WO2006025551A1 - スクリーニング方法 - Google Patents

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ligand
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Yasuaki Ito
Kazunori Nishi
Shoichi Ohkubo
Masataka Harada
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • kits for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the protein or a salt thereof and the ligand, comprising a ligand having an ability to act
  • test compound When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention.
  • substantially the same activity examples include ligand binding activity and signal signal transduction action.
  • “Substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal signal transduction activity are equivalent (for example, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to It is preferable that it is 2 times) S, but quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Measurement of activities such as ligand binding activity and signal signal transduction can be carried out according to a method known per se, for example, it can be measured according to a ligand determination method or a screening method described later. .
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention. Peptides are preferred.
  • the carboxy is amidated or esterified. And included in the partial peptides of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the labeled ligand is 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione, 6_ditto_7-sulfamoylbenzo [f] quinoxaline-labeled with [3 ⁇ 4] or [ 125 1], respectively. 2, 3-dione, 6-ciano-7-ditroquinoxaline-2,3-dione, or 5,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione. Preferred is 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione labeled with [3 ⁇ 4] or [ 25 1].
  • hosts examples include Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315 ⁇ , 592 (1985)].
  • molecular and general genetics 168 ⁇ , 111 (1979) can be used to convert the genus Bachinores into a transformed form.
  • the target nucleic acid if the target nucleic acid can hybridize with the target region, the target nucleic acid is compared with the polynucleotide of the target region. It can be said that it is “antisense”.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention characterized by measuring and comparing the binding amount to the receptor;
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, the ligand of the present invention and a test compound are expressed in the receptor of the present invention.
  • a compound that changes the binding ability of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring and comparing the intracellular cAMP production inhibitory activity of the cell when contacted with the cell.
  • CRE- reporter gene receptor-expressing cells of the present invention was introduced (luciferase) were seeded at 5xl0 3 cell / well in 24-well plates, and cultured for 48 hours. The cells are washed with Hanks buffer (PH7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in the incubator. After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 2 ⁇ of ⁇ of the ligand of the present invention or 1 ⁇ of the ligand of the present invention and the test compound.
  • Hanks buffer PH7.4
  • reaction buffer containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES
  • the enzyme activity of is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit
  • Alkaline phosphatase activity is measured using, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • chloramphenicol acetyl transferase activity is measured, for example,
  • the 3-galactosidase activity is measured using, for example, Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries, using FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransf erase Assay KiT manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • an agonistist can be screened by measuring the increase in fluorescence intensity due to the addition of the test compound alone.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded at 5,000 cells / tool in a 24-well plate and cultured for 1 day. Next, the cells are cultured for 2 days in a medium not containing serum, and the cells are starved. Alternatively, the ligand of the present invention and the test compound are added to the cells and cultured for 24 hours, and then [methyl-]-thymidine is added at 0.015 MBq per tool and cultured for 6 hours. Then add methanol and let stand for 10 minutes, then add 5% trichloroacetic acid and let stand for 15 minutes, then wash the fixed cells 4 times with distilled water 0. 3N Hydroxy sodium solution Lyse the cells and measure the radioactivity in the lysate with a liquid scintillation counter.
  • the test compound that suppresses the increase in 86 Rb efflux activity by ligand stimulation of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • the agonist can be stared in the test by feeding only the test compound into the receptor-expressing cells of the present invention and measuring the increase in 86 Rb efflux activity similar to the ligand of the present invention.
  • screening of an agonist is performed by contacting only the test compound with the Xenopus laevis oocyte introduced with the receptor gene RNA of the present invention, and measuring a change in cell membrane potential similar to the ligand of the present invention. You can also. ⁇
  • a safe and low-toxic drug such as gastrointestinal tract disease, cancer, immune disease, diabetes, etc., preferably as a preventive or therapeutic agent for gastrointestinal tract diseases (eg, diarrhea, malabsorption syndrome) , Irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia) It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for type II diabetes, etc.) Ulcers caused by inflammatory agents, hyperacidity and ulcers due to postoperative stress.
  • gastrointestinal tract diseases eg, diarrhea, malabsorption syndrome
  • Irritable bowel syndrome e.g, Irritable bowel syndrome, Crohn's disease
  • peptic ulcer eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-
  • Gastrointestinal diseases eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome), gastritis, reflux Used as a prophylactic / therapeutic agent for type II diabetes, etc.), esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, post-surgical stress, acidity and ulcers it can.
  • peptic ulcer eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome
  • NUD Non Ulcer Dyspepsia
  • digestive tract diseases eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenum) Ulcers, anastomotic ulcers, Zollinge r-Ellison syndrome, etc.
  • peptic ulcer eg, gastric ulcer, duodenum
  • Ulcers eg, gastric ulcer, duodenum
  • anastomotic ulcers e.g., Zollinge r-Ellison syndrome, etc.
  • gastritis eg, reflux esophagitis
  • UD Non Ulcer Dyspepsia
  • ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory agents e.g., post-surgical stress hyperacidic acid pickles Etc.
  • the above-described it gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of sciences of The United States of America, 86, 2766-2770 (1989)).
  • the lipozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention in accordance with a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7 ⁇ , 221 pages, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of RNA encoding the receptor of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the receptor of the present invention of the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known ribozyme.
  • a non-human mammal having an exogenous DN A of the present invention or a mutant DN A thereof is an embryo containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a progenitor cell thereof.
  • the calcium phosphate method, electric pulse It can be produced by transferring the target DNA by the method, ribofusion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc.
  • Promoters derived from various mammals such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, Muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dartathione S-transferase, platelet-derived growth factor; 3, keratin K l, 10 0 14 1, collagen type I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase ; 3 I subunit, dystrophin Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor thicine synkinase (commonly abbreviated as Tie 2), sodium thallium adenosine triphosphate (Na, K-one ATP ase), Neurofilament light chain, meta-orchionein I and IIA,
  • cytomegalovirus promoter capable of being highly expressed throughout the body
  • a human polypeptide chain elongation factor 1a (EF-1) promoter a human and chicken j3 lactin promoter, and the like are suitable.
  • the vector preferably has a sequence (generally called terminator 1) that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • terminator 1 a sequence that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • each vector derived from viruses and various mammals The sequence can be used, preferably the SV40 terminator of simian virus etc. Used.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and as the salt of the compound, the same salt as the salt of the test compound described above is used.
  • the GPR35 gene expression level in the rat ileal mucosa layer and muscle layer separated by the microdissection method was measured by TaqMan method, respectively.
  • Eleven week old male SD (IGS) rats were anesthetized with ether, then decapitated and exsanguinated.
  • the excised ileum was cooled and embeded in OCT compound under cooling with liquid nitrogen.
  • a 10 / m fresh frozen section was prepared on a slide glass with a special film (Leica: 90F0IL-SL25) using a cryostat, and then the section was dried in a cryostat chamber (_20 ° C).
  • the expression level of GPR35 gene increased.
  • the number of GPR35 gene expression copies per 25 ng RNA before differentiation and on maintenance days 5, 10, and 15 was 2300, 2200, 110000, and 160000, respectively.

