JP2002345491A - 新規gタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのdna - Google Patents
新規gタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのdnaInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アゴニスト/アンタゴニストのスクリーニン
グ等に有用な新規タンパク質の提供。 【解決手段】 新規タンパク質またはその塩、該タンパ
ク質をコードするDNA、該タンパク質に対するリガン
ドの決定方法、リガンドと該タンパク質との結合性を変
化させる化合物のスクリーニング方法/スクリーニング
用キット、該スクリーニングで得られる化合物またはそ
の塩など。 【効果】 本発明のタンパク質またはそれをコードする
DNAは、(1)本発明のタンパク質に対するリガンド
の決定、(2)本発明のタンパク質の機能不全に関連す
る疾患の予防および/または治療剤、(3)本発明のタ
ンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物(ア
ゴニスト、アンタゴニストなど)のスクリーニングなど
に用いることができる。
グ等に有用な新規タンパク質の提供。 【解決手段】 新規タンパク質またはその塩、該タンパ
ク質をコードするDNA、該タンパク質に対するリガン
ドの決定方法、リガンドと該タンパク質との結合性を変
化させる化合物のスクリーニング方法/スクリーニング
用キット、該スクリーニングで得られる化合物またはそ
の塩など。 【効果】 本発明のタンパク質またはそれをコードする
DNAは、(1)本発明のタンパク質に対するリガンド
の決定、(2)本発明のタンパク質の機能不全に関連す
る疾患の予防および/または治療剤、(3)本発明のタ
ンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物(ア
ゴニスト、アンタゴニストなど)のスクリーニングなど
に用いることができる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト肺由来の新規
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩
およびそれをコードするDNAなどに関する。
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩
およびそれをコードするDNAなどに関する。
【0002】
【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質などの生
理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータ
ンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらの
レセプタータンパク質のうち多くは共役しているguanin
e nucleotide-binding protein(以下、Gタンパク質と
略称する場合がある)の活性化を通じて細胞内のシグナ
ル伝達を行ない、また、7個の膜貫通領域を有する共通
した構造をもっていることから、Gタンパク質共役型レ
セプタータンパク質あるいは7回膜貫通型レセプタータ
ンパク質(7TMR)と総称される。Gタンパク質共役
型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細
胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分
子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物
質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レ
セプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細
胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制と
いった種々の反応が惹起される。各種生体の細胞や臓器
の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプ
タータンパク質、特にはGタンパク質共役型レセプター
タンパク質との関係を明らかにすることは、各種生体の
細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連し
た医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとな
る。
理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータ
ンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらの
レセプタータンパク質のうち多くは共役しているguanin
e nucleotide-binding protein(以下、Gタンパク質と
略称する場合がある)の活性化を通じて細胞内のシグナ
ル伝達を行ない、また、7個の膜貫通領域を有する共通
した構造をもっていることから、Gタンパク質共役型レ
セプタータンパク質あるいは7回膜貫通型レセプタータ
ンパク質(7TMR)と総称される。Gタンパク質共役
型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細
胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分
子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物
質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レ
セプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細
胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制と
いった種々の反応が惹起される。各種生体の細胞や臓器
の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプ
タータンパク質、特にはGタンパク質共役型レセプター
タンパク質との関係を明らかにすることは、各種生体の
細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連し
た医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとな
る。
【0003】例えば、生体の種々の器官では、多くのホ
ルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活
性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行われ
ている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存
在し、それぞれに対応するレセプタータンパク質を通し
てその生理機能の調節を行っている。生体内には未知の
ホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、
それらのレセプタータンパク質の構造に関しても、これ
まで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセ
プタータンパク質においてもサブタイプが存在するかど
うかについても分かっていないものが多い。生体におけ
る複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター
タンパク質との関係を明らかにすることは、医薬品開発
に非常に重要な手段である。また、レセプタータンパク
質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスク
リーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発
現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を解明
し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であ
った。近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手
段として、cDNAの配列をランダムに解析する研究が
活発に行われており、このようにして得られたcDNA
の断片配列がExpressed Sequence Tag(EST)として
データベースに登録され、公開されている。しかし、多
くのESTは配列情報のみであり、その機能を推定する
ことは困難である。
ルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活
性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行われ
ている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存
在し、それぞれに対応するレセプタータンパク質を通し
てその生理機能の調節を行っている。生体内には未知の
ホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、
それらのレセプタータンパク質の構造に関しても、これ
まで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセ
プタータンパク質においてもサブタイプが存在するかど
うかについても分かっていないものが多い。生体におけ
る複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター
タンパク質との関係を明らかにすることは、医薬品開発
に非常に重要な手段である。また、レセプタータンパク
質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスク
リーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発
現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を解明
し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であ
った。近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手
段として、cDNAの配列をランダムに解析する研究が
活発に行われており、このようにして得られたcDNA
の断片配列がExpressed Sequence Tag(EST)として
データベースに登録され、公開されている。しかし、多
くのESTは配列情報のみであり、その機能を推定する
ことは困難である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】従来、Gタンパク質共
役型レセプターと生理活性物質(すなわち、リガンド)
との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質(す
なわち、リガンド)と同様なシグナル伝達を引き起こす
物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストま
たはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品とし
て活用されてきた。従って、このように生体内での生理
発現において重要であるばかりでなく、医薬品開発の標
的ともなりうるGタンパク質共役型レセプタータンパク
質を新規に見出し、その遺伝子(例えばcDNA)をク
ローニングすることは、新規Gタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の特異的リガンドや、アゴニスト、アン
タゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。し
かし、Gタンパク質共役型レセプターはその全てが見出
されているわけではなく、現時点でもなお、未知のGタ
ンパク質共役型レセプター、また対応するリガンドが同
定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数
存在しており、新たなGタンパク質共役型レセプターの
探索および機能解明が切望されている。Gタンパク質共
役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とす
る、新たな生理活性物質(すなわち、リガンド)の探
索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアン
タゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガン
ドが見出されなくても、該レセプターの不活化実験(ノ
ックアウト動物)から該レセプターの生理作用を解析す
ることにより、該レセプターに対するアゴニストまたは
アンタゴニストを作製することも可能である。これら該
レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストなどは、Gタンパク質共役型レセプターの機能
不全に関連する疾患の予防/治療薬や診断薬として活用
することが期待できる。さらにまた、Gタンパク質共役
型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプ
ターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因と
なっている場合も多い。この場合には、該レセプターに
対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、
該レセプター遺伝子の生体内(またはある特定の臓器)
への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス
核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもでき
る。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の
欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であ
り、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全
に関与する疾患の予防/治療薬や診断薬に応用すること
もできる。本発明は、上記のように有用な新規Gタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質を提供するものであ
る。すなわち、新規Gタンパク質共役型レセプタータン
パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、該Gタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドをコードするポリヌクレオチド(DNA、RNA
およびそれらの誘導体)を含有するポリヌクレオチド
(DNA、RNAおよびそれらの誘導体)、該ポリヌク
レオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクター
を保持する形質転換体、該Gタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質またはその塩の製造法、該Gタンパク質共
役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドま
たはその塩に対する抗体、該Gタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の発現量を変化させる化合物、該Gタン
パク質共役型レセプターに対するリガンドの決定方法、
リガンドと該Gタンパク質共役型レセプタータンパク質
との結合性を変化させる化合物(アンタゴニスト、アゴ
ニスト)またはその塩のスクリーニング方法、該スクリ
ーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスク
リーニングキットを用いて得られうるリガンドと該Gタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質との結合性を変化
させる化合物(アンタゴニスト、アゴニスト)またはそ
の塩、およびリガンドと該Gタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質との結合性を変化させる化合物(アンタゴ
ニスト、アゴニスト)もしくは該Gタンパク質共役型レ
セプタータンパク質の発現量を変化させる化合物または
その塩を含有してなる医薬などを提供する。
役型レセプターと生理活性物質(すなわち、リガンド)
との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質(す
なわち、リガンド)と同様なシグナル伝達を引き起こす
物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストま
たはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品とし
て活用されてきた。従って、このように生体内での生理
発現において重要であるばかりでなく、医薬品開発の標
的ともなりうるGタンパク質共役型レセプタータンパク
質を新規に見出し、その遺伝子(例えばcDNA)をク
ローニングすることは、新規Gタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の特異的リガンドや、アゴニスト、アン
タゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。し
かし、Gタンパク質共役型レセプターはその全てが見出
されているわけではなく、現時点でもなお、未知のGタ
ンパク質共役型レセプター、また対応するリガンドが同
定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数
存在しており、新たなGタンパク質共役型レセプターの
探索および機能解明が切望されている。Gタンパク質共
役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とす
る、新たな生理活性物質(すなわち、リガンド)の探
索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアン
タゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガン
ドが見出されなくても、該レセプターの不活化実験(ノ
ックアウト動物)から該レセプターの生理作用を解析す
ることにより、該レセプターに対するアゴニストまたは
アンタゴニストを作製することも可能である。これら該
レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストなどは、Gタンパク質共役型レセプターの機能
不全に関連する疾患の予防/治療薬や診断薬として活用
することが期待できる。さらにまた、Gタンパク質共役
型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプ
ターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因と
なっている場合も多い。この場合には、該レセプターに
対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、
該レセプター遺伝子の生体内(またはある特定の臓器)
への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス
核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもでき
る。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の
欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であ
り、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全
に関与する疾患の予防/治療薬や診断薬に応用すること
もできる。本発明は、上記のように有用な新規Gタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質を提供するものであ
る。すなわち、新規Gタンパク質共役型レセプタータン
パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、該Gタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドをコードするポリヌクレオチド(DNA、RNA
およびそれらの誘導体)を含有するポリヌクレオチド
(DNA、RNAおよびそれらの誘導体)、該ポリヌク
レオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクター
を保持する形質転換体、該Gタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質またはその塩の製造法、該Gタンパク質共
役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドま
たはその塩に対する抗体、該Gタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の発現量を変化させる化合物、該Gタン
パク質共役型レセプターに対するリガンドの決定方法、
リガンドと該Gタンパク質共役型レセプタータンパク質
との結合性を変化させる化合物(アンタゴニスト、アゴ
ニスト)またはその塩のスクリーニング方法、該スクリ
ーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスク
リーニングキットを用いて得られうるリガンドと該Gタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質との結合性を変化
させる化合物(アンタゴニスト、アゴニスト)またはそ
の塩、およびリガンドと該Gタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質との結合性を変化させる化合物(アンタゴ
ニスト、アゴニスト)もしくは該Gタンパク質共役型レ
セプタータンパク質の発現量を変化させる化合物または
その塩を含有してなる医薬などを提供する。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ヒト肺由来の新規なGタンパク質共役型
レセプタータンパク質をコードするcDNAを単離し、
その全塩基配列を解析することに成功した。そして、こ
の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、第1〜第
7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、これらの
cDNAにコードされるタンパク質が7回膜貫通型のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質であることを確
認した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さら
に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
を重ねた結果、ヒト肺由来の新規なGタンパク質共役型
レセプタータンパク質をコードするcDNAを単離し、
その全塩基配列を解析することに成功した。そして、こ
の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、第1〜第
7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、これらの
cDNAにコードされるタンパク質が7回膜貫通型のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質であることを確
認した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さら
に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【0006】すなわち、本発明は、(1)配列番号:1
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有することを特徴とするGタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩、(2)配列
番号:1で表されるアミノ酸配列を含有する上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質、
(3)上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質の部分ペプチドまたはその塩、(4)上記
(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質
をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ
チド、(5)DNAである上記(4)記載のポリヌクレ
オチド、(6)配列番号:2で表される塩基配列を含有
する上記(5)記載のDNA、(7)上記(4)記載の
ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、(8)上
記(7)記載の組換えベクターで形質転換させた形質転
換体、(9)上記(8)記載の形質転換体を培養し、上
記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質を生成せしめることを特徴とする上記(1)記載のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の
製造法、(10)上記(1)記載のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペ
プチドまたはその塩に対する抗体、(11)上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質のシグ
ナル伝達を不活性化する中和抗体である上記(10)記
載の抗体、(12)上記(10)記載の抗体を含有して
なる診断薬、(13)上記(10)記載の抗体を含有し
てなる医薬、(14)上記(1)記載のGタンパク質共
役型レセプタータンパク質もしくは上記(3)記載の部
分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られうる
上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質またはその塩に対するリガンド、(15)上記(1
4)記載のGタンパク質共役型レセプターのリガンドを
含有してなる医薬、(16)上記(1)記載のGタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記(3)記
載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とす
る上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータン
パク質またはその塩に対するリガンドの決定方法、(1
7)上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまたは
その塩を用いることを特徴とするリガンドと上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
クリーニング方法、(18)上記(1)記載のGタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記(3)記
載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴と
するリガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質またはその塩との結合性を変化させ
る化合物またはその塩のスクリーニング用キット、(1
9)上記(17)記載のスクリーニング方法または上記
(18)記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
うるリガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質またはその塩との結合性を変化させ
る化合物またはその塩、(20)上記(17)記載のス
クリーニング方法または上記(18)記載のスクリーニ
ング用キットを用いて得られうるリガンドと上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含
有してなる医薬、(21)上記(4)記載のポリヌクレ
オチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチド、(22)上記(4)記載のポ
リヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含
有してなるポリヌクレオチド、(23)上記(4)記載
のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴
とする上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質のmRNAの定量方法、(24)上記(1
0)記載の抗体を用いることを特徴とする上記(1)記
載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質の定量方
法、(25)上記(23)または上記(24)記載の定
量方法を用いることを特徴とする上記(1)記載のGタ
ンパク質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断
法、(26)上記(23)記載の定量方法を用いること
を特徴とする上記(1)記載のGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質の発現量を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、(27)上記(24)記載
の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜における上
記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング
方法、(28)上記(26)記載のスクリーニング方法
を用いて得られうる上記(1)記載のGタンパク質共役
型レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物ま
たはその塩、(29)上記(27)記載のスクリーニン
グ方法を用いて得られうる細胞膜における上記(1)記
載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化
させる化合物またはその塩、(30)上記(28)記載
の化合物またはその塩を含有してなる医薬、(31)上
記(29)記載の化合物またはその塩を含有してなる医
薬、(32)中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患、癌、心
疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、免疫系疾患または
感染症の予防・治療剤である上記(20)、(30)ま
たは(31)記載の医薬、(33)哺乳動物に対して、
上記(19)、(28)または(29)記載の化合物ま
たはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾
患、内分泌疾患、代謝疾患、癌、心疾患、呼吸器系疾
患、消化器系疾患、免疫系疾患または感染症の予防・治
療方法、(34)中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患、
癌、心疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、免疫系疾患
または感染症の予防・治療剤を製造するための上記(1
9)、(28)または(29)記載の化合物またはその
塩の使用等に関する。
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有することを特徴とするGタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩、(2)配列
番号:1で表されるアミノ酸配列を含有する上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質、
(3)上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質の部分ペプチドまたはその塩、(4)上記
(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質
をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ
チド、(5)DNAである上記(4)記載のポリヌクレ
オチド、(6)配列番号:2で表される塩基配列を含有
する上記(5)記載のDNA、(7)上記(4)記載の
ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、(8)上
記(7)記載の組換えベクターで形質転換させた形質転
換体、(9)上記(8)記載の形質転換体を培養し、上
記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質を生成せしめることを特徴とする上記(1)記載のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の
製造法、(10)上記(1)記載のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペ
プチドまたはその塩に対する抗体、(11)上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質のシグ
ナル伝達を不活性化する中和抗体である上記(10)記
載の抗体、(12)上記(10)記載の抗体を含有して
なる診断薬、(13)上記(10)記載の抗体を含有し
てなる医薬、(14)上記(1)記載のGタンパク質共
役型レセプタータンパク質もしくは上記(3)記載の部
分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られうる
上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質またはその塩に対するリガンド、(15)上記(1
4)記載のGタンパク質共役型レセプターのリガンドを
含有してなる医薬、(16)上記(1)記載のGタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記(3)記
載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とす
る上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータン
パク質またはその塩に対するリガンドの決定方法、(1
7)上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまたは
その塩を用いることを特徴とするリガンドと上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
クリーニング方法、(18)上記(1)記載のGタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記(3)記
載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴と
するリガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質またはその塩との結合性を変化させ
る化合物またはその塩のスクリーニング用キット、(1
9)上記(17)記載のスクリーニング方法または上記
(18)記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
うるリガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質またはその塩との結合性を変化させ
る化合物またはその塩、(20)上記(17)記載のス
クリーニング方法または上記(18)記載のスクリーニ
ング用キットを用いて得られうるリガンドと上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含
有してなる医薬、(21)上記(4)記載のポリヌクレ
オチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチド、(22)上記(4)記載のポ
リヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含
有してなるポリヌクレオチド、(23)上記(4)記載
のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴
とする上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質のmRNAの定量方法、(24)上記(1
0)記載の抗体を用いることを特徴とする上記(1)記
載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質の定量方
法、(25)上記(23)または上記(24)記載の定
量方法を用いることを特徴とする上記(1)記載のGタ
ンパク質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断
法、(26)上記(23)記載の定量方法を用いること
を特徴とする上記(1)記載のGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質の発現量を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、(27)上記(24)記載
の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜における上
記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング
方法、(28)上記(26)記載のスクリーニング方法
を用いて得られうる上記(1)記載のGタンパク質共役
型レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物ま
たはその塩、(29)上記(27)記載のスクリーニン
グ方法を用いて得られうる細胞膜における上記(1)記
載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化
させる化合物またはその塩、(30)上記(28)記載
の化合物またはその塩を含有してなる医薬、(31)上
記(29)記載の化合物またはその塩を含有してなる医
薬、(32)中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患、癌、心
疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、免疫系疾患または
感染症の予防・治療剤である上記(20)、(30)ま
たは(31)記載の医薬、(33)哺乳動物に対して、
上記(19)、(28)または(29)記載の化合物ま
たはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾
患、内分泌疾患、代謝疾患、癌、心疾患、呼吸器系疾
患、消化器系疾患、免疫系疾患または感染症の予防・治
療方法、(34)中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患、
癌、心疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、免疫系疾患
または感染症の予防・治療剤を製造するための上記(1
9)、(28)または(29)記載の化合物またはその
塩の使用等に関する。
【0007】さらには、(35)タンパク質が、配列
番号:1で表されるアミノ酸配列、配列番号:1で表さ
れるアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、
1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さら
に好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失した
アミノ酸配列、配列番号:1で表されるアミノ酸配列
に1または2個以上(好ましくは、1〜30個程度、よ
り好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個
(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号:1で表されるアミノ酸配列中の1または2個
以上(好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1
〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))の
アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ま
たはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタ
ンパク質である上記(1)記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質またはその塩、(36)上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質もしく
はその塩または上記(2)記載の部分ペプチドもしくは
その塩と、試験化合物とを接触させることを特徴とする
上記(16)記載のリガンドの決定方法、(37)リガ
ンドが、例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナ
ビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニ
ン、メラトニン、ニューロペプチドY、オピオイド、プ
リン、バソプレッシン、オキシトシン、PACAP
(例、PACAP27,PACAP38)、セクレチ
ン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、
ソマトスタチン、GHRH、CRF、ACTH、GR
P、PTH、VIP(バソアクティブ インテスティナ
ル ポリペプチド)、ソマトスタチン、ドーパミン、モ
チリン、アミリン、ブラジキニン、CGRP(カルシト
ニンジーンリレーティッドペプチド)、ロイコトリエ
ン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロン
ボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスー
パーファミリー(例、IL−8,GROα,GROβ,
GROγ,NAP−2,ENA−78,GCP−2,P
F4,IP−10,Mig,PBSF/SDF−1など
のCXCケモカインサブファミリー;MCAF/MCP
−1,MCP−2,MCP−3,MCP−4,eota
xin,RANTES,MIP−1α、MIP−1β,
HCC−1,MIP−3α/LARC、MIP−3β/
ELC,I−309,TARC,MIPF−1,MIP
F−2/eotaxin−2,MDC,DC−CK1/
PARC,SLCなどのCCケモカインサブファミリ
ー;lymphotactinなどのCケモカインサブ
ファミリー;fractalkineなどのCX3Cケ
モカインサブファミリー等)、エンドセリン、エンテロ
ガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、TRH、
パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホ
スファチジン酸(LPA)またはスフィンゴシン1−リ
ン酸である上記(36)記載のリガンドの決定方法、
番号:1で表されるアミノ酸配列、配列番号:1で表さ
れるアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、
1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さら
に好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失した
アミノ酸配列、配列番号:1で表されるアミノ酸配列
に1または2個以上(好ましくは、1〜30個程度、よ
り好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個
(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号:1で表されるアミノ酸配列中の1または2個
以上(好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1
〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))の
アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ま
たはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタ
ンパク質である上記(1)記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質またはその塩、(36)上記(1)
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質もしく
はその塩または上記(2)記載の部分ペプチドもしくは
その塩と、試験化合物とを接触させることを特徴とする
上記(16)記載のリガンドの決定方法、(37)リガ
ンドが、例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナ
ビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニ
ン、メラトニン、ニューロペプチドY、オピオイド、プ
リン、バソプレッシン、オキシトシン、PACAP
(例、PACAP27,PACAP38)、セクレチ
ン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、
ソマトスタチン、GHRH、CRF、ACTH、GR
P、PTH、VIP(バソアクティブ インテスティナ
ル ポリペプチド)、ソマトスタチン、ドーパミン、モ
チリン、アミリン、ブラジキニン、CGRP(カルシト
ニンジーンリレーティッドペプチド)、ロイコトリエ
ン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロン
ボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスー
パーファミリー(例、IL−8,GROα,GROβ,
GROγ,NAP−2,ENA−78,GCP−2,P
F4,IP−10,Mig,PBSF/SDF−1など
のCXCケモカインサブファミリー;MCAF/MCP
−1,MCP−2,MCP−3,MCP−4,eota
xin,RANTES,MIP−1α、MIP−1β,
HCC−1,MIP−3α/LARC、MIP−3β/
ELC,I−309,TARC,MIPF−1,MIP
F−2/eotaxin−2,MDC,DC−CK1/
PARC,SLCなどのCCケモカインサブファミリ
ー;lymphotactinなどのCケモカインサブ
ファミリー;fractalkineなどのCX3Cケ
モカインサブファミリー等)、エンドセリン、エンテロ
ガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、TRH、
パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホ
スファチジン酸(LPA)またはスフィンゴシン1−リ
ン酸である上記(36)記載のリガンドの決定方法、
【0008】(38)(i)上記(1)記載のGタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩または
上記(3)記載の部分ペプチドもしくはその塩と、リガ
ンドとを接触させた場合と、(ii)上記(1)記載のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩
または上記(3)記載の部分ペプチドもしくはその塩
と、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との
比較を行なうことを特徴とする上記(17)記載のスク
リーニング方法、(39)(i)標識したリガンドを上
記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質もしくはその塩または上記(3)記載の部分ペプチド
もしくはその塩に接触させた場合と、(ii)標識したリ
ガンドおよび試験化合物を上記(1)記載のGタンパク
質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩または上
記(3)記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させ
た場合における、標識したリガンドの上記(1)記載の
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその
塩または上記(3)記載の部分ペプチドもしくはその塩
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリ
ガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合
物またはその塩のスクリーニング方法、(40)(i)
標識したリガンドを上記(1)記載のGタンパク質共役
型レセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場
合と、(ii)標識したリガンドおよび試験化合物を上記
(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質
を含有する細胞に接触させた場合における、標識したリ
ガンドの該細胞に対する結合量を測定し、比較すること
を特徴とするリガンドと上記(1)記載のGタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を
変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(41)(i)標識したリガンドを上記(1)記載のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質を含有する細胞
の膜画分に接触させた場合と、(ii)標識したリガンド
および試験化合物を上記(1)記載のGタンパク質共役
型レセプタータンパク質を含有する細胞の膜画分に接触
させた場合における、標識したリガンドの該細胞の膜画
分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化
合物またはその塩のスクリーニング方法、
ク質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩または
上記(3)記載の部分ペプチドもしくはその塩と、リガ
ンドとを接触させた場合と、(ii)上記(1)記載のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩
または上記(3)記載の部分ペプチドもしくはその塩
と、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との
比較を行なうことを特徴とする上記(17)記載のスク
リーニング方法、(39)(i)標識したリガンドを上
記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質もしくはその塩または上記(3)記載の部分ペプチド
もしくはその塩に接触させた場合と、(ii)標識したリ
ガンドおよび試験化合物を上記(1)記載のGタンパク
質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩または上
記(3)記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させ
た場合における、標識したリガンドの上記(1)記載の
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその
塩または上記(3)記載の部分ペプチドもしくはその塩
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリ
ガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合
物またはその塩のスクリーニング方法、(40)(i)
標識したリガンドを上記(1)記載のGタンパク質共役
型レセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場
合と、(ii)標識したリガンドおよび試験化合物を上記
(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質
を含有する細胞に接触させた場合における、標識したリ
ガンドの該細胞に対する結合量を測定し、比較すること
を特徴とするリガンドと上記(1)記載のGタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を
変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(41)(i)標識したリガンドを上記(1)記載のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質を含有する細胞
の膜画分に接触させた場合と、(ii)標識したリガンド
および試験化合物を上記(1)記載のGタンパク質共役
型レセプタータンパク質を含有する細胞の膜画分に接触
させた場合における、標識したリガンドの該細胞の膜画
分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化
合物またはその塩のスクリーニング方法、
【0009】(42)(i)標識したリガンドを上記
(8)記載の形質転換体を培養することによって該形質
転換体の細胞膜に発現したGタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質に接触させた場合と、(ii)標識したリガ
ンドおよび試験化合物を上記(8)記載の形質転換体を
培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させた
場合における、標識したリガンドの該Gタンパク質共役
型レセプタータンパク質に対する結合量を測定し、比較
することを特徴とするリガンドと上記(1)記載のGタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、(43)(i)上記(1)記載のGタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩を活性化する
化合物を上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、(i
i)上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質またはその塩を活性化する化合物および試験化
合物を上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を介した細胞
刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンド
と上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータン
パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング方法、(44)上記(1)記
載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
の塩を活性化する化合物を上記(8)記載の形質転換体
を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現し
たGタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させ
た場合と、上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩を活性化する化合物および
試験化合物を上記(8)記載の形質転換体を培養するこ
とによって該形質転換体の細胞膜に発現したGタンパク
質共役型レセプタータンパク質に接触させた場合におけ
る、Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を介する
細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガ
ンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング方法、
(8)記載の形質転換体を培養することによって該形質
転換体の細胞膜に発現したGタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質に接触させた場合と、(ii)標識したリガ
ンドおよび試験化合物を上記(8)記載の形質転換体を
培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させた
場合における、標識したリガンドの該Gタンパク質共役
型レセプタータンパク質に対する結合量を測定し、比較
することを特徴とするリガンドと上記(1)記載のGタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、(43)(i)上記(1)記載のGタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩を活性化する
化合物を上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、(i
i)上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質またはその塩を活性化する化合物および試験化
合物を上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を介した細胞
刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンド
と上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータン
パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング方法、(44)上記(1)記
載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
の塩を活性化する化合物を上記(8)記載の形質転換体
を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現し
たGタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させ
た場合と、上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩を活性化する化合物および
試験化合物を上記(8)記載の形質転換体を培養するこ
とによって該形質転換体の細胞膜に発現したGタンパク
質共役型レセプタータンパク質に接触させた場合におけ
る、Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を介する
細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガ
ンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング方法、
【0010】(45)上記(1)記載のGタンパク質共
役型レセプタータンパク質を活性化する化合物が、アン
ギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシスト
キニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニュー
ロペプチドY、オピオイド、プリン、バソプレッシン、
オキシトシン、PACAP(例、PACAP27,PA
CAP38)、セクレチン、グルカゴン、カルシトニ
ン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、GHRH、
CRF、ACTH、GRP、PTH、VIP(バソアク
ティブ インテスティナル ポリペプチド)、ソマトス
タチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニ
ン、CGRP(カルシトニンジーンリレーティッドペプ
チド)、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロス
タグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナ
リン、ケモカインスーパーファミリー(例、IL−8,
GROα,GROβ,GROγ,NAP−2,ENA−
78,GCP−2,PF4,IP−10,Mig,PB
SF/SDF−1などのCXCケモカインサブファミリ
ー;MCAF/MCP−1,MCP−2,MCP−3,
MCP−4,eotaxin,RANTES,MIP−
1α、MIP−1β,HCC−1,MIP−3α/LA
RC、MIP−3β/ELC,I−309,TARC,
MIPF−1,MIPF−2/eotaxin−2,M
DC,DC−CK1/PARC,SLCなどのCCケモ
カインサブファミリー;lymphotactinなど
のCケモカインサブファミリー;fractalkin
eなどのCX3Cケモカインサブファミリー等)、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、TRH、パンクレアティックポリペプタイ
ド、ガラニン、リゾホスファチジン酸(LPA)または
スフィンゴシン1−リン酸である上記(43)または
(44)記載のスクリーニング方法、(46)上記(3
8)〜(45)記載のスクリーニング方法で得られうる
リガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化
合物またはその塩、(47)上記(38)〜上記(4
5)記載のスクリーニング方法で得られうるリガンドと
上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質またはその塩との結合性を変化させる化合物または
その塩を含有することを特徴とする医薬、
役型レセプタータンパク質を活性化する化合物が、アン
ギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシスト
キニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニュー
ロペプチドY、オピオイド、プリン、バソプレッシン、
オキシトシン、PACAP(例、PACAP27,PA
CAP38)、セクレチン、グルカゴン、カルシトニ
ン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、GHRH、
CRF、ACTH、GRP、PTH、VIP(バソアク
ティブ インテスティナル ポリペプチド)、ソマトス
タチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニ
ン、CGRP(カルシトニンジーンリレーティッドペプ
チド)、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロス
タグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナ
リン、ケモカインスーパーファミリー(例、IL−8,
GROα,GROβ,GROγ,NAP−2,ENA−
78,GCP−2,PF4,IP−10,Mig,PB
SF/SDF−1などのCXCケモカインサブファミリ
ー;MCAF/MCP−1,MCP−2,MCP−3,
MCP−4,eotaxin,RANTES,MIP−
1α、MIP−1β,HCC−1,MIP−3α/LA
RC、MIP−3β/ELC,I−309,TARC,
MIPF−1,MIPF−2/eotaxin−2,M
DC,DC−CK1/PARC,SLCなどのCCケモ
カインサブファミリー;lymphotactinなど
のCケモカインサブファミリー;fractalkin
eなどのCX3Cケモカインサブファミリー等)、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、TRH、パンクレアティックポリペプタイ
ド、ガラニン、リゾホスファチジン酸(LPA)または
スフィンゴシン1−リン酸である上記(43)または
(44)記載のスクリーニング方法、(46)上記(3
8)〜(45)記載のスクリーニング方法で得られうる
リガンドと上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化
合物またはその塩、(47)上記(38)〜上記(4
5)記載のスクリーニング方法で得られうるリガンドと
上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質またはその塩との結合性を変化させる化合物または
その塩を含有することを特徴とする医薬、
【0011】(48)上記(1)記載のGタンパク質共
役型レセプタータンパク質を含有する細胞を含有するこ
とを特徴とする上記(18)記載のスクリーニング用キ
ット、(49)上記(1)記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質を含有する細胞の膜画分を含有する
ことを特徴とする上記(18)記載のスクリーニング用
キット、(50)上記(8)記載の形質転換体を培養す
ることによって該形質転換体の細胞膜に発現したGタン
パク質共役型レセプタータンパク質を含有することを特
徴とする上記(18)記載のスクリーニング用キット、
(51)上記(48)〜(50)記載のスクリーニング
用キットを用いて得られうる、リガンドと上記(1)記
載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、(5
2)上記(48)〜(50)記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる、リガンドと上記(1)記載の
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩
との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有する
ことを特徴とする医薬、(53)上記(10)記載の抗
体と、上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまた
はその塩とを接触させることを特徴とする上記(1)の
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記
(3)記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、(5
4)上記(10)記載の抗体と、被検液および標識化さ
れた上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまたは
その塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化
された上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまた
はその塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の
上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまたはその
塩の定量法、および(55)被検液と担体上に不溶化し
た上記(10)記載の抗体および標識化された上記(1
0)記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴
とする被検液中の上記(1)記載のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペ
プチドまたはその塩の定量法等を提供する。
役型レセプタータンパク質を含有する細胞を含有するこ
とを特徴とする上記(18)記載のスクリーニング用キ
ット、(49)上記(1)記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質を含有する細胞の膜画分を含有する
ことを特徴とする上記(18)記載のスクリーニング用
キット、(50)上記(8)記載の形質転換体を培養す
ることによって該形質転換体の細胞膜に発現したGタン
パク質共役型レセプタータンパク質を含有することを特
徴とする上記(18)記載のスクリーニング用キット、
(51)上記(48)〜(50)記載のスクリーニング
用キットを用いて得られうる、リガンドと上記(1)記
載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、(5
2)上記(48)〜(50)記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる、リガンドと上記(1)記載の
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩
との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有する
ことを特徴とする医薬、(53)上記(10)記載の抗
体と、上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまた
はその塩とを接触させることを特徴とする上記(1)の
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記
(3)記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、(5
4)上記(10)記載の抗体と、被検液および標識化さ
れた上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまたは
その塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化
された上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまた
はその塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の
上記(1)記載のGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質もしくは上記(3)記載の部分ペプチドまたはその
塩の定量法、および(55)被検液と担体上に不溶化し
た上記(10)記載の抗体および標識化された上記(1
0)記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴
とする被検液中の上記(1)記載のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質もしくは上記(3)記載の部分ペ
プチドまたはその塩の定量法等を提供する。
【0012】
【発明の実施の形態】本発明のGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質(以下、レセプタータンパク質と略記
する場合がある)は、配列番号:1で表されるアミノ酸
配列(図2)と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するレセプタータンパク質である。本発明のレ
セプタータンパク質は、例えば、ヒトやその他の哺乳動
物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、サルなど)のあらゆる細胞(例え
ば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細
胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など)や血球系の細胞、またはそ
れらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の
各部位(例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、
視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、
前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質)、脊髄、
下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆の
う、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、
小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末
梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、
関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよ
く、また合成タンパク質であってもよい。
プタータンパク質(以下、レセプタータンパク質と略記
する場合がある)は、配列番号:1で表されるアミノ酸
配列(図2)と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するレセプタータンパク質である。本発明のレ
セプタータンパク質は、例えば、ヒトやその他の哺乳動
物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、サルなど)のあらゆる細胞(例え
ば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細
胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中
球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟
骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細
胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹
細胞もしくはガン細胞など)や血球系の細胞、またはそ
れらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の
各部位(例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、
視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、
前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質)、脊髄、
下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆の
う、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、
小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末
梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、
関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよ
く、また合成タンパク質であってもよい。
【0013】配列番号:1で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号:1で表されるアミノ酸配列と約50%以上、好まし
くは約60%以上、より好ましくは約70%以上、さら
に好ましくは約80%以上、なかでも好ましくは約90
%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する
アミノ酸配列などが挙げられる。本発明の配列番号:1
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号:1
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有し、配列番号:1で表されるアミノ酸配列と実質
的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。実
質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活
性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に
同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示
す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達
作用などの活性が同等(例、約0.01〜100倍、好
ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜
2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度や
タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活
性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる
が、例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリ
ーニング方法に従って測定することができる。
質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号:1で表されるアミノ酸配列と約50%以上、好まし
くは約60%以上、より好ましくは約70%以上、さら
に好ましくは約80%以上、なかでも好ましくは約90
%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する
アミノ酸配列などが挙げられる。本発明の配列番号:1
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号:1
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有し、配列番号:1で表されるアミノ酸配列と実質
的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。実
質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活
性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に
同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示
す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達
作用などの活性が同等(例、約0.01〜100倍、好
ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜
2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度や
タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活
性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる
が、例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリ
ーニング方法に従って測定することができる。
【0014】また、本発明のレセプタータンパク質とし
ては、配列番号:1で表されるアミノ酸配列中の1ま
たは2個以上(好ましくは、1〜30個程度、より好ま
しくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5
個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号:1で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(好
ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個
程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸
が付加したアミノ酸配列、配列番号:1で表されるア
ミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜3
0個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ま
しくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせ
たアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられ
る。
ては、配列番号:1で表されるアミノ酸配列中の1ま
たは2個以上(好ましくは、1〜30個程度、より好ま
しくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5
個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号:1で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(好
ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個
程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸
が付加したアミノ酸配列、配列番号:1で表されるア
ミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜3
0個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ま
しくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせ
たアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられ
る。
【0015】本明細書におけるレセプタータンパク質
は、ペプチド表記の慣例に従って、左端がN末端(アミ
ノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)である。
配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するレセプ
タータンパク質をはじめとする、本発明のレセプタータ
ンパク質は、C末端がカルボキシル基(−COOH)、
カルボキシレート(−COO-)、アミド(−CON
H2)またはエステル(−COOR)の何れであっても
よい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メ
チル、エチル、n−プロピル、イソプロピルもしくはn
−ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペン
チル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基、
例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6-12アリール
基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C
1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−
ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基
のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオ
キシメチル基などが用いられる。本発明のレセプタータ
ンパク質がC末端以外にカルボキシル基(またはカルボ
キシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミ
ド化またはエステル化されているものも本発明のレセプ
タータンパク質に含まれる。この場合のエステルとして
は、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられ
る。さらに、本発明のレセプタータンパク質には、上記
したタンパク質において、N末端のメチオニン残基のア
ミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチルなどの
C2-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など)で保護
されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグ
ルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のア
ミノ酸の側鎖上の置換基(例えば、−OH、−SH、ア
ミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基
など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル
などのC2-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など)
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、例え
ば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するレ
セプタータンパク質などが用いられる。
は、ペプチド表記の慣例に従って、左端がN末端(アミ
ノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)である。
配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するレセプ
タータンパク質をはじめとする、本発明のレセプタータ
ンパク質は、C末端がカルボキシル基(−COOH)、
カルボキシレート(−COO-)、アミド(−CON
H2)またはエステル(−COOR)の何れであっても
よい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メ
チル、エチル、n−プロピル、イソプロピルもしくはn
−ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペン
チル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基、
例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6-12アリール
基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C
1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−
ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基
のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオ
キシメチル基などが用いられる。本発明のレセプタータ
ンパク質がC末端以外にカルボキシル基(またはカルボ
キシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミ
ド化またはエステル化されているものも本発明のレセプ
タータンパク質に含まれる。この場合のエステルとして
は、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられ
る。さらに、本発明のレセプタータンパク質には、上記
したタンパク質において、N末端のメチオニン残基のア
ミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチルなどの
C2-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など)で保護
されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグ
ルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のア
ミノ酸の側鎖上の置換基(例えば、−OH、−SH、ア
ミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基
など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル
などのC2-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など)
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、例え
ば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するレ
セプタータンパク質などが用いられる。
【0016】本発明のレセプタータンパク質の部分ペプ
チド(以下、部分ペプチドと略記する場合がある)とし
ては、上記した本発明のレセプタータンパク質の部分ペ
プチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、
本発明のレセプタータンパク質分子のうち、細胞膜の外
に露出している部位であって、実質的に同質のレセプタ
ー結合活性を有するものなどが用いられる。具体的に
は、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を有するレセ
プタータンパク質の部分ペプチドとしては、疎水性プロ
ット解析において細胞外領域(親水性(Hydrophilic)
部位)であると分析された部分を含むペプチドである。
また、疎水性(Hydrophobic)部位を一部に含むペプチ
ドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別
に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に
含む部分のペプチドでもよい。本発明の部分ペプチドの
アミノ酸の数は、上記した本発明のレセプタータンパク
質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも20個以上、好
ましくは50個以上、より好ましくは100個以上のア
ミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。ここで、
「実質的に同質のレセプター結合活性」とは、上記と同
意義を示す。「実質的に同質のレセプター結合活性」の
測定は上記と同様に行なうことができる。
チド(以下、部分ペプチドと略記する場合がある)とし
ては、上記した本発明のレセプタータンパク質の部分ペ
プチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、
本発明のレセプタータンパク質分子のうち、細胞膜の外
に露出している部位であって、実質的に同質のレセプタ
ー結合活性を有するものなどが用いられる。具体的に
は、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を有するレセ
プタータンパク質の部分ペプチドとしては、疎水性プロ
ット解析において細胞外領域(親水性(Hydrophilic)
部位)であると分析された部分を含むペプチドである。
また、疎水性(Hydrophobic)部位を一部に含むペプチ
ドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別
に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に
含む部分のペプチドでもよい。本発明の部分ペプチドの
アミノ酸の数は、上記した本発明のレセプタータンパク
質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも20個以上、好
ましくは50個以上、より好ましくは100個以上のア
ミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。ここで、
「実質的に同質のレセプター結合活性」とは、上記と同
意義を示す。「実質的に同質のレセプター結合活性」の
測定は上記と同様に行なうことができる。
【0017】また、本発明の部分ペプチドは、上記ア
ミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜1
0個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミ
ノ酸が欠失し、上記アミノ酸配列に1または2個以上
(好ましくは、1〜20個程度、より好ましくは1〜1
0個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミ
ノ酸が付加し、または上記アミノ酸配列中の1または
2個以上(好ましくは、1〜10個程度、より好ましく
は数個、さらに好ましくは1〜5個程度)のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発明の
部分ペプチドはC末端が通常カルボキシル基(−COO
H)またはカルボキシレート(−COO-)であるが、
上記した本発明のタンパク質と同様に、C末端がアミド
(−CONH2)またはエステル(−COOR)であっ
てもよい(Rは上記と同意義を示す)。本発明の部分ペ
プチドがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキ
シレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド
化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプ
チドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば
上記したC末端のエステルなどが用いられる。さらに、
本発明の部分ペプチドには、上記した本発明のレセプタ
ータンパク質と同様に、N末端のメチオニン残基のアミ
ノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で
切断され生成したGlnがピログルタミン酸化したも
の、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発
明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの塩
としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が
挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好
ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例え
ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるい
は有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル
酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ
酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸)との塩などが用いられる。
ミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜1
0個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミ
ノ酸が欠失し、上記アミノ酸配列に1または2個以上
(好ましくは、1〜20個程度、より好ましくは1〜1
0個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミ
ノ酸が付加し、または上記アミノ酸配列中の1または
2個以上(好ましくは、1〜10個程度、より好ましく
は数個、さらに好ましくは1〜5個程度)のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発明の
部分ペプチドはC末端が通常カルボキシル基(−COO
H)またはカルボキシレート(−COO-)であるが、
上記した本発明のタンパク質と同様に、C末端がアミド
(−CONH2)またはエステル(−COOR)であっ
てもよい(Rは上記と同意義を示す)。本発明の部分ペ
プチドがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキ
シレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド
化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプ
チドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば
上記したC末端のエステルなどが用いられる。さらに、
本発明の部分ペプチドには、上記した本発明のレセプタ
ータンパク質と同様に、N末端のメチオニン残基のアミ
ノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で
切断され生成したGlnがピログルタミン酸化したも
の、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発
明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの塩
としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が
挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好
ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例え
ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるい
は有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル
酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ
酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸)との塩などが用いられる。
【0018】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩は、上記したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組
織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって
製造することもできるし、後に記載する本発明のレセプ
タータンパク質をコードするDNAを含有する形質転換
体を培養することによっても製造することができる。ま
た、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて
製造することもできる。ヒトやその他の哺乳動物の組織
または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物
の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出
を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ
ーを組み合わせることにより精製単離することができ
る。
塩は、上記したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組
織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって
製造することもできるし、後に記載する本発明のレセプ
タータンパク質をコードするDNAを含有する形質転換
体を培養することによっても製造することができる。ま
た、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて
製造することもできる。ヒトやその他の哺乳動物の組織
または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物
の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出
を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ
ーを組み合わせることにより精製単離することができ
る。
【0019】本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成
には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることが
できる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチ
ル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン
樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジルオキシベンジル
アルコール樹脂、4−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチルフェニル
アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4
−(2’,4’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル)フェノキシ樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフ
ェニル−Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを
挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミ
ノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的と
するタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列通りに、
公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応
の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保
護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ
ド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはそのアミド体を取得する。上記した保
護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、D
CC、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、N−
エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロリル)カルボ
ジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラ
セミ化抑制添加剤(例えば、HOBt、HOOBt)と
ともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、
対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOB
tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行
なった後に樹脂に添加することができる。
の部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成
には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることが
できる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチ
ル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン
樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジルオキシベンジル
アルコール樹脂、4−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチルフェニル
アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4
−(2’,4’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル)フェノキシ樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフ
ェニル−Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを
挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミ
ノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的と
するタンパク質またはペプチドのアミノ酸配列通りに、
公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応
の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保
護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ
ド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはそのアミド体を取得する。上記した保
護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、D
CC、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、N−
エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロリル)カルボ
ジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラ
セミ化抑制添加剤(例えば、HOBt、HOOBt)と
ともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、
対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOB
tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行
なった後に樹脂に添加することができる。
【0020】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、N,N−ジメチルホルムアミド,N,N−ジメチル
アセトアミド,N−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン,クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン,ジオキサン,テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル,プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル,酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−20℃〜50℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化す
ることができる。
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、N,N−ジメチルホルムアミド,N,N−ジメチル
アセトアミド,N−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン,クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン,ジオキサン,テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル,プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル,酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−20℃〜50℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十
分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチ
ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化す
ることができる。
【0021】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Cl−Z、Br−Z、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、2−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化)、ア
ラルキルエステル化(例えば、ベンジルエステル、4−
ニトロベンジルエステル、4−メトキシベンジルエステ
ル、4−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化)、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Bzl、Cl2−Bzl、2−ニトロベンジ
ル、Br−Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Tos、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bu
m、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
ば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Cl−Z、Br−Z、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、2−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化)、ア
ラルキルエステル化(例えば、ベンジルエステル、4−
ニトロベンジルエステル、4−メトキシベンジルエステ
ル、4−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化)、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Bzl、Cl2−Bzl、2−ニトロベンジ
ル、Br−Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Tos、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼ
ンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bu
m、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
【0022】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール(例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5−トリクロロフェノール、2,4−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、HONB、N−ヒドロキシスクシミド、N
−ヒドロキシフタルイミド、HOBt)とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去(脱離)方法としては、例えば、Pd
−黒あるいはPd−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−20℃〜40℃の温
度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソー
ル、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パ
ラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4−ブタンジ
チオール、1,2−エタンジチオールなどのようなカチ
オン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイ
ミダゾール保護基として用いられる2,4−ジニトロフ
ェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプ
トファンのインドール保護基として用いられるホルミル
基は上記の1,2−エタンジチオール、1,4−ブタン
ジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、
希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアル
カリ処理によっても除去される。
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール(例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5−トリクロロフェノール、2,4−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、HONB、N−ヒドロキシスクシミド、N
−ヒドロキシフタルイミド、HOBt)とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去(脱離)方法としては、例えば、Pd
−黒あるいはPd−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−20℃〜40℃の温
度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソー
ル、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パ
ラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4−ブタンジ
チオール、1,2−エタンジチオールなどのようなカチ
オン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイ
ミダゾール保護基として用いられる2,4−ジニトロフ
ェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプ
トファンのインドール保護基として用いられるホルミル
基は上記の1,2−エタンジチオール、1,4−ブタン
ジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、
希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアル
カリ処理によっても除去される。
【0023】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド(タンパク質)鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とC末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド(タンパク質)鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とC末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。
【0024】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
(1975年) 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。
その塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
(1975年) 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。
【0025】本発明のレセプタータンパク質をコードす
るポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のレセプ
タータンパク質をコードする塩基配列(DNAまたはR
NA、好ましくはDNA)を含有するものであればいか
なるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとして
は、本発明のレセプタータンパク質をコードするDN
A、mRNA等のRNAであり、二本鎖であっても、一
本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、
二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでも
よい。一本鎖の場合は、センス鎖(すなわち、コード
鎖)であっても、アンチセンス鎖(すなわち、非コード
鎖)であってもよい。本発明のレセプタータンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新PCRとその応用」15(7)、19
97記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明
のレセプタータンパク質のmRNAを定量することがで
きる。同様に、本発明のレセプタータンパク質の非翻訳
領域の塩基配列に相補な配列を有するポリヌクレオチド
を用いても本発明のレセプタータンパク質のmRNAを
定量することができる。本発明のレセプタータンパク質
をコードするDNAおよび本発明のレセプタータンパク
質の非翻訳領域のDNAとしては、ゲノムDNA、ゲノ
ムDNAライブラリー、上記した細胞・組織由来のcD
NA、上記した細胞・組織由来のcDNAライブラリ
ー、合成DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用
するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コ
スミド、ファージミドなどいずれであってもよい。ま
た、上記した細胞・組織よりtotalRNAまたはm
RNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Trans
criptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT−P
CR法と略称する)によって増幅することもできる。具
体的には、本発明のレセプタータンパク質をコードする
DNAとしては、例えば、配列番号:2で表される塩基
配列を含有するDNA、または配列番号:2で表される
塩基配列を有するDNAとハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするDNAを有し、本発明のレセプ
タータンパク質と実質的に同質の活性(例、リガンド結
合活性、シグナル情報伝達作用など)を有するレセプタ
ータンパク質をコードするDNAであれば何れのもので
もよい。配列番号:2で表される塩基配列を有するDN
Aとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るDNAとしては、例えば、配列番号:2で表される塩
基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より
好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以
上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用
いられる。本発明のレセプタータンパク質をコードする
DNAの5’端非翻訳領域しては、例えば配列番号:8
で表される塩基配列などが、3’端非翻訳領域として
は、例えば配列番号:5で表される塩基配列などが挙げ
られる。
るポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のレセプ
タータンパク質をコードする塩基配列(DNAまたはR
NA、好ましくはDNA)を含有するものであればいか
なるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとして
は、本発明のレセプタータンパク質をコードするDN
A、mRNA等のRNAであり、二本鎖であっても、一
本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、
二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでも
よい。一本鎖の場合は、センス鎖(すなわち、コード
鎖)であっても、アンチセンス鎖(すなわち、非コード
鎖)であってもよい。本発明のレセプタータンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新PCRとその応用」15(7)、19
97記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明
のレセプタータンパク質のmRNAを定量することがで
きる。同様に、本発明のレセプタータンパク質の非翻訳
領域の塩基配列に相補な配列を有するポリヌクレオチド
を用いても本発明のレセプタータンパク質のmRNAを
定量することができる。本発明のレセプタータンパク質
をコードするDNAおよび本発明のレセプタータンパク
質の非翻訳領域のDNAとしては、ゲノムDNA、ゲノ
ムDNAライブラリー、上記した細胞・組織由来のcD
NA、上記した細胞・組織由来のcDNAライブラリ
ー、合成DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用
するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コ
スミド、ファージミドなどいずれであってもよい。ま
た、上記した細胞・組織よりtotalRNAまたはm
RNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Trans
criptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT−P
CR法と略称する)によって増幅することもできる。具
体的には、本発明のレセプタータンパク質をコードする
DNAとしては、例えば、配列番号:2で表される塩基
配列を含有するDNA、または配列番号:2で表される
塩基配列を有するDNAとハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするDNAを有し、本発明のレセプ
タータンパク質と実質的に同質の活性(例、リガンド結
合活性、シグナル情報伝達作用など)を有するレセプタ
ータンパク質をコードするDNAであれば何れのもので
もよい。配列番号:2で表される塩基配列を有するDN
Aとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るDNAとしては、例えば、配列番号:2で表される塩
基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より
好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以
上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用
いられる。本発明のレセプタータンパク質をコードする
DNAの5’端非翻訳領域しては、例えば配列番号:8
で表される塩基配列などが、3’端非翻訳領域として
は、例えば配列番号:5で表される塩基配列などが挙げ
られる。
【0026】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング(Molecular Cloning)2nd(J. Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の
