PT2489364E - Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos - Google Patents

Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos Download PDF

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PT2489364E
PT2489364E PT121577837T PT12157783T PT2489364E PT 2489364 E PT2489364 E PT 2489364E PT 121577837 T PT121577837 T PT 121577837T PT 12157783 T PT12157783 T PT 12157783T PT 2489364 E PT2489364 E PT 2489364E
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Peter D Senter
Mark X Sliwkowski
Svetlana O Doronina
Brian E Toki
Allen J Ebens
Toni Beth Kline
Paul Polakis
Susan D Spencer
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Seattle Genetics Inc
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Description

DESCRIÇÃO
COMPOSTOS DE MONOMETILVALINA CONJUGADOS COM ANTICORPOS
1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a conjugados de anticorpo-fármaco, a composições incluindo os mesmos, e a métodos para a utilização destes no tratamento de cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa. Também se descreve no presente documento métodos de utilização de compostos de conjugado de anticorpo-fármaco para o diagnóstico ou tratamento in vitro, in situ e in vivo de células de mamíferos, ou condições patológicas associadas.
2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Melhorar a administração de fármacos e outros agentes a células, tecidos e tumores alvos para atingir eficácia máxima e toxicidade mínima tem sido o objetivo central de pesquisas consideráveis durante muitos anos. Embora muitas tentativas tenham sido feitas para desenvolver métodos efetivos para importar moléculas biologicamente ativas para dentro das células, não foi provado, tanto in vivo quanto in vitro, que alguma delas seja inteiramente satisfatória. A otimização da associação do fármaco com seu alvo intracelular, ao mesmo tempo em que se minimiza a redistribuição intercelular do fármaco, por exemplo, para células vizinhas, é frequentemente difícil ou ineficiente. A maioria dos agentes atualmente administrados parentericamente a um paciente não são direcionados, resultando em aplicação sistémica do agente a células e tecidos do corpo onde ele não é necessário, e frequentemente é indesejável. Isto pode resultar em efeitos secundários adversos do fármaco, e frequentemente limita a dose de um fármaco (por exemplo, agentes quimioterápicos (anti-cancro), citotóxicos, inibidores de enzimas e fármacos antivirais ou antimicrobianos) que pode ser administrado. Em comparação, embora a administração oral de fármacos seja considerada um modo conveniente e económico de administração, apresenta os mesmos problemas de toxicidade não especifica em células não afetadas após o fármaco ter sido absorvido na circulação sistémica. Complicações adicionais envolvem problemas com biodisponibilidade oral e residência do fármaco no intestino conduzindo à exposição adicional do intestino ao fármaco e, assim, ao risco de toxicidade no intestino. Consequentemente, um objetivo principal foi desenvolver métodos para direcionar agentes especificamente para células e tecidos. Os benefícios deste tratamento incluem evitar os efeitos fisiológicos gerais de aplicação inapropriada destes agentes a outras células e tecidos, tal como células não infetadas. 0 direcionamento intracelular pode ser obtido por métodos, compostos, e formulações que permitam o acúmulo ou retenção de agentes biologicamente ativos, isto é metabolitos ativos, dentro das células.
Terapêutica de anticorpo monoclonal foi estabelecida para o tratamento direcionado de pacientes com cancro, distúrbios imunológicos e angiogénicos. A utilização de conjugados de anticorpo-fármaco para a administração local de agentes citotóxicos ou citostáticos, por exemplo, fármacos para destruir ou inibir células tumorais no tratamento de cancro (Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; Patente US N° 4975278) permite, teoricamente, a administração direcionada da fração de fármaco a tumores, e acúmulo intracelular nos mesmos, enquanto a administração sistémica destes agentes de fármaco não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade em células normais, assim como em células tumorais a serem eliminadas (Baldwin et al. , 1986, Lancet pág. (15 de Mar. de 1986) :603-05; Thorpe, 1985, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer
Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), páginas 475-506). Eficácia máxima com toxicidade minima é buscada. Tanto os anticorpos policlonais como os anticorpos monoclonais foram considerados úteis nestas estratégias (Rowland et ai., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). Fármacos usados nestes métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, e vindesina (Rowland et ai., 1986, supra). Toxinas usadas em conjugados de anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tais como toxina de difteria, toxinas de planta, tais como ricina, toxinas de molécula pequena tal como geldanamicina (Kerr et ai., 1997, Bioconjugate Chem. 8 ( 6) :781-784; Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Biogonjugate Chem. 13:786-791), maytansinoids (documento EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342) . As toxinas podem afetar os seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos incluindo ligação de tubulina, ligação de ADN, ou inibição de topoisomerase (Meyer, D. L. e Senter, P.D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy" no "Annual Reports in Medicinal Chemistry", Volume 38 (2003), Capitulo 23, 229-237). Alguns fármacos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos quando conjugados com ligandos de recetor de proteínas ou anticorpos grandes. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugado de anticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal IgGl capa de murino direcionado contra o antigénio CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais ou malignos e radioisótopo Τ111η ou 90Y ligados por um quelador-ligante de tioureia (Wiseman et al. (2000) Eur.
Jour. Nucl. Med. 27(7) :766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12) :4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10) :2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15) :3262- 69) . Embora ZEVALIN tenha atividade contra
Linfoma não Hodgkin (LNH) de célula B, a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado de fármaco e anticorpo composto de um anticorpo hu CD33 ligado à caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mieloide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7) : 686; Patentes US N° 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina
(Immunogen, Inc.), um conjugado de anticorpo-fármaco composto do anticorpo huC242 ligado através do ligante de dissulfeto SPP à fração de fármaco maytansinoid, DM1, está a avançar a ensaios de Fase II para o tratamento de cancros que expressam CanAg, tal como do cólon, pancreático, gástrico, e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL
Biologies, Immunogen Inc.), um conjugado de anticorpo-fármaco composto do anticorpo monoclonal do antigénio de membrana especifico anti-prostático (PSMA) ligado à fração de fármaco maytansinoid, DM1, está a ser desenvolvido para o tratamento potencial de tumores prostáticos. A mesma fração de fármaco maytansinoid, DM1, foi ligada através de um ligante não dissulfeto, SMCC, a um anticorpo monoclonal de murino de ratinho, TA.l (Chari et al. (1992) Cancer Research 52:127-131). Este conjugado foi considerado 200 vezes menos potente que o conjugado de ligante de dissulfeto correspondente. O ligante SMCC foi considerado aqui como "não clivável". Vários compostos de péptido curtos foram isolados do molusco marinho Dolabella auricularia e descobriu-se que tinham atividade biológica (Pettit et al. (1993) Tetrahedron 49:9151; Nakamura et al. (1995) Tetrahedron
Letters 36:5059-5062; Sone et al. (1995) Jour. Org Chem. 60:4474). Análogos destes compostos foram também preparados, e descobriu-se que alguns tinham atividade biológica (para uma análise, veja-se Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277). Por exemplo, auristatina E (Patente US N° 5635483) é um análogo sintético do produto natural marinho Dolastatina 10, um agente que inibe a polimerização de tubulina pela ligação ao mesmo dominio na tubulina que o fármaco anti-cancro vincristina (G.R. Pettit (1997) Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70:1-79). Dolastatina 10, auristatina PE, e auristatina E são péptidos lineares que têm quatro aminoácidos, três dos quais são únicos da classe dolastatina de compostos, e uma amida C-terminal.
Os péptidos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMEAE), análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados em: (i) anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (especifico para Lewis Y em carcinomas); (ii) cAClO que é especifico para CD30 em malignidades hematológicas (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21 (7) :778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al. (2003) Blood 102 (4) :1458-1465; publicação PCT WO 2004/010957; Publicação US 2004/0018194; (iii) anticorpos anti-CD20 tais como RITUXAN® (documento WO 04/032828) para o tratamento de cancros que expressam CD20 e distúrbios imunológicos; (iv) anticorpos anti-EphB2 e anti-IL-8 para o tratamento de cancro colorretal (Mao, et al. (2004) Cancer Research 64 (3) :781-788) ; (v) anticorpo de selectina E (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6394); e (vi) outros anticorpos anti-CD30 (documento WO 03/043583) .
Auristatina E conjugada com anticorpos monoclonais são apresentadas por Senter et al., Proceedings of the American
Association for Cancer Research, Volume 45, Número de Resumo 623, apresentado em 28 de Março de 2004.
Apesar dos dados in vitro para compostos da classe de dolastatina e seus análogos, toxicidades gerais significativas nas doses requeridas para atingir um efeito terapêutico comprometem sua eficácia em estudos clínicos. Consequentemente, existe uma necessidade clara na técnica para derivados de dolastatina/auristatina que tenham toxicidade significativamente menor, e ainda eficiência terapêutica útil. Estas e outras limitações e problemas do passado são considerados pela presente invenção. A família de ErbB de cinases de tirosina de recetor são mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência da célula. A família do recetor inclui quatro membros distintos incluindo recetor de fator de crescimento epidérmico (EGFR, ErbBl, HER1) , HER2 (ErbB2 ou pl85neu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2). Um painel de anticorpos anti-ErbB2 foi caracterizado usando a linha celular tumoral de mama humano SKBR3 (Hudziak et ai., (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172. Inibição máxima foi obtida com o anticorpo denominado 4D5 que inibiu a proliferação celular em 56 %. Outros anticorpos no painel reduziram a proliferação celular numa extensão menor nesta análise. Descobriu-se ainda que o anticorpo 4D5 sensibiliza linhas celulares de tumor de mama que sobre-expressam ErbB2 aos efeitos citotóxicos de TGF-α (Patente US N° 5677171) . Os anticorpos anti-ErbB2 discutidos por Hudziak et ai. são ainda caracterizados em Fendly et ai. (1990) Cancer Research 40:1550-1558; Kotts et ai. (1990) In vitro 26(3):59A; Sarup et ai. (1991) Growth Regulation 1:72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11 (3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11 (2):979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54:5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661- 14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem.. 266:14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewis et al. (1996)
Cancer Research 56:1457-1465; e Schaefer et al. (1997)
Oncogene 15:1385-1394.
Outros anticorpos anti-ErbB2 com várias propriedades foram descritos em Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989);
Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al.
Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. Proc. Nati Acad. Sci. USA 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. int. J.
Cancer 53:401-408 (1993); documento W094/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Shawver et al. (1994)
Cancer Res. 54:1367-1373; Arteaga et al. (1994) Cancer Res. 54:37 5 8-37 65; Harwerth et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15160-15167; Patente US N° 5783186; e Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109. O rastreio de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família do recetor ErbB; ErbB3 (Patente US N° 5.183.884; Patente US N° 5.480.968; KraU.S. et al. (1989) Proc. Nati Acad. Sci. USA 86:9193-9197) e ErbB4 (documento EP 599274; Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:1746-1750; e Plowman et al. (1993) Nature 366:473-475. Estes dois recetores apresentam expressão aumentada em pelo menos algumas linhas celulares de cancro de mama. HERCEPTIN® (Trastuzumab) é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se liga seletivamente com alta afinidade numa análise baseada em célula (Kd = 5 nM) ao domínio extracelular da proteína de recetor2 de fator de crescimento epidérmico humano, HER2 (ErbB2) (Patente US N° 5821337; Patente US N° 6054297; Patente US N° 6407213; Patente US N° 6639055; Coussens L, et al. (1985) Science 230:1132-9; Slamon DJ, et al. (1989) Science 244:707-12). Trastuzumab é um anticorpo IgGl capa que contém regiões de estrutura humana com as regiões de determinação de complementação de um anticorpo de murino (4D5) que se liga a HER2. Trastuzumab liga-se ao antigénio HER2 e, assim, inibe o crescimento de células cancerígenas. Devido ao fato de Trastuzumab ser um anticorpo humanizado, ele minimiza qualquer resposta HAMA nos pacientes. O anticorpo humanizado contra HER2 é produzido por uma suspensão de cultura de célula de mamífero (Ovário de Hamster Chinês, CHO) . O protoncogene HER2 (ou c- erbB2) codifica uma proteína de recetor de transmembrana de 185 kDa, que é estruturalmente relacionada ao recetor de fator de crescimento epidérmico. A sobre-expressão da proteína HER2 é observada em 25 %-30 % de cancros de mama primários e pode ser determinada usando uma avaliação baseada em imunohistoquimica de blocos de tumor fixados (Press MF, et al. (1993) Cancer Res 53:4960-70. Trastuzumab demonstrou, em análises in vitro e em animais, inibir a proliferação de células tumorais humano que sobre-expressam HER2 (Hudziak RM, et al. (1989) Mol Cell Biol 9: 1165-72; Lewis GD, et al. (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga J, et al., (1998) Cancer Res. 58:2825-2831) . Trastuzumab é um mediador de citotoxicidade celular dependente de anticorpo ADCC (Hotaling TE, et al. (1996) [resumo], Proc. Annual Meeting Am Assoe Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al. (1997) [resumo], Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 38:602). In vitro, ADCC mediado por Trastuzumab demonstrou ser preferencialmente atuante em células cancerígenas que sobre-expressam HER2 comparado com células cancerígenas que não sobre-expressam HER2. HERCEPTIN® como agente único é indicado para o tratamento de pacientes com cancro de mama metastático cujos tumores sobre-expressam a proteína HER2 e que receberam um ou mais regimes de quimioterapia para sua doença metastática. HERCEPTIN® em combinação com paclitaxel é indicado para o tratamento de pacientes com cancro de mama metastático cujos tumores sobre-expressam a proteína HER2 e que não receberam quimioterapia para a sua doença metastática. HERCEPTIN® é clinicamente ativo em pacientes com cancros de mama metastáticos que sobre-expressam ErbB2 que receberam terapêutica anti-cancro anterior extensiva (Baselga et al., (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744). 0 anticorpo anti-HER2 monoclonal de murino inibe o crescimento de linhas celulares de cancro de mama que sobre-expressam HER2 no nível 2+ e 3+ (1-2 x 106 recetores HER2 por célula) , mas não tem atividade em células que expressam níveis mais baixos de HER2 (Lewis et al. , (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263). Com base nesta observação, o anticorpo 4D5 foi humanizado (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Patente US N° 5821337; Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4285-4289) e testado em pacientes com cancro de mama cujos tumores sobre-expressam HER2, mas que progrediram após quimioterapia convencional (Cobleigh et al., (1999) J. Clin. Oncol. 17:2639-2648).
Embora HERCEPTIN seja um marco no tratamento de pacientes com cancros de mama que sobre-expressam ErbB2 que receberam terapêutica anti-cancro anterior extensiva, alguns pacientes nesta população não responderam ou responderam apenas muito pouco ao tratamento com HERCEPTIN.
Portanto, existe uma necessidade clínica significativa para o desenvolvimento adicional de terapêuticas de cancro direcionadas para HER2 para aqueles pacientes com tumores que sobre-expressam HER2 ou outras doenças associadas com a expressão de HER2 que não respondem, ou respondem muito pouco, ao tratamento com HERCEPTIN. A menção a qualquer referência neste pedido não é uma admissão de que a referência seja técnica anterior a este pedido.
3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um conjugado de anticorpo-fármaco com a fórmula:
ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que
Ab é um anticorpo R17 é alquileno Ci-Ci0-, -carbociclo C3-C8-, -0-(alquilo
Ci-C8) -, -arileno-, -alquileno Ci-Ci0-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno Ci-Ci0- (carbociclo C3-C8) -, - (carbociclo C3-C8) -alquileno Ci-Ci0-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno Ci-Ci0- (heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno Cq-Cho-, - (CH2CH20) r-, ou - (CH2CH20) r-CH2-; e r é um número inteiro variando de 1 a 10; P varia de 1 a cerca de 20, e
Df é um unidade do fármaco com a fórmula:
em que, independentemente em cada localização: R2 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R3 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3- c8); R4 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo Ci-C8-(heterociclo C3-C8) ; R5 é selecionado de H e metilo; ou : R4 e R5 juntamente formam um anel carbocíclico e têm a fórmula - (CRaRb) n-, em que Ra e Rb são independentemente selecionados de H, alquilo Ci-C8, e carbociclo C3-C8, e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6; R5 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R7 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; cada R8 é independentemente selecionado de H, OH, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, e 0- (alquilo 03-08) ; R9 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R10 é selecionado de arilo e heterociclo C3-C8; Z é 0, S, NH, ou NR12, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de -H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14, ou - (R130) m-CH (R15) 2; m é um número inteiro variando de 1 a 1000; R13 é alquilo C2-C8; R14 é H ou alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, COOH, (CH2) n—N (R16) 2, - (CH2)n-S03H, ou - (CH2)n-S03-alquilo C^Cg; cada ocorrência de R16 é independentemente H, alquilo C3-C8, ou - (CH2) n-C00H; e n é um número inteiro variando de 0 a 6.
Também é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de conjugado de anticorpo-fármaco de acordo qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável desta, e um portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
Também é proporcionada uma composição para o tratamento de cancro compreendendo uma quantidade do conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável desta, sendo a referida quantidade eficaz para tratar cancro.
Também é proporcionado um composto de conjugado de anticorpo-fármaco, conforme definido acima para utilização no tratamento de cancro, em que o referido tratamento de cancro compreende ainda opcionalmente o tratamento com um agente anticancerigeno adicional.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra uma análise de eficácia in vivo, de dose única subcutânea, de cAClO-mcMMAF em xenoenxertos de Karpas-299 ALCL. A Figura 2 mostra uma análise de eficácia in vivo, de dose única subcutânea, de cAClO-mcMMAF em L540cy. Para este estudo havia 4 ratinhos no grupo não tratado e 10 em cada um dos grupos de tratamento.
As Figuras 3a e 3b mostram uma análise de eficácia in vivo de cBR96-mcMMAF em L2987 subcutânea. Os triângulos preenchidos na Figura 3a e setas na Figura 3b indicam os dias de terapêutica.
As Figuras 4a e 4b mostram atividade in vitro de conjugados de cACl0-anticorpo-fármaco contra linhas celulares CD30+.
As Figuras 5a e 5b mostram atividade in vitro de conjugados de cBR9 6-anticorpo-fármaco contra linhas celulares Ley+.
As Figuras 6a e 6b mostram atividade in vitro de conjugados de cl F6-anticorpo-fármaco contra linhas celulares de carcinoma de célula renal CD70+. A Figura 7 mostra um ensaio de proliferação celular in vitro com células SK-BR-3 tratadas com conjugados de anticorpo-fármaco (ADC): -·- Trastuzumab-MC-vc-PAG-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -o- Trastuzumab-MC- MMAF, 4,1 MMAF/Ab, e -Δ— Trastuzumab-MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab, medidos em Unidades de Fluorescência Relativa (ULR) contra concentração pg/ml de ADC. H = Trastuzumab onde H está ligado através de uma cisteína [cys], A Figura 8 mostra um ensaio de proliferação celular in vitro com células BT-474 tratadas com ADC: -·-Trastuzumab-MC-vc-PAG-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -o-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab, e -Δ- Trastuzumab- MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab. A Figura 9 mostra um ensaio de proliferação celular in vitro com células MCF-7 tratadas com ADC: -·-Trastuzumab-MC-vc-PAG-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -o-Trastuzumab-MC-(N-Me)VC-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab, e -Δ-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab A Figura 10 mostra um ensaio de proliferação celular in vitro com células MDA-MB-468 tratadas com ADC: -·-Trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAE, 4,1 MMAE/Ab, -o-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab, e -Δ-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab. A Figura 11 mostra um estudo de depuração de concentração plasmática após administração de H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG e H-MC-vc-PAB- MMAF a ratos Sprague-Dawley: A dose administrada foi de 2 mg de ADC por kg de rato. As concentrações de anticorpo total e ADC foram medidas durante o decorrer do tempo. (H = Trastuzumab). A Figura 12 mostra um estudo de depuração de concentração plasmática após administração de H-MC-vc-MMAE a macacos Cynomolgus em doses diferentes: 0,5, 1,5, 2,5, e 3,0 mg/kg administradas no dia 1 e dia 21. As concentrações de anticorpo e ADC totais foram medidas durante o decorrer do tempo. (H = Trastuzumab). A Figura 13 mostra a mudança de volume médio do tumor durante o tempo em ratinhos nus atimicos com aloenxertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosados no dia 0 com: veiculo, Trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAE (1250 pg/ml2) e Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF (555 pg/ml2) . (H = Trastuzumab). A Figura 14 mostra a mudança de volume médio do tumor durante o tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosados no Dia 0 com 10 mg/kg (660 pg/ml2) de Trastuzumab-MC-MMAE e 1250 pg/ml2 de Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE. A Figura 15 mostra a mudança no volume médio do tumor com o passar do tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosados no Dia 0 com Veículo e 650 pg/ml2 de trastuzumab-MC-MMAF. A Figura 16 mostra a mudança no volume médio de tumor com o tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosados no Dia 0 com veículo de 350 pg/ml2 de quatro conjugados de trastuzumab-MC-MMAF onde a proporção de MMAF/trastuzumab (H) é de 2, 4, 5,9 e 6. A Figura 17 mostra a mudança média no Grupo, com barras de erro, nos pesos corporais de animal (rato) (Média ± DP) após administração de Veiculo, trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB- MMAF, trastuzumab-MC-MMAF e trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF. A Figura 18 mostra a mudança média no Grupo nos pesos corporais de animal (rato) (Média ± DP) após administração de 9,94 mg/kg de H-MC-vc-MMAF, 24, 90 mg/kg de H-MC-vc-MMAF, 10,69 mg/kg de H-MC(Me)- vc-PAB-MMAF, 26,78 mg/kg de H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF, 10,17 mg/kg de H- MC-MMAF, 25,50 mg/kg de H-MC-MMAF, e 21,85 mg/kg de H-MC-vc-PAB- MMAF. H = trastuzumab. O ligante MC é unido através de uma cisteína de trastuzumab para cada conjugado. A Figura 19 mostra a mudança média no Grupo, com barras de erro, nos pesos corporais de rato Sprague-Dawley (Média ± DP) após administração de trastuzumab (H)-MC-MMAF em doses de 2105, 3158, e 4210 pg/ml2. O ligante MC é unido através de uma cisteína de trastuzumab para cada conjugado.
4. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO EXEMPLARES
4.1 DEFINIÇÕES E ABREVIAÇÕES A não ser que mencionado de outro modo, os termos e frases a seguir, conforme usados no presente documento, visam ter os seguintes significados:
Quando nomes comerciais são usados no presente documento, os requerentes objetivam incluir independentemente a formulação do produto de nome comercial, o fármaco genérico, e o(s) ingrediente(s) farmaceuticamente ativo(s) do produto de nome comercial. 0 termo "anticorpo" é usado no presente documento no seu sentido mais amplo e abrange, especificamente, anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos (por exemplo, anticorpos biespecificos) formados por pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpo, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imunológico que é capaz de reconhecer e ligar-se a um antigénio específico. Descrito em termos de sua estrutura, um anticorpo tipicamente tem uma proteína de formato Y consistindo de quatro cadeias de aminoácidos, duas pesadas e duas leves. Cada anticorpo possui duas regiões primárias: uma região variável e uma região constante. A região variável está localizada nas extremidades dos braços do Y, ligam-se e interagem com o antigénio alvo. Esta região variável inclui uma região de terminação complementar (CDR) que reconhece e se liga a um local de ligação específico num antigénio específico. A região constante, localizada na cauda do Y, é reconhecida e interage com o sistema imunológico (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5-. Ed., Garland Publishing, Nova York). Um antigénio alvo geralmente tem numerosos locais de ligação, também denominados epítopos, reconhecidos por CDRs em anticorpos múltiplos. Cada anticorpo que especificamente se liga a um epítopo diferente possui uma estrutura diferente. Dessa maneira, um antigénio pode ter mais que um anticorpo correspondente. 0 termo "anticorpo" conforme usado no presente documento, também se refere a uma molécula de imunoglobulina de comprimento total ou uma fração imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina, isto é, uma molécula que contém um local de ligação de antigénio que se liga imunoespecificamente a um antigénio de um alvo de interesse ou parte do mesmo, tais alvos incluindo, mas não limitados a célula ou células cancerígenas que produzem anticorpos autoimunes associados a uma doença autoimune. A imunoglobulina revelada no presente documento pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA) , classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e lgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Num aspeto, entretanto, a imunoglobulina é de origem humana, de murino, ou de coelho. Num outro aspeto, os anticorpos são policlonais, monoclonais, biespecíficos, humanos, humanizados ou anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, Fv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, anticorpos anti-idióticos (anti-ld), CDR's, e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos acima que se liga imunoespecificamente a antigénios de célula cancerígena, antigénios virais ou antigénios microbianos. 0 termo "anticorpo monoclonal" conforme usado no presente documento refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades mínimas.
Anticorpos monoclonais são altamente específicos, estando direcionados contra um local antigénico único. Além do mais, em contraste com preparações de anticorpo policlonal que incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epitopos), cada anticorpo monoclonal está direcionado contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos visto que podem ser sintetizados de forma não contaminada por outros anticorpos. 0 modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser considerada como requerendo produção de anticorpo por um método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou pode ser feito por métodos de ADN recombinante (veja-se, Patente US N° 4816567) . Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fagos usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597, por exemplo.
Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma fração da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie especifica ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da(s) cadeia (s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos destes anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente US N° 4816567; e Morrison et al. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Vários métodos foram utilizados para produzir anticorpos monoclonais (MAbs). Tecnologia de hibridoma, a qual se refere a uma linha celular clonada que produz um tipo único de anticorpo, usa as células de várias espécies, incluindo ratinhos (murino), hamsters, ratos, e humanos. Um outro método para preparar MAbs usa engenharia genética incluindo técnicas de ADN recombinante. Anticorpos monoclonais feitos a partir destas técnicas incluem, entre outros, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo quimérico combina regiões de codificação de ADN de mais de um tipo de espécie. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode derivar uma região variável de um ratinho e a região constante de um ser humano. Um anticorpo humanizado origina-se predominantemente de um ser humano, embora contenha porções não humanas. Como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado pode conter uma região constante completamente humana. Mas, diferente de um anticorpo quimérico, a região variável pode ser parcialmente derivada de um ser humano. As porções não humanas, sintéticas, de um anticorpo humanizado frequentemente advêm de CDRs em anticorpos de murino. Em qualquer caso, estas regiões são cruciais para permitir que o anticorpo reconheça e se ligue a um antigénio específico.
Conforme observado, anticorpos de murino podem ser usados. Embora úteis para diagnósticos e terapêuticas de curta duração, anticorpos de murino não podem ser administrados a pessoas por um período longo sem aumentar o risco de uma resposta imunogénica prejudicial. Esta resposta, denominada Anticorpo Humano Anti-Ratinho (HAMA), ocorre quando o sistema imunológico humano reconhece o anticorpo murino como estrangeiro e o ataca. Uma resposta HAMA pode causar choque tóxico ou mesmo a morte.
Anticorpos quiméricos e humanizados reduzem a probabilidade de uma resposta HAMA pela minimização das porções não humanas de anticorpos administrados. Além do mais, anticorpos quiméricos e humanizados possuem o beneficio adicional de ativar respostas imunológicas humanas secundárias, tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpo. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma fração de um anticorpo intacto, preferivelmente que compreende a região de ligação de antigénio ou variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2f e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmento(s) de anticorpo.
Um anticorpo "intacto" é aquele que compreende uma região variável de ligação ao antigénio, assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CHI, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variante de sequência de aminoácido dos mesmos. 0 anticorpo intacto pode ter uma ou mais "funções de efetor" que se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções de efetor de anticorpo incluem ligação Ciq; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de recetor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; subrregulação de recetores de superfície de célula (por exemplo, recetor de célula B, BCR), etc.
Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser designados a diferentes "classes". Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3,
IgG4, IgA, e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominadas α, δ, □, γ, e μ respetivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. A expressão "ErbB2" e "HER2" são usadas de forma intercambiável no presente documento e referem-se à proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto et al., (1986) Nature 319:230-234 (Número de acesso do Genebank X03363). O termo "erbB2" refere-se ao gene que codifica ErbB2 humano e "neu" refere-se ao gene que codifica pl85neu de rato. ErbB2 preferido é a sequência nativa humana ErbB2.
Anticorpos para recetores ErbB estão disponíveis comercialmente a partir de uma série de fontes, incluindo, por exemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Califórnia, EUA.
Por "ligando de ErbB" entende-se um polipéptido que se liga e/ou ativa um recetor ErbB. O ligando de ErbB pode ser um ligando de ErbB humano de sequência nativa tal como o fator de crescimento epidérmico (EGF) (Savage et al. (1972) J. Biol. Chem. 247:7612-7621); fator de crescimento de transformação alfa (TGF-α) (Marquardt et al. (1984) Science 223:1079-1082); anfirregulina, também conhecida como schwanoma ou fator de crescimento autócrino de queratinócito (Shoyab et al. (1989) Science 243:1074-107 6; Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1990); e Cook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993); e Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1995); e Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); uma herregulina (veja-se a seguir); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 94:9562- 9567 (1997)); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene, 18:2681-89 (1999)) ou cripto (CR-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem. 272 (6) :3330-3335 (1997)) .
Ligandos ErbB que se ligam a EGFR incluem EGF, TGF-a, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF e epirregulina. Ligandos ErbB que se ligam a ErbB3 incluem herregulinas. Ligandos ErbB capazes de ligação a ErbB4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e herregulinas. O ligando de ErbB pode também ser um ligando de ErbB sintético. O ligando sintético pode ser especifico para um recetor ErbB especifico, ou pode reconhecer complexos específicos de recetor ErbB. Um exemplo de um ligando sintético é a herregulina/birregulina EGF quimera sintética (veja-se, por exemplo, Jones et al., (1999) FEBS Letters, 447:227-231). "Herregulina" (HRG) refere-se a um polipéptido codificado pelo produto do gene herregulina conforme revelado na Patente US N° 5641869 ou Marchionni et al. , Nature, 362:312-318 (1993) . Exemplos de herregulinas incluem herregulina-a, herregulina-βΐ, herregulina-p2 e herregulina-p3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992) ; e Patente US N° 5641869); fator de diferenciação neu (NDF) (Peles et al., Cell 69:205-216 (1992)); atividade induzida por recetor de acetilcolina (ARIA) (Falis et al. (1993) Cell 72:801 -815); fatores de crescimento gliais (GGFs) (Marchionni et al. Nature, 362:312-318 (1993)); fator derivado de neurónio sensorial e motor (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); γ-regulina (Schaefer et al. Oncogene, 15:1385-1394 (1997)). O termo inclui fragmentos biologicamente ativos e/ou variantes de sequência de aminoácidos de um polipéptido HRG de sequência nativa, tal como um fragmento de domínio tipo EGF do mesmo (por exemplo, HRGpll77-244). "Hetero-oligómero ErbB" é um oligómero não covalentemente associado que compreende pelo menos dois recetores ErbB diferentes. Um "dímero ErbB" é um oligómero não covalentemente associado que compreende dois recetores ErbB diferentes. Estes complexos podem formar-se quando uma célula que expressa dois ou mais recetores ErbB é exposta a um ligando de ErbB. Oligómeros ErbB, tais como dímeros ErbB, podem ser isolados por imunoprecipitação e analisados por SDS-PAGE conforme descrito em Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), por exemplo. Exemplos destes hetero-oligómeros ErbB incluem complexos EGFR-ErbB2 (também referidos como HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) e ErbB3- ErbB4 (HER3/HER4). Além do mais, o hetero-oligómero ErbB pode compreender dois ou mais recetores ErbB2 combinados com um recetor ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 ou EGFR (ErbBl) . Outras proteínas, tais como uma subunidade do recetor de citocina (por exemplo, gpl30) podem ser incluídas no hetero-oligómero.
Um polipéptido de "sequência nativa" é aquele que tem a mesma sequência de aminoácidos que um polipéptido, por exemplo, recetor de antigénio associado com tumor, derivado da natureza. Estes polipéptidos de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. Dessa maneira, um polipéptido de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácido de polipéptido humano de ocorrência natural, polipéptido de murino, ou polipéptido de qualquer outra espécie de mamíferos. O termo "variante de sequência de aminoácidos" refere-se a polipéptidos que tem sequências de aminoácidos que diferem em alguma extensão de um polipéptido de sequência nativa. Ordinariamente, variantes de sequência de aminoácidos possuirão pelo menos cerca de 70 % de homologia com pelo menos um domínio de ligação do recetor de um ligando nativo, ou com pelo menos um domínio de ligação a ligando de um recetor nativo, tal como um antigénio associado a tumor, e preferivelmente, eles serão pelo menos cerca de 80 %, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90 % homólogos a estes domínios de ligação de recetor ou ligando. As variantes de sequência de aminoácidos possuem substituições, deleções, e/ou inserções em certas posições dentro da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa. "Identidade de sequência" é definida como a percentagem de resíduos na variante de sequência de aminoácido que são idênticos após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessários, para atingir o percentual máximo de identidade de sequência. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Um destes programas de computador é o "Align 2", da Genentech, Inc., que foi depositado com documentação de utilizador na United States Copyright Office, Washington, DC 20559, em 10 de dezembro de 1991. "Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" e "ADCC" refere-se a uma reação mediada pela célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam recetores Fc (FcRs) (por exemplo, células natural killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem um anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente causa lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida no quadro 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol., 9:457— 92. Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, uma análise in vitro de ADCC, tal como aquela descrita na Patente US N° 5500362 ou 5821337 pode ser executada. Células efetoras úteis para estas análises incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células natural killer (NK) . Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, num modelo animal tal como aquele revelado em Clynes et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:652-656 (1998) .
Os termos "recetor Fc" ou "FcR" são usados para descrever um recetor que se liga à região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além do mais, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um recetor gama) e inclui recetores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas destes recetores. Recetores FcyRII incluem FcyRIIA (um "recetor ativador") e FcyR11B (um "recetor inibidor"), que possuem sequências de aminoácidos semelhantes que diferem primariamente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. 0 recetor ativador F cyR11A contém um motivo de ativação baseado no imunorrecetor tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. 0 recetor inibidor FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado no imunorrecetor tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (Veja-se análise M. no Daéron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcRs são analisados por Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capei et al. , Immunomethods, 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. clin. Me d., 126:330- 41 (1995) . Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são abrangidos pelo termo "FcR" no presente documento. O termo também inclui o recetor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto. (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à capacidade de uma molécula para lisar um alvo na presença do complemento. O caminho de ativação do complemento é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (Ctq) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexado com um antigénio cognato. Para avaliar a ativação de complemento, uma análise CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizada. O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente na sequência entre anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para o seu antigénio específico. Entretanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente em todos os domínios variáveis de anticorpos. É concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve quanto nos de cadeia pesada. As porções mais bem conservadas de domínios variáveis são denominadas de regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas, cada um, compreendem quatro FRs, principalmente adotando uma forma de realização de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam alças conectando, e em alguns casos constituindo uma parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antigénio de anticorpos (veja-se Rabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções de efetor, tal como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). O termo "região hipervariável" quando usado no presente documento refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligação de antigénio. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma "região de determinação de complementação" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Rabat et al. supra) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917) . Resíduos de "Região de Estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definidos no presente documento.
Digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um local de ligação de antigénio único, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete a sua capacidade para cristalizar prontamente. Tratamento com pepsina resulta num fragmento F(ab')2 que possui dois locais de ligação de antigénio e é ainda capaz de reticular o antigénio. ”Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento de antigénio e ligação de antigénio. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação próxima, não covalente. É nesta forma de realização que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir o local de ligação de antigénio na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antigénio ao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antigénio) possui a capacidade para reconhecer e ligar-se a antigénio, embora numa afinidade menor do que aquela do local de ligação inteiro. 0 fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos do terminal carboxi do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente documento para Fab' na qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes suporta(m) pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.
As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser designadas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominado capa (k) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácido dos seus domínios constantes.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, onde estes domínios estão presentes numa cadeia de polipéptido única. Preferivelmente, o polipéptido Fv compreende ainda um ligante de polipéptido entre os domínios VH e VL que permite ao scFv formar a estrutura desejada para ligação de antigénio. Para uma análise de scFv, veja-se Pluckthun em "The Pharmacology of Monoclonal antibodies", vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994). 0 termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação de antigénio, cujos fragmentos compreendem um domínio pesado variável (VH) conectado a um domínio leve variável (VL) na mesma cadeia de polipéptido (VH - VL) . Através da utilização de um ligante que é muito curto para permitir a formação de pares entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a formar um par com os domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois locais de ligação de antigénio. Diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, na EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448.
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, roedores) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nos quais resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano, que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além do mais, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. No geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente tudo dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os FRs são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma fração de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para pormenores adicionais, veja-se Jones et al. (1986) Nature, 321:522:525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e
Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596.
Anticorpos anti-ErbB2 humanizados incluem huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) conforme descrito no quadro 3 da Patente US N° 5821337; anticorpos 520C9 humanizados (documento W093/21319) e anticorpos 2C4 humanizados são descritos no presente documento a seguir.
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com o diagnóstico ou utilizações terapêuticas para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteicos ou não proteicos. Nas formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais que 95 % em peso do anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry, e mais preferivelmente mais que 99 % em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando azul de Coomassie ou, preferivelmente, coloração com prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Ordinariamente, entretanto, anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
Um anticorpo "que se liga" a um antigénio de interesse é aquele capaz de se ligar àquele antigénio com afinidade suficiente de modo que o anticorpo seja útil para ser direcionado a uma célula que expressa o antigénio.
Um anticorpo que "induz apoptose" é aquele que induz morte programada de célula conforme determinado pela ligação de anexina V, fragmentação de ADN, encolhimento da célula, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação de célula, e/ou formação de vesículas de membrana (denominados corpos apoptóticos) . A célula é uma célula tumoral, por exemplo, uma célula de mama, do ovário, estomacal, endométrica, da glândula salivar, pulmão, rins, cólon, tiroide, pancreática ou da bexiga. Vários métodos estão disponíveis para avaliar os eventos celulares associados a apoptose. Por exemplo, translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida pela ligação de anexina; fragmentação de ADN pode ser avaliada através de escalonamento de ADN; e condensação nuclear/cromatina juntamente com fragmentação de ADN pode ser avaliada por qualquer aumento nas células hipodiploides.
Um "distúrbio" é qualquer condição que beneficiaria de tratamento da presente invenção. Isto inclui distúrbios crónicos e agudos ou doenças incluindo estas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitativos de distúrbios a serem tratados no presente documento incluem tumores benignos e malignos; leucemia e malignidades linfoides, em especial cancro de mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rins, cólon, tiroide, pâncreas, próstata ou bexiga; distúrbios neuronais, gliais, astrócitos, hipotalâmicos e outros distúrbios glandulares, de macrófagos, epiteliais, estromais e blastocoélicos; e distúrbios inflamatórios, angiogénicos e imunológicos. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou distúrbio num mamífero. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir em alguma extensão e preferivelmente cessar) a infiltração de células cancerígenas nos órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir em alguma extensão e preferivelmente cessar) metástase de tumor; inibir, em alguma extensão, o crescimento do tumor; e/ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados a o cancro. Na extensão em que o fármaco pode impedir o crescimento e/ou destruir as células cancerígenas existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. Para terapêutica de cancro, a eficácia pode, por exemplo, ser medida pela avaliação do tempo de progressão da doença (TTP) e/ou determinação da taxa de resposta (RR). 0 termo "quantidade substancial" refere-se a uma maioria, isto é, >50 % de uma população, de um conjunto ou uma amostra. O termo "metabolito intracelular" refere-se a um composto resultante de um processo ou reação metabólica dentro de uma célula num conjugado de anticorpo-fármaco (ADC). O processo ou reação metabólica pode ser um processo enzimático tal como clivagem proteolítica de um ligante de péptido do ADC, ou hidrólise de um grupo funcional tal como hidrazona, éter, ou amida. Metabolitos intracelulares incluem, mas não se limitam a anticorpos e fármaco livre que sofreram clivagem intracelular após a entrada, difusão, absorção ou transporte para dentro de uma célula.
Os termos "intracelularmente clivado" e "clivagem intracelular" referem-se a um processo ou reação metabólica dentro de uma célula num Conjugado de Fármaco-Ligando, um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando, e um conjugado de ant icorpo-f ármaco (ADC) ou semelhante pelo qual a união covalente, por exemplo, o ligante, entre a fração de fármaco (D) e o anticorpo (Ab) é quebrada, resultando no fármaco livre dissociado do anticorpo dentro da célula. As porções clivadas do Conjugado de Fármaco-Ligando, um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando ou ADC são, dessa maneira, metabolitos intracelulares. O termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistémica (isto é, níveis sanguíneos/plasmáticos) de uma quantidade dada de fármaco administrado a um paciente. A biodisponibilidade é um termo absoluto que indica a medição do tempo (taxa) e a quantidade total (extensão) de fármaco que atinqe a circulação qeral de uma forma farmacêutica administrada. 0 termo "atividade citotóxica" refere-se a um efeito de eliminação de célula, citostático ou anti-proliferação de um composto conjugado de anticorpo-fármaco ou um metabolito intracelular de um composto conjugado de anticorpo-fármaco. A atividade citotóxica pode ser expressa como o valor IC50 que é a concentração (molar ou massa) por volume unitário na qual metade das células sobrevive.
Os termos "cancro" e "cancerígeno" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento não regulado de células. Um "tumor" compreende uma ou mais células cancerígenas. Exemplos de cancro incluem, mas não se limitam a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos destes cancros incluem cancro de célula escamosa (por exemplo, cancro de célula escamosa epitelial), cancro do pulmão incluindo cancro de pulmão de célula pequena, cancro do pulmão de célula não pequena ("NSCLC"), adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou estomacal, incluindo cancro gastrintestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro retal, cancro colorretal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma da glândula salivar, cancro dos rins ou renal, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, assim como cancro da cabeça e pescoço.
Um "cancro que expressa ErbB2" é aquele que produz níveis suficientes de ErbB2 na superfície de células do mesmo, de modo que um anticorpo anti-ErbB2 pode ligar-se às mesmas e ter um efeito terapêutico em relação ao cancro.
Um cancro "caracterizado por ativação excessiva" de um recetor ErbB2 é aquele em que a extensão de ativação de recetor ErbB2 nas células cancerígenas excede significativamente o nível de ativação daquele recetor em células não cancerígenas do mesmo tipo de tecido. Esta ativação excessiva pode resultar da sobre-expressão do recetor ErbB2 e/ou de níveis maiores que o normal de um ligando de ErbB2 disponível para ativar o recetor ErbB2 nas células cancerígenas. Esta ativação excessiva pode causar e/ou ser causada pelo estado maligno de uma célula cancerígena. Em algumas formas de realização, o cancro será submetido a uma análise de diagnóstico ou prognóstico para determinar se a amplificação e/ou sobre-expressão de um recetor ErbB2 está ocorrendo, que resulte nesta ativação excessiva do recetor ErbB2. Alternativamente, ou adicionalmente, o cancro pode ser submetido a uma análise de diagnóstico ou prognóstico para determinar se a amplificação e/ou sobre-expressão de um ligando de ErbB2 está ocorrendo no cancro, o que é atribuído à ativação excessiva do recetor. Num subconjunto destes cancros, ativação excessiva do recetor pode resultar numa via de estimulação autócrina.
Um cancro que "sobre-expressa" um recetor ErbB2 é aquele que tem níveis significativamente mais elevados de um recetor ErbB2 na superfície da célula do mesmo, comparado com uma célula não cancerígena do mesmo tipo de tecido. Esta sobre-expressão pode ser causada por amplificação de gene ou por transcrição ou tradução aumentada. A sobre-expressão do recetor ErbB2 pode ser determinada numa análise de diagnóstico ou prognóstico através da avaliação dos níveis aumentados da proteína ErbB2 presentes na superfície de uma célula (por exemplo, através de uma análise de imunohistoquímica; IHC) . Alternativamente, ou adicionalmente, os níveis de ácido nucleico que codifica ErbB2 na célula podem ser medidos, por exemplo, através de técnicas de hibridização fluorescente in situ (FISH; veja-se documento WO 98/45479), southern blotting, ou reação em cadeia por polimerase (PCR), tais como PCR quantitativa de tempo real (RT-PCR). A sobre-expressão do ligando de ErbB2 pode ser determinada por diagnóstico através da avaliação dos níveis do ligando (ou ácido nucleico que codifica o mesmo) no paciente, por exemplo, numa biopsia de tumor ou através de várias análises de diagnóstico, tal como IHC, FISH, southern blotting, PCR ou análises in vivo descritas acima. A sobre-expressão do recetor ErbB2 pode também ser estudada através da medição do antigénio livre em circulação (por exemplo, domínio extracelular ErbB2) num fluido biológico tal como soro (veja-se, por exemplo, Patente US N° 4933294; documento WO 91/05264; Patente US N° 5401638; e Sias et ai., (1990) J. Immunol. Methods, 132:73-80) . Além das análises acima, várias outras análises in vivo estão disponíveis para o técnico especializado. Por exemplo, as células podem ser expostas dentro do corpo do paciente a um anticorpo que seja opcionalmente marcado com um rótulo detetável, por exemplo, um isótopo radioativo, e a ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, por exemplo, por rastreio externo quanto à radioatividade ou pela análise de uma biopsia retirada de um paciente previamente exposto ao anticorpo.
Os tumores que sobre-expressam HER2 são classificados por pontuações de imunohistoquímica correspondendo ao número de cópias de moléculas de HER2 expressas por célula, e podem ser determinadas bioquímicamente: 0 = 0-10.000 cópias/célula, 1+ = pelo menos cerca de 200.000 cópias/célula, 2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias/célula, 3+ = cerca de 1-2 x 106 cópias/célula. A sobre-expressão de HER2 no nível 3+, que conduz a ativação independente de ligando da cinase de tirosina (Hudziak et al., (1987; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7159-7163), ocorre em cerca de 30 % dos cancros da mama, e nestes pacientes, a sobrevivência isenta de recidiva e a sobrevivência geral são diminuídas (Slamon et al., (1989) Science, 244:707-712; Slamon et al., (1987) Science, 235:177-182).
Inversamente, um cancro que "não seja caracterizado por sobre-expressão do recetor ErbB2" é aquele que, numa análise de diagnóstico, não expressa níveis mais elevados que o normal de recetor ErbB2 se comparado a uma célula não cancerígena do mesmo tipo de tecido. O termo "agente citotóxico" conforme usado no presente documento refere-se a uma substância que inibe ou impede a função de células e/ou causa destruição de células. O termo objetiva incluir isótopos radioativos (por exemplo, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C, e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo análogos sintéticos e derivados dos mesmos. Num aspeto, o termo não se destina a incluir isótopos radioativos.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes de alquilação tais como tiotepa e CYTOXAN® ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA™); acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicina; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo o seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilinico; teniposido; criptoficinas (especificamente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostarda nitrogenada tal como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimustina; bisfosfonatos, tal como clodronato; antibióticos tais como o antibiótico enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina omega 11) (veja-se, por exemplo, Agnew, Chem Inti. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)) e antraciclinas tais como anamicina, AD 32, alcarrubicina, daunorrubicina, dexrazoxano, DX-52-1, epirrubicina, GPX-100, idarrubicina, KRN5500, menogaril, dinemicina, incluindo dinemicina A, uma esperamicina, cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, doxorrubicina lipossomal, e desoxidoxorrubicina) , esorrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, e zorrubicina; análogos de ácido fólico tais como denopterina, pteropterina, e trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, e tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, e floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, e testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, e trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido folínico (leucovorina) ; aceglatona; agentes antifolato antineoplásticos tais como ALIMTA®, LY231514 pemetrexed, inibidores de redutase de diidrofolato tais como metotrexato, antimetabolitos tais como 5-fluorouracil (5-FU) e seus pró-fármacos tais como UFT, S-l e capecitabina, e inibidores de sintase de timidilato e inibidores de formiltransferase de glicinamida ribonucleótido tais como raltitrexed (TOMUDEX™, TDX); inibidores de desidrogenase de diidropirimidina tais como eniluracil; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico, amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maytansinoids tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK® complexo de polissacárido (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2 ' ,2 ' '-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina a, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol, mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosideo ("Ara-C") ; ciclofosfamida; tiotepa; taxoides e taxanos, por exemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ Cremophor-free, formulação de paclitaxel com nanopartícula manipulada de albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e TAXOTERE® doxetaxel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); cloranbucil; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; platina; análogos de platina ou análogos a base de platina tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vimblastina (VELBAN®), etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona, vincristina (ONCONVIN®); alcaloide vinca; vinorrelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato, daunomicina; aminopterina; xeloda, ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinoico; sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos acima tal como CHOP, uma abreviação para uma terapêutica combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada com 5-FU e leucovorina.
Também incluídos nesta definição estão agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação de hormonas em tumores tais como antiestrogénios e moduladores de recetor seletivo de estrogénio, incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX® tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON® toremifena; inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase que regula a produção de estrogénio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4 (5)-imidazois, aminoglutetimida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® exemestano, formestano, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, e ARIMIDEX® anastrozol; e antiandrogénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserrelina; assim como troxacitabina, um análogo de 1,3-dioxolano nucleosideo citosina); oligonucleótidos antissense, especificamente aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular aberrante, tal como, por exemplo, alfa PKC, Raf, H-Ras, e recetor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como vacinas de terapêutica génica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
Conforme usado no presente documento, o termo "fármaco direcionado a EGFR" refere-se a um agente terapêutico que se liga a EGFR e, opcionalmente, inibe a ativação de EGFR. Exemplos destes agentes incluem anticorpos e moléculas pequenas que se ligam a EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (veja-se Patente US N° 4943533, Mendelsohn et al.) e variantes dos mesmos, tais como 225 quimerizado (C225 ou Cetuximab; ERBITUX® e 225 reformatado humano (H225) (veja-se, documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.) ; anticorpos que se ligam a EGFR mutante tipo II (Patente US N° 5.212.290); anticorpos humanizados e quiméricos que se ligam a EGFR conforme descrito na Patente US N° 5891996; e anticorpos humanos que se ligam a EGFR, tal como ABX-EGF (veja-se documento WO 98/50433, Abgenix). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, dessa maneira gerando um imunoconjugado (veja-se, por exemplo, documento EP 659.439A2, Merck Patent GmbH) . Exemplos de moléculas pequenas que se ligam a EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca);
Erlotinib HC1 (CP-358774, TARCEVA™; Genentech/OSI) e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen).
Um "inibidor de tirosina-cinase" é uma molécula que inibe em alguma extensão a atividade de uma tirosina-cinase tal como um recetor ErbB. Exemplos destes inibidores incluem os fármacos direcionados para EGFR observados no parágrafo anterior, assim como quinazolinas tais como PD 153035,4 (3-cloroanilino)quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706, e pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas, curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas contendo porções de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas antissense (por exemplo, aquelas que se ligam a ácido nucleico que codifica ErbB); quinoxalinas (Patente US N° 5.804.396); trifostinas (Patente US N° 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK- 787 (Novartis/Schering AG); inibidores pan-ErbB tais como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly) ; Imatinib mesilato (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxanib (Sugen); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); ou conforme descrito em qualquer uma das publicações de patentes a seguir: Patente US N° 5804396; documento WO 99/09016 (American Cyanamid); documento WO 98/43960 (American Cyanamid); documento WO 97/38983 (Warner Lambert); documento WO 99/06378 (Warner Lambert); documento WO 99/06396 (Warner Lambert); documento WO 96/30347 (Pfizer, Inc.); documento WO 96/33978 (Zeneca); documento WO 96/3397 (Zeneca); e documento WO 96/33980 (Zeneca).
Um "agente antiangiogénico" refere-se a um composto que bloqueia, ou interfere em algum grau, com o desenvolvimento de vasos sanguíneos. O fator antiangiogénico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou anticorpo que se liga a um fator de crescimento ou recetor de fator de crescimento envolvido na promoção de angiogénese. Numa forma de realização, o fator ant iangiogénico é um anticorpo que se liga a Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF). 0 termo "citocina" é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população de célula que agem numa outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos destas citocinas são linfocinas, monocinas, e hormonas de polipéptido tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão hormona de crescimento tal como hormona de crescimento humano, hormona de crescimento humano N-metionilo, e hormona de crescimento bovino; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina, prorrelaxina; hormonas de glicoproteína tais como hormona estimulante de folículo (FSH), hormona estimulante da tiroide (TSH), e hormona luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogénio placentário; fator α e β de necrose de tumor; substância inibidora de mulleriano; péptido associado com gonadotropina de ratinho; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento neural tais como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento tipo insulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferões tais como interferão-α, -β, e -γ; fatores de estimulação de colónia (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM- CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um fator de necrose tumoral tal como TGF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipéptidos incluindo LIF e conjunto de ligandos (KL) . Conforme usado no presente documento, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de culturas de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa. 0 termo "pró-fármaco" conforme usado neste pedido refere-se a um precursor ou forma derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para células tumorais se comparada com o fármaco parental e é capaz de ser enzimaticamente ou hidroliticamente ativada ou convertida na forma parental mais ativa. Veja-se, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al. , "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), páginas 247-267, Humana Press (1985) . Os pró-fármacos desta invenção incluem, mas não se limitam a pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptido, pró-fármacos modificados por D-aminoácido, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo β-lactama, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, pró-fármacos 5-fluorocitosina e outras 5-fluorouridinas que podem ser convertidos no fármaco livre mais citotóxico. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivados numa forma de pró-fármaco para utilização nesta invenção incluem, mas não se limitam àqueles agentes quimioterápicos descritos acima.
Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta de vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioativos que é útil para aplicação de um fármaco (tal como incluindo os anticorpos anti-CD30, CD40, CD70 ou Lewis Y e, opcionalmente, um agente quimioterápico) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comummente arranjados numa formação de bicamada, semelhante ao arranjo de lípido de membranas biológicas. 0 termo "folheto informativo" é usado no presente documento para referir-se a instruções comummente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contraindicação e/ou avisos relacionados com a utilização destes produtos terapêuticos.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está ordinariamente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente na forma ou forma de realização na qual é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas, portanto, são distintas da molécula de ácido nucleico da maneira como existe nas células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que ordinariamente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está num local cromossómico diferente daquele nas células naturais. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num organismo hospedeiro específico. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação de ribossoma. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação, e intensificadores.
Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado num relacionamento funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, ADN para uma pré-sequência ou líder secretor está operativamente ligado ao ADN para um polipéptido se ele for expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou intensificador é operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. De forma geral, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguo e na fase de leitura. Entretanto, intensificadores não necessitam ser contíguos. A ligação pode ser obtida pela ligação em locais de restrição convenientes. Se estes locais não existirem, os adaptadores ou ligantes sintéticos de oligonucleótido podem ser usados de acordo com a prática convencional.
Conforme usado no presente documento, a expressão "célula", "linha celular", e "cultura de célula" são usadas de forma intercambiável e todas estas designações incluem progénie. Dessa maneira, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula objeto primária e culturas derivadas das mesmas sem consideração com o número de transferências. É também entendido que toda a progénie não precisa ser precisamente idêntica em teor de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Progénies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica conforme explorado na célula originalmente transformada são incluídas. Onde existir a intenção de designações distintas, isto ficará claro em consequência do contexto.
Uma "doença autoimune" no presente documento é uma doença ou distúrbio resultante e direcionada contra os tecidos do próprio indivíduo ou um co-segregado ou manifestação das mesmas ou condição resultante das mesmas. Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas não se limitam a artrite (artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, e espondilite anquilosante), psoríase, dermatite, incluindo dermatite atópica; urticária idiopática crónica, incluindo urticária autoimune crónica, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia e esclerose sistémicas, respostas associadas com doença inflamatória do intestino (IBD) (doença de Crohn, colite ulcerativa), e IBD com co-secregado de piodermatite gangrenosa, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, e/ou episclerite), sindrome de dificuldade respiratória, incluindo sindrome de dificuldade respiratória do adulto (ARDS), meningite, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica, encefalite tal como encefalite de Rasmussen, uveite, colite tal como colite microscópica e colite colagenosa, glomerulonefrite (GN) tal como GN membranosa, GN membranosa idiopática, GN proliferativa membranosa (MPGN) , incluindo Tipo I e Tipo II, e GN rapidamente progressiva, condições alérgicas, eczema, asma, condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas, aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócito, lúpus eritematoso sistémico (SLE) tal como SLE cutâneo, lúpus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrica, não renal, discoide, alopecia), diabete de inicio na juventude, esclerose múltipla (MS) tal como MS espino-ótica, encefalomielite alérgica, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite dos grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e arterite de célula gigante (Takayasu)), vasculite dos vasos médios (incluindo doença de Kawasaki e poliarterite nodosa), vasculite do CNS, e vasculite associada com ANCA, tal como vasculite ou sindrome de Churg-Strauss (CSS)), anemia aplástica, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond-Blackfan, anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia de hemácias puras (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese de leucócito, distúrbios inflamatórias do CNS, sindrome de ferimento de múltiplos órgãos, miastenia gravis, doenças mediadas por complexo de antigénio-anticorpo, doença de membrana de base antiglomerular, sindrome de anticorpo de antifosfolipido, neurite alérgica, doença de Bechet, sindrome de Castleman, sindrome de Goodpasture, sindrome miasténica de Lambert-Eaton, sindrome de Reynaud, sindrome de Sjorgen, sindrome de Stevens-Johnson, rejeição de transplante de órgão sólido (incluindo pré-tratamento para titulações de anticorpo reativo de alto painel, depósito IgA nos tecidos, e rejeição decorrente de transplante renal, transplante de fígado, transplante de intestino, transplante cardíaco, etc.), doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD), penfigoide bolhosa, pênfigo (incluindo vulgar, foliáceo, e penfigoide da membrana mucosa do pênfigo, poliendocrinopatias autoimunes, doença de Reiter, sindrome do homem rígido, nefrite de complexo imune, polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia (conforme desenvolvida por pacientes de enfarto de miocárdio, por exemplo), incluindo trombocitopenia autoimune, doença autoimune do testículo e ovário, incluindo orquite e ooforite autoimunes, hipotireoidismo primário; doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite autoimune, tireoidite crónica (tireoidite de Hashimoto), tireoidite sub-aguda, hipotireoidismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, sindromes poliglandulares autoimunes (ou sindrome da endocrinopatia poliglandular), diabete Tipo I também referida como diabete mellitus dependente de insulina (IDDM), incluindo IDDM pediátrica, e sindrome de Sheehan; hepatite autoimune, pneumonite intersticial linfoide (VIH), bronquiolite obliterante (não transplante) vs. NSIP, sindrome de
Guillain-Barré, doença de Berger (nefropatia de IgA), cirrose biliar primária, doença celíaca (enteropatia de glúten), esprue refratário com dermatite herpetiforme co-segregada, crioglobulinemia, esclerose amilotrófica lateral (ALS; doença de Lou Gehrig), doença da artéria coronária, doença autoimune do ouvido interno (AIED), perda auditiva autoimune; síndrome de opsoclonus-mioclonus (OMS); policondrite tal como policondrite refratária, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, hepatite de célula gigante, esclerite, gamopatia monoclonal de significância incerta/desconhecida (MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplástica, doenças de canal tais como epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e doenças de canal do CNS; autismo, miopatia inflamatória, e glomerulosclerose focal segmentar (FSGS). "Alquilo" é hidrocarboneto Ci-Cis contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos. Exemplos são metilo (Me, -CH3) , etilo (Et, -CH2CH3) , 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2-CH2-CH3) , 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, CH2CH2CH2CH3) , 2-metil-l-propilo (i- Bu, i-butilo, CH2CH (CH3) 2) , 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH (CH3) CH2CH3) , 2- met il-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-pentilo (-CH (CH3) CH2CH2CH3) , 3- pentilo (-CH (CH2CH3) 2) , 2-metil-2-butilo (-C (CH3) 2CH2CH3) , 3-metil-2-butilo (-CH (CH3) CH (CH3) 2) , 3-metil-l-butilo (-CH2 CH2CH (CH3) 2) , 2-met il-l-but ilo (-CH2CH (CH3) CH2CH3) , 1-hexilo (-CH2 CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-hexilo (-CH (CH3) CH2CH2CH2CH3) , 3- hexilo (-CH (CH2CH3) (CH2CH2CH3) ) , 2-metil-2-pentilo (-C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 3-meti 1-2-pentilo (-CH (CH3) CH (CH3) CH2CH3) , 4-metil-2-pentilo (-CH (CH3) CH2CH (CH3) 2) , 3-metil-3-pentilo (-C (CH3) (CH2CH3) 2) , 2-metil-3-pentilo (-CH (CH2CH3) CH (CH3) 2) , 2,3-dimetil-2-butilo (-C (CH3) 2CH (CH3) 2) , 3,3-dimetil-2- butilo (-CH (CH3) C (CH3) 3. "Alquenilo" é hidrocarboneto Ci-Cis contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos, com pelo menos um local de insaturação, isto é, um carbono- carbono, ligação dupla sp2. Exemplos incluem, mas não se limitam a: etileno ou vinilo (-CH=CH2) , alilo (-CH2CH=CH2) , ciclopentenilo (-C5H7) , e 5-hexenilo (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2) . "Alquinilo" é hidrocarboneto C2-Cis contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos, com pelo menos um local de insaturação, isto é, um carbono- carbono, ligação tripla sp. Exemplos incluem, mas não se limitam a: acetilénico (-CH^CH) e propargil (-CH2C=CH) . "Alquileno" refere-se a um radical de hidrocarboneto saturado, de cadeia ramificada ou linear ou cíclico de 1-18 átomos de carbono, e que tem dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio dos mesmos ou dois átomos de carbono diferentes de um alcano parental. Radicais típicos de alquileno incluem, mas não se limitam a: metileno (-CH2-) , 1,2-etilo (-CH2CH2-) , 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-) , 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-) , e semelhantes. "Alquenileno" refere-se a um radical de hidrocarboneto saturado, de cadeia ramificada ou linear ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e que tem dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio dos mesmos ou dois átomos de carbono diferentes de um alqueno parental. Radicais típicos de alquenileno incluem, mas não se limitam a: 1,2-etileno (-CH=CH-). "Alquinileno" refere-se a um radical de hidrocarboneto saturado, de cadeia ramificada ou linear ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e que tem dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio dos mesmos ou dois átomos de carbono diferentes de um alcino parental. Radicais típicos de alquinileno incluem, mas não se limitam a: acetileno (~C=C~), propargil (—CH2C=C—) , e 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C=CH-) . "Arilo" significa um radical hidrocarboneto monovalente aromático de 6-20 átomos de carbono derivado pela remoção de um átomo de hidrogénio de um átomo de carbono único de um sistema de anel aromático parental. Alguns grupos arilo são representados nas estruturas exemplares como "Ar". Grupos arilo típicos incluem, mas não se limitam a radicais derivados de benzendo, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenilo, e semelhantes. "Arilalquilo" refere-se a um radical alquilo acíclico no qual um dos átomos de hidrogénio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical arilo. Grupos arilalquilo típicos incluem, mas não se limitam a, benzilo, 2-feniletan-l-ilo, 2-fenileten-l-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-l-ilo, 2-naftileten-l-ilo, naftobenzilo, 2-naftofeniletan-l-ilo e semelhantes. O grupo arilalquilo compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquilo, incluindo grupos alcanilo, alquenilo ou alquinilo, do grupo arilalquilo é 1 a 6 átomos de carbono e a fração arilo é de 5 a 14 átomos de carbono. O grupo arilalquilo compreende de 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquilo, incluindo grupos alcanilo, alquenilo ou alquinilo, do grupo arilalquilo é de 1 a 6 átomos de carbono e a fração arilo é de 5 a 14 átomos de carbono. "Heteroarilalquilo" refere-se a um radical alquilo acíclico no qual um dos átomos de hidrogénio ligado a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical heteroarilo. Grupos heteroarilalquilo típicos incluem, mas não se limitam a, 2-benzimidazolilmetilo, 2-furiletilo, e semelhantes. O grupo heteroarilalquilo compreende de 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquilo, incluindo grupos alcanilo, alquenilo ou alquinilo, do grupo heteroarilalquilo é de 1 a 6 átomos de carbono e a fração heteroarilo é de 5 a 14 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P, e S. A fração heteroarilo do grupo heteroarilalquilo pode ser um monociclo que tem de 3 a 7 membros do anel (2 a 6 átomos de carbono) ou um biciclo que tem de 7 a 10 membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e de 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P, e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6] . "Alquilo substituído", "arilo substituído", e "arilalquilo substituído" significa alquilo, arilo, e arilalquilo, respetivamente, nas quais um ou mais átomos de hidrogénio são cada um, independentemente, substituídos por um substituinte. Substituintes típicos incluem, mas não se limitam a: -X, -R, -0”, -OR, -SR, -S~, -NR2, -NR3, =NR, CX3, -CN, -OCN, -SON, -N=C=0, -NCS, -NO, -N02, =N2, -N3, NC(=0)R, -C(=0)NR2, -S03, -S03H, -S (=0) 2R, -OS (=0) 20R, - S(=0)2NR, -S(=0)R, -op (=0) (0R) 2, -P(=0)(0R)2, -P0d, -P03H2, -C (=0) R, -C(=0)X, -C( = S)R, -C02R, -C02-, -C( = S)0R, C (=0) SR, -C( = S)SR, -C(=0)NR2, -C( = S)NR2, -C(=NR)NR2, onde cada X é, independentemente um halogénio: F, Cl, Br, ou I; e cada R é, independentemente, -H, alquilo C2-Ci8, arilo C6-C2or heterociclo C3-Ci4, grupo protetor ou fração pró-fármaco. Grupos alquileno, alquenileno, e alquinileno conforme descritos acima podem também ser substituídos de maneira semelhante. "Heteroarilo" e "Heterociclo" referem-se a um sistema de anel no qual um ou mais átomos do anel é um heteroátomo, por exemplo, nitrogénio, oxigénio, e enxofre. 0 radical heterociclo compreende de 1 a 20 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P, e S. Um heterociclo pode ser um monociclo que tem de 3 a 7 membros de anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P, e S) ou um biciclo que tem de 7 a 10 membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P, e S) , por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6] .
Heterociclos são descritos por Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, Nova York, 1968), especificamente Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, e 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nova York, 1950 até o presente) , em especial os volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Exemplos de heterociclos incluem como exemplo e não como limitação, piridilo, diidropiridilo, tetraidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetraidrotiofenilo, tetraidrotiofenilo oxidado com enxofre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetraidrofuranilo, bis-tetraidrofuranilo, tetraidropiranilo, bis-tetraidropiranilo, tetraidroquinolinilo, tetraidroisoquinolinilo, decaidroquinolinilo, octaidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, lH-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, β-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzissoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, e isatinoilo.
Como exemplo e não como limitação, heterociclos ligados a carbono são ligados na posição 2, 3, 4, 5, ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5, ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4, 5, ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5, ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4, ou 5 de um furano, tetraidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetraidropirrol, posição 2, 4, ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4, ou 5 de um isoxazol, pirazol, ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridina, posição 2, 3, ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma quinolina ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma isoquinolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados por carbono incluem 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, ou 5-tiazolilo.
Como exemplo e não como limitação, heterociclos ligados por nitrogénio são ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posição 2 de um isoindol, ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina, e posição 9 de um carbazol, ou β-carbolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados por nitrogénio incluem 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo, e 1-piperidinilo. "Carbociclo" significa um anel saturado ou insaturado que tem 3 a 7 átomos de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono como um biciclo. Carbociclos monocíclicos têm 3 a 6 átomos no anel, ainda mais tipicamente 5 ou 6 átomos no anel. Carbociclos bicíclicos têm 7 a 12 átomos no anel, por exemplo, arranjados como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou 9 ou 10 átomos no anel arranjados como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6] . Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3-enilo, cicloexilo, 1-cicloex-l-enilo, l-cicloex-2-enilo, l-cicloex-3-enilo, cicloeptilo, e ciclooctilo. "Ligante" "Unidade de Ligante", ou "ligação" significa uma fração química que compreende uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que covalentemente anexam um anticorpo a uma fração de fármaco. Em várias formas de realização, um ligante é especificado como LU, Ligantes incluem um radical bivalente tal como uma alquildiilo, uma arildiilo, um heteroarildiilo, porções tais como: - (CR2) nO (CR2) n-, unidades repetitivas de alquiloxi (por exemplo, polietilenoxi, PEG, "polimetilenoxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine™); e éster diácido e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato, e caproamida. O termo "quiral" refere-se a moléculas que têm a propriedade de não sobreposição do parceiro de imagem refletida, enquanto o termo "aquiral" refere-se a moléculas que são sobrepostas ao seu parceiro de imagem refletida. O termo "estereoisómeros" refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem com relação ao arranjo dos átomos ou grupos no espaço. "Diastereómero" refere-se a um estereoisómero com dois ou mais centros de quiralidade e aquelas moléculas não são imagens refletidas uma da outra. Diasterómeros possuem propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espetrais, e reatividades. Misturas de diasterómeros podem ser separadas sob procedimentos analíticos de alta resolução, tais como eletroforese e cromatografia. "Enantiómeros" referem-se a dois estereoisómeros de um composto que não são imagens refletidas sobrepostas um do outro.
Definições e convenções de estereoquímica usadas no presente documento geralmente seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nova York; e Eliel, E. e Wilen, s., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nova York. Muitos compostos orgânicos existem nas formas oticamente ativas, isto é, eles têm a capacidade para girar o plano de luz polarizada por plano. Na descrição de um composto oticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, são usados para denotar a forma de realização absoluta da molécula sobre o(s) seu (s) centro(s) quiral(is). Os prefixos d e 1 ou (+) e (-) são utilizados para designar o sinal de rotação de luz polarizada por plano pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levogiro. Um composto prefixado com (+) ou d é dextrogiro. Para uma estrutura química dada, estes estereoisómeros são idênticos, exceto pelo facto de que são imagens refletidas um do outro. Um estereoisómero específico pode também ser referido como um enantiómero, e uma mistura destes isómeros é frequentemente denominada de mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiómeros é referida como uma mistura racémica ou um racemato, que pode ocorrer onde não houver ocorrido estereosseleção ou estereoespecificidade numa reação ou processo químico. Os termos "mistura racémica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, isentas de atividade ótica.
Exemplos de um "paciente" incluem, mas não se limitam a, um ser humano, rato, ratinho, cobaia, macaco, porco, vaca, cavalo, cão, gato, pássaro e aves. Numa forma de realização exemplar, o paciente é um ser humano. "Arilo" refere-se a um grupo carbocíclico aromático. Exemplos de grupos arilo incluem, mas não se limitam a fenilo, naftilo e antracenilo. Um grupo carbocíclico aromático ou um grupo heterocíclico aromático pode ser não substituído ou substituído com um ou mais grupos incluindo, mas não limitado a: alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , arilo, -C (0) R' , -0C(0)Rf, -C (0) 0Rf , - C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)Rf, -OH, - halogénio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo. 0 termo "alquilo Ci-C8", conforme usado no presente documento, refere-se a um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado que tem de 1 a 8 átomos de carbono. Grupos "alquilo Ci-C8" representativos incluem, mas não se limitam a -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n- heptilo, -n-octilo, -n-nonilo e -n-decilo; enquanto alquilos Ci-C8 ramificados incluem, mas não se limitam a -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butil, - isopentilo, 2-metilbutilo, alquilos Ci-C8 insaturadas incluem mas não se limitam a, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-l-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1-butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo, - 3-metil-l-butinilo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isoexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 2,3, 4-trimetilpentilo, 3-metilexilo, 2,2-dimetilexilo, 2,4-dimetilexilo, 2,5-dimetilexilo, 3,5-dimetilexilo, 2,4-dimetilpentilo, 2-metileptilo, 3-metileptilo, n-heptilo, isoeptilo, n-octilo, e isooctilo. Um grupo alquilo Ci-C8 pode ser não substituído ou substituído com um ou mais grupos incluindo, mas não limitado a -alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , arilo, -C (0) R' , -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', - C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -SO3R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, - halogénio, -N3, -NH2, -NH (R' ) , -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "carbociclo C3-C8" é um anel carbociclico saturado ou insaturado não aromático de 3-, 4-, 5-, 6-, 7- ou 8 membros. Carbociclos C3-C8 representativos incluem, mas não se limitam a -ciclopropilo, -ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentadienilo, -cicloexilo, -cicloexenilo, -1,3-cicloexadienilo, - 1,4-cicloexadienilo, cicloeptilo, -1,3-cicloeptadienilo, -1,3,5-cicloeptatrienilo, -ciclooctilo, e -ciclooctadienilo. Um grupo carbociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído por um ou mais grupos incluindo, mas não limitados a -alquilo Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , arilo, -C (0) R' , -0C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', - C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -oh, -halogénio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "carbociclo C3-C8" refere-se a um grupo carbociclo C3—C8 definido acima onde um dos átomos de hidrogénio dos grupos carbociclos é substituído com uma ligação.
Um "alquileno Ci-Ci0" é um grupo hidrocarboneto de cadeia linear, saturado com a fórmula -(CH2)1_10-. Exemplos de um alquileno Ci-Ci0 incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno e decaleno.
Um "arileno" é um grupo arilo que tem duas ligações covalentes e pode estar nas formas de realização orto, meta ou para, conforme mostrado nas estruturas a seguir:
nas quais o grupo fenilo pode ser não substituído ou substituído com até quatro grupos incluindo, mas não limitado a -alquilo Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -arilo, C (0) R' , -0C (0) R' , -C (0) OR' , -C(0)NH2, -C(0)NHRf, C(0)N(R')2, -NHC(0)Rf, -S(0)2Rf, -S(0)Rf, -OH, -halogénio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "heterociclo C3-C8" refere-se a um carbociclo C3-C8 aromático ou não aromático no qual de um a quatro dos átomos de carbono do anel são independentemente substituídos com um heteroátomo do grupo consistindo de 0, S e N. Exemplos representativos de um heterociclo C3-C8 incluem, mas não se limitam a benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, e tetrazolilo. Um heterociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído com até sete grupos incluindo, mas não limitados a - alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R', C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', S (0) R' , -OH, -halogénio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "heterociclo C3-C8" refere-se a um grupo heterociclo C3-C8 definido acima, onde um dos átomos de hidrogénio do grupo heterociclo é substituído por uma ligação. Um heterociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído por até seis grupos incluindo, mas não limitados a -alquilo Ci-C8, - 0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, -C (0) R' , -0C (0) R' , -C (0) OR' , -C(0)NH2, -C(0)NHR', C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halogénio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "Composto Exemplar" é um Composto de Fármaco ou um Composto de Fármaco-Ligante.
