CZ299161B6 - Polypeptid BAFF-R, nukleová kyselina kódující BAFF-R, protilátka proti BAFF-R a farmaceutické prípravky, které je obsahují - Google Patents

Polypeptid BAFF-R, nukleová kyselina kódující BAFF-R, protilátka proti BAFF-R a farmaceutické prípravky, které je obsahují Download PDF

Info

Publication number
CZ299161B6
CZ299161B6 CZ20031103A CZ20031103A CZ299161B6 CZ 299161 B6 CZ299161 B6 CZ 299161B6 CZ 20031103 A CZ20031103 A CZ 20031103A CZ 20031103 A CZ20031103 A CZ 20031103A CZ 299161 B6 CZ299161 B6 CZ 299161B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
baff
seq
polypeptide
nucleic acid
sequence
Prior art date
Application number
CZ20031103A
Other languages
English (en)
Inventor
M. Ambrose@Christine
S. Thompson@Jeffrey
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27499682&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ299161(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of CZ299161B6 publication Critical patent/CZ299161B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

Rešení se týká nukleové kyseliny kódující polypeptid BAFF-R, protilátek proti polypeptidu BAFF-R a farmaceutických prípravku, které obsahují polypeptid nebo protilátku podle vynálezu. Tento receptor,nebo nukleová kyselina, která ho kóduje, nebo proti nemu namírená protilátka mohou být využity pri lécení karcinomu, lymfomu, autoimunitních nemocí nebo dedicných genetických onemocnení týkajících seB lymfocytu.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález poskytuje nový receptorový protein. Vynález se obecně týká nukleových kyselin a polypeptidů. Vynález se konkrétně týká nukleové kyseliny kódující polypeptidy příbuzné receptoru pro BAFF, aktivační faktor B lymfocytů patřící k rodině proteinů nádorového nekro10 tického faktoru (TNF), který souvisí s expresí B lymfocytů a imunoglobulinů. Tento receptor může být využit při léčení karcinomů, lymfomů, autoimunitních nemocí nebo dědičných genetických onemocnění týkajících se B lymfocytů.
Dosavadní stav techniky
Předkládaný vynález se týká nového receptoru patřícího do rodiny TNF. Nový receptor byl identifikován jako receptor pro BAFF (BAFF-R ).
Rodina TNF se skládá z dvojic ligandů jejich specifických receptorů, které bývají označovány jako ligandy rodiny TNF receptory rodiny TNF ((Bazzoni a Beutler (1996) N. Engl. J. Med. 334 (26) : 1717-1725). Tato rodina se účastní regulace imunitního systému, a také možná i jiných neimunitních systémů. Jde často o regulaci typu hlavního přepínače, kdy signalizace typu TNF může vést k mnoha různým následným událostem, jejichž typickým příkladem je právě
TNF. TNF může např. iniciovat obecnou obrannou zánětlivou reakci organismu v reakci na cizorodou látku, která zahrnuje pozměněnou prezentaci adhezivních molekul zúčastněných v buněčném transportu (cell trafficking), produkci chemokinů, které směrují specifické buňky do specifických kompartmentů, ve specifickém instruování (priming) různých efektorových buněk. Tudíž regulace těchto metabolických drah má jistě i klinický potenciál.
Fze se domnívat, že indukce různých typů buněčných odpovědí zprostředkovaných cytokiny z rodiny TNF je iniciována jejich navázáním na specifické buněčné receptory. Byly identifikovány přinejmenším dva odlišné TNF receptory velikosti přibližně 55 kDa (TNFR1), 75 kDa (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem. 264: 14 927-14 934 (1989), Brockhaus et al., PNAS,
87: 3127-3131 (1990)]. S geny pro oba receptory TNF je spojen významný polymorfismus. Oba
TNFR sdílejí typickou strukturu receptorů na buněčném povrchu, tj. obsahují extracelulámí, transmembránovou intracelulámí doménu. Extracelulámí část TNFR typu 1 a 2 obsahuje repetitivní profil aminokyselinových sekvencí čtyřech domén bohatých na cystein (CDR). Podobný repetitivní profil CDR se vyskytuje i u několika jiných proteinů na buněčném povrchu jako je např. receptor nervového růstového faktoru p75 nebo antigen CD-40 B lymfocytů.
TNF receptory jsou významnými nástroji k vyhledávání a analýze metabolických signalizačních drah, neboť mohou být snadno upraveny na imunoglobulinové fúzní proteiny. Tyto dimemí rozpustné formy představují dobré inhibitory událostí zprostředkovaných jak přirozenými secemo45 vánými nebo povrchově vázanými ligandy. Tyto fúzní proteiny, tím, že se naváží na ligandy, zabrání ligandům v interakci s receptory asociovanými s buňkami, tím inhibují navazující signalizaci. Tyto fúzní proteiny receptor-Ig jsou užitečné nejen z experimentálního hlediska, ale byly úspěšně využity i klinicky, tak např. TNF-R-Fc byl úspěšně užit k léčení zánětlivé nemoci střev, revmatoidní artritidy nebo akutního klinického syndromu, který doprovází podávání OKT3 (Eason et al. (1996) Transplantation 61 (2): 224-228; Feldmann et al. (1996) Int. Arch. Allergy Immunol. 111 (4): 362-365; and van Dullemen et al. (1995) Gastroeraterol. 109 (1): 129-135). Fze očekávat, že cílené ovlivnění mnoha událostí zprostředkovaných signalizací za účasti receptorů TNF rodiny by se mohlo využít při léčení poruch imunity také mnoha nemocí, které mají patologické následky zahrnující imunitní systém. Tak např. rozpustná forma v současnosti popsa55 ného receptoru, osteoprotegerinu, blokuje ztráty kostní hmoty, takže je vidět, že události řízené signalizací zahrnující receptory TNF rodiny se neomezují jen na regulaci imunitního systému (Simonet et al. (1997) Cell 89 (2): 309-319). Protilátky k receptorům mohou blokovat vazbu ligandu tudíž mít také klinický využití. Takové protilátky mají často velmi dlouhou životnost jsou tudíž výhodnější než rozpustné fůzní proteiny receptor-Fc, které mají v krvi kratší poločas.
I když inhibice receptorem zprostředkované metabolické dráhy představuje nyní nejužívanější terapeutickou aplikaci receptorů, byla to původně aktivace TNF receptorů, která se jevila jako klinicky slibná (Aggarwal a Natarajan (1996) Eur Cytokine Netw. 7 (2): 93 124). Aktivace TNF receptorů může iniciovat buněčnou smrt cílových buněk tudíž aplikace u nádorů byla stále je ío atraktivní (Eggermont et al. (1996) Ann. Surg. 224 (6): 756-765). Receptor může být aktivován buďto podání ligandu, tj. využitím přirozené cesty, nebo podáním protilátek, které se zesilují („crosslink“) receptor. Protilátky mohou být výhodné např. při léčení rakoviny, neboť mohou přežívat v krvi delší dobu na rozdíl od ligandu, které mají v krvi zpravidla kratší životnost. Agonistické protilátky jsou užitečné „zbraně“ pro léčení rakoviny, neboť receptory mohou být expri15 movány v nádorech selektivněji, nebo mohou být signálem pouze pro buněčnou smrt nebo diferenciaci u nádorových buněk. Podobně mnohé pozitivní imunologické události jsou zprostředkovány receptory rodiny TNF, např. zánětlivá reakce hostitele, tvorba protilátek apod., tudíž agonistické protilátky mohou být užitečné i v jiných než jen onkologických aplikacích.
Paradoxně i inhibice metabolické/signální dráhy může být klinicky prospěšná při léčení nádorů. Tak např. ligand Fas je exprimován v některých nádorech a tato exprese může vést k odumření Fas-pozitivních lymfocytů, což umožňuje, že nádor se vyhne účinkům imunitnímu systému. V takovém případě by inhibice systému Fas dovolila, aby imunitní systém reagoval na nádor jiným způsobem (Green a Ware (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94 (12): 5986-90).
Ligand BAFF z TNF rodiny, také známý pod označením TALL-1, THANK, BLyS a zTNF4 (Schneider et al. (1999) J. Exp. Med. 189 (11): 1747-1756; Shu et al. (1999) J Leukoc. Biol. 65 (5): 680-683; Mukhopadhyay et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (23): 15 978-15 981; Moore et al. (1999) Science 285 (5425): 260-263; Gross et al. (2000) Nátuře 404 (6 781): 995-999) zlepšuje in vitro přežívání B lymfocytů (Batten et al. (2000) J. Exp. Med. 192 (10): 1453-1466) a zdá se být klíčovým regulátorem populace periferních B lymfocytů in vivo. Myši nadměrně exprimující BAFF vykazují hyperplazii zralých B lymfocytů a symptomy systémového lupus erythaematosus (SLE) (Mackay et al. (1999) J. Exp. Med. 190 (11): 1697-1710). Také někteří pacienti trpící SLE mají významně zvýšené hladiny BAFF v séru (Zhang et al. (2001) J: Immunol. 166 (1): 6-10).
Bylo proto navrženo, že abnormálně vysoké hladiny tohoto ligandu mohou přispívat k patogenezi autoimunních nemocí tím, že podporují přežívání autoreaktivních B lymfocytů (Batten et al. (2000) J. Exp. Med. 192 (10): 1 453-1 466).
BAFF, membránový protein typu II, je produkován v buňkách myeloidního původu (Schneider et al. (1999) J Exp. Med. 189 (11): 1747-1 56; Moore et al. (1999) Science 285 (5425): 260 263) aje exprimován buď na buněčném povrchu, nebo v rozpustné formě (Schneider et al. (1999) J. Exp, Med. 189 (11): 1 47-1756). Již dříve bylo ukázáno, že dva členové rodiny TNF receptorů, BCMA a TACÍ, interagují s BAFF (Gross et al. (2000) Nátuře 404: 995-999; Thompson et al. (2000) J. Exp. Med. 192(1): 129-135; Xiaet al. (2000) J. Exp. Med. 192: 137 143; Masters et al.
(2000) Curr. Biol. 10 (13): 785-788; Shu et al. (2000) J. Leukoc. Biol. 65 (5): 680-683; Wu et al.
(2000) J. Biol. Chem. 275: 35 478-35 485).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález je založen, alespoň z části, na objevu BAFF-R, tj. receptorového proteinu pro BAFF, polynukleotidových sekvencí a polypeptidů BAFF-R kódovaných těmito sekvencemi nukleových kyselin.
-2CZ 299161 B6
V jednom aspektu vynález poskytuje izolovanou nukleovou kyselinu, která kóduje BAFF-R polypeptid, nebo její fragment nebo její derivát. Patří sem např. taková sekvence nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid alespoň s 50% identitou nebo alespoň s 90% identitou, vzhledem k polypeptidu obsahujícímu aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2D (SEKV. ID. C. 5).
Vynález také poskytuje v podstatě čistou molekulu nukleové kyseliny obsahující sekvenci, která hybridizuje ve stringentních podmínkách s hybridizační sondou, když sekvence nukleové kyseliny sondy tvoří kódující sekvence uvedené na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3) a obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) nebo komplement (tj. komplementární sekvence) kódující sekvence.
V některých provedeních sekvence nukleové kyseliny kóduje polypeptid mající sekvenci uvedenou na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5) s alespoň jednou konzervativní aminokyselinovou substitucí.
V některých provedeních sekvence nukleové kyseliny kóduje polypeptid, který se váže na BAFF.
Nukleová kyselina zahrnuje např. nukleovou kyselinu zahrnující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6).
Nukleová kyselina může být např. fragment genomové DNA nebo to může být molekula cDNA.
Vynález zahrnuje také vektor obsahující jednu nebo více nukleových kyselin popsaných v předkládané přihlášce a dále také buňky obsahující vektory nebo nukleové kyseliny popsané v předkládané přihlášce.
V dalším aspektu vynález poskytuje v podstatě čistou molekulu nukleové kyseliny kódující fúzní protein obsahující alespoň dva segmenty, kde jeden ze segmentů obsahuje polypeptid nebo jeho fragment, jak byl popsán aminokyselinovými sekvencemi uvedenými ve výše popsaných provedeních vynálezu. Vynález také poskytuje fúzní protein obsahující alespoň dva nebo tři segmenty, kde první segment obsahuje heterologní signální polypeptid, druhý obsahuje polypeptid nebo jeho fragment, jak byl popsán BAFF-R aminokyselinovou sekvencí popsanou ve výše uvedeném provedení vynálezu, a třetí segment obsahuje imunoglobulinový polypeptid. Alternativně první segment obsahuje imunoglobulinový polypeptidový fragment obsahující signální sekvenci a druhý segment obsahuje fragment polypeptidů BAFF-R.
V dalších aspektech vynález poskytuje v podstatě čisté vazebné agens, které se specificky váže k polypeptidu podle výše popsaného provedení vynálezu.
Předkládaný vynález se také týká hostitelských buněk, transformovaných rekombinantním expresním vektorem obsahujícím kteroukoliv molekulu nukleové kyseliny popsanou výše.
Další aspekt vynálezu se týká farmaceutického přípravku, který obsahuje nukleovou kyselinu BAFF-R a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
V dalším aspektu vynález zahrnuje v podstatě purifikovaný BAFF-R polypeptid, např. kterýkoliv polypeptid kódovaný BAFF-R nukleovou kyselinou.
Vynález také poskytuje farmaceutický přípravek, který obsahuje BAFF-R polypeptid a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
V ještě dalším aspektu vynález poskytuje protilátku, která se váže specificky k BAFF-R polypeptidů. Protilátka může být např. monoklonální nebo polyklonální protilátka.
Vynález také poskytuje farmaceutický přípravek obsahující BAFF-R protilátky a farmaceuticky přijatelného nosič nebo ředidlo.
-3CZ 299161 B6
Předkládaný vynález se také týká izolovaných protilátek, které se vážou na epitop polypeptidu kódovaného kteroukoliv molekulou nukleové kyseliny popsanou výše.
Předkládaný vynález se dále týká soupravy obsahující protilátky, které se vážou na polypeptid kódovaný kteroukoliv molekulou nukleové kyseliny popsanou výše, a negativní kontrolní protilátku.
Vynález dále poskytuje způsob přípravy BAFF-R polypeptidu. Způsob zahrnuje poskytnutí buněk obsahujících BAFF-R nukleovou kyselinu, např. vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu BAFF-R, a kultivaci těchto buněk v podmínkách umožňujících dostatečně exprimovat BAFFR polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou. Exprimovaný BAFF-R polypeptid je pak získán z buněk. Výhodně, buňka vytváří jen málo a nebo vůbec žádný endogenní BAFF-R polypeptid. Buňka může být např. prokaryotická buňka nebo eukaryotická buňka.
Předkládaný vynález poskytuje způsob indukce imunitní reakce u savce proti polypeptidu kódovanému kteroukoliv molekulou nukleové kyseliny popsanou výše, podáváním savci takového množství polypeptidu, které je dostatečné k indukci imunitní reakce.
Předkládaný vynález se také týká způsobu identifikace sloučeniny, která se váže k BAFF-R polypeptidu, který spočívá v tom, že se kontaktuje BAFF-R polypeptid se sloučeninou, a určí se, zda se sloučenina váže k BAFF-R polypeptidu.
Předkládaný vynález se také týká způsobu identifikace sloučenin, které vážou molekulu nukleové kyseliny kódující BAFF-R polypeptid, který spočívá v tom, že se kontaktuje nukleová kyselina BAFF-R se sloučeninou a určí se, zda se sloučenina váže na molekulu nukleové kyseliny.
Vynález dále poskytuje způsoby identifikace sloučeniny, která moduluje aktivitu BAFF-R polypeptidu, který spočívá v tom, že se kontaktuje BAFF-R polypeptid se sloučeninou a určí se, zda je aktivita BAFF-R polypeptidu modifikována.
Předkládaný vynález se také týká sloučenin, které modulují aktivitu BAFF-R polypeptidu, a které byly identifikovány tím, že se kontaktoval BAFF-R polypeptid se sloučeninou a určilo se, zda sloučenina modifikuje aktivitu BAFF-R polypeptidu, váže se k BAFF-R polypeptidu nebo se váže na molekulu nukleové kyseliny kódující BAFF-R polypeptid.
V dalším aspektu se vynález týká způsobu diagnózy nemoci zprostředkované B lymfocyty, např. autoimunitní nemoci nebo karcinomu, u pacienta. Způsob zahrnuje poskytnutí proteinového vzorku od pacienta a měření množství BAFF-R polypeptidu v tomto vzorku. Množství BAFF-R ve vzorku od pacienta se pak srovnává s množstvím BAFF-R polypeptid v kontrolním proteinovém vzorku. Změna v množství BAFF-R polypeptidu v proteinovém vzorku od pacienta vzhledem k množství BAFF-R polypeptidu v kontrolním proteinovém vzorku ukazuje, že je nemoc pacienta zprostředkována B lymfocyty. Kontrolní vzorek je výhodně odebrán od odpovídajícího „shodného“ jedince, tj. jedince podobného věku, pohlaví a dalších obecných znaků, přičemž ale u toho45 to jedince není podezření na nemoc. Jinak může být jako kontrolní vzorek použit vzorek, odebraný u pacienta v době, kdy ještě netrpěl nemocí. V některých provedeních je BAFF-R polypeptid detekován s použitím BAFF-R protilátky.
V dalším aspektu se vynález týká způsobu diagnózy nemocí zprostředkované B lymfocyty, např.
autoimunitní nemoci u pacienta. Způsob zahrnuje poskytnutí vzorku nukleové kyseliny, např.
RNA nebo DNA nebo obou, od pacienta a měření množství nukleových kyselin BAFF-R ve vzorku nukleových kyselin od pacienta. Množství nukleové kyseliny BAFF-R ve vzorku nukleových kyselin pacienta se pak srovnává s množstvím nukleové kyseliny BAFF-R v kontrolním vzorku. Změna v množství nukleové kyseliny BAFF-R ve vzorku od pacienta vzhledem k množ55 ství BAFF-R v kontrolním vzorku indikuje, že pacient trpí autoimunitním onemocněním.
-4CZ 299161 B6
V dalším aspektu se vynález týká způsobu diagnózy tumorigenních nebo autoimunitních onemocnění u pacienta. Způsob zahrnuje poskytnutí vzorku nukleových kyselin od pacienta a identifikaci alespoň ěásti nukleotidové sekvence nukleové kyseliny BAFF-R ve vzorku nukleových kyselin od pacienta. Nukleotidová sekvence BAFF-R ve vzorku od pacienta se pak srovnává s nukleotidovou sekvencí BAFF-R v kontrolním vzorku. Změna v nukleotidové sekvenci BAFFR ve vzorku od pacienta vzhledem k nukleotidové sekvenci BAFF-R v kontrolním vzorku indikuje, že pacient trpí uvedeným onemocněním.
ίο V ještě dalším aspektu se vynález týká způsobu léčení nebo prevence nebo oddálení nemoci zprostředkované B lymfocyty. Způsob zahrnuje podávání pacientovi, který takovou léčbu potřebuje, nukleové kyseliny BAFF-R, BAFF-R polypeptidu nebo protilátky anti-BAFF-R v množství dostatečném k léčení, prevenci nebo zpoždění tumorigenního nebo imunoregulačního onemocnění.
K nemocem, které mohou být diagnostikovány, terapeuticky nebo profylakticky léčeny nebo oddáleny s použitím molekul BAFF-R nukleové kyseliny, polypeptidů nebo protilátky, jsou rakovinná nebo imunoregulační onemocnění.
K těmto nemocem patří onemocnění autoimunitní povahy jako je například systémový lupus erythematosus, revmatoidní artritida, myasthenia gravis, autoimunní hemolytická anémie, idiopatická thrombocytopenia purpura, anti-fosfolipidový syndrom, Chagasova nemoc, Gravesova nemoc, Wegenerova granulomatóza, polyarteritis nodosa a rychle progresivní glomerulonephritis. Terapeutické agens má také aplikace při nemocech plazmatických buněk jako například mno25 honásobný myelom, Waldenstromova makroglobulinémie, nemoc těžkých řetězců, primární nebo s imunocyty-aociovaná amyloidóza a monoklonální gammopatie neurčeného význam (MGUS). K onkologickým cílům patří karcinomy B lymfocytů, leukémie a lymfómy.
Přípravky a léčebné postupy s použitím nukleový kyseliny, polypeptidů a protilátek podle před30 kládaného vynálezu mohou být použity při jakékoliv nemoci spojené s nežádoucí buněčnou proliferací, konkrétně může být předkládaný vynález využit při léčení nádorových buněk, které exprimují BAFF a/nebo BAFF-R.
Přípravky podle vynálezu obsahující BAFF-R agonisty (jako například protilátky vázající
BAFF-R a napodobující BAFF) mohou být použity například při léčení imunitní defícience charakterizované nízkým počtem B lymfocytů. Taková onemocnění mohou být například způsobena radiací a/nebo chemoterapií.
Další aspekt vynálezu se týká způsobu snížení agregace rekombinantně exprimovaných proteinů.
Způsob zahrnuje srovnání homologů proteinu nebo jeho fúzního proteinu pro stanovení konzervativních domén a neidentických aminokyselin v konzervativních úsecích. Obecně, alespoň jedna nepolární aminokyselina je změněna na nenabitou polární aminokyselinu nebo na prolin, alanin nebo serin.
Není-li konkrétně uvedeno jinak, všechny technické a vědecké termíny jsou použity v předkládané přihlášce ve stejném významu, v jakém jsou obecně užívány odborníky v oboru, do kterého tento vynález patří. Ačkoli metody a látky podobné nebo ekvivalentní k těm, které jsou popsány v předkládané přihlášce, mohou být použity při realizaci nebo zkoušení předkládaného vynálezu, vhodné metody a látky jsou popsány dále v textu. Všechny publikace, přihlášky vynálezu a patenty a jiné zdroje uvedené v předkládané přihlášce jsou zahrnuty formou odkazu v plném znění. V případě konfliktu je rozhodující zněné předkládaného popisu včetně definic. Navíc materiály a metody popsané v příkladech jsou ilustrativní a vynález nijak neomezují.
Další znaky a výhody vynálezu budou zjevné z následujícího podrobného popisu a připojených nároků.
-5CZ 299161 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1A ukazuje DNA sekvenci BJAB cDNA (SEKV. ID. Č. 1) klonovanou v pJST576.
Obrázek 1B ukazuje kompletní DNA sekvenci cDNA IMAGE klonu 2000271 (EST AI250289) (SEKV. ID. Č. 2).
Obrázek 2A ukazuje nukleotidovou sekvenci JST576 s intronem odstraněným na základě ío predikce programem GENESCAN (SEKV. ID. Č. 3).
Obrázek 2B ukazuje 1% agarózový gel s analýzou PCR produktů získaných pro BAFF-R s použitím prvního vlákna cDNA generovaného z BJAB nebo IM-9 RNA nebo JST576 cDNA. Dráha 1. Štěpení lambda DNA HindlII. Dráha 2. BJAB oligo dT instruován BAF-225/BAF-191.
Dráha 3. BJAB oligo dT s primery BAF-226/BAF- 191. Dráha 4. BJAB s náhodnými primery BAF-225/BAF-191. Dráha 5. BJAB s náhodnými primery BAF-226/BAF-191. Dráha 6. IM-9 oligo dT s primery BAF225/BAF-191. Dráha 7. IM-9 oligo dT s primery BAF-226/BAF-191. Dráha 8. IM-9 s náhodnými primery BAF-225/BAF-191. Dráha 9. IM-9 s náhodnými primery BAF-226/BAF-191. Dráha 10. JST576 cDNA BAF-225/BAF-L91. Dráha 11. JST576 cDNABAF-226/BAF-L91. Dráha 12. Žádný templát BAF-225/BAF-191. Dráha 13. Žádný templát BAF-226/BAF-191.
Obrázek 2C ukazuje zralou JST576 (BAFF-R) sekvenci (SEKV. ID. Č. 4) (viz také GenBank přístupové č. AF373846) určenou sekvencováním celkového PCR produktu ohraničujícího predi25 kovaný intron z BJAB prvního vlákna cDNA.
Obrázek 2D ukazuje aminokyselinovou sekvenci BAFF-R (JST576) (SEKV. ID. Č. 5). (Ala) zbytek zvýrazněný tučně ukazuje sekvenci, která je výsledkem užití alternativní sestřihového donorového místa. Predikovaná transmembránová doména je vyznačena rámečkem a předpoklá30 daný stop transferový signál je podtržen.
Obrázek 3 zobrazuje sestřiženou verzi JST576 (SEKV. ID. Č. 6) obsahující 5'UTR sekvenci získanou pomocí RT-PCR na prvním vláknu cDNA z humánní sleziny a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci (SEKV. ID. Č. 7). Tato sekvence obsahuje „upstream“ (v protisměru) stop kodon ve shodném čtecím rámci s ATG.
Obrázek 4A ukazuje sekvenci myší BAFF-R cDNA (SEKV. ID. Č. 8) (také GenBank přístupové č. AF373847).
Obrázek 4B ukazuje aminokyselinovou sekvenci myší BAFF-R (SEKV. ID. Č. 9). Cys zbytky jsou vyznačeny tučně a podtržením a predikovaný transmembránový úsek je vyznačen rámečkem.
Obrázek 4C ukazuje homologii mezi humánní (SEKV. ID. Č. 10) a myší (SEKV. ID. Č. 9) sekvencí BAFF-R proteinu.
Obrázek 5 zobrazuje vazbu humánního BAFF k buňkám transfekovaným JST576. 293EBNA buňky byly kotransfekovány pJST576 nebo CA336 (huTACI) a GFP reportérovým konstruktem. Buňky byly testované na BAFF vazbu s pg/ml biotinylovaného myc-huBAFF s následným
SAV-PE.
Obrázek 6 ukazuje vazbu humánního a myšího BAFF k buňkám transfekovaným JST576. 293EBNA buňky byly kotransfekovány pJST576 a GFP reportérovým konstruktem. Buňky byly testovány 24 hodin později na BAFF vazbu s 5 pg/ml flag-huBAFF nebo flag-muBAFF s nás55 lednou anti-flag monoklonální protilátka M2 a oslí proti-myší IgG-PE.
-6CZ 299161 B6
Obrázek 7 ukazuje, že APRÍL se neváže na buňky transfekované JST576. 293EBNA buňky byly kotransfekovány pJST576 nebo CA336 (huTACI) a GFP reportérovým konstruktem. Buňky byly testována na APRÍL vazbu s 1 pg/ml myc-muAPRIL následovaným anti-muAPRIL potkaním
IgG2b, biotinylovaným anti-potkanním FcG2b a SAV-PE.
Obrázek 8 ukazuje, že BAFF precipituje protein z buněk transfekovaných JST576. 293EBNA buňky byly transfekovány buďto BAFF-R (pJST576), samotným vektorem (CH269), nebo huTACI (CA336), a značeny pulzem 35S cysteinu a methioninu. Extrakty byly imunoprecipitoio vány s flag-huBAFF a pak analyzovány na redukčním SDS-PAGE gelu. Standardy molekulové hmotnosti jsou ukázány vlevo.
Obrázek 9 znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKV. ID. Č. 11) a z ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEKV. ID. Č. 12) genu kódujícího humánní BAFF-R:Fc: Nukleotidy
1 až 63 kódují myší IgG-kappa signální sekvence, nukleový kyselina zbytky 64-66 byly představilo restrikční enzym místo, nukleový kyselinové zbytky 67-276 kódují část BAFF-R extracelulámí doména, nukleový kyselina zbytky 277-279 byly představilo restrikční enzym místo a nukleový kyselina zbytky 280-960 kódují Fc úsek humánní IgGl.
Obrázek 10 zobrazuje výsledky Northern blot analýzy s použitím EcoNI fragmentu JST56 jako sondy. Všechny expozice byly 4 dny. 10A: humánní Imunoblot II firmy Clontech, 10B: humánní 12 dráhový multi-tkáňový blot firmy Clontech, 10C: humánní multi-tkáňový blot II firmy Clontech.
Obrázek 11 ukazuje výsledek Northern blot analýzy s 20 pg celkové RNA izolované z různých buněčných linií. Blot byl zkoušen sondou, kterou tvořil EcoNI restrikční fragment JST576, a byl exponován po dobu 4 dnů. Schopnost buněčné linie vázat BAFF, jak byla určena FACS analýzou, je ukázána pod příslušnou dráhou.
Obrázek 12 ukazuje výsledky imunoprecipitace s použitím BAFF-R:Fc. Humánní BAFF byl imunoprecipitován s BAFF-R: Fc nebo BCMA: Fc, ale nikoliv Fnl4-Fc. Kontrolní BAFF protein je ukázán v dráze 1.
Obrázek 13 ukazuje, že humánní BAFF-R: Fc blokuje vazbu humánního BAFF k buňkám BJAB.
Výsledky FACS analýzy jsou ukázané na obr. 13A. Křivka E reprezentuje vazbu biotinylovaného BAFF k buňkám BJAB bez přítomnosti BAFF—R: Fc. Křivky B až D představují schopnost BAFF vázat se k BJAB buňkám v přítomnosti 5 pg/ml, 1 pg/ml nebo 0,2 pg/ml BAFF-R: Fc, v daném pořadí. Křivka A je křivka druhého kroku. Obrázek 13B ukazuje schopnost různých koncentrací BAFF-R: Fc (čtverečky) ve srovnání s TACFFc (trojúhelníky) nebo nespecifickým fúzním proteinem, LTR: Fc (kroužky), blokovat vazbu BAFF k BJAB buňkám exprimujícím receptor.
Obrázek 14 ukazuje schopnost BAFF-R:Fc blokovat BAFF-indukovanou kostimulaci B lymfocytů ze sleziny. Je uveden graf inkorporace [3H]-thymidinu (cpm) v závislosti na zvyšujícím se množství z hBAFF (ng/ml).
Obrázek 15 ukazuje, že podávání BAFF-R:Fcl má u normálních myší za následek ztrátu periferních B lymfocytů.
Obrázek 16 ukazuje, že podávání humánního a myšího BAFF-R: Fc redukuje počet B220+ B lymfocytů ve slezině myší.
Obrázek 17 ukazuje, že podávání BAFF-R: Fc myším redukuje procento B220+ B lymfocytů v lymfatických uzlinách.
-7CZ 299161 B6
Obrázek 18 ukazuje, že podávání BAFF-R: Fc k myším redukuje B220+ B lymfocyty periferní krve.
Obrázek 19A ukazuje FACS data ze supematantů čtyř klonů produkujících protilátky, které vážou BAFF-R. Je také ukázán kontrolní supematant, který neobsahuje protilátky vázající se na BAFF-R.
Obrázek 19B ukazuje histogram znázorňující dva klony, které blokují vazbu BAFF na BAFF-R. (a) ukazuje kontrolu bez BAFF, (b) ukazuje blokační schopnost protilátky z klonu 2, (c) ukazuje ío blokační schopnost protilátky z klonu 9 a (d) ukazuje křivku kontrolní protilátky, která neváže
BAFF-R.
Obrázek 20 ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence humánní BAFF-R: Fc (hBAFF-R) a myší BAFF-R: Fc (mBAFF-R) extracelulámí domény a procento agregace pozorované po expresi Fc fúzních proteinů obsahujících uvedené sekvence. Očíslované JST klony představují aminokyselinové sekvence vykazující mutace (vyznačeny podtržením) v základní sekvenci a výslednou agregaci exprimovaného proteinu. Uvedeny jsou parciální sekvence pro humánní (aminokyseliny 2 až 71 ze SEKV. ID. Č. 10, SEKV. ID. Č. ID. Č. 13) a myší (aminokyseliny 2 až 71 ze SEKV. ID. Č. 9, SEKV. ID. Č. 14) BAFF-R a odpovídající části pro následující klony: JST659 (SEKV. ID. Č. 15), JST660 (SEKV. ID. Č. 16), JST661 (SEKV. ID. Č. 17), JST662 (SEKV. ID. Č. 18), JST663 (SEKV. ID. Č. 19), JST673 (SEKV. ID. Č. 20), JST 674 (SEKV. ID. Č. 21), JST675 (SEKV. ID. Č. 22), JST672 (SEKV. ID. Č. 23), JST676 (SEKV. ID. Č. 24), JST671 (SEKV. ID. Č. 25), JST677 (SEKV. ID. Č. 26), JST678 (SEKV. ID. Č. 27), JST664 (SEKV. ID. Č. 28), JST668 (SEKV. ID. Č. 29), JST665 (SEKV. ID. Č. 30), JST666 (SEKV. ID. Č. 31) a JST667 (sekv. ID. č. 32).
Obrázek 21 ukazuje autoradiogram proteinů imunoprecipitovaných použitím lyzátu připraveného z buněk transfekovaných BAFF-R-i.c.d. (BAFF-R intracelulámí doména) (dráha 1) nebo kontrolním vektorem (dráha 2). Přibližně 6x106 buněk 293E bylo transfekováno konstruktem kódují30 cím BAFFR-i.c.d. nebo „slepým“ kontrolním plazmidem. Po 48 hodinách byly buňky metabolicky značeny 35S po dobu 24 hodin, lyžovány lyzačním pufrem, stočeny centrifugou a imunoprecipitovány monoklonální protilátkou (mAb) anti-myc 9E10. Imunoprecipitáty pak byly rozděleny na 10 až 20% SDS PAGE v redukčních podmínkách.
Podrobný popis vynálezu
Publikované práce, patenty, přihlášky vynálezu a další vědecká literatura, včetně přístupových čísel v databázi sekvencí GenBank, na které se odkazuje v předkládané přihlášce, přestavují stav techniky a jsou proto formou odkazu v plném znění zahrnuty v předkládané přihlášce. Jakýkoliv konflikt mezi odkazem citovaným v předkládané přihlášce a specifickou naukou tohoto popisuje třeba řešit ve prospěch tohoto popisu. Podobně jakýkoliv konflikt mezi definicí termínu nebo fráze, jak je obecně v oboru přijímána, a definicí termínu nebo fráze specificky uvedené v předkládaném popisu, je třeba řešit ve prospěch tohoto popisu.
Standardní referenční publikace, které popisují obecné principy technologie rekombinantní DNA, které jsou odborníkům známy, zahrnují Ausubel et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York (1998); Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2D ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Plainview, New York (1989); Kaufman et al., Eds., HANDBOOK OF MOLECULAR AND CELLULAR METHODS IN BIOLOGY AND MEDICINE, CRC Press, BocaRaton (1995); McPherson, Ed., DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, Oxford (1991).
-8CZ 299161 B6
Předkládaný vynález popisuje nukleové kyseliny BAFF-R, izolované nukleové kyseliny, které kódují BAFF-R polypeptid nebo jeho část, BAFF-R polypeptidy, vektory obsahující tyto nukleové kyseliny, hostitelské buňky transformované nukleovou kyselinou BAFF-R, anti-BAFF-R protilátky a farmaceutické přípravky. Také jsou popsány způsoby přípravy BAFF-R polypeptidu, a také způsoby screeningu, a dále způsoby týkající se diagnostiky a terapie s použitím uvedených sloučenin, a dále způsoby screeningu sloučenin, které modulují aktivitu BAFF-R polypeptidu.
Nukleové kyseliny BAFF-R a odpovídající BAFF-R polypeptidy, a také BAFF-R protilátky, a také farmaceutické přípravky diskutované v předkládané přihlášce, jsou použitelné kromě další10 ho, při léčení karcinomů a/nebo imunoregulačních onemocnění. K těmto nemocem patří např. onemocnění zprostředkovaná B lymfocyty, která jsou autoimunitní povahy, jako je například systémový lupus erythematosus, revmatoidní artritida, myasthenia gravis, autoimunní hemolytická anémie, idiopatická thrombocytopenia purpura, anti-fosfolipidový syndrom, Chagasova nemoc, Gravesova nemoc, Wegenerova granulomatóza, polyarteritis nodosa a rychle progresivní glomerulonephritis. Terapeutické agens má také má aplikace při nemocech plazmatických buněk jako například mnohočetný myelom, Waldenstromova makroglobulinémie, nemoc těžkých řetězců, primární nebo s imunocyty-aociovaná amyloidóza a monoklonální gammopatie neurčeného význam (MGUS). K onkologickým cílům patří karcinomy B lymfocytů, leukémie a lymfómy.
Nukleové kyseliny BAFF-R
Jeden aspekt vynálezu se týká izolované molekuly nukleové kyseliny, která kóduje BAFF-R protein nebo jeho biologicky účinnou částí. Také zahrnuje fragmenty nukleové kyseliny dostatečné pro použití jako hybridizační sondy rozpoznávající nukleové kyseliny kódující BAFF-R (např.
BAFF-R mRNA) a fragmenty pro použití jako primery pro amplifikaci nebo mutaci molekuly nukleové kyseliny BAFF-R v polymerázové řetězové reakci (PCR). Termín molekula nukleové kyseliny, jak se v předkládané přihlášce používá, zahrnuje molekuly DNA (např. cDNA nebo genomové DNA), molekuly RNA (např. mRNA), analogy DNA nebo RNA vytvořen s použitím nukleotidových analogů, a také jejich deriváty, fragmenty a homology. Molekula nukleové kyse30 líny může být jednovláknová (jednořetězcová) nebo dvojvláknová (dvojřetězcová), ale výhodně je to dvojvláknová DNA.
Termín sondy označuje sekvence nukleových kyselin variabilní délky, výhodně mezi alespoň přibližně 10 nukleotidy (nt) až přibližně např. 6000 nt, v závislosti na účelu použití. Sondy se užívají pro detekci totožných, podobných nebo komplementárních sekvencí nukleových kyselin. Delší sondy jsou obvykle získány z přírodních nebo rekombinantních zdrojů, jsou vysoce specifické a mnohem pomalejší při hybridizaci než oligomery. Sondy mohou být jedno- nebo dvojvláknové a navržené tak, aby byly specifické v PCR, v testech užívajících princip hybridizace na membránách nebo v testech založených na principu podobnému ELISA testu.
Izolovaná molekula nukleové kyseliny je taková molekula, která je oddělena od jiných molekul nukleových kyselin, které jsou normálně přítomny v přírodním zdroji nukleové kyseliny. Příklady izolované molekuly nukleové kyseliny zahrnují, ale bez omezení, rekombinantní molekuly DNA obsažené ve vektorech, rekombinantní DNA molekuly udržované v heterologní hostitelské buňce, částečně nebo v podstatě purifikované molekuly nukleových kyselin a také syntetické molekuly DNA nebo RNA. Výhodně, izolovaný nukleová kyselina neobsahuje sekvence, které ji v přirozeném stavu obklopují (tj. sekvence lokalizované na 5' a 3' koncích nukleové kyseliny) v genomové DNA organismu, ze kterého nukleová kyselina pochází. Například v různých provedeních vynálezu izolovaná molekula nukleové kyseliny BAFF-R může obsahovat méně než přibližně 50 kb, 25 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb nebo 0,1 kb nukleotidových sekvencí, které ji v přirozeném stavu obklopují v genomové DNA buňky, ze které nukleová kyselina pochází. Navíc izolovaná molekula nukleové kyseliny, jako například cDNA molekula, je v podstatě zbavena všech ostatních buněčných složek a materiálů, nebo kultivačního média, když je získána rekombinantními technikami, nebo všech chemických prekurzorů a dalších chemikálií, když je chemicky syntetizována.
-9CZ 299161 B6
Molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, např. molekula nukleové kyseliny mají nukleotidovou sekvenci uvedenou zde na obr. 1A (SEKV. ID. C. 1), obr. 1B (SEKV. ID. C. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6), nebo komple5 ment ke kterékoliv z těchto nukleotidových sekvencí, může být izolována s použitím standardních technik molekulární biologie a sekvenčních informací uvedených v předkládané přihlášce. S použitím celých sekvencí nukleových kyselin obr. ΙΑ, B, 2A, C a 3 nebo jejich částí jako hybridizační sondy, může být izolována sekvence nukleové kyseliny BAFF-R standardním hybridizačním a klonovacím postupem (např. jak je popsáno v základní příručce Sambrook et al., ío Eds., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2ND ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., Eds., CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993).
Nukleová kyselina podle vynálezu může být amplifikována s použitím cDNA, mRNA nebo alter15 nativně i genomové DNA, jakožto templátu a vhodných oligonukleotidových primerů pomocí standardní amplifikační techniky PCR (polymerázové řetězové reakce). Nukleová kyselina takto amplifikována může pak být klonována do vhodného vektoru a charakterizována sekvencováním DNA. Kromě toho oligonukleotidy odpovídající nukleotidové sekvenci BAFF-R mohou být připraveny standardními technikami syntézy, např. s použitím automatizovaného DNA syntetizáto20 ru.
Termín oligonukleotid, jak se v předkládané přihlášce používá, se týká řady spojených nukleotidových zbytků, přičemž oligonukleotid má dostatečný počet nukleotidových bází na to, aby mohl být použit v PCR reakci. Krátká oligonukleotidová sekvence může být založena nebo navr25 žena na základě sekvence genomové DNA nebo cDNA a používá se k amplifikaci, potvrzení nebo zjištění přítomnosti totožné, podobné nebo komplementární DNA nebo RNA ve zkoumané buňce nebo tkáni.
Oligonukleotidy obsahují části sekvence nukleové kyseliny v délce alespoň přibližně lOnt až přibližně 50 nt, výhodně přibližně 15 nt až 30 nt. Mohou být syntetizovány chemicky a používány jsou pak jako sondy.
V dalším provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu obsahuje molekulu nukleové kyseliny, která je komplementem (tj. je komplementární) nukleotidové sekvence uvede35 né na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6). V dalším provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu obsahuje molekulu nukleové kyseliny, která je komplementem nukleotidové sekvence uvedené na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) nebo část této nukleotidové sekvence. Molekula nukleové kyseliny, která je komplementární k nukleotidové sekvenci uvedené na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. C. 6) je taková sekvence, která je dostatečně komplementární k nukleotidové sekvenci uvedené na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6), která se může vodíkovými vazbami s malou nebo žádnou „neshodou“ („mismatch“) vázat s nukleotidovou sekvencí uvedenou na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) a vytvářet tak stabilní dvoušrobovicovou (duplexní) strukturu.
Termín komplementární, jak se v předkládané přihlášce používá, se týká Watson-Crickových nebo Hoogsteenových základních párů (dvojic) nukleotidů mezi jednotlivými molekulami nukleových kyselin a termín vazba znamená fyzikální nebo chemický interakce mezi dvěma polypeptidy nebo sloučeniny nebo sdruženými polypeptidy a sloučeninami nebo jejich kombinací. Vazba zahrnuje iontové, neiontové, Van der Waalsovy, hydrofobní a další interakce. Fyzikální interakce může být buď přímá, nebo nepřímá. Nepřímá interakce může být prostřednictvím
-10CZ 299161 B6 a nebo právě díky účinkům dalšího polypeptidu nebo sloučeniny. Přímá vazba se týká interakce, která není způsobena účinkem jiného polypeptidu nebo sloučeniny, aleje bez dalších chemických „prostředníků“.
Navíc molekula nukleové kyseliny podle vynálezu může zahrnovat jen část sekvence nukleové kyseliny uvedené na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6), např. fragment, který může být použit jako sonda nebo primer, nebo fragment kódující biologicky účinnou část BAFF-R.
Fragmenty popsané v předkládané přihlášce jsou definovány jako sekvence přinejmenším 6 (souvisejících, tj. bezprostředně po sobě následujících) nukleových kyselin nebo přinejmenším 4 (souvisejících, bezprostředně po sobě následujících) aminokyselin, což je délka dostatečná pro specifickou hybridizaci v případě nukleových kyselin nebo pro specifické rozpoznávání epitopu v případě aminokyselin, v daném pořadí, a jsou nanejvýše o nějakou část menší než kompletní sekvence. Fragmenty mohou být získány z kterékoliv souvislé část nukleové kyselina nebo aminokyselinové sekvence podle výběru.
Deriváty jsou sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselinové sekvence vytvořené z nativní sloučeniny buďto přímo, nebo modifikací nebo parciální substitucí. Analogy jsou sekvence nuk20 leových kyselin nebo aminokyselinové sekvence, který mají strukturu podobnou, ale nikoliv totožnou, s nativní sloučeninou, ale liší se od nativní v určitých aspektech pokud jde o některé složky nebo postranní řetězce. Analogy mohou být syntetické nebo odlišného evolučního původu a mají podobnou nebo opačnou metabolickou aktivitu ve srovnání s divokým typem.