方法などに従って行なうことができる。また、市販のラ
イブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の
方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハ
イストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナト
リウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜2
0mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜
65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19m
Mで温度が約65℃の場合が最も好ましい。より具体的
には、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有する
レセプタータンパク質をコードするDNAとしては、配
列番号:2で表される塩基配列を含有するDNAなどが
用いられる。本発明のレセプタータンパク質をコードす
るDNAの塩基配列の一部、または該DNAと相補的な
塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、
下記の本発明の部分ペプチドをコードするDNAを包含
するだけではなく、RNAをも包含する意味で用いられ
る。本発明に従えば、Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのでき
るアンチセンス・ポリヌクレオチド(核酸)を、クロー
ン化した、あるいは決定されたGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするDNAおよびその非翻訳
領域の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そう
したポリヌクレオチド(核酸)は、Gタンパク質共役型
レセプタータンパク質遺伝子およびその非翻訳領域のR
NAとハイブリダイズすることができ、該RNAの合成
または機能を阻害することができるか、あるいはGタン
パク質共役型レセプタータンパク質関連RNAとの相互
作用を介してGタンパク質共役型レセプタータンパク質
遺伝子の発現を調節・制御することができる。Gタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質関連RNAの選択され
た配列に相補的なポリヌクレオチド、およびGタンパク
質共役型レセプタータンパク質関連RNAと特異的にハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生
体内および生体外でGタンパク質共役型レセプタータン
パク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、
また病気などの治療または診断に有用である。用語「対
応する」とは、遺伝子および非翻訳領域を含めたヌクレ
オチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有
するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチ
ド、塩基配列または核酸とペプチド(タンパク質)との
間で「対応する」とは、ヌクレオチド(核酸)の配列ま
たはその相補体から誘導される指令にあるペプチド(タ
ンパク質)のアミノ酸を通常指している。Gタンパク質
共役型レセプタータンパク質遺伝子の5’端ヘアピンル
ープ、5’端6−ベースペア・リピート、5’端非翻訳
領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード
領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’
端パリンドローム領域、および3’端ヘアピンループは
好ましい対象領域として選択しうるが、Gタンパク質共
役型レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域も対
象として選択しうる。
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング(Molecular Cloning)2nd(J. Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の
方法などに従って行なうことができる。また、市販のラ
イブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の
方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハ
イストリンジェントな条件に従って行なうことができ
る。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナト
リウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜2
0mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜
65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19m
Mで温度が約65℃の場合が最も好ましい。より具体的
には、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有する
レセプタータンパク質をコードするDNAとしては、配
列番号:2で表される塩基配列を含有するDNAなどが
用いられる。本発明のレセプタータンパク質をコードす
るDNAの塩基配列の一部、または該DNAと相補的な
塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、
下記の本発明の部分ペプチドをコードするDNAを包含
するだけではなく、RNAをも包含する意味で用いられ
る。本発明に従えば、Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのでき
るアンチセンス・ポリヌクレオチド(核酸)を、クロー
ン化した、あるいは決定されたGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするDNAおよびその非翻訳
領域の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そう
したポリヌクレオチド(核酸)は、Gタンパク質共役型
レセプタータンパク質遺伝子およびその非翻訳領域のR
NAとハイブリダイズすることができ、該RNAの合成
または機能を阻害することができるか、あるいはGタン
パク質共役型レセプタータンパク質関連RNAとの相互
作用を介してGタンパク質共役型レセプタータンパク質
遺伝子の発現を調節・制御することができる。Gタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質関連RNAの選択され
た配列に相補的なポリヌクレオチド、およびGタンパク
質共役型レセプタータンパク質関連RNAと特異的にハ
イブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生
体内および生体外でGタンパク質共役型レセプタータン
パク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、
また病気などの治療または診断に有用である。用語「対
応する」とは、遺伝子および非翻訳領域を含めたヌクレ
オチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有
するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチ
ド、塩基配列または核酸とペプチド(タンパク質)との
間で「対応する」とは、ヌクレオチド(核酸)の配列ま
たはその相補体から誘導される指令にあるペプチド(タ
ンパク質)のアミノ酸を通常指している。Gタンパク質
共役型レセプタータンパク質遺伝子の5’端ヘアピンル
ープ、5’端6−ベースペア・リピート、5’端非翻訳
領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード
領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’
端パリンドローム領域、および3’端ヘアピンループは
好ましい対象領域として選択しうるが、Gタンパク質共
役型レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域も対
象として選択しうる。
【0027】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブ
リダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係
は、「アンチセンス」であるということができる。アン
チセンス・ポリヌクレオチドは、2−デオキシ−D−リ
ボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、D−
リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまた
はピリミジン塩基のN−グリコシドであるその他のタイ
プのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を
有するその他のポリマー(例えば、市販のタンパク質、
核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー)または特殊
な結合を含有するその他のポリマー(但し、該ポリマー
はDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリン
グや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含
有する)などが挙げられる。それらは、2本鎖DNA、
1本鎖DNA、2本鎖RNA、1本鎖RNA、さらにD
NA:RNAハイブリッドであることができ、さらに非
修飾ポリヌクレオチド(または非修飾オリゴヌクレオチ
ド)、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当
該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたも
の、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチ
ドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾の
されたもの、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホ
ネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カ
ルバメートなど)を持つもの、電荷を有する結合または
硫黄含有結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロ
ジチオエートなど)を持つもの、例えばタンパク質(ヌ
クレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、
抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジンなど)や糖
(例えば、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有し
ているもの、インターカレート化合物(例えば、アクリ
ジン、ソラレンなど)を持つもの、キレート化合物(例
えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金
属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するも
の、修飾された結合を持つもの(例えば、αアノマー型
の核酸など)であってもよい。ここで「ヌクレオシ
ド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンお
よびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾された
その他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良
い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピ
リミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あ
るいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾さ
れたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた
糖部分が修飾されていてよく、例えば、1個以上の水酸
基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、
あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されてい
てよい。
相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブ
リダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係
は、「アンチセンス」であるということができる。アン
チセンス・ポリヌクレオチドは、2−デオキシ−D−リ
ボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、D−
リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまた
はピリミジン塩基のN−グリコシドであるその他のタイ
プのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を
有するその他のポリマー(例えば、市販のタンパク質、
核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー)または特殊
な結合を含有するその他のポリマー(但し、該ポリマー
はDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリン
グや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含
有する)などが挙げられる。それらは、2本鎖DNA、
1本鎖DNA、2本鎖RNA、1本鎖RNA、さらにD
NA:RNAハイブリッドであることができ、さらに非
修飾ポリヌクレオチド(または非修飾オリゴヌクレオチ
ド)、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当
該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたも
の、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチ
ドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾の
されたもの、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホ
ネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カ
ルバメートなど)を持つもの、電荷を有する結合または
硫黄含有結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロ
ジチオエートなど)を持つもの、例えばタンパク質(ヌ
クレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、
抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジンなど)や糖
(例えば、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有し
ているもの、インターカレート化合物(例えば、アクリ
ジン、ソラレンなど)を持つもの、キレート化合物(例
えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金
属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するも
の、修飾された結合を持つもの(例えば、αアノマー型
の核酸など)であってもよい。ここで「ヌクレオシ
ド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンお
よびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾された
その他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良
い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピ
リミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あ
るいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾さ
れたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた
糖部分が修飾されていてよく、例えば、1個以上の水酸
基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、
あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されてい
てよい。
【0028】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド
(核酸)は、RNA、DNA、あるいは修飾された核酸
(RNA、DNA)である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。アンチセンス
核酸を構成する塩基数は特に限定されないが、通常5〜
30個程度である。本発明のアンチセンス核酸は、変化
せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有して
いて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な
形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、
付加された形態で与えられることができうる。こうして
付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電
荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオ
ン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを
増大せしめるような脂質(例えば、ホスホリピド、コレ
ステロールなど)といった粗水性のものが挙げられる。
付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやそ
の誘導体(例えば、コレステリルクロロホルメート、コ
ール酸など)が挙げられる。こうしたものは、核酸の
3’端あるいは5’端に付着させることができ、塩基、
糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることが
できうる。その他の基としては、核酸の3’端あるいは
5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソ
ヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分
解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャッ
プ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエ
チレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該
分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに
限定されるものではない。アンチセンス核酸の阻害活性
は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺
伝子発現系、あるいはGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べること
ができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用でき
る。
(核酸)は、RNA、DNA、あるいは修飾された核酸
(RNA、DNA)である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。アンチセンス
核酸を構成する塩基数は特に限定されないが、通常5〜
30個程度である。本発明のアンチセンス核酸は、変化
せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有して
いて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な
形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、
付加された形態で与えられることができうる。こうして
付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電
荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオ
ン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを
増大せしめるような脂質(例えば、ホスホリピド、コレ
ステロールなど)といった粗水性のものが挙げられる。
付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやそ
の誘導体(例えば、コレステリルクロロホルメート、コ
ール酸など)が挙げられる。こうしたものは、核酸の
3’端あるいは5’端に付着させることができ、塩基、
糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることが
できうる。その他の基としては、核酸の3’端あるいは
5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソ
ヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分
解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャッ
プ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエ
チレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該
分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに
限定されるものではない。アンチセンス核酸の阻害活性
は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺
伝子発現系、あるいはGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べること
ができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用でき
る。
【0029】本発明の部分ペプチドをコードするDNA
としては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のcDNA、上記した細胞
・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織
よりmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reaction(以下、RT
-PCR法と略称する)によって増幅することもでき
る。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするD
NAとしては、例えば、(1)配列番号:2で表される
塩基配列を有するDNAの部分塩基配列を有するDN
A、または(2)配列番号:2で表されるDNAとハイ
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
を有し、本発明のタンパク質ペプチドと実質的に同質の
活性(例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用な
ど)を有するタンパク質をコードするDNAの部分塩基
配列を有するDNAなどが用いられる。配列番号:2で
表されるDNAとハイストリンジェントな条件でハイブ
リダイズするDNAとしては、例えば、配列番号:2で
表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%
以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは
約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDN
Aなどが用いられる。
としては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のcDNA、上記した細胞
・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織
よりmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reaction(以下、RT
-PCR法と略称する)によって増幅することもでき
る。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするD
NAとしては、例えば、(1)配列番号:2で表される
塩基配列を有するDNAの部分塩基配列を有するDN
A、または(2)配列番号:2で表されるDNAとハイ
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
を有し、本発明のタンパク質ペプチドと実質的に同質の
活性(例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用な
ど)を有するタンパク質をコードするDNAの部分塩基
配列を有するDNAなどが用いられる。配列番号:2で
表されるDNAとハイストリンジェントな条件でハイブ
リダイズするDNAとしては、例えば、配列番号:2で
表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%
以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは
約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDN
Aなどが用いられる。
【0030】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチド(以下、本発明のレセプタータンパク質と
略記する場合がある)を完全にコードするDNAのクロ
ーニングの手段としては、本発明のペプチドをコードす
るDNAの塩基配列の部分塩基配列を有する合成DNA
プライマーを用いてPCR法によって増幅するか、また
は適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のレセプ
タータンパク質の一部あるいは全領域をコードするDN
A断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハ
イブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラ
ー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J. Sa
mbrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9)に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。
部分ペプチド(以下、本発明のレセプタータンパク質と
略記する場合がある)を完全にコードするDNAのクロ
ーニングの手段としては、本発明のペプチドをコードす
るDNAの塩基配列の部分塩基配列を有する合成DNA
プライマーを用いてPCR法によって増幅するか、また
は適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のレセプ
タータンパク質の一部あるいは全領域をコードするDN
A断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハ
イブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラ
ー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J. Sa
mbrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9)に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【0031】DNAの塩基配列の変換は、PCRや公知
のキット、例えば、MutanTM−super Exp
ress Km(宝酒造(株))、MutanTM−K
(宝酒造(株))等を用いて、ODA−LA PCR
法、Gapped duplex法、Kunkel法等
の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行な
うことができる。クローン化されたレセプタータンパク
質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所
望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したり
して使用することができる。該DNAはその5’末端側
に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端
側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはT
AGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻
訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて
付加することもできる。本発明のレセプタータンパク質
の発現ベクターは、例えば、(イ)本発明のレセプター
タンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断
片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現ベクタ
ー中のプロモーターの下流に連結することにより製造す
ることができる。
のキット、例えば、MutanTM−super Exp
ress Km(宝酒造(株))、MutanTM−K
(宝酒造(株))等を用いて、ODA−LA PCR
法、Gapped duplex法、Kunkel法等
の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行な
うことができる。クローン化されたレセプタータンパク
質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所
望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したり
して使用することができる。該DNAはその5’末端側
に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端
側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはT
AGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻
訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて
付加することもできる。本発明のレセプタータンパク質
の発現ベクターは、例えば、(イ)本発明のレセプター
タンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断
片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現ベクタ
ー中のプロモーターの下流に連結することにより製造す
ることができる。
【0032】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド(例、pCR4、pCR2.1、pBR322、pB
R325、pUC12、pUC13)、枯草菌由来のプ
ラスミド(例、pUB110、pTP5、pC19
4)、酵母由来プラスミド(例、pSH19、pSH1
5)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウ
イルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの
動物ウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pR
c/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoな
どが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとし
ては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、
SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプ
ロモーター、HSV-TKプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、CMVプロモーター、SRαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、trpプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、
lppプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である
場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモータ
ー、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GA
Pプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、P10プロモーターなどが好ましい。
ド(例、pCR4、pCR2.1、pBR322、pB
R325、pUC12、pUC13)、枯草菌由来のプ
ラスミド(例、pUB110、pTP5、pC19
4)、酵母由来プラスミド(例、pSH19、pSH1
5)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウ
イルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの
動物ウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pR
c/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoな
どが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとし
ては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、
SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプ
ロモーター、HSV-TKプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、CMVプロモーター、SRαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、trpプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、
lppプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である
場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモータ
ー、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GA
Pプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、P10プロモーターなどが好ましい。
【0033】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加
シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン(以
下、SV40oriと略称する場合がある)などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、dhfr
と略称する場合がある)遺伝子〔メソトレキセート(M
TX)耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子(以下、Amp
rと略称する場合がある)、ネオマイシン耐性遺伝子
(以下、Neorと略称する場合がある、G418耐
性)等が挙げられる。特に、CHO(dhfr-)細胞
を用いてdhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明のレセプタータンパク質のN端末側に
付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ph
oA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、
宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シ
グナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主
が酵母である場合は、MFα・シグナル配列、SUC2
・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、
インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・
シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ
利用できる。このようにして構築された本発明のレセプ
タータンパク質をコードするDNAを含有するベクター
を用いて、形質転換体を製造することができる。
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加
シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン(以
下、SV40oriと略称する場合がある)などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、dhfr
と略称する場合がある)遺伝子〔メソトレキセート(M
TX)耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子(以下、Amp
rと略称する場合がある)、ネオマイシン耐性遺伝子
(以下、Neorと略称する場合がある、G418耐
性)等が挙げられる。特に、CHO(dhfr-)細胞
を用いてdhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明のレセプタータンパク質のN端末側に
付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ph
oA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、
宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シ
グナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主
が酵母である場合は、MFα・シグナル配列、SUC2
・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、
インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・
シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ
利用できる。このようにして構築された本発明のレセプ
タータンパク質をコードするDNAを含有するベクター
を用いて、形質転換体を製造することができる。
【0034】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH
1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),60巻,160(1
968)〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リ
サーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309
(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biolog
y)〕,120巻,517(1978)〕,HB101
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,4
1巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティック
ス(Genetics),39巻,440(1954)〕,DH5
α〔Inoue,H., Nojima,H. and Okayama,H.,Gene,96,23-
28(1990)〕,DH10B〔プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A),87巻,4645−4649(1990)〕などが
用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス
・ズブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジー
ン,24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Bioch
emistry),95巻,87(1984)〕などが用いられ
る。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビ
シエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22
R-,NA87−11A,DKD−5D、20B−1
2、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomy
ces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピ
キア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられ
る。
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH
1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),60巻,160(1
968)〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リ
サーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309
(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biolog
y)〕,120巻,517(1978)〕,HB101
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,4
1巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティック
ス(Genetics),39巻,440(1954)〕,DH5
α〔Inoue,H., Nojima,H. and Okayama,H.,Gene,96,23-
28(1990)〕,DH10B〔プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A),87巻,4645−4649(1990)〕などが
用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス
・ズブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジー
ン,24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Bioch
emistry),95巻,87(1984)〕などが用いられ
る。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビ
シエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22
R-,NA87−11A,DKD−5D、20B−1
2、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomy
ces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピ
キア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられ
る。
【0035】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがA
cNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodop
tera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia ni
の中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM 細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがBmNPVの場合は、カイコ由来株化細胞(Bombyx
mori N;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞
としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf
21細胞(以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ(In V
ivo),13, 213-217,(1977))などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー(Nature),315巻,592(198
5)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−
7,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO(以
下、CHO細胞と略記)、dhfr遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞CHO(以下、CHO(dhf
r-)細胞と略記)、マウスL細胞,マウスAtT−2
0、マウスミエローマ細胞、ラットGH3、ヒトFL細
胞などが用いられる。
cNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodop
tera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia ni
の中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM 細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがBmNPVの場合は、カイコ由来株化細胞(Bombyx
mori N;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞
としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf
21細胞(以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ(In V
ivo),13, 213-217,(1977))などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー(Nature),315巻,592(198
5)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−
7,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO(以
下、CHO細胞と略記)、dhfr遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞CHO(以下、CHO(dhf
r-)細胞と略記)、マウスL細胞,マウスAtT−2
0、マウスミエローマ細胞、ラットGH3、ヒトFL細
胞などが用いられる。
【0036】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),69巻,2110
(1972)やジーン(Gene),17巻,107(198
2)などに記載の方法に従って行なうことができる。バ
チルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular
& General Genetics),168巻,111(1979)
などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を
形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイ
モロジー(Methods in Enzymology),194巻,18
2−187(1991)、プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A),75巻,1929(1978)などに記載の方法に
従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質
転換するには、例えば、バイオ/テクノロジー(Bio/Te
chnology), 6, 47-55(1988)などに記載の方法に従っ
て行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、
例えば、細胞工学別冊8新細胞工学実験プロトコール.
263−267(1995)(秀潤社発行)、ヴィロロ
ジー(Virology),52巻,456(1973)に記載
の方法に従って行なうことができる。このようにして、
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードする
DNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転
換体が得られる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属
菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培
地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転
換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含
有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコー
ス、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源と
しては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーン
スチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大
豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無
機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素
ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。ま
た、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),69巻,2110
(1972)やジーン(Gene),17巻,107(198
2)などに記載の方法に従って行なうことができる。バ
チルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular
& General Genetics),168巻,111(1979)
などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を
形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイ
モロジー(Methods in Enzymology),194巻,18
2−187(1991)、プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A),75巻,1929(1978)などに記載の方法に
従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質
転換するには、例えば、バイオ/テクノロジー(Bio/Te
chnology), 6, 47-55(1988)などに記載の方法に従っ
て行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、
例えば、細胞工学別冊8新細胞工学実験プロトコール.
263−267(1995)(秀潤社発行)、ヴィロロ
ジー(Virology),52巻,456(1973)に記載
の方法に従って行なうことができる。このようにして、
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードする
DNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転
換体が得られる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属
菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培
地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転
換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含
有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコー
ス、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源と
しては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーン
スチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大
豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無
機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素
ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。ま
た、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
【0037】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地
〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journa
l of Experiments in Molecular Genetics),431−
433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York1
972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、3β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で
約3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通
常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により
通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形
質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バーク
ホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),77巻,4505
(1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地
〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),
81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地の
pHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約
20℃〜35℃で約24〜72時間行ない、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地
〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journa
l of Experiments in Molecular Genetics),431−
433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York1
972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、3β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で
約3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通
常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により
通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形
質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バーク
ホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),77巻,4505
(1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地
〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),
81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地の
pHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約
20℃〜35℃で約24〜72時間行ない、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。
【0038】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m(Grace, T.C.C.,ネイチャー(Nature),195,788(196
2))に非動化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.
4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3
〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM
培地〔サイエンス(Science),122巻,501(19
52)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),
8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション(The Journal of the American Medica
l Association)199巻,519(1967)〕,19
9培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine),73
巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8
であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約
15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜ま
たは細胞外に本発明のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質を生成せしめることができる。
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m(Grace, T.C.C.,ネイチャー(Nature),195,788(196
2))に非動化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.
