JP2003532057A - 非内因性の、構成的に活性化される既知ｇタンパク質−共役受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本特許文書に開示される発明は、膜貫通受容体、より特別には、内因性リガンドが既知であるヒトのＧタンパク質−共役受容体（「既知ＧＰＣＲ」）、およびもっとも特別には、もっとも好ましくは、逆アゴニスト、アゴニストもしくは部分アゴニスとしての候補化合物の直接同定のためのスクリーニングアッセイにおいて使用するための、既知ＧＰＣＲの変異された（非内因性の）型に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本特許出願は、２０００年４月７日に米国特許商標庁により受理された米国暫
定出願第６０／１９５，７４７号からの優先権を請求し；そして１９９８年１０
月１３日に米国特許庁により受理された米国特許第０９／１７０，４９６号に関
していて、これらの各々は引用によって完全に組み入れられている。

【０００２】 発明の分野 本特許文書に開示される発明は、膜貫通受容体、より特別には、内因性リガン
ドが同定されているＧタンパク質−共役受容体（「既知ＧＰＣＲ」）、および具
体的には、受容体の構成的活性を確立するか、または増強するべく改変された既
知ＧＰＣＲに関する。もっとも好ましくは、改変されたＧＰＣＲは、治療剤とし
ての使用のための、受容体アゴニスト、逆アゴニストもしくは部分アゴニストと
しての候補化合物の直接同定のために使用される。

【０００３】 発明の背景 多数の受容体クラスがヒトには存在するけれども、はるかにもっとも豊富な、
そして治療的に関係があるのは、Ｇタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）クラス
によって代表される。ヒトのゲノム中には約１００，０００個の遺伝子が存在す
ると概算され、そしてこれらの中の約２％もしくは２，０００遺伝子がＧＰＣＲ
をコードしていると算定される。内因性リガンドが同定されているＧＰＣＲを含
む受容体は「既知」受容体と呼ばれ、これに対して、内因性リガンドが同定され
ていない受容体は「オーファン」受容体と呼ばれる。ＧＰＣＲは、製薬生産物の
開発のための重要な領域を表す：１００種の既知ＧＰＣＲの約２０種から、全処
方薬の６０％が開発されている。

【０００４】 ＧＰＣＲは共通の構造モチーフを共有する。（すべてのこれらの受容体は、７
つのα−ヘリックスを形成する疎水性アミノ酸２２〜２４個の７種の配列を有し
、これらの各々は膜をわたっている（各スパンは、数字によって特定される、す
なわち膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通ー２（ＴＭ−２）など））。膜貫通ヘリ
ックスは、細胞膜の外側もしくは「細胞外」側において膜貫通−２と膜貫通−３
、膜貫通−４と膜貫通−５、および膜貫通−６と膜貫通−７の間のアミノ酸の鎖
によって結合されている（これらは、それぞれ「細胞外」領域１，２および３（
ＥＣ−１，ＥＣ−２およびＥＣ−３）と呼ばれる）。また、膜貫通ヘリックスは
、細胞膜の内側もしくは「細胞内」側において膜貫通−１と膜貫通−２、膜貫通
−３と膜貫通−４、および膜貫通−５と膜貫通−６の間のアミノ酸の鎖によって
結合されている（これらは、それぞれ「細胞内」領域１，２および３（ＩＣ−１
，ＩＣ−２およびＩＣ−３）と呼ばれる）。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）
末端は、細胞の中の細胞内空間に位置し、そして受容体の「アミノ」（「Ｎ」）
末端は、細胞の外側の細胞外空間に位置する。

【０００５】 一般に、内因性リガンドが受容体に結合する（しばしば、受容体の「活性化」
と呼ばれる）場合、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」との間の結合を可能に
する細胞内領域のコンホメーションにおける変化がある。ＧＰＣＲは、Ｇタンパ
ク質に関して「無差別」である、すなわちＧＰＣＲは、１種以上のＧタンパク質
と相互作用できると報告されている。参照、Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔ．，４３ Ｌｉ ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９５（１９８８）。別種のＧタンパク質が存在す
るけれども、現在、Ｇｑ，Ｇｓ，Ｇｉ，ＧｚおよびＧｏが、同定されているＧタ
ンパク質である。内因性リガンドで活性化されるＧＰＣＲのＧタンパク質との結
合は、シグナルカスケードプロセス（「シグナル伝達」と呼ばれる）を開始する
。正常な条件下では、シグナル伝達は、最終的に細胞活性化もしくは細胞抑制を
もたらす。受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端がＧタンパク質と相
互作用すると考えられている。

【０００６】 生理学的条件下では、ＧＰＣＲは、異なるコンホメーション：「不活性」状態
と「活性」状態の間の平衡において細胞膜に存在する。不活性状態における受容
体は、細胞内シグナル伝達経路に連結して生物学的応答を起こすことができない
。受容体コンホメーションを活性状態に変えることは、伝達経路への連結（Ｇタ
ンパク質を介して）を可能にし、そして生物学的応答を起こす。

【０００７】 受容体は、内因性リガンドもしくは薬物のような化合物によって活性状態にお
いて安定化される。全く限定されるものではないが、受容体のアミノ酸配列に対
する改変を含む近年の発見は、活性状態コンホメーションにおいて受容体を増強
し、そして安定化するべき、内因性リガンドもしくは薬物以外の手段を提供して
いる。これらの手段は、受容体への内因性リガンド結合の効果を刺激することに
よって活性状態における受容体を効果的に安定化する。そのようなリガンド非依
存手段による安定化は、「構成的受容体活性化」と命名されている。

【０００８】 伝統的なリガンド依存スクリーニングは、リガンドに誘導される受容体の活性
化を防ぐ試みにおいて、受容体へのリガンドの作用に拮抗する化合物を直接同定
することを捜し求めている。しかしながら、しばしばニュートラルアンタゴニス
トと呼ばれる、そのような化合物は、一般に、受容体のリガンド非依存活性、も
しくは過剰活性（ｏｖｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）およびこの過剰活性からもたらさ
れるその後の異常な細胞応答に影響を与えることは期待できない。このことは、
伝統的なニュートラルアンタゴニストは、これらの受容体の異常なリガンド非依
存活性をブロックしないであろうから、過剰活性ＧＰＣＲに結び付けられた下記
の表において同定される疾病のように、増加する疾病数に特に関係がある。

【０００９】

【表１】

【００１０】 発明の概要 内因性の既知ＧＰＣＲの非内因性型およびそれらの使用が、本明細書において
開示される。

【００１１】 詳細な記述 受容体周辺を包含した科学文献は、受容体に対して種々の影響を有するリガン
ドに関する多数の用語を採用している。明白および確実には、次の定義が、この
特許文書を通して使用される。これらの定義がこれらの用語について他の定義と
矛盾しない限り、次の定義が支配するであろう： アゴニストは、それらが受容体に結合する場合に細胞内応答を活性化するか、
または膜へのＧＴＰ結合を増強する物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意
味する。

【００１２】 本明細書で使用されるアミノ酸略語は表Ａにおいて示される：

【００１３】

【表２】

【００１４】 部分アゴニストは、それらが受容体に結合する場合に細胞内応答を、アゴニス
トよりも弱い程度に活性化するか、または膜へのＧＴＰ結合を、アゴニストより
も弱い程度に増強する物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。

【００１５】 アンタゴニストは、アゴニストと同じ部位において拮抗的に受容体に結合する
が、受容体の活性型により開始される細胞内応答を活性化せず、それによってア
ゴニストもしくは部分アゴニストによる細胞内応答を抑制できる物質（例えば、
リガンド、候補化合物）を意味する。

【００１６】 候補化合物は、本発明の文脈上、スクリーニング技術に受け入れられる低分子
（例えば、限定されるものではないが化学化合物）を意味する。

【００１７】 組成物は、少なくとも１種の成分を含有してなる材料を意味する；「製薬組成
物」は組成物の１例である。

【００１８】 化合物効力は、受容体結合性親和力に対抗するような、受容体機能を抑制もし
くは促進する化合物の能力の測定値を意味する。化合物の効力を検出する代表的
手段は、本特許文書の実施例の節において開示される。

【００１９】 コドンは、１群の３個のヌクレオチド（またはヌクレオチド等価物）を意味し
、これは、一般に、リン酸に結合したヌクレオシド（アデノシン（Ａ）、グアノ
シン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）およびチミジン（Ｔ））を含み、
そして翻訳される場合に、アミノ酸をコードしている。

【００２０】 構成的に活性化される受容体は、構成的な受容体活性化を受ける受容体を意味
する。構成的に活性化される受容体は、内因性もしくは非内因性であってもよい
。

【００２１】 構成的な受容体活性化は、受容体とその内因性リガンドもしくはその化学的等
価物との結合以外の手段による、活性状態における受容体の安定化を意味する。

【００２２】 接触もしくは接触させるは、イン・ビトロ系でもイン・ビボ系においても、少
なくとも２つの部分を一緒にさせることを意味する。

【００２３】 直接同定するもしくは直接同定されるは、用語「候補化合物」との関係におい
て、構成的に活性化される受容体、好ましくは、構成的に活性化される受容体、
もっとも好ましくは、構成的に活性化されるＧタンパク質−共役細胞表面受容体
に対する候補化合物のスクリーニング、およびそのような化合物の化合物効力を
調査することを意味する。この用語は、どんなことがあっても、用語「直接同定
する」または「直接同定される」によって包含されるか、またはそれを包含する
と、解釈または理解されてはならない。

【００２４】 内因性は、哺乳動物の天然に生産する物質を意味する。例えば、そして限定さ
れるものではないが、用語「受容体」に関して内因性は、哺乳動物（例えば、そ
して限定されるものではないが、ヒト）もしくはウイルスによって天然に生産さ
れる物質を意味する。反対に、本文脈上、用語非内因性は、哺乳動物（例えば、
そして限定されるものではないが、ヒト）もしくはウイルスによって天然に生産
されない物質を意味する。例えば、そして限定されるものではないが、その内因
性形態において構成的に活性ではないが、操作された場合に構成的に活性になる
受容体は、もっとも好ましくは、「非内因性の構成的に活性化される受容体」と
してここでは言及される。両用語は、両「イン・ビボ」および「イン・ビトロ」
系を述べるために利用することができる。例えば、そして限定されるものではな
いが、スクリーニングアプローチでは、内因性または非内因性受容体は、イン・
ビトロスクリーニング系に関して存在しうる。さらなる例として、そして限定さ
れるものではないが、哺乳動物のゲノムが、非内因性の構成的に活性化される受
容体を含むように操作された場合は、イン・ビボ系による候補化合物のスクリー
ニングが有効である。

【００２５】 Ｇタンパク質共役受容体融合タンパク質およびＧＰＣＲ融合タンパク質は、本
発明の文脈上、各々、好ましくは内因性ＧＰＣＲと天然に共役するＧタンパク質
と同じタイプであるＧタンパク質を有する、少なくとも１つのＧタンパク質、も
っとも好ましくは、そのようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（こ
れはＧＴＰに結合するサブユニットである）に融合された、内因性の構成的に活
性化されるＧＰＣＲまたは非内因性の構成的に活性化されるＧＰＣＲを含んでな
る非内因性タンパク質を意味する。例えば、そして限定されるものではないが、
内因性状態において、Ｇタンパク質「Ｇｓα」がＧＰＣＲに共役する主要なＧタ
ンパク質である場合は、特異的ＧＰＣＲに基づくＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｇ
ｓαに融合したＧＰＣＲを含んでなる非内因性タンパク質であろう；ある状況で
は、以下に記されるように、主要ではないＧタンパク質はＧＰＣＲに融合するこ
とができない。Ｇタンパク質は、構成的に活性なＧＰＣＲのｃ末端に直接融合で
きるか、または２つの間にはスペーサーが存在してもよい。

【００２６】 宿主細胞は、そこに組み入れられるプラスミドおよび／またはベクターを有す
ることができる細胞を意味する。原核生物宿主細胞の場合は、プラスミドは、典
型的には、宿主細胞が複製するような自律性分子として複製される（一般に、プ
ラスミドは、真核生物宿主細胞への導入のためにその後単離される）；真核生物
宿主細胞の場合は、プラスミドは、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミ
ドが複製するように、宿主細胞の細胞ＤＮＡ中に組み込まれる。好ましくは、本
発明の目的のためには、宿主細胞は真核生物、より好ましくは哺乳動物のもので
あり、そしてもっとも好ましくはＨｅｋ−２９３、Ｈｅｋ−２９３ＴおよびＣＯ
Ｓ−７細胞からなる群から選ばれる。

【００２７】 間接同定するもしくは間接同定されるは、内因性受容体に特異的な内因性リガ
ンドの同定、リガンド−受容体相互作用を妨害および／または競合するものを決
定するための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、および活性化された
受容体により関与される少なくとも１つの第２のメッセンジャー経路への影響に
ついて化合物の効力を調査することを伴う、薬物発見方法に対する伝統的アプロ
ーチを意味する。

【００２８】 抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）もしくは抑制は、用語「受容体」に関連して、応
答が、化合物の不在下とは反対に、化合物の存在下で減少されるか、または妨げ
られることを意味する。

【００２９】 逆アゴニストは、受容体の内因性形態か、または受容体の構成的に活性化され
た形態のいづれかに結合し、そして受容体の活性型によって開始される基礎細胞
内応答を、アゴニストもしくは部分アゴニストの不在下で観察される活性の正常
な基礎レベル以下に抑制するか、または膜へのＧＴＰ結合を低下させる物質（例
えば、リガンド、候補化合物）を意味する。好ましくは、基礎細胞内応答は、逆
アゴニストの存在下で、逆アゴニストの不在下の基礎応答に較べて少なくとも３
０％、より好ましくは少なくとも５０％、そしてもっとも好ましくは少なくとも
７５％抑制される。

【００３０】 既知受容体は、その受容体に特異的な内因性リガンドが同定されている内因性
受容体を意味する。

【００３１】 リガンドは、内因性の天然に存在する受容体に特異的な、内因性の天然に存在
する分子を意味する。

【００３２】 変異体もしくは変異は、内因性受容体の核酸および／またはアミノ酸に関して
、内因性の、非構成的に活性化される受容体の変異型が受容体の構成的活性化を
立証するように、そのような内因性配列に対する特定の変化を意味する。特定の
配列に対する等価物という用語では、（ａ）ヒト受容体のその後の変異型の構成
的活性化のレベルが、受容体の最初の変異によって立証されたものと実質的に同
様である；および（ｂ）受容体のその後の変異型と受容体の最初の変異の間の配
列（アミノ酸および／または核酸）相同性パーセントが、少なくとも約８０％、
より好ましくは少なくとも約９０％、そしてもっとも好ましくは少なくとも９５
％である場合は、ヒト受容体のその後の変異型がヒト受容体の最初の変異と等価
であると見なされる。理想的には、そして構成的活性化を達成するための本明細
書に開示されるもっとも好適なカセットは、ＧＰＣＲの内因性および非内因性形
態間に単一のアミノ酸および／またはコドン変化を含むという事実による場合は
、配列相同性パーセントは少なくとも９８％であろう。

【００３３】 非オーファン受容体は、受容体に対するリガンドの結合が細胞内シグナル伝達
経路を活性化する、内因性の天然に存在するリガンドに特異的な内因性の天然に
存在する分子を意味する。

【００３４】 オーファン受容体は、その受容体に特異的な内因性リガンドが同定されてない
か、または知られていない内因性受容体を意味する。

【００３５】 製薬組成物は、少なくとも１種の有効成分を含んでなる組成物を意味し、それ
によって、組成物が哺乳動物（例えば、限定されるものではないが、ヒト）にお
ける特定の有効な成果についての研究に受け入れられる。当業者は、有効成分が
、医者のニーズに基づく所望の有効な成果を有するか否かを決定するために適当
な技術を理解し、そして評価できる。

【００３６】 プラスミドは、ベクターおよびｃＤＮＡの組み合わせ物を意味する。一般に、
プラスミドは、タンパク質としてのｃＤＮＡの複製および／または発現の目的で
宿主細胞に導入される。

【００３７】 刺激するもしくは刺激は、用語「応答」に関して、応答が化合物の不在下とは
反対に化合物の存在下で増強されることを意味する。

【００３８】 ベクターは、ｃＤＮＡに関して、少なくとも１個のｃＤＮＡを組み入れ、そし
て宿主細胞中に組み入れることができる環状ＤＮＡを意味する。

【００３９】 次節の目的は、提示される効力について記述されていて、そして続く開示もし
くは特許請求の範囲に関する制約として、意図したものではなく、また考えるべ
きではない。

【００４０】 Ａ．序論 本特許文書に開示される、既知のＧタンパク質−共役受容体の構成的に活性な
形態は、当業者には周知の部位特異的変異誘発法によって得ることができる。候
補化合物の直接同定のために有用な構成的に活性な受容体は、好ましくは、細胞
内ループ内、もっとも好ましくは細胞内ループ３（ＩＣ３）域内の特定の位置に
おいて受容体を変異させることによって達成される。そのような変異は、受容体
の機能的活性における増大、例えば、第２のメッセンジャー活性のレベルにおけ
る増大によって立証されるように、構成的に活性化されるよう意図される非内因
性受容体を生産することができる。部位特異的変異誘発の標準法が使用できるが
、好適な方法は、本明細書に引用によって組み入れられている、係属の、一般に
譲渡された特許文書、米国特許第０９／１７０，４９６号において開示されてい
る方法である。

【００４１】 下記表Ｂは、非内因性型に変換された既知の内因性ＧＰＣＲ、それら各々のＧ
タンパク質および内因性リガンドを列挙している。

【００４２】

【表３】

【００４３】

【表４】

【００４４】

【表５】

【００４５】 Ｂ．受容体スクリーニング 本明細書に開示される既知ＧＰＣＲの非内因性の構成的に活性化される型に対
する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内因性リガンドの使用を必要とし
ない、受容体の細胞表面において作用する候補化合物の直接同定を可能にする。
本明細書に開示される既知ＧＰＣＲの内因性型（ｖｅｒｓｉｏｎ）が発現および
／または過発現される体内の領域を決定することによって、受容体の発現および
／または過発現に伴う関連疾病／障害病態を決定することが可能であり；そのよ
うなアプローチは本特許文書において開示されている。

【００４６】 下記表Ｃは、発現および／または過発現される既知ＧＰＣＲおよび体内の組織
を列挙している。挙げられた引用文献はそのような組織発現についての支持を与
える。

