JP2003531565A - 非内因性の構成的に活性化されたヒトｇタンパク質共役受容体 - Google Patents

非内因性の構成的に活性化されたヒトｇタンパク質共役受容体

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Abstract

(57)【要約】 本明細書において開示するのは、GPCRの膜貫通-6（TM6）及び細胞内ループ-3（IC3）領域を横切る（ａ）以下のアミノ酸配列領域（C末端〜N末端の向き）及び/または（ｂ）以下の核酸配列領域（3'〜5'の向き）：それぞれ（ａ）P1 AA15X及び/または（ｂ）Pcodon (AA-codon)15 Xcodonを含んでなる内因性ヒトGタンパク質共役受容体の構成的に活性化された非内因性バージョンである。最も好ましい態様として、P1及びPcodonは、それぞれ、非内因性GPCRのTM6内に位置する内因性のプロリン及びプロリンをコードする内因性の核酸コード領域であり；AA 15及び(AA-codon)15は、それぞれ、15個の内因性アミノ酸残基及び内因性アミノ酸残基をコードする15個のコドンであり；そしてX及びXcodonは、それぞれ、非内因性GPCRのIC3内に位置する非内因性のリシン及びリシンをコードする非内因性の核酸コード領域である。これらの突然変異を含む非内因性ヒトGPCRは、哺乳類細胞中に取り込まれ、候補化合物のスクリーニングに利用されることが最も好ましいので、突然変異を含む非内因性ヒトGPCRはそれ自体精製され、単離される必要はない（すなわち、これらは哺乳類細胞の細胞膜内に含まれる）が、そのような精製され、単離された非内因性ヒトGPCRは本開示の十分に範囲内である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 1998年10月13日に出願された共通して所有する米国第09/170,496号、1997年4
月14日に出願された米国第08/839,449号（現在放棄された）、1998年4月14日に
出願された米国第09/060,188号；1998年6月26日に出願された米国仮出願第60/09
0,783号；及び1998年8月7日に出願された米国仮出願第60/095,677号の利益は本
明細書により請求される。前述の出願の各々は引用することによりそれらの全部
が本明細書に組み込まれる。
【０００２】 発明の分野 本特許書類において開示する本発明は膜貫通受容体、より詳細には、改変した
ヒトGタンパク質共役受容体(GPCR)が構成的に活性化されるように改変されてい
るGPCRに関する。最も好ましくは、改変したヒトGPCRを治療化合物のスクリーニ
ングに用いる。
【０００３】 発明の背景 多数の受容体クラスがヒトにおいて存在するが、明らかに最も豊富で且つ治療
的に関係のあるのはGタンパク質共役受容体（GPCRまたはGPCRs）クラスにより代
表される。ヒトゲノム内にはおよそ100,000個の遺伝子があると概算され、これ
らのうち約2％、すなわち2,000個の遺伝子がGPCRをコードすると見積もられる。
これらの中に、GPCRに結合する内因性リガンドが同定されている約100個のGPCR
がある。内因性GPCR及びその内因性リガンドの発見の間に存在する著しい時間的
ずれのために、残りの1,900個のGPCRは、これらの受容体の内因性リガンドが同
定されるずっと前に同定され、特性化されると推定することができる。実際、ヒ
トゲノムプロジェクトが100,000個のヒト遺伝子をシークエンスしている迅速さ
は、残りのヒトGPCRが次の数年以内に完全にシークエンスされることを示す。そ
れにもかかわらず、そしてヒトゲノムをシークエンスする努力にもかかわらず、
ヒト症状を改善し、良くするために科学者等がどのようにこの情報を迅速に、効
果的に且つ効率よく利用することができるかに関してまだ非常に不明瞭である。
本発明はこの重要な目的に適合する。
【０００４】 GPCRを包含する、内因性リガンドが同定されている受容体は「既知の」受容体
と呼ばれ、一方、内因性リガンドが同定されていない受容体は「オーファン」受
容体と呼ばれる。この区別は、特にGPCRの場合、単に語義ではない。GPCRは製薬
学的製品の開発のための重要な分野であり：100個の既知のGPCRのうち約20個か
ら、全ての処方製薬の60％が開発されている。従って、オーファンGPCRは製薬産
業にとって、19世紀末期に金がカリフォルニアにとってそうであったこと-成長
、拡張、拡大及び発展を導く機会である。しかしながら、新規な治療法の開発に
関してオーファン受容体には重大な欠点が存在する。これは、製薬の発見及び開
発への伝統的な方法が受容体及びその内因性リガンドの両方の入手を必要として
いるからである。従って、これまで、オーファンGPCRは製薬の発見のための興味
をかき立てる未開発の供給源を当該技術分野に示している。
【０００５】 可能性がある治療法の発見への伝統的な方法では、一般に受容体が最初に同定
されると言える。薬剤発見努力を開始できる前に、典型的には、該受容体の内因
性リガンドを同定し、単離し、作製するために複雑で、多くの時間を必要とし且
つ費用のかかる手続きが行われ（put into place）、この手続きは受容体当たり
約500万ドル（U.S.）の費用で受容体当たり３〜10年を必要とする可能性がある
。これらの時間及び財源は、薬剤発見への伝統的方法が開始できる前に使い果た
されるはずである。これは、伝統的な薬剤発見技術が、内在性リガンドが受容体
に結合するのを妨げる化合物（「アンタゴニスト」）または受容体に結合するリ
ガンドの作用を高めるかもしくは模倣する化合物（「アゴニスト」）のいずれか
を発見しようと努力して推定の治療因子が受容体に対して「スクリーニングされ
る」、いわゆる「競合結合アッセイ」に依存するからである。全体的な目的は、
リガンドが受容体に結合した場合に細胞活性化を妨げる化合物（アンタゴニスト
）またはリガンドが受容体と正しく結合している場合にそうでなければ生じる細
胞活性を高めるかもしくは上げる化合物（アゴニスト）を同定することである。
オーファンGPCRの内因性リガンドは自明のこととして同定されていないので、伝
統的な薬剤発見技術を用いてこれらの受容体に対する新規で且つ独特な治療法を
発見できることはあり得ない。本発明は、以下にさらに詳細に記述するように、
そのような伝統的な薬剤発見技術によりもたらされるこれら及び他の深刻な制約
を克服する。
【０００６】 GPCRは共通の構造モチーフを共有する。これらの受容体は全て、７個のαヘリ
ックスを形成する22〜24個の間の疎水性アミノ酸の7配列を有し、それらの各々
は膜にまたがる（各スパンは番号により同定される、すなわち、膜貫通-1（TM-1
）、膜貫通-2（TM-2）等）。これらの膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外側、すな
わち「細胞外」側で膜貫通-2と膜貫通-3、膜貫通-4と膜貫通-5、そして膜貫通-6
と膜貫通-7の間でアミノ酸の鎖により連結されている（これらはそれぞれ「細胞
外」領域１、２及び３（EC-1、EC-2及びEC-3）と呼ばれる）。膜貫通ヘリックス
はまた、細胞膜の内側、すなわち「細胞内」側で膜貫通-1と膜貫通-2、膜貫通-3
と膜貫通-4、そして膜貫通-5と膜貫通-6の間でアミノ酸の鎖により連結されてい
る（これらはそれぞれ「細胞内」領域１、２及び３（IC-1、IC-2及びIC-3）と呼
ばれる）。受容体の「カルボキシ」（「C」）末端は細胞内の細胞内空間にあり
、そして受容体の「アミノ」（「N」）末端は細胞の外側の細胞外空間にある。G
タンパク質共役受容体の一般構造を図１に示す。
【０００７】 一般に、内因性リガンドが受容体と結合すると（多くの場合、受容体の「活性
化」と呼ばれる）、細胞内領域の構造の変化があり、これは細胞内領域と細胞内
「Gタンパク質」間の共役を与える。他のGタンパク質も存在するが、現在、Gq、
Gs、Gi及びGoが同定されているGタンパク質である。内因性リガンドにより活性
化されたGタンパク質と共役するGPCRは、シグナリングカスケードプロセスを開
始する（「シグナル伝達」と呼ばれる）。通常の条件下で、シグナル伝達は最終
的に細胞活性化または細胞阻害をもたらす。受容体のIC-3ループ並びにカルボキ
シ末端がGタンパク質と相互作用すると考えられる。本発明の主要な焦点は、GPC
Rの膜貫通-6(TM6)領域及び細胞内-3(IC3)領域に向けられる。
【０００８】 生理的条件下で、GPCRは２つの異なる構造：「不活性」状態及び「活性」状態
間で平衡を保って細胞膜中に存在する。図２に図式的に示すように、不活性状態
の受容体は、細胞内シグナリング伝達経路に連結して生物学的応答を引き起こす
ことができない。受容体構造を活性状態に変えることにより（Gタンパク質を介
して）伝達経路に連結され、生物学的応答を引き起こす。
【０００９】 受容体は、内因性リガンドまたは薬剤のような化合物により活性状態に安定さ
せることができる。受容体のアミノ酸配列に対する改変を包含するがこれだけに
限定されるものではない最近の発見は、活性状態構造の受容体を増進し安定させ
るために内因性リガンドまたは薬剤以外の手段を提供する。これらの手段は、受
容体に結合する内因性リガンドの作用をまねることにより活性状態の受容体を効
果的に安定させる。そのようなリガンドに依存しない手段による安定化は、「構
成的受容体活性化」と呼ばれる。
【００１０】 上述のように、スクリーニング目的のためのオーファン受容体の使用はあり得
なかった。これは、化合物のスクリーニングに関する伝統的な「原則」が、受容
体のリガンドが既知であることを要求するからである。従って、自明のこととし
て、この方法はオーファン受容体に関して適用性がない。従って、治療法の発見
へのこの独断的な方法に固執することにより、当該技術分野は、本質的に、受容
体の内因性リガンドが発見されるまでオーファン受容体の使用をやめるように教
示し且つ教示されてきた。概算して2,000個のGタンパク質共役受容体があり、こ
れらの大多数がオーファン受容体であることを考えれば、そのような原則は、治
療法の発見への独創的で独特な異なる方法を訂正する。
【００１１】 様々なGPCRの核酸及び／またはアミノ酸配列に関する情報を以下の表Aに要約
する。本明細書において開示する本発明の重要な焦点はオーファンGPCRに向けら
れるので、以下に記載する参考文献の多くはオーファンGPCRに関連する。しかし
ながら、この表は、本明細書において開示する本発明がオーファンGPCRまたは以
下に記載する特定のGPCRにのみ適用できることを意味するものではなく、またこ
の表は、法的にせよそうでないにせよ、そのように解釈されるべきではない。さ
らに、単離されているある種の受容体は公開自体の主題ではなく；例えば、GPCR
を載せている「ワールド-ワイドウエッブ（world-wide web）」上のGタンパク質
共役受容体データベース（指定された発明者も譲受人もこのサイトといかなる関
係もない）を参照する。他のGPCRは本譲受人により所有される特許出願の主題で
あり、これらは以下に記載されていない（GPR3、GPR6及びGPR12を包含する；米
国仮第60/094879号を参照）。
【００１２】
【表１】
【００１３】 以下にさらに詳細に記述し、開示するように、ヒトGPCRの内因性配列を改変する
ための突然変異カセットの利用により、ヒトGPCRの構成的に活性化されたバージ
ョンがもたらされる。ヒトGPCRのこれらの非内因性の構成的に活性化されたバー
ジョンは、とりわけ、例えば治療関連性の化合物を直接同定するための候補化合
物のスクリーニングに利用することができる。
【００１４】 発明の要約 本明細書において開示するのは、GPCRの膜貫通-6（TM6）及び細胞内ループ-3
（IC3）領域を横切る（ａ）最も好ましいアミノ酸配列領域として（C末端〜N末
端の向き）、そして/または（ｂ）最も好ましい核酸配列領域として（3'〜5'の
向き）： （ａ）P1AA15X ここで： （１）P1はGPCRのTM6領域内に位置するアミノ酸残基であり、ここで、P1は（ｉ
）内因性GPCRのプロリン残基及び（ii）プロリン以外の非内因性アミノ酸残基よ
りなる群から選択される； （２）AA15は（ａ）内因性GPCRのアミノ酸、（ｂ）非内因性アミノ酸残基並びに
（ｃ）内因性GPCRのアミノ酸及び非内因性アミノ酸の組み合わせよりなる群から
選択される15個のアミノ酸であり、ただし、GPCRのTM6領域内に位置する15個の
内因性アミノ酸残基のいずれもプロリンでない；そして （３）Xは該GPCRのIC3領域内に位置する非内因性アミノ酸残基であり、好ましく
はリシン、ヒスチジン及びアルギニンよりなる群から選択され、最も好ましくは
リシンであり、ただし、位置Xの内因性アミノ酸がリシンである場合には、Xはリ
シン以外のアミノ酸、好ましくはアラニンである 及び/または （ｂ）Pcodon (AA-codon)15 Xcodon ここで： （１）PcodonはGPCRのTM6領域内の核酸配列であり、ここで、Pcodonは（ｉ）内
因性GPCRのプロリン残基及び（ii）プロリン以外の非内因性アミノ酸残基よりな
る群から選択されるアミノ酸をコードする； （２）(AA-codon)15は（ａ）内因性GPCRのアミノ酸、（ｂ）非内因性アミノ酸残
基並びに（ｃ）内因性GPCRのアミノ酸及び非内因性アミノ酸の組み合わせよりな
る群から選択される15個のアミノ酸をコードする15個のコドンであり、ただし、
GPCRのTM6領域内の15個の内因性コドンのいずれもプロリンアミノ酸残基をコー
ドしない；そして （３）Xcodonは該GPCRのIC3領域内に位置する領域残基をコードする核酸であり
、ここで、Xcodonは非内因性アミノ酸、好ましくは、リシン、ヒスチジン及びア
ルギニンよりなる群から選択される非内因性アミノ酸、最も好ましくはリシンで
をコードし、ただし、位置Xcodonの内因性コード領域がアミノ酸リシンをコード
