CN1341123A - 新型g蛋白偶联型受体蛋白及其dna - Google Patents

Abstract

本发明涉及来自于人的G蛋白偶联型受体蛋白、其部分肽,或它们的盐;编码该受体蛋白的核酸及其衍生物;具有与编码该受体蛋白及其衍生物的碱基序列互补的反义链的核酸;制备该G蛋白偶联型受体蛋白的方法;测定针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体的方法;使这些配体与所述G蛋白偶联型受体蛋白之间的结合特性发生变化的化合物的筛选方法/试剂盒;通过所述筛选获得的化合物或其盐;所述G蛋白偶联型受体蛋白的抗体。本发明中人(海马)的G蛋白偶联型受体蛋白或编码该受体蛋白的核酸及其衍生物可用于:(1)测定针对本发明受体蛋白的配体(激动剂),(2)作为预防和/或治疗与本发明G蛋白偶联型受体蛋白的功能异常相关的疾病的制剂,(3)作为基因诊断制剂,(4)定量针对本发明G蛋白偶联型受体蛋白的配体,(5)筛选使本发明的G蛋白偶联型受体蛋白与配体之间的结合特性发生改变的化合物(激动剂、拮抗剂等),(6)作为预防和/或治疗各种疾病的制剂,其中包含使本发明的G蛋白偶联型受体蛋白与配体之间的结合特性发生改变的化合物(激动剂、拮抗剂等),(7)定量本发明的受体蛋白、其部分肽或它们的盐,(8)通过抗体来中和本发明的受体蛋白、其部分肽或它们的盐。

Description

新型G蛋白偶联型受体蛋白及其DNA

                           发明领域

本发明涉及来自人(海马)的一种新型G蛋白偶联型受体蛋白或其盐以及编码它们的DNA等。

                           发明背景

多种生理活性物质如激素、神经递质等通过细胞膜上特异性受体蛋白调节着生物机体的功能。很多这类受体蛋白通过活化它们所偶联的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(以下简称为G蛋白)而介导细胞内的信号传递，它们具有共同结构，即7个跨膜区，因此将其总称为G蛋白偶联型受体蛋白或7跨膜型受体蛋白(7TMR)。

G蛋白偶联型受体蛋白存在于机体每一功能性细胞和器官的细胞表面，它们作为调节这些细胞或器官功能的分子诸如激素、神经递质、生理活性物质等分子的重要靶。这些受体蛋白通过结合生理活性物质而介导细胞内的信号传递，并由这些信号引发各种反应如细胞的激活或抑制。

弄清那些调节各种细胞和器官之复杂功能的物质与它们的特异性受体蛋白(尤其G蛋白偶联型受体蛋白)之间的关系，将阐明体内各种细胞和器官的功能机制，并因此提供一种用于开发与这些功能密切相关之药物的非常重要的方法。

如，在机体的各种器官中，生理功能均通过多种激素、激素样物质、神经递质或生理活性物质控制。尤其是，机体内各个部位的生理活性物质通过其相应受体蛋白调节其生理功能。体内还有很多未知激素，神经递质或其他生理活性物质，关于这些物质的受体蛋白的构造至今只有少数的报导。即使是已知的受体蛋白至今也不清楚其是否存在亚型。

药物开发中，弄清调节体内复杂功能的物质与其特异性受体蛋白之间的关系也十分重要。为了在药物开放中更有效地筛选受体蛋白的激动剂和拮抗剂，必须阐明体内表达的受体蛋白基因的功能，并在适当的表达系统中表达这些基因。

近年来，cDNA序列的随机分析已成为体内表达的基因的常用分析方法。如此获得的cDNA片段的序列已注册并作为表达序列标签(EST)公开在数据库中。但大多数EST仅含有序列信息，很难推测其功能。

可以抑制G蛋白偶联型受体与生理活性物质(即配体)结合的物质，以及能结合并诱导出与该生理活性物质(即配体)所诱导信号传导相似的信号传导的物质，均已作为这些受体的特异性拮抗剂或激动剂用于调节生物功能。因此，找到一种不仅对体内生理表达十分重要，而且可作为药物开发之目标的新型G蛋白偶联型受体蛋白，并克隆这些基因(例如cDNA)，对于寻找该新型G蛋白偶联型受体蛋白的特异性配体、激动剂及拮抗剂具有非常重要的意义。

但是，并非所有的G蛋白偶联型受体都已经被发现，即使到现在，仍然有许多未知的G蛋白偶联型受体，其中那些相应配体未明的受体被称为孤儿受体。因而，亟需发现一种新型G蛋白偶联型受体蛋白，并阐明其功能。

G蛋白偶联型受体可用于根据所述信号传导活性寻找新型生理活性物质(即配体)，还可用于寻找该受体的激动剂和拮抗剂。即使未发现任何生理活性配体，也可以通过受体灭活试验(基因敲除动物)分析该受体的生理活性以制备其激动剂和拮抗剂。该受体的配体、激动剂及拮抗剂可作为与G蛋白偶联型受体之功能紊乱相关的疾病的预防/治疗性药物及诊断药物。

因G蛋白偶联型受体的基因异常引发该受体功能低下或亢进常导致某些疾病。这种情况下，所述G蛋白偶联型受体不仅可用于该受体的拮抗剂或激动剂给药，还可通过将该受体基因，或该受体基因的反义核酸转入机体(或特定器官)内而实现基因治疗。在所述基因治疗中，所述受体碱基序列的信息对于研究该基因的缺失或突变是必不可少的。该受体基因还可作为与该受体失调相关的疾病的预防/治疗性药物及诊断药物。

本发明提供了一种如上所述新型有效的G蛋白偶联型受体蛋白。即，本发明提供了一种新型G蛋白偶联型受体蛋白，它的部分肽及其盐；包含编码该G蛋白偶联型受体蛋白或其部分肽的多核苷酸(DNA和RNA，及其衍生物)的多核苷酸(DNA和RNA，及其衍生物)；含有上述多核苷酸的重组载体；带有该重组载体的转化体；用于制备该G蛋白偶联型受体蛋白及其盐类的方法；抗所述G蛋白偶联型受体蛋白、其部分肽及其盐类的抗体；改变所述G蛋白偶联型受体蛋白表达水平的化合物；用于测定所述G蛋白偶联型受体蛋白的配体的方法；用于筛选能够改变配体与所述G蛋白偶联型受体蛋白结合特性之化合物(拮抗剂及激动剂)或其盐类的方法；用于所述筛选方法的试剂盒；利用所述筛选方法或利用所述筛选试剂盒和所述G蛋白偶联型受体蛋白可获得的配体结合特性已改变的化合物(拮抗剂及激动剂)或其盐类；以及药物组合物等，该药物组合物含有能改变G蛋白偶联型受体蛋白之配体结合特性的化合物(拮抗剂及激动剂)、或能改变G蛋白偶联型受体蛋白表达水平的化合物或其盐类。

                    发明公开

本发明人经过反复的研究，根据由简并PCR方法获得的EST信息，成功分离到编码来自人(海马)的新型G蛋白偶联型受体蛋白的cDNA，并测序该cDNA的完整碱基序列。从该碱基序列推导氨基酸序列时，在疏水图谱中发现第1到第7个跨膜结构域，这样就确证了由所述cDNA编码的蛋白质是一种7次通过胞膜的G蛋白偶联型受体蛋白。基于这些发现，本发明人进行了广泛的研究，得出了结论，从而完成本发明。

因此，本发明涉及：

(1)一种含有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白质或其盐类；

(2)一种(1)所述蛋白质的部分肽或其盐；

(3)一种多核苷酸，其包含具有编码(1)所述蛋白质的碱基序列的多核苷酸；

(4)一种如(3)所述多核苷酸，该多核苷酸为DNA；

(5)一种如(3)所述多核苷酸，其含有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列；

(6)一种含有如(3)所述多核苷酸的重组载体；

(7)一种被如(6)所述重组载体转化的转化体；

(8)一种用于制备如(1)所述蛋白质或其盐的方法，该方法包括培养如(7)所述转化体，使之产生如(1)所述蛋白质；

(9)抗如(1)所述蛋白质或抗如(2)所述部分肽或其盐的抗体；

(10)如(9)所述的抗体，其为能够灭活如(1)所述蛋白质的信号传导作用的中和抗体；

(11)一种含有如(9)所述抗体的诊断组合物；

(12)一种如(1)所述蛋白质或其盐的配体，该配体可通过使用如(1)所述蛋白质或使用如(2)所述部分肽或其盐来获得；

(13)一种含有如(12)所述配体的药用组合物；

(14)一种用于测定如(1)所述蛋白质或其盐的配体的方法，其中使用如(1)所述蛋白质或如(2)所述部分肽或其盐；

(15)一种用于筛选能够改变配体与如(1)所述蛋白质或其盐的结合特性的化合物或其盐的方法，该方法包括使用如(1)所述蛋白质，或如(2)所述部分肽或其盐；

(16)一种用于筛选能够改变配体与如(1)所述蛋白质或其盐结合特性的化合物或其盐的试剂盒，其含有如(1)所述蛋白质，或如(2)所述部分肽或其盐；

(17)一种能够改变配体与(1)所述蛋白质或其盐的结合特性的化合物或其盐，该化合物可以通过使用如(15)所述筛选方法或如(16)所述筛选试剂盒来获得；

(18)一种含有能够改变配体与如(1)所述蛋白质或其盐结合特性的化合物或其盐的药用组合物，其可以通过使用如(15)所述筛选方法或如(16)所述筛选试剂盒来获得；

(19)一种多核苷酸，其在高度严谨条件下能与如(3)所述多核苷酸杂交。

(20)一种多核苷酸，其含有与如(3)所述多核苷酸或部分互补的碱基序列及其一部分。

(21)一种定量如(1)所述蛋白质的mRNA的方法，其包括使用如(3)所述多核苷酸或其部分。

(22)一种定量如(1)所述蛋白质的方法，其包括使用如(9)所述抗体。

(23)一种与如(1)所述蛋白质功能相关的疾病的诊断方法，其包括使用如(21)或(22)所述的定量方法。

(24)一种用于筛选能改变如(1)所述蛋白质表达水平的化合物或其盐的方法，其包含使用如(22)所述的定量方法。

(25)一种用于筛选能改变细胞膜上的如(1)所述蛋白质量的化合物或其盐的方法，其包含使用如(22)所述的定量方法。

(26)一种能改变如(1)所述蛋白质表达水平的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用如(24)所述的筛选方法来获得。

(27)一种能改变细胞膜上的如(1)所述蛋白质量的化合物或其盐的方法，所述化合物或其盐可通过使用如(25)所述的筛选方法来获得。

本发明还提供了：

(28)一种如(1)所述蛋白质或其盐，其中该蛋白质包含：(i)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中的1个、2个或多个氨基酸(优选1～30个氨基酸，更优选1～9个氨基酸，最优选数(1～5)个氨基酸)被缺失；(ii)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中添加了1个、2个或多个氨基酸(优选1～30个氨基酸，更优选1～10个氨基酸，最优选数(1～5)个氨基酸)；(iii)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中的1个、2个或多个氨基酸(优选1～30个氨基酸，更优选1～10个氨基酸，最优选数(1～5)个氨基酸)被其他氨基酸所取代；以及(iv)上述氨基酸序列的组合；

(29)一种如(14)所述测定配体的方法，其包括使如(1)所述蛋白质或其盐或如(2)所述部分肽或其盐与待测化合物接触；

(30)测定如(29)所述配体的方法，其中所述配体有，例如血管紧张素、韩蛙皮素、canavinoid、缩胆囊素、谷氨酰胺、5-羟色胺、褪黑激素、神经肽Y、类阿片、嘌呤、加压素、催产素、PACAP、促胰泌素、胰高血糖素、降钙素、肾上腺皮质激素、生长抑素、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PTH、血管肠肽(VIP)、生长抑素、多巴胺、胃动素、糊精、缓激肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓素、腺苷、肾上腺素、α和β-趋化因子(例如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1-α、MIP-1β和RANTES)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽、促生长激素神经肽。

(31)如(15)所述的筛选方法，其中比较下述两种情况：(i)让如(1)所述蛋白质或其盐或如(2)所述部分肽或其盐与所述配体接触；(ii)让如(1)所述蛋白质或其盐或如(2)所述部分肽或其盐与所述配体以及待测化合物接触；

(32)一种筛选能改变配体与(1)所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的方法，其中包括：(i)使标记配体与(1)所述蛋白质或其盐或(2)所述部分肽或其盐接触；(ii)使标记配体及待测化合物与如(1)所述蛋白质或其盐或(2)所述部分肽或其盐接触，然后测量并比较上述两种情况下与(1)所述蛋白质或其盐或(2)所述部分肽或其盐结合的该标记配体的量；

(33)一种筛选能改变配体与(1)所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的方法，其中包括：(i)使标记配体与含有如(1)所述蛋白质的细胞接触；(ii)使标记配体及待测化合物与所述细胞接触，然后测量并比较上述两种情况下与所述细胞结合的标记配体的量；

(34)一种筛选能改变配体与(1)所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的方法，其中包括：(i)使标记配体与含有如(1)所述蛋白质的细胞膜组分接触；(ii)使标记配体及待测化合物与所述细胞膜组分接触，然后测量并比较上述两种情况下与该细胞膜组分结合的标记配体的量；

(35)一种筛选能改变配体与(1)所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的方法，其中包括：(i)使标记配体与(7)所述转化体经培养后表达在细胞膜上的蛋白质接触；(ii)使标记配体及待测化合物与(7)所述转化体经培养后表达在细胞膜上的蛋白质接触，然后测量并比较上述两种情况下与表达于细胞膜上的蛋白结合的标记配体的量；

(36)一种筛选能改变配体与(1)所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的方法，其中包括：(i)使能活化如(1)所述蛋白质或其盐的化合物与含有如(1)所述蛋白质的细胞接触；(ii)使能活化如(1)所述蛋白质或其盐的化合物及待测化合物与含有如(1)所述蛋白质的细胞接触，然后测量并比较上述两种情况下所述蛋白质所介导的细胞刺激活性；

(37)一种筛选能改变配体与(1)所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐的方法，其中包括：(i)使能活化如(1)所述蛋白质或其盐的化合物与与(7)所述转化体经培养后表达在细胞膜上的蛋白质接触；(ii)使能活化如(1)所述蛋白质或其盐的化合物及待测化合物与与(7)所述转化体经培养后表达在细胞膜上的蛋白质接触，然后测量并比较上述两种情况下所述蛋白质所介导的细胞刺激活性；

(38)如(36)或(37)所述的筛选方法，其中能活化如(1)所述蛋白质的化合物为：血管紧张素、韩蛙皮素、canavinoid、缩胆囊素、谷氨酰胺、5-羟色胺、褪黑激素、神经肽Y、类阿片、嘌呤、加压素、催产素、PACAP、促胰泌素、胰高血糖素、降钙素、肾上腺皮质激素、生长抑素、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PTH、血管肠肽(VIP)、生长抑素、多巴胺、胃动素、糊精、缓激肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓素、腺苷、肾上腺素、α和β-趋化因子(例如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1-α、MIP-1β和RANTES)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽、或促生长激素神经肽。