4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3
〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM
培地〔サイエンス(Science),122巻,501(19
52)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),
8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション(The Journal of the American Medica
l Association)199巻,519(1967)〕,19
9培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine),73
巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8
であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約
15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜ま
たは細胞外に本発明のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質を生成せしめることができる。
【0039】上記培養物から本発明のレセプタータンパ
ク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行
なうことができる。本発明のレセプタータンパク質を培
養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、
公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩
衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結
融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を
得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩
酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンX−
100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養
液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、培
養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分
離し、上清を集める。このようにして得られた培養上
清、あるいは抽出液中に含まれるレセプタータンパク質
の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。
ク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行
なうことができる。本発明のレセプタータンパク質を培
養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、
公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩
衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結
融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を
得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩
酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンX−
100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養
液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、培
養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分
離し、上清を集める。このようにして得られた培養上
清、あるいは抽出液中に含まれるレセプタータンパク質
の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。
【0040】かくして得られるレセプタータンパク質が
遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で
得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法
により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するレセプタータンパク質を、精
製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用さ
せることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチド
を部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素
としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アル
ギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリ
コシダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明
のレセプタータンパク質またはその塩の活性は、標識し
たリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイなどにより測定することができる。
遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で
得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法
により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するレセプタータンパク質を、精
製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用さ
せることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチド
を部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素
としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アル
ギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリ
コシダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明
のレセプタータンパク質またはその塩の活性は、標識し
たリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【0041】本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明の
レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたは
その塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩(以下、本発明のレセプタータンパク質等と略
記する場合がある)に対する抗体は、本発明のレセプタ
ータンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗
血清の製造法に従って製造することができる。
の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明の
レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたは
その塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩(以下、本発明のレセプタータンパク質等と略
記する場合がある)に対する抗体は、本発明のレセプタ
ータンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗
血清の製造法に従って製造することができる。
【0042】〔モノクローナル抗体の作製〕 (a)モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のレセプタータンパク質等は、哺乳動物に対して
投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用
いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イ
ヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げ
られるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を
免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認め
られた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓または
リンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨
髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中
の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタータ
ンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合し
た標識剤の活性を測定することにより行なうことができ
る。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー(Nature)、256巻、49
5頁(1975年)〕に従い実施することができる。融
合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール
(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好
ましくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としては、例
えば、NS−1、P3U1、SP2/0などが挙げられ
るが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体
産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比
率は1:1〜20:1程度であり、PEG(好ましく
は、PEG1000〜PEG6000)が10〜80%
程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約
30〜37℃で約1〜10分間インキュベートすること
により効率よく細胞融合を実施できる。
投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用
いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イ
ヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げ
られるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を
免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認め
られた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓または
リンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨
髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中
の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタータ
ンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合し
た標識剤の活性を測定することにより行なうことができ
る。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー(Nature)、256巻、49
5頁(1975年)〕に従い実施することができる。融
合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール
(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好
ましくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としては、例
えば、NS−1、P3U1、SP2/0などが挙げられ
るが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体
産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比
率は1:1〜20:1程度であり、PEG(好ましく
は、PEG1000〜PEG6000)が10〜80%
程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約
30〜37℃で約1〜10分間インキュベートすること
により効率よく細胞融合を実施できる。
【0043】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体
とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素
などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用い
られる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗
体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロ
ブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで
標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合し
たモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられ
る。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに
準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHA
T(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添
加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含
むRPMI1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含
むGIT培地(和光純薬工業(株))またはハイブリド
ーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬
(株))などを用いることができる。培養温度は、通常
20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間
は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間であ
る。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体
とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素
などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用い
られる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗
体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロ
ブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで
標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合し
たモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられ
る。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに
準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHA
T(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添
加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別
および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育でき
るものならばどのような培地を用いても良い。例えば、
1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含
むRPMI1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含
むGIT培地(和光純薬工業(株))またはハイブリド
ーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬
(株))などを用いることができる。培養温度は、通常
20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間
は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間であ
る。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【0044】(b)モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。
【0045】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
(本発明のタンパク質等の抗原)とキャリアータンパク
質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製
造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から
本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物を
採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造でき
る。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキ
ャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータン
パク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して
抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率
で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、
ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜2
0、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用
いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルア
ルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、
チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル
試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対し
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2
〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
(本発明のタンパク質等の抗原)とキャリアータンパク
質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製
造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から
本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物を
採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造でき
る。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキ
ャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータン
パク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して
抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率
で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、
ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜2
0、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用
いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルア
ルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、
チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル
試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対し
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2
〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。
【0046】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩、その部分ペプチドまたはその塩、および該レセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドをコードするDN
Aは、(1)本発明のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質に対するリガンド(アゴニスト)の決定、
(2)本発明のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療
剤、(3)遺伝子診断剤、(4)本発明のレセプタータ
ンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる
化合物のスクリーニング方法、(5)本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ
せる化合物を含有する各種疾病の予防および/または治
療剤、(6)本発明のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質に対するリガンドの定量法、(7)本発明のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの
結合性を変化させる化合物(アゴニスト、アンタゴニス
トなど)のスクリーニング方法、(8)本発明のGタン
パク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結合
性を変化させる化合物(アゴニスト、アンタゴニスト)
を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、
(9)本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドまたはその塩の定量、(10)細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、(1
1)細胞膜における本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する
各種疾病の予防および/または治療剤、(12)本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩に対する抗体による中和、(13)本発明のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするD
NAを有する非ヒト動物の作製などに用いることができ
る。特に、本発明の組換え型Gタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の発現系を用いたレセプター結合アッセ
イ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的な
Gタンパク質共役型レセプターに対するリガンドの結合
性を変化させる化合物(例、アゴニスト、アンタゴニス
トなど)をスクリーニングすることができ、該アゴニス
トまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤など
として使用することができる。本発明のレセプタータン
パク質もしくは部分ペプチドまたはその塩(以下、本発
明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある)、
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
をコードするDNA(以下、本発明のDNAと略記する
場合がある)および本発明のレセプタータンパク質等に
対する抗体(以下、本発明の抗体と略記する場合があ
る)の用途について、以下に具体的に説明する。
塩、その部分ペプチドまたはその塩、および該レセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドをコードするDN
Aは、(1)本発明のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質に対するリガンド(アゴニスト)の決定、
(2)本発明のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療
剤、(3)遺伝子診断剤、(4)本発明のレセプタータ
ンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる
化合物のスクリーニング方法、(5)本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ
せる化合物を含有する各種疾病の予防および/または治
療剤、(6)本発明のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質に対するリガンドの定量法、(7)本発明のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの
結合性を変化させる化合物(アゴニスト、アンタゴニス
トなど)のスクリーニング方法、(8)本発明のGタン
パク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結合
性を変化させる化合物(アゴニスト、アンタゴニスト)
を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、
(9)本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドまたはその塩の定量、(10)細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、(1
1)細胞膜における本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する
各種疾病の予防および/または治療剤、(12)本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩に対する抗体による中和、(13)本発明のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするD
NAを有する非ヒト動物の作製などに用いることができ
る。特に、本発明の組換え型Gタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の発現系を用いたレセプター結合アッセ
イ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的な
Gタンパク質共役型レセプターに対するリガンドの結合
性を変化させる化合物(例、アゴニスト、アンタゴニス
トなど)をスクリーニングすることができ、該アゴニス
トまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤など
として使用することができる。本発明のレセプタータン
パク質もしくは部分ペプチドまたはその塩(以下、本発
明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある)、
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
をコードするDNA(以下、本発明のDNAと略記する
場合がある)および本発明のレセプタータンパク質等に
対する抗体(以下、本発明の抗体と略記する場合があ
る)の用途について、以下に具体的に説明する。
【0047】(1)本発明のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質に対するリガンド(アゴニスト)の決定 本発明のレセプタータンパク質もしくはその塩または本
発明の部分ペプチドもしくはその塩は、本発明のレセプ
タータンパク質またはその塩に対するリガンド(アゴニ
スト)を探索し、または決定するための試薬として有用
である。すなわち、本発明は、本発明のレセプタータン
パク質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもし
くはその塩と、試験化合物とを接触させることを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドの
決定方法を提供する。試験化合物としては、公知のリガ
ンド(例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビ
ノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、
メラトニン、ニューロペプチドY、オピオイド、プリ
ン、バソプレッシン、オキシトシン、PACAP(例、
PACAP27,PACAP38)、セクレチン、グル
カゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトス
タチン、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PT
H、VIP(バソアクティブ インテスティナル アン
ドリレイテッド ポリペプチド)、ソマトスタチン、ド
ーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、CGR
P(カルシトニンジーンリレーティッドペプチド)、ロ
イコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモ
カインスーパーファミリー(例、IL−8,GROα,
GROβ,GROγ,NAP−2,ENA−78,GC
P−2,PF4,IP−10,Mig,PBSF/SD
F−1などのCXCケモカインサブファミリー;MCA
F/MCP−1,MCP−2,MCP−3,MCP−
4,eotaxin,RANTES,MIP−1α、M
IP−1β,HCC−1,MIP−3α/LARC、M
IP−3β/ELC,I−309,TARC,MIPF
−1,MIPF−2/eotaxin−2,MDC,D
C−CK1/PARC,SLCなどのCCケモカインサ
ブファミリー;lymphotactinなどのCケモ
カインサブファミリー;fractalkineなどの
CX3Cケモカインサブファミリー等)、エンドセリ
ン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシ
ン、TRH、パンクレアティックポリペプタイド、ガラ
ニン、リゾホスファチジン酸(LPA)、スフィンゴシ
ン1−リン酸など)の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動
物(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サ
ルなど)の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられ
る。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などを本発明
のレセプタータンパク質に添加し、細胞刺激活性などを
測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得るこ
とができる。
タータンパク質に対するリガンド(アゴニスト)の決定 本発明のレセプタータンパク質もしくはその塩または本
発明の部分ペプチドもしくはその塩は、本発明のレセプ
タータンパク質またはその塩に対するリガンド(アゴニ
スト)を探索し、または決定するための試薬として有用
である。すなわち、本発明は、本発明のレセプタータン
パク質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもし
くはその塩と、試験化合物とを接触させることを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドの
決定方法を提供する。試験化合物としては、公知のリガ
ンド(例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビ
ノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、
メラトニン、ニューロペプチドY、オピオイド、プリ
ン、バソプレッシン、オキシトシン、PACAP(例、
PACAP27,PACAP38)、セクレチン、グル
カゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトス
タチン、GHRH、CRF、ACTH、GRP、PT
H、VIP(バソアクティブ インテスティナル アン
ドリレイテッド ポリペプチド)、ソマトスタチン、ド
ーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、CGR
P(カルシトニンジーンリレーティッドペプチド)、ロ
イコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモ
カインスーパーファミリー(例、IL−8,GROα,
GROβ,GROγ,NAP−2,ENA−78,GC
P−2,PF4,IP−10,Mig,PBSF/SD
F−1などのCXCケモカインサブファミリー;MCA
F/MCP−1,MCP−2,MCP−3,MCP−
4,eotaxin,RANTES,MIP−1α、M
IP−1β,HCC−1,MIP−3α/LARC、M
IP−3β/ELC,I−309,TARC,MIPF
−1,MIPF−2/eotaxin−2,MDC,D
C−CK1/PARC,SLCなどのCCケモカインサ
ブファミリー;lymphotactinなどのCケモ
カインサブファミリー;fractalkineなどの
CX3Cケモカインサブファミリー等)、エンドセリ
ン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシ
ン、TRH、パンクレアティックポリペプタイド、ガラ
ニン、リゾホスファチジン酸(LPA)、スフィンゴシ
ン1−リン酸など)の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動
物(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サ
ルなど)の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられ
る。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などを本発明
のレセプタータンパク質に添加し、細胞刺激活性などを
測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得るこ
とができる。
【0048】具体的には、本発明のリガンド決定方法
は、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペ
プチドもしくはその塩を用いるか、または組換え型レセ
プタータンパク質の発現系を構築し、該発現系を用いた
レセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発
明のレセプタータンパク質に結合して細胞刺激活性(例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
タンパク質のリン酸化、c−fos活性化、pHの低下
などを促進する活性または抑制する活性)を有する化合
物(例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物など)またはその塩を決定
する方法である。本発明のリガンド決定方法において
は、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプ
チドと試験化合物とを接触させた場合の、例えば、該レ
セプタータンパク質または該部分ペプチドに対する試験
化合物の結合量や、細胞刺激活性などを測定することを
特徴とする。
は、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペ
プチドもしくはその塩を用いるか、または組換え型レセ
プタータンパク質の発現系を構築し、該発現系を用いた
レセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発
明のレセプタータンパク質に結合して細胞刺激活性(例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
タンパク質のリン酸化、c−fos活性化、pHの低下
などを促進する活性または抑制する活性)を有する化合
物(例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物など)またはその塩を決定
する方法である。本発明のリガンド決定方法において
は、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプ
チドと試験化合物とを接触させた場合の、例えば、該レ
セプタータンパク質または該部分ペプチドに対する試験
化合物の結合量や、細胞刺激活性などを測定することを
特徴とする。
【0049】より具体的には、本発明は、 標識した試験化合物を、本発明のレセプタータンパク
質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしくは
その塩に接触させた場合における、標識した試験化合物
の該タンパク質もしくはその塩、または該部分ペプチド
もしくはその塩に対する結合量を測定することを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対す
るリガンドの決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のレセプタータンパク
質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合における、標識した試験化合物の該細胞または該膜画
分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明の
レセプタータンパク質またはその塩に対するリガンドの
決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のレセプタータンパク
質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養する
ことによって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質
に接触させた場合における、標識した試験化合物の該レ
セプタータンパク質またはその塩に対する結合量を測定
することを特徴とする本発明のレセプタータンパク質に
対するリガンドの決定方法、
質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしくは
その塩に接触させた場合における、標識した試験化合物
の該タンパク質もしくはその塩、または該部分ペプチド
もしくはその塩に対する結合量を測定することを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対す
るリガンドの決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のレセプタータンパク
質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合における、標識した試験化合物の該細胞または該膜画
分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明の
レセプタータンパク質またはその塩に対するリガンドの
決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のレセプタータンパク
質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養する
ことによって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質
に接触させた場合における、標識した試験化合物の該レ
セプタータンパク質またはその塩に対する結合量を測定
することを特徴とする本発明のレセプタータンパク質に
対するリガンドの決定方法、
【0050】試験化合物を、本発明のレセプタータン
パク質を含有する細胞に接触させた場合における、レセ
プタータンパク質を介した細胞刺激活性(例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊
離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質
のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを促
進する活性または抑制する活性など)を測定することを
特徴とする本発明のレセプタータンパク質またはその塩
に対するリガンドの決定方法、および 試験化合物を、本発明のレセプタータンパク質をコー
ドするDNAを含有する形質転換体を培養することによ
って細胞膜上に発現したレセプタータンパク質に接触さ
せた場合における、レセプタータンパク質を介する細胞
刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内
cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を測定することを特徴とする本発明のレセプター
タンパク質またはその塩に対するリガンドの決定方法を
提供する。特に、上記〜の試験を行ない、試験化合
物が本発明のレセプタータンパク質に結合することを確
認した後に、上記〜の試験を行なうことが好まし
い。
パク質を含有する細胞に接触させた場合における、レセ
プタータンパク質を介した細胞刺激活性(例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊
離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質
のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを促
進する活性または抑制する活性など)を測定することを
特徴とする本発明のレセプタータンパク質またはその塩
に対するリガンドの決定方法、および 試験化合物を、本発明のレセプタータンパク質をコー
ドするDNAを含有する形質転換体を培養することによ
って細胞膜上に発現したレセプタータンパク質に接触さ
せた場合における、レセプタータンパク質を介する細胞
刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内
cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を測定することを特徴とする本発明のレセプター
タンパク質またはその塩に対するリガンドの決定方法を
提供する。特に、上記〜の試験を行ない、試験化合
物が本発明のレセプタータンパク質に結合することを確
認した後に、上記〜の試験を行なうことが好まし
い。
【0051】まず、リガンド決定方法に用いるレセプタ
ータンパク質としては、上記した本発明のレセプタータ
ンパク質または本発明の部分ペプチドを含有するもので
あれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて
大量発現させたレセプタータンパク質が適している。本
発明のレセプタータンパク質を製造するには、上記の発
現方法が用いられるが、該レセプタータンパク質をコー
ドするDNAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現すること
により行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部
分をコードするDNA断片には、通常、相補DNAが用
いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。
例えば、遺伝子断片や合成DNAを用いてもよい。本発
明のレセプタータンパク質をコードするDNA断片を宿
主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるため
には、該DNA断片を昆虫を宿主とするバキュロウイル
スに属する核多角体病ウイルス(nuclear polyhedrosis
virus;NPV)のポリヘドリンプロモーター、SV4
0由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショッ
クプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、
SRαプロモーターなどの下流に組み込むのが好まし
い。発現したレセプターの量と質の検査は公知の方法で
行うことができる。例えば、文献〔Nambi,P.ら、ザ・
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.
Biol. Chem.),267巻,19555〜19559
頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。
ータンパク質としては、上記した本発明のレセプタータ
ンパク質または本発明の部分ペプチドを含有するもので
あれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて
大量発現させたレセプタータンパク質が適している。本
発明のレセプタータンパク質を製造するには、上記の発
現方法が用いられるが、該レセプタータンパク質をコー
ドするDNAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現すること
により行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部
分をコードするDNA断片には、通常、相補DNAが用
いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。
例えば、遺伝子断片や合成DNAを用いてもよい。本発
明のレセプタータンパク質をコードするDNA断片を宿
主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるため
には、該DNA断片を昆虫を宿主とするバキュロウイル
スに属する核多角体病ウイルス(nuclear polyhedrosis
virus;NPV)のポリヘドリンプロモーター、SV4
0由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショッ
クプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、
SRαプロモーターなどの下流に組み込むのが好まし
い。発現したレセプターの量と質の検査は公知の方法で
行うことができる。例えば、文献〔Nambi,P.ら、ザ・
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.
Biol. Chem.),267巻,19555〜19559
頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。
【0052】したがって、本発明のリガンド決定方法に
おいて、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部
分ペプチドまたはその塩を含有するものとしては、公知
の方法に従って精製したレセプタータンパク質もしくは
その部分ペプチドまたはその塩であってもよいし、該レ
セプタータンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画
分を用いてもよい。本発明のリガンド決定方法におい
て、本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞を用
いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンな
どで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従っ
て行なうことができる。本発明のレセプタータンパク質
を含有する細胞としては、本発明のレセプタータンパク
質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、
大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用い
られる。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知
の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをい
う。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモ
ジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダ
ーやポリトロン(Kinematica社製)による破砕、超音波
による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を
細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げら
れる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠
心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速(500rpm〜300
0rpm)で短時間(通常、約1分〜10分)遠心し、
上清をさらに高速(15000rpm〜30000rp
m)で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパ
ク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分
が多く含まれる。
おいて、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部
分ペプチドまたはその塩を含有するものとしては、公知
の方法に従って精製したレセプタータンパク質もしくは
その部分ペプチドまたはその塩であってもよいし、該レ
セプタータンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画
分を用いてもよい。本発明のリガンド決定方法におい
て、本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞を用
いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンな
どで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従っ
て行なうことができる。本発明のレセプタータンパク質
を含有する細胞としては、本発明のレセプタータンパク
質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、
大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用い
られる。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知
の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをい
う。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモ
ジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダ
ーやポリトロン(Kinematica社製)による破砕、超音波
による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を
細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げら
れる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠
心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速(500rpm〜300
0rpm)で短時間(通常、約1分〜10分)遠心し、
上清をさらに高速(15000rpm〜30000rp
m)で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパ
ク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分
が多く含まれる。
【0053】該レセプタータンパク質を含有する細胞や
その膜画分中のレセプタータンパク質の量は、1細胞当
たり103〜108分子であるのが好ましく、105〜1
07分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほ
ど膜画分当たりのリガンド結合活性(比活性)が高くな
り、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか
りでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるように
なる。本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対
するリガンドを決定する上記の〜の方法を実施する
ためには、適当なレセプタータンパク質画分と、標識し
た試験化合物が必要である。レセプタータンパク質画分
としては、天然型のレセプタータンパク質画分か、また
はそれと同等の活性を有する組換え型レセプター画分な
どが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガン
ド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識し
た試験化合物としては、〔3H〕、〔125I〕、
〔14C〕、〔35S〕などで標識したアンギオテンシン、
ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタ
ミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドY、
オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、
PACAP(例、PACAP27,PACAP38)、
セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジ
ュリン、ソマトスタチン、GHRH、CRF、ACT
H、GRP、PTH、VIP(バソアクティブ インテ
スティナル アンド リイテッド ポリペプチド)、ソ
マトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラ
ジキニン、CGRP(カルシトニンジーンリレーティッ
ドペプチド)、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、
プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、ア
ドレナリン、ケモカインスーパーファミリー(例、IL
−8,GROα,GROβ,GROγ,NAP−2,E
NA−78,GCP−2,PF4,IP−10,Mi
g,PBSF/SDF−1などのCXCケモカインサブ
ファミリー;MCAF/MCP−1,MCP−2,MC
P−3,MCP−4,eotaxin,RANTES,
MIP−1α、MIP−1β,HCC−1,MIP−3
α/LARC、MIP−3β/ELC,I−309,T
ARC,MIPF−1,MIPF−2/eotaxin
−2,MDC,DC−CK1/PARC,SLCなどの
CCケモカインサブファミリー;lymphotact
inなどのCケモカインサブファミリー;fracta
lkineなどのCX3Cケモカインサブファミリー
等)、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、TRH、パンクレアティックポ
リペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸(LP
A)、スフィンゴシン1−リン酸などが好適である。
その膜画分中のレセプタータンパク質の量は、1細胞当
たり103〜108分子であるのが好ましく、105〜1
07分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほ
ど膜画分当たりのリガンド結合活性(比活性)が高くな
り、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか
りでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるように
なる。本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対
するリガンドを決定する上記の〜の方法を実施する
ためには、適当なレセプタータンパク質画分と、標識し
た試験化合物が必要である。レセプタータンパク質画分
としては、天然型のレセプタータンパク質画分か、また
はそれと同等の活性を有する組換え型レセプター画分な
どが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガン
ド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識し
た試験化合物としては、〔3H〕、〔125I〕、
〔14C〕、〔35S〕などで標識したアンギオテンシン、
ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタ
ミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドY、
オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、
PACAP(例、PACAP27,PACAP38)、
セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジ
ュリン、ソマトスタチン、GHRH、CRF、ACT
H、GRP、PTH、VIP(バソアクティブ インテ
スティナル アンド リイテッド ポリペプチド)、ソ
マトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラ
ジキニン、CGRP(カルシトニンジーンリレーティッ
ドペプチド)、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、
プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、ア
ドレナリン、ケモカインスーパーファミリー(例、IL
−8,GROα,GROβ,GROγ,NAP−2,E
NA−78,GCP−2,PF4,IP−10,Mi
g,PBSF/SDF−1などのCXCケモカインサブ
ファミリー;MCAF/MCP−1,MCP−2,MC
P−3,MCP−4,eotaxin,RANTES,
MIP−1α、MIP−1β,HCC−1,MIP−3
α/LARC、MIP−3β/ELC,I−309,T
ARC,MIPF−1,MIPF−2/eotaxin
−2,MDC,DC−CK1/PARC,SLCなどの
CCケモカインサブファミリー;lymphotact
inなどのCケモカインサブファミリー;fracta
lkineなどのCX3Cケモカインサブファミリー
等)、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、TRH、パンクレアティックポ
リペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸(LP
A)、スフィンゴシン1−リン酸などが好適である。
【0054】具体的には、本発明のレセプタータンパク
質またはその塩に対するリガンドの決定方法を行なうに
は、まず本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞
または細胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに
懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッフ
ァーには、pH4〜10(望ましくはpH6〜8)のリ
ン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガン
ドとレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッフ
ァーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低
減させる目的で、CHAPS、Tween−80TM(花
王−アトラス社)、ジギトニン、デオキシコレートなど
の界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各
種タンパク質をバッファーに加えることもできる。さら
に、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を
抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E−64(ペプ
チド研究所製)、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害
剤を添加することもできる。0.01ml〜10mlの
該レセプター溶液に、一定量(5000cpm〜500
000cpm)の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35
S〕などで標識した試験化合物を共存させる。非特異的
結合量(NSB)を知るために大過剰の未標識の試験化
合物を加えた反応チューブも用意する。反応は約0℃〜
50℃、望ましくは約4℃〜37℃で、約20分〜24
時間、望ましくは約30分〜3時間行なう。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチ
レーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測す
る。全結合量(B)から非特異的結合量(NSB)を引
いたカウント(B−NSB)が0cpmを越える試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対
するリガンド(アゴニスト)として選択することができ
る。
質またはその塩に対するリガンドの決定方法を行なうに
は、まず本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞
または細胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに
懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッフ
ァーには、pH4〜10(望ましくはpH6〜8)のリ
ン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガン
ドとレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッフ
ァーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低
減させる目的で、CHAPS、Tween−80TM(花
王−アトラス社)、ジギトニン、デオキシコレートなど
の界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各
種タンパク質をバッファーに加えることもできる。さら
に、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を
抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E−64(ペプ
チド研究所製)、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害
剤を添加することもできる。0.01ml〜10mlの
該レセプター溶液に、一定量(5000cpm〜500
000cpm)の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35
S〕などで標識した試験化合物を共存させる。非特異的
結合量(NSB)を知るために大過剰の未標識の試験化
合物を加えた反応チューブも用意する。反応は約0℃〜
50℃、望ましくは約4℃〜37℃で、約20分〜24
時間、望ましくは約30分〜3時間行なう。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチ
レーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測す
る。全結合量(B)から非特異的結合量(NSB)を引
いたカウント(B−NSB)が0cpmを越える試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対
するリガンド(アゴニスト)として選択することができ
る。
【0055】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に対するリガンドを決定する上記の〜の方法を実
施するためには、該レセプタータンパク質を介する細胞
刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内
cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を公知の方法または市販の測定用キットを用いて
測定することができる。具体的には、まず、レセプター
タンパク質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に
培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前もって
新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッフ
ァーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間イン
キュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収し
て、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。
細胞刺激活性の指標とする物質(例えば、アラキドン酸
など)の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定
困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してア
ッセイを行なってもよい。また、cAMP産生抑制など
の活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的
産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用と
して検出することができる。
塩に対するリガンドを決定する上記の〜の方法を実
施するためには、該レセプタータンパク質を介する細胞
刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内
cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を公知の方法または市販の測定用キットを用いて
測定することができる。具体的には、まず、レセプター
タンパク質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に
培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前もって
新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッフ
ァーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間イン
キュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収し
て、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。
細胞刺激活性の指標とする物質(例えば、アラキドン酸
など)の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定
困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してア
ッセイを行なってもよい。また、cAMP産生抑制など
の活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的
産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用と
して検出することができる。
【0056】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に結合するリガンド決定用キットは、本発明のレセプ
タータンパク質もしくはその塩、本発明の部分ペプチド
もしくはその塩、本発明のレセプタータンパク質を含有
する細胞、または本発明のレセプタータンパク質を含有
する細胞の膜画分などを含有するものである。本発明の
リガンド決定用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 1.リガンド決定用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution(ギブコ社製)に、0.
05%のウシ血清アルブミン(シグマ社製)を加えたも
の。孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたCHO細胞
を、12穴プレートに5×105個/穴で継代し、37
℃、5%CO2、95%airで2日間培養したもの。 標識試験化合物 市販の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの水
溶液の状態のものを4℃あるいは−20℃にて保存し、
用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。水に難溶性
を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミド、
DMSO、メタノール等に溶解する。 非標識試験化合物 標識化合物と同じものを100〜1000倍濃い濃度に
調製する。
塩に結合するリガンド決定用キットは、本発明のレセプ
タータンパク質もしくはその塩、本発明の部分ペプチド
もしくはその塩、本発明のレセプタータンパク質を含有
する細胞、または本発明のレセプタータンパク質を含有
する細胞の膜画分などを含有するものである。本発明の
リガンド決定用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 1.リガンド決定用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution(ギブコ社製)に、0.
