JP4672866B2 - 非内因性の構成的に活性化されたヒトｇタンパク質共役受容体 - Google Patents

Description

【０００１】
1998年10月13日に出願された共通して所有する米国第09/170,496号、1997年4月14日に出願された米国第08/839,449号（現在放棄された）、1998年4月14日に出願された米国第09/060,188号；1998年6月26日に出願された米国仮出願第60/090,783号；及び1998年8月7日に出願された米国仮出願第60/095,677号の利益は本明細書により請求される。前述の出願の各々は引用することによりそれらの全部が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本特許書類において開示する本発明は膜貫通受容体、より詳細には、改変したヒトGタンパク質共役受容体(GPCR)が構成的に活性化されるように改変されているGPCRに関する。最も好ましくは、改変したヒトGPCRを治療化合物のスクリーニングに用いる。
【０００３】
発明の背景
多数の受容体クラスがヒトにおいて存在するが、明らかに最も豊富で且つ治療的に関係のあるのはGタンパク質共役受容体（GPCRまたはGPCRs）クラスにより代表される。ヒトゲノム内にはおよそ100,000個の遺伝子があると概算され、これらのうち約2％、すなわち2,000個の遺伝子がGPCRをコードすると見積もられる。これらの中に、GPCRに結合する内因性リガンドが同定されている約100個のGPCRがある。内因性GPCR及びその内因性リガンドの発見の間に存在する著しい時間的ずれのために、残りの1,900個のGPCRは、これらの受容体の内因性リガンドが同定されるずっと前に同定され、特性化されると推定することができる。実際、ヒトゲノムプロジェクトが100,000個のヒト遺伝子をシークエンスしている迅速さは、残りのヒトGPCRが次の数年以内に完全にシークエンスされることを示す。それにもかかわらず、そしてヒトゲノムをシークエンスする努力にもかかわらず、ヒト症状を改善し、良くするために科学者等がどのようにこの情報を迅速に、効果的に且つ効率よく利用することができるかに関してまだ非常に不明瞭である。本発明はこの重要な目的に適合する。
【０００４】
GPCRを包含する、内因性リガンドが同定されている受容体は「既知の」受容体と呼ばれ、一方、内因性リガンドが同定されていない受容体は「オーファン」受容体と呼ばれる。この区別は、特にGPCRの場合、単に語義ではない。GPCRは製薬学的製品の開発のための重要な分野であり：100個の既知のGPCRのうち約20個から、全ての処方製薬の60％が開発されている。従って、オーファンGPCRは製薬産業にとって、19世紀末期に金がカリフォルニアにとってそうであったこと-成長、拡張、拡大及び発展を導く機会である。しかしながら、新規な治療法の開発に関してオーファン受容体には重大な欠点が存在する。これは、製薬の発見及び開発への伝統的な方法が受容体及びその内因性リガンドの両方の入手を必要としているからである。従って、これまで、オーファンGPCRは製薬の発見のための興味をかき立てる未開発の供給源を当該技術分野に示している。
【０００５】
可能性がある治療法の発見への伝統的な方法では、一般に受容体が最初に同定されると言える。薬剤発見努力を開始できる前に、典型的には、該受容体の内因性リガンドを同定し、単離し、作製するために複雑で、多くの時間を必要とし且つ費用のかかる手続きが行われ（put into place）、この手続きは受容体当たり約500万ドル（U.S.）の費用で受容体当たり３〜10年を必要とする可能性がある。これらの時間及び財源は、薬剤発見への伝統的方法が開始できる前に使い果たされるはずである。これは、伝統的な薬剤発見技術が、内在性リガンドが受容体に結合するのを妨げる化合物（「アンタゴニスト」）または受容体に結合するリガンドの作用を高めるかもしくは模倣する化合物（「アゴニスト」）のいずれかを発見しようと努力して推定の治療因子が受容体に対して「スクリーニングされる」、いわゆる「競合結合アッセイ」に依存するからである。全体的な目的は、リガンドが受容体に結合した場合に細胞活性化を妨げる化合物（アンタゴニスト）またはリガンドが受容体と正しく結合している場合にそうでなければ生じる細胞活性を高めるかもしくは上げる化合物（アゴニスト）を同定することである。オーファンGPCRの内因性リガンドは自明のこととして同定されていないので、伝統的な薬剤発見技術を用いてこれらの受容体に対する新規で且つ独特な治療法を発見できることはあり得ない。本発明は、以下にさらに詳細に記述するように、そのような伝統的な薬剤発見技術によりもたらされるこれら及び他の深刻な制約を克服する。
【０００６】
GPCRは共通の構造モチーフを共有する。これらの受容体は全て、７個のαヘリックスを形成する22〜24個の間の疎水性アミノ酸の7配列を有し、それらの各々は膜にまたがる（各スパンは番号により同定される、すなわち、膜貫通-1（TM-1）、膜貫通-2（TM-2）等）。これらの膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外側、すなわち「細胞外」側で膜貫通-2と膜貫通-3、膜貫通-4と膜貫通-5、そして膜貫通-6と膜貫通-7の間でアミノ酸の鎖により連結されている（これらはそれぞれ「細胞外」領域１、２及び３（EC-1、EC-2及びEC-3）と呼ばれる）。膜貫通ヘリックスはまた、細胞膜の内側、すなわち「細胞内」側で膜貫通-1と膜貫通-2、膜貫通-3と膜貫通-4、そして膜貫通-5と膜貫通-6の間でアミノ酸の鎖により連結されている（これらはそれぞれ「細胞内」領域１、２及び３（IC-1、IC-2及びIC-3）と呼ばれる）。受容体の「カルボキシ」（「C」）末端は細胞内の細胞内空間にあり、そして受容体の「アミノ」（「N」）末端は細胞の外側の細胞外空間にある。Gタンパク質共役受容体の一般構造を図１に示す。
【０００７】
一般に、内因性リガンドが受容体と結合すると（多くの場合、受容体の「活性化」と呼ばれる）、細胞内領域の構造の変化があり、これは細胞内領域と細胞内「Gタンパク質」間の共役を与える。他のGタンパク質も存在するが、現在、Gq、Gs、Gi及びGoが同定されているGタンパク質である。内因性リガンドにより活性化されたGタンパク質と共役するGPCRは、シグナリングカスケードプロセスを開始する（「シグナル伝達」と呼ばれる）。通常の条件下で、シグナル伝達は最終的に細胞活性化または細胞阻害をもたらす。受容体のIC-3ループ並びにカルボキシ末端がGタンパク質と相互作用すると考えられる。本発明の主要な焦点は、GPCRの膜貫通-6(TM6)領域及び細胞内-3(IC3)領域に向けられる。
【０００８】
生理的条件下で、GPCRは２つの異なる構造：「不活性」状態及び「活性」状態間で平衡を保って細胞膜中に存在する。図２に図式的に示すように、不活性状態の受容体は、細胞内シグナリング伝達経路に連結して生物学的応答を引き起こすことができない。受容体構造を活性状態に変えることにより（Gタンパク質を介して）伝達経路に連結され、生物学的応答を引き起こす。
【０００９】
受容体は、内因性リガンドまたは薬剤のような化合物により活性状態に安定させることができる。受容体のアミノ酸配列に対する改変を包含するがこれだけに限定されるものではない最近の発見は、活性状態構造の受容体を増進し安定させるために内因性リガンドまたは薬剤以外の手段を提供する。これらの手段は、受容体に結合する内因性リガンドの作用をまねることにより活性状態の受容体を効果的に安定させる。そのようなリガンドに依存しない手段による安定化は、「構成的受容体活性化」と呼ばれる。
【００１０】
上述のように、スクリーニング目的のためのオーファン受容体の使用はあり得なかった。これは、化合物のスクリーニングに関する伝統的な「原則」が、受容体のリガンドが既知であることを要求するからである。従って、自明のこととして、この方法はオーファン受容体に関して適用性がない。従って、治療法の発見へのこの独断的な方法に固執することにより、当該技術分野は、本質的に、受容体の内因性リガンドが発見されるまでオーファン受容体の使用をやめるように教示し且つ教示されてきた。概算して2,000個のGタンパク質共役受容体があり、これらの大多数がオーファン受容体であることを考えれば、そのような原則は、治療法の発見への独創的で独特な異なる方法を訂正する。
【００１１】
様々なGPCRの核酸及び／またはアミノ酸配列に関する情報を以下の表Aに要約する。本明細書において開示する本発明の重要な焦点はオーファンGPCRに向けられるので、以下に記載する参考文献の多くはオーファンGPCRに関連する。しかしながら、この表は、本明細書において開示する本発明がオーファンGPCRまたは以下に記載する特定のGPCRにのみ適用できることを意味するものではなく、またこの表は、法的にせよそうでないにせよ、そのように解釈されるべきではない。さらに、単離されているある種の受容体は公開自体の主題ではなく；例えば、GPCRを載せている「ワールド-ワイドウエッブ（world-wide web）」上のGタンパク質共役受容体データベース（指定された発明者も譲受人もこのサイトといかなる関係もない）を参照する。他のGPCRは本譲受人により所有される特許出願の主題であり、これらは以下に記載されていない（GPR3、GPR6及びGPR12を包含する；米国仮第60/094879号を参照）。
【００１２】
【表１】

