JP4772684B2 - スクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＧＰＲ３５受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドとＧＰＲ３５受容体とを用いる医薬のスクリーニング方法およびスクリーニング用キット、該スクリーニング方法またはキットによって得られうる化合物などに関する。詳細には、消化器疾患などの予防・治療剤などのスクリーニング方法およびスクリーニング用キットなどに関する。

Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）は、７回膜貫通型受容体で、ホルモン、神経伝達物質、サイトカインや他の分子のシグナルを細胞膜内へ伝える働きを行っている。
ヒトＧＰＲ３５（非特許文献１ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４７巻、３１０−３１３頁、１９８８年）はＧＰＣＲの一つで、そのリガンドは報告されていない。ヒト胃癌から抽出したＧＰＲ３５のｃＤＮＡ断片に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフォームさせる活性があることを示唆することが報告されている（非特許文献２ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９５巻、１３１−１３５頁、２００４年）。
６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンは、グルタミン酸受容体に作用するＮＭＤＡ拮抗薬として知られている（非特許文献３ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３２巻、２８１−３０３頁、１９９０年）。
エラグ酸は、イチゴなどに含まれている天然のポリフェノールで、抗癌作用（非特許文献４ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０２巻、４２９−４４６頁、１９８８年）、抗酸化作用（非特許文献５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４２巻、１４４１−１４４５頁、１９９１年）などの生理作用を有することが知られている。

安全で優れた消化器疾患、癌、免疫疾患または糖尿病などの予防・治療剤が求められている。
本発明者たちは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンなどのキノキサリン−２，３−ジオン化合物およびエラグ酸がＧＰＲ３５のリガンドであることを見出した。ＧＰＲ３５とキノキサリン−２，３−ジオン化合物またはエラグ酸とを用いて、消化器疾患、癌、免疫疾患などに有効な医薬の探索が可能となると考え、これらの知見に基づき、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（ｂ）該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２〕 リガンドが、キノキサリン−２，３−ジオン化合物である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕 キノキサリン−２，３−ジオン化合物が、６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、または５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンである上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕 リガンドが、エラグ酸である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔６〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｂ）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、該リガンドの該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較する、上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔７〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｂ）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該リガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する、上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔８〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔７〕記載のスクリーニング方法、
〔９〕 リガンドが、標識したリガンドである上記〔６〕〜〔８〕記載のスクリーニング方法、
〔１０〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｂ）該リガンドの存在下または非存在下、試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１１〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｂ）該リガンドの存在下または非存在下、試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１２〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔１１〕記載のスクリーニング方法、
〔１３〕 細胞刺激活性が、細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下または上昇である、上記〔１０〕〜〔１２〕記載のスクリーニング方法、
〔１４〕 （ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（ｂ）該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔１４ａ〕 上記〔１〕記載のスクリーニング方法または上記〔１４〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
〔１４ｂ〕 化合物が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とリガンドとの結合を阻害する化合物またはその塩である上記〔１４ａ〕記載の化合物またはその塩、
〔１４ｃ〕 アゴニストである上記〔１４ｂ〕記載の化合物またはその塩、
〔１４ｄ〕 アンタゴニストである上記〔１４ｂ〕記載の化合物またはその塩、
〔１４ｅ〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とリガンドとの結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔１４ｆ〕 上記〔１４ｃ〕記載の化合物またはその塩を含有してなる消化管疾患またはＩＩ型糖尿病の予防・治療剤、
〔１４ｇ〕 上記〔１４ｄ〕記載の化合物またはその塩を含有してなる消化器癌、免疫疾患または肥満の予防・治療剤、
〔１５〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる消化管疾患またはＩＩ型糖尿病の予防・治療剤、
〔１６〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる消化器癌、免疫疾患または肥満の予防・治療剤、
〔１７〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンド、
〔１８〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする消化管疾患またはＩＩ型糖尿病の予防・治療法、
〔１９〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする消化器癌、免疫疾患または肥満の予防・治療法、
〔２０〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消化管疾患またはＩＩ型糖尿病の予防・治療法、
〔２１〕 配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消化器癌、免疫疾患または肥満の予防・治療法、
〔２２〕 消化管疾患またはＩＩ型糖尿病の予防・治療剤の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用、
〔２３〕 消化器癌、免疫疾患または肥満の予防・治療剤の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用などに関する。
以下、「配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドもしくはその塩」を「本発明の受容体」または「本発明の蛋白質」と略記する場合がある。さらに、「本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド」を「本発明のリガンド」と略記する場合がある。
さらに、本発明は、
（ｉ）標識したＧＴＰγＳの存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉ）細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物をＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｖ）本発明のリガンドを、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｖ）本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｖｉ）標識したイノシトールの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｖｉｉ）本発明のリガンドを、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物をＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｖｉｉｉ）本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｘ）標識したルビジウムの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、標識したルビジウムの流出活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｘ）本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｘｉ）ヒスチジン合成遺伝子を導入した本発明の受容体発現酵母を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、本発明のリガンドを接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を接触させた場合の、該酵母の生育を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｘｉｉ）本発明のリガンドを、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドの存在下または非存在下、試験化合物を本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法なども提供する。

図１は、ＧＰＲ３５およびＧα１５を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞にＤＮＱＸを添加した時の、細胞内Ｃａ^２＋濃度の変化を調べた結果を表す。図中、縦軸は細胞内Ｃａ^２＋濃度を示す蛍光強度を、横軸は測定開始後の時間経過（秒）を、◇はＤＮＱＸ ０．３μＭ、□はＤＮＱＸ １．０μＭ、△はＤＮＱＸ ３．０μＭ、×はＤＮＱＸ １０μＭの場合をそれぞれ表す。
図２は、ＧＰＲ３５およびＧα１５を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞にエラグ酸を添加した時の、細胞内Ｃａ^２＋濃度の変化を調べた結果を表す。図中、縦軸は細胞内Ｃａ^２＋濃度を示す蛍光強度を、横軸は測定開始後の時間経過（秒）を、◇はエラグ酸 ０．３μＭ、□はエラグ酸 １．０μＭ、△はエラグ酸 ３．０μＭ、×はエラグ酸 １０μＭの場合をそれぞれ表す。
図３は、ＧＰＲ３５を安定発現させたＣＨＯ細胞における、ホルスコリン刺激によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のＤＮＱＸおよびＮＢＱＸ添加による抑制作用を調べた結果を表す。図中、縦軸はｃＡＭＰ量（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）を、横軸はホルスコリン（ＦＳＫ）、ＤＮＱＸおよびＮＢＱＸの各添加量をそれぞれ表す。

配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：７で表されるアミノ酸配列、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、本発明の受容体としては、（ｉ）配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本発明の受容体の具体例としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質などが挙げられる。
本発明の受容体の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであってもよく、例えば、本発明の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のリガンド結合活性などを有するものなどが用いられる。
配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
具体例としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第２４〜２９５番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチド、配列番号：７で表されるアミノ酸配列の第２４〜２９５番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチド、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列の第５５〜３２６番目のアミノ酸配列、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列の第６５〜３３６番目のアミノ酸配列、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列の第１０９〜３８０番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチド、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の第２３〜２９４番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチドなどが用いられる。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。Ｃ末端はカルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキルもしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキルなどのＣ_７−１４アラルキルのほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルなどが用いられる。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシ（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシがアミド化またはエステル化されているものも本発明の受容体および本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の受容体および本発明の部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシルなど）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシルなど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明の受容体または本発明の部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド（本発明のリガンド）としては、本発明の受容体と特異的に結合するものであれば、何れの物であってもよい。例えば、本発明の受容体との結合の解離定数が１０μＭ以下、好ましくは２μＭ以下、さらに好ましくは１μＭ以下、特に好ましくは２００ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下である物などが挙げられる。
本発明のリガンドとしては、例えば、キノキサリン−２，３−ジオン化合物、エラグ酸などが用いられる。
キノキサリン−２，３−ジオン化合物としては、キノキサリン−２，３−ジオン骨格を有する化合物であればいずれでもよく、例えば６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、または５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンなどが挙げられる。好ましくは、６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンなどが挙げられる。
標識されたキノキサリン−２，３−ジオン化合物、標識されたエラグ酸も、本発明のリガンドに含まれる。
標識物質としては、放射性同位元素（例、〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３２Ｐ〕、〔^３３Ｐ〕、〔^３５Ｓ〕など）、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質（例、ルミノールなど）、酵素（例、ペルオキシダーゼなど）、ランタニド元素などがあげられる。中でも、放射性同位元素が好ましい。
標識したリガンドとして好ましくは、〔^３Ｈ〕または〔^１２５Ｉ〕でそれぞれ標識された６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、または５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンなどが挙げられる。好ましくは〔^３Ｈ〕または〔^１２５Ｉ〕で標識された６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンである。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、ペプチド合成法に準じて製造することもできる。例えば、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５６巻、１２−２１頁、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４４６巻、５７−７０頁、１９９９年などに記載の方法またはこれに準じた方法により、製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩の合成には、通常、市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、受容体、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ_１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
