PL207267B1 - Wyizolowany polipeptyd BAFF-R, sposób jego wytwarzania i zastosowanie, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka, przeciwciało lub polipeptyd obejmujący część przeciwciała wiążącą antygen, hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna, sonda kwasu nukleinowego, sposoby identyfikowania funkcjonalnie aktywnego zmutowanego polipeptydu BAFF-R, związku modulującego aktywność BAFF-R oraz komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R, sposób wytwarzania polipeptydu BAFF-R o zmniejszonej skłonności do agregacji, zestawy oraz sposób diagnozowania in vitro stanu, w którym pośredniczą komórki B, sposób - Google Patents

Wyizolowany polipeptyd BAFF-R, sposób jego wytwarzania i zastosowanie, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka, przeciwciało lub polipeptyd obejmujący część przeciwciała wiążącą antygen, hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna, sonda kwasu nukleinowego, sposoby identyfikowania funkcjonalnie aktywnego zmutowanego polipeptydu BAFF-R, związku modulującego aktywność BAFF-R oraz komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R, sposób wytwarzania polipeptydu BAFF-R o zmniejszonej skłonności do agregacji, zestawy oraz sposób diagnozowania in vitro stanu, w którym pośredniczą komórki B, sposób

Info

Publication number
PL207267B1
PL207267B1 PL366331A PL36633101A PL207267B1 PL 207267 B1 PL207267 B1 PL 207267B1 PL 366331 A PL366331 A PL 366331A PL 36633101 A PL36633101 A PL 36633101A PL 207267 B1 PL207267 B1 PL 207267B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
baff
seq
polypeptide
nucleic acid
binds
Prior art date
Application number
PL366331A
Other languages
English (en)
Other versions
PL366331A1 (pl
Inventor
Christine M. Ambrose
Jeffrey S. Thompson
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27499682&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL207267(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of PL366331A1 publication Critical patent/PL366331A1/pl
Publication of PL207267B1 publication Critical patent/PL207267B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd receptora BAFF („BAFF-R”), sposób jego wytwarzania i zastosowanie, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka, przeciwciało lub polipeptyd obejmujący część przeciwciała wiążącą antygen, hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna, sonda kwasu nukleinowego, sposoby identyfikowania funkcjonalnie aktywnego zmutowanego polipeptydu BAFF-R, związku modulującego aktywność BAFF-R oraz komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R, sposób wytwarzania polipeptydu BAFF-R o zmniejszonej skłonności do agregacji, zestawy oraz sposób diagnozowania in vitro stanu, w którym pośredniczą komórki B, sposób oznaczania BAFF-R in vitro w próbce biologicznej, sposób określania in vitro czy sekwencja genomowego BAFF-R została zmutowana lub usunięta.
Polipeptydy według wynalazku są spokrewnione z receptorem dla BAFF, czynnikiem aktywującym komórki B należącym do rodziny czynnika martwicy nowotworów (ang. Tumor Necrosis Factor, „TNF”), który jest związany z ekspresją komórek B i immunoglobulin. Receptor ten można wykorzystać do leczenia nowotworów, chłoniaków, chorób autoimmunologicznych i chorób dziedzicznych z udziałem komórek B.
Rodzina TNF składa się z pary ligandów i ich swoistych receptorów określanych jako ligandy z rodziny TNF (Bazzoni i Beutler (1996) N. Engl. J. Med. 334(26): 1717-1725). Rodzina uczestniczy w regulacji uk ł adu immunologicznego, a moż liwe, ż e i innych systemów nie-immunologicznych. Regulacja odbywa się często na poziomie „głównego przełącznika”, tak że przekazywanie sygnału przez TNF może prowadzić do licznych kolejnych zdarzeń, czego najlepszym przykładem jest TNF. TNF może inicjować ogólną ochronną odpowiedź zapalną organizmu na obcą inwazję, która obejmuje zmienioną prezentację cząsteczek adhezyjnych uczestniczących w przemieszczaniu się komórek, wytwarzanie chemokin w celu kierowania specyficznych komórek do konkretnych przedziałów oraz uczulanie różnych komórek efektorowych. A zatem, regulacja tych szlaków ma potencjał kliniczny.
Uważa się, że indukcja różnych odpowiedzi komórkowych, w których pośredniczą takie cytokiny z rodziny TNF, jest inicjowana przez ich wią zanie się ze swoistymi receptorami komórkowymi. Zidentyfikowano co najmniej dwa odrębne receptory TNF o wielkości około 55 kDa (TNFR1) i 75 kDa (TNFR2) (Hohman i wsp. (1989) J. Biol. Chem. 264: 14927-14934 oraz Brockhaus i wsp. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3127-3131). Z genami obydwu receptorów TNF związane są rozległe polimorfizmy. Obydwa TNFR wykazują typową strukturę powierzchniowych receptorów komórkowych, włączając w to domeny zewnątrzkomórkową, transbłonową i wewnątrzkomórkową. Część zewnątrzkomórkowa TNFR typu 1 i typu 2 zawiera wzór powtórzonych sekwencji aminokwasowych czterech domen bogatych w cysteinę (CDR). Wzór powtórzonych CDR występuje w kilku innych powierzchniowych białkach komórkowych, włączając w to, między innymi, receptor czynnika wzrostu nerwów p75 i antygen CD40 komórek B.
Receptory są potężnym narzędziem do wyjaśniania szlaków biologicznych z powodu łatwości ich przekształcania w fuzje białkowe z immunoglobulinami. Te dimerowe rozpuszczalne postaci receptorów są dobrymi inhibitorami zdarzeń, w których pośredniczą wydzielane albo związane z powierzchnią ligandy. Poprzez wiązanie się z tymi ligandami, zapobiegają one oddziaływaniu ligandu ze związanymi z komórką receptorami, które mogą przekazywać sygnał. Te fuzje receptor-Fc są przydatne nie tylko w sensie eksperymentalnym, ale zostały również, w przypadku TNF-R-Fc, z powodzeniem użyte klinicznie do leczenia zapalnej choroby jelit, reumatoidalnego zapalenia stawów i zespołu ostrych objawów klinicznych towarzyszących podawaniu OKT3 (Eason i wsp. (1996) Transplantation 61(2): 224-228; Feldmann i wsp. (1996) Int. Arch. Allergy Immunol. 111(4): 362-365 oraz van Dullemen i wsp. (1995) Gastroenterol. 109(1): 129-135). Można sobie wyobrazić, że manipulacja wieloma zdarzeniami, w których pośredniczy przekazywanie sygnału poprzez rodzinę receptorów TNF będzie miała szerokie zastosowanie w leczeniu chorób immunologicznych, a także szerokiego zakresu ludzkich chorób, których następstwa fizjologiczne wynikają z udziału układu immunologicznego. Rozpuszczalna postać opisanego ostatnio receptora, osteoprotegryny, może blokować utratę masy kostnej, a zatem zdarzenia kontrolowane przez przekazywanie sygnał u przez rodzinę receptora TNF nie jest koniecznie ograniczone do regulacji układu immunologicznego (Simonet i wsp. (1997) Cell 89(2): 309319). Przeciwciała wobec receptora mogą blokować wiązanie ligandu, a zatem mogą mieć również zastosowanie kliniczne. Takie przeciwciała wykazują często długą żywotność i mają przewagę nad rozpuszczalnymi fuzjami białkowymi receptor-Fc, które mają krótsze okresy półtrwania we krwi.
PL 207 267 B1
Jakkolwiek hamowanie szlaku, w którym pośredniczy receptor reprezentuje najczęściej wykorzystywane zastosowanie terapeutyczne tych receptorów, oryginalnie to aktywacja receptorów TNF stanowiła nadzieję kliniczną (Aggarwal i Natarajan (1996) Eur. Cytokine Netw. 7(2): 93-124). Aktywacja receptorów TNF może inicjować śmierć komórkową komórek docelowych, a zatem zastosowanie wobec nowotworów było i jest nadal atrakcyjne (Eggermont i wsp. (1996) Ann. Surg. 224(6): 756-765). Receptor może być aktywowany bądź przez podawanie ligandu, tj. poprzez szlak naturalny, albo niektóre przeciwciała, które mogą wiązać się krzyżowo z receptorem i są również silnymi agonistami. Przeciwciała mogłyby mieć przewagę w onkologii, ponieważ pozostają we krwi przez dłuższe okresy czasu, podczas gdy ligandy mają generalnie krótszy okres trwania we krwi. Ponieważ wiele z tych receptorów może być wyrażanych bardziej selektywnie w nowotworach albo mogą one jedynie sygnalizować śmierć komórki albo różnicowanie w nowotworach, przeciwciała agonistyczne mogłyby stanowić dobrą broń w leczeniu raka. Analogicznie, w wielu pozytywnych zdarzeniach immunologicznych pośredniczą receptory z rodziny TNF, np. reakcjach zapalnych gospodarza, wytwarzaniu przeciwciał, itd., a zatem przeciwciała agonistyczne mogą mieć korzystne efekty w innych zastosowaniach nieonkologicznych.
Paradoksalnie, hamowanie szlaku może dawać korzyści kliniczne przy leczeniu nowotworów. Przykładowo, ligand Fas jest wyrażany w niektórych nowotworach i ta ekspresja może prowadzić do śmierci limfocytów Fas dodatnich, tym samym ułatwiając nowotworowi unik przed układem immunologicznym. W tym przypadku hamowanie systemu Fas mogłoby umożliwić układowi immunologicznemu reakcję z nowotworem innymi dostępnymi teraz drogami (Green i Ware (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(12): 5986-90).
Ligand BAFF z rodziny TNF, znany również jako TALL-1, THANK, BLyS i zTNF4 (Schneider i wsp. (1999) J. Exp. Med. 189(11): 1747-1756; Shu i wsp. (1999) J. Leukoc. Biol. 65(5): 680-683; Mukhopadhyay i wsp. (1999) J. Biol. Chem. 274(23): 15978-15981; Moore i wsp. (1999) Science 285(5425): 260-263; Gross i wsp. (2000) Nature 404(6781): 995-999) zwiększa przeżywalność komórek B in vitro (Batten i wsp. (2000) J. Exp. Med. 192(10): 1453-1466) i okazał się kluczowym regulatorem populacji obwodowych komórek B in vivo. Myszy z nadekspresją BAFF wykazują rozrost dojrzałych komórek B i objawy tocznia rumieniowatego układowego (ang. systemic lupus erythaematosus, SLE) (Mackay i wsp. (1999) J. Exp. Med. 190(11): 1697-1710). Ponadto, niektórzy pacjenci z SLE mają znacząco zwiększone poziomy BAFF w surowicy (Zhang i wsp. (2001) J. Immunol. 166(1): 6-10). Zaproponowano zatem, że nieprawidłowo wysokie poziomy tego ligandu mogą uczestniczyć w patogenezie chorób immunologicznych poprzez zwiększenie przeżywalności autoreaktywnych komórek B (Batten i wsp. (2000) J. Exp. Med. 192(10): 1453-1466).
BAFF, białko błonowe typu II, jest wytwarzane przez komórki pochodzenia szpikowego (Schneider i wsp. (1999) J. Exp. Med. 189(11): 1747-1756; Moore i wsp. (1999) Science 285(5425): 260-263) i jest wyrażane bą d ź na powierzchni komórek, bą d ź w postaci rozpuszczalnej (Schneider i wsp. (1999) J. Exp. Med. 189(11): 1747-1756). Wykazano uprzednio, że dwóch członków rodziny TNF, BCMA i TACI oddziałuje z BAFF (Gross i wsp. (2000) Nature 404: 995-999; Thompson i wsp. (2000) J. Exp. Med. 192(1): 129-135; Xia i wsp. (2000) J. Exp. Med. 192: 137-143; Marsters i wsp. (2000) Curr. Biol. 10(13): 785-788; Shu i wsp. (2000) J. Leukoc. Biol. 65(5): 680-683; Wu i wsp. (2000) J. Biol. Chem. 275: 35478-35485).
Niniejszy wynalazek oparty jest, co najmniej po części na ujawnieniu „BAFF-R”, białka receptora BAFF, sekwencji polinukleotydowych i polipeptydów BAFF-R kodowanych przez te sekwencje kwasu nukleinowego.
W jednym z aspektów, wynalazek dostarcza wyizolowanego polipeptydu BAFF-R (receptora czynnika aktywującego komórki B należącego do rodziny czynnika martwicy nowotworów TNF) obejmującego sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
- SEK NR ID: 5, SEK NR ID: 9, SEK NR ID: 10 lub SEK NR ID: 14,
- fragment SEK NR ID: 5, SEK NR ID: 9, SEK NR ID: 10 lub SEK NR ID: 14, który wiąże się z BAFF,
- sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 70%, 80%, 90% lub 95% identyczna z SEK NR ID: 5, SEK NR ID: 9, SEK NR ID: 10 lub SEK NR ID: 14 albo fragmentem SEK NR ID: 5, SEK NR ID: 9, SEK NR ID: 10 lub SEK NR ID: 14,
- SEK NR ID: 5, SEK NR ID: 9, SEK NR ID: 10 lub SEK NR ID: 14 albo fragment SEK NR ID: 5, SEK NR ID: 9, SEK NR ID: 10 lub SEK NR ID: 14 zmodyfikowane przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
PL 207 267 B1
Korzystnie wyizolowany polipeptyd BAFF-R według wynalazku obejmuje: aminokwasy 19-35 z SEK NR ID: 5, aminokwasy 19-35 z SEK NR ID: 5 zmodyfikowanej przez jedno albo wię kszą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF, sekwencję SEK NR ID: 13, lub sekwencję SEK NR ID: 13 zmodyfikowaną przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
Również korzystnie wyizolowany polipeptyd BAFF-R według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: SEK NR ID: 15, SEK NR ID: 16, SEK NR ID: 17, SEK NR ID: 18, SEK NR ID: 19, SEK NR ID: 20, SEK NR ID: 21, SEK NR ID: 22, SEK NR ID: 23, SEK NR ID: 24, SEK NR ID: 25, SEK NR ID: 26, SEK NR ID: 27, SEK NR ID: 28, SEK NR ID: 29, SEK NR ID: 30, SEK NR ID: 31, SEK NR ID: 32, fragmentu dowolnej z poprzedzających sekwencji wiążącego się z BAFF, oraz dowolnej spośród poprzedzających sekwencji zmodyfikowanej przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowany polipeptyd wiąże się z BAFF. Korzystniej wyizolowany polipeptyd BAFF-R według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK NR ID: 19, SEK NR ID: 22, SEK NR ID: 25, SEK NR ID: 24, SEK NR ID: 26, SEK NR ID: 27 i fragmentu dowolnej z tych sekwencji wiążącego się z BAFF.
Korzystnie wyizolowany polipeptyd BAFF-R według wynalazku wiąże się z BAFF i ma zmniejszoną skłonność do agregacji w porównaniu z natywnym polipeptydem BAFF-R i obejmuje: (a) SEK NR ID: 5 lub SEK NR ID: 10, przy czym jeden albo większa liczba niekonserwowanych aminokwasów w regionie C19-L27 natywnego polipeptydu BAFF-R jest zastą piona odpowiadają cymi aminokwasami z polipeptydu BAFF-R z SEK NR ID: 9; lub fragment sekwencji z (a), który wiąże się z BAFF. Korzystniej podstawienia są wprowadzone w jednej albo większej liczbie pozycji wybranych z grupy składającej się z: (a) V20, P21, A22 i L27 SEK NR ID: 10; (b) V41, P42, A43 i L48 SEK NR ID: 12; i (c) C19 do L27 fragmentu SEK NR ID: 10 obejmującego aminokwasy 2-71. Najkorzystniej wyizolowany polipeptyd BAFF-R według wynalazku obejmuje aminokwasy 2-71 SEK NR ID: 10, przy czym zmienione aminokwasy są wybrane z grupy składającej się z: (a) V20N, P21Q, A22T i L27P; (b) V20N i L27P; (c) P21Q i L27P; (d) L27P; (e) V20N i L27A; oraz (f) V20N i L27S.
W korzystnej postaci wykonania wyizolowany polipeptyd BAFF-R według wynalazku jest białkiem chimerowym. Korzystniej białko chimero we według wynalazku obejmuje SEK NR ID: 12, wiążący się z BAFF fragment SEK NR ID: 12, wiążącą się z BAFF sekwencję aminokwasową, która i jest w co najmniej 80% identyczna z SEK NR ID: 12 lub fragmentem SEK NR ID: 12, lub SEK NR ID: 12 lub fragment SEK NR ID: 12, zmodyfikowane przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
Chimerowe białko BAFF-R według wynalazku korzystnie obejmuje aminokwasy 23 - 92 SEK NR ID: 12 i region Fc ludzkiej IgG1. Również korzystnie białko chimerowe według wynalazku obejmuje region Fc przeciwciała, sekwencje pochodzące z białka immunoglobuliny, heterologiczną sekwencję sygnałową lub S-transferazę glutationową. W korzystnej postaci wykonania chimerowe białko według wynalazku obejmuje region stały immunoglobuliny i polipeptyd BAFF-R wybrany z grupy składającej się z: (a) dowolnej spośród SEK NR ID: 13, SEK NR ID: 14; SEK NR ID: 15; SEK NR ID: 16; SEK NR ID: 17; SEK NR ID: 18; SEK NR ID: 19; SEK NR ID: 20; SEK NR ID: 21; SEK NR ID: 22; SEK NR ID: 23; SEK NR ID: 24; SEK NR ID: 25; SEK NR ID: 26; SEK NR ID: 27; SEK NR ID: 28; SEK NR ID: 29; SEK NR ID: 30; SEK NR ID: 31 i SEK NR ID: 32; oraz (b) fragmentu z (a), który wiąże się z BAFF.
Zatem dostarczono niniejszym fuzję białkową zawierającą co najmniej dwa lub trzy odcinki, przy czym pierwszy odcinek stanowi heterologiczny peptyd sygnałowy, drugi stanowi polipeptyd albo jego fragment jak opisano w sekwencjach aminokwasowych BAFF-R przedstawionych powyżej, a trzeci odcinek stanowi polipeptyd immunoglobuliny. Alternatywnie, pierwszy odcinek stanowi polipeptyd immunoglobuliny zawierający peptyd sygnałowy, a drugi odcinek stanowi fragment polipeptydu BAFF-R. W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza wyizolowany kwas nukleinowy, który koduje polipeptyd BAFF-R według wynalazku albo jego aktywną biologicznie część. Kwas nukleinowy może zawierać np. sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, który jest w co najmniej 80% identyczny albo w co najmniej 90% identyczny z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej z Fig. 2D (SEK NR ID: 5). Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEK NR ID: 8, fragmentu SEK NR ID: 8 obejmującego co najmniej 100 kolejnych nukleotydów, sekwencji kwasu nukleinowego, która koduje SEK NR ID: 14,
PL 207 267 B1 sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd, który jest w co najmniej 70% lub 90% identyczny z SEK NR ID: 14 i wiąże się z BAFF, oraz sekwencji do nich komplementarnej.
W szczególności przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z; SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6, SEK NR ID: 11, nukleotydów 67 - 276 SEK NR ID: 11, nukleotydów 67 - 276 i 280 - 960 SEK NR ID: 11, fragmentu, co najmniej 100 kolejnych nukleotydów dowolnej z poprzedzających sekwencji, fragmentu dowolnej z poprzedzających sekwencji, który koduje polipeptyd wiążący się z BAFF, oraz sekwencji nukleotydowej, która koduje polipeptyd wiążący się z BAFF i jest w co najmniej 70%, 80% lub 90% identyczna z dowolną spośród powyższych sekwencji.
Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest mniejszy niż BAFF-R pełnej długości i wiąże się z BAFF.
Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową komplementarną do wyżej wskazanych sekwencji nukleotydowych według wynalazku lub sekwencję nukleotydową, która w ostrych warunkach (6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 500 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia w 65°C, po czym następuje jedno lub więcej przemywanie 0,2X SSC, 0,1% BSA w 50°C) hybrydyzuje z SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3 (sekwencja kodująca z Fig. 2A), SEK NR ID: 4 (sekwencja kodująca z Fig. 2C), SEK NR ID: 6 lub nukleotydami 67 - 276 z SEK NR ID: 11, sekwencją komplementarną do SEK NR ID: 3 lub SEK NR ID: 4, przy czym powyższe sekwencje nie stanowią EST AI250289, SEK NR ID: 2 lub depozytu w GenBank o nr dostępu Z99716.
W niektórych wykonaniach sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd o sekwencji z Fig. 2D (SEK NR ID: 5), z co najmniej jednym konserwatywnym podstawieniem aminokwasowym.
W niektórych wykonaniach sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd, który wiąże się z BAFF.
Kwas nukleinowy może obejmować np. kwas nukleinowy, który zawiera sekwencję nukleotydową pokazaną w Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6).
Kwasem nukleinowym może być np. fragment DNA genomowego albo może to być cząsteczka cDNA.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza zasadniczo czystą cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą fuzję białkową zawierającą, co najmniej dwa odcinki, gdzie jeden z odcinków stanowi polipeptyd albo jego fragment jak opisano w sekwencjach aminokwasowych przedstawionych w powyższych wykonaniach wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest także sonda będąca wyizolowanym kwasem nukleinowym składającym się z od 10 do 50 kolejnych nukleotydów wybranych spośród:
(a) sekwencji wybranej z grupy składającej się z SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6;
(b) SEK NR ID: 8;
(c) sekwencji komplementarnej do sekwencji wybranej z grupy składającej się z SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6; oraz (d) sekwencji zdegenerowanych względem sekwencji (a) lub (b) kodujących tę samą sekwencję aminokwasową.
Wynalazkiem objęty jest również wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. Niniejszy wynalazek dotyczy również komórki gospodarza stransformowanej zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym zawierającym dowolną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. Korzystnie komórka jest komórką jajnika chomika chińskiego.
W jeszcze dalszym aspekcie wynalazek dostarcza przeciwciało, które wiąże się swoiście z polipeptydem BAFF-R. Przeciwciałem może być np. przeciwciało monoklonalne albo poliklonalne. W szczególnoś ci przedmiotem wynalazku jest przeciwciał o lub polipeptyd obejmują cy część przeciwciała wiążącą antygen, które swoiście wiążą się z częścią BAFF-R polipeptydu według wynalazku. Korzystnie przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu stanowi przeciwciało monoklonalne, poliklonalne, chimerowe, humanizowane, przeciwciało jednołańcuchowe, fragment Fab lub fragmenu F(ab)'2. Korzystniej przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu według wynalazku jest humanizowana. Również korzystnie przeciwciało według wynalazku jest wytwarzane przez klon hybrydoma #2.1, zdeponowany jako ATCC nr PTA-3689; lub klon hybrydoma #9.1, zdeponowany jako
PL 207 267 B1
ATCC nr PTA-3688. Korzystniej przeciwciało lub polipeptyd obejmujący część przeciwciała wiążącą antygen blokują wiązanie BAFF z BAFF-R.
Przedmiotem wynalazku jest także hybrydoma wybrana z grupy składającej się z klonu hybrydoma #2.1, zdeponowanego jako ATCC nr PTA-3689 i klonu hybrydoma #9.1, zdeponowanego jako ATCC nr PTA-3688.
W innym aspekcie, wynalazek obejmuje kompozycję farmaceutyczną, która zawiera zawiera jeden lub więcej polipeptydów według wynalazku lub przeciwciał lub polipeptydów obejmujących część przeciwciała wiążącą antygen według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo rozcieńczalnik.
Niniejszy wynalazek dotyczy również zestawów zawierających przeciwciała według wynalazku i przeciwciał o bę d ą ce kontrolą negatywną .
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw diagnostyczny do identyfikowania komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R obejmujący sondę oligonukleotydową o co najmniej 10 kolejnych nukleotydach z sekwencji wybranej z grupy składającej się z SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6 i sekwencji, które są komplementarne do dowolnej spośród SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania obecności BAFF-R w próbce biologicznej, obejmujący wyznakowany związek albo czynnik zdolny do wykrywania polipeptydu BAFF-R lub mRNA kodującego polipeptyd BAFF-R według wynalazku w próbce biologicznej, środek do oznaczania ilości BAFF-R w próbce biologicznej oraz środek do porównywania ze standardem ilości polipeptydu BAFF-R lub mRNA w próbce.
Wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania polipeptydu BAFF. Sposób obejmuje dostarczenie komórki według wynalazku zawierającej kwas nukleinowy BAFF-R, np. wektor, który zawiera kwas nukleinowy BAFF-R i hodowanie komórki w warunkach dostatecznych dla wyrażania polipeptydu BAFF-R kodowanego przez kwas nukleinowy. Wyrażony polipeptyd BAFF-R jest następnie odzyskiwany z komórki. Korzystne jest, jeżeli komórki wytwarzają mało albo wcale endogennego polipeptydu BAFF-R. Komórką może być np., komórka prokariotyczna albo eukariotyczna.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania polipeptydu BAFF-R o zmniejszonej skłonności do agregacji w porównaniu z natywnym polipeptydem BAFF-R, który obejmuje etapy:
(a) transformowania komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd BAFF-R według wynalazku, w którym jeden albo większa liczba niekonserwowanych aminokwasów, korzystnie aminokwasów niepolarnych, z regionu C19-L27 jest zastąpiona odpowiadającymi aminokwasami z polipeptydu BAFF-R z SEK NR ID: 9;
(b) hodowania komórki w warunkach dostatecznych do wyrażania polipeptydu BAFF-R z zastąpionymi aminokwasami; oraz (c) odzyskiwania polipeptydu BAFF-R z (b).
Korzystniej, aminokwas niepolary niepolarny jest zamieniony na aminokwas wybrany z grupy składającej się z proliny, seryny lub alaniny.
Niniejszym opisano również sposób indukowania odpowiedzi immunologicznej u ssaka wobec polipeptydu kodowanego przez dowolną z ujawnionych powyżej cząsteczek kwasu nukleinowego poprzez podawanie ssakowi ilości polipeptydu wystarczającej dla indukowania odpowiedzi immunologicznej.
Poniżej opisane zostały również sposoby identyfikowania związku, który wiąże się z polipeptydem BAFF-R, poprzez doprowadzenie do kontaktu polipeptydu BAFF-R ze związkiem i ustalenie, czy związek wiąże się z polipeptydem BAFF-R oraz sposoby identyfikowania związku, który wiąże się z czą steczką kwasu nukleinowego kodują cego polipeptyd BAFF-R, poprzez doprowadzenie do kontaktu kwasu nukleinowego BAFF-R ze związkiem i ustalenie, czy związek wiąże się z cząsteczką kwasu nukleinowego.
Przedmiotem wynałazku jest natomiast sposób identyfikowania związku, który moduluje aktywność polipeptydu BAFF-R, poprzez doprowadzenie do kontaktu polipeptydu BAFF-R ze związkiem i ustalenie, czy aktywno ść polipeptydu BAFF-R jest modyfikowana. Niniejszym opisano również zwią zki, które modulują aktywność polipeptydu BAFF-R, zidentyfikowanych poprzez doprowadzenie do kontaktu polipeptydu BAFF-R ze związkiem i ustalenie, czy związek modyfikuje aktywność polipeptydu BAFF-R albo wiąże się z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd BAFF-R.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu diagnozowania in vitro stanów, w których pośredniczą komórki B, np. choroby autoimmunologicznej albo nowotworu, u osobnika. Sposób obejmuPL 207 267 B1 je pomiar ilości polipeptydu BAFF-R w próbce biologicznej od osobnika. Ilość polipeptydu BAFF-R w próbce od osobnika porównuje się następnie z iloś cią polipeptydu BAFF-R w kontrolnej próbce białka. Zmiana w ilości polipeptydu BAFF-R w próbce białka od osobnika wskazuje, że osobnik ma stan, w którym poś redniczą komórki B. Korzystne jest, jeż eli próbka kontrolna jest pobrana od pasującego osobnika, tj. osobnika o podobnym wieku, płci i ogólnym stanie, który nie jest podejrzewany o posiadanie takiego stanu. Alternatywnie, próbka kontrolna może być pobrana od osobnika w czasie, kiedy osobnik ten nie był podejrzewany o to, że ma chorobę. Polipeptyd BAFF-R może być wykrywany przy użyciu przeciwciała BAFF-R.
W dalszym aspekcie, wynalazek obejmuje sposób diagnozowania in vitro stanu, w którym pośredniczą komórki B, np. choroby autoimmunologicznej, u osobnika. Sposób obejmuje pomiar ilości kwasu nukleinowego BAFF-R, np. RNA lub DNA albo obydwu, w próbce kwasu nukleinowego od osobnika. Ilość kwasu nukleinowego BAFF-R w próbce kwasu nukleinowego od osobnika porównuje się następnie z ilością kwasu nukleinowego BAFF-R w próbce kontrolnej. Zmiana w ilości kwasu nukleinowego BAFF-R w próbce w stosunku do ilości BAFF-R w próbce kontrolnej wskazuje, że osobnik ma stan autoimmunologiczny.
Niniejszym ujawniono także sposób diagnozowania stanu nowotworowego albo autoimmunologicznego u osobnika. Sposób obejmuje dostarczenie próbki kwasu nukleinowego, od pacjenta i zidentyfikowanie, co najmniej części sekwencji nukleotydowej kwasu nukleinowego BAFF-R w próbce kwasu nukleinowego od osobnika. Sekwencję nukleotydową BAFF-R w próbce od osobnika porównuje się następnie z sekwencję nukleotydową BAFF-R w próbce kontrolnej. Zmiana sekwencji nukleotydowej BAFF-R w próbce w stosunku do sekwencji nukleotydowej BAFF-R w takiej próbce kontrolnej wskazuje, że osobnik ma taki stan.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania funkcjonalnie aktywnego zmutowanego polipeptydu BAFF-R według wynalazku obejmujący ocenę zmutowanego BAFF-R pod kątem jednej albo większej liczby następujących aktywności:
(a) zdolności do wiązania się z BAFF;
(b) zdolności do wiązania się z wewnątrzkomórkowym białkiem docelowym lub jego aktywną biologicznie częścią; oraz (c) zdolności do swoistego wiązania się z przeciwciałem anty-BAFF-R; przy czym obecność jednej albo większej liczby tych aktywności wskazuje, że zmutowany polipeptyd BAFF-R jest funkcjonalnie aktywny.
Ponadto wynalazek dostarcza sposobu identyfikowania komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R obejmującego (a) doprowadzanie do kontaktu sondy oligonukleotydowej obejmującej co najmniej 10 kolejnych nukleotydów z sekwencji wybranej spośród SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6 i sekwencji, które są komplementarne do dowolnej spośród SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6, z próbką biologiczną od osobnika; i (b) pomiar poziomu kwasu nukleinowego kodującego BAFF-R w próbce biologicznej przez wykrywanie poziomów mRNA BAFF-R; lub alternatywnie, (c) oznaczenie, czy kwas nukleinowy BAFF-R w próbce biologicznej został zmutowany albo uległ delecji.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób oznaczania BAFF-R in vitro w próbce biologicznej od osobnika obejmujący etapy wykrywania polipeptydu BAFF-R według wynalazku w próbce biologicznej od osobnika przy użyciu przeciwciała lub polipeptydu obejmującego wiążącą antygen część przeciwciała według wynalazku.
Wynalazek dostarcza również sposobu określania in vitro czy sekwencja genomowego BAFF-R została zmutowana lub usunięta obejmującego etap określania czy cząsteczka kwasu nukleinowego dla BAFF-R w próbce biologicznej od osobnika, została zmutowana lub usunięta, w którym to wykorzystuje się cząsteczkę kwasu nukleinowego zdolną do hybrydyzacji w ostrych warunkach z genomową sekwencją ludzkiego BAFF-R (SEK NR ID: 10) lub mysiego BAFF-R (SEK NR ID: 9), przy czym ostre warunki hybrydyzacji określono powyżej.
Rozwiązania według wynalazku są użyteczne w sposobie diagnozowania, leczenia, zapobiegania albo opóźniania stanu, w którym pośredniczą komórki B. Sposób taki obejmuje podawanie osobnikowi, u którego takie leczenie, zapobieganie albo opóźnianie jest pożądane, kwasu nukleinowego BAFF-R, polipeptydu BAFF-R albo przeciwciała anty-BAFF-R w ilości wystarczającej dla leczenia, zapobiegania albo opóźniania stanu nowotworowego albo immunoregulacyjnego u osobnika.
PL 207 267 B1
Przedmiotem wynalazku jest zatem polipeptyd BAFF-R, przeciwciało lub polipeptyd obejmujący wiążącą antygen część przeciwciała według wynalazku do stosowania w leczeniu.
Stanami diagnozowanymi, leczonymi, którym się zapobiega albo opóźnia, z użyciem cząsteczek kwasu nukleinowego, polipeptydów albo przeciwciał BAFF-R według wynalazku może być choroba nowotworowa albo immunoregulacyjna. Choroby obejmują te, które są autoimmunologicznymi w swojej naturze, takie jak toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, ciężka miastenia, autoimmunologiczna anemia hemolityczna, samoistna plamica małopłytkowa, zespół antyfosfolipidowy, choroba Chagasa, choroba Gravesa, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie guzkowate tętnic i szybko postępujące zapalenie kłębuszków nerkowych. Czynnik leczniczy ma również zastosowanie w chorobach komórek plazmatycznych, takich jak szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstroma, choroba ciężkich łańcuchów, pierwotna albo związana z immunocytami skrobiawica oraz gammopatia monoklonalna o nieustalonym znaczeniu (MGUS). Cele onkologiczne obejmują nowotwory komórek B, białaczki i chłoniaki. W szczególności możliwe jest leczenie choroby choroby limfoproliferacyjnej komórek B, chłoniaka Burkitta lub zapalenia.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu BAFF-R, przeciwciała lub polipeptydu obejmującego wiążącą antygen część przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia wyżej wskazanych chorób. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do leczenia, przeciwdziałania lub opóźniania reumatoidalnego zapalenia stawów lub tocznia rumieniowatego układowego.
Kompozycje według wynalazku obejmujące agonisty BAFF-R (takie jak przeciwciała, które wiążą się z BAFF-R i naśladują BAFF) można również użyć do leczenia niedoboru odporności charakteryzującej się na przykład niską liczebnością komórek B. Takie choroby mogą być spowodowane na przykład napromieniowaniem i/lub chemioterapią.
Niniejszym opisano także sposób zmniejszania agregacji białka wyrażanego przez rekombinowanie DNA. Sposób obejmuje porównanie homologów białka albo jego fuzji białkowej w celu ustalenia konserwowanych domen i nieidentycznych aminokwasów w obrębie regionów konserwowanych. Generalnie, co najmniej jeden niepolarny aminokwas zmienia się na nienaładowany aminokwas polarny, taki jak prolina, alanina lub seryna.
O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie stosowane tu terminy techniczne i naukowe mają takie samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie, do której ten wynalazek należy. Jakkolwiek można zastosować metody i materiały podobne lub równoważne do tych opisanych tutaj, odpowiednie metody i materiały są opisane poniżej. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne wspomniane tu odnośniki są włączone w całości jako odniesienie. W przypadku niezgodności, będzie to nadzorował niniejszy opis, włączając w to definicje. Ponadto, materiały, metody i przykłady są jedynie ilustracyjne i bez zamiaru ograniczenia.
Inne właściwości i korzyści wynalazku będą oczywiste z następującego szczegółowego opisu i zastrzeż e ń .
Krótki opis rysunków
Fig. 1A pokazuje sekwencję DNA cDNA BJAB (SEK NR ID: 1) sklonowaną w pJST576.
Fig. 1B pokazuje pełną sekwencję DNA klonu cDNA IMAGE 2000271 (EST AI250289) (SEK NR ID: 2).
Fig. 2A pokazuje sekwencję nukleotydową JST576 z usuniętym intronem według przewidywań programu GENESCAN (SEK NR ID: 3).
Fig. 2B pokazuje 1% żel agarozowy produktów PCR otrzymanych dla BAFF-R przy użyciu bądź pierwszej nici cDNA otrzymanej z RNA BJAB lub IM-9 bądź cDNA JST576. Ścieżka 1. Trawienie Hindlll DNA Lambda. Ścieżka 2. BJAB ze starterami oligo dT i BAF-225/BAF-191. Ścieżka 3. BJAB ze starterami oligo dT i BAF-226/BAF-191. Ścieżka 4. BJAB z losowymi starterami i BAF-225/BAF-191. Ścieżka 5. BJAB z losowymi starterami i BAF-226/BAF-191. Ścieżka 6. IM-9 ze starterami oligo dT i BAF-225/BAF-191. Ś cież ka 7. IM-9 ze starterami oligo dT i BAF-226/BAF-191. Ś cież ka 8. IM-9 z losowymi starterami i BAF-225/BAF-191. Ś cież ka 9. IM-9 z losowymi starterami i BAF-226/BAF-191. Ścieżka 10. cDNA JST576 i BAF-225/BAF-191. Ścieżka 11. cDNA JST576 i BAF-226/BAF-191. Ścieżka 12. Bez matrycy i BAF-225/BAF-191. Ścieżka 13. Bez matrycy i BAF-226/BAF-191.
Fig. 2C pokazuje sekwencję dojrzałego JST576 (BAFF-R) (SEK NR ID: 4) (również numer dostępu w GenBank AF373846) ustaloną poprzez sekwencjonowanie całego produktu PCR otaczającego przewidywany intron z pierwszej nici cDNA BJAB.
PL 207 267 B1
Fig. 2D pokazuje sekwencję aminokwasową BAFF-R (JST576) (SEK NR ID: 5). Reszta A (Ala) zaznaczona tłustym drukiem wskazuje na sekwencję będącą wynikiem wykorzystania alternatywnego akceptorowego miejsca składania. Przewidywana domena transbłonowa wzięta jest w ramkę, a przypuszczalny sygnał stop dla transferu jest podkreślony.
Fig. 3 przedstawia wersję składania JST576 (SEK NR ID: 6) zawierającą sekwencję 5' UTR otrzymaną przez RT-PCR z pierwszej nici cDNA z ludzkiej śledziony i wydedukowaną sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 7). Sekwencja ta zawiera kodon stop w ramce przed ATG.
Fig. 4A pokazuje sekwencję mysiego BAFF-R cDNA (SEK NR ID: 8) (również numer dostępu w GenBank AF373847).
Fig. 4B pokazuje sekwencję aminokwasową mysiego BAFF-R (SEK NR ID: 9). Reszty Cys są zaznaczone tłustym drukiem i podkreślone, a przewidywana domena transbłonowa jest wzięta w ramkę.
Fig. 4C pokazuje homologię między sekwencjami ludzkiego (SEK NR ID: 10) i mysiego (SEK NR ID: 9) białka BAFF-R.
Fig. 5 przedstawia wiązanie się ludzkiego BAFF z komórkami kotransfekowanymi pJST576.
Komórki 293EBNA kotransfekowano pJST576, CA336 (huTACI) i konstruktem reporterowym z GFP.
Komórki testowano pod kątem wiązania się z BAFF przy użyciu 1 μg/ml biotynylowanego mychuBAFF, a następnie SAV-PE.
Fig. 6 pokazuje wiązanie się ludzkiego i mysiego BAFF z komórkami kotransfekowanymi JST576. Komórki 293EBNA kotransfekowano pJST576 i konstruktem reporterowym z GFP. Komórki testowano 24 godz. później pod kątem wiązania się z BAFF przy użyciu 5 μg/ml flag-huBAFF lub flagmuBAFF, a następnie przeciwciała monoklonalego M2 anty-flag i oślich przeciwciał anty-mysia IgG-PE.
Fig. 7 pokazuje, że APRIL nie wiąże się z JST576 komórkami kotransfekowanymi JST576. Komórki 293EBNA kotransfekowano pJST576 lub CA336 (huTACI) i konstruktem reporterowym z GFP. Komórki testowano pod kątem wiązania się z APRIL przy użyciu 1 μg/ml myc-muAPRIL, a następnie szczurzej IgG2b anty-muAPRIL, biotynylowanego przeciwciała anty-szczurza FcG2b i SAV-PE.
Fig. 8 pokazuje, że BAFF wytrąca białko z komórek kotransfekowanych JST576. Komórki 293EBNA kotransfekowano BAFF-R (pJST576), samym wektorem (CH269) albo huTACI (CA336) i znakowano pulsowo 35S cysteiną i metioniną. Ekstrakty poddawano immunoprecypitacji z flaghuBAFF i puszczano na redukujący żel SDS-PAGE. Markery masy cząsteczkowej są pokazane po lewej stronie.
Fig. 9 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (SEK NR ID: 11) i pochodzącą od niego sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 12) genu kodującego ludzki BAFF-R:Fc: reszty kwasu nukleinowego 1-63 kodują mysią sekwencję sygnałową IgG-kappa; reszty kwasu nukleinowego 64-66 użyto do wprowadzenia miejsca dla enzymu restrykcyjnego, reszty kwasu nukleinowego 67-276 kodują część domeny zewnątrzkomórkowej BAFF-R, reszty kwasu nukleinowego 277-279 użyto do wprowadzenia miejsca dla enzymu restrykcyjnego, a reszty kwasu nukleinowego 280-960 kodują region Fc ludzkiej IgG1.
Fig. 10 przedstawia wyniki analizy Northern przy użyciu fragmentu EcoNI z JST56 jako sondy. Wszystkie ekspozycje były 4 dniowe. 10A: Clontech - ludzki zestaw Immune II blot; 10B: Clontech ludzki 12-ścieżkowy zestaw wielotkankowy; 10C: Clontech - ludzki zestaw wielotkankowy II blot.
Fig. 11 pokazuje wyniki analizy Northern dla 20 μg całkowitego RNA wyizolowanego z różnych linii komórkowych. Jako sondy użyto fragmentu restrykcyjnego EcoNI JST576 i ekspozycję prowadzono przez 4 dni. Zdolność linii komórkowych do wiązania BAFF, co ustalono poprzez analizę FACS jest pokazana poniżej ścieżki.
Fig. 12 pokazuje wyniki immunoprecypitacji z użyciem BAFF-R:Fc. Ludzki BAFF ulega immunoprecypitacji z BAFF-R:Fc lub BCMA:Fc, ale nie z Fn14-Fc. Kontrolne białko BAFF jest pokazane w ścieżce 1.
Fig. 13 pokazuje, że ludzki BAFF-R:Fc blokuje wiązanie się ludzkiego BAFF z komórkami BJAB. Wyniki analizy FACS są pokazane na Fig. 13A. Krzywa E reprezentuje wiązanie się biotynylowanego BAFF do komórek BJAB w nieobecności BAFF-R:Fc. Krzywe B-D reprezentują zdolność do wiązania się BAFF z komórkami BJAB w obecności, odpowiednio, 5 μg/ml, 1 μg/ml albo 0,2 μg/ml. Krzywa A jest krzywą jedynie dla drugiego etapu. Fig. 13B ilustruje zdolność różnych stężeń BAFF-R:Fc (kwadraty) w porównaniu z TACI:Fc (trójkąty) albo niespecyficzną fuzją białkową, LT_R:Fc (kółka), do blokowania wiązania się BAFF z komórkami BJAB wyrażającymi receptor.
PL 207 267 B1
Fig. 14 pokazuje zdolność BAFF-R:Fc do blokowania indukowanej BAFF kostymulacji komórek B śledziony. Pokazany jest wykres inkorporacji [3H] tymidyny (cpm) względem rosnącej ilości hBAFF (ng/ml).
Fig. 15 pokazuje, że traktowanie BAFF-R:Fc1 prowadzi do utraty obwodowych komórek B u zdrowych myszy.
Fig. 16 pokazuje, że traktowanie BAFF-R:Fc1 ludzkim i mysim BAFF-R:Fc zmniejsza liczbę komórek B śledziony, B220+.
Fig. 17 pokazuje, że podawanie BAFF-R:Fc myszom zmniejsza procent komórek B B220+ w węźle limfatycznym.
Fig. 18 pokazuje, że podawanie BAFF-R:Fc myszom zmniejsza liczbę komórek B B220+ we krwi obwodowej.
Fig. 19A pokazuje dane FACS dla supematanów z czterech klonów, które wytwarzają przeciwciała, które wiążą się z BAFF-R. Pokazany jest również kontrolny supematant, który nie zawiera przeciwciał, które wiążą się z BAFF-R.
Fig. 19B przedstawia histogram pokazujący, że dwa klony blokują wiązanie się BAFF z BAFF-R. (a) pokazuje kontrolę bez BAFF; (b) pokazuje blokowanie zdolności wiązania się przeciwciała z klonu 2; (c) pokazuje blokowanie zdolności wiązania się przeciwciała z klonu 9; i (d) pokazuje krzywą dla przeciwciała kontrolnego, które nie wiąże się z BAFF-R.
Fig. 20 pokazuje dopasowanie sekwencji aminokwasowych domeny zewnątrzkomórkowej ludzkiego BAFF-R:Fc (hBAFF-R) i mysiego BAFF-R:Fc (mBAFF-R) i procent agregacji obserwowany po ekspresji fuzji białkowych Fc zawierających wskazane sekwencje. Numerowane klony JST reprezentują sekwencje aminokwasowe wykazujące mutacje (podkreślone) w rodzicielskich sekwencjach i będącą ich wynikiem agregacji wyrażanego białka. Pokazane są częściowe sekwencje, ludzka (SEK NR ID: 13) i mysia (SEK NR ID: 14) BAFF-R; oraz odpowiadające im części następujących klonów: JST659 (SEK NR ID: 15), JST660 (SEK NR ID: 16), JST661 (SEK NR ID: 17), JST662 (SEK NR ID: 18), JST663 (SEK NR ID: 19), JST673 (SEK NR ID: 20), JST 674 (SEK NR ID: 21), JST675 (SEK NR ID: 22), JST672 (SEK NR ID: 23), JST676 (SEK NR ID: 24), JST671 (SEK NR ID: 25), JST677 (SEK NR ID: 26), JST678 (SEK NR ID: 27), JST664 (SEK NR ID: 28), JST668 (SEK NR ID: 29), JST665 (SEK NR ID: 30), JST666 (SEK NR ID: 31) i JST667 (SEK NR ID: 32).
