KR20010103766A - 신규 ｇ 단백질 공역형 리셉터 단백질 및 그 ｄｎａ - Google Patents

Abstract

인간 유래 G 단백질-공역형 리셉터 단백질, 이의 펩티드 단편 또는 염; 이러한 리셉터 단백질을 코딩하는 핵산 및 이의 유도체; 상기 리셉터 단백질을 코딩하는 염기서열에 대해 안티센스 서열을 갖는 핵산 및 이의 유도체; 상기 G 단백질-공역형 리셉터 단백질의 제조방법; 상기 G 단백질-공역형 리셉터 단백질에 대한 리간드의 측정방법; 상기 G 단백질-공역형 리셉터 단백질에 대한 리간드의 결합을 변경시킬 수 있는 화합물의 스크리닝 방법/스크리닝용 키트; 스크리닝에 의해 수득된 화합물 또는 이의 염; 및 상기 G 단백질-공역형 리셉터 단백질에 대한 항체등.

Description

신규 Ｇ 단백질 공역형 리셉터 단백질 및 그 ＤＮＡ {NOVEL G PROTEIN- COUPLED RECEPTOR PROTEIN AND DNA THEREOF}

대부분의 호르몬이나 신경전달물질 등과 같은 생리활성물질은 세포막에 존재하는 특이적 리셉터 단백질을 통하여 생체의 기능을 조절하고 있다. 이들 리셉터 단백질 중 다수가 공역하고 있는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 (guanine nucleotide-binding protein) (이하 G 단백질로 약칭하는 경우가 있다) 의 활성화를 통하여 세포내의 시그널 전달을 수행하고, 또 7 개의 막 관통 영역을 갖는 공통된 구조를 가지고 있기 때문에, G 단백질 공역형 리셉터 단백질 또는 7 회 막 관통형 리셉터 단백질 (7 TMR) 로 총칭된다.

G 단백질 공역형 리셉터 단백질은 생체의 세포나 장기의 각 기능세포 표면에 존재하고, 이들 세포나 장기의 기능을 조절하는 분자, 예를 들면 호르몬, 신경전달물질 및 생리활성물질 등의 표적으로서 생리적으로 중요한 역할을 담당하고 있다. 리셉터는 생리활성물질과의 결합을 통하여 시그널을 세포내에 전달하며, 이 시그널에 의해 세포의 부활이나 억제라는 각종 반응이 야기된다.

각종 생체의 세포나 장기내의 복잡한 기능을 조절하는 물질과 이 특이적 리셉터 단백질, 특히 G 단백질 공역형 리셉터 단백질과의 관계를 명확하게 하는 것은, 각종 생체의 세포나 장기의 기능을 해명하여 이들 기능과 밀접하게 관련된 의약품 개발에 매우 중요한 수단을 제공하게 된다.

예를 들면 생체의 각종 기관에서는 다수의 호르몬, 호르몬형 물질, 신경전달물질 또는 생리활성물질에 의한 조절하에 생리적인 기능의 조절이 이루어지고 있다. 특히, 생리활성물질은 생체내의 다양한 부위에 존재하여, 각각에 대응하는 리셉터 단백질을 통하여 그 생리기능의 조절을 수행하고 있다. 생체내에는 아직 미지의 호르몬이나 신경전달물질 기타 생리활성물질도 많고, 이들 리셉터 단백질의 구조에 관해서도 지금까지 보고되어 있지 않은 것이 많다. 또한 이미 알고 있는 리셉터 단백질에 있어서도 서브타입이 존재하는지의 여부에 대해서도 알지 못하고 있는 것이 많다.

생체에서의 복잡한 기능을 조절하는 물질과 그 특이적 리셉터 단백질의 관계를 명확하게 하는 것은 의약품 개발에 매우 중요한 수단이다. 또, 리셉터 단백질에 대한 작동제, 길항제를 효율적으로 스크리닝하고 의약품을 개발하기 위해서는, 생체내에서 발현되어 있는 리셉터 단백질의 유전자 기능을 해명하고 이들을 적당한 발현계에서 발현시킬 필요가 있었다.

최근, 생체내에서 발현되어 있는 유전자를 해석하는 수단으로 cDNA 의 서열을 랜덤하게 해석하는 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 이렇게 얻은 cDNA 의 단편 서열이 Expressed Sequence Tag (EST) 로서 데이터베이스에 등록되고 공개되어 있다. 그러나, 대부분의 EST 는 서열정보뿐으로서 그 기능을 추정하기가 어렵다.

종래 G 단백질 공역형 리셉터와 생리활성물질 (즉 리간드) 의 결합을 저해하는 물질이나 결합하여 생리활성물질 (즉 리간드) 과 동일한 시그널 전달을 일으키는 물질은, 이들 리셉터의 특이적인 길항제 또는 작동제로서 생체기능을 조절하는 의약품으로 활용되어 왔다. 따라서, 이렇게 생체내에서의 생리발현에서 중요할 뿐만 아니라 의약품 개발의 표적으로도 될 수 있는 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 신규하게 발견하여 그 유전자 (예를 들면 cDNA) 를 클로닝하는 것은, 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 특이적인 리간드나 작동제, 길항제를 발견함에 있어서 매우 중요한 수단이 된다.

그러나, G 단백질 공역형 리셉터 단백질은 그 전부가 발견되어 있는 것은 아니며, 현시점에서도 여전히 미지의 G 단백질 공역형 리셉터 또는 대응하는 리간드가 동정되어 있지 않은 소위 오펀(orphan) 리셉터가 다수 존재하고 있어 새로운 G 단백질 공역형 리셉터의 탐색 및 기능해명이 요망되고 있다.

G 단백질 공역형 리셉터는 그 시그널 전달 작용을 지표로 하는 새로운 생리활성물질 (즉 리간드) 의 탐색, 또한 이 리셉터에 대한 작동제 또는 길항제의 탐색에 유용하다. 한편, 리간드가 발견되지 않아도, 이 리셉터의 불활화 실험 (녹아웃 동물) 으로부터 이 리셉터의 생리작용을 해석함으로써 이 리셉터에 대한 작동제 또는 길항제를 제작하는 것도 가능하다. 이들 리셉터에 대한 리간드, 작동제 또는 길항제 등은 G 단백질 공역형 리셉터의 기능부전에 관련된 질환의 예방/치료약이나 진단약으로의 활용을 기대할 수 있다.

또 G 단백질 공역형 리셉터의 유전자 변이에 기초하는, 생체에서의 이 리셉터 기능 저하 또는 앙진이 어떠한 질환의 원인으로 되어 있는 경우도 많다. 이 경우에는, 이 리셉터에 대한 길항제나 작동제의 투여뿐만 아니라 이 리셉터 유전자의 생체내 (또는 임의의 특정 장기) 로의 도입 또는 이 리셉터 유전자에 대한 안티센스 핵산의 도입에 의한 유전자 치료에 응용할 수도 있다. 이 경우에는 이 리셉터의 염기 서열은 유전자상의 결실이나 변이의 유무를 조사하기 위해 필요불가결한 정보로서, 이 리셉터의 유전자는 이 리셉터의 기능부전에 관련된 질환의 예방/치료약이나 진단약에 응용할 수도 있다.

본 발명은 상기와 같이 유용한 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 제공하는 것이다. 즉, 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염, 이 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (DNA, RNA 및 이들의 유도체) 를 함유하는 폴리뉴클레오티드 (DNA, RNA 및 이들의 유도체), 이 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를 유지하는 형질전환체, 이 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 또는 그 염의 제조법, 이 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 항체, 이 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 발현량을 변화시키는 화합물, 이 G 단백질 공역형 리셉터에 대한 리간드의 결정 방법, 리간드와 이 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 (길항제, 작동제) 또는 그 염의 스크리닝 방법, 이 스크리닝용 키트, 이 스크리닝 방법 또는 스크리닝 키트를 사용하여 얻을 수 있는 리간드와 이 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 (길항제, 작동제) 또는 그 염, 및 리간드와 이 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 (길항제, 작동제) 또는 이 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 발현량을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유하여 이루어지는 의약 등을 제공한다.

본 발명은, 인간 (인간해마) 유래의 신규 단백질 또는 그 염 및 이를 코딩하는 DNA 등에 관한 것이다.

도 1 은 실시예 1 에서 얻은 본 발명의 인간해마 유래의 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 hSLT 를 코딩하는 DNA 의 염기 서열, 및 이들로부터 추정되는 아미노산 서열을 나타낸다 (도 2 에 이어짐).

도 2 는 실시예 1 에서 얻은 본 발명의 인간해마 유래의 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 hSLT 를 코딩하는 DNA 의 염기 서열, 및 이들로부터 추정되는 아미노산 서열을 나타낸다 (도 1 의 연속).

도 3 은 도 1 ∼ 도 2 에 표시된 아미노산 서열을 기초로 작성한, 본 발명의 인간해마 유래의 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 hSLT 의 소수성 플롯을 나타낸다.

본 발명자들은, 예의 연구를 거듭한 결과 변성 PCR 법에 의해 작성한 EST 정보에 기초하여 인간 (인간해마) 유래의 신규 단백질을 코딩하는 cDNA 를 단리하고, 그 전체 염기 서열을 해석하는 것에 성공했다. 그리고, 이 염기 서열을 아미노산 서열로 번역한 결과 제 1 ∼ 제 7 막 관통 영역이 소수성 플롯상에서 확인되어, 이들 cDNA 에 코딩되는 단백질이 7 회 막 관통형의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질임을 확인했다. 본 발명자들은 이러한 발견에 기초하여 더욱 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은,

(1) 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그 염,

(2) 상기 (1) 에 기재된 단백질의 부분 펩티드 또는 그 염,

(3) 상기 (1) 에 기재된 단백질을 코딩하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드,

(4) DNA 인 상기 (3) 에 기재된 폴리뉴클레오티드,

(5) 서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열을 갖는 상기 (3) 에 기재된 폴리뉴클레오티드,

(6) 상기 (3) 에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터,

(7) 상기 (6) 에 기재된 재조합 벡터로 형질전환시킨 형질전환체,

(8) 상기 (7) 에 기재된 형질전환체를 배양하고, 상기 (1) 에 기재된 단백질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 제조법,

(9) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 항체,

(10) 상기 (1) 에 기재된 단백질의 시그널 전달을 불활성화하는 중화항체인 상기 (9) 에 기재된 항체,

(11) 상기 (9) 에 기재된 항체를 함유하여 이루어지는 진단약,

(12) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을 사용함으로써 얻을 수 있는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 리간드,

(13) 상기 (12) 에 기재된 리간드를 함유하여 이루어지는 의약,

(14) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정 방법,

(15) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(16) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트,

(17) 상기 (15) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는, 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염,

(18) 상기 (15) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는, 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유하여 이루어지는 의약,

(19) 상기 (3) 에 기재된 폴리뉴클레오티드와 매우 엄격한 조건하에서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드,

(20) 상기 (3) 에 기재된 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열 및 그 일부를 함유하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드,

(21) 상기 (3) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부를 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질의 mRNA 의 정량 방법,

(22) 상기 (9) 에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질의 정량 방법,

(23) 상기 (21) 또는 상기 (22) 에 기재된 정량 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질의 기능이 관련된 질환의 진단 방법,

(24) 상기 (21) 에 기재된 정량 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 에 기재된 단백질의 발현량을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(25) 상기 (22) 에 기재된 정량 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포막에서의 상기 (1) 에 기재된 단백질량을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(26) 상기 (24) 에 기재된 스크리닝 방법을 사용하여 얻을 수 있는, 상기 (1) 에 기재된 단백질의 발현량을 변화시키는 화합물 또는 그 염,

(27) 상기 (25) 에 기재된 스크리닝 방법을 사용하여 얻을 수 있는, 세포막에서의 상기 (1) 에 기재된 단백질량을 변화시키는 화합물 또는 그 염 등에 관한 것이다.

또,

(28) 단백질이 ① 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 9 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 ④ 이들을 조합한 아미노산 서열을 함유하는 단백질인 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염,

(29) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염과, 시험화합물을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 상기 (14) 에 기재된 리간드의 결정 방법,

(30) 리간드가 예를 들면 안기오텐신, 봄베신, 카나비노이드, 콜레시스토키닌, 글루타민, 세로토닌, 멜라토닌, 뉴로펩티드Y, 오피오이드, 푸린, 바소프레신, 옥시토신, PACAP, 세크레틴, 글루카곤, 칼시토닌, 아드레노메듀린, 소마토스타틴, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (바소액티브 인테스티널 및 관련 폴리펩티드), 소마토스타틴, 도파민, 모틸린, 아밀린, 브래디키닌, CGRP (칼시토닌 진(gene) 관련 펩티드), 류코트리엔, 판크레아스타틴, 프로스타글란딘, 트롬복산, 아데노신, 아드레날린, α및 β-케모카인 (chemokine) (예를 들면, IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 등), 엔도텔린, 엔테로가스트린, 히스타민, 뉴로텐신, TRH, 판크레아틱 폴리펩타이드 또는 갈라닌인 상기 (29) 에 기재된 리간드의 결정 방법,

(31) (i) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염과 리간드를 접촉시킨 경우와, (ii) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염과, 리간드 및 시험화합물을 접촉시킨 경우를 비교하는 것을 특징으로 하는 상기 (15) 에 기재된스크리닝 방법,

(32) (i) 표지한 리간드를 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염에 접촉시킨 경우와, (ii) 표지한 리간드 및 시험화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 리간드의 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(33) (i) 표지한 리간드를 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우와, (ii) 표지한 리간드 및 시험화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 리간드의 이 세포에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(34) (i) 표지한 리간드를 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유하는 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우와, (ii) 표지한 리간드 및 시험화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유하는 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 리간드의 이 세포의 막 분획에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(35) (i) 표지한 리간드를 상기 (7) 에 기재된 형질전환체를 배양함으로써이 형질전환체의 세포막에 발현된 단백질에 접촉시킨 경우와, (ii) 표지한 리간드 및 시험화합물을 상기 (7) 에 기재된 형질전환체를 배양함으로써 이 형질전환체의 세포막에 발현된 단백질에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 리간드의 이 단백질에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(36) (i) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염을 활성화하는 화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우와, (ii) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염을 활성화하는 화합물 및 시험화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우에서의, 단백질을 통한 세포자극활성을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(37) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염을 활성화하는 화합물을 상기 (7) 에 기재된 형질전환체를 배양함으로써 이 형질전환체의 세포막에 발현된 단백질에 접촉시킨 경우와, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염을 활성화하는 화합물 및 시험화합물을 상기 (7) 에 기재된 형질전환체를 배양함으로써 이 형질전환체의 세포막에 발현된 단백질에 접촉시킨 경우에서의, 단백질을 통한 세포자극활성을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

(38) 상기 (1) 에 기재된 단백질을 활성화하는 화합물이, 안기오텐신, 봄베신, 카나비노이드, 콜레시스토키닌, 글루타민, 세로토닌, 멜라토닌, 뉴로펩티드Y,오피오이드, 푸린, 바소프레신, 옥시토신, PACAP, 세크레틴, 글루카곤, 칼시토닌, 아드레노메듀린, 소마토스타틴, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (바소액티브 인테스티널 폴리펩티드), 소마토스타틴, 도파민, 모틸린, 아밀린, 브래디키닌, CGRP (칼시토닌 진(gene) 관련 펩티드), 류코트리엔, 판크레아스타틴, 프로스타글란딘, 트롬복산, 아데노신, 아드레날린, α및 β-케모카인 (chemokine) (예를 들면, IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 등), 엔도텔린, 엔테로가스트린, 히스타민, 뉴로텐신, TRH, 판크레아틱 폴리펩타이드 또는 갈라닌인 상기 (36) 또는 (37) 에 기재된 스크리닝 방법,

(39) 상기 (31) ∼ (38) 에 기재된 스크리닝 방법으로 얻을 수 있는, 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염,

(40) 상기 (31) ∼ (38) 에 기재된 스크리닝 방법으로 얻을 수 있는, 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 의약,

(41) 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유하는 세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트,

(42) 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유하는 세포의 막 분획을 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트,

(43) 상기 (7) 에 기재된 형질전환체를 배양함으로써 이 형질전환체의 세포막에 발현된 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트,

(44) 상기 (41) ∼ (43) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는, 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염,

(45) 상기 (41) ∼ (43) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는, 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 의약,

(46) 상기 (9) 에 기재된 항체와, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 의 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염의 정량법,

(47) 상기 (9) 에 기재된 항체와, 피검액 및 표지화된 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을 경합적으로 반응시켜, 이 항체에 결합된 표지화된 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염의 정량법, 및

(48) 피검액과 항체상에 불용화된 상기 (9) 에 기재된 항체 및 표지화된 상기 (9) 에 기재된 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (2) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염의 정량법 등을 제공한다.

본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 (이하, 리셉터 단백질로 약기하는 경우가 있다) 은, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열 (도 1 및 도 2 중의 아미노산 서열) 과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 리셉터 단백질이다.

본 발명의 리셉터 단백질은, 예를 들면 인간이나 포유동물 (예를 들면 모르모트, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 모든 세포 (예를 들면, 지라세포, 신경세포, 글리어세포, 췌장β세포, 골수세포, 사구체간질세포, 랑겔한스세포, 표피세포, 상피세포, 내피세포, 섬유아세포, 섬유세포, 근세포, 지방세포,면역세포 (예, 매크로파지, T 세포, B 세포, 내츄럴킬러세포, 비만세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단구), 거핵구, 활막세포, 연골세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 유선세포, 간세포 또는 간질세포, 또는 이들 세포의 전구세포, 줄기세포 또는 암세포 등) 나 혈구계의 세포, 또는 이들 세포가 존재하는 모든 조직, 예를 들면 뇌, 뇌의 각 부위 (예, 후구(嗅球), 편두핵, 대뇌기저구, 해마, 시상, 시상하부, 시상하핵, 대뇌피질, 연수, 소뇌, 후두엽, 전두엽, 측두엽, 피곡, 미상핵(尾狀核:꼬리형핵), 뇌염, 흑질), 척수, 하수체, 위, 췌장, 신장, 간장, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육, 폐, 소화관 (예, 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 악하선, 말초혈, 말초혈구, 전립선, 고환, 정소, 난소, 태반, 자궁, 뼈, 관절, 골격근 등 (특히 뇌나 뇌의 각 부위) 에서 유래하는 단백질이어도 되고, 또 합성 단백질이어도 된다.