する場合には、Xcodonはリシン以外のアミノ酸、好ましくはアラニンをコードす
る を含んでなる非内因性のヒトGタンパク質共役受容体である。 これらの配列カセットに関連する内因性及び非内因性という用語は、内因性GPCR
に関してである。例えば、いったん内因性プロリン残基が特定のGPCRのTM6領域
内に位置決定され、それから16番目のアミノ酸が受容体を構成的に活性化する突
然変異のために同定されると、プロリン残基が突然変異されないことが最も好ま
しいが、この内因性のプロリン残基を突然変異させることもまた可能である（す
なわち、いったんマーカーが位置決定され、そして突然変異させる16番目のアミ
ノ酸が同定されると、マーカー自体を突然変異させることができる）。同様に、
AA15はそれらの内因性形態で保たれることが最も好ましいが、これらのアミノ酸
もまた突然変異させることができる。ヒトGPCRの非内因性バージョンにおいて突
然変異させなければならない唯一のアミノ酸はXであり、すなわち、本明細書に
おいてさらに開示するように、P1から16残基である内因性アミノ酸はその内因性
形態で保つことができず、突然変異させなければならない。再び言明すると、ヒ
トGPCRの非内因性バージョンにおいて、P1及びAA15はそれらの内因性形態のまま
である（すなわち、それらの野性型形態と同一である）ことが好ましいが、いっ
たんXが同定され、突然変異されると、P1及びAA15のいずれか及び/または全てを
突然変異させることができる。これは核酸配列にも同様に当てはまる。位置Xの
内因性アミノ酸がリシンである場合、そのようなGPCRの非内因性バージョンにお
いて、Xはリシン以外のアミノ酸、好ましくはアラニンである。
【００１５】 従って、仮定の例として、内因性GPCRが上記の位置で以下の内因性アミノ酸配
列：P-AACCTTGGRRRDDDE-Q を有する場合、以下の代表的な仮定のカセットはいず
れも本開示の範囲内に入る（非内因性アミノ酸をボールド体で記述する）： Ｐ−ＡＡＣＣＴＴＧＧＲＲＲＤＤＤＥ−Ｋ Ｐ−ＡＡＣＣＴＴＨＩＧＲＲＤＤＤＥ−Ｋ Ｐ−ＡＤＥＥＴＴＧＧＲＲＲＤＤＤＥ−Ａ Ｐ−ＬＬＫＦＭＳＴＷＺＬＶＡＡＰＱ−Ｋ Ａ−ＬＬＫＦＭＳＴＷＺＬＶＡＡＰＱ−Ｋ AA15内にアミノ酸残基を付加することもまた可能であるが、そのような方法は特
に提示されない。実際、最も好ましい態様として、ヒトGPCRの内因性バージョン
と比較した場合にそのGPCRの非内因性バージョンにおいて異なる唯一のアミノ酸
は位置Xのアミノ酸であり；このアミノ酸自体の突然変異が受容体の構成的活性
化を導く。
【００１６】 従って、特に好ましい態様として、P1及びPcodonはそれぞれ内因性プロリン及
びプロリンをコードする内因性核酸コード領域であり；そしてX及びXcodonはそ
れぞれ非内因性のリシンまたはアラニン及びリシンまたはアラニンをコードする
非内因性核酸コード領域であり、リシンが最も好ましい。これらの突然変異を含
むヒトGPCRの非内因性バージョンは哺乳類細胞中に取り込まれ、候補化合物のス
クリーニングに利用されることが最も好ましいので、突然変異を含む非内因性ヒ
トGPCRはそれ自体精製され、単離される必要はない（すなわち、これらは哺乳類
細胞の細胞膜内に含まれる）が、そのような精製され、単離された非内因性ヒト
GPCRは本開示の十分に範囲内である。非内因性ヒトGPCRを含む遺伝子ターゲッテ
ィングした及びトランスジェニックの非ヒト哺乳類（好ましくはラット及びマウ
ス）もまた本発明の範囲内であり；特に、遺伝子ターゲッティングした哺乳類は
、これらの動物が非ヒト哺乳類の内因性GPCRをコードする領域の代わりにヒトGP
CRの非内因性バージョンを含む点で最も好ましい（非ヒト哺乳類のタンパク質コ
ード領域をヒトコード領域で置き換えるためにそのような非ヒト哺乳類を作製す
る技術は周知である；例えば米国特許第5,777,194号を参照）。
【００１７】 内因性ヒトGPCRに対するこれらの変異はGPCRを構成的に活性にし、その結果、
本明細書においてさらに開示するように、ヒトGPCRの非内因性の構成的に活性化
されたバージョンを、とりわけ、内因性リガンドの必要なしに候補化合物の直接
スクリーニングに利用できることが発見された。従って、これらの材料を用いる
方法及びこれらの方法により同定される生成物もまた以下の開示の範囲内である
。
【００１８】 詳細な記述 受容体に関して出ている科学文献は、受容体に対して様々な作用を有するリガ
ンドを表すために多数の用語を採用している。明瞭化及び一貫性のために、以下
の定義を本特許書類の全体にわたって用いる。これらの定義がこれらの用語の他
の定義と矛盾するのであれば、以下の定義が支配するものとする： アゴニストは、受容体に結合すると細胞内応答を活性化するかまたは膜へのGT
P結合を高める化合物を意味するものとする。
【００１９】 本明細書において用いるアミノ酸省略形を以下に示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】 部分アゴニストは、受容体に結合すると細胞内応答をアゴニストより少ない度
合い/程度に活性化するかまたは膜へのGTP結合をアゴニストより少ない度合い/
程度に高める化合物を意味するものとする。
【００２２】 アゴニストは、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合するが、受容体
の活性形態により開始される細胞内応答を活性化せず、それによりアゴニストま
たは部分アゴニストによる細胞内応答を阻害することができる化合物を意味する
ものとする。アンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下で
の基準細胞内応答を減少させない。
【００２３】 候補化合物は、スクリーニング技術が容易にできる分子を意味するものとする
（例えば、限定ではなく、化学化合物）。好ましくは、「候補化合物」という語
句には、間接的同定方法により以前に決定されたような、受容体に対する逆アゴ
ニスト、アゴニストまたはアンタゴニストよりなる群から選択される化合物であ
ることが公的に既知であった化合物（「間接的に同定された化合物」）は包含さ
れず；より好ましくは、少なくとも１つの哺乳類において治療効能を有すること
が以前に決定されている間接的に同定された化合物は包含されず；そして最も好
ましくは、ヒトにおいて治療有用性を有することが以前に決定されている間接的
に同定された化合物は包含されない。
【００２４】 コドンは、一般にリン酸基に結合したヌクレオシド（アデノシン(A)、グアノ
シン(G)、シチジン(C)、ウリジン(U)及びチミジン(T)）を含んでなり、翻訳され
た場合にアミノ酸をコードする3個のヌクレオチド（またはヌクレオチドの同等
物）のグループを意味するものとする。
【００２５】 化合物効能は、受容体結合親和性とは対照的に、受容体機能性を阻害するかま
たは刺激する化合物の能力の測定を意味するものとする。化合物効能を検出する
好ましい手段は、本特許書類の実施例の節においてさらに開示するように、例え
ば［35S］GTPγS結合の測定による。
【００２６】 構成的に活性化された受容体は、構成的受容体活性化を受ける受容体を意味す
るものとする。本明細書において開示する本発明では、非内因性の構成的に活性
化されたヒトGタンパク質共役受容体は、以下にさらに詳細に記述するように、
アミノ酸カセットP1AA15Xを含むように突然変異されているものである。
【００２７】 構成的受容体活性化は、受容体の内因性リガンドまたはその化学的同等物と受
容体との結合以外の手段による活性状態の受容体の安定化を意味するものとする
。好ましくは、本明細書において開示する本発明の構成的受容体活性化を受けた
Gタンパク質共役受容体は、そのGPCRの内因性形態と比較した場合に構成的活性
化に関して測定したシグナルに対する応答の少なくとも10％の差（場合によって
、増加または減少）、より好ましくは、そのような比較応答の約25％の差、最も
好ましくはそのような比較応答の約50％の差を示す。候補化合物を直接同定する
目的のために用いる場合、選択した候補化合物間を区別するために十分な差が内
因性シグナルと非内因性シグナル間であるようにシグナルの差が少なくとも約50
％であることが最も好ましい。大部分の場合において、「差」はシグナルの増加
であるが；しかしながら、Gs共役GPCRに関しては、以下にさらに詳細に記述する
ように、測定される「差」は好ましくは減少である。
【００２８】 接触または接触するは、インビトロ系にせよインビボ系にせよ、少なくとも２
つの成分を一緒にすることを意味するものとする。
【００２９】 「候補化合物」という語句に関連して、直接同定するまたは直接同定されたは
、構成的に活性化されたGタンパク質共役受容体に対する候補化合物のスクリー
ニング及びそのような化合物の化合物効能を評価することを意味するものとする
。この語句は、いかなる状況下でも、「間接的に同定する」または「間接的に同
定された」という語句により包含されるかまたはそれを包含すると解釈されるか
または理解されるべきではない。
【００３０】 内因性のは、種のゲノムにより生来生産される物質を意味するものとする。例
えば、限定ではなく、GPCRに関して内因性のは、ヒト、昆虫、植物、細菌または
ウイルスにより生来生産されるものを意味するものとする。それに反して、これ
に関連して非内因性のという用語は、種のゲノムにより生来生産されないものを
意味するものとする。例えば、限定ではなく、最も好ましくは、内因性形態では
構成的に活性でないが、本明細書において開示するカセットを用いることにより
突然変異させると、その後、構成的に活性になる受容体が、本明細書において「
非内因性の構成的に活性化された受容体」と呼ばれる。両方の用語を「インビボ
」及び「インビトロ」系の両方を表すために利用することができる。例えば、限
定ではなく、スクリーニング方法において、内因性または非内因性受容体は、受
容体が哺乳類細胞の細胞表面上に発現されるインビトロスクリーニング系に関し
てであることができる。さらなる例として、限定ではなく、哺乳類のゲノムが非
内因性の構成的に活性化された受容体を含むように操作されている場合、インビ
ボ系の手段による候補化合物のスクリーニングが実行可能である。
【００３１】 宿主細胞は、その中にプラスミド及び／またはベクターを含むことができる細
胞を意味するものとする。原核生物宿主細胞の場合、プラスミドは典型的に宿主
細胞が複製する場合に自律的分子として複製され（一般に、プラスミドは真核生
物宿主細胞中への導入のためにその後単離される）；真核生物宿主細胞の場合、
プラスミドは、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミドが複製するように
宿主細胞の細胞DNA中に組込まれる。好ましくは、本明細書において開示する本
発明の目的のために、宿主細胞は真核生物の、より好ましくは哺乳類のであり、
最も好ましきは293、293T及びCOS-7細胞よりなる群から選択される。
【００３２】 間接的に同定するまたは間接的に同定されたは、内因性受容体に特異的な内因
性リガンドの同定、リガンド-受容体相互作用を妨げるもの及び／またはそれと
競合するものを決定するための受容体に対する候補化合物のスクリーニング並び
に活性化された受容体と関連する少なくとも１つの第二メッセンジャー経路に影
響を及ぼすことに関して化合物の効能を評価することを含む薬剤発見プロセスへ
の伝統的な方法を意味する。
【００３３】 「応答」という用語に関連して阻害するまたは阻害しているは、化合物の非存
在下とは対照的に化合物の存在下で応答が減少されるかまたは妨げられることを
意味するものとする。
【００３４】 逆アゴニストは、受容体の内因性形態または受容体の構成的に活性化された形
態のいずれかに結合し、受容体の活性形態により開始される基準細胞内応答をア
ゴニストもしくは部分アゴニストの非存在下で認められる活性の通常基礎レベル
未満に阻害するかまたは膜へのGTP結合を減少させる化合物を意味するものとす
る。好ましくは、基準細胞内応答は、逆アゴニストの非存在下での基準応答と比
較した場合に、逆アゴニストの存在下で少なくとも30％、より好ましくは少なく
とも50％、最も好ましくは少なくとも75％阻害される。
【００３５】 既知の受容体は、その受容体に特異的な内因性リガンドが同定されている内因
性受容体を意味するものとする。
【００３６】 リガンドは、内因性の天然に存在する受容体に特異的な内因性の天然に存在す
る分子を意味するものとする。
【００３７】 内因性受容体の核酸及び／またはアミノ酸配列に関する突然変異体または突然
変異は、内因性の構成的に活性化されていない受容体の突然変異形態が受容体の
構成的活性化を示すような、そのような内因性配列に対する特定の１つの変異ま
たは複数の変異を意味するものとする。特定の配列の同等物に関して、（ａ）受
容体の次に突然変異させた形態の構成的活性化のレベルが受容体の第一の突然変
異により示されるものと実質的に同じである場合；そして（ｂ）受容体の次に突
然変異させた形態と受容体の第一の突然変異の間の配列（アミノ酸及び／または
核酸）相同性％が少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％、最も好
ましくは少なくとも95％である場合、ヒト受容体の次に突然変異させた形態はヒ
ト受容体の第一の突然変異と同等であると考えられる。理想的には、そして構成
的活性化を行うために本明細書において開示する最も好ましいカセットはGPCRの
内因性及び非内因性形態間で単一のアミノ酸及び／またはコドン変異（すなわち
、XまたはXcodon）を含むということのために、配列相同性％は少なくとも98％
であるはずである。
【００３８】 オーファン受容体は、その受容体に特異的な内因性リガンドが同定されていな
いかまたは既知でない内因性受容体を意味するものとする。
【００３９】 製薬学的組成物は、少なくとも１つの有効成分を含んでなる組成物を意味する