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Abstract

（a）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（b）該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法およびスクリーニング用キットなどを提供する。本発明のスクリーニング方法およびキットは、例えば、消化管疾患、癌、免疫疾患、II型糖尿病または肥満などの予防・治療剤のスクリーニングに有用である。

Description

明細書 スクリーニング方法 技術分野
本努明は、 GPR35受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドと GPR35受容 体とを用いる医薬のスクリーユング方法およびスクリーニング用キット、 該スク リーニング方法またはキットによって得られうる化合物などに関する。 詳細には
、 消化器疾患などの予防 ·治療剤などの クリ一ユング方法おょぴスクリ一ニン グ用キットなどに関する。 背景技術
G protein-coupled receptor (GPCR) は、 7回膜貫通型受容体で、 ホノレモン、 神経伝達物質、 サイトカインゃ他の分子のシグナルを細胞膜内へ伝える働きを行 つている。
ヒト GPR35 (非特許文献 1 Genomics 47卷、 310- 313頁、 1988年） は GPCRの D で、 そのリガンドは報告されていない。 ヒト胃癌から抽出した GPR35の cDNA断片 に、 NIH3T3細胞をトランスフォームさせる活性があることを示唆することが報告 されている （非特許文献 2 Cancer Science 95卷、 131-135頁、 2004年） 。
6, 7-ジニトロキノキサリン 2， 3-ジオンは、 グルタミン酸受容体に作用する NMD A拮抗薬として知られている (非特許文献 3 International Review of Neurobio logy 32卷、 281- 303頁、 1990年） 。
エラグ酸は、 イチゴなどに含まれている天然のポリフエノールで、 抗癌作用 （ 非特許文献 4 Mutation Research 202卷、 429- 446頁、 1988年） 、 抗酸化作用 ( 非特許文献 5 Biochemical Pharmacology 42卷、 1441- 1445頁、 1991年） などの 生理作用を有することが知られている。 発明の開示
安全で優れた消化器疾患、 癌、 免疫疾患または糖尿病などの予防 ·治療剤が求 められている。 本発明者たちは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 6, 7-ジ ニトロキノキサリン 2， 3-ジオンなどのキノキサリン -2, 3-ジオン化合物おょぴェ ラグ酸が GPR35のリガンドであることを見出した。 とキノキサリン- 2, 3-ジ オンィ匕合物またはェラグ酸とを用いて、 消化器疾患、 癌、 免疫疾患などに有効な 医薬の探索が可能となると考え、 これらの知見に基づき、 さらに検討を重ねた結 果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩おょぴ (b) 該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いる ことを特徴とする、 該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリ一二ング方法、 .
〔2〕 リガンドが、 キノキサリン- 2， 3-ジオン化合物である上記 〔1〕 記載のス クリーニング方法、
[ 3 J キノキサリン- 2, 3 -ジオン化合物が、 6, 7 ジニトロキノキサリン- 2, 3 -ジ オン、 6 -二トロ- 7-スルファモイルベンゾ [f]キノキサリン- 2, 3 -ジオン、 6 -シァ ノ- 7 -二トロキノキサリン -2, 3 -ジオン、 または 5，トジ トロキノキサリン- 2， 3 - ジオンである上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、
〔4〕 リガンドが、 エラグ酸である上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、 〔5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が 、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列 番号： 2 7で表されるアミノ酸配列である上記 [ 1〕 記載のスクリーニング方法
〔6〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異 的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に接蝕させた場合と、 （b) 該リガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩に接触させた場合における、 該リガンド の該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、 比 較する、 上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、 [ 7 ] (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしぐは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩と特異 的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 （b) 該リ ガンドおよび試験ィ匕合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 該リガンドの該 細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較する、 上記 〔1〕 記載のスク リーニング方法、
〔8〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、 該蛋白 質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩をコードする D N Aを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩である上記 〔7〕 記載のスクリーニング方法、 ·
〔9〕 リガンドが、 標識したリガンドである上記 〔6〕 〜 〔8〕 記載のスクリ 一二ング方法、
〔1 0〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と特 異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガンドの存在下または非存在下、 試 験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合 における、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活 性を測定し、 比較する、 上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、
( 1 1〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と特 異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドま たはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 （b) 該 リガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を、 - 該蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお ける、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を 測定し、 比較する、 上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、 〔1 2〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩が、 該蛋 白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩をコードする D NAを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩である上記 〔1 1〕 記載のスクリーニング方法、
〔1 3〕 細胞刺激活性が、 細胞内 c AM P濃度の低下または上昇である、 上記
〔1 0〕 〜 〔1 2〕 記載のスクリーニング方法、
〔1 4〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および （b) 該蛋白質またはそ の塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、 該 蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング用キット、
〔1 4 a〕 上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法または上記 〔1 4〕 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
〔' 1 4 b〕 化合物が、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩とリガンドとの結合を阻害する化合物またはその塩である上記 〔 1 4 a〕 記 载の化合物またはその塩、
〔1 4 c〕 ァゴニストである上記 〔1 4 b〕 記載の化合物またはその塩、 〔1 4 d〕 アンタゴニストである上記 〔1 4 b〕 記載の化合物またはその塩、 C 1 4 e j 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩とリガ ンドとの結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔1 4 f 〕 上記 〔1 4 c〕 記載の化合物またはその塩を含有してなる消化管疾 患または Π型糖尿病の予防 ·治療剤、
〔1 4 g〕 上記 〔1 4 d〕 記載の化合物またはその塩を含有してなる消化器癌 、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療剤、 -
〔1 5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性を 促進する化合物またはその塩を含有してなる消化管疾患または II型糖尿病の予防 •治療剤、
〔1 6〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を 阻害する化合物またはその塩を含有してなる消化器癌、 免疫疾患または肥満の予 防 ·治療剤、
〔1 7〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリ ガンド、
〔1 8〕 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を 促進することを特徴とする消化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療法、
〔1 9〕 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を 阻害することを特徴とする消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療法、 〔2 0〕 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性を 促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消 化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療法、
〔2 1〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸.配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を 阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消 ィ匕器癌、 免疫疾患または肥満の予防、治療法、
〔2 2〕 消化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番 号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性を促進する化合物ま たはその塩の使用、
〔2 3〕 消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療剤の製造のための、 配列 番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同」のァミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物 またはその塩の使用などに関する。 以下、 「配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドもしくはその塩」 を 「本 発明の受容体」 または.「本発明の蛋白質」 と略記する場合がある。 さらに、 「本 発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド」 を 「本発明のリガンド 」 と略記する場合がある。
さらに、 本発明は、
(i) 標識した G T P γ Sの存在下、 本発明のリガンドを本発明の受容体細胞膜 画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合 物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の受容体細胞 膜画分への G T P y S結合促進活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発 明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング 方法、
(ii) 細胞内 c AMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のリガンドを本発明 の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在 下、 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の 細胞内 c AM Pの産生抑制活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明の リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ユング方法
(iii) 細胞内 c AMP量を增加させる物質の存在下、 本発明のリガンドを、 C R E—レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を C R E—レ ポータ一遺伝子べクタ一を導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合に おける、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較することを特徴とす る、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ 一二ング方法、
(iv) 本発明のリガンドを、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験ィ匕 合物を標識したァラキド ^酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場 合における、 ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することを特徴とす る、 本発明のリガンドと本努明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ 一ユング方法、
(V) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発 明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、 比較するこ とを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化 合物のスクリーニング方法、
(vi) 標識したイノシトールの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験ィ匕 合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 イノシトール三リン 酸産生活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の 受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ユング方法、
(vii) 本発明のリガンドを、 T R E—レポーター遺伝子ベクターを導入した本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非 存在下、 試験化合物を T R E—レポ一タ一遺伝子べクタ一を導入した本発明の受 容体発現細胞に接触させた場合における、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を 測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結 合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