서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 예를 들면 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열과 약 50 % 이상, 바람직하게는 약 70 % 이상, 보다 바람직하게는 약 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 가장 바람직하게는 약 95 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 단백질로는, 예를 들면 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질 등이 바람직하다.

실질적으로 동질의 활성으로는 예를 들면 리간드 결합활성, 시그널 정보전달 작용 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이란, 이들 활성이 성질적으로 동질한 것을 나타낸다. 따라서, 리간드 결합활성이나 시그널 정보전달 작용 등의 활성이 동등 (예, 약 0.01 ∼ 100 배, 바람직하게는 약 0.5 ∼ 20 배, 보다 바람직하게는 약 0.5 ∼ 2 배) 한 것이 바람직하지만, 이들 활성의 정도나 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다.

리간드 결합활성이나 시그널 정보전달 작용 등과 같은 활성은 자체 공지의 방법에 준하여 측정할 수 있지만, 예를 들면 후술하는 리간드의 결정 방법이나 스크리닝 방법에 따라 측정할 수 있다.

또, 본 발명의 리셉터 단백질로는, ① 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 기타 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 ④ 이들을 조합한 아미노산 서열을 함유하는 단백질 등도 사용된다.

본 명세서에서의 리셉터 단백질은, 펩티드 표기의 관례에 따라 좌단이 N 말단 (아미노 말단), 우단이 C 말단 (카르복실 말단) 이다. 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 리셉터 단백질을 비롯한 본 발명의 리셉터 단백질은 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 이어도 된다.

여기서 에스테르에서의 R 로는, 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등의 C_1-6알킬기, 예를 들면 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C_3-8시클로알킬기, 예를 들면 페닐, α-나프틸 등의 C_6-12아릴기, 예를 들면 벤질, 페네틸 등의 페닐-C_1-2알킬기 또는 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C_1-2알킬기 등의 C_7-14아르알킬기 외에, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등이 사용된다.

본 발명의 리셉터 단백질이 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 가지고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 리셉터 단백질에 포함된다. 이 경우의 에스테르로는, 예를 들면 상기한 C 말단의 에스테르 등이 사용된다.

또, 본 발명의 리셉터 단백질에는, 상기한 단백질에서 N 말단의 메티오닌 잔기의 아미노기가 보호기 (예를 들면 포르밀기, 아세틸 등의 C_2-6알카노일기 등의 C_1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것, N 단측이 생체내에서 절단되어 생성된 글루타밀기가 피로글루타민 산화한 것, 분자내의 아미노산의 측쇄 상의 치환기 (예를 들면, -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 가 적당한 보호기(예를 들면 포르밀기, 아세틸 등의 C_2-6알카노일기 등의 C_1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 또는 당사슬이 결합한 소위 당단백질 등의 복합 단백질 등도 포함된다.

본 발명의 리셉터 단백질의 구체예로는, 예를 들면 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 인간 유래 (보다 바람직하게는 인간해마 유래) 의 리셉터 단백질 등이 사용된다.

본 발명의 리셉터 단백질의 부분 펩티드 (이하, 부분 펩티드로 약기하는 경우가 있다) 로는, 본 발명의 리셉터 단백질의 부분 펩티드라면 어느 것이나 상관없으며, 예를 들면 본 발명의 리셉터 단백질 분자 중 세포막의 밖으로 노출되어 있는 부위로서 리셉터 결합활성을 갖는 것 등이 사용된다.

구체적으로는, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 리셉터 단백질의 부분 펩티드는, 도 3 에 나타낸 소수성 플롯 해석에 있어서 세포외 영역 (친수성 (Hydrophilic) 부위) 이라고 분석된 부분을 포함하는 펩티드이다. 또, 소수성 (Hydrophobic) 부위를 일부에 포함하는 펩티드도 동일하게 사용할 수 있다. 개개의 도메인을 개별적으로 포함하는 펩티드도 사용할 수 있지만, 복수의 도메인을 동시에 포함하는 부분의 펩티드이어도 된다.

본 발명의 부분 펩티드의 아미노산의 수는, 상기한 본 발명의 리셉터 단백질의 구성 아미노산 서열 중 적어도 20 개 이상, 바람직하게는 50 개 이상, 보다 바람직하게는 100 개 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 등이 바람직하다.

실질적으로 동일한 아미노산 서열이란, 이들 아미노산 서열과 약 50 % 이상, 바람직하게는 약 70 % 이상, 보다 바람직하게는 약 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 % 이상, 가장 바람직하게는 약 95 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 나타낸다.

여기서 「실질적으로 동질의 활성」이란 상기와 동일한 의미를 나타낸다. 「실질적으로 동질의 활성」은 상기와 동일한 방법으로 측정할 수 있다.

또, 본 발명의 부분 펩티드는, 상기 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결실되고, 또는 그 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 20 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 부가되고, 또는 그 아미노산 서열 중의 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 보다 바람직하게는 수개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개 정도) 의 아미노산이 기타 아미노산으로 치환되어 있어도 된다.

또, 본 발명의 부분 펩티드는 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, 상기한 본 발명의 단백질과 같이 C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 이어도 된다. 에스테르의 R 로는 상기와 동일한 것 등이 사용된다.

또, 본 발명의 부분 펩티드에는, 상기한 본 발명의 리셉터 단백질과 마찬가지로 N 말단의 메티오닌 잔기의 아미노기가 보호기로 보호되어 있는 것, N 단측이생체내에서 절단되어 생성된 Gln 이 피로글루타민 산화한 것, 분자내의 아미노산의 측쇄 상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 또는 당사슬이 결합한 소위 당펩티드 등의 복합 펩티드 등도 포함된다.

또, 본 발명의 부분 펩티드는 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, 상기한 본 발명의 단백질과 같이 C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 이어도 된다. 에스테르의 R 로는 상기와 동일한 것 등이 사용된다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 염으로는, 산 또는 염기와의 생리학적으로 허용되는 염을 들 수 있고, 그중에서도 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이러한 염으로는, 예를 들면 무기산 (예를 들면 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염, 또는 유기산 (예를 들면 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염은, 전술한 인간이나 포유동물의 세포 또는 조직으로부터 자체 공지의 리셉터 단백질의 정제 방법에 의해 제조할 수도 있고, 후술하는 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 것에 의해서도 제조할 수 있다. 또, 후술하는 단백질 합성법 또는 이에 준하여 제조할 수도 있다.

인간이나 포유동물의 조직 또는 세포로부터 제조하는 경우, 인간이나 포유동물의 조직 또는 세포를 호모디나이징한 후, 산 등으로 추출을 실시하고, 이 추출액을 역상 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 조합함으로써 정제단리할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염 또는 그 아미드체의 합성에는 통상 시판하는 단백질 합성용 수지를 사용할 수 있다. 이러한 수지로는, 예를 들면 클로로메틸 수지, 히드록시메틸 수지, 벤즈히드릴아민 수지, 아미노메틸 수지, 4-벤질옥시벤질알콜 수지, 4-메틸벤즈히드릴아민 수지, PAM 수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세트아미드메틸 수지, 폴리아크릴아미드 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노에틸)페녹시 수지 등을 들 수 있다. 이러한 수지를 사용하여, α-아미노기와 측쇄 관능기를 적당히 보호한 아미노산을 목적으로 하는 단백질의 서열대로 자체 공지의 각종 축합 방법에 따라 수지상에서 축합시킨다. 반응의 마지막에 수지로부터 단백질을 잘라냄과 동시에 각종 보호기를 제거하고 고희석 용액 중에서 분자내 디술피드 결합형성 반응을 실시하여, 목적하는 단백질 또는 그 아미드체를 수득한다.

상기한 보호 아미노산의 축합에 관해서는 단백질 합성에 사용할 수 있는 각종 활성화 시약을 사용할 수 있지만, 특히 카르보디이미드류가 좋다. 카르보디이미드류로는 DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로릴)카르보디이미드 등이 사용된다. 이들에 의한 활성화에는 라세미화 억제첨가제 (예를 들면, HOBt, HOOBt) 와 함께 보호 아미노산을 직접 수지에 첨가하거나 또는 대칭 산무수물 또는 HOBt 에스테르 또는 HOOBt 에스테르로서 미리 보호 아미노산의 활성화를 수행한 후에 수지에 첨가할 수 있다.

보호 아미노산의 활성화나 수지와의 축합에 사용되는 용매로는, 단백질 축합반응에 사용할 수 있는 것으로 알려져 있는 용매로부터 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 산아미드류, 염화메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류, 트리플루오로에탄올 등의 알콜류, 디메틸술폭시드 등의 술폭시드류, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류 또는 이들의 적절한 혼합물 등이 사용된다. 반응온도는 단백질 결합형성 반응에 사용될 수 있는 것으로 알려져 있는 범위에서 적절히 선택되며, 통상 약 -20 ℃ ∼ 50 ℃ 의 범위에서 적절히 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상 1.5 ∼ 4 배 과잉으로 사용된다. 닌히드린 반응을 사용한 테스트의 결과, 축합이 불충분한 경우에는 보호기의 탈리를 실시하지 않고 축합반응을 반복함으로써 충분한 축합을 수행할 수 있다. 반응을 반복해도 충분한 축합을 얻을 수 없는 경우에는, 무수아세트산 또는 아세틸이미다졸을 사용하여 미반응 아미노산을 아세틸화할 수 있다.

원료인 아미노기의 보호기로는, 예를 들면 Z, Boc, tert-펜틸옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, Cl-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈로일, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피노티오일, Fmoc 등이 사용된다.

카르복실기는, 예를 들면 알킬에스테르화 (예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필,부틸, tert-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 2-아다만틸 등의 직쇄상, 분지상 또는 환상 알킬에스테르화), 아르알킬에스테르화 (예를 들면, 벤질에스테르, 4-니트로벤질에스테르, 4-메톡시벤질에스테르, 4-클로로벤질에스테르, 벤즈히드릴에스테르화), 펜아실에스테르화, 벤질옥시카르보닐히드라지드화, tert-부톡시카르보닐히드라지드화, 트리틸히드라지드화 등에 의해 보호할 수 있다.

세린의 수산기는, 예를 들면 에스테르화 또는 에테르화에 의해 보호할 수 있다. 이 에스테르화에 적합한 기로는, 예를 들면 아세틸기 등의 저급 알카노일기, 벤조일기 등의 아로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 탄산에서 유도되는 기 등이 사용된다. 또, 에테르화에 적합한 기로는, 예를 들면 벤질기, 테트라히드로피라닐기, t-부틸기 등이다.

티로신의 페놀성 수산기의 보호기로는, 예를 들면 Bzl, Cl₂-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, tert-부틸 등이 사용된다.

히스티딘의 이미다졸의 보호기로는, 예를 들면 Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, Fmoc 등이 사용된다.

원료인 카르복실기가 활성화된 것으로는, 예를 들면 대응하는 산무수물, 아지드, 활성에스테르 [알콜 (예를 들면 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알콜, 파라니트로페놀, HONB, N-히드록시숙시미드, N-히드록시프탈이미드, HOBt) 과의 에스테르] 등이 사용된다. 원료인 아미노기가 활성화된 것으로는, 예를 들면 대응하는 인산아미드가 사용된다.

보호기의 제거 (탈리) 방법으로는, 예를 들면 Pd-흑 또는 Pd-탄소 등의 촉매 존재하에서의 수소 기류 중에서의 접촉환원이나, 또는 무수플루오르화 수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산 또는 이들의 혼합액 등에 의한 산처리나, 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등에 의한 염기처리, 또는 액체 암모니아 중 나트륨에 의한 환원 등도 사용할 수 있다. 상기 산처리에 의한 탈리반응은 일반적으로 약 -20 ℃ ∼ 40 ℃ 의 온도에서 이루어지며, 산처리에 있어서는 예를 들면 아니솔, 페놀, 티오아니솔, 메타크레졸, 파라크레졸, 디메틸술피드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올 등과 같은 양이온 포착제의 첨가가 유효하다. 또, 히스티딘의 이미다졸 보호기로서 사용되는 2,4-디니트로페닐기는 티오페놀 처리에 의해 제거되고, 트립토판의 인돌 보호기로서 사용되는 포르밀기는 상기 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디티올 등의 존재하의 산처리에 의한 탈보호 이외에 희수산화나트륨 용액, 희암모니아 등에 의한 알카리 처리에 의해서도 제거된다.

원료의 반응에 관여하지 않을 관능기의 보호 및 보호기, 및 그 보호기의 탈리, 반응에 관여하는 관능기의 활성화 등은 공지의 기 또는 공지의 수단에서 적절히 선택할 수 있다.

단백질의 아미드체를 얻는 다른 방법으로는, 예를 들면 우선 카르복시 말단 아미노산의 α-카르복실기를 아미드화하여 보호한 후, 아미노기측에 펩티드 (단백질) 사슬을 원하는 사슬길이까지 늘린 후, 이 펩티드 사슬의 N 말단의 α-아미노기의 보호기만을 제거한 단백질과 C 말단의 카르복실기의 보호기만을 제거한 단백질을 제조하고, 이 양 단백질을 상기한 바와 같은 혼합용매 중에서 축합시킨다. 축합 반응의 상세한 내용에 대해서는 상기와 동일하다. 축합에 의해 얻은 보호 단백질을 정제한 후, 상기 방법에 의해 모든 보호기를 제거하여 원하는 조(粗)단백질을 얻을 수 있다. 이 조단백질은 기지의 각종 정제수단을 구사하여 정제하고, 주요 분획을 동결건조함으로써 원하는 단백질의 아미드체를 얻을 수 있다.

단백질의 에스테르체를 얻기 위해서는, 예를 들면 카르복시 말단 아미노산의 α-카르복실기를 원하는 알콜류와 축합하여 아미노산 에스테르로 한 후, 단백질의 아미드체와 동일한 방법으로 원하는 단백질의 에스테르체를 얻을 수 있다.

본 발명의 단백질의 부분 펩티드 또는 그 염은, 자체 공지의 펩티드의 합성법에 따라, 또는 본 발명의 단백질을 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 펩티드의 합성법으로는, 예를 들면 고상 합성법, 액상 합성법 중 어느 것이나 상관없다. 즉, 본 발명의 단백질을 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 잔여부분을 축합시키고, 생성물이 보호기를 갖는 경우는 보호기를 탈리함으로써 목적하는 펩티드를 제조할 수 있다. 공지의 축합 방법이나 보호기의 탈리로는, 예를 들면 이하의 ① ∼ ⑤ 에 기재된 방법을 들 수 있다.

① M. Bodanszky 및 M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1996)

② Schroeder 및 Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)

③ 이즈미야노부오 외, 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠 (주) (1795)

④ 야지마하루아키 및 사까기바라순페이, 생화학실험강좌 1, 단백질의 화학Ⅳ, 205, (1977)

⑤ 야지마하루아키 감수, 속 의약품의 개발, 제 14 권, 펩티드 합성, 히로카와쇼뗑

또, 반응후는 통상의 정제법, 예를 들면 용매 추출·증류·칼럼 크로마토그래피·액체 크로마토그래피·재결정 등을 조합하여 본 발명의 부분 펩티드를 정제 단리할 수 있다. 상기 방법에서 얻어지는 부분 펩티드가 유리체인 경우는 공지의 방법에 의해 적당한 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻은 경우는 공지의 방법에 의해 유리체로 변환할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로는, 전술한 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 염기 서열 (DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA) 을 함유하는 것이라면 어떠한 것이라도 상관없다. 이 폴리뉴클레오티드로는, 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA, mRNA 등의 RNA 로서, 이중 가닥이어도 되고, 단일 가닥이어도 된다. 이중 가닥의 경우는 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 DNA : RNA 의 하이브리드이어도 된다. 단일 가닥의 경우는 센스 가닥 (즉 코딩 가닥) 이어도 되고, 안티센스 가닥 (즉 비코딩 가닥) 이어도 된다.

본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 예를 들면 공지의 실험의학증간 「신 PCR 과 그 응용」15(7), 1997 에 기재된 방법 또는 이에 준한 방법에 의해 본 발명의 리셉터 단백질의 mRNA 를 정량할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 로는, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포·조직 유래의 cDNA, 상기한 세포·조직 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 하나이어도 된다. 라이브러리에 사용하는 벡터는, 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 중 어느 하나이어도 된다. 또, 상기한 세포·조직으로부터 total RNA 또는 mRNA 분획을 조제한 것을 사용하여 직접 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (이하, RT-PCR 법이라고 약칭한다) 에 의해 증폭할 수도 있다.

구체적으로는, 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 로는 예를 들면 서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열을 함유하는 DNA, 또는 서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리다이징하는 염기 서열을 가지고, 본 발명의 리셉터 단백질과 실질적으로 동질의 활성 (예, 리간드 결합활성, 시그널 정보전달 작용 등) 을 갖는 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 라면 어느 것이라도 된다.

서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열과 하이브리다이징할 수 있는 DNA 로는, 예를 들면 서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열과 약 70 % 이상, 바람직하게는 약 80 % 이상, 보다 바람직하게는 약 90 % 이상, 가장 바람직하게는 약 95 % 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유하는 DNA 등이 사용된다.

하이브리다이제이션은, 자체 공지의 방법 또는 이에 준하는 방법 예를 들면 모레큘러·클로닝 (Molecular Cloning) 2nd (J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등에 따라 수행할 수 있다. 또, 시판하는 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부의 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다. 보다 바람직하게는 매우 엄격한 조건에 따라 수행할 수 있다.