【００４７】

【表６】

【００４８】

【表７】

【００４９】

【表８】

【００５０】

【表９】

【００５１】 構成的活性を立証できる既知ＧＰＣＲの非内因性型の創造は、もっとも好まし
くは、ＧＰＣＲのＴＭ６内に位置するプロリン残基からの距離に基づいている；
この技術は、本明細書に引用によって組み入れられている、係属の、一般に譲渡
された特許文書、米国特許第０９／１７０，４９６号において開示されている。
この技術は、伝統的な配列「アラインメント」ではなく、むしろ前記ＴＭ６プロ
リン残基からの特定の距離に基づいている。この残基から１６アミノ酸残基に位
置する（多分、受容体のＩＣ３域に位置する）アミノ酸残基を、もっとも好まし
くはリジン残基に変異させることによって、そのような活性化が得られる。他の
アミノ酸残基が変異のために使用されてもよいが、リジンがもっとも好適である
。

【００５２】 Ｄ．疾病／障害の同定および／または選択 以下に詳細に記述されるように、もっとも好ましくは、非内因性の構成的に活
性化されるＧＰＣＲに対する低分子化学化合物の形態における逆アゴニスト、部
分アゴニストおよびアゴニストは、本発明の方法によって同定することができる
。そのような化合物は、特定の受容体に関連する疾病もしくは障害を治療するた
めの薬物発見プログラムにおいて、先導モジュレーターとして理想的な候補であ
る。受容体の内因性リガンドを使用することなく、ＧＰＣＲに対するそのような
化合物を直接同定する機能が、製薬組成物の開発を可能にする。

【００５３】 好ましくは、いかなる疾病もしくは障害が受容体に関連するかが不明である場
合には、既知ＧＰＣＲのＤＮＡ配列が使用されて、（ａ）組織−ｍＲＮＡに対す
るドット・ブロット解析、および／または（ｂ）組織サンプルにおける受容体の
発現のＲＴ−ＰＣＲ同定、のためのプローブが作成される。組織起源もしくは疾
病組織における受容体の存在、または正常組織に較べて疾病組織における高濃度
の受容体の存在が、限定されるものではないが、好ましくは、その疾病に関連す
る疾病を含む、治療レジメとの相関関係を同定するために利用できる。受容体は
、この技術によって臓器の領域に等しく良好に局限することができる。受容体が
局在している特定の組織の既知の機能に基づいて、受容体の予想される機能的役
割が推定できる。

【００５４】 Ｅ．候補化合物のスクリーニング １．一般的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術 Ｇタンパク質受容体が構成的に活性になる場合、それはＧタンパク質（例えば
Ｇｑ，Ｇｓ，Ｇｉ，Ｇｚ，Ｇｏ）に結合し、そしてＧタンパク質に対するＧＴＰ
の結合を刺激する。次いで、Ｇタンパク質はＧＴＰアーゼとして働き、そして徐
々にＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、それによって受容体は、正常条件下では不活
性になる。しかしながら、構成的に活性化される受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換
することを続ける。ＧＴＰの非加水分解性類似体、［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳは、構成
的に活性化される受容体を発現する膜への結合の増強をモニターするために使用
できる。［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳが、リガンドの不在および存在下で膜へのＧタンパ
ク質共役をモニターするために使用できることが報告されている。当業者にとっ
て周知の利用できる他の例の中でも、このモニタリングの例は、１９９５年にＴ
ｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉによって報告された。このアッセイ系は、
一般に、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質に関係なく
、すべてのＧタンパク質−共役受容体に応用しうるので、この系の好適な使用は
、候補化合物の初期スクリーニングのためにある。

【００５５】 ２．特定のＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術 候補化合物が、一度、「一般的」Ｇタンパク質−共役受容体アッセイ（すなわ
ち、アゴニスト、部分アゴニストもしくは逆アゴニストである化合物を選択する
アッセイ）を用いて同定されれば、その化合物が受容体部位において相互作用す
ることを確認するためのさらなるスクリーニングが好適である。例えば、「一般
的」アッセイによって同定された化合物は、受容体に結合しないで、代わりに細
胞内ドメインからＧタンパク質を単に「解離させる」のかも知れない。

【００５６】 ａ． Ｇｓ，ＧｚおよびＧｉ Ｇｓは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。反対に、Ｇｉ（およびＧｚとＧ
ｏ）はこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの転化
を触媒する；かくして、Ｇｓタンパク質に共役する構成的に活性化されるＧＰＣ
Ｒは、ｃＡＭＰの細胞内レベルの増加に関与する。反対に、Ｇｉ（またはＧｚ、
Ｇｏ）タンパク質に共役する構成的に活性化されるＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの細胞
内レベルの減少に関与する。参照、一般に、”Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ”，Ｃｈｐｔ．
８，Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（３ｒｄ Ｅｄ．）Ｎｉｃｈｏ
ｌｓ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ ｅｄｓ．Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，
Ｉｎｃ．（１９９２）。かくして、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物
が、例えば、受容体に対する逆アゴニストである（すなわち、そのような化合物
はｃＡＭＰレベルを減少させる）か否かを決定するために利用できる。ｃＡＭＰ
を測定するための当該技術分野において既知の種々のアプローチが利用できる；
もっとも好適なアプローチは、ＥＬＩＳＡに基づくフォーマットにおける抗ｃＡ
ＭＰ抗体の使用によっている。利用できるその他のタイプのアッセイは、第２の
メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子におけるプロモーターは、
特定の遺伝子がコードしているタンパク質の発現を作動させる。サイクリックＡ
ＭＰは、ｃＡＭＰ−応答ＤＮＡ結合性タンパク質またはｃＡＭＰ応答要素と呼ば
れる特定の部位におけるプロモーターにその後に結合する転写因子（ＣＲＥＢ）
の結合を促進することによって発現を作動させ、そして遺伝子の発現を作動させ
る。レポーター遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼの
前に多数のｃＡＭＰ応答要素を含有しているプロモーターを有するレポーター系
が考えられる。かくして、構成的に活性化されるＧｓ−連結受容体は、ｃＡＭＰ
の蓄積を惹起し、これが次に遺伝子を活性化し、そしてレポータータンパク質の
発現を惹起する。次いで、β−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼのよう
なレポータータンパク質は、標準の生化学的アッセイを用いて検出できる（Ｃｈ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９５）。

【００５７】 ｂ．ＧｏおよびＧｑ ＧｑおよびＧｏは、酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関与し、この酵素は、順
に、リン脂質ＰＩＰ₂を加水分解し、そして２種の細胞内メッセンジャー：ジア
シクログリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ₃ ）を遊離する。ＩＰ₃の蓄積増加は、Ｇｑ−およびＧｏ−会合受容体の活性化に
関与する。参照、一般に、”Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ
Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏ”，Ｃｈｐｔ．８，Ｆｒｏｍ Ｎｅ ｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ （３ｒｄ Ｅｄ．）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ
ａｌ ｅｄｓ．Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２
）。ＩＰ₃蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えばＧｑ−もしくはＧ
ｏ−会合受容体に対する逆アゴニストであるか否かを決定するために利用できる
（すなわち、そのような化合物はＩＰ₃のレベルを減少させる）。また、Ｇｑ−
会合受容体は、Ｇｑ−依存ホスホリパーゼＣがＡＰ１要素を含有している遺伝子
の活性化を惹起するＡＰ１レポーターアッセイを用いて試験できる；かくして、
活性化されたＧｑ−会合受容体は、そのような遺伝子の発現における増大を立証
でき、それによって、さらに、逆アゴニストは、そのような発現における減少を
立証し、そしてアゴニストは、そのような発現における増大を立証できる。その
ような検出のための市販されるアッセイ法が利用できる。

【００５８】 ３．リガンドに基づく確認アッセイ 上記技術（または同等の技術）を用いて直接に同定された候補化合物は、次に
、もっとも好ましくは、リガンドに基づく実証アッセイ、例えば実施例８の方法
において記述されるアッセイを用いて立証される。候補化合物が直接同定される
ことが、ここでは重要である；必要ならば、内因性リガンドを用いる続く確認は
、単に、直接同定された候補化合物が受容体を標的にしたことを確認することで
ある。

【００５９】 例えば、スマトリプタン（ｓｕｍａｔｒｉｐｔａｎ）は、５−ＨＴ１Ｂおよび
５−ＨＴ１Ｄ受容体の周知のアゴニストであるが、一方、ナルトリンドール（ｎ
ａｌｔｒｉｎｄｏｌｅ）は、ＯＰＭ１Ｄ受容体に対する周知のアンタゴニストで
ある。したがって、アゴニスト（スマトリプタン）および／またはアンタゴニス
ト（ナルトリンドール）競合結合アッセイを使用して、非内因性の構成的に活性
化される５−ＨＴ１Ｂもしくは５−ＨＴ１Ｄおよび非内因性の構成的に活性化さ
れるＯＰＭ１Ｄ、それぞれを含んでなるリガンド非依存スクリーニングを用いて
直接同定されるそれらの候補化合物が、確認目的のために使用できることを確認
できる。当業者は、リガンドに基づく確認アッセイのための技術を選択する能力
を保証されている。

【００６０】 ４．ＧＰＣＲ融合タンパク質 逆アゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストの直接同定のための候補化合
物スクリーニングにおいて使用するために、非内因性の構成的に活性化されるＧ
ＰＣＲの使用は、興味あるスクリーニングチャレンジを提供するが、このスクリ
ーニングにおいて、確かなことは、受容体はそれに結合される内因性リガンドの
不在下でさえも活性がある。かくして、そのような化合物が逆アゴニスト、アゴ
ニスト、部分アゴニストであるか、あるいはそのような受容体に対する影響を有
していないかどうかの理解を可能にするそのような区別を目的として、例えば、
候補化合物の存在下の非内因性受容体とその化合物の不在下の非内因性受容体と
を区別するために、そのような区別を増強できるアプローチを利用するのが好適
である。好適なアプローチは、ＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。

【００６１】 一般に、前述のアッセイ技術（ならびにその他の技術）を用いて、非内因性Ｇ
ＰＣＲが構成的に活性化されていることが決定されると、内因性ＧＰＣＲに共役
する主要なＧタンパク質を決定することが可能である。Ｇタンパク質のＧＰＣＲ
への共役は、調査することができるシグナル伝達経路を提供する。スクリーニン
グが哺乳動物発現系の使用によって行われるのが好適であるので、そのような系
が内因性のＧタンパク質をそこに有することが期待される。かくして、確かに、
そのような系においては、非内因性の構成的に活性化されるＧＰＣＲが連続的に
シグナルを伝達できる。これに関して、受容体に対する例えば逆アゴニストの存
在下で、受容体が逆アゴニストと接触される場合の受容体間を、特にスクリーニ
ングに関して、比較的容易に区別できることが可能なようにこのシグナルが増強
されることが好適である。

【００６２】 ＧＰＣＲ融合タンパク質は、非内因性ＧＰＣＲと共役しているＧタンパク質の
効力を増強することを意図している。そのようなアプローチは、そのようなスク
リーニング技術においてもっとも好ましく利用されるシグナルを増強するので、
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、非内因性の構成的に活性化されるＧＰＣＲによるス
クリーニングのために好適である。このことは、有意な「シグナル」対「ノイズ
」比を容易にするので重要である；そのような有意な比は、本明細書で開示され
る候補化合物のスクリーニングのために好適である。

【００６３】 ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現のために有用な構築物の構築は、当該技術分野
において通常の技術を有する者の範囲内にある。市販される発現ベクターおよび
系は、研究者の特定のニーズに合致できる種々のアプローチを提供する。そのよ
うなＧＰＣＲ融合タンパク質構築物のための重要性の基準は、内因性ＧＰＣＲ配
列およびＧタンパク質配列の両者がイン・フレームにあり（好ましくは、内因性
ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質配列の上流にある）、そしてＧＰＣＲの終止コド
ンが、ＧＰＣＲの発現に際して、Ｇタンパク質もまた発現できるように、欠失ま
たは置換されていなければならないことである。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に直
接連結されてもよく、または２つの間にスペーサー残基が存在してもよい（好ま
しくは、この数は当業者によって容易に確かめられるが、約１２個未満）。使用
されない若干の制限部位が、発現に際して、有効にスペーサーになるスペーサー
の使用が好適である（都合良さに基づき）。もっとも好ましくは、非内因性ＧＰ
ＣＲに共役するＧタンパク質は、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の創造前に同定
されている。同定されている少数のＧタンパク質があるだけなので、Ｇタンパク
質の配列を含んでなる構築物（すなわち、普遍的なＧタンパク質構築物）は、そ
の中への内因性ＧＰＣＲ配列の挿入のために利用できることが好適である；これ
は、異なる配列をもつ種々の異なる内因性ＧＰＣＲの大規模なスクリーニングに
関して効力を提供する。

【００６４】 Ｆ．標的Ｇｉ共役ＧＰＣＲとシグナル−エンハンサーＧｓ共役ＧＰＣＲのコ・ トランスフェクション（ｃＡＭＰに基づくアッセイ） Ｇｉ共役受容体は、アデニリルシクラーゼを阻害し、したがってｃＡＭＰ生産
のレベルを減少させることが知られており、これがｃＡＭＰレベルチャレンジの
調査を可能にする。活性化に際してＧｉに顕著に共役する受容体の構成的活性化
の指標として、ｃＡＭＰの生産における減少の測定における効果的な技術は、シ
グナルエンハンサー、例えば、活性化に際してＧｓと顕著に共役する非内因性の
構成的に活性化される受容体（例えば、下記ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を、Ｇｉ連
結ＧＰＣＲとともにコ・トランスフェクションすることによって達成することが
できる（そのような技術は、ここでは、Ｇｉ共役受容体、ＧＰＲ２４により例証
される）。明らかなように、Ｇｓ共役受容体の構成的活性化は、ｃＡＭＰの生産
における増大に基づいて決定できる。Ｇｉ共役受容体の構成的活性化は、ｃＡＭ
Ｐの生産における減少をもたらす。かくして、コ・トランスフェクションアプロ
ーチは、これらの「反対の」効果を都合よく利用することを意図している。例え
ば、内因性のＧｉ共役受容体（「標的受容体」）とともに非内因性の構成的に活
性化されるＧｓ共役受容体（シグナルエンハンサー）のコ・トランスフェクショ
ンは、基礎ｃＡＭＰシグナルを提供する（すなわち、Ｇｉ共役受容体はｃＡＭＰ
レベルを減少させるけれども、この「減少」は、構成的に活性化されるＧｓ共役
シグナルエンハンサーによって確立されたｃＡＭＰレベルにおける実質的増大に
関係している）。次いで、シグナルエンハンサーを標的受容体の構成的に活性化
される型とともにコ・トランスフェクションによって、Ｇｉ標的の増大した機能
的活性（すなわち、ｃＡＭＰを減少させる）により、さらに減少させる（基線に
較べて）ことが期待できる。

【００６５】 ｃＡＭＰに基づくアッセイを用いる候補化合物のスクリーニングは、次に、２
つの条件を含んで達成できる：第１の条件、Ｇｉ共役標的受容体に関して、「反
対の」効果がもたらされる、すなわち、Ｇｉ共役標的受容体の逆アゴニストが、
測定されるｃＡＭＰシグナルを増大させ、一方Ｇｉ共役標的受容体のアゴニスト
が、このシグナルを減少させる；第２、明らかなように、このアプローチを用い
て直接同定される候補化合物は、これらがシグナル増強受容体を標的としないこ
とを確認するために独立に調査されるべきである（これは、コ・トランスフェク
ションされた受容体に対するスクリーニングの前後に行うことができる）。

【００６６】 Ｇ．薬化学 一般に、常にではないが、候補化合物の直接同定は、好ましくは、コンビナト
リアル化学技術により生成された化合物と合わせて実施され、それによって、数
千の化合物がそのような解析のためにランダムに作成される。一般に、そのよう
なスクリーニングの結果は、ユニークな核構造を有する化合物であろう；その後
、これらの化合物は、好ましくは、その薬物の性質をさらに増強するために好適
な核構造の周辺のさらなる化学的改変にかけられる。そのような技術は、当業者
には既知であり、そして本特許文書において詳細には示されない。

【００６７】 Ｈ．製薬組成物 さらなる開発のために選択された候補化合物は、当業者には周知の技術を用い
て製薬組成物に製剤化できる。適当な製薬的に許容しうるキャリヤーが当業者に
とって利用できる；例えば、参照、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８０，Ｍａ
ｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（Ｏｓｌｏ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）
。

【００６８】 Ｉ．他の効用 本明細書に開示される既知ＧＰＣＲの非内因性型の好適な使用は、逆アゴニス
ト、アゴニストもしくは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定のために
ある（好ましくは、製薬剤としての使用のための）が、既知ＧＰＣＲのこれらの
型は、また、研究設定においても利用することができる。例えば、ＧＰＣＲを組
み入れているイン・ビトロおよびイン・ビボ系は、ヒトの状態、両正常および罹
患状態においてこれらの受容体が演じる役割をさらに解明し、そしてより良く理
解するために、ならびにそれがシグナル伝達カスケードを理解するために適用さ
れるような構成的活性化の役割を理解することに利用できる。非内因性の既知Ｇ
ＰＣＲにおける価値は、それらの研究道具としての利用が、それらのユニークな
特徴のために、非内因性既知ＧＰＣＲが内因性リガンドが同定される前にヒトの
体内におけるこれらの受容体の役割を理解するために使用できることで向上され
ることである。開示される受容体のその他の使用は、なかんずく、本特許文書の
概観に基づいて当業者には明らかになるであろう。

【００６９】 実施例 次の実施例は、限定されるものではないが、本発明の説明の目的のために提示
される。特定の核酸およびアミノ酸配列がここにおいて開示されるが、当業者は
、以下に報告される同じまたは実質的に類似の結果を達成する場合にこれらの配
列に対して小さい改変をする能力を保証されている。１つの配列からその他の配
列へ（例えば、ラット受容体からヒト受容体へ、またはヒト受容体Ａからヒト受
容体Ｂへ）の配列カセットの応用または理解に対する伝統的アプローチは、一般
に、配列が共通性の領域を決定する作業において整列される配列アラインメント
技術により予測される。本明細書に開示される変異アプローチは、配列アライン
メントアプローチにはよらないが、代わりに、アルゴリズム的アプローチおよび
ＧＰＣＲのＴＭ６領域内に位置する保存プロリン残基からの位置の距離に基づい
ている。このアプローチが確実に行われれば、当業者は、ここに開示される同じ
結果を実質的に達成するよう、それに対して小さい改変をする能力を保証されて
いる。そのような改変されたアプローチは本開示の範囲内と見なされる。

【００７０】 例１ 内因性の既知ＧＰＣＲの作成 Ａ．標準ＰＣＲによる発現 ＰＣＲは、鋳型としての特定のｃＤＮＡおよび製造者によって提供されるバッ
ファー系、各プライマー０．２５μＭおよび各４種のヌクレオチド０．２ｍＭと
ともにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施された
。

【００７１】 得られるＰＣＲ断片はそれぞれの制限部位で消化され、そしてｐＣＭＶ発現ベ
クター中にクローン化された。核酸およびアミノ酸配列がその後に決定、確認さ
れた。下記表Ｄ参照：

