú szekveneíavázlaton

A reverz transzkriptáz polímeráz láncreakciót használjuk a

BR43xl expresszió lokalizálására ’T- és S-sejíekben és monoitákban. A ZC19980 (15, számú szekvencia) és a ZC19981 (18. számú szekvencia) oligonukleotíd primereket használjuk arra, hogy a CD19-Í-, CD3* és monocita cDNS-ben BR43-at

A reverz transzkriptáz reakciót 94 Tkon hajtjuk végre 3 ciklusban 94 ^s'C-on tartjuk 30 másodpercig, 68 79on percig, és 72 °C-on tartjuk 1 percig, ezt követi egy ís extenziő 72 C-on. Egv várt méretű (72

φφφ* * φ $ ->* η «

V * *· «,_νcsfkot csak a B-seitekben tudtunk detektálni de nem tudtuk detektálni az aktivált T-sejtekben, amint azt ellenanyagok alkalmazásával a TACbra pub

Science

228, 138-14:

?O 98/39361 WÍPO

Így 1x10« lefagyasztott, eáris sejteket < 37 ^eC-os vízin használatával s vér mons-

tt Dulbecco tái

h 10% hővel ínaktivált ) rcszuszaz borjúmagzat szérum, 5% -es használatával. Tíz milliliter

is-t í Pharmacia Nd) rétegzünk a sejíszuszjuk 1800 per perc

tesszük át, térfogatát 40 ml-re r perc

a. Az i hűk, A B

mttle, WAj, juk, és egy friss 50 ml-es csőbe 0 percig centrifugáljuk, a féket életképességét Trypan Blue-vai , majd 180 pl / luk mennyienekű lemezre (Falcon, íz az alábbi süniül

adunk egyet, ú:

Ιό φ φ φ 9 φ* Φ

X X * Φ *

Φ φ Φ $ Φ *Φ * * ♦ Χ’ί.φ ΦφφΧ * Φ Φ $ «>·#» φ φ jt* Φ» * gifáshan, 1 mg/H ng/ml között, vagy önmagában, IÖ ug,< anö-IgM-mel (kecske anü Humán IgMj, NaHCCb-bán (pH-9,5) hígítva (Southern Bioteehnology Associates, Inc,, Birmingham, AL):

áns humán vagy 10 ag/ml anti-lgM-rnel és 1.0 interleukin-4-gye! (PBE-beri és 0,1% BSA-han hígítva), Emellett más citokineket is, azaz például ínterleukin-3-at és az interleukin-S-ot, valamint egy oldható CD40 (sCD40) ellenanyagot (Pharmingen, San Diego, CA) is vizsgálunk, A sejteket azután 72 óra hosszat 37 ^s'C-on ínkubáljuk egy nedvesített inkubátorban., A begyűjtés előtt tizenhat órával 1 yCi ^SH línháínt adunk az összes lukhoz. A sejteket egy 96-lukas szúrólemezre gyűjtjük össze (UníFilter GFZC, Packard, Merídem CT), ahol egy cél! harvesterzkard) szedjük őket össze, a gyártó utasításai szerint, A lepercig 55 °C-on szári!

lemezlezáróval

ate Scintíllation Coünter-rel

A ti >áé résere a majd 9 napig inkub:

sejtek stímulálása után. a különböző B~se)t adott. IgG termelődés indukciójának méismertetett módon készítjük el, . A sejt félülüszőt összegyűjtjük, hogy meghatározzuk az IgG termelődést,

A tisztított B-sejtek stímulálása után a különböző B-sejt génekre válaszként: adott sejtfelszíni aktiválás mérésére a : az előzőkben ismertetett módon készítjük eh de csak 48 óra hosszat Ínkubáljuk, A sejtfelszíni markereket FACS módszerrel mérjük.

Φ φ ?»«* ** _w * « φ φ * * «

Φ φ Φ φ Φ «Α 9 φ » Φ Φ « « χ φ χ φ φ *»/

Φ 9 Φ* ΦΦ *

A. különböző B-sejt. autogénekkel stimulált, tisztított humán B-sejtek szaporodását az 5. táblázatban foglaljuk össze.

S. Táblázat ,o ztní4vlL4 ztnf4*antl·

15,8

A ztnf4 ínterfeukin<-4-gyel, Interleukin-S-mal -6-ta.l mutatott színe rgisztikna hatása es a Emseitek szaporodására, A B-sejt jeladás kétszeres növekedése figyelhető meg sCD40 A tisztított Bmitogénekre vák foglaltok össze a 6.

sömulálása után a

zfní'4 /a

AnthlőMi'114

A sejtfelszíni aktiválási markerek novekeöese v:

;lhetö a tisztított B-sejtek csak ztnf4-gyel, vagy anö-IgM-mel való sttmulálása után. A nincs hatása a vagy szubopörnáhs 7-sejt u Emellett a TNFh h vagy' anti-lg^

Is sem figyeli ásra adott v meg a tisztre í, az stimu• 4 η:

·* *

♦ φ

Φ Φ «Α «Ε-ΦΦ Φ X * $ ΦΦ Φα * I fc φ * **£*

Α 3. ábrán láthatjuk humán B-limiociták oldható zfni4-es ko-akUválását a szaporodáshoz és az immunglobulin szekréciójához, A 3A. ábrán láthatjuk a tisztított, humán períferiáhs vér B-sejtek szaporodását az oldható ztnM-gyel (25 ng/ml) végzett stimulálásra adott válaszként, csak hiterleukin-4, tnterleukin-4 vas plusz antnigM, antitenyésztés után, A 3B. ábrán látható az IgM és IgG szint, az oldható ztnf4-gyel végzett stimulálásra adott válaszként, csak interleukin-4-gyel, vagy mterleukín-4-gyel plusz ínterleukín-5-teI stimulált B-sejtek felülúszójában.

Ezek az eredmények azt sugllják, hogy az oldható ziní4 egy B-sejt aktiváló molekula, ami más B-sejt stimulálókkal összhang4, és gyangén hat maga Is, A ztnf4 elősegíti a B-sejtek ását és az lg termelődését. A tapadási molekulák, ko-stíés aktiváló receptorok megerősítése azt sngall-

szerepei játszik a B-sejtek ójának elősegítésé-

A TAGI fehérjét magas szinten expresszáló BHK sejteket egy gításos klónozásával szelektáljuk. A transzfektáns sejteket (2x1 Ö⁵) 30 percig jégen inkuháljuk biotinllezett I ng/ml zlnf4-gyel, kötő pafferben (PBS, 2% BSA, 0,02% nátriumazíd). A sejteket 2x kötőpufferrel mossuk, majd 30 percig jégen SE-PB~vel fCaltag) inkuháljuk fldÖÖÖ-es hígítás kötőpufferben). A sejteket azután kétszer mossak kötőpufferben, reszuszpendáltjd RACS-szal leolvassuk (PAKS Vantage,

Beoton Dickinson). Azokat a klánokat választjuk ki, amik a legnagyobb ΪΧΕ4 kötődést mutatják.

A BCMA fehérjét magas színien expresszáló BHK sejteket úgy szelektáljuk, hogy blotíndezett ziní4-gyel a felszínén jelöljük a BCMA-t expresszáló franszfektáns poolt. Ezt követi a sztreptavidin-Phyco-Erythrin ISA-PE Caltag Burllngame, CA}< és a fényes sejtek steril osztályozása FL2-ben a FACS Vantage berendezésen (Becton Dickinson). Az egyedi kiónokat átvizsgáljuk, hogy mutatnak-e ziní4 kötődést.

Humán többszörös szöveti Northern biottot (MTN 1, MTN II és MTN ΠΙ (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA}) vizsgálunk át, hogy meghatározzuk a humán BR43x2 és TACI expresszié· szöveti eloszlását. Egy körülbelül 500 bázispár polimeráz láncreakció eredetű próbát (21, számú szekvencia} ampliíikálunk BR43x2-t (E számú szekvencia) használva templáfként, és a ZC20Ö61 (22, számú szekvencia) és ZC2ÖÖ62 (23. számú szekvencia) primerek használatával. Ez a szekvencia azonos a TACI homológ régiójával. Az amplifikálásí a következők szerint hajtjuk végre: I ciklus 94 °C 60 másodperc, 30 ciklusban 94 *C 30 másodpercig, 60 °C 30 másodpercig és 72 °C 3 másodpercig, majd 1 ciklusban 72 °C 19 percig. A polimeráz láncreakció termékeit agaróz gélelektroíbrézlssel tesszük láthatóvá, és az 500 bázispár méretű polimeráz láncreakció terméket gél. extrakeiós kittel (QiAGEN, Chalsworth, CA) tisztítjuk, a gyártó utasításai szerint. A próbát egy NDCTEAP nyomott oszloppal (Stratagene) tisztítjuk. EXPRESSHYB ((Clontech, Palo Alto, CA) oldatot haszi 15

Φ * « fc# £ # nálunk az elöhihridizáláshoz és hibridizáló oldatként Is, a Northern bioitokhoz. A hibridizáció éjszakán át játszódik le, 65 ^öC-on, 10⁶ cpm/ml jelzett próba felhasználásával, A bioitokat 2X SSC és 0,1% SDS összetételű oldatban mossuk szobahőmérsékleten, majd kétszer mossuk Ö,1X SSC és 0,1% SDS Összetételű oldatban, 50 ^:C-on, Egy körülbelül 1,5 kilobázts méretű transzkripturoot tudtunk kimutatni a lépten, a mdrokesomöban és a

A humán többszörös szöveti Northern biottot (MTN 1, MTN Π és MTN III (CIontech Laboratories, Inc,, Palo Alin, CA)) átvizs>zzuk a humán BCMA expresszié szöveti ül 25? bázíspár méretű pohmeráz láncre-

, számú szekvenciaj primerek ; a következők szerint hajtjuk végi ciklusban 94 ^eC 30 másod( és 72 ’C 3 számű szekvencia) és ZC használatával. Az re; 1 ei *C élele

poiimeraz ia ÍQIAOEN, Chatsworth, CA) u és az out gél extrákeiós kittel a gyártó utasításai szerint, ((CIontech, Palo Alto, CA) oldatot használunk az elohibnáizáláshöz és hibridizáló oldatként fs, a Northern íz, A hibridizáció éjszakán át játszódik le, 65 °C~oo. 10® 1 jelzett próba felhasználásával, A biottokat 2X SSC és 0,1% SDS összetételű oldatban maid kétszer mossuk 0,lX SSC és *

Uó oldatban, 50 °C~on. Egy körülbelül 1.2 kilobázis méretű transzkriptnmnt tudtunk kimutatni a. lépben, a nyirokcsomóban., és a vékonybélben, a gyomorban, a tracheában és a herékben.

Azokat az RNA Master Blot-tokat ((CIontech, Palo Alto, CA), .amik. különböző szövetekből származó RNS-eket tartalmaznak, és 8 háztartási génre nnrmahzálva vannak, szintén átvizsgáltuk a TACÍ próbával (21. számú szekvencia) vagy a BCMA próbával (24. számú, szekvencia) és az előzőkben ismertetett módon hibridiA BR4Sx2/TACI expresszíő a lépben, a ybélbem a gyomorban, a ryáhningybem a vakbélben, a üdőben, a csontvelőben és a magzati lépben ügyelhető meg, A 8CMA expresszió kimutatható volt a vékonybélben, a lépben, a ryomorban, a vastagbélben, a nyirokcsomóban és a vakbélben.

nem

Ce^np d, CD8-E CDI 94- és kevert limfocita reá az össz-RNS-t

juk elő íChlrgvvln cs mtsai: Biochemístry 18, 52-94 (1979)}, A. oli(Ab RNS-t Aviv és Leder módszerével izoláljuk az össz-RNSés Leder: Prooeedínös of the National Aeademv of

, LSA 89_; 14 az alá smertetett módon hajtjuk végre.

$

Μ*

Az egyes poliAv RNS-ekhöl körülbelül 2-2 mg-ot denaturálunk 2,2 mol/i formaldehid/foszfát pufferben (50 mmol/1 NaaHPCh, 50 mmol/1 NaHsPCh, 50 mmol/1 nátrium-aeetái, 1 mmol/1 EDTA és 2,2 mol/1 formaldehid), majd egy 1,5%-os agaréz mínigel (Stratagene Cloning Systems, La doha, CA) elektroforézissel választjuk széf formaldehid / foszfát púderben. Az RNS-t éjszakán át nytran. szórólapra (Sehleieher and Sehuell, Keene, N'H) bio tt óljuk, majd a szűrölapon ultraibolya besugárzással keresztkötéseket alakítunk ki (1200 mJoule) egy

STRATALINEER™ OT keresztkötéses berendezésben (Stratagene Cloning Systems). majd 80 “C-on 1 óra hosszat sütjük.

A biottokat azután egy TACí (21. számú szekvencia) vagy BCMA (24, számú szekvencia) próbával vizsgáljuk át. Egy 1,5 kb lobázisos csíkot, ami a TACbt reprezentálja, csak a CDI 9+ sejtekben lehetett kimutatni. Égi' 1,2 kilobázis méretű transzkripfumot, ami a BCMA-t reprezentálja, gyengén ki lehetett mutatni a CD8+, CD 19+ és MLR sejtekben.

További Northern biot elemzéseket végeztünk K-S82 sejtekből (entroid, ATCC CCL 243), HUT78 sejtekből (T-sejt, ATCC ΠΒ-161), Jurkat sejtekből (T-sejt), DAUDI sejtekből (Burkift humán limloma, Clontech, Palo Alto, CA), RAJI sejtekből (Burkift humán limloma, Clontech, Palo Alto, CA), és HL80 sejtekből (Monocyte) származó poli(A) RNS-ekkel készített biottokon, az előzőkben ismertetett mődon. A biottokat vagy TÁCI (21. számú szekvencia) vagy BCMA (24. számú szekvencia) próbával vizsgáltuk át. Egy 1,5 kilobázis méretű, a TACl-nak megfelelő Iranszkríptumot lehetett kimutatni a Raji sejtekben. Egy 1,2 kilobázis méretű, a BCMA-nak megfelelő transzkripturnot lehetett kimutatni a Daudi, Raji és HUT78 sejtekben.

φ φ φ φφ ♦ » χ φ » X φ φφ ·

US φ » ♦ » « φ φ * φ «♦ . Χ· ♦»»’

Φ. X

XX ΦΦ φ '« φ φ φφ

Egy polimeráz láncreakció alapú szűrővizsgálatot használunk olyan szövetek azonosítására, amik humán vagy rágcsáló TACI-t és humán BCMA-t expresszálnak, A humán és rágcsáló Rapid-Sean™ Gene Expression Paneleket (Örigene Technologies, Inc., Rockville, MD) a gyártó utasításai szerint átvizsgáljuk. A ZC24200 (27, számú szekvencia) és ZC242Ö1 (28. számú szék-

:lő 272 bázispár méretű fragmenst eredményezzenek. Az iő kimutatható a léphen, a csecsemőmirigyben, a tüdőn, a szívóén, az emlőben, az izmokban, a bőrben, a az ag.

elit l, a es b es az számos

A ZC24271 (31. számú szekvencia) és a ZC24272 (32. számú szekvencia) ohgonukleotid primereket úgy terveztük meg, hogy átfedjenek egy exon kapcsolódást és egy, a humán BCMAzispár méretű fragmenst eredményezzenek.

tüdőben, a vél

A ZC24495 (33. számú szekvencia.) és a ZC244 számú szekvencia) ohgonukleotid primereket úgy terveztük meg, v átfedjenek egy exon kapcsolódást és egy, a rágcsáló BCMAmegfelelő 436 bázispár méretű :preasziő kimutatható a

TACMg és BCMA-lg fúziós vektorok készítése tg gamma Fc4 fragmens «φφ * » »· φφ Φ φ ' ' X Φ

X» * φ φ φ ΦΦΦ» χ-χ· * istruKcio

A TACl-ig fúziós fehérje készítéséhez a humán IgG I Fe réia csuxio régió és a CH2 valamint a el távolítsuk az Fc receptor (Feül es

Á humán XgGl Femek ezt a módosított verzióját nevezzük Fc4 -nek.

Az Fe régiót humán magzati máj könyvtárból (Ckmtech, láncreakcióval, a ZC1Ö.134 (43,

Baum és (Leu-Leu-Gly szekvenciára

hogy' est csal szerint Ala-Glu-Gly(a 45. számú szekvencia 38-41-es esőJournal 18, 3992-4ÖÖ1 (1994)1, az PcRt kötődését (Duncan és mtsai: Natúré >L A ZC15345 (46. számú szekvencia) és a ZC 15347 (47. számú szekvencia) oligonnkleotid primereket használjuk a mutáció bevitelére. 50 μΐ végtérfogathoz 570 ng IgPc terápiátok 5 μΐ 10.X Pfu reakció-puffért (Stratagene), 8 ol 1,25 xnmol/1 dN'TP-t, 31 μΐ dHaO-t, 2 pl 20 xnmol/1 ZC 15345-ös (46. számú szekvencia) és ZCI5347-es (47. számú szekvencia) prímért adunk. Azonos térfogatú ásványolajat adunk hozzá, majd a reakcióelegyet i percig 94 °C-on tartjuk. 2,5 egység Pfu-t ciklusban 94 *C-on tartjuk 30 ^öC-on tartjuk 1

no φφ χ Φ .* ♦:

« Φ- ♦ * grces extenziót végzünk 72 °C-on.. A roakegy cióternrékeket elektroforetízáijuk és a várt, körűikéiül 576 bázispár méretű csikót kimutatjuk. A csíkot kivágjak a gélből és tyeriüK. egy QIAöEN QtAquickTM gél extrakciós kit íQIAGENj vak a gyártó utasításai szerint.