Um "Conjugado Exemplar" é um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando ou um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando.
Em algumas formas de realização os Compostos Exemplares e Conjugados Exemplares estão na forma isolada ou purificada. Conforme usado no presente documento, "isolado" significa separado de outros componentes de (a) uma fonte natural, tal como uma célula vegetal ou animal ou cultura de célula, ou (b) uma mistura de reação química orgânica sintética. Conforme usado no presente documento "purificado" significa que, quando isolado, o isolado contém pelo menos 95 %, e num outro aspeto pelo menos 98 %, de Composto Exemplar ou Conjugado Exemplar em peso do isolado.
Exemplos de um "grupo de proteção de hidroxilo" incluem, mas não se limitam a metoximetiléter, 2-metoxietoximetiléter, tetraidropiraniléter, benziléter, p-metoxibenziléter, trimetilsililéter, trietilsililéter, triisopropilsililéter, t-butildimetilsililéter, trifenilmetilsililéter, éster de acetato, ésteres de acetato substituídos, pivaloato, benzoato, metanossulfonato e p-toluenossulfonato. "Grupo abandonante" refere-se a um grupo funcional que pode ser substituído por um outro grupo funcional. Estes grupos abandonantes são bem conhecidos na técnica, e exemplos incluem, mas não se limitam a haleto (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), metano sulfonilo (mesilo) , p-tolueno sulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato), e trifluorometilsulfonato. A frase "sal farmaceuticamente aceitável", conforme usada no presente documento, refere-se a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um Composto Exemplar ou Conjugado Exemplar. Os Compostos Exemplares e Conjugados Exemplares contêm pelo menos um grupo amino, e consequentemente sais de adição ácidos podem ser formados com este grupo amino. Sais exemplares incluem, mas não se limitam a sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, e pamoato (isto é, 1,1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de uma outra molécula tal como um ião de acetato, um ião de succinato ou outros contra-iões. 0 contra-ião pode ser qualquer fração orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga do composto parental. Além do mais, um sal f armaceut icamente aceitável pode ter mais que um átomo carregado na sua estrutura. Casos onde átomos de carga múltipla são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter contra-iões múltiplos. Assim, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contra-iões. "Solvato farmaceuticamente aceitável" ou "solvato" refere-se a uma associação de uma ou mais moléculas de solvente e um composto da invenção, por exemplo, um Composto Exemplar ou Conjugado Exemplar. Exemplos de solvente que formam solvatos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético, e etanolamina.
As abreviações a seguir são usadas no presente documento e possuem as definições indicadas: AE é auristatina E, Boc é N-(t-butoxicarbonil), cit é citrulina, dap é dolaproina, DCC é 1,3-dicicloexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD é dietilazodicarboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD é diisopropilazodicarboxilato, DIEA é N,N-diisopropiletilamina, dil é dolaisoleuina (SIC), DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DME é éter dimetilico de etilenoglicol (ou 1,2-dimetoxietano) , DMF é N,N-dimetilformamida, DMSO é dimetilsulfóxido, doe é dolafenina, dov é N,N-dimet ilvalina, DTNB é 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), DTPA é ácido dietilenotriaminapentaacético, DTT é ditiotreitol, EDCI é cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida, EEDQ é 2-etoxi-l-etoxicarbonil-l,2-diidroquinolina, ES-MS é espetrometria de massa de eletropulverização, EtOAc é acetato de etilo, Fmoc é N- (9-fluorenilmetoxicarbonil), gly é glicina, HATU é 0-(7-azabenzotriazol-l- il)-N,N,N',N'~ tetrametilurónio hexafluorofosfato, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia liquida de alta pressão, ile é isoleucina, lys é lisina, MeCN (CH3CN) é acetonitrilo, MeOH é metanol, Mtr é 4-anisildifenilmetilo (ou 4-metoxitritilo) , nor é (IS,2R)- ( + )-norefedrina, PAB é p-aminobenzilo, PBS é fosfato-solução salina tamponada (pH 7,4), PEG é polietilenoglicol, Ph é fenilo, Pnp é p-nitrofenilo, MC é 6-maleimidocaproilo, phe é L-fenilalanina, PyBrop é bromo tris-pirrolidino fosfónio hexafluorofosfato, SEC é cromatografia de exclusão de tamanho, Su é succinimida, TBTU é O-benzotriazol-l-il-Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametilurónio tetrafluoroborato, TFA é ácido trifluoroacético, TLC é cromatografia de camada fina, UV é ultravioleta, e vai é valina.
As abreviações de ligante a seguir são usadas no presente documento e têm as definições indicadas: Vai Cit é valina-citrulina, local do dipéptido no ligante clivável por protease; PAB é p-aminobenzilcarbamoil; (Me)vc é N-metil-valina citrulina, onde a ligação peptídica do ligante foi modificada para impedir sua clivagem por catepsina B; MC (PEG)6-OH é maleimidocaproil-polietilenoglicol; SPP é 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo; e SMCC é 4-(N-maleimidometil)cicloexano-l-carboxilato de N-succinimidilo.
Os termos "tratar" ou "tratamento", a não ser que indicado o contrário pelo contexto, referem-se a tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventivas, onde o objetivo é impedir ou tornar mais lento (diminuir) uma alteração fisiológica ou distúrbio indesejado, tal como o desenvolvimento ou disseminação de cancro. Para os objetivos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, não agravamento) da doença, atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhora ou mitigação do estado da doença, e remissão (quer parcial ou total), quer detetável ou indetetável. "Tratamento" pode também significar prolongamento da sobrevivência se comparado com a sobrevivência esperada se não estivesse recebendo tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já apresentam a condição ou distúrbio, assim como aqueles propensos a desenvolver a condição ou distúrbio ou aqueles nos quais a condição ou distúrbio deve ser prevenida.
No contexto de cancro, o termo "tratamento" inclui qualquer ou todos dentre: impedir o crescimento de células tumorais, células cancerígenas, ou de um tumor; impedir a replicação de células tumorais ou células cancerígenas, diminuir a carga geral do tumor ou diminuir o número de células cancerígenas, e melhorar um ou mais sintomas associados a a doença.
No contexto de uma doença autoimune, o termo "tratamento" inclui qualquer um ou todos dentre: impedir a replicação de células associadas com um estado de doença autoimune incluindo, mas não limitado a células que produzem um anticorpo autoimune, diminuição da carga de anticorpo autoimune e melhoria de um ou mais sintomas de uma doença autoimune.
No contexto de uma doença infeciosa, o termo "tratamento" inclui qualquer um ou todos dentre: impedir o crescimento, multiplicação ou replicação do patógeno que causa a doença infeciosa e melhorar um ou mais sintomas de uma doença infeciosa.
As abreviações a seguir de fármacos citotóxicos são usadas no presente documento e têm as definições indicadas: MMAE é monometil auristatina E (MW 718); MMAF é N-
metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-fenilalanina (MW 731,5); MMAF-D ME A é MMAF com D MAE A (dimetilaminoetilamina) numa ligação de amida à fenilalanina do terminal C (MW 801,5); MMAF-TEG é MMAF com tetraetilenoglicol esterificado à fenilalanina; MMAF-NtBu é N-t-butilo, unido como uma amida ao terminal C de MMAF; AEVB é auristatina E valeril benzilidrazona, ligante de ácido instável através do terminal C de AE (MW 732); e AFP é monoamida de p-fenileno diamina com fenilalanina de terminal C de auristatina F (MW 732).
4.2 COMPOSTOS 4.2.1 OS COMPOSTOS DE FÓRMULA (Ia) São descritos no presente documento Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando que tem a Fórmula Ia: L-(Aa-Ww-Yy-D)p la ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo em que, L- é uma unidade de Ligando; -Aa-Ww-Yy- é uma unidade de Ligante (LU), em que a unidade de Ligante inclui: -A- é uma unidade de Estirador, a é 0 ou 1, cada -W- é independentemente uma unidade de Aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, -Y- é uma unidade de Espaçador, e y é 0, 1 ou 2; p varia de 1 a cerca de 20; e -D é uma unidade de Fármaco que tem a fórmula DE e DF:
em que, independentemente em cada localização: R2 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R3 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R4 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R5 é selecionado de H e metilo; ou R4 e R5 juntamente formam um anel carbociclico e têm a fórmula -(CRaRb)n_ em que Ra e Rb são independentemente selecionados de H, alquilo Ci-C8 e carbociclo C3-C8 e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R7 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; cada R8 é independentemente selecionado de H, OH, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8 e 0- (alquilo Ci-C8) ; R9 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R10 é selecionado de arilo ou heterociclo C3-C8; Z é 0, S, NH, ou NR12, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14, ou - (R130) m-CH (R15) 2; m é um número inteiro variando de 1-1000; R13 é alquilo C2-C8; R14 é H ou alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, COOH, (CH2) n-N (R16) 2, - (CH2)n-S03H, ou - (CH2) n-S03-alquilo Ci-Cg; cada ocorrência de R16 é independentemente H, alquilo C2-C8, ou - (CH2) n-COOH; R18 é selecionado de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, -C (R8) 2-C (R8) 2-(heterociclo C3-C8) , e -C (R8) 2-C (R8) 2- (carbociclo C3-C8) ; e n é um número inteiro variando de 0 a 6.
Também são descritos no presente documento Compostos de Fármaco que têm a fórmula Ib:
ou sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que: R2 é selecionado de hidrogénio e -alquilo Ci-C8; R3 é selecionado de hidrogénio, -alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, -alquilo Ci-C8-arilo, -alquilo
Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , -heterociclo C3-C8 e -alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R4 é selecionado de hidrogénio, -alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, -alquilo Ci-C8-arilo, -alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , -heterociclo C3-C8 e -alquilo Ci-C8-(heterociclo C3-C8) em que R5 é selecionado de -H e metilo; ou R4 e R5 juntamente têm a fórmula -(CRaRb)n- em que Ra e Rb são independentemente selecionados de -H, - alquilo Ci-C8 e -carbociclo C3-C8 e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6, e formam um anel com o átomo de carbono ao qual estão unidos; R6 é selecionado de H e -alquilo Ci-C8; R7 é selecionado de H, -alquilo Ci-C8, -carbociclo C3-C8, arilo, -alquilo Ci-C8-arilo, -alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , -heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; cada R8 é independentemente selecionado de H, -OH, alquilo Ci-C8, -carbociclo C3-C8 e -0- (alquilo Ci-C8) ; R9 é selecionado de H e -alquilo Ci-C8; R10 é selecionado de grupo arilo ou -heterociclo C3-C8; Z é -0-, -S-, -NH-, ou -NR12-, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14, ou - (R130) m-CH (R15) 2; m é um número inteiro variando de 1-1000; R13 é -alquilo C2-C8; R14 é H ou -alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, -COOH, (CH2) n-N (R16) 2, - (CH2)n-S03H, ou - (CH2) n-S03-alquilo C!-C8; cada ocorrência de R16 é independentemente H, -alquilo Ci-C8, ou - (CH2) n-C00H; e n é um número inteiro variando de 0 a 6.
Também são descritos Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando que têm a fórmula Ia':
Ab-(Aa-Ww-Yy-D) p Fórmula Ia' ou sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que
Ab é um anticorpo, A é uma unidade de Estirador, A é 0 ou 1,
Cada W é independentemente uma unidade de Aminoácido, w é um número inteiro variando de 0 a 12, Y é uma unidade de Espaçador, e y é 0, 1 ou 2, p varia de 1 a cerca de 20, e D é uma fração de Fármaco selecionada a partir das Fórmulas DE e DF:
em que, independentemente em cada localização: R2 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R3 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R4 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R5 é selecionado de H e metilo; ou R4 e R5 juntamente formam um anel carbociclico e têm a fórmula -(CRaRb)n- em que Ra e Rb são independentemente selecionados de H, alquilo Ci-C8 e carbociclo C3-C8 e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R7 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; cada R8 é independentemente selecionado de H, OH, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8 e 0- (alquilo Ci-C8) ; R9 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R10 é selecionado de arilo ou heterociclo C3-C8; Z é 0, S, NH, ou NR12, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14, ou - (R130) m-CH (R15) 2; m é um número inteiro variando de 1-1000; R13 é alquilo C2-C8; R14 é H ou alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, COOH, (CH2) n—N (R16) 2, - (CH2)n-S03H, ou - (CH2)n-S03-alqullo Ci-Cg; cada ocorrência de R16 é independentemente H, alquilo C3-C8, ou - (CH2) n-C00H; R18 é selecionado de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, -C (R8) 2-C (R8) 2-(heterociclo C3-C8) , e -C (R8) 2-C (R8) 2- (carbociclo C3-C8) ; e n é um número inteiro variando de 0 a 6.
Ab é qualquer anticorpo covalentemente unido a uma ou mais unidades de fármaco. Ab inclui um anticorpo que se liga a CD30, CD40, CD70, antigénio Lewis Y. Numa outra forma de realização, Ab não inclui um anticorpo que se liga a um recetor ErbB ou a um ou mais dos recetores (D - (35) : (1) BMPR1B (recetor de proteína morfogenética óssea do tipo IB, N° de acesso do Genbank NM_001203); (2) E16 (LATI, SLC7A5, N° de acesso do Genbank NM_0 0 34 8 6) ; (3) STEAP1 (seis antigénios transmembranares epiteliais da próstata, N° de acesso do Genbank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUC16, N° de acesso do Genbank AF 3 614 8 6) ; (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócit0, mesotelina, N° de acesso do Genbank NM_0 0 5 82 3) ; (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do veículo de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, portador de fosfato dependente de sódio do tipo II 3b, N° de acesso do Genbank NM_006424) (7) Serna 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de tromboespondina (tipo 1 e semelhante ao tipo 1), domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, N° de acesso do Genbank AB 04 0 87 8); (8) PS CA hlg (gene de 2700050Ci2Rik, C530 0 0 8 016Rik, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, N° de acesso do Genbank AY358628); (9) ETBR (recetor endotelina tipo B, N° de acesso do Genbank AY275463); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, N° de acesso do Genbank NM_017763); (11) STEAP2 (HGNC_8 63 9, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado com cancro da próstata, proteína 1 associada com cancro da próstata, seis antigénios de transmembrana epitelial de próstata 2, seis proteínas de transmembrana da próstata, N° de acesso do Genbank AF455138); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catião potencial de recetor transiente, subfamília M, membro 4, N° de acesso do Genbank NM_017636); (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N° de acesso do
Genbank NP_003203 ou NM_003212); (14) CD21 (CR2 (recetor de complemento 2) ou C3DR (recetor de virus Cad/Epstein Barr) ou Hs.73792, N° de acesso do Genbank M26004); (15) CD79b (IGb (beta imunoglobulina-associada), B29, N° de acesso do Genbank NM_000626); (16) FcRH2, (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase la), SPAP1B, SPAP1C, N° de acesso do Genbank NM_030764); (17) HER2 (N° de acesso do Genbank M11730); (18) NCA (N° de acesso do Genbank M18728); (19) MDP (N° de acesso do Genbank BC0i7023); (20) IL20Ra (N° de acesso do Genbank AF184971); (21) Brevican (N° de acesso do Genbank AF229053); (22) Ephb2R (N° de acesso do Genbank NM_004442); (23) ASLG659 (N° de acesso do Genbank AX092328); (24) PSCA (N° de acesso do Genbank AJ297436); (25) GEDA (N° de acesso do Genbank AY260763); (26) BAFF-R (N° de acesso do Genbank NP_443177.1); (27) CD22 (N° de acesso do Genbank NP_001762.1); (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa imunoglobulina- associada, uma proteína específica de célula B que interage covalentemente com Ig beta (CD79B) e forma um complexo na superfície com molécula de IgM, faz a transdução de um sinal envolvido na diferenciação de célula B, N° de acesso do Genbank NP_001774.1); (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt, um recetor acoplado a proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfócito e defesa humoral, possui um papel na infeção por VIH-2 e talvez no desenvolvimento de SIDA, linfoma, mieloma, e leucemia, N° de acesso do Genbank NP_001707.1); (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula MHC classe II (antigénio Ia) que se liga a péptidos e os apresenta aos línfócitos CD4+ T, N° de acesso do Genbank NP_0 02111.1); (31) P2X5 (canal de ião de ligando fechado P2X de recetor purinérgico, um ião de canal fechado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogénese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabilidade de detrusor idiopático, N° de acesso do Genbank NP_002552.2); (32) CD72 (antigénio de diferenciação de célula B CD72, Lyb-2, N° de acesso do Genbank NP_001773.1); (33) LY64 (antigénio de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica de leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função está associada com atividade aumentada de doença em pacientes com eritematose de lúpus sistémico, N° de acesso do Genbank NP_005573.1); (34) FCRH1 (proteína 1 tipo recetor Fc, um recetor putativo para o domínio de imunoglobulina Fc que contém domínios C2 tipo semelhante a Ig e ITAM, pode ter um papel na diferenciação de linfócito B, N° de acesso do Genbank NP_44317 0.1) ; ou (35) IRTA2 (translocação de recetor da superfamília imunoglobulina associada 2, um imunorrecetor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento da célula B e linfomagénese; desregulação do gene pela translocação ocorre em algumas malignidades de célula B, N° de acesso do Genbank NP_112571.1).
Numa forma de realização, -Ww- é —Val-Cit-. R3, R4 e R7 podem ser independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H. Numa forma de realização exemplar, R3 e R4 são cada um isopropilo, R5 é -H, e R7 é sec-butilo. Em ainda uma outra forma de realização, R2 e R6 são cada um metilo, e R9 é -H. Ainda noutro exemplo, cada ocorrência de R8 é -OCH3.
Num exemplo, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H.
Num exemplo, z é -0- ou -NH-.
Num exemplo, R10 é arilo.
Num exemplo particular, R10 é -fenilo.
Num exemplo particular, quando Z é -0-, R11 é -H, metilo ou t-butilo.
Num exemplo, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é - (CH2) n-N (R16) 2, e R16 é -alquilo Cp-Cg ou - (CH2) n-C00H.
Noutro exemplo, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é - (CH2)n-S03H.
Ab pode ser cACIO, cBR96, cS2C6, clF6, c2F2, hAClO, hBR96, hS2C6, hlF6, e h2F2 .
Conjudados de Fórmula Ia exemplares têm as seguintes estruturas:
/V
em que L é um anticorpo, Vai é valina, e Cit é citrulina. A carga do fármaco é representada por p, o número médio de moléculas de fármaco por anticorpo numa molécula (por exemplo, de Fórmula Ia, Ia' e Ic). A carga do fármaco pode variar de 1 a 20 fármacos (D) por Ligando (por exemplo Ab ou mAb). Composições de Fórmula Ia e Fórmula Ia' incluem coleções de anticorpos conjugados com uma variedade de fármacos, de 1 a 20. O número médio de fármacos por anticorpo na preparação de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espetroscopia de massa, análise ELISA, e HPLC. A distribuição quantitativa de Conjugados de Ligando-Fármaco em termos de p pode também ser determinada. Em alguns casos, separação, purificação, e caracterização de conjugados de Ligando-Fármaco homogéneos onde p é certo valor de Conjugados de Ligando-Fármaco com outras cargas de fármaco podem ser atingidas por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese. 4.2.2 OS COMPOSTOS DE FÁRMACO DE FÓRMULA (Ib)
Também são descritos no presente documento Compostos de Fármaco que têm a Fórmula (Ib):
ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R2 é selecionado de hidrogénio e -alquilo Ci-C8; R3 é selecionado de hidrogénio, -alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, -alquilo Ci-C8-arilo, -alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , -heterociclo C3-C8 e -alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R4 é selecionado de hidrogénio, -alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, -alquilo Ci-C8-arilo, -alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , -heterociclo C3-C8 e -alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) em que R5 é selecionado de -H e metilo; ou R4 e R5 juntamente têm a fórmula -(CRaRb)n_ em que Ra e Rb são independentemente selecionados de -H, - alquilo Ci-C8 e -carbociclo C3-C8 e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6, e formam um anel com o átomo de carbono ao qual estão unidos; R6 é selecionado de -H e -alquilo Ci-C8; R7 é selecionado de -H, -alquilo Ci-C8, -carbociclo C3-C8, arilo, -alquilo Ci-C8-arilo, -alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , -heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8-(heterociclo C3-C8) ; cada R8 é independentemente selecionado de -H, -OH, alquilo Ci-C8, -carbociclo C3-C8 e -0- (alquilo Ci-C8) ; R9 é selecionado de -H e -alquilo Ci-C8; R10 é selecionado de grupo arilo ou -heterociclo C3-C8; Z é -0-, -S-, -NH-, ou -NR12-, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de -H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14, ou - (R130) m-CH (R15) 2; m é um número inteiro variando de 1-1000; R13 é -alquilo C2-C8; R14 é -H ou -alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente -H, -C00H, - (CH2)n-N(R16)2, - (CH2)n-S03H, ou - (CH2) n-S03-alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R16 é independentemente -H, -alquilo C2—C8, ou - (CH2) n-C00H; e n é um número inteiro variando de 0 a 6.
Num exemplo, R3, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H. Num exemplo, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R5 é -H, e R7 é sec-butilo.
Noutro exemplo, R2 e R6 são, cada um, metilo, e R9 é - H.
Ainda noutro exemplo, cada ocorrência de R8 é -0CH3. Num exemplo, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -0CH3, e R9 é -H.
Num exemplo, Z é -0- ou -NH-.
Num exemplo, R10 é arilo
Num exemplo, R10 é -fenilo. Num exemplo, qunado Zé- 0-, R11 é -H, metilo ou t-butilo.
Num exemplo, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é - (CH2) n-N (R16) 2, e R16 é -alquilo Ci-C8 ou - (CH2) n-COOH.
Noutro exemplo, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é - (CH2) n-S03H.
Compostos ilustrativos de Fórmula (Ib), cada um dos quais pode ser usado como frações de fármaco (D) em ADC, incluem compostos que têm as secruintes estruturas:
e sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. OS COMPOSTOS DE FÓRMULA (Ic)
Também são descritos no presente documento compostos de conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) que têm a Fórmula Ic:
Ab- (Aa-Ww-Yy-D) p IC que compreende um anticorpo covalentemente unido a uma ou mais unidades de fármaco (frações). Os compostos de conjugado de anticorpo-fármaco incluem sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Os compostos de Fórmula Ic são definidos em que:
Ab é um anticorpo que se liga a um ou mais recetores de antigénios associados a tumores (1)-(35): (1) BMPR1B (recetor de proteína morfogenética óssea do tipo IB, N° de acesso do Genbank NM_001203); (2) E16 (LATI, SLC7A5, N° de acesso do Genbank NM_0 0 34 8 6) ; (3) STEAP1 (seis antigénios transmembranares epiteliais de próstata, N° de acesso do Genbank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUC16, N° de acesso do Genbank AF 3 614 8 6) ; (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócito, mesotelina, N° de acesso do Genbank NM_0 0 5 82 3) ; (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do veículo de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, portador de fosfato dependente de sódio do tipo II 3b, N° de acesso do Genbank NM_006424) (7) Serna 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de tromboespondina (tipo 1 e semelhante ao tipo 1), domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, N° de acesso do Genbank AB040878); (8) PSCA hlg (gene de 2700050C12Rik, C530008016Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, ADNc de RIKEN 2700050C12, N° de acesso do Genbank AY358628); (9) ETBR (recetor endotelina tipo B, N° de acesso do Genbank AY275463); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, N° de acesso do Genbank NM_017763); (11) STEAP2 (HGNC_8 63 9, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado a cancro da próstata, proteína 1 associada a cancro da próstata, seis antigénios de transmembrana epitelial de próstata 2, seis proteínas de transmembrana da próstata, N° de acesso do Genbank AF455138); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catião potencial de recetor transiente, subfamília M, membro 4, N° de acesso do Genbank NM_017636); (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N° de acesso do Genbank NP_003203 ou NM_003212); (14) CD21 (CR2 (recetor de complemento 2) ou C3DR (recetor de virus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792, N° de acesso do Genbank M26004); (15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (beta imunoglobulina-associada), B29, N° de acesso do Genbank NM_000626); (16) FcRH2, (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase la) , SPAP1B, SPAP1C, N° de acesso do Genbank NM_030764); (17) HER2 (N° de acesso do GenbankM11730); (18) NCA (N° de acesso do Genbank M18728); (19) MDP (N° de acesso do Genbank BC0i7023); (20) IL20Ra (N° de acesso do Genbank AF184971); (21) Brevican (N° de acesso do Genbank AF229053); (22) Ephb2R (N° de acesso do Genbank NM_004442); (23) ASLG659 (N° de acesso do Genbank AX092328); (24) PSCA (N° de acesso do Genbank AJ297436); (25) GEDA (N° de acesso do Genbank AY260763); (26) BAFF-R (N° de acesso do Genbank NP_443177.1); (27) CD22 (N° de acesso do Genbank NP_001762.1); (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa imunoglobulina-associada, uma proteína específica de célula B que interage covalentemente com beta Ig (CD79B) e forma um complexo na superfície com molécula de IgM, faz a transdução de um sinal envolvido na diferenciação de célula B, N° de acesso do Genbank NP_001774.1); (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt, um recetor acoplado a proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfócito e defesa humoral, possui um papel na infeção por VIH-2 e talvez no desenvolvimento de SIDA, linfoma, mieloma, e leucemia, N° de acesso do Genbank NP_001707.1); (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula MHC classe II (antigénio Ia) que se liga a péptidos e os apresenta aos linfócitos T CD4+, N° de acesso do Genbank NP_002111.1); (31) P2X5 (canal de ião de ligando fechado P2X de recetor purinérgico, um ião de canal fechado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogénese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabilidade de detrusor idiopático, N° de acesso do Genbank NP_002552.2); (32) CD72 (antigénio de diferenciação de célula B CD72, Lyb-2, N° de acesso do Genbank NP_001773.1) ; (33) LY64 (antigénio de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica em leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função está associada com atividade aumentada de doença em pacientes com eritematose de lúpus sistémico, N° de acesso do Genbank NP_005573.1); (34) FCRH1 (proteína 1 tipo recetor Fc, um recetor putativo para o domínio de imunoglobulina Fc que contém domínios C2 tipo Ig e ITAM, pode ter um papel na diferenciação de linfócito B, N° de acesso do Genbank NP_443170.1) ; ou (35) IRTA2 (translocação de recetor da superfamilia imunoglobulina associada 2, um imunorrecetor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento da célula B e linfomagénese; desregulação do gene pela translocação ocorre em algumas malignidades de célula B, N° de acesso do Genbank NP_112571.1). A é uma unidade de Estirador, a é 0 ou 1, cada W é independentemente uma unidade de Aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, Y é uma unidade de Espaçador, e y é 0, 1 ou 2, p varia de 1 a cerca de 8, e D é uma fração de Fármaco que tem a Fórmula DE e DF:
em que a linha ondulada de DE e DF indica o local de união covalente a A, W, ou Y, e independentemente em cada localização: R2 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R3 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo Ci-C8, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3- C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3- C8) ; R4 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo Ci-C8, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3- C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3- C8) ; R5 é selecionado de H e metilo; ou R4 e R5 juntamente formam um anel carbocíclico e têm a formula -(CRaRb)n“ em que Ra e Rb são independentemente selecionados de H, alquilo Ci-C8 e carbociclo C3-C8 e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R7 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo Ci-C8, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3- C8) ; cada R8 é independentemente selecionado de H, OH, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8 e 0- (alquilo Ci-C8) ; R9 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R10 é selecionado de arilo ou heterociclo C3-C8; Z é 0, S, NH, ou NR12, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14, ou - (R130) m-CH (R15) 2; m é um número inteiro variando de 1-1000; R13 é alquilo C2-C8; R14 é H ou alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, COOH, (CH2) n-N (R16) 2, - (CH2) n-S03H, ou - (CH2) n-S03-alquilo C!-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, alquilo C2-C8, ou - (CH2) n-COOH; R18 é selecionado de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, -C (R8) 2-C (R8) 2-(heterociclo C3-C8) , e -C (R8) 2-C (R8) 2- (carbociclo C3-C8) ; e n é um número inteiro variando de 0 a 6.
Num exemplo, -Ww- é -Val-Cit-.
Noutro exemplo, R3, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H. Num exemplo, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R5 é -H, e R7 é sec-butilo.
Ainda noutro exemplo, R2 e R6 são, cada um, metilo, e R9 é - Η.
Ainda noutro exemplo, cada ocorrência de R8 é -OCH3. Num exemplo, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H.
Num exemplo, Z é -0- ou -NH-.
Num exemplo, R10 é arilo.
Num exemplo, R10 é -fenilo.
Num exemplo, quando Z é -0-, R11 é -H, metilo ou t- butilo.
Num exemplo, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é - (CH2) n-N (R16) 2, e R16 é -alquilo Ci-C8 ou - (CH2) n-C00H.
Noutro exemplo, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é - (CH2) n-S03H.
Conjugados ilustrativos de Fórmula Ic têm as seguintes estruturas:
em que Ab é um anticorpo que se liga a um ou mais recetores de antigénio associado a tumor (l)-(35); Vai é valina; e Cit é citrulina. A carga de fármaco é representada por p, o número médio de fármacos por anticorpo numa molécula de Fórmula I. A carga de fármaco varia de 1 a 20 fármacos (D) por anticorpo (Ab ou mAb) . Composições de ADC de Fórmula I incluem coleções de anticorpos conjugados com uma variedade de fármacos, de 1 a 20. O número médio de fármacos por anticorpo nas preparações de ADC de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espetroscopia visivel/UV, espetrometria de massa, análise ELISA, e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Em alguns casos, separação, purificação, e caracterização de ADC homogéneo onde p é certo valor de ADC com outras cargas de fármaco, podem ser atingidas por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese.
Para alguns conjugados de anticorpo-fármaco, p pode estar limitado pelo número de locais de união no anticorpo. Por exemplo, onde a união é uma cisteina tiol, como nas formas de realização exemplares acima, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos cisteina tiol, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser unido.
Tipicamente, menos que o valor teórico máximo de frações de fármaco são conjugados a um anticorpo durante a reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com o intermediário de fármaco-ligante ou reagente de ligante. Apenas os grupos de lisina mais reativos podem reagir com um reagente de ligante reativo por amina. Geralmente, anticorpos não contêm muitos, se é que contêm algum, grupos cisteina tiol livres e reativos que podem ser ligados a uma fração de fármaco. A maioria dos resíduos de cisteina tiol nos anticorpos dos compostos da invenção existe como pontes de bissulfeto e deve ser reduzida com um agente de redução tal como ditiotreitol (DTT). Adicionalmente, o anticorpo deve ser submetido a condições de desnaturação para revelar os grupos nucleofilicos reativos tais como lisina ou cisteina. A carga (proporção fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de várias maneiras diferentes, incluindo: (i) limitação do excesso molar de intermediário de fármaco-ligante ou reagente de ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura da reação de conjugação, e (iii) condições redutivas parciais ou limitativas para modificação de cisteina tiol.
Deve ser entendido que onde mais de um grupo nucleofilico reage com um intermediário de fármaco-ligante, ou reagente de ligante seguido por reagente da fração de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos ADC com uma distribuição de uma ou mais frações de fármaco unidas a um anticorpo. 0 número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura por análise dupla de anticorpo ELISA, especifica para anticorpo e especifica para o fármaco. Moléculas de ADC individuais podem ser identificadas na mistura através de espetroscopia de massa, e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica ("Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Hamblett, K.J., et al., Resumo N° 624, American Association for Cancer Research; 2004 Annual Meeting, 27-31 de Março de 2004; Proceedings of the AACR, Volume 45, Março de 2004; "Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Conjugates", Alley, S.C., et al., Resumo N2 627, American Association for Cancer Research; 2004 Annual Meeting, 27-31 de Março de 2004; Proceeding of the AACR, Volume 45, Março de 2004) . Assim, um ADC homogéneo com urn valor de carga único pode ser isolado da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia.
4.3 A UNIDADE DE LIGANTE
Uma "unidade de Ligante" (LU) é um composto bifuncional que pode ser usado para unir uma unidade de Fármaco e uma unidade de Ligando para formar Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando, ou que é útil na formação de imunoconjugados direcionados contra antigénios associados a tumor. Estes imunoconjugados permitem a aplicação seletiva de fármacos tóxicos a células tumorais. Numa forma de realização, a unidade de Ligante do Composto de Fármaco-Ligante e Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando possui a fórmula: -Aa-Ww-Yy- em que: -A- é uma unidade de Estirador; a é 0 ou 1; cada -W- é independentemente uma unidade de Aminoácido; w é independentemente um número inteiro que varia de 0 a 12; -Y- é uma unidade de Espaçador; e y é 0, 1 ou 2.
No Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando, o Ligante é capaz de unir a fração de Fármaco e a unidade de Ligando.
4.3.1_A UNIDADE DE ESTIRADOR A unidade de Estirador (-A-), quando presente, é capaz de unir uma unidade de Ligando a uma unidade de aminoácido (-W-). Com relação a isto, um Ligando (L) possui um grupo funcional que pode formar uma ligação com um grupo funcional de uma unidade de Estirador. Grupos funcionais úteis que podem estar presentes num ligando, tanto por ocorrência natural quanto via manipulação química, incluem, mas não se limitam a sulfidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxi, o grupo hidroxilo anomérico de um hidrato de carbono, e carboxilo. Num aspeto, os grupos funcionais de Ligando são sulfidrilo e amino. Grupos sulfidrilo podem ser gerados pela redução de uma ligação de bissulfeto intramolecular de um Ligando. Alternativamente, grupos sulfidrilo podem ser gerados pela reação de um grupo amino de uma fração lisina de um Ligando, usando 2-iminotiolano (reagente de Traut) ou um outro reagente gerador de sulfidrilo.
Numa forma de realização, a unidade de Estirador forma uma ligação com um átomo de enxofre da unidade de Ligando. 0 átomo de enxofre pode ser derivado de um grupo sulfidrilo de um Ligando. Unidades de Estirador representativas desta forma de realização são ilustradas dentro dos colchetes das Fórmulas Ilia e Illb, onde L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definidos acima, e R17 é selecionado a partir de -alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8-, -0-(alquilo Ci-C8)- , --arileno-, -alquileno Ci-Cio-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno Ci-Ci0- (carbociclo C3-C8) -, - (carbociclo C3-C8) -alquileno Ci-Ci0-, -heterociclo C3- C8-, -alquileno C1-C10- (heterociclo C3-C8) -, - (heterociclo C3-C8) -alquileno C1-C10-, - (CH2CH20) r-, e (CH2CH20) r-CH2-; e r é um número inteiro que varia de 1-10. Deve ser entendido a partir das formas de realização exemplares de Fórmula Ia, tal como III—VI, que mesmo onde não denotado expressamente, de 1 a 20 frações de fármaco estão ligadas a um ligando (p = 1-20) .
Uma unidade de Estirador ilustrativa é aquela de Fórmula Ilia em que R17 é -(CH2)5-:
Uma outra unidade de Estirador ilustrativa é aquela de Fórmula Ilia em que R17 é - (CH2CH20) r-CH2-; e r é 2:
Ainda uma outra unidade de Estirador ilustrativa é aquela de Fórmula Illb onde R17 é -(CH2)5-:
Noutro exemplo, a unidade de Estirador é ligada à unidade de Ligando através de uma ligação de bissulfeto entre um átomo de enxofre da unidade de Ligando e um átomo de enxofre da unidade de Estirador. Uma unidade de Estirador representativa é ilustrada dentro dos colchetes de Fórmula IV, onde R17, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definidos acima.
Ainda noutro exemplo, o grupo reativo do Estirador contém um local reativo que pode formar uma ligação com um grupo amino primário ou secundário de um Ligando. Exemplos destes locais reativos incluem, mas não se limitam a, ésteres ativados tais como ésteres de succinimida, 4- nitrofenilésteres, pentafluorofenilésteres, tetrafluorofenilésteres, anidridos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos.
Unidades de Estirador representativas I são ilustradas dentro dos colchetes das Fórmulas Va e Vb, onde -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definidos acima.
0 grupo reativo do Estirador pode conter um local reativo que é reativo para um grupo de hidrato de carbono modificado (-CHO) que pode estar presente num Ligando. Por exemplo, um hidrato de carbono pode ser fracamente oxidado usando um reagente tal como periodato de sódio e a unidade resultante (-CHO) do hidrato de carbono oxidado pode ser condensada com um Estirador que contém uma funcionalidade tal como uma hidrazida, uma oxima, uma amina primária ou secundária, uma hidrazina, uma tiossemicarbazona, um carboxilato de hidrazina e uma arilidrazida tal como aquelas descritas por Kaneko, T. et al. (1991) Bioconjugate Chem 2:133-41. Unidades de Estirador representativas são ilustradas dentro dos colchetes de Fórmulas Via, VIb, e VIc, onde -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definidos acima.
4.3.2_A UNIDADE DE AMINOÁCIDO A unidade de Aminoácido (-W-), quando presente, liga a unidade de Estirador à unidade de Espaçador se a unidade de Espaçador estiver presente, liga a unidade de Estirador à fração de Fármaco se a unidade de Espaçador estiver ausente, e liga a unidade de Ligando à unidade de Fármaco se a unidade de Estirador e unidade de Espaçador estiverem ausentes.
Ww— é uma unidade de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido ou dodecapéptido. Cada unidade -W- independentemente tem a fórmula denotada a seguir entre colchetes, e w é um número inteiro que varia de 0 a 12.
em que R19 é hidrogénio, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, benzilo, p-hidroxibenzilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -ch2ch2sch3, -ch2conh2, -ch2cooh, -ch2ch2conh2, -CH2CH2COOH, -(CH2) 3nhc (=NH)NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2) 3nhcoch3, - (CH2) 3nhcho, -(CH2) 4nhc (=NH) nh2, -(CH2)4NH2, - (CH2) 4nhcoch3, - (CH2) 4nhcho, - (CH2) 3NHCONH2, - (CH2) 4NHCONH2, -CH2CH2CH (OH) CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo,
A unidade de Aminoácido pode ser clivada enzimaticamente por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a tumor, para libertar a unidade de Fármaco (-D), que numa forma de realização é protonada in vivo mediante libertação para proporcionar um Fármaco (D). Unidades Ww ilustrativas são representadas pelas fórmulas (VII) - (IX) :
Unidades de Aminoácido exemplares incluem, mas não se limitam a unidades de fórmula (VII) onde: R20 é benzilo e R21 é -(CH2)4NH2; R20 é isopropilo e R21 é - (CH2) 4NH2; R20 é isopropilo e R21 é - (CH2) 3NHCONH2. Uma outra unidade de Aminoácido exemplar é uma unidade de fórmula (VIII) onde R20 é benzilo, R21 é benzilo, e R22 é -(CH2)4NH2.
Unidades úteis -Ww- podem ser designadas e otimizadas nas suas seletividades para clivagem enzimática por enzimas específicas, por exemplo, uma protease associada a tumor. Num exemplo, uma unidade -Ww- é aquela cuja clivagem é catalisada por catepsina B, C e D, ou por uma protease plasmina.
Num exemplo, -Ww- é um dipéptido, tripéptido, tetrapéptido ou pentapéptido.
Quando R19, R20, R21, R22 ou R23 é diferente de hidrogénio, o átomo de carbono ao qual R19, R20, R21, R22 ou R23 está unido é quiral.
Cada átomo de carbono ao qual R19, R20, R21, R22 ou R23 é unido está independentemente na configuração (S) ou (R).
Num exemplo da unidade de Aminoácido, a unidade de Aminoácido é valina-citrulina. Num outro aspeto, a unidade de Aminoácido é fenilalanina- lisina (isto é, fk). Ainda noutro exemplo da unidade de Aminoácido, a unidade de Aminoácido é N-metilvalina-citrulina. Em ainda um outro aspeto, a unidade de Aminoácido é ácido 5-aminovalérico, homo fenilalanina lisina, tetraisoquinolinacarboxilato lisina, cicloexilalanina lisina, ácido isonopecótico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina e ácido isonopecótico.
Em certos casos, a unidade de Aminoácido pode compreender aminoácidos naturais. Noutros casos, a unidade de Aminoácido pode compreender aminoácidos não naturais.
4.3.3 A UNIDADE DE ESPAÇADOR A unidade de Espaçador (-Y-), quando estiver presente, liga uma unidade de Aminoácido à fração de fármaco quando uma unidade de Aminoácido estiver presente. Alternativamente, a unidade de Espaçador liga a unidade de Estirador à fração de Fármaco quando a unidade de Aminoácido estiver ausente. A unidade de Espaçador também liga a fração de Fármaco à unidade de Ligando quando a unidade de Aminoácido e a unidade de Estirador estiverem ausentes.
Unidades de Espaçador são de dois tipos gerais: auto- sacrifical e não auto-sacrifical. Uma unidade de Espaçador não auto-sacrifical é aquela na qual parte ou toda a unidade de Espaçador permanece ligada à fração de Fármaco após clivagem, especialmente enzimática, de uma unidade de Aminoácido do Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando ou Composto de Fármaco-Ligante. Exemplos de uma unidade de Espaçador não auto-sacrifical incluem, mas não se limitam a uma unidade de Espaçador (glicina-glicina) e uma unidade de Espaçador glicina (ambas ilustradas no Esquema 1) (infra). Quando um Composto Exemplar contendo uma unidade de Espaçador glicina-glicina ou uma unidade de Espaçador glicina sofre clivagem enzimática através de protease associada à célula tumoral, protease associada a célula cancerígena ou uma protease associada a linfócito, uma fração glicina-glicina-Fármaco ou uma fração glicina-Fármaco é clivada de L-Aa-Ww-. Numa forma de realização, uma reação de hidrólise independente ocorre dentro da célula alvo, que cliva a fração de glicina-Fármaco ligada e que liberta o Fármaco.
Numa outra forma de realização, -Yy- é uma unidade de álcool p-aminobenzílico (PAB) (veja-se Esquemas 2 e 3) cuja fração fenileno é substituída por Qm onde Q é alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; e m é um inteiro que varia de 0-4.
Num exemplo, uma unidade de Espaçador não auto-sacrifical (-Y-) é -Gly-Gly-.
Noutro exemplo, uma unidade de Espaçador não auto-sacrifical (-Y-) é -Gly-.
Num exemplo, é proporcionado um Composto de Fármaco-Ligante ou um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando em que a unidade de Espaçador está ausente (y=0), ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Alternativamente, um Composto Exemplar contendo uma unidade de Espaçador auto-sacrifical pode libertar -D sem a necessidade de uma etapa de hidrólise separada. Nesta forma de realização, -Y- é um grupo PAB que está ligado a -Ww-através do átomo de nitrogénio aminado do grupo PAB, e conectado diretamente à -D através de um carbonato, carbamato ou grupo éter. Sem estar limitado por qualquer teoria ou mecanismo específico, o Esquema 2 ilustra um possível mecanismo de libertação de Fármaco de um grupo PAB que está unido diretamente a -D através de um grupo carbamato ou carbonato patrocinado porToki et al. (2002) J Org. Chem. 67:1866-1872.
em que Q é -alquilo Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; e p varia de 1 a cerca de 20.
Sem estar limitado por qualquer teoria ou mecanismo especifico, o Esquema 3 ilustra um possível mecanismo de libertação de Fármaco de um grupo PAB que está unido diretamente a -D através de uma ligação de éter ou amina.
em que Q é -alquilo Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; e p varia de 1 a cerca de 20.
Outros exemplos de espaçadores auto-sacrificais incluem, mas não se limitam a compostos aromáticos que são eletronicamente semelhantes ao grupo PAB tal como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e orto- ou para-aminobenzilacetais. Podem ser usados Espaçadores que sofrem ciclização mediante hidrólise de ligação de amida, tal como ácido 4-aminobutirico amidas substituídas ou não substituídas (Rodrigues, et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223), sistemas de anel biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] apropriadamente substituídos (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815) e amidas do ácido 2- aminofenilpropiónico (Amsberry, et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 5867). A eliminação de fármacos contendo amina que são substituídas na posição a de glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) são também exemplos de espaçador auto-sacrifical úteis nos Compostos Exemplares.
Num exemplo, a unidade de Espaçador é uma unidade bis(hidroximetil)estireno ramificada (BHMS) conforme ilustrado no Esquema 4, que pode ser usada para incorporar e libertar diversos fármacos.
em que Q é -alquilo Ci-C8, -O-(alquilo Ci-C8) , -halogénio, - nitro ou - ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a cerca de 20.
Num exemplo, as frações -D são iguais. Em ainda uma outra forma de realização, as frações -D são diferentes.
Num exemplo, unidades de Espaçador (-Yy-) são representadas pelas Fórmulas (X)-(XII):
em que Q é -alquilo Ci-C8, -O- (alquilo Ci-C8) , -halogénio, - nitro ou - ciano; e m é um número inteiro que varia de 0-4. e
Exemplos dos compostos de conjugado de anticorpo-fármaco das Fórmula Ia' e Ic incluem:
em que w e y são, cada um, 0,
4.4 A UNIDADE DE FÁRMACO (FRAÇÃO) A fração de fármaco (D) dos conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) são do tipo dolastatina/auristatina (Patente US N° 5635483; 5780588) que demonstraram interferir com a dinâmica de microtúbulo, hidrólise GTP, e divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12) :3580-3584 e têm atividade anticancerigena (Patente US N° 5663149) e antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). D é uma unidade de Fármaco (fração) que tem um átomo de nitrogénio que pode formar uma ligação com a unidade de Espaçador quando y = 1 ou 2, com o grupo carboxilo C-terminal de uma unidade de Aminoácido quando y = 0, com o grupo carboxilo de uma unidade de Estirador quando w e y = 0, e com o grupo carboxilo de uma unidade de Fármaco quando a, w, e y = 0. Deve ser entendido que os termos "unidade de fármaco" e "fração de fármaco" são sinónimos e usados de forma intercambiável no presente documento.
Num exemplo, -D é da fórmula DE ou DF:
em que, independentemente em cada localização: R2 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R3 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, aquilarilo Ci-C8, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R4 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, aquilarilo Ci-C8, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R5 é selecionado de H e metilo; ou R4 e R5 juntamente formam um anel carbocíclico e têm a fórmula -(CRaRb)n- em que Ra e Rb são independentemente selecionados de H, alquilo Ci-C8 e carbociclo C3-C8 e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R7 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, aquilarilo Ci-C8, alquilo Ci-C8- (carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8 e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; cada R8 é independentemente selecionado de H, OH, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8 e 0- (alquilo Ci-C8) ; R9 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R10 é selecionado de arilo ou heterociclo C3-C8; Z é 0, S, NH, ou NR12, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de H, alquilo Ci-C2o, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14, ou - (R130) m-CH (R15) 2; m é um número inteiro variando de 1-1000; R13 é alquilo C2-C8; R14 é H ou alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, COOH, (CH2) n-N (R16) 2, - (CH2) n-S03H, ou - (CH2) n-S03-alquilo C!-C8; cada ocorrência de R16 é independentemente H, alquilo C3-C8, ou - (CH2) n-COOH; R18 é selecionado de -C (R8) 2-C (R8) 2-arilo, -C (R8) 2-C (R8) 2-(heterociclo C3-C8) , e -C (R8) 2-C (R8) 2- (carbociclo C3-C8) ; e n é um número inteiro variando de 0 a 6.
Num exemplo, R3, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H. Num exemplo, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R5 é H, e R7 é sec-butilo.
Noutro exemplo, R2 e R5 são, cada um, metilo, e R9 é H.
Ainda noutro exemplo, cada ocorrência de R8 é -OCH3.
Num exemplo, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é H.
Num exemplo, Z é -0- ou -NH-.
Num exemplo, R10 é arilo.
Num exemplo, R10 é fenilo.
Num exemplo, quando Z é -0-, R11 é H, metilo ou t-butilo.
Num exemplo, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é - (CH2) n-N (R16) 2, e R16 é -alquilo Ci-C8 ou - (CH2) n-C00H.
Num exemplo, quando Z é -NH, R11 é -CH(R15)2, em que R15 é - (CH2) n-S03H.
Unidades de Fármaco (-D) ilustrativas incluem as unidades de fármaco que tem as seguintes estruturas:
e sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Grupos hidrofilicos, tais como, mas não limitados a trietilenoglicol ésteres (TEG), conforme mostrado acima, podem ser unidos à Unidade de Fármaco em R11. Sem estar limitado pela teoria, os grupos hidrofílicos auxiliam na internalização e não aglomeração da Unidade de Fármaco.
4.5 A UNIDADE DE LIGANDO A unidade de Ligando (L-) inclui dentro de seu âmbito qualquer unidade de um Ligando (L) que se ligue ou reativamente se associe ou forme um complexo com um recetor, antigénio ou outra fração recetiva associada com uma população de célula alvo dada. Um Ligando é uma molécula que se liga, forma um complexo, ou reage com uma fração de uma população de células que se destinam a serem terapeuticamente ou, por outro lado, biologicamente modificadas. Num exemplo, a unidade de Ligando age para aplicar a unidade de Fármaco a uma população de célula alvo especifica com a qual a unidade de Ligando reage. Estes Ligandos incluem, mas não se limitam a, proteínas de grande peso molecular tais como, por exemplo, anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpo, proteínas de peso molecular menor, polipéptido ou péptidos, lectinas, glicoproteínas, não péptidos, vitaminas, moléculas de transporte de nutriente (tal como, mas não limitadas a transferina), ou qualquer outra molécula ou substância de ligação de célula.
Uma unidade de Ligando pode formar uma ligação com uma unidade de Estirador, uma unidade de Aminoácido, uma Unidade de Espaçador, ou uma Unidade de Fármaco. Uma unidade de Ligando pode formar uma ligação com uma unidade de Ligante através de um heteroátomo do Ligando. Heteroátomos gue podem estar presentes numa unidade de Ligando incluem enxofre (numa forma de realização, de um grupo sulfidrilo de um Ligando), oxigénio (numa forma de realização, de um grupo carbonilo, carboxilo ou hidroxilo de um Ligando) e nitrogénio (numa forma de realização, de um grupo amino primário ou secundário de um Ligando). Estes heteroátomos podem estar presentes no Ligando no estado natural do Ligando, por exemplo, um anticorpo de ocorrência natural, ou podem ser introduzidos no Ligando através de modificação guimica.
Num exemplo, um Ligando possui um grupo sulfidrilo e o Ligando liga-se à unidade de Ligante através do átomo de enxofre do grupo sulfidrilo.
Em ainda um outro exemplo, o Ligando tem um ou mais resíduos de lisina gue podem ser modificados guimicamente para introduzir um ou mais grupos sulfidrilo. A unidade de Ligando liga-se à unidade de Ligante através do átomo de enxofre do grupo sulfidrilo. Os reagentes gue podem ser usados para modificar lisinas incluem, mas não se limitam a S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA) e cloridrato de 2-iminotiolano (Reagente de Traut).
Noutro exemplo, o Ligando pode ter um ou mais grupos hidrato de carbono gue podem ser modificados guimicamente para ter um ou mais grupos sulfidrilo. A unidade de Ligando liga-se à unidade de Ligante, tal como a unidade de Estirador, através do átomo de enxofre do grupo sulfidrilo.
Ainda noutro exemplo, o Ligando pode ter um ou mais grupos hidrato de carbono gue podem ser oxidados para proporcionar um grupo aldeído (- CHO) (veja-se, por exemplo, Laguzza et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55) . 0 aldeído correspondente pode formar uma ligação com um Local Reativo numa unidade de Estirador. Locais Reativos num Estirador que podem reagir com um grupo carbonilo num Ligando incluem, mas não se limitam a hidrazida e hidroxilamina. Outros protocolos para a modificação de proteínas para a união ou associação de Unidades de Fármaco são descritos por Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & sons (2002) .
Proteína não imunorreativa, polipéptido, ou Ligandos de péptido úteis incluem, mas não se limitam a transferrina, fatores de crescimento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido de libertação de gastrina, fator de crescimento derivado de plaqueta, IL-2, IL-6, fatores de crescimento de transformação ("TGF"), tais como TGF-α e TGF-β, fator de crescimento de vacínia ("VGF"), insulina e fatores de crescimento tipo insulina I e II, lectinas e apoproteína de lipoproteína de baixa densidade.
Anticorpos policlonais úteis são populações heterogéneas de moléculas de anticorpo derivadas do soro de animais imunizados. Vários procedimentos bem conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de anticorpos policlonais para um antigénio de interesse. Por exemplo, para a produção de anticorpos policlonais, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com um antigénio de interesse ou derivado do mesmo, incluindo, mas não limitado a coelhos, ratinhos, ratos, e cobaias. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo das espécies hospedeiras, e incluindo, mas não limitados a adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substância tensioativas tais como lisolecitinas, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões de óleo, hemocianinas do molusco "key-hole", dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin), e Corynebacterium parvum. Estes adjuvantes são também conhecidos na técnica.
Anticorpos monoclonais úteis são populações homogéneas de anticorpos para um determinante antigénico especifico (por exemplo, um antigénio de célula cancerígena, um antigénio virai, um antigénio microbiano, uma proteína, um péptido, um hidrato de carbono, um produto químico, um ácido nucleico, ou fragmentos dos mesmos). Um anticorpo monoclonal (mAb) para um antigénio de interesse pode ser preparado através da utilização de qualquer técnica conhecida na técnica que proveja a produção de moléculas de anticorpo por linhas celularess contínuas em cultura. Estas técnicas incluem, mas não se limitam à técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (1975, Nature 256, 495-497), a técnica do hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), e a técnica do hibridoma EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancro Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96) . Estes anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, e IgD e de qualquer subclasse das mesmas. 0 hibridoma que produz mAbs de utilização nesta invenção pode ser cultivado in vitro ou in vivo.
Anticorpos monoclonais úteis incluem, mas não se limitam a anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, fragmentos de anticorpos, anticorpos monoclonais quiméricos humano-ratinho (ou outras espécies). Anticorpos monoclonais humanos podem ser feitos por qualquer uma dentre numerosas técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, Teng et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80, 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72-79; e Olsson et aí., 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16). O anticorpo pode também ser um anticorpo biespecífico. Métodos para preparar anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co- expressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia pesada-cadeia leve, onde as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Milstein et al. , 1983, Nature 305:537-539). Devido à seleção aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas diferentes de anticorpo, das quais apenas uma possui a estrutura biespecifica correta. Procedimentos semelhantes são apresentados são apresentados na Publicação Internacional N° WO 93/08829, e por Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão, preferivelmente, dá-se com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter uma primeira região constante de cadeia pesada (CH1), contendo o local necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Ácidos nucleicos, com sequências que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, de cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos nos vetores de expressão separados, e são co-transfetados num organismo hospedeiro adequado. Isto possibilita grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptido em formas de realização nas quais proporções desiguais das três cadeias de polipéptido usadas na construção proporcionam os resultados ideais. É possível, portanto, inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipéptido num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipéptido em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não têm significância específica.
Num exemplo desta abordagem, os anticorpos biespecíficos possuem uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com a primeira especificidade de ligação num braço, e um par híbrido de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações não desejadas de cadeia de imunoglobulina, visto que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona uma maneira fácil de separação (Publicação Internacional N° WO 94/04690).
Para pormenores adicionais para gerar anticorpos biespecíficos veja-se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210; Rodrigues et al., 1993, J. of Immunology 151:6954-6961; Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Carter et al., 1995, J. of Hematotherapy 4:463-470; Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology 16:677-681. Através da utilização destas técnicas, anticorpos biespecificos podem ser preparados para utilização no tratamento ou prevenção de doença conforme definido no presente documento.
Anticorpos bifuncionais são também descritos, na Publicação de Patente Europeia N° EPA 0 105 360. Conforme apresentado nesta referência, anticorpos híbridos ou bifuncionais podem ser derivados tanto biologicamente, isto é, por técnicas de fusão de célula, quanto quimicamente, especialmente com agentes de reticulação ou reagentes formadores de ponte de bissulfeto, e podem compreender anticorpos inteiros ou fragmentos dos mesmos. Métodos para obtenção destes anticorpos híbridos são apresentados, por exemplo, na Publicação Internacional WO 83/03679, e Publicação de Patente Europeia N° EPA 0 217 577. O anticorpo pode ser um fragmento funcionalmente ativo, derivado ou análogo de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a antigénios de célula cancerígena, antigénios virais, ou antigénios microbianos ou outros anticorpos ligados a células tumorais ou matrizes. Com relação a isto, "funcionalmente ativo" significa que o fragmento, derivado ou análogo é capaz de extrair anticorpos anti-anti-idiotipos que reconhecem o mesmo antigénio que o anticorpo do qual o fragmento, derivado ou análogo é derivado reconhecido (SIC). Especificamente, numa forma de realização exemplar a antigenicidade do idiotipo da molécula de imunoglobulina pode ser aumentada pela deleção de estrutura e sequências CDR que sejam de terminal C para a sequência CDR que especificamente reconhece o antigénio. Para determinar quais sequências CDR se ligam ao antigénio, péptidos sintéticos contendo as sequências CDR podem ser usados nas análises de ligação com o antigénio através de quaisquer métodos de análise de ligação conhecidos na técnica (por exemplo, a análise de núcleo BIA) (Veja-se, por exemplo, Rabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD; Rabat E. et al., 1980, J. of Immunology 125(3):961- 969).
Outros anticorpos úteis incluem fragmentos de anticorpos tais como, mas não limitados a, fragmentos F(ab')2, que contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada e podem ser produzidos por digestão de pepsina da molécula de anticorpo, e fragmentos Fab, que podem ser gerados pela redução das pontes de bissulfeto dos fragmentos F(ab')2· Outros anticorpos são dímeros de cadeia leve de anticorpos, ou qualquer fragmento mínimo dos mesmos, tais como Fvs ou anticorpos de cadeia única (SCAs) (por exemplo, conforme descritos na Patente US N° 4946778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei USA 85:5879-5883; e Ward et al. 1989, Nature, 334:544-54), ou quaisquer outras moléculas com a mesma especificidade que o anticorpo .
Adicionalmente, anticorpos recombinantes, tais como anticorpos monoclonais quiméricos ou humanizados, que compreendem tanto porções humanas quanto não humanas, e que podem ser feitos usando técnicas de ADN recombinante padrão, são anticorpos úteis. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes são derivadas de diferentes espécies de animais, tais como aqueles que têm uma região variável derivada e regiões monoclonal de murino e constante de imunoglobulina humana. (Veja-se, por exemplo, Cabilly et al. , Patente US N° 4816567; e Boss et al., Patente US N° 4.816397). Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas que têm uma ou mais regiões de determinação de complementação (CDRs) de espécies não humanas e uma região de estrutura de uma molécula de imunoglobulina. (Veja-se, por exemplo, Queen, Patente US N° 5.585.089). Estes anticorpos quiméricos e humanizados podem ser produzidos por técnicas de ADN recombinante conhecidas na técnica, por exemplo, usando métodos descritos na Publicação Internacional N° WO 87/02671; Publicação de Patente Europeia N° 184.187; Publicação de Patente Europeia N° 171496 Publicação de Patente Europeia N° 173494; Publicação Internacional N° WO 86/01533; Patente US N° 4816567; Publicação de Patente Europeia N° 12.023; Berter et al., 1988, Science 240:1041- 1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. , 1985,
Nature 314:446-449; e Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Patente US N° 5225539; Jones et al., 1986; Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; e Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
Anticorpos completamente humanos são especificamente desejáveis e podem ser produzidos usando ratinhos transgénicos que sejam incapazes de expressar genes de cadeias leve e pesada de imunoglobulina endógena, mas que possam expressar genes humanos de cadeia leve e pesada. Os ratinhos transgénicos são imunizados da maneira normal com um antigénio selecionado, por exemplo, todo ou uma fração de um polipéptido da invenção. Anticorpos monoclonais direcionados contra o antigénio podem ser obtidos usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humanos ancorados de ratinhos transgénicos são rearranjados durante a diferenciação de célula B, e subsequentemente sofrem mudança de classe e mutação somática. Dessa maneira, usando esta técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma análise desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, veja-se Lonberg e Huszar (1995, Int. Ref. Immunol. 13:65- 93). Para uma discussão pormenorizada desta tecnologia para produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para a produção destes anticorpos, veja-se, por exemplo, as Patentes US N° 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806. Outros anticorpos humanos podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da Abgenix, Inc. (Freemont, CA) e Genpharm (San Jose, CA).
Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo selecionado podem ser gerados usando uma técnica referida como "seleção guiada". Nesta abordagem, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de ratinho, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconheça o mesmo epítopo. (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899-903). Anticorpos humanos podem também ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de apresentação de fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Quan, Μ. P. e Carter, P. 2002. The rise of monoclonal antibodies as therapeutics. Em Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu, P. M. e Fick Jr., R. B., eds. , Marcel Dekker, Nova York, NY, Capítulo 20, páginas 427-469) .
Noutros exemplos, o anticorpo é uma proteína de fusão de um anticorpo, ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, por exemplo, no qual o anticorpo é fundido através de uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação peptídica), tanto no terminal N quanto no terminal C para uma sequência de aminoácido de uma outra proteína (ou porção da mesma, preferivelmente uma porção com pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos da proteína) que não seja o anticorpo. Preferivelmente, o anticorpo ou fragmento do mesmo é covalentemente ligado à outra proteína no terminal N do domínio constante.
Anticorpos incluem análogos e derivados que são modificados, isto é, pela união covalente de qualquer tipo de moléculas, contanto que esta união covalente permita que o anticorpo retenha sua imunoespecificidade de ligação ao antigénio. Por exemplo, mas não como uma limitação, os derivados e análogos dos anticorpos incluem aqueles foram adicionalmente modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma unidade de anticorpo celular ou outra proteína etc. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser executada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a clivagem química, acetilação, formulação, síntese metabólica na presença de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o análogo ou derivado pode conter um ou mais aminoácidos não naturais.
Os anticorpos incluem anticorpos que têm modificações (por exemplo, substituições, deleções ou adições) nos resíduos de aminoácidos que interagem com recetores Fc. Em especial, anticorpos incluem anticorpos que tenham modificações nos resíduos de aminoácidos identificados como envolvidos na interação entre o domínio anti-Fc e o recetor FcRn (veja-se, por exemplo, a Publicação Internacional N° WO 97/34631) . Anticorpos imunoespecíficos para antigénio de célula cancerígena podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da Genentech (São Francisco, CA) ou produzidos por qualquer método conhecido por aqueles especializados na técnica, tais como, por exemplo, técnicas de síntese química ou expressão recombinante. As sequências de nucleótido que codifica anticorpos imunoespecíficos para um antigénio de célula cancerígena podem ser obtidas, por exemplo, do banco de dados GenBank ou de um banco de dados semelhante, de publicações da literatura, ou através de clonagem e sequenciamento de rotina.
Num exemplo especifico, anticorpos conhecidos para o tratamento ou prevenção de cancro podem ser usados. Anticorpos imunoespecíficos para um antigénio de célula cancerígena podem ser obtidos comercialmente ou produzido por qualquer método conhecido daqueles especializados na técnica, tal como, por exemplo, técnicas de expressão recombinante. A sequência de nucleótido que codifica anticorpos imunoespecíficos para um antigénio de célula cancerígena pode ser obtida, por exemplo, do banco de dados GenBank ou de um banco de dados semelhante, de publicações da literatura, ou através de clonagem e sequenciamento de rotina. Exemplos de anticorpos disponíveis para o tratamento de cancro incluem, mas não se limitam a anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado, HERCEPTIN® (trastuzumab; Genentech) para o tratamento de pacientes com cancro de mama metastático; RITUXAN® (rituximab; Genentech) que é um anticorpo monoclonal antí-CD20 quimérico para o tratamento de pacientes com linfoma não Hodgkin; OvaRex (AltaRex Corporation, MA) que é um anticorpo de murino para o tratamento de cancro do ovário; Panorex (Glaxo Wellcome, NC) que é um anticorpo IgG2a de murino para o tratamento de cancro colorretal; Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY) que é um anticorpo quimérico anti-EGFR IgG para o tratamento de cancros positivos para fator de crescimento epidérmico, tais como cancro da cabeça e pescoço; Vitaxin (Medlmmune, Inc., MD) que é um anticorpo humanizado para o tratamento de sarcoma; Campath I/H (Leukosite, MA) que é um anticorpo IgGi humanizado para o tratamento de leucemia linfocitica crónica (CLL); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo IgG anti-CD33 humanizado para o tratamento de leucemia mieloide aguda (AML); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ) que é um anticorpo IgG anti-CD22 humanizado para o tratamento de linfoma não Hodgkin; Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo anti-HLA-DR humanizado para o tratamento de linfoma não Hodgkin; Oncolym (Techniclone, Inc., CA) que é um anticorpo anti-HLA-Drl0 de murino rádio marcado para o tratamento de linfoma não Hodgkin; Allomune (BioTransplant, CA) que um mAb anti-CD2 humanizado para o tratamento de Doença de Hodgkin ou linfoma não Hodgkin; Avastin (Genentech, Inc., CA) que é um anticorpo humanizado anti-VEGF para o tratamento de cancros de pulmão e colorretal; Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ e Amgen, CA) que um anticorpo anti-CD22 para o tratamento de linfoma não Hodgkin; e CEAcide (Immunomedics, NJ) que é um anticorpo anti-CEA humanizado para o tratamento de cancro colorretal.
Outros anticorpos úteis para o tratamento de cancro incluem, mas não se limitam a anticorpos contra os seguintes antigénios: CA125 (do ovário), C215-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), Lewis Y (carcinomas), Lewis X (carcinomas), alfa-fetoproteína (carcinomas), CA 242 (colorretal), fosfatase alcalina placentária (carcinomas), antigénio especifico da próstata (próstata), fosfatase prostática ácida (próstata), fator de crescimento epidérmico (carcinomas), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE-4 (carcinomas), recetor de antitransferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MUC1-KLH (cancro de mama), CEA (colorretal), gplOO (melanoma), MARTI (melanoma), PSA (próstata), recetor IL-2 (leucemia de célula T e linfomas) ; CD20 (linfoma não Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), CD22 (linfoma), gonadotropina coriónica humana (carcinoma), CD38 (mieloma múltiplo), CD40 (linfoma), mucina (carcinomas), P21 (carcinomas), MPG (melanoma) , e produto oncogene Neu (carcinomas). Alguns anticorpos específicos úteis incluem, mas não se limitam a BR96 mAb (Trail, P. A., Willner, D., Lasch, S.J., Henderson, A. J., Hofstead, S.J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellstrõm, I., Hellstrõm, K. E., "Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates" Science 1993, 261, 212-215), BR64 (Trail, PA, Willner, D., Knipe, J., Henderson, A.J., Lasch, S.J., Zoeckler, M.E., Trailsmith, M.D., Doyle, T.W., King, H. D., Casazza, A. M., Braslawsky, G.R., Brown, J. P., Hofstead, S.J., (Greenfield, R.S., Firestone, R.A., Mosure, K., Kadow, D. F., Yang, Μ. B., Hellstrõm, K. E., e Hellstrõm, I. "Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin Immunoconjugates" Cancer Research 1997, 57 100-105, mAbs contra o antigénio CD-40, tal como S2C6 mAb (Francisco, J. A., Donaldson, K. L., Chace, D., Siegall, C. B., e Wahl, A. F. "Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14" Cancer Res. 2000, 60, 3225-3231), mAbs contra o antigénio CD70, tal como 1F6 mAb e 2F2 mAb, e mAbs contra o antigénio CD30, tal como AC10 (Bowen, M.A., Olsen, K. J., Cheng, L., Avila, D., e Podack, E. R. "Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT" J. Immunol. 151, 5896-5906, 1993: Wahl et ai., 2002 Cancer Res. 62(13) :3736-42) . Muitos outros anticorpos de internalização que se ligam aos antigénios associados a tumores podem ser usados e foram analisados (Franke, A. E., Sievers, E. L., e Scheinberg, D. A., "Cell surface recetor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review" Cancer Biother Radiopharm. 2000, 15, 459-76; Murray, J. L., "Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age" Semin Oncol. 2000, 27, 64-70; Breitling, F., e Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley and Sons, Nova York, 1998).
Em certos exemplos, o anticorpo não é Trastuzumab (anti-HER2 de comprimento total, humanizado (PM 145167)), HerceptinF (ab')2 (derivado de anti-HER2 enzimaticamente (PM 100000)), 4D5 (anti-HER de comprimento total, murino, de hibridoma), rhu4D5 (anticorpo humanizado de comprimento total, expressado de forma transiente), rhuFab4D5 (Fab humanizado recombinante (PM 47738)), 4D5Fc8 (antiHER2 de comprimento total, murino, com domínio de ligação FcRn com mutação), ou Hg (4D5 humanizado de comprimento total "Sem articulação", com cisteínas de articulação de cadeia pesada que sofreu mutação para serinas. Expresso em E. coli (portanto não glicosilado)).
Noutro exemplo expecifico, anticorpos conhecidos para o tratamento ou prevenção de uma doença autoimune são usados de acordo com as composições e métodos da invenção. Anticorpos imunoespecíficos para um antigénio de uma célula que é responsável pela produção de anticorpos autoimunes podem ser obtidos que qualquer organização (por exemplo, uma universidade científica ou uma companhia) ou produzidos por qualquer método conhecido daqueles com especialização na técnica tais como, por exemplo, técnicas de síntese química ou expressão recombinante. Numa outra forma de realização, anticorpos úteis são imunoespecificos para o tratamento de doenças autoimunes, mas não se limitam a Anticorpo Antinuclear; Anti-ds ADN; Anti-ss ADN, Anticorpo Anticardiolipina IgM, IgG; Anticorpo Antifosfolípido IgM, IgG; Anticorpo Anti- SM; Anticorpo Antimitocondrial;
Anticorpo de Tiroide; Anticorpo Microssómico; Anticorpo Tiroglobulina; Antí-SCL-70; Anti-Jo, Anti-UiRNP; Anti-La/SSB; Anti SSA, Anti-SSB, Anticorpo Anticélulas Peritais; Anti-Histonas; Anti-RNP; C- ANCA; P-ANCA; Anticentrómero; Antifibrilarina, e Anticorpo Anti-GBM.
Em certos casos, anticorpos úteis podem ligar-se a um recetor ou a um complexo de recetor expresso num linfócito ativado. 0 recetor ou complexo de recetor pode compreender um membro da superfamilia do gene imunoglobulina, um membro da superfamilia do recetor TNF, uma integrina, um recetor de citocina, um recetor de quimiocina, uma proteina de histocompatibilidade principal, uma lectina, ou uma proteina de controlo de complemento. Exemplos não limitativos de membros da superfamilia de imunoglobulina são CD2, CD3, CD4, CD 8, CD19, CD22, CD28, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1, e ICOS. Exemplos não limitativos de membros da superfamilia de recetor TNF são CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-IBB, TNF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, BCMA, osteoprotegerina, Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, e APO-3. Exemplos não limitativos de integrinas adequadas são CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD29, CD41, CD4 9a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 e CD104. Exemplos não limitativos de lectinas adequadas são lectina tipo C, tipo S, e tipo I.
Num exemplo, o Ligando liga-se a um linfócito ativado que está associado com uma doença autoimune.
Noutro exemplo especifico, Ligandos imunoespecificos úteis para um antigénio virai ou microbiano são anticorpos monoclonais. Os anticorpos podem ser quiméricos, humanizados ou anticorpos monoclonais humanos. Conforme usado no presente documento, o termo "antigénio virai" inclui, mas não está limitado a, qualquer péptido virai, proteina de polipéptido (por exemplo, VIH gpl20, VIH nef, RSV F glicoproteina, neuraminidase de influenza virus, hemaglutinina de influenza virus, HTLV tax, glicoproteina de vírus herpes simples (por exemplo, gB, gC, gD, e gE) e antigénio superficial de hepatite B) que é capaz de obter uma resposta imunológica. Conforme usado no presente documento, o termo "antigénio microbiano" inclui, mas não se limita a, qualquer péptido microbiano, proteína, sacárido, polissacárido, ou molécula de lípido (por exemplo, uma molécula bacteriana, fúngica, protozoário patogénico, ou polipéptido de levadura incluindo, por exemplo, LPS e polissacárido capsular 5/8) que seja capaz de obter uma resposta imunológica.
Anticorpos imunoespecíficos para um antigénio virai ou microbiano podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da BD Biosciences (São Francisco, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), ou Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) ou produzidos por qualquer método conhecido por aqueles especializados na técnica, tais como, por exemplo, técnicas de síntese química ou expressão recombinante. A sequência de nucleótido que codifica anticorpos que são imunoespecíficos para um antigénio virai ou microbiano pode ser obtida, por exemplo, do banco de dados GenBank. ou de um banco de dados semelhante, de publicações da literatura, ou através de clonagem e sequenciamento de rotina.
Num exemplo específico, Ligandos úteis são aqueles que são úteis para o tratamento ou prevenção de infeção virai ou microbiana de acordo com os métodos apresentados no presente documento. Exemplos de anticorpos úteis disponíveis para o tratamento de infeção virai ou infeção microbiana incluem, mas não se limitam a, SYNAGIS (Medlmmune, Ind., MD) que é um anticorpo monoclonal de vírus sincicial anti-respiratório (RSV) humanizado útil para o tratamento de pacientes com infeção por RSV; PR0542 (Progenies) que é um anticorpo de fusão CD4 útil para o tratamento de infeção por VIH; OSTAVIR (Protein Design Labs, Inc. , CA) que é um anticorpo humano útil para o tratamento de vírus de hepatite B; PROTOVIR (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo IgGi humanizado útil para o tratamento de citomegalovírus (CMV); e anticorpos anti-LPS.
Outros anticorpos úteis no tratamento de doenças infeciosas incluem, mas não se limitam a anticorpos contra os antigénios de estirpes patogénicas de bactérias (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphteriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio colerae, Escherichia coll, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hidrophilo, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.), fungos patogénicos (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); protozoários (Entomoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Tryoanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); ou helmintos (Enterobius vermicularis,
Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, e anciliostemas).
Outros anticorpos para o tratamento de doença viral incluem, mas não se limitam a anticorpos contra antigénios de virus patogénicos, incluindo como exemplos e não com intuito limitativo: Poxviridae, Herpesviridae, Herpes Simplex virus 1, Herpes Simplex virus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, virus de influenza, virus de parainfluenza, caxumba, sarampo, virus sincicial respiratório, rubéola, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, virus da Hepatite A, virus da Hepatite B, virus da Hepatite C, virus da Hepatite E, virus da Hepatite não A/não B, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae, e Virus da Imunodeficiência Humana.