Deriváty a analogy mohou být kompletní (tzv. plné délky) nebo jiné než kompletní, jestliže derivát nebo analog obsahuje modifikovanou nukleovou kyselinu nebo aminokyselinu, jak bude ještě popsáno dále. Deriváty nebo analogy nukleových kyselin nebo proteinů podle vynálezu zahrnují, ale bez omezení, molekuly obsahující oblasti, které jsou v podstatě homologní s nukleovými kyselinami nebo proteiny podle vynálezu, v různém provedení, alespoň přibližně se 45%, 50%,
70%, 80%, 95%, 98% nebo dokonce 99% identitou (výhodně s identitou 80 až 99 %) se sekvencí nukleové kyseliny nebo aminokyselinovou sekvencí totožné velikosti, nebo když jsou srovnávány se sekvencí, kdy porovnání se provádí počítačovým programem pro vyhledávání homologie, jak je to v oboru známo, nebo jejichž kódující nukleová kyselina je schopna hybridizovat s komplementem sekvence kódující výše uvedené proteiny v podmínkách vysoké, mírné nebo nízké stringence (viz např. Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOFS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993 a níže). Příkladem programu Gap program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI) s použitím standardního „předvoleného“ nastavení, který používá algoritmus Smitha a Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482-489, zahrnut formou odkazu v předkládané přihlášce).
Termíny homologní sekvence nukleové kyseliny nebo homologní sekvence aminokyselin nebo jejich variace se týkají sekvencí charakterizovaných homologií na úrovni nukleotidové sekvence nebo na úrovni aminokyselin, jak bylo již popsáno výše. Homologní nukleotidové sek45 vence jsou sekvence kódující izoformy BAFF-R polypeptidu. Izoformy mohou být exprimovány v různých tkáních stejného organismu například jako výsledek alternativního sestřihu RNA. Jinak izoformy mohou být kódovány různými geny, V předkládaném vynálezu, homologní nukleotidové sekvence zahrnují nukleotidové sekvence kódující BAFF-R polypeptid jakéhokoliv biologického druhu s výjimkou člověka, včetně, bez omezení, savce, tedy např. myši, laboratorního pot50 kana, králíka, psa, kočky, krávy, koně a dalších organismů. Homologní nukleotidová sekvence také zahrnuje, bez omezení, přirozeně se vyskytující alelické variace a mutace nukleotidová sekvence uveden v předkládané přihlášce. Homologní nukleotidová sekvence však nezahrnuje nukleotidové sekvence kódující humánní BAFF-R protein. Homologní sekvence nukleových kyselin zahrnují ty sekvence nukleové kyseliny, které kódují konzervativní substituce aminokyse55 lin (viz dolů) v obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5), a také polypeptidy mající BAFF-R aktivitu. Homolog- 11 CZ 299161 B6 ní aminokyselinové sekvence nekódují aminokyselinové sekvence humánního BAFF-R polypeptidu.
Nukleotidová sekvence stanovená na základě klonování humánního genu BAFF-R umožňuje vytvoření sond a příměrů určených pro použití při identifikaci a/nebo klonování BAFF-R homologů v jiném buněčném typu, např. z jiné tkáně, a také BAFF-R homologů z jiných savců. Sonda/primer typicky obsahuje v podstatě purifikovaný oligonukleotid. Oligonukleotid typicky obsahuje úsek nukleotidové sekvence, který hybridizuje ve stringentních podmínkách s se souvislým úsekem po sobě následujících alespoň přibližně 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ío nebo 400 nukleotidů kterékoliv „sense“ sekvence ze sekvenci na obr. 1A (SEKV. ID. C. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) nebo „anti-sense“ nukleotidová sekvence ze sekvenci na obr. 1A (SEKV. ID. C. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a 3 (SEKV. ID. Č. 6) nebo přirozeně se vyskytující mutantou kterékoliv sekvence na obr. 1A (SEKV. ID. C. 1), obr. B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6).
Sondy založené na nukleotidové sekvenci humánního BAFF-R mohou být použity k detekování transkriptů nebo genomových sekvencí kódujících stejné nebo homologní proteiny. V různém provedení vynálezu sondy dále obsahují značící skupiny (značky, markéry) k nim navázané, např. značící skupina může být radioizotop, fluorescenční sloučenina, enzym nebo kofaktor enzymu. Takové sondy mohou být použity jako část diagnostické testovací soupravy (kitu) pro identifikaci buněk nebo tkání, které chybně exprimují BAFF-R protein, jako například k měření hladiny nukleových kyselin kódujících BAFF-R ve vzorku buněk od pacienta, např. při detekci hladiny BAFF-R mRNA, nebo při určování toho, zda genomový BAFF-R gen byl mutován nebo odstraněn.
Polypeptid mající biologicky účinný úsek BAFF-R SE týká polypeptidu, který vykazuje aktivitu podobnou, ale nikoliv nutně totožnou, s aktivitou polypeptidu podle předkládaného vynále30 zu, včetně zralých forem, jak je měřeno v konkrétním biologickém testu, se závislostí na dávce nebo bez. Fragment nukleové kyseliny kódující biologicky účinný úsek BAFF-R může být připraven tak, že se izoluje část kterékoliv ze sekvencí na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6), které kódují polypeptid mající BAFF-R biologickou aktivitu (biologická účinnost nebo aktivi35 ta, termíny jsou užívány zaměnitelně, BAFF-R proteinů je vysvětlena a popsána dále) exprimuje se kódovaná část BAFF-R proteinu (např. rekombinantní expresí in vitro) a vyhodnotí se aktivita kódované části BAFF-R. Například fragment nukleové kyseliny kódující biologicky účinnou část BAFF-R může volitelně zahrnovat BAFF vazebnou doménu. V dalších provedeních fragment nukleové kyseliny kódující biologicky účinnou část BAFF-R zahrnuje jeden úsek nebo více úse40 ků.
Varianty BAFF-R
Vynález dále zahrnuje molekuly nukleové kyseliny, které se liší od nukleotidových sekvencí uvedených na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a 3 (SEKV. ID. Č. 6) kvůli degeneraci genetického kódu. Tyto nukleové kyseliny tedy kódují stejný BAFF-R protein jako je protein, který je kódován nukleotidovou sekvenci uvedenou na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr 2C (SEKV. ID. Cč. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. č. 6). V dalším provedení izolovaná mole50 kula nukleové kyseliny podle vynálezu má nukleotidovou sekvenci kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2D (SEKV. ID. č. 5).
Kromě humánní BAFF-R nukleotidové sekvence uvedené na kterémkoliv z obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. C. 6), bude oborníkovi zřejmé, že v populaci (např. v lidské populaci) mohou existo- 12CZ 299161 B6 vat DNA sekvenční polymorfismy, které vedou ke změnám v aminokyselinové sekvenci BAFFR. Takový genetický polymorfizmus v BAFF-R genu může existovat mezi jednotlivci v populaci kvůli přírodní alelické variaci. Termíny gen a rekombinantní gen, jak se v předkládané přihlášce používají, se týkají molekul nukleové kyseliny obsahujících otevřený čtecí rámec kódu5 jící BAFF-R protein, výhodně savčí BAFF-R protein. Takové přirozené alelické variace mohou typicky vést k 1 až 5% rozdílnosti v nukleotidové sekvenci BAFF-R genu. Kterákoliv z těchto variací a současně všechny takové nukleotidové variace a také výsledné aminokyselinové polymorfismy v BAFF-R, který jsou výsledkem přirozené alelické variace a které nemění funkční aktivitu BAFF-R, spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu.
Navíc molekuly nukleových kyselin kódující BAFF-R proteiny jiného biologického druhu, tj. mající také nukleotidové sekvence odlišné od humánní sekvence uvedené na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. C. 6), jsou také zahrnuty do rozsahu vynálezu. Molekuly nukleových kyselin odpoví15 dajících přirozeným alelickým variantám a homologům BAFF-R cDNA podle vynálezu mohou být izolovány na základě jejich homologie s humánní nukleovou kyselinou BAFF-R popsanou v předkládané přihlášce s použitím humánní cDNA nebo její část jakožto hybridizační sondy standardním postupem hybridizace ve stringentních hybridizačních podmínkách. Tak například cDNA pro rozpustný humánní BAFF-R může být izolována na základě její homologie s DNA pro humánní BAFF-R vázaný na membráně. Podobně, cDNA pro humánní BAFF-R vázaný v membráně může být izolován na základě její homologie s rozpustným humánním BAFF-R.
V souladu s tím v dalším provedení, izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je dlouhá alespoň 6 nukleotidů a hybridizuje ve stringentních podmínkách s molekulou nukleové kyseliny obsahující kteroukoliv z nukleotidových sekvencí na obr. 1A (SEKV. ID. C. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6). V dalším provedení je nukleová kyselina podle vynálezu dlouhá alespoň 10, 25, 50, 100, 250 nebo 500 nukleotidů. V dalším provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu hybridizuje k kódujícím úsekem. Termín hybridizuje ve stringentních podmínkách, jak se v předkládané přihlášce používá, popisuje podmínky pro hybridizaci a promývání, kdy nukleotidové sekvence s alespoň 60% homologií typicky zůstávají navzájem hybridizované.
Homology (tj., nukleové kyseliny kódující BAFF-R proteiny pocházející z jiných biologických druhů než člověka) nebo jiné příbuzné sekvence (např. paralogy) mohou být získány hybridizaci v podmínkách s nízkou, mírnou nebo vysokou stringencí, s celou nebo částí konkrétní humánní sekvence jakožto sondou při použití způsobů pro hybridizaci nukleových kyselin a klonování, které jsou odborníkům dobře známy.
Termín stringentní hybridizační podmínky nebo přísné hybridizační podmínky, jak se v před40 kládané přihlášce používají, se týkají podmínek, ve kterých je sonda, primer nebo oligonukleotid hybridizován s cílovou sekvencí, avšak s žádnou jinou sekvencí. Stringentní podmínky jsou závislé na sekvenci a budou různé za různých okolností. Delší sekvence hybridizují specificky při vyšších teplotách než kratší sekvence. Obecně se stringentní podmínky vybírají tak, že teplota je přibližně o 5 °C nižší než je teplota tání (Tm) pro specifickou sekvenci při definované iontové síle a pH. Tm je teplota (při definované iontové síle, pH a koncentraci nukleové kyseliny), ve které 50 % sondy komplementární k cílové sekvence hybridizuje s cílovou sekvencí v rovnováze. Protože cílová sekvence je obecně přítomna v nadbytku, při Tm je 50 % sond obsazeno v rovnováhu. Typicky, stringentní podmínky jsou takové, že koncentrace soli je nižší než přibližně l,0M sodíkových iontů, typicky přibližně 0,01 až l,0M sodíkových iontů (nebo jiné soli) při pH 7,0 až
8,3 a teplota je alespoň přibližně 30 °C pro krátké sondy, příměry nebo oligonukleotidy (např.
nt až 50 nt) a alespoň přibližně 60 °C pro delší sondy, příměry a oligonukleotidy. Stringentní podmínky mohou také být dosaženy přidáním destabilizujícího činidla, jako například formamidu.
- 13CZ 299161 B6
Stringentní podmínky jsou odborníkům dobře známy a lze je běžně najit popsané v CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6,3,1-6,3,6. Výhodné podmínky jsou takové, kdy sekvence s alespoň přibližně 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % nebo 99 % vzájemnou homologií zůstávají navzájem hybridizovány. Příkla5 dem, který však není omezující, přísných hybridizačních podmínek neboli podmínek (vysoce) stringentních je hybridizace v pufru s vysokým obsahem solí, a sice v pufru obsahujícím 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA a 500 mg/ml denaturované DNA lososího spermatu, při 65 °C. Tato hybridizace je následována jedním nebo více promytími v 0,2X SSC, 0,01% BSA, při 50 °C. Izolovaná molekula nukleově kyseliny podle ío vynálezu, která hybridizuje ve stringentních podmínkách se sekvenci SEKV. ID. C. 1, SEK.V. ID. Č. 2, SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6 odpovídá přirozeně se vyskytující molekule nukleově kyseliny. Termín přirozeně se vyskytující molekula nukleově kyseliny, jak se v předkládané přihlášce používá, se týká RNA nebo DNA molekuly mající nukleotidovou sekvenci, které se vyskytuje v přírodě (např. kóduje přírodní, tj. přirozeně se vyskytující protein).
Druhé provedení vynálezu poskytuje sekvence nukleově kyseliny, která jsou v podmínkách střední (mírné) stringence hybridizovatelné s molekulou nukleově kyseliny obsahující kteroukoliv z nukleotidových sekvencí na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a 3 (SEKV. ID. Č. 6), nebo jejich fragmenty, analo20 gy nebo deriváty. Neomezujícím příklad takových podmínek s mírnou stringencí je hybridizace v pufru obsahujícím 6X SSC, 5X Denhardtův roztok, 0,5% SDS a 100 mg/ml denaturované DNA lososího spermatu, při 55 °C, následovaná jedním nebo více promytími v IX SSC, 0,1 % SDS při 37 °C. Jiné středně (mírně) stringentní podmínky jsou odborníkům dobře známy a jsou popsány např. v základních příručkách Ausubel et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1993; and Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY, 1990.
Třetí provedení vynálezu poskytuje nukleově kyseliny, které jsou v podmínkách nízkou (slabou) stringenci hybridizovatelné s molekulou nukleově kyseliny obsahující kteroukoliv nukleotidovou sekvenci ze sekvencí na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 2B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6), nebo jejich fragmenty, analogy nebo deriváty. Neomezujícím příkladem podmínek s nízkou stringencí je hybridizace v pufru obsahujícím 35 % formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02 % PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 mg/ml denaturované DNA lososího spermatu, 10% (hmot.) dextransulfátu při 40 °C, následovaná jedním nebo více promytími ve 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA a 0,1 % SDS, při 50 °C. Další podmínky nízké stringence, které mohou být použity, jsou odborníkům dobře známy (např. se užívají při mezidruhové hybridizaci). Viz např. Ausubel et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1993; and Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY
MANUAL, Stockton Press, NY, 1990; Shilo and Weinberg (1981) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 6789-6792.
Konzervativní mutace
Navíc k přirozeně se vyskytujícím alelickým variantám BAFF-R sekvence, které mohou existovat v populaci, je odborníkovi známo, že další změny mohou být zavedeny mutací do nukleotidové sekvence uvedené na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4), obr. 3 (SEKV. ID. C. 6), což umožní změnit aminokyselinovou sekvenci kódovaného BAFF-R proteinu, aniž by se změnila funkční schopnost BAFF-R proteinu. Například nukleotidové substituce vedoucí k sub50 stituce aminokyselin v tzv. neesenciálních aminokyselinových zbytcích mohou být provedeny v kterékoliv ze sekvencí na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. C. 6). Neesenciální aminokyselinový zbytek je zbytek, který může být změněn na odlišný ve srovnání se sekvencí BAFF-R divokého typu, aniž by se změnila biologická aktivita, zatímco esenciální aminokyselinový zbytek je nutný pro biologickou aktivitu. Například lze předvídat,
-14CZ 299161 B6 že aminokyselinové zbytky, které jsou konzervativní (tj. jsou zachovány u všech srovnávaných sekvencí) pro BAFF-R proteiny podle předkládaného vynálezu, nejsou vhodné pro záměny.
Kromě toho, aminokyselinové zbytky, které jsou konzervativní v celé rodině BAFF-R proteinů podle předkládaného vynálezu, také nejsou příhodné k provádění záměn. Například BAFF-R proteiny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat alespoň jednu doménu, která je typicky konzervativním úsekem v rodině TNF proteinů. Tyto konzervativní domény (úseky) rozhodně nejsou předurčené k tomu být mutovány. Nicméně jiné aminokyselinové zbytky (např. ty, které nejsou konzervativní nebojsou semi-konzervativní v rámci rodiny BAFF-R proteinů) nemusejí být esenciální pro aktivitu a tak mohou být případně změněny (mutovány).
Další aspekt vynálezu se týká molekul nukleových kyselin kódujících BAFF-R proteiny, které obsahují změny aminokyselinových zbytků, který nejsou esenciální (podstatné) pro aktivitu. Takové BAFF-R proteiny se liší v aminokyselinové sekvenci od sekvence uvedené na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5), avšak udržují si biologickou aktivitu. V jednom provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein, kde protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci alespoň přibližně s 45% homologií s aminokyselinovou sekvenci na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5). Výhodně, protein kódovaný molekulou nukleové kyseliny je alespoň přibližně ze 60 % homologní se sekvencí na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5), výhodněji alespoň při20 bližně ze 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % a nejvýhodněji alespoň přibližně z 99 % homologní se sekvencí uvedenou na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5).
Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující BAFF-R protein homologní k proteinu uvedenému na obr. 2D může být připravena tak, že se vnese jedna nebo více nukleotidových substitucí, mutací nebo delecí do nukleotidová sekvence na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. C. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6), a to takových, že se do kódovaného proteinu vnese jedna nebo více substitucí, adicí a nebo delecí aminokyselin.
Mutace mohou být vneseny do sekvencí uvedených na obr. 2A (SEKV. ID. C. 3), obr. 2C (SEKV. ID. C. 4) nebo obr. 3 (SEKV. ID. C. 6), například známými standardními postupy, jako například místně cílenou mutagenezí a PCR-zprostředkovanou metagenezí. Výhodně se provádějí konzervativní substituce aminokyselin v jednom nebo více predikovaných neesenciálních aminokyselinových zbytcích. Konzervativní aminokyselina substituce je taková substituce, kdy aminokyselinový zbytek je nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem majícím podobný post35 ranní řetězec. Rodiny aminokyselinových zbytků (aminokyselin) majících podobný postranní řetězce byly v oboru definovány a jsou odborníkům známy. Tyto rodiny zahrnují aminokyseliny s bazickým postranním řetězcem (např. lysin, arginin, histidin), kyselým postranním řetězcem (např. asparagová kyselina, glutamová kyselina), s nenabitým polárním postranním řetězcem (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), s nepolárním postranním řetězcem (např. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), betarozvětveným postranním řetězcem (např. threonin, valin, izoleucin) a aromatickým postranním řetězcem (např. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Takže predikované neesenciální aminokyselinový zbytek v BAFF-R je nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem z rodiny se stejným postranním řetězcem. Alternativně v jiném provedení mohou být vneseny mutace náhodně do celé nebo části kódující sekvence BAFF-R, například tzv. saturaění mutagenezí, a vzniklé mutanty se pak podrobí screeningu na BAFF-R biologickou aktivitu, čímž se identifikují mutanty, které si udržely aktivitu. Následně po mutagenezí kterékoliv ze sekvencí na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6), kódovaný protein může být exprimován jakoukoliv odborníkovi známou rekombinantní technologií a pak může být stanovena aktivita proteinu.
V jednom provedení, mutantní BAFF-R protein může být testován (1) na schopnost vytvářet protein: protein interakce s jinými BAFF-R proteiny, jiným proteiny na buněčném povrchu, nebo biologicky účinnými částmi těchto proteinů, (2) na vytváření komplexů mezi mutantním
BAFF-R proteinem a BAFF-R ligandem, (3) na schopnost mutantního BAFF-R proteinu vázat
-15CZ 299161 B6 se na intracelulámí cílový protein nebo jeho biologicky účinnou část (např. avidin proteiny), (4) na schopnost vázat BAFF nebo (5) na schopnost specificky vázat protilátku proti BAFF-R proteinu.
Vynález dále poskytuje specifické mutanty kódující BAFF-R:Fc polypeptid, zkonstruované s cílem zmírnit agregaci exprimovaného proteinu a přitom udržet vazebnou aktivitu pro BAFF. Takové mutanty zahrnují například klony kódující aminokyselinové sekvence JST661 (SEKV. ID. Č. 17), JST662 (SEKV. ID. Č. 18), JST663 (SEKV. ID. Č. 19), JST673 (SEKV. ID. Č. 20), JST674 (SEKV. ID. Č. 21), JST675 (SEKV. ID. Č. 22), JST672 (SEKV. ID. Č. 23), JST676 ío (SEKV. ID. Č. 24), JST671 (SEKV. ID. Č. 25), JST677 (SEKV. ID. Č. 26) a JST678 (SEKV. ID. C. 27). Jiná provedení zahrnují mutanty kódující BAFF-R nebo BAFF-R:Fc polypeptid, který má podobné agregační vlastnosti jako nativní humánní BAFF-R nebo BAFF-R:Fc polypeptid, ale také vážou BAFF, jsou to například sekvence obsahující aminokyselinové sekvence JST659 (SEKV. ID. Č. 15), JST660 (SEKV. ID. Č. 16), JST664 (SEKV. ID. Č. 28), JST668 (SEKV. ID.
Č. 29), JST665 (SEKV. ID. Č. 30), JST666 (SEKV. ID. Č. 31) a JST667 (SEKV. ID. Č. 32). Jiná provedení zahrnují mutanty kódující BAFF-R nebo BAFF-R:Fc polypeptid, kde konzervativní aminokyseliny v humánním a myším BAFF-R jsou zaměněny za jiné konzervativní aminokyseliny a kde vazebná aktivita BAFF-R nebo BAFF-R:Fc polypeptidů k BAFF je zachována. V jiném provedení mutanty kódují BAFF-R nebo BAFF-R:Fc polypeptidy mající aminokyseli20 ny, které nejsou konzervativní pro humánní a myší BAFF-R a které byly změněny na jiné aminokyseliny. Výhodně je alespoň jedna nepolární aminokyselina změněna na prolinový zbytek nebo na nenabitou polární aminokyselinu.
Antisense nukleová kyselina
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolovaných molekul antisense nukleové kyseliny, které jsou hybridizovatelné nebo komplementární s molekulou nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obr. 2A, C, 3 nebo jejich fragmentů, analogů nebo derivátů. Antisense nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k sense nukleové kyselině kódující protein, např. je komplementární ke kódujícímu vláknu z dvojvláknové cDNA molekuly neboje komplementární k mRNA sekvenci. Specifické aspekty vynálezu se týkají molekul antisense nukleových kyselin, které zahrnují sekvence komplementární k úseku alespoň přibližně 10, 25, 50, 100, 250 nebo 500 nukleotidů nebo celému BAFF-R kódujícímu vláknu nebo jen k jeho části. Dále jsou poskytnuty molekuly nukleové kyseliny kódu35 jící fragmenty, homology, deriváty a analogy BAFF-R proteinu mající kteroukoliv ze sekvencí na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4), obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) nebo antisense nukleové kyseliny komplementární k BAFF-R nukleové kyselině s kteroukoliv sekvencí na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6).
V jednom provedení je molekula antisense nukleové kyseliny je antisense ke kódujícímu úseku kódujícího vlákna nukleotidové sekvence kódující BAFF-R. Termín kódující úsek se týká úseku nukleotidové sekvence obsahující kodony, které jsou translatovány do aminokyselinových zbytků (např. úsek kódující humánní protein BAFF-R odpovídá nukleotidům 13 až 568 v sekvenci na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3) nebo nukleotidům 13 až 565 na obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) nebo nukleotidům 298 až 849 na obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6)). V dalším provedení molekula antisense nukleové kyseliny je antisense k nekódujícímu úseku kódujícího vlákna nukleotidové sekvence kódující BAFF-R. Termín nekódující úsek se týká sekvencí na 5' a 3' koncích, které lemují kódující úsek a které nejsou translatovány do aminokyselin (takzvané 5' a 3' netranslatované úseky).
Vzhledem k popsaným kódujícím sekvencím vlákna kódujícího BAFF-R, antisense nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být konstruovány podle pravidel Watson a Crickova párování nebo Hoogsteenova párování bází. Molekula antisense nukleové kyseliny může být komplementární k celému kódujícímu úseku BAFF-R mRNA, ale výhodnější je pouze oligonukleotid, který je antisense sekvencí k části kódujícího nebo nekódujícího úseku BAFF-R mRNA. Například
-16CZ 299161 B6 antisense oligonukleotid může být komplementární k úseku obklopujícímu počátek translace BAFF-R mRNA. Antisense oligonukleotid může být velikosti například přibližně 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 nebo 50 nukleotidů. Antisense nukleová kyselina podle vynálezu může být konstruována s využitím chemické syntézy nebo reakce enzymatické ligace, jak jsou v oboru zná5 my. Například antisense nukleová kyselina (např. antisense oligonukleotid) může být chemicky syntetizován s použitím přirozeně se vyskytujících nukleotidů nebo různě modifikovaných nukleotidů navržených s cílem zvýšit biologickou stabilitu molekul nebo zvýšit fyzikální stabilitu duplexu vytvořeného mezi antisense a sense nukleovou kyselinou, jako jsou např. fosforothioátové deriváty a akridinem substituované nukleotidy.
Příklady modifikovaných nukleotidů, které mohou být použity k přípravě antisense nukleových kyselin zahrnují: 5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5-chloruracil, 5-joduracil, hypoxanthin, xantin, 4acetylcytosin, 5-(karboxyhydroxymethyl) uráčil, 5-karboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5karboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktosylqueosin, inozin, N6-iso15 pentenyladenin, 1-methylguanin, 1-methylinosin, 2,2-dimethylguanin, 2-methyladenin, 2methylguanin, 3-methylcytosin, 5-methylcytosin, N6-adenin, 7-methylguanin, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosin, 5'-methoxykarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenin, uracil-5-oxyoctová kyselina (v), wybutoxosin, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosin, 5-methyl-2-thiouracil, 220 thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, methylester uracil-5-oxyoctové kyseliny, uracil-5oxyoctová kyselina (v), 5-methyl-2-thiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboxypropyl)uracil, (acp3)w a 2,6-diaminopurin. Alternativně mohou být antisense nukleové kyseliny připraveny biologickým způsobem s použitím expresního vektoru, do kterého je nukleová kyselina subklonována v antisense orientaci (tj. RNA transkribovaná z vložené nukleové kyseliny bude v anti25 sense orientaci vzhledem k požadované cílové nukleové kyselině, jak bude popsáno dále v následující sekci).
Molekuly antisense nukleové kyseliny podle vynálezu jsou typicky podávány pacientovi nebo vytvářeny in sítu, takže hybridizují nebo se váží na buněčnou mRNA a/nebo genomovou DNA kódující BAFF-R protein, a tím inhibují expresi proteinu, např. tím, že inhibují transkripci a/nebo translaci. Hybridizace může být na principu obvyklé nukleotidové komplementarity za vzniku stabilního duplexu, nebo například v případě molekuly antisense nukleové kyseliny, který se váže na DNA duplex, zprostředkována specifickou interakcí v hlavní rýze dvojšroubovice. Příkladem způsobu podávání molekuly antisense nukleové kyseliny podle vynálezu je primy vstřik místa ve tkáni. Alternativně mohou být molekuly antisense nukleové kyseliny modifikovány, aby cílily na vybrané buňky, a pak mohou být podávány systémově. Například pro systémové podávání antisense molekuly mohou být modifikovány tak, že se specificky vážou k receptorům nebo antigenům exprimovaným na povrchu vybraných buněk, např. ták, že se spojí molekuly antisense nukleové kyseliny s peptidy nebo protilátkami, které se vážou na receptory nebo antige40 ny na buněčném povrchu. Molekuly antisense nukleové kyseliny mohou také být dopraveny k buňkám s použitím vektorů popsaných v předkládané přihlášce. Pro dosažení dostatečných intracelulámích koncentrací antisense molekul se vektorový konstrukt, ve kterém je vložena molekula antisense nukleové kyseliny, výhodně umisťují pod kontrolu silného promotoru pól II nebo pól III.
V ještě dalším provedení molekula antisense nukleové kyseliny podle vynálezu je a-anomemí molekula nukleové kyseliny. A-anomemí molekula nukleové kyseliny vytváří specifické dvojřetězcové hybridy s komplementární RNA, kde na rozdíl od obvyklých b-jednotek vlákna probíhají navzájem paralelně (Gaultier et al. (1987) Nud. Acids Res. 15: 6 625-6 641). Molekula antisense nukleové kyseliny může také obsahovat 2'-O-methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nud. Acids Res. 15: 6 131-6 148) nebo chimérický RNA-DNA analog (Inoue et al. (1987) FEBSLett. 215: 327-330).
- 17CZ 299161 B6
Ribozymy a PNA skupiny
V ještě dalším provedení vynálezu je antisense nukleová kyselina podle vynálezu ribozym. Ribozymy jsou katalytické RNA molekuly s ribonukleázovou aktivitou, které jsou schopné štěpit jednořetězcovou nukleovou kyselinu, jako je například mRNA, k níž mají komplementární úsek. Takže ribozymy (např. tzv. „hammerhead“ ribozymy, popsané v Haselhoff and Gerlach (1988) Nátuře 334: 585-591) mohou být použity ke katalytickému štěpení BAFF-R mRNA transkriptů a tím k inhibici translace BAFF-R mRNA. Ribozymy mající specifitu k BAFF-R-kódující nukleové kyselině mohou být zkonstruovány na základě nukleotidové sekvence BAFF-R DNA popsané v předkládané přihlášce (tj. SEKV. ID. Č. 3, SEKV. ID. Č. 4, SEKV. ID. Č. 6). Tak například může být konstruován derivát L-19 IVS RNA z '['etrahymena, ve kterém je nukleotidová sekvence aktivního místa komplementární k nukleotidové sekvenci, která má být štěpena v BAFF-R-kódující mRNA (viz, např. Cech et al. Patent US 4 987 071 a Cech et al. Patent US 5 116 742). Alternativně, BAFF-R mRNA může být užita pro selekci katalytické RNA mající specifickou ribonukleázovou aktivitu z poolo RNA molekuly (viz, např. Bartel et al., (1993) Science 261: 1 411-1 418.).
Alternativně exprese BAFF-R genu může být inhibována tím, že se zacílí nukleotidová sekvence komplementární k regulačnímu úsek BAFF-R (např. BAFF-R promotor a/nebo zesilovač) za vzniku trojšroubovicové struktury, která pak zabraňuje transkripci BAFF-R genu v cílových buňkách. Viz obecně Helene (1991) Anticancer Drug Dev. 6: 569-84, Helene et al. (1992) Ann. N. Y Acad. Sci. 660: 27-36 a Maher (1992) Bioassays 14: 807-15.
V dalším provedení mohou nukleové kyseliny BAFF-R být modifikovány ve skupinách bází, cukru nebo fosfátové kostry, aby se zlepšila např. stabilita, hybridizace nebo rozpustnost molekuly. Například deoxyribózofosfátová páteř nukleové kyseliny může být modifikována a vytvářet tak peptidovou nukleovou kyselinu (viz Hyrup et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4: 5-23). Termín peptidová nukleová kyselina neboli PNA, jak se v předkládané přihlášce používá, se týká „napodobenin“ („mimics“) nukleových kyselin, např. DNA „napodobenin“, kde deoxy30 ribózofosfátová páteř je nahrazena pseudopeptidovou páteří a jsou zachovány jen čtyři přírodní nukleobáze. Bylo ukázáno, že neutrální páteř PNA umožňuje specifickou hybridizaci k DNA a RNA za podmínek nízké iontové síly. Syntéza PNA oligomerů může být prováděna užitím standardních protokolů syntézy peptidů na pevné fázi, jak byla popsána v Hyrup et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4: 5-23, Perry-O'Keefe et al. (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:
14 670-675.
PNA pro BAFF-R může být použita v terapeutických a diagnostických aplikacích. Například PNA může být použita jako antisense nebo antigenní činidlo pro sekvenčně specifickou modulaci genové exprese, např. pro indukci zástavy transkripce nebo translace nebo inhibici replikace.
PNA pro BAFF-R může být také použita např. pro analýzu jednonukleotidových mutací v genu, např. tzv. PNA řízeným PCR „sevřením“, jako umělý restrikční enzym v kombinaci s jinými enzymy, např. SI nukleázou (Hyrup B. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4: 5-23) nebo jako sondy nebo příměry pro DNA sekvencování a hybridizaci (Hyrup et al. (1996), Bioorg Med. Chem. 4: 5-23, Perry-O'Keefe (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 14 670-675).
V dalším provedení, PNA pro BAFF-R může být modifikována, např. zesílením její stability nebo buněčného příjmu, a to tím, že se k PNA připojí lipofilní nebo jiné pomocné skupiny, vytvoří se PNA-DNA chiméry nebo se použijí lipozomy nebo jiné způsoby aplikace léčiv, které jsou odborníkům známy. Tak například mohou být vytvořeny PNA-DNA chiméry BAFF-R, které slučují výhodné vlastnosti PNA a DNA. Takové chiméry umožňují enzymům rozpoznávajícím DNA, jako jsou např. Rnáza H a DNA polymerázy, interagovat s DNA částí, zatímco PNA část by poskytovala vysokou vazebnou afinitu a specifitu. PNA-DNA chiméry mohou být spojeny pomocí linkeru (spojovacího elementu) vhodné délky, vybraného s ohledem na shlukování bází, počet vazeb mezi nukleobazemi a orientaci (Hyrup (1996) Bioorg. Med. Client. 4: 5-23).
Syntéza PNA-DNA chimér může být prováděna jak bylo popsáno v Hyrup (1996) Bioorg. Med.
-18CZ 299161 B6
Chem. 4: 5-23 a Finn et al. (1996) Nucal. Acids Res. 24: 3 57-63. Například DNA řetězec může být syntetizován na pevná fáze s použitím standardní fosforamiditové kondenzační chemie, a modifikovaný nukleosidový analog, jako je např. 5'-(4-methoxytrityl)amino-5'-deoxy-thymidinfosforamidit, může být použit mezi PNA a 5 ' koncem DNA (Mag et al. (1989) Nud. Acids
Res. 17. 5973-88). PNA monomery jsou pak kondenzovány postupným způsobem za vzniku chimérické molekulu s 5' PNA segment a 3' DNA segmentem (Finna et al. (1996) výše). Alternativně chimérické molekuly mohou být syntetizovány s 5' DNA segmentem a 3' PNA segmentem, viz Petersen et al. (1975) Bioorg. Med. Chem. Lett. 5:1 119-11 124.
ίο V jiném provedení oligonukleotid může obsahovat jiné navázané skupiny jako například peptidy (např. pro cílení či směrování na hostitelské buněčné receptory in vivo) nebo činidla usnadňující transport přes buněčnou membránu (viz např. Letsinger et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556, Lemaitre et al. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 648-652, PCT Publikace č. WO 88/09810/) nebo hematoencefalickou bariéru (viz, např. PCT Publikace č.
WO 89/10134/). Kromě toho oligonukleotid může být modifikován s hybridizací spouštěnými štěpícími činidly (viz např. Krol et al., (1988) BioTechniques 6: 958-976) nebo interkalačními činidly (viz, např. Zon, (1988) Pharm. Res. 5: 539-549). Pro tento účel oligonukleotid může být kondenzován na jinou molekulu, např. peptid, hybridizací spouštěné zesíťující činidlo, transportní činidlo, hybridizací spouštěné štěpící činidlo atd.
BAFF-R polypeptidy
Jeden aspekt vynálezu se týká izolovaných BAFF-R proteinů ajejich biologicky účinných částí, derivátů, fragmentů, analogů nebo homologů. Také se týká polypeptidových fragmentů vhodných pro použití jako imunogenů pro vyvolání produkce (produkci) anti-BAFF-R protilátek. V jednom provedení nativní BAFF-R proteiny mohou být izolovány z buněk nebo zdrojových tkání vhodnou purifikací podle standardního postupu proteinové purifikace. V dalším provedení jsou BAFF-R proteiny připravovány technikou rekombinantní. Alternativně k rekombinantní expresí BAFF-R protein nebo polypeptid může být syntetizován chemicky standardními postupy syntézy peptidů.
Termín izolovaný nebo „purifikovaný“ (zaměnitelný s termínem čistý) protein nebo jeho biologicky účinná (zaměnitelně s termínem „aktivní“) část je protein v podstatě bez buněčných složek nebo jiných kontaminujících proteinů buňky nebo tkáňového zdroje, ze kterého BAFF-R protein pochází, nebo v podstatě bez chemických prekurzorů nebo ostatních chemikálií, když je chemicky syntetizován. Slovní spojení v podstatě bez buněčných složek zahrnuje preparáty BAFF-R proteinu, ve kterých je protein oddělen od buněčné složky buněk, ze kteiých pochází, neboje připraven rekombinantně. V jednom provedení slovní spojení v podstatě bez buněčných složek zahrnuje preparáty BAFF-R proteinu, které obsahují méně než přibližně 30 % (suchá hmotnost) proteinů (zde zvaných kontaminující proteiny), jiných než BAFF-R, výhodněji méně než přibližně 20 % a ještě výhodněji méně než přibližně 10 %, a nejvýhodněji méně než přibližně 5 % proteinu jiného než BAFF-R. Když je BAFF-R protein nebo jeho biologicky účinná část produkován rekombinantně, je také výhodně v podstatě bez kultivačního média, tj., kultivační médium reprezentuje méně než přibližně 20 %, výhodněji méně než přibližně 10 % a nej45 výhodněji méně než přibližně 5 % objemu proteinového preparátu.
Slovní spojení v podstatě bez chemických prekurzorů nebo ostatních chemikálií zahrnuje preparáty BAFF-R proteinu, kde je protein oddělen od chemických prekurzorů nebo ostatních chemikálií, které se účastní syntézy proteinu. V jednom provedení vynálezu slovní spojení v podstatě bez chemických prekurzorů nebo jiných chemikáliích zahrnuje preparáty BAFF-R proteinu mající méně než přibližně 30 % (suchá hmotnost) chemických prekurzorů nebo chemických sloučenin jiných než BAFF-R, výhodněji méně než přibližně 20 %, ještě výhodněji méně než přibližně 10 % a nejvýhodněji méně než přibližně 5 % chemických prekurzorů nebo chemických sloučenin jiných než BAFF-R.
- 19CZ 299161 B6
Biologicky aktivní (účinná) část BAFF-R proteinu zahrnuje peptidy obsahující aminokyselinové sekvence dostatečně homologní nebo přímo pocházející z aminokyselinové sekvence BAFF-R proteinu, např. aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. C. 5, které obsahují méně aminokyseliny než kompletní BAFF-R protein a projevují alespoň jednu aktivitu BAFF-R pro5 teinu. Typicky biologicky aktivní část zahrnuje doménu nebo motiv s alespoň jednoho aktivitou BAFF-R proteinu. Biologicky aktivní část BAFF-R proteinu může být polypeptid, který je dlouhý například 10, 25, 50, 100 nebo více aminokyselin.
Biologicky aktivní část BAFF-R proteinu podle předkládaného vynálezu může obsahovat ales10 poň jednu z výše identifikovaných domén, které jsou konzervativní v rodině BAFF-R proteinů. Alternativně biologicky aktivní část BAFF-R proteinu může obsahovat alespoň dvě z výše identifikovaných domén. Další biologicky aktivní část BAFF-R proteinu může obsahovat alespoň tři z výše identifikovaných domén. Ještě další biologicky aktivní část BAFF-R proteinu podle předkládaného vynálezu může obsahovat alespoň čtyři z výše identifikovaných domén.
Navíc jiné biologicky aktivní části, ve kterých jsou deletovány jiné úseky proteinu, mohou být připraveny rekombinantními technikami a pak hodnoceny na jednu nebo více funkčních aktivit nativního BAFF-R proteinu.
V jednom provedení BAFF-R protein má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5). V jiném provedení je BAFF-R protein v podstatě homologní se sekvencí uvedenou na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5) a udržuje si funkční aktivitu proteinu uvedeného na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5), přičemž se liší v aminokyselinové sekvenci kvůli přírodní alelické variaci nebo mutagenezi, jak bude podrobněji popsáno níže. V souladu s tím v dalším vynálezu je protein
BAFF-R protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci alespoň přibližně ze 45 % homologní s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 2D (SEKV. ID. C. 5) a udržuje si funkční aktivitu BAFF-R proteinu na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5).
V některých provedeních vynález zahrnuje specifické mutanty BAFF-R:Fc polypeptidu zkon30 struované proto, aby se snížila agregace exprimovaného proteinu a přitom se zachovala BAFF vazebná aktivita. Takové mutanty zahrnují například klony kódující aminokyselinové sekvence JST661 (SEKV. ID. Č. 17), JST662 (SEKV. ID. Č. 18), JST663 (SEKV. ID. Č. 19), JST673 (SEKV. ID. Č. 20), JST674 (SEKV. ID. Č. 21), JST675 (SEKV. ID. Č. 22), JST672 (SEKV. ID. Č. 23), JST676 (SEKV. ID. Č. 24), JST671 (SEKV. ID. Č. 25), JST677 (SEKV. ID. Č. 26) a JST678 (SEKV. ID. Č. 27). Jiná provedení zahrnují mutanty kódující BAFF-R nebo BAFFR:Fc polypeptidy, které mají podobné agregační charakteristiky jako nativní humánní BAFF-R nebo BAFF-R:Fc polypeptid, ale také vážou BAFF, jako například sekvence obsahující aminokyselinové sekvence JST659 (SEKV. ID. Č. 15), JST660 (SEKV. ID. Č. 16), JST664 (SEKV. ID. Č. 28), JST668 (SEKV. ID. Č. 29), JST665 (SEKV. ID. Č. 30), JST666 (SEKV. ID. Č. 31) a JST667 (SEKV. ID. Č. 32). Jiná provedení zahrnují mutanty kódující BAFF-R nebo BAFFR:Fc polypeptid, kde konzervativní aminokyseliny v humánním a myším BAFF-R jsou zaměněny za jiné konzervativní aminokyseliny a kde vazebná aktivita BAFF-R nebo BAFF-R:Fc polypeptidu k BAFF je zachována. V jiném provedení mutanty kódují BAFF-R nebo BAFFR:Fc polypeptidy mající aminokyseliny, které nejsou konzervativní pro humánní a myší BAFF-R a které byly změněny na jiné aminokyseliny. Výhodně je alespoň jedna nepolární aminokyselina změněna na prolinový zbytek nebo na nenabitou polární aminokyselinu.
Stanovení homologie mezi dvěma nebo více sekvencemi
Pro stanovení procentní homologie dvou aminokyselinových sekvencí nebo dvou sekvencí nukleových kyselin jsou sekvence přiřazeny („aligned“) pro dosažení optimálního srovnání (např. pro optimální přiřazení s druhou sekvencí aminokyselin nebo nukleotidovou sekvencí mohou být zavedeny mezery v první sekvenci aminokyselin nebo sekvenci nukleové kyseliny). Aminokyselinové zbytky nebo nukleotidy v odpovídající poloze aminokyseliny nebo nukleotid jsou pak srovnávány. Když je poloha v první sekvence obsazena stejným aminokyselinovým zbytkem
-20CZ 299161 B6 nebo nukleotidem jako odpovídající poloha v druhé sekvenci, pak jsou molekuly homologní dané poloze (tj. homologie aminokyseliny nebo nukleotidu, jak se v tomto popisu užívá, je ekvivalentní identitě aminokyselin nebo nukleotidů).
Sekvenční homologie nukleových kyselin může být určena jako míra identity mezi dvěma sekvencemi. Homologie může být určena pomocí počítačových programů, které jsou odborníkům známy, jako například software GAP, který je součásti programu GCG (viz Needleman a Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443^453). S použitím software GAP GCG s následujícím nastavením parametrů pro srovnávání sekvencí nukleových kyselin: záporné skóre za vytvoření ío mezery 5,0 a záporné skóre za extenzi mezery 0,3, kódující úseky analogických nukleových kyselin uvedené výše vykazují míru identity s kódujícími částmi (CDS) DNA sekvencí na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) výhodně alespoň %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % nebo 99 %.
Termín sekvenční identita se týká míry, v jaké jsou dvě polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence identické postupně jeden zbytek za druhým, po celém srovnávaném úseku. Termín procento sekvenční identity je vypočteno tak, že se srovnávají dvě optimálně přiřazené sekvence v úseku, který má být srovnán, určením počtu poloh, kde jsou identické báze nukleové kyseliny (např. T, C, G, U nebo I, v případě nukleové kyseliny) v obou sekvencích, čímž se určí počet shodných („matching“) poloh, který se dělí celkovým počtem poloh ve srovnávaném úseku (tzv. velikost okna) a výsledek se násobí 100, čímž se získá procento sekvenční identity. Termín v podstatě identická, jak se v předkládané přihlášce používá, označuje vlastnost polynukleotidové sekvence, kde polynukleotid obsahuje sekvenci, která má alespoň 80% sekvenční identitu výhodně alespoň 85%, a alespoň 90 až 95%, a obvykleji alespoň 99% sekvenční identitu pro srovnání s referenční sekvencí ve srovnávacím úseku.
