WO2005100987A1 - Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の新規リガンドとその用途 - Google Patents

Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の新規リガンドとその用途 Download PDF

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WO2005100987A1
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cancer
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Ryo Fujii
Shoichi Okubo
Kazunori Nishi
Shuji Hinuma
Masaaki Mori
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a novel ligand for a G protein-coupled receptor protein and its use. '' Background technology
  • G protein-coupled receptor protein GPCR
  • TMR seven transmembrane receptor proteins
  • G protein-coupled receptor protein is present on the surface of each functional cell in living cells and organs, and is a molecule that regulates the functions of those cells and organs, for example, targets such as hormones, neurotransmitters and bioactive substances. Plays a physiologically important role.
  • the receptor transmits a signal into a cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
  • G protein-coupled receptor protein Elucidating the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various organisms and their specific receptor proteins, especially G protein-coupled receptor protein, is important for various organisms. It will elucidate the functions of cells and organs and provide a very important means for drug development closely related to those functions.
  • physiological functions are regulated under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • physiologically active substances exist in various parts of the body, and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins.
  • hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances in the living body There are many unknown hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances in the living body.
  • Many protein structures have not yet been reported.
  • TGR25 is known as one of the orphan G protein-coupled receptor proteins (W002 / 46394). This protein is also called GPR97 (FEBS Letters 531, 407-414 (2002)), and its mouse homologue, Pb99, is known (MoI. Cell. Biol. 20, 4405-4410 (2000) )). Pb99 is expressed on B precursor cells and thymocytes, but not on mature B and T cells, and has been reported to be involved in lymphatic development. There is also a report that TGR25 is a receptor expressed in bone marrow (JP-A-2003-24070).
  • the G protein-coupled receptor is useful for searching for a new physiologically active substance (that is, a ligand) and for searching for an agonist or antagonist for the receptor, using its signal transduction action as an index.
  • a new physiologically active substance that is, a ligand
  • an agonist or antagonist to the receptor can be produced by analyzing the physiological action of the receptor from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor. It is also possible.
  • These ligands, agonists, antagonists, and the like for the receptor are expected to be used as preventive and / or therapeutic or diagnostic agents for diseases associated with dysfunction of the G protein-coupled receptor.
  • a decrease or enhancement of the function of the receptor in a living body based on a gene mutation of a G protein-coupled receptor often causes some disease.
  • the nucleotide sequence of the receptor is essential information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene. And / or can be applied to therapeutic and diagnostic agents.
  • an object of the present invention is to determine a ligand for TGR25, and to further provide uses of TGR25 and its ligand. That is, the present invention provides a method for screening a compound (antagonist, agonist) or a salt thereof that changes the binding property between a ligand and TGR25, a screening kit thereof, the screening method, or a screening kit.
  • a pharmaceutical comprising a compound (antagonist, agonist) or a salt thereof that alters the binding between a ligand and TGR25, or a salt thereof, and a compound that alters the binding between a ligand and TGR25 (antagonist, agonist), such as leukocytes Low-incidence, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, Muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, Po Rick syndrome, thrombocytopenia, an object thrombocytosis, cancer, providing a preventive or therapeutic agent for pulmonary edema or multiple organ failure.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, disclosed in Japanese Patent Application No. 2003-393056 (PCT-JP04-017519), which does not require a special cell line, and which is not required for ligands.
  • Using a screening method AM251 was found to be a surrogate ligand for TGR25.
  • AM281 and DH97 were also found to be surrogate ligands for TGR25.
  • the present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • [1] (1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide or a salt thereof, and ( 2) a ligand or The use of the receptor protein or a salt thereof and the ligand or a salt thereof characterized by using a salt thereof.
  • [La] signal transduction (1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, part thereof: tide or a salt thereof, and ( 2) The screening method according to the above (1), wherein the signal transduction is a signal transduction caused by binding to a ligand or a salt thereof.
  • Ar 1 and Ar 2 each represent an aryl which may have a substituent
  • R 1 represents a hydrocarbon group which may have a substituent
  • R 2 and R 3 each represent a hydrogen atom or an optionally substituted homo or heterocyclic group] or a salt thereof (hereinafter abbreviated as compound (I)
  • compound (I) The screening method according to the above (1),
  • the ligand is AM251 [(2,4-dichlorophenyl) -5- (4-iodophenyl) -4-methylpiperidine-triyl-1H-pyrazole-3-carboxamide; Tri (2,4-dichlorophenyl) -5- (4-iodophenyl) -4-methyl-N-piperidin-l-yl-lH-pyrazole-3-carboxamide) or AM281 [tri (2,4-dichlorophenyl) -5- (4-iodophenyl) -4-methyl-N-morpholine-4-yl-1H-pyrazol-3--3-propanolamide; (2,4-dichlorophenyl) -5- (4-iodophenyl) -4-methyl-N-morpholin-4-yl-lH-pyrazole-3-carboxamide) is the screening method according to the above (1),
  • ring A is a benzene ring which may have a substituent
  • R 4 and R 5 are each a hydrogen atom, a hydrocarbon group which may have a substituent, a heterocyclic group or an acyl which may have a substituent,
  • R 6 is a hydrocarbon group which may have a substituent
  • X represents one NR 7 — (R 7 represents a hydrogen atom, a hydrocarbon group optionally having substituent (s) or a heterocyclic group optionally having substituent (s)), —O— or —S—) or a salt thereof (hereinafter may be abbreviated as compound (II)).
  • the ligand is DH97 [N- [2- (2-benzyl-1H-indole-3-yl) ethyl] pentanamide;-[2- (2-benzyl-lH-indol-3-yl) ) ethyl] pentanamide].
  • [7] (1) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide or a salt thereof, and (2) a ligand or A screening of an agonist or an agonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises using a compound or a salt thereof that changes the binding between the salt and the receptor protein or the salt thereof.
  • a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) The receptor or a salt thereof, which comprises a ligand or a salt thereof.
  • a G protein-coupled receptor protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) a ligand Or binding of the salt thereof to the receptor protein or a salt thereof: screening for an agonist or an angoniist against the receptor protein or a salt thereof, which comprises a compound or a salt thereof that changes the sex. Kit,
  • a protein or a salt thereof that has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with a ligand or a salt thereof;
  • a medicament comprising a compound to be changed or a salt thereof,-
  • leukopenia or leukemia comprising a ligand for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 , Lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardium Prevention and treatment of infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, mesopolitic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytosis, cancer, pulmonary edema or multiple organ failure, [15] SEQ ID NO: Identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by 1 Leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsils containing agonist against
  • the test compound contains a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Measuring a change in binding or signal transduction when brought into contact with a cell, a method for screening an angonist for the receptor protein or a salt thereof,
  • a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • G protein-coupled receptor protein or a portion thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Leukopenia, leukemia, lymphoma, malignancy, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease or inflammation comprising a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a peptide
  • G protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, containing an antibody against S-coupled receptor protein or its partial peptide or a salt thereof Prevention and treatment of leukocyte hyperplasia or leukocyte activator,
  • a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Leukopenia leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, heredity Muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metabolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytosis, cancer, pulmonary edema or multiple organ failure Diagnostic agents, ''
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or a part thereof and a therapeutic or leukocyte activator
  • [26] to a mammal (i) the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 Or a G protein-coupled receptor protein containing substantially the same amino acid sequence, a partial peptide thereof or a salt thereof, (ii) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the above-mentioned receptor protein or a partial peptide thereof Or (iii) an agonist against the receptor protein or a salt thereof, or (iv) an effective amount of a ligand for a protein or a salt thereof.
  • Malignant tumors ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease or inflammatory disease prevention and treatment method,
  • a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1 (this amino acid sequence is the same, a partial peptide thereof) Or a salt thereof, or (ii) a polynucleotide comprising a salt sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the receptor protein or a partial peptide thereof or a part thereof.
  • leukopenia Prevent leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease or inflammatory disease
  • a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a partial peptide thereof
  • a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the receptor protein or a partial peptide thereof
  • a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an antibody against a partial peptide or a salt thereof, (ii) complementary to the polynucleotide containing the polynucleotide encoding the receptor protein or a partial peptide thereof.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence or a part thereof, or
  • the activity of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the activity of a partial peptide or a salt thereof, or the aforementioned receptor Yuichi It is characterized by promoting the activity of ligand for protein, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease or inflammatory disease Disease prevention and treatment methods,
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof is referred to as “the receptor of the present invention” or “the protein of the present invention”. May be abbreviated.
  • the method comprises measuring and comparing the enzymatic activity of a reporter gene protein when brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention into which a single gene vector has been introduced, and comparing the ligand of the present invention with the receptor of the present invention. Screening method for a compound that changes the binding property of
  • (V) a case where the ligand of the present invention is brought into contact with a cell expressing the receptor of the present invention containing labeled arachidonic acid; and a case where the ligand of the present invention and a test compound are brought into contact with the labeled arachidonic acid.
  • the binding activity between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is characterized by measuring and comparing the release activity of arachidonic acid metabolites when the cells are brought into contact with cells expressing the receptor of the present invention. Screening method of the compound to be
  • a method for screening a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention which comprises measuring and comparing calcium concentration increasing activities;
  • (xi i)-a yeast expressing the receptor of the present invention into which a histidine synthesis gene has been introduced is cultured in a histidine-deficient medium, and the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound are brought into contact with each other to grow the yeast. Measuring and comparing the compound, a method for screening a compound that alters the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention,
  • FIG. 1 shows the distribution of TGR25 mRNA expression in various human tissues.
  • FIG. 2 shows a diagram showing specific high expression of TGR25 mRNA in human peripheral blood polymorphonuclear leukocytes.
  • FIG. 3 shows a diagram showing the inhibitory effect of AM251 on MAP kinase activation on human peripheral blood polymorphic leukocytes.
  • FIG. 4 is a graph showing the activity of AM251 to induce differentiation of HL-60, a human leukemia cell line, into neutrophil-like cells.
  • the dashed line represents untreated cells
  • the thin solid line represents cells treated with DMS0 alone
  • the thick solid line represents the expression level of neutrophil differentiation marker cell surface antigen CDl lb / Mac-1 in cells treated with DMS0 and AM251, respectively. Is shown.
  • TGR25 used in the present invention is a receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • TGR25 can be expressed in all cells (splenocytes, neurons, glial cells, glial cells, glandular beta cells, bone marrow, etc.) in human mammals (guinea pigs, lads, mice, egrets, bushes, hidges, horses, monkeys, etc.).
  • Cells mesangial cells, Langer's cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, ⁇ cells, ⁇ cells, natural killer cells, obesity Cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or Progenitor cells of these cells, stem cells or cancer cells, etc.), blood cells, or any tissue where these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, Basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla oblongata, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 85% or more, preferably 90% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Represents an amino acid sequence having about 95% or more homology. Amino acid sequence homology is calculated using the homology calculation algorithm NCBI
  • the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention includes, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein having substantially the same activity as TGR25 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • substantially the same activity examples include a ligand binding activity and a signal transduction activity.
  • substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as the ligand binding activity and the signal transduction activity are equivalent (for example, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 20 times).
  • the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • the activity such as the ligand binding activity and the signal signal transduction can be measured according to a known method. For example, the activity can be measured according to a screening method described later.
  • TGR25 includes: a) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably Is an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted, b) 1 or more (preferably about 1 to 30 and more preferably 1 to 30 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) About 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids, and c) one or more (preferably, one or more) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Is for example, a protein containing an amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids have been substituted with another amino acid, or d) an amino acid sequence combining them.
  • TGR25 has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a 0-terminus (potoxyl terminus) at the right end, according to the convention of peptide labeling.
  • TGR 25 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, including TGR 25, has a carboxyl group (one COOH), a carboxylate (—C ⁇ -), and an amide at the C-terminal.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, ⁇ Bok 6 alkyl group such as isopropyl or n- butyl, cyclopentyl Le, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example , phenyl, alpha-naphthyl etc.
  • TGR25 has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • an amidated or esterified propyloxyl group is also included in the TGR25 of the present invention.
  • ester for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the TGR25 in protein described above, is protected with Amino group protecting group of Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, etc. Ct_ 6 Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoi Le group such Asechiru) N-terminal cleavage in vivo, daryumin mill group generated by pyroglutamine oxidation, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (for example, 1 OH, 1 SH, amino group, imidazo Ichirumoto, indole group, etc. Guanijino group) if a suitable protecting group (eg, those protected by the formyl group, etc.
  • a suitable protecting group eg, those protected by the formyl group, etc.
  • TGR25 of the present invention for example, human-derived TGR25 (WO200246394) comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used. It is.
  • the partial peptide of TGR 25 may be any peptide as long as it is a partial peptide of TGR 25 described above. Sites that are exposed outside the cell membrane and have substantially the same receptor binding activity are used. Specifically, as a partial peptide of TGR 25 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the extracellular region (hydrophilicity)
  • a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used.
  • a peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the receptor protein of the present invention.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence having about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with these amino acid sequences. Amino acid sequence homology can be calculated under the same conditions using the same homology calculation algorithm NCBI BLAST as described above.
  • substantially the same receptor activity has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same receptor activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide of the present invention has one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence, Or one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence; or One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence may be substituted with another amino acid .
  • the C-terminus has a hydroxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO—), an amide (—C ⁇ NH 2 ), or an ester (1-COO—).
  • R hydroxyl group
  • the partial peptide of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • the partial peptide of the present invention also includes a lipoxyl group amidated or esterified. .
  • the ester for example, the above-mentioned ester at the end of the chain is used.
  • the partial peptides of the present invention include those in which the amino group of the ⁇ -terminal methionine residue is protected with a protecting group, and those in which ⁇ -terminal side is cut in vivo to produce daltamyl. Includes those in which the group is pyroglutamine-oxidized, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bonded, such as a so-called sugar peptide. It is.
  • Examples of the salt of TGR25 or a partial peptide thereof of the present invention include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • the ligand of the present invention may be any ligand as long as it has the ability to specifically bind to TGR25.
  • the dissociation constant of the bond to TGR25 is 10 ⁇ or less, preferably 2M or less, more preferably 1M or less, particularly preferably 200nM or less, and most preferably 100nM or less. The following are examples.
  • ligand of the present invention for example, compound (I), compound (II) and the like are used.
  • a halogen atom e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • 3 Arukirenjio Alkoxy eg, Mechirenjiokishi, etc.
  • alkyl which may be halogenation, halogenated which may be C 2 _ 6 an alkenyl, Karupokishi C 2 _ 6 alkenyl (e.g., 2-force Lipoxetenyl, 2-carboxy-2-methylethenyl, etc.), optionally halogenated C 2 _ 6 alkynyl, optionally halogenated and optionally condensed C 3 _ 8 cycloalkyl, C 6 _ 14 aryl (eg, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 2-biphenyl, 3-biphenyl, 4-biphenyl, 2-anthryl, etc.), optionally halogenated C ⁇ - s alkoxy, C physician 6 alkoxy Ichiriki Lupo two Lou C Bok 6 alkoxy (e.g., ethoxy Cal Poni methyl O carboxymethyl, etc.), C
  • Ariruokishi eg, Fueniruokishi, 1 over Na Fuchiruokishi, 2 Nafuchiruokishi
  • C ⁇ 6 Ararukiruokishi eg, Ben Jiruokishi , Fuenechiruokishi etc.
  • mercapto alkylthio but it may also be halogenated
  • C 6 - 1 4 Ariruchio eg, phenylene thioether, 1 one naphthyl Chio, 2-naphthylthio
  • C 7 _ 1 6 Ararukiruchio e.g., benzylthio, etc.
  • E chill methyl ⁇ Mino di - C 6 _ 1 4 Ariruamino (eg, such as Jifue two Ruamino), nitro, nitro Lil, formyl, carboxy, alkyl Ichiriki Ruponiru (eg, Asechiru, flop port Pioniru etc.), C 3 - 8 cycloalkyl one Karuponiru (e.g., cyclopropyl force Ruponiru, cyclopentyl Luca Lupo cycloalkenyl, cyclohexylene, etc.
  • Ariruamino eg, such as Jifue two Ruamino
  • nitro nitro Lil
  • formyl carboxy
  • alkyl Ichiriki Ruponiru eg, Asechiru, flop port Pioniru etc.
  • C 3 - 8 cycloalkyl one Karuponiru e.g., cyclopropyl force
  • Kishirukaruponiru 6 alkoxy - Karuponiru (e.g., methoxy Cal Poni Le, ethoxy Cal Poni Le, flop port Po butoxycarbonyl, tert- such butoxycarbonyl), C 6 - 1 4 Ariru one local Poniru (eg, Benzoiru, 1 one naphthoyl and 2-naphthoyl), C 7 - 1 6 ⁇ La alkyl Ichiriki Ruponiru (eg, phenylene Ruasechiru, 3- off enyl propionyl, etc.), C 6 _ 1 4 Ariruoki Shi Ichiriki Ruponiru (eg, such as full enoki deer Lupo sulfonyl), C 7 _ 1 6 Ararukiruokishi - Karuponiru (e.g., benzyl O carboxymethyl Cal Poni Le, Fuenechiruo 5- or 6-membered
  • Echirusuruhoniru (6 _ 14 ⁇ reel sulfonyl (e.g., Fuenirusuru Honiru, 1 one naphthylsulfonyl, etc. 2 one-naphthylsulfonyl) , Formylamino, Ci-e Alkyl Ichiriki Ruponiruamino (eg, such as Asechiruamino), C 6 _ 14 ⁇ Li one Roux carbonyl ⁇ amino (e.g., Benzoiruamino, etc.
  • Nafutoiruamino alkoxy - Power Ruponiruamino (e.g., methoxycarbonyl ⁇ Mino, Etoki deer Lupo sulfonyl ⁇ Mino, propoxy power Ruponiruamino, etc.
  • alkylsulfonyl ⁇ amino e.g., methylsulfonyl ⁇ Mino, E Ji Le sulfonyl ⁇ amino etc.
  • C 14 ⁇ Li one Le sulfonyl ⁇ amino e.g., Fuenirusu Ruhoniruamino, 2-naphthylsulfonyl ⁇ amino, 1 one naphthylsulfonyl amino etc.
  • CH alkyl - Karuponiruokishi eg, Asetokishi, etc.
  • propionyl Okishi C 6 _ 14 ⁇ Li one Roux carbonyl O carboxymethyl (eg, Benzoiruokishi, Na Fuchirukaruponiru Oxy Etc.), C, _ 6 alkoxy Ichiriki Ruponiruokishi (eg, main Toki deer Lupo sulfonyl O carboxymethyl, ethoxy Cal Poni Ruo carboxymethyl, propoxycarbonyl O alkoxy, butoxy Cal Poni Ruo carboxymethyl, etc.), mono- C physician 6 alkyl Ichiriki Rubamoiru Okishi (e.g., methyl Carbamoyloxy, ethyl carbamoyloxy, etc.), dialkyl 6- alkyl rubamoyloxy (eg, dimethyl carbamoyloxy, dimethyl carbamoyloxy, etc.), C 6 _ 1 (1 ally (E.g., Phenylcarbamoyloxy, naphthylcarbamo
  • halogenated ( ⁇ -6 alkyl) includes, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.).
  • alkyl which may have (e.g., methyl, Echiru, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec- butyl, tert- butyl, pentyl, carboxymethyl, etc.
  • _ 6 alkyl such as Le
  • Examples include: methyl, chloromethyl, difluoromethyl, trichloromethyl, trifluoromethyl, ethyl, 2-bromoethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, pennofluorethyl, propyl, 3,3,3 —Trifluoropropyl, isopropyl, butyl, 4,4,4-trifluorobutyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopropyl Chill, neopentyl, 5, 5, 5-triflate Ruo b pentyl, to alkoxy Le, 6, 6, etc. hexyl and the like to 6 Torifuruo port.
  • optionally halogenated C 2 _ 6 alkenyl optionally means, for example 1 a stone 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) have a good C 2 even - 6 alkenyl (e.g., vinyl, Purobe alkenyl, isopropenyl, 2-butene - 1 f le, 4-pentenoic one 1 one ⁇ gamma le, etc. xenon Hmm 1 Iru to 5) and No.
  • halogen atoms e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • C ⁇ Gen reduction by c 2 _ 6 optionally Arukinifure for example 1 a stone 5, preferably 1 to 3 halogen atoms Yes (e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine) and good C 2 _ 6 alkynyl also be (e.g., propargyl, 2-Bed Chin one 1 one I le, 4 one pentyne - 1 one ⁇ gamma le, etc. relaxin one 1 Iru to 5), and the like.
  • halogen atoms Yes e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine
  • good C 2 _ 6 alkynyl also be (e.g., propargyl, 2-Bed Chin one 1 one I le, 4 one pentyne - 1 one ⁇ gamma le, etc. relaxin one 1 Iru to 5), and the like.
  • C 3 _ 6 cycloalkyl optionally having 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) (eg, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, Cyclohexyl) and the like.
  • halogen atoms eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • Specific examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, 4,4-dichlorocyclohexyl, 2,2,3,3-tetrafluorocyclopentyl, and 4-chlorocyclohexyl.
  • C 3 _ 8 cycloalkyl for example, of 1 4-membered to 8 to bicyclic or tricyclic bicyclic C 3 _ 8 cycloalkyl (e.g., 1 Adamanchiru, 2-Ryo Damman chill, decalin - 1 one I le, tetralin - 1 one I le, 9 Furuoreniru, 1 I Ndaniru, 1, 2, 3, 4 -Tetrahydro-11-naphthyl, etc.). Further, the "fused ⁇ 3 - 8 cycloalkyl", but it may also be halogenated.
  • the “optionally halogenated alkoxy” may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) ⁇ -s alkoxy (eg, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, pliers Roxy, hexyloxy, etc.).
  • halogen atoms eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • ⁇ -s alkoxy eg, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, pliers Roxy, hexyloxy, etc.
  • Specific examples include, for example, methoxy, difluoromethoxy, trifluoromethoxy, ethoxy, 2,2,2-trifluoroethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, 4,4,41-trifluorobutoxy, isobutoxy , Sec-butoxy, pentyloxy, hexyloxy and the like.
  • the “optionally halogenated alkylthio” may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.).
  • Alkylthio eg, methylthio, ethylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, sec-butylthio, ter.t-butylthio, etc.
  • Alkylthio eg, methylthio, ethylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, sec-butylthio, ter.t-butylthio, etc.
  • Specific examples include methylthio, difluoromethylthio, trifluoromethylthio, ethylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, 4,4,4-trifluorobutylthio, pentylthio, hexylthio and the like.
  • aryl may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 of the above substituents at substitutable positions, and when the number of the substituents is 2 or more, each substituent is the same or It may be different.
  • the “hydrocarbon group” of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 1 in compound (I) for example, a linear or cyclic hydrocarbon group (eg, alkyl, alkenyl) Alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, aralkyl, polycyclic hydrocarbon, etc.).
  • a chain or cyclic hydrocarbon group having 1 to 19 carbon atoms is preferable.
  • alkyl examples include alkyl (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, hexyl, etc.).
  • C 2 _ 6 alkenyl e.g., vinyl, Ariru, isopropenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-heptenyl, 2-methyl-2 - Purobe alkenyl, 1-methyl-2- Propyl, 2-methyl-1-propenyl, etc.
  • alkynyl for example, C 2 _ 6 alkynyl (e.g., Echiniru, flop Mouth pargyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-hexynyl, etc.).
  • cycloalkyl for example, C 3 _ 6 cycloalkyl (e.g., cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexylene cyclohexyl, etc.), etc. like et be.
  • cycloalkenyl for example C 5 _ 6 cycloalkenyl (e.g., 1 - cyclopentenyl, 3-cyclopentenyl, 4-cyclopentenyl, cyclohexenyl 1-sik port, 3-cyclohexane hexenyl, 4-cyclohexylene Xenyl, etc.). .
  • ⁇ Li Ichiru for example, ⁇ 6 _ 1 4 Ariru (e.g., phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 2-Bifue two Lil, 3 Bifue two Lil, 4 Bifue two drill, 2-anthryl, 3-indenyl, etc.).
  • Ariru e.g., phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 2-Bifue two Lil, 3 Bifue two Lil, 4 Bifue two drill, 2-anthryl, 3-indenyl, etc.
  • Ararukiru for example C 7 _ 1 9 Ararukiru (e.g., benzyl, Hue Nechiru, Jifuenirumechiru, trityl, 1 one naphthylmethyl, 2-Nafuchirumechi Le, 2, 2-Jifueniruechiru, 3-phenylpropyl, 4 one Phenylbutyl, 5-phenylpentyl, 91-fluorenyl, etc.).
  • Ararukiru e.g., benzyl, Hue Nechiru, Jifuenirumechiru, trityl, 1 one naphthylmethyl, 2-Nafuchirumechi Le, 2, 2-Jifueniruechiru, 3-phenylpropyl, 4 one Phenylbutyl, 5-phenylpentyl, 91-fluorenyl, etc.
  • polycyclic hydrocarbon group examples include a bicyclic to tetracyclic non-aromatic hydrocarbon group (eg, 1-adamantyl, 2-adamantyl, decalin-11-yl, tetralin-11-yl, indane 11-yl, Androstan-13-yl, 5-and Sten-13-yl, etc.).
  • a bicyclic to tetracyclic non-aromatic hydrocarbon group eg, 1-adamantyl, 2-adamantyl, decalin-11-yl, tetralin-11-yl, indane 11-yl, Androstan-13-yl, 5-and Sten-13-yl, etc.
  • hydrocarbon group having a substituent for example, represented by A r 1 of the "optionally substituted Ariru” is “substituent”
  • hydrocarbon group may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 of the above substituents at substitutable positions, and when the number of the substituents is 2 or more, each substituent The groups can be the same or different.
  • the “homologous or heterocyclic group” of the “optionally substituted homo- or heterocyclic group” represented by R 2 or R 3 in compound (I) includes, for example, a 3- to 14-membered ( (Preferably 5 to 7 members) Homogeneous or heterocyclic group.
  • C 3 _cycloalkyl eg, Chloropropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, etc.
  • C 3 _ 14 cycloalkenyl eg, 1-cyclopentenyl, 3-cyclopentenyl, 4-cyclopentenyl, 1-cyclohexenyl, 3-cyclohexenyl, 4-six mouth hexenyl, etc.
  • C 6 _aryl eg, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 2-biphenyl, '3-biphenyl, 4-biphenyl, 2-anthryl And 3-indenyl).
  • Examples of the "3- to 14-membered heterocyclic group” include, for example, 5 to 14 containing 1 or 2 or 1 to 4 heteroatoms selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom in addition to a carbon atom.
  • Member (monocyclic, bicyclic or tricyclic) heterocycle preferably (i) 5- to 14-membered (preferably 5- to 10-membered) aromatic heterocycle, (ii) 3- to 14-membered non-aromatic And (iii) a monovalent group formed by removing any one hydrogen atom from a 7- to 10-membered bridged heterocyclic ring.
  • Examples of the above “5- to 14-membered (preferably 5- to 1-Q-membered) aromatic heterocycle” include, for example, thiophene, benzo [b] thiophene, benzo [b] furan, benzimidazole, benzoxazole , Benzothiazole, benzisothiazole, 1H-benzotriazole, naphtho [2,3_b] thiophene, furan, pyrrole, imidazole, pyrazole, oxazole, 1,2,3-triazole, 1,2, 4-triazole, tetrazole, 1,3,4-thiadiazol, 1,3,4-oxaziazol, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, indole, isoindole, 1H-indazole, purine, 4 H-quinolidine, isoquinoline, quinoline, phthalazine, naphthyridine, quinox
  • Examples of the above “3- to 14-membered non-aromatic heterocycle” include oxylane, oxetane, tetrahydrofuran, dihydrofuran, pyran, dioxolane, dioxane Sun, azetidine, pyrrolidine, imidazoline, pyrazolidine, pyrazoline, piperidine, piperazine, morpholine, thiomorpholine, thiazolidine, oxazolysine, oxaziazolin, thiadiazolin, triazoline, 1,4-diazepan, 1,4—oxane , 4-monothiazepan, and reduced or partially reduced forms of the above aromatic heterocycle (1 ⁇ 4, 1, 2, 3, 4-tetrahydroquinoline, 1, 2, 3, 4-tetrahydroisoquinoline, indoline, etc.) Can be
  • Examples of the “7- to 10-membered bridged heterocyclic ring” include quinuclidine, 7-azabicyclo [2.2.1] heptane, and the like.
  • heterocyclic group is preferably a 5- to 14-membered group containing one or two, preferably one to four, heteroatoms selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom. It is preferably a 5- to 10-membered) (monocyclic or bicyclic) heterocyclic group.
  • the "substituent" of the “optionally may allotrope or heterocyclic group which may have a substituent", for example, “substituted” optionally substituted Ariru "represented by the above A r 1 Group ".
  • the “homologous or heterocyclic group” may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 of the above substituents at replaceable positions. When the number of groups is two or more, each substituent may be the same or different.
  • a r 1 is preferably phenyl which may have a substituent, more preferably phenyl having 1 to 3 Hagen atoms.
  • Ar 2 is preferably phenyl which may have a substituent, more preferably phenyl having 1 to 3 halogen atoms.
  • R 1 is preferably alkyl which may have a substituent, more preferably alkyl.
  • R 2 and R 3 is preferably a hydrogen atom, and the other is a 5- to 7-membered heterocyclic group which may have a substituent. More preferably, one is a hydrogen atom, and the other is a 5- to 7-membered non-aromatic heterocyclic group which may have a substituent (eg, 1-pyrrolidinyl, 2-pyrrolidinyl, 3-pyrrolidinyl, 2- Imidazolinyl, 4-imidazolinyl, 2-birazolidinyl, 3-pyrazolidinyl, 4-pyrazolidinyl, piperidino, 2-piperidyl, 3-piperidyl, 4-piperidyl, 1-piperazinyl, 2-piperazinyl, morpholino, thio Morpholino).
  • substituent eg, 1-pyrrolidinyl, 2-pyrrolidinyl, 3-pyrrolidinyl, 2- Imidazolinyl, 4-imidazolinyl, 2-birazo
  • compound (I) include:
  • a r 1 is a phenyl having 1 to 3 halogen atoms
  • R 2 and R 3 include compounds in which one is a hydrogen atom and the other is a 6-membered non-aromatic heterocyclic group.
  • AM 25 1 [(2,4-dichlorophenyl) -5- (4-odophenyl) -4-methyl-N-piperidine-1-yl-1H-pyrazole-3 is preferred.
  • -Caproloxamide AM 28 1 [1- (2,4-dichlorophenol) -5- (4-rhodophenyl) -4-methyl-N-morpholine-4-yl-1H-pyrazole- 3-force lipoxamide].
  • Examples of the “substituent” of the “optionally substituted benzene ring” represented by ring A in compound ( ⁇ ) include, for example, “optionally substituted benzene ring” represented by Ar 1 above. "Substituent” of "aryl”.
  • the ⁇ hydrocarbon group '' may have, for example, 1 to 4, preferably 1 to 3 substituents at the substitutable position, and when the number of substituents is 2 or more, each substituent is Same or different Good.
  • the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 4 or R 5 in the compound (II) includes, for example, the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 1 above. Hydrogen group ".
  • heterocyclic group optionally having substituent (s)” represented by R 4 or R 5 in the compound ( ⁇ ) include, for example, a nitrogen atom, a sulfur atom, 5- or 14-membered (monocyclic, bicyclic or tricyclic) heterocyclic ring containing 1 or 2 or 1 to 4 heteroatoms selected from oxygen atoms, preferably (i) 5- to 14-membered ( (Preferably 5 to 10 members) aromatic heterocyclic ring, (ii) 3- to 14-membered non-aromatic heterocyclic ring or (iii) 7 to 10-membered heterocyclic bridged ring except for any one hydrogen atom Monovalent groups and the like.
  • Examples of the above “5- to 14-membered (preferably 5- to 10-membered) aromatic heterocycle” include, for example, thiophene, benzo. [B] thiophene, benzo [b] furan, benzimidazole, benzoxazole , Benzothiazole, benzisothiazole, 1H-benzotriazole, naphtho [2,3-b] thiophene, furan, pyrrole, imidazole, pyrazole, oxazole, 1,2,3-triazo 1,2,4-triazole, tetrazole, 1,3,4-thiadiazole, 1,3,4-oxadiazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, indole, isoindole, 1H-indazole , Purine, 4H-quinolidine, isoquinoline, quinoline, phthalazine, naphthyridine, quinoxa
  • Examples of the above “3- to 14-membered non-aromatic heterocycle” include oxylane, oxetane, tetrahydrofuran, dihydrofuran, pyran, dioxolane, dioxan, azetidine, pyrrolidine, imidazoline, pyrazolidine, pyrazoline, Peridine, piperazine, morpholine, thiomorpholine, thiazolidine, oxazolidine, oxaziazoline, thiadiazoline, triazoline, 1,4-diazepan, 1,4-diazepan, 1,4-diazepane, 1,4-thiazepan, and the above aromatic heterocyclic ring Isomeric or partially reduced forms (eg, 1,2,3,4-tetrahydroquinoline, 1,2,3,4-tetrahydroishiquinoline, indoline, etc.).
  • Examples of the “7- to 10-membered bridged heterocyclic ring” include quinuclidine, 7-azabicyclo [2.2.1] heptane, and the like.
  • heterocyclic group is preferably a 5- to 14-membered member containing one or two, preferably one to four, hetero atoms selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom in addition to a carbon atom (preferably Is a 5- to 10-membered) (monocyclic or bicyclic) heterocyclic group.
  • Aromatic heterocycles such as 3-indolyl, 2-benzothiazolyl, 2-benzo [b] phenyl, 3-benzo [b].
  • Phenyl, 2-benzo [b] furanyl, 3-benzo [b] furanyl Groups such as 1-pyrrolidinyl, 2-pyrrolidinyl, 3-pyrrolidinyl, 2-imidazolinyl, 4- ⁇ -midazolinyl, 2-birazolidinyl, 3-pyrazolidinyl, 4-birazolidinyl, piperidino, 2-piperidyl, 3-piperidyl,
  • Non-aromatic heterocyclic groups such as 4-piperidyl, 1-piperazinyl, 2-piperazinyl, morpholino, and thiomorpholino.