本発明の受容体または部分ペプチドを得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、受容体またはその部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望の受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の受容体または部分ペプチドは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは受容体の部分ペプチドについては、受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明受容体または部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法があげられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の受容体または部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる受容体または部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明の受容体または部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。このうちＤＮＡが好ましく、該ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明の受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２０で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、本発明の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。具体的には、配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、自体公知の方法で標識化されていてもよい。標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質、酵素、ビオチン、ランタニド元素などがあげられる。
本発明の受容体または部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明の受容体または部分ペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明の受容体または部分ペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された受容体をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、例えば、（ａ）本発明の受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ｂ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の受容体のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウィルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来、のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ^ＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウィルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７），Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地、〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明の受容体または部分ペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の受容体または部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明の受容体または部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる受容体または部分ペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる受容体または部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドは、市販されている場合には市販品をそのまま用いることもでき、自体公知の方法またはこれらに準じた方法に従って抽出または製造することもできる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明の受容体に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の受容体に対する抗体としては、受容体のシグナル伝達を不活性化する抗体、受容体のシグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。
本発明の受容体に対する抗体は、本発明の受容体を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の受容体は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明の受容体に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、該ポリヌクレオチドに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）であってもよい。
具体的には、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）が挙げられ、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明の受容体のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
具体的には、配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。好ましくは例えば、配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、配列番号：２、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４または配列番号：２８で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスＤＮＡなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明の受容体遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいはアミノ酸が決定された蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明の受容体遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明の受容体関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明の受容体遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明の受容体関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明の受容体関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明の受容体遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。蛋白質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、蛋白質翻訳終止コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係については、目的核酸が対象領域とハイブリダイズすることができる場合は、その目的核酸は、当該対象領域のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンスヌクレオチドは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンスヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明の受容体の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下に、（ｉ）本発明の受容体、（ｉｉ）本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）、（ｉｉｉ）本発明の受容体に対する抗体（本発明の抗体）、（ｉｖ）本発明の受容体のアンチセンスポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）（例、本発明のアンチセンスＤＮＡ）、（ｖ）本発明の受容体に特異的に結合する能力を有するリガンド（本発明のリガンド）などの用途を説明する。
〔１〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のリガンドは、例えば、消化管機能調節活性、腸管細胞増殖調節活性などを有する。
本発明の受容体を用い、または組換え型本発明の受容体の発現系を用いたリガンドレセプターアッセイ系を用いることにより、本発明の受容体と、本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
該化合物またはその塩には、（ｉ）本発明の受容体を介して細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、微小管結合蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性、受容体細胞内移行活性など）を有する化合物（アゴニスト）、（ｉｉ）上記細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、（ｉｉｉ）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、（ｉｖ）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物などが含まれる。
具体的には、（ｉ）本発明の受容体に、本発明のリガンドを接触させた場合と（ｉｉ）本発明の受容体に、本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なう。比較は、例えば、本発明の受容体に対する本発明のリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して行う。
本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、例えば、
（ａ）本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、本発明のリガンドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｂ）本発明のリガンドを、本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明のリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｃ）本発明の受容体が、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（ｂ）記載のスクリーニング方法、
（ｄ）本発明のリガンドが、標識したリガンドである上記（ａ）〜（ｃ）のスクリーニング方法などのレセプター結合アッセイ系、
（ｅ）本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｆ）本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｇ）本発明の受容体が、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（ｆ）のスクリーニング方法などの細胞刺激アッセイ系などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明の受容体としては、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適に用いられる。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。
本発明の受容体を製造するには、前述の本発明の受容体の製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。製造方法は前述と同様である。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、１細胞当たり１０^３〜１０^８分子であるのが好ましく、１０^５〜１０^７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
前記のレセプター結合アッセイ系や細胞刺激アッセイ系などのスクリーニング方法を実施するためには、例えば、本発明の受容体画分と、本発明のリガンド（例、標識した本発明のリガンド）などが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとしては、例えば、放射性同位元素（例、〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３２Ｐ〕、〔^３３Ｐ〕、〔^３５Ｓ〕など）、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質（例、ルミノールなど）、酵素（例、ペルオキシダーゼなど）またはランタニド元素などで標識されたリガンドなどを用いることができる。
具体的には、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドと受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のリガンドを添加し、同時に１０^−１０〜１０^−７Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃〜５０℃、望ましくは４℃〜３７℃で２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ_０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ_０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
さらに、表面プラズモンセンサー技術を利用することによって、本発明の受容体に結合する化合物をスクリーニングすることもできる。
具体的には、ビアコア３０００（ビアコア社）のセンサーチップ表面に、本発明の受容体を固定化後、チップ表面にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）などに溶解した試験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、本発明の受容体に結合する試験化合物を選択する。例えば、表面プラズモンの変化の測定値が５レゾナンスユニット以上与える試験化合物を本発明の受容体に結合性を有する物質として選択する。
前記の細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法を実施するためには、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、微小管結合蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性または抑制する活性、受容体細胞内移行活性など）を、自体公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、蛋白質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよく、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、生理学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
上記細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法について、さらに具体的に以下（１）〜（１２）に記載する。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のＧ蛋白質が活性化されてＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくと、ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧ蛋白質に結合するが、加水分解されずにＧ蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞膜に残存した標識されたＧＴＰγＳを測定することにより、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。
この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
この方法は、本発明の受容体を含む膜画分を用いて行う。本測定法において本発明の受容体膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストである。
具体的には、標識したＧＴＰγＳの存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定することにより、アゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１μＭ ＧＤＰ、０．１％ＢＳＡ；ｐＨ７．４）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをＦａｌｃｏｎ２０５３に０．２ｍｌずつ分注し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を加え、さらに終濃度２００ｐＭとなるように［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳを加える。２５℃で１時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳ；ｐＨ７．４）１．５ｍｌを加えて、ガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｆでろ過する。６５℃、３０分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放射活性を測定する。本発明のリガンドのみを加えた実験区の放射活性を１００％、本発明のリガンドを加えなかった実験区の放射活性を０％とし、本発明のリガンドによるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
（２）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰの産生が抑制される。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