Chimérické a fúzní proteiny
Vynález také poskytuje BAFF-R chimérické nebo fúzní proteiny. Termín BAFF-R chimérický protein nebo fúzní protein, jak se v předkládané přihlášce používá, označuje BAFF-R polypeptid operativně spojený s polypeptidem jiným než je BAFF-R polypeptid. Termín BAFF-R polypeptid se týká polypeptidu majícího aminokyselinovou sekvenci odpovídající BAFF-R, zatímco polypeptid jiný než BAFF-R se týká polypeptidu majícího aminokyselinovou sekvenci odpovídající proteinu, který není v podstatě homologní s BAFF-R proteinem, např. proteinu, který je odlišný od BAFF-R proteinu a který je pochází ze stejného nebo z odlišného organismu. V BAFF-R fúzním proteinu BAFF-R polypeptid může odpovídat celému nebo jen části BAFFR protein. V jednom provedení BAFF-R fúzní protein obsahuje alespoň jednu biologicky aktivní část BAFF-R proteinu. V dalším provedení BAFF-R fúzní protein obsahuje alespoň dvě biologicky aktivní části BAFF-R proteinu. V ještě dalším provedení BAFF-R fúzní protein obsahuje alespoň tři biologicky aktivní části BAFF-R proteinu. Ve fúzním protein termín operativně spojený znamená, že BAFF-R polypeptid a polypeptid jiný než BAFF-R jsou k sobě fúzovány ve shodném čtecím rámci. Polypeptid jiný než BAFF-R může být fúzován na N-konec nebo Ckonec BAFF-R polypeptidu. Polypeptid jiný než BAFF-R může být například Fc část (fragment) protilátky. Ten může být operativně navázán buďto na N-konec, nebo C-konec BAFF-R poly45 peptidu. Fúze (fúzní proteiny) „Fc-cílový protein“ byly popsány v Fou et al. (1998) Protein Engineering 11: 495-500 a Patentech US 5 541 087 a US 5 726 044, jejichž obsah je v předkládané přihlášce zahrnut formou odkazu.
Například v jednom provedení BAFF-R fúzní protein obsahuje BAFF-R doménu operativně spojenou s extracelulámí doménou druhého proteinu. Takový fúzní protein může být dále použit ve screeningových testech pro sloučeniny, které modulují BAFF-R aktivitu (takové testy jsou popsány podrobně níže). V ještě dalším provedení fúzní protein je fúzní protein „GST-BAFFR“, ve kterém BAFF-R sekvence je fúzována s C-koncem sekvence GST (tj. glutathion-Stransferázy). Takový fúzní protein může usnadnit purifikaci rekombinantního BAFF-R.
-21 CZ 299161 B6
V dalším provedení fúzní protein je BAFF-R protein obsahující heterologní signální sekvenci na svém N-konci. Protože BAFF-R neobsahuje svou vlastní signální sekvenci, pro účinnou sekreci BAFF-R fúzního proteinu musí být heterologní signální sekvence fúzována na 5'-konec BAFFR kódující sekvence. Exprese a/nebo sekrece BAFF-R může být zvýšena tím, že se použijí různé heterologní signální sekvence.
V ještě dalším provedení vynálezu je fúzní protein fúze „BAFF-R-Imunoglobulin“, kde BAFFR sekvence obsahující jednu nebo více domén jsou fúzovány se sekvencemi pocházejícími z proteinu rodiny imunoglobulinů. Fúzní proteiny „BAFF-R-imunoglobulin“ podle vynálezu mohou být formulovány do farmaceutického přípravku a podávány pacientovi pro inhibici interakce mezi BAFF-R ligandem a BAFF-R proteinem na povrchu buňky, aby se tím potlačila BAFF-Rzprostředkovaná signální transdukce in vivo. Fúzní proteiny BAFF-R-Imunoglobulin mohou být použity k ovlivnění biologické dostupnosti ligandů rozpoznávaných BAFF-R. Inhibice interakce BAFF-R ligand/BAFF-R může být použitelná terapeuticky jak pro léčba proliferativních a dife15 renciačních patologických stavů, tak i k modulaci (např. stimulaci nebo inhibici) buněčné přežívání. Navíc BAFF-R-Imunoglobulin fúzní proteiny podle vynálezu mohou být použity jak imunogeny pro vyvolání a produkci anti-BAFF-R protilátek u pacientů, pro purifikaci BAFF-R ligandů a také ve screeningových testech na rozpoznání molekul, které inhibují interakci BAFFR s BAFF R ligandem.
BAFF-R chimérické nebo fúzní proteiny podle vynálezu mohou být připraveny metodami standardní rekombinantní DNA. Například DNA fragmenty kódující různé polypeptidové sekvence se spolu ligují ve shodném čtecím rámci, standardními postupy odborníkovi známými, např. tak, že se využijí „tupé“ nebo „ostré“ konce pro ligace, štěpení restrikčními enzymy poskytne vhodné konce pro doplnění kohezivních konců, pokud je to třeba, ošetření alkalickou fosfatázou umožní zabránit nežádoucímu spojení, a pak následuje enzymatická ligace. V dalším provedení fúzní gen může být syntetizován obvyklými technikami včetně automatizované syntézy DNA. Alternativně může být provedena PCR amplifikace genových fragmentů s použitím kotvových primerů, které umožní připravit komplementární přesahy mezi dvěma po sobě jdoucími genovými fragmenty, které mohou být následně komplementárně spojeny a reamplifikovány, čímž se připraví celá sekvence chimérického genu (viz například Ausubel et al. Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOFECUFAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Navíc jsou komerčně dostupné mnohé expresní vektory, které už kódují fúzní skupinu (např. GST polypeptid). BAFF-R-kódující nukleová kyselina může být pak klonována do takového expresního vektoru, kde je fúzní skupina spojena ve shodném čtecím rámci s BAFF-R proteinem.
Ve výhodném provedení vynálezu je poskytnuta nukleová kyselina pro BAFF-R fúzi (SEKV. ID. Č. 11) a její aminokyselinová sekvence uvedená na obr. 9. (SEKV. ID. Č. 12).
Agonisté a antagonisté BAFF—R
Předkládaný vynález se také týká variant BAFF-R proteinů, které působí buďto jako BAFF-R agonisté (mimetika), nebo jako BAFF-R antagonisté. Varianty BAFF-R proteinu mohou být připraveny mutagenezí, např. bodovou mutací nebo zkrácením BAFF-R proteinu. Agonista
BAFF-R proteinu si může udržet v podstatě stejnou aktivitu nebo podmnožinu biologických aktivit přirozeně se vyskytující formy BAFF-R proteinu. Antagonista BAFF-R proteinu může inhibovat jednu nebo více aktivit přirozeně se vyskytující formy BAFF-R proteinu, například se může kompetitivně vázat „po směru“ nebo „v protisměru“ na jiný člen buněčné signální kaskády, která zahrnuje BAFF-R protein. Takže specifický biologický účinek může být vyvolán působe50 ním varianty s omezenou funkcí. V jednom provedení vynálezu léčení pacienta podáváním varianty, která si uchovala podmnožinu biologických účinků přirozeně se vyskytující formy proteinu, má méně vedlejších účinků na pacienta ve srovnání s léčením podáváním přirozeně se vyskytující formy BAFF-R proteinu.
-22CZ 299161 B6
Varianty BAFF-R proteinu, které účinkují buďto jako BAFF-R agonisté (mimetika), nebo jako BAFF-R antagonisté, mohou být identifikovány screeningem kombinanční knihovny mutant, např. zkrácených mutant BAFF-R proteinu, na vyhledávání agonistické nebo antagonistické aktivita BAFF-R proteinu. V jednom provedení vynálezu je rozmanitá knihovna BAFF-R variant vytvořena kombinační mutagenezí nukleových kyselin a je kódována rozmanitou genovou knihovnou. Rozmanitá knihovna BAFF-R variant může být vytvořena například enzymatickou ligací směsi syntetických oligonukleotidů do genových sekvencí, takže je pak exprimován degenerovaný soubor potenciálních BAFF-R sekvencí jakožto individuální polypeptidy, nebo alternativně jako soubor větších fúzních proteinů (např. při expresi na fágu, tzv. fágový displej) obsahu10 jících soubor BAFF-R sekvencí. Existuje celá řada metod, které mohou být použity pro přípravu knihovny potenciálních BAFF-R variant z degenerované oligonukleotidové sekvence. Chemická syntéza degenerované genové sekvence může být provedena pomocí automatického syntetizátoru DNA a syntetický gen je pak ligován do vhodného expresního vektoru. Použití degenerovaného souboru genů umožňuje získání, a sice v jedné směsi, všech sekvencí kódujících požadovaný soubor potenciálních BAFF-R sekvencí. Metody pro syntézu degenerovaných oligonukleotidů jsou odborníkům známy (viz např. Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1977) Science 198: 1056-1063; lke et al. (1983) Nud. Acids Res. 11: 477-488.)
Polypeptidové knihovny
Kromě toho mohou být připraveny knihovny sekvencí kódujících fragmenty BAFF-R proteinu pro přípravu rozmanité populace BAFF-R fragmentů pro screening a následnou selekci variant BAFF-R proteinu. V jednom provedení vynálezu může být připravena knihovna sekvencí kódu25 jících fragmenty tím, že se dvoj vláknové PCR sekvence kódující fragmenty BAFF-R ošetří nukleázou v podmínkách, kdy se vytvoří zlomy, a to pouze jeden na molekulu, pak se dvojvláknová DNA denaturuje, pak renaturuje DNA za vzniku dvojvláknové DNA, která může obsahovat sense/antisense páry z různě „zlomených“ produktů, pak se odstraní jednovláknové části z nově vytvořených duplexů působením SI nukleázy a výsledná knihovna fragmentů se liguje do expres30 ního vektoru. Tímto způsob se získá expresní knihovna, která kóduje N-koncové a vnitřní fragmenty různých velikostí z BAFF-R proteinu.
Je známa celá řada metod pro screening genových produktů z kombinačních knihoven připravených bodovými mutacemi nebo zkrácením genu, a také pro screening cDNA knihoven na genové produkty mající vybrané vlastnosti. Takové techniky jsou adaptovatelné pro rychlý screening genových knihoven připravených kombinanční mutagenezí BAFF-R proteinů. Nejužívanějšími postupy, které jsou vhodné pro vysokovýkonové analýzy, pro screening velkých genových knihoven typicky zahrnují klonování genové knihovny do replikovatelného expresního vektoru, transformaci vhodných buněk výslednou knihovnou vektorů a expresi kombinačních genů v podmín40 kách, kde detekce požadované aktivity umožní izolaci vektoru kódujícího gen, jehož produkt byl detekován. Opakovaná souborná mutageneze (REM), nová technická, která zvyšuje frekvenci funkčních mutant v knihovnách, může být použita v kombinaci se screeningovými testy na rozpoznání BAFF-R variant (Arkin a Yourvan (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7 811— 7 815, Delgrave et aL (1993) Protein Engineering 6: 327-331).
Protilátky anti-BAFF-R
Izolovaný BAFF-R protein nebo jeho část nebo fragment může být použit jako imunogen pro vyvolání tvorby protilátek, které vážou BAFF-R, a sice s využitím standardních postupů přípravy polyklonálních a monoklonálních protilátek. Může být použit kompletní BAFF-R protein nebo antigenní peptidové fragmenty BAFF-R pro použití jak imunogeny, které poskytuje předkládaný vynález. Antigenní peptid BAFF-R podle vynálezu obsahuje alespoň 8 aminokyselinových zbytků z aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5) a zahrnuje takový epitop BAFF-R, že protilátka produkovaná proti peptidu vytváří specifický imunitní komplex s BAFF55 R. Výhodně antigenní peptid obsahuje alespoň 10 aminokyselinových zbytků, výhodněji alespoň
-23 CZ 299161 B6 aminokyselinových zbytků, ještě výhodněji alespoň 20 aminokyselinových zbytků a nejvýhodněji alespoň 30 aminokyselinových zbytků. Výhodné epitopy obsažené v antigenním peptidu jsou úseky BAFF-R, které jsou lokalizovány na povrch proteinu, např. hydrofilní úseky.
Jak bylo již popsáno v předkládané přihlášce, BAFF-R protein mající sekvenci uvedenou na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5) nebo jeho deriváty, fragmenty, analogy nebo homology mohou být použity jak imunogeny pro vyvolání tvorby protilátek, které imunospecificky vážou tyto proteinové komponenty. Termín protilátka, jak se v předkládané přihlášce používá, se týká imunoglobulinové molekuly a imunologicky účinné části imunoglobulinové molekul, tj. molekuly, ío která obsahuje vazebné místo pro antigen, které specificky váže (imunoreaguje) antigen, jako například BAFF-R. Takové protilátky zahrnují, ale bez omezení, polyklonální, monoklonální, chimérické a jednořetězcové protilátky, a protilátkové fragmenty Fab a F(ab')2, a také Fab expresní knihovnu. Ve specifickém provedení jsou připraveny protilátky proti humánnímu BAFF-R proteinu. Různé postupy, které jsou odborníkům známy, mohou být použity pro produkci poly15 klonálních nebo monoklonálních protilátek proti proteinu BAFF-R se sekvencí na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5) nebo jeho derivátu, fragmentu, analogu nebo homologu. Některé z těchto proteinů budou popsány dále.
Pro produkci polyklonálních protilátek jsou různá vhodná hostitelská zvířata (např. králík, koza, myš nebo jiný savec) imunizována injekcí s nativním proteinem nebo jeho syntetickou variantou nebo derivátem. Vhodný imunogenní preparát může obsahovat například rekombinantně exprimovaný BAFF-R protein nebo chemicky syntetizovaný BAFF-R polypeptid. Preparát může dále obsahovat adjuvans. Různá adjuvancia zesilující imunologickou reakci zahrnují, ale bez omezení, Freundovo (úplné nebo neúplné) adjuvans, minerální gely (např. hydroxid hlinitý), povrchově účinné látky (např. lysolecitin, polyoly pluronic, polyanionty, peptidy, olejové emulze, dinitrofenol apod.), humánní adjuvancia jako například bacil Calmette-Guerinův (BCG) a Corynebacterium parvum nebo podobná imunostimulační činidla. Je-li to žádoucí, molekuly protilátky proti BAFF-R mohou být izolovány ze savce (např. z krve) a dále puntíkovány známými technikami, jako například proteinovou chromatografií za zisku IgG (imunoglobulinové) frakce.
Termíny monoklonální protilátka nebo preparát monoklonální protilátky, jak se v předkládané přihlášce používají, se týkají populace protilátkových molekul, které obsahují jen jeden druh vazebného místa pro antigen schopného imunoreakce s konkrétním epitopem BAFF-R. Preparát monoklonální protilátky tak typicky vykazuje jednoduchou vazebnou afinitu pro konkrétní
BAFF-R protein, se kterým imunoreaguje. Pro přípravu monoklonálních protilátek proti BAFFR proteinu nebo jeho derivátům, fragmentům, analogům nebo homologům, lze využít jakoukoliv techniku, která umožňuje produkci protilátkových molekul v kontinuální buněčné linii. Techniky přípravy humánních protilátek zahrnují, ale bez omezení, hybridomovou techniku (viz Kohler & Milstein, (1975) Nátuře 256: 495-497), triomovou techniku, techniku hybridomů humánních B lymfocytů (viz Kozbor et al. (1983) Imunol. Today 4: 72) a techniku EBV hybridomů, humánní monoklonální protilátky (viz Cole, et al. v MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, lne., 1985, pp. 77-96). Humánní monoklonální protilátky mohou být použity při realizaci předkládaného vynálezu a mohou být připraveny s použitím humánních hybridomů (viz Cote et al. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2 026-2 030) nebo tak, že se transformují humánní B lymfocyty in vitro virem Epstein-Barrové (viz Cole et al. v MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, lne., 1985 pp. 77-96).
Podle vynálezu mohou být různé techniky přizpůsobeny k produkci jednořetězcových protilátek specifických pro k BAFF-R protein (viz např. Patent US 4 946 778). Kromě toho metody mohou být přizpůsobeny ke konstrukci Fab expresní knihovny (viz např. Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281), která umožňuje rychlou a účinnou identifikaci Fab fragmentů monoklonální protilátky s požadovanou specifítou pro BAFF-R protein nebo jeho deriváty, fragmenty, analogy nebo homology. Protilátky jiného než lidského původu mohou být humanizovány technikami, které jsou odborníkům dobře známy, viz např. Patent US 5 225 539. Protilátkové fragmenty, které obsahují idiotypy BAFF-R proteinu, mohou být vytvořeny technikami odborníkovi známý-24CZ 299161 B6 mi, včetně, avšak bez omezení: (i) F(ab')2 fragmenty se připraví pepsinovým štěpením molekula protilátky, (ii) Fab fragment vzniká redukcí disulfidických můstků F(ab')2 fragmentu, (iii) Fab fragment vzniká po ošetření protilátkové molekuly papainem a redukčním agens a (iv) Fv fragmenty.
Dále rekombinantní anti-BAFF-R protilátky, jako například chimérické a humanizované monoklonální protilátky, obsahující jak humánní části tak i části jiného než lidského původu, které můžou být připraveny s použitím standardních technik rekombinantní DNA, spadají do rozsahu vynálezu. Takové chimérické a humanizované monoklonální protilátky mohou být připraveny technikami rekombinantní DNA známými v oboru, například s použitím metody popsaný v PCT mezinárodní přihlášce PCT/US86/02269, Evropské patentové přihlášce 184,187, Evropské patentová přihlášce 171,496, Evropská patentové přihlášce 173,494, publikované PCT mezinárodní přihlášce č. WO 86/01 533/, Patentu US 4 816 567, Evropské patentové přihlášce 125,023, a dalších publikacích: Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043, Liu et al. (1987) Proč. Nati. Acad.
Sci. USA 84: 3439-3443, Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526, Sun et al. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 214-218, Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47: 999-1005, Wood et al. (1985) Nátuře 314: 446^149, Shaw et al. (1988) J. Nati. Caracer Inst. 80: 1553-1559), Morrison (1985) Science 229: 1202-1207, Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214, Patent US 5 225 539, Jones et al. (1986) Nátuře 321: 552-525, Verhoeyan et al. (1988) Science 239:
1 534 aBeidleretal.(1988) J. Immu7101. 141:4 053-4 060.
V jednom provedení vynálezu způsoby screeningu protilátek, které mají požadovanou specifitu, zahrnují, ale bez omezení, test ELISA a další imunologicky zprostředkované techniky, které jsou odborníkům známy. Ve specifickém provedení vynálezu je selekce protilátek, které jsou speci25 fické ke konkrétní doméně BAFF-R proteinu, umožněna vytvořením hybridomů, které se vážou k fragmentu BAFF-R proteinu obsahujícímu takovou doménu. Protilátky, které jsou specifické pro jednu nebo více domény v BAFF-R proteinu, např. domény zahrnující výše identifikované konzervativní úseky BAFF-R proteinové rodiny nebo jejich deriváty, fragmenty, analogy nebo homology, jsou také poskytnuty.
Anti-BAFF-R protilátky mohou být použity v metodách, které jsou odborníkům známy, a které se týkají lokalizace a/nebo kvantifikace BAFF-R proteinu (např. měření hladiny BAFF-R proteinu ve vhodném fyziologickém vzorku, diagnostické metody, pro zobrazení proteinu apod.).
V daném provedení protilátky proti BAFF-R proteinu nebo její deriváty, fragmenty, analogy nebo homology, které obsahují vazebnou doménu pocházející z protilátka, jsou použity jak farmakologicky účinné sloučeniny (a dále v tomto textu zvány léčiva).
Anti-BAFF-R protilátka (např. monoklonální protilátka) může být použit pro izolaci BAFF-R standardním postupem, jako je například afinitní chromatografie nebo imunoprecipitace. anti40 BAFF R protilátka může usnadnit purifikaci přírodního BAFF—R z buněk a rekombinantně vytvořeného BAFF-R exprimovaného v hostitelských buňkách. Navíc, anti-BAFF-R protilátka může být použita k detekci BAFF-R proteinu (např. v buněčném lyzátu nebo buněčném supematantu) pro stanovení množství a profilu exprese BAFF-R proteinu. Anti-BAFF-R protilátky mohou být použity diagnosticky pro sledování hladiny proteinu v tkáni jako část klinického testu, např. pro určení účinnosti daného léčebného režimu. Detekce může být usnadněna kondenzací (tj. fyzickým spojením) protilátky s detekovatelnou látkou. Příklady detekovatelných látek zahrnují různé enzymy, prostetické skupiny, fluorescenční látky, luminiscenční látky, bioluminescenční látky a radioaktivní látky. Příklady vhodných enzymů zahrnují křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, (β-galaktozidázu nebo acetylcholinesterázu, příklady vhodných komplexů prostetic50 kých skupin zahrnují streptavidin/biotin a avidin/biotin, příklady vhodných fluorescenčních látek zahrnují umbelliferon, fluorescein, isothiokyanát fluoresceinu, rhodamin, dichlortriazinylamin fluoresceinu, dansylchlorid nebo fýkoerythrin, příklad luminiscenčních látek zahrnuje luminol, příklady bioluminescenčních látek zahrnují luciferázu, luciferin a aequorin, a konečně příklady vhodných radioaktivních látek zahrnují 125I, I131,35S a 3H.
-25CZ 299161 B6
Rekombinantní expresní vektory BAFF-R a hostitelské buňky
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká vektorů, výhodně expresních vektorů, obsahujících nukleovou kyselinu kódující BAFF-R protein nebo jeho deriváty, fragmenty, analogy nebo homology. Termín vektor, jak se v předkládané přihlášce používá, se týká molekuly nukleové kyseliny schopné transportovat další nukleovou kyselinu, se kterou byl spojen. Jeden typ vektoru je plazmid, což je cirkulámí dvojvláknová DNA klička, do kterého mohou být ligovány další DNA segmenty. Dalším typem vektoru je virový vektor, kde další DNA segmenty mohou být ligovány do virového genomu. Některé vektory jsou schopné autonomní replikace v hostitelské buňce, do které byly zavedeny (např. bakteriální vektory mající bakteriální replikační počátek a episomální savčí vektory). Jiné vektory (např. neepisomální savčí vektory) se po vnesení do buňky integrují do genomu hostitelské buňky a proto jsou kopírovaný spolu s hostitelským genomem. Navíc některé vektory jsou schopné regulovat expresi genu, se kterým jsou operativně spojeny. Takový vektory jsou nazývány k v předkládané přihlášce expresní vektory. Obecně jsou expresní vektory používané v technikách rekombinantní DNA často ve formě plazmidů. Takže v předkládaném popisu jsou termíny plazmid a vektor užívány zaměnitelně, neboť plazmid je nejrozšířenější používaná forma vektoru. Nicméně vynález zahrnuje i jiné formy expresních vektorů, jako například virové vektory (např. replikačně defektní retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry), který poskytují shodné funkce.
Rekombinantní expresní vektory podle vynálezu obsahují nukleovou kyselinu podle vynálezu ve formě vhodné pro expresi nukleové kyseliny v hostitelské buňce, což znamená, že rekombinantní expresní vektory obsahují jednu nebo více regulačních sekvencí, vybraných podle hostitelské buňky zvolené pro expresi, přičemž tyto regulační sekvence jsou operativně spojeny se sekvencí nukleové kyseliny, která má být exprimována. V rekombinantním expresním vektoru termín operativně spojený znamená, že požadovaná nukleotidová sekvence je spojena s regulační sekvencí (nebo regulačními sekvencemi) takovým způsobem, který umožňuje expresi nukleotidové sekvence (např. v in vitro transkripčním/translačním systému nebo v hostitelské buňce po vnesení vektoru do hostitelské buňky). Termín regulační sekvence zahrnuje promotory, zesilovače ajiný element kontrolující expresi (expresní kontrolní prvky), jako je např. polyadenylační signál. Takové regulační sekvence byly popsány například v Goeddel Gene Expression Technology METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academie Press, San Diego, Calif., 1990. Regulační sekvence zahrnují takové, které regulují konstitutivní expresi nukleotidové sekvence v mnoha typech hostitelských buněk, i takové, které regulují exprese nukleotidové sekvence jen v určitých hostitelských buňkách (např. tkáňově specifické regulační sekvence). Odborníkovi je zřejmé, že výběr expresního vektoru může záviset na takových faktorech jako je volba hostitelské buňky, která má být transformována, požadovaná hladina exprese proteinu, apod. Expresní vektory podle vynálezu mohou být vneseny do hostitelských buněk, aby v nich produkovaly proteiny nebo peptidy, včetně fúzních proteinů nebo peptidu, které jsou kódovány nukleovými kyselinami, jak bylo popsáno výše v předkládané přihlášce (např. BAFF—R proteiny, mutantní formy BAFF—R, fúzní proteiny, apod.).
Rekombinantní expresní vektory podle vynálezu mohou být konstruovány pro expresi BAFF-R v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Například BAFF-R může být exprimován v bakteriálních buňkách jako například Escherichia coli, hmyzích buňkách (s použitím bakulovirových expresních vektorů), kvasinkách nebo savčích buňkách. Vhodné hostitelské buňky jsou popsány dále v publikaci Goeddel Gene Expression Technology METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academie Press, San Diego, Calif., 1990. Alternativně rekombinantní expresní vektor může být transkribován a translatován in vitro, například s použitím regulační sekvence T7 promotoru a T7 polymerázy.
Exprese proteinů v prokaryotech se nejčastěji provádí v E. coli s pomocí vektorů obsahujících konstitutivní nebo indukovatelný promotor regulující expresi buď fúzního, nebo nefúzního proteinu. Fúzní vektory přidávají několik aminokyselin k proteinu, který je v nich kódován, a to obvykle na aminokonec rekombinantního proteinu. Takový fúzní vektory má typicky tři účely:
-26CZ 299161 B6 (1) zvýšení exprese rekombinantního proteinu, (2) zvýšení rozpustnosti rekombinantního proteinu a (3) usnadnění purifikace rekombinantního proteinu tím, že působí jako ligand pro afinitní purifíkaci. Často je ve fúzním expresním vektoru vloženo proteolytické štěpné místo do místa spojení fúzované skupiny a rekombinantního proteinu, což umožní po purifíkaci fúzního proteinu oddělit rekombinantní protein od fúzní skupiny. Takové enzymy a jejich příslušné rozpoznávací sekvence, zahrnují faktor Xa, trombin a enterokinázu. Typické fúzní expresní vektory zahrnují pGEX (Pharmacia Biotech lne, Smith a Johnson (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) a pR!T5 (Pharmacia, Piscataway, N. J. ), které fúzují glutathion-Stransferázu (GST), E vazebný protein maltózy nebo A protein, daném pořadí, k cílovému rekomio binantnímu proteinu.
Příklady vhodných indukovatelných nefúzních expresních vektorů pro E. coli zahrnují pTrc (Amrami et al., (1988) Gerae 69: 301-315) a pETlld (Studier et al.,Gene Expression Technology METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academie Press, San Diego, Kalif, 1990, pp. 6015 89).
Jedna strategie, jak maximalizovat expresi rekombinantního proteinu v E. coli, je exprimovat protein v hostitelské bakterii s narušenou schopností proteolyticky štěpit rekombinantní protein (viz např. Gottesman, Gene Expression Technology METHODS 1N ENZYMOLOGY 185,
Academie Press, San Diego, Kalif., 1990, pp. 119-128). Další strategie je změnit sekvenci nukleové kyseliny, která má být vložena do expresního vektoru tak, že individuální kodony pro každou aminokyselinu jsou ty kodony, které jsou přednostně užívány E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2 111-2 118). Taková záměna sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu může být provedena standardním postupem DNA syntézy.
V dalším provedení je BAFF-R expresní vektor kvasinkový expresní vektor. Příklady vektorů pro expresi v kvasinkách (např. Saccharomyces cerivisae) zahrnují pYepSed (Baldari, et al., (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan a Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Kalif.) a pro kvasinku P. pastoris zahrnují rodinu vektorů pPIC (Invitrogen Corp, San Diego, Kalif.).
Alternativně BAFF-R může být exprimován v hmyzích buňkách s využitím bakulovirových expresních vektorů. Dostupné bakulovirové vektory pro expresi proteinů v kultivovaných hmyzích buňkách (např. SF9 buňky) zahrnují vektory série pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol.
3 : 2 1 56-2 1 65) a série pVL (Lucklow a Summers (1989) Virology 170: 31-39).
V ještě dalším provedení je nukleová kyselina podle vynálezu exprimována v savčích buňkách s použitím savčích expresních vektorů. Příklady savčích expresních vektorů zahrnují pCDM8 (Seed (1987) Nátuře 329: 840-842) a pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
Když jsou použity v savčích buňkách, kontrolní funkce expresního vektoru jsou často poskytovány virovými regulačním prvky. Například obecně používané promotory pocházející z polyomaviru, adenoviru 2, cytomegaloviru a SV 40.
Další vhodné expresní systémy jak pro prokaryotické, tak eukaryotické buňky byly popsány např.
v kapitolách 16 a 17, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2ND ED., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989.
V dalším provedení vynálezu je rekombinantní savčí expresní vektor schopný regulovat expresi nukleové kyseliny přednostně v určitém buněčném typu (např. jsou použity tkáňově-specifické regulační prvky pro expresi nukleové kyseliny). Tkáňově specifické regulační prvky jsou odborníkům známy. Neomezující příklady vhodných tkáňově specifických promotorů zahrnují albuminový promotor (specifický pro játra, Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoidně specifické promotory (Calame a Eaton (1988) Adv. Imunol. 43: 235-275), konkrétně promotory
T lymfocytových receptorů (Winoto a Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) a imunoglobulinů
-27CZ 299161 B6 (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740, Queen a Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronově specifick promotory (např. neurofilamentový promotor, Byme a Ruddle (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 5 473-5 477), promotory specifické pro pankreas (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916) a promotory specifické pro prsní žlázu (např. promotor mléčného proteinu, Patent
US 4 873 316 a Evropská patentová přihláška 264,166). Vývojově regulované promotory jsou také zahrnuty, např. myší hox promotory (Kessela a Gruss (1990) Science 249: 374-379) a promotor α-fetoproteinu (Campes a Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
Vynález dále poskytuje rekombinantní expresní vektor obsahující DNA molekulu podle vynálezu ío klonovanou do expresního vektoru v antisense orientaci. To znamená, že DNA molekula je operativně spojena s regulační sekvencí způsobem, který umožňuje expresi (transkripci z DNA molekuly) PNA molekuly, která je v antisense orientaci k BAFF-R mRNA. Regulační sekvence operativně spojené s nukleovou kyselinou klonovanou v antisense orientaci může být vybrána tak, že umožňuje kontinuální expresi antisense RNA molekuly v celé řadě buněčných typů, napří15 klad mohou být vybrány virové promotory a/nebo zesilovače nebo regulační sekvence, které regulují konstitutivní, tkáňově specifickou nebo buněčně specifickou expresi antisense RNA. Antisense expresní vektor může být ve formě rekombinantního plazmidu, fagemidu nebo oslabeného viru, kde je antisense nukleová kyselina produkována pod kontrolou vysoce účinného regulačního úseku, jehož aktivita může být určována buněčným typem, do kterého byl vektor vnesen.
Pro diskuzi o regulaci genové exprese s použitím antisense genů viz např. Weintraub et al. (1986) Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews Trends in Genetics 1(1).
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká hostitelských buněk, do kterých byl vnesen rekombinantní expresní vektor podle vynálezu. Termíny hostitelská buňka a rekombinantní hostitel25 ská buňka jsou používány v předkládané přihlášce zaměnitelně. Rozumí se, že tyto termíny se netýkají jen konkrétních buněk, ale také potomstva nebo potenciálního potomstva takové buňky nebo buněk. Protože se mohou v následujících generacích vyskytovat určité modifikace způsobené buďto mutací, nebo environmentálními vlivy, takové potomstvo nemusí být ve skutečnosti zcela totožné s původní, parentální buňkou, avšak přesto buňky dalších generací jsou zahrnuty v rozsahu termínu, jak se v předkládané přihlášce používá.
Hostitelská buňka může být jakákoli prokaryotická nebo eukaryotická buňka. Například BAFF-R protein může být exprimován v bakteriálních buňkách jako například v E. coli, hmyzích buňkách, kvasinkách nebo savčích buňkách (jako například v buňkách vaječníků čínského křečka (CHO) nebo COS buňkách). Další vhodné hostitelské buňky jsou odborníkům známy.
Vektorová DNA může být vnesena do prokaryotických nebo eukaryotických buněk prostřednictvím známých metod transformace nebo transfekce. Termíny transformace a transfekce, jak se v předkládané přihlášce používají, zahrnují celou řadu technik, jak přenést cizorodou nukleovou kyselinu (např. DNA) do hostitelské buňky, které jsou odborníkům známy, a zahrnují např. koprecipitaci s fosforečnanem vápenatým nebo chloridem vápenatým, DEAE-dextranem zprostředkovanou transfekci, lipofekci nebo elektroporaci. Vhodné metody pro transformaci nebo transfekci hostitelské buňky mohou být nalezeny v Sambrook et al. MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL 2ND ED., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) a jiných laboratorních příručkách.
O stabilní transfekci savčích buněk je známo, že v závislosti na použitém expresním vektoru a metodě transfekce, jen určitá malá frakce buněk může začlenit cizorodou DNA do svého genomu. Aby bylo možné identifikovat a selektovat tyto integranty (buňky s integrovanou cizorodou
DNA), společně s požadovaným genem se obvykle do hostitelských buněk vnáší gen, který kóduje vhodný selekční markér (např. gen rezistence k antibiotikům). Různé selekční markéry zahrnují např. geny rezistence k léčivu, jako například G418, hygromycinu a methotrexatu. Nukleová kyselina kódující selekční markér může být vnesena do hostitelské buňky ve stejném vektoru jako nukleová kyselina kódující BAFF-R nebo může být vnesena v odděleném vektoru.
Buňky trvale transfekované vnesenou nukleovou kyselinou mohou být identifikovány selekcí
-28CZ 299161 B6 pomocí léčiva (např. buňky, které obsahují vnesený gen pro selekční markér přežijí, zatímco ostatní buňky uhynou).
Hostitelská buňka podle vynálezu, jako například prokaryotická nebo eukaryotická hostitelská buňka v buněčné kultuře, mohou být použity k produkci (tj. expresi) BAFF-R proteinu. Takže vynález dále poskytuje způsoby produkce BAFF-R proteinu s použitím hostitelských buněk podle vynálezu. V jednom provedení vynálezu způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle vynálezu (do kterých byl vnesen rekombinantní expresní vektor kódující BAFF-R) ve vhodném médiu, kde se tvoří BAFF-R protein. V dalším provedení způsob dále obsahuje izolaci BAFF-R z média nebo hostitelských buněk.
Transgenní zvířata
Hostitelské buňky podle vynálezu mohou také být použity pro přípravu transgenních zvířat s výjimkou člověka. Například v jednom provedení vynálezu je hostitelská buňka podle vynálezu oplodněný oocyt nebo embryonální kmenová buňka, do které byla vložena sekvence kódující BAFF-R. Takové hostitelské buňky pak mohou být použity k vytvoření transgenních zvířat s výjimkou člověka, kde exogenním BAFF-R sekvence je vložena do jejich genomu, nebo homologní rekombinantní zvířata, kde je endogenní BAFF-R sekvence změněna. Taková zvířata jsou pak použitelná pro výzkum funkce a/nebo aktivity BAFF-R a pro identifikaci a/nebo hodnocení modulátorů BAFF-R aktivity. Termín „transgenní zvíře“, jak se v předkládané přihlášce používá, označuje zvíře s výjimkou člověka, výhodně savce, výhodněji hlodavce, jako je například laboratorní potkan nebo myš, kde jedna nebo více buněk zvířete obsahuje transgen. Jiné příklady transgenních zvířat zahrnují primáty s výjimkou člověka, ovce, psi, krávy, kozy, kuřata, obojživelníky apod. Transgenem se rozumí exogenní DNA, která je začleněna do genomu buňky, ze které se transgenní zvíře vyvíjí a který tudíž zůstane v genomu dospělého zvířete, a vede k expresi produktu kódovaného genem v jednom nebo více buněčných typech nebo tkáních transgenního zvířete. Termín homologní rekombinantní zvíře, jak se v předkládané přihlášce používá, je zvíře s výjimkou člověka, výhodně savec, výhodněji myš, kde endogenní BAFF-R gen je změ30 něn homologní rekombinací, ke které došlo mezi endogenním genem a exogenní DNA molekulou vnesenou do buňky zvířete, např. embryonální buňky zvířete, před vývojem zvířete.
Transgenní zvíře podle vynálezu může být vytvořeno tím, že se nukleová kyselina kódující BAFF-R vnese do samčího pronukleu oplodněného oocytu, např. microinjekcí nebo retrovirovou infekcí, a oocyt se ponechá dále vyvíjet v pseudopregnantní samici jakožto „náhradní“ matce. Humánní BAFF-R DNA sekvence na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4), obr. 3 (SEKV. ID. C. 6) mohou být takto vloženy jako transgen do genomu zvířete s výjimkou člověka. Alternativně non-humánní homolog humánního BAFF-R genu, jako například myší BAFF-R gen (obr. 4A) (SEKV. ID. Č. 8), může být izolován na základě hybridizace s humánní
BAFF-R cDNA (popsanou výše) a použít jako transgen. Intronové sekvence a polyadenylační signály mohou také být zahrnuty v transgenu pro zvýšení účinnosti exprese transgenu. Tkáňově specifické regulační sekvence mohou být operativně spojeny s BAFF-R transgenem pro řízení exprese BAFF-R proteinu v určitém typu buněk. Metody přípravy transgenních zvířat prostřednictvím zárodečné manipulace a microinjekce, zejména u zvířat jako jsou například myši, se staly obvyklými v oboru a jsou popsány např. Patentech US 4 736 866, US 870 009 a US 4 873 191 a v Hogan, MANIPULATING THE MOUŠE EMBRYO, Cold Spring Harbor Faboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986. Podobné metody jsou používány také pro přípravu jiných transgenních zvířat. Transgenní zakladatelské zvíře („founder snímal“) může být identifikováno na základě přítomnosti BAFF-R transgenu ve svém genomu a/nebo na základě exprese BAFF-R mRNA v tkáních nebo buňkách zvířete. Transgenní zakladatelské zvíře pak může být použito k chovu dalších generací zvířat nesoucích transgen. Navíc transgenní zvířata nesoucí transgen kódující BAFF-R mohou být dále křížena s jinými transgenními zvířaty nesoucími jiné transgeny.
-29CZ 299161 B6
Pro vytvoření homologního rekombinantního zvířete se připraví vektor, který obsahuje alespoň část BAFF-R genu, do kterého byla vnesena delece, adice nebo substituce, aby byl BAFF-R gen změněn, např. funkčně přerušen. BAFF-R gen může být humánní gen (např. gen uvedený na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4), obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6)), ale výhodněji je to homolog k humánnímu BAFF-R genu jiného než lidského původu. Například myší homolog (obr. 4a) humánního BAFF-R genu na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4), obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) může být použit pro konstrukci homologního rekombinantního vektoru vhodného pro vnesení změn do endogenního BAFF-R genu v myším genomu. V jednom provedení je vektor konstruován tak, aby po homologní rekombinaci byl endogenní BAFF-R gen funkčně přerušený (tj. již nekóduje funkční protein, proto je také nazýván „knock out“ vektor).
Alternativně vektor může být navržen tak, aby po homologní rekombinaci byl endogenní BAFFR gen mutován nebo jinak změněn, ale ještě kódoval funkční protein (např. „upstream“ regulační úsek může být změněn, čímž se změní exprese endogenního BAFF-R proteinu). V homologním rekombinačním vektoru je změněná část BAFF-R genu obklopena na svých 5' a 3' koncích další nukleovou kyselinou BAFF-R genu, aby byla umožněna homologní rekombinace mezi exogenním BAFF-R genem vneseným vektorem a endogenním BAFF-R genem v embryonální kmenové buňce. Tato dodatečná hraniční BAFF-R nukleová kyselina musí být dostatečně dlouhá, aby mohla proběhnou úspěšná homologní rekombinace s endogenním genem. Typicky je ve vektoru zahrnuto několik kilobází hraniční DNA (jak na 5' tak na 3' konci), viz např. popis homologních rekombinačních vektorů v Thomas et al. (1987) Cell 51: 503. Vektor se vnese do linie embryonálních kmenových buněk (např. elektroporací) a selektují se buňky, ve kterých BAFF-R gen homologně rekombinoval s endogenním BAFF-R genem (viz např. Fi et al. (1992) Cell 69: 915).
Vybrané buňky jsou pak injikovány do blastocysty zvířete (např. myši), čímž vznikne agregační chiméra, viz např. Bradley, TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: APRACTICAF APPROACH, Robertson, Ed. IRE, Oxford, 1987, pp. 113-152. Chimérické embryo může pak být implantováno do vhodné pseudopregnantní „pěstounské“ samice a zárodek donesen. Potomstvo zachovávající homologně rekombinovanou DNA ve svých zárodečných buň30 kách může být použito k chovu zvířat, ve kterých všechny buňky zvířete obsahují homologně rekombinovanou DNA, a sice transmisí transgenu zárodečnou linií. Metody konstrukce homologních rekombinačních vektorů a zvířata připravená homologní rekombinaci byly popsány např. v Bradley (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829, PCT mezinárodních přihláškách publikovaných jako WO 90/11354/, WO 91/01140/, WO 92/0968/ a WO 93/04169/.
V dalším provedení vynálezu mohou být vytvořena transgenní zvířata s výjimkou člověka, která obsahují vybrané systémy umožňující regulovat expresi transgenu. Jedním příkladem takového systému je cre/loxP rekombinázový systém z bakteriofága Pl. Pro popis cre/loxP rekombinázového systému viz, např. Fakso et al. (1992) Proč. Nati. Acad Sci. USA 89: 6 232-6 236. Dalším příkladem rekombinázového systému je FFP rekombinázový systém ze S. cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355. Jestliže cre/loxP rekombinázový systém je použit pro regulaci exprese transgenu, pak jsou třeba zvířata obsahující transgeny kódující jak Cre rekombinázu, tak i vybraný protein. Taková zvířata mohou být získána konstrukcí tzv. „dvojitě“ transgenních zvířat, např. tím, že se zkříží dvě transgenní zvířata, jedno obsahující transgen kódující vybraný protein a druhé obsahující transgen kódující rekombinázu.
Klony transgenních zvířat s výjimkou člověka popsané v předkládané přihlášce mohou také být vytvořeny postupem, který popsali Wilmut et al. (1997) Nátuře 385: 810-813. Ve stručnosti, buňka, např. somatická buňka, z transgenního zvířete může být izolována a indukována, aby vystoupila z růstového cyklu a vstoupila do fáze Go. Klidová buňka může pak být fúzována, např. použitím elektrických pulzů, s oocytem zbaveným jádra ze zvířete stejného druhu, ze kterého je izolována klidová buňka. Rekonstruovaný oocyt je pak pěstován, takže se vyvíjí na morulu nebo blastocyt a pak se přenese do pseudopregnantní pěstounské samice. Potomstvo této pěstounské samice bude klonem zvířete, ze kterého byla buňka, např. somatická buňka, izolována.
-30CZ 299161 B6
Farmaceutické přípravky
Molekuly nukleových kyselin BAFF-R, BAFF-R proteiny a anti-BAFF-R protilátky (také nazývané v předkládané přihlášce jako účinné sloučeniny) podle vynálezu a jejich deriváty, fragmenty, analogy a homology, mohou být použit jako složky farmaceutického přípravku vhodného k podávání. Takové přípravky typicky obsahují molekuly nukleové kyseliny, protein nebo protilátku, a farmaceuticky přijatelný nosič. Termín farmaceuticky přijatelný nosič, jak se v předkládané přihlášce používá, znamená jakákoliv rozpouštědla, disperzní média, povlaky, antibakteriální a protiplísňová činidla, izotonická a absorpci zpožďující činidla, apod., kompati10 bilní s farmaceutickým podáváním. Vhodné nosiče jsou popsány v posledním vydání Remingtonů Pharmaceutical Sciences, což je standardní referenční pro oblast, do které spadá vynález, aje proto zahrnut celý formou odkazu. Výhodné příklady nosičů nebo ředidla zahrnují, ale bez omezení, vodu, fyziologický roztok, Fingerův roztok, dextrózový roztok a 5% roztok humánního sérového albuminu. Lipozomy a nevodná vehikula jako například ztužené oleje mohou také být použity. Použití z takových médií a činidel pro farmaceuticky účinné látky je odborníkům dobře známo. S výjimkou toho, že by některé z tradičních médií nebo agens bylo neslučitelné s účinnou sloučeninou, lze předpokládat jejich užití v přípravku. Doplňkové účinné sloučeniny mohou také být přidány do přípravky.