;ráz láncreakciót is használunk egy mutáció bevitelére, aminek során egy Ála-t Ser-re cserélünk (a 45. számú székvénei 134-es amínosav csoportjai és egy Prc-t Ser-re cserélünk (a 45. számú szekvencia 135-ös csoportja), hogy csökkentsük a ését és/vagy a komplement fixálást és Winien Natúré 332, 788 (1988)1 és a TAA let első fordulós reakciót hajtunk végre, az FcvRI kötőhely-mutáli IgFc szekvenciát használva tenrplátként. 50 μί tót, 5 μΐ 10X Ríu reakcíőpnfíert (Stratagene), 8 μ! i/1 dNTP-t, 31 μί dHzO-t, 2 μΐ 20 mmol/1 205517 (48.

pnukleotldot, ami egy 5 primer, ami a 45.

k, és 2 μί io 2-2 yl~t /1-es egy 5' primer, ami a kezdődik és a számú ss számú szekvencia 26-os mmol/,1 ZC15530 (49, számú szekvencia) oligonukleotidot, ami egy 3' primer, ami a 46. számú szekvencia iái a

45. számú szekvencia 388, as

ZC25437 (47, számú szekvencia), egy 3' primer, amivel egy AláSer mutációt, Xbal restrikciós hasítási helyet és egy stopkodont lehet bevinni. Azonos térfogatú ásványolajat adunk hozzá, majd a reakciöelegyet 1 porcig 94 °C-on tartjuk, 2,5 egység Pfu~t «gvu^, *mzzá, majd ^c'C-on tartjuk 30

El «Γ fc * * fcfcfcfc fcfcfcfc fcfcfcfc fc* * ♦ .fc * * φ «« fc *

Λ X fc ♦ fcfcfci ág, 55 ®C~on 30 cig, 72 A>on ti percig, majd. egy hétperces extenziöt végzünk 72 °C-on. A reakeiótermékeket clektroforetizáljuk és a várt, körülbelül 370 és 395 bázíspár méretű csíkot kimutatjuk, A csíkot kivágjuk a gélből és kinyerjük, egy QIAGEN QIAquickTM gél extrakclós kit sQIAGEN) használatával a gyártő utasításai szerint. Egy

is vegzunx, a ására, és az 5' BanHI restrikciós hasítási ására, 50 ul végtérfogathoz

1,25 mmol/I dNTF-t, 5 pl 1ÖX Pfu polimeráz keiöpuifert íStratagene), és 1-1 μ,Ι-t a két első polimeráz lánefeeiő termékből Azonos térfogatú ásványolajat adunk hozzá, )d a. reakeíóelegyet 1 percig 94 ' C-on tartjuk, 2,5 egység Píu-t -atagene) adunk hozzá, majd 5 ciklusban 94 ^űC-oa tartjuk 39 sodpercíg, 55 °C-on 30 másodpercig, 72 °C-on tartjuk 2 cig. A hőmérsékletet ismét 94 ^í:C-ra emeljük, és a reakció2-2 μΐ-t adunk a ZC15516 (51 < számú szekvencia} oligo•es törzsoldatábők ami egy 5' primer, és a számú szekvencia 1-es nnkleotidjánál kezdődik, v;

'7. számú szekvencia) oligonukleotidhől, ^üC-on tartjuk 39 másodpercig, 55 X-on cig, 72 'C-on tartjuk i percig, majd egy hétperces extenziöt ünk 72 °C-om A reskeiotermék egy részét gek tesszük láthatóvá, Bgy 789 bázispár méretű tatni, ami megfelel a várt méretnek.

TAC1-Fc4 és BCMA-Fe4 expressziős vektor konstrukció A TAC1-Fc4 és BCMA~Fe4 fúziós fehérjéi expresszíos plazmidokat homológ rekombinációval állítjuk elő

X « ^x* t φ· Φ * X * * φ _χ « 4 Φ *Χ * *

ΦΦΦ* « * **«

Φ ** ** ' élesztőben, A TAC1 cDNS egy fragmensét polimeráz láncreakcióvá! izoláljuk, ami az 5, számú szekvencia 15-475-ös nukleotidjai közötti polínukieotid szekvenciát tartalmazza. A TACI feagniens előállításánál használt két tor határoló szekvencia 40 számú szekvencia) 17 bázispárját h a következő: 1} az 5'vekén a TACÍ íra&mens (52.

szánni platót, lö pl vegrenogathoz lu ng eráz reakciópuffert (Perkm Elmer), 3 al 2,5 78 pl desztillált vizet, 2-2 pl-t az 52, és 53, számú sze yl-es t (2,5 egység Life Technoi _ k hozzá, majd a reakcideiegyet 2 on tartjuk, majd 25 ciklusban 94 6C-on tartjuk 55 °C-on 30 másodpercig, 72 °C-on tartjuk 1 percig, majd e ötperces extenziót végzünk 72 °C-on,

A BCMA eDN'S egy fraámensé

cs cíg 94 ciövui, ami ádiait, A

párt az 5 vektor namroío szcxvenciaöoi, es megfelel a BCMA fragmens ^-terminálisának (54, számú szeka 3' vég 48 házispárját, ami megfelel a határoló Fc4 szekvenciának, és 17 bázispárt, ami megfelelő a BCMA fragmens C-terminálisának (55, számú szekvencia}, 100 ul végtérfbgathoz 10 ng /1 dNTP-t, 78 pl desztillált vizet, 2-2 ul-t az

k 8 φ X X *Φ ** * χ φ * Φ * φ « φ φφ * * φφφ Φ Φ. * X Φ χ ΦΦ «β* *

54« és 55, számú szekvenciának megfelelő oligonukleofíd primer 20 mmol/hcs törzsoldatábőt. Azonos térfogatú ásványolajat adunk hozzá, majd a reakcióeiegyet 2 percig 94 °C-on tartjuk,

,-on ápereig, 55 ^:C-on mos

a ms

3' végből, ami me_ máz 17 bázispárt a Fc4 szekvenciából (57, számú *agraens g, 72 úon tartjuk 1 percig, majc 5t végzünk 72 ®G-on..

kódoló cDNS-t tartalmaző fragmenst hameg, egyet-egyet a TAGI és a

A TAGI esetében az Fe4 psfream és downstream) közül az , ami tartalmaz 40 bázispárt az 5' és 17 bázispárt az Fc4 fragmens N~ zek véne iából (56. számú szekvenciák primer, ami. 40 bázispárt tartalmaz a a határoló vektorszekvenciának, és tártálc4 fragmens C-terminálksának megfelelő az Fcá am primer egy oligt máz az 5 ' szekvenciából és 17 bázispárt az Fe4 fragmens N'-terminálisának megfelelő szekvenciából (58. számú szekvenciák A BCMA konstrukció esetében az Fc4 downstream primere ugyanaz, r az előzőkben a ?ACI-Fe4-re ismertettünk (57, számú s$

IÖ0 pl végtér fogathoz 10 ng, előzőkben Ismertetett Fc4 pl 2,5 nmol/1 dNTP-i. 78 pl desztillált vizet, 2-2 pl-t az 56. és 57, számú szekvenciának megfelelő oligonuki mmol/l-es törzsold a tából. Azonos térfogatú ásványolajat a a reakcióeiegyet 2 percig 94 ^cC-on tartjuk, majd 25

φ * φ * * φ φ * φΦΦ» * * »

Φ 9 ciklusban 94 6€-οη tartjuk 30 másodpercig, 55 *€-οη 30 másodpercig, 72 *C-on tartjuk 1 percig, majd egy ötperces extenzíői végzünk 72 X-on.

Az leemzésbez mindegyik előzőkben ismertetett 190 yl-es polimeráz láncreakció reakeiőelegyhől tíz-tíz yl-t 0,8%-os LMP agaráz gélen (Seaplaqüe CTG) futtatunk, IxTBE pufferben. Az al 1

os v*

Type Gnlture , ami tartalmaz expressziős kazettát, amiben a CMV korai promotere van, valamint egy konszenzus latron az eger lánc ; rei

-reduktáz génje és SV4Ö ternilnátora. A

keret 5 végén.

motert a citomegalovírus közvetlen korai promoterrel és a Kozac a nyitc

Kompetens élesztősefteknöi (önocaarornyces c« mikroIMert kombinálunk 10 pl oldattak ami körülbelül 1-1 pg-ot tartalmaz a TACI vagy a BCMA extracelluláns dornénbök és az Fc4 polimeráz láncreakció ifagmeusből, amik képesek egymással rekombinálódni, valamint 100 ng Smai restrikciós enzimmel *

Φ

Φ Φ *»?

ΓΛ\ * » « * * * * * ♦ « φφ *♦*

9, Φ

Φφφφ ?*

Φ χ 9 *

Φ Φ Φ Φ» emésztett ρΖΜΡδ vektort, majd egy 0.2 cm-es elekiropörácíós küvetláha visszük át. Az élesztő/DNS elegyeket a következő paraméterekkel elektropulzáltatjuk; 0,75 kV (5 kV/cmk Ohm, 25 μ,Ρ. Mindegyik küvettához 600 μΐ-t adunk egy 1,2 mol/l-es .szprfeit, oldatból, majd az élesztőt két 300 ui-es alíkvot részben szélesztjük UR/VD lemezekre, és 30 ^cC-on mkubáljok.

Körülbelül 48 éra elteltével az egyik lemezen levő Urae élesztő transzformánsokat 1 ml vízben resznszpendáljuk, majd röviden centrifugáljuk, hogy ülepítsük az élesztős üledéket 1 ml lizis púderben 12% Triton X-100, Γ mmoi/i md.rium-kloríd, 10 mmol/1 TRÍSZ pH-8,0, 1 mmol/1 EDTA) resznszpendáljuk. A lizis elegyböl ötszáz míkrolítert ey Eppendorf esőbe teszünk, ami 300 μ! savval mosott üveggyöngyöt ) μΐ fenol/kloroformot tartalmaz, majd kétszer-háromszor 1 vortexeljük, majd 5 percig centrifugáljuk Eppendorf centri1. A vizes fázisból 300 mlkrolítert át, majd a DNS-t 600 pl e % SI és

Gaíthersburg, MD) transzformálását 0,5-2 ml élesztő DNS

). 0,5% élesztökivonatot ÍDiíeo, Detroit, Mh, 10 mmol/1 kloríd, 2,5 mmol/1 kálium-klorid, 10 mmol/1 MgCb, 10 dgSCk. 20 mmol/1 glükóz) szétosztunk 250 μΐ-es alikvoi lemezre íbennoxk 1, (Difeo, Detroit, Mi), mez

Φ φ

* * φ φφφ φ

$ 4£·«·φ:φ * * φ Φ *'

Φ φΦΦ Φ * .χ ΦΦ.

A helyes TACi-Fe4 vagy BCMA-Fc4 expressziős konstrukciót tartalmazó egyedi klönokat restrikciós emésztéssel azonosítjuk, hogy igazoljuk az inszert jelenlétét, és hogy igazoljuk, hogy a különböző DNS szekvenciák helyes sorrendben kapcsolódtak egymáshoz, A pozitív kiónok ínszerijeit szekvencia-elemzésnek vetjük alá. Nagyobb mennyiségű plazmid DNS-t izolálunk a

Maxi Kit-tel (Q1AGENL a gyártó utasításai szerint.

crn-es szőve ttenyésztő lemezekre, éjszakán át, 37 ^cC-om /FBS táptalajban (DME-M, ,, Gaithersburg, MD), 5% igzat szerűm (Hyclone, bogán, UT), 1 mmol/l L-glutamin ÍJRH Biöseíences, Lenexa, ES), 1 mmol/l nátrium-piruvát {Gibco szaporodni. A

inzulin, 2 mg/ml fétuin, 1% L,-glutamin és

1% nátrium-pi.ru vátL A

vaí ml-es csövekben f gíijuk, összesen 840 μί térfogatban. A Upofectandne·'⁵ xevm hozzáadjuk a DNS keverékhez, majd körülbelül 30 percig szobahőmérsékleten hagyjuk inkubálódnL Öt milliliter SF táptalajt adunk a DNS-Lipoíeeiamine™ elegyhez. A sejteket, egyszer öblítjük 5 ml SF táptalajjal. majd leszívjuk róluk, és a pj^t hozzáadjuk, A sejteket öt óra φ » X Φ >♦«ί *φφφ φ * ^φ

Α φ «·*

127

ΦΦ*Χ Φ* * » φ :Φ * .Φ $Φ «· Φ * ⁹ */* kán síijúk. 5

Jajban T hosszat 37 ^cC-on inkubáljuk, majd 6,4 ml DMEM/10% FBS, 1% £ adunk minden egyes lemezhez. A lemezeket éjsza37 ”C-on inkubáljuk. majd másnap a a transzfekeid után a sejteket szelekciós táptaosztjuk szét CDMEM/ 5% FBS, 1% L-Gíu,

1% NáPyr). A transzíekcíő után körülbelül 10 nappal az egyes transzfekeiókbói származó rezisztens telepek két 150 mm-es

at.

A ztnf4 ge termékeny (B6C3fík serdülő ált hímek fB6D2fl) és

vaze nőstények

egyik a Taeonie Farms-ró! származik, A serdülő termékeny nőstényeket vemhes kanca szérum gonadotropinnal iSígma, St.

touís, MO) szuperovuláitatjuk. A szuperovu Iái látott nőstényeket ezt követően felnőtt, termékeny hímekkel keresztezzük, majd a közösülést vaginálís dugók jelenlétével igazoljuk.

A megtermékenyített peteseiteket sel alatt gyűjtjük össze (beica MZ 12 Stereo Mieroscope, Leíce, Wetzlar, Németország. A petesejteket azután bialuronidázban és Whitten W640 táptalajban tS, táblázat, minden reagens beszerezhető a Sigma-íól, St, bonts, MO) mossuk, amit 5% Cöz, 3% Oz,

128

Φ ♦

f A 9 χΦΦ

Φ

ΦΦ«Φ * * *,

9Ö% Ah összetételű atmoszférában inkufoáltunk 37 *C-om A petesejteket 37 ^eC/5% CCb inkubátorban inkubáljuk a mikrolnjekclózásig

8. Táblázat Whliten 640 táptalaj

5% fenolvörös 200 pl

A teljes hosszúságú TAGI ligandumot, a Blys-t kódoló 858 bázispár méretű nyitott leolvasási keretet (35, számú szekvencia) hmeráz lanereal és a határoló S' Fmeí és 3' Asel restrikciós hasítási helyet juttassuk be. a 36, számú 37. számú szekvenciavázlathan bemutatott ólig merek alkalmazásával. Ezt a Fmel/Asel fragrnensi pKPÖ24 plaz és a szűbklőnozzuk, ami egy Β~ és/vagy T-sejtre korlátozott transzgenikus vektor, ami tartalmazza az lg Em (okozóját [690 bázispár méretű Notl/Xbal fragmens a pBmSR-ből; Bodrog és mtsai: EMBÖ Journal 13, 2124-2130 419943, az lg Vn promotert 1536 bázispár méretű HíncII/Xhol fragmens a pJHIXRés mtsaf: J. Exp. Med. 177. 1681-169Ö (1993)), az SV< in tront íl? 1 bázispár méretű XhoI/HíndlII fragmens a pEmSR/Ase.1 Dolliinkért és a humán növekedési hormon gén _;υώ7 bázispár méretű

1, 239-249 (1982)3 A transzgén ínszertet a

mens azmid-gerinctől Xotl restrikciós enzimes emésztéssel és agaróz gél tisztítással választjnk el, az

és mtsai:

A beioganonat narosavat tesszük vissza 12 napos terheséget biztosítunk, A születés időszakot biztosítunk a szexálás és az tiszta ollóval a farokból egy 0,5 cm-es

A génomiális DNS-t a levágott egy kereskedelmi forgalomban levő kittet használva [DNeasy Tlssue Kit; QIAGEN, Valencia, CA), a gyártó utasításai szerint. A genomiáüs DNS~t polimeráz láncreakcióval elemezzük, a transzgenlkus vektor humán növekedési hormon (hGH) 3 UTR részére tervezett primerekkel, A ZC 17251 (38. számú szekvencia) és a ZC 17252 (39. számú szekvencia) primerek a hGH-nak egy 368 bázispár méretű fragmensét amplifíkálják, A csak a

130 venctára jellemző régió (amit a humán és egér növekedési hormon 3' UTR DNS szekvenciák egymáshoz illesztéséval lehet azo:ráz láncreakció nem nositaní) használata biztosítja, hogy a amplífikálja az egér szekvenciát. Emellett a ZC17518 (40, számú szekvencia) és a ZC17157 (41. számú szekvencia) primerek, amik a vektorszekveneiákhöz hibridtzálődnak, és amphfíkálják a oDNB használhatók a hGH prímerekkel Ezekben a kiséra transzgénre pozitív állatokból származó DNS két ierái, egy 368 bázispár méretűt, ami megfelel a hGH 3 ' UTR fragmensének, valamint egy változó méretű csíkot, ami a , hogy transzgemkusak.

cDNS ínszerinek felel meg.

eeníkus nőstényt egy vad-típusú hímmel, vagy egy transzhímet egy vagy több vad-típusú nősténnyel Ahogy az utódok megszületnek és elválasztjuk őket, a nemüeket elválasztjuk, majd a farkuk egy részét lecsípjük a éhez túlélési hiopsziát hajtunk végre. Az egyes· transzgének nrRN'S expressziős szintjének elemzését egy RNS oldat hibridizációs esszével vagy valós idejű polimeráz láncreakcióval bájtjuk végre egy ABI Frism 7700 berendezéssel ÍPE Applied Biosystems, Inc., Fos tér City, CA), a gyártó utasításai szerint.

A sejtek preparálása és áramlási citometrta

Az alapító sejteket különböző korban elemezzük. A limfold szövetek áramlási cítometriás (FACS) elemzéséhez csontvelő (BM) eket izolálunk a eombcsontokből és a sipcsontokból, foszfáttal .φ ·» i

φ: φ Φ * Φ Φ puffereit sóoldathan (PBS) végzett, óvatos roncsolással, amihez dörzsmozsarat és mozsár torol használunk, A sejteket reszuszláljuk, passzív ülepítéssel eltávolítjuk a esont-fragmenseket, lOÖÖxg-vel ülepítjük. Szpienocüákat, timocifákaf vagy nyh csomó sejteket kapunk intakt szövetek üveglemezek, közötti roncsolásával, majd a sejtek BM-ben való reszuss A sejteket a testes etott facb mosc kiegyensúlyozott sö p0~7,4) reszus eiőban. A festéshez tx 1

azután 20 percig jégen , és/vagy TriColor (TC)~konjugáh mennyiségének leiemeteben

ellenanyagok ml. FACS WB végtérfok, majd 400 ml reszuszpendáljuk, és FACSCalibur áramlási eltométerben elemezzük, a CeMQuest szoftver használatával (Beeton Dickinsom Monntain View, CA). Az előre történő (FSC) és oldalra történő fényszórást lineáris skálán állítjuk he, mig logaritmikus használunk mindhárom íluoreszeenciás esatornáFL-1, FL-2 és FL-3),

Az. FL csatornák közötti spel kísérletben elvégezzük, egyetlen színnel hót használva. Minden sejtet (korlátozás és az adatokat CeMQuest szoftverrel elemezzük. A vörös vérsejteket és az elpusztult, sejteket az FSC és SSC alapján szelektált adatokkal kizárjuk.

a go k

ΦΦ«Χ Φ* *

X Φ * φ £ χ φ » Φ φ * * * »*Χ« «ΦΦΦ » *****£

X φ φ * φ* * •X Φ

A iluoreszeein-izohocsanáttal (FITC) kői fikoerítrinnel (PE) konjugált anti~CD4 (RM4-5 klón), ant.i-C.D5 {53-7.3 .klónk anti-CD19 {1D3 .klón) és anfí-szindekán (281-2) monoklonális ellenanyagokat a ;

vasaro klonális ellenanyagot (RA3-8B2) a Caltag-tói vásároljuk.

A timföld kompar tmentben ztní4~et túlexprcsszálő transzgenikus egerek megnövekedett számú B-scjteket termelnek, magnő

ben, A lép B-sejtek megnőtt száma tartalmazza mind a hagyományos B-2 sejteket, mind a B~1 sejtek normális körülmények koszt a íáiis és más

tású, önmagával reagáló asszocí álódnak autoimmun ,s erítematózus SLE kífe

tt termelve, és gyakran égek, azaz példán! szisztémás termelődnek, proteínuría és szklerotikus glomerulák keletkeznek, amik a szisztémás lupus eritematózusra } felső panel), bélfodor nyirokcsomó (középső panel), és csontvelő {alsó panel) az előzőkben ismertetett módon készített egysejt szuszpenziőkat láthatunk, anti-B22O-TCvel festve, áramlási eltörnetrIával elemezve, Az egyes szövetekben levő B220* sejtek számát úgy számítjuk ki, hogy a B22Ö+ százalékát. az élő (azaz a tripánkék festéket kizáró) sejtet citométerrel megszámlált ossz-számával szorozzuk. Mindegyik

Φ * φ««» .»* ♦ ; » »·♦*·* * Φ χ Φ * *

ΦΧ«·Φ φφνφ-Φ X * * Φ *** χ φ Φ* Φ* *

Η3 egyedi adatokat jelent ztní4 transzgenikus (Tg, árnyékolt oszlopoki nagy nem-traxiszgenikus (üres oszlopok) egerekből.