【００７２】

【表１０】

【００７３】

【表１１】

【００７４】

【表１２】

【００７５】

【表１３】

【００７６】

【表１４】

【００７７】

【表１５】

【００７８】

【表１６】

【００７９】 Ｂ．代替アプローチによる発現 １．ＡＶＰＲ１Ａ 内因性ヒトＡＶＰＲ１Ａは、鋳型および製造者によって提供されるバッファー
系、各プライマー０．２５μＭおよび各４種のヌクレオチド０．２ｍＭとともに
ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲによって得
られた。サイクル条件は９４℃で１分間、６４℃で１分間および７２℃で１分３
０秒間の３０サイクルであった。５’ＰＣＲ断片は鋳型としてのゲノムＤＮＡと
下記プライマーセットを用いて得られた。 5′-ATCACCATGCGTCTCTCCGCCGGTCCCGA-3′(配列番号：133）および 5′-TTGTTCACCTCGATCATGGAGAAGA-3′-(配列番号：134)。 3′PCR 断片は鋳型としての IMAGE 1055179 と下記のプライマーセットを用いる
pfu ポリメラーゼ（Stratagene）により得られた。 5′-CGCAGTACTTCGTCTTCTCCATGA-3′(配列番号：135）および 5′-CAAGAATTCAGTTGAAACAGGAATGAATTTGATGG-3′(配列番号：136)。 ３’ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は次のとおりであった：９４℃で１分間、
６０℃および７２℃で１分３０秒間の３０サイクル。次いで、５’および３’Ｐ
ＣＲ断片が同時に鋳型として使用されて、ｐｆｕポリメラーゼおよびプライマー
としての配列番号：１３３と配列番号：１３６を用いて全長ｃＤＮＡが得られた
。各ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は９４℃で１分間、６５℃と７２℃で２分
１０秒間の３０サイクルであった。

【００８０】 得られるＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩ制限部位で消化され、そしてＥｃｏＲＩ ｐ
ＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。核酸およびアミノ酸配列がその後に
決定され、確認された。

【００８１】 ２．ＡＶＰＲ１Ａ型 内因性ヒトＡＶＰＲ１Ａ型は、鋳型および製造者によって提供されるバッファ
ー系、各プライマー０．２５μＭおよび各４種のヌクレオチド０．２ｍＭととも
にｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲによって
得られた。サイクル条件は９４℃で１分間、６４℃で１分間および７２℃で１分
３０秒間の３０サイクルであった。５’ＰＣＲ断片は鋳型としてのゲノムＤＮＡ
、および： プライマーとしての配列番号：１３３と配列番号：１３４を用いて得られた。 ３’ＰＣＲ断片は鋳型としてのＩＭＡＧＥ１５４２４６９、および配列番号：１
３６と 5′-ACAGAATTCTCCAGTTCTCATTTTCTTATCCGTAC-3′(配列番号：137)。 を用いてｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって得られた。 ３’ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は次のとおりであった：９４℃で１分間、
６０℃で１分間および７２℃で１分３０秒間の３０サイクル。次いで、５’およ
び３’ＰＣＲ断片が同時に鋳型として使用されて、ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）およびプライマーとしての配列番号：１３３と配列番号：１３
６を用いて全長ｃＤＮＡを得た。各ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は９４℃で
１分間、６５℃で１分間および７２℃で２分１０秒間の３０サイクルであった。

【００８２】 得られるＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩ制限部位で消化され、そしてＥｃｏＲＩ ｐ
ＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。核酸およびアミノ酸配列がその後に
決定され、確認された。

【００８３】 ３．ＡＶＰＲ１Ｂ 内因性ヒトＡＶＰＲ１Ｂは、鋳型および製造者によって提供されるバッファー
系、各プライマー０．２５μＭおよび各４種のヌクレオチド０．２ｍＭとともに
ｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲによって得
られた。２回のＰＣＲは次のサイクル条件を有した：９４℃で１分間、６５℃で
１分間および７２℃で２秒間の３０サイクル。第１回目のＰＣＲは鋳型としての
下垂体ＤＮＡ、および次の配列を有するＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’ＰＣＲプ
ライマーを用いた。 5′-GCAAAGCTTGCTCATGGATTCTGGGCCTCT-3′(配列番号：138） 3′PCR プライマーは下記の配列を有する EcoRI 部位を含んでいた。 5′-TCTGAATTCAAAGATGATGGTCTCAGCGGTGCC-3′-(配列番号：139)。 第２回目の PCR は鋳型として下垂体 DNA と下記の配列をそれぞれ有する Hind
III 部位を含む 5′PCR プライマーおよび EcoRI 部位を含む 3′PCR プライマ
ーとを用いた。 5′-GCAAAGCTTGCTCATGGATTCTGGGCCTCTGTGGG-3′(配列番号：140) 5′-TCTGAATTCAAAGATGATGGTCTCAGCGGTGCCTTCCC-3′(配列番号：141)。

【００８４】 得られるＰＣＲ断片はＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限部位で消化され、そし
てＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ｐＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。
核酸およびアミノ酸配列がその後に決定され、そして確認された。

【００８５】 ４．５ＨＴ６ 内因性ヒト５ＨＴ６受容体は、鋳型および製造者によって提供されるバッファ
ー系、各プライマー０．２５μＭおよび各４種のヌクレオチド０．２ｍＭととも
にｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲによって
得られた。２回のＰＣＲは次のサイクル条件を有した：９４℃で１分間、６０℃
で１分間および７２℃で１分４５秒間の３０サイクル。第１回目のＰＣＲは鋳型
としての尾状核ＤＮＡ、および次の配列を有するＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む５’
ＰＣＲプライマーを用いた。 5′-CATAAGCTTTCCCGCCACCCTATCACT-3′(配列番号：142) 3′PCR プライマーは下記の配列を有する EcoRI 部位を含んでいた。 5′-ACTGAATTCTGCTCAATCCAGCTCCCCA-3′-(配列番号：143)。 第２回目の PCR は、また、鋳型として尾状核 DNA と下記の配列をそれぞれ有す
る EcoRV 部位を含む 5′PCR プライマーおよび XbaI 部位を含む 3′PCR プラ
イマーを用いた。 5′-CCTCGGATATCATGGTCCCAGAGCCGGGCCC-3′(配列番号：144) 5′-CAGCTCTAGATTGGCCAGCCCCAAGCCCGGGT-3′(配列番号：145)。

【００８６】 核酸およびアミノ酸配列がその後に決定され、そして確認された。

【００８７】 ５．ドーパミンＤ１ ドーパミンＤ１はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られ
た全長ｃＤＮＡクローンからサブクローン化された。

【００８８】 ６．ドーパミンＤ２ ドーパミンＤ２はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られ
た全長ｃＤＮＡクローンからサブクローン化された。

【００８９】 ７．ドーパミンＤ５ ドーパミンＤ５を得るために、ＰＣＲは鋳型としてのゲノムｃＤＮＡおよび製
造者によって提供されるバッファー系、各プライマー０．２５μＭおよび各４種
のヌクレオチド０．２ｍＭとともにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ）を用いて実施された。

【００９０】 ドーパミンＤ５受容体はコーディング領域にイントロンを含まなかった。しか
しながら、ドーパミンＤ５受容体はコーディング領域内に８ｂｐのフレームシフ
ト挿入を有する２つの偽遺伝子を含有していた。偽遺伝子を避けるために、フレ
ームシフトインサートのＤＮＡ断片５’と３’が各々ゲノムＤＮＡから増幅され
た。５’ＰＣＲ断片は下記プライマーセットを用い： 5′-CCTGAATTCCAGCCCGAAATGCTGCCGCCAG-3′(配列番号：146；センス） 5′-GGTCCACGCTGATGACGCACAGGTTC-3′(配列番号：147；アンチセンス）および 3′PCR 断片は下記のプライマーセットを用いて得られた。 5′-GAACCTGTGCGTCATCAGCGTGGACC-3′(配列番号：148；センス） 5′-TGCGGATCCATGAGGGGGTTTCTTAATG-3′(配列番号：149；アンチセンス)。 次いで、５’および３’ＰＣＲ断片が同時に鋳型として使用されて、ｐｆｕポリ
メラーゼおよびプライマーとしての配列番号：１４６と配列番号：１４９を用い
て全長ｃＤＮＡを得た。各ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は９４℃で１分間、
６５℃で２分３０秒間および７２℃で１分３０秒間の３０サイクルであった。

【００９１】 得られるＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限部位で消化され、そしてＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ ｐＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。その後核
酸およびアミノ酸配列が決定され、そして確認された。

【００９２】 ８．ＥＴＡ 内因性ヒトＥＴＡは、鋳型および製造者によって提供されるバッファー系、各
プライマー０．２５μＭおよび各４種のヌクレオチド０．２ｍＭとともにｒＴｔ
ｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲによって得られた
。サイクル条件は９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で２秒間の３０
サイクルであった。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいる５’ＰＣＲ断片は鋳型とし
てのゲノムＤＮＡ、および下記のプライマーセットを用いて得られた： 5′-CGGAAGCTTCTGGAGCAGGTAGCAGCATG-3′(配列番号：150）および 5′-TGGGCAATAGTTGTGCATTGAGCCA-3′-(配列番号：151)。 BamHI 部位を含有する 3′PCR 断片は、鋳型としての IMAGE 666747と下記のプ
ライマーセットを用いる pfu ポリメラーゼ（Stratagene）により得られた。 5′-CTAATTTGGTCCTACCCAGCAATGGC-3′(配列番号：152）および 5′-CTTGGATCCAGATGAGCTGTATTTATTACTGGAACG-3′(配列番号：153)。 3′PCR 反応のサイクル条件は次のとおりであった。94℃で1分間、64℃で1分間
および72℃で2秒間の30サイクル。次いで、これらの5′および 3′PCR 断片を共
鋳型として用い、pfu ポリメラーゼ（Stratagene）および下記のプライマーを用
いて全長 cDNA を得た。 5′-AATAAGCTTCAAGATGGAAACCCTTTGCCTCAG-3′(配列番号：154) 5′-CGTTCATGCTGTCCTTATGGCTGCTC-3′(配列番号：155)。

【００９３】 全長クローンのためのＰＣＲサイクル条件は９４℃で１分間、６５℃で１分間
および７２℃で２分１０秒間の３０サイクルであった。

【００９４】 得られるＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩ制限部位で消化され、そしてＥｃｏＲＩ ｐ
ＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。核酸およびアミノ酸配列がその後に
決定され、そして確認された。

【００９５】 ９．ｍＧｌｕＲ１ 内因性ヒトｍＧｌｕＲ１は、鋳型および製造者によって提供されるバッファー
系とともにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲ
によって得られた。第１回目のＰＣＲのためのサイクル条件は次のとおりであっ
た：９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で１分５０秒間の３０サイク
ル。５’ＰＣＲ断片はＳａｌＩ部位を含んでいて、鋳型としての海馬ＤＮＡ、お
よび下記のプライマーセットを用いて得られた： 5′-GCAGGCTGTCGACCTCGTCCTCACCACCATGGTC-3′(配列番号：156）および 5′-AATGGGCTCACAGCCTGTTAGATCTGCATTGGGCCAC-3′-(配列番号：157)。

【００９６】 中間 PCR 断片は、サイクル条件を94℃で1分間、65℃で1分間および72℃で1分
50秒間の30サイクルとし、鋳型としてゲノム DNA を、そして下記のプライマー
セットを用いて得られた。 5′-TAACAGGCTGTGAGCCCATTCCTGTGCG-3′(配列番号：158）および 5′-TTAGAATTCGCATTCCCTGCCCCTGCCTTCTTTC-3′(配列番号：159)。

【００９７】 3′PCR 断片は BamHI 部位を含み、そして鋳型としてのゲノム cDNA と下記の
プライマーセットを用いて得られた。 5′-TGCGAATTCTAATGGCAAGTCTGTGTCATGGTC-3′(配列番号：160）および 5′-TCCGGATCCCAGGGTGGAAGAGCTTTGCTTGTA-3′(配列番号：161)。 ３’ＰＣＲ反
応のためのサイクル条件は次のとおりであった：９４℃で１分間、６５℃で１分
間および７２℃で１分１５秒間の３０サイクル。

【００９８】 得られるＰＣＲ断片はＳａｌＩとＢａｍＨＩ制限部位で消化され、そしてＳａ
ｌＩ−ＢａｍＨＩ ｐＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。核酸およびア
ミノ酸配列がその後に決定され、そして確認された。

【００９９】 １０．ＧＰＲ２４（またＭＣＨもしくはＳＬＣ−１として知られる） 内因性ヒトＧＰＲ２４は、鋳型としてのゲノムＤＮＡおよび製造者によって提
供されるバッファー系、各プライマー０．２５μＭおよび各４種のヌクレオチド
０．２ｍＭとともにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用い
るＰＣＲによって得られた。サイクル条件は９４℃で１分間、５６℃で１分間お
よび７２℃で１分間の３０サイクルであった。 それぞれ、5′PCR プライマーは下記の配列を有する HindIII 部位を含み、そし
て 3′プライマーは下記の配列を有する EcoRI 部位を含んでいた。 5′-GTGAAGCTTGCCTCTGGTGCCTGCAGGAGG-3′(配列番号：162) 5′-GCAGAATTCCCGGTGGCGTGTTGTGGTGCCC-3′(配列番号：163)。

【０１００】 １．３ｋｂのＰＣＲ断片はＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化され、そしてＣ
ＭＶｐ発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位中にクローン化された。
Ｌａｋａｙｅらによるその後のクローニング作業で、遺伝子のクローニング領域
中にイントロンが存在することが示された。かくして、ｃＤＮＡの５’末端は、
鋳型としてのＣｌｏｎｔｅｃｈのｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ視床下部ｃＤＮ
Ａおよびサイクリング条件のための製造者の指示するプロトコールを用いる５’
ＲＡＣＥ ＰＣＲによって得られた。第１および第２回目のＰＣＲのための５’
ＲＡＣＥ ＰＣＲは次のとおりであった： 5′-CATGAGCTGGTGGATCATGAAGGG-3′(配列番号：164）および 5′-ATGAAGGGCATGCCCAGGAGAAAG-3′(配列番号：165)。

【０１０１】 核酸およびアミノ酸配列がその後に決定され、そして確認された。

【０１０２】 １１．ＮＴＳＲ１ 内因性ヒトＮＴＳＲ１は、鋳型および製造者によって提供されるバッファー系
、各プライマー０．２５μＭおよび各４種のヌクレオチド０．２ｍＭとともにｒ
Ｔｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲによって得ら
れた。サイクル条件は９４℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で１分１０
秒間の３０サイクルであった。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいる５’ＰＣＲ断片
は鋳型としてのゲノムＤＮＡおよび下記プライマーセットを用いて得られた： 5′-CCCAAGCTTCCAGCCCCGGAGGCGCCGGAC-3′(配列番号：166）および 5′-TGAAGGTGTTGACCTGTATGACGACCTTGACGGTGGG-3′-(配列番号：167)。 ＥｃｏＲＩ部位を含んでいる３’ＰＣＲ断片は鋳型としての脳のｃＤＮＡおよび
下記プライマーセットを用いて得られた： 5′-GGTCGTCATACAGGTCAACACCTTCATGTCCTTCATA-3′(配列番号：168）および 5′-CACGAATTCGTACAGCGTCTCGCGGGTGGCATT-3′(配列番号：169)。 3′PCR 反応のサイクル条件は次のとおりであった。94℃で1分間、60℃で1分間
および72℃で1分10秒間の30サイクル。次いで、これらの5′および 3′PCR 断片
を共鋳型として用い、pfu ポリメラーゼ（Stratagene）およびプライマーとして
次の配列と配列番号：169 を用いて全長 cDNA を得た。 5′-ATCACCATGCGCCTCAACAGCTCCGC-3′(配列番号：170)。 各ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は９４℃で１分間、６５℃で１分間および７
２℃で２分１０秒間の３０サイクルであった。

【０１０３】 得られるＰＣＲ断片はＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限部位で消化され、そし
てＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩｐＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。核
酸およびアミノ酸配列がその後に決定され、そして確認された。

【０１０４】 １２．ＮＴＳＲ２ 内因性ヒトＮＴＳＲ２は、鋳型および製造者によって提供されるバッファー系
とともにｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いるＰＣＲによって
得られた。サイクル条件は９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で１分
１５秒間の３０サイクルであった。５’ＰＣＲ断片は鋳型としてのＩＭＡＧＥ１
５３７５２３および下記プライマーセットを用いて得られた： 5′-ATCACCATGGAAACCAGCAGCCCGCGGC-3′(配列番号：171）および 5′-CGGGGTAGAAGTGGACGGCACTTGGG-3′-(配列番号：172)。 ＥｃｏＲＩ部位を含んでいる３’ＰＣＲ断片は鋳型としての尾状核ｃＤＮＡおよ
び下記プライマーセットを用いて得られた： 5′-GCTCCCAAGTGCCGTCCACTTCTACC-3′(配列番号：173）および 5′-TTAGAATTCGGTCCGGGTTTCTGGGGGATCC-3′(配列番号：174)。 ３’ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は次のとおりであった：９４℃で１分間、
６０℃で１分間および７２℃で１分２０秒間の３０サイクル。次いで、５’と３
’ＰＣＲ断片が同時に鋳型として使用されて、ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）およびプライマーとしての配列番号：１７１と配列番号：１７４を
用いて全長ｃＤＮＡを得た。全長クローンのためのＰＣＲサイクル条件は、９４
℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で２分１０秒間の３０サイクルであっ
た。

【０１０５】 得られるＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩ制限部位で消化され、そしてＥｃｏＲＩｐＣ
ＭＶ発現ベクター中にクローン化された。核酸およびアミノ酸配列がその後に決
定され、そして確認された。

【０１０６】 １３．ＯＰＲＭ１ 内因性ヒトＯＰＲＭ１は、鋳型および製造者によって提供されるバッファー系
とともにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲに
よって得られた。サイクル条件は９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃
で４０秒間の３０サイクルであった。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいる５’ＰＣ
Ｒ断片は鋳型としてのゲノムＤＮＡおよび下記プライマーセットを用いて得られ
た： 5′-CCCAAGCTTCAGTACCATGGACAGCAGCGCTGCC-3′(配列番号：175）および 5′-CATCTTGGTGTATCTGACAATCACATACATGACCAGGAA-3′(配列番号：176)。

【０１０７】 中間 PCR 断片は、サイクル条件を94℃で1分間、60℃で1分間および72℃で40
秒間の30サイクルとし、鋳型としてゲノム DNA を、そして下記のプライマーセ
ットを用いて得られた。 5′-GTATGTGATTGTCAGATACACCAAGATGAAGACTGCCAC-3′(配列番号：177）および 5′-TACAATCTATGGAACCTTGCCTGTATTTTGTTGTAGCCA-3′(配列番号：178)。