  • Examples of the “substituent” of the “heterocyclic group optionally having a substituent” include the “substituent” of the “optionally substituted aryl” represented by the above Ar 1 Group).
  • the above “heterocyclic group” may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 substituents at the substitutable positions, and when the number of substituents is 2 or more, each substituent May be the same or different.
  • the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 7 , R 8 or R 9 includes the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 1 above. And so on.
  • the “optionally substituted heterocyclic group” represented by R 7 , R 8 or R 9 includes the “optionally substituted heterocyclic group” represented by R 4 or R 5 above. Group).
  • Examples of the “cyclic amino” represented by NR 8 R 9 include, for example, in addition to one nitrogen atom and a carbon atom, one or two or one to four hetero atoms selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom
  • Examples include 5- to 7-membered saturated cyclic amino which may contain a terrorist atom.
  • Specific examples include pyrrolidine-111-yl, piberidino ', piperazine-1-1-yl, morpholino, thiomorpholino, and tetrahydroazepine. And 11-yl, homopyrazine-1yl and the like.
  • Examples of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 6 in compound (II) include the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 1 above. No.
  • Examples of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 7 in the compound ( ⁇ ) include the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 1 above. No.
  • heterocyclic group optionally having substituent (s)” represented by R 7 in compound (II) includes the “heterocyclic group optionally having substituent (s)” represented by R 4 or R 5 above. And the like.
  • Ring A is preferably an unsubstituted benzene ring or the like.
  • R 4 and R 5 is preferably a hydrogen atom and the other is, for example, acyl. More preferably, one is a hydrogen atom and the other is a C 8 alkyl-potassium.
  • the R 6 is' Ru der such good C 7 _ 1 9 Ararukiru have a substituent. More preferably, it is benzyl.
  • X is preferably one NR 7 —.
  • R 7 is preferably a hydrogen atom.
  • Ring A is an unsubstituted benzene ring
  • DH97 N- [2- (2-benzyl-1H-indole-3-isole) ethyl] pentanamide] is preferred.
  • Examples of the salt of the compound represented by the formula (I) or (II) include a metal salt, an ammonium salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a basic or acidic amino acid. And salts with acids.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; and aluminum salt.
  • Suitable examples of salts with organic bases include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridin, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine.
  • Preferred examples of the salt with an inorganic acid include, for example, salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Preferred examples of the salt with an organic acid include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfone Acid, p-toluenesulfonic acid And salt.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orditin and the like.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like. Salts. Of these, pharmaceutically acceptable salts are preferred.
  • the compound when it has an acidic functional group, it may be an alkali metal salt (eg, sodium salt, potassium salt, etc.) or an alkaline earth metal salt (eg, calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.).
  • the compound has a basic functional group in the compound such as an inorganic salt or an ammonium salt, for example, a salt with an inorganic acid such as hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, or phosphoric acid, or acetic acid, fumaric acid, or fumaric acid Salts with organic acids such as acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, and ⁇ _toluenesulfonic acid.
  • an inorganic acid such as hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, or phosphoric acid
  • acetic acid fumaric acid, or fumaric acid Salts with organic acids
  • organic acids such as acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, and ⁇ _toluenesulfonic acid.
  • Labeled compounds (I) and (II) can also be used for screening as ligands of the present invention.
  • the labeling substance a radioactive same ⁇ elevational element (e.g., [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], [ "c], C 32 P], [33 P] and [3]), a fluorescent substance
  • Cyanine fluorescent dyes e.g, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience), etc.
  • fluorescamine fluorescein isothiocyanate, NBD (7-nitrobenz-2 -oxa-l, 3-diazol)
  • enzymes eg, ⁇ -galactosidase,) 3-darcosidase, alcaliphosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • luminescent substances eg,.
  • radioisotopes [3 ⁇ 4], [ 14 C], [ 125I ] are preferable.
  • a commercially available product can be used as it is, and can be produced or extracted according to a method known per se or a method analogous thereto. You can also.
  • the TGR25 or a salt thereof of the present invention can be produced from the above-described human or mammalian cells or tissue by a known method for purifying a receptor protein, or encodes the TGR25 of the present invention described later. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA. Also, the protein can be produced by the protein synthesis method described later or according to the method.
  • Human or mammalian tissues or cells In the case of production from cells, human or mammalian tissues or cells are homogenized, extracted with an acid or the like, and the extract is purified and purified by a combination of chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography. Can be released.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethyl resin.
  • Tylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy Examples include resin.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin and, at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or its amide.
  • the condensation of the above protected amino acids various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • carpoimides DCC, N, N, diisopropyl carpoimide, N-ethyl N '-(3-dimethylaminoprolyl) carpoimide, and the like are used.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t, HO OB t), or may be pre-protected as a symmetric anhydride or HOB t ester or HO OB t ester
  • the amino acid can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • solvents known to be usable for the protein condensation reaction for example, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethyl Acid amides such as acetoamide and N-methylvinylidone; and halogenated carbons such as methylene chloride and chloroform Hydrogens, alcohols such as trifluoroethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein-binding type reaction, and is usually selected from the range of about 120 to 50.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, tertiary pentoxycarbonyl, isoporonyoxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, alkyl-esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.).
  • alkyl-esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Is cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification benzyl ester It can be protected by zircoxycarbonyl hydrazide, evening butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, etc.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarponyl group, and the like are used.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, t-butyl group and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz and C 1 2 - Bz l, 2- two Torobenjiru, B r- Z, and evening one rice one heptyl used.
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Tri ;, Fmoc and the like. Used.
  • Examples of the activated carbonyl group of the starting material include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, HOB tester) and the like.
  • alcohols eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol
  • Phenol Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, HOB tester
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 to 4 Ot:
  • a cation scavenger such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butanedithiol described above.
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia, etc.
  • Protection and protection of functional groups that should not be involved in the reaction of the raw materials, and their protection Elimination of a group, activation of a functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein for example, first, after protecting a single carboxyl group of the terminal amino acid of a lipoxy group by amidation, a peptide (protein) chain is added to the amino group side of the desired chain. After lengthening the protein chain, a protein was obtained in which only the N-terminal ⁇ -amino protecting group was removed from the peptide chain, and a protein in which only the C-terminal protecting group was removed. The condensation is carried out in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above method, and a desired crude protein can be obtained. This crude protein is purified using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, after condensing a monohydroxy group of a carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein can be obtained in the same manner as the amide of a protein. You can get
  • the partial peptide of TGR25 of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving TGR25 of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid capable of constituting TGR 25 of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the desired peptide. can do.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following a) to e).
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and the like.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be converted.
  • the polynucleotide encoding the TGR25 of the present invention may be any polynucleotide that contains the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the TGR25 of the present invention.
  • the polynucleotide is a DNA encoding the TGR25 of the present invention or an RNA such as mRNA, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. If single-stranded, it may be the sense strand (ie, the coding strand) or the antisense strand (ie, the non-coding strand). ⁇
  • the TGR25 of the present invention can be prepared, for example, by the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its Applications” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto. MRNA can be quantified.
  • the DNA encoding the TGR25 of the present invention may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • the DNA encoding the human TGR25 of the present invention includes, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a highly stringent DNA with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Base sequence that hybridizes under conditions Encoding a receptor protein having a sequence and having substantially the same activity as human TGR25 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, ligand binding activity, signal transduction activity, etc.) Any one may be used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA containing a nucleotide sequence having homology to the above is used. Nucleotide sequence homology is calculated using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local
  • Hybridization is performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be.
  • the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, the reaction can be performed under high stringent conditions.
  • the isstringent conditions include, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. Show. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
  • DNA encoding human TGR 25 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like are used.
  • polynucleotide comprising a part of the nucleotide sequence of the DNA encoding TGR25 of the present invention or a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA refers to the following partial peptide of the present invention. It is used not only to include coding DNA, but also to include RNA.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the TGR25 gene has been loaned or determined. It can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence information of DNA encoding TGR25. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the TGR25 gene, inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the TGR25-associated RNA. Gene expression can be regulated.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid sequence, including a gene.
  • a “correspondence” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide (protein) is defined as the amino acid of the peptide (protein) in the instructions derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. pointing.
  • 5 'end hairpin loop of TGR25 gene 5' end 6-base spare 'repeat, 5' end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, translation stop codon, 3 'end untranslated region,
  • the 3 'end palindrome region and the 3' end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the TGR25 gene may be selected as a target.
  • the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide that is complementary to at least a part of the target region and can hybridize can be said to be “antisense” with the target.
  • Antisense polynucleotides are polydexoxy liponucleotides containing 2-dexoxy-D-report, polyliponucleotides containing D-lipose, N-daricosides of purine or pyrimidine bases
  • Other types of polynucleotides or other polymers having a non-nucleotide backbone eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • other polymers containing special bonds eg, Contains nucleotides having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in DNA and RNA).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, as well as unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides). ), And also those with known modifications, such as labeled, capped, methylated, and one or more natural nucleotides as analogs known in the art.
  • Substituted, modified with an intramolecular nucleotide such as one having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, Those having phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases * inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides, etc.) ), Etc., which have side chain groups, and intercalate compounds (eg, , .Acridine, psoralen, etc.), containing chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), containing alkylating agents, modified It may have a bond (for example, an anomeric nucleic acid).
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups are replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, diphosphophosphate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as liposomes, microspheres, or may be applied by gene therapy. Or can be given in an added form.
  • additional forms include polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids that enhance the interaction with cell membranes and increase the uptake of nucleic acids (eg, , Phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, a sugar, or an intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or 5' end of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNa.se. Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be determined by using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the G protein-coupled receptor protein. You can find out.
  • Shark nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • any DNA may be used as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • genomic DNA genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • the vectors used for the library are Pacteriophage, Bra Any of a sumid, cosmid, phagemid and the like may be used.
  • it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using the mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the peptide of the present invention includes, for example,
  • DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (2) a base that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions A partial nucleotide sequence of a DNA encoding a receptor protein having a sequence, and having substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal transduction activity, etc.) as TGR25 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. DNA or the like is used.
  • the DNA capable of hybridizing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the homology of the nucleotide sequences can be calculated under the same conditions using the homology calculation algorithm NCB I BLAST described above.
  • the DNA having the partial base sequence of TGR25 of the present invention may be used.
  • Hybridization methods include, for example, molecular 'cloning
  • the cloned DNA encoding TGR25 can be used as it is depending on the purpose, or it can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the TGR25 expression vector of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the TGR25 of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by linking.
  • the vector examples include a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, .pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), pacteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA iZNeo or the like is used.
  • E. coli eg, pBR322, .pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast eg, pSH19, pSH15
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter, SV40 promoter, LTR motor, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV promoter, SR promoter and the like it is preferable to use CMV promoter, SR promoter and the like.
  • the host is Escherichia, the trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, 1 p ⁇ promoter, etc. ⁇ 2 pro
  • yeast such as the mouse and penP promoters, the PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may further include an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like, if desired.
  • selection markers include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp 1 ) ), And neomycin-resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne of, G418-resistant), etc.
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • Amp 1 ampicillin resistance gene
  • Ne neomycin-resistant gene
  • the target gene can be selected by using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, Pho A signal sequence, OmpA signal sequence, etc.
  • the host is a Bacillus genus, the amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc.
  • the host is yeast
  • an insulin signal sequence, an ⁇ -interferon signal sequence, an antibody molecule and a signal sequence can be used.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli.
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis (Bacillus).
  • subtilis M I 114 Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
  • yeast examples include 'Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R ", NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC2036, Pichia Pastoris (Pichia pastoris) K M71 or the like is used.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of Spodoptera (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five derived from egg of Trichoplusia ni TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, J.L. et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7 (COS 7), Vero, Chinese hamster cell CH ⁇ (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhir gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter, CHO ( dh fr ”) cells, mouse L cells, mouse At T-20, mouse myeloid cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Transformation of insect cells or insects can be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells can be performed, for example, by the method described in Cell Engineering Annex 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). It can be done according to the law.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is contained therein.
  • Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid As a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments s in Molecular culture]
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be applied.
  • the medium When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the medium may be 10% serum serum immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). And the like, to which the additives described above are appropriately added.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology , 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are applied.
  • the TGR25 of the present invention can be produced in the transformant, in the cell membrane, or outside the cell.
  • the TGR25 of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and Z or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of TGR25 by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • TGR25 When TGR25 is secreted into the culture solution, after the culture is completed, bacterial cells or cells are separated from the supernatant by a known method, and the supernatant is collected. On the culture obtained in this way? ! Alternatively, the purification of TGR 25 contained in the extract can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific novelty such as affinity chromatography, hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid mouth chromatography, etc.
  • a method using a difference in gender, a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • TGR 25 When the thus obtained TGR 25 is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto. It can be converted to a free form or another salt by an analogous method.
  • TGR25 produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed before or after purification by the action of an appropriate protein-modifying enzyme.
  • the protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the thus produced TGR25 of the present invention can be measured by a binding experiment with a labeled ligand (ligand peptide) and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • the antibody against TGR25 of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the TGR25 of the present invention.
  • the antibody against TGR25 of the present invention can be produced by using the TGR25 of the present invention as an antigen according to a known antibody or antiserum production method.
  • the TGR 25 of the present invention is administered to a mammal at a site where the antibody can be produced by administration, itself or together with a carrier and a diluent.
  • Antibody production during administration Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be given to increase the level.
  • Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Millstein (Nature, 256, 495 (1975)).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2Z0 and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • PEG preferably PEG1000 to PEG6000
  • hybridoma supernatants can be collected on a solid phase (eg, microplate) on which a receptor protein antigen has been adsorbed directly or together with a carrier. Then, add an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice) or tin A, which is labeled with a radioactive substance or enzyme, and add it to the solid phase.
  • a solid phase eg, microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice
  • tin A which is labeled with a radioactive substance or enzyme
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in an animal medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) or the like.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • SFM-101 serum-free medium for hybridoma culture
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 ports, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies.
  • Immunoglobulins can be separated and purified (e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers). (Eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G to collect only antibody and dissociate to obtain antibody Specific purification method].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (TGR25 antigen) and a carrier protein is formed, a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and an antibody against the TGR25 of the present invention is obtained from the immunized animal. It can be produced by collecting the inclusions and separating and purifying the antibody.
  • TGR25 antigen immunizing antigen
  • carrier protein a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody
  • an antibody against the TGR25 of the present invention is obtained from the immunized animal. It can be produced by collecting the inclusions and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the efficiency of the antibody against the hapten immunized by cross-linking with the carrier.
  • any substance may be cross-linked at any ratio.
  • ⁇ serum albumin, ⁇ psiloglopurine, keyhole limpet, hemocyanin, etc. are used in a weight ratio of 1 to hapten 1.
  • About 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 are used.
  • Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Examples of the surrogate ligand that binds to TGR25 of the present invention include non-peptide compounds such as AM251, AM281, and DH97.
  • non-peptide compounds such as AM251, AM281, and DH97.
  • peptides, proteins, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc., and these compounds may be novel compounds or Or a compound of the formula
  • the ligand may form a salt, and as the salt, a salt with a physiologically acceptable acid or base is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.)
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric
  • the ligand is a peptide
  • cells of humans and other warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, whales, monkeys, etc.
  • hepatocytes, spleen cells nerve cells, Glial cells, kidney 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells or Stromal cells, or precursors of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which those cells are present, for example, the brain
  • Substantially the same refers to the activity of a ligand, for example, TGR25 binding activity, intracellular signaling activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production) , Suppression of intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, decrease of pH, GTP rS binding activity, Activation of cAMP-dependent protein kinase, activation of cGMP-dependent protein kinase, activation of phospholipid-dependent protein kinase, activation of mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) Physiological properties such as activation, increased expression of serum response factor gene, promotion or suppression of changes in TGR25 protein intracellular localization, etc.), anti-inflammatory effects, etc.
  • TGR25 binding activity
  • a ligand peptide the substitution, deletion, addition or insertion of an amino acid is performed unless the physiological or chemical properties of the amino acid are significantly changed.
  • the native peptide is substantially the same as that having no substitution, deletion, addition or insertion.
  • Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence can be selected, for example, from other amino acids in the class to which the amino acid belongs.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, palin, proline, phenylalanine, tributofan, methionine, and the like.
  • Polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Arginine, lysine, histidine and the like are mentioned as positively charged (basic) amino acids.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the ligand peptide also includes a peptide in which a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide having a sugar chain bonded thereto. Furthermore, the ligand peptide has an arbitrary foreign peptide sequence (eg, FLAG, His tag, HA tag, HSV tag, etc.) that can be an epitope (antibody recognition site) at the N-terminal or C-terminal. This includes those that do.
  • an arbitrary foreign peptide sequence eg, FLAG, His tag, HA tag, HSV tag, etc.
  • Ligand peptides such as the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have C-terminal carboxylic acid group (-COOH), carboxylate (1-CII-), amide It may be (—CONH 2 ) or an ester (—COOR), but is preferably an amide.
  • R in the ester e.g., methyl, Edjiru, n- flop port pills, alkyl groups such as isopropyl or n- butyl, cyclo pentyl, cyclo hexyl, etc.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue eg, methionine residue
  • a protecting group for example, a 6- amino group such as a CM alkanol such as a formyl group or an acetyl group.
  • the N-terminal daltamyl group formed by cleavage in vivo is pyroglutamine-oxidized, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule (eg, _OH, —SH, amino group, imidazole group, indole Or a guanidino group) protected by an appropriate protecting group (for example, a C6alkyl group such as a C alkanol group such as a formyl group or an acetyl group), or a sugar polysaccharide to which a sugar chain is bound.
  • an appropriate protecting group for example, a C6alkyl group such as a C alkanol group such as a formyl group or an acetyl group
  • complex polypeptides such as peptides, and those in which the amino acid residue at the C-terminus is modified.
  • the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a formyl group.
  • the amino group may be further
  • the ligand peptide may be a salt.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, an organic acid
  • a base eg, an alkali metal salt
  • acid addition salts that are chemically acceptable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid
  • the ligand peptide can be produced from the above-mentioned human or non-human warm-blooded animal cells or tissues by a known polypeptide purification method, or can be produced according to the peptide synthesis method described later. it can.
  • the tissues or cells of a human / non-human mammal are homogenized, and then extracted with an acid or the like, and the obtained extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange. Purification and isolation can be carried out by combining chromatography such as exchange chromatography.
  • a commercially available polypeptide An application resin can be used.
  • resins include chloromethyl tree J3, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine tree Ji, aminomethyl ⁇ J3, resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl tree.
  • Fat polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2,, 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an appropriately protected a-amino group and side chain functional group is condensed on the resin in accordance with the sequence of the desired polypeptide according to various known condensation methods.
  • the polypeptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target polypeptide or an amide thereof.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt) or may be pre-formed as the corresponding acid anhydride or HOBT ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOBt, HOOBt
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the polypeptide condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpiperidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; A mixture or the like is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the polypeptide bond formation reaction. It is appropriately selected from the range of about ⁇ 20 to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyoxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1-Z, Br-Z, and adaman.
  • Tyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group may be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxy carbonyl It can be protected by hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohex
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • groups appropriately used for the esterification include a lower (C, _ 6) such Asechiru group Arukanoiru group, Aroiru groups such Benzoiru group, benzyl O carboxymethyl Cal Po group, groups derived from carbonic acid such as ethoxy Cal Poni Le group Are used.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, a t-butyl group, and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C l 2 - B z 2- two Torobenjiru, B r- Z, t one-butyl or the like is used.
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include, for example, Tos, 4-methoxy -2,3,6-Trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc, etc. are used.
  • Examples of the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenylimide, and an ester with HOB t)].
  • alcohols for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenylimide, and an ester with HOB t
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or the like.
  • Can be The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about ⁇ 20 to 4 ° C.
  • anisol, phenol, thioanisole, methacresol, paracresol, dimethyl Sulfid for example, anisol, phenol, thioanisole, methacresol, paracresol, dimethyl Sulfid,
  • a cation scavenger such as 1,4-butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tryptophan is replaced with 1,2-ethanedithiol,
  • it is also removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia, etc.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of the ligand peptide for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -hydroxyl group of the carboxy-terminal amino acid, the amino group side After the peptide (polypeptide) chain is extended to the desired length, only the polypeptide which is obtained by removing only the N-terminal ⁇ -amino protecting group and the C-terminal protecting group of the peptide chain is removed. The removed polypeptide is produced, and the two polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected polypeptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude polypeptide. The crude polypeptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired ligand peptide.
  • an ester form of the ligand peptide for example, after condensing the Q! -Carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, in the same manner as the amide form of the ligand peptide, Can be obtained.
  • the ligand peptide can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting a ligand peptide with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) to (V).
  • the polypeptidic compound of the present invention may be combined with a conventional purification method such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated.
  • the polypeptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto. Alternatively, it can be converted to a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • An antibody against the ligand peptide can be produced in the same manner as the antibody against TGR25 of the present invention.
  • Ligand, TGR25, DNA encoding TGR25 (hereinafter sometimes abbreviated as DNA of the present invention), ligand peptide or antibody against TGR25 (hereinafter sometimes abbreviated as antibody of the present invention)
  • the use of the antisense DNA for the DNA of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as the antisense DNA of the present invention) is described below.
  • the ligand or TGR25 or the polynucleotide encoding it is abnormal, is deficient, or has an abnormally reduced expression level, for example, leukopenia , Leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease , Myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metapolitic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytosis, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, Laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell
  • Pulmonary edema preferably leukopenia, leukemia, Various diseases such as lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease and inflammatory disease develop.
  • the amount of ligand or TGR25 in the body of the patient can be increased by transplanting the cells into the patient, and the effect of the ligand can be sufficiently exerted.
  • a) a ligand, b) TGR25 or c) DNA encoding TGR25 can be used as a medicament such as an agent for preventing or treating a disease associated with dysfunction of ligand or TGR25.
  • the ligand, TGR25 or the DNA of the present invention may be, for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammation Sexual disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metabolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytosis, cancer (Eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, esophagus Cancer, colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer
  • the ligand or TGR25 When the ligand or TGR25 is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention when used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA of the present invention may be used alone or inserted into an appropriate vector such as a reto-fcl virus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus azovirus vector. After that, it can be carried out according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary for promoting uptake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • a) a ligand, b) TGR25 or c The DNA of the present invention may be, if necessary, orally as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or water or It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with other pharmaceutically acceptable liquids, or suspensions.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • Swelling agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • Aqueous injection solutions include, for example, saline, isotonic solutions containing dextrose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride). Thorium, etc.), and suitable solubilizers, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene daricol), nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80 TM, HCO) -50).
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene daricol
  • nonionic surfactant eg, Polysorbate 80 TM, HCO
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • buffers for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans
  • the dose of the ligand varies depending on the administration target, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration generally, for example, in a leukopenia patient (assuming a body weight of 60 kg), About 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • an injection it is usually used, for example, for patients with leukopenia (body weight 6 Ok g), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. .
  • the dose can be administered in terms of the body weight per 6 Okg.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a leukopenia patient (with a body weight of 60 kg), It is about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose depends on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the DNA and the antisense DNA of the present invention can be used as probes in humans or other mammals (rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • Abnormality (genetic abnormality) of DNA or mRNA encoding TGR25 or a partial peptide thereof can be detected. For example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, or DNA or mRNA It is useful as a gene diagnostic agent for increased or over-expressed genes.
  • TGR25 expression is reduced by Northern hybridization or DNA mutation is detected by PCR-SSCP method, for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colon, etc.
  • Inflammation rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscle degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, high fat Blood, arteriosclerosis, metabolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma Tumor, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, esophagus cancer, colon cancer
  • cancer
  • TGR25 if overexpression of TGR25 is detected by Northern hybridization, for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, Inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, heart muscle infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis Disease, metabolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer , Lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, esophagus cancer, colon cancer, colon cancer, rectum cancer, liver cancer,
  • the DNA of the TGR25 of the present invention can be used. It can be used for screening for a compound that changes the expression level or a salt thereof. That is, the present invention relates to, for example, (a) a non-human mammal, a) blood, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant contained in a transformant or the like.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of TGR25 of the present invention by measuring the amount of mRNA of TGR2,5 of the present invention is provided. The measurement of the TGR25 mRNA amount of the present invention is specifically performed as follows.
  • a drug for example, an immunomodulator
  • physical stress for example, immersion stress, electric shock, light and dark, low temperature, etc.
  • organs eg, brain, liver, kidney, etc.
  • the TGR25 mRNA of the present invention contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a usual method and using, for example, a technique such as TaqMan PCR.
  • the analysis can also be performed by performing a Northern plot by means.
  • a transformant expressing the TGR25 of the present invention is prepared according to the above method, and the TGR25 mRNA of the present invention contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.
  • the screening of a compound or a salt thereof that changes the expression level of TGR25 of the present invention comprises:
  • a predetermined time before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) Before to 6 hours before) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or simultaneously with drug or physical stress
  • the compound is administered, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the TGR25 of the present invention contained in the cells
  • the test compound is mixed in a medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days ), By quantifying and analyzing the amount of mRNA of TGR25 of the present invention contained in the transformant.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma. May be a novel compound or a known compound.
  • the test compound may be in the form of a salt, and examples of the salt of the test compound include physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, And salts with basic or acidic amino acids.
  • the metal salt include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; and aluminum salt.
  • Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexyl and the like.
  • Can be Preferable examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, Salts with benzenesulfonic acid, P-toluenesulfonic acid and the like can be mentioned.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orditin and the like.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like. Salts.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an effect of changing the expression level of TGR 25 of the present invention.
  • the expression level of TGR 25 of the present invention is By increasing it, TGR25-mediated cell stimulating activity (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular CAMP production inhibition, Produces inositol monophosphate Production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease of pH, GT PrS binding activity, activation of cAMP-dependent protein kinase, activity of cGMP-dependent protein kinase Activation, activation of phospholipid-dependent protein kinase, activation of mitogen-activated protein kinase (MAP kinase), TG25 cell translocation activity, and serum response factor expression level variation activity
  • a compound that reduces the expression of TGR is by increasing it,
  • Examples of the compound include peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma. It may be a compound or a known compound.
  • Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids. No. Preferable examples of the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; and aluminum salt.
  • salts with organic bases include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridin, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine. , N, N 'dibenzylethylenediamine and the like.
  • Preferred examples of the salt with an inorganic acid include, for example, salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfone Examples include salts with acids, p-toluenesulfonic acid, and the like.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orditin and the like.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like. Salts. Compound obtained by the above screening method,
  • a compound that increases the expression level of TGR25 of the present invention and prevents and treats a disease associated with dysfunction of TGR25 of the present invention for example, leukopenia, leukemia, lymph Tumor, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary disease, muscular dystrophy, muscle degenerative disease, myocardial infarction, Obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, mesopolitic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, Tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer,
  • a disease caused by excessive expression of TGR25 of the present invention which decreases the expression level of TGR25 of the present invention, for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, Rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscle degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, Arteriosclerosis, Mesopolitic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelial Tumor, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, esophagus cancer,
  • the compounds or salts thereof that increase the expression level of TGR25 of the present invention obtained by the above screening method include, for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammation Sexual bowel disease, tonsils disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metapolic Syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non- Small cell lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, e
  • a compound or a salt thereof that reduces the expression level of TGR25 of the present invention obtained by the above screening method is a disease caused by excessive expression of TGR25 of the present invention, for example, leukopenia, leukemia, Lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction , Obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metapolic syndrome; thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, larynx Cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung
  • the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., as needed, orally, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquids. Or it can be used parenterally in the form of injections such as suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in the unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • Swelling agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above type of material can further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • Aqueous liquids for injection include, for example, saline, dextrose and others
  • An isotonic solution containing an auxiliary agent eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • a suitable solubilizing agent for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene) It may be used in combination with glycols, polyethylene dalicol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50).
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the above-mentioned prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg, rats, mice, egrets, sheep, bush, horses, cats, cats, dogs, sal, etc.). Can be administered.
  • the dose of the above compound or its salt varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, in a leukopenia patient (with a body weight of 60 kg), the daily About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg of the compound that increases the expression level of TGR25 of the present invention.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • a compound that increases the expression level of TGR25 of the present invention per day is about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg. Is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of a body weight of 60 kg.
  • the compound that reduces the expression level of TGR25 of the present invention per day is about 0.1 to 10 Omg, preferably about 10 to 10 Omg. 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in patients with leukocytosis (body weight 60 kg ), About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 mg of the compound of the present invention that reduces the expression of TGR25 per day. It is convenient to administer about Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • an antibody against the ligand peptide can specifically recognize the ligand peptide of the present invention, it can be used for detecting or neutralizing the ligand peptide in the test solution.
  • the antibody against TGR25 of the present invention can specifically recognize TGR25 of the present invention, it can be used for detection and neutralization of TGR25 in a test solution.
  • a method for quantifying TGR 25 using an antibody against TGR 25 of the present invention will be described, but a method for quantifying ligand peptide using an antibody against ligand peptide can be carried out in the same manner.
  • the present invention provides a method for quantifying TGR 25 in a test solution.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of TGR25 and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of TGR25.
  • TGR25 can be quantified using a monoclonal antibody against TGR25, and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, and F (ab ') 2 , Fa The b ′ or Fab fraction may be used.
  • the method for quantifying TGR25 using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of TGR25) in the test solution. Any method that detects the amount of the antigen complex by chemical or physical means and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used. You may. For example, nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [125 1], [131 1], [], are used like [14 c].
  • the above-mentioned enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different TGR25 binding site. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of TGR25, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • BZF separation The amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody was used as the antibody
  • B / F separation was performed using a polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody, etc. and an immobilized antibody was used as the first antibody.
  • a solid-phase method using a soluble first antibody and a solid-phased antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test wave and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test wave.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the TGR25 measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the operation method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, documents, etc.
  • the TGR25 of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a change in the concentration of TGR25 is detected by quantifying the concentration of TGR25 using the antibody of the present invention, for example, for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor , Ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, Obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metapolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer , Thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, es
  • the binding of the ligand to TGR25 causes an increase in the expression of the serum response factor gene and a change in the subcellular localization of the TGR25 protein. (Including natural ligands and synthetic ligands) is useful as a reagent for searching or determining.
  • the present invention provides a method for determining an agonist against TGR25, which comprises, when a test compound is brought into contact with a cell containing TGR25, measuring an activity of inhibiting intracellular cAMP production via TGR25. provide.
  • Test compounds include known ligands (e.g., angiotensin, monobombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxotocin, ⁇ ACAP (e.g., PACAP27, PACAP38), secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (basoactive intestinal and related polypeptide), somatos, dopamine, Motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin direducted peptide), leukotriene, pancreatastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, chemokine superfamily ⁇ (eg, IL-8, GROa, GROj3, GR
  • a compound or a salt thereof eg, agonist, antagonist, etc.
  • the binding between the ligand and the TGR25 of the present invention is changed.
  • a compound that alters the signal transmission resulting from this binding e.g., peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, Or a salt thereof can be efficiently screened.
  • Such compounds include (a) compounds having a cell stimulating activity through TGR25 (so-called agonists against TGR25 of the present invention), (mouth) compounds which inhibit TGR25-mediated cell stimulating activity (so-called An antagonist to the TGR25 of the present invention), (8) a compound that enhances the binding force between the ligand and the TGR25 of the present invention, or (2) a compound that decreases the binding force between the ligand and the TGR25 of the present invention. It is.
  • Cell stimulating activities include, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, Intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP production inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, pH Decrease, GTP TS binding activity, activation of cAMP-dependent protein kinase, activation of cGMP-dependent protein kinase, activation of phospholipid-dependent protein kinase, mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) Activation, increase in serum response factor gene expression, activity to promote or suppress changes in the intracellular localization of TGR25 protein, etc., among which the activity to increase serum response factor expression is preferred .
  • MAP kinase mitogen-activated protein kinase
  • the present invention provides a comparison between (i) the case where the TGR25 of the present invention is brought into contact with the ligand and (ii) the case where the TGR25 of the present invention is brought into contact with the ligand and the test compound.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property or signal transduction between a ligand characterized by the following and TGR25 of the present invention.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of ligand binding to TGR25, cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • a compound or a salt thereof for example, a low-molecular-weight synthetic compound, preferably a low-molecular-weight synthetic agonist
  • a compound or a salt thereof that changes the binding property of the ligand to TGR25 of the present invention can be obtained by using a screening method described later.
  • the term “ligand” includes a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand and TGR25 of the present invention.
  • the labeled ligand and the test compound are ligated to the DNA of the present invention.
  • the method comprises measuring and comparing the amount of labeled ligand bound to the TGR25 of the present invention, which is expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the TGR25.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a ligand and TGR 25 of the present invention
  • TGR25-mediated cell stimulating activity when a compound and a test compound are brought into contact with a TGR25-containing cell of the present invention are measured and compared with each other. Screening methods for compounds or salts thereof that alter signal transduction;
  • TGR of the present invention expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention with a compound that activates the TGR25 of the present invention (eg, a ligand for TGR25 of the present invention). 25 and the TGR25-activating compound of the present invention and the test compound are brought into contact with the TGR25 of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding or signal transduction between a ligand and TGR25 of the present invention, wherein the cell stimulating activity mediated by the receptor protein is measured and compared in the case of I do.
  • the TGR 25 of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-described TGR 25 of the present invention.
  • Cell membrane fractions of animal organs are preferred.
  • human-derived TGR 25 expressed in large amounts using recombinants is suitable for screening.
  • the above method is used to produce the TGR 25 of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells.
  • Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment is converted into a nuclear polyhedrosis virus belonging to the paculovirus using an insect as a host.
  • NP V polyhedrin promoter
  • SV40-derived promoter SV40-derived promoter
  • retrovirus promoter meta-oral thionine promoter
  • human heat shock promoter overnight cytomegalovirus promoter overnight
  • SR promoter SR promoter It is preferred to incorporate it downstream, such as one.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, it can be carried out according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992]. it can.
  • the TGR25 containing the TGR25 of the present invention may be TGR25 purified according to a known method, or a cell containing the TGR25 may be used.