本発明の受容体発現細胞内のｃＡＭＰ産生量は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗ｃＡＭＰ抗体と〔^１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰ（ともに市販品）を使用することによるＲＩＡ系、または抗ｃＡＭＰ抗体と標識ｃＡＭＰとを組み合わせたＥＩＡ系で測定することができる。また、抗ｃＡＭＰ抗体を、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａまたは抗ｃＡＭＰ抗体産生に用いた動物のＩｇＧなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと〔^１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰとを使用するＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ）法による定量、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ系であるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を応用した競合法ｃＡＭＰ検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）による定量も可能である。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞のｃＡＭＰ産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、ｃＡＭＰ産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動物細胞）を２４穴プレートに５ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ ３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後、０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１μＭの本発明のリガンドまたは１μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。１００μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、その後氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出する。抽出液中のｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ ＥＩＡキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリンの刺激によって産生されたｃＡＭＰ量を１００％とし、１μＭの本発明のリガンドの添加によって抑制されたｃＡＭＰ量を０％として、本発明のリガンドによるｃＡＭＰ産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。本発明のリガンドの活性を阻害して、ｃＡＭＰ産生活性が例えば５０％以上になる試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、本発明のリガンドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰ量が増加する性質を示す本発明の受容体発現細胞を使用する場合、本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生促進活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞のｃＡＭＰ産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させてｃＡＭＰ産生促進活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
ｃＡＭＰ産生促進活性は、上記のスクリーニング法においてフォルスコリンを添加せずに本発明の受容体発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動物細胞）に本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加して産生されたｃＡＭＰを上記の方法で定量して測定する。
（３）ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＣＲＥ（ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、ｃＡＭＰの上昇を伴う刺激は、ＣＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のｃＡＭＰ量の変動を検出することができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン ベイシックベクター、ピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＣＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性抑制を回復させる試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量の本発明のリガンドと同様な抑制を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＣＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ ３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１μＭの本発明のリガンドまたは１μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のリガンド単独を添加した場合と、１μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のリガンドは、フォルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光量の増加を抑制する。該抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ ＣＡＴ ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
（４）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
あらかじめ、標識したアラキドン酸を、本発明の受容体発現細胞に取り込ませておくことによって、アラキドン酸代謝物放出活性を、細胞外に放出された標識されたアラキドン酸代謝物を測定することによって測定することができる。
具体的には、本発明のリガンドを、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンドによるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明の受容体発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに５ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養後、［^３Ｈ］アラキドン酸を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌとなるよう添加し、１６時間後、細胞を０．０５％ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）（以下、反応用バッファーと略記する）で洗浄する。終濃度１０μＭの本発明のリガンドまたは終濃度１０μＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を含む反応用バッファー５００μｌを、各ｗｅｌｌに添加する。３７℃で６０分間インキュベートした後、反応液４００μｌをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。
反応用バッファー５００μｌのみを添加した場合（本発明のリガンド非添加・試験化合物非添加）の遊離［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を０％、１０μＭの本発明のリガンドを含む反応用バッファーを添加した場合（試験化合物非添加）の遊離［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を１００％として、試験化合物を添加した場合の遊離［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を算出する。
アラキドン酸代謝物放出活性が、例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
（５）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、細胞内のＣａ濃度が上昇する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、本発明のリガンドによる細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を、４ｍＭ Ｆｕｒａ−２ ＡＭ（同仁化学研究所）を縣濁したＨＢＳＳに置換し、室温で２時間３０分おく。ＨＢＳＳで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの、５０５ｎｍの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
また、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社製）を使って行ってもよい。本発明の受容体発現細胞縣濁液にＦｌｕｏ−３ ＡＭ（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。ＦＬＩＰＲ装置にセットし、Ｆｕｒａ−２の場合と同様に、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
さらに、本発明の受容体発現細胞に、細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）を共発現させておき、細胞内Ｃａイオン濃度の上昇によって、該遺伝子蛋白質（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）がＣａ結合型となり発光することを利用して、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることもできる。
細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させた本発明の受容体発現細胞を、９６穴プレートに播き、上記と同様に、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
本発明のリガンドによる蛍光強度の上昇を、抑制する試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
（６）受容体を発現する細胞に、受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度は上昇する。本発明のリガンドの、本発明の受容体発現細胞における細胞内イノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、標識したイノシトールの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、イノシトール三リン酸産生上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播き、１日間培養する。その後、ｍｙｏ−［２−^３Ｈ］ｉｎｏｓｉｔｏｌ（２．５μ Ｃｉ／ｗｅｌｌ）を添加した培地で１日間培養し、細胞を放射活性を有するイノシトールを無添加の培地でよく洗浄する。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加後、１０％過塩素酸を加え、反応を止める。１．５Ｍ 水酸化カリウムおよび６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液で中和し、０．５ｍｌのＡＧ１ｘ８樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を詰めたカラムに通し、５ｍＭ 四ホウ酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７）および６０ｍＭ ギ酸アンモニウムで洗浄した後、１Ｍ ギ酸アンモニウムおよび０．１Ｍ ギ酸で溶出した放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定する。本発明のリガンドを添加しない場合の放射活性を０％、本発明のリガンドを添加した場合の放射活性を１００％とし、試験化合物の、本発明のリガンドと本発明の受容体の結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
（７）ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＴＲＥ（ＴＰＡ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、ＴＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。
具体的には、本発明のリガンドを、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン ベイシックベクター、ピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＴＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみをＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な発光量の増加を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＴＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．０５％ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１０ｎＭの本発明のリガンドまたは１０ｎＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のリガンドを添加した場合と、１０ｎＭの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のリガンドによる細胞内カルシウムの上昇によって、ルシフェラーゼによる発光量が増加する。この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ ＣＡＴ ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
（８）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、ＭＡＰキナーゼが活性化され、増殖する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本発明の受容体発現細胞の増殖は、例えば、ＭＡＰキナーゼ活性、チミジン取り込み活性、ＡＴＰ量、細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、ＭＡＰキナーゼ活性については、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に添加した後、細胞溶解液から抗ＭＡＰキナーゼ抗体を用いた免疫沈降によりＭＡＰキナーゼ分画を得た後、公知の方法、例えば和光純薬製ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔおよびγ−［^３２Ｐ］−ＡＴＰを使用してＭＡＰキナーゼ活性を測定し、比較する。
チミジン取り込み活性については、本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播種し、培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した後、放射活性により標識したチミジン（例、［ｍｅｔｈｙｌ−^３Ｈ］−チミジンなど）を加え、その後、細胞を溶解し、細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シンチレーションカウンターで計数することにより、チミジン取り込み活性を測定し、比較する。
ＡＴＰ量の測定については、本発明の受容体発現細胞を９６穴プレートに播種し、培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した後、例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内のＡＴＰ量を測定し、比較する。
細胞数の測定については、本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播種し、培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した後、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を添加する。細胞内に取り込まれてＭＴＴが変化したＭＴＴホルマザンを、塩酸にて酸性としたイソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、５７０ｎｍの吸収によって測定し、比較する。
本方法において、本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞増殖活性を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに５０００個／ウェル播き、１日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を、細胞に添加して２４時間培養した後、［ｍｅｔｈｙｌ−^３Ｈ］−チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し、６時間培養する。細胞をＰＢＳで洗った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。
本発明のリガンドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
（９）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、カリウムチャネルが活性化し、細胞内にあるＫイオンが、細胞外に流出する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
Ｋイオンと同族元素であるＲｂイオン（ルビジウムイオン）は、Ｋイオンと区別無く、カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。よって、本発明の受容体発現細胞に、放射活性同位体であるＲｂ（［^８６Ｒｂ］）を取り込ませておいた後、本発明のリガンドの刺激によって流出する^８６Ｒｂの流れ（流出活性）を測定することにより、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定する。
具体的には、^８６Ｒｂの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、^８６Ｒｂの流出活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンド刺激による^８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な^８６Ｒｂの流出活性の上昇を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を２４穴プレートに播き、２日間培養する。その後、１ｍＣｉ／ｍｌの^８６ＲｂＣｌを含む培地中で２時間保温する。細胞を培地でよく洗浄し、外液中の^８６ＲｂＣｌを完全に除く。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を細胞に添加し、３０分後外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定し、比較する。
本発明のリガンド刺激による^８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
（１０）本発明の受容体発現細胞が本発明のリガンドに反応し、細胞外のｐＨが変化する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞外ｐＨ変化は、例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定する。
本方法において、本発明のリガンドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞外ｐＨ変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞をＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約２時間、０．１％ ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。灌流によって生じた培地のｐＨ変化を測定し、比較する。