【００１３】
以下にさらに詳細に記述し、開示するように、ヒトGPCRの内因性配列を改変するための突然変異カセットの利用により、ヒトGPCRの構成的に活性化されたバージョンがもたらされる。ヒトGPCRのこれらの非内因性の構成的に活性化されたバージョンは、とりわけ、例えば治療関連性の化合物を直接同定するための候補化合物のスクリーニングに利用することができる。
【００１４】
発明の要約
本明細書において開示するのは、GPCRの膜貫通-6（TM6）及び細胞内ループ-3（IC3）領域を横切る（ａ）最も好ましいアミノ酸配列領域として（C末端〜N末端の向き）、そして/または（ｂ）最も好ましい核酸配列領域として（3'〜5'の向き）：
（ａ）P¹AA₁₅X
ここで：
（１）P¹はGPCRのTM6領域内に位置するアミノ酸残基であり、ここで、P¹は（ｉ）内因性GPCRのプロリン残基及び（ii）プロリン以外の非内因性アミノ酸残基よりなる群から選択される；
（２）AA₁₅は（ａ）内因性GPCRのアミノ酸、（ｂ）非内因性アミノ酸残基並びに（ｃ）内因性GPCRのアミノ酸及び非内因性アミノ酸の組み合わせよりなる群から選択される15個のアミノ酸であり、ただし、GPCRのTM6領域内に位置する15個の内因性アミノ酸残基のいずれもプロリンでない；そして
（３）Xは該GPCRのIC3領域内に位置する非内因性アミノ酸残基であり、好ましくはリシン、ヒスチジン及びアルギニンよりなる群から選択され、最も好ましくはリシンであり、ただし、位置Xの内因性アミノ酸がリシンである場合には、Xはリシン以外のアミノ酸、好ましくはアラニンである
及び/または
（ｂ）P^codon (AA-codon)₁₅ X_codon
ここで：
（１）P^codonはGPCRのTM6領域内の核酸配列であり、ここで、P^codonは（ｉ）内因性GPCRのプロリン残基及び（ii）プロリン以外の非内因性アミノ酸残基よりなる群から選択されるアミノ酸をコードする；
（２）(AA-codon)₁₅は（ａ）内因性GPCRのアミノ酸、（ｂ）非内因性アミノ酸残基並びに（ｃ）内因性GPCRのアミノ酸及び非内因性アミノ酸の組み合わせよりなる群から選択される15個のアミノ酸をコードする15個のコドンであり、ただし、GPCRのTM6領域内の15個の内因性コドンのいずれもプロリンアミノ酸残基をコードしない；そして
（３）X_codonは該GPCRのIC3領域内に位置する領域残基をコードする核酸であり、ここで、X_codonは非内因性アミノ酸、好ましくは、リシン、ヒスチジン及びアルギニンよりなる群から選択される非内因性アミノ酸、最も好ましくはリシンでをコードし、ただし、位置X_codonの内因性コード領域がアミノ酸リシンをコードする場合には、X_codonはリシン以外のアミノ酸、好ましくはアラニンをコードする
を含んでなる非内因性のヒトGタンパク質共役受容体である。
これらの配列カセットに関連する内因性及び非内因性という用語は、内因性GPCRに関してである。例えば、いったん内因性プロリン残基が特定のGPCRのTM6領域内に位置決定され、それから16番目のアミノ酸が受容体を構成的に活性化する突然変異のために同定されると、プロリン残基が突然変異されないことが最も好ましいが、この内因性のプロリン残基を突然変異させることもまた可能である（すなわち、いったんマーカーが位置決定され、そして突然変異させる16番目のアミノ酸が同定されると、マーカー自体を突然変異させることができる）。同様に、AA₁₅はそれらの内因性形態で保たれることが最も好ましいが、これらのアミノ酸もまた突然変異させることができる。ヒトGPCRの非内因性バージョンにおいて突然変異させなければならない唯一のアミノ酸はXであり、すなわち、本明細書においてさらに開示するように、P¹から16残基である内因性アミノ酸はその内因性形態で保つことができず、突然変異させなければならない。再び言明すると、ヒトGPCRの非内因性バージョンにおいて、P¹及びAA₁₅はそれらの内因性形態のままである（すなわち、それらの野性型形態と同一である）ことが好ましいが、いったんXが同定され、突然変異されると、P¹及びAA₁₅のいずれか及び/または全てを突然変異させることができる。これは核酸配列にも同様に当てはまる。位置Xの内因性アミノ酸がリシンである場合、そのようなGPCRの非内因性バージョンにおいて、Xはリシン以外のアミノ酸、好ましくはアラニンである。
【００１５】
従って、仮定の例として、内因性GPCRが上記の位置で以下の内因性アミノ酸配列：P-AACCTTGGRRRDDDE-Q を有する場合、以下の代表的な仮定のカセットはいずれも本開示の範囲内に入る（非内因性アミノ酸をボールド体で記述する）：
Ｐ−ＡＡＣＣＴＴＧＧＲＲＲＤＤＤＥ−Ｋ
Ｐ−ＡＡＣＣＴＴＨＩＧＲＲＤＤＤＥ−Ｋ
Ｐ−ＡＤＥＥＴＴＧＧＲＲＲＤＤＤＥ−Ａ
Ｐ−ＬＬＫＦＭＳＴＷＺＬＶＡＡＰＱ−Ｋ
Ａ−ＬＬＫＦＭＳＴＷＺＬＶＡＡＰＱ−Ｋ
AA₁₅内にアミノ酸残基を付加することもまた可能であるが、そのような方法は特に提示されない。実際、最も好ましい態様として、ヒトGPCRの内因性バージョンと比較した場合にそのGPCRの非内因性バージョンにおいて異なる唯一のアミノ酸は位置Xのアミノ酸であり；このアミノ酸自体の突然変異が受容体の構成的活性化を導く。
【００１６】
従って、特に好ましい態様として、P¹及びP^codonはそれぞれ内因性プロリン及びプロリンをコードする内因性核酸コード領域であり；そしてX及びX_codonはそれぞれ非内因性のリシンまたはアラニン及びリシンまたはアラニンをコードする非内因性核酸コード領域であり、リシンが最も好ましい。これらの突然変異を含むヒトGPCRの非内因性バージョンは哺乳類細胞中に取り込まれ、候補化合物のスクリーニングに利用されることが最も好ましいので、突然変異を含む非内因性ヒトGPCRはそれ自体精製され、単離される必要はない（すなわち、これらは哺乳類細胞の細胞膜内に含まれる）が、そのような精製され、単離された非内因性ヒトGPCRは本開示の十分に範囲内である。非内因性ヒトGPCRを含む遺伝子ターゲッティングした及びトランスジェニックの非ヒト哺乳類（好ましくはラット及びマウス）もまた本発明の範囲内であり；特に、遺伝子ターゲッティングした哺乳類は、これらの動物が非ヒト哺乳類の内因性GPCRをコードする領域の代わりにヒトGPCRの非内因性バージョンを含む点で最も好ましい（非ヒト哺乳類のタンパク質コード領域をヒトコード領域で置き換えるためにそのような非ヒト哺乳類を作製する技術は周知である；例えば米国特許第5,777,194号を参照）。
【００１７】
内因性ヒトGPCRに対するこれらの変異はGPCRを構成的に活性にし、その結果、本明細書においてさらに開示するように、ヒトGPCRの非内因性の構成的に活性化されたバージョンを、とりわけ、内因性リガンドの必要なしに候補化合物の直接スクリーニングに利用できることが発見された。従って、これらの材料を用いる方法及びこれらの方法により同定される生成物もまた以下の開示の範囲内である。
【００１８】
詳細な記述
受容体に関して出ている科学文献は、受容体に対して様々な作用を有するリガンドを表すために多数の用語を採用している。明瞭化及び一貫性のために、以下の定義を本特許書類の全体にわたって用いる。これらの定義がこれらの用語の他の定義と矛盾するのであれば、以下の定義が支配するものとする：
アゴニストは、受容体に結合すると細胞内応答を活性化するかまたは膜へのGTP結合を高める化合物を意味するものとする。
【００１９】
本明細書において用いるアミノ酸省略形を以下に示す。
【００２０】
【表２】