  • the cells containing the TGR25 of the present invention When cells containing the TGR25 of the present invention are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a known method.
  • the TGR25-containing cell of the present invention refers to a host cell expressing the TGR25.
  • the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, and animal cells. Are preferred.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. Potter—
  • a fractionation method using a centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (typically about 1-10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (1500-3000 rpm) for 30 minutes-2 hours.
  • the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed TGR 25 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of TGR25 in the cells containing TGR25 or in the membrane fraction is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • an appropriate TGR25 fraction and a labeled ligand are used.
  • TGR25 fraction a natural TGR25 fraction or a recombinant TGR25 fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction activity, and the like.
  • labeled ligand for example, a ligand labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like is used.
  • cells or a membrane fraction of the TGR25-containing cell of the present invention are suitable for screening.
  • Buffers include phosphate buffers such as pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and tris-hydrochloride buffer. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between TGR25 and TGR25.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin or dexcholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMSF, diptin, 64-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), or dipeptin may be added in order to suppress the degradation of the receptor and the ligand by the protease. it can. 0.01 to the receptions evening one protein solution OML, added labeled ligand certain amount (5000 ⁇ 500000 c pm), Ru coexist test compound 10_ 4 M ⁇ 10- 1Q M simultaneously.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, and washed with an appropriate amount of the same buffer. Then, the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured by a liquid scintillation counter or a counter.
  • the specific binding amount (B-NSB) is calculated as follows: For example, a test compound having 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • cells containing the TGR25 of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before conducting screening, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant. Then, the generated product is quantified according to each method. If the production of a substance that serves as an indicator of cell stimulating activity (eg, arachidonic acid, cAMP, etc.) is difficult to perform due to the presence of a degrading enzyme contained in the cells, an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. Is also good. In addition, for activities such as cAMP production suppression, It can be detected as a production inhibitory effect on cells whose basal production has been increased.
  • a substance that serves as an indicator of cell stimulating activity eg, arachidonic acid, cAMP, etc.
  • an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. Is also good.
  • cells expressing an appropriate TGR25 are required.
  • a cell line having the natural TGR25 of the present invention a cell line expressing the above-mentioned recombinant TGR25, and the like are desirable.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma. It may be a novel compound or a known compound.
  • the test compound may be in the form of a salt, and examples of the salt of the test compound include physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, And salts with basic or acidic amino acids.
  • the metal salt include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; and aluminum salt.
  • salt with an organic base examples include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, jetanoylamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N'—Salts such as dibenzylethylenediamine.
  • salts with inorganic acids include, for example, salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzene Salts with zensulfonic acid, P-toluenesulfonic acid and the like can be mentioned.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orditin and the like.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like. Salts.
  • test compound may bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of TGR25 of the present invention and the position of the ligand binding pocket.
  • Compounds designed in the above are preferably used.
  • the atomic coordinates of the active site of TGR25 and the position of the ligand binding pocket of the present invention can be measured by a known method or a method analogous thereto.
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property or signal transduction between a ligand and the TGR25 of the present invention includes the TGR25 of the present invention, the cell containing the TGR25 of the present invention, or the present invention. And those containing the membrane fraction of cells containing TGR25.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • the solution may be sterilized by filtration through a filter with a pore size of 0.45_im, and stored at 4 ° C or may be prepared at use.
  • CH ⁇ cells expressing the TGR25 of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 holes, and cultured for 2 days in 37, 5% CO 2 , 95% air.
  • test compound is brought into contact with cells containing the TGR25 of the present invention, and the above-mentioned cell stimulating activity is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist against TGR25 of the present invention.
  • the TGR25-activating compound (eg, ligand) of the present invention is brought into contact with a TGR25-containing cell of the present invention, and the TGR25-activating compound and test compound of the present invention are referred to as the present invention.
  • the TGR25-mediated cell stimulating activity of the present invention when it is brought into contact with cells containing TGR25 is measured and compared.
  • the compound or a salt thereof capable of decreasing the cell stimulating activity of the compound activating TGR25 of the present invention is an antagonist to TGR25 of the present invention.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding between the ligand and TGR25 of the present invention or signaling, and specifically, (A) a compound having a cell stimulating activity through a receptor (so-called agonist against TGR25 of the present invention); (mouth) a compound having a binding activity to receptor but not having the cell stimulating activity ( A so-called angonist for the TGR25 of the present invention),, ii) a compound that enhances the binding strength between the ligand and the TGR25 of the present invention, or (2) the binding between the ligand and the TGR25 of the present invention A compound that reduces force.
  • Such compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • the agonist against TGR25 of the present invention has the same action as the physiological activity of the ligand, it is useful as a safe and low-toxic drug according to the physiological activity of the ligand peptide.
  • the antagonist against TGR25 of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand, and is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the ligand peptide.
  • the compound of the present invention that enhances the binding force between TGR25 and TGR25 is useful as a safe and low-toxicity drug for enhancing the physiological activity of the ligand.
  • the compound of the present invention that reduces the binding force between the ligand and TGR25 is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the biological activity of the ligand for reducing the biological activity of the ligand.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is, for example, Leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscle disease Strophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, Metapolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, auditory schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer
  • cancer eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, auditory schwannoma, phary
  • a compound or a salt thereof that reduces the binding force between the antagonist and the ligand obtained by the above screening method and the TGR25 of the present invention is a disease caused by excessive expression of TGR25 of the present invention, for example, , Leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscle Disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metapolitic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytosis, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, Glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., as needed, orally, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquids. Or it can be used parenterally in the form of injections such as suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in the unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • Swelling agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • Agents such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), non-ionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50) You may.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. Good.
  • the prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • buffers for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity. For example, they should be administered to human
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a leukopenia patient (with a body weight of 60 kg), About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg of agonist per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • an injection it is usually used, for example, for patients with leukopenia (body weight 6 Okg ), It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg of agonist per day by intravenous injection. is there. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 Q kg of body weight.
  • the dose can be administered in terms of 6 Q kg of body weight.
  • oral administration in general, for example, in patients with leukocytosis (with a body weight of 6 Okg), about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 0.1 to 10 Omg of the antagonist per day Is about 1.0-20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in patients with leukocytosis (body weight 6 Okg )
  • body weight 6 Okg body weight 6 Okg
  • the dose can be administered in terms of the body weight per 6 Okg.
  • the present invention also relates to a stem cell or undifferentiated mesenchymal cell present in bone marrow and the like, A compound that alters the binding between ligand and its salt and TGR25, which regulates the function of lineage cells or the function of adipocytes and adipose progenitor cells existing in hematopoietic support tissues in bone marrow, etc. Or a pharmaceutical comprising a salt thereof is provided.
  • the bone marrow is the spongy tissue inside the bone, such as the medullary cavity of the long bone and the vertebral body, ribs, sternum, and pelvis, and is a place of hematopoiesis.
  • pluripotent hematopoietic stem cells which have the ability to differentiate into various blood cell lines, as well as precursor cells, macrophages, and fat cells of each blood cell , Reticular cells, reticular fibers, etc.
  • pluripotent hematopoietic stem cells which have the ability to differentiate into various blood cell lines, as well as precursor cells, macrophages, and fat cells of each blood cell , Reticular cells, reticular fibers, etc.
  • adhesion to cells and substrates, cytokines that act locally, etc. are important, which are called the concept of hematopoietic microenvironment. It is thought that molecules involved in homing involved, molecules involved in proliferation and maintenance of pluripotent stem cells, molecules involved in migration of blood cells from bone marrow, and recruitment are acting.
  • Adipocytes, fibroblasts, and reticulocytes in the bone marrow stromal cells have unique properties that are different from other sites, and are considered to be important in the formation of the hematopoietic microenvironment in bone marrow.
  • a G protein-coupled receptor transmits a signal into a cell through binding to a physiologically active substance, secretion of various humoral factors such as proteins and expression of new cell surface antigen molecules allow other cells in close proximity to It also affects functions. Therefore, ligands, agonists, and antagonists that control the signal of the G protein-coupled receptor expressed in the bone marrow are present in the bone marrow because they directly or indirectly affect specific cell functions in these cell populations. It can also be applied to the prevention, Z or therapeutic or diagnostic agents for diseases caused by the above various cell functions.
  • TGR25 various drugs have pharmacological effects via TGR25. It can be checked whether or not it is exerting.
  • TGR25 for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory Disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, myopathic disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, atherosclerosis, metabolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia , Cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, Gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, ⁇ cancer, ⁇ en
  • TGR25 for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory Disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, myopathic disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, atherosclerosis, metabolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia , Cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, Gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, Teng cancer, ⁇
  • TGR25 for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, Inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metabolic syndrome, thrombocytopenia, platelets Hyperplasia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell Lung, stomach, esophagus, colon, colon, rectum, liver, hepatocellular, Teng, Teng endocrine, bil
  • This confirmation method can be carried out by using the above-mentioned drug in place of the test compound in the above-mentioned method for screening a compound that changes the binding property between ligand and TGR25.
  • the kit for a confirmation method of the present invention is a kit for screening a compound that alters the binding property between the ligand and TGR25, wherein the kit contains the above drug in place of a test compound.
  • the confirmation method of the present invention it is possible to confirm that various drugs on the market or in development are exhibiting a pharmacological effect via TGR25.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the TGR25 of the present invention, it can be used for screening a compound or a salt thereof that changes the amount of the TGR25 of the present invention in a cell membrane. .. That is, the present invention provides, for example,
  • the transformant expressing the TGR25 of the present invention is sectioned, and the degree of staining of the receptor protein on the cell surface is quantified by using immunostaining method. It is intended to provide a method for screening a compound or a salt thereof that changes the amount of TGR25 of the present invention in a cell membrane by confirming the protein.
  • TGR25 of the present invention contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows. Do it.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by a known method after breaking cells.
  • Cell crushing methods include Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing cells, and Warrin Blender Polytron.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation and density gradient centrifugation
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (150 to 300 rpm). (0 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed TGR25 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the TGR25 of the present invention contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, a sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by known means.
  • a transformant expressing the TGR25 of the present invention is prepared according to the above method, and the TGR25 of the present invention contained in the cell membrane fraction can be quantified. Screening of a compound or a salt thereof that changes the amount of TGR25 of the present invention in a cell membrane,
  • test compound is administered at the same time as the physical stress, and after a lapse of a certain time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the present invention in the cell membrane
  • TGR 25 a certain time after administration
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 to 3 days) This can be achieved by quantifying the amount of TGR25 of the present invention in the cell membrane.
  • TGR 25 of the present invention contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • ⁇ properties e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P production, intracellular c AM P generation suppression, intracellular c GM P, production of inositol phosphate, cell membrane potential Fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, decrease of pH, increase in expression of serum response factor gene, change in subcellular localization of TGR25 protein, etc.
  • B a compound that attenuates the cell stimulating activity by reducing the amount of TGR25 of the present invention in the cell membrane.
  • Such compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • salt of the compound examples include physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids.
  • metal salt examples include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; aluminum salt.
  • Preferred examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, Salts with N, ⁇ '-dibenzylethylenediamine and the like can be mentioned.
  • Preferable examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzene Examples include salts with sulfonic acid, ⁇ -toluenesulfonic acid, and the like.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orditin and the like.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like. Salts.
  • the compound or a salt thereof that enhances the cell stimulating activity by increasing the amount of the TGR25 of the present invention in the cell membrane can be used as the agent for preventing or treating a disease associated with dysfunction of the TGR25 of the present invention. It can be used as a medicine.
  • the compound or a salt thereof is used, for example, for leukopenia, leukemia, lymphatic disease, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease , Leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, atherosclerosis, metapolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer ( For example, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, Colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, hepato
  • TGR25 of the present invention Compounds or salts thereof that attenuate the cell stimulating activity by reducing the amount of TGR25 of the present invention in the cell membrane include diseases caused by overexpression of TGR25 of the present invention, such as leukopenia, Leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, Myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, mesopolitic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, Pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention can be formulated according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof is orally administered as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, coated with water or other pharmaceutically acceptable liquid.
  • It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the compound or a salt thereof may be combined with a known physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc., in a unit dose required for generally accepted formulation practice. It can be manufactured by mixing in the form. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid Swelling agents such as sucrose, lubricating agents such as magnesium stearate, sweetening agents such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin
  • alginic acid Swelling agents such as sucrose, lubricating agents such as magnesium stearate, sweetening agents such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • a liquid carrier such as a fat and oil.
  • Sterile compositions for injection include an active
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, glucose and Isotonic solutions containing other adjuvants (eg D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride 7354
  • solubilizers for example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene daricol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM) HCO-50).
  • alcohols eg, ethanol
  • polyalcohols eg, propylene glycol, polyethylene daricol
  • nonionic surfactants eg, Polysorbate 80 TM HCO-50
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • buffers for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be administered to humans and mammals (rat
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a leukopenia patient (with a body weight of 60 kg), About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of a compound that increases the amount of TGR25 of the present invention in the cell membrane per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the amount of the compound that increases the amount of TGR25 of the present invention in the cell membrane per day is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg. It is convenient to administer about 1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other ftj products, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the neutralizing activity of the antibody against TGR25 of the present invention means an activity of inactivating the signal transduction function involving the TGR25. Therefore, the antibody has neutralizing activity.
  • signal transduction involving the TGR25 for example, cell stimulating activity through the TGR25 (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP production Inhibition, intracellular c GMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, ⁇ TPrS binding activity, activation of cAMP-dependent proteinase C, activation of GMP-dependent protein kinase, activation of phospholipid-dependent protein kinase, activation of mitogen-activated protein kinase (MAP kinase), etc., expression of serum response factor gene Increase, activity to promote or suppress changes in the intracellular local
  • the neutralizing antibody against TGR25 of the present invention may be a disease caused by overexpression of TGR25 or excessive ligands, such as leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, Inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis , Medullary politic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytosis, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, auditory schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, Breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, esophagus cancer
  • the prophylactic / therapeutic agent can be produced and used in the same manner as the above-mentioned medicament containing TGR 25 of the present invention. (10) A medicine comprising the antisense DNA of the present invention
  • the antisense DNA of the present invention may be used for diseases caused by overexpression of TGR25 or excessive ligands, such as leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory Intestinal disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, atherosclerosis, metapolic syndrome , Thrombocytopenia, thrombocytosis, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, auditory schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell Lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon
  • the antisense DNA When the antisense DNA is used, the antisense DNA is used alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. Can be implemented.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered with a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • RNA for the receptor of the present invention smal l (short) interfering RNA
  • shRNA smal l (short) hairpin RNA
  • liposomes containing a part of RNA encoding TGR25 etc.
  • TGR25 can suppress the expression of TGR25 or its polynucleotide in vivo, such as leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, chronic Rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, high fat Blood, arteriosclerosis, metapolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytopenia, cancer (, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, auditory schwannomas, pharynx, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, medium Sarcoma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, esophagus cancer, colon cancer, colon cancer, rectum cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, victory
  • the double-stranded RNA can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • a ribozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the receptor of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the receptor of the present invention of the present invention includes a portion (RNA fragment) adjacent to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known lipozyme.
  • RNA or lipozyme When the above-described double-stranded RNA or lipozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide.
  • the present invention relates to a non-human having an exogenous ⁇ : DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DN ⁇ of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as an exogenous mutant DNA of the present invention).
  • exogenous DN ⁇ of the present invention DNA of the present invention
  • mutant DNA thereof sometimes abbreviated as an exogenous mutant DNA of the present invention.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • a calcium phosphate method, an electric pulse method, a Lipofection can be produced by transferring the target DNA by a method such as DNA, agglutination, microinjection, particle injection, and DEAE-dextran.
  • the exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, organs of living organisms, tissue cells and the like can be transferred and used for cell culture, tissue culture and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be produced by fusing the cells with the above-mentioned germ cells by a known cell fusion method.
  • non-human mammal for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, blue herons, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and the like are used.
  • rodents that have relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems and are easy to breed, especially mice (for example, C57B L / 6 strains and DBA2 strains as pure strains)
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • mutant DNA of the present invention DNA having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition, deletion, or substitution of another base DNA that has been used is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses the abnormal TGR25 of the present invention, for example, a DNA that expresses TGR25 that suppresses the function of the normal TGR25 of the present invention, and the like.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • DNs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • having the DNA of the present invention having a high homology to the human DNA are transferred.
  • DNA construct for example, a vector
  • a target mammal for example, a mouse fertilized egg
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses DNA can be created.
  • TGR25 expression vector of the present invention examples include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or Animal viruses such as baculovirus are used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoter that regulates DNA expression examples include, for example, (i) a promoter of DNA derived from virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.).
  • virus eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • (Ii) promoters derived from various mammals such as albumin, Phosphorus II, Peroplakin II, Elaster if, Erythropoietin, Endothelin, Muscle creatine kinase, Glial fibrillary acidic protein, Daltathione S-transferase, Platelet-derived growth factor 3, Keratin Kl, 10 and 1 ⁇ 14, Collagen Type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase ⁇ subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium diuretic factor, 'endothelial receptor thymic synkinase (commonly abbreviated as Tie 2), sodium potassium Adenosine triphosphatase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, meta-oral thionein I and
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the target mRNA in a DNA-transferred mammal (generally referred to as an “initiator”).
  • an initiator a DNA-transferred mammal
  • the sequence of each DNA derived from an animal can be used, and preferably, the SV40 terminator of Simian virus is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. should be added to the 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, in order to further express the target exogenous DNA. It may be linked to the 3 'downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal TGR25 translation region of the present invention is derived from human, various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), liver, kidney, DNA derived from thyroid cells, fibroblasts and various commercially available genomic DNA libraries as whole or part of genomic DNA, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblast-derived RNA It can be obtained as a raw material.
  • the foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the normal TGR25 translation region obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA-based method in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells Means that.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. You can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • Means to have The progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the function of endogenous normal DNA to thereby ultimately develop the normal DNA.
  • TGR25 hyperactivity may develop, and it can be used as a model animal for the disease.
  • the normal DNA-transferred animal of the present invention it is possible to elucidate the pathological mechanism of the TGR25 hyperfunction of the present invention and the disease associated with the TGR25 of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible. Further, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased condition of TGR25 of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic agent for a disease associated with TGR25 of the present invention. It is.
  • a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating.
  • the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. Transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of the DNA means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the endogenous normal DNA is ultimately inactivated by inhibiting the function of endogenous normal DNA. It can cause type refractory disease and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of TGR25 function-inactive refractory disease of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit normal TGR25 function inhibition (dominant) by abnormal TGR25 of the present invention in TGR25 inactive refractory disease of the present invention. negative effect).
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has the TGR25 increase symptom of the present invention, it can also be used for a therapeutic drug screening test for TGR25 or a functionally inactive refractory disease of the present invention. is there.
  • TGR25 of the present invention Specific expression or activation by TGR25 of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing TGR25 tissue expressed by DNA Analysis of the association with TGR 25,
  • each organ from the DNA-transferred animal of the present invention cut it into small pieces, and then use a proteolytic enzyme such as tribcine to obtain the released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. It is possible. Furthermore, the TGR25-producing cells of the present invention can be identified, apoptosis, their relationship with differentiation or proliferation, or their signaling mechanisms can be examined, and their abnormalities can be examined. And effective research materials for elucidating its action.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • a repo overnight gene eg, a 3-galactosidase enzyme gene derived from Escherichia coli
  • the DNA is inactivated by introducing a repo overnight gene (eg, an i3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene is a promoter of the DNA of the present invention.
  • a repo overnight gene eg, an i3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • the reporter gene is a promoter of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal according to (6) which can be expressed under control
  • the non-human mammal according to (8) which is a mouse, and
  • a compound that promotes or inhibits the promoter activity of DNA of the present invention which comprises administering a test compound to the animal according to (7) and detecting the expression of a reporter gene, or a compound thereof. It provides for increased expression of the serum response factor gene, and altered intracellular localization of the TGR25 protein.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the expression of the DNA, or By substantially losing the activity of the TGR25 of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the TGR25 of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention. )
  • Non-human refers to mammalian embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter overnight or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells of the present invention in which DNA is inactivated include, for example, DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated, a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or a lacZ () 3-galactosidase gene) in the exon portion thereof; Disruption of exon function by inserting a repo overnight gene or the like represented by cat (chloramphenicol acetyltransferase gene), or termination of gene transcription in the intron region between exons.
  • DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention include, for example, DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated, a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or a lacZ () 3-galactosidase gene) in
  • DNA sequence for example, a poIyA addition signal to prevent complete mRNA synthesis, resulting in gene disruption.
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to be disrupted (hereinafter abbreviated as an evening getter vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, a homologous recombination method.
  • the DNA sequence on or near the DNA of the invention used as a probe for Southern hybridization analysis or the DNA sequence on the targeting vector and the DN of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector It can be obtained by analyzing by the PCR method using the A sequence as a primer and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established may be used as described above, or the method described in the known Evans and Kaufman method may be used. A newly established one may be used. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since their immunological background has not been fixed, a pure line that substitutes them has been used for immunological inheritance.
  • BDF1 mice C57BLZ6 mice and DBA / 2 cells whose C57BLZ6 mice and C57BL / 6 eggs have a low number of eggs improved by crossing with DBAZ2 Those established using F1
  • BDF1 mice have the advantage of high number of eggs collected and robust eggs.
  • C57BLZ6 mice are used as background, ES cells obtained using these cells are It can be used advantageously in that the genetic background can be changed to C57BL / 6 mice by performing a pack cross with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used, but in addition to this, a large number of cells can be efficiently collected by collecting 8-cell embryos and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
  • male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • the number of ES cells in one colony (approximately 50) is sufficient, compared to the conventional method requiring about 106 cells for karyotype analysis.
  • the primary selection of ES cells in the stage can be performed by discriminating between males and females, and the early stages of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • LIF (1-1000) on a suitable feeder cell such as STO fibroblasts (OU / ⁇ ) in a CO2 incubator (preferably 5% CO2, 95% air or 5% oxygen, 5% CO2, 90% air) with about 37 cells.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts (OU / ⁇ ) in a CO2 incubator (preferably 5% CO2, 95% air or 5% oxygen, 5% CO2, 90% air) with about 37 cells.
  • the cells are converted to single cells by treatment with a trypsin ZEDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin / ImM EDTA), and a newly prepared feeder is used.
  • a method of seeding on one cell is used.
  • Such subculture is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be transformed into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature, Vol. 292, pp. 154, 1981; GR Martin Proceedings of the National Academy of Sciences. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981;
  • the DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention. Is useful in cell biological studies of the TGR25 of the present invention or the TGR25 of the present invention in the mouth.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. .
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be prepared, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the targeting vector into the non-human mammal of the present invention.
  • the DNA in which A is inactivated undergoes homologous recombination by gene homologous recombination to replace the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, thereby obtaining the DNA of the present invention. Can be knocked out.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out may be on or near the DNA of the present invention.
  • Southern hybridization analysis using the adjacent DNA sequence as a probe or the DNA sequence on the first gettering vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used for the evening getter vector were used as primers. It can be determined by analysis using the PCR method.
  • a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human cells.
  • the chimeric embryo is injected into a mammalian embryo or a blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially obtained from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention having the mutation added thereto, for example, by judging coat color.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual lacking the expression of the TGR25 of the present invention, and an individual lacking the expression of the TGR25 of the present invention is bred to each other. An individual lacking the homo-expression of TGR25 of the present invention can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg cell by a microinjection method. Compared to human mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the animal individual obtained by mating can confirm that the DNA has been knocked out, and can carry out rearing in an ordinary rearing environment. .
  • the germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained. Heterozygous animal By crossing males and females, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the TGR 25 of the present invention, the non-human mammal of the present invention may cause inactivation of the biological activity of the TGR 25 of the present invention. It is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods. (12a) A method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage according to the present invention
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against a disease caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • a method for screening a compound or a salt thereof, which has a therapeutic and / or preventive effect on a disease caused by the above includes the same ones as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, fang, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma. May be a novel compound or a known compound.
  • the test compound may be in the form of a salt, and examples of the salt of the test compound include physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, and salts with organic acids. And salts with basic or acidic amino acids.
  • the metal salt include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; and aluminum salt.
  • salts with organic bases include, for example, Examples include salts of limethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexyl and the like.
  • salts with inorganic acids include, for example, salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzene Salts with zensulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like can be mentioned.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orditin and the like.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like. Salts.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with a non-treated control animal, and changes in organs, tissues, disease symptoms, and the like of the animal are indicated.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • a method of treating a test animal with a test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the inflammatory symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by TGR25 deficiency or damage of the present invention (for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignancy).
  • Tumor ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscle disease, muscular dystrophy, muscle degenerative disease, myocardial infarction, obesity, Diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metapolic syndrome, thrombocytopenia, blood Platelet aplasia, cancer (eg, brain tumor, pituitary adenoma, glioma, acoustic schwannoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small Cell lung
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, and organic acids. Examples thereof include salts with acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; aluminum salt and the like.
  • salts with organic bases include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, jetanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexane. Salts with xylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine and the like can be mentioned.
  • salts with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid Acids and salts with p-toluenesulfonic acid and the like.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, ornithine
  • preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like. Salts.
  • a drug containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof is manufactured in the same manner as the above-mentioned drug containing a compound that alters the binding property or signal transduction between TGR25 and ligand peptide of the present invention. be able to.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs). And monkeys).
  • humans or mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs). And monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound when administered, it is generally used in patients with inflammation (as body weight 60 kg).
  • the single dose of the compound will vary depending on the administration subject, target disease, etc.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to inflammatory patients (with a body weight of 60 kg).
  • it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day.
  • the dose can be administered in terms of a body weight of 6 O kg.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and detects the expression of a reporter gene. And a method for screening a compound or a salt thereof.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be one of the above-mentioned non-human mammals deficient in expression of the DNA of the present invention, which is obtained by introducing the reporter gene into the DNA of the present invention. Those which are activated and which can express the reporter gene under the control of the promoter for the DNA of the present invention are used. Examples of the test compound include the same compounds as described above.
  • the same one as described above is used, and a ⁇ -galactosidase gene (1 acZ), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is suitable.
  • the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, and therefore the By tracing the expression, the activity of the promoter can be detected.
  • TGR25 of the present invention when a part of the DNA region encoding the TGR25 of the present invention is substituted with the) 3-galactosidase gene (1 ac Z) derived from Escherichia coli, a tissue that originally expresses the TGR25 of the present invention may be used. However, ⁇ -galactosidase is expressed instead of TGR25 of the present invention. Therefore, for example, by staining with a reagent that serves as a substrate for) 3-galactosidase, such as 5-promo 4-chrome-3 indolyl-3-galactopyranoside (X-gal), Then, the expression state of the TGR25 of the present invention in an animal body can be observed.
  • a reagent that serves as a substrate for) 3-galactosidase such as 5-promo 4-chrome-3 indolyl-3-galactopyranoside (X-gal
  • the TGR25-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour in the vicinity of b), the / 3-galactosidase reaction can be stopped by washing the tissue specimen with ImM EDTAZPBS solution, and the coloration can be observed. Further, mRNA encoding 1acZ may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by the above screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, and organic salts. Examples thereof include salts with acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; and aluminum salt.
  • salts with bases include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolylamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, And salts with N'-dibenzylethylenediamine and the like.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, Salts with benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like can be mentioned.
  • Preferable examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orditin and the like.
  • Preferred examples of the salt with the acidic amino acid include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like. Salts.
  • the compound of the present invention which promotes the promoter activity against the DNA or a salt thereof can promote the expression of the TGR25 of the present invention and promote the function of the TGR25. It can be used as a medicament such as an agent for preventing and treating diseases related to dysfunction of 25.
  • the compound is used, for example, as an anti-inflammatory agent, and further, for example, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis , Mesopolitic syndrome, leukopenia, thrombocytopenia, leukopenia, thrombocytopenia cancer, leukemia, lymphoma, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, pulmonary edema, multiple organ failure, inflammatory bowel disease, tonsils It can be used as a low-toxicity and safe medicine as a preventive and therapeutic agent for glandular diseases, collagen diseases and inflammatory diseases.
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits promoter activity against DNA can inhibit the expression of TGR25 of the present invention and can inhibit the function of TGR25.
  • Diseases associated with overexpression of TGR25 such as cardiac insufficiency, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, and mesobolic Syndrome, leukopenia, thrombocytopenia, leukocytosis, thrombocytopenic cancer, leukemia, lymphoma, ulcerative colitis, chronic disease It is useful as a drug for the prevention and treatment of rheumatoid arthritis, pulmonary edema, multiple organ failure, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, etc.
  • a compound derived from the compound obtained by the above screening can also be used.
  • the medicament containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method is produced in the same manner as the above-mentioned medicament containing a compound that alters the binding property between TGR25 or a salt thereof and a ligand peptide of the present invention. be able to.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or other mammals (rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound of the present invention that promotes duromoe activity on DNA is orally administered
  • the compound is administered in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound of the present invention that promotes the overnight activity of DNA against the DNA may be in the form of an injection.
  • the conjugate when administered to an inflamed patient (assuming a body weight of 60 kg), is used in an amount of about 0.01 to Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 0.1 mg per day. It is convenient to administer 11 Omg or so by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by insufficient expression of DNA, or the development of therapeutic drugs.
  • TGR25 of the present invention uses a DNA containing the promoter region of TGR25 of the present invention to produce a so-called transgenic animal (gene transfer). Animal), it would be possible to specifically synthesize its TGR25 and study its effects in living organisms.
  • TGR25 of the present invention has an action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of TGR25 itself. Can be used as a search system for low molecular compounds.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the relevant field, and examples thereof are described below.
  • an amino acid may have an optical isomer
  • the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • RNA Liponucleic acid
  • a la Alanine
  • Leu Leucine ⁇
  • Th r Threonine
  • TC thiazolidine-4 (R) -caproloxamide group
  • HONB trihydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide DCC
  • [SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of human-derived TGR 25 of the present invention.
  • SEQ ID NO: 2 This shows the base sequence of cDNA encoding human-derived TGR 25 of the present invention. .
  • cDNA encoding the G protein-coupled receptor protein TGR25 (SEQ ID NO: 1) prepared by a known method was converted into pAKKO-111H (Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al., 1219, 251). Escherichia coli JM109 was transformed using an expression plasmid for animal cells inserted into the same plasmid vector as pAKKO-1.111H described in 259, 1994), and the resulting colonies were isolated. Large amounts of plasmid were prepared using Plasraid Maxi Kit (Qiagen). In addition, pSRE_Luc in which the luciferase gene was linked as a reporter downstream of the serum response element (SRE)
  • Human GaoA is a type of reporter plus Mi de and G proteins (Invitrogen), was prepared human Gpl, the expression vector plus Mi de of human G Y 2 in the same manner.
  • HeLa cells were used as host cells to introduce the G protein-coupled receptor protein expression plasmid and reporter plasmid, and were seeded at 4,000 cells / well in a 384-well assemblage (C0STAR 3704) at a culture volume of 25 ⁇ l. ⁇ Cultivated.
  • the medium used was DMEM (Invitrogen) supplemented with 10% fetal calf serum and 1% MEM non-essential amino acids solution (DMEM / NEAA).
  • each plasmid Dilute each plasmid to a concentration of 240 ngAil, and use the expression vector for the G protein-coupled receptor protein expression plasmid or, as a control experiment, the expression vector without the DNA encoding the receptor protein instead of the expression plasmid for the receptor pAKKO- 111H plasmid was added to 240 ⁇ l of 0pti_MEM_I (Invitrogen) at a ratio of ⁇ , 9 ⁇ l of reporter plasmid and each of the G protein expression plasmids of GaoA, Gpl, and Gy2 ( ⁇ ). This was added to 240 ⁇ 1 of 0pti_MEM-1 and ⁇ of Lipofectamine TM 2000.
  • 0pti_MEM_I Invitrogen
  • HeLa cells were prepared in Example 1, washed twice with ⁇ shea fetal without serum DMEM / NEAA (Atsuse I medium), '37 ° C, and cultured for 2 hours at 53 ⁇ 4 C0 2 below. Further, after washing once with the medium for Atsey, AM251 (Bioraol) dissolved in the medium for Atsey containing 0.05% CHAPS was added to the cells in each well. Performs 37 ° C, 5% C0 2 incubator Beshiyon below 4 hours after the sample addition, the transcription and translation of the reporter gene derived from intracellular signal transduction caused attract by Agonisuto activity of the ligand through the receptions evening one Promotion was induced.
  • AM251 Bioraol
  • AM251 enhances luciferase activity (cps) in TGR25 expressing cells
  • ABI PRISM7700 SequenceDetector (Applied Biosystems) was used for quantification of mRNA expression level.
  • Primer used for quantification of expression level [5,- TGAGTGTGGGACAAATGCATGT-3 '(SEQ ID NO: 3), 5'-ACACAGGTGAGGGTCATGTTAGG-3'
  • SEQ ID NO: 4 and the probe [5,-ATCGTCTTCTCTCACCAGCGACCGC-3, (SEQ ID NO: 5)] are based on the human TGR25 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) and are exclusively for ABI PRISM SequenceDetec tor
  • the software was designed using PrimerExpress (Applied Biosystems).
  • the cDNA used as type I was synthesized by reverse transcription using total primers (Clontech) g derived from various human tissues using a random primer. The reverse transcription reaction was performed using SuperScriptl (GIBC0 BRL) as a reverse transcriptase according to the attached protocol.
  • ABI PRISM7700 SequenceDetector is TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 12.1, each primer 0.9-1 and the probe 0.25-1, the cDNA solution is mixed, and distilled water is added. Prepared as 25 ⁇ 1.
  • the mouse-derived 3T3-L1 cells were cultured by a conventional method (pre-fat). The cells were induced to differentiate for 2 days by adding insulin (li ⁇ g / ml), dexamethasone 2.5 / ⁇ , and 0.5 mM, and then cultured for 12 days in a medium containing insulin ( ⁇ zg / ml). The adipocytes were differentiated. Total RNA was prepared from each cell using Isogen (Futtsubon Gene) according to the manual. Type III cDNA was prepared in the same manner as in Example 1. ABI PRISM7700 SequenceDetector (Applied Biosystems) was used for quantification of mRNA expression level.