ものとし、それにより組成物は哺乳類（例えば、限定ではなくヒト）における特
定の有効な結果に関して容易に調べることができる。当業者は、当業者の必要性
に基づいて有効成分が所望する有効な結果を有するかどうかを決定するために適
当な技術を理解し、認識する。
【００４０】 プラスミドは、ベクターとcDNAの組み合わせを意味するものとする。一般に、
プラスミドは、複製及び／またはタンパク質としてのcDNAの発現の目的のために
宿主細胞中に導入される。
【００４１】 「応答」という用語に関連して、刺激するまたは刺激しているは、化合物の非
存在下とは対照的に化合物の存在下で応答が増加されることを意味するものとす
る。
【００４２】 特定の核酸配列または特定のアミノ酸配列のいずれかに関して、横切るまたは
横切っているは、該配列が少なくとも２つの異なる特定の領域内に位置すること
を意味するものとする。例えば、10個の成分のうち3個がGPCRのTM6領域中であり
、そして残りの7個の成分がGPCRのIC3領域中である、10アミノ酸成分の長さであ
るアミノ酸配列において、この10アミノ酸成分はGPCRのTM6及びIC3領域を横切る
と記述することができる。
【００４３】 ｃDNAに関連するベクターは、少なくとも１つのcDNAを含むことができ且つ宿主
細胞中に取り込むことができる環状DNAを意味するものとする。
【００４４】 以下の節の順序は表象的効率のために記述され、以下の開示または請求に対す
る限定として意図されず、また解釈されるべきではない。 Ａ．概論 受容体の伝統的研究は、いつも、受容体に作用することができるアンタゴニス
ト及び他の分子を発見により次に見出すことができるより前にまず内因性リガン
ドが同定されなければならないという（歴史的に基づく）前提から生じている。
アンタゴニストが最初に既知である可能性がある場合でさえ、探索はすぐに内因
性リガンドを探すことに及ぶ。この考え方は、構成的に活性化された受容体の発
見後でさえ受容体研究において存続している。これまで認識されていないことは
、受容体のアゴニスト、部分アゴニスト及び逆アゴニストを見出すために最も有
用であるのは受容体の活性状態であるということである。過度に活性である受容
体または不十分に活性である受容体に起因する疾病に対して、治療薬において所
望されるものは、それぞれ、受容体の活性状態を減らすかまたは受容体の活性を
高めるように作用する化合物であり、必ずしも内因性リガンドに対するアンタゴ
ニストである薬剤ではない。これは、活性のある受容体状態の活性を減らすまた
は高める化合物は内因性リガンドと同じ部位で結合する必要がないからである。
従って、本発明の方法により教示されるように、治療化合物のあらゆる探索は、
リガンドに依存しない活性状態に対して化合物をスクリーニングすることにより
出発するはずである。
【００４５】 非内因性の構成的に活性化されたGPCRに対して候補化合物をスクリーニングす
ることにより、受容体の内因性リガンドのいかなる事前の知識または使用も必要
とせずに、これらの細胞表面受容体で作用する候補化合物を直接同定することが
できる。そのようなGPCRの内因性バージョンが発現される及び／または過剰に発
現される体内の領域を決定することにより、これらの受容体の発現及び／または
過剰発現と関係する関連疾病／疾患状態を決定することが可能であり；そのよう
な方法を本特許書類において開示する。 Ｂ．疾病／疾患の同定及び／または選択 最も好ましくは、本発明の材料を用いて非内因性の構成的に活性化されたGPCR
に対する逆アゴニストを同定することができる。そのような逆アゴニストは、こ
れらの受容体に関連する疾病を処置するための薬剤発見プログラムにおける先導
化合物（lead compound）として理想的な候補である。これらの受容体に対する
逆アゴニスト、部分アゴニストまたはアゴニストを直接同定することができ、そ
れにより製薬学的組成物を開発することができるので、これらの受容体と関連す
る疾病及び疾患の検索が可能である。例えば、これらの受容体の存在に関して罹
病及び正常組織サンプルの両方を詳しく調べることは、今や学究的試行またはオ
ーファン受容体の場合には内因性リガンドを同定する道筋に沿って実施されるか
もしれないもの以上になる。組織精査は、広範囲の健康な組織及び罹患組織にわ
たって実施することができる。そのような組織精査は、疾病及び／または疾患と
特定の受容体とを結び付けることにおける好ましい第一段階を与える。
【００４６】 好ましくは、組織サンプルにおけるGPCRの発現の放射性標識したcDNAまたはRT
-PCR同定のいずれかのプローブを作製するために内因性GPCRのDNA配列を用いる
。好ましくは、罹病組織における受容体の存在または正常組織と比較して罹病組
織における増大したもしくは減少した濃度での受容体の存在を、その疾病との相
関関係を同定するために利用することができる。この技術により受容体を器官の
全域に同等に適切に位置決定することができる。受容体が位置決定される特定の
組織の既知の機能に基づき、受容体の一般に考えられる機能的役割を推定するこ
とができる。 Ｃ．「ヒトGPCRプロリンマーカー」アルゴリズム及び非内因性の構成的に活性の
あるヒトGPCRの作製 バイオテクノロジー技術に立ち向かう多くの難題の中に、ある種から遺伝情報
を収集し、そしてその情報を別の種に相関させることに関して予測できないこと
があり、この問題は、この技術のいかなるところにも核酸及びタンパク質をコー
ドする遺伝子配列におけるほど厄介な悪化を示さない。従って、一貫性のため、
そしてこの技術の非常に予測できない性質のために、以下の発明は、哺乳類に関
してはヒトGPCRに限定され、他の哺乳類種への本発明の適用性は、潜在的可能性
はあるが、単なる機械的適用を超えると考えられる。
【００４７】 一般に、ある関連したタンパク質配列から別のものにまたはある種から別のも
のに共通の「規則」を適用しようとする場合、当該技術は典型的に配列整列に頼
っており、すなわち、配列を線状にし、次に２つまたはそれ以上の配列間の共通
の性質の領域を見い出そうと試みる。有用ではあるが、この方法はいつも意味の
ある情報をもたらすとは限らない。GPCRの場合、一般的な構造モチーフは全ての
GPCRに対して同一であるが、TM、EC及びICの長さの変動は、あるGPCRから別のも
のにそのような整列方法をせいぜい困難にする。従って、例えば構成的活性化へ
の一貫した方法をあるGPCRから別のものに適用することが望ましい可能性がある
が、あるGPCRから次のものへの配列の長さ、正確さ等の大きな違いのために、一
般的に適用でき容易にうまくいく突然変異整列方法は本質的にあり得ない。類似
として、そのような方法は、縮尺または距離マーカーが地図のどこにもなく、旅
行者に地点Bへの多数の異なる地図を与えることにより地点Aで旅行者に旅行を開
始させ、次にそれらの地図を用いることによってのみ目的地Bへの最短で且つ最
も効率のよい経路を見出すように旅行者に求めることと同じである。そのような
状況において、この作業は、（ａ）各地図上の共通の「場所マーカー」及び（ｂ
）その場所マーカーから目的地Bへの距離を測定する能力を有することにより容
易に簡単にすることができ、従って、これにより旅行者は出発地点Ａから目的地
Ｂへの最も効率のよいものを選択することができる。
【００４８】 本質的に、本発明の特徴は、ヒトGPCRの構成的に活性のある形態を容易に作製
することができるヒトGPCR内のそのような位置を提供することである。
【００４９】 当業者が認識するように、細胞の膜貫通領域は非常に疎水性であり；従って、
標準的な疎水性プロット技術を用いて、当業者はGPCRのTM領域、特にTM6を容易
に決定することができる（この同じ方法は、GPCRのEC及びIC領域を決定すること
にも適用できる）。ヒトGPCRのTM6領域内で、（一般にTM6の真ん中近くの）共通
のプロリン残基が構成的活性化「マーカー」の役割を果たすことが発見された。
このプロリンマーカーから15アミノ酸を数えることにより、（IC3ループ中に位
置する）16番目のアミノ酸が、その内因性形態から非内因性形態に突然変異させ
ると、受容体の構成的活性化を導く。便宜上、これを「ヒトGPCRプロリンマーカ
ー」アルゴリズムと称する。この位置の非内因性アミノ酸はアミノ酸のいずれで
あってもよいが、最も好ましくは、非内因性アミノ酸はリシンである。いかなる
理論によっても拘束されることを望まないが、我々は、この位置自体が独特であ
り、そしてこの位置での突然変異は構成的活性化を与えるように受容体に影響を
与えると考える。
【００５０】 例えば、16番目の位置の内因性アミノ酸がすでにリシンである場合（GPR4及び
GPR32がそうであるが）、Xが非内因性アミノ酸であるためには、それはリシン以
外でなければならず；従って、内因性GPCRが16番目の位置で内因性のリシン残基
を有する状況では、そのGPCRの非内因性バージョンは、好ましくは、この位置で
リシン以外のアミノ酸、好ましくはアラニン、ヒスチジン及びアルギニンを含む
ことを特筆する。さらに重要なことに（of further note）、GPR4はGsに共役し
、その内因性形態で活性であるようであると決定された（データは示さない）。
【００５１】 （天然に存在しないアミノ酸の使用もまた実行可能であるが）20個の天然に存
在するアミノ酸しかないので、この16番目の位置での置換のために特定の非内因
性アミノ酸の選択は実行可能であり、研究者の要求に適合する非内因性アミノ酸
を効率よく選択することができる。しかしながら、記載したように、16番目の位
置のより好ましい非内因性アミノ酸はリシン、ヒスチジン、アルギニン及びアラ
ニンであり、リシンが最も好ましい。当業者は、所望する突然変異を行うために
コドンの配列を変える熟練した方法を容易に決定することができると考えられる
。
【００５２】 いつもとは限らないが、時折、TM6中でプロリン残基マーカーの前にW2が位置
すること（すなわち、W2P1AA15X）もまた見出され、ここで、Wはトリプトファン
であり、２はあらゆるアミノ酸残基である。
【００５３】 我々の発見は、とりわけ、当該技術分野により一般的に用いられる予測できず
且つ面倒な配列整列法の必要性を否定する。実際、我々の発見の長所は、アルゴ
リズムが事実上あるが（while an algorithm in nature）、独特で且つ非常に有
用な最終生成物、すなわち、ヒトGPCRの構成的に活性化されたバージョンを得る
ために、当業者が熟練した扱いやすさで、ヒトGPCRにそれを容易に適用できるこ
とである。ヒトゲノムプロジェクトが明らかにしているヒトGPCRの内因性リガン
ドを決定するためには多年及びかなりの額の金銭が必要とされるので、開示した
本発明は、この配列情報を実践的に利用するために必要な時間を減らすだけでな
く、著しく費用を節減する。この方法は、例えば疾病におけるGPCRの役割を理解
するためだけではなく、ヒト症状を改善する機会を与えるためにも遺伝子情報の
利用を可能にするので、ヒトゲノムプロジェクトの重要性を適切に実証する。 Ｄ．候補化合物のスクリーニング １．一般的なGPCRスクリーニングアッセイ技術 Gタンパク質受容体が構成的に活性になると、それはGタンパク質（例えばGq、Gs
、Gi、Go）に共役し、GDPの遊離及び続いて起こるGタンパク質へのGTPの結合を
刺激する。Gタンパク質は次にGTPアーゼとして働き、GTPをGDPにゆっくり加水分
解し、それにより受容体は通常の条件下で非活性化されるようになる。しかしな
がら、本発明の非内因性の構成的に活性のあるヒトGPCRを包含する構成的に活性
化された受容体は、GDPをGTPに交換し続ける。GTPの加水分解できない類似体［3 5 S］GTPγSは、構成的に活性化された受容体を発現する膜上に存在するGタンパ
ク質への増大した結合をモニターするために用いることができる。［35S］GTPγ
Sは、リガンドの非存在下及び存在下で膜へのGタンパク質結合をモニターするた
めに使用できることが報告されている。このモニタリングの例は、当業者が周知
で且つ利用できる他の例の中、1995年にTraynor及びNahorskiにより報告された
。このアッセイ系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のGタンパク
質にかかわらず全てのGタンパク質共役受容体に一般的に適用できるので、この
系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリーニングに対してである。
【００５４】 B 2. 特定のGPCRスクリーニングアッセイ技術 C 「一般的な」Gタンパク質共役受容体アッセイ（すなわち、アゴニスト、部
分アゴニストまたは逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を用
いていったん候補化合物が同定されると、それらの化合物が受容体部位で相互作
用していることを確かめるためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、
「一般的な」アッセイにより同定された化合物は受容体に結合することができな
いが、その代わりに細胞内ドメインからGタンパク質を単に「離す」ことができ
る。
【００５５】 ａ．Gs及びGi． Gsは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。一方、Gi（及びGo）はこの酵素を
阻害する。アデニリルシクラーゼはcAMPへのATPの転化を触媒し；従って、Gsタ
ンパク質と共役する構成的に活性化されたGPCRはcAMPの増加した細胞レベルと関
係する。一方、Gi（またはGo）タンパク質と共役する構成的に活性化されたGPCR
はcAMPの減少した細胞レベルと関係する。一般的に、「Indirect Mechanisms of
Synaptic Transmission」, 8章, From Neuron To Brain（第3版）Nichols, J.