(39)一种能够改变配体与如(1)所述蛋白或其盐之间结合特性的化合物或其盐，其可通过(31)～(38)所述筛选方法来获得；

(40)一种药用组合物，其含有能够改变配体与如(1)所述蛋白或其盐之间结合特性的化合物或其盐，该化合物或其盐可通过(31)～(38)所述筛选方法来获得；

(41)一种如(16)所述筛选试剂盒，其包括含如(1)所述蛋白质的细胞；

(42)一种如(16)所述筛选试剂盒，其中包括一种含有如(1)所述蛋白质的细胞膜组分；

(43)一种如(16)所述筛选试剂盒，其中包括一种通过培养如(7)所述转化体细胞而在其膜中表达的蛋白质；

(44)一种能够改变配体与如(1)所述蛋白质或其盐之间结合特性的化合物或其盐，该化合物或其盐可通过(41)～(43)所述筛选试剂盒来获得；

(45)一种药用组合物，其包括一种能够改变配体与如(1)所述蛋白或其盐之间结合特性的化合物或其盐，该化合物或其盐可通过(41)～(43)所述筛选试剂盒来获得；

(46)一种用于定量如(1)所述蛋白质或如(2)所述部分肽，或它们的盐的方法，该方法包括让如(9)所述抗体与如(1)所述蛋白质或如(2)所述部分肽或其盐接触；

(47)一种用于定量样品溶液中的如(1)所述蛋白质或如(2)所述部分肽或其盐的方法，该方法包括让如(9)所述抗体与样品溶液及标记的(1)所述蛋白质或如(2)所述部分肽或其盐进行竞争性反应，测定与所述抗体结合的上述标记物质的相应比例；以及

(48)一种用于定量样品溶液中的如(1)所述蛋白质或如(2)所述部分肽或其盐的方法，该方法包括让样品溶液与固定于载体上的(9)所述抗体以及经标记后的(9)所述抗体同时或先后反应，然后测定固定于载体上的标记物活性。

                      附图说明

图1为实施例1中来自人海马的本发明新型G蛋白偶联型受体蛋白hSLT的DNA序列以及从该DNA序列推导的氨基酸序列(下接图2)。

图2为编码实施例1中来自人海马的本发明新型G蛋白偶联型受体蛋白hSLT的DNA序列以及从该DNA序列推导的氨基酸序列(上续图1)。

图3为在图1～2所示氨基酸序列基础上制备的来自人海马的本发明新型G蛋白偶联型受体蛋白的疏水性图谱。

                 实施本发明的最佳模式

本发明的G蛋白偶联型受体蛋白(下文通常简称为“受体蛋白”)包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列(图1及2所示氨基酸序列)。

本发明受体蛋白可以是来自人或哺乳动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)的任一种细胞(如脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞等)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等)或血细胞系、或任一种含此类细胞的组织，例如脑、脑的各部分(例如，嗅球、屏状核、大脑基底神经节、海马、丘脑、丘脑下部、丘脑下核、大脑皮质、延髓、小脑、后额叶、前额叶、颞叶、豆状核、尾状核、胼胝体、黑质)、脊髓、脑垂体、胃、胰腺、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、腭下腺、外周血、外周血细胞、前列腺、睾丸、附睾、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等，特别是脑及脑的各部分。所述受体蛋白也可以是合成蛋白。

与SEQ ID NO：1所示序列基本相同的氨基酸序列包括与SEQ ID NO：1所示序列具有不小于50％同源性的氨基酸序列，优选同源性不小于70％，较优选不小于80％，更优选不小于90％，最优选不小于95％。

与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列基本相同的蛋白质的优选实例是一种序列与SEQ ID NO：1基本相同以及活性与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列基本相同的蛋白质。

基本相同活性的实例包括配体结合活性、信号传导活性等。术语“基本相同”是指其活性的实质彼此相同。因此优选地，尽管配体结合活性或信号传导活性等活性是同等的(如约0.01-100倍，优选约0.5-20倍，更优选约0.5-2倍)，但活性的大小以及蛋白质分子量等量化因素可以彼此不同。

所述活性，例如配体结合活性或信号传导活性可以根据公知方法测定，例如，用将在下文中描述的配体测定以及筛选方法。

本发明受体蛋白可以包括(i)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中的1个、2个或多个氨基酸(优选1～30个氨基酸，更优选1～10个氨基酸，最优选数(1-5)个氨基酸)被缺失；(ii)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中的1个、2个或多个氨基酸(优选1～30个氨基酸，更优选1～10个氨基酸，最优选数(1-5)个氨基酸)被添加；(iii)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中的1个、2个或多个氨基酸(优选1～30个氨基酸，更优选1～10个氨基酸，最优选数(1-5)个氨基酸)被其他氨基酸所取代；以及(iv)上述氨基酸序列的组合。

本说明书中的受体蛋白可以用本领域已知的描述肽的方法来定义。即，左末端(氨基端)为N末端，右末端(羧基端)为C-末端。本发明受体蛋白中包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO^-)，但是C-末端也可以为酰胺(-CONH₂)或酯(-COOR)。

用R表示的酯基团有C_1～6烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等；C_3～8环烷基如环戊基、环己基等；C_6～12芳基如苯基、α-萘基等；C_{7～ 14}芳烷基如苯基-C_1-2烷基或α-萘基-C_1-2烷基等、苯基-C_1-2烷基又如苯甲基、苯乙基等、α-萘基-C_1-2烷基又如α-萘甲基等。此外，广泛用作口服酯类的三甲基乙酰氧甲基或其类似物也可以使用。

当本发明受体蛋白在羧基末端以外的位置上包括一个羧基(羧酸酯)时，它可以酰胺化或酯化，则这类酰胺或酯也可以包括在本发明所述受体的范围之内。所述酯基可以与上述C-末端的酯基相同。

另外，本发明受体蛋白可以包括，那些N末端甲硫氨酸之氨基用保护基(例如C_1～6酰基，其中如C_2～6烷醇基象甲酰基、乙酰基等)保护的蛋白质变体；那些N末端区域在体内切割，形成的谷氨酰基团焦谷氨酸化的变体；那些使所述蛋白分子氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受适当基团(例如C_1～6酰基，其中如C_2～6烷醇基象甲酰基、乙酰基等)保护的变体；或结合蛋白如结合在糖链上的糖蛋白。

本发明受体蛋白的实例包括来自人(优选来自海马)的、含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的受体蛋白。

本发明受体蛋白的部分肽(下文通常简称为部分肽)可以为任一种部分肽，只要它构成上述本发明受体蛋白的一部分。这类部分肽的实例包括具有暴露于细胞膜外侧，并保留了受体结合活性的位点的部分肽。

更具体地说，含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的受体蛋白部分肽的一个实例为，包含下述区域的肽，该区域经分析为图3所示疏水图谱中的胞外区域(亲水区或亲水位点)。部分含有疏水区或疏水位点的肽也可以使用。另外，分别只包含一个结构域的肽可以使用，同时含有多种结构域的部分肽也可使用。

本发明部分肽中参与构成本发明受体蛋白的氨基酸数目可以为至少不小于20个，优选不小于50个，更优选不小于100个。

基本相同的氨基酸序列是指氨基酸序列的同源性至少不小于50％，优选不小于70％，较优选不小于80％，更优选不小于90％，最优选不小于95％。

本发明中，术语“基本相同的活性”定义同上。“基本相同的活性”可以用上述方法分析。

本发明部分肽的氨基酸序列中，缺失了1个、2个或多个氨基酸(优选约1～10个氨基酸，更优选数(1-5)个氨基酸)；添加了1个、2个或多个氨基酸(优选约1～20个氨基酸，更优选约1～10个氨基酸，最优选数(1-5)个氨基酸)；或其中的1个、2个或多个氨基酸(优选1～10个氨基酸，更优选数个，最优选1-5个氨基酸)被其他氨基酸所取代。

本发明部分肽中，C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO^-)，但是C-末端也可以为酰胺(-CONH₂)或酯(-COOR)，其中R如前述。

如上述本发明受体蛋白一样，本发明部分肽也可包括那些N末端甲硫氨酸氨基受保护基团保护的肽；那些N末端残基被体内切割，产生的Gln转化为焦谷氨酸的肽；肽分子中氨基酸侧链上的取代基受适当保护基团保护的肽；以及以糖链连接为糖肽的结合肽。

还有，本发明部分肽中，C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO^-)，但是C-末端也可以为酰胺(-CONH₂)或酯(-COOR)，其中的酯R如前述。

因此，本发明受体蛋白或其部分肽可以用生理上可接受的碱或酸形式使用，优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、蚁酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)等。

本发明的受体蛋白或其盐可用公知的从人或其它哺乳动物细胞或组织中纯化受体蛋白的方法来制备。本发明受体蛋白或其盐也可以通过培养含有本发明受体蛋白之编码DNA的转化体而制备，该方法见下文。本发明受体蛋白或其盐也可用下述蛋白合成法或其改良法来制备。

当从人或其它哺乳动物组织或细胞中制备受体蛋白或其盐时，首先将人或哺乳动物组织或细胞匀浆，然后用酸等抽提，通过反向层析、离子交换层析等多种层析技术的联用来分离并纯化该抽提物。

为了合成本发明受体蛋白、部分肽或其盐或胺，可以使用可用于蛋白合成的商用树脂。这类树脂的实例包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂，4-甲基二苯甲基胺树脂，PAM树脂，4-羟甲基甲苯乙酰胺甲酯树脂，聚丙烯酰胺树脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′，4二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时，将那些其侧链上α-氨基及功能基团受到相应保护的氨基酸，在树脂上按目标蛋白的序列顺序，用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时，将蛋白质从树脂上切除下来，同时除去保护基团。然后在高度稀释的溶液中进行分子内二硫键的形成反应，以获得目标蛋白或其酰胺。

进行上述受保护氨基酸的缩合反应时，可使用蛋白合成的多种活化试剂，但优选使用碳二亚胺。这样的碳二亚胺有DCC、N，N′-二异丙基碳二亚胺、以及正乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。用这些试剂活化时，直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如，HOBt，HOOBt)，或先将受保护的氨基酸活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到树脂上。

适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂剂选自已知可用于蛋白质缩合反应的溶剂。这样的溶剂有酰胺类如N，N二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及正甲基吡咯烷酮；卤化烃类如亚甲基盐酸盐和氯仿；醇类如三氟乙醇；亚砜类如二甲亚砜；醚类如吡啶、二噁烷和四氢呋喃；腈类如乙腈和丙腈；酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯；以及这些溶剂的相应混合物。反应温度从已知适用于蛋白质成键反应的范围中选取，通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通常以过量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反应检验所述缩合反应；当所述缩合不充分时，可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成。当重复反应后仍未充分缩合时，可用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化。

用于保护初始氨基酸的保护基团有Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc。

羧基可用如下的酯化作用保护，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基和2-金刚烷基的线性、支链或环状烷基酯)，芳烷基酯化(例如，苯甲酯、4-硝基苄酯、4-甲氧苄酯、4-氯苄酯以及二苯甲基酯)，苯甲酰甲基酯化，苄氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化。

丝氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级烷酰基如乙酰基，芳酰基如苯甲酰基，以及来自碳酸的基团如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基。

适于保护酪氨酸中酚羟基的基团有Bzl，Cl₂-Bzl，2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基。

适于保护组氨酸中咪唑基的基团有Tos，4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。

起始氨基酸中的活化羧基包括相应酸酐、叠氮化物、活化酯(带有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、HONB，N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)。将起始物质中待活化的氨基酸的氨基活化时，可以使用其相应磷酰胺。

为了除去(脱离)保护基，在氢气流下用Pd-黑或Pd-碳等催化剂进行催化还原；用氢氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸或三氟醋酸，或这些酸的混合液进行酸处理；用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪等碱进行碱处理；以及用液态氨中的钠还原。用上述酸处理除去所述保护基团的反应通常在约-20℃～40℃进行。在酸处理中，添加阳离子清除剂以使反应有效进行，例如使用甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、间甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇或1，2-乙二硫醇。此外，用苯硫酚处理以除去已知可作为组氨酸中咪唑的保护基团的2，4-二硝基苯基。用作色氨酸中吲哚的保护基团的甲酰基用下述方法去除：在1，2-乙二硫醇或1，4-丁二硫醇存在时用上述酸进行处理，以及用氢氧化钠稀溶液和稀氨水等碱进行处理。

与起始物质之反应无关的功能基团的保护、保护基的选择、该保护基的消除、以及与上述反应有关的功能基团的活化，从公知的基团和公知的方法中适当选择。

获得酰胺化蛋白质的其它方法有，如先将羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而加以保护；然后，将肽(蛋白)链从氨基侧延伸至预期长度。然后，制备只将其中N末端α-氨基的保护基团除去的蛋白质以及只将其中C-末端羧基的保护基团除去的蛋白质。将这两种蛋白质在上述溶剂的混合液中浓缩。浓缩反应的细节同上。对浓缩所得被保护蛋白进行纯化后，通过上述方法除去所有的保护基团获得所需粗制蛋白。该粗制蛋白可用各种已知的纯化方法进行纯化。冻干主要成分获得所需蛋白的酰胺化物。

将羧基末端氨基酸的α-羧基与所选醇缩合获得氨基酸酯，然后用与上述制备酰胺化蛋白方法类似的方法获得所需酯化蛋白。

本发明部分肽可通过已知的肽合成方法，或用相应肽酶切割本发明受体蛋白而制备。就肽合成的方法而言，固相合成或液相合成都可使用。即，将能构成本发明受体蛋白的部分肽或氨基酸与本发明受体蛋白的其他部分缩合在一起。当产物中包含保护基团时，除去这些保护基团得到所需肽。用来缩合或除去保护基团的公知方法见下列1)～5)。

1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti：肽的合成，Inter科学Publishers，纽约(1966)

2)Schroeder和Luebke：肽，Academic Press，纽约(1965)

3)泉屋信夫等：多肽合成与实验，丸善公司(1975)

4)矢岛治明和榊原俊平：生物化学实验教材1，蛋白质化学IV，205(1977)

5)矢岛治明编：药物开发续篇，卷14，肽合成，广川书店

反应完成后，可将常规纯化方法如溶剂提取、蒸馏、柱层析、液体层析以及重结晶等进行组合以纯化并回收本发明部分肽。当用上述方法获得的部分肽为游离形式时，可以用公知的方法将所述肽转化为相应盐；当所述蛋白以盐形式获得时，可以用公知的方法将其转化为游离形式。

编码本发明受体蛋白的多核苷酸可以为任一种多核苷酸，只要其中含有上述的编码本发明受体蛋白的碱基序列(DNA或RNA，优选DNA)即可。所述多核苷酸可以为包含本发明受体蛋白的编码mRNA的RNA和DNA。所述多核苷酸可以为双链也可以为单链。当该多核苷酸为双链时，它可以为双链DNA、双链RNA或DNA：RNA杂合体。当该多核苷酸为单链时，它可以为正义链(即编码链)或反义链(即非编码链)。

使用编码本发明受体蛋白的多核苷酸时，可以用实验医学增刊，15(7)，“新型PCR及其应用”(1997)中公开的方法或其改良法对本发明受体蛋白的mRNA进行定量。

编码本发明受体蛋白的DNA可以为下述情形的任何一种：基因组DNA、基因组DNA文库、上述组织或细胞的cDNA、上述组织或细胞的cDNA文库以及合成DNA。用于上述文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一种。所述DNA可以用从上述细胞或组织中制备的总RNA或mRNA级分通过反转录聚合酶链反应(以下简称为RT-PCR)直接扩增。

具体而言，编码本发明受体蛋白的DNA可以为任一种DNA，只要其具有SEQ ID NO：2所示的碱基序列，或在高度严谨条件下与SEQ ID NO：2所示碱基序列能够进行杂交，且编码蛋白的活性(配体结合活性、信号传导活性等)与本发明受体蛋白基本相同。