이 매우 엄격한 조건이란, 예를 들면 나트륨 농도가 약 19 ∼ 40 mM, 바람직하게는 약 19 ∼ 20 mM 이고, 온도가 약 50 ∼ 70 ℃, 바람직하게는 약 60 ∼ 65 ℃ 인 조건을 말한다. 특히, 나트륨 농도가 약 19 mM 이고 온도가 약 65 ℃ 인 경우가 가장 바람직하다.

보다 구체적으로는, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 로는 서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 의 염기 서열의 일부 또는 이 DNA 와 상보적인 염기 서열의 일부를 함유하여 형성되는 폴리뉴클레오티드로는, 하기의 본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 를 포함할 뿐만 아니라 RNA 도 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에 따르면, G 단백질 공역형 리셉터 단백질 유전자의 복제 또는 발현을 저해할 수 있는 안티센스·폴리뉴클레오티드 (핵산) 를, 클론화한 또는 결정된 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 정보에 기초하여 설계하고 합성할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 (핵산) 는 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 유전자의 RNA 와 하이브리다이징할 수 있어, 이 RNA 의 합성 또는 기능을 저해할 수 있거나, 또는 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 관련 RNA 와의 상호 작용을 통하여 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 유전자의 발현을 조절·제어할 수 있다. G 단백질 공역형 리셉터 단백질 관련 RNA 의 선택된 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 및 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 관련 RNA 와 특이적으로 하이브리다이징할 수 있는 폴리뉴클레오티드는, 생체내 및 생체외에서 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 유전자의 발현을 조절·제어하는데에 유용하며, 또한 질병 등의 치료 또는 진단에 유용하다. 용어 「대응하는」은, 유전자를 포함한 뉴클레오티드, 염기 서열 또는 핵산의 특정 서열에 상동성을 갖는 또는 상보적인 것을 의미한다. 뉴클레오티드, 염기 서열 또는 핵산과 펩티드 (단백질) 의 사이에서 「대응하는」은, 뉴클레오티드 (핵산) 의 서열 또는 그 상보체로부터 유도되는 지령에 있는 펩티드 (단백질) 의 아미노산을 통상 가리키고 있다. G 단백질 공역형 리셉터 단백질 유전자의 5' 말단 헤어핀루프, 5' 말단 6-염기쌍·리피트, 5' 말단 비번역 영역, 폴리펩티드 번역개시 코돈, 단백질 코드 영역, ORF 번역개시 코돈, 3' 말단 비번역 영역, 3' 말단 팔린드롬(palindrome) 영역, 및 3' 말단 헤어핀루프는 바람직한 대상영역으로 선택될 수 있지만, G 단백질 공역형 리셉터 단백질 유전자내의 어떠한 영역도 대상으로 선택할 수 있다.

목적 핵산과, 대상영역의 적어도 일부에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 관계는, 대상물과 하이브리다이징할 수 있는 폴리뉴클레오티드와 대상물의 관계는 「안티센스」라고 할 수 있다. 안티센스·폴리뉴클레오티드는 2-데옥시-D-리보오스를 함유하고 있는 폴리데옥시뉴클레오티드, D-리보오스를 함유하고 있는 폴리데옥시뉴클레오티드, 푸린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드인 기타 타입의 폴리뉴클레오티드, 또는 비뉴클레오티드 골격을 갖는 기타 폴리머 (예를 들면, 시판하는 단백질 핵산 및 합성서열 특이적 핵산 폴리머) 또는 특수한 결합을 함유하는 기타 폴리머 (단, 이 폴리머는 DNA 나 RNA 중에서 발견되는 염기의 페어링나 염기의 부착을 허용하는 배치를 갖는 뉴클레오티드를 함유한다) 등을 들 수 있다. 이들은, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 또 DNA:RNA 하이브리드일 수 있으며, 또한 비수식 폴리뉴클레오티드 (또는 비수식 올리고뉴클레오티드), 나아가 공지의 수식이 부가된 것, 예를 들면 당해분야에서 알려진 표지가 있는 것, 캡이 부착된 것, 메틸화된 것, 1 개 이상의 천연 뉴클레오티드를 유연(類緣)물로 치환한 것, 분자내 뉴클레오티드 수식된 것, 예를 들면 비하전 결합 (예를 들면, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스폴아미테이트, 카르바메이트 등) 을 갖는 것, 전하를 갖는 결합 또는 황함유 결합 (예를 들면 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 을 갖는 것, 예를 들면 단백질 (뉴클레아제, 뉴클레아제·인히비터, 톡신, 항체, 시그널펩티드, 폴리-L-리신 등) 이나 당 (예를 들면 모노사카라이드 등) 등의 측쇄기를 가지고 있는 것, 내위첨가 화합물 (예를 들면, 아크리딘, 푸소라렌 등) 을 갖는 것, 킬레이트 화합물 (예를 들면 금속, 방사활성을 갖는 금속, 붕소, 산화성의 금속 등) 을 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 수식된 결합을 갖는 것 (예를 들면 α아노머형의 핵산 등) 이어도 된다. 여기서, 「뉴클레오시드」, 「뉴클레오티드」및 「핵산」은 푸린 및 피리미딘 염기를 함유하는 것 뿐만 아니라 수식된 기타 복소환형 염기를 갖는 것을 포함하고 있어도 된다. 이러한 수식물은, 메틸화된 푸린 및 피리미딘, 아실화된 푸린 및 피리미딘, 또는 기타 복소환을 포함하는 것이어도 된다. 수식된 뉴클레오티드 및 수식된 뉴클레오티드는 또 당(糖)부분이 수식되어 있어도 되고, 예를 들면 1 개 이상의 수산기가 할로겐이나 지방족기 등으로 치환되어 있거나 또는 에테르, 아민 등의관능기로 변환되어 있어도 된다.

본 발명의 안티센스·폴리뉴클레오티드 (핵산) 는 RNA, DNA 또는 수식된 핵산 (RNA, DNA) 이다. 수식된 핵산의 구체예로는 핵산의 황 유도체나 티오포스페이트 유도체, 그리고 폴리뉴클레오시드아미드나 올리고뉴클레오시드아미드의 분해에 저항성인 것을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 안티센스 핵산은 다음과 같은 방침에서 바람직하게 설계될 수 있다. 즉, 세포내에서의 안티센스 핵산을 보다 안정적인 것으로 하고, 안티센스 핵산의 세포투과성을 보다 향상시키며, 목표로 하는 센스 사슬에 대한 친화성을 보다 큰 것으로 하고, 또 만약 독성이 있다면 안티센스 핵산의 독성을 보다 작은 것으로 한다.

이렇게 하여 수식은 당해 분야에서 많이 알려져 있으며, 예를 들면 J.Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol.8, pp.395, 1992; S.T.Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 등에 개시되어 있다.

본 발명의 안티센스 핵산은 변화되어지거나, 수식된 당, 염기, 결합을 함유하고 있어도 되고, 리포좀, 미크로스페어와 같은 특수한 형태로 공여되거나, 유전자 치료에 의해 적용되거나, 부가된 형태로 부여되어질 수 있다. 이렇게 부가형태로 사용되는 것으로는 인산기 골격의 전하를 중화하도록 기능하는 폴리리신과 같은 폴리양이온체, 세포막과의 상호작용을 높이거나, 핵산의 삽입을 증대시키는 지질 (예를 들면 포스폴리피드, 콜레스테롤 등) 과 같은 조수성의 것을 들 수 있다. 부가하기에 적당한 지질로는 콜레스테롤이나 그 유도체 (예를 들면 콜레스테릴클로로포르메이트, 콜산 등) 를 들 수 있다. 이러한 것은, 핵산의 3' 말단 또는 5' 말단에 부착시킬 수 있으며, 염기, 당, 분자내 뉴클레오시드 결합을 통하여 부착시킬 수 있다. 기타 기로는, 핵산의 3' 말단 또는 5' 말단에 특이적으로 배치된 캡용 기로서, 엑소뉴클레아제, RNase 등의 뉴클레아제에 의한 분해를 저지하기 위한 것을 들 수 있다. 이러한 캡용의 기로는, 폴리에틸렌글리콜, 테트라에틸렌글리콜 등의 글리콜을 비롯한 당해분야에서 알려진 수산기의 보호기를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

안티센스 핵산의 저해활성은 본 발명의 형질전환체, 본 발명의 생체내 또는 생체외의 유전자 발현계, 또는 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 생체내 또는 생체외의 번역계를 사용하여 조사할 수 있다. 이 핵산은 자체 공지의 각종 방법으로 세포에 적용할 수 있다.

본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 전술한 본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 함유하는 것이라면 어떠한 것이라도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포·조직 유래의 cDNA, 상기한 세포·조직 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 하나이어도 된다. 라이브러리에 사용하는 벡터는, 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 중 어느 하나이어도 된다. 또, 상기한 세포·조직으로부터 mRNA 분획을 조제한 것을 사용하여 직접 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (이하, RT-PCR 법이라고 약칭한다) 에 의해 증폭할 수도 있다.

구체적으로는, 본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 로는, 예를 들면 (1)서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 의 부분 염기 서열을 갖는 DNA, 또는 (2) 서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리다이징하는 염기 서열을 가지고, 본 발명의 리셉터 단백질 펩티드와 실질적으로 동질의 활성 (예 리간드 결합활성, 시그널 정보전달 작용 등) 을 갖는 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 의 부분 염기 서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열과 하이브리다이징할 수 있는 DNA 로는, 예를 들면 서열번호 : 2 로 표시되는 염기 서열과 약 70 % 이상, 바람직하게는 약 80 % 이상, 보다 바람직하게는 약 90 % 이상, 가장 바람직하게는 약 95 % 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유하는 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 (이하, 본 발명의 리셉터 단백질이라고 약칭하는 경우가 있다) 를 완전하게 코딩하는 DNA 의 클로닝 수단으로는, 본 발명의 리셉터 단백질의 부분 염기 서열을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 증폭하거나 또는 적당한 벡터에 삽입한 DNA 를 본 발명의 리셉터 단백질의 일부 또는 전영역을 코딩하는 DNA 단편 또는 합성 DNA 를 사용하여 표지한 것과의 하이브리다이제이션에 의해 선별할 수 있다. 하이브리다이제이션의 방법은 모레큘러·클로닝 (Molecular Cloning) 2nd (J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등에 따라 수행할 수 있다. 또, 시판하는 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부의 사용설명서에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

DNA 염기 서열의 변환은, 공지의 키트, 예를 들면 Mutan^TM-G (다까라슈조 (주)), Mutan^TM-K (다까라슈조 (주)) 등을 사용하여 Gupped duplex 법이나 Kunkel 법 등과 같은 자체 공지의 방법 또는 이들에 준하는 방법에 따라 수행할 수 있다.

클론화된 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 는 목적에 따라 그대로, 또는 원한다면 제한효소로 소화하거나, 링커를 부가하여 사용할 수 있다. 이 DNA 는 그 5'말단측에 번역개시 코돈으로서의 ATG 를 가지고, 또 3'말단측에는 번역중지 코돈으로서의 TAA, TGA 또는 TAG 를 가지고 있어도 된다. 이들 번역개시 코돈이나 번역중지 코돈은 적당한 합성 DNA 어댑터를 사용하여 부가할 수도 있다.

본 발명의 리셉터 단백질의 발현 벡터는 예를 들면 (가) 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 로부터 목적하는 DNA 단편을 잘라내고, (나) 이 DNA 단편을 적당한 발현 벡터 중의 프로모터의 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.

벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래의 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), λ파지 등의 박테리오파지, 레트로 바이러스, 백시니어 바이러스, 버큘로 바이러스 등과 같은 동물 바이러스 등 외에, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등이 사용된다.

본 발명에서 사용되는 프로모터로는, 유전자의 발현에 사용하는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터라면 어떠한 것이라도 된다. 예를 들면 동물세포를 숙주로 사용하는 경우, SRα프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV 프로모터,HSV-TK 프로모터 등을 들 수 있다.

이들 중 CMV 프로모터, SRα프로모터 등을 사용하는 것이 바람직하다. 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우는 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λP_L프로모터, lpp 프로모터 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 숙주가 효모인 경우는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 곤충세포인 경우는, 폴리헤드린프로모터, P10 프로모터 등이 바람직하다.

발현 벡터에는 상기한 것 외에, 원한다면 엔핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 표지, SV40 복제 오리신 (이하, SV40ori 이라고 약칭하는 경우가 있다) 등을 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 선택 표지로는, 예를 들면 디히드로 엽산 환원효소 (이하, dhfr 로 약기하는 경우가 있다) 유전자 [메소트렉키세이트 (MTX) 내성], 암피실린 내성 유전자 (이하, Amp^r이라고 약칭하는 경우가 있다), 네오마이신 내성 유전자 (이하, Neo^r이라고 약칭하는 경우가 있다, G418 내성) 등을 들 수 있다. 특히, CHO (dhfr^-) 세포를 사용하여 dhfr 유전자를 선택 표지로 사용하는 경우, 목적 유전자를 티미딘을 포함하지 않는 배지에 의해서도 선택할 수 있다.

또, 필요에 따라, 숙주에 맞는 시그널 서열을 본 발명의 리셉터 단백질의 N 단말측에 부가한다. 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우, PhoA·시그널 서열, OmpA·시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우는 α-아밀라아제·시그널 서열, 서브틸리신·시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우는 MFα, 시그널 서열, SUC2·시그널 서열 등, 숙주가 동물세포인 경우는 인슐린·시그널 서열, α-인터페론·시그널 서열, 항체 분자·시그널 서열 등을 각각 이용할 수 있다.

이렇게 하여 구축된 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 벡터를 사용하여 형질전환체를 제조할 수 있다.

숙주로는, 예를 들면 에쉐리키아속 균, 바실러스속 균, 효모, 곤충세포, 곤충, 동물세포 등이 사용된다.

에쉐리키아속 균의 구체적 예로는, 에쉐리키아·콜리 (Escherichia coli) K12·DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 60 권, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9 권, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120 권, 517 (1978)], HB101 [Journal of Mplecular Biology, 41 권, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39 권, 440 (1954)] 등이 사용된다.

바실러스속 균으로는, 예를 들면 바실러스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) MI114 [Gene, 24 권, 255 (1983)], 207 - 21 [Journal of Biochmeistry, 95 권, 87 (1984)] 등이 사용된다.

효모로는, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R^-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1913, NCYC 2036, 피키아 파스트리스 (Pichiapastoris) 등이 사용된다.

곤충세포로는, 예를 들면 바이러스가 AcNPV 인 경우는 야도충(밤나방)의 유충 유래 주화세포 (Spodoptera frugiperda cell; Sf 세포), 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni)의 중장 유래의 MG1 세포, 트리코플러시아 니의 난(卵) 유래의 High Five^TM세포, 마메스트라 브라시캐 (Mamestra brassicae)유래의 세포 또는 에스티그메나 아크레아 (Estigmena acrea)유래의 세포 등이 사용된다. 바이러스가 BmNPV 인 경우는 누에 유래의 주화세포 (Bombyx mori N; BmN 세포) 등이 사용된다. 이 Sf 세포로는, 예를 들면 Sf9 세포 (ATCC CRL1711), Sf21 세포 [이상, Vaughn, J.L. 등, In Vivo, 13, 213-217, (1977)] 등이 사용된다.

곤충으로는, 예를 들면 누에의 유충 등이 사용된다 [마에다 등, Nature, 315 권, 592 (1985)].

동물 세포로는, 예를 들면 원숭이 세포 COS-7, Vero, 차이니즈 햄스터 세포 CHO (이하, CHO 세포라고 약기), dhfr 유전자 결손 차이니즈 햄스터 세포 CHO (이하, CHO(dhfr^-) 세포라고 약기), 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20, 마우스미엘로마 세포, 래트 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다.

에쉐리키아속 균을 형질전환하는 데에는, 예를 들면 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 권, 2110 (1972) 이나 Gene, 17 권, 107 (1982) 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다. 바실러스속 균을 형질전환하는데에는, 예를 들면 Molecular & General Genetics, 168 권, 111 (1979) 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

효모를 형질전환하는데에는, 예를 들면 Methods in Enzymology, 194 권, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 권, 1929 (1978) 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

곤충세포 또는 곤충을 형질전환하는데에는, 예를 들면 Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

동물세포를 형질전환하기에는, 예를 들면 세포공학별책 8 신세포공학실험 프로토콜. 263-267 (1995) (슈우쥰사 발행), Virology, 52 권, 456 (1973) 에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

이렇게 하여, G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체가 얻어진다.

숙주가 에쉐리키아속 균, 바실러스속 균인 형질전환체를 배양할 때, 배양에 사용되는 배지로는 액체 배지가 적당하고, 그 안에는 이 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 및 기타가 포함된다. 탄소원으로는 예를 들면 글루코오스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등, 질소원으로는 예를 들면 암모늄염류, 질산염류, 콘스티프·리큐르(리커), 펩톤, 카제인, 고기엑기스, 대두(콩)깻묵, 감자추출액 등의 무기 또는 유기물질, 무기물로는 예를 들면 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또, 효모, 비타민류, 생장촉진인자 등을 첨가할 수도 있다. 배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 이 적당하다.

에쉐리키아속 균을 배양할 때의 배지로는, 예를 들면 글루코오스, 카자미노산을 포함하는 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] 가 바람직하다. 여기서 필요에 의해 프로모터를 효율적으로 작동시키기 위해서는, 예를 들면 3 β-인돌릴 아크릴산과 같은 약제를 첨가할 수 있다. 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우, 배양은 통상 약 15 ∼ 43 ℃ 에서 약 3 ∼ 24 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가할 수도 있다.

숙주가 바실러스속 균인 경우, 배양은 통상 약 30 ∼ 40 ℃ 에서 약 6 ∼ 24 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가할 수도 있다.