  • Primers [5, -GCTGTCGGAACCTGTAGAGATCA-3 '(SEQ ID NO: 6), 5, -TCCCAGMTACACAGGTGAGGAT-3, (SEQ ID NO: 7)] and probe [5, -TCCCATGAGCGTCAACCACCTMCGT-3, (SEQ ID NO: : 8)] is software for ABI PRISM SequenceDetector based on the nucleotide sequence of mouse TGR25 (Mol. Cell. Biol. 20, 4405-4410 (2000)).
  • An expression plasmid was constructed to express a fusion protein in which the Green Fluorescent Protein in (GFP) cDNA isolated from O jellyfish was linked to the C-terminus of TGR25 in translation frame.
  • GFP Green Fluorescent Protein in
  • PQBI25 Takara Shuzo
  • the termination codon of TGR25 was corrected to the recognition sequence of the restriction enzyme Nhel by PCR, and a GFP fragment was ligated thereto and inserted into the expression vector pAKKO-111H described in Example 1.
  • TGR25-GFP fusion protein TGR25-GFP that stably expresses TGR25-GFP by a known method using a plasmid of an expression vector Expression CH0 (CHO-TGR25-GFP) was produced. This is the number of Lab-Tekl cover glass chambers with eight chambers.
  • Heparin-added human peripheral blood derived from healthy volunteers was diluted 4-fold with phosphate buffered saline (PBS) and layered on Ficoll Paque TM Plus (Amersham Biosciences). After centrifugation at 800 G for 40 minutes, the suspension layer (lymphocyte and monocyte fraction) and The sedimented layers (polymorphonuclear leukocyte and erythrocyte fractions) were collected and washed twice with PBS (phosphate-buffered saline). The floating layer fraction was directly suspended in a culture medium (RPI1640 medium containing 10% inactivated fetal serum) to obtain a lymphocyte / monocyte suspension.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the precipitate layer fraction is hemolyzed by osmotic shock in sterile water for 40 seconds, then 1/10 volume of 10-fold concentrated PBS is added, washed with culture medium, suspended in the same medium, and polymorphized. Nuclear leukocyte suspension was used.
  • the cDNA was used as a solution of 25 ng / ⁇ in terms of total RNA, and used as a template for subsequent PCR reactions.
  • the PCR reaction used Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosysteras), and the primers and TaqMan probe used for amplification and detection were those used in Example 3 (SEQ ID NOS: 3, 4 and 5). .
  • the PCR reaction solution was added to TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 12.51, 0.051 of IOOM primer solution, 0.5 of 5M TaqMan probe and 0.5 ⁇ 1 of the cDNA solution prepared above, and distilled. The total amount of the reaction solution was adjusted with water.
  • TGR25 mRNA was calculated as the number of copies per 25 ng of total RNA using a calibration curve obtained from a PCR reaction using a standard DNA fragment containing the amplified DNA as a type I PCR reaction.
  • TGR25 was specifically expressed in polymorphonuclear leukocytes.
  • Example 6 Higher than peripheral blood from healthy subjects according to the method described in (1).
  • the cell population of morphonuclear leukocytes was separated and collected.
  • the cells were suspended to a concentration of 4xl0 6 cells / ml with ice-cold HBSS (Hank 's balanced salt solution , Invitrogen), 2x10, divided into plastic tubes by cells (0.5 ml), 5 minutes at 37 ° C for It was left still.
  • AM251 was added to a final concentration of 30 M and 10 iM, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 5 minutes, 10 minutes, and 30 minutes, centrifuged, and the supernatant was removed to obtain a cell pellet.
  • the cells were immediately added with 501 Blue Loading Buffer (Daiichi Pure Chemicals) and lysed by pipetting. After sonication, heat-treat the cell lysate at 95 ° C for 5 minutes and centrifuge.
  • the protein was electrophoresed on a 10% SDS-polyacrylamide gel, and then electrically transferred to a PVDF membrane (BIO-RAD) by a known method.
  • the membrane was first blocked with a TBS-T solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) containing 5% serum albumin, and then the primary antibody (Phospho-p44 / 42 Map Kinase antibody (Daiichi Pure Chemicals, diluted 2000-fold) in a TBS-T solution and shaken at room temperature for 1 hour.
  • TBS-T solution 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20
  • the primary antibody Phospho-p44 / 42 Map Kinase antibody (Daiichi Pure Chemicals, diluted 2000-fold) in a TBS-T solution and shaken at room temperature for 1 hour.
  • the membrane is washed with a TBS-T solution and then immersed in a horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Goat Anti-Rabbit IgG, HRP-conjugate, Daiichi Kagaku) diluted 5000-fold with the TBS-T solution. Soaked for 1 hour at room temperature. Finally, the membrane was washed again with a TBS-T solution, and chemiluminescence was detected using ECLplus Western Blotting Detection System (Amers am Biosciences) and Flemino Image Analyzer (LAS-1000; FUJIFILM).
  • ECLplus Western Blotting Detection System Amers am Biosciences
  • Flemino Image Analyzer LAS-1000; FUJIFILM
  • A251-treated cells showed that MAP kinase of human peripheral blood polymorphonuclear
  • Human leukemia cell line (derived from human acute promyelocytic leukemia cells) HL-60 is DMS0
  • the cells DMS0 (final concentration 1.25%) in the presence, or DMS0 (final concentration 1.25%) and AM25 final concentration 10 M) presence, 37 ° (:, differentiation induced by culturing at 5% C0 2 4 days
  • the degree of cell differentiation was determined by using the expression level of the cell surface antigen CDllb / Mac-1, which is a differentiation marker, as an index, using a fluorescently labeled antibody (PE-anti-human CDllb / Mac-K Nippon Becton Dickinson). And flow cytometry (BD FACSVantage TM, Nippon Becton Dickinson).
  • Fig. 4 shows the results.
  • CD11 b / Mac-1 expression was enhanced in the 1.25% DMS0-treated HL-60 cell group compared to the drug-free control cell group, but the expression level was further increased in the presence of AM251 (10 M) .
  • AM251 was found to act stimulatively on HL-60 neutrophil-like cell differentiation.
  • TGR25 was transiently expressed in HeLa cells in the same manner as in Example 1, and the cells were washed in the same manner as in Example 2 and then dissolved in ATSEI medium containing CHAPS.
  • T0CRIS T0CRIS
  • DH97 T0CRIS
  • AM281 enhances luciferase activity in TGR25-expressing cells (cps)
  • Compounds or salts thereof that alter the binding or signal transduction between TGR25 and ligands or salts thereof include, for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumors, ulcerative colitis, chronic arthritis, inflammatory bowel disease , Tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis, heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, atherosclerosis, metapolic syndrome, platelets It has preventive and therapeutic effects on hypotension, thrombocytosis, cancer, pulmonary edema, and multiple organ failure.
  • TGR 25 eg, compound (I), compound (II), etc.
  • compounds or salts thereof that promote the binding between TGR 25 and ligand, and TGR 25 are for example, useful as a preventive or therapeutic agent for low toxicity, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, etc. It is.
  • TGR25 antibodies to TGR25, antisense polynucleotides to TGR25, and the like are useful as, for example, low-toxic, preventive and therapeutic agents for leukocytosis or leukocyte activators. Useful.
  • TGR25 and its ligands include, for example, leukopenia, leukemia, lymphoma, malignant tumor, ulcerative colitis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, tonsillar disease, collagen disease, inflammatory disease, leukocytosis , Heart failure, hereditary muscular disease, muscular dystrophy, muscular degenerative disease, 'myocardial infarction, obesity, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, metapolic syndrome, thrombocytopenia, thrombocytosis, cancer, lung edema, multiple organs It is useful for screening for compounds or salts thereof that have preventive and / or therapeutic actions against insufficiency.

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Abstract

本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩およびリガンドまたはその塩を用いることを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法などを提供する。本発明は、例えば、白血球減少症、白血病、リンパ腫、悪性腫瘍、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、扁桃腺疾患、膠原病、炎症性疾患、白血球増多症、心不全、遺伝性筋疾患、筋ジストロフィー、筋変性疾患、心筋梗塞、肥満、糖尿病、高脂血症、動脈硬化症、メタボリックシンドローム、血小板減少症、血小板増加症、癌、肺水腫、多臓器不全などの予防・治療剤のスクリーニングに有用である。

Description

明細書
Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の新規リガンドとその用途 技術分野
本発明は、 Gタンパク寳共役型レセプタータンパク質の新規リガンドとその用 途に関する。' 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特異 的なレセプタータンパク質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプ 夕一タンパク質のうち多くは共役している guanine nucleot ide-binding protein (以下、 Gタンパク質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナ ル伝達を行ない、 また、 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっているこ とから、 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 （GPCR) または 7回膜貫通型レ セプ夕一タンパク質 （7TMR) と総称される。
G夕ンパク質共役型レセプタ一タンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表 面に存在し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えば、 ホルモン、 神経 伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシ グナルにより細胞の賦活ゃ抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ 夕一タンパク質、 特には Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質との関係を明 らかにすることは、 各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、 それら機能と密接に 関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達 物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれて いる。 特に、 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、 それぞれに対応する レセプタータンパク質を通してその生理機能の調節を行っている。 生体内には未 知のホルモンゃ神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、 それらのレセプ夕一 タンパク質の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに、 既知のレセプタータンパク質においてもサブタイプが存在するかどうかについて も分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ夕一タンパク質 との関係を明らかにするととは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセプ夕—夕ンパク質に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストを効率よくスクリー ニングし、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプタータンパ ク質の遺伝子の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要で あった。
レセプ夕一タンパク質のうち、 ァゴニストおよびアン夕ゴニストを含むリガン ドが不明なレセプ夕一タンパク質をォ一ファンレセプター夕ンパク質と称する。 このォーファン Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の一つとして、 TGR25が 知られている （W0 02/46394号公報） 。 このタンパク質はまた、 GPR97とも呼ばれ (FEBS Let ters 531 , 407-414 (2002) ) 、 そのマウスホモログとして Pb99が知ら れている (Mo l . Cel l . Bi ol . 20, 4405-4410 (2000) ) 。 Pb99は B前駆細胞と胸腺 細胞において発現するが、 成熟 B細胞および T細胞では発現せず、 リンパの発達に 関与していると報告されている。 また TGR25が骨髄で発現しているレセプ夕一で あるという報告もある （特開 2003-24070) 。
AM251. U_ (2, 4-ジクロロフエ二ル）- 5- (4-ョ一ドフエ二ル）- 4-メチル -N-ピペリ ジン-卜ィル -m-ピラゾ一ル- 3-カルポキサミド〕 は、 カンナビノィドレセプ夕一 のアン夕ゴニス卜で、 食欲抑制、 体重減少作用を有することが 〔Eur J
Pharmaco l 462 (1-3) : 125-132 (2003) 〕 、 Gタンパク質共役型レセプタータンパ ク質の一つである GPR55にァゴニスト作用を有することが報告されている （W0 01/86305号公報） に開示されている。 AM251、 AM281 〔1- (2, 4-ジクロロフエ二 ル) - 5- (4-ョードフエ二ル)- 4-メチル -N-モルホリン -4-ィル- 1H-ピラゾール- 3 -力 ルポキサミド〕 などは、 カンナピノイド受容体 CB1特異的なアン夕ゴニストであ ると報告されている (Li fe Sc i . 76 (12)： 1307-1324 (2005) ) 。 N-ペンタノィル 2-ベンジルトリプタミン 〔N_pentanoyl 2-benzyl tryptamine (DH97) 〕 は、 メラ トニン受容体 MT2アン夕ゴニス卜であると報告されている 〔Naunyn Sc mi edebergs Arch Pharmaco l . 358 (5)： 522 - 528 (1998)〕 。 発明の開示
従来、 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質と生理活性物質 （すなわち、 リガンド） との結合を阻 する物質や、 結合して生理活性物質 （すなわち、 リガ ンド） と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、 これらレセプターの特異的な アン夕ゴニストまたはァゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用 されてきた。 従って、 このように生体内での生理現象において重要であるばかり でなく、 医薬品開発の標的ともなりうる Gタンパク質共役型レセプタータンパク 質を新規に見出し、 その遺伝子 （例えば cDNA) をクローニングすることは、 新規 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 ァ ンタゴ二ストを見出す際に、 非常に重要な手段となる。
しかし、 Gタンパク質共役型レセプ夕一はその全てが見出されているわけでは なく、 現時点でもなお、 未知の Gタンパク質共役型レセプター、 また上記の
TGR25のようなォ一ファンレセプ夕一が多数存在しており、 新たな Gタンパク質 共役型レセプターの探索および機能解明が切望されている。
Gタンパク質共役型レセプ夕一は、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新た な生理活性物質 （すなわち、 リガンド） の探索、 また、 該レセプターに対するァ ゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。 一方、 生理的なリガンドが 見出されなくても、 該レセプ夕一の不活化実験 （ノックアウト動物） から該レセ プ夕一の生理作用を解析することにより、 該レセプターに対するァゴニストまた はアンタゴニストを作製することも可能である。 これら該レセプ夕一に対するリ ガンド、 ァゴニストまたはアンタゴニストなどは、 Gタンパク質共役型レセプ夕 一の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療薬や診断薬として活用す ることが期待できる。
さらにまた、 Gタンパク質共役型レセプ夕一の遺伝子変異に基づく生体での該 レセプターの機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合も 多い。 この場合には、 該レセプターに対するアン夕ゴニストやァゴニストの投与 だけでなく、 該レセプター遺伝子の生体内 （またはある特定の臓器） への導入や、 該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、 遺伝子治療に応用 することもできる。 この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失や変 異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプターの遺伝子は、 該 レセプ夕一の機能不全に関与する疾患の予防および/または治療薬や診断薬に応 用することもできる。
具体的には、 本発明は TGR25に対するリガンドを決定し、 さらに TGR25とそのリ ガンドの用途を提供することを目的とする。 すなわち本発明は、 リガンドと TGR25との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） またはそ の塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方法 もしくはスクリ一二ング用キットを用いて得られるリガンドと TGR25との結合性 を変化させる化合物 （アンタゴニスト、 ァゴニスト） またはその塩、 およびリガ ンドと TGR25との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） を 含有してなる医薬、 例えば白血球 少症、 白血病、.リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性 大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗 塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリックシンドローム、 血小板 減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫または多臓器不全の予防 ·治療剤などを提供 することを目的とする。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために、 鋭意研究を重ねた結果、 特願 2003-393056 (PCT-JP04-017519) に開示される、 特別な細胞株を必要としない、 リガンドのスクリーニング方法を用いて、 AM251が TGR25のサロゲ一トリガンドで あることを見出した。 さらに、 AM281、 DH97も TGR25のサロゲートリガンドである ことを見出した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに研究を重ねた 結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 ( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部 分ペプチドまたはその塩、 および （2 ) リガンドまたはその塩を用いることを特 徴とする、 該レセプタータンパク質またはその塩と該リガンドまたはその塩との 結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方 法、
〔l a〕 シグナル伝達が、 （1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプター タンパク質、 その部分べ: チドまたはその塩、 および （2) リガンドまたはその 塩との結合による生じるシグナル伝達である上記 〔1〕 記載のスクリーニング方 法、
〔2〕 リガンドが、 式
Figure imgf000007_0001
〔式中、 A r1および A r 2は、 それぞれ置換基を有していてもよいァリール、 R1は、 置換基を有していてもよい炭化水素基、
R2および R3は、 それぞれ水素原子、 または置換基を有していてもよい同素も しくは複素環基を示す〕 で表される化合物またはその塩 〔以下、 化合物 （I) と 略記することもある〕 である上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、
〔3〕 リガンドが、 AM251 〔卜（2， 4-ジクロロフエ二ル)- 5- (4-ョ一ドフエ二 ル)- 4-メチル ピぺリジン-卜ィル- 1H-ピラゾール- 3 -カルボキサミド；卜（2,4 - dichlorophenyl)-5-(4-iodophenyl)-4-methyl-N-piperidin-l-yl-lH-pyrazole- 3-carboxamide) または AM281 〔卜（2， 4-ジクロロフエ二ル)- 5- (4-ョードフ ェニル )-4-メチル -N-モルホリン- 4-ィル- 1H-ピラゾ一ル- 3-力ルポキサミド；卜 (2, 4-dichlorophenyl)-5-(4-iodophenyl)-4-methyl-N-morpholin-4-yl-lH- pyrazole-3-carboxamide) である上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、
〔4〕 リガンドが、 AM251である上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、 〔5〕 リガンドが、 式
Figure imgf000008_0001
〔式中、 環 Aは、 置換基を有していてもよいベンゼン環、
R4および R5は、 それぞれ水素原子、 置換基を有していてもよい炭化水素基、 置換基を有していてもよい複素環基またはァシル、
R6は、 置換基を有していてもよい炭化水素基、
Xは、 一 NR7— （R7は、 水素原子、 置換基を有していてもよい炭化水素基ま たは置換基を有していてもよい複素環基を示す） 、 —O— または — S— を示 す〕 で表される化合物またはその塩 〔以下、 化合物 （II) と略記することもあ る〕 である上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、
〔6〕 リガンドが、 DH97 〔N- [2- (2-ベンジル- 1H -インドール- 3-ィル）ェチ ル]ペンタンアミド； -[2-(2-benzyl-lH-indol-3-yl)ethyl]pentanamide] であ る上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、
〔7〕 (1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部 分ペプチドまたはその塩、 および （2) リガンドまたはその塩と該レセプ夕一夕 ンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いること を特徴とする該レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するァゴニストまたはァ ン夕ゴ二ストのスクリーニング方法、
〔8〕 リガンドが、 AM251、 AM281または DH97である上記 〔7〕 記 載のスクリーニング方法、
[93 (1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部 分ペプチドまたはその塩、 および （2) リガンドまたはその塩を含有することを 特徴とする該レセプ夕一タンパク質またはその塩と該リガンドまたはその塩との 結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用 キッ卜、
〔9 a〕 シグナル伝達が、 （1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプター タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩、 および （2 ) リガンドまたはその 塩との結合【こよる生じるシグナル伝達である上記 〔9〕 記載のスクリーニング用 十ット、
〔1 0〕 リガンドが、 AM 2 5 1、 AM 2 8 1または DH 9 7である上記 〔9〕 記載のスクリーニング用キット、
〔1 1〕 ( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その 部分ペプチドまたはその塩、 および （2 ) リガンドまたはその塩と該レセプタ一 タンパク質またはその塩との結合:性を変化させる化合物またはその塩を含有する ことを特徴とする該レセプ夕一夕ンパク質またはその塩に対するァゴニストまた はアン夕ゴニストのスクリーニング用キット、
〔1 2〕 リガンドが AM 2 5 1、 AM 2 8 1または D H 9 7である上記 〔1 1〕 記載のスクリーニング用キット、
〔1 3〕 リガンドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプ夕一 タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有して なる医薬、 -
〔1 4〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩 に対するリガンドを含有してなる白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性 疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫または多臓器不全の予防 ·治療剤、 〔1 5〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩 に対するァゴニストを含有してなる白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎 症性疾患の予防 ·治療剤、
〔1 6〕 ァゴニストが、 ^合物 （I) または化合物 （I I) である上記 〔1 5〕 記 載の予防 ·治療剤、
〔1 7〕 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩 に対するアンタゴニストを含有してなる白血球増多症の予防 ·治療剤または白血 球賦活剤、
〔1 8〕 リガンドまたはその塩を配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一の Tミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプター夕 ンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、 試験化合物を配列番号： 1で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する Gタン パク質共役型レセプ夕一タンパク質を含有する細胞に接触させた場合における結 合性またはシグナル伝達の変化を比較することを特徴とする該レセプ夕一タンパ ク質またはその塩に対するァゴニストのスクリーニング方法、
〔1 9〕 リガンドまたはその塩の存在下、 試験化合物を配列番号： 1で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する Gタンパク 質共役型レセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場合における結合性 またはシグナル伝達の変化を測定することを特徴とする、 該レセプ夕ータンパク 質またはその塩に対するアン夕ゴニストのスクリーニング方法、
〔2 0〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩を含有してなる白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性 腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病ま たは炎症性疾患の予防 ·治療剤、
〔2 1〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有して なる白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウ マチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎症性疾患の予防 ·治療剤、 〔2 2〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有して なる白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウ マチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂 血症、 動脈硬化症、 メタボリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫または多臓器不全の診断剤、
〔2 3〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク S共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる白血球増多症の予防 ·治療 剤または白血球賦活剤、
〔2 4〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる白血球減少症、 白血病、 リ ンパ腫、.悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾 患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフ ィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタボリ ックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫または多臓器不全 の診断剤、 '
〔2 5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分 ぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な 塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる白血球 増多症の予防 ·治療剤または白血球賦活剤、
〔2 6〕 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプター タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩、 （i i) 上記レセプ夕一タンパク質 またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チド、 （i i i) 上記レセプタータンパク質またはその塩に対するァゴニスト、 ま たは （iv) レセプ夕一夕'ンパク質またはその塩に対するリガンドの有効量を投与 することを特徴とする白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸 炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎症性疾患の 予防 ·治療方法、
〔2 7〕 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的 (こ同一のァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一 タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 (i i) 上記レセプ夕 —夕ンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有する ポリヌクレオチドと相補的な塩 配列またはその一部を含有してなるポリヌクレ ォチド、 または （i i i) 上記レセプタータンパク質またはその塩に対するアン夕 ゴニストの有効量を投与することを特徴とする白血球増多症の予防 ·治療方法ま たは白血球賦活方法、 - 〔2 8〕 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節 リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎症性疾患の予防，治療剤 を製造するための （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩、 （i i) 上記レセプタータンパク質またはその部 分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(i i i) 上記レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するァゴニスト、 または
(iv) レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するリガンドの使用、
〔2 9〕 白血球増多症の予防 ·治療剤または白血球賦活剤を製造するための
(i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプター夕ンパク質、 その部分べプチ ドまたはその塩に対する抗体、 (i i) 上記レセプ夕一タンパク質またはその部分 ぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な 塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、 または （i i i) 上記 レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するアン夕ゴニストの使用、
〔3 0〕 骨髄に存在する幹細胞、 間葉系未分化細胞もしくは幼若造血系細胞の機 能、 または骨髄内造血支持組織中に存在する脂肪細胞もしくは脂肪前駆細胞の機 能を制御することを特徴 する上記 〔1 4〕 記載の医薬、
〔3 1〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部分ぺプ チドまたはその塩の活性、 または上記レセプ夕一タンパク質に対するリガンドの 活性を促進することを特徴とする白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎 症性疾患の予防 ·治療方法、
〔3 2〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部分ぺプ チドまたはその塩の活性、 または上記レセプタータンパク質に対するリガンドの 活性を阻害することを特徴とする白血球増多症の予防 ·治療方法または白血球賦 活方法などを提供する。
以下、 「配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドもしくはその塩」 を 「本 発明の受容体」 または 「本発明の蛋白質」 と略記する場合がある。
さらに、 本発明は、
(i) 標識した G T P r Sの存在下、 本発明のリガンドを本発明の受容体細胞膜 画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体 細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の受容体細胞膜画分への G T Pァ S結合促進活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発 明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ニング方法、
(i i) 本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明 のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合におけ る、 該細胞の細胞内 c AM Pの濃度を測定し、 比較することを特徴とする、 本発 明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング 方法、
(i i i) 本発明のリガンドを、 C R E—レポ一夕一遺伝子べクタ一を導入した本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物 を、 C R E—レポ一夕一遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接 触させた場合における、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較する ことを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる 化合物のスクリーニング方法、
(iv) 本発明のリガンドを、 S R E—レポーター遺伝子ベクターを導入した本発 明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 S R E—レポ一ター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合における、 レポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較すること を特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物のスクリーニング方法、
(V) 本発明のリガンドを、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 標識したァ ラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 ァラ キドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガ ンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
(vi) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発 明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合に おける、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二 ング方法、
(vi i) 標識したイノシトールの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体 発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の 受容体発現細胞に接触させた場合における、 イノシトール三リン酸産生活性を測 定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合 性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
(vi i i) 本発明のリガンドを、 T R E—レポーター遺伝子べクタ一を導入した本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物 を、 T R E—レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接 触させた場合における、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較する ことを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる 化合物のスクリーニング 法、
(ix) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発 明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合に おける、 細胞増殖を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本 発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、 .