可与SEQ ID NO：2所示碱基序列杂交的DNA有，与SEQ ID NO：2所示碱基序列具有不少于70％同源性的DNA，优选不少于80％，更优选不少于90％，最优选不少于95％。

可以用公知方法或其改良方法进行所述杂交反应，例如，分子克隆，第2版；J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，(1989)中所述方法。也可以按照所附说明书使用商购文库。该杂交反应优选在高度严谨的条件下进行。

此处使用的高严谨度条件为，例如钠离子的浓度为大约19-40mM，优选约19-20mM，而温度为大约50-70℃，优选大约60-65℃。最优选钠离子浓度大约19mM，杂交温度为大约65℃。

更具体的，对于编码SEQ ID NO：1所代表氨基酸序列(受体蛋白)的DNA序列，可以使用SEQ ID NO：2所代表的DNA序列。

包含本发明受体蛋白之编码DNA的部分碱基序列或与该DNA互补的部分碱基序列的多核苷酸，不但包括下述编码本发明部分肽的DNA，还包括RNA。

根据本发明，基于所克隆或测定的G蛋白偶联型受体蛋白编码DNA的碱基序列信息，可设计并合成能够抑制本发明G蛋白偶联型受体蛋白基因复制或表达的反义多核苷酸(核酸)。这些多核苷酸(核酸)可以与G蛋白偶联型蛋白基因的RNA杂交以抑制该RNA的合成或功能，或通过与G蛋白偶联型受体蛋白相关RNA的相互作用，来调控G蛋白偶联型受体蛋白基因的表达。与G蛋白偶联型受体蛋白相关的RNA的特定序列互补的多核苷酸，以及能与G蛋白偶联型受体蛋白相关RNA特异性杂交的多核苷酸，可用于在体内和体外调控该受体蛋白基因的表达。这些多核苷酸也可用于治疗和诊断疾病。术语“相应”指与含有该基因的特定核苷酸序列、碱基序列或核酸同源或互补。核苷酸、碱基序列或核酸和肽(蛋白)之间的“相应”通常指依照核苷酸(核酸)或其互补序列的顺序排列的肽(蛋白)的氨基酸。可选定G蛋白偶联型受体蛋白基因的5’末端发夹结构、5’末端6碱基对重复序列、5’末端非翻译区、多肽翻译起始密码子、蛋白编码区、ORF翻译起始密码子、3’端非翻译区、3’端回文区、和3’端发夹环作为优选目标区域，但G蛋白偶联型受体蛋白基因的任何区域都可作为目标区域。

目标核酸和至少部分互补于该目标的多核苷酸之间的关系，更具体的说，目标序列和能与其杂交的多核苷酸之间的关系被指定为“反义”。反义多核苷酸可以是包含2-脱氧-D-核糖的多聚脱氧核苷酸、包含D-核糖的多聚脱氧核苷酸、任何可以为N-糖苷嘌呤或嘧啶的其它多核苷酸或其它含有非核苷酸骨架的多聚体(例如蛋白核酸和商品化合成性序列特异性核酸多聚体)或其它含有非标准连接的多聚体(只要该多聚体含有的核苷酸，其构型允许碱基配对或堆积，如在DNA或RNA中一样)。反义多核苷酸可以是双链DNA、单链DNA、单链RNA或DNA：RNA杂交体，并可进一步包括未修饰的多核苷酸(或未修饰的寡核苷酸)、具有众所周知修饰类型的多核苷酸，例如具有本领域所知的标记的多核苷酸，具有帽子的多核苷酸、甲基化多核苷酸、一个或多个天然核苷酸被相应类似物替代而形成的多核苷酸、具有核苷酸分子内修饰的多核苷酸例如具有不带电荷连接(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)的多核苷酸以及具有带电荷连接或含硫连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的多核苷酸、具有侧链基团的多核苷酸例如蛋白(包括核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、多聚L-赖氨酸等)和糖(例如单糖等)、具有插入子(例如吖啶、补骨脂素等)的多核苷酸、具有鏊合物(例如，金属、放射性金属、硼、金属氧化物等)的多核苷酸、含有烷化剂的多核苷酸、含有修饰连接(例如，α异构核酸等)的多核苷酸。此处术语“核苷”、“核苷酸”和“核酸”用以指，不但包含嘌呤和嘧啶碱基部分，还包括经过修饰的杂环型碱基分子的那些组成部分。这些修饰包括甲基化嘌呤和嘧啶、乙酰化嘌呤和嘧啶以及其它杂环。修饰的核苷或核苷酸还包括在糖基部分的修饰，例如可选择性的将一或多个羟基用卤素原子、脂肪酸基团代替，或转化为相应功能基团例如醚、酰胺或类似物。

本发明的反义多核苷酸(核酸)为RNA、DNA或修饰的核酸(RNA、DNA)。修饰型核酸的具体例子为，但不局限于，核酸的含硫衍生物和硫代磷酸衍生物以及能抗多核苷酰胺和寡核苷酰胺降解的核酸。本发明反义核酸的修饰优选根据以下设计进行，也就是说，通过增加该反义核酸在细胞内的稳定性、增加该反义核酸的细胞通透性、增加该核酸同靶正义链的亲和性至较高水平、或如果反义核酸有毒性，则降低其毒性。

在本领域有许多这样的修饰，如J.Kawakami等，Pharm.Tech.Japan，vol.8，pp.247，1992；vol.8，pp.395，1992；S.T.Crooke等编，反义研究与应用，CRCPress，1993等。

本发明的反义核酸可包含改变或修饰的糖基、碱基或键。反义核酸可以以脂质体、微球等或用于基因治疗的特殊形式提供、或组合连接部分。这些连接部分包括聚阳离子，例如作为磷酸骨架的电荷中和剂的赖氨酸、或疏水部分如用于加强同细胞膜之相互作用或增加核酸摄入的脂(例如磷脂、胆固醇等)。优选的连接脂有胆固醇或其衍生物(例如胆甾醇氯甲酸酯、胆酸等)。这些部分可以连接在核酸的3’或5’端，也可通过连接碱基、糖基或分子内核苷键连接。其它部分可能为特异性位于核酸的3’或5’端的加帽基团以阻止核酸酶如外切酶、RNase等对核酸的降解。这类加帽基团包括但不局限于本领域熟知的羟基保护基团、包括醇类如聚乙二醇、四乙醇等。

对反义核酸的抑制活性的检测，可以使用本发明的转化体、本发明的体外和体内基因表达系统、或本发明受体蛋白的体外或体内翻译系统等进行。可以用不同的已知方法将核酸用于细胞。

编码本发明部分肽的DNA可以是任何DNA，只要它包含编码本发明上述部分肽的碱基序列。DNA可以是基因组DNA、基因组DNA文库、来自于上述细胞和组织的cDNA、来自于上述细胞和组织的cDNA文库和合成性DNA。用于文库的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒或噬菌粒。DNA可以通过反转录聚合酶链反应(此处仅指RT-PCR)从上述细胞和组织制备的mRNA部分直接扩增得到。

编码本发明部分肽的DNA序列的具体例子包括：(1)具有SEQ ID NO：2所示DNA的部分序列的DNA，或(2)具有下述DNA的部分序列的DNA，所述DNA能与SEQ ID NO：2所示DNA序列在高严谨条件下杂交，并且所述DNA编码具有与本发明受体蛋白基本相同活性(如配体结合活性、信号转导活性等)的受体蛋白。

能与SEQ ID NO：2所示DNA序列杂交的DNA例子包括，具有同SEQ IDNO：2所示DNA序列不少于70％同源性的DNA，优选不少于80％同源性，更优选不少于90％，最优选不少于95％。

克隆本发明受体蛋白或其部分肽(以后有时称本发明的受体蛋白)的完整DNA编码序列时，可直接用含本发明受体蛋白碱基序列之一部分的合成DNA引物进行PCR扩增，或通过与标记的、编码本发明受体蛋白之部分或完整区域的DNA片段或合成DNA杂交来筛选已插入到合适载体中的DNA。杂交可以根据分子克隆，第二版(J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989)描述的方法进行。也可用商品化的文库根据所附的说明进行杂交。

DNA碱基序列的转换可根据众所周知的方法如Gupped duplex法或Kunkel法或其改进方法，使用众所周知的商品化试剂盒Mutan^TM-G或Mutan^TM-K(均来自宝酒造株式会社)进行。

已经克隆的编码本发明受体蛋白的DNA，根据所要达到的目的，可直接使用或用限制酶消化后使用，或连接一接头之后使用。该DNA可在5’端包含ATG密码作为翻译起始密码，而在3’端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码。这些翻译起始和终止密码也可通过合适的合成DNA接头添加。

本发明受体蛋白的表达载体可通过以下方法生产，例如，(a)从编码本发明受体蛋白的DNA上切下所需DNA片段，(b)将该DNA片段连接到一合适的载体的启动子下游。

可以使用的载体例子包括来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌体如λ噬菌体等、动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒等以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。

本发明使用的启动子可以是任何启动子，只要它能与用于表达的宿主很好的匹配。在使用动物细胞作为宿主时，启动子有SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等。

在这些启动子中，优选CMV启动子或SRα启动子。如果宿主为大肠杆菌属的细菌，优选的启动子有trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时，优选的启动子有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子。在用酵母作宿主时，优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子。在用昆虫细胞作宿主时，优选的启动子有多角体蛋白启动子和P10启动子。

除了前述的实例，表达载体还可任选包含增强子、剪接信号、poly A加尾信号、选择标记、SV40复制起点(下文有时简写为SV40ori)等。选择标记的例子包括，二氢叶酸还原酶(下文缩写为dhfr)基因[氨甲喋呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因(下文有时缩写为Amp^r)、新霉素抗性基因(下文有时缩写为Neo^r，G418抗性)等。具体的，当CHO(dhfr^-)细胞用dhfr基因作为选择标记时，使用无胸腺嘧啶的培养基进行筛选。

如果必需或希望，可在本发明受体蛋白的N端加上与宿主匹配的信号序列。在用大肠杆菌属细菌作宿主时，可以使用的信号序列的例子为Pho A信号序列、OmpA信号序列等；当用枯草杆菌属的细菌作宿主时，可以使用的信号序列的例子为α淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等；在用酵母作宿主时，可以使用的信号序列的例子为MFα信号序列、SUC2信号序列等；在用动物细胞作宿主时，可以使用的信号序列的例子为胰岛素信号序列、α干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。

使用如此构建的含有编码本发明受体蛋白之DNA序列的载体可获得转化体。

可以使用的宿主的实例有，大肠杆菌属的细菌、枯草杆菌属的细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫以及动物细胞等。

大肠杆菌属的细菌有，大肠杆菌K12 DH1(美国国家科学院院刊，60，160(1968))、JM103(核酸研究，9，309(1981))、JA221(分子生物学杂志，120，517(1978))、HB101(分子生物学杂志，41，459(1969))、C600(遗传学，39，440(1954))等。

枯草杆菌属的细菌有，枯草杆菌MI114(基因，24，255(1983))、207-21(生物化学杂志，95，87(1984))等。

酵母有，酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)KM71等。

就昆虫细胞而言，病毒为AcNPV时有草地夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf)幼虫的细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中肠的MG1细胞、粉纹夜蛾卵的High Five^TM细胞、甘蓝夜蛾(Mamesatra brassicae)的细胞、Estigment acrea的细胞等；病毒为BmNPV时有家蚕(Bombyx mori)的N细胞(BmN细胞)等。可用的Sf细胞有Sf9细胞(ATCC CRL1711)和Sf21细胞(这两种细胞均由Vaughn，J.L.等在In Vivo，13，213-217(1977)中描述)。

昆虫可以使用家蚕的幼虫(Maeda等，自然，315，592(1985))。

动物细胞可用猴COS-7细胞、Vero细胞、中华仓鼠细胞CHO(下文称作CHO细胞)、dhfr基因缺陷型中华仓鼠细胞CHO(下文称作CHO(dhfr^-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3细胞、人FL细胞等。

大肠杆菌属的细菌可以根据美国国家科学院院刊，69，2110(1972)或基因，17，107(1982)中描述的方法进行转化。枯草杆菌属的细菌可以根据分子及普通遗传学，168，111(1979)中描述的方法进行转化。

酵母可以根据酶学方法，194，182-187(1991)或美国国家科学院院刊.，75，1929(1978)中描述的方法进行转化。

昆虫细胞或昆虫可以根据生物/技术，6，47-55(1988)中描述的方法进行转化。

动物细胞的转化可以根据，细胞工程学增订版8，细胞工程实验最新方法，秀润出版社，263-267(1995)或病毒学，52，456(1973)中描述的方法进行。

由此，可以获得用含有本发明G蛋白偶联型受体蛋白之编码DNA的表达载体转化的转化体。

当宿主为大肠杆菌或枯草杆菌属的细菌时，转化体可以在合适的液体培养基中保温，该培养基含有转化体生长所需的物质例如碳源、氮源、无机物等。碳源的例子包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源的例子包括无机或有机物质如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯抽提物等。无机物的例子包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。此外，在培养基中也可加入酵母、维生素、促生长因子等。优选将培养基的pH值调节到大约5-8。

优选用于培养大肠杆菌属细菌的培养基有，加有葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培养基(Miller，分子遗传学实验杂志，431-433，冷泉港实验室，纽约，1972)。如果需要和希望，可以在培养基中加入化学试剂如3β-吲哚基丙烯酸，来有效激活启动子。

当用大肠杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约15-43℃培养大约3-24小时。如果需要和希望，培养物可以进行充气或搅拌。

当用枯草杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约30-40℃培养大约6-24小时。如果需要和希望，培养物可以进行充气或搅拌。

当用酵母作为宿主时，转化体培养在，例如Burkholder氏基本培养基(Bostian，K.L.等，美国国家科学院院刊，77，4505(1980))或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培养基(Bitter，G.A.等，美国国家科学院院刊，81，5330(1984))。优选将培养基pH值调节到大约5-8。转化体通常在大约20-35℃培养大约24-72小时。如果需要和希望，培养物可以进行充气或搅拌。

当用昆虫细胞或昆虫作为宿主时，转化体培养在，例如Grace’s昆虫培养基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))，其中添加有固相化10％胎牛血清等适当添加剂。优选的，培养基pH值调节到大约6.2-6.4。转化体通常在大约27℃培养大约3-5天。如果需要和希望，培养物可以进行充气或搅拌。

当用动物细胞作为宿主时，转化体培养在，例如含有大约5-20％胎牛血清的MEM培养基(科学，122，501(1952))、DMEM培养基(病毒学，8，396(1959))、RPMI 1640培养基(美国医学会杂志，199，519(1967))、199培养基(Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950))等。优选将培养基pH值调节到大约6-8。转化体通常在大约30-40℃培养大约15-60小时。如果需要和希望，培养物可以进行充气或搅拌。

如上所述，本发明的受体蛋白可以产生在转化体的细胞膜上。

可以根据下述方法从上述培养物中分离纯化本发明的受体蛋白。

在培养后，用众所周知的方法收集转化体或细胞，悬浮在一合适的缓冲液中，从中抽提本发明的受体蛋白。然后用众所周知的方法破碎转化体或细胞，如超声处理、溶菌酶处理和/或反复冻溶等，然后离心、过滤。因此可以获得本发明受体蛋白的粗提物。用于此程序的缓冲液包含蛋白变性剂如尿素或盐酸胍、或表面活性剂如Triton X-100^TM等。当本发明的受体蛋白分泌在培养液中时，在培养后，用众所周知的方法从转化体或细胞中经分离以收集上清。