G. et al編集, Sinauer Associates, Inc. (1992)を参照。従って、候補化合物
が受容体に対する例えば逆アゴニストであるかどうかを決定するためにcAMPを検
出するアッセイを利用することができる（すなわち、そのような化合物はcAMPの
レベルを下げる）。ｃAMPを測定するために当該技術分野において既知の様々な
方法を利用することができ；最も好ましい方法は、ELISAに基づく形態の抗-cAMP
抗体の使用による。利用することができる別のタイプのアッセイは、全細胞第二
メッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上のプロモーターは、特定
の遺伝子がコードするタンパク質の発現を導く。サイクリックAMPは、cAMP応答D
NA結合タンパク質または転写因子（CREB）の結合を促進することにより遺伝子発
現を導き、それは次にcAMP応答配列と呼ばれる特定の位置でプロモーターに結合
し、遺伝子の発現を導く。レポーター遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼまた
はルシフェラーゼの前に多数のcAMP応答配列を含有するプロモーターを有するレ
ポーター系を構築することができる。従って、構成的に活性化されたGs共役受容
体（Gs-linked receptor）はcAMPの蓄積をもたらし、これは次にレポータータン
パク質の遺伝子及び発現を活性化する。次に、標準的な生化学アッセイを用いて
β-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検
出することができる（Chen et al. 1995）。Gi（またはGo）に共役し、従ってcA
MPのレベルを下げるGPCRに関して、Gsに共役する（従って、cAMPのレベルを上げ
る）受容体の利用に基づく例えば逆アゴニストのスクリーニングの方法をGPR17
及びGPR30について実施例の節において開示する。
【００５６】 ｂ．Go及びGq Go及びGqは酵素ホスホリパーゼCの活性化と関係し、これは次にリン脂質PIP2
を加水分解し、2つの細胞内メッセンジャー：ジアシルグリセロール（DAG）及び
イノシトール１,４,５-三リン酸（IP3）を遊離する。IP3の増加した蓄積は、Gq-
及びGo-共役受容体（Go-associated receptors）の活性化と関係する。一般的に
、「Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission」, 8章, From Neuron To Brain （第3版）Nichols, J. G. et al編集, Sinauer Associates, Inc. (1992)
を参照。候補化合物がGq-またはGo-共役受容体に対する例えば逆アゴニストであ
るかどうかを決定するためにIP3蓄積を検出するアッセイを利用することができ
る（すなわち、そのような化合物はIP3のレベルを下げる）。Gq依存性ホスホリ
パーゼCはAP1要素を含有する遺伝子の活性化をもたらし；従って、活性化された
Gq-共役受容体はそのような遺伝子の発現の増加を示し、それにより、その逆ア
ゴニストはそのような発現の減少を示し、そしてアゴニストはそのような発現の
増加を示すので、AP1レポーターアッセイを用いてGq-共役受容体を調べることも
できる。そのような検出のために市販されているアッセイが利用できる。 Ｅ．医薬品化学 必ずしもそうとは限らないが、一般に、候補化合物の直接的同定は、好ましく
は、組み合わせ化学技術により作製された化合物と共に実施され、それにより何
千もの化合物がそのような分析のために無作為に調製される。一般に、そのよう
なスクリーニングの結果は、独特なコア構造を有する化合物であり；その後、こ
れらの化合物は、好ましくは、その医薬品特性をさらに高めるために好ましいコ
ア構造（１つまたは複数）の辺りのさらなる化学的改変に供される。そのような
技術は当業者に既知であり、本特許書類において詳細には検討されない。 Ｆ．製薬学的組成物 さらなる開発のために選択された候補化合物は、当業者に周知の技術を用いて
製薬学的組成物中に調合することができる。当業者は適当な製薬学的に許容しう
る担体を利用できる；例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１６
版, 1980, Mack Publishing Co., （Oslo et al.編集）を参照。 Ｇ．他の有用性 開示したヒトGPCRの非内因性バージョンの好ましい用途は、逆アゴニスト、ア
ゴニストまたは部分アゴニストとして候補化合物を直接同定するため（好ましく
は、製薬としての使用のため）であるが、これらの受容体を研究環境において利
用することもできる。例えば、これらの受容体を含むインビボ及びインビトロ系
は、正常及び罹病の両方のヒト状態におけるこれらの受容体の役割をさらに明ら
かにし理解するため並びにそれがシグナリングカスケードを理解することに適用
される場合に構成的活性化の役割を理解することに利用することができる。これ
らの非内因性受容体の価値は、それらの独特な特徴のために、開示した受容体を
その内因性リガンドが同定される前に人体における特定の受容体の役割を理解す
るために用いることができるので研究手段としてのそれらの有用性が高められる
ことである。開示した受容体の他の用途は、とりわけ本特許書類の説明に基づい
て当業者に明らかになる。
【００５７】 実施例 以下の実施例は、本発明を明らかにする目的のために示し、限定ではない。本
明細書において特定の核酸及びアミノ酸配列が開示されるが、ヒトGPCRを構成的
に活性化するためにTM6中のプロリン残基に対する位置に基づき受容体のIC3ルー
プにおいて突然変異カセットを利用することができるという本特許書類の教示に
従って、当業者は以下に報告するものと同じまたは実質的に同様な結果を得なが
らこれらの配列に対してわずかな改変を行うことができると考えられる。配列突
然変異の特定の方法は、当業者の特定の必要性に基づき当業者の認識範囲内であ
る。
【００５８】 実施例１ 内因性ヒトGPCRの調製 様々なGPCRを以下の実施例において利用した。いくつかの内因性ヒトGPCRは（
以下に謝辞を示すように）発現ベクター中で親切にも提供され、そして他の内因
性ヒトGPCRは公的に利用できる配列情報を用いて新規に合成した。
【００５９】 １．GPR1（ジーンバンク受託番号：U13666） GPR1のヒトcDNA配列は、Brian O'Dowd（University of Toronto）によりpRcCM
V中で提供された。GPR1 cDNA(1.4kBフラグメント)をpRcCMVベクターからNdeI-Xb
aIフラグメントとして切り出し、pCMVベクター（図３参照）のNdeI-XbaI部位中
にサブクローン化した。その後、ヒトGPR1の核酸（配列番号:1）及びアミノ酸（
配列番号:2）配列を決定し、確認した。
【００６０】 ２．GPR4（ジーンバンク受託番号：L36148、U35399、U21051） GPR4のヒトcDNA配列は、Brian O'Dowd（University of Toronto）によりpRcCM
V中で提供された。GPR1 cDNA(1.4kBフラグメント)をpRcCMVベクターからApaI（
平滑にした）-XbaIフラグメントとして切り出し、pCMVベクターのHindIII（平滑
にした）-XbaI部位中に（5'非翻訳領域の大部分を除いて）サブクローン化した
。その後、ヒトGPR4の核酸（配列番号:3）及びアミノ酸（配列番号:4）配列を決
定し、確認した。
【００６１】 ３．GPR5（ジーンバンク受託番号：L36149） ヒトGPR5のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により
提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチド
と共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；64℃で1分間；そし
て72℃で1.5分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-TATGAATTCAGATGCTCTAAACGTCCCTGC-3'（配列番号:5） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-TCCGGATCCACCTGCACCTGCGCCTGCACC-3'（配列番号:6） でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR5の核
酸（配列番号:7）及びアミノ酸（配列番号:8）配列を決定し、確認した。
【００６２】 ４．GPR７（ジーンバンク受託番号：U22491） ヒトGPR７のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：PCR条件-鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造
業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌ
クレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１
分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列
： 5'-GCAAGCTTGGGGGACGCCAGGTCGCCGGCT-3'（配列番号:9） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GCGGATCCGGACGCTGGGGGAGTCAGGCTGC-3'（配列番号:10） でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをHindIII及びBamHIで消化し
、pCMV発現ベクターのHindIII-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR
7の核酸（配列番号:11）及びアミノ酸（配列番号:12）配列を決定し、確認した
。
【００６３】 5．GPR8（ジーンバンク受託番号：U22492） ヒトGPR8のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により
提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチド
と共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そし
て72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-CGGAATTCGTCAACGGTCCCAGCTACAATG-3'（配列番号:13） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-ATGGATCCCAGGCCCTTCAGCACCGCAATAT-3'（配列番号:14） でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。シークエンスした4個
全てのcDNAクローンは、ArgからGlnへのアミノ酸206の変異を伴う、可能性があ
る多型を含有した。この違いを除いて、その後、ヒトGPR8の核酸（配列番号:15
）及びアミノ酸（配列番号:16）配列を決定し、確認した。
【００６４】 ６．GPR９（ジーンバンク受託番号：X95876） ヒトGPR９のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型として（Brian O'Dowdにより提供された）クローン及びpfuポリメラーゼ
（Stratagene）を10％ DMSOを補足した製造業者により提供されるバッファー系
、0.25μMの各プライマー及び0.5mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施
した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そして72℃で2.5分間を25サ
イクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-ACGAATTCAGCCATGGTCCTTGAGGTGAGTGACCACCAAGTGCTAAAT-3'（配列番号:17）
でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GAGGATCCTGGAATGCGGGGAAGTCAG-3'（配列番号:18） でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現ベ
クターのEcoRI-SmaI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR9の核酸（配列番
号:19）及びアミノ酸（配列番号:20）配列を決定し、確認した。
【００６５】 ７．GPR9-6（ジーンバンク受託番号：U45982） ヒトGPR9-6のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化し
た：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者に
より提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオ
チドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；
そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-TTAAGCTTGACCTAATGCCATCTTGTGTCC-3'（配列番号:21） でキナーゼ処理し（kinased）、そして3'プライマーは配列： 5'-TTGGATCCAAAAGAACCATGCACCTCAGAG-3'（配列番号:22） でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベ
クターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR9-6の核酸（配
列番号:23）及びアミノ酸（配列番号:24）配列を決定し、確認した。
【００６６】 8．GPR10（ジーンバンク受託番号：U32672） GPR10のヒトcDNA配列は、Brian O'Dowd（University of Toronto）によりpRcCMV
中で提供された。GPR10 cDNA(1.3kBフラグメント)をpRcCMVベクターからEcoRI-X
baIフラグメントとして切り出し、pCMVベクターのEcoRI-XbaI部位中にサブクロ
ーン化した。その後、ヒトGPR10の核酸（配列番号:25）及びアミノ酸（配列番号
:26）配列を決定し、確認した。
【００６７】 9．GPR15（ジーンバンク受託番号：U34806） GPR15のヒトcDNA配列は、Brian O'Dowd（University of Toronto）によりpCDNA3
中で提供された。GPR15 cDNA(1.5kBフラグメント)をpCDNA3ベクターからHindIII
-Bamフラグメントとして切り出し、pCMVベクターのHindIII-Bam部位中にサブク
ローン化した。その後、ヒトGPR15の核酸（配列番号:27）及びアミノ酸（配列番
号:28）配列を決定し、確認した。
【００６８】 10．GPR17（ジーンバンク受託番号：Z94154） ヒトGPR17のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.２mMの各４ヌクレオ
チドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；
そして72℃で１分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-CTAGAATTCTGACTCCAGCCAAAGCATGAAT-3'（配列番号:29） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GCTGGATCCTAAACAGTCTGCGCTCGGCCT-3'（配列番号:30） でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR17の
核酸（配列番号:31）及びアミノ酸（配列番号:32）配列を決定し、確認した。
【００６９】 11．GPR18（ジーンバンク受託番号：L42324） ヒトGPR18のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；54℃で１分間；そ
して72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-ATAAGATGATCACCCTGAACAATCAAGAT-3'（配列番号:33） でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列： 5'-TCCGAATTCATAACATTTCACTGTTTATATTGC-3'（配列番号:34） でEcoRI部位を含有した。1.0kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現ベ
クターの平滑-EcoRI部位中にクローン化した。シークエンスした8個全てのcDNA
クローンは、ThrからProへのアミノ酸12、AlaからGluへのアミノ酸86、IleからL
euへのアミノ酸97及びLeuからMetへのアミノ酸310の変異を伴う、可能性がある4
つの多型を含有した。これらの変異を除いて、その後、ヒトGPR18の核酸（配列
番号:35）及びアミノ酸（配列番号:36）配列を決定し、確認した。
【００７０】 12．GPR20（ジーンバンク受託番号：U66579） ヒトGPR20のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そ
して72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-CCAAGCTTCCAGGCCTGGGGTGTGCTGG-3'（配列番号:37） でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列： 5'-ATGGATCCTGACCTTCGGCCCCTGGCAGA-3'（配列番号:38） でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベ
クターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR20の核酸（配列
番号:39）及びアミノ酸（配列番号:40）配列を決定し、確認した。
【００７１】 13．GPR21（ジーンバンク受託番号：U66580） ヒトGPR21のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そ
して72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-GAGAATTCACTCCTGAGCTCAAGATGAACT-3'（配列番号:41） でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列： 5'-CGGGATCCCCGTAACTGAGCCACTTCAGAT-3'（配列番号:42） でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベ
クターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR21の核酸（配列
番号:43）及びアミノ酸（配列番号:44）配列を決定し、確認した。
【００７２】 14．GPR22（ジーンバンク受託番号：U66581） ヒトGPR22のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；50℃で１分間；そ
して72℃で1.5分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-TCCCCCGGGAAAAAAACCAACTGCTCCAAA-3'（配列番号:45） でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列： 5'-TAGGATCCATTTGAATGTGGATTTGGTGAAA-3'（配列番号:46） でBamHI部位を含有した。1.38kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現
ベクターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR22の核酸（配
列番号:47）及びアミノ酸（配列番号:48）配列を決定し、確認した。
【００７３】 15．GPR24（ジーンバンク受託番号：U71092） ヒトGPR24のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そ
して72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-GTGAAGCTTGCCTCTGGTGCCTGCAGGAGG-3'（配列番号:49） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GCAGAATTCCCGGTGGCGTGTTGTGGTGCCC-3'（配列番号:50） でEcoRI部位を含有した。1.3kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し
、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR
24の核酸（配列番号:51）及びアミノ酸（配列番号:52）配列を決定し、確認した
。
【００７４】 16．GPR30（ジーンバンク受託番号：U63917） ヒトGPR30のcDNAを以下のように作製し、クローン化した：GPR30のコーディング
配列（1128bpの長さ）をプライマー： 5'-GGCGGATCCATGGATGTGACTTCCCAA-3'（配列番号:53）及び 5'-GGCGGATCCCTACACGGCACTGCTGAA-3'（配列番号:54） を用いてゲノムDNAから増幅した。次に、増幅産物を市販されているベクターpCR
2.1(Invitrogen)中に製造業者の説明書に従って「TOPO-TAクローニングキット」
（Invitrogen、#K4500-01）を用いてクローン化した。全長GPR30インサートをBa
mHIでの消化により遊離し、アガロースゲル電気泳動によりベクターから分離し
、Sephaglas BandprepTMキット(Pharmacia、#27-9285-01)を製造業者の説明書に
従って用いて精製した。その後、ヒトGPR30の核酸（配列番号:55）及びアミノ酸
（配列番号:56）配列を決定し、確認した。
【００７５】 17．GPR31（ジーンバンク受託番号：U65402） ヒトGPR31のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；58℃で１分間；そ
して72℃で2分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-AAGGAATTCACGGCCGGGTGATGCCATTCCC-3'（配列番号:5７） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GGTGGATCCATAAACACGGGCGTTGAGGAC-3'（配列番号:58） でBamHI部位を含有した。1.0kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR31の
核酸（配列番号:59）及びアミノ酸（配列番号:60）配列を決定し、確認した。
【００７６】 18．GPR32（ジーンバンク受託番号：AF045764） ヒトGPR32のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そ
して72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-TAAGAATTCCATAAAAATTATGGAATGG-3'（配列番号:243） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-CCAGGATCCAGCTGAAGTCTTCCATCATTC-3'（配列番号:244） でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR32の
核酸（配列番号:245）及びアミノ酸（配列番号:246）配列を決定し、確認した。
【００７７】 19．GPR40（ジーンバンク受託番号：AF024687） ヒトGPR40のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そ
して72℃で1分10秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-GCAGAATTCGGCGGCCCCATGGACCTGCCCCC-3'（配列番号:247） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GCTGGATCCCCCGAGCAGTGGCGTTACTTC-3'（配列番号:248） でBamHI部位を含有した。1kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、pCM
V発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR40の核
酸（配列番号:249）及びアミノ酸（配列番号:250）配列を決定し、確認した。
【００７８】 20．GPR41（ジーンバンク受託番号：AF024688） ヒトGPR41のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そ
して72℃で1分10秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-CTCAAGCTTACTCTCTCTCACCAGTGGCCAC-3'（配列番号:251） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-CCCTCCTCCCCCGGAGGACCTAGC-3'（配列番号:252） でキナーゼ処理した。1kbのPCRフラグメントをHindIIIで消化し、pCMV発現ベク
ターのHindIII-平滑部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR41の核酸（配列
番号:253）及びアミノ酸（配列番号:254）配列を決定し、確認した。
【００７９】 21．GPR43（ジーンバンク受託番号：AF024690） ヒトGPR43のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そ
して72℃で1分10秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-TTTAAGCTTCCCCTCCAGGATGCTGCCGGAC-3'（配列番号:255） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GGCGAATTCTGAAGGTCCAGGGAAACTGCTA-3'（配列番号:256） でEcoRI部位を含有した。1kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し、p
CMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR43
の核酸（配列番号:257）及びアミノ酸（配列番号:258）配列を決定し、確認した
。
【００８０】 22．APJ（ジーンバンク受託番号：U03642） ヒトAPJ cDNA（pRcCMVベクター中）は、Brian O'Dowd（University of Toronto
）により提供された。ヒトAPJ cDNAをpRcCMVベクターからEcoRI-XbaI（平滑にし
た）フラグメントとして切り出し、pCMVベクターのEcoRI-SmaI部位中にサブクロ
ーン化した。その後、ヒトAPJの核酸（配列番号:61）及びアミノ酸（配列番号:6
2）配列を決定し、確認した。
【００８１】 23．BLR1（ジーンバンク受託番号：X68149） ヒトBLR1のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型として胸腺cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提
供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.２mMの各４ヌクレオチド
と共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そし
て72℃で１分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-TGAGAATTCTGGTGACTCACAGCCGGCACAG-3'（配列番号:63） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GCCGGATCCAAGGAAAAGCAGCAATAAAAGG-3'（配列番号:64） でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトBLR1の核
酸（配列番号:65）及びアミノ酸（配列番号:66）配列を決定し、確認した。
【００８２】 24．CEPR（ジーンバンク受託番号：U77827） ヒトCEPRのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型としてゲノムDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により
提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチド
と共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そし
て72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-CAAAGCTTGAAAGCTGCACGGTGCAGAGAC-3'（配列番号:67） でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列： 5'-GCGGATCCCGAGTCACACCCTGGCTGGGCC-3'（配列番号:68） でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベ
クターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトCEPRの核酸（配列
番号:69）及びアミノ酸（配列番号:70）配列を決定し、確認した。
【００８３】 25．EBI1（ジーンバンク受託番号：L31581） ヒトEBI1のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型として胸腺cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提
供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと
共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62℃で１分間；そして
72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-ACAGAATTCCTGTGTGGTTTTACCGCCCAG-3'（配列番号:71） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-CTCGGATCCAGGCAGAAGAGTCGCCTATGG-3'（配列番号:72） でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトEBI1の核
酸（配列番号:73）及びアミノ酸（配列番号:74）配列を決定し、確認した。
【００８４】 26．EBI2（ジーンバンク受託番号：L08177） ヒトEBI2のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型としてcDNAクローン（Kevin Lynch、University of Virginia Health Scien
ces Centerにより親切に提供された；利用したベクターは供給者により同定され
なかった）及びpfuポリメラーゼ（Stratagene）を10％ DMSOを補足した製造業者
により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.5mMの各４ヌクレ
オチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；60℃で１分間
；そして72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-CTGGAATTCACCTGGACCACCACCAATGGATA-3'（配列番号:75） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-CTCGGATCCTGCAAAGTTTGTCATACAGTT-3'（配列番号:76） でBamHI部位を含有した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトEBI2の核
酸（配列番号:77）及びアミノ酸（配列番号:78）配列を決定し、確認した。
【００８５】 27．ETBR-LP2（ジーンバンク受託番号：D38449） ヒトETBR-LP2のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化し
た：鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により
提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチド
と共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そし
て72℃で1.5分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-CTGGAATTCTCCTGCTCATCCAGCCATGCGG-3'（配列番号:79） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-CCTGGATCCCCACCCCTACTGGGGCCTCAG-3'（配列番号:80） でBamHI部位を含有した。1.5kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトETBR-LP2
の核酸（配列番号:81）及びアミノ酸（配列番号:82）配列を決定し、確認した。
【００８６】 28．GHSR（ジーンバンク受託番号：U60179） ヒトGHSRのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型として海馬cDNA及びTaqPlus Precisionポリメラーゼ（Stratagene）を製造
業者により提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌ
クレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；68 ℃で
１分間；そして72℃で1分10秒間を30サイクルであった。1回目のPCRのために、5
' PCRプライマー配列は： 5'-ATGTGGAACGCGACGCCCAGCG-3'（配列番号:83） であり、そして3'プライマー配列は： 5'-TCATGTATTAATACTAGATTCT-3'（配列番号:84） であった。1回目のPCR のうち2μlを2回目のPCRに鋳型として用い、その場合、5
'プライマーは配列： 5'-TACCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAAGAGCCGGGGT-3'（配列番号:85） でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列： 5'-CGGAATTCATGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCCCG-3'（配列番号:86） でEcoRI部位を含有した。 1.1kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現
ベクターの平滑-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトGHSRの核酸（配列
番号:87）及びアミノ酸（配列番号:88）配列を決定し、確認した。
【００８７】 29．GPCR-CNS（ジーンバンク受託番号：AFO17262） ヒトGPCR-CNSのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化し
た：鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により
提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチド
と共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そし
て72℃で2分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-GCAAGCTTGTGCCCTCACCAAGCCATGCGAGCC-3'（配列番号:89） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-CGGAATTCAGCAATGAGTTCCGACAGAAGC-3'（配列番号:90） でEcoRI部位を含有した。1.9kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し
、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。シークエンスし
た9個全てのクローンは、S284C変異を伴う、可能性がある多型を含有した。この
違いを除いて、その後、ヒトGPCR-CNSの核酸（配列番号:91）及びアミノ酸（配
列番号:92）配列を決定し、確認した。
【００８８】 30．GPR-NGA（ジーンバンク受託番号：U55312） ヒトGPR-NGAのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化し
た：鋳型としてゲノムcDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者に
より提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオ
チドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；
そして72℃で1.5分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-CAGAATTCAGAGAAAAAAAGTGAATATGGTTTTT-3'（配列番号:93） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-TTGGATCCCTGGTGCATAACAATTGAAAGAAT-3'（配列番号:94） でBamHI部位を含有した。1.3kbのPCRフラグメントをEcoRI及びBamHIで消化し、p
CMV発現ベクターのEcoRI-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトGPR-NGA
の核酸（配列番号:95）及びアミノ酸（配列番号:96）配列を決定し、確認した。
【００８９】 31．H9（ジーンバンク受託番号：U52219） ヒトHB954のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型として下垂体cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチ
ドと共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；62 ℃で１分間；