【０１０８】 3′PCR 断片は、鋳型としての脳の cDNA と下記のプライマーセットを用いて
得られた。 5′-CAAAATACAGGCAAGGTTCCATAGATTGTACACTAACAT-3′(配列番号：179）および 5′-CGGGCAACGGAGCAGTTTCTGCTTCAG-3′(配列番号：180)。 ３’ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は次のとおりであった：９４℃で１分間、
６３℃で１分間および７２℃で１分１５秒間の３０サイクル。

【０１０９】 ５’ＰＣＲ断片と中間ＰＣＲ断片が鋳型として使用されて、ｐｆｕポリメラー
ゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および配列番号：１７５と配列番号：１７８を用い
、次のとおりのサイクル条件：９４℃で１分間、６３℃で１分間および７２℃で
１分１５秒間の３０サイクルにより、ＯＰＲＭ１の中間領域をとおしての５’領
域（「５’中間ＰＣＲ断片」）を得た。

【０１１０】 次いで、５’中間ＰＣＲ断片と３’ＰＣＲ断片が鋳型として使用されて、ｐｆ
ｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマーとしての配列番号：
１７５と配列番号：１８０を用いて全長ｃＤＮＡを得た。全長ＰＣＲ反応のため
のサイクル条件は、９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で１分１５秒
間の３０サイクルであった。

【０１１１】 得られるＰＣＲ断片はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で消化され、そしてＨｉｎｄＩ
ＩＩｐＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。核酸およびアミノ酸配列がそ
の後に決定され、そして確認された。

【０１１２】 １４．ＯＰＲＭ１Ａ 内因性ヒトＯＰＲＭ１Ａは、鋳型および製造者によって提供されるバッファー
系とともにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲ
によって得られた。サイクル条件は９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２
℃で４０秒間の３０サイクルであった。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいる５’Ｐ
ＣＲ断片は鋳型としてのゲノムＤＮＡおよび配列番号：１７５と配列番号：１７
６を用いて得られた。

【０１１３】 中間ＰＣＲ断片は、サイクル条件を９４℃で１分間、６０℃で１分間および７
２℃で４０秒間の３０サイクルとし、そして鋳型としてのゲノムＤＮＡおよび配
列番号：１７７と配列番号：１７８を用いて得られた。

【０１１４】 ３’ＰＣＲ断片は鋳型としてのゲノムＤＮＡおよび配列番号：１７９と配列番
号：１８０を用いて得られた。３’ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は次のとお
りであった：９４℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で１分３０秒間の３
０サイクル。

【０１１５】 ５’ＰＣＲ断片と中間ＰＣＲ断片が同時に鋳型として使用されて、ｐｆｕポリ
メラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および配列番号：１７５と配列番号：１７８
を用い、次のとおりのサイクル条件：９４℃で１分間、６３℃で１分間および７
２℃で１分１５秒間の３０サイクルにより、ＯＰＲＭ１Ａの中間領域をとおして
の５’領域（「５’中間ＰＣＲ断片」）を得た。

【０１１６】 次いで、５’中間ＰＣＲ断片と３’ＰＣＲ断片が同時に鋳型として使用されて
、ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマーとしての配列
番号：１７５と配列番号：１８０を用いて全長ｃＤＮＡを得た。全長ＰＣＲ反応
のためのサイクル条件は、９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で１分
１５秒間の３０サイクルであった。

【０１１７】 得られるＰＣＲ断片はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で消化され、そしてＨｉｎｄＩ
ＩＩｐＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。核酸およびアミノ酸配列がそ
の後に決定され、そして確認された。

【０１１８】 １５．ＯＸ₁Ｒ ＯＸ₁Ｒ ＥＳＴクローン４０６０８は全長ｃＤＮＡクローンである。しかし
ながら、それは４ｂｐのフレームシフト挿入を含有していた。そのインサートを
除去するために、フレームシフトインサートの断片５’と３’が各々鋳型として
のＥＳＴクローン４０６０８および２種のプライマー対を用いてＰＣＲによって
得られた。ＥｃｏＲＩ部位を含有する５’プライマーセットは次のとおりであっ
た： 5′-ATGGAATTCTGCTGCAGCGGCTCCTGAGCTC-3′(配列番号：181；センス) 5′-ACGGACACAGCCTGTAGATAGGGGATGACCTTGCAG-3′(配列番号：182；アンチセンス
）および BamHI 部位を含有する 3′プライマーセットは次のとおりであった。 5′-ATCCCCTATCTACAGGCTGTGTCCGTGTCAGTGGCAG-3′(配列番号：183；センス) 5′-GGAGGATCCAGGGCAGCCCTCGCTCAGGGC-3′(配列番号：184；アンチセンス)。 次いで、５’および３’ＰＣＲ断片が同時に鋳型として使用されて、プライマー
としての配列番号：１８１と配列番号：１８４を用いて全長ｃＤＮＡを得た。各
ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は９４℃で１分間、６５℃で２分３０秒間およ
び７２℃で１分３０秒間の３０サイクルであった。

【０１１９】 得られるＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限部位で消化され、そしてＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ ｐＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。その後核
酸およびアミノ酸配列が決定され、そして確認された。

【０１２０】 １６．ＰＴＨＲ１ 内因性ヒトＰＴＨＲ１は、鋳型および製造者によって提供されるバッファー系
とともにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲに
よって得られた。サイクル条件は９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃
で１分３０秒間の３０サイクルであった。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいる５’
ＰＣＲ断片は鋳型としての腎臓ｃＤＮＡ、および下記のプライマーセットを用い
て得られた： 5′-CGCAAGCTTAGGCGGTGGCGATGGGGACCGCC-3′(配列番号：185）および 5′-GGATGTGGTCCCATTCCGGCAGACAG-3′-(配列番号：186)。

【０１２１】 EcoRI 部位を含有する 3′PCR 断片は、pfu PCR（Stratagene）および鋳型と
しての IMAGE 1624048 と下記のプライマーセットにより得られた。 5′-AGGAGGCACCCACTGGCAGCAGGTA-3′(配列番号：187）および 5′-GCCGAATTCCATGACTGTCTCCCACTCTTCCTG-3′(配列番号：188)。 ３’ＰＣＲ反応のためのサイクル条件は次のとおりであった：９４℃で１分間、
６５℃で１分間および７２℃で１分３０秒間の３０サイクル。

【０１２２】 次いで、５’と３’ＰＣＲ断片が同時に鋳型として使用されて、ｐｆｕポリメ
ラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマーとしての配列番号：１８５と
配列番号：１８８を用いて全長ｃＤＮＡを得た。全長クローンのためのＰＣＲサ
イクル条件は、９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で３秒間の３０サ
イクルであった。

【０１２３】 得られるＰＣＲ断片はＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限部位で消化され、そし
てＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ｐＣＭＶ発現ベクター中にクローン化された。
核酸およびアミノ酸配列がその後に決定され、そして確認された。

【０１２４】 １７．ＳＳＴ２ ＳＳＴ２はＥＴＡ０６８１８をｐＣＭＶベクター中にサブクローニングするこ
とによって得られた。

【０１２５】 下記表Ｅは、前記内因性受容体が指定でき、そして内因性の核酸およびアミノ
酸配列が提供されるＧｅｎＢａｎｋ受理番号を示す。

【０１２６】

【表１７】

【０１２７】

【表１８】

【０１２８】

【表１９】

【０１２９】 例２ 非内因性の、既知ＧＰＣＲの型の作成 Ａ．部位特異的突然変異 当業者は核酸配列の変異のための技術を選択する能力を保証されている。先に
開示された数種のヒトＧＰＣＲの非内因性型を創造するために利用されるアプロ
ーチが以下に示される。以下に開示される変異は、保存プロリン残基（ＴＭ６／
ＩＣ３の接点に近い、ＧＰＣＲのＴＭ６域に位置する）から１６番目のアミノ酸
（ＧＰＣＲのＩＣ３域に位置する）が、もっとも好ましくはリジンアミノ酸残基
に変異されるアルゴリズム的アプローチに基づいている。

【０１３０】 ほとんどのこの例２の実施例では、前記アルゴリズム的アプローチが変異され
たアミノ酸残基を同定するために使用された。しかしながら、下記の数種のＧＰ
ＣＲは改変されたアルゴリズム的アプローチを利用した（例えば、ＣＲＦＲ１，
ＧＩＰ，ｍＧｌｕＲ１，ＧＰＲ２４，ＰＴＨＲ１，ＰＴＨＲ２，ＳＣＴＲ，ＴＳ
ＨＲ，ＶＩＰＲおよびＶＩＰＲ２）。この改変アプローチは、プロリンから上流
５番目のアミノ酸が一般に、限定されるものではないがスレオニン残基である、
保存プロリン残基（また、ＴＭ６／ＩＣ３の接点に近い、ＧＰＣＲのＴＭ６域に
位置する）に焦点を定める。これらの受容体では、内因性の５番目のアミノ酸残
基が、もっとも好ましくはプロリンアミノ酸残基に変異される。

【０１３１】 他の変異アプローチも使用することができ（例えば、ｍＧｌｕＲ１，ＧＰＲ２
４およびＴＳＨＲ）、そして当業者は核酸配列の変異のための技術を選択する能
力を保証されている。ここで重要なことは、変異が構成的に活性化される受容体
をもたらし、そして構成的活性の決定のための本明細書に記述される拡張アプロ
ーチが与えられれば、日常分析がこれに関して使用できることである。

【０１３２】 非内因性の既知ＧＰＣＲの作成は、好ましくは、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓ
ｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ^TM Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ、製造者の指示にしたがう）を用いることによって実施される。好まし
くは、内因性ＧＰＣＲが鋳型として使用され、そして２種の変異誘発プライマー
、ならびにもっとも好ましくはリジン変異誘発性オリゴヌクレオチドおよび選択
マーカーオリゴヌクレオチド（配列番号：２５２；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのキッ
トに含まれる）が利用される。便宜上、既知ＧＰＣＲ中に組み入れられたコドン
変異およびそれぞれのオリゴヌクレオチドが標準型において示される（表Ｆ）：

【０１３３】

【表２０】

【０１３４】

【表２１】

【０１３５】

【表２２】

【０１３６】

【表２３】

【０１３７】

【表２４】

【０１３８】 Ｂ．変異に対する代替アプローチ １．ｍＧｌｕＲ１ ヒトｍＧｌｕＲ１受容体の非内因性型の作成は、３’末端における細胞内領域
の一部を欠失することによって達成された。非内因性ヒトｍＧｌｕＲ１は、鋳型
および製造者によって提供されるバッファー系とともにｒＴｔｈポリメラーゼ（
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲによって得られた。第１回目のＰＣ
Ｒのためのサイクル条件は次のとおりであった：９４℃で１分間、６５℃で１分
間および７２℃で１分５０秒間の３０サイクル。５’ＰＣＲ断片はＳａｌＩ部位
を含み、そして鋳型としての海馬ＤＮＡ、および下記のプライマーセットを用い
て得られた： 5′-GCAGGCTGTCGACCTCGTCCTCACCACCATGGTC-3′(配列番号：340）および 5′-AATGGGCTCACAGCCTGTTAGATCTGCATTGGGCCAC-3′-(配列番号：341)。

【０１３９】 中間 PCR 断片は、サイクル条件を94℃で1分間、65℃で1分間および72℃で1分
50秒間の30サイクルとし、鋳型としてゲノム DNA を、そして下記のプライマー
セットを用いて得た。 5′-TAACAGGCTGTGAGCCCATTCCTGTGCG-3′(配列番号：342）および 5′-TTAGAATTCGCATTCCCTGCCCCTGCCTTCTTTC-3′(配列番号：343)。

【０１４０】 3′PCR 断片は、pfu ポリメラーゼを用いる全長 cDNA を得るための共鋳型の
一つとして内因性 mGluR1クローンを用いることにより得られた。この PCR 反応
のサイクル条件は、94℃で1分間、65℃で2分30秒間および72℃で1分30秒間の30
サイクルであり、そして次のプライマーセットを用いた。 5′-TGCGAATTCTAATGGCAAGTCTGTGTCATGGTC-3′(配列番号：344）および 5′-TGCGGATCCTCTTCGGAAGATGTTGAGGAAAGTG-3′(配列番号：345)。 （核酸配列については 配列番号：346 を、そしてアミノ酸配列については 配列
番号：347 を参照されたい）。

【０１４１】 ２．ＧＰＲ２４（ＭＣＨまたはＳＬＣ−１） ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｔ２５５Ｋ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３５０、アミノ酸配列については配列番号：３５１）、
Ｔ２５５Ｋ／Ｔ２５７Ｒ変異（参照、核酸配列については配列番号：３５４、ア
ミノ酸配列については配列番号：３５５）、２４−ＩＣ３−ＳＳＴ３変異（参照
、核酸配列については配列番号：３５８、アミノ酸配列については配列番号：３
５９）、Ｃ３０５Ｙ変異（参照、核酸配列については配列番号：３６２、アミノ
酸配列については配列番号：３６３）、Ｐ２７１Ｌ変異（参照、核酸配列につい
ては配列番号：３６６、アミノ酸配列については配列番号：３６７）、Ｗ２６９
Ｃ変異（参照、核酸配列については配列番号：３７０、アミノ酸配列については
配列番号：３７１）、Ｗ２６９Ｆ変異（参照、核酸配列については配列番号：３
７４、アミノ酸配列については配列番号：３７５）、およびＷ２６９Ｌ変異（参
照、核酸配列については配列番号：３７８、アミノ酸配列については配列番号：
３７９）、Ｆ２６５Ｉ変異（参照、核酸配列については配列番号：３８２、アミ
ノ酸配列については配列番号：３８３）、Ｉ２６１Ｑ変異（参照、核酸配列につ
いては配列番号：３８６、アミノ酸配列については配列番号：３８７）、および
Ｄ１４０Ｎ変異（参照、核酸配列については配列番号：３９０、アミノ酸配列に
ついては配列番号：３９１）を創造することによって達成された。

【０１４２】 Ａ．Ｔ２５５Ｋ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｔ２５５Ｋ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３５０、およびアミノ酸配列については配列番号：３５
１）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＴｒａ
ｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋ
ｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-AGAGGGTGAAACGCACAGCCATCGCCATCTG-3′(配列番号：348) そして、アンチセンスプライマーは（選択マーカー）は次の配列を有していた。 5′-CTCCTTCGGTCCTCCTATCGTTGTCAGAAGT-3′(配列番号：349)。 内因性ＧＰＲ２４ ｃＤＮＡが鋳型として使用された。

【０１４３】 Ｂ．Ｔ２５５Ｋ／Ｔ２５７Ｒ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｔ２５５Ｋ／Ｔ２５７Ｒ変異（
参照、核酸配列については配列番号：３５４、およびアミノ酸配列については配
列番号：３５５）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にした
がってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-AGAGGGTGAAACGCAGAGCCATCGCCATCTG-3′(配列番号：352) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CAGATGGCGATGGCTCTGCGTTTCACCCTCT-3′(配列番号：353)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１４４】 Ｃ．２４−ＩＣ３−ＳＳＴ３変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、２４−ＩＣ３−ＳＳＴ３変異（
参照、核酸配列については配列番号：３５８、およびアミノ酸配列については配
列番号：３５９）を創造することによって達成された。Ｂｌａｓｔ結果は、ＧＰ
Ｒ２４がＳＳＴ２に対する最高の配列相同性を有することを示した。かくして、
ＧＰＲ２４のＩＣ３ループは、キメラが構成的活性を示すか否かを明らかにする
ためにＳＳＴ２のそれと置換された。

【０１４５】 ＧＰＲ２４のＩＣ３を含有するＢａｍＨＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片は、ＳＳＴ２の
ＩＣ３を含有する合成オリゴヌクレオチドと置換された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-GATCCTGCAGAAGGTGAAGTCCTCTGGAATCCGAGTGGGCTCCTCTAAGAGGAAGAAGTCTGAGAAGA
AG-3′(配列番号：356) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-GTGACCTTCTTCTCAGACTTCTTCCTCTTAGAGGAGCCCACTCGGATTCCAGAGGACTTCACCTTCTG
CAG-3′(配列番号：357)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１４６】 Ｄ．Ｃ３０５Ｙ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｃ３０５Ｙ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３６２、およびアミノ酸配列については配列番号：３６
３）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-GGCTATGCCAACAGCTACCTCAACCCCTTTGTG-3′(配列番号：360) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CACAAAGGGGTTGAGGTAGCTGTTGGCATAGCC-3′(配列番号：361)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１４７】 Ｅ．Ｐ２７１Ｌ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｐ２７１Ｌ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３６６、およびアミノ酸配列については配列番号：３６
７）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-TTGTGTGCTGGGCACTCTACTATGTGCTACAGC-3′(配列番号：364) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-GCTGTAGCACATAGTAGAGTGCCCAGCACACAA-3′(配列番号：365)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１４８】 Ｆ．Ｗ２６９Ｃ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｗ２６９Ｃ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３７０、およびアミノ酸配列については配列番号：３７
１）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-GGTCTTCTTTGTGTGCTGCGCACCCTACTATGTG-3′(配列番号：368) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CACATAGTAGGGTGCGCAGCACACAAAGAAGACC-3′(配列番号.：369)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１４９】 Ｇ．Ｗ２６９Ｆ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｗ２６９Ｆ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３７４、およびアミノ酸配列については配列番号：３７
５）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-GGTCTTCTTTGTGTGCTTCGCACCCTACTATGTG-3′(配列番号：372) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CACATAGTAGGGTGCGAAGCACACAAAGAAGACC-3′(配列番号：373)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１５０】 Ｈ．Ｗ２６９Ｌ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｗ２６９Ｌ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３７８、およびアミノ酸配列については配列番号：３７
９）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-GGTCTTCTTTGTGTGCTTGGCACCCTACTATGTG-3′(配列番号：376) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CACATAGTAGGGTGCCAAGCACACAAAGAAGACC-3′(配列番号：377)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１５１】 Ｉ．Ｆ２６５Ｉ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｆ２６５Ｉ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３８２、およびアミノ酸配列については配列番号：３８
３）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-GCCATCTGTCTGGTCATCTTTGTGTGCTGGG-3′(配列番号：380) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CCCAGCACACAAAGATGACCAGACAGATGGC-3′(配列番号：381)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１５２】 Ｊ．Ｉ２６１Ｑ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｉ２６１Ｑ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３８６、およびアミノ酸配列については配列番号：３８
７）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-CGCACAGCCATCGCCCAGTGTCTGGTCTTCTTTGTG-3′(配列番号：384) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CACAAAGAAGACCAGACACTGGGCGATGGCTGTGCG-3′(配列番号：385)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１５３】 Ｋ．Ｄ１４０Ｎ変異 ヒトＧＰＲ２４受容体の非内因性型の作成は、Ｄ１４０Ｎ変異（参照、核酸配
列については配列番号：３９０、およびアミノ酸配列については配列番号：３９
１）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-ACCGCCATGGCCATTAACGCGTACCTGGCCACT-3′(配列番号：388) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-AGTGGCCAGGTAGCGGTTAATGGCCATGGCGGT-3′(配列番号：389)。 内因性 GPR24 cDNA が鋳型として用いられた。