05%のウシ血清アルブミン(シグマ社製)を加えたも
の。孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたCHO細胞
を、12穴プレートに5×105個/穴で継代し、37
℃、5%CO2、95%airで2日間培養したもの。 標識試験化合物 市販の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの水
溶液の状態のものを4℃あるいは−20℃にて保存し、
用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。水に難溶性
を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミド、
DMSO、メタノール等に溶解する。 非標識試験化合物 標識化合物と同じものを100〜1000倍濃い濃度に
調製する。
【0057】2.測定法 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセ
プタータンパク質発現CHO細胞を、測定用緩衝液1m
lで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴
に加える。 標識試験化合物を5μl加え、室温にて1時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を5μl加えておく。 反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を0.2N NaO
H−1%SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーター
A(和光純薬製)と混合する。 液体シンチレーションカウンター(ベックマン社製)
を用いて放射活性を測定する。
プタータンパク質発現CHO細胞を、測定用緩衝液1m
lで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴
に加える。 標識試験化合物を5μl加え、室温にて1時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を5μl加えておく。 反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を0.2N NaO
H−1%SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーター
A(和光純薬製)と混合する。 液体シンチレーションカウンター(ベックマン社製)
を用いて放射活性を測定する。
【0058】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に結合することができるリガンドとしては、例えば、
心臓、肺、胃、小腸、胸腺、卵巣、副腎、白血球、精
巣、脳下垂体、膵臓、脾臓、前立腺、子宮、網膜、脂肪
細胞、骨髄、乳腺などに特異的に存在する物質などが挙
げられ、具体的には、アンギオテンシン、ボンベシン、
カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロト
ニン、メラトニン、ニューロペプチドY、オピオイド、
プリン、バソプレッシン、オキシトシン、PACAP
(例、PACAP27,PACAP38)、セクレチ
ン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、
ソマトスタチン、GHRH、CRF、ACTH、GR
P、PTH、VIP(バソアクティブ インテスティナ
ル アンド リレイテッド ポリペプチド)、ソマトス
タチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニ
ン、CGRP(カルシトニンジーンリレーティッドペプ
チド)、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロス
タグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナ
リン、ケモカインスーパーファミリー(例、IL−8,
GROα,GROβ,GROγ,NAP−2,ENA−
78,GCP−2,PF4,IP−10,Mig,PB
SF/SDF−1などのCXCケモカインサブファミリ
ー;MCAF/MCP−1,MCP−2,MCP−3,
MCP−4,eotaxin,RANTES,MIP−
1α、MIP−1β,HCC−1,MIP−3α/LA
RC、MIP−3β/ELC,I−309,TARC,
MIPF−1,MIPF−2/eotaxin−2,M
DC,DC−CK1/PARC,SLCなどのCCケモ
カインサブファミリー;lymphotactinなど
のCケモカインサブファミリー;fractalkin
eなどのCX3Cケモカインサブファミリー等)、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、TRH、パンクレアティックポリペプタイ
ド、ガラニン、リゾホスファチジン酸(LPA)、スフ
ィンゴシン1−リン酸などが用いられる。
塩に結合することができるリガンドとしては、例えば、
心臓、肺、胃、小腸、胸腺、卵巣、副腎、白血球、精
巣、脳下垂体、膵臓、脾臓、前立腺、子宮、網膜、脂肪
細胞、骨髄、乳腺などに特異的に存在する物質などが挙
げられ、具体的には、アンギオテンシン、ボンベシン、
カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロト
ニン、メラトニン、ニューロペプチドY、オピオイド、
プリン、バソプレッシン、オキシトシン、PACAP
(例、PACAP27,PACAP38)、セクレチ
ン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、
ソマトスタチン、GHRH、CRF、ACTH、GR
P、PTH、VIP(バソアクティブ インテスティナ
ル アンド リレイテッド ポリペプチド)、ソマトス
タチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニ
ン、CGRP(カルシトニンジーンリレーティッドペプ
チド)、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロス
タグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナ
リン、ケモカインスーパーファミリー(例、IL−8,
GROα,GROβ,GROγ,NAP−2,ENA−
78,GCP−2,PF4,IP−10,Mig,PB
SF/SDF−1などのCXCケモカインサブファミリ
ー;MCAF/MCP−1,MCP−2,MCP−3,
MCP−4,eotaxin,RANTES,MIP−
1α、MIP−1β,HCC−1,MIP−3α/LA
RC、MIP−3β/ELC,I−309,TARC,
MIPF−1,MIPF−2/eotaxin−2,M
DC,DC−CK1/PARC,SLCなどのCCケモ
カインサブファミリー;lymphotactinなど
のCケモカインサブファミリー;fractalkin
eなどのCX3Cケモカインサブファミリー等)、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、TRH、パンクレアティックポリペプタイ
ド、ガラニン、リゾホスファチジン酸(LPA)、スフ
ィンゴシン1−リン酸などが用いられる。
【0059】(2)本発明のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および
/または治療剤 上記(1)の方法において、本発明のレセプタータンパ
ク質に対するリガンドが明らかになれば、該リガンドが
有する作用に応じて、本発明のレセプタータンパク質
または該レセプタータンパク質をコードするDNA
を、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連す
る疾患の予防および/または治療剤などの医薬として使
用することができる。例えば、生体内において本発明の
レセプタータンパク質が減少しているためにリガンドの
生理作用が期待できない(該レセプタータンパク質の欠
乏症)患者がいる場合に、本発明のレセプタータンパ
ク質を該患者に投与し該レセプタータンパク質の量を補
充したり、(イ)本発明のレセプタータンパク質をコ
ードするDNAを該患者に投与し発現させることによっ
て、あるいは(ロ)対象となる細胞に本発明のレセプタ
ータンパク質をコードするDNAを挿入し発現させた後
に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者
の体内におけるレセプタータンパク質の量を増加させ、
リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すな
わち、本発明のレセプタータンパク質をコードするDN
Aは、安全で低毒性な本発明のレセプタータンパク質の
機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤と
して有用である。本発明のレセプタータンパク質は、G
タンパク質共役型レセプタータンパク質であるHE6レ
セプター(DNA AND CELL BIOLOGY 16:379-389, 1997)
にアミノ酸配列レベルで、約35%程度の相同性が認め
られる新規7回膜貫通型レセプタータンパク質である。
本発明のレセプタータンパク質または該レセプタータン
パク質をコードするDNAは例えば、中枢疾患(例え
ば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など)、内分泌
疾患(例えば、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異
常、下垂体機能異常など)、代謝疾患(例えば、糖尿病、
脂質代謝異常、高脂血症など)、癌(例えば、非小細胞
肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸
部癌、結腸癌、直腸癌など)、心疾患(例えば、狭心
症、心筋梗塞など)、呼吸器系疾患(例えば、気道閉塞
性疾患、感染性肺疾患など)、消化器系疾患(例えば、
潰瘍、ポリポーシスなど)、免疫系疾患(例えば、全身
性エリテマトーデス、リウマチ性疾患など)、感染症
(例えば、免疫機能不全、肺炎、インフルエンザなど)
などの予防および/または治療に有用である。本発明の
レセプタータンパク質を上記予防・治療剤として使用す
る場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のレセプタータンパク質をコードするDN
A(以下、本発明のDNAと略記する場合がある)を上
記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のDNA
を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルス
ベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段
に従って実施することができる。本発明のDNAは、そ
のままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、
遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテル
によって投与できる。例えば、本発明のレセプタータ
ンパク質または該レセプタータンパク質をコードする
DNAは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、本発明のレセプタ
ータンパク質または該レセプタータンパク質をコード
するDNAを生理学的に認められる公知の担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
用量が得られるようにするものである。
タータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および
/または治療剤 上記(1)の方法において、本発明のレセプタータンパ
ク質に対するリガンドが明らかになれば、該リガンドが
有する作用に応じて、本発明のレセプタータンパク質
または該レセプタータンパク質をコードするDNA
を、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連す
る疾患の予防および/または治療剤などの医薬として使
用することができる。例えば、生体内において本発明の
レセプタータンパク質が減少しているためにリガンドの
生理作用が期待できない(該レセプタータンパク質の欠
乏症)患者がいる場合に、本発明のレセプタータンパ
ク質を該患者に投与し該レセプタータンパク質の量を補
充したり、(イ)本発明のレセプタータンパク質をコ
ードするDNAを該患者に投与し発現させることによっ
て、あるいは(ロ)対象となる細胞に本発明のレセプタ
ータンパク質をコードするDNAを挿入し発現させた後
に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者
の体内におけるレセプタータンパク質の量を増加させ、
リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すな
わち、本発明のレセプタータンパク質をコードするDN
Aは、安全で低毒性な本発明のレセプタータンパク質の
機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤と
して有用である。本発明のレセプタータンパク質は、G
タンパク質共役型レセプタータンパク質であるHE6レ
セプター(DNA AND CELL BIOLOGY 16:379-389, 1997)
にアミノ酸配列レベルで、約35%程度の相同性が認め
られる新規7回膜貫通型レセプタータンパク質である。
本発明のレセプタータンパク質または該レセプタータン
パク質をコードするDNAは例えば、中枢疾患(例え
ば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など)、内分泌
疾患(例えば、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異
常、下垂体機能異常など)、代謝疾患(例えば、糖尿病、
脂質代謝異常、高脂血症など)、癌(例えば、非小細胞
肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸
部癌、結腸癌、直腸癌など)、心疾患(例えば、狭心
症、心筋梗塞など)、呼吸器系疾患(例えば、気道閉塞
性疾患、感染性肺疾患など)、消化器系疾患(例えば、
潰瘍、ポリポーシスなど)、免疫系疾患(例えば、全身
性エリテマトーデス、リウマチ性疾患など)、感染症
(例えば、免疫機能不全、肺炎、インフルエンザなど)
などの予防および/または治療に有用である。本発明の
レセプタータンパク質を上記予防・治療剤として使用す
る場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のレセプタータンパク質をコードするDN
A(以下、本発明のDNAと略記する場合がある)を上
記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のDNA
を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルス
ベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段
に従って実施することができる。本発明のDNAは、そ
のままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、
遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテル
によって投与できる。例えば、本発明のレセプタータ
ンパク質または該レセプタータンパク質をコードする
DNAは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、本発明のレセプタ
ータンパク質または該レセプタータンパク質をコード
するDNAを生理学的に認められる公知の担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
用量が得られるようにするものである。
【0060】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩
化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアル
コール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート
80TM、HCO−50)などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩
化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアル
コール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート
80TM、HCO−50)などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【0061】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物(例
えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができ
る。本発明のレセプタータンパク質の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(60k
gとして)においては、一日につき約0.1mg〜10
0mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましく
は約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合
は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では
通常例えば、癌患者(60kgとして)においては、一
日につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.
1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与する
ことができる。本発明のDNAの投与量は、投与対象、
対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経
口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(60kgとし
て)においては、一日につき約0.1mg〜100m
g、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約
1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、
その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌患者(60kgとして)においては、一日に
つき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜
20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、60kg当たりに換算した量を投与すること
ができる。
剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物(例
えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができ
る。本発明のレセプタータンパク質の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(60k
gとして)においては、一日につき約0.1mg〜10
0mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましく
は約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合
は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では
通常例えば、癌患者(60kgとして)においては、一
日につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.
1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与する
ことができる。本発明のDNAの投与量は、投与対象、
対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経
口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(60kgとし
て)においては、一日につき約0.1mg〜100m
g、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約
1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、
その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌患者(60kgとして)においては、一日に
つき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜
20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、60kg当たりに換算した量を投与すること
ができる。
【0062】(3)遺伝子診断剤 本発明のDNAは、プローブとして使用することによ
り、ヒトまたはその他の哺乳動物(例えば、ラット、マ
ウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル
など)における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドをコードするDNAまたはmRNAの異
常(遺伝子異常)を検出することができるので、例え
ば、該DNAまたはmRNAの損傷、突然変異あるいは
発現低下や、該DNAまたはmRNAの増加あるいは発
現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明の
DNAを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノ
ーザンハイブリダイゼーションやPCR−SSCP法
(ゲノミックス(Genomics),第5巻,874〜879
頁(1989年)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユ
ーエスエー(Proceedings of theNational Academy of
Sciences of the United States of America),第86
巻,2766〜2770頁(1989年))などにより
実施することができる。
り、ヒトまたはその他の哺乳動物(例えば、ラット、マ
ウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル
など)における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドをコードするDNAまたはmRNAの異
常(遺伝子異常)を検出することができるので、例え
ば、該DNAまたはmRNAの損傷、突然変異あるいは
発現低下や、該DNAまたはmRNAの増加あるいは発
現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明の
DNAを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノ
ーザンハイブリダイゼーションやPCR−SSCP法
(ゲノミックス(Genomics),第5巻,874〜879
頁(1989年)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユ
ーエスエー(Proceedings of theNational Academy of
Sciences of the United States of America),第86
巻,2766〜2770頁(1989年))などにより
実施することができる。
【0063】(4)本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスク
リーニング方法 本発明のDNAは、プローブとして用いることにより、
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いる
ことができる。すなわち、本発明は、例えば、(i)非
ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器から単離
した組織もしくは細胞、または(ii)形質転換体等に含
まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドのmRNA量を測定することによる、本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を
変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスク
リーニング方法 本発明のDNAは、プローブとして用いることにより、
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いる
ことができる。すなわち、本発明は、例えば、(i)非
ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器から単離
した組織もしくは細胞、または(ii)形質転換体等に含
まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドのmRNA量を測定することによる、本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を
変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【0064】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドのmRNA量の測定は具体的には以下のよ
うにして行なう。 (i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物(例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど)に対して、
薬剤(例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など)あるいは物理的ストレス(例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など)などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器(例え
ば、脳、肺、大腸など)、または臓器から単離した組
織、あるいは細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発
明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのm
RNAは、例えば、通常の方法により細胞等からmRN
Aを抽出し、例えば、TaqManPCRなどの手法を
用いることにより定量することができ、公知の手段によ
りノザンブロットを行うことにより解析することもでき
る。 (ii)本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製
し、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドのmRNAを同様にして定
量、解析することができる。
部分ペプチドのmRNA量の測定は具体的には以下のよ
うにして行なう。 (i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物(例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど)に対して、
薬剤(例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など)あるいは物理的ストレス(例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など)などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器(例え
ば、脳、肺、大腸など)、または臓器から単離した組
織、あるいは細胞を得る。得られた細胞に含まれる本発
明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのm
RNAは、例えば、通常の方法により細胞等からmRN
Aを抽出し、例えば、TaqManPCRなどの手法を
用いることにより定量することができ、公知の手段によ
りノザンブロットを行うことにより解析することもでき
る。 (ii)本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製
し、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドのmRNAを同様にして定
量、解析することができる。
【0065】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニ
ングは、(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物
に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一
定時間前(30分前〜24時間前、好ましくは30分前
〜12時間前、より好ましくは1時間前〜6時間前)も
しくは一定時間後(30分後〜3日後、好ましくは1時
間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間
後)、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検
化合物を投与し、投与後一定時間経過後(30分後〜3
日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1
時間後〜24時間後)、細胞に含まれる本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドのmRNA量を
定量、解析することにより行なうことができ、(ii)形
質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中
に混合させ、一定時間培養後(1日後〜7日後、好まし
くは1日後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日
後)、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータン
パク質またはその部分ペプチドのmRNA量を定量、解
析することにより行なうことができる。
部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニ
ングは、(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物
に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一
定時間前(30分前〜24時間前、好ましくは30分前
〜12時間前、より好ましくは1時間前〜6時間前)も
しくは一定時間後(30分後〜3日後、好ましくは1時
間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間
後)、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検
化合物を投与し、投与後一定時間経過後(30分後〜3
日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1
時間後〜24時間後)、細胞に含まれる本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドのmRNA量を
定量、解析することにより行なうことができ、(ii)形
質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中
に混合させ、一定時間培養後(1日後〜7日後、好まし
くは1日後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日
後)、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータン
パク質またはその部分ペプチドのmRNA量を定量、解
析することにより行なうことができる。
【0066】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩は、本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用
を有する化合物であり、具体的には、(イ)本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を
増加させることにより、Gタンパク質共役型レセプター
を介する細胞刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP
生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−f
osの活性化、pHの低下などを促進する活性または抑
制する活性など)を増強させる化合物、(ロ)本発明の
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量
を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる
化合物である。該化合物としては、ペプチド、タンパク
質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など
が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよ
いし、公知の化合物であってもよい。該細胞刺激活性を
増強させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等
の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として
有用である。該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本
発明のレセプタータンパク質等の生理活性を減少させる
ための安全で低毒性な医薬として有用である。
れる化合物またはその塩は、本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用
を有する化合物であり、具体的には、(イ)本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を
増加させることにより、Gタンパク質共役型レセプター
を介する細胞刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP
生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−f
osの活性化、pHの低下などを促進する活性または抑
制する活性など)を増強させる化合物、(ロ)本発明の
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量
を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる
化合物である。該化合物としては、ペプチド、タンパク
質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など
が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよ
いし、公知の化合物であってもよい。該細胞刺激活性を
増強させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等
の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として
有用である。該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本
発明のレセプタータンパク質等の生理活性を減少させる
ための安全で低毒性な医薬として有用である。
【0067】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物(例え
ば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に、例えば、癌患者(60kgとして)
においては、一日につき約0.1〜100mg、好まし
くは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜2
0mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投
与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっ
ても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌
患者(60kgとして)においては、一日につき約0.
01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程
度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
60kg当たりに換算した量を投与することができる。
れる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物(例え
ば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に、例えば、癌患者(60kgとして)
においては、一日につき約0.1〜100mg、好まし
くは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜2
0mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投
与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっ
ても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌
患者(60kgとして)においては、一日につき約0.
01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程
度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
60kg当たりに換算した量を投与することができる。
【0068】(5)本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有
する各種疾病の予防および/または治療剤本発明のレセ
プタータンパク質は上記のとおり、例えば、中枢機能な
ど生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えら
れる。したがって、本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、本
発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患
の予防および/または治療剤として用いることができ
る。該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不
全に関連する疾患の予防および/または治療剤として使
用する場合は、常套手段に従って製剤化することができ
る。例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合
物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形
剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一
般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混
和することによって製造することができる。これら製剤
における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得
られるようにするものである。
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有
する各種疾病の予防および/または治療剤本発明のレセ
プタータンパク質は上記のとおり、例えば、中枢機能な
ど生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えら
れる。したがって、本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、本
発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患
の予防および/または治療剤として用いることができ
る。該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不
全に関連する疾患の予防および/または治療剤として使
用する場合は、常套手段に従って製剤化することができ
る。例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合
物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形
剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一
般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混
和することによって製造することができる。これら製剤
における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得
られるようにするものである。
【0069】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩
化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアル
コール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート
80TM、HCO−50)などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩
化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアル
コール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート
80TM、HCO−50)などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【0070】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(60k
gとして)においては、一日につき約0.1〜100m
g、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約
1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、
その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌症患者(60kgとして)においては、一日
につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1
〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与するこ
とができる。
剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(60k
gとして)においては、一日につき約0.1〜100m
g、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約
1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、
その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌症患者(60kgとして)においては、一日
につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1
〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与するこ
とができる。
【0071】(6)本発明のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプタータンパク質等は、リガンドに対して
結合性を有しているので、生体内におけるリガンド濃度
を感度良く定量することができる。本発明の定量法は、
例えば、競合法と組み合わせることによって用いること
ができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータン
パク質等と接触させることによって被検体中のリガンド
濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以
下のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる
方法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和4
9年発行) 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和
54年発行)
タータンパク質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプタータンパク質等は、リガンドに対して
結合性を有しているので、生体内におけるリガンド濃度
を感度良く定量することができる。本発明の定量法は、
例えば、競合法と組み合わせることによって用いること
ができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータン
パク質等と接触させることによって被検体中のリガンド
濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以
下のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる
方法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和4
9年発行) 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和
54年発行)
【0072】(7)本発明のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物(アゴニスト、アンタゴニストなど)のスクリーニン
グ方法 本発明のレセプタータンパク質等を用いるか、または組
換え型レセプタータンパク質等の発現系を構築し、該発
現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることに
よって、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等と
の結合性を変化させる化合物(例えば、ペプチド、タン
パク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物
など)またはその塩を効率よくスクリーニングすること
ができる。このような化合物には、(イ)Gタンパク質
共役型レセプターを介して細胞刺激活性(例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊
離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質
のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを促
進する活性または抑制する活性など)を有する化合物
(いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するア
ゴニスト)、(ロ)該細胞刺激活性を有しない化合物
(いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するア
ンタゴニスト)、(ハ)リガンドと本発明のGタンパク
質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化
合物、あるいは(ニ)リガンドと本発明のGタンパク質
共役型レセプタータンパク質との結合力を減少させる化
合物などが含まれる(なお、上記(イ)の化合物は、上
記したリガンド決定方法によってスクリーニングするこ
とが好ましい)。すなわち、本発明は、(i)本発明の
レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたは
その塩と、リガンドとを接触させた場合と(ii)本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩と、リガンドおよび試験化合物とを接触させた
場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発
明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドま
たはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニ
ング方法においては、(i)と(ii)の場合における、
例えば、該レセプタータンパク質等に対するリガンドの
結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを
特徴とする。
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物(アゴニスト、アンタゴニストなど)のスクリーニン
グ方法 本発明のレセプタータンパク質等を用いるか、または組
換え型レセプタータンパク質等の発現系を構築し、該発
現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることに
よって、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等と
の結合性を変化させる化合物(例えば、ペプチド、タン
パク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物
など)またはその塩を効率よくスクリーニングすること
ができる。このような化合物には、(イ)Gタンパク質
共役型レセプターを介して細胞刺激活性(例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊
離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質
のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを促
進する活性または抑制する活性など)を有する化合物
(いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するア
ゴニスト)、(ロ)該細胞刺激活性を有しない化合物
(いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するア
ンタゴニスト)、(ハ)リガンドと本発明のGタンパク
質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化
合物、あるいは(ニ)リガンドと本発明のGタンパク質
共役型レセプタータンパク質との結合力を減少させる化
合物などが含まれる(なお、上記(イ)の化合物は、上
記したリガンド決定方法によってスクリーニングするこ
とが好ましい)。すなわち、本発明は、(i)本発明の
レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたは
その塩と、リガンドとを接触させた場合と(ii)本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩と、リガンドおよび試験化合物とを接触させた
場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発
明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドま
たはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニ
ング方法においては、(i)と(ii)の場合における、
例えば、該レセプタータンパク質等に対するリガンドの
結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを
特徴とする。
【0073】より具体的には、本発明は、 標識したリガンドを、本発明のレセプタータンパク質
等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場
合における、標識したリガンドの該レセプタータンパク
質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とす
るリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、 標識したリガンドを、本発明のレセプタータンパク質
等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレ
セプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該
細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する
ことを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパ
ク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
クリーニング方法、 標識したリガンドを、本発明のDNAを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセ
プタータンパク質等に接触させた場合と、標識したリガ
ンドおよび試験化合物を本発明のDNAを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発
明のレセプタータンパク質等に接触させた場合におけ
る、標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対
する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガン
ドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場
合における、標識したリガンドの該レセプタータンパク
質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とす
るリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、 標識したリガンドを、本発明のレセプタータンパク質
等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレ
セプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該
細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する
ことを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパ
ク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
クリーニング方法、 標識したリガンドを、本発明のDNAを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセ
プタータンパク質等に接触させた場合と、標識したリガ
ンドおよび試験化合物を本発明のDNAを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発
明のレセプタータンパク質等に接触させた場合におけ
る、標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対
する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガン
ドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【0074】本発明のレセプタータンパク質等を活性
化する化合物(例えば、本発明のレセプタータンパク質
等に対するリガンドなど)を本発明のレセプタータンパ
ク質等を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のレ
セプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞
に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺
激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内c
GMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を測定し、比較することを特徴とするリガンドと
本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させ
る化合物またはその塩のスクリーニング方法、および 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物
(例えば、本発明のレセプタータンパク質等に対するリ
ガンドなど)を本発明のDNAを含有する形質転換体を
培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセ
プタータンパク質等に接触させた場合と、本発明のレセ
プタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合
物を本発明のDNAを含有する形質転換体を培養するこ
とによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータン
パク質等に接触させた場合における、レセプターを介す
る細胞刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチル
コリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、
細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜
電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの
活性化、pHの低下などを促進する活性または抑制する
活性など)を測定し、比較することを特徴とするリガン
ドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。
化する化合物(例えば、本発明のレセプタータンパク質
等に対するリガンドなど)を本発明のレセプタータンパ
ク質等を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のレ
セプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞
に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺
激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内c
GMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を測定し、比較することを特徴とするリガンドと
本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させ
る化合物またはその塩のスクリーニング方法、および 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物
(例えば、本発明のレセプタータンパク質等に対するリ
ガンドなど)を本発明のDNAを含有する形質転換体を
培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセ
プタータンパク質等に接触させた場合と、本発明のレセ
プタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合
物を本発明のDNAを含有する形質転換体を培養するこ
とによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータン
パク質等に接触させた場合における、レセプターを介す
る細胞刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチル
コリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、
細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜
電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの
活性化、pHの低下などを促進する活性または抑制する
活性など)を測定し、比較することを特徴とするリガン
ドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。
【0075】本発明のレセプタータンパク質等が得られ
る以前は、Gタンパク質共役型レセプターアゴニストま
たはアンタゴニストをスクリーニングする場合、まずラ
ットなどのGタンパク質共役型レセプタータンパク質を
含む細胞、組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合
物を得て(一次スクリーニング)、その後に該候補化合
物が実際にヒトのGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認する試
験(二次スクリーニング)が必要であった。細胞、組織
または細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプタータ
ンパク質も混在するために、目的とするレセプタータン
パク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを実際
にスクリーニングすることは困難であった。しかしなが
ら、例えば、本発明のヒト由来レセプタータンパク質を
用いることによって、一次スクリーニングの必要がなく
なり、リガンドとGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニン
グすることができる。さらに、スクリーニングされた化
合物がアゴニストかアンタゴニストかを簡便に評価する
ことができる。本発明のスクリーニング方法の具体的な
説明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法
に用いる本発明のレセプタータンパク質等としては、上
記した本発明のレセプタータンパク質等を含有するもの
であれば何れのものであってもよいが、本発明のレセプ
タータンパク質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画
分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が
極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるも
のとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来
のレセプタータンパク質等などが適している。
る以前は、Gタンパク質共役型レセプターアゴニストま
たはアンタゴニストをスクリーニングする場合、まずラ
ットなどのGタンパク質共役型レセプタータンパク質を
含む細胞、組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合
物を得て(一次スクリーニング)、その後に該候補化合
物が実際にヒトのGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認する試
験(二次スクリーニング)が必要であった。細胞、組織
または細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプタータ
ンパク質も混在するために、目的とするレセプタータン
パク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを実際
にスクリーニングすることは困難であった。しかしなが
ら、例えば、本発明のヒト由来レセプタータンパク質を
用いることによって、一次スクリーニングの必要がなく
なり、リガンドとGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニン
グすることができる。さらに、スクリーニングされた化
合物がアゴニストかアンタゴニストかを簡便に評価する
ことができる。本発明のスクリーニング方法の具体的な
説明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法
に用いる本発明のレセプタータンパク質等としては、上
記した本発明のレセプタータンパク質等を含有するもの
であれば何れのものであってもよいが、本発明のレセプ
タータンパク質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画
分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が
極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるも
のとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来
のレセプタータンパク質等などが適している。
【0076】本発明のレセプタータンパク質等を製造す
るには、上記の方法が用いられるが、本発明のDNAを
哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが
好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするDN
A断片には相補DNAが用いられるが、必ずしもこれに
制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成D
NAを用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質を
コードするDNA断片を宿主動物細胞に導入し、それら
を効率よく発現させるためには、該DNA断片を昆虫を
宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイル
ス(nuclear polyhedrosis virus;NPV)のポリヘド
リンプロモーター、SV40由来のプロモーター、レト
ロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロ
ウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどの下流
に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質
の検査は公知の方法で行うことができる。例えば、文献
〔Nambi,P.ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),267巻,19555〜19
559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができ
る。したがって、本発明のスクリーニング方法におい
て、本発明のレセプタータンパク質等を含有するものと
しては、公知の方法に従って精製したレセプタータンパ
ク質等であってもよいし、該レセプタータンパク質等を
含有する細胞を用いてもよく、また該レセプタータンパ
ク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
るには、上記の方法が用いられるが、本発明のDNAを
哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが
好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするDN
A断片には相補DNAが用いられるが、必ずしもこれに
制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成D
NAを用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質を
コードするDNA断片を宿主動物細胞に導入し、それら
を効率よく発現させるためには、該DNA断片を昆虫を
宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイル
ス(nuclear polyhedrosis virus;NPV)のポリヘド
リンプロモーター、SV40由来のプロモーター、レト
ロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロ
ウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどの下流
に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質
の検査は公知の方法で行うことができる。例えば、文献
〔Nambi,P.ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),267巻,19555〜19
559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができ
る。したがって、本発明のスクリーニング方法におい
て、本発明のレセプタータンパク質等を含有するものと
しては、公知の方法に従って精製したレセプタータンパ
ク質等であってもよいし、該レセプタータンパク質等を
含有する細胞を用いてもよく、また該レセプタータンパ
ク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【0077】本発明のスクリーニング方法において、本
発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行
なうことができる。本発明のレセプタータンパク質等を
含有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発
現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸
菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好まし
い。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方
法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。
細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナ
イザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーや
ポリトロン(Kinematica社製)のよる破砕、超音波によ
る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細い
ノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ
る。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心
分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速(500rpm〜300
0rpm)で短時間(通常、約1分〜10分)遠心し、
上清をさらに高速(15000rpm〜30000rp
m)で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパ
ク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成
分が多く含まれる。該レセプタータンパク質等を含有す
る細胞や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、1細
胞当たり103〜108分子であるのが好ましく、105
〜107分子であるのが好適である。なお、発現量が多
いほど膜画分当たりのリガンド結合活性(比活性)が高
くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になる
ばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるよ
うになる。
発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行
なうことができる。本発明のレセプタータンパク質等を
含有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発
現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸
菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好まし
い。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方
法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。
細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナ
イザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーや
ポリトロン(Kinematica社製)のよる破砕、超音波によ
る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細い
ノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ
る。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心
分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速(500rpm〜300
0rpm)で短時間(通常、約1分〜10分)遠心し、
上清をさらに高速(15000rpm〜30000rp
m)で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパ
ク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成
分が多く含まれる。該レセプタータンパク質等を含有す
る細胞や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、1細
胞当たり103〜108分子であるのが好ましく、105
〜107分子であるのが好適である。なお、発現量が多
いほど膜画分当たりのリガンド結合活性(比活性)が高
くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になる
ばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるよ
うになる。
【0078】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
上記の〜を実施するためには、例えば、適当なレセ
プタータンパク質画分と、標識したリガンドが必要であ
る。レセプタータンパク質画分としては、天然型のレセ
プタータンパク質画分か、またはそれと同等の活性を有
する組換え型レセプタータンパク質画分などが望まし
い。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活
性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識したリガン
ドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナ
ログ化合物などが用いられる。例えば〔3H〕、
〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで標識されたリガ
ンドなどが用いられる。具体的には、リガンドと本発明
のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合
物のスクリーニングを行なうには、まず本発明のレセプ
タータンパク質等を含有する細胞または細胞の膜画分
を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁すること
によりレセプタータンパク質標品を調製する。バッファ
ーには、pH4〜10(望ましくはpH6〜8)のリン
酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンド
とレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッファ
ーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減
させる目的で、CHAPS、Tween−80TM(花王
−アトラス社)、ジギトニン、デオキシコレートなどの
界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さら
に、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を
抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E−64(ペプ
チド研究所製)、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害
剤を添加することもできる。0.01ml〜10mlの
該レセプター溶液に、一定量(5000cpm〜500
000cpm)の標識したリガンドを添加し、同時に1
0-4M〜10-10Mの試験化合物を共存させる。非特異
的結合量(NSB)を知るために大過剰の未標識のリガ
ンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約0℃か
ら50℃、望ましくは約4℃から37℃で、約20分か
ら24時間、望ましくは約30分から3時間行う。反応
後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで
洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体
シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計
測する。拮抗する物質がない場合のカウント(B0)か
ら非特異的結合量(NSB)を引いたカウント(B0−
NSB)を100%とした時、特異的結合量(B−NS
B)が、例えば、50%以下になる試験化合物を拮抗阻
害能力のある候補物質として選択することができる。
等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
上記の〜を実施するためには、例えば、適当なレセ
プタータンパク質画分と、標識したリガンドが必要であ
る。レセプタータンパク質画分としては、天然型のレセ
プタータンパク質画分か、またはそれと同等の活性を有
する組換え型レセプタータンパク質画分などが望まし
い。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活
性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識したリガン
ドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナ
ログ化合物などが用いられる。例えば〔3H〕、
〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで標識されたリガ
ンドなどが用いられる。具体的には、リガンドと本発明
のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合
物のスクリーニングを行なうには、まず本発明のレセプ
タータンパク質等を含有する細胞または細胞の膜画分
を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁すること
によりレセプタータンパク質標品を調製する。バッファ
ーには、pH4〜10(望ましくはpH6〜8)のリン
酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンド
とレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッファ
ーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減
させる目的で、CHAPS、Tween−80TM(花王
−アトラス社)、ジギトニン、デオキシコレートなどの
界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さら
に、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を
抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E−64(ペプ
チド研究所製)、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害
剤を添加することもできる。0.01ml〜10mlの
該レセプター溶液に、一定量(5000cpm〜500
000cpm)の標識したリガンドを添加し、同時に1
0-4M〜10-10Mの試験化合物を共存させる。非特異
的結合量(NSB)を知るために大過剰の未標識のリガ
ンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約0℃か
ら50℃、望ましくは約4℃から37℃で、約20分か
ら24時間、望ましくは約30分から3時間行う。反応
後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで
洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体
シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計
測する。拮抗する物質がない場合のカウント(B0)か
ら非特異的結合量(NSB)を引いたカウント(B0−
NSB)を100%とした時、特異的結合量(B−NS
B)が、例えば、50%以下になる試験化合物を拮抗阻
害能力のある候補物質として選択することができる。
【0079】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物スクリーニングする上
記の〜の方法を実施するためには、例えば、レセプ
タータンパク質を介する細胞刺激活性(例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、
細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリ
ン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など)を公知の方法または市
販の測定用キットを用いて測定することができる。具体
的には、まず、本発明のレセプタータンパク質等を含有
する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリ
ーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地ある
いは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、
試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした
後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産
物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の
指標とする物質(例えば、アラキドン酸など)の生成
が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合
は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行
なってもよい。また、cAMP産生抑制などの活性につ
いては、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増
大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す
ることができる。細胞刺激活性を測定してスクリーニン
グを行なうには、適当なレセプタータンパク質を発現し
た細胞が必要である。本発明のレセプタータンパク質等
を発現した細胞としては、天然型の本発明のレセプター
タンパク質等を有する細胞株、上記の組換え型レセプタ
ータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。試験
化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペ
プチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。
等との結合性を変化させる化合物スクリーニングする上
記の〜の方法を実施するためには、例えば、レセプ
タータンパク質を介する細胞刺激活性(例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、
細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリ
ン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など)を公知の方法または市
販の測定用キットを用いて測定することができる。具体
的には、まず、本発明のレセプタータンパク質等を含有
する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリ
ーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地ある
いは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、
試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした
後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産
物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の
指標とする物質(例えば、アラキドン酸など)の生成
が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合
は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行
なってもよい。また、cAMP産生抑制などの活性につ
いては、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増
大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す
ることができる。細胞刺激活性を測定してスクリーニン
グを行なうには、適当なレセプタータンパク質を発現し
た細胞が必要である。本発明のレセプタータンパク質等
を発現した細胞としては、天然型の本発明のレセプター
タンパク質等を有する細胞株、上記の組換え型レセプタ
ータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。試験
化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペ
プチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。
【0080】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キットは、本発明のレセプタータンパク質
等、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞、
または本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞
の膜画分を含有するものなどである。本発明のスクリー
ニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。 1.スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution(ギブコ社製)に、0.
05%のウシ血清アルブミン(シグマ社製)を加えたも
の。孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Gタンパク質共役型レセプター標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたCHO細胞
を、12穴プレートに5×105個/穴で継代し、37
℃、5%CO2、95%airで2日間培養したもの。 標識リガンド 市販の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで
標識したリガンド 水溶液の状態のものを4℃あるいは−20℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。 リガンド標準液 リガンドを0.1%ウシ血清アルブミン(シグマ社製)
を含むPBSで1mMとなるように溶解し、−20℃で
保存する。
等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キットは、本発明のレセプタータンパク質
等、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞、
または本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞
の膜画分を含有するものなどである。本発明のスクリー
ニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。 1.スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution(ギブコ社製)に、0.
05%のウシ血清アルブミン(シグマ社製)を加えたも
の。孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Gタンパク質共役型レセプター標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたCHO細胞
を、12穴プレートに5×105個/穴で継代し、37
℃、5%CO2、95%airで2日間培養したもの。 標識リガンド 市販の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで
標識したリガンド 水溶液の状態のものを4℃あるいは−20℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。 リガンド標準液 リガンドを0.1%ウシ血清アルブミン(シグマ社製)
を含むPBSで1mMとなるように溶解し、−20℃で
保存する。
【0081】2.測定法 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセ
プタータンパク質発現CHO細胞を、測定用緩衝液1m
lで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴
に加える。 10-3〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた
後、標識リガンドを5μl加え、室温にて1時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わ
りに10-3Mのリガンドを5μl加えておく。 反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを0.2N NaOH
−1%SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーターA
(和光純薬製)と混合する。 液体シンチレーションカウンター(ベックマン社製)
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
(PMB)を次の式で求める。 PMB=[(B−NSB)/(B0−NSB)]×10
0 PMB:Percent Maximum Binding B :検体を加えた時の値 NSB:Non-specific Binding(非特異的結合量) B0 :最大結合量
プタータンパク質発現CHO細胞を、測定用緩衝液1m
lで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴
に加える。 10-3〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた
後、標識リガンドを5μl加え、室温にて1時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わ
りに10-3Mのリガンドを5μl加えておく。 反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを0.2N NaOH
−1%SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーターA
(和光純薬製)と混合する。 液体シンチレーションカウンター(ベックマン社製)
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
(PMB)を次の式で求める。 PMB=[(B−NSB)/(B0−NSB)]×10
0 PMB:Percent Maximum Binding B :検体を加えた時の値 NSB:Non-specific Binding(非特異的結合量) B0 :最大結合量
【0082】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結
合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的に
は、(イ)Gタンパク質共役型レセプターを介して細胞
刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内
cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を有する化合物(いわゆる、本発明のレセプター
タンパク質に対するアゴニスト)、(ロ)該細胞刺激活
性を有しない化合物(いわゆる、本発明のレセプタータ
ンパク質に対するアンタゴニスト)、(ハ)リガンドと
本発明のGタンパク質共役型レセプタータンパク質との
結合力を増強する化合物、あるいは(ニ)リガンドと本
発明のGタンパク質共役型レセプタータンパク質との結
合力を減少させる化合物である。該化合物としては、ペ
プチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な
化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよ
い。本発明のレセプタータンパク質等に対するアゴニス
トは、本発明のレセプタータンパク質等に対するリガン
ドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、該
リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用で
ある。本発明のレセプタータンパク質等に対するアンタ
ゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対する
リガンドが有する生理活性を抑制することができるの
で、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬とし
て有用である。リガンドと本発明のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物は、
本発明のレセプタータンパク質等に対するリガンドが有
する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬とし
て有用である。リガンドと本発明のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物
は、本発明のレセプタータンパク質等に対するリガンド
が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医
薬として有用である。
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結
合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的に
は、(イ)Gタンパク質共役型レセプターを介して細胞
刺激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内
cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を有する化合物(いわゆる、本発明のレセプター
タンパク質に対するアゴニスト)、(ロ)該細胞刺激活
性を有しない化合物(いわゆる、本発明のレセプタータ
ンパク質に対するアンタゴニスト)、(ハ)リガンドと
本発明のGタンパク質共役型レセプタータンパク質との
結合力を増強する化合物、あるいは(ニ)リガンドと本
発明のGタンパク質共役型レセプタータンパク質との結
合力を減少させる化合物である。該化合物としては、ペ
プチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な
化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよ
い。本発明のレセプタータンパク質等に対するアゴニス
トは、本発明のレセプタータンパク質等に対するリガン
ドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、該
リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用で
ある。本発明のレセプタータンパク質等に対するアンタ
ゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対する
リガンドが有する生理活性を抑制することができるの
で、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬とし
て有用である。リガンドと本発明のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物は、
本発明のレセプタータンパク質等に対するリガンドが有
する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬とし
て有用である。リガンドと本発明のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物
は、本発明のレセプタータンパク質等に対するリガンド
が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医
薬として有用である。
【0083】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従
って実施することができる。例えば、上記した本発明の
レセプタータンパク質を含有する医薬と同様にして、錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、
無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このよ
うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例え
ば、ヒトや哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与
することができる。該化合物またはその塩の投与量は、
投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異は
あるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(6
0kgとして)においては、一日につき約0.1〜10
0mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましく
は約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合
は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では
通常例えば、癌患者(60kgとして)においては、一
日につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.
1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与する
ことができる。
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従
って実施することができる。例えば、上記した本発明の
レセプタータンパク質を含有する医薬と同様にして、錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、
無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このよ
うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例え
ば、ヒトや哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与
することができる。該化合物またはその塩の投与量は、
投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異は
あるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(6
0kgとして)においては、一日につき約0.1〜10
0mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましく
は約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合
は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では
通常例えば、癌患者(60kgとして)においては、一
日につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.
1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与する
ことができる。
【0084】(8)本発明のGタンパク質共役型レセプ
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物(アゴニスト、アンタゴニスト)を含有する各種疾病
の予防および/または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば
中枢機能、循環機能、消化機能、心機能など生体内で何
らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従っ
て、本発明のレセプタータンパク質とリガンドとの結合
性を変化させる化合物(アゴニスト、アンタゴニスト)
や本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドは、
本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾
患の予防および/または治療剤として用いることができ
る。該化合物やリガンドを本発明のレセプタータンパク
質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療
剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化する
ことができる。例えば、該化合物やリガンドは、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知
の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、
結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求さ
れる単位用量形態で混和することによって製造すること
ができる。これら製剤における有効成分量は指示された
範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物(アゴニスト、アンタゴニスト)を含有する各種疾病
の予防および/または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば
中枢機能、循環機能、消化機能、心機能など生体内で何
らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従っ
て、本発明のレセプタータンパク質とリガンドとの結合
性を変化させる化合物(アゴニスト、アンタゴニスト)
や本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドは、
本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾
患の予防および/または治療剤として用いることができ
る。該化合物やリガンドを本発明のレセプタータンパク
質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療
剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化する
ことができる。例えば、該化合物やリガンドは、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知
の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、
結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求さ
れる単位用量形態で混和することによって製造すること
ができる。これら製剤における有効成分量は指示された
範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【0085】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩
化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアル
コール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート
80TM、HCO−50)などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩
化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアル
コール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート
80TM、HCO−50)などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【0086】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。さらに、上記予防・治療剤は適
当な薬剤と組み合わせて例えば本発明のレセプタータン
パク質が高発現している臓器や組織を特異的なターゲッ
トとしたDDS製剤として使用することもできる。この
ようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例
えば、ヒトやその他の哺乳動物(例えば、ラット、マウ
ス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど)に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例
えば、癌患者(60kgとして)においては、一日につ
き約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50m
g、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口
的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、癌患者(60kgとし
て)においては、一日につき約0.01〜30mg程
度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましく
は約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに
換算した量を投与することができる。
剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。さらに、上記予防・治療剤は適
当な薬剤と組み合わせて例えば本発明のレセプタータン
パク質が高発現している臓器や組織を特異的なターゲッ
トとしたDDS製剤として使用することもできる。この
ようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例
えば、ヒトやその他の哺乳動物(例えば、ラット、マウ
ス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど)に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例
えば、癌患者(60kgとして)においては、一日につ
き約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50m
g、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口
的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常例えば、癌患者(60kgとし
て)においては、一日につき約0.01〜30mg程
度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましく
は約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに
換算した量を投与することができる。
【0087】(9)本発明のレセプタータンパク質もし
くはその部分ペプチドまたはその塩の定量 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を特
異的に認識することができるので、被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫
測定法による定量などに使用することができる。すなわ
ち、本発明は、例えば、(i)本発明の抗体と、被検液
および標識化レセプタータンパク質等とを競合的に反応
させ、該抗体に結合した標識化レセプタータンパク質等
の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量法、(ii)被検液と担体
上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明
の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被
検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法を提
供する。上記(ii)においては、一方の抗体が本発明の
レセプタータンパク質等のN端部を認識する抗体で、他
方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のC端部に
反応する抗体であることが好ましい。
くはその部分ペプチドまたはその塩の定量 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を特
異的に認識することができるので、被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫
測定法による定量などに使用することができる。すなわ
ち、本発明は、例えば、(i)本発明の抗体と、被検液
および標識化レセプタータンパク質等とを競合的に反応
させ、該抗体に結合した標識化レセプタータンパク質等
の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量法、(ii)被検液と担体
上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明
の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被
検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法を提
供する。上記(ii)においては、一方の抗体が本発明の
レセプタータンパク質等のN端部を認識する抗体で、他
方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のC端部に
反応する抗体であることが好ましい。
【0088】本発明のレセプタータンパク質等に対する
モノクローナル抗体(以下、本発明のモノクローナル抗
体と称する場合がある)を用いて本発明のレセプタータ
ンパク質等の測定を行なえるほか、組織染色等による検
出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子
そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2
、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。本発
明のレセプタータンパク質等に対する抗体を用いる測定
法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の
抗原量(例えば、レセプタータンパク質量)に対応した
抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的また
は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む
標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法で
あれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフ
ロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンド
イッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、
後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好まし
い。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤として
は、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質などが用いられる。放射性同位元素としては、例え
ば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが
用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きな
ものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−
グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキ
シダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光
物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッ
センイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質と
しては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体
あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系
を用いることもできる。
モノクローナル抗体(以下、本発明のモノクローナル抗
体と称する場合がある)を用いて本発明のレセプタータ
ンパク質等の測定を行なえるほか、組織染色等による検
出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子
そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2
、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。本発
明のレセプタータンパク質等に対する抗体を用いる測定
法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の
抗原量(例えば、レセプタータンパク質量)に対応した
抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的また
は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む
標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法で
あれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフ
ロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンド
イッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、
後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好まし
い。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤として
は、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質などが用いられる。放射性同位元素としては、例え
ば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが
用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きな
ものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−
グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキ
シダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光
物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッ
センイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質と
しては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体
あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系
を用いることもできる。
【0089】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法に
おいては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検
液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した本発明の
モノクローナル抗体を反応させ(2次反応)た後、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中
の本発明のレセプタータンパク質量を定量することがで
きる。1次反応と2次反応は逆の順序に行なっても、ま
た、同時に行なってもよいし時間をずらして行なっても
よい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準
じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測
定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いら
れる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度
を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用
いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるレセプター
タンパク質等の測定法においては、1次反応と2次反応
に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプター
タンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく
用いられる。すなわち、1次反応および2次反応に用い
られる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、
レセプタータンパク質のC端部を認識する場合、1次反
応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えば
N端部を認識する抗体が用いられる。
理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法に
おいては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検
液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した本発明の
モノクローナル抗体を反応させ(2次反応)た後、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中
の本発明のレセプタータンパク質量を定量することがで
きる。1次反応と2次反応は逆の順序に行なっても、ま
た、同時に行なってもよいし時間をずらして行なっても
よい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準
じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測
定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いら
れる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度
を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用
いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるレセプター
タンパク質等の測定法においては、1次反応と2次反応
に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプター
タンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく
用いられる。すなわち、1次反応および2次反応に用い
られる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、
レセプタータンパク質のC端部を認識する場合、1次反
応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えば
N端部を認識する抗体が用いられる。
【0090】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(F)と抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B
/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、
上記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、およ
び、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(F)と抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B
/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、
上記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、およ
び、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【0091】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のレセプタータンパク質またはその塩の測定系を構築
すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細について
は、総説、成書などを参照することができる〔例えば、
入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和4
9年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」
(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫
測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年
発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)
(医学書院、昭和62年発行)、「メソッズ・イン・エ
ンジモノジー(Methods in ENZYMOLOGY)」 Vol. 70(Imm
unochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Imm
unochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Imm
unochemical Techniques(PartC))、 同書 Vol. 84(Immu
nochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me
thods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques
(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibo
dies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本
発明のレセプタータンパク質またはその塩を感度良く定
量することができる。さらに、本発明の抗体を用いて、
生体内での本発明のレセプタータンパク質またその塩を
定量することによって、本発明のレセプタータンパク質
の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができ
る。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中
に存在する本発明のレセプタータンパク質等を特異的に
検出するために使用することができる。また、本発明の
レセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体
カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のレセプター
タンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のレセ
プタータンパク質の挙動の分析などのために使用するこ
とができる。
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のレセプタータンパク質またはその塩の測定系を構築
すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細について
は、総説、成書などを参照することができる〔例えば、
入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和4
9年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」
(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫
測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年
発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)
(医学書院、昭和62年発行)、「メソッズ・イン・エ
ンジモノジー(Methods in ENZYMOLOGY)」 Vol. 70(Imm
unochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Imm
unochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Imm
unochemical Techniques(PartC))、 同書 Vol. 84(Immu
nochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me
thods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques
(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibo
dies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本
発明のレセプタータンパク質またはその塩を感度良く定
量することができる。さらに、本発明の抗体を用いて、
生体内での本発明のレセプタータンパク質またその塩を
定量することによって、本発明のレセプタータンパク質
の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができ
る。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中
に存在する本発明のレセプタータンパク質等を特異的に
検出するために使用することができる。また、本発明の
レセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体
カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のレセプター
タンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のレセ
プタータンパク質の挙動の分析などのために使用するこ
とができる。
【0092】(10)細胞膜における本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物のスクリーニング方法 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質もしく