(viii) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本 発明のリガンドの存在下または非存在下、 験化合物を本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することを特徴とする、 本発 明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング 方法、
(ix) 標識したルビジウムの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現 細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合 物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 標識したルビジウム の流出活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の 受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
(X) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発 明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を本努明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞外の p H変化を測定し、 比較することを特徴とす る、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ 一二ング方法、
(xi) ヒスチジン合成遺伝子を導入した本発明の受容体発現酵母を、 ヒスチジン 欠乏培地で培養し、 本発明のリガンドを接触させた場合と、 本発明のリガンドの 存在下または非存在下、 試験化合物を接触させた場合の、 該酵母の生育を測定し 、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を 変化させる化合物のスクリーニング方法、
(xii) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体遺伝子 RN A導入アフリカッメガ エル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を本発明の受容体遺伝子 RN A導入ァフリカツメガエル卵母細胞に接 触させた場合における、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較することを特徴とする 、 本努明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリー ユング方法なども提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 GPR 3 5および 1 5を発現する CHO— K 1細胞に DNQXを 添加した時の、 細胞内 C a 2+濃度の変化を調べた結果を表す。 図中、 縦軸は細 胞内 C a 2+濃度を示す蛍光強度を、 横軸は測定開始後の時間経過 （秒） を、 ◊ は DNQX 0. 3 μΜ、 □は DNQX 1. 0 μΜ、 △は DNQX 3. 0 μ Μ、 Xは DNQX . 1 0 μΜの場合をそれぞれ表す。
図 2は、 GPR 3 5および G o; 1 5を発現する CHO— K 1細胞にエラグ酸を 添加した時の、 細胞内 C a 2+濃度の変化を調べた結果を表す。 図中、 縦軸は細 胞内 C a 2+濃度を示す蛍光強度を、 横軸は測定開始後の時間経過 （秒） を、 ◊ はェラグ酸 0. 3 Μ、 口はエラグ酸 1. Ο μΜ、 △はェラグ酸 3. 0 μ Μ、 Xはェラグ酸 1 0 μΜの場合をそれぞれ表す。
図 3は、 GPR 3 5を安定発現させた CHO細胞における、 ホルスコリン刺激 によって増加させた細胞内 c AMP量の DNQXおよび NB QX添加による抑制 作用を調べた結果を表す。 図中、 縦軸は c AM Pi (pmo l'/w e 1 1 ) を、 横軸はホルスコリン （F SK) 、 0 ぉょぴ 8(3 の各添加量をそれぞれ 表す。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸 配列を有する蛋白質は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス 、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細 胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 脾臓 細胞、 骨髄細胞、 メサンギ ゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞 、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核 球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もし くは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もし くはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 網膜 、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎 、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下 腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または 血球系の細胞もしくはその培養細胞 （例、 MEL， Ml, CTLL-2, HT- 2， WEHI- 3， HL - 60， J0SK-1, K562, ML - 1， M0LT-3, MOLT - 4, MOLT - 10， CCRF-CEM, TALL-1, Jurka t， CCRT - HSB— 2， KE-37, SKW— 3， HUT - 78， HUT— 102， H9， U937, THP-1, HEL， JK— 1 ， CMK, K0-812, MEG-01など） に由来する蛋白質であってもよく、 合成蛋白質で あってもよい。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては 、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以 上、 より好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられ る。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Cen ter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Γοοΐ) を 用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギヤップを許す；マトリクス=8し031¾62；フィ ルタリング =0FF) にて計算することができる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す る蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同質 の活性を有する蛋白質などが好ましい。 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 7で表されるァミノ 酸配列、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列、 配列番号： 2 1で表されるァ ミノ酸配列、 配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列、 配列番号： 2 7で表され るアミノ酸配列などが挙げられる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であること力 S好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の 分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方 法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガンドの決定方法や スクリ一二ング方法に従って測定することができる。
また、 本発明の受容体と.しては、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番 号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 7で表されるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに 好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列 番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3ま たは配列番号： 2 7で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ま しくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加 したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配 列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1'〜5 0個程度、 好 ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 (iv) 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば ；!〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 よ り好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸 が挿入されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を 含有する蛋白質なども用いられる。
本発明の受容体の具体例としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含 有する蛋白質、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番 号： 1 9で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 2 1で表される ァミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 2 3で表されるァミノ酸配列を含有 する蛋白質、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質などが挙 げられる。
本努明の受容体の部分ペプチド （以下、 本努明の部分ペプチドと称する場合が ある） としては、 後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分 ペプチドであれば、 いかなるものであってもよく、 例えば、 本努明の蛋白質分子 のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 実質的に同質のリガンド結合 活性などを有するものなどが用いられる。
配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分べプチ ドとしては、 疎水性プロット解析において細胞外領域 （親水性 （Hydrophilic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 （Hydropho bic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。 個々のドメイン を個別に含むぺプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチ ドでもよい。
本発明の部分べプチドのァミノ酸の数は、 本発明の蛋白質の構成ァミノ酸配列 のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個 以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ま-しい。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以 上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜 5個） ） のアミ ノ酸が欠失し、 （ii) 上記アミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1 〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜 5個 ) ) のアミノ酸が付カ卩し、 または （iii) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以 上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜 5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
具体例としては、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列の第 24〜295番目のァ ミノ酸配列を含む部分ペプチド、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列の第 24〜 295番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチド、 配列番号： 1 9で表されるァミノ 酸配列の第 55〜326番目のァミノ酸配列、 配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配 列の第 65〜336番目のアミノ酸配列、 配列番号： 2 3で表されるァミノ酸配列の 第 109〜380番目のァミノ酸配列を含む部分ぺプチド、 配列番号： 2 7で表される ァミノ酸配列の第 23〜294番目のアミノ酸配列を含む部分べプチドなどが用いら れる。
本発明の受容体およぴ本努明の部分ペプチドは、 ペプチド標記の慣例に従って 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 C末 端はカルポキシ （- C00H) 、.カルボキシレート （- C00— ) 、 アミ ド （- C0NH2) また はエステル (-C00R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル、 例えば、 シクロペンチ ノレ、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル、 例えば、 フエニル、 a—ナフチ ルなどの 6_12ァリール、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー アルキルもしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー アルキルなどの C7_14ァラルキルのほ力 経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメ チルなどが用いられる。
本発明の受容体おょぴ本発明の部分ペプチドが C末端以外にカルポキシ （また はカルボキシレート） を有している場合、 カルボキシがアミ ド化またはエステル 化されているものも本発明の受容体およぴ本発明の部分べプチドに含まれる。 こ の場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる 。 さらに、 本楽明の受容体および本発明の部分ペプチドには、 N末端のアミノ酸 残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル、 ァセチル などの CMアルカノィルなどの ァシルなど） で保護されているもの、 生体內 で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 - 0H、 - SH、 アミノ基、 イミダゾー ル基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル、 ァセチルなどの C 6アル力ノィルなどの C wァシルなど） で保護されているもの
、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。 本発明の受容体または本発明の部分べプチドの塩としては、 生理学的に許容さ れる酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用い られ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩として は、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 ある いは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハ ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベン ゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド （本発明のリガンド ) としては、 本発明の受容体と特異的に結合するものであれば、 何れの物であつ てもよい。 例えば、 本発明の受容体との結合の解離定数が 1 0 M以下、 好まし くは 2 μ Μ以下、 さらに好ましくは 1 μ Μ以下、 特に好ましくは 2 0 0 η Μ以下 、 最も好ましくは 1 0 0 ηΜ以下である物などが挙げられる。
本発明のリガンドとしては、 例えば、 キノキサリン- 2, 3 -ジオン化合物、 エラ グ酸などが用いられる。 ―