Fig. 21 pokazuje autoradiogram białek ulegających immunoprecypitacji przy użyciu lizatów wytworzonych z komórek transfekowanych BAFF-R-i.c.d. (domena wewnątrzkomórkowa BAFF-R) (ścieżka 1) lub wektorem kontrolnym (ścieżka 2). Około 6x106 komórek 293E transfekowano konstruktem kodującym BAFFR-i.c.d. i plazmidem stanowiącym ślepą próbę. Po 48 godzinach komórki znakowano metabolicznie 35S przez 24 godziny, lizowano w buforze do lizy, wstępnie klarowano i poddawano immunoprecypitacji z anty-myc, 9E10. Immunoprecipitanty rozdzielano poprzez 10-20% SDSPAGE w warunkach redukujących.
Szczegółowy opis wynalazku
Prace stanowiące odnośniki, patenty, zgłoszenia patentowe i piśmiennictwo naukowe, włączając w to numery dostępu do sekwencji w bazach danych, do których następuje tu odniesienie stanowią wiedzę specjalisty w tej dziedzinie i są włączone jako odniesienie w całości w tym samym zakresie, jak gdyby każdy z nich był konkretnie i indywidualnie wskazany, aby być włączonym jako odniesienie. Jakakolwiek sprzeczność pomiędzy przytoczonym tu odnośnikiem a konkretną nauką wynikającą z tego opisu bę dzie rozstrzygana na korzyść tej ostatniej. Podobnie, jakakolwiek sprzeczność między rozumianą w tej dziedzinie definicją słowa albo zdania a definicją słowa albo zdania podaną w tym opisie będzie rozstrzygana na korzyść tej ostatniej.
Standardowe prace odnośnikowe podane w celu przedstawienia ogólnych zasad technologii rekombinowania DNA znanych specjalistom w tej dziedzinie obejmują Ausubel i wsp. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998); Sambrook i wsp. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman i wsp., Wyd., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Wyd., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991).
Niniejszy wynalazek ujawnia kwasy nukleinowe BAFF-R, wyizolowane kwasy nukleinowe, które kodują polipeptyd BAFF-R albo jego aktywną biologicznie część, polipeptydy BAFF-R, wektory zawierające te kwasy nukleinowe, komórki gospodarza transformowane kwasami nukleinowymi BAFF-R, przeciwciała anty-BAFF-R oraz kompozycje farmaceutyczne. Ujawnione są również sposoby wytwaPL 207 267 B1 rzania polipeptydów BAFF-R, jak również sposoby poszukiwania, diagnozowania i leczenia stanów przy użyciu tych związków oraz sposoby poszukiwania związków, które modulują aktywność polipeptydu BAFF-R.
Kwasy nukleinowe i polipeptydy BAFF-R, jak również przeciwciała anty-BAFF-R, a także dyskutowane tu kompozycje farmaceutyczne są przydatne między innymi w leczeniu nowotworu i/lub chorób immunoregulacyjnych. Te choroby obejmują np. choroby z udziałem komórek B, które są autoimmunologicznymi w swojej naturze, takie jak ogólnoustrojowy toczeń rumieniowaty, reumatoidalne zapalenie stawów, ciężka miastenia, autoimmnologiczna anemia hemolityczna, samoistna plamica małopłytkowa, zespół anty-fosfolipidowy, choroba Chagasa, choroba Gravesa, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie guzkowate tętnic i szybko postępujące zapalenie kłębuszków nerkowych. Czynnik leczniczy ma również zastosowanie w chorobach komórek plazmatycznych, takich jak szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstroma, choroba ciężkich łańcuchów, pierwotna albo związana z immunocytami skrobiawica oraz gammopatia monoklonalna o nieustalonym znaczeniu (MGUS). Cele onkologiczne obejmują nowotwory komórek B, białaczki i chłoniaki.
Kwasy nukleinowe BAFF-R
Jeden z aspektów wynalazku dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują białka BAFF-R albo ich biologicznie aktywne części. Obejmuje to również fragmenty kwasów nukleinowych wystarczające do zastosowania jako sondy do hybrydyzacji w celu zidentyfikowania cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących BAFF-R (np. mRNA BAFF-R) oraz fragmenty do zastosowania jako startery w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do powielania albo mutacji cząsteczek kwasu nukleinowego BAFF-R. Stosowany tu termin „cząsteczka kwasu nukleinowego” ma obejmować cząsteczki DNA (np. cDNA lub DNA genomowy) i cząsteczki RNA (np. mNMA), analogi DNA lub RNA wytworzone przy użyciu analogów nukleotydów oraz ich pochodne, fragmenty i homologi. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa albo dwuniciowa, ale korzystne jest, jeżeli jest dwuniciowym DNA.
„Sonda” dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego o różnej długości, korzystnie, między co najmniej około 10 nukleotydów (nt) a tak dużo jak około np. 6000 nt, zależnie od zastosowania. Sondy są stosowane przy wykrywaniu identycznych, podobnych albo komplementarnych sekwencji kwasu nukleinowego. Dłuższe sondy zwykle otrzymuje się ze źródła naturalnego albo zrekombinowanego, są wysoce specyficzne i znacznie wolniej hybrydyzują niż oligomery. Sondy mogą być jednoniciowe albo dwuniciowe i zaprojektowane tak, żeby miały specyficzność w PCR, technologiach hybrydyzacji w oparciu o membrany albo technologie typu ELISA.
„Wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego jest taką, która jest oddzielona od innych cząsteczek kwasu nukleinowego, które są obecne w naturalnym źródle kwasu nukleinowego. Przykłady wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują między innymi zrekombinowane cząsteczki DNA zawarte w wektorze, zrekombinowane cząsteczki DNA utrzymywane w heterologicznej komórce gospodarza, częściowo albo zasadniczo oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego i syntetyczne cząsteczki DNA albo RNA. Korzystne jest, jeżeli „wyizolowany” kwas nukleinowy jest wolny od sekwencji, które naturalnie flankują kwas nukleinowy (tj. sekwencji znajdujących się na końcach 5' i 3' kwasu nukleinowego) w DNA genomowym organizmu, z którego kwas nukleinowy pochodzi. Przykładowo, w różnych wykonaniach wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego BAFF-R może zawierać mniej niż około 50 kb, 25 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb albo 0,1 kb sekwencji nukleotydowych, które naturalnie flankują cząsteczkę kwasu nukleinowego w DNA genomowym komórki, z której kwas nukleinowy pochodzi. Ponadto, „wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego, taka jak cząsteczka cDNA, może być zasadniczo wolna od innego materiału komórkowego albo pożywki hodowlanej, kiedy jest wytwarzana przy zastosowaniu technik rekombinowania DNA, albo zasadniczo wolna od prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych, kiedy jest syntetyzowana chemicznie.
Cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku np. cząsteczka kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) albo sekwencja komplementarna do dowolnej z tych sekwencji nukleotydowych może być wyizolowana przy zastosowaniu standardowych technik biologii molekularnej i dostarczonych tu informacji o sekwencji. Stosując całą albo część sekwencji kwasu nukleinowego z Fig. 1A, B, 2A, C i 3 jako sondę do hybrydyzacji, można wyizolować sekwencje kwasu nukleinowego BAFF-R przy zastosowaniu standardowych technik hybrydyzacji i klonowania (np. jak opisano w Sambrook i wsp. Molecular-Cloning: A Laboratory Manual. Wyd. 2., Cold Spring
PL 207 267 B1
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 oraz Ausubel i wsp., wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993).
Kwas nukleinowy według wynalazku można powielać przy użyciu cDNA, mRNA lub alternatywnie, DNA genomowego jako matrycy i odpowiednich starterów oligonukleotydowych według standardowych technik amplifikacji PCR. Powielony w ten sposób kwas nukleinowy można klonować w odpowiednim wektorze i charakteryzować poprzez analizę sekwencji DNA. Ponadto, oligonukleotydy odpowiadające sekwencjom nukleotydowym BAFF-R można wytwarzać poprzez zastosowanie standardowych technik, np. stosując automatyczne syntetyzatory DNA.
Stosowany tu termin „oligonukleotyd” dotyczy serii połączonych reszt nukleotydowych, gdzie oligonukleotyd ma dostateczną liczbę zasad nukleotydowych aby być stosowanym w reakcji PCR. Krótka sekwencja oligonukleotydowa może być oparta albo zaprojektowana na podstawie sekwencji genomowej albo cDNA i używana do powielania, potwierdzania albo ujawniania obecności identycznego, podobnego albo komplementarnego DNA lub RNA w konkretnej komórce albo tkance. Oligonukleotydy zawierają część sekwencji kwasu nukleinowego o długości od około 10 nt do tak dużej jak 50 nt, korzystnie około 15 do 30 nt. Mogą być syntetyzowane chemicznie i używane jako sondy.
W innym wykonaniu wyizolowana czą steczka kwasu nukleinowego wedł ug wynalazku zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej pokazanej w Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6). W innym wykonaniu wyizolowana czą steczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej pokazanej w Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2) Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) albo część takiej sekwencji nukleotydowej. Cząsteczką kwasu nukleinowego, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej pokazanej Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2) Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) jest taka, która jest wystarczająco komplementarna do sekwencji nukleotydowej pokazanej w Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2) Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6), tak, że może wiązać się poprzez wiązania wodorowe z niewielkimi albo bez niedopasowań z sekwencją nukleotydową pokazaną w Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6), tworząc w ten sposób stabilny dupleks.
Stosowany tu termin „komplementarny” dotyczy parowania zasad Watsona-Cricka albo Hoogsteena pomiędzy jednostkami nukleotydowymi w cząsteczce kwasu nukleinowego, a termin „wiązanie” oznacza fizyczne albo chemiczne oddziaływanie pomiędzy dwoma polipeptydami lub związkami albo połączonymi polipeptydami lub związkami albo ich kombinacją. Wiązanie obejmuje oddziaływania jonowe, niejonowe, Wan der Waalsa, hydrofobowe, itd. Oddziaływania fizyczne mogą być bądź bezpośrednie bądź pośrednie. Oddziaływania pośrednie mogą następować poprzez albo na skutek: efektów innego polipeptydu albo związku. Oddziaływania bezpośrednie dotyczą oddziaływań, które nie następują poprzez albo na skutek efektów innego polipeptydu albo związku, mają natomiast miejsce bez innych zasadniczych pośrednich związków chemicznych.
Ponadto, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może zawierać jedynie część sekwencji kwasu nukleinowego z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6), np. fragment, który można użyć jako sondę albo starter, albo fragment kodujący aktywną biologicznie część BAFF-R. Dostarczone tu fragmenty są zdefiniowane jako sekwencje o długości, co najmniej 6 (ciągłych) reszt kwasy nukleinowego albo, co najmniej 4 (ciągłych) aminokwasów, co jest długością wystarczającą dla umożliwienia specyficznej hybrydyzacji w przypadku kwasów nukleinowych albo specyficznego rozpoznania epitopu w przypadku aminokwasów, odpowiednio, i mają, co najwyżej jakąś część mniejszą niż sekwencja pełnej długości. Fragmenty mogą pochodzić z dowolnej wybranej ciągłej części sekwencji kwasu nukleinowego albo aminokwasowej. Pochodnymi są sekwencje kwasu nukleinowego albo sekwencje aminokwasowe utworzone z natywnych związków bądź bezpośrednio, bądź poprzez modyfikację albo częściowe podstawienie. Analogami są sekwencje kwasu nukleinowego albo sekwencje aminokwasowe, które różnią się od nich pod względem pewnych składników albo łańcuchów bocznych. Analogi mogą być syntetyczne albo różnego pochodzenia ewolucyjnego i mogą mieć podobną albo przeciwną aktywność metaboliczną w porównaniu z typem dzikim.
Pochodne lub analogi mogą być pełnej długości albo inne niż pełnej długości, jeżeli pochodna lub analog zawiera zmodyfikowany kwas nukleinowy albo aminokwas, jak opisano poniżej. Pochodne lub analogi kwasów nukleinowych lub białek według wynalazku obejmują między innymi cząsteczki
PL 207 267 B1 zawierające regiony, które są zasadniczo homologiczne do kwasów nukleinowych lub białek według wynalazku, w różnych wykonaniach, co najmniej w około 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98% a nawet 99% identyczne (z korzystną identycznością 80-99%) w stosunku do sekwencji kwasu nukleinowego albo aminokwasowej o identycznych rozmiarach albo po porównaniu z dopasowaną sekwencją, w której dopasowanie jest dokonane przy użyciu programu komputerowego do badania homologii znanego w tej dziedzinie, albo gdzie kodujący ją kwas nukleinowy jest zdolny do hybrydyzowania z sekwencją komplementarną wobec sekwencji kodującej wspomniane uprzednio białka w ostrych warunkach, średnich warunkach albo łagodnych warunkach. Patrz np. Ausubel, i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993, i poniżej. Przykładowym programem jest program Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Wersja 8 dla UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI) z użyciem ustawień domyślnych, który stosuje algorytm Smitha i Watermana (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489 i który jest tu włączony w cał o ś ci jako odniesienie).
„Homologiczna sekwencja kwasu nukleinowego” lub „homologiczna sekwencja aminokwasowa” albo ich warianty dotyczą sekwencji charakteryzujących się homologią na poziomie nukleotydowym albo na poziomie aminokwasowym jak dyskutowano powyżej. Homologiczne sekwencje nukleotydowe kodują sekwencje kodujące izoformy polipeptydu BAFF-R. Izoformy mogą być wyrażane w różnych tkankach tego samego organizmu jako rezultat na przykład alternatywnego składania RNA. Alternatywnie, izoformy mogą być kodowane przez różne geny. W niniejszym wynalazku homologiczne sekwencje nukleotydowe obejmują sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptyd BAFF-R z gatunku innego niż człowiek, włączając w to między innymi ssaki, a zatem mogą obejmować mysz, szczura, królika, psa, kota, krowę, konia i inne organizmy. Homologiczne sekwencje nukleotydowe obejmują również między innymi naturalnie występujące warianty alleliczne i mutacje przedstawionych tu sekwencji nukleotydowych. Homologiczne sekwencje nukleotydowe nie obejmują jednakże sekwencji nukleotydowej kodującej ludzkie białko BAFF-R. Homologiczne sekwencje kwasu nukleinowego obejmują te sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują konserwatywne podstawienia aminokwasowe (patrz niżej) na Fig. 2D (SEK NR ID: 5), jak również polipeptyd mający aktywność BAFF-R. Homologiczna sekwencja aminokwasowa nie koduje sekwencji aminokwasowej ludzkiego polipeptydu BAFF-R.
Sekwencja nukleotydowa ustalona poprzez klonowanie genu BAFF-R umożliwia wytwarzanie sond i starterów zaprojektowanych dla zastosowania do identyfikowania i/lub klonowania homologów BAFF-R w innych typach komórek, np. innych tkanek, jak również homologów BAFF-R z innych ssaków. Sondę/starter typowo stanowi zasadniczo oczyszczony oligonukleotyd. Oligonukleotyd zawiera typowo region sekwencji nukleotydowej, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z ciągłymi sekwencjami nukleotydami sensownej nici o długości, co najmniej około 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 albo 400 nukleotydów z dowolnej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) albo sekwencją nukleotydową antysensownej nici z dowolnej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2) Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) albo naturalnie występującymi mutantami z dowolnej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6).
Sondy w oparciu o sekwencję nukleotydową ludzkiego BAFF-R można stosować do wykrywania transkryptów albo sekwencji genomowych kodujących te same albo homologiczne białka. W różnych wykonaniach sonda zawiera ponadto przyłączoną do niej grupę znacznikową, np. grupą znacznikową może być radioizotop, związek fluorescencyjny, enzym albo kofaktor enzymu. Takie sondy można użyć jako część zestawu diagnostycznego do identyfikowania komórek albo tkanek z nieprawidłową ekspresją białka BAFF-R, np. poprzez mierzenie poziomu kwasu nukleinowego kodującego BAFF-R w próbce komórek od danego osobnika np. wykrywając poziomy mRNA BAFF-R albo ustalając, czy genomowy gen BAFF-R uległ mutacji albo delecji.
„Polipeptyd mający aktywną biologicznie część BAFF-R” dotyczy polipeptydów wykazujących aktywność podobną, ale niekoniecznie identyczną z aktywnością polipeptydu według wynalazku, włączając w to postaci dojrzałe, co mierzy się w konkretnych testach biologicznych z albo bez zależności od dawki. Fragment kwasu nukleinowego kodujący „aktywną biologicznie część białka BAFF-R” można wytworzyć poprzez izolowanie części dowolnej z sekwencji Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6), która koduje polipeptyd mający aktywność biologiczną BAFF-R (aktywności biologiczne opisanych poniżej białek
PL 207 267 B1
BAFF-R), wyrażenie zakodowanej części białka BAFF-R (np. poprzez zrekombinowaną ekspresję in vitro) i badanie aktywności zakodowanej części białka BAFF-R. Przykładowo, fragment kwasu nukleinowego kodujący aktywną biologicznie część białka BAFF-R może ewentualnie zawierać domenę wiążącą BAFF. W innym wykonaniu, fragment kwasu nukleinowego kodujący aktywną biologicznie część BAFF-R obejmuje jeden albo więcej regionów.
Wynalazek obejmuje ponadto cząsteczki kwasu nukleinowego, które różnią się od sekwencji nukleotydowej pokazanej na Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) na skutek degeneracji kodu genetycznego. Te kwasy nukleinowe kodują zatem to samo białko BAFF-R co to zakodowane przez sekwencję nukleotydową pokazaną na Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6). W innym wykonaniu wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku ma sekwencję nukleotydową kodującą białko mające sekwencję aminokwasową pokazaną na Fig. 2D (SEK NR ID: 5).
Poza sekwencją nukleotydową ludzkiego BAFF-R pokazaną na dowolnej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6), będzie wiadome specjalistom w tej dziedzinie, że w populacji (np. w populacji ludzkiej) mogą istnieć polimorfizmy sekwencji DNA, które prowadzą do zmian w sekwencjach aminokwasowych BAFF-R. Takie polimorfizmy genetyczne genu BAFF-R mogą istnieć wśród osobników w populacji na skutek naturalnej zmiany allelicznej. Stosowane tu terminy „gen” i „gen zrekombinowany” dotyczą cząsteczek kwasu nukleinowego, które zawierają otwartą ramkę odczytu kodującą białko BAFF-R, korzystnie białko BAFF-R ssaków. Takie naturalne warianty alleliczne mogą typowo prowadzić do 1-5% różnic w sekwencji nukleotydowej genu BAFF-R. Dowolny albo wszystkie takie warianty nukleotydowe i będące ich wynikiem polimorfizmy aminokwasowe w BAFF-R, które są skutkiem występowania naturalnych wariantów allelicznych i nie zmieniają aktywności funkcjonalnej BAFF-R, mają wchodzić w zakres wynalazku.
Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białka BAFF-R z innych gatunków, a zatem mające sekwencję nukleotydową, która różni się od ludzkich sekwencji z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) mają być objęte zakresem wynalazku. Cząsteczki kwasu nukleinowego odpowiadające naturalnym wariantom allelicznym i homologom cDNA BAFF-R według wynalazku można wyizolować na podstawie ich homologii z ujawnionymi tu kwasami nukleinowymi ludzkiego BAFF-R stosując ujawnione tu ludzkie cDNA albo ich części jako sondy do hybrydyzacji stosując standardowe techniki hybrydyzacyjne w ostrych warunkach hybrydyzacji. Przykładowo, cDNA rozpuszczalnego ludzkiego BAFF-R moż na wyizolować w oparciu o jego homologię z ludzkim związanym z błoną BAFF-R. Podobnie cDNA ludzkiego związanego z błoną BAFF-R można wyizolować w oparciu o jego homologię z ludzkim rozpuszczalnym BAFF-R.
A zatem, w innym wykonaniu, wyizolowana czą steczka kwasu nukleinowego wedł ug wynalazku ma długość co najmniej 6 nukleotydów i hybrydyzuje w ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową z dowolnej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6). W innym wykonaniu kwas nukleinowy ma długość co najmniej 10, 25, 50, 100, 250 lub 500 nukleotydów. W innym wykonaniu wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku hybrydyzuje z regionem kodującym. Stosowany tu termin „hybrydyzuje w ostrych warunkach” ma opisywać warunki hybrydyzacji i pł ukania, w których sekwencje nukleotydowe w co najmniej 60% homologiczne do siebie zazwyczaj pozostają zhybrydyzowane ze sobą.
Homologi (tj. kwasy nukleinowe kodujące białka BAFF-R pochodzące z gatunków innych niż ludzie) albo inne spokrewnione sekwencje (np. paralogi) można otrzymać poprzez hybrydyzację w łagodnych, średnich lub ostrych warunkach hybrydyzacji z całą albo częścią konkretnej ludzkiej sekwencji jako sondą stosując sposoby dobrze znane w tej dziedzinie dla hybrydyzacji i klonowania kwasów nukleinowych.
Stosowane tu wyrażenie „ostre warunki hybrydyzacji” dotyczy warunków, w których sonda, starter albo oligonukleotyd będą hybrydyzowały ze swoją sekwencją docelową, ale nie z innymi sekwencjami. Ostre warunki są zależne od sekwencji i będą różne w różnych okolicznościach. Dłuższe sekwencje hybrydyzują specyficznie w wyższych temperaturach niż krótsze sekwencje. Generalnie, ostre warunki wybiera się tak, aby były około 5°C niższe niż punkt topnienia termicznego (Tm) dla specyficznej sekwencji przy określonej sile jonowej i pH. Tm to temperatura (przy określonej sile jonowej,
PL 207 267 B1 pH i stężeniu kwasu nukleinowego), przy której 50% sond komplementarnych do sekwencji docelowej hybrydyzuje z sekwencją docelową w stanie równowagi. Ponieważ sekwencja docelowa jest na ogół obecna w nadmiarze, w Tm 50% sondy jest zajęta w stanie równowagi. Zazwyczaj ostrymi warunkami będą takie, w których stężenie soli wynosi mniej niż około 1,0 M jonów sodu, zazwyczaj około 0,01 do 1,0 M jonów sodu (lub innych soli) w pH 7,0 do 8,3 a temperatura wynosi co najmniej 30°C dla krótkich sond, starterów albo oligonukleotydów (np. 10 nt do 50 nt) i co najmniej około 60°C dla dłuższych sond, starterów albo oligonukleotydów. Ostre warunki można również uzyskać dodając czynnik destabilizujący, taki jak formamid.
Ostre warunki hybrydyzacji są znane specjalistom w tej dziedzinie i można je znaleźć w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Korzystne jest, jeżeli warunki są takie, że sekwencje, w co najmniej 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% lub 99% homologiczne do siebie pozostają zhybrydyzowane ze sobą. Nieograniczający przykład ostrych warunków hybrydyzacji to hybrydyzacja w buforze z wysoka solą zawierającym 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 500 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia w 65°C. Po takiej hybrydyzacji następuje jedno albo więcej płukań w 0,2 X SSC, 0,01% BSA w 50°C. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją z SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6, odpowiada naturalnie występującej cząsteczce kwasu nukleinowego. Stosowany tu termin „naturalnie występująca” cząsteczka kwasu nukleinowego dotyczy cząsteczki RNA albo DNA mającej sekwencję nukleotydową, która występuje w naturze (np. koduje naturalne białko).
W drugim wykonaniu, dostarczona jest sekwencja kwasu nukleinowego, która moż e hybrydyzować z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową z dowolnej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) albo jej fragmentami, analogami albo pochodnymi w warunkach umiarkowanej ostrości. Nieograniczający przykład umiarkowanie ostrych warunków hybrydyzacji to hybrydyzacja w 6X SSC, 5X roztwór Denhardta, 0,5% SDS i 500 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia w 55°C, a nastę pnie jedno albo wię cej pł ukań w 1 X SSC, 0,1% SDS w 37°C. Inne warunki umiarkowanej ostrości, które można zastosować są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Ausubel i wsp., Wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993 oraz Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.
W trzecim wykonaniu, dostarczony jest kwas nukleinowy, który moż e hybrydyzować z czą steczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową z dowolnej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) albo jej fragmentami, analogami albo pochodnymi w warunkach łagodnych. Nieograniczający przykład łagodnych warunków hybrydyzacji to hybrydyzacja w: 35% formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia, 10% (wag./obj.) siarczan dekstranu w 40°C, a następnie jedno albo więcej płukań w 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA i 0,1% SDS w 50°C. Inne łagodne warunki, które można zastosować są dobrze znane w tej dziedzinie (np. jak wykorzystywane przy hybrydyzacjach międzygatunkowych). Patrz np. Ausubel i wsp., Wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993 oraz Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990; Shilo i Weinberg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6789-6792.
Mutacje konserwatywne
Poza występującymi naturalnie wariantami allelicznymi sekwencji BAFF-R, które mogą istnieć w populacji, specjalista w tej dziedzinie zorientuje się ponadto, ż e mo ż na wprowadzić zmiany poprzez mutacje do sekwencji nukleotydowej z Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6), co prowadzi do zmiany w sekwencji aminokwasowej zakodowanego białka BAFF-R, bez zmiany zdolności funkcjonalnej białka BAFF-R. Przykładowo, można dokonać podstawień nukleotydowych prowadzących do podstawień aminokwasowych w „nie-niezbędnych” resztach aminokwasowych w dowolnej sekwencji z Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6). „Nie-niezbędna” reszta aminokwasowa to reszta, którą można zmienić w sekwencji BAFF-R typu dzikiego nie zmieniając aktywności biologicznej, podczas gdy „niezbędna” reszta aminokwasowa jest wymagana do aktywności biologicznej. Przykładowo, można przewidywać, że reszty aminokwasowe, które są konserwowane pomiędzy białkami BAFF-R według niniejszego wynalazku, są przewidywane jako szczególnie niepodatne na zmiany.
PL 207 267 B1
Dodatkowo, reszty aminokwasowe, które są konserwowane wśród członków rodziny białek BAFF-R według niniejszego wynalazku są również przewidywane jako szczególnie niepodatne na zmiany. Przykładowo, białka BAFF-R według niniejszego wynalazku mogą zawierać, co najmniej jedną domenę, która jest typowo konserwowanym regionem wśród białek rodziny TNF. A zatem jest mało prawdopodobne, aby te domeny były podatne na mutację. Jednakże inne reszty aminokwasowe (np. te, które nie są konserwowane albo jedynie częściowo konserwowane wśród przedstawicieli białek BAFF-R) mogą nie być niezbędne dla aktywności, a zatem będą prawdopodobnie podatne na zmiany.
Inny aspekt wynalazku dotyczy cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białka BAFF-R, które zawierają zmiany w resztach aminokwasowych, które nie są niezbędne dla aktywności. Takie białka BAFF-R różnią się sekwencją aminokwasową od Fig. 2D (SEK NR ID: 5), zachowując jednakże aktywność biologiczną. W jednym z wykonań wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko, gdzie białko zawiera sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w około 45% homologiczna z sekwencją aminokwasową z Fig. 2D (SEK NR ID: 5). Korzystne jest, jeżeli białko zakodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jest co najmniej w około 60% homologiczne z Fig. 2D (SEK NR ID: 5), korzystniej co najmniej w około 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, a najkorzystniej co najmniej w około 99% homologiczne z Fig. 2D (SEK NR ID: 5).
Wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko BAFF-R homologiczne do białka z Fig. 2D można wytworzyć poprzez wprowadzenie jednego lub więcej podstawienia, addycji lub delecji nukleotydowych w sekwencji nukleotydowej z Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6), tak, że do zakodowanego białka wprowadzone zostaje jedno lub więcej podstawień, addycji lub delecji aminokwasowych.
Mutacje można wprowadzić do Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6) na przykład przy zastosowaniu standardowych technik, takich jak ukierunkowana mutageneza i mutageneza za pośrednictwem PCR. Korzystne jest, jeżeli konserwatywne podstawienia aminokwasowe dokonuje się dla jednego albo większej liczby nie-niezbędnych reszt aminokwasowych. „Konserwatywne podstawienie aminokwasowe” jest takim, w którym reszta aminokwasowa jest zastępowana przez resztę aminokwasową mającą podobny łańcuch boczny. Rodziny reszt aminokwasowych mających podobny łańcuch boczny zostały zdefiniowane w tej dziedzinie. Rodziny te obejmują reszty aminokwasowe mające zasadowe łańcuchy boczne (np. lizyna, arginina, histydyna), kwaśne łańcuchy boczne (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowane polarne łańcuchy boczne (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolame łańcuchy boczne (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), łańcuchy boczne z rozgałęzieniem beta (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatyczne łańcuchy boczne (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). A zatem korzystne jest zastąpienie przewidywanej nie-niezbędnej reszty aminokwasowej inną resztą aminokwasową z tej samej rodziny łańcuchów bocznych. Alternatywnie, w innym wykonaniu mutacje można wprowadzać losowo na przestrzeni całej albo części sekwencji kodującej BAFF-R, tak jak poprzez mutagenezę saturacyjną i otrzymane w rezultacie mutanty można przeszukiwać pod kątem aktywności biologicznej BAFF-R w celu zidentyfikowania mutantów, które zachowują aktywność. Po mutagenezie dowolnej z Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4) i Fig. 3 (SEK NR ID: 6), zakodowane białko może zostać wyrażone poprzez jakąkolwiek technologię rekombinowania DNA znaną w tej dziedzinie i można określić aktywność białka.
W jednym z wykonań, zmutowane białko BAFF-R można badać pod kątem zdolności do (1) oddziaływań białko-białko z innymi białkami BAFF-R, innymi białkami na powierzchni komórki albo ich aktywnymi biologicznie częściami; (2) tworzenia się kompleksu pomiędzy zmutowanym białkiem BAFF-R a ligandem BAFF-R; (3) zdolności zmutowanego białka BAFF-R do wiązania się z wewnątrzkomórkowym białkiem docelowym albo jego aktywną biologicznie częścią; (np. białkami awidyny);
(4) zdolności do wiązania się z białkiem BAFF; albo (5) zdolności do swoistego wiązania się z przeciwciałem wobec białka BAFF-R.
Wynalazek dostarcza specyficznych mutantów, kodujących polipeptyd BAFF-R:Fc zaprojektowany dla złagodzenia agregacji wyrażonego białka utrzymując aktywność wiązania BAFF. Takie mutanty obejmują na przykład klony kodujące sekwencje aminokwasowe JST661 (SEK NR ID: 17),
JST662 (SEK NR ID: 18), JST663 (SEK NR ID: 19), JST673 (SEK NR ID: 20), JST674 (SEK NR ID: 21), JST675 (SEK NR ID: 22), JST672 (SEK NR ID: 23), JST676 (SEK NR ID: 24), JST671 (SEK NR ID: 25),
JST677 (SEK NR ID: 26) i JST678 (SEK NR ID: 27). Inne wykonania obejmują mutanty kodujące polipeptyd BAFF-R albo BAFF-R:Fc, który ma podobną charakterystykę agregacji co natywny ludzki poliPL 207 267 B1 peptyd BAFF-R albo BAFF-R:Fc, ale także wiąże BAFF, włączając w to na przykład sekwencje zawierające sekwencje aminokwasowe JST659 (SEK NR ID: 15), JST660 (SEK NR ID: 16), JST664 (SEK NR ID: 28), JST668 (SEK NR ID: 29), JST665 (SEK NR ID: 30), JST666 (SEK NR ID: 31), i JST667 (SEK NR ID: 32). Inne wykonania obejmują mutanty kodujące polipeptyd BAFF-R lub BAFF-R:Fc, gdzie aminokwasy konserwowane między ludzkim i mysim BAFF-R są zmienione na inne konserwowane aminokwasy i gdzie aktywność wiązania się polipeptydu BAFF-R lub BAFF-R:Fc z BAFF jest zachowana. W innych wykonaniach mutanty kodują polipeptyd BAFF-R lub BAFF-R:Fc mający aminokwasy, które nie są konserwowane między ludzkim i mysim BAFF-R, zmienione na inne aminokwasy. Korzystne jest, jeżeli co najmniej jeden niepolarny aminokwas jest zmieniony na resztę prolinową albo nienaładowany aminokwas polarny.
Cząsteczka antysensowna
Inny aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanych antysensownych cząsteczek kwasu nukleinowego, które mogą hybrydyzować albo są komplementarne do cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję nukleotydową z Fig. 2A, C lub 3 albo ich fragmentów, analogów i pochodnych. „Antysensowny” kwas nukleinowy zawiera sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do „sensownego” kwasu nukleinowego kodującego białko, np. komplementarna do nici kodującej dwuniciowej cząsteczki cDNA albo komplementarna do sekwencji mRNA. W specyficznych aspektach dostarczone są anty-sensowne cząsteczki kwasu nukleinowego, które zawierają sekwencję komplementarną, do co najmniej około 10, 25, 50, 100, 250 lub 500 nukleotydów albo do całej nici kodującej BAFF-R, albo jedynie do jej części. Dodatkowo dostarczone są cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące fragmenty, homologi, pochodne i analogi białka BAFF-R z dowolnej z Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6) albo antysensowne kwasy nukleinowe, komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego BAFF-R z dowolnej z Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6).
W jednym z wykonań czą steczka antysensownego kwasu nukleinowego jest antysensowna do „regionu kodującego” nici kodującej sekwencji nukleotydowej kodującej BAFF-R. Termin „region kodujący” odnosi się do regionu sekwencji nukleotydowej zawierającej kodony, które ulegają translacji do reszt aminokwasowych (np. region kodujący ludzkiej BAFF-R odpowiada nukleotydom 13 do 568 z Fig. 2A (SEK NR ID: 3) albo nukleotydom 13 do 565 z Fig. 2C (SEK NR ID: 4) albo nukleotydom 298 do 849 z Fig. 3 (SEK NR ID: 6)). W innym wykonaniu cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego jest antysensowna do „regionu niekodującego” nici kodującej sekwencji nukleotydowej kodującej BAFF-R. Termin „region niekodujący” odnosi się do sekwencji 5' i 3', które flankują region kodujący, które nie podlegają translacji do aminokwasów (tj. są określane również jako niepodlegające translacji regiony 5' i 3').
Biorąc pod uwagę ujawnione tu sekwencje nici kodującej kodujące BAFF-R, antysensowne kwasy nukleinowe według wynalazku można zaprojektować zgodnie z regułą parowania zasad Watsona i Cricka. Cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego może być komplementarna do całego regionu kodującego mRNA BAFF-R, ale korzystniej jest oligonukleotydem, który jest antysensowny jedynie do części regionu kodującego albo niekodującego mRNA BAFF-R. Przykładowo, antysensowny oligonukleotyd może być komplementarny do regionu otaczającego miejsce startu translacji mRNA BAFF-R. Antysensowny oligonukleotyd może mieć długość na przykład 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 lub 50 nukleotydów. Antysensowny kwas nukleinowy według wynalazku można wytworzyć przy zastosowaniu syntezy chemicznej i reakcji ligacji enzymatycznej stosując procedury znane w tej dziedzinie. Przykładowo, antysensowny kwas nukleinowy (np. antysensowny oligonukleotyd) można zsyntetyzować chemicznie przy użyciu występujących naturalnie nukleotydów albo w rozmaicie zmodyfikowanych nukleotydów zaprojektowanych dla zwiększenia stabilności biologicznej dulpeksu utworzonego pomiędzy antysensownymi i sensownymi kwasami nukleinowymi np. można zastosować pochodne fosforotionianowe i nukleotydy podstawione akrydyną.
Przykłady zmodyfikowanych nukleotydów, które można użyć do wytworzenia antysensownych kwasów nukleinowych obejmują 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-chlorouracyl, 5-jodouracyl, hipoksantynę, ksantynę, 4-acetylocytozynę, 5-(karboksyhydroksylometylo)uracyl, 5-karboksymetyloaminometylo-2-tiourydynę, 5-karboksymetyloaminometylouracyl, dihydrouracyl, beta-D-galaktozylokeozynę, inozynę, N6-izopentenyloadeninę, 1-metyloguaninę, 1-metyloinozynę, 2,2-dimetyloguaninę, 2-metyloadeninę, 2-metyloguaninę, 3-metylocytozynę, 5-metylocytozynę, N6-adeninę, 7-metyloguaninę, 5-metyloaminometylouracyl, 5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl, beta-D-mannozylokeozynę, 5'-metoksykarboksymetylouracyl, 5-metoksyuracyl, 2-metylotio-N6-izopentenyloadeninę, kwas uracylo-5-oksy18
PL 207 267 B1 octowy (v), wybutoksozynę, pseudouracyl, keozynę, 2-tiocytozynę, 5-metylo-2-tiouracyl, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-metylouracyl, ester metylowy kwasu uracylo-5 oksyoctowego, kwas uracylo-5-oksyoctowy (v), 5-metylo-2-tiouracyl, 3-(3-amino-3-N-2-karboksypropylo)uracyl, (acp3)w i 2,6-diaminopurynę. Alternatywnie, antysensowny kwas nukleinowy można wytworzyć biologicznie przy użyciu wektora ekspresyjnego, do którego kwas nukleinowy został wklonowany w orientacji antysensownej (tj. RNA transkrybowany z wstawionego kwasu nukleinowego będzie w orientacji antysensowenej w stosunku do docelowego kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania, opisanego w następujących dalej podrozdziałach).
Cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego według wynalazku jest zazwyczaj podawana osobnikowi albo wytwarzana in situ, tak, że hybrydyzuje albo wiąże się z komórkowym mRNA i/lub genomowym DNA kodującym białko BAFF-R, hamując w ten sposób ekspresję białka, np. poprzez hamowanie transkrypcji i/lub translacji. Hybrydyzacja może być poprzez konwencjonalną komplementarność nukleotydów z wytworzeniem stabilnego dupleksu albo, na przykład w przypadku cząsteczki antysensownego kwasu nukleinowego, która wiąże się z dupleksami DNA, poprzez specyficzne oddziaływania z większym rowkiem podwójnej helisy. Przykładem drogi podawania cząsteczki antysensownego kwasu nukleinowego według wynalazku jest bezpośrednie wstrzyknięcie do tkanki. Alternatywnie, cząsteczki antysensownego kwasu nukleinowego można modyfikować, tak aby kierować je do wybranych komórek, a następnie podawać ogólnoustrojowo. Przykładowo, do podawania ogólnoustrojowego, cząsteczki antysensowne mogą być tak modyfikowane, aby wiązały się specyficznie z receptorami albo antygenami wyrażanymi na powierzchni wybranych komórek, np. poprzez połączenie cząsteczek antysensownego kwasu nukleinowego z peptydami albo przeciwciałami, które wiążą się z receptorami powierzchniowymi albo antygenami. Cz ą steczki antysensownego kwasu nukleinowego można również dostarczać do komórek przy użyciu opisanych tu wektorów. Dla uzyskania dostatecznego wewnątrzkomórkowego stężenia cząsteczek, korzystne są konstrukty wektorów, w których cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego jest umieszczona pod kontrolą silnego promotora dla polll lub polIII.
W jeszcze innym wykonaniu czą steczką antysensownego kwasu nukleinowego wedł ug wynalazku jest cząsteczka α-anomerowego kwasu nukleinowego. Cząsteczka α-anomerowego kwasu nukleinowego tworzy dwuniciowe hybrydy z komplementarnym RNA, w którym, w przeciwieństwie do zwykłych jednostek b, nici biegną równolegle do siebie (Gaultier i wsp. (1987) Nucl. Acids. Res. 15: 6625-6641). Cząsteczka antysensownego kwasu nukleinowego może również zawierać 2'-O-metylorybonukleotyd (Inoue i wsp. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) albo chimerowy analog RNADNA (Inoue i wsp. (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).
Rybozymy i cząsteczki PNA
W jeszcze innym wykonaniu antysensownym kwasem nukleinowym według wynalazku jest rybozym. Rybozymy to katalityczne cząsteczki RNA z aktywnością rybonukleazy, które są zdolne do przecinania jednoniciowych kwasów nukleinowych, takich jak mRNA, do których mają region komplementarny. A zatem rybozymy (np. rybozymy młotkokształtne (opisane w Haselhoff i Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)) można zastosować do cięcia katalitycznego transkryptów mRNA BAFF-R, hamując w ten sposób translację BAFF-R. Rybozym o specyficzności wobec kwasu nukleinowego kodującego BAFF-R można zaprojektować w oparciu o ujawnioną tu sekwencję nukleotydową cDNA BAFF-R (np. SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6). Przykładowo, można skonstruować pochodne RNA L-19 IVS Tetrahymena, w którym sekwencja nukleotydowa miejsca aktywnego jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej, która ma być cięta w mRNA kodującym BAFF-R. Patrz np. Cech i wsp., patent USA nr 4987071 oraz Cech i wsp. patent USA nr 5116742. Alternatywnie, mRNA BAFF-R można użyć do selekcji RNA katalitycznych mających specyficzną aktywność rybonukleazy z puli cząsteczek RNA. Patrz np. Bartel i wsp. (1993) Science 261: 1411-1418.
Alternatywnie, ekspresję genu BAFF-R można hamować poprzez kierowanie do celu sekwencji nukleotydowych komplementarnych do regionu regulacyjnego BAFF-R (np. promotora i/lub wzmacniaczy BAFF-R) z wytworzeniem struktur trójhelikalnych, które zapobiegają transkrypcji genu BAFF-R w komórkach docelowych. Patrz ogólnie, Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene i wsp. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36 oraz Maher (1992) Bioassays 14: 807-15.
W różnych wykonaniach, kwasy nukleinowe BAFF-R mogą mieć modyfikowaną resztę zasady, resztę cukru albo szkielet fosforanowy w celu polepszenia np. stabilności, hybrydyzacji albo rozpuszczalności cząsteczki. Przykładowo, szkielet z fosforanu deoksyrybozy kwasu nukleinowego można modyfikować w celu wytworzenia peptydowych kwasów nukleinowych (patrz Hyrup i wsp. (1996) BioPL 207 267 B1 org. Med. Chem. 4(1): 5-23). Stosowane tu terminy „peptydowe kwasy nukleinowe” lub „PNA” dotyczą mimetyków kwasów nukleinowych, np. mimetyków DNA, w których szkielet z fosforanu deoksyrybozy jest zastąpiony przez szkielet pseudopeptydowy, a zachowywane są jednie cztery naturalne nukleozasady. Wykazano, że obojętny szkielet PNA umożliwia specyficzną hybrydyzację do DNA i RNA w warunkach niskiej siły jonowej. Syntezę oligomerów PNA można przeprowadzić przy użyciu protokołów standardowej syntezy peptydów w fazie stałej, jak opisano w Hyrup i wsp. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1): 5-23); Perry-O'Keefe i wsp. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675.
PNA dla cząsteczek kwasu nukleinowego BAFF-R można użyć w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych. Przykładowo, PNA można użyć jako czynniki antysensowne lub anty-genowe dla specyficznej wobec sekwencji modulacji ekspresji genu poprzez na przykład indukowanie transkrypcji lub zatrzymanie translacji albo hamowanie replikacji. PNA dla cząsteczek kwasu nukleinowego BAFF-R można również użyć w analizie mutacji pojedynczej pary zasad w genie, np. poprzez kierowane przez PNA zakleszczanie PCR, jako sztuczne enzymy restrykcyjne przy użyciu w kombinacji z innymi enzymami (np. nukleazami S1 (Hyrup B. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1): 5-23); albo jako sondy lub startery do sekwencjonowania DNA albo hybrydyzacji (Hyrup B. i wsp. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1): 5-23); Perry-O'Keefe (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675).
W innym wykonaniu, PNA dla BAFF-R moż na modyfikować, np. dla zwiększenia ich stabilności albo pobierania przez komórkę, poprzez przyłączenie do PNA grup lipofilowych albo innych grup wspomagających, poprzez wytwarzanie chimer PNA-DNA albo poprzez użycie liposomów lub innych technik dostarczania leków znanych w tej dziedzinie. Przykładowo, można wytworzyć chimery PNADNA dla BAFF-R, które mogą łączyć w sobie korzystne właściwości PNA i DNA. Takie chimery umożliwiają enzymom rozpoznającym DNA, np. RNAzie H i polimerazom DNA, oddziaływanie z częścią DNA, podczas gdy część PNA dostarczałaby wysokie powinowactwo i specyficzność. Chimery PNADNA można łączyć przy użyciu łączników o odpowiedniej długości wybranych z uwzględnieniem upakowania zasad, liczby wiązań pomiędzy nukleozasadami i orientacji (Hyrup (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1): 5-23)). Syntezę chimer PNA-DNA można przeprowadzić jak opisano w Hyrup (1996), Bioorg. Med. Chem. 4(1): 5-23) oraz Finn i wsp. (1996) Nucl. Acids Res. 24(17): 3357-63. Przykładowo, łańcuch DNA można zsyntetyzować na podłożu stałym przy zastosowaniu standardowej reakcji chemicznej łączenia z fosforamidytem, a modyfikowane analogi nukleozydów, np. 5'-(4-metoksytritylo)amino-5'-deoksytymidynofosforamidyt, można zastosować pomiędzy PNA a końcem DNA (Mag i wsp. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 5973-88). Monomery PNA łączy się następnie stopniowo z wytworzeniem chimerowych cząsteczek z odcinkiem PNA po stronie 5' i odcinkiem DNA po stronie 3' (Finn i wsp. (1996), jak wyżej). Alternatywnie, moż na zsyntetyzować cząsteczki z odcinkiem DNA po stronie 5' i odcinkiem PNA po stronie 3'. Patrz. Petersen i wsp. (1975) Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-1124.
W innych wykonaniach, oligonukleotyd moż e zawierać inne dołączone grupy, takie jak peptydy (np. do kierowania do receptorów komórek gospodarzy in vivo) albo czynniki ułatwiające transport przez błonę komórkową (patrz np. Letsinger i wsp. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre i wsp. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652; publikacja PCT nr W088/09810) lub przekroczenie bariery krew/mózg (patrz np. publikacja PCT nr W089/10134). Ponadto, oligonukleotydy mogą być modyfikowane przez czynniki cięcia wyzwalanego przez hybrydyzację (Patrz, np. Krol i wsp. (1988) Bio-Techniques 6: 958-976) albo czynniki interkalują ce. (patrz, np. Zon (1988) Pharm. Res. 5: 539-549). Wreszcie, oligonukleotyd może być łączony z inną cząsteczką, np. peptydem, czynnikiem łączenia krzyżowego wyzwalanego przez hybrydyzację, czynnikiem transportowym albo czynnikami cięcia wyzwalanego przez hybrydyzację, itd.