Farmaceutický přípravek podle vynálezu je formulován tak, aby byl kompatibilní se zamýšleným způsobem podávání. Příklady způsobů podávání zahrnují parenterální, např. intravenózní, intradermální, subkutánní, perorální (např. inhalace), transdermální (topický), přes sliznici a rektální podávání. Roztoky nebo suspenze používané pro parenterální, intradermální nebo subkutánní aplikace obsahují následující složky: sterilní ředidlo jako například voda pro injekci, fyziologický roztok, stálé oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol nebo jiná syntetická rozpouštědla, antibakteriální činidla jako například benzylalkohol nebo methylparabeny, antioxidanty jako například askorbová kyselina nebo disiřičitan sodný, chelatační činidla jako například ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), pufry jako například acetátový, citrátový nebo fosfátový pufr a také činidla pro upravení tonicity, jako je například chlorid sodný nebo dextróza.
Hodnota pH může být upravena kyselinami nebo bází, jako například chlorovodíkovou kyselinou nebo hydroxidem sodným. Parenterální přípravek může být uzavřen v ampulkách, jednorázových injekčních stříkačkách nebo lahvičkách vyrobených ze skla nebo plastu obsahujících mnohonásobnou dávku.
Farmaceutické přípravky vhodné pro injekční použití obsahují sterilní vodný roztok (pokud jsou ve vodě rozpustné) nebo disperze a sterilní prášky pro přípravu sterilního roztoku nebo disperze pro injekci. Pro intravenózní podávání vhodné nosiče zahrnují fyziologický roztok, bakteriostatickou vodu, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N. J. ) nebo fyziologický roztok pufrovaný fosfáty (PBS). V každém případě přípravek musí být sterilní a měl by být tekutý v takové míře, aby byl snadno injikovatelný. Musí být stabilní v podmínkách výroby a uskladnění a musí být chráněn před kontaminujícím působením mikroorganismů jako například bakterií a hub. Nosič může být rozpouštědlo nebo disperzní médium obsahující například vodu, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol apod.) a jejích vhodné směsi. Správná tekutost může být udržována například použitím povlaků jako například lecitinu, udržováním požadované velikosti částic v případě disperze a použitím surfaktantů. Prevence účinku mikroorganismů může být dosažena různými antibakteriálními a protiplísňovými činidly, jako jsou například parabeny, chlorbutanol, fenol, askorbová kyselina, thimerosal, apod. V mnoha případech je výhodné, když přípravek obsahuje izotonizující činidla, například cukry, polyalkoholy jako například manitol, sorbitol, nebo chlorid sodný. Prodloužená absorpce injekcí podávaných přípravků může být způsobena zahrnutím do přípravku takového agens, který zpožďuje absorpci, například monostearátu aluminia a želatiny.
Sterilní roztoky pro injekci mohou být připraven tím, že se vnese účinná sloučenina (např. BAFF-R protein nebo anti-BAFF-R protilátka) v požadovaném množství do vhodného rozpouš55 tědla v kombinaci s jednou nebo více složkami uvedenými výše, v závislosti na požadavcích,
-31 CZ 299161 B6 a pak následuje sterilizace filtrováním. Obecně se disperze připravují tak, že se účinná sloučenina vnese do sterilního vehikula, které obsahuje bazické disperzní médium a případně jiné složky podle požadavků (vyjmenované výše). V případě sterilních prášků pro přípravu sterilního roztoku pro injekci se užívají metody jako vakuové sušení a lyofilizace, které poskytují prášek účinné složky plus kterýkoliv další požadované složky z roztoku, který byl před tím sterilizován filtrací.
Perorální přípravky obecně obsahují inertní ředidlo nebo jedlý nosič. Mohou být uzavřeny v želatinové tobolce nebo lisovány do tablet. Pro účely perorálního terapeutického podávání může být účinná sloučenina smíchána s excipienty a použita ve formě tablet, pastilek (dražé) nebo tobolek.
Perorální přípravky mohou také být připraveny s použitím tekutých nosičů pro použití jako ústní voda, kde sloučenina v tekutém nosiči je aplikována perorálně, kdy je vnesena do úst a vyplivnuta nebo spolknuta. Farmaceuticky kompatibilní pojidla a/nebo adjuvancia mohou být také součástí přípravku. Tablety, pilulky, tobolky, pastilky apod. mohou obsahovat kteroukoliv z následujících složek nebo sloučeniny podobné povahy: pojivá jako je například mikrokrystalická celulózu, tragantová guma nebo želatina, excipient jako je například škrob nebo laktóza, rozvolňující agens jako je například alginová kyselina, Primogel nebo kukuřičný škrob, lubrikant jako je například stearát horečnatý nebo Sterotes, glidant (kluzné činidlo) jako je například koloidní oxid křemičitý, sladidlo jako je například sacharóza nebo sacharín nebo aromatizační agens jako je například mentol, methylsalicylát nebo pomerančové aroma.
Pro podávání inhalací jsou sloučeniny podávány ve formě aerosolového spreje z tlakové nádobky nebo dávkovače, který obsahuje vhodný propelent, např. plyn, jako například oxid uhličitý, nebo nebulizátoru.
Systémové podávání může také být prováděno přes sliznici nebo transdermálně. Pro podávání přes sliznici nebo transdermální podávání se v přípravku používají vhodné penetranty (činidla usnadňující penetraci) vůči překážce, která má být účinnou látkou prostupována. Takové penetranty jsou obecně v oboru známy a zahrnují, například pro podávání přes sliznici, detergenty, soli kyseliny žlučové a deriváty fusidové kyseliny. Podávání přes sliznici může být také uskutečněno použitím nazálního spreje nebo čípků. Pro transdermální podávání jsou účinné sloučeniny formulovány do masti, mazání, gelů nebo krémů, jak je obecně odborníkům známo.
Sloučeniny mohou také být připraveny ve formě čípků (např. s obvyklou čípkovou bází jako je například kakaové máslo a jiné glyceridy) nebo klystýru pro rektální aplikaci.
V jednom dalším provedení jsou účinné sloučeniny formulovány s nosičem, který sloučeniny chrání před rychlou eliminací z organismu, jako jsou například přípravky s řízeným uvolňováním, které zahrnují implantáty a aplikační mikrosystémy. Biologicky degradovatelné biokompatibilní polymery mohou být použity, jako je například ethylenvinylacetát, polyanhydridy, poly40 glykolová kyselina, kolagen, polyorthoestery a polymléčná kyselina. Metody přípravy takových formulací jsou odborníkům známy. Tyto materiály jsou také komerčně dostupné od firmě Alza Corporation a Nova Pharmaceuticals, lne. Fiposomové suspenze (včetně liposomů cílených na infikované buňky pomocí monoklonálních protilátek proti virovým antigenům) mohou také být použity jako farmaceuticky přijatelné nosiče. Ty mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známé, například jak bylo popsáno v Patentu US 4 522 811.
Je obzvláště výhodné formulovat perorální nebo parenterální přípravky v jednotkové lékové formě, neboť to umožňuje snadné podávání a uniformitu dávek. Jednotková léková forma, jak se v předkládané přihlášce používá, znamená fyzicky oddělené jednotky vhodné jako jednorázové dávky pro podávání léčenému pacientovi, kdy každá jednotka obsahuje předem stanovené množství účinné sloučeniny vypočtené tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku, ve spojení s požadovaným farmaceutickým nosičem. Konkrétní podoba jednotkové lékové formy podle vynálezu je určena a přímo závisí na unikátních vlastnostech účinné sloučeniny podle vynálezu a konkrétním terapeutickém účinku, který má být dosažen.
-32CZ 299161 B6
Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být vloženy do vektoru a použit jako vektory genová terapie. Vektory genová terapie mohou být podávány pacientovi jakýmkoliv vhodným způsobem, např. jak bylo popsáno v Patentu US 5 703 055. Způsoby podávání také zahrnují, např. intravenózní injekce, lokální podávání (viz Patent US 5 328 470) nebo stereotaktické injek5 ce (viz např. Chen et al. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 3054-3057). Farmaceutický přípravek obsahující vektor genové terapie může obsahovat vektor genová terapie v přijatelném ředidle nebo může obsahovat pomalu uvolňující nosič, ve kterém je rozptýlen nosič terapeutického genu. Jestliže celý vektor přenášející gen může být získán jako celek z rekombinantní buněk, např. jako retrovirový vektor, pak farmaceutický přípravek může obsahovat jednu nebo více buněk, které i o produkuj í vektor nesoucí gen.
Farmaceutické přípravky jsou uloženy v nádobce, balíčku nebo dávkovači společně s instrukcemi pro podávání.
Použití a způsoby
Molekuly nukleové kyseliny, proteiny, proteinové homology a protilátky popsané v předkládaném vynálezu mohou být použity při jedné nebo více z následujících metod: (a) screeningové testy, (b) detekční testy (např. chromozómové mapování, typizace tkání, forenzní biologie), (c) prediktivní lékařství (např. diagnostické testy, prognostické testy, sledování průběhu klinických zkoušek a farmakogenomika) a (d) léčebné postupy (např. terapeutické a profylaktické). Jak bylo již popsáno v předkládané přihlášce, v jednom provedení BAFF-R protein podle vynálezu má schopnost vázat BAFF.
Izolované nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být použity pro expresi BAFF-R proteinu (např. prostřednictvím rekombinantního expresního vektoru v hostitelské buňce při genové terapii), pro detekci BAFF-R mRNA (např. v biologickém vzorku) nebo detekci genetické léze v BAFF-R genu, a také pro modulaci aktivity BAFF a/nebo BAFF-R, jak bude popsáno dále. Kromě toho, BAFF-R proteiny mohou být použity ke screeningu léčiv nebo sloučenin, který modulují BAFF-R aktivitu nebo expresi, a také k léčbě nemocí charakterizovaných nedostatečnou nebo naopak nadměrnou tvorbou BAFF a/nebo BAFF-R proteinů nebo tvorbou takových forem BAFF-R proteinu, které mají sníženou nebo aberantní aktivitu ve srovnání s BAFF-R proteinem divokého typu. Kromě toho, anti-BAFF-R protilátky podle vynálezu mohou být použity k detekci a izolaci BAFF-R proteinů a k modulaci aktivity BAFF a/nebo BAFF-R.
Předkládaný vynález se dále týká nových činidel, identifikovaných ve screeningových testech, které byly popsány výše, a použití těchto činidel pro léčení, jak se popisuje v této přihlášce.
Vyhledávací testy (screening)
Vynález poskytuje způsob (také nazývaný v předkládané přihlášce „screeningový test“ nebo zkráceně „screening“) pro identifikaci modulátorů, tj. kandidátních nebo testovaných sloučenin nebo činidel (např. peptidu, peptidomimetik, malých molekul nebo jiných případných léčiv), která se vážou k BAFF-R proteinu nebo mají stimulační nebo inhibiční účinek například na expresi BAFF-R nebo na aktivitu BAFF-R.
V jednom provedení předkládaný vynález poskytuje testy pro screening kandidátních nebo testovaných sloučenin, které se vážou k nebo modulují aktivitu BAFF-R proteinu nebo polypeptidu nebo jeho biologicky účinné části. Testované sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny použitím kteréhokoliv z mnoha známých postupů kombinačních knihoven, jako jsou např. biologické knihovny, prostorově adresovatelné knihovny imobilizované na pevné fázi nebo v roztoku, syntetické metody přípravy knihovny vyžadující dekonvoluci, metody přípravy knihoven typu one-bead one-compound (Jedna mikroperlička - jedna sloučenina“) a syntetické metody se selekcí použitím afinitní chromatografie. Metody biologických knihoven jsou ome55 zeny na peptidové knihovny, zatímco další výše jmenované postupy jsou vhodné pro peptidové
-33 CZ 299161 B6 knihovny, knihovny nepeptidových oligomeru nebo knihovny sloučenin s malou molekulou (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-167).
Příklady metod syntézy molekulárních knihoven jsou známy v oboru, a byly popsány např.
v: Dewitt et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6909-6013, Erb et al. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 11 422-11 426, Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-2685, Cho et al. (1993) Science 261: 1303, Carrell et al. (1994) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059, Carrell et al. (1994) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 a Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-1251.
Knihovny sloučenin mohou být přítomny v roztoku (např. Houghten (1992) Biotechniques 13: 412^121) nebo na perličkách (mikroperličkách) (Lam (1991) Nátuře 354: 82-84), na čipech (Fodor (1993) Nátuře 364: 555-556), bakteriích (Ladner Patent US 5 223 409 , sporách (Ladner Patent US 5 223 409), plazmidech (Culí et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) nebo na fágách (Scott a Smith (1990) Science 249: 386-390, Devlin (1990) Science 249: 404406, Cwirla et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, Felici (1991) J Mol. Biol. 222: 301-310, Ladner Patent US 5 223 409).
V jednom provedení testu podle vynálezu je test buněčný test, ve kterém buňka, která exprimuje na svém povrchu na membránu vázanou formu BAFF-R proteinu nebo její biologicky účinnou část, je kontaktována s testovanou sloučeninou a zjišťuje se schopností testované sloučeniny vázat se na BAFF-R protein. Buňka, je například buňka savčího původu nebo kvasinková buňka. Určení schopnosti testované sloučeniny vázat se na BAFF-R protein může být provedeno například tím, že se kondenzuje testovaná sloučenina s radioizotopem nebo enzymatickou značkou, takže pak vazba testované sloučeniny na BAFF-R protein nebo jeho biologicky účinnou část může být určena detekcí značené sloučeniny v komplexu. Například testovaná sloučenina může být značena pomocí 125I, 35S, 14C, nebo 3H, buďto přímo, nebo nepřímo, a radioizotop pak detekován přímým měřením emitovaného záření nebo scintilačním počítačem. Alternativně testované sloučeniny mohou být enzymaticky značeny například křenovou peroxidázou, alkalickou fosfatá30 zou nebo luciferázou, a enzymatická značka je pak detekována stanovením konverze vhodného substrátu na produkt. V jednom provedení test zahrnuje kontaktování buňky, která na svém povrchu exprimuje na membránu vázanou formu BAFF-R proteinu nebo jeho biologicky účinnou část, se známou sloučeninou, která se váže na BAFF-R, čímž se připraví testová směs, kontaktování této testové směsi s testovanou sloučeninou a určení schopnosti testované sloučeniny interagovat s BAFF-R proteinem, přičemž určení schopnosti testované sloučeniny interagovat s BAFF-R proteinem zahrnuje určení schopnosti testované sloučeniny se přednostně vázat na BAFF-R nebo jeho biologicky účinnou část ve srovnání se známou sloučeninou.
V dalším provedení vynálezu se jedná o buněčný test, který zahrnuje kontaktování buněk expri40 mujících na svém povrchu na membráně vázanou formu BAFF-R proteinu nebo jeho biologicky účinné části její, s testovanou sloučeninou a pak určení schopnosti testované sloučeniny modulovat (např. stimulovat nebo inhibovat) aktivitu BAFF-R proteinu nebo jeho biologicky účinné části. Určení schopnosti testované sloučeniny modulovat aktivitu BAFF-R nebo jeho biologicky účinné části může být provedeno například tím, že se určuje schopnost BAFF-R proteinu vázat se k nebo interagovat s BAFF-R s cílovou molekulou. Cílová molekula, jak se v předkládané přihlášce používá, je molekula, se kterou se BAFF-R protein váže nebo interaguje v přírodě, například molekula na povrch buňky, která exprimuje BAFF-R protein, molekula na povrch druhé buňky, molekula v extracelulámím prostředí, molekula asociovaná s vnitřním povrchem buněčné membrány nebo cytoplazmatická molekula. BAFF-R cílová molekula může být mole50 kula odlišná od BAFF-R (non-BAFF-R) nebo BAFF-R protein nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu. V jednom provedení BAFF-R cílová molekula je součástí dráhy signální transdukce, která umožňuje transdukci extracelulámího signálu (např. signál tvořený vazbou sloučeniny na BAFF-R molekulu vázanou na membráně) přes buněčnou membránu do buňky. Cíl například může být druhý intercelulámí protein, který má katalytickou aktivitu, nebo protein, který usnadní asociaci BAFF-R se signálními molekulami ležícími po směru signální dráhy.
-34CZ 299161 B6
Určení schopnosti BAFF-R proteinu vázat se na nebo interagovat s BAFF-R cílovou molekulou může být provedenou jednou z metod popsaných pro určení přímé vazby. V jednom provedení stanovení schopnosti BAFF-R proteinu vázat se na nebo interagovat s BAFF-R cílovou moleku5 lou může být uskutečněn tím, že se určí aktivita cílové molekuly. Například aktivita cílové molekuly může být určena detekcí indukce buněčného druhého posla cílové molekuly (tj. intracelulárního Ca2+ diacylglycerolu, IP3 apod.), detekci katalytické a/nebo enzymatické aktivity cílového vhodného substrátu, detekci indukce reportérového genu (obsahujícího BAFF-R-responzivní regulační prvek operativně spojený s nukleovou kyselinou kódující detekovatelný markér, např.
luciferázu) nebo detekcí buněčné reakce, například buněčného přežití, buněčné diferenciace nebo buněčné proliferace.
V ještě dalším provedení vynálezu je test bezbuněčný test zahrnující kontaktování BAFF-R proteinu nebo jeho biologicky účinné části s testovanou sloučeninou a určení schopnosti testova15 né sloučeniny vázat se na BAFF-R protein nebo jeho biologicky účinnou část. Vazba testované sloučeniny na BAFF-R protein může být určena buďto přímo,nebo nepřímo jak již bylo popsáno výše. V jednom provedení test zahrnuje kontaktování BAFF-R proteinu nebo jeho biologicky účinné části se známou sloučeninou, která se váže na BAFF-R, čímž se připraví testová směs, kontaktování testové směsi s testovanou sloučeninou, a určení schopnosti testované sloučeniny interagovat s BAFF-R proteinem, kde určení schopnosti testované sloučeniny interagovat s BAFF-R proteinem zahrnuje určení schopnosti testované sloučeniny přednostně se vázat na BAFF-R nebo jeho biologicky účinnou část ve srovnání se známou sloučeninou.
V dalším provedení je test bezbuněčný test zahrnující kontaktování BAFF-R proteinu nebo jeho biologicky účinné části s testovanou sloučeninou a určení schopnosti testované sloučeniny modulovat (např. stimulovat nebo inhibovat) aktivitu BAFF-R proteinu nebo jeho biologicky účinné části. Určení schopnosti testované sloučeniny modulovat aktivitu BAFF-R může být provedeno například tím, že se určuje schopnost BAFF-R proteinu vázat BAFF-R cílovou molekulu jednou z metod popsaných výše pro určení přímé vazby. V alternativním provedení určení schopnosti testované sloučeniny modulovat aktivitu BAFF-R může být provedeno tím, že se určuje schopnost BAFF-R proteinu dále modulovat BAFF-R cílovou molekulu. Například katalytická/enzymatická aktivita cílové molekuly na vhodný substrát může být stanovena jak bylo popsáno dříve.
V ještě dalším provedení bezbuněčný test podle vynálezu zahrnuje kontaktování BAFF-R pro35 teinu nebo jeho biologicky účinné části se známou sloučeninou, která se váže na BAFF-R, čímž se připraví testová směs, kontaktování testové směsi s testovanou sloučeninou a určení schopnosti testované sloučeniny interagovat s BAFF-R proteinem, přičemž určení schopnosti testované sloučeniny interagovat s BAFF-R proteinem zahrnuje stanovení schopnosti BAFF-R proteinu přednostně se vázat nebo modulovat aktivitu BAFF-R cílové molekuly.
Bezbuněčné testy podle předkládaného vynálezu jsou schopné užívat jak rozpustnou formu nebo na membránu vázanou formu BAFF-R. V případě bezbuněčných testů založených na formě BAFF-R vázané na membránu může být žádoucí využít solubilizační činidla, aby se na membránu vázaná forma BAFF-R udržovala v roztoku. K příkladům takových solubilizačních činidel patří neiontové detergenty jako například n-oktylglukosid, n-dodecylglukosid, n-dodecylmaltosid, oktanoyl-N-methylglukamid, dekanoyl-N-methylglukamid, Triton X-100, Triton X-114, Thesit, isotridecypoly(ethylenglykolether)n, 3-(3-cholamidopropyl)dimethylamminiol-l-propansulfonát (CHAPS), 3-(3-cholamidopropyl)dimethylamminiol-2-hydroxy-l-propansulfonát (CHAPSO) nebo N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-l-propansulfonát.
Ve více než jednom provedení testovacích metod podle předkládaného vynálezu může být žádoucí imobilizovat buď BAFF-R, nebo jeho cílovou molekulu pro usnadnění separace komplexu od nekoplexované formy jednoho nebo obou proteinů, a také pro usnadnění automatizace takových testů. Vazba testované sloučeniny na BAFF-R nebo interakce BAFF-R s cílovou molekulou v přítomnosti či nepřítomnosti testované sloučeniny může být uskutečněna v jakékoliv
-35CZ 299161 B6 vhodné nádobě obsahující reaktanty. Příkladem takové nádoby jsou (jamky) mikrotitraění destičky, zkumavky a mikrocentrifugační zkumavky. V jednom provedení je poskytnut fúzní protein, který má navíc doménu, která umožňuje navázání jednoho nebo obou proteinů na nosič. Například fúzní proteiny GST-BAFF-R nebo GST-cílový protein proteiny mohou být adsorbovány na glutathion-safarózové perličky (Sigma Chemical, St. Louis, MO) nebo glutathionem derivatizované mikrotitraění destičky, na které je pak nanesena testovaná sloučenina nebo testovaná sloučenina a buďto neadsorbovaný cílový protein, nebo BAFF-R protein a směs je pak inkubována v podmínkách, které jsou vhodné pro tvorbu komplexu (např. ve fyziologických podmínkách koncentrace solí a pH). Po inkubaci jsou perličky nebo jamky mikrotitraění destičky promyty, aby se odstranily všechny nenavázané složky, a v případě perliček je nosič imobilizován, a pak jsou stanoveny komplexy buďto přímo, nebo nepřímo, například jak bylo již popsáno výše. Alternativně mohou být komplexy odděleny z nosiče a pak je úroveň BAFF-R vazby nebo aktivity určena s využitím standardních technik.
Jiné způsoby imobilizace proteinů na nosič (matrici) mohou také být použity ve screeningových testech podle vynálezu. Například buďto BAFF-R, nebo jeho cílová molekula může být imobilizována pomocí kondenzace (konjugace) biotinu a streptavidinu. Biotinylovaný BAFF-R, nebo cílová molekula mohou být připraveny z biotin-NHS (N-hydroxysukcinimid) s použitím techniky odborníkům dobře známé (např. pomocí biotinylační souprava od firmy Pierce Chemical,
Rockford, 111.) a imobilizovány na jamky streptavidinem potažené 96jamkové destičky (Pierce Chemical). Alternativně protilátky reaktivní s BAFF-R nebo cílovou molekulou, ale současně neinterferující s vazbou BAFF-R proteinu k jeho cílové molekule, mohou být derivatizována na jamky destičky a neuvázané cílové molekuly nebo BAFF-R zachycený v jamkách kondenuací s protilátkou. Metody detekce takových komplexů, kromě již výše popsaných pro GST-imobili25 zované komplexy, zahrnují imunodetekci komplexů s použitím protilátky reaktivní s BAFF-R nebo cílovou molekulou, a také s enzymem spojené testy, které jsou založeny na detekci enzymatické aktivity spojené s BAFF-R nebo cílovou molekulou.
V dalším provedení jsou modulátory exprese BAFF-R identifikovány způsobem, kdy buňky jsou kontaktovány s kandidátní sloučeninou a pak je určována exprese BAFF-R mRNA nebo proteinu v buňkách. Hladina exprese BAFF-R mRNA nebo proteinu v přítomnosti kandidátní sloučeniny se pak srovnává s hladinou exprese BAFF-R mRNA nebo proteinu bez přítomnosti kandidátní sloučeniny. Kandidátní sloučenina pak může být identifikována jako modulátor BAFF-R exprese na základě tohoto srovnání. Například když exprese BAFF-R mRNA nebo proteinu je vyšší (sta35 tisticky významně vyšší) v přítomnosti kandidátní sloučeniny než v její nepřítomnosti, pak kandidátní sloučenina je identifikována jako stimulátor exprese BAFF-R mRNA nebo proteinu. Naopak když exprese BAFF-R mRNA nebo proteinu je nižší (statisticky významně nižší) v přítomnosti kandidátní sloučeniny než v její nepřítomnosti, kandidátní sloučenina je identifikována jako inhibitor exprese BAFF-R mRNA nebo proteinu. Hladina exprese BAFF-R mRNA nebo proteinu v buňkách může být určena metodami popsanými v předkládané přihlášce pro detekci BAFF-R mRNA nebo proteinu.
V ještě dalším aspekt vynálezu BAFF-R proteiny mohou být použity jako návnadové proteiny ve dvouhybridovém testu nebo tříhybridovém test (viz např. Patent US 5 283 317, Zervos et al.
(1993) Cell 72: 223-232, Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12 046-12 054, Bartel et al.
(1993) Biotechniques 14: 920-924, Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1 693-1 696 a Brent WO 94/10300/) pro identifikaci jiných proteinů, které vážou nebo interagují s BAFF-R (BAFFR-vazebné proteiny nebo zkráceně BAFF-R-BP) a modulují aktivitu BAFF-R. Takové BAFF-R vazebné proteiny jsou také pravděpodobně zapojený do šíření signálů BAFF-R protei50 nů, a sice jako elementy „v protisměru“ nebo „po směru“ BAFF-R signální dráhy.
Dvouhybridový systém je založen na modulární povaze většiny transkripčních faktorů, které sestávají ze separátních DNA-vazebných a aktivačních domén. Stručně řečeno, test používá dva různé DNA konstrukty. V jednom konstruktu je gen, který kóduje BAFF-R fúzován s genem kódujícím DNA vazebnou doménu známého transkripčního faktoru (např. GAL-4). V druhém
-36CZ 299161 B6 konstruktu je DNA sekvence z knihovnu DNA sekvencí, která kóduje neidentifikovaný protein (tj. „vzorek“ neboli „kořist“) fúzovaný s genem, který kóduje aktivační doménu známého transkripčního faktoru. Jestliže proteiny zvané návnada a kořist jsou schopný interakce in vivo, pak vytvořením BAFF-R-závislého komplexu jsou DNA-vazebné a aktivační domény transkrip5 čního faktoru přivedeny do bezprostřední blízkosti. Tato blízkost umožní transkripci reportérového genu (např. LacZ), který je operativně spojen k transkripčním regulačním místem responzívním k transkripčnímu faktoru. Exprese reportérového genu může být detekována a buněčná kolonie obsahující funkční transkripční faktor může být izolována a použita pro přípravu klonovaného genu, který kóduje protein, který interaguje s BAFF-R.
Předkládaný vynález se dále týká nových činidel identifikovaných výše popsanými sreeningovými testy a použití těchto činidel pro léčení, jak bylo popsáno v předkládané přihlášce.
Detekční testy
Části nebo fragmenty sekvencí cDNA identifikovaných v předkládané přihlášce (a odpovídající kompletní genové sekvenci) mohou být použity v mnoha různých způsobech jako polynukleotidová činidla. Například tyto sekvence mohou být použity k: (i) mapování příslušných genů na chromozómu, a, tak lokalizaci genových úseků spojených s genetickým onemocněním, (ii) identi20 fikaci jedince z malého biologického vzorku (typizace tkání) a (iii) forenzní identifikaci biologického vzorku. Tyto aplikace jsou popsány dále.
Chromozómové mapování
Jakmile byla jednou sekvence (nebo část sekvence) genu izolována, tato sekvence může být použita k mapování a lokalizaci genu na chromozómu. Tento postup se nazývá chromozómové mapování. V souladu s tím, části nebo fragmenty BAFF-R sekvence, popsané v předkládané přihlášce, mohou být použity k mapování umístění BAFF-R genů na chromozómu. Toto mapování BAFF-R sekvencí na chromozómu je důležitým první krokem při snaze najít souvislost těchto sekvenci s geny spojenými s nemocemi.
Stručně řečeno, BAFF-R geny mohou být mapovány na chromozómech užitím PCR primerů (výhodně velikosti 15 až 25 bp) z BAFF-R sekvence. Počítačová analýza BAFF-R sekvence může být použita pro rychlý výběr primerů, které nepřeklenou víc než jeden exon v genomové
DNA, čímž se komplikuje amplifíkační postup. Tyto primery mohou pak být použity pro PCR screening hybridů somatických buněk obsahující individuální chromozómy daného biologického druhu. Pouze hybridy obsahující druhově specifický gen odpovídající BAFF-R sekvenci poskytnou amplifikovaný fragment.
PCR mapování somatických buněčných hybridů je rychlý postup pro přiřazování konkrétní sekvence ke konkrétnímu chromozómu. Tři nebo více sekvencí může být přiřazeno za den s použitím jednoduchého termálního cykleru. S použitím BAFF-R sekvence pro návrh oligonukleotidových primerů sublokalizace může být dosažena s panely fragmentů ze specifických chromozómů.
Fluorescenční in šitu hybridizace (FISH) DNA sekvence k roztěru chromozomů v metafázi může dále být použita k tomu, aby se získala přesná chromozómová lokalizace v jednom kroku. Chromozómové roztěry se připravují z buněk, jejichž dělení je zablokován v metafázi působením chemické látky jako například kolcemid, který narušuje mitotické vřeténko. Chromozómy mohou být ošetřeny krátce trypsinem a pak obarveny Giemsou. Vzorec světlých a tmavých proužků vznikne na každém chromozómu, takže jednotlivé chromozómy mohou být identifikovány. FISH technika může být použita pro DNA sekvence velikosti 500 nebo 600 bází. Nicméně klony delší než 1000 bází mají vyšší pravděpodobnost vazby v jedinečné chromozómové lokalizaci s dostatečnou intenzitou signálu pro jednoduchou detekci. Výhodně velikost 1000 bázi a výhodněji
2 0 00 bází je dostatečná pro získání dobrých výsledků v rozumném čase. Pro přehled této techni-37CZ 299161 B6 ky viz např. Verma et al. HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamen Press, N. Y., 1988.
Reagencie pro chromozómové mapování mohou být použity individuálně k označení jednoho chromozómu nebo k označení jednoho místa na tomto chromozómu, nebo může být užit panel reagencí pro značení několika míst a/nebo více chromozómů. Reagencie odpovídající nekódujícím úsekům genů jsou vlastně výhodnější pro účely mapování. Kódující sekvence jsou s mnohem vyšší pravděpodobností konzervativní v rámci genových rodin, takže zvyšují naději na zkřížené hybridizace během chromozómového mapování.
Jakmile je jednou sekvence mapována (lokalizována) v konkrétní poloze na chromozómu, fyzikální poloha sekvence na chromozómu může být korelována s mapovými genetickými daty. Taková data jsou k dispozici například v publikaci McKusick, MENDELIAN INHERITANCE IN MAN, a jsou dostupná on-line přes Johns Hopkins University, Welch Medical Library).
Vztah mezi geny a nemocí, mapovaný do stejného chromozómového úseku, může pak být identifikován analýzou genetické vazby (koinheritance fyzicky sousedících genů), popsanou například v Egeland et al. (1987) Nátuře, 325: 783-787.
Navíc mohou být určeny rozdíly v DNA sekvencích mezi jednotlivcem zdravým a postiženým nemocí spojenou s BAFF-R genem. Jestliže je pozorována mutace u některých nebo u všech postižených jedinců, ale u žádného ze zdravých jedinců, pak je tato mutace pravděpodobně v příčinné souvislosti s konkrétní nemocí. Srovnání postižených a zdravých jedinců obecně zahrnuje nejdříve hledání strukturálních změn v chromozómech, jako například delece nebo translokace, které jsou viditelné na roztěrech z chromozómů nebo jsou detekovatelné s použitím PCR na těchto DNA sekvencích. Nakonec může být provedeno kompletní sekvencování genů několik jedinců, aby byla potvrzena přítomnost mutace a mutace byla odlišena od polymorfismů.
Typizace tkání
BAFF-R sekvence podle předkládaného vynálezu může také být použita k identifikaci jedinců z malých biologických vzorků. Při této technice je genomová DNA jedince štěpena jedním nebo více restrikčními enzymy a pak testována sondou metodou Southemova přenosu (Southern blot), kdy vzniká jedinečný profil pásů vhodný pro identifikaci. Sekvence podle předkládaného vynálezu jsou použitelné jako další DNA markéry pro RFLP (délkový polymorfismus restrikčních fragmentů, viz Patent US 5 272 057).
Dále sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro alternativní způsob, který určuje skutečnou DNA sekvenci „báze za bází“ vybrané části genomu jedince. Takže BAFF-R sekvence popsané v předkládané přihlášce mohou být použity pro přípravu dvou PCR primerů z 5' a 3' konců sekvence. Tyto primery se pak užijí pro amplifikaci DNA jedince a pro následné sekvencování.
Panely odpovídající DNA sekvencím jedinců připravené tímto způsobem, mohou poskytovat jedinečnou identifikaci jedinců, jelikož každý jedinec bude mít jedinečný soubor takových DNA sekvencí z důvodu alelických rozdílů. Sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro získání takových identifikačních sekvencí z jedinců a z tkání. BAFF-R sekvence podle vynálezu jedinečně představují části genomu člověka. Alelické variace se vyskytují v určité míře v kódujících úsecích těchto sekvencí a ve vyšší míře v nekódujících úsecích. Odhaduje se, že se alelické variace mezi jednotlivými lidmi vyskytují s frekvencí přibližně jednou na každých 500 bází. Velká část alelických variací je způsobena jednonukleotidovými polymorfismy (SNP), včetně polymorfismů délky restrikčních fragmentů (RFLP).
Každá ze sekvencí popsaných v předkládané přihlášce může být do určité míry použita jako standard proti kterému může být srovnávána DNA z jedince pro identifikační účely. Protože se větší množství polymorfismů vyskytuje v nekódujících úsecích, je k rozlišení jedinců potřeba
-38CZ 299161 B6 menší počet takových sekvencí. Nekódující sekvence uvedené na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2B (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) mohou vhodně poskytovat pozitivní individuální identifikaci s panelem 10 až 1000 primerů, z nichž každý poskytne nekódující amplifikovanou sekvenci velikosti asi 100 bází. Jestliže se použije predikovaná kódující sekvence, jako je například sekvence uvedená na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2B (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6), pak je vhodné použít větší počet primerů pro pozitivní individuální identifikaci, a sice 500 až 2000.
Prediktivní medicína
Předkládaný vynález se také týká oblasti prediktivní medicíny, kde se užívají diagnostické testy, prognostické testy, farmakogenomika a sledování klinických zkoušek pro prediktivní účely (prognózu, předpověď) pro účely případného profytaktického léčení. V souladu s tím se jeden aspekt předkládaného vynálezu týká diagnostických testů pro stanovení BAFF-R proteinu a/nebo exprese nukleové kyseliny, a také aktivity BAFF-R, v biologickém vzorku (jako je např. krev, sérum, buňky, tkáň), aby se určilo, zda je jedinec postižen nemocí nebo poruchou neboje ohrožen rozvinutím takové nemoci spojené s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R. Vynález také poskytuje prognostické (prediktivní) testy pro určení, zdaje u jedince riziko rozvinutí chorobné20 ho stavu spojeného s expresí nebo aktivitou BAFF-R proteinu nebo nukleové kyseliny. Tak například v biologickém vzorku mohou být testovány mutace v BAFF-R genu. Takový test může být použit pro prognostické nebo prediktivní s cílem případné profylaktické léčby jedince ještě před propuknutím nemoci, která je spojena s expresí nebo aktivitou BAFF-R proteinu nebo nukleové kyseliny.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje metody pro stanovení BAFF-R proteinu, exprese nukleové kyseliny BAFF-R nebo aktivity BAFF-R u jedince, aby bylo možné případně vybrat vhodná terapeutická nebo proíylaktická činidla pro konkrétního jedince (což se zde nazývá farmakogenomika). Farmakogenomika umožňuje výběr vhodných činidel (např. léků), pro tera30 peutické nebo profylaktické podávání jedinci; přičemž tento výběr je založen na genotypu jedince (např. genotyp jedince je vyšetřen na schopnost jednotlivce reagovat na konkrétní agens.)
Ještě další aspekt vynálezu se týká sledováni účinků činidla (např. léku, obecně sloučenin) na expresi nebo aktivitu BAFF-R při klinických zkouškách.
Tato a ještě další činidla jsou popsána podrobněji v dalších částech předkládané přihlášky. Diagnostické testy
Příklad způsobu detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti BAFF—R v biologickém vzorku zahrnuje získání biologického vzorku od pacienta, který má být vyšetřen, a kontaktování biologického vzorku se sloučeninou nebo činidlem schopným detekovat BAFF—R protein nebo nukleovou kyselinu (např. mRNA, genomovou DNA), která kóduje BAFF-R protein, takže přítomnost BAFF-R je detekována v biologickém vzorku. Činidlo pro detekci BAFF-R mRNA nebo geno45 mové DNA je sonda představovaná značenou nukleovou kyselinou, která je schopná hybridizovat s BAFF-R mRNA nebo genomovou DNA.
Sonda tvořená nukleovou kyselinou může být například kompletní BAFF-R nukleová kyselina, jako například kterákoliv z nukleových kyselin uvedených na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1), obr. 1B (SEKV. ID. Č. 2), obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), obr. 2B (SEKV. ID. Č. 4) a obr. 3 (SEKV. ID. Č. 6) nebo jejich část, jako například oligonukleotid velikosti alespoň 15, 30, 50, 100, 250 nebo 500 nukleotidů a dostatečně specifický pro hybridizaci s BAFF-R mRNA nebo genomovou DNA za stringentních podmínek. Jiné vhodné sondy pro použití v diagnostických testech podle vynálezu jsou popsány dále v předkládané přihlášce.
-39CZ 299161 B6
Činidlo pro detekci BAFF-R protein je protilátku schopná vázat se na BAFF-R protein, výhodně protilátka spojená s detekovatelnou značkou. Protilátky mohou být polyklonální nebo výhodněji monoklonální. Může být použita intaktní protilátka nebo její fragment (např. fragment Fab nebo F(ab')2). Termín značená, ve vztahu k sondě nebo protilátce, znamená přímé značení sondy nebo protilátky kondenzací (tj. fyzickým spojením) detekovatelné látky se sondou nebo protilátkou, a také nepřímé značení sondy nebo protilátky tím, že reaguje s dalším činidlem, které je přímo značeno. Příklady nepřímého značení zahrnují detekci primární protilátky s použitím fluorescenčně značené sekundární protilátky a koncové značení DNA sondy biotinem, takže pak může být detekována fluorescentně značeným streptavidinem. Termín biologický vzorek zahr10 nuje tkáně, buňky a biologické tekutiny izolované z pacienta, a také tkáně, buňky a tekutiny přítomné v pacientovi. To znamená, že způsob detekce podle vynálezu může být použit pro detekci BAFF-R mRNA, proteinu nebo genomové DNA v biologickém vzorku jak in vitro, tak také in vivo. Tak například techniky in vitro detekce BAFF-R mRNA zahrnují Northern hybridizaci a in šitu hybridizaci. In vitro techniky detekce BAFF-R proteinu zahrnují testy ELISA („enzyme-linked immunosorbent assay“), Western blot, imunoprecipitaci a imunofluorescenci. K in vitro technikám detekce BAFF-R genomové DNA patří Southemova hybridizace. Kromě toho in vivo techniky detekce BAFF-R proteinu zahrnují testy, kdy se pacientovi podává značená anti-BAFF-R protilátka. Protilátka může být například značena radioaktivním markérem, jehož přítomnost a lokalizace v těle pacienta může být detekována standardními zobrazovacími techni20 kami.
V jednom provedení vynálezu biologický vzorek obsahuje proteinové molekuly získané od vyšetřovaného pacienta. Jindy biologický vzorek může obsahovat mRNA molekuly nebo molekuly genomové DNA získané od vyšetřovaného pacienta. Výhodným biologickým vzorkem je vzorek leukocytů z periferní krve odebraný pacientovi obvyklým způsobem.
V dalším provedení způsoby podle vynálezu dále zahrnují získání kontrolního biologického vzorku od kontrolního pacienta, kontaktování tohoto kontrolního vzorku se sloučeninou nebo činidlem schopným detekovat BAFF-R protein, mRNA nebo genomovou DNA, takže je přítomnost
BAFF-R proteinu, mRNA nebo genomové DNA detekována v biologickém vzorku, a srovnání přítomnosti BAFF-R proteinu, mRNA nebo genomové DNA v kontrolním vzorku s přítomností BAFF-R proteinu, mRNA nebo genomové DNA v testovaném vzorku.
Vynález dále zahrnuje soupravy pro detekci přítomnosti BAFF-R v biologickém vzorku. Napří35 klad souprava může obsahovat: značenou sloučeninu nebo činidlo schopné detekovat BAFF-R protein nebo mRNA v biologickém vzorku, prostředek pro stanovení množství BAFF-R ve vzorku a prostředek pro srovnání množství BAFF-R ve vzorku se standardem. Sloučenina nebo činidlo může být zabaleno ve vhodné nádobě. Souprava může dále obsahovat instrukce pro použití soupravy k detekci BAFF-R proteinu nebo nukleové kyseliny.
Prognostické testy
Diagnostické způsoby popsané v předkládané přihlášce mohou kromě výše popsaného uplatnění být použity k identifikaci pacienta, u něhož je riziko vypuknutí a/nebo rozvoje nemoci nebo chorobného stavu spojeného s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R. Například testy popsané v předkládané přihlášce, jako například výše uvedené diagnostické testy nebo následující testy, mohou být použity k identifikaci pacienta, u něhož je riziko vypuknutí a/nebo rozvinutí chorobného stavu spojeného s expresí nebo aktivitou BAFF-R proteinu nebo nukleové kyseliny, např. autoimunní nemoci jako je například autoimunní hemolytická anémie a systémový lupus erythematosus. Jinak mohou být použity prognostické testy k identifikaci pacienta, který již trpí a nebo u něhož je riziko vyvinutí nemoci nebo chorobného stavu. Takže předkládaný vynález poskytuje způsob identifikace nemoci nebo chorobného stavu spojeného s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R, kdy je testovaný vzorek získán od pacient a je detekován BAFF-R protein nebo nukleová kyselina (např. mRNA nebo genomová DNA), přičemž přítomnost BAFF-R pro55 teinu nebo nukleové kyseliny je diagnostickým ukazatelem, že pacient již má nebo u něho existu-40CZ 299161 B6 je riziko vyvinutí nemoci nebo chorobného stavu spojeného s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R. Termín testovaný vzorek, jak se v předkládané přihlášce používá, se týká biologického vzorku získaného od vyšetřovaného pacienta. Například testovaný vzorek může být biologická tekutina (např. sérum), vzorek buněk nebo tkáně.
Navíc prognostické testy popsané v předkládané přihlášce mohou být použity k určení toho, zda pacientovi může být podáváno činidlo (např. agonista, antagonista, peptidomimetikum, protein, peptid, nukleová kyselina, malá molekula nebo jiné uvažované léčivo) pro léčení nemoci nebo chorobného stavu spojeného s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R. Například takové meto10 dy mohou být použity k určení toho, zda pacient může být účinně léčen léčivem pro daný chorobný stav. Takže předkládaný vynález poskytuje způsoby k určení toho, zda pacient může být účinně léčen činidlem (léčivem) určeným k léčení chorobného stavu spojeného s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R, kdy je získán testovaný vzorek a je provedena detekce BAFF-R proteinu nebo nukleové kyseliny (např. přítomnost BAFF-R proteinu nebo nukleové kyseliny je pro pacienta diagnostickým ukazatelem, že může být léčen činidlem k léčbě chorobného stavu spojeného s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R).