本発明のリガンドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
（１１）酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｈａｐｌｏｉｄ α−ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ（ＭＡＴ α）の性フェロモン受容体Ｓｔｅ２は、Ｇ蛋白質Ｇｐａ１と共役しており、性フェロモンα−ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒに応答してＭＡＰキナーゼを活性化し、これに引き続き、Ｆａｒ１（ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）および転写活性化因子Ｓｔｅ１２が活性化される。Ｓｔｅ１２は、種々の蛋白質（例えば、接合に関与するＦＵＳ１）の発現を誘導する。一方、制御因子Ｓｓｔ２は上記の過程に抑制的に機能する。この系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などを指標として用いる、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５巻，４８７−４９４頁，１９９７年）。上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体例を以下に示す。
ＭＡＴ α酵母のＳｔｅ２およびＧｐａ１をコードする遺伝子を除去し、代わりに、本発明の受容体遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。Ｆａｒ１をコードする遺伝子を除去してｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔが生じないようにし、また、Ｓｓｔ２をコードする遺伝子を除去して本発明のリガンドに対する応答の感度を向上させておく。さらに、ＦＵＳ１にヒスチジン生合成遺伝子ＨＩＳ３を結合したＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子を導入する。この遺伝子組換え操作は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５巻，６１８８−６１９５頁，１９９５年に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（ＳＳＴＲ２）遺伝子を、本発明の受容体に置き換えて実施することができる。
このように構築された形質変換酵母は、本発明のリガンドに高感度で反応し、その結果、ＭＡＰキナーゼの活性化が起き、ヒスチジン生合成酵素が合成されるようになり、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、上記の本発明の受容体発現酵母（Ｓｔｅ２遺伝子およびＧｐａ１遺伝子が除去され、本発明の受容体遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質コード遺伝子が導入され、Ｆａｒ遺伝子およびＳｓｔ２遺伝子が除去され、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子が導入されたＭＡＴ α酵母）を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、該酵母の生育を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、本発明のリガンドと同様な酵母の生育を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、その後、ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、２ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるように加える。ついで、９ｘ９ｃｍの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、３０℃で３日間培養する。試験化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を、本発明のリガンドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。また、あらかじめ、ヒスチジンを除去した寒天培地に本発明のリガンドを添加しておき、滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。
酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
（１２）本発明の受容体遺伝子ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、本発明のリガンドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｕｒｒｅｎｔが生じる。これは、膜電位の変化としてとらえることができる（Ｋイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。本発明のリガンドによって生じる本発明の受容体導入アフリカツメガエル卵母細胞における上記反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞膜電位変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊を、ＭＢＳ液（８８ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＫＣｌ，０．４１ｍＭ ＣａＣｌ_２，０．３３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ_３）_２，０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ_４，２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）に溶かしたコラーゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で卵塊がほぐれるまで１９℃、１〜６時間、１５０ｒｐｍで処理する。外液をＭＢＳ液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピュレーターで本発明の受容体遺伝子ｐｏｌｙ Ａ付加ｃＲＮＡ（５０ｎｇ／５０ｎｌ）を卵母細胞にマイクロインジェクションする。
本発明の受容体遺伝子ｍＲＮＡは、組織や細胞から調製してもよく、プラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏで転写してもよい。本発明の受容体遺伝子ｍＲＮＡをＭＢＳ液中で２０℃で３日培養し、これをＲｉｎｇｅｒ液を流しているｖｏｌｔａｇｅ ｃｌａｍｐ装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、（−）極は細胞外に置く。電位が安定したら、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を含むＲｉｎｇｅｒ液を流して電位変化を記録する。試験化合物の影響は、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を、本発明のリガンドのみ含むＲｉｎｇｅｒ液を流した場合と比較することによって測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
上記の系において、電位の変化量を増大させると、測定しやすくなるため、各種のＧ蛋白質遺伝子のｐｏｌｙ Ａ付加ＲＮＡを導入してもよい。また、カルシウム存在下で発光を生じるような蛋白質（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）の遺伝子のｐｏｌｙ Ａ付加ＲＮＡを共インジェクションすることにより、膜電位変化ではなく発光量を測定することもできる。
本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の受容体または本発明の受容体を含有する細胞もしくは細胞の膜画分、および本発明のリガンドを含有する。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（ｉ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、または用時調製しても良い。
（ｉｉ）本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０^５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（ｉｉｉ）標識リガンド
〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３２Ｐ〕、〔^３３Ｐ〕、〔^３５Ｓ〕などの放射性同位元素で標識した本発明のリガンドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを、４℃または−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（ｉｖ）リガンド標準液
本発明のリガンドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
（ｉ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｉｉ）１０^−３〜１０^−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のリガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０^−３Ｍの本発明のリガンドを５μｌ加えておく。
（ｉｉｉ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のリガンドを０．２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｉｖ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ_０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ_０ ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合を変化させる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進または阻害する化合物であり、具体的には、（ｉ）本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（本発明の受容体アゴニスト）、（ｉｉ）該刺激活性を有しない化合物（本発明の受容体アンタゴニスト）、（ｉｉｉ）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、（ｉｖ）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物などである。該化合物としては、ペプチド、蛋白質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様のものが用いられる。
上記本発明の受容体アゴニストであるか、またはアンタゴニストであるかの評価方法は、例えば、以下の（ｉ）または（ｉｉ）に従えばよい。
（ｉ）前記（ａ）〜（ｃ）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニスト（アゴニスト）であり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニスト（アンタゴニスト）である。
（ｉｉ）（ａ）試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストである。
（ｂ）本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
前述したように、本発明のリガンドは、消化管機能調節活性、腸管細胞増殖調節活性などを有する。従って、本発明の受容体アゴニストは、本発明のリガンドが有する生理活性（例、消化管機能調節活性、腸管細胞増殖調節活性など）と同様の作用を有しており、安全で低毒性な医薬、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などの予防・治療剤として有用である。
本発明の受容体アンタゴニストは、本発明のリガンドが有する生理活性（例、消化管機能調節活性、腸管細胞増殖調節活性など）を抑制することができるので、安全で低毒性な医薬、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などの予防・治療剤として有用である。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの予防・治療剤などとして有用である。
また、本発明は、本発明の受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法なども提供する。
具体的には、（ｉ）本発明の受容体を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｉｉ）本発明の受容体を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行い、本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、本発明の受容体の遺伝子の発現量（具体的には、本発明の受容体量または本発明の受容体をコードするｍＲＮＡ量など）を測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該試験化合物は塩を形成していてもよく、該試験化合物の塩としては、前記した細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法などで用いられる試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明ポリペプチドまたは本発明の受容体を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーとしては、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明の受容体の活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明の受容体を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）などが用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明の受容体を細胞膜上に発現させた形質転換体などが好ましく用いられる。
本発明の受容体の蛋白質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明の抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドまたは受容体を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を促進（発現量を増加）する化合物またはその塩は、本発明のリガンドと同様に、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などの予防・治療剤などの医薬として使用できる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、本発明の受容体に対する本発明のリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、蛋白、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物、本発明の受容体の活性または機能を促進または阻害する化合物、本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害（発現量を増加または減少）する化合物などである。
該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬（予防・治療剤など）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
該化合物またはその塩は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物またはその塩を、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明の受容体アゴニストの投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、ＩＩ型糖尿病の治療の目的で該アゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合、該アゴニストの投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、ＩＩ型糖尿病の治療の目的で該アゴニストを注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、本発明の受容体アンタゴニストの投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、大腸癌の治療の目的で該アンタゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合、該アンタゴニストの投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、大腸癌の治療の目的で該アンタゴニストを注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進または阻害する化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、大腸癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合、該化合物の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、大腸癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１、〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
〔２〕本発明の受容体が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明の受容体は、前述したような活性を有する本発明のリガンドへの結合活性などを有する。従って本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に異常があったり、欠損している場合には、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病など、好ましくは消化管疾患〔例、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、下痢、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などとなる可能性が高い。従って、本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、例えば、消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として使用することができる。
本発明の受容体または本発明のポリヌクレチドは、例えば、生体内において本発明の受容体が減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（ｉ）本発明のポリヌクレオチドを該患者に投与し、生体内で本発明の受容体を発現させることによって、（ｉｉ）細胞に本発明のポリヌクレオチドを挿入し、本発明の受容体を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ｉｉｉ）本発明の受容体を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明の受容体の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明の受容体を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明の受容体は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、または水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明の受容体を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）が挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