Polipeptydy BAFF-R
Jeden z aspektów wynalazku dotyczy wyizolowanych białek BAFF-R oraz ich aktywnych biologicznie części albo ich pochodnych, fragmentów, analogów lub homologów. Dostarczone są również fragmenty polipeptydowe przydatne do użycia jako immunogeny do wzbudzania przeciwciał antyBAFF-R. W jednym z wykonań natywne białka BAFF-R mogą być izolowane z komórek albo źródeł tkankowych poprzez odpowiedni schemat oczyszczania przy zastosowaniu standardowych technik oczyszczania. W innym wykonaniu białka BAFF-R są wytwarzane technikami rekombinowania DNA. Alternatywnie do ekspresji poprzez rekombinowanie DNA, białka albo polipeptyd BAFF-R można syntetyzować chemicznie przy zastosowaniu standardowych technik syntezy peptydów.
„Wyizolowane” albo „oczyszczone” białko albo biologicznie aktywna jego część są zasadniczo wolne od materiału komórkowego lub innych zanieczyszczających białek pochodzących z komórki albo tkanki, z której pochodziło białko BAFF-R, albo zasadniczo wolne od prekursorów chemicznych
PL 207 267 B1 i innych związków chemicznych, kiedy syntetyzuje się je chemicznie. Okreś lenie „zasadniczo wolny od materiału komórkowego” obejmuje preparaty białka BAFF-R mające mniej niż około 30% (suchej masy) białka nie-BAFF-R (określanego również jako „białko stanowiące zanieczyszczenie”), korzystniej mniej niż około 20% białka nie-BAFF-R, jeszcze korzystniej mniej niż około 10% białka nie-BAFF-R, a najkorzystniej mniej niż okoł o 5% biał ka nie-BAFF-R. Kiedy biał ko BAFF-R albo jego aktywną biologicznie część wytwarza się poprzez rekombinowanie DNA, korzystnie, jeżeli jest również zasadniczo wolne od pożywki hodowlanej, tj. pożywka hodowlana stanowi mniej niż około 20%, jeszcze korzystniej mniej niż około 10%, a najkorzystniej mniej niż około 5% objętości preparatu polipeptydu.
Określenie „zasadniczo wolny od prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych” obejmuje preparaty białka BAFF-R, w których białko jest oddzielone od prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych, które uczestniczą w syntezie białka. W jednym z wykonań, określenie „zasadniczo wolny od prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych” obejmuje preparaty białka BAFF-R mające mniej niż około 30% (suchej masy) prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych nie będących BAFF-R, korzystniej mniej niż około 20% prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych nie będących BAFF-R, jeszcze korzystniej mniej niż około 10% prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych nie będących BAFF-R, a najkorzystniej mniej niż około 5% prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych nie będących BAFF-R.
Aktywna biologicznie część białka BAFF-R obejmuje sekwencję aminokwasową wystarczająco homologiczną albo pochodzącą z sekwencji aminokwasowej białka BAFF-R, np. sekwencji aminokwasowej pokazanej w SEK NR ID: 5, która obejmuje mniej aminokwasów niż białka BAFF-R pełnej długości i wykazuje co najmniej jedną aktywność białka BAFF-R. Typowo, aktywne biologicznie części zawierają domenę albo motyw, z co najmniej jedną aktywnością białka BAFF-R. Aktywną biologicznie częścią białka BAFF-R może być polipeptyd, który ma długość na przykład 10, 25, 50, 100 lub więcej aminokwasów.
Aktywna biologicznie część białka BAFF-R według niniejszego wynalazku może zawierać, co najmniej jedną spośród zidentyfikowanych powyżej domen konserwowanych pomiędzy białkami BAFF-R. Alternatywna aktywna biologicznie część białka BAFF-R może zawierać co najmniej dwie spośród zidentyfikowanych powyżej domen. Inna aktywna biologicznie część białka BAFF-R może zawierać co najmniej trzy spośród zidentyfikowanych powyżej domen. Jeszcze inna aktywna biologicznie część białka BAFF-R może zawierać co najmniej cztery spośród zidentyfikowanych powyżej domen.
Ponadto, inne aktywne biologicznie części, z delecją innych regionów, można wytworzyć poprzez techniki rekombinowania DNA i oceniać pod kątem jednej albo większej liczby aktywności funkcjonalnych natywnego białka BAFF-R.
W jednym z wykonań białko BAFF-R ma sekwencję aminokwasową pokazaną na Fig. 2D (SEK NR ID: 5). W innych wykonaniach, białko BAFF-R ma sekwencję aminokwasową zasadniczo identyczną z Fig. 2D (SEK NR ID: 5) i zachowuje aktywność funkcjonalną białka z Fig. 2D (SEK NR ID: 5), różniąc się jednakże sekwencją aminokwasową na skutek naturalnych różnic allelicznych albo mutagenezy, jak opisano szczegółowo poniżej. A zatem, w innym wykonaniu białkiem BAFF-R jest białko o sekwencji aminokwasowej, która jest w okoł o 45% homologiczna z sekwencją aminokwasową z Fig. 2D (SEK NR ID: 5) i zachowuje aktywność funkcjonalną białek BAFF-R z Fig. 2D (SEK NR ID: 5).
W niektórych wykonaniach wynalazek obejmuje specyficzne mutanty polipeptydu BAFF-R:Fc zaprojektowane dla złagodzenia agregacji wyrażonego białka utrzymując aktywność wiązania BAFF. Takie mutanty obejmują na przykład klony kodujące sekwencje aminokwasowe JST661 (SEK NR ID: 17), JST662 (SEK NR ID: 18), JST663 (SEK NR ID: 19), JST673 (SEK NR ID: 20), JST674 (SEK NR ID: 21), JST675 (SEK NR ID: 22), JST672 (SEK NR ID: 23), JST676 (SEK NR ID: 24), JST671 (SEK NR ID: 25), JST677 (SEK NR ID: 26) i JST678 (SEK NR ID: 27). Inne wykonania obejmują mutanty kodujące polipeptyd BAFF-R albo BAFF-R:Fc, który ma podobną charakterystykę agregacji co natywny ludzki polipeptyd BAFF-R albo BAFF-R:Fc, ale także wiąże BAFF, włączając w to na przykład sekwencje zawierające sekwencje aminokwasowe JST659 (SEK NR ID: 15), JST660 (SEK NR ID: 16), JST664 (SEK NR ID: 28), JST668 (SEK NR ID: 29), JST665 (SEK NR ID: 30), JST666 (SEK NR ID: 31) i JST667 (SEK NR ID: 32). Inne wykonania obejmują mutanty kodujące polipeptyd BAFF-R lub BAFF-R:Fc, gdzie aminokwasy konserwowane między ludzkim i mysim BAFF-R są zmienione na inne konserwowane aminokwasy i gdzie aktywność wiązania się polipeptydu BAFF-R lub BAFF-R:Fc z BAFF jest zachowana. W innych wykonaniach mutanty kodują polipeptyd BAFF-R lub BAFF-R:Fc,
PL 207 267 B1 mający aminokwasy, które nie są konserwowane między ludzkim i mysim BAFF-R, zmienione na inne aminokwasy. Korzystne jest, jeżeli co najmniej jeden niepolarny aminokwas jest zmieniony na resztę prolinową albo nienaładowany aminokwas polarny.
Ustalanie homologii między dwiema albo większą liczbą sekwencji
W celu ustalenia procentu identycznoś ci dwóch sekwencji aminokwasowych lub kwasów nukleinowych sekwencje dopasowuje się w celu optymalnego porównania (np. można wprowadzić przerwy w pierwszej sekwencji aminokwasowej albo kwasu nukleinowego dla optymalnego dopasowania z drugą sekwencją aminokwasową albo kwasu nukleinowego). Nastę pnie porównuje się reszty aminokwasowe albo nukleotydy w odpowiadających pozycjach aminokwasowych lub pozycjach nukleotydowych. Kiedy pozycja w pierwszej sekwencji jest zajmowana przez tą samą resztę aminokwasową albo nukleotyd co w odpowiedniej pozycji w drugiej sekwencji, wówczas cząsteczki są homologiczne w tej pozycji (tj. stosowany tu termin „homologia” aminokwasowa albo kwasu nukleinowego jest równoważny z „identycznością” aminokwasu albo kwasu nukleinowego).
Homologię sekwencji kwasu nukleinowego można określić jako stopień identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami. Homologię można ustalić stosując programy komputerowe znane w tej dziedzinie, takie jak oprogramowanie GAP w pakiecie programów GCG. Patrz Needleman i Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453. Stosując oprogramowanie GCG GAP z następującymi nastawieniami: kara za przerwę 5,0 i kara za wydłużenie przerwy 0,3, region kodujący analogicznych sekwencji kwasu nukleinowego, o których była mowa powyżej, wykazują stopień identyczności korzystnie, co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% lub 99% z częścią (kodującą) CDS sekwencji DNA pokazanej w Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6).
Termin „identyczność sekwencji” dotyczy stopnia, w którym dwie sekwencje polinukleotydowe albo polipeptydowe są identyczne na zasadzie reszta z resztą na przestrzeni danego regionu porównania. „Procent identyczności sekwencji” oblicza się poprzez porównanie dwóch optymalnie dopasowanych sekwencji na przestrzeni tego regionu porównania, ustalając liczbę pozycji, w których identyczne zasady kwasu nukleinowego (np. A, T, C, G, U lub I w przypadku kwasów nukleinowych) występują w obydwu sekwencjach z uzyskaniem liczby pasujących pozycji, dzieląc liczbę pasujących pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w regionie porównania (tj. wielkość okna) i mnożąc wynik przez 100 dla uzyskania procentu identyczności sekwencji. Stosowany tu termin „zasadnicza identyczność” określa właściwość sekwencji polinukleotydowej, gdzie polinukleotyd zawiera sekwencję, która jest ma, co najmniej 80 procent identyczności sekwencji, korzystnie, co najmniej 85 procent identyczności sekwencji, a często 90 do 95 procentu identyczności sekwencji, częściej co najmniej 99 procent identyczności sekwencji w porównaniu z sekwencją stanowiącą odniesienie na przestrzeni tego regionu porównania.
Białka chimerowe i fuzje białkowe
Wynalazek dostarcza również białek chimerowych lub fuzji białkowych BAFF-R. Stosowany tu termin „białko chimerowe” lub „fuzja białkowa” obejmuje polipeptyd BAFF-R połączony funkcjonalnie z polipeptydem nie-BAFF-R. „Polipeptyd BAFF-R dotyczy polipeptydu mają cego sekwencję aminokwasową odpowiadającą BAFF-R, podczas gdy polipeptyd nie-BAFF-R dotyczy polipeptydu mającego sekwencję aminokwasową odpowiadającą białku, które nie jest zasadniczo homologiczne z białkiem BAFF-R, np. białku, które jest różne od białka BAFF-R i które pochodzi z tego samego albo innego organizmu. W obrębie fuzji białkowej BAFF-R, polipeptyd BAFF-R może odpowiadać całej albo części białka BAFF-R. W korzystnym wykonaniu, fuzja białkowa BAFF-R zawiera co najmniej jedną aktywną biologicznie część białka BAFF-R. W innym korzystnym wykonaniu, fuzja białkowa BAFF-R zawiera co najmniej dwie aktywne biologicznie części białka BAFF-R. W obrębie fuzji białkowej, termin „połączony funkcjonalnie” ma wskazywać, że polipeptyd BAFF-R i polipeptyd nie-BAFF-R są połączone ze sobą w ramce. Polipeptyd nie-BAFF-R może być połączony z końcem N albo końcem C polipeptydu BAFF-R. Polipeptydem nie-BAFF-R może być na przykład część Fc przeciwciała. Może być ona połączona funkcjonalnie z końcem N albo końcem C polipeptydu BAFF-R. Fuzje Fc-białko docelowe zostały opisane w Lo i wsp. (1998) Protein Enginering 11: 495-500 oraz patentach USA nr 5541087 i 5726044, ujawnienie których jest tu włączone jako odniesienie.
Przykładowo, w jednym z wykonań fuzja białkowa BAFF-R zawiera domenę BAFF-R połączoną funkcjonalnie z domeną zewnątrzkomórkową drugiego białka. Takie fuzje białkowe można ponadto wykorzystać w testach do poszukiwania związków, które modulują aktywność BAFF-R (takie testy są opisane szczegółowo poniżej).
PL 207 267 B1
W jeszcze innym wykonaniu fuzją białkową jest fuzja białkowa GST-BAFF-R, w której sekwencje BAFF-R są połączone z końcem C sekwencji GST (tj. S-transferazy glutationu). Takie fuzje białkowe mogą ułatwić oczyszczanie zrekombinowanego BAFF-R.
W innym wykonaniu, fuzją białkową jest białko BAFF-R zawierające heterologiczną sekwencję sygnałową na swoim końcu N. Przykładowo, ponieważ BAFF-R nie zawiera swojej własnej sekwencji sygnałowej, heterologiczna sekwencja sygnałowa musi być połączona z końcem 5' sekwencji kodującej dla wydajnej sekrecji fuzji białkowej BAFF-R. Ekspresja i/lub sekrecja BAFF-R może być zwiększona poprzez zastosowanie heterologicznej sekwencji sygnałowej.
W jeszcze innym wykonaniu, fuzją biał kową jest fuzja biał kowa BAFF-R-immunoglobulina, w której sekwencje BAFF-R zawierają ce jedną albo wię cej domen są połączone z sekwencjami pochodzącymi z przedstawiciela rodziny białkowej immunoglobulin. Fuzje białkowe BAFF-R-immunoglobulina według wynalazku można włączyć do kompozycji farmaceutycznych i podawać osobnikowi w celu zahamowania oddziaływania pomiędzy ligandem BAFF-R a białkiem BAFF-R na powierzchni komórki, znosząc w ten sposób przekazywanie sygnału za pośrednictwem BAFF-R in vivo. Fuzje białkowe BAFF-R-immunoglobulina można zastosować w celu uzyskania biodostępności odpowiedniego ligandu BAFF-R. Hamowanie oddziaływania ligand BAFF-R/BAFF-R może być przydatne terapeutycznie zarówno do leczenia chorób związanych z proliferacją jak i różnicowaniem, jak również modulowania (np. promowania albo hamowania) przeżywalności komórek. Ponadto, fuzje białkowe BAFF-R-immunoglobulina według wynalazku można użyć jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał antyBAFF-R u osobnika, do oczyszczania ligandów BAFF-R i testów przesiewowych do identyfikowania cząsteczek, które hamują oddziaływanie BAFF-R z ligandem BAFF-R.
Białko chimerowe albo fuzję białkową BAFF-R według wynalazku można wytwarzać standardowymi technikami rekombinowania DNA. Przykładowo, fragmenty DNA kodujące różne sekwencje polipeptydowe łączy się poprzez ligację w ramce zgodnie z konwencjonalnymi technikami, np. poprzez zastosowanie tępych albo wystających końców do ligacji, trawienie enzymami restrykcyjnymi w celu dostarczenia odpowiednich końców, wypełnianie lepkich końców jeżeli potrzeba, traktowanie alkaliczną fosfatazą w celu zapobiegania niepożądanemu łączeniu oraz ligacji enzymatycznej. W innym wykonaniu, można zsyntetyzować fuzję genową poprzez konwencjonalne techniki, włączając w to automatyczne syntetyzatory DNA. Alternatywnie, można przeprowadzić amplifikację fragmentów genów w reakcji PCR przy zastosowaniu zakotwiczonych starterów, w wyniku czego powstają komplementarne wystające końce pomiędzy dwoma sąsiadującymi fragmentami genu, które można następnie łączyć ze sobą i ponownie amplifikować w celu wytworzenia chimerowej sekwencji genu (patrz na przykład Ausubel i wsp. Wyd. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992). Ponadto, dostępnych handlowo jest wiele wektorów ekspresyjnych, które już kodują część fuzji (np. polipeptyd GST). Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą BAFF-R można klonować w takim wektorze ekspresyjnym, tak, że cząsteczka wchodząca w skład fuzji jest połączona w ramce z białkiem BAFF-R.
W korzystnym wykonaniu fuzja biał kowa BAFF-R jest dostarczona przez sekwencje kwasu nukleinowego (SEK NR ID: 11) i aminokwasową (SEK NR ID: 12) z Fig. 9.
Agonisty i antagonisty BAFF-R
Niniejszy wynalazek dotyczy również wariantów białka BAFF-R, które działają bądź jako agonisty BAFF-R (mimetyki) bądź jako antagonisty BAFF-R. Warianty białka BAFF-R można wytworzyć poprzez mutagenezę, np. odrębne mutacje punktowe albo skrócenie białka BAFF-R. Agonista białek BAFF-R może zachowywać zasadniczo te same albo część aktywności biologicznych postaci białka BAFF-R występujących naturalnie. Antagonista białka BAFF-R może hamować jedną albo więcej aktywności występującego naturalnie białka BAFF-R, na przykład modulować poprzez współzawodnictwo aktywność białka BAFF-R z udziałem białka BAFF-R. A zatem specyficzne efekty biologiczne można uzyskać poprzez traktowanie wariantem o ograniczonej funkcji. W jednym z wykonań traktowanie osobnika wariantem mającym część aktywności biologicznych występujących naturalnie postaci białka ma mniejsze efekty uboczne u osobnika w porównaniu do traktowania występującą naturalnie postacią białka BAFF-R.
Warianty białka BAFF-R, które działają bądź jako agonisty BAFF-R (mimetyki) bądź jako antagonisty BAFF-R można zidentyfikować poprzez przeszukiwanie kombinatorycznych bibliotek mutantów białka BAFF-R, np. mutantów ze skróceniami, pod kątem aktywności agonisty białka BAFF-R bądź antagonisty białka BAFF-R. W jednym z wykonań, zróżnicowaną bibliotekę wariantów BAFF-R wytwarza się poprzez kombinatoryczną mutagenezę na poziomie kwasu nukleinowego i jest ona kodowana przez zróżnicowaną bibliotekę genową. Zróżnicowaną bibliotekę wariantów BAFF-R można
PL 207 267 B1 wytworzyć na przykład poprzez enzymatyczną ligację mieszaniny syntetycznych oligonukleotydów w sekwencję genu, tak, ż e zestaw zdegenerowanych potencjalnych sekwencji BAFF-R moż e podlegać ekspresji do poszczególnych polipeptydów, albo alternatywnie, jako zestaw większych fuzji białkowych (np. do prezentacji na fagach) zawierających w sobie zestaw sekwencji BAFF-R. Istnieje szereg różnych metod, które można zastosować do wytworzenia bibliotek potencjalnych wariantów BAFF-R ze zdegenerowanych sekwencji oligonukleotydowych. Syntezę chemiczną zdegenerowanej sekwencji genu można przeprowadzić w automatycznym syntetyzatorze DNA i syntetyczny gen można następnie poddać ligacji z odpowiednim wektorem ekspresyjnym. Zastosowanie zestawu zdegenerowanych genów umożliwia dostarczenie w jednej mieszaninie wszystkich sekwencji kodujących pożądany zestaw potencjalnych sekwencji BAFF-R. Sposoby syntetyzowania zdegenerowanych oligonukleotydów są znane w tej dziedzinie (patrz np. Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura i wsp. (1984) Annu. Rev. Blochem. 53: 323; Itakura i wsp. (1984) Science 198: 1056-1063; Ike i wsp. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 477-488.
Biblioteki polipeptydowe
Dodatkowo, biblioteki fragmentów sekwencji kodującej białko BAFF-R można użyć do wytworzenia zróżnicowanej populacji fragmentów BAFF-R do przeszukiwania, a następnie selekcji wariantów białka BAFF-R. W jednym z wykonań, bibliotekę fragmentów sekwencji kodującej BAFF-R można wytworzyć poprzez traktowanie nukleazą dwuniciowych fragmentów PCR sekwencji kodującej BAFF-R w warunkach, gdzie nacinanie zachodzi tylko raz na czą steczkę , denaturowanie dwuniciowego DNA, renaturowanie DNA z wytworzeniem dwuniciowego DNA, które może zawierać sensowną/antysensowną parę z różnych naciętych produktów, usunięcie jednoniciowych części z utworzonych ponownie dupleksów poprzez traktowanie nukleazą S1 i ligację otrzymanych w rezultacie fragmentów do wektora ekspresyjnego. Tą metodą można uzyskać bibliotekę ekspresyjną, która koduje N-końcowe, i wewnę trzne fragmenty biał ka BAFF-R rozmaitych rozmiarów.
Znanych jest w tej dziedzinie szereg technik przeszukiwania produktów genowych z bibliotek kombinatorycznych wytworzonych poprzez mutacje punktowe albo skrócenia oraz przeszukiwania bibliotek cDNA pod kątem produktów genowych mających wybrane właściwości. Takie techniki można zaadoptować do szybkiego przeszukiwania bibliotek genowych wytworzonych poprzez mutagenezę kombinatoryczną białek BAFF-R. Najszerzej stosowane techniki, które można zastosować w analizie na dużą skalę do przeszukiwania dużych bibliotek obejmują typowo klonowanie biblioteki genowej w ulegają cych replikacji wektorach, transformowanie odpowiednich komórek otrzymaną w rezultacie biblioteką wektorów i wyrażenie kombinacji genów w warunkach, w których wykrywanie pożądanych aktywności ułatwia izolację wektora kodującego gen, którego produkt był wykrywany. Rekursywną zbiorową mutagenezę (REM, ang. recursive ensemble mutagenesis), nową technikę, która zwiększa częstość mutantów funkcjonalnych w bibliotekach, można zastosować w połączeniu z testami przeszukiwania do identyfikowania wariantów BAFF-R (Arkin i Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave i wsp. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
Przeciwciała anty-BAFF-R
Wyizolowane białko BAFF-R albo jego części lub fragmenty można użyć jako immunogen do wytwarzania przeciwciał, które wiążą BAFF-R przy zastosowaniu standardowych technik wytwarzania przeciwciała poliklonalnego i monoklonalnego. Można użyć białka BAFF-R pełnej długości albo, alternatywnie, wynalazek dostarcza antygenowych fragmentów peptydowych BAFF-R do zastosowania jako immunogeny. Antygenowy peptyd BAFF-R zawiera co najmniej 8 reszt aminokwasowych sekwencji aminokwasowej pokazanej na Fig. 2D (SEK NR ID: 5) i obejmuje epitop BAFF-R, tak, że przeciwciało otrzymane wobec peptydu tworzy swoisty kompleks immunologiczny ze BAFF-R. Korzystne jest, jeżeli peptyd antygenowy zawiera co najmniej 10 reszt aminokwasowych, korzystniej co najmniej 15 reszt aminokwasowych, jeszcze korzystniej co najmniej 20 reszt aminokwasowych, a najkorzystniej co najmniej 30 reszt aminokwasowych. Korzystnymi epitopami zawartymi w peptydach antygenowych są regiony BAFF-R, które znajdują się na powierzchni białka, np. regiony hydrofilowe.
Jak tu ujawniono, sekwencję białka BAFF-R z Fig. 2D (SEK NR ID: 5) lub jej pochodne, fragmenty, analogi lub homologi można użyć jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał, które wiążą immunospecyficznie te składniki białkowe. Stosowany tu termin „przeciwciało” dotyczy cząsteczek immunoglobulin i aktywnych immunologicznie części cząsteczek immunoglobulin, tj. cząsteczek, które zawierają miejsce wiązania antygenu, które wiąże się swoiście (wykazuje reakcję immunologiczną) z antygenem, takim jak BAFF-R. Takie przeciwciała obejmują między innymi przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, chimerowe, jednołańuchowe, fragmenty Fab i F(ab')2 i bibliotekę ekspresyjną Fab.
PL 207 267 B1
W konkretnym wykonaniu, ujawnione są przeciwciała wobec ludzkich białek BAFF-R. Różne procedury znane w tej dziedzinie można zastosować do wytworzenia przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych wobec sekwencji białka BAFF-R z Fig. 2D (SEK NR ID: 5) lub jej pochodnych, fragmentów, analogów lub homologów. Niektóre z tych białek są dyskutowane poniżej.
W celu wytworzenia przeciwciał poliklonalnych różne odpowiednie zwierzęta-gospodarza (np. królika, kozę, mysz albo innego ssaka) można immunizować poprzez wstrzyknięcie natywnego białka albo jego syntetycznych wariantów lub jego pochodnych. Odpowiedni immunogenny preparat może zawierać, na przykład, wyrażane poprzez rekombinowanie DNA białko BAFF-R albo polipeptyd BAFFR zsyntetyzowany chemicznie. Preparat może ponadto zawierać adiuwant. Różne adiuwanty stosowane do wzmagania odpowiedzi immunologicznej obejmują między innymi adiuwant Freunda (kompletny albo niekompletny), żele mineralne (np., wodorotlenek glinu), substancje powierzchniowo czynne (np., lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, dinitrofenol, itd.), ludzkie adiuwanty, takie jak Bacille Calmette-Guerin (BCG) i Corynebacterium parvum albo podobne czynniki immunostymulacyjne. Jeśli to pożądane, cząsteczki przeciwciała skierowane przeciw BAFF-R można izolować ze ssaka (np. z krwi) i dalej oczyszczać przy zastosowaniu dobrze znanych technik, takich jak chromatografia na białku A w celu otrzymania frakcji IgG.
Stosowany tu termin „przeciwciało monoklinalne” lub „kompozycja przeciwciała monoklonalnego” dotyczy populacji cząsteczek przeciwciał, które zawierają jedynie jeden rodzaj miejsca wiązania antygenu zdolny do reakcji immunologicznej z konkretnym epitopem BAFF-R. Kompozycja przeciwciała monoklonalnego wykazuje, zatem typowo jedno powinowactwo wiązania dla konkretnego białka BAFF-R, z którym wchodzi w reakcję immunologiczną. W celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych skierowanych wobec konkretnemu białku BAFF-R lub jego pochodnym, fragmentom, analogom lub homologom, można zastosować dowolną technikę, która prowadzi do wytwarzania cząsteczek przeciwciała przez stałą hodowlę linii komórkowej. Takie techniki obejmują między innymi, technikę hybrydom (patrz Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495-497), technikę triom, technikę hybrydom komórek B (patrz Kozbor i wsp. (1983) Immunol. Today 4: 72) oraz technikę hybrydom EBV dla wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Cole i wsp., w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985, str. 77-96). Ludzkie przeciwciała monoklonalne można zastosować przy wykonywaniu niniejszego wynalazku i mogą być one wytwarzane przy użyciu ludzkich hybrydom (patrz Cote i wsp. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) albo transformowanie ludzkich komórek B wirusem Epstein Barr in vitro (patrz Cole i wsp., w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985, str. 77-96).
Według wynalazku techniki można zaadoptować do wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych swoistych dla białka BAFF-R (patrz np. patent USA nr 4946778). Ponadto, można zaadaptować metody do wytwarzania bibliotek ekspresyjnych Fab (patrz np., Huse i wsp. (1989) Science 246: 1275-1281) w celu umożliwienia szybkiej i skutecznej identyfikacji fragmentów Fab przeciwciał monoklonalnych o pożądanej swoistości wobec białka BAFF-R lub jego pochodnych, fragmentów, analogów lub homologów. Przeciwciała „nie-ludzkie” można „humanizować” przy zastosowaniu technik znanych w tej dziedzinie. Patrz np. patent USA nr 5225539. Fragmenty przeciwciał, które zawierają idiotypy wobec białka BAFF-R można wytworzyć przy zastosowaniu technik znanych w tej dziedzinie, obejmujących między innymi: (i) fragment F(ab')2 wytworzony poprzez trawienie cząsteczki przeciwciała pepsyną; (ii) fragment Fab wytworzony poprzez redukowanie mostków dwusiarczkowych fragmentu F(ab')2, (iii) fragment Fab wytworzony poprzez traktowanie cząsteczki przeciwciała papainą i czynnikiem redukującym i (iv) fragmenty Fv.
Dodatkowo, w zakresie wynalazku są zrekombinowane przeciwciała anty-BAFF-R, takie jak przeciwciała chimerowe i humanizowane, zawierające zarówno części ludzkie, jak i nie-ludzkie, które można wytworzyć przy zastosowaniu standardowych technik rekombinowania DNA. Takie chimerowe i humanizowane przeciwciała monoklonalne można wytworzyć technikami rekombinowania DNA znanymi w tej dziedzinie, na przykład stosując metody opisane w międzynarodowym zgłoszeniu PCT nr PCT/US86/02269; europejskim zgłoszeniu patentowym nr 184187; europejskim zgłoszeniu patentowym nr 171496; europejskim zgłoszeniu patentowym nr 173494; międzynarodowej publikacji PCT nr WO 86/01533; patencie USA nr 4816567; europejskim zgłoszeniu patentowym nr 125023; Better i wsp. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu i wsp. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu i wsp. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun i wsp. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214218; Nishimura i wsp. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood i wsp. (1985) Nature 314: 446-449 oraz Shaw i wsp. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi
PL 207 267 B1 i wsp. (1986) BioTechniques 4: 214; patencie USA nr 5225539; Jones i wsp. (1986) Nature 321: 552525; Verhoeyan i wsp. (1988) Science 239: 1534 oraz Beidler i wsp. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060.
W jednym z wykonań, sposoby poszukiwania przeciwciał, które posiadają pożądaną swoistość obejmują między innymi enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA) i inne techniki immunologiczne znane w tej dziedzinie. W konkretnym wykonaniu, selekcja przeciwciał, które są swoiste wobec konkretnej domeny białka BAFF-R jest ułatwiona poprzez wytwarzanie hybrydom, które wiążą się z fragmentem białka BAFF-R posiadającego taką domenę. Dostarczone są tu również przeciwciała, które są swoiste wobec jednej albo większej liczby domen w białku BAFF-R, np. domen obejmujących zidentyfikowane powyżej konserwowane regiony białek z rodziny BAFF-R, lub jego pochodnych, fragmentach, analogach albo homologach.
Przeciwciała anty-BAFF-R mogą być wykorzystywane w znanych w tej dziedzinie metodach związanych z lokalizacją i/lub oceną ilościową białka BAFF-R (np. zastosowane przy mierzeniu poziomów białka BAFF-R w odpowiednich próbkach fizjologicznych, zastosowane w metodach diagnostycznych, zastosowane do uwidaczniania białka i temu podobne). W przedstawionym wykonaniu, przeciwciała wobec białek BAFF-R lub ich pochodnych, fragmentów, analogów albo homologów, które zawierają domenę wiążącą pochodzącą z przeciwciała są stosowane jako związki aktywne farmakologicznie (nazywane tu dalej „terapeutykami”).
Przeciwciało anty-BAFF-R (np. przeciwciało monoklonalne) można użyć do izolowania BAFF-R poprzez zastosowanie standardowych technik, takich jak chromatografia powinowactwa lub immunoprecypitacja. Przeciwciało anty-BAFF-R może ułatwić oczyszczanie naturalnego BAFF-R z komórek oraz BAFF-R wytwarzanego poprzez rekombinowanie DNA i wyrażanego w komórkach gospodarza. Ponadto, przeciwciała anty-BAFF-R można użyć do wykrywania białka BAFF-R (np. w lizacie komórkowym albo supernatancie hodowlanym) w celu oceny poziomu i wzoru ekspresji białka BAFF-R. Przeciwciała anty-BAFF-R można użyć diagnostycznie do śledzenia poziomów białka w tkance jako część procedury testów klinicznych, np. do oceny skuteczności danego trybu leczenia. Wykrywanie może być ułatwione poprzez połączenie (tj. połączenie fizyczne) przeciwciała z wykrywalną substancją. Przykłady wykrywalnych substancji obejmują rozmaite enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne, materiały bioluminescencyjne oraz materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę z chrzanu, alkaliczną fosfatazę, β-galaktozydazę oraz acetylocholinoesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminofluoresceinę, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykład materiału luminescencyjnego obejmuje luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują lucyferazę, lucyferynę i akworynę, przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują 125I, 131I, 35S lub 3H.
Zrekombinowane wektory ekspresyjne i komórki gospodarzy dla BAFF-R
Inny aspekt wynalazku dotyczy wektorów, korzystnie wektorów ekspresyjnych, zawierających kwas nukleinowy kodujący białko BAFF-R albo jego pochodne, fragmenty, analogi lub homologi. Stosowany tu termin „wektor” dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innej cząsteczki kwasu nukleinowego, z którą został połączony. Jednym z typów wektorów jest „plazmid”, co odnosi się do kolistej dwniciowej pętli DNA, do której zostały włączone poprzez ligację inne odcinki DNA. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, gdzie dodatkowe odcinki DNA można włączyć poprzez ligację do genomu wirusowego. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza, do których zostały wprowadzone (np. wektory bakteryjne mające bakteryjny początek replikacji i episomalne wektory ssacze). Inne wektory (np. nieepisomowe wektory ssacze) są włączane do genomu komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza, a zatem podlegają replikacji razem z genomem gospodarza. Ponadto, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi są funkcjonalnie połączone. Takie wektory określa się jako „wektory ekspresyjne”. Generalnie, wektory ekspresyjne mające zastosowanie w technikach rekombinowania DNA są często w postaci plazmidów. W niniejszym opisie, „plazmid” i „wektor” mogą być stosowane wymiennie, ponieważ plazmid jest najczęściej stosowaną postacią wektora. Jednakże wynalazek ma obejmować takie inne postaci wektorów ekspresyjnych, jak wektory wirusowe (np. retrowirusy o defektywnej replikacji, adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom), które pełnią równoważne funkcje.
Zrekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku zawierają kwas nukleinowy według wynalazku w postaci odpowiedniej do ekspresji kwasu nukleinowego w komórce gospodarza, co oznacza, że zrekombinowane wektory ekspresyjne zawierają jedną lub więcej sekwencji regulacyj26
PL 207 267 B1 nych, wybranych w oparciu o komórki gospodarza, które mają być użyte do ekspresji, które są połączone funkcjonalnie z sekwencją kwasu nukleinowego, która ma ulegać ekspresji. W obrębie wektora ekspresyjnego „połączona funkcjonalnie” ma oznaczać, że sekwencja nukleotydowa będąca przedmiotem zainteresowania jest połączona z sekwencją(mi) regulacyjnymi w sposób, który umożliwia ekspresję sekwencji nukleotydowej (np. w systemie translacji/transkrypcji albo w komórce gospodarza, kiedy wektor jest wprowadzony do komórki gospodarza). Termin „sekwencja regulacyjna” ma obejmować promotory, wzmacniacze i inne elementy regulujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji). Takie sekwencje regulacyjne są opisane na przykład w Goeddel „Gene Expression Technology” Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalif 1990. Sekwencje regulacyjne obejmują te, które kierują ekspresją konstytutywną sekwencji nukleotydowej w wielu typach komórek gospodarza oraz te, które kierują ekspresją sekwencji nukleotydowej jedynie w pewnych komórkach gospodarza (np. sekwencje regulacyjne specyficzne tkankowo). Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że projekt wektora ekspresyjnego będzie zależał od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza, która ma być transformowana, pożądanego poziomu ekspresji białka i temu podobnych. Wektory ekspresyjne według wynalazku można wprowadzać do komórki gospodarza wytwarzając w ten sposób białka lub peptydy, włączając w to fuzje białkowe albo peptydowe, kodowane przez opisane tu kwasy nukleinowe (np. białka BAFF-R, zmutowane postaci białek BAFF-R, fuzje białkowe i temu podobne).
Zrekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku można zaprojektować do ekspresji białek BAFF-R w komórkach prokariotycznych albo eukariotycznych. Przykładowo, białka BAFF-R mogą być wyrażane w komórkach Escherichia coli, komórkach owadów (z zastosowaniem bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych), komórkach drożdży lub komórkach ssaków. Odpowiednie komórki gospodarzy są dyskutowane dalej w Goeddel „Gene Expression Technology” Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif 1990. Alternatywnie, zrekombinowane wektory ekspresyjne mogą ulegać transkrypcji i translacji in vitro, na przykład przy zastosowaniu sekwencji regulacyjnych promotora T7 i polimerazy T7.
Ekspresję białek w organizmach prokariotycznych najczęściej przeprowadza się w E. coli przy zastosowaniu wektorów zawierających konstytutywne albo indukowalne promotory kierujące ekspresją białka jako fuzji i nie fuzji. Wektory do fuzji dodają pewną liczbę aminokwasów do zakodowanego w nich białka, zwykle na końcu aminowym zrekombinowanego białka. Takie wektory do fuzji zazwyczaj służą trzem celom: (1) zwiększeniu ekspresji zrekombinowanego białka; (2) zwiększeniu rozpuszczalności zrekombinowanego białka; i (3) pomocy w oczyszczaniu zrekombinowanego białka poprzez działanie jako ligand w oczyszczaniu przez powinowactwo. Często, w wektorach ekspresyjnych dla fuzji wprowadzane jest miejsce cięcia proteolitycznego na styku reszty fuzji i zrekombinowanego białka dla umożliwienia oddzielenia zrekombinowanego białka od reszty fuzji po oczyszczeniu fuzji białkowej. Takie enzymy i ich odpowiednie miejsca rozpoznawania obejmują czynnik Xa, trombinę i enterokinazę. Typowe wektory ekspresyjne obejmują pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith i Johnson (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) i pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), które łączą S-transferasę glutationową (GST), białko wiążące maltozę E lub białko A, odpowiednio, z docelowym zrekombinowanym białkiem.
Przykłady odpowiednich indukowalnych wektorów ekspresyjnych nie-fuzji E. coli obejmują pTrc (Amrann i wsp., (1988) Gene 69: 301-315) i pETlld (Studier i wsp., „Gene Expression Technology” Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. 1990, str. 60-89).
Jedną ze strategii maksymalizacji ekspresji zrekombinowanego białka w E. coli jest ekspresja białka w gospodarzu bakteryjnym z zaburzoną zdolnością do cięcia proteolitycznego zrekombinowanego białka. Patrz, Gottesman, „Gene Expression Technology” Methods in Enzymogy 185, Academic Press, San Diego, Calif 1990, str. 119-128. Inną strategią jest zmiana sekwencji nukleotydowej kwasu nukleinowego, który ma być wstawiony do wektora ekspresyjnego, tak aby poszczególne kodony dla każdego z aminokwasów były takimi, które są preferencyjnie używane w E. coli (Wada i wsp., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Takie zmiany w sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku można przeprowadzić poprzez standardowe techniki syntezy DNA.
W innym wykonaniu, wektorem do ekspresji BAFF-R jest drożdżowy wektor ekspresyjny. Przykłady wektorów do ekspresji w drożdżach (np. Saccharomyces cerevisae) obejmują pYepSec1 (Baldari i wsp., (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan i Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz i wsp., (1987) Gene 54: 113-123) i pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Kalif), a dla
P. pastoris obejmują rodzinę wektorów pPIC (lnvitrogen Corp, San Diego, Kalif).
PL 207 267 B1
Alternatywnie, białka BAFF-R mogą być wyrażane w komórkach owadów z zastosowaniem bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych. Wektory bakulowirusowe dostępne do ekspresji białek w hodowanych komórkach owadzich (np. komórkach SF9) obejmują serię pAc (Smith i wsp., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) i serię pVL (Lucklow i Summers, (1989) Virology 170: 31-39).
W jeszcze innym wykonaniu kwas nukleinowy według wynalazku jest wyrażany w komórkach ssaków przy użyciu ssaczych wektorów ekspresyjnych. Przykłady ssaczych wektorów ekspresyjnych obejmują pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) i pMT2PC (Kaufman i wsp. (1987) EMBO J. 6: 187195). Kiedy stosuje się komórki ssacze, funkcje kontrolne dla wektora są często dostarczane przez wirusowe elementy regulacyjne. Przykładowo, powszechnie stosowane promotory pochodzą z wirusa polioma, adenowirusa 2, cytomegalowirusa i wirusa małpiego 40. Dla innych przydatnych systemów ekspresyjnych, zarówno dla komórek prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Patrz np. rozdziały 16 i 17 Sambrook i wsp. T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
W jeszcze innym wykonaniu zrekombinowany ssaczy wektor ekspresyjny jest zdolny do kierowania ekspresją kwasu nukleinowego preferencyjnie w konkretnym typie komórki (np. do ekspresji kwasu nukleinowego stosuje się elementy regulacyjne specyficzne tkankowo). Specyficzne tkankowo elementy regulacyjne są znane w tej dziedzinie. Nieograniczające przykłady odpowiednich specyficznych tkankowo promotorów obejmują promotor albuminy (specyficzny dla wątroby; Pinkert i wsp. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), promotory specyficzne dla układu limfoidalnego (Calame i Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), a w szczególności promotory receptorów komórek T (Winoto i Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) oraz immunoglobulin (Banerji i wsp. (1983) Cell 33: 729-740; Queen i Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), promotory specyficzne dla neuronów (np. promotor neurofilamentu; Byrne i Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 5473-5477), promotory specyficzne dla trzustki (Edlund i wsp. (1985) Science 230: 912-916) oraz promotory specyficzne dla gruczoły mlecznego (np. promotor serwatki mleka; patent USA nr 4873316 i publikacja zgłoszenia europejskiego nr 264166). Obejmuje to także promotory regulowane w rozwoju, np. mysie promotory hox (Kessel i Gruss (1990) Science 249: 374-379) oraz promotor α -fetoproteiny (Campes i Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
Wynalazek dostarcza ponadto zrekombinowanego wektora ekspresyjnego zawierającego cząsteczkę DNA według wynalazku sklonowaną w wektorze ekspresyjnym w orientacji antysensownej. To jest, cząsteczka DNA jest połączona funkcjonalnie z sekwencją regulacyjną w sposób, który umożliwia ekspresję cząsteczki RNA (poprzez transkrypcję cząsteczki DNA), która jest antysensowna w stosunku do mRNA BAFF-R. Można wybrać sekwencje regulacyjne połączone funkcjonalnie z kwasem nukleinowym sklonowanym w orientacji antysensownej, które kierują stałą ekspresją antysensownej cząsteczki RNA w różnych typach komórek, na przykład promotory/wzmacniacze wirusowe, albo można wybrać sekwencje regulacyjne, które kierują konstytutywną, specyficzną tkankowo albo specyficzną komórkowo ekspresją antysensownego RNA. Wektory do antysensownej ekspresji mogą być w postaci zrekombinowanego plazmidu, fagmidu albo atenuowanego wirusa, w którym antysensowne kwasy nukleinowe są wytwarzane pod kontrolą wysoce wydajnego regionu regulacyjnego, którego aktywność można określić przez typ komórki, do której wektor jest wprowadzany. Dla dyskusji o regulacji ekspresji genów przy zastosowaniu genów antysensownych patrz Weintraub i wsp. (1986) „Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis”, Reviews-Trends in Genetics, 1(1).
Inny aspekt wynalazku dotyczy komórek gospodarzy, do których zrekombinowany wektor ekspresyjny został wprowadzony. Terminy „komórka gospodarza” i „zrekombinowana komórka gospodarza” są tu stosowane wymiennie. Jest zrozumiałe, że takie terminy dotyczą nie tylko konkretnej komórki osobnika, ale potomstwa albo potencjalnego potomstwa takiej komórki. Ponieważ pewne modyfikacje mogą następować w kolejnych pokoleniach bądź na skutek mutacji, bądź wpływów środowiskowych, takie potomstwo może nie być faktycznie identyczne z komórką rodzicielską, ale nadal być objęte zakresem stosowanego tu terminu.
Komórką gospodarza może być dowolna komórka prokariotyczna albo eukariotyczna. Na przykład, białko BAFF-R może być wyrażane w komórkach bakteryjnych, takich jak E. coli, komórkach owadów, komórkach drożdży lub ssaków (takich jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub komórki COS). Inne przydatne komórki gospodarza są znane specjalistom w tej dziedzinie.
Wektorowy DNA można wprowadzać do komórek prokariotycznych albo eukariotycznych przy zastosowaniu konwencjonalnych technik transformacji albo transfekcji. Stosowane tu terminy „transformacja” albo „transfekcja” mają dotyczyć rozmaitych znanych w tej dziedzinie technik wprowadzania
PL 207 267 B1 obcych kwasów nukleinowych (np. DNA) do komórki gospodarza, włączając w to, współwytrącanie fosforanem wapnia albo chlorkiem wapnia, transfekcję za pośrednictwem DEAE dekstranu, lipofekcję albo elektroporację. Odpowiednie metody transformowania komórek gospodarza można znaleźć w Sambrook i wsp. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 i innych podręcznikach laboratoryjnych.
W przypadku stabilnej transfekcji komórek ssaków wiadomo, że w zależności od wektora ekspresyjnego i zastosowanej techniki transfekcji jedynie niewielka frakcja komórek może włączać obcy DNA do swojego genomu. W celu zidentyfikowania i selekcji tych integrantów, do komórki gospodarza wprowadza się zwykle razem z genem będącym przedmiotem zainteresowania gen, który koduje marker selekcyjny (np. oporność na antybiotyk). Korzystne markery selekcyjne obejmują te, które nadają oporność na lek, taki jak G418, higromycynę i metotreksan. Kwas nukleinowy kodujący marker selekcyjny można wprowadzać do komórki gospodarza na tym samym wektorze co ten kodujący białko BAFF-R, albo może być wprowadzony na odrębnym wektorze. Komórki stabilnie transfekowane wprowadzonym kwasem nukleinowym można zidentyfikować poprzez selekcję lekiem (np. komórki, które mają włączony marker selekcyjny przeżyją, podczas gdy inne komórki umierają).