숙주가 효모인 형질전환체를 배양할 때, 배지로는 예를 들면 버크홀더 (Burkholder) 최소배지 [Bostian, K. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 권, 4505 (1980)] 이나 0.5 % 카자미노산을 함유하는 SD 배지 [Bitter, G. A 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 권, 5330 (1984)] 를 들 수 있다. 배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 ℃ ∼ 35 ℃ 에서 약 24 ∼ 72 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다.

숙주가 곤충세포 또는 곤충인 형질전환체를 배양할 때, 배지로는 Grace's Insect Medium [Grace, T.C.C, Nature, 195, 788 (1962)] 에 비동화한 10 % 소혈청 등의 첨가물을 적절히 첨가한 것 등이 사용된다. 배지의 pH 는 약 6.2 ∼ 6.4 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 27 ℃ 에서 약 3 ∼ 5 일간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다.

숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때, 배지로는 예를 들면 약 5 ∼ 20 % 의 소태아 혈청을 포함하는 MEM 배지 [Science, 122 권, 501 (1952)], DMEM 배지[Virology, 8 권, 396 (1959)], RPMI 1640 배지 [The Journal of the American Medical Association, 199 권, 519 (1967)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 권, 1 (1950)] 등이 사용된다. pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30 ℃ ∼ 40 ℃ 에서 약 15 ∼ 60 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다.

이상과 같이, 형질전환체의 세포막에 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 생성시킬 수 있다.

상기 배양물에서 본 발명의 리셉터 단백질을 분리정제하는데에는, 예를 들면 하기 방법에 의해 수행할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질을 배양균체 또는 세포로부터 추출함에 있어서는, 배양 후 공지의 방법으로 균체 또는 세포를 모으고, 이를 적당한 완충액에 현탁하여 초음파, 라이소자임 및/또는 동결융해 등에 의해 균체 또는 세포를 파괴한 다음, 원심분리나 여과에 의해 리셉터 단백질의 조추출액을 얻는 방법 등이 적절히 사용된다. 완충액 중에 요소나 염산구아니딘 등의 단백질 변성제나, 트리톤 X-100^TM등의 계면활성제가 포함되어 있어도 된다. 배양액 중에 리셉터 단백질이 분비되는 경우에는 배양종료 후, 그자체 공지의 방법으로 균체 또는 세포와 상청을 분리하여 상청을 모은다.

이렇게 하여 얻은 배양상청, 또는 추출액 중에 포함되는 리셉터 단백질의 정제는 자체 공지의 분리·정제법을 적절하게 조합하여 실시할 수 있다. 이들 공지의 분리·정제법으로는, 염석(鹽析)이나 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 겔여과법 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등의 주로 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피 등의 하전의 차를 이용하는 방법, 친화성 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기영동법 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등이 사용된다.

이렇게 얻은 리셉터 단백질이 유리체로 얻어진 경우에는 자체 공지의 방법 또는 이에 준하는 방법에 의해 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻은 경우에는 자체 공지의 방법 또는 이에 준하는 방법에 의해 유리체 또는 기타 염으로 변환할 수 있다.

또, 재조합체가 생산하는 리셉터 단백질을, 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백수식효소를 작용시킴으로써 임의로 수식을 가하거나, 폴리펩티드를 부분적으로 제거할 수도 있다. 단백수식효소로서는 예를 들면 트립신, 키모트립신, 알기닐엔도펩티다아제, 프로테인키나아제, 글리코시다아제 등이 사용된다.

이렇게 생성된 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염의 활성은, 표지한 리간드와의 결합 실험 및 특이항체를 사용한 엔자임이뮤노 어세이 등에 의해 측정할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 항체는, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염을 인식할 수 있는 항체라면, 폴리크로날 항체, 모노크로날 항체 중 어느 것이라도 상관없다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염 (이하, 본 발명의 리셉터 단백질로 약기하는 경우도 있다) 에 대한 항체는, 본 발명의 리셉터 단백질을 항원으로 사용하여 자체 공지의 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조할 수 있다.

[모노크로날 항체의 제작]

(a) 모노크로날 항체 생산세포의 제작

본 발명의 리셉터 단백질은 포유동물에 대하여 투여에 의해 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여에 있어서 항체 생산능을 높이기 위해 완전 프로인트 아쥬반트나 불완전 프로인트 아쥬반트를 투여해도 된다. 투여는 통상 2 ∼ 6 주 마다 1 회씩, 합계 2 ∼ 10 회 정도 실시된다. 사용되는 포유동물로는 예를 들면, 원숭이, 토끼, 개, 모르모트, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 들 수 있고, 마우스 및 래트가 바람직하게 사용된다.

모노크로날 항체 생산세포의 제조에 있어서는, 항원을 면역된 온혈동물 예를 들면 마우스로부터 항체가가 인정된 개체를 선택하여 최종 면역의 2 ∼ 5 일 후에 비장(脾臟) 또는 임파절을 채취하고, 이들에 포함되는 항체 생산세포를 골수종세포와 융합시킴으로써 모노크로날 항체 생산 하이브리도머를 제조할 수 있다. 항혈청 중의 항체가의 측정은, 예를 들면 후기하는 표지화 리셉터 단백질과 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합된 표지제의 활성을 측정함으로써 수행할 수 있다. 융합 조작은 기지의 방법, 예를 들면 케이러와 밀스타인의 방법 [Nature, 256 권, p.495, (1975)] 에 따라 실시할 수 있다. 융합촉진제로는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이나 센다이 바이러스 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 PEG 가 사용된다.

골수종세포로는 예를 들면 NS-1, P3U1, SP2/0 등을 들 수 있고만, P3U1 이 바람직하게 사용된다. 사용되는 항체 생산세포 (비장세포) 수와 골수종세포수의 바람직한 비율은 1:1 ∼ 20:1 정도이고, PEG (바람직하게는 PEG 1000 ∼ PEG 6000) 가 10 ∼ 80 % 정도의 농도로 첨가되며, 약 20 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 약 30 ∼ 37 ℃ 에서 약 1 ∼ 10 분간 인큐베이트함으로써 효율적으로 세포융합을 실시할 수 있다.

모노크로날 항체 생산 하이브리도머의 스크리닝에는 각종 방법을 사용할 수 있지만, 예를 들면 본 발명의 리셉터 단백질의 항원을 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 고상 (예, 마이크로플레이트) 에 하이브리도머 배양상청을 첨가하고, 이어서 방사성 물질이나 효소 등으로 표지한 항면역 글로불린 항체 (세포융합에 사용되는 세포가 마우스인 경우, 항마우스 면역 글로불린 항체가 사용된다) 또는 프로테인 A 를 첨가하여 고상에 결합한 모노크로날 항체를 검출하는 방법, 항면역 글로불린 항체 또는 프로테인 A 를 흡착시킨 고상에 하이브리도머 배양상청을 첨가하고 방사성물질이나 효소 등으로 표지한 리셉터 단백질을 첨가하여 고상에 결합한 모노크로날 항체를 검출하는 방법 등을 들 수 있다.

모노크로날 항체의 선별은 자체 공지 또는 이에 준하는 방법에 따라 수행할 수 있지만, 통상은 HAT (히포크산틴, 아미노푸테린, 티미딘) 을 첨가한 동물세포용 배지 등에서 수행할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는, 하이브리도머가 생육할 수 있는 것이라면 어떠한 배지를 사용해도 된다. 예를 들면, 1 ∼ 20 %, 바람직하게는 10 ∼ 20 % 의 소태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지, 1 ∼ 10 % 의 소태아 혈청을 포함하는 GIT 배지 (와꼬쥰야꾸고우교 (주)) 또는 하이브리도머 배양용 무혈청 배지 (SFM-101, 닛쓰이세이야꾸 (주)) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는 통상 20 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다. 배양시간은 통상 5 일 ∼ 3 주간, 바람직하게는 1 주간 ∼ 2 주간이다. 배양은 통상 5 % 탄산가스 하에서 수행할 수 있다. 하이브리도머 배양상청의 항체가는 상기 항혈청 중의 항체가의 측정과 동일한 방법으로 측정할 수 있다.

(b) 모노크로날 항체의 정제

모노크로날 항체의 분리정제는, 통상의 폴리크로날 항체의 분리정제와 동일한 방법으로 면역 글로불린의 분리정제법 [예, 염석법, 알콜침전법, 등전점 침전법, 전기영동법, 이온교환체 (예, DEAE) 에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔여과법, 항원결합고상 또는 프로테인 A 혹은 프로테인 G 등의 활성흡착제에 의해 항체만을 채취하고 결합을 분리시켜 항체를 얻는 특이적 정제법] 에 따라 수행할 수 있다.

[폴리크로날 항체의 제조]

본 발명의 폴리크로날 항체는 그자체 공지 또는 그에 준하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역항원 (리셉터 단백질의 항원) 과 캐리어 단백질의 복합체를 만들고 상기 모노크로날 항체의 제조법과 동일한 방법으로 포유동물에 면역을 실시한 다음, 이 면역동물로부터 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 항체함유물을 채취하여 항체의 분리정제를 수행함으로써 제조할 수 있다.

포유동물을 면역하기 위해 사용되는 면역항원과 캐리어 단백질의 복합체에 관하여, 캐리어 단백질의 종류 및 캐리어와 햅텐의 혼합비는 캐리어에 가교시켜 면역한 햅텐에 대하여 항체가 효율적으로 만들어진다면 임의의 것을 임의의 비율로 가교시켜도 되고, 예를 들면 소혈청 알부민, 소 사일로글로불린, 키홀·린페트·헤모시아닌 등을 중량비로 햅텐 1 에 대하여 약 0.1 ∼ 20, 바람직하게는 약 1 ∼ 5 의 비율로 커플링시키는 방법이 사용된다.

또, 햅텐과 캐리어의 커플링에는 각종 축합제를 사용할 수 있지만, 글루탈알데히드나 카르보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르, 티올기, 디티오피리딜기를 함유하는 활성 에스테르 시약 등이 사용된다.

축합생성물은 온혈동물에 대하여 항체생산이 가능한 부위에 그자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여에 있어서 항체생산능을 높이기 위해, 완전 프로인트 아쥬반트나 불완전 프로인트 아쥬반트를 투여해도 된다. 투여는, 통상 약 2 ∼ 6 주마다 1 회씩, 합계 약 3 ∼ 10 회 정도 실시할 수 있다.

폴리크로날 항체는 상기 방법에 의해 면역된 포유동물의 혈액, 복수 등, 바람직하게는 혈액에서 채취할 수 있다.

항혈청 중의 폴리크로날 항체가의 측정은 상기 혈청 중의 항체가의 측정과 동일한 방법으로 측정할 수 있다. 폴리크로날 항체의 분리정제는, 상기 모노크로날 항체의 분리정제와 동일한 면역 글로불린의 분리정제법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염, 그 부분 펩티드 또는 그 염, 및 이 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 는, (1) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질에 대한 리간드 (작동제) 의 결정, (2) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제, (3) 유전자 진단제, (4) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법, (5) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 화합물을 함유하는 각종 질병의 예방 및/또는 치료제, (6) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질에 대한 리간드의 정량법, (7) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질과 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (작동제, 길항제 등) 의 스크리닝 방법, (8) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질과 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (작동제, 길항제) 을 함유하는 각종 질병의 예방 및/또는 치료제, (9) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염의 정량, (10) 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법, (11) 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물을 함유하는 각종 질병의 예방 및/또는 치료제, (12) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 항체에 의한 중화, (13) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 갖는 비인간 동물의 제작 등에 사용할 수 있다.

특히, 본 발명의 재조합형 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 발현계를 사용한 리셉터 결합 어세이계를 사용함으로써 인간이나 포유동물에 특이적인 G 단백질 공역형 리셉터에 대한 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (예, 작동제, 길항제등) 을 스크리닝할 수 있어, 이 작동제 또는 길항제를 각종 질병의 예방·치료제 등으로 사용할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 부분 펩티드 또는 그 염 (이하, 본 발명의 리셉터 단백질으로 약기하는 경우가 있다), 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 DNA 라고 약기하는 경우가 있다) 및 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 항체 (이하, 본 발명의 항체로 약기하는 경우가 있다) 의 용도에 대하여 이하에 구체적으로 설명한다.

(1) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질에 대한 리간드 (작동제) 의 결정

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염 또는 본 발명의 부분 펩티드 또는 그 염은, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드 (작동제) 를 탐색하고, 또는 결정하기 위한 시약으로 유용하다.

즉, 본 발명은, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염 또는 본 발명의 부분 펩티드 또는 그 염과, 시험화합물을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드의 결정 방법을 제공한다.

시험화합물로는, 공지의 리간드 (예를 들면 안기오텐신, 봄베신, 카나비노이드, 콜레시스토키닌, 글루타민, 세로토닌, 멜라토닌, 뉴로펩티드Y, 오피오이드, 푸린, 바소프레신, 옥시토신, PACAP, 세크레틴, 글루카곤, 칼시토닌, 아드레노메듀린, 소마토스타틴, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (바소액티브 인테스티널 및 관련 폴리펩티드), 소마토스타틴, 도파민, 모틸린, 아밀린, 브래디키닌, CGRP (칼시토닌 진(gene) 관련 펩티드), 류코트리엔, 판크레아스타틴, 프로스타글란딘, 트롬복산, 아데노신, 아드레날린, α및 β-케모카인 (chemokine) (예를 들면, IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 등), 엔도텔린, 엔테로가스트린, 히스타민, 뉴로텐신, TRH, 판크레아틱 폴리펩타이드 또는 갈라닌 등) 의 외에, 예를 들면 인간 또는 포유동물 (예를 들면 마우스, 래트, 돼지, 소, 양, 원숭이 등) 의 조직추출물, 세포배양상청 등이 사용된다. 예를 들면, 이 조직추출물, 세포배양상청 등을 본 발명의 리셉터 단백질에 첨가하고 세포자극활성 등을 측정하면서 분획하여, 최종적으로 단일 리간드를 얻을 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 리간드 결정 방법은, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염을 사용하거나 또는 재조합형 리셉터 단백질의 발현계를 구축하고 이 발현계를 사용한 리셉터 결합 어세이계를 사용함으로써, 본 발명의 리셉터 단백질에 결합하여 세포자극활성 (예를 들면, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성) 을 갖는 화합물 (예를 들면, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등) 또는 그 염을 결정하는 방법이다.

본 발명의 리간드 결정 방법에 있어서는, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그부분 펩티드와 시험 화합물을 접촉시킨 경우의, 예를 들면 이 리셉터 단백질 또는 이 부분 펩티드에 대한 시험화합물의 결합량이나 세포자극활성 등을 측정하는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로는, 본 발명은,

① 표지한 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염 또는 본 발명의 부분 펩티드 또는 그 염에 접촉시킨 경우의, 표지한 시험화합물의 이 단백질 또는 그 염, 또는 이 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 결합량을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정 방법,

② 표지한 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우의, 표지한 시험화합물의 이 세포 또는 이 막 분획에 대한 결합량을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정 방법,

③ 표지한 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막 상에 발현된 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우의, 표지한 시험화합물의 이 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 결합량을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드의 결정 방법,

④ 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우의, 리셉터 단백질을 통한 세포자극활성 (예를 들면 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정 방법, 및

⑤ 시험화합물을, 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현된 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우의, 리셉터 단백질을 통한 세포자극활성 (예를 들면 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정 방법을 제공한다.

특히, 상기 ① ∼ ③ 의 시험을 실시하여 시험화합물이 본 발명의 리셉터 단백질에 결합하는 것을 확인한 다음, 상기 ④ ∼ ⑤ 의 시험을 실시하는 것이 바람직하다.

우선, 리간드 결정 방법에 사용하는 리셉터 단백질로는, 상기한 본 발명의 리셉터 단백질 또는 본 발명의 부분 펩티드를 함유하는 것이라면 어느 것이라도 좋지만, 동물세포를 사용하여 대량 발현시킨 리셉터 단백질이 적합하다.

본 발명의 리셉터 단백질을 제조하는데에는 전술한 발현 방법이 사용되지만, 이 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 포유동물세포나 곤충세포에서 발현함으로써 수행하는 것이 바람직하다. 목적으로 하는 단백질 부분을 코딩하는 DNA 단편에는 통상 상보 DNA 가 사용되지만, 반드시 이에 제약되는 것은 아니다. 예를 들면 유전자 단편이나 합성 DNA 를 사용해도 된다. 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 숙주동물세포에 도입하고 이들을 효율적으로 발현시키기 위해서는, 이 DNA 단편을 곤충을 숙주로 하는 버큘로 바이러스에 속하는 핵다각체병 바이러스 (nuclear polyhedrosis virus; NPV) 의 폴리헤드린 프로모터, SV40 유래의 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메타로티오네인 프로모터, 인간 히트쇼크 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, SRα프로모터 등의 하류에 삽입하는 것이 바람직하다. 발현된 리셉터의 양과 질의 검사는 그자체 공지의 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면 문헌 [Nambi, P. 등, J.Biol.Chem, 267 권, p.19555 ∼ 19559, (1992)] 에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명의 리간드 결정 방법에 있어서, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염을 함유하는 것으로는, 그자체 공지의 방법에 따라 정제한 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염이어도 되고, 이 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 그 세포막 분획을 사용해도 된다.

본 발명의 리간드 결정 방법에 있어서, 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 사용하는 경우, 이 세포를 글루탈알데히드, 포르말린 등으로 고정화해도 된다. 고정화 방법은 그자체 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포로는 본 발명의 리셉터 단백질을 발현한 숙주세포를 말하며, 이 숙주세포로는, 대장균, 고초균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등이 사용된다.