【００２１】
部分アゴニストは、受容体に結合すると細胞内応答をアゴニストより少ない度合い/程度に活性化するかまたは膜へのGTP結合をアゴニストより少ない度合い/程度に高める化合物を意味するものとする。
【００２２】
アゴニストは、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合するが、受容体の活性形態により開始される細胞内応答を活性化せず、それによりアゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内応答を阻害することができる化合物を意味するものとする。アンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下での基準細胞内応答を減少させない。
【００２３】
候補化合物は、スクリーニング技術が容易にできる分子を意味するものとする（例えば、限定ではなく、化学化合物）。好ましくは、「候補化合物」という語句には、間接的同定方法により以前に決定されたような、受容体に対する逆アゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストよりなる群から選択される化合物であることが公的に既知であった化合物（「間接的に同定された化合物」）は包含されず；より好ましくは、少なくとも１つの哺乳類において治療効能を有することが以前に決定されている間接的に同定された化合物は包含されず；そして最も好ましくは、ヒトにおいて治療有用性を有することが以前に決定されている間接的に同定された化合物は包含されない。
【００２４】
コドンは、一般にリン酸基に結合したヌクレオシド（アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)及びチミジン(T)）を含んでなり、翻訳された場合にアミノ酸をコードする3個のヌクレオチド（またはヌクレオチドの同等物）のグループを意味するものとする。
【００２５】
化合物効能は、受容体結合親和性とは対照的に、受容体機能性を阻害するかまたは刺激する化合物の能力の測定を意味するものとする。化合物効能を検出する好ましい手段は、本特許書類の実施例の節においてさらに開示するように、例えば［³⁵S］GTPγS結合の測定による。
【００２６】
構成的に活性化された受容体は、構成的受容体活性化を受ける受容体を意味するものとする。本明細書において開示する本発明では、非内因性の構成的に活性化されたヒトGタンパク質共役受容体は、以下にさらに詳細に記述するように、アミノ酸カセットP¹AA₁₅Xを含むように突然変異されているものである。
【００２７】
構成的受容体活性化は、受容体の内因性リガンドまたはその化学的同等物と受容体との結合以外の手段による活性状態の受容体の安定化を意味するものとする。好ましくは、本明細書において開示する本発明の構成的受容体活性化を受けたGタンパク質共役受容体は、そのGPCRの内因性形態と比較した場合に構成的活性化に関して測定したシグナルに対する応答の少なくとも10％の差（場合によって、増加または減少）、より好ましくは、そのような比較応答の約25％の差、最も好ましくはそのような比較応答の約50％の差を示す。候補化合物を直接同定する目的のために用いる場合、選択した候補化合物間を区別するために十分な差が内因性シグナルと非内因性シグナル間であるようにシグナルの差が少なくとも約50％であることが最も好ましい。大部分の場合において、「差」はシグナルの増加であるが；しかしながら、Gs共役GPCRに関しては、以下にさらに詳細に記述するように、測定される「差」は好ましくは減少である。
【００２８】
接触または接触するは、インビトロ系にせよインビボ系にせよ、少なくとも２つの成分を一緒にすることを意味するものとする。
【００２９】
「候補化合物」という語句に関連して、直接同定するまたは直接同定されたは、構成的に活性化されたGタンパク質共役受容体に対する候補化合物のスクリーニング及びそのような化合物の化合物効能を評価することを意味するものとする。この語句は、いかなる状況下でも、「間接的に同定する」または「間接的に同定された」という語句により包含されるかまたはそれを包含すると解釈されるかまたは理解されるべきではない。
【００３０】
内因性のは、種のゲノムにより生来生産される物質を意味するものとする。例えば、限定ではなく、GPCRに関して内因性のは、ヒト、昆虫、植物、細菌またはウイルスにより生来生産されるものを意味するものとする。それに反して、これに関連して非内因性のという用語は、種のゲノムにより生来生産されないものを意味するものとする。例えば、限定ではなく、最も好ましくは、内因性形態では構成的に活性でないが、本明細書において開示するカセットを用いることにより突然変異させると、その後、構成的に活性になる受容体が、本明細書において「非内因性の構成的に活性化された受容体」と呼ばれる。両方の用語を「インビボ」及び「インビトロ」系の両方を表すために利用することができる。例えば、限定ではなく、スクリーニング方法において、内因性または非内因性受容体は、受容体が哺乳類細胞の細胞表面上に発現されるインビトロスクリーニング系に関してであることができる。さらなる例として、限定ではなく、哺乳類のゲノムが非内因性の構成的に活性化された受容体を含むように操作されている場合、インビボ系の手段による候補化合物のスクリーニングが実行可能である。
【００３１】
宿主細胞は、その中にプラスミド及び／またはベクターを含むことができる細胞を意味するものとする。原核生物宿主細胞の場合、プラスミドは典型的に宿主細胞が複製する場合に自律的分子として複製され（一般に、プラスミドは真核生物宿主細胞中への導入のためにその後単離される）；真核生物宿主細胞の場合、プラスミドは、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミドが複製するように宿主細胞の細胞DNA中に組込まれる。好ましくは、本明細書において開示する本発明の目的のために、宿主細胞は真核生物の、より好ましくは哺乳類のであり、最も好ましきは293、293T及びCOS-7細胞よりなる群から選択される。
【００３２】
間接的に同定するまたは間接的に同定されたは、内因性受容体に特異的な内因性リガンドの同定、リガンド-受容体相互作用を妨げるもの及び／またはそれと競合するものを決定するための受容体に対する候補化合物のスクリーニング並びに活性化された受容体と関連する少なくとも１つの第二メッセンジャー経路に影響を及ぼすことに関して化合物の効能を評価することを含む薬剤発見プロセスへの伝統的な方法を意味する。
【００３３】
「応答」という用語に関連して阻害するまたは阻害しているは、化合物の非存在下とは対照的に化合物の存在下で応答が減少されるかまたは妨げられることを意味するものとする。
【００３４】
逆アゴニストは、受容体の内因性形態または受容体の構成的に活性化された形態のいずれかに結合し、受容体の活性形態により開始される基準細胞内応答をアゴニストもしくは部分アゴニストの非存在下で認められる活性の通常基礎レベル未満に阻害するかまたは膜へのGTP結合を減少させる化合物を意味するものとする。好ましくは、基準細胞内応答は、逆アゴニストの非存在下での基準応答と比較した場合に、逆アゴニストの存在下で少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも75％阻害される。
【００３５】
既知の受容体は、その受容体に特異的な内因性リガンドが同定されている内因性受容体を意味するものとする。
【００３６】
リガンドは、内因性の天然に存在する受容体に特異的な内因性の天然に存在する分子を意味するものとする。
【００３７】
内因性受容体の核酸及び／またはアミノ酸配列に関する突然変異体または突然変異は、内因性の構成的に活性化されていない受容体の突然変異形態が受容体の構成的活性化を示すような、そのような内因性配列に対する特定の１つの変異または複数の変異を意味するものとする。特定の配列の同等物に関して、（ａ）受容体の次に突然変異させた形態の構成的活性化のレベルが受容体の第一の突然変異により示されるものと実質的に同じである場合；そして（ｂ）受容体の次に突然変異させた形態と受容体の第一の突然変異の間の配列（アミノ酸及び／または核酸）相同性％が少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも95％である場合、ヒト受容体の次に突然変異させた形態はヒト受容体の第一の突然変異と同等であると考えられる。理想的には、そして構成的活性化を行うために本明細書において開示する最も好ましいカセットはGPCRの内因性及び非内因性形態間で単一のアミノ酸及び／またはコドン変異（すなわち、XまたはX_codon）を含むということのために、配列相同性％は少なくとも98％であるはずである。
【００３８】
オーファン受容体は、その受容体に特異的な内因性リガンドが同定されていないかまたは既知でない内因性受容体を意味するものとする。
【００３９】
製薬学的組成物は、少なくとも１つの有効成分を含んでなる組成物を意味するものとし、それにより組成物は哺乳類（例えば、限定ではなくヒト）における特定の有効な結果に関して容易に調べることができる。当業者は、当業者の必要性に基づいて有効成分が所望する有効な結果を有するかどうかを決定するために適当な技術を理解し、認識する。
【００４０】
プラスミドは、ベクターとcDNAの組み合わせを意味するものとする。一般に、プラスミドは、複製及び／またはタンパク質としてのcDNAの発現の目的のために宿主細胞中に導入される。
【００４１】
「応答」という用語に関連して、刺激するまたは刺激しているは、化合物の非存在下とは対照的に化合物の存在下で応答が増加されることを意味するものとする。
【００４２】
特定の核酸配列または特定のアミノ酸配列のいずれかに関して、横切るまたは横切っているは、該配列が少なくとも２つの異なる特定の領域内に位置することを意味するものとする。例えば、10個の成分のうち3個がGPCRのTM6領域中であり、そして残りの7個の成分がGPCRのIC3領域中である、10アミノ酸成分の長さであるアミノ酸配列において、この10アミノ酸成分はGPCRのTM6及びIC3領域を横切ると記述することができる。
【００４３】
ｃDNAに関連するベクターは、少なくとも１つのcDNAを含むことができ且つ宿主細胞中に取り込むことができる環状DNAを意味するものとする。
【００４４】
以下の節の順序は表象的効率のために記述され、以下の開示または請求に対する限定として意図されず、また解釈されるべきではない。
Ａ．概論
受容体の伝統的研究は、いつも、受容体に作用することができるアンタゴニスト及び他の分子を発見により次に見出すことができるより前にまず内因性リガンドが同定されなければならないという（歴史的に基づく）前提から生じている。アンタゴニストが最初に既知である可能性がある場合でさえ、探索はすぐに内因性リガンドを探すことに及ぶ。この考え方は、構成的に活性化された受容体の発見後でさえ受容体研究において存続している。これまで認識されていないことは、受容体のアゴニスト、部分アゴニスト及び逆アゴニストを見出すために最も有用であるのは受容体の活性状態であるということである。過度に活性である受容体または不十分に活性である受容体に起因する疾病に対して、治療薬において所望されるものは、それぞれ、受容体の活性状態を減らすかまたは受容体の活性を高めるように作用する化合物であり、必ずしも内因性リガンドに対するアンタゴニストである薬剤ではない。これは、活性のある受容体状態の活性を減らすまたは高める化合物は内因性リガンドと同じ部位で結合する必要がないからである。従って、本発明の方法により教示されるように、治療化合物のあらゆる探索は、リガンドに依存しない活性状態に対して化合物をスクリーニングすることにより出発するはずである。
【００４５】
非内因性の構成的に活性化されたGPCRに対して候補化合物をスクリーニングすることにより、受容体の内因性リガンドのいかなる事前の知識または使用も必要とせずに、これらの細胞表面受容体で作用する候補化合物を直接同定することができる。そのようなGPCRの内因性バージョンが発現される及び／または過剰に発現される体内の領域を決定することにより、これらの受容体の発現及び／または過剰発現と関係する関連疾病／疾患状態を決定することが可能であり；そのような方法を本特許書類において開示する。
Ｂ．疾病／疾患の同定及び／または選択
最も好ましくは、本発明の材料を用いて非内因性の構成的に活性化されたGPCRに対する逆アゴニストを同定することができる。そのような逆アゴニストは、これらの受容体に関連する疾病を処置するための薬剤発見プログラムにおける先導化合物（lead compound）として理想的な候補である。これらの受容体に対する逆アゴニスト、部分アゴニストまたはアゴニストを直接同定することができ、それにより製薬学的組成物を開発することができるので、これらの受容体と関連する疾病及び疾患の検索が可能である。例えば、これらの受容体の存在に関して罹病及び正常組織サンプルの両方を詳しく調べることは、今や学究的試行またはオーファン受容体の場合には内因性リガンドを同定する道筋に沿って実施されるかもしれないもの以上になる。組織精査は、広範囲の健康な組織及び罹患組織にわたって実施することができる。そのような組織精査は、疾病及び／または疾患と特定の受容体とを結び付けることにおける好ましい第一段階を与える。
【００４６】
好ましくは、組織サンプルにおけるGPCRの発現の放射性標識したcDNAまたはRT-PCR同定のいずれかのプローブを作製するために内因性GPCRのDNA配列を用いる。好ましくは、罹病組織における受容体の存在または正常組織と比較して罹病組織における増大したもしくは減少した濃度での受容体の存在を、その疾病との相関関係を同定するために利用することができる。この技術により受容体を器官の全域に同等に適切に位置決定することができる。受容体が位置決定される特定の組織の既知の機能に基づき、受容体の一般に考えられる機能的役割を推定することができる。
Ｃ．「ヒトGPCRプロリンマーカー」アルゴリズム及び非内因性の構成的に活性のあるヒトGPCRの作製
バイオテクノロジー技術に立ち向かう多くの難題の中に、ある種から遺伝情報を収集し、そしてその情報を別の種に相関させることに関して予測できないことがあり、この問題は、この技術のいかなるところにも核酸及びタンパク質をコードする遺伝子配列におけるほど厄介な悪化を示さない。従って、一貫性のため、そしてこの技術の非常に予測できない性質のために、以下の発明は、哺乳類に関してはヒトGPCRに限定され、他の哺乳類種への本発明の適用性は、潜在的可能性はあるが、単なる機械的適用を超えると考えられる。
【００４７】
一般に、ある関連したタンパク質配列から別のものにまたはある種から別のものに共通の「規則」を適用しようとする場合、当該技術は典型的に配列整列に頼っており、すなわち、配列を線状にし、次に２つまたはそれ以上の配列間の共通の性質の領域を見い出そうと試みる。有用ではあるが、この方法はいつも意味のある情報をもたらすとは限らない。GPCRの場合、一般的な構造モチーフは全てのGPCRに対して同一であるが、TM、EC及びICの長さの変動は、あるGPCRから別のものにそのような整列方法をせいぜい困難にする。従って、例えば構成的活性化への一貫した方法をあるGPCRから別のものに適用することが望ましい可能性があるが、あるGPCRから次のものへの配列の長さ、正確さ等の大きな違いのために、一般的に適用でき容易にうまくいく突然変異整列方法は本質的にあり得ない。類似として、そのような方法は、縮尺または距離マーカーが地図のどこにもなく、旅行者に地点Bへの多数の異なる地図を与えることにより地点Aで旅行者に旅行を開始させ、次にそれらの地図を用いることによってのみ目的地Bへの最短で且つ最も効率のよい経路を見出すように旅行者に求めることと同じである。そのような状況において、この作業は、（ａ）各地図上の共通の「場所マーカー」及び（ｂ）その場所マーカーから目的地Bへの距離を測定する能力を有することにより容易に簡単にすることができ、従って、これにより旅行者は出発地点Ａから目的地Ｂへの最も効率のよいものを選択することができる。
【００４８】
本質的に、本発明の特徴は、ヒトGPCRの構成的に活性のある形態を容易に作製することができるヒトGPCR内のそのような位置を提供することである。
【００４９】
当業者が認識するように、細胞の膜貫通領域は非常に疎水性であり；従って、標準的な疎水性プロット技術を用いて、当業者はGPCRのTM領域、特にTM6を容易に決定することができる（この同じ方法は、GPCRのEC及びIC領域を決定することにも適用できる）。ヒトGPCRのTM6領域内で、（一般にTM6の真ん中近くの）共通のプロリン残基が構成的活性化「マーカー」の役割を果たすことが発見された。このプロリンマーカーから15アミノ酸を数えることにより、（IC3ループ中に位置する）16番目のアミノ酸が、その内因性形態から非内因性形態に突然変異させると、受容体の構成的活性化を導く。便宜上、これを「ヒトGPCRプロリンマーカー」アルゴリズムと称する。この位置の非内因性アミノ酸はアミノ酸のいずれであってもよいが、最も好ましくは、非内因性アミノ酸はリシンである。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、我々は、この位置自体が独特であり、そしてこの位置での突然変異は構成的活性化を与えるように受容体に影響を与えると考える。
【００５０】
例えば、16番目の位置の内因性アミノ酸がすでにリシンである場合（GPR4及びGPR32がそうであるが）、Xが非内因性アミノ酸であるためには、それはリシン以外でなければならず；従って、内因性GPCRが16番目の位置で内因性のリシン残基を有する状況では、そのGPCRの非内因性バージョンは、好ましくは、この位置でリシン以外のアミノ酸、好ましくはアラニン、ヒスチジン及びアルギニンを含むことを特筆する。さらに重要なことに（of further note）、GPR4はGsに共役し、その内因性形態で活性であるようであると決定された（データは示さない）。
【００５１】
（天然に存在しないアミノ酸の使用もまた実行可能であるが）20個の天然に存在するアミノ酸しかないので、この16番目の位置での置換のために特定の非内因性アミノ酸の選択は実行可能であり、研究者の要求に適合する非内因性アミノ酸を効率よく選択することができる。しかしながら、記載したように、16番目の位置のより好ましい非内因性アミノ酸はリシン、ヒスチジン、アルギニン及びアラニンであり、リシンが最も好ましい。当業者は、所望する突然変異を行うためにコドンの配列を変える熟練した方法を容易に決定することができると考えられる。
【００５２】
いつもとは限らないが、時折、TM6中でプロリン残基マーカーの前にW2が位置すること（すなわち、W2P¹AA₁₅X）もまた見出され、ここで、Wはトリプトファンであり、２はあらゆるアミノ酸残基である。
【００５３】
我々の発見は、とりわけ、当該技術分野により一般的に用いられる予測できず且つ面倒な配列整列法の必要性を否定する。実際、我々の発見の長所は、アルゴリズムが事実上あるが（while an algorithm in nature）、独特で且つ非常に有用な最終生成物、すなわち、ヒトGPCRの構成的に活性化されたバージョンを得るために、当業者が熟練した扱いやすさで、ヒトGPCRにそれを容易に適用できることである。ヒトゲノムプロジェクトが明らかにしているヒトGPCRの内因性リガンドを決定するためには多年及びかなりの額の金銭が必要とされるので、開示した本発明は、この配列情報を実践的に利用するために必要な時間を減らすだけでなく、著しく費用を節減する。この方法は、例えば疾病におけるGPCRの役割を理解するためだけではなく、ヒト症状を改善する機会を与えるためにも遺伝子情報の利用を可能にするので、ヒトゲノムプロジェクトの重要性を適切に実証する。
Ｄ．候補化合物のスクリーニング
１．一般的なGPCRスクリーニングアッセイ技術
Gタンパク質受容体が構成的に活性になると、それはGタンパク質（例えばGq、Gs、Gi、Go）に共役し、GDPの遊離及び続いて起こるGタンパク質へのGTPの結合を刺激する。Gタンパク質は次にGTPアーゼとして働き、GTPをGDPにゆっくり加水分解し、それにより受容体は通常の条件下で非活性化されるようになる。しかしながら、本発明の非内因性の構成的に活性のあるヒトGPCRを包含する構成的に活性化された受容体は、GDPをGTPに交換し続ける。GTPの加水分解できない類似体［³⁵S］GTPγSは、構成的に活性化された受容体を発現する膜上に存在するGタンパク質への増大した結合をモニターするために用いることができる。［³⁵S］GTPγSは、リガンドの非存在下及び存在下で膜へのGタンパク質結合をモニターするために使用できることが報告されている。このモニタリングの例は、当業者が周知で且つ利用できる他の例の中、1995年にTraynor及びNahorskiにより報告された。このアッセイ系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のGタンパク質にかかわらず全てのGタンパク質共役受容体に一般的に適用できるので、この系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリーニングに対してである。
【００５４】
B 2. 特定のGPCRスクリーニングアッセイ技術
C 「一般的な」Gタンパク質共役受容体アッセイ（すなわち、アゴニスト、部分アゴニストまたは逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を用いていったん候補化合物が同定されると、それらの化合物が受容体部位で相互作用していることを確かめるためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「一般的な」アッセイにより同定された化合物は受容体に結合することができないが、その代わりに細胞内ドメインからGタンパク質を単に「離す」ことができる。
【００５５】
ａ．Gs及びGi．
Gsは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。一方、Gi（及びGo）はこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはcAMPへのATPの転化を触媒し；従って、Gsタンパク質と共役する構成的に活性化されたGPCRはcAMPの増加した細胞レベルと関係する。一方、Gi（またはGo）タンパク質と共役する構成的に活性化されたGPCRはcAMPの減少した細胞レベルと関係する。一般的に、「Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission」, 8章, From Neuron To Brain（第3版）Nichols, J. G. et al編集, Sinauer Associates, Inc. (1992)を参照。従って、候補化合物が受容体に対する例えば逆アゴニストであるかどうかを決定するためにcAMPを検出するアッセイを利用することができる（すなわち、そのような化合物はcAMPのレベルを下げる）。ｃAMPを測定するために当該技術分野において既知の様々な方法を利用することができ；最も好ましい方法は、ELISAに基づく形態の抗-cAMP抗体の使用による。利用することができる別のタイプのアッセイは、全細胞第二メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を導く。サイクリックAMPは、cAMP応答DNA結合タンパク質または転写因子（CREB）の結合を促進することにより遺伝子発現を導き、それは次にcAMP応答配列と呼ばれる特定の位置でプロモーターに結合し、遺伝子の発現を導く。レポーター遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に多数のcAMP応答配列を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、構成的に活性化されたGs共役受容体（Gs-linked receptor）はcAMPの蓄積をもたらし、これは次にレポータータンパク質の遺伝子及び発現を活性化する。次に、標準的な生化学アッセイを用いてβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができる（Chen et al. 1995）。Gi（またはGo）に共役し、従ってcAMPのレベルを下げるGPCRに関して、Gsに共役する（従って、cAMPのレベルを上げる）受容体の利用に基づく例えば逆アゴニストのスクリーニングの方法をGPR17及びGPR30について実施例の節において開示する。