【０１５４】 ３．ＴＳＨＲ ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、Ｖ５０９Ａ変異（参照、核酸配列
については配列番号：３９４、アミノ酸配列については配列番号：３９５）、Ｄ
６１９Ｇ変異（参照、核酸配列については配列番号：３９８、アミノ酸配列につ
いては配列番号：３９９）、Ａ６２３Ｉ変異（参照、核酸配列については配列番
号：４０２、アミノ酸配列については配列番号：４０３）、Ａ６２３Ｋ変異（参
照、核酸配列については配列番号：４０６、アミノ酸配列については配列番号：
４０７）、Ｃ６７２Ｙ変異（参照、核酸配列については配列番号：４１０、アミ
ノ酸配列については配列番号：４１１）、Ｄ６１９Ｇ／Ａ６２３Ｋ変異（参照、
核酸配列については配列番号：４１４、アミノ酸配列については配列番号：４１
５）、Ｖ５０９Ａ／Ｃ６７２Ｙ変異（参照、核酸配列については配列番号：４１
８、アミノ酸配列については配列番号：４１９）、およびＶ５０９Ａ／Ａ６２３
Ｋ／Ｃ６７２Ｙ変異（参照、核酸配列については配列番号：４２２、アミノ酸配
列については配列番号：４２３）を創造することによって達成された。

【０１５５】 Ａ．Ｖ５０９Ａ変異 ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、Ｖ５０９Ａ変異（参照、核酸配列
については配列番号：３９４、およびアミノ酸配列については配列番号：３９５
）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉｋ
Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-CAAGCGAGTTATCGGCATATACGCTGACGGTC-3′(配列番号：392) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-GACCGTCAGCGTATATGCCGATAACTCGCTTG-3′(配列番号：393)。 鋳型として内因性 TSHR cDNA を用いた。この V509A 変異体は、AccI 部位近傍
の部位を欠くことによる内因性の型から分化しうる。

【０１５６】 Ｂ．Ｄ６１９Ｇ変異 ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、また、Ｄ６１９Ｇ変異（参照、核
酸配列については配列番号：３９８、およびアミノ酸配列については配列番号：
３９９）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱ
ｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-ACCCAGGGGACAAAGGTACCAAAATTGCCAA-3′(配列番号：396) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-TTGGCAATTTTGGTACCTTTGTCCCCTGGGT-3′(配列番号：397)。 鋳型として内因性 TSHR cDNA を用いた。この D619G 変異体は KpnI 部位近傍の
変異部を存在させることにより内因性型から分化できる。

【０１５７】 Ｃ．Ａ６２３Ｉ変異 ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、Ａ６２３Ｉ変異（参照、核酸配列
については配列番号：４０２、およびアミノ酸配列については配列番号：４０３
）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱｕｉｋ
Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-AAAGATACCAAAATTATCAAGAGGATGGCTGT-3′(配列番号：400) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-ACAGCCATCCTCTTGATAATTTTGGTATCTTT-3′(配列番号：401)。 鋳型として内因性 TSHR cDNA を用いた。この A623I 変異体は BstXI 部位近傍
の変異部位を欠くことにより内因性型から分化できる。

【０１５８】 Ｄ．Ａ６２３Ｋ変異 ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、また、Ａ６２３Ｋ変異（参照、核
酸配列については配列番号：４０６、およびアミノ酸配列については配列番号：
４０７）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱ
ｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-AAAGATACCAAAATTAAGAAGAGGATGGCTGTG-3′(配列番号：404) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CACAGCCATCCTCTTCTTAATTTTGGTATCTTT-3′(配列番号：405)。 鋳型として内因性 TSHR cDNA を用いた。この A623K 変異体は BstXI 部位近傍
の変異部位を欠くことにより内因性型から分化できる。

【０１５９】 Ｅ．Ｃ６７２Ｙ変異 ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、また、Ｃ６７２Ｙ変異（参照、核
酸配列については配列番号：４１０、およびアミノ酸配列については配列番号：
４１１）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者にしたがってＱ
ｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-CTATCCACTTAACTCGTACGCCAATCCATTCCTC-3′(配列番号：408) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-GAGGAATGGATTGGCGTACGAGTTAAGTGGATAG-3′(配列番号：409)。 鋳型として内因性 TSHR cDNA を用いた。この C672Y 変異体は BsiWI 部位近傍
の変異部位を存在させることにより内因性型から分化できる。

【０１６０】 Ｆ．Ｄ６１９Ｇ／Ａ６２３Ｋ変異 ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、また、Ｄ６１９Ｇ／Ａ６２３Ｋ変
異（参照、核酸配列については配列番号：４１４、およびアミノ酸配列について
は配列番号：４１５）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者に
したがってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いた PCR 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-ACCCAGGGGACAAAGGTACCAAAATTAAGAAGAGGATGGCTGTG-3′(配列番号：412) そして、アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CACAGCCATCCTCTTCTTAATTTTGGTACCTTTGTCCCCTGGGT-3′(配列番号：413)。 ＴＳＨＲ ｃＤＮＡの非内因性Ｄ６１９Ｇ変異型が鋳型として使用された。この
Ｄ６１９Ｇ／Ａ６２３Ｋ変異体は、ＫｐｎＩ部位近傍のＤ６１９Ｇ変異部位を存
在させ、そしてＢｓｔＸＩ部位近傍のＡ６２３Ｋ変異部位を欠くことにより内因
性型から分化できる。

【０１６１】 Ｇ．Ｖ５０９Ａ／Ｃ６７２Ｙ変異 ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、また、Ｖ５０９Ａ／Ｃ６７２Ｙ変
異（参照、核酸配列については配列番号：４１８、およびアミノ酸配列について
は配列番号：４１９）を創造することによって達成された。変異誘発は製造者に
したがってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。 用いる V509A 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-CAAGCGAGTTATCGGCATATACGCTGACGGTC-3′(配列番号：416) そして、C672Y アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-GAGGAATGGATTGGCGTACGAGTTAAGTGGATAG-3′(配列番号：417)。 内因性ＴＳＨＲ ｃＤＮＡが鋳型として使用された。このＶ５０９Ａ／Ｃ６７２
Ｙ変異体は、ＡｃｃＩ部位近傍のＶ５０９Ａ変異部位を欠き、そしてＢｓｉＷＩ
部位近傍のＣ６７２Ｙ変異部位を存在させることにより内因性型から分化できる
。

【０１６２】 Ｈ．Ｖ５０９Ａ／Ａ６２３Ｋ／Ｃ６７２Ｙ変異 ヒトＴＳＨＲ受容体の非内因性型の作成は、Ｖ５０９Ａ／Ａ６２３Ｋ／Ｃ６７
２Ｙ変異（参照、核酸配列については配列番号：４２２、およびアミノ酸配列に
ついては配列番号：４２３）を創造することによって達成された。変異誘発は製
造者にしたがってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施された。用い
る A623K 変異誘発センスプライマーは次の配列を有し、 5′-AAAGATACCAAAATTAAGAAGAGGATGGCTGTG-3′(配列番号：420) そして、A623K アンチセンスプライマーは次の配列を有していた。 5′-CACAGCCATCCTCTTCTTAATTTTGGTATCTTT-3′(配列番号：421)。 ＴＳＨＲ ｃＤＮＡの非内因性Ｖ５０９Ａ／Ｃ６７２Ｙ変異型が鋳型として使用
された。このＶ５０９Ａ／Ａ６２３Ｋ／Ｃ６７２Ｙ変異体は、ＡｃｃＩ部位近傍
のＶ５０９Ａ変異部位を欠き、ＢｓｔＸＩ部位近傍のＡ６２３Ｋ変異部位を欠き
、そしてＢｓｉＷＩ部位近傍のＣ６７２Ｙ変異部位を存在させることにより内因
性型から分化できる。

【０１６３】 次いで、非内因性のヒトＧＰＣＲは配列決定され、そして誘導され、確認され
た核酸およびアミノ酸配列が、下記表Ｇに総括されるように、本特許文書に付随
する「配列リスト」追録に列挙される：

【０１６４】

【表２５】

【０１６５】

【表２６】

【０１６６】

【表２７】

【０１６７】

【表２８】

【０１６８】 次いで既知ＧＰＣＲの非内因性型の後構成的活性の調査が行われた。

【０１６９】 例３ 受容体の発現 種々の細胞がタンパク質の発現のための技術に対して利用できるけれども、哺
乳動物細胞を利用することがもっとも好適である。この主たる理由は、実用性に
より予測される、すなわち、ＧＰＣＲの発現のために例えば酵母細胞の利用は、
可能ではあるが、哺乳動物系のために進化した受容体共役、遺伝機構および分泌
経路を含んでいないかも知れない（事実、酵母の場合は含んでいない）非哺乳動
物細胞をプロトコール中に導入すると−非哺乳動物細胞において得られる結果は
、使用は可能であっても、哺乳動物細胞から得られる結果と同じように好適であ
るとは言えない。利用される特定の哺乳動物細胞が技術者の特定のニーズにより
予測できるが、哺乳動物細胞の中で、ＣＯＳ−７、Ｈｅｋ−２９３およびＨｅｋ
−２９３Ｔ細胞は特に好適である。次のアプローチが指示された受容体のために
使用され、そして本明細書に開示される他の受容体に関してもまた応用すること
ができる。

【０１７０】 １日目に、２Ｘ１０⁴のＨｅｋ−２９３Ｔ細胞／ウェルがプレートアウトされ
た。２日目に、反応チューブ２本が調製された（各チューブのための分量は１プ
レート当たりである）：チューブＡは、血清不含のＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）１．２ｍｌ中ＤＮＡ２０μｇ（例え
ば、ｐＣＭＶベクター；受容体ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶベクターなど）を混合す
ることによって調製された；チューブＢは、血清不含のＤＭＥＭ１．２ｍｌ中リ
ポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）１２０μｌを混合することによって調製
された。チューブＡおよびＢを逆転（数回）して混合し、続いて室温で３０−４
５分間インキュベートした。混合液は「トランスフェクション混合液」と呼ばれ
る。プレートしたＨｅｋ−２９３Ｔ細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、続いて血清不含
のＤＭＥＭ１０ｍｌを添加した。トランスフェクション混合液２．４ｍｌを細胞
に添加し、続いて３７℃／５％ＣＯ₂で４時間インキュベートした。トランスフ
ェクション混合液を吸引して除去し、続いてＤＭＥＭ／１０％胎児ウシ血清２５
ｍｌを添加した。細胞を３７℃／５％ＣＯ₂においてインキュベートした。イン
キュベーション７２時間後、細胞を収穫し、そして分析のために使用した。

【０１７１】 例４ 非内因性ＧＰＣＲの構成的活性の決定のためのアッセイ 種々のアプローチが既知ＧＰＣＲの非内因性型の構成的活性の調査のために利
用できる。下記に具体的に説明される；当業者は、技術者のニーズに優先的に得
策であるそれらの技術を決定する能力を保証されている。

【０１７２】 １．膜結合アッセイ：［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ Ｇタンパク質−共役受容体が、リガンド結合または構成的活性化のいずれかの
結果としてその活性状態にある場合、受容体はＧタンパク質に結合し、そしてＧ
ＤＰの遊離とそれに続くＧＴＰのＧタンパク質への結合を刺激する。Ｇタンパク
質受容体複合体のαサブユニットはＧＴＰアーゼとして作用し、そしてＧＴＰを
ＧＤＰに徐々に加水分解し、この時点で正常には受容体は不活性化される。構成
的に活性化される受容体は、ＧＤＰをＧＴＰに交換し続ける。加水分解不能なＧ
ＴＰアナログ、［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳは、構成的に活性化される受容体を発現して
いる膜への［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の増強を例証するために使用することがで
きる。構成的な活性化を測定するために［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を使用する利点
は、（ａ）一般にそれがすべてのＧタンパク質−共役受容体に応用できる；（ｂ
）それが膜表面のもっとも近くに存在して、細胞内カスケードに影響する分子を
ほとんど拾い上げられないようにさせることである。

【０１７３】 本アッセイは、関連する受容体を発現している膜への［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合
を刺激するＧタンパク質共役受容体の能力を利用する。したがって、アッセイは
、既知および構成的に活性化されるＧタンパク質−共役受容体に対する候補化合
物をスクリーニングする直接同定法において使用できる。アッセイは一般的であ
り、そしてすべてのＧタンパク質−共役受容体における薬物発見に対する応用性
を有する。

【０１７４】 ［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、約０．３〜約１．２ｎＭ［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ
（この量は１．２が好適であるが結果の最適化のために調整できる）および１２
．５〜７５μｇ膜タンパク質（例えば、受容体を発現しているＣＯＳ−７細胞、
この量は７５μｇが好適であるが結果の最適化のために調整できる）および１μ
ＭＧＤＰ（この量は結果の最適化のために調整できる）を含有する、２０ｍＭＨ
ＥＰＥＳおよび１〜約２０ｍＭＭｇＣｌ₂（この量は２０ｍＭが好適であるが結
果の最適化のために調整できる）ｐＨ７．４結合バッファー中で１時間インキュ
ベートできる。次いで、コムギ胚芽アグルチニン・ビーズ（２５μｌ；Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）が添加され、そして混合液は室温でさらに３０分間インキュベートさ
れる。次いで、チューブは室温で５分間１５００ｘｇにおいて遠心され、次いで
シンチレーションカウンターでカウントされる。

【０１７５】 また、大規模なスクリーニングのニーズに合致する、よりコストは低いが同様
に応用可能な代替法が特定された。Ｆｌａｓｈ ｐｌａｔｅ^TMおよびＷａｌｌａ
ｃ^TMｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐが高処理［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイを組み立
てるために利用されてもよい。さらにまた、この技術を用いて、アッセイは、［³⁵ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を介して効力をモニターすると同時に、受容体へのトリチ
ウム化リガンドの結合を同時にモニターするために既知ＧＰＣＲについて応用す
ることができる。このことは、Ｗａｌｌａｃベータカウンターが両トリチウムお
よび³⁵Ｓ標識プローブを調べるエネルギーウインドーを切り替えることができる
ので可能である。また、このアッセイは、受容体活性化をもたらす他のタイプの
膜活性化現象を検出するために使用されてもよい。例えば、本アッセイは、種々
の受容体（両Ｇタンパク質共役およびチロシンキナーゼ受容体）の³⁵Ｓリン酸化
をモニターするために使用されてもよい。膜がウェルの底に遠心されると、結合
した［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳまたは³⁵Ｓ−リン酸化受容体がウェルの被覆されている
シンチラントを活性化できる。Ｓｃｉｎｔｉ^TMストリップ（Ｗａｌｌａｃ）はこ
の原理を例証するために使用された。さらにまた、アッセイは、放射能標識され
たリガンドを用いて受容体に結合するリガンドを測定するための利用性も有する
。同様に、放射能標識リガンドがウェルの底まで遠心されると、ｓｃｉｎｔｉｓ
ｔｒｉｐラベルは活性化と検出をもたらす放射能標識リガンドに近接する。

【０１７６】 ２．膜に基づくｃＡＭＰ 細胞に基づくアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ^TM Ａｄｅ
ｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）は、粗血漿膜とともに使用するために改変
することができる。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特定
の抗体をまた含有するシンチラントコーティングを含有している。ウェル内で生
成したｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合に対する
直接競合によって定量できる。次のことは、受容体を発現している膜におけるｃ
ＡＭＰレベルの変化の測定のための簡単な方法として役立つ。

【０１７７】 トランスフェクション細胞はトランスフェクション後約３日目に収穫された。
膜は２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４と１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含有するバッファ
ー中に懸濁した細胞のホモジナイゼーションによって調製された。ホモジナイゼ
ーションはＢｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ^TMを用いて約１０秒間氷上で実
施する。得られるホモジネートは４９，０００ｘｇにおいて４℃で１５分間遠心
される。次いで、得られるペレットを２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４および０
．１ｍＭＥＤＴＡを含有するバッファー中に再懸濁し、１０秒間ホモジナイズし
、続いて４９，０００ｘｇにおいて４℃で１５分間遠心する。得られるペレット
は使用するまで−８０℃で保存される。測定の日に、膜ペレットが室温で徐々に
融解され、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４および１０ｍＭＭｇＣｌ₂（これら
の量は、ここに挙げられた値が好適であるが、最適化されてもよい）を含有する
バッファー中に再懸濁して、最終タンパク質濃度０．６０ｍｇ／ｍｌを得る（再
懸濁された膜は使用まで氷上に置かれる）。

【０１７８】 ｃＡＭＰスタンダードおよび検出バッファー（検出バッファー１１ｍｌに対し
てトレーサー［¹²⁵ＩｃＡＭＰ（１００μｌ）］２μＣｉを含有する）が調製さ
れ、そして製造者の指示にしたがって維持される。アッセイバッファーはスクリ
ーニングのために新しく調製され、そして２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１
０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ），クレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉ
ｇｍａ）０．１ユニット／ｍｌ、５０μＭＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）および０．２ｍ
ＭＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含有した；アッセイバッファーは使用まで氷上で保存
できる。本アッセイはＮＥＮ Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅへのアッセイバッファー
５０μｌの添加、続いて膜懸濁液５０μｌの添加によって開始される。得られた
アッセイ混合液は室温で６０分間インキュベートされた後検出バッファー１００
μｌを添加される。次いで、プレートはさらに２−４時間インキュベートされた
後Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ^TMシンチレーションカウンターにおいてカ
ウントされる。ｃＡＭＰ／ウェルの値が各アッセイプレート内に含まれる標準ｃ
ＡＭＰ曲線から推定される。

【０１７９】 ３．Ｇｉ共役標的ＧＰＣＲのための細胞に基づくｃＡＭＰ ＴＳＨＲは、活性化によりｃＡＭＰの蓄積を惹起するＧｓ共役ＧＰＣＲである
。ＴＳＨＲはアミノ酸残基６２３を変異する（すなわち、アラニン残基をイソロ
イシン残基に変える）ことによって構成的に活性化された。参照、核酸配列につ
いては配列番号：４０２、および推定アミノ酸配列については配列番号：４０３
。Ｇｉ共役受容体はアデニリルシクラーゼを阻害することが期待され、したがっ
てｃＡＭＰ産生レベルを減少させ、これがｃＡＭＰレベルチャレンジングの調査
を可能にする。Ｇｉ共役受容体の構成的活性化の指標としてｃＡＭＰの生産にお
ける減少を測定する有効な技術が、もっとも好ましくは、「シグナルエンハンサ
ー」としての非内因性の構成的に活性化されるＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ
）（または内因性の構成的に活性なＧｓ共役受容体）を、ｃＡＭＰの基礎レベル
を確立するようＧｉ連結標的ＧＰＣＲ、例えばＧＰＲ２４とともにコ・トランス
フェクションすることによって達成できる。Ｇｉ共役受容体の非内因性型を創造
するには、標的ＧＰＣＲのこの非内因性型が、次にシグナルエンハンサーととも
にコ・トランスフェクションされ、そしてそれがスクリーニングのために使用で
きるこの材料である。本発明者らは、そのようなアプローチを利用してｃＡＭＰ
アッセイが使用される場合のシグナルを効果的に生成した；このアプローチは好
ましくは、Ｇｉ共役受容体に対する候補化合物の直接同定において使用される。
Ｇｉ共役ＧＰＣＲについて、このアプローチが使用される場合、標的ＧＰＣＲの
逆アゴニストはｃＡＭＰシグナルを増加し、そしてアゴニストはｃＡＭＰシグナ
ルを減少させることが注目される。