Způsoby podle vynálezu mohou také být použity k detekci genetických lézt v genu BAFF-R, tedy k určení toho, zda pacient s genovou lézí je v riziku nebo již trpí tumorigenním nebo auto20 imunním onemocněním. V různých provedeních vynálezu způsoby zahrnují detekci, a sice ve vzorku buněk od pacienta, přítomnosti nebo nepřítomnosti genetické léze charakterizované alespoň jednou změnou ovlivňující integritu genu kódujícího protein BAFF-R nebo chybnou expresí genu BAFF-R. Například takové genetické léze mohou být detekovány tím, že se zjistí existence alespoň jedné ze skutečností: (1) delece jednoho nebo více nukleotidů z BAFF-R genu, (2) adice jednoho nebo více nukleotidů k BAFF-R genu, (3) substituce jednoho nebo více nukleotidů v BAFF-R genu, (4) chromozómové přeskupení BAFF-R genu, (5) změna hladina mRNA transkriptů BAFF-R genu, (6) aberantní modifikace BAFF-R genu jako je například modifikace profilu methylace genomové DNA, (7) výskyt jiného typu sestřihu mRNA transkriptů BAFF-R genu než jaký se vyskytuje u genu divokého typu, (8) hladina BAFF-R proteinu odlišná od hladi30 ny divokého typu, (9) alelická ztráta BAFF-R genu a (10) nepatřičné posttranslační modifikace BAFF-R proteinu. Jak se popisuje v předkládané přihlášce, existuje velký počet testů, které jsou obecně v oboru známy, které mohou být použity pro detekci leží v BAFF-R genu. Výhodný biologický vzorek je vzorek leukocytů z periferní krve izolovaný obvyklým způsobem z pacienta. Nicméně jakýkoliv biologický vzorek obsahující jaderné buňky může být použit, například včet35 ně vzorku buněk z bukální sliznice.
V některých provedeních vynálezu detekce léze zahrnuje použití sond/primerů v polymerázové řetězové reakci (PCR) (viz např. Patenty US 4 683 195 a US 4 683 202), jako například v „zakotvené“ PCR nebo „RACE“ PCR, nebo také v ligační řetězové reakci (FCR) (viz např. Fandegran et al. (1988) Science 241: 1077—1080 a Nakazawa et al. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 360-364), přičemž LCR může být zvláště vhodná k detekci genových mutací v BAFF-R genu (viz Abravaya et al. (1995) Nud. Acids Res. 23: 675-682). Tento způsob zahrnuje kroky, kdy se odebere vzorek buněk od pacienta, izolují se nukleové kyselina (např. genomová DNA nebo mRNA nebo obě) z buněk ve vzorku, nukleová kyselina ze vzorku se kontaktuje s jedním nebo více primeiy, které specificky hybridizují s BAFF-R genem v podmínkách, kdy nastane hybridizace a amplifikace BAFF-R genu (jestliže je přítomen), a detekuje se přítomnost nebo nepřítomnost amplifikovaného produktu nebo se detekuje velikost amplifikovaného produktu a srovnává se s délkou kontrolního vzorku. Fze předpokládat, že PCR a/nebo FCR mohou být výhodně užity jako předběžný amplifikační krok ve spojení s jakýmkoliv ze způsobů detekce mutace, které jsou v předkládané přihlášce zmíněny.
Alternativní způsoby amplifikace zahrnují: samostatně se udržující replikace sekvence (Guatelli et al., (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), transkripční amplifikační systém (Kwoh, et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), systém Q-beta replikázy (Lizardi et al. (1988) BioTechnology 6: 1197) nebo kterýkoliv jiný způsob amplifikace nukleo-41 CZ 299161 B6 vých kyselin, po kterém následuje detekce amplifikováných molekul s použitím technik, které jsou odborníkům známy. Tato detekční schémata jsou obzvláště užitečná pro detekci molekul nukleových kyselin, jestliže jsou tyto molekuly přítomny ve velmi nízkém počtu.
V alternativním provedení mutace v BAFF-R genu z testovaných buněk mohou být identifikovány změnami v profilu štěpení restrikčními enzymy. Například testovaný vzorek DNA a kontrolní DNA jsou izolovány, amplifikovány (volitelně), štěpeny jedením nebo více restrikčními endonukleázami a délky fragmentů jsou určeny gelovou elektroforézou a porovnány. Rozdíly v délce fragmentů mezi testovaným vzorkem a kontrolní DNA ukazují na mutaci v testovaném vzorku DNA. Navíc sekvenčně specifické ribozymy (viz například Patent US 5 493 531) mohou být použity k vyhodnocení přítomnosti specifických mutací projevujících se vznikem nebo ztrátou ribozymového štěpného místa.
V jiných provedeních vynálezu mohou být genetické mutace v BAFF-R identifikován tím, že se hybridizují Dnukleová kyselina ze vzorku a kontrolní nukleová kyselina, např. DNA nebo RNA, a sice na matrice obsahující stovky nebo tisíce oligonukleotidových sond ve vysoké hustotě (Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal et al. (1996) Nátuře Med. 2: 753-759). Například genetické mutace v BAFF-R mohou být identifikovány na dvojrozměrných matricích obsahujících světelným zářením generované sondy DNA, jak bylo popsáno v Cronin et al. (1996)
Human Mutation 7: 244-255. Stručně shrnuto, první hybridizační matrice sond může být použita ke screeningu dlouhých úseků DNA ve vzorku a kontrole pro identifikaci nukleotidových záměn mezi sekvence tím, že se připraví lineární matrice následných překrývajících se sond. Tento krok umožňuje identifikaci bodových genových mutací. Tento krok je následován druhou hybridizační matricí, která umožňuje charakterizovat specifické mutace s použitím menší, specializované matrice sond, komplementární ke všem variantám nebo mutacím již detekovaným. Každá mutační matrice je složena z paralelních souborů sond, kdy jeden je komplementární ke genu divokého typu a druhý je komplementární k mutantnímu genu.
V ještě dalším provedení kterákoliv z celé řada reakcí vhodných pro sekvencování, které jsou známy v oboru, může být použita k přímému sekvencování BAFF-R genu a detekci mutace tím, že se srovná sekvence testovaného vzorku BAFF-R s odpovídající sekvencí divokého typu (kontrolní). Příklady reakcí pro sekvencování zahrnují techniky publikované např.: Maxam a Gilbert (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 560 nebo Sanger (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463. Samozřejmě také kterýkoliv z celé řada známých automatizovaných postupů sekvenco35 vání může být použit pro provedení diagnostický testů (Naeve et al. (1995) Biotechniques 19: 448). Tyto postupy zahrnují sekvencování užitím hmotové spektrometrie (viz, např. PCT mezinárodní přihláška publikovaná jako WO 94/16 101, Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127— 162 aGriffin etal. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159).
Další metody detekce mutací v BAFF—R genu zahrnují metody, kdy se užívá ochrana proti štěpícím činidlům pro detekci nesprávného („mismatched“) párování bází RNA/RNA duplexech nebo RNA/DNA heteroduplexech (Myers et al. (1985) Science 230: 1 242). Obecně tato technika mismatch štěpení začíná tím, že se vytvoří heteroduplexy hybridizaci (značené) RNA nebo DNA obsahující BAFF-R sekvenci divokého typu s potenciální mutantní RNA nebo DNA získa45 nou ze vzorku tkáně. Dvojvláknové duplexy jsou pak ošetřeny činidlem, které štěpí jednořetězcové oblasti duplexu, jako jsou například úseky, které vzniknou v důsledku nesprávného párování kontrolním vláknem a vláknem testovaného vzorku. Aby se enzymaticky naštěpily špatně spárované úseky, RNA/DNA duplexy mohou být ošetřeny například Rnázou a DNA/DNA hybridy mohou být ošetřeny SI nukleázou. V jiném provedení, buďto DNA/DNA, nebo RNA/DNA duplexy mohou být ošetřeny hydroxylaminem nebo oxidem osmičelým s piperidinem, aby se enzymaticky naštěpily špatně spárované úseky. Po naštěpení nespárovaných úseků je výsledný materiál dělen podle velikosti na denaturujícím polyakrylamidovém gelu, aby se určilo místo výskytu mutace. Viz například Cotton et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 4397, Saleeba et aL (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295. V takovém provedení může být například kontrolní DNA nebo RNA značena pro účely detekce.
-42CZ 299161 B6
V ještě dalším provedení se v reakci štěpení nespárovaných („mismatched“) úseků používá jeden nebo více proteinů, které rozpoznávají nesprávné páry bází v dvojvláknové DNA (tzv. reparační enzymy nesprávného párování v DNA) v definovaných systémech pro detekci a mapování bodo5 vých mutací v BAFF-R cDNA získané ze vzorku buněk. Tak například enzym mutY z E. coli vyštěpí A v místě G/A „neshody“ a thymidin DNA glykosyláza z HeLa buněk vyštěpí T v místě G/T neshody (Hsua et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662). V příkladu provedení vynálezu je sonda založená na BAFF-R sekvenci, např. BAFF-R sekvenci divokého typu, hybridizována s cDNA nebo jinou DNA z testovaných buněk. Duplex DNA je pak ošetřen reparačním enzymem ío nesprávného párování v DNA a štěpné produkty, jestliže vzniknou, pak mohou být detekovány elektroforézou nebo jiným známým způsobem (viz například Patent US 5 459 039).
V jiném provedení vynálezu změny v elektroforetické pohyblivosti jsou využity pro rozpoznání mutací v BAFF-R genech. Například konformační polymorfizmus jednoho vlákna (SSCP) může být použit k detekci rozdílů v elektroforetické pohyblivosti mezi mutantou a nukleovou kyselinou divokého typu (Orita et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2766, viz také Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144; Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79). Jednořetězcové DNA fragmenty ze vzorku a kontrolní nukleová kyselina BAFF-R se denaturují a pak se ponechají renaturovat. Sekundární struktura jednořetězcové nukleové kyseliny je závislá na sekvenci a tudíž změna v elektroforetické pohyblivosti umožní detekovat dokonce i záměnu jediné báze. DNA fragmenty mohou být značeny nebo detekovány značenými sondami. Senzitivita testu může být zesílena použitím RNA (spíše než DNA), u které je sekundární struktura citlivější na změnu sekvence. V jednom provedení se používá analýza heteroduplexů pro separaci dvojvláknových heteroduplexů na základě změn v elektroforetické pohyblivosti (Keen et al. (1991)
Trends Genet. 7: 5).
V ještě dalším provedení vynálezu se testuje pohyb mutantních fragmentů nebo fragmentů divokého typu v polyakrylamidovém gelu obsahujícím gradient denaturačního prostředku v tzv. gelové elektroforéze v denaturačním gradientu (DGGE) (Myers et al. (1985) Nátuře 313: 495). Když se použije jako analýza DGGE, DNA se modifikuje, aby se zajistilo, že se nebude kompletně denaturovat, například tím, že se přidá tzv. „GC svorka“, tj. úsek přibližně 40 bp DNA bohaté na GC páry s vysokou teplotou tání užitím metody PCR. V ještě další provedení se užívá teplotní gradient místo denaturačního gradientu pro rozpoznání rozdílů v pohyblivosti kontrolní DNA a DNA vzorku (Rosenbaum a Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12 753).
Příklady dalších technik pro detekci genových mutací zahrnují, ale bez omezení, selektivní oligonukleotidovou hybridizaci, selektivní amplifikaci nebo selektivní extenzi primerů. Například mohou být připraveny oligonukleotidové primery, ve kterých je centrálně umístěna známá mutace, a pak hybridizovány s cílovou DNA v podmínkách, které umožňují hybridizaci jen když je dokonalá shoda sekvencí (Saiki et al. (1986) Nátuře 324: 163), Saiki et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 6230). Takové alelicky specifické oligonukleotidy jsou hybridizovány s PCR amplifikovanou cílovou DNA nebo s mnoha různými mutantami, přičemž oligonukleotidy jsou navázány na hybridizační membránu a hybridizovány se značenou cílovou DNA.
Jinak může být užita metoda alelicky specifické amplifikace, která závisí na selektivní PCR amplifikaci, ve spojení s předkládaným vynálezem. Oligonukleotidy použité jako primery pro specifickou amplifikaci mají uprostřed sekvence požadovanou (takže amplifikace závisí na diferenciální hybridizaci) (Gibbs et al. (1989) Nud. Acids Res. 17: 2 437-2 448) nebo na 3 konci jednoho příměru kde za vhodných podmínek neshoda sekvence může předejít nebo alespoň redu50 kovat polymerázovou extenxi (Prossner (1993) Tibtech 11: 238). Kromě toho může být potřeby vnést nové restrikcní místo do úseku mutace, aby se tak vytvořilo štěpné místo umožňující následnou detekci (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell. Probes 6: 1). Lze předpokládat, že v určitých provedeních amplifikaci může být amplifikace prováděna užitím Taq ligázy pro amplifikaci (Barany (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 189). V takovém případě ligace nastane jen tehdy, když existuje dokonalá shoda na 3' konci 5' sekvence, což umožňuje detekovat přítomnost
-43CZ 299161 B6 známé mutace na specifickém místě tím, že se zjišťuje přítomnost nebo nepřítomnost amplifikace.
Metody popsané výše mohou být prováděny například tím, že se využije předem připravená diagnostická souprava, která obsahuje alespoň jednu sondu nukleové kyseliny nebo protilátku podle vynálezu, a která může být snadno použita, např. pro stanovení diagnózy pacienta vykazujícího klinické symptomy nebo v anamnéze rodinný výskyt nemoci zahrnující BAFF-R gen.
Kromě toho k provádění prognostických testů popsaných zde v mohou být použity jakékoliv buněčné typy nebo tkáně, ve kterých je BAFF-R exprimován. Tedy může být užit jakýkoliv biologický vzorek obsahující jaderné buňky, včetně například buněk z bukální sliznice.
Farmakogenomika
Činidla nebo modulátory mající stimulační nebo inhibiční účinek na aktivitu BAFF-R (např. expresi genu BAFF-R), které byly identifikovány screeningovými testy popsanými v předkládaném vynálezu, mohou být podávány jedincům při léčení (profylaktickém nebo terapeutickém) nemocí a stavů, např. stavů spojených s rakovinným onemocněním nebo autoimunitních patologických stavů. V souvislosti s takovým typem léčení přichází do úvahy farmakogenomika (tj.
zkoumání vztahu mezi genotypem jedince a reakcí na cizorodou sloučeninu nebo léčivo). Rozdíly v metabolismu léčiva mohou vést k závažné toxicitě nebo terapeutickému selhání tím, že se změní vztah mezi dávkou a koncentrací farmakologicky účinné látky v krvi. Farmakogenomika jedince umožňuje, aby výběr účinného činidla (např. léku) pro profylaktickou nebo terapeutickou léčbu byl založen na zvážení genotypu jedince. Taková farmakogenomika může být dále použita k určení vhodných dávek a terapeutických režimů. V souladu s tím aktivita BAFF-R proteinu, exprese BAFF-R nukleových kyselin nebo obsah mutací BAFF-R genů individuálních pacientů mohou sloužit k výběru vhodného činidla pro terapeutickou nebo proíylaktickou léčbu individuálního pacienta.
Farmakogenomika se zabývá klinicky významnými dědičnými variacemi v reakci na léky v důsledku změněných dispozic k léčivu a abnormálního působení u postižených osob. Viz např. Eichelbaum (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23: 983-985 a Linder (1997) Clin. Chez. 43: 254-266. Obecně se rozlišují dva typy farmakogenetických stavů. Genetické stavy přenášené jako jednoduchý faktor pozměňující způsob, jak léčivo působí na organismus (tj. změněný účinek léku) nebo genetické stavy přenášené jako jednoduchý faktor pozměňující způsob, jak organismus působí na léčivo (změněný metabolismus léku). Tyto farmakogenetické stavy nastávají buďto jako unikátní defekty, nebo jako polymorfismy. Tak například deficience glukóza-6-fosfát dehydrogenázy (G6PD) je obecná dědičná enzymopatie, kde hlavní klinická komplikace je hemolýza po požití oxidačních léčiv (antimalarik, sulfonamidu, analgetik nebo nitrofuranů) nebo po požití bobů „fava“.
V příkladu provedení aktivita enzymů metabolizujících léčivo je hlavním faktorem, který determinuje jak intenzitu účinku tak trvání účinku léku. Objev genetického polymorfismů enzymů metabolizujících léčiva (např. N-acetyltransferáza 2 (NAT 2) a enzymy cytochrom P450
CYP2D6 a CYP2C19) poskytl vysvětlení pokud jde o to, proč u některých pacientů nedochází k očekávanému účinku léku nebo vykazují zveličenou reakci na lék nebo vážnou toxicitu po aplikaci standardní a bezpečné dávky léku. Tyto polymorfismy jsou exprimovány ve dvou fenotypech v populaci, označovaných jako „dobrý metabolizátor (EM)“ a „špatný metabolizátor“ (PM). Prevalence PM je různá v různých populacích. Například gen kódující CYP2D6 je velmi polymorfní a bylo v něm identifikováno již několik mutací, které všechny vedou k nepřítomnosti funkčního CYP2D6. U špatných metabolizátorů CYP2D6 a CYP2C19 se velmi často vyskytuje zveličená reakce na léčivo a nadměrné vedlejší účinky po aplikaci standardní dávky. Jestliže metabolitem je terapeutik účinná skupina, pak PM nevykazují žádnou terapeutickou reakci, jak bylo demonstrováno na analgetickém účinku kodeinu, který je zprostředkován morfiem, což je metabolit tvořený CYP2D6. Jiným extrémem je tzv. „ultra-rychlý metabolizátor“, který nereagu-44CZ 299161 B6 je na standardní dávky. Nedávno bylo zjištěno, že molekulárním základem ultra-rychlého metabolizmu amplifikace CYP2D6 genu.
Takže aktivita BAFF-R proteinu, exprese nukleové kyseliny BAFF-R nebo mutace obsažené v BAFF-R gen jedince mohou být určovány k tomu, aby sloužily pro výběr vhodných činidel pro terapeutickou nebo proíylaktickou léčbu jednotlivce. Kromě toho farmakogenetické studie mohou být využity pro genotypizaci polymorfních alele kódujících enzymy metabolizující léčiva, pro identifikaci fenotypu reakce na léčivo u jednotlivých osob. Tyto znalosti, když se aplikují na dávkování nebo výběr léku, umožní vyhnout se nežádoucím nepříznivým reakcím nebo terapeu10 tickému selhání a tak zesílí terapeutickou nebo proíylaktickou účinnost při léčení pacienta BAFF-R modulátorem, například modulátorem identifikovaným jedním ze screeningových testů popisovaných v předkládaném vynálezu.
Monitorování klinické účinnosti
Sledování účinku činidla (např. léčiva nebo sloučeniny) na expresi nebo aktivitu BAFF-R (např. schopnost modulovat aberantní proliferaci a/nebo diferenciaci buněk) může být aplikováno nejen při základním screeningu léčiv, ale také při klinických zkouškách. Například účinnost činidla nalezeného pomocí screeningového testu, jak byl popsán v předkládané přihlášce, na zvýšení exprese BAFF-R genu a hladiny proteinu nebo „upregulaci“ BAFF-R aktivity může být monitorována v klinických zkouškách s pacienty, u kterých byla zjištěna snížená exprese BAFF-R genu, hladina proteinu nebo „downregulovaná“ BAFF-R aktivita. Nebo naopak účinnost činidla nalezeného pomocí screeningového testu, jak byl popsán v předkládané přihlášce, na snížení exprese BAFF-R genu a hladiny proteinu nebo „upregulaci“ BAFF-R aktivity může být monitorována v klinických zkouškách s pacienty, u kterých byla zjištěna zvýšená exprese BAFF-R genu, hladina proteinu nebo „uregulovaná“ BAFF-R aktivita. V takových klinických zkouškách exprese nebo aktivita BAFF-R, a výhodně i jiných genů, které se podílejí například na chorobném stavu, mohou být použity jako měřítko nebo markér imunitní citlivosti konkrétní buňky.
Například geny, včetně BAFF-R, které jsou modulovány v buňkách působením činidel (např. sloučenin, léčiv nebo malých molekul), která modulují BAFF-R aktivitu (např. činidel identifikovaných ve screeningovém testu, jak je popsán v předkládané přihlášce) mohou být identifikovány. Tak např. pro výzkum účinku činidla na poruchy buněčném proliferace, například v průběhu klinického testu, mohou být izolovány buňky a z nich připravena RNA a analyzována tak hladina exprese BAFF-R a dalších genů, které se podílejí na chorobném stavu. Hladiny genové exprese (tj. profil genové exprese) může být kvantifikován užitím Northern blot analýzy nebo RT-PCR, jak je popsáno v předkládané přihlášce, nebo alternativně tím, že se měří množství vytvořeného proteinu, a to jednou z metod, jak jsou popsány v předkládané přihlášce, nebo tím, že se měří hladiny aktivity BAFF-R nebo produktů ostatních genů. Tímto způsobem profil genové exprese může sloužit jako markér či ukazatel, svědčící o fyziologické reakci buněk na testované činidlo.
V souladu s tím tento stav reakce (odpovědi) může být určen před zahájením, v různých časových bodech během léčení pacienta testovaným činidlem.
V jednom provedení vynález poskytuje způsob pro monitorování účinnosti léčby pacient činid45 lem (jako je např. agonista, antagonista, protein, peptid, peptidomimetikum, nukleová kyselina, malá molekula nebo jiné léčivo identifikované screeningovými testy popsanými v předkládané přihlášce) zahrnující kroky (i) získání vzorku od pacienta před zahájením podávání činidla pacientovi, (ii) detekce hladiny exprese BAFF-R proteinu, mRNA nebo genomové DNA ve vzorku před léčením, (iii) získání jednoho nebo více vzorků od pacienta v průběhu léčení, (iv) detekce hladiny exprese nebo aktivity BAFF-R proteinu, mRNA nebo genomové DNA ve vzorcích v průběhu léčení, (v) srovnání hladiny exprese nebo aktivity BAFF-R proteinu, mRNA nebo genomové DNA ve vzorku před zahájením léčení s hladinou exprese nebo aktivity BAFF-R proteinu, mRNA nebo genomové DNA ve vzorku nebo vzorcích v průběhu léčení a (vi) změna podávání činidla pacientovi v souladu s tím, co bylo zjištěno v předchozích krocích. Tak např.
zvýšené podávání činidla může být potřebné pro dosažení zvýšení exprese nebo aktivity BAFF-R
-45CZ 299161 B6 na vyšší hladiny než byly detekovány, tj. zvýšení účinnosti činidla. Nebo naopak snížené podávání činidla může být potřeba ke snížení exprese nebo aktivity BAFF-R na nižší hladiny než detekované, tj. snížení účinnosti činidla.
Léčení
Předkládaný vynález se týká jak proíylaktických tak terapeutických způsobů léčení pacientů, u kterých je riziko (nebojsou vnímaví k) nemoci nebo stavu, nebo již trpí nemocí nebo stavem, které jsou spojeny s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R.
Nemoci a chorobné stavy, které jsou charakterizované zvýšením (relativně vzhledem k pacientovi, který netrpí nemocí ani chorobným stavem) hladiny nebo biologické aktivity, mohou být léčeny léčivy, která jsou antagonisté aktivity (tj. snižují nebo inhibují aktivitu). Léčiva, která antagonizují aktivitu, mohou být využita při terapeutickém nebo proíylaktickém léčení. Léčiva, která mohou být takto použita, zahrnují, ale bez omezení, (i) BAFF-R polypeptid nebo jeho analogy, deriváty, fragmenty nebo homology, (ii) protilátky k BAFF-R peptidu, (iii) nukleové kyseliny kódující BAFF-R peptid, (iv) antisense nukleové kyseliny a nukleové kyseliny, které jsou dysfunkční (tj. z důvodů heterologní inzerce v kódující sekvenci BAFF-R peptidu), sloužící k vyřazení („knock out“) endogenní funkce BAFF-R peptidu homologní rekombinací (viz, např. Capecchi (1989) Science 244: 1288-1292) nebo (v) modulátory (tj., inhibitory, agonisté a antagonisté, včetně dalších peptidomimetik podle vynálezu nebo protilátek specifických k peptidu podle vynálezu), které mění interakci mezi BAFF-R peptidem a jeho vazebným partnerem.
Nemoci a chorobné stavy, které jsou charakterizované sníženou (relativně vzhledem k jedinci, který nemocí nebo chorobným stavem netrpí) hladinou nebo biologickou aktivitou, mohou být léčený podáváním léčiv, která zvyšují (tj. jsou to agonisté) aktivitu. Léčiva, která „uregulují“ aktivitu, mohou být podávána při terapeutickém nebo proíylaktickém léčení. Léčiva, která mohou být použita, zahrnují, ale bez omezení, BAFF-R peptid nebo jeho analogy, deriváty, fragmenty nebo homology, a nebo jeho agonisu, který zvyšuje biologickou dostupnost.
Zvýšené nebo snížené hladiny mohou být snadno detekovány tím, že se kvantifikuje peptid a/nebo RNA, a to tak, že se získá tkáňový vzorek od pacienta (např. z biopsie tkání) a testuje se in vitro na hladiny RNA nebo peptidu, strukturu a/nebo aktivitu exprimovaného peptidu (nebo mRNA BAFF-R peptidu). Metody, které jsou odborníkům dobře známy, zahrnují, ale bez omezení, imunotesty (např. Western blot analýzu, imunoprecipitaci následovanou elektroforézou v polyakryl-amidovém gelu s dodecylsulfátem (SDS-PAGE), imunocytochemickou analýzu apod.) a/nebo hybridizační testy k detekci exprese mRNA (např. Northern blot, „tečkový“ blot, in šitu hybridizace apod.).
V jednom aspektu se vynález týká prevence u pacienta nemoci nebo stavu spojených s aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R podáváním pacientovi činidla, které moduluje BAFF-R expresi nebo alespoň jednu BAFF-R aktivitu. Pacienti s rizikem nemoci nebo chorobného stavu, které jsou způsobeny nebo se na nich podílejí aberantní exprese nebo aktivita BAFF-R, mohou být identifikováni, například jakoukoliv kombinací z diagnostických nebo prognostických testů, jak byly popsáno v předkládané přihlášce. Podávání profylaktického činidla může nastat před projevem symptomů charakteristických pro poruchu spojenou s BAFF-R, takže se poruše nebo nemoci zabrání, nebo se oddálí její průběh. V závislosti na typu BAFF-R odchylky, pro léčení pacienta se užije například BAFF-R agonistické nebo BAFF-R antagonistické činidlo. Vhodné činidlo může být nalezeno způsobem podle screeningových testů popsaných v předkládané přihlášce.
Další aspekt vynálezu se týká způsobů modulace exprese nebo aktivity BAFF-R pro terapeutický účely. Způsob modulace podle vynálezu zahrnuje kontaktování buňky s činidlem, které moduluje jednu nebo více aktivit BAFF-R proteinu spojené s buňkou. Činidlo, které moduluje aktivitu
BAFF-R proteinu, může být činidlo, jak je popsáno v předkládané přihlášce, jako například
-46CZ 299161 B6 nukleová kyselina nebo protein, přirozeně se vyskytující ligand BAFF-R proteinu, peptid, BAFF-R peptidomimetikum nebo jiná malá molekula. V jednom provedení činidlo stimuluje jednu nebo více aktivit BAFF-R proteinu. K příkladům takových stimulačních činidel patří aktivní BAFF-R protein a molekula nukleové kyseliny kódující BAFF-R, které byly vneseny do buň5 ky. V dalším provedení činidlo inhibuje jednu nebo více aktivit BAFF-R proteinu. K příkladům takového inhibičního činidla patří antisense nukleové kyseliny BAFF-R a anti-BAFF-R protilátky. Tito modulační způsoby mohou být prováděny in vitro (např. tím, že se kultivují buňky společně s činidlem) nebo také in vivo (např. tím, že podává činidlo pacientovi). Takže předkládaný vynález se týká léčení jedince postiženého nemocí nebo chorobným stavem, které jsou charakterizované aberantní expresí nebo aktivitou BAFF-R proteinu nebo molekuly nukleové kyseliny. V jednom provedení způsob zahrnuje podávání činidla (např. činidla identifikovaného screeningem podle předkládané přihlášky) nebo kombinace činidel, která modulují (např. „uregulují“ neboli zesilují nebo „downregulují“ neboli zeslabují) expresi nebo aktivitu BAFF-R. V dalším provedení způsob zahrnuje podávání BAFF-R proteinu nebo molekuly nukleové kyseliny jakožto terapie kompenzující sníženou nebo aberantní expresi nebo aktivitu BAFF-R.
V jednom provedení se vynález týká způsobů použití BAFF-R. Zahrnuty zde jsou způsoby inhibice růstu B lymfocytů, růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami a produkce imunoglobulinů ve zvířeti použitím BAFF-R polypeptidů obsahujícího alespoň část
BAFF-R vázající BAFF. Jiné provedení se týká způsobu stimulace růstu B lymfocytů, růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami a produkce imunoglobulinů ve zvířeti použitím BAFF-R polypeptidů (například transfekcí buněk, které postrádají BAFF-R, vektory umožňujícími účinnou expresi BAFF-R, a nebo tím, že se podávají protilátky, které vážou BAFF-R a napodobují tak BAFF).
V dalším provedení se vynález týká použití BAFF-R při léčení autoimunních nemocí, hypertenze, kardiovaskulárních chorob, onemocnění ledvin, lymfoproliferativních chorobných stavů B lymfocytů, imunosupresivních nemocí, transplantace orgánů a HIV. Také jsou zahrnuty způsoby použití činidla pro léčení, potlačení nebo změnu imunitní reakce zahrnující signální dráhu mezi
BAFF-R a jeho ligandem a způsoby inhibice zánětu podáváním protilátky specifické pro BAFFR nebo jeho epitop.
Způsoby podle předkládaného vynálezu jsou výhodně prováděny podáváním terapeuticky účinného množství BAFF-R polypeptidů, chimérické molekuly obsahující BAFF-R polypeptid fúzo35 váný s heterologní aminokyselinovou sekvencí nebo homologu anti-BAFF-R protilátky.
V dalším provedení předkládaný vynález poskytuje farmaceutické přípravky obsahující BAFF-R polypeptid a farmaceuticky přijatelný excipient.
V dalším provedení vynález poskytuje chimérické molekuly obsahující BAFF—R polypeptid fúzovaný s heterologním polypeptidem nebo aminokyselinovou sekvencí. Příkladem takové chimérické molekuly je molekula, která obsahuje BAFF-R fúzovaný k Fc úseku imunoglobulinů nebo epitopovou značkovací („tag“) sekvenci.
V dalším provedení vynález poskytuje protilátku, která se specificky váže na BAFF-R polypeptid. Volitelně je protilátka monoklonální protilátka.
V jednom provedení vynálezu se vynález týká léčení savce na nemoc, která je spojena s nežádoucí buněčnou proliferací, podáváním terapeuticky účinného množství přípravku obsahujícího
BAFF-R antagonistu, kde BAFF-R antagonista obsahuje polypeptid, který antagonizuje interakci mezi BAFF a jeho receptorem nebo receptory, s farmaceuticky přijatelný nosič.
Ve výhodném provedení je receptor rozpoznávající BAFF na povrch buňky BAFF-R.
-47CZ 299161 B6
Způsoby podle vynálezu mohou být použity s kterýmkoliv BAFF-R antagonistou, který obsahuje polypeptid, který antagonizuje interakci mezi BAFF a jeho příslušným receptorem nebo receptory. Příklady BAFF-R antagonistu zahrnují, ale bez omezení, rozpustný BAFF-R polypeptid, roz5 pustné chimérické BAFF-R molekuly, zahrnující bez omezení BAFF-R-IgG-Fc a homology anti-BAFF-R protilátky.
Způsoby podle vynálezu mohou být použity na jakékoliv stavy spojené s nežádoucí buněčnou proliferací. Zejména způsoby podle předkládaného vynálezu jsou užitečné při léčení nádorových buněk, které exprimují BAFF a/nebo BAFF-R.
Například karcinomy, jejichž buněčná proliferace je modulována BAFF, mohou být vyhledávány měřením in vitro hladiny BAFF a/nebo BAFF-R mRNA exprese v knihovnách z nádorových tkání. Knihovny nádorových tkání, kde je silně exprimována BAFF a/nebo BAFF-R mRNA by pak byly kandidáti. Alternativně lze vyhledávat kandidáty ve veřejných a soukromých databázích (např. Incyte databáze) užitím například kompletní humánní BAFF cDNA sekvence.
BAFF-R antagonisté podle předkládaného vynálezu, kteří jsou pro použití při léčení stavů spojených s nežádoucí buněčnou proliferací, konkrétně při protinádorové terapii, výhodně inhibují nádorový buněčný růst více než z 10 %, 20 %, 30 % nebo 40 % a výhodně více než z 50 %. BAFF-R antagonisté jsou získáni pomocí screeningu. Například BAFF-R antagonisté mohou být selektováni na základě rostoucí inhibiční aktivity (tj., vyšší než 10%, 20%, 30%, 40% nebo 50%) na buňky HT29 humánního karcinomu tračníku nebo buňky A549 humánního karcinomu plic.
Další provedení vynálezu se týká způsobů inhibice růstu B lymfocytů a jiných lymfocytů („nonB lymfocytů), růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami nebo tvorby imunoglobulinů ve zvířeti s použitím BAFF-R polypeptidů, jak bylo popsáno výše.
Způsob inhibice růstu B lymfocytů a jiných lymfocytů („non-B lymfocytů), růstu a zrání B lym30 focytů indukovaného dendritickými buňkami nebo tvorby imunoglobulinů může také zahrnovat podávání anti-BAFF-R protilátky (polyklonální nebo monoklonální), která se váže na BAFF-R a inhibuje vazbu BAFF k BAFF-R. Podávání protilátky tak inhibuje růst B lymfocytů a jiných lymfocytů („non-B lymfocytů), růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami a tvorbu imunoglobulinů. Množství protilátky, které může být vhodné použít, může být extrapo35 lováno pomocí in vivo dat, prezentovaných v předkládané přihlášce. Odborníkům jsou známy různé metody pro extrapolaci dávky z pokusů na zvířatech, např. založené na tělesná hmotnost nebo velikosti povrchu.
V některých provedeních vynálezu BAFF-R:Fc polypeptidy nebo anti-BAFF-R protilátky jsou podávány v množství přibližně 1 až 20 mg/kg/dávka. Dávky mohou být podávány dvakrát týdně, jednou týdně, jednou za dva týdny nebo jednou měsíčně, v závislosti na tom, jak je to potřeba. Lékař je schopný určit řádnou dávku stanovením v porovnání s omezením jakýkoliv vedlejších nežádoucích účinků terapie.
V dalším provedení se vynález týká použití BAFF-R nebo anti BAFF-R protilátky v léčbě autoimunní nemocí, hypertenze, kardiovaskulárních nemocí, onemocnění ledvin, lympfoproliferativních chorob B lymfocytů, imunosupresivních nemocí, transplantaci orgánů, zánětů a HIV. Zahrnuty jsou také použití činidla pro léčení, potlačení nebo změnu imunitní reakce zahrnující signální dráhu mezi BAFF-R a jeho ligandem.
Způsoby inhibice agregace exprimovaných proteinů, BAFF-R a BAFF-R:Fc
Předkládaný vynález také poskytuje způsob inhibice nebo snížení agregace exprimovaného proteinu, konkrétně humánního BAFF-R nebo huBAFF-R:Fc, který má tendenci agregovat během exprese, což znesnadňuje purifikaci a snižuje výtěžek. Ve způsobu podle vynálezu aminokyseli-48CZ 299161 B6 nová sekvence proteinu, který inklinuje k agregaci, když je exprimován v rekombinantním systému, je porovnána s aminokyselinovou sekvencí homologního proteinu, který projevuje méně agregační aktivity. Tyto dva homology budou mít konzervativní domény a nekonzervativní aminokyseliny mezi nimi a možná i roztroušené uvnitř. Obecně, alespoň jedna z nekonzervativ5 nich aminokyselin agregujícího proteinu může být substituována aminokyselinou z homologa, která zmenší agregaci. V některých provedeních vynálezu jsou substituovány nepolární aminokyseliny. Nepolární aminokyseliny zahrnují glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan a cystein. V jiných provedeních nepolární aminokyseliny jsou nahrazeny jinými nepolárními aminokyselinami. Výhodné nepolární aminokyseliny, které inhibují nebo snižují agregaci, jsou prolin a alanin. V jiném provedení je nepolární aminokyselina nahrazena polární aminokyselinou bez náboje. Polární aminokyseliny bez náboje zahrnují asparagin, glutamin, serin, threonin a tyrosin.
Ve způsobech podle vynálezu jsou provedeny takové substituce, které jsou výhodné pro zacho15 vání biologické aktivity proteinu. Obecně, nekonzervativní aminokyseliny jsou vhodnější pro substituce bez znatelné změny biologické aktivity.
Ve specifickém příkladu způsobu podle vynálezu, humánní BAFF-R protein může mít substituce aminokyselin v polohách V20, P21, A22 a L27 podle SEKV. ID. Č. 5 (nebo V41, P42, A43 aL48 podle SEKV. ID. Č. 12) a různých jejich kombinacích, což výrazně snižuje agregaci proteinu. Podobné strategie mohou být použity i pro jiné proteiny, který inklinují k agregaci, když jsou exprimovány v rekombinantních systémech. Bez ohledu na jakékoliv teorie vysvětlující mechanismus, má se za to, že substituce nepolární aminokyseliny polární aminokyselinou bez náboje poskytuje proteinu rozpustnost a narušuje agregaci nepolárních úseků propteinu.
Předkládaný vynález není nijak omezen rozsahem specifických provedení popisovaných v předkládané přihlášce. Naopak odborníkovi je na základě popisu a obrázků jasné, že kromě popsaných provedení jsou možné různé modifikace, které také spadají do rozsahu vynálezu definovaného připojenými patentovými nároky.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Tento příklad popisuje molekulární klonování BAFF-R, nového receptoru pro BAFF.
Materiál a metody cDNA knihovna byla pomocí oligo-dT primerů připravena z buněk BJAB, linie humánních B lymfocytů, které váží humánní BAFF, a směrově klonována do expresního vektoru CH269. CH269 je derivát pCEP4 (Invitrogen), který obsahuje CMV promotor řídicí expresí klonované DNA, a také obsahuje oriP EBV. Ten umožňuje mnohočetnou autonomní replikaci těchto plaz45 midů v buňkách, které jsou trvale transformovány EBNA-1, jako jsou například buňky 293EBNA. BJAB cDNA knihovna byla transfekována do buněk E. coli DH10B buňky a nasazena ve formátu 96jamkových destiček jako pool přibližně po 2500 nezávislých klonech na jamku. DNA byl připravena z poolo pomocí zařízení Qiagen BioRobot 9600. DNA pooly byly transfekovány s použitím Lipofektaminu (Life Technologie) do buněk 293EBNA vysetých na fibronektinem potažené ójamkové kultivační misky. 48 hodin po transfekci bylo médium odstraněno a buňky promyty pufrem pro omývání destičkových testů (20 mM HEPES, 0,5 mg/ml bovinní sérový albumin, 0,1% NaN3). Buněčná monovrstva byla překryta 100 mg/ml biotinylovaného humánního rekombinantního rozpustného myc-BAFF (myc-huBAFF) ve vazebném pufru (PBS, 2% fetální bovinní sérum, 0,1% NaN3) a inkubována při teplotě místnosti po dobu
-49CZ 299161 B6 hodiny. Myc-huBAFF (aminokyseliny 136-285) použitý v testu byl exprimován v Pichia pastoris a purifikován pomocí aniontové výměnné chromatografie následované gelovou filtrací.
Roztok BAFF byl pak odstraněn a buňky byly promyty a fixovány inkubací v 1,8% formaldehyd
- 0,2% glutaraldehyd v PBS po dobu 5 minut. Buňky byly znovu promyty a pak inkubovány po dobu 30 minut se streptavidinem konjugovaným s alkalickou fosfatázou (SAV-AP) (Jackson ImunoResearch) v ředění 1 : 3000 zásobního roztoku ve vazebném pufru. Buňky byly promyty a obarveny rychlou červení s naftolfosfátem (Pierce). Buňky vážící komplexy biotinBAFF/SAV-AP byly identifikovány na základě přítomnosti červeného precipitátu po vyšetření ío pod slabě zvětšujícím mikroskopem. Sekundární screening byl proveden vysetím glycerolových zásobních roztoků buněčných poolů DH10B vážících BAFF jako jednotlivé kolonie, očkování kultur pooly po 100 a opakování BAFF vazebného testu, jak byl popsán výše. Pool pozitivní v sekundárním creeningu byl následně podobně rozdělen na individuální klony a opět testován na BAFF vazbu po transfekci do buněk 293EBNA, jak bylo popsáno výše. Nakonec byla určena
DNA sekvence nezávislých klonů vážících BAFF.
Výsledky
Jeden z klonů vážících BAFF byl klon pJST576. Ten obsahoval inzert velikosti 1201 párů bází (bp) nepočítaje v to poly-A úsek. Sekvence inzertu z pJST576 je ukázána na obr. 1A (SEKV. ID. Č. 1). Analýza programem BLAST tohoto klon ukazovala homologii v Genebank databázi s klonem HS250D10 BAC chromozómu 22 (přístupové číslo Genebank Z99716). Celá pJST576 sekvence byla nalezena v tomto BAC. Homologie byla také zjištěna s 3'-koncem humánního EST klonu AI250289 (IMAGE klon 2000271). EST byl připraven z knihovny humánního foliku25 lámího lymfomu. EST AI250289 byl získán od firmy Incyte a byla stanovena sekvence inzertu (Obr. 1B) (SEKV. ID. Č. 2). Tato sekvence obsahuje navíc 15 bp z 5'-konce pJST576 sekvence, které jsou souhlasné s genomovou sekvencí, a 23 bp, které nejsou. Zbytek EST sekvence má dokonalou homologii s pJST576. V těchto klonech nebyl identifikován otevřený čtecí rámec.
Příklad 2
V tomto příkladu bylo zjištěno, že JST576 cDNA obsahuje intron, a pak byl nalezen otevřený čtecí rámec.
Prediktivní program GENSCAN (Burge, C. & Karlin, S. J. (1997) Mol. Biol. 268: 78-94) pro vyhledávání exonů byl aplikován na JST576 cDNA sekvenci. Výsledky tohoto programu předpověděly, že v cDNA je přítomen intron. Aby bylo potvrzeno, že predikce je správná, byla provedena PCR analýza na prvním vláknu cDNA ze 2 buněčných linií exprimujících JST576. RNA byla purifikována přibližně z 107 buněk BJAB nebo IM-9 s použitím soupravy RNEASY (Qiagen) podle protokolu výrobce. RNA byla kvantifikována a 5 pg bylo použito pro syntézu prvního vlákna cDNA v reakci s použitím soupravy Superscript Preamplification Kit (Life Technologies). Jak oligo dT, tak i náhodné hexamery byly použity pro syntézu prvního vlákna. Syntéza prvního vlákna byla provedena podle výrobcem doporučeného protokolu. Tři (1 z každé reakce), 10 ng JST576, nebo žádná DNA, pak bylo použito jako templát pro PCR s použitím oligonukleotidů obklopujících předpovězený intron. Oligonukleotidy použité v této reakci byly: 5'-oligo BAF-225 [5'-GGCCGAGTGCTTCGACCTGCT-3'] (SEKV. ID. Č. 33) nebo BAF-226 [5'-GGTCCGCCACTGCGTGGCCTG-3'] (SEKV. ID. Č. 34) a 3'-oligo BAF-191 [51CACCAAGACGGCCGGCCCTGA-3'] (SEKV. ID. Č. 35). Každá reakce obsahovala 1 x Pfu pufr (Stratagene), 200 pM dNTPs, 10% DMSO, 150 ng každého oligo a 1,25 jednotky Turbo Pfu polymerázy (Stratagene). Reakce byly prováděny v 35 cyklech s 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po dobu 1 minuta a 72 °C po dobu 1,5 minuty. Deset μΐ z každé reakce pak bylo naneseno na 1% agarózový gel. Zbývající produkty z BJAB a IM-9 BAF-225/191 reakce byly purifikovány s použitím soupravy pro purifikaci PCR produktů High Pure PCR (Roche Molecular Bioche55 micals) a získaný produkt byl podroben DNA sekvencování. Kromě toho byly připraveny PCR
-50CZ 299161 B6 produkty s použitím primerů BAF-225 a BAF-191 z cDNA klidových B lymfocytů, subklonovány a individuální klony pak byly sekvencovány. V tomto případě bylo použito 5 μΐ cDNA B lymfocytů (Clontech) v PCR reakci s BAF-225 a BAF-191 primery, jak bylo popsáno výše. PCR produkt pak byl purifikován s použitím soupravy pro purifikaci PCR produktů High Pure PCR a koncentrován. Pro subklonování PCR fragmentu byly konce fragmentu fosforylovány a zatupeny s použitím ligační soupravy Sure Cloně (Amersham Pharmacia Biotechnologies) podle doporučeného protokolu. Výsledný produkt byl klonován do EcoRV místa v pBluescriptlI (Stratagene) a transformován do E. coli. byly vypěstovány individuální kolonie a byla provedena minipreparace plazmidové DNA. Šest nezávislých klonů bylo nakonec sekvencováno.