【００５６】
ｂ．Go及びGq
Go及びGqは酵素ホスホリパーゼCの活性化と関係し、これは次にリン脂質PIP₂を加水分解し、2つの細胞内メッセンジャー：ジアシルグリセロール（DAG）及びイノシトール１,４,５-三リン酸（IP₃）を遊離する。IP₃の増加した蓄積は、Gq-及びGo-共役受容体（Go-associated receptors）の活性化と関係する。一般的に、「Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission」, 8章, From Neuron To Brain（第3版）Nichols, J. G. et al編集, Sinauer Associates, Inc. (1992)を参照。候補化合物がGq-またはGo-共役受容体に対する例えば逆アゴニストであるかどうかを決定するためにIP₃蓄積を検出するアッセイを利用することができる（すなわち、そのような化合物はIP₃のレベルを下げる）。Gq依存性ホスホリパーゼCはAP1要素を含有する遺伝子の活性化をもたらし；従って、活性化されたGq-共役受容体はそのような遺伝子の発現の増加を示し、それにより、その逆アゴニストはそのような発現の減少を示し、そしてアゴニストはそのような発現の増加を示すので、AP1レポーターアッセイを用いてGq-共役受容体を調べることもできる。そのような検出のために市販されているアッセイが利用できる。
Ｅ．医薬品化学
必ずしもそうとは限らないが、一般に、候補化合物の直接的同定は、好ましくは、組み合わせ化学技術により作製された化合物と共に実施され、それにより何千もの化合物がそのような分析のために無作為に調製される。一般に、そのようなスクリーニングの結果は、独特なコア構造を有する化合物であり；その後、これらの化合物は、好ましくは、その医薬品特性をさらに高めるために好ましいコア構造（１つまたは複数）の辺りのさらなる化学的改変に供される。そのような技術は当業者に既知であり、本特許書類において詳細には検討されない。
Ｆ．製薬学的組成物
さらなる開発のために選択された候補化合物は、当業者に周知の技術を用いて製薬学的組成物中に調合することができる。当業者は適当な製薬学的に許容しうる担体を利用できる；例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１６版, 1980, Mack Publishing Co., （Oslo et al.編集）を参照。
Ｇ．他の有用性
開示したヒトGPCRの非内因性バージョンの好ましい用途は、逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストとして候補化合物を直接同定するため（好ましくは、製薬としての使用のため）であるが、これらの受容体を研究環境において利用することもできる。例えば、これらの受容体を含むインビボ及びインビトロ系は、正常及び罹病の両方のヒト状態におけるこれらの受容体の役割をさらに明らかにし理解するため並びにそれがシグナリングカスケードを理解することに適用される場合に構成的活性化の役割を理解することに利用することができる。これらの非内因性受容体の価値は、それらの独特な特徴のために、開示した受容体をその内因性リガンドが同定される前に人体における特定の受容体の役割を理解するために用いることができるので研究手段としてのそれらの有用性が高められることである。開示した受容体の他の用途は、とりわけ本特許書類の説明に基づいて当業者に明らかになる。
【００５７】
実施例
以下の実施例は、本発明を明らかにする目的のために示し、限定ではない。本明細書において特定の核酸及びアミノ酸配列が開示されるが、ヒトGPCRを構成的に活性化するためにTM6中のプロリン残基に対する位置に基づき受容体のIC3ループにおいて突然変異カセットを利用することができるという本特許書類の教示に従って、当業者は以下に報告するものと同じまたは実質的に同様な結果を得ながらこれらの配列に対してわずかな改変を行うことができると考えられる。配列突然変異の特定の方法は、当業者の特定の必要性に基づき当業者の認識範囲内である。
【００５８】
実施例１
内因性ヒトGPCRの調製
様々なGPCRを以下の実施例において利用した。いくつかの内因性ヒトGPCRは（以下に謝辞を示すように）発現ベクター中で親切にも提供され、そして他の内因性ヒトGPCRは公的に利用できる配列情報を用いて新規に合成した。
【００５９】
１．GPR1（ジーンバンク受託番号：U13666）
GPR1のヒトcDNA配列は、Brian O'Dowd（University of Toronto）によりpRcCMV中で提供された。GPR1 cDNA(1.4kBフラグメント)をpRcCMVベクターからNdeI-XbaIフラグメントとして切り出し、pCMVベクター（図３参照）のNdeI-XbaI部位中にサブクローン化した。その後、ヒトGPR1の核酸（配列番号:1）及びアミノ酸（配列番号:2）配列を決定し、確認した。
【００６０】
２．GPR4（ジーンバンク受託番号：L36148、U35399、U21051）
GPR4のヒトcDNA配列は、Brian O'Dowd（University of Toronto）によりpRcCMV中で提供された。GPR1 cDNA(1.4kBフラグメント)をpRcCMVベクターからApaI（平滑にした）-XbaIフラグメントとして切り出し、pCMVベクターのHindIII（平滑にした）-XbaI部位中に（5'非翻訳領域の大部分を除いて）サブクローン化した。その後、ヒトGPR4の核酸（配列番号:3）及びアミノ酸（配列番号:4）配列を決定し、確認した。
【００６１】
３．GPR5（ジーンバンク受託番号：L36149）
ヒトGPR5のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；64℃で1分間；そして72℃で1.5分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-TATGAATTCAGATGCTCTAAACGTCCCTGC-3'（配列番号:5）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-TCCGGATCCACCTGCACCTGCGCCTGCACC-3'（配列番号:6）
でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR5の核酸（配列番号:7）及びアミノ酸（配列番号:8）配列を決定し、確認した。
【００６２】
４．GPR７（ジーンバンク受託番号：U22491）
ヒトGPR７のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：PCR条件-鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-GCAAGCTTGGGGGACGCCAGGTCGCCGGCT-3'（配列番号:9）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GCGGATCCGGACGCTGGGGGAGTCAGGCTGC-3'（配列番号:10）
でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをHindIII及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのHindIII-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR7の核酸（配列番号:11）及びアミノ酸（配列番号:12）配列を決定し、確認した。
【００６３】
5．GPR8（ジーンバンク受託番号：U22492）
ヒトGPR8のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-CGGAATTCGTCAACGGTCCCAGCTACAATG-3'（配列番号:13）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-ATGGATCCCAGGCCCTTCAGCACCGCAATAT-3'（配列番号:14）
でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。シークエンスした4個全てのcDNAクローンは、ArgからGlnへのアミノ酸206の変異を伴う、可能性がある多型を含有した。この違いを除いて、その後、ヒトGPR8の核酸（配列番号:15）及びアミノ酸（配列番号:16）配列を決定し、確認した。
【００６４】
６．GPR９（ジーンバンク受託番号：X95876）
ヒトGPR９のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として（Brian O'Dowdにより提供された）クローン及びpfuポリメラーゼ（Stratagene）を10％ DMSOを補足した製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.5mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そして72℃で2.5分間を25サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-ACGAATTCAGCCATGGTCCTTGAGGTGAGTGACCACCAAGTGCTAAAT-3'（配列番号:17）でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GAGGATCCTGGAATGCGGGGAAGTCAG-3'（配列番号:18）
でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-SmaI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR9の核酸（配列番号:19）及びアミノ酸（配列番号:20）配列を決定し、確認した。
【００６５】
７．GPR9-6（ジーンバンク受託番号：U45982）
ヒトGPR9-6のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-TTAAGCTTGACCTAATGCCATCTTGTGTCC-3'（配列番号:21）
でキナーゼ処理し（kinased）、そして3'プライマーは配列：
5'-TTGGATCCAAAAGAACCATGCACCTCAGAG-3'（配列番号:22）
でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR9-6の核酸（配列番号:23）及びアミノ酸（配列番号:24）配列を決定し、確認した。
【００６６】
8．GPR10（ジーンバンク受託番号：U32672）
GPR10のヒトcDNA配列は、Brian O'Dowd（University of Toronto）によりpRcCMV中で提供された。GPR10 cDNA(1.3kBフラグメント)をpRcCMVベクターからEcoRI-XbaIフラグメントとして切り出し、pCMVベクターのEcoRI-XbaI部位中にサブクローン化した。その後、ヒトGPR10の核酸（配列番号:25）及びアミノ酸（配列番号:26）配列を決定し、確認した。
【００６７】
9．GPR15（ジーンバンク受託番号：U34806）
GPR15のヒトcDNA配列は、Brian O'Dowd（University of Toronto）によりpCDNA3中で提供された。GPR15 cDNA(1.5kBフラグメント)をpCDNA3ベクターからHindIII-Bamフラグメントとして切り出し、pCMVベクターのHindIII-Bam部位中にサブクローン化した。その後、ヒトGPR15の核酸（配列番号:27）及びアミノ酸（配列番号:28）配列を決定し、確認した。
【００６８】
10．GPR17（ジーンバンク受託番号：Z94154）
ヒトGPR17のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.２mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そして72℃で１分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-CTAGAATTCTGACTCCAGCCAAAGCATGAAT-3'（配列番号:29）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GCTGGATCCTAAACAGTCTGCGCTCGGCCT-3'（配列番号:30）
でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR17の核酸（配列番号:31）及びアミノ酸（配列番号:32）配列を決定し、確認した。
【００６９】
11．GPR18（ジーンバンク受託番号：L42324）
ヒトGPR18のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；54℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-ATAAGATGATCACCCTGAACAATCAAGAT-3'（配列番号:33）
でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列：
5'-TCCGAATTCATAACATTTCACTGTTTATATTGC-3'（配列番号:34）
でEcoRI部位を含有した。1.0kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターの平滑-EcoRI部位中にクローン化した。シークエンスした8個全てのcDNAクローンは、ThrからProへのアミノ酸12、AlaからGluへのアミノ酸86、IleからLeuへのアミノ酸97及びLeuからMetへのアミノ酸310の変異を伴う、可能性がある4つの多型を含有した。これらの変異を除いて、その後、ヒトGPR18の核酸（配列番号:35）及びアミノ酸（配列番号:36）配列を決定し、確認した。
【００７０】
12．GPR20（ジーンバンク受託番号：U66579）
ヒトGPR20のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-CCAAGCTTCCAGGCCTGGGGTGTGCTGG-3'（配列番号:37）
でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列：
5'-ATGGATCCTGACCTTCGGCCCCTGGCAGA-3'（配列番号:38）
でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR20の核酸（配列番号:39）及びアミノ酸（配列番号:40）配列を決定し、確認した。
【００７１】
13．GPR21（ジーンバンク受託番号：U66580）
ヒトGPR21のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-GAGAATTCACTCCTGAGCTCAAGATGAACT-3'（配列番号:41）
でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列：
5'-CGGGATCCCCGTAACTGAGCCACTTCAGAT-3'（配列番号:42）
でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR21の核酸（配列番号:43）及びアミノ酸（配列番号:44）配列を決定し、確認した。
【００７２】
14．GPR22（ジーンバンク受託番号：U66581）
ヒトGPR22のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；50℃で１分間；そして72℃で1.5分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-TCCCCCGGGAAAAAAACCAACTGCTCCAAA-3'（配列番号:45）
でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列：
5'-TAGGATCCATTTGAATGTGGATTTGGTGAAA-3'（配列番号:46）
でBamHI部位を含有した。1.38kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR22の核酸（配列番号:47）及びアミノ酸（配列番号:48）配列を決定し、確認した。
【００７３】
15．GPR24（ジーンバンク受託番号：U71092）
ヒトGPR24のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-GTGAAGCTTGCCTCTGGTGCCTGCAGGAGG-3'（配列番号:49）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GCAGAATTCCCGGTGGCGTGTTGTGGTGCCC-3'（配列番号:50）
でEcoRI部位を含有した。1.3kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR24の核酸（配列番号:51）及びアミノ酸（配列番号:52）配列を決定し、確認した。
【００７４】
16．GPR30（ジーンバンク受託番号：U63917）
ヒトGPR30のcDNAを以下のように作製し、クローン化した：GPR30のコーディング配列（1128bpの長さ）をプライマー：
5'-GGCGGATCCATGGATGTGACTTCCCAA-3'（配列番号:53）及び
5'-GGCGGATCCCTACACGGCACTGCTGAA-3'（配列番号:54）
を用いてゲノムDNAから増幅した。次に、増幅産物を市販されているベクターpCR2.1(Invitrogen)中に製造業者の説明書に従って「TOPO-TAクローニングキット」（Invitrogen、#K4500-01）を用いてクローン化した。全長GPR30インサートをBamHIでの消化により遊離し、アガロースゲル電気泳動によりベクターから分離し、Sephaglas Bandprep^TMキット(Pharmacia、#27-9285-01)を製造業者の説明書に従って用いて精製した。その後、ヒトGPR30の核酸（配列番号:55）及びアミノ酸（配列番号:56）配列を決定し、確認した。
【００７５】
17．GPR31（ジーンバンク受託番号：U65402）
ヒトGPR31のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；58℃で１分間；そして72℃で2分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-AAGGAATTCACGGCCGGGTGATGCCATTCCC-3'（配列番号:5７）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GGTGGATCCATAAACACGGGCGTTGAGGAC-3'（配列番号:58）
でBamHI部位を含有した。1.0kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR31の核酸（配列番号:59）及びアミノ酸（配列番号:60）配列を決定し、確認した。
【００７６】
18．GPR32（ジーンバンク受託番号：AF045764）
ヒトGPR32のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-TAAGAATTCCATAAAAATTATGGAATGG-3'（配列番号:243）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-CCAGGATCCAGCTGAAGTCTTCCATCATTC-3'（配列番号:244）
でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR32の核酸（配列番号:245）及びアミノ酸（配列番号:246）配列を決定し、確認した。
【００７７】
19．GPR40（ジーンバンク受託番号：AF024687）
ヒトGPR40のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で1分10秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-GCAGAATTCGGCGGCCCCATGGACCTGCCCCC-3'（配列番号:247）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GCTGGATCCCCCGAGCAGTGGCGTTACTTC-3'（配列番号:248）
でBamHI部位を含有した。1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR40の核酸（配列番号:249）及びアミノ酸（配列番号:250）配列を決定し、確認した。
【００７８】
20．GPR41（ジーンバンク受託番号：AF024688）
ヒトGPR41のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で1分10秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-CTCAAGCTTACTCTCTCTCACCAGTGGCCAC-3'（配列番号:251）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-CCCTCCTCCCCCGGAGGACCTAGC-3'（配列番号:252）
でキナーゼ処理した。1kbのPCRフラグメントをHindIIIで消化し、pCMV発現ベクターのHindIII-平滑部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR41の核酸（配列番号:253）及びアミノ酸（配列番号:254）配列を決定し、確認した。
【００７９】
21．GPR43（ジーンバンク受託番号：AF024690）