本発明の受容体の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、ＩＩ型糖尿病の治療の目的で該受容体を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該受容体を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合、該受容体の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、ＩＩ型糖尿病の治療の目的で該受容体を注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該受容体を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
〔３〕本発明の受容体の定量
本発明の抗体は、本発明の受容体を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明の受容体の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明の受容体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明の受容体の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明の受容体のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明の受容体のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明の受容体に対するモノクローナル抗体を用いて本発明の受容体の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の受容体の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の受容体量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明の受容体の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明の受容体の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明の受容体のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の受容体の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、同書 Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、同書 Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、同書 Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書 Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書 Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明の受容体を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明の受容体の濃度を定量することによって、本発明の受容体の濃度の増加が検出された場合、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病など、好ましくは消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明の受容体の濃度の減少が検出された場合には、例えば、消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明の受容体を検出するために使用することができる。また、本発明の受容体を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明の受容体の検出、被検細胞内における本発明の受容体の挙動の分析などのために使用することができる。
〔４〕遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）は、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトや温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明の受容体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、本発明の受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病など、好ましくは消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明の受容体の遺伝子の発現減少が検出された場合は、例えば、消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
〔５〕アンチセンスポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）を含有する医薬
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的に結合し、該ポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができるアンチセンスポリヌクレオチド（例、アンチセンスＤＮＡ）は、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
例えば、上記アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（本発明の受容体に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）など）、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制することができ、生体内における本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチドの機能を抑制することができるので、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明の本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
〔６〕本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、例えば消化管疾患、癌、免疫疾患、糖尿病などの予防・治療剤として、好ましくは消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
本発明の抗体を含有する上記医薬は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトや温血動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、大腸癌患者の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
〔７〕ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明の受容体をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ_１系統，ＢＤＦ_１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明の受容体を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明の受容体の機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明の受容体の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明の受容体の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明の受容体の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能亢進症や、本発明の受容体が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明の受容体の増加症状を有することから、本発明の受容体に関連する疾患〔例、消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、癌（例、消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、咽頭癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）、免疫疾患〔例、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、ＩＩ型糖尿病、肥満など〕に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明の受容体の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明の受容体の機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドまたは本発明の異常受容体による正常ポリペプチドまたは受容体の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明の受容体の増加症状を有することから、本発明の受容体の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチドまたは受容体組織を分析することによる、本発明の受容体により特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドまたは受容体との関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異ポリペプチドまたは受容体を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不活性型不応症などを含む、本発明の受容体に関連する疾患〔例、消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、癌（例、消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、咽頭癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、ＩＩ型糖尿病、肥満など〕の臨床症状を調べることができ、また、本発明の受容体に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明の受容体産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明の受容体およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不括性型不応症を含む、本発明の受容体に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明の受容体が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
〔８〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明の受容体の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明の受容体の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ 第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明の受容体の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明の受容体のヘテロ発現不全個体であり、本発明の受容体のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明の受容体のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明の受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明の受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
〔８ａ〕本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。該試験化合物は塩を形成していてもよく、該試験化合物の塩としては、前記と同様の物が用いられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明の受容体をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明の受容体の発現する組織で、本発明の受容体の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明の受容体の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明の受容体欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明の受容体の発現を促進し、本発明の受容体の活性または機能を促進することができるので、例えば、消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明の受容体の発現を阻害し、本発明の受容体の活性または機能を阻害することができるので、例えば、消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、肥満などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、吸収不良症候群の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合、該化合物の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、吸収不良症候群の治療の目的で該化合物を注射剤の形で投与する場合、通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、大腸癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合、該化合物の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、大腸癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で投与する場合、通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明の受容体のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明の受容体そのものの体内での産生能力を特異的に促進または阻害（抑制）する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｉ ：イノシン
Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしく
はチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ ：ジイソプロピルエチルアミン
Ｇｌｙ又はＧ：グリシン
Ａｌａ又はＡ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ：リジン
Ａｒｇ又はＲ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ）：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｐｂｆ ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾ
フラン−５−スルホニル
Ｃｌｔ ：２−クロロトリチル
Ｂｕ^ｔ ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ）：メチオニンスルフォキシド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＧＰＲ３５のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
参考例１で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
参考例１で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例５で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例５で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
マウスＧＰＲ３５のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：７で示されるアミノ酸配列を有するマウスＧＰＲ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例６で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例６で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例６で用いられたプローブ１の塩基配列を示す。〔５’末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３’末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕。
〔配列番号：１２〕
実施例６で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例６で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例６で用いられたプローブ２の塩基配列を示す。〔５’末端にリポーター色素としてＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、３’末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を標識した〕。
〔配列番号：１５〕
実施例７で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例７で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例７で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例７で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
ヒトＧＰＲ３５−Ｌ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
配列番号：１９で示されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ３５−Ｌ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ヒトＧＰＲ３５−Ｌ２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
配列番号：２１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ３５−Ｌ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
ヒトＧＰＲ３５−Ｌ３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