キノキサリン - 2， 3 -ジオン化合物としては、 キノキサリン- 2， 3 -ジオン骨格を有 する化合物であればいずれでもよく、 例えば 6， 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジ オン、 6-ニトロ- 7 -スルファモイルベンゾ [f]キノキサリン- 2, 3-ジオン、 6-シァ ノ- 7 -二トロキノキサリン- 2, 3 -ジオン、 または 5， 7-ジニトロキノキサリン- 2，3- ジオンなどが挙げられる。 好ましくは、 6， 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジオン などが挙げられる。 ·
標識されたキノキサリン- 2, 3 -ジオン化合物、 標識されたェラグ酸も、 本発明 のリガンドに含まれる。 標識物質としては、 放射性同位元素 （例、 〔¾〕 、 〔125i〕 、 C14c] 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 〔3¾〕 など） 、蛍光物質 （例、 フルォレセインなど） 、発光物質 （ 例、 ルミノールなど） 、 酵素 （例、 ペルォキシダーゼなど） 、 ランタニド元素な どがあげられる。 中でも、 放射性同位元素が好ましい。
標識したリガンドとして好ましくは、 〔¾〕 または 〔1251〕 でそれぞれ標識さ れた 6， 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3-ジオン、 6_二ト口 _7 -スルファモイルべンゾ [f]キノキサリン- 2, 3 -ジオン、 6-シァノ -7 -二トロキノキサリン -2， 3 -ジオン、 ま たは 5, 7 -ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジオンなどが挙げられる。 好ましくは 〔¾ 〕 または ひ251〕 で標識された 6, 7 -ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジオンである。 本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、 前述したヒトゃ温血動物の細 胞または組織から自体公知のポリべプチドの精製方法によって製造することもで きるし、 ポリぺプチドをコ一ドする D N Aで形質転換された形質転換体を培養す ることによつても製造することができる。 また、 ペプチド合成法に準じて製造す ることもできる。 例えば、 Genomics、 56卷、 12- 21頁、 1999年、 Biochim. Biophy s. Acta, 1446卷、 57 - 70頁、 1999年などに記載の方法またはこれに準じた方法に より、 製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺轧動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩の合成には、 通常、 巿 販のポリぺプチド合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルアミン樹脂 、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチル ベンズヒドリルァミン樹脂、■ P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニル ァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2 ' ， 4， 一ジメ ト キシフエ二ルーヒ ドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2， ， 4， —ジメ ト キシフエニル一F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などをあげることができ る。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したァミノ 酸を、 目的とするポリペプチドの配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からポリぺプチドを切り出すと同時に各 種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実 施し、 目的のポリペプチド、 受容体、 部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取 得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリペプチド合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジ イミド類としては、 D C C、 N, N ' ージイソプロピルガルポジイミド、 N—ェ チルー N ' — ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられる 。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t， HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活 性ィ匕を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ポリべプチ ド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば 、 N, N—ジメチルホ /レムアミ ド， N， N—ジメチルァセトアミ ド， N—メチル ピロリ ドンなどの酸アミ ド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭 化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシド などのスルホキシド癀、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエー テル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢 酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反 応温度はポリぺプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から 適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化され たァミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用 いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合 反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返して も十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用 いて未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えない ようにすることができる。 . ·
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t一ペンチルォキシ カノレポ二ノレ、 イソポノレニノレ才キシカノレポ二ノレ、 4ーメ トキシペンジノレオキシカノレ ポ二/レ、 C 1一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフノレオロア セチノレ、 フタロイル、 ホルミノレ、 2—二トロフエニルスノレフエニル、 ジフエ二ル ホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステノレ化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t—プチノレ、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シクロヘプ チル、 シクロオタチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4一 二トロべンジノレエステル、 4ーメ トキシベンジノレエステノレ、 4—クロ口べンジノレ エステノレ、 ベンズヒ ドリノレエステノレィ匕） 、 フエナシノレエステノレィ匕、 ペンジノレオキ シカルボニルヒドラジド化、 tーブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （Cw) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカ ノレポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロ ピラニル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフヱノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12- B z l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メ トキシ -2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル 、 Bum, B o c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフヱノール、 2 ， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N —ヒドロキシフタルイミ ド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性ィ匕されたものとしては、 例えば、 対応するリ 'ン酸アミ ドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロピノレエチノレアミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、.また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チォァニソール、 メタクレゾーノレ、 パラクレゾーノレ、 ジメチノレスノレ フイド、 1， 4一ブタンジチォ一ノレ、 1， 2—エタンジチォーノレなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され 、 トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2一エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による 脱保護以外に、 希水酸ィ匕ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。
原料の反応に閿与すべきでない宫能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性ィヒなどは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
本発明の受容体または部分ペプチドを得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミ ノ.基側にペプチド （ポリペプチド） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド 鎖の Ν末端の α—アミノ基の保護基のみを除いたポリべプチドと C末端のカルボ キシル基の保護基のみを除去したポリぺプチドとを製造し、 この両ポリぺプチド を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同 様である。 縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、 上記方法により すべての保護基を除去し、 所望の粗ポリペプチドを得ることができる。 この粗ポ リぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥するこ とで所望の受容体またはその部分べプチドのァミド体を得ることができる。 本発明の受容体または部分べプチドもしくはそれらの塩のエステル体を得るに は、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール 類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 受容体またはその部分ペプチドのアミド 体と同様にして、 所望の受容体またはその部分ぺプチドのエステル体を得ること ができる。
本発明の受容体または部分ぺプチドは、 自体公知のぺプチドの合成法に従って 、 あるいは受容体の部分ペプチドについては、 受容体を適当なぺプチダーゼで切 断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば 、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明受容体ま たは部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮 合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプ チドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば 、 以下の （i) 〜 (V) に記載された方法があげられる。
(i M. Bodanszky■および M. A. 0ndetti、 Peptide Synthesis, Interscience P ublishers, New York (1966年〉
(ii) Schroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965 年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 20 5、 （1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ぺプチド合成、 広川書店
' また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラ フィ一、 液体ク口マトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて本発明の受容体ま たは部分ぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる受容体また は部分べプチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法に よって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方 法あるいはそれに準じる方法によつて遊離体または他の塩に変換することができ る。 '
本発明の受容体または部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 前述した本発明の受容体または部分べプチドをコ ドする塩基配列を含有するも のであればいかなるものであってもよい。 このうち D N Aが好ましく、 該 D N A は、 ゲノム D N A、 ゲノム D N Aライブラリー、 前記した細胞.組織由来の c D N A、 前記した細胞 ·組織由来の c D N Aライブラリー、 合成 D N Aのいずれで もよい。
ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞，糸且織より total R Aまたは mENA画分.を調製したものを用いて ft接 Revefse Transcriptase P olymerase Chain Reaction (以下、 RT-PCR法と略称する） によって增幅すること もできる。
本発明の受容体をコードする D N Aとしては、 例えば配列番号： 2、 配列番号 ： 8、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4または配列番号： 2 8 で表される塩基配列を含有する D N A、 または配列番号： 2、 配列番号： 8、 配 列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4または配列番号： 2 8で表され る塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有 し、 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号 ： 2 3または配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的 に同質の活性を有する受容体をコードする D N Aなどであれば何れのものでもよ い。
配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4または配列番号： 2 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下 でハイブリダィズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 8 、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4または配列番号： 2 8で表 される塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ばヽ Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Haroor Lao. P ress, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライ ブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことが できる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従つて行なうことがで きる。 .
ハイストリンジヱントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜 4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜65。Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65°Cの 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコ ードする D N Aとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D N Aな どが、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする DN Aとしては、 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番 号： 19で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする DNAとしては 、 配列番号： 20で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、 配列番号： 21 で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする DNAとしては、 配列番 号： 22で表される塩基配列を含有する D N Aなどが、 配列番号： 23で表され るアミノ酸配列を含有する受容体をコードする DNAとしては、 配列番号： 24 で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号： 27で表されるァミノ 酸配列を含有する受容体をコードする DN Aとしては、 配列番号： 28で表され る塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明の部分ぺプチドをコ一ドする DN Aとしては、 本発明の受容体の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ い。 また、 ゲノム DNA、 .ゲノム DNAライプラリー、 前記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのい ずれでもよい。 具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配 列番号： 22、 配列番号： 24または配列番号： 28で表される塩基配列を有す る D N Aの部分塩基配列を有する D N A、 または配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24または配列番号： 28で表さ れる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を 有し、 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 19、 配列番号： 21、 配列番 号 ·· 23または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質 的に同質の活性を有する受容体をコードする DN Aの部分塩基配列を有する DN Aなどが用いられる。 - 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号：'22、 配列番号： 24または配列番号： 28で表される塩基配列とハイプリダイズできる D N Aは 、 前記と同意義を示す。 ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D N A) は、 自体公知の方法で標識化されていてもよい。 標識物質としては、 放射性 同位元素、 蛍光物質 （例、 フルォレセインなど） 、 発光物質、 酵素、 ピオチン、 ランタニド元素などがあげられる。
本発明の受容体または都分ぺプチドを完全にコードする D NAのクローニング の手段としては、 本発明の受容体または部分ペプチドの部分塩基配列を有する合 成 D NAプライマーを用いて自体公知の P C R法によつて増幅する力 または適 当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明の受容体または部分べプチドの一部あ るいは全領域をコードする D NA断片もしくは合成 D NAを用いて標識したもの とのハイブリダイゼーシヨンによつて選別することができる。 ハイブリダイゼー シ 3ンの方法は、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法 に従って行なうことができる。
D N Aの塩基配列の変換は、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA- ύ PCR法、 G apped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従 つて行なうことができる。
クローン化された受容体をコードする D NAは目的によりそのまま、 または所 望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することができ る。 該 D NAはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての T AA、 T GAまたは T AGを有していて もよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 D NAァダプ ターを用いて付加することもできる。
本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （a) 本発明 の受容体または部分べプチドをコ一ドする D N Aから目的とする D N A断片を切 り出し、 （b) 該 D NA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連 結することにより製造することができる。 ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR322， p BR 32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110， p TP 5, p C 194) 酵母由来プラスミ ド (例、 p SH19， p SH15) 、 又ファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス ， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 ρΧΤ1、 R c/CMV, pR c/RS V, p c DNA I ZN e oなどが用いられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRo;プロモーター、 SV40プロモーター、 HI V * LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 HS V - ΤΚプロモーターなどがあ げられる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRひプロモ 一ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a。プロモーター、 r e cAプロモーター、 LPLプロモー ター、 1 p pプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 p e nPプロモータ 一など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター 、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞で ある場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Am と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遣 伝子 （以下、 Ne と'略称する場合がある、 G418耐性） 等があげられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスタ^ "細胞を用いて dh f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の受容体の N端末 側に付加する。 宿主がェシヱリヒァ属菌である場合は、 P h o A ·シグナル配列 、 Omp A · シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミ ラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン .シグナノレ配列などが、 宿主が酵母である 場合は、 MF a · シグナル配列、 SUC 2 · シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 ィンシュリン ·シグナノレ配列、 c —ィンターフェロン ·シグナ ル配列、 抗体分子'シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の受容体または部分べプチドをコ一ドする D N Aを含有するべクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシヱリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌の具体例としては、 例えば、 ェシェリヒア .コリ （Escheric hia coli) K 1 2 · DH 1 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 160 (1968)〕 ， JM1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309(1981)〕 ， J A2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120卷， 517(1978)〕 ， HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41卷， 459 (1969)〕 , C 6 00 [Genetics, 39 , 440(1954)] などが用い られる。
バチ^/ス属菌としては、 例えば、 バチノレス ·サブチ^^ス （Bacillus subtilis ) M I 1 1 4 [Gene, 24¾ 255(1983)] , 2 0 7- 2 1 [Journal of Biochemist ry, 95卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例え ίま、 サッカロマイセス セレビシェ (Saccharomyces cere visiae) AH 2 2, AH 2 2 R―， NA8 7- 1 1 A, DKD— 5D， 2 O B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c NPVの場合は、 ョトウガの幼虫 由来株化細胞 （Spodoptera frugiperda cell ； S f細胞） 、 Trichoplusia の 中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来.の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細 胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL17 11) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 In Vivo, 13, 213-217, (1977)) な どが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 卷， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7 (COS 7) ， Ve r o, チ ャィニーズハムスター細胞 C HO (以下、 CHO細胞と略記）.， d h f r遺伝子 欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO ( d h f r -) 細胞と略 記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH 3， ヒ ト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 69卷， 2110 (1972)や Gene, 17卷， 107(1982)などに記載の方法に従って行なうこと ができる。
バチノレス属菌を开質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, 1 68卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194卷， 182- 187 (19 91)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75卷， 1929(1978)などに記載の方法に従って 行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263-267(1995) (秀潤社発行） 、 Virology, 52卷， 456(1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。
このように.して、 受容体または部分べプチドをコ一ドする DN Aを含有する発 現べクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 パレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシェリヒア属菌を培養する際の培地としては 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetic s, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 力 S好ましレヽ。 こ こに必要によりプロモーターを効率よく働力せるために、 例えば、 3 —インド リルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5 - 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 パークホ 一ルダー (Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 77卷， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 （Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330 (1984)〕 があげられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整する が好ましい。 培養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4 〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜 6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日聞行な い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 122卷， 501 (1%2)〕 ， DME M培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕 ， R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of the American Medical Association 199卷， 519 (1967)〕 ， 1 9 9培地 〔Proceedi ng of the Society for the Biological Medicine, 73卷， 1 (1950)〕 などが用いら れる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外などに本発明の 受容体または部分べプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の受容体または部分ぺプチドを分離精製するには、 例え ば、 下記の方法により行なうことができる。
本発明の受容体または部分べプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際 しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に 懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは 細胞を破壌したのち、 遠心分離+ろ過によりポリべプチドの粗抽出液を得る方法 などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤 や、 トリ トン X— 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に ポリペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体ぁ るいは細胞と上清とを分離し、 上^を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる受容体または 部分ぺプチドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適宜組み合わせて行なうこと ができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解 度を利用する方法、 透析法、 限外ろ適法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアク リルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交 換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマト グラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ 一などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かくして得られる受容体または部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、 自 体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に 塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体 または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、 精製前または精製後 に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリぺ プチドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリ プシン、 キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロティンキナーゼ 、 グリコシダーゼなどが用いられる。 本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドは、 市販されている 場合には市販品をそのまま用いることもでき、 自体公知の方法またはこれらに準 じた方法に従って抽出または製造することもできる。