包含在所获上清或抽提物中的本发明受体蛋白可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括，利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀等；利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等；利用电荷差异的方法如离子交换层析等；利用特异性亲和力差异的方法如亲和层析等；利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱等；利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳的方法。

当如此获得的本发明受体蛋白为游离形式时，可用众所周知的方法将其转换为盐。相反的，当获得的本发明的受体蛋白为盐时，可用众所周知的方法将其转换为游离形式或另一种盐形式。

重组产生的本发明受体蛋白或部分肽，在纯化前或纯化后，可用相应蛋白修饰酶处理，从而使蛋白或部分肽经合适修饰，部分去除一段多肽。这种蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。

由此产生的本发明的受体蛋白、部分肽或其盐的活性，可通过对标记配体的结合测试和特异性抗体的酶免疫分析法测定。

针对本发明受体蛋白、部分肽或其盐的抗体可以是任何多克隆或单克隆抗体，只要它们能识别本发明的受体蛋白、部分肽或其盐。

针对本发明的受体蛋白、部分肽或其盐(下文通常称作本发明的受体蛋白)的抗体可用众所周知的生产抗体或抗血清的方法生产，其中使用本发明的受体蛋白作为抗原。

[单克隆抗体的制备]

(a)单克隆抗体生产细胞的制备

将本发明的受体蛋白，单独或与载体或稀释剂一起给药于哺乳动物体内能产生抗体的部位。为了增强给药后抗体的产量，可给予弗氏完全或不完全佐剂。有效给药通常为大约每2-6周一次，一共2-10次。使用的哺乳动物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等，优选小鼠和大鼠。

在制备产单克隆抗体的细胞时，从抗原免疫的温血动物如小鼠中选择抗体滴度比较明显的动物，在最后一次免疫的2-5天后取脾脏或淋巴结，使其中产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合，获得产生抗体的杂交瘤细胞。抗血清中抗体滴度的测定可以通过使抗血清与标记的本发明受体蛋白反应，然后测定标记试剂同抗体的结合活性。可以根据Koehler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法进行融合。融合加速剂的例子为聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选PEG。

骨髓瘤细胞的例子包括NS-1、P3U1和SP2/0，优选P3U1。所用产生抗体的细胞(脾细胞)与骨髓瘤细胞的比例优选为大约1∶1到20∶1。当加入PEG(优选PEG 1000-6000)至浓度为大约10％-80％时，可在20-40℃，优选大约30-37℃保温约1-10分钟进行有效的细胞融合。

可以用各种方法筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。这些方法有：将作为抗原的本发明受体蛋白，直接或与载体一起吸附至一种固相，将杂交瘤上清加入到该固相中，然后加入标记有放射性物质、酶或蛋白A的抗免疫球蛋白抗体(如果用小鼠细胞作融合，则用抗小鼠的免疫球蛋白抗体)，检测结合到固相上的单克隆抗体；另一方法为，将杂交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相中，加入标记有放射性物质或酶的本发明受体蛋白，检测结合到固相上的单克隆抗体。

单克隆抗体的筛选可以根据众所周知的方法或其改进方法进行。一般的，在含有HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的动物细胞培养基中进行筛选。可以使用任何筛选和生长培养基，只要杂交瘤可以在其中生长。例如，可以使用含有1％-20％，优选10-20％胎牛血清的RPMI 1640培养基、含有1％-10％胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)、无血清的杂交瘤培养基(SFM-101，日水制药株式会社)以及类似培养基来作为筛选或生长培养基。通常在含5％CO2的条件下于20-40℃(优选37℃)培养约5天-3周(优选1-2周)。杂交瘤培养上清中抗体滴度的测定与上述抗血清中抗体滴度的测定方法相同。

(b)单克隆抗体的纯化

单克隆抗体的分离和纯化可根据传统多克隆抗体分离和纯化的方法进行，例如免疫球蛋白的分离和纯化方法(如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、用离子交换剂(如DEAE)吸附和去吸附、超离心、凝胶过滤、或一种特异性纯化方法，其包括收集仅与活化的吸附剂如抗原结合性固相、蛋白A或蛋白G结合的抗体，然后解除该结合以获得抗体)。

[多克隆抗体的制备]

本发明多克隆抗体的制备用众所周知的方法或其改进方法进行。例如，用与上述生产单克隆抗体相似的方式配制免疫原(受体蛋白的抗原)与载体蛋白的复合物并用其免疫哺乳动物。从免疫动物收集产物，其中含有本发明受体蛋白的抗体，分离和纯化该抗体。

在由免疫原和载体蛋白组成的用于免疫动物的复合物中，对载体蛋白的类型和载体同半抗原的混合比率无限定，只要能针对与载体一起免疫的半抗原有效产生抗体。例如，牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或匙孔血蓝蛋白与半抗原以载体比半抗原重量比约0.1-20(优选1-5)的方式偶联。

不同的缩合剂可用于偶联载体和半抗原。戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活化的酯和含有巯基或二硫代吡啶基的活化的酯试剂可用于偶联。

将缩合产物单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增强给药后抗体的产量，可给予弗氏完全或不完全佐剂。大约每2-6周给药一次，共约3-10次。

多克隆抗体从用上述方法免疫的动物的血液、腹水等(优选血液)中收集。

血清中多克隆抗体滴度的测定与上述测定血清抗体滴度的方法相同。可以根据上述用于分离和纯化单克隆抗体的免疫球蛋白分离纯化方法来分离和纯化多克隆抗体。

本发明的受体蛋白或其盐、部分肽或其盐、以及编码这些物质的DNA可用于：(1)测定针对本发明G蛋白偶联型受体蛋白的配体(激动剂)，(2)作为预防和/或治疗同本发明G蛋白偶联型受体蛋白功能异常相关疾病的制剂，(3)作为基因诊断制剂，(4)用于筛选能够改变本发明受体蛋白、其部分肽的表达水平的化合物，(5)作为预防和/或治疗各种疾病的制剂，其包含能够改变本发明受体蛋白、其部分肽的表达水平的化合物，(6)定量本发明G蛋白偶联型受体蛋白的配体，(7)用于筛选能够改变本发明受体蛋白与配体的结合特性的化合物(激动剂、拮抗剂等)，(8)作为预防和/或治疗各种疾病的制剂，其包含能够改变本发明受体蛋白同配体的结合特性的化合物(激动剂、拮抗剂等)，(9)定量本发明受体蛋白、部分肽或其盐，(10)用于筛选能够改变细胞膜上的本发明受体蛋白、其部分肽水平的化合物，(11)作为预防和/或治疗各种疾病的制剂，其包含能够改变细胞膜上的本发明受体蛋白、部分肽水平的化合物，(12)通过抗体来中和本发明受体蛋白、部分肽或其盐，(13)制备非人类动物的编码本发明G蛋白偶联型受体蛋白的DNA。

具体的，使本发明受体蛋白与其特异性的人或其它哺乳动物类配体的结合特性发生变化的化合物(激动剂、拮抗剂等)，可通过利用本发明G蛋白偶联型受体蛋白的重组表达系统的受体结合测定系统筛选，这些激动剂或拮抗剂可作为下述各种疾病的预防/治疗制剂使用。

在下文具体描述本发明的受体蛋白、部分肽或其盐(此后有时简称为本发明的受体蛋白或部分肽)、编码本发明受体蛋白的DNA(此后有时简称为本发明的DNA)、和针对本发明受体蛋白或类似物的抗体(此后有时统称本发明的抗体)的用途。

(1)测定针对本发明G蛋白偶联型受体蛋白的配体(激动剂)

本发明受体蛋白或其盐、本发明部分肽或其盐可用作发现并测定针对本发明受体蛋白或其盐的配体(激动剂)的一种试剂。

也就是说，本发明提供了一种测定针对本发明受体蛋白的配体的方法，其中包括，使本发明的受体蛋白或其盐、本发明部分肽或其盐同待测化合物接触。

待测化合物包括众所周知的配体(例如，血管紧张素、韩蛙皮素、canavinoid、缩胆囊素、谷氨酰胺、5-羟色胺、褪黑激素、神经肽Y、类阿片、嘌呤、加压素、催产素、PACAP、促胰泌素、胰高血糖素、降钙素、肾上腺皮质激素、生长抑素、GNRH、CRF、ACTH、GRP、PTH、血管肠肽(VIP)、生长抑素、多巴胺、胃动素、糊精、缓激肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓素、腺苷、肾上腺素、α和β-趋化因子(例如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β和RANTES)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽、促生长激素神经肽等)以及其它物质，例如人和哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猪、牛、羊和猴)的组织抽提物或细胞培养上清。例如，将组织抽提物或细胞培养上清加入到本发明的受体蛋白，分级分离并同时分析细胞刺激活性，最后获得单一配体。

更具体的，用以测定本发明配体的方法包括，利用本发明的受体蛋白、部分肽或其盐，或通过利用了已构建的重组受体蛋白表达系统的受体结合测定系统，测定化合物(例如，肽、蛋白、非肽类化合物、合成化合物、发酵产物)或其盐，所述化合物或其盐与本发明的受体蛋白结合后具有细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)。

测定本发明配体的方法有以下特征，通过使待测化合物与本发明的受体蛋白或其部分肽接触，测定其结合于本发明受体蛋白或其部分肽的量或其细胞刺激活性。

更具体的，本发明提供了：

(1)一种测定针对本发明受体蛋白或其盐的配体的方法，包括使一标记的待测化合物同本发明的受体蛋白或其盐、本发明部分肽或其盐接触，测定同受体蛋白或其盐、或该部分肽或其盐结合的标记化合物的量；

(2)一种测定针对本发明受体蛋白或其盐的配体的方法，包括使一标记的待测化合物同包含本发明受体蛋白的细胞或该细胞的膜级分接触，测定同所述细胞或细胞膜级分结合的标记化合物的量；

(3)一种测定针对本发明受体蛋白或其盐的配体的方法，其中包括，培养含有编码本发明受体蛋白DNA的转化体，使一标记的待测化合物同表达在细胞膜上的本发明受体蛋白接触，测定同表达的受体蛋白或其盐结合的标记化合物的量；

(4)一种测定针对本发明受体蛋白或其盐的配体的方法，包括，使一待测化合物同包含本发明受体蛋白的细胞接触，测定受体介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)；

(5)一种测定针对本发明受体蛋白或其盐的配体的方法，其中包括，培养含有编码本发明受体蛋白DNA的转化体，使一待测化合物同表达在细胞膜上的本发明受体蛋白接触，测定受体介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙烯胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)；

具体的，优选进行方法(1)至(3)来确认待测化合物可与本发明受体蛋白结合，然后进行方法(4)和(5)。

任何蛋白质只要其包含本发明的受体蛋白均可用于本发明的配体测定。但是，在动物细胞中大量表达的受体蛋白等更适合于本发明。

在生产本发明受体蛋白时，可使用上述表达方法，优选在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达所述受体蛋白的DNA。编码预期蛋白部分的DNA片段包括，但不限于互补DNA。例如，可使用基因片段或合成DNA。为了将编码所述受体蛋白等的DNA片段导入宿主动物细胞，并高效表达，优选将DNA片段插入具有昆虫宿主的杆状病毒属核多角体病毒(NPV)的多角体启动子、SV40来源的启动子、金属硫蛋白启动子、人热休克启动子、反转录病毒启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等启动子下游。所表达受体的量和质的检测用众所周知的方法进行，例如，Nambi，P.等在J.Biol.Chem.，267，19555-19559(1992)中描述的方法。

因此，在本发明的测定配体的方法中，含有本发明受体蛋白或其部分肽或其盐的物质可以是用众所周知的方法纯化的受体蛋白、其部分肽或其盐、含有受体蛋白的细胞或这些细胞的膜级分。

使用含有本发明受体蛋白的细胞测定配体时，这些细胞可用戊二醛、福尔马林等固定。固定可用众所周知的方法进行。

含有本发明受体蛋白的细胞指表达本发明受体蛋白的宿主细胞。这类细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞。

细胞膜级分指，用众所周知的方法破碎细胞并进行分级分离而制备的含有大量细胞膜的级分。细胞破碎的有效方法包括用Potter-Elvehjem匀浆器挤压、用Waring blender或Polytron(Kinematica公司生产)破碎、超声破碎、用French press加压使细胞通过细嘴喷射而破裂。细胞膜组分分离主要通过离心力来实现，如分级离心和密度梯度离心。例如，细胞破碎液在低速(500-3000rpm)离心一小段时间(正常为1-10分钟)，得到的上清在高速(15000-30000rpm)正常离心0.5-2小时。由此获得的沉淀部分用作细胞膜级分。细胞膜级分富含表达的受体蛋白以及膜成分如细胞来源的磷脂和膜蛋白。

在含有受体蛋白等的细胞和细胞膜级分中，受体蛋白含量优选10³-10⁸分子/细胞，更优选10⁵-10⁷分子/细胞。随着表达量的增加，单位细胞膜级分的配体结合活性(比活)增加，因而不但可以构建高敏感筛选体系，而且可以在同一批获得大量的样品。

为了进行方法(1)-(3)来测定针对本发明受体蛋白或其盐的配体，需要合适的受体级分和标记的待测化合物。

受体蛋白级分优选天然的受体蛋白级分，或与其具有同等活性的重组受体蛋白级分。此处术语“同等活性”是指在配体结合活性和信号传导活性方面同天然受体蛋白所拥有的活性同等。

优选标记的待测化合物有血管紧张素、韩蛙皮素、canavinoid、缩胆囊素、谷氨酰胺、5-羟色胺、褪黑激素、神经肽Y、类阿片、嘌呤、加压素、催产素、PACAP、促胰泌素、胰高血糖素、降钙素、肾上腺皮质激素、生长抑素、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PTH、血管活性肠多肽(VIP)、生长抑素、多巴胺、胃动素、糊精、缓激肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓素、腺苷、肾上腺素、α和β-趋化因子(例如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β和RANTES)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽、促生长激素神经肽，它们用[³H]、[¹²⁵I]、[¹⁴C]或[³⁵S]等标记。

更具体地，针对本发明受体蛋白或其盐的配体用下述方法测定。首先，将含有本发明受体蛋白的细胞或其膜级分悬浮于本方法的相应的缓冲液中，制备标准受体制剂。可以使用任何缓冲液，只要它不干扰配体-受体结合。此类缓冲液有pH值约4-10(优选6-8)的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。为了降低非特异结合，可任选在缓冲液中加入表面活性剂如CHAPS、吐温-80^TM(Kao-Atlas公司)、毛地黄皂甘或脱氧胆酸和各种蛋白如牛血清白蛋白或明胶等。为了抑制蛋白酶对受体或配体的降解，可加入蛋白酶抑制剂如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Institute公司生产)和胃蛋白酶抑制剂。将一定量(5000-500000cpm)的用[³H]、[¹²⁵I]、[¹⁴C]或[³⁵S]标记的待测化合物加入到0.01-10ml的受体溶液中。为了测定非特异性结合(NSB)，需提供一个含有过量未标记的待测化合物的反应管。在约0-50℃(优选约4-37℃)反应约20分钟-约24小时(优选约30分钟-约3小时)。在反应完成后，反应混合物用玻璃纤维滤纸等过滤，用合适量的相同缓冲液洗涤。然后用液闪仪或γ-计数仪测定在玻璃纤维滤纸中的残留放射活性。从总结合数值(B)中减去非特异结合值(NSB)(B-NSB)，得到待测化合物的值，该值超过0时相应化合物被选为本发明受体蛋白或盐的配体(激动剂)。