【０１８０】 １日目に、２Ｘ１０⁴のＨｅｋ−２９３およびＨｅｋ−２９３Ｔ細胞／ウェル
がプレートアウトされた。２日目に、反応チューブ２本が調製された（各チュー
ブのための分量は１プレート当たりである）：チューブＡは、血清不含のＤＭＥ
Ｍ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）１．２ｍｌ中
全ＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；変異ＴＨＳＲ（ＴＨＳＲ−Ａ６２３Ｉを
含むｐＣＭＶベクター；ＴＨＳＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＲ２４、など）４μｇ
について、哺乳動物細胞にトランスフェクションされた各受容体のＤＮＡ２μｇ
を混合することによって調製された；チューブＢは、血清不含のＤＭＥＭ１．２
ｍｌ中リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）１２０μｌを混合することによ
って調製された。次いで、チューブＡおよびＢを逆転（数回）して混合し、続い
て室温で３０−４５分間インキュベートした。混合液は「トランスフェクション
混合液」と呼ばれる。プレートしたＨｅｋ−２９３細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、
続いて血清不含のＤＭＥＭ１０ｍｌを添加した。次いで、トランスフェクション
混合液２．４ｍｌを細胞に添加し、続いて３７℃／５％ＣＯ₂で４時間インキュ
ベートした。次いで、トランスフェクション混合液を吸引して除去し、続いてＤ
ＭＥＭ／１０％胎児ウシ血清２５ｍｌを添加した。次いで、細胞を３７℃／５％
ＣＯ₂においてインキュベートした。インキュベーション２４時間後、細胞を収
穫し、そして分析のために使用した。

【０１８１】 細胞に基づくアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ^TM Ａｄｅ
ｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）は、粗血漿膜とともに使用するために改変
することができる。Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特定
の抗体をまた含有するシンチラントコーティングを含有している。ウェル内で生
成したｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合に対する
直接競合によって定量できる。次のことは、受容体を発現している細胞全体にお
けるｃＡＭＰレベルの変化の測定のための簡単な方法として役立つ。

【０１８２】 トランスフェクションされた細胞は一過性トランスフェクション後約２４時間
目に収穫された。培地を注意して吸引し、そして廃棄した。ＰＢＳ１０ｍｌを各
細胞のディッシュに静かに添加し、続いて注意して吸引した。Ｓｉｇｍａ細胞破
壊バッファー１ｍｌおよびＰＢＳ３ｍｌを各プレートに添加する。細胞をプレー
トからピペットで採取し、そして細胞懸濁液を５０ｍｌコニカル遠心管中に回収
する。次いで、細胞を室温において１，１００ｒｐｍで５分間遠心する。細胞ペ
レットを注意して適当な容量のＰＢＳ中に再懸濁する（約３ｍｌ／プレート）。
次いで、細胞を血球計を用いてカウントし、さらなるＰＢＳを添加して適当な数
の細胞を得る（最終濃度約５０μｌ／ウェル）。

【０１８３】 ｃＡＭＰスタンダードおよび検出バッファー（検出バッファー１１ｍｌに対し
てトレーサー［¹²⁵ＩｃＡＭＰ（５０μｌ］１μＣｉを含有する）が調製され、
そして製造者の指示にしたがって維持される。アッセイバッファーはスクリーニ
ングのために新しく調製すべきであり、そしてＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎバッファ
ー５０μｌ、試験化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）３μｌおよび細胞５０μ
ｌを含有した；アッセイバッファーは使用まで氷上で保存できる。本アッセイは
適当なウェルへのｃＡＭＰスタンダード５０μｌの添加、続いてウェルＨ−１１
とＨ１２へのＰＢＳＡ５０μｌの添加によって開始される。Ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｏｎバッファー５０μｌが全ウェルに添加された。選ばれた化合物（例えば、Ｔ
ＳＨ、１００ｎＭＭＣＨ、ＭＣＨ／ＴＳＨ）が、化合物溶液３μｌを分配できる
ピンツールを用いて適当なウェルに添加され、最終アッセイ濃度１２μＭ試験化
合物および総アッセイ容量１００μｌを得た。次いで、細胞をウェルに添加し、
そして室温で６０分間インキュベートした。トレーサーｃＡＭＰを含有する検出
混合液１００μｌをウェルに添加した。次いで、プレートはさらに２時間インキ
ュベートされた後Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンタ
ーにおいてカウントされた。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値が各アッセイプレー
ト内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線から推定された。

【０１８４】 図１は、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ（ＴＳＨの存在下で）および非内因性の構成的
に活性化されるＧＰＲ２４（「２４−ＩＣ３−ＳＳＴ２」）によりコ・トランス
フェクションされた細胞のｃＡＭＰ生産（２６２．２６６ｐｍｏｌｃＡＭＰ／ウ
ェル）における、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉと内因性ＧＰＲ２４（「ＧＰＲ２４ ｗ
ｔ」）（３３６．５０２９３ｐｍｏｌｃＡＭＰ／ウェル）に比較した場合の約２
２％の減少を立証している。ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉと非内因性の構成的に活性化
されるＧＰＲ２４（「Ｉ２６１Ｑ」）とのコ・トランスフェクションは、「ＧＰ
Ｒ２４ ｗｔ」に比較した場合ｃＡＭＰ生産における約２７％減少を立証してい
る。ｃＡＭＰ生産におけるそのような減少は、ＧＰＲ２４の非内因性型（「Ｉ２
６１Ｑ」）が構成的に活性であることを表している。かくして、ｃＡＭＰシグナ
ルを増大することによってＧＰＲ２４受容体にインパクトを与える候補化合物は
逆アゴニストであり、一方ＧＰＲ２４アゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少させ
る。図１において生成したデータに基づいて、２４−ＩＣ３−ＳＳＴ２およびＩ
２６１Ｑは、ＴＳＨＲにおいて使用される場合もっとも好適なＧＰＲ２４の非内
因性型である（ｃＡＭＰアッセイを用いる構成的に活性化されるコ・トランスフ
ェクションアプローチ）。

【０１８５】 図２は、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ（ＴＳＨの存在下で）および非内因性の構成的
に活性化されるＧＰＲ５（「Ｖ２２４Ｋ」）によりコ・トランスフェクションさ
れた細胞のｃＡＭＰ生産（２３．５ｐｍｏｌｃＡＭＰ／ウェル）における、ＴＳ
ＨＲ−Ａ６２３Ｉと内因性ＧＰＲ５（「ＧＰＲ５ ｗｔ」）（５８．７９ｐｍｏ
ｌｃＡＭＰ／ウェル）に比較した場合の、約６０％の減少を立証している。ｃＡ
ＭＰ生産における約７８％と約４５％減少は、「Ｖ２２５Ｋ」とともにコ・トラ
ンスフェクションされたＴＨＳＲ−Ａ６２３Ｉと「ＧＰＲ５ｗｔ」とともにコ・
トランスフェクションされたＴＨＳＲ−Ａ６２３Ｉを、それぞれＴＳＨＲ−Ａ６
２３Ｉとともにコ・トランスフェクションされたｐＣＭＶ（１０６．７５ｐｍｏ
ｌｃＡＭＰ／ウェル）に対して比較した場合に立証された。前記のように、ｃＡ
ＭＰ生産における減少は構成的に活性なＧＰＲ５を立証する。かくして、好適な
候補化合物（すなわち、逆アゴニスト）はＧｉ共役受容体に結合して活性化のシ
グナルを増強するのであろう。

【０１８６】 好ましくは、先に注目したように、低分子候補化合物がＧｉ共役標的受容体を
標的とし、そして例えばＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉを標的としないことを確認するた
めには、直接同定された候補化合物が、好ましくは、標的受容体の不在下でシグ
ナルエンハンサーに対してスクリーニングされる。

【０１８７】 Ｃ．レポーターに基づくアッセイ １．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ−会合受容体） Ｇｓ刺激を検出する方法は、ｃＡＭＰ−依存様式において活性化される転写因
子ＣＲＥＢの既知の性質に依存している。ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ^TM ＣＲＥＢ
ｔｒａｎｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタ
ログ＃２１９０１０）は、２９３もしくは２９３Ｔ細胞におけるＧｓ共役活性を
アッセイするために利用できる。細胞は、製造者の指示にしたがいＭａｍｍｒｉ
ａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ＃
２００２８５）を用いて、この前記系のプラスミド成分および内因性または変異
受容体をコードしている指示される発現プラスミドをトランスフェクションされ
る。簡単に言えば、ｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｇａｌ４認識配列を含んでいるルシフェラ
ーゼレポータープラスミド）４００ｎｇ、ｐＦＡ２−ＣＲＥＢ（Ｇａｌ４ＤＮＡ
結合性ドメインを含んでいるＧａｌ４−ＣＲＥＢ融合タンパク質）４０ｎｇ、ｐ
ＣＭＶ−受容体発現プラスミド（受容体を含む）８０ｎｇおよびＣＭＶ−ＳＥＡ
Ｐ（分泌アルカリ性ホスファターゼ発現プラスミド；アルカリ性ホスファターゼ
活性は、サンプル間のトランスフェクション効率における変化について、対照に
対してトランスフェクション細胞の培地において測定される）２０ｎｇが、キッ
トの指示によりリン酸カルシウム沈降物中に合体される。沈降物の半分が９６穴
プレートの３ウェルに平等に分配され、細胞上で一夜維持され、そして翌朝新鮮
な培地と置換される。トランスフェクションの開始４８時間後、細胞を処理し、
そしてルシフェラーゼ活性についてアッセイする。

【０１８８】 ２．８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１ウェル当たり３ｘ１０⁴細胞の濃度で９６穴プレー
トにプレート・アウトし、そして製造者の指示にしたがって翌日Ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔａｍｉｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクションした。
ＤＮＡ／脂質混合液は次のように各６穴のトランスフェクションのために調製さ
れる：ＤＭＥＭ１００μｌ中プラスミドＤＮＡ２６０ｎｇが、ＤＭＥＭ１００μ
ｌ中脂質２μｌと静かに混合された（プラスミドＤＮＡ２６０ｎｇは、８ＸＣＲ
Ｅ−Ｌｕｃレポータープラスミド（プラスミドの一部分の表示については下記お
よび図１参照）２００ｎｇ、内因性受容体もしくは非内因性受容体を含むｐＣＭ
ＶまたはｐＣＭＶ単独５０ｎｇおよびＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（
Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中ＧＰＲＳ）１０ｎｇからなった）。８ＸＣＲＥ−Ｌ
ｕｃレポータープラスミドは次のように調製された：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇ
ａｌはｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のＢｇｌ
Ｖ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位においてラットのソマトスタチンプロモーター（−７１
／＋５１）をクローニングすることによって得られた。ｃＡＭＰ応答要素の８コ
ピーが、アデノウイルスの鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（参照、７ Ｈｕｍ ａｎ Ｇｅｎｅ ＴＨｅｒａｐｙ １８８３（１９９６））からＰＣＲによって
得られ、そしてＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位においてＳＲＩＦ−β−ｇａｌ中にクロー
ン化されて８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターを生成した。８ｘＣＲＥ
−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター
中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位において
ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得られるルシフェラーゼ
遺伝子と置換することによって生成された。室温で３０分のインキュベーション
後、ＤＮＡ／脂質混合液をＤＭＥＭ４００μｌで希釈し、そして希釈混合液１０
０μｌを各ウェルに添加した。細胞培養インキュベーター中で４時間のインキュ
ベーション後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ１００μｌを各ウェルに添加した。
翌日、トランスフェクション細胞は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ２００μｌ／
ウェルと変えられた。８時間後、ウェルは、ＰＢＳによる１回の洗浄後、フェノ
ールレッドを含まないＤＭＥＭ１００μｌ／ウェルに変えられた。ルシフェラー
ゼアッセイは、翌日、製造者の指示にしたがってＬｕｃＬｉｔｅ^TMレポーター遺
伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて測定され、そして１４５０Ｍｉ
ｃｒｏＢｅｔａ^TMシンチレーションおよびルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａ
ｃ）において読み取られた。

【０１８９】 図３Ａは、内因性のドーパミンＤ１の活性（７０６２２相対ライトユニット）
と比較した場合、ヒト・ドーパミンＤ１受容体の非内因性の構成的に活性な型の
活性（１８９２７０相対ライトユニット）における約６３％の増加を示す。 図
３Ｂは、それぞれのＧＰＣＲの内因性型に較べた場合、ヒトＯＰＲＭ（Ｇｉ共役
受容体、例４（３）参照）の非内因性の構成的に活性な型の活性における約４８
％の減少、ヒト５−ＨＴ１Ａ（Ｇｉ共役受容体、例４（３）参照）の非内因性の
構成的に活性な型の活性における約５３％の減少、ヒト５−ＨＴ１Ｂの非内因性
の構成的に活性な型の活性における約９１％の増加、およびヒト５−ＨＴ２Ｂの
非内因性の構成的に活性な型の活性における約２０％の増加を示す。

【０１９０】 図３Ｃは、それぞれのＧＰＣＲの内因性型に較べた場合、ヒトＣＣＲ３の非内
因性の構成的に活性な型の活性における約２９％の増加、ヒトＮＴＳＲ１の非内
因性の構成的に活性な型の活性における約４１％の増加、ヒトＣＢ２の非内因性
の構成的に活性な型の活性における約５１％の増加、およびヒトＣＸＣＲ４（Ｇ
ｉ共役受容体、例４（３）参照）の非内因性の構成的に活性な型の活性における
約２０％の減少を示す。

【０１９１】 図３Ｄは、それぞれのＧＰＣＲの内因性型に較べた場合、ヒトＰＴＨＲ１の非
内因性の構成的に活性な型の活性における約７５％の増加、ヒトＰＴＨＲ２の非
内因性の構成的に活性な型の活性における約７４％の増加、ヒトＳＣＴＲの非内
因性の構成的に活性な型の活性における約５６％の増加、ヒトＰＡＣＡＰの非内
因性の構成的に活性な型の活性における約９６％の増加、ヒトＶＩＰＲ１の非内
因性の構成的に活性な型の活性における約８８％の増加、およびヒトＶＩＰＲ２
の非内因性の構成的に活性な型の活性における約９１％の増加を示す。

【０１９２】 図３Ｅは、それぞれのＧＰＣＲの内因性型に較べた場合、ヒトＮＴＳＲ１の非
内因性の構成的に活性な型の活性における約５１％の増加、ヒトＭ１の非内因性
の構成的に活性な型の活性における約３１％の減少、ヒトＭ２の非内因性の構成
的に活性な型の活性における約１９％の減少、ヒトＭ３の非内因性の構成的に活
性な型の活性における約３２％の増加、ヒトＭ４の非内因性の構成的に活性な型
の活性における約３３％の減少、ヒトＭ５の非内因性の構成的に活性な型の活性
における約１７％の減少、およびヒト５−ＨＴ１Ｄの非内因性の構成的に活性な
型の活性における約６０％の増加を示す。Ｍ２，Ｍ４および５−ＨＴ１ＤはＧｉ
共役性であることが示されており、一方ＮＴＳＲ１，Ｍ１，Ｍ３およびＭ５はＧ
ｑ共役性であることが示されている。

【０１９３】 ３．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ−会合受容体） Ｇｑ刺激を検出する方法は、それらのプロモーター中にＡＰ１要素を含んでい
る遺伝子の活性化を惹起するＧｑ−依存性ホスホリパーゼＣの既知の性質に依存
している。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ^TM ＡＰ−１ ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ＃２１９０７３）は、リン酸カ
ルシウム沈降物の成分がｐＡＰ１−Ｌｕｃ４１０ｎｇ、ｐＣＭＶ−受容体発現プ
ラスミド８０ｎｇおよびＣＭＶ−ＳＥＡＰ２０ｎｇである以外は、ＣＲＥＢレポ
ーターアッセイに関して先に記述された方法にしたがって使用できる。

【０１９４】 ４．ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ−会合受容体） Ｇｑ刺激を検出する１つの方法は、それらのプロモーター中に血清応答因子を
含んでいる遺伝子の活性化を惹起するＧｑ−依存性ホスホリパーゼＣの既知の性
質に依存している。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ^TM ＳＲＦ−Ｌｕｃ−Ｒｅｐｏｒｔｉ
ｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、例えばＣＯＳ７細胞において
Ｇｑ共役活性についてアッセイするために利用される。細胞は、製造者の指示に
したがいＭａｍｍｒｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ^TM Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ，カタログ＃２００２８５）を用いて、この系のプラスミド成分およ
び内因性または非内因性のＧＰＣＲをコードしている指示される発現プラスミド
をトランスフェクションされる。簡単に言えば、ＳＲＦ−Ｌｕｃ４１０ｎｇ、ｐ
ＣＭＶ−受容体発現プラスミド８０ｎｇおよびＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌アルカリ
性ホスファターゼ発現プラスミド；アルカリ性ホスファターゼ活性は、サンプル
間のトランスフェクション効率における変化について、対照に対してトランスフ
ェクション細胞の培地において測定される）２０ｎｇが、製造者の指示によりリ
ン酸カルシウム沈降物中に合体される。沈降物の半分が９６穴プレートの３ウェ
ルに平等に分配され、血清不含の培地中の細胞上で２４時間維持される。指示さ
れれば、最後の５時間、細胞は１μＭアンジオテンシンとともにインキュベート
される。次いで、細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性について、製造者の
指示にしたがってＬｕｃｌｉｔｅ^TMキット（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｃａｔ．＃６０１
６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ １４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」シンチレーシ
ョンおよびルミネセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いてアッセイする。デ
ータはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ^TM２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて解析できる。