Em tentativas para descobrir alvos celulares efetivos para diagnóstico de e terapêutica de cancro, pesquisadores buscaram identificar transmembrana ou, por outro lado, polipéptidos associados a tumor que fossem especificamente expressos na superfície de um ou mais tipos específicos de célula cancerígena, se comparado com uma ou mais células não cancerígenas normais. Frequentemente, estes polipéptidos associados a tumor são mais expressos de forma abundante na superfície das células cancerígenas se comparado com a superfície de células não cancerígenas. A identificação destes polipéptidos de antigénio de superfície celular associado com tumor fez surgir a capacidade para direcionar especificamente para células cancerígenas alvo para destruição através de terapêuticas baseadas em anticorpo.
Anticorpos que compreendem Ab na Fórmula Ic de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) e que podem ser úteis no tratamento de cancro incluem, mas não se limitam a anticorpos contra antigénios associados a tumor (TAA). Estes antigénios associados a tumor são conhecidos na técnica, e podem ser preparados para utilização na geração de anticorpos que usam métodos e informação que são bem conhecidos na técnica. Exemplos de TAA incluem (1) - (35), mas não se limitam a TAA (1) - (35) listados a seguir. Para conveniência, informação referente a estes antigénios, todos os quais são conhecidos na técnica, está listada a seguir e inclui nomes, nomes alternativos, números de acesso do Genbank e referências principais. Antigénios associados a tumor direcionados por anticorpos incluem todas as variantes de sequência de aminoácido e isoformas que possuam pelo menos cerca de 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, ou 95 % de identidade de sequência em relação às sequências identificadas nas sequências correspondentes listadas (SEQ ID NOS: 1-35) ou nas sequências identificadas nas referências citadas. Em alguns exemplos, TAA que têm variantes de sequência de aminoácido exibem substancialmente as mesmas propriedades biológicas ou caracteristicas que um TAA que a sequência encontrada nas sequências correspondentes listadas (SEQ ID NOS: 1-35). Por exemplo, um TAA que tem uma sequência variante geralmente é capaz de se ligar especif icamente a um anticorpo que se ligue especificamente ao TAA com a sequência correspondente listada. As sequências e apresentações especificamente citadas no presente documento são expressamente incorporadas por referência.
Antigénios Associados a Tumor (1) - (35):
(1) BMPR1B (recetor de proteína morfogenética óssea do tipo IB, N° de acesso do Genbank NM_001203, ten Dijke, P., et al. Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997)); documento WO 2004063362 (Reivindicação 2) WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento US 2003134790-A1 (Páginas 38-39); documento WO 2002102235 (Reivindicação 13; Página 296); documento WO 2003055443 (Páginas 91-92; documento WO 200299122 (Exemplo 2; Páginas 528-530); documento WO 2003029421 (Reivindicação 6); documento WO 2003024392 (Reivindicação 2, Figura 112); documento WO 200298358 (Reivindicação 1; Página 183); documento WO 200254940 (Páginas 100-101); documento WO 200259377 (Páginas 349-350); documento WO 200230268 (Reivindicação 27; Página 376); documento WO 200148204 (Exemplo; Figura 4) NP_001194 recetor de proteína morfogenética óssea, tipo IB/pid=NP_001194.1 - Referências Cruzadas: MIM:603248; NP_001194.1; NM_001203_1 502 aa i civdoychpe i eed ktíu:??: s τ tot i apdi kcp oowtolyiu toy y υεευευ tvLK:>rntaes mle tAvasvãu:. rt i rçtçççrAL í ιλαχεου o;«yexyravk n yd
tttVDl vtRtvottKtfRf ttvi DE <: dmt itylv X EMEfí S EGY. £ :!,EEVAts<:u:?;«G IV v N * * ' í' ' N-Çs ' ' " \ \ iisywe Et (ssg m » í 1) (2) E16 (LATI, SLC7A5, N° de acesso do Genbank NM_003486); Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H. W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16) : 11267-11273); documento WO 2004048938 (Exemplo 2); documento WO 2004032842 (Exemplo IV); documento WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento WO 2003016475 (Reivindicação 1); documento WO 200278524 (Exemplo 2); documento WO 200299074 (Reivindicação 19); páginas 127-129); documento WO 200286443 (Reivindicação 27; Páginas 222, 393); documento WO 2003003906 (Reivindicação 10; Página 293); documento WO 200264798 (Reivindicação 33; Páginas 93-95); documento WO 200014228 (Reivindicação 5; páginas 133-136); documento US 2003224454 (Figura 3) ; documento WO 2003025138 (Reivindicação 12; Página 150); NP_003477 família de portador de soluto 7 (portador de aminoácido catiónico, sistema y+) , membro 5/pid=NP_003477.3 - Referências cruzadas de Homo sapiens: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1 507 aa tmmmmmmm «jjut r Γίτττν^ι»^*^ V ,ννϋν.ν. .ww. VA-.V. iv > %$mg. 18? Mí* àí
(3) STEAP1 (seis antigénios transmembrana epitelial da próstata, N° de acesso do Genbank NM_012449); Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96 (25) 14523-14528); documento WO 2004065577 (Reivindicação 6); documento WO 2004027049 (Figura 1L) ; EP 1394274 (Exemplo 11); documento WO 2004016225 (Reivindicação 2); documento WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento US 2003157089 (Exemplo 5) ; documento US 2003185830 (Exemplo 5) ; documento US 2003064397 (Figura 2); documento WO 200289747 (Exemplo 5; Páginas 618-619); documento WO 2003022995 (Exemplo 9; Figuras 13A, Exemplo 53; Página 173, Exemplo 2; Figura 2A); NP_036581 seis antigénios epiteliais de transmembrana da próstata Referências Cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012 4 4 9_1 33 9 aa wm:w&M^x>p&¥7h&T\^xàí®mmmM$w?MiWMMm^Miãmww$M®M^$tim mm®mmvt2££r^i&vw#wmmiMm%mm&wmmz'*m&$mMM$,mzm visSfKfi t t^3^ci.jímwai^3tw»^i^wi^Wí í® ® » J) (4) 0772P (CA125, MUC16, N° de acesso do Genbank AF 3 614 8 6); J. Biol. Chem. 276 (2(:27371-27375 (2001)); documento WO 2004045553 (Reivindicação 14); documento WO 200292836 (Reivindicação 6; Figura 12); documento WO 200283866 (Reivindicação 15; Páginas 116-121); documento US 2003124140 (Exemplo 16); documento US 2003091580 (Reivindicação 6); documento WO 200206317 (Reivindicação 6; Páginas 400- 408);
Referências Cruzadas: Gl:34501467; AAK74120.3; AF3 614 8 6_1 6995 aa
PTOSlJ^X^IAaTTORMt^ISRlPGTSSTSHLSSTSKSRl.TtL.EDTVDTEM-íQPSTHTÍtVT ffVRTS 1 sGmsQssvLsmwzpvjkTsmGTTyymKTsvsTSTãD fpktsriqxeptssl
TSGLRETSSSSRISSftrEOaTVItSEWSSATTEVSSXlVISSROTSMSQFDQFXXSFDIS TEaiTRLSTSÍ>XmTGSAESÃXTIIST6SPaA'rSEGTt.XX1DX$rrrFWS<ÍTHSTASP0fSHS EKXTEWSRTPGDVPÍTJPSI, P® VSRASSVSGSItSS PAMTSTSFPÍJTLPKS IS SSPHPVTALL ΤΧ,5ΡνΖΤΤηΜΜΤ5ΞΗΡΕΤ3δΡΡΚΜ3ΧΚΑΕΧΪΑΤΗΕ7ΧΚΙ?ΚΕΚΙ8Ρ33ΜΤΡννΝνΰ'ΓνΣ YKHLSPS S^-TLADLVTTKFrS PM&TTS TLGNTSV STST PAPPETMWTQPTSG ItTSGLBJS IS Τ3ΟΚΡ53&ΤΕΒ3Α51»3βΜΡ·Κ3&ΤΤΚνΗΕΤΕΑΪίδΙ!ΐ3ΚΤ0ΤΡ6ΡΑα8ΤΙ3ΡΒΪ8Τ1ΤΙΤΚ.Ι® XPtTXXGSAEMflXPKXGHSGASSQGTFX^DTSSRASWPÇTKSaATHRSPBSÍjmTPHSR £ΡΕαν£ΜΡ8βΡ8νΒΚΧ3ΡΡά3^8ΐ,ΗΑνΤ8Ρ3ΡΒΥ3ΓΡ3Β38Η33ΡΕΒνΤ3Ι1ΡΤε·νΜΜΚΤ TímusTsiiEPVTTappsmiTSBESiATS¥jmmTmzQL3Emhvr(mstxaRRQmYB SYPGLPEPSRT/TSPWTSSTIíCDrVSTTIPAS SB XTRIEMESTSTLTFTPRKTSTSQElH SATKPSTVBYKRLTSATXEDSMTQTOSSSRGPSPDQSTWSGDlSTBVITRl.STSPIKTBa TSMTITTQTCSPímTSRGniníOTSTITMSGTHSTASQSRSESQMTM.MSRTPGSVPííIíS ΗΡ3^ΒΑ33Ά3Ρ3Χ35Ρνΐ^383ΡΥ33ΤΧ:εΦ3ΙΗ333ΙΡνΤ3ΕΕΤ3ΕΙ1νΐ<:ΤΤΕΑΙΛ3Τ33Ε PSTSS ppm>s STSAHIIAOTVXTDTSKLSím^iTSGYTHSe&SSVIADSVXTKATSSM GXrYPXGDTím.TSTPAFSDTgRÃQmSKljSLTPGLHfiTSXSESTSSATEiCSTOUSSVPX GAOTSVÊRTEAISSSRTSIPQPAÔSTMSSBTSMSTtTRISTPLTaKESTDMAXTPKTGPS GATSQGTFTLDSSSTASÍ-fPGTHSAXraRFPSSWTXPMSRGPEDVSWPSPLSVSKKgPPS
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LKTB^MHSPGSKK^m,TBRVI^TIJV0Pr^£CNTSyGIlLYSGCRItTr)I,RSKKW?Aft'Et3WiA IC THMiD PXBPOTBPjíQL YWBLSQLTNGIKHÁG PYTIjQ&RS £A*YÍK5FTH5íí PVPTSSTPG TSTyDLGSGTPSSI>?Sei:SATAGPLLVPFTMr^tITHLJrfEgDMiíCPGSRXFKTrEK.VLQ SI^PMPm^SVGH.YSGCHLTU^Sm>SAATGWDArCTOR£tDPitSFGVDiRKa.»ilELS ΟΧ-τΐίΏΐΚΕΙ<ΟΡΥΤΪ,&Είί3Ι>ΥνΝΰΡΪΉΟ'Χ«ΑΡΝΤ3ΤΡΟ'Τ5ΤνΒΐ,£5Τ55ΤΡ33Ιίρ3Ρ1!δΑαΡ LLVPFTI.KFTI^fíLQY^DMHHFGSRKFtíYTBRVLQGM-SSMFKMTSVGTXYSGCPXTLI, Ι^ΕΚΙΚΙΛΤ^Ι^ΪΟΒΗΗΙΦΡΚβ^Ι^^^ΥΚΗ^ΚΟ^ΤΗδΙΙ^Ι^ΡΥΤΧ^ΚΜβΙίΥνίϊίϊΡ THRSSVAPTSÍMTsnT5IX5T3STPSSI,PSPTTAVPLtíWrrxJ!íFPJTKX,QYQE»IRHPG ^ΕΚΡΚΤΪΚΚν^^1^ΡΑ1ίΚί^1^Ρ£!^δ€Ι^ΙδΧ,Ε3Κϊΐ!βΙ^^νΒΜβ»ΗΛΙΙΪΡ03Ρ G^DREQL.^QLSQWTOGlKElPSPYTLDRiíSIiWHGSTimSSaLfTSTS^STVDLGTSOl’ PSPVPSP^AGPLLWFTLÍfFPlTUI.GYSBOMHRPGSÍÍKFÍÍATeaV^ÇíGX^SPIFmSSV GPLY8ÍÍCR.TiTSlJEPE-KDí?AATC3«DAVCI.YKPÍl£fKRí>C}Ií0RSQIíYWBI>âQWÍ«tITELGFY SX^RDSLYVEKPm2KSVFTTSTPGTSWYWAXTGTPSSF3^!nrSPGPIlaPFrFNFTTT Ϊ^ΒΥΕΗ®^Η5^3ΕΚϊί^ΤΒ^βδ^ϊ^^3βΠ,$ν®ΡΙίΥ3θςΕ&ϊ,ϊΑΕΡΐΚ!ζ?ΕΜΤ(ϊνϊϊ TICYHRVDPXGPGI.DREPI>Yí'IELSQt,’mSIT.SLGPY'rLDRB3IiYVKGPKPWSSyPMSTP QTfSTVHIjATSGTPS SLPGKTAPVPLLI P FTLSSfFT I TNIdrtf YSENMQHP GS RKFSTIPRVT^Q αΐ.Ι,ΚΡΙ,ΡΚΒΤΒνβΡϊίΥΒΟαίϋΤϋΕΡΕΚΗαβΑΤΏνΕΑΙΟΧΙ,ΡαΧίΡΤαΡδ^ΟίϊΒΚΙ,ΏίΕΧίβ ς^Ί^3ν*ΓΕ1,Γ,ΡΥΪΙ*0ΚΤ>δΙ,ΥνΗ<3ΡΤΗδ33νΡΤΤδ τ FGTSAVHLSTSGTPA8I.PGHTA PG P ^Χ,νΡΡΤΙ^'ΙΡΤΙΤΝ^ΟΥΕ®ΡΪ5ΗΗΡΏ^ΚΡί5ΓΤΤΕΡ^ααΜ;^^Ρ^Τδν«Ρ1,Υ3δσΚ1«ΤΙ^ ΗΡΕΚΕΘΑΑΤΏν0ΤΧ0ΤΗΚΙ®&ί1ΚΡ0Ι^Εβ0^ΥΜΜ^3Κ&Τ^ΙΙΕ^^ΡΥΙΛηκαδΙ>Υ^αΡ 1^IáJPP®S1^i;P<n,ST™^TSETPSS&PRPIVPÔPÍ^VPFTI^ri'I‘PHLaY®ESMHIíPG GI^REQkYKS&SQLTHGItM^FYTi^RDSkWDGFrHWSPiPrrSTPGTSXTOÍIiGTSGT Ρ&άΧ1ΡΕΤΡΡΑΤδΡΧ^^ΡΥΜΪΡ^ΐ™έ1ξϊΧΕΕΐ3ΜαΗΡ<33Β;ΚΡίΤ2Φβδ’Μ,0<3Χ.ΐίΚΡΑΡΚβ5'θν GPJíYSSCKIiTX*í*KPEKaGVATH</m.ICTHRPPPK3: &ΰΙΛίϊ^βΣ.ΥΜΕΑΕΟ£>ΧΗΕ ÍTEXiSF Υ TLDRDSLY^IGFTQSSSWTTSTFGXI^QPETS STPSSLPGPmTGFVLLPFTWIFTI I JiLQ’/EEDMHRPGSRKPMTTERVLQGIjMPIjPKKTSVSSLYSGCRiiTLLSPEKSGAATfiVD AVCXBRPDPKSI^LDSEELYVíía^QLTfíGJTSUSPYTMJRHSLYVHaFTHQSSKTTTE.TP ΏΧ©ΤΜΗΧΑΤ3ΕΤ»Αάϊ^3ΡΤΧΑ^Ρΐ,Α%^»ΪΤΙΤΪ^Υ®®ΜΜΐώΜ§ΕΚΡϊ^βΚνϊία GLrj?PVP^TSVGPl»YSOCRI.Tl<IiRPKKDGAft.TKVBAICrYEPDPKSPC;LDRBQ^YWEXíS QLTHS ITBJjQPYTIííJKDSÍiYVliKSFTQRSSVFrXS I PGf Pl^fPI^TSSYFVSKPGPSaAS P Μ^ΡΧΒΝΡΤΪΤί«(ΕΤεΒΜ^ΗΡα®Η?αΡΕΤΧΕΕΥΙ^ίΑ«δ&ΚΚ!8Τ8νΘΡΙ.Υβθαϊϋ:)ΤΙιϊ, ΑΡ3ίΜΤΑΧανΓΑΙΟΤίΙΚΡϋΡΚβΡβΙίΟΕΕαΐΛΤΐΒΧΗς)1ΙΤ·Μ?ΐ:ΤΕΙ<ΟΡΥΜ,Γ®ΪΒ3ΧΡνΐίαΡ THP^SVSTTSXPGTPWYLGASKXPiPsSIPGPSAASírLLILFTAKPTI ®SLSYÍBSI®®GS RKPBTTERVI^ELRPLFíamTCPI*YS<3CRLTLX,RPBKDGEATGVDAICTKaPí>PTGPS l^REQL¥LBLSai,Tag XI^GPYfaMSRBS^YWG PXBBS SVPXtSTGVVSSÉPFTLííFTI Ι^ΑΥΜΜΜ^ΕδδΙ^ΡΒΣΤΟΜνϊ^ϊ^βΡΙίΡβΑΒβ^Ο^Υ^Ι^ΚνίΑΙ,ΙϊδΜΒδΑΕΧΚν MLtC^Yl.tSPljSGPGlíPPJKQVFHSIjSQOfllGrTRIjSPYSÍíDKDSXiYIjílGYirajPGPOEtPIT PKPATTFLPPiSFATTAMGYHLJCTLTIjiJFTXSínjQySPDííGKGSATPlíSrSG^X.QHtiLR.P ί,ΡΟΚΒ5ΜαΡ5Ύ1βΟΟΙ4Ι8Ι*ΚΡΒΚΙΪ5ίιΑΧΐ3ντ>,ΪΤ€ΤΏΪΡΌΡνβΡΟΙ1ΟΙθαί,ΏίΒ^3αί,ΤΚίΟ VTQLGFYVIíDRDSÍiFXHGYAPQSIjSXRGBYQXMPHIVRWMjS&POPTSSBYXTÍjIiRDIQD K^m'RYKGSGX«MFRFCIíVXm.X&lDSVBVTV1<AfcFSSS)UDPS&YlQWX1E5KELmSFEW X^8TYQX.VDXH\?TE»SiSSVYQPTeSS9XGBPYXiKm'Sm1PSEGORAQPGTanfQR3SKKR XEDAMIQI.FRNSS IKSYPSI>CQV3TFRSVPl'ÍRHHTGVDS.IfCÍÍFSPLARHVDRVÃl ΥΕΒΡΪ, ΗΜΧΚϊΤατΟΙ1'3ίϊΡΤΡΟΙϊ33νΤ,νΤ>βΥ8ΡΗΚίίΕΡ1ΧΟΜά£:Ί1ρΡΜΑν.ϊΛΐαθιδΧΙ1ΟΙ1Χ'ΓΟίίΧϋ
GW/rrRRRKKEGSW/QQQCPGYYQSHLDLSDIQ ÇSEQ ID Ϊί0ι4) (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócito, mesotelina, N° de acesso do Genbank NM_005823); Yamaguchi, N., et al. Biol. Chem. 269(2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96 (20): 11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); documento WO 2003101283 (Reivindicação 14); documento WO 2002102235 (Reivindicação 13; Páginas 287-288); documento WO 2002101075 (Reivindicação 4; Páginas 308-309); documento WO 200271928 (Páginas 320-321); documento WO 9410312 (Páginas 52-57);
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DLLLPLNPDAFSGPC^-CTRFFSRITKAmnJl^pRGIUÍRRQTa&PAM^C^VRGSt.LSEA SVST^DALRGLLpyl.GQPIIRSIIKKnVAAWRQRSSRDPSWRgPEiRTfLRPftF&ftBVEKT ACPSGKKAREIDSSLI FYKK^f Eft-C\rí>A^Ll.A'TQMURWàl P FTYEQLDVLKHKLDSLY PQOYPESVIQHLGYLFLKMSPSDIRKWIWtSIiETLKaitfSViíKGHEMSPQVAIl.IDRFVK GP^GOnpKnTLDTLTAFYPGYIiÇSrSPEEIíSSVPPSSlWAVIlpQpLDTÇDPRQIjDVLYPKft. aLAtQM-^gSBYFVKIQSPfG<3Af>,í:EDIJKAL$OQÍP/Sí1PIATFMKIíRTPAVnPIfmASVQ KYiLGPHV^GLKAESRHRPVRDÇíIIiRQRQDDLDTLGLGtiQGGIPlíGYlVLDLSKfQEALSioT pcnuG ΡΟΡνι,τνίΑηηι^τχΑ {SBQ ID SOsS) (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIlb, SLC34A2, família do veículo de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, portador de fosfato dependente de sódio do tipo II 3b, N° de acesso do Genbank NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002); Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J. A., et ai. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); documento WO 2004022778 (Reivindicação 2); EP 1394274 (Exemplo 11); documento WO 2002102235 (Reivindicação 13; Página 326); EP 875569 (Reivindicação 1; Páginas 17-19); documento WO 200157188 (Reivindicação 20; Página 329); documento WO 2004032842 (Exemplo IV); documento WO 200175177 (Reivindicação 24; Páginas 139-140) ;
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AVXSSÍ^SrIYAA,fV']:iDFSGEDFAIYSSItGSGFFI.RTAS'mSKSffiMS:KtíFVAÀYDISS»mY FFXRBSAVEH0C6RTVYâRVARVCí3S!DVGGRFLXEDTWTTF^IKASLHGSRP3EVPFYTNIÍ
IiQSAFHLPEÇDLIYGVFTWVlíSrAASAVCA.FKLSAISQAKíGPFRYQEíipRAA-WLFlÃiJ ν0ΑΚΐ3ΧΧΥΗ^/Ι1ΥϊαΤΕδΟΤΓ3^ΚΑΧ3ΤΑ3Η3Ι,ίίβεΥΧΒ®1ίΜνΐιΡΡΟΗΚΞΡΙ)β3ΧΕΪΜί3ΑΗ M,PVGLSJXrVTiRVPLERCiU^YRSQGACXt3AHr>PYCGVÍDQKQQRCSTLBDSSMMSLÍ>fTQKl ΤΑαί»νΕΝνΤΕΙ3θ0?ί3ΡΜΒ^Ρ€ΕΗΙΰ?αθΚΕί33ΟΪ1€ΚΑΚ3α53&ΕΙ!ΕΟβϊ3ΙΧ)(!Ι»β?Ά£Ηΐ M^CSRJSGaWTPKSSWALCSTSCGISFQmQRSCSt^APRKGGRXCTGKSKESRPCMEiJTF C&TOXFWASWaSWSKCSSMCOGGMQSSSRAC^a^ÒLGOSYSFKÍXCNPSGCPHVRRÍíTF WTPWLPIWTQ&GARQSQRFRFTCRA PLAD PHGLQFGR RRT STRTCPADG S G SCDTDALV BDIXRSaeMPKTVSGGMA.W'JC&W.SSCSaaCSLGPiiVRI'fRTCXffgSPRiiGGLPCTGCAAS YQDCKPQACPmGAWS^TSWSPCSSSCGGGHYQRTRSCTSPAPSPGSDXCXSiaTSEAL· CAfÕACKStfSFSfSEWSKCTBDGAQSRSRHCBBX.LKSSSÃCASBfSSSSR&CPYSiSIFVlL· PASat'taBATGCAaFfiLimjVA’I'-jISCPXGSGLXTLAVYASOSHCQRQSQSS'rLi/tiPATPisr
HXHYKG<^TFSirEKYTP^FICTI^KmLIPTORMPYPI^QTím”rXYrYP3PLf4KKSFR
PBASPGQRCPPNS tSEQ IO HO:7} (8) PS CA hlg (gene de 2700050Ci2Rik, C530008016Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, ADNc de RIKEN 2700050C12, N° de acesso do Genbank AY358628); documento US 2003129192 (Reivindicação 2); documento US 2004044180 (Reivindicação 12); documento US 2004044179 (Reivindicação 11); documento US 2003096961 (Reivindicação 11); documento US 2003232056 (Exemplo 5); documento WO 2003105758 (Reivindicação 12); documento US 2003206918 (Exemplo 5); EP 1347046 (Reivindicação 1); documento WO 2003025148 (Reivindicação 20); Referências Cruzadas: Gl:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1 141 aa
MWVAGIAAYFCGLFLX8?SFALQIQCYQC8B FQnWMDCSSPE FtWCIWi?QÍ5f«CQíaBVMl QSAGIMYRICSCASSAACLIASAGyQSFCSPGKLKSYÇ ISCCNTPLCNGPRPKKSGSSASA LS.FGLRTTILFLKIíALFSAHC iSm 2D NO:8) (9) ETBR (recetor endotelina tipo B, acesso Genbank N° AY275463); Nakamuta M. , et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al. Biochem.
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(Reivindicação 1); documento WO 200261087 (Figura 1); documento WO 2003016494 (Figura 6); documento WO 2003025138 (Reivindicação 12; Página 144); documento WO 200198351 (Reivindicação 1; Páginas 124-125); EP 522868 (Reivindicação 8; Figura 2); documento WO 200177172 (Reivindicação 1; Páginas 297-299); documento US 2003109676; documento US 6518404 (Figura 3); documento US 5773223 (Reivindicação la; Col. 31-34); documento WO 2004001004; 442 aa
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lKPKM®HGYDNFRS8SraWSSS ÍSJ3Q ID SO;?} (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, N° de acesso do Genbank NM_017763); documento WO 2003104275 (Reivindicação 1); documento WO 2004046342 (Exemplo 2); documento WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento WO 2003083074 (Reivindicação 14; Página 61); documento WO 2003018621 (Reivindicação 1); documento WO 2003024392 (Reivindicação 2; Figura 93); documento WO 200166689 (Exemplo 6);
Referências Cruzadas: LocuslD:54894; NP_060233.2; NM_0177 63_1 783 aa MâGGMQLQLftAL«PÇSFLl1í-i&^QAG^RT(^V‘I^%AVE:fíSRÊAEQKi\I IEVI PLX$®PTGK LÍILTtIE6VPA®7AEITPAEaKl,M<JSHÍ1I.YLCyASDDDlíLSPGPISIVKLESFHRAPRPCL 3LASKMU^At3ERGASAVIiFDXTBÍ>RAAfi.2QIiQQPIíGliXWi'WXjXWGiíDAÊ:Kli&53FVh>!'ÍCNQ KÂHVR ϊ RtKB PPAWPGYDVW X LMTWGTÍ FYlI IíASVLH XRCaPRHSRPOPLQQRTAMAI SQLATRRPQASCSOARGKWÍOSGSSCSSAPVCAICLEEFSEGQELRVrãCLHEFÍÍEííCVD PWIíSQHRTCPIiCUFNITEGDSFSQSIíGPSRSYQSPGRRLKLIRQHPGHAHYHLPAíkYLLG PSRSAVAHFPP.PGPFI.FSQEPGMGPSHímFPaAAHFRAFGPQQRIAGAiSHPYAQGWGMSH LQS?SQHPRACPVPLRRARPr'DSSGS3RSYCTERS0YLADGPASDSSS0PCKGSSS&GVV SCTOJSLQGYHGSSSTFCSSLSSDFDPLVYCSPKGDPQRTOMQPSVTER.PRSI.DSWPTG ETQVSS HVHYHIUíBÍíHH YK3CRFQWHGRKFGP ST0Vf>QS R PPX PRTQPQPEP PS PDQQVTG SMSAAPSGRXiSETPQCPRAt.PEPAPGPTOAGSICFSTSSIiI^TLGKSSLSARfíPQRKRR.GGP SSPTPQSRPOÊmrVEPACOI FPHTrPSVAYPWSPEAHPLI CGPtKiLtiKRXíLPETPGPCYS SSQPWKatTPRQPtEPirPPGSGPSB^SSDYAEGRPCPYPHCQVIíSAQPGSSRSABBliC»
QAV íseq m κοαο) (11) STEAP2 (HGNC_8 63 9, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado com cancro da próstata, proteína 1 associada com cancro da próstata, seis antigénios de transmembrana epitelial de próstata 2, seis proteínas de transmembrana da próstata, N° de acesso do Genbank AF 4 55138; Lab. Invest. 82 (11):1573:1582 (2002)); documento WO 2003087306; documento US 2003064397 (Reivindicação 1; Figura 1); documento WO 200272596 (Reivindicação 13; Página 54-55); documento WO 200172962 (Reivindicação 1; Figura 4B) ; documento WO 2003104270 (Reivindicação 11); documento WO 2003104270 (Reivindicação 16); documento US 2004005598 (Reivindicação 22); documento WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento US 2003060612 (Reivindicação 12; Figura 10); documento WO 200226822 (Reivindicação 23; Figura 2); documento WO 200216429 (Reivindicação 12; Figura 10);
Referências Cruzadas: Gl:22655488; AAN04080.1; AF455138_1 4 90 aa
MKSXSMMâ$PKSLSÊTVT.,PNGlííGlKBftKÍC(m/GVI GSGQFAK&LT I R& XKCGYKWIGS ímPKFASSFFPHWDVTHHEDALTICTÍÍX I ^ΑΙΗβΕΗΥΤβωπιΧΗΗηηνΟΚΙΙ,ΧΠνβΝΜΚ RXJilQYPKSmE'snUASLFPDSIiI^'SUFmfVSAWALQLGPKUAgRQVYXCSHiiXQAROQV'IB XARQIXJFIPIDXíGSXSSARE I EÍTLPI.RLFTliWRGFWVAISLATFFFLYS FVHOTIHFYA RHQQSDFYKI PXEIV>rKTLPXVAI’I’IiIj8LVYLíV3IjIiAaAYÇiLYYGTKYRRFPI,WLÊTÍ'?LQ CRKQXCSIíÍSFFFAMVHVAYSLCL TORRSSRYLFI*MMAYQQVHMtI ENSWííESEWRIEMY i s fchmslgddsllavts ι psvsKALttWK&FSFiQSFi^WA:EJL· i srvmt. íyqèíkrafi!
SBYYlFYTFFSÍFffLM.Vl.PSX ΥΪ XiGKI I LFLPCXSQKLICRIKíÍGS-íEICSOFIíBEGXGGYXP HVS PE £VTVM 5SSO ID TO; IX) (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catião potencial de recetor transiente, subfamilia M, membro 4, número de acesso do Genbank NM_017636); Xu, X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98 (19): 10692- 10697 (2001); Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol.
Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); documento US
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Referências Cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017 63 6_1 1214 aa MWPEiCEQSVJI PKI FKOrrCTTFIVDSl'DPGim.CQCGRPRTAHPAVAtiffiDAB'GM.Vl/TV TOSm!m:i3^m¥^SIíí5FTaAi^KBS^FIfRI*SBRíK3PM,VTSI.VTRTW3FRAFMLVVS VI1S<3SGGPVT:<aírVflJQDl.LaRGI>m!>laQSTGAWIV’rSGIlKTGlGRHVG’1WVaDHQMAS;rGS ΤΚννΑΜβ¥ΑΡΜΏ!¥™ίΗΒΤΙ1ΙΝΪ1Κ08?ΡΑΪΕϊΚΜαΕΡΕυ(3νΏΡΡΗ>Χ1ίΥ3ΑΕΪΙ»νϋΧΚ3ΤΒ
GCtGGKWFRÍAE55S’/ISgQKT(5Ví3ô’rí31DIPVl1t1IJJIÍ>QDSK[ÍJJTRXEmi*<}AQi.PCLL VASSGGAADCLAETLEDTLAPGSGGARgGEARDHrRRFFPRGDLSVLQAQVBRIKTRKEL ΕϊνΎ33ΕβθβΒΕΡΕ^ΐνΕΚΜίνΚήΟΟβ3ΕΑ^ΥΧ£>^ΚΙΑνΑΜΚΪϊνΐ3ΐΑ03ΕίιΡΡ,(3ΓιΧζ2^ RSFHLKASLTOALLNDRPSS’V«LIJISttGl>SÍJeiíFt1TP5<IRIAOÍ4ySAAPSKSX.lia'lALDQA SHSAGTKAPaiK^AMMPPDVOHVLliMI.l^ía-tCAPR^PSGQAWDPHPQOGFGESMYLL SDKATSPLSIiDAGIiGQAPSSDMjI.WMjtiBi^^íAM^FWSMSSM&VSSMGACl.tiíiRVm ΗΙ*Β^ΛΕΚβΑΕΚΚ33ΙΑ?Ε?ΚΟ^™ΐ1|^ΚσίΚΒΕ®νΗΑΑ®1ί1Ι^ΟΡΙ.^^ϊα(ΰΧίωίΰ ADAR&FFAQmVQSkLTQMWGDNASTTPXWaVIAFPCPPLIYim^TFRKSEEEPTRB BijEFDMPSVINQSGPVSTiiDPiUliCTPLGWRQSGRPGCCGGRCGGRF.CXiRRWFHF'iiGAPV 'ΓXF¾Gf^W3YL·LPI.L·L·FSR\íLLVΊ5FQPAPPα3íJ«XíLLΐrFWAFTIJl.CSEI,RQGLSGGGGSL ASG9SSPGHi^SQRL®IíttADSWQC^^AATCFX1MS¥GCRL,PlsGÍ,imSKrVI(CXIJFM VireVSf^íIPTFMRQI^FRIViVSKMfGEDVFFFIiFFIiGVWIiV&YW&TEQIiUSÍPRDSDPP SXLRRVFYRPYLQXFGGIPOEDKDVMAíEBSHCSSSÇGFWAÍíPPGAQAGTCVSQYAKIWIíV VX.X.I^IFlJaVMIXLLWJt.tlAME'SYtPGiGiOfS'iSDX.YWKAGRYRIiIR.KFHaRPAIAPPFI νϊ8ΗΕ&Ι^ΕϋΟΕΟΚΚΡΚ8ΡΟΡ3ΒΡ&ΕΗΗΡΚν¥Α£Κ^&ΕΚΚ^ΐϊ,333νΗ£ΒΐίΡΕΪΑ&Α&ΕιΚ: SESDSEHLKRTSQKWDÍiMíKQXiGHtlíEYSQRIiiKVXtEREVQQCSRVXjGííVASALSRSAXiIiP PGÍÍPP PPiDLPGSKD ÍSRQ ID NO:i») (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N° de acesso do Genbank NP_003203 ou NM_003212),
Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989),
Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)); documento US 2003224411 (Reivindicação 1); documento WO 2003083041 (Exemplo 1); documento WO 2003034984 (Reivindicação 12); documento WO 200288170 (Reivindicação 2; Páginas 52-53); documento WO 2003024392 (Reivindicação 2; Figura 58); documento WO 200216413 (Reivindicação 1; Páginas 94-95, 105); documento WO 200222808 (Reivindicação 2; Figura 1); documento US 5854399 (Exemplo 2; coluna 17- 18); documento US 5792616 (Figura 2);
Referências Cruzadas: MIM: 187395; NP_003203.1; NM_003212_1 18 8 aa
MDCaamaPSYSVIWIMAJSWSSlâ&VÃiSiiâHQEFARPSReYL&FSKJSIWFQESPÃXR
PRSSQRWPMGIQESKELNRTCt7I.''IGaTa'!LC,SFG^CP?SFYGKWCEH0VRKBMCiJSVPH ΚΓν&Ρΐα<:0310Κ0{ΐίϊΰαΐίΚΟ^Ρ0ΑΡΙ£Η30ϋβΙ,·ν’ΜϋΒΗίνΑδΕΤΡΕ^ΡΡ3ΑΚΪ<ΤΤΡΜί,νθΙ
ÇLSIQSYY {SEQ ID NO:13} (14) CD21 (CR2 (recetor de complemento 2) ou C3DR (recetor de vírus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792, N° de acesso do Genbank M26004);
Fujisaku et al. (1989) J. Biol. chem. 264 (4) :2118- 2125); Weis J.J. et al. J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84, 9194-9198, 1987; Barel M, et al. Mol. Immunol. 35,1025- 1031,1998; Weis J.J., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S. K, et al. (1993) J.
Immunol. 150, 5311-5320; documento WO 2004045520 (Exemplo 4); documento US 2004005538 (Exemplo 1); documento WO 2003062401 (Reivindicação 9); documento WO 2004045520 (Exemplo 4); documento WO 9102536 (Figura 9.1-9.9); documento WO 2004020595 (Reivindicação 1); Acesso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA3578 6.1 . 1033 aa
MmaGIxDQVFIALVAPt;^/LGI3CSSPPPXXaSRlS^YSTPIAVGr/ÍRYSCSaTFRIJlGE F^LLCITi'Xiia/BGXViDKPAi’KCEYFSiC’/SSCPEPXTOGQYKXRGSTPYHHGDSWFACKT NPSMtíGtOXSWTCQMÍíMT^PTI^&TCVSVFPI.ECPALPMI.HNGHilTSmWGSIAPGLgVT YSCSSQY$^VGEKXXNCIjSSGK«S&WFI«BE&RCKSI^RFPBSK3raCBPPXL®WFTAiJF FCOEGYPJ>aGPf3SReVIAGQGVAWTKI.IPVCSEIFCP3PPJ?IH«3SHXGNSUiNVSYGSI VTYTCDPDPEKGVrcFXLXGBSTl<H€rrVPSQKTOm5G)?APRCEl>STSAVGCFHP$Il<RGR MVSGQKDRYTWDTVIFACtlFGFTXjI-CGSKOÍ RCMAQG-rWS PSAPVCEOCQAPPNXXMGQ liEDaHMVSFEPGTSIKl’SCHPGYVX.VGEESIQCTSSGl'WTPPVPQCKVAACEa-rGIiaLLT KPQHQFVBEDWSSCQBGYKLSGSWSECQGTIPWFMEI RLCKSITCPPPWIYflGMiTG SSX.EDFPYGTTVTyxxXíPGPEF&VWSLIGKSTXFCTSHlX}KR<^SGPAPLCFXíSLIAV QCSHVHIMÍGYÍÍISGKEAPyFYimTVTFKCYSGFTLKGSSQlRCKADNraDPKIPVCSKB TCQKWQSIiQELPAGSRYELVSTSCQDSYQIiTGKftYQMCQCAEWCiltíFKKXPXjCKVIHCH PPPVXWGiam5MMa.EÍ<fFLYÍ3iíEVSYSCO!3GFYLLGEKKX>QCRSDSKGHaSWSGPS PQCL RãPPVXRC&SPÉVSfiíGtítLHKTttSAYStaJDrTr^DaJFGFXKaGSRyiftCMTGímrVPsV PTCIKK&FIGCF ΡΡ?ΚΤΡΝβ^ΤαθΗΙΑΕΡ3ΡαΜ3ΙΧΥ8αϋααΥΧΑνΰΒΜ,ηΐ,ΟΜΚ3Τνί SaPAPHCKSXWCSSPADHDGIQKGLEPRKMYQYGAV^JTLECEDGYJíLSGSPQSQCQSDBQ KMPFIi&VCESRGt^YIíCaiAAGE.II.XsTFlíXVXTI.YVISKHRERSYYTEíTSaiímFEIíSA RBVYSVSPYHPAS (SEO XS M3;14) (15) CD79b (CD79B, CD79(3, IGb (beta imunoglobulina- associada), B29, N° de acesso do Genbank NM_000626) ou 11038674, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); documento WO 2004016225 (Reivindicação 2, Figura 140); documento WO 2003087768, US 2004101874 (Reivindicação 1, página 102); documento WO 2003062401 (reivindicação 9); documento WO 200278524 (Exemplo 2); documento US 2002150573 (reivindicação 5, página 15) ; documento US 5644033; documento WO 2003048202 (reivindicação 1, páginas 306 e 309); documento WO 99/558658, US 6534482 (reivindicação 13, Figura 17A/B); documento WO 200055351 (reivindicação 11, páginas 1145-1146);
Referências Cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_0 0 0 62 6_1 22 9 aa
M^M^SPVFSH^íyALLi.LtSASPVPMítâgDÃYEmPKGSACSRIWQSPRFlMitRSFT ViM€!í'MSSASÍSÊIVSMI*M^EMDEMPQQ£1Kl^l!33KMSfiíPESt^TlíTI©3S«PSraíSIÍ FCQQKd®fTSEVVQG>CGTF;LRVMGPSTtAQljKQRNTtj|C0<5I IHXQTLtlXLFIIVPIFLL MJKBDSKAGJiffiEOKTyEGLDlDQTATyEtíIVTltíRTSlVíWSVGEHPOQE <SEQ ΪΟ NOíXS) (16) FcRH2, (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase la), SPAP1B, SPAP1C, N° de acesso do Genbank NM_030764),
Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2) :87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3) :768-775; documento WO 2004016225 (Reivindicação 2); documento WO 2003077836; documento WO 200138490 (reivindicação 5; Figuras 18D-1-18D-2); documento WO 2003097803 (Reivindicação 12); documento WO 2003089624 (Reivindicação 25); Referências Cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM 030764 1 508 aa
^E.UWSnLV3: FDAOTKÇtADÊLTnVAPS SVPÊGDSIVLKCQGBQNWKII QÍM&YHKDNKKLSV tíXFSDFtlQSAVLSDSONYFCSTKGQLFLÍTOKTSNIVKlKVQELFQaFyLTASSFQPIS
S?ELQI S&WS1OTGSYWCK&B TVTSEIEKQSI^SQ IHVQRIΡΪ SNVS tEIEAKKXJVT EG QKL X LTjCSVAGGTGNVTF SWY RSATGTSMGKKTQKS^SARUg; I PAVKBSDAGiCyYCRADNSHV? XQSKVWXPWIPVSRP T.njTLRSE’GAQAAVGDI.LSI.HCKALRGSFPILYQFYHEDVTLGlfSSAPSGQSSS^SLTA ΕΗβα®γβθΕΜϊΗ£;ηαΑροδΕΑ\Φν5ΐδσριχ;γβΕηηΜΤΑ5νΜ7θηρβνηοΕτσνί>χι,ηΥΑ LFHXI SGBSSATUE P PjSASK PNPQRF TY S S FTPmSSLQP^/lWGSVD'i.mVV’irSQVWSN OQPSSSA»IRTliLBNSDSQ¥IYSSVKKS ÍSEQ m NO:IS) (17) HER2 (ErbB2, N° de acesso do Genbank M11730.
Coussens L, et al. Science (1985) 230(4730): 1132-1139;
Yamamoto T, et al. Nature 319, 230- 234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6497-6501, 1985;
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TISPSKMJYRPGEflIjNXiSCiíaASÍÍPPAQYSWFIÍJSTFOQSTQKLFIPííITVKKSOSVMCQ J^SAl^XímTTVTMlTVSGSAPVXSA¥AW{3ITlCm«ARVALl (SBQ ID MOI18} (19) MDP (DPEP1, N° de acesso do Genbank BC017023),
Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 99 (26):16899-16903 (2002)); documento WO 2003016475 (Reivindicação 1); documento WO 200264798 (Reivindicação 33; Páginas 85-87); JP 05003790 (Figuras 6-8); documento WO 9946284 (Figura 9); Referências Cruzadas: MIM:179780; AAH17023.1; BCoi7023_l 411 aa MWS0NW&MFI)VA%M^ADPFSffiKAgRIMTOSPVIDOHMD£^WODIiI>MFSMRIíaDERMIIiTf
LAGTHTMIPKtRAGFVGGOFMSVYTFCDTQMKDàWRTIjEQMDVVHRMCBI^YPSTFIiYVT
SSAGIHQAFREGKVASLIGVEGGHSIDSSIjGVIjRALYQIíGMRYLTIiTKSCIíTPWADMWEíV
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VCASimWPDDVLStVKOT:DSLVMVMPY]^YISCTMKMíLSQVM3ÍÍLE)HlKSmíSísRAVG ΡΡ3ΡΡ00¥ΡΙί^®3&ΡΏν8ΜΥΡ0ϊ»ΙΜΙΙίΕΛΰϊΜ^ΓΕΑΒνΚΕιΜιΜϊΜΑΙιβνΡΕΜ?1ί5Α8ΜΙίΤ
QAP8EBPIPIIX3.nSGSCRTHYC5YSSSB.SSIjHRHWSlifjljASI<APt<VLC.tiSIiL {SBQ I» MO,19} (20) IL20Ra (IL20Ra, ZCYTOR7, N° de acesso do Genbank AF184971); Clark H.F. et al. Genoma Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al. Nature 425, 805-811, 2003;
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ÇLQGVlCm^/^YFXyGQOa^W^ECmTlSRTYCDLS^^SD^HQYYAiCVKAIWGTíCC
SICWJiESGSPyFFl.ETQiaPPSVM.TTDEKSISWtTAPSKWKSMPEDL.PVSMQQti'SIiLK Y^/SVl^i'J^iJRWSQCVTMI^Vt'im.BPHTtyCVHyESFVPSPPR^QPSBKQCARTi.
KDQSSKFKAKXI F1fXVI.PI SITVFLFSVM3YSIYRYIHVGKEÍCHPKSLI t lYGHB FDKRF FVFABKIVIKpITliKISDDSKjSHQDMSMiSKSSOySSLMlFQPSGKIiaPPQEEEBVKHii QYA^ÍMBlFC^EWrSQTSFJTOESI^RÍIPPOKWIEYEfDVRTyQXCASPElQSM IjQEEVSTÍJSTLIíE SOfiALAVLG PQTItQYS Ϊ ÍPCíLQQtJP PLAQEHTDÔEEG PSEEP3TXÍ.V mffiPQaOSLCÍPStSSFCQDSBGCSPSESDSI^EEGMíSRI.YSEEAFDaPPSEMETYLMQ FMEEWGkYVQMEH (SKQ m MO:20) (21) Brevican (BCAN, BEHAB, N° de acesso do Genbank AF229053) ; Gary S.C., et al. Gene 256, 139-147; 2000;
Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003;
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uvt^uw^y^t^mimMbru^v^mLru^Mm^^^mtMmm^^^^^M m ι^ΐΜΐ^ΜΡ^ιχχ^Λψτ^χ^τχ,ΨΜΐ^^ζΜ^ΓΜ^η^Αΐ ybii immmBBm wmw^^wmhmmmmfwmwmMmmMmnmtmmMmmmmmmmm mmmimwmmMmihm'h\fthmv^m<fimwulBmwm§mmwmBMmmBhhhArm mmm^mmmMmm\rAPAmiiT<iQp^pn^f&mmmwmwmmumh^<;immhi mim x mmwQmnmmm vm x mmim i íwm xo msoil (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, N° de acesso do Genbank NM_004442) Chan, J. e Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991), Oncogene (10 (5):897-905 (1995),
Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Inte. Rev.
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Referências Cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1 987 aa
^ÍMJERL·í3AMJL·IΛPL2J^¾^τIΛ«3S¾,TATÃSLGWÍ'r¢/HPFSGWEEVSGYDS^'IK^ITIRTYQ
V<3Sr^HSSQ^Ít.RTKSaRRRGA|iRIW^ÍKFSVRDCSSiPSVPGSCT<ETfmyY¥SMJF Ο3ΑΤΚϊΡΡΗννΤ*1ΕΪΙ^ΓνΚνϋΤΧΑ^ΕβΡ3ί^Ι-®3Ην^ΙΚΤΕνϊί3Κί&ν3ί13<36ΉιΑΡα0
Y^cKSMAVRWin^cPHiíCPSMroiTi^aASStsimasGSciJumssTOvpiKtY CHGOGEWLVPIGSCMCKAGPEA^KJTVCRGCPSGTPÍOMJGDEACTHCPINSRTTSEÍJA THCVCRN^i't^LDPLlMPCTTr E!SAPQA.VISâVHSTâLMLSWfí>PRDSGGRg:OÍ.VTYÍÍÍ ICKâÇQSGRGACTB.CGDÍíV^YAPRQLOLTEPHIYISDIitAKTQYPFEiQft.VilSVTDCÍSPP SPQFASWITTííQAã,PSAVS3:KHQVSRTVDS ITLSWSQPDQPíIOTILDYEMJYYEKBLSS YHATAIKBPTNTWVQaLK^OAIYVPQW-ASTVAGYGHYSGKMYPQXIÍTBASYOTSIQEK I^LIXGSS&MÍLVFAIAVWlAXVaíRRRGFBSAlJSSTroKXQHYTSíSHMTSK^ÍKIYIOP FTYSDENSaWEPAKSIDI SCVKIEQfPXGAGSFGBVCSaaiaSLPGKESI FVAXKTLKSGY TBKQRR0FLSEAS IM<3Q5?DHPaVIHAB<3WTKSXPVMl ITSPMEMGSLOSPtKQSiÈDGQFT YIQLVGMl.RGIAASJfKYX.AOMífjn/ÍÍSDIAARHXt.VNSm.VCCTSDFQIíSRFLEDDTSPFr YTSM.^KIPIRWTAPEAiaYSKFTSASDVKSYGIVJ^ffiWSYGERPyííBMTKODVXimi Ε03^ΡΡΡ^αΡ^ΑΑΗΰΑ5^ΒεΝ0Κ^Ρ^ΜβΡΚΡΟ0.Ι^ΤΙ^>^ίΚ2<ΐΜ8Ι^αΜΑΕ·Χ3&« XHMU.DRTlPDYTSPHWDEWLSAIKKGQYSESFANAaPTSFDWSQMÍ^IEDIARVGVT IAGEQK30:LKSIQWRAQm«)IQSVm? {SBQ IP NO : 32} (23) ASLG659 (B7h, N° de acesso do Genbank AX092328); US 2004010899 (Reivindicação 2); documento WO 2003104399 (Reivindicação 11); documento WO 2004000221 (Figura 3); documento US 2003165504 (Reivindicação 1); documento US 2003124140 (Exemplo 2); documento US 2003065143 (Figura 60); documento WO 2002102235 (Reivindicação 13, Página 299); documento US 2003091580 (Exemplo 2); documento WO 200210187 (Reivindicação 6, Figura 10); documento WO 200194641 (Reivindicação 12, Figura 7b); documento WO 200202624 (Reivindicação 13, Figura 1A-1B); documento US 2002034749 (Reivindicação 54; Páginas 45-46); documento WO 200206317 (Exemplo 2; Páginas 320-321, Reivindicação 34; Páginas 321-322); documento WO 200271928 (Páginas 468-469); documento WO 200202587 (Exemplo 1, Figura 1); documento WO 200140269 (Exemplo 3, Páginas 190-192); documento WO 200036107 (Exemplo 2, páginas 205-207); documento WO 2004053079 (Reivindicação 12); documento WO 2003004989 (Reivindicação 1); documento WO 200271928 (Páginas 233-234, 452-453); documento WO 0116318; 2 82 aa
MftSIiGQlLFWS IISIXI XhAbAIAXX IGFQXSGÍWÍS ITVXTVAÇftÇMXblSbGXLSeWSP DXKXiSOXVXOWIXKEQyLííLVHEFKSGKDSItSEQDB^ÍPRGRTAVFAIfQVIVGJilASIjRXtKtW QLTOAGTYXCyi XTSKGK^fM5LBYíCTGAFSMPEWVX3YlíAÍ>SETLRCEAF'R.WFPQFXW mSQVDQGaHFSEVSHTSPELlISEtíVTKKVVSVI.YlJVTIIÍÍírFYSCMIEiíDIAKATGDIXV THSEIKRRSHIiQIiXiWSíCaSJjCVSSFFAl SWAIXI*PX.$ ΡΥΧ,ΜΙ,Κ {SBQ m MQ:23) (24) PSCA (Precursor de antigénio de célula estaminal prostática, N° de acesso do Genbank AJ297436); Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z.., et al. Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783—788; documento WO 2004022709; EP 1394274 (Exemplo 11); documento US 2004018553 (Reivindicação 17); documento WO 2003008537 (Reivindicação 1); documento WO 200281646 (Reivindicação 1; Página 164); documento WO 2003003906 (Reivindicação 10; Página 288); documento WO 200140309 (Exemplo 1; Figura 17); documento US 2001055751 (Exemplo 1; Figura lb); documento WO 200032752 (Reivindicação 18; Figura 1); documento WO 9851805 (Reivindicação 17, Página 97); documento WO 9851824 (Reivindicação 10; Página 94); documento WO 9840403 (Reivindicação 2; Figura 1B);
Acesso: 043653; EMBL; AF043498; AAC39607.1. 123 aa VJSKGCSXlICWD8QDYTVVi3ÍKMITCCDTDnCMA$GAHAIcQPAAAIIAT.irPAI>ÍSIiLItWG3? QQlt (SEQ ID MOi34) (25) GEDA (N° de acesso do Genbank AY260763); proteína do tipo-parceiro de fusão HMGIC lipoma AAP14954 /pid=AAP14954.1 - Homo sapiens
Espécie: Homo sapiens (ser humano)
Documento WO 2003054152 (Reivindicação 20); documento WO 2003000842 (reivindicação 1); documento WO 2003023013 (Exemplo 3, Reivindicação 20); documento US 2003194704 (Reivindicação 45);
Referências Cruzadas: Gl:30102449; AAP14954.1; AY2 607 63_1 236 aa FTICFAIWWCFIQPVí1? ig0a¥DTPOft.a¥P®&FH?CI^SPSREI1TCSQSFT0^TLPSGAfÍCÃASS’FiaííSÍ®H1Il ACX ieFX5.Fi· mmmryKIÇftSftSQIí^SâACLVLíSÇMl ffdgkdsdevkrí-ícgsktdkyt
I^CSVKWAYXX^IIGILDAlIXiSFIAFVLGiíRQDSI^kESLKAEHKVLI^QYSLE ÍSEQ IB KO;25) (26) BAFF-R (recetor de fator de ativação de célula B, recetor BLyS 3, BR3, N° de acesso do Genbank NP_4 4 317 7.1) ; NP_443177 recetor BAFF/pid=NP_443177.1 -
Homo sapiens Thompson, J.S., et al. Science 293 (5537),
2108-2111 (2001); documento WO 2004058309; documento WO 2004011611; documento WO 2003045422 (Exemplo; Páginas 32-33); documento WO 2003014294 (Reivindicação 25; Figura 6B) ; documento WO 2003035846 (Reivindicação 70; Páginas 615-616); documento WO 200294852 (Coluna 136-137); documento WO 200238766 (Reivindicação 3, Página 133); documento WO 200224909 (Exemplo 3, Figura 3); Referências Cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_0 52 94 5_1 184 aa
MKS?GFHSX.RGKPJ\PA»X,PCVFABCFr)Ll,VKHCVft.CGX1LfiTPaE>KPAi3ASBFAPRTALQPp £ SVGAGAGEAAX. PL FGLLFSÂPALX.GjMljVXkALVLVGL VS ÇÍRP.RQa RI^GASS A&RPDGD KDAPRPLBírVXILSPGISDATAPA^PPPGEDPGTEtFUHSVPVPATSLQSTEtVTTKTAG
S’SQQ (3EQ XB JHOíâS) (27) CD22 (isoforma de recetor de célula B CD22-B, N° de
acesso do Genbank NP_001762.1); Stamenkovic, I., e Seed, B., Nature 345 (6270), 74-77 (1990); documento US 2003157113; documento US 2003118592; documento WO 2003062401 (Reivindicação 9); documento WO 2003072036 (Reivindicação 1, Figura 1); documento WO 200278524 (Exemplo 2); Referências Cruzadas: MIM:107266; NP_0 017 62.1; NM_001771_1 847 aa
JSHIilíGPWIíLIíLVLSyjjRFSDSSKWVFEHPETLYAlSíBGACVWIFCTÍHRLDGDI.ESFIIíFH ΝΡΚ^ΚΝ1'ΕΚΡΏ«ΤΚΧ,ΥΕ8ΤΚΙΧ;'!ΚνΡ£!^ΚΚνθ?1ίδΠΚίϊΙ«ΐΟ'ΓΧ»5ΙΗΡνΗΜΐηΞβαΐία^ ϊ<5Ε5ΚΤ®ΚΚΜδδ.ΙΗΕ1κν5εΐ5ΡΡΡΡΗίΟ^Ρ£ΪΟΕ3ί33νΤ1'Γ<;£3Λ}Ιν§ΰ'ί6¥ΡϊΰΧ,ζί^Ι,11ΕΟ
VPmQtóV^TmjTIKSWTP^^KFSP^ÍStíaQKÍVt^tQDMtgKPiaNDTVQIiíWIÍK
TPFXSlS^PSXmiWEaDSVTMTCS^'SSSiiPS’i'TTV'SiaKrJGTSLK.KOM’FTLJJliRSVT KWJSGKTCCQVSKDVGPGRSESVFLQUQYAPEPS’rVQILHSPAVBQaQTOn.CMSI.iJiPt, Ρ®ΪΥ,^^αΚΕΜ0Ο8ΤβΒΚνΒ1ΡΚΙΙ.ΡνΗίΑ6ΤΥ3σνΑΕΝΙΙ.δΤ<30ϊ:<3Ρα?ΐΕ^Ε5νβΥΡΡΚ:
fômviÕMFMPIREXSimrTLSCMmSSÍWSVTRYEWKPHGAWSKPaLGVLICIÔtWGWDbn’ TXACARCJÍSXÍCSKASPVM^QYaPRDVEVRKIKPLSSIHSGHSVSLQCDFSSSHPJCEVQ Ε?«ΕΧ&6£^ΚΒ30:θ^3Ι5ΡΕ^α3Υ3€^ί«ί3ΐααΤΆ5Κ&ΜΤ&Ε^ΥΆΡΡ^Κν3Μ SPGDQVMEGKBATI.TCE^M^PVSHYlT^WWQSLPHHSQKLRLSPXrKVOiíSGAYSCQ eTMS\mT3RSPLSTLTVYYSPSTIGRRVAVGI,a3CrAIX.IlAICaiJítt,QRSWKP.Tí2SQQQ l>QSS«g(^SPFWmKTOPJ^LSEQPHSLOCrm?!«4EDCJI STTTX^FtEHSI PETSDASS SBHQRPPaTCDD'rVTYSMíIÍKSQTO0Y3ÍJVIPDFP®33GXHYSEI1IQF(JVGBgPQAQE«V DYVILKH (SEQ XD MQi2?) (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa imunoglobulina-associada, uma proteína específica de célula B que interage covalentemente com lg beta (CD79B) e forma um complexo na superfície com moléculas lg M, faz a transdução de um sinal envolvido na diferenciação de célula B) SEQUÊNCIA DA PROTEÍNA completa mpggpgv...dvqlekp (1..226; 226 aa), pl:4.84, PM:25028 TM:2 [P] Gene Chromosome: 19ql3.2, N° de acesso do Genbank NP_ 001774.1;
Documento WO 2003088808, US 20030228319; documento WO 2003062401 (reivindicação 9); documento US 2002150573 (reivindicação 4, páginas 13-14); documento WO 9958658 (reivindicação 13, figura 16); documento WO 9207574 (Figura 1); documento US 5644033; Ha et al. (1992) J. Immunol. 148(5) :1526-1531; Mueller et al. (1992) Eur. J.
Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al. (1994)
Immunogenetics 40(4) :287- 295; Preud'homme et al. (1992)
Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7(11) : 3457-3464; 22 6 aa M?G3&0VÍQMJparXPltJJFE^AWÍ^J?GCa^WMHKf/PA8LMVSX(a6:i>Míf'QCP(ftíS&K ΝΑΐΛΓΤ!^Χ^ΗΓ^^ΡΡΕ?ΜΡ«310ΡΚα<ΓΙ.Ι IÇÍWNKSBGSX VVCRVQIOíESYdQSCG TYLRVRζ!PPi‘RPFLDMGEG'rKmnTAEGIΣIJt.PGAW?GTI,í1l:,F'R^RWQNEKLGL·I:!AGE) ΕΥ^Ο^ΪΕαίίΝΙΟΌεβΜΥΙΟΧβΗ^ΟβΐϊΙΒΟν^ίωίΙίϊΟνΏΙίΕΙΡ
CSEQ IO HOí28S (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt, um recetor acoplado a proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfócito e defesa humoral, possui um papel na infeção por VIH-2 e talvez no desenvolvimento de SIDA, linfoma, mieloma, e leucemia) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mnypltl . . . atslttf (1..372; 372 aa) , pl:8,54 MW:41959 TM: 7 [P]
Gene Chromosome: llq23.3, N° de acesso do Genbank NP_0 017 0 7.1) ;
Documento WO 2004040000; documento WO 2004015426; documento US 2003105292 (Exemplo 2); documento US 6555339 (Exemplo 2); documento WO 200261087 (Figura 1); documento WO 200157188 (Reivindicação 20, página 269); documento WO 200172830 (páginas 12-13); documento WO 200022129 (Exemplo 1, páginas 152-153, Exemplo 2, páginas 254-256); documento WO 9928468 (reivindicação 1, página 38); documento US 5440021 (Exemplo 2, col 49-52); documento WO 9428931 (páginas 56-58); documento WO 9217497 (reivindicação 7, Figura 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:27 95-27 99; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773-779); 372 aa
IFLtGVIG:^Γ'/tVXIyILBRHRQ3'RSSTE:rFIJFHJL·avAβLLL·VtIX,pmVΛÊGSt/GWVttGTF LCKTVIArHXVtíFycâStLÍACIATORl^IVmVHAYBHF.KIíLSIHITOGTIWIiVGFI.m
MiPKILFMCVBQíKÍHB^IíPIlCTFSÕSÍÍQftSTHâMFTSEFIiiYWMMiLFMIiVMiSíííCSÍW WH^Ra^RFPQRQKaVKVAIJUVTSIFFÍCTSPYMIVIFUDTpARrKR.VraíTCKI.Í^Sr. ΡνίιΧΤΜΟΕ^5Οϋΐ€Ο&ΗΜΧΥ?ΡΑ0νΚΡΡ.3Ο13Ε^Γΐαΐ3€ΪΒΡΑ5£ΟΟΙ*ΡΡ5ϊ,ίΗϊ:33Ι, SRssKATsmn’?· ÍSSQ XO 1*0:29)
(30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula MHC classe II (antigénio la) que se liga a péptidos e os apresenta aos linfócitos CD4+ T) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mgsgwvp ...vllpqsc (1..273; 273 aa, pl: 6.56 PM:30820 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 6p21.3, número de acesso do
Genbank NP_002111.1);
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Biol. Chem. 260 (26) : 14111-14119; 273 aa m (31) P2X5 (canal 5 de ião de ligando fechado P2X de recetor purinérgico, um canal de ião fechado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogénese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabilidade de detrusor idiopático) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mgqagck.Jephrst (1..422; 422 aa) , pl:7,63, PM:47206 TM: 1 [P] Gene Chromosome:17pl3.3, N° de acesso do Genbank NP_002552.2;
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1 IlAYLVWVFLIKKGYQDVDT
HBGI PDGACSKDSDCHAGEAVTAGWGVKTGRCLRaKÍJLAB.GTCKI FAWCPLETSSRFEEP FUKEAEDFTXF IKWHXRFPKFJSfFSKSKVKDVKDRSFIjKBCHFGPKÍHíXCP XFRLGSVIRW AGSDPODIAL-EGSVIQiííIHMtíCXUtDKAASSCH.PHYSFSfí.LDHKiiSKSVSSQYKFRFARY mDARGWFaTLf4KAYGIR.FDVMVHGKGfl.FFCDL\rUIYI.IKKRSF,fKDíaCYEEVReí)SDg SQHAHDEASOLGUSSQtTSGPGI.LGMPEQQELOEPPEAKRGSSSQKGNGaVCPpni.EPHR ST {sag ID NO:31) (32) CD72 (antigénio de diferenciação de célula B CD72,
Lyb-2) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa) , pl: 8,66, PM: 40225 TM: 1 [P] Gene
Chromosome: 9pl3.3, N° de acesso do Genbank NP_001773.1; Documento WO 2004042346 (reivindicação 65); documento WO 2003026493 (páginas 51-52, 57-58); documento WO 200075655 (páginas 105-106); Von Hoegen et al. (1990) J.
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^lA^ITYADIJ?FVKAPria<BISSHLGQDP<lfiBDDC:EXTYSSl/pVPaVLíT/I>SSlABS\'tG
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QKSCFYISLTSKEft^fQSSgKi^CETLSSKXATFSEIYFQSRSYYFIiNSLrPKGGSGiíSyWTG
l^SMKD^TDMQRTRTmsKSKaSKmKTWSÍWTIjEâESClíSSLPYlCS&mFRFPD {SSQ XD MO:32] (33) LY64 (antigénio de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica de leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função está associada com atividade aumentada de doença em pacientes com eritematose de lúpus sistémico) SEQUÊNCIA de PROTEÍNA completa mat dvsc. . . rwkyqhi (1 ..661; 661 aa) pl:6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] Gene Chromosome:5ql2, N° de acesso do Genbank NP_005573.1; documento US 2002193567; documento WO 9707198 (reivindicação 11, páginas 39-42); Miura et al.
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SFtíFLPTIHt^RTFSRIíMHIiTFI.DLTHCQIMlSIÍÍECTFQSHHQtiSTIíVliTGHPLIFMAETS QHfJAXHYI SRÍ^HKSI.SQAim^aLimíaW/KGISLGAFDSTVF-QSLHFGGTPHL.SVl FW QtQJfSTTQSirtitiGT’FEDmDEDXSSAMLiCQLCSWSVESLNIiQSHHPSDiSSTTFQCS'TQIj
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Documento WO 2003077836; documento WO 200138490 (reivindicação 6, Figuras 18E- 1-18-E-2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98(17):9772-9777; documento WO 2003089624 (reivindicação 8); EP 1347046 (reivindicação 1); documento WO 2003089624 (reivindicação 7); 42 9 aa
ΜΙ*ΡΗ1ΙΙ·Ι,1,ΧαΑΡΧίΟΕΡΑ5^ΡΙίΙ^35'3ΗΡΤΕ55ΡνΓΙίΤΟΚΚΡΡΙί03δβΆ0Ρξ3?ϋΡΡΡΙβΤΚΑ I1SPa^SSiSPiaU3IAaMÍ^OTeSYWCBàe5mSKVLRSRSSQIlWHRVPVÃE!VSI«CQPP GOQVMEODRI.VLlCSVMiGTeDITF^OTKGAVGLI'il.QSKTQRSLmEYB Ϊ PSTOS SDÍiEÇJ ννανΜΗδΫβΡάΡδαΐ.ν^ΙΤνΚΪΡνβΚΡΙΙ,ί^ΕΑΡΕΑΟΛΑΐ'βϋ’ΛΒΙ.ΗαΚΡίΙ,ΙΙΟβΡΡΙΙ,Υ
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TPf3Qr1QPIYRjrVTmfSGDSWSLAyy.NQPBQBSl/ftAEft.G'r{®EDKirSLDIYSRI»RKftKX TDVDYED&ÍÍ (SSQ ΪΒ J30í34} (35) IRTA2 (translocação de recetor da superfamília imunoglobulina associada 2, um imunorrecetor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento da célula B e linfomagénese; desregulação do gene pela translocação ocorre em algumas malignidades de célula B) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mllwviL.assaphr (1.977; 977 aa), pl:6.88 PM: 106468 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1 q21, N° de acesso do Genbank NP_112571.1;
documento WO 2003024392 (reivindicação 2, Figura 97); Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1 ):124-127; documento WO 2003077836; documento WO 200138490 (reivindicação 3, Figuras 18B-1-18B-2); 977 aa MLLVWIXiLVLAPVSGQP'AHTPRPIIFLQPi’WITVPQSEIi^^X'TCKSFRF'ZSPQKTKWYllR ΥΙ*αΚΒΧΒ8ΒΤΡΌΝ2ΒΚνθΕ361ΎΚΟΟΑθα£ΡΙ^δΡνΗΙ30Ρ£5^Τ..Ι&<^Β3νΡΕΟβ3νν I,RCRAÍÍAEVTt,MÍT XYOTWTVl.APMJKRTÍJPHl PHACBKPKGAYRCTGYKESCCPVSSST VKIQVQEPFTRPVLRASSFQPXSGNPVTLTeSTQI^ESSSWLRFRFFRDDÍ^I^LGMã I^PKFQXTJIUSWâíffiSGFYNCKÃATMPHSV^SrJSPRSWIQVQXPJ^HPVLrLSPBKALÍÍFE β^Κ^|^ύΜ^Βα§&βΐΜΚΡΥΗ^^ίΛί!^3^αΐΚάΑ8Χ3Ρ£!ΐ,ΤΤ®Κ®(Κ3γΥ0ΤΑΙ1ίβ LGAKPSKÃVSLjSVXVPV'3H?VMír,SSPEDLrFSGAKVTtÍHCSAQRiXSI.PXLYÔPHEm3AA Χ«βΕβΑΜ8Άί3<3^Χ8Ρ^1.ΤΑΚΗ8Θ33ΥΪΟΤΑΙ»ΚΪΡθΡ0ίΙ^ΚΑνΒΏάΧΤνρν3ΗΡνΐ»ΤΪ!Β3Α EAXíTFEGATVTLHCEVQRGSPQIBYQF¥HED&PLWSâSTPSVGRVSF:SPS^TEGHS31^ CTABlíGFSPQRSRWSLF'/TVΪ!VSRPIL·TLRVPRAQAWGDl,LSt.aCSΆPRβSPPXX,*tl<^P YHEDVTLSSSSAPSGGEASFiíLSL.TAHHSGHYSCSMmGLVA.QHSDTISt.SVIVPVSRPI LTPRAPmÇ^WCffiíX^IiHCEMJI^SSPXLYWFYHEBTOliGKXSAPS8(S3aSFí3X.SXí$T® H3GIYSCEAJDÍIQPEaQR3FMVTLIWAVPYSRFVLTLRAPGTHAA.VGDTJI1RXtHCESBRí3SP LÍLYRFFHEDVTXíSMRSSPSíKSÃSIiHtjSLTASHSGtTYSCEADNGLGAQRSSTVTIiYXTSL *íAJ5Í EtSG £> PATíSVAG GLLSI ΑβΒΑΑΟΑΙο.ΙιΙ.ΥΟΜΙ^ΗΚΑβ RKPA3DFARS PPBSPSQEPTYH frVPAf^LOPV^WAtíPSGEíW/SBTOXlQSKKKfíAVASDeRHLRÍíKGSPtXYSE^A STPYSGSIiFLASSAPHil ÍSSQ Ιΐ) MO;35)
Veja-se também: documento W004/045516 (03 de Junho de 2004); documento W003/000113 (03 de Janeiro de 2003); documento W002/016429 (28 de Fevereiro de 2002); documento WO02/16581 (28 de Fevereiro de 2002); documento WO03/024392 (27 de Março de 2003); documento W004/016225 (26 de
Fevereiro de 2004); documento W001/40309 (07 de Junho de 2001); e Pedido de Patente Provisória US N° de Série 60/520842 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TUMOR OF HEMATOPOIETIC ORIGEN" depositada em 17 de Novembro de 2003.
Num exemplo, o Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando possui a Fórmula Ilia, onde o Ligando é um anticorpo Ab incluindo um que se liga a pelo menos um antigénio dentre CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w = 0, y = 0, e D possui a Fórmula Ib. Conjugados Exemplares de Fórmula Ilia incluem onde R17 for -(CH2)s-. Estão também incluídos estes Conjugados de Fórmula Ilia nos quais D possui a estrutura do Composto 2 no Exemplo 3 e ésteres do mesmo. Também estão incluídos estes Conjugados de Fórmula Ilia contendo cerca de 3 a cerca de 8, num aspeto, cerca de 3 a cerca de 5 frações de fármaco D, isto é, Conjugados de Fórmula Ia onde p é um valor no intervalo de cerca de 3- 8, por exemplo, cerca de 3-5. Conjugados contendo combinações das caracteristicas estruturais observadas neste parágrafo são também descritos.
Noutro exemplo, o Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando possui a Fórmula Ilia, onde Ligando é um Anticorpo Ab que se liga a um dentre os antigénios CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w = 1, y = 0, e D tem a Fórmula Ib. Estão incluídos estes Conjugados de Fórmula Ilia nos quais R17 é -(CH2)s-. Estão também incluídos estes Conjugados de Fórmula Ilia nos quais W é -Vai- Cit-, e/ou onde D tem a estrutura do Composto 2 no Exemplo 3 e ésteres do mesmo. Estão também incluídos os Conjugados de Fórmula Ilia contendo cerca de 3 a cerca de 8, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 5 frações de fármaco D, isto é, Conjugados de Fórmula Ia onde p é um valor no intervalo de cerca de 3-8, preferivelmente cerca de 3-5. Conjugados contendo combinações das caracteristicas estruturais mencionadas neste parágrafo são também exemplares.
Num exemplo, o Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando possui a Fórmula Ilia, onde o Ligando é um Anticorpo Ab que se liga a um dos antigénios CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w = 1, y = 1, e D tem a Fórmula lb. Estão incluídos estes Conjugados de Fórmula Ilia nos quais R17 for -(CH2)s-. Estão também incluídos estes Conjugados de Fórmula Ilia onde: W é -Val-Cit-, Y tem a Fórmula X; D tem a estrutura do Composto 2 no Exemplo 3 e ésteres do mesmo; p é cerca de 3 a cerca de 8, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 5 frações de fármaco D. Conjugados contendo combinações de caracteristicas estruturais mencionadas nestes parágrafos são também contemplados.
Um exemplo adicional é um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC), ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde Ab é um anticorpo que se liga a um dos antigénios associados a tumor (1) - (35) mencionados acima (o "Composto TAA").
Um outro exemplo é o Composto TAA ou sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo que está na forma isolada e purificada.
Também é descrito um método para destruir ou inibir a multiplicação de uma célula tumoral ou célula cancerígena que compreende a administração a um paciente, por exemplo, um ser humano com um distúrbio hiperproliferativo, de uma quantidade do Composto TAA ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, a referida quantidade sendo eficaz para destruir ou inibir a multiplicação de uma célula tumoral ou célula cancerígena.
Também é descrito um método para o tratamento de cancro que compreende a administração a um paciente, por exemplo, um ser humano com um distúrbio hiperproliferativo, de uma quantidade do Composto TAA ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, a referida quantidade sendo eficaz para tratar cancro, sozinha ou juntamente com uma quantidade eficaz de um agente anti-cancro adicional.
Também é descrito um método para tratar uma doença autoimune que compreende a administração a um paciente, por exemplo, um ser humano com um distúrbio hiperproliferativo, de uma quantidade do Composto TAA ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, a referida quantidade sendo eficaz para tratar uma doença autoimune.