세포막 분획은, 세포를 파쇄한 후 그자체 공지의 방법으로 얻은 세포막이 많이 포함되는 분획을 말한다. 세포의 파쇄방법으로는, Potter-Elvehjem 형 호모디나이저로 세포를 눌러 찌부러뜨리는 방법, 와링블렌더나 폴리트론 (Kinematica 사 제조) 에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 프렌치프레스 등으로 가압하면서 세포를 미세한 노즐로부터 분출시키는 것에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 세포막의 분획에는 분획 원심분리법이나 밀도구배 원심분리법 등의 원심력에 의한 분획법이 주로 사용된다. 예를 들면 세포파쇄액을 저속 (500 rpm ∼ 3000 rpm) 에서 단시간 (통상 약 1 분 ∼ 10 분) 원심하고, 상청을 더욱 고속 (15000 rpm ∼ 30000 rpm) 에서 통상 30 분 ∼ 2 시간 원심하고, 얻은 침전을 막 분획으로 한다. 이 막 분획 중에는, 발현된 리셉터 단백질과 세포 유래의 인지질이나 막단백질 등의 막 성분이 많이 포함된다.

이 리셉터 단백질을 함유하는 세포나 그 막 분획 중의 리셉터 단백질의 양은 1 세포당 10³∼ 10⁸분자인 것이 바람직하고, 10⁵∼ 10⁷분자인 것이 적절하다. 또, 발현량이 많을수록 막 분획 당의 리간드 결합활성 (비활성) 이 높아져, 고감도의 스크리닝계의 구축이 가능하게 될 뿐만 아니라 동일 로트에서 대량의 시료를 측정할 수 있게 된다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드를 결정하는 상기 ① ∼ ③ 의 방법을 실시하기 위해서는 적당한 리셉터 단백질 분획과 표지한 시험화합물이 필요하다.

리셉터 단백질 분획으로는, 천연형의 리셉터 단백질 분획이나 또는 이와 동등한 활성을 갖는 재조합형 리셉터 분획 등이 바람직하다. 여기서 동등한 활성이란, 동등한 리간드 결합활성, 시그널 정보전달 작용 등을 나타낸다.

표지한 시험화합물로는, [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] 등으로 표지한 안기오텐신, 봄베신, 카나비노이드, 콜레시스토키닌, 글루타민, 세로토닌, 멜라토닌, 뉴로펩티드Y, 오피오이드, 푸린, 바소프레신, 옥시토신, PACAP, 세크레틴, 글루카곤, 칼시토닌, 아드레노메듀린, 소마토스타틴, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (바소액티브 인테스티널 및 관련 폴리펩티드), 소마토스타틴, 도파민, 모틸린, 아밀린, 브래디키닌, CGRP (칼시토닌 진(gene) 관련 펩티드), 류코트리엔, 판크레아스타틴, 프로스타글란딘, 트롬복산, 아데노신, 아드레날린, α및 β-케모카인 (chemokine) (예를 들면, IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 등), 엔도텔린, 엔테로가스트린, 히스타민, 뉴로텐신, TRH, 판크레아틱 폴리펩타이드 또는 갈라닌 등이 바람직하다.

구체적으로는, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정 방법을 실시하는데에는, 우선 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획을 결정 방법에 적합한 버퍼에 현탁함으로써 리셉터 표품을 제조한다 버퍼에는, pH 4 ∼ 10 (바람직하게는 pH 6 ∼ 8) 의 인산 버퍼, 트리스염산 버퍼 등의 리간드와 리셉터 단백질의 결합을 저해하지 않는 버퍼라면 어느 것이라도 상관없다. 또, 비특이적 결합을 저감시킬 목적에서 CHAPS, Tween-80^TM(카오오-아트라스사), 디기토닌, 데옥시콜레이트 등의 계면활성제나 소혈청 알부민이나 젤라틴 등의 각종 단백질을 버퍼에 첨가할 수도 있다. 또, 프로테아제에 의한 리셉터나 리간드의 분해를 억제할 목적에서 PMSF, 로이펩틴, E-64 (펩티드 연구소 제조), 펩스타틴 등의 프로테아제 저해제를 첨가할 수도 있다. 0.01 ㎖ ∼ 10 ㎖ 의 이 리셉터 용액에 일정량 (5000 cpm ∼ 500000 cpm) 의 [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] 등으로 표지한 시험화합물을 공존시킨다. 비특이적 결합량 (NSB) 을 알기 위해 대량과잉의 미표지 시험화합물을 첨가한 반응 튜브도 준비한다. 반응은 약 0 ℃ 에서 50 ℃, 바람직하게는 약 4 ℃ 에서 37 ℃ 에서 약 20 분에서 24 시간, 바람직하게는 약 30 분에서 3 시간 실시한다. 반응 후 유리섬유 여과지 등으로 여과하고, 적량의 동 버퍼로 세정한 후, 유리섬유 여과지에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터 또는 γ-카운터로 계측한다. 전체 결합량 (B) 에서 비특이적 결합량 (NSB) 을 뺀 카운터 (B-NSB) 가 0 cpm 을 넘는 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드 (작동제) 로서 선택할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드를 결정하는 상기 ④ ∼ ⑤ 의 방법을 실시하기 위해서는, 이 리셉터 단백질을 통한 세포자극활성 (예를 들면 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 공지의 방법 또는 시판하는 측정용 키트를 사용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는, 우선 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 멀티웰 플레이트 등에 배양한다. 리간드 결정을 실시함에 있어서는 미리 신선한 배지 또는 세포에 독성을 나타내지 않는 적당한 버퍼로 교환하고, 시험화합물 등을 첨가하여 일정 시간 인큐베이트한 후, 세포를 추출 또는 상청액을 회수하여 생성된 산물을 각각의 방법에 따라 정량한다. 세포자극활성의 지표로 하는 물질 (예를 들면 아라키돈산 등) 의 생성이 세포가 함유하는 분해효소에 의해 검정이 곤란한 경우에는, 이 분해효소에 대한 저해제를 첨가하여 어세이를 수행해도 된다. 또, cAMP 생산 억제 등의 활성에 대해서는, 폴스콜린 등으로 세포의 기초적인 생산량을 증대시켜 둔 세포에 대한 생산억제작용으로서 검출할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 결합하는 리간드 결정용 키트는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염, 본 발명의 부분 펩티드 또는 그 염, 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포, 또는 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포의 막 분획 등을 함유하는 것이다.

본 발명의 리간드 결정용 키트의 예로는 다음의 것을 들 수 있다.

1. 리간드 결정용 시약

① 측정용 완충액 및 세정용 완충액

Hank's Balanced Salt Solution (기브코사 제조) 에 0.05 % 의 소혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 첨가한 것.

구멍직경 0.45 ㎛ 의 필터로 여과 멸균하고, 4 ℃ 에서 보존하거나 또는 사용시 제조해도 된다.

② G 단백질 공역형 리셉터 단백질 표품

본 발명의 리셉터 단백질을 발현시킨 CHO 세포를 12 웰 플레이트에 5 ×10⁵개/웰로 계대(繼代)하고, 37 ℃, 5 % CO₂, 95 % 공기 에서 2 일간 배양한 것.

③ 표지 시험화합물

시판하는 [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] 등으로 표지한 화합물, 또는 적당한 방법으로 표지화한 것.

수용액 상태의 것을 4 ℃ 또는 - 20 ℃ 로 보존하고, 사용시에 측정용 완충액으로 1 μM 으로 희석한다. 물에 난용성을 나타내는 시험화합물에 대해서는, 디메틸포름아미드, DMSO, 메탄올 등에 용해한다.

④ 비표지 시험화합물

표지화합물과 동일한 것을 100 ∼ 1000 배 진한 농도로 제조한다.

2. 측정법

① 12 웰 조직배양용 플레이트에서 배양한 본 발명의 리셉터 단백질 발현 CHO 세포를, 측정용 완충액 1 ㎖ 으로 2 회 세정한 후, 490 ㎕ 의 측정용 완충액을 각 웰에 첨가한다.

② 표지 시험화합물을 5 ㎕ 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨다. 비특이적 결합량을 알기 위해서는 비표지 시험화합물을 5 ㎕ 첨가해 둔다.

③ 반응액을 제거하고, 1 ㎖ 의 세정용 완충액으로 3 회 세정한다. 세포에 결합한 표지 시험화합물을 0.2 N NaOH - 1 % SDS 로 용해하고, 4 ㎖ 의 액체 신틸레이터 A (와꼬쥰야꾸 제조) 와 혼합한다.

④ 액체 신틸레이션 카운터 (베크만사 제조) 를 사용하여 방사활성을 측정한다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 결합할 수 있는 리간드로는, 예를 들면 뇌, 하수체, 췌장 등에 특이적으로 존재하는 물질 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 안기오텐신, 봄베신, 카나비노이드, 콜레시스토키닌, 글루타민, 세로토닌, 멜라토닌, 뉴로펩티드Y, 오피오이드, 푸린, 바소프레신, 옥시토신, PACAP, 세크레틴, 글루카곤, 칼시토닌, 아드레노메듀린, 소마토스타틴, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (바소액티브 인테스티널 및 관련 폴리펩티드), 소마토스타틴, 도파민, 모틸린, 아밀린, 브래디키닌, CGRP (칼시토닌 진(gene) 관련 펩티드), 류코트리엔, 판크레아스타틴, 프로스타글란딘, 트롬복산, 아데노신, 아드레날린, α및 β-케모카인 (chemokine) (예를 들면, IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 등), 엔도텔린, 엔테로가스트린, 히스타민, 뉴로텐신, TRH, 판크레아틱 폴리펩타이드 또는 갈라닌 등이 사용된다.

(2) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제

상기 (1) 의 방법에 있어서, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드가 명확해지면 이 리간드가 갖는 작용에 따라서 ① 본 발명의 리셉터 단백질 또는 ② 이 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를, 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제 등의 의약으로 사용할 수 있다.

예를 들면 생체 내에서 본 발명의 리셉터 단백질이 감소되어 있기 때문에 리간드의 생리작용을 기대할 수 없는 (이 리셉터 단백질의 결핍증) 환자가 있는 경우에 ① 본 발명의 리셉터 단백질을 이 환자에게 투여하고 이 리셉터 단백질의 양을 보충하거나, ② (가) 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 이 환자에게 투여하여 발현시키는 것에 의해, 또는 (나) 대상이 되는 세포에 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 삽입하고 발현시킨 후에 이 세포를 이 환자에게 이식하는 것 등에 의해 환자의 체내에서의 리셉터 단백질의 양을 증가시키고, 리간드의 작용을 충분히 발휘시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 는 안전하고 저독성인 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제로서 유용하다.

본 발명의 리셉터 단백질은, G 단백질 공역형 리셉터 단백질인 SLC-1 수용체 또는 소마토스타틴 수용체 타입3 또는 타입5 (SS5R 또는 SS3R) 에 아미노산 서열 레벨에서 약 60 % 의 상동성이 인정된다.

본 발명의 리셉터 단백질 및 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 는, 중추질환 (예를 들면 알츠하이머병·치매·섭식장애(거식증)·간질 등), 호르몬계의 질환 (예를 들면 미약진통, 이완출혈, 태반만출 전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체(젖이 나오지 않는 것) 등), 간/담/췌/내분비 질환 (예를 들면 당뇨병·섭식장애 등), 염증성 질환 (알레르기·천식·류마티즘 등), 순환기 질환 (예를 들면 고혈압증·심비대·협심증·동맥경화 등) 의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

본 발명의 리셉터 단백질을 상기 예방·치료제로서 사용하는 경우는 상투수단에 따라 제제화할 수 있다.

한편, 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 DNA 라고 약기하는 경우가 있다) 를 상기 예방·치료제로서 사용하는 경우는, 본 발명의 DNA 를 단독 또는 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 어소시에이디트 바이러스 벡터 등의 적당한 벡터에 삽입한 후, 상투 수단에 따라 투여할 수 있다. 본 발명의 DNA 는, 그대로 또는 섭취 촉진을 위한 보조제와 함께 유전자총이나 하이드로겔 카테터과 같은 카테터에 의해 투여할 수 있다.

예를 들면, ① 본 발명의 리셉터 단백질 또는 ② 이 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 는, 필요에 따라 당의를 입힌 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로, 또는 물이나 그밖의 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제 등의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 ① 본 발명의 리셉터 단백질 또는 ② 이 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 생리학적으로 인정되는 공지의 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이얻어지도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로는, 예를 들면 젤라틴, 콘스타치, 트라간드, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 콘스타치, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 제조단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등의 통상의 제제실시에 따라 처방할 수 있다. 주사용 수성액으로는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함하는 등장액 (예를 들면 D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알콜 (예, 에탄올), 폴리알콜 (예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예, 폴리솔베이트 80^TM, HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로는, 예를 들면 참기름, 대두유 등이 사용되고, 용해보조제인 안식향산 벤질, 벤질알콜 등과 병용해도 된다.

또, 상기 예방·치료제는, 예를 들면 완충제 (예를 들면 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예를 들면 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예를 들면 인간혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들면 벤질알콜, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.

이렇게 얻은 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예를 들면 인간이나 포유동물 (예를 들면, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질의 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우 일반적으로 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우, 1 회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

본 발명의 DNA 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우 일반적으로 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우, 1 회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(3) 유전자 진단제

본 발명의 DNA 는 프로브로서 사용함으로써 인간 또는 포유동물 (예를 들면, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA 의 이상 (유전자 이상) 을 검출할 수 있기 때문에, 예를 들면 이 DNA 또는 mRNA 의 손상, 돌연변이 또는 발현저하, 이 DNA 또는 mRNA 의 증가 또는 발현 과다 등의 유전자 진단제로서 유용하다.

본 발명의 DNA 를 사용하는 상기 유전자 진단은, 예를 들면 자체 공지의 노던 (northern) 하이브리다이제이션이나 PCR-SSCP 법 [Genomics, 제 5 권, p.874 ∼ 879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 제 86 권, p.2766 ∼ 2770 (1989)] 등에 의해 실시할 수 있다.

(4) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법.

본 발명의 DNA 는 프로브로서 사용함으로써 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 화합물의 스크리닝에 사용할 수 있다.

즉, 본 발명은, 예를 들면 (i) 비인간 포유동물의 ① 혈액, ② 특정 장기, ③ 장기로부터 단리한 조직 또는 세포, 또는 (ii) 형질전환체 등에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 mRNA 양을 측정하는 것에 의한, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 mRNA 양의 측정은 구체적으로는 다음과 같이 수행된다.

(i) 정상 또는 질환모델 비인간 포유동물 (예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등, 보다 구체적으로는 치매 래트, 비만 마우스, 동맥경화 토끼, 담암 마우스 등) 에 대하여, 약제 (예를 들면 항치매약. 혈압강하약, 항암제, 항비만약 등) 또는 물리적 스트레스 (예를 들면 침수 스트레스, 전기 쇼크, 명암, 저온 등) 등을 부여하고, 일정시간 경과한 후에 혈액 또는 특정 장기 (예를 들면 뇌, 간장, 신장 등) 또는 장기로부터 단리한 조직, 또는 세포를 얻는다.

얻은 세포에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 mRNA 는, 예를 들면 통상의 방법에 의해 세포 등에서 mRNA 를 추출하고, 예를 들면 TaqManPCR 등의 수법을 사용함으로써 정량할 수 있고, 자체 공지의 수단에 의해 노던 블로팅(northern blotting)을 실시함으로써 해석할 수도 있다.

(ii) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 발현하는 형질전환체를 전술한 방법에 따라 제조하여, 이 형질전환체에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 mRNA 를 동일한 방법으로 정량, 해석할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 화합물의 스크리닝은,

(i) 정상 또는 질환모델 비인간 포유동물에 대하여 약제 또는 물리적인 스트레스 등을 부여하는 일정시간전 (30 분전 내지 24 시간전, 바람직하게는 30 분전 내지 12 시간전, 보다 바람직하게는 1 시간전 내지 6 시간전) 또는 일정시간후 (30 분후 내지 3 일후, 바람직하게는 1 시간후 내지 2 일후, 보다 바람직하게는 1 시간후 내지 24 시간후), 또는 약제 또는 물리적 스트레스와 동시에 피검 화합물을 투여하고, 투여후 일정시간 경과후 (30 분후 내지 3 일후, 바람직하게는 1 시간후 내지 2 일후, 보다 바람직하게는 1 시간후 내지 24 시간후), 세포에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 mRNA 양을 정량, 해석함으로써 수행할 수 있고,

(ii) 형질전환체를 통상법에 따라 배양할 때에 피검화합물을 배지 중에 혼합시키고, 일정시간 배양후 (1 일후 내지 7 일후, 바람직하게는 1 일후 내지 3 일후, 보다 바람직하게는 2 일후 내지 3 일후), 이 형질전환체에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 mRNA 양을 정량하고 해석함으로써 실시할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 얻은 화합물 또는 그 염은, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 작용을 갖는 화합물로서, 구체적으로는 (가) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 증가시킴으로써 G 단백질 공역형 리셉터를 통한 세포자극활성 (예를 들면 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 증강시키는 화합물,

(나) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 감소시킴으로써 이 세포자극활성을 감약시키는 화합물이다.

이 화합물로는, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지의 화합물이어도 된다.

이 세포자극활성을 증강시키는 화합물은, 본 발명의 리셉터 단백질의 생리활성을 증강시키기 위한 안전하고 저독성의 의약 (예를 들면 중추질환 (예를 들면 알츠하이머병·치매·섭식장애(거식증)·간질 등), 호르몬계의 질환 (예를 들면 미약진통, 이완출혈, 태반만출 전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체 등), 간/담/췌/내분비 질환 (예를 들면 당뇨병·섭식장애 등), 염증성 질환 (알레르기·천식·류마티즘 등), 순환기 질환 (예를 들면 고혈압증·심비대·협심증·동맥경화 등) 의 예방 및/또는 치료제) 으로 유용하다.

이 세포자극활성을 감약시키는 화합물은 본 발명의 리셉터 단백질의 생리활성을 감소시키기 위한 안전하고 저독성의 의약으로 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 얻은 화합물 또는 그 염을 의약조성물로서 사용하는 경우, 상투수단에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면 상기한 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 의약과 동일한 방법으로, 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제, 무균성 용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.