そして72℃で2分間を30サイクルであった。5'プライマーは配列： 5'-GGAAAGCTTAACGATCCCCAGGAGCAACAT-3'（配列番号:97） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-CTGGGATCCTACGAGAGCATTTTTCACACAG-3'（配列番号:98） でBamHI部位を含有した。 1.9kbのPCRフラグメントをHindIII及びBamHIで消化し
、pCMV発現ベクターのHindIII-BamHI部位中にクローン化した。公開配列と比較
した場合に、細胞質尾部中に12bpのインフレーム挿入を有する異なるアイソフォ
ームも同定され、「H9b」と称した。両方のアイソフォームは、アミノ酸P320S及
びアミノ酸G448Aの変異を伴う２つの可能がある多型を含有した。アイソフォー
ムH9aはアミノ酸S493Nの別の可能性がある多型を含有し、一方、アイソフォーム
H9bはアミノ酸I502T及びアミノ酸A532T（アイソフォームH9aのアミノ酸528に対
応する）の変異を伴う２つのさらなる可能性がある多型を含有した。その後、ヒ
トH9の核酸（配列番号:99）及びアミノ酸（配列番号:100）配列を決定し、確認
した（以下の節において、両方のアイソフォームをヒトGPCRプロリンマーカーア
ルゴリズムに従って突然変異させた）。
【００９０】 32．HB954（ジーンバンク受託番号：D38449） ヒトHB954のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した
：鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提
供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと
共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；58℃で１分間；そして
72℃で2分間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-TCCAAGCTTCGCCATGGGACATAACGGGAGCT-3'（配列番号:101） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-CGTGAATTCCAAGAATTTACAATCCTTGCT-3'（配列番号:102） でEcoRI部位を含有した。1.6kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し
、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトHB9
54の核酸（配列番号:103）及びアミノ酸（配列番号:104）配列を決定し、確認し
た。
【００９１】 33．HG38（ジーンバンク受託番号：AF062006） ヒトHG38のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供
されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共
に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；56℃で１分間；そして72
℃で1分30秒間を30サイクルであった。5'及び3'フラグメントを別個に得るため
に２つのPCR反応を実施した。5'フラグメントのために、5' PCRプライマーは配
列： 5'-CCCAAGCTTCGGGCACCATGGACACCTCCC-3'（配列番号:259） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-ACAGGATCCAAATGCACAGCACTGGTAAGC-3'（配列番号:260） でBamHI部位を含有した。この1.５kbの5' PCRフラグメントをHindIII及びBamHI
で消化し、pCMVのHindIII-BamHI部位中にクローン化した。3'フラグメントのた
めに、5' PCRプライマーは配列： 5'-CTATAACTGGGTTACATGGTTTAAC-3'（配列番号:261） でキナーゼで処理し、そして3'プライマーは配列： 5'-TTTGAATTCACATATTAATTAGAGACATGG-3'（配列番号:262） でEcoRI部位を含有した。1.4kbの3' PCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMVベ
クターの平滑-EcoRI部位中にサブクローン化した。次に5'及び3'フラグメントを
共通のEcoRV部位を介して一緒に連結して全長cDNAクローンを作製した。その後
、ヒトHG38の核酸（配列番号:263）及びアミノ酸（配列番号:264）配列を決定し
、確認した。
【００９２】 34．HM74（ジーンバンク受託番号：D10923） ヒトHM74のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型としてゲノムDNAまたは胸腺cDNA（プールした）のいずれか及びrTthポリメ
ラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供されるバッファー系、0.25μMの
各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。サイク
ル条件は94℃で1分間；65 ℃で１分間；そして72℃で1分20秒間を30サイクルで
あった。5' PCRプライマーは配列： 5'-GGAGAATTCACTAGGCGAGGCGCTCCATC-3'（配列番号:105） でEcoRI部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-GGAGGATCCAGGAAACCTTAGGCCGAGTCC-3'（配列番号:106） でキナーゼ処理した。 1.3kbのPCRフラグメントをEcoRIで消化し、pCMV発現ベク
ターのEcoRI-SmaI部位中にクローン化した。シークエンスしたクローンは、N94K
変異を伴う、可能性がある多型を示した。この違いを除いて、その後、ヒトHM74
の核酸（配列番号:107）及びアミノ酸（配列番号:108）配列を決定し、確認した
。
【００９３】 35．MIG（ジーンバンク受託番号：AFO44600及びAFO44601） ヒトMIGのcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型としてゲノムcDNA及び1回目のPCRにはTaqPlus Precisionポリメラーゼ（Str
atagene）または2回目のPCRにはpfuポリメラーゼ（Stratagene）を製造業者によ
り提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mM（TaqPlus Precis
ion）または0.5mM（pfu）の各４ヌクレオチドと共に用いてPCRを実施した。Pfu
を用いる場合、10％ DMSOをバッファー中に含んだ。サイクル条件は94℃で1分間
；65℃で１分間；そして72℃で：（a）1回目のPCRでは1分間；そして（b）2回目
のPCRでは2分間を30サイクルであった。コーディング領域中にイントロンがある
ので、重なり合う5'及び3'フラグメントを作製するために２組のプライマーを別
個に用いた。5' フラグメントPCRプライマーは： 5'-ACCATGGCTTGCAATGGCAGTGCGGCCAGGGGGCACT-3'（外側のセンス）（配列番号:
109） 及び 5'-CGACCAGGACAAACAGCATCTTGGTCACTTGTCTCCGGC-3'（内側のアンチセンス）（
配列番号:110） であった。3'フラグメントPCRプライマーは： 5'-GACCAAGATGCTGTTTGTCCTGGTCGTGGTGTTTGGCAT-3'（内側のセンス）（配列番
号:111） 及び 5'-CGGAATTCAGGATGGATCGGTCTCTTGCTGCGCCT-3'（EcoRI部位を有する外側のアン
チセンス）（配列番号:112） であった。２回目のPCRを行うために鋳型として1回目のPCR並びにキナーゼ処理
した外側のセンスプライマー及び外側のアンチセンスプライマーを用いることに
より5'及び3'フラグメントを一緒に連結した。1.2kbのPCRフラグメントをEcoRI
で消化し、pCMV発現ベクターの平滑-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒ
トMIGの核酸（配列番号:113）及びアミノ酸（配列番号:114）配列を決定し、確
認した。
【００９４】 36．OGR1（ジーンバンク受託番号：U48405） ヒトOGR1のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型としてゲノムcDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により
提供されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチド
と共に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そし
て72℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-GGAAGCTTCAGGCCCAAAGATGGGGAACAT-3'（配列番号:115） でキナーゼ処理し、そして3'プライマーは配列： 5'-GTGGATCCACCCGCGGAGGACCCAGGCTAG-3'（配列番号:116） でBamHI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをBamHIで消化し、pCMV発現ベ
クターのEcoRV-BamHI部位中にクローン化した。その後、ヒトOGR1の核酸（配列
番号:117）及びアミノ酸（配列番号:118）配列を決定し、確認した。
【００９５】 37．セロトニン5HT2A 内因性ヒト5HT2A受容体をコードするcDNAをヒト脳ポリ-A+ RNA；XhoI制限部位を
有する5'非翻訳領域からの5'プライマー： 5'-GACCTCGAGTCCTTCTACACCTCATC-3'（配列番号:119） 及びXbaI部位を含有する3'非翻訳領域からの3'プライマー： 5'-TGCTCTAGATTCCAGATAGGTGAAAACTTG-3'（配列番号:120） を用いてRT-PCRにより得た。TaqPllusTM Precisionポリメラーゼ（Stratagene）
またはrTthTMポリメラーゼ（Perkin Elmer）のいずれかを製造業者により提供さ
れるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共に
用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；57 ℃で１分間；そして72
℃で2分間を30サイクルであった。1.5kbのPCRフラグメントをXbaIで消化し、pBl
uescriptのEcoRV-XbaI部位中にサブクローン化した。得られたcDNAクローンを完
全にシークエンスし、公開配列から２個のアミノ酸変異をコードすることが分か
った。第一のものはN末端細胞外ドメイン中のT25N突然変異であり；第二のもの
はH452Y突然変異である。２つの異なる市販の製造業者からのTaqポリメラーゼ（
StratageneからのTaqPllusTM及びPerkin ElmerからのrTthTM）を用いて２つの独
立したPCR反応から得られたcDNAクローンが同じ2つの突然変異を含有したので、
これらの突然変異はPCRの誤りよりむしろ配列多型であると思われる。これらを
除いて、その後、ヒト5HT2Aの核酸（配列番号:121）及びアミノ酸（配列番号:12
2）配列を決定し、確認した。
【００９６】 38．セロトニン5HT2C 内因性ヒト5HT2C受容体をコードするcDNAをヒト脳ポリ-A+ RNAからRT-PCRによ
り得た。5'及び3'プライマーは５'及び3'非翻訳領域から得られ、以下の配列： 5'-GACCTCGAGGTTGCTTAAGACTGAAGC-3'（配列番号:123） 5'-ATTTCTAGACATATGTAGCTTGTACCG-3'（配列番号:124） を含有した。その後、ヒト5HT2Cの核酸（配列番号:125）及びアミノ酸（配列番
号:126）配列を決定し、確認した。
【００９７】 39．V28（ジーンバンク受託番号：U20350） ヒトV28のcDNAを以下のように作製し、pCMV発現ベクター中にクローン化した：
鋳型として脳cDNA及びrTthポリメラーゼ（Perkin Elmer）を製造業者により提供
されるバッファー系、0.25μMの各プライマー及び0.2mMの各４ヌクレオチドと共
に用いてPCRを実施した。サイクル条件は94℃で1分間；65℃で１分間；そして72
℃で1分20秒間を30サイクルであった。5' PCRプライマーは配列： 5'-GGTAAGCTTGGCAGTCCACGCCAGGCCTTC-3'（配列番号:127） でHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは配列： 5'-TCCGAATTCTCTGTAGACACAAGGCTTTGG-3'（配列番号:128） でEcoRI部位を含有した。1.1kbのPCRフラグメントをHindIII及びEcoRIで消化し
、pCMV発現ベクターのHindIII-EcoRI部位中にクローン化した。その後、ヒトV28
の核酸（配列番号:129）及びアミノ酸（配列番号:130）配列を決定し、確認した
。
【００９８】 実施例２ 非内因性ヒトGPCRの調製 １．部位特異的突然変異誘発 本明細書において開示するヒトGPCRプロリンマーカー法に基づく突然変異誘発を
Transformer部位特異的突然変異誘発キット（Clontech）を製造業者の説明書に
従って用いて前述の内因性ヒトGPCRに対して実施した。この突然変異誘発法のた
めに、突然変異プローブ及び選択マーカープローブ（他に示さないかぎり、配列
番号:132のプローブは終始同じであった）を利用し、特定の配列に対するこれら
の配列を以下の表Bに記載する（挿入番号は配列番号である）。便宜上、ヒトGPC
R中に含まれるコドン突然変異もまた標準的な形態で記載する：
【００９９】
【表３】
【０１００】
【表４】
【０１０１】
【表５】
【０１０２】 次に非内因性ヒトGPCRをシークエンスし、得られた、確認された核酸及びアミノ
酸配列を以下の表Ｃに要約するように本特許書類に添付の「配列表」付表中に記
載する：
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】 ２．プロリンマーカーアルゴリズムの利用のための別の突然変異方法：APJ；
セロトニン5HT2A；セロトニン5HT2C；及びGPR30 上記の部位特異的突然変異誘発法が特に好ましいが、そのような突然変異を作
製するために他の方法を利用することができ；当業者は、当業者の特定の必要性
に適合するGPCRを突然変異させる方法を容易に選択することができると考えられ
る。
【０１０６】 ａ．APJ L247Kに突然変異させることにより非内因性ヒトAPJ受容体の調製を実施した。
この突然変異を含有する2個のオリゴヌクレオチドを合成した： 5'-GGCTTAAGAGCATCATCGTGGTGCTGGTG-3'（配列番号:233） 5'-GTCACCACCAGCACCACGATGATGCTCTTAAGCC-3'（配列番号:234） これら2個のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ヒト内因性APJのNaeI-Bst
EIIフラグメントを置き換えるために用いてヒトAPJの非内因性バージョンを作製
した。
【０１０７】 ｂ．セロトニン5HT2A アミノ酸322を包含する制限酵素部位SphIを利用することにより点突然変異C322K
を含有するcDNAを構築した。C322K突然変異を含有するプライマー： 5'-CAAAGAAAGTACTGGGCATCGTCTTCTTCCT-3'（配列番号:235） を受容体の3'非翻訳領域からのプライマー： 5'-TGCTCTAGATTCCAGATAGGTGAAAACTTG-3'（配列番号:236） と一緒に用いて（上記の条件下で）PCRを実施した。次に、T4ポリメラーゼで平
滑にしたSphI部位を介して、得られたPCRフラグメントを用いて内因性5HT2A cDN
Aの3'末端を置き換えた。
【０１０８】 ｃ．セロトニン5HT2C アミノ酸310を含有するStyI制限フラグメントを所望する突然変異をコードす
る合成の二本鎖オリゴヌクレオチドで置き換えることによりS310K突然変異を含
有するcDNAを構築した。利用したセンス鎖配列は以下の配列： 5'-CTAGGGGCACCATGCAGGCTATCAACAATGAAAGAAAAGCTAAGAAAGTC-3'（配列番号:237
） を有し、そして利用したアンチセンス鎖配列は以下の配列： 5'-CAAGGACTTTCTTAGCTTTTCTTTCATTGTTGATAGCCTGCATGGTGCCC-3'（配列番号:238
） を有した。
【０１０９】 ｄ．GPR30 非内因性GPR30を作製する前に、PCRにより生じる突然変異を含まないクローン
を同定するためにいくつかの独立したpCR2.1/GPR30単離体をそれらの全体をシー
クエンスした。突然変異を含まないクローンをEcoRIで消化し、そしてpCI-Neoを
EcoRIで消化し、pCR2.1/GPR30からEcoRIで遊離したGPR30フラグメントをサブク
ローン化することにより内因性GPR30 cDNAフラグメントをCMVにより制御される
発現プラスミドpCI-neo（Promega）中に移し、pCI/GPR30を作製した。その後、
製造業者の説明書に従ってQuick-ChangeTM 部位特異的突然変異誘発キット（Str
atagene、#200518）及び以下のプライマー： 5'-CGGCGGCAGAAGGCGAAACGCATGATCCTCGCGGT-3'（配列番号:239）及び 5'-ACCGCGAGGATCATGCGTTTCGCCTTCTGCCGCCG-3'（配列番号:240） を用いてコドン258のロイシンをリシンに突然変異させた。
【０１１０】 実施例３ （内因性及び突然変異させた）受容体発現 タンパク質の発現のために様々な細胞を当該技術分野は利用できるが、哺乳類
細胞を利用することが最も好ましい。この主な理由は実用性に基づき、すなわち
、GPCRの発現のための例えば酵母細胞の利用は、可能ではあるが、哺乳類系に対
して進化した受容体共役、遺伝子機構及び分泌経路を含有しない可能性がある（
実際、酵母の場合には含有しない）非哺乳類細胞をプロトコル中に導入し、従っ
て、非哺乳類細胞において得られた結果は、有用である可能性はあるが、哺乳類
細胞から得られたものほど好ましくない。哺乳類細胞のうち、COS-7、293及び29
3T細胞が特に好ましいが、利用する特定の哺乳類細胞は当業者の特定の必要性に
基づくことができる。
【０１１１】 本明細書において他に記載しないかぎり、以下のプロトコルを内因性及び非内
因性ヒトGPCRの発現のために利用した。表Dは、GPCR発現のための哺乳類細胞及
び（150mmプレート当たり）利用した数を記載する。
【０１１２】
【表８】
【０１１３】 1日目に、哺乳類細胞を平板培養した。2日目に、２本の反応チューブを調製し
（各チューブの以下の割合はプレート当たりである）：チューブAは、20μgのDN
A（例えば、pCMVベクター；内因性受容体cDNAを有するpCMVベクター及び非内因
性受容体cDNAを有するpCMVベクター）を1.2mlの無血清DMEM（Irvine Scientific
, Irvine, CA）中に混合することにより調製し；チューブBは、120μlのリポフ
ェクトアミン（lipofectamine）（Gibco BRL）を1.2mlの無血清DMEM中に混合す
ることにより調製した。次に、チューブA及びBを反転（数回）により混合し、続
いて室温で30-45分間インキュベーションした。この混合物を「トランスフェク
ション混合物」と称する。平板培養した細胞を1X PBSで洗浄し、続いて10mlの無
血清DMEMを加えた。次に、2.4mlのトランスフェクション混合物をこれらの細胞
に加え、続いて37℃/5％ CO2で４時間インキュベーションした。次に、トランス
フェクション混合物を吸引により除き、続いて25mlのDMEM/10％ウシ胎仔血清を
加えた。次に、細胞を37℃/5％ CO2でインキュベーションした。72時間のインキ