上述用于测定本发明受体蛋白或其盐配体的方法(4)或(5)可按照下述进行。用众所周知的方法或商品化的分析试剂盒来测定受体蛋白介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)。具体的，首先在多孔板等上培养含有受体蛋白的细胞。在测定配体之前，用新鲜培养基或合适的非细胞毒性缓冲液替换培养基，然后在含有待测化合物等的条件下保温一段时间。然后提取细胞或回收上清，对得到的产物用适当方法定量。很难检测细胞刺激活性的指示物质(例如花生四烯酸)的产生，因为细胞中存在降解酶，故在分析前可加入该降解酶的抑制剂。检测cAMP产生的抑制活性等活性时，细胞中基础生产水平可通过毛喉素等提高，因此可检测对提高的基础生产的抑制效应。

用于测定能同本发明受体蛋白或其盐结合的配体的试剂盒中包含，本发明的受体蛋白或其盐、本发明的部分肽或其盐、含有本发明的受体蛋白的细胞，或含有本发明的受体蛋白的细胞膜级分。

本发明配体测定试剂盒的例子如下。

1.测定配体的试剂

(1)用于分析和洗涤的缓冲液

补加有0.05％牛血清白蛋白(Sigma公司)的Hanks’平衡盐溶液(Gibco公司生产)。

溶液用0.45μm的滤膜过滤除菌，储存于4℃。或者，溶液可以在用时制备。

(2)标准G蛋白偶联型受体蛋白

以5×10⁵个/孔的细胞密度，将表达本发明受体蛋白的CHO细胞在12孔板上传代培养，在含5％CO₂和95％空气环境中于37℃培养两天。

(3)标记的待测化合物

用市售[³H]、[¹²⁵I]、[¹⁴C]或[³⁵S]标记的化合物，或用合适方法标记的化合物。

化合物水溶液贮存在4℃或-20℃。溶液在使用时用分析缓冲液稀释到1μM。低水溶性的待测化合物溶解在二甲基甲酰胺、DMSO或甲醇中。

(4)非标记化合物

同种化合物的非标记形式的浓度比其相应标记形式的高100-1000倍。

2.分析方法

(1)用于表达本发明受体蛋白的CHO细胞在12孔板上进行培养。在用1ml的分析缓冲液洗涤2次后，每孔加入490μl该分析缓冲液。

(2)在加入5μl的标记测试化合物后，得到的混合液在室温保温1小时。为了测定非特异结合，先在该系统中加5μl的非标记待测化合物。

(3)去除反应混合液，用1ml的洗涤液将培养孔洗涤3遍。用0.2NNaOH-1％SDS溶解同细胞结合的标记测试化合物，然后同4ml的液闪剂A(和光纯药生产)混合。

(4)用液闪计数器(Beckman公司生产)测定放射性。

能与本发明受体蛋白或其盐结合的配体包括，在脑、垂体和胰腺中特异存在的物质。这些配体的例子包括血管紧张素、韩蛙皮素、canavinoid、缩胆囊素、谷氨酰胺、5-羟色胺、褪黑激素、神经肽Y、类阿片、嘌呤、加压素、催产素、PACAP、促胰泌素、胰高血糖素、降钙素、肾上腺皮质激素、生长抑素、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PTH、血管肠肽(VIP)、生长抑素、多巴胺、胃动素、糊精、缓激肽、降钙素基因相关肽(CGRP)、白三烯、胰抑制素、前列腺素、血栓素、腺苷、肾上腺素、α和β-趋化因子(例如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β和RANTES)、内皮素、肠抑胃素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽促生长激素神经肽。

(2)与本发明受体蛋白功能异常相关之疾病的预防和/或治疗制剂

通过上述(1)的方法测定一种化合物是针对本发明受体蛋白的配体后，可根据该配体所具有的功能，将①本发明的受体蛋白、或②其编码DNA作为同本发明受体蛋白功能异常相关的疾病的预防和/或治疗制剂使用。

例如，当病人体内受体蛋白水平低下(受体蛋白不足)使本发明配体的生理活性达不到预期水平时，可通过下述方法实现配体活性：(1)使病人服用本发明的受体蛋白，从而补充受体蛋白的量；或(2)增加病人的本发明受体蛋白的量，其通过：a)给药编码本发明受体蛋白的DNA来表达受体蛋白，或通过b)将编码本发明受体蛋白的DNA插入靶细胞表达，然后将表达细胞移植给病人。病人受体蛋白的量可以因此而增加，从而使配体的活性得以实现。因此，本发明的受体蛋白或编码本发明受体蛋白的DNA可用作安全、低毒的预防和/或治疗制剂，用于同本发明受体功能异常相关的疾病。

本发明的受体蛋白与SLC-1受体(其为一种G蛋白偶联型受体蛋白)或生长抑素受体3型或5型(SS5R或SS3R)在氨基酸序列水平上证实了大约60％的同源性。

本发明的受体蛋白以及其编码DNA可用于预防和治疗中枢系统疾病(如阿尔茨海默氏痛、痴呆、摄食抑制(厌食症)、癫痫等)；激素类疾病(如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等)；肝/胆/胰/内分泌疾病(如糖尿病、摄食抑制等)，炎性疾病(如过敏、哮喘、类风湿病等)，循环系统疾病(如高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化等)。

当本发明的受体蛋白用作上述预防/治疗药物时，可用常规方法将其制成药物组合物。

当编码本发明受体蛋白的DNA(下文称本发明的DNA)用作上述预防/治疗药物时，本发明的DNA可单独使用，或插入合适载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺联病毒载体后按常规方法给药。本发明的DNA可以以裸露的DNA给药，或使用基因枪或含有水凝胶的导管使其与有助于吸收的佐剂联合给药。

例如，(1)本发明的受体蛋白或(2)其编码DNA可以制成片剂(必要时加糖衣(片剂)、胶囊、酏剂、微胶囊等口服剂型，或非胃肠道给药的可注射剂型如与水或其它可药用液体形成无菌溶液或悬浮液。这些制剂的生产是通过将(1)本发明的受体蛋白或(2)其编码DNA与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成常规制药的单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。

可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃。当单位剂型为胶囊时，在上述剂型中可进一步包含如油和脂肪等液体载体。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等一起溶解或悬浮在载体如注射用的水中来制备药物组合物。用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水和包含葡萄糖及其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙烯醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酯(polysorbate)80^TM和HCO-50)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。

此外，上述的治疗/预防制剂可进一步同缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇)、防腐剂(例如苯甲醇、酚)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。

所获制剂安全、低毒，因此可用于人和哺乳动物(例如，大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴子等)。

本发明受体蛋白的剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而异；在对厌食症病人(体重60kg)口服给药时，正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选约1.0-20mg/天。在对厌食症病人(体重60kg)非胃肠道给药时，一次剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而变，但优选静脉注射给药，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

编码本发明受体蛋白的DNA的剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而异，在对厌食症病人(体重60kg)口服给药时，正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天；在对厌食症病人(体重60kg)非胃肠道给药时，一次剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而变，但优选静脉注射给药，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

(3)基因诊断试剂

用本发明的DNA作探针，可以检测人或哺乳动物(例如，大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)中编码本发明受体蛋白或其部分肽的DNA或mRNA的异常(基因异常)。因此，本发明的DNA可用作基因诊断制剂，用于诊断DNA或mRNA的损伤、突变，或其表达量的减少、DNA或mRNA表达量的增加或过表达。

上述基因诊断通过使用本发明DNA，用众所周知的Northern杂交分析或PCR-SSCP分析来完成(Genomics，5,874-879(1989)；美国科学院报，86，2766-2770(1989))。

(4)用于筛选能够改变本发明受体蛋白或其部分肽的表达水平的化合物之方法

用本发明的DNA作探针，可以筛选能够改变本发明受体蛋白或其部分肽的表达水平的化合物。

即，本发明提供一种筛选能够改变本发明受体蛋白或其部分肽的表达水平的化合物的方法，它包括测定例如(i)非人哺乳动物的①血液、②特定器官、③从器官分离的组织或细胞，或(ii)转化体中所包含的本发明受体蛋白或其部分肽的mRNA表达水平。

具体地说，本发明受体蛋白或其部分肽的mRNA表达水平的测定如下进行。

(i)对非人哺乳动物的健康模型或疾病模型(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等，更具体地为痴呆大鼠、肥胖症小鼠、动脉硬化兔、肿瘤小鼠等)给药(如抗痴呆药、降压药、抗癌药物、治肥胖药物等)或给与物理压力(如浸没(soaking)压力、电击、光的明暗、低温等)，经过一定时间后，得到血液或特定器官(如脑、肝、肾脏等)、或从器官分离的组织或细胞。

所得细胞内本发明受体蛋白或其部分肽的mRNA可用，例如，常规方法从细胞中提取，并用TaqManPCR定量，也可以根据公知的Northern印迹法进行分析。

(ii)表达本发明受体蛋白或其部分肽的转化体可根据上述方法制备，该转化体中本发明受体蛋白或其部分肽的mRNA可如上述进行定量和分析。

能够改变本发明受体蛋白或其部分肽的表达水平的化合物可用如下方法筛选：

(i)对于非人哺乳动物的健康模型或疾病模型，可在给药或给予物理压力之前一段时间(30分钟前-24小时之前，优选30分钟前-12小时之前，更优选1小时前-6小时之前)，或之后一段时间(30分钟后-3天后，优选1小时后-2天后，更优选1小时后-24小时后)，或同时，来给予待检化合物。给予待测化合物一定时间(30分钟-3天，优选1小时-2天，更优选1小时-24小时)后，定量分析细胞中所含本发明受体蛋白或其部分肽的mRNA。

(ii)根据常规法培养转化体，将待检化合物加入培养基，经过一定时间(1-7天，优选1-3天，更优选2-3天)的培养后，定量所述转化体中本发明受体蛋白或其部分肽的mRNA量。

可用本发明筛选方法获得的化合物或其盐，是能改变本发明受体蛋白或其部分肽表达水平的化合物，具体是，(a)通过增加本发明受体蛋白或其部分肽的表达水平而增加G蛋白偶联型受体介导之细胞刺激活性(如促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)的化合物；(b)通过降低本发明受体蛋白或其部分肽的表达水平而降低细胞刺激活性的化合物。

所述化合物包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物和发酵产物。它们可以是新的化合物，也可以是已知化合物。

所述增加细胞刺激活性的化合物可作为能增加本发明受体蛋白之生理活性的、既安全又低毒的药物有效预防和/或治疗[中枢系统疾病(如阿尔茨海默氏病、痴呆、摄食抑制(厌食症)、癫痫等)；激素类疾病(如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等)；肝/胆/胰/内分泌疾病(如糖尿病、摄食抑制等)，炎性疾病(如过敏、哮喘、类风湿病等)，循环系统疾病(如高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化等)]。

所述降低细胞刺激活性的化合物可作为降低本发明受体蛋白的生理活性的、既安全又低毒的药物。

将通过本发明筛选方法所得到的化合物或其盐用作药物组合物时，可根据常规方法配制这些化合物。例如，如上文配制含有本发明受体蛋白的药物一样，可将这些化合物制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌溶液、悬浮液等。

所获制剂安全、低毒，因此可用于人和哺乳动物(例如，大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴子等)。

该化合物或其盐的投药剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而异；在对厌食症病人(体重60kg)口服给药时，正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选约1.0-20mg/天。在对厌食症病人(体重60kg)非胃肠道给药时，一次剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而变，但优选静脉注射给药，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

(5)用于预防和/或治疗各种疾病的制剂，其含有能改变本发明受体蛋白或其部分肽表达水平的化合物

如上述，本发明受体蛋白在体内例如中枢神经系统起着一定的重要作用。因此，改变本发明受体蛋白或其部分肽的表达水平的化合物可用作预防和/或治疗同本发明受体蛋白功能异常相关的疾病[例如，中枢系统疾病(如阿尔茨海默氏病、痴呆、摄食抑制(厌食症)、癫痫等)；激素类疾病(如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等)；肝/胆/胰/内分泌疾病(如糖尿病、摄食抑制等)，炎性疾病(如过敏、哮喘、类风湿病等)，循环系统疾病(如高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化等)]的制剂。

当这些化合物作为药物用于预防/治疗与本发明受体蛋白功能异常相关的疾病时，可用常规方法配制。

例如，化合物可以制成糖衣片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等口服剂型，以及非胃肠道给药的可注射剂型如与水或其它可药用液体形成的无菌溶液或悬浮液。这些制剂的生产是通过将该化合物与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成常规制药要求的单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。

可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃。当单位剂型为胶囊时，可进一步将液态载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体，如注射用的水中来制备药物组合物。用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水和包含葡萄糖及其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙烯醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酯80^TM和HCO-50)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。

此外，上述的治疗/预防制剂可进一步同缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇)、防腐剂(例如苯甲醇、酚)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。

所获制剂安全、低毒，因此可用于人和哺乳动物(例如，大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。

该化合物或其盐的投药剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而异；在对厌食症病人(体重60kg)口服给药时，正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选约1.0-20mg/天。在对厌食症病人(体重60kg)非胃肠道给药时，一次剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而变，但优选静脉注射给药，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

(6)定量本发明G蛋白偶联型受体蛋白的配体的方法

因为本发明受体蛋白具有配体结合特性，因此可体内定量配体浓度，且灵敏度高。

本发明的定量方法可与竞争方法联合使用。因此，可使待测样品同本发明的受体蛋白接触，由此测定样品中配体浓度。具体地，可以使用下述方法(1)或(2)或其改进方法进行：

(1)入江宽编：“放射免疫分析”(1974，讲谈社，日本)；和

(2)入江宽编：“放射免疫分析，续篇”(1979，讲谈社，日本)

(7)能改变本发明G蛋白偶联型受体蛋白同配体结合活性的化合物(激动剂，拮抗剂等)的筛选方法

通过使用本发明受体蛋白，或构建受体蛋白的重组表达系统并应用该表达系统实施受体结合测定，可以有效筛选能改变本发明受体蛋白与配体结合的活性的化合物(如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵产物等)或其盐。

上述化合物的例子包括：(a)表现G蛋白偶联型受体所介导的细胞刺激活性(如促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)的化合物(所谓本发明受体蛋白的激动剂)；或(b)不具有此类细胞刺激活性的化合物(所谓本发明受体蛋白的拮抗剂)；或(c)提高配体与本发明受体蛋白的结合能力的化合物；或(c)降低配体与本发明受体蛋白的结合能力的化合物(优选用上述配体测定法来筛选化合物(a))。

因此，本发明也提供了筛选能改变本发明受体蛋白、其部分肽或其盐与配体之结合特性的化合物或其盐的方法，其中包括比较下述两种情况：(i)使本发明受体蛋白、其部分肽或其盐同配体接触；和(ii)使本发明受体蛋白、其部分肽或其盐同配体及待测化合物接触。

本发明筛选方法的特征为，测定并比较(i)和(ii)的情况下结合受体蛋白的配体量或其细胞刺激活性。

更具体的，本发明提供了下述方法。

(1)筛选能改变本发明受体蛋白同配体结合特性的化合物或盐的方法，其中包括，在本发明受体蛋白同标记配体接触的情况下，和在本发明受体蛋白同标记配体及待测化合物接触的情况下，测定并比较结合到本发明受体蛋白上的标记配体的量；

(2)筛选能改变本发明受体蛋白同配体结合特性的化合物或盐的方法，其中包括，在含本发明受体蛋白之细胞或其细胞膜级分与标记配体接触的情况下，和在含本发明受体蛋白之细胞或细胞膜级分与标记配体及待测化合物接触的情况下，测定并比较结合到所述细胞或其细胞膜级分上的标记配体的量；