Komórka gospodarza według wynalazku, taka jak prokariotyczna albo eukariotyczna komórka gospodarza w hodowli może być użyta do wytwarzania (tj. ekspresji) białka BAFF-R. A zatem wynalazek dostarcza ponadto sposobu wytwarzania białka BAFF-R przy zastosowaniu komórki gospodarza według wynalazku. W jednym z wykonań sposób obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku (do którego zrekombinowany wektor ekspresyjny kodujący białko BAFF-R został wprowadzony) w odpowiedniej pożywce, tak że białko BAFF-R jest wytwarzane. W innym wykonaniu sposób obejmuje ponadto izolowanie BAFF-R z pożywki albo komórki gospodarza.
Zwierzęta transgeniczne
Komórki gospodarza według wynalazku można również użyć do wytworzenia zwierząt transgenicznych z wyłączeniem człowieka. Przykładowo, w jednym z wykonań komórką gospodarza według wynalazku jest zapłodniony oocyt albo embrionalna komórka macierzysta, do której zostały wprowadzone sekwencje kodujące BAFF-R. Taką komórkę można użyć następnie do wytworzenia zwierzęcia transgenicznego z wyłączeniem człowieka, w którym endogenne sekwencje BAFF-R zostały zmienione. Takie zwierzęta są przydatne do badania funkcji i/lub aktywności BAFF-R i do identyfikowania i/lub oceny modulatorów aktywności BAFF-R. Stosowany tu termin „zwierzę transgeniczne” to zwierzę oprócz człowieka, korzystnie ssak, a korzystniej gryzoń, taki jak szczur lub mysz, w którym jedna lub więcej komórek zwierzęcia zawiera transgen. Inne przykłady zwierząt transgenicznych obejmują naczelne oprócz człowieka, owce, psy, krowy, kozy, kury, płazy i temu podobne. Transgenem jest egzogenny DNA, który jest włączony do genomu komórki, z której transgeniczne zwierzę rozwija się i która pozostaje w genomie dojrzałego zwierzęcia, kierując w ten sposób ekspresją zakodowanego produktu genu w jednej lub większej liczbie typów komórek lub tkanek transgenicznego zwierzęcia. Stosowane tu określenia „zwierzę po homologicznej rekombinacji” to zwierzę oprócz człowieka, korzystnie ssak, korzystnej mysz, w którym endogenny gen BAFF-R został zmieniony poprzez homologiczną rekombinację pomiędzy endogennym genem a egzogenną cząsteczką DNA wprowadzaną do komórki zwierzęcia, np. komórki zarodkowej zwierzęcia, przed rozwojem zwierzęcia.
Zwierzę transgeniczne według wynalazku można wytworzyć poprzez wprowadzenie kwasu nukleinowego kodującego BAFF-R do męskich przedjądrzy zapłodnionych oocytów, np. poprzez mikroiniekcję, infekcję retrowirusową i umożliwienie oocytowi rozwój u samicy zastępczej w ciąży rzekomej. Sekwencję cDNA BAFF-R z Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6) można wprowadzić jako transgen do genomu zwierzęcia oprócz człowieka. Alternatywnie, nie-ludzki homolog ludzkiego genu BAFF-R, taki jak mysi gen BAFF-R (Fig. 4A) (SEK NR ID: 8) może zostać wyizolowany w oparciu o hybrydyzację z cDNA (opisaną dalej powyżej) i użyty jako transgen. Do transgenu można również wprowadzić sygnały intronowe i poliadenylacji dla zwiększenia wydajności ekspresji transgenu. Z transgenem może być połączona funkcjonalnie specyficzna tkankowo sekwencja(e) regulacyjna(e) dla skierowania ekspresji białka BAFF-R do określonych komórek. Sposoby wytwarzania zwierząt transgenicznych poprzez manipulację i mikroiniekcję zarodków, a w szczególności zwierząt, takich jak mysz, stały się konwencjonalne w tej dziedzinie i są opisane na przykład w patentach USA nr 4736866, 4870009 i 4873191 oraz w Hogan w Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986. Podobne metody są stosowane do wytwarzania innych zwierząt transgenicznych. Transgeniczne zwierzę-założyciela można zidentyfikoPL 207 267 B1 wać na podstawie obecności transgenu BAFF-R w jego genomie i/lub ekspresji mRNA BAFF-R w tkankach lub komórkach zwierzęcia. Transgeniczne zwierzę-założ yciela moż na następnie użyć do wyhodowania dodatkowych zwierząt niosących transgen. Ponadto, transgeniczne zwierzę kodujące białko BAFF-R można następnie krzyżować z innymi transgenicznymi zwierzętami niosącymi inne transgeny.
W celu wytworzenia zwierzęcia po rekombinacji homologicznej wytwarza się wektor, który zawiera, co najmniej część genu BAFF-R, do którego wprowadza się delecję, addycję albo podstawienie, zmieniając w ten sposób, np. funkcjonalnie niszcząc gen BAFF-R. Genem BAFF-R może być gen ludzki (np. Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6), ale korzystniej, jest nim nie-ludzki homolog genu BAFF-R. Przykładowo, mysi hololog (Fig. 4A) ludzkiego genu BAFF-R z Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2C (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6) moż na uż y ć do konstrukcji cząsteczki kwasu nukleinowego do homologicznej rekombinacji np. wektora odpowiedniego do zmieniania endogennego genu BAFF-R myszy w genomie myszy. W jednym z wykonań wektor projektuje się tak, aby po rekombinacji homologicznej endogenny gen BAFF-R był funkcjonalnie zniszczony (tj., nie kodował już dłużej funkcjonalnego białka; określany również jako wektor do „knock out”).
Alternatywnie, wektor można zaprojektować tak, aby po rekombinacji homologicznej endogenny gen BAFF-R był zmutowany lub w inny sposób zmieniony, ale nadal kodował funkcjonalne białko (np. leżące powyżej sekwencje regulacyjne można zmienić, zmieniając w ten sposób ekspresję endogennego białka BAFF-R). W wektorze do homologicznej rekombinacji zmieniona część genu BAFF-R jest oflankowana na końcach 5' i 3' przez dodatkową sekwencję kwasu nukleinowego genu BAFF-R dla umożliwienia zajścia homologicznej rekombinacji pomiędzy egzogennym genem BAFF-R przenoszonym przez wektor i endogennym genem BAFF-R w embrionalnej komórce macierzystej. Dodatkowa sekwencja flankująca sekwencję kwasu nukleinowego BAFF-R ma dostateczną długość dla udanej rekombinacji homologicznej z endogennym genem. Typowo, w wektorze znajduje się kilka tysięcy par zasad flankującego DNA (na obydwu końcach 5' i 3'). Patrz, np., Thomas i Capecchi (1987) Cell 51: 503 dla opisu wektorów do homologicznej rekombinacji. Wektor wprowadza się do linii embrionalnych komórek macierzystych (np. poprzez elektroporację) i selekcjonuje się komórki, w których nastąpiła rekombinacja homologiczna wprowadzonego genu BAFF-R z endogennym genem BAFF-R (patrz np. Li i wsp. (1992) Cell 69: 915).
Wyselekcjonowane komórki można następnie wstrzyknąć do blastocysty zwierzęcia (np. myszy) z wytworzeniem chimer agregacyjnych. Patrz np., Bradley w Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, wyd. IRL, Oxford, 1987, str. 113-152. Chimerowe zarodki można następnie wszczepić do odpowiedniej samicy zastępczej w ciąży rzekomej i doprowadzić do zakończenia rozwoju zarodka. Potomstwo niosące DNA po homologicznej rekombinacji w komórkach rozrodczych używa się następnie do wyhodowania zwierząt, w których wszystkie komórki zwierzęcia zawierają DNA po homologicznej rekombinacji poprzez przenoszenie transgenu w linii płciowej. Sposoby konstruowania cząsteczek kwasu nukleinowego do homologicznej rekombinacji, np. wektorów albo zwierząt po homologicznej rekombinacji są opisane ponadto w Bradley (1991) Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829, międzynarodowych publikacjach PCT nr: WO 90/11354; WO 91/01140; WO 92/0968 oraz WO 93/04169.
W innym wykonaniu, można wytworzyć zwierzęta transgeniczne oprócz człowieka, które zawierają systemy selekcji, które umożliwiają regulowaną ekspresję transgenu. Przykładem takiego systemu jest system rekombinazy cre/loxP bacteriofaga P1. Dla opisu systemu rekombinazy cre/loxP patrz. np. Lakso i wsp. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236. Innym przykładem systemu rekombinazy jest system rekombinazy FLP z S. cerevisiae (O'Gorman i wsp. (1991) Science 251: 13511355). Jeżeli do regulacji ekspresji transgenu stosowany jest system rekombinazy cre/loxP, wymagane jest posiadanie zwierząt zawierających transgeny kodujące zarówno rekombinazę Cre, jak i wybrane białko. Takie zwierzęta mogą być dostarczone poprzez konstrukcję „podwójnych” zwierząt transgenicznych, np. poprzez krzyżowanie dwóch zwierząt transgenicznych, jednego zawierającego transgen kodujący wybrane białko i drugiego zawierającego transgen kodujący rekombinazę.
Klony opisanych tu zwierząt transgenicznych oprócz człowieka można również wytworzyć według metod opisanych w Wilmut i wsp. (1997) Nature 385: 810-813. Pokrótce, ze zwierzęcia transgenicznego można wyizolować komórkę, np. komórkę somatyczną i zaindukować, aby wyszła z cyklu wzrostowego i weszła w fazę GO. Spoczynkową komórkę można następnie poddać fuzji, np. poprzez zastosowanie pulsów elektrycznych, z pozbawionym jądra ooocytem ze zwierzęcia tego samego gatunku, z którego wyizolowana została komórka spoczynkowa. Zrekonstruowany ooocyt hoduje się
PL 207 267 B1 następnie tak, aby rozwinęła się morula lub blastocysta, a następnie przenosi się do samicy zastępczej w ciąży rzekomej. Potomstwo urodzone przez tą samicę zastępczą będzie klonem zwierzęcia, z którego komórka, np. komórka somatyczna został a wyizolowana.
Kompozycje farmaceutyczne
Cząsteczki kwasu nukleinowego BAFF-R, białka BAFF-R i przeciwciała anty-BAFF-R (określane tu również jako „związki aktywne”) według wynalazku można włączyć do kompozycji farmaceutycznych odpowiednich do podawania. Takie kompozycje zawierają zazwyczaj cząsteczkę kwasu nukleinowego, białko lub przeciwciało i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Stosowany tu termin „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” ma obejmować dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, podłoża dyspersyjne, powłoki, czynniki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe, czynniki izotoniczne i opóźniające absorpcję i tym podobne, odpowiednie do podawania farmaceutycznego. Odpowiednie nośniki są opisane w najnowszej edycji Remington's Pharmaceutical Sciences, standardowym tekście podnośnikowym w tej dziedzinie, który jest tu włączony jako odniesienie. Korzystne przykłady takich nośników albo rozcieńczalników obejmują między innymi wodę, sól fizjologiczną, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy i 5% ludzką surowiczą albuminę. Można również zastosować liposomy i nośniki nie-wodne, takie jak utrwalone oleje. Stosowanie takich podłóż i czynników dla substancji farmaceutycznie czynnych jest dobrze znane w tej dziedzinie. Z wyjątkiem sytuacji, gdy jakieś konwencjonalne podłoże lub czynnik nie pasuje do związku aktywnego, bierze się pod uwagę jego zastosowanie w kompozycjach. Do kompozycji mogą być także włączone dodatkowe związki aktywne.
Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku wytwarza się tak, aby była odpowiednia do zamierzonej drogi jej podawania. Przykłady dróg podawania obejmują podawanie pozajelitowe np. dożylne, doskórne, podskórne, doustne (np. inhalacja), przezskórne (miejscowe), przezśluzówkowe i doodbytowe. Rozwory lub zawiesiny do stosowania pozajelitowego, doskórnego lub podskórnego mogą zawierać następujące składniki: sterylny rozcieńczalnik, taki jak woda do zastrzyków, roztwór soli fizjologicznej, utrwalone oleje, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol polietylenowy i inne rozpuszczalniki syntetyczne; czynniki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub metyloparabeny; przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodowy; czynniki chelatujące, takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA); bufory, takie jak octany, cytryniany lub fosforany oraz czynniki do ustalania ciśnienia osomotycznego, takie jak chlorek sodowy lub dekstroza. pH może być ustalone przy użyciu kwasów lub zasad, takich jak kwas solny lub wodorotlenek sodowy. Preparaty pozajelitowe mogą być zamknięte w ampułkach, jednorazowych strzykawkach albo wielodawkowych fiolkach wykonanych ze szkła albo plastyku.
Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do stosowania w zastrzykach obejmują sterylne roztwory wodne (gdy są rozpuszczalne w wodzie) lub zawiesiny i sterylne proszki do przygotowania sterylnych roztworów lub zawiesin bezpośrednio przed wstrzyknięciem. Do podawania dożylnego odpowiednie nośniki obejmują sól fizjologiczną, wodę bakteriostatyczną, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) lub roztwór soli buforowany fosforanem (PBS). We wszystkich przypadkach kompozycje muszą być sterylne i powinny być płynne, tak, aby mogły być łatwo podawane strzykawką. Muszą być one stabilne w warunkach produkcji oraz przechowywania i muszą być chronione przed zanieczyszczającym działaniem mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub podłoże rozpraszające zawierające na przykład wodę, etanol, poliol (na przykład glicerol, glikol propylenowy oraz płynny glikol polietylenowy i tym podobne) oraz odpowiednie ich mieszaniny. Może być utrzymana odpowiednia płynność na przykład poprzez zastosowanie powlekania, takiego jak lecytyną, przez utrzymanie pożądanej wielkości cząstek w przypadku zawiesin i przez stosowanie związków powierzchniowo czynnych. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów można uzyskać za pomocą różnych czynników przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybowych, na przykład parabenów, chlorobutanolu, fenolu, kwasu askorbinowego, timerosalu i tym podobnych. W wielu przypadkach będzie korzystne włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, na przykład cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol, chlorek sodu. Przedłużoną absorpcję związków w zastrzykach można uzyskać poprzez włączenie do kompozycji czynnika, który opóźnia absorpcję, na przykład monostearynianu glinu i żelatyny.
Sterylne roztwory do iniekcji można przygotować przez włączenie związku aktywnego (np. białka BAFF-R lub przeciwciała anty-BAFF-R) w wymaganej ilości w odpowiednim rozpuszczalniku wraz jednym lub kombinacją wymienionych powyżej składników, w zależności od wymagań, a następnie sterylizację z zastosowaniem filtrów. Generalnie, dyspersje przygotowuje się przez włączenie związku aktywnego do sterylnego nośnika, który zawiera podstawowe podłoże dyspersyjne i inne wymagane
PL 207 267 B1 składniki spośród tych wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do przygotowania sterylnych roztworów do zastrzyków, korzystne sposoby przygotowania to suszenie pod próżnią i suszenie po zamrożeniu, w wyniku czego uzyskuje się proszek składnika aktywnego plus dowolny inny pożądany dodatkowy składnik z jego uprzednio przefiltrowanego, sterylnego roztworu.
Kompozycje doustne generalnie zawierają bierny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogą być one zamknięte w żelatynowych kapsułkach albo sprasowane w tabletki. Dla celów terapeutycznego podawania doustnego, związek aktywny może być włączony razem z zaróbkami i używany w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek; kompozycje doustne mogą być również wytworzone z użyciem nośnika płynnego do zastosowania jako płyn do ust, gdzie związek w nośniku płynnym jest stosowany doustnie i po przepłukaniu wypluwany lub połykany. Odpowiednie farmaceutycznie czynniki wiążące i/lub materiały adiuwantowe mogą być włączone jako część kompozycji. Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i temu podobne mogą zawierać dowolny z następujących lub związki o podobnej naturze: czynnik wiążący, taki jak celuloza mikrokrystaliczna, guma tragakantowa lub żelatyna; zaróbkę, taką jak skrobia lub laktoza, środek rozpraszający, taki jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana; smar, taki jak stearynian magnezowy lub Sterotes; środek poślizgowy, taki jak koloidalny dwutlenek silikonu; środek słodzący, taki jak sacharoza lub sacharyna albo środek smakowy, taki jak mięta pieprzowa, salicynian metylowy albo aromat pomarańczowy.
Do podawania przez inhalację związki dostarcza się w postaci aerozolu z pojemnika ciśnieniowego albo dozownika, który zawiera odpowiednie propelenty, np. gaz, taki jak dwutlenek węgla, albo nebulizatora.
Podawanie ogólnoustrojowe może być również sposobami przezśluzówkowymi lub przezskórnymi. Do podawania przezśluzówkowego lub przezskórnego w kompozycji stosuje się czynniki penetrujące odpowiednie dla bariery, która ma być pokonywana. Takie czynniki penetrujące są generalnie znane w tej dziedzinie i obejmują na przykład, do podawania przezskórnego, detergenty, sole żółciowe i pochodne kwasu fusydowego. Podawanie przezśluzówkowe można przeprowadzić poprzez zastosowanie rozpylaczy i czopków donosowych. Do podawania przezskórnego, związki aktywne mogą być przygotowane w postaci maści, balsamów, żeli, kremów, jak jest to ogólnie znane w tej dziedzinie.
Związki można również wytwarzać w postaci czopków (np. z konwencjonalnymi podłożami podstawowymi do czopków, takimi jak masło kokosowe lub inne glicerydy) lub utrzymujące się wlewy do podawania doodbytowego.
W jednym z wykonań, związki aktywne są przygotowywane z nośnikami, które będą chronić związek przed szybką eliminacją z ciała, takie jak kompozycje o kontrolowanym uwalnianiu, włączając w to implanty i systemy dostarczania w mikrokapsułkach. Można zastosować ulegające biodegradacji, zgodne biologicznie polimery, takie jest octan etylenowinylowy, polianhydrydy, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania takich kompozycji będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie. Materiały można również nabyć w Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Jako farmaceutycznie dopuszczalne nośniki można również zastosować zawiesiny liposomowe (włączając w to liposomy kierowane do zainfekowanych komórek przy zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych wobec antygenów wirusowych). Mogą być one wytwarzane według znanych metod znanych specjalistom w tej dziedzinie, na przykład jak opisano w patencie USA nr 4522811.
Jest szczególnie korzystne wytwarzanie kompozycji doustnych lub pozajelitowych w postaci jednostkowych dawek dla łatwości podawania i jednorodności dawkowania. Stosowane tu dawki w formie jednostkowej dotyczą fizycznie odrębnych jednostek odpowiednich jako jednostkowe dawki dla osobnika, który ma być leczony; każda jednostka zawiera z góry ustaloną ilość związku aktywnego wyliczoną tak, by dała pożądany efekt terapeutyczny w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym.
Kwasy nukleinowe według wynalazku można wstawiać do wektorów i stosować jako wektory do terapii genowej. Wektory do terapii genowej mogą być dostarczane do osobnika poprzez na przykład wstrzyknięcie dożylne, podawanie miejscowe (patrz patent USA 5328470 albo wstrzyknięcie stereotaktyczne (patrz np. Chen i wsp. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). Kompozycje farmaceutyczne wektora do terapii genowej mogą zawierać wektor do terapii genowej w dopuszczalnym rozcieńczalniku albo mogą zawierać podłoże do powolnego uwalniania, w którym nośnik do dostarczania genu jest zatopiony. Alternatywnie, tam gdzie cały wektor do dostarczania genu może zostać wytworzony w postaci nienaruszonej ze zrekombinowanych komórek, np. dla wektorów wirusowych, kompozycja farmaceutyczna może zawierać jedną lub więcej komórek, które wytwarzają system dostarczania genu.
PL 207 267 B1
Kompozycja farmaceutyczna może być umieszczona w pojemniku, opakowaniu albo dozowniku łącznie z instrukcją stosowania.
Zastosowania i sposoby według wynalazku.
Opisane tu cząsteczki kwasu nukleinowego, białka, homologi białek oraz przeciwciała można zastosować w jednej lub większej liczbie następujących metod: (a) badaniach przesiewowych;
(b) testach wykrywania (np. mapowanie do chromosomu, typowanie tkankowe, biologia sądowa), (c) medycynie prognostycznej (np. testach diagnostycznych, testach prognostycznych, monitorowaniu testów klinicznych oraz farmakogenetyce) oraz (d) sposobach leczenia (np. terapeutycznych i profilaktycznych). Jak tu opisano, w jednym z wykonań białko BAFF-R według wynalazku ma zdolność wiązania BAFF.
Izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku można użyć na przykład do ekspresji białka BAFF-R (np. poprzez rekombinowany wektor ekspresyjny w komórce gospodarza w zastosowaniach terapii genowej), do wykrywania mRNA BAFF-R (np. w próbce biologicznej) lub do genetycznej zmiany w genie BAFF-R oraz do modulowania aktywności BAFF i BAFF-R, jak opisano poniżej. Dodatkowo, białka BAFF-R można wykorzystać w do poszukiwania leków bądź związków, które modulują aktywność BAFF-R, jak również w leczeniu chorób, w których występuje niedostateczne bądź nadmierne wytwarzanie białka BAFF i/lub BAFF-R albo wytwarzanie form białka BAFF-R o obniżonej lub nieprawidłowej aktywności w porównaniu z aktywnością dzikiej formy białka BAFF-R. Dodatkowo, przeciwciała BAFF-R według wynalazku można użyć do wykrywania i izolacji białek BAFF-R oraz do modulowania aktywności BAFF i/lub BAFF-R.
Wynalazek dotyczy ponadto nowych czynników zidentyfikowanych w opisanych powyżej testach przesiewowych i ich zastosowania do leczenia jak tu opisano.
Testy przesiewowe
Wynalazek dostarcza metody (opisywanej tutaj jako „badanie przesiewowe”) identyfikacji modulatorów, tj. potencjalnych lub testowych związków albo czynników (np. peptydów, peptydomimetyków, leków drobnocząsteczkowych i innych), które wiążą białka BAFF-R albo mają działanie stymulujące lub hamujące na przykład na ekspresję BAFF-R albo aktywność BAFF-R.
W jednym z wykonań, wynalazek dostarcza testów do przeszukiwania związków-kandydatów albo związków testowanych pod kątem substratów dla białka lub polipeptydu BAFF-R albo jego biologicznie aktywnej części. Związki testowane według niniejszego wynalazku można otrzymać wykorzystując dowolną z licznych znanych w tej dziedzinie metod bibliotek kombinatorycznych obejmujących: biblioteki biologiczne; przestrzennie adresowane równoległe biblioteki w fazie stałej lub w roztworze; metodę bibliotek syntetycznych wymagających dekonwolucji; metodę bibliotek typu, jedna kulka - jeden związek” oraz metodę bibliotek syntetycznych z zastosowaniem selekcji poprzez chromatografię powinowactwa. Wykorzystanie metody biblioteki biologicznej jest ograniczone do bibliotek peptydowych, podczas gdy pozostałe cztery metody można stosować do peptydów, niepeptydowych oligomerów lub bibliotek związków drobnocząsteczkowych (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-167).
Przykłady metod syntezy bibliotek cząsteczkowych można znaleźć w tej dziedzinie, na przykład w: DeWitt i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6909-6013; Erb i wsp. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-11426; Zuckermann i wsp. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-2685; Cho i wsp. (1993) Science 261: 1303; Carrell i wsp. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell i wsp. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 oraz w Gallop i wsp. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-1251.
Biblioteki związków można prezentować w roztworze (np. Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421) lub na kulkach (Lam (1991) Nature 354: 82-84), mikromacierzach (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bakteriach (Ladner, patent USA 5223409), sporach (Ladner, patent USA 5223409), plazmidach (Cull i wsp. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) lub na fagu (Scott i Smith (1990) Science 249: 386-390; Devlin (1990) Science 249: 404-406; Cwirla i wsp. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 7: 6378-6382; Felici (1991) J Mol. Biol. 222: 301-310; Ladner, patent USA 5223409).
W jednym z wykonań testem jest oparte na komórkach oznaczenie, w którym doprowadza się do kontaktu komórki wyrażającej związaną z błoną postać białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywną część na powierzchni komórki ze związkiem testowanym i określa się zdolność testowanego związku do wiązania się z białkiem BAFF-R. Komórka może być na przykład pochodzenia ssaczego lub komórką drożdży. Określenia zdolności testowanego związku do wiązania się z białkiem BAFF-R można dokonać na przykład przez połączenie testowanego związku z radioizotopem lub znacznikiem enzymatycznym, tak, aby wiązanie się testowanego związku białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywnej części można było określić wykrywając wyznakowany związek w kompleksie. Na przykład,
PL 207 267 B1 testowane związki można wyznakować 125I, 35S, 14C lub 3H, bezpośrednio lub pośrednio, a radioizotop wykrywać przez bezpośrednie zliczane emisji promieniowania lub przez zliczanie w liczniku scyntylacyjnym. Alternatywnie, związki można wyznakować enzymatycznie na przykład peroksydazą chrzanową, fosfatazą alkaliczną lub lucyferazą, a znacznik enzymatyczny wykrywać przez oznaczenie przekształcenia odpowiedniego substratu do produktu. W jednym z wykonań test obejmuje doprowadzenie do kontaktu komórki, która wyraża związaną z błoną postać białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywną część na powierzchni komórki ze znanym związkiem, który wiąże się z BAFF-R, tworząc mieszaninę testową, doprowadzenie do kontaktu mieszaniny testowej z testowanym związkiem i określenie zdolności testowanego związku do oddziaływania z białkiem BAFF-R, gdzie ustalenie zdolności testowanego związku do oddziaływania z białkiem BAFF-R obejmuje określenie zdolności testowanego związku do preferencyjnego wiązania się z BAFF-R lub jego biologicznie aktywną częścią w porównaniu ze znanym związkiem.
W innym wykonaniu, testem jest test bezkomórkowy, obejmują cy doprowadzenie do kontaktu komórki wyrażającej związaną z błoną postać białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywną część na powierzchni komórki ze związkiem testowanym i określenie zdolności testowanego związku do modulacji (np. stymulacji lub hamowania) aktywności białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywnej części. Określenia zdolności testowanego związku do modulowania aktywności białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywnej części można dokonać na przykład określając zdolność białka BAFF-R do wiązania lub oddziaływania z cząsteczką docelową dla BAFF-R. Stosowany tu termin „cząsteczka docelowa” oznacza cząsteczkę, z którą białko BAFF-R wiąże się albo oddziałuje w naturze, na przykład cząsteczka na powierzchni komórki, która wyraża białko BAFF-R, cząsteczka na powierzchni innej komórki, cząsteczka w środowisku zewnątrzkomórkowym, cząsteczka związane z wewnętrzną powierzchnią błony komórkowej albo cząsteczka cytoplazmatyczna. Cząsteczką docelową dla BAFF-R może być cząsteczka inna niż BAFF-R albo białko lub polipeptyd BAFF-R według niniejszego wynalazku. W jednym z wykonań cząsteczka docelowa dla BAFF-R jest składnikiem szlaku przekazywania sygnału, która ułatwia przekazywanie zewnątrzkomórkowego sygnału (np. sygnału wytwarzanego przez wiązanie się związku ze związaną z błoną cząsteczką BAFF-R) przez błonę komórkową do komórki. Celem może być na przykład drugie białko wewnątrzkomórkowe, które ma aktywność katalityczną albo białko, które ułatwia łączenie się z BAFF-R cząsteczek przekazujących sygnał dalej.
Określenia zdolności białka BAFF-R do wiązania lub oddziaływania z cząsteczką docelową dla BAFF-R można dokonać przy użyciu jednej z metod opisanych powyżej dla ustalenia bezpośredniego wiązania. W jednym z wykonań ustalenia zdolności białka BAFF-R do wiązania lub oddziaływania z cząsteczką docelową dla BAFF-R moż na dokonać poprzez określenie aktywności cząsteczki docelowej. Przykładowo, aktywności cząsteczki docelowej można określić poprzez wykrywanie indukcji drugorzędowego przekaźnika komórkowego dla cząsteczki docelowej (np. wewnątrzkomórkowego Ca+2, diacyloglicerolu, IP3, itd.), wykrywanie aktywności katalitycznej/enzymatycznej docelowej cząsteczki wobec odpowiedniego substratu, wykrywanie indukcji genu reporterowego (zawierającego odpowiadający na BAFF-R element regulacyjny połączony funkcjonalnie z kwasem nukleinowym kodującym wykrywalny marker, np. lucyferazę), wykrywanie odpowiedzi komórkowej, na przykład przeżywalności komórek, różnicowania komórek albo proliferacji komórek.
W jeszcze innym wykonaniu, testem wedł ug wynalazku jest test bezkomórkowy, obejmują cy doprowadzenie do kontaktu białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywnej części ze związkiem testowanym i określenie zdolności testowanego związku do wiązania się z białkiem BAFF-R lub jego biologicznie aktywną częścią. Wiązania się testowanego związku z białkiem BAFF-R można określić bezpośrednio lub pośrednio jak opisano powyżej. W jednym z wykonań test obejmuje doprowadzenie do kontaktu komórki, która wyraża związaną z błoną postać białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywną część na powierzchni komórki ze znanym związkiem, który wiąże się z BAFF-R, tworząc mieszaninę testową, doprowadzenie do kontaktu mieszaniny testowej z testowanym związkiem i określenie zdolności testowanego związku do oddziaływania z białkiem BAFF-R, gdzie ustalenie zdolności testowanego związku do oddziaływania z białkiem BAFF-R obejmuje określenie zdolności testowanego związku do preferencyjnego wiązania się z BAFF-R lub jego biologicznie aktywną częścią w porównaniu ze znanym związkiem.
W innym wykonaniu, testem wedł ug wynalazku jest test bezkomórkowy, obejmują cy doprowadzenie do kontaktu białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywnej części ze związkiem testowanym i okreś lenie zdolno ś ci testowanego zwią zku do modulacji (np. stymulacji lub hamowania) aktywnoś ci białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywnej części. Określenia zdolności testowanego związku do
PL 207 267 B1 modulowania aktywności białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywnej części można dokonać na przykład określając zdolność białka BAFF-R do wiązania lub oddziaływania z cząsteczką docelową dla BAFF-R przy zastosowaniu jednej z opisanych powyżej metod ustalania bezpośredniego wiązania. W alternatywnym wykonaniu ustalenia zdolności białka BAFF-R zdolności testowanego związku do modulowania aktywności białka BAFF-R można dokonać poprzez określenie zdolności białka BAFF-R do dalszego modulowania cząsteczki docelowej dla BAFF-R. Przykładowo, można określić aktywność katalityczną/enzymatyczną docelowej cząsteczki wobec odpowiedniego substratu jak opisano uprzednio.
W jeszcze innym wykonaniu test bezkomórkowy obejmuje doprowadzenie do kontaktu białka BAFF-R lub jego biologicznie aktywnej części ze znanym związkiem wiążącym białko BAFF-R w celu utworzenia mieszaniny testowej, doprowadzenie do kontaktu mieszaniny testowej ze związkiem testowanym i określenie zdolności testowanego związku do oddziaływania z białkiem BAFF-R, gdzie określenie zdolności testowanego związku do oddziaływania z białkiem BAFF-R obejmuje określenie zdolności białka BAFF-R do preferencyjnego wiązania lub modulowania aktywności cząsteczki docelowej dla BAFF-R.
Test bezkomórkowy według niniejszego wynalazku można stosować zarówno dła postaci BAFF-R rozpuszczalnej, jak i postaci związanej z błoną. W przypadku testów bez-komórkowych zawierających związaną z błoną postać BAFF-R może być pożądane zastosowanie czynników upłynniających, tak aby związana z błoną postać BAFF-R pozostawała w roztworze. Przykłady takich czynników upłynniających obejmują detergenty niejonowe takie jak n-oktyloglukozyd, n-dodecyloglukozyd, n-dodecylomaltozyd, oktano-ilo-N-metyloglukamid, dekanoilo-N-metyloglukamid, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit, izotridecypoli(etylenoglykoloether)n, sulfonian 3-(3-cholamidopropylo)dimetyloaminiolo-1-propanowy (CHAPS), sulfonian 3-(3-cholamidopropylo)dimetyloaminiolo-2-hydroksy-1-propanowy (CHAPSO) albo sulfonian N-dodecylo-N,N-dimetylo-3-amonio-1-propanowy.
W więcej niż jednym wykonaniu powyższych metod testowych według niniejszego wynalazku, korzystne może być unieruchomienie BAFF-R lub jego cząsteczki docelowej w celu ułatwienia oddzielenia form w kompleksach od form niebędących w kompleksach jednego lub obu białek, jak również w celu umożliwienia automatyzacji testu. Wiązanie testowanego związku do białka BAFF-R lub oddziaływanie białka BAFF-R z cząsteczką docelową w obecności i braku potencjalnego związku można przeprowadzić w dowolnym naczyniu odpowiednim do umieszczenia w nim składników reakcji. Przykłady takich naczyń obejmują płytki do mikromiareczkowania, probówki do testów oraz probówki do mikrowirowania. W jednym z wykonań może być dostarczona fuzja białkowa z domeną umożliwiającą jednemu lub obu białkom związanie z podłożem. Na przykład, fuzję białkową GST/BAFF-R lub fuzję białkową GST/związek docelowy można zadsorbować na kulkach sefaroza-glutation (Sigma Chemical, St. Louis, MO) lub pokrywanych glutationem płytkach do mikromiareczkowania, które następnie łączy się ze związkiem testowanym lub związkiem testowanym i niezadsorbowanymi białkami docelowymi lub białkami BAFF-R, a mieszaninę inkubuje w warunkach korzystnych dla utworzenia kompleksu (np. w warunkach fizjologicznych pod względem soli i pH). Po inkubacji, kulki lub płytki do mikromiareczkowania przemywa się w celu usunięcia niezwiązanych składników, w przypadku kulek podłoże unieruchamia się, a kompleks oznacza bezpośrednio lub pośrednio, na przykład jak opisano wyżej. Alternatywnie, kompleksy można oddzielić od podłoża, a poziom wiązania BAFF-R lub aktywność określać standardowymi technikami.
Inne techniki unieruchamiania białek na podłożach można wykorzystać w testach przesiewowych według wynalazku. Na przykład białko BAFF-R lub cząsteczkę docelową BAFF-R można unieruchamiać wykorzystując koniugaty biotyny i streptawidyny. Biotynylowane białko BAFF-R lub cząsteczki docelowe można przygotować z biotyny-NHS (N-hydroksy-sukcynoimid) przy użyciu technik znanych w tej dziedzinie (np. zestaw do biotynylacji, Pierce Chemicals, Rockford, II.) i unieruchamiać w pokrytych streptawidyną studzienkach 96-studzienkowych płytek (Pierce Chemical). Alternatywnie, przeciwciała reagujące z białkiem BAFF-R lub cząsteczkami docelowymi, ale takimi, które nie zakłócają wiązania białka BAFF-R do jego cząsteczki docelowej, można umieszczać w studzienkach płytki, a niezwiązany związek docelowy lub białko BAFF-R zatrzymywać w studzienkach dzięki połączeniu z przeciwciałem. Metody służące wykrywaniu takich kompleksów, dodatkowe oprócz opisanych powyżej dla kompleksów unieruchamianych GST, obejmują immunodetekcję kompleksów przy użyciu przeciwciał reagujących z białkiem BAFF-R lub jego cząsteczką docelową, jak również testy enzymatyczne, opierające się na wykrywaniu aktywności enzymatycznej związanej z białkiem BAFF-R lub jego cząsteczką docelową.
PL 207 267 B1
W innym wykonaniu modulatory ekspresji BAFF-R identyfikuje się metodą , w której doprowadza się do kontaktu komórki ze związkiem-kandydatem, a w komórce określa się ekspresję mRNA lub białka BAFF-R. Poziom ekspresji mRNA lub białka BAFF-R w obecności związku-kandydata porównuje się z poziomem ekspresji mRNA lub białka BAFF-R w przypadku braku związku-kandydata. Na podstawie tego porównania związek-kandydat związek można zidentyfikować jako modulator ekspresji BAFF-R. Na przykład, kiedy ekspresja mRNA lub białka BAFF-R jest większa (znacząco statystycznie większa) w obecności związku-kandydata niż w przypadku jego braku, związek-kandydat identyfikuje się jako stymulator ekspresji mRNA lub białka BAFF-R. Alternatywnie, kiedy ekspresja mRNA BAFF-R lub białka jest mniejsza (istotnie statystycznie mniejsza) w obecności związkukandydata niż w przypadku jego braku, związek-kandydat identyfikuje się jako inhibitor ekspresji mRNA lub białka BAFF-R. Poziom ekspresji mRNA lub białka BAFF-R w komórkach można określić metodami opisanymi tu dla wykrywania mRNA lub białka BAFF-R.
W jeszcze innym wykonaniu wynalazku białek BAFF-R można użyć jako „białek-przynęt” w teście dwuhybrydowym lub teście trójhybrydowym (patrz np. patent USA nr 5283317; Zervos i wsp. (1993) Cell 72: 223-232; Madura i wsp. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel i wsp. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi i wsp. (1993) Oncogene 8: 1693-1696 oraz Brent W094/10300) w celu zidentyfikowania innych biał ek, które wiążą się lub oddział ują ze BAFF-R („biał ka wiążące BAFF-R” lub „BAFF-R-bp”) i modulują aktywność BAFF-R. Takie białka wiążące BAFF-R prawdopodobnie są również zaangażowane w przekazywanie sygnału przez białka BAFF-R jako, na przykład, elementy znajdujące się powyżej lub poniżej w szlaku BAFF-R.
System dwuhybrydowy opiera się na modułowej naturze większości czynników transkrypcyjnych, które składają się z oddzielnych domen wiążących DNA i aktywujących. W skrócie, test wykorzystuje dwa różne konstrukty DNA. W jednym gen kodujący białko BAFF-R łączy się z genem kodującym domenę wiążącą DNA znanego czynnika transkrypcyjnego (np. GAL-4). W drugim konstrukcie sekwencję DNA pochodzącą z biblioteki sekwencji DNA, kodującą nieznane białko („zdobycz” lub „próbka”) łączy się z genem kodującym domenę aktywującą znanego czynnika transkrypcyjnego. Jeśli białka „przynęty” i „zdobyczy” reagują in vivo, tworząc kompleks zależny od BAFF-R, domeny wiążąca i aktywująca DNA czynnika transkrypcyjnego znajdą się w bliskim sąsiedztwie. Umoż liwia to transkrypcję genu reporterowego (np. LacZ), funkcjonalnie połączonego z obszarem regulatorowym transkrypcji wrażliwym na czynnik transkrypcyjny. Ekspresję genu reporterowego można wykryć, a kolonie komórek zawierające działający czynnik transkrypcyjny można wyizolować i użyć to otrzymania sklonowanego genu kodującego białko, które oddziałuje z białkiem BAFF-R.
Wynalazek dotyczy ponadto nowych czynników zidentyfikowanych przy wykorzystaniu opisanych powyżej testów i ich zastosowania do leczenia jak tu opisano.
Testy wykrywania
Określone tu części lub fragmenty sekwencji cDNA (oraz odpowiadające im kompletne sekwencje genowe) można wykorzystać na wiele sposobów jako odczynniki polinukleotydowe. Na przykład, sekwencji tych można użyć do: (i) mapowania odpowiadających im genów na chromosomie, a tym samym lokalizacji obszarów genu związanych z chorobą genetyczną; (ii) identyfikacji osobnika na podstawie niewielkiej próbki tkanki (typowanie tkanek); oraz (iii) jako pomoc w sądowej identyfikacji próbki biologicznej. Zastosowania te opisano niżej.
Mapowanie na chromosomach
Po wyizolowaniu sekwencji (lub części sekwencji) genu, sekwencji tej można użyć do mapowania położenia genu na chromosomie. Proces ten nazywa się mapowaniem na chromosomach. A zatem, opisane tutaj części lub fragmenty sekwencji nukleotydowych BAFF-R można zastosować do mapowania położenia genów BAFF-R na chromosomie. Mapowanie sekwencji BAFF-R na chromosomach jest ważnym pierwszym krokiem w korelowaniu tych sekwencji z genami związanymi z chorobą.
W skrócie, geny BAFF-R mo ż na zmapować na chromosomie przygotowują c startery PCR (korzystnie długości 15-25 bp) na podstawie sekwencji nukleotydowej BAFF-R. Analizę komputerową sekwencji BAFF-R można wykorzystać do zaprojektowania starterów obejmujących nie więcej niż jeden ekson w genomowym DNA, aby nie komplikować procesu amplifikacji. Te startery można wykorzystać do przeszukiwania poprzez PCR somatycznych komórek hybrydowych zawierających pojedyncze ludzkie chromosomy. Powielony fragment powstanie tylko dla tych hybryd, które zawierają ludzki gen odpowiadający sekwencji BAFF-R.
Mapowanie poprzez PCR somatycznych komórek hybrydowych to szybka procedura służąca przypisaniu konkretnej sekwencji do konkretnego chromosomu. Przy użyciu jednego termocyklera
PL 207 267 B1 można przypisać do chromosomu trzy lub więcej sekwencji dziennie. Wykorzystując sekwencje nukleotydowe BAFF-R do zaprojektowania starterów oligonukleotydowych, można przeprowadzić sublokalizację z zestawami fragmentów pochodzących z poszczególnych chromosomów.
Można ponadto wykorzystać fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) sekwencji DNA do płytki metafazowej chromosomów do precyzyjnego ustalenia położenia na chromosomie w jednym kroku. Płytkę metafazową chromosomów można wytworzyć w komórkach, których podziały chemicznie zablokowano w metafazie przy użyciu kolcemidu niszczącego wrzeciono podziałowe. Na chromosomy można krótko podziałać trypsyną, a następnie wyznakować metodą Giemzy. Wzór ciemnych i jasnych prążków pojawiający się na każdym chromosomie umożliwia jego precyzyjną identyfikację. Technikę FISH można stosować do sekwencji DNA tak krótkich, jak 500 czy 600 zasad. Jednakże klony większe niż 1000 zasad z większym prawdopodobieństwem wiążą się z pojedynczym obszarem chromosomu z intensywnością sygnału wystarczającą do łatwego wykrycia. Korzystnie 1000 zasad, a korzystniej 2000 zasad wystarczy do otrzymania dobrych wyników w rozsądnym czasie. Dla omówienia tej techniki, patrz Verma i wsp., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, N.Y., 1988.
Odczynniki do mapowania chromosomu można zastosować indywidualnie w celu oznaczenia pojedynczego chromosomu lub pojedynczego miejsca na tym chromosomie, a grupy odczynników można wykorzystać do oznaczenia wielu miejsc i/lub wielu chromosomów. Odczynniki odpowiadające niekodującym obszarom genów są w rzeczywistości preferowane do celów mapowania. Sekwencje kodujące mają większą szansę być konserwatywne w obrębie rodzin genów, tym samym zwiększając szansę krzyżowej hybrydyzacji w czasie mapowania do chromosomu.
Po precyzyjnym zmapowaniu sekwencji na chromosomie, fizyczne położenie sekwencji na chromosomie można skorelować z danymi z map genetycznych. Takie dane znajdują się na przykład, w V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, dostępne on-line przez Johns Hopkins University Welch Medical Library. Następnie można określić związek między genem a chorobą, zmapowanymi w tym samym obszarze chromosomu, przez analizę sprzężeń (współdziedziczenie fizycznie blisko położonych genów) opisaną, na przykład, w Egeland i wsp. (1987) Nature, 325: 783-787.
Ponadto, można również określić różnice w sekwencjach DNA między osobnikami dotkniętymi i niedotkniętymi chorobą związaną z genem BAFF-R. Jeśli wykryje się mutację u niektórych, bądź u wszystkich chorych osobników, ale u żadnego ze zdrowych, wtedy mutacja jest prawdopodobnie czynnikiem sprawczym tej choroby. Porównanie zdrowych i chorych osobników zwykle obejmuje najpierw poszukiwanie zmian strukturalnych w chromosomach, takich jak delecje lub translokacje, które są widoczne w rozdzielonych chromosomach bądź są wykrywalne metodą PCR na tej sekwencji DNA. Ostatecznie, można przeprowadzić pełne sekwencjonowanie genów od kilku osobników w celu potwierdzenia obecności mutacji i odróżnienia mutacji od polimorfizmów.
Typowanie tkanek
Sekwencje BAFF-R według niniejszego wynalazku można również wykorzystać do identyfikowania osobników na podstawie niewielkich próbek tkanek. W tej technice genomowy DNA osobnika trawi się jednym lub więcej enzymami restrykcyjnymi i następnie bada metodą Southern w celu otrzymania unikalnego wzoru prążków do identyfikacji. Sekwencje według niniejszego wynalazku są przydatne jako dodatkowe markery DNA do RFLP („polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych” opisany w patencie USA 5272057).
Ponadto, sekwencje według niniejszego wynalazku można wykorzystać w alternatywnej technice, określającej rzeczywistą, zasada po zasadzie, sekwencję wybranej części genomu osobnika. Opisane tutaj sekwencje nukleotydowe BAFF-R można wykorzystać do przygotowania dwóch starterów PCR z końców 5' i 3' sekwencji. Te startery można użyć to powielenia DNA danej osoby i następnie do sekwencjonowania.
Przygotowane w ten sposób zestawy odpowiednich fragmentów sekwencji DNA pochodzących od osób zapewniają jednoznaczną identyfikację osób, jako że z powodu różnic w allelach, każdy osobnik posiada unikalny zestaw takich sekwencji DNA. Sekwencje według niniejszego wynalazku można wykorzystać do otrzymania takich sekwencji identyfikacyjnych pochodzących od osób i tkanek. Sekwencje nukleotydowe BAFF-R według wynalazku w sposób unikalny reprezentują fragmenty ludzkiego genomu. Różnice alleliczne występują w pewnym stopniu w obszarach kodujących tych sekwencji i w większym stopniu w obszarach niekodujących. Szacuje się, że różnice alleliczne między ludźmi występują z częstością około jednej na każde 500 zasad. Większość wariantów allelicznych ma
PL 207 267 B1 miejsce na skutek polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), co obejmuje polimorfizmy długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).