Os anticorpos adequados para utilização na invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em especial, por síntese química ou por expressão recombinante, e são preferivelmente produzidos por técnicas de expressão recombinante.
4.5.1_PRODUÇÃO DE ANTICORPOS RECOMBINANTES
Anticorpos podem ser produzidos usando qualquer método conhecido na técnica que seja útil para a síntese de anticorpos, em especial, por síntese química ou por expressão recombinante. A expressão recombinante de anticorpos, ou fragmento, derivado ou análogo dos mesmos, requer a construção de um ácido nucleico que codifique o anticorpo. Se a sequência de nucleótido do anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleótidos sintetizados quimicamente (por exemplo, conforme descrito por Kutmeier et ai., 1994, BioTechniques 17:242), que envolve a síntese de oligonucleótidos sobrepostos contendo porções da sequência que codifica o anticorpo, associação e ligação daqueles oligonucleótidos, e então amplificação dos oligonucleótidos ligados, por exemplo, por PCR.
Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo pode ser gerada de uma fonte adequada. Se um clone contendo o ácido nucleico que codifica o anticorpo específico não estiver disponível, mas a sequência do anticorpo é conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de ADNc do anticorpo, ou biblioteca de ADNc gerada de qualquer tecido ou células que expressam a imunoglobulina) , por exemplo, por meio de amplificação de PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5' da sequência ou por meio de clonagem usando uma sonda de oligonucleótido específica a sequência de gene específica.
Se um anticorpo que especificamente reconheça um antigénio particular não estiver comercialmente disponível (ou uma fonte para uma biblioteca de ADNc para clonagem de um ácido nucleico que codifica esta imunoglobulina) , anticorpos específicos para um antigénio específico podem ser gerados por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por imunização de um paciente, ou modelo animal adequado tal como um coelho ou ratinho, para gerar anticorpos policlonais ou, mais preferivelmente, pela geração de anticorpos monoclonais, por exemplo, conforme descrito por Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495-497) ou, conforme descrito por Kozbor et al. 91983, Immunology Today 4:72) ou por Cole et al. (1985 no Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Alternativamente, urn clone que codifica pelo menos a fração Fab do anticorpo pode ser obtido por rastreio de bibliotecas de expressão de Fab (por exemplo, conforme descrito por Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se ligam ao antigénio especifico ou por rastreio de bibliotecas de anticorpos (Veja-se, por exemplo, Clackson et al., 1991 Nature 352:624; Hane et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4937) .
Após uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos o domínio variável do anticorpo ser obtida, ela pode ser introduzida num vetor contendo a sequência de nucleótido que codifica as regiões constantes do anticorpo (veja-se, por exemplo, a Publicação Internacional N° WO 86/05807; documento WO 89/01036; e Patente US N° 5122464) . Estão disponíveis vetores contendo a cadeia leve ou pesada completa, que permite a expressão de uma molécula de anticorpo completa. Então, o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser usado para introduzir as substituições de nucleótido ou deleção necessária para substituir (ou deletar) um ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam de uma ligação de bissulfeto intracadeia com um resíduo de aminoácido que não contém um grupo sulfidilo. Estas modificações podem ser executadas por qualquer método conhecido na técnica para a introdução de mutações ou deleções específicas numa sequência de nucleótido, por exemplo, mas não limitadas a mutagénese química e mutagénese direcionada por local in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551).
Além disso, podem ser usadas técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al. , 1985, Nature 314:452-454) por junção de genes de uma molécula de anticorpo de ratinho de uma especificidade de antigénio apropriada, juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes são derivadas de espécies animais diferentes, tais como aquelas que tem uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante de imunoglobulina humana, por exemplo, anticorpos humanizados.
Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente US 4.694.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei USA 85:5879- 5883; e Ward et al., 1989, Nature 334:544-54) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única. Anticorpos de cadeia única são formados pela ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoácido, resultando num polipéptido de cadeia única. Técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coll podem também ser usadas (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
Fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, estes fragmentos incluem, mas não se limitam aos fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão de pepsina da molécula do anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados pela redução das pontes de bissulfeto dos fragmentos F(ab')2·
Após uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo ter sido obtida, o vetor para a produção do anticorpo pode ser produzido por tecnologia de ADN recombinante usando técnicas bem conhecidas na técnica. Métodos que são bem conhecidos por aqueles especializados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão que contenham as sequências que codificam o anticorpo e sinais de controlos de transcrição e tradução apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Veja-se, por exemplo, as técnicas descritas por Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) e Ausubel et al. (eds, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
Um vetor de expressão que compreende a sequência de nucleótido de um anticorpo, ou a sequência de nucleótido de um anticorpo pode ser transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais (por exemplo, eletroporação, transfecção lipossómica, e precipitação de fosfato de cálcio), e as células transfectadas são, então, cultivadas por técnicas convencionais para produzir o anticorpo. Em formas de realização especificas, a expressão do anticorpo é regulada por um promotor especifico constitutivo, indutivel ou um tecido.
As células hospedeiras usadas para expressar o anticorpo recombinante podem ser tanto células bacterianas como Escherichia coli, como, preferivelmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula de imunoglobulina recombinante integral. Em especial, células de mamíferos tais como células do ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor tal como o elemento promotor principal intermediário de gene inicial de citomegalovírus humano é um sistema de expressão efetivo para imunoglobulinas (Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2).
Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar os anticorpos de imunoglobulina. Estes sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos através dos quais as sequências de codificação do anticorpo podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleótido apropriadas, podem expressar uma molécula de imunoglobulina de anticorpo in situ. Estes incluem, mas não se limitam a microrganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformadas com vetores de expressão de ADN de bacteriófagos recombinantes, ADN de plasmídeo ou ADN de cosmídio contendo sequências de codificação de imunoglobulina; levadura (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformado com vetores de expressão de levadura recombinantes contendo sequências de codificação de imunoglobulina; sistemas de célula de inseto infetados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo as sequências de codificação de imunoglobulina; sistemas de células vegetais infetados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus mosaico de couve-flor (CaMV) e vírus mosaico de tabaco (TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo as sequências de codificação de imunoglobulina; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3) que ancoram construções de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus; o promotor de vírus vacínia 7,5K) .
Em sistemas bacterianos, uma série de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionada dependendo da utilização destinado para o anticorpo que está a ser expresso. Por exemplo, quando uma grande quantidade desta proteína deve ser produzida, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são prontamente purificados devem ser desejáveis. Estes vetores incluem, mas não se limitam ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al. , 1983, EMBO J. 2:1791), nos quais a sequência de codificação do anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região de codificação de lac Z, de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); e semelhantes. Vetores pGEX podem também ser usados para expressar polipéptidos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). No geral, estas proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadas pela absorção e ligação a uma matriz de contas de glutationa-agarose seguidas por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são designados para incluir locais de clivagem de protease de trombina ou fator Xa, de modo que o produto de gene alvo clonado pode ser libertado da fração GST.
Num sistema de inseto, vírus poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) ou o vírus análogo de Drosophila melanogaster é usado como um vetor para expressar genes estrangeiros. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais do vírus (por exemplo, o gene poliedrina), e colocada sob controlo de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor poliedrina).
Em células de hospedeiros de mamífero, uma série de sistemas de expressão baseados em vírus pode ser utilizada. Em casos onde um adenovirus é usado como um vetor de expressão, a sequência de codificação do anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução de adenovirus, por exemplo, o promotor tardio e sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode, então, ser inserido no genoma do adenovirus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virótico (por exemplo, região EI ou E3) resulta num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de imunoglobulina em hospedeiros infestados, (por exemplo, veja-se Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:355-359) . Sinais de iniciação específicos podem também ser requeridos para tradução eficiente de sequências de codificação de anticorpo. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além do mais, o codão de iniciação deve estar em fase com a estrutura de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a tradução da inserção inteira. Estes sinais de controlo de tradução exógenos e codões de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência de expressão pode se aumentada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (veja-se Bittner et ai., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
Além disso, uma estirpe de célula hospedeira pode ser escolhida para modular a expressão das sequências inseridas, ou modificar e processar o produto de gene da maneira específica desejada. Estas modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) dos produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes possuem mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos de gene. Linhas celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para garantir a modificação correta e processamento da proteína estrangeira expressa. Com este fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento apropriado da transcrição, glicosilação, e fosforilação primárias do produto de gene podem ser usadas. Estas células hospedeiras de mamífero incluem, mas não se limitam a, CHO, VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, CRL7030 e Hs578Bst.
Para produção de longa duração e alto rendimento de proteínas recombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhas celulares que expressam de forma estável um anticorpo podem ser engenheiradas. Ao invés de usar vetores de expressão que contenham origens viróticas de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (por exemplo, locais de promotor, intensificador, sequências, transcrição, terminadores, poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Após a introdução do ADN estrangeiro, células engenheiradas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido, e então são mudadas para um meio seletivo. 0 marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que células integrem de forma estável o plasmídeo nos seus cromossomas e cresçam para formar foci que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode vantajosamente ser usado para engenheirar linhas celulares que expressam o anticorpo. Estas linhas celulares engenheiradas podem ser especificamente úteis no rastreio e avaliação de antigénios de tumor que interagem diretamente ou indiretamente com o anticorpo.
Uma série de sistemas de seleção pode ser usada, incluindo, mas não limitada a cinase de timidina de vírus de herpes simples (Wigler et al. , 1977, Cell 11:223), fosforibosil transferase de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202), e genes de fosforibosil transferase de adenina (Lowy et al. , 1980, Cell 22:817) podem ser utilizados em células tk-, hgprt- ou aprt-, respetivamente. Também, resistência antimetabolito pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: DHFR, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al. , 1980, Proc. Natl. Acad. Sei.
USA 77:357; 0'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei USA 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573- 596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann Rev. Biochem. 62:191-217; Maio, 1993, TIB TECH 11(5): 155-215) e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al. , 1984, Gene 30:147). Métodos comummente conhecidos na técnica de tecnologia de ADN recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. , (eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics,
John Wiley & Sons, NY; Colberre-Gerapin et al. , 1981, J. Mol. Biol. 150 : 1) .
Os níveis de expressão de um anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetor (para uma análise, veja-se Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in ADN cloning, vol. 3. (Academic Press, Nova York, 1987)) . Quando um marcador no sistema de vetor que expressa um anticorpo é amplificável, um aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Visto que a região amplificada está associada com a sequência de nucleótido do anticorpo, a produção do anticorpo irá, também, aumentar (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257) . A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão, o primeiro vetor que codifica um polipéptido derivado de cadeia pesada e o segundo vetor que codifica um polipéptido derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem expressão igual de polipéptidos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, um vetor único pode ser usado para codificar tanto polipéptidos de cadeia pesada quanto de cadeia leve. Nestas situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar excesso de cadeia pesada isenta de tóxico (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.
Após o anticorpo ter sido expresso de forma recombinante, ele pode ser purificado usando qualquer método conhecido na técnica para purificação de um anticorpo, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iónica, afinidade, especificamente por afinidade para o antigénio especifico após Proteína A, e cromatografia de coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal.
Em qualquer caso, os anticorpos híbridos têm uma especificidade dupla, preferivelmente com um ou mais locais de ligação específicos para o hapteno de escolha ou um ou mais locais de ligação específicos para um antigénio alvo, por exemplo, um antigénio associado com um tumor, uma doença autoimune, um organismo infecioso, ou outro estado de doença.
4.5.2_PRODUÇÃO DE ANTICORPOS A produção de anticorpos será ilustrada com referência a anticorpos anti-CD30, mas ficará aparente aos peritos na especialidade que anticorpos para outros membros da família do recetor TNF podem ser produzidos e modificados de maneira semelhante. A utilização de CD30 para a produção de anticorpos é apenas exemplar e não objetiva ser limitativa. 0 antigénio CD30 a ser usado para produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de CD30 ou uma fração do mesmo, contendo o epítopo desejado. Alternativamente, células que expressam CD30 nas suas superfícies celulares (por exemplo, L540 (linha celular derivada de linfoma de Hodgkin com um fenótipo de célula T) e L428 (linha celular derivada de linfoma de Hodgkin com um fenótipo de célula B)) podem ser usadas para gerar anticorpos. Outras formas de CD30 úteis para gerar anticorpos ficarão aparentes aos peritos na especialidade.
Noutro exemplo, o antigénio ErbB2 a ser usado para produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de ErbB2 ou uma fração do mesmo, contendo o epítopo desejado. Alternativamente, células que expressam ErbB2 nas suas superfícies celulares (por exemplo, células NIH-3T3 transformadas para sobre-expressar ErbB2; ou uma linha celular de carcinoma tal como células SK-BR-3, veja-se Stancovski et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8691-8695 (1991)) podem ser usadas para gerar anticorpos. Outras formas de ErbB2 úteis para gerar anticorpos ficarão aparentes aos peritos na especialidade, (i) Anticorpos Policlonais
Anticorpos policlonais são preferivelmente criados em animais através de múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante a uma proteína que seja imunogénica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina do molusco "keyhole", albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivador, por exemplo, maleimidobenzoil sulfossuccinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), N- hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquilo diferentes.
Animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos, ou derivados pela combinação, por exemplo, de 100 yg ou 5 yg da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respetivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e por injeção da solução intradermicamente em múltiplos locais. Um mês após os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em vários locais. Sete a 14 dias depois os animais são sangrados e o soro é analisado para titulação de anticorpo. Os animais são reforçados até o platô da titulação. Preferivelmente, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugados com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Conjugados também podem ser feitos em cultura de célula recombinante como fusões de proteína. Também agentes de agregação tais como alume são adequadamente usados para aumentar a resposta imunológica. (ii) Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais são obtidos de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades mínimas. Dessa maneira, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos usando o método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser feito pelos métodos de ADN recombinantes (Patente US N° 4816567).
No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado como descrito no presente documento acima para preparar linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que irão, especificamente, ligar-se à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos são, então, fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59- 103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas num meio de cultura adequado, que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma precursoras não fundidas. Por exemplo, se células de mieloma precursoras não possuem a transferase de enzima hipoxantina guanina fosforibosil (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, amino proteína, e timidina (meio HAT), cujas substâncias impedem o crescimento de células deficientes de HGPRT. Células de mieloma preferidas são aquelas que fundem eficientemente, suportam alto nível de produção estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio como o meio HAT. Entre estes, linhas celularess de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Salk Institute Cell Distribution Center, São Diego, Califórnia, EUA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis do American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho- humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)).
Meio de cultura no qual células de hibridoma estão a crescer é analisado quanto à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antigénio. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por uma análise de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise "Scatchard" de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Após serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados pela limitação dos procedimentos de diluição e cultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)) . Meios de cultura adequados para este objetivo incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores asciticos num animal.
Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite, ou soro por procedimentos convencionais de purificação de anticorpo tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese por gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. ADN, que codifica os anticorpos monoclonais, é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, através da utilização de sondas de oligonucleótidos que são capazes de ligação específica a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino) . As células de hibridoma servem como uma fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vetores de expressão, que são, então, transfectados em células hospedeira tais como células de E. coli, células COS de simios, células do ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que, pelo contrário, não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células de hospedeiro recombinante. Artigos de análise em expressão recombinantes na bactéria de ADN que codifica o anticorpo incluem Skerra et al. , Curr. Opinion in Immunol., 5:256- 262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
Anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticorpo usando as técnicas descritas por McCafferty et al., Nature, 348:552- 554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al. , J. Mol. Biol. , 222:581 -597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e humano, respetivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (intervalo de nM) por rearranjo de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como infeção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Dessa maneira, estas técnicas são alternativas viáveis a técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para isolamento de anticorpos monoclonais.
O ADN também pode ser modificado, por exemplo, através de substituição da sequência de codificação para domínios constantes humanos de cadeia pesada e cadeia leve no lugar das sequências de murino homólogo (Patente US N° 4816567; e Morrison, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851), ou por união covalente com a sequência de codificação de imunoglobulina toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não imunoglobulina.
Tipicamente, estes polipéptidos de não imunoglobulina são substituídos para os domínios constantes de um anticorpo, ou são substituídos para os domínios variáveis de um local de combinação de antigénio de um anticorpo, de modo a criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um local de combinação de antigénio que tem especificidade para um antigénio, e um outro local de combinação de antigénio que tem especificidade para um antigénio diferente. (iii) Anticorpos Humanizados
Um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humano são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente executada através do método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), pela substituição de sequências de região hipervariável para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US N° 4.816.567) onde substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de região hipervariável, e possivelmente alguns resíduos FR, são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, para serem usados na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado de "mais adequado", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é explorada contra a biblioteca inteira de sequências conhecidas de domínio variável humano. A sequência humana que é mais próxima àquela do roedor é, então, aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al. , J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Um outro método usa uma região de estrutura específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. , J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Os anticorpos podem ser humanizados com retenção de alta afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Anticorpos humanizados podem ser preparados por um processo de análise das sequências precursoras e vários produtos humanizados conceituais, usando modelos tridimensionais das sequências precursoras e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comummente disponíveis e são familiares aos peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador, que ilustram e mostram as estruturas prováveis de conformação tridimensional das sequências de imunoglobulina candidata selecionada. A inspeção destas apresentações permite analisar o papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar a seu antigénio. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências recipientes e importadas, de modo que as características desejadas do anticorpo, tal como afinidade aumentada para o antigénio(s) alvo(s), seja atingida. De forma geral, os resíduos da região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação a antigénio. Várias formas do anticorpo humanizado são consideradas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgGl intacto.
Os Exemplos descrevem a produção de um anticorpo anti-ErbB2 humanizado exemplar. 0 anticorpo humanizado pode, por exemplo, compreender resíduos da região hipervariável não humana incorporados num domínio pesado variável humano e podem, ainda, compreender uma substituição de região de estrutura (FR) numa posição selecionada do grupo consistindo de 69H, 71H e 73H, utilizando o sistema de numeração do domínio variável definido por Rabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR em duas ou todas as posições 69H, 71H e 73H. Um outro Exemplo descreve a preparação de anticorpo trastuzumab purificado da formulação HERCEPTIN®. (iv) Anticorpos Humanos
Como uma alternativa para humanização, anticorpos humanos podem ser gerados. Por exemplo, é possível, agora, produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união de cadeia pesada do anticorpo (JH) em ratinhos quiméricos e mutantes da linha de germe resulta na inibição completa de produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo do gene de imunoglobulina da linha de germe nestes ratinhos mutantes de linha de germe resulta na produção de anticorpos humanos mediante desafio com antigénio. Veja-se, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255- 258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e Patentes US N° 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807.
Alternativamente, tecnologia de apresentação de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo In vitro, de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores imunizados. De acordo com esta técnica, genes de domínio V de anticorpo são clonados na estrutura dentro de um gene de proteína de revestimento principal ou mínima de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e apresentada como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula do fago. Devido ao fato da partícula filamentosa conter uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma do fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Dessa maneira, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A apresentação do fago pode ser executada numa variedade de formatos; para sua análise veja-se, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David. J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para apresentação de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos de antioxazolona de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de ratinhos imunizados. Um repertório de genes V a partir de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um arranjo diverso de antigénios (incluindo auto-antigénios) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993) . Vejam também as Patentes US N° 5565332 e 5573905. Conforme discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (veja-se Patentes US N° 5567610 e 5229275) . Anticorpos humanos anti-CD30 são descritos no pedido de Patente US N° de Série 10/338.366. (v) Fragmentos de Anticorpo Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja-se, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, estes fragmentos podem, agora, ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com uma outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para produção de fragmentos de anticorpo ficarão aparentes para os técnicos especializados. Em outras formas de realização, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Veja-se documento WO 93/16185; Patente US N° 5.571.894; e Patente US N° 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Patente US N° 5.641.870, por exemplo. Estes fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecificos ou biespecíficos. (vi) Anticorpos Biespecificos
Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidade de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se a dois epítopos diferentes da proteína CD30. Alternativamente, um braço anti-CD30 pode ser combinado com um braço que se liga a recetores Fc para IgG (FcyR) , tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de modo a direcionar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa CD30. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expressam CD30. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et ai., Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à escolha aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas diferentes de anticorpo, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é usualmente feita por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante incómoda, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos semelhantes são apresentados no documento WO 93/08829, e por Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) . De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação de anticorpo-antigénio) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferivelmente é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste de proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptido nas formas de realização quando proporções desiguais das três cadeias de polipéptido usadas na construção proporcionam os rendimentos ideais. É possível, portanto, inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipéptido num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipéptido em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não são de significância específica.
Num exemplo desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, visto que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona uma via fácil de separação. Esta abordagem é apresentada no documento WO 94/04690. Para pormenores adicionais sobre geração de anticorpos biespecíficos, veja-se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acordo com uma outra abordagem descrita na Patente US N° 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser engenheirada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados de cultura de célula recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácido da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às cadeias laterais grandes são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo pela substituição de cadeias laterais grandes de aminoácido por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros. Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos de fragmentos de anticorpo foram também descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) descreve um procedimento onde anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2· Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação ditiol de arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e impedir a formação intermolecular de bissulfeto. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-ΤΝΒ é, então, convertido novamente em Fab'-tiol pela redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
Um progresso recente facilitou a recuperação direta dos fragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi separadamente segregado de E. coli e submetido a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. Várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente de cultura de célula recombinante foram também descritas. Por exemplo, anticorpos biespecificos foram produzidos usando ziperes de leucina. Kostelny et ai., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os péptidos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Os homodímeros do anticorpo foram reduzidos na região de articulação para formar monómeros e, então, reoxidados para formar heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) proveu um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpo biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio de cadeia pesada variável (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir a formação de pares entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e Vh complementares de um outro fragmento, formando, portanto, dois locais de ligação de antigénio. Uma outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpo biespecífico pela utilização de dímeros de cadeia única Fv (sFv) foi também relatada. Veja-se Gruber et ai., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Anticorpos com mais que duas valências são considerados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et ai., J. Immunol. 147:60 (1991) . (vii) Outras modificações em sequências de aminoácidos
Modificação(ões) de sequências de aminoácidos dos anticorpos descritos no presente documento são consideradas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequência de aminoácido dos anticorpos são preparadas pela introdução de alterações de nucleótido apropriadas no ácido nucleico do anticorpo, ou por síntese de péptido. Estas modificações incluem, por exemplo, deleções, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para obter a construção final, contanto que a construção final possua as características desejadas. As alterações no aminoácido também podem alterar processos pós-tradução do anticorpo, tais como alteração do número ou posição de locais de glicosilação.
Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são locais favorecidos para mutagénese é denominado de "mutagénese de rastreio de alanina" conforme descrito por Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). No presente documento, um resíduo ou grupo de resíduos alvos é identificado (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antigénio. Aqueles locais de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional em relação às substituições são, então, refinados pela introdução de variantes adicionais ou outras variantes, nos locais de substituição. Dessa maneira, embora o local para introdução de uma variação de sequência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação por si mesma não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num local dado, mutagénese aleatória ou por rastreio de ala é conduzida no codão ou região alvo e as variantes de anticorpo expressas são exploradas quanto à atividade desejada.
Inserções de sequências de aminoácido incluem fusões de terminal de amino e/ou carboxilo variando em comprimento de um resíduo para os polipéptidos contendo uma centena ou mais resíduos, assim como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções de terminal incluem um anticorpo com um resíduo N-terminal metionilo ou o anticorpo fundido a um polipéptido citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão do terminal N- ou C-do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipéptido que aumente a meia-vida do soro do anticorpo.
Um outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituída por um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para mutagénese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações FR são também consideradas.
Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são obtidas pela seleção de substituições que diferem significativamente no seu efeito na manutenção de (a) estrutura de suporte do polipéptido na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr; (3) ácida: asp, glu; (4) básica: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromático: trp, tyr, phe.
Substituições não conservativas irão acarretar a troca de um membro de uma destas classes por uma outra classe.
Um tipo especialmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo precursor (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá propriedades biológicas melhoradas em relação ao anticorpo precursor do qual elas são geradas. Uma maneira conveniente para gerar estas variantes de substituição envolve a maturação de afinidade usando apresentação de fago. Resumidamente, vários locais de região hipervariável (por exemplo, 6-7 locais) sofrem mutações para gerar todas as substituições de amino possível em cada local. As variantes de anticorpo geradas desta maneira são apresentadas de uma maneira monovalente de partículas de fago filamentoso como fusões do produto do gene III de M13 embalados dentro de cada partícula. As variantes apresentadas de fago são, então, exploradas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conforme apresentado no presente documento. De modo a identificar locais de região hipervariável candidata para modificação, mutagénese de rastreio de alanina pode ser executada para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente para ligação a antigénio. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o antigénio. Estes resíduos de contacto e resíduos adjacentes são candidatos a substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente documento. Após estas variantes serem geradas, o painel de variantes é submetido ao rastreio conforme descrito no presente documento e anticorpos com propriedades superiores numa ou mais análises relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.
Pode ser desejável modificar o anticorpo com relação à função de efetor, por exemplo, de modo a aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antigénio (ADCC) e/ou complementar a citotoxicidade dependente (CDC) do anticorpo. Isto pode ser obtido pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido na região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, permitindo, através disso, a formação de ligação de bissulfeto entre as cadeias nesta região. 0 anticorpo homodimérico gerado desta maneira pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou capacidade de eliminação de célula mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentadas. Veja-se Caron et al. J. Exp. Med. 17 6:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral aumentada podem também ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais conforme descrito por Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode-se engenheirar um anticorpo que tenha duas regiões Fc e que pode, portanto, ter lise de complemento e capacidade de ADCC aumentadas. Veja-se Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
Para aumentar a semivida do soro do anticorpo, pode ser incorporado um epítopo de ligação de recetor de salvamento no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) conforme descrito na Patente US N° 5739277, por exemplo. Conforme usado no presente documento, o termo "epítopo de ligação de recetor de salvamento" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semivida do soro in vivo da molécula de IgG. (viii) Variantes de Glicosilação
Anticorpos no ADC da invenção podem ser glicosilados nas posições conservadas nas suas regiões constantes (Jefferis e Lund, (1997) Chem. Immunol. 65:111-128; Wright e Morrison, (1997) TibTECH 15:26-32) . As cadeias laterais de oligossacáridos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318;
Wittwe e Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180), e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína que podem afetar a conformação e apresentaram superfície tridimensional da glicoproteína (Hefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, (1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416). Oligossacáridos podem também servir para direcionar uma glicoproteína dada para certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. Por exemplo, foi relatado que na IgG agalactosilada, a fração de oligossacárido "move-se" para fora do espaço inter-CH2 e resíduos terminais N-acetilglicosamina se tornam disponíveis para ligar proteína de ligação de manose (Malhotra et al., (1995) Nature Med. 1:237- 243). A remoção por glicopeptidase dos oligossacáridos de CAMPATH-1H (um anticorpo IgGl monoclonal de murino humanizado recombinante que reconhece o antigénio CDw52 de linfócitos humanos) produzidos nas células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) resultou numa redução completa na lise mediada por complemento (CMCL) (Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311- 1318), enquanto a remoção seletiva de resíduos de ácido siálico usando neuraminidase não resultou em perda de DMCL. Foi também relatado que glicosilação de anticorpos afeta a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) . Em especial, foi relatado que células CHO com expressão regulada por tetraciclina de p(l,4)-N-acetilglicosaminil transferase III (GnTIII), uma formação de catalisação de glicosil transferase de bissecção de GlcNAc, tiveram atividade ADCC melhorada (Umana et al. (1999) Mature Biotech. 17:176-180).
Glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O-ligada. N- ligada refere-se à união da fração de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripéptido asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para união enzimática da fração de hidrato de carbono para a cadeia lateral de asparagina. Dessa maneira, a presença de qualquer uma destas sequências de tripéptido num polipéptido cria um local de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à união de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiamínico, mais comummente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
Variantes de glicosilação de anticorpos são variantes nas quais o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Por alteração entende-se a deleção de uma ou mais porções de hidrato de carbono encontradas no anticorpo, a adição de uma ou mais porções de hidrato de carbono ao anticorpo, a alteração da composição de glicosilação (padrão de glicosilação), a extensão da glicosilação, etc. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente obtida através da alteração da sequência de aminoácido, de modo que ela contenha uma ou mais das sequências de tripéptido descritas acima (para locais de glicosilação N-ligada). A alteração pode também ser feita pela adição, ou substituição, de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação O-ligada). De maneira semelhante, a remoção de locais de glicosilação pode ser obtida por alteração de aminoácido dentro dos locais de glicosilação nativos do anticorpo. A sequência de aminoácidos é usualmente alterada pela alteração da sequência de aminoácido subjacente. Estes métodos incluem, mas não se limitam a isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleótido (ou direcionada ao local), mutagénese de PCR, e mutagénese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou de uma versão não variante do anticorpo. A glicosilação (incluindo padrão de glicosilação) de anticorpos pode também ser alterada sem alterar a sequência de aminoácido ou a sequência de nucleótido subjacente. A glicosilação depende grandemente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Visto que o tipo de célula usado para expressão de glicoproteína recombinante, por exemplo, anticorpos, como potencial terapêutico está raramente na célula nativa, variações significativas no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas. Veja-se, por exemplo, Hse et al., (1997) J. Biol. Chem. 272-9062-9070. Além da escolha de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, formulação do meio, densidade da cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e semelhantes. Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação atingido num organismo hospedeiro especifico, incluindo a introdução ou sobre-expressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacáridos (Patentes US N° 5047335; 5510161; 5278299) . Glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, podem ser enzimaticamente removidos da glicoproteína, por exemplo, usando endoglicosidase H (Endo H) . Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser engenheirada geneticamente, por exemplo, tornando-as defeituosas no processamento de certos tipos de polissacáridos. Estas e técnicas semelhantes são bem conhecidas na técnica. A estrutura de glicosilação de anticorpos pode ser prontamente analisada por técnicas convencionais de análise de hidrato de carbono, incluindo cromatografia de lectina, RMN, espetrometria de massa, HPLC, GPC, análise de composição de monossacárido, digestão enzimática sequencial, e HPAEC- PAD, que usa cromatograf ia de troca aniónica de alto pH para separar oligossacáridos com base na carga. Métodos para libertar oligossacáridos para objetivos analíticos são também conhecidos, e incluem, sem limitação, tratamento enzimático (comummente executado usando péptido-N-glicosidase F/endo^-galactosidase) , eliminação usando ambiente alcalino adstringente para libertar principalmente estruturas O-ligadas, e métodos químicos usando hidrazina anidra para libertar tanto oligossacáridos N- quanto O-ligados. 4.5.2a RASTREIO DE CONJUGADO DE ANTICORPO-FÁRMACO (ADC)
Animais transgénicos e linhas celulares são especialmente úteis no rastreio de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) que têm potencial como tratamentos profiláticos ou terapêuticos de doenças ou distúrbios envolvendo a sobre-expressão de proteínas incluindo Lewis Y, CD30, CD40, e CD70. Animais transgénicos e linhas celulares são especialmente úteis no rastreio de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) que têm potencial como tratamentos profiláticos ou terapêuticos de doenças ou distúrbios envolvendo a sobre-expressão de HER2 (documento US 6632979) . 0 rastreio de um ADC útil pode envolver a administração de ADC candidato numa variedade de doses para o animal transgénico, e a análise em vários pontos no tempo dos efeitos do ADC na doença ou distúrbio que está a ser avaliada. Alternativamente, ou adicionalmente, o fármaco pode ser administrado antes ou simultaneamente com a exposição a um indutor da doença, se aplicável. ADC candidato pode ser explorado serialmente e individualmente, ou em paralelo sob meio ou formato de rastreio de alto-resultado. A taxa na qual ADC pode ser explorado para utilidade em tratamentos profiláticos ou terapêuticos de doenças ou distúrbios é limitada apenas pela taxa de síntese ou metodologia de rastreio, incluindo a deteção/medição/análise de dados.
Um exemplo é um método de rastreio que compreende (a) transplantar células de uma linha celular cancerígena de célula renal estável num animal não humano, (b) administrar um fármaco ADC candidato ao animal não humano e (c) determinar a capacidade do candidato para inibir a formação de tumores da linha celular transplantada.
Um outro exemplo é um método de rastreio que compreende (a) colocar em contacto células de uma linha
celular de doença de Hodgkin estável com um candidato a fármaco ADC e (b) avaliar a capacidade do candidato ADC para bloquear a ativação do ligando de CD40.
Um outro exemplo é um método de rastreio que compreende (a) colocar em contacto células de uma linha celular de doença de Hodgkin com um fármaco ADC candidato e (b) avaliar a capacidade do candidato ADC para induzir a morte da célula. Numa forma de realização a capacidade do ADC candidato para induzir apoptose é avaliada.
Um exemplo um método de rastreio que compreende (a) transplantar células de uma linha celular cancerígena estável num animal não humano, (b) administrar um fármaco ADC candidato ao animal não humano e (c) determinar a capacidade do candidato para inibir a formação de tumores da linha celular transplantada. A invenção também se refere a um método de rastreio de candidatos ADC para o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizada pela sobre-expressão de HER2 que compreende (a) colocar em contacto células de uma linha celular cancerígena de mama estável com um fármaco candidato e (b) avaliar a capacidade do ADC candidato para inibir o crescimento da linha celular estável.
Um outro exemplo é um método de rastreio que compreende (a) colocar em contacto células de uma linha celular cancerígena estável com um fármaco ADC candidato e (b) avaliar a capacidade do ADC candidato para bloquear a ativação de HER2. Numa forma de realização, a capacidade do ADC candidato para bloquear a ligação de herregulina é avaliada. Numa outra forma de realização, a capacidade do ADC candidato para bloquear fosforilação de tirosina estimulada por ligando é avaliada.
Também é descrito um método de rastreio que compreende (a) colocar em contacto células de uma linha celular cancerígena estável com um fármaco ADC candidato e (b) avaliar a capacidade do ADC candidato para induzir a morte da célula. Numa forma de realização, a capacidade do ADC candidato para induzir apoptose é avaliada.
Também é descrito um método de rastreio que compreende (a) administrar um fármaco ADC candidato a um mamífero não humano transgénico que sobre-expressa nas suas células de glândula mamária uma proteína HER2 humana ou um fragmento da mesma, em que este mamífero transgénico possui, integrada de forma estável no seu genoma, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína HER2 humana nativa ou um fragmento da mesma que tem a atividade biológica de HER2 humano nativo operativamente ligada a sequências reguladoras de transcrição que direcionam a sua expressão para a glândula mamária, e desenvolve um tumor de mama que não responde ou responde muito pouco a tratamento de anticorpo anti-HER2, ou a um mamífero não humano que possui um tumor transplantado do referido mamífero não humano transgénico; e (b) avaliar o efeito do ADC candidato na doença ou distúrbio alvo. Sem limitações, a doença ou distúrbio pode ser um cancro que sobre-expressam HER2, tal como cancro de mama, de ovário, estomacal, do endométrio, da glândula salivar, pulmonar, renal, do cólon, tiroide, pancreático e da bexiga. 0 cancro preferivelmente é cancro de mama que expressou HER2 em pelo menos cerca de 500.000 cópias por célula, mais preferivelmente pelo menos cerca de 2.000.000 cópias por célula. Fármaco ADC candidatos podem, por exemplo, ser avaliados quanto à sua capacidade para induzir morte e/ou apoptose de célula, usando métodos de análise bem conhecidos na técnica e descritos no presente documento posteriormente.
Num exemplo, ADC candidatos são explorados através de sua administração ao animal transgénico numa variedade de doses, e da avaliação da resposta fisiológica do animal aos compostos com o passar do tempo. A administração pode ser oral, ou por injeção adequada, dependendo da natureza química do composto que está a ser avaliado. Em alguns casos, pode ser apropriado administrar o composto em conjunto com co-fatores que intensificariam a eficácia do composto. Se linhas celulares derivadas dos animais transgénicos em questão são usadas para explorar compostos úteis no tratamento de várias distúrbios, os compostos de teste são adicionados ao meio de cultura de célula num momento apropriado, e a resposta celular ao composto é avaliada com o passar do tempo usando análises bioquímicas e/ou histológicas apropriadas. Em alguns casos, pode ser apropriado aplicar o composto de interesse ao meio de cultura em conjunto com co-fatores que intensificariam a eficácia do composto.
Dessa maneira, são descritas no presente documento análises para a identificação de ADC que especificamente se direcionam e se ligam à proteína alvo, cuja presença está correlacionada com função celular anormal, e na patogénese de proliferação celular e/ou diferenciação que está relacionada de forma causal com o desenvolvimento de tumores.
Para identificar um ADC que bloqueie ativação de ligando de um recetor de ErbB (por exemplo, ErbB2), a capacidade do composto para bloquear ligação de ligandos de ErbB a células que expressam o recetor ErbB (ErbB2) (por exemplo, em conjunto com um outro recetor ErbB com o qual o recetor ErbB de interesse forma um hetero-oligómero ErbB) pode ser determinada. Por exemplo, células isoladas do animal transgénico que sobre-expressam HER2 e transfectadas para expressar um outro recetor ErbB (com o qual HER2 forma hetero-oligómero) podem ser incubadas, isto é, cultivadas com ADC e então expostas a ligando de ErbB marcado. A capacidade do composto para bloquear ligação de ligando ao recetor ErbB no hetero- oligómero ErbB pode, então, ser avaliada.
Por exemplo, a inibição de ligação de herregulina (HRG) a linhas celulares de tumor de mama, que sobre-expressam HER2 e estabelecida dos mamíferos não humanos transgénicos (por exemplo, ratinho) no presente documento, pelo ADC candidato pode ser executada usando culturas de camada única em gelo num formato de placa de 24 poços. Anticorpos monoclonais anti-ErbB2 podem ser adicionados a cada poço e incubados durante 30 minutos. rHRGpii77-224 marcado com 125I (25.000 cpm) pode, então, ser adicionado, e a incubação pode ser continuada durante 4 a 16 horas. Curvas de resposta de dose podem ser preparadas e um valor IC5o (atividade citotóxica) pode ser calculada para o composto de interesse.
Alternativamente, ou adicionalmente, a capacidade de um ADC para bloquear fosforilação de tirosina estimulada por ligando de ErbB de um recetor ErbB presente num hetero-oligómero ErbB pode ser avaliada. Por exemplo, linhas celulares estabelecidas a partir dos animais transgénicos no presente documento, podem ser incubadas com um ADC de teste e então avaliadas quanto à atividade de fosforilação de tirosina dependente de ligando de ErbB usando um anticorpo monoclonal antifosfotirosina (que é opcionalmente conjugado com um rótulo detetável). A análise de ativação do recetor de cinase descrita na Patente US N° 5766863 está também disponível para determinar ativação de recetor ErbB e bloqueio daquela atividade pelo composto.
Num exemplo, é possível explorar ADC que inibe a estimulação de HRG de fosforilação de tirosina pl80 em células MCF7 essencialmente conforme descrito a seguir. Por exemplo, uma linha celular estabelecida de um animal transgénico HER2 pode ser colocada em placas de 24 poços e o composto pode ser adicionado a cada poço e incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente; então rHRGpr 177-224 pode ser adicionado a cada poço até uma concentração final de 0,2 nM, e a incubação pode ser continuada durante cerca de 8 minutos. O meio pode ser aspirado de cada poço, e reações podem ser paradas pela adição de 100 μΐ de tampão de amostra SDS (5 % de SDS, 25 mM DTT, e 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8). Cada amostra (25 μΐ) pode passar por eletroforese num gel gradiente de 4-12 % (Novex) e então transferidos eletroforeticamente para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunoblots de antifosfotirosina (a 1 pg/ml) podem ser desenvolvidas, e a intensidade da banda reativa predominante a Mr-180.000 pode ser quantificada por densitometria de refletância. Um método alternativo para avaliar a inibição de fosforilação de recetor é a análise KIRA (ativação de recetor de cinase) de Sadick et al. (1998) Jour, of Pharm. and Biomed. Anal. Alguns dos anticorpos monoclonais bem estabelecidos contra HER2 que são conhecidos por inibir a estimulação de HRG de fosforilação de tirosina pl80 podem ser usados como controlo positivo nesta análise. Uma curva dose-resposta para a inibição de estimulação de HRG da fosforilação de tirosina pl80, conforme determinado por densitometria de refletância, pode ser preparada e um IC50 para o composto de interesse pode ser calculado.
Os efeitos inibidores de crescimento de um teste ADC em linhas celulares derivadas de um animal transgénico HER2, por exemplo, essencialmente conforme descrito em Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394, podem também ser avaliados. De acordo com esta análise, as células podem ser tratadas com um composto de teste em várias concentrações durante 4 dias e coradas com violeta cristal ou corante de redox "Alamar Blue". A incubação com o composto pode mostrar um efeito inibidor no crescimento nesta linha celular semelhante àquele apresentado por anticorpo monoclonal 2C4 em células MDA-MB-175 (Schaefer et al., supra). Numa forma de realização adicional, HRG exógeno não inverterá significativamente esta inibição.
Para identificar compostos inibidores de crescimento, os quais especificamente se direcionam para um antigénio de interesse, pode ser efetuado rastreio para compostos que inibam o crescimento de células cancerígenas que sobre-expressam um antigénio de interesse derivado de animais transgénicos, e a análise descrita na Patente US N° 5677171 pode ser executada. De acordo com está análise, células cancerígenas que sobre-expressam o antigénio de interesse são cultivadas numa mistura 1:1 de meio F12 e DMEM suplementado com 10 % de soro bovino, glutamina e penicilina estreptomicina. As células são laminadas a 20.000 células num placa de cultura de célula de 35 mm (placa 2 ml/35 mm) e o composto de teste é adicionado em várias concentrações. Após seis dias, o número de células, comparado com células não tratadas, é contado usando um contador de célula COULTER™ eletrónico. Os compostos que inibem o crescimento de célula em cerca de 20-100 % ou cerca de 50-100 % podem ser selecionados como compostos inibidores de crescimento.
Para selecionar compostos que induzam morte celular, perda de integridade de membrana conforme indicado por, por exemplo, PI, absorção de azul tripano ou 7AAD pode ser avaliada em relação ao controlo. A análise de absorção de PI usa células isoladas do tecido de tumor de interesse de um animal transgénico. De acordo com esta análise, as células são cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado com 10 % de FBS desativado por calor (Hyclone) e 2 mM de L-glutamina. Dessa maneira, a análise é executada na ausência de complemente e células de efetor imunes. As células são semeadas numa densidade de 3 x 106 por placa em placas de 100 x 20 mm e deixadas anexar durante a noite. O meio é, então, removido e substituído com meio fresco sozinho ou meio contendo as várias concentrações do composto. As células são incubadas durante um período de 3 dias. Após cada tratamento, monocamadas são lavadas com PBS e separadas por tripsinização. Células são, então, centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 °C, a conta suspensa novamente em 3 ml de tampão de ligação frio Ca2+ (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) e divididos em tubos de 12 x 75 mm tapados de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupos de tratamento) para remoção de aglomerados de célula. Os tubos, então, recebem PI (10 yg/ml). Amostras podem ser analisadas usando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e software CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson). Aqueles compostos que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular conforme determinado por absorção de PI podem ser selecionados como compostos indutores de morte celular.
Para selecionar compostos que induzam apoptose, é executada uma análise de ligação de anexina usando células estabelecidas de tecido de tumor de interesse do animal transgénico. As células são cultivadas e semeadas em placas conforme discutido no parágrafo anterior. O meio é, então, removido e substituído com meio fresco sozinho ou meio contendo 10 pg/ml do conjugado de anticorpo-fármaco (ADC). Após um período de incubação de três dias, monocamadas são lavadas com PBS e separadas por tripsinização. Células são, então, centrifugadas, suspensas novamente em tampão de ligação Ca2+ e divididas em tubos conforme discutido acima para a análise de morte celular. Tubos, então, recebem anexina marcada (por exemplo, anexina V-FITC) (1 pg/ml).
Amostras podem ser analisadas usando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e software FACSCONVERT™ CelIQuest (Becton Dickinson). Os compostos que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina em relação ao controlo são selecionados como compostos indutores de apoptose.
4.5.3_ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO
De forma geral, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) é medida por: exposição de células de mamífero, que possuem proteínas do recetor para o anticorpo do ADC, num meio de cultura de célula; cultivo das células durante um período de cerca de 6 horas a cerca de 5 dias; e medida da viabilidade da célula. Os ensaios in vitro à base de células foram usados para medir a viabilidade (proliferação), citotoxicidade, e indução de apoptose (ativação de caspase) do ADC da invenção. A potência in vitro de conjugados de anticorpo-fármaco foi medida por um ensaio de proliferação celular (Exemplo 19, Figuras 7-10) . O Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo® está comercialmente disponível (Promega Corp., Madison, Wl) , método de análise homogénea com base na expressão recombinante de luciferase de Coleoptera (Patente US N° 5583024; 5674713 e 5700670) . Este ensaio de proliferação celular determina o número de células viáveis na cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et ai. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, Patente US N° 6602677). O Ensaio de CellTiter-Glo® foi conduzido no formato de 96 poços, tornando-a recetível paro rastreio automatizada de alto resultado (HTS) (Cree et ai. (1995) Anti Cancer Drugs 6:398-404). O procedimento de análise homogénea envolve a adição do reagente único (Reagente Celltiter-Glo®) diretamente nas células cultivadas no meio suplementado com soro. As etapas de lavagem de célula, remoção do meio e pipetagens múltiplas não são requeridas. 0 sistema deteta uma quantidade tão pequena quanto 15 células/poço num formato de 384 poços em 10 minutos após adição de reagente e mistura. As células podem ser tratadas continuamente com ADC, ou podem ser tratadas e separadas de ADC. De forma geral, células tratadas brevemente, isto é, 3 horas, mostraram os mesmos efeitos de potência que as células tratadas de forma continua. O formato "adição-mistura-medição" homogéneo resulta em lise celular e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade de ATP é diretamente proporcional ao número de células presentes na cultura. O Ensaio CellTiter-Glo® gera um sinal luminescente "tipo brilho", produzido pela reação de luciferase, que possui uma semivida geralmente maior que cinco horas, dependendo do tipo de célula e meio usados. Células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativas (ULR). O substrato, Beetle Luciferin, é oxidativamente descarboxilado por luciferase de vaga-lume com conversão concomitante de ATP para AMP e geração de fotões. A semivida estendida elimina a necessidade de usar injetores de reagente e proporciona flexibilidade para processamento de modo continuo ou de lote de múltiplas lâminas. Este ensaio de proliferação celular pode ser usado com vários formatos de poços múltiplos, por exemplo, formato de 96 ou 384 poços. Dados podem ser registados pelo luminómetro ou dispositivo de imagem de câmara CCD. A saída de luminescência é apresentada como unidades relativas de luz (ULR), medidas com o decorrer do tempo.
Os efeitos anti-proliferativos de conjugados de anticorpo-fármaco foram medidos pela proliferação celular, análise de morte celular in vitro acima contra quatro linhas celulares de tumor de mama diferentes (Figuras 7-10). Valores de IC50 foram estabelecidos para SK-BR-3 e BT-474 que são conhecidos por sobre-expressar a proteína do recetor HER2. O quadro 2b mostra as medições de potência (IC50) de conjugados de anticorpo-fármaco exemplares no ensaio de proliferação celular contra células BT-474.
Conjugados de anticorpo-fármaco: Trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAF, 3,8 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC- vc-PAB-MMAE, 4,1 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab; e Trastuzumab- MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab não inibiram a proliferação de células MCF-7 (Figura 9).
Conjugados de anticorpo-fármaco: Trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAE, 4,1 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab; e Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab não inibiram a proliferação de células MDA-MB-468 (Figura 10). Células MCF-7 e MDA-MB-468 não sobre-expressam a proteína de recetor HER2. Os conjugados de anticorpo-fármaco anti-HER2 descritos no presente documento, portanto, mostram seletividade para inibição de células que expressam HER2.
Numa descoberta surpreendente e inesperada, os resultados de atividade de proliferação celular in vitro do ADC nos Quadros 2a e 2b mostram, de forma geral, que ADC com um número médio baixo de frações de fármaco por anticorpo mostrou eficácia, por exemplo, IC50 < 0,1 yg ADC/ml. Os resultados sugerem que pelo menos para ADC trastuzumab, a proporção ideal de frações de fármaco por anticorpo pode ser menor que 8, e pode ser de cerca de 2 a cerca de 5.
4.5.4_DEPURAÇÃO E ESTABILIDADE PLASMÁTICA IN VIVO
Depuração e estabilidade plasmática farmacocinética de ADC foram investigadas em ratos e macacos cynomolgus. A concentração plasmática foi medida com periodicamente. O quadro 2c mostra dados de farmacocinética de conjugados de anticorpo-fármaco e outras amostras dosadas em ratos. Ratos são um modelo não específico para anticorpo de recetor ErbB, visto que não se tem conhecimento de que o rato expresse proteínas do recetor HER2
Quadro 2c Farmacocinética em ratos
Dose de 2 mg/kg exceto onde mencionado de outro modo. AUCinf é a área sob a curva de concentração plasmática-tempo do momento da dosagem até o infinito e é uma medida da exposição total à entidade medida (fármaco, ADC) . CL é definida como o volume de plasma depurado da entidade medida em unidade de tempo e é expressa pela normalização ao peso corporal. 0 termo Th é a semivida do fármaco no corpo medida durante sua fase de eliminação. 0 termo % de
Conj. é a quantidade relativa de ADC comparada com anticorpo total detetado por testes separados de imunoafinidade ELISA ("Analytical Methods for Biotechnology Products", Ferraiolo et al. , páginas 85-98 no
Pharmacokinetics of Drugs (1994) P.G. Welling e L.P. Balant, Eds., Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 110, Springer-Verlag. O cálculo da % de Conj. é simplesmente AUCinf de ADC + AUCinf total de Ab, e é urn indicador geral de estabilidade do ligante, embora outros fatores e mecanismos possam estar presentes. A Figura 11 mostra um gráfico de um estudo de depuração de concentração plasmática após administração dos conjugados de anticorpo- fármaco: H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG e H-MC-vc-PAB-MMAF a ratos Sprague-Dawley. Concentrações totais de anticorpo e ADC foram medidas ao longo do tempo.
A Figura 12 mostra um gráfico de um estudo de duas fases de depuração de concentração plasmática onde ADC foi administrado em dosagens diferentes e as concentrações de anticorpo e ADC totais foram medidas ao longo do tempo. EFICÁCIA IN VIVO A eficácia in vivo do ADC da invenção foi medida por um modelo de ratinho de explante transgénico com alta expressão de HER2. Um aloenxerto foi propagado do ratinho transgénico Fo5 mmtv que não responde, ou responde muito pouco, a terapêutica com HERCEPTIN®. Os indivíduos foram tratados uma vez com ADC e monitorizados durante 3-6 semanas para medir o tempo para o tumor dobrar, registo de morte celular, e diminuição do tumor. Acompanhamento resposta-dose e experiências de doses múltiplas foram conduzidos. O tumor aparece prontamente em ratinhos transgénicos que expressam uma forma ativada por mutação de neu, um homólogo de rato para HER2, mas o HER2 que é sobre-expresso nos cancros de mama não sofre mutação e a formação do tumor é muito menos robusta em ratinhos transgénicos que sobre- expressam HER2 sem mutação (Webster et ai. (1994) Semin. Cancer Biol. 5:69-76).
Para melhorar a formação tumoral com HER2 sem mutação, foram produzidos ratinhos transgénicos usando plasmideo ADNc HER2 nos quais uma ATG a montante foi deletada de modo a impedir o inicio de tradução nestes codões ATG a montante, que, caso contrário, reduziriam a frequência de inicio de tradução do codão de inicio autêntico a jusante de HER2 (por exemplo, veja-se Child et ai. (1999) J. Biol. Chem. 274:24335-24341). Adicionalmente, um intrão quimérico foi adicionado à extremidade 5', que deveria, também, aumentar o nível de expressão conforme relatado anteriormente (Neuberger e Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16:6713; Buchman e Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395; Brinster et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836) . 0 intrão quimérico foi derivado de um vetor
Promega, vetor de expressão de pCI-neo de mamífero (bp 890-1022) . A extremidade 3' de ADNc é flanqueada por exões de crescimento humano 4 e 5, e sequências de poliadenilação. Além do mais, ratinhos FVB foram usados, porque esta estirpe é mais suscetível a desenvolvimento tumoral. O promotor de MMTV-LTR foi usado para garantir expressão de HER2 específica de tecido na glândula mamária. Os animais foram alimentados com a dieta AIN 76A de modo a aumentar a suscetibilidade à formação de tumores (Rao et ai. (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158).
Quadro 2d Medições tumorais em modelo de ratinho com aloenxerto - tumor mamário MMTV-HER2 Fo5, ratinho nu atimico
0 termo Ti é ο número de animais no grupo de estudo com tumor em T = 0 1 total de animais no grupo. 0 termo PR é o número de animais que obtiveram remissão parcial do tumor 1 animais com tumor em T = 0 no grupo. 0 termo CR é o número de animais que obtiveram remissão completa do tumor 1 animais com tumor em T = 0 no grupo. 0 termo registo de mortalidade celular é o tempo em dias para o volume do tumor dobrar - o tempo em dias para o volume do tumor de controlo dobrar dividido por 3,32 x tempo para o volume do tumor dobrar nos animais de controlo (dosados com Veiculo). 0 cálculo de registo de mortalidade da célula considera o atraso de crescimento do tumor resultante de tratamento e o tempo para duplicação de volume do tumor do grupo de controlo. Atividade anti-tumoral de ADC é classificada com valores de destruição celular em Log de: + + + + á 3,4 (altamente ativo) +++ = 2,5-3,4 ++ = 1,7-2,4 + = 1,0-1,6 inativo = 0 A Figura 13 mostra a alteração média no volume do tumor durante um período de tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor mamário MMTV-HER2 dosados no Dia 0 com: Veiculo, Trastuzumab- MC-vc-PAB-MMAE (1250 yg/m2) e
Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (555 yg/m2) . (H = Trastuzumab) . O crescimento de tumores foi retardado pelo tratamento com ADC se comparado com o nível de crescimento do controlo (Veículo). A Figura 14 mostra a alteração média de volume tumoral durante um período de tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor mamário MMTV-HER2 Fo5 dosados no Dia 0 com 10 mg/kg (660 yg/m2) de Trastuzumab-MC-MMAE e 1250 yg/m2 de Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE. A Figura 15 mostra a alteração média no volume do tumor durante um período de tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor mamário MMTV-HER2 Fo5 dosados com 650 yg/m2 de Trastuzumab-MC-MMAF. O quadro 2d e Figuras 13-15 mostram que o ADC possui potente atividade anti-tumoral no aloenxerto de um tumor positivo para HER2 (Fo5) que originalmente surgir no ratinho transgénico MMTV-HER2. O anticorpo sozinho (por exemplo, Trastuzumab) não possui atividade anti-tumoral significativa neste modelo (Erickson et al. Patente US N° 6632979) . Conforme ilustrado nas Figuras 13-15, o crescimento dos tumores foi retardado pelo tratamento com ADC se comparado com o nível do controlo (Veículo) de crescimento.
Numa descoberta surpreendente e inesperada, os resultados da atividade anti-tumoral in vivo do ADC no quadro 2d mostram, de forma geral, que ADC com um número médio baixo de frações de fármaco por anticorpo mostrou eficácia, por exemplo, tempo de duplicação do tumor > 15 dias e registo médio de mortalidade celular > 1,0. A Figura 16 mostra que para o conjugado de anticorpo-fármaco, trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, o volume médio do tumor diminuiu e não progrediu onde a proporção de MMAF:trastuzumab era de 2 e 4, enquanto o tumor progrediu numa taxa de 5,9 e 6, mas numa taxa mais lenta que no Veiculo (tampão) . A taxa de progressão do tumor neste modelo de xenoenxerto de ratinho foi aproximadamente igual, isto é, 3 dias, para Veiculo e trastuzumab. Os resultados sugerem que pelo menos para trastuzumab ADC, a proporção ideal de frações de fármaco por anticorpo pode ser menor que cerca de 8, e pode ser de cerca de 2 a cerca de 4.
4.5.5 TOXIDADE EM ROEDOR
Conjugados de anticorpo-fármaco e controlo menos ADC, "Veiculo", foram avaliados num modelo de rato para toxicidade aguda. A toxicidade de ADC foi investigada por tratamento de ratos Sprague-Dawley macho e fêmea com o ADC e inspeção subsequente e análise dos efeitos em vários órgãos. Observações gerais incluíram alterações nos pesos corporais e sinais de lesões e sangramento. Parâmetros de patologia clínica (soro, química e hematologia) , histopatologia, e necropsia foram conduzidos nos animais dosados.
Considera-se que a perda de peso, ou alteração no peso relativa a animais dosados apenas com Veículo, em animais após dosagem com ADC é um indicador bruto e geral de toxicidade sistémica ou localizada. As Figuras 17-19 mostram os efeitos de vários ADC e controlo (Veiculo) após dosagem no peso corporal de ratos. A hepatotoxicidade foi medida por enzimas hepáticas elevadas, números aumentados de figuras mitóticas e apoptóticas e necrose de hepatócitos. A toxicidade hematolinfoide foi observa pela depleção de leucócitos, primariamente granulócitos (neutrófilos) e/ou plaquetas, e envolvimento de órgão linfoide, isto é, atrofia ou atividade apoptótica. A toxicidade foi também observada por lesões no trato gastrintestinal tais como números aumentados de figuras mitóticas e apoptóticas e enterocolite degenerativa.
Enzimas indicativas de danos hepáticos que foram estudadas incluem: AST (aspartato aminotransferase) - Localização: citoplasmática; fígado, coração, musculoesquelética, rins - Fígado: proporção plasmática 7000:1 - T^: 17 horas ALT (alanina aminotransferase) - Localização: citoplasmática; fígado, rins, coração, musculoesquelética - Fígado: proporção plasmática 3000:1 - T^: 42 horas, variação diurna GGT (g-glutamil transferase) - Localização: membrana plasmática de células com alta capacidade secretória ou de absorção; fígado, rim, intestino - Prognóstico inadequado para danos hepáticos; comummente elevado em distúrbios do duto biliar.
Os perfis de toxicidade de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF e trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF foram estudados em ratos Sprague-Dawley fêmeas (Exemplo 19). O anticorpo trastuzumab humanizado não se liga de forma apreciável a tecido de rato, e qualquer toxicidade seria considerada não específica. Variantes nos níveis da dose de 840 e 2105 ug/m2 de MMAF foram comparados com trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF a 2105 ug/m2.
Os animais nos grupos 1, 2, 3, 4, 6 e 7 (Veículo, 9,94 & 24,90 mg/kg de Trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, 10,69 mg/kg de trastuzumab- MC (Me)-val-cit-PAB-MMAF, e 10,17 & 25,50 mg/kg de trastuzumab-MC-MMAF, respetivamente) ganharam peso durante o estudo. Os animais nos grupos 5 e 8 (26,78 mg/kg de trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF e 21,85 mg/kg de trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF, respetivamente) perderam peso durante o estudo. No Dia 5 do Estudo, a alteração nos pesos corporais de animais nos grupos 2, 6 e 7 não foi significativamente diferente dos animais do grupo 1. A alteração nos pesos corporais de animais nos grupos 3, 4, 5 e 8 foi estatisticamente diferente dos animais do grupo 1 (Exemplo 19).
Ratos tratados com trastuzumab-MC-MMAF (grupos 6 e 7) não foram distinguíveis dos animais de controlo tratados com veículo em ambos os níveis de dosagem; isto é, este conjugado mostrou um perfil de segurança superior neste modelo. Os ratos tratados com trastuzumab-MC-val-cit-MMAF (sem a fração PAB auto-sacrifical; grupos 2 e 3) mostraram alterações dependentes da dosagem típica para conjugados MMAF; a extensão das alterações foi menor se comparada com um conjugado de comprimento total MC-val-cit-PAB-MMAF (grupo 8) . As contagens de plaquetas no dia 5 estavam a cerca de 30 % dos valores basais em animais do grupo 3 (alta dose de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF) comparado com 15 % nos animais do grupo 8 (alta dose de trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF). A elevação das enzimas hepáticas AST e ALT, de bilirrubina e a extensão de trombocitopenia foi mais evidente em animais tratados com trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF (grupos 4 e 5) de uma maneira dependente da dose; animais do grupo 5 (grupo de alta dosagem) mostrou, no dia 5, níveis de ALT de cerca de ΙΟχ o valor basal e as plaquetas estavam reduzidas em cerca de 90 % no momento da necropsia.
Ratos Sprague-Dawley fêmeas foram também dosados com altos níveis (Exemplo 19, Estudo de Alta Dosagem: Grupos 2, 3, 4) com trastuzumab-MC-MMAF, e Veículo de controlo (Grupo 1) . Sinais leves de toxicidade foram observados, incluindo uma elevação dependente da dosagem das enzimas hepáticas ALT, AST e GGT. No dia 5 os animais no grupo de dosagem mais elevada mostraram uma elevação de 2 vezes na ALT e uma elevação de 5 vezes na AST; GGT também está elevada (6U/L). Os níveis enzimáticos mostraram uma tendência para normalização no dia 12. Havia uma granulocitose em todos os três grupos de dosagem no dia 5, a contagem de plaquetas permaneceu essencialmente inalterada em todos os animais. Alterações morfológicas eram leves; os animais tratados no nível de dose de 4210 yg/m2 (Grupo 2) mostram histologia não relevante do fígado, baço, timo, intestinos e medula óssea. Atividade apoptótica e mitótica levemente aumentada foi observada no timo e fígado, respetivamente nos animais tratados no nível de dose de 5500 yg/m2 (Grupo 3). A medula óssea estava normocelular, mas mostrava evidência de hiperplasia granulocítica, que é consistente com a granulocitose absoluta observada nas contagens sanguíneas periféricas nestes animais. Animais na dose mais elevada no grupo 4 mostram qualitativamente as mesmas características; a atividade mitótica no fígado parece um pouco aumentada se comparada com animais no Grupo 3. Também, hematopoiese foi observada no baço e fígado.
EphB2R é um tipo de recetor de tirosina cinase 1 TM com homologia próxima entre ratinho e ser humano, e é sobre-expressa em células cancerígenas colorretal. 2H9 é um anticorpo contra EphB2R. O anticorpo nu não possui efeito no crescimento do tumor, mas 2H9-val-cit-MMAE mataram células que expressam EphB2R e mostraram eficácia num modelo de xenoenxerto usando tumores de cólon humano CXF1103 (Mao et al. (2004) Cancer Res. 64:781-788) . 2H9 e 7C2 são ambos anticorpos de ratinho IgGl anti-HER2. Os perfis de toxicidade de 2H9-MC-val-cit-PAB-MMAF (3,7 MMAF/Ab), 7C2-MC-val-cit-PAB-MMAF (4 MMAF/Ab), e trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF (5, 9 MMAF/Ab) foram comparados. As diferenças na estrutura de cada imunoconjugado ou fração de fármaco do imunoconjugado podem afetar a farmacocinética e em último caso, o perfil de segurança. 0 anticorpo trastuzumab humanizado não se liga de forma apreciável a tecido de rato, e qualquer toxicidade seria considerada não específica.
TOXIDADE/SEGURANÇA EM MACACO CYNOMOLGUS
Semelhante ao estudo de toxicidade/segurança com ratos, macacos cynomolgus foram tratadas com ADC seguido por medições de enzima hepática e inspeção e análise dos efeitos em vários órgãos. Observações gerais incluíram alterações nos pesos corporais e sinais de lesões e sangramento. Parâmetros de patologia clínica (química sérica e hematologia), histopatologia, e necropsia foram conduzidos em animais dosados (Exemplo 19). 0 conjugado de anticorpo-fármaco, H-MC-vc-PAB-MAAE (H = trastuzumab ligado através de cisteína) não mostraram evidência de toxicidade hepática em qualquer nível de dosagem testado. Granulócitos sanguíneos periféricos mostraram depleção após uma dose única de 1100 mg/m2 com recuperação completa 14 dias após a dose. O conjugado de anticorpo- fármaco H-MC-vc-PAB-MMAF mostrou elevação de enzimas hepáticas no nível de dosagem de 550 (transiente) e 880 mg/m2, nenhuma evidência de granulocitopenia, e um declínio transiente, dependente da dose (grupos 2 & 3) de plaquetas.
4.6 SÍNTESE DOS COMPOSTOS
Os Compostos Exemplares e Conjugados Exemplares podem ser feitos usando os procedimentos sintéticos descritos a seguir nos Esquemas 5-16. Conforme descrito em maior pormenor a seguir, os Compostos Exemplares ou Conjugados Exemplares podem ser convenientemente preparados usando um Ligante que tem um local reativo para ligação ao Fármaco e Ligando. Num exemplo, um Ligante tem um local reativo que tem um grupo eletrofílico que é reativo a um grupo nucleofílico presente num Ligando, tal como, mas não limitado a um anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis num anticorpo incluem, mas não se limitam a grupos sulfidrilo, hidroxilo e amino. 0 heteroátomo do grupo nucleofilico de um anticorpo é reativo a um grupo eletrofilico de um Ligante e forma uma ligação covalente com uma unidade de Ligante. Grupos eletrofilicos úteis incluem, mas não se limitam a grupos maleimida e haloacetamida. 0 grupo eletrofilico proporciona um local conveniente para união do anticorpo.
Num outro exemplo, um Ligante possui um local reativo que tem um grupo nucleofilico que é reativo a um grupo eletrofilico presente num anticorpo. Grupos eletrofilicos úteis num anticorpo incluem, mas não se limitam a grupos aldeído e cetona carbonilo. 0 heteroátomo de um grupo nucleofilico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofilico num anticorpo e formar uma ligação covalente para uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofilicos úteis num Ligante incluem, mas não se limitam a hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, hidrazina carboxilato, e arilidrazida. 0 grupo eletrofilico num anticorpo proporciona um local conveniente para união a um Ligante.
Grupos funcionais de ácido carboxílico e grupos funcionais de cloroformato são também locais reativos úteis para um Ligante porque podem reagir com grupos amino secundários de um Fármaco para formar uma ligação de amida. Também útil como um local reativo é um grupo funcional carbonato num Ligante, tal como, mas não limitado a carbonato de p-nitrof enilo, que pode reagir com um grupo amino de um Fármaco, tal como, mas não limitado a N-metil valina, para formar uma ligação de carbamato. Tipicamente, Fármacos à base de péptido podem ser preparados pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de péptido. Estas ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (veja-se E. Schrõder e K. Lubke, "The Peptides", volume 1, páginas 76-136, 1965,
Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de péptido. A síntese de um Estirador que tem um grupo maleimida eletrofílico é ilustrada a seguir nos Esquemas 8-9. Métodos sintéticos gerais úteis para a síntese de um Ligante são descritos no Esquema 10. O Esquema 11 mostra a construção de uma unidade de Ligante que tem um grupo val-cit, um grupo maleimida eletrofílico e um grupo Espaçador auto-sacrifical. O esquema 12 ilustra a síntese de um Ligante que tem o grupo phe-lys, um grupo maleimida eletrofílico, com e sem o grupo Espaçador auto-sacrifical PAB. O Esquema 13 apresenta uma descrição geral para a síntese de um Composto de Fármaco-Ligante, enquanto o Esquema 14 apresenta uma via alternativo para preparar um Composto de Fármaco-Ligante. O Esquema 15 ilustra a síntese de um ligante ramificado que contém um grupo BHMS. O Esquema 16 descreve a união de um anticorpo a um Composto de Fármaco-Ligante para formar um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo, e o Esquema 14 ilustra a síntese de conjugados Fármaco-Ligante-Ant icorpo que tem, por exemplo, mas não limitado a 2 ou 4 fármacos por Anticorpo.
Conforme descrito em maior pormenor a seguir, os Conjugados Exemplares são convenientemente preparados usando um Ligante que tem dois ou mais Locais Reativos para ligação ao Fármaco e um Ligando. Num exemplo, um Ligante tem um local Reativo que possui um grupo eletrofílico que é reativo a um grupo nucleofílico presente num Ligando, tal como um anticorpo. Grupos nucleofilicos úteis num anticorpo incluem, mas não se limitam a grupos sulfidrilo, hidroxilo e amino. O heteroátomo do grupo nucleofílico de um anticorpo é reativo a um grupo eletrofílico num Ligante e forma uma ligação covalente com uma unidade de Ligante. Grupos eletrofilicos úteis incluem, mas não se limitam a grupos maleimida e haloacetamida. O grupo eletrofílico proporciona um local conveniente para união do anticorpo.
Num outro exemplo, um Ligante tem um local Reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo a um grupo eletrofílico presente num Ligando, tal como um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis num anticorpo incluem, mas não se limitam a grupos aldeído e cetona carbonilo. 0 heteroátomo de um grupo nucleofílico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofílico num anticorpo e formar uma ligação covalente com uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofilicos úteis num Ligante incluem, mas não se limitam a hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, hidrazida carboxilato, e arilidrazida. 0 grupo eletrofílico num anticorpo proporciona um local conveniente para união a um Ligante.
4.6.1 SÍNTESE DA FRAÇÃO DE FÁRMACO
Tipicamente, Fármacos baseados em péptidos podem ser preparados pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de péptido. Estas ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (veja-se e. Schroder e K. Lubke, "The Peptides", volume 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de péptido.
As frações de fármaco auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos gerais de: Patente US N° 5635483; Patente US N° 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-
Cancer Drug Design 13:243-277; e Pettit et al. (1996) J.
Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863.
Num exemplo, um Fármaco é preparado pela combinação de um equipamento aproximadamente estequiométrico de um dipéptido e um tripéptido, preferivelmente numa reação de um pote sob condições de condensação adequadas. Esta abordagem é ilustrada nos Esquemas 5-7, a seguir. O Esquema 5 ilustra a síntese de uma unidade F de tripéptido N-terminal que é um intermediário útil para a síntese dos compostos de fármaco de Fórmula Ib.
Conforme ilustrado no Esquema 5, um aminoácido protegido A (onde GP representa um grupo protetor de amina, R4 é selecionado a partir de hidrogénio, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, alquil-arilo, alquilo-(carbociclo C3- C8) , heterociclo C3-C8, alquilo- (heterociclo C3-C8) , onde R5 é selecionado a partir de H e metilo; ou R4 e R5, conjuntamente, têm a fórmula -(CRaRb)n-onde Ra e Rb são, independentemente, selecionados a partir de hidrogénio, alquilo Ci-C8 e carbociclo C3-C8 e n é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6; e forma um anel com o átomo de carbono ao qual eles são unidos) é acoplado a éster t-butílico B (onde R6 é selecionado a partir de -H e alquilo -Ci-C8; e R7 é selecionado a partir de hidrogénio, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -arilo, alquil-arilo, alquilo-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo-(heterociclo C3-C8) , sob condições de acoplamento adequadas, por exemplo, na presença de PyBrop e diisopropiletilamina, ou usando DCC (veja-se, por exemplo, Miyazaki, K. et al. Chem. Pharm. Buli. 1995, 43(10), 1706- 1718) .
Grupos protetores GP adequados, e métodos sintéticos adequados para proteger um grupo amino com um grupo protetor são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Greene, T.W. e Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2a. Edição, 1991, John Wiley & Sons. Aminoácidos protegidos exemplares A são GP-lle e, especificamente, GP-Val, enquanto outros aminoácidos protegidos adequados incluem sem limitação: GP- cicloexilglicina, GP- cicloexilalanina, ácido GP-aminociclopropano-1- carboxilico, ácido GP- aminoisobutírico, GP-fenilalanina, GP-fenilglicina, e GP-terc-butilglicina. Z é um grupo protetor exemplar. Fmoc é um outro grupo protetor exemplar. Um éster t-butílico B exemplar é éster t-butílico dolaisoleucina. 0 dipeptideo C pode ser purificado, por exemplo, usando cromatografia, e subsequentemente desprotegido, por exemplo, usando H2 e 10 % de Pd-C em etanol quando GP é benziloxicarbonilo, ou usando dietilamina para remoção de um grupo protetor Fmoc. A amina D resultante prontamente forma uma ligação peptidica com um aminoácido BB (onde R1 é selecionado a partir de -H, alquilo - Ci-C8, e carbociclo -C3-C8; e R2 é selecionado a partir de -H e alquilo -Ci-C8; ou R1 e R2, conjuntamente, têm a fórmula -(CRaRb)n- onde Ra e Rb são, independentemente, selecionados a partir de -H, alquilo -Ci-C8 e carbociclo -C3-C8 e n é selecionado a partir de 2, 3,4, 5 e 6; e forma um anel com o átomo de nitrogénio ao qual eles são unidos; e R3 é selecionado a partir de hidrogénio, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -arilo, alquil-arilo, alquilo-(carbociclo C3—C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo- (heterociclo C3- C8) ) . N,N-Dialquil aminoácidos são aminoácidos exemplares para BB, tal como o comercialmente disponível, N,N-dimetil valina. Outros N,N-dialquil aminoácidos podem ser preparados por bis-alquilação redutiva usando procedimentos conhecidos (veja-se, por exemplo, Bowman, R.E., Stroud, Η.H. J. Chem. Soc., 1950, 1342-1340). Fmoc-Me-L-Val e Fmoc-Me-L-glicina são dois aminoácidos exemplares BB úteis para a síntese de derivados de JV-monoalquilo. A amina D e o aminoácido BB reagem para proporcionar o tripéptido E usando reagente de acoplamento DEPC com trietilamina como a base. O grupo protetor de terminal C de E é subsequentemente desprotegido usando HC1 para proporcionar o composto de tripéptido de fórmula F.
Metodologia ilustrativa de acoplamento de DEPC e a metodologia de acoplamento de PyBrop mostrada no Esquema 5 são descritas a seguir no Procedimento Geral A e Procedimento Geral B, respetivamente. Metodologia ilustrativa para a desproteção de uma amina protegida Z através de hidrogenação catalítica é descrita a seguir no Procedimento Geral C.
Procedimento Geral A: Sintese de péptido usando DEPC. O aminoácido iV-protegido ou N, N-bissubstituido ou péptido D (1,0 eq.) e uma amina BB (1,1 eq.) são diluídos com um solvente orgânico aprótico, tal como diclorometano (0,1 a 0,5 M). Uma base orgânica tal como trietilamina ou diisopropiletilamina (1,5 eq.) é, então, adicionada, seguido por DEPC (1,1 eq.). A solução resultante é agitada, preferivelmente sob árgon, durante até 12 horas enquanto é monitorizada por HPLC ou TLC. O solvente é removido a vácuo à temperatura ambiente, e o produto bruto é purificado usando, por exemplo, HPLC ou cromatografia de coluna de fulgor (coluna de sílica gel). Frações relevantes são combinadas e concentradas á vácuo para suportar tripéptido E que é seco sob vácuo durante a noite.