(3)筛选能改变本发明受体蛋白和配体结合特性的化合物或盐的方法，其中包括，培养含有本发明DNA的转化体，使细胞膜上表达的受体蛋白与标记配体接触，和培养含有本发明DNA的转化体，使细胞膜上表达的受体蛋白与标记配体及待测化合物接触，然后测定并比较结合到本发明受体蛋白等上的标记配体的量；

(4)筛选能改变本发明受体蛋白和配体结合特性的化合物或盐的方法，其中包括，使能活化本发明受体蛋白的化合物(如本发明受体蛋白的配体)与含本发明受体蛋白的细胞接触，和使该化合物及待测化合物与含本发明受体蛋白的细胞接触，测定并比较受体介导的细胞刺激活性(如促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)，以及

(5)筛选能改变本发明受体蛋白和配体结合特性的化合物或盐的方法，其中包括，使能活化本发明受体蛋白的化合物(如针对本发明受体蛋白的配体)与本发明受体蛋白(其通过培养含本发明DNA的转化体而表达在细胞膜上)接触，和使上述能活化本发明受体蛋白的化合物及待测化合物与本发明受体蛋白(其通过培养含本发明DNA的转化体而表达在细胞膜上)接触，检测并比较受体介导的细胞刺激活性(如促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)。

在获得本发明的受体蛋白之前，为了筛选G蛋白偶联型受体激动剂或拮抗剂以便获得候选化合物，首先需使用来自大鼠或其它动物的含G蛋白偶联型受体蛋白的细胞、组织或细胞膜级分(首次筛选)，然后验证该待测化合物是否能抑制人源G蛋白偶联型受体蛋白与配体的结合(二次筛选)。如果直接使用细胞、组织或细胞膜级分，由于不可避免混有其它受体蛋白，很难筛选目标受体蛋白的激动剂或拮抗剂。

但使用本发明的人源受体蛋白使得无须所述首次筛选，就能有效筛选抑制G蛋白偶联型受体蛋白与配体结合的化合物。此外，可很容易地评价筛选的化合物是激动剂还是拮抗剂。

用于本发明的筛选方法在下文有更详细描述。

首先，用于本发明筛选方法的本发明受体蛋白可以是任何物质，只要它含有上述的本发明受体蛋白，但优选使用哺乳动物器官的含本发明受体蛋白的细胞膜级分。然而，人的器官很难得到，因此优选使用经重组体大量表达的大鼠的受体蛋白等。

在制备本发明受体蛋白时，可使用上述方法，优选在哺乳动物和昆虫细胞中表达本发明DNA。编码目的蛋白区域的DNA片段可使用互补DNA，但不局限于此。例如，可使用基因片段或合成DNA作为所述DNA片段。为了将编码本发明受体蛋白的DNA片段导入宿主动物细胞，并高效表达，优选将所述DNA片段插入以昆虫为宿主的杆状病毒属核多角体病毒(NPV)的多角体蛋白启动子、SV40启动子、人热休克启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等的下游。受体的表达量和质用众所周知的方法检测，见Nambi，P.等，生物化学杂志267，19555-19559(1992)。

因此，在本发明的筛选方法中，含有本发明受体蛋白的物质可以是用众所周知的方法纯化的受体蛋白。或者也可使用含有本发明受体蛋白的细胞或细胞膜级分。

使用含有本发明受体蛋白的细胞时，这些细胞可用戊二醛、福尔马林等固定。固定可用众所周知的方法进行。

含有本发明受体蛋白的细胞指表达本发明受体蛋白的宿主细胞。这类细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞。

细胞膜级分指，用众所周知的方法破碎细胞并进行分级分离而制备的含有大量细胞膜的级分。细胞破碎的有效方法包括用Potter-Elvehjem匀浆器挤压、用Waring blender或Polytron(Kinematica公司生产)破碎、超声破碎、用French press加压使细胞通过细嘴喷射而破裂。细胞膜组分分离主要通过离心力来实现，如分级离心和密度梯度离心。例如，细胞破碎液在低速(500-3000rpm)离心一小段时间(正常为1-10分钟)，得到的上清在高速(15000-30000rpm)正常离心0.5-2小时。由此获得的沉淀部分用作细胞膜级分。细胞膜级分富含表达的受体蛋白以及膜成分如细胞来源的磷脂和膜蛋白。

在含有受体蛋白等的细胞和细胞膜级分中，受体蛋白含量优选10³-10⁸分子/细胞，更优选10⁵-10⁷分子/细胞。随着表达量的增加，单位细胞膜级分的配体结合活性(比活)增加，因而不但可以构建高敏感筛选体系，而且可以在同一批获得大量的样品。

为了进行方法(1)-(3)来筛选能改变配体与本发明受体蛋白结合特性的化合物，需要合适的受体蛋白级分和标记的配体。

受体蛋白级分优选天然的受体蛋白级分，或与其具有同等活性的重组受体蛋白级分。此处术语“同等活性”是指在配体结合活性和信号传导活性方面同天然受体蛋白所拥有的活性同等。

优选标记的配体有标记的配体、标记的配体类似物。例如用[³H]、[¹²⁵I]、[¹⁴C]或[³⁵S]等标记的配体。

更具体地，为了筛选能够改变配体和本发明受体蛋白之间结合特性的化合物，首先，将含有本发明受体蛋白的细胞或其膜级分悬浮于本方法的相应的缓冲液中，制备标准受体蛋白制剂。可以使用任何缓冲液，只要它不干扰配体-受体蛋白的结合。此类缓冲液有pH值约4-10(优选6-8)的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。为了降低非特异结合，可任选在缓冲液中加入表面活性剂如CHAPS、Tween-80^TM(Kao-Atlas公司)、毛地黄皂甘或脱氧胆酸等。为了抑制蛋白酶对受体或配体的降解，可加入蛋白酶抑制剂如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Institute公司生产)和胃蛋白酶抑制剂。将一定量(5000-500000cpm)的标记配体加入到0.01-10ml的受体溶液中，同时加入10^-4M-10^-10M的待测化合物。为了测定非特异性结合(NSB)，需提供一个含有过量未标记的配体的反应管。在约0-50℃(优选约4-37℃)反应20分钟-24小时(优选30分钟-3小时)。在反应完成后，反应混合物用玻璃纤维滤纸等过滤，用合适量的相同缓冲液洗涤。然后用液闪仪或γ-计数仪测定在玻璃纤维滤纸中的残留放射活性。以缺乏竞争性底物的情况下所得值(B₀)减去非特异结合值(NSB)而得到的(B₀-NSB)为100％，当特异性结合量(B-NSB)为50％或更低时，该待测化合物可选为具有竞争抑制潜力的化合物。

上述用于筛选能改变配体和本发明受体蛋白之间结合特性化合物的方法(4)或(5)可按照下述进行。用众所周知的方法或商品化的分析试剂盒来测定受体蛋白介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)。

具体的，首先在多孔板等上培养含有受体蛋白的细胞。在进行筛选之前，用新鲜培养基或合适的非细胞毒性缓冲液替换培养基，然后在含有待测化合物等的条件下保温一段时间。然后提取细胞或回收上清，对得到的产物用适当方法定量。很难检测细胞刺激活性的指示物质(例如花生四烯酸)的产生，因为细胞中存在降解酶，故在分析前可加入该降解酶的抑制剂。检测cAMP产生的抑制活性等活性时，细胞中基础生产水平可通过毛喉素等提高，因此可检测对提高的基础生产的抑制效应。

通过测定细胞刺激活性进行筛选时，需使用表达相应受体蛋白的细胞。优选表达本发明受体蛋白等的细胞为，含有本发明受体蛋白的天然细胞系和表达重组型受体蛋白等的上述细胞系。

待测化合物的例子包括肽、蛋白、非肽类化合物、合成化合物、发酵产物、细胞抽提物、植物抽提物和动物组织抽提物。这些测试化合物可以是新的或已知的。

用于筛选能改变本发明受体蛋白与配体的结合特性的试剂盒中包含，本发明的受体蛋白、含有本发明受体蛋白的细胞，或含有本发明的受体蛋白的细胞膜级分。

本发明筛选试剂盒的例子如下。

1.用于筛选的试剂

(1)用于分析和洗涤的缓冲液

补加有0.05％牛血清白蛋白(Sigma公司)的Hanks’平衡盐溶液(Gibco公司生产)。

溶液用孔径为0.45μm的滤膜过滤除菌，储存于4℃。或者，溶液可以在用时制备。

(2)G蛋白偶联型受体蛋白标样制剂

以5×10⁵个/孔的细胞密度，将表达本发明受体蛋白的CHO细胞在12孔板上传代培养，在含5％CO₂和95％空气环境中于37℃培养两天。

(3)标记的配体

用市售[³H]、[¹²⁵I]、[¹⁴C]或[³⁵S]标记的配体的水溶液贮存在4℃或-20℃，使用时用分析缓冲液稀释到1μM。

(4)标准配体溶液

将配体溶于含0.1％牛血清白蛋白(Sigma)的PBS中，浓度为1mM，储存于-20℃。

2.测定方法

(1)在12孔组织培养板上培养能表达本发明受体蛋白的CHO细胞。用1ml测定缓冲液将表达受体蛋白的CHO细胞洗2次后，每孔加入490μl测定缓冲液。

(2)加入5μl浓度为10^-3-10^-10M的待测化合物后，在体系中加入5μl的标记配体。在室温保温1小时。为测定非特异性结合，在系统中加5μl浓度为10^-3M的配体以代替待测化合物。

(3)用1ml的洗涤液将培养孔洗3遍以去除反应混合物。将结合于细胞的标记配体用0.2N NaOH-1％SDS溶解，与4ml的液闪剂A(和光纯药)混合。

(4)用液闪仪(Beckman)测定放射性，根据以下等式计算PMB(最大结合百分率)：

PMB＝[(B-NSB)/(B₀-NSB)]×100

PMB：最大结合百分率

B  ：加入样品时的值

NSB：非特异性结合

B₀  ：最大结合

通过本发明筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物或盐是能改变配体和本发明受体蛋白的结合特性的化合物。更具体的，该化合物包括(a)表现G蛋白偶联型受体介导的细胞刺激活性(如促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)的化合物(所谓本发明受体蛋白的激动剂)；或(b)不具有此类细胞刺激活性的化合物(所谓本发明受体蛋白的拮抗剂)；或(c)增加配体与本发明G蛋白偶联型受体蛋白的结合能力的化合物；或(d)降低配体与本发明G蛋白偶联型受体蛋白的结合能力的化合物。

这类化合物的例子包括肽、蛋白、非肽类化合物、合成化合物和发酵产物。这些化合物可以是新的或已知的。

由于本发明受体蛋白的激动剂具有同本发明受体蛋白的配体相同的生理活性。因此，所述激动剂可作为具有相应配体活性的安全、低毒的药物制剂使用。

由于本发明受体蛋白的拮抗剂可以抑制本发明受体蛋白的配体所具有的生理活性。因此，所述拮抗剂可作为安全、低毒的药物制剂用于抑制所述配体的活性。

增加配体与本发明G蛋白偶联型受体蛋白之结合力的化合物，可作为增强本发明G蛋白偶联型受体蛋白之配体的活性的、安全低毒的药物使用[例如，作为预防和/或治疗中枢系统疾病(例如阿尔茨海默氏病、痴呆、摄食障碍(厌食症)、癫痫等)；激素类疾病(如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等)；肝/胆/胰/内分泌疾病(如糖尿病、摄食障碍等)；炎性疾病(过敏、哮喘、类风湿病等)、循环系统疾病(如高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化等)的制剂]。

降低本发明G蛋白偶联型受体蛋白与配体的结合能力的化合物可用作安全、低毒的药物制剂，用于降低本发明受体蛋白的配体所具有的生理活性。

当通过本发明筛选方法或筛选试剂盒可获得的化合物或其盐用作上述药物组合物时，可使用传统方法制备。例如该化合物或其盐可以制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌溶液或悬浮液形式。

所获制剂安全、低毒，因此可用于人和哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。

该化合物或其盐的投药剂量依赖于给药主体、给药部位、症状和给药方法等而异；在对厌食症病人(体重60kg)口服给药时，正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选约1.0-20mg/天。在对厌食症病人(体重60kg)非胃肠道给药时，一次剂量依赖于给药主体、给药部位、症状和给药方法等而变，但优选静脉注射给药，一次剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

(8)用于预防和/或治疗各种疾病的制剂，其含有能改变本发明G蛋白偶联型受体蛋白和配体之间结合特性的化合物(激动剂或拮抗剂)

如上述，本发明受体蛋白在体内例如中枢神经系统起着一定的重要作用。因此，改变本发明受体蛋白和配体之间结合特性的化合物(激动剂、拮抗剂)可用作预防和/或治疗同本发明受体蛋白功能异常相关的疾病。

当上述化合物作为预防/治疗同本发明受体蛋白功能异常相关的疾病[例如，中枢系统疾病(例如阿尔茨海默氏病、痴呆、摄食障碍(厌食症)、癫痫等)；激素类疾病(如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等)；肝/胆/胰/内分泌疾病(如糖尿病、摄食障碍等)；炎性疾病(过敏、哮喘、类风湿病等)、循环系统疾病(如高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化等)]的药物时，可用传统方法制备。

例如，所述化合物可以制成糖衣片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等口服剂型，以及非胃肠道给药的可注射剂型如与水或其它可药用液体形成的无菌溶液或悬浮液。这些制剂的生产是通过将该化合物与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成常规制药要求的单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。

可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃。当药剂型为胶囊时，可进一步将液态载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体，如注射用的水中来制备药物。用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水和包含葡萄糖及其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙烯醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酯80^TM和HCO-50)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。

此外，上述的治疗/预防制剂可进一步同缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇)、防腐剂(例如苯甲醇、酚)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。

所获制剂安全、低毒，因此可用于人和哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。

该化合物或其盐的投药剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而异；在对厌食症病人(体重60kg)口服给药时，正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选约1.0-20mg/天。在对厌食症病人(体重60kg)非胃肠道给药时，一次剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而变，但优选静脉注射给药，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

(9)本发明受体蛋白、其部分肽或其盐的定量

本发明受体蛋白的抗体能特异性识别本发明的受体蛋白，因此可用于定量待测样品液中的本发明受体蛋白，尤其是通过夹心免疫分析进行定量。因此，本发明提供了下述的定量方法：

(i)一种定量待测样品液中本发明受体蛋白的方法，其包括，使本发明的抗体与待测样品液以及标记的本发明受体蛋白进行竞争反应，测定与该抗体结合的本发明标记性受体蛋白的比率；

(ii)一种定量待测样品液中本发明受体蛋白的方法，其包括，同时或先后使所述待测样品液与固定在不溶性载体上的本发明的抗体，以及标记的本发明的抗体反应，测定不溶性载体上标记试剂的活性。

在上述方法(ii)中，优选一种抗体能识别本发明受体蛋白的N末端区域，而另一抗体能识别本发明受体蛋白的C末端区域。

针对本发明受体蛋白的单克隆抗体(下文称本发明的单克隆抗体)可用于分析本发明受体蛋白。此外，也可通过组织染色来检测本发明受体蛋白。为此，可用抗体本身或使用抗体分子的F(ab’)₂、Fab’或Fab片段。对使用本发明受体蛋白的抗体的分析方法没有特别的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根据待测样品液中相应抗原含量(例如受体蛋白的量)，用化学或物理方法检测抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量，然后根据含已知量抗原的标准溶液制备的标准曲线来计算。优选的方法为，例如nephrometry、竞争法、免疫测定(immunometric)方法和夹心法；就敏感性和特异性而言，特别优选后面将要描述的夹心法。