ュベーション後、次に細胞を集め、分析のために利用した。 １．Gi共役受容体：Gs共役受容体との共トランスフェクション GPR30の場合、この受容体はGタンパク質Giに共役することが決定されている。
Giは、cAMPへのATPの転化を触媒するために必要である酵素アデニリルシクラー
ゼを阻害することが知られている。従って、GPR30の非内因性の構成的に活性化
された形態は、cAMPの減少したレベルと関連すると予想される。cAMPの減少する
レベルの測定により直接GPR30の非内因性の構成的に活性化された形態をアッセ
イ確認することは、実行可能であるが、好ましくは、Gs共役受容体の共同使用に
より測定することができる。例えば、Gsに共役する受容体はアデニリルシクラー
ゼを刺激し、従って、cAMPの増加と関連する。本願の譲受人は、オーファン受容
体GPR6が内因性の構成的に活性化されたGPCRであることを発見している。GPR6は
Gsタンパク質に共役する。従って、共トランスフェクションすると、推定される
GPR30-突然変異がその構成的活性化を導くことを容易に確かめることができ、す
なわち、内因性の構成的に活性化されたGPR6/内因性の構成的に活性化されてい
ないGPR30細胞は、内因性の構成的に活性のあるGPR6/非内因性の構成的に活性化
されたGPR30と比較した場合にcAMPの増大したレベルを示す（後者は比較的より
低いレベルのcAMPを示す）。候補化合物がGs共役受容体に対する例えば逆アゴニ
スト（すなわち、そのような化合物はcAMPのレベルを下げるとみられる）または
Gi共役受容体（もしくはGo共役受容体）に対する例えば逆アゴニスト（すなわち
、そのような候補化合物はcAMPのレベルを上げるとみられる）であるかどうかを
決定するためにcAMPを検出するアッセイを利用することができる。cAMPを測定す
るための当該技術分野において既知の様々な方法を利用することができ；好まし
い方法は抗-cAMP抗体の使用による。別の方法で、最も好ましいものは、全細胞
第二メッセンジャーレポーター系アッセイを利用する。遺伝子上のプロモーター
は、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を導く。サイクリックAMPは、c
AMP応答DNA結合タンパク質または転写因子（CREB）の結合を促進することにより
遺伝子発現を導き、それは次にcAMP応答配列と呼ばれる特定の位置でプロモータ
ーに結合し、遺伝子の発現を導く。レポーター遺伝子、例えばβ-ガラクトシダ
ーゼまたはルシフェラーゼの前に多数のcAMP応答配列を含有するプロモーターを
有するレポーター系を構築することができる。従って、GPR6のような活性化され
た受容体は、cAMPの蓄積をもたらし、これは次にレポータータンパク質の遺伝子
及び発現を活性化する。最も好ましくは、293細胞を好ましくは1：1の比率の、
最も好ましくは1：4の比率のGPR6（または別のGs共役受容体）及びGPR30（また
は別のGi共役受容体）プラスミドで共トランスフェクションする。GPR6はcAMPの
生成を刺激する内因性の構成的に活性のある受容体であるので、GPR6はレポータ
ー遺伝子及びその発現を強力に活性化する。次に、標準的な生化学アッセイを用
いてβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質
を検出することができる（Chen et al. 1995）。内因性の構成的に活性でないGP
R30と内因性の構成的に活性のあるGPR6との共トランスフェクションは、ルシフ
ェラーゼレポータータンパク質の増加を示す。逆に、非内因性の構成的に活性の
あるGPR30と内因性の構成的に活性のあるGPR6との共トランスフェクションは、
ルシフェラーゼの発現の劇的な減少を示す。いくつかのレポータープラスミドが
既知であり、第二メッセンジャーアッセイを測定するために当該技術分野におい
て利用できる。主として当業者の特定の必要性に基づいて特定の遺伝子発現のた
めに適当なレポータープラスミドを決定することは当業者の十分に範囲内である
と考えられる。様々な細胞が発現のために利用できるが、哺乳類細胞が最も好ま
しく、そしてこれらのタイプのうち、293細胞が最も好ましい。哺乳類トランス
フェクションTMキット（Stratagene、＃200285）CaPO4沈殿プロトコルを製造業
者の説明書に従って用いて293細胞をレポータープラスミドpCRE-Luc/GPR6及び非
内因性の構成的に活性化されたGPR30でトランスフェクションした（公開された
内因性GPR6配列については28 Genomics 347(1995)を参照）。この沈殿物は、400
ngの受容体、80ngのCMV-発現プラスミド（1：4のGPR6：内因性GPR30または非内
因性GPR30比を有する）及び20ngのCMV-SEAP（分泌されるアルカリホスファター
ゼをコードするトランスフェクションコントロールプラスミド）を含有した。沈
殿物の50％を（4 X 104細胞/ウェルを含有する）96穴組織培養皿の３ウェル中に
分け；残りの50％を捨てた。翌朝、培地を交換した。トランスフェクションの開
始後48時間で細胞を溶解し、LucliteTMキット（Packard、カタログ＃6016911）
並びにTrilux 1450 MicrobetaTM液体シンチレーション及び発光カウンター（Wal
lac）を販売業者の説明書どおりに用いてルシフェラーゼ活性に関して調べた。G
raphPad Prism 2.0a（GraphPad Software Inc.）を用いてデータを分析した。
【０１１４】 Giに共役することが同様に決定されているGPR17に関しては、とりわけ、別のG
s共役内因性受容体GPR3（23 Genomics 609(1994)及び24 Genomics 391(1994)を
参照）の使用に基づき、前述の方法の改変を利用した。最も好ましくは293細胞
を利用する。これらの細胞を96穴プレート上にウェル当たり2 X 104細胞の密度
で平板培養し、翌日リポフェクトアミン試薬（BRL）を製造業者の説明書に従っ
て用いてトランスフェクションした。DNA/脂質混合物を各6ウェルトランスフェ
クションに対して以下のように調製した：100μlのDMEM中260ngのプラスミドDNA
を100μlのDMEM中2μlの脂質と穏やかに混合した（260ngのプラスミドDNAは、20
0ngの8xCRE-Lucレポータープラスミド（以下参照）、50ngの内因性受容体もしく
は非内因性受容体を含んでなるpCMVまたはpCMVのみ及び10ngのGPRS発現プラスミ
ド（pcDNA3（Invitrogen）中のGPRS）からなった）。8XCRE-Lucレポータープラ
スミドは以下のように調製した：pβgal-Basicベクター(Clontech)中のBglV-Hin
dIII部位でラットソマトスタチンプロモーター（-71/+51）をクローン化するこ
とによりベクターSRIF-β-galを得た。8コピーのcAMP応答配列をアデノウイルス
鋳型AdpCF126CCRE8(7 Human Gene Therapy 1883(1996)を参照)からPCRにより得
、Kpn-BglV部位でSRIF-β-galベクター中にクローン化し、8xCRE-β-galレポー
ターベクターをもたらした。8xCRE-Lucレポータープラスミドは、8xCRE-β-gal
レポーターベクター中のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をHindIII-BamHI部位でpGL3
-basicベクター（Promega）から得たルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることに
より作製した。室温で30分のインキュベーション後、DNA/脂質混合物を400μlの
DMEMで希釈し、希釈した混合物のうち100μlを各ウェルに加えた。細胞培養イン
キュベーター中で4時間のインキュベーション後に10％のFCSを含む100μlのDMEM
を各ウェルに加えた。翌朝、トランスフェクションした細胞を10％のFCSを含む2
00μl/ウェルのDMEMで交換した。8時間後に、PBSで1回洗浄した後、フェノール
レッドを含まない100μl/ウェルのDMEMにウェルを交換した。翌日、LucLiteTMレ
ポーター遺伝子アッセイキット（Packard）を製造業者の説明書に従って用いて
ルシフェラーゼ活性を測定し、1450 MicroBetaTMシンチレーション及び発光カウ
ンター（Wallac）で読み取った。
【０１１５】 図４は、構成的に活性のあるGPR30が293細胞においてGPR6によりもたらされる
CRE-Lucレポーターの活性化を阻害することを示す。ルシフェラーゼは、発現ベ
クターpCMVにおいて約4.1相対光単位で測定された。内因性GPR30はルシフェラー
ゼを約8.5相対光単位で発現し、一方、非内因性の構成的に活性のあるGPR30（L2
58K）はルシフェラーゼをそれぞれ約3.8及び3.1相対光単位で発現した。1：4の
比率で、内因性GPR6と内因性GPR30との共トランスフェクションは、ルシフェラ
ーゼ発現を約104.1相対光単位まで劇的に増加した。同じ比率で、内因性GPR6と
非内因性GPR30（L258K）との共トランスフェクションは、発現を劇的に減少し、
これはそれぞれ約18.2及び29.5相対光単位で明白である。図5に記載するように
、GPR3との共トランスフェクションに関してGPR17について同様の結果が認めら
れた。
【０１１６】 実施例３ 非内因性GPCRの構成的活性を測定するためのアッセイ Ａ．膜結合アッセイ １．［35S］GTPγSアッセイ Gタンパク質共役受容体がその活性状態にある場合、リガンド結合または構成
的活性化のいずれかの結果として、該受容体はGタンパク質に共役し、GDPの遊離
及びそれに続くGタンパク質へのGTPの結合を刺激する。Gタンパク質-受容体複合
体のαサブユニットはGTPアーゼとして働き、GTPをGDPにゆっくり加水分解し、
この時点で受容体は通常非活性化される。構成的に活性化された受容体は、GDP
をGTPに交換し続ける。加水分解できないGTP類似体［35S］GTPγSを利用して、
構成的に活性化された受容体を発現する膜への［35S］GTPγSの増大した結合を
示すことができる。構成的活性化を測定するために［35S］GTPγS結合を用いる
利点は：（ａ）それが全てのGタンパク質共役受容体に一般的に適用できること
；（ｂ）それが膜表面で近接し、細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を捕らえ
る可能性を低くすることである。
【０１１７】 該アッセイは、問題とされる受容体を発現する膜への［35S］GTPγS結合を刺
激するGタンパク質共役受容体の能力を利用する。従って、該アッセイは、既知
の、オーファン及び構成的に活性化されたGタンパク質共役受容体に対して候補
化合物をスクリーニングする直接同定法において用いることができる。該アッセ
イは一般的であり、全てのGタンパク質共役受容体での薬剤発見に適応性を有す
る。
【０１１８】 ［35S］GTPγSアッセイを約0.3~約1.2nMの間の［35S］GTPγS（1.2が好ましい
が、結果の最適化のためにこの量を調整することができる）及び12.5~75μgの膜
タンパク質（例えば、受容体を発現するCOS-7細胞；75μgが好ましいが、最適化
のためにこの量を調整することができる）及び1μMのGDP（最適化のためにこの
量を変えることができる）と共に 20mM HEPES及び1~約20mMの間のMgCl2（20mMが
好ましいが、結果の最適化のためにこの量を調整することができる）pH7.4、結
合バッファー中で1時間インキュベーションした。次に、コムギ胚芽凝集素ビー
ズ（25μl；Amersham）を加え、混合物を室温でさらに30分間インキュベーショ
ンした。次に、チューブを室温で1500 x gで5分間遠心分離し、次にシンチレー
ションカウンターで計数した。
【０１１９】 大規模スクリーニングの要求を同様に満たす、かかる費用がより少ないが同等
に適用できる代案が同定されている。Flash platesTM及びWallacTMシンチストリ
ップ（scintistrip）を高処理量［35S］GTPγS結合アッセイを構成するために利
用することができる。さらに、この技術を用いて、アッセイを［35S］GTPγS結
合による効能をモニターするのと同時に受容体へのトリチウム化したリガンド結
合を同時にモニターするために既知のGPCRに対して利用することができる。Wall
ac βカウンターは、トリチウムで標識したプローブ及び35Sで標識したプローブ
の両方を調べるためにエネルギーウインドーを切り換えることができるのでこれ
が可能である。このアッセイはまた、受容体活性化をもたらす他のタイプの膜活
性化事象を検出するために用いることもできる。例えば、様々な受容体（Gタン
パク質共役受容体及びチロシンキナーゼ受容体の両方）の32Pリン酸化をモニタ
ーするために該アッセイを用いることができる。膜がウェルの底に遠心分離され
ると、結合した［35S］GTPγSまたは32Pでリン酸化された受容体は、ウェルに被
覆されているシンチラント（scintillant）を活性化する。ScintiRストリップ(W
allac)は、この原理を実証するために用いられている。さらに、該アッセイはま
た、放射性標識したリガンドを用いて受容体へのリガンド結合を測定するために
も有用性を有する。同様に、放射性標識した結合したリガンドがウェルの底に遠
心分離されると、シンチストリップ標識は放射性標識したリガンドと近接するよ
うになり、活性化及び検出をもたらす。
【０１２０】 前述のプロトコルに基づいて、コントロール（pCMV）、内因性APJ及び非内因
性APJを比較するグラフの代表的な結果を図6に記載する。
【０１２１】 ２．アデニリルシクラーゼ 細胞に基づくアッセイのために設計されたFlash PlateTMアデニリルシクラー
ゼキット（New England Nuclear;カタログ番号SMP004A）を未精製の細胞膜での
使用のために改変した。Flash Plateウェルは、cAMPを認識する特定の抗体も含
有するシンチラント被覆を含有した。ウェル中に生成したcAMPをcAMP抗体への放
射性cAMPトレーサーの結合に対する直接競合により定量した。以下のものは、受
容体を発現する膜におけるcAMPレベルの変化の測定のための簡潔なプロトコルと
して使える。
【０１２２】 トランスフェクション後約3日目にトランスフェクションした細胞を集めた。2
0mM HEPES、pH 7.4及び10mM MgCl2を含有するバッファー中での懸濁した細胞の
均質化により膜を調製した。Brinkman PolytronTMを約10秒間用いて均質化を氷
上で実施した。得られたホモジネートを４℃で49,000 X gで15分間遠心分離した
。得られたペレットを次に20mM HEPES、pH 7.4及び0.1mM EDTAを含有するバッフ
ァー中に再懸濁し、10秒間均質化し、続いて４℃で49,000 X gで15分間遠心分離
した。得られたペレットを利用するまで-80℃で保存することができる。測定の
日に、膜ペレットを室温でゆっくり解凍し、20mM HEPES、pH 7.4及び10mM MgCl2 （本明細書に記載する値が好ましいが、これらの量を最適化することができる）
を含有するバッファー中に再懸濁し、0.60mg/mlの最終タンパク質濃度をもたら
した（再懸濁した膜は使用するまで氷上に置いた）。
【０１２３】 ｃAMP基準及び（11mlの検出バッファーに対して2μCiのトレーサー［125I］cA
MP（100μl）を含んでなる）検出バッファーを調製し、製造業者の説明書に従っ
て維持した。アッセイバッファーをスクリーニングのために新しく調製し、それ
は20mM HEPES、pH 7.4、10mM MgCl2、20mM（Sigma）、0.1ユニット/mlクレアチ
ンホスホキナーゼ（Sigma）、50μM GTP（Sigma）及び0.2mM ATP（Sigma）を含
有し；アッセイバッファーは、利用するまで氷上で保存することができる。NEN
Flashプレートに50μlのアッセイバッファーを加え、続いて50μlの膜懸濁液を
加えることによりアッセイを開始した。得られたアッセイ混合物を室温で60分間
インキュベーションし、続いて100μlの検出バッファーを加える。次に、プレー
トをさらに2-4時間インキュベーションし、続いてWallac MicroBetaシンチレー
ションカウンターで計数する。各アッセイプレート内に含まれる基準cAMP曲線か
らcAMP/ウェルの値を外挿する。前述のアッセイをMIGの分析に関して利用した。
【０１２４】 Ｂ．レポーターに基づくアッセイ １．CREBレポーターアッセイ（Gs共役受容体） Gs刺激を検出する方法は、cAMPに依存して活性化される転写因子CREBの既知の
特性による。293または293T細胞においてGs共役活性をアッセイするためにPathD
etect CREB trans-Reporting System（Stratagene、カタログ#219010）を利用し
た。哺乳類トランスフェクションキット（Stratagene、カタログ#200285）を製
造業者の説明書に従って用いて細胞をこの上記の系のプラスミド成分及び内因性
または突然変異体受容体をコードする示した発現プラスミドでトランスフェクシ
ョンした。簡潔に言えば、400ngのpFR-Luc（Gal4認識配列を含有するルシフェラ
ーゼレポータープラスミド）、40ngのpFA2-CREB（Gal4 DNA結合ドメインを含有
するGal4-CREB融合タンパク質）、80ngの（受容体を含んでなる）CMV-受容体発
現プラスミド及び20ngのCMV-SEAP（分泌されるアルカリホスファターゼ発現プラ
スミド；アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効
率の変動を制御するためにトランスフェクションした細胞の培地において測定さ
れる）をリン酸カルシウム沈殿物中にキットの説明書どおりに合わせた。沈殿物
の半分を96穴プレート中の3ウェル上に等しく分配し、細胞上で一晩保ち、翌朝
新しい培地で置き換えた。トランスフェクションの開始後48時間で、上記GPR30
系に関して記述したように細胞を処置し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイ
した。このアッセイをGHSRについて用いた。
【０１２５】 ２．AP1レポーターアッセイ（Gq共役受容体） Gq刺激を検出する方法は、プロモーター中にAP1要素を含有する遺伝子の活性
化をもたらすGq依存性ホスホリパーゼCの既知の特性による。リン酸カルシウム
沈殿物の成分が410ngのpAP1-Luc、80ngの受容体発現プラスミド及び20ngのCMV-S
EAPであったことを除いて、CREBレポーターアッセイに関して上に記述したプロ
トコルに従ってPathdetect AP-1 cis-Reporting System（Stratagene、カタログ
#219073）を利用した。このアッセイをETBR-LP2について用いた。
【０１２６】 Ｃ．細胞内IP3蓄積アッセイ 1日目に、（内因性及び突然変異させた）セロトニン受容体を含んでなる細胞
を24穴プレート上に通常1 x 105細胞／ウェル平板培養した。2日目に、まず第一
に50μlの無血清DMEM／ウェル中0.25μgのDNAと50μlの無血清DMEM／ウェル中2
μlのリポフェクトアミンを混合することにより細胞をトランスフェクションし
た。これらの溶液を穏やかに混合し、室温で15-30分間インキュベーションした
。細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、400μlの無血清培地をトランスフェクション培地
と混合し、細胞に加えた。次に、細胞を37℃/5％ CO2で3-4時間インキュベーシ
ョンし、次にトランスフェクション培地を除き、1ml/ウェルの通常の増殖培地で
置き換えた。3日目に細胞を3H-ミオ-イノシトールで標識した。簡潔に言えば、
培地を除き、細胞を0.5mlのPBSで洗浄した。次に、0.5mlのイノシトールを含ま
ない/無血清培地（GIBCO BRL）/ウェルを0.25μCiの3H-ミオ-イノシトール/ウェ
ルと共に加え、細胞を37℃/5％ CO2で16-18時間インキュベーションした。4日目
に細胞を0.5mlのPBSで洗浄し、イノシトールを含まない/無血清培地、10μMのパ
ルジリン、10mMの塩化リチウムを含有する0.45mlのアッセイ培地または0.4mlの
アッセイ培地と50μlの10xケタンセリン（ket）を10μMの最終濃度に加えた。次