Każdą z sekwencji opisanych tutaj można w pewnym stopniu wykorzystać jako standard, z którym DNA pochodzące od osobnika może być porównane dla celów identyfikacyjnych. Ponieważ obszary niekodujące zawierają większą liczbę polimorfizmów, potrzeba mniej sekwencji do rozróżnienia osobników. Sekwencje niekodujące z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2) Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2B (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6) wraz ze zbiorem około 10 do 1000 starterów, z których każdy daje namnożoną niekodującą sekwencję długości 100 zasad, mogą zapewnić wygodną pozytywną identyfikację osobników. Jeśli wykorzystywane są przewidywane sekwencje kodujące, jak te na Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2B (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6), odpowiednia liczba starterów do pozytywnej identyfikacji osobników to 500-2000.
Prognostyka medyczna
Niniejszy wynalazek dotyczy również dziedziny prognostyki medycyny, w której wykorzystuje się testy diagnostyczne, prognostyczne oraz monitorowanie prób klinicznych w celach prognostycznych (predykcyjnych) do profilaktycznego leczenia osobnika. A zatem, jeden z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy testu diagnostycznego do określania ekspresji białka i/lub kwasu nukleinowego BAFF-R, jak również aktywności BAFF-R w kontekście próbki biologicznej (np. krwi, osocza, komórek, tkanki) w celu ustalenia, czy dany osobnik jest dotknięty chorobą czy schorzeniem lub czy istnieje dla niego ryzyko rozwoju schorzenia związanego z nieprawidłową lub niepożądaną ekspresją lub aktywnością BAFF-R. Niniejszy wynalazek dostarcza również testów prognostycznych (lub predykcyjnych) do określania, czy istnieje ryzyko rozwoju choroby albo schorzenia związanego z białkiem, ekspresją kwasu nukleinowego lub aktywnością BAFF-R. Na przykład, mutacje w genie BAFF-R można oznaczyć w próbce biologicznej. Takie testy można wykorzystać w celach prognostycznych lub predykcyjnych w profilaktycznym leczeniu osobnika przed pojawieniem się choroby charakteryzowanej poprzez lub związanej z białkiem, ekspresją kwasu nukleinowego lub aktywnością BAFF-R.
Inny aspekt niniejszego wynalazku dostarcza sposobów określania białka BAFF-R, ekspresji kwasu nukleinowego albo aktywności BAFF-R u danego osobnika w aby w ten sposób wybrać odpowiednie czynniki lecznicze albo profilaktyczne dla tego osobnika (co określa się tu jako „farmakogenomika”). Farmakogenomika umożliwia wybór czynnika (np. leków) do traktowania leczniczego albo profilaktycznego danego osobnika w oparciu o genotyp tego osobnika (np. genotyp osobnika zbadany w celu ustalenia zdolności osobnika do odpowiadania na konkretny czynnik).
Jeszcze inny aspekt wynalazku dotyczy śledzenia wpływu czynników (np. leków, związków) na ekspresję albo aktywność BAFF-R w próbach klinicznych.
Te i inne czynniki opisane są dokładniej w następnych częściach.
Testy diagnostyczne
Przykładowym sposobem wykrywania obecności lub braku białka lub kwasu nukleinowego BAFF-R w próbce biologicznej jest otrzymanie próbki biologicznej od badanego osobnika i doprowadzenie do kontaktu próbki biologicznej ze związkiem lub czynnikiem zdolnym do wykrycia białka BAFF-R lub kwasu nukleinowego (np. mRNA lub DNA genomowego), kodującego białko BAFF-R, tak że obecność białka BAFF-R lub kwasu nukleinowego w próbce biologicznej jest wykrywana. Korzystnym czynnikiem do wykrywania mRNA lub genomowego DNA BAFF-R jest wyznakowany kwas nukleinowy-sonda zdolna do hybrydyzacji z mRNA lub genomowym DNA BAFF-R. Kwasem nukleinowymsondą może być na przykład kwas nukleinowy BAFF-R pełnej długości, taki jak kwasy nukleinowe z dowolnej z Fig. 1A (SEK NR ID: 1), Fig. 1B (SEK NR ID: 2), Fig. 2A (SEK NR ID: 3), Fig. 2B (SEK NR ID: 4), Fig. 3 (SEK NR ID: 6) albo ich część, taka jak oligonukleotyd o długości co najmniej 15, 30, 50, 100, 250 lub 500 nukleotydów i wystarczający do specyficznej hybrydyzacji w ostrych warunkach do mRNA lub genomowego DNA BAFF-R. Inne odpowiednie sondy do wykorzystania w testach diagnostycznych opisano w niniejszym ujawnieniu.
Czynnikiem do wykrywania białka BAFF-R jest przeciwciało zdolne do wiązania się z białkiem BAFF-R, korzystnie przeciwciało z wykrywalnym znacznikiem. Przeciwciała mogą być poliklonalne lub, korzystniej, monoklonalne. Można zastosować całe przeciwciało lub jego fragment (np. Fab lub F(ab')2). Termin „wyznakowane”, w odniesieniu do sondy lub przeciwciała ma obejmować bezpośrednie znakowanie sondy lub przeciwciała przez połączenie (tj. fizyczne związanie) wykrywalnej substancji z sondą lub przeciwciałem, jak również znakowanie pośrednie sondy lub przeciwciała, dzięki reagowaniu z innym odczynnikiem wyznakowanym bezpośrednio. Przykłady znakowania pośredniego
PL 207 267 B1 obejmują wykrywanie pierwszorzędowego przeciwciała przy użyciu fluorescencyjnie wyznakowanego przeciwciała drugorzędowego oraz znakowanie końca sondy DNA biotyną tak, by można ją wykryć wyznakowaną fluorescencyjnie streptawidyną. Termin „próbka biologiczna” ma obejmować tkanki, komórki i płyny ciała izolowane od badanego osobnika, jak również tkanki, komórki i płyny obecne w organizmie osobnika. To znaczy, metod ę wykrywania wedł ug niniejszego wynalazku moż na zastosować do wykrywania mRNA, białka lub genomowego DNA BAFF-R w próbce biologicznej in vitro, jak również in vivo. Na przykład, techniki wykrywania mRNA BAFF-R in vitro obejmują hybrydyzacje Northern oraz hybrydyzacje in situ. Techniki wykrywania białka BAFF-R in vitro obejmują immunosorpcyjne testy enzymatyczne (ELISA), technikę Western, immunoprecypitację i immunofluorescencję. Techniki wykrywania genomowego DNA BAFF-R in vitro obejmują hybrydyzacje Southern. Ponadto, techniki wykrywania białka BAFF-R in vivo obejmują podanie badanemu osobnikowi wyznakowanego przeciwciała anty-BAFF-R. Na przykład, przeciwciało można wyznakować radioaktywnym znacznikiem, którego obecność i położenie w organizmie osobnika można wykryć standardowymi technikami obrazowania.
W jednym z wykonań próbka biologiczna zawiera cz ąsteczki biał ek pochodzą cych od badanego osobnika. Alternatywnie, próbka biologiczna może zawierać cząsteczki mRNA badanego osobnika lub cząsteczki genomowego DNA badanego osobnika. Korzystną próbką biologiczną jest próbka surowicy wyizolowana z badanego osobnika standardowymi technikami.
W innym wykonaniu sposoby obejmują ponadto otrzymanie kontrolnej próbki biologicznej od osobnika kontrolnego, doprowadzenie do kontaktu próbki kontrolnej ze związkiem lub czynnikiem zdolnym do wykrycia białka, mRNA lub genomowego DNA BAFF-R, tak, by w próbce biologicznej wykryć obecność białka, mRNA lub genomowego DNA BAFF-R i porównanie obecności białka, mRNA lub genomowego DNA BAFF-R w próbce kontrolnej z obecnością białka, mRNA lub genomowego DNA BAFF-R w próbce badanej.
Wynalazek obejmuje również zestawy do wykrywania obecności BAFF-R w próbce biologicznej. Zestaw obejmuje na przykład: wyznakowany związek lub czynnik zdolny do wykrycia białka lub mRNA w próbce BAFF-R biologicznej; środki służące do okreś lenia ilości BAFF-R w próbce oraz środki do porównania ilości BAFF-R w próbce ze standardem. Związek lub czynnik może być opakowany w odpowiedni pojemnik. Dalej, zestaw moż e obejmować instrukcje jego u ż ycia w celu wykrycia biał ka lub kwasu nukleinowego BAFF-R.
Testy prognostyczne
Opisane tu metody diagnostyczne mogą być ponadto wykorzystane do identyfikacji osób zagrożonych rozwojem choroby lub schorzenia związanego z nieprawidłową lub niepożądaną ekspresją lub aktywnością BAFF-R. Przykładowo, opisane tu testy, takie jak opisane uprzednio metody diagnostyczne albo testy, które następują dalej można zastosować do identyfikacji osób zagrożonych rozwojem schorzenia związanego z białkiem, ekspresją kwasu nukleinowego albo aktywnością BAFF-R, np. chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak autoimmunologiczna anemia hemolityczna i ogólnoustrojowy toczeń rumieniowaty. Alternatywnie, testy prognostyczne można zastosować do identyfikacji osób zagrożonych rozwojem choroby lub schorzenia. A zatem niniejszy wynalazek dostarcza sposobów identyfikowania choroby lub schorzenia związanego z nieprawidłową ekspresją lub aktywnością BAFF-R, w których od osobnika pobiera się próbkę testową i wykrywa się białko lub kwas nukleinowy BAFF-R (np. mRNA lub DNA genomowy), gdzie obecność białka lub kwasu nukleinowego BAFF-R jest podstawą diagnozy, że osobnik ma albo jest zagrożony rozwojem choroby lub schorzenia związanego z nieprawidłową lub niepożądaną ekspresją lub aktywnością BAFF-R. Stosowany tu termin „próbka testowa” dotyczy próbki biologicznej otrzymanej od osobnika będącego przedmiotem zainteresowania. Przykładowo, próbką testową może być płyn biologiczny (np. surowica), próbka komórek lub tkanka.
Ponadto, opisane tu testy prognostyczne można zastosować do ustalenia, czy osobnikowi można podawać czynnik (np. agonistę, antagonistę, peptydomimetyk, białko, peptyd, kwas nukleinowy, małą cząsteczką lub inny lek-kandydata) do leczenia choroby lub schorzenia związanego z nieprawidłową ekspresją lub aktywnością BAFF-R. Przykładowo, takie sposoby można zastosować do ustalenia, czy osobnik może być skutecznie leczony czynnikiem dla choroby. A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów ustalenia, czy osobnik można być skutecznie leczony czynnikiem dla schorzenia związanego z nieprawidłową ekspresją lub aktywnością BAFF-R, w których pobiera się próbkę testową i wykrywa się ekspresję białka lub kwasu nukleinowego albo aktywność BAFF-R (np. gdzie
PL 207 267 B1 obecność białka lub kwasu nukleinowego jest podstawą diagnozy, że osobnikowi można podawać czynnik do leczenia schorzenia związanego z nieprawidłową ekspresją lub aktywnością BAFF-R).
Sposoby według wynalazku można również zastosować do wykrywania zmian genetycznych w genie BAFF-R, ustalając w ten czy osobnik ze zmienionym genem jest zagroż ony rozwojem albo cierpi na chorobę nowotworową albo autoimmunologiczną. W różnych wykonaniach sposoby obejmują wykrywanie w próbce komórek pochodzących od badanego osobnika obecności lub braku zmiany genetycznej cechującej się przynajmniej jedną zmianą wpływającą na integralność genu kodującego białko BAFF-R lub niewłaściwą ekspresję genu BAFF-R. Takie zmiany genetyczne można wykryć na przykład przez stwierdzenie obecności przynajmniej jednego spośród: 1) delecji jednego lub więcej nukleotydów genu BAFF-R; 2) dodania jednego lub więcej nukleotydów do genu BAFF-R; 3) substytucji jednego lub więcej nukleotydów genu BAFF-R, 4) rearanżacji chromosomalnej genu BAFF-R; 5) zmiany w poziomie transkryptu RNA informacyjnego genu BAFF-R, 6) nieprawidłowej modyfikacji genu BAFF-R, takiej jak wzór metylacji genomowego DNA, 7) obecności wzoru składania transkryptu informacyjnego RNA genu BAFF-R innego niż w formie dzikiej, 8) poziomu białka BAFF-R odmiennego od formy dzikiej, 9) utraty allelu genu BAFF-R oraz 10) nieodpowiedniej modyfikacji potranslacyjnej białka BAFF-R. Jak tu opisano, znanych jest w tej dziedzinie wiele testów, które można zastosować do wykrycia zmian w genie BAFF-R. Korzystną próbką biologiczną jest próbka leukocytów krwi obwodowej wyizolowana przy użyciu standardowych sposobów z danego osobnika. Jednakże, można użyć dowolną próbkę biologiczną zawierającą komórki z jądrami, włączając w to na przykład komórki śluzówki policzka.
W pewnych wykonaniach wykrycie zmiany obejmuje użycie sondy/startera w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) (patrz np. patenty USA nr 4683195 i 4683202), takiej jak zakotwiczony PCR lub RACE PCR, bądź też w łańcuchowej reakcji ligacji (LCR) (patrz np. Landegran i wsp. (1988) Science 241: 1077-1080 i Nakazawa i wsp. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364), z których ten drugi może być szczególnie użyteczny do wykrywania mutacji punktowych w genie BAFF-R (patrz Abravaya i wsp. (1995) Nucl. Acids Res. 23: 675-682). Ta metoda obejmuje etapy: pobrania próbki komórek od badanego, izolacji kwasu nukleinowego (np. genomowego, mRNA lub obu) z komórek próbki, doprowadzenia do kontaktu próbki kwasu nukleinowego ze starterami specyficznie hybrydyzującymi do genu BAFF-R w warunkach, w których zachodzi hybrydyzacja i powielenie genu BAFF-R (jeśli jest obecny) oraz wykrycia obecności lub braku produktu amplifikacji lub wykrycia rozmiaru produktu amplifikacji i porównanie jego długości z próbką kontrolną. Przewiduje się, że PCR i/lub LCR można wykorzystać jako wstępny etap powielania w połączeniu z dowolną spośród opisanych tutaj technik wykrywania mutacji.
Alternatywne metody amplifikacji obejmują: samopodtrzymującą się replikację sekwencji (Guatelli i wsp., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), system amplifikacji transkrypcyjnej (Kwoh i wsp., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), replikazę Q-Beta (Lizardi i wsp. (1988) Bio-Technology 6: 1197) lub dowolną inną metodę amplifikacji kwasów nukleinowych oraz wykrywania powielonych cząsteczek przy użyciu technik dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Te schematy wykrywania są przydatne zwłaszcza do wykrywania cząsteczek kwasów nukleinowych, jeśli takich cząsteczek jest bardzo niewiele.
W alternatywnym wykonaniu, mutacje w genie BAFF-R z próbki komórek moż na zidentyfikowa ć poprzez zmiany we wzorze trawienia enzymami restrykcyjnymi. Na przykład izoluje się DNA z próbki i kontrolny, powiela (opcjonalnie), trawi jedną lub większą liczbą endonukleaz restrykcyjnych, a długości fragmentów określa się i porównuje przez elektroforezę w żelu. Różnice w długości fragmentów między próbką i kontrolnym DNA oznaczają mutacje w próbce DNA. Co więcej, można wykorzystać specyficzne wobec sekwencji rybozymy (patrz na przykład patent USA nr 5498531) do sprawdzenia obecności specyficznej mutacji dzięki pojawianiu się lub utracie miejsca trawienia dla rybozymu.
W innych wykonaniach, mutacje genetyczne w BAFF-R moż na zidentyfikować przez hybrydyzację próbki i kontrolnych kwasów nukleinowych, np. DNA lub RNA do macierzy o wysokiej gęstości zawierających gęsto upakowane setki lub tysiące sond oligonukleotydowych (Cronin i wsp. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal i wsp. (1996) Nature Medicine 2: 753759). Na przykład, mutacje genetyczne w BAFF-R można zidentyfikować na dwuwymiarowych macierzach zawierających wytwarzane z użyciem światła sondy DNA, jak opisano w Cronin i wsp. (1996) Human Mutation 7: 244-255. Pokrótce, pierwszą macierz sond do hybrydyzacji można zastosować do przeszukiwania długich odcinków w DNA próbki i kontroli, aby znaleźć różnice zasad między sekwencjami poprzez utworzenie liniowych macierzy kolejnych zachodzących na siebie sond. Ten krok umożliwia identyfikację mutacji
PL 207 267 B1 punktowych. Następnie przeprowadza się hybrydyzację z drugą macierzą, co umożliwia charakteryzację specyficznych mutacji przy wykorzystaniu mniejszych specyficznych zestawów sond komplementarnych do wszystkich wykrytych wariantów lub mutacji. Każda macierz dla mutacji składa się z równoległych zestawów sond, jednego komplementarnego do genu typu dzikiego, a drugiego komplementarnego do genu zmutowanego.
W jeszcze innym wykonaniu można zastosować dowolną z wielu różnych reakcji sekwencjonowania znanych w tej dziedzinie do bezpośredniego sekwencjonowania genu BAFF-R i wykrycia mutacji przez porównanie sekwencji próbki BAFF-R z odpowiadającą jej sekwencją dzikiego typu (kontrolną). Przykłady reakcji sekwencjonowania obejmują te oparte na technikach opracowanych przez Maxama i Gilberta (1977) Proc. Natl. Scad. Sci. USA 74: 560 lub Sangera (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463. Bierze się również pod uwagę, że przy przeprowadzaniu testów diagnostycznych (Naeve i wsp. (1995) Biotechniques 19: 448) można zastosować dowolną z wielu różnych procedur automatycznego sekwencjonowania, w tym sekwencjonowanie przy użyciu spektrometrii mas (patrz np. międzynarodowa publikacja PCT nr WO 94/16101; Cohen i wsp. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-162 oraz Griffin i wsp. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159).
Inne sposoby wykrywania mutacji w genie BAFF-R obejmują metody, w których do wykrycia źle dopasowanych zasad w RNA/RNA lub heterodupleksach RNA/DNA wykorzystuje się ochronę przed czynnikiem tnącym (Myers i wsp. (1985) Science 230: 1242). Ogólnie, technika „cięcia źle dopasowanych zasad” polega na otrzymaniu heterodupleksów utworzonych przez hybrydyzację (wyznakowanych) RNA lub DNA zawierających sekwencję BAFF-R dzikiego typu z potencjalnie zmutowanym RNA lub DNA otrzymanym z próbki tkanki. Dwuniciowe dupleksy poddaje się działaniu czynnika, który tnie jednoniciowe obszary dupleksu, takie jak te, które pojawią się na skutek nieprawidłowego dopasowania między nićmi pochodzącymi z kontroli i próbki badanej. Na przykład, dupleksy RNA/DNA można poddać działaniu RNazy, a hybrydy DNA/DNA nukleazy S1 w celu enzymatycznego trawienia źle dopasowanych regionów. W innych wykonaniach dupleksy DNA/DNA, jak i RNA/DNA, można poddać działaniu hydroksylaminy lub tetratlenku osmu i piperydyny w celu strawienia źle dopasowanych obszarów. Po trawieniu źle dopasowanych obszarów otrzymany materiał rozdziela się ze względu na wielkość na denaturującym żelu poliakryloamidowym w celu określenia miejsca mutacji. Patrz na przykład Cotton i wsp. (1988) Proc. Natl Acad Sci USS 85: 4397; Saleeba i wsp. (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295. W jednym z wykonań, kontrolne DNA lub RNA można wyznakować dla wykrywania.
W jeszcze innym wykonaniu wynalazku reakcja cięcia źle dopasowanych zasad wykorzystuje jedno lub więcej białek rozpoznających źle dopasowane pary zasad w dwuniciowym DNA (tak zwane enzymy „naprawy źle sparowanego DNA”) w określonych systemach wykrywania i mapowania mutacji punktowych w cDNA BAFF-R otrzymanych z próbek komórek. Na przykład, enzym mutY E. coli tnie A w źle dopasowanej parze G/A, a glikozylaza tymidynowa DNA z komórek HeLa tnie T w źle dopasowanej parze G/T (Hsu i wsp. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662). Według przykładowego wykonania, sonda oparta na sekwencji BAFF-R, np. sekwencji dzikiego typu, hybrydyzuje do cDNA lub innego produktu DNA z komórki(ek) testowej(ych). Dupleks poddaje się działaniu enzymu naprawiającego źle dopasowane DNA i ewentualne produkty cięcia można wykrywać elektroforetycznie lub podobnie. Patrz na przykład, patent USA nr 5459039.
W innych wykonaniach do identyfikacji mutacji w genach BAFF-R można wykorzystać zmiany ruchliwości elektroforetycznej. Na przykład do wykrycia różnic w ruchliwości elektroforetycznej pomiędzy kwasami nukleinowymi zmutowanymi i typu dzikiego można wykorzystać polimorfizm konformacji jednoniciowych łańcuchów DNA (SSCP) (Orita i wsp. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86: 2766, patrz także Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144 oraz Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79). Jednoniciowe fragmenty DNA próbki i kontroli BAFF-R denaturuje się i pozwala na renaturację. Drugorzędowa struktura jednoniciowych kwasów nukleinowych różni się w zależności od sekwencji, a powstała w ten sposób różnica w ruchliwości elektroforetycznej umożliwia wykrycie nawet pojedynczej zmiany zasady. Fragmenty DNA można wyznakować lub wykryć znakowanymi sondami. Czułość testu można zwiększyć używając RNA (zamiast DNA), w którym struktura drugorzędowa jest bardziej wrażliwa na zmiany sekwencji. W korzystnym wykonaniu sposób ten wykorzystuje analizę heterodupleksów w celu rozdzielenia dwuniciowych cząsteczek heterodupleksów na podstawie zmian w ruchliwości elektroforetycznej (Keen i wsp. (1991) Trends Genet 7: 5).
W jeszcze innym wykonaniu przesuwanie się zmutowanych lub dzikich fragmentów w żelu poliakryloamidowym z gradientem denaturującym oznacza się przy użyciu denaturującej gradientowej
PL 207 267 B1 elektroforezy w żelu (DGGE) (Myers i wsp. (1985) Nature 313: 495). Kiedy jako metodę analizy stosuje się DGGE, DNA musi być zmodyfikowany aby zapobiec całkowitej denaturacji, na przykład przez dodanie poprzez reakcję PCR klamry GC o długości około 40 bp składającej się z DNA bogatego w pary GC o wyższej temperaturze topnienia. W kolejnym wykonaniu do zidentyfikowania różnic w ruchliwości DNA kontrolnego i próbki zamiast gradientu denaturującego wykorzystuje się gradient temperatury (Rosenbaum i Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753).
Przykłady innych technik wykrywania mutacji punktowych obejmują między innymi selektywną hybrydyzację oligonukleotydów, selektywną amplifikację lub selektywne wydłużanie startera. Na przykład, można przygotować startery oligonukleotydowe w taki sposób, aby znana mutacja znajdowała się centralnie, a następnie hybrydyzować z docelowym DNA w warunkach dopuszczających hybrydyzację tylko w przypadku całkowitej zgodności sekwencji (Saiki i wsp. (1986) Nature 324: 163); Saiki i wsp. (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86: 6230). Takie specyficzne dla allelu oligonukleotydy hybrydyzuje się z powielonym w reakcji PCR docelowym DNA lub kilkoma różnymi mutacjami, gdy oligonukleotydy są przytwierdzone do błony hybrydyzacyjnej i hybrydyzowane z wyznakowanym docelowym DNA.
Alternatywnie, w związku z niniejszym wynalazkiem można wykorzystać technikę amplifikacji specyficznej dla allelu, która zależy od selektywnego powielania w reakcji PCR. Oligonukleotydy użyte jako startery do specyficznej amplifikacji mogą zawierać badaną mutację pośrodku cząsteczki (tak, że namnożenie zależy od różnicującej hybrydyzacji) (Gibbs i wsp. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 24372448) lub na końcu 3' startera, gdzie w odpowiednich warunkach złe dopasowanie zasad może uniemożliwić lub zahamować reakcję wydłużania (Prossner (1993) Tibtech 11: 238). Dodatkowo, może być pożądane wprowadzenie nowego miejsca restrykcyjnego w regionie mutacji w celu umożliwienia wykrycia opartego na reakcji cięcia (Gasparini i wsp. (1992) Mol. Cell Probes 6: 1). Przewiduje się, że w pewnych wykonaniach amplifikację moż na przeprowadzać takż e przy uż yciu do powielania ligazy Taq (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189). W takich przypadkach, ligacja następuje tylko w przypadku całkowitej zgodności końca 3' sekwencji 5', umożliwiając wykrycie obecności znanej mutacji w konkretnym miejscu poprzez obserwowanie obecności bądź braku amplifikacji.
Opisane tu sposoby można stosować wykorzystując na przykład gotowe zestawy diagnostyczne, złożone z co najmniej jednego opisanego tu kwasu nukleinowego-sondy lub odczynnika-przeciwciała, które wygodnie jest stosować, np. w warunkach klinicznych, do diagnozowania pacjentów wykazujących objawy lub posiadających rodzinną historię choroby lub schorzenia z udziałem genu BAFF-R.
Ponadto, do opisanych tutaj testów prognostycznych można wykorzystać każdy typ komórki lub tkanki, w którym BAFF-R ulega ekspresji. Jednakże, można użyć dowolną próbkę biologiczną zawierającą komórki z jądrami, włączając w to na przykład komórki śluzówki policzka.
Farmakogenomika
Czynniki albo modulatory wywierające efekt stymulujący lub hamujący na aktywność BAFF-R (np. na ekspresję genu BAFF-R), zidentyfikowane w opisanym tutaj teście przesiewowym, można podawać pacjentom w celu leczenia (profilaktycznego lub terapeutycznego) chorób (np. chorób związanych z nowotworem lub autoimmunologicznych). W powiązaniu z takim leczeniem, można rozważać wykorzystanie farmakogenetyki (tj. badania zależności między genotypem osobnika a jego odpowiedzią na obcy związek lub lek). Różnice w metabolizmie leków mogą prowadzić do poważnej toksyczności lub niepowodzenia leczenia przez zmianę stosunku dawki do stężenia farmakologicznie aktywnego leku we krwi. Dlatego też lekarz lub klinicysta może rozważyć wykorzystanie wiedzy otrzymanej z odpowiednich badań farmakogenomicznych do podjęcia decyzji o podaniu skutecznych czynników (np. leków) do profilaktycznego lub leczniczego traktowania osobnika biorąc pod uwagę genotyp danego osobnika. Taką farmakogenomikę można dalej użyć do ustalenia odpowiednich dawek i trybów leczenia. A zatem można określić aktywność białka BAFF-R, ekspresję kwasu nukleinowego BAFF-R albo zawartość mutacji w genach BAFF-R danego osobnika aby wybrać odpowiedni czynnik(i) do leczniczego lub profilaktycznego traktowania osobnika.
Farmakogenomika zajmuje się znaczącymi klinicznie różnicami w odpowiedzi na leki, spowodowanymi zmienioną dostępnością leku i jego nieprawidłowym działaniem u chorych osób. Patrz np., Eichelbaum (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11): 983-985 oraz Linder i wsp. (1997) Clin. Chem. 43 (2): 254-266. Ogólnie, można wyróżnić dwa rodzaje uwarunkowań farmakogenetycznych: uwarunkowania genetyczne przekazywane jako pojedyncze czynniki zmieniające sposób działania leku na organizm (zmienione działanie leku) lub uwarunkowania genetyczne przekazywane jako poje42
PL 207 267 B1 dyncze czynniki zmieniające sposób oddziaływania organizmu na lek (zmieniony metabolizm leku). Te uwarunkowania farmakogenetyczne mogą występować zarówno jako rzadkie defekty genetyczne, jak i jako naturalnie wystę pują ce polimorfizmy. Na przykł ad, niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (G6PD) to częsta dziedziczna choroba metaboliczna, w której przyczyną komplikacji klinicznych jest hemoliza po przyjęciu leków utleniających (przeciwmalarycznych, sulfonamidów, leków przeciwbólowych, nitrofuranów) oraz spożyciu ziaren bobu.
Jako ilustrujące wykonanie, aktywność enzymów metabolizmu leku jest głównym czynnikiem decydującym zarówno o intensywności, jak i czasie trwania działania leku. Odkrycie genetycznych polimorfizmów enzymów metabolizujących lek (np. N-acetylotransferazy 2 (NAT2) i enzymów CYP2D6 oraz CYP2C19 cytochromu P450) wyjaśniło dlaczego niektórzy pacjenci nie wykazują oczekiwanych efektów leku lub wykazują nadmierną odpowiedź na lek i poważne działanie toksyczne po przyjęciu standardowej i bezpiecznej dawki leku. Te polimorfizmy wyrażane są w populacji jako dwa fenotypy, intensywnie metabolizujący (EM) i słabo metabolizujący (PM). Występowanie PM jest różne w różnych populacjach. Na przykład, gen kodujący CYP2D6 jest silnie polimorficzny i zidentyfikowano kilka mutacji w PM, z których wszystkie prowadzą do braku funkcjonalnego CYP2D6. Słabo metabolizujące CYP2D6 i CYP2C19 dość często wykazują nadmierną odpowiedź na lek i skutki uboczne po otrzymaniu standardowych dawek. Jeśli metabolit jest częścią aktywnie terapeutyczną, PM nie wykazuje odpowiedzi terapeutycznej, jak pokazano dla działania przeciwbólowego kodeiny, w którym pośredniczy jej metabolit tworzony przez CYP2D6 z morfiny. Drugą skrajnością są tak zwani ultraszybcy „metabolizerzy”, którzy nie reagują na standardowe dawki. Ostatnio zidentyfikowano molekularne podłoże ultraszybkiego metabolizmu jako amplifikację genu CYP2D6.
A zatem można okreś lić aktywność białka BAFF-R, ekspresję kwasu nukleinowego BAFF-R albo zawartość mutacji w genach BAFF-R danego osobnika aby wybrać odpowiedni czynnik(i) do leczniczego lub profilaktycznego traktowania osobnika. Dodatkowo, badania farmakogenetyczne można wykorzystać do zastosowania genotypowania alleli polimorficznych kodujących enzymy metabolizujące leki do identyfikacji fenotypu odpowiedzi na lek danego osobnika. Wiedza ta, stosowana przy wyborze dawkowania albo leku, może pozwolić uniknąć niekorzystnych reakcji albo niepowodzenia leczenia, a zatem zwiększa skuteczność terapeutyczną lub profilaktyczną przy leczeniu osobnika modulatorem BAFF-R, takim jak modulator zidentyfikowany w jednym z przykładowych opisanych tu testów przesiewowych.
Monitorowanie skuteczności klinicznej
Śledzenie wpływu czynników (np. leków, związków) na ekspresję lub aktywność białka BAFF-R (np. zdolność do modulowania nieprawidłowej proliferacji i/lub różnicowania) można zastosować nie tylko przy podstawowym badaniu leku, ale także w próbach klinicznych. Na przykład, ustaloną poprzez opisany tutaj test przesiewowy skuteczność czynnika w zwiększaniu ekspresji genu BAFF-R, poziomu białka lub zwiększaniu aktywności BAFF-R, można monitorować w próbach klinicznych u osobników wykazujących obniżoną ekspresję genu BAFF-R, poziom białka lub zmniejszoną aktywność BAFF-R. Alternatywnie, ustaloną w teście przesiewowym skuteczność czynnika w obniżaniu ekspresji genu BAFF-R, poziomu białka lub zmniejszaniu aktywności BAFF-R można monitorować w próbach klinicznych u osobników wykazują cych zwię kszoną ekspresję genu BAFF-R, poziom biał ka lub zwiększoną aktywność BAFF-R. W takich próbach klinicznych ekspresję lub aktywność genu BAFF-R i, korzystnie, innych genów, dla których postuluje się udział na przykład w chorobach związanych ze BAFF-R, można wykorzystać jako „odczyt” lub znaczniki odpowiedzi immunnologicznej konkretnej komórki.
Dla przykładu, można zidentyfikować geny, w tym BAFF-R, które są modulowane w komórkach poprzez działanie czynnika (np. związku, leku lub małej cząsteczki) modulującego aktywność BAFF-R (np. zidentyfikowane w opisanym tutaj teście przesiewowym). A zatem, aby badać wpływ czynnika na choroby związane z proliferacją komórkową, na przykład w teście klinicznym, można izolować komórki, otrzymać RNA i analizować je pod względem ekspresji, odpowiednio, BAFF-R i innych genów, dla których postuluje się udział w chorobie. Poziomy ekspresji genów (tj. wzór ekspresji genu) można oznaczyć ilościowo metodą Northern lub RT-PCR, jak tu opisano, lub alternatywnie, przez pomiar ilości wytworzonego białka jednym z opisanych tu sposobów lub przez pomiar poziomu aktywności BAFF-R lub innych genów. W ten sposób wzór ekspresji genu może służyć jako znacznik fizjologicznej odpowiedzi komórki na czynnik. A zatem, stan tej odpowiedzi można określić przed i w różnych punktach w trakcie leczenia danego osobnika takim czynnikiem.
PL 207 267 B1
W jednym z wykonań wynalazek dostarcza sposobu monitorowania skuteczności leczenia pacjenta czynnikiem (np. agonistą, antagonistą peptydomimetykiem, białkiem, peptydem, kwasem nukleinowym, małą cząsteczką lub innym potencjalnym lekiem zidentyfikowanym w opisanych tutaj testach przesiewowych), obejmującego etapy: (i) pobrania próbki sprzed podawania od osobnika przed podawaniem czynnika; (ii) oznaczenia ekspresji białka, mRNA lub genomowego DNA BAFF-R w próbce sprzed podawania; (iii) pobrania od pacjenta jednej lub więcej próbek po podawaniu; (iv) wykrycia poziomu ekspresji lub aktywności białka, mRNA lub genomowego DNA BAFF-R w próbkach po podawaniu; (v) porównania poziomu ekspresji lub aktywności białka, mRNA lub genomowego DNA BAFF-R w próbkach sprzed podawania z białkiem, mRNA lub genomowym DNA BAFF-R w próbce lub próbkach po podawaniu; oraz (vi) dokonania odpowiedniej zmiany w podawaniu czynnika osobnikowi. Na przykład, zwiększenie podawania czynnika może być pożądane dla zwiększenia ekspresji lub aktywności BAFF-R do wyższych poziomów niż wykrywane, tj. dla zwiększenia skuteczności czynnika. Alternatywnie, zmniejszone podawanie czynnika może być pożądane dla obniżenia ekspresji lub aktywności BAFF-R do niższych poziomów niż wykrywane, tj. dla obniżenia skuteczności czynnika.
Sposoby leczenia
Niniejszy wynalazek dostarcza zarówno profilaktycznych, jak i terapeutycznych sposobów leczenia pacjenta obciążonego ryzykiem (lub podatnego na) chorobę lub chorego na schorzenie związane z nieprawidłową ekspresją lub aktywnością BAFF-R.
Choroby i schorzenia charakteryzują się zwiększonymi (w stosunku do osobnika niecierpiącego z powodu choroby albo schorzenia) poziomami albo aktywnością biologiczną można leczyć terapeutykami, które przeciwdziałają (tj. zmniejszają albo hamują) aktywności. Terapeutyki, które przeciwdziałają aktywności można podawać leczniczo albo profilaktycznie. Terapeutyki, które można zastosować obejmują między innymi, (i) polipeptyd BAFF-R albo jego analogi, pochodne, fragmenty lub homologi; (ii) przeciwciała wobec peptydu BAFF-R; (iii) kwasy nukleinowe kodujące peptyd BAFF-R; (iv) podawanie antysensownych kwasów nukleinowych i kwasów nukleinowych, które są „niefunkcjonalne” (tj. na skutek heterologicznej insercji w obrębie sekwencji kodujących w sekwencjach kodujących peptyd BAFF-R) stosuje się do „knock out” endogennych funkcji peptydu BAFF-R poprzez homologiczną rekombinację (patrz, np. Capecchi (1989) Science 244: 1288-1292); albo (v) modulatory (tj. inhibitory, agonisty, antagonisty, włączając w to dodatkowe mimetyki peptydowe według wynalazku i przeciwciała swoiste wobec peptydu według wynalazku), które zmieniają oddziaływanie pomiędzy peptydem BAFF-R i jego partnerem wiązania.
Choroby i schorzenia charakteryzują się zmniejszonymi (w stosunku do osobnika niecierpiącego z powodu choroby albo schorzenia) poziomami albo aktywnością biologiczną można leczyć terapeutykami, które zwiększają (tj. są agonistami) aktywności. Terapeutyki, które zwiększają poziom aktywności można podawać leczniczo albo profilaktycznie. Terapeutyki, które można zastosować obejmują między innymi polipeptyd BAFF-R albo jego analogi, pochodne, fragmenty lub homologi albo agonisty, które zwiększają biodostępność.
Zwiększone albo zmniejszone poziomy można łatwo wykryć dokonując oceny ilościowej peptydu i/lub RNA poprzez pobranie próbki tkanki od pacjenta (np. z biopsji tkanki) i testowanie jej in vitro pod kątem poziomów RNA lub peptydu, struktury i/lub aktywności wyrażanych peptydów (lub mRNA peptydu BAFF-R). Sposoby są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują między innymi testy immunologiczne (np. analiza Western, immunoprecypitacja, a następnie elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z sodowym siarczanem dodecylu (SDS), immunocytochemia, etc.) i/lub testy hybrydyzacyjne w celu wykrycia ekspresji mRNA (np. testy Northern, kroplowe, hybrydyzacja in situ, itd.).
W jednym z aspektów wynalazek dostarcza sposobu zapobiegania u osobnika chorobie lub stanowi związanemu z nieprawidłową ekspresją albo aktywnością BAFF-R poprzez podawanie osobnikowi BAFF-R lub czynnika modulującego ekspresję BAFF-R lub przynajmniej jedną z aktywności BAFF-R. Osoby obciążone ryzykiem zachorowania na chorobę spowodowaną lub, do której przyczyniła się nieprawidłowa lub niepożądana ekspresja albo aktywność BAFF-R można zidentyfikować na przykład poprzez dowolny z opisanych tu testów diagnostycznych lub prognostycznych albo ich połączenie. Czynnik profilaktyczny można podać przed wystąpieniem objawów charakterystycznych dla nieprawidłowości BAFF-R, tak aby zapobiec chorobie lub schorzeniu lub, alternatywnie, opóźnić ich postęp. Zależnie od typu nieprawidłowości BAFF-R, w leczeniu pacjenta można wykorzystać na przykład BAFF-R, agonistę BAFF-R lub antagonistę BAFF-R. Odpowiedni czynnik można określić na podstawie przedstawionych tutaj testów przesiewowych.
PL 207 267 B1
Inny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy sposobów modulowania ekspresji lub aktywności BAFF-R do celów terapeutycznych. Sposób modulowania według wynalazku obejmuje doprowadzenie do kontaktu komórki ze BAFF-R lub z czynnikiem, który moduluje jedną lub więcej aktywności białka BAFF-R związanych z komórką. Czynnik modulujący aktywność białka BAFF-R może być opisanym tu czynnikiem, takim jak kwas nukleinowy lub białko, naturalnie występującym odpowiednim ligandem białka BAFF-R, peptydomimetykiem BAFF-R albo inną małą cząsteczką. W jednym z wykonań, czynnik stymuluje jedną lub więcej aktywności BAFF-R. Przykłady takich czynników stymulujących obejmują aktywne białko BAFF-R i cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą BAFF-R, którą wprowadzono do komórki. W innym wykonaniu czynnik hamuje jedną lub więcej z aktywności BAFF-R. Przykłady takich czynników hamujących obejmują antysensowne cząsteczki kwasu nukleinowego BAFF-R i przeciwciała anty-BAFF-R. Takie sposoby modulacji można stosować in vitro (np. hodując komórki z czynnikiem) lub, alternatywnie, in vivo (np. przez podanie czynnika osobnikowi). Jako taki, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów leczenia osobników dotkniętych chorobą lub zaburzeniem charakteryzującym się nieprawidłową ekspresją lub aktywnością białka lub cząsteczki kwasu nukleinowego BAFF-R. W jednym z wykonań sposób obejmuje podanie czynnika (np. czynnika zidentyfikowanego w opisanym tutaj teście przesiewowym) lub kombinacji czynników, które modulują (np. podwyższają lub obniżają) ekspresję lub aktywność BAFF-R. W innym wykonaniu, sposób obejmuje podawanie białka lub cząsteczki kwasu nukleinowego BAFF-R jako terapii kompensującej obniżoną, zmienioną lub niepożądaną ekspresję lub aktywność BAFF-R.
W jednym z wykonań wynalazek dostarcza sposobu użycia BAFF-R. Sposoby te obejmują sposoby hamowania wzrostu komórek B, wzrostu komórek B indukowanego komórkami dendrytowymi oraz dojrzewania lub wytwarzania przeciwciał u zwierząt poprzez zastosowanie polipeptydu BAFF-R, zawierającego przynajmniej część wiążącą BAFF. Inne wykonania obejmują sposoby stymulowania wzrostu komórek B, wzrostu komórek B indukowanego komórkami dendrytowymi oraz dojrzewania lub wytwarzania przeciwciał u zwierząt poprzez zastosowanie polipeptydu BAFF-R (na przykład poprzez transfekowanie komórek, którym brak BAFF-R wektorami, które umożliwiają wydajną ekspresję BAFF-R albo podawanie przeciwciał, które wiążą się z BAFF-R i naśladują BAFF).
W innym wykonaniu wynalazek dostarcza sposobu użycia BAFF-R do leczenia chorób autoimmunologicznych, nadciśnienia, chorób sercowo-naczyniowych, chorób nerek, chorób związanych z limfatyczną proliferacją komórek B, chorób immunosupresyjnych, transplantacji narządów i HIV. Obejmuje to sposoby użycia czynników do leczenia, hamowania albo zmiany odpowiedzi immunologicznej obejmującej szlak przekazywania sygnału pomiędzy BAFF-R i jego ligandem i sposoby hamowania zapalenia poprzez podawanie przeciwciała swoistego wobec BAFF-R albo jego epitopu.
Sposoby według niniejszego wynalazku korzystnie przeprowadza się poprzez podawanie skutecznej terapeutycznie ilości polipeptydu BAFF-R, cząsteczki chimerowej zawierającej polipeptyd BAFF-R połączony z heterologiczną sekwencją aminokwasową albo homolog przeciwciała antyBAFF-R.
W jednym z wykonań wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną zawierającą polipeptyd BAFF-R i dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę.
W innym wykonaniu wynalazek dostarcza chimerową cząsteczkę zawierającą polipeptyd BAFFR połączony z heterologicznym polipeptydem albo sekwencją aminokwasową. Przykład takiej chimerowej cząsteczki obejmuje BAFF-R połączony z regionem Fc immunoglobuliny albo sekwencją znacznika epitopowego.
W innym wykonaniu wynalazek dostarcza przeciwciało, które wiąże się z polipeptydem BAFF-R. Przeciwciało jest ewentualnie przeciwciałem monoklonalnym.
W jednym z wykonań wynalazek dostarcza sposobu leczenia u ssaka stanów związanych z niepożądaną proliferacją komórek poprzez podawanie ssakowi skutecznej terapeutycznie ilości kompozycji zawierającej antagonistę BAFF-R, gdzie antagonista BAFF-R zawiera polipeptyd, który przeciwdziała oddziaływaniu pomiędzy BAFF-R i jego odpowiednim receptorem albo receptorami z dopuszczalną farmaceutycznie zaróbką.
W korzystnym wykonaniu odpowiednim receptorem BAFF na powierzchni komórki jest BAFF-R.
Sposób według wynalazku można zastosować z dowolnym antagonistą BAFF-R, który ma polipeptyd, który przeciwdziała oddziaływaniu pomiędzy BAFF-R i jego odpowiednim receptorem albo receptorami. Przykłady antagonistów BAFF obejmują między innymi rozpuszczalny polipeptyd BAFF-R, rozpuszczalne chimerowe cząsteczki BAFF-R, włączając w to między innymi BAFF-R-lgG-Fc i homologi przeciwciała anty-BAFF-R.
PL 207 267 B1
Sposób według wynalazku można zastosować dla dowolnego stanu związanego z niepożądaną proliferacją komórek. W szczególności sposoby według wynalazku można zastosować do leczenia komórek nowotworowych, które wyrażają BAFF i/lub BAFF-R.
Przykładów nowotworów, w których proliferacja komórek jest modulowana przez BAFF, można poszukiwać poprzez pomiar in vitro poziomu BAFF i/lub mRNA BAFF-R wyrażanych w bibliotekach tkanek nowotworowych. Kandydatami byłyby biblioteki tkanek nowotworowych, w których BAFF i/lub mRNA BAFF-R jest wyrażany na wysokim poziomie. Alternatywnie, można poszukiwać kandydatów przeszukując publiczne i prywatne bazy danych (np. bazę danych Incyte) przy użyciu na przykład ludzkiej sekwencji cDNA BAFF pełnej długości.
Korzystne jest, jeżeli antagonisty BAFF-R będące przedmiotem wynalazku, które stosuje się do leczenia stanów związanych z niepożądaną proliferacją komórek, a w szczególności terapii nowotworowej hamują wzrost komórek nowotworowych więcej niż 10%, 20%, 30% lub 40% a najkorzystniej więcej niż 50%. Antagonisty BAFF-R otrzymuje się poprzez przeszukiwanie. Przykładowo, antagonisty BAFF-R, można wybrać na podstawie aktywności hamowania wzrostu (tj. więcej niż 10%, 20%, 30%, 40% lub 50%) ludzkiego raka okrężnicy HT29 albo ludzkiego raka płuc A549, które pochodzą z okrężnicy i płuc, odpowiednio.
Inne wykonanie wynalazku dostarcza sposobów hamowania wzrostu komórek B i innych niż B, wzrostu komórek B indukowanego komórkami dendrytowymi oraz dojrzewania lub wytwarzania przeciwciał u zwierząt poprzez zastosowanie polipeptydów BAFF-R jak te opisane powyżej.