用于分析方法的标记试剂的例子为放射性同位素、酶、荧光物质和化学发光物质等。同位素的例子包括[³H]、[¹²⁵I]、[¹³¹I]、[³H]、[¹⁴C]等。优选酶的例子为稳定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。荧光物质的例子包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等。化学发光物质的例子包括发光氨、发光氨衍生物、虫萤光素、光泽精等。此外，也可使用生物素-链亲和素系统来对抗原或抗体标记。

在固定抗原或抗体时，可以利用物理吸附。传统上也使用化学结合来固定蛋白质或酶。载体的例子包括，不溶性多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、和硅；玻璃等。

在夹心法中，待测样品溶液同本发明的固相化单克隆抗体反应(第一反应)，然后同本发明的标记的单克隆抗体反应(第二反应)，测定不溶性载体上的标记试剂活性，由此可以测定待测样品中本发明受体蛋白的量。第一和第二反应可以以相反次序进行，或同时或间隔一段时间进行。标记试剂的类型和固定的方法同上述的相同。

在夹心法免疫分析中，用于标记和固相的抗体并不必需是一种类型或一个物种的抗体，也可使用两或多种抗体的混合物来改善测定的灵敏度。

在根据本发明的夹心方法测定本发明的受体蛋白时，优选用于第一和第二反应的单克隆抗体与本发明受体蛋白的结合位点彼此不同。因此，在第一和第二反应所用的抗体为，当第二反应的抗体识别受体蛋白的C端区域时，优选在第一反应中使用能识别除C端区域以外的位点，如N端区域的抗体。

本发明单克隆抗体可用于除夹心法以外的其它分析，例如竞争法、immunometric法和nephrometry。在竞争法中，待测溶液中的抗原和标记抗原竞争与抗体的反应，然后将未反应的标记抗原(F)及结合于抗体的标记抗原(B)区分(即B/F区分)，测定B或F的标记量，从而可以测定待测溶液中的抗原量。在此类方法的反应中，有一种液相方法和一种固相方法，前者使用可溶性抗体，加入针对第一抗体的第二抗体后，用聚乙二醇来有效区分B/F；后者可用固定的抗体作为第一抗体，或用可溶性抗体作为第一抗体但第二抗体为固相抗体。

在immunometric法中，待测溶液中的抗原和固相抗原竞争性地与给定量的标记抗体反应，然后从液相中分离固相；或待测溶液中的抗原与过量标记抗体反应，然后加入固相抗原，使未反应的标记抗体与该固相结合，然后从液相中分离固相。随后，测定两相的标记量，来测定待测溶液中的抗原量。

在nephrometry中，测定抗原-抗体在凝胶或溶液中反应产生的不溶性沉淀的量。即使待测溶液中抗原量很少且仅获得小量的沉淀，利用激光散射的激光nephrometry方法也适于此应用。

本发明应用这些免疫分析方法中任何一个进行分析时，不需要任何特殊条件和操作。除了每种方法的常规条件和操作外，本领域技术人员可构建测定本发明受体蛋白或其盐的分析系统。所述常规技术的细节，参见如入江宽(编)：“放射免疫分析”(1974，讲谈社，日本)；入江宽(编)：“放射免疫分析，第二版”(1979，讲谈社，日本)；石川荣志等(编)：“酶免疫分析”(医学书院，1978)；石川荣志等(编)：“酶免疫分析，第二版”(医学书院，1982)；石川荣志等(编)：“酶免疫分析，第三版”(医学书院，1987)；“酶学方法”卷70(免疫化学技术(A))；同上，卷73(免疫化学技术(B))；；同上，卷74(免疫化学技术(C))；同上，卷84(免疫化学技术(D：选择性免疫分析))；同上，卷92(免疫化学技术(E：单克隆抗体及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化学技术(I：杂交瘤技术及单克隆抗体))(Academic Press出版)等)。

如上所述，使用本发明的抗体可高度敏感地定量本发明的受体蛋白或其盐。

此外，使用本发明的抗体，通过定量机体内本发明的受体蛋白或其盐，可诊断各种同本发明受体蛋白功能异常相关的疾病[例如，中枢系统疾病(例如阿尔茨海默氏病、痴呆、摄食障碍(厌食症)、癫痫等)；激素类疾病(如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等)；肝/胆/胰/内分泌疾病(如糖尿病、摄食障碍等)；炎性疾病(过敏、哮喘、类风湿病等)、循环系统疾病(如高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化等)]。

本发明的抗体可用于特异性检测待测样品液如体液、组织等中可能存在的本发明受体蛋白。该抗体也可用于制备抗体柱，用于纯化本发明受体蛋白，通过纯化检测级分中的本发明受体蛋白，分析待检细胞中本发明受体蛋白的行为。

(10)用于筛选能改变细胞膜上本发明受体蛋白或其部分肽之量的化合物的方法

本发明的抗体能特异性识别本发明的受体蛋白、其部分肽或其盐，因此可用于筛选能改变细胞膜上本发明受体蛋白或其部分肽的量的化合物。因此，本发明提供了下述的用于筛选能改变细胞膜上本发明受体蛋白或其部分肽量的化合物的方法：

(i)将非人哺乳动物的①血液、②特定器官、③从器官分离的组织或细胞破碎，分离得到细胞膜级分，测定细胞膜级分中所含本发明受体蛋白或其部分肽的量；

(ii)将能表达本发明受体蛋白或其部分肽的转化体等破碎，分离得到细胞膜级分，测定细胞膜级分中所含本发明受体蛋白或其部分肽的量；

(iii)将非人哺乳动物的①血液、②特定器官、③从器官分离的组织或细胞作成切片，用免疫染色法检测细胞表层上所述受体蛋白的染色强度，从而验证细胞膜上的该蛋白质；

(iv)将能表达本发明受体蛋白或其部分肽的转化体作成切片，用免疫染色法检测细胞表层上该受体蛋白的染色强度，从而验证细胞膜上的该蛋白质。

细胞膜级分中所含的本发明受体蛋白或其部分肽如下测定。

(i)对非人哺乳动物的健康模型或疾病模型(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等，更具体地为痴呆大鼠、肥胖症小鼠、动脉硬化兔、患癌小鼠等)给药(如抗痴呆药、降压药、抗癌药物、治肥胖药物等)或给与物理压力(如浸没压力、电击、光的明暗、低温等)，一段时间后取血液或特定器官(如脑、肝、肾脏等)、或从器官分离的组织或细胞。将所得器官、组织或细胞等悬浮于相应缓冲液(如Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液等)，破碎所述器官、组织或细胞，使用表面活性剂(Triton-X100^TM、Tween-20^TM等)及离心分离、过滤、柱分离等方法获得细胞膜级分。

细胞膜级分指，用众所周知的方法破碎细胞并进行分级分离而制备的含有大量细胞膜的级分。细胞破碎的有效方法包括用Potter-Elvehjem匀浆器挤压、用Waring blender或Polytron(Kinematica公司生产)破碎、超声破碎、用French press加压使细胞通过细嘴喷射而破裂。细胞膜组分分离主要通过离心力来实现，如分级离心和密度梯度离心。例如，细胞破碎液在低速(500-3000rpm)离心一小段时间(正常为1-10分钟)，所得上清在高速(15000-30000rpm)通常离心0.5-2小时。由此获得的沉淀部分用作细胞膜级分。细胞膜级分富含表达的受体蛋白以及膜成分如细胞来源的磷脂和膜蛋白。

细胞膜级分中所含本发明受体蛋白或其部分肽可利用本发明抗体经夹心免疫分析、Western印迹等进行定量。

夹心免疫分析可如上述实施，Western印迹可用公知方法进行。

(ii)根据所述方法培养能表达本发明受体蛋白或其部分肽的转化体，从而可以定量细胞膜级分中所含有的本发明受体蛋白或其部分肽。

能改变细胞膜上本发明受体蛋白或其部分肽的量的化合物可以如下筛选：

(i)对于非人哺乳动物的健康模型或疾病模型，可在给药或给予物理压力之前一段时间(30分钟前-24小时之前，优选30分钟前-12小时之前，更优选1小时前-6小时之前)，或之后一段时间(30分钟后-3天后，优选1小时后-2天后，更优选1小时后-24小时后)，或同时，来给予待检化合物。给予待测化合物一定时间(30分钟-3天，优选1小时-2天，更优选1小时-24小时)后，定量分析细胞中所含的本发明受体蛋白或其部分肽。

(ii)根据常规方法培养转化体，将待检化合物加入培养基，经过一定时间(1-7天，优选1-3天，更优选2-3天)的培养后，定量所述转化体中本发明受体蛋白或其部分肽的量。

具体地，细胞膜级分中所含本发明受体蛋白或其部分肽可如下证实。

(iii)对非人哺乳动物的健康模型或疾病模型(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等，更具体地为痴呆大鼠、肥胖症小鼠、动脉硬化兔、患癌小鼠等)给药(如抗痴呆药、降压药、抗癌药物、治肥胖药物等)或给与物理压力(如浸没压力、电击、光的明暗、低温等)，一定时间后，取血液或特定器官(如脑、肝、肾脏等)、或从器官分离的组织或细胞。将所得器官、组织或细胞等按照常规方法作成切片，用本发明的抗体进行免疫染色。测定细胞表层上该受体蛋白的染色强度以证实细胞膜上的蛋白，本发明受体蛋白或其部分肽在细胞膜上的量可以定量地或定性地证实。

(iv)也可用类似的方法，利用能表达本发明受体蛋白或其部分肽的转化体证实。

通过本发明筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物或盐是能改变细胞膜上本发明受体蛋白或其部分肽的量的化合物。更具体的，所述化合物包括：(a)通过增加细胞膜上本发明受体蛋白或其部分肽的量，从而增加G蛋白偶联型受体介导的细胞刺激活性(如促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)的化合物；或(b)通过降低细胞膜上本发明受体蛋白或其部分肽的量，从而减弱细胞刺激活性的化合物。

这类化合物的例子包括肽、蛋白、非肽类化合物、合成化合物和发酵产物。这些化合物可以是新的或已知的。

增强细胞刺激活性的化合物可作为安全低毒的药物用于增强本发明受体蛋白的生理活性[例如，用于预防和/或治疗中枢系统疾病(例如阿尔茨海默氏病、痴呆、摄食障碍(厌食症)、癫痫等)；激素类疾病(如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等)；肝/胆/胰/内分泌疾病(如糖尿病、摄食障碍等)；炎性疾病(过敏、哮喘、类风湿病等)、循环系统疾病(如高血压、心脏肥大、心绞痛、动脉硬化等)]。

降低该细胞刺激活性的化合物可作为安全、低毒的药物用于降低本发明受体蛋白的生理活性。

当通过本发明筛选方法或筛选试剂盒可获得的化合物或其盐用作上述药物组合物时，可使用传统方法制备。例如同含有所述本发明受体蛋白的药物制剂一样可以制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌溶液或悬浮液形式。

所获制剂安全、低毒，因此可用于人和哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。

该化合物或其盐的投药剂量依赖于给药主体、给药部位、症状和给药方法等而异；在对厌食症病人(体重60kg)口服给药时，正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选约1.0-20mg/天。在对厌食症病人(体重60kg)非胃肠道给药时，一次剂量依赖于给药主体、给药部位、症状和给药方法等而变，但优选静脉注射给药，一次剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

(11)用于预防和/或治疗各种疾病的制剂，其含有能改变细胞膜上的本发明受体蛋白或其部分肽的量的化合物

如上述，本发明受体蛋白在体内例如中枢神经系统起着一定的重要作用。因此，改变细胞膜上的本发明受体蛋白或其部分肽的量的化合物可用作预防和/或治疗同本发明受体蛋白功能异常相关的疾病。

当上述化合物作为药物用于预防/治疗与本发明受体蛋白功能异常相关的疾病时，可用传统方法制备。

例如，该化合物可以制成糖衣片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等口服剂型，以及非胃肠道给药的可注射剂型如与水或其它或药用液体形成的无菌溶液或悬浮液。这些制剂的生产是通过将该化合物与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成常规制药要求的单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。

可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃。当药剂型为胶囊时，可进一步将液态载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体，如注射用的水中来制备药物。用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水和包含葡萄糖及其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙烯醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酯80^TM和HCO-50)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。

此外，上述的治疗/预防制剂可进一步同缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇)、防腐剂(例如苯甲醇、酚)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。

所获制剂安全、低毒，因此可用于人和哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。

该化合物或其盐的投药剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而异；在对厌食症病人(体重60kg)口服给药时，正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选约1.0-20mg/天。在对厌食症病人(体重60kg)非胃肠道给药时，一次剂量依赖于给药对象、给药部位、症状和给药方法等而变，但优选静脉注射给药，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

(12)用本发明受体蛋白、其部分肽或其盐的抗体进行中和反应

所述抗体针对本发明受体蛋白、其部分肽或其盐的中和活性指，使所述受体蛋白所参与的信号传导功能失去作用。因此，当所述抗体具有中和活性时，其可使所述受体蛋白所参与的信号传导功能失去作用，如受体蛋白介导的细胞刺激活性(如促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低)失活。因此，该抗体可用于预防和/或治疗由所述受体蛋白过量表达导致的疾病。

(13)携带本发明G蛋白偶联型受体蛋白之编码DNA的非人类动物的产生

可用本发明的DNA产生出表达本发明受体蛋白的非人类转基因动物。非人类动物可使用哺乳动物(如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)，优选小鼠和兔。

为将本发明的DNA转入目标动物，通常优选使用基因构建体，其中将该DNA连接在一启动子下游，以使所述构建体能在动物细胞中表达该DNA。例如，当转移本发明中兔子来源的DNA时，将该DNA连接在启动子(其能表达与兔源DNA高度同源的本发明动物源DNA)的下游，将该构建体显微注射至兔受精卵。从而可产生能高水平表达本发明受体蛋白的转基因动物。可使用的启动子包括病毒启动子和广泛表达的启动子，如金属硫蛋白启动子，但优选特异性表达于脑部的NGF基因启动子和烯醇化酶基因的启动子。

在受精卵阶段转入本发明的DNA，可保证该DNA在目标动物的所有生殖细胞和体细胞中存在。该转基因动物的生殖细胞中出现本发明的受体蛋白意味着，在该动物的所有后代的所有体细胞和生殖细胞都含有本发明的受体蛋白。含有该基因的动物后代在所有生殖细胞和体细胞中都含有本发明的受体蛋白。

含有本发明DNA的转基因动物在证实该基因通过交配可稳定维持后，可在常规育种条件下交配、并繁殖数代。而且，使含有所需DNA的雄性和雌性动物交配可得到纯合子，其在两条同源染色体上都含有所转移的基因，随后使雄性和雌性纯合子继续交配数代，使后代都含有该DNA。

含有本发明DNA的转基因动物因大量表达本发明受体蛋白，而可用于筛选本发明受体蛋白的激动剂和拮抗剂。

含有本发明DNA的转基因动物也可用作组织培养的细胞源。可对本发明的受体蛋白进行分析，如直接分析本发明转基因小鼠组织中的DNA或RNA，或分析表达了该受体蛋白的组织。可用常规培养技术培养来自含本发明受体蛋白的组织的细胞。可用这些细胞研究通常难以培养的组织中细胞(如脑部和周边组织的细胞)的功能。可用这些细胞筛选能改善组织功能的药物。有了高表达细胞系后，可从该细胞系中分离、纯化本发明的受体蛋白。