配列番号：２３で示されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ３５−Ｌ３をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
参考例２で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
参考例２で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
ラットＧＰＲ３５のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２８〕
配列番号：２７で示されるアミノ酸配列を有するラットＧＰＲ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号２９〕
実施例１０で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号３０〕
実施例１０で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号３１〕
実施例１０で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号３２〕
実施例１１で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号３３〕
実施例１１で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号３４〕
実施例１１で用いられたプローブの塩基配列を示す。

以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
ＤＮＱＸは、６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン（６，７−ｄｉｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−２，３−ｄｉｏｎｅ）を表す。
ＮＢＱＸは、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン（６−ｎｉｔｒｏ−７−ｓｕｌｆａｍｏｙｌｂｅｎｚｏ［ｆ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−２，３−ｄｉｏｎｅ）を表す。
参考例１
ヒトＧＰＲ３５発現ＣＨＯ細胞株
ヒトＧＰＲ３５をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ法により取得した。２種のプライマー（配列番号：３および配列番号：４）各２０ｐｍｏｌ、１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）５μｌ、５０×ｄＮＴＰ ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）１μｌ、５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）１μｌ、鋳型ＤＮＡとしてヒト肝臓ｃＤＮＡ液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）１μｌを含む混合液５０μｌを調製し、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｍｏｄｅｌ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて９６℃、１分、続いて９６℃、３０秒；６３℃、４０秒；７２℃、１２０秒を３５サイクル繰り返し、さらに７２℃、１０分で伸長反応させるプログラムでＰＣＲ反応を行った。反応終了液をアガロースゲル電気泳動することにより単一の生成物を得、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングし、遺伝子配列を確認した。ＰＣＲエラーがないクローンについて、制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）、ＣｌａＩ（宝酒造）で二重消化した後、アガロースゲル電気泳動して、単一の生成物を切り出した。得られた断片（約１ｋｂ）をｐＡＫＫＯ−１１１ベクター〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２１９巻，２５１（１９９４）〕に導入し、常法に従ってＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、ヒトＧＰＲ３５発現ＣＨＯ細胞株を得た。
参考例２
ラットＧＰＲ３５のクローニング
ラット（ＳＤ）小腸ｃＤＮＡ（Ｓｅｅｇｅｎｅ）を鋳型として、プライマー１（配列番号：２５）およびプライマー２（配列番号：２６）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、（１）９８℃ １０秒の後、（２）９８℃ １０秒、６８℃ ６０秒を３５回の後、（３）６８℃ ７分の伸長反応を行なった。増幅産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入してクローニングした。その塩基配列を解析した結果、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を有するラットＧＰＲ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２７）を得た。
実施例１
ＧＰＲ３５に対するリガンド探索
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣより購入）は、特に記載が無い限り１０％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むハムＦ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。トランスフェクションを行う前日に１０ｃｍ^２あたり４．５ｘ１０^５個の細胞を播き、５％ＣＯ_２濃度に調整されたＣＯ_２培養器にて３７℃で１５時間以上培養した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、試薬添付の方法に準じて操作を行った。培養器に６−ｗｅｌｌプレートを使用する場合は、以下のように行った。まず、１．５ｍｌ容チューブを２本用意し、それぞれにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μｌ分注した。次に、片方のチューブに参考例１で得られたＧＰＲ３５発現ベクター１μｇ、およびＧα１５発現ベクター（Ｇｕｔｈｒｉｅ ｃＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）０．５μｇを入れ、もう片方のチューブにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を６μｌ添加後、両者を混合し、２０分間室温に静置した。この溶液にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を８００μｌ加えたトランスフェクション用混合液を、あらかじめＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を用いて洗浄したＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加後、ＣＯ_２培養器にて６時間培養した。培養後の細胞は、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリンスした後、０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて剥がし、遠心操作にて回収した。得られた細胞の数を測定し、培地１００μｌあたり５ｘ１０^４個の細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ_２培養器にて一晩培養した。上記トランスフェクション操作にて一過性に受容体を発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞に各種の試験サンプルを添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。
ＦＬＩＰＲにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処置を施した。まず、細胞に蛍光色素Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）を添加するため、またはＦＬＩＰＲアッセイを行う直前に細胞を洗浄するためのアッセイバッファーを作成した。ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０００ｍｌに１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）２０ｍｌを加えた溶液（以下、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液）に、プロベネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらにＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し、この溶液をアッセイバッファーとした。次にＦｌｕｏ−３ＡＭ ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％ プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファーに加え、蛍光色素溶液を調製した。トランスフェクション処理を施したＣＨＯ−Ｋ１細胞の培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ_２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した後、ＦＬＩＰＲにセットした。また、受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に添加する試験サンプルは、アッセイバッファーを用いて調製し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。
以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定した。
その結果、ＤＮＱＸ（図１）、エラグ酸（図２）、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、ＮＢＱＸおよび５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンを加えたとき、ＧＰＲ３５およびＧα１５を同時に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞が、用量依存的に応答（細胞内カルシウム濃度の上昇）した。発現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２１９巻，２５１頁，１９９４年）のみを導入した対照のＣＨＯ−Ｋ１細胞では、このような応答は見られなかった。
実施例２
ヒトＧＰＲ３５発現ＣＨＯ細胞株における、フォルスコリン添加による増加細胞内ｃＡＭＰ量のＤＮＱＸおよびＮＢＱＸによる抑制
参考例１で得られたヒトＧＰＲ３５発現ＣＨＯ細胞を、アッセイ用培地（ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．２ｍＭ ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅを添加したもの）にて洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で３０分培養した。アッセイ用培地にて希釈した各濃度のＤＮＱＸおよびＮＢＱＸを添加し、その後フォルスコリン２μＭとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ_２条件下で３０分培養した。培養上清を捨てて、ｃＡＭＰ ｓｃｒｅｅｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）のプロトコールに従い、細胞内のｃＡＭＰ量をプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて測定した。
その結果、ヒトＧＰＲ３５発現ＣＨＯ細胞株にのみ、フォルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のＤＮＱＸおよびＮＢＱＸによる用量依存的減少かつ特異的な減少が検出された（図３）。
これより、ＧＰＲ３５がアゴニストにより活性化されると、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下することがわかる。細胞内でｃＡＭＰは主要なシグナル伝達物質の一つとして働いており、細胞に様々な変化をもたらすことが知られている。従って、細胞内ｃＡＭＰの濃度を、ＧＰＲ３５のアゴニスト（ｃＡＭＰ濃度を下げる作用を有する）、またはＧＰＲ３５のアンタゴニスト（ｃＡＭＰ濃度を上げる作用を有する）で調節することにより、種々の病態を改善させることが可能となる。
実施例３
ＭＡＰＫのリン酸化亢進
参考例１で得られたヒトＧＰＲ３５発現ＣＨＯ細胞を、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で１２−ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅで４８時間培養した。培地は１０％透析ＦＢＳを含むＭＥＭα（核酸不含）を使用した。培地を吸引除去後、血清を含まない培地１ｍｌ（ｘ２）で細胞を洗浄後、血清を含まない培地５００μｌを添加し、３７℃で１６時間培養した。細胞に至適濃度のＤＮＱＸまたはＮＢＱＸを添加し、３７℃で５分間培養した。培地を吸引除去後、直ちに５０μｌのＢｌｕｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （ＢｉｏＬａｂｓ）を添加し、ピペッティングにて細胞を溶解・分取した。細胞溶液をｓｏｎｉｃａｔｏｒ（ｓｏｎｏ ｃｌｅａｎｅｒ；ＫＡＩＪＯ ＤＥＮＫＩ）を用いて破砕後、９５℃で５分間熱処理を行なった。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，４℃，５分間）を行い、上清を最終サンプルとした。
サンプル１０μｌを１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、ウェスタンブロッティング法にてＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にトランスファーした。膜をブロックエース（大日本製薬株式会社）に浸し、室温で１時間振とうした。一次抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ Ｍａｐ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を含むブロックエース（１／２０００希釈）に浸し、室温で１時間振とうした。膜をＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に浸し５分間（ｘ２）振とうし、洗浄した。膜をＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０で希釈したＨＲＰ標識二次抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ｕｐｓｔａｔｅ）（１／５０００希釈）に浸し、室温で１時間振とうした。膜をＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０に浸し１０分間（ｘ３）振とうし、洗浄した。膜をＥＣＬｐｌｕｓウエスタンブロッティングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の取り扱い説明書に従い、蛍光検出器（ＬＡＳ−１０００；ＦＵＪＩＦＩＬＭ）により検出を行なった。１−５μＭのＤＮＱＸまたはＮＢＱＸ刺激により、ヒトＧＰＲ３５受容体発現ＣＨＯ細胞のＭＡＰ−ｋｉｎａｓｅのリン酸化レベルは亢進されていた。コントロール細胞（公知方法により作製されたヒトＴＧＲ２３発現ＣＨＯ細胞）に対しては、リン酸化レベルの亢進は観察されなかった。
実施例４
ＣＨＯ細胞に発現させたＧＰＲ３５−ＧＦＰ融合タンパク質のＤＮＱＸ、ＮＢＱＸ添加による細胞内移行
ヒトＧＰＲ３５タンパク質のＣ末端にＧＦＰを融合したタンパク質を安定的に発現させたＣＨＯ細胞株を、自体公知の方法により動物細胞用発現プラスミドを用いて樹立した。該タンパク質の細胞内移行（インターナリゼーション）の検定には、増殖期にある該細胞を、４００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの濃度で９６穴プレート（Ｐａｃｋａｒｄ社、Ｖｉｅｗ−Ｐｌａｔｅ^ＴＭ−９６，Ｂｌａｃｋ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養したものを用いた。まず、アッセイ用緩衝液（ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に０．１％ウシ血清アルブミンを添加したもの）にてウェル内の該細胞を洗浄した後、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭのＤＮＱＸおよびＮＢＱＸを含む同アッセイ用緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２条件下で培養した。その後細胞固定液（４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇ不含））を１００μｌ／ウェル添加して室温下３０分放置した。細胞固定液を除去し、Ｃａ／Ｍｇ不含−ＰＢＳで細胞を洗浄後、ラベル化溶液（３．１３μｇ／ｍｌ ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社 Ｗ−８４９）、５μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ含有Ｃａ／Ｍｇ不含ＰＢＳ）を５０μｌ／ウェル添加し、室温下２０分放置した。ラベル化溶液を除去後、細胞をＣａ／ＭｇフリーＰＢＳ（２００μｌ／ウェル）で洗浄し、同液（２００μｌ／ウェル）へ置換した後、プレート表面をシールして、直ちにＣｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社）にて解析した。ＧＰＲ３５−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在性の評価は、同システムに付属のＧＰＣＲ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ中のパラメータの一つであるＭｅｍＣｙｔｏ Ａｂｏｖｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（ウェル内の全細胞集団に対し、タンパク質の膜／細胞質局在比を表す一定のパラメータ値（ＭｅｍＣｙｔｏ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｒａｔｉｏ）を超える細胞群の割合（単位％））で行った。
その結果、ＤＮＱＸ、ＮＢＱＸを添加した場合、上記濃度域で濃度依存的なＧＰＲ３５−ＧＦＰタンパク質のインターナリゼション誘導活性（ＭｅｍＣｙｔｏ Ａｂｏｖｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ値の低下）が認められた。
実施例５
マウスＧＰＲ３５のクローニングと種差の検討