【０１９５】 ５．細胞内ＩＰ₃蓄積アッセイ（Ｇｑ−会合受容体） １日目に、受容体（内因性および／または非内因性の）を含有する細胞が、２
４穴プレートに、通常１ｘ１０⁵細胞／ウェル（この数字は最適化されてもよい
が）でプレートされる。２日目に、血清不含のＤＭＥＭ５０μｌ／ウェルにおけ
るＤＮＡ０．２５μｇと血清不含のＤＭＥＭ５０μｌ／ウェルにおけるリポフェ
クタミン２μｌを最初に混合することによってトランスフェクションすることが
できる。溶液を静かに混合し、そして１５−３０分間インキュベートする。細胞
をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄し、そして血清不含の培地４００μｌをトランスフェ
クション培地と混合し、そして細胞に添加した。次いで、細胞を３７℃／５％Ｃ
Ｏ₂で３−４時間インキュベートし、次いで、トランスフェクション培地を除去
し、そして規定の増殖培地１ｍｌ／ウェルと置換した。３日目に、細胞を³Ｈ−
ミオ−イノシトールによりラベルした。簡単に言えば、培地を除去し、そして細
胞をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄した。次いで、イノシトール不含／血清不含培地（
ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）０．５ｍｌを、³Ｈ−ミオ−イノシトール０．２５μＣｉ
／ウェルを含むウェルに添加し、そして細胞を１６−１８時間３７℃／５％ＣＯ₂ においてインキュベートする。４日目に、細胞をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄し、
そしてイノシトール不含／血清不含培地１０μＭパルギリン１０ｍＭ塩化リチウ
ムを含有するアッセイ媒質０．４５ｍｌ、またはアッセイ媒質０．４ｍｌおよび
１０ｘケタンセリン（ｋｅｔ）５０μｌを最終濃度１０μＭまで添加した。次い
で、細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、細胞をＰＢＳ０．５
ｍｌで洗浄し、そして新鮮／氷冷停止液（１ＭＫＯＨ；１８ｍＭホウ酸Ｎａ；３
．８ｍＭＥＤＴＡ）２００μｌを１ウェル当たり添加した。溶液を氷上で５−１
０分間または細胞が溶解するまで維持し、そして新鮮／氷冷中和液（７．５％Ｈ
Ｃｌ）２００μｌにより中和する。次いで、溶解液を１．５ｍｌ容エッペンドル
フチューブに移し、そしてクロロホルム／メタノール（１：２）１ｍｌを１チュ
ーブ当たり添加する。溶液を１５分間回転させ、上相をＢｉｏｒａｄ ＡＧ１−
Ｘ８^TM陰イオン交換樹脂（１００−２００メッシュ）に適用する。最初に、樹脂
を１：１．２５ｗ／ｖにおいて水で洗浄し、そして上相０．９ｍｌをカラムに負
荷する。カラムを５ｍＭミオ−イノシトール１０ｍｌおよび５ｍＭホウ酸Ｎａ／
６０ｍＭギ酸Ｎａ１０ｍｌで洗浄する。イノシトールトリスホスフェートを０．
１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウム２ｍｌを含むシンチレーションカクテル１０ｍ
ｌを含有するシンチレーションバイアルに溶出する。カラムを０．１Ｍギ酸／３
Ｍギ酸アンモニウム１０ｍｌで洗浄することによって再生し、そしてＨ₂Ｏで２
回洗浄し、そして水中４℃で保存する。

【０１９６】 図４は、ＩＰ₃アッセイにおいて使用するためのＧＰＲ２４の２種の好適な非
内因性の構成的に活性化される代表的型，２４−ＩＣ３−ＳＳＴ２およびＩ２６
１Ｑを示す。ＧＰＲ２４の内因性型（「ＧＰＲ２４ｗｔ」）に比較した場合、２
４−ＩＣ３−ＳＳＴ２はＩＰ₃蓄積における約２７％の増加を立証し、一方Ｉ２
６１Ｑ型は約３２％の増加を示した。

【０１９７】 例６ ＧＰＣＲ融合タンパク質の調製 構成的に活性化されるＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計は次のように
達成された：ラットＧタンパク質Ｇｓαの両５’および３’末端（ロングフォー
ム；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，８３ ＰＮＡＳ ３７７６（１９８６））は
、ＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を含むように作成された。
正確な配列（隣接するＨｉｎｄＩＩＩ配列を含むこと）の確認後、完全な配列が
ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｖ７９５−２
０）中にベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いるサブクローニングによって
シャトルされた。Ｇｓα配列の正確な方向がｐｃＤＮＡ３．１（−）へのサブク
ローニング後に決定された。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ配列においてラットＧｓα
含有する改変されたｐｃＤＮＡ３．１（−）が証明された；このベクターは「ユ
ニバーサル」Ｇｓαタンパク質ベクターとしてここに利用可能になった。ｐｃＤ
ＮＡ３．１（−）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に種々の既知制限部位
を含有し、かくして有利には、Ｇｓタンパク質の上流に、内因性の構成的に活性
なＧＰＣＲのコーディング配列を挿入する能力を提供する。この同じアプローチ
が利用されて、他の「ユニバーサル」Ｇタンパク質ベクターが創造でき、そして
もちろん、他の市販されるかまたは技術者にとって既知の適当なベクターも利用
できる−重要な基準は、ＧＰＣＲについての配列がＧタンパク質の配列の上流に
、そしてインフレームに存在することである。

【０１９８】 １．ＴＳＨＲ−Ｇｓα融合タンパク質 ａ．ＴＳＨＲについての安定な細胞系の生成 約１．２〜１．３ｘ１０⁷ＨＥＫ−２９３細胞を１５ｃｍ組織培養プレート上
にプレートする。１０％胎児ウシ血清および１％ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グ
ルタミンおよび抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地において増殖させる
。２９３細胞のプレーティング後〜８０％集密までの２４時間目に、細胞をＤＮ
Ａ１２μｇを用いてトランスフェクションする。ＤＮＡ１２μｇをリポフェクタ
ミン６０μｌおよび血清を含まないＤＭＥ高グルコース培地２ｍｌと合体する。
培地をプレートから吸引し、そして細胞を血清不含の培地で１回洗浄する。ＤＮ
Ａ、リポフェクタミンおよび培地混合液を、血清不含の培地１０ｍｌとともにプ
レートに添加する。３７℃で４〜５時間インキュベート後、培地を吸引し、そし
て血清を含む培地２５ｍｌを添加する。トランスフェクション後２４時間に、培
地を再び吸引し、そして血清を含む新鮮培地を添加する。トランスフェクション
後４８時間に、培地を吸引し、そしてゲネチシン（Ｇ４１８薬物）を最終濃度５
００μｇ／ｍｌで含有する血清を含む培地を添加する。トランスフェクション細
胞が、ここに、Ｇ４１８耐性遺伝子を含有するポジティブなトランスフェクショ
ン細胞について選択にかけられる。培地は選別が生じるように４〜５日毎に置換
される。選別の間、細胞は増殖して、安定なプールを生成するか、または安定な
クローン選択へと分裂する。

【０１９９】 ｂ．ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｋ）融合タンパク質 次に、ＴＳＨＲ−Ｇｓα融合タンパク質構築物が次のように作成された：プラ
イマーが両内因性の構成的に活性化されるＴＳＨＲおよび非内因性の、構成的に
活性化されるＴＳＨＲについて次のとおり設計された： 5′-gatc[TCTAGA]ATGAGGCCGGCGGACTTGCTGC-3′(配列番号：582；センス) 5′-ctag[GATATC]CGCAAAACCGTTTGCATATACTC-3′(配列番号：583；アンチセンス)
。

【０２００】 ロアー（ｌｏｗｅｒ）キャップのヌクレオチドが、内因性ＴＳＨＲとＧタンパ
ク質の間の制限部位直前にスペーサーとして含まれる。センスおよびアンチセン
スプライマーはそれぞれＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶの制限部位を含有した。

【０２０１】 次いで、ＰＣＲが、各々について次のプロトコールを用いて使用され、先に開
示したＧｓαユニバーサルベクター内に融合のためのそれぞれの受容体配列を確
保した：ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｋ）についてのｃＤＮＡ１００ｎｇは、各プライマ
ー（センスおよびアンチセンス）２μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ３μｌ、１０ＸＴａ
ｑＰｌｕｓ^TM Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎバッファー１０μｌ、ＴａｑＰｌｕｓ^TM Ｐ
ｒｅｃｉｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ：＃６００２１１）１μ
ｌおよび水８０μｌを含有する別々のチューブに添加された。ＴＳＨＲのための
反応温度およびサイクル時間は次のとおりであった：初発変性段階は９４℃で５
分間、そして９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；７２℃で２分間の１サイク
ルで実施された。最終伸長時間は７２℃１０分間において実施された。ＰＣＲ生
成物は１％アガロースゲル上で展開され、次いで、精製された（データ未掲載）
。精製された生成物をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）で消化し、そして所望のインサートを単離し、精製し、そしてそ
れぞれぼ制限部位においてＧｓユニバーサルベクター中に連結した。ポジティブ
クローンが形質転換後に単離され、そして制限酵素消化物によって決定された；
Ｈｅｋ−２９３細胞を用いる発現は下記プロトコールにしたがって達成された。
ＴＳＨＲについての各ポジティブクローン：Ｇｓ−融合タンパク質が配列決定さ
れ、そして候補化合物の直接同定のために利用された（参照、核酸配列について
は配列番号：５８８およびアミノ酸配列については配列番号：５８９）。

【０２０２】 ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｋ）の非内因性型の場所はラットのＧタンパク質Ｇｓより
上流に位置する（すなわち、ヌクレオチド１〜２，２９２；参照、配列番号：５
８６およびアミノ酸残基１〜７６４；参照、配列番号：５８７）。ＴＳＨＲ（Ａ
６２３Ｋ）はＧタンパク質に直接結合できるか、または２つの間にスペーサー残
基があってもよい。ＴＳＨＲに関して、２４アミノ酸残基（７２個のヌクレオチ
ドと同等）は非内因性ＧＰＣＲとＧタンパク質Ｇｓαの開始コドンとの間に置か
れた。したがって、Ｇｓタンパク質はヌクレオチド２，３６５〜３，５４９（参
照、配列番号：５８６）およびアミノ酸残基７８９〜１，１８３（参照、配列番
号：５８７）に位置する。当業者は、Ｇタンパク質が問題のＧＰＣＲの３’末端
に融合されているＧＰＣＲ融合タンパク質を構築する技術を選ぶ能力を保証され
ている。

【０２０３】 ＧＰＣＲ融合タンパク質が分析され（例６で示されるように、候補化合物のス
クリーニング中ＧＰＣＲを安定化するために）、そして例４（２）において見い
だされるプロトコールを使用して構成的に活性であることが証明された。図５で
は、ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｋ）−Ｇｓα：融合タンパク質は、対照ベクター（ｐＣ
ＭＶ）と比較した場合ｃＡＭＰにおける約８７％の増加を実証した。

【０２０４】 ２．ＧＰＲ２４−Ｇｉα融合タンパク質 次に、ＧＰＲ２４−Ｇｉα融合タンパク質構築物が次のように作成された：プ
ライマーが両内因性の構成的に活性化されるＧＰＲ２４および非内因性の、構成
的に活性化されるＧＰＲ２４について次のとおり設計された： １３７ 5′-GTGAAGCTTGCCCGGGCAGGATGGACCTGG-3′(配列番号：584；センス) 5′-ATCTAGAGGTGCCTTTGCTTTCTG-3′(配列番号：585；アンチセンス)。 センス
およびアンチセンスプライマーはそれぞれＫＢ４およびＸｂａＩの制限部位を含
有した。

【０２０５】 次いで、ＰＣＲが、各々について次のプロトコールを用いて使用され、先に開
示したＧｉαユニバーサルベクター内に融合のためのそれぞれの受容体配列を確
保した：ＧＰＲ２４についてのｃＤＮＡ１００ｎｇは、各プライマー（センスお
よびアンチセンス）２μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ３μｌ、１０ＸＴａｑＰｌｕｓ^TM Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎバッファー１０μｌ、ＴａｑＰｌｕｓ^TM Ｐｒｅｃｉｓｉ
ｏｎポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ：＃６００２１１）１μｌおよび水８
０μｌを含有する別々のチューブに添加された。ＴＳＨＲのための反応温度およ
びサイクル時間は次のとおりであった：初発変性段階はそれを９４℃で５分間、
そして９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；７２℃で２分間の１サイクルで実
施された。最終伸長時間は７２℃１０分間において実施された。ＰＣＲ生成物は
１％アガロースゲル上で展開され、次いで、精製された（データ未掲載）。精製
された生成物をＫＢ４およびＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）で消化し、そして所望のインサートを単離し、精製し、そしてそれぞれぼ制
限部位においてＧｉユニバーサルベクター中に連結した。ポジティブクローンが
形質転換後に単離され、そして制限酵素消化物によって決定された；Ｈｅｋ−２
９３細胞を用いる発現は下記プロトコールにしたがって達成された。ＧＰＲ２４
についての各ポジティブクローン：Ｇｉ−融合タンパク質が配列決定され、そし
て候補化合物の直接同定のために利用された（参照、核酸配列については配列番
号：５９０およびアミノ酸配列については配列番号：５９１）。

【０２０６】 ＧＰＲ２４の内因性型はＧタンパク質Ｇｉより上流に融合され、そしてヌクレ
オチド１〜１，０５９（参照、配列番号：５８８）およびアミノ酸残基１〜３５
３（参照、配列番号：５８９）に位置する。ＧＰＲ２４に関して、２アミノ酸残
基（６個のヌクレオチドと同等）は内因性（または非内因性）ＧＰＣＲとＧタン
パク質Ｇｉαの開始コドンとの間に置かれた。したがって、Ｇｉタンパク質はヌ
クレオチド１，０６６〜２，１３３（参照、配列番号：５８８）およびアミノ酸
残基３５９〜７１１（参照、配列番号：５８９）に位置する。当業者は、Ｇタン
パク質が問題のＧＰＣＲの３’末端に融合されているＧＰＣＲ融合タンパク質を
構築する技術を選ぶ能力を保証されている。

【０２０７】 Ｇｉ共役受容体、例えばＧＰＲ２４がコ・トランスフェクションアプローチと
一緒に使用できることが先に示されているが、これは、ｃＡＭＰに基づくアッセ
イに関していて、そしてｃＡＭＰレベルに及ぼすＧｉの影響によると予測される
。しかしながら、他のタイプのアッセイ、例えばＧＴＰに基づくアッセイでは、
コ・トランスフェクションアプローチは必須ではない。かくして、ＧＴＰに基づ
くアッセイのようなアッセイでは、ＧＰＣＲ融合タンパク質アプローチは、ＧＰ
Ｒ２４のＧＴＰに基づくアッセイに関してＧＰＲ２４：Ｇｉ融合タンパク質が好
適であるように、好適である。

【０２０８】 例６ プロトコール：［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳを用いる逆アゴニストおよびアゴニストの 直接同定 内因性ＧＰＣＲが候補化合物、例えば逆アゴニストの直接同定のために使用さ
れてもよいが、完全には理解されないという理由で、イントラ・アッセイ改変法
は満足できなくなった。好ましくは、次に、先に開示されたＧＰＣＲ融合タンパ
ク質が、また非内因性の構成的に活性化されるＧＰＣＲを用いて利用できる。本
発明者らは、そのようなタンパク質が使用される場合、イントラ・アッセイ改変
法は実質的に安定化されるようであり、それによって効果的なシグナル対ノイズ
比が得られることを決定できる。このことは候補化合物のより強固な同定を可能
にするという好ましい結果をもっている。かくして、直接同定ではＧＰＣＲ融合
タンパク質が使用され、そして使用される場合には、次のアッセイプロトコール
が利用されることが好ましい。

【０２０９】 １．膜の調製 関心のある非内因性の構成的に活性なＧＰＣＲ融合タンパク質を含んでいて、
そして逆アゴニストもしくは部分アゴニストとしての候補化合物の直接同定に使
用するための膜は、好ましくは次のように調製される： ａ．材料 「膜スクレープバッファー」は２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭＥＤＴＡ，
ｐＨ７．４からなり；「膜洗浄バッファー」は２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび０．１
ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４からなり；「結合バッファー」は２０ｍＭＨＥＰＥＳ
，１００ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ７．４からなる。

【０２１０】 ｂ．操作 全材料は操作をとおして氷上に維持される。最初に、培地を細胞の集密モノレ
アーから吸引し、続いて冷ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄し、続いて吸引する。その後、
膜スクレープバッファー５ｍｌを添加して細胞を剥ぎ取る；続いて細胞抽出物を
５０ｍｌ遠心管に移す（４℃において２０，０００ｒｐｍで１７分間遠心）。そ
の後、上澄液を吸引し、そしてペレットを膜洗浄バッファー３０ｍｌに再懸濁し
、そして４℃において２０，０００ｒｐｍで１７分間遠心する。次いで、上澄液
を吸引し、そしてペレットを結合バッファーに再懸濁する。次にこれをＢｒｉｎ
ｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ^TMホモジナイザーを用いてホモジナイズする（全材
料が懸濁液状になるまで１５−２０秒破壊）。ここでは、これを「膜タンパク質
」と呼ぶ。

【０２１１】 ２．Ｂｒａｄｆｏｌｄタンパク質アッセイ ホモジナイゼーション後、膜のタンパク質濃度がＢｒａｄｆｏｌｄタンパク質
アッセイを用いて決定される（タンパク質を約１．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、一定
分量に分け、そして後の使用のために凍結（−８０℃）する；凍結の場合、使用
のプロトコールは次のとおりである：アッセイ当日に、凍結膜タンパク質を室温
で解凍し、撹拌し、次いでＰｏｌｙｔｒｏｎを用いて約５−１０秒間約１２ｘ１
，０００ｒｐｍにおいてホモジナイズする；多数の調製のためには、ホモジナイ
ザーを異なる調製物のホモジナイゼーションの間に徹底的に洗浄しなければなら
ない）。

【０２１２】 ａ．材料 結合バッファー（前記のとおり）；Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎ
ｔ；Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質標準が製造者の指示にしたがって使用される（
Ｂｉｏｒａｄ，ｃａｔ．ｎｏ．５００−０００６）。

【０２１３】 ｂ．操作 １本は膜を含有し、そして１本は対照「ブランク」としての２並列のチューブ
を作成する。各々は結合バッファー８００μｌを含有する。したがって、Ｂｒａ
ｄｆｏｒｄタンパク質標準（１ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを各チューブに添加し、次
いで膜タンパク質１０μｌを１本のチューブのみに添加する（ブランクはしない
）。その後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ２００μｌを各チュー
ブに添加し、各々を撹拌する。５分後、チューブを再撹拌し、そしてその中の材
料をキュベットに移す。次いで、キュベットをＣＥＣＩＬ３０４１分光光度計を
使用して波長５９５において読み取る。

【０２１４】 ３．直接同定アッセイ ａ．材料 ＧＤＰバッファーは結合バッファー３７．５ｍｌおよびＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ，
ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ−７１２７）２ｍｇからなり、結合バッファーにおける一連の
希釈によりＧＤＰ０．２μＭを得る（各ウェル中のＧＤＰの最終濃度は０．１μ
ＭＧＤＰであった）；候補化合物を含有する各ウェルは、ＧＤＰバッファー１０
０μｌ（最終濃度、０．１μＭＧＤＰ）、結合バッファー中膜タンパク質５０μ
ｌおよび結合バッファー中［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）５０μｌ（結合バ
ッファー１０ｍｌ当たり［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ２．５μｌ）からなる最終容量２０
０μｌを有する。