在说明数和附图中，碱基和氨基酸的代码使用IUPAC-IUB生化命名委员会规定的或本领域通用的代码，如下述例示。对于有光学异构体的氨基酸，除非特别说明，指L形式。

DNA ：脱氧核糖核酸

cDNA：互补脱氧核糖核酸

A   ：腺嘌呤

T   ：胸腺嘧啶

G   ：鸟嘌呤

C   ：胞嘧啶

RNA ：核糖核酸

mRNA：信使核糖核酸

dATP：脱氧腺苷三磷酸

dTTP：脱氧胸腺嘧啶三磷酸

dGTP：脱氧鸟苷三磷酸

dCTP：脱氧胞嘧啶三磷酸

ATP ：腺苷三磷酸

EDTA：乙二胺四乙酸

SDS ：十二烷基硫酸钠

Gly ：甘氨酸

Ala ：丙氨酸

Val ：缬氨酸

Leu ：亮氨酸

Ile ：异亮氨酸

Ser ：丝氨酸

Thr ：苏氨酸

Cys ：半胱氨酸

Met ：蛋氨酸

Glu ：谷氨酸

Asp ：天冬氨酸

Lys ：赖氨酸

Arg ：精氨酸

His ：组氨酸

Phe ：苯丙氨酸

Tyr ：酪氨酸

Trp ：色氨酸

Pro ：脯氨酸

Asn ：天冬酰胺

Gln ：谷氨酰胺

pGlu：焦谷氨酸

Me  ：甲基

Et    ：乙基

Bu    ：丁基

Ph    ：苯基

TC    ：四氢噻唑-4(R)-酰胺基

本说明中大量使用的取代基、保护基和试剂的代码如下。

Tos   ：对甲苯磺酰基

CHO   ：甲酰基

Bzl   ：苄基

Cl₂Bzl：2，6-二氯苄基

Bom   ：苄氧甲基

Z     ：苄氧基羰基

Cl-Z  ：2-氯苄氧基羰基

Br-Z  ：2-溴苄氧基羰基

Boc   ：叔丁氧基羰基

DNP   ：二硝基苯酚

Trt   ：三苯甲基

Bum   ：叔丁氧基甲基

Fmoc  ：N-9-芴基甲氧基羰基

HOBt  ：1-羟基苯并三唑

HOOBt ：3，4-二羟基-3-羟基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪

HONB  ：1-羟基-5-降冰片烯基-2，3-二羧酰亚胺

DCC   ：N，N′-二环己基碳二亚胺

本说明书的序列表中的序列编号(SEQ ID NO：)分别表示下列序列。

[SEQ ID NO：1]

本发明来自人海马的新G蛋白偶联型受体蛋白hSLT的氨基酸序列。

[SEQ ID NO：2]

编码本发明来自人海马的新G蛋白偶联型受体蛋白hSLT的cDNA序列，所述蛋白质具有[SEQ ID NO：1]所示的氨基酸序列。

[SEQ ID NO：3]

克隆编码本发明来自人海马的新G蛋白偶联型受体蛋白hSLT的cDNA所用引物1的碱基序列。

[SEQ ID NO：4]

克隆编码本发明来自人海马的新G蛋白偶联型受体蛋白hSLT的cDNA所用引物2的碱基序列。

实施例1描述的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/pCR3.1-hSLT于1999年4月28日保藏位于日本国茨城县茨城市东1-1-3的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERM BP-6710，于1999年4月20日保藏位于日本国大阪府大阪市淀川区十三本町2-17-85的财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16284。

实施例

本发明可利用参考实施例和实施例详述，但并非限制本发明的范围。使用大肠杆菌进行基因操作按“分子克隆”的方法进行。

实施例1对编码来自人海马的G蛋白偶联型受体蛋白的cDNA进行克隆并测定碱基序列

用人海马的cDNA(Clontech公司)作为模板，用两个引物，即引物1(SEQID NO：3)和引物2(SEQ ID NO：4)，进行PCR反应。上述反应的溶液包含1/10体积的cDNA、1/50体积的Advantage 2 Polymerase Mix(Clontech公司)、0.2μM的引物1(SEQ ID NO：3)和0.2μM的引物2(SEQ ID NO：4)、各200μM的每种dNTP和酶缓冲液，总体积25μl。PCR为(1)94℃1分钟，(2)然后以94℃20秒、72℃2分钟进行3个循环，(3)以94℃20秒、65℃20秒、68℃2分钟进行3个循环，(4)以94℃20秒、58℃20秒、68℃2分钟进行36个循环，(5)最后在68℃延伸7分钟。在完成PCR反应后，用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按说明书将产物亚克隆到质粒载体pCR3.1(Invitrogen)，再导入大肠杆菌菌株DH5α中，携带所述cDNA的克隆在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行筛选。分析每一个克隆的序列，找出编码新的G蛋白偶联型受体蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO：2)。含有从该cDNA推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的新G蛋白偶联型受体蛋白被命名为hSLT，该转化体被命名为大肠杆菌DH5α/pCR3.1-hSLT。

实施例2制备能表达hSLT的CHO细胞

利用携有人海马hSLT全长氨基酸序列的编码基因(其序列已在实施例1中证实)的质粒pCR3.1-hSLT转化大肠杆菌DH5α(Toyobo)，培养这些转化体，用Plasmid Midi试剂盒(Quiagen公司)制备pCR3.1-hSLT的质粒DNA。使用CellPhect转染试剂盒(Amerham Pharmacia Biotech公司)按照所附说明书将所述质粒DNA导入到CHO-K1细胞。将10mg的质粒DNA与磷酸钙在悬浮液中共沉淀，加入到在24小时前已接种5×10⁵或1×10⁶个CHO-K1细胞的10cm平板上。在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养1天之后，传代培养，在选择性培养基即含有10％胎牛血清及1mg/ml G418的DMEM培养基上培养。从该选择培养基上表达hSLT的CHO细胞的菌落中选出40个菌落。进一步从选出的表达hSLT的CHO细胞中用常规法提取总RNA，然后用TaqMan法分析hSLT的mRNA水平以确定拷贝数。最终选出3个克隆(#5、#7及#28)作为高效表达的细胞系。

                     工业应用

本发明中G蛋白偶联型受体蛋白、其部分肽或其盐，以及编码它们的多核苷酸(例如DNA、RNA及其衍生物)可用于：(1)测定配体(激动剂)，(2)制备抗体和抗血清，(3)构建重组受体蛋白表达系统，(4)用该表达系统开发受体结合测定系统和筛选可能的药用化合物，(5)根据与具有类似结构的配体-受体的比较来设计药物，(6)作为制备基因诊断中所用探针和PCR引物的试剂，(7)产生转基因动物，或(8)作为基因预防/基因治疗剂。

                           序列表<110>武田药品工业株式会社<120>新型G蛋白偶联型受体蛋白及其DNA<130>2590WOOP<150>JP11-041336<151>1999-02-19<150>JP11-125768<151>1999-05-06<160>4<210>1<211>340<212>PRT<213>人<400>1Met Asn Pro Phe His Ala Ser Cys Trp Asn Thr Ser Ala Glu Leu Leu

             5                   10                  15Ash Lys Ser Trp Asn Lys Glu Phe Ala Tyr Gln Thr Ala Ser Val Val

         20                  25                  30Asp Thr Val Ile Leu Pro Ser Met Ile Gly Ile Ile Cys Ser Thr Gly

     35                  40                  45Leu Val Gly Asn Ile Leu Ile Val Phe Thr Ile Ile Arg Ser Arg Lys

 50                  55                  60Lys Thr Val Pro Asp Ile Tyr Ile Cys Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu65                  70                  75                  80Val His Ile Val Gly Met Pro Phe Leu Ile His Gln Trp Ala Arg Gly

             85                  90                  95Gly Glu Trp Val Phe Gly Gly Pro Leu Cys Thr Ile Ile Thr Ser Leu

        100                 105                 110Asp Thr Cys Asn Gln Phe Ala Cys Ser Ala Ile Met Thr Val Met Ser

    115                 120                 125Val Asp Arg Tyr Phe Ala Leu Val Gln Pro Phe Arg Leu Thr Arg Trp

130                 135                 140Arg Thr Arg Tyr Lys Thr Ile Arg Ile Asn Leu Gly Leu Trp Ala Ala145                 150                 155                 160Ser Phe Ile Leu Ala Leu Pro Val Trp Val Tyr Ser Lys Val Ile Lys

            165                 170                 175Phe Lys Asp Gly Val Glu Ser Cys Ala Phe Asp Leu Thr Ser Pro Asp

        180                 185                 190Asp Val Leu Trp Tyr Thr Leu Tyr Leu Thr Ile Thr Thr Phe Phe Phe

    195                 200                 205Pro Leu Pro Leu Ile Leu Val Cys Tyr Ile Leu Ile Leu Cys Tyr Thr

210                 215                 220Trp Glu Met Tyr Gln Gln Asn Lys Asp Ala Arg Cys Cys Asn Pro Ser225                 230                 235                 240Val Pro Lys Gln Arg Val Met Lys Leu Thr Lys Met Val Leu Val Leu

            245                 250                 255Val Val Val Phe Ile Leu Ser Ala Ala Pro Tyr His Val Ile Gln Leu

        260                 265                 270Val Asn Leu Gln Met Glu Gln Pro Thr Leu Ala Phe Tyr Val Gly Tyr

    275                 280                 285Tyr Leu Ser Ile Cys Leu Ser Tyr Ala Ser Ser Ser Ile Asn Pro Phe

290                 295                 300Leu Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Asn Phe Gln Lys Arg Leu Pro Gln Ile305                 310                 315                 320Gln Arg Arg Ala Thr Glu Lys Glu Ile Asn Asn Met Gly Asn Thr Leu

            325                 330                 335Lys Ser His Phe

        340<210>2<211>1023<212>DNA<213>人<400>2ATGAATCCAT TTCATGCATC TTGTTGGAAC ACCTCTGCCG AACTTTTAAA CAAATCCTGG   60AATAAAGAGT TTGCTTATCA AACTGCCAGT GTGGTAGATA CAGTCATCCT CCCTTCCATG  120ATTGGGATTA TCTGTTCAAC AGGGCTGGTT GGCAACATCC TCATTGTATT CACTATAATA  180AGATCCAGGA AAAAAACAGT CCCTGACATC TATATCTGCA ACCTGGCTGT GGCTGATTTG  240GTCCACATAG TTGGAATGCC TTTTCTTATT CACCAATGGG CCCGAGGGGG AGAGTGGGTG  300TTTGGGGGGC CTCTCTGCAC CATCATCACA TCCCTGGATA CTTGTAACCA ATTTGCCTGT  360AGTGCCATCA TGACTGTAAT GAGTGTGGAC AGGTACTTTG CCCTCGTCCA ACCATTTCGA  420CTGACACGTT GGAGAACAAG GTACAAGACC ATCCGGATCA ATTTGGGCCT TTGGGCAGCT  480TCCTTTATCC TGGCATTGCC TGTCTGGGTC TACTCGAAGG TCATCAAATT TAAAGACGGT  540GTTGAGAGTT GTGCTTTTGA TTTGACATCC CCTGACGATG TACTCTGGTA TACACTTTAT  600TTGACGATAA CAACTTTTTT TTTCCCTCTA CCCTTGATTT TGGTGTGCTA TATTTTAATT  660TTATGCTATA CTTGGGAGAT GTATCAACAG AATAAGGATG CCAGATGCTG CAATCCCAGT  720GTACCAAAAC AGAGAGTGAT GAAGTTGACA AAGATGGTGC TGGTGCTGGT GGTAGTCTTT  780ATCCTGAGTG CTGCCCCTTA TCATGTGATA CAACTGGTGA ACTTACAGAT GGAACAGCCC  840ACACTGGCCT TCTATGTGGG TTATTACCTC TCCATCTGTC TCAGCTATGC CAGCAGCAGC  900ATTAACCCTT TTCTCTACAT CCTGCTGAGT GGAAATTTCC AGAAACGTCT GCCTCAAATC  960CAAAGAAGAG CGACTGAGAA GGAAATCAAC AATATGGGAA ACACTCTGAA ATCACACTTT 1020TAG                                                               1023<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3ATGAATCCAT TTCATGCATC TTGT                                24<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4CTAAAAGTGT GATTTCAGAG TGTTT                               251/4

Claims (27)

1.一种蛋白质或其盐，其含有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。

2.权利要求1所述蛋白的部分肽，或其盐。

3.一种多核苷酸，其包含具有编码权利要求1所述蛋白质的碱基序列的多核苷酸。

4.权利要求3所述多核苷酸，该多核苷酸为DNA。

5.权利要求3所述多核苷酸，其含有SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

6.一种重组载体，其含有权利要求3的多核苷酸。

7.一种转化体，其用权利要求6所述重组载体转化而成。

8.一种制备权利要求1的蛋白或其盐的方法，其包含培养权利要求7的转化体，并从中产生权利要求1的蛋白质。

9.一种抗体，其针对权利要求1的蛋白质或权利要求2的部分肽，或所述蛋白质或部分肽的盐。

10.权利要求9的抗体，其为能使权利要求1所述蛋白质的信号传导活性失活的中和抗体。

11.一种诊断组合物，其含有权利要求9的抗体。

12.一种针对权利要求1中蛋白质或其盐的配体，该配体通过使用权利要求1的蛋白质或权利要求2的部分肽，或所述蛋白质或部分肽的盐来获得。

13.一种药物组合物，其含有权利要求12的配体。

14.一种测定针对权利要求1中蛋白质或其盐的配体的方法，其中使用权利要求1的蛋白或权利要求2的部分肽，或所述蛋白质或部分肽的盐。

15.一种筛选能改变配体与权利要求1中蛋白质或其盐的结合特性的化合物或其盐的方法，其包括对权利要求1中蛋白质或权利要求2中部分肽，或所述蛋白质或部分肽的盐的应用。

16.一种筛选能改变配体与权利要求1中蛋白质或其盐之结合特性的化合物或其盐的试剂盒，其包含权利要求1的蛋白质或权利要求2的部分肽，或所述蛋白质或部分肽的盐。

17.一种能改变配体与权利要求1中蛋白质或其盐之结合特性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用权利要求15的筛选方法或权利要求16的试剂盒来获得。

18.一种药物组合物，其含有能改变配体与权利要求1中蛋白质或其盐之结合特性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用权利要求15的筛选方法或权利要求16的试剂盒来获得。

19.一种多核苷酸，其在高度严谨条件下能与权利要求3的多核苷酸杂交。

20.一种多核苷酸，其含有与权利要求3的多核苷酸或其一部分互补的碱基序列。

21.一种定量权利要求1所述蛋白质的mRNA的方法，其包括使用权利要求3的多核苷酸或其一部分。

22.一种定量权利要求1的蛋白质的方法，其包括使用权利要求9的抗体。

23.一种与权利要求1中蛋白质功能相关的疾病的诊断方法，其包括使用权利要求21或权利要求22的定量方法。

24.一种筛选能改变权利要求1中蛋白质表达水平的化合物或其盐的方法，其包含使用权利要求21的定量方法。

25.一种筛选能改变细胞膜上的权利要求1之蛋白质的量的化合物或其盐的方法，其包含使用权利要求22的定量方法。

26.一种能改变权利要求1中蛋白质表达水平的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用权利要求24的筛选方法来获得。

27.一种能改变细胞膜上的权利要求1之蛋白质的量的化合物或其盐的方法，所述化合物或其盐可通过使用权利要求25的筛选方法来获得。

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