ヒトGPR43のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で1分10秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-TTTAAGCTTCCCCTCCAGGATGCTGCCGGAC-3'（配列番号:255）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GGCGAATTCTGAAGGTCCAGGGAAACTGCTA-3'（配列番号:256）
でEcoRI部位を含有した。1kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR43の核酸（配列番号:257）及びアミノ酸（配列番号:258）配列を決定し、確認した。
【００８０】
22．APJ（ジーンバンク受託番号：U03642）
ヒトAPJ cDNA（pRcCMVベクター中）は、Brian O'Dowd（University of Toronto）により提供された。ヒトAPJ cDNAをpRcCMVベクターからEcoRI-XbaI（平滑にした）フラグメントとして切り出し、pCMVベクターのEcoRI-SmaI部位中にサブクローン化した。その後、ヒトAPJの核酸（配列番号:61）及びアミノ酸（配列番号:62）配列を決定し、確認した。
【００８１】
23．BLR1（ジーンバンク受託番号：X68149）
ヒトBLR1のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として胸腺cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.２mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そして72℃で１分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-TGAGAATTCTGGTGACTCACAGCCGGCACAG-3'（配列番号:63）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GCCGGATCCAAGGAAAAGCAGCAATAAAAGG-3'（配列番号:64）
でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトBLR1の核酸（配列番号:65）及びアミノ酸（配列番号:66）配列を決定し、確認した。
【００８２】
24．CEPR（ジーンバンク受託番号：U77827）
ヒトCEPRのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-CAAAGCTTGAAAGCTGCACGGTGCAGAGAC-3'（配列番号:67）
でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列：
5'-GCGGATCCCGAGTCACACCCTGGCTGGGCC-3'（配列番号:68）
でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトCEPRの核酸（配列番号:69）及びアミノ酸（配列番号:70）配列を決定し、確認した。
【００８３】
25．EBI1（ジーンバンク受託番号：L31581）
ヒトEBI1のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として胸腺cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-ACAGAATTCCTGTGTGGTTTTACCGCCCAG-3'（配列番号:71）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-CTCGGATCCAGGCAGAAGAGTCGCCTATGG-3'（配列番号:72）
でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトEBI1の核酸（配列番号:73）及びアミノ酸（配列番号:74）配列を決定し、確認した。
【００８４】
26．EBI2（ジーンバンク受託番号：L08177）
ヒトEBI2のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてcDNAクローン（Kevin Lynch、University of Virginia Health Sciences Centerにより親切に提供された；利用したベクターは供給者により同定されなかった）及びpfuポリメラーゼ（Stratagene）を10％ DMSOを補足した製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.5mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；60℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-CTGGAATTCACCTGGACCACCACCAATGGATA-3'（配列番号:75）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-CTCGGATCCTGCAAAGTTTGTCATACAGTT-3'（配列番号:76）
でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトEBI2の核酸（配列番号:77）及びアミノ酸（配列番号:78）配列を決定し、確認した。
【００８５】
27．ETBR-LP2（ジーンバンク受託番号：D38449）
ヒトETBR-LP2のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で1.5分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-CTGGAATTCTCCTGCTCATCCAGCCATGCGG-3'（配列番号:79）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-CCTGGATCCCCACCCCTACTGGGGCCTCAG-3'（配列番号:80）
でBamHI部位を含有した。1.5kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトETBR-LP2の核酸（配列番号:81）及びアミノ酸（配列番号:82）配列を決定し、確認した。
【００８６】
28．GHSR（ジーンバンク受託番号：U60179）
ヒトGHSRのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として海馬cDNA及びTaqPlus Precisionポリメラーゼ（Stratagene）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；68 ℃で１分間；そして72℃で1分10秒間を30サイクルであった。1回目のPCRのために、5' PCRプライマー配列は：
5'-ATGTGGAACGCGACGCCCAGCG-3'（配列番号:83）
であり、そして3'プライマー配列は：
5'-TCATGTATTAATACTAGATTCT-3'（配列番号:84）
であった。1回目のPCR のうち2μlを2回目のPCRに鋳型として用い、その場合、5'プライマーは配列：
5'-TACCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAAGAGCCGGGGT-3'（配列番号:85）
でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列：
5'-CGGAATTCATGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCCCG-3'（配列番号:86）
でEcoRI部位を含有した。 1.1kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターの平滑-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトGHSRの核酸（配列番号:87）及びアミノ酸（配列番号:88）配列を決定し、確認した。
【００８７】
29．GPCR-CNS（ジーンバンク受託番号：AFO17262）
ヒトGPCR-CNSのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で2分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-GCAAGCTTGTGCCCTCACCAAGCCATGCGAGCC-3'（配列番号:89）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-CGGAATTCAGCAATGAGTTCCGACAGAAGC-3'（配列番号:90）
でEcoRI部位を含有した。1.9kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。シークエンスした9個全てのクローンは、S284C変異を伴う、可能性がある多型を含有した。この違いを除いて、その後、ヒトGPCR-CNSの核酸（配列番号:91）及びアミノ酸（配列番号:92）配列を決定し、確認した。
【００８８】
30．GPR-NGA（ジーンバンク受託番号：U55312）
ヒトGPR-NGAのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムcDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そして72℃で1.5分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-CAGAATTCAGAGAAAAAAAGTGAATATGGTTTTT-3'（配列番号:93）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-TTGGATCCCTGGTGCATAACAATTGAAAGAAT-3'（配列番号:94）
でBamHI部位を含有した。1.3kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR-NGAの核酸（配列番号:95）及びアミノ酸（配列番号:96）配列を決定し、確認した。
【００８９】
31．H9（ジーンバンク受託番号：U52219）
ヒトHB954のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として下垂体cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62 ℃で１分間；そして72℃で2分間を30サイクルであった。5'プライマーは配列：
5'-GGAAAGCTTAACGATCCCCAGGAGCAACAT-3'（配列番号:97）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-CTGGGATCCTACGAGAGCATTTTTCACACAG-3'（配列番号:98）
でBamHI部位を含有した。 1.9kbのPCRフラグメントをHindIII及びBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのHindIII-BamHI部位中にクローン化した。公開配列と比較した場合に、細胞質尾部中に12bpのインフレーム挿入を有する異なるアイソフォームも同定され、「H9b」と称した。両方のアイソフォームは、アミノ酸P320S及びアミノ酸G448Aの変異を伴う２つの可能がある多型を含有した。アイソフォームH9aはアミノ酸S493Nの別の可能性がある多型を含有し、一方、アイソフォームH9bはアミノ酸I502T及びアミノ酸A532T（アイソフォームH9aのアミノ酸528に対応する）の変異を伴う２つのさらなる可能性がある多型を含有した。その後、ヒトH9の核酸（配列番号:99）及びアミノ酸（配列番号:100）配列を決定し、確認した（以下の節において、両方のアイソフォームをヒトGPCRプロリンマーカーアルゴリズムに従って突然変異させた）。
【００９０】
32．HB954（ジーンバンク受託番号：D38449）
ヒトHB954のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；58℃で１分間；そして72℃で2分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-TCCAAGCTTCGCCATGGGACATAACGGGAGCT-3'（配列番号:101）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-CGTGAATTCCAAGAATTTACAATCCTTGCT-3'（配列番号:102）
でEcoRI部位を含有した。1.6kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトHB954の核酸（配列番号:103）及びアミノ酸（配列番号:104）配列を決定し、確認した。
【００９１】
33．HG38（ジーンバンク受託番号：AF062006）
ヒトHG38のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そして72℃で1分30秒間を30サイクルであった。5'及び3'フラグメントを別個に得るために２つのPCR反応を実施した。5'フラグメントのために、5' PCRプライマーは配列：
5'-CCCAAGCTTCGGGCACCATGGACACCTCCC-3'（配列番号:259）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-ACAGGATCCAAATGCACAGCACTGGTAAGC-3'（配列番号:260）
でBamHI部位を含有した。この1.５kbの5' PCRフラグメントをHindIII及びBamHIで消化し、pCMVのHindIII-BamHI部位中にクローン化した。3'フラグメントのために、5' PCRプライマーは配列：
5'-CTATAACTGGGTTACATGGTTTAAC-3'（配列番号:261）
でキナーゼで処理し、そして3'プライマーは配列：
5'-TTTGAATTCACATATTAATTAGAGACATGG-3'（配列番号:262）
でEcoRI部位を含有した。1.4kbの3' PCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMVベクターの平滑-EcoRI部位中にサブクローン化した。次に5'及び3'フラグメントを共通のEcoRV部位を介して一緒に連結して全長cDNAクローンを作製した。その後、ヒトHG38の核酸（配列番号:263）及びアミノ酸（配列番号:264）配列を決定し、確認した。
【００９２】
34．HM74（ジーンバンク受託番号：D10923）
ヒトHM74のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムDNAまたは胸腺cDNA（プールした）のいずれか及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65 ℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-GGAGAATTCACTAGGCGAGGCGCTCCATC-3'（配列番号:105）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-GGAGGATCCAGGAAACCTTAGGCCGAGTCC-3'（配列番号:106）
でキナーゼ処理した。 1.3kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRI-SmaI部位中にクローン化した。シークエンスしたクローンは、N94K変異を伴う、可能性がある多型を示した。この違いを除いて、その後、ヒトHM74の核酸（配列番号:107）及びアミノ酸（配列番号:108）配列を決定し、確認した。
【００９３】
35．MIG（ジーンバンク受託番号：AFO44600及びAFO44601）
ヒトMIGのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムcDNA及び1回目のPCRにはTaqPlus Precisionポリメラーゼ（Stratagene）または2回目のPCRにはpfuポリメラーゼ（Stratagene）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mM（TaqPlus Precision）または0.5mM（pfu）の各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。Pfuを用いる場合、10％ DMSOをバッファー中に含んだ。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で：（a）1回目のPCRでは1分間；そして（b）2回目のPCRでは2分間を30サイクルであった。コーディング領域中にイントロンがあるので、重なり合う5'及び3'フラグメントを作製するために２組のプライマーを別個に用いた。5' フラグメントPCRプライマーは：
5'-ACCATGGCTTGCAATGGCAGTGCGGCCAGGGGGCACT-3'（外側のセンス）（配列番号:109）
及び
5'-CGACCAGGACAAACAGCATCTTGGTCACTTGTCTCCGGC-3'（内側のアンチセンス）（配列番号:110）
であった。3'フラグメントPCRプライマーは：
5'-GACCAAGATGCTGTTTGTCCTGGTCGTGGTGTTTGGCAT-3'（内側のセンス）（配列番号:111）
及び
5'-CGGAATTCAGGATGGATCGGTCTCTTGCTGCGCCT-3'（EcoRI部位を有する外側のアンチセンス）（配列番号:112）
であった。２回目のPCRを行うために鋳型として1回目のPCR並びにキナーゼ処理した外側のセンスプライマー及び外側のアンチセンスプライマーを用いることにより5'及び3'フラグメントを一緒に連結した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターの平滑-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトMIGの核酸（配列番号:113）及びアミノ酸（配列番号:114）配列を決定し、確認した。
【００９４】
36．OGR1（ジーンバンク受託番号：U48405）
ヒトOGR1のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型としてゲノムcDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-GGAAGCTTCAGGCCCAAAGATGGGGAACAT-3'（配列番号:115）
でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列：
5'-GTGGATCCACCCGCGGAGGACCCAGGCTAG-3'（配列番号:116）
でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベクターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトOGR1の核酸（配列番号:117）及びアミノ酸（配列番号:118）配列を決定し、確認した。
【００９５】
37．セロトニン5HT_2A
内因性ヒト5HT_2A受容体をコードするcDNAをヒト脳ポリ-A⁺ RNA；XhoI制限部位を有する5'非翻訳領域からの5'プライマー：
5'-GACCTCGAGTCCTTCTACACCTCATC-3'（配列番号:119）
及びXbaI部位を含有する3'非翻訳領域からの3'プライマー：
5'-TGCTCTAGATTCCAGATAGGTGAAAACTTG-3'（配列番号:120）
を用いてRT-PCRにより得た。TaqPllus^TM Precisionポリメラーゼ（Stratagene）またはrTth^TMポリメラーゼ（Perkin Elmer）のいずれかを製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；57 ℃で１分間；そして72℃で2分間を30サイクルであった。1.5kbのPCRフラグメントをXbaIで消化し、pBluescriptのEcoRV-XbaI部位中にサブクローン化した。得られたcDNAクローンを完全にシークエンスし、公開配列から２個のアミノ酸変異をコードすることが分かった。第一のものはN末端細胞外ドメイン中のT25N突然変異であり；第二のものはH452Y突然変異である。２つの異なる市販の製造業者からのTaqポリメラーゼ（StratageneからのTaqPllus^TM及びPerkin ElmerからのrTth^TM）を用いて２つの独立したPCR反応から得られたcDNAクローンが同じ2つの突然変異を含有したので、これらの突然変異はPCRの誤りよりむしろ配列多型であると思われる。これらを除いて、その後、ヒト5HT_2Aの核酸（配列番号:121）及びアミノ酸（配列番号:122）配列を決定し、確認した。
【００９６】
38．セロトニン5HT_2C
内因性ヒト5HT_2C受容体をコードするcDNAをヒト脳ポリ-A⁺ RNAからRT-PCRにより得た。5'及び3'プライマーは５'及び3'非翻訳領域から得られ、以下の配列：
5'-GACCTCGAGGTTGCTTAAGACTGAAGC-3'（配列番号:123）
5'-ATTTCTAGACATATGTAGCTTGTACCG-3'（配列番号:124）
を含有した。その後、ヒト5HT_2Cの核酸（配列番号:125）及びアミノ酸（配列番号:126）配列を決定し、確認した。
【００９７】
39．V28（ジーンバンク受託番号：U20350）
ヒトV28のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列：
5'-GGTAAGCTTGGCAGTCCACGCCAGGCCTTC-3'（配列番号:127）
でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列：
5'-TCCGAATTCTCTGTAGACACAAGGCTTTGG-3'（配列番号:128）
でEcoRI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトV28の核酸（配列番号:129）及びアミノ酸（配列番号:130）配列を決定し、確認した。
【００９８】
実施例２
非内因性ヒトGPCRの調製
１．部位特異的突然変異誘発
本明細書において開示するヒトGPCRプロリンマーカー法に基づく突然変異誘発をTransformer部位特異的突然変異誘発キット（Clontech）を製造業者の説明書に従って用いて前述の内因性ヒトGPCRに対して実施した。この突然変異誘発法のために、突然変異プローブ及び選択マーカープローブ（他に示さないかぎり、配列番号:132のプローブは終始同じであった）を利用し、特定の配列に対するこれらの配列を以下の表Bに記載する（挿入番号は配列番号である）。便宜上、ヒトGPCR中に含まれるコドン突然変異もまた標準的な形態で記載する：
【００９９】
【表３】