Výsledky
Nukleotidová sekvence JST576 a odpovídající programem GENSCAN predikovaná aminokyselinová sekvence jsou uvedeny na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3). PCR produkty z BJAB a IM9 reakce obsahující předpovězený intron jsou ukázány na obr. 2B a potvrzují tak existenci intronu v cDNA klonu JST576. Předpovězená velikost PCR produktu z JST576 cDNA je přibližně 788 bp pro BAF-225/BAF-191 a 767 bp pro BAF-226/BAF-191. PCR produkty získané z JST576 templátu byly přibližně této velikosti (dráhy 10 a 11). PCR produkty získané použitím BAF-225/BAF-191 na prvním vláknu cDNA BJAB nebo IM-9 připraveném pomocí oligo dT primerů (dráhy 2 a 6) jsou stejná velikosti a významně kratší než produkty z JST576 cDNA. Předpovězená velikost tohoto fragmentu bez předpovězeného intronu je 484 bp. Velikost PCR produktů je v souladu s touto velikostí. Stejné výsledky byly získány, jestliže BJAB nebo IM-9 RNA byly v reakci s náhodnými hexameiy jako primery (dráhy 4 a 8). Reakce s použitím BAF-226BAF-191 neběžela na templátu prvního vlákna cDNA. Proto se zdá, že intron předpovězený programem
GENSCAN existuje v JST576 cDNA. Sekvence sestřiženého produktu z BJAB a IM-9 RNA byla potvrzena sekvencováním hlavního PCR produktu a je zobrazena v sekvenci uvedené zde na obr. 2C (SEKV. ID. Č. 4). Sekvence je totožná se sekvencí uvedenou na obr. 2A (SEKV. ID. Č. 3), s výjimkou nepřítomnosti alaninového kodonu (GCA) v nukleotidu 149 (ukázáno jako malá písmena). Výsledky sekvencování 6 nezávislých klonů z RT-PCR reakcí na cDNA z klidových B lymfocytů ukázalo, že obě sestřihová akceptorová místa jsou užita. Výhodné akceptorové místo se zdá vést k jednomu alaninovému zbytku (5/6 klonů). Nicméně sekvence předpovězená programem GENSCAN (SEKV. ID. Č. 3), která obsahuje dva alaniny, byl pozorována u 1/6 klonů. Proto byl určen otevřený čtecí rámec pro humánní JST576 a jednoaminokyselinová sestřihová varianta byla určena. Otevřený čtecí rámec předpovídá protein sestávající ze 184 aminokyselin, uvedený na obr. 2D (SEKV. ID. Č. 5). Alaninový (A) zbytek ukázaný tučně reprezentuje sestřiženou variantu. Tento protein je označován jako BAFF—R. Dedukovaná aminokyselinová sekvence BAFF-R obsahuje hydrofobní úsek zahrnující zbytky 72-100 (podle Hopp-Woodsova algoritmu) a potenciální transmembránový segment zahrnující zbytky 84-102, jak bylo analyzováno algoritmem TMPred. Tento úsek je následován vysoce nabitým úsekem aminokyselin, který může fungovat jako signál pro zastavení přenosu („stop transfer signál“). BAFF-R postrádá N—koncovou signální sekvenci a jedná se tedy o membránový protein typu III podobný jiným BAFF vážícím proteinům BCMA (Laabi et al. (1992) EMBO J. 11:3 897-3 904) a TACÍ (von Bulow a Bram, (1997) Science 278: 138-141). N-konec je dle předpovědi extracelulární doménou BAFF-R a obsahuje 4 cysteinové motivy v úseku zbytků 19-35 na rozdíl od kteréhokoliv jiného člena TNF receptorové rodiny. C-konec BAFF-R je podle předpovědi intracelulámí doména.
-51 CZ 299161 B6
Příklad 3
Byla určena DNA sekvence v protisměru („upsteram“) od předpokládaného iniciačního methioninu pro humánní BAFF-R zahrnující stop kodon ve shodném čtecím rámci
Metody
Primer BAF-254 (5'GGGCGCCTACAATCTCAGCTA 3') (SEKV. ID. Č. 36) byl připraven podle genomové sekvence přítomný v BAC HS250DLO (Genbank přístup, číslo Z99716), v proio tisměru („upsteam“) od předpokládaného ATG a byl použit v PCR reakci s oligo BAF-236 (5'GGCGGACCAGCAGGTCGAAGCACTC 3’) (SEKV. ID. Č. 37). Templát v reakci bylo první vlákno cDNA připravené z RNA humánní sleziny (Clontech) s použitím PCR preamplifřkační soupravy, podle popisu výrobce (Life Technologies). PCR reakce obsahovala 3 μΐ reakční směsi prvního vlákna, 1 x Pfu pufr (Stratagene), 10% DMSO, 0,2 mM dNTP, 150 ng každého primerů a 1,25 jednotky Pfu Turbo polymerázy (Stratagene). PCR produkt byl purifíkován s použitím purifíkační soupravy High Pure PCR Product Purification (Roche Molecular Biochemicals) podle instrukcí výrobce. Konce PCR produktu byly zaplněny a fosforylovány použitím soupravy Sure Cloně Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotechnologies), klonovány do EcoRV místa v pBSK2 (Stratagene) a transformovány do buněk DH5. Kolonie vzniklé z ligace byly izolovány minipreparací podle instrukcí výrobce soupravy Wizard (Promega) a pak sekvencovány s použitím přístroje ABI.
Výsledky
Sekvence PCR produktu potvrzuje, že mRNA obsahuje sekvenci přímo v protisměru od ATG, která je obsažený v genomové sekvenci. Tato sekvence je zvýrazněna podtržením v sekvenci uvedené na obr. 3. Přítomnost stop kodonu ve shodném čtecím rámci v protisměru („upstream“) a nepřítomnosti dalšího methioninu ukazují, že methionin zjištěný v JST576 cDNA je skutečně správný iniciační methionin.
Příklad 4
Tento příklad popisuje klonování myší BAFF-R cDNA.
Metody
Přibližně jeden milión fagových plaků z cDNA knihovny myší A20 buněčné linie od firmy Stratagene (La Jolla, CA) byl podroben screeningu, jak je popsáno v protokolu výrobce. JST576 humánní BAFF—R cDNA byla štěpena EcoNI a pak dělena na 1% gelu z agarózy s nízkou teplotou tání. Fragment o velikosti 425 bp byl vyříznut z gelu a zvážen. Byl přidán trojnásobek objemu vody a gel s fragmentem byl vařen 5 minut. Fragment byl značen pomocí 50 pCi 32PdCTP (Amersham) v reakční směsi obsahující 50 mM Tris pH 8,5 mM MgCl2, 10 μΐ βmerkaptoethanolu, 200 mM HEPES pH 6,5, 20 μΜ dNTP (kromě dCTP), 0,27 jednotky pd(N)6 hexanukleotidů (Amersham Pharmacia Biotechnology) a 1 jednotku Klenow enzymu (USB) přes noc při teplotě místnosti. Přibližně jeden milión impulzů na 1 ml sondy byl inkubován s filtry v pufru pro screening plaků (50mM Tris, 1% SDS, 1M NC1, 0,1% pyrofosforečnan sodný, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll, 0,2% BSA) přes noc v 65 °C. Filtry pak byly promyty v 2XSSC a 0,1% SDS v 50 °C po dobu 1,5 hodin (3x2 litry) a pak exponovány na rentgenovém filmu po dobu 2 dnů.
Přibližně 36 pozitivních plaků bylo identifikováno. Z těchto bylo 6 purifikováno. Fagemidy byly uvolněny in vivo „vystřižením“ podle protokolu firmy Stratagene. Výsledné kolonie byly kultivovány a DNA pak byla izolována minipreparací (Qiagen). Klony cDNA pak byly sekvencovány.
-52CZ 299161 B6
Výsledky
Myši BAFF-R kanonická sekvence nukleotidová sekvence je uvedena na obr. 4A (SEKV. ID. C. 8) a odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena na obr. 4B (SEKV. ID. C. 9). Tři z klonů obsahovaly deleci 10 aminokyselin zahrnující aminokyseliny 119 až 129 v intracelulámí doméně myšího BAFF-R. Porovnání humánní a myší BAFF-R sekvence ukazuje, že 4 cysteinové zbytky v extracelulámí doméně jsou konzervativní, že poloha iniciačního methioninu je podobná a že Ckoncový úsek proteinu je vysoce konzervativní (obr. 4C), přičemž posledních 24 aminokyselinových zbytků je zcela identických. Sekvence jako celek mají přibližně 56% identitu.
Příklad 5
V tomto příkladu je popsána schopnost humánního rekombinantního rozpustného BAFF vázat se na buňky kotransfekované pJST576 a reportérovým plazmidem GFP Materiál a metody
Reportérovy plazmid kóduje GFP molekulu zakotvenou v membráně a umožňuje rozlišit trans20 fekované buňky od netransfekovaných buněk. 293EBNA buňky byly kotransfekovány tímto reportérovým plazmidem a pJST576 s použitím Lipofektaminu 2000 (Life Technologies). 18 až 20 hodin po transfekci buňky byly uvolněny z destiček užitím 5mM EDTA v PBS a spočítány. Buňky byly promyty dvakrát FACS pufrem (PBS obsahující 10% fetální bovinní sérum, 0,1% NaN3) a 2,5 x 105 buněk bylo inkubováno po dobu 1 hodiny na ledu s biotinylovaným myc-huBAFF naředěným ve FACS pufru v rozsahu koncentrací 8 ng/ml až 5 pg/ml. Buňky byly promyty FACS pufrem a inkubovány po dobu 30 minut se streptavidinem konjugovaným na fykoerytrin (SAV-PE) (Jackson ImunoResearch) v ředění ze zásobního roztoku 1 : 100. Buňky byly znovu promyty FACS pufrem a resuspendovány v 1% paraformaldehydu ve FACS pufru. Buňky byly analyzovány FACS na GFP a PE fluorescenci a data pak byla vynesena v obvyklém čtyřkvadrantovém bodovém grafu. Body ve dvou pravých kvadrantech představují buňky exprimující transfekovaný reportérovy GFP. Body ve dvou horních kvadrantech představují buňky mající návazný biotinylovaný myc-huBAFF. Kde je tato vazba detekována SAV-PE. Buňky v horním pravém kvadrantu jsou tedy transfekované buňky, které vážou biotinylovaný mychuBAFF.
Výsledky
Neoznačené (neobarvené) buňky a buňky označené jen SAV-PE přibližně z 50 % jsou GFP pozitivní a byly kotransfekovány s reportérovým plazmidem (obr. 5). Když buňky kotransfekova40 né GFP reportérovým plazmidem a pJST576 jsou označeny 1 pg/ml biotinylovaného myc— huBAFF, pak se téměř všechny buňky z dolního pravého kvadrantu posunou nahoru, což ukazovat navázání BAFF. Podobný výsledek byl pozorován, jestliže plazmid exprimující huTACI byl kotransfekován místo z pJST576. Je známo, že TACÍ váže BAFF. Buňky byly označeny pětinásobným ředěním biotinylovaného myc-huBAFF z 5 pg/ml na 8 ng/ml a když se koncent45 race biotinylovaného myc-huBAFF snižovala, zmenšovala se i velikost posunu.
-53CZ 299161 B6
Příklad 6
V tomto příkladu je popsána schopnost humánního rekombinantního rozpustného BAFF nebo myšího rekombinantního rozpustného BAFF vázat se na buňky kotransfekované pJST576 a reportérovým plazmidem GFP.
Materiál a metody
Kotransfekce buněk 293EBNA byla již popsána v příkladu 5. 18 až 20 hodin po transfekci byly ío buňky uvolněny, spočítány a označeny (obarveny) pro FACS analýzu podobnou jak byla popsána v příkladu 5, avšak s následující modifikacemi. Buňky byly inkubovány po dobu 1 hodiny na ledu s 5 pg/ml buďto myšího, nebo humánního rekombinantního rozpustného flag-BAFF, pak následovalo promytí a inkubace po dobu 30 minut s 5 pg/ml anti-flag monoklonální protilátka
M2 (Sigma Aldrich), a nakonec detekce inkubací promytých buněk po dobu 30 minut s PE kon15 jugovaným oslím anti-myším IgG (Jackson ImunoResearch) v ředění zásobního roztoku 1 : 100.
Buňky byly znovu promyty, fixovány paraformaldehydem a analyzovány FACS na GFP a PE pozitivní buňky.
Výsledky
Přibližně 50 % buněk bylo GFP pozitivních a mají proto kontransfekovaný reportérovy plazmid (obr. 6). Když buňky kotransfekované GFP reportérovým plazmidem a pJST576 byly označeny 5 pg/ml buďto humánního, nebo myšího rekombinantního rozpustného flag-BAFF, téměř všechny buňky v dolním pravém kvadrantu se posunuly nahoru. Tento ukazuje, že jak myší, tak humánní BAFF se vážou k buňkám transfekovaným pJST576.
Příklad 7
V tomto příkladu je demonstrována neschopnost myšího rekombinantního rozpustného APRÍL vázat se k buňkám kotransfokovaným pJST576 a reportérovým plazmidem GFP.
Materiál a metody
Kotransfekce buněk 293EBNA byla provedena jak bylo již popsáno v příkladu 5. 18 až 20 hodin po transfekci byly buňky odděleny, spočítány a označeny (obarveny) pro FACS analýzu podobně jako v příkladu 5, ale s následujícími modifikacemi. Buňky byly inkubovány po dobu 1 hodiny na ledu s 1 pg/ml myšího rekombinantního rozpustného myc-APRIL, pak následovalo promytí a poté inkubace po dobu 30 minut s 5 pg/ml anti-myší APRÍL monoklonální protilátkou, pak následovala 30minutová inkubace promytých buněk s 5 pg/ml biotinylovaného anti—potkaního IgG2b (Pharmingen) a konečně detekce inkubací promytých buněk po dobu 30 minut s SAV-PE. Buňky byly znovu promyty, fixovány paraformaldehydem a analyzovány FACS na GFP a PE pozitivní buňky.
Výsledky
Přibližně 50 % buněk bylo GFP pozitivních a mají proto kontransfekovaný reportérovy plazmid (obr. 7). Když buňky kotransfekované GFP reportérovým plazmidem a pJST576 byly označeny 5 pg/ml myšího myc-APRIL, žádná z buněk dolního kvadrantu se neposunula do horního. To je v protikladu k buňkám, které kotransfokovaným plazmidem exprimujícím humánní TACÍ místo pJST576. Z těchto transfekovaných buněk téměř všechny byly pozitivní na vazbu k myšímu myc-APRIL. Již dříve bylo ukázáno, že jak BAFF, tak i APRÍL se váží jak na TACÍ, tak i BCMA. Tudíž fakt, že APRÍL se neváže na BAFF-R jak je exprimován na pJST576 transfekovaných buňkách ukazuje specifitu BAFF-R pro BAFF.
-54CZ 299161 B6
Příklad 8
Tento příklad popisuje schopnost BAFF-R exprimovaného z pJST576 být koimunoprecipitován rekombinantním rozpustným humánním flag-BAFF.
Materiál a metody
Buňky 293EBNA byly transfekovány pomocí Lipofektaminu 2000 plazmidem pJST576, nebo pouze kontrolním vektorem nebo plazmidem exprimujícím huTACI jako pozitivní kontrola pro ío BAFF vazbu. Po 20 hodinové inkubaci bylo transfekcní médium odsáto, buňky promyty PBS a médium bylo nahrazeno 35S značeným médiem (9 dílů DMEM bez methioninu a cysteinu a 1 díl kompletního DMEM, doplněno 10% dialyzovaným fetálním bovinním sérem, 4 mM glutaminu a 100pCi/ml 35S methioninu a cysteinu (Translabel, ICN Radiochemicals). Buňky byly inkubovány v tomto médiu po šest hodin a pak bylo médium odstraněno. Buňky byly promyty PBS a pak solubilizovány 250 μΐ extrakčního pufru (1% Brij 98,150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5). Koimunoprecipitace byly prováděny tak, že se inkubovalo 75 μΐ 35S značeného buněčného extraktu s 5 μg rekombinantního rozpustného humánního flag-BAFF v 1 ml DMEM, 10% fetální bovinní sérum, 0,1% NaN3 přes noc ve 4 °C. Pak byly přidána anti-flag monoklonální protilátka M2, 10 pg, a protein A-sefaróza, a inkubace pokračovala po dobu 2 hodin.
Sefarózové perličky byly sklizeny centrifugací, promyty FACS pufrem a resuspendovány v SDS nanášecím pufru s beta-merkaptoethanolem jako redukčním činidlem. Vzorky byly 5 minut povařeny, krátce stočeny, aby se odstranily sefarózové perličky a alikvoty pak byly naneseny na SDS-PAGE. Gel byl inkubován s Enlightning (New England Nuclear), usušen a exponován na film při -80 °C.
Výsledky
Při koimunoprecipitaci se váže flag-BAFF k sefarózovým perličkám s proteinem A prostřednictvím anti-flag protilátky M2. To znamená, že se naváže také jakýkoliv protein z buněč30 ného extraktu, který se váže k flag-BAFF a tento radioaktivně značený protein pak bude detekován autoradiografií. Jelikož buňky 293EBNA samy nevážou BAFF, kontrola s prázdným vektorem ukázala toto pozadí, které je nevyhnutelnou složkou měření (viz obr 8). Když byly extrakty z buněk transfekovaných TACÍ koimunoprecipitovány s flag-BAFF, byl detekován pás se zjevnou molekulovou hmotnosti přibližně 34 kDa. To je přibližně předpovězená molekulová hmot35 nost kompletního humánního TACÍ (31,2 kDa), proteinu, který váže BAFF. Když byl extrakty z buněk transfekovaných pJST576 koimunoprecipitovány s flag-BAFF, byl detekován pás se zjevnou molekulovou hmotnosti přibližně 12 kDa. Předpovězená molekulová hmotnost pro BAFF-R exprimovaný z pJST576 je 18,9 kDa. Neshoda mezi předpovězenou a pozorovanou molekulovou hmotností by mohla být způsobena neobvyklou elektroforetickou pohyblivostí danou buďto nábojem, nebo konformací BAFF—R. Další možností je, že pás velikosti 12 kDa představuje proteolytický fragment BAFF-R.
Příklad 9
Tento příklad popisuje přípravu rozpustných forem BAFF-R.
Oligonukleotidové příměry komplementární k pJST576 byly navrženy pro PCR amplifikaci BAFF-R extracelulámí domény bez přítomnosti transmembránové a intracelulámí domény.
Typicky jedna taková doména zahrnovala větší úsek „stonku“ nebo aminokyselinový úsek mezi doménou vázající ligand a transmembránovou doménou. Bylo možné měnit podíl stonkového úseku, aby se optimalizovala účinnost výsledného rozpustného receptoru. Tento amplifikovaný fragment byl geneticky upraven pomocí vhodných restrikčních míst, aby bylo možné klonování různých heterologních vedoucích sekvencí na 5'-konec fragmentu a k různým Ig fúzním chimé55 rickým vektorům na 3'-konci. Nebo je možné provést inzerci stop signálu na 3'-konci BAFF-R
-55CZ 299161 B6 extracelulámí domény a připravit tak rozpustnou formu receptoru nebo použití dalšího C-koncového fúzního partnera místo použití Ig fúzní chiméry. Také je možné připlavit N-koncový fúzní protein, sestávající z fúzního partnera obsahujícího signální sekvenci, po které následuje N-koncová extracelulámí doména BAFF-R. Výsledné vektory mohou být exprimovány ve většině systémů používaných v biotechnologii včetně kvasinek, hmyzích buněk, bakterie a savčí buněk, a příklady existují pro všechny tyto typy exprese. Různé humánní Fc domény mohou být připojeny pro optimalizaci nebo eliminaci FcR a komplementární interakce, pokud je to třeba. Alternativně mohou být užity mutované formy těchto Fc domén pro selektivní odstranit FcR nebo komplementárních interakcí nebo pro připojení N-navázaných cukrů k Fc doméně, což může mít určité výhody. Jeden příklad BAFF-R:Fc fúzní molekuly je ukázán na obr. 9. Tato molekula obsahuje vedoucí sekvenci typu I z myšího genu Ig-k spojený restrikčním místem Aat2k k extracelulámí doméně BAFF-R (aminokyselinové zbytky 2 až 71 jak je uvedeno na obrázku 2D), která je zase spojena restrikčním místem Sáli k Fc doméně humánního IgGl.
Příklad 10
V tomto příkladu je demonstrován expresní profil (Northern blot analýzou) BAFF-R v humánních tkáních a buněčných liniích.
Materiál a metody
Různé buněčné linie B lymfocytů a jiných buněk (non-B linie) byly pěstovány za vhodných podmínek. RNA byla připravena přibližně z 107 buněk s použitím soupravy Rneasy (Qiagen). RNA byly kvantifikovány a 20 pg každého vzorku bylo analyzováno na 1,2% formaldehydovém gelu, jak je popsáno v Sambrook et al. MOLECUFAR CFON1NG: A FABORATORY MANUAF, 1989. RNA z gelu byla přenesena („blotována“) na nylonovou membránu (BMB) a pak fixována (zesítěním) ultrafialovým zářením (UV). Bylo zakoupeno několik membrán pro Northern bloty s humánní tkání (12 dráhový multi-tkáňový humánní systém II a imunitní systémový II od firmy
Clontech). Filtry byly prehybridizovány v 65 °C v pufru ExpressHyb (Clontech) po dobu 30 minut a pak hybridizovány s EcoNI fragmentem z 3'-konce JST576 náhodně značeným 32p po dobu přibližně 3 hodin. Filtry pak byly promývány při teplotě místnosti ve 2X SSC/0,05% SDS po dobu 45 minut, a pak v 50 °C v 0,1 X SSC/0,1% SDS po dobu 45 minut. Filtry pak byly exponovány na rentgenové filmy po dobu 4 dnů s použitím zesilujícího stínítka. Navíc několik Northern blotů z humánních tkání (12 dráhový multi-tkáňový humánní systém II a imunitní systémový II od firmy Clontech) bylo zakoupeno a hybridizováno se sondou JST576, jak bylo popsáno výše. Výsledky mRNA pro BAFF—R se zdá být v převládající míře exprimována v orgánech imunitního systému při této hladině detekce. Nej vyšší hladina byla zjištěna ve slezině a lymfatických uzlinách, ale mRNA byla také detekována v PBLS, thymu, tenkém střevu a tračníku (obr. 10, B a C). Přibližná velikost mRNA je 4,5 kb, takže se zdá, že se jedná o dvě populace mRNA ve vzorkách, kde není gen silně exprimován. Dvě mRNA zřejmě existují ve slezině a také v lymfatických uzlinách.
To může indikovat, že BAFF-R má alternativní místa napojení polyA nebo že RNA podstupuje alternativní sestřih. Když byl vyšetřen pro přítomnost BAFF-R mRNA větší počet buněčných linií, stejná 4,5 kb mRNA byla detekována. Jen linie B lymfocytů exprimují BAFF-R mRNA (obr. 11). Žádná mRNA nebyla detekována v buněčné linii U266, RPMI8226 a Daudi ani v nonB buněčných liniích.
-56CZ 299161 B6
Příklad 11
V tomto příkladu je ukázáno, že JST576 exprese je omezena na buněčné linie, které vážou BAFF.
Materiál a metody
Buněčné linie byly zakoupeny od ATCC a pěstovány v doporučených podmínkách. Různé buněčné linie B lymfocytů a jiných buněk (non-B linie) byly pěstovány za vhodných podmínek. RNA byla připravena přibližně z 107 buněk s použitím soupravy Rneasy (Qiagen). RNA byly ío kvantifikovány a 20 pg každého vzorku bylo analyzováno na 1,2% formaldehydovém gelu, jak je popsáno v Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1989.
RNA z gelu byla přenesena („blotována“) na nylonovou membránu (BMB) a pak fixována (zesílením) ultrafialovým zářením (UV). Filtry byly hybridizovány se sondou JST576, jak bylo popsáno v příkladu 10. Buňky pak byly testována na jejich schopnost vázat BAFF s použitím FACS analýzy. Přibližně 2,5 až 5 x 105 buněk byly sebráno a promyto. FLAG-značený BAFF, naředěný v PBS + 5 % FCS a 0,05% azidu sodném (FACS pufr), byl inkubován s buňkami v rozmezí koncentrací (8 - 0,125 μΐ/ml) po dobu 30 minut na ledu. Buňky byly promyty FACS pufrem a inkubovány po dobu 30 minut na ledu s anti-FLAG monoklonální protilátka M2 (Sigma) v 5 pg/ml. Znovu byly buňky promyty FACS pufrem a pak inkubovány s 1 : 5000 ředěním kozí anti-myši
IgG PE konjugované protilátky (Jackson Imuno Research) 30 minut na ledu. Buňky byly promyty jak výše popsáno a pak analyzovány průtokovou cytometrií FACSCALIBUR (Bectondickinson) s použitím programového vybavení CellQuest.
Výsledky
Výsledky BAFF vazebných experimentů jsou uvedeny v tabulce 1. Buněčné linie, který vážou BAFF, jsou Ramos, Namalwa, IM-9, NC-37, Ráji, BJAB a SKW64. Hladina vazby je indikována počtem znamének +. Buněčné linie, který nevážou BAFF, jsou U266, RPMI 8226, Daudi, U937, Jurkat, HT29, A549, SW480 a ME260. Schopnost buněčné linie vázat BAFF korelovala s přítomností BAFF-R mRNA, jak je ukázáno na obr. 11.
Tabulka 1
Buněčná linie typ Vazba BAFF
BJAB Burkittův lymfom +++
IM-9 Lymfoblast IgG +++
NC-37 Lymfoblast EBV+ ++
Ramos Burkittův lymfom EBV- ++
Ráji Burkittův lymfom ++
SKW6,4 Lymfoblast IgM ++
Namalwa Burkittův lymfom +
Daudi Burkittův lymfom EBV+ -
U266 Plazmacytom -
RPMI 8226 Plazmacytom -
U937 Monocyt -
Jurkat T lymfocytárni leukémie -
HT29 Kolorektélni adenokarcinom
A549 Plicni karcinom -
SW480 Kolorektálni adenokarcinom -
ME260 Melanom
Příklad 12
Tento příklad popisuje schopnost huBAFF-R:hugGl fúzního proteinu, který je exprimován a sekretován do kondicionovaného média transientně transfekováných buněk 293EBNA, koimu10 noprecipitovat rekombinantní rozpustný biotinylovaný myc-huBAFF.
Materiál a metody
Buňky 293EBNA byly transfekovány užitím Lipofektaminu 2000 (LifeTechnologies) buďto pJST618, který exprimuje huBAFF-R (aa2-71): Fc, plazmidem exprimujícím huBCMA: hulgGI jako pozitivní kontrola pro BAFF vazbu, nebo plazmidem exprimujícím huFN14: hulgGI jako negativní kontrola pro BAFF vazba. Po 24 hodinách inkubace byla odebrána kondicionovaná média.
SDS-PAGE byla provedena smícháním stejného objemu 2X SDS testového pufru s redukčním činidlem nebo bez něho, s kondicionovaným médiem a pak povařením po dobu 5 minut. Vzorky byly pak analyzovány na gradientovém 4 až 20% SDS-polyakrylamidovém gelu. Známá množství purifikovaného hBCMA:Fc byla analyzována na sousedních dráhách pro stanovení množství hlgGl fúzního proteinu v kondicionovaném médiu. Vzorky byly přeneseny na membránu (Immobillon P, Millipore) Western blotem v pufru 0,01M CAPS, pHl 1, 10% MeOH. Membrány byly blokovány s 5% odtučněným sušeným mlékem (NFDM) v TBST a pak inkubovány se sondou kozí anti-humánní IgG-HRP v ředění 1 : 3000 (Jackson ImunoResearch) po dobu 1 hodiny, promyty v TBST a exponovány na film. Koimunoprecipitace byly prováděny tak, že se inkubovalo 200 μΐ kondicionovaného média s 200 ng rekombinantního rozpustného humánního flag30 BAFF v 1 ml DMEM, 10% fetální bovinní sérum, 0,1% NaN3 přes noc ve 4 °C. Protein A-sefa-58CZ 299161 B6 róza byla přidána a inkubace pokračovala po dobu 2 hodin. Sefarózové perličky pak byly sebrány centrifugách promyty FACS TBST pufrem a resuspendovány v SDS nanášecím pufru s betamerkaptoethanolem jako redukčním činidlem. Vzorky byly vařeny 5 minut, stočeny krátce pro odstranění sefarózových perliček a alikvoty pak byly naneseny na SDS-PAGE. FLAG-huBAFF,
50 ng, byl analyzován současně jakožto pozitivní kontrola. Vzorky byly přeneseny na PVDF membránu (Immobillon P, Millipore) Western blotem v pufru 0,01M CAPS, pHl 1, 10% MeOH. Membrány byly blokovány 5% NFDM-TBST, a pak inkubovány se sondou 1 pg/ml anti-FLAG M2-HRP po dobu 1 hodinu, promyty v TBST a exponovány na film.
ío Výsledky
Koimunoprecipitace strhává různé fuze receptor: Fc fúze tím, že fúzní partner interaguje s proteinem A sefarózou. To znamená, že také agreguje jakékoliv proteiny interagující s fúzí R:IgGl, jako například flag-BAFF. Kondicionovaná média z buněk exprimujících hBCMA:Fc jsou schopná koimunoprecipitovat flag-BAFF, podle očekávání, jako pás, který migruje společně s flag-BAFF podle analýzy na Western blotu (obr. 12). Kondicionovaná média z buněk exprimujících hFN14: Fc nepůsobí koimunoprecipitaci flag-BAFF. Kondicionovaná média z buněk exprimujících BAFF-R:Fc jsou schopná koimunoprecipitovat flag-BAFF. Pás, který společně migruje s flag-BAFF byl pozorován na Western blotu a má podobnou intenzitu jako při koimu20 noprecipitaci s huBCMA:hu!gG 1.
Příklad 13
Tento příklad ukazuje schopnost BAFF-R:Fc fúzního proteinu, konkrétně huBAFF-R(aa2-71): hulgGI, blokovat vazbu huBAFF na buňky BJAB.
Materiál a metody huBAFF-R (2-71)-huIgGl fúze popsaná v příkladu 9 byla připravena a nazvána pJST618. Tento konstrukt byl transientně transfekován do buněk 293EBNA a ubylo získáno kondicionované médium. Fúzní protein byl purifikován kyselou elucí z protein A sefarózy a následně gelovou filtrační chromatografií. Biotinylovaný myc-huBAFF, 200 ng/ml, byl preinkubován s buďto 50 pl FACS pufru, nebo s pěti násobným sériovým ředěním, v rozmezí od z 5 pg/ml do
2 00 ng/ml, purifikovaného huBAFF-R:Fc po dobu 30 minut na ledu. Buňky BJAB (2,5 χ 105 buněk) byly pak inkubovány s těmito roztoky na ledu jednu hodinu. Buňky byly promyty FACS pufrem a označeny (obarveny) užitím SAV-PE. Buňky byly analyzovány FACS na PE fluorescenci a data byla prezentována ve formátu překrývajících se histogramů. Alternativně 200 ng/ml biotinylovaného BAFF bylo preinkubováno s dvojnásobným sériovým ředěním buďto hBAFF40 R:Fc, hTACFFc, nebo hLTBR:Fc. Buňky byly obarveny na vazbu s biotinylovaným BAFF jak bylo popsáno výše.
Výsledky
Obrázek 13A ukazuje překrývající se histogramy vynesené do grafu pro huBAFF vazbu k BJAB v přítomnosti různých koncentrací huBAFF-R:Fc. Černá čára označená „A“ reprezentuje „základní“ hladinu („šum“) vazby SAV-PE a červená čára označená „E“ reprezentuje buňky obarvené biotinylovaným myc-huBAFF bez preinkubace s BAFF-R:Fc. Preinkubace biotinylovaného myc-huBAFF s 5 pg/ml huBAFF-R:Fc vedla k posunu v histogramu téměř k základní linii (křivka B). Preinkubace s buďto 1 pg /ml (křivka C), nebo 200 ng/ml (křivka D) huBAFFR-huígGl vedla přibližně ke čtyřnásobnému poklesu vazby biotinylovaného myc-huBAFF.
Obrázek 13B ukazuje, že jak BAFF-R:Fc, tak TACEFc jsou schopné blokovat BAFF vazbu na BJAB buňky. Preinkubace s LTBR:Fc nemá žádný BAFF blokující účinek.
-59CZ 299161 B6
Příklad 14
Tento příklad popisuje schopnost fúzního proteinu BAFF-R:IgGl blokovat proliferaci B lymfocytů indukovanou BAFF.
Materiál a metody
Pro in vitro proliferační test byly myší B lymfocyty izolovány ze sleziny C57B16 myší (8 týdnů starých) s použitím izolační kolony pro B lymfocyty (izolační kolona Cellect™ pro myší B lym10 focyty od firmy Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Kanada.) Purifikované B lymfocyty byly analyzovány FACS a > 90% bylo zjištěno jako pozitivní na B220 značení (barvení). B lymfocyty byly inkubovány v 96 jamkových destičkách (105 buněk/jamka v 50 ml RPMI doplněném 10% FBS) po dobu 72 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti 2 mg/ml kozí anti-humánní mřetězcové protilátky (Sigma Chemical Co.), kontrolní hlgG 10 mg/ml, a huBAFF-R:Fc,
10 mg/ml. Vzorky byly ve třech opakováních naneseny na misky s uvedenými koncentracemi myc-hBAFF. Buňky byly pulzně značeny dalších 18 hodin s [3H] thymidinem (1 pCi/jamka) a pak odebrány. Inkorporace [3H] thymidinu byla monitorována kapalinovou scintilaci. Humánní BAFF-R:Fc fúzní protein, připravený jak bylo popsáno v příkladu 13, byl použit v tomto testu, jak bylo diskutováno v příkladu 9, a byl získán ze supematantu 293EBNA buněk transfeko20 váných pJST618. Supematant byl získán, nanesen na kolonu s proteinem A eluován kyselinou, neutralizován a pak podroben gelové filtrační chromatografií, aby byla získána frakce huBAFFR:Fc proteinu bez agregátů. BAFF použitý v tomto testu byl exprimován v Pichia pastoris a purifikován aniontovou výměnnou chromatografií následovanou gelovou filtrací.
Výsledky
Obrázek 14 ukazuje, že BAFF může kostimulovat růst B lymfocytů za přítomnosti anti-m protilátky (čtverečky) a hlgG (trojúhelníky). BAFF samotný (kosočtverečky) není schopen indukovat proliferaci B lymfocytů. Inkubace s 10 mg/ml huBAFF-R: Fc (hvězdičky) vede k úplné inhibici proliferace B lymfocytů indukované BAFF.
Příklad 15
Materiál a metody Myši
Šest týdnů staré samice BALB/C myší byly získány od firmy The Jackson Laboratory (Bar Har40 bor, ME) a chovány v chráněných podmínkách chovné stanice Biogen.
Činidla a léčebný režim
Receptorové fúzní proteiny obsahují humánní IgGl Fc úsek. Myši (5/skupina) dostávaly ip (intraperitoneálně) dávku 200 pg fúzního proteinu (myší BAFF-R:Fc nebo humánní BAFFR:Fc) 2x týdně po dobu 4 týdny. Kontrolní myši dostávaly polyklonální humánní IgG (PanglobulinTM) (HlgG), 200 pg 2x týdně po dobu 4 týdnů. Tři dny po poslední dávce byla odebrána krev z orbitálního sinusu a pak byly myši utraceny a byly odebrány sleziny, lymfatické uzliny a kostní dřeň pro další analýzy.
Průtoková cytometrická analýza
V okamžiku utracení byla zaznamenána hmotnost sleziny. Ze sleziny a krve pak byla připravena suspenze jednotlivých buněk po lýzy červených krvinek v hypotonickém roztoku. Suspenze jed55 notlivých buněk byla také připravena z tříselních lymfatických uzlin a kostní dřeně. Průtoková
-60CZ 299161 B6 cytometrie byla prováděna s použitím monoklonálních protilátek (mAb) proti B220, IgM, IgD aCD21. Subpopulace B lymfocytů ve slezině byla definována jako folikulámí (B220+, IgM Iow, CD21low), marginální zóny (B220+, IgMhl, CD21hl) a nově vytvořená (B220+, IgMhl, CD21-). Stručně shrnuto, 1,5 χ 106 buněk bylo inkubováno s 10 pg/ml činidla Fc Block (Pharmingen) po dobu 10 minut na ledu pro zablokování Fc receptoru, následovalo přidání fluorescenčně značených monoklonálních protilátek inkubace na ledu po dobu 30 minut. Buňky byly promyty Ix a resuspendovány v 0,5% paraformaldehydu. Data fluorescence buněk byla získána užitím průtokového cytometru FACSCALIBUR (Becton Dickinson, San Jose, CA) a analyzována užitím softwaru CellQuest (Becton Dickinson).
Výsledky
Po 4týdenním podávání myšího nebo humánního BAFF-R:Fc bylo zjištěno výrazné snížení hmotnost sleziny u myší léčených jak myším, tak i humánním BAFF-R: Fc (obr. 15), a sice ve srovnání s kontrolními myšmi, kterým byl podáván humánní IgG. Zjevný pokles slezinných buněk byl zřejmě důsledkem snížení počtu B lymfocytů sleziny. Průměrný počet všech B220+ B lymfocytů sleziny u myší léčených myším a humánním BAFF-R:Fc byl 1,8 χ 106 a 2,6 χ 106 buněk, v daném pořadí, a byl významně snížen ve srovnání k počet B lymfocytů u kontrolních zvířat, kterým byl podáván HlgG, kde byl průměr 19,8 χ 106 buněk (obr. 16). Vyšetření různých subpopulací B lymfocytů sleziny, a sice folikulární, marginální zóny a nově vytvořených, ukázalo, že počty B lymfocytů v každé subpopulací byl redukován u myší léčených BAFF-R:Fc (viz tabulka 2), přičemž k největšímu snížení došlo u folikulámích B lymfocytů a B lymfocytů maginální zóny.
Tabulka 2
Podávání BAFF-R:Fc vede ke zmenšení subpopulací B lymfocytů ve slezině
Subpopulace B lymfocytů (10* buněk ± směr. odchyl.)
Folikulární Marginální zóna Nově vytvořené
Humánní IgG 14,5 ± 2,4 1,1 ± 0,3 1,5 ± 0,2
mBAFF-R:Fc 0,7 ± 0,1 0,06 ± 0,02 0,4 ± 0,1
hBAFF-R:Fc 1,4 ± 0,5 0,05 ± 0,02 0,5 ± 0,2
- -Myším bylo podáno 200 pg HlgG, mBAFF-R-Fc nebo hBAFF-R-Fc 1., 4., 8., 11., 15., 18., 22. a 25. den. Myši byly utraceny 28. den, byly jim odebrány sleziny a byly analyzovány subpopulace B lymfocytů.
Vyšetření procenta B220+ B lymfocytů v tříselných lymfatických uzlinách (LN) ukázalo, že průměrné populace B lymfocytů byly významně redukovány u myší léčených myším a humánním BAFF-R: Fc, a sice 12,3 %± l.,4 a 18,6 %± 1,3, v daném pořadí, ve srovnání s kontrolními myšmi léčenými HlgG, které měly průměr B lymfocytů 30,8 % ± 4,1 (obr. 17). Podobné výsled40 ky byly získány, když byly vyšetřeny B lymfocyty periferní krve. 42,5 % ± 2,9 z lymfocytů umyší léčených humánním IgG-byly B lymfocyty, zatímco jen 21,2% ±6,1 a 8,3% ±4,5 z lymfocytů byly B lymfocyty u myší léčených myším a humánním BAFF-R:Fc, v daném pořadí (obr. 18).
-61 CZ 299161 B6
Ačkoli populace nově vytvořených (nezralých) B lymfocytů a zralých B lymfocytů byly redukovány u myší léčených BAFF-R:Fc, prekurzory B lymfocytů v kostní dřeni zůstaly ovlivněny (data neuvedena).
Diskuse
Tyto výsledky naznačují existenci in vivo blokování BAFF rozpustným receptorovým fúzním proteinem BAFF-R, které vede k inhibici přežívání a/nebo zrání B lymfocytů.
Tyto výsledky také naznačují možnosti potenciálního použití fúzního proteinu BAFF-R jako léčiva s klinickými aplikacemi při nemocech zprostředkovaných B lymfocyty. K těmto nemocem patří onemocnění autoimunitní povahy jako je například systémový lupus erythematosus, revmatoidní artritida, myasthenia gravis, autoimunní hemolytická anémie, idiopatická thrombocytopenia purpura, anti-fosfolipidový syndrom, Chagasova nemoc, Gravesova nemoc, Wegenerova granulomatóza, polyarteritis nodosa a rychle progresivní glomerulonephritis. Terapeutické agens má také má aplikace při nemocech plazmatických buněk jako například mnohonásobný myelom, Waldenstromova makroglobulinémie, nemoc těžkých řetězců, primární nebo s imunocyty-aociovaná amyloidóza a monoklonální gammopatie neurčeného významu (MGUS). K onkologickým cílům patří karcinomy B lymfocytů, leukémie a lymfómy.
Příklad 16
V tomto příkladu je popsána charakterizace počátečního panelu myších monoklonálních proti25 látek připravených proti extracelulámí doméně BAFF-R. Všechny tyto protilátky rozpoznávají extracelulámí doménu BAFF-R a podmnožina těchto protilátek má antagonistické vlastnosti, takže zabraňuje následné vazbě BAFF na BAFF-R.
Materiál a metody
RBF myši byly imunizovány dávkou a pak i posilovači dávkou huBAFF-R:Fc. Standardním postupem byly připraveny hybridomy, a sice tak, že splenocyty z takto imunizovaných myší byly fúzovány s buněčným kmenem myšího myelomu FF653, což je derivát kmenu P3-X63AgS.653
Kondicionovaná média z hybridomových klonů sekretu jících protilátky proti extracelulámí doméně huBAFFR byla testována užitím FACS. FACS vazebné testy byly prováděny s buňkami 293EBNA kotransfekovanými plazmidy exprimující kompletní huBAFF-R nebo muBAFF-R a GFP, jak bylo popsáno v příkladu 5. Hybridomová kondicionovaná média byla naředěna 1:10 FACS pufirem a inkubována s transfekovanými buňkami 30 minut na ledu. Buňky byly promyty
FACS pufrem a vazba byla detekována inkubací s anti-myším IgG (H+L) (Jackson ImunoResearch) v ředění 1 : 100 po dobu 30 minut na ledu. Buňky byly znovu promyty FACS pufrem a resuspendovány v 1% paraformaldehydu ve FACS pufru. Buňky pak byly analyzovány FACS na GFP a PE fluorescenci a data byla získána ve formátu čtyřkvadrantového bodového grafu, jak bylo popsáno v příkladu 5. Blokovací testy BAFF byly prováděny tak, že se inkubovalo 10 pg/ml anti-BAFF-R mAb purifikované na proteinu A nebo kontrolní protilátky (MOP C21) s BJAB buňkami po dobu 30 minut na ledu. Po promytí byly buňky inkubovány s 250 ng/ml biotinylovaného huBAFF po dobu 30 minut na ledu. Buňky byly znovu promyty a navázání BAFF bylo detekováno inkubací se SAV-PE. Buňky byly analyzovány FACS na PE fluorescenci a data byla vynesena do grafu jak překrývající se histogramy.