Procedimento Geral B: Síntese de péptido usando PyBrop. O aminoácido B (1,0 eq.), opcionalmente que tem um grupo protetor carboxilo, é diluído com um solvente orgânico aprótico tal como diclorometano ou DME para proporcionar uma solução com uma concentração entre 0,5 e 1,0 mM, e então é adicionada diisopropiletilamina (1,5 eq.) . Aminoácido A protegido por Fmoc- ou Z- (1,1 eq.) é adicionado como um sólido numa fração, então é adicionado PyBrop (1,2 eq.) à mistura resultante. A reação é monitorizada por TLC ou HPLC, seguido por um procedimento de preparação semelhante àquele descrito no Procedimento Geral A.
Procedimento Geral C: Remoção de Z através de hidrogenação catalítica. Aminoácido protegido por Z ou péptido C é diluído com etanol para proporcionar uma solução com uma concentração entre 0,5 e 1,0 mM num recipiente adequado, tal como um balão de fundo redondo de paredes espessas. Adiciona-se 10 % de paládio em carbono (5-10 % p/p) e a mistura de reação é colocada sob atmosfera de hidrogénio. O progresso da reação é monitorizado usando HPLC e está completa, geralmente, dentro de 1-2 horas. A mistura de reação é filtrada através de uma almofada de celite pré-lavada e a celite é novamente lavada com um solvente orgânico polar, tal como metanol após a filtração. A solução de eluente é concentrada a vácuo para suportar um resíduo que seja diluído com um solvente orgânico, preferivelmente tolueno. O solvente orgânico é, então, removido a vácuo para suportar a amina desprotegida C. O esquema 6 mostra um método útil para preparar um dipéptido de terminal C de fórmula K e um método para acoplamento do dipéptido de fórmula K com o tripéptido de fórmula F para preparar compostos de fármaco de Fórmula Ib.
0 dipéptido Κ pode ser prontamente preparado pela condensação do aminoácido modificado Boc-dolaproína G (veja-se, por exemplo, Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725), com uma amina de fórmula H usando agentes de condensação bem conhecidos para química de péptido, tal como, por exemplo, DEPC na presença de trietilamina, conforme mostrado no Esquema 5. 0 dipéptido de fórmula K pode, então, ser acoplado com um tripéptido de fórmula F usando o Procedimento Geral D para preparar os compostos de fármaco protegidos Fmoc de fórmula L, que podem ser subsequentemente desprotegidos usando o Procedimento Geral E de modo a proporcionar os compostos de fármaco de fórmula (Ib).
Procedimento Geral D: Sintese de fármaco. Uma mistura de dipéptido K (1,0 eq.) e tripéptido F (1 eq.) é diluída com um solvente orgânico aprótico, tal como diclorometano, para formar uma solução de 0,1 M; então um ácido forte, tal como ácido trifluoroacético (1/2 p/p) é adicionado e a mistura resultante é agitada sob atmosfera de nitrogénio durante duas horas a 0 °C. A reação pode ser monitorizada usando TLC ou, preferivelmente, HPLC. O solvente é removido a vácuo e o resíduo resultante é azeotropicamente seco duas vezes, preferivelmente usando tolueno. O resíduo resultante é seco sob alto vácuo durante 12 horas e então diluído com um solvente orgânico aprótico, tal como diclorometano. Uma base orgânica tal como trietilamina ou diisopropiletilamina (1,5 eq.) é, então, adicionada, seguida tanto por PyBrop (1,2 eq.) quanto por DEPC (1,2 eq.) dependendo da funcionalidade química no resíduo. A mistura de reação é monitorizada tanto por TLC quanto HPLC e ao término, a reação é submetida a um procedimento de preparação semelhante ou idêntico àquele descrito no Procedimento Geral A.
Procedimento Geral E: Remoção de Fmoc usando dietilamina. Um Fármaco protegido por Fmoc L é diluído com um solvente orgânico aprótico tal como diclorometano e à solução resultante é adicionada dietilamina (1/2 p/p) . O progresso da reação é monitorizado por TLC ou HPLC e está tipicamente completa dentro de 2 horas. A mistura de reação é concentrada a vácuo e o resíduo resultante é seco azeotropicamente, preferivelmente usando tolueno, então é seco sob vácuo elevado para suportar o Fármaco lb que tem o grupo amino desprotegido. O Esquema 7 mostra um método útil para preparar derivados de MMAF de Fórmula (Ib).
0 polipéptido Ο pode ser prontamente preparado pela condensação do aminoácido modificado Boc-dolaproína G (veja-se, por exemplo, Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725), com uma amina de fórmula M usando agentes de condensação bem conhecidos para química de péptido, tal como, por exemplo, DEPC na presença de trietilamina, conforme mostrado nos Esquemas 5 e 6. 0 dipéptido de fórmula O pode, então, ser acoplado a um tripéptido de fórmula F usando o Procedimento Geral D para preparar os compostos MMAF protegidos com Fmoc de fórmula P, que podem ser subsequentemente desprotegidos usando o Procedimento Geral E de modo a proporcionar os compostos de fármaco MMAF de fórmula (Ib).
Dessa maneira, os métodos acima são úteis para preparar Fármacos conforme descrito no presente documento.
4.6.2 SÍNTESE DE LIGANTE DE FÁRMACO
Para preparar um Composto de Fármaco-Ligante, o Fármaco é feito reagir com um local reativo no Ligante. No geral, o Ligante pode ter a estrutura:
quando uma unidade de Espaçador (-Y-) e uma unidade de
Estirador (-A-) estão presentes. Alternativamente, o Ligante pode ter a estrutura:
quando a unidade de Espaçador (-Y-) está ausente. 0 Ligante pode também ter a estrutura:
quando a unidade de Estirador (-A-) e a unidade de
Espaçador (-Y-) estão ausentes. 0 Ligante pode ter também a estrutura:
quando a unidade de Aminoácido (W) e a unidade de Espaçador (Y) estão ausentes.
No geral, um Ligante adequado tem uma unidade de Aminoácido ligada a uma unidade de Estirador opcional e uma unidade de Espaçador opcional. 0 Local Reativo 1 está presente no terminal do Espaçador e o local Reativo 1 está presente no terminal do Estirador. Se uma unidade de Espaçador não estiver presente, então o local Reativo 1 está presente no terminal C da unidade de Aminoácido. Num exemplo da invenção, o Local Reativo N° 1 é reativo a um átomo de nitrogénio do Fármaco, e o Local Reativo N° 2 é reativo a um grupo sulfidrilo no Ligando. Locais Reativos 1 e 2 podem ser reativos a grupos funcionais diferentes.
Num exemplo, o Local Reativo N° 1 é
Num outro exemplo, o Local Reativo N° 1 é
Em ainda um outro exemplo, o Local Reativo N° 1 é um carbonato de p-nitrofenilo gue tem a fórmula
Num exemplo, o Local Reativo N° 2 é um grupo de aceitação de tiol. Grupos de aceitação de tiol adeguados incluem grupos haloacetamida gue tem a fórmula
em gue X representa um grupo abandonante, preferivelmente O-mesilo, O-tosilo, -Cl, -Br, ou -I, ou um grupo maleimida gue tem a fórmula
Ligantes úteis podem ser obtidos através de fontes comerciais, tal como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) , ou preparados conforme resumido nos Esguemas 8-10 a seguir.
em que X é -CH2- ou - CH2OCH2-; e n é um número inteiro de 0-10 quando X é - CH2-; ou 1-10 quando X é - CH2OCH2- 0 método mostrado no Esquema 9 combina maleimida com um glicol sob condições de Mitsunobu e faz um Estirador polietilenoglicol maleimida (veja-se, por exemplo, Walker, M.A. J. Org. Chem. 1995, 60, 5352-5), seguido por instalação de um grupo de Local Reativo carbonato de p-nitrofenilo.
em que E é -CH2- ou -CH2OCH2-; e n é um número inteiro de 0- 8;
Alternativamente, estiradores PEG-maleimida e PEG-haloacetamida podem ser preparados conforme descrito por Frisch, et al. , Bioconjugate Chem. 1996, 7, 180-186. O Esquema 10 ilustra uma síntese geral de uma unidade de Ligante ilustrativa contendo um grupo Estirador maleimida e opcionalmente um Espaçador auto-sacrifical p-aminobenzil éter.
em que Q é -alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4, e n é um número inteiro que varia de 0-10.
Estiradores úteis podem ser incorporados a um Ligante usando os intermediários comercialmente disponíveis da Molecular Biosciences (Boulder, CO) descritos a seguir, através da utilização de técnicas conhecidas de síntese orgânica. Estiradores de Fórmula (Ilia) podem ser introduzidos num Ligante através da reação dos intermediários a seguir com o terminal N de uma unidade de Aminoácido conforme ilustrados nos Esquemas 11 e 12.
em que n é um número inteiro que varia de 1-10 e T é -H ou -S03Na;
em que n é um número inteiro que varia de 0-3;
e
Unidades de Estirador de fórmula (Illb) podem ser introduzidas num Ligante pela reação dos intermediários a seguir com o terminal N de uma unidade de Aminoácido:
em que X é -Br ou -I; e
Unidades de Estirador de fórmula (IV) podem ser introduzidas num Ligante através da reação dos intermediários a seguir com o terminal N de uma unidade de Aminoácido: e
Unidades de Estirador de fórmula (Va) podem ser introduzidas num Ligante através da reação dos
intermediários a seguir com o terminal N de uma unidade de Aminoácido: e
Outros Estiradores úteis podem ser sintetizados de acordo com procedimentos conhecidos. Estiradores de Aminooxi da fórmula mostrada a seguir podem ser preparados através do tratamento de haletos de alquilo com N- Boc-hidroxilamina de acordo com os procedimentos descritos por Jones, D.S. et al., Tetrahedron Letters, 2000, 41(10), 1531-1533; e Gilon, C. et al., Tetrahedron, 1967, 23(11), 4441-4447.
em que R17 é selecionado a partir de -alquileno Ci-Ci0-, -carbociclo C3-C8-, -0-(alquilo Ci-C8)-, -arileno-, alquileno Ci-Cio-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C2-Ci0- (carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8) -alquileno Ci-Ci0-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno Ci-Ci0- (heterociclo C3-C8) -, -(heterociclo C3-C8)-alquileno Ci-Ci0-, - (CH2CH20) r-, e (CH2CH20) r-CH2-; e r é um inteiro que varia de 1-10; Estiradores de isotiocianato da fórmula mostrada a seguir podem ser preparados de cloretos de ácido isotiocianato carboxílico conforme descrito na Angew. Chem. 1975, 87(14) : 517 .
em que R17 é conforme descrito no presente documento. 0 Esquema 11 mostra um método para obter um ligante de dipéptido val-cit que tem um Estirador de maleimida e opcionalmente um Espaçador auto-sacrifical p-aminobenzila.
em que Q é -alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4.
0 Esquema 12 ilustra a síntese de uma unidade de Ligante de dipéptido phe-lys(Mtr) que tem uma unidade de Estirador maleimida e uma unidade de Espaçador auto-sacrifical p-aminobenzilo. Material de partida AD (lys(Mtr)) está comercialmente disponível (Bachem,
Torrance, CA) ou pode ser preparado de acordo com Dubowchik, et al. Tetrahedron Letters (1997) 38:5257-60.
em que Q é -alquilo Ci-C8, -O- (alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4.
Conforme mostrado no Esquema 13, um Ligante pode ser feito reagir com um grupo amino de um Composto de Fármaco de Fórmula (Ib) para formar um Composto de Fármaco-Ligante que contém um grupo amida ou carbamato, ligando a unidade de Fármaco com a unidade de Ligante. Quando o Local de Reação N° 1 é um grupo ácido carboxilico, como no Ligante AJ, a reação de acoplamento pode ser executada usando HATU ou PyBrop e uma base de amina apropriada, resultando num Composto de Fármaco-Ligante AK, contendo uma ligação de amida entre a unidade de Fármaco e a unidade de Ligante. Quando o Local de Reação N° 1 for um carbonato, como no Ligante AL, o Ligante pode ser acoplado ao Fármaco usando HOBt numa mistura de DMF/piridina para proporcionar um Composto de Fármaco-Ligante AM, contendo uma ligação carbamato entre a unidade de Fármaco e a unidade de Ligante
Alternativamente, quando o Local Reativo N- 1 for um bom grupo abandonante, tal como no Ligante AN, o Ligante pode ser acoplado com um grupo amina de um Fármaco através de um processo de substituição nucleofilico para proporcionar um Composto de Fármaco-Ligante que tem uma ligação de amina (AO) entre a unidade de Fármaco e a unidade de Ligante. Métodos ilustrativos úteis para ligação de um Fármaco a um Ligando para formar um Composto de Fármaco-Ligante são ilustrados no Esquema 13 e são descritos nos Procedimentos Gerais G-H.
Procedimento Geral G: Formação de amida usando HATU. Um Fármaco (Ib) (1,0 eq.) e um Ligante N-protegido contendo um local Reativo de ácido carboxilico (1,0 eq.) são diluídos com um solvente orgânico adequado, tal como diclorometano, e a solução resultante é tratada com HATU (1,5 eq.) e uma base orgânica, preferivelmente piridina (1,5 eq.) . A mistura de reação é deixada agitar sob uma atmosfera inerte, preferivelmente árgon, durante 6 horas, em cujo período de tempo a mistura de reação é monitorizada usando HPLC. A mistura de reação é concentrada e o resíduo resultante é purificado usando HPLC para resultar na amida de fórmula AK.
Procedimento H: Formação de carbamato usando HOBt. Uma mistura de um Ligante AL que tem um local Reativo carbonato de p-nitrof enilo (1,1 eq.) e Fármaco (Ib) (1,0 eq.) é diluída com um solvente orgânico aprótico, tal como DMF, para proporcionar uma solução que tem uma concentração de 50-100 nM, e a solução resultante é tratada com HOBt (2,0 eq.) e colocada em atmosfera inerte, preferivelmente árgon. A mistura de reação é deixada agitar durante 15 minutos, então uma base orgânica, tal como piridina (1/4 v/v) é adicionada e o progresso da reação é monitorizado usando HPLC. O Ligante é tipicamente consumido dentro de 16 horas. A mistura de reação é, então, concentrada no vácuo e o resíduo resultante é purificado usando, por exemplo, HPLC para resultar no carbamato AM.
Um método alternativo para preparar Compostos Fármaco-Ligante é descrito no Esquema 14. Usando o método do Esquema 14, o fármaco é unido a uma unidade Ligante parcial (por exemplo, ZA) , que não possui uma unidade de Estirador unida. Isto proporciona o intermediário AP, que tem uma unidade de Aminoácido que tem terminal N protegido com Fmoc. 0 grupo Fmoc é, então, removido e o intermediário de Amina AQ resultante é, então, unido a uma unidade de Estirador através de uma reação de acoplamento catalisada usando PyBrop ou DEPC. A construção de Compostos Fármaco-Ligante contendo um Estirador de bromoacetamida AR ou um Estirador de maleimida PEG AS é ilustrado no Esquema 14.
em que Q é -alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4. A metodologia útil para a preparação de uma unidade de Ligante contendo um espaçador ramificado é mostrada no Esquema 15.
0 Esquema 15 ilustra a síntese de um ligante dipéptido val-cit que tem uma unidade de Estirador de maleimida e uma unidade bis(4-hidroximetil)estireno (BHMS). A síntese do intermediário BHMS (AW) foi melhorada em relação a procedimento anteriores da literatura (veja-se Publicação
Internacional N° WO 9813059 de Firestone et al., e Crozet, M.P.; Archaimbault, G.; Vanelle, P., Nouguier, R. Tetrahedron Lett. (1985) 26:5133-5134) e utiliza como materiais de partida dietil(4-nitrobenzil)fosfonato (AT) , comercialmente disponível, e 2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-ona (AU), comercialmente disponível. Ligantes AY e BA podem ser preparados do intermediário AW usando a metodologia descrita no Esquema 9.
4.6.3 LIGANTES DENDRÍTICOS O ligante pode ser um ligante do tipo dendrítico para união covalente de mais de uma fração de fármaco através de uma fração ligante de ramificação, multifuncional a um Ligando, tal como, mas não limitada a um anticorpo (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Ligantes dendríticos podem aumentar a proporção molar de fármaco para anticorpo, isto é, a carga, que está relacionada com a potência do Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando. Dessa maneira, onde um anticorpo engenheirado de cisteina suporta apenas um grupo cisteina tiol reativo, uma variedade de frações de fármaco pode ser unida através de um ligante dendrítico.
As formas de realização exemplares a seguir de reagentes de ligante dendrítico permitem que até nove reagentes de fração de fármaco nucleofílicos sejam conjugados pela reação com os grupos funcionais mostarda nitrogenada de cloroetilo:
4.6.4 CONJUGAÇÃO DE FRAÇÕES DE FARMACO A ANTICORPOS O Esquema 16 ilustra uma metodologia útil para preparar conjugados Fármaco-Ligante-Ligando que tem cerca de 2 a cerca de 4 fármacos por anticorpo. Um anticorpo é tratado com um agente de redução, tal como ditiotreitol (DTT) para reduzir alguns ou todos os resíduos de bissulfeto de cisteína para formar grupos cisteína tiol altamente nucleofílicos (-CH2SH) . 0 anticorpo parcialmente reduzido reage, dessa maneira, com compostos fármaco-ligante, ou reagentes de ligante, com grupos funcionais eletrofilicos tais como maleimida ou a-halo carbonilo, de acordo com o método de conjugação na página 766 de
Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765- 773 .
Esquema 16
Por exemplo, um anticorpo, isto é, AC10, dissolvido em 500 mM de borato de sódio e 500 mM de cloreto de sódio com pH 8,0 é tratado com um excesso de 100 mM de ditiotreitol (DTT). Após incubação a 37 °C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição com resina Sephadex G25 e eluida com PBS com 1 mM DTPA. O valor tiol/Ab é verificado por determinação da concentração do anticorpo reduzido da absorvância de 280 nm da solução e a concentração de tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) e determinação da absorvância 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é arrefecido em gelo. O ligante de fármaco, por exemplo, MC-val-cit-PAB-MMAE em DMSO, dissolvido em acetonitrilo e água na concentração conhecida é adicionado ao anticorpo reduzido arrefecido em PBS. Após cerca de 1 hora, maleimida em excesso é adicionada para resfriar rapidamente a reação e capear quaisquer grupos tióis de anticorpo não reagidos. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o ADC, por exemplo, AC10-MC-vc-PAB-MMAE, é purificado e dessalinizado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 pm sob condições estéreis, e congelado para armazenagem.
Uma variedade de conjugados de anticorpo fármaco (ADC) foi preparada, com uma variedade de ligantes, e as frações de fármaco MMAE e MMAF. O quadro a seguir é um grupo exemplar de ADC que foi preparado seguindo o protocolo do Exemplo 27, e caracterizado por HPLC e ensaio de carga de fármaco.
Alvo ADC Quantidade Proporção (antigénio) Isolada de (mg) Fármaco/Ab 0772P 16E12-MC-vc-PAB-MMAE 1,75 4 0772P llDIO-MC-vc-PAB-MMAE 46,8 4,4 0772P llDIO-MC-vc-PAB-MMAF 54,5 3,8
Brevican Brevican-MC-MMAF 2 6
Brevican Brevican-MC-vc-MMAF 2 6
Brevican Brevican-MC-vc-PAB-MMAF 1,4 6 CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAE 38,1 4,3 CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAF 43 4,1 CRIPTO 11F4-MC-VC-PAB-MMAF 6 4,8 CRIPTO 25G8-MC-vc-PAB-MMAF 7,4 4,7
El 6 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 2,3 4,6
El 6 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 2,9 4,6 EI 6 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 1,4 3,8
El 6 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 5,1 4
El 6 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 3 4,6 EI 6 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 4,8 4,1 EI 6 385-MC-vc-PAB-MMAF 2 4,7 4,4
EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 29,9 7,1
EphB2R 2H9-MC-fk-PAB-MMAE 25 7,5
EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 175 4,1
EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 150 3,8
EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 120 3,7
EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 10,7 4,4 IL-20Ra IL2 ORa-fk-MMAE 26 6,7 IL-20Ra IL2 ORa-vc-MMAE 27 7,3
EphB2 IL8-MC-vc-PAB-MMAE 251 3,7 MDP MDP-vc-MMAE 32 MPF 19C3-vc-MMAE 1,4 4 6,5 MPF 7D9-VC-MMAE 4,3 3,8 MPF 19C3-vc-MMAE 7,9 3 MPF 7D9-MC-vc-PAB-MMAF 5 4,3
Napi3b lOHl-vc-MMAE 4,5 4,6
Napi3b 4C9-vc-MMAE 3,0 5,4
Napi3b lOHl-vc-MMAE 4,5 4,8
Napi3b lOHl-vc-MMAF 6,5 4 NCA 3E 6-MC-fk-PAB-MMAE 49, 6 5,4 NCA 3E6-MC-vc-PAB-MMAE 56,2 6,4 PSCA P SC A-f k-MMAE 51,7 8,9 PSCA PSCA-vc-MMAE 61,1 8,6
Napi3b lOHl-MC-vc-PAB-MMAE 75 4,2
Napi3b lOHl-MC-vc-PAB-MMAF 95 4,4
Napi3b 10H1-MC-MMAF 92 4
EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 79 5
EphB2R 2H9-MC-MMAF 92 4,9 0772P 11D10(quimera de Fc)-MC-vc- 79 4,3
PAB-MMAE 0772P 11D10(quimera de Fc)-MC-vc- 70 4,5
PAB-MMAF 0772P 11D10 (quimera de Fc)-MC- 23 4,5
MMAF
Brevican 6D2-MC-vc-PAB-MMAF 0,3 4,5
Brevican 6D2-MC-MMAF 0,36 4,5
EphB2R 2H9(quimera de Fc)-MC-vc- 1983 4,3
PAB-MMAE
El 6 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 14,1 4,6
El 6 12B9-MC-vc-PAB-MMAF 16,4 4,5
El 6 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 10,5 4,1
El 6 12G12-MC-vc-PAB-MMAF 10,2 3,8
El 6 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 58, 6 3,8
El 6 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 8 3,1 0772P 11D10(quimera de Fc)-MC-vc- 340 3,9
PAB-MMAE
Steapl (Steapl-92)-MC-vc-PAB-MMAE 3,5 4
Steapl (Steapl-92)-MC-vc-PAB-MMAF 4,7 4
Steapl (Steapl-120)-MC-vc-PAB-MMAE 2 4
Steapl (Steapl-120)-MC-vc-PAB-MMAF 2,3 4
El 6 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 52,2 4,5
4.7 COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO
Também é descrita uma composição incluindo uma quantidade eficaz de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar e um portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável. Para conveniência, as unidades de Fármaco e Compostos Fármaco-Ligante e Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando podem ser referidos como Conjugados Exemplares. As composições são adequadas para administração humana e veterinária.
As composições presentes podem estar em qualquer forma que permita que a composição seja administrada a um paciente. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um sólido, liquido ou gás (aerossol) . Vias típicas de administração incluem, sem limitação, oral, tópica, parentérica, sublingual, retal, vaginal, ocular, intratumoral, e intranasal. Administração parentérica inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, intramuscular, intra-esternal ou técnicas de infusão. As composições podem ser administradas parentericamente. Alternativamente, os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições podem ser administrados intravenosamente.
Composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo a permitir que um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar esteja biodisponível quando a composição é administrada a um paciente. Composições podem ter a forma de uma ou mais unidades farmacêuticas, onde, por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade farmacêutica, e um recipiente de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar na forma aerossol pode conter uma pluralidade de unidades farmacêuticas.
Materiais usados na preparação das composições farmacêuticas podem ser atóxicas na quantidade usada. Ficará evidente para aqueles com especialização ordinária na técnica que a dosagem ideal do(s) princípio(s) ativo(s) na composição farmacêutica dependerá de uma variedade de fatores. Fatores relevantes incluem, sem limitação, o tipo de animal (por exemplo, ser humano), a forma especifica do Composto Exemplar ou Conjugado Exemplar, a maneira de administração, e a composição utilizada. 0 portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável pode ser particulado, de modo que as composições estão, por exemplo, na forma de comprimido ou pó. 0(s) portador(es) pode(m) ser líquido(s), com as composições sendo, por exemplo, um xarope oral ou líquido injetável. Além disso, o(s) portador(es) pode(m) ser gasoso(s) ou particulado(s) , de modo a proporcionar uma composição aerossol útil, por exemplo, para administração por inalação.
Quando destinada a administração oral, a composição está preferivelmente na forma sólida ou liquida, e formas semissólidas, semilíquidas, em suspensão ou gel estão incluídas dentro das formas consideradas no presente documento como sólidas ou líquidas.
Como uma composição sólida para administração oral, a composição pode ser formulada num pó, grânulo, comprimido, pílula, cápsula, goma de mascar, bolacha ou forma semelhante. Esta composição sólida tipicamente contém um ou mais diluentes inertes. Além disso, um ou mais dentre os seguintes pode estar presente: aglutinantes tais como carboxi metil celulose, etil celulose, celulose microcristalina, ou gelatina; excipientes, tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes de desintegração tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e semelhantes; lubrificantes tais como estearato de magnésio ou Sterotex; agentes de brilho tais como dióxido de silício; agentes edulcorantes tais como sacarose ou sacarina, um agente aromatizante tal como hortelã, salicilato de metilo ou aromatizante de laranja e um agente de coloração.
Quando a composição estiver na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, ela pode conter, além dos materiais do tipo acima, um portador líquido tal como polietilenoglicol, ciclodextrina ou um óleo gordo. A composição pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, um xarope, solução, emulsão ou suspensão. 0 liquido pode ser útil para administração oral ou para administração por injeção. Quando destinado para administração oral, uma composição pode compreender um ou mais dentre um agente edulcorante, conservantes, tintura/corante e intensificador de sabor. Numa composição para administração por injeção, um ou mais dentre um tensioativo, conservante, agente de humedecimento, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizador e agente isotónico podem também ser incluídos.
As composições líquidas, sejam soluções, suspensões ou de outra forma semelhante, podem também incluir um ou mais dentre os seguintes: diluentes estéreis tais como água para injeção, solução salina, preferivelmente solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotónico, óleos fixos tais como mono ou diglicéridos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, ciclodextrina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfeto de sódio; agentes quelantes tais como ácido etileno diamina tetraacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. Uma composição parentérica pode ser contida numa ampola, uma seringa descartável ou um balão de doses múltiplas feito de vidro, plástico ou outro material. Solução salina fisiológica é um adjuvante exemplar. Uma composição injetável é preferivelmente estéril. A quantidade de Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar que é eficaz no tratamento de um distúrbio ou condição específica dependerá da natureza da distúrbio ou condição e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro ou in vivo podem, opcionalmente, ser utilizados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideais. A dose precisa a ser utilizada nas composições dependerá também da via de administração, e da gravidade da doença ou distúrbio, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e com as circunstâncias de cada paciente.
As composições compreendem uma quantidade eficaz de um
Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar de modo que uma dosagem adequada será obtida. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos cerca de 0,01 % de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar em peso da composição. Quando destinada a administração oral, esta quantidade pode variar de cerca de 0,1 % a cerca de 80 % em peso da composição. As composições orais podem compreender de cerca de 4 % a cerca de 50 % do Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar em peso da composição. Além disso, as presentes composições podem ser preparadas de modo que uma unidade farmacêutica parentérica contenha de cerca de 0,01 % a cerca de 2 % em peso do Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar.
Para administração intravenosa, a composição pode compreender de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar por kg de peso corporal do animal. A composição pode incluir de cerca de 1 a cerca de 100 mg de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar por kg do peso corporal do animal. A quantidade administrada pode estar no intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 25 mg/kg de peso corporal do Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar.
De forma geral, a dosagem de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar administrada a um paciente é tipicamente de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 2000 mg/kg de peso corporal do animal. A dosagem administrada a um paciente pode estar entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal do animal ou a dosagem administrada a um paciente pode estar entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 250 mg/kg de peso corporal do animal; em ainda um outro aspeto, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg de peso corporal do animal ou a dosagem administrada está entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal do animal, ou a dosagem administrada está entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal do animal.
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolo, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.). A administração pode ser sistémica ou local. Vários sistemas de administração são conhecidos, por exemplo, encapsulação em lipossomas, microparticulas, microcápsulas, cápsulas, etc., e podem ser usados para administrar um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar ou composição. Em certos casos, mais que um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar ou composição é administrado a um paciente.
Em casos específicos, pode ser desejado administrar um ou mais Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições localmente à área que necessita de tratamento. Isto pode ser obtido, por exemplo, e não de forma limitativa, por infusão local durante cirurgia; aplicação tópica, por exemplo, em conjunto com um curativo após cirurgia; por injeção, por meios de um cateter, por meio de um supositório; ou por meio de um implante, sendo o implante de um material poroso ou não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, ou fibras. Num exemplo, a administração pode ser por injeção direta no local (ou antigo local) de um cancro, tumor ou tecido neoplástico ou pré-neoplásico. Num outro exemplo, a administração pode ser por injeção direta no local (ou antigo local) de uma manifestação de uma doença autoimune.
Em certos casos, pode ser desejável introduzir um ou mais Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições no sistema nervoso central por uma via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal. Injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, unido a um reservatório, tal como um reservatório de Ommaya.
Administração pulmonar pode também ser utilizada, por exemplo, através da utilização de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente para aerossol, ou via perfusão num tensioativo pulmonar de fluorocarbono ou sintético.
Em ainda um outro exemplo, os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições podem ser administrados num sistema de libertação controlada, tal como, mas não limitado, uma bomba ou vários materiais poliméricos podem ser usados. Em ainda um outro exemplo, um sistema de libertação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo dos Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições, por exemplo, o cérebro, dessa maneira requerendo apenas uma fração da dose sistémica (veja-se, por exemplo, Goodson, no Medicai Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, páginas 115-118 (1984)) . Outros sistemas de libertação controlada discutidos na análise por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)) podem ser usados. O termo "portador" refere-se a um diluente, adjuvante ou excipiente, com o qual um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar é administrado. Estes portadores farmacêuticos podem ser líquidos, tal como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. Os portadores podem ser solução salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, ceratina, sílica coloidal, ureia, e semelhantes. Além disso, agentes auxiliares, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes podem ser usados. Num exemplo, quando administrado a um paciente, o Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar ou composições e portadores farmaceuticamente aceitáveis são estéreis. Água é um portador exemplar quando os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares são administrados intravenosamente. Soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas podem também ser utilizadas como portadores líquidos, especificamente para soluções injetáveis. Portadores farmacêuticos adequados também incluem excipientes tais como amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, nata seca de leite, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. As presentes composições, se for desejado, podem também conter quantidades mínimas de agentes de humedecimento e emulsificantes, ou agentes tampão de pH.
As presentes composições podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, contas, cápsulas, cápsulas contendo líquidos, pós, formulações de libertação sustentada, supositórios, emulsões, aerossóis, pulverizadores, suspensões, ou qualquer outra forma adequada para utilização. Outros exemplos de portadores farmacêuticos adequados são descritos por E.W. Martin na "Remington's Pharmaceutical Sciences".
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares podem ser formulados de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a animais, particularmente seres humanos. Tipicamente, os portadores ou veículos para administração intravenosa são soluções tampão aquosas, estéreis e isotónicas. Onde necessário, as composições podem também incluir um agente solubilizante. Composições para administração intravenosa podem, opcionalmente, compreender um anestésico local tal como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção. De forma geral, os ingredientes são supridos tanto separadamente como misturados na forma farmacêutica unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água, num recipiente hermeticamente vedado tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade do agente ativo. Onde um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar é para ser administrado por infusão, pode ser distribuído, por exemplo, com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Onde o Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar é administrado por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser provida, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
Composições para administração oral podem estar na forma de comprimidos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, grânulos, pós, emulsões, cápsulas, xaropes, ou elixires, por exemplo. Composições administradas oralmente podem conter, opcionalmente, um ou mais agentes, por exemplo, agentes edulcorantes tais como frutose, aspartame ou sacarina; agentes aromatizantes tais como hortelã, óleo de gualtéria, ou cereja; agentes corantes; e agentes conservantes, para proporcionar uma preparação farmaceuticamente palatável. Além do mais, quando na forma de comprimido ou pílula, as composições podem ser revestidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrintestinal, proporcionando assim uma ação sustentada durante um período prolongado de tempo. Membranas seletivamente permeáveis, envolvendo um composto de ação osmoticamente ativo, são também adequadas para compostos administrados oralmente. Nestas plataformas posteriores, fluido do ambiente envolvendo a cápsula é embebido pelo composto de ação, que incha para deslocar o agente ou composição de agente através de uma abertura. Estas plataformas de administração podem proporcionar um perfil de administração de ordem essencialmente zero em oposição a perfis perfurados de formulações de libertação imediata. Um material de atraso de tempo tal como monoestearato de glicerol ou estearato de glicerol pode também ser usado.
As composições podem ser destinadas a administração tópica, caso em que o portador pode estar na forma de uma solução, emulsão, unguento ou base de gel. Se destinado para administração transdérmica, a composição pode estar na forma de um curativo transdérmico ou um dispositivo de iontoforese. Formulações tópicas podem compreender uma concentração de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar de cerca de 0,05 % a cerca de 50 % peso/volume (peso por unidade de volume da composição) ; num outro aspeto, de 0,1 % a 10 % p/v. A composição pode ser destinada a administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório que irá derreter no reto e libertar o Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar. A composição pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma unidade farmacêutica sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam uma proteção de revestimento ao redor dos ingredientes ativos. Os materiais que formam o revestimento protetor são tipicamente inertes, e podem ser selecionados de, por exemplo, açúcar, goma-laca, e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser envolvidos numa cápsula de gelatina.
As composições podem consistir em unidades farmacêuticas gasosas, por exemplo, podem estar na forma de aerossol. O termo aerossol é usado para denotar uma variedade de sistemas que variam daqueles de natureza coloidal até aqueles sistemas que consistem de pacotes pressurizados. A administração pode ser feita através de um gás liquefeito ou comprimido ou através de um sistema de bomba adequado que distribui os ingredientes ativos.
Se na forma sólida, líquida ou gasosa, as presentes composições podem incluir um agente farmacológico usado no tratamento de cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa.
4.8 USOS TERAPÊUTICOS DOS CONJUGADOS EXEMPLARES
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares são úteis para tratar cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa num paciente.
4.8.1_TRATAMENTO DE CANCRO
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares são úteis para inibir a multiplicação de uma célula tumoral ou célula cancerígena, causar apoptose numa célula tumoral ou cancerígena, ou para tratar cancro num paciente. Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares podem ser usados, consequentemente, numa variedade de configurações para o tratamento de cancros em animais. Os Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando podem ser usados para administrar um Fármaco ou unidade de Fármaco a uma célula tumoral ou célula cancerígena. Sem estar limitado pela teoria, numa forma de realização, a unidade de Ligando de um Conjugado Exemplar liga-se ou associa-se a um antigénio associado a uma célula cancerígena ou célula tumoral, e o Conjugado Exemplar pode ser absorvido dentro de uma célula tumoral ou célula cancerígena através de endocitose mediada por recetor. 0 antigénio pode ser unido a uma célula tumoral ou célula cancerígena ou pode ser uma proteína de matriz extracelular associada à célula tumoral ou célula cancerígena. Uma vez dentro da célula, uma ou mais sequências peptidicas especificas dentro da unidade de Ligante são hidroliticamente clivadas por uma ou mais proteases associadas à célula tumoral ou célula cancerígena, resultando na libertação de um Fármaco ou um Composto de Fármaco-Ligante. 0 Fármaco libertado ou
Composto de Fármaco-Ligante está, então, livre para migrar dentro da célula e induzir atividades citotóxicas ou citostáticas. Numa forma de realização alternativa, o Fármaco ou unidade de Fármaco é clivado do Conjugado Exemplar fora da célula tumoral ou célula cancerígena, e o Fármaco ou Composto de Fármaco-Ligante penetra subsequentemente na célula.
Num exemplo, a unidade de Ligando liga-se à célula tumoral ou célula cancerígena.
Num outro exemplo, a unidade de Ligando liga-se a um antigénio de célula tumoral ou célula cancerígena que está na superfície da célula tumoral ou célula cancerígena.
Num outro exemplo, a unidade de Ligando liga-se a um antigénio de célula tumoral ou célula cancerígena que é uma proteína de matriz extracelular associada à célula tumoral ou célula cancerígena. A especificidade da unidade de Ligando para uma célula tumoral ou célula cancerígena pode ser importante para determinar aqueles tumores ou cancros que são mais eficazmente tratados. Por exemplo, Conjugados Exemplares que tem uma unidade de Ligando BR96 podem ser úteis para tratar carcinomas de antigénio positivo incluindo aqueles do pulmão, mama, cólon, ovários, e pâncreas. Conjugados Exemplares que tem uma unidade de Ligando Anti-CD30 ou anti-CD40 podem ser úteis para o tratamento de malignidades hematológicas.
Outros tipos particulares de cancros que podem ser tratados com Conjugados Exemplares incluem, mas não se limitam àqueles apresentados no Quadro 3. QUADRO 3
Tumores sólidos incluindo, mas não limitados a:
Fibrossarcoma
Mixossarcoma
Lipossarcoma
Condrossarcoma
Sarcoma osteogénico
Cordoma
Angiossarcoma
Endoteliossarcoma
Linfangiossarcoma
Linfangioendoteliossarcoma
Sinovioma
Mesotelioma
Tumor de Ewing
Leiomiossarcoma
Rabdomiossarcoma
Cancro do cólon
Cancro colorretal
Cancro dos rins
Cancro pancreático
Cancro ósseo
Cancro de mama
Cancro do ovário
Cancro prostático
Cancro esofágico
Cancro estomacal
Cancro oral
Cancro nasal
Cancro da garganta
Carcinoma de células escamosas
Carcinoma de célula basal
Adenocarcinoma
Carcinoma da glândula sudorifera Carcinoma da glândula sebácea Carcinoma papilar Adenocarcinomas papilares Cistadenocarcinoma Carcinoma medular Carcinoma broncogénico Carcinoma de célula renal Hepatoma
Carcinoma do duto biliar Coriocarcinoma
Seminoma
Carcinoma embrionário Tumor de Wilms Cancro do colo do útero Cancro uterino Cancro testicular
Carcinoma pulmonar de célula pequena
Carcinoma de bexiga
Cancro do pulmão
Carcinoma epitelial
Glioma
Glioblastoma multiforme
Astrocitoma
Meduloblastorna
Craniofaringioma
Ependimoma
Pinealoma
Hemangioblastoma
Neuroma acústico
Oligodendroglioma
Meningioma
Cancro da pele
Melanoma
Neuroblastoma
Retinoblastorna
Cancros originários do sangue, incluindo, mas não limitados a:
Leucemia linfoblástica aguda "ALL"
Leucemia de célula B linfoblástica aguda Leucemia de célula T linfoblástica aguda Leucemia mieloblástica aguda "AML"
Leucemia promielocitica aguda "APL"
Leucemia monoblástica aguda Leucemia eritroleucémica aguda Leucemia megacarioblástica aguda
Leucemia mielomonocítica aguda Leucemia não linfocitica aguda Leucemia não diferenciada aguda Leucemia mielocitica crónica "CML"
Leucemia linfocitica crónica "CLL"
Leucemia de célula capilar Mieloma múltiplo Leucemias agudas e crónicas:
Linfoblástica
Mielógena
Linfocitica
Leucemias mielociticas Linfornas:
Doença de Hodgkin Linfoma não Hodgkin Mieloma múltiplo
Macroglobulinemia de Waldenstrom Doença de cadeia pesada Policitemia vera
Os Conjugados Exemplares proporcionam direcionamento de conjugação especifica a tumor ou cancro, reduzindo dessa maneira a toxicidade geral destes compostos. As unidades Ligadoras estabilizam os Conjugados Exemplares no sangue, e ainda são cliváveis pelas proteases especificas do tumor dentro da célula, libertando um Fármaco.
4.8.2_TERAPÊUTICA DE MÚLTIPLAS MODALIDADES PARA CANCRO
Cancros, incluindo, mas não limitados a um tumor, metástase, ou outra doença ou distúrbio caracterizada por crescimento celular descontrolado, podem ser tratados ou prevenidos pela administração de um Conjugado Exemplar e/ou um Composto Exemplar. Métodos para tratar ou prevenir cancro são descritos no presente documento, incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado Exemplar e um agente quimioterápico a um paciente em necessidade dos mesmos. Num exemplo, o agente quimioterápico é aquele com o qual o tratamento do cancro não foi considerado refratário. Num ouro exemplo, o agente quimioterápico é aquele com o qual o tratamento de cancro foi considerado refratário. Os Conjugados Exemplares podem ser administrados a um paciente que também foi submetido a cirurgia como tratamento de cancro.
Num exemplo, o método adicional de tratamento é terapêutica de radiação.
Num exemplo especifico, o Conjugado Exemplar é administrado concomitantemente com o agente quimioterápico ou com terapêutica de radiação. Num outro exemplo especifico, o agente quimioterápico ou terapêutica de radiação é administrado antes ou subsequentemente à administração de um Conjugado Exemplar, por exemplo, pelo menos uma hora, cinco horas, 12 horas, um dia, uma semana, um mês ou vários meses (por exemplo, até três meses) , anteriormente ou subsequentemente à administração de um Conjugado Exemplar.
Um agente quimioterápico pode ser administrado durante uma série de sessões. Qualquer um ou uma combinação dos agentes quimioterápicos listados no quadro 4 pode ser administrado. Com relação à radiação, qualquer protocolo de terapêutica de radiação pode ser usado, dependendo do tipo de cancro a ser tratado. Por exemplo, mas não de forma limitativa, radiação de raio x pode ser administrada; em especial, megavoltagem de alta energia (radiação maior que 1 MeV de energia) pode ser usada para tumores profundos, e feixe de elétron e radiação de raio X de ortovoltagem pode ser usada para cancros da pele. Radioisótopos que emitem raio gama, tal como isótopos radioativos de rádio, cobalto e outros elementos, podem também ser administrados.
Adicionalmente, são descritos métodos de tratamento de cancro com um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar como uma alternativa à quimioterapia ou terapêutica de radiação, quando a quimioterapia ou a terapêutica de radiação são ou podem ser muito tóxicas, por exemplo, resultando em efeitos secundários inaceitáveis ou insuportáveis, para os indivíduos que estão recebendo o tratamento. 0 animal que está a ser tratado pode, opcionalmente, ser tratado com um outro tratamento para cancro tal como cirurgia, terapêutica de radiação ou quimioterapia, dependendo de qual tratamento seria aceitável ou suportável.
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares podem também ser usados de uma maneira in vitro ou ex vivo, como para o tratamento de certos cancros, incluindo, mas não limitados a leucemias e linfomas, este tratamento envolvendo transplantes de célula estaminal autóloga. Isto pode envolver um processo de etapas múltiplas, no qual as células estaminais hematopoiéticas autólogas do animal são colhidas e purgadas de todas as células cancerígenas; a população de célula da medula óssea remanescente do animal é, então, erradicada através da administração de uma alta dose de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar com ou sem o acompanhamento de uma alta dose de terapêutica de radiação, e o enxerto de célula estaminal é infundido de volta no animal. Tratamento de suporte é, então, proporcionado enquanto a função da medula óssea é restaurada e o animal se recupera.
4.8.3_TERAPÊUTICA DE FÁRMACOS MÚLTIPLOS PARA CANCRO Métodos para o tratamento de cancro incluindo a administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um Conjugado Exemplar e um outro agente terapêutico que é um agente anti-cancro são apresentados. Agentes anticancro adequados incluem, mas não são limitados a metotrexato, taxol, L-asparaginase, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiureia, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureias, cisplatina, carboplatina, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, topotecano, mostardas nitrogenadas, citoxan, etoposido, 5-fluorouracil, BCNU, irinotecano, camptotecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, aspariginase, vimblastina, vincristina, vinorrelbina, paclitaxel, docetaxel. Num aspeto, o agente anti-cancro inclui, mas não se limita a urn fármaco listado no Quadro 4.
4.8.4_TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES
Os Conjugados Exemplares são úteis para eliminar ou inibir a replicação de uma célula que produz uma doença autoimune ou para o tratamento de uma doença autoimune. Os Conjugados Exemplares podem ser usados adequadamente numa variedade de configurações para o tratamento de uma doença autoimune num paciente. Os Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando podem ser usados para administrar um Fármaco a uma célula alvo. Sem estar limitado pela teoria, o Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando pode associar-se com um antigénio na superfície de uma célula alvo, e o Conjugado Exemplar é, então, absorvido dentro de uma célula alvo através de uma endocitose mediada por recetor. Uma vez dentro da célula, uma ou mais sequências peptídicas específicas dentro da unidade de Ligante são enzimaticamente ou hidroliticamente clivadas, resultando na libertação de um Fármaco. 0 Fármaco libertado está, então, livre para migrar no citosol e induzir atividades citotóxicas ou citostáticas. Num exemplo alternativo, o Fármaco é clivado do Conjugado Exemplar fora da célula alvo, e o Fármaco penetra subsequentemente na célula.
Num exemplo, a unidade de Ligando liga-se a um antigénio autoimune. Num aspeto, o antigénio está na superfície de uma célula envolvida numa condição autoimune.
Num outro exemplo, a unidade de Ligando liga-se a um antigénio autoimune que está na superfície de uma célula.
Num exemplo, o Ligando liga-se a linfócitos ativados que estão associados ao estado da doença autoimune.
Num exemplo adicional, os Conjugados Exemplares destroem ou inibem a multiplicação de células que produzem um anticorpo autoimune associado a uma doença autoimune específica.
Tipos específicos de doenças autoimunes que podem ser tratados com os Conjugados Exemplares incluem, mas não se limitam a distúrbios relacionados com linfócito Th2 (por exemplo, dermatite atópica, asma atópica, rinoconjuntivite, rinite alérgica, síndrome de Omenn, esclerose sistémica, e doença de enxerto versus hospedeiro); distúrbios relacionados com linfócito Thl (por exemplo, artrite reumatoide, esclerose múltipla, psoríase, síndrome de
Sjorgren, tireoidite de Hashimoto, doença de Grave, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, e tuberculose); distúrbios relacionados com linfócito B ativado (por exemplo, lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artrite reumatoide, e diabete tipo I), e aquelas apresentadas no Quadro 5. QUADRO 5
Hepatite Ativa Crónica Doença de Addison Alveolite Alérgica Reação Alérgica Rinite Alérgica Síndrome de Alport Anafilaxia
Espondilite anquilosante Síndrome antifosfolípido
Artrite
Ascariase
Aspergilose
Alergia Atópica Dermatite Atrópica Rinite Atrópica Doença de Behcet Pulmão de "Bird-Fancier"
Asma brônquica Síndrome de Caplan
Cardiomiopatia
Doença celíaca
Doença de Chagas
Glomerulonefrite crónica Síndrome de Cogan
Doença de Aglutinina Fria
Infeção por Rubéola Congénita
Síndrome de CREST
Doença de Crohn
Crioglobulinemia Síndrome de Cushing
Dermatomiosite Lúpus Discoide Síndrome de Dressier Síndrome de Eaton-Lambert
Infeção por Echovírus
Encefalomielite
Oftalmopatia endócrina
Infeção por Vírus Epstein-Barr
Asma equina
Eritematose Síndrome de Evan Síndrome de Felty
Fibromialgia
Ciclite de Fuch
Atrofia Gástrica
Alergia Gastrintestinal
Arterite de Células Gigantes
Glomerulonefrite
Sindrome de Goodpasture
Doença do Enxerto contra Hospedeiro
Doença de Grave
Doença de Guillain-Barre
Tireoidite de Hashimoto
Anemia hemolitica Púrpura de Henoch-Schonlein
Atrofia Adrenal Idiopática
Fibrite Pulmonar Idiopática
Nefropatia de IgA
Enteropatias Intestinais Inflamatórias Diabetes Mellitus dependente de Insulina Artrite Juvenil
Diabetes Mellitus Juvenil (Tipo 1)
Sindrome de Lambert-Eaton
Laminite
Liquen piano
Hepatite Lupoide Lúpus
Linfopenia
Doença de Meniere
Doença de Tecido Conectivo Mista
Esclerose Múltipla
Miastenia Gravis
Anemia Perniciosa
Sindromes Poliglandulares
Demência Pré-senil
Agamaglobulinemia Primária
Cirrose Biliar Primária
Psoriase
Artrite Psoriática Fenómeno de Raynauds Aborto Recorrente Sindrome de Reiter
Febre Reumática
Artrite Reumatoide Síndrome de Sampter
Esquistossomose Síndrome de Schmidt
Esclerodermia Síndrome de Shulman Síndrome de Sjorgen Síndrome do Homem Rígido
Oftalmia Simpática Lúpus Eritematoso Sistémico
Arterite de Takayasu
Arterite Temporal
Tireoidite
Trombocitopenia
Tirotoxicose
Necrólise Epidérmica Tóxica
Resistência à Insulina Tipo B
Diabetes Mellitus Tipo 1
Colite Ulcerativa
Uveíte
Vitiligo
Macroglobulinemia de Waldenstrom Granulomatose de Wegener
4.8.5_TERAPÊUTICA DE FÁRMACOS MÚLTIPLOS PARA DOENÇAS
AUTOIMUNES Métodos para o tratamento de uma doença autoimune são também revelados incluindo a administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um Conjugado Exemplar e um outro agente terapêutico conhecido para o tratamento de uma doença autoimune. Num exemplo, o agente de doença anti-autoimune inclui, mas não se limita aos agentes listados no Quadro 6.
Quadro 6 Ciclosporina Ciclosporina A micofenilato mofetil Sirolimus Tacrolimus Enanercept Prednisona Azatioprina metotrexato ciclofosfamida
Prednisona Ácido aminocaproico
Cloroquina
Hidroxicloroquina
Hidrocortisona
Dexametasona
Clorambucil
DHEA
Danazol
Bromocriptina
Meloxicam
Infliximab
4.8.6_TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECIOSAS
Os Conjuqados Exemplares são úteis para eliminar ou inibir a multiplicação de uma célula que produz uma doença infeciosa ou para o tratamento de uma doença infeciosa. Os Conjugados Exemplares podem ser usados adequadamente numa variedade de configurações para o tratamento de uma doença infeciosa num paciente. Os Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando podem ser usados para administrar um Fármaco a uma célula alvo. Num exemplo, a unidade de Ligando liga-se à célula da doença infeciosa.
Numa exemplo, os Conjugados eliminam ou inibem a multiplicação de células que produzem uma doença infeciosa específica.
Tipos específicos de doenças infeciosas que podem ser tratadas com os Conjugados Exemplares incluem, mas não se limitam àquelas apresentadas no Quadro 7. QUADRO 7
Doenças Bacterianas:
Difteria
Tosse convulsa
Bacterinemia Oculta
Infeção do Trato Urinário
Gastroenterite
Celulite
Epiglotidite
Traqueíte
Hipertrofia do Tecido Adenoide
Abcesso Retrofaríngico
Impetigo
Ectimia
Pneumonia
Endocardite
Artrite Séptica
Pneumococose
Peritonite
Bacteriemia
Meningite
Meningite Purulenta Aguda
Uretrite
Cervicite
Proctite
Faringite
Salpingite
Epididimite
Gonorreia Sífilis
Listeriose
Carbúnculo
Nocardiose
Salmonelose
Febre tifoide
Disenteria
Conjuntivite
Sinusite
Brucelose
Tularemia Cólera
Peste Bubónica Tétano
Enterite Necrosante Actinomicose Infeção Anaeróbica Mista Sífilis
Febre Recorrente
Leptospirose
Doença de Lyme
Febre da mordida de rato
Tuberculose
Linfadenite
Lepra
Clamidiose
Pneumonia por Clamídia Tracoma
Conjuntivite de Inclusão Doenças Fúngicas Sistémicas: Histoplasmose Coccidiodomicose Blastomicose Esporotricose Criptococose Candidiase Sistémica Aspergilose
Mucormicose
Micetoma
Cromomicose
Doenças por Rickettisias:
Tif o
Febre Maculosa das Montanhas Rochosas Erliquiose
Rickettsiose Transmitida por Carraças do Leste Varíola por rickettsia Febre Q Bartonelose Doenças Parasitárias:
Malária
Babesiose
Doença do Sono Africana
Doença de Chagas
Leishmaniose
Febre Dum-Dum
Toxoplasmose
Meningoencefalite
Ceratite
Entamebíase
Giardíase
Criptosporidiose
Isosporiose
Ciclosporiase
Microsporidiose
Ascaríase
Infeção dos vermes intestinais Infeção por ancilóstoma duodenal Infeção por nematoide Larva Migrans Ocular Triquinose
Doença pelo verme da Guiné Filaríase Linfática
Loíase
Cegueira "River"
Infeção por Dirofilária Canina Esquistossomose Prurido dos Nadadores Trematodo Pulmonar Oriental Trematodo Hepático Oriental Fascioliase Fasciolopsiase Opistorquiase Infeções por ténia Doença Hidatidica Doença Hidatidica Alveolar Doenças Virais:
Sarampo
Panencefalite esclerosante subaguda
Constipação
Papeira
Rubéola
Roséola
Quinta Doença
Varicela
Infeção virai sincicial respiratória
Laringotraqueobronquite
Bronquiolite
Mononucleose Infeciosa
Poliomielite
Herpangina
Doença da mão-pé-e-boca Doença de Bornholm Herpes Genital Verruga Genital Meningite Asséptica Miocardite Pericardite
Gastroenterite Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA)
Virus da Imunodeficiência Humana (VIH)
Sindrome de Reye
Sindrome de Kawasaki
Influenza
Bronquite
Pneumonia Atipica
Doença Respiratória Febril Aguda
Febre Faringoconjuntival Aguda
Ceratoconjuntivite Epidémica
Virus da Herpes Simplex 1 (HSV-1) Vírus da Herpes Simplex 2 (HSV-2)
Herpes Zoster
Doença de Inclusão Citomegálica Raiva
Leucoencefalopatia Progressiva Multifocal Kuru
Insónia Familiar Fatal
Doença de Creutzfeldt-Jakob
Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker
Paraparesia Espástica Tropical
Encefalite da Califórnia
Encefalite de St. Louis
Febre Amarela
Dengue
Coriomeningite Linfocítica
Febre de Lassa
Febre Hemorrágica Síndrome Pulmonar do Hantavirus
Infeções por Virus Marburg
Infeções por Vírus Ebola
Varíola
4.8.7_TERAPÊUTICA DE FÁRMACOS MÚLTIPLOS PARA DOENÇAS
INFECIOSAS São apresentados métodos para o tratamento de uma doença infeciosa incluindo a administração a um paciente em necessidade do mesmo de um Conjugado Exemplar e um outro agente terapêutico que é um agente anti-doença infeciosa. Num exemplo, o agente anti-doença infeciosa são agentes listados no Quadro 8, mas não limitados a eles. QUADRO 8
Antibióticos β-Lactâmicos:
Penicilina G Penicilina V Cloxacilina Dicloxacilina Meticilina Nafcilina Oxacilina Ampicilina Amoxicilina Bacampicilina Azlocilina Carbenicilina Mezlocilina Piperacilina Ticarcilina Aminoglicosideos:
Amicacina Gentamicina Canamicina Neomicina Netilmicina Estreptomicina Tobramicina Macrólidos:
Az itromicina
Claritromicina Eritromicina Lincomicina Clindamicina Tetraciclinas:
Demeclociclina Doxiciclina Minociclina Oxitetraciclina Tetraciclina Quinolonas:
Cinoxacina Ácido nalidixico Fluoroquinolonas:
Ciprofloxacina Enoxacina Grepafloxacina Levofloxacina Lomefloxacina Norfloxacina Ofloxacina Esparfloxacina Trovafloxicina Polipéptidos :
Bacitracina Colistina Polimixina B Sulfonamidas:
Sulfissoxazol Sulfametoxazol Sulfadiazina Sulfametizol Sulfacetamida
Agentes Antibacterianos Variados: Trimetoprim
Sulfametazol
Cloranfenicol
Vancomicina
Metronidazol
Quinupristina
Dalfopristina
Rifampina
Espectinomicina
Nitrofurantoina
Agentes Antivirais
Agentes Antivirais Gerais: Idoxuradina Vidarabina Trifluridina Aciclovir Fanciciclovir Penciciclovir Valaciclovir Ganciciclovir Foscarnet Ribavirina Amantadina Rimantadina Cidofovir
Oligonucleótidos Antissense
Imunoglobulinas
Interferdes Fármacos para Infeção por VIH: Tenofovir Entricitabina Zidovudina Didanosina Zalcitabina Estavudina Lamivudina
Neviparina
Delavirdina
Saquinavir
Ritonavir
Indinavir
Nelfinavir
5. EXEMPLOS
Exemplo 1 - Preparação do composto AB
Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 eq.,
Patente US N° 6214345 de Firestone et al.) foi diluido com DMF (120 ml, 0,2 M) e a esta solução foi adicionada dietilamina (60 ml) . A reação foi monitorizada por HPLC e foi completada em 2 horas. A mistura de reação foi concentrada e o resíduo resultante foi precipitado usando acetato de etilo (ca. 100 ml) sob exposição a ondas sonoras durante 10 minutos. Éter (200 ml) foi adicionado e o precipitado foi exposto a ondas sonoras adicionalmente durante 5 minutos. A solução foi deixada descansar durante 30 minutos sem agitação e foi, então, filtrada e seca sob vácuo elevado para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. Rendimento: 8,84 g (96 %). Val-cit- PAB-OH (8,0 g 21 mmol) foi diluído com DMF (110 ml) e a solução resultante foi tratada com MC-OSu (Willner et al., (1993) Bioconjugate
Chem. 4:251; 6,5 g, 21 mmol, 1,0 eq.). A reação foi completada após 2 horas de acordo com HPLC. A mistura de reação foi concentrada e o óleo resultante foi precipitado usando acetato de etilo (50 ml) . Após exposição a ondas sonoras durante 15 minutos, éter (400 ml) foi adicionado e a mistura foi exposta a ondas sonoras adicionalmente até todas as partículas grandes serem quebradas. A solução foi, então, filtrada e o sólido foi seco para proporcionar um intermediário sólido esbranquiçado. Rendimento: 11,63 g (96 %); ES-MS m/z 757,9 [M-H]
Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 eq., Patente US N° 6214345 de Firestone et al.) foi diluído com DMF (120 ml, 0,2 M) e a esta solução foi adicionada dietilamina (60 ml) . A reação foi monitorizada por HPLC e foi completada em 2 horas. A mistura de reação foi concentrada e o resíduo resultante foi precipitado usando acetato de etilo (ca. 100 ml) sob exposição a ondas sonoras durante 10 minutos. Éter (200 ml) foi adicionado e o precipitado foi exposto a ondas sonoras adicionalmente durante 5 minutos. A solução foi deixada descansar durante 30 minutos sem agitação e foi, então, filtrada e seca sob vácuo elevado para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. Rendimento: 8,84 g (96 %). Val-cit- PAB-OH (8,0 g 21 mmol) foi diluído com DMF (110 ml) e a solução resultante foi tratada com MC-OSu (Willner et al., (1993) Bioconjugate
Chem. 4:521; 6,5 g 21 mmol, 1,0 eq.). A reação foi completada após 2 horas, de acordo com HPLC. A mistura de reação foi concentrada e o óleo resultante foi precipitado usando acetato de etilo (50 ml) . Após exposição a ondas sonoras durante 15 minutos, éter (400 ml) foi adicionado e a mistura foi exposta a ondas sonoras adicionalmente até todas as partículas grandes serem quebradas. A solução foi, então, filtrada e o sólido foi seco para proporcionar um intermediário sólido esbranquiçado. Rendimento: 11,63 g (96 %); ES-MS m/z 757,9 [M-H]. 0 intermediário sólido esbranquiçado (8,0 g, 14,0 mmol) foi diluído com DMF (120 ml, 0,12 M) e à solução resultante foi adicionado bis (4-nitrofenil)carbonato (8,5 g 28,0 mmol, 2,0 eq.) e DIEA (3,66 ml, 21,0 mmol, 1,5 eq.). A reação estava completa em 1 hora de acordo com HPLC. A mistura de reação foi concentrada para proporcionar um óleo que foi precipitado com EtOAc, e então triturado com EtOAc (ca. 25 ml) . O soluto foi precipitado adicionalmente com éter (ca. 200 ml) e triturado durante 15 minutos. O sólido foi filtrado e seco sob vácuo elevado para proporcionar o Composto AB que era 93 % puro de acordo com HPLC e usado na próxima etapa sem purificação adicional. Rendimento: 9,7 g (94 %) .
Exemplo 2 - Preparação do Composto 1
Sal de HC1 de éster t-butílico de fenilalanina (868 mg, 3 mmol), N-Boc- Dolaproína (668 mg, 1 eq.), DEPC (820 pL, 1,5 eq.), e DIEA (1,2 ml) foram diluídos com diclorometano (3 ml). Após 2 horas (h) à temperatura ambiente (cerca de 28 graus Centígrados), a mistura de reação foi diluída com diclorometano (20 ml) , lavada sucessivamente com NaHC03 aquoso (aq.) saturado (2x10 ml), NaCl saturado aq. (2 x 10 ml) . A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi novamente suspenso em acetato de etilo e foi purificado através de cromatografia de fulgor em acetato de etilo. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar o dipéptido como um sólido branco: 684 mg (46 %) . ES-MS m/z 491,3 [M+H]+.
Para clivagem seletiva de Boc na presença de éster t-butílico, o dipéptido acima (500 mg, 1,28 mmol) foi diluído com dioxano (2 ml) . 4M HCl/dioxano (960 pL, 3 eq.) foi adicionado, e a mistura de reação foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Desproteção quase completa de Boc foi observada por RP-HPLC com quantidade mínima de clivagem de éster t-butílico. A mistura foi arrefecida num banho de gelo, e trietilamina (500 pL) foi adicionado. Após 10 minutos, a mistura foi removida do banho de arrefecimento, diluída com diclorometano (20 ml), lavada sucessivamente com NaHCCq aquoso (aq.) saturado (2x10 ml), NaCl saturado aq. (2x10 ml). A camada orgânica foi concentrada para proporcionar uma espuma amarela: 287 mg (57 %) . O intermediário foi usado sem purificação adicional. O tripéptido Fmoc-Meval-val-dil-O-t-Bu (preparado conforme descrito no documento WO 02/088172, intitulado "Pentapeptide Compounds and Uses Related Thereto"; 0,73 mmol) foi tratado com TFA (3 ml) , diclorometano (3 ml) durante 2 horas à temperatura ambiente. A mistura foi concentrada até secagem, o resíduo foi co-evaporado com tolueno (3 x 20 ml), e seca sob vácuo durante a noite. O resíduo foi diluído com diclorometano (5 ml) e adicionado ao dipéptido desprotegido (287 mg, 0,73 mmol), seguido por DIEA (550 pL, 4 eq.), DEPC (201 pL, 1,1 eq.). Após 2 horas à temperatura ambiente, a mistura de reação foi diluída com acetato de etilo (50 ml), lavada sucessivamente com ácido cítrico aq. a 10 % (2x20 ml) , NaHCCp aq. saturado (2x10 ml) , NaCl saturado aq. (2x10 ml) . A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi novamente suspenso em acetato de etilo e foi purificado através de cromatografia de fulgor em acetato de etilo. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar Fmoc-Meval- val-dil-dap-phe-O-f-Bu como um sólido branco: 533 mg (71 %) . Rf 0,4 (EtOAc) . ES-MS m/z 1010,6 [M+H] + . O produto (200 mg, 0,2 mmol) foi diluído com diclorometano (3 ml), dietilamina (1 ml) . A mistura de reação foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Solventes foram removidos para proporcionar um óleo que foi purificado por cromatografia de fulgor de sílica gel num gradiente de etapas 0-10 % de MeOH em diclorometano para proporcionar o Composto 1 como um sólido branco: 137 mg (87 %) . Rf 0,3 (10 % de MeOH/CH2Cl2) . ES-MS m/z 788,6 [M+H]+.
Exemplo 3 - Preparação do Composto 2
O Composto 2 foi preparado a partir do composto 1 (30
mg, 0,038 mmol) pelo tratamento com 4M HCl/dioxano (4 ml) durante 7 horas à temperatura ambiente. O solvente foi removido, e o resíduo foi seco sob vácuo durante a noite para proporcionar o Composto 2 como um sólido branco hidroscópico: 35 mg (120 % calculado para sal HC1) . ES-MS m/z 732,56 [M+H]+.
Exemplo 4 - Preparação do Composto 3
Fmoc-Meval-val-dil-dap-phe-O-f-Bu (Exemplo 2, 50 mg) foi tratado com 4M HCl/dioxano (4 ml) durante 16 horas à temperatura ambiente. O solvente foi removido, e o resíduo foi seco sob vácuo durante a noite para proporcionar 50 mg de um intermediário sólido branco hidroscópico. O intermediário sólido branco (20 mg, 0,02 mmol) foi diluído com diclorometano (1 ml); DEPC (5 pL, 0,03 mmol, 1,5 eq.) foi adicionado seguido por DIEA (11 pL, 0,06 mmol, 3 eq.), e t-butilamina (3,2 pL, 0,03 mmol 1,5 eq.). Após 2 horas à temperatura ambiente, a reação ainda não estava completa de acordo com RP-HPLC. Mais DEPC (10 pL) e t-butilamina (5 pL) foram adicionados e a reação foi agitada por mais 4 horas. A mistura de reação foi diluída com diclorometano (15 ml), lavada sucessivamente com água (5 ml), 0,1 M HC1 aq. (10 ml), NaCl aq. saturado (10 ml). A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi diluído com diclorometano e purificado através de cromatografia de fulgor num gradiente de etapas 0-5 % de MeOH em diclorometano. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar o intermediário de Fmoc protegido como um sólido branco: 7,3 mg (36 %). Rf 0,75 (10 % de MeOH/CH2Cl2) . O intermediário de Fmoc protegido foi diluído com diclorometano (0,5 ml) e tratado com dietilamina (0,5 ml) durante 3 horas à temperatura ambiente. A mistura de reação foi concentrada até a secagem. O produto foi isolado por cromatografia de fulgor de sílica gel num gradiente de etapas de 0-10 % de MeOH em diclorometano para proporcionar o Composto 3 como um sólido branco: 4 mg (70 %) . Rf 0,2 (10 % MeOH/CH2C12) . ES-MS m/z 787 [M+H]+, 809 [M+Na] + . Exemplo 5 - Preparação do Composto 4
Boc-L-Fenilalanina (265 mg, 1 mmol, 1 eq.) e
trietileno glicol monometil éter (164 pL, 1 mmol, 1 eq.) foram diluídos com diclorometano (5 ml) . Então, DCC (412 mg, 2 mmol, 2 eq.) foi adicionado, seguido por DMAP (10 mg). A mistura de reação foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. O precipitado foi filtrado. O solvente foi removido sob vácuo, o resíduo foi diluído com acetato de etilo, e purificado por cromatografia de fulgor de sílica gel em acetato de etilo. As frações contendo produto foram retiradas, concentradas, e secas em vácuo para proporcionar um sólido branco: 377 mg (91 %) . Rf 0,5 (EtOAc). ES-MS m/z 434 [M+Na]+. A remoção do grupo de proteção Boc foi executada pelo tratamento do material acima em dioxano (10 ml) com 4M HCl/dioxano (6 ml) durante 6 horas à temperatura ambiente. O solvente foi removido sob vácuo, o resíduo foi seco em vácuo para proporcionar um sólido branco. O sal HC1 de fenilalanina-trietileno glicol monometil éter éster (236 mg, 0,458 mmol, 1 eq.) e ΛΤ-Boc-Dolaproína (158 mg, 0,55 mmol, 1,2 eq.) foram diluídos com diclorometano (3 ml). DEPC (125 pL, 1,5 eq.) (SIC) e adicionado à mistura seguido por DIEA (250 pL, 3 eq.). Após 2 horas à temperatura ambiente a mistura de reação foi diluída com acetato de etilo (30 ml), lavada sucessivamente com NaHC03 aq. saturado (2x10 ml), ácido cítrico aq. a 10 % (2x10 ml), NaCl saturado aq. (2x10 ml). A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi novamente suspenso em acetato de etilo e foi purificado através de cromatografia de fulgor de sílica gel em acetato de etilo. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar um intermediário de espuma branca: 131 mg (50 %) . Rf 0,25 (EtOAc) . ES-MS m/z 581,3 [M+H]+. A desproteção de Boc foi efetuada em diclorometano (2 ml), TFA (0,5 ml) à temperatura ambiente durante 2 horas. Solvente foi removido sob vácuo, e o resíduo foi co-evaporado com tolueno (3 x 25 ml), então seco em vácuo para proporcionar 138 mg de sal de dipéptido TFA.
Fmoc-Meval-val-dil-OH (Exemplo 2, 147 mg, 0,23 mmol, 1 eq.) e sal de dipéptido TFA (138 mg) foram diluídos com diclorometano (2 ml). À mistura foi adicionado DEPC (63 pL, 1,5 eq.), seguido por DIEA (160 pL, 4 eq.). Após 2 horas à temperatura ambiente, a mistura de reação foi diluído com diclorometano (30 ml) , lavada sucessivamente com ácido cítrico aq. a 10 % (2x20 ml), NaCl aq. saturado (20 ml). A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi suspenso novamente em diclorometano e foi purificado através de cromatografia de fulgor em sílica gel num gradiente de etapa de 0-5 % de MeOH em diclorometano. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar uma espuma branca: 205 mg (81 %). Rf 0,4 (10 % de MeOH/CH2CI2) . ES-MS m/z 1100,6 [M+H]+, 1122,4 [M+Na]+. O grupo protetor Fmoc foi removido por tratamento com dietilamina (2 ml) em diclorometano (6 ml). Após 6 horas a temperatura ambiente, solvente foi removido sob vácuo, o produto foi isolado por cromatografia de fulgor em sílica gel num gradiente de etapa de 0-5 % de MeOH em diclorometano. As frações relevantes foram combinadas e concentradas. Após evaporação de diclorometano/hexano, 1:1, o Composto 4 foi obtido como uma espuma branca: 133 mg (80 %) . Rf 0,15 (10 % de MeOH/CH2Cl2) . ES-MS m/z 878,6 [M+H]+.
Exemplo 6 - Preparação do Composto 5
Fmoc-Meval-val-dil-OH (Exemplo 2, 0,50 g, 0,78 mmol) e dap- phe-OMe HC1 (0,3 g, 0,78 mmol, preparado de acordo com Pettit, G.R., et al. Anti-Cancer Drug Design 1998, 13, 243-277) foram dissolvidos em CH2CI2 (10 ml) seguido pela adição de diisopropiletilamina (0,30 ml, 1,71 mmol, 2,2 eq.) . DEPC (0,20 ml, 1,17, 1,5 eq.) foi adicionado e o conteúdo permaneceu sob Ar. A reação estava completa em 1 hora de acordo com HPLC. A mistura foi concentrada num óleo e purificada por cromatografia de Si02 (coluna 300 x 25 mm) e eluida com EtOAc a 100 %. O produto foi isolado como um sólido espumoso branco: 0,65 g (87 %) . ES-MS m/z 968,35 [M+H], 991,34 [M+Na]+; UV 215, 265 nm. O péptido protegido com Fmoc (0,14 g, 0,14 mmol) em cloreto de metileno (5 ml) foi tratado com dietilamina (2 ml) e o conteúdo foi mantido à temperatura ambiente durante 2 horas. A reação, completa de acordo com HPLC, foi concentrada num óleo, colocada em 2 ml de DMSO e injetada num HPLC preparativo (coluna C22-RP, 5 μ, 100 Á, gradiente linear de MeCN em água (contendo 0,1 % de TFA) de 10 a 100 % em 40 minutos, seguido por 20 minutos a 100 %, numa taxa de fluxo de 25 ml/minuto). Frações contendo o produto foram evaporadas para suportar um pó branco para o sal de trifluoroacetato. Rendimento: 0,126 g (98 %). Rf 0,28
(100 % EtOAc). ES-MS m/z 746,59 [M+H]+, 768, 51 [M+Na]+; UV ^max 215 nm.
Exemplo 7 - Preparação do Composto 6
0 sal de trifluoroacetato do Composto 5 (0,11 g, 0,13 mmol) , composto AB (0,103 g, 0,14 mmol, 1,1 eq.) e HOBt (3,4 mg, 26 pmol, 0,2 eq.) foram suspensos em DMF/piridina (2 ml/0,5 ml, respetivamente). Diisopropiletilamina (22,5 pL, 0,13 mmol, 1,0 eq.) foi adicionado e a solução amarela foi agitada enquanto mantida sob árgon. Após 3 horas, 1,0 eq. adicional de DIEA foi adicionado. 24 horas mais tarde, 0,5 eq. do ligante ativado foi incluído na mistura de reação. Após um total de 40 horas, a reação estava completa. O conteúdo foi evaporado, colocado em DMSO e injetado em HPLC preparatória (coluna Ci2-RP, 5 μ, 100 Á, gradiente linear de MeCN em água (contendo 0,1 % de TFA) de 10 a 100 % em 40 minutos, seguido por 20 minutos a 100 %, numa taxa de fluxo de 50 ml/minuto) . As frações desejadas foram evaporadas para proporcionar o produto como um óleo amarelo. Cloreto de metileno (ca. 2 ml) e éter em excesso foram adicionados para proporcionar o Composto 6 como um precipitado branco que foi filtrado e seco. Rendimento: 90
mg (52 %) . ES-MS m/z 1344,32 [M+H]+, 1366,29 [M+Na]+; UV 215, 248 nm.