Az 5B. ábrán ztnf4 lek) vagy nem-traxiszgenikus utódok (baloldali csomóiból (felső sor), lépteiből (középsó sorok) és csecsenwxnirigyhöl (alsó sor) izolált sejtek láthatók, amiket a jelzett mo~ ák elleni monoklonálls ellenanyagokkal (D€5, CD4 és CDS) elemezzük. A bemutatott _ ~ az elpusztult sejteket és a vörös vé

<«. úgy v™g, az ossz-IgG, -IgM és MgE es ei szgeníl a zfnf4 transzgenikus et vese-i lerakodása és megvastagodott mesaugiuma látható, a utódokból származó normális glomerulákkal összehasonlítva.

Az 5E, ábrákon az effektor T-sejtek növek Ztnf4 transzgenikus egerekben, a Maekay és leírthoz hasonlóan (Maekay és mtsal; J. Exp, Med, 190, 16971710 (1999)1,

Oldható TACÍ(BR43x2) vagy BCMA-lg fúziókat ín (Íntraperitoneálisan, intramuszkulárísan vagy zíní4-ei túlexpresszáló transzgenikus állatokba, A iímfoid szövetek áramlási eitometriás (FACS) elemzését arra használjuk, >^v bármilyen változást azonosítsunk a B220+ B-sejtek számain, a nyirokcsomóban és a csecsemőmirigyben.

134 fefefefe fefe fe ......« « * *

X * XX * * fefefe x ♦ * * *♦» « fe* ** *

Közvetlen kötési ELISA k-ΐ fel ’&V az

Cl-Ig-nek vagy az oldható BCMA-lg-nek azt a kéíen nogy ín aitm köti és gátolja a ztnfrá biológiai aktivitását, -lukas lemezt 1 pg/ml keeske-anti-humán. Ig-vel s, Bar ι; í. ί>ί·<ι.η^Μ·$ át 4 Ak-οπ inkubáljuk. A TACI, rokonságban nem levő TNF receptort, azaz (42, számú szekvencia), mint kontrollt titrá ötszörös hígításokban 320 ngk együtt inkubáljuk 2,5, 0,5 vagy 0,1 vei vagy ovaibnminnal mint negatív kontroliak majd 1 óra sékíeten a ztn.fr 10-et

3A C, 500 pl Tween 2C Sígma Chemical Co., St. Louls, MO), 200 ing nátrlum-azíd, foszfáttal pufíerelt sóoldal 1 liter végtériogatra

Superbloek-kal blokkoljuk (Pierce, Rockkord, IL), A azután 2 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk.

A lemezeket ismét mossuk ELISA C-veL '100 μΐ/luk mennyiségű neufr-avfáin-HRP-t hozzáadva ELISA B-ben (5 vagy 10 pg BSA (Sígma Chemical Co.), 1 vagy 2% BSA koncentrációhoz, 250 μΐ Tween 20 (Sígma Chemical Co,), 100 mg nátrium-azid, foszfáttál pufíerelt sóoldat pH~?,2 (FBS, Signia Chemical Co.), 500 ml végtérfogatra. Egy másik változat szerint a puffért 1 vagy 2%-os BSA koncentrációjú BUSA C pufferben készíthetjük ek A leφφ χ Φ ♦ Φ mezeket azután OPD-vel hívjuk elő 10 percig, szobahőmérsékleten, majd 492 nm-en leolvassuk.

i *

* φ φ φ*’ *

11. Példa

Biológiai aktivitás esszét fejlesztettünk ki. hogy mérjük az oldható ztnfá-gyel stimulált humán B-sejl oldható TACI-FC-vel való gátlását. A B-sejteket perifériális vér mononukieáris

ng/ml (Pharmíngen) rekombináns humán interleukín-4-et adunk hozzá, és három párhuzamosban kerekfenekű. 96-lu.kas lemezekre szélesztjük, 1.x 10⁵ sejt/ml koncentrációban.

Az okibató TACl-FC-t 5 pg/ml-ről 6 ng/ml-re hígítjuk, majd 5 napig a B-sejtekkel inkubáljuk, a 4. napon Inkánként I uCi ³H tímidirmel (Amersham) ímpulzus-jelezzük. Kontrollként oldható TACl-FC-t is inknbálunk B~sejiekkel és fnterlenkin-4gyel, anélkül hogy ztní4 lenne jelen,

A lemezeket Packard lemez-begyűjtővel gyűjtjük be, majd. Packard leolvasóval olvassuk le, A TACI-Ig oldható receptor gátolta az oldható ztn.í4-nek azt a képességét, hogy ín tóim serkenti a 8-sejt s tinin látását ínterleu kin-4 jelenlétében.

136

KW W

A ¢. Φ. * ♦ * ♦ *· * > * * * * * χφφφ »♦«* ♦ ♦ « * ***«

A « *4 ** *

12. Példa.

á essze

A ztrú'4 szintjét kóros álla$:

«1 P, Ví/w reumás arthritisben) szenvedő egyedekben határozzuk szerrel. Standard görbéi készítünk oldható, humán ztní4~höl 10 ng/mt 1 og/mí, 0,1 ng/ml, Ö.OI ng/mt valamint 0 ng/ml koncentrációban, ORIGÍN pufferben (Igen, Gaithersburg, MD). A szérum-mintákat ORIGIN pufferben hígítjuk. A standardokat és a en 2 óra hosszat ínkubáljuk Origin M) 1 ^ig/ml-re hígított, biotinilezett nyúl an Αν ellenanyaggal, valamint Origin esszé ben IIGEN1 1 pg/ml-re hígított, rutenilezett nyű ztnfá BV poliklonális ellenanyaggal, Az /ortexeijük és 0,4 mg/ml sztreptavídin stanöaror essze

μ,Ι/csö mennyiségben, majd 30 percig szobahőmérsékleten Ínkubáljuk, A mintákat azután vori mintákat egy Origin Analyzer-rel (Igen) olvassuk le, a gyártó utasításai szerint. Az Origin esszé elektroiumineszeencián alapul, és ECL-hen adja a leolvasási értéket, hogy mi ez, hogyan működik és mit mond ez nekünk.

A ztnf4 megnőtt szintjét lehetett kimutatni a mind az NZBWFl/d mind az MRL/Mpj-FasT*' egerekből vett szérummintákban, amelv egerek a glomerulonefritísz és az autoimmun betegségek előrehaladott álla

Oldható TAG-lg az SLB spontán modelljében

137

X Φ * # Φ Φ X Φ * * *< **** * 4

X Φ ** φ Φ :* * χχ Φ . Φ ΦΦ χφ

Az NZBW egerek körülbelül 7-9 hónapos korukban spontán

SLE tüneteket mutatnak. A TAGI

a B-sejtekre, amikor az NZBW egerekben a B-sejt autoellenanya^ termelődését átlagosan magas szintűnek gc Száz nyolchetes nőstény Π Labs) osztunk 6, 15 egérből állő csoportra. A Kezel havonta egyszer ellenőrizzük az egerek vizeletének k és vért veszünk tőlük CSC és szérum-bankhoz. A szé-

rurnot átvizsgáljuk,

CSD¹ van-e benne a a

, a vizsgálat során a vizelet fehértesztcsíkkal szabályos időközönként el

138 v# · X

φ X s.

Csoport (mindegyikben 5 egér)	Kezelés	Dózis
: 1	Kezeletlen kontroll
2	Csak hordozó
3	humán IgG-FC	20 pg
4	humán IgG-FC	100 ug
3	humán TACÍ-FC4	20 |ig
6	humán TACJ-FC4	100 ag

utáni időszakban is legalább kétszer m<=m? megkezdése után két héttel kéthetente raej proteinuria tesztcsík értékeit és a vért, és a beadás

érte

tggal, a bal vese és az agy súlyát megmérjük- A lépet és a cseA szubmandibuláris (alsó állkapocs alatti) nyálmhígyg nyirokcsomó láncot, a májlebenyeket az ef és a vastagbelet, a gyomrot, a vékonybelet, a hasnyálmirigyet, a jobb vesét, a mellékvesét, a nyelvet a légcsővel és a nyelőcsővel, a szivet és a tüdőt is előkészítjük a hísztológiához.

A 6. ábrán a ztní4 megnőtt szintje látható N2BWF1 és MRL/lpr/lpr egerekben, ami korrelál az SLE kifejlődésével, A 6A, Ábra felső paneljében láthatjuk a korrelációt a ztnfá szérumszintek és az életkor között, 68 N2BWF1 egérben, amiknek az életkora 10-40 bét, valamint 30 hetes kontroll N2B/B egerekben, A középső panel mutatja a profeinuriával való korrelációt három tartományban, nyomoktól 20 má/dm³~ig (T-3Ö1, 100-300 ng/<

és 2000 mg/dm³ NZBWFI egerekben, a kontroll NZB/I3 egerekkel összehasonlítva. Az alsó panel mutatja a ztnf4 szinteket az anti-ds DNS ellenanyag különböző színijeivel egerekben, a kontroli N2B/B egerekkel összehasonlítva.

A 6B. ábrán ugyanezek a korrelációk láthatók, amiket 23,

18-24 hetes MRL /1 egérrel mk. valamint lö 11 hetes

MpJ egérrel kaptunk.

A 7. ábrán az urtnalízis eredményei láthatók. Az

össze a kezelés tesztcsíkos leolvasás értéke sdOO mg/d:mA IgG FC, 100 mg, (C) humán IgG FC, 20 mg, ÍD)

100 mg és (Ej humán TACl-IgG, 20 mg. Az fúzióval kezelt egerekben a proteinnria lecsökkent.

A kezelt állatokból származó perifériális vér elemzéséből a 20 és 100 mg TACI-FC-vel kezelt egerekben, ha a és 100 mg FC-vel kezeit és a egkezdese után 2 héttel, után hat héttel (két héttel az utolsó kezelés után) Alis vér FACS elemzése (limfocita kizárás) a mintákban levő B-sejtek százaléka drasztikus csökkenést mutatott. A Bsejt szintek még öt héttel az utolsó kezelés után is csökkentek, de ez nem volt nagyon drasztikus, A 9. táblázatban láthatjuk az egyes kezelési csoportokban levő egerek átlagát (és a standard deviációt), A B-sejteknek a perifériális vérben v csökkenését Is megfigyelhet tök a kezelés más

9, Táblázat »»« φSt * φ φ φ Φ κ φφ * «

Φ * * Φ 9 *

Kezelés •Ο/

26.05 (8,521 23.34 (5,771

180 mg TACHFC 11,07 (5,031

1,37 <7,2:

87,05 (83 68,23 (7, 65,27 (7,18) 79.06 (8,71) 89,72 (8,901 . hét % T-sejt 20,83(3,14)

25,0-*

14,79 (4,78) 19,14 (5,27) mg TACI-FC

hatását.. Hatvan nyolchetes nőstény 12, 5 egérből az egerek súlyát, es vert veszumt a ctsc es

1-9-es , A. 11-es és 12-es cs apentoneálís injekciókat kan, és a

szerűm neális ülj IgG-FC-hö majd a 14 hétig hetente

Egércsoport	Kezelés	Dózis
1	humán TACI-FC4	200 mg
2	humán TA.C1-FC4	löö mg
3	humán TACÍ-FC4	20 yg
4	humán TACÍ-PC4	5 yg
5	humán FC4	200 yg
6	humán FC4	100mg

φ ΧΦΦΧ

Φ φ ♦; Φ *

χ. X φ * Φ Φ. Φ Φ > χ.φ χ »φ φ .♦ φ · χ Φ * ·.** * ;φ Φ* Φ* *

Hí

Α 7. és 12. napon vért veszünk. Az eutanázia kíő| veszünk és megmérjük a testsúlyokat. A tépet és a csecsemömlngyet elosztjuk a FACS elemzés és a hlsztológla között, á t, a t, a béltooor Lív táncát, a

az blyaggal, a. vakbelet és a vastagbelet, a gyomrot, a elet, a hasnyálmirigyei, a jobb vesét, a mellékvesét, a

csökkenés volt a TACCFC4 liiiijssííi, az nyelvet a légcsővel es a nyelőcsővel, a sz es jobb comfoesontot, és az agyat is

Amint azt az előzőkben a 13. példában ismertettük, az összes TACI-PCá-gvel kezelt mintából vett perifériális vérsejtek között a B-sejtek százalékának szignifikáns csökkenése látható a 7. napon (CBC-vel) és a 12. napon (FACS-szab, a csak FC4-gvel vág)' csak PBS-sel kezelt és CBC-vel vagy FACS-sza.1 kezelt mintákkal összehasonlítva. Emellett a 14, napon kőzet 50%-os ikbol veit lépőkben a összehasonlítva,

Anlí-dsDNS ELISA ··.*-♦ X

9»

XX «« *

142

Az autoimmunitást az antí-kétszálú DNS ellenanyagok magas szintje jellemzi. Ahoz, hogy megmérjük az anti-dsDNS ellenanyagok szintjei mind a túlexpresszáló ztní4 transzgenikus egerekben, mind az NZBW egerekben, egy ELISA. esszét fejlesztettünk ki. Egy 96-lukas mikrotiter lemezt (Nunel 75 μΐ/luk mennyiségben poIi-L-lízInnel (Sigma Chemical Co.) borítunk (20 μΐ/l 0,1 mol/l. Trisz pufférben majd szobahőmérsékleten 60 percig inkubáljuk. A lemezeket azután desztillált vízzel mossuk cs 30 percig szobahőmérsékleten 2%-os BSA-val (Sigma Chemical Co,) blokkoljuk TRISZ puffer ben, majd végül desztillált vízzel mossuk.

A 11, példában ismertetett ztní4 transzgenikus egerekből és a 11.. példában Ismertetett N2BW egerekből szérum-mintákat veszünk, A szérum-mintákat 1:50 arányban higi'ijuk TRÍSZ pub ferben készített 1% BSA/2% BCG oldatban (Calbiochcm). A bigíiott mintákat a beborított lemezre titráljuk 1:50. 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 és 1:8400 arányban (50 μΐ/ink), majd 90 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.

A lemezeket desztillált vízban mossuk, maid 1% BSA/2% BCG oldatban 1:1000 arányban hígított kecske anti-egér IgG-FcHRP-t adunk hozzá (50 al/lukl. A lemezeket 60 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A lemezeket 5x mossuk desztillált vízben, majd OPD-vel előhívjuk, 1 tabletta/10 ml Növő D, és 100 μΙ/IuK mennyiségben szélesztjük. Az előhívást 100 ul/lnk I mol/I H?.SCb hozzáadásával állítjuk le, majd az OD~t 492 nm-en leolvassuk.

A 8, ábrán az aníhdsDNS szintek láthatok két, 23 hetes transzgenikus egérben, két nem-transzgenikus utódban, 32

X φ φφ φφ φ φ φ φ φ *

Φ Φ X φ Φ *«

Φ ΦΦΦ Φ χ ΦΦ χ X »:

φ φ ΦΦ Φφ

X

és hetes MRL/lpr/lpr egerekben mért Irtva.

16. Példa o TACI-lg az ELE s

Huszonöt 12 hetes nőstény PtxSJi. FI egérnek (daekson

I szubkután injekcióban 125 ug/egér antigént adunk be (mtelin Proteokpid Protein, PLP, 139-151-es csoport), Ereund fele kiszerelve. Az

b egér van. é álisan a 0. és a 2, napon. A es dózisban adunk be TACI-1, kezelést. A megelőző kezelés a 0, «0 a 7. napon kezdődik, vagy a

A betegség, a testsúly-vesztés és a bénulás tünetei 10-14 nap ;g, és körülbelül 1 hétig tartanak, Az állatokat ük, megérve testsúlyukat és megbecsülve a nikai értékszámot, hogy megfeleltessük tüneteik kiteriedtségével. Az EAE klinikai tünetei a beoltás után 10és körülbelül 1 hétig tartanak. A vizsgálat tót eutanízáijuk gáz túladagolással, majd felboncoljuk. Az. agyat és a gerincvelőt a hisztológiához összegyűjtjük, vagy mfeNS elemzéshez lefagyasztjuk. A testsúlyokat, és a klinikai értékszáés csoportonként, ábrázoljuk.

Normális

Xfcfcfc χχ

X ♦ * fc ♦ χ » fc X fc X fc fc fc fc fc » « «

♦.· fc fc*

144 .5 Gyenge, a faroknak csökkenhet, a tónusa, de nem hiányzik {nem tövénél tetei gyenáe ín meg tud állni,

te a ietuuK a teste alatt a

Bénulás (nem tud Iá) csak sétáink lábalt maga után húzva) 4 Bénulás (nem tudja mozgatni a megpróbál járkálni o Kvaárípiégia (bénulás az vagy a vízért nyűtek az

, es a ci u a reumás

Nyolchetes hím DBA/ 13 egereket (daekson Labs) ötös eső-

majd két szubkután injekciót ar 1 mg/ml kollagénből (csirke vagy szarvasmar·· eredetűt, háromhetenként, Az egyik kontroll nem . injekciókat. Az első injekciót szereliük ki, a második miekeiőt nemszen ♦ vagy az előtt, vagy miután az be a második í állatban 2-es vagy

meg, ami legalább 24 óra hosszat tart. Az á neteit a második kollagén injekció után kezdik mutatni, általában 2-3 héten belül, A betegség kiterjedtségét az összes mancsban értékeljük, nérökörzővel mérve a mancs vastagságát

Λ*

Φ * ♦«< *·χ * φ φ φ- Φ *

Κ· Φ Φ' X Φ *'Φ' * *' φφΦΦ *»·* κ * Φ * **Φ ♦ φ φ* φ* * és 0-3 közötti klinikai értékszámot rendelünk mindegyik mancshoz. Ha a klinikai érték 0, akkor az a normális állapot, ha

Kor az ujjak gyulladtak, ha 2, akkor a mancs dásos, ha 3, akkor a mancs közepesen gyulladásos, és ha 4, akkor az a mancs súlyos gyulladását k eutanizáljnk, miután egy

a elemzéshez összegyűjtjük, és szérumot gyűjtünk az immunglobulin és ettokm víz

18, Példa

szintetizátorral (Applied Biosystems, Inc., Fos tér City, CA) szintetizáljuk, a gyártó utasításai szerint, A peptideket azután maleímid-aktiválással konjugáljuk a füroesiga hemocianin (KLH) hordozó pepiidhez, Mindegyik nyúlnak adunk egy indító intraperítoneábs (ipl injekciói, ami 200 mg pepiidet tartalmaz komplett neálís injekciókat adunk be, amik 100 mg pepiidet tartalmaznak

Freund. fék után (összesen , A második erősítő ) az a

vereztetjük és összegyűjtjük a szérumot. Az állatokat azután haromhetente fokozzuk és vérezteiiük.