に、細胞を37℃で30分間インキュベーションした。次に、細胞を0.5mlのPBSで洗
浄し、200μlの新しい/よく冷えた停止溶液（1M KOH；18mM ホウ酸Na；3.8mM ED
TA）/ウェルを加えた。この溶液を5-10分間または細胞が溶解されるまで氷上に
保ち、次に200μlの新しい/よく冷えた中和溶液（7.5％ HCL）により中和した。
次に、溶解産物を1.5mlエッペンドルフチューブ中に移し、1mlのクロロホルム/
メタノール（1：2）/ウェルを加えた。この溶液を15秒間ボルテックスし、上相
をBiorad AG1-X8陰イオン交換樹脂（100-200メッシュ）に添加した。まず第一に
、樹脂を1：1.25 W/Vで水で洗浄し、0.9mlの上相をカラム上に載せた。カラムを
10mlの5mMミオ-イノシトール及び10mlの5mMホウ酸Na/60mMギ酸Naで洗浄した。イ
ノシトールトリスリン酸塩を2mlの0.1Mギ酸/1Mギ酸アンモニウムで10mlのシンチ
レーションカクテルを含有するシンチレーションバイアル中に溶出した。カラム
を10mlの0.1Mギ酸/3Mギ酸アンモニウムで洗浄することにより再生し、dd H2Oで2
回すすぎ、水中4℃で保存した。
【０１２７】 図７は、C322K突然変異を含むヒト5-HT2A受容体からのIP3生成の実例を示す。
これらの結果は、プロリン突然変異アルゴリズム法がこの受容体を構成的に活性
化することを示すが、可能性がある治療法の同定のためのスクリーニングにその
ような受容体を用いる目的のためには、さらに確固たる差が好ましい。しかしな
がら、活性化された受容体は、構成的活性化の役割を理解し解明するため及びさ
らに調べることができる化合物の同定のために利用することができるので、この
差はそれ自体ヒト5HT2A受容体の内因性及び非内因性バージョンを区別すること
において有用であると考える。
【０１２８】 Ｄ．結果の要約 試験したGPCRの結果を表Eに記載し、ここで、増加％は、内因性GPCRに比較し
た場合に非内因性GPCRに対して認められた結果の％差を示し；これらの値の後に
は利用したアッセイのタイプに関する挿入表示が続く。さらに、利用したアッセ
イ系を挿入して記載する（そして異なる宿主細胞を用いた場合には両方を記載す
る）。これらの結果が示すように、ヒトGPCRの非内因性バージョンの構成的活性
を測定するために様々なアッセイを利用することができる。当業者は、前述の事
項に基づきそして当該技術分野が利用できる情報を参照して、研究者の特定の必
要性に適合する特定のアッセイ方法を選択すること及び／または最大限に活用す
ることができると考えられる。
【０１２９】
【表９】
【０１３０】 実施例６ 内因性オーファンGPCRの組織分布 市販されているヒト組織ドットブロット形態を用いて、内因性オーファンGPCR
をそのような受容体が局在する領域を決定するためにプローブで調べた。以下に
示す場合を除いて、（放射性標識した）全受容体cDNAをプローブとして用い：Ｐ
rime-It IITMランダムプライマーラベリングキット（Stratagene、#300385）を
製造業者の説明書に従って使用して（ベクターから切り出した）完全な受容体cD
NAを用いて放射性標識したプローブを作製した。ヒトRNA Master BlotTM（Clont
ech、#7770-1）にGPCR放射性標識プローブをハイブリダイズさせ、製造業者の説
明書に従ってストリンジェントな条件下で洗浄した。ブロットをKodak BioMaXオ
ートラジオグラフィーフィルムに-80℃で一晩感光させた。
【０１３１】 代表的なドットブロット形態結果を図8にGPR1（8A）、GPR30（8B）及びAPJ（8
C）について示し、全ての受容体について結果を表Ｆに要約する。
【０１３２】
【表１０】
【０１３３】 前述の情報に基づき、ヒトGPCRを罹病組織における分布に関しても評価するこ
とができ；次に「正常」及び罹病組織間の比較評価を利用して罹病状態における
特定の受容体の過剰発現または不十分な発現の可能性を決定することができるこ
とを記す。可能性がある治療関連性の候補化合物を直接同定するスクリーニング
の目的のためにヒトGPCRの非内因性バージョンを利用することが望ましい状況に
おいて、特定のヒトGPCRが過剰発現される疾病及び疾患の処置では逆アゴニスト
が有用であり、一方、特定のヒトGPCRが不十分に発現される疾病及び疾患の処置
ではアゴニストまたは部分アゴニストが有用であることを記す。
【０１３４】 所望に応じて、目的の受容体が発現されるこれらの組織内の特定の細胞を同定
するために、当業者に周知の技術（例えばインサイチューハイブリダイゼーショ
ン）を用いて、受容体のより詳細な細胞位置決定を利用することができる。
【０１３５】 本特許書類中に挙げる特許、出願及び発行された（printed）公開の各々は、
これらを全部引用することにより本明細書に組み込まれるものとする。
【０１３６】 当業者が認識するように、本発明の精神からそれずに本発明の好ましい態様に
対して多数の変更及び改変を行うことができる。全てのそのような変形は本発明
の範囲内に入るものとする。
【０１３７】 内因性及び非内因性ヒトGPCRの両方に利用する目的のために、様々な発現ベク
ターを当業者は利用できるが、利用するベクターがpCMVであることが最も好まし
い。このベクターは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約の条項により1998年10月13日にAmerican Type Culture Collection(ATC
C)(10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA)に寄託されている
。このベクターは1998年 にATCCにより試験され、1998年 に生育できると
確認された。ATCCはpCMVに以下の寄託番号: を付与している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 膜貫通ヘリックス、細胞内ループ及び細胞外ループに番号を付与したGタンパ
ク質共役受容体の一般化構造を示す。
【図２】 典型的なGタンパク質共役受容体の活性及び不活性の２つの状態並びに第二メ
ッセンジャー伝達経路への活性状態の連結を図式的に示す。
【図３】 制限酵素部位の位置を含む、好ましいベクターpCMVの配列表である。
【図４】 pCMV、CRE-LucレポーターのGPR6によりもたらされる活性化の非内因性の構成
的に活性のあるGPR30阻害をCRE-LucレポーターのGPR6によりもたらされる活性化
の内因性GPR30阻害と比較する測定されたシグナルの図示である。
【図５】 pCMV、CRE-LucレポーターのGPR3によりもたらされる活性化の非内因性の構成
的に活性化されたGPR17阻害をCRE-LucレポーターのGPR3によりもたらされる活性
化の内因性GPR17阻害と比較する測定されたシグナルの図示である。
【図６】 コントロールのpCMV、内因性APJ及び非内因性APJを比較する測定されたシグナ
ルの図式結果を示す。
【図７】 非内因性ヒト5-HT2A受容体からのIP3生成をこの受容体の内因性バージョンと
比較した場合の実例を示す。
【図８】 GPR1(8A)、GPR30(8B)及びAPJ(8C)のドットブロット形態の結果である。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リオウ，チエン・ダブリユー アメリカ合衆国カリフオルニア州92129サ ンデイエゴ・サリツクスプレイス7668 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA36 DA77 FB02 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA20 4B063 QA05 QQ08 QQ13 QQ20 QQ62 QR48 QR51 QR77 QR80 QS38 4B065 AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA46 4C084 AA06 AA17 ZC42 ZC78 4H045 AA10 BA10 CA40 DA50 EA20 FA72 FA74

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 内因性ヒトオーファンGタンパク質共役受容体（GPCR）の構
    成的に活性のある非内因性の変種であって、非内因性GPCRの膜貫通-6（TM6）及
    び細胞内ループ-3（IC3）領域を横切る以下のアミノ酸残基（カルボキシ末端〜
    アミノ末端の向き）を含んでなる非内因性ヒトGPCR： P1AA15X ここで： （１）P1は非内因性GPCRのTM6領域内に位置するアミノ酸残基であり、ここで、P1 は（ｉ）内因性オーファンGPCRプロリン残基及び（ii）プロリン以外の非内因
    性アミノ酸残基よりなる群から選択され； （２）AA15は（ａ）内因性オーファンGPCRの15個の内因性アミノ酸残基、（ｂ）
    15個の非内因性アミノ酸残基並びに（ｃ）内因性オーファンGPCRの少なくとも１
    個の内因性アミノ酸残基及び少なくとも１個の非内因性アミノ酸残基を含んでな
    る15個のアミノ酸残基の組み合わせよりなる群から選択される15個のアミノ酸残
    基であり、ただし、GPCRのTM6領域内に位置する15個の内因性アミノ酸残基のい
    ずれもプロリンでない；そして （２）Xは該非内因性GPCRのIC3領域内に位置する非内因性アミノ酸残基である。
  2. 【請求項２】 P1が内因性プロリン残基である請求項１の非内因性ヒトGPCR
    。
  3. 【請求項３】 P1がプロリン残基以外の非内因性アミノ酸残基である請求項
    １の非内因性ヒトGPCR。
  4. 【請求項４】 AA15が内因性GPCRの15個の内因性アミノ酸残基である請求項
    １の非内因性ヒトGPCR。
  5. 【請求項５】 Xがリシン、ヒスチジン、アルギニン及びアラニン残基より
    なる群から選択され、ただし、該内因性ヒトGPCRの位置Xの内因性アミノ酸がリ
    シンである場合には、Xがヒスチジン、アルギニン及びアラニンよりなる群から
    選択される請求項１の非内因性ヒトGPCR。
  6. 【請求項６】 Xがリシン残基であり、ただし、該内因性ヒトGPCRの位置Xの
    内因性アミノ酸がリシンである場合には、Xがリシン以外のアミノ酸である請求
    項１の非内因性ヒトGPCR。
  7. 【請求項７】 Xがリシン残基であり、ただし、該内因性ヒトGPCRの位置Xの
    内因性アミノ酸がリシンである場合には、Xがリシン以外のアミノ酸である請求
    項４の非内因性ヒトGPCR。
  8. 【請求項８】 P1がプロリン残基であり、そしてXがリシン残基であり、た
    だし、該内因性ヒトGPCRの位置Xの内因性アミノ酸がリシンである場合には、Xが
    リシン以外のアミノ酸である請求項１の非内因性ヒトGPCR。
  9. 【請求項９】 請求項１の非内因性ヒトGPCRを含んでなる宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 該宿主細胞が哺乳類起源のものである請求項９の材料。
  11. 【請求項１１】 精製され、単離された形態の請求項１の非内因性ヒトGPCR
    。
  12. 【請求項１２】 内因性ヒトオーファンGタンパク質共役受容体（GPCR）の
    構成的に活性のある非内因性の変種をコードする核酸配列であって、オーファン
    GPCRの膜貫通-6（TM6）及び細胞内ループ-3（IC3）領域を横切る以下の核酸配列
    領域： 3'-Pcodon (AA-codon)15 Xcodon-5' ここで： （１）Pcodonは非内因性GPCRのTM6領域内の領域をコードする核酸であり、ここ
    で、Pcodonは（ｉ）内因性GPCRプロリン残基及び（ii）プロリン以外の非内因性
    アミノ酸残基よりなる群から選択されるアミノ酸をコードする； （２）(AA-codon)15は（ａ）内因性オーファンGPCRの15個の内因性アミノ酸残基
    、（ｂ）15個の非内因性アミノ酸残基並びに（ｃ）内因性オーファンGPCRの少な
    くとも１個の内因性アミノ酸残基及び少なくとも１個の非内因性アミノ酸残基を
    含んでなる15個のアミノ酸残基の組み合わせよりなる群から選択される15個のア
    ミノ酸残基をコードする15個のコドンであり、ただし、オーファンGPCRのTM6領
    域内に位置する15個の内因性アミノ酸残基のいずれもプロリンでない；そして （３）Xcodonは該非内因性ヒトGPCRのIC3領域内に位置する領域残基をコードす
    る核酸であり、ここで、Xcodonは非内因性アミノ酸をコードする、 を含んでなる核酸配列。
  13. 【請求項１３】 Pcodonが内因性プロリン残基をコードする請求項１２の核
    酸配列。
  14. 【請求項１４】 Pcodonがプロリン残基以外の非内因性アミノ酸残基をコー
    ドする請求項１２の核酸配列。
  15. 【請求項１５】 Xcodonがリシン、ヒスチジン、アルギニン及びアラニンよ
    りなる群から選択される非内因性アミノ酸をコードし、ただし、該内因性ヒトGP
    CRの位置Xの内因性アミノ酸がリシンである場合には、Xcodonがヒスチジン、ア
    ルギニン及びアラニンよりなる群から選択されるアミノ酸をコードする請求項１
    ２の核酸配列。
  16. 【請求項１６】 Xcodonが非内因性のリシンアミノ酸をコードし、ただし、
    該内因性ヒトGPCRの位置Xの内因性アミノ酸がリシンである場合には、Xcodonが
    ヒスチジン、アルギニン及びアラニンよりなる群から選択されるアミノ酸をコー
    ドする請求項１３の核酸配列。
  17. 【請求項１７】 XcodonがAAA、AAG、GCA、GCG、GCC及びGCUよりなる群から
    選択される請求項１２の核酸配列。
  18. 【請求項１８】 XcodonがAAA及びAAGよりなる群から選択される請求項１２
    の核酸配列。
  19. 【請求項１９】 PcodonがCCA、CCC、CCG及びCCUよりなる群から選択され、
    そしてXcodonがAAA及びAAGよりなる群から選択される請求項１２の核酸配列。
  20. 【請求項２０】 請求項１２の核酸配列を含んでなるベクター。
  21. 【請求項２１】 請求項１２の核酸配列を含んでなるプラスミド。
  22. 【請求項２２】 請求項２１の核酸配列を含んでなる宿主細胞。
  23. 【請求項２３】 精製され、単離された形態の請求項１２の核酸配列。
  24. 【請求項２４】 ヒトGタンパク質共役受容体（「GPCR」）の第三細胞内ル
    ープ内の内因性アミノ酸残基の改変を選択する方法であって、該受容体が膜貫通
    ６領域及び細胞内ループ３領域を含んでなり、その内因性アミノ酸が非内因性ア
    ミノ酸に改変された場合に該ヒトGPCRを構成的に活性化し、以下の工程： （ａ）ヒトGPCRの膜貫通６領域内の内因性プロリン残基を同定すること； （ｂ）該GPCRのカルボキシ末端領域〜該GPCRのアミノ末端領域の向きに移動する
    ことにより、該プロリン残基から16番目の内因性アミノ酸残基を同定すること； （ｃ）工程（ｂ）の内因性残基を非内因性アミノ酸残基に改変して内因性ヒトGP
    CRの非内因性の変種を作製すること；及び （ｄ）工程（ｃ）の非内因性ヒトGPCRが構成的に活性であるかどうかを決定する
    こと、 を含んでなる方法。
  25. 【請求項２５】 膜貫通６領域中の該プロリン残基からカルボキシ末端〜ア
    ミノ末端の向きに2残基であるアミノ酸残基がトリプトファンである請求項２４
    の方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２４の方法により作製された構成的に活性のある非
    内因性ヒトGPCR。
  27. 【請求項２７】 請求項２５の方法により作製された構成的に活性のある非
    内因性ヒトGPCR。
  28. 【請求項２８】 内因性ヒトGタンパク質共役受容体（GPCR）の非内因性の
    構成的に活性のある変種を作製するためのアルゴリズム法であって、該内因性GP
    CRが膜貫通６領域及び細胞内ループ３領域を含んでなり、 （ａ）膜貫通-6領域中のプロリン残基を含んでなる内因性ヒトGPCRを選択するこ
    と； （ｂ）工程（ａ）のプロリン残基からカルボキシ末端〜アミノ末端の向きに16ア
    ミノ酸残基を数えることにより内因性アミノ酸残基を同定すること； （ｃ）工程（ｂ）の同定したアミノ酸残基を非内因性アミノ酸残基に改変して内
    因性ヒトGPCRの非内因性の変種を作製すること；及び （ｄ）工程（ｃ）の内因性ヒトGPCRの非内因性の変種が構成的に活性であるかど
    うかを決定すること、 の工程を含んでなるアルゴリズム法。
  29. 【請求項２９】 膜貫通６領域中の該プロリン残基からカルボキシ末端〜ア
    ミノ末端の向きに2残基であるアミノ酸残基がトリプトファンである請求項２８
    のアルゴリズム法。
  30. 【請求項３０】 請求項２８のアルゴリズム法により作製された構成的に活
    性のある非内因性ヒトGPCR。
  31. 【請求項３１】 請求項２９のアルゴリズム法により作製された構成的に活
    性のある非内因性ヒトGPCR。
  32. 【請求項３２】 非内因性の構成的に活性化されたヒトGタンパク質共役受
    容体に対する逆アゴニスト、アゴニスト及び部分アゴニストよりなる群から選択
    される化合物を直接同定する方法であって、該受容体が膜貫通-６領域及び細胞
    内ループ-３領域を含んでなり、 （ａ）内因性ヒトGPCRを選択すること； （ｂ）工程（ａ）のGPCRの膜貫通-6領域内のプロリン残基を同定すること； （ｃ）カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに工程（ｂ）のプロリン残基から16番
    目の内因性のアミノ酸残基を同定すること； （ｄ）工程（ｃ）の内因性アミノ酸を非内因性アミノ酸に改変すること； （ｅ）工程（ｄ）の非内因性GPCRが構成的に活性であることを確認すること； （ｆ）工程（ｅ）の非内因性の構成的に活性化されたGPCRと候補化合物とを接触
    させること；及び （ｇ）該接触させた受容体での化合物効能の測定により、該化合物が該受容体の
    逆アゴニスト、アゴニストまたは部分アゴニストであるかどうかを決定すること
    、 の工程を含んでなる方法。
  33. 【請求項３３】 工程（ｄ）の非内因性アミノ酸がリシンである請求項３２
    の方法。
  34. 【請求項３４】 請求項３２の方法により直接同定された化合物。
  35. 【請求項３５】 直接同定された化合物が逆アゴニストである請求項３２の
    方法。
  36. 【請求項３６】 直接同定された化合物がアゴニストである請求項３２の方
    法。
  37. 【請求項３７】 直接同定された化合物が部分アゴニストである請求項３２
    の方法。
  38. 【請求項３８】 請求項３５の逆アゴニストを含んでなる組成物。
  39. 【請求項３９】 請求項３６のアゴニストを含んでなる組成物。
  40. 【請求項４０】 請求項３７の部分アゴニストを含んでなる組成物。
  41. 【請求項４１】 非内因性の構成的に活性化されたヒトGタンパク質共役受
    容体（「GPCR」）に対する逆アゴニストを直接同定する方法であって、該GPCRが
    膜貫通-６領域及び細胞内ループ-３領域を含んでなり、 （ａ）内因性ヒトGPCRを選択すること； （ｂ）工程（ａ）のGPCRの膜貫通-6領域内のプロリン残基を同定すること； （ｃ）カルボキシ末端〜アミノ末端の向きに工程（ｂ）のプロリン残基から16番
    目の内因性のアミノ酸残基を同定すること； （ｄ）工程（ｃ）の内因性アミノ酸を非内因性のリシン残基に改変すること； （ｅ）工程（ｄ）の非内因性GPCRが構成的に活性であることを確認すること； （ｆ）工程（ｅ）の非内因性の構成的に活性化されたGPCRと候補化合物とを接触
    させること；及び （ｇ）該接触させた受容体での化合物効能の測定により、該化合物が該受容体の
    逆アゴニストであるかどうかを決定すること、 の工程を含んでなる方法。
  42. 【請求項４２】 請求項３７の方法により直接同定された逆アゴニスト。
  43. 【請求項４３】 請求項３８の逆アゴニストを含んでなる組成物。
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