【０１００】
【表４】

【０１０１】
【表５】

【０１０２】
次に非内因性ヒトGPCRをシークエンスし、得られた、確認された核酸及びアミノ酸配列を以下の表Ｃに要約するように本特許書類に添付の「配列表」付表中に記載する：
【０１０３】
【表６】

【０１０４】
【表７】

【０１０５】
２．プロリンマーカーアルゴリズムの利用のための別の突然変異方法：APJ；セロトニン5HT_2A；セロトニン5HT_2C；及びGPR30
上記の部位特異的突然変異誘発法が特に好ましいが、そのような突然変異を作製するために他の方法を利用することができ；当業者は、当業者の特定の必要性に適合するGPCRを突然変異させる方法を容易に選択することができると考えられる。
【０１０６】
ａ．APJ
L247Kに突然変異させることにより非内因性ヒトAPJ受容体の調製を実施した。この突然変異を含有する2個のオリゴヌクレオチドを合成した：
5'-GGCTTAAGAGCATCATCGTGGTGCTGGTG-3'（配列番号:233）
5'-GTCACCACCAGCACCACGATGATGCTCTTAAGCC-3'（配列番号:234）
これら2個のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ヒト内因性APJのNaeI-BstEIIフラグメントを置き換えるために用いてヒトAPJの非内因性バージョンを作製した。
【０１０７】
ｂ．セロトニン5HT_2A
アミノ酸322を包含する制限酵素部位SphIを利用することにより点突然変異C322Kを含有するcDNAを構築した。C322K突然変異を含有するプライマー：
5'-CAAAGAAAGTACTGGGCATCGTCTTCTTCCT-3'（配列番号:235）
を受容体の3'非翻訳領域からのプライマー：
5'-TGCTCTAGATTCCAGATAGGTGAAAACTTG-3'（配列番号:236）
と一緒に用いて（上記の条件下で）PCRを実施した。次に、T4ポリメラーゼで平滑にしたSphI部位を介して、得られたPCRフラグメントを用いて内因性5HT_2A cDNAの3'末端を置き換えた。
【０１０８】
ｃ．セロトニン5HT_2C
アミノ酸310を含有するStyI制限フラグメントを所望する突然変異をコードする合成の二本鎖オリゴヌクレオチドで置き換えることによりS310K突然変異を含有するcDNAを構築した。利用したセンス鎖配列は以下の配列：
5'-CTAGGGGCACCATGCAGGCTATCAACAATGAAAGAAAAGCTAAGAAAGTC-3'（配列番号:237）
を有し、そして利用したアンチセンス鎖配列は以下の配列：
5'-CAAGGACTTTCTTAGCTTTTCTTTCATTGTTGATAGCCTGCATGGTGCCC-3'（配列番号:238）
を有した。
【０１０９】
ｄ．GPR30
非内因性GPR30を作製する前に、PCRにより生じる突然変異を含まないクローンを同定するためにいくつかの独立したpCR2.1/GPR30単離体をそれらの全体をシークエンスした。突然変異を含まないクローンをEcoRIで消化し、そしてpCI-NeoをEcoRIで消化し、pCR2.1/GPR30からEcoRIで遊離したGPR30フラグメントをサブクローン化することにより内因性GPR30 cDNAフラグメントをCMVにより制御される発現プラスミドpCI-neo（Promega）中に移し、pCI/GPR30を作製した。その後、製造業者の説明書に従ってQuick-Change^TM 部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene、#200518）及び以下のプライマー：
5'-CGGCGGCAGAAGGCGAAACGCATGATCCTCGCGGT-3'（配列番号:239）及び
5'-ACCGCGAGGATCATGCGTTTCGCCTTCTGCCGCCG-3'（配列番号:240）
を用いてコドン258のロイシンをリシンに突然変異させた。
【０１１０】
実施例３
（内因性及び突然変異させた）受容体発現
タンパク質の発現のために様々な細胞を当該技術分野は利用できるが、哺乳類細胞を利用することが最も好ましい。この主な理由は実用性に基づき、すなわち、GPCRの発現のための例えば酵母細胞の利用は、可能ではあるが、哺乳類系に対して進化した受容体共役、遺伝子機構及び分泌経路を含有しない可能性がある（実際、酵母の場合には含有しない）非哺乳類細胞をプロトコル中に導入し、従って、非哺乳類細胞において得られた結果は、有用である可能性はあるが、哺乳類細胞から得られたものほど好ましくない。哺乳類細胞のうち、COS-7、293及び293T細胞が特に好ましいが、利用する特定の哺乳類細胞は当業者の特定の必要性に基づくことができる。
【０１１１】
本明細書において他に記載しないかぎり、以下のプロトコルを内因性及び非内因性ヒトGPCRの発現のために利用した。表Dは、GPCR発現のための哺乳類細胞及び（150mmプレート当たり）利用した数を記載する。
【０１１２】
【表８】