Exemplo 8 - Preparação do Composto 7
0 Composto 4 (133 mg, 0,15 mmol, 1 eq.) , Composto AB (123 mg, 0,167 mmol, 1,1 eg.), e HOBt (4 mg, 0,2 eg.) foram diluídos com DMF (1,5 ml). Após 2 minutos, piridina (5 ml) foi adicionada e a reação foi monitorizada usando RP-HPLC. A reação estava completa dentro de 18 horas. A mistura de reação foi diluída com diclorometano (20 ml), lavada sucessivamente com 10 % de ácido cítrico (2x10 ml) , água (10 ml), NaCl ag. saturado (10 ml) . A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi suspenso novamente em diclorometano e foi purificado através de cromatografia de fulgor em sílica gel com um gradiente de etapas de 0-10 % de MeOH em diclorometano. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar o Composto 7 como uma espuma branca: 46 mg (21 %) . Rf 0,15 (10 % de MeOH/CH2CI2) . ES-MS m/z 1476, 94 [M+H]+.
Exemplo 9 - Preparação de éster t-butílico de MC-Val-Cit-PAB-MMAF 8
O Composto 1 (83 mg, 0,11 mmol), Composto AB (85 mg, 0,12 mmol, 1,1 eg.), e HOBt (2,8 mg, 21 pmol, 0,2 eg.) foram colocados em DMF seco (1,5 ml) e piridina (0,3 ml) enquanto mantidos sob árgon. Após 30 horas, a reação estava essencialmente completa de acordo com HPLC. A mistura foi evaporada, colocada numa quantidade mínima de DMSO e purificada por HPLC preparatória (coluna C12-RP, 5 μ, 100 Â, gradiente linear de MeCN em água (contendo 0,1 % de TFA) de 10 a 100 % em 40 minutos, seguido por 20 minutos a 100 %, numa taxa de fluxo de 25 ml/minuto) para proporcionar o Composto 8 como um sólido branco. Rendimento: 103 mg (71 %). ES- MS m/z 1387,06 [M+H]+, 14 0 9, 04 [M+Na]+; UV 2 05, 24 8 nm.
Exemplo 10 - Preparação de MC-Val-Cit-PAB-MMAF 9
O Composto 8 (45 mg, 32 pmol) foi suspenso em cloreto de metileno (6 ml) seguido pela adição de TFA (3 ml) . A solução resultante descansou durante 2 horas, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo e purificada por HPLC preparatória (coluna Ci2-RP, 5 μ, 100 Â, gradiente linear de MeCN em água (contendo 0,1 % de TFA) de 10 a 100 % em 40 minutos, seguido por 20 minutos a 100 %, numa taxa de fluxo de 25 ml/minuto). As frações desejadas foram concentradas para proporcionar maleimidocaproil-valina- citrulina-p-hidroximetilaminobenzeno-MMAF (MC-val-cit-PAB-MMAF) 9 como um sólido esbranquiçado. Rendimento: 11 mg (25 %) . ES-MS m/z 1330,29 [M+H]+, 1352,24 [M+Na]+; UV Xmax 205, 248 nm.
Exemplo 11 - Preparação de terc-butil amida de MC-Val-Cit-PAB-MMAF 10
O Composto 3 (217 mg, 0,276 mmol, 1,0 eq.), Composto AB (204 mg, 0,276 mmol, 1,0 eq.), e HOBt (11 mg, 0,0828 mmol, 0,3 eq.) foram diluídos com piridina/DMF (6 ml) . À esta mistura foi adicionado DIEA (0, 048 ml), e a mistura foi agitada durante 16 horas. Orgânicos voláteis foram evaporados sob vácuo. O resíduo bruto foi purificado por Chromatotron® (cromatografia de camada final radial) com um gradiente de etapas (0-5 metanol a 10 % em DCM) para proporcionar terc-butil amida de MC-val-cit-PAB-MMAF 10. Rendimento: 172 mg (45 %); ES-MS m/z 1386,33 [M+H]+, 1408,36 [M+Na]+; UV λ^χ 215, 248 nm.
Exemplo 12 - Preparação de AC1Q-MC-MMAE pela Conjugação de AC10 e MC-MMAE AC10, dissolvido em 500 mM de borato de sódio e 500 mM de cloreto de sódio a um pH de 8,0, é tratado com um excesso de 100 mM de ditiotreítol (DTT) . Após incubação a 37 °C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição sobre resina Sephadex G25 e eluído com PBS com 1 mM DTPA. O valor de tiol/Ab é verificado por determinação da concentração de anticorpo reduzido da absorvância a 280 nm da solução e a concentração de tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) e determinação da absorvância a 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é arrefecido em gelo. O reagente de fármaco ligante, maleimidocaproil-monometil auristatina E, isto é, MC-MMAE, dissolvido em DMSO, é diluído em acetonitrilo e água em concentração conhecida, e adicionado ao anticorpo reduzido arrefecido AC10 em PBS. Após aproximadamente uma hora, um excesso de maleimida é adicionado para resfriar rapidamente a reação e capear quaisquer grupos tióis de anticorpo não feito reagir. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e AC10-MC-MMAE é purificado e dessalinizado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 ym sob condições estéreis, e congelado para armazenagem.
Exemplo 13 - Preparação de AC1Q-MC-MMAE pela conjugação de AC10 e MC-MMAF AC10-MC-MMAF foi preparado pela conjugação de AC10 e MC- MMAF seguindo o procedimento do Exemplo 12.
Exemplo 14 - Preparação de AC1Q-MC-val-cit-PAB-MMAE pela conjugação de AC10 e MC-val-cit-PAB-MMAE AC1O-MC-val-cit-PAB-MMAE foi preparado pela conjugação de AC10 e MC-val-cit-PAB-MMAE seguindo o procedimento do Exemplo 12.
Exemplo 15 - Preparação de AC1Q-MC-val-cit-PAB-MMAF pela conjugação de AC10 e MC-val-cit-PAB-MMAF (9) AC1O-MC-val-cit-PAB-MMAF foi preparado pela conjugação de AC10 e MC-val-cit-PAB-MMAF (9) seguindo o procedimento do Exemplo 12.
Exemplo 16 - Determinação de citotoxicidade de compostos selecionados A atividade citotóxica de MMAF e dos Compostos 1-5 foi avaliada nas linhas celulares positiva Lewis Y OVCAR-3, carcinoma de mama H3396, carcinoma de pulmão L2987 e linhas celulares positiva Lewis Y de carcinoma de cólon LS174t podem ser analisadas quanto à toxicidade. Para avaliar a citotoxicidade dos Compostos 1-5, as células podem ser semeadas a cerca de 5 - 10.000 por poço em 150 μΐ de meio de cultura então tratadas com doses graduadas dos Compostos 1-5 em quadruplicatas no início do ensaio. Os ensaios de citotoxicidade são usualmente executados durante 96 horas após a adição dos compostos de teste. Cinquenta μΐ de corante resazurina podem ser adicionados a cada poço durante as últimas 4 a 6 horas da incubação para avaliar as células viáveis ao final da cultura. A redução do corante pode ser determinada por espetrometria de fluorescência usando a excitação e emissão de comprimentos de onda de 535 nm e 590 nm, respetivamente. Para análise, a extensão de redução de resazurina pelas células tratadas pode ser comparada àquela das células de controlo não tratadas.
Para ensaios de exposição de 1 hora, as células podem ser pulsadas com o fármaco durante 1 hora e então lavadas; o efeito citotóxico pode ser determinado após 96 horas de incubação. EXEMPLO 17 - dados de citotoxicidade in vitro para compostos selecionados O Quadro 10 mostra o efeito citotóxico de Conjugados de cAClO dos Compostos 7-10, analisados como descrito no Procedimento Geral I numa linha celular CD30+ Karpas 299. Os dados de duas experiências separadas são apresentados. Os conjugados de cAClO dos Compostos 7 e 9 tiveram resultados ligeiramente mais ativos que cACl0-val-cit-MMAE.
Em outras experiências, BR96-val-cit-MMAF foi pelo menos 250 vezes mais potente que o MMAF livre.
Procedimento Geral I - Determinação de citotoxicidade.
Para avaliar a citotoxicidade dos Conjugados Exemplares 7-10, as células foram semeadas a cerca de 5 - 10.000 por poço em 150 μΐ de meio de cultura, então tratadas com doses graduadas de Conjugados Exemplares 7-10 em quadruplicatas no início do ensaio. Análises de citotoxicidade foram executadas durante 96 horas após a adição dos compostos de teste. Cinquenta μΐ do corante resazurina foram adicionados a cada poço durante as últimas 4 a 6 horas da incubação para avaliar as células viáveis no final da cultura. A redução de corante foi determinada por espetrometria de fluorescência usando a excitação e emissão dos comprimentos de onda de 535 nm e 590 nm, respetivamente. Para análise, a extensão de redução de resazurina pelas células tratadas foi comparada àquela das células de controlo não tratadas. Exemplo 18 - ensaio de proliferação celular in vitro A eficácia de ADC pode ser medida por um ensaio de proliferação celular utilizando o protocolo a seguir (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62:5485-5488): 1. Uma alíquota de 100 μΐ de cultura de célula contendo cerca de 104 células (SKBR-3, BT474, MCF7 ou MDA-MB-468) no meio foi depositada em cada poço de uma lâmina de parede opaca de 96 poços. 2. Poços de controlo foram preparados contendo meio e sem células. 3. ADC foi adicionado aos poços experimentais e incubado durante 3-5 dias. 4. As lâminas foram equilibradas à temperatura ambiente durante cerca de 30 minutos. 5. Um volume de Reagente CellTiter-Glo igual ao volume de meio de cultura de célula presente em cada poço foi adicionado. 6. O conteúdo foi misturado durante 2 minutos num agitador orbital para induzir lise das células. 7. A lâmina foi incubada à temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar o sinal de luminescência. 8. A luminescência foi registada e relatada em gráficos como ULR = unidades de luminescência relativa.
Exemplo 19 - Depuração plasmática em ratos A farmacocinética de depuração plasmática de conjugados de anticorpo- fármaco e anticorpo total foi estuda em ratos Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 250-275 g cada). Os animais foram dosados por bolo de injeção da veia da cauda (IV Push). Aproximadamente 300 μΐ de sangue total foi colhido através da cânula jugular, ou alfinetada na cauda, em recipientes de anticoagulante de litio/heparina em cada ponto no tempo: 0 (pré-dose), 10 e 30 minutos; 1, 2, 4, 8, 24 e 36 horas; e 2, 3, 4, 7, 14, 21, 28 dias após a dose. O anticorpo total foi medido por ELISA - ECD/GxhuFc-HRP. Conjugado de anticorpo- fármaco foi medido por ELISA - MMAE/MMAF/ECD-Bio/SA-HRP.
Exemplo 20 - Depuração plasmática em macaco A farmacocinética de depuração plasmática de conjugados de anticorpo-fármaco e anticorpo total pode ser estuda em macacos Cynomolgus. A Figura 12 mostra um estudo de depuração da concentração plasmática de dois estágios após administração de H-MC-vc-MMAE a macacos Cynomolgus em doses diferentes: 0,5, 1,5, 2,5, e 3,0 mg/kg, administrada no dia 1 e dia 21. Concentrações de anticorpo total e ADC foram medidas periodicamente. (H = Trastuzumab).
Exemplo 21 - Eficácia in vivo de volume tumoral em explantes de ratinhos transgénicos
Animais adequados para experiências transgénicos podem ser obtidos de fontes comerciais padrões tais como Taconic (Germantown, N.Y.) . Muitas estirpes são adequadas, mas ratinhos FVB fêmeas são preferidos devido a sua alta suscetibilidade ã formação de tumor. FVB machos podem ser usados para acasalamento e machos CD.1 vasectomizados podem ser usados para estimular pseudogravidez. Ratinhos vasectomizados podem ser obtidos de qualquer fornecedor comercial. Fundadores podem ser criados tanto com ratinhos FVB quanto com ratinhos 129/BL6 x FVB p53 heterozigóticos. Os ratinhos com heterozigosidade no alelo p53 podem ser usados para aumentar potencialmente a formação de tumor. Alguns tumores F1 são de estirpe mista. Tumores primários podem ser apenas FVB.
Animais que têm tumores (aloenxerto propagado de ratinho transgénico Fo5 mmtv) podem ser tratados com uma dose única ou múltipla por injeção IV de ADC. 0 volume do tumor pode ser avaliado em vários pontos no tempo após a injeção.
Exemplo 22 - Síntese de MC-MMAF via éster t-butílico Síntese 1:
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (composto 1, 128,6 mg, 0,163 mmol) foi suspenso em CH2CI2 (0,500 ml) . Ácido 6-maleimidocaproico (68,9 mg, 0,326 mmol) e 1,3-diisopropilcarbodiimida (0,0505 ml, 0,326 mmol) foram adicionados seguido por piridina (0,500 ml). A mistura de reação foi deixada agitar durante 1,0 hora. Análise por HPLC indicou consumo completo do composto 1 de partida. Orgânicos voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O produto foi isolado através de cromatografia de fulgor de coluna, usando um gradiente de etapa de 0 a 5 % de Metanol em CH2C12. Um total de 96 mg de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (12) puro (60 % de rendimento) foi recuperado. ES-MS m/z 981,26 [M+H]+, 1003,47 [M+Na]+; 979, 65 [M-H ]-. MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Composto 12, 74 mg, 0,0754 mmol) foi suspenso em CH2C12 (2,0 ml) e TFA (1 ml) à temperatura ambiente. Após 2,5 horas, análise de HPLC indicou consumo completo do material de partida. Orgânicos voláteis foram evaporados sob pressão reduzida, e o produto foi isolado através de RP-HPLC preparatória, usando uma Coluna Phenomenex C22 Synergi Max-RP 80Á (250 x 21,2 mm) .
Eluente: gradiente linear 10 % a 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq.) durante 30 minutos, então 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) isocrático durante mais 20 minutos. ES-MS m/z 925,33 [M+H ] +; 947,30 [M+Na]+; 923,45 [M-H ] -.
Exemplo 23a - Síntese de MC-MMAF (11) via éster dimetoxibenzílico Síntese 2:
Preparação de éster Fmoc-L-Fenilalanina-2,4- dimetoxibenzílico (Fmoc-Phe-ODMB)
Um balão de fundo redondo de 5 L, 3 gargalos, foi carregado com Fmoc-L-fenilalanina (200 g, 516 mmol Bachem), álcool 2,4-dimetoxibenzílico (95,4 g, 567 mmol, Aldrich), e CH2C12 (2,0 L). N,N-dimetilformamida t-butil acetal (155 ml, 586 mmol, Fluka) foi adicionado à suspensão resultante durante 20 minutos sob N2, o que resultou numa solução límpida. A reação foi, então, agitada à temperatura ambiente durante a noite, e após este período de tempo análise TLC (0,42, Heptano/EtOAc = 2:1) indicou que a reação estava completa. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para proporcionar um óleo amarelo claro, que foi redissolvido em CH2C12 (200 ml) e purificado através de um plugue curto de sílica gel (25 cm x 25 cm, CH2C12) para proporcionar uma espuma incolor (250 g). MeCN (1 L) foi adicionado na espuma resultante, que dissolveu totalmente o lote. Ela foi então concentrada até secagem e redissolvida em MeCN (1 L) e a suspensão resultante foi agitada durante 1 hora, filtrada e o bolo de filtragem foi enxaguado com MeCN (2 x 200 ml) para proporcionar éster Fmoc-L-fenilalanina-2,4-dimetoxibenzílico como um sólido branco (113,58 g, 41 %, 95,5 % AUC por análise de HPLC) .
Dados: HPLC.
Preparação de éster L-fenilalanina-2,4-dimetoxibenzílico (Phe-ODMB).
Um balão de fundo redondo de 500 ml foi carregado com éster Fmoc-L-fenilalanina-2,4-dimetoxibenzílico (26,00 g, 48,3 mmol), CH2C12 (150 ml) e dietilamina (75 ml, Acros). A mistura foi agitada à temperatura ambiente e o término foi monitorizado por HPLC. Após 4 horas, a mistura foi concentrada (temperatura do banho < 30 °C) . O resíduo foi novamente suspenso em CH2C12 (20 ml), e concentrado. Isso foi repetido mais uma vez. Ao resíduo foi adicionado MeOH (20 ml), o que causou a formação de um gel. Este resíduo foi diluído com CH2C12 (200 ml), concentrado e o óleo turvo foi deixado sob vácuo durante a noite. O resíduo foi suspenso em CH2C12 (100 ml), então tolueno (120 ml) foi adicionado. A mistura foi concentrada e o resíduo foi deixado sob vácuo durante a noite.
Dados: HPLC, 1H RMN.
Preparação de Fmoc-Dolaproína (Fmoc-Dap)
Boc-Dolaproína (58,8 g, 0,205 mol) foi suspenso em 4 N HC1 em 1,4-dioxano (256 ml, 1,02 mol, Aldrich). Após agitação durante 1,5 horas, análise de TLC indicou que a reação estava completa (10 % de MeOH/CH2Cl2) e a mistura foi concentrada até secagem quase completa. 1,4-dioxano adicional foi carregado (50 ml) e a mistura foi concentrada até secagem e seca sob vácuo durante a noite. O sólido branco resultante foi dissolvido em H20 (400 ml) e transferido para um balão de fundo redondo, de 3 L, três gargalos, com um agitador mecânico e sonda de temperatura. N,N-diisopropiletilamina (214,3 ml, 1,23 mol, Acros) foi adicionado durante um minuto, causando uma exoterma de 20,5 a 28,2 °C (interna). A mistura foi arrefecida num banho de gelo e 1,4-dioxano foi adicionado (400 ml). Uma solução de Fmoc-OSu (89,90 g, 0,267 mol, Advanced ChemTech) em 1,4-dioxano (400 ml) foi adicionada de um funil de adição durante 15 minutos, mantendo a temperatura de reação a seguir de 9 °C. A mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante 19 horas, após o que a mistura foi concentrada por evaporação giratória até uma pasta aquosa (390 g). A suspensão foi diluída com H20 (750 ml) e Et20 (750 ml) , causando a formação copiosa de um precipitado branco. As camadas foram separadas, mantendo os sólidos com a camada orgânica. A camada aquosa foi acidificada usando HC1 concentrado (30 ml) e extraída com EtOAc (3 x 500 ml). Os extratos combinados foram secos com MgS04, filtrados e concentrados para proporcionar 59,25 de um óleo amarelo A. O extrato de Et20 foi extraído uma vez com "sat" (SIC) . NaHC03 (200 ml) , mantendo os sólidos com a camada aquosa. A suspensão aquosa foi acidificada usando HC1 concentrado (50 ml) e extraída com Et20 (50 ml) , mantendo os sólidos com a camada orgânica. A camada orgânica foi filtrada e concentrada para proporcionar 32,33 g de um óleo amarelo B. Os dois óleos (A e B) foram combinados e purificados por cromatografia de fulgor em sílica gel eluindo com CH2C12 (3,5 L) , então 3 % de
MeOH/CH2C12 (9 L) para proporcionar 68,23 g de Fmoc- dolaproína como uma espuma branca (81 %, 97,5 % de pureza por HPLC (AUC)).
Preparação de Fmoc-Dap-Phe-ODMB
Phe-ODMB bruto (48,3 mmol) foi suspenso em DMF anidro (105 ml, Acros) durante 5 minutos e Fmoc-Dap (19,80 g, 48,3 mmol) foi adicionado. A mistura foi arrefecida num banho de gele e TBTU (17,08 g, 53,20 mmol, Matrix Innovations) foi adicionado. N,N-diisopropiletilamina (25,3 ml, 145,0 mmol, Acros) foi adicionada através de seringa durante 3 minutos. Após 1 hora, o banho de gelo foi removido e a mistura foi deixada aquecer durante 30 minutos. A mistura foi colocada em água (1 L) e extraída com acetato de etilo (300 ml) . Após separação, a camada aquosa foi novamente extraída com acetato de etilo (2 x 150 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (150 ml), secas (MgSCq) e filtradas (filtro de papel) para remover os insolúveis (inorgânicos e um pouco de dibenzofulveno). Após concentração, o resíduo (41 g) foi absorvido em sílica (41 g) e purificado por cromatografia (coluna de 22 cm x 8 cm; 65 % de Heptano/EtOAc (2,5 L); 33 % de Heptano/EtOAc (3,8 L) , para proporcionar 29,4 g de produto como uma espuma branca (86 %, 92 % de pureza por HPLC).
Dados: HPLC, 1H RMN, TLC (1:1 EtOAc/Heptano Rf = 0,33, vermelho em coloração com vanilina).
Preparação de Dap-Phe-ODMB
Um balão de fundo redondo de 1 L foi carregado com Fmoc-Dap- Phe-ODMB (27,66 g), CH2CI2 (122 ml) e dietilamina (61 ml, Acros). A solução foi agitada à temperatura ambiente e o término foi monitorizado por HPLC. Após 7 horas, a mistura foi concentrada (temperatura do banho < 30 °C) . O resíduo foi suspenso em CH2C12 (300 ml) e concentrado. Isto foi repetido duas vezes. Ao resíduo foi adicionado MeOH (20 ml) e CH2CI2 (300 ml) , e a solução foi concentrada. O resíduo foi suspenso em CH2C12 (100 ml) e tolueno (400 ml) , concentrado, e o resíduo foi deixado sob vácuo durante a noite para proporcionar um resíduo tipo creme.
Dados: HPLC, 1H RMN, MS Preparação de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Dap-Phe-ODMB bruto (39,1 mmol) foi suspenso em DMF anidro (135 ml, Acros) durante 5 minutos e Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (24,94 g, 39,1 mmol, veja-se Exemplo 2 para preparação) foi adicionado. A mistura foi arrefecida num banho de gelo e TBTU (13,81 g, 43,0 mmol, Matrix
Innovations) foi adicionado. N,N-diisopropiletilamina (20,5 ml, 117,3 mmol, Acros) foi adicionada através de seringa durante 2 minutos. Após 1 hora, o banho de gelo foi removido e a mistura foi deixada aquecer durante 30 minutos. A mistura foi colocada em água (1,5 L) e diluída com acetato de etilo (480 ml) . Após descansar durante 15 minutos, as camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (300 ml) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (200 ml), secas (MgS04) e filtradas (filtro de papel) para remover os insolúveis (inorgânicos e um pouco de dibenzofulveno). Após concentração, o resíduo (49 g) foi raspado do balão e absorvido em sílica (49 g) e purificado por cromatografia (coluna dia de 15 cm x 10 cm; 2:1 EtOAc/Heptano (3 L) , EtOAc (5L); frações de 250 ml) para proporcionar 31,84 g de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB como uma espuma branca (73 %, 93 % de pureza por HPLC (AUC)).
Dados, HPLC, TLC (2:1 EtOAc/heptano, Rf = 0,21, vermelho em coloração com vanilina).
Preparação de MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Um balão de fundo redondo de 1 litro foi carregado com Fmoc- MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (28,50 g) , CH2CI2 (80 ml) e dietilamina (40 ml). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite e então foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi absorvido em sílica (30 g) e purificado por cromatografia de fulgor (coluna dia de 15 cm x 8 cm; 2 % de MeOH/DCM (2L), 3 % de MeOH/DCM (1 L), 6 % de MeOH/DCM (4 L) ; frações de 250 ml) para proporcionar 15,88 g de MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB como uma espuma branca (69 %, 96 % de pureza por HPLC (AUC)).
Dados: HPLC, TLC (6 % de MeOH/DCM, Rf = 0,24, vermelho em coloração com vanilina).
Preparação de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Um balão de fundo redondo, 50 ml, foi carregado com MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (850 mg, 0,85 mmol), DMF anidro (4 ml), ácido maleimidocaproico (180 mg, 0,85 mmol), e TBTU (300 mg, 0,93 mmol, Matrix Innovations) à temperatura ambiente. N,N-diisopropiletilamina (450 pL, 2,57 mmol) foi adicionado através de seringa. Após 1,5 horas, a mistura foi colocada em água (50 ml) e diluída com acetato de etilo (30 ml) . NaCl foi adicionado para melhorar a separação. Após separação das camadas, a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (25 ml) . As camadas orgânicas combinadas foram secas (MgS04) , filtradas e concentradas. O óleo resultante (1 g) foi purificado por cromatografia de fulgor [100 ml de sílica; 25 % de Heptano/EtOAc (100 ml), 10 % de Heptano/EtOAc (200 ml), EtOAc (1,5 L)] para proporcionar MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (13) como uma espuma branca (521 mg, 57 %, 94 % de pureza por HPLC (AUC)) .
Dados: 1H RMN, HPLC.
Preparação de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH (MC-MMAF) (11)
Um balão de fundo redondo de 50 ml foi carregado com MC- MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (Composto 13, 428 mg, 0,39 mmol) e dissolvido em 2,5 % de TFA/CH2CI2 (20 ml) . A solução tornou-se rosa-roxa durante 2 minutos. O término foi monitorizado por HPLC e TLC (6 % de MeOH/DCM, coloração com KMn04) . Após 40 minutos, três gotas de água foram adicionadas e a mistura turva rosa-roxo foi concentrada para proporcionar 521 mg de um resíduo de cor rosa. Purificação por cromatografia (15 % IPA/DCM) proveu 270 mg de MC- MMAF (73 %, 92 % de pureza por HPLC) como um sólido branco.
Exemplo 23b - Síntese de análogo de mc-MMAF
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Composto 1, 35 mg, 0,044 mmol) foi suspenso em DMF (0,250 ml) . Ácido 4-(2,5-Dioxo-2,5-diidro-pirrol-l-il) - benzoico (11 mg, 0,049 mmol) e HATU (17 mg, 0,044 mmol) foram adicionados, seguidos por DIEA (0,031 ml, 0,17 mmol) . Esta mistura de reação foi deixada agitar durante 2,0 horas. Análise de HPLC indicou consumo completo do composto 1 de partida. O produto foi isolado através de RP-HPLC preparatória, usando uma Coluna Phenomenex Ci2 Synergi Max-RP 80 Ã (250 x 21,20 mm). Eluente: gradiente linear 10 % a 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) durante 8 minutos, então 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) isocrático durante mais 12 minutos. Um total de 20 mg de produto puro (14) foi isolado (0,02 mmol, 46 % de rendimento). ES-MS m/z 987,85 [M+H]+, 1019,41 [M+Na] +; 985,54 [M-H] - . MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Composto 14, 38 mg,
0,0385 mmol) foi suspenso em CH2CI2 (1 ml) e TFA (1 ml). A mistura foi agitada durante 2,0 horas, e então os orgânicos voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O produto foi purificado por RP-HPLC preparatória, usando uma Coluna Phenomenex C12 Synergi Max-RP 80 Á (250 x 21,20 mm) . Eluente: gradiente linear 10 % a 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (ag) durante 8 minutos, então 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (ag) isocrático durante mais 12 minutos. Um total de 14,4 mg de produto MB-MMAF foi isolado (0,015 mmol, 40 % de rendimento). ES-MS m/z 930,96 [M+H]+, 952,98 [M+Na]+; 929,37 [Μ-ΗΓ.
Exemplo 23c - Preparação de MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF (16)
A uma suspensão à temperatura ambiente de Fmoc-MeVal-OH (3,03 g, 8,57 mmol) e carbonato de N,N'-dissuccimidilo (3,29 g, 12,86 mmol) em CH2C12 (80 ml) foi adicionado DIEA (4,48 ml, 25,71 mmol). Esta mistura de reação foi deixada agitar durante 3,0 horas, e então foi colocada num funil de separação onde a mistura orgânica foi extraída com 0,1 M HC1 (ag). O resíduo orgânico bruto foi concentrado sob pressão reduzida, e o produto foi isolado por cromatografia de fulgor de coluna em sílica gel usando um gradiente linear de 20-100 % de acetato de etila/hexanos. Um total de 2,18 g de Fmoc-MeVal- OSu puro (4,80 mmol, 56 % de rendimento) foi recuperado. A uma suspensão de Fmoc-MeVal-OSu (2,18 g, 4,84 mmol) em DME (13 ml) e THF (6,5 ml) à temperatura ambiente foi adicionada uma solução de L-citrulina (0,85, 4,84 mmol) e NaHC03 (0,41 g, 4,84 mmol) em H20 (13 ml). A suspensão foi deixada agitar à temperatura ambiente durante 16 horas, então foi extraída em terc-Bu0H/CHCl3/H20, acidificada a um pH = 2-3 com 1 M HC1. A fase orgânica foi separada, seca e concentrada sob pressão reduzida. 0 resíduo foi triturado com dietil éter resultando em 2,01 g de Fmoc- MeVal-Cit-COOH que foi usado sem purificação adicional. O Fmoc-MeVal-cit-COOH bruto foi suspenso em CH2CI2/MeOH a 2:1 (100 ml), e a ele foi adicionado álcool p-aminobenzí lico (0,97 g, 7,9 mmol) e EEDQ (1,95 g, 7,9 mmol). Esta suspensão foi deixada agitar durante 125 horas, então os orgânicos voláteis foram removidos sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de fulgor em sílica gel, usando 10 % de MeOH/CH2Cl2. Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH puro (0,55 g, 0,896 mmol, 18,5 % de rendimento) foi recuperado. ES-MS m/z 616,48 [M+H]+. A uma suspensão de Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH (0,55 g, 0,896 mmol) em CH2CI2 (40 ml) foi adicionado STRATOSPHERES™ (ligado a piperazina-resina) (> 5 mmol/g, 150 mg). Após ser agitada à temperatura ambiente durante 16 horas, a mistura foi filtrada através de celite (pré-lavada com MeOH), e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi triturado com dietil éter e hexanos. O material sólido resultante, MeVal-Cit-PAB-OH, foi suspenso em CH2C12 (20 ml) , e a ele foi adicionado MC-OSu (0,28 g, 0,896 mmol), DIEA (0,17 ml, 0,99 mmol), e DMF (15 ml) . Esta suspensão foi agitada durante 16 horas, mas análise de HPLC da mistura de reação indicou reação incompleta, assim a suspensão foi concentrada sob pressão reduzida até um volume de 6 ml, então uma solução a 10 % de NaHC03 (aq) foi adicionada e a suspensão foi agitada por mais 16 horas. Solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de fulgor em sílica gel, usando um gradiente de 0-10 % de MeOH/CH2Cl2, resultando em 42 mg (0,072 mmol, 8 % de rendimento) de MC-MeVal-Cit-PAB-OH. A uma suspensão de MC-MeVal-Cit-PAB-OH (2,37 g, 4,04 mmol) e bis (nitrofenil)carbonato (2,59 g, 8,52 mmol) em CH2C12 (10 ml) foi adicionado DIEA (1,06 ml, 6,06 mmol) .
Esta suspensão foi agitada durante 5,5 horas, concentrada sob pressão reduzida e purificada por trituração com dietil éter. MC-MeVal-Cit-PAB-OCO-pNP (147 mg, 0,196 mmol) foi suspensa numa solução de 1:5 de piridina/DMF (3 ml), e a isto foi adicionado HOBt (5 mg, 0,039 mmol), DIEA (0,17 ml, 0,978 mmol) e MMAF (composto 2, 150 mg, 0,205 mmol). Esta mistura de reação foi agitada durante 16 horas à temperatura ambiente, e então purificada por RP-HPLC preparatória (x3), usando uma Coluna Phenomenex C12 Synergi Max-RP 80 Á (250 x 21,20 mm) . Eluente: gradiente linear 10 % a 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) durante 30 minutos, então 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) isocrático durante mais 20 minutos. MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF (16) foi obtido como um sólido amarelado (24,5 mg, 0,0182, 0,45 % de rendimento) . ES-MS m/z 1344, 95 [M+H]+, 1366, 94 [M+Na]+. Exemplo 23d - Preparação de éster de succinimida de suberil Val-Cit-PAB-MMAF (17)
Composto 17 O composto 1 (300 mg, 0,38 mmol), Fmoc-Val-cit-PAB-pNP (436 mg, 0,57 mmol, 1,5 eq.) foram suspensos em piridina anidra, 5 ml. HOBt (10 mg, 0,076 mmol, 0,2 eq.) foi adicionado seguido por DIEA (199 μΐ, 1,14 mmol, 3 eq.) . A mistura de reação foi exposta a ondas sonoras durante 10 minutos, e então foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Piridina foi removida sob pressão reduzida, o resíduo foi novamente suspenso em CH2C12. A mistura foi separada por cromatografia de fulgor de sílica gel num gradiente de etapa de MeOH, de 0 a 10 %, em CH2C12. As frações contendo produto foram extraídas, concentradas, secas em vácuo durante a noite para proporcionar 317 mg (59 % de rendimento) de Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu. ES-MS m/z 1415,8 [M+H]+.
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu (100 mg) foi agitado em 20 % de TFA/CH2C12 (10 ml), durante 2 horas. A mistura foi diluída com CH2C12 (50 ml) . A camada orgânica foi lavada sucessivamente com água (2 x 30 ml) e salmoura (1 x 30 ml). A fase orgânica foi concentrada, carregada numa almofada de sílica gel em 10 % de MeOH/CH2Cl2. O produto foi eluído com 30 % de MeOH/CH2Cl2. Após secagem sob vácuo durante a noite, Fmoc-Val-Cit- PAB-MMAF foi obtido como um sólido branco, 38 mg, 40 % de rendimento. ES- MS m/z 1357,7 [M-H]-
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF, 67 mg, foi suspenso em CH2C12 (2 ml) dietilamina (2 ml) e DMF (2 ml) . A mistura foi agitada durante 2 horas à temperatura ambiente. Solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi co-evaporado com piridina (2 ml), então com tolueno (2x5 ml), seco sob vácuo. Val-Cit-PAB-MMAF foi obtido como um óleo amarronzado, e usado sem purificação adicional.
Todo Val-Cit-PAB-MMAF preparado de 67 mg de Fmoc-Val-cit- PAB-MMAF, foi suspenso em piridina (2 ml) , e adicionado a uma solução de suberato de dissuccinimidilo (74 mg, 0,2 mmol, 4 eq.), em piridina (1 ml). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente. Após 3 horas, éter (20 ml) foi adicionado. Precipitado foi colhido, lavado com uma quantidade adicional de éter. Um sólido avermelhado foi suspenso em 30 % de MeOH/ CH2C12, filtrado através de uma almofada de sílica gel com 30 % de MeOH/ CH2C12 como um eluente. O Composto 17 foi obtido como um sólido branco, 20 mg (29 % de rendimento). ES-MS m/z 1388,5 [M-H]-.
Exemplo 24 - Eficácia In vivo de Conjugados Anticorpo-Fármaco mcMMAF
Eficácia de cAClO-mcMMAF em xenoenxertos de Karpas-1299 ALCL: Para avaliar a eficácia in vivo de cAClO-mcMMAF com uma média de 4 frações de fármaco por anticorpo (cAClO-mcF4), células Karpas-299 humana ALCL foram implantadas subcutaneamente em ratinhos C.B-17 SCID imunodeficiente (5xl06 células por ratinho). Os volumes de tumor foram calculados usando a fórmula (0,5xLxW2) onde L e W são as duas medições bidirecionais, mais longa e mais curta. Quando o volume médio do tumor nos animais do estudo atingiu cerca de 100 mm3 (intervalo 48-162), os ratinhos foram divididos em 3 grupos (5 ratinhos por grupo) e foram tanto deixados sem tratamento quanto foram proporcionados com uma injeção intravenosa única através da veia da cauda com 1 ou 2 mg/kg cAC10-mcF4 (Figura 1) . Os tumores nos ratinhos não tratados cresceram rapidamente até um volume médio de > 1.000 mm3 dentro de 7 dias do início da terapêutica. Em contraste, todos os tumores tratados com cAC10-mcF4 mostraram regressão rápida com 3/5 no grupo de 1 mg/kg e 5/5 no grupo de 2 mg/kg obtendo resposta completa do tumor. Embora o tumor num dos indivíduos totalmente respondedores no grupo de 2 mg/kg tenha recorrido cerca de 4 semanas mais tarde, não houve tumores detetáveis nos 4/5 das respostas remanescentes neste grupo e nos 3 casos de resposta completa no grupo de 1 mg/kg nas 10 semanas após a terapêutica.
Eficácia de cBR96-mcMMAF nos Xenoenxertos L2981 NSCLC: cBR96 é um anticorpo quimérico que reconhece o antigénio LeY. Para avaliar a eficácia in vivo de cBR96-mcMMAF com 4 fármacos por anticorpo (cBR96-mcF4) fragmentos de tumor de cancro de pulmão de célula grande L2987 (NSCLC) foram implantadas em ratinho nu atímico. Quando os tumores atingiram uma média de cerca de 100 mm3, os ratinhos foram divididos em 3 grupos: grupo não tratado e 2 grupos de terapêuticas. Para terapêutica, conforme mostrado na Figura 3a, os ratinhos receberam cBR96- mcF4 em doses de 3 ou 10 mg/kg/in jeção cada 4 dias para um total de 4 injeções (q4dx4). Conforme mostrado na Figura 3b, cBR96-mcF4 ou um conjugado de controlo não ligando foi administrado aos ratinhos em injeções de 3 ou 10 mg/kg a cada 4 dias, num total de 4 injeções (q4dx4). Conforme mostrado nas Figuras 3a e 3 b, BR96-mcF4 produziu atraso pronunciado no crescimento do tumor se comparado aos controlos. A Figura 2 mostra um ensaio de eficácia in vivo, de dose única de cAClO-mcMMAF em L540CY subcutaneamente. Para este estudo existiam 4 ratinhos no grupo sem tratamento e 10 em cada um dos grupos de tratamento.
Exemplo 25 - Eficácia In vitro de Conjugados de Anticorpo-Fármaco mc-MMAF
Atividade de conjugados de cAClO-anticorpo-fármaco contra linhas celulares CD30+. As Figuras 4a e 16b mostram curvas de resposta a dosagem de uma experiência representativa onde culturas de Karpas 299 (linfoma de célula grande anaplástico) e L428 (Linfoma de Hodgkin) foram incubadas com cAClO-mcMMAF diluído (Figura 4a) ou cAC-10-vcMMAF (Figura 4b) de forma serial durante 96 horas. As culturas foram marcadas durante 4 horas com 50 μΜ de resazurina [10-óxido de 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona] e a fluorescência foi medida. Os dados foram reduzidos no GraphPad Prism, versão 4.000, usando o procedimento de ajuste de curva de dose - resposta de 4 de parâmetros. Os valores IC50 são definidos como a concentração onde o crescimento é reduzido 50 % se comparado com culturas de controlo não tratadas. Cada concentração foi testada quatro vezes.
Atividade de conjugados de cBR96-anticorpo-fármaco contra linhas celulares LeY+. As Figuras 5a e 5b mostram curvas de resposta de dose de uma experiência representativa onde culturas de H3396 (carcinoma de mama) e L2987 (carcinoma de pulmão de célula grande) foram incubadas com cBR96-mcMMAF (Figura 5a) ou -vcMMAF (Figura 5b) diluídos de forma serial durante 96 horas. As culturas foram marcadas durante 4 horas com resazurina 50 μΜ e a fluorescência foi medida. Os dados foram reduzidos no GraphPad Prism, versão 4.000, usando o procedimento de ajuste de 4-dose de parâmetro-curva de resposta. Os valores IC50 são definidos como a concentração onde o crescimento é reduzido 50 % se comparado com culturas de controlo não tratadas. Cada concentração foi testada quatro vezes.
Atividade de conjugados de clF6-anticorpo-fármaco contra linhas celulares de carcinoma de célula renal CD70+. As Figuras 6a e 6b mostram curvas de resposta-dose de uma experiência representativa onde culturas de células Caki-1 e 786-0 foram incubadas com clF6-mcMMAF (Figura 6a) ou -vcMMAF (Figura 6b) diluídos de forma serial durante 96 horas. As culturas foram marcadas durante 4 horas com resazurina 50 μΜ e a fluorescência foi medida. Os dados foram reduzidos no GraphPad Prism, versão 4.000, usando o procedimento de ajuste de curva de dose - resposta de 4 parâmetros. Os valores IC50 são definidos como a concentração onde o crescimento é reduzido 50 % se comparado com culturas de controlo não tratadas. Cada concentração foi testada quatro vezes.
Exemplo 26 - Purificação de Trastuzumab
Um balão contendo 440 mg de anticorpo HERCEPTIN® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Patente US N° 5821337) foi dissolvido em 50 ml de tampão MES (25 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5,6) e carregados numa coluna de troca catiónica (Sepharose S, 15 cm x 1,7 cm) que havia sido equilibrada no mesmo tampão. A coluna foi, então, lavada com o mesmo tampão (5 volumes de coluna) . Trastuzumab foi eluído por elevação da concentração de NaCl do tampão para 200 mM. Frações contendo o anticorpo foram agrupadas, diluídas a 10 mg/ml, e dialisadas num tampão contendo 50 mm de fosfato de potássio, 50 mM NaCl, 2 MM EDTA, pH 6,5.
Exemplo 27 - Preparação de Trastuzumab-MC-MMAE por
Conjugação de Trastuzumab e MC-MMAE
Trastuzumab dissolvido em borato de sódio 500 mM e cloreto de sódio 500 mM a um pH de 8,0 é tratado com um excesso de ditiotreitol (DTT) 100 mM. Após incubação a 37 °C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição com resina Sephadex G25 e eluido com PBS com DTPA 1 mM. O valor tiol/Ab é verificado por determinação da concentração de anticorpo reduzido a partir da absorvância a 280 nm da solução e a concentração de tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) e a determinação da absorvância a 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é arrefecido em gelo. O reagente de ligante de fármaco, maleimidocaproí1-monometil auristatina E (MMAE), isto é MC-MMAE, dissolvido em DMSO, é diluído em acetonitrilo e água em concentração conhecida, e adicionado ao anticorpo trastuzumab reduzido arrefecido em PBS. Após cerca de 1 hora, um excesso de maleimida é adicionado para resfriar rapidamente a reação e capear quaisquer grupos tióis de anticorpo não reagidos. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e trastuzumab-MC-MMAE é purificado e dessalinizado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 um sob condições estéreis, e congelado para armazenagem.
Exemplo 28 - Preparação de Trastuzumab-MC-MMAF por
Conjugação de Trastuzumab e MC-MMAF
Trastuzumab-MC-MMAF foi preparado pela conjugação de trastuzumab e MC-MMAF seguindo o procedimento do Exemplo 27 .
Exemplo 29 - Preparação de Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAE por Conjugação de Trastuzumab e MC-val-cit-PAB-MMAE
Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAE foi preparado pela conjugação de trastuzumab e MC-val-cit-PAB-MMAE seguindo o procedimento do Exemplo 27.
Exemplo 30 - Preparação de Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF por Conjugação de trastuzumab e MC-val-cit-PAB-MMAF 9
Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF foi preparado pela conjugação de trastuzumab e MC-val-cit-PAB-MMAF 9 seguindo o procedimento do Exemplo 27.
Exemplo 31 - Toxicidade em Rato O perfil de toxicidade aguda de fármacos e ADC livres foi avaliado em ratos Sprague-Dawley adolescentes (75-125 g cada, Charles River Laboratories (Hollister, CA)) Os animais foram injetados no dia 1, perfis completos da química e hematologia foram obtidos na linha basal, dia 3 e dia 5 e uma necropsia completa foi executada no dia 5. Medições de enzima hepática foram efetuadas em todos os animais e histologia de rotina foi executada em três animais de forma aleatória para cada grupo para os tecidos a seguir: esterno, fígado, rins, timo, baço, intestino grosso e delgado. Os grupos experimentais foram como se segue:
Para trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit- PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF e trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF, o pg MMAF/m2 foi calculado usando 731,5 como o Peso Molecular (PM) de MMAF e 145167 como o PM de Herceptin . A área superficial corporal foi calculada como se segue: [{ (peso corporal em gramas a 0, 667 de força) x 11,8J/10000] . (Guidance for Industry and Reviewers, 2002) .
As soluções de dose foram administradas por uma injeção única intravenosa em bolo na veia da cauda no Dia 1 do Estudo num volume de dose de 10 ml/kg. Os pesos corporais dos animais foram medidos antes da dose no Dia 1 do Estudo e diariamente no período restante. Sangue total foi colhido em tubos contendo EDTA para análise hematológica. Sangue total foi colhido em tubos com separador de soro para análise de química clínica. Amostras de sangue foram colhidas antes da dose no Dia 4 do Estudo, Dia 3 do Estudo e Dia 5 do Estudo. Sangue total foi também colhido em tubos contendo heparina de sódio na necropsia e o plasma foi congelado a -70 °C para possível análise posterior. Os tecidos a seguir foram colhidos e colocados em formalina tamponada neutra na necropsia: fígado, rins, coração, timo, baço, cérebro, esterno e seções do trato GI, incluindo estômago, intestino grosso e delgado. O esterno, intestino delgado, intestino grosso, fígado, timo, baço e rins foram examinados.
Os níveis de enzima sérico associados a o fígado em cada ponto no tempo foram comparados a um intervalo (de 5 a 95 por cento) de ratos Sprague-Dawley fêmeas normais. Contagens de leucócitos e plaquetas em cada ponto no tempo foram comparadas com um intervalo (5 a 95 por cento) de ratos Sprague-Dawley fêmeas normais.
Estudo de alta dose em ratos Sprague-Dawley fêmeas normais:
Tecidos de 11 animais foram submetidos a histologia de rotina. Estes animais haviam participado de um estudo de toxicidade aguda de intervalo de dosagem usando um imunoconjugado trastuzumab-MC-MMAF. Os animais foram acompanhados durante 12 dias após a dosagem.
Exemplo 32 - Toxicidade/Segurança em Macaco Cynomolgus
Três grupos de quatro (2 machos, 2 fêmeas) Macaca fascicularis naive (macaco cynomolgus) foram estudados em relação a tratamento com trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE e trastuzumab-MC- vc-PAB-MMAF. A administração intravenosa foi conduzida nos dias 1 e 22 dos estudos.
A dosagem é expressa na área superficial de um animal de modo a ser relevante a outras espécies, isto é, dosagem em pg/m2 é dependente da espécie e, dessa maneira, comparável entre espécies. As formulações de ADC continham PBS, fosfato de sódio a 5,4 mM, fosfato de potássio a 4,2 mM, cloreto de sódio a 140 mM, pH 6,5. O sangue foi colhido para análise hematológica antes da dose, e 5 minutos, 6 horas, 10 horas, e 1, 3, 5, 7, 14,
21 dias após cada dose. Contagens de eritrócito (RBC) e plaqueta (PLT) foram efetuadas pelo método de difusão de luz. A contagem de leucócitos (WBC) foi efetuada pelo método de peroxidase/basófilo. A contagem de reticulócito foi efetuada pelo método de difusão de luz com corante catiónico. Contagens de célula foram efetuadas num aparelho Advia 120. ALT (aminotransferase alanina) e AST (aminotransferase aspartato) foram medidos em U/L por UV/NADH; metodologia IFCC num equipamento Olympus AU400, e usando os testes Ab ELISA Total - ECD/GxhuFc-HRP. Conj. Ab ELISA - MMAE/MMAF//ECD- Bio/SA-HRP.
Exemplo 33 - Produção, Caracterização e Humanização de
Anticorpo Monoclonal Anti-Erbb2 4D5 O anticorpo monoclonal de murino 4D5 que se liga especificamente ao domínio extracelular de ErbB2 foi produzido conforme descrito em Fendly et al. (1990) Cancer Research 50:1550-1558. Em resumo, células NIH 3T3/HER2-34oo (que expressam cerca de 1 x 105 moléculas ErbB2/célula) produzidas conforme descrito em Hudziak et al. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84:7158-7163 (1987) foram colhidas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo EDTA a 25 mM e usadas para imunizar ratinhos BALB/c. Os ratinhos receberam injeções i.p. de 107 células em 0,5 ml de PBS nas semanas 0, 2, 5 e 7. Os ratinhos com antissoro que precipitou imunologicamente 32P-ErbB2 marcado receberam injeções i.p. de um extrato de membrana de ErbB2 purificado de aglutinina/Sepharose de germe de trigo (WGA) nas semanas 9 e 13. Isto foi seguido por uma injeção i.v. de 0,1 ml da preparação de ErbB2 e os esplenócitos foram fundidos com a linha de mieloma de ratinho X63-Ag8.653. Flutuantes de hibridoma foram explorados quanto à ligação a ErbB2 por ELISA e radioimunoprecipitação.
Mapeamento e Caracterização de Epítopo 0 epítopo de ErbB2 ligado por anticorpo monoclonal 4D5 foi determinado por análise de ligação competitiva (Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990) . Estudos de bloqueio cruzado foram efetuados por fluorescência direta em células intactas usando a "PANDEX™ Screen Machine" para quantificar a fluorescência. O anticorpo monoclonal foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), usando procedimentos estabelecidos (Wofsy et ai. Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel e Schiigi (eds.) São Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Monocamadas confluentes de células de NIH 3T3/HER2-340o foram tripsinizadas, lavadas uma vez, e suspensas novamente a 1,75 x 105 células/ml em PBS frio contendo 0,5 % de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1 % de NaN3. Uma concentração final de 1 % de partículas de látex (IDC, Portland, OR) foi adicionado para reduzir a coagulação das membranas da lâmina PANDEX™. Células em suspensão, 20 e 20 μΐ de anticorpos monoclonais purificados (100 pg/ml a 0,1 yg/ml) foram adicionadas aos poços da lâmina PANDEX™ e incubados em gelo durante 30 minutos. Uma diluição predeterminada para o anticorpo monoclonal marcado com FITC em 20 μΐ foi adicionada em cada poço, incubada durante 30 minutos, lavada, e a fluorescência foi quantificada pelo PANDEX™. Anticorpos monoclonais partilham um epítopo se cada ligação bloqueada do outro em 50 % ou mais, em comparação com um controlo de anticorpo monoclonal irrelevante. Neste experiência, o anticorpo monoclonal 4D5 foi designado epítopo I (resíduos de aminoácidos de cerca de 529 a cerca de 625, inclusive dentro do domínio extracelular de ErbB2).
As características inibidoras de crescimento de anticorpo monoclonal 4D5 foram avaliadas usando a linha celular tumoral, SK-BR-3 (veja-se Hudziak et al. (1989) Molec. Cell. Biol. 9(3) :1165-1172) . Em resumo, células SK- BR-3 foram separadas usando 0,25 % (vol/vol) de tripsina e suspensas em meio completo a uma densidade de 4 x 105 células por ml. Aliquotas de 100 μΐ (4 x 104 células) foram colocadas na lâmina em lâminas de microdiluição de 96 poços, as células foram deixadas aderir, e 100 μΐ de meio sozinho ou meio contendo anticorpo monoclonal (concentração final 5 pg/ml) foram adicionados. Após 72 horas, as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS (pH 7,5), coradas com violeta cristal (0,5 % em metanol), e analisadas quando a proliferação relativa de célula conforme descrito por Sugarman et al. (1985) Science 230:943-945. Anticorpo monoclonal 4D5 inibiu a proliferação relativa de célula SK-BR-3 em cerca de 56 %. O anticorpo monoclonal 4D5 foi também avaliado quanto à sua capacidade para inibir fosforilação de tirosina estimulada por HRG das proteínas nos intervalos de Mr 180.000 de lisados de célula total de células MCF7 (Lewis et al. (1996) Cancer Research 56:1457-1465) . É relatado que células MCF7 expressam todos os recetores ErbB conhecidos, mas em níveis relativamente baixos. Visto que ErbB2, ErbB3, 3 ErbB4 têm tamanhos moleculares quase idênticos, não é possível discernir qual proteína está se tornando fosforilada por tirosina quando lisados de célula total são avaliados por análise de Western blot. Entretanto, estas células são ideias para análises de fosforilação de tirosina HRG porque, sob as condições de análise usadas, na ausência de HRG adicionado de forma exógena, elas exibem níveis de baixos a indetetáveis de proteínas de fosforilação de tirosina no intervalo de Mr 180.000.
As células MCF7 foram cultivadas em placas de 24 poços e anticorpos monoclonais para ErbB2 foram adicionados a cada poço e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente, então, rHRGpli77-244 foi adicionado a cada poço a uma concentração final de 0,2 nM, e a incubação foi continuada durante 8 minutos. O meio foi cuidadosamente aspirado de cada poço, e as reações foram cessadas pela adição de 100 μΐ de tampão de amostra SDS (5 % de SDS, 25 nM de DTT, e 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8) . Cada amostra (25 μΐ) passou por eletroforese num gel de gradiente de 4-12 % (Novex) e então foi transferida eletroforeticamente para membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunoblots de antifosfotirosina (4G10, da UBI, usada a 1 pg/ml) foram desenvolvidas, e a intensidade do intervalo reativa predominante a Mr 180.000 foi quantificada por densitometria de refletância, conforme descrito previamente (Holmes et al. (1992) Science 256:1205-1210; Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994)).
Anticorpo monoclonal 4D5 inibiu significativamente a geração de sinal de fosforilação de tirosina induzida por HRG a Mr 180.000. Na ausência de HRG, mas foi incapaz de estimular fosforilação de tirosina de proteínas no intervalo de Mr 180.000 (SIC). Também, este anticorpo não tem reação cruzada;om EGFR (Fendly et al. Cancer Research 50:1550- 1558 (1990)), ErbB3, ou ErbB4. O anticorpo monoclonal 4D5 foi capaz de bloquear a estimulação de HRG de fosforilação de tirosina em 50 %. O efeito inibidor de crescimento de anticorpo monoclonal 4D5 em células MDA-MB-175 e SK-BR-3 na presença ou ausência de rHRGpl exógeno foi avaliado (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Os níveis de ErbB2 em células MDA-MB-175 são 4-6 vezes mais elevados do que o nível encontrado em células epiteliais de mama normais e o recetor ErbB2-ErbB4 é constitutivamente fosforilado por tirosina em células MDA-MB-175. O anticorpo monoclonal 4D5 foi capaz de inibir a proliferação celular de células MDA-MB-175 tanto na presença quanto na ausência de HRG exógeno. A inibição de proliferação celular pelo 4D5 é dependente do nível de expressão de ErbB2 (Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993)). Uma inibição máxima de 66 % nas células SK-BR3 poderia ser detetada. Entretanto, este efeito seria suplantado por HRG exógeno. 0 anticorpo monoclonal de murino 4D5 foi humanizado, usando uma estratégia de "mutagénese de conversão de gene", conforme descrito na Patente US N° 5821337. 0 anticorpo monoclonal humanizado 4D5 usado nas experiências a seguir é designado huMAb4D5-8. Este anticorpo é do isotipo IgGl.
Lista De Sequências <110> Doronina, Svetlana 0.
Toki, Brian E.
Senter, Peter D.
Ebens, Allen J.
Polakis, Paul Sliwkowski, Mark X.