(X) 標識したルビジウムの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現 細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容 体発現細胞に接触させた場合における、 標識したルビジウムの流出活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発日月のリガンドと本発明の受容体との結合性を変 化させる化合物のスクリーニング方法、
(xi) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発 明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合に おける、 細胞外の P H変化を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガ ンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
(xi i) -ヒスチジン合成遺伝子を導入した本発明の受容体発現酵母を、 ヒスチジ ン欠乏培地で培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合 物を接触させ、 該酵母の生育を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリ ガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
(xi i i) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体遺伝子 R N A導入アフリカッメガ エル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発 明の受容体遺伝子 R N A導入ァフリカッメガエル卵母細胞に接触させた場合にお ける、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガン ドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法なども 提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト各種組織での TGR25 mRNAの発現分布を示す。
図 2は、 ヒト末梢血多形核白血球における TGR25の mRNAの特異的な高発現を示す 図を示す。
図 3は、 ヒト末梢血多形 白血球に対する AM251の MAPキナーゼ活性化抑制作用を 示す図を示す。
図 4は、 AM251のヒト白血病細胞株である HL- 60に対する好中球様細胞への分化誘 導促進活性を示す図を示す。 破線は無処理細胞、 細い実線は DMS0のみを投与した 細胞、 太い実線は DMS0および AM251を投与した細胞のそれぞれにおける好中球分 化マーカ一である細胞表面抗原 CDl lb/Mac- 1の発現量を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される T G R 2 5は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一タンパク質であ る。
T G R 2 5は、 例えばヒトゃ哺乳動物 （モルモット、 ラッド、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （脾細胞、 神経細胞、 グリア細 胞、 滕臓 β細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 Τ細胞、 Β細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存在する あらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 腸 管、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 特に、 脾臓、 骨髄、 腸管、 単球、 マ クロファージなどの免疫担当臓器と免疫担当細胞に由来するタンパク質であって もよく、 また合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列として, は、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 8 5 %以上、 好ましく は 9 0 %以上、 より好ま くは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列など が挙げられる。 アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI
BLAST (Nat ional Center for Biotechnology Informat ion Bas ic Local
Al ignment Search Tool)を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；マ トリクス =BLOSUM62；フィルタリング = O F F) にて計算することができる。. 本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列からなる T G R 2 5と実質的.に同質の活性を有するタンパク質などが好まし い。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 リガンド結合活性やシグナル 情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、 T G R 2 5としては、 a ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程 度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 b ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜 5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 c ) 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましく は 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または d)それらを組み合わせたアミノ酸配列 を含有するタンパク質なども用いられる。
本明細書における TGR25は、 ペプチド標記の慣例に従って、 左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が 0末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列を含有する TGR 25をはじめとする TGR 25は、 C末 端がカルボキシル基 （一 COOH) 、 カルポキシレート（― C〇〇-)、 アミド
(-CONH2) またはエステル （一 COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの〇卜6アルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフ チルなどの (36_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー CMアルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの a一ナフチルー CMアルキル 基などの C 7— 14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるビバ口ィ ルォキシメチル基などが用いられる。
TGR 25が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキシレート） を有し ている場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発 明の TGR25に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末 端のエステルなどが用いられる。
さらに、 TGR25には、 上記したタンパク質において、 N末端のメチォニン 残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C2_6アルカノィ ル基などの Ct_6ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体内で切断さ れ生成したダル夕ミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側 鎖上の置換基 （例えば、 一 OH、 一 SH、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 インドー ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例 ば、 ホルミル基、 ァセチルなど の C2_6アルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 あるい は糖鎖が結合した.いわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。 本発明の TGR25の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列からなるヒト由来 TGR 25 (WO 200246394) が用いら れる。
TGR 25の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する場合がある） とし ては、 上記した TGR 25の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、 例えば、 TGR25のタンパク質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位で あって、 実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。 具体的にほ、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する TGR 25の部 分ペプチドとしては、 疎水性プロット解析において細胞外領域 （親水性
(Hydrophilic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含 む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分べプチドのァミノ酸の数は、 上記した本発明のレセプタ一夕ンパ ク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 20個以上、 好ましくは 50個以上、 より好ましくは 100個以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましい。 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 85%以上、 好ま しくは約 90%以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配 列を示す。 アミノ酸配列の相同性は、 前記と同様の相同性計算アルゴリズム NC B I BLASTを用い、 同様の条件にて計算することができる。
ここで、 「実質的に同質のレセプ夕一活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実 質的に同質のレセプ夕一活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜20 個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜10個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 (-COOH) 、 カル ボキシレート （― COO— ) 、 アミド （― C〇NH2) またはエステル （一 COO R) の何れであってもよい。 本発明の部分ペプチドが C末端以外に力ルポキシル 基 （またはカルポキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化ま たはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合の エステルとしては、 例えば上記したじ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の部分 プチドには、 上記した T G R 2 5と同様に、 Ν末端の メチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 Ν端側が生体内で切 断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合し たいわゆる糖べプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明の T GR 2 5またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または塩基との 生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が 好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭 化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香 酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のリガンドとしては、 T G R 2 5と特異的に結合する能力を有するもの であれば、 何れの物であってもよい。 例えば、 T GR 2 5との結合の解離定数が 1 0 ζ Μ以下、 好ましくは 2 M以下、 さらに好ましくは 1 M以下、 特に好ま しくは 2 0 0 nM以下、 最も好ましくは 1 0 0 n M以下である物などが挙げられ る。
本発明のリガンドとしては、 例えば、 化合物 （I) 、 化合物 （I I) などが用い られる。
化合物 （I) における A r 1または A r 2で示される 「置換基を有していてもよ ぃァリール」 の 「ァリ一ル」 としては、 例えば C6_ 1 4ァリール （例、 フエニル、 1一ナフチル、 2—ナフチル、 2—ピフエ二リル、 3—ビフエ二リル、 4—ビフ ェニリル、 2—アンスリル、 3—インデニルなど） などが挙げられる。 好ましく はフエニルである。
上記 「置換基を有していてもよいァリール」 の 「置換基」 としては、 例えば、 ハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） 、 （ 3アルキレンジォ キシ （例、 メチレンジォキシ、 エチレンジォキシなど） 、 ニトロ、 シァノ、 ハロ ゲン化されていてもよい アルキル、 ハロゲン化されていてもよい C2_ 6アル ケニル、 カルポキシ C2_ 6アルケニル （例、 2—力ルポキシェテニル、 2—カル ポキシ—2—メチルェテニルなど） 、 ハロゲン化されていてもよい C2 _ 6アルキ ニル、 ハロゲン化されて てもよく、 縮合していてもよい C3 _8シクロアルキル、 C6_ 1 4ァリール （例、 フエニル、 1—ナフチル、 2—ナフチル、 2—ビフエ二リ ル、 3—ビフエ二リル、 4—ビフエ二リル、 2 —アンスリルなど) 、 ハロゲン化 されていてもよい C^— sアルコキシ、 Cい 6アルコキシ一力ルポ二ルー C卜 6アル コキシ （例、 エトキシカルポニルメチルォキシなど） 、 C3 _ 8 シクロアルキル一 ォキシ （例、 シクロプロピルォキシ、 シクロペンチルォキシ、 シクロへキシルォ キシなど） 、 ヒドロキシ、 C6— 1 4ァリールォキシ （例、 フエニルォキシ、 1ーナ フチルォキシ、 2—ナフチルォキシなど） 、 C?^ 6ァラルキルォキシ （例、 ベン ジルォキシ、 フエネチルォキシなど) 、 メルカプト、 ハロゲン化されていてもよ い アルキルチオ、 C6— 1 4ァリールチオ （例、 フエ二ルチオ、 1 一ナフチル チォ、 2—ナフチルチオなど） 、 C7_ 1 6ァラルキルチオ （例、 ベンジルチオ、 フ エネチルチオなど） 、 ァミノ、 ヒドロキシァミノ、 モノー (^ _ 6アルキルアミノ (例、 メチルァミノ、 ェチルァミノなど） 、 モノ一 C6— 1 4ァリールァミノ （例、 フエニルァミノ、 1 一ナフチルァミノ、 2—ナフチルァミノなど） 、 ジー アルキルアミノ (例、 ジメチルァミノ、 ジェチルァミノ、 ェチルメチルァミノな ど） 、 ジ— C6_ 1 4ァリールァミノ （例、 ジフエ二ルァミノなど） 、 ニトロ、 ニト リル、 ホルミル、 カルボキシ、 アルキル一力ルポニル （例、 ァセチル、 プ 口ピオニルなど） 、 C3— 8 シクロアルキル一カルポニル （例、 シクロプロピル力 ルポニル、 シクロペンチルカルポニル、 シクロへキシルカルポニルなど） 、 6アルコキシ—カルポニル （例、 メトキシカルポニル、 エトキシカルポニル、 プ 口ポキシカルボニル、 tert-ブトキシカルボニルなど） 、 C6— 1 4ァリール一カル ポニル （例、 ベンゾィル、 1 一ナフトイル、 2—ナフトイルなど） 、 C7— 1 6ァラ ルキル一力ルポニル （例、 フエ二ルァセチル、 3—フエニルプロピオニルなど） 、 C6 _ 1 4ァリールォキシ一力ルポニル （例、 フエノキシカルポニルなど） 、 C7_ 1 6 ァラルキルォキシ—カルポニル （例、 ベンジルォキシカルポニル、 フエネチルォ キシカルボニルなど） 、 5または 6員複素環カルポニル （例、 ニコチノィル、 ィ ソニコチノィル、 テノィル、 フロイル、 モルホリノ力ルポニル、 チオモルホリノ 力ルポニル、 ピペラジン— 1一^ fルカルポニル、 ピロリジン— 1ーィルカルポ二 ルなど） 、 力ルバモイル、 モノー アルキル一力ルバモイル （例、 メチルカ ルバモイル、 ェチルカルパモイルなど） 、 ジ— アルキル一力ルバモイル
(例、 ジメチルカルバモイル、 ジェチルカルバモイル、 ェチルメチルカルバモイ ルなど） 、 C6— 14ァリール一力ルバモイル （例、 フエ二ルカルバモイル、 1ーナ フヂルカルバモイル、 2—ナフチルカルバモイルなど） 、 C^-eアルコキシ一力 ルバモイル （例、 メトキシカルバモイル、 エトキシカルバモイルなど） 、 5また は 6員複素環力ルバモイル （例、 2—ピリジルカルバモイル、 3—ピリジルカル バモイル、 4一ピリジルカルバモイル、 2—チェ二ルカルバモイル、 3—チェ二 ルカルバモイルなど） 、 スルホ、 C卜 6アルキルスルホニル （例、 メチルスルホ ニル、 ェチルスルホニルなど） 、 （ 6_14ァリールスルホニル （例、 フエニルスル ホニル、 1一ナフチルスルホニル、 2一ナフチルスルホニルなど) 、 ホルミルァ ミノ、 Ci-eアルキル一力ルポニルァミノ （例、 ァセチルァミノなど） 、 C6_14 ァリ一ルーカルボニルァミノ （例、 ベンゾィルァミノ、 ナフトイルァミノなど） 、 アルコキシ—力ルポニルァミノ （例、 メトキシカルボニルァミノ、 ェトキ シカルポニルァミノ、 プロポキシ力ルポニルァミノ、 ブトキシカルボニルァミノ など） 、 （^-6アルキルスルホニルァミノ （例、 メチルスルホニルァミノ、 ェチ ルスルホニルァミノなど） 、 C 14ァリ一ルスルホニルァミノ (例、 フエニルス ルホニルァミノ、 2—ナフチルスルホニルァミノ、 1一ナフチルスルホニルアミ ノなど） 、 CHアルキル—カルポニルォキシ （例、 ァセトキシ、 プロピオニル ォキシなど） 、 C6_14ァリ一ルーカルボニルォキシ （例、 ベンゾィルォキシ、 ナ フチルカルポニルォキシなど） 、 C,_6アルコキシ一力ルポニルォキシ （例、 メ トキシカルポニルォキシ、 エトキシカルポニルォキシ、 プロポキシカルボニルォ キシ、 ブトキシカルポニルォキシなど） 、 モノー Cい 6アルキル一力ルバモイル ォキシ （例、 メチルカルバモイルォキシ、 ェチルカルバモイルォキシなど） 、 ジ 一〇卜6アルキル一力ルバモイルォキシ （例、 ジメチルカルバモイルォキシ、 ジ ェチルカルバモイルォキシなど） 、 C6_1(1ァリ一ルー力ルバモイルォキシ （例、 フエ二ルカルバモイルォキシ、 ナフチルカルバモイルォキシなど） 、 5または 6 員複素環カルボニルォキシ （例、 ニコチノィルォキシ、 イソニコチノィルォキシ など） 、 5ないし 7員飽和環状アミノ （例、 ピロリジン一 1—ィル、 ピペリジノ、 ピぺラジン一 1一ィル、 モルホリノ、 チオモルホリノ、 テトラヒドロアゼピン一 1—ィル、 ホモピペラジシ— 1ーィルなど） 、 5ないし 1 0員芳香族複素環基 (例、 2—チェニル、 3—チェニル、 2—フリル、 3—フリル、 2—ピリジル、 3—ピリジル、 4一ピリジル、 2—キノリル、 3—キノリル、 4一キノリル、 5 一キノリル、 8—キノリル、 1一イソキノリル、 3—イソキノリル、 4—イソキ ノリル、 5 _イソキノリル、 1—インドリル、 2—インドリル、 3—インドリル、 2—べンゾチアゾリル、 2—べンゾ 〔b〕 チェニル、 3—べンゾ 〔b〕 チェニル、 2—ベンゾ 〔b〕 フラエル、 3—ベンゾ 〔b〕 フラニルなど） 、 3ないし 1 0員 非芳香族複素環基 （例、 1ーァゼチジニル、 2—ァゼチジニル、 3—ァゼチジニ ル、 1—ピロリジニル、 2—ピロリジニル、 3—ピロリジニル、 2—イミダゾリ ニル、 4一イミダゾリニル、 2—ピラゾリジニル、 3—ピラゾリジニル、 4ーピ ラゾリジニル、 2―ピぺリジル、 3―ピぺリジル、 4ーピペリジル、 1ーピペラ ジニル、 2—ピペラジニル、 モルホリノ、 チオモルホリノ、 2—才キシラニル、 2—ォキセタニル、 3—才キセタニル、 2—テトラヒドロフラニル、 4ーテトラ ヒドロビラニルなど） 、 ォキソなどが挙げられる。
前記 .「ハロゲン化されていてもよい (^— 6アルキル」 としては、 例えば 1ない し 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ョ ゥ素など） を有していてもよいアルキル （例、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソ プロピル、 ブチル、 イソブチル、 sec-ブチル、 tert-ブチル、 ペンチル、 へキシ ルなどの _ 6アルキルなど） などが挙げられる。 具体例としては、 メチル、 ク 口ロメチル、 ジフルォロメチル、 トリクロロメチル、 トリフルォロメチル、 ェチ ル、 2—ブロモェチル、 2， 2， 2—トリフルォロェチル、 ペン夕フルォロェチ ル、 プロピル、 3 , 3 , 3—トリフルォロプロピル、 イソプロピル、 ブチル、 4， 4 , 4一トリフルォロブチル、 イソブチル、 sec-プチル、 tert-ブチル、 ペンチ ル、 イソペンチル、 ネオペンチル、 5， 5， 5—トリフルォロペンチル、 へキシ ル、 6， 6 , 6—トリフルォ口へキシルなどが挙げられる。 前記 「ハロゲン化されていてもよい C2 _6アルケニル」 としては、 例えば 1な いし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい C2— 6アルケニル （例、 ビニル、 プロべニル、 イソプロぺニル、 2—ブテン— 1 fル、 4—ペンテン一 1一^ Γル、 5—へキセ ンー 1ーィルなど） などが挙げられる。
前記 「ハ ΰゲン化されていてもよい c2_ 6アルキニフレ」 としては、 例えば 1な いし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい C2 _ 6アルキニル （例、 プロパルギル、 2—ブ チン一 1一ィル、 4一ペンチン— 1一^ Γル、 5—へキシン一 1ーィルなど） など が挙げられる。
前記 「ハロゲン化されていてもよく、 縮合していてもよい c3_8シクロアルキ ル」 の 「ハロゲン化されていてもよい c3_8シクロアルキル」 としては、 例えば
1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭 素、 ヨウ素など） を有していてもよい C3_6シクロアルキル （例、 シクロプロピ ル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシルなど） などが挙げられる。 具体例としては、 シクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキ シル、 4 , 4ージクロロシクロへキシル、 2， 2， 3， 3—テトラフルォロシク 口ペンチル、 4一クロロシクロへキシルなどが挙げられる。
前記 .「ハロゲン化されていてもよく、 縮合していてもよい C3 _8シクロアルキ ル」 の 「縮合した C3_ 8シクロアルキル」 としては、 例えば、 8ないし 1 4員の 二環または三環性 C3_ 8シクロアルキル （例、 1ーァダマンチル、 2—了ダマン チル、 デカリン— 1一ィル、 テトラリン— 1一ィル、 9—フルォレニル、 1—ィ ンダニル、 1， 2， 3， 4ーテトラヒドロー 1一ナフチルなど） などが挙げられ る。 また、 該 「縮合した〇3 -8シクロアルキル」 は、 ハロゲン化されていてもよ い。
前記 「ハロゲン化されていてもよい アルコキシ」 としては、 例えば 1な いし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい ^ -sアルコキシ （例、 メトキシ、 エトキシ、 プロポキシ、 イソプロポキシ、 ブトキシ、 イソブトキシ、 sec-ブトキシ、 ペンチ ルォキシ、 へキシルォキシなど） などが挙げられる。 具体例としては、 例えばメ トキシ、 ジフルォロメトキシ、 トリフルォロメトキシ、 エトキシ、 2， 2 , 2— トリフルォロエトキシ、 プロボキシ、 イソプロボキシ、 ブトキシ、 4 , 4， 4一 トリフルォロブトキシ、 イソブトキシ、 sec-ブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシ ルォキシなどが挙げられ 。
前記 「ハロゲン化されていてもよい アルキルチオ」 としては、 例えば 1 ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい — 6アルキルチオ （例、 メチルチオ、 ェチル チォ、 プロピルチオ、 イソプロピルチオ、 ブチルチオ、 sec -プチルチオ、 ter.t - プチルチオなど) などが挙げられる。 具体例としては、 メチルチオ、 ジフルォロ メチルチオ、 卜リフルォロメチルチオ、 ェチルチオ、 プロピルチオ、 イソプロピ ルチオ、 ブチルチオ、 4， 4， 4—トリフルォロブチルチオ、 ペンチルチオ、 へ キシルチオなどが挙げられる。
上記 「ァリール」 は、 例えば上記置換基を、 置換可能な位置に 1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個有していてもよく、 置換基数が 2個以上の場合、 各置換 基は同一または異なっていてもよい。 - 化合物 （I) における R 1で示される 「置換基を有していてもよい炭化水素 基」 の 「炭化水素基」 としては、 例えば、 鎖状または環状炭化水素基 （例、 アル キル、 アルケニル、 アルキニル、 シクロアルキル、 シクロアルケニル、 ァリール、 ァラルキル、 多環式炭化水素基など） などが挙げられる。 このうち、 炭素数 1な いし 1 9個の鎖状または環状炭化水素基などが好ましい。
上記 「アルキル」 としては、 例えば アルキル （例、 メチル、 ェチル、 プ 口ピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 sec-ブチル、 tert-ブチル、 ペン チル、 ネオペンチル、 へキシルなど） などが挙げられる。
上記 「ァルケニル」 としては、 例えば C 2 _ 6アルケニル （例、 ビニル、 ァリル、 イソプロぺニル、 1—ブテニル、 2—ブテニル、 3—プテニル、 2—メチル—2 —プロべニル、 1ーメチルー 2—プロぺニル、 2 _メチル— 1—プロぺニルな ど） などが挙げられる。
上記 「アルキニル」 としては、 例えば C2 _ 6アルキニル （例、 ェチニル、 プ 口パルギル、 1ーブチニル、 2—ブチニル、 3—ブチニル、 1一へキシニルな ど） などが挙げられる。
上記 「シクロアルキル」 としては、 例えば C3 _ 6シクロアルキル （例、 シクロ プロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシルなど） などが挙げら れる。
上記 「シクロアルケニル」 としては、 例えば C5 _ 6シクロアルケニル （例、 1 —シクロペンテニル、 3—シクロペンテニル、 4—シクロペンテニル、 1—シク 口へキセニル、 3—シクロへキセニル、 4—シクロへキセニルなど） などが挙げ られる。 . - 上記 「ァリ一ル」 としては、 例えば < 6_ 1 4ァリール （例、 フエニル、 1—ナフ チル、 2—ナフチル、 2—ビフエ二リル、 3—ビフエ二リル、 4ービフエ二リル、 2—アンスリル、 3—インデニルなど） などが挙げられる。
上記 「ァラルキル」 としては、 例えば C7_ 1 9ァラルキル （例、 ベンジル、 フエ ネチル、 ジフエニルメチル、 トリチル、 1一ナフチルメチル、 2—ナフチルメチ ル、 2 , 2—ジフエニルェチル、 3—フエニルプロピル、 4一フエニルブチル、 5—フエ二ルペンチル、 9一フルォレニルなど） などが挙げられる。 .
上記 「多環式炭化水素基」 としては、 例えば 2ないし 4環性非芳香族炭化水素 基 （例、 1—ァダマンチル、 2—ァダマンチル、 デカリン一 1一ィル、 テトラリ ンー 1一ィル、 インダン一 1 _ィル、 アンドロスタン一 3—ィル、 5—アンド口 ステン一 3—ィルなど） などが挙げられる。
上記 「置換基を有していてもよい炭化水素基」 の 「置換基」 としては、 例えば、 上記 A r 1で示される 「置換基を有していてもよいァリール」 の 「置換基」 が挙 げられる。 上記 「炭化水素基」 は、 例えば上記置換基を、 置換可能な位置に 1な いし 5個、 好ましくは 1ないし 3個有していてもよく、 置換基数が 2個以上の場 合、 各置換基は同一または異なっていてもよい。
化合物 （I) における R 2または R 3で示される 「置換基を有していてもよい同 素または複素環基」 の 「同素または複素環基」 としては、 例えば、 3ないし 1 4 員 （好ましくは 5ないし 7員） 同素または複素環基などが挙げられる。
「3ないし 1 4員同素環基」 としては、 例えば C3_ シクロアルキル （例、 シ クロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシルなど） 、 C3_14 シクロアルケニル （例、 例、 1ーシクロペンテニル、 3—シクロペンテニル、 4 ーシクロペンテニル、 1ーシクロへキセニル、 3—シクロへキセニル、 4ーシク 口へキセニルなど） 、 C6_ ァリ一ル （例、 フエニル、 1一ナフチル、 2—ナフ チル、 2—ビフエ二リル、' 3—ビフエ二リル、 4ービフエ二リル、 2—アンスリ ル、 3—インデニルなど） などが挙げられる。
「3ないし 1 4員複素環基」 としては、 例えば、 炭素原子以外に窒素原子、 硫 黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、 1ないし 4個のへテロ原子を 含む 5ないし 1 4員 （単環、 2環または 3環式） 複素環、 好ましくは （i) 5な いし 1 4員 （好ましくは 5ないし 1 0員） 芳香族複素環、 （i i) 3ないし 1 4員 非芳香族複素環または （i i i) 7ないし 1 0員複素架橋環から任意の 1個の水素 原子を除いてできる 1価基などが挙げられる。
上記 「5ないし 1 4員 （好ましくは 5ないし 1 Q員） の芳香族複素環」 として は、 例えば、 チォフェン、 ベンゾ 〔b〕 チォフェン、 ベンゾ 〔b〕 フラン、 ベン ズイミダゾ一ル、 ベンズォキサゾール、 ベンゾチアゾ一ル、 ベンズイソチアゾ一 ル、 1 H—べンゾトリァゾ一ル、 ナフト 〔2 , 3 _ b〕 チォフェン、 フラン、 ピ ロール、 イミダゾール、 ピラゾール、 ォキサゾール、 1 , 2， 3—トリァゾール、 1 , 2 , 4—トリァゾール、 テトラゾール、 1， 3 , 4—チアジアゾ一ル、 1， 3 , 4一ォキサジァゾ一ル、 ピリジン、 ピラジン、 ピリミジン、 ピリダジン、 ィ ンドール、 イソインドール、 1 H—インダゾ一ル、 プリン、 4 H—キノリジン、 イソキノリン、 キノリン、 フタラジン、 ナフチリジン、 キノキサリン、 キナゾリ ン、 シンノリン、 カルバゾール、 ]3—力ルポリン、 フエナントリジン、 ァクリジ ン、 フエナジン、 チアゾール、 イソチアゾ一ル、 フエノチアジン、 イソォキサゾ ール、 フラザン、 フエノキサジンなどの芳香族複素環、 またはこれらの環 （好ま しくは単環） が 1ないし複数個 （好ましくは 1または 2個） の芳香環 （例、 ベン ゼン環、 ピリジン環、 イミダゾール環等） と縮合して形成された環などが挙げら れる。
上記 「3ないし 1 4員非芳香族複素環」 としては、 例えば、 ォキシラン、 ォキ セタン、 テトラヒドロフラン、 ジヒドロフラン、 ピラン、 ジォキゾラン、 ジォキ サン、 ァゼチジン、 ピロリジン、 イミダゾリン、 ピラゾリジン、 ピラゾリン、 ピ ペリジン、 ピぺラジン、 モルホリン、 チオモルホリン、 チアゾリジン、 ォキサゾ リジン、 ォキサジァゾリン、.チアジアゾリン、 トリァゾリン、 1 , 4—ジァゼパ ン、 1 , 4—ォキサゼパン、 1 , 4一チアゼパン、 および上記芳香族複素環の還 元体または部分還元体 （¼、 1， 2 , 3， 4—テトラヒドロキノリン、 1， 2， 3， 4—テトラヒドロイソキノリン、 インドリンなど） などが挙げられる。
上記 「 7ないし 1 0員複素架橋環」 としては、 例えば、 キヌクリジン、 7—ァ ザビシクロ 〔2 . 2 . 1〕 ヘプタンなどが挙げられる。
該 「複素環基」 として好ましくは、 炭素原子以^ こ窒素原子、 硫黄原子および 酸素原子から選ばれる 1または 2種、 好ましくは、 1ないし 4個のへテロ原子を 含む 5ないし 1 4員 （好ましくは 5ないし 1 0員） の （単環または 2環式） 複素 環基である。 具体的には、 例えば 2—チェニル、 3—チェニル、 2—フリル、 3 一フリル、 2 _ピリジル、 3—ピリジル、 4—ピリジル、 2—キノリル、 3—キ ノリル、 4—キノリル、 5—キノリル、 8—キノリル、 1一イソキノリル、 3— イソキノリル、 4一イソキノリル、 5 _イソキノリル、 ピラジニル、 2—ピリミ ジニル、 4—ピリミジニル、 1一ピロリル、 3 _ピロリル、 1一イミダゾリル、 2—イミダゾリル、 3—ピリダジニル、 2—チアゾリル、 2—ォキサゾリル、 3 —イソチアゾリル、 3—イソォキサゾリル、 1—インドリル、 2—インドリル、 3一^ Γンドリル、 2—べンゾチアゾリル、 2—べンゾ 〔b〕 チェニル、 3—ベン ゾ 〔b〕 チェニル、 2—ベンゾ 〔b〕 フラニル、 3—ベンゾ 〔b〕 フラニルなど の芳香族複素環基、 例えば 1—ピロリジニル、 2—ピロリジニル、 3—ピロリジ ニル、 2—イミダゾリニル、 4一イミダゾリニル、 2—ピラゾリジニル、 3—ピ ラゾリジニル、 4—ビラゾリジニル、 ピペリジノ、 2—ピペリジル、 3—ピペリ ジル、 4—ピペリジル、 1—ピペラジニル、 2—ピペラジニル、 モルホリノ、 チ オモルホリノなどの非芳香族複素環基などである。
上記 「置換基を有していてもよい同素または複素環基」 の 「置換基」 としては、 例えば、 上記 A r 1で示される 「置換基を有していてもよいァリール」 の 「置換 基」 が挙げられる。 上記 「同素もしくは複素環基」 は、 例えば上記置換基を、 置 換可能な位置に 1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個有していてもよく、 置換 基数が 2個以上の場合、 各置換基は同一または異なっていてもよい。
A r 1として好ましくは、 置換基を有していてもよいフエニル、 さらに好まし くはハ口ゲン原子 1ないし 3個を有するフエニルなどである。
A r 2として好ましくは、 置換基を有していてもよいフエニル、 さらに好まし くはハロゲン原子 1ないじ 3個を有するフエニルなどである。
R 1として好ましくは、 置換基を有していてもよいアルキル、 さらに好ましく は アルキルなどである。
R 2および R 3として好ましくは、 一方が水素原子、 他方が置換基を有してい てもよい 5ないし 7員複素環基である。 さらに好ましくは、 一方が水素原子、.他 方が置換基を有していてもよい 5ないし 7員非芳香族複素環基 （例、 1一ピロリ ジニル、 2—ピロリジニル、 3—ピロリジニル、 2—イミダゾリニル、 4一イミ ダゾリニル、 2—ビラゾリジニル、 3—ピラゾリジニル、 4ーピラゾリジニル、 ピぺリジノ、 2—ピぺリジル、 3—ピペリジル、 4 -ピぺリジル、 1—ピペラジ ニル、 2—ピペラジニル、 モルホリノ、 チオモルホリノなど） である。
化合物 （I) の具体例としては、
A r 1が、 ハロゲン原子 1ないし 3個を有するフエニル、
A r 2がハロゲン原子 1ないし 3個を有するフエニル、
！^がじ^ァルキル、
R 2およ-び R 3として好ましくは、 一方が水素原子、 他方が 6員非芳香族複素環 基である化合物などが挙げられる。
なかでも好ましくは、 AM 2 5 1 〔卜（2， 4-ジクロロフエ二ル) - 5- (4-ョードフ ェニル ) -4-メチル -N-ピぺリジン- 1-ィル- 1H-ピラゾール -3-力ルポキサミド〕 、 AM 2 8 1 〔1- (2, 4 -ジクロ口フエ二ル） -5- (4-ョードフエニル) -4-メチル -N -モ ルホリン- 4-ィル- 1H-ピラゾール- 3-力ルポキサミド〕 などが挙げられる。
化合物 （Π) における環 Aで示される 「置換基を有していてもよいベンゼン 環」 の 「置換基」 としては、 例えば、 上記 A r 1で示される 「置換基を有してい てもよぃァリール」 の 「置換基」 が挙げられる。 上記 「炭化水素基」 は、 例えば 上記置換基を、 置換可能な位置に 1ないし 4個、 好ましくは 1ないし 3個有して いてもよく、 置換基数が 2個以上の場合、 各置換基は同一または異なっていても よい。
化合物 （I I) における R 4または R 5で示される 「置換基を有していてもよい 炭化水素基」 としては、 例えば、 上記 R 1で示される 「置換基を有していてもよ い炭化水素基」 と同様のものが挙げられる。
化合物 （Π) における R 4または R 5で示される 「置換基を有していてもよい 複素環基」 め 「複素環基」 としては、 例えば、 例えば、 炭素原子以外に窒素原子、 硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、 1ないし 4個のへテロ原子 を含む 5ないし 1 4員 （単環、 2環または 3環式） 複素環、 好ましくは （i) 5 ないし 1 4員 （好ましくは 5ないし 1 0員） 芳香族複素環、 （i i) 3ないし 1 4 員非芳香族複素環または （i i i) 7ないし 1 0員複素架橋環から任意の 1個の水 素原子を除いてできる 1価基などが挙げられる。
上記 「5ないし 1 4員 （好ましくは 5ないし 1 0員） の芳香族複素環」 として は、 例えば、 チォフェン、 ベンゾ.〔b〕 チォフェン、 ベンゾ 〔b〕 フラン、 ベン ズイミダゾール、 ベンズォキサゾール、 ベンゾチアゾール、 ベンズイソチアゾー ル、 1 H—べンゾトリァゾ一ル、 ナフト 〔2， 3— b〕 チォフェン、 フラン、 ピ ロール、 イミダゾ一ル、 ピラゾール、 ォキサゾ一ル、 1 , 2， 3—トリァゾ一ル、 1， 2 , 4一トリァゾ一ル、 テトラゾール、 1， 3， 4—チアジアゾール、 1 , 3 , 4—ォキサジァゾール、 ピリジン、 ピラジン、 ピリミジン、 ピリダジン、 ィ ンドール、 イソインド一ル、 1 H—インダゾール、 プリン、 4 H—キノリジン、 イソキノリン、 キノリン、 フタラジン、 ナフチリジン、 キノキサリン、 キナゾリ ン、 シンノリン、 カルバゾール、 ]8—力ルポリン、 フエナントリジン、 ァクリジ ン、 フエナジン、 チア、 ール、 イソチアゾール、 フエノチアジン、 イソォキサゾ ール、 フラザン、 フエノキサジンなどの芳香族複素環、 またはこれらの環 （好ま しくは単環） が 1ないし複数個 （好ましくは 1または 2個） の芳香環 （例、 ベン ゼン環、 ピリジン環、 イミダゾ一ル環等） と縮合して形成された環などが挙げら れる。
上記 「3ないし 1 4員非芳香族複素環」 としては、 例えば、 ォキシラン、 ォキ セタン、 テトラヒドロフラン、 ジヒドロフラン、 ピラン、 ジォキソラン、 ジォキ サン、 ァゼチジン、 ピロリジン、 イミダゾリン、 ピラゾリジン、 ピラゾリン、 ピ ペリジン、 ピぺラジン、 モルホリン、 チオモルホリン、 チアゾリジン、 ォキサゾ リジン、 ォキサジァゾリン、 チアジアゾリン、 トリァゾリン、 1 , 4—ジァゼパ ン、 1 , 4一才キサゼパン、 1， 4一チアゼパン、 および上記芳香族複素環の還 元体または部分還元体 （例、 1 , 2 , 3 , 4—テトラヒドロキノリン、 1， 2， 3， 4—テトラヒドロイシキノリン、 インドリンなど） などが挙げられる。
上記 「7ないし 1 0員複素架橋環」 としては、 例えば、 キヌクリジン、 7—ァ ザビシクロ 〔2 . 2 . 1〕 ヘプタンなどが挙げられる。
該 「複素環基」 として好ましくは、 炭素原子以外に窒素原子、 硫黄原子および 酸素原子から選ばれる 1または 2種、 好ましくは、 1ないし 4個のへテロ原子を 含む 5ないし 1 4員 （好ましくは 5ないし 1 0員） の （単環または 2環式） 複素 環基である。 具体的には、 例えば 2—チェニル、 3—チェニル、 2—フリル、 3 —フリル、 2—ピリジル、 3—ピリジル、 4一ピリジル、 2—キノリル、 3—キ ノリル、 4一キノリル、 5—キノリル、 8—キノリル、 1一イソキノリル、 3— イソキノリル、 4—イソキノリル、 5—イソキノリル、 ピラジニル、 2—ピリミ ジニル、 4一ピリミジニル、 1一ピロリル、 3—ピロリル、 1一イミダゾリル、
2—イミダゾリル、 3—ピリダジニル、 2—チアゾリル、 2—ォキサゾリル、 3 —イソチアゾリル、 3—イソォキサゾリル、 1一インドリル、 2—インドリル、
3—インドリル、 2—べンゾチアゾリル、 2 _ベンゾ 〔b〕 チェニル、 3—ベン ゾ 〔b〕.チェニル、 2—ベンゾ 〔b〕 フラニル、 3—べンゾ 〔b〕 フラニルなど の芳香族複素環基、 例えば 1一ピロリジニル、 2—ピロリジニル、 3—ピロリジ ニル、 2—イミダゾリニル、 4一^ Γミダゾリニル、 2—ビラゾリジニル、 3—ピ ラゾリジニル、 4一ビラゾリジニル、 ピペリジノ、 2—ピペリジル、 3—ピペリ ジル、 4ーピペリジル、 1ーピペラジニル、 2—ピペラジニル、 モルホリノ、 チ オモルホリノなどの非芳香族複素環基などである。
上記 「置換基を有していてもよい複素環基」 の 「置換基」 としては、 例えば、 上記 A r 1で示される 「置換基を有していてもよいァリ一ル」 の 「置換基」 が挙 げられる。 上記 「複素環基」 は、 例えば上記置換基を、 置換可能な位置に 1ない し 5個、 好ましくは 1ないし 3個有していてもよく、 置換基数が 2個以上の場合、 各置換基は同一または異なっていてもよい。 化合物 （Π) における R4または R5で示される 「ァシル」 としては、 例えば、 式 —（C =〇）一OR7、 一（C =〇）一 R8、 一（C =〇）— NR8 R9、 一（C = S)-NR8 R9 、 -SO-R7 、 一S〇2— R7 または — S〇2— NR8 R9 〔式中、 R7は置換基を有していてもよい炭化水素基、 または置換基を有してい てもよい複素環基； R8ほ水素原子、 置換基を有していてもよい炭化水素基、 ま たは置換基を有していてもよい複素環基； R9 は水素原子、 置換基を有していて もよい炭化水素基または置換基を有していてもよい複素環基を示し、 NR8 R9 は環状ァミノであってもよい〕 で表される基などが挙げられる。
R7 、 R8 または R9で示される 「置換基を有していてもよい炭化水素基」 .と しては、 上記 R1で示される 「置換基を有していてもよい炭化水素基」 などが挙 げられる。
R7 、 R8 または R9で示される 「置換基を有していてもよい複素環基」 とし ては、 上記 R4または R5で示される 「置換基を有していてもよい複素環基」 な どが挙げられる。
NR8 R9で示される 「環状ァミノ」 としては、 例えば、 1個の窒素原子と炭 素原子以外に、 窒素原子、 硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、 1ないし 4個のへテロ原子を含んでいてもよい 5ないし 7員飽和環状ァミノが挙 げられ、 具体例としては、 ピロリジン一 1一ィル、 ピベリジノ'、 ピぺラジン一 1 ーィル、.モルホリノ、 チオモルホリノ、 テトラヒドロアゼピン一 1一ィル、 ホモ ピぺラジン— 1ーィルなどが挙げられる。
化合物 （II) における R6で示される 「置換基を有していてもよい炭化水素 基」 としては、 上記 R1で示される 「置換基を有していてもよい炭化水素基」 な どが挙げられる。
化合物 （Π) における R7で示される 「置換基を有していてもよい炭化水素 基」 としては、 上記 R1で示される 「置換基を有していてもよい炭化水素基」 な どが挙げられる。
化合物 （II) における R7で示される 「置換基を有していてもよい複素環基」 としては、 上記 R4または R5で示される 「置換基を有していてもよい複素環 基」 などが挙げられる。 環 Aとして好ましくは、 無置換のベンゼン環などである。
R 4および R 5として好ましくは、 一方が水素原子で、 他方がァシルなどであ る。 さらに好ましくは、 一方が水素原子で、 他方が C 8アルキル—力ルポニルな どである。
R 6として好ましくは、 '置換基を有していてもよい C7_ 1 9ァラルキルなどであ る。 さらに好ましくはべンジルなどである。
Xとして好ましくは、 一 N R 7—である。 R 7として好ましくは、 水素原子で ある。
化合物 （I I) の具体例としては、
環 Aが、 無置換のベンゼン環、
R 4および R 5の一方が水素原子で、 他方が < 卜8アルキル一力ルポニル、
R 6が置換基を有していてもよいベンジル、
Xがー N R 7 -、
R 7が水素原子である化合物などが挙げられる。
なかでも好ましくは、 D H 9 7 〔N- [2- (2-ベンジル- 1H-インド一ル- 3-ィゾレ）ェ チル]ペンタンアミド〕 などである。
式 （I) または （I I) で表される化合物の塩としては、 例えば金属塩、 アンモ ニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性ァ ミノ酸との塩などが挙げられる。 金属塩の好適な例としては、 例えばナトリウム 塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウ ム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。 有機塩基と の塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジ ン、 ピコリン、 2 , 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 ト リエタノールアミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N， N 'ージベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸との塩の好適 な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げ られる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢 酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸な どとの塩が挙げられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアル ギニン、 リジン、 オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適 な例としては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。 このうち、 薬学的に許容し得る塩が好ましい。 例えば、 化合物内に酸性官能基 を有する場合にはアル力 ΰ金属塩 （例、 ナトリウム塩， カリウム塩など） 、 アル カリ土類金属塩 （例、 カルシウム塩， マグネシウム塩， バリウム塩など） などの 無機塩、 アンモニゥム塩など、 また、 化合物内に塩基性官能基を有する場合には、 例えば臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸など無機酸との塩、 または酢酸、 フ夕ル 酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 メタンス ルホン酸、 ρ _トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
標識された化合物 （I) および （Π) も、 本発明のリガンドとして、 スクリ一 ニングに用いることができる。
標識物質としては、 放射性同 ί立元素 （例、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔"c〕 、 C32P] 、 〔33P〕 、 〔3 〕 など） 、 蛍光物質 〔例、 シァニン蛍光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス社製） など） 、 フルォレス カミン、 フルォレツセンイソチオシァネート、 NBD (7-ni trobenz-2-oxa-l, 3- diazol)など〕 、 酵素 （例、 β—ガラクトシダーゼ、 )3—ダルコシダ一ゼ、 アル カリフォスファターゼ、 パーォキシダ一ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素など） 、 発光物 質 （例、.ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなど） 、 ビ ォチン、 ランタニド元素などがあげられる。 中でも、 放射性同位元素 〔¾〕 、 〔14C〕 、 〔l25I〕 が好ましい。
本発明のリガンド、 例えば化合物 （I) 、 化合物 （I I) などは、 市販されてい る場合には市販品をそのまま用いることもでき、 自体公知の方法またはこれらに 準じた方法に従って製造または抽出することもできる。
本発明の T G R 2 5またはその塩は、 上記したヒトゃ哺乳動物の細胞または組 織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造することもできるし、 後に記載する本発明の T G R 2 5をコードする D NAを含有する形質転換体を培 養することによつても製造することができる。 また、 後に記載するタンパク質合 成法またはこれに準じて製造することもできる。 ヒトゃ哺乳動物の組織または細 胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマ トグラフィ一などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離する ことができる。
本発明の T G R 2 5も tくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド 体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのよ うな樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズ ヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコー ル樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメ チルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 ( 2， ， 4 ' ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 ( 2 ' ， 4 ' ージメトキシフエニル— F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂な どを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基を 適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 公知の各種縮 合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出 すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合 形成反応を実施し、 目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N， ージイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ルー N ' ― ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活 性化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン、 ジォキサン、 テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形'成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0〜 5 0 の範囲から適宜選択される。 活性化されたアミ ノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテ ス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰 り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な 縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反 応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャリーペンチ ルォキシカルポニル、 ィソポルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルポニル、 C 1— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 夕ーシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステ ル、 4—ニトロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4—クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルボニルヒドラジド化、 夕一シャリーブトキシカルポニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラニル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz し C 12- Bz l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 夕一シャリ一プチルなどが用いられる。 ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキシ —2， 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum, Bo c、 Tr i；、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2， 4, 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフ夕ルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。
原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミド が用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0〜4 Ot:の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フ エノ一ル、 チオア二ソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフ イド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのようなカチ オン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として 用いられる 2, 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2 —エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチォ一ルなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 力ルポキシ末 端アミノ酸のひ一カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を^望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端の α —ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端の力ルポキシル基の保護基 のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質は既知の各種精製手 段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド 体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の 一 力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることがで さる。
本発明の T G R 2 5の部分ペプチドまたはその塩は、 公知のペプチドの合成法 に従って、 あるいは本発明の T G R 2 5を適当なぺプチダ一ゼで切断することに よって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の T G R 2 5を構成し得 る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有 する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の a) 〜e) に記載された 方法が挙げられる。
a) M. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t i、 ペプチド シンセシス （Pept ide
Synthes i s) , Iniersc i ence Publ ishers, New York (1966 ;
b) Schroederおよび Luebke、 ザペプチド（The Pept ide) , Academi c Press, New York (1965年）
c) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年） d) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
e) 矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグ フィ一 ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で 得られた場合は、 公知の方法によつて遊離体に変換することができる。
本発明の TGR25をコードするポリヌクレオチドとしては、 上記した本発明 の TGR 25をコードする塩基配列 （DNAまたは RNA、 好ましくは DNA) を含有するものであ tlばいかなるものであってもよい。 該ポリヌクレオチドとし ては、 本発明の TGR 25をコードする DNA、 mRN A等の RN Aであり、 二 本鎖であっても、 一本鎖であって.もよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本 鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリッドでもよい。 一本鎖の場合は、 セン ス鎖 （すなわち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （すなわち、 非コード 鎖） であってもよい。 ―
本発明の TGR25をコードするポリヌクレオチドを用いて、 例えば、 公知の 実験医学増刊 「新 PCRとその応用」 15 (7) 、 1997記載の方法またはそ れに準じた方法により、 本発明の TGR 25の mRNAを定量することができる。 本発明の TGR25をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノム DN Aライブラリー、 上記した細胞 ·組織由来の cDNA、 上記した細胞 ·組織由来 の cDNAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用す るべクタ一は、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなど いずれであってもよい。 また、 上記した細胞 ·組織より全 RNAまたは mRNA 画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— P C R法と略称する） によって増幅することもできる。 具体的には、 本発明のヒト TGR25をコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で表 わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配 列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列からなるヒト TGR25と実 質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有す るレセプタータンパク質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で ¾わされる塩基配列と約 85%以上、 好ましくは約 9 0%以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。 塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local
Alignment Search Tool)を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；フ ィル夕リング =0N；マッチスコア =1；ミスマッチスコア =-3) にて計算するこ とができる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クローニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと ができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジエンドな 条件に従って行なうことができる。 該 Λイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 19〜 40 mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜70°C、 好ましくは約 60〜65°Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度 が約 19 mMで温度が約 65 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列からなるヒト TGR 25をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列からなる DN Aなどが用いられる。
また、 本発明の TGR 25をコードする DNAの塩基配列の一部、 または該 D NAと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記の本 発明の部分べプチドをコ一ドする D N Aを包含するだけではなく、 R N Aをも包 含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 TGR25遺伝子の複製または発現を阻害することのできる アンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 ローン化した、 あるいは決定され た TGR25をコードする DNAの塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド （核酸） は、 TGR25遺伝子の RNAとハイブリダ ィズすることができ、 該 RN Aの合成または機能を阻害することができるか、 あ るいは TGR25関連 RNAとの相互作用を介して TGR25遺伝子の発現を調 節'制御することができ ¾。 TGR25関連 RNAの選択された配列に相補的な ポリヌクレオチド、 および TGR25関連 RN Aと特異的にハイブリダィズする ことができるポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で TGR 25遺伝子の発 現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用であ る。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸 の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオ チド、 塩基配列または核酸とペプチド （タンパク質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるべプチ ド （タンパク質） のアミノ酸を通常指している。 TGR25遺伝子の 5' 端ヘア ピンループ、 5' 端 6—ベ一スペア 'リピート、 5' 端非翻訳領域、 ポリべプチ ド翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 翻訳終止コドン、 3' 端非翻訳領域、 3' 端パリンドローム領域、 および 3' 端ヘアピンループは好ましい対象領域と して選択しうるが、 TGR25遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダィズすることが できるポリヌクレオチドとの関係は、 対象物と、 「アンチセンス」 であるという ことができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2—デォキシ一D—リポース を含有しているポリデォキシリポヌクレオチド、 D—リポ一スを含有しているポ リリポヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその 他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他の ポリマー （例えば、 市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマ 一） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （伹し、 該ポリマーは DN A や RNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を もつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 DNA、 1 本鎖 DNA、 2本鎖 RNA、 1本鎖 RNA、 さらに DNA： RNAハイブリッド であることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレ ォチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標 識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然の ヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホ ルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含 有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えばタンパク質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ*インヒビ夕一、 トキシン、 抗 体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライ ドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インタ一カレ一ト化合物 （例えば、.ァ クリジン、 ソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活 性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含 有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 ァノマー型の核酸など） で あってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環 型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化された プリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはそ の他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾され たヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基 がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミン などの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 あるい は修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては 核酸の硫黄誘導体ゃチ ホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃ オリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計 されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 ァ ンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性 をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性を より小さなものにする。 こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8， pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T.
Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リポゾ一ム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチォン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ —ト、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3' 端あるいは 5' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付 着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3' 端あるいは 5' 端に 特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 RNa.s eなどの ヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ 用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグ リコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは Gタンパク質共役型レセプタ一夕ンパク質の生体内 や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 詼核酸は公知の各種の方法で細 胞に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 上記した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ い。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 上記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 上記した細胞'組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのい ずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファ一ジ、 ブラ スミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細 胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— P C R法と略称する） によって増幅 することもできる。
具体的には、 本発明の都分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、
(1) 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有す る DNA、 または （2) 配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列からなる TGR25と実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプタータンパク質をコードする DNA の部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2で表わされる塩基配列ハイブリダィズできる DNAとしては、 例 えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 85%以上、 好ましくは約 90% 以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNA などが用いられる。
塩基配列の相同性は、 前記した相同性計算アルゴリズム NCB I BLAST を用い、 同様の条件にて計算することができる。
ハイプリダイゼーションの方法および条件は前記と同様である。
本発明の TGR 25またはその部分ペプチド （以下、 本発明の TGR25と略 記する場合がある） を完全にコードする DN Aのクロ一ニングの手段としては、 本発明の TGR25の部分塩基配列を有する合成 DNAプライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明の TGR 25の一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合成 DNAを 用いて標識したものとのハイブリダイゼ一シヨンによつて選別することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー 'クローニング
(Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ イブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこと ができる。 DNAの塩基配列の置換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mu t an™— s u e r Exp r e s s Km (宝酒造 （株） ） 、 Mu t a n™-K (宝酒造 (株） ） などを用いて、 ODA— LA PCR法、 Gapp e d dup l e x法、 Kunke 1法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうこ とができる。
クロ一ン化された TGR 25をコードする DNAは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することが できる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 ま た 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有,して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダブ夕一を用いて付加することもできる。
本発明の TGR 25の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明の TGR25を コードする DNAから目的とす ¾DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現ベクター中のプロモータ一の下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322、 .pBR32 5、 pUC 12、 pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110、 pTP 5、 p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH19、 p SH 15) 、 λファ.ージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 pXTl、 pR c/CMV、 pRc/RSV、 p cDNA iZNe oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモ一ターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。 これらのうち、 CMVプロモーター、 SRひプロモーターなどを用いるのが好ま しい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロ モーター、 r e cAプロモーター、 λ PLプロモーター、 1 p ρプロモ一夕一な どが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 SP〇2プロ モ一夕一、 p e nPプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロ モーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなど が好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモー夕一、 P 10 プロモ一ターなどが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne ofと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 CH〇 (dh f r") 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マーカ一として 使用する場合、 目的遺伝子をチミジン不含培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプタータン パク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 Pho A ·シグナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である 場合は、 ひ一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インターフ ェロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 このようにして構築された本発明の TGR 25をコードする DNAを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ
(Escherichia coli) K 12 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 巻， 160(1968)〕 ， JM103 [Nucleic Acids Research, 9巻， 309 (1981)〕 ， J A221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517(1978)3， HB 101
[Journal of Molecular Biology, 41卷， 459(1969)〕 , C 600 [Genetics, 39 巻， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus
subtilis) M I 114 〔Gene， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207-21 [Journal of Bioc emis t ry, 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、'サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH 22 R", NA87 - 11 A, DKD— 5D， 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NC YC 1913, NCYC2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) K M71などが用いられる。
. 昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが AcNPVの場合は、 ョトウガの幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、. Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細 胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 In Vivo, 13, 213- 217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 巻，592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7 (COS 7) , Ve r o， チ ャィニーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO細胞と略記） ， dh i r遺伝子 欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r") 細胞と略 記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエ口一マ細胞， ラット GH 3, ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従つて行なうこ とができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。 酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182- , .187 (1991)、 Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA, 75卷， 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology， 6, 47- 55 (1988) などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Vi rol ogy, 52巻， 456 (1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。
このようにして、 受容体または部分ペプチドをコードする D NAを含有する発 現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添 加してもよい。 培地の p Hは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 [Mi l l er, Journal of Exper iment s in Mo lecul ar
Genet i cs, 431-433, Co ld Spr ing Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好まし い。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 β— インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜4 3 °Cで約 3〜2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー (Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5 %カザミノ酸を含有する S D培地 [Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81巻， 5330(1984)〕 があげられる。 培地の pH は約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20°C〜35°Cで約 24〜7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C.C., Nature, 195, 788(1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜5日間行 ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 122巻， 501 (1952)〕 , DME M培地 [Virology, 8巻， 396(1959)〕 , RPMI 1640培地 〔The Journal of the American Medical Association 199巻， 519(1967)〕 , 199培地
[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73巻， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約.30°C〜4 0°Cで約 15〜60時間行な.い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の TG R 25を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の TGR 25を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明の TGR25を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの ち、 遠心分離やろ過により TGR25の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X ― 100™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に TGR25が分 泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離 し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上？！、 あるいは抽出液中に含まれる TGR 25の 精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これら の公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィ 一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特 異的新和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水性の差 を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用い られる。
このようにして得られる TGR 25が遊離体で得られた場合には、 公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた 場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変 換することができる。
なお、 組換え体が産生する TGR 25を、.精製前または精製後に適当なタンパ ク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプ シン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明の TGR25の活性は、 標識したリガンド （リ ガンドペプチド） との結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセ ィなどにより測定することができる。
本発明の TGR 25に対する抗体は、 本発明の TGR 25を認識し得る抗体で あれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明の TGR25に対する抗体は、 本発明の TGR25を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の TGR 25は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが好ましく用い られる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプ夕一タンパク質 と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによ り行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタイ ンの方法 〔ネィチヤ一 （Nature) 、 256巻、 495頁 （1975年） 〕 に従い 実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール (PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いら れる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP2Z0などが挙げら れるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜40°C、 好ましくは約 30〜37°Cで約 1〜10分間インキュべ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 レセプ夕一タンパタ質の抗原を直接あるいは担体とともに 吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いら れる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプ 口ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清 を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプタ一タンパク質を加え、 固相 に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクロ一ナル抗体の選別は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミ ジン） を添加した動物細 用培地などで行なうことができる。 選別および育種用 培地としてほ、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いて も良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M l 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ） またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 (株） ) などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0口、 好ましく は約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間 である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培 養上清の抗体価は、 上記の抗血清.中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクロ一ナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にし たがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （T G R 2 5抗原） とキヤリ ァータンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様 に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明の T G R 2 5に対する抗体含 有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複 合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミン、 ゥシサイログロプリン、 キーホール · リンペット ·へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプル させる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。
本発明の T G R 2 5に結合するサロゲートリガンド （以下、 リガンドと称する 場合もある） として、 例えば AM 2 5 1、 AM 2 8 1、 D H 9 7などの非べプチ ド性化合物をあげることができ、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などであってもよ く、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよ い。
上記リガンドは塩を形成していてもよく、 その塩としては、 生理学的に許容さ れる酸または塩基などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加 塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられ る。
リガンドがペプチドである場合、 例えばヒトやその他の温血動物 （モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 (例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 脬臓 3細胞、 骨髄細胞、 メ サンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽 細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞もしくは 間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞等） もしくは それらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁 桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下 垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋 肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、.胸腺、 脾臓、 唾液腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 軟骨、 関節、 骨格筋等に由来するポリべ プチドであってもよく、 また組換えポリペプチド、 あるいは合成ポリペプチドで あってもよい。 以下、 リガンドがペプチドである場合をリガンドペプチドと称す る。
「実質的に同一」 とはリガンドの活性、 例えば、 T G R 2 5への結合活性、 細 胞内シグナル伝達活性 （例、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c AM P産生抑制、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下、 G T P r S結合活性、 c AM P依存性プロテインキナ —ゼの活性化、 c GM P依存性プロテインキナーゼの活性化、 リン脂質依存性プ 口ティンキナーゼの活性化、 マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素 （MA Pキ ナーゼ） の活性化、 血清応答因子遺伝子の発現上昇、 T G R 2 5タンパク質の細 胞内局在の変化などを促進または抑制する活性など） 、 抗炎症作用など、 生理的 な特性などが、 実質的に同じことを意味する。 リガンドペプチドの場合、 ァミノ 酸の置換、 欠失、 付加あるいは挿入が、 その生理的な特性や化学的な特性に大き な変化をもたらさない限り、 当該置換、 欠失、 付加あるいは揷入を施されたリガ ンドペプチドは、 当該置換、 欠失、 付加あるいは挿入されていないものと実質的 に同一である。 該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、 たとえばそのアミノ酸が属するクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができ る。
例えば、 非極性 （疎水性） アミノ酸としては、 ァラニン、 ロイシン、 イソロイ シン、 パリン、 プロリン、 フエ二ルァラニン、 トリブトファン、 メチォニンなど があげられる。 極性 （中性） アミノ酸としてはグリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなどがあげられる。 陽電荷を もつ （塩基性） アミノ酸としてはアルギニン、 リジン、 ヒスチジンなどがあげら れる。 負電荷をもつ （酸性） アミノ酸としては、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸 などが挙げられる。
また、 リガンドペプチドには、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保 護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの 複合ペプチドなども含まれる。 さらに、 リガンドペプチドには、 おのおのの N末 端または C末端などにェピトープ （抗体認識部位） となりうる任意の外来べプチ ド配列 （例えば、 F L A G, H i sタグ、 HAタグ、 H S Vタグなど） を有して いるものも含まれる。
リガンドペプチドは、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァミノ末 端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列からなるぺプチドをはじめとするリガンドぺプチドは、 C末端が力ルポ キシル基 （― C O OH) 、 カルポキシレート （一 C〇〇-) 、 アミド （—C O N H 2) またはエステル （—C O O R) であってもよいが、 アミドである場合が好 ましい。 ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 エヂル、 n—プ 口ピル、 イソプロピルもしくは n—ブチル等の アルキル基、 例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシル等の (：3-8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ— ナフチル等の 06_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチル等のフエニル— C卜 2アルキル基もしくはひ一ナフチルメチル等のひ一ナフチル— C卜 2アルキル基 等の c7_14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるピバロィルォ キシメチル基等が用いられる。 リガンドぺプチドが C末端以外に力ルポキシル基 (またはカルボキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化また はエステルイ匕されているものも本願明細書におけるリガンドペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステル等が用いられる。 さらに、 リガンドペプチドには、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基' (例えば、 ホルミル基、 ァセチル基等の C Mアルカノィ ル等の 6ァシル基等） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成する N 末端のダルタミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上 の置換基 （例えば _ O H、 — S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基等） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基等の C ァ ルカノィル基等の C卜 6ァシル基等） で保護されているもの、 糖鎖が結合したい わゆる糖ポリぺプチド等の複合ポリぺプチド、 C末端のアミノ酸残基が修飾され ているもの等も含まれる。 特に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基がホルミル 基で保護されている場合が好ましく、 この場合、 さらに上記した保護、 修飾等を 受けていてもよい。
リガンドペプチドは塩であってもよく、 該塩としては、 生理学的に許容される 酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） 等との塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては、 例 えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有 機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンス ルホン酸） との塩等が用いられる。
リガンドペプチドは、 前述したヒトゃ非ヒト温血動物の細胞または組織から公 知のポリぺプチドの精製方法によつて製造することもできるし、 後述のぺプチド 合成法に準じて製造することもできる。 ヒトゃ非ヒト哺乳動物の組織または細胞 から製造する場合、 ヒトゃ非ヒト哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした 後、 酸等で抽出を行ない、 得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン交 換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単 離することができる。
リガンドペプチドまたはそのアミド体の合成には、 通常市販のポリペプチド合 成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチ ル樹 J3旨、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルアミン樹 Ji旨、 アミノメチル榭 J3旨、 樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹 脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 ' ージメトキシフエ二ル―ヒドロ キシメチル) フエノキシ樹脂、 4一 （2， , 4 ' ージメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエノキシ樹脂等をあげることができる。 このような樹脂を用 レ a—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするポリべ プチドの配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の 最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高 希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のポリペプチドま たはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリペプチド合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジ イミド類としては、 D C C、 N, N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェ チル— N ' — （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミド等が用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対応する酸無水物または HO B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の 活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ポリべプチ ド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド、 N， N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピ 口リドン等の酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルム等のハロゲン化炭化水素 類、 トリフルォロエタノール等のアルコール類、 ジメチルスルホキシド等のスル ホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン等のェ一テル類、 ァセ トニトリル、 プロピオ二トリル等の二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチル等のェ ステル類あるいはこれらの適宜の混合物等が用いられる。 反応温度はポリべプチ ド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常 約— 2 0〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通 常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮 合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことに より十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られ ないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸を ァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないようにすることができ る。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキシ カルボニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォキシカル ポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニル ホスフイノチオイル、 Fm o c等が用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t—ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチル等の直鎖状、 分枝状もしくは環状アル キルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4一二 トロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口ベンジルェ ステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキシ カルボニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒド ラジド化等によって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基等の低級 (C ,_6) アルカノィル基、 ベンゾィル基等のァロイル基、 ベンジルォキシカルポ ニル基、 エトキシカルポニル基等の炭酸から誘導される基等が用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t -ブチル基等である。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C l 2— B z 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチル等が用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 T o s、 4ーメトキシ - 2 , 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル、 B um、 B o c、 T r t、 F m o c等が用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2， 4 , 5—トリクロ口フエクール、 2 , 4—ジニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 H〇N B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフ夕ルイミド、 H O B t ) とのエステル〕 等が用いられる。
原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミド が用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素等 の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタン スルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液等による酸処理や、 ジイソプロピル:!:チルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジン等による塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムに よる還元等も用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約— 2 0〜4 o °cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノー ル、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフイド、
1， 4一ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオール等のようなカチオン捕捉 剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられ る 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリプト ファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2—ェタン ジチオール、 1， 4—ブタンジチオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリゥム溶液、 希アンモニア等によるアル力リ処理によっても除去さ れる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化等は公知の基または公知の手段から適 宜選択しうる。
リガンドペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボ キシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側 にペプチド （ポリペプチド） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N 末端の α—アミノ基の保護基のみを除いたポリぺプチドと C末端の力ルポキシル 基の保護基のみを除去したポリぺプチドとを製造し、 この両ポリぺプチドを上記 したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様であ る。 縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、 上記方法によりすベて の保護基を除去し、 所望の粗ポリペプチドを得ることができる。 この粗ポリぺプ チドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所 望のリガンドぺプチドのアミド体を得ることができる。
リガンドペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸 の Q!—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 リガンドペプチドのアミド体と同様にして、 所望のポリペプチドのエステル体を 得ることができる。
リガンドぺプチドは、 公知のぺプチドの合成法に従つても製造することができ る。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによ つても良い。 すなわち、 リガンドペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはァ ミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離す ることにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基 の脱離としては、 例えば、 以下の （i ) 〜 （V) に記載された方法などが挙げられ る。
(i) M. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t K ペプチド ·シンセシス （Pept ide Synthes is) , Intersc ience Publ ishers, New York (1966年)、
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド（The Pept ide)， Academic Press, New York (1965年）、
(i i i) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年） 、 (iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、
205、 (1977年）、 および
(v) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店。
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィ一.液体クロマトグラフィー ·再結晶等を組み合わせて本発明のポリべプチ ド、 本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られるポ リペプチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によつ て適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。 リガンドペプチドに対する抗体は、 本発明の T G R 2 5に対する抗体と同様に して製造することができる。
リガンド、 T G R 2 5、 T G R 2 5をコードする D NA (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） 、 リガンドペプチドまたは T G R 2 5に対する抗体 (以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 本発明の D NAに対するアンチ センス D NA (以下、 本発明のアンチセンス D NAと略記する場合がある） の用 途について以下に記述する。
( 1 ) 本発明の TGR 2 5の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤
リガンドもしくは T G R 2 5またはそれをコ一ドするポリヌクレオチド （例、 D NA等） などに異常が生じたり、 欠損している場合あるいは発現量が異常に減 少している場合、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性 大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗 塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドローム、 血小板 減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺 癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 勝癌、 滕内分 泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫 瘍、 前立腺窟、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮類部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性 骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 滕内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺 疾患、 膠原病、 炎症性疾患などの種々の疾病が発症する。
したがって、 生体内においてリガンドまたは TGR 25が減少しているために、 リガンドの生理作用が期待できない （リガンドまたは TGR25の欠乏症） 患者 がいる場合に、 a) リガンドまたは TGR25を該患者に投与し、 リガンドまた は TGR 25の量を補充したり、 b) (i) TGR 25をコードする DNAを該 患者に投与し発現させることによって、 あるいは （ii) 対象となる細胞に TGR 25をコードする DNAを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植するこ となどによって、 患者の体内におけるリガンドまたは TGR 25の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。
すなわち、 a) リガンド、 b) TGR25または c) TGR25をコードする DNAを、 リガンドまたは TGR25の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤 などの医薬として使用することができる。
具体的には、 リガンド、 TGR25または本発明の DNAは、 例えば、 白血球 減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症 性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋 疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動 脈硬化症、 メタボリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、.下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸 癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 滕癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子 宮癌、 子宮顇部癌、 子宮体部癥、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 磨癌、 卵巣癌、—卵巣胚 細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リン パ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血 病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞 白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓 器不全など、 好ましくは白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大 腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患など の予防 ·治療剤として、 低毒性で安全な医薬として使用することができる。
リガンドまたは T G R 2 5を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手 段に従って製剤化することができる。
一方、 本発明の D NAを上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D NAを単独あるいはレト fclウィルスベクター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノ ウィルスァゾシェ一テッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 ある いは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ うなカテーテルによって投与できる。 . 例えば、 a ) リガンド、 b ) T G R 2 5または c ) 本発明の D NAは、 必要に 応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤など として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌 性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 a ) リガンド、 b ) T G R 2 5または c ) 本発明の D NAを生理学的に認められ る公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などととも に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって 製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当 な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80™、 HCO-50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤な どと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 （ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
例えば、 リガンドの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによ り差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 白血球減少症患者 （体重 6 0 kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する 場合は、 _その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 白血球減少症患者 （体重 6 Ok gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 Okg当たりに換算した量 を投与することができる。
本発明の DN Aの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 白血球減少症患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 白血球減少症患者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量 を投与することができる。'
(2) 遣伝子診断剤
本発明の DNAおよびアンチセンス DNAは、 プローブとして使用することに より、 ヒトまたはその他の哺乳動物 （ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明の TGR 25またはその部分ぺプ チドをコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することが できるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低 下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤とし て有用である。
本発明の DNAまたはアンチセンス DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例え ば、 公知のノーザンハイブリダィゼーシヨンや PCR— S S CP法 （Genomics, 第 5巻， 874〜879頁（1989年）、 Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America，第 86卷， 2766〜2770頁（1989年））な どにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼーションにより TGR 25の発現低下が検出 された場合や PCR— SSCP法により DNAの突然変異が検出された場合は、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節 リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心 不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタボリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加 症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌 癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 滕癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆 嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱 癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮顏部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部 肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血 病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 滕内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫 瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎 症性疾患などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することが できる。
一方、 例えば、 ノ一ザンハイブリダィゼ一シヨンにより T G R 2 5の発現過剰 が検出された場合は、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰 瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾 患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心 筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタボリックシンドローム、 血 小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘 腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細 胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 塍癌、 滕 内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞瘟、 精 巣腫瘍、.前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮類部癌、 子宮体部癌、 子宮肉 腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息 肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白 血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 塍内分泌 腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球增多症な どの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
( 3 ) 本発明の TGR 2 5の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有す る医薬
本発明の D NAは、 プローブとして用いることにより、 本発明の T G R 2 5の 発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、 (i) 非ヒト哺乳動物の a) 血液、 b) 特定の 臓器、 c) 臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （ii) 形質転換体等に含 まれる本発明の TGR 2,5の mRNA量を測定することによる、 本発明の TGR 25の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明の TGR 25の mRNA量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
(i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒ ッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的にはアルツハイマー病モ デルラット、 マウス、 ゥサギなど） に対して、 薬剤 （例えば、 免疫調節薬など） あるいは物理的ストレス （例えば、 浸水ス卜レス、 電気ショック、 明暗、 低温な ど） などを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得 られた細胞に含まれる本発明の TGR 25の mRNAは、 例えば、 通常の方法に より細胞等から mRNAを抽出し、 例えば、 TaqMan PCRなどの手法を 用いることにより定量することができ、 公知の手段によりノーザンプロットを行 うことにより解析することもできる。
(ii) 本発明の TGR 25を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明の TGR 25の mRNAを同様にして定量、 解析 することができる。
本発明の TGR 25の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グは、
(i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （30分前〜 24時間前、 好ましくは 30分前 〜 12時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （30 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 24時 '間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （30分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 24時間後） 、 細胞に含まれる本発明の TGR 25の mRNA 量を定量、 解析することにより行なうことができ、 (i i) 形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましくは 2日後〜 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明の T G R 2 5の mR NA量を 定量、 解析することにより行なうことができる。
試験化合物としては、 锎えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などが用いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合 物であってもよい。 試験化合物は塩を形成していてもよく、 試験化合物の塩とし ては、 生理学的に許容される金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸 との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金 属塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属 塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；ァ ルミニゥム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばト リメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシ どとの塩が挙げられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、. 臭ィ匕水 素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例と しては、.例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベン ゼンスルホン酸、 P—トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性アミ ノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル二チンなどと の塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン 酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 本発明の T G R 2 5 の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （a) 本発明の T G R 2 5の発現量を増加させることにより、 T G R 2 5を介する細胞刺激活性 (例、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c A M P生成、 細胞内 C AM P産生抑制、 細胞内 c GM P生成、 イノシト一ルリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの 低下、 GT P r S結合活性、 c AMP依存性プロテインキナーゼの活性化、 c G M P依存性プロティンキナーゼの活性化、 リン脂質依存性プロティンキナーゼの 活性化、 マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素 （MA Pキナーゼ） の活性化な どを促進する活性、 T G 2 5細胞内移行活性、 血清応答因子の発現量変動活性 など） を増強させる化合物、 （b) 本発明の T G R 2 5の発現量を減少させるこ とにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿 などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物 であってもよい。 該化合物の塩としては、 生理学的に許容される金属塩、 アンモ ニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性ァ ミノ酸との塩などが挙げられる。 金属塩の好適な例としては、 例えばナトリウム 塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウ ム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。 有機塩基と の塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジ ン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 ト リエ夕ノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N， N 'ージベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸との塩の好適 な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げ られる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢 酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸な どとの塩が挙げられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアル ギニン、 リジン、 オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適 な例としては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。 上記スクリーニング方法で得られる化合物は、
(i) 本発明の T GR 2 5の発現量を増加し、 本発明の T G R 2 5の機能不全に 関連する疾患を予防 ·治療する化合物、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ 腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性 疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリツクシ ンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経 膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小 細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細 胞癌、 塍癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮顏部癌、 子宮体 部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒 色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異 形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急 性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾 患、 滕内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白 血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患などの予防 ·治療作用を有する 化合物、 または
(i i) 本発明の T G R 2 5の発現量を減少させ、 本発明の T G R 2 5の発現過多 に起因する疾患、 例えば、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性 疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経 鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小 細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 塍癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮顏部癌、 子宮体部癌、 子宮 肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状 息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白 血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 塍内分泌 腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球増多症な どの予防 ·治療作用を有する化合物、 白血球賦活作用を有する化合物などである。 したがって、 上記スクリーニング方法で得られる本発明の T G R 2 5の発現量. を増加する化合物またはその塩は、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原 病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋 変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシン ドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠 腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細 胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞 癌、 膝癌、 滕内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮類部癌、 子宮体 部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒 色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異 形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急 性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾 患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白 血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患などの予防 ·治療剤として、 低 毒性で安全な医薬として使用することができる。
一方、 上記スクリーニング方法で得られる本発明の T G R 2 5の発現量を減少 させる化合物またはその塩は、 本発明の T G R 2 5の発現過多に起因する疾患、 例えば、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増 多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドローム； 血小板減少症、 血 小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉 頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 塍癌、 塍内分泌腫瘍、 胆 管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺 癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮穎部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、'ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血 病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性 白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌な ど） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球増多症の予防 ·治療剤、 また は白血球賦活剤などとして、 低毒性で安全な医薬として使用することができる。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従つて製剤化することができる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよ うにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有す'ることができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80™、 HCO-50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防 '治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤な どと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
上記化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法な どにより差異はあるが、 経口投与の場合、 例えば、 白血球減少症患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき本発明の TGR 25の発現量を増加する化 合物を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは 約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与 対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形 では通常例えば、 白血球減少症患者 （体重 6 Okgとして） においては、 一日に つき本発明の TGR25の発現量を増加する化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 k g当 たりに換算した量を投与することができる。
また、 経口投与の場合、 例えば、 白血球増多症患者 （体重 6 O kgとして） に おいては、 一日につき本発明の TGR25の発現量を減少する化合物を約 0.1 〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20 mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 白血球増多症患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき本発明の TG R 25の発現量を減少する化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量 を投与することができる。
(4) 本発明の抗体を用いる診断方法
リガンドぺプチドに対する抗体は、 本発明のリガンドぺプチドを特異的に認識 することができるので、 被検液中のリガンドぺプチドの検出や中和に使用するこ とができる。
本発明の TGR 25に対する抗体は、 本発明の TGR 25を特異的に認識する ことができるので、 被検液中の TGR25の検出や中和に使用することができる。 以下、 本発明の TGR 25に対する抗体を用いる TGR 25の定量法について 説明するが、 リガンドぺプチドに対する抗体を用いるリガンドぺプチドの定量法 も同様にして実施することができる。
すなわち、 本発明は、
( 本発明の抗体と、 被検液および標識化された TGR 25とを競合的に反応 させ、 該抗体に結合した標識化された TGR25の割合を測定することを特徴と する被検液中の TGR 25の定量法、 および
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特^：とする被検液中の TGR 25の定量法を提供する。
上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が TGR 25の N端部を認識する 抗体で、 他方の抗体が TGR25の C端部に反応する抗体であることが望ましい。 また、 TGR25に対するモノクローナル抗体を用いて TGR 25の定量を行 うことができるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目 的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F(ab')2、 Fa b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる T G R 2 5の定量法は、 特に制限されるべきものではな く、 被測定液中の抗原量 （例えば、 T G R 2 5量） に対応した抗体、 抗原もしく は抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量 の抗原を含む標準液を用^て作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 い ずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリ ック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述 するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔125 1〕 、 〔131 1〕 、 〔 〕 、 〔14c〕 などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダ一ゼ、 )3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パ一ォキシダ一ゼ、 リンゴ酸 脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例え ば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられ る。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用い ることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 T G R 2 5あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある いはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定するこ により 被検液中の本発明の T G R 2 5量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって もよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 ま た、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による T G R 2 5の測定法においては、 1次反応と 2 次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 T G R 2 5の結合する部位 が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次反応に用 いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 T G R 2 5の C端部を 認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N 端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し (BZF分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量す る。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B /F分離をポリエチレング リコ一ル、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体と して固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体 として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検波中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレ一ザ一の散乱を利用するレーザーネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の T G R 2 5の測定系を構築 すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参 照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィ Λノアッセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 （"Methods in
ENZYM0L0GY」 Vol . 70 (Immunochemical Techniques (Part A) ) , 同書 Vol . . 73 (I腿画 chemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol . 84 (Immunochemical Techniques (Part D ： Selected Immunoassays)) , 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E ： Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I ： Hybridoma Technology and
Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の T G R 2 5 を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて T G R 2 5の濃度を定量することによって、 T G R 2 5の濃度の変化が検出された場合、 例えば、 例えば、 白血球減少症、 白 血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジ ストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下 垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳 癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 脬癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎 盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮 頸部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジ キン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨 髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢 性骨髄増殖性疾患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など の疾病である、 または将籴罹患する可能性が高いと診断することができる。
(5) TGR 25に対するァゴニストのスクリーニング方法
リガンドが TGR25に結合することによって、 血清応答因子遺伝子の発現上 昇、 TGR 25タンパク質の細胞内局在の変化が見られることから、 TGR25 は、 これらの変化を指標として TGR25に対する上記リガンド以外のァゴニス ト （天然リガンド、 合成リガンドを含む） を探索し、 または決定するための試薬 として有用である。
すなわち、 本発明は、 試験化合物を TGR 25を含有する細胞に接触させた場 、合における、 TGR25を介した細胞内 c AMP生成抑制活性を測定することを 特徴とする TGR25に対するァゴニストの決定方法を提供する。