Sposób hamowania wzrostu komórek B i innych niż B, wzrostu komórek B indukowanego komórkami dendrytowymi oraz dojrzewania lub wytwarzania przeciwciał może również obejmować podawanie przeciwciała anty-BAFF-R (poliklonalnego lub mono poliklonalnego), które wiąże się z BAFFR i wiązanie się BAFF z BAFF-R. Podawanie przeciwciała, które hamuje w ten sposób wzrost komórek B i innych niż B, wzrost komórek B indukowany komórkami dendrytowymi oraz dojrzewanie lub wytwarzanie przeciwciał. Różne metody znane w tej dziedzinie ekstrapolują dawki z doświadczeń na zwierzętach, włączając w to na przykład ekstrapolację w oparciu o wagę ciała lub powierzchnię.
W niektórych wykonaniach polipeptydy BAFF-R:Fc albo przeciwciał a anty-BAFF-R podaje się w ilości 1 do 20 mg/kg/dawkę. Dawki można podawać dwa razy na tydzień, raz na tydzień, co dwa tygodnie lub raz w miesiącu, jak potrzeba. Lekarz będzie potrafił określić prawidłową dawkę poprzez określenie skuteczności przy jak najmniejszych efektach ubocznych wobec leczenia.
W innym wykonaniu wynalazek dostarcza sposobów użycia BAFF-R albo przeciwciał antyBAFF-R do leczenia chorób autoimmunologicznych, nadciśnienia, chorób sercowo-naczyniowych, chorób nerek, chorób związanych z limfatyczną proliferacją komórek B, chorób immunosupresyjnych, transplantacji narządów i HIV. Obejmuje to sposoby użycia czynników do leczenia, hamowania albo zmiany odpowiedzi immunologicznej obejmującej szlak przekazywania sygnału pomiędzy BAFF-R i jego ligandem.
Sposoby hamowania agregacji wyrażanego białka, włączając w to BAFF-R i BAFF-R:Fc
Wynalazek dostarcza sposobu hamowania albo zmniejszania agregacji wyrażanego białka, a w szczególnoś ci ludzkiego BAFF-R lub huBAFF-R:Fc, które ma tendencję do agregowania w czasie wyrażania, co stoi na przeszkodzie oczyszczaniu z dużą wydajnością. W sposobie według wynalazku sekwencję aminokwasową białka, które ma tendencję do agregowania przy wyrażaniu w zrekombinowanym systemie, porównuje się z sekwencją aminokwasową homologa białka, które wykazuje mniejszą aktywność agregacyjną. Dwa homologi będą miały domeny konserwowane i niekonserwowane aminokwasy pomiędzy nimi, a być może rozproszone w ich obrębie. Generalnie, co najmniej jeden nie-konserwowany aminokwas agregującego białka można zastąpić homologiem aminokwasu w celu złagodzenia agregacji. W niektórych wykonaniach, zastępowane są aminokwasy niepolarne. Aminokwasy niepolarne obejmują glicynę, alaninę, walinę, leucynę, izoleucynę, prolinę, fenyloalaninę, metioninę, tryptofan, i cysteinę. W innych wykonaniach, aminokwasy niepolarne są zastępowane innymi aminokwasami niepolarnymi. Korzystne aminokwasy niepolarne do hamowania albo zmniejszania agregacji to prolina i alanina. W innych wykonaniach, aminokwas niepolarny jest zastępowany nienaładowanym aminokwasem polarnym. Nienaładowane aminokwasy polarne obejmują asparaginę, glutaminę, serynę, treoninę i tyrozynę.
W sposobie według wynalazku dokonuje się podstawień, które korzystnie umożliwiają białku zachowanie aktywności biologicznej. Generalnie, aminokwasy niekonserwowane są podatne na podstawienia bez widocznego wpływu na aktywność biologiczną.
PL 207 267 B1
W konkretnym przypadku sposobu według wynalazku, ludzkie białko BAFF-R moż e mieć podstawienia aminokwasowe wprowadzone w pozycjach V20, P21, A22 i L27 z SEK NR ID: 5 (lub V41, P42, A43 i L48 z SEK NR ID: 10) i różnych ich kombinacjach, które znacznie łagodzą agregację białka. Podobne strategie można zastosować dla innych białek, które mają tendencję do agregowania przy wyrażaniu w zrekombinowanych systemach. Bez zamiaru przywiązywania się do żadnej konkretnej teorii działania, uważa się, że zastąpienie aminokwasu niepolarnego nienaładowanym aminokwasem polarnym nadaje białku rozpuszczalność i przeciwdziała agregacji pomiędzy niepolarnymi regionami białek.
Zakres niniejszego wynalazku nie ma być ograniczany konkretnymi opisanymi tu wykonaniami. Rzeczywiście, różne modyfikacje wynalazku poza tymi tu opisanymi będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie z przytoczonego opisu i towarzyszą cych mu figur. Takie modyfikacje maj ą się mieś cić w zakresie dołączonych zastrzeżeń.
Przykłady
P r z y k ł a d 1
Przykład ten opisuje klonowanie molekularne BAFF-R, nowego receptora dla BAFF.
Materiały i Metody
Bibliotekę cDNA wytworzono z zastosowaniem starterów oligo-dT z komórek BJAB, linii ludzkich komórek B, która wiąże ludzki BAFF i sklonowano w sposób ukierunkowany w wektorze ekspresyjnym CH269. CH269 to pochodna pCEP4 (Invitrogen), która zawiera CMV promotor dla kierowania ekspresją sklonowanego DNA, a także zawiera oriP z EBV. Umożliwia to wielokopiową autonomiczną replikację tych plazmidów w komórkach, które są stabilnie transformowane EBNA-1, takich jak 293EBNA. Bibliotekę cDNA BJAB transfekowano do komórek E. coli DH10B i wysiano do 96 studzienek jako pule około 2500 niezależnych klonów na studzienkę. DNA wytworzono z tych pul przy użyciu Qiagen BioRobot 9600. Pule DNA transfekowano stosując Lipofectamine (Life Technologies) do komórek 293EBNA wysianych na 6 studzienkowe płytki powleczone fibronektyną 48 godzin po transfekcji pożywkę usuwano i komórki przemywano buforem do przemywania w testach płytkowych (20 mM HEPES, 0,5 mg/ml bydlęca albumina surowicza, 0,1% NaN3). Na pojedynczą warstwę komórek nakładano 100 mg/ml biotynylowanego ludzkiego zrekombinowanego rozpuszczalnego myc-BAFF (mychuBAFF) w buforze do wiązania (PBS, 2% płodowa surowica bydlęca, 0,1%) NaN3) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę . myc-huBAFF (aminokwasy 136-285) zastosowany w teście był wyrażany w Pichia pastoris i oczyszczony przez chromatografię anionowymienną, a następnie sączenie molekulerne.
Roztwór BAFF usuwano i komórki przemywano i utrwalano poprzez inkubację z 1,8% formaldehydem-0,2% glutaraldehydem w PBS przez 5 minut. Komórki ponownie przemywano, a następnie inkubowano przez 30 minut ze streptawidyną połączoną z alkaliczną fosfatazą (SAV-AP) (Jackson ImmunoResearch) w rozcieńczeniu 1:3000 z roztworu wyjściowego w buforze do wiązania. Komórki przemywano i barwiono szybka czerwień/fosforan naftolu (Pierce). Komórki wiążące kompleks biotyna-BAFF/SAV-AP identyfikowano poprzez obecność czerwonego strontu po obejrzeniu pod mikroskopem o niskiej mocy. Drugie przeszukiwanie polegało na wysianiu zawiesin glicerolowycłi DH10B z puli wiążących BAFF na pojedyncze kolonie, zaszczepienie do hodowli w pulach ze 100 i powtarzając test wiązania BAFF jak opisano powyżej. Dodatnie pule z drugiego przeszukiwania podobnie rozdzielano na poszczególne klony i testowano pod kątem wiązania BAFF po transfekcji 293EBNA jak opisano powyżej. Ustalono sekwencję DNA niezależnych klonów wiążących BAFF.
Wyniki
Jednym z klonów wiążących BAFF był pJST576. Miał on wstawkę o wielkości 1201 par zasad (bp) nie włączając w to ogona poli-A. Sekwencja wstawki z pJST576 jest pokazana na Fig. 1A (SEK NR ID: 1). Analiza BLAST tego klonu wykazała homologię w bazie danych Genbank do klonu HS250D10 z chromosomu 22 BAC (numer dostępu Z99716). W obrębie tego BAC znajduje się cała sekwencja pJST576. Homologię znaleziono również do końca 3' ludzkiego EST, AI250289 (klon IMAGE 2000271). EST pochodził z ludzkiej biblioteki chłoniaka grudkowego. EST AI250289 otrzymano z Incyte i ustalono sekwencję wstawki (Fig. 1B) (SEK NR ID: 2). Sekwencja ta dodaje 15 bp z sekwencji 5' do sekwencji pJST576, która jest ciągła z genomową sekwencją i 23 bp, które nie są ciągłe. Pozostała sekwencja EST ma idealną homologię z pJST576. Nie można było zidentyfikować otwartej ramki odczytu w tych klonach.
PL 207 267 B1
P r z y k ł a d 2
W tym przykł adzie ustalamy, ż e cDNA JST576 zawiera intron, a nastę pnie znajdujemy otwartą ramkę odczytu.
Metody
Program przewidywania eksonów GENSCAN (Burge, C. & Karlin, S. J. (1997) Mol. Biol. 268: 78-94) zastosowano wobec sekwencji cDNA JST576. Wyniki tego programu przewidywały, że w cDNA obecny jest intron. W celu ustalenia, czy to przewidywanie jest prawidł owe, przeprowadzono analizę PCR na pierwszej nici cDNA z 2 linii komórkowych wyrażających JST576. Z około 107 komórek BJAB lub lM-9 oczyszczono RNA przy użyciu zestawu RNeasy kit (Qiagen) postępując zgodnie z protokołem sugerowanym przez producentów. RNA poddano ocenie ilościowej i 5 μg użyto do reakcji syntezy pierwszej nici cDNA stosując zestaw Superscript preamplification kit (Life Technologies). Użyto zarówno oligo dT, jak i losowych heksamerów do wytworzenia produktu-pierwszej nici. Syntezy pierwszej nici dokonano zgodnie z rekomendowanym protokołem. Trzy (1 z każdej reakcji, 10 ng JST576 albo bez DNA użyto następnie jako matrycę do PCR stosując oligonukleotydy flankujące przewidywany intron. Oligonukleotydami użytymi w reakcji są 5' oligo BAF-225
[5'-GGCCGAGTGCTTCGACCTGCT-3'] (SEK NR ID: 33) lub BAF-226
[5'-GGTCCGCCACTGCGTGGCCTG-3'] (SEK NR ID: 34) i 3' oligo BAF-191 [5'-CACCAAGACGGCCGGCCCTGA-3'] (SEK NR ID: 35). Każda reakcja zawierała 1 x bufor Pfu (Stratagene), 200 (M dNTP, 10% DMSO, 150 ng każdego i 1,25 jednostek polimerazy Turbo Pfu (Stratagene). Reakcję prowadzono przez 35 cykli w 94°C przez 30 sek., 60°C przez 1 min. i 72°C przez 1,5 min. Dziesięć μl każdej z mieszanin reakcyjnych rozdzielono w 1% żelu agarozowym. Pozostałe produkty z reakcji BJAB i lM-9 BAF-225/191 oczyszczono stosując zestaw High Pure PCR product purification kit (Roche Molecular Biochemicals) i cały produkt poddano sekwencjonowaniu DNA. Dodatkowo, z cDNA spoczynkowych komórek B wytworzono produkty PCR stosując startery BAF-225 i BAF-191, subklonowano i poszczególne klony sekwencjonowano. Tutaj w reakcji PCR użyto 5 μl cDNA spoczynkowych komórek B (Clontech) ze starterami BAF-225 i BAF-191, jak opisano szczegółowo poniżej. Produkt PCR oczyszczono następnie przy zastosowaniu zestawu do czyszczenia produktów PCR High Pure PCR product purification kit i zatężono. W celu subklonowania fragmentu PCR, końce fragmentu poddano fosforylacji i wytępiono przy użyciu zestawu do ligacji Sure Clone ligation kit (Amersham Pharmacia Biotech) jak zalecano. Otrzymany w rezultacie produkt sklonowano w miejscu EcoRV pBluescriptll (Stratagene) i transformowano do E. coli. Wyhodowano poszczególne kolonie i otrzymano minipreparaty plazmidowego DNA. Sześć niezależnych izolatów zsekwencjonowano.
Wyniki
Dojrzała sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa JST576 przewidywana przez program GENSCAN jest pokazana na Fig. 2A (SEK NR ID: 3). Produkty PCR z reakcji BJAB i IM-9 rozciągające się na przewidywany intron są pokazane na Fig. 2B i potwierdzają istnienie intronu w klonie cDNA JST576. Przewidywana wielkość produktu PCR z cDNA JST576 wynosi około 788 bp dla BAF225/BAF-191 i 767 bp dla BAF-226/BAF-191. Produkty PCR otrzymane z matrycy JST576 mają mniej więcej taką samą wielkość (ścieżki 10 i 11). Produkty PCR otrzymane przy użyciu BAF-225/BAF-191 na pierwszej nici cDNA - BJAB lub lM-9 ze starterami oligo dT (ścieżki 2 i 6) były tej samej wielkości i znacznie krótsze niż produkt z cDNA JST576. Przewidywana wielkość tego fragmentu bez przewidywanego intronu wynosi 484 bp. Wielkość produktu PCR zgadza się z tym rozmiarem. Te same wyniki otrzymano kiedy jako startery dla BJAB lub IM-9 RNA zastosowano losowe heksamery (ścieżki 4 i 8). Reakcje z użyciem BAF-226/BAF-191 nie wychodziły na pierwszej nici matryc cDNA. A zatem wydaje się, że intron przewidywany przez program GENSCAN rzeczywiście występuje w cDNA JST576. Sekwencję produktu po składaniu z RNA BJAB i lM-9 potwierdzono po zsekwencjonowaniu całego produktu PCR i jest przedstawiony w sekwencji pokazanej na Fig. 2C (SEK NR ID: 4). Sekwencja jest identyczna z sekwencją pokazaną na Fig. 2A (SEK NR ID: 3), z wyjątkiem nieobecności kodonu alaninowego (GCA) w pozycji nukleotydowej 149 (pokazane małymi literami). Wyniki sekwencjonowania 6 niezależnych klonów z reakcji RT-PCR na cDNA spoczynkowych komórek B wskazuje, wykorzystywane są obydwa akceptorowe miejsca składania. Preferowanym miejscem akceptorowym wydaje się być to dające produkt z jedną resztą (5/6 klonów). Jednakże w 1/6 klonów obserwowano sekwencję przewidywaną przez GENSCAN (SEK NR ID: 3), która zawiera dwie alaniny. A zatem ustalono otwartą ramkę odczytu dla ludzkiego JST576 i ustalono jednoaminokwasowy wariant składania. Otwarta ramka odczytu przewiduje białko o długości 184 aminokwas pokazane na Fig. 2D (SEK NR ID: 5). Reszta alaninowa (A) zaznaczona tłustym drukiem reprezentuje wariant składania. Białko to
PL 207 267 B1 jest określane jako BAFF-R. Wydedukowana sekwencja aminokwasowi BAFF-R zawiera region hydrofobowy od obejmujący reszty 72-100 (algorytm Hopp-Woods) i potencjalny odcinek transbłonowy obejmujący reszty 84-102 według analizy algorytmem TMPred. Po regionie tym następuje silnie naładowany ciąg aminokwasów, który może działać jako sygnał stop dla transferu. W BAFF-R brak N-końcowej sekwencji sygnałowej i jest białkiem błonowym typu III podobnym do innych białek wiążących BAFF, BCMA (Laabi i wsp. (1992) EMBO J. 11: 3897-3904) i TACI (von Bulow i Bram, (1997) Science 278: 138-141). Koniec N jest przewidywany jako domena zewnątrzkomórkowa BAFF-R i zawiera 4-cysteinowy motyw obejmujący reszty 19-35 w odróżnieniu do innego członka rodziny receptorów TNF. Koniec C BAFF-R jest przewidywany jako domena wewnątrzkomórkowa.
P r z y k ł a d 3
Ustalamy sekwencję DNA przed proponowaną inicjacyjną metioniną dla ludzkiego BAFF-R zawierającą kodon stop w ramce.
Metody
Wytworzono starter BAF-254 (5'GGGCGCCTACAATCTCAGCTA 3') (SEK NR ID: 36) dla genomowej sekwencji obecnej w BAC HS250d10 (numer dostępu Genbank Z99716) przed proponowanym ATG i użyto w reakcji PCR z oligo BAF-236 (5' GGC-GGACCAGCAGGTCGAAGCACTC 3') (SEK NR ID: 37). Matrycą w reakcji była pierwsza nić cDNA wytworzona z RNA z ludzkiej śledziony (Clontech) przy użyciu zestawu do preamplifikacji PCR zgodnie z opisem producenta (Life Technologies).
Reakcja PCR zawierała PCR 3 μΐ mieszaniny reakcyjnej dla pierwszej nici, 1 x Pfu buforu (Stratagene), 10% DMSO, 0,2 mM dNTP, 150 ng każdego startera i 1,25 jednostek polimerazy Pfu Turbo (Stratagene). Produkt PCR oczyszczano przy użyciu zastawów do oczyszczania produktu PCR High Pure PCR Product Purification zgodnie z zaleceniami producenta (Roche Molecular Biochemicals). Końce produktu PCR przekształcono w tępe i fosforylowano stosując zastaw do ligacji Sure Clone ligation (Amersham Pharmacia Biotech), sklonowano w miejscu EcoRV w pBSK2 (Stratagene) i transformowano do komórek DH5. Z kolonii uzyskanych w wyniku ligacji otrzymano minopreparaty przy użyciu systemu Wizard (Promega), a następnie sekwencjonowano stosując urządzenie ABI.
Wyniki
Sekwencja produktu PCR potwierdza, że mRNA zawiera sekwencje bezpośrednio przed ATG, która jest obecna w sekwencji genomowej. Sekwencja ta jest podkreślona w sekwencji pokazanej na Fig. 3. Obecność kodonu stop w ramce i brak innej metioniny wskazuje, że metionina znajdująca się w cDNA JST576 jest właściwą inicjacyjną metioniną.
P r z y k ł a d 4
Przykład ten opisuje klonowanie cDNA mysiego BAFF-R.
Metody
Przeszukano około miliona łysinek fagowych z biblioteki cDNA mysiej linii komórkowej A20 otrzymanej ze Stratagene (La Jolla, CA) jak opisano przez producenta. cDNA JST576 dla ludzkiego BAFF-R strawiono EcoNI i puszczono na 1% żel o niskiej temperaturze topnienia. Fragment o wielkości 425 bp fragment wcięto z żelu i zważono. Dodano trzykrotną objętość wody i fragment żelu gotowano przez 5 min. Fragment wyznakowano 50 μ Ci 32P-dCTP (Amersham) w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 50 mM Tris pH 8, 5 mM MgCl2, 10 μM β-merkaptoetanol, 200 mM HEPES pH 6,5, 20 μM dNTP (z wyjątkiem dCTP), 0,27 jednostek pd(N)6 heksanukleotydów (Amersham Pharmacia Biotech) i 1 jednostkę enzymu Klenow (USB) przez noc w temperaturze pokojowej. Około miliona zliczeń na ml sondy inkubowano z filtrami w buforze do przeszukiwania łysinek (50 mM Tris, 1% SDS, 1M NaCl, 0,1% pirofosforan sodu, 0,2% PVP, 0,2% FicoU, 0,2% BSA) przez noc w 65°C. Filtry przemywano w 2X SSC i 0,1% SDS w 50°C przez 1,5 godz. (3x2 litry) a następnie eksponowano wobec błony rentgenowskiej przez 2 dni. Zidentyfikowano około 36 dodatnich łysinek. Jedną z tych 6 łysinek oczyszczono. Fagmidy uwolniono w reakcji wycinania in vivo, którego szczegóły są podane w Stratagene. Otrzymane w rezultacie kolonie hodowano, a następnie uzyskano preparaty DNA (Qiagen). Klony cDNA sekwencjonowano.
Wyniki
Sekwencja nukleotydowa największej zgodności mysiego BAFF-R jest przedstawiona na Fig. 4A (SEK NR ID: 8), a sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona na Fig. 4B (SEK NR ID: 9). Trzy z klonów zawierały 10 aminokwasową delecję od aminokwasu 119 do 129 w domenie zewnątrzkomórkowej mysiego BAFF-R. Dopasowanie sekwencji ludzkiego i mysiego BAFF-R pokazuje, że 4 reszty cysternowe w domenie zewnątrzkomórkowej są konserwowane, że pozycja metioniny inicjaPL 207 267 B1 cyjnej jest podobna i że C-końcowy region białek jest silnie konserwowany (Fig. 4C), z ostatnimi 24 resztami będącymi identycznymi. Sekwencje mają około 56% całkowitej identyczności.
P r z y k ł a d 5
W tym przykładzie opisana jest zdolność ludzkiego zrekombinowanego rozpuszczalnego BAFF do wiązania się z komórkami kotransfekowanymi pJST576 i plazmidem reporterowym GFP.
Materiały i Metody
Plazmid reporterowy koduje zakotwiczoną w błonie cząsteczkę GFP i umożliwia identyfikację transfekowanych komórek wśród nietransfekowanych komórek. Komórki 293EBNA kotransfekowano plazmidem reporterowym i pJST576 przy użyciu Lipofektaminy 2000 (Life Technologies). 18-20 godz. po transfekcji, komórki odczepiano od płytek w 5 mM EDTA w PBS i liczono. Komórki przemywano dwukrotnie buforem FACS (PBS zawierający 10% płodową surowicę bydlęcą, 0,1% NaN3) i 2,5 x 105 komórek inkubowano przez 1 godzinę w lodzie z biotynylowanymi myc-huBAFF rozcieńczonymi w buforze FACS w zakresie stężeń od 8 ng/ml do 5 μg/ml. Komórki przemywano buforem FACS i inkubowano przez 30 minut ze streptawidyną połączoną z fikoerytryną (SAV-PE) (Jackson ImmunoResearch) w rozcieńczeniu 1:100 roztworu podstawowego. Komórki ponownie przemywano buforem FACS i zawieszano ponownie w 1% paraformaldehydzie w buforze FACS. Komórki analizowano poprzez FACS dla fluorescencji GFP i PE i dane przedstawiono jako czterokwadrantowy wykres punktowy. Punkty w dwóch prawych kwadrantach reprezentują komórki wyrażające transfekowane reporterowym GFP. Punkty w dwóch górnych kwadrantach reprezentują komórki mające związane biotynylowany myc-huBAFF, gdzie to wiązanie jest uwidocznione przez SAV-PE. Punkty w górnym prawym kwadrancie są komórkami stransfekowanymi, które wiążą biotynylowany myc-huBAFF.
Wyniki
Niebarwiące się komórki i komórki barwiące się jedynie SAV-PE stanowiły 50%, były GFP dodatnie i zostały kotransfekowane plazmidem reporterowym (Fig. 5). Kiedy komórki reporterowym GFP i pJST576 barwi się 1 μg/ml biotynylowanego myc-huBAFF prawie wszystkie komórki w dolnym lewym kwadrancie przesuwają się do góry, co wskazuje na wiązanie się BAFF. Podobny wynik jest widoczny jeżeli zamiast pJST576 kotransfekuje się plazmidem wyrażającym huTACI. Wiadomo, że TACI wiąże się z BAFF. Komórki barwiono pięciokrotnymi rozcieńczeniami biotynylowanego myc-huBAFF w zakresie od 5 μg/ml do 8 ng/ml i wraz ze zmniejszaniem się stężenia biotynylowanego myc-huBAFF zmniejszała się intensywność przesunięcia.
P r z y k ł a d 6
W tym przykładzie opisana jest zdolność ludzkiego zrekombinowanego rozpuszczalnego BAFF lub mysiego zrekombinowanego rozpuszczalnego BAFF do wiązania się z komórkami kotransfekowanymi pJST576 i plazmidem reporterowym GFP.
Materiały i Metody
Kotransfekcje do 293EBNA wykonano jak opisano w Przykładzie 5. 18-20 po transfekcji, komórki odczepiano, liczono i barwiono w celu przeprowadzenia analizy FACS podobnie jak w Przykładzie 5 z następującymi modyfikacjami. Komórki inkubowano przez 1 godzinę w lodzie z 5 μg/ml mysiego bądź ludzkiego zrekombinowanego rozpuszczalnego flag-BAFF, następnie, po przemyciu inkubowano przez 30 minut z 5 μg/ml przeciwciała monoklonalego M2 anty-flag (Sigma Aldrich), a uwidaczniano przez inkubowanie przepłukanych komórek przez 30 minut z oślimi przeciwciałami antymysia IgG połączonymi z PE (Jackson ImmunoResearch) w rozcieńczeniu 1:100 roztworu podstawowego. Komórki ponownie przemywano, utrwalano w paraformaldehydzie i analizowano poprzez FACS dla komórek GFP- i PE-dodatnich.
Wyniki
Około 50% komórek było GFP dodatnich, a zatem były kotransfekowane plazmidem reporterowym (Fig. 6). Kiedy komórki kotransfekowane reporterowym GFP i pJST576 barwi się 5 μg/ml ludzkiego bądź mysiego zrekombinowanego rozpuszczalnego flag-BAFF, prawie wszystkie komórki w dolnym prawym kwadrancie przesuwają się do góry. To wskazuje, że zarówno mysi, jak i ludzki BAFF wiąże się do komórek transfekowanych pJST576.
P r z y k ł a d 7
W tym przykładzie opisana jest niezdolność mysiego zrekombinowanego rozpuszczalnego APRIL do wiązania się z komórkami kotransfekowanymi pJST576 i plazmidem reporterowym GFP.
Materiały i Metody
Kotransfekcje do 293EBNA wykonano jak opisano w Przykładzie 5. 18-20 po transfekcji, komórki odczepiano, liczono i barwiono w celu przeprowadzenia analizy FACS podobnie jak w Przykła50
PL 207 267 B1 dzie 5 z następującymi modyfikacjami. Komórki inkubowano przez 1 godzinę w lodzie z 1 μg/ml mysiego zrekombinowanego rozpuszczalnego myc-APRIL, następnie, po przemyciu inkubowano przez 30 minut z 5 μg/ml przeciwciała monoklonalego anty-mysi APRIL, a następnie przepłukane komórki inkubowano przez 30 minut z 5 μg/ml, biotynylowanych przeciwciał anty-szczurza IgG2b (Pharmingen), a na koniec uwidaczniano przez inkubowanie przepłukanych komórek przez 30 minut z SAVPE. Komórki ponownie przemywano, utrwalano w paraformaldehydzie i analizowano poprzez FACS dla komórek GFP- i PE-dodatnich.
Wyniki
Około 50% komórek było GFP dodatnich, a zatem były kotransfekowane plazmidem reporterowym (Fig. 7). Kiedy komórki kotransfekowane reporterowym GFP i pJST576 barwi się 1 μg/ml mysiego zrekombinowanego rozpuszczalnego myc-APRIL, żadna z komórek w dolnym prawym kwadrancie nie przesuwa się do góry. Jest to wynik przeciwny w stosunku do komórek kotransfekowanych plazmidem wyrażającym ludzki TACI zamiast pJST576. Wśród takich transfekowanych komórek, prawie wszystkie są dodatnie pod względem barwienia się dla myc-APRIL. Pokazano uprzednio, że zarówno BAFF, jak i APRIL wiążą się i z TACI i z BCMA. A zatem fakt, że APRIL nie wiąże się z BAFF-R wyrażanym na komórkach transfekowanych pJST576 wskazuje na specyficzność BAFF-R wobec BAFF.
P r z y k ł a d 8
Przykład ten opisuje zdolność BAFF-R wyrażanego z pJST576 do koimmunoprecypitacji przez zrekombinowany rozpuszczalny ludzki flag-BAFF.
Materiały i Metody
Komórki 293EBNA kotransfekowano przy użyciu Lipofectamine 2000 pJST576, wektorem jako kontrolą albo plazmidem wyrażającym huTACl jako kontrola dodatnia dla wiązania się BAFF. Po 20 godzinach inkubacji pożywkę do transfekcji odsysano, komórki przemywano PBS i pożywkę zastępowano pożywką do znakowania 35S (9 części DMEM bez metioniny i cysteiny do jednej części pełnego DMEM, uzupełniona 10% dializowaną płodową surowicą bydlęcą, 4 mM glutaminą i 100 μθί/mi metioniny i cysteiny 35S (Translabel, ICN Radiochemicals). Komórki inkubowano w tej pożywce przez sześć godzin, po czym pożywkę usuwano. Komórki przemywano PBS, a następnie upłynniano przy użyciu 250 μl buforu do ekstrakcji (1% Brij 98, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5). Koimmunoprecypitacje przeprowadzano poprzez inkubowanie 75 μl ekstraktów komórkowych wyznakowanych 35S z 5 μg zrekombinowanego rozpuszczalnego ludzkiego flag-BAFF w 1 ml DMEM-10% płodowa surowica bydlęca-0,1%) NaN3 przez noc w 4°C. Dodawano monoklonalne przeciwciało M2 anty-flag, 10 μg, i białko A-sefaroza i inkubacje kontynuowano przez 2 godziny. Kulki sefarozowe zbierano przez odwirowanie, przemywano buforem FACS i ponownie zawieszano w buforze do nakładania z SDS i betamerkaptoetanolem jako czynnikiem redukującym. Próbki gotowano przez 5 minut, krótko odwirowywano w celu osadzenia kulek sefarozowych i próbki poddawano SDS-PAGE. Żel inkubowano z odczynnikiem Enlightning (New England Nuclear), suszono i błonę eksponowano w -80°C.
Wyniki
W czasie koimmunoprecypitacji flag-BAFF wiąże się z kulkami białko A-sefaroza poprzez przeciwciało anty-flag, M2. Wytrąca ono również dowolne białko w ekstrakcie komórkowym, które wiąże się z flag-BAFF i te wyznakowane radioaktywnie białka będą wykrywane przez autoradiografię. Poniewa ż komórki 293EBNA nie wi ążą si ę z BAFF, kontrola pustego wektora daje zawsze takie samo tło w trakcie procedury (Fig. 8). Kiedy ekstrakty z komórek transfekowanych dla TACI są koimmunoprecypitowane z flag-BAFF, obserwuje się prążek o widocznej masie cząsteczkowej około 34 kDa. Jest to przybliżona przewidywana masa cząsteczkowa dla ludzkiego TACI pełnej długości (31,2 kDa), białka, o którym wiadomo, że wiąże się z BAFF. Kiedy ekstrakty z komórek transfekowanych pJST576 poddaje się koimmunoprecypitacji z flag-BAFF, obserwuje się prążek o widocznej masie cząsteczkowej około 12 kDa. Przewidywana masa cząsteczkowa dla BAFF-R wyrażanego z pJST576 wynosi 18,9 kDa. Rozbieżność między przewidywaną i obserwowaną masą cząsteczkową może być na skutek nieprawidłowej ruchliwości elektrofotretycznej spowodowanej ładunkiem albo konformacją BAFF-R. Inna możliwość, to że 12 kDa jest fragmentem proteolitycznym BAFF-R.
P r z y k ł a d 9
Przykład ten opisuje wytwarzanie rozpuszczalnych postaci BAFF-R. Można zaprojektować startery oligonukleotydowe komplementarne do pJST576 w celu powielenia poprzez PCR zewnątrzkomórkowej domeny BAFF-R bez domen transbłonowej i wewnątrzkomórkowej. Zazwyczaj obejmuje ona większość regionu „szypułkowego”, albo regionu aminokwasowego leżącego pomiędzy domeną wiążącą ligand i domeną transbłonową. Można zmieniać wielkość włączonego regionu szypułkowego
PL 207 267 B1 w celu optymalizacji mocy otrzymanego rozpuszczalnego receptora. Ten powielony fragment moż na poddać zabiegom inżynierii genetycznej przy użyciu odpowiednich miejsc restrykcyjnych dla umożliwienia klonowania z różnymi heretologicznymi sekwencjami liderowymi na końcu 5' fragmentu i różnymi chimerowymi fuzjami z Ig w wektorach do fuzji na końcu 3'. Alternatywnie, można wstawić sygnał stop na końcu 3' domeny zewnątrzkomórkowej BAFF-R w celu wytworzenia rozpuszczalnej postaci receptora albo użyć innego C-końcowego partnera do fuzji bez zwrotnego stosowania zamiast używania podejścia z chimerą-fuzją z Ig. Można również wytworzyć N-końcową fuzję białkową składającą się z partnera fuzji zawierają cego sekwencję sygnał ową , po której następuje N-koń cowa domena zewnątrzkomórkowa BAFF-R. Otrzymane w rezultacie wektory można wyrażać w większości systemów stosowanych w biotechnologii, włączając w to drożdże, komórki owadów, bakterie i komórki ssaków, a przykłady istnieją dla wszystkich typów ekspresji. Moż na dołączać różne ludzkie domeny Fc w celu optymalizacji albo eliminacji oddziaływań FcR i dopełniacza jeśli to pożądane. Alternatywnie, można zastosować zmutowane postaci tych domen Fc aby wybiórczo usuwać oddziaływania FcR lub dopełniacza albo połączenie dołączanych przez N-cukrów z domeną, co daje pewne korzyści. Przykład cząsteczki-fuzji BAFF-R:Fc jest pokazany na Fig. 9. Cząsteczka ta zawiera sekwencję liderową typu I z mysiego genu Ig-k połączonego przez miejsce restrykcyjne Aat2 z domeną zewną trzkomórkową BAFF-R (reszty aminokwasowe 2-71 jak pokazano na Fig. 2D), która z kolei jest połączona przez miejsce restrykcyjne SalI z domeną Fc ludzkiego IgGl.
P r z y k ł a d 10
Przykład ten pokazuje profil ekspresji BAFF-R w ludzkich tkankach i liniach komórkowych przy zastosowaniu analizy Northern.
Materiały i Metody
Różne linie komórek B i nie-B hodowano w odpowiednich warunkach. RNA wytworzono z około
107 komórek stosując zastaw RNeasy (Qiagen). RNA oceniano ilościowo i 20 μg każdej próbki puszczano na 1,2% żel formaldehydowy jak opisano przez Sambrook i wsp. Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989. Żel przenoszono na błonę nylonową (BMB), a następnie wiązano ultrafioletem (UV). Kilka ludzkich filtrów Northern (12 ścieżkowy wielotkankowy ludzki II i dla układu immunologicznego II) otrzymano z Clontech. Filtry prehybrydyzowano w 65°C w buforze ExpressHyb (Clontech) przez 30 min., a następnie hybrydyzowano z fragmentem EcoNI z końca 3' JST576 wyznakowanym 32P przy użyciu losowych starterów przez około 3 godz. Filtry przemywano w temperaturze pokojowej w 2X SSC/0,05% SDS przez 45 min., a następnie w 50°C w 0,1 X SSC/0,1% SDS przez 45 min. Filtry eksponowano wobec błony rentgenowskiej przez 4 dni stosując dwa ekrany wzmacniające. Dodatkowo, kilka ludzkich filtrów Northern (12 ścieżkowy wielotkankowy ludzki II i dla układu immunologicznego II) otrzymano z Clontech, hybrydyzowano z sondą JST576 i traktowano jak wyżej.
Wyniki mRNA dla BAFF-R wydaje się być wyrażany głównie w narządach układu immunologicznego na tym poziomie wykrywania. Najwyższy poziom jest w śledzionie i węzłach limfatycznych, mRNA był również widoczny w PBL, grasicy, jelicie cienkim i okrężnicy. (Fig. 10A, B i C). Przybliżona wielkość mRNA wynosi 4,5 kb; wydaje się ze w próbkach, gdzie gen nie jest ulega ekspresji na wysokim poziome, występują dwie populacje mRNA. Dwa mRNA mogą również istnieć w śledzionie i węzłach limfatycznych. Może to wskazywać, że BAFF-R ma alternatywne miejsca dodawania poliA albo że RNA podlega alternatywnemu składaniu. Kiedy wiele linii komórkowych badano pod kątem obecności mRNA BAFF-R, wykrywano ten sam mRNA o wielkości 4,5 kb. Jedynie linie komórek B wyrażały mRNA BAFF-R (Fig. 11). Nie wykrywano mRNA w liniach komórkowych U266, RPMI8226 i Daudi, ani w badanych liniach nie-B.
P r z y k ł a d 11
W przykładzie tym pokazujemy, że ekspresja JST576 jest ograniczona do linii komórkowych, które wiążą BAFF.
Materiały i Metody
Linie komórek otrzymano z ATCC i hodowano we wskazanych warunkach. Różne linie komórek B i nie-B hodowano w odpowiednich warunkach. RNA wytworzono z około 107 komórek stosując zastaw RNeasy (Qiagen). RNA oceniano ilościowo i 20 μg każdej próbki puszczano na 1,2% żel formaldehydowy jak opisano przez Sambrook i wsp. Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989. Żel przenoszono na błonę nylonową (BMB), a następnie wiązano ultrafioletem (UV). Filtr hybrydyzowano z wyznakowanym fragmentem JST576, a następnie przemywano jak w Przykładzie 10. Komórki sprawdzano pod kątem ich zdolności do wiązania BAFF stosując analizę FACS. Około 2,5-5 x 105
PL 207 267 B1 komórek zbierano i przemywano. BAFF ze znacznikiem FLAG, rozcieńczony w PBS + 5% FCS i 0,05% azydku sodu (bufor FACS), inkubowano z komórkami w zakresie stężeń (8-0,125 μg/ml) przez 30 min. w lodzie. Komórki przemywano buforem FACS i inkubowano przez 30 min. w lodzie z monoklonalnym przeciwciałem anty-FLAG M2 (Sigma) w stężeniu 5 μg/ml. Ponownie, komórki przemywano buforem FACS, a następnie inkubowano z rozcieńczeniem 1:5000 koziego przeciwciała anty-mysia IgG połączonego z PE (Jackson Immuno Research) przez 30 min. w lodzie. Komórki przemywano jak wyżej i analizowano w sorterze przepływowym FACSCalibur (Becton-Dickinson) stosując oprogramowanie CellQuest.
Wyniki
Wyniki doświadczeń z wiązaniem BAFF są pokazane w Tabeli 1. Linie komórkowe, które wiążą BAFF to Ramos, Namalwa, IM-9, NC-37, Raji, BJAB i SKW6.4. Poziom wiązania jest wskazany przez liczbę znaków +. Linie komórkowe, które nie wiążą BAFF to U266, RPMI 8226, Daudi, U937, Jurkat, HT29, A549, SW480 i ME260. Zdolność linii komórkowych do wiązania BAFF koreluje z obecnością mRNA BAFF-R jak pokazano na Fig. 11.
T a b e l a 1
Linia komórkowa Typ Wiązanie BAFF
BJAB Chłoniak Burkitta +++
IM-9 Limfoblast IgG +++
NC-37 Limfoblast EBV+ ++
Ramos Chłoniak Burkitta EBV- ++
Raji Chłoniak Burkitta ++
SKW6.4 Limfoblast IgM ++
Na ma lwa Chłoniak Burkitta +
Daudi Chłoniak Burkitta EBV+ -
U266 Szpiczak -
RPMI 8226 Szpiczak -
U937 Monocyt -
Jurkat Białaczka komórek T -
HT29 Gruczolakorak okrężnicy i odbytnicy -
A549 Rak płuc -
SW480 Gruczolakorak okrężnicy i odbytnicy -
ME260 Czerniak -
P r z y k ł a d 12
Przykład ten opisuje zdolność fuzji białkowej huBAFF-R:huIgG1 wyrażanej i wydzielanej do kondycjonowanej pożywki przez przejściowo transfekowane komórki 293EBNA do koimmunoprecypitacji ze zrekombinowanym rozpuszczalnym ludzkim biotynylowanym myc-huBAFF.
Materiały i Metody
Komórki 293EBNA kotransfekowano przy użyciu Lipofectamine 2000 (LifeTechnologies) pJST618, który wyraża huBAFF-R (aa 2-71):Fc, plazmidem wyrażającym huBCMA:huIgGl jako kontrola dodatnia dla wiązania BAFF albo plazmidem wyrażającym huFN14:huIgG1 jako kontrola ujemna dla wiązania BAFF. Po 24 godzinach inkubacji zbierano kondycjonowaną pożywkę. SDS-PAGE puszczono poprzez zmieszanie równej objętości 2X bufor do elektroforezy z SDS, z lub bez czynnika redukującego i gotowanie przez 5 minut. Próbki puszczono następnie później 4-20% żel poliakryloamidowy z SDS. Znane ilości oczyszczonego hBCMA:Fc puszczono w sąsiednich ścieżkach w celu oszacowaPL 207 267 B1 nia ilości fuzji białkowej hIgG1 w kondycjonowanej pożywce. Próbki przeniesiono na błony (Immobillon P, Millipore) techniką Western w buforze 0,01 M CAPS pH 11-10% MeOH. Błony blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku (NFDM) w TBST, inkubowano z rozcieńczeniem 1:3000 koziego przeciwciała anty-mysia IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch) przez 1 godzinę, przepłukiwano TBST i eksponowano wobec bł ony. Koimmunoprecypitacje przeprowadzano poprzez inkubowanie kondycjonowanej pożywki z 200 ng zrekombinowanego rozpuszczalnego ludzkiego flag-BAFF w 1 ml DMEM10% płodowa surowica bydlęca - 0,1% NaN3 przez noc w 4°C. Dodawano białko A-sefaroza i inkubacje kontynuowano przez 2 godziny. Kulki sefarozowe zbierano przez odwirowanie, przemywano buforem FACS TBST i ponownie zawieszano w buforze do nakładania z SDS i beta-merkaptoetanolem jako czynnikiem redukującym. Próbki gotowano przez 5 minut, krótko odwirowywano w celu osadzenia kulek sefarozowych i próbki poddawano SDS-PAGE. FLAG-huBAFF, 50 ng, puszczono jako kontrolę dodatnią. Próbki przenoszono na błony PVDF (Immobillon P, Millipore) techniką Western w buforze
0,01 M CAPS pH 11-10%MeOH. Błony blokowano 5% NFDM-TBST, inkubowano z 1 μg/ml antyFLAG M2-HRP przez 1 godzinę, przepłukiwano TBST i eksponowano wobec błony.
Wyniki
W wyniku koimmunoprecypitacji wytrącone zostają różne fuzje receptor:Fc poprzez partnera fuzji oddziałującego z białkiem A-sefaroza. Wytrącone zostają również dowolne białka oddziałujące z fuzjami R:IgGl, takie jak flag-BAFF. Kondycjonowane pożywki z komórek wyrażających hBCMA:Fc mają zdolność koimmunoprecypitacji z flag-BAFF, jak oczekiwano, ponieważ na filtrach Western obserwuje się prążek, który migruje razem z flag-BAFF (Fig. 12). Kondycjonowane pożywki z komórek wyrażających hFN14:Fc nie koimmunoprecypitują z flag-BAFF. Kondycjonowane pożywki z komórek wyrażających BAFF-R:Fc mają zdolność koimmunoprecypitacji flag-BAFF. Na filtrach Western obserwuje się prążek, który migruje razem z flag-BAFF i ma on podobną intensywność, co ten, który ulega koimmunoprecypitacji przez huBCMA:huIgG1.
P r z y k ł a d 13
Przykład ten opisuje zdolność fuzji białkowej BAFF-R:Fc, w tym przypadku huBAFF-R (aa 2-71):hulgG1, do blokowania wiązania się huBAFF z komórkami BJAB.
Materiały i Metody
Wytworzono fiazję huBAFF-R (2-71)-huIgG1 dyskutowaną w Przykładzie 9 i nazwano ją pJST618. Konstrukt ten transfekowano przejściowo do komórek 293EBNA i zbierano kondycjonowane pożywki. Fuzję białkową oczyszczono poprzez kwaśną elucję z białka A-sefaroza, a następnie sączenie molekularne. Biotynylowany myc-huBAFF, 200 ng/ml, preinkubowano bądź z 50 μl buforu FACS albo serią pięciokrotnych rozcieńczeń, w zakresie od 5 μg/ml do 200 ng/ml, oczyszczonej huBAFF-R:Fc przez 30 minut w lodzie. Komórki BJAB (2,5 x 105 komórek) inkubowano następnie z tymi roztworami w lodzie przez jedną godzinę. Komórki przemywano buforem FACS i barwiono SAV-PE. Komórki analizowano poprzez FACS dla fluorescencji PE i dane formatowano jako nakładające się histogramy. Alternatywnie, 200 ng/ml biotynylowanego-BAFF pre-inkubowano z serią dwukrotnych rozczeńczeń hBAFF-R:Fc, hTACFFc albo hLTBR:Fc. Komórki barwiono pod kątem wiązania biotynylowanego BAFF jak wyżej.
Wyniki
Fig. 13A pokazuje nałożenie histogramów uzyskach dla wiązania się huBAFF z BJAB w obecności różnych stężeń huBAFF-R:Fc. Czarna linia oznaczona „A” reprezentuje tło wiązania SAV-PE, a czerwona linia zaznaczona jako „E” reprezentuje komórki barwione biotynylowanym myc-huBAFF bez preinkubacji z BAFF-R:Fc. Preinkubacja biotynylowanego myc-huBAFF z 5 μg/ml huBAFF-R:Fc prowadzi do przesunięcia na histogramie prawie do poziomów tła (krzywa B). Preinkubacja z 1 μg/ml (krzywa C) albo 200 ng/ml (krzywa D) huBAFF-R-hulgG1 prowadzi do około czterokrotnego wzrostu wiązania biotynylowanego myc-huBAFF.
Fig. 13B pokazuje że zarówno BAFF-R:Fc, jak i TACFFc mają zdolność do blokowania wiązania się BAFF z komórkami BJAB. Preinkubacja z LTBR:Fc nie ma efektu blokowania BAFF.
P r z y k ł a d 14
Przykład ten opisuje zdolność fuzji białkowej BAFF-R:IgG1 do blokowania indukowanej BAFF proliferacji komórek B.