Spencer, Susan D Kline, Toni Beth
<120> COMPOSTOS DE MONOMETILVALINA CAPAZES DE CONJUGAÇÃO A LIGANDOS
<130> 018891-001020PC <141> 05-11-2004 <150> US 60/598.899 <151> 04-08-2004 <150> US 60/557.116 <151> 26-03-2004 <150> US 60/518.534 <151> 06-11-2003 <160> 35
<210> 1 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1
Met Leu Leu Arg Ser Ala Gly Lys Leu Asn Val Gly Thr Lys Lys 15 10 15
Glu Asp Gly Glu Ser Thr Ala Pro Thr Pro Arg Pro Lys Val Leu 20 25 30
Arg Cys Lys Cys His His His Cys Pro Glu Asp Ser Val Asn Asn 35 40 45 lie Cys Ser Thr Asp Gly Tyr Cys Phe Thr Met He Glu Glu Asp 50 55 60
Asp Ser Gly Leu Pro Val Val Thr Ser Gly Cys Leu Gly Leu Glu .65 70 75
Gly Ser Asp Phe Gin Cys Arg Asp Thr Pro lie Pro His Gin Arg 80 85 90
Arg Ser He Glu Cys Cys Thr Glu Arg Asn Glu Cys Asn Lys Asp 95 100 105
Leu His Pro Thr Leu Pro Pro Leu Lys Asn Arg Asp Phe Val Asp 110 115 120
Gly Pro He His His Arg Ala Leu Leu lie Ser Val Thr Val Cys 125 130 135
Ser Leu Leu Leu Vai Leu lie Ile Leu Phe Cys Tyr Phe Arg Tyr 140 145 150
Lys Arg Gin Glu Thr Arg Pro Arg Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Gin 155 160 165
Asp Glu Thr Tyr He Pro Pro Gly Glu Ser Leu Arg Asp Leu Ile no 175 130
Glu Gin Ser Gin Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu Leu 185 190 195
Vai Gin Arg Thr lie Ala Lys Gin lie Gin Met Vai Lys Gin Ile 200 205 210
Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Vai Trp Met Gly Lys Trp Arg Gly 215 220 225
Glu Lys Vai Ala Vai Lys Vai Phe phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser 230 235 240
Trp Phe Arg Glu Thr Glu lie Tyr Gin Thr Vai Leu Met Arg Hls 245 250 255
Glu Asn lie Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly 260 265 270
Ser Trp Thr Gin Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr Hls Glu Asn Gly 275 280 235
Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Lys Ser Thr Thr Leu Asp Ala Lys Ser 290 295 300
Met Leu Lys Leu Ala Tyr Ser Ser Vai Ser Gly Leu Cys His Leu 305 310 315
His Thr Glu Ile Phe Ser Thr Gin Gly Lys Pro Ala Ile Ala His 320 325 330
Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Vai Lys Lys Asn Gly Thr 335 340 345
Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Vai Lys Phe Ile Ser Asp 350 355 360
Thr Asn Glu Vai Asp lie Pro Pro Asn Thr Arg Vai Gly Thr Lys 365 370 375
Arg Tyr Met Pro Pro Glu Vai Leu Asp Glu Ser Leu Asn Arg Asn 380 385 390
His Phe Gin Ser Tyr lie Met Ala Asp Met Tyr Ser Phe Gly Leu 395 400 405
Ile Leu Trp Glu Vai Ala Arg Arg Cys vai Ser Gly Gly Ile Vai 410 415 420
Glu Glu Tyr Gin Leu Pro Tyr His Asp Leu Vai Pro Ser Asp Pro 425 430 435
Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Ile Vai Cys Ile Lys Lys Leu Arg 440 445 450
Pro Ser Phe Pro Asn Arg Trp Ser Ser Asp Glu Cys Leu Arg Gin 455 460 465
Met Gly Lys Leu Met Thr Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser 470 475 480
Arg Leu Thr Ala Leu Arg Val Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Ser 485 490 495
Glu Ser Gin Asp lie Lys Leu 500
<210> 2 <211> 507 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Ala Gly Ala Gly Pro Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ala 15 10 15
Ala Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Glu Lys Met Leu Ala Ala Lys 20 25 30
Ser Ala Asp Gly Ser Ala Pro Ala Gly Glu Gly Glu Gly Val Thr 35 40 45
Leu Gin Arg Asn lie Thr Leu Leu Asn Gly Val Ala lie lie Val 50 55 60
Gly Thr lie He Gly Ser Gly He Phe Val Thr Pro Thr Gly Val 65 70 75
Leu Lys Glu Ala Gly Ser Pro Gly Leu Ala Leu Val Val Trp Ala 80 85 90
Ala Cys Gly Val Phe Ser lie Val Gly Ala Leu Cys Tyr Ala Glu 95 100 105
Leu Gly Thr Thr He Ser Lys Ser Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Met 110 115 120
Leu Glu Val Tyr Gly Ser Leu Pro Ala Phe Leu Lys Leu Trp He 125 130 135
Glu Leu Leu lie lie Arg Pro Ser Ser Gin Tyr lie Val Ala Leu 140 145 150
Val Phe Ala Thr Tyr Leu Leu Lys Pro Leu Phe Pro Thr Cys Pro 155 160 165
Val Pro Glu Glu Ala Ala Lys Leu Val Ala Cys Leu Cys Val Leu 170 175 180
Leu Leu Thr Ala Val Asn Cys Tyr Ser Val Lys Ala Ala Thr Arg 185 190 195
Val Gin Asp Ala Phe Ala Ala Ala Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu 200 205 210 lie lie Leu Leu Gly Phe Val Gin lie Gly Lys Gly Val Val Ser
2IS 220 22S
Asn Leu Asp Pro Asn Phe Ser Phe Glu Gly Thr Lys Leu Asp Val 230 235 240
Gly Asn ile Val Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Phe Ala Tyr Gly 245 250 255
Gly Trp Asn Tyr Leu Asn Phe Val Thr Glu Glu Met lie Asn Pro 260 265 270
Tyr Arg Asn Leu Pro Leu Ala lie lie He Ser Leu Pro lie val 275 280 285
Thr Leu Val Tyr Val Leu Thr Asn Leu Ala Tyr Phe Thr Thr Leu 290 295 300
Ser Thr Glu Gin Met Leu Ser Ser Glu Ala Val Ala Val Asp Phe 305 310 315
Gly Asn Tyr His Leu Gly Val Met Ser Trp Ile lie Pro Val Phe 320 325 330
Val Gly Leu Ser Cys Phe Gly Ser Val Asn Gly Ser Leu Phe Thr 335 340 345
Ser Ser Arg Leu Phe Phe Val Gly Ser Arg Glu Gly His Leu Pro 350 355 360
Ser lie Leu Ser Met Ile His Pro Gin Leu Leu Thr Pro Val Pro 365 370 375
Ser Leu Val Phe Thr Cys Val Met Thr Leu Leu Tyr Ala Phe Ser 380 385 390
Lys Asp lie Phe Ser Val lie Asn Phe Phe Ser Phe Phe Asn Trp 395 400 405
Leu Cys Val Ala Leu Ala lie lie Gly Met lie Trp Leu Arg His 410 415 420
Arg Lys Pro Glu Leu Glu Arg Pro lie Lys Val Asn Leu Ala Leu 425 430 435
Pro Val Phe Phe Ile Leu Ala Cys Leu Phe Leu lie Ala Val Ser 440 445 450
Phe Trp Lys Thr Pro Val Glu Cys Gly Ile Gly Phe Thr Ile lie 455 450 465
Leu Ser Gly Leu Pro Val Tyr Phe Phe Gly Val Trp Trp Lys Asn 470 475 480
Lys Pro Lys Trp Leu Leu Gin Gly Ile Phe Ser Thr Thr Val Leu 485 490 495
Cys Gin Lys Leu Met Gin Val Val Pro Gin Glu Thr 500 505
<210> 3 <211> 339 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Met Glu Ser Arg Lys Asp He Thr Asn Gin Glu Glu Leu Trp Lys 15 10 15
Met Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys 20 25 30
Asp Thr Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Vai Leu Leu His 35 40 45
Leu His Gin Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu 50 55 60
Leu Gin His Thr Gin Glu Leu Phe Pro Gin Trp His Leu Pro He 65 70 75
Lys lie Ala Ala lie lie Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu 80 85 90
Leu Arg Glu Val lie His Pro Leu Ala Thr Ser His Gin Gin Tyr 95 100 105
Phe Tyr Lys He Pro lie Leu Val lie Asn Lys Val Leu Pro Met 110 115 120
Val Ser He Thr Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Pro Gly Val He 125 130 135
Ala Ala He Val Gin Leu JHis Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 140 145 150
Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gin Phe Gly 155 160 165
Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala lie Tyr Ser Leu 170 175 180
Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp 185 1Θ0 195
Ala Tyr Gin Gin Val Gin Gin Asn Lys Glu Asp Ala Trp He Glu 200 205 210
His Asp Val Trp Arg Met Glu lie Tyr Val Ser Leu Gly lie Val 215 220 225
Gly Leu Ala He Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser He Pro Ser 230 235 240
Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr lie Gin Ser 245 250 255
Lys Leu Gly lie Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr lie His Ala Leu 260 265 270 lie Phe Ala Trp Asn Lys Trp He Asp lie Lys Gin Phe Val Trp 275 280 285
Tyr Thr Pro Pro Thr Phe Met He Ala Val Phe Leu Pro He Val 290 295 300
Val Leu lie Phe Lys Ser lie Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys 305 310 315
Lys He Leu Lys He Arg His Gly Trp Giu Asp Val Thr Lys lie 320 325 330
Asn Lys Thr Glu He Cys Ser Gin Leu 335
<210> 4 <211> 6995 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Pro Vai Thr Ser Leu Leu Thr Pro Gly Leu Val lie Thr Thr Asp 1 5 10 15
Arg Met Gly He Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn 20 25 30
Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr 35 40 45
Val Asp Thr Glu Ala Met Gin Pro Ser Thr His Thr Ala Val Thr 50 55 60
Asn Val Arg Thr Ser lie Ser Gly His Glu Ser Gin Ser Ser Val 65 70 75
Leu Ser Asp Ser Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr 80 85 90
Thr Tyr Thr Met Gly Glu Thr Ser Val Ser lie Ser Thr. Ser Asp 95 100 105
Phe Phe Glu Thr Ser Arg lie Gin lie Glu Pro Thr Ser Ser Leu 110 115 120
Thr Ser Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg He Ser Ser 125 130 135
Ala Thr Glu Gly Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Ser Gly Ala 140 145 150
Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val lie Ser Ser Arg Gly Thr 155 160 165
Ser Met Ser Gly Pro Asp Gin Phe Thr lie Ser Pro Asp lie Ser 170 175 180
Thr Glu Ala lie Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro He Met Thr Glu 185 190 195
Ser Ala Glu Ser Ala He Thr lie Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala 200 205 210
Thr Ser Glu Gly Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe 215 220 225
Trp Ser Gly Thr His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser 230 235 240
Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Asp Vai Pro Trp 245 250 255
Pro Ser Leu Pro Ser Vai Glu Glu Ala Ser Ser Vai Ser Ser Ser 260 265 270
Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu 275 280 285
Pro Glu Ser lie Ser Ser Ser Pro His Pro Vai Thr Ala Leu Leu 290 295 300
Thr Leu Gly Pro Vai Lys Thr Thr Asp Met Leu Arg Thr Ser Ser 305 310 315
Glu Pro Glu Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala 320 325 330
Glu Ile Leu Ala Thr Ser Glu Vai Thr Lys Asp Arg Glu Lys lie 335 340 345
His Pro ser ser Asn Thr Pro Vai vai Asn Vai Gly Thr Vai lie 350 355 360
Tyr Lys His Leu Ser Pro Ser Ser Vai Leu Ala Asp Leu Vai Thr 365 370 375
Thr Lys Pro Thr Ser Pro Met Ala Thr Thr Ser Thr Leu Gly Asn 380 385 390
Thr Ser Vai Ser Thr Ser Thr Pro Ala Phe Pro Glu Thr Met Met 395 400 405
Thr Gin Pro Thr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser 410 415 420
Thr Ser Gin Glu Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu 425 430 435
Ser Gly Met Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Vai Ser Arg Thr Glu 440 445 450
Ala Leu Ser Leu Gly Arg Thr Ser Thr Pro Gly Pro Ma Gin Ser 455 460 465
Thr Ile Ser Pro Glu Ile Ser Thr Glu Thr lie Thr Arg Ile Ser 470 475 480
Thr Pro Leu Thr Thr Thr Gly Ser Ala Glu Met Thr lie Thr Pro 485 490 495
Lys Thr Gly His Ser Gly Ala Ser Ser Gin Gly Thr Phe Thr Leu 500 505 510
Asp Thr Ser Ser Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala 515 520 525
Thr His Arg Ser Pro His Ser Gly Met Thr Thr Pro Met Ser Arg 530 535 540
Gly Pro Glu Asp Val Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Val Glu Lys 545 550 555
Thr Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Ser 560 565 570
Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser Glu Ser Ser His Ser Ser 575 560 585
Pro Leu Arg Val Thr Ser Leu Fhe Thr Pro Val Met Met Lys Thr 590 595 600
Thr Asp Met Leu Asp Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Thr Ser Pro 605 610 615
Pro Ser Met Asn lie Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Thr Ser Lys 620 625 630
Ala Thr Met Glu Thr Glu Ala lie Gin Leu Ser Glu Asn Thr Ala 635 640 645
Val Thr Gin Met Gly Thr lie Ser Ala Arg Gin Glu Phe Tyr Ser 650 655 660
Ser Tyr Pro Gly Leu Pro Glu Pro Ser Lys Val Thr Ser Pro Val 665 670 675 val Thr Ser Ser Thr lie Lys Asp He Val Ser Thr Thr lie Pro $80 685 690
Ala Ser Ser Glu lie Thr Arg lie Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr 695 700 705
Leu Thr Pro Thr Pro Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gin Glu lie His 710 715 720
Ser Ala Thr Lys Pro Ser Thr Val Pro Tyr Lys Ala Leu Thr Ser 725 730 735
Ala Thr He Glu Asp Ser Met Thr Gin Val Met Ser Ser Ser Arg 740 745 750
Gly Pro Ser Pro Asp Gin Ser Thr Met Ser Gin Asp lie Ser Thr 755 760 765
Glu Val lie Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro lie Lys Thr Glu Ser 770 775 780
Thr Glu Met Thr He Thr Thr Gin Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr 785 790 795
Ser Arg Gly Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser 800 805 810
Gly Thr His Ser Thr Ala Ser Gin Gly Phe Ser His Ser Gin Met 8X5 820 825
Thr Ala Leu Met Ser Arg Thr Pro Gly Glu Val Pro Trp Leu Ser 830 835 840
His Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser 845 850 855
Ser Pro Val Met Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro 860 865 870
Asp Ser lie His Ser Ser ,Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr 875 880 805
Ser Gly Leu Val Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu 890 895 900
Pro Glu Thr Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu 905 910 915 lie Leu Ala Thr Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu 920 925 930
Met Thr Asn Val Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser 935 940 945
Ser Val Leu Ala Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met 950 955 960
Gly He Thr Tyr Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr 965 970 975
Pro Ala Phe Ser Asp Thr Ser Arg lie Gin Thr Lys Ser Lys Leu 980 985 990
Ser Leu Thr Pro Gly Leu Met Glu Thr Ser lie Ser Glu Glu Thr 995 1000 1005
Ser Ser Ala Thr Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr 1010 1015 1020
Gly Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala He Ser Ser Ser 1025 1030 1035
Arg Thr Ser lie Pro Gly Pro Ala Gin Ser Thr Met Ser Ser Asp 1040 1045 1050
Thr Ser Met Glu Thr lie Thr Arg lie Ser Thr Pro Leu Thr Arg 1055 1060 1065
Lys Glu Ser Thr Asp Met Ala He Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser 1070 1075 1030
Gly Ala Thr Ser Gin Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr 1085 1090 1095
Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Thr Thr Gin Arg Phe Pro 1100 1105 1110
Arg Ser Val Val Thr Thr pro Met Ser Arg Gly Pro Glu Asp Val 1115 1120 1125
Ser Trp Pro Ser Pro Leu Ser Vai Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser 1130 1135 1140
Ser Leu Vai Ser Ser Ser Ser Vai Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr 1145 1150 1155
Ser Thr Pro Ser Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Vai Pro Vai Thr 1160 1165 1170
Ser Leu Phe Thr Ser lie Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp 1175 1180 1135
Ala Ser Leu Glu Pro Glu Thr Thr Ser Ala Pro Asn Met Asn Ile 1190 1195 1200
Thr Ser Asp Glu Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr 1205 1210 1215
Glu Ala Ile His Vai Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Vai Glu 1220 1225 1230
Thr Thr Ser Ala Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe 1235 1240 1245
Ser Glu Pro Thr Lys Vai Ile Ser Pro vai vai Thr Ser ser ser 1250 1255 1260 lie Arg Asp Asn Met Vel Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly 1265 1270 1275 lie Thr Arg lie Glu Ile Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly 1280 1285 1290
Leu Arg Glu Thr Arg Thr Ser Gin Asp Ile Thr Ser Ser Thr Glu 1295 1300 1305
Thr Ser Thr Vai Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu 1310 1315 1320
Vai Ser Arg Thr Glu Vai Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser lie Pro 1325 1330 1335
Gly Pro Ala Gin Ser Thr Met Ser Leu Asp Ile Ser Asp Glu Vai 1340 1345 1350
Vai Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro lie Met Thr Glu Ser Ala Glu 1355 1360 1365
Ile Thr Ile Thr Thr Gin Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gin 1370 1375 1390
Vai Thr Leu Pro Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr 1395 1390 1395
His Ser Thr Met Ser Gin Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn 1400 1405 1410
Leu Met Ser Arg Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg 1415 1420 1425
Phe Val Glu The Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro 1430 1433 1440
Leu Thr Thr Ser Leu Ser Pro Vai Sex Ser Thr Leu Leu Asp Ser 1445 1450 1455
Ser Pro Ser Ser Pro Leu Pro Vai Thr Ser Leu lie Leu Pro Gly 1460 1465 1470
Leu Vai Lys Thr Thr Glu Vai Leu Asp Thr Ser Ser Glu Pro Lys 1475 1480 1485
Thr Ser Ser Ser Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Vai Glu lie Pro 1490 1495 1500
Ala Thr Ser Glu He Met Thr Asp Thr Glu Lys lie His Pro Ser 1505 1510 1515
Ser Asn Thr Ala vai Ala Lys Vai Arg Thr Ser ser Ser Vai His 1520 1525 1530
Glu Ser His Ser Ser Vai Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Tie Thr 1535 1540 1545 lie Pro Ser Met Gly lie Thr Ser Ala Vai Glu Asp Thr Thr Vai 1550 1555 1560
Phe Thx Ser Asu Pro Ala Phe Ser Glu Thr Arg Arg lie Pro Thr 1565 1570 1575
Glu Pro Thr Phe Ser Leu Thr Pro Gly Phe Arg Glu Thr Ser Thr 1580 1585 1590
Ser Glu Glu Thr Thr Ser Ile Thr Glu Thr Ser Ala Vai Leu Phe 1595 1600 1605
Gly Vai Pro Thr Ser Ala Thr Thr Glu Vai Ser Met Thr Glu Ile 1610 1615 1620
Met Sex Ser Asn Arg Thr His lie Pro Asp Ser Asp Gin Ser Thr 1625 1630 1635
Met Ser Pro Asp lie lie Thr Glu Vai Ile Thr Arg Leu Ser Ser 1640 1645 1650
Ser Ser Met Met Ser Glu Ser Thr Gin Met Thr Ile Thr Thr Gin 1655 1660 1665
Lys Ser Ser -Pro Gly Ala Thr Ala Gin Ser Thr Lau Thr Leu Ala 1670 1675 1680
Thr Thr Thr Ala Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Vai Pro Pro 1685 1690 1695
Arg Phe Leu His Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pró 1700 1705 1710
Glu Asn Pro Ser Trp Lys Ser Ser Pro Phe Vai Glu Lys Thr Ser 1715 1720 1725
Ser Ser Ser Ser Leu Leu ser Leu Pro Vai Thr Thr Ser Pro Ser 1730 1735 1740
Vai Ser Ser Thr Leu Pro Gin Ser lie Pro Ser Ser Ser Phe Ser 1745 1750 1755
Vai Thr Ser Leu Leu Thr Pro Gly Met Vai Lys Thr Thr Asp Thr 1760 1765 1770
Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Leu Ser Pro Asn Leu Ser Gly Thr 1775 1780 1785
Ser Vai Glu Ile Leu Ala Ala Ser Glu Vai Thr Thr Asp Thr Glu 1790 1795 1800
Lys lie Bis Pro Ser Ser Ser Met Ala Vai Thr Asn Vai Gly Thr 1805 1810 1815
Thr Ser Ser Gly His Glu Leu Tyr Ser Ser Vai Ser Ile His Ser 1820 1825 1830
Glu Pro Ser Lys Ala Thr Tyr Pro Vai Gly Thr Pro Ser Ser Met 1835 1840 1845
Ala Glu Thr Ser Ile Ser Thr Ser Met Pro Ala Asn Phe Glu Thr 1850 1855 1860
Thr Gly Phe Glu Ala Glu Pro Phe Ser His Leu Thr Ser Gly Leu 1865 1870 1875
Arg Lys Thr Asn Met Ser Leu Asp Thr Ser Ser Vai Thr Pro Thr 1880 1885 1890
Asn Thr Pro Ser Ser Pro Gly Ser Thr His Leu Leu Gin Ser Ser 1895 1900 1905
Lys Thr Asp Phe Thr Ser Ser Ala Lys Thr Ser Ser Pro Asp Trp 1910 1915 1920
Pro Pro Ala Ser Gin Tyr Thr Glu lie Pro Vai Asp Ile Ile Thr 1925 1930 1935
Pro Phe Asn Ala Ser Pro Ser Ile Thr Glu Ser Thr Gly Ile Thr 1940 1945 1950
Ser Phe Pro Glu Ser Arg Phe Thr Met Ser Vai Thr Glu Ser Thr 1955 1960 1965
His His Leu Ser Thr Asp Leu Leu Pro Ser Ala Glu Thr Ile Ser 1970 1975 1980
Thr Gly Thr Vai Met Pro Ser Leu Ser Glu Ala Met Thr Ser Phe 1985 1990 1995
Ala Thr Thr Gly Vai Pro Arg Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Pro 2000 2005 2010
Phe Ser Arg Thr Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr 2015 2020 2025
Ile Ala Glu Ser Leu Pro Ser Ser Thr Pro Vai Pro Phe Ser Ser 2030 2035 2040
Ser Thr Phe Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr lie Pro Ala Leu His 2045 2050 2055
Glu He Thr Ser Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Val Asp Thr Ser 2060 2065 2070
Leu Gly Thr GlO Ser Ser Thr Thr Glu Gly Arg Leu Val Met Val 2075 2080 2085
Ser Thr Leu Asp Thr Ser Ser Gin Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser 2090 2095 2100
Pro lie Leu Asp Thr Arg Met Thr Glu Ser Val Glu Leu Gly Thr 2105 2110 2115
Val Thr Ser Ala Tyr Gin Val Pro Ser Leu Ser Thr Arg Leu Thr 2120 2125 2130
Arg Thr Asp Gly lie Met Glu His lie Thr Lys lie Pro Asn Glu 2135 2140 2145
Ala Ala His Arg Gly Thr lie Arg Pro Val Lys Gly Pro Gin Thr 2150 2155 2160
Ser Thr Ser Pro Ala Ser Pro Lys Gly Leu His Thr Gly Gly Thr 2165 2170 2175
Lys Arg Met Glu Thr Thr Thr Thr Ala Leu Lys Thr Thr Thr Thr 2180 2185 2190
Ala Leu Lys Thr Thr Ser Arg Ala Thr Leu Thr Thr Ser Val Tyr 2195 2200 2205
Thr Pro Thr Leu Gly Thr Leu Thr Pro Leu Asn Ala Ser Met Gin 2210 2215 2220
Met Ala Ser Thr lie Pro Thr Glu Met Met lie Thr Thr Pro Tyr 2225 2230 2235
Val Phe Pro Asp Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser 2240 2245 2250
Leu Gly Ala Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser 2255 2260 2265
Val Phe Asn Arg Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg 2270 2275 2280
Ser Gly Ala Glu Arg Ser Pro Val lie Gin Thr Leu Asp Val Ser 2285 2290 2295
Ser Ser Glu Pro Asp Thr Thr Ala Ser Trp Val lie His Pro Ala 2300 2305 2310
Glu Thr lie Pro Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His 2315 2320 2325
Ser Glu Leu Asp Thr Val Ser Ser Thr Ala Thr Ser His Gly Ala 2330 2335 2340
Asp Vai Ser Ser Ala lie Pro Thr Asn Ile Ser Pro Ser Glu Leu 2345 2350 2355
Asp Ala Leu Thr Pro Leu Vai T,hr Ile Ser Gly Thr Asp Thr Ser 2360 2365 2370
Thr Thr Phe Pro Thr Leu Thr Lys Ser Pro RÍ3 Glu Thr Glu Thr 2375 2390 23B5
Arg Thr Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu Thr Ser Ser Thr Ile 2390 2395 ' 2400
Pro Arg Thr lie Pro Asn Phe Ser His His Glu Ser Asp Ala Thr 2405 2410 2415
Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Thr Ser Ser Ala Ile 2420 2425 2430
Pro lie Met Thr Vai Ser Pro Gly Ala Glu Asp Leu Vai Thr Ser 2435 2440 2445
Gin Vai Thr Ser Ser Gly Thr Asp Arg Asn Met Thr lie Pro Thr 2450 2455 2460
Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Lys Thr Ile Ala Ser Leu Vai 2465 2470 2475
Thr His Pro Glu Ala Gin Thr Ser Ser Ala lie Pro Thr Ser Thr 2480 2485 2490
Ile Ser Pro Ala Vai Ser Arg Leu Vai Thr Ser Met Vai Thr Ser . 2495 2500 2505
Leu Ala Ala Lys Thr Ser Thr Thr Asn Arg Ala Leu Thr Asn Ser 2510 2515 2520
Pro Gly Glu Pro Ala Thr Thr Vai Ser Leu Vai Thr His Ser Ala 2525 2530 2535
Gin Thr Ser Pro Thr Vai Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His 2540 2545 2550
Ser Lys Ser Asp Thr Thr Pro Ser Met Thr Thr Ser His Gly Ala 2555 2560 2565
Glu Ser Ser Ser Ala Vai Pro Thr Pro Thr Vai Ser Thr Glu Vai 2570 2575 2580
Pro Gly Vai Vai Thr Pro Leu Vai Thr Ser Ser Arg Ala Vai Ile 2585 2590 2595
Ser Thr Thr lie Pro lie Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro Glu 2600 2605 2610
Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Glu Glu Ala Ser Ser 2615 2620 2625
Ala lie Pro Thr Pro Thr Vai Ser Pro Gly Vai Pro Gly Vai Vai 2630 2635 2640
Thr Ser Leu Vai Thr Ser Ser Arg Ala Vai Thr Ser Thr Thr Ile 2645 2650 2655
Pro He Leu Thr Phe Ser Leu Gly Glu pro Glu Thr Thr Pro Ser 2660 2665 2670
Met Ala Thr Ser His Gly Thr Glu Ala Gly Ser Ala Val Pro Thr 2675 2680 2685
Val Leu Pro Glu Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser 2690 2695 2700
Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser 2705 2710 2715
Pro Gly Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly 2720 2725 2730
Ala Glu Ala Ser Ser Thr Val Pro Thr Val Ser Pro Glu Val Pro 2735 2740 2745
Gly Val Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Ser Gly Val Asn Ser 2750 2755 2760
Thr Ser lie Pro Thr Leu lie Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Thr 2765 2770 2775
Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His Gly Ala Glu Ala Ser Ser Ala 2780 2785 2790
Val Pro Thr Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Ser Gly Val Val Thr 2795 2800 2805
Pro Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr He Pro 2810 2815 2820
He Leu Thr Leu Ser Sex Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met 2825 2830 2835
Ala Thr Ser His Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val 2840 2045 2850 ser Pro Glu Val Pro Gly Met Val Thr phe Leu Val Thr Ser ser 2855 2860 2B65
Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr lie Pro Thr Leu Thr lie Ser Ser 2870 2875 2B80
Asp Glu Pro Glu Thr Thr Thr Ser Leu Val Thr His Ser Glu Ala 2885 2890 2895
Lys Met lie Ser Ala He Pro Thr Leu Gly Val Ser Pro Thr Val 2900 2905 2910
Gin Gly Leu Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr 2915 2920 2925
Ser Ala Phe Ser Asn Leu Thr Val Ala Ser Ser Gin Pro Glu Thr 2930 2935 2940 lie Asp Ser Trp Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val 2945 2950 2955
Val Pro Thr Leu Thr Val Ser Thr Gly Glu Pro Phe Thr Asn lie 2960 2965 2910
Ser Leu Val Thr/His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg 2975 2980 2985
Thr Thr Ser Arg Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser 2990 2995 3000
Thr Val Thr Ser Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala He Ser Thr 3005 3010 3015
Thr lie Ser Pro Gly lie Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr 3020 3025 3030
Ser Ser Gly Arg Asp He Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu 3035 3040 3045
Ser Pro His Glu Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro 3050 3055 3060
Ala Val Thr Ser Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser 3065 3070 3075
His Ser Glu Pro Asp Thr Thr Pro Ser lie Ala Thr Ser Pro Gly 3080 3085 3090
Ala Glu Ala Thr Ser Asp Phe Pro Thr lie Thr Val Ser Pro Asp 3095 3100 3105
Val pro Asp Met Val Thr Ser Gin Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp 3110 3115 3120
Thr Ser lie Thr lie Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro 3125 3130 3135
Glu Thr Thr Thr Ser Phe lie Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser 3140 3145 3150
Ser Ala He Pro Thr Leu Pro Val Ser Pro Asp Ala Ser Lys Met 3155 3160 3165
Leu Thr Ser Leu Val He Sex Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr 3170 3175 3180
Phe Pro Thr Leu Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala 3185 3190 3195 lie Gin Leu He His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met val Pro Arg 3200 3205 3210
Thr Thr Pro Lys Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro 3215 3220 3225
Val Ala lie Thr Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser 3230 3235 3240
Thr Thr Thr lie Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu 3245 3250 3255
Val Pro Ser Ser Gly Thr Asp Thr ser Thr Thr phe Pro Thr Lee 3260 3265 3270
Ser Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr 3275 3280 3285
His Pro Ala Glu Thr Sax Thr Thr Val Ser Gly Thr lie Pro Asn 3290 3295 3300
Phe Ser His Arg Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser 3305 3310 3315
Pro Gly Val Asp Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr He Pro 3320 3325 3330
Pro Ser lie Pro Gly Val Val Thr Ser Gin Val Thr Ser Ser Ala 3335 3340 3345
Thr Asp Thr Ser Thr Ala He Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly 3350 3355 3360
Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gin 3365 3370 3375
Thr Gly Phe Thr Val Pro He Arg Thr Val Pro Ser Ser Glu Pro 3380 3385 3390
Asp Thr Met Ala Ser Trp Val Thr His Pro Pro Gin Thr Ser Thr 3395 3400 3405
Pro Val Ser Arg Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp 3410 3415 3420
Ala Thr Pro Val Met Ala Thr Ser Pro Arg Thr Glu Ala Ser Ser 3425 3430 3435
Ala Val Leu Thr Thr Ile Ser Pro Gly Ala Pro Glu Met Val Thr 3440 3445 3450
Ser Gin Ile Thr Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro 3455 3460 3465
Thr Leu Thr His Ser Pro Gly Met Pro Glu Thr Thr Ala Leu Leu
3470 3475 348Q
Ser Thr His Pro Arg Thr Glu Thr Ser Lys Thr Phe Pro Ala Ser 3485 3490 3495
Thr Val Phe Pro Gin Val Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Thr He 3500 3505 3510
Arg Pro Gly Ala Glu Thr Ser Thr Ala Leu Pro Thr Gin Thr Thr 3515 3520 3525
Ser Ser Leu Phe Thr Leu Leu Val Thr Gly Thr Ser Arg Val Asp 3530 3535 3540
Leu Ser Pro Thr Ala Ser Pro Gly Val Ser Ala Lys Thr Ala Pro 3545 3550 3555
Leu Ser Thr His Pro Gly Thr Glu Thr Ser Thr Met He Pro Thr 3560 3565 3570
Ser Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala 3575 3580 3585
Thr Ser Ser Ser Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Leu Thr 3590 3595 3600
Vai Ser Pro Ala Vai Ser Gly Leu Ser Ser Ala Ser Ile Thr Thr 3605 3610 3615
Asp Lys Pro Gin Thr Vai Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro 3620 3625 3530
Ser Vai Thr Ser Vai Gly Pro Pro Glu Fhe Ser Arg Thr Vai Thr 3635 3640 3645
Gly Thr Thr Met Thr Leu lie Pro Ser Glu Met Pro Thr Pro Pro 3650 3655 3660
Lys Thr Ser His Gly Glu Gly Vai Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg 3665 3670 3675
Thr Thr Met Vai Glu Ala Thr Asn Leu Ala Thr Thr Gly Ser Ser 3680 3685 3690
Pro Thr Vai Ala Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly 3695 3700 3705
Ser Leu Phe Thr pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala 3710 3715 3720
Ser Glu Ser Vai Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp 3725 3730 3735
Ile Ser Thr Thr Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala 3740 3745 3750
Thr Ser Thr Pro Vai Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr 3755 3760 3765
Ser Ser He Pro Ser Ser Thr Ala Ala Thr Vai Pro Phe Met Vai 3770 3775 3780
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gin Tyr Glu Glu 3785 3790 3795
Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg 3800 3805 3810
Glu Leu Gin Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu 3815 3820 3825
Glu Tyr Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu 3830 3835 3840
Lys Asp Ser Ser Ala Thr Ala Vai Asp Ala Ile Cys Thr His Arg 3845 3850 3855
Pro Asp Pro Glu Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp 3860 3865 3870
Glu Leu Ser Asn Leu Thr Asn Gly lie Gin Glu Leu Gly Pro Tyr 3B75 3880 3885
Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Vai Asn Gly Phe Thr His Arg 3390 3895 3900
Ser Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Vai Asp 3905 3910 3915
Vai Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr 3920 3925 3930
Ala Gly Pro Leu Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr lie Thr 3935 3940 3945
Asn Leu Gin Tyr Glu Glu Asp Met Arg Arg Thr Gly Ser Arg Lys 3950 3955 3960
Phe Asn Thr Met Glu Ser Vai Leu Gin Gly Leu Leu Lys Pro Leu 3965 3970 3975
Phe Lys Asn Thr Ser Vai Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu 3980 3985 3990
Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Vai Asp 3995 4000 4005
Ala lie Cys Thr Sis Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn 4010 4015 4020
Arg Glu Gin Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile 4025 4030 4035
Glu Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Vai 4040 4045 4050
Asn Gly Phe Thr His Gin Ser Ser Vai Ser Thr Thr Ser Thr Pro 4055 4060 4065
Gly Thr Ser Thr Vai Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser 4070 4075 4080
Leu Ser Ser Pro Thr lie Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Frg 4085 4090 4095
Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gin Tyr Gly Glu Asp 4100 4105 4110
Met Gly His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val 4115 4120 4125
Leu Gin Gly Leu Leu Gly Pro Ile Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly 4130 4135 4140
Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys 4145 4150 4155
Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala lie Cys Ile His His Leu 4160 4165 4170
Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg GXu Arg Leu Tyr Trp Giu 4175 4180 4185
Leu Ser Gin Leu Thr Asn Gly lie Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr 4190 4195 4200
Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr 4205 4210 4215
Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu 4220 4225 4230
Gly Thr Ser Gly Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala 4235 4240 4245
Gly Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr lie Thr Asn 4250 4255 4260
Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe 4265 4270 4275
Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin Thr Leu Val Gly Pro Met Phe 4280 4285 4290
Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr 4295 4300 4305
Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala 4310 4315 4320 lie Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg 4325 4330 4335
Glu Gin Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gin Leu Thr Asn Gly lie Lys 4340 4345 4350
Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn 4355 4360 4365
Gly Phe Thr His Trp lie Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly 4370 4375 4380
Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro 4385 4390 4395
Ser Pro Thr Ser Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr 4400 4405 4410
Leu Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His 4415 4420 4425
Cys Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin 4430 4435 4440
Ser Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu 4445 4450 4455
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly 4460 4465 4470
Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala lie Cys Thr His Arg Leu Asp Pro 4475 4430 4485
Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gin Leu Tyr Trp Glu Leu Ser 4490 4495 4500
Gin Leu Thr Asn Gly He Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp 4505 4510 4515
Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gin Thr Ser Ala 4520 4525 4530
Pro Asn Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr 4535 4540 4545
Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro 4550 4555 4560
Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu Gin 4565 4570 4575
Tyr Glu Glu Asp Met His His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr 4580 4585 4590
Thr Glu Arg Val Leu Gin Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn 4595 4600 4605
Thr Ser Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu 4610 4615 4620
Arg Pro Glu Lys Asn Gly Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala lie Cys 4625 4630 4635
Ser His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gin 4640 4645 4650
Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gin Leu Thr His Gly lie Lys Glu Leu 4655 4660 4665
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe 4670 4675 4680
Thr His Arg Ser Ser Val Ala Pro Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser 4685 4690 4695
Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser 4700 4705 4710
Pro Thr Thr Ala Val Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe 4715 4720 4725
Thr Tie Thr Asn Leu Gin Tyr Gly Glu Asp Met Arg His Pro Gly 4730 4735 4740
Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin Gly Leu Leu 4745 4750 4755
Gly Pro Leu Phe Lys Asn Ser Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly 4760 4765 4770
Cys Arg Leu lie Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr 4775 4780 4785
Gly Val Asp Ala He Cys Thr His His Leu Asn Pro Gin Ser Pro 4790 4795 4300
Gly Leu Asp Arg Glu Gin Leu Tyr Trp Gin Leu Ser Gin Met Thr 4805 4310 4815
Asn Gly lie Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser 4820 4825 4830
Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Gly Leu Thr Thr 4835 4840 4845
Ser Thr Pro Trp Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr 4850 4855 4860
Pro Ser Pro Val Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu Leu Val 4865 4870 4875
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu Gin Tyr Glu Glu 4880 4885 4890
Asp Met Kis Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg 4895 4900 4905
Val Leu Gin Gly Leu Leu Ser Pro He Phe Lys Asn Ser Ser Val 4910 4915 4920
Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Pro Glu 4925 4930 4935
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Val Cys Leu Tyr His 4940 4945 4950
Pro Asn Pro Lys Arg Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gin Leu Tyr Trp 4955 4960 4965
Glu Leu Ser Gin Leu Thr His Asn lie Thr Glu Leu Gly Pro Tyr 4970 4975 4980
Ser Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gin 4985 4990 4995
Asn Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Tyr 5000 5005 5010
Trp Ala Thr Thr Gly Thr Pro Ser Ser Phe Pro Gly His Thr Glu 5015 5020 5025
Pro Gly Pro Leu Leu He Pro Phe Thr Phe Asn Phe Thr He Thr 5030 5035 5040
Asn Leu His Tyr Glu Glu Asn Met Gin His Pro Gly Ser Arg Lys 5045 5050 5055
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin Gly Leu Leu Lys Pro Leu 5060 5065 5070
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu 5075 5080 5085
Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Gin Glu Ala Ala Thr Gly Val Asp 5090 5095 5100
Thr lie Cys Thr His Arg Val Asp Pro He Gly Pro Gly Leu Asp 5105 5110 5115
Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gin Leu Thr Asn Ser lie 5120 5125 5130
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val 5135 5140 5145
Asn Gly Phe Asn Pro Trp Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro 5150 5155 5160
Gly Thr Ser Thr Val His Leu Ala Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser 5165 5170 5175
Leu Pro Gly His Thr Tlla Pro Val Pro Leu Leu lie Pro Phe Thr 5180 5185 5190
Leu Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu His Tyr Glu Glu Asn Met Gin 5195 5200 5205
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin 5210 5215 5220
Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu 5225 5230 5235
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leh Arg Pro Glu Lys His Gly 5240 5245 5250
Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala lie Cys Thr Leu Arg Leu Asp Pro 5255 5260 5265
Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser 5270 5275 5280
Gin Leu Thr Asn Ser Val Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp 5285 5290 5295
Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val 5300 5305 5310
Pro Thr Thr Ser lie Pro Gly Thr Ser Ala Val His Leu Glu Thr 5315 5320 5325
Ser Gly Thr Pro Ala Ser Leu Pro Gly His Thr Ala Pro Gly Pro 5330 5335 5340
Leu Leu Val Pro Phe Thr lieu Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu Gin 5345 5350 5355
Tyr Glu Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr 5360 5365 5370
Thr Glu Arg Val Leu Gin Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser 5375 5380 5385
Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu 5390 5395 5400
Arg Pro Glu Lys Arg Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr lie Cys 5405 5410 5415
Thr His Arg Leu Asp Pro Leu Asn Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gin 5420 5425 5430
Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Arg Gly lie He Glu Leu 5435 5440 5445
Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Arg Gly Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe 5450 5455 5460
Thr His Arg Asn Phe Val Pro lie Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser 5465 5470 5475
Thr val His Leu Gly Thr Ser Glu Thr Pro Ser Ser Leu Pro Arg 5480 5485 5490
Pro Tie Val Pro Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe 5495 5500 5505
Thr lie Thr Asn Leu Gin Tyr Glu Glu Ala Met Arg His Pro Gly 5510 5515 5520
Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin Gly Leu Leu 5525 5530 5535
Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser lie Gly Pro Leu Tyr Ser Ser 5540 5545 5550
Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Lys Ala Ala Thr 5555 5560 5565
Arg Val Asp Ala lie Cys Thr His His Pro Asp Pro Gin Ser Pro 5570 5575 5580
Gly Leu Asn Arg Glu Gin Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gin Leu Thr 5585 5590 5595
His Gly lie Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser 5600 5605 5610
Leu Tyr Val Asp Gly Phe Thr His Trp Ser Pro lie Pro Thr Thr 5615 5620 5625
Ser Thr Pro Gly Thr Ser He Val Asn Leu Gly Thr Ser Gly lie 5630 5635 5640
Pro Pro Ser Leu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Gly Pro Leu Leu Val 5645 5650 5655
Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu Gin Tyr Glu Glu 5660 5665 5670
Asn Met Gly His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn lie Thr Glu Ser 5675 5680 5685
Val Leu Gin Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val 5690 5695 5700
Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu 5705 5710 5715
Lys Asp Gly Val Ala Thr Arg Val Asp Ala lie Cys Thr His Arg 5720 5725 5730
Pro Asp Pro Lys lie Pro Gly Leu Asp Arg Gin Gin Leu Tyr Trp 5735 5740 5745
Glu Leu Ser Gin Leu Thr His Ser He Thr Glu Leu Gly Pro Tyr 5750 5755 5760
Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gin Arg 5765 5770 5775
Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Phe Thr Val Gin 5780 57Θ5 5790
Pro Glu Thr Ser Glu Thr Pro Ser Ser Leu Pro Gly Pro Thr Ala 5795 5800 5805
Thr Gly Pro Val Leu Leu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr lie lie 5810 5815 5820
Asn Leu Gin Tyr Glu Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys 5825 5830 5835
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin Gly Leu Leu Met Pro Leu 5840 5845 5850
Phe Lys Asn Thr Ser Val Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu 5855 5860 5865
Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val Asp 5870 5875 5880
Ala Val Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp 5885 5890 5395
Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Lys Leu Ser Gin Leu Thr His Gly He 5900 5905 5910
Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg His Ser Leu. Tyr Val 5915 5920 5925
Asn Gly Phe Thr His Gin Ser Ser Met Thr Thr Thr Arg Thr Pro 5930 5935 5940
Asp Thr Ser Thr Met His Leu Ala Thr Ser Arg Thr Pro Ala Ser 5945 5950 5955
Leu Ser Gly Pro Thr Thr Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr 5960 5965 5970 lie Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His 5975 5980 5985
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin 5990 5995 6000
Gly Leu Leu Arg Pro Val Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu 6005 6010 6015
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly 6020 6025 6030
Ala Ala Thr Lys Val Asp Ala lie Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro 6035 6040 6045
Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gin Leu Tyr Trp Glu Leu Ser 6050 6055 6060
Gin Leu Thr His Ser lie Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp 6065 6070 6075
Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gin Arg Ser Ser Val 6030 6035 6090
Pro Thr Thr Ser He Pro Gly Thr Pro Thr Val 'Asp Leu Gly Thr 6095 6100 6105
Ser Gly Thr Pro Val Ser Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ser Pro 6110 6115 6120
Leu Leu Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu Arg 6125 6130 6135
Tyr Glu Glu Asn Met Gin His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr 6140 6145 6150
Thr Giu Arn val Ιίθϋ Gift G2v Leu Leu A.r^ Ser Lsu Phe L^s 6155 ^ 6160 J 6165
Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu 6170 6175 6180
Arg Pro Glu Lys Asp Gly Thr Ala Thr Gly Val Asp Ala lie Cys 6185 6190 6195
Thr His His Pro Asp Pro Lys Ser Pro Arg Leu Asp Arg Glu Gin 6200 6205 6210
Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gin Leu Thr His Asn lie Thr Glu Leu 6215 6220 6225
Gly Pro Tyr Ala Leu Asp Asn Asp Ser Leu Phe Val Asn Gly Phe 6230 6235 6240
Thr His Arg Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr pro 6245 6250 6255
Thr Val Tyr Leu Gly Ala Ser Lys Thr Pro Ala Ser He Phe Gly 6260 6265 6270
Pro Ser Ala Ala Ser His Leu Leu He Leu Phe Thr Leu Asn Phe 6275 6280 6235
Thr He Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser 6290 6295 6300
Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gin Gly Leu Leu Arg 6305 63X0 6315
Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Set Gly Cys 6320 6325 6330
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly 6335 6340 6345
Val Asp Ala lie Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly 6350 6355 6360
Leu Asp Arg Glu Gin Leu Tyr Leu Glu Leu Ser Gin Leu Thr His 6365 6370 6375
Ser lie Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu 6380 6385 6390
Tyr val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser 6395 6400 6405
Thr Gly Val Val Ser Glu Glu pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr lie 6410 6415 6420
Asn Asn Leu Arg Tyr Met Ala Asp Met Gly Gin Pro Gly Ser Leu 6425 6430 6435
Lys Phe Asn lie Thr Asp Asn Val Met Gin His Leu Leu Ser Pro 6440 6445 6450
Leu Phe Gin Arg Ser Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg 6455 6460 6465
Val lie Ala Leu Arg Ser Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val 6470 6475 6480
Asp Leu Leu Cys Thr Tyr Leu Gin Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu 6485 6490 6495
Pro lie Lys Gin Val Phe His Glu Leu Ser Gin Gin Thr His Gly 6500 6505 6510 lie Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr 6515 6520 6525
Leu Asn Gly Tyr Asn Glu Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr 6530 6535 6540
Pro Lys Pro Ala Thr Thr Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr 6545 6550 6555
Thr Ala Met Gly Tyr His Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr 6560 6565 6570 lie Ser Asn Leu Gin Tyr Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala 6575 6580 6585
Thr Phe Asn Ser Thr Glu Gly Val Leu Gin His Leu Leu Arg Pro 6590 6595 6600
Leu Phe Gin Lys Ser Ser Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gin 6605 6610 6615
Leu He Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Qly Ala Ala Thr Gly Val 6620 6625 6630
Asp Thr Thr Cys Thr Tyr Bis Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu 6635 6640 6645
Asp Tie Gin Gin Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gin Leu Thr His Gly 6650 6655 6660
Val Thr Gin Leu Gly Phe Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe 6665 6670 6675 lie Asn Gly Tyr Ala Pro Gin Asn Leu Sex lie Arg Gly Glu Tyr 6680 6685 €690
Gin lie Asn Phe His lie Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp 6695 6700 6705
Pro Thr Ser Ser Glu Tyr lie Thr Leu Leu Arg Asp lie Gin Asp 6710 6715 6720
Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gin Leu His Asp Thr Phe 6725 6730 6735
Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser Val Leu Val 6740 6745 6750
Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val 6755 6760 6765
Glu Gin Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp 6770 6775 6780
Leu Gly Ser Thr Tyr Gin Leu Val Asp lie His Val Thr Glu Met 6785 6790 6795
Glu Ser Ser Val Tyr Gin Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gin His 6800 6805 6810
Phe Tyr Leu Asn Phe Thr lie Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gin Asp 6815 6820 6825
Lys Ala Gin Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gin Arg Asn Lys Arg Asn 6830 6835 6840 lie Glu Asp Ala Leu Asn Gin Leu Phe Arg Asn Ser Ser He Lys 6845 6850 6855
Ser Tyr Phe Ser Asp Cys Gin Val Ser Thr Phe Arg Sex Val Pro 6860 6865 6870
Asn Arg His His Thr Gly Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro 6875 6880 6885
Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala lie Tyr Glu Glu Phe Leu 6890 6895 6900
Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gin Leu Gin Asn Phe Thr Leu Asp 6905 6910 6915
Arg Ser Ser Vai Leu Vai Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu 6920 6925 6930
Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Vai Ile Leu 6935 6940 6945 lie Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys 6950 6955 6960
Gly Vai Leu Vai Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr 6965 6970 6975
Asn Vai Gin Gin Gin Cys Pro Gly Tyr Tyr Gin Ser His Leu Asp 6980 6985 6990
Leu Glu Asp Leu Gin 6995
<210> 5 <211> 622 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr 15 10 15
Pro Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp 20 25 30
Val Gin Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gin Glu Ala 35 40 45
Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn lie Ser Ser 50 55 60
Leu Ser Pro Arg Gin Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser 65 70 75
Gly Leu Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala 80 85 90
Gin Lys Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu Gin Leu Arg Cys Leu Ala 95 100 105
His Arg Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu 110 115 120
Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gin 125 130 135
Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg lie Thr Lys Ala Asn Val Asp 140 145 150
Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gin Arg Leu Leu Pro Ala 155 160 165
Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser Glu Ala 170 175 180
Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg 185 190 195
Phe Vai Ala Glu Ser Ala Glu Vai Leu Leu Pro Arg Leu Vai Ser 200 205 210
Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gin Asp Gin Gin Glu Ala Ala Arg Ala 215 220 225
Ala Leu Gin Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp 230 235 240
Ser Vai Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu 245 250 255
Gly Gin Pro He lie Arg Ser He Pro Gin Gly He Val Ala Ala 260 265 270
Trp Arg Gin Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gin Pro Glu 275 2B0 285
Arg Thr lie Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr 290 295 300
Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu lie Asp Glu Ser Leu 305 310 . 315 lie Phe Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala 320 325 330
Leu Leu Ala Thr Gin Mat Asp Arg Val Asn Ala lie Pro Phe Thr 335 340 345
Tyr Glu Gin Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr 350 355 360
Pro Gin Gly Tyr Pro Glu Ser Val lie Gin His Leu Gly Tyr Leu 365 370 375
Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp He Arg Lys Trp Asn Val Thr 380 385 390
Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His 395 400 405
Glu Met Ser Pro Gin Val Ala Thr Leu lie Asp Arg Phe Val Lys 410 415 420
Gly Arg Gly Gin Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala 425 430 435
Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser 440 445 450
Ser Val Pro Pro Ser Ser lie Trp Ala Val Arg Pro Gin Asp Leu 455 460 465
Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gin Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala 470 475 480
Arg Leu Ala Phe Gin Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys 485 490 495 lie Gin Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala 500 505 510
Leu Ser Gin Gin Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys 515 520 525
Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gin 530 535 540
Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg 545 550 555
His Arg Pro Val Arg Asp Trp lie Leu Arg Gin Arg Gin Asp Asp 560 565 570
Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gin Gly Gly lie Pro Asn Gly 575 580 585
Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gin Glu Ala Leu Ser Gly Thr 590 595 600
Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu 605 610 615
Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala 620
<210> 6 <211> 690 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Met Ala Pro Trp Pro Glu Leu Gly Asp Ala Gin Pro Asη Pro Asp 1 5 10 15
Lys Tyr Leu Glu Gly Ala Ala Gly Gin Gin Pro Thr Ala Pro Asp 20 25 30
Lys Ser Lys Glu Thr Asn Lys Thr Asp Asn Thr Glu Ala Pro Val 35 40 45
Thr Lys lie Glu Leu Leu Pro Ser Tyr Ser Thr Ala Thr Leu lie 50 55 60
Asp Glu Pro Thr Glu Val Asp Asp Pro Trp Asn Leu Pro Thr Leu 65 10 75
Gin Asp Ser Gly lie Lys Trp Ser Glu Arg Asp Thr Lys Gly Lys SO 85 90 lie Leu Cys Phe Phe Gin Gly lie Gly Arg Leu lie Leu Leu Leu 95 100 105
Gly Phe Leu Tyr Phe Phe Val Cys Ser Leu Asp He Leu Ser Ser 110 115 120
Ala Phe Gin Leu Val Gly Gly Lys Met Ala Gly Gin Phe Phe Ser 125 130 135
Asn Ser Ser lie Met Ser Asn Pro Leu Leu Gly Leu Vai Ile Gly 140 145 150
Vai Leu Vai Thr Vai leu Vai Gin Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser 155 160 165 IIe Vai Vai Ser Met Vai Ser Ser Ser Leu Leu Thr Vai Arg Ala 170 175 1B0
Ala lie Pro He Ile Met Gly Ala Asn lie Gly Thr Ser lie Thr 185 190 195
Asn Thr lie Val Ala Leu Met Gin Val Gly Asp Arg Ser Glu Phe 200 205 210
Arg Arg Ala Phe Ala Gly Ala Thr Val His Asp Phe Phe Asn Trp 215 220 225
Leu Ser Val Leu Val leu Leu Pro Val .Glu Val Ala Thr His Tyr 230 235 240
Leu Glu lie Ile Thr Gin Leu Ile Val Glu Ser Phe His Phe Lys 245 250 255
Asn Gly Glu Asp Ala Pro Asp Leu Leu Lys Val Ile Thr Lys Pro 260 265 270
Phe Thr Lys Leu lie Val Gin Leu Asp Lys Lys Val Ile Ser Gin 275 280 285 I is Ais Vgt Asn Asp Glu Lys A! 3 Lys Asn Lys S sít Lsu Vâl Lys 290 295 300
Ile Trp Cys Lys Thr Phe Thr Asn Lys Thr Gin Ile Asn Val Thr 305 310 315
Val Pro Ser Thr Ala Asn Cys Thr Ser Pro Ser Leu Cys Trp Thr 320 325 330
Asp Gly Ile Gin Asn Trp Thr Met Lys Asn Val Thr Tyr Lys Glu 335 340 345
Asn Ile Ala Lys Cys Gin His Ile Phe Val Asn Phe His Leu Pro 350 355 360
Asp Leu Ala Val Gly Thr Ile Leu Leu lie Leu Ser Leu Leu Val 365 370 375
Leu Cys Gly Cys Leu lie Met Ile Val Lys lie Leu Gly Ser Val 380 385 390
Leu Lys Gly Gin Val Ala Thr Val Ile Lys Lys Thr lie Asn Thr 395 400 405
Asp Phe Pro Phe Pro Phe Ala Trp Leu Thr Gly Tyr Leu Ala Ile 410 415 420
Leu Val Gly Ala Gly Met Thr Phe lie Val Gin Ser Ser Ser Val 425 430 435
Phe Thr Ser Ala Leu Thr Pro Leu lie Gly lie Gly Val lie Thr 440 445 450 lie Glu Arg Ala Tyr Pro Leu Thr Leu Gly Ser Asn He Gly Thr 455 460 465
Thr Thr Thr Ala lie Leu Ala Ala Leu Ala Ser Pro Gly Asn Ala 470 475 480
Leu Arg Ser Ser Leu Gin lie Ala Leu Cys His Phe Phe Phe Asn 485 490 495 lie Ser Gly lie Leu Leu Trp Tyr Pro lie Pro Phe Thr Arg Leu 500 505 510
Pro lie Arg Met Ala Lys Gly Leu Gly Asn lie Ser Ala Lys Tyr 515 520 525
Arg Trp Phe Ala Val Phe Tyr Leu lie lie phe Phe Phe Leu lie 530 535 540
Pro Leu Thr Val Phe Gly Leu Ser Leu Ala Gly Trp Arg Val Leu 545 550 555
Val Gly Val Gly Val Pro Val Val Phe lie He He Leu Val Leu 560 565 570
Cys Leu Arg Leu Leu Gin Ser Arg Cys Pro Arg Val Leu Pro Lys 575 580 585
Lys Leu Gin Asn Trp Asn Phe Leu Pro Leu Trp Met Arg Ser Leu 590 595 600
Lys Pro Trp Asp Ala Val Val Ser Lys Phe Thr Gly Cys Phe Gin 605 610 615
Met Arg Cys Cys Tyr Cys Cys Arg Val Cys Cys Arg Ala Cys Cys 620 625 630
Leu Leu Cys Gly Cys Pro Lys Cys Cys Arg Cys Ser Lys Cys Cys 635 640 645
Glu Asp Leu Glu Glu Ala Gin Glu Gly Gin Asp Val Pro Val Lys 650 655 660
Ala Pro Glu Thr Phe Asp Asn lie Thr lie Ser Arg Glu Ala Gin 665 670 675
Gly Glu Val Pro Ala Ser Asp Ser Lys Thr Glu Cys Thr Ala Leu 680 685 690
<210> 7 <211> 1093 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 7
Met Val Leu Ala Gly Pro Leu Ala Val Ser Leu Leu Leu Pro Ser 15 10 15
Leu Thr Leu Leu Val Ser His Leu Ser Ser Ser Gin Asp Val Ser 20 25 30
Ser Glu Pro Ser Ser Glu Gin Gin Lee Cys Ala Leu Ser Lys His 35 40 45
Pro Thr Vai Ala Phe Glu Asp Leu Gin Pro Trp Vai Ser Asn Phe 50 55 60
Thr Tyr Pro Gly Ala Arg Asp Phe Ser Gin Leu Ala Leu Asp Pro 65 70 75
Ser Gly Asn Gin Leu Ile Vai Gly Ala Arg Asn Tyr Leu Phe Arg 60 85 90
Leu Ser Leu Ala Asn Vai Ser Leu Leu Gin Ala Thr Glu Trp Ala 95 100 105
Ser Ser Glu Asp Thr Arg Arg Ser Cys Gin Ser Lys Gly Lys Thr 110 115 120
Glu Glu Glu Cys Gin Asn Tyr Vai Arg Vai Leu Ile Vai Ala Gly 125 130 135
Arg Lys Vai Phe Met Cys Gly Thr Asn Ala Phe Ser Pro Met Cys 140 145 150
Thr Ser Arg Gin Vai Gly Asn Leu Ser Arg Thr Thr Glu Lys Ile 155 160 165
Asn Gly Vai Ala Arg Cys Pro Tyr Asp Pro Arg His Asn Ser Thr 170 175 180
Ala Val Ile Ser Ser Gin Gly Glu Leu Tyr Ala Ala Thr Vai Ile 185 190 195
Asp Phe Ser Gly Arg Asp Pro Ala Ile Tyr Arg Ser Leu Gly Ser 200 205 210
Gly Pro Pro Leu Arg Thr Ala Gin Tyr Asn Ser Lys Trp Leu Asn 215 220 225
Glu Pro Asn Phe Val Ala Ala Tyr Asp Ile Gly Leu Phe Ala Tyr 230 235 240
Phe Phe Leu Arg Glu Asn Ala Val Glu His Asp Cys Gly Arg Thr 245 250 255
Val Tyr Ser Arg Val Ala Arg Val Cys Lys Asn Asp Val Gly Gly 260 265 270
Arg Phe Leu Leu Glu Asp Thr Trp Thr Thr Phe Met Lys Ala Arg 275 280 285
Leu Asn Cys Ser Arg Pro Gly Glu Val Pro Phe Tyr Tyr Asn Glu 290 295 300
Leu Gin Ser Ala Phe His Leu Pro Glu Gin Asp Leu Ile Tyr Gly 305 310 315
Val Phe Thr Thr Asn Val Asn Ser Ile Ala Ala Ser Ala Val Cys 320 325 330
Ala Phe Asn Leu Ser Ala He Ser Gin Ala Phe Asn Gly Pro Phe 335 340 345
Arg Tyr Gin Glu Asn Pro Arg Ala Ala Trp Leu Pro lie Ala Asn 350 355 360
Pro He Pro Asn Phe Gin Cys Gly Thr Leu Pro Glu Thr Gly Pro 365 370 375
Asn Glu Asn Leu Thr Glu Arg Ser Leu Gin Asp Ala Gin Arg Leu 380 385 390
Phe Leu Met Ser Glu Ala Val Gin Pro Val Thr Pro Glu Pro Cys 395 400 405
Val Thr Gin Asp Ser Val Arg Phe Ser His Leu Val Val Asp Leu 410 415 420
Val Gin Ala Lys Asp Thr Leu Tyr His Val Leu Tyr lie Gly Thr 425 430 435
Glu Ser Gly Thr lie Leu Lys Ala Leu Ser Thr Ala Ser Arg Ser 440 445 450
Leu His Gly Cys Tyr Leu Glu Glu Leu His Val Leu Pro Pro Gly 455 460 465
Arg Arg Glu Pro Leu Arg Ser Leu Arg lie Leu His Ser Ala Arg 470 475 480
Ala Leu Phe Val Gly Leu Arg Asp Gly Val Leu Arg Val Pro Leu 485 490 495
Glu Arg Cys Ala Ala Tyr Arg Ser Gin Gly Ala Cys Leu Gly Ala 500 505' 510
Arg Asp Pro Tyr Cys Gly Trp Asp Gly Lys Gin Gin Arg Cys Ser 515 520 525
Thr Leu Glu Asp Ser Ser Asn Met Ser Leu Trp Thr Gin Asn lie 530 535 540
Thr Ala Cys Pro Val Arg Asn Val Thr Arg Asp Gly Gly Phe Gly 545 550 555
Pro Trp Ser Pro Trp Gin Pro Cys Glu His Leu Asp Gly Asp Asn 560 565 570
Ser Gly Ser Cys Leu Cys Arg Ala Arg Ser Cys Asp Ser Pro Arg 575 580 585
Pro Arg Cys Gly Gly Leu Asp Cys Leu Gly Pro Ala He His lie 590 595 600
Ala Asn Cys Ser Arg Asn Gly Ala Trp Thr Pro Trp Ser Ser Trp 605 610 615
Ala Leu Cys Ser Thr Ser Cys Gly lie Gly Phe Gin Val Arg Gin 620 625 630
Arg Ser Cys Ser Asn Pro Ala Pro Arg His Gly Gly Arg He Cys 635 640 €45
Vai Gly Lys Ser Arg Gin Glu Arg Phe Cys Asn Glu Asn Thr Pro 650 655 660
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Cys Ser Ser Asn Cys Gly Gly Gly Met Gin Ser Arg Arg Arg Ala 680 685 690
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Cys Pro Ala Asp Gly Ser Gly Ser Cys Asp Thr Asp Ala Leu Vai 770 775 7B0
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Gly Gly Trp Ala Ala Trp Gly Pro Trp Ser Ser Cys Ser Arg Asp 800 805 810
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Gly His Tyr Gin Arg Thr Arg Ser Cys Thr Ser Pro Ala Pro Ser 875 880 885
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Cys Ala Thr Gin Ala Cys Pro Glu Gly Trp Ser Pro Trp Ser Glu 905 910 915
Trp Ser Lys Cys Thr Asp Asp Gly Ala Gin Ser Arg Ser Arg His 920 925 930
Cys Glu Glu Leu Leu Pro Gly Ser Ser Ala Cys Ala Gly Asn Ser 935 940 945
Ser Gin Ser Arg Pro Cys Pro Tyr Ser Glu lie Pro Val lie Leu 950 955 960
Pro Ala Ser Ser Met Glu Glu Ala Thr Gly Cys Ala Gly Phe Asn 965 970 975
Leu lie His Leu Val Ala Thr Gly He Ser Cys Phe Leu Gly Ser 980 985 990
Gly Leu Leu Thr Leu Ala Val Tyr Leu Ser Cys Gin His Cys Gin 995 1000 1005
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His Leu His Tyr Lys Gly Gly Gly Thr Pro Lys Asn Glu Lys Tyr 1025 1030 1035
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Asp Asp Arg Ala Asn Phe Tyr Pro Leu Gin Gin Thr Asn Val Tyr 1055 1060 1065
Thr Thr Thr Tyr Tyr Pro Ser Pro Leu Asn Lys His Ser Phe Arg 1070 1075 1080
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<210> 8 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Met Trp Val Leu Gly lie Ala Ala Thr Phe Cys Gly Leu Phe Leu 1 5 10 15
Leu Pro Gly Phe Ala Leu Gin lie Gin Cys Tyr Gin Cys Glu Glu 20 25 30
Phe Gin Leu Asn Asn Asp Cys Ser Ser Pro Glu Phe lie Val Asn 35 40 45
Cys Thr Val Asn Val Gin Asp Met Cys Gin Lys Glu Val Met Glu 50 55 60
Gin Ser Ala Gly lie Met Tyr Arg Lys Ser Cys Ala Ser Ser Ala 65 70 75
Ala Cys Leu lie Ala Ser Ala Gly Tyr Gin Ser Phe Cys Ser Pro 80 85 90
Gly Lys Leu Asn Ser Val Cys lie Ser Cys Cys Asn Thr Pro Leu 95 100 105
Cys Asn Gly Pro Arg Pro Lys Lys Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala 110 115 120
Leu Arg Pro Gly Leu Arg Thr Thr lie Leu Phe Leu Lys Leu Ala 125 130 135
Leu Phe Ser Ala His Cys 140
<210> 9 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Met Gin Pro Pro Pro Ser Leu Cys Gly Arg Ala Leu Val Ala Leu 15 10 15
Val Leu Ala Cys Gly Leu Ser Arg lie Trp Gly Glu Glu Arg Gly 20 25 50
Phe Pro Pro Asp Arg Ala Thr Pro Leu Leu Gin Thr Ala Glu lie 35 40 45
Met Thr Pro Pro Thr Lys Thr Leu Trp Pro Lys Gly Ser Asn Ala 50 55 60
Ser Leu Ala Arg Ser Leu Ala Pro Ala Glu Val Pro Lys Gly Asp 65 70 75
Arg Thr Ala Gly Ser Pro Pro Arg Thr lie Ser Pro Pro Pro Cys 80 85 90
Gin Gly Pro lie Glu lie Lys Glu Thr Phe Lys Tyr lie Asn Thr 95 100 105
Val Val Ser Cys Leu Val Phe Val Leu Gly He lie Gly Asn Ser 110 115 120
Thr Leu Leu Arg lie He Tyr Lys Asn Lys Cys Met Arg Asn Gly 125 130 135
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He Val He Asp He Pro lie Asn Val Tyr Lys Leu Leu Ala Glu 155 160 165
Asp Trp Pro Phe Gly Ala Glu Met Cys Lys Leu Val Pro Phe lie 170 175 180
Gin Lys Ala Ser Val Gly lie Thr Val Leu Ser Leu Cys Ala Leu 185 190 195
Ser He Asp Arg Tyr Arg Ala Val Ala Ser Trp Ser Arg lie Lys 200 205 210
Gly He Gly Val Pro Lys Trp Thr Ala Val Glu He Val Leu He 215 220 225
Trp Val Val Ser Val Val Leu Ala Val Pro Glu Ala lie Gly Phe 230 235 240
Asp He lie Thr Met Asp Tyr Lys Gly Ser Tyr Leu Arg lie Cys 245 250 255
Leu Leu His Pro Val Gin Lys Thr Ala Phe Met Gin Phe Tyr Lys 260 265 270
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Leu Ala He Thr Ala Phe Phe Tyr Thr Leu Met Thr Cys Glu Met 290 295 300
Leu Arg Lys Lys Ser Gly Met Gin lie Ala Leu Asn Asp His Leu 305 310 315
Lys Gin Arg Arg Glu Val Ala Lys Thr Val Phe Cys Leu Val Leu 320 325 330
Val Phe Ala Leu Cys Trp Leu Pro Leu His Leu Ser Arg lie Leu 335 340 345
Lys Leu Thr Leu Tyr Asn Gin Asn Asp Pro Asn Arg Cys Glu Leu 350 355 360
Leu Ser Phe Leu Leu Val Leu Asp Tyr He Gly lie Asn Met Ala 365 370 375
Ser Leu Asn Ser Cys He Asn Pro lie Ala Leu Tyr Leu Val Ser 380 385 390
Lys Arg Phe Lys Asn Cys Phe Lys Ser Cys Leu Cys Cys Trp Cys 395 400 405
Gin Ser Phe Glu Glu Lys Gin Ser Leu Glu Glu Lys Gin Ser Cys 410 415 420
Leu Lys Phe Lys Ala Asn Asp His Gly Tyr Asp Asn Phe Arg Ser 425 430 435
Ser Asn Lys Tyr Ser Ser Ser 440
<210> 10 <211> 783 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10
Met Ser Gly Gly His Gin Leu Gin Leu Ala Ala Leu Trp Pro Trp 1 5 10 15
Leu Leu Met Ala Thr Leu Gin Ala Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu 20 25 30
Val Leu Ala Ala Ala Val Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gin Lys 35 40 45
Ala He lie Arg Val lie Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys 50 55 60
Leu Asn Leu Thr Leu Glu Gly Val Phe Ala Gly Val Ala Glu lie 65 70 75
Thr Pro Ala Glu Gly Lys Leu Met Gin Ser His Pro Leu Tyr Leu 80 85 90
Cys Asn Ala Ser Asp Asp Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe lie Ser 95 100 105 lie Val Lys Léu Glu Ser Pro Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu 110 115 120
Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Met Ala Gly Glu Arg Gly Ala Ser 125 130 135
Ala Val Leu Phe Asp lie Thr Glu Asp Arg Ala Ala Ala Glu Gin UO 145 150
Leu Gin Gin Pro Leu Gly Leu Thr Trp Pro Val Val Leu lie Trp 155 160 165
Gly Asn Asp Ala Glu Lys Leu Met Glu Phe Val Tyr Lys Asn Gin 170 175 180
Lys Ala His Val Arg He Glu Leu Lys Glu Pro Pro Ala Trp Pro 185 190 195
Asp Tyr Asp Val Trp lie Leu Met Thr Val Val Gly Thr He Phe 200 205 210
Val He lie Leu Ala Ser Val Leu Arg lie Arg Cys Arg Pro Arg 215 220 225
His Ser Arg Pro Asp Pro Leu Gin Gin Arg Thr Ala Trp Ala lie 230 235 240
Ser Gin Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gin Ala Ser Cys Arg Gin Ala 245 250 255
Arg Gly Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Pro 260 265 270
Val Cys Ala He Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gin Glu Leu 275 280 285
Arg Val lie Ser Cys Leu His Glu Phe His Arg Asn Cys Val Asp 290 295 300
Pro Trp Leu His Gin His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Val Phe Asn 305 310 315
He Thr Glu Gly Asp Ser Phe Ser Gin Ser Leu Gly Pro Ser Arg 320 325 330
Ser Tyr Gin Glu Pro Gly Arg Arg Leu His Leu lie Arg Gin His 335 340 345
Pro Gly His Ala His Tyr His Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Gly 350 355 360
Pro Ser Arg Ser Ala Val Ala Arg Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe 365 370 375
Leu Pro Ser Gin Glu Pro Gly Met Gly Pro Arg His His Arg Phe 380 385 390
Pro Arg Ala Ala His Pro Arg Ala Pro Gly Glu Gin Gin Arg Leu 395 400 405
Ala Gly Ala Gin His Pro Tyr Ala Gin Gly Trp Gly Met Ser His 410 · 415 420
Leu Gin Ser Thr Ser Gin His Pro Ala Ala Cys Pro Val Pro Leu 425 430 435
Arg Arg Ala Arg Pro Pro Asp Ser Ser Gly Ser Gly Glu Ser Tyr 440 445 4S0
Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Gly Pro Ala Ser Asp 455 460 465
Ser Ser Ser Gly Pro Cys His Gly Ser Ser Ser Asp Ser Val Val 470 475 480
Asn Cys Thr Asp lie Ser Leu Gin Gly Val His Gly Ser Ser Ser. 485 490 495
Thr Phe Cys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val Tyr 500 505 510
Cys Ser Pro Lys Gly Asp Pro Gin Arg Val Asp Met Gin Pro Ser 515 520 525
Val Thr Ser Arg Pro Arg Ser Leu Asp Ser Val Val Pro Thr Gly 530 535 540
Glu Thr Gin Val Ser Ser His Val His Tyr His Arg His Arg His 545 . 550 555
His His Tyr Lys Lys Arg Phe Gin Trp His Gly Arg Lys Pro Gly 560 565 570
Pro Glu Thr Gly Val Pro Gin Ser Arg Pro Pro lie Pro Arg Thr 575 580 ' 585
Gin Pro Gin Pro Glu Pro Pro Ser Pro Asp Gin Gin Val Thr Gly 590 595 600
Ser Asn Ser Ala Ala Pro Ser Gly Arg Leu Ser Asn Pro Gin Cys 605 610 615
Pro Arg Ala Leu Pro Glu Pro Ala Pro Gly Pro Val Asp Ala Ser 620 625 630
Ser lie Cys Pro Ser Thr Ser Ser Leu Phe Asn Leu Gin Lys Ser 635 640 645
Ser Leu Ser Ala Arg His Pro Gin Arg Lys Arg Arg Gly Gly Pro 650 655 660
Ser Glu Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Gin Asp Ala Thr Val His 665 670 675
Pro Ala Cys Gin He Phe Pro His Tyr Thr Pro Ser Val Ala Tyr 680 685 690
Pro Trp Ser Pro Glu Ala His Pro Leu lie Cys Gly Pro Pro Gly 695 700 705
Leu Asp Lys Arg Leu Leu Pro Glu Thr Pro Gly Pro Cys Tyr Ser 710 715 720
Asn Ser Gin Pro Val Trp Leu Cys Leu Thr Pro Arg Gin Pro Leu 725 730 735
Glu Pro His Pro Pro Gly Glu Gly Pro Ser Glu Trp Ser Ser Asp 740 745 750
Thr Ala Glu Gly Arg Pro Cys Pro Tyr Pro His Cys Gin Val Leu 755 760 765
Ser Ala Gin Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu 770 775 780
Gin Ala Val
<210> 11 <211> 490 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11
Met Glu Ser lie Ser Met Met Gly Ser Pro Lys Ser Leu Ser GJLu 1 5 10 15
Thr Val Leu Pro Asn Gly lie Asn Gly lie Lys Asp Ala Arg Lys 20 25 30
Val Thr Val Gly Val He Gly Ser Gly Asp Phe Ala Lys Sex Leu 35 40 45
Thr He Arg Leu lie Arg Cys Gly Tyr His Val Val lie Gly Ser 50 55 60
Arg Asn Pro Lys Phe Ala Ser Glu Phe Phe Pro His Val Val Asp 65 70 75
Val Thr His His Glu Asp Ala Leu Thr Lys Thr Asn lie lie Phe 80 85 90
Val Ala lie His Arg Glu His Tyr Thr Ser Leu Trp Asp Leu Arg 95 100 105
His Leu Leu Val Gly Lys He Leu He Asp Val Ser Asn Asn Met 110 115 120
Arg He Asn Gin Tyr Pro Glu Ser Asn Ala Glu Tyr Leu Ala Ser 125 130 135
Leu Phe Pro Asp Ser Leu He Val Lys Gly Phe Asn Val Val Ser 140 145 150
Ala Trp Ala Leu Gin Leu Gly Pro Lys Asp Ala Ser Arg Gin Val 155 160 165
Tyr He Cys Ser Asn Asn lie Gin Ala Arg Gin Gin Val He Glu 170 175 180
Leu Ala Arg Gin Leu Asn Phe He Pro He Asp Leu Gly Ser Leu 185 190 195
Ser Ser Ala Arg Glu lie Glu Asn Leu Pro Leu Arg Leu Phe Thr 200 205 210
Leu Trp Arg Gly Pro Val Val Val Ala lie Ser Leu Ala Thr Phe 215 220 225
Phe Phe Leu Tyr Ser Phe Val Arg Asp Val lie His Pro Tyr Ala 230 235 240
Arg Asn Gin Gin Ser Asp Phe Tyr Lys lie Pro lie Glu He Val 245 250 255
Asn Lys Thr Leu Pro lie Val Ala He Thr Leu Leu Ser Leu Val 260 265 270
Tyr Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ala Ala Tyr Gin Leu Tyr Tyr Gly 275 280 285
Thr Lys Tyr Arg Arg Phe Pro Pro Trp Leu Glu Thr Trp Leu Gin 290 295 300
Cys Arg Lys Gin Leu Gly Leu Leu Ser Phe Phe,Phe Ala Met' Val 305 310 315
His Val Ala Tyr Ser Leu Cys Leu Pro Met Arg Arg Ser Glu Arg 320 325 330
Tyr Leu Phe Leu Asn Met Ala Tyr Gin Gin Val His Ala Asn lie 335 340 345
Glu Asn Ser Trp Asn Glu Glu Glu Val Trp Arg lie Glu Met Tyr 350 355 360 lie Ser Phe Gly lie Met Ser Leu Gly Leu Leu Ser Leu Leu Ala 365 370 375
Val Thr Ser lie Pro Ser Val Ser Asn Ala Leu Asn Trp Arg Glu 380 385 390
Phe Ser Phe lie Gin Ser Thr Leu Gly Tyr Val Ala Leu Leu He 395 400 405
Ser Thr Phe His Val Leu lie Tyr Gly Trp Lys Arg Ala Phe Glu 410 415 420
Glu Glu Tyr Tyr Arg Phe Tyr Thr Pro Pro Asn Phe Val Leu Ala 425 430 435
Leu Val Leu Pro Ser He Val lie Leu Gly Lys lle lie Leu Phe 440 445 450
Leu Pro Cys He Ser Gin Lys Leu Lys Arg lie Lys Lys Gly Trp 455 460 465
Glu Lys Ser Gin Phe Leu Glu Glu Gly He Gly Gly Thr lie Pro 470 475 480
His Val Ser Pro Glu Arg Val Thr Val Met 485 490
<210> 12 <211> 1214 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12
Met Val Val Pro Glu Lys Glu Gin Ser Trp lie Pro Lys lie Phe 15 10 15
Lys Lys Lys Thr Cys Thr Thr Phe lie Val Asp Ser Thr Asp Pro 20 25 30
Gly Gly Thr Leu Cys Gin Cys Gly Arg Pro Arg Thr Ala His Pro 35 40 45
Ala Val Ala Met Glu Asp Ala Phe Gly Ala Ala Val Val Thr Val 50 55 60
Trp Asp Ser Asp Ala His Thr Thr Glu Lys Pro Thr Asp Ala Tyr 65 70 75
Gly Glu Leu Asp Phe Thr Gly Ala Gly Arg Lys His Ser Asn Phe 80 85 90
Leu Arg Leu Ser Asp Arg Thr Asp Pro Ala Ala Val Tyr Ser Leu 95 100 105
Val Thr Arg Thr Trp Gly Phe Arg Ala Pro Asn Leu val Val Ser 110 115 120
Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Pro Val Leu Gin Thr Trp Leu Gin 125 130 135
Asp Leu Leu Arg Arg Gly Leu Val Arg Ala Ala Gin Ser Thr Gly
140 145 ISO
Ala Trp lie Val Thr Gly Gly Leu His Thr Gly lie Gly Arg His 155 160 165
Val Gly Val Ala Val Arg Asp His Gin Met Ala Ser Thr Gly Gly 170 175 180
Thr Lys Val Val Ala Met Gly Val Ala Pro Trp Gly Val Val Arg 185 190 195
Asn Arg Asp Thr Leu lie Asn Pro Lys Gly Ser Phe Pro Ala Arg 200 205 210
Tyr Arg Trp Arg Gly Asp Pro Glu Asp Gly Val Gin Phe Pro Leu 215 220 225
Asp Tyr Asn Tyr Ser Ala Phe Phe Leu Val Asp Asp Gly Thr His 230 235 240
Gly Cys Leu Gly Gly Glu Asn Arg Phe Arg Leu Arg Leu Glu Ser 245 250 255
Tyr He Ser Gin Gin Lys Thr Gly Val Gly Gly Thr Gly lie Asp 260 265 270 lie Pro Val Leu Leu Leu Leu lie Asp Gly Asp Glu Lys Met Leu 275 280 285
Thr Arg lie Glu Asn Ala Thr Gin Ala Gin Leu Pro Cys Leu Leu 290 295 300
Val Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ala Asp Cys Leu Ala Glu Thr Leu 305 310 315
Glu Asp Thr Leu Ala Pro Gly Ser Gly Gly Ala Arg Gin Gly Glu 320 325 330
Ala Arg Asp Arg He Arg Arg Phe Phe Pro Lys Gly Asp Leu Glu 335 340 345
Val Leu Gin Ala Gin Val Glu Arg lie Met Thr Arg Lys Glu Leu 350 355 360
Leu Thr Val Tyr Ser Ser Glu Asp Gly Ser Glu Glu Phe Glu Thr 365 370 375 lie Val Leu Lys Ala Leu Val Lys Ala Cys Gly Ser Ser Glu Ala 380 385 390
Ser Ala Tyr Leu Asp Glu Leu Arg Leu Ala Val Ala Trp Asn Arg 395 400 405
Val Asp lie Ala Gin Ser Glu Leu Phe Arg Gly Asp lie Gin Trp 410 415 420
Arg Ser Phe His Leu Glu Ala Ser Leu Met Asp Ala Leu Leu Asn 425 430 435
Asp Arg Pro Glu Phe Val Arg Leu Leu lie Ser His Gly Leu Ser 440 445 450
Leu Gly His Phe Leu Thr Pro Met Arg Leu Ala Gin Leu Tyr Ser 455 460 465
Ala Ala Pro Ser Asn Ser Leu lie Arg Asn Leu Leu Asp Gin Ala 470 475 480