試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、一ボンべシ ン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 Ρ ACAP (例、 PACAP27, PACAP38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 AC TH、 GRP、 PTH、 VI P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミ リン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジ一ンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ケモカインスーパーファミリー （例、 IL— 8, G ROa, GROj3, GROr, NAP- 2, ENA- 78, GCP- 2, PF4, IP— 10, Mi g, PB S FZSDF— 1などの CXCケモカインサブフアミ リー； MCAF/MCP— 1， MCP-2, MCP— 3， MCP - 4， e o t a χ i n, RANTES, MI P— 1ひ、 MI P— 1 |8, HCC— 1, MI P— 3 a/LARC, MI P-3 i3/ELC, I一 309， TAR C， M I P F— 1 , M I PF— 2/e o t a x i n - 2， MDC, DC— CK1/PARC, SLC などの CCケモカインサブファミリ一； 1 ymp h o t a c t i nなどの Cケモ 力インサブファミリ一； f r a c t a 1 k i n eなどの C X 3 Cケモカインサブ ファミリ一等） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテ ンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イド、 ガラニン、 リゾホスファ チジン酸 （LPA) 、 スフインゴシン 1一リン酸など） の他に、 例えば、 ヒトま たはその他の哺乳動物 （マウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組 織抽出物、 細胞培養上清、 低分子合成化合物などが用いられる。 例えば、 該組織 抽出物、 細胞培養上清などを TGR 25に添加し、 細胞刺激活性などを測定しな がら分画し、 最終的に単一のリガンドを得ることができる。
(6) 本発明の TGR25とリガンドとの結合性またはシグナル伝達を変化さ せる化合物またはその塩 （ァゴ二スト、 アンタゴニストなど） のスクリーニン グ方法、 および本発明の TGR25とリガンドとの結合性またはシグナル伝達 を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明の TGR25を用いるか、 または組換え型 TGR25の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることによって、 リガンドと 本発明の TGR25との結合性を変化させる、 またはこの結合によって生じるシ グナル伝達を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ぺプ チド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽 出液、 血漿など） またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。 このような化合物には、 （ィ） TGR 25を介して細胞刺激活性を有する化合 物 （いわゆる、 本発辆の TGR 25に対するァゴニスト） 、 （口） TGR25を 介する細胞刺激活性を阻害する化合物 （いわゆる、 本発明の TGR 25に対する アンタゴニスト） 、 （八） リガンドと本発明の TGR25との結合力を増強する 化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の TGR 25との結合力を減少させる 化合物などが含まれる。
細胞刺激活性としては、 例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 cAM P産生抑制、 細胞内 cGM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 pHの低下、 GTP T S結合活性、 c AMP依存性プロテ インキナーゼの活性化、 cGMP依存性プロテインキナーゼの活性化、 リン脂質 依存性プロティンキナーせの活性化、 マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素 (MAPキナーゼ） の活性化、 血清応答因子遺伝子の発現上昇、 TGR25タン パク質の細胞内局在の変化などを促進する活性または抑制する活性などが挙げら れ、 なかでも、 血清応答因子の発現上昇活性が好ましい。
すなわち、 本発明は、 （i) 本発明の TGR25とリガンドとを接触させた場 合と （ii) 本発明の TGR25とリガンドおよび試験ィ匕合物とを接触させた場合 との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明の TGR 25との結合性ま たはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供 する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i) と （ii) の場合における、 例 えば、 TGR25に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比 較することを特徴とする。
リガンドとしては、 前記したリガンドに代えて、 リガンドと本発明の TGR2 5との結合性を変化させる化合物またはその塩 （例えば、 低分子合成化合物、 好 ましくは低分子合成ァゴニスト） を用いることができる。 リガンドと本発明の T GR25との結合性を変化させる化合物またはその塩は、 後述するスクリーニン グ方法を用いて得ることができる。 本発明のスクリーニング方法においては、 こ れらリガンドと本発明の TGR25との結合性を変化させる化合物またはその塩 も含めてリガンドと称する。
より具体的には、 本 明は、
a) 標識したリガンドを、 本発明の TGR 25に接触させた場合と、 標識した リガンドおよび試験化合物を本発明の TGR 25に接触させた場合における、 標 識したリガンドの該 TGR25に対する結合量を測定し、 比較することを特徴と するリガンドと本発明の TGR25との結合性を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、 b) 標識したリガンドを、 本発明の TGR 25を含有する細胞または該細胞の 膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明の TG R25を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識し たリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特 徴とするリガンドと本発翻の TGR25との結合性を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
c) 標識したリガンドを、 本発明の DNAを含有する形質転換体を培養するこ とによって細胞膜上に発現した TGR 25に接触させた場合と、 標識したリガン ドおよび試験化合物を本発明の DNAを含有する形質転換体を培養することによ つて細胞膜上に発現した本発明の TGR 25に接触させた場合における、 標識し たリガンドの該 TGR25に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと本発明の TGR 25との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
d) 本発明の TGR 25を活性化する化合物 （例えば、 本発明の TGR25に 対するリガンドなど） を本発明の TGR 25を含有する細胞に接触させた場合と、 本発明の TGR 25を活性化する化合物および試験化合物を本発明の TGR 25 を含有する細胞に接触させた場合における、 TGR25を介した細胞刺激活性を 測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明の TGR 25との結合性ま たはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 お„ょ. び
e) 本発明の TGR 25を活性化する化合物 （例えば、 本発明の TGR25に 対するリガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することに よって細胞膜上に発現した本発明の TGR 25に接触させた場合と、 本発明の T GR25を活性化する化合物および試験化合物を本発明の DNAを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の TGR25に接触さ せた場合における、 レセプ夕一タンパク質を介する細胞刺激活性を測定し、 比較 することを特徴とするリガンドと本発明の T G R 25との結合性またはシグナル 伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下に記述する。 まず、 本 明のスクリーニング方法に用いる本発明の TGR 25としては、 上 記した本発明の TGR 25を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 本発明の TGR25を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。 しか し、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリ ニングに用い られるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させたヒト由来の TGR 25な どが適している。
本発明の TGR 25を製造するには、 上記の方法が用いられるが、 本発明の D NAを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的と するタンパク質部分をコードする DNA断片には相補 DNAが用いられるが、 必 ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DNAを用い てもよい。 本発明の TGR25をコードする DNA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 DNA断片を昆虫を宿主とするパキュ ロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； NP V) のポリヘドリンプロモ一ター、 S V40由来のプロモ一夕一、 レトロウィル スのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒートショックプロモ 一夕一、 サイトメガロウィルスプロモ一夕一、 SR プロモータ一などの下流に 組み込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方 法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ- バイオロジカル ·ケミストリ一 (J. Biol. Chem. ) , 267巻， 19555〜19559頁， 1992 年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明の TGR25を含 有するものとしては、 公知の方法に従って精製した TGR 25であってもよいし、 該 TGR25を含有する細胞を用いてもよく、 また該 TGR25を含有する細胞 の膜画分を用いてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の TGR 25を含有する細胞を 用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
本発明の TGR 25を含有する細胞としては、 該 TGR 25を発現した宿主細 胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞 などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter—
Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングブレンダ一やポリ トロン （Kinematica社製)'のよる破碎、 超音波による破碎、 フレンチプレスなど で加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などが挙げられ る。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1〜10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1500 0〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分と する。 該膜画分中には、 発現した TGR 25と細胞由来のリン脂質や膜タンパク 質などの膜成分が多く含まれる。
該 TGR25を含有する細胞や膜画分中の TGR 25の量は、 1細胞当たり 1 03〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量 の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明の TGR 25との結合性またはシグナル伝達を変化させる化 合物をスクリーニングする上記の a) 〜c) を実施するためには、 例えば、 適当 な TGR25画分と、 標識したリガンドが必要である。 TGR25画分としては、 天然型の TGR25画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型 TGR 2 5画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シ グナル情報伝達作用などを示す。 標識したリガンドとしては、 例えば 〔3H〕 、 〔l25I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明の TGR25との結合性またはシグナル伝達を 変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明の TGR25を含 有する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁す ることにより TGR25標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ま しくは pH6〜8) のリン酸バッファ一、 トリス一塩酸バッファ一などのリガン ドと TGR25との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n— 80™ (花王—ァ トラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加 えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプ夕一やリガンドの分.解を 抑える目的で PMSF、 άィぺプチン、 Ε— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス 夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0.01〜1 Oml の該レセプ夕一タンパク質溶液に、 一定量 （5000〜500000 c pm) の 標識したリガンドを添加し、 同時に 10_4M〜10— 1QMの試験化合物を共存させ る。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた 反応チューブも用意する。 反応は約 0〜50°C、 望ましくは約 4〜37°Cで、 約 20分〜 24時間、 望ましくは約 30分〜 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙 等で濾過し、. 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射 活性を液体シンチレ一ションカウンターまたはァ一カウンタ一で計測する。 拮抗 する物質がない場合のカウント（B。；)から非特異的結合量 （NSB) を引いた力 ゥント （B。― NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B— NSB) が、 例えば、 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択 することができる。
リガンドと本発明の TGR 25との結合性またはシグナル伝達を変化させる化 合物またはその塩をスクリーニングする上記の d) 〜e) の方法を実施するため には、 例えば、 TGR 25を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定 用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明の TGR 25を含有する細胞をマルチウエルプレー ト等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もつて新鮮な培地ある いは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加し て一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成 した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 (例えば、 ァラキドン酸、 cAMPなど） の生成が、 細胞が含有する分解酵素に よって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行な つてもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンな どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検 出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な T G R 2 5を発 現する細胞が必要である。 本発明の T G R 2 5を発現する細胞としては、 天然型 の本発明の T G R 2 5を有する細胞株、 上記の組換え型 T G R 2 5を発現した細 胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などが用いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合 物であってもよい。 試験化合物は塩を形成していてもよく、 試験化合物の塩とし ては、 生理学的に許容される金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸 との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金 属塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属 塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；ァ ルミニゥム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばト リメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2 , 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジェタノ一ルァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシ ルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N， N' —ジベンジルエチレンジァミンな どとの塩が挙げられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水 素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例と しては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベン ゼンスルホン酸、 P—トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性アミ ノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル二チンなどと の塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン 酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。 また、 試験化合物としては、 本発明の T G R 2 5の活性部位の原子座標および リガンド結合ポケットの位置に基づいて、 リガンド結合ポケットに結合するよう に設計された化合物が好ましく用いられる。 本発明の TGR25の活性部位の原 子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、 公知の方法あるいはそれに 準じる方法を用いて行うことができる。
リガンドと本発明の TGR 25との結合性またはシグナル伝達を変化させる化 合物またはその塩のスク ύ一二ング用キットは、 本発明の TGR25、 本発明の TGR25を含有する細胞、 または本発明の TGR25を含有する細胞の膜画分 を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。
1. スクリーニング用試薬
a) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 _imのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
b) TGR 25標品
本発明の TGR 25を発現させた CH〇細胞を、 12穴プレートに 5x105個 穴で継代し、 37 、 5%C02、 95% a i rで 2日間培養したもの。
c) 標識リガンド
市販の 〔 〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは— 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 に希釈する。
d) リガンド標準液
リガンド.を 0.1%ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで ImM となるように溶解し、 — 20°Cで保存する。
2. 測定法
a) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の TGR 25発現 CH〇細 胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴 に加える。
b) 10—3〜10—1()Mの試験化合物溶液を 5^ 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化合 物の代わりに 10_3Mのリガンドを 5 1加えておく。
c) 反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した 標識リガンドを 0.2 N Na〇H— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製)' と混合する。
d) 液体シンチレ一シヨンカウン夕一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB= [ (B-NSB) / (B0— NSB) 1 x100
PMB： Percent Ma imum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B0 ：最大結合量
TGR 25に対するァゴニストであるかアン夕ゴニストであるかの具体的な評 価方法は以下の （i) または （ii) に従えばよい。
(i) 前記 a) 〜c) のスクリーニング方法で示されるバインディング ·ァッセ ィを行い、 リガンドペプチドと本発明の TGR25との結合性を変化させる （特 に、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した細胞刺激活性を有し ているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の TGR25に対するァゴニストであり、 該活性を有しない化合物またはその塩は 本発明の TGR 25に対するアン夕ゴニストである。
(ii) (a) 試験化合物を本発明の TGR 25を含有する細胞に接触させ、 上記 した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発 明の TGR 25に対するァゴニストである。
(b) 本発明の TGR 25を活性化する化合物 （例えば、 リガンド） を本発明の TGR25を含有する細胞に接触させた場合と、 本発明の TGR 25を活性化す る化合物および試験化合物を本発明の TGR 25を含有する細胞に接触させた場 合における、 本発明の TGR 25を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する。 本 発明の TGR25を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物 またはその塩は本発明の TGR 25に対するアンタゴニストである。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 リガンドと本発明の T G R 2 5との結合性またはシグナ ル伝達を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） レセプター を介して細胞刺激活性を有する化合物 （いわゆる、 本発明の T G R 2 5に対する ァゴニスト） 、 （口） レセプ夕一への結合活性は有するが該細胞刺激活性を有し ない化合物 （いわゆる、 本発明の T G R 2 5に対するアン夕ゴニスト） 、 ひ、） リガンドと本発明の T G R 2 5との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） リ ガンドと本発明の T G R 2 5との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが挙 げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、.公知の化合物であって もよい。
本発明の T G R 2 5に対するァゴニストは、 リガンドが有する生理活性と同様 の作用を有しているので、 リガンドぺプチドが有する生理活性に応じて安全で低 毒性な医薬として有用である。
本発明の T G R 2 5に対するアンタゴニス卜は、 リガンドが有する生理活性を 抑制することができるので、 リガンドぺプチドの生理活性を抑制するための安全 で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の T G R 2 5との結合力を増強する化合物は、 リガンドが有 する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の T G R 2 5との結合力を減少させる化合物は、 リガンドが 有する生理活性を減少させるためのリガンドの生理活性を抑制するための安全で 低毒性な医薬として有用である。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用 いて得られる化合物またはその塩、 特にァゴニストまたはリガンドと本発明の T G R 2 5との結合力を増強する化合物またはその塩は、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジ ストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下 垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳 癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癒、 肝臓癌、 肝細胞癌、 塍癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎 盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、'精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮 頸部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジ キン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨 髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢 性骨髄増殖性疾患、 滕内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関 節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患などの予防 ·治療 剤として、 低毒性で安全な医薬として使用することができる。
一方、 上記スクリーニング方法で得られるアン夕ゴニストまたはリガンドと本 発明の T G R 2 5との結合力を減少させる化合物またはその塩は、 本発明の T G R 2 5の発現過多に起因する疾患、 例えば、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リ ンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾 患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフ ィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリ ックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 滕癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿 管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮頸部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血 病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増 殖性疾患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好まし くは白血球増多症などの予防 ·治療剤、 白血球賦活剤などとして低毒性で安全な 医薬として使用することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って 製剤化することができる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよ うにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コ一ル） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベー卜 8 0™、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例えば、 ペンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤な どと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 白血球減少症患者 （体 重 60 kgとして） においては、 一日につきァゴニストを約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非 経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方 法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 白血球減少症 患者 （体重 6 Okgとして） においては、 一日につきァゴニストを約 0. 01〜 30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 Q kg当たりに換算した量を投与することができる。 経口投与の場合、 一 般的に例えば、 白血球増多症患者 （体重 6 Okgとして） においては、 一日につ きアンタゴニストを約 0.1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 よ り好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回 投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 白血球増多症患者 （体重 6 Okgとして） において は、 一日につきアンタゴニストを約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 Okg当たりに換算した量 を投与することができる。
また本発明は、 骨髄などに存在する幹細胞または間葉系未分化細胞、 幼若造血 系細胞の機能、 あるいは骨髄内造血支持組織中などに存在する脂肪細胞、 脂肪前 駆細胞の機能を制御することを特徴とする、 リガンドまたはその塩と T G R 2 5 との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬を提供する。 骨髄は、 長骨の髄腔や、 椎体、 肋骨、 胸骨、 骨盤など骨の内部にある海綿状の 組織であり、 造血の場である。 大きくは血液細胞とそれを支持する間質細胞から なり、 さらに細かくは様々な血球系細胞に分化しうる能力をもつた多能性造血幹 細胞の他、 各血球の前駆細胞、 マクロファージ、 脂肪細胞、 細網細胞、 細網繊維 等からなっている。 骨髄中の造血幹細胞の分化には、 細胞や基質との接着、 局所 で作用するサイトカインなどが重要で、 それは造血微小環境という概念でよばれ ており、 細胞が造血微小環境に着床することに関与するホ一ミングをになう分子、 多能性幹細胞の増殖、 維持に関与する分子、 骨髄からの血球の遊出、 動員に関与 する分子が作用していると考えられる。 また、 骨髄間質の脂肪細胞、 繊維芽細胞、 細網細胞は他の部位とは異なる独特の性質をもち、 骨髄の造血微小環境の形成に 重要と考えられている。 Gタンパク質共役型レセプタ一が生理活性物質との結合 を介してシグナルを細胞内に伝達すると、 タンパク質など様々な液性因子の分泌 や新たな細胞表面抗原分子の発現により、 近接した他の細胞の機能にも影響を及 ぼす。 従って、 骨髄に発現する Gタンパク質共役型レセプターのシグナルを制御 するリガンド、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストは、 こうした細胞集団中において、 特定の細胞機能に直接或いは間接的に影響を及ぼすため、 骨髄に存在する上記の 各種細胞機能に由来する疾患の予防および Zまたは治療薬や診断薬に応用するこ ともできる。
Nat ional Center for Biotechnology Informat ionの Gene Express ion Omnibus に開示されているマイクロアレイで解析したデ一夕によれば、 cardiotoxinを投 与した骨格筋で、 該レセプ夕一の遺伝子発現が亢進することが示されている。 こ のことから該レセプターのシグナルを制御するリガンド、 ァゴニスト、 アンタゴ ニストは筋細胞の損傷、 あるいは機能異常などによる疾患の治療に応用できる。
( 7 ) 各種薬物の作用メカニズムの解明方法
T G R 2 5を用いることによって、 各種薬物が T G R 2 5を介して薬理効果を 発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、 本発明は、
(i) T G R 2 5を用いることを特徴とする、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺 疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロ フィ一、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポ リックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺 腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺 癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓 癌、 肝細胞癌、 塍癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癒、 外陰癌、.子宮癌、 子宮頸部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血 病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増 殖性疾患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全などの予防 · 治療薬が該レセプタータンパク質またはその塩に結合することを確認する方法、
(i i) T G R 2 5を用いることを特徴とする、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺 疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロ フィ一、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポ リックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺 腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺 癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓 癌、 肝細胞癌、 滕癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮類部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血 病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増 殖性疾患、 膝内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全などの予防- 治療薬が該レセプタータンパク質またはその塩に対するァゴニストであることを 確認する方法、
(i i i) T G R 2 5を用"ることを特徴とする、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺 疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロ フィ一、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタボ リックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺 腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺 癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓 癌、 肝細胞癌、 滕癌、 滕内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮顏部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血 病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増 殖性疾患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全などの予防' 治療薬が該レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するアンタゴニストであるこ とを確認する方法、
(iv) 各薬を T G R 2 5に接触させた場合における、 各薬と T G R 2 5との結合 量を測定することを特徴とする上記 （i) 〜 （i i i) 記載のスクリーニング方法を 提供する。
この確認方法は、 前記したリガンドと T G R 2 5との結合性を変化させる化合 物のスクリーニング方法において、 試験化合物に代えて、 上記の薬物を使用する ことによつて実施することができる。
また、 本発明の確認方法用キットは、 前記したリガンドと T G R 2 5との結合 性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、 試験化合物に代えて、 上記の薬物を含有するものである。 このように、 本発明の確認方法を用いることによって、 市販または開発途中の 各種薬物が TGR 25を介して薬理効果を発揮していることを確認することがで きる。 (8) 細胞膜における本発明の TGR 25またはその部分ペプチドの量を変化 させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明の抗体は、 本発明の TGR25を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明の TGR 25の量を変化させる化合物またはその塩のスク リ一ニングに用いることができる。 . . すなわち本発明は、 例えば、
(i) 非ヒト哺乳動物の a) 血液、 b) 特定の臓器、 c) 臓器から単離した組織 もしくは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発 明の TGR25を定量することによる、 細胞膜における本発明の TGR 25の量 を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(ii) 本発明の TGR 25を発現する形質転換体等を破壊した後、 細胞膜画分を 単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明の TGR 25を定量することによる、 細胞 膜における本発明の TGR 25の量を変化させる化合物またはその塩のスクリー ニング方法、
(iii) -非ヒト哺乳動物の a) 血液、 b) 特定の臓器、 c) 臓器から単離した組 織もしくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層で の該受容体夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該タン パク質を確認することによる、 細胞膜における本発明の TGR 25の量を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(iv) 本発明の TGR 25を発現する形質転換体等を切片とした後、 免疫染色法 を用いることにより、 細胞表層での該受容体タンパク質の染色度合いを定量化す ることにより、 細胞膜上の該タンパク質を確認することによる、 細胞膜における 本発明の TGR 25の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法 を提供する。
細胞膜画分に含まれる本発明の TGR 25の定量は具体的には以下のようにし て行なう。
(i) 正常あるいは疾患モデル非ヒ卜哺乳動物 （例、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的にはアルツハイマー病 モデルラット、 マウス、 ゥサギなど） に対して、 薬剤 （例、 免疫調節薬など） あ るいは物理的ストレス （例、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） な どを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩 衝液、 へぺス緩衝液など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壊し、 界面 活性剤 （例、 トリトン X I 0 0™、 ツイ一ン 2 0™など） などを用い、 さらに遠 心分離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、 細胞を破枠した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Po t ter— Elvehj em型ホモ ジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン
(Kinemat ica社製） による破砕、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （5 0ひ〜 3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1〜1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0〜 3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した T G R 2 5と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質など の膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明の T G R 2 5は、 例えば、 本発明の抗体を用いた サンドイッチ免疫測定法、 ウエスタンブロット解析などにより定量することがで さる。
このようなサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことがで き、 ウエスタンブロットは公知の手段により行なうことができる。
(i i) 本発明の T G R 2 5を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、 細 胞膜画分に含まれる本発明の T G R 2 5を定量することができる。 細胞膜における本発明の T G R 2 5の量を変化させる化合物またはその塩のス クリーニングは、
(i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好まじくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （ 3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、. より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （3 0分〜 3日後、 好ましくは 1時間〜 2日後、 より好ましく は 1時間〜 2 4時間後） 、 細胞膜における本発明の T G R 2 5の量を定量するこ とにより行なうことができ、
(i i) 形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日〜 7日後、 好ましくは 1日〜 3日後、 より好ましくは 2日 〜3日後） 、 細胞膜における本発明の T G R 2 5の量を定量することにより行な うことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明の T G R 2 5の確認は具体的には以下のようにし て行なう。
(i i i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒ ッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的にはアルツハイマー病モ デルのラット、 マウス、 ゥサギなど） に対して、 薬剤 （例えば、 免疫調節薬な ど） あるいは物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低 温など） などを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例え ば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞等を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を 用いて免疫染色を行う。 細胞表層での該受容体タンパク質の染色度合いを定量化 することにより、 細胞膜上の該タンパク質を確認することにより、 定量的または 定性的に、 細胞膜における本発明の T G R 2 5の量を確認することができる。
(iv) 本発明の T G R 2 5を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとるこ とにより確認することもできる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞膜 における本発明の T G R 2 5の量を変化させる作用を有する化合物であり、 具体 的には、 （a) 細胞膜における本発明の T G R 2 5の量を増加させることにより、 T G R 2 5を介する細胞剌澳活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c AM P生成抑制、 細 胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク 質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下、 血清応答因子遺伝子の発現上 昇、 T G R 2 5タンパク質の細胞内局在の変化などを促進する活性または抑制す る活性など） を増強させる化合物、 （b) 細胞膜における本発明の T G R 2 5の 量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが挙 げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であって もよい。
該化合物の塩としては、 生理学的に許容される金属塩、 アンモニゥム塩、 有機 塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩な どが挙げられる。 金属塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩 などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウム塩などのアル カリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例 としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2 , 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァ ミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N, Ν'—ジベンジル エチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸 との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フタル酸、 フマル酸、.シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メ タンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 ρ—トルエンスルホン酸などとの塩が挙 げられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジ ン、 オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。 細胞膜における本発明の T G R 2 5の量を増加させることにより、 細胞刺激活 性を増強させる化合物またはその塩は、 本発明の T G R 2 5の機能不全に関連す る疾患の予防'治療剤などの医薬として使用することができる。 具体的には、 該 化合物またはその塩は、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ臈、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性 疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドロ一ム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経 鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小 細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 勝癌、 滕内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮頸部癌、 子宮体部癌、 子宮 肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状 息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白 血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 塍内分泌 腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患などの予防 ·治療剤として、 低毒性で安全な医 薬として使用することができる。
細胞膜における本発明の T G R 2 5の量を減少させることにより、 細胞刺激活 性を減弱させる化合物またはその塩は、 本発明の T G R 2 5の発現過多に起因す る疾患、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増 多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリックシンドローム、 血小板減少症、 血 小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉 頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 塍癌、 塍内分泌腫瘍、 胆 7354
98 管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺 癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮類部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部,肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血 病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性 白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌な 'ど） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球増多症などに対する安全で低 毒性な予防 ·治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って製剤化することができる。 例えば、 該 化合物またはその塩は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知 の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般 に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量 が得られるようにするものである。
錠剤、.カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さら (こ油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ 7354
99 トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80™、 HCO-50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤な どと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 白血球減少症患者 （体 重 60 kgとして） においては、 一日につき細胞膜における本発明の TGR 25 の量を増加させる化合物を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50m g、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 そ の 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 白血球減少症患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき細胞膜における本発明の TGR 25の量を増加させる化 合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好 ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の ftj物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(9) 本発明の TGR 25に対する抗体を含有してなる医薬
本発明の TGR25に対する抗体の中和活性とは、 該 TGR25の関与するシ グナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。 従って、 該抗体が中和活性を有 する場合は、 該 TGR 25の関与するシグナル伝達、 例えば、 該 TGR25を介 する細胞刺激活性 （例、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+ 遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cAMP産生抑制、 細胞内 c GMP生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o s の活性化、 pHの低下、 ^TPrS結合活性、 c AMP依存性プロテインキナー ゼの活性化、 c GMP依存性プロティンキナーゼの活性化、 リン脂質依存性プロ ティンキナーゼの活性化、 マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素 （MAPキナ ーゼ） の活性化などを促進する活性、 血清応答因子遺伝子の発現上昇、 TGR2 5タンパク質の細胞内局在の変化などを促進する活性または抑制する活性など） を不活性化することができる。 したがって、 本発明の TGR 25に対する中和抗 体は、 TGR25の過剰発現やリガンド過多などに起因する疾患、 例えば、 白血 球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎 症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性 筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、.胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸 癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 塍癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎 腎臓癌、 ·腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子 宮癌、 子宮顏部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚 細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リン パ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血 病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞 白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 滕内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓 器不全など、 好ましくは白血球増多症の予防 ·治療剤、 白血球賦活剤などとして 用いることができる。
上記予防 ·治療剤は、 前記した本発明の TGR 25を含有する医薬と同様にし て製造し、 使用することができる。 ( 1 0 ) 本発明のアンチセンス DNAを含有してなる医薬
本発明のアンチセンス D N Aは、 T G R 2 5の過剰発現やリガンド過多などに 起因する疾患、 例えば、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰癟性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性 疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経 鞘腫、 咽頭癌、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小 細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 塍瘅、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮頸部癌、 子宮体部癌、 子宮 肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状 息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白 血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 滕内分泌 腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好ましくは白血球増多症の 予防 ·治療剤、 白血球賦活剤などとして用いることができる。
該アンチセンス D N Aを用いる場合、 該アンチセンス D N Aを単独あるいはレ トロウィルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテ ッドウィルスベクタ一などの適当なベクタ一に揷入した後、 常套手段に従って実 施することができる。 該アンチセンス D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進 のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃や ハイド口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 さらに、 該ァ ンチセンス D N Aは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在やその発現状況 を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。 上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明の受容体をコードする R NAの一部を含有する二重鎖 R NA (本発明の受容体に対する s i R NA (smal l (short) interfering RNA)、 s h R NA (smal l (short) hairpin RNA)など） 、 T G R 2 5をコードする R NAの一部を含有するリポザィムなども、 T G R 2 5 の発現を抑制することができ、 生体内における T G R 2 5またはそのポリヌクレ ォチドの機能を抑制することができるので、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リ ンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾 患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフ ィ一、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリ ックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌 （ 、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭瘟、 喉頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 勝癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、.尿 管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮類部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血 病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増 殖性疾患、 塍内分泌腫瘍、 原発不明癌など） 、 肺水腫、 多臓器不全など、 好まし くは白血球増多症の予防 ·治療剤、 白血球賦活剤などの低毒性で安全な医薬とし て有用である。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medic ine, 7巻， 221頁, 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造するこ とができる。 例えば、 本発明の受容体をコードする R N Aの一部に公知のリポザ ィムを連結することによって製造することができる。 本発明の本発明の受容体を コードする R N Aの一部としては、 公知のリポザィムによって切断され得る本発 明の R NA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げられる。
上記の二重鎖 R NAまたはリポザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
( 1 1 ) 本発明の D N A導入動物の作製 本発明は、 外来性の φ:発明の DNA (以下、 本発明の外来性 DN Αと略記す る） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DNAと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 〔2〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 記載の動物、
〔3〕 ゲッ歯動 fがマウスまたはラットである第 〔2〕 記載の動物、 および 〔4〕 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えべクタ一を提供するものである。 ， 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 ,凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DNAを転移することによつて作出することがで きる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 DN Aを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合 させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57B L/6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B6C3F1系統， BDF1系統， B 6D2 F1系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラット （例えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。 本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置 換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DNAとしては、 異常な本発明の TGR25を発現させる DNAを意味 し、 例えば、 正常な本発明の TGR 25の機能を抑制する TGR 25を発現させ る D N Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモータ一の下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒ卜 D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動 物 （ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来 の DN Aを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DNAを結合 した DNAコンストラクト （例えば、 ベクタ一） を対象哺乳動物の受精卵、 例え ば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の DN A を高発現する DNA転移哺乳動物を作出することができる。
本発明の TGR 25の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのパクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好 ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （i) ウィル ス （例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモ 一ター、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス ター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン、 インス リン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスター if、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチオン S—トラン スフエラ一ゼ、 血小板由来成長因子 3、 ケラチン Kl， 10ぉょび1^14、 コ ラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ βΐサ ブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナ トリウム利尿性因子、 '内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略さ れる） 、 ナトリウムカリウムアデノシン三リン酸化酵素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタロブ 口ティナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン] 3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 1 (EF- 1 α) 、 βァクチン、 αおよび j3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口エンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現す ることが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 α) のプロモータ一、 ヒトおよびニヮトリ /3ァクチンプロモ一タ一 などが好適である。
上記べクタ一は、 DNA転移哺乳動物において目的とする mRNAの転写を終 結する配列 （一般に夕一ミネ一ターと呼ばれる） を有していることが好ましく、 例えば、 ウィルス由来およぴ各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用いることが でき、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネ一夕一などが用いられ る。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5' 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3' 下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明の TGR 25の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAライブラリー よりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを原料として 取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上記の細胞または組織よ り得られた正常な TGR 25の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳 領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前記 のプロモータ一の下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の DN Aェ 的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DNAが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DNAを保持 することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有する。
本発明の外来性正常 DN Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 DN Aを安定に保持することを確認して、 該 DN A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DNA転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DNAを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DNAを過剰に有する。 導入 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 DNAを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが高発現 させられており、 内在性の正常 DN Aの機能を促進することにより最終的に本発 4
107 明の TGR25の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 DNA転移動物を用いて、 本発明 の TGR25の機能亢進症や、 本発明の TGR25が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 本 発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、 本発明の TGR25の増加症 状を有することから、 本発明の TGR25に関連する疾患に対する治療薬のスク' リーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 DNAを前述のプラス ミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモータ一との DN Aコン ストラク卜は、 通常の DNA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 DNAの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 DNAが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DN Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 DN Aを有する。 導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホ モザィ ート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 DNAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明の TGR25の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 DNA転移動物を用いて、 本 発明の TGR 25の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DN A高発現動物は、 本発 明の TGR25の機能不活性型不応症における本発明の異常 TGR 25による正 常 TGR25の機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 DNAを転移させた哺乳動物は、 本発明の TGR25 の増加症状を有することから、 本発明の TGR25またはの機能不活性型不応症 に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の DNA転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、 '
( i ) 組織培養のための細胞源としての使用、
(ii) 本発明の DNA転移動物の組織中の DNAもしくは RN Aを直接分析する 、 または DNAにより発現された TGR25組織を分析することによる、 本発 明の TGR 25により特異的に発現あるいは活性化する TGR 25との関連性に ついての解析、
(iii) DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （iii) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異 TGR 25を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明の TGR25の機能不 生 型不応症などを含む、 本発明の TGR25に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明の TGR 25に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 卜リブシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の TGR2 5産生細胞の特定化、 アポト一シス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明の TGR 25およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明の TGR 25の機能不活性 型不応症を含む、 本発明の TGR25に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転移動物ま たは本発明の外来性 DNA発現べクタ一を用いて、 本発明の TGR25が関連す る疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。 (12) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本 発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
C 1〕 本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔2〕 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の 3—ガラクトシダ一ゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔3〕 ネオマイシン耐性である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔4〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔5〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔4〕 項記載の胚幹細胞、
〔6〕 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
〔7〕 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の i3—ガラク卜シダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポ一ター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 〔6〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 〔8〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔6〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 〔9〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔8〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
〔10〕 第 〔7〕 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一ター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩の、 血清応答因子遺伝子の発現上昇、 TGR 25タンパク質の細胞内局在の変化を提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明の TGR25の活性 を実質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に本発明の TGR25の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを揷入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモ一夕一あるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックアウト DN Aを作製すればよい。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z ()3—ガラクトシダ一ゼ遺伝 子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝子） を代 表とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のィントロン部分に遺伝子の転写を終結させる D N A配列 (例えば、 poIyA付加シグナルなど） を揷入し、 完全な mRNAを合成できなく することによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA配列を有す る DNA鎖 （以下、 夕一ゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換 え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA 上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ一ショ ン解析あるいはターゲッティングベクタ一上の DNA配列とターゲッティングべ クタ一作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をプライマ一 とした PC R法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を選別することに より得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知の Evansと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免 疫学的背景がはつきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背 景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C57BLZ6マウスや C 57 BL/6の採卵数の少なさを DBAZ2との交雑により改善した BDF1 マウス （C 57 BLノ 6と DBA/2との F1) を用いて樹立したものなども良 好に用いうる。 BDF1マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという 利点に加えて、 C 57 BLZ 6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C57BLZ6マウスとパックク ロスすることでその遺伝的背景を C 57BL/6マウスに代えることが可能であ る点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。 また、 雌雄いずれの ES細胞を用い てもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なう ことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初 期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で きる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。- このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1〜1000 OU/πιΓ)存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気ま たは 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37口で培養するなどの方法で 培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0.001〜0. 5%トリプシン/ 0. l〜5mM EDTA、 好ましくは約 0.1%トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に 播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜3日每に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養 細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの 種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evansおよび M. H. Kaufman, ネィチヤ一 (Nature) 第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロ シ一ディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ュ一エス ェ一 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78巻、 7634頁、 1981年； Τ· C.