【０２１５】 ｂ．操作 好ましくは、候補化合物は９６穴プレートフォーマットを用いてスクリーニン
グされる（これらは−８０℃で凍結できる）。膜タンパク質（または対照として
の、ＧＰＣＲ融合タンパク質を含まない発現ベクターを有する膜）を懸濁状態に
なるまで短時間ホモジナイズする。次いで、タンパク質濃度を上記のようにＢｒ
ａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用して決定する。次に、膜タンパク質（ま
たは対照）を結合バッファー中０．２５ｍｇ／ｍｌまで希釈する（最終アッセイ
濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、ＧＤＰバッファー１００μｌをＷａｌ
ｌａｃ Ｓｉｎｔｉｓｔｒｉｐ^TM（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに添加する。次い
で、ピン・ツールを使用して候補化合物５μｌをそのようなウェル中に移す（す
なわち、全アッセイ容量２００μｌ中５μｌは、候補化合物の最終スクリーニン
グ濃度が１０μＭであるように１：４０比である）。再び、汚染を避けるために
、各注入段階後はピン・ツールを水（１Ｘ）、エタノール（１Ｘ）および水（２
Ｘ）を含有する３種の容器中で洗浄しなければならない−過剰の液を各洗浄後ツ
ールから振り払い、そして紙およびｋｉｍｗｉｐｅｓを用いて乾かす。その後、
膜タンパク質５０μｌを各ウェルに添加し（また、ＧＰＣＲ融合タンパク質を有
しない膜を含有する対照ウェルが使用される）、そして室温で５−１０分間プレ
インキュベーションする。次いで、結合バッファー中［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．
６ｎＭ）５０μｌを各ウェルに添加し、室温で６０分間振盪機上でインキュベ−
トする（再び、この実施例では、プレートをフォイルでカバーする）。次いで、
アッセイを２２℃で１５分間４０００ＲＰＭにおけるプレートの回転によって停
止する。次に、プレートを８チャンネルのマニホルドを用いて吸引し、そしてプ
レートカバーで密閉する。次いで、プレートを「Ｐｒｏｔ，＃３７」を設定して
用いＷａｌｌａｃ１４５０において読み取る（製造者の指示にしたがって）。

【０２１６】 例７ プロトコール：確認アッセイ 独立したアッセイアプローチを使用して前記のように直接同定された候補化合
物の確認をするために、次に確認アッセイを使用するのが好適である。この場合
、好適な確認アッセイはシクラーゼに基づくアッセイである。

【０２１７】 好ましくは、改変されたＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ^TM Ａｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙ
ｃｌａｓｅ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ
．ＳＭＰ００４Ａ）が、次のようなプロトコールにしたがって、非内因性の構成
的に活性化されるＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストとして直接同
定された候補化合物の確認のために利用される。

【０２１８】 トランスフェクション細胞はトランスフェクション後約３日目に収穫される。
膜は２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４と１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含有するバッファ
ー中に懸濁した細胞のホモジナイゼーションによって調製する。ホモジナイゼー
ションはＢｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ^TMを用いて約１０秒間氷上で実施
する。得られるホモジネートを４９，０００ｘｇにおいて４℃で１５分間遠心す
る。次いで、得られるペレットを２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４および０．１
ｍＭＥＤＴＡを含有するバッファー中に再懸濁し、１０秒間ホモジナイズし、続
いて４９，０００ｘｇにおいて４℃で１５分間遠心する。得られるペレットは使
用するまで−８０℃で保存される。直接同定スクリーニングの日に、膜ペレット
が室温で徐々に融解され、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４および１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂を含有するバッファー中に再懸濁して、最終タンパク質濃度０．６０ｍｇ
／ｍｌを得る（再懸濁された膜は使用まで氷上に置かれる）。

【０２１９】 ｃＡＭＰスタンダードおよび検出バッファー（検出バッファー１１ｍｌに対し
てトレーサー［¹²⁵ＩｃＡＭＰ（１００μｌ）］２μＣｉを含有する）が調製さ
れ、そして製造者の指示にしたがって維持される。アッセイバッファーはスクリ
ーニングのために新しく調製され、そして２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、１
０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ），クレアチンホス
ホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）０．１ユニット／ｍｌ、５０μＭＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ
）および０．２ｍＭＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含有する；アッセイバッファーは使
用まで氷上で保存できる。

【０２２０】 好ましくは、前記のように同定された候補化合物（凍結している場合は室温で
融解する）は、次に膜タンパク質４０μｌ（３０μｇ／ウェル）およびアッセイ
バッファー５０μｌとともに、９６穴プレートウェルに添加される（３μｌ／ウ
ェル；１２μＭ最終アッセイ濃度）。この混合液を弱く振盪しながら室温で３０
分間インキュベートする。

【０２２１】 インキュベーション後、検出バッファー１００μｌを各ウェルに添加し、続い
て、２−２４時間インキュベートする。次に、プレートを「Ｐｒｏｔ，＃３１」
を用いてＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ^TMプレートリーダーにおいてカウン
トする（製造者の指示にしたがって）。

【０２２２】 例８ リガンドに基づく確認アッセイ 膜はトランスフェクションＨｅｋ−２９３細胞（参照、例３）から、２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳと１０ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４中でのホモジナイゼーションによっ
て調製し、そして４９，０００ｘｇで１５分間遠心する。ペレットを２０ｍＭＨ
ＥＰＥＳおよび０．１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４中に再懸濁し、Ｐｏｌｙｔｒｏ
ｎホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）を用いて５０００ｒｐｍにおいて１０秒
間ホモジナイズし、そして４９，０００ｘｇで１５分間遠心する。最終ペレット
を２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ７．４中に再懸濁し、Ｐ
ｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）を用いて５０００ｒｐｍに
おいて１０秒間ホモジナイズする。

【０２２３】 リガンドに基づく確認アッセイは９６穴プレートにおいて３並列の２００μｌ
容量において実施される。アッセイバッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび１０
ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ７．４）を使用して、膜、トリチウム化逆アゴニストおよ
び／またはアゴニストおよび受容体の内因性リガンド（非特異的結合を定義する
ために使用される）を希釈する。最終アッセイ濃度は、トリチウム化逆アゴニス
トおよび／またはアゴニスト１ｎＭ、膜タンパク質（受容体を含有する）５０μ
ｇおよび内因性リガンド１００μｍからなる。アゴニストアッセイは３７℃で１
時間インキュベートされ、一方逆アゴニストアッセイ室温で１時間インキュベー
トされる。アッセイは、Ｓｋａｔｒｏｎセルハーベスターを用いて、氷冷結合バ
ッファーによりＷａｌｌａｃ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ Ｔｙｐｅ Ｂ上での急速濾
過によって終結させる。放射能はＷａｌｌａｃ１２０５ ＢｅｔａＰｌａｔｅカ
ウンターにおいて決定される。

【０２２４】 さらに、このアプローチは、リガンド結合に及ぼす直接同定された候補化合物
のインパクトを理解するために単に使用される。当業者が評価するように、直接
同定された候補化合物がアロステリックモジュレーターであることも可能である
（すなわち、受容体の機能的活性には影響するが、受容体への結合に対して内因
性リガンドを阻害しない）。アロステリックモジュレーターは、逆アゴニスト、
部分アゴニストおよびアゴニストを含む。

【０２２５】 係属および関連特許出願を含む本特許文書をとおして引用される文献は、他に
指示されない限り、引用によって本明細書に完全に組み入れられている。技術者
の視野の内にある開示される発明の改変および延長は、前記開示および以下に示
す請求範囲内に包含される。

【０２２６】 種々の発現ベクターが、両内因性および非内因性の既知ＧＰＣＲのための使用
の目的で当業者には利用しうるが、使用されるベクターがｐＣＭＶであることが
もっとも好適である。このベクターは、特許手続きの目的のための微生物の寄託
の国際承認に関するブダペスト条約の約定の下に、１９９８年１０月１３日付け
でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（１０８０１
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２
２０９ ＵＳＡ）に寄託された。ＤＮＡはＡＴＣＣによって試験され、そして決
定された。ＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに対して次の寄託番号：ＡＴＣＣ＃２０３３５
１を指定した。

【０２２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、アデニリルシクラーゼアッセイを用いる、非内因性ＴＳＨＲ−Ａ６２
３Ｉ（「シグナルエンハンサー」）および内因性標的受容体、この場合ＧＰＲ２
４（「ＧＰＲ２４ ｗｔ」）のコ・トランスフェクションの、非内因性ＴＳＨＲ
−Ａ６２３Ｉとともにコ・トランスフェクションされた標的受容体ＧＰＲ２４の
非内因性の構成的に活性化された型（「Ｔ２５５Ｋ」、「Ｔ２５５Ｋ／Ｔ２５７
Ｒ」、「２４−ＩＣ３−ＳＳＴ２」、「Ｃ３０５Ｙ」、「Ｐ２７１Ｌ」、「Ｗ２
６９Ｃ」、「Ｗ２６９Ｆ」、「Ｗ２６９Ｌ」、「Ｆ２６５Ｉ」、「Ｉ２６１Ｑ」
、および「Ｄ１４０Ｎ」）に対する、比較解析のグラフによる結果を提供する。
このアッセイは、それぞれ、ＴＳＨおよびＭＣＨ、ＴＳＨＲおよびＧＰＲ２４に
対する内因性リガンド、の添加を必要とする。

【図２】 図２は、アデニリルシクラーゼアッセイを用いる、非内因性シグナルエンハン
サーＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ（ＴＳＨの有無において）および内因性標的受容体、
この場合ＧＰＲ５（「ＧＰＲ５ ｗｔ」）のコ・トランスフェクションの、非内
因性ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ（ＴＳＨの有無において）とともにコ・トランスフェ
クションされた非内因性の構成的に活性化される標的受容体ＧＰＲ５（「Ｖ２２
４Ｋ」）に対する、比較解析のグラフによる結果を提供する。

【図３Ａ−３Ｅ】 図３Ａ−３Ｅは、８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いる、ＣＭＶ
、非内因性の構成的に活性化されるＧＰＣＲを比較して測定されたシグナルの図
式による表示を提供する。

【図４】 図４は、ＧＰＲ２４の数種の非内因性型からのＩＰ₃産生の、この受容体の内
因性型（ｖｅｒｓｉｏｎ）と比較された図表示を提供する。

【図５】 図５は、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｋ：融合タンパク質および対照ベクター（ｐＣＭ
Ｖ）の構成的シグナル伝達についての比較成績を提供する、膜に基づくサイクリ
ックＡＭＰアッセイの結果のグラフ表示である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リン，イ−リン アメリカ合衆国カリフオルニア州92126サ ンデイエゴ・ゴールドコーストドライブ 8291−７ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB10 BB46 BB48 BB50 BB51 DA13 DA36 FB08 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ22 QQ33 QQ41 QQ61 QQ63 QQ89 QQ91 QR48 QR77 QR80 QS36

Claims (102)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 膜貫通−６領域と細胞内領域を含有する既知Ｇタンパク質−
   共役受容体の非内因性の構成的に活性化された型に対する、逆アゴニスト、平行
   （ｐａｒａｌｌｅｌ）アゴニストおよび部分アゴニストからなる群から選ばれる
   活性を有する化合物としての非内因性化合物を直接同定する方法であって、 （ａ）配列番号：４２５； 配列番号：４２７；配列番号：４２９；配列番号：４３１；配列番号：４３３；
   配列番号：４３５；配列番号：４３７；配列番号：４３９；配列番号：４４１；
   配列番号：４４３；配列番号：４４５；配列番号：４４７；配列番号：４４９；
   配列番号：４５１；配列番号：４５３；配列番号：４５５；配列番号：４５７；
   配列番号：４５９；配列番号：４６１；配列番号：４６３；配列番号：４６５；
   配列番号：４６７；配列番号：４６９；配列番号：４７１；配列番号：４７３；
   配列番号：４７５；配列番号：４７７；配列番号：４７９；配列番号：４８１；
   配列番号：４８３；配列番号：４８５；配列番号：４８７；配列番号：４８９；
   配列番号：４９１；配列番号：４９３；配列番号：４９５；配列番号：４９７；
   配列番号：４９９；配列番号：５０１；配列番号：５０３；配列番号：５０５；
   配列番号：５０７；配列番号：３４７；配列番号：５０９；配列番号：３５１；
   配列番号：３５５；配列番号：３５９；配列番号：３６３；配列番号：３６７；
   配列番号：３７１；配列番号：３７５；配列番号：３７９；配列番号：３８３；
   配列番号：３８７；配列番号：３９１；配列番号：５１１；配列番号：５１３；
   配列番号：５１５；配列番号：５１７；配列番号：５１９；配列番号：５２１；
   配列番号：５２３；配列番号：５２５；配列番号：５２７；配列番号：５２９；
   配列番号：５３１；配列番号：５３３；配列番号：５３５；配列番号：５３７；
   配列番号：５３９；配列番号：５４１；配列番号：５４３；配列番号：５４５；
   配列番号：５４７；配列番号：５４９；配列番号：５５１；配列番号：５５３；
   配列番号：５５５；配列番号：５５７；配列番号：５５９；配列番号：５６１；
   配列番号：５６３；配列番号：５６５；配列番号：５６７；配列番号：５６９；
   配列番号：５７１；配列番号：５７３；配列番号：５７５；配列番号：５７７；
   配列番号：３９５；配列番号：３９９；配列番号：４０３；配列番号：４０７；
   配列番号：４１１；配列番号：４１５；配列番号：４１９；配列番号：４２３；
   配列番号：５７９；および配列番号：５８１： からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する既知ＧＰＣＲの非内因性型を選択
   し； （ｂ）段階（ａ）の選択された非内因性ＧＰＣＲが構成的に活性であることを確
   認し； （ｃ）非内因性候補化合物を段階（ｂ）の非内因性の構成的に活性化されたＧＰ
   ＣＲと接触させ；そして （ｄ）逆アゴニストとしての逆アゴニスト活性またはアゴニスト活性を有する該
   非内因性化合物が、段階（ｂ）の該受容体に対するアゴニストであるか否かを、
   該接触させた受容体における化合物の効力の測定によって決定する： 段階を含む方法。
2. 【請求項２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４２５の配列を
   有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４２７の配列を
   有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
4. 【請求項４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４２９の配列を
   有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
5. 【請求項５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４３１の配列を
   有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
6. 【請求項６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４３３の配列を
   有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
7. 【請求項７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４３５の配列を
   有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
8. 【請求項８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４３７の配列を
   有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
9. 【請求項９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４３９の配列を
   有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
10. 【請求項１０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４４１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
11. 【請求項１１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４４３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
12. 【請求項１２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４４５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
13. 【請求項１３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４４７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
14. 【請求項１４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４４９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
15. 【請求項１５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４５１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
16. 【請求項１６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４５３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
17. 【請求項１７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４５５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
18. 【請求項１８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４５７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
19. 【請求項１９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４５９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
20. 【請求項２０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４６１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
21. 【請求項２１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４６３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
22. 【請求項２２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４６５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
23. 【請求項２３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４６７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
24. 【請求項２４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４６９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
25. 【請求項２５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４７１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
26. 【請求項２６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４７３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
27. 【請求項２７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４７５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
28. 【請求項２８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４７７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
29. 【請求項２９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４７９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
30. 【請求項３０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４８１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
31. 【請求項３１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４８３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
32. 【請求項３２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４８５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
33. 【請求項３３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４８７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
34. 【請求項３４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４８９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
35. 【請求項３５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４９１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
36. 【請求項３６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４９３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
37. 【請求項３７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４９５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
38. 【請求項３８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４９７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
39. 【請求項３９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４９９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
40. 【請求項４０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５０１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
41. 【請求項４１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５０３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
42. 【請求項４２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５０５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
43. 【請求項４３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５０７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
44. 【請求項４４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３４７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
45. 【請求項４５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５０９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
46. 【請求項４６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３５１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
47. 【請求項４７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３５５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
48. 【請求項４８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３５９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
49. 【請求項４９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３６１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
50. 【請求項５０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３６７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
51. 【請求項５１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３７１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
52. 【請求項５２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３７５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
53. 【請求項５３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３７９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
54. 【請求項５４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３８３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
55. 【請求項５５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３８７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
56. 【請求項５６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３９１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
57. 【請求項５７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５１１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
58. 【請求項５８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５１３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
59. 【請求項５９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５１５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
60. 【請求項６０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５１７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
61. 【請求項６１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５１９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
62. 【請求項６２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５２１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
63. 【請求項６３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５２３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
64. 【請求項６４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５２５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
65. 【請求項６５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５２７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
66. 【請求項６６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５２９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
67. 【請求項６７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５３１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
68. 【請求項６８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５３３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
69. 【請求項６９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５３５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
70. 【請求項７０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５３７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
71. 【請求項７１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５３９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
72. 【請求項７２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５４１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
73. 【請求項７３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５４３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
74. 【請求項７４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５４５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
75. 【請求項７５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５４７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
76. 【請求項７６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５４９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
77. 【請求項７７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５５１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
78. 【請求項７８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５５３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
79. 【請求項７９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５５５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
80. 【請求項８０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５５７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
81. 【請求項８１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５５９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
82. 【請求項８２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５６１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
83. 【請求項８３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５６３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
84. 【請求項８４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５６５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
85. 【請求項８５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５６７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
86. 【請求項８６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５６９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
87. 【請求項８７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５７１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
88. 【請求項８８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５７３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
89. 【請求項８９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５７５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
90. 【請求項９０】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５７７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
91. 【請求項９１】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３９５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
92. 【請求項９２】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：３９９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
93. 【請求項９３】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４０３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
94. 【請求項９４】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４０７の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
95. 【請求項９５】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４１１の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
96. 【請求項９６】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４１５の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
97. 【請求項９７】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４１９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
98. 【請求項９８】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：４２３の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
99. 【請求項９９】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５７９の配列
    を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
100. 【請求項１００】 段階（ｂ）の非内因性ＧＰＣＲが配列番号：５８１の配
     列を有するアミノ酸配列である、請求項１の方法。
101. 【請求項１０１】 次の段階： 内因性リガンドに基づくアッセイを用いることによって、段階（ａ）の該既知Ｇ
     ＰＣＲの非内因性型の既知ＧＰＣＲ型に対する内因性リガンドの、該既知ＧＰＣ
     Ｒとの結合における、段階（ｄ）の非内因性化合物のインパクトを評価すること
     をさらに含む、請求項１の方法。
102. 【請求項１０２】 該非内因性化合物が、該既知ＧＰＣＲのアロステリック
     モジュレーターである、請求項１０１の方法。