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の結腸からＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡ合成を行なった。これを鋳型として、プライマー１（配列番号：５）およびプライマー２（配列番号：６）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、（１）９４℃ １０秒の後、（２）９４℃ １０秒、６８℃ ９０秒を３回、（３）９４℃ １０秒、６２℃ ３０秒、６８℃ ６０秒を３回、（４）９４℃ １０秒、５６℃ ３０秒、６８℃ ９０秒を３５回の増幅反応後、（５）６８℃ ７分の伸長反応を行なった。さらにＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を加えて７２℃ １０分反応後、増幅産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入してクローニングした。その塩基配列を解析した結果、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するマウスＧＰＲ３５をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：８）を得た。このプラスミドを制限酵素Ｓａｌ ＩおよびＳｐｅ Ｉで切断した後、プラスミドベクター ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２１９巻，２５１（１９９４）〕に挿入して発現ベクターを構築した。この発現ベクターを実施例１に記載の方法に準じてＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、ＦＬＩＰＲを用いてＤＮＱＸおよびエラグ酸との反応性を検討した結果、ヒトＧＰＲ３５と同様にマウスＧＰＲ３５は、これらの化合物に応答した。
実施例６
ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ３５ｍＲＮＡの組織分布の検討
ヒトでの遺伝子発現分布を調べるために使用した鋳型となるｃＤＮＡには、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）から以下の方法で合成したものを使用した。
ＲＮＡ １μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、プライマー１（配列番号：９）およびプライマー２（配列番号：１０）およびプローブ１（配列番号：１１）（Ｆａｍ−ｃｔｃｃｃｃｇｔｇｃｔａａｇｇｃｃｃａｃａａａ−Ｔａｍｒａ）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのプローブ１を０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。その結果ヒトＧＰＲ３５は、胃、小腸、大腸などの消化管、後根神経節（ＤＲＧ）、下垂体、精巣、Ｃｏｌｏ２０１、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１４１７、ＳＷ８３７、ＳＷ１４６３、ＷｉＤｒなどの大腸癌細胞株で高発現していることが判明した。
マウスでの発現を調べるために使用した鋳型となるｃＤＮＡには、マウス各種組織由来のトータルＲＮＡから以下の方法で合成したものを使用した。
ＲＮＡ １μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、プライマー３（配列番号：１２）およびプライマー４（配列番号：１３）およびプローブ２（配列番号：１４）（Ｆａｍ−ｃｔｇｃｃｃｇａｇａｃａｃｃｔｔｃａｇｃｃｇｔ−Ｔａｍｒａ）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのプローブ２を０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。
その結果マウスＧＰＲ３５ ｍＲＮＡは、胃、小腸、大腸などの消化管、後根神経節（ＤＲＧ）、気管、脾臓、骨髄、精巣、卵巣、脂肪細胞分化誘導後の３Ｔ３−Ｌ１、白色脂肪細胞、ＣＥ−２、ＢＦなどの大腸癌細胞株で高発現していることが判明した。
実施例７
ヒトＧＰＲ３５のスプライシングバリアントの取得
ヒトＧＰＲ３５の３種類のバリアントＧＰＲ３５−Ｌ１、ＧＰＲ３５−Ｌ２およびＧＰＲ３５−Ｌ３のクローニングは、それぞれの塩基配列に特異的な２個のプライマーを用いたＰＣＲによって行なった。ＧＰＲ３５−Ｌ１クローニング用のプライマーとしては、プライマー１（配列番号：１５）およびプライマー２（配列番号：１６）を、ＧＰＲ３５−Ｌ２クローニング用のプライマーとしては、プライマー３（配列番号：１７）およびプライマー２（配列番号：１６）、ＧＰＲ３５−Ｌ３クローニング用のプライマーとしては、プライマー４（配列番号：１８）およびプライマー２（配列番号：１６）を用いた。ヒト結腸ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、それぞれのプライマーを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、（１）９８℃ １分の後、（２）９８℃ １０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ９０秒を３５回の増幅反応後、（３）７２℃ ５分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入してクローニングした。その塩基配列を解析した結果、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＰＲ３５−Ｌ１）をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２０）、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＰＲ３５−Ｌ２）をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２２）、および配列番号：２３で表されるアミノ酸配列（ヒトＧＰＲ３５−Ｌ３）をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２４）を得た。このプラスミドを制限酵素Ｓａｌ Ｉ及びＳｐｅ Ｉで切断した後、プラスミドベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２１９巻，２５１（１９９４）〕に挿入して発現ベクターを構築した。
ヒトＧＰＲ３５−Ｌ１蛋白質は、ヒトＧＰＲ３５蛋白質のＮ末端に３１アミノ酸残基の付加がある。ヒトＧＰＲ３５−Ｌ２蛋白質は、ヒトＧＰＲ３５蛋白質のＮ末端に４１アミノ酸残基の付加がある。ヒトＧＰＲ３５−Ｌ３蛋白質は、ヒトＧＰＲ３５蛋白質のＮ末端に８５アミノ酸残基の付加がある。
実施例８
Ｇα１６、ＧＰＲ３５安定共発現細胞の取得及び反応性の確認
宿主細胞のＧα１６の安定発現細胞株（Ｇα１６／ＣＨＯ細胞株）は、Ｇα１６発現ベクター（Ｇｕｔｈｒｉｅ ｃＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）を常法に従ってＣＨＯ細胞に導入し、１０％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／５０ｕｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＣＡＭＢＲＥＸ）、および１ｍｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むαＭＥＭ培地（核酸含有：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。トランスフェクションには、１０％ 牛胎児血清のみを含むαＭＥＭ培地（核酸含有）で、７５ｃｍ^２フラスコにて２日間培養した細胞を用いた。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、試薬添付の方法に準じて操作を行った。まず、１５ｍｌ容遠沈管を２本用意し、それぞれにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を６００μｌ分注した。次に、片方のチューブに発現ベクターを４．８μｇ、もう片方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を３６μｌ添加後、両者を混合し、２０分間室温に静置した。この溶液にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を６ｍｌ加えたトランスフェクション用混合液を、あらかじめＯｐｔｉ−ＭＢＭ培地を用いて洗浄したＧα１６／ＣＨＯ細胞に添加後、ＣＯ_２培養器（５％ＣＯ_２、３７℃）にて５時間培養した。培養後の細胞は、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリンスした後、０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて剥がし、遠心操作にて回収した。得られた細胞の数を測定し、培地１００μｌあたり０．３個、１．５個、および７．５個の細胞が含まれるように１０％牛胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のみを含むαＭＥＭ培地（核酸不含：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＦＡＬＣＯＮ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ_２培養器にて一晩培養した。翌日、培養上清を除去し、１穴あたり２００μｌの１０％ 牛胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／５０ｕｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＣＡＭＢＲＥＸ）、および１ｍｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むαＭＥＭ培地（核酸不含：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、これ以降の培養は同培地を使用）を加えて、更に約２週間培養した。顕微鏡にて１穴あたり１コロニーを形成したものを選択し、その培養上清を除去し、１ｇ／ｌ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いてリンスした後、剥がした細胞を１穴あたり１ｍｌの培地の入った２４穴プレートに移した。細胞の増殖したものから順次、２５ｃｍ^２フラスコ、７５ｃｍ^２フラスコへと移し換えた。
上記の方法で取得したヒトＧＰＲ３５とＧα１６を共発現させたＣＨＯ細胞株を３ｘ１０^４個／１００μｌの細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ_２培養器にて一晩培養した。実施例１に記載の方法に従い、細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定したところ、ＤＮＱＸおよびエラグ酸を添加することにより、細胞内カルシウム濃度が上昇することが確認された。
実施例９
ＦＬＩＰＲを用いたＧＰＲ３５アゴニストの探索法
上記実施例８で得られたＧα１６、ＧＰＲ３５安定共発現細胞を、それぞれ３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地（１０％牛胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／５０ｕｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＣＡＭＢＲＥＸ）、および１ｍｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むαＭＥＭ培地（核酸不含：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ、Ｃｏｓｔａｒ社）に８連ピペットを用いて各ウェルに１００μｌずつ植え込み（３．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ウェル）、５％ＣＯ_２インキュベーター中にて３７℃で一晩培養した以降のアッセイに用いる（以後、細胞プレートとする）。Ｈ／ＨＢＳＳ（ニッスイハンクス２（日水製薬株式会社）９．８ｇ、炭酸水素ナトリウム０．３５ｇ、ＨＥＰＥＳ ４．７７ｇ、６Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．４に合わせた後、フィルター滅菌処理）２０ｍｌ、２５０ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ ２００μｌ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）２００μｌを混合する。また、Ｆｌｕｏ ３−ＡＭ（同仁化学研究所）２バイアル（５０μｇ）をジメチルスルフォキサイド４０μｌ、２０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）４０μｌに溶解し、これを上記Ｈ／ＨＢＳＳ−Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ−ＦＢＳに加え、混和後、８連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル１００μｌずつ分注し、５％ＣＯ_２インキュベーター中にて３７℃で１時間インキュベートする（色素ローディング）。
試験化合物を含有する溶液を２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、０．１％ＣＨＡＰＳを含むＨ／ＨＢＳＳまたは２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、０．２％ ＢＳＡを含むＨ／ＨＢＳＳ ２２０μｌに加えて希釈し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍプレート、Ｃｏｓｔｅｒ社）へ移す（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、Ｈ／ＨＢＳＳに２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（ＥＬＸ４０５，Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて細胞プレートを洗浄し、洗浄後１００μｌの洗浄バッファーを残す。この細胞プレートとサンプルプレートをＦＬＩＰＲにセットし（ＦＬＩＰＲにより、サンプルプレートから５０μｌのサンプルが細胞プレートへと移される）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定する。ＧＰＲ３５を発現させないＣＨＯ細胞、または、ヒスタミンＨ１受容体、ＧＰＲ４０受容体、ＴＧＲ７受容体などの対照受容体を発現させたＣＨＯ細胞株を用いて上記と同様の試験を実施し、Ｇα１６、ＧＰＲ３５安定共発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を特異的に上昇させる化合物を探索する。
実施例１０
ラット腸管粘膜層での選択的ＧＰＲ３５遺伝子発現
腸管におけるＧＰＲ３５遺伝子発現部位が粘膜層であるか筋層であるかを明らかにするために、マイクロダイセクション法により分離したラット回腸粘膜層と筋層におけるＧＰＲ３５遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ法によりそれぞれ測定した。１１週齡の雄性ＳＤ（ＩＧＳ）ラットをエーテルで麻酔した後、断頭を行い放血した。摘出した回腸を、液体窒素による冷却下にて、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド中に凍結包埋した。クリオスタットを用いて専用フィルム付スライドガラス（Ｌｅｉｃａ：９０ＦＯＩＬ−ＳＬ２５）上に１０μｍ新鮮凍結切片を作製し、次に切片をクリオスタット庫内（−２０℃）で乾燥させた。軽く室温に馴染ませた後、５％酢酸を含む氷冷エタノール液中で３分間固定した。切片を氷冷ＲＮａｓｅＦｒｅｅ水で洗浄した後、氷冷０．０５％トルイジンブルーで２０秒間染色し、さらに氷冷ＲＮａｓｅＦｒｅｅ水で洗浄した。ドライヤーの冷風で乾燥した後、スライドはマイクロダイセクション直前まで４℃で保存した。Ｌｅｉｃａ Ｌａｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＭＤ）を用いて、１ｃｍ^２程度の組織切片４枚分から筋層と粘膜層を、ＩＳＯＧＥＮをあらかじめ分注したチューブにそれぞれ回収した。筋層と粘膜層のＩＳＯＧＥＮ抽出液からＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、最終的にそれぞれ１８μｌのＴｏｔａｌ ＲＮＡ溶液を得た。１０μｌのＲＮＡ溶液と１μｌの２００ｎｇ／μｌ濃度のランダムプライマーを７０℃で１０分間保温後、氷冷した。この溶液に、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４μｌの逆転写酵素に付属のバッファー、２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール溶液、１μｌの１０ｍＭデオキシヌクレオチド混合液と１μｌのＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して、総体積を２０μｌとした。逆転写反応は、以下の条件で行った。反応液を順次２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、７０℃で１５分間、４℃で５分間保温し、逆転写ｃＤＮＡ溶液を得た。
ラットＧＰＲ３５遺伝子と内部標準となるラットＧＡＰＤＨ遺伝子発現コピー数は、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により決定された。ラットＧＰＲ３５遺伝子測定のためのＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応液は、１０μｌの逆転写ｃＤＮＡ溶液または１μｌの各種濃度の標準ラットＧＰＲ３５ ＤＮＡ、０．２μＭの合成ＤＮＡフォワードプライマー（配列番号：２９）、０．２μＭの合成ＤＮＡリバースプライマー（配列番号：３０）、０．２μＭのラットＧＰＲ３５ ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：３１）とＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなり、全容量は２５μｌである。ラットＧＡＰＤＨ遺伝子測定のためのＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応液は、１０μｌの逆転写ｃＤＮＡ溶液または１μｌの各種濃度の標準ラットＧＡＰＤＨ ＤＮＡとＲｏｄｅｎｔ ＧＡＰＤＨ遺伝子測定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添付の合成ＤＮＡフォワードプライマー、合成ＤＮＡリバースプライマーおよびラットＧＡＰＤＨプローブとＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなり、全容量は２５μｌである。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、順次５０℃で２分、９５℃で１０分保温し、次に９５℃で１５秒、６０℃で６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。ラットＧＰＲ３５遺伝子とラットＧＡＰＤＨ遺伝子発現コピー数は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が、設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ＤＮＡのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。標準曲線から、逆転写ｃＤＮＡに含まれる遺伝子発現コピー数を算出し、ラットＧＰＲ３５遺伝子発現コピー数をＧＡＰＤＨ遺伝子発現コピー数で序した値を、標準化したラットＧＰＲ３５遺伝子発現量とした。
粘膜層と筋層における標準化したラットＧＰＲ３５遺伝子発現量は、それぞれ０．００４２と０．０００２であった。すなわち、粘膜層におけるＧＰＲ３５遺伝子発現量は、筋層におけるそれの約２１倍多かった。
ＧＰＲ３５遺伝子は粘膜層で選択的に発現することから、栄養素の吸収と消化、腸管免疫に関与することが示唆された。例えば、ＧＰＲ３５のアゴニストでｃＡＭＰの産生を阻害することにより、胃酸などの消化液の分泌を抑制でき、消化性潰瘍の予防・治療などが可能になる。また、ＧＰＲ３５のアゴニストにより腸管からの電解質漏洩を抑制できるため、下痢や吸収不良症候群の予防・治療などが可能になる。ＧＰＲ３５のアンタゴニストでｃＡＭＰの産生を促進させることにより、大腸粘膜やマクロファージからの各種炎症性サイトカインの分泌を抑制できるため、自己免疫疾患、炎症性腸疾患などの免疫疾患の予防・治療が可能になる。
実施例１１
脂肪細胞分化に伴うＧＰＲ３５遺伝子発現の亢進