:* 9

146

9 * # * ^Λ « < Φ Φ Φ ** Φ X « χ;*Φ * * * ν ♦ **>*

Λ Φ X* ♦♦

Α ztnf4 pepüd-specifikus nyúl szérumokat ELISA liter ellenőrzéssel jellemezzük, a pép üdékből 1 pg/ml-t használva az ellenanyag (59. és 60. számú szekvencia) előállítására ellenanyag célpontként, A huztnf4-l peptid (59. számú szekvencia) elleni 2 nyűlszérumnak van litere a specifikus peptidjük ellen 1;1E5 (1:100000 hígításban), A huztnf4-2 peptid (60. számú szekvencia) elleni 2 nyúlszőröm nak van litere a specifikus peptidjük ellen 1; 1E8 (1:100000 hígításban} és a teljes hosszúságú rekomdiérjék ellen (N-terminálís FLAG-jelzett ztní4, hakulovi?a (nuzini4s-F“-Svk és a C-termínálisán FLAGztnfá. BHK

számú szekvencia)

A ztní4-specifikus

specifikus ellenanyagokat ELISA titer ellenőrzéssel az ellenanyag célpontjaként 1 pg/ml-1 használva a tíd-antlgénbői vagy a teljes hosszúságú rekomhináns fehérjéből A nvúl anü~huztnf4~l affinitás-tiszt nyagnak a specifikus antigénjén (huztnJ4-l peptid, 59. számú szekvencia) a kimutatás alsó határa az 5 ng/ml-es hígítás. A nyűi antí-huztnf4-2 affinitás-tisztított ellenanyagnak a specifikus antigénjén (huztnf4-2 peptid, 80. számú szekvencia) a kimutatás alsó határa a 0,5 ng/ml-es hígítás, A nyúl anti~huzi.ní4»2 affiniszfított ellenanyagnak a rekomhináns huztnf4s-NF-Bv peptára az 5 ng/ ml-es is keszítür tálunk a bíodnnai jelzett oldható ztnf4 gátlására. Egyik TAGI * «X * * Φ * * X β χ

Φ χ* ♦ χ

147 monoklonális 248.3) gátolja a 248.23 körülbelül sem (243.14, 248,23. hoz való kötődését. A

50%-kal csökkenti 10 ng/ml , 24 vágy-

ét, ha a és a kötődést körülbelül 2x csökkenti monoklonális 246.3 ztní4-biotin kötődését, ha a kondicionált arányban hígítjuk, és a kötődést körülbelül 5x csökkenti, bigítatlan táptalajban.

eltérnénk a jé megfelelően a jelen a csatolt tgénvAz alábbiakban szekvenciákat.

SZEKVENCIAhlSTA <110> ZvmoGeneücs Iné <120> Oldható BE43x2 receptor és felhasználásának

<I30> 98-75 <150> 09/226.533 <151> 1999-01 -07 <X 60> 80 <170> FastSEQ fór Windows Version 3.0 <2I0> 1 <211> 1192 ν < .V Φ φ X Φ Φ * « * y <· * Φφ Φ * «Φφ» « Φ Φ * **·$*« φ s # Λ·- >· <212> D.NS <2Ι3> Homo sapiens <220>

<22l> CDS <222> (β)..,(746) <400> 1

gágfca at	.c agt gg	C ctg ggc egg agc agg cga ggt gg	ec ege agc cgt gtg 50
	Me	s.fc Ser Gly tea Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gl	y Arg Ser Arg Val
				5 10	IS
gac	cag	gag	gag	ege tgg tea etc agc tgc ege sí	ag gag caa ggc aag SS
Asp	Gin	Gin	Glo Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys	Gin Gin Gly Lys
				20 25	30
ttc	tat	gac	cat	ctc ctg agg gac tgc atc age tgt gcc tcc atc tgt 145
Fhe	Tyr	Asp	Hl e	Len Let Arg Asp Cys Ila Ser Cys	Ala Ser Ile Cys
			35	40	55
gga	cag	CSC	cet	aag caa tgt gos tac ttc tgt ga	g aac aag ctc agg 154
Gly	Gin	Sis	Pro	Lys Gin Cys Ala Tyr Pte Cys Gin	Asn Lys Leó Arg
		SS		55	se
agc	cca	gtg	ase	ett cca cca gag ctc agg aga cag egg agt gga gaa 242
Ser	Pro	Val	Asn	Lea Pro Pro Gin Leó Arg Arg Gin	Arg Ser Gly Glo
	65			7 V 75
gtt	gaa	aac	aat	tea gac aac teg gga agg tac cs	sa gga ttg gag cae 200
Val	Glti	Asn	Asn	Ser Asp Asa Ser Gly Arg Tyr Gin	Gly Leó Gin His
8 δ				SS 00	35
aga	ggc	tea	gaa	gca agt cca get ctc cég ggg ct	:g aag ctg agt gca 338
Arg	Gly	Ser	Gin	Ala Ser Pro Ala Lee Pro Gly Leó	Lys Len Ser Ala
					ί 1 D
				.φ ν V 1 tfv	A .ί. v
gat	cag	gtg	gcc	ctg gtc tac agc acg ctg ggg etc tgc ctg tgt gcc 386
Asp	Gin	Val	Ala	Lee Val Tyr Ser Thr Leó Gly Len	Cys Lee Cys Ala
			115	120	125

yte otc tgc tgc tte ctg gtg gcg gtg goe tgc tto ©to aa© aag agg 434 Val Le© Cys Cys Ph© .Lee val Ala Val Ala Cys Phe Lett Lys Lys Arg

130 135 140 ggg gat ©c© tg© tcc fegc «ag ccc ©ge tea agg ©ee ©gt ©aa agt. ©cg 482 Sly Asa Pro Cys Sár Cys SÍ a Pro Arg Ser Arg Pro Arg Cin Ser Pro

145 ISO 155 geo aag tét tee ©ag gat ©ae geg atg gaa gt© gg© ag© ©et gtg ege 530 Ala Lys Ser Ser Gin Asp Sls Ala Hét Gla Ala Gly Ser Pro Vei Ser

100 155 170 175 aca te© ©ee gag cea gtg gag ace tge ag© ttc tg© tt© cet geg tg© 575 The Ser Pro Glü Pro Val Sla TAr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glo Cys

ISO 165 100 agg geg sec acg cag gag aga gca gtc acg cet ggg aee ccc gae ©ee 020 Arg Ala Pro Thr Gin Sitt Ser Ala Val Thr Pro Sly Thr Pro Asp Pro

195 200 205 act tgt got gga agg tgg ggg tge cac ac© agg ac© aca gte ctg cag 874 Thr Cy© Ala Sly Arg Trp Gly Cys: h£s Thr Arg Thr Thr Val Lee Gin

210 215 220 cet. tg© cca eac atc cea gac agt gge ett gge att gtg tgt gtg cet 722 Pro Cys Pro Kis He Pro Asp Ser Gly Lett Sly He Val Cys Val Pro

225 230 235

geo cag ga· Ala Sin Sít	3 K? 39'C «ea ggt gea ι Gly Gly Pro Gly Ala	taaafeggggg teagggaggg aaaggaggag 775
24 0	24	5:
ggagagagat	ggagaggagg	ggagagagaa	agagaggtgg	ggagagggga	gagagatatg 838
aggagagaga	gaeagaggag	geagagaggg	agagaaaeag	sggagacaga	gagggagsga 89S
gagaeagsgg	gagagagaga	cagaggggaa	gagaggeaga	gagggaaaga	ggcagagaag 955
gaaagaggoe	gagagggaga	gaggeagaga	gggagagagg	cagagsgaoa	gsgagggagelSiS
gagggooaga	gagagataga	gcaggaggtc	ggggoactct	gagteecagt	te c cagt gc a1078
getgtaggte	gteátescet	aaccacaogt	geaat&asgt	ectegtgcct	gc t go te ao a 113 *3
gccccégega	geccctooto	otggagaata	aaaoorctg©	cagetgcoct	teetea 1192

<210>2 <21 !> 247 <2.i.2> FEHÉRJE <213» Homo sapiens <4ÖÖ>2

ffet Ser Gly Lee I

Gly 5

Arg

Ser

Arg

Arg

Gly 18

Gly

Arg

Ser

Arg

Val 15

Asp

Gin Glu Glu Arg

Trp

Ser

Lee

Ser

Cys

Arg

Lys

Gle

Gin

Gly

Lys

Phe

28

25

30

Tyr Asp 8is Let

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Alá

Ser

Ile

Cys

Gly

35

48

45

Gin Kis Pro Lys

Gin

Cys

Als

Tyr

Phe

Cys

Gin

Asn.

Lys

Lep

Arg

Ser

50

55

50

Pro Val Asn Leu

Pro

Pro

Glu

Lee

Arg

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Val.

SS

/ V

75

S8

Glo Áss Asn Ser

Asp

Asr.

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Len

Gin

Kis

Arg

S5

30

95

Gly Ser Gin Als

Ser

Pro

Alá

Leó

Pro

Gly

Le®

Lys

Lee

Ser

Alá

Asp

IÖÖ

105

118

Gin Val Ma Les

Vei

Tyr

Ser

Thr

Lee

Gly

Lee

cys

Les

cys

Als

Val

1X5

120

125

Len Cys Cys Phe

Lee

Vei

Ara

Val

Alá

Cys

Phe

Len

Lys

Lys

Arg

Gly

130

135

148

Asp Pro Cys Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

Pro

Als

145

ISO

155

160

Lys Ser Ser Gin

Asp

8 is

Alá

Met.

Gxu

Alá

Gly

Ser

Pro

Val

S&'tr

Thr

.165

178

175

Ser Pro Glu Pro

Vei

Gly

Thr

Cys

Ser

Ph®

Cys.

Phe

Pro

Guu

Cys

Arg

180

185

190

Alá Pro Thr Gin

Glu

Ser

Aie

WI

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

135

280

205

Cys Alá Gly Arg

Trp

siy

Cys

Kis

•‘pb V* A »4i

Arg

Thr

Thr

Val

Lee

Gin

Pro

2IÖ

220

Cys Pro Kis lle

Pro

Asp

Ser

Gly

Lee

Gly

ii©

Vai

Cys

Vei

Pro

Alá

225

238

235

240

Gin Glu Gly Gly

Pro

Gly

Aló

245

<21O>3 ζ\

? s ·> ÍN*

Η 7.^v ?

IS

Φ x *♦·. * χ *> * » x *

X « φ χ. φ ' X* Φ *· φ «Φφ ΦΧΧ» X ». * * ♦ »« χ « φ* Φ* * <211><

<212>

<ík's> Morno sapiens <s

áig

agt

gge

ctg

?9t

egg

agö

agg

ogs

ggt

ggc

ogg

age

egt

ctg

gac

45

Met

Sár

Gly

&€?ti

Gxy

Arg

Ser

Arg

Arg

Gly

Gly

Arg

S&.iC

Arg

VaX

Asp

1

5

10

15·

Cag

9»g

3>«3

ege

tgg

tea

ele

sgc

tge

ege

aag

gag

csa

gge

aag

Itc

9 6

Gin

Gin

GXki

Arg

w

Ser

Lee

Ser

Cys

Arg

Lys

Gio

Gin

oly

Lys

Ph®

tát

gac

est

ele

ctg

agg

gac

tge

aló

ágé

tgt

geo

léc

ato

tgt

gga

144

Tyr

Asp

HiS 3 λ

Lat

Len

Arg

Asp

Cys

ne

Ser

Cys

Alá

Ser 4 Λ

:.is

Cys

Gly

cag

CSC

cet

aag

C&Z

tgt

gea

lae

ttc

tgt

gsg

aao

aag

efce

agg

age

132

Gio

Hiá

Pro

Lys

Gin

Cys

Alá

G'vs?

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Let

Arg

Ser

Sö

55

Sö

cea

gtg

«.ae

ett

cea

tea

ele

s>gg

ága

vgg

agt

gga

g&a

gtl

240

Pro

val

Ásó

XjSU

Pro

Pro

GI.5i

X/öti

Arg

Arg

GXn

Arg

Ser

Gly

Giu

Val

SS

70

75

80

gaa

aac

s&t.

tea

gae

&&C

teg

gga

agg

tac

oaa

gga

ttg

gag

eac

aga

288

Gis

Asn

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

•Slv

Arg

Tyr

Gin

Gly

Les

Glt

Kis

Arg

g$

98

35

gge

tea

gaa

gea

ági

cca

get

ele

cég

333

ctg

aag

ctg

agt

gea

gat

33S

GI.y

Ser

ax&

Ser

Pro

Alá

Let

Pro

Gly

Let

Lys

Les

Ser

Alá

Asp

10 0

ÍÖ5

11 G

cag

gtg

**^t>*i«*:

ctg

gie

tae

a go

acg

180

Gin

’val

Al$

Let

Val

Tyr

Ser

Thr

115

120

<210> 4 <2Π> 120 <212> FEHÉRJE φφ φΧ ’ΑΓ

152

Φ * φ

Φ *

X * Φ Φ Φ φ ΦΦΦ Φ X ·Φ X * .φ φ φφ <213> Homo sapiens <400>4

Hat Ser

Gly Leu

<7. Ív? ** 5

Arg

Ser Arg

Arg

Gly 10

Gly

Arg

Ser

Arg

Val IS

Asp

Gd.il GXu

Glu

.&rg

Trp

Ser

Lee

Ser

Cys

Arg

lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Pfee

Tyr Asp

Ars

Λ:· V Leu

LáU

Arg

Asp

Cys

lls

Ser

Cys

Alá

Ser

lle

Cys

Gly

35

48

45

Gle .Kis

Pro

Lys

Gla

Cys

Ad.&

Tyr

Phe

Cys

GXcs

Asa

Lys

übíSXl

Arg

S®27

58

55

68

Pro Val

ASU

Leu

Pro

Pro

viú

Lee

,Arg

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Gin

Vei

65

70

75.

88

Glu Asa

Asn

Ser

Asp

Asa

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin.

Gly

Leu

Gla

His

Arg

85

98

95

Gly Ser

GXb.

A.Xs

Sér

Pro

ΆΧ&

Leu

Pro

Gly

Ls2Ad

Lys

Lee

Ser

Alá

Asp

ISO

155

110

GXii V&X

ax&

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

215

128

<210>5 <211> 1377 <212> DNS <213» Homo sapiens <220» <221» CDS <222> (14)..4395) <400»5 ageateetgá gta. atg agt ggc etp gge ogg agc agg ega ggt gge «gg 49 Mö't Ser Gly .Leu Gly Arg Ser Árg Arg Gly Gly Arg i 5 10

sv\5C·

cgt

gfcg

gac

eag

vág

3<S

ege

tét

oca

oag

ggc

ctg tgg

acg

933

97

Ser

Arg

val 1 c

Asp

Gla

Gre

Arg 9 Λ

Pfee

Pro

Gin

Gly

Lsu ··> ε

Trp

Tfer

Gly

g-hg

get

<rg atg

aga

tco

tgo

cec

v

gag

cég

φ· » Λ &- W

tgg

Λ. 2 gat

cet

ctg

ctg

14

V&X

Alá

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

»«<> vx

G.lu

SsXxi

Pyr

Trp

Asp

Pro

Leu

Leu

36

35

40

153

>

9 * X 9 X *

♦ Φ * Jfr **

ggt

SCO

tgc:

a tg

tcc

tg©

aaa

•set

art

tgc

aac

cat.

eag

ege

tag

ege

133

Gly

Thr

Cys.

Met

Ser

£ys

Lys

Thr

üe

Cys

Astí

Kis

Gin

Ser

Gin

Arg

45

50

55

§0

acc

tgt

gca

gcc

itt

tgc

agg

tea

ctc

agt

tgc

tgc

aag

gag

caa

ege

241

Thr

Cys

Alá

AX<2

Phe

Cys

Arg

Ser

Lee

Ser

Cys

Arg

Lys

Qlu

Gin

Gly

65

70

75

aag

ttc

tat

g&e

tat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

att

a^c

tgt

gcc

tcc

a te

283

ghe

ÍW

Asp

Hís

Let

Arg

íle

Ser

Cys

Alá

Ser

iis

80

VC <Λ»

90

tgt

ggs

tag

cat

cet

aag

caa

tgt

gca

tat

hit

tgt

gag

aac

aag

ctc

337

Cys

Gly

Glr; «3 ü

His

Pr©

Lys

ölt

Cys *

AÍS

Phe

Cys

Giu 5

Asa

jc?y s

Les

agg

agt

•cc.a.

gtg

aac

cit

tea

cca

gag

ctc

agg

aga

eag

egg

agt

gga

335

Arg

Ser

Pro

v&x

Asa

tea

Pro

Pro

Let

Arg

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

üö

115

1.20

$a«

gtt

gaa

&&C

aat

tea

gac

aac

heg

gga

agg

tae

caa

gga

ttg

gag

433

Gia

Vai

Clu

Asa

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Gin

125

130

135

190

CSC

aga

3G~

tea

gaa

gca

agt

tea

gtt

ctc

ecg

999

ctg

aag

ctg

agt

431

His

Arg

Gly

Ser

Giu

Alá

Ssr

Pro

AX a

Let

Pro

Gly

Lee

Lys:

Les

Ser

145

ISO

155

gca

gat

cag

gtg

geo

ctg

gtt

tat

agt

&C9

ctg

993

cte

tgt

ctg

tgt

529

Alá

Asp

Gin

Val

Alá

Let

Val

Pyr

Ser

Thr

Aj® ti

Gly

XíföVi

Cys

LStt

Cys

l’Sö

165

170

c?cc

gtc

ctc

tgc

tgc

ttc

ctg

gig

9<-·9

gig

gtc

tgt

tte

ctc

aag

aag

577

Alá

Val

Len

Cys

Cys

Phe

Let

Val

Alá

Val

A.la

Gys

Phe

Leu

Lys

Lys

175

ISO

185

agg

ggg

3&t

cet

tgc

tcc

tgc

cag

ccc

ege

tea

agg

tte

cgt

caa

•agt

625

Arg

oly

Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

130

195

200

ecg

gcc

aag

tet

tcc

cag

gat

eac

geg

a tg

caa

get

99©

agc

cet

§ag

67 3

Pro

Ai3

lys

S-er

Ser:

Gin

Asp

His

A2.3.

xet

Glu

Al &

Gly

Ser

Pro

val

205

210

215

220

154

agc

aca

fcec

ccc

gag

cca

s tg

gag

5íía O

ege

agc

ttc

tgc

ttc

cet

gag

721

Sár

Thr

Ser

Pro

Sík

Pro

Val

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

225

230

235

tgc

agg

3<3

ccc

acg

cag

gag

agc

ges

gfco

seg

cet

333

sec

ccc

geo

78$

Cys

Arc

Alá

Pro

Thr

Sitt

Glu

Ser

Alá

Val

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

240

245

250

cec

set

tgt

get

gga

agg

tgg

33?

tgc

cse

sec

agg

acc

aca

gtc

ctg

817

Pro

Thr

Cys

Λ* a

Gly

Arg

Trp

Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Thr

Val

Leu

255

260

2 SS

cag

cet

Ige

tea

cae

ate

eea

gac

agt

ggc

ott

ggc

att

3tg

tgfc

gtg

$65

Gitt

Pro

Cys

Pro

His

ne

Pro

Asp

Sár

Gly

Lett

Gly

21©

Val

Cys

Val·

270

275

250

cet

gcc

cag

gag

333

ggc

cca

ggt

gea

taa

atgggggtca gggsgggaaa 9.15

Pro

Alá

Gitt

Glu

Gly

Gly

Pro

Gly

Alá

2SS

290

ggagg&ggga g&gagatgga gaggagggga gagagaaaga gaggtgggga gaggggagsg 975 ágatatgagg agagagagac agaggaggca gaaagggaga gaaacagagg agacagagagl035 ggagagagae acagsgggag agagagaeag aggggaacag aggesgsgag ggaaagrgqcl095 agagaaggaa agagacaggc agagaaggag eg&ggcagag agggagagag gcagagaggg.l!55 agagaggeag agagacag&g agggagagag ggaeagsg&g agatsgsgca ggsggt-cggglllS gcactctgag tóoc&gfctcc eagrgcaget gtaggtegtc atcacetaac cacacgtgcal275 at&aagtcct egtgcetgct getcecagcc cccg&gagec cctcctccfcg gagaa-fcaaaalSZS cefcttggeag ctgcccfetcc fccaaaaaaaa saaaa&aaas aa 1377 <210»6 <211 > 293 <213> Homo sapiens <40ö> 6

4et 1

Ser

Gly

L~a

Gly 5

Arg

Ser

Arg

Arg

Gly Gly 10

Arg

Ser

Arg

Val 15

Asp

Gitt

Glu

Gitt

Arg 20

Phe

Pro

Gin

Gly

Leu 25

Trp

Thr

Gly

Val

Alá 30

zet

Arg

Sár

Cys

Pro 35

Glo

Glu

Gitt

Tyr

Trp 40

Asp

Pro

Leh-

Leu

Gly 65.