이렇게 얻은 정제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예를 들면 인간이나 포유동물 (예를 들면, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그 염의 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우 일반적으로 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우, 1 회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(5) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 화합물을 함유하는 각종 질병의 예방 및/또는 치료제

본 발명의 리셉터 단백질은 전술한 바와 같이, 예를 들면 중추기능 등 생체내에서 어떠한 중요 역할을 담당하고 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 발현량을 변화시키는 화합물은, 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환 (예를 들면 중추질환 (예를 들면 알츠하이머병·치매·섭식장애(거식증)·간질 등), 호르몬계의 질환 (예를 들면 미약진통, 이완출혈, 태반만출 전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체등), 간/담/췌/내분비 질환 (예를 들면 당뇨병·섭식장애 등), 염증성 질환 (알레르기·천식·류마티즘 등), 순환기 질환 (예를 들면 고혈압증·심비대·협심증·동맥경화 등) 등) 의 예방 및/또는 치료제로 사용할 수 있다.

이 화합물을 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제로서 사용하는 경우, 상투수단에 의해 제제화할 수 있다.

예를 들면, 이 화합물은 필요에 따라 당의를 입힌 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제 등으로 하여 경구적으로, 또는 물이나 기타 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제 등의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 이 화합물을 생리학적으로 인정되는 공지의 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 정제실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 정제에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로는, 예를 들면 젤라틴, 콘스타치, 트라간드, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 콘스타치, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 제조단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등의 통상의 제제실시에 따라 처방할 수 있다.주사용 수성액으로는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함하는 등장액 (예를 들면 D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알콜 (예, 에탄올), 폴리알콜 (예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예, 폴리솔베이트 80^TM, HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로는, 예를 들면 참기름, 대두유 등이 사용되고, 용해보조제인 안식향산 벤질, 벤질알콜 등과 병용해도 된다.

또, 상기 예방·치료제는, 예를 들면 완충제 (예를 들면 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예를 들면 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예를 들면 인간혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들면 벤질알콜, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.

이렇게 얻은 정제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예를 들면 인간이나 포유동물 (예를 들면 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그 염의 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우 일반적으로 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우, 1 회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면주사제의 형태에서는 통상 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(6) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질에 대한 리간드의 정량법

본 발명의 리셉터 단백질은, 리간드에 대하여 결합성을 가지고 있기 때문에 생체 내에서의 리간드 농도를 고감도로 정량할 수 있다.

본 발명의 정량법은, 예를 들면 경합법과 조합함으로써 사용할 수 있다. 즉, 피검체를 본 발명의 리셉터 단백질과 접촉시킴으로써 피검체중의 리간드 농도를 측정할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 이하의 ① 또는 ② 등에 기재된 방법 또는 이에 준하는 방법에 따라 사용할 수 있다.

① 이리에히로시 편 「라디오이뮤노 어세이」(고단사, 1974 년 발행)

② 이리에히로시 편 「속 라디오이뮤노 어세이」(고단사, 1979 년 발행)

(7) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질과 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (작동제, 길항제 등) 의 스크리닝 방법

본 발명의 리셉터 단백질을 사용하거나, 또는 재조합형 리셉터 단백질의 발현계를 구축하고, 이 발현계를 사용한 리셉터 결합 어세이계를 사용함으로써 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 (예를 들면 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등) 또는 그 염을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

이러한 화합물에는, (가) G 단백질 공역형 리셉터를 통하여 세포자극활성 (예를 들면, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 갖는 화합물 (소위, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 작동제), (나) 이 세포자극활성을 갖지 않는 화합물 (소위, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 길항제), (다) 리간드와 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합력을 증강하는 화합물, 또는 (라) 리간드와 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합력을 감소시키는 화합물 등이 포함된다 (또, 상기 (가) 의 화합물은 상기한 리간드 결정 방법에 의해 스크리닝하는 것이 바람직하다).

즉, 본 발명은 (i) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염과 리간드를 접촉시킨 경우와, (ii) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염과, 리간드 및 시험화합물을 접촉시킨 경우를 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서는, (i) 과 (ii) 의 경우에 있어서의, 예를 들면 이 리셉터 단백질에 대한 리간드의 결합량, 세포자극활성 등을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로는, 본 발명은,

① 표지한 리간드를 본 발명의 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우와, 표지한 리간드 및 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 리간드의 이 리셉터 단백질에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

② 표지한 리간드를 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우와, 표지한 리간드 및 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 리간드의 이 세포 또는 이 막 분획에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

③ 표지한 리간드를 본 발명의 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양하는 것에 의해 세포막 상에 발현된 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우와, 표지한 리간드 및 시험화합물을 본 발명의 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막 상에 발현된 본 발명의 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우에서의, 표지한 리간드와 이 리셉터 단백질에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,

④ 본 발명의 리셉터 단백질을 활성화하는 화합물 (예를 들면 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드 등) 을 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우와, 본 발명의 리셉터 단백질을 활성화하는 화합물 및 시험화합물을 본발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우에서의, 리셉터를 통한 세포자극활성 (예를 들면, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법, 및

⑤ 본 발명의 리셉터 단백질을 활성화하는 화합물 (예를 들면 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드 등) 을 본 발명의 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막 상에 발현된 본 발명의 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우와, 본 발명의 리셉터 단백질을 활성화하는 화합물 및 시험화합물을 본 발명의 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막 상에 발현된 본 발명의 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우의, 리셉터를 통한 세포자극활성 (예를 들면, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 리셉터 단백질을 얻기 이전에는, G 단백질 공역형 리셉터 작동제 또는 길항제를 스크리닝하는 경우, 우선 래트 등의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 포함하는 세포, 조직 또는 그 세포막 분획을 사용하여 후보화합물을 얻고 (일차 스크리닝), 그 후에 이 후보화합물이 실제로 인간의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질과 리간드의 결합을 저해하는지 여부를 확인하는 시약 (이차 스크리닝) 이 필요했다. 세포, 조직 또는 세포막 분획을 그대로 사용하면 기타 리셉터 단백질도 혼재하기 때문에 목적으로 하는 리셉터 단백질에 대한 작동제 또는 길항제를 실제로 스크리닝하기가 어려웠다.

그러나, 예를 들면 본 발명의 인간 유래의 리셉터 단백질을 사용함으로써 일차 스크리닝의 필요가 없어지고, 리간드와 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합을 저해하는 화합물을 효율적으로 스크리닝할 수 있다. 또한, 스크리닝된 화합물이 작동제인지 길항제인지를 간편하게 평가할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 구체적으로 이하에서 설명한다.

우선, 본 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 본 발명의 리셉터 단백질로는, 상기한 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 것이라면 어떠한 것이라도 상관없지만, 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 포유동물의 장기의 세포막 분획이 바람직하다. 그러나, 특히 인간 유래의 장기는 입수가 매우 어렵기 때문에, 스크리닝에 사용되는 것으로는 재조합체를 사용하여 대량 발현시킨 래트 유래의 리셉터 단백질 등이 적합하다.

본 발명의 리셉터 단백질을 제조하는데에는 전술한 방법이 사용되지만, 본 발명의 DNA 를 포유세포나 곤충세포에서 발현함으로써 제조하는 것이 바람직하다. 목적으로 하는 단백질 부분을 코딩하는 DNA 단편에는 상보 DNA 가 사용되지만, 반드시 이것으로 제약되는 것은 아니다. 예를 들면 유전자 단편이나 합성 DNA 를 사용해도 된다. 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 숙주동물세포에 도입하고, 이들을 효율적으로 발현시키기 위해서는, 이 DNA 단편을 곤충을 숙주로 하는 버큘로 바이러스에 속하는 핵다각체병 바이러스 (nuclear polyhedrosis virus; NPV) 의 폴리헤드린 프로모터, SV40 유래의 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메타로티오네인 프로모터, 인간 히트쇼크 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, SRα프로모터 등의 하류에 삽입하는 것이 바람직하다. 발현된 리셉터의 양과 질의 검사는 그자체 공지의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면 문헌 [Nambi, P. 등, J.Biol.Chem, 267 권, p.19555 ∼ 19559, (1992)] 에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 것으로는, 그자체 공지의 방법에 따라 정제한 리셉터 단백질이어도 되고, 이 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 사용해도 되며, 또 이 리셉터 단백질을 함유하는 세포의 막 분획을 사용해도 된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 사용하는 경우, 이 세포를 글루탈알데히드, 포르말린 등으로 고정화해도 된다. 고정화 방법은 그자체 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포로는 이 리셉터 단백질을 발현한 숙주세포를 말하며, 이 숙주세포로는, 대장균, 고초균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등이 바람직하다.

세포막 분획은, 세포를 파쇄한 후 그자체 공지의 방법으로 얻은 세포막이 많이 포함되는 분획을 말한다. 세포의 파쇄방법으로는, Potter-Elvehjem 형 호모디나이저로 세포를 눌러 찌부러뜨리는 방법, 와링블렌더나 폴리트론 (Kinematica 사 제조) 에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 프렌치프레스 등으로 가압하면서 세포를 미세한 노즐로부터 분출시키는 것에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 세포막의 분획에는 분획 원심분리법이나 밀도구배 원심분리법 등의 원심력에 의한 분획법이 주로 사용된다. 예를 들면 세포파쇄액을 저속 (500 rpm ∼ 3000 rpm) 에서 단시간 (통상 약 1 분 ∼ 10 분) 원심하고, 상청을 더욱 고속 (15000 rpm ∼ 30000 rpm) 에서 통상 30 분 ∼ 2 시간 원심하여 얻은 침전을 막 분획으로 한다. 이 막 분획 중에는, 발현된 리셉터 단백질과 세포 유래의 인지질이나 막단백질 등의 막 성분이 많이 포함된다.

이 리셉터 단백질을 함유하는 세포나 막 분획 중의 리셉터 단백질의 양은 1 세포당 10³∼ 10⁸분자인 것이 바람직하고, 10⁵∼ 10⁷분자인 것이 적절하다. 또, 발현량이 많을수록 막 분획 당의 리간드 결합활성 (비활성) 이 높아져, 고감도의 스크리닝계의 구축이 가능하게 될 뿐만 아니라 동일 로트에서 대량의 시료를 측정할 수 있게 된다.

리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝하는 상기 ① ∼ ③ 을 실시하기 위해서는 예를 들면 적당한 리셉터 단백질 분획과 표지한 리간드가 필요하다.

리셉터 단백질 분획으로는, 천연형의 리셉터 단백질 분획이나 또는 이와 동등한 활성을 갖는 재조합형 리셉터 단백질 분획 등이 바람직하다. 여기서 동등한 활성이란, 동등한 리간드 결합활성, 시그널 정보전달 작용 등을 나타낸다.

표지한 리간드로는 표지한 리간드, 표지한 리간드 아날로그 화합물 등이 사용된다. 예를 들면, [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] 등으로 표지된 리간드 등이 사용된다.

구체적으로는, 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 실시하는데에는 우선 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획을 스크리닝에 적합한 버퍼에 현탁함으로써 리셉터 단백질 표품을 제조한다. 버퍼에는, pH 4 ∼ 10 (바람직하게는 pH 6 ∼ 8) 의 인산 버퍼, 트리스염산 버퍼 등의 리간드와 리셉터 단백질의 결합을 저해하지 않는 버퍼라면 어느 것이라도 된다. 또, 비특이적 결합을 저감시킬 목적에서 CHAPS, Tween-80^TM(카오오-아트라스사), 디기토닌, 데옥시콜레이트 등의 계면활성제를 버퍼에 첨가할 수도 있다. 또, 프로테아제에 의한 리셉터나 리간드의 분해를 억제할 목적에서 PMSF, 로이펩틴, E-64 (펩티드 연구소 제조), 펩스타틴 등의 프로테아제 저해제를 첨가할 수도 있다. 0.01 ㎖ ∼ 10 ㎖ 의 이 리셉터 용액에 일정량 (5000 cpm ∼ 500000 cpm) 의 표지한 리간드를 첨가하고, 동시에 10^-4M ∼ 10^-10M 의 시험화합물을 공존시킨다. 비특이적 결합량 (NSB) 를 알기 위해 대량 과잉의 미표지 리간드를 첨가한 반응 튜브도 준비한다. 반응은 약 0 ℃ 에서 50℃, 바람직하게는 약 4 ℃ 에서 37 ℃ 에서 약 20 분에서 24 시간, 바람직하게는 약 30 분에서 3 시간 실시한다. 반응 후, 유리섬유 여과지로 여과하고, 적당량의 동 버퍼로 세정한 후, 유리섬유 여과지에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터 또는 γ-카운터로 계측한다. 길항하는 물질이 없는 경우의 카운터 (B₀) 에서 비특이적 결합량 (NSB) 을 뺀 카운터 (B₀-NSB) 를 100 % 로 했을 때, 특이적 결합량 (B-NSB) 이 예를 들면 50 % 이하가 되는 시험화합물을 길항 저해 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다.

리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝하는 상기 ④ ∼ ⑤ 의 방법을 실시하기 위해서는, 예를 들면 리셉터 단백질을 통한 세포자극활성 (예를 들면 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 공지의 방법 또는 시판하는 측정용 키트를 사용하여 측정할 수 있다.

구체적으로는, 우선 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 멀티웰 플레이트 등에 배양한다. 스크리닝을 실시함에 있어서는 미리 신선한 배지 또는 세포에 독성을 나타내지 않는 적당한 버퍼로 교환하고, 시험화합물 등을 첨가하여 일정 시간 인큐베이트한 후, 세포를 추출 또는 상청액을 회수하여 생성된 산물을 각각의 방법에 따라 정량한다. 세포자극활성의 지표로 하는 물질 (예를 들면아라키돈산 등) 의 생성이 세포가 함유하는 분해효소에 의해 검정이 곤란한 경우에는, 이 분해효소에 대한 저해제를 첨가하여 어세이를 수행해도 된다. 또, cAMP 생산 억제 등의 활성에 대해서는 폴스콜린 등으로 세포의 기초적 생산량을 증대시켜 둔 세포에 대한 생산억제 작용으로 검출할 수 있다.

세포자극활성을 측정하여 스크리닝을 수행하는데에는 적당한 리셉터 단백질을 발현한 세포가 필요하다. 본 발명의 리셉터 단백질을 발현한 세포로는, 천연형의 본 발명의 리셉터 단백질을 갖는 세포주, 전술한 재조합형 리셉터 단백질을 발현한 세포주 등이 바람직하다.

시험화합물로는, 예를 들면 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직 추출액 등이 사용되고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지의 화합물이어도 된다.

리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트는 본 발명의 리셉터 단백질, 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포, 또는 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 세포의 막 분획을 함유하는 것 등이다.

본 발명의 스크리닝용 키트의 예로는 다음의 것을 들 수 있다.

1. 스크리닝용 시약

① 측정용 완충액 및 세정용 완충액

Hank's Balanced Salt Solution (기브코사 제조) 에 0.05 % 의 소혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 첨가한 것.

구멍직경 0.45 ㎛ 의 필터로 여과 멸균하고, 4 ℃ 에서 보존하거나 또는 사용시 제조해도 된다.

② G 단백질 공역형 리셉터 표품

본 발명의 리셉터 단백질을 발현시킨 CHO 세포를 12 웰 플레이트에 5 ×10⁵개/웰로 계대하고, 37 ℃, 5 % CO₂, 95 % 공기 에서 2 일간 배양한 것.

③ 표지 리간드

시판하는 [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] 등으로 표지한 리간드 수용액 상태의 것을 4 ℃ 또는 - 20 ℃ 에서 보존하고, 사용시에 측정용 완충액으로 1 μM 으로 희석한다.

④ 리간드 표준액

리간드를 0.1 % 소혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 포함하는 PBS 에서 1 mM 이 되도록 용해하고, -20 ℃ 에서 보존한다.

2. 측정법

① 12 웰 조직배양용 플레이트에서 배양한 본 발명의 리셉터 단백질 발현 CHO 세포를, 측정용 완충액 1 ㎖ 로 2 회 세정한 후, 490 ㎕ 의 측정용 완충액을 각 웰에 첨가한다.

② 10^-3∼ 10^-10M 의 시험화합물 용액을 5 ㎕ 첨가한 후, 표지 리간드를 5 ㎕ 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨다. 비특이적 결합량을 알기 위해서는시험화합물 대신에 10^-3M 의 리간드를 5 ㎕ 첨가해 둔다.

③ 반응액을 제거하고, 1 ㎖ 의 세정용 완충액으로 3 회 세정한다. 세포에 결합한 표지 리간드를 0.2 N NaOH - 1 % SDS 로 용해하고, 4 ㎖ 의 액체 신틸레이터 A (와꼬쥰야꾸 제조) 와 혼합한다.

④ 액체 신틸레이션 카운터 (베크만사 제조) 를 사용하여 방사활성을 측정하고, Percent Maximum Binding (PMB) 을 다음 식 [수학식 1] 으로 구한다.

PMB = [(B - NSB) / (B₀- NSB)] ×100

PMB : Percent Maximum Binding

B : 검체를 첨가했을 때의 값

NSB : 비특이적 결합량

B₀: 최대 결합량

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻은 화합물 또는 그 염은 리간드와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 작용을 갖는 화합물로서, 구체적으로는 (가) G 단백질 공역형 리셉터를 통하여 세포자극활성 (예를 들면, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등)을 갖는 화합물 (소위, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 작동제), (나) 이 세포자극활성을 갖지 않는 화합물 (소위, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 길항제), (다) 리간드와 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합력을 증강하는 화합물, 또는 (라) 리간드와 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합력을 감소시키는 화합물이다.

이 화합물로는, 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지의 화합물이어도 된다.

본 발명의 리셉터 단백질에 대한 작동제는 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드가 갖는 생리활성과 동일한 작용을 가지고 있기 때문에, 이 리간드 활성에 따라 안전하고 저독성의 의약으로 유용하다.

본 발명의 리셉터 단백질에 대한 길항제는 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드가 갖는 생리활성을 억제할 수 있기 때문에, 이 리간드 활성을 억제하는 안전하고 저독성의 의약으로 유용하다.