マウス３Ｔ３−Ｌ１を脂肪細胞に分化させ、分化前と分化後におけるＧＰＲ３５遺伝子発現量を測定した。脂肪細胞分化は、以下の培養条件で行った。３Ｔ３−Ｌ１細胞を基本増殖培地（ＤＭＥＭ，１０％ウシ血清，０．２ｍＭアスコルビン酸）で培養した。細胞がコンフルエントに達した後、分化誘導培地（ＤＭＥＭ，１０％ウシ胎児血清，２．５μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，０．５７ｍＭ ＩＢＭＸ，０．２ｍＭ アスコルビン酸，１０μｇ／ｍｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ）で４８時間培養した。次に、細胞を分化維持培地（ＤＭＥＭ，１０％ウシ胎児血清，０．２ｍＭ アスコルビン酸，１０μｇ／ｍｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ）で培養した。分化前と分化維持５、１０と１５日目の細胞からＩＳＯＧＥＮを用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。５０μｌのＴｏｔａｌ ＲＮＡ溶液に、１μｌのＩ型ＤＮＡ分解酵素（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）と５．７μｌのキットに添付のバッファーを添加し、３７℃で３０分間保温した。フェノール／クロロホルム混液を用いて反応液からＲＮＡを抽出し、次いでＲＮＡ溶液の５倍容量のエタノールと８分の１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液の添加によるエタノール沈殿法によりＲＮＡを回収した。０．２μｇ／μｌのＲＮＡ溶液２．５μｌ、１０ｍＭのデオキシヌクレオチド混合液４μｌ、５０ｐｍｏｌ／μｌのランダムプライマー０．５μｌと蒸留水６μｌからなる混合液を６５℃で５分間保温後、氷冷した。この溶液に、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４μｌの逆転写酵素に付属のバッファー、１μｌの０．１Ｍ ジチオスレイトール溶液と１μｌのＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して、総体積を２０μｌとした。逆転写反応は、以下の条件で行った。これら反応液を順次２５℃で５分間、５０℃で６０分間、７０℃で１５分間、４℃で５分間保温し、逆転写ｃＤＮＡ溶液を得た。
マウスＧＰＲ３５遺伝子発現コピー数は、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法により決定された。マウスＧＰＲ３５遺伝子測定のためのＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応液は、１μｌの逆転写ｃＤＮＡ溶液または標準マウスＧＰＲ３５ ＤＮＡ、０．２μＭの合成ＤＮＡフォワードプライマー（配列番号：３２）、０．２μＭの合成ＤＮＡリバースプライマー（配列番号：３３）、０．２μＭのラットＧＰＲ３５ ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：３４）とＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなり、全容量は２５μｌである。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、順次５０℃で２分、９５℃で１０分保温し、次に９５℃で１５秒、６０℃で６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。マウスＧＰＲ３５遺伝子発現コピー数は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が、設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ＤＮＡのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。標準曲線から、逆転写ｃＤＮＡに含まれる遺伝子発現コピー数を算出し、２５ｎｇ ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに含まれるマウスＧＰＲ３５遺伝子発現コピー数を得た。
脂肪細胞分化に伴い、ＧＰＲ３５遺伝子発現量は増加した。分化前と分化維持５、１０と１５日目の２５ｎｇ ＲＮＡあたりのＧＰＲ３５遺伝子発現コピー数は、それぞれ２３００、２２０００、１１００００と１６００００であった。
脂肪細胞分化に伴いＧＰＲ３５遺伝子発現量が増加することから、脂肪細胞においてＧＰＲ３５は脂肪分解、糖取り込み、脂肪分化調節に関与することが示唆された。ＧＰＲ３５のアゴニストは細胞内ｃＡＭＰ濃度を下げる作用を有し、細胞内ｃＡＭＰの低下は、脂肪分解を抑え血中脂肪酸濃度を低下させることより、ＧＰＲ３５のアゴニストは、ＩＩ型糖尿病の予防・治療に有用である。また、ＧＰＲ３５のアンタゴニストは細胞内ｃＡＭＰ濃度を上げる作用を有し、細胞内ｃＡＭＰの上昇は、脂肪分解を刺激して脂肪合成を抑えることより、ＧＰＲ３５のアンタゴニストは肥満の予防・治療に有用である。
実施例１２
アルファスクリーンを用いたＧＰＲ３５アゴニストの探索法
１５０ｃｍ^２フラスコ一本に参考例１で得られたヒトＧＰＲ３５発現ＣＨＯ細胞を１ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ捲き込み、一晩３７℃、ＣＯ_２インキュベーターで培養する。培養後、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて細胞をはがし、ＰＢＳで細胞を洗浄後、１ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度でＢｕｆｆｅｒ １（ＨＢＳＳ＋０．１％ＢＳＡ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ）に懸濁する。この細胞懸濁液４４０μｌとアルファスクリーンｃＡＭＰ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のａｎｔｉ−ｃＡＭＰ ａｃｃｅｐｔｏｒｂｅａｄｓ ２２μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ１ ６３８ μｌを混合し、白色９６ｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１０μｌずつ分注する。次に、各ウエルにフォルスコリン（ＦＳＫ）２μＭを含むＢｕｆｆｅｒ １で希釈した化合物を１０μｌずつ加える。この時、プレートの一列は細胞懸濁液を入れずａｎｔｉ−ｃＡＭＰ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｂｅａｄｓ ９μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ１ ４４１μｌのみを混ぜた液とし、化合物の代わりにｃＡＭＰの希釈系列を加え、スタンダードとする。細胞懸濁液と化合物を混ぜたプレートを室温で３０分間振とうした後、アルファスクリーンｃＡＭＰａｓｓａｙ ｋｉｔのＢｉｏｔｉｎｙｌ ｃａｍｐ ２０μｌ、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｎ ｄｏｎｏｒ ｂｅａｄｓ ８２μｌをＢｕｆｆｅｒ２（ＨＢＳＳ＋０．１％ＢＳＡ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）４０ｍｌにくわえた液をプレートの全ウエルに３０μｌずつ加える。室温で３時間プレートを分間振とうし続け、Ｆｕｓｉｏｎα（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にて蛍光強度を測定し、プレートに加えたｃＡＭＰの反応曲線から各ウェル内のｃＡＭＰ濃度を算出する。
実施例１３
ＦＬＩＰＲを用いたＧＰＲ３５アゴニストの探索
実施例８で得られたＧα１６、ＧＰＲ３５安定共発現細胞を、それぞれ３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地〔１０％牛胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／５０ｕｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＣＡＭＢＲＥＸ）、および１ｍｇ／ｍｌ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むαＭＥＭ培地（核酸不含：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）〕に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ、Ｃｏｓｔａｒ社）に８連ピペットを用いて各ウェルに１００μｌずつ植え込み（３．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ウェル）、５％ ＣＯ_２インキュベーター中にて３７℃で一晩培養し、以降のアッセイに用いた（以後、細胞プレートとする）
。細胞プレート２枚当たりに対して、Ｈ／ＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）５００ｍｌに１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ｐＨ７．４（同仁化学研究所）を１０ｍｌ添加）２０ｍｌ、２５０ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ ２００μｌ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）２００μｌを混合した。また、Ｆｌｕｏ ３−ＡＭ（同仁化学研究所）２バイアル（５０μｇ）をジメチルスルフォキサイド４０μｌ、２０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）４０μｌに溶解し、これを上記Ｈ／ＨＢＳＳ−Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ−ＦＢＳに加え、混和後、８連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル１００μｌずつ分注し、５％ ＣＯ_２インキュベーター中にて３７℃で１時間インキュベートした（色素ローディング）。
試験化合物を含有する溶液を２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含むＨ／ＨＢＳＳで調製し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍプレート、Ｃｏｓｔｅｒ社）へ２２０μｌずつ移した（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、Ｈ／ＨＢＳＳに２．５ｍＭ Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（ＥＬＸ４０５，Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて細胞プレートを洗浄し、洗浄後１００μｌの洗浄バッファーが残るようにした。この細胞プレートとサンプルプレートをＦＬＩＰＲにセットし（ＦＬＩＰＲにより、サンプルプレートから５０μｌのサンプルが細胞プレートへと添加される）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定した。ＧＰＲ３５を発現させないＣＨＯ細胞、または、ヒスタミンＨ１受容体などの対照受容体を発現させたＣＨＯ細胞株を用いて上記と同様の試験を実施し、Ｇα１６、ＧＰＲ３５安定共発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を特異的に上昇させる化合物を探索した。

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットで得られうる化合物またはその塩（例、ＧＰＲ３５アゴニスト、ＧＰＲ３５アンタゴニスト）などは、例えば、消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、癌（例、消化器癌（例、胃癌、大腸癌、胃ＭＡＬＴリンパ腫など）、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、咽頭癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、ＩＩ型糖尿病、肥満などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明の受容体の活性を促進する化合物またはその塩、ＧＰＲ３５アゴニスト、本発明の受容体、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド、本発明のリガンドなどは、例えば、消化管疾患〔例、下痢、吸収不良症候群、過敏性腸症候群、クローン病、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部漬瘍、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、ＮＵＤ（Ｎｏｎ Ｕｌｃｅｒ Ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕、ＩＩ型糖尿病などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明の受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、ＧＰＲ３５アゴニスト、本発明の受容体に対するアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の受容体に対する抗体などは、例えば、免疫疾患〔例、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、粥状硬化症、ＡＩＤＳ、自己免疫性疾患（例、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血、橋本病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、特発性血小板減少性紫斑病、原田病、悪性貧血、シェーグレン症候群、グッドパスチュア症候群など）など〕、消化器癌（例、胃癌、大腸癌など）、肥満などの予防・治療剤などとして有用である。
また、本発明の受容体（例、ＧＰＲ３５など）およびそのリガンド（例、キノキサリン−２，３−ジオン化合物、エラグ酸など）は、消化管疾患、癌、免疫疾患、ＩＩ型糖尿病、肥満などの予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。

Claims (10)

1. （ａ）配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７のアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（ｂ）キノキサリン−２，３−ジオン化合物（６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、および５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンから選ばれる）またはエラグ酸であるリガンドを用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2. （ａ）キノキサリン−２，３−ジオン化合物（６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、および５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンから選ばれる）またはエラグ酸であるリガンドを、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に接触させた場合と、（ｂ）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質またはその塩に接触させた場合における、該リガンドの該蛋白質またはその塩に対する結合量を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
3. （ａ）キノキサリン−２，３−ジオン化合物（６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、および５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンから選ばれる）またはエラグ酸であるリガンドを、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有する細胞または細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｂ）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質またはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該リガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
4. 配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩が、該蛋白質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質またはその塩である請求項３記載のスクリーニング方法。
5. リガンドが、標識したリガンドである請求項２〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
6. （ａ）キノキサリン−２，３−ジオン化合物（６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、および５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンから選ばれる）またはエラグ酸であるリガンドを、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に接触させた場合と、（ｂ）該リガンドの存在下または非存在下、試験化合物を、該蛋白質またはその塩に接触させた場合における、該蛋白質またはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
7. （ａ）キノキサリン−２，３−ジオン化合物（６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、および５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンから選ばれる）またはエラグ酸であるリガンドを、配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｂ）該リガンドの存在下または非存在下、試験化合物を、該蛋白質またはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該蛋白質またはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
8. 配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩が、該蛋白質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質またはその塩である請求項７記載のスクリーニング方法。
9. 細胞刺激活性が、細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下または上昇である、請求項６〜８のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
10. （ａ）配列番号：１、配列番号：７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：２７のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（ｂ）キノキサリン−２，３−ジオン化合物（６，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオン、６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン、および５，７−ジニトロキノキサリン−２，３−ジオンから選ばれる）またはエラグ酸であるリガンドを含有することを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。

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