Výsledky
Bylo pozorováno, že supematanty z deseti klonů vážou huBAFF-R transfekované buňky. Bodové graíy FACS dat pro čtyři z deseti anti-BAFF-R supematantů jsou ukázány na obr. 19A.
Transfekční účinnost byla přibližně 50 %, a téměř všechny transfekované buňky se přesunuly do
-62CZ 299161 B6 horního pravého kvadrantu po značení supematantem. Žádný z těchto deseti supematantů nevázal 293EBNA buňky transfekované muBAFFR (data nejsou ukázána). Kondicionovaná média z klonů, které byly pozitivní na vazbu k BAFF-R, byla testována na schopnost blokovat interakci BAFF s BAFF-R exprimovaným na povrchu BJAB buněk. BJAB buňky exprimují BAFFR na svém povrchu a přitom neexprimují žádné detekovatelné množství BCMA ani TACÍ (Thompson et al. (2001) Science, Aug 16). Dva z deseti hybridomů, klony 2 a 9, vytvořily monoklonální protilátky (mAb), které byly schopny blokovat interakci BAFF-R s BAFF (klon 2 byl uložen v ATCC 6. září 2001 jako anti-BAFF-R klon č. 2.1 (IgGl-kappa izotop), klon 9 byl uložen vATCC 6. září 2001 jako anti-BAFF-R klon č. 9.1 (IgGl-kappa izotyp)). Překryvy histoio gramů na obr. 19B ukazují, že preinkubace s 10 pg/ml buďto mAb klonu 2 (křivka (b)), nebo klonu 9 (křivka (c)) posune BAFF vazebnou křivka více než desetinásobně do leva, téměř k signálu odpovídajícímu kontrole bez BAFF (křivka (a)). Pravý histogram (křivka (d)) ukazuje posun, když kontrolní mAb MOP C21, tj. anti-BAFF-R neblokující mAb, nebo vůbec žádný protein, byly inkubovány s buňkami před vazbou BAFF.
Příklad 17
Tento příklad popisuje konstrukci, sekvenci a proteinové charakteristiky substitucí aminokyselin v hBAFF-R(2-71)-Fc, které vedly ke zvýšení rozpustnosti rekombinantně exprimované molekuly·
Materiál a metody
Dvojvláknové oligonukleotidové kazety s kohezivními konci byly použity k vnesení substituce do cílového zbytky ligací do téhož místa v genu pro hBAFF-R(2-71):IgGl.
Expresní plazmidy byly transfekovány do 293EBNA buněk s použitím Lipofektaminu 2000 jako v příkladu 5. Agregace byla určena tím, že byl vzorek kondicionovaného média 20 hodin po transfekci analyzován neredukující SDS-PAGE elektroforézou následovanou Western blotem a detekcí s HRP konjugovaným anti-humánním IgG (1 : 100, Jackson ImunoResearch) a ECL detekcí jako v příkladu 12.
Imunoprecipitační experimenty byly prováděna se 100 pl kondicionovaného média 20 hodin po transfekci v 1 ml DMEM/10% FBS/0,2% NaA3 s 200 ng flag-huBAFF. Vzorky byly míchány kýváním po dobu 30 minut ve 4 °C, do každé zkumavky bylo přidáno 30 μΐ sefarózy s proteinem A a kývání pokračovalo dalších 30 minut. Sefarózové perličky byly stočeny a promyty třikrát 1 ml chladného PBS. Perličky byly resuspendovány ve 2X SDS redukčním pufru a naneseny na 4 až 20% akrylamidový gel. Po Western blotu, jak byl popsán výše, byla detekována schopnost imunoprecipitovat flag-BAFF inkubací filtrů s 1 pg/ml HRP konjugované na anti-flag M2 (Sigma) následovanou ECL detekcí.
Výsledky
Zatímco humánní BAFF-R:Fc silně agreguje, myší BAFF-R:Fc je jen mírně (< 10%) agregovaný. Deleční analýza ukázala, že celá C-koncová část BAFF-R může být odstraněna od A71 až po V36 (poslední Cys z domény bohaté na cystein, CRD, je C35) aniž by došlo ke snížení tvorby agregátů. To by znamenalo, že pro tvorbu agregátů jsou potřebné N-koncový úsek a CRD úsek hBAFFR.
Zpočátku bylo připraveno několik myších-humánních BAFF-R:Fc chimér, kde byly různé velikosti N—koncové humánní BAFF—R sekvence nahrazeny homologním úsekem myší sekvence a analyzovány z hlediska agregace proteinu. Aminokyselinové sekvence těchto a dalších substituci v hBAFF—R:Fc jsou ukázány na obrázku 20. Tento obrázek ukazuje BAFF—R skupiny jak humánní (Obr. 9), tak myší BAFF-R:Fc divoký typu s číslováním odpovídajícím aminokyse-63CZ 299161 B6 línovým zbytkům kompletního humánního (obr. 2d) (SEKV. ID. Č. 5) nebo myšího BAFF-R (obr. 4b) (SEKV. ID. Č. 9). Obrázek 20 také ukazuje hBAFFR-R:Fc klony se substitucemi, kde jsou substituovaná zbytky vyznačeny tučně a červeně podtrženy. Chiméry obsahující méně než prvních 21 zbytků (Q21) myší sekvence před přechodem na humánní vykazovaly agregaci podobnou divokému typ hBAFF-R:Fc, nicméně ty, které obsahují alespoň prvních 39 zbytků myší sekvence agregují významně méně, podobně jako mBAFF-R. Z dalších devíti zbytků odlišujících se mezi uvedenými dvěma chimérickými BAFF-R:Fc konstrukty, čtyři z nich se liší mezi myší a humánní sekvenci. To by znamenalo, že alespoň jeden humánní zbytek v úseku mezi 09 a L27, tj. vnitřním úseku CRD, je potřebný pro agregaci.
Standardními postupy byly připraveny konstrukty nahrazující humánní zbytky těmi, které odpovídají myším pouze v těchto 4 polohách nebo jejich podmnožinách. Když jen 4 zbytky, a sice V20N P21Q A22T L27P byly substituovány do humánního BAFF-R, takto modifikovaný BAFF-R:Fc neagregoval. hBAFF-R (V20N P21Q A22T L27P):Fc byl přitom stále ještě schopen interagovat s BAFF, jak ukázala analýza imunoprecipitací. V20N L27P substituce také redukovaly agregaci hBAFF-R:Fc přibližně od 90% do přibližně 10%. Střední hladiny agregace byly pozorovány pro substituce P21Q L27P (40 %), L27P (60 %), V20N L27A (6 %) a V20N L27S (60 %). Žádná z následujících substitucí nevedla ke snížení agreagace proteinu: V20N P21Q A22T, V20N A22T, V20N P21Q, V20N a P21Q.
Příklad 18
Tento příklad popisuje protein p21-Arc asociovaný s BAFF-R. Pro zjištění této interakce byla užita imunoprecipitace.
Metody
Konstrukt obsahující cDNA kódující intracelulámí doménu BAFF-R (BAFF-R-i.c.d.) s myc značkou fúzovanou na N-konec byl připraven a subklonován do plazmid CH269 v místech Nhel (5') a Xhol (3'). 293E buňky byly transfekovány tímto konstruktem a byly lyžovány po 72 hodinách lyzačním pufrem obsahujícím 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF a 1% Brij 97. Buněčné lyzáty byly přečištěny na stolní centrifuze při 10 000 g po dobu 5 minut a pak byly imunoprecipitovány s anti-myc monoklonální protilátkou 9E10. Imuno35 precipitáty byly rozděleny elektroforézou na 10 až 20% SDS PAGE v redukčních podmínkách a byly přeneseny (trans-blotovány) na PVDF membránu. Přenesené proteiny na membráně byly vizualizovány obarvením roztokem 0,2% Ponceau S a úseky odpovídající proteinu specificky asociovanému s BAFF-R byly vyříznuty a podrobeny N-koncové aminokyselinové sekvenční analýze. Vyhledávání v proteinové databázi bez redundance bylo provedeno pomocí algoritmu
PATTERN SEARCH s cílem získat N—koncová sekvenční data.
Výsledky
Jeden z proteinů specificky asociovaných s myc-značenou BAFF-R cytoplazmatickou doménou má zjevnou molekulovou hmotnost 21 kDa. Tento protein byl jednoznačně identifikován jako p21-Arc (proteinový komplex příbuzný aktinu). P21-Arc je složkou proteinu sestávajícího ze sedmi podjednotek nazvaného Arp2/3 komplex, který, jak bylo ukázáno, se účastní polymerizace aktinu (Welcha et al. (1997) J. Cell. Biol. 138: 357). Nedávno bylo publikováno, že protein vázající aktin, filamin, je asociován faktorem 2 asociovaným s receptorem pro nádorový nekrotický faktor (TRAF2) (Leonardi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 271). Takže identifikace p21-Arc v koimunoprecipitátech BAFFR cytoplazmatické domény znamená, že p21-Arc je buďto přímo asociován s BAFFR, nebo je nepřímo asociován a BAFFR prostřednictvím asociace s TRAF2 a/nebo jiným TRAF proteinem, který je zase asociován s BAFFR.
-64CZ 299161 B6
Z předcházejícího podrobného popisu specifických provedení vynálezu je zjevné, že jde o jedinečný vynález. Ačkoliv konkrétní provedení byla podrobně popsána v předkládané přihlášce, bylo to z důvodu poskytnutí příkladu a ilustrace, a rozsah vynálezu není tedy těmito příklady nijak omezen. Je jasné, že lze provést různé substituce, změny a modifikace vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky a rozsahu vynálezu, který je definován připojenými patentovými nároky
-65CZ 299161 B6
Seznam sekvencí <210> 1 <211> 1201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> i gcaccatgag gcgagggccc cggagcctgc gcgtcccggc cgagtgcttc gacctgctgg gcacgccgcg gccgaaaccg ggtaaggggg ggggagaacg gggccccgat cgccagggcg agggctgaaa ggaccstgtg ggcagggcct accgccgcct ctctcscfccc ccttgtccac cagcctegcc cccctccgcc cctccccgtc ctccctccct gtcccstccc gaagcagccg tgcagccgca ggagtsggtg ggcgcggggg tgctctttgg egeecscgeg ctgctgggce gtctggtgag ctggaggcgg cgacagcggc ccgacggaga caaggacgcc ccagagcccc tctctgatgc cacag:tcct gcctggcctc ctggccacag tgtccstgtg ccagccacag agacggccgg ccctgagcaa caatagcagg tetggacccc cagccagggg cttggaaatc gccctctttc tgggaccagg ctaaocctgc cagcccccat ggagtttggt gtgcttgect ccttgaaggt ggtagcccag ctcctgttce taaaagacog cttttaaaat ggggaaggca c
ggggcaggga cgcgccagcc cccacgccct 60 tccgccactg cgtggcctgc gggctcctgc 120 acccacgggg cgcgcggcgc cggcagctgc 180 caggcagagc cccgaccccc gggggcgccg 240 ggaggggccc gcgatcaccg cgtggccctc 300 cgccccccgg ctgtccctec cctccccggc 360 cccgctcctc cctcccctcg gccccctggc 420 gggccagcag ccctgcgccc aggacggcgc 480 ccggcgaggc ggcgctgccc ctgcccgggc 540 tggcactggt cctggcgctg gtectggtgg 600 ggcttcgcgg cgcgtcctcc gcagaggccc 660 tggacaaggt catcattctg tctccgggaa 720 ctcctgggga agacccagga accaccccac 780 agctgggctc cactgaaetg gtgaccacca 840 gagccggcag gaggtggccc ctgccctccc 900 aaattcagct cttcactcca gcatgcacat 960 agaagcacag acactacaga ccacagcatt 1020 ttggcttcag acctcaccat ctttgacagc 1080 tgtgccttca aaaggctggg gcactatgag 1140 ccattaagcc aaaatgaatc tgaaaaaaga 1200
1201
-66CZ 299161 B6 <210> 2 <211> 992 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2
gtcgacccac gcgtccgccc acgcgtccgg tgcggcggcg tcggcaccat gaggcgaggg 60
ccccggagce tgcggggcag ggacgegcca gcccccacge cctgegtccc ggccgagtgc 120
ttcgacctgo tggtccgcca ctgcgtggcc tgcgggctcc tgcgcacgec gcggccgaaa 180
ccgggtaagg gggacccacg gggcgcgcgg cgccggcagc tgcggggaga acggggcccc 240
gatcgccagg gcgcaggcag agccccgacc cccgggggcg ccgagggctg aaaggaccct 300
gtgggcaggg cctggagggg cccgcgatca ccgcgtggcc ctcaccgccg cctctctccc 360
tccccttgtc caccgccccc cggctgtccc tcccctcccc ggccagcctc gcccccctcc 420
gcccctcccc gtccccgctc ctccctcccc tcggccccct ggcctccctc cctgtcccct 480
cocgaagcag ccggggccag cagccctgcg cccaggacgg cgctgcagcc gcaggagtcg 540
gtgggcgcgg gggccggcga ggcggcgctg cccctgcccg ggctgctctt tggcgccccc 600
gcgctgctgg gcctggcact ggtcctggcg ctggtcctgg tgggtctggt gagctggagg 660
cggcgacage ggcggsttcg cggcgcgtce tccgcagagg cecccgacgg agacaaggac 720
gccccagagc ccctggacaa ggtcatcatt ctgtctccgg gaatctctga tgccacagct 780
cctgcctggc ctcctcctgg ggaagaccca ggaaccaccc cacctggcca cagtgtccct 840
gtgccagcca cagagctggg ctccactgaa ctggtgacca ccaagacggc cggccctgag 900
caacaatage agggagccgg caggaggtgg cccctgccct ccctctggac ccccagccag 960
gggcttggaa atcaaattca gctcttcact cc 992
<210> 3 <211> 906 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggcgcgccgc accatgaggc gagggccccg gagcctgcgg ggcagggacg cgccagceco 60 cacgccctgc gtcccggccg agtgcttcga cctgctggtc cgccactgcg tggcctgcgg 120 gctcctgcgc acgccgcggc cgaaaccggc agccggggcc agcagccctg cgcccaggac 180
-67CZ 299161 B6 ggcgctgcag ccgcaggagt cggtgggcgc gggggccggc gaggcggcgc tgcccctgcc 240 cgggctgctc tttgocgccc ccgcgctgct gggcctggca ctggtcctgg cgctggtcct 300 ggtgggtctg gtgagctgga ggcggcgaca gcggcggctt cgcggcgcgt cctccgcaga 360 ggcccccgac ggagacaagg acgccccaga gcccctggac aaggtcatca ttctgtctcc 420 gggaatctct gatgccacag ctcctgcctg gcctcctcct ggggaagacc caggaaccac 480 cccacctggc cacagtgtcc ctgtgccagc cacagagctg ggctccactg aactggtgac 540 caccaagacg gccggccctg agcaacaata geagggagcc ggcaggaggt ggcccctgcc 600 ctccctetgg acccccagcc aggggcttgg aaatcaaatt cagctcttca ctccagcatg 660 cacatgccct ctttctggga ccaggctaac cctgcagaag cacagacact acagaccaca 720 gcattcagcc cccatggagt ttggtgtgct tgcctttggc ttcagacctc accatctttg 780 acageccttg aaggtggtag cccagctcct gttcetgtgc cttcaaaagg ctggggcact 840 atgagtaaaa gaccgctttt aaaatgggga aggeaccatt aagceaaaat gaatctgaaa 900 aaagac 906 <210> 4 <211> 903 <212> DNA <213>Homosapiens <400» 4 ggcgcgccgc accatgaggc gagggccccg gagcctgcgg ggcagggacg cgccagcccc 60 cacgccctgc gtcccggccg agtgcttcga cctgctggtc cgccactgcg tggcctgcgg 120 gctcctgcgc acgccjcggc cgaaaccggc cggggccagc agccctgcgc ccaggacggc 180 gctgcagccg caggagtcgg tgggcgcggg ggccggcgag gcggcgctgc ccctgcccgg 240 gctgctcttt ggcgcccccg cgctgctggg cctggcactg gtcctggcgc tggtcctggt 300 gggtctggtg agctgjaggc ggcgacagcg gcggcttcgc ggcgcgtcct ccgcagaggc 360 ccccgacgga gacaajgacg ccccagagcc cctggacaag gtcatcattc tgtctccggg 420 aatctctgat gccacsgctc ctgcotggcc tcctcctggg gaagacccag gaaccacccc 480 acctggccac agtgtscctg tgccagccac agagctgggc tccactgaac tggtgaccac 540 caagacggcc ggccctgagc aacaatagca gggagccggc aggaggtggc ccctgccctc 600 cctctggacc cccagscagg ggcttggaaa tcaaattcag ctcttcactc cagcatgcac 660 atgccctctt tctgggacca ggctaaccct gcagaagcac agacactaca gaccacagca 720 ttcagccccc atggagtttg gtgtgcttgc ctttggcttc agaccteacc atctttgaea 780 gcccttgaag gtggtagccc agctcctgtt cctgtgcctt caaaaggctg gggcactatg 840 agrtaaaagac cgcttfctaaa atggggaagg caccattaag ccaaaatgaa tctgaaaaaa 900 gac 903
-68CZ 299161 B6 <210> 5 <211> 185 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 5
Met Arg 1 Arg Gly Pro 5 Arg Ser Leu Arg Gly Arg 10 Asp Ala Pro Ala 15 Pro
Thr Pro Cye Val 20 Pro Ala Glu Cys Phe 25 Asp Leu Leu Val Arg 30 His Cys
Val Ala Cys 35 Gly Leu Leu Arg Thr 40 Pro Arg Pro Lys Pro 45 Ala Ala Gly
Ala Ser 50 Ser Pro Ala Pro Arg 55 Thr Ala Leu Gin Pro 60 Gin Glu Ser Val
Gly Ala 65 Gly Ala Gly Glu 70 Ala Ala Leu Pro Leu 75 Pro Gly Leu Leu Phe 80
Gly Ala Pro Ala Leu 85 Leu Gly Leu Ala Leu 90 Val Leu Ala Leu Val 95 Leu
Val Gly Leu Val 100 Ser Trp Arg Arg Arg 105 Gin Arg Arg Leu Arg Gly 110 Ala
Ser Ser Ala 115 Glu Ala Pro Asp Gly 120 Asp Lys Asp Ala Pro 125 Glu Pro Leu
Asp Lys 130 Val Ile Ile Leu Ser 135 Pro Gly Ile Ser Asp 140 Ala Thr Ala Pro
Ala 145 Trp Pro Pro Pro Gly 150 Glu Asp Pro Gly Thr 155 Thr Pro Pro Gly His 160
Ser Val Pro Val Pro 165 Ala Thr Glu Leu Gly 170 Ser Thr Glu Leu Val 175 Thr
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin
180 185
69CZ 299161 B6 <210> 6 <211> 1187 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gggcgcctac aatctsagct actcgggagg ctgaggcaga gaattgtttg aacccgggag 60 geagagcttg cagtgagccg agatagcgcc actccgtctc aaaaaiaaaa aaagaaaaga ecagcaggcg ggggcggggc agggcagagt ggccccggag cccagctcag cctcagtccc aggcgagggc cccggigcct gcggggcagg gccgagtgct tcgac;tgct ggtccgccac cggccgaaac cggccggggc cagcagccct tcggtgggcg cgggggccgg cgaggcggcg cccgcgctgc tgggcjtggc actggtcctg aggcggcgac agcggcggct tcgcggcgcg gacgccccag agccc3tgga caaggtcatc gctcctgcct ggcctcctcc tggggaagac cctgtgecag ccaeagagct gggctccact gagcaacaat agcagggagc cggcaggagg caggggcttg gaaatcaaat tcagctcttc accaggctaa ccctgcagaa gcacagacac tttggtgtgc ttgccxttgg cttcagacct gcccagctcc tgttcctgtg ccttcaaaag taaaatgggg aaggc.iccat taagccaaaa attgcactoc agcctgggcg acagagcgag 120 aaggggggcc ceaggegagc tcggtcccac 180 getccccccg ccccccgctt octccccgag 240 cgcagcttgt gcggcggcgt cggcaccatg 300 gacgcgccag cccccacgcc ctgcgtcccg 360 tgcgtggcct gcgggctcct gcgcacgccg 420 gcgcccagga cggcgctgca gccgcaggag 480 ctgcccctgc ccgggctgct ctttggcgcc 540 gcgctggtcc tggtgggtct ggtgagctgg 600 tcctccgcag aggcccccga cggagacaag 660 attctgtcfcc cgggaatctc tgatgccaca 720 ccaggaaoca ceccacctgg ccacagtgtc 780 gaaetggtga ceaccaagac ggccggccct 840 tggcccctgc cctccctctg gacccccagc 900 actccagcat gcacatgccc tctttctggg 960 tacagaccac agcattcagc ccccatggag 1020 eaccatcttt gacagccctt gaaggtggta 1080 gctggggcac tatgagtaaa agaccgcttt 1140 tgaatctgaa aaaagac 1187 <210> 7 <211> 266 <212> PRT <213> Homo sapiens
-70CZ 299161 B6 <*00» 7
Thr Axg Olu Ala >31u Leu Ala Val Ser Arg Aap Ser Ala Zle Ala Leu l 5 10 15
Gin Pro Gly Arg Gin Ser Olu Thr Pro Ser Gin Lya Lys Lys Lya Lys 20 25 30
Arg Ala Arg Ser Hia Pro Ale
40 45
Pro Pro Ala Pro Arg Phe Leu
55 60
Leu Ser Pro Arg Ser Leu Cys
Gly Thr Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Aap Ala Pro 95 90 95
Ala Pro Thr Pro Tys Val Pro Ala Glu Cye Phe Aap Leu Leu Val Arg 100 105 110
His Cys Val Ala Cya Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lye Pro Ala 115 120 125
Gly Ala Ser Ser ?ro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 130 135 140
Vel Gly Ala Gly .lla Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu 145 150 155 160
Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Oly Leu Ale Leu val Leu Ala Leu Val .165 170 175
Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin Arg. Arg Leu Arg Gly 180 185 190
Ala Ser Ser Ale <31u Ala Pro Aap Gly Aap Lye Aap Ala Pro Glu Pro 195 200 205
Leu Aap Lye val ::le Zle Leu Ser Pro Gly Zle Ser Aap Ale Thr Ala 210 215 220
Pro Ala Trp Pro l»ro Pro Gly Glu Aap Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly 225 330 235 240
Bia Ser Val Pro vel Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Vel 245 250 255
Thr Thr Lys Thr Jda Gly Pro Glu Gin Gin 260 265 <210> 8 <211> 1943 <212> DNA <213> Mus musculus «400» β gaattcggca cgagcccaga efceggaactg teccagctgc atgaggcggc gacatgggcg 60 ccaggagact ccgggv.ccga agccagagga gccgggacag ctcggtgccc acccagtgca 120 ateagaccga gtgcttegac cctctggtga gaaactgcgt gtcctgtgag ctcttccaca 180 cgecggacac tggacntaca agcagcctgg agcctgggae agctctgcag cetcaggagg 240 gctccgcgct gagacccgac gtggcgctgc tcgtcggtgc ccccgcactc ctgggactga 300 tactggcgct gaccctggtg ggtctagtga gtctggtgag ctggaggtgg cgtcaacagc 360 tcaggacggc ctccccagac acttcagaag gagtccagca agagtccctg gaaaatgtct 420 ttgtaccctc ctcagaaacc cctcatgcet cagctcccac ctggcctccg etcaaagaag 480 atgcagacag cgccctgcca cgccacagcg tcecggtgcc cgccacagaa ctgggctcca 540 ccgagctggt gaccaccaag acagctggcc cagagcaata gcagcagtgg aggctggaac 600 ccagggatcfe ctaetgggct tgtggacttc acccaacagc ttgggaaaga acttggccct 660 tcagtgacgg agtcctttgc ctggggggcg aaeccggoag aaeeagaeae cacaggccac 720 atgagattgc ttttgtgtta gctettgact tgagaacgtt ccatttctga gatggttttt 780 aagcctgtgt geettcagat ggttggatag acttgagggt tgcatattta atctctgtag 840 tgagtcggag actggaaact taatctcgtt ctaaaaattt tggattactg ggctggaggt 900 atggctcagc agttcggttt gtgtgctgtt ctagccgagg actccagttg ttcagcttcc 960 cggaactcag atctggcagc ttaagaccac ctgtcactcc agcccctgga acatccttgc 1020 efcceaaaggc accagcactc atttgctcta gagcacacac acacacacac acacacacac 1080 acaeacacae acacacaeat atgcatgcat gcacacttaa aaatgtcaaa attagcggct 1140 ggagaaattc atggtcaaca gcgcttactg tgattccaga ggatgagagt ttgattccca 1200 gaatgcaccg cgggtggctc attactgage ataacttttg cttcagggga cctgatgcct 1260 ctggacttca tgggcatctg tattcacgtg cacatcctac acacacacac acacacacac 1320 acagacatae acacacacac actcttttac aaatgataaa atataagata ggeatggtgg 1380 tacacacctt caatcccaac attggggaag caaaggcagg caggtaactg agttggaggc 1440 catcctggtc tacatagcaa gttccaggct aaccagagct aaatggtgag accaagtctc 1500 aaaataatac tcecccccca aaaaaaaaaa acttttaaat tttgattttt ttcttttatt 1560 attatttttt atattaattt catggtgttt agaagtggta Cacttagatg gtgactaaga 1620 ggaggtaaag ccatcaggac tgagccccca acatacaagg agaaagcaga gacaatgaac 1680 acgcccctct cctgctgtgt gccagctctg gaccaccagc cagagggcaa tcatcagatg 1740 tgggccctag aaccttcaga gecgaaagct aaatcaatct catttctttg taaagctatt 1800 tagccttagg tgttttgtta cggtgatata aaatggacta acacaggcac tatgagtaag 1860 aagcttttct ttgagctggg aaaggtactg ttaaaccaaa attaatctga ataaaaaaag 1920 gctaagggga agacacttaa aaa 1543
-72CZ 299161 B6 <210> 9 <211> 175 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9
Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser 15 10 15
Ser Val Pro Thr 3ln Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu 30 Val
20 25
Arg Asn Cys Val 3er 35 Cys Glu Leu phe 40 His Thr Pro Asp Thr Gly 45 His
Thr Ser Ser Leu >31u 50 Pro Gly Thr Ala 55 Leu Gin Pro 60 Gin Glu Gly Ser
Ala Leu Arg Pro .Asp 65 Val Ala Leu Leu 70 Val Gly Ala 75 Pro Ala Leu Leu 80
Gly Leu Ile Leu Ala 35 Leu Thr Leu Val Gly Leu Val 90 Ser Leu Val 95 Ser
Trp Arg Trp Arg »31n 100 Gin Leu Arg Thr Ala Ser Pro 105 Asp Thr Ser 110 Glu
Gly Val Gin Gin Glu 115 Ser Leu Glu Aan 120 Val Phe Val Pro Ser Ser 125 Glu
Thr Pro Bis Ala Ber 130 Ala Pro Thr Trp 135 Pro Pro Leu 140 Lya Glu Asp Ala
Aap Ser Ala Leu :?ro 145 Arg His Ser Val 150 Pro Val Pro 155 Ala Thr Glu Leu 160
Gly Ser Thr Glu Leu val Thr Thr Lya :.65 <210> 10 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens Thr Ala Gly 170 Pro Glu Gin 175
-73CZ 299161 B6
<400> 10
Met Arg Arg Gly Pro Arg Sec Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 !> 10 15
Thr Pxo Cys Val 3»ro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
35 40 45
Ser Ser Pro 50 :?ro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly
55 60
Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly
65 70 75 80
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val
H5 90 95
Gly Leu Val Ser ’?rp Arg Arg Arg Gin Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser
100 105 110
Ser Ala Glu Ala 3?ro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp
115 120 125
Lys Val Ile Zle Leu Ser Pro Gly Zle Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala
130 135 140
Trp Pro Pro Pro Oly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser
145 150 155 160
Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr
:.65 170 175
Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin
180 <210> 11 <211> 963 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> sig_peptid <222> (1) . . (63) <223> kóduje signální peptid
-74CZ 299161 B6 <220>
<221> různé znaky <222> (64) ..(66) <223> vnáší restrikční místo <220>
<221> různé znaky <222> (67) .. (276) <223> kóduje extracelulární úsek BAFF-R <220>
<221> různé znaky <222> (277) .. (279) <223> vnáší restrikční místo <220>
<221> různé znaky <222> (280)..(950) <223> kóduje humánní IgGl Fc <400> 11 atggagacag acacactcct gttatgggtg gacgtcaggc gagggccccg gagcctgcgg gtcccggccg agtgcttcga ectgctggtc acgccgcggc cgaaaccggc cggggcoagc caggagtcgg tgggcgcggg ggccggcgag ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg aagacaaagc cgcgggagga geagtacaac gtcetgcacc aggaetggct gaatggeaag ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctggtcaaag gcttc :atcc cagcgacatc gagaacaaet acaagaccac gcctcccgtg agcaagctca ccgtgjacaa gagcaggtgg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg fcga
ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 50
ggcagggacg cgccagcccc cacgccctgc 120
cgccactgcg tggcctgcgg gctcctgcgc 180
agccctgcgc ccaggacggc gctgcagccg 240
gcggcggtcg acaaaactca cacatgccca 300
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 360
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 420
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 480
ageacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 540
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagce 500
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 660
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 720
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagocg 780
ttggacteeg acggctcctt cttcctetac 840
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 500
cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa 560 563
-75CZ 299161 B6 <210> 12 <211> 320 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> SIGNÁL <222> (1) . . (21) <223> signální sekvence <220>
<221> různé znaky <222> (22) ..(22) <223> kódováno úsekem vnášejícím restrikční místo <220>
<221> PEPTID <222> (23) . . (92) <223> extracelulární doména BAFF-R <220>
<221> různé znaky <222> (93) ..(93) <223> kódováno úsekem vnášejícím restrikční místo <220>
<221> PEPTID <222> (94) . . (320) <223> Human IgGl:Fc
-76CZ 299161 B6 «400> 12
Met Glu Thr Asp C-hr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp 10
1 !>
Gly Ser Thr Gly Asp 20 Val Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg 25 30
Asp Ala Pro Ala Pro 35 Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe 40 45
Leu Val 50 Arg His (lys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro 55 60
Lys Pro 65 Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu 70 75
Gin Glu Ser Val Gly 85 Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Val Asp 90
His Thr Cys Pro Pro 100 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 105 110
Val Phe Leu Phe Pro 115 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Zle 120 125
Thr Pro 130 Glu Val Thr Cys val Val Val Asp Val Ser His Glu 135 140
Glu Val 145 Lys Phe Jusn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 150 155
Lys Thr Lys Pro Jsxg 165 Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 170
Ser Val Leu Thr Val 180 Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Oly Lys 185 190
Val Pro 15
Oly Arg
Asp Leu
Arg Pro
Gin Pro 80
Lya Thr 95
Pro Ser
Ser Arg
Asp Pro
Asn Ala 160
Val Val 175
Glu Tyr
-77CZ 299161 B6
Lys Cye Lys Val Sex Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 195 200 205
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin 'Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 210 215 220
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 225 230 ' 23S 240
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 245 250 255
Asn Gly Gin Pro Glu· Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 260 265 270
Ser Asp Oly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 275 280 285
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 290 295 300
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 315 320 <210> 13 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Bis Cys Val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Azg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
70
-78CZ 299161 B6 <210> 14 <211> 65 <212> PRT <213> Mus musculus <400» 14
Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser ala Arg Ser Arg Asp Ser Ser 15 10 15
Val Pro Thr Ola Cya Aaa Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg 20 25 30
Asn Cya Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His Thr 35 40 45
Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Gly Ser Ala 50 55 60
Leu <210> 15 <211> 73 <212> PRT <213> Horao sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (1) . . (1) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (2) . . (2) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (5) . . (5) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (6) . . (6) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (7) . . (7) <223> substituce
-79CZ 299161 B6 <220>
<221> VARIANTA <222> {10} . . (10) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (12) .. (12) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (15)..(15) <223> substituce <400> 15
Gly Ala Axg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Axg Ser Arg Asp Ser Pro 15 10 15
Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 20 25 30
His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 50 55 50
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 16 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (1)..(1) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (2)..(2) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (10)..(10) <223> substituce
80CZ 299161 B6 <220>
<221> VARIANTA <222> {12)..(12) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (15)..(15) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (16)..(16) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (17)..(17) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (20) .. (20) <223> substituce <400> 16
Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser Ser 15 10 15
Val Pro Thr Gin Cye val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 20 25 30
His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 50 55 60
Val Gly Al* Gly Ma Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 17 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (1) . . (1) <223> substituce
-81 CZ 299161 B6 <220> .
<221> VARIANTA <222> (2) . . (2) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (5)..(5) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (6) . . (6) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (7)..(7) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (10)..(10) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (12) .. (12) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (15)..(15) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (16)..(16) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (17)..(17) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (20) . . (20) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (22)..(22) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (23)..(23) <2~23> substituce
-82CZ 299161 B6
<220>
<221> VARIANTA
<222> (24) . . (24)
<223> substituce
<220>
<221> VARIANTA
<222> (29) . . (29)
<223> substituce
<400> 17
Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser Ser
1 5 10 15
Val Pro Thr Gin Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg
20 25 30
Bia Cys Val Ala Cya Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser
50 55 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala
70 <210> 18 <211> 73 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (1) . . (1) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (2) . . (2) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (5)..(5) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (6)..(6) <223> substituce
-83CZ 299161 B6 <220>
<221> VARIANTA <222> (7).,(7) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (10) .. (10) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (12) . . (12) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (15)..(15) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (16)..(16) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (17) .. (17) <223> substituce <220>
<221> VAiťlANT <222> (20) .. (20j <223> substitut:ion <220>
<221> VARIANTA <222> (22) . . (22) <223 > substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (23) .. (23) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (24) . . (24) <223> substituce <22Q>
<22I> VARIANTA <222> (29)..(29) <223> substituce <220> <221> VARIANTA <222> (33) . . (33) <223> substituce
-84CZ 299161 B6 <400> 18
Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser Ser 15 10 15
Val Pro Thr Gin Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg 20 25 30
Asn Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 50 55 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 19 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> {22} . . (22) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (23) .. (23) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (24) . . (24) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (29) .. (29) <223> substituce <400> 19
Axg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15
-85CZ 299161 B6
Pro Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Axg Thr Pro Arg Pro Lya Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 €0
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
70 <210> 20 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22) . . (22) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (24) . . (24) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (29) . . (29) <223> substituce <400> 20
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Axg Asp Ala Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Pro Cys Asn Pro Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu ,Ua Ala
70
-86CZ 299161 B6 <210> 21 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22) . . (22) <223> substituCE <220>
<221> VARIANTA <222> (23) .. (23) <223> substituce <220>
<221 > VARIANTA <222> (29) . . (29) <223> substituce <400> 21
Arg Arg Oly Pro Arg Ser Leu Arg Oly Axg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Ciys Asn Gin Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Azg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Azg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 22 <211> 70 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22) .. (22) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (29)..(29) <223> substituce
-87CZ 299161 B6 <400? 22
hxg Arg i Sly Pro •W Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val
20 25 30
Ala Cya Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lya Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gis Pro Gin Glu Ser val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
«5 70 <210> 23 <211> 70 <212 > PRT <213> Homo sapiens <220>
<227> VARIANTA <222> (23) . . (23) <223 > substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (24) . . (24) <223> substituce <220>
<221> VARIANT <222> (29) . . (29) <223> substituce
-88CZ 299161 B6
<400> 23
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Pro Cys Val Gin Thr Glu Cye Phe Asp Pro Leu Val Arg Bis Cys
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Axg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gis Pro Gis Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 24 <210> 24 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (23) . . (23) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (29) . . (29) <223> substituce <400> 24
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15
Pro cys Val Gis Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys val 20 25 30
Ala Cye Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gis Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70
-89CZ 299161 B6 <210> 25 <211> 70 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (29) . . (29) <223> substituce <400» 25
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu :ieu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 26 <211> 70 <212 > PRT <213> Homo Sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22) . . (22) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (29) . . (29) <223> substituce
-90CZ 299161 B6 <400> 26
Arg Axg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Axg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Axg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 27 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22)..(2) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (29)..(2S) <223> substituce <4Q0> 27
Arg Arg Gly Prc· Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Ala Leu Val Arg His Cys val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu ser Val Gly Ala S0 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70
-91 CZ 299161 B6 <210> 28 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22)..(20) <223> substituce <220r>
<221> VARIANTA <222> (23) .. (23) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (24)..(24) <223> substituce <400> 28
Arg Arg Gly Pro .Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Gin Thr Glu Cya Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cya Val 20 25 30
Ala Cya Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lya Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Oly Olu Ala Ala 65 70 <210> 29 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22) . . (22) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (24) . . (24) <223> substituce
-92CZ 299161 B6 <400> 29
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Oly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Pro Thr Glu Cys Phe Aep Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 30 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22) . . (22) <223> substituce <220>
<221> VARIANTA <222> (23)..(23) <223> substituce <400» 30
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Aap Ala Pro Ala Pro Thr 13 10 15
Pro Cys Asn Gin Ala Glu Cya Phe Aap Leu Leu Val Arg His Cya Val 20 25 30
Ala Cya Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Vel Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70
-93CZ 299161 B6 <210> 31 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (23) . . (23) <223> substituce <400> 31
Arg Arg Gly pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro cys Val Gin Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Axg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Oly Leu Leu Arg Thr Pro kcg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Oly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 32 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> VARIANTA <222> (22) . . (22) <223> substituce <400> 32
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr l 5· 10 is
-94CZ 299161 B6
Pro Cys Aen Pro Ala Glu cya Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cya Val
20 25 30
Ala Cya Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lya Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Sar Pro Ala prc· Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
55 60
Gly Ala Gly Olu Ala Ala 65 70 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Oligonukleotidový primer <400> 33 ggccgagtgc ttcg<icctgc t <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Oligonukleotidový primer <400» 34 ggtccgccac tgcgtggcct g <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Oligonukleotidový primer <400» 35 eaecaagacg gccggccctg a
-95CZ 299161 B6 <210> 36 <2I1> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Oligonukleotidový primer <400 > 36 gggcgcctao aatctcagct a <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Oligonukleotidový primer <400> 37 ggcggaccag caggtcgaag cactc

Claims (44)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Izolovaný polypeptid BAFF-R obsahující:
    a) SEKVENCI ID. Č. 5,
    b) fragment SEKVENCE ID. Č. 5, který se váže na BAFF,
    c) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 70% identitu se SEKVENCI ID. Č. 5 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 5,
    d) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 80% identitu se SEKVENCÍ
    15 ID. Č. 5 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 5,
    e) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 90% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 5 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 5,
    20 f) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 95% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 5 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 5,
    g) SEKVENCI ID. Č. 5 nebo fragment SEKVENCE ID. Č. 5, modifikované jednou nebo více konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž modifikovaná sekvence se váže na
    25 BAFF.
  2. 2. Izolovaný polypeptid BAFF-R podle nároku 1, který obsahuje
    a) SEKVENCI ID. Č. 10,
    b) fragment SEKVENCE ID. Č. 10, který se váže na BAFF,
    c) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 70% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 10 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 10,
    d) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 80% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 10 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 10,
    e) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 90% identitu se SEKVENCÍ
    40 ID. Č. 10 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 10,
    f) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 95% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 10 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 10,
    45 g) SEKVENCI ID. Č. 10 nebo fragment SEKVENCE ID. Č. 10 modifikované jednou nebo více konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž modifikovaná sekvence se váže na BAFF.
  3. 3. Izolovaný polypeptid BAFF-R podle nároku 1 nebo 2, který obsahuje
    a) aminokyseliny 19 až 35 ze SEKVENCE ID. Č. 5,
    b) aminokyseliny 19 až 35 ze SEKVENCE ID. Č. 5 modifikované jednou nebo více konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž modifikovaná sekvence se váže na BAFF,
    -97CZ 299161 B6
    c) SEKVENCI ID. Č. 13 nebo
    d) SEKVENCI ID. Č. 13 modifikovanou jednou nebo více konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž modifikovaná sekvence se váže na BAFF.
  4. 4. Izolovaný polypeptid BAFF-R podle nároku 1, který obsahuje sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající z:
    a) SEKVENCE ID. Č. 15,
    10 b) SEKVENCE ID. Č. 16,
    c) SEKVENCE ID. Č. 17,
    d) SEKVENCE ID. Č. 18,
    e) SEKVENCE ID. Č. 19,
    f) SEKVENCE ID. Č. 20,
    15 g) SEKVENCE ID. Č. 21,
    h) SEKVENCE ID. Č. 22,
    i) SEKVENCE ID. Č. 23
    j) SEKVENCE ID. Č. 24
    k) SEKVENCE ID. Č. 25,
    20 1) SEKVENCE ID. Č. 26,
    m) SEKVENCE ID. Č. 27,
    n) SEKVENCE ID. Č. 28,
    o) SEKVENCE ID. Č. 29,
    p) SEKVENCE ID. Č. 30,
    25 q) SEKVENCE1D. Č. 31,
    r) SEKVENCE ID. Č. 32,
    s) fragmentu kterékoliv ze sekvencí a) až r) vázající se na BAFF, a
    t) jakékoliv sekvence ze sekvencí a) až s) modifikované jednou nebo více konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž modifikovaný polypeptid se váže na BAFF.
  5. 5. Izolovaný polypeptid BAFF—R podle nároku 4, který obsahuje sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající z:
    a) SEKVENCE ID. Č. 19,
    35 b) SEKVENCE ID. Č. 22,
    c) SEKVENCE ID. Č. 24,
    d) SEKVENCE ID. Č. 25,
    e) SEKVENCE ID. Č. 26,
    f) SEKVENCE ID. Č. 27, a
    40 g) fragment kterékoliv ze sekvencí a) až I) vázající se na BAFF.
    -98CZ 299161 B6
  6. 6. Izolovaný polypeptid BAFF-R podle nároku 1 nebo 2, který se váže na BAFF a má snížený sklon k agregaci ve srovnání s odpovídajícím nativním polypeptidem BAFF-R, a který obsahuje:
    a) 5 SEKVENCI ID. Č. 5 nebo SEKVENCI ID. Č. 10, kde 1 nebo více nekonzervativních aminokyselin z úseku Cl 9 až L27 nativního polypeptidu BAFF-R je substituována odpovídající aminokyselinou z polypeptidu BAFF-R SEKVENCE ID. Č. 9, nebo b) fragment z a) vázající se na BAFF.
    ío
  7. 7. Izolovaný polypeptid BAFF-R podle nároku 6, kde substituce je vnesena do jedné nebo více poloh vybraných ze skupiny sestávající z:
    a) V20, P21, A22 a F27 ze SEKVENCE ID. Č. 10,
    15 b) V41, P42, A43 a L48 ze SEKVENCE ID. Č. 12 a c) C19 až L27 z fragmentu SEKVENCE ID. Č. 10 obsahujícího aminokyseliny 2 až 71.
  8. 8. Izolovaný polypeptid BAFF-R podle nároku 7 obsahující aminokyseliny 2 až 71 ze SEKVENCE ID. C. 10, kde změněné aminokyseliny jsou vybrány ze skupiny sestávající z:
    a) b) c) d) V20N, P21Q, A22T a L27P, V20N a L27P, P21QaL27P, L27P, 25 e) f) V20N a L27A a V20N a L27S.
  9. 9. Izolovaný polypeptid BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde polypeptid je chimérický protein.
    10. Chimérický polypeptid BAFF-R podle nároku 9, který obsahuje: a) SEKVENCIID. Č. 12, 35 b) fragment SEKVENCE ID. Č. 12, který se váže na BAFF, c) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 80% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 12 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 12, 40 d) SEKVENCI ID. Č. 12 nebo fragment SEKVENCE ID. Č. 12 modifikované jednou nebo více konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž modifikovaná sekvence se váže na BAFF. 11. 45 Chimérický polypeptid BAFF-R podle nároku 10 obsahující aminokyseliny 23 až 92 ze SEKVENCE ID. Č. 12 a úsek Fc z humánního IgGl. 12. Chimérický polypeptid BAFF-R podle nároku 9, který obsahuje: a) 50 b) úsek Fc z protilátky, sekvence pocházející z imunoglobulinového proteinu,
    -99CZ 299161 B6
    c) heterologní signální sekvenci nebo
    d) glutathion-S-transferázu.