리간드와 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합력을 증강시키는 화합물은, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드가 갖는 생리활성을 증강하기 위한 안전하고 저독성의 의약 (예를 들면 중추질환 (예를 들면 알츠하이머병·치매·섭식장애(거식증)·간질 등), 호르몬계의 질환 (예를 들면 미약진통, 이완출혈, 태반만출 전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체 등), 간/담/췌/내분비 질환 (예를 들면 당뇨병·섭식장애 등), 염증성 질환 (알레르기·천식·류마티즘 등), 순환기 질환 (예를 들면 고혈압증·심비대·협심증·동맥경화 등) 의 예방 및/또는 치료제) 으로 유용하다.

리간드와 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질의 결합력을 감소시키는 화합물은, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드가 갖는 생리활성을 감소시키기 위한 안전하고 저독성의 의약으로 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻은 화합물 또는 그 염을 상술한 의약조성물로서 사용하는 경우, 상투수단에 따라 사용할 수 있다. 예를 들면 상기한 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 의약과 동일한 방법으로, 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제, 무균성 용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.

이렇게 얻은 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예를 들면 인간이나 포유동물 (예를 들면, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그 염의 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우 일반적으로 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우, 1 회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(8) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질과 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (작동제, 길항제) 을 함유하는 각종 질병의 예방 및/또는 치료제

본 발명의 리셉터 단백질은 전술한 바와 같이, 예를 들면 중추기능 등 생체내에서 어떠한 중요 역할을 담당하고 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 리셉터 단백질과 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (작동제, 길항제) 는 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다.

이 화합물을 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환 (예를 들면 중추질환 (예를 들면 알츠하이머병·치매·섭식장애(거식증)·간질 등), 호르몬계의 질환 (예를 들면 미약진통, 이완출혈, 태반만출 전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체 등), 간/담/췌/내분비 질환 (예를 들면 당뇨병·섭식장애 등), 염증성 질환 (알레르기·천식·류마티즘 등), 순환기 질환 (예를 들면 고혈압증·심비대·협심증·동맥경화 등) 등) 의 예방 및/또는 치료제로서 사용하는 경우는, 상투수단에 의해 제제화할 수 있다.

예를 들면, 이 화합물은 필요에 따라 당의를 입힌 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제 등으로 하여 경구적으로, 또는 물이나 기타 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제 등의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 이 화합물을 생리학적으로 인정되는 공지의 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 정제실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 정제에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로는, 예를 들면 젤라틴, 콘스타치, 트라간드, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 콘스타치, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 제조단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등의 통상의 제제실시에 따라 처방할 수 있다. 주사용 수성액으로는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함하는 등장액 (예를 들면 D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알콜 (예, 에탄올), 폴리알콜 (예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예, 폴리솔베이트 80^TM, HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로는, 예를 들면 참기름, 대두유 등이 사용되고, 용해보조제인 안식향산 벤질, 벤질알콜 등과 병용해도 된다.

또, 상기 예방·치료제는, 예를 들면 완충제 (예를 들면 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예를 들면 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예를 들면 인간혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들면 벤질알콜, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.

이렇게 얻은 정제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예를 들면 인간이나 포유동물 (예를 들면 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그 염의 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우 일반적으로 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우, 1 회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(9) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염의 정량

본 발명의 항체는 본 발명의 리셉터 단백질을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 중의 본 발명의 리셉터 단백질의 정량, 특히 샌드위치 면역측정법에 의한 정량 등에 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은, 예를 들면

(i) 본 발명의 항체와, 피검액 및 표지화 리셉터 단백질을 경합적으로 반응시키고, 이 항체에 결합한 표지화 리셉터 단백질의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 본 발명의 리셉터 단백질의 정량법,

(ii) 피검액과 담체 상에 불용화한 본 발명의 항체 및 표지화된 본 발명의 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 본 발명의 리셉터 단백질의 정량법을 제공한다.

상기 (ii) 에 있어서는 하나의 항체가 본 발명의 리셉터 단백질의 N 단부를 인식하는 항체이고, 다른 하나의 항체가 본 발명의 리셉터 단백질의 C 단부에 반응하는 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 리셉터 단백질에 대한 모노크로날 항체 (이하, 본 발명의 모노크로날 항체로 칭하는 경우가 있다) 를 사용하여 본 발명의 리셉터 단백질의 측정을 수행할 수 있는 것 외에, 조직염색 등에 의한 검출을 수행할 수도 있다. 이들 목적에는 항체 분자 그 자체를 사용할 수도 있고, 또 항체 분자의 F(ab')₂, Fab', 또는 Fab 분획을 사용해도 된다. 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 항체를 사용하는 측정법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 피측정액 중의 항원량 (예를 들면 리셉터 단백질량) 에 대응한 항체, 항원 또는 항체-항원복합체의 양을 화학적 또는 물리적 수단에 의해 검출하고, 이를 검지량의 항원을 포함하는 표준액을 사용하여 제작한 표준곡선으로부터 산출하는 측정법이라면 어떠한 측정법을 사용해도 된다. 예를 들면 네프로메트리, 경합법, 이뮤노메트릭법 및 샌드위치법이 바람직하게 사용되지만, 감도, 특이성의 면에서 후술하는 샌드위치법을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

표지물질을 사용하는 측정법에 사용되는 표지제로는, 예를 들면 방사성 동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질 등이 사용된다. 방사성 동위원소로는, 예를 들면 [¹²⁵I], [¹³¹I], [³H], [¹⁴C] 등이 사용된다. 상기 효소로는, 안정적이면서 비활성이 큰 것이 바람직하고, 예를 들면 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알카리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소효소 등이 사용된다. 형광물질로는, 예를 들면 플루오레스카민, 플루오레세인이소티오시아네이트 등이 사용된다. 발광물질로는, 예를 들면 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용된다. 또한, 항체 또는 항원과 표지제의 결합에 비오틴-아비딘계를 사용할 수도 있다.

항원 또는 항체의 불용화에 있어서는, 물리흡착을 사용해도 되고, 또 통상 단백질 또는 효소 등을 불용화, 고정화하는데에 사용되는 화학결합을 사용하는 방법이어도 된다. 담체로는 예를 들면 아갈로스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 불용화 다당류, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리콘 등의 합성수지, 또는 유리 등이 사용된다.

샌드위치법에서는 불용화한 본 발명의 모노크로날 항체에 피검액을 반응시키고 (1 차 반응), 또 표지한 본 발명의 모노크로날 항체를 반응시킨 (2 차 반응) 후, 불용화 담체 상의 표지제의 활성을 측정함으로써 피검액 중의 본 발명의 리셉터 단백질량을 정량할 수 있다. 1 차 반응과 2 차 반응은 반대의 순서로 실시해도 또는 동시에 실시해도 되며, 시간을 어긋나게 하여 실시해도 된다. 표지화제 및 불용화의 방법은 상기한 방법들에 준하여 실시할 수 있다.

또, 샌드위치법에 의한 면역측정법에 있어서, 고상용 항체 또는 표지용 항체에 사용되는 항체가 반드시 1 종류일 필요는 없고, 측정감도를 향상시킬 목적 등에서 2 종류 이상의 항체의 혼합물을 사용해도 된다.

본 발명의 샌드위치법에 의한 리셉터 단백질의 측정법에 있어서는, 1 차 반응과 2 차 반응에 사용되는 본 발명의 모노크로날 항체는 리셉터 단백질의 결합하는 부위가 상이한 항체가 바람직하게 사용된다. 즉, 1 차 반응 및 2 차 반응에 사용되는 항체는, 예를 들면 2 차 반응에서 사용되는 항체가 리셉터 단백질의 C 단부를 인식하는 경우, 1 차 반응에서 사용되는 항체는 바람직하게는 C 단부 이외, 예를 들면 N 단부를 인식하는 항체가 사용된다.

본 발명의 모노크로날 항체를 샌드위치법 이외의 측정 시스템, 예를 들면 경합법, 이뮤노메트릭법 또는 네프로메트리 등에 사용할 수 있다. 경합법에서는, 피검액 중의 항원과 표지항원을 항체에 대하여 경합적으로 반응시킨 후, 미반응의 표지항원 (F) 과 항체와 결합한 표지항원 (B) 을 분리하고 (B/F 분리), B, F 중 어느 하나의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다. 본 반응법에서는, 항체로서 가용성 항체를 사용하고, B/F 분리를 폴리에틸렌글리콜, 상기 항체에 대한 제 2 항체 등을 사용하는 액상법, 및 제 1 항체로서 고상화 항체를 사용하거나 또는 제 1 항체는 가용성의 것을 사용하고 제 2 항체로서 고상화 항체를 사용하는 고상화법이 사용된다.

이뮤노메트릭법에서는, 피검액 중의 항원과 고상화 항원을 일정량의 표지화 항체에 대하여 경합반응시킨 후 고상과 액상으로 분리하거나, 또는 피검액 중의 항원과 과잉량의 표지화 항체를 반응시키고, 다음으로 고상화 항원을 첨가하여 미반응의 표지화 항체를 고상에 경합시킨 후, 고상과 액상을 분리한다. 이어서, 이들 중 어느 하나의 상의 표지량을 측정하고 피검액 중의 항원량을 정량한다.

또, 네프로메트리에서는, 겔 내 또는 용액 중에서 항원항체 반응의 결과 발생한 불용성 침전물의 양을 측정한다. 피검액 중의 항원량이 극히 적고, 소량의 침전물밖에 얻을 수 없는 경우에도 레이저의 산란을 이용하는 레이저 네프로메트리 등이 바람직하게 사용된다.

이들 개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 측정방법에 적용함에 있어서는 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요치 않다. 각각의 방법에서의 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 가하여 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염의 측정계를 구축하면 된다. 이들의 상세한 일반적인 기술수단에 대해서는, 총설, 성서(成書) 등을 참조할 수 있다 [예를 들면 이리에히로시 편 「라디오이뮤노 어세이」(고단사, 1974 년 발행), 이리에히로시 편 「속 라디오이뮤노 어세이」(고단사, 1979 년 발행), 이시카와에이지 등 편 「효소면역 측정법」(이가꾸쇼인, 1978 년 발행), 이시카와에이지 등 편 「효소면역 측정법」(제 2 판) (이가꾸쇼인, 1982 년 발행), 이시카와에이지 등 편 「효소면역 측정법」(제 3 판) (이가꾸쇼인, 1987 년 발행), 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70 (ImmunochemicalTechniques (Part A)), 동서 Vol.73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 동서 Vol.74 (Immunochemical Techniques (Part C)), 동서 Vol.84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), 동서 Vol.92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 동서 Vol.121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (이상, 아카데믹프레스사 발행) 등 참조].

이상과 같이 본 발명의 항체를 사용함으로써 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염을 고감도로 정량할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체를 사용하여 생체내에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염을 정량함으로써 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 각종 질환 (예를 들면, 중추질환 (예를 들면 알츠하이머병·치매·섭식장애(거식증)·간질 등), 호르몬계의 질환 (예를 들면 미약진통, 이완출혈, 태반만출 전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체 등), 간/담/췌/내분비 질환 (예를 들면 당뇨병·섭식장애 등), 염증성 질환 (알레르기·천식·류마티즘 등), 순환기 질환 (예를 들면 고혈압증·심비대·협심증·동맥경화 등) 등) 을 진단할 수 있다.

또, 본 발명의 항체는, 액체나 조직 등의 피검체 중에 존재하는 본 발명의 리셉터 단백질을 특이적으로 검출하기 위해 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 리셉터 단백질을 정제하기 위해 사용하는 항체 칼럼의 제조, 정제시의 각 분획 중의 본 발명의 리셉터 단백질의 검출, 피검세포 내에서의 본 발명의 리셉터 단백질의 거동의 분석 등을 위해 사용할 수 있다.

(10) 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법

본 발명의 항체는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물의 스크리닝에 사용할 수 있다.

즉 본 발명은, 예를 들면

(i) 비인간 포유동물의 ① 혈액, ② 특정 장기, ③ 장기에서 단리한 조직 또는 세포 등을 파괴한 후, 세포막 분획을 단리하고, 세포막 분획에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 정량하는 것에 의한, 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법,

(ii) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 발현하는 형질전환체 등을 파괴한 후, 세포막 분획을 단리하고, 세포막 분획에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 정량하는 것에 의한, 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법,

(iii) 비인간 포유동물의 ① 혈액, ② 특정 장기, ③ 장기에서 단리한 조직 또는 세포 등을 절편으로 한 후 면역염색법을 사용함으로써, 세포표층에서의 이 수용체 단백질의 염색 정도를 정량화함으로써 세포막 상의 이 단백질을 확인하는 것에 의한, 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.

(iv) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 발현하는 형질전환체 등을 절편으로 한 후 면역염색법을 사용함으로써, 세포표층에서의 이 수용체 단백질의 염색 정도를 정량화함으로써 세포막상의 이 단백질을 확인하는 것에 의한, 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.

세포막 분획에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 정량은 구체적으로는 다음과 같이 수행한다.

(i) 정상 또는 질환모델 비인간 포유동물 (예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등, 보다 구체적으로는 치매 래트, 비만 마우스, 동맥경화 토끼, 담암 마우스 등) 에 대하여, 약제 (예를 들면 항치매약. 혈압강하약, 항암제, 항비만약 등) 또는 물리적 스트레스 (예를 들면 침수 스트레스, 전기 쇼크, 명암, 저온 등) 등을 부여하고, 일정시간 경과한 후에 혈액 또는 특정 장기 (예를 들면 뇌, 간장, 신장 등) 또는 장기로부터 단리한 조직, 또는 세포를 얻는다. 얻은 장기, 조직 또는 세포 등을 예를 들면 적당한 완충액 (예를 들면 트리스 염산 완충액, 인산 완충액, 헤페스 완충액 등) 등에 현탁한 후, 장기, 조직 또는 세포를 파괴하고 계면활성제 (예를 들면 트리톤 X100^TM, 트윈 20^TM등) 등을 사용하고, 다시 원심분리나 여과, 칼럼 분획 등의 수법을 사용하여 세포막 분획을 얻는다.

세포막 분획은, 세포를 파쇄한 후 그자체 공지의 방법으로 얻은 세포막이 많이 포함되는 분획을 말한다. 세포의 파쇄방법으로는, Potter-Elvehjem 형 호모디나이저로 세포를 눌러 찌부러뜨리는 방법, 와링블렌더나 폴리트론 (Kinematica 사 제조) 에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 프렌치프레스 등으로 가압하면서 세포를 미세한 노즐로부터 분출시키는 것에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 세포막의 분획에는 분획 원심분리법이나 밀도구배 원심분리법 등의 원심력에 의한 분획법이 주로 사용된다. 예를 들면 세포파쇄액을 저속 (500 rpm ∼ 3000 rpm) 에서 단시간 (통상 약 1 분 ∼ 10 분) 원심하고, 상청을 더욱 고속 (15000 rpm ∼ 30000 rpm) 에서 통상 30 분 ∼ 2 시간 원심하여 얻은 침전을 막 분획으로 한다. 이 막 분획 중에는, 발현된 리셉터 단백질과 세포 유래의 인지질이나 막단백질 등의 막 성분이 많이 포함된다.

세포막 분획에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드는, 예를 들면 본 발명의 항체를 사용한 샌드위치 면역측정법, 웨스턴 블로팅 (western blotting) 해석 등에 의해 정량할 수 있다.

이러한 샌드위치 면역측정법은 전술한 방법과 동일한 방법으로 실시할 수 있고, 웨스턴 블로팅은 자체 공지의 수단에 의해 실시할 수 있다.

(ii) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 발현하는 형질전환체를 전술한 방법에 따라 제작하고, 세포막 분획에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 정량할 수 있다.

세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물의 스크리닝은,

(i) 정상 또는 질환모델 비인간 포유동물에 대하여 약제 또는 물리적인 스트레스 등을 부여하기 일정시간전 (30 분전 내지 24 시간 전, 바람직하게는 30 분전 내지 12 시간전, 보다 바람직하게는 1 시간전 내지 6 시간전) 또는 일정시간후 (30 분후 내지 3 일후, 바람직하게는 1 시간후 내지 2 일후, 보다 바람직하게는 1 시간후 내지 24 시간후), 또는 약제 또는 물리적 스트레스와 동시에 피검 화합물을 투여하고, 투여후 일정시간 경과후 (30 분후 내지 3 일후, 바람직하게는 1 시간후 내지 2 일후, 보다 바람직하게는 1 시간후 내지 24 시간후), 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 정량함으로써 실시할 수 있고,

(ii) 형질전환체를 통상법에 따라 배양할 때에 피검화합물을 배지 중에 혼합시키고, 일정시간 배양후 (1 일후 내지 7 일후, 바람직하게는 1 일후 내지 3 일후, 보다 바람직하게는 2 일후 내지 3 일후), 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 정량함으로써 실시할 수 있다.

세포막 분획에 포함되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 확인은 구체적으로는 다음과 같은 방법으로 실시한다.

(iii) 정상 또는 질환모델 비인간 포유동물 (예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등, 보다 구체적으로는 치매 래트, 비만 마우스, 동맥경화 토끼, 담암 마우스 등) 에 대하여, 약제 (예를 들면 항치매약. 혈압강하약, 항암제, 항비만약 등) 또는 물리적 스트레스 (예를 들면 침수 스트레스, 전기 쇼크, 명암, 저온 등) 등을 부여하고, 일정시간 경과한 후에 혈액 또는 특정 장기 (예를 들면 뇌, 간장, 신장 등) 또는 장기로부터 단리한 조직, 또는 세포를얻는다. 얻은 장기, 조직 또는 세포 등을 통상법에 따라 조직절편으로 하고, 본 발명의 항체를 사용하여 면역염색을 수행한다. 세포표층에서의 이 수용체 단백질의 염색정도를 정량화함으로써, 세포막 상의 이 단백질을 확인하는 것에 의해 정량적 또는 정성적으로 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 확인할 수 있다.