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以 下、 単に本発明の抗体と称する場合がある） は、 本発明の受容体に対する抗体を 認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであ つてもよい。 本発明の受容体に対する抗体としては、 受容体のシグナル伝達を不 活性化する抗体、 受容体のシグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。 本発明の受容体に対する抗体は、 本発明の受容体を抗原として用い、 公知の抗 体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕 '
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の受容体は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ 自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高め るため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与し てもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 用い られる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリがあげられるが、 マウスおょぴラットが好まし く用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマゥスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化ポ リぺプチドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定す ることにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーと ミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature)、 '256、 495 (1975)〕 に従い実施する ことができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G ) やセンダイウィルスなどがあげられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2Z0、 AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80%程度の濃度で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°C で 1〜 10分間ィンキュペートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 ポリペプチド （蛋白質） 抗原を直接あるいは担体とともに 吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いら れる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプ 口ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清 を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、 固相に結合し たモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン) を添 加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば 、 1〜 20 %、 好ましくは 10〜 20 %の牛胎児血清を含む R PMI 1640 培地、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ) あるい はハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ） などを 用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ましくは約 37。Cであ る。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は 、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイブリ ドーマ培養上清の抗体価 は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b) モノクローナル抗体の精製 - モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例、 DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相 あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを 採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことができ る。
〔ポリク口ーナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製造 することができる。 例えば、 免疫抗原 （ポリペプチド抗原） 自体、 あるいはそれ とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に温血動物に免疫を行い、 該免疫動物から本発明の受容体に対する抗体含有 物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリァ一に架橋させて免疫したハヅテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンや ゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1 〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクロ ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ノレ抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで きる。 · '
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードするポリ ヌクレオチド （例、 DNA) に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列また はその一部を含有するポリヌクレオチド （例、 DNA) としては、 該ポリヌクレ ォチドに相補的な、 または実質的に相捕的な塩基配列またはその一部を有し、 該 ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのポリ ヌクレオチド (ァンチセンスポリヌクレオチド) であってもよい。
具体的には、 本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド （例、 DNA) ( 以下、 これらの DNAを本発明の DN Aと略記する場合がある） に相補的な、 ま たは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンス DN A (以 下、 これらの DNAをアンチセンス DNAと略記する場合がある） が挙げられ、 本発明の DNAに相補的な、 または実質的に相捕的な塩基配列またはその一部を 有し、 該 DNAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチ センス DN Aであってもよい。
本発明の DN Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DN Aに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DN Aの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などがあげられ る。 特に、 本発明の DN Aの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明の受容体の N末端 部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の 相補鎖と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上 、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンス DNAが好適であ る。 これらのアンチセンス DNAは、 公知の DN A合成装置などを用いて製造す ることができる。
具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22 、 配列番号： 24または配列番号： 28で表される塩基配列を有する DN Aの塩 基配列に相捕的な、 もしくは実質的に相捕的な塩基配列、 またはその一部分を有 するアンチセンスポリヌクレオチド、 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24または配列番号： 28で表される塩基配 列を有する DNAの塩基配列に相捕的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンス DNAなどが挙げられる。 好ましくは例 えば、 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番 号： 2 4または配列番号： 2 8で表される塩基配列を有する D NAの塩基配列に 相補な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、 配 列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4 または配列番号： 2 8で表される塩基配列を有する D N Aの塩基配列に相補な塩 基配列、 またはその一部分を有するアンチセンス D NAなどが挙げられる。 アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホスホ ロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修飾りん 酸残基に置換されていてもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、 公 知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明の受容体遺伝子の複製または発現を阻害することので きるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 あるいはアミ ノ酸が決定された蛋白質をコードする D NAの塩基配列情報に基づき設計し、 合 成しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明の受容体遺伝子の RN A とハイブリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害することが できる力、 あるいは本発明の受容体関連 R N Aとの相互作用を介して本発明の受 容体遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明の受容体関連 RN Aの 選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明の受容体関連 RNA と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体内および 生体外で本発明の受容体遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病 気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めた ヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相捕 的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白 質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相捕体 から誘導される指令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 蛋 白質遺伝子の 5，端ヘアピンループ、 5， 端 6'—ベースペア 'リピート、 5， 端 非翻訳領域、 蛋白質翻訳終止コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン 、 3， 端非翻訳領域、 3， 端パリンドローム領域、 および 3， 端ヘアピンループ は好ましい対象領域として選択しうるが、 蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象 として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 については、 目的核酸が対象領域とハイブリダィズすることができる場合は、 そ の目的核酸は、 当該対象領域のポリヌクレオチドに対して 「アンチセンス」 であ るということができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2—デォキシ一 D— リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリヌ クレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその他のタイ プのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー (例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊 な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見 出されるような塩基のペアリング 塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチ ドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 二本鎖 D NA、 一本鎖 D NA、 二 本鎖 R NA、 一本鎖 RNA、 さらに D NA： R NAハイブリッドであることがで き、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さら には公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを 類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結 合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば 、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 (ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルぺプ チド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側 鎖基を有しているもの、 インター力レート化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレ ンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホ ゥ素、 酸ィヒ性の金属など） を含有するもの、 アルキルィヒ剤を含有するもの、 修飾 された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 こ こで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおょぴピ リミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつよ うなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチルイ匕されたプリンおょぴピ リミジン、 ァシルイ匕されたプリンおょぴピリミジン、 あるいはその他の複素環を 含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチド はまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか
、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に 変換されていてよい。
本努明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 あるい は修飾された核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例としては 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃ オリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それ 限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンスヌクレオチドは次のような方針で好ま しく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンスヌクレオチドをより安定 なものにする、 アンチセンスヌクレオチドの細胞透過性をより高める、 目標とす るセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるなら アンチセンスヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8， pp. 247, 1992； Vol. 8, pp. 395, 1992； S. T. Cro oke et al. ed.， Ant is ens e Research and Applications, し RC Press, 1993 な どに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾された 糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊 な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与え られることができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基 骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜と の相互作用を高めたり、 核酸の取込みを增大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロ ルなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加する に好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリル クロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。. こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合 を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 '端あるい は 5 '端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうし たキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコー ルなどのダリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げら れるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンスヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体 內ゃ生体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明の受容体の生体内や生体外の翻訳系 を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。 以下に、 （i) 本発明の受容体、 （ii) 本発明の受容体をコードするポリヌク レオチド （本努明のポリヌクレオチド） 、 （iii) 本発明の受容体に対する抗体 (本発明の抗体） 、 （iv) 本発明の受容体のアンチセンスポリヌクレオチド （例 、 D NA) (例、 本発明のアンチセンス D NA) 、 （V) 本発明の受容体に特異 的に結合する能力を有するリガンド （本発明のリガンド） などの用途を説明する