Thr

Cys

Hét

Ser

Cys 50

cys

Thr

Xle

Cvs

Astt 55

Kis

Gin

Ser

el r.

Arg 60

Thr

Cys

Alá

Alá

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gitt

G ly

Lys

Phe

Tyr

Asp

.fc Λ fcfcfcfc fc* * fc * » fc ♦ *

X fc: fc x fc Xfc * * fcfcfcfc fcfcxx fc fc ♦ » fcfcfcfc * fc fc* *·* * '55

δ 5 HiS

Len

Lep

Arg

Asp

70 cys

lle

Ser

Cys

Alá.

7 5 Ser

lle

Cys

Gin

80 Kis

Pro

iys

Gin

Cys ι ή n

85 Aia

Tyr

Phe

Cys

-Glu

90 Asn

Lys

Arg

Ser

35

'Cai

Asn

Lse

Pro

Pro

Gin

Arg

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

ksii-Ái

Val

G-hu

Asn

Asn

Ser

115 &Sp

Asn.

Sár

Gly

Arg

120 Tyr

Gin

Gly

Len

Glu

125 KÍ3:

Arg

Gly

S er

Gx d

130 Alá

Ser

Pro

Alá

Lsu

135 Pro

Gly

Les

ü/s

Lee

140 Ser

Ara

Asp

Gin

Val

145 H&íi ’S

Lsu

Val

Tyr

Ser

150 Thr

Len

Gly

1.-20

Cys T7A

155

Cys

>Ads

val

ISO Lee Gys 5 ” -

Cys

Phe

L©«

Val

AXs

Val

Aia

Cys

Phe

«1 .ί .Len

Lys

Lys

Arg

Gly

Asp

Pro

Cys

Ser

cys

ISO Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

185 Pro

Axtcj

Gin

Ser

Pro

190 Alá

Lys

Ser

Ser

Gin

135 Asp

Bí'·

.AX&

MSt

Gin

200 AXe

GXy

Ser

Pro

val

205 Ser

Tár

Ser

Pro

Gin

21 ö Pro

Val

Gin

Thr

Cys

215 Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

220 Gin

Cys

Arg

Aia

Pro

225 Thr

Gin

8Iu

Ser

Aia

238 Val

Thr

Pro

Gly

Thr

235 Pro

Asp

Pro

Thr

Cys

140 iAx,&

W

Arg

Trp

Gly

245 Cys

Kis

Thr

Arg

Thr

250 Thr

v&x

Gin

Pro

255 Cys

Pro

Sis

AÍÖ

?rc

250 Asp

Ser

Gly

Len

Gly

255 xie

Val

Cys

Val

Pro

270 Aia

Gin

Gin

Sly

Gly 28 0

275 Pro

Gly

Aia

280

285

<210>7 <211> 995 <212> DNS <213» Homo sapiens <220>

<221 > CDS <222> (219»,, 4773) <400»7 gtggtattca aatocttacg rgeegegaag 60 gcaggcgsag ttcattgttc tcaacattct 120 crtgtagags tattaettgt octtccaggc 180 ttgtgatc atg ttg cag atg get ggg 236

Met Geo Gin Aet Ála Gly

156

Φ Φ »*** ♦ * * φ Φ Φ: Φ Φ Φ

Φ χ χ Φ Φ ΦΦ Φ *

Χ*«Φ χ ΦΦΦ φ Φ Φ X Χ*ΦΦ * φ: φ·Φ X* ’ aagaotc&aa acaeagaeag agctgctett tgttettict cttsgaaact eeecxgtaag getgo&tttg gtagetecet tgaattagat aacecacgaa eictggaatt tgttitettG

cag

tge

tce

aat

gaa

tat

ttt

gac

agt

ttg

ttg

cat

get

tge

ata

284

Gin

Cys

Ssr

Gla 10

.tsa

Gla

Tyr

Phe

Asp 15

Ser

Gea

Gea

His

Alá 20

Cys

Xle

cet

tgt

caa

ett

tgt

tét

tót

aat

act

cet

cet

cta

aca

tgt

cag

332

Pro

Cys

5 « GyU-J* ’? «χ

Lee

Cys

Ser

Ser

Asn.

Thr

Pre

Pro

Gea ·$«.

Thr

cys

egt

tat

£t tgt

aat

gea

agt

gtg

•7 ú acc

aat

tea

gtg

aaa

ggv

aeg

aat

gcg

388

Ars

Tyr 4 0

Cys

Asr

&X&

Ser

Val 45

Thr

Asn

Sár

Val

Gys 50

Gly

Thr

Astk

Alá

att

ete

tea Λ* rt/

sec

tgt

ttg

95S

ctg

aga

tta

ata

tefe

ttg

gea

gtt

428

Xle 55

Trp

Thr

Cys

Gaa 68

Gly

Gea

Ser

XiÖi'ú

Xle 55

lie

Sér

Gaa

Alá

Val 70

ttc

grg

éta

$

rtt

ttg

ete

agg

aag

ata

age

tet

gaa

cca

tta

aag

478

Phe

Val

Gea

Met

Phe 75 aae

Lse

Gea

Arg

.Gys

ne

Ser

Ser

GXu

Pro

Leu

Gys

qse

gag

ttt

aaa

aca

gga

tea

ggt

ete

ctg

ggo

atg

get

aae

att

524

Asp

Gx'yl

Phs

cys 90

£sr>

Thr

Gly

Ser

Gly 95

Gea

Gly

Met

Als 108

Asa

XX^s

gac

ctg:

gaa

aag

aga

agg

act

ggt

gat

gaa

att

att

Ott

ccg

aga

33«

572

Asp

.ίοίϊ'ϋ

GXíi 1Ű5

Gys

Ser

Arg

Thr

Gly 110

Asp

Gla

He

lle

Geu 11.5

Pro

Arg

Gly

gag

tac

aeg

gtg

gaa

gaa

tgq

acc

tgt

gaa

gae

tgc

atc

aag

age

828

XdSkí

Gla 120

Tyr

Thr

Val

Gla 125

Cys

Thr

Cys

Gla

ASp 130

Cys

Xle

Gys

Ser

aaa

cég

aag

gtc

gac

tét

eac

cat

rge

ttt

cce

ete

cea

got

atg

gag

SS®

Cys 135

L.rc

Gys

Val

Asp

Ser 140

Asp

His

Cys

Phe

Pro 145

Gea

Pro

A-lca

Mjgt +*

Gla 150

gaa

ggc

gea

acc

att

ett

gtc

ace

acg

aaa

acg

aat

gac

tat

tgc

aag

718

GXu

Gly

Thr

Tla 155

Χ·.'·ί2-'ti.

Val

Thr

Thr

Gys 168

Thr

Asr·

Asp

Tyr

cys 185

Gys

age

ctg

cea

get

get

ttg

agt

get.

aeg

gag

ata

gag

tea

att

tét

764

Sár

Lee

Pro

AX& 1

Alá

Gea

Sár

Alá

Thr 175

Glu

lle

Gla

Gys

Ser 180

Ser

φφφ

X ΦΦ*Φ Φ« *

X χ * » χ ^β χ « φ χ Φ *χ * « ΦΦΦ φ χ χ ί φ 9 Φ Φ * * Φ φ φφ ΦΦ •get agg taa ttaaccattt cgaetcgage agtgocactt taaaaatctt 813

Alá Arg

ttgtoagaat s	sgahgatgtg toagatetet	ttaggatgac	tgtattttte ·	agttgoeget 873
aoagottttt «	ítcctcfcaac tgtggaaact	etttatgtta	gatatattto	tchaggttac 933
tgttgggagc t	;taatggtag aaacttoott	ggtttoatga	ttaaagtctt·	fcttttttoot 393
ga				995

«240> 8 «211> 184 <212> FEHÉRJE «213> Homo sapiens <4ÖÖ> 8

Mát 1 Leu

Lí&U

Gin His

Met Alá s Ale Cys Ο Λ

Giy lle

Gin Pro

Cys Cys

Ser Gin 10 Gin Len ‘'S&l

Asn Arg

Gye

Lyr Phe Ser Ser

Asp 15 Asn

Ser Lhr

Pro

Pro

Leó

<á V Thr Cys

Gin

Arg

Tyr

Gye

Asn

Alá

Ser

o V Val Lhr

Asn

Ser

35

48

45

Val

Lys

Giy

Thr

Ais

lle

Leu

Trp

Lhr

Cys

Len

Giy Len

Ser

Len

so

55

60

lle

Xxís

Ser

&JL-&

Val

Phe

Val

Les

Met

Phe

Leu

Len Arg

Lys

He

65

79

75

80

Ser

Ser

Oio

Pro

Lys

Asp

Glu

Phe

0Λ

Asn

Lhr

Giy Ser

Giy 9«

Len

Lee

Giy

Met

Ala Asn 1 Λ Λ

Lle

Asp

Len

Gin 1 0 £

•X VÍ Lys

Ser

Arg

Lhr Giy 4 4 í>

7 Of Asp

Gin

lla

lle

Leó

:. ν ν Pro Arg

Giy

Len

Glu

Lyr

Lhr

val

Glo

Glu Cys

Thr

Cys

I 13

120

125

Glu

Asp

Cys

Iie Lys

Ser

Lye

Pro

Lys

Var

Asp

Ser

Asp His

Cys

Phe

139·

135

140

Pro

Len

Pro

Alá Met

Gin

Glu

Giy

AX&

Lhr

lle

Leu

v«i Lhr

Lhr

Lys

14 5

158

155

•60

Thr

Asn

Asp

lyr Cys

Lys

Ser

leu

Pro

Ai®

Alá

Leu

Ser Ais

Lhr

Gin

165

170

175

lls

Gin

Lys

Ser lle

ser

Alá

Arg

ISO

HS <2Γ0> 9 <211 > 245 <212> FEHÉRJE <213> Homo sapiens <400>9

Gly

Ars

Ser

Arcj

Arg

ciy

Gly

Arg

Ser

Ars

val

Asp

Gin Gin

Gin

Arg

1

$·

10

xs

rhe

Pro

Gin

Gly

3XGU

Trp

Thr

Gly

Val

Alá

Met

Arp

Ser Cys

Pro

G.Xu

2 0

25

30

GXu

Gin

Tyr 5 ς

Trp

Asp

Pro

Lee

Leu. Λ Λ

Gly

Thr

Gye

Met

Ser Cys

Gys

Thr

Xle

Cys

ta.

Kis

Gin

Ser

Gin

Are

Thr

Cys

Alá

Alá

Phe Cys

Ars

Ser

Sö

SS

SO

Geo

Ser

Cys

Ars

lys

Gxu

CXn

Ciy

Gys

Phe

Tyr

Asp

Fis Gén

Gén

Arp

SS

ΤΛ / v

75

80

Asp

Cys

Xle

Ser

cys

Alá

Ser

He

cys

Gly

ÖiH

Kis

Pro Lys

Gin

Cys

SS

SO

05

Alá

Tyr

Phe

Cys

,·ν > < s \y -κ\4

Asr.

Gye

Len

Arp

Ser

Pro

Val

Asn Gén

Pro

Pro

10ö

105

110

Gin

Arg

Ars

Gin

Ars

Ser

Gly

Gin

val

Gin

Asn

Asn Ser

Asp

Asn

i A χϊ

120

125

Ser

Gly

Ars

Tyr

Gin

Gly

XíSlí

Gin

His

Ara:

Gly

Ser

Gin Alá

Ser

Pro

130

135

140

Als

Fro

Gly

Lee

Gys

Len

Ser

A X&

Asp

Gin

Vei

Val

Tyr

145

ISO

155

1SS

Ser

Thr

L<eu

Gly

len

cys

Gén

Gye

Alá

Val

Gén

Cys

Cys Phe

Gén

val

1:65

120

175

Als

Val

Cys

Phe

Geo

JuVS

Gys

Arg

Gly

Asp

Pro

Cys Ser

Cys

GXxs

ISO

IS 5

100

Pro

Arg

Ser 1 O £

Arg

T3 £ q

Arg

Gin

Ser

Pro

A 2. ,¾

Gye

Ser

Ser Gin

Asp

HÍS

Ai &

Jíefe

Gin

Alá

Gly

Bér

Pro

X»-:W v Val

Ser

Thr

Pro

Λ·Λί -5 Gin Pro

Val

Gin

2IQ

2 IS

220

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Gin

Cys

Ars

Alá

Pro

Thr Gin

Gin

Ser

225

230

135

240

Val

Thr

Pro

Gly

* 9 ***« V* ♦ φ Φ Φ Φ ♦ * φ· φ χ φ χ ·** * Φ <ΦΦΦ «ΦΦ* Φ « Φ Φ »*Φ^Λ

159 <2ίΟ> 10 <211> 40 <212> FEHÉRJE <2Ι3> Mesterséges <221> VARIÁNS

aminosav, a cisz tein i> VARIÁNS (4).,,(4)

aminosav, a

sse gluiamin, gi

Intamín, glutaminsav, lizln asz· argimn, aszparaginsav, hisztidin, vagy szerin. <221> VARIÁNS (7).,.(7) <223> Xaa jelentése glutamín vagy glutaminsav <22I>\3 <222> (8),..u.,._f <223> Mindegyik Xaa egymástól aminosav <22!> V7 a cisztein kivételével, vagy hiányozhat φφ ·ί φ

Φ Φ Φ **·ί* **#* <223> Xaa jelentése tirozin, fenilalanln vagy' triptofán <221 > VARIÁNS <223> Xaa jelentése bármelyik amínosav; a eisztein kivételével <221> VARIÁNS <222> (18),.417) <223> Mindegyik Xaa egymástól függetlenül lehet bármelyik amínosav, a eisztein kivételével <222> (19),.419) <223> Xaa jelentése ízoíeuein, metionin, leuein vagy valin <221> VARIÁNS a eisztein kivételével

amínosav, a eisztein kivételével <222> (28),.431) <223> Mindegyik Xaa egymástól függetlenül lehet bármelyik amínosav, a eisztein kivételével <221 > VARIÁNS <222> (32).. 433) <223> Mindegyik Xaa egymástól függetlenül lehet bármelyik amínosav, a eisztein kivételével, vagy hiányozhat <221> VARIÁNS ?etlenül lehet bármelyik φ W/»

Φ χ *

X χ <> * *

Φ Φ

V V ' φ* * * < ' ->' * * Á-rf:

aminosav, a eisztein kivételével <221> VARIÁNS <222> ίύί.ο.ο <223> Xaa jelentése tírozm va| <221>V, <222> (

... jók xaa e aminosav, a eiszteín

Xaa 7yi	5 Xaa	Xaa	Xaa	Xaa		Xaa	Xaa	Xaa	Asp Xaa 3a	;u Lsa Xaa
		5					10			15
Cys Xa<	?, Xaa	Cys	Xaa	Xaa	Xaa	Cya	Xaa	Xaa	Xaa Xaa X«	ia Xaa Xaa
	20					25			3i	3
Cys Xatí 3:	s. Xaa 3	Xaa	cys	Xaa	X Λ

210> 11 <212> DNS 'θ'· <220>

<223> Á 4. számú szekvenciát kódoló degenerált olts szekvencia <221 > variáns <222> (1)...( <223> Mindegyik N jelentése egianástől függetlenül A, T, G, vagy C.