はその部分ペプチドまたはその塩を特異的に認識するこ
とができるので、細胞膜における本発明のレセプタータ
ンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合
物のスクリーニングに用いることができる。すなわち本
発明は、例えば、(i)非ヒト哺乳動物の血液、特
定の臓器、臓器から単離した組織もしくは細胞等を破
壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
を定量することによる、細胞膜における本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ
る化合物のスクリーニング方法、(ii)本発明のレセプ
タータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形
質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜
画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドを定量することによる、細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、(ii
i)非ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器か
ら単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染
色法を用いることにより、細胞表層での該レセプタータ
ンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜
上の該タンパク質を確認することによる、細胞膜におけ
る本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチ
ドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供
する。(iv)本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした
後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該レ
セプタータンパク質の染色度合いを定量化することによ
り、細胞膜上の該タンパク質を確認することによる、細
胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング
方法を提供する。
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物のスクリーニング方法 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質もしく
はその部分ペプチドまたはその塩を特異的に認識するこ
とができるので、細胞膜における本発明のレセプタータ
ンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合
物のスクリーニングに用いることができる。すなわち本
発明は、例えば、(i)非ヒト哺乳動物の血液、特
定の臓器、臓器から単離した組織もしくは細胞等を破
壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
を定量することによる、細胞膜における本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ
る化合物のスクリーニング方法、(ii)本発明のレセプ
タータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形
質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜
画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドを定量することによる、細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、(ii
i)非ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器か
ら単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染
色法を用いることにより、細胞表層での該レセプタータ
ンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜
上の該タンパク質を確認することによる、細胞膜におけ
る本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチ
ドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供
する。(iv)本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした
後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該レ
セプタータンパク質の染色度合いを定量化することによ
り、細胞膜上の該タンパク質を確認することによる、細
胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング
方法を提供する。
【0093】細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの定量は具体的には
以下のようにして行なう。 (i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物(例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど)に対して、
薬剤(例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など)あるいは物理的ストレス(例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など)などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器(例え
ば、脳、肺、大腸など)、または臓器から単離した組
織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細
胞等を、例えば、適当な緩衝液(例えば、トリス塩酸緩
衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など)等に懸濁し、
臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤(例え
ば、トリトンX100TM、ツイーン20TMなど)などを
用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を
用いて細胞膜画分を得る。
タンパク質またはその部分ペプチドの定量は具体的には
以下のようにして行なう。 (i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物(例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど)に対して、
薬剤(例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など)あるいは物理的ストレス(例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など)などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器(例え
ば、脳、肺、大腸など)、または臓器から単離した組
織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細
胞等を、例えば、適当な緩衝液(例えば、トリス塩酸緩
衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など)等に懸濁し、
臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤(例え
ば、トリトンX100TM、ツイーン20TMなど)などを
用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を
用いて細胞膜画分を得る。
【0094】細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、
公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のこと
をいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型
ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレ
ンダーやポリトロン(Kinematica社製)のよる破砕、超
音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細
胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙
げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾
配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用い
られる。例えば、細胞破砕液を低速(500rpm〜3
000rpm)で短時間(通常、約1分〜10分)遠心
し、上清をさらに高速(15000rpm〜30000
rpm)で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を
膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータ
ンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの
膜成分が多く含まれる。
公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のこと
をいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型
ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレ
ンダーやポリトロン(Kinematica社製)のよる破砕、超
音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細
胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙
げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾
配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用い
られる。例えば、細胞破砕液を低速(500rpm〜3
000rpm)で短時間(通常、約1分〜10分)遠心
し、上清をさらに高速(15000rpm〜30000
rpm)で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を
膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータ
ンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの
膜成分が多く含まれる。
【0095】細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドは、例えば、本発明
の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブ
ロット解析などにより定量することができる。かかるサ
ンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なう
ことができ、ウエスタンブロットは公知の手段により行
なうことができる。
タンパク質またはその部分ペプチドは、例えば、本発明
の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブ
ロット解析などにより定量することができる。かかるサ
ンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なう
ことができ、ウエスタンブロットは公知の手段により行
なうことができる。
【0096】(ii)本発明のレセプタータンパク質もし
くはその部分ペプチドを発現する形質転換体を上記の方
法に従い作製し、細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドを定量すること
ができる。
くはその部分ペプチドを発現する形質転換体を上記の方
法に従い作製し、細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドを定量すること
ができる。
【0097】細胞膜における本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物の
スクリーニングは、(i)正常あるいは疾患モデル非ヒ
ト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなど
を与える一定時間前(30分前〜24時間前、好ましく
は30分前〜12時間前、より好ましくは1時間前〜6
時間前)もしくは一定時間後(30分後〜3日後、好ま
しくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜2
4時間後)、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時
に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後(30分
後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好まし
くは1時間後〜24時間後)、細胞膜における本発明の
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を定
量することにより行なうことができ、(ii)形質転換体
を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合さ
せ、一定時間培養後(1日後〜7日後、好ましくは1日
後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日後)、細胞膜
における本発明のレセプタータンパク質またはその部分
ペプチドの量を定量することにより行なうことができ
る。
ク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物の
スクリーニングは、(i)正常あるいは疾患モデル非ヒ
ト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなど
を与える一定時間前(30分前〜24時間前、好ましく
は30分前〜12時間前、より好ましくは1時間前〜6
時間前)もしくは一定時間後(30分後〜3日後、好ま
しくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜2
4時間後)、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時
に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後(30分
後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好まし
くは1時間後〜24時間後)、細胞膜における本発明の
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を定
量することにより行なうことができ、(ii)形質転換体
を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合さ
せ、一定時間培養後(1日後〜7日後、好ましくは1日
後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日後)、細胞膜
における本発明のレセプタータンパク質またはその部分
ペプチドの量を定量することにより行なうことができ
る。
【0098】細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの確認は具体的には
以下のようにして行なう。(iii)正常あるいは疾患モ
デル非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より
具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、
担癌マウスなど)に対して、薬剤(例えば、抗痴呆薬、
血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など)あるいは物理的ス
トレス(例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、
低温など)などを与え、一定時間経過した後に、血液、
あるいは特定の臓器(例えば、心臓、肺、胃、小腸、胸
腺、卵巣、副腎、精巣、脳下垂体、膵臓、脾臓、前立
腺、子宮など)、または臓器から単離した組織(例え
ば、網膜、乳腺など)、あるいは細胞(例えば白血球、脂
肪細胞、骨髄細胞など)を得る。得られた臓器、組織ま
たは細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体
を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該レセプタータ
ンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜
上の該タンパク質を確認することにより、定量的または
定性的に、細胞膜における本発明のレセプタータンパク
質またはその部分ペプチドの量を確認することができ
る。(iv)本発明のレセプタータンパク質もしくはその
部分ペプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手
段をとることにより確認することもできる。
タンパク質またはその部分ペプチドの確認は具体的には
以下のようにして行なう。(iii)正常あるいは疾患モ
デル非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より
具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、
担癌マウスなど)に対して、薬剤(例えば、抗痴呆薬、
血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など)あるいは物理的ス
トレス(例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、
低温など)などを与え、一定時間経過した後に、血液、
あるいは特定の臓器(例えば、心臓、肺、胃、小腸、胸
腺、卵巣、副腎、精巣、脳下垂体、膵臓、脾臓、前立
腺、子宮など)、または臓器から単離した組織(例え
ば、網膜、乳腺など)、あるいは細胞(例えば白血球、脂
肪細胞、骨髄細胞など)を得る。得られた臓器、組織ま
たは細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体
を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該レセプタータ
ンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜
上の該タンパク質を確認することにより、定量的または
定性的に、細胞膜における本発明のレセプタータンパク
質またはその部分ペプチドの量を確認することができ
る。(iv)本発明のレセプタータンパク質もしくはその
部分ペプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手
段をとることにより確認することもできる。
【0099】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩は、細胞膜における本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化
させる作用を有する化合物であり、具体的には、(イ)
細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドの量を増加させることにより、Gタンパ
ク質共役型レセプターを介する細胞刺激活性(例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+
遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノ
シトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク
質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを
促進する活性または抑制する活性など)を増強させる化
合物、(ロ)細胞膜における本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの量を減少させることによ
り、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。該化合
物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化
合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物で
あってもよい。該細胞刺激活性を増強させる化合物は、
本発明のレセプタータンパク質等の生理活性を増強する
ための安全で低毒性な医薬として有用である。該細胞刺
激活性を減弱させる化合物は、本発明のレセプタータン
パク質等の生理活性を減少させるための安全で低毒性な
医薬として有用である。
れる化合物またはその塩は、細胞膜における本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化
させる作用を有する化合物であり、具体的には、(イ)
細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドの量を増加させることにより、Gタンパ
ク質共役型レセプターを介する細胞刺激活性(例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+
遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノ
シトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク
質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下などを
促進する活性または抑制する活性など)を増強させる化
合物、(ロ)細胞膜における本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの量を減少させることによ
り、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。該化合
物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化
合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物で
あってもよい。該細胞刺激活性を増強させる化合物は、
本発明のレセプタータンパク質等の生理活性を増強する
ための安全で低毒性な医薬として有用である。該細胞刺
激活性を減弱させる化合物は、本発明のレセプタータン
パク質等の生理活性を減少させるための安全で低毒性な
医薬として有用である。
【0100】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物(例え
ば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に例えば、癌患者(60kgとして)に
おいては、一日につき約0.1〜100mg、好ましく
は約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20
mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与
量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによって
も異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患
者(60kgとして)においては、一日につき約0.0
1〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程
度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
60kg当たりに換算した量を投与することができる。
れる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物(例え
ば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に例えば、癌患者(60kgとして)に
おいては、一日につき約0.1〜100mg、好ましく
は約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20
mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与
量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによって
も異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患
者(60kgとして)においては、一日につき約0.0
1〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程
度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
60kg当たりに換算した量を投与することができる。
【0101】(11)細胞膜における本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例え
ば、肺または末梢リンパ器官など生体内で何らかの重要
な役割を果たしていると考えられる。したがって、細胞
膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部
分ペプチドの量を変化させる化合物は、本発明のレセプ
タータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および
/または治療剤として用いることができる。該化合物を
本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾
患の予防および/または治療剤として使用する場合は、
常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該
化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的
に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、
防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた
製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによ
って製造することができる。これら製剤における有効成
分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにす
るものである。
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例え
ば、肺または末梢リンパ器官など生体内で何らかの重要
な役割を果たしていると考えられる。したがって、細胞
膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部
分ペプチドの量を変化させる化合物は、本発明のレセプ
タータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および
/または治療剤として用いることができる。該化合物を
本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾
患の予防および/または治療剤として使用する場合は、
常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該
化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口
的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得
る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形
で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的
に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、
防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた
製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによ
って製造することができる。これら製剤における有効成
分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにす
るものである。
【0102】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩
化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアル
コール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート
80TM、HCO−50)などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩
化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアル
コール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(例、ポリソルベート
80TM、HCO−50)などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【0103】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(60k
gとして)においては、一日につき約0.1〜100m
g、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約
1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、
その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌患者(60kgとして)においては、一日に
つき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜
20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、60kg当たりに換算した量を投与すること
ができる。
剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者(60k
gとして)においては、一日につき約0.1〜100m
g、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約
1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、
その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌患者(60kgとして)においては、一日に
つき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜
20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、60kg当たりに換算した量を投与すること
ができる。
【0104】(12)本発明のレセプタータンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体による
中和 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドまたはその塩に対する抗体の、それらレセプタータン
パク質などに対する中和活性とは、すなわち、該レセプ
タータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化
する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有す
る場合は、該レセプタータンパク質の関与するシグナル
伝達、例えば、該レセプタータンパク質を介する細胞刺
激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内c
GMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を不活性化することができる。したがって、該レ
セプタータンパク質の過剰発現などに起因する疾患の予
防および/または治療に用いることができる。
その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体による
中和 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドまたはその塩に対する抗体の、それらレセプタータン
パク質などに対する中和活性とは、すなわち、該レセプ
タータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化
する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有す
る場合は、該レセプタータンパク質の関与するシグナル
伝達、例えば、該レセプタータンパク質を介する細胞刺
激活性(例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内c
GMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下などを促進する活性または抑制する活性
など)を不活性化することができる。したがって、該レ
セプタータンパク質の過剰発現などに起因する疾患の予
防および/または治療に用いることができる。
【0105】(13)本発明のGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするDNAを有する動物の作
出 本発明のDNAを用いて、本発明のレセプタータンパク
質等を発現するトランスジェニック動物を作出すること
ができる。動物としては、非ヒト哺乳動物(例えば、ラ
ット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど)など(以下、動物と略記する場合があ
る)が挙げられるが、特に、マウス、ウサギなどが好適
である。本発明のDNAを対象動物に導入するにあたっ
ては、該DNAを動物細胞で発現させうるプロモーター
の下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるの
が一般に有利である。例えば、ウサギ由来の本発明のD
NAを導入する場合、これと相同性が高い動物由来の本
発明のDNAを動物細胞で発現させうる各種プロモータ
ーの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、
ウサギ受精卵へマイクロインジェクションすることによ
って本発明のレセプタータンパク質等を高産生するDN
A導入動物を作出できる。このプロモーターとしては、
例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン
等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好
ましくは肺で特異的に発現する遺伝子のプロモーターが
用いられる。受精卵細胞段階における本発明のDNAの
導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。DNA導入後の作出動物の胚芽
細胞において本発明のレセプタータンパク質等が存在す
ることは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体
細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有する
ことを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子
孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプ
タータンパク質等を有する。本発明のDNA導入動物
は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認し
て、該DNA保有動物として通常の飼育環境で飼育継代
を行うことができる。さらに、目的DNAを保有する雌
雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色
体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄
の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを
有するように繁殖継代することができる。本発明のDN
Aが転移された動物は、本発明のレセプタータンパク質
等が高発現させられているので、本発明のレセプタータ
ンパク質等に対するアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング用の動物などとして有用である。本発明
のDNA導入動物を、組織培養のための細胞源として使
用することもできる。例えば、本発明のDNA導入マウ
スの組織中のDNAもしくはRNAを直接分析するか、
あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタータ
ンパク質が存在する組織を分析することにより、本発明
のレセプタータンパク質等について分析することができ
る。本発明のレセプタータンパク質等を有する組織の細
胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用し
て、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難
な組織からの細胞の機能を研究することができる。ま
た、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の
機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高
発現細胞株があれば、そこから、本発明のレセプタータ
ンパク質等を単離精製することも可能である。
プタータンパク質をコードするDNAを有する動物の作
出 本発明のDNAを用いて、本発明のレセプタータンパク
質等を発現するトランスジェニック動物を作出すること
ができる。動物としては、非ヒト哺乳動物(例えば、ラ
ット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど)など(以下、動物と略記する場合があ
る)が挙げられるが、特に、マウス、ウサギなどが好適
である。本発明のDNAを対象動物に導入するにあたっ
ては、該DNAを動物細胞で発現させうるプロモーター
の下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるの
が一般に有利である。例えば、ウサギ由来の本発明のD
NAを導入する場合、これと相同性が高い動物由来の本
発明のDNAを動物細胞で発現させうる各種プロモータ
ーの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、
ウサギ受精卵へマイクロインジェクションすることによ
って本発明のレセプタータンパク質等を高産生するDN
A導入動物を作出できる。このプロモーターとしては、
例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン
等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好
ましくは肺で特異的に発現する遺伝子のプロモーターが
用いられる。受精卵細胞段階における本発明のDNAの
導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。DNA導入後の作出動物の胚芽
細胞において本発明のレセプタータンパク質等が存在す
ることは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体
細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有する
ことを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子
孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプ
タータンパク質等を有する。本発明のDNA導入動物
は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認し
て、該DNA保有動物として通常の飼育環境で飼育継代
を行うことができる。さらに、目的DNAを保有する雌
雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色
体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄
の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを
有するように繁殖継代することができる。本発明のDN
Aが転移された動物は、本発明のレセプタータンパク質
等が高発現させられているので、本発明のレセプタータ
ンパク質等に対するアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング用の動物などとして有用である。本発明
のDNA導入動物を、組織培養のための細胞源として使
用することもできる。例えば、本発明のDNA導入マウ
スの組織中のDNAもしくはRNAを直接分析するか、
あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタータ
ンパク質が存在する組織を分析することにより、本発明
のレセプタータンパク質等について分析することができ
る。本発明のレセプタータンパク質等を有する組織の細
胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用し
て、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難
な組織からの細胞の機能を研究することができる。ま
た、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の
機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高
発現細胞株があれば、そこから、本発明のレセプタータ
ンパク質等を単離精製することも可能である。
【0106】また、本発明のアンチセンスDNAを含有
する医薬の用途を以下に述べる。本発明のDNAに相補
的に結合し、該DNAの発現を抑制することができるア
ンチセンスDNAは低毒性であり、生体内における本発
明のレセプタータンパク質または本発明のDNAの活性
を抑制することができるので、例えば、本発明のレセプ
タータンパク質またはそのリガンドの過剰発現に伴う疾
患などの予防・治療剤として使用することができる。上
記アンチセンスDNAを上記の予防・治療剤として使用
する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与すること
ができる。例えば、該アンチセンスDNAを用いる場
合、該アンチセンスDNAを単独あるいはレトロウイル
スベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス
アソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクタ
ーに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたはその他の
哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的
に投与することができる。該アンチセンスDNAは、そ
のままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理
学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハ
イドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与
できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管
内に局所投与することもできる。さらに、該アンチセン
スDNAは、組織や細胞における本発明のDNAの存在
やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチ
ドプローブとして使用することもできる。
する医薬の用途を以下に述べる。本発明のDNAに相補
的に結合し、該DNAの発現を抑制することができるア
ンチセンスDNAは低毒性であり、生体内における本発
明のレセプタータンパク質または本発明のDNAの活性
を抑制することができるので、例えば、本発明のレセプ
タータンパク質またはそのリガンドの過剰発現に伴う疾
患などの予防・治療剤として使用することができる。上
記アンチセンスDNAを上記の予防・治療剤として使用
する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与すること
ができる。例えば、該アンチセンスDNAを用いる場
合、該アンチセンスDNAを単独あるいはレトロウイル
スベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス
アソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクタ
ーに挿入した後、常套手段に従ってヒトまたはその他の
哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的
に投与することができる。該アンチセンスDNAは、そ
のままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理
学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハ
イドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与
できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管
内に局所投与することもできる。さらに、該アンチセン
スDNAは、組織や細胞における本発明のDNAの存在
やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチ
ドプローブとして使用することもできる。
【0107】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すもの
とする。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA :相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA :メッセンジャーリボ核酸 dATP :デオキシアデノシン三リン酸 dTTP :デオキシチミジン三リン酸 dGTP :デオキシグアノシン三リン酸 dCTP :デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA :エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すもの
とする。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA :相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA :メッセンジャーリボ核酸 dATP :デオキシアデノシン三リン酸 dTTP :デオキシチミジン三リン酸 dGTP :デオキシグアノシン三リン酸 dCTP :デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA :エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
【0108】Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Cys :システイン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニルアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン pGlu :ピログルタミン酸 * :終止コドンに対応する Me :メチル基 Et :エチル基 Bu :ブチル基 Ph :フェニル基 TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキ
サミド基
サミド基
【0109】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Tos :p−トルエンスルフォニル CHO :ホルミル Bzl :ベンジル Cl2Bzl :2,6−ジクロロベンジル Bom :ベンジルオキシメチル Z :ベンジルオキシカルボニル Cl−Z :2−クロロベンジルオキシカルボニ
ル Br−Z :2−ブロモベンジルオキシカルボニ
ル Boc :t−ブトキシカルボニル DNP :ジニトロフェノール Trt :トリチル Bum :t−ブトキシメチル Fmoc :N−9−フルオレニルメトキシカル
ボニル HOBt :1−ヒドロキシベンズトリアゾール HOOBt :3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ
−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン HONB :1−ヒドロキシ−5−ノルボルネン
−2,3−ジカルボキシイミド DCC :N,N’−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Tos :p−トルエンスルフォニル CHO :ホルミル Bzl :ベンジル Cl2Bzl :2,6−ジクロロベンジル Bom :ベンジルオキシメチル Z :ベンジルオキシカルボニル Cl−Z :2−クロロベンジルオキシカルボニ
ル Br−Z :2−ブロモベンジルオキシカルボニ
ル Boc :t−ブトキシカルボニル DNP :ジニトロフェノール Trt :トリチル Bum :t−ブトキシメチル Fmoc :N−9−フルオレニルメトキシカル
ボニル HOBt :1−ヒドロキシベンズトリアゾール HOOBt :3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ
−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン HONB :1−ヒドロキシ−5−ノルボルネン
−2,3−ジカルボキシイミド DCC :N,N’−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド
【0110】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 配列番号:1 本発明のヒト由来新規Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質TGR25のアミノ酸配列を示す。 配列番号:2 本発明のヒト由来新規Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質TGR25をコードするcDNAの塩基配列を
示す。 配列番号:3 以下の実施例1および実施例4におけるPCR反応で使
用したプライマー1の塩基配列を示す。 配列番号:4 以下の実施例1および実施例4におけるPCR反応で使
用したプライマー2の塩基配列を示す。 配列番号:5 本発明のヒト由来新規Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質TGR25をコードするcDNAの塩基配列の
3’端非翻訳領域を示す。 配列番号:6 以下の実施例2におけるPCR反応で使用したプライマ
ー3の塩基配列を示す。 配列番号:7 以下の実施例2におけるPCR反応で使用したプライマ
ー4の塩基配列を示す。 配列番号:8 本発明のヒト由来新規Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質TGR25をコードするcDNAの塩基配列の
5’端非翻訳領域を示す。 配列番号:9 以下の実施例3におけるPCR反応で使用したプライマ
ー5の塩基配列を示す。 配列番号:10 以下の実施例3におけるPCR反応で使用したプライマ
ー6の塩基配列を示す。
列を示す。 配列番号:1 本発明のヒト由来新規Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質TGR25のアミノ酸配列を示す。 配列番号:2 本発明のヒト由来新規Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質TGR25をコードするcDNAの塩基配列を
示す。 配列番号:3 以下の実施例1および実施例4におけるPCR反応で使
用したプライマー1の塩基配列を示す。 配列番号:4 以下の実施例1および実施例4におけるPCR反応で使
用したプライマー2の塩基配列を示す。 配列番号:5 本発明のヒト由来新規Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質TGR25をコードするcDNAの塩基配列の
3’端非翻訳領域を示す。 配列番号:6 以下の実施例2におけるPCR反応で使用したプライマ
ー3の塩基配列を示す。 配列番号:7 以下の実施例2におけるPCR反応で使用したプライマ
ー4の塩基配列を示す。 配列番号:8 本発明のヒト由来新規Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質TGR25をコードするcDNAの塩基配列の
5’端非翻訳領域を示す。 配列番号:9 以下の実施例3におけるPCR反応で使用したプライマ
ー5の塩基配列を示す。 配列番号:10 以下の実施例3におけるPCR反応で使用したプライマ
ー6の塩基配列を示す。
【0111】後述の実施例1で得られた形質転換体Es
cherichia coli TOP10/pTB21
82は、2000年11月28日から、大阪府大阪市淀
川区十三本町2−17−85(郵便番号532−868
6)、財団法人・発酵研究所(IFO)に受託番号IF
O 16502として、2000年12月4日から、日
本国茨城県つくば市東1−1−1 中央第6(郵便番号
305−8566)、独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター(旧 通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所(NIBH))に受託番号 FE
RM BP−7381としてそれぞれ寄託されている。
cherichia coli TOP10/pTB21
82は、2000年11月28日から、大阪府大阪市淀
川区十三本町2−17−85(郵便番号532−868
6)、財団法人・発酵研究所(IFO)に受託番号IF
O 16502として、2000年12月4日から、日
本国茨城県つくば市東1−1−1 中央第6(郵便番号
305−8566)、独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター(旧 通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所(NIBH))に受託番号 FE
RM BP−7381としてそれぞれ寄託されている。
【0112】
【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー
・クローニング(Molecular cloning)に記載されている
方法に従った。 実施例1 ヒト肺由来Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を
コードするcDNAのクローニングと塩基配列の決定 ヒト肺Marathon−Ready cDNA(CL
ONTECH社)を鋳型とし、2個のプライマー、プラ
イマー1(配列番号:3)およびプライマー2(配列番
号:4)を用いてPCR反応を行った。該反応における
反応液の組成は上記cDNA2μlを鋳型として使用
し、Pfu Turbo DNA Polymerase
(STRATAGENE社)1U、プライマー1(配列
番号:3)およびプライマー2(配列番号:4)を各1
μM、dNTPsを200μM、および酵素に2XGC
BufferI(TaKaRa社)を10μl加え、
20μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の
後、95℃・1分、65℃・1分、72℃・2.5分の
サイクルを38回繰り返した。次にアガロースゲル電気
泳動にて該PCR反応産物を精製した後、これをZer
o Blunt TOPO PCR クローニングキッ
ト(Invitrogen社)の処方に従いプラスミド
ベクターpCR−BluntII−TOPO(Invi
trogen社)へサブクローニングした。これを大腸
菌TOP10に導入し、cDNAを持つクローンをカナ
マイシンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクロ
ーンの配列を解析した結果、新規Gタンパク質共役型レ
セプタータンパク質をコードするcDNAの塩基配列
(配列番号:2)を得た。このDNAの塩基配列がコー
ドするアミノ酸配列(配列番号:1)を含有する新規G
タンパク質共役型レセプタータンパク質をTGR25と
命名した。さらに配列番号:2で表される塩基配列を有
するDNAを有するプラスミドをpTB2182と名付
け、その形質転換体を大腸菌(Escherichia
coli)TOP10/pTB2182と命名した。
TGR25の疎水性プロット図を〔図1〕に示す。
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー
・クローニング(Molecular cloning)に記載されている
方法に従った。 実施例1 ヒト肺由来Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を
コードするcDNAのクローニングと塩基配列の決定 ヒト肺Marathon−Ready cDNA(CL
ONTECH社)を鋳型とし、2個のプライマー、プラ
イマー1(配列番号:3)およびプライマー2(配列番
号:4)を用いてPCR反応を行った。該反応における
反応液の組成は上記cDNA2μlを鋳型として使用
し、Pfu Turbo DNA Polymerase
(STRATAGENE社)1U、プライマー1(配列
番号:3)およびプライマー2(配列番号:4)を各1
μM、dNTPsを200μM、および酵素に2XGC
BufferI(TaKaRa社)を10μl加え、
20μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の
後、95℃・1分、65℃・1分、72℃・2.5分の
サイクルを38回繰り返した。次にアガロースゲル電気
泳動にて該PCR反応産物を精製した後、これをZer
o Blunt TOPO PCR クローニングキッ
ト(Invitrogen社)の処方に従いプラスミド
ベクターpCR−BluntII−TOPO(Invi
trogen社)へサブクローニングした。これを大腸
菌TOP10に導入し、cDNAを持つクローンをカナ
マイシンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクロ
ーンの配列を解析した結果、新規Gタンパク質共役型レ
セプタータンパク質をコードするcDNAの塩基配列
(配列番号:2)を得た。このDNAの塩基配列がコー
ドするアミノ酸配列(配列番号:1)を含有する新規G
タンパク質共役型レセプタータンパク質をTGR25と
命名した。さらに配列番号:2で表される塩基配列を有
するDNAを有するプラスミドをpTB2182と名付
け、その形質転換体を大腸菌(Escherichia
coli)TOP10/pTB2182と命名した。
TGR25の疎水性プロット図を〔図1〕に示す。
【0113】実施例2 TGR25の3’端非翻訳領域の配列決定 ヒト肺Marathon−Ready cDNA(CL
ONTECH社)を鋳型とし、2個のプライマー、プラ
イマー3(配列番号:6)およびプライマー4(配列番
号:7)を用いて3’−RACE反応を行った。該反応
における反応液の組成は上記cDNA2μlを鋳型とし
て使用し、Advantage2 Polymeras
e(CLONTECH社)0.4μl、プライマー3
(配列番号:6)およびAdaptor Primer
(CLONTECH社)を各0.2μM、dNTPsを
200μM、および酵素に2XGC BufferI
(TaKaRa社)を10μl加え、20μlの液量と
した。PCR反応は、94℃・30秒の後、94℃・5
秒、72℃・4分のサイクルを5回、次に94℃・5
秒、70℃・4分のサイクルを5回、最後に94℃・5
秒、68℃・4分のサイクルを25回行った。次に該P
CR反応産物0.8μlを鋳型として使用し、Adva
ntage2 Polymerase(CLONTEC
H社)0.4μl、プライマー4(配列番号:7)およ
びNested Adaptor Primer(CL
ONTECH社)を各0.2μM、dNTPsを200
μM、および酵素に2XGC BufferI(TaK
aRa社)を10μl加え、20μlの液量とした。P
CR反応は、94℃・30秒の後、94℃・5秒、72
℃・4分のサイクルを5回、次に94℃・5秒、70℃
・4分のサイクルを5回、最後に94℃・5秒、68℃
・4分のサイクルを25回行った。次にアガロースゲル
電気泳動にて該PCR反応産物を精製した後、これをT
OPO TA クローニングキット(Invitrog
en社)の処方に従いプラスミドベクターpCR2.1
−TOPO(Invitrogen社)へサブクローニ
ングした。これを大腸菌TOP10に導入し、3’端非
翻訳領域を持つクローンを、カナマイシンを含むLB寒
天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析し、
TGR25の3’端非翻訳領域の配列(配列番号:5)
を明らかにした。
ONTECH社)を鋳型とし、2個のプライマー、プラ
イマー3(配列番号:6)およびプライマー4(配列番
号:7)を用いて3’−RACE反応を行った。該反応
における反応液の組成は上記cDNA2μlを鋳型とし
て使用し、Advantage2 Polymeras
e(CLONTECH社)0.4μl、プライマー3
(配列番号:6)およびAdaptor Primer
(CLONTECH社)を各0.2μM、dNTPsを
200μM、および酵素に2XGC BufferI
(TaKaRa社)を10μl加え、20μlの液量と
した。PCR反応は、94℃・30秒の後、94℃・5
秒、72℃・4分のサイクルを5回、次に94℃・5
秒、70℃・4分のサイクルを5回、最後に94℃・5
秒、68℃・4分のサイクルを25回行った。次に該P
CR反応産物0.8μlを鋳型として使用し、Adva
ntage2 Polymerase(CLONTEC
H社)0.4μl、プライマー4(配列番号:7)およ
びNested Adaptor Primer(CL
ONTECH社)を各0.2μM、dNTPsを200
μM、および酵素に2XGC BufferI(TaK
aRa社)を10μl加え、20μlの液量とした。P
CR反応は、94℃・30秒の後、94℃・5秒、72
℃・4分のサイクルを5回、次に94℃・5秒、70℃
・4分のサイクルを5回、最後に94℃・5秒、68℃
・4分のサイクルを25回行った。次にアガロースゲル
電気泳動にて該PCR反応産物を精製した後、これをT
OPO TA クローニングキット(Invitrog
en社)の処方に従いプラスミドベクターpCR2.1
−TOPO(Invitrogen社)へサブクローニ
ングした。これを大腸菌TOP10に導入し、3’端非
翻訳領域を持つクローンを、カナマイシンを含むLB寒
天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析し、
TGR25の3’端非翻訳領域の配列(配列番号:5)
を明らかにした。
【0114】実施例3 TGR25の5’端非翻訳領域の配列決定 ヒト肺Marathon−Ready cDNA(CL
ONTECH社)を鋳型とし、2個のプライマー、プラ
イマー5(配列番号:9)およびプライマー6(配列番
号:10)を用いてPCR反応を行った。該反応におけ
る反応液の組成は上記cDNA2μlを鋳型として使用
し、Advantage2 Polymerase(C
LONTECH社)0.4μl、プライマー5(配列番
号:9)およびプライマー6(配列番号:10)を各1
μM、dNTPsを200μM、および酵素に2XGC
BufferI(TaKaRa社)を10μl加え、
20μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の
後、95℃・20秒、60℃・15秒、72℃・1分1
5秒のサイクルを38回繰り返した。次にアガロースゲ
ル電気泳動にて該PCR反応産物を精製した後、これを
TOPO TA クローニングキット(Invitro
gen社)の処方に従いプラスミドベクターpCR2.