Materiały i Metody
W celu przeprowadzenia testu proliferacji in vitro, izolowano mysie komórki B ze śledzion myszy C57B16 (w wieku 8 tygodni przy użyciu) kolumny do odzyskiwania komórek B (CellectTM Mouse B Cell Recovery Column: Cedarlane Laboratories Limited, Ontario, Canada). Oczyszczone komórki B anali54
PL 207 267 B1 zowano poprzez FACS i >90% okazało się być dodatnimi pod względem barwienia przez B220. Komórki B inkubowano w 96-studzienkowych płytkach (105 komórek/studzienkę w 50 ml RPMI uzupełnionej 10% FBS) przez 72 godzin w obecności lub nieobecności 2 mg/ml koziego przeciwciała antyludzki łańcuch m (Sigma Chemical Co.); kontrolą hIgG (10 mg/ml) huBAFF-R:Fc (10 mg/ml). Próbki wysiewano w trzech powtórzeniach razem ze wskazanymi stężeniami myc-hBAFF. Komórki traktowano przez dodatkowe 18 godzin [3H] tymidyna (1 μCi/studzienkę) i zbierano. Inkorporację [3H] tymidyny śledzono poprzez zliczanie w płynnym scyntylatorze. Fuzję białkową ludzki BAFF-R:Fc, wytworzoną jak w Przykładzie 13, użytą w tym teście jak dyskutowano w Przykładzie 139, otrzymano z supernatantu komórek 293EBNA transfekowanych pJST618. Supernatant zbierano, nakładano na kolumnę z białkiem A, wymywano kwasem, neutralizowano, a następnie poddano sączeniu molekularnemu w celu uzyskania wolnego od agregatów białka huBAFF-R:Fc. BAFF użyty w teście był wyrażany w Pichia pastoris i oczyszczany poprzez chromatografię anionowymienną, a następnie sączenie molekularne.
Wyniki
Fig. 14 pokazuje, że BAFF może kostymulować wzrost komórek B w obecności przeciwciał anty-m (kwadraty) i hIgG (trójkąty). Sam BAFF (romby) nie miał zdolności indukowania proliferacji komórek B. Inkubacja z 10 mg/ml huBAFF-R:Fc (gwiazdki) prowadzi do całkowitego zahamowania indukowanej BAFF proliferacji komórek B.
P r z y kł a d 15
Materiały i Metody
Myszy
Samice myszy BALB/c w wielu sześciu tygodni otrzymano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i utrzymywano w warunkach izolacji w Biogen Animal Facility.
Odczynniki i tryb traktowania
Receptorowe fuzje białkowe zawierają ludzki region Fc IgG1. Myszy (5/grupę) otrzymywało 200 μg fuzji białkowych (mysi BAFF-R:Fc lub ludzki BAFF-R:Fc) 2x/tydzień przez 4 tygodnie, ip (dootrzewnowo). Myszy kontrolne otrzymywały ludzką poliklonalą IgG (Panglobulin™) (HIgG), 200 μg) 2x/tydzień przez 4 tygodnie. Trzy dni po ostatniej dawce, zbierano krew przez zatokę oczodołową, po czym myszy poddawano eutanazji i pobierano śledziony, węzły limfatyczne i szpik kostny do analizy.
Analiza poprzez cytometrię przepływową
Po uśmierceniu określano wagę śledzion. Ze śledziony i krwi uzyskiwano zawiesinę pojedynczych komórek po zlizowaniu czerwonych komórek krwi w roztworze hipotonicznym. Zawiesinę pojedynczych komórek wytwarzano również z pachwinowych węzłów limfatycznych i szpiku kostnego. Cytometrię przepływową przeprowadzono przy użyciu mAb skierowanych przeciw B220, IgM, IgD i CD21. Podpopulacje komórek B śledziony zdefiniowano jako grudkowe (B220+, IgMlow, CD21low), strefy brzegowej (B220+, IgMhi CD21hi) i nowoutworzone (B220+, IgMhi CD21-). Pokrótce, ~1,5 x 106 komórek inkubowano z 10 μg/ml Fc Block (Pharmingen) przez 10 min. w lodzie w celu zablokowania receptorów Fc, a następnie dodawano wyznakowane fluorescencyjnie mAb i inkubowano w lodzie przez 30 min. Komórki przemywano 1X i zawieszano ponownie w 0,5% paraformaldehydzie. Dane o fluorescencji komórek uzyskiwano w cytometrze przepływowym FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) i analizowano przy użyciu oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson).
Wyniki
Po 4-tygodniowym okresie traktowania mysim albo ludzkim BAFF-R:Fc następowało znaczące zmniejszenie wagi śledzion od myszy traktowanych mysim i ludzkim BAFF-R:Fc (Fig. 15), w porównaniu z myszami kontrolnymi traktowanymi ludzkim IgG. Znaczące zmniejszenie liczby komórek śledziony stwierdzono jako rezultat zmniejszenia liczby komórek B. Średnia liczba wszystkich komórek B śledziony B220+ u myszy traktowanych mysim i ludzkim BAFF-R:Fc, odpowiednio, 1,8 x 106 i 2,6 x 106 komórek, była znacząco zmniejszona w porównaniu z liczbą komórek B u zwierząt kontrolnych traktowanych HigG, u których średnia liczba komórek wynosiła 19,8 x 106 komórek (Fig. 16). Badanie różnych subpopulacji komórek B śledziony, grudkowych, strefy brzegowej i nowoutworzonych, wskazywało, że liczba komórek B w każdym podzbiorze była zmniejszona u myszy traktowanych BAFF-R::Fc (Tabela 2), jakkolwiek komórki B grudkowe i strefy brzegowej wykazywały większą redukcję.
PL 207 267 B1
T a b e l a 2. Traktowanie BAFF-R::Fc prowadzi do zmniejszenia subpopulacji komórek B śledziony
Subpopulacje komórek B śledziony (106 komórek ± SD)
Grudkowe Strefy brzegowej Nowoutworzone
Ludzki IgG 14,5 ± 2,4 1,1 ± 0,3 1,5 ± 0,2
mBAFF-R:Fc 0,7 ± 0,1 0,06 ± 0,02 0,4 ± 0,1
hBAFF-R:Fc 1,4 ± 0,5 0,05 ± 0,02 0,5 ± 0,2
Myszy otrzymały 200 μg HIgG, mBAFF-R:Fc lub hBAFF-R:Fc w dniach 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 i 25. Myszy poddano eutanazji dnia 28 i pobrano śledziony w celu analizy subpopulacji komórek B.
Badanie procentu komórek B B220+ zawartych w pachwinowych węzłach limfatycznych (LN) pokazało, że średnie populacje komórek B były znacząco zmniejszone u myszy traktowanych mysim i ludzkim BAFF-R::Fc, odpowiednio, 12,3% ± 1,4 i 18,6% ± 1,3, w porównaniu z myszami kontrolnymi traktowanymi HigG, u których średnia liczba komórek wynosiła 30,8% ± 4,1 komórek B (Fig. 17). Podobne wyniki otrzymano, kiedy badano komórki B krwi obwodowej. 42,5% ± 2,9 limfocytów od myszy traktowanych ludzkim IgG było komórkami B, podczas gdy jedynie 21,2% ± 6,1 i 8,3% ± 4,5 limfocytów było komórkami B od myszy traktowanych odpowiednio, mysim i ludzkim BAFF-R::Fc (Fig. 18).
Jakkolwiek populacje nowoutworzonych (niedojrzałych) komórek B i dojrzałych komórek B były zmniejszone u myszy traktowanych BAFF-R::Fc, nie obserwowano wpływu na prekursory komórek B w szpiku kostnym (dane niepokazane).
Dyskusja
Wyniki sugerują, że blokada BAFF in vivo rozpuszczalną fuzją białkową receptora BAFF-R prowadzi do zahamowania przeżywalności i/lub dojrzewania komórek B.
Wyniki te sugerują również potencjalne użycie fuzji białkowej BAFF-R jako leku do zastosowań klinicznych w chorobach, w których pośredniczą komórki B. Choroby obejmują te, które są autoimmunologicznymi w swojej naturze, takie jak ogólnoustrojowy toczeń rumieniowaty, reumatoidalne zapalenie stawów, ciężka miastenia, autoimmnologiczna anemia hemolityczna, samoistna plamica małopłytkowa, zespół anty-fosfolipidowy, choroba Chagasa, choroba Gravesa, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie guzkowate tętnic i szybko postępujące zapalenie kłębuszków nerkowych. Czynnik leczniczy ma również zastosowanie w chorobach komórek plazmatycznych, takich jak szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstroma, choroba ciężkich łańcuchów, pierwotna albo związana z immunocytami skrobiawica oraz gammopatia monoklonalna o nieustalonym znaczeniu (MGUS). Cele onkologiczne obejmują nowotwory komórek B, białaczki i chłoniaki.
P r z y k ł a d 16:
W tym przykładzie opisana jest charakteryzacja wyjściowego zestawu mysich przeciwciał monoklonalnych wzbudzonych wobec zewnątrzkomórkowej domeny BAFF-R. Wszystkie przeciwciała rozpoznają domenę zewnątrzkomórkową BAFF-R, a podzbiór tych przeciwciał ma właściwości antagonistyczne, ponieważ przeciwdziałają wiązaniu się BAFF z BAFF-R.
Materiały i Metody:
Myszy RBF immunizowano i podawano dawkę wzmagającą huBAFF-R:Fc. Splenocyty immunizowanej myszy poddawano fuzji ze szczepem mysiego szpiczaka FL653, pochodnej szczepu P3-X63-Ag8.653 w celu wytworzenia hybrydom przy zastosowaniu standardowych technologii.
Kondycjonowane pożywki z klonów hybrydom wydzielających przeciwciała wobec zewnątrzkomórkowej domeny BAFF-R testowano poprzez FACS. Testy wiązania FACS przeprowadzono na komórkach 293EBNA kotransfekowanych plazmidami wyrażającymi huBAFF-R albo muBAFF-R pełnej długości i GFP jak w Przykładzie 5. Kondycjonowane pożywki z hybrydomy rozcieńczano 1:10 w buforze FASC i inkubowano ze stransfekowanymi komórkami przez 30 min. w lodzie. Komórki przemywano buforem FASC i wiązanie wykrywano przez inkubację z rozcieńczeniem 1:100 przeciwciała antymysia IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) przez 30 min. w lodzie. Komórki przemywano ponownie buforem FASC i zawieszano w 1% paraformaldehydzie w buforze FASC. Komórki analizowano poprzez FACS dla fluorescencji GFP i PE i dane przedstawiono jako czterokwadrantowy wykres punktowy, jak opisano w Przykładzie 5. Testy blokowania BAFF przeprowadzono poprzez inkubowanie 10 μg/ml oczyszczonego na białku A mAb anty-BAFF-R lub przeciwciała kontrolnego (MOP C21) z komórkami BJAB przez 30 min w lodzie. Po przepłukaniu komórki inkubowano z 250 μg/ml biotyny56
PL 207 267 B1 lowanego-huBAFF przez 30 min. w lodzie. Komórki przemywano ponownie i wiązanie BAFF wykrywano poprzez inkubację z SAV-PE. Komórki analizowano poprzez FACS dla fluorescencji PE i dane nanoszono na wykres jako nakładające się histogramy.
Wyniki:
Zaobserwowano wiązanie się supernatantów z dziesięciu klonów z komórkami transfekowanymi huBAFF. Wykresy punktowe danych z FACS dla czterech z dziesięciu supernatantów anty-BAFF-R są pokazane na Fig. 19A. Wydajność transfekcji wynosiła około 50%, z prawie wszystkimi transfekowanymi komórkami przesuniętymi do górnego prawego kwadrantu po barwieniu z supernatantami. Żaden z tych dziesięciu supernatantów nie wiązał się z komórkami 293EBNA transfekowanymi muBAFFR (dane niepokazane). Kondycjonowane pożywki z tych klonów, które były dodatnie względem wiązania się z BAFF-R testowano pod kątem ich zdolności do blokowania oddziaływania BAFF z BAFF-R wyrażanym na powierzchni komórek BJAB. Komórki BJAB wyrażają BAFF-R na swojej powierzchni i nie wyrażają wykrywalnych ilości BCMA albo TACI (Thompson i wsp. (2001) Science 16 sierp.). Dwie spośród dziesięciu hybrydom, klony 2 i 9, wytwarzały mAbs, które miały zdolność do blokowania oddziaływania BAFF-R z BAFF. (Klon 2 zdeponowano w ATCC 6 września, 2001 jako „anty-BAFF-R klon #2.1” (izotyp IgG1-kappa) i uzyskał nr ATCC PTA-3689; Klon 9 zdeponowano w ATCC 6 września, 2001 jako „anty-BAFF-R klon #9.1. izotyp IgG1-kappa) i uzyskał nr ATCC PTA-3688). Nakładające się histogramy Fig. 19B pokazują, że pre-inkubacja z 10 μg/ml klonu 2 mAb (krzywa (b)) albo 9 (krzywa (c)) przesuwała krzywe wiązania BAFF więcej niż dziesięciokrotnie w lewo, prawie do sygnału kontrolnego BAFF (krzywa (a)). Najbardziej prawy histogram (krzywa (d)) wskazuje na przesunięcie, kiedy komórki przed wiązaniem z BAFF inkubowano z mAb MOP C21, nieblokującymi mAb anty-BAFF-R albo bez białka.
P r z y k ł a d 17:
Przykład ten opisuje konstrukcję, sekwencję i charakterystykę postawień aminokwasowych w białku w hBAFF-R(2-71)-Fc, które prowadzą do zwiększonej rozpuszczalności cząsteczki wyrażanej poprzez rekombinowanie DNA.
Materiały i Metody:
Dwuniciowe kasety oligonukleotydowe z lepkimi końcami użyto do wprowadzenia podstawień w docelowych resztach poprzez ligację w tych samych miejscach w genie hBAFF-R(2-71):IgG1.
Plazmidy ekspresyjne transfekowano do komórek 293EBNA przy użyciu Lipofectamine 2000 jak w Przykładzie 5. Agregację ustalano poprzez poddanie SDS-PAGE w warunkach niedenaturujących kondycjonowanych pożywek 20 godz. po transfekcji, a następnie transfer Western i wykrywanie przy użyciu połączonego z HRP przeciwciała anty-ludzka IgG (1:100, Jackson ImmunoResearch) i wykrywanie przy użyciu ECL jak w przykładzie Przykład 12.
Doświadczenia z immunoprecypitacją przeprowadzono używając 100 μl kondycjonowanych pożywek 20 godz. po transfekcji w 1 ml DMEM/10% FBS/0,2% NaA3 z 200 ng flag-huBAFF. Próbki kołysano przez 30 min. w 4°C, dodawano 30 μl białko A-sefaroza na rurkę i kołysanie kontynuowano przez dalsze 30 minut. Kulki sefarozy odwirowywano i przemywano trzykrotnie 1 ml zimnego PBS. Kulki zawieszano ponownie w 2X buforze redukującym z SDS i nakładano na 4-20% żele akryloamidowe. Po transferze Western jak opisano uprzednio, zdolność do immunoprecypitacji flag-BAFF uwidaczniano poprzez inkubację filtrów z 1 μg/ml połączonego z HRP przeciwciała anty-flag M2 (Sigma), a następnie wykrywanie poprzez ECL.
Wyniki:
Podczas gdy ludzki BAFF-R:Fc jest wysoce zagregowany, mysi BAFF-R:Fc jest zagregowany jedynie w niewielkim stopniu (<10%). Analiza delecyjna wykazała, że cała C-końcowa część BAFF-R została usunięta, od A71 do V36 (ostatnią Cys z domeny bogatej w cysteiną (CRD) jest C35) bez zmniejszenia tworzenia się agregatów. To świadczyłoby, że do tworzenia się agregatów wymagane są regiony N-końcowe i CRD hBAFFR.
Wyjściowo, wytworzono kilka mysio-ludzkich chimer BAFF-R:Fc, w których różne N-końcowe ilości ludzkiej sekwencji BAFF-R zastępowano homologiczną sekwencją mysią i analizowano wpływ na agregację białka. Sekwencje aminokwasowe dla tych kolejnych podstawień w hBAFF-R:Fc są pokazane na Fig. 20. Figura ta pokazuje część BAFF-R zarówno ludzkiego „typu dzikiego” (Fig. 9), jak i mysiego BAFF-R:Fc, z numeracją odpowiadającą resztom aminokwasowym w ludzkim (Fig. 2d) (SEK NR ID: 5) lub mysim BAFF-R (Fig. 4b) (SEK NR ID: 9) pełnej długości. Fig. 20 pokazuje również klony hBAFFR-R:Fc z podstawieniami, z podstawionymi resztami zaznaczonymi tłustym drukiem, na czerwono, z podkreśleniem. Chimery zawierające mniej niż pierwszych 21 mysich reszt (Q21) przed
PL 207 267 B1 zamianą z ludzkimi wydają się agregować podobnie jak ludzki hBAFF-R:Fc typu dzikiego; jednakże te, które zawierają, co najmniej 39 mysich reszt agregują w znacznie mniejszym stopniu, podobnie do mBAFF-R. Spośród dodatkowych dziewięciu reszt różniących się między tymi dwoma konstruktami BAFF-R:Fc, cztery różnią się między mysim i ludzkim. Świadczyłoby to, że co najmniej jedna ludzka reszta pomiędzy C19 i L27, regionie wewnętrznym w stosunku do CRD, jest wymagana do agregacji.
Konstrukty zastępujące ludzkie reszty odpowiadającymi mysimi tylko w tych czterech miejscach albo ich części wytworzono przy zastosowaniu standardowych technik. Kiedy tylko 4 reszty V20N P21Q A22T L27P zostały podstawione w ludzkiej części BAFFR to zmodyfikowane białko BAFF-R:Fc nie agregowało. Białko hBAFF-R(V20N P21Q A22T L27P):Fc było nadal zdolne do oddziaływania z BAFF co analizowano przez immunoprecypitację. Podstawienie V20N L27P również zmniejszało agregację hBAFF-R:Fc z około 90% do około 10%. Pośrednie poziomy agregacji obserwowano dla P21Q L27P (40%), L27P (60%), V20N L27A (60%) i V20N L27S (60%). Żadne z następujących podstawień nie zmniejszało agregacji białka: V20N P21Q A22T; V20N A22T; V20N P21Q; V20N; oraz P21Q.
P r z y k ł a d 18
Przykład ten opisuje, że p21-Arc jest białkiem związanym z BAFF-R. Metodą zastosowaną do ustalenia takiego oddziaływania była immunoprecypitacja.
Metody
Wytworzono konstrukt zawierający cDNA kodujący domenę wewnątrzkomórkową BAFF-R (BAFF-R-i.c.d.) ze znacznikiem myc przyłączonym do końca N i subklonowano do plazmidu CH269 w miejscach Nhel (5') i XhoI (3'). Komórki 293E transfekowano tym konstruktem i lizowano 72 godzin później przy użyciu buforu do lizy zawierającego 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF i 1% Brij 97. Lizaty komórkowe klarowano na wirówce stołowej przy 10000 g przez 5 minut i poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem monoklonalnym anty-myc, 9E10. Immunoprecipitaty rozdzielano poprzez 10-20% SDS-PAGE w warunkach redukujących i przenoszono na błonę PVDF. Przeniesione białka uwidaczniano przy użyciu 0,2% roztworu Ponceau S i obszary odpowiadające białkom specyficznie połączonym z BAFF-R wycinano i poddawano analizie N-końcowej sekwencji aminokwasowej. Przeprowadzono niejednoznaczne poszukiwanie w nie-nadmiarowej białkowej bazie danych stosując algorytm PATTERN SEARCH w celu otrzymania danych dla N-końcowej sekwencji.
Wyniki
Jedno z białek specyficznie połączonych z domeną cytoplazmatyczną BAFFR ze znacznikiem myc ma widoczną masę cząsteczkową 21 kDa. Białko to zostało jednoznacznie zidentyfikowane jako p21-Arc (kompleks białek związanych z aktyną). P21-Arc jest składnikiem siedmiopodjednostkowego kompleksu białkowego zwanego Arp2/3, dla którego pokazano, że uczestniczy w polimeryzacji aktyny (Welch i wsp. (1997) J. Cell Biol. 138: 357). Ostatnio, doniesiono, że białko wiążące się z aktyną filaminą, jest związana z czynnikiem 2 związanym z receptorem czynnika martwicy nowotworów 2 (TRAF2) (Leonardi i wsp. (2000) J. Biol. Chem. 275: 271). A zatem identyfikacja p21-Arc w koimmunoprecipitatach domeny cytoplazmatycznej BAFFR sugeruje, że p21-Arc jest bądź bezpośrednio związany z BAFFR bądź pośrednio związany BAFFR poprzez jego powiązanie z TRAF2 i/lub innym białkiem TRAF, które z kolei, asocjuje z BAFFR.
Z przedstawionego szczegółowego opisu konkretnych wykonań wynalazku powinno być oczywiste, że zostało opisane jedno z nich. Jakkolwiek konkretne wykonania zostały tu ujawnione szczegółowo, dokonano tego jako przykład jedynie dla celów ilustracji i bez zamiaru stanowienia ograniczenia w odniesieniu do zakresu dołączonych zastrzeżeń, które następują dalej. W szczególności, brana jest pod uwagę przez wynalazcę możliwość dokonania różnych zastąpień, zmian i modyfikacji bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku zdefiniowanych przez zastrzeżenia.
PL 207 267 B1
Lista sekwencji <110> Biogen, Inc. Thompson, Jeffrey S Ambrose, Christine M <120> Kwasy nukleinowe i polipeptydy receprora <130> BIOG-0086 <150> 60/233152 <151> 2000-09-18 <150> 60/234140 <151> 2000-09-21 <150 60/268499 <151> 2001-02-13 <150 60/312185 <151> 2001-08-14 <160 37 <170> Patentln version 3.1 <210 1 <211> 1201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 1
gcaccatgag gcgagggccc cggagcctgc ggggcaggga cgcgccagcc cccacgccct 60
gcgtcccggc cgagtgcttc gacctgctgg tccgccactg ogtggcctgc gggctcctgc 120
gcacgccgcg gccgaaaccg ggtaaggggg acccacgggg cgcgcggcgc cggcagctgc 180
ggggagaacg gggccccgat cgccagggcg caggcagagc cccgaccccc gggggcgccg 240
agggctgaaa ggaccctgtg ggcagggcct ggaggggccc gcgatcaccg cgtggccctc 300
accgccgcct ctctccctcc ccttgtccac cgccccccgg ctgtccctcc cctccccggc 360
cagcctcgcc cccctccgcc cctccccgtc cccgctcctc cctcccctcg gccccctggc 420
ctccctccct gtcccctccc gaagcagccg gggccagcag ccctgogccc aggacggcgc 480
tgcagccgca ggagtcggtg ggcgcggggg ccggcgaggc ggcgctgccc ctgcccgggc 540
tgctctttgg cgcccccgcg ctgctgggcc tggcactggt cctggcgctg gtcctggtgg 600
gtctggtgag ctggaggcgg cgacagcggc ggcttcgcgg cgcgtcctcc gcagaggccc 660
ccgacggaga caaggacgcc ccagagcccc tggacaaggt catcattctg tctccgggaa 720
tctctgatgc cacagctcct gcctggcctc ctcctgggga agacccagga accaccccac 780
ctggccacag tgtccctgtg ccagccacag agctgggctc cactgaactg gtgaccacca 840
agacggccgg ccctgagcaa caatagcagg gagccggcag gaggtggccc ctgccctccc 900
tctggacccc cagccagggg cttggaaatc aaattcagct cttcactcca gcatgcacat 960
gccctctttc tgggaccagg ctaaccctgc agaagcacag acactacaga ccacagcatt 1020
cagcccccat ggagtttggt gtgcttgcct ttggcttcag acctcaccat ctttgacagc 1080
ccttgaaggt ggtagcccag ctcctgttcc tgtgccttca aaaggctggg gcactatgag 1140
PL 207 267 B1
taaaagaccg c cttttaaaat ggggaaggca ccattaagcc aaaatgaatc tgaaaaaaga 1200 1201
<210> 2 <211> 992 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2
gtcgacccac gcgtccgccc acgcgtccgg tgcggcggcg tcggcaccat gaggcgaggg 60
ccccggagcc tgcggggcag ggacgcgcca gcccccacgc cctgcgtccc ggccgagtgc 120
ttcgacctgc tggtccgcca ctgcgtggcc tgcgggctcc tgcgcacgcc gcggccgaaa 180
ccgggtaagg gggacccacg gggcgcgcgg cgccggcagc tgcggggaga acggggcccc 240
gatcgccagg gcgcaggcag agccccgacc cccgggggcg ccgagggctg aaaggaccct 300
gtgggcaggg cctggagggg cccgcgatca ccgcgtggcc ctcaccgccg cctctctccc 360
tccccttgtc caccgccccc cggctgtccc tcccctcccc ggccagcctc gcccccctcc 420
gcccctcccc gtccccgctc ctccctcccc tcggccccct ggcctccctc cctgtcccct 480
cccgaagcag ccggggccag cagccctgcg cccaggacgg cgctgcagcc gcaggagtcg 540
gtgggcgcgg gggccggcga ggcggcgctg cccctgcccg ggctgctctt tggcgccccc 600
gcgctgctgg gcctggcact ggtcctggcg ctggtcctgg tgggtctggt gagctggagg 660
cggcgacagc ggcggcttcg cggcgcgtcc tccgcagagg cccccgacgg agacaaggac 720
gccccagagc ccctggacaa ggtcatcatt ctgtctccgg gaatctctga tgccacagct 780
cctgcctggc ctcctcctgg ggaagaccca ggaaccaccc cacctggcca cagtgtccct 840
gtgccagcca cagagctggg ctccactgaa ctggtgacca ccaagacggc cggccctgag 900
caacaatagc agggagccgg caggaggtgg cccctgccct ccctctggac ccccagccag 960
gggcttggaa atcaaattca gctcttcact cc 992
<210> 3 <211> 906 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 3
ggcgcgccgc accatgaggc gagggccccg gagcctgcgg ggcagggacg cgccagcccc 60
cacgccctgc gtcccggccg agtgcttcga cctgctggtc cgccactgcg tggcctgcgg 120
gctcctgcgc acgccgcggc cgaaaccggc agccggggcc agcagccctg cgcccaggac 180
ggcgctgcag ccgcaggagt cggtgggcgc gggggccggc gaggcggcgc tgcccctgcc 240
cgggctgctc tttggcgccc ccgcgctgct gggcctggca ctggtcctgg cgctggtcct 300
PL 207 267 B1
ggtgggtctg gtgagctgga ggcggcgaca gcggcggctt cgcggcgcgt cctccgcaga 360
ggcccccgac ggagacaagg acgccccaga gcocctggac aaggtcatca ttctgtctcc 420
gggaatctct gatgccacag ctcotgcctg gcctcctcct ggggaagacc caggaaccac 480
cccacctggc cacagtgtcc ctgtgccagc cacagagctg ggctccactg aactggtgac 540
caccaagacg gccggccctg agcaacaata gcagggagcc ggcaggaggt ggcccctgcc 600
ctccctctgg acccccagcc aggggcttgg aaatcaaatt cagctcttca ctccagcatg 660
cacatgccct ctttctggga ccaggctaac cctgcagaag cacagacact acagaccaca 720
gcattcagcc cccatggagt ttggtgtgct tgcctttggc ttcagacctc accatctttg 780
acagcccttg aaggtggtag cccagctcct gttcctgtgc cttcaaaagg ctggggcact 840
atgagtaaaa gaccgctttt aaaatgggga aggcaccatt aagccaaaat gaatctgaaa 900
aaagac 906 <210> 4 <211> 903 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 4
ggcgcgccgc accatgaggc gagggccccg gagcctgcgg ggcagggaog cgccagcccc 60
cacgccctgc gtcccggccg agtgcttcga cctgctggtc cgccactgcg tggcctgcgg 120
gctcctgcgc acgccgcggc cgaaaccggc cggggccagc agccctgcgc ccaggacggc 180
gctgcagccg caggagtcgg tgggcgcggg ggccggcgag gcggcgctgc ccctgcccgg 240
gctgctcttt ggcgcccccg cgctgctggg cctggcactg gtcctggcgc tggtcctggt 300
gggtctggtg agctggaggc ggcgacagcg gcggcttcgc ggcgcgtcct ccgcagaggc 360
ccccgacgga gacaaggacg ccccagagcc cctggacaag gtcatcattc tgtctccggg 420
aatctctgat gccacagctc ctgcctggcc tcctcctggg gaagacccag gaaccacccc 480
acctggccac agtgtccctg tgccagccac agagctgggc tccactgaac tggtgaccac 540
caagacggcc ggccctgagc aacaatagca gggagccggc aggaggtggc ccctgccctc 600
octctggacc cccagccagg ggcttggaaa tcaaattcag ctcttcactc cagcatgcac 660
atgccctctt tctgggacca ggctaaccct gcagaagcac agacactaca gaccacagca 720
ttcagccccc atggagtttg gtgtgcttgc ctttggcttc agacctcacc atctttgaca 780
gcccttgaag gtggtagccc agctcctgtt cctgtgcctt caaaaggctg gggcactatg 840
agtaaaagac cgcttttaaa atggggaagg caccattaag ccaaaatgaa tctgaaaaaa 900
gac 903
PL 207 267 B1
<210 5
<211> 185
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400 5
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 35 40 45
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val 50 55 60
Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe 65 70 75 80
Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu 85 90 95
Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin Arg Arg Leu Arg Gly Ala 100 105 110
Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu 115 120 125
Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro 130 135 140
Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His 145 150 155 160
Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr 165 170 175
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 180 185
<210 6
<211> 1187
<212> DNA
<213> Homo
<400> 6
sapiens
PL 207 267 B1
gggcgcctac aatctcagct actcgggagg ctgaggcaga gaattgtttg aacccgggag 60
gcagagcttg cagtgagccg agatagcgcc attgcactcc agcctgggcg acagagcgag 120
actccgtctc aaaaaaaaaa aaagaaaaga aaggggggcc ccaggcgagc tcggtcccac 180
ccagcaggcg ggggcggggc agggcagagt gctccccccg ccccccgctt cctccccgag 240
ggccccggag cccagctcag cctcagtccc cgcagcttgt gcggcggcgt cggcaccatg 300
aggcgagggc cccggagcct gcggggcagg gacgcgccag cccccacgcc ctgcgtcccg 360
gccgagtgct tcgacctgct ggtccgccac tgcgtggcct gcgggctcct gcgcacgccg 420
cggccgaaac cggccggggc cagcagccct gcgcccagga cggcgctgca gccgcaggag 480
tcggtgggcg cgggggccgg cgaggcggcg ctgcccctgc ccgggctgct ctttggcgcc 540
cccgcgctgc tgggcctggc actggtcctg gcgctggtcc tggtgggtct ggtgagctgg 600
aggcggcgac agcggcggct tcgcggcgcg tcctccgcag aggcccccga cggagacaag 660
gacgccccag agcccctgga caaggtcatc attctgtctc cgggaatctc tgatgccaca 720
gctcctgcct ggcctcctcc tggggaagac ccaggaacca ccccacctgg ccacagtgtc 780
cctgtgccag ccacagagct gggctccact gaactggtga ccaccaagac ggccggccct 840
gagcaacaat agcagggagc cggcaggagg tggcccctgc cctccctctg gacccccagc 900
caggggcttg gaaatcaaat tcagctcttc actccagcat gcacatgccc tctttctggg 960
accaggctaa ccctgcagaa gcacagacac tacagaccac agcattcagc ccccatggag 1020
tttggtgtgc ttgcctttgg cttcagacct caccatcttt gacagccctt gaaggtggta 1080
gcccagctcc tgttcctgtg ccttcaaaag gctggggcac tatgagtaaa agaccgcttt 1140
taaaatgggg aaggcaccat taagccaaaa tgaatctgaa aaaagac 1187
<210> 7 <211> 266 <212> PRT
<213> <400> Homo 7 sapiens
Thr 1 Arg Glu Ala Glu 5 Leu Ala Val Ser Arg 10 Asp Ser Ala Ile Ala 15 Leu
Gin Pro Gly Arg Gin 20 Ser Glu Thr Pro 25 Ser Gin Lys Lys Lys 30 Lys Lys
Arg Lys Gly 35 Gly Pro Arg Arg Ala 40 Arg Ser His Pro Ala 45 Gly Gly Gly
Gly Ala Gly Gin Ser Ala Pro Pro Ala Pro Arg Phe Leu Pro Glu Gly
PL 207 267 B1
55 60
Pro Gly Ala Gin Leu Ser Leu Ser Pro Arg Ser Leu Cys Gly Gly Val 65 70 75 80
Gly Thr Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro 85 90 95
Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 100 105 110
His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 115 120 125
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 130 135 140
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu 145 150 155 160
Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val 165 170 175
Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin Arg Arg Leu Arg Gly 180 185 190
Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro 195 200 205
Leu Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala 210 215 220
Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly 225 230 235 240
His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val 245 250 255
Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin
260
<210> 8
<211> 1943
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 8
PL 207 267 B1
gaattcggca cgagcccaga ctcggaactg tcccagctgc atgaggcggc gacatgggcg 60
ccaggagact ccgggtccga agccagagga gccgggacag ctcggtgccc acccagtgca 120
atcagaccga gtgcttcgac cctctggtga gaaactgcgt gtcctgtgag ctcttccaca 180
cgccggacac tggacataca agcagcctgg agcctgggac agctctgcag cctcaggagg 240
gctccgcgct gagacccgac gtggcgctgc tcgtcggtgc ccccgcactc ctgggactga 300
tactggcgct gaccctggtg ggtctagtga gtctggtgag ctggaggtgg cgtcaacagc 360
tcaggacggc ctccccagac acttcagaag gagtccagca agagtccctg gaaaatgtct 420
ttgtaccctc ctcagaaacc cctcatgcct cagctcctac ctggcctccg ctcaaagaag 480
atgcagacag cgccctgcca cgccacagcg tcccggtgcc cgccacagaa ctgggctcca 540
ccgagctggt gaccaccaag acagctggcc cagagcaata gcagcagtgg aggctggaac 600
ccagggatct ctactgggct tgtggacttc acccaacagc ttgggaaaga acttggccct 660
tcagtgacgg agtcctttgc ctggggggcg aacccggcag aaccagacac tacaggccac 720
atgagattgc ttttgtgtta gctcttgact tgagaacgtt ccatttctga gatggttttt 780
aagcctgtgt gccttcagat ggttggatag acttgagggt tgcatattta atctctgtag 840
tgagtcggag actggaaact taatctcgtt ctaaaaattt tggattactg ggctggaggt 900
atggctcagc agttcggttt gtgtgctgtt ctagccgagg actccagttg ttcagcttcc 960
cggaactcag atctggcagc ttaagaccac ctgtcactcc agcccctgga acatccttgc 1020
ctccaaaggc accagcactc atttgctcta gagcacacac acacacacac acacacacac 1080
acacacacac acacacacat atgcatgcat gcacacttaa aaatgtcaaa attagcggct 1140
ggagaaattc atggtcaaca gcgcttactg tgattccaga ggatgagagt ttgattccca 1200
gaatgcactg cgggtggctc attactgagc ataacttttg cttcagggga cctgatgcct 1260
ctggacttca tgggcatctg tattcacgtg cacatcctac acacacacac acacacacac 1320
acagacatac acacacacac actcttttac aaatgataaa atataagata ggcatggtgg 1380
tacacacctt taatcccaac attggggaag caaaggcagg caggtaactg agttggaggc 1440
catcctggtc tacatagcaa gttccaggct aaccagagct aaatggtgag accaagtctc 1500
aaaataatac tcccccccca aaaaaaaaaa acttttaaat tttgattttt ttcttttatt 1560
attatttttt atattaattt catggtgttt agaagtggta tacttagatg gtgactaaga 1620
ggaggtaaag ccatcaggac tgagccccta acatacaagg agaaagcaga gacaatgaac 1680
acgcccctct cctgctgtgt gccagctctg gaccaccagc cagagggcaa tcatcagatg 1740
tgggccctag aaccttcaga gccgaaagct aaatcaatct catttctttg taaagctatt 1800
PL 207 267 B1
tagccttagg tgttttgtta cggtgatata aaatggacta acacaggcac tatgagtaag 1860
aagcttttct ttgagctggg aaaggtactg ttaaaccaaa attaatctga ataaaaaaag 1920
gctaagggga agacacttaa aaa 1943
<210> 9 <211> 175 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9
Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser 15 10 15
Ser Val Pro Thr Gin Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val 20 25 30
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His 35 40 45
Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Gly Ser 50 55 60
Ala Leu Arg Pro Asp Val Ala Leu Leu Val Gly Ala Pro Ala Leu Leu 65 70 75 80
Gly Leu Ile Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Ser Leu Val Ser 85 90 95
Trp Arg Trp Arg Gin Gin Leu Arg Thr Ala Ser Pro Asp Thr Ser Glu 100 105 110
Gly Val Gin Gin Glu Ser Leu Glu Asn Val Phe Val Pro Ser Ser Glu 115 120 125
Thr Pro His Ala Ser Ala Pro Thr Trp Pro Pro Leu Lys Glu Asp Ala 130 135 140
Asp Ser Ala Leu Pro Arg His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu 145 150 155 160
Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin 165 170 175
<210> 10
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo
sapiens
PL 207 267 B1 <400> 10
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 15 10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 35 40 45
Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly 50 55 60
Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly 65 70 75 80
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val 85 90 95
Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser 100 105 110
Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp 115 120 125
Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala 130 135 140
Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser 145 150 155 160
Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr 165 170 175
Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gin Gin 180
<210> 11
<211> 963
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220><221> sig_peptide
<222> (1) · • (63)
<223> koduje peptyd sygnałowy
<220><221> misc feature
<222> (64) ..(66)
PL 207 267 B1 <223> wprowadza miejsce restrykcyjne <220x221> misc_feature <222> (67)..(276) <223> koduje region domeny zewnątrzkomórkowej BAFF-R <220><221> misc_feature <222> (277)..(279) <223> wprowadza miejsce restrykcyjne <220><221> misc_feature <222> (280)..(960) <223> koduje ludzki IgGl Fc <400> 11
atggagacag acacactcct gttatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacgtcaggc gagggccccg gagcctgcgg ggcagggacg cgccagcccc cacgcoctgc 120
gtcccggccg agtgcttcga cctgctggtc cgccactgcg tggcctgcgg gctcctgcgc 180
acgccgcggc cgaaaccggc cggggccagc agccctgcgc ccaggacggc gctgcagccg 240
caggagtcgg tgggcgcggg ggccggcgag gcggcggtcg acaaaactca cacatgccca 300
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctottccc cccaaaaccc 360
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 420
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 480
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 540
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 600
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 660
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag octgacctgc 720
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 780
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ttggactccg acggctcctt cttcctctac 840
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 900
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa 960
tga 963
<210> <211> <212> <213> 12 320 PRT Homo sapiens
<220x221> SYGNAŁ
<222> (1) .. . (21)
<223> sekwencja sygnałowa <22OX221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22)
PL 207 267 B1 <223> kodowany przez region wprowadzający miejsce restrykcyjne <220><221> PEPTYD <222> (23)..(92) <223> BAFF-R domena zewnątrzkomórkowa <220><221> MISC_FEATDRE <222> (93)..(93) <223> kodowany przez region wprowadzający miejsce restrykcyjne <220x221> PEPTYD <222> (94)..(320) <223> Humań IgGl Fc <400> 12
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Val Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg 20 25 30
Asp Ala Pro Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu 35 40 45
Leu Val Arg His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro 50 55 60
Lys Pro Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro 65 70 75 80
Gin Glu Ser Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Val Asp Lys Thr 85 90 95
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 100 105 110
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 115 120 125
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 130 135 140
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 145 150 155 160
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 165 170 175
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
PL 207 267 B1
180 185 190
Lys Cys Lys Val 195 Ser Asn Lys Ala 200 Leu Pro Ala Pro Ile Glu 205 Lys Thr
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu
210 215 220
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys
225 230 235 240
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
245 250 255
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
260 265 270
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
275 280 285
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
290 295 300
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
305 310 315 320
<210> 13
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
70
PL 207 267 B1
<210> 14
<211> 65
<212> PRT
<213> Mus musculus
400> 14
Gly Ala Arg Arg Leu
Val Pro Thr Gin Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg 20 25 30
Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His Thr 35 40 45
Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Gly Ser Ala 50 55 60
Leu <210> 15 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> WARIANT <222> (1)..(1) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (2)..(2) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (5)..(5) <223> podstawienie <22OX221> WARIANT <222> (6)..(6) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (7)..(7) <223> podstawienie <2 2 0X221> WARIANT <222> (10)..(10) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (15) . . (15) <2 2 0X221> WARIANT <222> (12)..(12) <223> podstawienie
PL 207 267 B1 <223> podstawienie <400> 15
Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser Pro 15 10 15
Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 20 25 30
His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 50 55 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 16 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> WARIANT <222> (1)..(1) <223> podstawienie <22 0X221> WARIANT <222> (2)..(2) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (10)..(10) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (12) . . (12) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (15)..(15) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (16)..(16) <223> podstawienie <220X221> WARIANT <222> (17)..(17) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (20)..(20) <223> podstawienie
PL 207 267 B1 <400> 16
Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser Ser 15 10 15
Val Pro Thr Gin Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 20 25 30
His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 50 55 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 17 <211> 73
212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> WARIANT <222> (1)..(1) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (2)..(2) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (5)..(5)<223>
podstawienie <220><221> WARIANT <222> (6)..(6)<223>
podstawienie <220><221> WARIANT <222> (7)..(7) <223> podstawienie <22OX221> WARIANT <222> (10)..(10) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (12)..(12) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (15)..(15) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (16)..(16)
PL 207 267 B1 <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (17) . . (17) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (20)..(20) <223> podstawienie <220Χ221> WARIANT <222> (22)..(22) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (23)..(23) <223> podstawienie <220Χ221> WARIANT <222> (24)..(24) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (29)..(29) <223> podstawienie <400> 17
Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser Ser 15 10 15
Val Pro Thr Gin Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg 20 25 30
His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala 35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser 50 55 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 18 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> WARIANT <222> (1)..(1) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (2)..(2) <223> podstawienie
PL 207 267 B1 <2 2 ΟΧ 221> WARIANT <222> (5)..(5) <223> podstawienie <220><221> WARIANT
222> (6)..(6) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (7)..(7) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (10)..(10) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (12)..(12) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (15)..(15) <223> podstawienie <22ΟΧ221> WARIANT <222> (16)..(16) <223> podstawienie <220X2 21> WARIANT <222> (17). . (17) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (20)..(20) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (22)..(22) <223> podstawienie <2 2 0X2 21> WARIANT <222> (23)..(23) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (24)..(24) <223> podstawienie <220><221> WARIANT 222> (29)..(29) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (33)..(33) <223> podstawienie <400> 18
Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gin Arg Ser Arg Asp Ser Ser 15 10 15
PL 207 267 B1
Val Pro Thr Gin Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg
20 25 30
Asn Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser
50 55 60
Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala
65 70
<210> 19 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220><221> WARIANT <222> (22)..(22) <223> podstawienie
<220><221> WARIANT <222> (23)..(23) <223> podstawienie
<220x221> WARIANT <222> (24)..(24) <223> podstawienie
<220><221> WARIANT <222> (29)..(29) <223> podstawienie
<400> 19
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Pro Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 20
PL 207 267 B1 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> WARIANT <222> (22)..(22) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (24)..(24 )<223> podstawienie <22OX221> WARIANT <222> (29)..(29) <223> podstawienie <400> 20
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Pro Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 21 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220x221> WARIANT <222> (22).. (22) <223> podstawienie <22 0X221> WARIANT <222> (23)..(23) <223> podstawienie <220><221> WARIANT <222> (29)..(29) <223> podstawienie <400> 21
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Gin Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
PL 207 267 B1
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
65 70
<210> 22
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220><221> WARIANT
<222> (22), •·(22)
<223> podstawienie
<220><221> WARIANT
<222> (29). .·(29)
<223> podstawienie
<400> 22
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 23 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> WARIANT <222> (23)..(23) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (24)..(24) <223> podstawienie
PL 207 267 B1 <220x221> WARIANT <222> (29)..(29) <223> podstawienie <400> 23
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp 10 Ala Pro Ala Pro 15 Thr
1 5
Pro Cys Val Gin Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
65 70
<210> 24 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220><221> WARIANT
<222> (23), ..(23)
<223> podstawienie
<220><221> WARIANT
<222> (29). •·(29)
<223> podstawienie
<400> 24
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Pro Cys Val Gin Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70
PL 207 267 B1 <210> 25 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220x221> WARIANT <222> (29)..(29) <223> podstawienie <400> 25
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
65 70
<210> 26
<211> 70
212> PRT
213> 214> <213> Homo sapiens
215> <220X221> WARIANT
216> <222> (22) . . (22)
217> <223> podstawienie
<220><221> WARIANT
<222> (29) , . . (29)
<223> podstawienie <400> 26
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Ser Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
PL 207 267 B1
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70
<210> 27
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220x221> WARIANT
<222> (22) •·(22)
<223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (29)..(29) <223> podstawienie <400> 27
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Ala Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 28 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220x221> WARIANT <222> (22)..(22) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (23)..(23) <223> podstawienie <220x221> WARIANT <222> (24) . . (24) <223> podstawienie <400> 28
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
PL 207 267 B1
Pro Cys Asn Gin Thr Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
65 70
<210> 29
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<22OX221> WARIANT
<222> (22) ..(22)
<223> podstawienie
<220x221> WARIANT
<222> (24) .. (24)
<223> podstawienie
<400> 29
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Pro Cys Asn Pro Thr Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val
20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 30 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> WARIANT <222> (22)..(22) <223> podstawienie
PL 207 267 B1 <220><221> WARIANT <222> (23)..(23) <223> podstawienie <400> 30
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Gin Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 31 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220X221> WARIANT <222> (23)..(23) <223> podstawienie
<400> 31
Arg Arg Gly 1 Pro Arg 5 Ser Leu Arg Gly Arg 10 Asp Ala Pro Ala Pro 15 Thr
Pro Cys Val Gin 20 Ala Glu Cys Phe Asp 25 Leu Leu Val Arg His 30 Cys Val
Ala Cys Gly 35 Leu Leu Arg Thr Pro 40 Arg Pro Lys Pro Ala 45 Gly Ala Ser
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala
55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala
65
<210> 32
<211> 70
<212> PRT
PL 207 267 B1 <213> Homo sapiens <220x221> WARIANT <222> (22)..(22) <223> podstawienie <400> 32
Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr 15 10 15
Pro Cys Asn Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val 20 25 30
Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser 35 40 45
Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin Glu Ser Val Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Gly Glu Ala Ala 65 70 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220x223> Starter oligonukleotydowy <400> 33 ggccgagtgc ttcgacctgc t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220x223> Starter oligonukleotydowy <400> 34 ggtccgccac tgcgtggcct g 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22OX223> Starter oligonukleotydowy <400> 35 caccaagacg gccggccctg a 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 207 267 B1 <220><223> Starter oligonukleotydowy <400> 36 gggcgcctac aatctcagct a 21 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220><223> Starter oligonukleotydowy <400> 37 ggcggaccag caggtcgaag cactc 25

Claims (65)

Zastrzeżenia patentowe
1. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R (receptor czynnika aktywującego komórki B należący do rodziny czytnika martwicy nowotworów TNF) obejmujący:
(a) SEK NR ID: 5;
(b) fragment SEK NR ID: 5, który wiąże się z BAFF (czynnikiem aktywującym komórki B należącym do rodziny TNF), (c) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 70% identyczna z SEK NR ID: 5 lub fragmentem SEK NR ID: 5;
(d) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 80% identyczna z SEK NR ID: 5 lub fragmentem SEK NR ID: 5;
(e) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 90% identyczna z SEK NR ID: 5 lub fragmentem SEK NR ID: 5;
(f) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 95% identyczna z SEK NR ID: 5 lub fragmentem SEK NR ID: 5; lub (g) SEK NR ID: 5 lub fragment SEK NR ID: 5 zmodyfikowane przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
2. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje:
(a) SEK NR ID: 10;
(b) fragment SEK NR ID: 10, który wiąże się z BAFF, (c) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 70% identyczna z SEK NR ID: 10 lub fragmentem SEK NR ID: 10;
(d) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 80% identyczna z SEK NR ID: 10 lub fragmentem SEK NR ID: 10;
(e) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 90% identyczna z SEK NR ID: 10 lub fragmentem SEK NR ID: 10;
(f) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 95% identyczna z SEK NR ID: 10 lub fragmentem SEK NR ID: 10; lub (g) SEK NR ID: 10 lub fragment SEK NR ID: 10 zmodyfikowane przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
3. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obejmuje:
(a) aminokwasy 19-35 z SEK NR ID: 5;
(b) aminokwasy 19-35 z SEK NR ID: 5 zmodyfikowanej przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF, (c) SEK NR ID: 13, lub (d) SEKNR ID: 13 zmodyfikowaną przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
PL 207 267 B1
4. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:
(a) SEK NR ID: 15;
(b) SEK NR ID: 16;
(c) SEK NR ID: 17;
(d) SEKNR ID: 18;
(e) SEK NR ID: 19;
(f) SEK NR ID: 20;
(g) SEK NR ID: 21;
(h) SEK NR ID: 22;
(i) SEK NR ID: 23;
(j) SEK NR ID: 24;
(k) SEK NR ID: 25;
(l) SEK NR ID: 26;
(m) SEK NR ID: 27;
(n) SEK NR ID: 28;
(o) SEK NR ID: 29;
(p) SEK NR ID: 30;
(q) SEK NR ID: 31;
(r) SEK NR ID: 32;
(s) fragmentu dowolnej sekwencji spośród (a) - (r), który wiąże się z BAFF, i (t) dowolnej spośród sekwencji z (a) - (s), zmodyfikowanej przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowany polipeptyd wiąże się z BAFF.
5. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:
(a) SEK NR ID: 19;
(b) SEK NR ID: 22;
(c) SEK NR ID: 24;
(d) SEK NR ID: 25;
(e) SEK NR ID: 26;
(f) SEK NR ID: 27; i (g) fragmentu dowolnej sekwencji spośród (a) - (f), który wiąże się z BAFF.
6. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wiąże się z BAFF i ma zmniejszoną skłonność do agregacji w porównaniu z natywnym polipeptydem BAFF-R i obejmuje:
(a) SEK NR ID: 5 lub SEK NR ID: 10, przy czym jeden albo większa liczba niekonserwowanych aminokwasów w regionie C19-L27 natywnego polipeptydu BAFF-R jest zastąpiona odpowiadającymi aminokwasami z polipeptydu BAFF-R z SEK NR ID: 9; lub (b) fragment sekwencji z (a), który wiąże się z BAFF.
7. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R według zastrz. 6, znamienny tym, że podstawienia są wprowadzone w jednej albo większej liczbie pozycji wybranych z grupy składającej się z:
(a) V20, P21, A22 i L27 SEK NR ID: 10;
(b) V41, P42, A43 i L48 SEK NR ID: 12; i (c) C19 do L27 fragmentu SEK NR ID: 10 obejmującego aminokwasy 2-71.
8. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje aminokwasy 2-71 SEK NR ID: 10, przy czym zmienione aminokwasy są wybrane z grupy składającej się z:
(a) V20N, P21Q, A22T i L27P;
(b) V20N i L27P;
(c) P21Q i L27P;
(d) L27P;
(e) V20N i L27A; oraz (f) V20N i L27S.
9. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że jest białkiem chimerowym.
10. Chimerowe białko BAFF-R według zastrz. 9, znamienne tym, że obejmuje:
(a) SEK NR ID: 12;
PL 207 267 B1 (b) fragment SEK NR ID: 12, który wiąże się z BAFF, (c) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 80% identyczna z SEK NR ID: 12 lub fragmentem SEK NR ID: 12; lub (d) SEK NR ID: 12 lub fragment SEK NR ID: 12, zmodyfikowane przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
11. Chimerowe białko BAFF-R według zastrz. 10, znamienne tym, że obejmuje aminokwasy 23 - 92 SEK NR ID: 12 i region Fc ludzkiej IgG1.
12. Chimerowe białko BAFF-R według zastrz. 9, znamienne tym, że obejmuje:
(a) region Fc przeciwciała;
(b) sekwencje pochodzące z białka immunoglobuliny;
(c) heterologiczną sekwencję sygnałową; lub (d) S-transferazę glutationową.
13. Chimerowe białko według zastrz. 9, znamienne tym, że obejmuje region stały immunoglobuliny i polipeptyd BAFF-R wybrany z grupy składającej się z:
(a) dowolnej spośród SEK NR ID: 13, SEK NR ID: 14; SEK NR ID: 15; SEK NR ID: 16; SEK NR ID: 17; SEK NR ID: 18; SEK NR ID: 19; SEK NR ID: 20; SEK NR ID: 21; SEK NR ID: 22; SEK NR ID: 23; SEK NR ID: 24; SEK NR ID: 25; SEK NR ID: 26; SEK NR ID: 27; SEK NR ID: 28; SEK NR ID: 29; SEK NR ID: 30; SEK NR ID: 31 i SEK NR ID: 32; oraz (b) fragmentu z (a), który wiąże się z BAFF.
14. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R, znamienny tym, że obejmuje:
(a) SEK NR ID: 9;
(b) fragment SEK NR ID: 9, który wiąże się z BAFF, (c) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 70% identyczna z SEK NR ID: 9 lub fragmentem SEK NR ID: 9;
(d) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 80% identyczna z SEK NR ID: 9 lub fragmentem SEK NR ID: 9;
(e) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 90% identyczna z SEK NR ID: 9 lub fragmentem SEK NR ID: 9;
(f) SEK NR ID: 9 lub fragment SEK NR ID: 9 zmodyfikowane przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
15. Wyizolowany polipeptyd BAFF-R, znamienny tym, że obejmuje:
(a) SEK NR ID: 14;
(b) fragment SEK NR ID: 14, który wiąże się z BAFF, (c) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 70% identyczna z SEK NR ID: 14 lub fragmentem SEK NR ID: 14;
(d) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 80% identyczna z SEK NR ID: 14 lub fragmentem SEK NR ID: 14;
(e) sekwencję aminokwasową, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 90% identyczna z SEK NR ID: 14 lub fragmentem SEK NR ID: 14; lub (f) SEK NR ID: 14 lub fragment SEK NR ID: 14 zmodyfikowane przez jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów, przy czym zmodyfikowana sekwencja wiąże się z BAFF.
16. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd BAFF-R określony w zastrz. 14 lub 15.
17. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd BAFF-R określony w jednym z zastrz. 1 do 13.
18. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z;
(a) SEK NR ID: 3;
(b) SEK NR ID: 4;
(c) SEK NR ID: 6;
(d) SEK NR ID: 11;
(e) nukleotydów 67 - 276 SEK NR ID: 11;
(f) nukleotydów 67 - 276 i 280 - 960 SEK NR ID: 11;
(g) fragmentu, co najmniej 100 kolejnych nukleotydów dowolnej z sekwencji (a)-(e), (h) fragmentu dowolnej z sekwencji (a)-(f), który koduje polipeptyd wiążący się z BAFF,
PL 207 267 B1 (i) sekwencji nukleotydowej, która koduje polipeptyd wiążący się z BAFF i jest w co najmniej 70% identyczna z dowolną spośród (a) - (h);
(i) sekwencji nukleotydowej, która koduje polipeptyd wiążący się z BAFF i jest w co najmniej 80% identyczna z dowolną spośród (a) - (h); i (k) sekwencji nukleotydowej, która koduje polipeptyd wiążący się z BAFF i jest w co najmniej 90% identyczna z dowolną spośród (a) - (h).
19. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17 albo 18, znamienna tym, że koduje polipeptyd BAFF-R, który obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:
(a) SEK NR ID: 5 lub fragmentu SEK NR ID: 5, który wiąże się z BAFF;
(b) SEK NR ID: 10 lub fragmentu z SEK NR ID: 10, który wiąże się z BAFF;
(c) SEK NR ID: 13 lub fragmentu z SEK NR ID: 13, który wiąże się z BAFF;
(d) sekwencji aminokwasowej, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 70% identyczna z dowolną spoś ród (a) - (c);
(e) sekwencji aminokwasowej, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 80% identyczna z dowolną spoś ród (a) - (c); i (f) sekwencji aminokwasowej, która wiąże się z BAFF i jest w co najmniej 90% identyczna z dowolną spoś ród (a) - (c).
20. Cząsteczka kwasu nukleinowego według jednego z zastrz. 17 do 19, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa koduje polipeptyd, który jest mniejszy niż BAFF-R pełnej długości i który wiąże się z BAFF.
21. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że kodowany polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z:
(a) SEK NR ID: 19;
(b) SEK NR ID: 22;
(c) SEK NR ID: 24;
(d) SEK NR ID: 25;
(e) SEK NR ID: 26;
(f) SEK NR ID: 27; i (g) fragmentu dowolnej spośród (a) - (f), który wiąże się z BAFF.
22. Cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową która (a) hybrydyzuje w ostrych warunkach z SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6 lub nukleotydami 67 - 276 z SEK NR ID: 11;
(b) hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją komplementarną do SEK NR ID: 3 lub SEK NR ID: 4, lub (c) jest komplementarna do kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6 lub nukleotydów 67 - 276 z SEK NR ID: 11; przy czym ostre warunki z (a) i (b) stanowią 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 500 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia w 65°C, po czym następuje jedno lub więcej przemywanie 0,2X SSC, 0,1% BSA w 50°C, a nukleotydy sekwencji z (a), (b) i (c) nie stanowią EST AI250289, SEK NR ID: 2 lub depozytu w GenBank o nr dostę pu Z99716.
23. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 22, znamienna tym, że sekwencja nukleotydów jest komplementarna do cząsteczki kwasu nukleinowego określonej w zastrz. 18.
24. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 16, znamienna tym, że obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z:
(a) SEK NR ID: 8;
(b) fragmentu SEK NR ID: 8 obejmującego co najmniej 100 kolejnych nukleotydów;
(c) sekwencji kwasu nukleinowego, która koduje SEK NR ID: 14;
(d) sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd, który jest w co najmniej 70% identyczny z SEK NR ID: 14 i wiąże się z BAFF;
(e) sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd, który jest w co najmniej 90% identyczny z SEK NR ID: 14 i wiąże się z BAFF; i (f) sekwencji kwasu nukleinowego, która jest komplementarna do dowolnej spośród (a)-(e).
25. Wektor obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w jednym z zastrz. 17 do 23.
26. Komórka obejmująca wektor określony w zastrz. 25.
PL 207 267 B1
27. Komórka według zastrz. 26, znamienna tym, że jest komórką jajnika chomika chińskiego.
28. Komórka według zastrz. 26, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 19.
29. Przeciwciało lub polipeptyd obejmujący część przeciwciała wiążącą antygen, znamienne tym, że przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu swoiście wiążą się z częścią BAFF-R polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1-15.
30. Przeciwciało lub polipeptyd według zastrz. 29, znamienne tym, że przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu swoiście wiążą się z polipeptydem BAFF-R o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z:
(a) SEK NR ID: 5;
(b) SEK NR ID: 10;
(c) SEK NR ID: 13; i (d) fragmentu dowolnej sekwencji spośród (a) - (c), który wiąże się z BAFF.
31. Przeciwciało lub polipeptyd według zastrz. 29 albo 30, znamienne tym, że przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu stanowią jeden lub więcej spośród:
(a) monoklonalnego;
(b) poliklonalnego;
(c) chimerowego;
(d) humanizowanego;
(e) przeciwciała jednołańcuchowego;
(f) fragmentu Fab; i (g) fragmentu F(ab)'2.
32. Przeciwciało lub polipeptyd według zastrz. 31, znamienne tym, że przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu specyficznie wiążą polipeptyd określony w zastrz. 2 albo 3.
33. Przeciwciało według zastrz. 29 albo 30 wytwarzane przez:
(a) klon hybrydoma #2.1, zdeponowany jako ATCC nr PTA-3689; lub (b) klon hybrydoma #9.1, zdeponowany jako ATCC nr PTA-3688.
34. Przeciwciało według jednego z zastrz. 29 do 33 lub polipeptyd według jednego z zastrz. 29 do 32, znamienne tym, że przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu blokuje wiązanie BAFF z BAFF-R.
35. Przeciwciało lub polipeptyd według zastrz. 34, znamienne tym, że przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu jest humanizowana.
36. Przeciwciało lub polipeptyd według zastrz. 30, znamienne tym, że przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu jest humanizowana.
37. Hybrydoma wybrana z grupy składającej się z klonu hybrydoma #2.1, zdeponowanego jako ATCC nr PTA-3689 i klonu hybrydoma #9.1, zdeponowanego jako ATCC nr PTA-3688.
38. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej spośród:
(a) polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 13; lub (b) przeciwciała lub polipeptydu obejmującego wiążącą antygen część przeciwciała, jak określono w jednym z zastrz. 29 do 36.
39. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 38, znamienna tym, że zawiera przeciwciało lub polipeptyd obejmujący wiążącą antygen część przeciwciała, jak określono w zastrz. 36.
40. Polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 13 lub przeciwciało lub polipeptyd obejmujący wiążącą antygen część przeciwciała, jak określono w jednym z zastrz. 29 do 36, do stosowania w leczeniu.
41. Zastosowanie polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 13 lub przeciwciała lub polipeptydu obejmującego wiążącą antygen część przeciwciała, jak określono w jednym z zastrz. 29 do 36, do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania lub opóźniania zaburzenia komórek plazmatycznych, choroby autoimmunologicznej, raka komórek B, białaczki, chłoniaka, choroby limfoproliferacyjnej komórek B, chłoniaka Burkitta lub zapalenia.
42. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że zaburzeniem komórek plazmatycznych jest szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstroma, choroba łańcuchów ciężkich, pierwotna albo związana z immunocytami skrobiawica oraz gammopatia monoklonalna o nieustalonym znaczeniu (MGUS).
43. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że chorobą autoimmunologiczną jest reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy, ciężka miastenia, autoimmunoloPL 207 267 B1 giczną anemia hemolityczna, samoistna plamica małopłytkowa, zespół anty-fosfolipidowy, choroba Chagasa, choroba Gravesa, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie guzkowate tętnic lub zapalenie kłębuszków nerkowych.
44. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do leczenia, przeciwdziałania lub opóźniania tocznia zmieniowatego układowego.
45. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do leczenia, przeciwdziałania lub opóźniania reumatoidalnego zapalenia stawów.
46. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że lek zawiera polipeptyd określony w jednym z zastrz. 3 do 5 i jest przeznaczony do leczenia, zapobiegania lub opóźniania tocznia rumieniowatego układowego.
47. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że lek zawiera przeciwciało lub polipeptyd obejmujący wiążącą antygen część przeciwciała, jak określono w zastrz. 36 i jest przeznaczony do leczenia, zapobiegania lub opóźniania tocznia rumieniowatego układowego.
48. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że lek zawiera polipeptyd określony w zastrz. 3 lub zastrz. 5 i jest przeznaczony do leczenia, zapobiegania lub opóźniania reumatoidalnego zapalenia stawów.
49. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że lek zawiera przeciwciało lub polipeptyd obejmujący wiążącą antygen część przeciwciała jak określono w zastrz. 36 i jest przeznaczony do leczenia, zapobiegania lub opóźniania reumatoidalnego zapalenia stawów.
50. Sonda będąca wyizolowanym kwasem nukleinowym składającym się z od 10 do 50 kolejnych nukleotydów wybranych spośród:
(a) sekwencji wybranej z grupy składającej się z SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6;
(b) SEK NR ID: 8;
(c) sekwencji komplementarnej do sekwencji wybranej z grupy składającej się z SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6; oraz (d) sekwencji zdegenerowanych względem sekwencji (a) lub (b) kodujących tę samą sekwencję aminokwasową.
51. Sposób wytwarzania polipeptydu BAFF-R, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) dostarczania komórki określonej w jednym z zastrz. 26 do 28;
(b) hodowania komórki w warunkach dostatecznych do wyrażania polipeptydu BAFF-R; i (c) odzyskiwania polipeptydu BAFF-R.
52. Sposób identyfikowania funkcjonalnie aktywnego zmutowanego polipeptydu BAFF-R, jak określono w jednym z zastrz. 1-15, znamienny tym, że obejmuje ocenę zmutowanego BAFF-R pod kątem jednej albo większej liczby następujących aktywności:
(a) zdolności do wiązania się z BAFF;
(b) zdolności do wiązania się z wewnątrzkomórkowym białkiem docelowym lub jego aktywną biologicznie częścią; oraz (c) zdolności do swoistego wiązania się z przeciwciałem anty-BAFF-R;
przy czym obecność jednej albo większej liczby tych aktywności wskazuje, że zmutowany polipeptyd BAFF-R jest funkcjonalnie aktywny.
53. Sposób identyfikowania związku, który moduluje aktywność BAFF-R, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) doprowadzenia do kontaktu BAFF-R jak określono w jednym z zastrz. 1-15 ze związkiem; i (b) ustalenia, czy aktywność BAFF-R jest modulowana.
54. Sposób wytwarzania polipeptydu BAFF-R o zmniejszonej skłonności do agregacji w porównaniu z natywnym polipeptydem BAFF-R, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) transformowania komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodującym polipeptyd BAFF-R jak określono w jednym z zastrz. 1 do 15, w którym jeden albo większa liczba niekonserwowanych aminokwasów z regionu C19-L27 jest zastąpiona odpowiadającymi aminokwasami z polipeptydu BAFF-R z SEK NR ID: 9;
(b) hodowania komórki w warunkach dostatecznych do wyrażania polipeptydu BAFF-R z zastąpionymi aminokwasami; oraz (c) odzyskiwania polipeptydu BAFF-R z (b).
55. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że niekonserwowanym aminokwasem jest aminokwas niepolarny.
PL 207 267 B1
56. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że aminokwas niepolarny jest zamieniony na aminokwas wybrany z grupy składającej się z proliny, seryny lub alaniny.
57. Zestaw obejmujący, co najmniej jedno przeciwciało jak określono w zastrz. 29 do 36 i kontrolę.
58. Sposób identyfikowania komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R, znamienny tym, że obejmuje:
(a) doprowadzanie do kontaktu sondy oligonukleotydowej obejmującej co najmniej 10 kolejnych nukleotydów z sekwencji wybranej spośród SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6 i sekwencji, które są komplementarne do dowolnej spośród SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6, z próbką biologiczną od osobnika; i (b) pomiar poziomu kwasu nukleinowego kodującego BAFF-R w próbce biologicznej przez wykrywanie poziomów mRNA BAFF-R; lub alternatywnie, (c) oznaczenie, czy kwas nukleinowy BAFF-R w próbce biologicznej został zmutowany albo uleg ł delecji.
59. Zestaw diagnostyczny do identyfikowania komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R, znamienny tym, że obejmuje sondę oligonukleotydową obejmującą co najmniej 10 kolejnych nukleotydów z sekwencji wybranej z grupy składającej się z SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4, SEK NR ID: 6 i sekwencji, które są komplementarne do dowolnej spośród SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 3, SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 6.
60. Zestaw do wykrywania obecności BAFF-R w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje:
wyznakowany związek albo czynnik zdolny do wykrywania polipeptydu BAFF-R jak określono w jednym z zastrz. 1 do 15 lub mRNA kodującego polipeptyd BAFF-R jak określono w jednym z zastrz. 1 do 15 w próbce biologicznej, środek do oznaczania ilości BAFF-R w próbce biologicznej oraz środek do porównywania ze standardem ilości polipeptydu BAFF-R lub mRNA w próbce.
61. Sposób diagnozowania in vitro u osobnika stanu, w którym pośredniczą komórki B, znamienny tym, że obejmuje etapy:
(a) pomiaru ilości polipeptydu BAFF-R jak określono w jednym z zastrz. 1 do 15 lub kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd BAFF-R jak określono w jednym z zastrz. 1 do 15 w próbce biologicznej od osobnika; i (b) porównania ilości polipeptydu BAFF-R lub kwasu nukleinowego dla BAFF-R w próbce od osobnika z ilością polipeptydu BAFF-R lub kwasu nukleinowego BAFF-R w próbce kontrolnej, przy czym zmiana w ilości polipeptydu BAFF-R lub kwasu nukleinowego BAFF-R w próbce od osobnika w porównaniu z ilością polipeptydu BAFF-R lub kwasu nukleinowego BAFF-R w próbce kontrolnej wskazuje na występowanie stanu, w którym pośredniczą komórki B.
62. Sposób oznaczania BAFF-R in vitro w próbce biologicznej od osobnika, znamienny tym, że obejmuje etapy:
wykrywania polipeptydu BAFF-R jak określono w jednym z zastrz. 1 do 15 w próbce biologicznej od osobnika przy użyciu przeciwciała lub polipeptydu obejmującego wiążącą antygen część przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 28 do 35.
63. Sposób według zastrz. 62, znamienny tym, że przeciwciało lub wiążąca antygen część polipeptydu stanowią jeden lub więcej spośród:
(a) monoklonalnego;
(b) poliklonalnego;
(c) chimerowego;
(d) humanizowanego;
(e) przeciwciała jednołańcuchowego;
(f) fragmentu Fab; i (g) fragmentu F(ab)'2.
64. Sposób określania in vitro czy sekwencja genomowego BAFF-R została zmutowana lub usunięta, znamienny tym, że obejmuje etap określania czy cząsteczka kwasu nukleinowego dla BAFF-R w próbce biologicznej od osobnika, została zmutowana lub usunięta, w którym to wykorzystuje się cząsteczkę kwasu nukleinowego zdolną do hybrydyzacji w ostrych warunkach z genomową sekwencją ludzkiego BAFF-R (SEK NR ID: 10) lub mysiego BAFF-R (SEK NR ID: 9),
PL 207 267 B1 przy czym ostre warunki stanowią 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA i 500 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia w
65°C, po czym następuje jedno lub więcej przemywanie 0,2X SSC, 0,1% BSA w 50°C.
PL366331A 2000-09-18 2001-09-06 Wyizolowany polipeptyd BAFF-R, sposób jego wytwarzania i zastosowanie, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka, przeciwciało lub polipeptyd obejmujący część przeciwciała wiążącą antygen, hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna, sonda kwasu nukleinowego, sposoby identyfikowania funkcjonalnie aktywnego zmutowanego polipeptydu BAFF-R, związku modulującego aktywność BAFF-R oraz komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R, sposób wytwarzania polipeptydu BAFF-R o zmniejszonej skłonności do agregacji, zestawy oraz sposób diagnozowania in vitro stanu, w którym pośredniczą komórki B, sposób PL207267B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23315200P 2000-09-18 2000-09-18
US23414000P 2000-09-21 2000-09-21
US26849901P 2001-02-13 2001-02-13
US31218501P 2001-08-14 2001-08-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL366331A1 PL366331A1 (pl) 2005-01-24
PL207267B1 true PL207267B1 (pl) 2010-11-30

Family

ID=27499682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL366331A PL207267B1 (pl) 2000-09-18 2001-09-06 Wyizolowany polipeptyd BAFF-R, sposób jego wytwarzania i zastosowanie, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka, przeciwciało lub polipeptyd obejmujący część przeciwciała wiążącą antygen, hybrydoma, kompozycja farmaceutyczna, sonda kwasu nukleinowego, sposoby identyfikowania funkcjonalnie aktywnego zmutowanego polipeptydu BAFF-R, związku modulującego aktywność BAFF-R oraz komórek lub tkanek z nieprawidłową ekspresją BAFF-R, sposób wytwarzania polipeptydu BAFF-R o zmniejszonej skłonności do agregacji, zestawy oraz sposób diagnozowania in vitro stanu, w którym pośredniczą komórki B, sposób

Country Status (33)

Country Link
US (8) US7112421B2 (pl)
EP (3) EP1352063B1 (pl)
JP (2) JP5904689B2 (pl)
KR (1) KR100935744B1 (pl)
CN (3) CN104311658A (pl)
AR (1) AR030760A1 (pl)
AT (2) ATE360070T1 (pl)
AU (2) AU2001288858B2 (pl)
BG (1) BG66208B1 (pl)
BR (1) BR0113921A (pl)
CA (1) CA2422622C (pl)
CY (2) CY1106708T1 (pl)
CZ (1) CZ299161B6 (pl)
DE (1) DE60128002T2 (pl)
DK (3) DK2325317T3 (pl)
EA (2) EA024034B1 (pl)
EE (1) EE05411B1 (pl)
ES (2) ES2286139T3 (pl)
GE (1) GEP20074267B (pl)
HU (1) HU227331B1 (pl)
IL (3) IL154622A0 (pl)
IS (1) IS6729A (pl)
MX (1) MXPA03002328A (pl)
NO (2) NO332318B1 (pl)
NZ (1) NZ525187A (pl)
PL (1) PL207267B1 (pl)
PT (2) PT1842918E (pl)
RS (1) RS50728B (pl)
SK (1) SK4712003A3 (pl)
TW (1) TWI322181B (pl)
UA (1) UA83458C2 (pl)
WO (1) WO2002024909A2 (pl)
ZA (1) ZA200301903B (pl)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
AU3516899A (en) 1998-05-04 1999-11-23 Dako A/S Method and probes for the detection of chromosome aberrations
WO2001060397A1 (en) * 2000-02-16 2001-08-23 Genentech, Inc. Uses of agonists and antagonists to modulate activity of tnf-related molecules
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
WO2001012812A2 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
PT2275449T (pt) * 2000-06-16 2016-12-27 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
WO2002016411A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
DE60140773D1 (de) 2000-08-18 2010-01-21 Dyax Corp Polypeptide zur Bindung an das B-Lymphozyten-stimulatorische Protein (BLyS)
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
WO2002038766A2 (en) * 2000-11-07 2002-05-16 Zymogenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
EP1365024A4 (en) * 2001-02-28 2005-04-20 Riken TRAF3 BINDING, B-CELL SPECIFIC RECEPTOR
MXPA04001050A (es) * 2001-08-03 2004-07-08 Genentech Inc Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos.
US7112410B1 (en) * 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
WO2003055509A1 (en) * 2001-12-26 2003-07-10 Genset S.A. Agonists and antagonists of bromix for the treatment of metabolic disorders
WO2003072713A2 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
WO2003089616A2 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Soluble mic polypeptides as markers for diagnosis, prognosis and treatment of cancer and autoimmune diseases or conditions
DK1511767T3 (da) * 2002-05-17 2009-11-23 Retrovec Aps Oprenset polypeptid, isolerede nukleinsyrer, som koder for polypeptidet, vektorer og anvendelse deraf
CA2492447A1 (en) * 2002-07-25 2004-02-05 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
AU2004233164B2 (en) 2003-03-28 2009-10-08 Biogen Ma Inc. Truncated BAFF receptors
WO2005005462A2 (en) * 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
BRPI0415709A (pt) * 2003-10-20 2006-12-19 Biogen Idec Inc esquemas terapêuticos para antagonistas de baff
ES2456325T3 (es) 2003-11-06 2014-04-22 Seattle Genetics, Inc. Compuestos de monometilvalina capaces de conjugación con ligandos
WO2005075511A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
CA2595112A1 (en) * 2004-12-31 2006-07-13 Genentech, Inc. Polypeptides that bind br3 and uses thereof
NZ560285A (en) * 2005-01-28 2011-04-29 Biogen Idec Inc Use of baff to treat Th2-mediated conditions
CN101223448B (zh) 2005-05-20 2012-01-18 健泰科生物技术公司 来自自身免疫病受试者的生物学样品的预处理
EP1933873A4 (en) 2005-10-13 2009-12-02 Human Genome Sciences Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PATIENTS WITH POSITIVE DISEASES FOR SELF-ANTIBODIES
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
JP6088723B2 (ja) 2005-11-23 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アッセイに関する組成物及び方法。
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
AR060978A1 (es) 2006-05-30 2008-07-23 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados y sus usos
WO2008008482A2 (en) * 2006-07-13 2008-01-17 Genentech, Inc. Altered br3-binding polypeptides
WO2009052293A1 (en) 2007-10-16 2009-04-23 Zymogenetics, Inc. Combination of blys inhibition and anti-cd 20 agents for treatment of autoimmune disease
MX2010004740A (es) 2007-10-30 2010-05-27 Genentech Inc Purificacion de anticuerpos por cromatografia de intercambio cationico.
EP2315780B8 (en) 2008-07-17 2015-09-23 Novartis AG Compositions and methods of use for therapeutic antibodies
FI3604324T3 (fi) 2008-08-14 2024-05-16 Genentech Inc Menetelmiä epäpuhtauden poistamiseksi käyttäen luontaisen proteiinin syrjäytyksen ioninvaihtomembraanikromatografiaa
KR20110076918A (ko) 2008-09-10 2011-07-06 제넨테크, 인크. 단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
NZ612647A (en) 2009-03-10 2015-03-27 Biogen Idec Inc Anti-bcma antibodies
BR112012004777A2 (pt) 2009-09-03 2019-09-24 Genentech Inc métodos para tratar diagnósticar e monitorar artrite reumatoide
EP2475391B1 (en) 2009-09-09 2018-09-12 Centrose, LLC Extracellular targeted drug conjugates
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
BR112012021873B8 (pt) 2010-03-22 2021-09-14 Genentech Inc composição de matéria, artigo de manufatura, métodos para preparar uma composição, para aumentar a estabilidade de uma proteína em solução aquosa livre de polissorbato e para prevenir ou reduzir a agregação de uma proteína em solução aquosa livre de polissorbato
CN102933236B (zh) 2010-04-15 2014-10-08 斯皮罗根有限公司 吡咯并苯二氮卓类及其结合物
WO2011139718A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Genentech, Inc. Compositions and methods useful for reducing the viscosity of protein-containing formulations
RU2600847C2 (ru) 2010-05-10 2016-10-27 Интас Биофармасьютикалс Лимитед Жидкий состав полипептидов, содержащих fc-домен иммуноглобулина
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
AU2011265054B2 (en) 2010-06-08 2016-09-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
NZ605147A (en) 2010-06-24 2014-12-24 Genentech Inc Compositions and methods containing alkylglycosides for stabilizing protein-containing formulations
EP2640727B1 (en) 2010-11-17 2015-05-13 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US8735347B2 (en) 2011-02-02 2014-05-27 Children's Hospital Medical Center Regulation of energy metabolism and obesity by modulating B cell activating factor (BAFF, BLYS) or BAFF signaling
EP2680884B1 (en) 2011-02-28 2018-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Biological markers and methods for predicting response to b-cell antagonists
WO2012155019A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides
WO2013055987A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
RU2649364C2 (ru) * 2011-12-16 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Составы на основе модифицированного нуклеозида, нуклеотида и нуклеиновой кислоты
TR201815709T4 (tr) 2011-12-22 2018-11-21 Hoffmann La Roche İyon değişim membranı kromatografisi.
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
WO2014057120A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
RS58921B1 (sr) 2012-10-12 2019-08-30 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
PT2906253T (pt) 2012-10-12 2018-11-05 Medimmune Ltd Conjugados de anticorpo anti-psma de pirrolobenzodiazepina
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
HRP20182129T1 (hr) 2012-10-12 2019-02-08 Adc Therapeutics Sa Konjugati protutijelo - pirolobenzodiazepin
LT2906251T (lt) 2012-10-12 2017-12-11 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepino-anti-cd22 antikūno konjugatai
HRP20180945T1 (hr) 2012-10-12 2018-08-10 Adc Therapeutics Sa Konjugati protutijelo-pirolobenzodiazepin
WO2014096368A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6527466B2 (ja) 2012-12-21 2019-06-05 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 増殖性疾患および自己免疫疾患の治療に使用するための非対称ピロロベンゾジアゼピンニ量体
KR102066319B1 (ko) 2013-03-13 2020-01-14 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
NZ710746A (en) 2013-03-13 2018-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2014159981A2 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10442836B2 (en) 2013-08-12 2019-10-15 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo[E]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6671292B2 (ja) 2013-12-16 2020-03-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
EA201691023A1 (ru) 2013-12-16 2016-10-31 Дженентек, Инк. Пептидомиметические соединения и их конъюгаты антитела с лекарственным средством
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
WO2015100246A1 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
WO2016003876A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of multiple sclerosis and neuromyelitis optica
CN106687141A (zh) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其缀合物
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
JP2017531620A (ja) 2014-09-12 2017-10-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン操作抗体及びコンジュゲート
PE20170905A1 (es) 2014-09-17 2017-07-12 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de anticuerpo-disulfuro de las mismas
KR20170101895A (ko) 2014-11-25 2017-09-06 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 접합체
EP3226909A1 (en) 2014-12-03 2017-10-11 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CN109152843A (zh) 2016-05-20 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
JP7043425B2 (ja) 2016-06-06 2022-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド シルベストロール抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
JP7093767B2 (ja) 2016-08-11 2022-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
SI3544636T1 (sl) 2017-02-08 2021-08-31 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin-protitelo
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
HRP20221063T1 (hr) 2017-04-18 2022-11-11 Medimmune Limited Konjugati pirolobenzodiazepina
WO2018193102A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
CA3060225A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Cyano Biotech Gmbh Modified microcystins and nodularins
WO2018219619A1 (en) 2017-05-09 2018-12-06 Cyano Biotech Gmbh Method for modifying microcystins and nodularins
ES2988683T3 (es) 2017-06-14 2024-11-21 Adc Therapeutics Sa Pautas posológicas para la administración de un CAF anti-CD19
JP7220203B2 (ja) 2017-08-18 2023-02-09 メドイミューン・リミテッド ピロロベンゾジアゼピン複合体
CN111788208B (zh) 2017-09-20 2023-11-24 Ph制药有限公司 泰兰他汀类似物
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
WO2020073917A1 (en) 2018-10-09 2020-04-16 Single Cell Technology, Inc. Anti-bcma antibodies
IL282441B2 (en) 2018-10-24 2025-07-01 Hoffmann La Roche Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
CN113631560B (zh) 2019-03-15 2025-02-18 麦迪穆有限责任公司 氮杂环丁烷并苯并二氮杂䓬二聚体和用于治疗癌症的包含它们的缀合物
CN113660953A (zh) 2019-04-01 2021-11-16 豪夫迈·罗氏有限公司 用于稳定含蛋白质制剂的组合物和方法
ES2827148B2 (es) * 2019-11-19 2021-10-19 Instituto Nac De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria Inia Plásmido codificante para el receptor del factor de activación de células B (BAFF-R) y usos del mismo en el tratamiento y prevención de enfermedades inflamatorias en peces
US20230295274A1 (en) 2020-07-27 2023-09-21 Single Cell Technology, Inc. Anti-sars coronavirus-2 spike protein antibodies
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
IL300087A (en) * 2020-08-04 2023-03-01 Novartis Ag Treatment of CLL
CN116133687A (zh) * 2020-08-04 2023-05-16 诺华股份有限公司 B细胞恶性肿瘤的治疗
WO2022246041A2 (en) * 2021-05-20 2022-11-24 Achelois Biopharma, Inc. Compositions and methods for multivalent surface display on enveloped particles
KR20240095442A (ko) 2021-11-03 2024-06-25 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 항체의 특이적 접합
KR20250021316A (ko) 2022-06-07 2025-02-12 듀얼리티 바이올로직스 (쑤저우) 컴퍼니 리미티드 항-b7h3 항체-약물 접합체 및 이의 용도
EP4637833A2 (en) 2022-12-23 2025-10-29 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
AU2024227909A1 (en) * 2023-02-28 2025-08-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Molecules that bind to b-cell activating factor receptor polypeptides
US12173081B2 (en) 2023-03-21 2024-12-24 Biograph 55, Inc. CD19/CD38 multispecific antibodies
WO2024220546A2 (en) 2023-04-17 2024-10-24 Peak Bio, Inc. Antibodies and antibody-drug conjugates and methods of use and synthetic processes and intermediates
CN116626306B (zh) * 2023-05-18 2025-09-16 上海吉宣生物科技有限公司 一种检测尿液中HIV(l+2)抗体试剂条的制备方法、试剂条及试剂笔
CN118949008B (zh) * 2024-07-25 2025-06-10 安徽医科大学第二附属医院 一种可溶性b淋巴细胞刺激因子受体3和脂联素球部融合蛋白制备方法及其应用

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
AU633958B2 (en) 1989-07-25 1993-02-11 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5945397A (en) 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
IL98764A0 (en) 1990-07-10 1992-07-15 Smithkline Beecham Corp Oxamides
WO1992009689A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Stratagene PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS)
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP0672131B1 (en) 1992-10-30 2003-12-17 The General Hospital Corporation A novel cell cycle control protein
US5547835A (en) 1993-01-07 1996-08-20 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
DE69320824T2 (de) 1993-12-09 1999-05-12 Stmicroelectronics S.R.L., Agrate Brianza, Mailand/Milano Integrierte Schaltung zur Überwachung der Benutzung von Redunanzspeicherbauelementen in einer Halbleiterspeichereinrichtung
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
JP2001501453A (ja) 1996-03-14 2001-02-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子δおよびε
US6541224B2 (en) 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
PT939804E (pt) 1996-10-25 2005-11-30 Human Genome Sciences Inc Neutroquina alfa
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
WO1998027114A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
CA2292899A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
WO1998055620A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
WO1999004001A1 (en) 1997-07-21 1999-01-28 Zymogenetics, Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
BR9812433A (pt) 1997-09-12 2000-09-26 Biogen Inc Kay- uma proteìna do sistema de imunização
HUP0004611A3 (en) 1997-09-12 2002-04-29 Apotech R & D Sa April- a novel protein with growth effects
US6297367B1 (en) 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
WO1999033980A2 (en) 1997-12-30 1999-07-08 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
WO2000026244A2 (en) 1998-11-04 2000-05-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
WO2000040716A2 (en) * 1999-01-07 2000-07-13 Zymogenetics, Inc. Soluble receptor br43x2 and methods of using them for therapy
AU762839B2 (en) 1999-01-25 2003-07-03 Apoxis Sa Baff, related blocking agents and their use in the stimulation and inhibition of B-cells and immunoglobulins in immune responses
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US6475986B1 (en) 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
WO2000050597A2 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
AU3380200A (en) 1999-02-24 2000-09-14 General Hospital Corporation, The Method for cloning signal transduction intermediates
WO2000058362A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
US6475987B1 (en) 1999-05-06 2002-11-05 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 receptor homologues
US20030166003A1 (en) 1999-06-14 2003-09-04 Cochran Andrea G. Structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
WO2001012812A2 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
CA2399387C (en) 2000-02-11 2015-11-03 Biogen, Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
PT2275449T (pt) 2000-06-16 2016-12-27 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
EP1309718A4 (en) 2000-08-15 2004-08-25 Human Genome Sciences Inc NEUTROKINE-ALPHA AND NEUTROKINE-ALPHA SPLICE VARIANT
DE60140773D1 (de) 2000-08-18 2010-01-21 Dyax Corp Polypeptide zur Bindung an das B-Lymphozyten-stimulatorische Protein (BLyS)
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
WO2002038766A2 (en) 2000-11-07 2002-05-16 Zymogenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
AU2002342669C1 (en) 2001-05-11 2010-10-07 Amgen, Inc. Peptides and related molecules that bind to TALL-1
MXPA04001050A (es) 2001-08-03 2004-07-08 Genentech Inc Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos.
AU2002330074A1 (en) 2001-09-21 2003-04-01 Amgen Inc. Tall-1 receptor molecules and uses thereof
AU2002356858A1 (en) 2001-10-24 2003-05-06 National Jewish Medical And Research Center Structure of tall-1 and its cognate receptor
AU2002364954A1 (en) 2001-11-16 2003-07-15 Human Genome Sciences, Inc. ANTIBODIES THAT IMMUNOSPECIFICALLY BIND TO BLyS
WO2005005462A2 (en) 2003-06-05 2005-01-20 Genentech, Inc. Blys antagonists and uses thereof
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione

Also Published As

Publication number Publication date
NZ525187A (en) 2006-02-24
US20040072188A1 (en) 2004-04-15
CN104311658A (zh) 2015-01-28
US7709220B2 (en) 2010-05-04
SK4712003A3 (en) 2003-10-07
CY1113421T1 (el) 2016-06-22
US20120070437A1 (en) 2012-03-22
US8026072B2 (en) 2011-09-27
DE60128002T2 (de) 2008-01-03
EP1842918B2 (en) 2016-07-27
AU2001288858A2 (en) 2002-04-02
JP2004509624A (ja) 2004-04-02
IL206414A (en) 2012-02-29
PL366331A1 (pl) 2005-01-24
US20060240518A1 (en) 2006-10-26
WO2002024909A2 (en) 2002-03-28
WO2002024909A3 (en) 2003-07-31
US20060240517A1 (en) 2006-10-26
BG107621A (bg) 2004-01-30
YU19903A (sh) 2006-05-25
NO332318B1 (no) 2012-08-27
US7112421B2 (en) 2006-09-26
NO20031248L (no) 2003-05-16
CA2422622C (en) 2010-11-16
EE05411B1 (et) 2011-04-15
DK1842918T3 (da) 2012-07-23
MXPA03002328A (es) 2003-06-06
ES2286139T3 (es) 2007-12-01
US7635677B2 (en) 2009-12-22
HK1158260A1 (en) 2012-07-13
BR0113921A (pt) 2004-12-14
BG66208B1 (bg) 2012-04-30
HU227331B1 (en) 2011-03-28
PT1352063E (pt) 2007-07-11
KR20030074596A (ko) 2003-09-19
EA012833B1 (ru) 2009-12-30
ZA200301903B (en) 2004-06-25
ES2388153T3 (es) 2012-10-09
US20060240520A1 (en) 2006-10-26
AU8885801A (en) 2002-04-02
EE200300107A (et) 2005-02-15
EP2325317B2 (en) 2016-07-27
EA200300381A1 (ru) 2003-10-30
DE60128002D1 (de) 2007-05-31
HK1059283A1 (en) 2004-06-25
EP1842918A1 (en) 2007-10-10
JP2014064585A (ja) 2014-04-17
CY1106708T1 (el) 2012-05-23
HUP0401591A3 (en) 2005-05-30
CN1622995B (zh) 2013-09-04
AU2001288858B2 (en) 2007-11-01
IL154622A (en) 2010-11-30
RS50728B (sr) 2010-08-31
US8524672B2 (en) 2013-09-03
CN1622995A (zh) 2005-06-01
US20100311189A1 (en) 2010-12-09
US7638327B2 (en) 2009-12-29
KR100935744B1 (ko) 2010-01-06
DK1352063T3 (da) 2007-08-06
NO20120869A1 (no) 2014-02-07
EP1352063B1 (en) 2007-04-18
AR030760A1 (es) 2003-09-03
IL206414A0 (en) 2010-12-30
NO20031248D0 (no) 2003-03-18
EP2325317B1 (en) 2012-11-07
JP5904689B2 (ja) 2016-05-25
GEP20074267B (en) 2007-12-25
EP1842918B1 (en) 2012-04-18
TWI322181B (en) 2010-03-21
IL154622A0 (en) 2003-09-17
DK2325317T3 (da) 2013-01-07
EA024034B1 (ru) 2016-08-31
CA2422622A1 (en) 2002-03-28
UA83458C2 (uk) 2008-07-25
CZ299161B6 (cs) 2008-05-07
WO2002024909A9 (en) 2003-04-03
ATE554171T1 (de) 2012-05-15
IS6729A (is) 2003-02-28
EP2325317A1 (en) 2011-05-25
EP1352063A2 (en) 2003-10-15
US20060240519A1 (en) 2006-10-26
HUP0401591A2 (hu) 2004-11-29
EA200901129A1 (ru) 2010-04-30
US20140187485A1 (en) 2014-07-03
PT1842918E (pt) 2012-07-23
ATE360070T1 (de) 2007-05-15
CN1940068A (zh) 2007-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100935744B1 (ko) 신규 수용체의 핵산 및 폴리펩티드
JP2004509624A5 (pl)
AU2001288858A1 (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
HK1158260B (en) Receptor nucleic acids and polypeptides
HK1059283B (en) Receptor nucleic acids and polypeptides