    13. Chimérický protein podle nároku 9, který obsahuje konstantní úsek imunoglobulinu a poly5 peptid BAFF-R vybraný ze skupiny sestávající z:
    a) kterékoliv ze sekvencí SEKVENCE ID. Č. 13, SEKVENCE ID. Č. 14, SEKVENCE ID. Č. 15, SEKVENCE ID. Č. 16, SEKVENCE ID. Č. 17, SEKVENCE ID. Č. 18, SEKVENCE ID. Č. 19, SEKVENCE ID. Č. 20, SEKVENCE ID. Č. 21, SEKVENCE ID. Č. 22,
  10. 10 SEKVENCE ID. Č. 23, SEKVENCE ID. Č. 24, SEKVENCE ID. Č. 25, SEKVENCE ID. Č.
    26, SEKVENCE ID. Č. 27, SEKVENCE ID. Č. 28, SEKVENCE ID. Č. 29, SEKVENCE ID. Č. 30, SEKVENCE ID. Č. 31 a SEKVENCE ID. Č. 32, a
    b) fragmentu z a) vázajícího se na BAFF.
  11. 14. Izolovaný polypeptid BAFF-R, který obsahuje:
    a) SEKVENCI ID. Č. 9,
    20 b) fragment SEKVENCE ID. Č. 9, který se váže na BAFF,
    c) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 70% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 9 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 9,
    25 d) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 80% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 9 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 9,
    e) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 90% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 9 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 9,
    e) SEKVENCI ID. Č. 9 nebo fragment SEKVENCE ID. Č. 9 modifikované jednou nebo více konzervativními substitucemi, přičemž modifikovaná sekvence se váže na BAFF.
  12. 15. Izolovaný polypeptid BAFF-R, který obsahuje:
    a) SEKVENCI ID. Č. 14,
    b) fragment SEKVENCE ID. Č. 14, který se váže na BAFF,
    40 c) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 70% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 14 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 14,
    d) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 80% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 14 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 14,
    e) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 90% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 14 nebo fragmentem SEKVENCE ID. Č. 14,
    f) SEKVENCI ID. C. 14 modifikovanou jednou nebo více konzervativními substitucemi
    50 aminokyselin, přičemž modifikovaná sekvence se váže na BAFF.
  13. 16. Molekula nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů, která kóduje polypeptid BAFF-R podle nároku 14 nebo 15.
    - 100CZ 299161 B6
  14. 17. Molekula nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů, která kóduje polypeptid BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13.
  15. 18. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 17, která obsahuje sekvenci nukleotidů vybranou 5 ze skupiny sestávající z:
    a) SEKVENCE ID. Č. 3,
    b) SEKVENCE ID. Č. 4,
    c) SEKVENCE ID. Č. 6, ío d) SEKVENCE ID. Č. 11,
    e) nukleotidy 67 až 276 ze SEKVENCE ID. Č. 11,
    f) nukleotidy 67 až 276 a 280 až 960 ze SEKVENCE ID. Č. 11,
    g) úsek alespoň 100 po sobě jdoucích nukleotidů ze kterékoliv sekvence a) až e),
    h) fragment kterékoliv sekvence a) až f), který kóduje polypeptid vázající se na BAFF,
    15 i) nukleotidová sekvence kódující polypeptid, který se váže na BAFF a má alespoň 70% identitu s kteroukoliv sekvencí a) až h),
    j) nukleotidová sekvence kódující polypeptid, který se váže na BAFF a má alespoň 80% identitu s kteroukoliv sekvencí a) až h), a
    k) nukleotidová sekvence kódující polypeptid, který se váže na BAFF a má alespoň 90% identitu s kteroukoliv sekvencí a) až h).
  16. 19. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 17 nebo 18, která kóduje polypeptid BAFF-R 25 obsahující sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající z:
    a)
    b)
    c)
    SEKVENCE ID. Č. 5 nebo fragment SEKVENCE ID. Č. 5, který se váže na BAFF, SEKVENCE ID. Č. 10 nebo fragment SEKVENCE ID. Č. 10, který se váže na BAFF, SEKVENCE ID. Č. 13 nebo fragment SEKVENCE ID. Č. 13, který se váže na BAFF,
    d) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 70% identitu se sekvencí podle
    a) až c),
    e) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 80% identitu se sekvencí podle
    a) až c),
    f) sekvenci aminokyselin, která se váže na BAFF a má alespoň 90% identitu se sekvencí podle
    40 a) až c).
  17. 20. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19, kde nukleotidová sekvence kóduje polypeptid, který je kratší než úplný BAFF-R a váže se na BAFF.
    45
  18. 21. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 17, kde kódovaný polypeptid je vybrán ze skupiny sestávající z:
    a) SEKVENCE ID. Č. 19,
    b) SEKVENCE ID. Č. 22,
    50 c) SEKVENCE ID. Č. 24,
    - 101 CZ 299161 B6
    d) SEKVENCE ID. Č. 25,
    e) SEKVENCE ID. Č. 26,
    f) SEKVENCE ID. Č. 27 a
    g) fragmentu kterékoliv ze sekvencí a) až f) vázající se na BAFF.
  19. 22. Molekula nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů, která:
    a) hybridizuje za stringentních podmínek se SEKVENCÍ ID. Č. 2, SEKVENCÍ ID. Č. 3, SEKVENCÍ ID. Č. 4, SEKVENCÍ ID. Č. 6 nebo nukleotidy 67 až 276 ze SEKVENCE ID. Č. 11, 10
    b) hybridizuje za stringentních podmínek s komplementem SEKVENCE ID. C. 3 nebo SEKVENCE ID. Č. 4, nebo
    c) je komplementární k SEKVENCI ID. Č. 2, SEKVENCI ID. Č. 3, SEKVENCI ID. Č. 4,
    15 SEKVENCI ID. Č. 6 nebo nukleotidům 67 až 276 ze SEKVENCE ID. Č. 11, přičemž stringentní podmínky podle a) a b) znamenají 6xSSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA a 500 mg/ml denaturované DNA z lososího spermatu při 65 °C, následováno jedním nebo více promytími v 0,2xSSC, 0,1% BSA při 50 °C, a přičemž sekvence nukleotidů není EST AI250289, SEKVENCE ID. Č. 2 ani sekvence z GenBank s přístupovým č. Z99716.
  20. 23. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 22, kde sekvence nukleotidů je komplementární 25 k molekule nukleové kyseliny podle nároku 18.
  21. 24. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 16, která obsahuje sekvenci nukleových kyselin vybranou ze skupiny sestávající z:
    30 a) SEKVENCE ID. Č. 8,
    b) fragment SEKVENCE ID. C. 8 obsahující alespoň 100 po sobě jdoucích nukleotidů,
    c) sekvence nukleové kyseliny kódující SEKVENCI ID. C. 14,
    d) sekvence nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má alespoň 70% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 14 a váže se na BAFF,
    e) sekvence nukleové kyseliny kódující polypeptid, který má alespoň 90% identitu se SEK40 VENCÍ ID. Č. 14 a váže se na BAFF, a
    f) sekvence nukleové kyseliny, která je komplementární ke kterékoliv sekvenci a) až e).
  22. 25. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 17 až 23.
  23. 26. Buňka obsahující vektor podle nároku 25.
  24. 27. Buňka podle nároku 26, která je buňka ovarií čínského křečíka (CHO).
    50
  25. 28. Buňka podle nároku 26, která obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 19.
    -102CZ 299161 B6
  26. 29. Protilátka nebo polypeptid obsahující antigen vázající část protilátky, kde protilátka nebo polypeptid obsahující antigen vázající část protilátky se specificky váže na úsek BAFF-R polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
    5 30. Protilátka nebo polypeptid podle nároku 29, kde se protilátka nebo antigen vázající část polypeptidů specificky váže na polypeptid BAFF-R mající aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z:
    a) SEKVENCE ID. Č. 5, ío b) SEKVENCEID. Č. 10,
    c) SEKVENCEID. Č. 13,
    d) fragmentu kterékoliv z a) až c) vázajícího se na BAFF.
    31. Protilátka nebo polypeptid podle nároku 29 nebo 30, kde protilátka nebo antigen vázající
    15 část polypeptidů je jedna nebo více z následujících:
    a) monoklonální protilátka,
    b) polyklonální protilátka,
    c) chimérická protilátka,
    20 d) humanizovaná protilátka,
    e) jednořetězcová protilátka,
    f) fragment Fab, a
    g) fragment F(ab) 2.
    25 32. Protilátka nebo polypeptid podle nároku 31, kde se protilátka nebo antigen vázající část polypeptidů specificky váže na polypeptid podle nároku 2 nebo 3.
    33. Protilátka podle nároku 29 nebo 30, která je produkována:
  27. 30 a) hybridomovým klonem č. 2.1, který byl uložen v ATTC pod č. PTA-3689, nebo
    b) hybridomovým klonem č. 9.1, který byl uložen v ATTC pod č. PTA-3688.
  28. 34. Protilátka podle kteréhokoliv z nároků 29 až 33 nebo polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 29 až 32, kde protilátka nebo antigen vázající část polypeptidů blokuje vazbu BAFF na BAFF-R.
  29. 35. Protilátka nebo polypeptid podle nároku 34, kde protilátka nebo antigen vázající část polypeptidu je humanizovaná.
  30. 36. Protilátka nebo polypeptid podle nároku 30, kde protilátka nebo antigen vázající část poly40 peptidu je humanizovaná.
  31. 37. Hybridem vybraný ze skupiny sestávající z hybridomového klonu č. 2.1, který byl uložen v ATTC pod č. PTA-3689, a hybridomového klonu č. 9.1, který byl uložen v ATTC pod ě. PTA3688.
  32. 38. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo více z následujících složek:
    a) polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 a
    -103CZ 299161 B6
    b) protilátku nebo polypeptid obsahující antigen vázající část protilátky podle kteréhokoliv z nároků 29 až 36.
  33. 39. Farmaceutická kompozice podle nároku 38, vyznačující se tím, že obsahuje pro5 tilátku nebo polypeptid obsahující antigen vázající část protilátky podle nároku 36.
  34. 40. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 nebo protilátka nebo polypeptid obsahující antigen vázající část protilátky podle kteréhokoliv z nároků 29 až 36 pro použití při léčení.
    ío
  35. 41. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 nebo protilátky nebo polypeptidu obsahujícího část protilátky vázající antigen podle kteréhokoliv z nároků 29 až 36 pro výrobu léku k léčení, prevenci nebo zpomalení nemocí zprostředkovaných B lymfocyty, poruch plazmatických buněk, autoimunitních onemocnění, tumorigenních stavů, hypertenze, kardiovaskulárních nemocí, nemocí ledvin, lymfoproliferativních poruch B-lymfocytů, Burkittova lymfomu,
    15 imunosupresivních onemocnění, orgánových transplantací, zánětů, nebo HIV.
  36. 42. Použití podle nároku 41, kde porucha plazmatických buněk je mnohočetný myelom, Waldenstromova makroglobulinémie, nemoc těžkých řetězců, primární nebo s imunocyty asociovaná amyloidóza nebo monoklonální gammopatie neurčeného významu (MGUS).
  37. 43. Použití podle nároku 41, kde autoimunitní onemocnění je revmatoidní artritida, systémový lupus erythematosus, myasthenia gravis, autoimunní hemolytická anémie, idiopatická thrombocytopenia purpura, anti-fosfolipidový syndrom, Chagasova nemoc, Gravesova nemoc, Wegenerova granulomatóza, polyarteritis nodosa nebo glomerulonefritida.
  38. 44. Použití podle nároku 41, kde tumorigenní stav je karcinom B-lymfocytů, leukémie nebo lymfom.
  39. 45. Použití podle nároku 41, kde lék je formulován pro léčení, prevenci nebo zpomalení systé30 mového lupus erythematosus.
  40. 46. Použití podle nároku 41, kde lék je formulován pro léčení, prevenci nebo zpomalení revmatoidní artritidy.
    35
  41. 47. Použití podle nároku 41, kde lék obsahuje polypeptid podle nároku 3 nebo 5 a je formulován pro léčení, prevenci nebo zpomalení systémového lupus erythematosus.
  42. 48. Použití podle nároku 41, kde lék obsahuje protilátku nebo polypeptid obsahující antigen vázající část protilátky podle nároku 36 a je formulován pro léčení, prevenci nebo zpomalení
    40 systémového lupus erythematosus.
  43. 49. Použití podle nároku 41, kde lék obsahuje polypeptid podle nároku 3 nebo 5 a je formulován pro léčení, prevenci nebo zpomalení revmatoidní artritidy.
    45 50. Použití podle nároku 41, kde lék obsahuje protilátku nebo polypeptid obsahující antigen vázající část protilátky podle nároku 36 a je formulován pro léčení, prevenci nebo zpomalení revmatoidní artritidy.
    51. Izolovaná sonda nukleové kyseliny sestávající z 10 až 50 po sobě jdoucích nukleotidů vybra50 ných z:
    a) sekvence vybrané ze skupiny sestávající ze SEKVENCE ID. Č. 2, 3, 4 a 6,
    b) SEKVENCE ID. Č. 8,
    - 104CZ 299161 B6
    c) sekvence komplementární k sekvenci vybrané ze skupiny sestávající z SEKVENCE ID. Č. 2, 3, 4 a 6, a
    d) degenerovaných sekvencí a) nebo b) kódujících shodné sekvence aminokyselin.
    52. Způsob přípravy polypeptidu BAFF-R, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se:
    a) poskytnou buňky podle kteréhokoliv z nároků 26 až 28, ío b) buňky kultivují v podmínkách vhodných pro expresi polypeptidu BAFF-R, a
    c) izoluje polypeptid BAFF-R.
    53. Způsob identifikace funkčně aktivního mutovaného polypeptidu BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že způsob zahrnuje hodnocení mutovaného
    15 polypeptidu BAFF-R na jednu z následujících aktivit:
    a) schopnost vázat se na BAFF,
    b) schopnost vázat se na intracelulámí cílový protein nebo jeho biologicky aktivní část,
    c) schopnost specificky se vázat na anti-BAFF-R protilátku, a přičemž přítomnost jedné nebo více z těchto aktivit ukazuje, že mutovaný BAFF-R je funkčně aktivní.
    54. Způsob identifikace sloučeniny, která moduluje aktivitu BAFF-R, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se:
    a) sloučenina uvede do kontaktu s BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, a 30 b) určí, zda aktivita BAFF-R byla modulována.
    55. Způsob přípravy polypeptidu BAFF-R se sníženým sklonem k agregaci při srovnání s odpovídajícím nativním polypeptidem BAFF-R, vyznačující se tím, že způsob zahrnuje kroky, kdy se:
    a) transformuje hostitelská buňka nukleovou kyselinou kódující polypeptid BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, ve které je jedna nebo více nekonzervativních aminokyselin v úseku Cl9 až L27 nahrazeno odpovídajícími aminokyselinami z polypeptidu BAFF-R se SEKVENCÍ ID. Č. 9,
    b) buňka kultivuje v podmínkách vhodných pro expresi polypeptidu BAFF-R se substituovanými aminokyselinami, a
    c) izoluje polypeptid BAFF-R podle bodu b).
    56. Způsob podle nároku 55, vyznačující se tím, že nekonzervativní aminokyselina je nepolární aminokyselina.
    57. Způsob podle nároku 56, vyznačující se tím, že nepolární aminokyselina je změ50 něna na aminokyselinu vybranou ze skupiny sestávající z prolinu, šeřinu a alaninu.
    -105CZ 299161 B6
    58. Transgenní živočich, s výjimkou člověka, do jehož genomu byla vložena exogenní sekvence BAFF-R kódující polypeptid BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 nebo jehož endogenní sekvence BAFF-R byla změněna.
    5 59. Souprava, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu protilátku podle kteréhokoliv z nároků 29 až 36 a kontrolu.
    60. Způsob identifikace buněk nebo tkání které chybně exprimují BAFF-R, vyznačující se tí m , že obsahuje kroky, kdy:
    a) biologický vzorek z pacienta se přivede do kontaktu s oligonukleotidovou sondou obsahující alespoň 10 po sobě jdoucích nukleotidů ze sekvence vybrané ze skupiny sestávající z: SEKVENCE ID. C. 1, 2, 3, 4, 6 a sekvencí komplementárních ke kterékoliv sekvenci ze SEKVENCE ID. Č. 1,2,3,4, 6, a
    b) v biologickém vzorku se změří hladina nukleově kyseliny kódující BAFF-R tím, že se detekuje mRNA BAFF-R, nebo alternativně
    c) se stanoví, zda nukleová kyselina BAFF-R v biologickém vzorkuje mutována nebo deleto20 vána.
    61. Diagnostická souprava pro identifikaci buněk nebo tkání které chybně exprimují BAFF-R, vyznačující se tím, že obsahuje oligonukleotidovou sondu obsahující alespoň 10 po sobě jdoucích nukleotidů ze sekvence vybrané ze skupiny sestávající z: SEKVENCE ID. C. 1,2,
    25 3 , 4, 6 a sekvencí komplementárních ke kterékoliv sekvenci ze SEKVENCE ID. Č. 1,2, 3, 4, 6.
    62. Souprava pro detekci přítomnosti BAFF-R v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje: značenou sloučeninu nebo činidlo schopné detekovat polypeptid BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 nebo mRNA kódující polypeptid BAFF-R podle kteréhoko30 liv z nároků 1 až 15 v biologickém vzorku, prostředky ke stanovení množství BAFF-R ve vzorku a prostředky k porovnání množství polypeptidu BAFF-R nebo BAFF-R mRNA ve vzorku se standardem.
    63. Způsob in vitro diagnostiky nemoci zprostředkované B lymfocyty u pacienta, vyznaču35 jící se tím, že zahrnuje kroky, kdy se:
    a) poskytne biologický vzorek z pacienta,
    b) ve vzorku změří množství polypeptidu BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 nebo
    40 nukleově kyseliny kódující polypeptid BAFF-R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, a
    c) množství polypeptidu BAFF—R nebo nukleově kyseliny BAFF—R ve vzorku z pacienta porovná s množstvím polypeptidu BAFF-R nebo nukleově kyseliny BAFF-R v kontrolním vzorku, přičemž rozdíl v množství polypeptidu BAFF-R nebo nukleově kyseliny BAFF-R ve vzorku z pacienta a množství polypeptidu BAFF-R nebo nukleově kyseliny BAFF-R v kontrolním vzorku indikuje, že pacient trpí nemocí zprostředkovanou B lymfocyty.
  44. 50 64. Použití
    a) polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13,
    b) molekuly nukleově kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 17 až 23,
    - 106CZ 299161 B6
    c) protilátky podle kteréhokoliv z nároků 29 až 36, nebo sondy podle nároku 51 pro výrobu diagnostického činidla pro diagnostiku nemoci zprostředkované B lymfocyty.
    65. Polypeptid BAFF-R připravený způsobem, kdy se
    a) kultivuje hostitelská buňka obsahující nukleovou kyselinu kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 v podmínkách dostatečných pro expresi polypeptidu BAFF-R, a
    d) exprimovaný polypeptid se izoluje.
    66. Chimérický polypeptid připravený způsobem, kdy se:
    a) kultivuje hostitelská buňka obsahující nukleovou kyselinu kódující
    15 i) polypeptid BAFF-R obsahující SEKVENCI ID. C. 10 nebo její fragment vázající se na
    BAFF, a ii) polypeptid jiný než BAFF-R, v podmínkách dostatečných pro expresi fúzního proteinu, a 20 b) exprimovaný chimérický polypeptid BAFF-R se izoluje.
    67. Polypeptid BAFF-R podle nároku 65 nebo chimérický polypeptid podle nároku 66, kde polypeptid BAFF-R obsahuje aminokyseliny 2 až 71 ze SEKVENCE ID. Č. 10 nebo fragment tohoto úseku vázající se na BAFF.
    68. Polypeptid BAFF-R podle nároku 65 nebo chimérický polypeptid podle nároku 66, kde polypeptid BAFF-R obsahuje aminokyseliny 2 až 71 ze SEKVENCE ID. Č. 10.
    69. Chimérický polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 66 až 68, kde jiný polypeptid než 30 BAFF-R obsahuje doménu Fc humánního IgG.
    70. Polypeptid BAFF-R podle nároku 65 nebo chimérický polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 66 až 69, kde hostitelská buňka je savčí buňka.
    35 71. Polypeptid podle nároku 70, kde savčí buňka je buňka ovarií čínského křečíka (CHO buňka).
    72. Polypeptid podle nároku 70, kde savčí buňka je buňka 293 EBNA.
    73. Způsob detekce BAFF-R v biologickém vzorku z pacienta, vyznačující se tím, 40 že zahrnuje kroky, kdy se:
    a) poskytne biologický vzorek z pacienta,
    b) detekuje polypeptid BAFF—R podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 ve vzorku z pacienta
    45 použitím protilátky nebo polypeptidu obsahujícího antigen vázající část protilátky podle kteréhokoliv z nároků 28 až 35.
    74. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že protilátka nebo polypeptid obsahující antigen vázající část protilátky jsou jednou nebo více z následujících:
    a) monoklonální
    b) polyklonální
    c) chimérická
    -107CZ 299161 B6
    d) humanizovaná
    e) jednořetězcová protilátka,
    í) fragment Fab,
    g) fragment F(ab) 2.
    75. Způsob stanovení toho, zda genomová BAFF-R sekvence je mutovaná nebo deletovaná, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se:
    a) poskytne biologický vzorek z pacienta,
    b) stanoví, zda genomová BAFF-R sekvence je mutovaná nebo deletovaná užitím molekuly nukleové kyseliny schopné hybridizovat za stringentních podmínek s genomovou sekvencí humánního BAFF-R (SEKVENCE ID. Č. 10) nebo myšího BAFF-R (SEKVENCE ID. Č. 9), přičemž stringentní podmínky znamenají 6xSSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA a 500 mg/ml denaturované DNA z lososího spermatu při 65 °C, následováno jedním nebo více promytími v 0,2xSSC, 0,1% BSA při 50 °C.
CZ20031103A 2000-09-18 2001-09-06 Polypeptid BAFF-R, nukleová kyselina kódující BAFF-R, protilátka proti BAFF-R a farmaceutické prípravky, které je obsahují CZ299161B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23315200P 2000-09-18 2000-09-18
US23414000P 2000-09-21 2000-09-21
US26849901P 2001-02-13 2001-02-13
US31218501P 2001-08-14 2001-08-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ299161B6 true CZ299161B6 (cs) 2008-05-07

Family

ID=27499682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20031103A CZ299161B6 (cs) 2000-09-18 2001-09-06 Polypeptid BAFF-R, nukleová kyselina kódující BAFF-R, protilátka proti BAFF-R a farmaceutické prípravky, které je obsahují

Country Status (33)

Country Link
US (8) US7112421B2 (cs)
EP (3) EP1842918B2 (cs)
JP (2) JP5904689B2 (cs)
KR (1) KR100935744B1 (cs)
CN (3) CN1622995B (cs)
AR (1) AR030760A1 (cs)
AT (2) ATE360070T1 (cs)
AU (2) AU8885801A (cs)
BG (1) BG66208B1 (cs)
BR (1) BR0113921A (cs)
CA (1) CA2422622C (cs)
CY (2) CY1106708T1 (cs)
CZ (1) CZ299161B6 (cs)
DE (1) DE60128002T2 (cs)
DK (3) DK2325317T3 (cs)
EA (2) EA024034B1 (cs)
EE (1) EE05411B1 (cs)
ES (2) ES2286139T3 (cs)
GE (1) GEP20074267B (cs)
HU (1) HU227331B1 (cs)
IL (3) IL154622A0 (cs)
IS (1) IS6729A (cs)
MX (1) MXPA03002328A (cs)
NO (2) NO332318B1 (cs)
NZ (1) NZ525187A (cs)
PL (1) PL207267B1 (cs)
PT (2) PT1352063E (cs)
RS (1) RS50728B (cs)
SK (1) SK4712003A3 (cs)
TW (1) TWI322181B (cs)
UA (1) UA83458C2 (cs)
WO (1) WO2002024909A2 (cs)
ZA (1) ZA200301903B (cs)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
JP2002513587A (ja) * 1998-05-04 2002-05-14 ダコ エー エス 染色体異常を検出するための方法およびプローブ
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
BR0013391A (pt) * 1999-08-17 2002-07-09 Biogen Inc Uso do receptor baff (bcma) como um agente imunoregulador
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
IL150755A0 (en) * 2000-02-16 2003-02-12 Genentech Inc Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
MXPA02012434A (es) 2000-06-16 2004-09-06 Cambridge Antibody Tech Anticuerpos que se unen inmunoespecificamente a estimulador de linfocitos ii.
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
WO2002016411A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
EP2267015A3 (en) 2000-08-18 2011-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
DE60138927D1 (de) * 2000-11-07 2009-07-16 Zymogenetics Inc Menschlicher rezeptor für tumor necrosis factor
EP1365024A4 (en) * 2001-02-28 2005-04-20 Riken TRAF3 BINDING, B-CELL SPECIFIC RECEPTOR
WO2003014294A2 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 Genentech, Inc. Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
US7112410B1 (en) * 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
AU2002339680A1 (en) * 2001-12-26 2003-07-15 Genset S.A. Agonists and antagonists of bromix for the treatment of metabolic disorders
AU2003221256A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
WO2003089616A2 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Soluble mic polypeptides as markers for diagnosis, prognosis and treatment of cancer and autoimmune diseases or conditions
CA2524892A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Retrovec Aps A purified polypeptide, isolated nucleic acids encoding said polypeptide, vectors and use thereof
CA2492447A1 (en) * 2002-07-25 2004-02-05 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
US7700317B2 (en) 2003-03-28 2010-04-20 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
CA2526402A1 (en) * 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
KR20070001880A (ko) 2003-10-20 2007-01-04 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｂαｆｆ 길항제를 위한 치료 섭생법
EP3858387A1 (en) 2003-11-06 2021-08-04 Seagen Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
JP2008505607A (ja) 2004-01-29 2008-02-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂｃｍａの細胞外ドメインの変異体とその使用法
RU2404810C9 (ru) 2004-06-01 2015-06-20 Дженентек, Инк. Конъюгаты антитело-лекарственное средство и способы
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
KR20070107687A (ko) * 2004-12-31 2007-11-07 제넨테크, 인크. Ｂｒ３과 결합하는 폴리펩티드, 및 그의 용도
WO2006081516A2 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Biogen Idec Ma Inc. USE OF BAFF TO TREAT Th2-MEDIATED CONDITIONS
ATE460672T1 (de) 2005-05-20 2010-03-15 Genentech Inc Vorbehandlung einer biologischen probe aus einem individuum mit autoimmunkrankheit
EP3037544A1 (en) 2005-10-13 2016-06-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of systemic lupus erythematosus (sle) patients with autoantibody positive diseases
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
AU2006318539B2 (en) 2005-11-23 2012-09-13 Genentech, Inc. Methods and compositions related to B cell assays
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
SG172656A1 (en) 2006-05-30 2011-07-28 Genentech Inc Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
WO2008008482A2 (en) * 2006-07-13 2008-01-17 Genentech, Inc. Altered br3-binding polypeptides
US8956611B2 (en) 2007-10-16 2015-02-17 Zymogenetics, Inc. Combination of BLyS inhibition and anti-CD 20 agents for treatment of autoimmune disease
TWI554517B (zh) 2007-10-30 2016-10-21 建南德克公司 藉陽離子交換層析法純化抗體
HUE025778T2 (en) 2008-07-17 2016-05-30 Novartis Ag Preparations and methods for the use of therapeutic antibodies
EP2321337B2 (en) 2008-08-14 2018-10-10 Genentech, Inc. Methods for removing a contaminant using protein displacement ion exchange membrane chromatography
KR20110076918A (ko) 2008-09-10 2011-07-06 제넨테크, 인크. 단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
PL2406284T3 (pl) 2009-03-10 2017-09-29 Biogen Ma Inc. Przeciwciała anty-bcma
US8728730B2 (en) 2009-09-03 2014-05-20 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring rheumatoid arthritis
JP2013504585A (ja) 2009-09-09 2013-02-07 セントローズ， エルエルシー 細胞外標的化薬物複合体
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
PL2550018T3 (pl) 2010-03-22 2019-08-30 F.Hoffmann-La Roche Ag Kompozycje i sposoby użyteczne do stabilizowania preparatów zawierających białko
EP2662095A1 (en) 2010-04-15 2013-11-13 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN102958538A (zh) 2010-05-03 2013-03-06 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于降低含有蛋白质的制剂的粘度的组合物和方法
EP2568960B1 (en) 2010-05-10 2018-06-06 Intas Pharmaceuticals Ltd. Liquid formulation of polypeptides containing an fc domain of an immunoglobulin
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
JP2013534520A (ja) 2010-06-08 2013-09-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン操作抗体及びコンジュゲート
CA2802756C (en) 2010-06-24 2021-05-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
WO2012074757A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US8735347B2 (en) 2011-02-02 2014-05-27 Children's Hospital Medical Center Regulation of energy metabolism and obesity by modulating B cell activating factor (BAFF, BLYS) or BAFF signaling
JP6271254B2 (ja) 2011-02-28 2018-01-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アンタゴニストに対する生物学的マーカー及び応答を予測するための方法
CN103608684B (zh) 2011-05-12 2016-05-04 基因泰克公司 利用框架签名肽检测动物样品中的治疗性抗体的多重反应监测lc-ms/ms方法
HUE025661T2 (en) 2011-10-14 2016-04-28 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and their conjugates
CA3018046A1 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
SG11201403437TA (en) 2011-12-22 2014-07-30 Genentech Inc Ion exchange membrane chromatography
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
PT2766048E (pt) 2012-10-12 2015-02-25 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
DK2906253T3 (en) 2012-10-12 2018-10-22 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine anti-PSMA antibody conjugates
TR201808051T4 (tr) 2012-10-12 2018-06-21 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin antikor konjugatları.
ES2660029T3 (es) 2012-10-12 2018-03-20 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepinas
DK2906251T3 (da) 2012-10-12 2017-11-20 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepin-anti-CD22-antistofkonjugater
SMT201900017T1 (it) 2012-10-12 2019-02-28 Medimmune Ltd Coniugati pirrolobenzodiazepina-anticorpo
WO2014057114A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
AU2013366493B2 (en) 2012-12-21 2017-08-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EA032986B1 (ru) 2012-12-21 2019-08-30 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины
CN105307685B (zh) 2013-03-13 2019-03-08 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓和其结合物
ES2731779T3 (es) 2013-03-13 2019-11-19 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
WO2015023355A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2929565A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
BR112016012410A2 (pt) 2013-12-16 2017-09-26 Genentech Inc conjugado de droga e anticorpo, composto conjugado de droga e anticorpo, composto não-peptídico, método de tratamento de doenças em seres humanos e composição farmacêutica
WO2015095227A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
US10435474B2 (en) 2013-12-24 2019-10-08 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
US20170247462A1 (en) 2014-07-03 2017-08-31 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of multiple sclerosis and neuromyelitis optica
CN106687141A (zh) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其缀合物
CN106714844B (zh) 2014-09-12 2022-08-05 基因泰克公司 蒽环类二硫化物中间体、抗体-药物缀合物和方法
BR112017003236A2 (pt) 2014-09-12 2017-11-28 Genentech Inc anticorpos elaborados com cisteína, conjugados de droga e anticorpos, método de preparação de conjugado de droga e anticorpo e composição farmacêutica
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EA201790359A1 (ru) 2014-09-17 2017-08-31 Дженентек Инк. Пирролобензодиазепины и их конъюгаты, связанные дисульфидной связью с антителами
BR112017011111A2 (pt) 2014-11-25 2017-12-26 Adc Therapeutics Sa conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo
KR20170086121A (ko) 2014-12-03 2017-07-25 제넨테크, 인크. 4급 아민 화합물 및 그의 항체-약물 접합체
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
JP7022080B2 (ja) 2016-05-27 2022-02-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 部位特異的抗体－薬物複合体の特徴付けのための生化学分析的方法
CN109476648B (zh) 2016-06-06 2022-09-13 豪夫迈·罗氏有限公司 司维司群抗体-药物缀合物和使用方法
EP3496763A1 (en) 2016-08-11 2019-06-19 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
DK3544636T3 (da) 2017-02-08 2021-05-10 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepin-antistof-konjugater
SI3612537T1 (sl) 2017-04-18 2022-10-28 Medimmune Limited Konjugati pirolobenzodiazepina
US20200129637A1 (en) 2017-04-20 2020-04-30 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
IL270522B2 (en) 2017-05-09 2024-04-01 Simris Biologics Gmbh Method for modifying microcystins and nodularins
CN110730787B (zh) 2017-05-09 2023-11-03 辛利斯生物制药有限责任公司 修饰的微囊藻毒素和节球藻毒素
WO2018229222A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc
KR102270107B1 (ko) 2017-08-18 2021-06-30 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 컨쥬게이트
SG11202001907QA (en) 2017-09-20 2020-04-29 Ph Pharma Co Ltd Thailanstatin analogs
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
US12116415B2 (en) 2018-10-09 2024-10-15 Single Cell Technology, Inc. Anti-BCMA antibodies
JP7708662B2 (ja) 2018-10-24 2025-07-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト コンジュゲート化された化学的分解誘導物質および使用方法
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
ES2967878T3 (es) 2019-03-15 2024-05-06 Medimmune Ltd Dímeros de azetidobenzodiazepina y conjugados que los comprenden para uso en el tratamiento del cáncer
AR118536A1 (es) 2019-04-01 2021-10-20 Genentech Inc Composiciones y métodos para estabilizar formulaciones que contienen proteína
ES2827148B2 (es) * 2019-11-19 2021-10-19 Instituto Nac De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria Inia Plásmido codificante para el receptor del factor de activación de células B (BAFF-R) y usos del mismo en el tratamiento y prevención de enfermedades inflamatorias en peces
WO2022027037A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Single Cell Technology, Inc. Anti-sars corona virus-2 spike protein antibodies
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
TW202206103A (zh) * 2020-08-04 2022-02-16 瑞士商諾華公司 Ｃｌｌ的治療
JP2023536596A (ja) * 2020-08-04 2023-08-28 ノバルティス アーゲー Ｂ細胞悪性腫瘍の治療
US20240360181A1 (en) * 2021-05-20 2024-10-31 Achelois Biopharma, Inc. Compositions and methods for multivalent surface display on enveloped particles
EP4426727A2 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Specific conjugation of an antibody
WO2023236949A1 (zh) 2022-06-07 2023-12-14 映恩生物制药（苏州）有限公司 抗b7h3抗体-药物偶联物及其用途
CN120417934A (zh) 2022-12-23 2025-08-01 基因泰克公司 Cereblon降解剂缀合物及其用途
WO2024182541A1 (en) * 2023-02-28 2024-09-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Molecules that bind to b-cell activating factor receptor polypeptides
AU2024239150A1 (en) 2023-03-21 2025-10-02 Biograph 55, Inc. Cd19/cd38 multispecific antibodies
WO2024220546A2 (en) 2023-04-17 2024-10-24 Peak Bio, Inc. Antibodies and antibody-drug conjugates and methods of use and synthetic processes and intermediates
CN116626306B (zh) * 2023-05-18 2025-09-16 上海吉宣生物科技有限公司 一种检测尿液中HIV(l+2)抗体试剂条的制备方法、试剂条及试剂笔
CN118949008B (zh) * 2024-07-25 2025-06-10 安徽医科大学第二附属医院 一种可溶性b淋巴细胞刺激因子受体3和脂联素球部融合蛋白制备方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043032A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Biogen, Inc. Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of b-cell response

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE3751873T2 (de) 1986-04-09 1997-02-13 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
WO1991001140A1 (en) 1989-07-25 1991-02-07 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5945397A (en) 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
MC2311A1 (fr) 1990-07-10 1993-09-27 Smithkline Beecham Corp Oxamides
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ATE256738T1 (de) 1992-10-30 2004-01-15 Gen Hospital Corp Ein neues zellzyklus kontrollprotein
JPH08509857A (ja) 1993-01-07 1996-10-22 シーケノム・インコーポレーテッド マススペクトロメトリーによるｄｎａ配列決定法
EP0657811B1 (en) 1993-12-09 1998-09-02 STMicroelectronics S.r.l. Integrated circuitry for checking the utilization rate of redundancy memory elements in a semiconductor memory device
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
JP2001501453A (ja) 1996-03-14 2001-02-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子δおよびε
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
DE69635088T3 (de) 1996-10-25 2012-01-26 Human Genome Sciences, Inc. NEUTROKIN alpha
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
WO1998027114A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
EP1012292A1 (en) 1997-06-06 2000-06-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
WO1998055621A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU9013998A (en) 1997-07-21 1999-02-10 Zymogenetics Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
CN1195849C (zh) 1997-09-12 2005-04-06 阿普泰克R&D公司 April－具有生长效应的新的蛋白质
IL134480A0 (en) 1997-09-12 2001-04-30 Apotech Sa Kay - an immune system protein and dna sequences encoding the same
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
AU1467000A (en) 1998-11-04 2000-05-22 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
ES2338661T3 (es) * 1999-01-07 2010-05-11 Zymogenetics, Inc. Usos terapeuticos de receptores solubles br43x2.
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
EP1860190A3 (en) 1999-02-23 2008-03-12 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variants
WO2000050633A1 (en) 1999-02-24 2000-08-31 The General Hospital Corporation Method for cloning signal transduction intermediates
AU3633000A (en) 1999-03-26 2000-10-16 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
US6475987B1 (en) * 1999-05-06 2002-11-05 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 receptor homologues
US20030166003A1 (en) 1999-06-14 2003-09-04 Cochran Andrea G. Structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
BR0013391A (pt) * 1999-08-17 2002-07-09 Biogen Inc Uso do receptor baff (bcma) como um agente imunoregulador
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
CA2399387C (en) 2000-02-11 2015-11-03 Biogen, Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
MXPA02012434A (es) 2000-06-16 2004-09-06 Cambridge Antibody Tech Anticuerpos que se unen inmunoespecificamente a estimulador de linfocitos ii.
WO2002018620A2 (en) 2000-08-15 2002-03-07 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
EP2267015A3 (en) * 2000-08-18 2011-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
DE60138927D1 (de) 2000-11-07 2009-07-16 Zymogenetics Inc Menschlicher rezeptor für tumor necrosis factor
PL393317A1 (pl) 2001-05-11 2011-05-23 Amgen Inc. Peptydy oraz pokrewne cząsteczki wiążące TALL-1
WO2003014294A2 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Genentech, Inc. Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
US7256015B2 (en) 2001-09-21 2007-08-14 Amgen Inc. TALL-1 receptor molecules and uses thereof
US7825089B2 (en) 2001-10-24 2010-11-02 National Jewish Health Three-dimensional structures of TALL-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
WO2003055979A2 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. ANTIBODIES THAT IMMUNOSPECIFICALLY BIND TO BLyS
CA2526402A1 (en) 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043032A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Biogen, Inc. Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of b-cell response

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gross J. et al. : "TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease", Nature, 404, 995-999, 2000 *
Marsters S.A. et al.: "Interaction of the TNF homologues BLyS and APRIL with the TNF receptor homologues BCMA and TACI", Current Biology, 10(13), 785-788, 2000 *
Schneider P. et al.: "BAFF, a novel ligand of the tumor necrosis factor family, stimulates B cell growth", Journal of Experimental Medicine 189(11), 1747-1756, 1999 *
Thompson J.S. et al.: "BAFF binds to the tumor necrosis factor receptor-like molecule B cell maturation antigen and is important for maintaining the peripheral B cell population", Journal of Experimental Medicine, 192(1), 129-135, 2000 *
Yu et al.: "APRIL and TALL-I and receptors BCMA and TACI: system for regulating humoral immunity", Nature Immunology, 1(3), 252-256, 2000 *

Also Published As

Publication number Publication date
BG107621A (bg) 2004-01-30
PL207267B1 (pl) 2010-11-30
WO2002024909A2 (en) 2002-03-28
EA200300381A1 (ru) 2003-10-30
MXPA03002328A (es) 2003-06-06
ZA200301903B (en) 2004-06-25
CA2422622C (en) 2010-11-16
ATE554171T1 (de) 2012-05-15
AU2001288858A2 (en) 2002-04-02
NO20031248D0 (no) 2003-03-18
AU8885801A (en) 2002-04-02
AR030760A1 (es) 2003-09-03
BR0113921A (pt) 2004-12-14
NO20120869A1 (no) 2014-02-07
US20040072188A1 (en) 2004-04-15
CN104311658A (zh) 2015-01-28
US20060240518A1 (en) 2006-10-26
JP5904689B2 (ja) 2016-05-25
US8524672B2 (en) 2013-09-03
NO332318B1 (no) 2012-08-27
WO2002024909A9 (en) 2003-04-03
RS50728B (sr) 2010-08-31
PT1842918E (pt) 2012-07-23
EA024034B1 (ru) 2016-08-31
WO2002024909A3 (en) 2003-07-31
EE05411B1 (et) 2011-04-15
SK4712003A3 (en) 2003-10-07
US7709220B2 (en) 2010-05-04
GEP20074267B (en) 2007-12-25
EP2325317B2 (en) 2016-07-27
CN1622995A (zh) 2005-06-01
EP2325317B1 (en) 2012-11-07
ES2388153T3 (es) 2012-10-09
US7112421B2 (en) 2006-09-26
DK1842918T3 (da) 2012-07-23
ATE360070T1 (de) 2007-05-15
CY1113421T1 (el) 2016-06-22
US20060240519A1 (en) 2006-10-26
HK1158260A1 (en) 2012-07-13
IL206414A (en) 2012-02-29
DK1352063T3 (da) 2007-08-06
IL206414A0 (en) 2010-12-30
PL366331A1 (en) 2005-01-24
US20100311189A1 (en) 2010-12-09
CA2422622A1 (en) 2002-03-28
EE200300107A (et) 2005-02-15
UA83458C2 (uk) 2008-07-25
IS6729A (is) 2003-02-28
DE60128002T2 (de) 2008-01-03
US20140187485A1 (en) 2014-07-03
HUP0401591A2 (hu) 2004-11-29
US20060240517A1 (en) 2006-10-26
JP2014064585A (ja) 2014-04-17
EA200901129A1 (ru) 2010-04-30
US8026072B2 (en) 2011-09-27
EP2325317A1 (en) 2011-05-25
NZ525187A (en) 2006-02-24
ES2286139T3 (es) 2007-12-01
CN1940068A (zh) 2007-04-04
US20120070437A1 (en) 2012-03-22
EP1842918A1 (en) 2007-10-10
EP1842918B1 (en) 2012-04-18
IL154622A (en) 2010-11-30
CN1622995B (zh) 2013-09-04
AU2001288858B2 (en) 2007-11-01
YU19903A (sh) 2006-05-25
PT1352063E (pt) 2007-07-11
CY1106708T1 (el) 2012-05-23
HU227331B1 (en) 2011-03-28
HK1059283A1 (en) 2004-06-25
BG66208B1 (bg) 2012-04-30
KR100935744B1 (ko) 2010-01-06
EP1352063A2 (en) 2003-10-15
DK2325317T3 (da) 2013-01-07
US7638327B2 (en) 2009-12-29
HUP0401591A3 (en) 2005-05-30
JP2004509624A (ja) 2004-04-02
TWI322181B (en) 2010-03-21
US20060240520A1 (en) 2006-10-26
EA012833B1 (ru) 2009-12-30
US7635677B2 (en) 2009-12-22
EP1842918B2 (en) 2016-07-27
KR20030074596A (ko) 2003-09-19
DE60128002D1 (de) 2007-05-31
EP1352063B1 (en) 2007-04-18
NO20031248L (no) 2003-05-16
IL154622A0 (en) 2003-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100935744B1 (ko) 신규 수용체의 핵산 및 폴리펩티드
JP2004509624A5 (cs)
AU2001288858A1 (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
HK1059283B (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
HK1158260B (en) Receptor nucleic acids and polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20160906