1−TOPO(Invitrogen社)へサブクロー
ニングした。これを大腸菌TOP10に導入し、5’端
非翻訳領域を持つクローンをカナマイシンを含むLB寒
天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析し、
TGR25の5’端非翻訳領域の配列(配列番号:8)
を明らかにした。
ONTECH社)を鋳型とし、2個のプライマー、プラ
イマー5(配列番号:9)およびプライマー6(配列番
号:10)を用いてPCR反応を行った。該反応におけ
る反応液の組成は上記cDNA2μlを鋳型として使用
し、Advantage2 Polymerase(C
LONTECH社)0.4μl、プライマー5(配列番
号:9)およびプライマー6(配列番号:10)を各1
μM、dNTPsを200μM、および酵素に2XGC
BufferI(TaKaRa社)を10μl加え、
20μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の
後、95℃・20秒、60℃・15秒、72℃・1分1
5秒のサイクルを38回繰り返した。次にアガロースゲ
ル電気泳動にて該PCR反応産物を精製した後、これを
TOPO TA クローニングキット(Invitro
gen社)の処方に従いプラスミドベクターpCR2.
1−TOPO(Invitrogen社)へサブクロー
ニングした。これを大腸菌TOP10に導入し、5’端
非翻訳領域を持つクローンをカナマイシンを含むLB寒
天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析し、
TGR25の5’端非翻訳領域の配列(配列番号:8)
を明らかにした。
【0115】実施例4 TGR25の発現組織の検討 実施例1で得られたpTB2182を鋳型とし、2個の
プライマー、プライマー1(配列番号:3)およびプラ
イマー2(配列番号:4)を用いてPCR反応を行っ
た。該反応における反応液の組成は上記プラスミドpT
B2182を鋳型として1ng使用し、TaKaRa
LA Taq(TaKaRa社)2.5U、プライマー
1(配列番号:3)およびプライマー2(配列番号:
4)を各1μM、dNTPsを200μM、および酵素
に2XGC BufferI(TaKaRa社)を25
μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、95
℃・30秒の後、95℃・20秒、60℃・15秒、7
2℃・2分のサイクルを30回繰り返し行った。次にア
ガロースゲル電気泳動を行い、Gel Extract
ion Kit(QIAGEN社)を用いて該PCR反
応産物を精製した。ここで得られたPCR反応産物を用
いてMegaprime DNA labelling
systems(アマシャム社)を用いてノーザンブロ
ット用のプローブを作製した。プローブの作製は上記P
CR反応産物25ngに同Megaprime DNA
labelling systemsに添付のPrim
er solutionを3μl加え15.6μlの液
量とし、5分間煮沸した。これに[32P]dCTP(ア
マシャム社)3μl、Megaprime DNA la
belling systemsに添付のdGTPを
2.4μl、dATPを2.4μl、dTTPを2.4
μl、Reaction bufferを3μl、En
zymeを1.2μl加え、37℃にて10分間反応を
行った。該反応産物をS−300 HRカラム(アマシ
ャム社)にて精製し、5mlのExpressHyb
Hybridization Solutionでプレ
ハイブリダイゼーション反応を行ったHuman MT
N Blot、およびHuman MTN BlotII
の反応液中へ添加し68℃にて一晩ハイブリダイゼーシ
ョン反応を行った。次に、これらHuman MTN B
lot、およびHuman MTN BlotIIを0.
05%SDS、および2xSSCを含む溶液で洗浄し、
さらに0.1%SDSおよび0.2xSSCを含む溶液
で3回洗浄し、BAS−2000II(FUJIX社)
にて検出を行った。その結果、TGR25は脾臓、小
腸、白血球で発現が強い他、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、
腎臓、胸腺、前立腺、卵巣、大腸などの組織で広範囲に
わたって発現していることがわかった。
プライマー、プライマー1(配列番号:3)およびプラ
イマー2(配列番号:4)を用いてPCR反応を行っ
た。該反応における反応液の組成は上記プラスミドpT
B2182を鋳型として1ng使用し、TaKaRa
LA Taq(TaKaRa社)2.5U、プライマー
1(配列番号:3)およびプライマー2(配列番号:
4)を各1μM、dNTPsを200μM、および酵素
に2XGC BufferI(TaKaRa社)を25
μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、95
℃・30秒の後、95℃・20秒、60℃・15秒、7
2℃・2分のサイクルを30回繰り返し行った。次にア
ガロースゲル電気泳動を行い、Gel Extract
ion Kit(QIAGEN社)を用いて該PCR反
応産物を精製した。ここで得られたPCR反応産物を用
いてMegaprime DNA labelling
systems(アマシャム社)を用いてノーザンブロ
ット用のプローブを作製した。プローブの作製は上記P
CR反応産物25ngに同Megaprime DNA
labelling systemsに添付のPrim
er solutionを3μl加え15.6μlの液
量とし、5分間煮沸した。これに[32P]dCTP(ア
マシャム社)3μl、Megaprime DNA la
belling systemsに添付のdGTPを
2.4μl、dATPを2.4μl、dTTPを2.4
μl、Reaction bufferを3μl、En
zymeを1.2μl加え、37℃にて10分間反応を
行った。該反応産物をS−300 HRカラム(アマシ
ャム社)にて精製し、5mlのExpressHyb
Hybridization Solutionでプレ
ハイブリダイゼーション反応を行ったHuman MT
N Blot、およびHuman MTN BlotII
の反応液中へ添加し68℃にて一晩ハイブリダイゼーシ
ョン反応を行った。次に、これらHuman MTN B
lot、およびHuman MTN BlotIIを0.
05%SDS、および2xSSCを含む溶液で洗浄し、
さらに0.1%SDSおよび0.2xSSCを含む溶液
で3回洗浄し、BAS−2000II(FUJIX社)
にて検出を行った。その結果、TGR25は脾臓、小
腸、白血球で発現が強い他、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、
腎臓、胸腺、前立腺、卵巣、大腸などの組織で広範囲に
わたって発現していることがわかった。
【0116】
【発明の効果】本発明のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、該
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコード
するポリヌクレオチド(例えば、DNA、RNAおよび
それらの誘導体)、あるいは該レセプタータンパク質の
非翻訳領域を有するポリヌクレオチドは、リガンド
(アゴニスト)の決定、抗体および抗血清の入手、
組換え型レセプタータンパク質の発現系の構築、同発
現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品
候補化合物のスクリーニング、構造的に類似したリガ
ンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザイ
ンの実施、遺伝子診断におけるプローブやPCRプラ
イマーの作成のための試薬、トランスジェニック動物
の作出または遺伝子治療剤等の医薬等として用いるこ
とができる。
タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、該
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコード
するポリヌクレオチド(例えば、DNA、RNAおよび
それらの誘導体)、あるいは該レセプタータンパク質の
非翻訳領域を有するポリヌクレオチドは、リガンド
(アゴニスト)の決定、抗体および抗血清の入手、
組換え型レセプタータンパク質の発現系の構築、同発
現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品
候補化合物のスクリーニング、構造的に類似したリガ
ンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザイ
ンの実施、遺伝子診断におけるプローブやPCRプラ
イマーの作成のための試薬、トランスジェニック動物
の作出または遺伝子治療剤等の医薬等として用いるこ
とができる。
【0117】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel G Protein-Coupled Receptor and its DNA <130> P01-0266 <150> JP 2000-372828 <151> 2000-12-07 <160> 10 <210> 1 <211> 549 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ala Thr Pro Arg Gly Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 5 10 15 Pro Thr Ser Gly Gln Glu Lys Pro Thr Glu Gly Pro Arg Asn Thr Cys 20 25 30 Leu Gly Ser Asn Asn Met Tyr Asp Ile Phe Asn Leu Asn Asp Lys Ala 35 40 45 Leu Cys Phe Thr Lys Cys Arg Gln Ser Gly Ser Asp Ser Cys Asn Val 50 55 60 Glu Asn Leu Gln Arg Tyr Trp Leu Asn Tyr Glu Ala His Leu Met Lys 65 70 75 80 Glu Gly Leu Thr Gln Lys Val Asn Thr Pro Phe Leu Lys Ala Leu Val 85 90 95 Gln Asn Leu Ser Thr Asn Thr Ala Glu Asp Phe Tyr Phe Ser Leu Glu 100 105 110 Pro Ser Gln Val Pro Arg Gln Val Met Lys Asp Glu Asp Lys Pro Pro 115 120 125 Asp Arg Val Arg Leu Pro Lys Ser Leu Phe Arg Ser Leu Pro Gly Asn 130 135 140 Arg Ser Val Val Arg Leu Ala Val Thr Ile Leu Asp Ile Gly Pro Gly 145 150 155 160 Thr Leu Phe Lys Gly Pro Arg Leu Gly Leu Gly Asp Gly Ser Gly Val 165 170 175 Leu Asn Asn Arg Leu Val Gly Leu Ser Val Gly Gln Met His Val Thr 180 185 190 Lys Leu Ala Glu Pro Leu Glu Ile Val Phe Ser His Gln Arg Pro Pro 195 200 205 Pro Asn Met Thr Leu Thr Cys Val Phe Trp Asp Val Thr Lys Gly Thr 210 215 220 Thr Gly Asp Trp Ser Ser Glu Gly Cys Ser Thr Glu Val Arg Pro Glu 225 230 235 240 Gly Thr Val Cys Cys Cys Asp His Leu Thr Phe Phe Ala Leu Leu Leu 245 250 255 Arg Pro Thr Leu Asp Gln Ser Thr Val His Ile Leu Thr Arg Ile Ser 260 265 270 Gln Ala Gly Cys Gly Val Ser Met Ile Phe Leu Ala Phe Thr Ile Ile 275 280 285 Leu Tyr Ala Phe Leu Arg Leu Ser Arg Glu Arg Phe Lys Ser Glu Asp 290 295 300 Ala Pro Lys Ile His Val Ala Leu Gly Gly Ser Leu Phe Leu Leu Asn 305 310 315 320 Leu Ala Phe Leu Val Asn Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Ser Asp Ala 325 330 335 Ala Cys Trp Ala Arg Gly Ala Val Phe His Tyr Phe Leu Leu Cys Ala 340 345 350 Phe Thr Trp Met Gly Leu Glu Ala Phe His Leu Tyr Leu Leu Ala Val 355 360 365 Arg Val Phe Asn Thr Tyr Phe Gly His Tyr Phe Leu Lys Leu Ser Leu 370 375 380 Val Gly Trp Gly Leu Pro Ala Leu Met Val Ile Gly Thr Gly Ser Ala 385 390 395 400 Asn Ser Tyr Gly Leu Tyr Thr Ile Arg Asp Arg Glu Asn Arg Thr Ser 405 410 415 Leu Glu Leu Cys Trp Phe Arg Glu Gly Thr Thr Met Tyr Ala Leu Tyr 420 425 430 Ile Thr Val His Gly Tyr Phe Leu Ile Thr Phe Leu Phe Gly Met Val 435 440 445 Val Leu Ala Leu Val Val Trp Lys Ile Phe Thr Leu Ser Arg Ala Thr 450 455 460 Ala Val Lys Glu Arg Gly Lys Asn Arg Lys Lys Val Leu Thr Leu Leu 465 470 475 480 Gly Leu Ser Ser Leu Val Gly Val Thr Trp Gly Leu Ala Ile Phe Thr 485 490 495 Pro Leu Gly Leu Ser Thr Val Tyr Ile Phe Ala Leu Phe Asn Ser Leu 500 505 510 Gln Gly Val Phe Ile Cys Cys Trp Phe Thr Ile Leu Tyr Leu Pro Ser 515 520 525 Gln Ser Thr Thr Val Ser Ser Ser Thr Ala Arg Leu Asp Gln Ala His 530 535 540 Ser Ala Ser Gln Glu 545 <210> 2 <211> 1647 <212> DNA <213> Human <400> 2 atggcgacgc ccaggggcct gggggccctg ctcctgctcc tcctgctccc gacctcaggt 60 caggaaaagc ccaccgaagg gccaagaaac acctgcctgg ggagcaacaa catgtacgac 120 atcttcaact tgaatgacaa ggctttgtgc ttcaccaagt gcaggcagtc gggcagcgac 180 tcctgcaatg tggaaaactt gcagagatac tggctaaact acgaggccca tctgatgaag 240 gaaggtttga cgcagaaggt gaacacgcct ttcctgaagg ctttggtcca gaacctcagc 300 accaacactg cagaagactt ctatttctct ctggagccct ctcaggttcc gaggcaggtg 360 atgaaggacg aggacaagcc ccctgacaga gtgcgacttc ccaagagcct ttttcgatcc 420 ctgccaggca acaggtctgt ggtccgcttg gccgtcacca ttctggacat tggtccaggg 480 actctcttca agggcccccg gctcggcctg ggagatggca gcggcgtgtt gaacaatcgc 540 ctggtgggtt tgagtgtggg acaaatgcat gtcaccaagc tggctgagcc tctggagatc 600 gtcttctctc accagcgacc gccccctaac atgaccctca cctgtgtatt ctgggatgtg 660 actaaaggga ccactggaga ctggtcttct gagggctgct ccacggaggt cagacctgag 720 gggaccgtgt gctgctgtga ccacctgacc tttttcgccc tgctcctgag acccaccttg 780 gaccagtcca cggtgcatat cctcacacgc atctcccagg cgggctgtgg ggtctccatg 840 atcttcctgg ccttcaccat tattctttat gcctttctga ggctttcccg ggagaggttc 900 aagtcagaag atgccccaaa gatccacgtg gccctgggtg gcagcctgtt cctcctgaat 960 ctggccttct tggtcaatgt ggggagtggc tcaaaggggt ctgatgctgc ctgctgggcc 1020 cggggggctg tcttccacta cttcctgctc tgtgccttca cctggatggg ccttgaagcc 1080 ttccacctct acctgctcgc tgtcagggtc ttcaacacct acttcgggca ctacttcctg 1140 aagctgagcc tggtgggctg gggcctgccc gccctgatgg tcatcggcac tgggagtgcc 1200 aacagctacg gcctctacac catccgtgat agggagaacc gcacctctct ggagctatgc 1260 tggttccgtg aagggacaac catgtacgcc ctctatatca ccgtccacgg ctacttcctc 1320 atcaccttcc tctttggcat ggtggtcctg gccctggtgg tctggaagat cttcaccctg 1380 tcccgtgcta cagcggtcaa ggagcggggg aagaaccgga agaaggtgct caccctgctg 1440 ggcctctcga gcctggtggg tgtgacatgg gggttggcca tcttcacccc gttgggcctc 1500 tccaccgtct acatctttgc acttttcaac tccttgcaag gtgtcttcat ctgctgctgg 1560 ttcaccatcc tttacctccc aagtcagagc accacagtct cctcctctac tgcaagattg 1620 gaccaggccc actccgcatc tcaagaa 1647 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding TGR25 <400> 3 tgggcaaggc tggccaagga tgg 23 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding TGR25 <400> 4 ctattcttga gatgcggagt gggcctggtc caatc 35 <210> 5 <211> 930 <212> DNA <213> Human <400> 5 taggaaggca cggccctgca atatggactc agctctggct ctctgtgtga ccttgggcag 60 ctccgtgcct ctctctgtac tccctcagtt tccttctctg tacaatgtgg ctggggaggg 120 agaggatggg accaggttgg accacgtggc atcagaggtc ccatccagat ccaactatag 180 gtccaagagt ccacgtaagc aggttagcaa ggctctaaag ttcctatagt cctgagaccc 240 cctgccagca aagagtgaca gtcacctcca tgccctgccc tcattgcaaa gccctcactc 300 accttctggt ctcagcaagg gaggagagtc tgttgctggc atagccctgg aaggagcccc 360 cagcctctcc cctcctcctc cttgtcactg gcctcccaca actccccttc tggctgcctg 420 taaccttgag gggcattcag gaggccagcg ttccctcagg cattgggggt ttgttttggg 480 gggtgggagt tgatcttccc acccagtctg cccctggtct ctgcccatcc aatcagagcc 540 caccctcctg gaagagaccc ccgtgttcag agtgctggca gccctgcacg tgtccaggga 600 cactgcattt caaagaacca ctgagtgggt gagctacctt gggcaaaccc cccactcctg 660 actctgactg ccacgtgggt ggcccgacct ctgacctgct gtcatcgtag aggtagaaag 720 caaacaatct ggggctcagc acacctgggg gtgctcccac tcattcagtg tgtggggccc 780 ctgagcagag gctgggcatt gccactagga cctgagctcc tagagaacaa ggacctgggt 840 ggcctcgctt actgttccag cccaggccaa gcacagggtc tggctcgtgg caaaccttga 900 ataaatattt gttggctaaa aaaaaaaaaa 930 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding 3' untrans lated region of TGR25 <400> 6 gctggccgca ttgctggacc ctgtgag 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding 3' untrans lated region of TGR25 <400> 7 gcatggtggt cctggccctg gtggtctg 28 <210> 8 <211> 154 <212> DNA <213> Human <400> 8 aaccaatggc gccatcgagc aggaagggtg agaaagagga cacaggaagc cagagtggtg 60 gggctgcagg gtgggggcag gccagctcag cagagcctgg ggccagaggg ccagacagcc 120 acagagctcc tggcgtgggc aaggctggcc aagg 154 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding 5' untrans lated region of TGR25 <400> 9 aaccaatggc gccatcgagc aggaa 25 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding 5' untrans lated region of TGR25 <400> 10 gggggcttgt cctcgtcctt catcacct 28
【図1】 TGR25の疎水性プロット図である。
【図2】 一文字表記によるTGR25のアミノ酸配列
を示す図である。
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 1/04 A61P 3/10 4C084 3/06 9/10 4C085 3/10 9/12 4H045 9/10 11/00 9/12 11/08 11/00 15/08 11/08 25/28 15/08 29/00 101 25/28 31/16 29/00 101 35/00 31/16 37/02 35/00 37/04 37/02 43/00 101 37/04 C07K 14/705 43/00 101 16/28 C07K 14/705 C12N 1/15 16/28 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/15 Z C12P 21/02 33/50 Z C12Q 1/68 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/15 5/00 A 33/50 A61K 37/02 (72)発明者 宮嶋 伸行 茨城県つくば市吾妻4丁目16−4 プレビ ュー吾妻403 Fターム(参考) 2G045 AA34 AA35 BB14 BB29 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 HA12 HA15 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG20 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA44 CA46 4C084 AA02 AA17 BA01 BA08 BA22 CA18 NA14 ZA15 ZA16 ZA40 ZA42 ZA59 ZA61 ZA68 ZA81 ZB05 ZB09 ZB15 ZB26 ZB33 ZC35 ZC54 4C085 AA13 AA14 BB11 CC03 CC22 CC23 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (34)
- 【請求項1】 配列番号:1で表されるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するこ
とを特徴とするGタンパク質共役型レセプタータンパク
質またはその塩。 - 【請求項2】 配列番号:1で表されるアミノ酸配列を
含有する請求項1記載のGタンパク質共役型レセプター
タンパク質。 - 【請求項3】 請求項1記載のGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩。 - 【請求項4】 請求項1記載のGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有
するポリヌクレオチド。 - 【請求項5】 DNAである請求項4記載のポリヌクレ
オチド。 - 【請求項6】 配列番号:2で表される塩基配列を含有
する請求項5記載のDNA。 - 【請求項7】 請求項4記載のポリヌクレオチドを含有
する組換えベクター。 - 【請求項8】 請求項7記載の組換えベクターで形質転
換させた形質転換体。 - 【請求項9】 請求項8記載の形質転換体を培養し、請
求項1記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質
を生成せしめることを特徴とする請求項1記載のGタン
パク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の製造
法。 - 【請求項10】 請求項1記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくは請求項3記載の部分ペプチ
ドまたはその塩に対する抗体。 - 【請求項11】 請求項1記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和
抗体である請求項10記載の抗体。 - 【請求項12】 請求項10記載の抗体を含有してなる
診断薬。 - 【請求項13】 請求項10記載の抗体を含有してなる
医薬。 - 【請求項14】 請求項1記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくは請求項3記載の部分ペプチ
ドまたはその塩を用いることにより得られうる請求項1
記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質または
その塩に対するリガンド。 - 【請求項15】 請求項14記載のGタンパク質共役型
レセプターのリガンドを含有してなる医薬。 - 【請求項16】 請求項1記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくは請求項3記載の部分ペプチ
ドまたはその塩を用いることを特徴とする請求項1記載
のGタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
塩に対するリガンドの決定方法。 - 【請求項17】 請求項1記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくは請求項3記載の部分ペプチ
ドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと請
求項1記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク質
またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその
塩のスクリーニング方法。 - 【請求項18】 請求項1記載のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくは請求項3記載の部分ペプチ
ドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと
請求項1記載のGタンパク質共役型レセプタータンパク
質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング用キット。 - 【請求項19】 請求項17記載のスクリーニング方法
または請求項18記載のスクリーニング用キットを用い
て得られうるリガンドと請求項1記載のGタンパク質共
役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変
化させる化合物またはその塩。 - 【請求項20】 請求項17記載のスクリーニング方法
または請求項18記載のスクリーニング用キットを用い
て得られうるリガンドと請求項1記載のGタンパク質共
役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変
化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。 - 【請求項21】 請求項4記載のポリヌクレオチドとハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項22】 請求項4記載のポリヌクレオチドと相
補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌク
レオチド。 - 【請求項23】 請求項4記載のポリヌクレオチドまた
はその一部を用いることを特徴とする請求項1記載のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質のmRNAの定
量方法。 - 【請求項24】 請求項10記載の抗体を用いることを
特徴とする請求項1記載のGタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質の定量方法。 - 【請求項25】 請求項23または請求項24記載の定
量方法を用いることを特徴とする請求項1記載のGタン
パク質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断
法。 - 【請求項26】 請求項23記載の定量方法を用いるこ
とを特徴とする請求項1記載のGタンパク質共役型レセ
プタータンパク質の発現量を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法。 - 【請求項27】 請求項24記載の定量方法を用いるこ
とを特徴とする細胞膜における請求項1記載のGタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング方法。 - 【請求項28】 請求項26記載のスクリーニング方法
を用いて得られうる請求項1記載のGタンパク質共役型
レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物また
はその塩。 - 【請求項29】 請求項27記載のスクリーニング方法
を用いて得られうる細胞膜における請求項1記載のGタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる化
合物またはその塩。 - 【請求項30】 請求項28記載の化合物またはその塩
を含有してなる医薬。 - 【請求項31】 請求項29記載の化合物またはその塩
を含有してなる医薬。 - 【請求項32】 中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患、
癌、心疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、免疫系疾患
または感染症の予防・治療剤である請求項20、請求項
30または請求項31記載の医薬。 - 【請求項33】 哺乳動物に対して、請求項19、請求
項28または請求項29記載の化合物またはその塩の有
効量を投与することを特徴とする中枢疾患、内分泌疾
患、代謝疾患、癌、心疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾
患、免疫系疾患または感染症の予防・治療方法。 - 【請求項34】 中枢疾患、内分泌疾患、代謝疾患、
癌、心疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、免疫系疾患
または感染症の予防・治療剤を製造するための請求項1
9、請求項28または請求項29記載の化合物またはそ
の塩の使用。
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