【０１１３】
1日目に、哺乳類細胞を平板培養した。2日目に、２本の反応チューブを調製し（各チューブの以下の割合はプレート当たりである）：チューブAは、20μgのDNA（例えば、pCMVベクター；内因性受容体cDNAを有するpCMVベクター及び非内因性受容体cDNAを有するpCMVベクター）を1.2mlの無血清DMEM（Irvine Scientific, Irvine, CA）中に混合することにより調製し；チューブBは、120μlのリポフェクトアミン（lipofectamine）（Gibco BRL）を1.2mlの無血清DMEM中に混合することにより調製した。次に、チューブA及びBを反転（数回）により混合し、続いて室温で30-45分間インキュベーションした。この混合物を「トランスフェクション混合物」と称する。平板培養した細胞を1X PBSで洗浄し、続いて10mlの無血清DMEMを加えた。次に、2.4mlのトランスフェクション混合物をこれらの細胞に加え、続いて37℃/5％ CO₂で４時間インキュベーションした。次に、トランスフェクション混合物を吸引により除き、続いて25mlのDMEM/10％ウシ胎仔血清を加えた。次に、細胞を37℃/5％ CO₂でインキュベーションした。72時間のインキュベーション後、次に細胞を集め、分析のために利用した。
１．Gi共役受容体：Gs共役受容体との共トランスフェクション
GPR30の場合、この受容体はGタンパク質Giに共役することが決定されている。Giは、cAMPへのATPの転化を触媒するために必要である酵素アデニリルシクラーゼを阻害することが知られている。従って、GPR30の非内因性の構成的に活性化された形態は、cAMPの減少したレベルと関連すると予想される。cAMPの減少するレベルの測定により直接GPR30の非内因性の構成的に活性化された形態をアッセイ確認することは、実行可能であるが、好ましくは、Gs共役受容体の共同使用により測定することができる。例えば、Gsに共役する受容体はアデニリルシクラーゼを刺激し、従って、cAMPの増加と関連する。本願の譲受人は、オーファン受容体GPR6が内因性の構成的に活性化されたGPCRであることを発見している。GPR6はGsタンパク質に共役する。従って、共トランスフェクションすると、推定されるGPR30-突然変異がその構成的活性化を導くことを容易に確かめることができ、すなわち、内因性の構成的に活性化されたGPR6/内因性の構成的に活性化されていないGPR30細胞は、内因性の構成的に活性のあるGPR6/非内因性の構成的に活性化されたGPR30と比較した場合にcAMPの増大したレベルを示す（後者は比較的より低いレベルのcAMPを示す）。候補化合物がGs共役受容体に対する例えば逆アゴニスト（すなわち、そのような化合物はcAMPのレベルを下げるとみられる）またはGi共役受容体（もしくはGo共役受容体）に対する例えば逆アゴニスト（すなわち、そのような候補化合物はcAMPのレベルを上げるとみられる）であるかどうかを決定するためにcAMPを検出するアッセイを利用することができる。cAMPを測定するための当該技術分野において既知の様々な方法を利用することができ；好ましい方法は抗-cAMP抗体の使用による。別の方法で、最も好ましいものは、全細胞第二メッセンジャーレポーター系アッセイを利用する。遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を導く。サイクリックAMPは、cAMP応答DNA結合タンパク質または転写因子（CREB）の結合を促進することにより遺伝子発現を導き、それは次にcAMP応答配列と呼ばれる特定の位置でプロモーターに結合し、遺伝子の発現を導く。レポーター遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に多数のcAMP応答配列を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。従って、GPR6のような活性化された受容体は、cAMPの蓄積をもたらし、これは次にレポータータンパク質の遺伝子及び発現を活性化する。最も好ましくは、293細胞を好ましくは1：1の比率の、最も好ましくは1：4の比率のGPR6（または別のGs共役受容体）及びGPR30（または別のGi共役受容体）プラスミドで共トランスフェクションする。GPR6はcAMPの生成を刺激する内因性の構成的に活性のある受容体であるので、GPR6はレポーター遺伝子及びその発現を強力に活性化する。次に、標準的な生化学アッセイを用いてβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができる（Chen et al. 1995）。内因性の構成的に活性でないGPR30と内因性の構成的に活性のあるGPR6との共トランスフェクションは、ルシフェラーゼレポータータンパク質の増加を示す。逆に、非内因性の構成的に活性のあるGPR30と内因性の構成的に活性のあるGPR6との共トランスフェクションは、ルシフェラーゼの発現の劇的な減少を示す。いくつかのレポータープラスミドが既知であり、第二メッセンジャーアッセイを測定するために当該技術分野において利用できる。主として当業者の特定の必要性に基づいて特定の遺伝子発現のために適当なレポータープラスミドを決定することは当業者の十分に範囲内であると考えられる。様々な細胞が発現のために利用できるが、哺乳類細胞が最も好ましく、そしてこれらのタイプのうち、293細胞が最も好ましい。哺乳類トランスフェクション^TMキット（Stratagene、＃200285）CaPO₄沈殿プロトコルを製造業者の説明書に従って用いて293細胞をレポータープラスミドpCRE-Luc/GPR6及び非内因性の構成的に活性化されたGPR30でトランスフェクションした（公開された内因性GPR6配列については28 Genomics 347(1995)を参照）。この沈殿物は、400ngの受容体、80ngのCMV-発現プラスミド（1：4のGPR6：内因性GPR30または非内因性GPR30比を有する）及び20ngのCMV-SEAP（分泌されるアルカリホスファターゼをコードするトランスフェクションコントロールプラスミド）を含有した。沈殿物の50％を（4 X 10⁴細胞/ウェルを含有する）96穴組織培養皿の３ウェル中に分け；残りの50％を捨てた。翌朝、培地を交換した。トランスフェクションの開始後48時間で細胞を溶解し、Luclite^TMキット（Packard、カタログ＃6016911）並びにTrilux 1450 Microbeta^TM液体シンチレーション及び発光カウンター（Wallac）を販売業者の説明書どおりに用いてルシフェラーゼ活性に関して調べた。GraphPad Prism 2.0a（GraphPad Software Inc.）を用いてデータを分析した。
【０１１４】
Giに共役することが同様に決定されているGPR17に関しては、とりわけ、別のGs共役内因性受容体GPR3（23 Genomics 609(1994)及び24 Genomics 391(1994)を参照）の使用に基づき、前述の方法の改変を利用した。最も好ましくは293細胞を利用する。これらの細胞を96穴プレート上にウェル当たり2 X 10⁴細胞の密度で平板培養し、翌日リポフェクトアミン試薬（BRL）を製造業者の説明書に従って用いてトランスフェクションした。DNA/脂質混合物を各6ウェルトランスフェクションに対して以下のように調製した：100μlのDMEM中260ngのプラスミドDNAを100μlのDMEM中2μlの脂質と穏やかに混合した（260ngのプラスミドDNAは、200ngの8xCRE-Lucレポータープラスミド（以下参照）、50ngの内因性受容体もしくは非内因性受容体を含んでなるpCMVまたはpCMVのみ及び10ngのGPRS発現プラスミド（pcDNA3（Invitrogen）中のGPRS）からなった）。8XCRE-Lucレポータープラスミドは以下のように調製した：pβgal-Basicベクター(Clontech)中のBglV-HindIII部位でラットソマトスタチンプロモーター（-71/+51）をクローン化することによりベクターSRIF-β-galを得た。8コピーのcAMP応答配列をアデノウイルス鋳型AdpCF126CCRE8(7 Human Gene Therapy 1883(1996)を参照)からPCRにより得、Kpn-BglV部位でSRIF-β-galベクター中にクローン化し、8xCRE-β-galレポーターベクターをもたらした。8xCRE-Lucレポータープラスミドは、8xCRE-β-galレポーターベクター中のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をHindIII-BamHI部位でpGL3-basicベクター（Promega）から得たルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることにより作製した。室温で30分のインキュベーション後、DNA/脂質混合物を400μlのDMEMで希釈し、希釈した混合物のうち100μlを各ウェルに加えた。細胞培養インキュベーター中で4時間のインキュベーション後に10％のFCSを含む100μlのDMEMを各ウェルに加えた。翌朝、トランスフェクションした細胞を10％のFCSを含む200μl/ウェルのDMEMで交換した。8時間後に、PBSで1回洗浄した後、フェノールレッドを含まない100μl/ウェルのDMEMにウェルを交換した。翌日、LucLite^TMレポーター遺伝子アッセイキット（Packard）を製造業者の説明書に従って用いてルシフェラーゼ活性を測定し、1450 MicroBeta^TMシンチレーション及び発光カウンター（Wallac）で読み取った。
【０１１５】
図４は、構成的に活性のあるGPR30が293細胞においてGPR6によりもたらされるCRE-Lucレポーターの活性化を阻害することを示す。ルシフェラーゼは、発現ベクターpCMVにおいて約4.1相対光単位で測定された。内因性GPR30はルシフェラーゼを約8.5相対光単位で発現し、一方、非内因性の構成的に活性のあるGPR30（L258K）はルシフェラーゼをそれぞれ約3.8及び3.1相対光単位で発現した。1：4の比率で、内因性GPR6と内因性GPR30との共トランスフェクションは、ルシフェラーゼ発現を約104.1相対光単位まで劇的に増加した。同じ比率で、内因性GPR6と非内因性GPR30（L258K）との共トランスフェクションは、発現を劇的に減少し、これはそれぞれ約18.2及び29.5相対光単位で明白である。図5に記載するように、GPR3との共トランスフェクションに関してGPR17について同様の結果が認められた。
【０１１６】
実施例３
非内因性GPCRの構成的活性を測定するためのアッセイ
Ａ．膜結合アッセイ
１．［³⁵S］GTPγSアッセイ
Gタンパク質共役受容体がその活性状態にある場合、リガンド結合または構成的活性化のいずれかの結果として、該受容体はGタンパク質に共役し、GDPの遊離及びそれに続くGタンパク質へのGTPの結合を刺激する。Gタンパク質-受容体複合体のαサブユニットはGTPアーゼとして働き、GTPをGDPにゆっくり加水分解し、この時点で受容体は通常非活性化される。構成的に活性化された受容体は、GDPをGTPに交換し続ける。加水分解できないGTP類似体［³⁵S］GTPγSを利用して、構成的に活性化された受容体を発現する膜への［³⁵S］GTPγSの増大した結合を示すことができる。構成的活性化を測定するために［³⁵S］GTPγS結合を用いる利点は：（ａ）それが全てのGタンパク質共役受容体に一般的に適用できること；（ｂ）それが膜表面で近接し、細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を捕らえる可能性を低くすることである。
【０１１７】
該アッセイは、問題とされる受容体を発現する膜への［³⁵S］GTPγS結合を刺激するGタンパク質共役受容体の能力を利用する。従って、該アッセイは、既知の、オーファン及び構成的に活性化されたGタンパク質共役受容体に対して候補化合物をスクリーニングする直接同定法において用いることができる。該アッセイは一般的であり、全てのGタンパク質共役受容体での薬剤発見に適応性を有する。
【０１１８】
［³⁵S］GTPγSアッセイを約0.3~約1.2nMの間の［³⁵S］GTPγS（1.2が好ましいが、結果の最適化のためにこの量を調整することができる）及び12.5~75μgの膜タンパク質（例えば、受容体を発現するCOS-7細胞；75μgが好ましいが、最適化のためにこの量を調整することができる）及び1μMのGDP（最適化のためにこの量を変えることができる）と共に 20mM HEPES及び1~約20mMの間のMgCl₂（20mMが好ましいが、結果の最適化のためにこの量を調整することができる）pH7.4、結合バッファー中で1時間インキュベーションした。次に、コムギ胚芽凝集素ビーズ（25μl；Amersham）を加え、混合物を室温でさらに30分間インキュベーションした。次に、チューブを室温で1500 x gで5分間遠心分離し、次にシンチレーションカウンターで計数した。
【０１１９】
大規模スクリーニングの要求を同様に満たす、かかる費用がより少ないが同等に適用できる代案が同定されている。Flash plates^TM及びWallac^TMシンチストリップ（scintistrip）を高処理量［³⁵S］GTPγS結合アッセイを構成するために利用することができる。さらに、この技術を用いて、アッセイを［³⁵S］GTPγS結合による効能をモニターするのと同時に受容体へのトリチウム化したリガンド結合を同時にモニターするために既知のGPCRに対して利用することができる。Wallac βカウンターは、トリチウムで標識したプローブ及び³⁵Sで標識したプローブの両方を調べるためにエネルギーウインドーを切り換えることができるのでこれが可能である。このアッセイはまた、受容体活性化をもたらす他のタイプの膜活性化事象を検出するために用いることもできる。例えば、様々な受容体（Gタンパク質共役受容体及びチロシンキナーゼ受容体の両方）の³²Pリン酸化をモニターするために該アッセイを用いることができる。膜がウェルの底に遠心分離されると、結合した［³⁵S］GTPγSまたは³²Pでリン酸化された受容体は、ウェルに被覆されているシンチラント（scintillant）を活性化する。Scinti^Rストリップ(Wallac)は、この原理を実証するために用いられている。さらに、該アッセイはまた、放射性標識したリガンドを用いて受容体へのリガンド結合を測定するためにも有用性を有する。同様に、放射性標識した結合したリガンドがウェルの底に遠心分離されると、シンチストリップ標識は放射性標識したリガンドと近接するようになり、活性化及び検出をもたらす。
【０１２０】
前述のプロトコルに基づいて、コントロール（pCMV）、内因性APJ及び非内因性APJを比較するグラフの代表的な結果を図6に記載する。
【０１２１】
２．アデニリルシクラーゼ
細胞に基づくアッセイのために設計されたFlash Plate^TMアデニリルシクラーゼキット（New England Nuclear;カタログ番号SMP004A）を未精製の細胞膜での使用のために改変した。Flash Plateウェルは、cAMPを認識する特定の抗体も含有するシンチラント被覆を含有した。ウェル中に生成したcAMPをcAMP抗体への放射性cAMPトレーサーの結合に対する直接競合により定量した。以下のものは、受容体を発現する膜におけるcAMPレベルの変化の測定のための簡潔なプロトコルとして使える。
【０１２２】
トランスフェクション後約3日目にトランスフェクションした細胞を集めた。20mM HEPES、pH 7.4及び10mM MgCl₂を含有するバッファー中での懸濁した細胞の均質化により膜を調製した。Brinkman Polytron^TMを約10秒間用いて均質化を氷上で実施した。得られたホモジネートを４℃で49,000 X gで15分間遠心分離した。得られたペレットを次に20mM HEPES、pH 7.4及び0.1mM EDTAを含有するバッファー中に再懸濁し、10秒間均質化し、続いて４℃で49,000 X gで15分間遠心分離した。得られたペレットを利用するまで-80℃で保存することができる。測定の日に、膜ペレットを室温でゆっくり解凍し、20mM HEPES、pH 7.4及び10mM MgCl₂（本明細書に記載する値が好ましいが、これらの量を最適化することができる）を含有するバッファー中に再懸濁し、0.60mg/mlの最終タンパク質濃度をもたらした（再懸濁した膜は使用するまで氷上に置いた）。
【０１２３】
ｃAMP基準及び（11mlの検出バッファーに対して2μCiのトレーサー［¹²⁵I］cAMP（100μl）を含んでなる）検出バッファーを調製し、製造業者の説明書に従って維持した。アッセイバッファーをスクリーニングのために新しく調製し、それは20mM HEPES、pH 7.4、10mM MgCl₂、20mM（Sigma）、0.1ユニット/mlクレアチンホスホキナーゼ（Sigma）、50μM GTP（Sigma）及び0.2mM ATP（Sigma）を含有し；アッセイバッファーは、利用するまで氷上で保存することができる。NEN Flashプレートに50μlのアッセイバッファーを加え、続いて50μlの膜懸濁液を加えることによりアッセイを開始した。得られたアッセイ混合物を室温で60分間インキュベーションし、続いて100μlの検出バッファーを加える。次に、プレートをさらに2-4時間インキュベーションし、続いてWallac MicroBetaシンチレーションカウンターで計数する。各アッセイプレート内に含まれる基準cAMP曲線からcAMP/ウェルの値を外挿する。前述のアッセイをMIGの分析に関して利用した。
【０１２４】
Ｂ．レポーターに基づくアッセイ
１．CREBレポーターアッセイ（Gs共役受容体）
Gs刺激を検出する方法は、cAMPに依存して活性化される転写因子CREBの既知の特性による。293または293T細胞においてGs共役活性をアッセイするためにPathDetect CREB trans-Reporting System（Stratagene、カタログ#219010）を利用した。哺乳類トランスフェクションキット（Stratagene、カタログ#200285）を製造業者の説明書に従って用いて細胞をこの上記の系のプラスミド成分及び内因性または突然変異体受容体をコードする示した発現プラスミドでトランスフェクションした。簡潔に言えば、400ngのpFR-Luc（Gal4認識配列を含有するルシフェラーゼレポータープラスミド）、40ngのpFA2-CREB（Gal4 DNA結合ドメインを含有するGal4-CREB融合タンパク質）、80ngの（受容体を含んでなる）CMV-受容体発現プラスミド及び20ngのCMV-SEAP（分泌されるアルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効率の変動を制御するためにトランスフェクションした細胞の培地において測定される）をリン酸カルシウム沈殿物中にキットの説明書どおりに合わせた。沈殿物の半分を96穴プレート中の3ウェル上に等しく分配し、細胞上で一晩保ち、翌朝新しい培地で置き換えた。トランスフェクションの開始後48時間で、上記GPR30系に関して記述したように細胞を処置し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。このアッセイをGHSRについて用いた。
【０１２５】
２．AP1レポーターアッセイ（Gq共役受容体）
Gq刺激を検出する方法は、プロモーター中にAP1要素を含有する遺伝子の活性化をもたらすGq依存性ホスホリパーゼCの既知の特性による。リン酸カルシウム沈殿物の成分が410ngのpAP1-Luc、80ngの受容体発現プラスミド及び20ngのCMV-SEAPであったことを除いて、CREBレポーターアッセイに関して上に記述したプロトコルに従ってPathdetect AP-1 cis-Reporting System（Stratagene、カタログ#219073）を利用した。このアッセイをETBR-LP2について用いた。
【０１２６】
Ｃ．細胞内IP3蓄積アッセイ
1日目に、（内因性及び突然変異させた）セロトニン受容体を含んでなる細胞を24穴プレート上に通常1 x 10⁵細胞／ウェル平板培養した。2日目に、まず第一に50μlの無血清DMEM／ウェル中0.25μgのDNAと50μlの無血清DMEM／ウェル中2μlのリポフェクトアミンを混合することにより細胞をトランスフェクションした。これらの溶液を穏やかに混合し、室温で15-30分間インキュベーションした。細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、400μlの無血清培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に加えた。次に、細胞を37℃/5％ CO₂で3-4時間インキュベーションし、次にトランスフェクション培地を除き、1ml/ウェルの通常の増殖培地で置き換えた。3日目に細胞を³H-ミオ-イノシトールで標識した。簡潔に言えば、培地を除き、細胞を0.5mlのPBSで洗浄した。次に、0.5mlのイノシトールを含まない/無血清培地（GIBCO BRL）/ウェルを0.25μCiの³H-ミオ-イノシトール/ウェルと共に加え、細胞を37℃/5％ CO₂で16-18時間インキュベーションした。4日目に細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、イノシトールを含まない/無血清培地、10μMのパルジリン、10mMの塩化リチウムを含有する0.45mlのアッセイ培地または0.4mlのアッセイ培地と50μlの10xケタンセリン（ket）を10μMの最終濃度に加えた。次に、細胞を37℃で30分間インキュベーションした。次に、細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、200μlの新しい/よく冷えた停止溶液（1M KOH；18mM ホウ酸Na；3.8mM EDTA）/ウェルを加えた。この溶液を5-10分間または細胞が溶解されるまで氷上に保ち、次に200μlの新しい/よく冷えた中和溶液（7.5％ HCL）により中和した。次に、溶解産物を1.5mlエッペンドルフチューブ中に移し、1mlのクロロホルム/メタノール（1：2）/ウェルを加えた。この溶液を15秒間ボルテックスし、上相をBiorad AG1-X8陰イオン交換樹脂（100-200メッシュ）に添加した。まず第一に、樹脂を1：1.25 W/Vで水で洗浄し、0.9mlの上相をカラム上に載せた。カラムを10mlの5mMミオ-イノシトール及び10mlの5mMホウ酸Na/60mMギ酸Naで洗浄した。イノシトールトリスリン酸塩を2mlの0.1Mギ酸/1Mギ酸アンモニウムで10mlのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアル中に溶出した。カラムを10mlの0.1Mギ酸/3Mギ酸アンモニウムで洗浄することにより再生し、dd H₂Oで2回すすぎ、水中4℃で保存した。
【０１２７】
図７は、C322K突然変異を含むヒト5-HT_2A受容体からのIP3生成の実例を示す。これらの結果は、プロリン突然変異アルゴリズム法がこの受容体を構成的に活性化することを示すが、可能性がある治療法の同定のためのスクリーニングにそのような受容体を用いる目的のためには、さらに確固たる差が好ましい。しかしながら、活性化された受容体は、構成的活性化の役割を理解し解明するため及びさらに調べることができる化合物の同定のために利用することができるので、この差はそれ自体ヒト5HT_2A受容体の内因性及び非内因性バージョンを区別することにおいて有用であると考える。
【０１２８】
Ｄ．結果の要約
試験したGPCRの結果を表Eに記載し、ここで、増加％は、内因性GPCRに比較した場合に非内因性GPCRに対して認められた結果の％差を示し；これらの値の後には利用したアッセイのタイプに関する挿入表示が続く。さらに、利用したアッセイ系を挿入して記載する（そして異なる宿主細胞を用いた場合には両方を記載する）。これらの結果が示すように、ヒトGPCRの非内因性バージョンの構成的活性を測定するために様々なアッセイを利用することができる。当業者は、前述の事項に基づきそして当該技術分野が利用できる情報を参照して、研究者の特定の必要性に適合する特定のアッセイ方法を選択すること及び／または最大限に活用することができると考えられる。
【０１２９】
【表９】