〔 1〕 疾病に対する医薬候捕化合物のスクリ一二ング
本発明のリガンドは、 例えば、 消化管機能調節活性、 腸管細胞増殖調節活性な どを有する。
本楽明の受容体を用い、 または組換え型本発明の受容体の発現系を用いたリガ ンドレセプターアツセィ系を用いることにより、 本発明の受容体と、 本発明のリ ガンドとの結合性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 抗体、 非べ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織 抽出液、 血漿など） またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。 該化合物またはその塩には、 （i) 本発明の受容体を介して細胞刺激活性 （例 、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AMP 生成、 細胞内 c AMP産生抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生 、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下 、 G T P γ S結合活性、 c AMP依存性プロティンキナーゼの活性化、 c GMP 依存性プロティンキナーゼの活性化、 リン脂質依存性プロティンキナーゼの活性 ィ匕、 微小管結合蛋白質リン酸化酵素 （MA Pキナーゼ） の活性化などを促進する 活性、 受容体細胞内移行活性など） を有する化合物 （ァゴ二スト） 、 （ii) 上記 細胞刺激活性を有しない化合物 （アンタゴニスト） 、 （iii) 本発明の受容体と 本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、 （iv) 本発明の受容体と.本発明 のリガンドとの結合力を阻害する化合物などが含まれる。
具体的には、 （i) 本発明の受容体に、 本発明のリガンドを接触させた場合と (ii) 本発明の受容体に、 本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させた場合 との比較を行なう。 比較は、 例えば、 本発明の受容体に対する本発明のリガンド の結合量、 細胞刺激活性などを測定して行う。
本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、 例えば、
ズ a) 本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明のリガン ドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、 本発明のリガ ンドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法、 ■
(b) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 本発明のリガン ドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする 、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその 塩のスクリーニング、方法、 および
(c) 本発明の受容体が、 本発明の受容体をコードする D N Aを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記 （b
) 記載のスクリーニング方法、
(d) 本発明のリガンドが、 標識したリガンドである上記 （a) 〜 （c) のスクリ 一二ング方法などのレセプター結合ァッセィ系、
(e) 本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明のリガン ドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、 本発明の受容 体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、.本発明のリガン ドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、 ·
(f) 本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分 に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含 有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 本発明の受容体を 介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方 法、 および
(g) 本発明の受容体が、 本発明の受容体をコードする D NAを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記 （f ) のスクリーニング方法などの細胞刺激アツセィ系などが挙げられる。
本発明のスクリ一二ング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明の受容体としては、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適に用いら れる。 しかし、 特にヒ ト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリー二 ングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容 体などが適している。 '
本発明の受容体を製造するには、 前述の本努明の受容体の製造方法などが用い られる。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の受容体を含有する細胞あるい は該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有す ¾細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って 行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、 本発明の受容体を発現した宿主細胞 をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物 細胞などが挙げられる。 製造方法は前述と同様である。
膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜が 多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破枠方法としては、 Potter— Elvehjem型 ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリ トロン （Ki nematica社製） による破碎、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧しな がら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。 細胞膜 の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が 主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500rpm〜3000rpm) で短時間 (通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （15000rpn！〜 30000rpm) で 通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発 現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含ま れる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、 1細胞 当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるのが好適 である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が 高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口 ットで大量の試料を測定できるようになる。
前記のレセプター結合ァッセィ系や細胞审激ァッセィ系などのスクリーニング 方法を実施するためには、 例えば、 本発明の受容体画分と、 本発明のリガンド （ 例、 標識した本発明のリガンド） などが用いられる。 本発明の受容体画分として は、 天然型の本発明の受容体画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型 本発明の受容体画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド 結合活性などを示す。 標識したリガンドとしては、 例えば、 放射性同位元素 （例 、 〔¾〕 、 〔12SI〕 、 〔14C〕 、 〔32P〕 、 ί33ρ] 、 〔35S〕 など） 、 蛍光物質 （例、 フルォレセインなど） 、発光物質 （例、 ノレミノーノレなど） 、酵素 （例、 ペルォキ シダーゼなど） またはランタ二ド元素などで標識されたリガンドなどを用いるこ とができる。
具体的には、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物のスクリ一ユングを行うには、 本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜 画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標 品を調製する。 バッファーには、 pH4〜： L 0 (望ましくは pH6〜8) のリン 酸バッファー、 トリス一塩酸バッファーなどのリガンドと受容体との結合を阻害 しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目 的で、 CHAPS、 Twe e n-80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デ +ォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチ ン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を 添加することもできる。 0.01〜10m 1の該レセプター溶液に、 一定量 （5 000〜500000 c pm) の標識した本発明のリガンドを添加し、 同時に 1 0一1。〜 10— 7Mの試験ィヒ合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るた めに大過剰の未標識の本発明のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応 は 0°C~50°C、 望ましくは 4°C〜37°Cで 20分〜 24時間、 望ましくは 30 分〜 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗 浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ 一または γ—カウンターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント（Β0) から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント (Β。一 NSB) を 100%と した時、 特異的結合量 （Β— NSB) が例えば 50%以下になる試験化合物を拮 抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
さらに、 表面プラズモンセンサー技術を利用することによって、 本 明の受容 体に結合する化合物をスクリーニングすることもできる。
具体的には、 ビアコア 3000 (ビアコア社） のセンサーチップ表面に、 本発 明の受容体を固定化後、 チップ表面にリン酸緩衝液 (PBS) などに溶解した試 験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、 本発明の 受容体に結合する試験化合物を選択する。 例えば、 表面プラズモンの変化の測定 値が 5レゾナンスュニット以上与える試験ィ匕合物を本発明の受容体に結合性を有 する物質として選択する。 .
前記の細胞刺激アツセィ系のスクリーニング方法を実施するためには、 本努明 の受容体を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c AMP産生抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン 酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下、 GT P γ S結合活性、 c AMP依存性 プロテインキナーゼの活性化、 c GMP依存性プロテインキナーゼの活性化、 リ ン脂質依存性プロテインキナ^ "ゼの活性化、 微小管結合蛋白質リン酸ィ匕酵素 （M APキナーゼ） の活性化などを促進する活性または抑制する活性、 受容体細胞内 移行活性など） を、 自体公知の方法または市販の測定用キタトを用いて測定する ことができる。 具体的には、 まず、 本発明の受容体を含有する細胞をマルチゥェ ルプレート等に培養する。 スクリーニングを行うにあたっては前もつて新鮮な培 地あるいは細胞に毒性を示さない適当なパッファ一に交換し、 試験化合物などを 添加して一定時間インキュべ^"トした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して 、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする 物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって 検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なっても よい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細 胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出する ことができる。
細胞刺激活性を測定してスクリ一ユングを行なうには、 適当な本発明の受容体 を発現した細胞が必要である。 本発明の受容体を発現した細胞としては、 前述の 本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験ィ匕合物としては、 例えばペプチド、 蛋白質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など があげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよく、 公知の化合物であつ てもよい。 試験ィ匕合物は塩を形成していてもよく、 試験ィ匕合物の塩としては、 金 属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性 または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金属塩の好適な例としては、 例え ばナトリゥム塩、 力リゥム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、 マグネシゥ ム塩、 バリゥム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる 。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァ ミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノー /レアミン、 トリエタノールァミン、 シク口へキシルァミン、 ジシクロへキシルァ ミン、 N, N，一ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸 との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸など との塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 ト リフルォロ酢酸、 プロピオン酸、 安息香酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒 石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼ ンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性ァミノ 酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 - リジン、 オル二チンなどとの 塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン酸 、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、 生理学的に許容し得る塩が好ましい。 例えば、 化合物内に酸性官能 基を有する場合にはアルカリ金属塩 （例、 ナトリウム塩， カリウム塩など） 、 ァ ルカリ土類金属塩 （例、 カルシウム塩， マグネシウム塩， バリウム塩など） など の無機塩、 アンモニゥム塩など、 また、 化合物内に塩基性官能基を有する場合に は、 例えば臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸など無機酸との塩、 または酢酸、 フ タル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 メタ ンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。 上記細胞刺激アツセィ系のスクリーユング方法について、 さらに具体的に以下 ( 1 ) 〜 （1 2 ) に記載する。