<40Ö> 11 fe ¢. fefe«fe fefe V * fe « fe fe fe

X * fefe fe fefe * fe •ÍV') fefefefe *fe«* « fefe « fefefefe fe * Afe fe* ♦ atgvswgwy tnggmgws afríg«®gngej« ggwgwsosi gp.gtngöyca rgargarragn SO tggwsaytw satgysignaá rgarcargga aarttytayg aycayytnyt mtgí3:g«ytsgy· 120 áshwsafegyy ^wsaa«.Htg yggae&leay ecnaarcart yygcRtayth ytgygaraay ISO aar.yenssgw snccagfcsaa yytnccneea gax-ytasjgrss· <5ncs.xsígws nggngargtrí 24 0 garaayaayv; sngayaayws a.gg-Rxag}itay carggnytng a.rcaym>gn;gg r.wsp.gargcn 300 wsn.ecngcny tRccngguyt ixaarytawn gc&gayearg tagc»yta.gt. Bt-aywsaaGa 3S0 <211» 741 <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» A 2. számú szekvenciát, kódoló degenerált oligonukleotid <221» variáns jelentése atgwsaggay tsggriEsgRw nasgtmgo.ggn feggsv-snytnw sí-stgymgnaa xgai'csrggn athwsatgyg cmísnath-tg yggneareay aarytriaügjrw sncsengtnaa yyfcaccnccK garasyaayw sagayaayw rsggaffigncay wsnccngcay Sriccaygnyt naeryt6w«s y-sxjggxxytafc gyytotgyge »gtKyt»tgy saraax^gnci grigayccrSsy ywsafcgycar aarssnvxsoc axgaycaygc rsatggsrgcr. gtngarawt gywsíítaytg yfctyeengsr aeaecnggna cnccngaycc aaoatgygca gtnytncare «nfegyecaea yathceagay c&rgarggag gnccnggngc a gga£?.gnwsnRi gngfcagayaa rgsxrgaw.gn SO aaxttytayc aycayytnyt mxgng&ytgy 120 ccnaawart. gygcataytt ytgygaraay 180 garyfcmsgmu gaeamgm?» nggngargta 24© carggaytng arcayxagngg nwagaxsgea. 300 gcngaycarg tngcnytnge ntsywsriac« 3őÖ t.gyttyytag tRgcngtngc ntgyfcfeyytn 420 ccRr.gnv/sna gnce«gnca. rws.ocen<3cn 480 ggnwRCcr.g fcjwsBawe aceagarcea 540 tgys-gngenc cBScncarga rwsr:gcr;gtn SSO ggmgntggg gatgycayac, K^gnscs-acn SSO wsBggoytsg gsát&gt&Lg ygfcftcciigcíi ?28

741 no β: 9 ♦ Φ * β Φ * « *

ΦΦΦ* Φ » Φ ** <21!> 8 <212> FEHÉRJE <213> Mesterséges Szekvencia <ζ·ζυ>

«223» FLAG jelölés

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 14 <211» 7 <212» FEHÉ •eneaa

Giu Giu Tyr Kefe. Vro Sat Gin 1 5 <áiU> ÍO <2H>

<213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» 20 9980 olígonuklentkl <400» 15 cgaagagcag ivcigggatc etet *«♦» »* φ * » φ « <210> 18 <2Ι1>23 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22ö>

<223> ΖΟΙ9981 oligonukleoUd <4(Χ)> 16 gec&aggcca úgtelggga tgi 23 <218» 17 <211» Π 49 <212> DNS gaattcggea egggccegaa aggagae-sst teagg&taac tetectgaeg ggtc&gccaa 00 gecctgce&t gtagtgescg c&cgacato» acs&acacsc ataacsggaa atgstee&tt 120 ccetgtggtc acttattcta aaggecccaa certcaaagt teaagtagtg atatggatga ISO «t«cac»Saa «gggegeagt cacgeettae Cfc-ettgecfct oaga&aagsg aágaa a tg 2 38

Két

aaa	ctg	aag	9>?-9	tgt	gtt	tce	ate
Oys	Lég	Lys	Óla 5	cys	Val	Ser	Ile
gtc	ega	tec	tcc	aaa	eac	gga	«ag
val	Arg	Ser	Ser	Lya	Asp	Oly	Lys
		29					25
gc&	ctg	ctg	tet	tgc	tgc	etc	cég
Alá	Lag	Lee	Ser	Cys	Cys	S©g	??hr

ete tea Lee Pro 10 ctg ctg Lse Laa	ögg Arg get Alá	ság Lys gca Alá	gaa agc cce tét 2SS Glu Ser Pro Ser
sec Thr	15
fctg ctg ctg	334
Les	Laa	Les
gtg	gtg	tét	ttc	•á V tsc	eag	Ctg	gce	382
Val	Val	Ser	Pha	Tyr	Cin	Val	Ma

4>«φ» Φ4 * Φ « X Φ

Φ X Φ X 9 Φ·Χ X φ

Η55

♦ * ΦΦ

Φ*

gcc

35 ctg

ess

93«

gac

ctg

45 gcc

agc

ctc

«93

gcs

45 gag

ctg

cs.g

93«

cac

430

Alá

LSU

Gin

Gly

Asp

ajÖU

Alá

Ser

Arg

Glu

Leu

Gin

Gly

HÍS

50 CSC

939

gag

agg

ctg

55 CCS

gca

g«a

goa

gga

•50 geo

CCC

«•sg

gcc

ggc

65 ctg

4? S

Alá

Sla

Lys

Lee

pro

Alá

Gly

Ά.Χ&

Gly

Alá

Pro

Lys

Alá

Gly

Leu

9W

gaa

get

cca

7ö get.

gtc

ace

gcg

99«

?5 ctg

aaa

atc

ttt

gaa

80 fcífc.Si

cca

525

Gin

Gin

Alc

Pro

Alá

Val

Thr

Al&

Gly Qft

Lee

Lys

Xle

8ha

Glu

Pro

Pro

get

cea

ggs

gaa

ggc

aac

tcc

agt

cag

aac

ege

aga

aat

cgt

•geo

574

Alá

Pro

Gly 1 fj fi

Gla

Sly

Asft

Ser

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

Asn i r n

Lys

Arg

Alá

gtt.

cag

4, W-AjJ ggt

cca

gaa

gaa

aca

gtc

act

ess

gac

tgc

4. X Lí ttg

caa

ctg

att

522

Val

Sla

Gly

Pro

GXis

Gla

Thr

Val

Thr

Gin

Asp

Lys

Gin

Leu

Xle

9««

115 gac

sgt

gaa

aca

cos

120 act

ata

caa

aaa

93«

135 tefc

tac

ács

ttt

gtt

«78

Alá

Asp

S&X*

Thr

Pro

Thr

He

Gin

Lys

Gly

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

130 ccs

^99

ett

ctc

135 ttt

aaa

agg

gga

ági

140 gcc

cta

gaa

3«a

aaa

145 gag

71S

Arc

l’rp

Lse

Lee

Ser

The

Lys

Arg

Gly

Ser

Alá

Glu

Glu

Lys

Glu

aat

aaa

& t &

ttg

150 <3 tC

aaa

gaa

act

ggt

155 tac

ttt

ttt

ata

tat

160 ggt

•rag

76$

Asn

Lys

He

Leu

Vai

Lys

Gin

Thr

sly

Tyr

Phe

Phe

Xle

Tyr

Gly

Gin

gtt

tta

tat

165 act

gat

aag

sec

tac

170 CCC

atg

93«

cat

óta

175 att

cag

agg

814

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr

Tyr

Alá

Met

Gly

Sis

Len

Xle

Gin

Arg

sag

aag

ISO gtc.

cet

gtc

ttt

ggg

iss gat

gaa

ttg

agt

Ctg

190 «tg

act

ttg

ttt

362

Lys

Lys

Val

Η í s

Val

Phe

Gly

Asp

Glu

Len

Ser

Leu

Val

Thr

Leu

Phe

ege

1,95 fegt

att

caa

aat

atg

200 cet

&C&

cta

CCC

283 a afc

aat

tcc

tgc

tat

318

Arg

Cys

Xle

Glr,

Asn

ííet

Pro

Gin

TtiS?

Len

Pro

Asn

Asn

Ser

Gye

Tyr

210 tea

get

ggc

att

gc&

315 aaa

ctg

gaa

gaa

gga

220 gat

gaa

ctc

caa

ett

125 gca

958

Ser

Λί&

Gly

1 le

AkS.

Lys

Glu

Glu

Gly

Asp

Glu

Len

Gin

Leu

Alá

ata

CCS

aga

gaa

230 aat

goa

caa

ata

tea

23c ctg

gat

gga

gat

gtc

240 ács

ttt

100$

Xle

Pro

Arg

Gla

Asn

Alá

Gin

Xle

Ser

L<5U

Asp

Gly

Asp

Vei

Thr

Phe

ttt

ggt

ge®

ttg

aaa

ctg

ctg

tgacctsctt acaccatgtc tgt«gefea.tt

5 .1057

Phe

Gly

Alá

tea

Lys

Leu

Les

2δδ ttpötóeett hetetgtsee hohaagaaga aágsatctaa ctgaaaafcac eaaaaaaaaa

1117 saasásaass. aááaasccct ogsgcggccg ;:c 1149 <2K)> 18 <21 i> 264 <212> FEHÉRJE <2I3> Home· sapiens <400> 13

Φ: »ΦΦ* φ Χ*Φ» sí X *

Λ ♦> » « X

Φ X X X» Φ * .

ΦΧΧΦ ♦ β X * ΦΧφφ·

Φ Φ« X* *

1

Lys

Len Lys

Glü 5

Cys

Val

Ser

Lle

Les 10

Pro Arg

Lys Gin

Ser 15

Pro

Ser

Vál

Arg

Ser 20

Ser

Lys

Asp

Gly

Lys 25

Les

Len Ala

Ala

Thr 30

Len

Leu

Leu

ΆΧ&

Lee 35

Len:

Ser

Cys

Cys

Len 40

Thr

Val

Val Ser

Phe 4 5

Tyr

Gin

Vs 1

Ala

ÁX&

Len

Gin

Oly

Asp

Len

Alá

Ser

Les

Arg Ala

Gin

Len

Sin

Gly

His S5

n v Sis

Alá

Gin

Lys

Len 78

33 Pro

Ala

Gly

Alá

Ο v Gly Ala 75

Pro

Lys

Ala

Gly ®0

Len

Cin

GT:

Alá

Pro 05

Als

Val

Thr

A Is

Gly 90

Len Lys

X le

Phe

Gla 95

Pro

Pro

Alá

Pro

Gly 100

Gly

Gly

Asa

Ser

Ser 105

Gin

Áss Ser

Arg

Áss ΐ ΐ Λ φ xw

Lys

Arg

Als

Val

Gin 115

Gly

Pro

Gin

Glu

Thr 120

Val

Thr

Gin Asp

Cys 125

LtíSúj

Gin

Len

Λ 1θ

Alá 130

Asp

Ser

Gin

Thr

Pro 135

Thr

Xle

Gin

Lys Gly 140

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val 145

Pro

Trp

Len

Len

Ser 150

Phe

Lys

Arg

Gly

Ser Ala 155

Len

Gin

Sin

Lys 168

Glo

Asn

Lys

Lle

Len IS 5

vei

Lys

Gin

Thr

Gly 17 0

Tyx Phe

Phe

lle

Tyr 175

Gly

GXe

Val

Len

Tyr 188

Thr

Asp

Lys

Thr

Tyr IS 5

Alá

Pét- Gly

His

Len 19 G

lle

Sin

Arg

Lys

Lys 195

Vaj.

His

Val

Phe

Gly 280

Asp

Gla

Len Ser

Lee 205

Val

Len

Phe

Arg 210

Cys

He

Gin

Asn

Met 215

Pro

Gin

Thr

Les Pro 220

Asp

Áss

Ser

Cys

Tyr 225

Sár

Ala

AV'i v. ’-Sijí

lle

Ala 230

Lys

Len

óin

Glü

Gly Asp 235

Gin

Len

Gin £f£S£i *· Λ Λ Λ *4 V

X» 5 .» Aiö

X P £:

Pro

Arg

Gin

Áss

Ala

Gin

Xle

Ser

Len Asp

Gly

Asp

Val

Thr

Φ * φ* *

Φ Φ X Φ Φ * φ φ φ » φ φφ φ φ

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ Φ * « »χβ»

245 255 255

Pás Gly Alá La» Lys is» Le» <2K)> 19 <2I1> 1430 <212> DNS <218> M«s musculus <220>

<221> CDS <222> (1021.4848) <400> 19 ttggcgeagg agcgtgcgta ggsttgctcg cteacaacag gcacctgagt ggtsttgasa 80 gccgs>gtctt cccttcctct ttasaggstt ggtgaccagg c «tg get atg ges ttc 115

Met Alá Met Alá vh®

5

tge ccc Cys Pro

aga Lys

gat Asc

esc Gin. 16

tsc Tyr

tgg gac ’l'rp Asp

tcc Ser

tea Ser 15

agg Arc

aaa Lys

tcc Ser

tgt Cys

gtc V<3.,1 20

tcc Ser

154

tat

ges

ctg

sec

tgc

agc

cag

agg

sgc

cag

ege

sec

tgt

ács

gsc

ttc

212

Cys

Alá

Les

Thr

Cys

Ser

Gin

Arc

Ser

Glíi

Arg

Thr

cys

Thr

Asp

Phe

25

30

35

tgc

sas

ttc

stc

·.&·&·&.

tgc

cga

sas

•gag

caa

ggc

agg

tsc

tsc

gac

est

280

Cys

Lys

Phs 4 Λ

Xle

Áss

Cys

Arg

Lys

Gi»

Gin

Gly

Arg

Tyr ΪΥ&

Tyx*

Asp

His

ttc

ctg

ggg

gce

tgc

agc

tgt

gac

tcc

acc

tgc

cag

c&c

cet

305

Lee

Lee

Gly

&X&

Cys

Val

Sor

Cys

Asp

Ser

Thr

Cys

TAr

Mis

Pro

55

8Ö

85

tag

tag

tgt

gtc

các

ttc

tgt

gag

sas

agg

ccc

aga

agc

cag

ccg

sac

356

ölt

Gin

Cys

Alá

Has

Aha

Cys

Gl»

Lys

Arg

Arc

Arg

Ser

Gin

Alá

Asn

78

75

80

85

ott

csg

ccc

gag

etc

559

aga

CCS

tag

góc

095

gag

9±.g

gsa

gtc

agg

404

Le»

Gin

Pro

Gls

.DÖlJ

Gly

Arg

Pro

Gin

Alá

Giy

GIq

Val

GXu

VöX

Arg

38

25

108

tea

gao

asc

tea

<3*

agg

esc

CSC

ggs

tet

999

est

ggt

CCS

gga

ttg

452

Ser

A:sp

AST:

Ser

Gly

Arg

Mis

Gin

Giy

Ser

Gin

His

Giy

Pro

Giy

Let

105 118 115 * φ· *♦ φ

X * Φ X φ * * X * * « Λ* * χ «τΦ·Φ Φ Φ ΦΦ* Φ· X φ Φ ΦΦ Φ χ φ- φ φφ· φ* φ

agg

cta

agt

agc

gac

cag

ctg

act

ctc

tac

ege

aca

ctg

ggg

gtc

tgc

588

Arg

Aac

Ser

Ser

Asp

Gin

Lse

Thr

Lee

Tyr

Cys

Thr'

Lse

Gly

Val

Cys

120

125

130

ctc

tgc

gcc

atc

ttc

tgc

tgt

ttc

ttg

gtg

gcc

ttg

gcc

tcc

ttc

ctc

545

Lee

Cys

Ala

x χ a

Pha

Cys

Gvs

Pha

Lee

Val

Ala

Lsu

Ala

Ser

Pfee

Len

135

140

145

agg

cgt

aga

gga

gag

cca

cta

CCC

agc

cag

cet

90c

ggg

cca

cgt

ggg

596

Arg

Arg

Arg

Gly

Glo

Pro

Lee

Pro

Ser

Sin

Pro

Ala

Gly

Pro

Arg

Gly

ISO

155

160

10 5

tea

caa

c<s

aac

tet

CCC

CSC

gcc

cae

ege

CCC

gtg

gag

get

tgc

644

Sár

Glr

Ala

Asn

Sár

Arc

Axs

Ala

Kis

Arg

Pro

Val

Thr

Glu

Ala

Cys

170

175

188

gac

gag

gtg

acc

gcg

tea

CCC

cag

cet

Stg

gas

acg

tgt

agc

ttc

tgc

652

Asp

Glo

Val

Thr

Ala

Ser

Pro

Gin.

Pro

val

Glo

Thr

Cys

Ser

Pfee

Cys

185

ISO

1SS

ttc

cég

gag

ege

agt

tet

CCC

act

cag

SAS

agc

gtg

ceg

cgt

teg

ctc

740

Phe

Pro

Gin

Arg

Ser

Ser

Pro

Thr

Gin

Gla

Ser

Ala

Pro

Arg

Ser

Lee

288

205

23.8

$gg

aha

cae

ggc

ttc

gcg

ggc

act

gcc

gcc

cég

cag

CCC

tgt

atg

cgt

788

Gly

21a

Kis

Gly

Phs

Ala

Gly

Ihl-

Ala

Ala

Pro

Gin

Pro

Cys

Met

Arg

215

220

225

gca

aca

gta

ggc

ggc

ctg

ggt

ete

ctg

ege

gca

tcc

act

ggg

gac

get

836

Ala

Thr

val

Gly

Gly

Lan

Gly

Val

Lse

Arg

Ala

Ssr

Thr

Gly

Asp

Ala

230 235 240 245 cgt ccg gca act tgaeageeeg aaaaafcaaaa aagaca&ttt agaggatgga 888 Arg Pro Ala Thr gtgacagagg gggaaaggga tggagaagag acsgatgaag aoaogataaa gga&gcccgg S48 ctgcacce&e gcagagcaac aaagcaacca cetgesgegc ccacgttccc agcaccgcctlOOO gtgectgccg ctgtgtccta taetttecag agcagtcaac ctgtgccfcxfc tttctttagt1068 cgagaaagsh gg&g&stg&c cggcacctag c&tcaccett acaattctta caaaceagtgl228 gtctttccta tggccttagg cagatagctg agtgcagtgt ggstgtsttt gtgatttaagli88 t&acctgtat gtgtatgtgc aga?ttegggg ttatgtcata tgtgc&tgta tacgtgagttI24S gtgtgtctgt atgagttgtg tgtatatgtg cgcctataaa fcatgtgtgtg aattctgtgcS3öS atgcagatgt gtgtgtacat atgtgtctgg ctgatgtggt atagccagaa agatgagggc!368 ccttotaggt gaaggecaaa catgtaaaaa ccatctaggt gatgggtgct egfcgccgaatl42S te •430 <213» Mus niuscuius <400»

Pét

Aia

mt

A.íci Ph<?

Cys

Pro

Lys

Asp

Gin Tyr

Trp

Asp

Ser

Ser Arg

I

5

•i. ϊ«:

1:5

Lys

Ser

Cys

Val

Ser

Cys

Alá

Len

Thr

Cys

Ser

Gin

Arg

Ser

Gin

Arg

28

25

33

Thr

Cys

Thr

Asp

Phe

Cys

Lys

Phe

lle

Asn

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

35

43

45

Arg

Tyr s«

Tyr

Asp

HÍS

Leu

Lee « ζ

Gly

Alá

Cys

Val

Ser

Cys

Asp

Ser

Thr

cys

V Thr

Gin

Kis

Pro

Gin

Gin

Cys

Aia

Kis

Phe

€3<«? Cys

Giu

Lys

Arg

Pro

SS

70

75

33

Ara

Ser

Gin

Alá

Asn

Leu

Gin

Pro

GiO

Len

Gly

Arg

Pro

Gin

AIA

Gly

SS

93

35

Gin

Vei

Glu

Val '! ΛΛ

Arg

Ser

ASp

Asn

Ser 1 fi

Gly

Arg

His

Cin

Gly 1 1 -A

Ser

Gin

His

Sly

Pro

i V V Gly

Leu

Arg

Leu

Ser

1G ni* Ser

Asp

Gin

Len

Thr

11V Len

Tyr

Cys

115

120

125

Thr

Gly

Val

cys

Len

cys

Aia

lle

Phe

Cys

Cys

Phe

Lan

Val

Aia

Λ 3 Ö

135

140

Les

Alá

Sör

Phe

Lén

Arg

Arg

Arg

Gly

Gin

Pro

Leu

Pro

Ser

Gin

Pro

145

158

.155

158

Aia

Gly

Pro

Arg

Gly

Ser

Gin

Aia

Asn

Ser 3 7 fi

Pro

Kis

Aia.