Ser His Ser Ala Gly Thr Lys Ala Pro Ala Leu Lys Gly Gly Ala 485 490 495
Ala Glu Leu Arg Pro Pro Asp Val Gly His Val Leu Arg Met Leu 500 505 510
Leu Gly Lys Met Cys Ala Pro Arg Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Trp 515 520 525
Asp Pro His Pro Gly Gin Gly Phe Gly Glu Ser Met Tyr Leu Leu 530 535 540
Ser Asp Lys Ala Thr Ser Pro Leu Ser Leu Asp Ala Gly Leu Gly 545 550 555
Gin Ala Pro Trp Ser Asp Leu Leu Leu Trp Ala Leu Leu Leu Asn 560 565 570
Arg Ala Gin Met Ala Met Tyr Phe Trp Glu Met Gly Ser Asn Ala 575 580 585
Val Ser Ser Ala Leu Gly Ala Cys Leu Leu Leu Arg Val Met Ala 590 595 600
Arg Leu Glu Pro Asp Ala Glu Glu Ala Ala Arg Arg Lys Asp Leu 605 610 615
Ala Phe Lys Phe Glu Gly Met Gly Val Asp Leu Phe Gly Glu Cys 620 625 630
Tyr Arg Ser Ser Glu Val Arg Ala Ala Arg Leu Leu Leu Arg Arg 635 640. 645
Cys Pro Leu Trp Gly Asp Ala Thr Cys Leu Gin Leu Ala Met Gin 650 655 660
Ala Asp Ala Arg Ala Phe Phe Ala Gin Asp Gly Val Gin Ser Leu 665 670 675
Leu Thr Gin Lys Trp Trp Gly Asp Met Ala Ser Thr Thr Pro lie 680 685 690
Trp Ala Leu Val Leu Ala Phe Phe Cys Pro Pro Leu He Tyr Thr 695 700 705
Arg Leu lie Thr Phe Arg Lys Ser Glu Glu Glu Pro Thr Arg Glu 710 715 720
Glu Leu Glu Phe Asp Met Asp Ser Val lie Asn Gly Glu Gly Pro 725 730 735
Val Gly Thr Ala Asp Pro Ala Glu Lys Thr Pro Leu Gly Val Pro 740 745 750
Arg Gin Ser Gly Arg Pro Gly Cys Cys Gly Gly Arg Cys Gly Gly 755 760 765
Arg Arg Cys Leu Arg Arg Trp Phe His Phe Trp Gly Ala Pro Val 770 775 780
Thr lie Phe Met Gly Asn Val Val Ser Tyr Leu Leu Phe Leu Leu 785 790 795
Leu Phe Ser Arg Val Leu Leu Val Asp Phe Gin Pro Ala Pro Pro 800 805 810
Gly Ser Leu Glu Leu Leu Leu Tyr Phe Trp Ala Phe Thr Leu Leu 815 820 825
Cys Glu Glu Leu Arg Gin Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 830 B35 840
Ala Ser Gly Gly Pro Gly Pro Gly His Ala Ser Leu Ser Gin Arg 845 850 855
Leu Arg Leu Tyr Leu Ala Asp Ser Trp Asa Gin Cys Asp Leu val 860 365 970
Ala Leu Thr Cys Phe Leu Leu Gly Val Gly Cys Arg Leu Thr Pro 875 830 885
Gly Leu Tyr His Leu Gly Arg Thr Val Leu Cys lie Asp Phe Met 890 395 900
Val Phe Thr Val Arg Leu Leu His lie Phe Thr val Asn Lys Gin 905 910 915
Leu Gly Pro Lys lie Val lie Val Ser Lys Met Met Lys Asp Val 920 925 930
Phe Phe Phe Leu Phe Phe Leu Gly Val Trp Leu Val Ala Tyr Gly 935 940 945
Val Ala Thr Glu Gly Leu Leu Arg Pro Arg Asp Ser Asp Phe Pro 950 955 960
Ser lie Leu Arg Arg Val Phe Tyr Arg Pro Tyr Leu Gin lie Phe 965 970 975
Gly Gin lie Pro Gin Glu Asp Met Asp Val Ala Leu Met Glu His 980 985 990
Ser Asn Cys Ser Ser Glu Pro Gly Phe Trp Ala His Pro Pro Gly 995 1000 1005
Ala Gin Ala Gly Thr Cys Val Ser Gin Tyr Ala Asn Trp Leu Val 1010 1015 1020
Val Leu Leu Leu Val lie Phe Leu Leu Val Ala Asn lie Leu Leu 1025 1030 1035
Val Asn Leu Leu lie Ala Met Phe Ser Tyr Thr Phe Gly Lys Val 1040 1045 1050
Gin Gly Asn Ser Asp Leu Tyr Trp Lys Ala Gin Arg Tyr Arg Leu 1055 1060 1065 lie Arg Glu Phe His Ser Arg Pro Ala Leu Ala Pro Pro Phe lie 1070 1075 1080
Val lie Ser His Leu Arg Leu Leu Leu Arg Gin Leu Cys Arg Arg 1085 1090 1095
Pro Arg Ser Pro Gin Pro Ser Ser Pro Ala Leu Glu His Phe Arg 1100 1105 1110
Val Tyr Leu Ser Lys Glu Ala Glu Arg Lys Leu Leu Thr Trp Glu 1115 1120 1125
Ser Val His Lys Glu Asn Phe Leu Leu Ala Arg Ala Arg Asp Lys 1130 1135 1140
Arg Glu Ser Asp Ser Glu Arg Leu Lys Arg Thr Ser Gin Lys Val 1145 1150 1155
Asp Leu Ala Leu Lys Gin Leu Gly His lie Arg Glu Tyr Glu Gin 1160 1165 1170
Arg Leu Lys Val Leu Glu Arg Glu Val Gin Gin Cys Ser Arg Val 1175 1180 1185
Leu Gly Trp Val Ala Glu Ala Leu Ser Arg Ser Ala Leu Leu Pro 1190 1195 1200
Pro Gly Gly Pro Pro Pro Pro Asp Leu Pro Gly Ser Lys Asp 1205 1210
<210> 13 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13
Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val lie Trp 15 10 15 lie Met Ala He Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly 20 25 30
Leu Gly His Gin Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala 35 40 45
Phe Arg Asp Asp Ser He Trp Pro Gin Glu Glu Pro Ala lie Arg 50 55 60
Pro Arg Ser Ser Gin Arg Val Pro Pro Met Gly He Gin His Ser 65 70 75
Lys Glu Leu Asn Arg Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met 80 85 90
Leu Gly Ser Phe Cys Ala Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn 95 100 105
Cys Glu His Asp Val Arg Lys Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His 110 115 120
Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys Ser Leu Cys Lys Cys Trp His 125 130 135
Gly Gin Leu Àrg Cys Phe Pro Gin Ala Phe Leu Pro Gly Cys Asp 140 145 150
Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala Ser Arg Thr Pro Glu 155 160 165
Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met Leu Val Gly lie 170 175 180
Cys Leu Ser lie Gin Ser Tyr Tyr 185
<210> 14 <211> 1033 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14
Met Gly Ala Ala Gly Leu Leu Gly Val Phe Leu Ala Leu Val Ala 15 10 15
Pro Gly Val Leu Gly lie Ser Cys Gly Ser Pro Pro Pro He Leu 20 25 30
Asn Gly Arg lie Ser Tyr Tyr Ser Thr Pro lie Ala Val Gly Thr 35 40 45
Val lie Arg Tyr Ser Cys Ser Gly Thr Phe Arg Leu lie Gly Glu 50 55 60
Lys Ser Leu Leu Cys lie Thr Lys Asp Lys Val Asp Gly Thr Trp 65 70 75
Asp Lys Pro Ala Pro Lys Cys Glu Tyr Phe Asn Lys Tyr Ser Ser 90 35 90
Cys Pro Glu Pro lie Val Pro Gly Gly Tyr Lys lie Arg Gly Ser 95 100 105
Thr Pro Tyr Arg His Gly Asp Ser Val Thr Phe Ala Cys Lys Thr 110 115 120
Asn Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys Ser Val Trp Cys Gin Ala Asn 125 130 135
Asn Met Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro Thr Cys Val Ser Val Phe 140 145 150
Pro Leu Glu Cys Pro Ala Leu Pro Met lie His Asn Gly His His 155 160 165
Thr Ser Glu Asn Val Gly Ser lie Ala Pro Gly Leu Ser Val Thr 170 175 180
Tyr Ser Cys Glu Ser Gly Tyr Leu Leu val Gly Glu Lys He Tie 185 190 195
Asn Cys Leu Ser Ser Gly Lys Trp Ser Ala Val Pro Pro Thr Cys 200 205 210
Glu GJu Ala. Arg Cys Lys Ser Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly Lys 215 220 225
Val Lys Glu Pro Pro lie Leu Arg Val Gly Val Thr Ala Asn Phe 230 235 240
Phe Cys Asp Glu Gly Tyr Arg Leu Gin Gly Pro Pro Ser Ser Arg 245 250 255
Cys Val lie Ala Gly Gin Gly Val Ala Trp Thr Lys Met Pro Val 260 265 270
Cys Glu Glu He Phe Cys Pro Ser Pro Pro Pro lie Leu Asn Gly 275 280 285
Arg His He Gly Asn ser Leu Ala Asn Val Sex Tyr Gly Ser He 290 295 300
Vai Thr Tyr Thr Cya Asp Pro Asp Pro Glu Glu Gly Val Asn Phe 305 310 315 lie Leu lie Gly Glu Ser Thr Leu Arg Cys Thr Val Asp Ser Gin 320 325 330
Ly$ Thr Gly Thr Trp Ser Gly Pro Ala Pro Arg Cys Glu Leu Ser 335 340 345
Thr Ser Ala Val Gin Cys Pro His Pro Gin He Leu Arg Gly Arg 350 355 360
Met Val Ser Gly Gin Lys Asp Arg Tyr Thr Tyr Asn Asp Thr Val 365 370 375 lie Phe Ala Cys Met Phe Gly Phe Thr Leu Lys Gly Ser Lys Gin 380 385 390 lie Arg Cys Asn Ala Gin Gly Thr Trp Glu Pro Ser Ala Pro Val 395 400 405
Cys Glu Lys Glu Cys Gin Ala Pro Pro Asn lie Leu Asn Gly Gin 410 415 420
Lys Glu Asp Arg His Met Val Arg Phe Asp Pro Gly Thr Ser He 425 430 435
Lys Tyr Ser Cys Asn Pro Gly Tyr Val Leu Val Gly Glu Glu Ser 440 445 450
He Gin Cys Thr Ser Glu Gly Val Trp Thr Pro Pro Val Pro Gin 455 460 465
Cys Lys Val Ala Ala Cys Glu Ala Thr Gly Arg Gin Leu Leu Thr 470 475 480
Lys Pro Gin His Gin Phe Val Arg Pro Asp Val Asn Ser Ser Cys 485 490 495
Gly Glu Gly Tyr Lys Leu Ser Gly Ser Val Tyr Gin Glu Cys Gin 500 505 510
Gly Thr lie Pro Trp Phe Met Glu lie Arg Leu Cys Lys Glu lie 515 520 525
Thr Cys Pro Pro Pro Pro Val lie Tyr Asn Gly Ala His Thr Gly 530 535 540
Ser Ser Leu Glu Asp Phe Pro Tyr Gly Thr Thr Val Thr Tyr Thr 545 550 555
Cys Asn Pro Gly Pro Glu Arg Gly Val Glu Phe Ser Leu lie Gly 560 565 570 ,
Glu Ser Thr lie Arg Cys Thr Ser Asn Asp Gin Glu Arg Gly Thr 575 580 5Θ5
Trp Ser Gly Pro Ala Pro Leu Cys Lys Leu Ser Leu Leu Ala Val 590 595 600
Gin Cys Ser His Val His lie Ala Asn Gly Tyr Lys lie Ser Gly 605 610 615
Lys Glu Ala Pro Tyr Phe Tyr Asn Asp Thr Val Thr Phe Lys Cys 620 625 630
Tyr Ser Gly Phe Thr Leu Lys Gly Ser Ser Gin lie Arg Cys Lys 635 640 645
Ala Asp Asn Thr Trp Asp Pro Glu lie Pro Val Cys Glu Lys Glu 650 655 660
Thr Cys Gin His Val Arg Gin Ser Leu Gin Glu Leu Pro Ala Gly 665 670 675
Ser Arg Val Glu Leu Val Asn Thr Ser Cys Gin Asp Gly Tyr Gin 660 685 690
Leu Thr Gly His Ala Tyr Gin Met Cys Gin Asp Ala Glu Asn Gly 695 700 705 lie Trp Phe Lys Lys lie Pro Leu Cys Lys Val lie His Cys His 710 715 720
Pro Pro Pro val He val Asn Gly Lys His Thr Gly Met Met Ala 725 730 735
Glu Asn Phe Leu Tyr Gly Asn Glu Val Ser Tyr Glu Cys Asp Gin 740 745 750
Gly Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Lys Lys Leu Gin Cys Arg Ser Asp 755 760 765
Ser Lys Gly His Gly Ser Trp Ser Gly Pro Ser Pro Gin Cys Leu 770 775 780
Arg Ser Pro Pro Val Thr Arg Cys Pro Asn Pro Glu Val Lys His 785 790 795
Gly Tyr Lys Leu Asn Lys Thr His Ser Ala Tyr Ser His Asn Asp 800 805 810 lie Val Tyr Val Asp Cys Asn Pro Gly Phe He Met Asn Gly Ser 815 820 825
Atg Val He Arg Cys His Thr Asp Asn Thr Trp Val Pro Gly Val 830 835 840
Pro Thr Cys He Lys Lys Ala Phe lie Gly Cys Pro Pro Pro Pro 845 850 855
Lys Thr Pro Asn Gly Asn His Thr Gly Gly Asn lie Ala Arg Phe 860 865 870
Ser Pro Gly Met Ser lie Leu Tyr Ser Cys Asp Gin Gly Tyr Leu 875 880 885
Leu Val Gly Glu Ala Leu Leu Leu Cys Thr His Glu Gly Thr Trp 890 895 900
Ser Gin Pro Ala Pro His Cys Lys Glu Val Asn Cys Ser Ser Pro 905 910 915
Ala Asp Met Asp Gly lie Gin Lys Gly Leu Glu Pro Arg Lys Met 920 925 930
Tyr Gin Tyr Gly Ala Val Val Thr Leu Glu Cys Glu Asp Gly Tyr 935 940 945
Met Leu Glu Gly Ser Pro Gin Ser Gin Cys Gin Ser Asp His Gin 950 955 960
Trp Asn Pro Pro Leu Ala Val Cys Arg Ser Arg Ser Leu Ala Pro 965 970 975
Val Leu Cys Gly lie Ala Ala Gly Leu He Leu Leu Thr Phe Leu 980 985 990 lie Val lie Thr Leu Tyr Val He Ser Lys His Arg Glu Arg Asn 995 1000 1005
Tyr Tyr Thr Asp Thr Ser Gin Lys Glu Ala Phe His Leu Glu Ala 1010 1015 1020
Arg Glu Val Tyr Ser Val Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ser 1025 1030
<210> 15 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 15
Met Ala Arg Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser Bis Trp Met Val 15 10 15
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg 20 25 30
Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg 35 40 45 lie Trp Gin Ser Pro Arg Phe lie Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr 50 55 60
Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser 65 70 75
Trp Leu Trp Lys Gin Glu Met Asp Glu Asn Pro Gin Gin Leu Lys 80 85 90
Leu Glu Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gin Asn Glu Ser Leu Ala 95 100 105
Thr Leu Thr lie Gin Gly lie Arg Phe Glu Asp Asn Gly lie Tyr 110 115 120
Phe Cys Gin Gin Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gin Gly 125 130 135
Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gin 140 145 150
Leu Lys Gin Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly lie lie Met lie Gin 155 160 165
Thr Leu Leu lie lie Leu Phe lie lie Val Pro lie Phe Leu Leu 170 175 180
Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr 185 190 195
Tyr Glu Gly Leu Asp lie Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Asp lie 200 205 210
Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His 215 220 225
Pro Gly Gin Glu
<210> 16 <211> 508 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 16
Met Leu Leu Trp Ser Leu Leu Val lie Phe Asp Ala Val Thr Glu 15 10 15
Gin Ala Asp Ser Leu Thr Leu Val Ala Pro Ser Ser Val Phe Glu 20 25 30
Gly Asp Ser He Val Leu Lys Cys Gin Gly Glu Gin Asn Trp Lys 35 40 45 lie Gin Lys Met Ala Tyr His Lys Asp Asn Lys Glu Leu Ser Val 50 55 60
Phe Lys Lys Phe Ser Asp Phe Leu He Gin Ser Ala Val Leu Ser 65 70 75
Asp Ser Gly Asn Tyr Phe Cys Ser Thr Lys Gly Gin Leu Phe Leu 80 85 90
Trp Asp Lys Thr Ser Asn lie Val Lys He Lys Val Gin Glu Leu 95 100 105
Phe Gin Arg Pro Val Leu Thr Ala Ser Ser phe Gin Pro lie Glu 110 115 120
Gly Gly Pro Val Ser Leu Lys Cys Glu Thr Arg Leu Ser Pro Gin 125 130 135
Arg Leu Asp Val Gin Leu Gin Phe Cys Phe Phe Arg Glu Asn Gin 140 145 150
Val Leu Gly Ser Gly Trp Ser Ser Ser Pro Glu Leu Gin lie Ser 155 160 165
Ala Val Trp Ser Glu Asp Thr Gly Ser Tyr Trp Cys Lys Ala Glu 170 175 180
Thr Val Thr His Arg He Arg Lys Gin Ser Leu Gin Ser Gin He 185 190 195
His Val Gin Arg lie Pro lie Ser Asn val Ser Leu Glu lie Arg 200 205 210
Ala Pro Gly Gly Gin val Thr Glu Gly Gin Lys Leu lie Leu Leu 215 220 225
Cys Ser Val Ala Gly Gly Thr Gly Asn Val Thr Phe Ser Trp Tyr 230 235 240
Arg Glu Ala Thr Gly Thr Ser Met Gly Lys Lys Thr Gin Arg Ser 245 250 255
Leu Ser Ala Glu Leu Glu lie Pro Ala Val Lys Glu Ser Asp Ala 260 265 270
Gly Lys Tyr Tyr Cys Arg Ala Asp Asn Gly His Val Pro lie Gin 275 280 285
Ser Lys Val Val Asn lie Pro Val Arg lie Pro Val Ser Arg Pro 290 295 300
Val Leu Thr Leu Arg Ser Pro Gly Ala Gin Ala Ala Val Gly Asp 305 310 315
Leu Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro Pro lie 320 325 330
Leu Tyr Gin Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Asn Ser Ser 335 340 345
Ala Pro Ser Gly Gly Gly Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Ala 350 355 360
Glu His Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu Gly 365 370 375
Ala Gin Cys Ser Glu Ala Val Pro Val Ser lie Ser Gly Pro Asp 380 385 390
Gly Tyr Arg Arg Asp Leu Met Thr Ala Gly Val Leu Trp Gly Leu 395 400 405
Phe Gly Val Leu Gly Phe Thr Gly Val Ala Leu Leu Leu Tyr Ala 410 415 420
Leu Phe His Lys lie Ser Gly Glu Ser Ser Ala Thr Asn Glu Pro 425 430 435
Arg Gly Ala Ser Arg Pro Asn Pro Gin Glu Phe Thr Tyr Sex Ser 440 445 450
Pro Thr Pro Asp Met Glu Glu Leu Gin Pro Val Tyr Val Asn Val 455 460 465
Gly Ser Val Asp Val Asp Val Val Tyr Ser Gin Val Trp Ser Met 470 475 480
Gin Gin Pro Glu Ser Ser Ala Asn lie Arg Thr Leu Leu Glu Asn 485 490 495
Lys Asp Ser Gin Val lie Tyr Ser Ser Val Lys Lys Ser 500 505
<210> 17 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 17
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu 15 10 15
Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp 20 25 30
Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met 35 40 45
Leu Arg His Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Val Val Gin Gly Asn Leu 50 55 60
Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gin 65 70 75
Asp lie Gin Glu Val Gin Gly Tyr Val Leu lie Ala His Asn Gin 80 85 90
Val Arg Gin Val Pro Leu Gin Arg Leu Arg lie Val Arg Gly Thr 95 100 105
Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly 110 115 120
Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly 125 130 135
Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser Leu Thr Glu He Leu Lys 140 145 150
Gly Gly Val Leu lie Gin Arg Asn Pro Gin Leu Cys Tyr Gin Asp 155 160 165
Thr lie Leu Trp Lys Asp He Phe His Lys Asn Asn Gin Leu Ala 170 175 180
Leu Thr Leu lie Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys 185 190 195
Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu 200 205 210
Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala 215 220 225
Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys 245 250 255
Leu His Phe Asn His Ser Gly lie Cys Glu Leu His Cys Pro Ala 260 265 270
Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro
275 230 26S
Glu Gly Art) Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro 290 295 300
Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys 305 310 315
Pro Leu His Asn Gin Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gin Arg 320 325 330
Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu 335 340 345
Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn 350 355 360 lie Gin Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys lie Phe Gly Ser Leu Ala 365 370 375
Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala 380 335 390
Pro Leu Gin Pro Glu Gin Leu Gin Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu 395 400 405 lie Thr Gly Tyr Leu Tyr lie Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro 410 415 420
Asp Leu Ser Val Phe Gin Asn Leu Gin Val lie Arg Gly Arg lie 425 430 435
Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu Gly He 440 445 450
Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu 455 460 465
Ala Leu lie His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 470 475 480
Pro Trp Asp Gin Leu Phe Arg Asn Pro His Gin Ala Leu Leu His 485 490 495
Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala 500 505 510
Cys His Gin Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro 515 520 525
Thr Gin Cys Val Asn Cys Ser Gin Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys 530 535 540
Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gin Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val 545 550 555
Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin 560 565 570
Asn Gly Ser Vai Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gin Cys Vai 575 580 585
Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Vai Ala Arg Cys 590 595 600
Pro Ser Gly Vai Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro lie Trp Lys 605 610 615
Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gin Pro Cys Pro lie Asn Cys 620 625 630
Thr His Ser Cys Vai Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu 635 640 645
Gin Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser lie Ile Ser Ala Vai Vai Gly 650 655 660
Ile Leu Leu Vai Vai Vai Leu Gly Vai Vai Phe Gly Ile Leu Ile 665 670 675
Lys Arg Arg Gin Gin Lys lie Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu 680 685 690
Leu Gin Glu Thr Glu Leu Vai Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala 695 700 705
Met Pro Asn Gin Ala Gin Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu 710 715 720
Arg Lys Vai Lys Vai Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Vai Tyr 725 730 735
Lys Gly lie Trp lie Pro Asp Gly Glu Asn Vai Lys lie Pro Vai 740 745 750
Ala Ile Lys Vai Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro.Lys Ala Asn Lys 755 760 765
Glu lie Leu Asp Glu Ala Tyr Vai Met Ala Gly Vai Gly Ser Pro 770 775 780
Tyr Vai Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Léu Thr Ser Thr Vai Gin 785 790 795
Leu Vai Thr Gin Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu. Asp Ris Vai 800 805 810
Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gin Asp Leu Leu Asn Trp 815 820 825
Cys Met Gin lie Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp Vai Arg 830 835 840
Leu Vai His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Vai Leu Vai Lys Ser 845 850 855
Pro Asn His Vai Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu 860 865 870
Asp lie Asp Glu The Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro 875 880 885 lie Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser lie Leu Arg Arg Arg Phe Thr 890 895 900
His Gig Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu 905 910 915
Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly lie Pro Ala Arg Glu 920 925 930 lie Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro Pro 935 940 945
He Cys Thr lie Asp Val Tyr Met lie Met Val Lys Cys Trp Met 950 955 960
He Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu 965 970 975
Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gin Arg Phe Val Vai lie Gin 980 98S 990
Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr 995 1000 1005
Arg Ser Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala 1010 1015 1020
Glu Glu Tyr Leu Val Pro Gin Gin Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro 1025 1030 1035
Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser 1040 1045 1050
Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro 1055 1060 1065
Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly 1070 1075 1080
Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala 1085 1090 1095
Lys Gly Leu Gin Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gin 1100 1105 1110
Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp 1115 1120 1125
Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gin Pro Glu Tyr Val 1130 1135 1140
Asn Gin Pro Asp Val Arg Pro Gin Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly 1145 1150 1155
Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro 1160 1165 1170
Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe 1175 1180 1185
Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gin 1130 1195 1200
Gly Gly Ala Ala Pro Gin Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro 1205 1210 1215
Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gin Asp Pro Pro Glu Arg 1220 1225 1230
Gly Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn 1235 1240 1245
Pro Glu Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255
<210> 18 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18
Met Gly Pro Pro Ser Ala Pro Pro Cys Arg Leu His Val Pro Trp IS 10 15
Lys Glu Val Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro 20 25 30
Pro Thr Thr Ala Lys Leu Thr He Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val 35 40 45
Ala Glu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Ala His Asn Leu Pro Gin 50 55 60
Asn Arg lie Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly 65 70 75
Asn Ser Leu lie Val Gly Tyr Val lie Gly Thr Gin Gin Ala Thr 80 85 90
Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg Glu Thr He Tyr Pro Asn Ala 95 100 105
Ser Leu Leu He Gin Asn Val Thr Gin Asn Asp Thr Gly Phe Tye 110 115 120
Thr Leu Gin Val He Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr 125 130 135
Gly Gin Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro lys Pro Ser lie Ser 140 145 150
Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe 155 160 165
Thr Cys Glu Pro Glu Val Gin Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val 170 175 180
Asn Gly Gin Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gin Leu Ser Asn
185 190 19S
Gly Asn Met Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Lys Arg Asn Asp Ala 200 205 210
Gly Ser Tyr Glu Cys Glu lie Gin Asn Pro Ala Ser Ala Asn Arg 215 220 225
Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Val Pro 230 235 240
Thr He Ser Pro Ser Lys Ala Asn Tyr Arg Pro Gly Glu Asn Leu 245 250 255
Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gin Tyr Ser 260 265 270
Trp Phe lie Asn Gly Thr Phe Gin Gin Ser Thr Gin Glu Leu Phe 275 280 285 lie Pro Asn lie Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Met Cys Gin 290 295 300
Ala His Asn Ser Ala Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Met 305 310 315
He Thr Val Ser Gly Ser Ala Pro Val Leu Ser Ala Val Ala Thr 320 325 330
Val Gly lie Thr lie Gly Val Leu Ala Arg Val Ala Leu He 335 340
<210> 19 <211> 411 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19
Met Trp Ser Gly Trp Trp Leu Trp Pro Leu Val Ala Val Cys Thr 15 10 15
Ala Asp Phe Phe Arg Asp Glu Ala Glu Arg lie Met Arg Asp Ser 20 25 30
Pro Val lie Asp Gly His Asn Asp Leu Pro Trp Gin Leu Leu Asp 35 40 45
Met Phe Asn Asn Arg Leu Gin Asp Glu Arg Ala Asn Leu Thr Thr 50 55 60
Leu Ala Gly Thr His Thr Asn lie Pro Lys Leu Arg Ala Gly Phe 65 70 75
Val Gly Gly Gin Phe Trp Ser Val Tyr Thr Pro Cys Asp Thr Gin 80 85 90
Asn Lys Asp Ala Val Arg Arg Thr Leu Glu Gin Met Asp Val Val 95 100 105
His Arg Met Cys Arg Met Tyr Pro Glu Thr Phe Leu Tyr Val Thr 110 115 120
Ser Ser Ala Gly Ile Arg Gin Ala Phe Arg Glu Gly Lys Vai Ala 125 130 135
Ser Leu Ile Gly Vai Glu Gly Gly Sis Ser Ile Asp Ser Ser Leu 140 145 150
Gly Vai Leu Arg Ala Leu Tyr Gin Leu Gly Met Arg Tyr Leu Thr 155 160 165
Leu Thr His Ser Cys Asn Thr Pro Trp Ala Asp Asn Trp Leu Vai 170 175 180
Asp Thr Gly Asp Ser Glu Pro Gin Ser Gin Gly Leu Ser Pro Phe 185 190 195
Gly Gin Arg Vai Vai Lys Glu Leu Asn Arg Leu Gly Vai Leu Ile 200 205 210
Asp Leu Ala His Vai Ser Vai Ala Thr Met Lys Ala Thr Leu Gin 215 220 225
Leu Ser Arg Ala Pro Vai Ile Phe Ser His Ser Ser Ala Tyr Ser 230 235 240
Vai Cys Ala Ser Arg Arg Asn Vai Pro Asp Asp Vai Leu Arg Leu 245 250 255
Vai Lys Gin Thr Asp Ser Leu Vai Met Vai Asn Phe Tyr Asn Asn 260 265 270
Tyr Ile Ser Cys Thr Asn Lys Ala Asn Leu Ser Gin Vai Ala Asp 275 280 285
His Leu Asp His Ile Lys Glu Vai Ala Gly Ala Arg Ala Vai Gly 290 295 300
Phe Gly Gly Asp Phe Asp Gly Vai Pro Arg Vai Pro Glu Gly Leu 305 310 315
Glu Asp Vai Ser Lys Tyr Pro Asp Leu Ile Ala Glu Leu Leu Arg 320 325 330
Arg Asn Trp Thr Glu A1a Gig Vai Lys Gly Ala Leu Ala Asp Asn 335 340 345
Leu Leu Arg vai Phe Glu Ala Vai Glu Gin Ala Ser Asn Leu Thr 350 355 360
Gin Ala Pro Glu Glu Glu Pro lie Pro Leu Asp Gin Leu Gly Gly 365 370 375
Ser Cys Arg Thr His Tyr Gly Tyr Ser Ser Gly Ala Ser Ser Leu 380 385 390
His Arg His Trp Gly Leu Leu Leu Ala Ser Leu Ala Pro Leu Val 395 400 405
Leu Cys Leu Ser Leu Leu 410
<210> 20 <211> 553 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Met Arg Ala Pro Gly Arg Pro Ala Leu Arg Pro Leu Pro Leu Pro 15 10 15
Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Pro Trp Gly Arg Ala Val 20 25 30
Pro Cys Val Ser Gly Gly Leu Pro Lys Pro Ala Asn lie Thr Phe 35 40 45
Leu Ser lie Asn Met Lys Asn Val Leu Gin Trp Thr Pro Pro Glu 50 55 60
Gly Leu Gin Gly Val Lys Val Thr Tyr Thr Val Gin Tyr Phe lie 65 70 75
Tyr Gly Gin Lys Lys Trp Leu Asn Lys Ser Glu Cys Arg Asn lie 80 85 90
Asn Arg Thr Tyr Cys Asp Leu Ser Ala Glu Thr Ser Asp Tyr Glu 95 100 105
His Gin Tyr Tyr Ala Lys Val Lys Ala lie Trp Gly Thr Lys Cys 110 115 120
Ser Lys Trp Ala Glu Ser Gly Arg Phe Tyr Pro Phe Leu Glu Thr 125 130 135
Gin lie Gly Pro Pro Glu Val Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lys Ser 140 145 150 lie Ser Val Val Leu Thr Ala Pro Glu Lys Trp Lys Arg Asn Pro 155 160 165
Glu Asp Leu Pro Val Ser Met Gin Gin He Tyr Ser Asn Leu Lys 170 175 180
Tyr Asn Val Ser Val Leu Asn Thr Lys Ser Asn Arg Thr Trp Ser 185 190 195
Gin Cys Val Thr Asn His Thr Leu Val Leu Thr Trp Leu Glu Pro 200 205 210
Asn Thr Leu Tyr Cys Val His Val Glu Ser Phe Val Pro Gly Pro 215 220 225
Pro Arg Arg Ala Gin Pro Ser Glu Lys Gin Cys Ala Arg Thr Leu 230 235 240
Lys Asp Gin Ser Ser Glu Phe Lys Ala Lys He lie Phe Trp Tyr 245 250 255
Val Leu Pro lie Ser He Thr Val Phe Leu Phe Ser Val Met Gly 260 265 270
Tyr Ser lie Tyr Arg Tyr He His Val Gly Lys Glu Lys His Pro 275 280 285
Ala Asn Leu lie Leu lie Tyr Gly Asn Glu Phe Asp Lys Arg Phe 290 295 300
Phe Val Pro Ala Glu Lys He Val lie Asn Phe lie Thr Leu Asn 305 310 315
He Ser Asp Asp Ser Lys lie Ser His Gin Asp Met Ser Leu Leu 320 325 330
Gly l>ys Ser Ser Asp Val Ser Ser Leu Asn Asp Pro Gin Pro Ser 335 340 345
Gly Asn Leu Arg Pro Pro Gin Glu Glu Glu Glu Val Lys His Leu 350 355 360
Gly Tyr Ala Ser His Leu Met Glu He Phe Cys Asp Ser Glu Glu 365 370 375
Asn Thr Glu Gly Thr Ser Phe Thr Gin Gin Glu Ser Leu Ser Arg 380 385 390
Thr He Pro Pro Asp Lys Thr Val lie Glu Tyr Glu Tyr Asp Val 395 400 405
Arg Thr Thr Asp lie Cys Ala Gly Pro Glu Glu Gin Glu Leu Ser 410 415 420
Leu Gin Glu Glu Val Ser Thr Gin Gly Thr Leu Leu Glu Ser Gin 425 430 435
Ala Ala Leu Ala Val Leu Gly Pro Gin Thr Leu Gin Tyr Ser Tyr 440 445 450
Thr Pro Gin Leu Gin Asp Leu Asp Pro Leu Ala Gin Glu His Thr 455 460 465
Asp Ser Glu Glu Gly Pro Glu Glu Glu Pro Ser Thr Thr Leu Val 470 475 480
Asp Trp Asp Pro Gin Thr Gly Arg Leu Cys He Pro Ser Leu Ser 485 490 495
Ser Phe Asp Gin Asp Ser Glu Gly Cys Glu Pro Ser Glu Gly Asp 500 505 510
Gly Leu Gly Glu Glu Gly Leu Leu Ser Arg Leu Tyr Glu Glu Pro 515 520 525
Ala Pro Asp Arg Pro Pro Gly Glu Asn Glu Thr Tyr Leu Met Gin 530 535 540
Phe Met Glu Glu Trp Gly Leu Tyr Val Gin Met Glu Asn 545 550
<210> 21 <211> 911 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Met Ala Gin Leu Phe Leu Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Leu Ala 15 10 15
Gin Ala Fro Ala Ala Leu Ala Asp Val Leu Glu Gly Asp Ser Ser 20 25 30
Glu Asp Arg Ala Phe Arg Val Arg lie Ala Gly Asp Ala Pro Leu 35 40 45
Gin Gly Val Leu Gly Gly Ala Leu Thr lie Pro Cys His Val His 50 55 60
Tyr Leu Arg Pro Pro Pro Ser Arg Arg Ala Val Leu Gly Ser Pro 65 70 75
Arg Val Lys Trp Thr Phe Leu Ser Arg Gly Arg Glu Ala Glu Val 80 85 90
Leu Val Ala Arg Gly Val Arg Val Lys Val Asn Glu Ala Tyr Arg 95 100 105
Phe Arg Val Ala Leu Pro Ala Tyr Pro Ala Ser Leu Thr Asp Val 110 115 120
Ser Leu Ala Leu Ser Glu Leu Arg Pro Asti Asp Ser Gly He Tyr 125 130 135
Arg Cys Glu Val Gin His Gly lie Asp Asp Ser Ser Asp Ala Val 140 145 150
Glu Val Lys Val Lys Gly Val Val Phe Leu Tyr Arg Glu Gly Ser 155 160 165
Ala Arg Tyr Ala Phe Ser Phe Ser Gly Ala Gin Glu Ala Cys Ala 170 175 180
Arg He Gly Ala His He Ala Thr Pro Glu Gin Leu Tyr Ala Ala 185 190 195
Tyr Leu Gly Gly Tyr Glu Gin Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ser Asp 200 205 210
Gin Thr Val Arg Tyr Pro lie Gin Thr Pro Arg Glu Ala Cys Tyr 215 220 225
Gly Asp Met Asp Gly Phe Pro Gly Val Arg Asn Tyr Gly Val Val 230 235 240
Asp Pro Asp Asp Leu Tyr Asp Val Tyr Cys Tyr Ala Glu Asp Leu 245 250 255
Asn Gly Glu Leu Phe Leu Gly Asp Pro Pro Glu Lys Leu Thr Leu 260 265 270
Glu Glu Ala Arg Ala Tyr Cys Gin Glu Arg Gly Ala Glu lie Ala 275 280 285
Thr Thr Gly Gin Leu Tyr Ala Ala Trp Asp Gly Gly Leu Asp His 290 295 300
Cys Ser Pro Gly Trp Leu Ala Asp Gly Ser Val Arg Tyr Pro He 305 310 315
Val Thr Pro Ser Gin Arg Cys Gly Gly Gly Leu Pro Gly Val Lys 320 325 330
Thr Leu Phe Leu Phe Pro Asn Gin Thr Gly Fhe Pro Asn Lys His 335 340 345
Ser Arg Phe Asn Val Tyr Cys Phe Arg Asp Ser Ala Gin Pro Ser 350 355 360
Ala lie Pro Glu Ala Ser Asn Pro Ala Ser Asn Pro Ala Ser Asp 365 370 375
Gly Leu Glu Ala He Val Thr Val Thr Glu Thr Leu Glu Glu Leu 380 365 390
Gin Leu Pro Gin Glu Ala Thr Glu Ser Glu Ser Arg Gly Ala He 395 400 405
Tyr Ser He Pro He Met Glu Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr 410 415 420
Pro Glu Asp Pro Ala Glu Ala Pro Arg Thr Leu Leu Glu Phe Glu 425 430 435
Thr Gin Ser Met Val Pro Pro Thr Gly Phe Ser Glu Glu Glu Gly 440 445 450
Lys Ala Leu Glu Glu Glu Glu Lys Tyr Glu Asp Glu Glu Glu Lys 455 460 465
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu GÍu Val Glu Asp Glu Ala Leu Trp 470 475 480
Ala Trp Pro Ser Glu Leu Ser Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Leu 485 490 495
Pro Thr Glu Pro Ala Ala Gin Glu Lys Ser Leu Ser Gin Ala Pro 500 505 510
Ala Arg Ala Val Leu Gin Pro Gly Ala Ser Pro Leu Pro Asp Gly 515 520 525
Glu Ser Glu Ala Ser Arg Pro Pro Arg Val His Gly Pro Pro Thr 530 535 540
Glu Thr Leu Pro Thr Pro Arg Glu Arg Asn Leu Ala Ser Pro Ser 545 550 555
Pro Ser Thr Leu Val Glu Ala Arg Glu Val Gly Glu Ala Thr Gly 560 565 570
Gly Pro Glu Leu Ser Gly Val Pro Arg Gly Glu Ser Glu Glu Thr 575 580 585
Gly Ser Ser Glu Gly Ala Pro Ser Leu Leu Pro Ala Thr Arg Ala 590 555 600
Pro Glu Gly Thr Arg Glu Leu Glu Ala Pro Ser Glu Asp Asn Ser 605 610 615
Gly Arg Thr Ala Pro Ala Gly Thr Ser Val Gin Ala Gin Pro Val 620 625 630
Leu Pro Thr Asp Ser Ala Ser Arg Gly Gly Val Ala Val Val Pro 635 640 645
Ala Ser Gly Asp Cys Vsl Pro Ser Pro Cys His Asn Gly Gly Thr 650 655 660
Cys Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val Arg Cys Leu Cys Leu Pro Gly 665 670 675
Tyr Gly Gly Asp Leu Cys Asp Val Gly Leu Arg Phe Cys Asn Pro 680 685 690
Gly Trp Asp Ala Phe Gin Gly Ala Cys Tyr Lys His Phe Ser Thr 695 700 705
Arg Arg Ser Trp Glu Gla Ala Glu Thr Gin Cys Arg Met Tyr Gly 710 715 720
Ala His Leu Ala Ser He Ser Thr Pro Glu Glu Gin Asp Phe lie 725 730 735
Asn Asn Arg Tyr Arg Glu Tyr Gin Trp lie Gly Leu Asn Asp Arg 740 745 750
Thr He Glu Gly Asp Phe Leu Trp Ser Asp Gly Val Pro Leu Leu 755 760 765
Tyr Glu Asn Trp Asn Pro Gly Gin Pro Asp Ser Tyr Phe Leu Ser 770 775 780
Gly Glu Asn Cys Val Val Met Val Trp His Asp Gin Gly Gin Trp 785 790 795
Ser Asp Val Pro Cys Asn Tyr His Leu Ser Tyr Thr Cys Lys Met 800 B05 810
Gly Leu Val Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Pro Leu Ala Gin 815 020 825
Val Phe Gly Arg Pro Arg Leu Arg Tyr Glu Val Asp Thr Val Leu 830 835 840
Arg Tyr Arg Cys Arg Glu Gly Leu Ala Gin Arg Asn Leu Pro Leu 845 850 855 lie Arg Cys Gin Glu Asn Gly Arg Trp Glu Ala Pro Gin lie Ser 860 865 870
Cys Val Pro Arg Arg Pro Ala Arg Ala Leu His Pro Glu Glu Asp 875 880 885
Pro Glu Gly Arg Gin Gly Arg Leu Leu Gly Arg Trp Lys Ala Leu 890 895 900
Leu He Pro Pro Ser Ser Pro Met Pro Gly Pro 905 910
<210> 22 <211> 987 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Met Ala Leu Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro Leu 15 10 15
Leu Ala Ala Val Glu Glu Thr Leu Met Asp Ser Thr Thr Ala Thr 20 25 30
Ala Glu Leu Gly Tip Met Val His Pro Pro Ser Gly Trp Glu Glu 35 40 45
Val Ser Gly Tyr Asp Glu Asn Met Asn Thr lie Arg Thr Tyr Gin 50 55 60
Val Cys Asn Val Phe Glu Ser Ser Gin Asn Asn Trp Leu Arg Thr 65 70 75
Lys Phe lie Arg Arg Arg Gly Ala His Arg lie His Val Glu Met 80 85 90
Lys Phe Ser Val Arg Asp Cys Ser Ser lie Pro Ser Val Pro Gly 95 100 105
Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ala Asp Phe 110 115 120
Asp Ser Ala Thr Lys Thr Phe Pro Asn Trp Met Glu Asn Pro Trp 125 130 135
Val Lys Val Asp Thr He Ala Ala Asp Glu Ser Phe Ser Gin Val 140 145 150
Asp Leu Gly Gly Arg Val Met Lys He Asn Thr Glu Val Arg Ser 155 160 165
Phe Gly Pro Val Ser Arg Ser Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gin Asp 170 175 180
Tyr Gly Gly Cys Met Ser Leu lie Ala Val Arg Val Phe Tyr Arg 185 190 195
Lys Cys Pro Arg He lie Gin Asn Gly Ala lie Phe Gin Glu Thr 200 205 210
Leu Ser Gly Ala Glu Ser Thr Ser Leu Val Ala Ala Arg Gly Ser 215 220 225
Cys lie Ala Asn Ala Glu Glu Val Asp Val Pro He Lys Leu Tyr 230 235 240
Cys Asn Gly Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro lie Gly Arg Cys Met 245 250 255
Cys Lys Ala Gly Phe Glu Ala Val Glu Asn Gly Thr Val Cys Arg 260 265 270
Gly Cys Pro Ser Gly Thr Phe Lys Ala Asn Gin Gly Asp Glu Ala 275 280 285
Cys Thr His Cys Pro He Asn Ser Arg Thr Thr Ser Glu Gly Ala 290 295 300
Thr Asn Cys Val Cys Arg Asn Gly Tyr Tyr Arg Ala Asp Leu Asp 305 310 315
Pro Leu Asp Met Pro Cys Thr Thr lie Pro Ser Ala Pro Gin Ala 320 325 330
Val lie Ser Ser Val Asn Glu Thr Ser Leu Met Leu Glu Trp Thr· 335 340 345
Pro Pro Arg Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Leu Val Tyr Asn lie 350 355 360 lie Cys Lys Ser Cys Gly Ser Gly Arg Gly Ala Cys Thr Arg Cys 365 370 375
Gly Asp Asn Val Gin Tyr Ala Pro Arg Gin Leu Gly Leu Thr Glu 380 385 390
Pro Arg lie Tyr lie Ser Asp Leu Leu Ala His Thr Gin Tyr Thr 395 400 405
Phe Glu lie Gin Ala Val Asn Gly Val Thr Asp Gin Ser Pro Phe 410 415 420
Ser Pro Gin Phe Ala Ser Val Asn lie Thr Thr Asn Gin Ala Ala 425 430 435
Pro Ser Ala Val Ser lie Met His Gin Val Ser Arg Thr Val Asp 440 445 450
Ser lie Thr Leu Ser Trp Ser Gin Pro Asp Gin Pro Asn Gly Val 45S 460 465 lie Leu Asp Tyr Glu Leu Gin Tyr Tyr Glu Lys Glu Leu Ser Glu 470 475 480
Tyr Asn Ala Thr Ala lie Lys Ser Pro Thr Asn Thr Val Thr Val 485 490 495
Gin Gly Leu Lys Ala Gly Ala lie Tyr Val Phe Gin Val Arg Ala 500 505 510
Arg Thr Val Ala Gly Tyr Gly Arg Tyr Ser Gly Lys Met Tyr Phe 515 520 525
Gin Thr Met Thr Glu Ala Glu Tyr Gin Thr Ser He Gin Glu Lys 530 535 540
Leu Pro Leu lie lie Gly Ser Ser Ala Ala Gly Leu val Phe Leu 545 550 555 lie Ala Val Val Val lie Ala lie Val Cys Asn Arg Arg Arg Gly 560 565 570
Phe Glu Arg Ala Asp Ser Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Gin His Tyr 575 580 585
Thr Ser Gly His Met Thr Pro Gly Met Lys He Tyr lie Asp pro 590 595 600
Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu Phe Ala Lys 605 610 615
Glu He Asp He Ser Cys Val Lys lie Glu Gin Val lie Gly Ala 620 625 630
Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly His Leu Lys Leu Pro Gly 635 640 645
Lys Arg Glu lie Phe Val Ala lie Lys Thr Leu Lys Ser Gly Tyr 650 655 660
Thr Glu Lys Gin Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser He Met 665 670 675
Gly Gin Phe Asp His Pro Asn Val lie His Leu Glu Gly Val Val 680 685 690
Thr Lys Ser Thr Pro Val Met lie lie Thr Glu Phe Met Glu Asn 695 700 705
Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Arg Gin Asn Asp Gly Gin Phe Thr 710 715 720
Val He Gin Leu Val Gly Met Leu Arg Gly lie Ala Ala Gly Met 725 730 735
Lys Tyr Leu Ala Asp Met Asn Tyr val His Arg Asp Leu Ala Ala 740 745 750
Arg Asn lie Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp 755 760 765
Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu Asp Asp Thr Ser Asp Pro Thr 770 775 780
Tyr Thr Ser Ala Leu Gly Gly Lys lie Pro lie Arg Trp Thr Ala 785 790 795
Pro Glu Ala lie Gin Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val 800 805 810
Trp Ser Tyr Gly He Val Met Trp Glu Val Met Ser Tyr Gly Glu 815 820 325
Arg Pro Tyr Trp Asp Met Thr Asn Gin Asp Val lie Asn Ala lie 830 835 840
Glu Gin Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala 845 850 855
Leu His Gin Leu Met Leu Asp Cys Trp Gin Lys Asp Arg Asn His 860 865 870
Arg Pro Lys Phe Gly Gin lie Val Asn Thr Leu Asp Lys Met He 975 880 885
Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Ala Met Ala Pro Leu Ser Ser Gly 890 895 900 lie Asn Leu Pro Leu Leu Asp Arg Thr lie Pro Asp Tyr Thr Ser 905 910 915
Phe Asn Thr Val Asp Glu Trp Leu Glu Ala lie LyS Met Gly Gin 920 925 930
Tyr Lys Glu Ser Phe Ala Asn Ala Gly Phe Thr Ser Phe Asp Val 935 940 945
Val Ser Gin Met Met Met Glu Asp lie Leu Arg Val Gly Val Thr 950 955 960
Leu Ala Gly His Gin Lys Lys lie Leu Asn Ser lie Gin Val Met 965 970 975
Arg Ala Gin Met Asn Gin lie Gin Ser Val Glu Val 980 985
<210> 23 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Met Ala Ser Leu Gly Gin lie Leu Phe Trp Ser lie He Ser lie 15 10 15 lie lie lie Leu Ala Gly Ala lie Ala Leu He lie Gly Phe Gly 20 25 30 lie Ser Gly Arg His Ser Xle Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala 35 40 45
Gly Asn lie Gly Glu Asp Gly He Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro 50 55 60
Asp He Lys Leu Ser Asp lie Val He Gin Trp Leu Lys Glu Gly 65 70 75
Val Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu 80 85 90
Ser Glu Gin Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala 95 100 105
Asp Gin Val lie Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val 110 115 120
Gin Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr He lie Thr Ser 125 130 135
Lys Gly Lys Lys Asn Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe 140 145 150
Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr 155 160 165
Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gin Pro Thr Val Val 170 175 180
Trp Ala Ser Gin Val Asp Gin Gly Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser 185 190 195
Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met Lys Val 200 205 210
Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr lie Asn Asn Thr Tyr Ser Cys 215 220 225
Met lie Glu Asn Asp lie Ala Lys Ala Thr Gly Asp He Lys Val 230 235 240
Thr Glu Ser Glu lie Lys Arg Arg Ser His Leu Gin Leu Leu Asn 245 250 255
Ser Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala He Ser Trp 260 265 270
Ala Leu Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys 275 280
<210> 24 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu 1 5 .10 15
Gin Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gin Val 20 25 30
Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gin Val Glu Asn Cys Thr Gin Leu Gly 35 40 45
Glu Gin Cys Trp Thr Ala Arg lie Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr 50 55 60
Val lie Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gin 65 70 75
Asp Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn He Thr Cys Cys Asp Thr Asp 80 85 90
Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gin Pro Ala Ala Ala 95 100 105
He Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro 110 115 120
Gly Gin Leu
<210> 25 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Met Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met 15 10 15
Leu Pro Ala Gin Glu Ala Ala Lys Leu Tyr Hi3 Thr Asn Tyr Val 20 25 30
Arg Asn Ser Arg Ala lie Gly Val Leu Trp Ala He Phe Thr lie 35 40 45
Cys Phe Ala lie Val Asn Val Val Cys Phe lie Gin Pro Tyr Trp 50 55 60 lie Gly Asp Gly Val Asp Thr Pro Gin Ala Gly Tyr Phe Gly Leu 65 70 75
Phe His Tyr Cys lie Gly Asn Gly Phe Ser Arg Glu Leu Thr Cys 80 85 90
Arg Gly Ser Phe Thr Asp Phe Ser Thr Leu Pro Ser Gly Ala Phe 95 100 105
Lys Ala Ala Ser Phe Phe lie Gly Leu Ser Met Met Leu He lie 110 115 120
Ala Cys lie lie Cys Phe Thr Leu Phe Phe Phe Cys Asn Thr Ala 125 130 135
Thr Val Tyr Lys lie Cys Ala Trp Met Gin Leu Thr Ser Ala Ala 140 145 150
Cys Leu Val Leu Gly Cys Met lie Phe Pro Asp Gly Trp Asp Ser 155 160 165
Asp Glu Val Lys Arg Met Cys Gly Glu Lys Thr Asp Lys Tyr Thr 170 175 180
Leu Gly Ala Cys Ser Val Arg Trp Ala Tyr lie Leu Ala lie lie 185 190 195
Gly He Leu Asp Ala Leu lie Leu Ser Phe Leu Ala Phe Val Leu 200 205 210
Gly Asn Arg Gin Asp Ser Leu Met Ala Glu Glu Leu Lys Ala Glu 215 220 225
Asn Lys Val Leu Leu Ser Gin Tyr Ser Leu Glu 230 235
<210> 26 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 26
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala 15 10 15
Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg 20 25 30
His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro 35 40 45
Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin 50 55 60
Glu Ser Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro 65 70, 75
Gly Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val 80 85 90
Leu Ala Leu Val Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gin 95 100 105
Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp 110 115 120
Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp Lys Val lie lie Leu Ser Pro 125 130 135
Gly lie Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu 140 145 150
Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser Val Pro Val Pro Ala 155 160 165
Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly 170 175 180
Pro Glu Gin Gin
<210> 27 <211> 847 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr 15 10 15
Leu Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu 20 25 30
Thr Leu Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp He Pro Cys Thr 35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe lie Leu Phe His 50 55 60
Asn Pro Glu Tyr Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg 65 70 75
Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gin Lys 80 85 90
Arg Val Gin Phe Leu Gly Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser 95 100 - 105 lie His Pro Val His Leu Asn Asp Ser Gly Gin Leu Gly Leu Arg 110 115 120
Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp Met Glu Arg lie His Leu Asn 125 130 135
Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His He Gin Leu Pro Pro Glu 140 145 150 lie Gin Glu Ser Gin Glu Val Thr Leu Thr Cys Leu Leu Asn Phe 155 160 165
Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro lie Gin Leu Gin Trp Leu Leu Glu Gly 170 175 180
Val Pro Met Arg Gin Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser Leu Thr lie 185 180 195
Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro Gin Trp 200 205 210
Ser His His Gly Lys lie Val Thr Cys Gin Leu Gin Asp Ala Asp 215 220 225
Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gin Leu Asn Val Lys His 230 235 240
Thr Pro Lys Leu Glu lie Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala lie val 245 250 255
Arg Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser 260 265 270
Asn Pro Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser 275 280 285
Leu Lys Lys Gin Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr 290 295 300
Lys Asp Gin Ser Gly Lys Tyr Cys Cys Gin Val Ser Asn Asp Val 305 310 315
Gly Pro Gly Arg Ser Glu Glu val Phe Leu Gin Val Gin Tyr Ala 320 325 330
Pro Glu Pro Ser Thr Val Gin lie Leu His Ser Pro Ala Val Glu 335 340 345
Gly Ser Gin Val Glu Phe Leu Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu 350 355 360
Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His Asn Gly Lys Glu Met Gin Gly 365 370 375
Arg Thr Glu Glu Lys Val His He Pro Lys He Leu Pro Trp His 380 385 390
Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn He Leu Gly Thr Gly 395 400 405
Gin Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gin Tyr Pro Pro Lys 410 415 420
Lys Val Thr Thr Val lie Gin Asn Pro Met Pro lie Arg Glu Gly 425 430 435
Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn Pro Ser 440 445 450
Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu Pro 4S5 460 465
Ser Leu Gly Val Leu Lys He Gin Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr 470 475 480
Thr He Ala Cys Ala Arg Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser 485 490 495
Pro Val Ala Leu Asn Val Gin Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val 500 505 510
Arg Lys He Lys Pro Leu Ser Glu lie His Ser Gly Asn Ser Val 515 520 525
Ser Leu Gin Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gin 530 535 540
Phe Phe Trp Glu Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gin 545 550 555
Leu Asn Phe Asp Ser lie Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser 560 565 570
Cys Trp Val Asn Asn Ser He Gly Gin Thr Ala Ser Lys Ala Trp 575 580 585
Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met 590 595 600
Ser Pro Gly Asp Gin Val Met Glu Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr 605 610 615
Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val Ser His Tyr Thr Trp Phe 620 625 630
Asp Trp Asn Asn Gin Ser Leu Pro His His Ser Gin Lys Leu Arg 635 640 645
Leu Glu Pro Val Lys Val Gin His Ser Gly Ala Tyr Trp Cys Gin 650 655 660
Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu Ser Thr Leu 665 670 675
Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr lie Gly Arg Arg Val Ala Val 680 685 690
Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala lie Leu lie Leu Ala lie Cys Gly 695 700 705
Leu Lys Leu Gin Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gin Ser Gin Gin Gly 710 715 720
Leu Gin Glu Asn Ser Ser Gly Gin Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys 725 730 735
Lys Val Arg Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly 740 745 750
Cys Tyr Asn Pro Met Met Glu Asp Gly He Ser Tyr Thr Thr Leu 755 760 765
Arg Phe Pro Glu Met Asn lie Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser 770 775 780
Ser Glu Met Gin Arg Pro Pro Arg Thr Cys Asp Asp Thr Val Thr 785 790 795
Tyr Ser Ala Leu His Lys Arg Gin Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val 800 805 810 lie Pro Asp Phe Pro Glu Asp Glu Gly lie His Tyr Ser Glu Leu 815 820 825
He Gin Phe Gly Val Gly Glu Arg Pro Gin Ala Gin Glu Asn Val 830 835 840
Asp Tyr Val He Leu Lys His ( 845
<210> 28 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gin Ala Leu Pro Ala Thr lie 15 10 15
Phe Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys 20 25 30
Gin Ala Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser 35 40 45
Leu Gly Glu Asp Ala His Phe Gin Cys Pro HÍ3 Asn Ser Ser Asn 50 55 60
Asn Ala Asn Val Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr 65 70 75
Trp Pro Pro Glu Phe Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr 80 85 90
Leu He lie Gin Asn Val Asn Lys Ser His Gly Gly He Tyr Val 95 100 105
Cys Arg Val Gin Glu Gly Asn Glu Ser Tyr Gin Gin Ser Cys Gly 110 115 120
Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gin Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp 125 130 135
Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg He He Thr Ala Glu Gly He 140 145 150
He Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe 155 160 165
Arg Lys Arg Trp Gin Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp 170 175 180
Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp 185 190 195
Cys Ser Met Tyr Glu Asp He Ser Arg Gly Leu Gin Gly Thr Tyr 200 205 210
Gin Asp Val Gly Ser Leu Asn lie Gly Asp Val Gin Leu Glu Lys 215 220 225
Pro
<210> 29 <211> 372 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 29
Met Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu 15 10 15
Asp Leu Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Tyr Asn Asp Thr 20 25 30
Ser Leu Val Glu Asn His Leu Cys Pro Ala Thr Glu Gly Pro Leu 35 40 45
Met Ala Ser Phe Lys Ala Val Phe Val Pro Val Ala Tyr Ser Leu 50 55 60 lie Phe Leu Leu Gly Val lie Gly Asn Val Leu Val Leu Val lie 65 70 75
Leu Glu Arg His Arg Gin Thr Arg Ser Ser Thr Glu Thr Phe Leu 80 85 90
Phe His Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Val Phe lie Leu Pro 95 100 105
Phe Ala Val Ala Glu Gly Ser Val Gly Trp Val Leu Gly Thr Phe 110 115 120
Leu Cys Lys Thr Val He Ala Leu His Lys Val Asn Phe Tyr Cys 125 130 135
Ser Ser Leu Leu Leu Ala Cys He Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala 140 145 150 lie Val His Ala Val His Ala Tyr Arg His Arg Arg Leu Leu Ser 155 160 165 lie His He Thr Cys Gly Thr He Trp Leu Val Gly Phe Leu Leu 170 175 180
Ala Leu Pro Glu lie Leu Phe Ala Lys Val Ser Gin Gly His His 185 190 195
Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gin Glu Asn Gin Ala 200 205 210
Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Val Ala 215 220 225
Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Val Met Gly Trp Cys Tyr Val Gly 230 235 240
Val Val His Arg Leu Arg Gin Ala Gin Arg Arg Pro Gin Arg Gin 245 250 255
Lys Ala Val Arg Val Ala He Leu Val Thr Ser lie Phe Phe Leu 260 265 270
Cys Trp Ser Pro Tyr His He Val lie Phe Leu Asp Thr Leu Ala 275 280 285
Arg Leu Lys Ala Val Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu 290 295 300
Pro Val Ala lie Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys 305 310 315
Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Val Lys Phe Arg 320 325 330
Ser Asp Leu Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro 335 340 345
Ala Ser Leu Cys Gin Leu Phe Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu 350 355 360
Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe 365 370
<210> 30 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Met Gly Ser Gly Trp Val Pro Trp Val Val Ala Leu Leu Val Asn 15 10 15
Leu Tbr Arg Leu Asp Ser Ser Met Thr Gin Gly Thr Asp Ser Pro 20 25 30
Glu Asp Phe Val He Gin Ala Lys Ala Asp Cys Tyr Phe Thr Asn 35 40 45
Gly Thr Glu Lys Val Gin Phe Val Val Arg Phe lie Phe Asn Leu 50 55 60
Glu Glu Tyr Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Met Phe Val Ala 65 70 75
Leu Thr Lys Leu Gly Gin Pro Asp Ala Glu Gin Trp Asn Ser Arg 80 85 90
Leu Asp Leu Leu Glu Arg Ser Arg Gin Ala Val Asp Gly Val Cys 95 100 105
Arg His Asn Tyr Arg Leu Gly Ala Pro Phe Thr Val Gly Arg Lys 110 115 120
Val Gin Pro Glu Val Thr Val Tyr Pro Glu Arg Thr Pro Leu Leu 125 130 135
His Gin His Asn Leu Leu His Cys Ser Val Thr Gly Phe Tyr Pro 140 145 150
Gly Asp lie Lys lie Lys Trp Phe Leu Asn Gly Gin Glu Glu Arg 155 160 165
Ala Gly Val Met Ser Thr Gly Pro lie Arg Asn Gly Asp Trp Thr 170 175 180
Phe Gin Thr Val Val Met Leu Glu Met Thr Pro Glu Leu Gly His 185 190 195
Val Tyr Thr Cys Leu Val Asp His Ser Ser Leu Leu Ser Pro Val 200 205 210
Ser Val Glu Trp Arg Ala Gin Ser Glu Tyr Ser Trp Arg Lys Met 215 220 225
Leu Ser Gly lie Ala Ala Phe Leu Leu Gly Leu lie Phe Leu Leu 230 235 240
Val Gly He Val lie Gin Leu Arg Ala Gin Lys Gly Tyr Val Arg 245 250 255
Thr Gin Met Ser Gly Asn Glu Val Ser Arg Ala Val Leu Leu Pro 260 265 270
Gin Ser Cys
<210> 31 <211> 422 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31
Met Gly Gin Ala Gly Cys Lys Gly Leu Cys Leu Ser Leu Phe Asp 15 10 15
Tyr Lys Thr Glu Lys Tyr Val lie Ala Lys Asn Lys Lys Val Gly 20 25 30
Leu Leu Tyr Arg Leu Leu Gin Ala Ser lie Leu Ala Tyr Leu Val 35 40 45
Val Trp Val Phe Leu lie Lys Lys Gly Tyr Gin Asp Val Asp Thr 50 55 60
Ser Leu Gin Ser Ala Vai Ile Thr Lys Vai Lys Gly Vai Ala Phe 65 70 75
Thr Asn Thr Ser Asp Leu Gly Gin Arg He Trp Asp Vai Ala Asp 80 85 90
Tyr Vai He Pro Ala Gin Gly Glu Asn Vai Phe Phe Vai Vai Thr 95 100 105
Asn Leu He Vai Thr Pro Asn Gin Arg Gin Asn Vai Cys Ala Glu 110 115 120
Asn Glu Gly lie Pro Asp Gly Ala Cys Ser Lys Asp Ser Asp Cys 125 130 135
His Ala Gly Glu Ala Vai Thr Ala Gly Asn Gly Vai Lys Thr Gly 140 145 150
Arg Cys Leu Arg Arg Glu Asn Leu Ala Arg Gly Thr Cys Glu Ile 155 160 165
Phe Ala Trp Cys Pro Leu Glu Thr Ser Ser Arg Pro Glu Glu Pro 170 175 180
Phe Leu Lys Glu Ala Glu A3p Phe Thr Ile Phe Ile Lys Asn His 185 190 195 lie Arg Phe Pro Lys Phe Asn Phe Ser Lys Ser Asn Vai Met Asp 200 205 210
Vai Lys Asp Arg Ser Phe Leu Lys Ser Cys His Phe Gly Pro lys 215 220 225
Asn His Tyr Cys- Pro lie Phe Arg Leu Gly Ser Vai Ile Arg Trp 230 235 240
Ala Gly Ser Asp Phe Gin Asp Ile Ala Leu Glu Gly Gly Vai Ile 245 250 255
Gly Ile Asn Ile Glu Trp Asn Cys Asp Leu Asp Lys Ala Ala Ser 260 265 270
Glu Cys His Pro His Tyr Ser Phe Ser Arg Leu Asp Asn Lys Leu 275 280 285
Ser Lys Ser Vai Ser Ser Gly Tyr Asn Phe Arg Phe Ala Arg Tyr 290 295 300
Tyr Arg Asp Ala Ala Gly Vai Glu Phe Arg Thr Leu Met Lys Ala 305 310 315
Tyr Gly lie Arg Phe Asp Vai Met Vai Asn Gly Lys Gly Ala Phe 320 325 330
Phe Cys Asp Leu Vai Leu Ile Tyr Leu Ile Lys Lys Arg Glu Phe 335 340 345
Tyr Arg Asp Lys Lys Tyr Glu Glu Vai Arg Gly Leu Glu Asp Ser 350 355 360
Ser Gin Glu Ala Glu Asp Glu Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ser Glu 365 370 375
Gin Leu Thr Ser Gly Pro Gly Leu Leu Gly Met Pro Glu Gin Gin 380 385 390
Glu Leu Gin Glu Pro Pro Glu Ala Lys Arg Gly Ser Ser Ser Gin 395 400 405
Lys Gly Asn Gly Ser Val Cys Pro Gin Leu Leu Glu Pro His Arg 410 415 420
Ser Thr
<210> 32 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Met Ala Glu Ala He Thr Tyr Ala Asp Leu Arg Phe Val Lys Ala 15 10 15
Pro Leu Lys Lys Ser lie Ser Ser Arg Leu Gly Gin Asp Pro Gly 20 25 30
Ala Asp Asp Asp Gly Glu lie Thr Tyr Glu Asn Val Gin Val Pro 35 40 45
Ala Val Leu Gly Val Prò Ser Ser Leu Ala Ser Ser Val Leu Gly 50 55 60
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Ala Val Thr Ser Pro Ala Val Gly Arg lie Leu Pro Cys Arg Thr B0 85 90
Thr Cys Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Thr Cys Leu 95 100 105
Leu Leu Gly Val Thr Ala He Cys Leu Gly Val Arg Tyr Leu Gin 110 115 120
Val Ser Gin Gin Leu Gin Gin Thr Asn Arg Val Leu Glu Val Thr 125 130 135
Asn Ser Ser Leu Arg Gin Gin Leu Arg Leu Lys He Thr Gin Leu 140 145 150
Gly Gin Ser Ala Glu Asp Leu Gin Gly Ser Arg Arg Glu Leu Ala 155 160 165
Gin Ser Gin Glu Ala Leu Gin Val Glu Gin Arg Ala His Gin Ala 170 175 180
Ala Glu Gly Gin Leu Gin Ala Cys Gin Ala Asp Arg Gin Lys Thr 185 190 195
Lys Glu Thr Leu Gin Çer Glu Glu Gin Gin Arg Arg Ala Leu Glu 200 205 210
Gin Lys Leu Ser Asn Met Glu Asn Arg Leu Lys Pro Phe Phe Thr 215 220 225
Cys Gly Ser Ala Asp Thr Cys Cys Pro Ser Gly Trp lie Met His 230 235 240
Gin Lys Ser Cys Phe Tyr lie Ser Leu Thr Ser Lys Asn Trp Gin 245 250 255
Glu Ser Gin Lys Gin Cys Glu Thr Leu Ser Ser Lys Leu Ala Thr 260 265 270
Phe Ser Glu He Tyr Pro Gin Ser His Ser Tyr Tyr Phe Leu Asn 275 280 285
Ser Leu Leu Pro Asn Gly Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Trp Thr Gly 290 295 300
Leu Ser Ser Asn Lys Asp Trp Lys Leu Thr Asp Asp Thr Gin Arg 305 310 315
Thr Arg Thr Tyr Ala Gin Ser Ser Lys Cys Asn Lys Val His Lys 320 325 330
Thr Trp Ser Trp Trp Thr Leu Glu Ser Glu Ser Cys Arg Ser Ser 335 340 345
Leu Pro Tyr lie Cys Glu Met Thr Ala Phe Arg Phe Pro Asp 350 355
<210> 33 <211> 661 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33
Met Ala Phe Asp Val Ser Cys Phe Phe Trp Val Val Leu Phe Ser 15 10 15
Ala Gly Cys Lys Val lie Thr Ser Trp Asp Girt Met Cys lie Glu 20 25 30
Lys Glu Ala Agn Lys Thr Tyr Asn Cys Glu Asm Leu Gly Leu Ser 35 40 45
Glu lie Pro Asp Thr Leu Pro Asn Thr Thr Glu Phe Leu Glu Phe 50 55 60
Ser Phe Asn Phe Leu Pro Thr lie His Asn Arg Thr Phe Ser Arg 65 70 75
Leu Met Asn Leu Thr Phe Leu Asp Leu Thr Arg Cys Gin lie Asn 30 85 90
Trp lie His Glu Asp Thr Phe Gin Ser His His Gin Leu Ser Thr 95 100 105
Leu Val Leu Thr Gly Asn Pro Leu lie Phe Met Ala Glu Thr Ser 110 115 120
Leu Asn Gly Pro Lys Sex Leu Lys His Leu Phe Leu lie Gin Thr 125 130 135
Gly lie Ser Asn Leu Glu Phe lie Pro Val His Asn Leu Glu Asn 140 145 150
Leu Glu Ser Leu Tyr Leu Gly Ser Asn His He Ser Ser lie Lys 155 160 165
Phe Pro Lys Asp Phe Pro Ala Arg Asn Leu Lys Val Leu Asp Phe 170 175 190
Gin Asn Asn Ala lie His Tyr lie Ser Arg Glu Asp Met Arg Ser 185 190 195
Leu Glu Gin Ala lie Asn Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gly Asn Asn 200 205 210
Val Lys Gly lie Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ser Thr Val Phe Gin 215 220 225
Ser Leu Asn Phe Gly Gly Thr Pro Asn Leu Ser Val lie Phe Asn 230 235 240
Gly Leu Gin Asn Ser Thr Thr Gin Ser Leu Trp Leu Gly Thr Phe 245 250 255
Glu Asp lie Asp Asp Glu Asp lie Ser Ser Ala Met Leu Lys Gly 260 265 270
Leu Cys Glu Met Ser Val Glu Ser Leu Asn Leu Gin Glu His Arg 275 280 285
Phe Ser Asp lie Ser Ser Thr Thr Phe Gin Cys Phe Thr Gin Leu 290 295 300
Gin Glu Leu Asp Leu Thr Ala Thr His Leu Lys Gly Leu Pro Ser 305 310 315
Gly Met Lys Gly Leu Asn Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu Ser Val 320 325 330
Asn His Phe Asp Gin Leu Cys Gin lie Ser Ala Ala Asn Phe Pro 335 340 345
Ser Leu Thr His Leu Tyr He Arg Gly Asn Val Lys Lys Leu His 350 355 360
Leu Gly Val Gly Cys Leu Glu Lys Leu Gly Asn Leu Gin Thr Leu 365 370 375
Asp Leu Ser His Asn Asp He Glu Ala Ser Asp Cys Cys Ser Leu 380 385 390
Gin Leu Lys Asn Leu Ser His Leu Gin Thr Leu Asn Leu Ser His 395 400 405
Asn Glu Pro Leu Gly Leu Gin Ser Gin Ala Phe Lys Glu Cys Pro 410 415 420
Gin Leu Glu Leu Leu Asp Leu Ala Phe Thr Arg Leu His lie Asn 425 430 435
Ala Pro Gin Ser Pro Phe Gin Asn Leu His Phe Leu Gin Val Leu 440 445 450
Asn Leu Thr Tyr Cys Phe Leu Asp Thr Ser Asn Gin His Leu Leu 455 460 465
Ala Gly Leu Pro Val Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His 470 475 480
Phe Gin Asp Gly Thr Tie Thr Lys Thr Asn Leu Leu Gin Thr Val 485 490 495
Gly Ser Leu Glu Val Leu lie Leu Ser Ser Cys Gly Leu Leu Ser 500 505 510
He Asp Gin Gin Ala Phe His Ser Leu Gly Lye Met Ser His Val 515 520 525
Asp Leu Ser His Asn Ser Leu Thr Cys Asp Ser lie Asp Ser. Leu 530 535 540
Ser His Leu Lys Gly lie Tyr Leu Asn Leu Ala Ala Asn Ser He 545 550 555
Asn lie lie Ser Pro Arg Leu Leu Pro lie Leu Ser Gin Gin Ser 560 565 570
Thr lie Asn Leu Ser His Asn Pro Leu Asp Cys Thr Cys Ser Asn 575 580 585 lie His Phe Leu Thr Trp Tyr Lys Glu Asn Leu His Lys Leu Glu 590 595 600
Gly Ser Glu Glu Thr Thr Cys Ala Asn Pro Pro Ser Leu Arg Gly 605 610 615
Val Lys Leu Ser Asp Val Lys Leu Ser Cys Gly He Thr Ala lie 620 625 630
Gly lie Phe Phe Leu lie Val Phe Leu Leu Leu Leu Ala lie Leu 635 640 645
Leu Phe Phe Ala Val Lys Tyr Leu Leu Arg Trp Lys Tyr Gin His 650 655 660 lie
<210> 34 <211> 429 <212> PRT <213> Sarcophaga bullata <4Ο0> 34
Met Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu He Cys Ala Pro Leu Cy$ Glu 15 10 15
Pro Ala Glu Leu Phe Leu lie Ala Ser Pro Ser His Pro Thr Glu 20 25 30
Gly Ser Pro Val Thr Leu Thr Cys Lys Met Pro Phe Leu Gin Ser 35 40 45
Ser Asp Ala Gin Phe Gin Phe Cys Phe Phe Arg Asp Thr Arg Ala 50 55 60
Leu Gly Pro Gly Trp Ser Ser Ser Pro Lys Leu Gin He Ala Ala 65 70 75
Met Trp Lys Glu Asp Thr Gly Ser Tyr Trp Cys Glu Ala Gin Thr 80 85 90
Met Ala Ser Lys Val Leu Arg Ser Arg Arg Ser Gin lie Asn Val 95 100 105
His Arg Val Pro Val Ala Asp Val Ser Leu Glu Thr Gin Pro Pro 110 115 120
Gly Gly Gin Val Met Glu Gly Asp Arg Leu Val Leu lie Cys Ser 125 130 135
Val Ala Met Gly Thr Gly Asp lie Thr Phe Leu Trp Tyr Lys Gly 140 145 150
Ala Val Gly Leu Asn Leu Gin Ser Lys Thr Gin Arg Ser Leu Thr 155 160 165
Ala Glu Tyr Glu He Pro Ser Val Arg Glu Ser Asp Ala Glu Gin 170 175 180
Tyr Tyr Cys Val Ala Glu Asn Gly Tyr Gly Pro Ser Pro Ser Gly 185 190 195
Leu Val Ser lie Thr Val Arg lie Pro Val Ser Arg Pro lie Leu 200 205 210
Met Leu Arg Ala Pro Arg Ala Gin Ala Ala Val Glu Asp Val Leu 215 220 225
Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro Pro lie Leu Tyr . 230 235 240
Trp Phe Tyr His Glu Asp lie Thr Leu Gly Ser Arg Ser Ala Pro 245 250 255
Ser Gly Gly Gly Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Glu Glu His 260 265 270
Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu Gly Ala Gin 275 280 285
Arg Ser Glu Ala Val Thr Leu Asn Phe Thr Val Pro Thr Gly Ala 290 295 300
Arg Ser Asn His Leu Thr Ser Gly Val lie Glu Gly Leu Leu Ser 305 310 315
Thr Leu Gly Pro Ala Thr Val Ala Leu Leu Phe Cys Tyr Gly Leu 320 325 330
Lys Arg Lys lie Gly Arg Arg Ser Ala Arg Asp Pro Leu Arg Ser 335 340 345
Leu Pro Ser Pro Leu Pro Gin Glu Phe Thr Tyr Leu Asn Ser Pro 350 355 360
Thr Pro Gly Gin Leu Gin Pro He Tyr Glu Asn Val Asn Val Val 365 370 375
Ser Gly Asp Glu Val Tyr Ser Leu Ala Tyr Tyr Asn Gin Pro Glu 380 385 390
Gin Glu Ser Val Ala Ala Glu Thr Leu Gly Thr His Met Glu Asp 395 400 405
Lys Val Ser Leu Asp lie Tyr Ser Arg Leu Arg Lys Ala Asn He 410 415 420
Thr Asp Val Asp Tyr Glu Asp Ala Met 425
<210> 35 <211> 977 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35
Met Leu Leu Trp Val lie Leu Leu Val Leu Ala Pro Val Ser Gly 15 10 15
Gin Phe Ala Arg Thr Pro Arg Pro lie lie Phe Leu Gin Pro Pro 20 25 30
Trp Thr Thr Val Phe Gin Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys 35 40 45
Gly Phe Arg Phe Tyr Ser Pro Gin Lys Thr Lys Trp Tyr His Arg 50 55 60
Tyr Leu Gly Lys Glu lie Leu Arg Glu Thr Pro Asp Asn lie Leu 65 70 75
Glu Val Gin Glu Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gin Ala Gin Gly Ser 80 85 90
Pro Leu Ser Ser Pro Val His Leu Asp Phe Ser Ser Ala Ser Leu 95 100 105 lie Leu Gin Ala Pro Leu Ser Val Phe Glu Gly Asp Ser Val Val 110 115 120
Leu Arg Cys Arg Ala Lys Ala Glu Val Thr Leu Asn Asn Thr lie 125 130 135
Tyr Lys Asn Asp Asn Val Leu Ala Phe Leu Asn Lys Arg Thr Asp 140 145 150
Phe His lie Pro His Ala Cys Leu Lys Asp Asn Gly Ala Tyr Arg 155 160 165
Cys Thr Gly Tyr Lys Glu Ser Cys Cys Pro Val Ser Ser Asn Thr 170 Π5 180
Vai Lys He Gin Val Gin Glu Pro Phe Thr Arg Pro Val Leu Arg 185 190 195
Ala Ser Ser Phe Gin Pro lie Ser Gly Asn Pro Val Thr Leu Thr 200 205 210
Cys Glu Thr Gin Leu Ser Leu Glu Arg Ser Asp Val Pro Leu Arg 215 220 225
Phe Arg Phe Phe Arg Asp Asp Gin Thr Leu Gly Leu Gly Trp Ser 230 235 240
Leu Ser Pro Asn Phe Gin lie Thr Ala Met Trp Ser Lys Asp Ser 245 250 255
Gly Phe Tyr Trp Cys Lys Ala Ala Thr Met Pro His Ser Val lie 260 265 270
Ser Asp Ser Pro Arg Ser Trp lie Gin Val Gin lie Pro Ala Ser 275 280 285
His Pro Val Leu Thr Leu Ser Pro Glu Lys Ala Leu Asn Phe Glu 290 295 300
Gly Thr Lys Val Thr Leu His Cys Glu Thr Gin Glu Asp Ser Leu 305 310 315
Arg Thr Leu Tyr Arg phe Tyr His Glu Gly Val Pro Leu Arg His 320 325 330
Lys Ser Val Arg Cys Glu Arg Gly Ala Ser He Ser Phe Ser Leu 335 340 345
Thr Thr Glu Asn Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Gly 350 355 360
Leu Gly Ala Lys Pro Ser Lys Ala Val Ser Leu Ser Val Thr Val 365 370 · 375
Pro Val Ser His Pro Val Leu Asn Leu Ser Ser Pro Glu Asp Leu 380 385 390 lie Phe Glu Gly Ala Lys val Thr Leu His cys Glu Ala Gln*Arg 395 400 405
I
Gly Ser Leu Pro lie Leu Tyr Gin Phe His His Glu Asp Ala Ala 410 415 420
Leu Glu Arg Arg Ser Ala Asn Ser Ala Gly Gly Val Ala lie Ser 425 430 435
Phe Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala 440 445 450
Asp Asn Gly Phe Gly Pro Gin Arg Ser Lys Ala Val Ser Leu Ser 455 460 465 lie Thr Val Pro Val Ser His Pro Val Leu Thr Leu Ser Ser Ala 470 475 480
Glu Ala Leia Thr Phe Glu Gly Ala Thr Val Thr Leu His Cys Glu 485 490 495
Val Gin Arg Gly Ser Pro Gin lie Leu Tyr Gin Phe Tyr His Glu 500 505 510
Asp Met Pro Leu Trp Ser Ser Ser Thr Pro Ser Val Gly Arg Val 515 520 525
Ser Phe Ser Phe Ser Leu Thr Glu Gly His Ser Gly Asn Tyr Tyr 530 535 540
Cys Thr Ala Asp Asn Gly Phe Gly Pro Gin Arg Ser Glu Val Val 545 550 555
Ser Leu Phe Val Thr Val Pro Val Ser Arg Pro lie Leu Thr Leu 560 565 570
Arg Val Pro Arg Ala Gin Ala Val Val Gly Asp Leu Leu Glu Leu 575 580 585
His Cys Glu Ala Pro Arg Gly Ser Pro Pro lie Leu Tyr Trp Phe 590 595 600
Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Ser Ser Ser Ala Pro Ser Gly 605 610 615
Gly Glu Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly 620 625 630
Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu Val Ala Gin His Ser 635 640 645
Asp Thr lie Ser Leu Sex Val He Val Pro Val Ser Arg Pro lie 650 655 660
Leu Thr Phe Arg Ala Pro Arg Ala Gin Ala Val Val Gly Asp Leu 665 670 675
Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Ser Pro lie Leu 680 685 690
Tyr Trp Phe Tyr His Giu Asp Val Thr Leu Gly Lys lie Ser Ala 695 700 705
Pro Ser Gly Gly Gly Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Thr Glu 710 715 720
His Ser Gly lie Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Pro Glu Ala 725 730 735
Gin Arg Ser Glu Met Val Thr Leu Lys Val Ala Val Pro Val Ser 740 745 750
Arg Pro Val Leu Thr Leu Arg Ala Pro Gly Thr His Ala Ala Val 755 760 765
Gly Asp Leu Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly ser Pro 770 775 780
Leu lie Leu Tyr Arg Phe Phe His Glu Asp Val Thr Leu Gly Asn 185 790 795
Arg Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ala Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr 800 805 810
Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Leu 815 320 825
Gly Ala Gin Arg Ser Glu Thr Val Thr Leu Tyr lie Thr Gly Leu 830 335 840
Thr Ala Asn Arg Ser Gly Pro Phe Ala Thr Gly Val Ala Gly Gly 845 850 855
Leu Leu Ser He Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Leu Leu Leu Tyr 360 865 870
Cys Trp Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Lys Pro Ala Ser Asp Pro 875 880 885
Ala Arg Ser Pro Pro Asp Ser Asp Ser Gin Glu Pro Thr Tyr His 890 895 900
Asn Val Pro Ala Trp Glu Glu Leu Gin Pro Val Tyr Thr Asn Ala 905 910 915
Asn Pro Arg Gly Glu Asn Val Val Tyr Ser Glu Val Arg lie lie 920 925 930
Gin Glu Lys Lys Lys His Ala Val Ala Ser Asp Pro Arg His Leu 935 940 945
Arg Asn Lys Gly Ser Pro lie lie Tyr Ser Glu Val Lys Val Ala 950 955 960
Ser Thr Pro Val Ser Gly Ser Leu Phe Leu Ala Ser Ser Ala Pro 965 970 975
His Arg
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 4975278 A [0005] • EP 1391213 A [0005] • US 4970198 A [0006] • US 5079233 A [0006] • US 5585089 A [0006] [0231] • US 5606040 A [0006] • US 5693762 A [0006] • US 5739116 A [0006] • US 5767285 A [0006] • US 5773001 A [0006] • US 5635483 A [0007] [0201] [0384] • WO 2004010957 A [0008] • US 20040018194 A [0008] • WO 04032828 A [0008] • WO 03043583 A [0008] • US 5677171 A [0011] [0345] • WO 9400136 A [0012] • US 5783186 A [0012] • US 5183884 A [0013] • US 5480968 A [0013] • EP 599274 A [0013] • US 5821337 A [0014] [0015] [0044] [0056] [0577] [0600] • US 6054297 A [0014] • US 6407213 B [0014] • US 6639055 B [0014] • US 4816567 A [0027] [0028] [0231] [0288] [0297] [0299] • US 5641869 A [0039] • US 5500362 A [0044] • EP 404097 A [0054] • WO 9311161 A [0054] • WO 9321319 A [0056] • WO 9845479 A [0070] • US 4933294 A [0070] • WO 9105264 A [0070] • US 5401638 A [0070] • US 4943533 A [0076] • WO 9640210 A [0076] • US 5212290 A [0076] • US 5891996 A 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Lisboa, 30 de Março de 2015

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um conjugado de anticorpo-fármaco que tem a fórmula:
    ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: Ab é um anticorpo, R17 é -alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8, -0- (alquilo Ci-C8) -, -arileno-, -alquileno Ci-Ci0-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno Ci-Ci0- (carbociclo C3-C8) -, -(carbociclo C3-C8)-alquileno Ci-Ci0-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno Ci-Ci0- (heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno Cq-Cho-, - (CH2CH20) r-, ou - (CH2CH20) r-CH2-; e r é um número inteiro que varia de 1 a 10; p varia de 1 a cerca de 20, e Df é uma Unidade de Fármaco que tem a fórmula:
    em que, independentemente em cada localização: R2 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R3 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3—C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R4 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3-C8) ; R5 é selecionado de H e metilo; ou: R4 e R5 juntamente formam um anel carbocíclico e têm a fórmula -(CRaRb)n-, em que Ra e Rb são independentemente selecionados de H, alquilo Ci-C8, e carbociclo C3-C8, e n é selecionado de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R7 é selecionado de H, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilo Ci-C8-arilo, alquilo Ci-C8-(carbociclo C3—C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo Ci-C8- (heterociclo C3~C8) ; cada R8 é independentemente selecionado de H, OH, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, e 0- (alquilo Ci-C8) ; R9 é selecionado de H e alquilo Ci-C8; R10 é selecionado de arilo e heterociclo C3-C8; Z é 0, S, NH, ou NR12, em que R12 é alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de -H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-C8, - (R130) m-R14, ou - (R130) m-CH (R15) 2; m é um número inteiro variando de 1 a 1000; R13 é alquilo C2-C8; R14 é H ou alquilo Ci-C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, COOH, -(CH2) n—N (R16) 2, - (CH2) n-S03H, ou - (CH2)n-S03-alquilo C2- C8; cada ocorrência de R15 é independentemente H, alquilo Ci-C8, ou - (CH2) n-C00H; e n é um número inteiro que varia de 0 a 6.
  2. 2. 0 composto de conjugado de anticorpo-fármaco da reivindicação 1 que tem a fórmula:
    ou um sal ou solvato farmaceuicamente aceitável do mesmo.
  3. 3. 0 composto de conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer das reivindicações anteriores, em que DF tem a estrutura:
    ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  4. 4. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que p varia de cerca de 3 a cerca de 5.
  5. 5. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.
  6. 6. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
  7. 7. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o anticorpo se liga a um antigénio de célula cancerígena que está sobre a superfície de uma célula cancerígena.
  8. 8. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
  9. 9. Uma composição para o tratamento de cancro que compreende uma quantidade do conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, sendo a dita quantidade eficaz para tratar cancro.
  10. 10. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, para utilização num método de tratamento de cancro.
  11. 11. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 10 para utilização no tratamento de cancro, que compreende ainda o tratamento com um agente anticancerigeno adicional. Lisboa, 30 de Março de 2015
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