Doetschman ら、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジー ·アンド ·ェクスぺリメ ンタル 'モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化さ せて得られる本発明の D N A発現不全細胞は、 インビト口における本発明の T G R25または本発明の TGR 25の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知の方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別す ることが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DN A発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入により夕一ゲッティングベクターの本発明の DN Aが不活性化された DN A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の DN Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DN Aを ノックアウトさせることができる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D N A上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析または夕一 ゲッティングベクタ一上の D N A配列と、 夕ーゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D NA座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 このよ うなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての組 織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例 えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このようにし て得られた個体は、 通常、 本発明の T G R 2 5のへテロ発現不全個体であり、 本 発明の T G R 2 5のへテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明 の T G R 2 5のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクタ を染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ —ト動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴ一ト動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒ卜哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。 また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の T G R 2 5により誘導され得る種々の 生物活性を欠失するため、 本発明の T G R 2 5の生物活性の不活性化を原因とす る疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明および治療法の検討に 有用である。 ( 1 2 a) 本発明の DNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予 防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷など に起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。 該スクリーニング方法において用いられる 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものがあげられ る。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 枋体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合 物であってもよい。 試験化合物は塩を形成していてもよく、 試験化合物の塩とし ては、'生理学的に許容される金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸 との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金 属塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属 塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；ァ ルミニゥム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばト リメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシ どとの塩が挙げられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水 素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例と しては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベン ゼンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性アミ ノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル二チンなどと の塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン 酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。 具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒ卜哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。 試験動物を試験 化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質などにあわせて適宜 選択することができる。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 例え ば、 該試験動物の炎症症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予 防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 本発明の T G R 2 5の欠損や損傷などによって引き起こさ れる疾患 （例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増 多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドローム、 血小板減少症、 血 小板増加症、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 咽頭癌、 喉 頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞癌、 塍癌、 滕内分泌腫瘍、 胆 管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺 癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子宮類部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 白血 病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ性 白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 滕内分泌腫瘍、 原発不明癌な ど） 、 肺水腫、 多臓器不全など） に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医 薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物 から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられ る。 金属塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのアル力 リ金属塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウム塩などのアルカリ土類金属 塩；アルミニウム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例 えばトリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチ ジン、 エタノールァミン、 ジェタノ一ルァミン、 トリエタノールァミン、 シクロ へキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N, N'—ジベンジルエチレンジァ ミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適 な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フタル酸、 フマル酸、 シ ユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン 酸、 ベンゼンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩 基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オルニチ ンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばァス パラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。 該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明の TGR 25とリガンドぺプチドとの結合性またはシグナル伝達を変 化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラッ卜、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に炎症患者 （体 重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜： L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などに よっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常、 炎症患者 （体重 60 kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O kg当 たりに換算した量を投与することができる。
(12b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する 化合物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーエング方法において、 本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝 子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。 試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 β—ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子またはルシフ エラーゼ遺伝子などが好適である。 本発明の D N Aをレポーター遺伝子で置換さ れた本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの支配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコー ドする物質の発現をトレースすることにより、 プロモーターの活性を検出するこ とができる。
例えば、 本発明の TGR25をコードする DN A領域の一部を大腸菌由来の )3 —ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明の T GR25の発現する組織で、 本発明の TGR25の代わりに^—ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4—クロ口— 3—インドリル—3 —ガラクトピラノシド （X— ga l) のような )3—ガラクトシダーゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明の TGR25の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明の TGR25欠損 マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 (PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 37ロ付近 で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を ImM EDTAZPBS 溶液で洗浄することによって、 /3—ガラクトシダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観 察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRNAを検出しても よい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。 該スクリーニング方法で得られた化合物は 塩を形成していてもよく、 該化合物の塩としては、 生理学的に許容される金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または 酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金属塩の好適な例としては、 例えばナト リウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。 有機 塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 ェタノ一ルァミン、 ジエタノールアミ ン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N, N'—ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸との塩 の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩 が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフル ォロ酢酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コ ハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 p—トルエンスル ホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例 えばアルギニン、 リジン、 オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との 塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げ られる。 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明の T G R 2 5の発現を促進し、 該 T G R 2 5の機能を促進することができ るので、 例えば、 本発明の T G R 2 5の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤 などの医薬として使用することができる。 具体的には、 該化合物は、 例えば、 抗 炎症剤として、 さらには、 例えば心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジズトロフィー、 筋 変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリックシン ドローム、 白血球減少症、 血小板減少症、 白血球増加症、 血小板増加症癌、 白血 病、 リンパ腫、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 肺水腫、 多臓器不全、 炎症性 腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患の予防 ·治療剤として、 低毒性で安全 な医薬として使用することができる。
本発明の D NAに対するプロモー夕一活性を阻害する化合物またはその塩は、 本発明の T G R 2 5の発現を阻害し、 該 T G R 2 5の機能を阻害することができ るので、 例えば、 本発明の T G R 2 5の発現過多に関連する疾患、 例えば、 心不 全、 遺伝性筋疾患、 筋ジズトロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ボリックシンドローム、 白血球減少症、 血小板減少 症、 白血球増加症、 血小板増加症癌、 白血病、 リンパ腫、 潰瘍性大腸炎、 慢性関 節リウマチ、 肺水腫、 多臓器不全、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性 疾患などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
さらに、 上記スクリ一ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明の T G R25またはその塩とリガンドぺプチドとの結合性を変化させ る化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた はその他の哺乳動物 （ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するズロモー夕一活性を促進する 化合物を経口投与する場合、 一般的に炎症患者 （体重 60 kgとして） において は、 一日につき該化合物を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50m g、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロ乇一夕一活性を促進する化合物を注射剤の形で通常、 炎症患者 （体重 60 kgとして） に投与する場合、 一日につき該ィ匕合物を約 0. 01〜 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0· 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合 も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ一二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明の TGR 25のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に 注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特 異的にその TGR25を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能とな る。 さらに上記プロモータ一部分に適当なレポ一ター遺伝子を結合させ、 これが 発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明の TGR25そのものの体内での産 生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として 使用できる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該 分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に 関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
cDNA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シ卜シン
RNA ： リポ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ：グリシン
A l a ：ァラニン
Va 1 ：バリン
Leu ： ロイシン ■
I 1 e ：イソロイシン S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As p ：ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ：アルギニン
H i s ：ヒスチジン
Ph e ：フエニルァラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
p G 1 u ：ピログルタミン酸
：終止コドンに対応する
Me ：メチル基
E t . ：ェチル基
Bu ：ブチル基
P h ：フエニル基
TC ：チアゾリジン— 4 (R) —力ルポキサミド基 また、 本明細 中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記 する。
T o s ： p—トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル
C12B z 1 ： 2, 6—ジクロ口べンジル Bom ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジルォキシカルポニル
C 1一 Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r -Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c ： t—ブトキシカルポニル
DNP ：ジニトロフエノール
T r t ： 卜 Uチル
Bum ： t一ブトキシメチル
Fmo c ： N- 9一フルォレニルメトキシカルボ：: ：ル
HOB t ： 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t ： 3， 4ージヒドロー 3—ヒドロキシ一 4
1, 2, 3—べンゾ卜リアジン
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルボルネン -2, 3-ジカルボキシイミド DCC 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号： 1] 本発明のヒト由来 TGR 25のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 2] 本発明のヒト由来 TGR 25をコードする cDNAの塩基配列 を示す。.
[配列番号： 3] 実施例 3で使用したプライマーを表す。
[配列番号： 4] 実施例 3で使用したプライマ一を表す。
[配列番号： 5] 実施例 3で使用したプローブを表す。
[配列番号： 6] 実施例 4で使用したプライマーを表す。
[配列番号： 7] 実施例 4で使用したプライマーを表す。
[配列番号： 8] 実施例 4で使用したプローブを表す。 実 施 例
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子は、 モレキュラー ' クローエング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1
GPCR発現プラスミ ドおよびレポータープラスミ ドの宿主細胞 （HeLa) での一過性 発現
まず、 公知の方法によつて作製した Gタンパク質共役型受容体タンパク質 TGR25 (配列番号： 1 ) をコードする cDNAを pAKKO- 111H (Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al. , 1219， 251—259， 1994記載の pAKKO - 1. 111Hと同一のプラスミ ドベクター） に挿入した動物細胞用発現プラスミ ドを用いて、 大腸菌 JM109を 質転換し、 得られたコロニーを単離 '培養後、 QIAGEN Plasraid Maxi Kit (キア ゲン） を用いてプラスミ ドの大量調製を行なった。 また、 血清応答配列 （SRE) の下流にレポーターとしてルシフエラーゼ遺伝子が連結された pSRE_Luc
(Invitrogen) のレポータープラスミ ドおよび Gタンパク質の一種であるヒ ト GaoA、 ヒ ト Gpl、 ヒ ト GY2の発現ベクタープラスミ ドを同様にして調製した。
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミ ドおよびレポータープ ラスミ ドを導入する宿主細胞としては、 HeLa細胞を用い、 384穴アツセィブレー ト （C0STAR 3704) に 4000細胞/穴、 培養液量 25μ1で播種し、 ー晚培養した。 培 地は DMEM (Invitrogen) に 10%のゥシ胎児血清と 1% MEM non - essential amino acids solutionを添加したもの （DMEM/NEAA) を用いた。
各プラスミ ドを 240ngAilの濃度に希釈し、 Gタンパク質共役型レセプタータン パク質の発現プラスミ ド、 あるいは対照実験としてレセプターの発現プラスミ の代りにレセプタータンパク質をコードする DNAを含まない発現べクタ一 pAKKO - 111Hのプラスミ ドを Ιμΐとレポータープラスミ ド 9μ1および GaoA、 Gpl、 Gy2の Gタ ンパク質発現プラスミ ド各 Ιμΐの割合で 240μ1の 0pti_MEM_I (Invitrogen) に添 加した。 これを、 同じく 240μ1の 0pti_MEM- 1に ΙΟμΙの Lipofectamine™ 2000
Reagent (Invitrogen) を添加したものと等量混合して、 添付のマニュアル記載 の方法に従ってリボソームとプラスミ ドの複合体を形成させた。 これらを 5μ1/ 穴ずつ HeLa細胞の培養液に添加し、 プラスミ ドの導入を行った後、 37°C、 5% C02 下で一晩培養した。 実施例 2
レポ一ターアツセィによる ガンド活性の検出
実施例 1で準備した HeLa細胞を、 ゥシ胎児血清を含まない DMEM/NEAA (アツセ ィ用培地） で 2回洗浄後、 ' 37°C、 5¾ C02下で 2時間培養した。 さらにアツセィ用培 地で 1回洗浄後、 0. 05% CHAPSを含むアツセィ用培地に溶解した AM251 (Bioraol) を各穴の細胞に添加した。 サンプル添加後に 37°C、 5% C02下で 4時間のインキュ ベーシヨンを行ない、 レセプ夕一を介したリガンドのァゴニスト活性によって惹 起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター遺伝子の転写 ·翻訳の促進を 誘導した。 インキュベーション終了後に各穴の培地を除去し、 ルシフェラーゼ活 性測定用の基質であるピツカジーン LT2. 0 (東洋インキ社） を 8 ずつ加えた。 細胞が溶解し、 基質と充分に混合した後、 各穴のレポーター遺伝子の発現誘導量 に由来する化学発光量をプレートリーダ一 （EnVis ion™、 パーキンエルマ一） に て測定した。
その結果、 表 1に示したように TGR25の発現細胞で AM251 (2^) 添加によって ルシフェラ一ゼ活性亢進が認められた。 一方、 対照の pAKKO- 111H導入細胞では、 AM251 (2^) を添加しても有意な活性の亢進は検出されなかった。
〔表 1〕.
TGR25発現細胞における AM251によるルシフェラーゼ活性 （cps) の亢進
AM251濃度 （ M) TGR25 pAKKO-l l lH (対照）
0 7527 6220
2 17897 5756
実施例 3
ヒト TGR25 niRNAの発現分布
mRNAの発現量の定量には ABI PRISM7700 SequenceDetector (アプライドバイオ システムズ社） を用いた。 発現量の定量に用いるプライマ一 [5， - TGAGTGTGGGACAAATGCATGT-3' (配列番号： 3 ) 、 5'-ACACAGGTGAGGGTCATGTTAGG-3'
(配列番号： 4 ) ] とプロ一ブ [5，- ATCGTCTTCTCTCACCAGCGACCGC- 3， （配列番 号： 5 ) ] は、 ヒト型 TGR25の塩基配列 （配列番号： 2 ) をもとに ABI PRISM SequenceDetec tor専用のソフトウェア PrimerExpress (アプライドバイオシステ ムズ社） を利用してデザインした。 铸型となる cDNAは、 ヒト各種組織由来の全 RNA (クロンテック社） gからランダムプライマーを用いて逆転写反応して合 成したものを使用した。 逆転写反応は逆転写酵素として SuperScriptl l (GIBC0 BRL社） を使用し、 添付のプロトコールにしたがって行った。 ABI PRISM7700 SequenceDetectorの反応液は TaqMan Universal PCR Mas ter Mix (アプライドパ ィォシステムズ社) を 12. 1、 各プライマーを 0. 9 ¾1、 プロ一ブを 0. 25 ¾1、 cDNA 溶液を混合し、 蒸留水で 25^1として調製した。 ABI PRISM7700
SequenceDetectorでの反応は、 50°Cで 2分、 95°Cで 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返して行った。 ヒト各種組織での mRNAの発現分 布を図 1に示す。 骨髄で高い発現量が検出された。 実施例 4
マウス TGR25 mRNAの 3T3- L1細胞における発現
マウス由来 3T3- L1細胞は常法により培養した （前駆脂肪） 。 この細胞をインス リン （li^g/ml) 、 デキサメタゾン 2· 5/ίΜ、 ΙΒΜΧ 0. 5mM添加により 2日間分化誘 導をかけ、 その後インスリン （ΙΟ zg/ml) を含む培地で 12日間培養し、 脂肪細胞 へ分化させた。 それぞれの細胞より Isogen (二ツボンジーン社） を用いて、 マ二 ュアルにしたがい、 全 RNAを調製した。 铸型となる cDNAは、 実施例 1と同様の方 法で調製した。 mRNAの発現量の定量には ABI PRISM7700 SequenceDetector (ァプ ライドバイオシステムズ社） を用いた。 発現量の定量に用いるプライマー [5， - GCTGTCGGAACCTGTAGAGATCA-3 ' (配列番号： 6 ) 、 5，- TCCCAGMTACACAGGTGAGGAT - 3， (配列番号： 7 ) ] とプローブ [5，- TCCCATGAGCGTCAACCACCTMCGT- 3， （配列番 号： 8 ) ] は、 マウス型 TGR25の塩基配列 （Mol . Cel l . Bi ol . 20, 4405-4410 (2000) ) をもとに ABI PRISM SequenceDetector専用のソフトウェア
PrimerExpress (アプライドバイオシステムズ社） を利用してデザインした。 ABI PRISM 7700 SequenceDetec torでの反応は、 50°Cで 2分、 95°Cで 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返して行った。 前駆脂肪細胞では 25ng全 RNAあたり 35コピーと発現量は非常に少なかったが、 脂肪細胞へ分化させると 25ng全 RNAあたり 81582コピーに上昇し、 脂肪分化により発現が上昇した。 実施例 5
CH0細胞に発現させた TGR25- GFP融合タンパク質の AM251添加による細胞内移行
TGR25の C末端に翻訳のフレ一ム合わせてォワンクラゲより単離された Green Fluorescent Prote in (GFP) cDNAをつないだ融合タンパク質を発現させるための 発現プラスミドを構築した。 その際 GFP cDNAには GFPの発現ベクター PQBI25 (宝 酒造） から切り出した断片を用いた。 TGR25は PCR法によりその終止コドンを制限 酵素 Nhelの認識配列に修正し、 ここに GFP断片を連結して、 実施例 1に記載の発 現ベクター pAKKO- 1 1 1Hに挿入した。 このようにして得た TGR25と GFPの融合夕ンパ ク質 （以下、 TGR25-GFP融合タンパク質） 発現べクタ一のプラスミドを用いて、 公知の方法で TGR25- GFPを安定的に発現する TGR25- GFP発現 CH0 (CHO-TGR25-GFP) を作製した。 これをチェンバー数 8つの Lab- Tekl lカバーグラスチェンバ一
(Nal en Nunc社） にまき、 37°C、 5¾ C02条件下で一晩培養した後、 共焦点顕微 鏡 （ライカ社） で GFPの蛍光像を観察した。 その後、'培地を AM251 ΙΟΟ^Μ含有の DMEM (Dulbecco' s Mod i f i ed Eagl e Medium) (GIBC0 BRL社) に置き換え、 37 、 5% C02条件下で 45分間反応させ、 共焦点顕微鏡で GFPの蛍光像の変化を観察した。 その結果、 AM251添加前には細胞膜を中心に検出された TGR25- GFP融合タンパク 質の一部が細胞質に移動していることが見出された。 このことは TGR25が AM251に 反応して細胞質へ移行、 すなわち AM251が TGR25に作用していることを示していた。 実施例 6
( 1 ) ヒト末梢血からの血球細胞の調製
健常人ポランティァ由来へパリン添加ヒト末梢血をリン酸緩衝生理食塩水 ( PBS) で 4倍に希釈し、 Fi col卜 Paque™ Plus (Amersham Biosc i ences) に重層 ' した。 800 Gで 40分間遠心した後、 浮遊層 （リンパ球および単球画分） および 沈澱層 （多形核白血球および赤血球画分） をそれぞれ回収し、 PBS (リン酸緩衝 生理食塩水） で 2 回洗浄した。 浮遊層画分はそのまま培養用培地 （10% 非働化 ゥシ胎児血清を含む RPMI1640培地） に懸濁してリンパ球 ·単球浮遊液とした。 沈澱層画分は滅菌水中で 40 秒間の浸透圧ショックによって溶血させた後、 1/10 容の 10倍濃縮 PBS を^加し、 さらに培養用培地で洗浄して同培地に懸濁し、 多形核白血球浮遊液とした。
(2) RT-PCR による TGR25 mRNA のヒト末梢血血球細胞での発現量の検討 血球細胞からの Total RNA の調製は、 上記で調製したリンパ球、 単球および 多形核白血球を用いて、 Isogen (二ツボンジーン） の処方に従って行なった。 得 られた Total RNA を DNasel (Amplification Grade, Invitrogen) で処理後、 l g を Superscript II RNase H" Reverse Transcriptase (Invitrogen) およ び Random Primers (Invitrogen) を用いて、 処方に従い cDNA を合成した。
cDNAは Total RNA換算で 25 ng/ ΐ の溶液とし、 以後の PCR反応の錡型とし て用いた。 PCR反応は Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosysteras) を用い、 増幅と検出のためのプライマーおよび TaqMan probe は、 実施例 3 で用いたもの （配列番号： 3、 4 および配列番号： 5) を使用した。 PCR反応液は TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosys terns) 12.5 1 に、 それぞれ IOO M のプライマー溶液を 0.05 1、 5 M の TaqMan probe を 0.5 し および上記で調製した cDNA溶液を 0.5^1 加え、 蒸留水で総反応 液量を とした。 PCR反応は 50°C を 2 分、 95°C を 10 分の後、 95°C を 15秒、 60°C を 1 分のサイクルを 40 回繰り返した。 TGR25 mRNAの発現量は、 増幅 DNA を含む標準 DNA断片を铸型とした PCR反応から得られた検量線を用 いて Total RNA 25 ng 当りのコピー数として算出した。
結果を図 2に示す。 TGR25 が多形核白血球で特異的に高発現していた。 実施例 7
ヒト末梢血多形核白血球に対する AM251の MAPキナーゼ活性抑制作用
TGR25が高発現していると考えられるヒト末梢血多形核白血球に対し、 MAPキナ ーゼ （ERK1/2) の活性化 （リン酸化） 状態を指標に TGR25ァゴニスト （AM- 251) ■ の作用を調べた。 実施例 6— (1) に記載した方法に従って健常人末梢血より多 形核白血球の細胞集団を分離回収した。 該細胞は、 氷冷 HBSS (Hank' s balanced salt solution, インビトロジェン社)で 4xl06 cells/mlの濃度に懸濁後、 2x10， 胞 （0.5ml) ずつプラスチックチューブに分け、 37°Cで 5分間静置した。 その後、 AM251を終濃度 30 M、 10 iMになるように添加し、 37°Cで 5分間、 10分間、 30分間 静置、 遠心後、 上清を除未して細胞沈渣を得た。 該細胞には直ちに 50 1の Blue Loading Buffer (第一化学薬品） を添加し、 ピペッティングにて細胞を溶解した。 さらに該細胞溶解液を超音波処理後 95°Cで 5分間熱処理を行い、 遠心分離
(15,000 rpm, 4°C, 5分間） を行い、 上清を細胞粗蛋白質抽出液として得た。 次に該蛋白質 （各 10 1分） を 10% SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、 公知の方法にて PVDF膜 (BIO- RAD社）に電気的に転写した。 次に該膜をまず 5%ゥシ 血清アルブミンを含む TBS-T溶液（50 mM Tris-HCl (pH7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween- 20)でブロッキング後、 一次抗体 (Phospho-p44/42 Map Kinase antibody; 第一化学薬品、 2000倍希釈） を含む TBS- T溶液に浸し、 室温で 1時間振とうした。 次に該膜を TBS- T溶液で洗浄後、 TBS-T溶液で 5000倍希釈したホースラディッシュ ペルォキシダ一ゼ標識二次抗体 (Goat Ant i -Rabbit IgG, HRP-conjugate, 第一 化学薬品）に浸し、 室温で 1時間浸とうした。 最後に該膜を TBS- T溶液で再洗浄後、 ECLplus Western Blotting Detection System (Amers am Biosciences社)とフレミ ノ ·イメージアナライザー (LAS- 1000; FUJIFILM)を用いて化学発光の検出を行つ た。
結果耷図 3に示す。
解析の結果、 A 251処理細胞ではヒト末梢血多形核白血球の MAPキナーゼ
(ERK1/2) のリン酸化 （活性化） が抑制されていることが明らかとなった。 実施例 8
HL- 60細胞株に対する AM251の分化促進作用
ヒト白血病細胞株 （ヒト急性前骨髄性白血病細胞由来） HL- 60は DMS0
(dimethyl sulfoxide)処理により好中球様細胞に分化することが知られている (Blood, 70, 1233-1244 (1987)) 。 実施例 3に準拠した遺伝子発現解析で該細 胞株での TGR25の発現が確認された。 そこで、 同細胞の分化への TGR25ァゴニスト である AM251の作用を調べた。 増殖期の HL- 60細胞を 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI 1640培地で懸濁後、 12穴組織 培養プレート （日本べクトンディッキンソン社） に 5xl04細胞ずつ播種した。 該 細胞は、 DMS0 (終濃度 1.25%)存在下、 または DMS0 (終濃度 1.25%)と AM25 終濃度 10 M)共存下、 37° (：、 5%C02で 4日間培養することで分化誘導させた。 細胞分 化の程度は、 分化マーカ一である細胞表面抗原 CDllb/Mac- 1の発現量を指標に、 蛍光標識抗体 (PE-anti-human CDllb/Mac-K 日本べクトンディッキンソン社） と フローサイトメトリー （BD FACSVantage™、 日本べクトンディッキンソン 社） を用いて解析した。
結果を図 4に示す。
薬剤非添加コントロール細胞群に比べ、 1.25% DMS0処理 HL-60細胞群で CD11 b/Mac-1の発現亢進が認められたが、 AM251 (10 M)の共存下ではその発現量が さらに増大した。 AM251は HL- 60の好中球様細胞分化に対し、 促進的に作用する ことが明らかとなった。 実施例 9
レポ一夕一アツセィによる AM281および DH97のリガンド活性の検出
実施例 1と同様にして HeLa細胞に TGR25を一過性に発現させ、 実施例 2と同 様の方法で細胞を洗浄後、 CHAPSを含むアツセィ用培地に溶解した AM281
(T0CRIS) または DH97 (T0CRIS) を添加した。 さらに 37°C、 5%C02下で 4時間 のインキュベーション後、 実施例 2と同様にしてァゴニスト活性を測定した。 そ の結果、 表 2および表 3に示すように TGR25の発現細胞において、 AM281
(20^M) または DH97 (20/ M) の添加によりルシフェラ一ゼ活性亢進が認めら れた。 一方、 対照の ρΑΚΚΟ-lllH導入細胞では、 AM281 (20 iM) または DH97 (20 ¾0 を添加しても有意な活性の亢進は検出されなかった。
〔表 2〕
TGR25発現細胞における AM281によるルシフェラ一ゼ活性の亢進 （cps)
AM281 濃度 ( Μ) TGR25 pAK O-lllH (対照）
0 6113 4506
20 9279 4590 〔表 3〕
TGR25発現細胞における DH97によるルシフエラ一ゼ活性の亢進 （cps )
Figure imgf000133_0001
産業上の利用可能性
TGR 2 5とリガンドまたはその塩の結合性またはシグナル伝達を変化させる 化合物またはその塩は、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウ チ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性 疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫、 多臓器不全などの予防 ·治療作用を 有する。
TGR 2 5の活性を促進する^合物またはその塩 （例、 化合物 （I) 、 化合物 (II) など） 、 TGR 2 5とリガンドとの結合を促進する化合物またはその塩、 TGR 2 5などは、 例えば、 低毒性な、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性 腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患などの予防 ·治療剤として有用である。
TGR 2 5の活性を阻害する化合物またはその塩、 TGR 2 5の抗体、 TGR 2 5のアンチセンスポリヌクレオチドなどは、 例えば、 低毒性な、 白血球増多症 の予防 ·治療剤または白血球賦活剤として有用である。
TGR 2 5およびそのリガンドは、 例えば、 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原 病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋 変性疾患、'心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシン ドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫、 多臓器不全などの予防 · 治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。

Claims

請求の範囲
1. (1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部分 ペプチドまたはその塩、 および （2) リガンドまたはその塩を用いることを特徴 とする、 該レセプ夕ータンパク質またはその塩と該リガンドまたはその塩との結 合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法。
2. リガンドが、 式
Figure imgf000134_0001
〔式中、 A r1および A r 2は、 それぞれ置換基を有していてもよいァリール、 R1は、 置換基を有していてもよい炭化水素基、
R2および R3は、 それぞれ水素原子、 または置換基を有していてもよい同素も しくは複素環基を示す〕 で表される化合物またはその塩である請求項 1記載のス クリーニング方法。
3. リガンドが、 AM251 〔1- (2， 4-ジクロロフエ二ル）- 5- (4-ョ一ドフエ二 ル)- 4-メチル -N-ピペリジン- ィル -1H-ピラゾール- 3-力ルポキサミド〕 または AM281 〔卜（2， 4-ジクロロフエ二ル)- 5- (4-ョードフエ二ル)- 4-メチル -N-モ ルホリン- 4-ィル- 1H-ピラゾ一ル- 3 -カルボキサミド〕 である請求項 1記載のスク リーニング方法。
4. リガンドが、 AM251である請求項 1記載のスクリーニング方法。
5. リガンドが、 式
Figure imgf000135_0001
〔式中、 環 Aは、 置換基を有していてもよいベンゼン環、
R4および R5は、 それぞれ水素原子、 置換基を有していてもよい炭化水素基、 置換基を有していてもよい複素環基またはァシル、
R6は、 置換基を有していてもよい炭化水素基、
Xは、 _NR7— （R7は、 水素原子、 置換基を有していてもよい炭化水素基ま たは置換基を有していてもよい複素環基を示す） 、 — O— または 一 S— を示 す〕 で表される化合物またはその塩である請求項 1記載のスクリーニング方法。
6. リガンドが、 DH97 〔N- [2- (2-ベンジル- 1H-インドール- 3-ィル）ェチル] ペンタンアミド〕 である請求項 1記載のスクリーニング方法。
7. (1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部分 ペプチドまたはその塩、 および （2) リガンドまたはその塩と該レセプ夕一夕ン パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを 特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩に対するァゴニストまたはアン タゴニストのスクリーニング方法。 ，
8. リガンドが、 AM251、 AM281または DH97である請求項 7記載の スクリーニング方法。
9. (1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その部分 ペプチドまたはその塩、 および （2) リガンドまたはその塩を含有することを特 徴とする該レセプ夕一タンパク質またはその塩と該リガンドまたはその塩との結 合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キ ' ッ卜。
1 0 . リガンドが、 AM 2 5 1、 AM 2 8 1または DH 9 7である請求項 9記載 のスクリーニング用キッ卜。
1 1 . ( 1 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その部 分ペプチドまたはその塩、' および （2 ) リガンドまたはその塩と該レセプター夕 ンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有するこ とを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩に対するァゴニストまたは アン夕ゴニス卜のスクリーニング用キッ卜。
1 2. リガンドが AM 2 5 1、 AM 2 8 1または DH 9 7である請求項 1 1記載 のスクリーニング用キット。
1 3 . リガンドまたはその塩と配列番号： 1で ¾わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一夕 ンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してな る医薬。
1 4. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に 対するリガンドを含有してなる白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰 瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾 患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心 筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メタポリックシンドローム、 血 小板減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫または多臓器不全の予防 ·治療剤。
1 5. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に 対するァゴニストを含有してなる白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎 症性疾患の予防 ·治療剤。
1 6 . ァゴニストが、 式
Figure imgf000137_0001
〔式中、 A r1および A r 2は、 それぞれ置換基を有していてもよいァリ一ル； R1は、 置換基を有していてもよい炭化水素基； R2および R3は、 それぞれ水素 原子、 または置換基を有していてもよい同素もしくは複素環基を示す〕 で表され る化合物またはその塩、 または式
Figure imgf000137_0002
〔式中、 環 Aは、 置換基を有していてもよいベンゼン環、
R4および R5は、 それぞれ水素原子、 置換基を有していてもよい炭化水素基、 置換基を有していてもよい複素環基またはァシル、
R6は、 -置換基を有していてもよい炭化水素基、
Xは、 一 NR7— （R7は、 水素原子、 置換基を有していてもよい炭化水素基ま たは置換基を有していてもよい複素環基を示す） 、 一 O— または 一 S— を示 す〕 で表される化合物またはその塩である請求項 15記載の予防 ·治療剤。
17. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型,レセプ夕一タンパク質またはその塩に 対するアン夕ゴニストを含有してなる白血球増多症の予防 ·治療剤または白血球 賦活剤。
18. リガンドまたはその塩を配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプ夕一夕ン パク質を含有する細胞に接触させた場合と、 試験化合物を配列番号： 1で表され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパ ク質共役型レセプ夕一タンパク質を含有する細胞に接触させた塲合における結合 性またはシグナル伝達の変化を比較することを特徴とする該レセプ夕一夕ンパク 質またはその塩に対するァゴニストのスクリーニング方法。
1 9 . リガンドまたはその塩の存在下、 試験化合物を配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質 共役型レセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場合における結合性ま たはシグナル伝達の変化を測定することを特徴とする、 該レセプタータンパク質 またはその塩に対するアンタゴニストのスクリーニング方法。
2 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩を含有してなる白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫 瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病また は炎症性疾患の予防 ·治療剤。
2 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してな る白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマ チ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎症性疾患の予防 ·治療剤。
2 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその部分べ プチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してな る白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマ チ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂 血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリックシンドローム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫または多臓器不全の診断剤。
2 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる白血球増多症の予防 ·治療剤 または白血球賦活剤。
2 4. 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる白血球減少症、 白血病、 リン パ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病、 炎症性疾患、 白血球増多症、 心不全、 遺伝性筋疾患、 筋ジストロフィー、 筋変性疾患、 心筋梗塞、 肥満、 糖尿病、 高脂血症、 動脈硬化症、 メ夕ポリツクシ ンドロ一ム、 血小板減少症、 血小板増加症、 癌、 肺水腫または多臓器不全の診断 剤。
2 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク質またはその部分べ プチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩 基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる白血球増 多症の予防 ·治療剤または白血球賦活剤。
2 6 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプター夕 ンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩、 （i i) 上記レセプタ一タンパク質ま たはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ ド、 （i i i) 上記レセプタータンパク質またはその塩に対するァゴニスト、 また は （iv) レセプタータンパク質またはその塩に対するリガンドの有効量を投与す ることを特徴とする白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎症性疾患の予 防 ·治療方法。
2 7 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一夕 ンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 (i i) 上記レセプ夕一 タンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポ リヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオ チド、 または （i i i) 上記レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するアンタゴ 二ストの有効量を投与することを特徴とする白血球増多症の予防 ·治療方法また は白血球賦活方法。
2 8 . 白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰瘍性大腸炎、 慢性関節リ ゥマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎症性疾患の予防 ·治療剤を 製造するための （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩、 （i i) 上記レセプ夕一タンパク質またはその部 分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(i i i) 上記レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するァゴニスト、 または
(iv) レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するリガンドの使用。
2 9 . 白血球増多症の予防 ·治療剤または白血球賦活剤を製造するための （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部分ペプチドまた はその塩に対する抗体、 (i i) 上記レセプタータンパク質またはその部分べプチ ドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配 列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、 または （i i i) 上記レセプ 夕一タンパク質またはその塩に対するアンタゴニス卜の使用。
3 0 . 骨髄に存在する幹細胞、 間葉系未分化細胞もしくは幼若造血系細胞の機能、 または骨髄内造血支持組織中に存在する脂肪細胞もしくは脂肪前駆細胞の機能を 制御することを特徴とする請求項 1 4記載の医薬。
3 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その部分べプチ ドまたはその塩の活性、 または上記レセプタータンパク質に対するリガンドの活 性を促進することを特徴とする白血球減少症、 白血病、 リンパ腫、 悪性腫瘍、 潰 瘍性大腸炎、 慢性関節リウマチ、 炎症性腸疾患、 扁桃腺疾患、 膠原病または炎症 性疾患の予防 ·治療方法。
3 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク質、 その部分べプチ ドまたはその塩の活性、 または上記レセプタータンパク質に対するリガンドの活 性を阻害することを特徴とする白血球増多症の予防 ·治療方法または白血球賦活
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