Kis

Arg < 7 se

Pro

Val

Thr

Gin

Aia 5 $ fi

cys

Asp

Gin

Val

Thr •1: &

X > Alá

Ser

Pro

\2Ái. xi

Pro < QA

χ vJ Val

Gin

r*>u>~

Cys

S«£

vv £3 Phe

cys

Phe

pro

Gin

Í ÖxJ Arg

Ser

Ser

Pro

Thr

Gin

Gin

Ser

195

238

235

Alá

Pro

Arg

Ser

Len

Gly

lle

Kis

Gly

Phe

Alá

Gly

Thr

áX&

A.X&

Pro

218

112

223

Gin

Pro

Cys

mt

Arg

Aia

Thr

Val

Gly

Giy

Len

ciy

Val

iiSü

Arg

Aia

225

233

235

.248

Sár

Thr

Giy

ÁSp

Alá

Arg

Pro

Aia

Thr

245

<210» 21 <2 Π» 473 ββΚΦ ««

170

ΦΦ * <· »9 9 * *

Φ 9 9 χ*χ c φ* * <212» DNS '9 <223» Northern Biot próba <4ϋν» 2 I ctgtggacgg qggtggct&t gagatcctgc ggfeacctgca fcgtcctgcaa aaccatfctgc ttctgeagyt eaetcagctg ccgcaaggag gactgcatca götgtgccfcc catcfegtgga gsg&aeasgc tcaggagccc agtgaacctt gaagttgaas acaattcaga caactcggga gaagc&agtx' cagctotocc gqggekgaag agcacgc-bgg ggctctgsofc gtgtgccgfcc

473 ceegaagagc sgfcaetoggs tccxcbgctg §8 aaccatcaga gccagcgcac ct.gtgoagcc 120 caaggsaagt fcctafcgaeca tctccfcgagg 188 císgcaeceta agcaatgtgc atacttctgt 24 0 ecaecagsge tcaggagaca gcggsgtgga 308 aggtaccaag gsttggagea cagaggctca 360 űtgagtgcag atcaggtggc cctggtctao 428 etctgcégct tcetggfcggc ggt <21.1» 25 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia.

<220» <223» 2C20061 ohgonukleotid <400» 22 ctgtggacsg gggtggcVat gagat 35 <210» 23 <211» 25 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» 2020062 otigonukleoUd

V «χν.Φ κ* Φ

Φ Φ < Φ Φ *

Φ Φ « Φ » Φφ Φ Φ

ΧΦΦΦ ΦΦΦΦ φ ♦ * φ ΦΦφ φ φ *φ φφ· <4ίΧ)> 23 sccgccacca egasccacag sggae 25 <210> 24 <211 > 256 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Northern Biot próba fcgegafetetc t.gg&ccégtt tgggaetgag ctfc&atsstt téfcitggrag ^.fctt.cgtgct SS satötetttc ctáagsjaaga· taagctcfeöa accatt&sag gaegagttta aaaacácagg 128 ateaggectc cxgggcafegg ctaaeattga ccfcggaaaag agcaggaefcg gtgafcgaaat 12ö feaetcttcog agaggéc-teg agtacacggfe -ggaagaatgc &cctgtga.ag actgcat.caa 240 gagcsa&ccg asggfce 255 <21I> 22 <212»

ha tgcgattct.·- tggscctgtt fcg £>

<212» * * <2!3> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> ZC21067 oligönuklcctid <4ÖÖ> 26 g&cct'fceggt ttgctcttga tg <21O> 2?

•Ϊ ·* 9 * < x * ·» 94 * x x x * >««* *$«·.· X Φ * ' -V* ·.

r>ry acacfcggggg tctgcctctg <210> 28 <211> 17

212>

<223> ZC24201 oligonukleotíd g c g a ag c c g t. gfcafccce <211> 17 <212> DNS ♦Se > * <2,13> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> 2C24I98 oiigonukieoüd <400> 29

173

4> * « >·.·»♦ <<

tctacagcac getgggg

gcacaagtgg ggtcgg itt <21!> 19 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> ZC24271 oligonukleotid

11attg taat gc a agt gfcg <2K)> 32 <21l> 17 <212> DNS fc<«* * fc ♦

X-'fcfc *

fc A χ fc » *· fc <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» ZC24272 okgonukfecöd <400» 32 « fc fc fc* tagetggg&g tggaasg <210» 33 <212» DNS

tee&sgegfeg accagfctc&g <211» 18 <213» egttggcttc tccatccc

IS <211» 1090 <212» DNS <213> Horno sapiens <400> 35 feaactcicct gaggggtgag_: ecaagccctg acagataaea ggaaaigatc eattcccigt aagttcaagi agtgatatgg stgaeheeac ccttaagaaa agagaagaaa tgaaaetgaa aagcceciet gteagatccfe ccaaagaegg aetgctgtet fcgctccctca cggtggfcgtc ectggccagc etecgggcag agctgeaggg aggageecce aaggccggce tggaggaagc tgaaecacca getceaggag asgge&sctc rcagggteca gaagaaacag te&cteaaga accaaetata eaaaaaggat ettaeacatt aagtgeccta gaagaaaa&g agaataasafc atatggteag gttttatata ctgafcsagsc gaaggtccat gtettigggg atgaattgag tatgecfeyaa acactgccea scaattectg aggagatgss etccaacttg caafeaccaag tgtcseatfct tfctggtgeat tgaaaetgct ttiecfccecc tteteigias ctctsagaag aaaaaaaaaa ecatgtagtg cacgcaggac ateaaeaaac SO ggteaettat tetaaaggcc ccaaccttea 120 agaaagggag eagteacgcc ttacttettg 180 ggagtgtgtt fcccatcctcc eacggaagga 240 aaageigetg getgcaacet tgctgctggc 309 itfectacéag gtggeegccc tgeaagggga MÖ ccaccacgcg gagaagetge eageagcagc 420 ieeagchgte acogegggac tgaaaaieii <§S cagtcag&ac agcagaaata agtghgcegfc 546 ctgcttgcaa etgsttgcag acagtgaaac WO tgttccafcgg cttctcagct ttaaaagggg 666 atfcggtcsaa gaaactggtt actfcttttat 730 ciacgceacg ggacatcfcaa ttcagaggaa 786 tctggtgact ttgtttegat gfcattcaaaa 840 etattcagct ggcattgcaa aaetggaaga 986 agaaaatgca caaatatcae tggafcggaga 960 gtgaectact taeaecafc gé ctg tagét a 11 δ 2 δ: aaagaatcta actgaaaats cesaaaaaaalÖSS

1050 <2I0> 38 <211> 3S

egegeggtit aaaegeeacc afcggatgaet <’210> 37 <21I> 32

Φ A Φ »

..... ♦

Φ * * « * *» * ♦· *« φ»Χ

Φ * *

Φ * * ♦ ♦ · χ ♦ Φ ΦΧ*« * 9 <213> Mesterséges; Szekvencia <220>

<400> 37 ctstacggcg ogcctoacsg cagtttesst ge

<400> 38 tctggacgtc etcetgctgg fcatsg <2i0> 39 <21! > 25 <2I2> DNS <2 !3> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> ZC 17252 öliganukleodd <48ö> 39 ggiatggage aaggcgoaag ttggg

Φ X *ν

ΦΧΧΦ «* • · · · φ X * φ *χ

Φ X φ * φφ φ* <223> 207156 oligonnkteötíd gagtggca&c ttccagggee agg&gsg 27 <210> 41 <2Π> 27 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia cfctttgetsg ecteaaccet gactatc 27

ggcscagcae ggggcgstgg acgegttfceg gctcagcctg ggtcagcgcc ecaecggcgg tgggacggga acggscgegc gctgctgccg cecgggcgag gagtgetgtt ccgagtggga eggsgaccct tgcigc&cga eeigscgyca gtecesgggg aaattcagtt ttggecteea C3ZS33ccac gaaggeeact gcaaseettg tg tgt. te cet gggascaaga eeeaca&cgc ggccctgtgc ggcclggegc tgc&gfegegc 83 tccegggtgc ggecctggge geetcctgct. 120 ggttcac&cg aegegetget gccgegatta 180 ctgeatgtgt gtecagcctg aattccaetg 240 ec&eecttgt cecccaggee agggggtaca 300 gtgtatcgas tgtgectcgg ggaeettctc 36Ö gaeagaetgc aecc&gttcg ggtttetcac 420 tgtgtgcgtc ecagggtcoe cgccggcaga 430 * X Φ φ Φ ♦ * * φ * * φ Φφ * 9

HS gcegctfcggg tggctgaccg tcgtcefccct ggeegfcggcc gcctacgtec fecetcctgac 540 crcggcccag cttggacfcgc acaPctggea gefegaggagfc cá^tgöatgt ggccccgaca 600 gacccágetg cfcgetggagg fcgeögecgfce gaccgaa^ác geesgasgcfc gee&gtfcccc 660 cgaggaagag cggggcgage gatcggcaga ggagaagggg cggetggg&g aectgtgggt 720 gtgagcctgg ctgtccteeg gggec&ccga esgcsgccag ec-cctcccca. -gg&gctcccc: 780 aggccgcagg gctctgcgtt cfcgefccfee'gg ccg 813 <21O> 43

3> &

<223>

.134 oligonukleotíd atsagcggaa ttcagafcctfe cagae&s&ae tcacacatgc cc&c <210> 44 <211> 35 <212> DNS <213>- Mesterséges Szekvencia <220>

<223> ZC1Ö135 oligonukleotíd <400> 44 ggeagfcctct sgafeesttta cccggagaca gggag <2I0> 45 <22ö>

<212>

<2 <221> CDS <222> (7),.4759) <223> lg Fc szekvencia <400> 45 ggatcc etg aag cac ©tg: fcgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg geg get ccc 4S

Met Lys Kis L«s Trp Phe Phe Lee Le» .Le» Val Ala. Ala Pro

1

5 10

aga

tgg

gt©

ctg

tee

9«3

ccc

ege

tót

tea

gac

aaa

act

eac

aca

tgc

85

Arg 15

Trp

V&£

Les

Ser

Gitt 28

Pro

Arg

Sár

ser

Asp 25

Lys

Thr

Kis

Thr

Gye 30

cca

cég

tgc

cca

gca

cet

gae

geo

g«g

393

gca

ccc

tea

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Pro

Cys

Pro

h£& 35

Pro

Gx.u

Al £5

Gla

Gly 40

Pro

Ser

Val

Phe 45

Len

ttc

ccc

cea

ccc

eeg

gac

acc

otc

etg

atc

tcc

©gg

acc

cet

geg

192

Phe

Pro

Pro

Lys 30 gtg

Pro

Lys

Asp

Thr

L£'<í SS

Met

Tle

Ser

Arg

Thr λ·π

Pro

Gitt

gtc

aca

tgc

gtg

ctg

gac

gtg

s~‘ aga

cac

gae

geo

oct

gag

gtc

eag

240

Vai

Thr

Cys

Vai

Vei

Vsl

Asp

Val 7 Λ

Ser

Kis

Gitt

Asp

Pro *?£

Gl.U

Vei

Lys

tte

aac

tgg

tee

Gtg

gac

99©

gtg

gag

gtg

CSi ti

aat

> ·> gcc

eeg

aca

aag

288

Phe

Asn 80

Trp

Tyr

Vei

Asp

Gly 85

Gle

Vei

Mis

ÁSD. Sö

Ala

Lys

Thr

Lys

cég

©99

gag

gag

cag

tec

aee

ege

ecg

ta©

cgt

gtg

gtc

gtc

ctc

336

Pro §5

Arg

Gitt

lylV

Gin

Tyr 100

Aaa

Ser

Thr

Tyr

Arg 105

Vei

val

Ser

Val Leu i 2 ö

•sec

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

gg©

eeg

geg

tao

aeg

tgc

eag

384

Thr

Val

Lea

HXS

Gin U5

Asp

Trp

Len

AStt

\?xy X' 0

Lys

Gitt

Tyr

Lys

Cys 125

Lys

gtc

tcc

aa©

aaa

gcc

ctc

cca

tcc

tcc

atc

g«q

aee

gc©

atc

tcc

aee

432

Val

Ser

Asn

Cys

Ala

jL’ÖLi

Pro

Ser

Ser 1 7Λ

11©

öiU

Ly»

Thr

iie 7 Λ Π:

Ser

Lys

gec

aaa

ggg

cag

ccc

ege

gae

cca

<*, MÍ cag

gtg

tee

SCO

ctg

CCC

qca

tcc

480

Ala

Lys

Gly 145

Gin

Pro

Arg

Gla

Pro 7 C Λ A 2? V

Gin

Val

Tyr

Thr

L&u 15 5

Pro

Pro

Ser

©39

gat

gag

ctg

ace

aag

eec

cag

gtc

ege

ctg

acc

tcc

ctg

gtc

aaa

528

Arg

Asp ISO

Gitt

Lee

Thr

Lys

Asn 165

Gin

val

Ser

Lee

Thr 170

Gye

Le»

Vei

Lys

gg©

ttc

tat

ccc

ege

atc

ccc

gtg

gag

tgg

9*9

ege

aat

ggg

cag

576

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

He

Ala

Va.k

Gl?d

Trp

GIö

Sor

Asn

Gly

•Gin

180

175

ISO

185

133

cég

gag

&SC

aac

tac

aag

sec

ace

cet

cec

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

Arc

•Gx o

Asn

Asn

Tyr 1S5

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro tfíh

Vsl

Lee

Asp

Ser

Asp

Gly

te

ttc

ttc

ere

tae

age

aag

cte

ace

gtg

gac

aag

age

agg

£· V -> *93

cag

Sár

Lhe

Pha

i<a« 219

Tyr

Bar

Lys

Lee

Thr 215

Vsai

ASp

Lys

Ser

Λ iUtf 223

Trc

Gin

C 3'<J

ggg

aac

gce·

ttc

tea

tgc

tea

gts

atg

cet

gsg

•get

ctg

eac

aac

Gin

Gly

Asn 225

Val

Pisa

Ser

Cys

Ser 230

Val

Mát

Hsa

Glu

Alá 235

Les

Sla

Asn

y v

* fc « fc*** fc

ISI » » fc * fc « * fc >**♦ *** * * fcfcffcfc fc* fc fc fc ♦♦ * * * _Λ fc» fc* esc tar. acg cag aag agc cte tcc ctg tét cég ggt aaa Kis Tyr Thr Gin Lys Ser Len Ser Lse Ser Pro Gry Lys 240 245 .250 :a«cctagg

788 <210» 46 <211» 52 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia ccgtgcceag cscctgaagc eg&gggggöa cegteagtct tcstcttcce cc 52 <210» 47 <211» 31 <212 gcattctaga ttttataccc ggagaeaggg a <210» 48 <211» 55 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» ZC15517 oHgönuteleoöd <400» 48 **/*

Í82

Φ *

X Φ ♦ *

ΦΦ:*· Φ *

Φ«Χ Φ φ

φ ο * »* ggtggcggct cce&gstggg tcctgtccga gcccagatcr tcagacaaaa ctcac 55 <2.1.0» 4.9 <211» 18 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» ZC15530 ohgonukleotíd <400» 49 tggqagggct ttgttgga 18 <210» 50 <211» 42 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» ZC1551S olígönukleottd <400» 50 tccaaoa&ag ccctcecate ctceatcgsg aaaaccatct. cc 42 <210» 51 <223» ZC15516 dligönukleotíd <400» 51 ggatggatcc afcgsage&ce tgtggttctt cctcctgctg gtggccgcto cesgstg 5?

«210» 52 «211» 59 «2 12> DNS «213» Mesterséges Szekvencia «220»

cfecstgcoagg aaáfcccatgc cgagtfegaga cgcttcogta gaatgagfegg cctgggccg 5§ «210» 53 «211» 48 <212>DNS «213» Mesterséges Szekvencia «220» «223» olígönnkleotid primer «400» 53 gcatgtgtga ^•fc.fctgesrfcg «agatctggg ctccttcagn ceagggag 48

<223> oligonukleotid primer «400» 54 ctcagccagg aaat«catgc cgagttgags cgcfetccgta gaatgagf.gg cötgggccg

SS <2lb 59 * 3» Mes srsekes Sz » oli| 0» 55 gcacggfcggg catgfcgtgag t£fefcgfcetga agstctgggo feacttcagec ccggg&gsg SS <210» 56 <211» 80 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia scacsgaggc tx&gs«gcss grccagctcfc cccgggootg a&ggagccca gatcttcaga Sö <210» 57 <211» 58

7,> FIX?

á>

<220» te •te primer <4ÖO> 57 ggggfcgggta caacccoaga gctgtittea tctagattát ttaccccgag ac&ggg 56 <210> 58 <211> 59 <212> DNS <2I3> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> oitgonukleoüd primer <400> 58 ctaacatgtc agcgttattg taafegcaagí. gtgaccaatt cagagcceag atcttcaga 5$ <210> 59

Ser Alá Gly Ils Als Lys Leu Glu Glu Gly Pro Glu Leu Gin Leu AI® 1 5 i8 ;.S

H-s Pro Arg Glu 20 <211> 20

Χ « φ « Φ V χφφ>· ' * ·* « * φφ * * φ .φφφτ*

Ser Phe Gys Arg Gly Ser Ma Gén Gin Gin Gys Gle Asn Gys Gin Len 1 5 10 is

Val Gys Gin Thr

Claims (69)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Fúziós protein alkalmazása emlősökben az alábbi betegségeknek a BR43x2, TACI vagy BCMA receptor-ztnfe kapcsolódás gátlása utján, történő kezelésére szolgáié gyógyszerkészítmény elöáliitására:

   ' a e . w , „ u ' n w ' \u m neuropátia, amiloidözis, membrán nelropáha, IgA nofeopátia, Bergerkór, IgM nefropátia, Goodpasture-betegség, fertőzést követe gfemerolonefribsz, mezangioprokferativ betegség, minirna.l~ch.ange neámikus szindróma, vagy iupus-szai összefüggő másodlagos glornerakmefeitisz vagy vaszkulitisz; ahol a. fúziós protein egy peptidkötés által összekapcsolt első részből és második részből áll, ahol az említett első rész a ö. sz. szekvencia 5-104 aminosavaiböi áll, és ahol az említett második rész egy immunglobulin, nehéz lánc konstans régió,
2. 2. Áz 1, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett immunglobulin nehéz lánc konstans régié egy humán immunglobulin nehéz lánc konstans régié.
3. 3. A 2. igénypont szerion alkalmazás, ahol az említett humán immunglobulin nehéz lánc konstans régié az IgGI humán immunglobulin nehéz tánc konstans régiója.
4. 4. Az 1 -3, Igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett gyógyszerkészítmény fúziós proteinek egy mnltimepét tartalm.asza,
5. 5. Á 4, igénypont szerinti alkalmazás, .ahol az említett győgyszerkészámény egy olyan immunglobulin nehéz lánc konstans régiót tartalmaz, amely két konstans régié domént tartalmaz és hiányzik belőle a variábilis régió.
6. 6. Λ 18. sz, szekvencia szerinti peiipeptidhez specifikusan kötődő antitest vagy an Ütést·· fregmeas alkalmazása olyan gyógy szerkészít·· meny előállítására, amely emlősökben a BR43x2_s TAGI vagy BCMÁ re·· ceptor-ztnf4 kapcsolódás gátlása útján akadályozza a. sxiszt.émás lupus erythematosis -sai összefüggő antítest-termelést.
7. 7. Izolált pclmukleotid molekula, amely a. 2. sz, szekvencia szerinti polipeptidet kódolja.
8. 8, Az 1, sz, szekvencia, szerinti Izolált polnukleotid. molekula,
9. 9, Expresszién vektor, amely az alábbi, működőképesen kapcsolt elemeket tartalmazza:

   ·· egy transzkripciós premoter

   - egy a 7. igénypont szerint pobnnkleorid molekula; és

   - egy transzkripciós ternünátor.