【０１３０】
実施例６
内因性オーファンGPCRの組織分布
市販されているヒト組織ドットブロット形態を用いて、内因性オーファンGPCRをそのような受容体が局在する領域を決定するためにプローブで調べた。以下に示す場合を除いて、（放射性標識した）全受容体cDNAをプローブとして用い：Ｐrime-It II^TMランダムプライマーラベリングキット（Stratagene、#300385）を製造業者の説明書に従って使用して（ベクターから切り出した）完全な受容体cDNAを用いて放射性標識したプローブを作製した。ヒトRNA Master Blot^TM（Clontech、#7770-1）にGPCR放射性標識プローブをハイブリダイズさせ、製造業者の説明書に従ってストリンジェントな条件下で洗浄した。ブロットをKodak BioMaXオートラジオグラフィーフィルムに-80℃で一晩感光させた。
【０１３１】
代表的なドットブロット形態結果を図8にGPR1（8A）、GPR30（8B）及びAPJ（8C）について示し、全ての受容体について結果を表Ｆに要約する。
【０１３２】
【表１０】

【０１３３】
前述の情報に基づき、ヒトGPCRを罹病組織における分布に関しても評価することができ；次に「正常」及び罹病組織間の比較評価を利用して罹病状態における特定の受容体の過剰発現または不十分な発現の可能性を決定することができることを記す。可能性がある治療関連性の候補化合物を直接同定するスクリーニングの目的のためにヒトGPCRの非内因性バージョンを利用することが望ましい状況において、特定のヒトGPCRが過剰発現される疾病及び疾患の処置では逆アゴニストが有用であり、一方、特定のヒトGPCRが不十分に発現される疾病及び疾患の処置ではアゴニストまたは部分アゴニストが有用であることを記す。
【０１３４】
所望に応じて、目的の受容体が発現されるこれらの組織内の特定の細胞を同定するために、当業者に周知の技術（例えばインサイチューハイブリダイゼーション）を用いて、受容体のより詳細な細胞位置決定を利用することができる。
【０１３５】
本特許書類中に挙げる特許、出願及び発行された（printed）公開の各々は、これらを全部引用することにより本明細書に組み込まれるものとする。
【０１３６】
当業者が認識するように、本発明の精神からそれずに本発明の好ましい態様に対して多数の変更及び改変を行うことができる。全てのそのような変形は本発明の範囲内に入るものとする。
【０１３７】
内因性及び非内因性ヒトGPCRの両方に利用する目的のために、様々な発現ベクターを当業者は利用できるが、利用するベクターがpCMVであることが最も好ましい。このベクターは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項により1998年10月13日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)(10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA)に寄託されている。このベクターは1998年 にATCCにより試験され、1998年 に生育できると確認された。ATCCはpCMVに以下の寄託番号: を付与している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 膜貫通ヘリックス、細胞内ループ及び細胞外ループに番号を付与したGタンパク質共役受容体の一般化構造を示す。
【図２】 典型的なGタンパク質共役受容体の活性及び不活性の２つの状態並びに第二メッセンジャー伝達経路への活性状態の連結を図式的に示す。
【図３】 制限酵素部位の位置を含む、好ましいベクターpCMVの配列表である。
【図４】 pCMV、CRE-LucレポーターのGPR6によりもたらされる活性化の非内因性の構成的に活性のあるGPR30阻害をCRE-LucレポーターのGPR6によりもたらされる活性化の内因性GPR30阻害と比較する測定されたシグナルの図示である。
【図５】 pCMV、CRE-LucレポーターのGPR3によりもたらされる活性化の非内因性の構成的に活性化されたGPR17阻害をCRE-LucレポーターのGPR3によりもたらされる活性化の内因性GPR17阻害と比較する測定されたシグナルの図示である。
【図６】 コントロールのpCMV、内因性APJ及び非内因性APJを比較する測定されたシグナルの図式結果を示す。
【図７】 非内因性ヒト5-HT_2A受容体からのIP₃生成をこの受容体の内因性バージョンと比較した場合の実例を示す。
【図８】 GPR1(8A)、GPR30(8B)及びAPJ(8C)のドットブロット形態の結果である。
【配列表】

Claims (19)

1. 内因性ヒトGタンパク質共役受容体（GPCR）の構成的に活性のある非内因性の変種を作製するための方法であって、該内因性GPCRは、膜貫通6領域及び細胞内ループ３領域を含んでなり、該方法は：
   （ａ）膜貫通６領域内のプロリン残基を含む内因性ヒトGPCRを選択すること；
   （ｂ）カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに、工程（ａ）のプロリン残基から16番目の内因性アミノ酸残基を同定すること；
   （ｃ）工程（ｂ）の同定されたアミノ酸残基を非内因性アミノ酸残基に改変して該内因性ヒトGPCRの非内因性の変種を作製すること；及び
   （ｄ）該内因性GPCRによって誘導されるシグナルと比較した場合の該非内因性の変種に関して測定した細胞内シグナルにおける差を測定することにより、工程（ｃ）の内因性ヒトGPCRの非内因性の変種が構成的に活性であるかどうかを決定すること、を含んでなる方法。
2. 非内因性の構成的に活性化されたヒトGタンパク質共役受容体に対する逆アゴニスト、アゴニスト及び部分アゴニストよりなる群から選択される化合物を直接同定する方法であって、該受容体が膜貫通６領域及び細胞内ループ３領域を含んでなり、該方法は、請求項１に記載の工程（ａ）〜（ｄ）を含み、さらに
   （ｅ）工程（ｄ）で同定された非内因性の構成的に活性のあるGPCRと候補化合物とを接触させること；及び
   （ｆ）該接触させた受容体での化合物効能の測定により、該化合物が該受容体の逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストであるかどうかを決定すること、の工程を含んでなる方法。
3. 膜貫通６領域中の該プロリン残基からカルボキシ末端〜アミノ末端の向きに2残基であるアミノ酸残基がトリプトファンである請求項１の方法。
4. カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに、前記プロリン残基から16番目の内因性アミノ酸残基がリシン残基に改変されている請求項１〜３のいずれか１項の方法。
5. カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに、前記プロリン残基から16番目の内因性アミノ酸残基がアラニン残基に改変されている請求項１〜３のいずれか１項の方法。
6. カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに、前記プロリン残基から16番目の内因性アミノ酸残基がヒスチジン残基またはアルギニン残基に改変されている請求項１〜３のいずれか１項の方法。
7. カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに、前記プロリン残基から16番目の内因性アミノ酸残基がアルギニン残基に改変されている請求項１〜３のいずれか１項の方法。
8. カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに、前記プロリン残基から16番目の内因性アミノ酸残基がヒスチジン残基に改変されている請求項１〜３のいずれか１項の方法。
9. 内因性ヒトGタンパク質共役受容体（GPCR）の構成的に活性のある非内因性の変種を作製するための方法であって、該内因性GPCRは、膜貫通6領域及び細胞内ループ３領域を含んでなり、該方法は：
   （ａ）ポリヌクレオチドを提供することであって、該ポリヌクレオチドは、内因性ヒトGPCRをコードし、該内因性GPCRは、膜貫通６領域および細胞内ループ３領域を含み、該膜貫通６領域はプロリン残基を含むこと；
   （ｂ）カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに、工程（ａ）のGPCRの該プロリン残基から16番目の内因性アミノ酸残基に対応する、該ポリヌクレオチドのコドンを同定すること；
   （ｃ）工程（ｂ）の同定されたコドンを非内因性アミノ酸残基をコードするように改変して非内因性ポリヌクレオチドを提供すること；
   （ｄ）該非内因性ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現し、それにより、該内因性ヒトGPCRの非内因性の変種を提供すること；および
   （ｅ）該内因性GPCRによって誘導されるシグナルと比較した場合の該非内因性の変種に関して測定した細胞内シグナルにおける差を測定することにより、工程（ｄ）の内因性ヒトGPCRの非内因性の変種が構成的に活性であるかどうかを決定すること、を含んでなる方法。
10. 膜貫通６領域中の該プロリン残基からカルボキシ末端〜アミノ末端の向きに2残基であるアミノ酸残基がトリプトファンである請求項９の方法。
11. 工程（ｂ）の同定されたコドンがリシンをコードするコドンに改変されている請求項９または請求項１０の方法。
12. 工程（ｂ）の同定されたコドンがアラニンをコードするコドンに改変されている請求項９または請求項１０の方法。
13. 工程（ｂ）の同定されたコドンがヒスチジンまたはアルギニンをコードするコドンに改変されている請求項９または１０の方法。
14. 工程（ｂ）の同定されたコドンがアルギニンをコードするコドンに改変されている請求項９または請求項１０の方法。
15. 工程（ｂ）の同定されたコドンがヒスチジンをコードするコドンに改変されている請求項９または請求項１０の方法。
16. 直接同定された化合物が逆アゴニストである請求項２の方法。
17. 直接同定された化合物がアゴニストである請求項２の方法。
18. 直接同定された化合物が部分アゴニストである請求項２の方法。
19. 前記化合物を製薬学的組成物中に調合する工程（ｇ）をさらに含んでなる請求項２の方法。

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