(iv) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 발현하는 형질전환체 등을 사용하여 동일한 수단을 취함으로써 확인할 수도 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 얻은 화합물 또는 그 염은, 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 작용을 갖는 화합물로서, 구체적으로는 (가) 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 증가시킴으로써 G 단백질 공역형 리셉터를 통한 세포자극활성 (예를 들면 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 증강시키는 화합물, (나) 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 감소시킴으로써 이 세포자극활성을 감약시키는 화합물이다.

이 화합물로는, 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지의 화합물이어도 된다.

이 세포자극활성을 증강시키는 화합물은, 본 발명의 리셉터 단백질의 생리활성을 증강시키기 위한 안전하고 저독성의 의약 (예를 들면 중추질환 (예를 들면 알츠하이머병·치매·섭식장애(거식증)·간질 등), 호르몬계의 질환 (예를 들면 미약진통, 이완출혈, 태반만출 전후, 자궁복고부전, 제왕절개술, 인공임신중절, 유즙울체 등), 간/담/췌/내분비 질환 (예를 들면 당뇨병·섭식장애 등), 염증성 질환 (알레르기·천식·류마티즘 등), 순환기 질환 (예를 들면 고혈압증·심비대·협심증·동맥경화 등) 의 예방 및/또는 치료제) 으로 유용하다.

이 세포자극활성을 감약시키는 화합물은 본 발명의 리셉터 단백질의 생리활성을 감소시키기 위한 안전하고 저독성의 의약으로 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 얻은 화합물 또는 그 염을 의약조성물로서 사용하는 경우, 상투수단에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면 상기한 본 발명의 리셉터 단백질을 함유하는 의약과 동일한 방법으로, 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제, 무균성 용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.

이렇게 얻은 정제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예를 들면 인간이나 포유동물 (예를 들면, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그 염의 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우 일반적으로 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우, 1 회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(11) 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물을 함유하는 각종 질병의 예방 및/또는 치료제

본 발명의 리셉터 단백질은 전술한 바와 같이, 예를 들면 중추기능 등 생체내에서 어떠한 중요 역할을 담당하고 있는 것으로 생각된다. 따라서, 세포막에서의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 양을 변화시키는 화합물은, 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다.

이 화합물을 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제로서 사용하는 경우 상투수단에 의해 제제화할 수 있다.

예를 들면, 이 화합물은 필요에 따라 당의를 입힌 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제 등으로 하여 경구적으로, 또는 물이나 기타 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제 등의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 이 화합물을 생리학적으로 인정되는 공지의 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로는, 예를 들면 젤라틴, 콘스타치, 트라간드, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 콘스타치, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 제조단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등의 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다. 주사용 수성액으로는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함하는 등장액 (예를 들면 D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알콜 (예, 에탄올), 폴리알콜 (예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예, 폴리솔베이트 80^TM, HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로는, 예를 들면 참기름, 대두유 등이 사용되고, 용해보조제인 안식향산 벤질, 벤질알콜 등과 병용해도 된다.

또, 상기 예방·치료제는, 예를 들면 완충제 (예를 들면 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예를 들면 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예를 들면 인간혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들면 벤질알콜, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.

이렇게 얻은 정제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예를 들면 인간이나 포유동물 (예를 들면 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그 염의 투여량은, 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우 일반적으로 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우, 1 회 투여량은 투여대상, 대상장기, 증상, 투여방법 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 주사제의 형태에서는 통상 예를 들면 거식증 환자 (60 kg) 에 있어서는 1 일에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도 60 kg 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(12) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 항체에 의한 중화

본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 항체가 이들 리셉터 단백질 등에 대한 중화활성이란, 즉 이 리셉터 단백질이 관여하는 시그널 전달 기능을 불활성화하는 활성을 의미한다. 따라서, 이 항체가 중화활성을 갖는 경우는, 이 리셉터 단백질이 관여하는 시그널 전달, 예를 들면 이 리셉터 단백질을 통한 세포자극활성 (예를 들면, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 불활성화할 수 있다. 따라서, 이 리셉터 단백질의 과잉발현 등에서 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다.

(13) 본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 갖는 비인간 동물의 제작

본 발명의 DNA 를 사용하여 본 발명의 리셉터 단백질을 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물을 제작할 수 있다. 비인간 동물로는, 포유동물 (예를 들면, 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 등 (이하 동물로 약기함) 을 들 수 있으며, 특히 마우스, 토끼 등이 바람직하다.

본 발명의 DNA 를 대상동물에 전이시킴에 있어서 이 DNA 를 동물세포에서 발현시킬 수 있는 프로모터의 하류에 결합한 유전자 컨스트럭터(constructor)로서 사용하는 것이 일반적으로 유리하다. 예를 들면 토끼 유래의 본 발명의 DNA 를 전이시키는 경우, 이와 상동성이 높은 동물 유래의 본 발명의 DNA 를 동물 세포에서 발현시킬 수 있는 각종 프로모터의 하류에 결합한 유전자 컨스트럭트를, 예를 들면 토끼 수정란에 마이크로인젝션함으로써 본 발명의 리셉터 단백질을 고(高)생산하는 DNA 전이동물을 만들어낼 수 있다. 이 프로모터로서는, 예를 들면 바이러스 유래 프로모터, 메타로티오네인 등의 유비키어스한 발현 프로모터도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 뇌에서 특이적으로 발현하는 NGF 유전자 프로모터나 에노라아제 (enolase) 유전자 프로모터 등이 사용된다.

수정란세포 단계에서의 본 발명의 DNA 의 전이는, 대상동물의 배아세포 및 체세포 모두에 존재하도록 확보된다. DNA 전이 후의 작출 동물의 배아세포에 있어서 본 발명의 리셉터 단백질이 존재하는 것은, 작출동물의 자손이 모두 그 배아세포 및 체세포 모두에 본 발명의 리셉터 단백질을 갖는 것을 의미한다. 유전자를 이어받은 이 종의 동물의 자손은 그 배아세포 및 체세포 모두에 본 발명의 리셉터 단백질을 갖는다.

본 발명의 DNA 전이동물은, 교배에 의해 유전자를 안정적으로 유지하는 것을 확인하고, 이 DNA 보유동물로서 통상의 사육환경에서 사육계대를 실시할 수 있다. 또한, 목적 DNA 를 보유하는 암수 동물을 교배함으로써 도입 유전자를 상동 염색체의 양쪽에 갖는 호모자이고트 동물을 채취하고, 이 암수 동물을 교배함으로써 모든 자손이 이 DNA 를 갖도록 번식 계대할 수 있다.

본 발명의 DNA 가 전이된 동물은, 본 발명의 리셉터 단백질이 고발현되어져 있기 때문에, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 작동제 또는 길항제의 스크리닝용 동물 등으로 유용하다.

본 발명의 DNA 전이동물을, 조직 배양을 위한 세포원으로 사용할 수도 있다. 예를 들면 본 발명의 DNA 전이 마우스의 조직 중의 DNA 또는 RNA 를 직접 분석하거나, 또는 유전자에 의해 발현된 본 발명의 리셉터 단백질이 존재하는 조직을 분석함으로써 본 발명의 리셉터 단백질에 대하여 분석할 수 있다. 본 발명의 리셉터 단백질을 갖는 조직의 세포를 표준세포 배양기술에 의해 배양하고, 이들을 사용하여 예를 들면 뇌나 말초조직 유래와 같은 일반적으로 배양이 어려운 조직으로부터의 세포의 기능을 연구할 수 있다. 또, 그 세포를 사용함으로써 예를 들면 각종 조직의 기능을 높일 수 있는 의약의 선택도 가능하다. 또, 고발현 세포주가 있으면 거기서부터 본 발명의 리셉터 단백질을 단리 정제하는 것도 가능하다.

본 명세서 및 도면에 있어서 염기나 아미노산 등을 약호로 표기하는 경우, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature 에 의한 약호 또는 당해 분야에서의 관용 약호에 기초하는 것으로, 그 예를 하기한다. 또 아미노산에 관하여 광학이성체가 있을 수 있는 경우는 특별히 명시하지 않으면 L 체를 나타내는 것으로 한다.

DNA : 데옥시리보 핵산

cDNA : 상보적 데옥시리보 핵산

A : 아데닌

T : 티민

G : 구아닌

C : 시토신

RNA : 리보핵산

mRNA : 메신저 리보핵산

dATP : 데옥시아데노신 삼인산

dTTP : 데옥시티미딘 삼인산

dGTP : 데옥시구아노신 삼인산

dCTP : 데옥시시티딘 삼인산

ATP : 아데노신 삼인산

EDTA : 에틸렌디아민 사아세트산

SDS : 도데실 황산나트륨

Gly : 글리신

Ala : 알라닌

Val : 발린

Leu : 루이신

Ile : 이소루이신

Ser : 세린

Thr : 트레오닌

Cys : 시스테인

Met : 메티오닌

Glu : 글루타민산

Asp : 아스파라긴산

Lys : 리신

Arg : 알기닌

His : 히스티딘

Phe : 페닐알라닌

Tyr : 티로신

Trp : 트립토판

Pro : 프롤린

Asn : 아스파라긴

Gln : 글루타민

pGlu : 피로글루타민산

Me : 메틸기

Et : 에틸기

Bu : 부틸기

Ph : 페닐기

TC : 티아졸리딘-4(R)-카르복사미드기

또, 본 명세서 중에서 자주 사용되는 치환기, 보호기 및 시약을 하기의 기호로 표기한다.

Tos : p-톨루엔술포닐

CHO : 포르밀

Bzl : 벤질

Cl₂Bzl : 2,6-시클로벤질

Bom : 벤질옥시메틸

Z : 벤질옥시카르보닐

Cl-Z : 2-클로로벤질옥시카르보닐

Br-Z : 2-브로모벤질옥시카르보닐

Boc : t-부톡시카르보닐

DNP : 디니트로페놀

Trt : 트리틸

Bum : t-부톡시메틸

Fmoc : N-9-플루오레닐메톡시카르보닐

HOBt : 1-히드록시벤즈트리아졸

HOOBt : 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아딘

HONB : 1-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드

DCC : N,N-디시클로헥실카르보디이미드

본 명세서의 서열표의 서열번호는 이하의 서열을 나타낸다.

[서열번호: 1]

본 발명의 인간해마 유래 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 hSLT 의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 2]

서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 인간해마 유래 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 hSLT 를 코딩하는 cDNA 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호: 3]

본 발명의 인간해마 유래 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 hSLT 를 코딩하는 cDNA 를 클로닝하기 위해 사용한 프라이머-1 의 염기 서열을 나타낸다.

[서열번호: 4]

본 발명의 인간해마 유래 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질 hSLT 를 코딩하는 cDNA 를 클로닝하기 위해 사용한 프라이머-2 의 염기 서열을 나타낸다.

후술하는 실시예 1 에서 얻은 Escherichia coli DH5 α/pCR 3.1-hSLT 는 1999년 4월 28일로부터 일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1-1-3, 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6710 으로, 1999년 4월 20일로부터 일본국 오오사까후 오오사까시 요도가와꾸 쥬우소 혼마찌 2-17-85, 재단법인·발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16284 로 기탁되어 있다.

(실시예)

이하에 참고예 및 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또, 대장균을 사용한 유전자 조작법은 모레큘러·클로닝 (Molecular Cloning) 에 기재되어 있는 방법에 따랐다.

실시예 1

인간해마의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 코딩하는 cDNA 의 클로닝과 염기 서열의 결정

인간해마 cDNA (CLONTECH 사) 를 주형으로 하고, 2 개의 프라이머, 프라이머-1 (서열번호 : 3) 및 프라이머-2 (서열번호 : 4) 를 사용하여 PCR 반응을 실시했다. 이 반응에서의 반응액의 조성은 상기 cDNA 의 10 분의 1 양을 주형으로 사용하고, Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH 사) 1/50 량, 프라이머-1 (서열번호 : 3) 및 프라이머-2 (서열번호 : 4) 를 각 0.2 μM, dNTPs 200 μM, 및 효소에 첨부한 버퍼를 첨가하여, 25 ㎕ 의 액량으로 했다. PCR 반응은 ① 94 ℃·1 분 후, ② 94 ℃·20 초, 72 ℃·2 분의 사이클을 3 회, ③ 94 ℃·20 초, 65 ℃·20 초, 68 ℃·2 분의 사이클을 3 회, ④ 94 ℃·20 초, 58 ℃·20 초, 68 ℃·2 분의 사이클을 36 회 반복하고, ⑤ 마지막으로 68 ℃·7 분의 신장반응을 실시했다. 이 PCR 반응 후의 반응산물을 TA 클로닝 키트 (Invitrogen 사) 의 처방에 따라 플라스미드 벡터 pCR 3.1 (Invitrogen 사) 로 서브클로닝했다. 이를 대장균 DH 5α에 도입하고, cDNA 를 갖는 클론을 암피실린을 포함하는 LB 한천배지중에서 선택한 후, 개개의 클론 서열을 해석한 결과 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 (서열번호: 2) 을 얻었다. 이 cDNA 로부터 도출되는 아미노산 서열 (서열번호: 1 을 함유하는 신규 G 단백질 공역형 리셉터 단백질을 hSLT 로 명명하고, 이 형질전환체를 대장균 (Escherichia coli) DH 5/pCR 3.1-hSLT 라고 명명했다.

실시예 2

hSLT 발현 CHO 세포의 제작

실시예 1 에서 서열이 확인된 인간해마 유래 hSLT 의 전장 아미노산 서열을 코딩한 유전자를 도입한 플라스미드 pCR 3.1-hSLT 를 사용하여 형질전환한 E. coli DH5α(토요보) 를 배양하고, Plasmid Midi Kit (키아겐사) 를 사용하여 pCR 3.1-hSLT 의 플라스미드 DNA 를 제조했다. 이것을 CellPhect Transfection Kit (아마샴팔마시아바이오테크사) 를 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라 CHO-K1 세포에 도입했다. 10 ㎎ 의 플라스미드 DNA 를 인산칼슘과의 공침현탁액으로 하고, 24 시간전에 5 ×10⁵또는 1 × 10⁶개의 CHO-K1 세포를 파종한 10 cm 샤알레에 첨가했다. 10 % 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 1 일간 배양한 후 계대하여, 선택배지인 10 % 소태아 혈청 및 1 ㎎/㎖ G418 을 포함하는 DMEM 배지에서 배양했다. 선택배지 중에서 증식해가는 hSLT 발현 CHO 세포의 콜로니 40 클론을 선택했다. 또, 선택한 hSLT 발현 CHO 세포로부터 통상법에 따라 전 RNA 를 추출한 후, TaqMan 법에 의해 hSLT 의 mRNA 량을 측정·카피 수를 산출했다. 그 결과, 발현량이 높은 주로서 3 클론 (#5, #7 및 #28) 을 선택했다.

본 발명의 G 단백질 공역형 리셉터 단백질, 그 부분 펩티드 또는 이들의 염, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, DNA, RNA 및 이들의 유도체) 는 ① 리간드 (작동제) 의 결정, ② 항체 및 항혈청의 입수, ③ 재조합형 리셉터 단백질의 발현계의 구축, ④ 동 발현계를 사용한 리셉터 결합 어세이계의 개발과 의약품 후보화합물의 스크리닝, ⑤ 구조적으로 유사한 리간드·리셉터와의 비교에 기초한 드럭 디자인의 실시, ⑥ 유전자 진단에서의 프로브나 PCR 프라이머의 작성을 위한 시약, ⑦ 트랜스제닉 동물의 제작 또는 ⑧ 유전자 예방·치료제 등의 의약 등으로 사용할 수 있다.

Claims (27)

1. 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그 염.
2. 제 1 항에 기재된 단백질의 부분 펩티드 또는 그 염.
3. 제 1 항에 기재된 단백질을 코딩하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드.
4. 제 3 항에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.
5. 제 3 항에 있어서, 서열번호: 2 로 표시되는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
6. 제 3 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.
7. 제 6 항에 기재된 재조합 벡터로 형질전환시킨 형질전환체.
8. 제 7 항에 기재된 형질전환체를 배양하고, 제 1 항에 기재된 단백질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그 염의 제조법.
9. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염에 대한 항체.
10. 제 9 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 단백질의 시그널 전달을 불활성화하는 중화항체인 항체.
11. 제 9 항에 기재된 항체를 함유하여 이루어지는 진단약.
12. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을 사용함으로써 얻을 수 있는 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 리간드.
13. 제 12 항에 기재된 리간드를 함유하여 이루어지는 의약.
14. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정 방법.
15. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을사용하는 것을 특징으로 하는 리간드와 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법.
16. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 2 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 리간드와 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트.
17. 제 15 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 16 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는, 리간드와 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염.
18. 제 15 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 16 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는, 리간드와 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유하여 이루어지는 의약.
19. 제 3 항에 기재된 폴리뉴클레오티드와 매우 엄격한 조건하에서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드.
20. 제 3 항에 기재된 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열 및 그 일부를 함유하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
21. 제 3 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부를 사용하는 것을 특징으로 하는 단백질의 mRNA 의 정량 방법.
22. 제 9 항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 단백질의 정량 방법.
23. 제 21 항 또는 제 22 항에 기재된 정량 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 단백질의 기능이 관련된 질환의 진단 방법.
24. 제 21 항에 기재된 정량 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항에 기재된 단백질의 발현량을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법.
25. 제 22 항에 기재된 정량 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포막에서의 제 1 항에 기재된 단백질량을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법.
26. 제 24 항에 기재된 스크리닝 방법을 사용하여 얻을 수 있는, 제 1 항에 기재된 단백질의 발현량을 변화시키는 화합물 또는 그 염.
27. 제 25 항에 기재된 스크리닝 방법을 사용하여 얻을 수 있는, 세포막에서의제 1 항에 기재된 단백질량을 변화시키는 화합물 또는 그 염.