   I. 0, Tenyésztett sejt, amelybe egy a 9. igénypere: szerinti expresszibe vektort juttattunk be, ahol az említett tenyésztett, sejt expresszálja az említett polinnkleetid által kódok említett polipeptidet.

   II. Eljárás pokpeptid előállítására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza;

   sejtet tenyésztünk, amelybe a 9, igénypont szerinti expreszsxiős vektort juttattunk be, ahol az említett sejt expmsszálja az említett peonukloend. által kódolt említett polipeptidet; és

   - kinyerjük az említett expreaszalt polipeptidet,
10. 12. A 2, sz. szekvencia szerinti, izolált pohpeptid.
11. 13. Α12, igénypont szerinti polipeptku egy győgyászatilag elfogadható hordozóval kombinálva,
12. 14. Gyógyászati kompozíció, amely az alábbiakat tartalmazza:

    - egy antitest vagy anktest-fragmens, amely specifikusan, kötődik a 2. sz, szekvencia szerinti pobpepkdhez; vagy

    - egy antitest vagy antítest~fragmena._s amely specifikusan. kötődik a 4, sz.. szekvencia szerinti polipeptidhez; éa

    - vgy győgyászatilag elfogadható hordozo,
13. 15. A 14. igénypont szerinti kompozíció, ahol az említett antitestet

    \.₄p\ aoonst a. rimának komi 'amszonk

    a) poliklonális antitestek; bl patkány antitestek;

    ri a bl anntvsri'ri -memazo hmnaniak? aooaasmk. dj bumán monoklonáiis antitestek, lő. A 1.4, vagy 15. igénypont szerinti kompcziciö_s ahol az említek: ana Ήχ a a k' χχθ\\ 'a fov M és scFv,
14. 17. Egy az alábbi csoportból választok: vegyüiet.................................

    al a BR43x2 (2> sz. szekvencia) extracelluláris doménjét tartalmazó poüpeptid; és

    b) a 4, sz, szekvencia, szerinti pobpepkd alkalmazása emlősökben a 'BE43:z.2, TAC1 vagy BCMA rceeptor-ztnib kapcsolódás gátlásán keresztül asztma, broncbiks, emhzéma, neíritlsz, pieionetritisz, könnyű lánc neuropátia, amiieidözis, membrán nefropáka, IgA nefimpátla, Berger-kör, IgM nefropátia, Goodpasture••betegség, fertőzést követé glomerulonefrítio_s mezangioproliferativ betegség, minimál-change. nefrotikus szindróma^ vagy lupns-szal összefüggő másodlagos glomerulonefritisz vagy vaszkumisz kezelésére szolgáié gyógyszerkészítmény előállítására vagy egy autoimmun, betegséggel Összefüggő antitest termelés gátlására, szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.,
15. 18, A 17. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett vegyület egy fúziós protein amely fúziós protein, egy peptidkőtés által összekapcsolt fru uu l\' w rn b ' ne a u am m , Λη κ < ag\ <' a polipeptidet tartalmaz, amely a. 2, az. szekvencia. 25-S8 amlnosavak. tartalmazza es ahol az említett második rész egy másik polipeptidet tartalmaz,
16. 19, A 18, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett első rész továbbá. egy a 2. sz, szekvencia m* 1 ?9 amínosavaiből álló polipeptidet is tartalmaz.
17. 20, A 18. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett első rész egy m\ ox pm papod omelv uruÍwnn < 1184 mi ϊ?. mmueomal eatraéellnláris doméryét,
18. 21, A 18, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett első rész egy a 4, sz, szekvencia, szerinti poiipeptíd,
19. 22, A 18-21. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említeti második rész egy iramunglobuhn nehéz lánc konstans régió.

    1<Π
20. 23, A 22, Igénypont szerinti alkalmazás> ahal az említett immunglobulin nehéz lánc konstans régié egy humán immungloinxlln nehéz lánc konstans régié,
21. 24, Á 23, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett hennán immunglobulin nehéz lánc konstans régió az IgGl egy humán immunglobulin nehéz lánc konstans régiója.
22. 25, A. 22-24, Igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett gyógyszerkészítmény továbbá fúziós p;<m ,mk egy m ultim ériét tartalmazza,
23. 26, A 25, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett gyógyszer -se'''. ári'.' _x »k>v , m ' e κ me' κ ' θ' m talraaz, amely két konstans régiót tartalmaz: és hfenyzik belőle a. variábilis elemén.,
24. 27, Egy az alábbi, csoportból választott vegyüiet aj egy antitest.: vagy anűtest-fragmens, amely specifikusan kötődik a. 2, sz, szekvencia szerinti polipeptidbez; és

    b) egy antitest vagy antitestriragmens, amely specifikusan kötődik a 4, sz, szekvencia szerinti polipeptidbez alkalmazása emlősökben a BR43a2_:> TAGI vagy BCMA receptor-ztnfe kapcsolódás gátlásán keresztül asztma, bronehitis, emfizéma., neíritisz, piekmeáitisz, könnyű lánc neoroparia, smikndézis, membrán mdropatia, IgA nefropátia, Berger-kér, IgM aeíropáha, Goodpastnrc' -betegség, fertőzést követő glomerulonelritisz, mezangioproliíerativ betegség, rninímabchange nelrotikűs szindróma, vagy lapus-szal Összefüggő másodlagos glomerulonelritisz vagy vaszknlitisz kezelésére szolgáló győgyszerkészitmény előállítására vagy egy autoimmun betegséggél összefüggő antitest termelés gátlására szolgáló gyógyszerkó szihneny előállítására,
25. 28, A 17-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett antitest-termelés az alábbi autoimmun betegségekkel kapcsolatos'. szisztémás kapus erythemaiosis, myasthenia gravis, szklerőzis multiplex vagy reumás arthritis,
26. 29, A 17-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett antitest-termelés az alábbi autoimmun betegségekkel kapcsolatos: inzulinfüggő diabetes mellhús vagy Crobn-betegség.
27. 30, A 1.7-27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett vesebetegség glomerulormíririsz, vaszkulirisz, neiritisz vagy pielonefritisz.
28. 31, A 17-27, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett gyulladásos betegség ízületi fájdalommal, duzzadással vagy szeptikus sokkal jár.

    82., Egy a 6, sz. szekvencia szerinti pokpeptidhez specifikusan kötődő antitest vagy antitest-lragmens alkalmazása olyan gyógy szerkészitmény előálktására, amely a TAGI reoeptor-ztnfá kapcsolódás gátlásán keresztül alkalmas emlősökben az asztma, a bronchiüs vagy az embzema kezelésére.
29. 33, A. 10, sz, szekvenciát tartalmazó polipeprid alkalmazása emlősökben asztma, bronehk.is emtizéma, nefriüsz, plelonetrlüsz, vese neoplazmák, könnyű lánc neuropátia, amiloldőzis, Crobn-betegség

    V)?· vagy izületi fáfdalommal, duzzadással vagy szeptikus sokkal járó gy ulladás kezelésére szolgáló gyógyszerkészitmény előállítására,
30. 34, A 33, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett polipeptid tartalmazza a 6, sz. szekvencia 34-66 anhnosavait,
31. 35, A 33, vagy 34, igénypont szerinti alkalmazás ahol az említett polipeptid tartalmasa a 6, sz. szekvencia 71-104 aminesavait,
32. 36, A 33-35. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett polipeptid egy peptidkrkéssel egy második: polipeptidhez kapcsolódva fúziós proteint képez,
33. 37, A 36, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az emutett második \ > χ- m g<' ' ··, , ' -m ·,' s v
34. 38, A 37. igénypont szerinti, alkalmazás, ahol az említett immunglobulin nehéz lánc konstans régió egy humán immunglobulin nehéz lánc kon st ans régió.
35. 39, A 38. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett humán immunglobulin nehéz lánc konstans régió az IgGl egy humán imnnmgiobuliu nehéz lánc konstans régitpa.,

    4(1 A 36. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a második, rész egy immunglobulin nehéz lánc konstans régió Fe fragmens, amely két konstans régió dornént tartalmaz, és amelyből hiányzik a variábilis régió.
36. 41, A 40. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett Fc fragmens a. humán IgG 1~bői származik,
37. 42, A 40, vagy 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahal az emláeit Fc \\\v\n n.\ \a^ . ' m\o - oc-' m, koto funkciót, és a komplement (Cigi kötő funkciót.·
38. 43, A 36-42. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az ??\?m a ·,'' t t,.s „'tóm mulrimenét tartalmazza.
39. 44, A 10, az, szekvenciát tartalmazó polipeptid emlősökben asztma, hroorinns enmmma, non ama pmleneá tcn, \em mepu.snak, Füíunu lánc neuropátia, amiloidózis. Grohn-betegzég vagy izületi féjdalomrnal duzzadással vagy szeptikus sokkal járó gyulladás kezelésénél történd alkalmazásra.
40. 45, A 44. igénypont szerinti alkalmazásra szolgáld polipeptid, ahol az említett polipeptid tartalmazza a 6, sz, szekvencia. 34-66 anúnosavait,
41. 46, A 44, vagy 45, igénypont szerinti alkalmazásra szolgáld polipeptid ahol az említed. polipeptid tar talmazza a 6. sz, szekvencia 71-104 aminosavait,
42. 47, A 44-46, igénypontok' bármelyike szerinti alkalmazásra szolgáló nelipeptnk almi ,c mobmn po'spepbd eg> pepn'dkötéssel em második poiipeptidhez kapcsolódva fúziós proteint képez.

    43, Á 47. igénypont szerinti alkalmazásra, szolgáld polipeptid, ahol az említett második rész egy inununglolnelin nehéz lánc konstan s régid.
43. 49, A 48. igénypont szerinti alkalmazásra, szolgáié polipeptid, ahol az említett immtmglobuhn nehéz lánc konstans régió egv humnn immunglobulin nehéz lánc konstans régió.
44. 50, A 49. igénypont szerinti alkalmazásra szolgáló polipeptid, ahol az említett humán immunglobulin nehéz lánc konstans régid az IgGl egy humán immunglobulin nehéz lánc konstans régiója,

    5h A 47. igénypont szerinti alkalmazásra szolgáló polipeptid, ahol a második rész egy immunglobukn nehéz lánc konstans régió Fó fragmens, amely két konstans régié domént tartalmaz, es amelyből hiányzik a. variábilis régió.
45. 52. Az 51, igénypont szerinti alkalmazásra szolgáló polipeptid, ahol m m m x y » ' m ri v \
46. 53, Az 51, vagy 52. igénypont szerinti alkalmazásra, szolgáló polipeptid, almi az említett Fe fragmenst úgy mödositotxuk, hogy efravobtottuk belőle az Fo receptor kötő funkciót, és a komplement. <Clq) kötő funkciót, ő-k A 45' 55, igénypontok bátmrivfre somion alkalmaxasm szofrydo polipeptid, ahol az említett gyógyszerkészítmény az említett fúziós proteinek egy mokimepét tartalmazza.,
47. 55. Polipeptid, amely az alábbi csoportból választott aminosav-szekvenciákból álh ai a. 8, sz, szekvencia 1-48 axmnosavak

    b) a. 8, sz, szekvencia 8-37 aminosavak

    c) a8. sz, szekvencia 41.-88 aminosavai; ás a 8. az. szekvencia 8---88 amínosavak vagy ej a 8. sz. szekvencia 1-150 aminosavak
48. 56, Aa 55. igénypont szerinél poiipeptid alkalmazása emlősökben asztma, bronehitís, emíriéma, vesebetegség, végső stádiumban lévő veseelégtelenség, vese nnoplazmák, mielőma multiplex, limlomáig kőnynueco- meeeout > ao G- Λ .\-> ' ugx m xriaúm- m\ek sen mm uee immun betegséggel összefüggő andfest-termelés gátlására vagy T-efa'klor ο·· ;Kk auUn'VO'u ^.miauin megy armkcsrummo eM.öl hasúra, almi az említett gátlás továbbá, magába főgalja a gmk kilökődéssel a graft versus hőst betegséggel, az autoimmun, betegséggel vagy a gyulladással összefüggő immunszuppressziöi. is.
49. 57. Fúziós protein., amely egy peptidkötéssel Összekapcsolt első részből és második részből áll, ahol az említett első rész egy az 55, Igénypont szerinti polipeptidböl áll, és az említett, második rész egy imnaunglobukn nehéz lánc konstans régióból vagy egy immunglobulin nehéz lánc konstans régió Fc fragmensből áll, amely két konstans régió domént tartalmaz, és amelyből, hiányzik a variábilis régió, s -, η χ' a r, a. χ·». en--.e éee m le- - a ,e giobnlm nehéz lánc konstans régió egy humán immungio-nulio nehez lánc konstans régió.
50. 59, Az 58, igénypont szerinti fúziós protein, ahol az említett humán immunglobulin nehéz lánc konstans régió sz.lgGl. egy humán immunglobulin nehéz lánc konstans régiója.
51. 60. Λζ 57, igénypont szerinti fúziós protein, ahol az említett Fc fragmens a humán. IgG 1 -bői származik,
52. 61. Áz 57, vagy 50, igénypont szerinti fúziós· protein, ahol az említett Fe fragmenst úgy módosítottuk, hogy eltávoktottuk belőle az Fc receptor kótö funkciót, és a komplement (Glg) kötő funkciót,

    60. Az 57-61. igénypontok bármelyike szerinti fúziós protein, amely az említett fúziós proteinek egy multímer.formájaként von jelen.
53. 63, Az- 57-62. Igénypontok bármelyike szerinti polipepud alkalmazása emlősökben asztma, bronchitis, emílzéma, vesvbetegseg, végső stádiumban lévő veaeelégtelenség, vese neoplazmák, mietőma mukiples, limfömák, fcbnnyúláne neuropátia, smiloldőzis vagy gyulladás kezelésére vagy^y autoimmun betegséggel összefüggő antitest-termelés gátlására. vagy T-eí-íektor sejtek gátlására szolgáló gyógyszerkészítmény előálUtasára, ahol az említett gátlás továbbá magába, fogatja a. graft kilökődéssel a. graft versus hőst betegséggel, az aufoimxnun betegséggel vagy a. gyulladással összefüggő Immun szuppressziöt is,
54. 64. A 63, Igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest-termelés az alábbiak közül választott autoimmun betegséggel, függ·· össze: sziszté vmuU' ca m ' ,·, j,cn, aa^' c ksuny.

    reumás arthritis.
55. 65, A 63, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest-termelés az alábbiak közül választott autoimmun betegséggel függ össze: inzulinfüggő diabetes mellltus vagy Crohn, betegség.
56. 66, A 63. igénypont szerinti alkalmazás,, ahol aa említett vesebetegség a. glamerulonekltisz, a vaszkuktisz, a. nefridsz vagy a pieloneá'itisz,
57. 67, A 63, igénypont szerinti .alkalmazás, ahol az említett, gyulladás a izületi fájdalommal, duzzadással, anémiával, vagy szeptikus sokkal jár..
58. 68, Folipepiid alkalmazása emlősökben szisztémás lupus CHthéma·· tosus, myasthenia gravís, szklerozls multiplex vagy reumás arthritis, asztma, broncbitis, emfizéma, vesebetegség, végső stádiumban lévő veseelégtelenség, vese neoplazmák, nnelmaa mnluplex, künn alom. neuropaüa, amiloidőzis vagy Izületi; lajdalommal duzzadással, anémiával vagy szeptikus sokkal járó gy ulladás kezelésére vagy T-efíéktar sejtek eatlásma szolgaid ey^zv szerkó sutmén\ eioallltasara, ahol m. emh tett gátlás továbbá magába, legalja a. graft kilökődéssel a graft versus hőst betegséggel, az autoimmun betegséggel vagy a gyulladással összefüggő immunszuppressziot is, és ahol az említett polipepüd egy az alábbiak, csoportból választott amínossv-szekvenciát tartalmaz:

    aj a 8, sz. szekvencia 1 -43 arnmosavai: bj a 8,. sz. szekvencia 8-37 aminosavak ej a 8. sz, szekvencia 41-88 amlnosavaú dj a 8. sz. szekvencia 8-88 aminosavak vagy ej a 8, sz, szekvencia 1--15Ö am.inosavsL
59. 69, A 68. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az emiitett polipepüd a 8, sz, szekvenciád tartalmazza..
60. 70. Fúziós protein alkalmazása emlősökben, szisztémás lupus erithematosis, myasthenia gravis·,· szklerozls multiplex vagy reumás arthritis, asztma, broncbitis, emüzéma, vesebetegség, végső stádiumban lévő veseelégtelenség, vese neoplazmák, núelöma. multiplex, köny1^9 nyűlánc neafopátia, amlloidézis vagy izületi fajdalommal, duzzadással, anémiával vagy szeptikus sakkal járó gyulladás kezelésére vagy Tefíektor sejtek gátlására szolgáié gyógyszerkészítmény előállítására, ahol az említett gátlás továbbá magába fogalja a graft kilökődéssel a. graü. versus bőst betegséggel az autoimmun betegséggel vagy a gyűlkutassal őssreföggo inam msen porosszal 'S, és ahol az emhteh t'őnoa protein egy peptidkőíéssel összekapcsolt első részből és második részből áll, ahol az említed: első rész egy az 55. igénypont szerinti pobpepüdét vagy egy a 8. sz, szekvencia szerinti pobpeptidet tartalmaz, és ahol a második rész egy másik polipeptidet tartalmaz,
61. 71, A 47. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett második rész egy immunglobulin nehéz lánc konstans régió.
62. 72, A 71. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett immunglobulin nehéz lánc konstans régié egy humán immunglobulin, nehéz lánc konstans régió.
63. 73, A 72, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett humán Immunglobulin nehez kme konstans régió or Igád egy humán immun· globulin nehéz lánc konstans régiója,
64. 74, A 70, igénypont szerinti alkalmazás, almi a második rész egy immunglobulin nehéz láne konstans régié Fc íragmens, amely két konstans régió domént tartalmaz, és amelyből hiányzik a variábilis régié,
65. 75, A 70. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett Fc fragmens a humán IgG 1-ből származik:.

    200
66. 76. A 74. vagy 75. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett Fc iragm enst ügy módosítottuk, hogy eltávolitottuk belőle. az· Fc receptor kötő funkciót, és a komplement (Clq) kőtö funkciót.
67. 77.. A 70-76. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az említett gyógyszerkészítmény az említed fúziós proteinek egy ruuitunerjét tartalmazza.
68. 78.. Az 1. igénypont szerinti polipeptidhez specifikusan kötődő antitest vagy antitest-fragmens alkalmazása emlősökben asztma, bronchitís.j emfízema_s vese neoplazmák, kőnnyüiáne neurnpátia, amiloidozis, nefrítisz, pieionehitisz, membrános nefropátiá, IgA nefropátia, Betget-kön IgM nefropátia, Ce< \\w um 1\ n \ „ glorneruionefritisn mezangíoprolíferativ betegség, minimál change· nefrotikns szindróma, vagy másodlagos glomemlonefritisz vagy lupusszál járó vaszkulítísz kezelésére: szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
69. 79. Az 56, igénypont szerinti vagy a 63-78. igénypontok bármelyike .szerinti alkalmazás, ahol az emkívit emlős egy főemlős.