( 1 ) 受容体努現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると細胞内の G蛋白 質が活性ィ匕されて GTPが結合する。 この現象は受容体発現細胞の膜画分において も観察される。 通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化するが、 このとき反応液 中に GTP y Sを添加しておくと、 GTP T/ Sは GTPと同様に G蛋白質に結合するが、 加水 分解されずに G蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維持される。 標識した GTP y Sを用いると細胞膜に残存した標識された GTP 0； Sを測定することにより、 受容体 ァゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。
この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺 激活性を測定することによ.り、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を 変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
この方法は、 本努明の受容体を含む膜画分を用いて行う。 本測定法において本 発明の受容体膜画分への GTP y S結合促進活性を示す物質はァゴニストである。 具体的には、 標識した GTP y Sの存在下、 本発明のリガンドを本努明の受容体細 胞膜画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受 容体細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の受容体細胞膜画分への GTP 結合促進活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本努明の 受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 - 本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体細胞膜画分への GTP 7 S結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補 物質として選択することができる。 ' ·
—方、 試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、 本発明の受容 体細胞膜画分への GTP / S結合促進活性を測定することにより、 ァゴニストのスク リーユングを行なうこともできる。
スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。
公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、 膜希釈緩衝 液 （50mM Tris、 5mM MgCl2、 150mM NaCl、 Ι μ Μ GDP、 0. 1% BSA； pH7. 4) で希釈 する。 希釈率は、 受容体の発現量により異なる。 これを Falcon2053に 0. 2mlずつ 分注し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を加え、 さ らに終濃度 200pMとなるように [35S] GTP Y Sを加える。 25°Cで 1時間保温した後、 氷冷した洗浄用緩衝液 (50mM Tris, 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 0. 1% BSA, 0. 05 % CHAPS； pH7. 4) 1. 5mlを加えて、 ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。 65°C、 30分 保温して乾燥後、 液体シンチレーシヨンカウンターでろ紙上に残った膜画分に結 合した [35S]GTP y Sの放射活性を測定する。 本発明のリガンドのみを加えた実験 区の放射活性を 100%、 本努明のリ ンドを加えなかつた実験区の放射活性を 0% とし、 本発明のリガンドによる GTP y S結合促進活性に対する試験化合物の影響を 算出する。 GTP y S結合促進活性が例えば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能 力のある候補物質として選択することができる。
( 2 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 細胞内 cAMP の産生が抑制される。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体 発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の 受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のリガンドを本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物 を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産 生抑制活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体 との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内 cAMP量を増加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カルシト ニンなどが用いられる。
本発明の受容体発現細胞内の cAMP産生量は、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と 2 I〕 標識 cAMP (ともに市販品） を 使用することによる RIA系、 または抗 cAMP抗体と標識 cAMPとを組み合わせた EIA系 で測定することができる。 また、 抗 cAMP抗体を、 protein Aまたは抗 cAMP抗体産 生に用いた動物の IgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを 含むビーズと 〔1251〕 標識 cAMPとを使用する SPA (Scintillation Proximity Assa y) 法による定量、 化学増幅型レミネッセンスプロキシミティーホモジニアスア ッセィ系である AlphaScreen (PerkinElmer社） を応用した競合法 cAMP検出キット (PerkinElmer社） による定量も可能である。
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞の cAMP産生 抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質とし て選択することができる。
—方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 cAMP産生抑制 活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ一ユングを行なう ことができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞 （例、 CH0細胞などの動物細胞） を 24穴プレートに 5x1 04cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2raM 3-ィソプチル-メチルキサ ンチン、 0. 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （pH7. 4) で洗 浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後、 0. 5mlの反応用パッフ ァーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファーを除き、 新たに 0. 25ml の反応用バッファーを細胞に加えた後、 l ^ Mの本発明のリガンドまたは l i Mの本 発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を添カ卩した 2 μ Μ フオルスコリンを含む 0. 25ml の反応用バッファーを、 細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させる。 100 ^ 1の 20%過 塩素酸を加えて反応を停止させ、 その後氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMP を抽出する。 抽出液中の cAMP量を、 cAMP EIAキット （アマシャムフアルマシアパ ィォテク） を用いて測定する。 フオルスコリンの刺激によって産生された cAMP量 を 100%とし、 Ι μ Μの本発明のリガンドの添カ卩によって抑制された cAMP量を 0%と して、 本発明のリガンドによる cAMP産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算 出する。 本努明のリガンドの活性を阻害して、 cAMP産生活性が例えば 50%以上に なる試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候捕物質として選択することができる。 また、 本発明のリガンドの刺激により、 細胞内 cAMP量が増加する性質を示す本 発明の受容体発現細胞を使用する場合、 本発明のリガンドを本発明の受容体発現 細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドぉよぴ試験化合物を本発明の受容体 発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産生促進活性を測定 し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化 させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞の cAMP産生 促進活性を阻害する活性を示す試験ィヒ合物を、 拮抗阻害能力のある候捕物質とし て選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本努明の受容体発現細胞に接触させて cAMP産生促進活 性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこ とができる。
cAMP産生促進活性は、 上記のスクリ一ユング法においてフオルスコリンを添加 せずに本発明の受容体発現細胞 （例、 CH0細胞などの動物細胞） に本発明のリガ ンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加して産生された cAMPを上記 の方法で定量して測定する。
( 3 ) CRE-レポーター遺伝子ベクターを用いて、 本発明のリガンドの本発明の受 容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発 明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
CRE (cAMP response element) を含む DNAを、 ベクターのレポーター遺伝子上 流に挿入し、 CRE -レポーター遣伝子ベクターを得る。 CRE-レポーター遺伝子べク ターを導入した本発明の受容体発現細胞において、 cAMPの上昇を伴う刺激は、 CR Eを介したレポーター遺伝子発現と、 それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子 産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 を測定することにより、 CRE-レポーター遺伝子ベクター導入細胞内の cAMP量の変 動を検出することができる。
具体的には、 細胞内 cAMP量を增加させる物質の存在下、 本発明のリガンドを、 CRE -レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と 、 本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を、 CRE -レポーター遺伝子ベクター導入本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、. レポーター遺伝子蛋白質の酵 素活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との 結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内 cAMP量を增加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カルシト ニンなどが用いられる。
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン べィシックベクター、 ピツカジー ン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用いられる。 CREを 含む DNAを、 上記ベクターのレポーター遺伝子、 例えばルシフェラーゼ遺伝子上 流のマルチクローニングサイトに挿入し、 CRE-レポーター遺伝子ベクターとする 本方法において、 本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 抑制を回復させる試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択するこ とができる。
一方、 試験ィヒ合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 フオルスコリ ン刺激によって上昇した発光量の本発明のリガンドと同様な抑制を測定すること によりァゴニストのスクリ一二ングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 このスクリ 一二ング方法の具体例を以下に述べる。
CRE-レポーター遺伝子 （ルシフェラーゼ） を導入した本発明の受容体発現細胞 を、 24穴プレートに 5xl03cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM 3- イソブチル-メチルキサンチン、 0. 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバ ッファー （PH7. 4) で洗浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後 0 . 5mlの反応用パッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用パッファーを 除き、 新たに 0. 25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 Ι μ Μの本発明のリガ ンドまたは 1 μ Μの本発明のリガンドぉよび試験化合物を添加した 2 μ Μ フォルス コリンを含む 0. 25mlの反応用バッファーを、 細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させ る。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶かし、 溶解 液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ) を添加する。 ルシフェラーゼによる発光 は、 ノレミノメーター、 液体シンチレーシヨンカウンターまたはトップカウンター により測定する。 本発明のリガンド単独を添加した場合と、 ： Mの本発明のリガ ンドおよび試験ィ匕合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して 、 比較する。 ' ■ '
本発明のリガンドは、 フオルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光 量の增加を抑制する。 該抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候捕物質 として選択することができる。
レポーター遣伝子として、 例えば、 ア^^カリフォスファターゼ、 クロラムフヱ ニコーノレ ·ァセテノレトフンスフェラ" ir (chloramphenicol acetyl transferase ) 、 ]3—ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。 これらのレポーター遺 伝子蛋白質の酵素活性は、 公知の方法に従い、 または市販の測定キットを用いて 測定する。 アルカリフォスファターゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530 を用いて、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラーゼ活性は、 例えば 和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransf erase Assay KiTを用いて、 3—ガラクトシダーゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Gal- XEを用いて測定す る。
( 4 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 ァラキドン 酸代謝物を細胞外に放出する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明 の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができ る。
あらかじめ、 標識したァラキドン酸を、 本発明の受容体発現細胞に取り込ませ ておくことによって、 ァラ.キドン酸代謝物放出活性を、 細胞外に放出された標識 されたァラキドン酸代謝物を測定することによつて測定することができる。 具体的には、 本発明のリガンドを、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の 受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 標 識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合におけ る、 ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリ ガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 本方法において、 本発明のリガンドによるァラキドン酸代謝物放出活性を阻害 する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候捕物質として選択することができる。 また、 試験ィヒ合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明の受容体 発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりァゴニ スト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに 5xl04cell/wellで播種し、 24時間培 養後、 [¾]ァラキドン酸を 0. 25 /x Ci/^llとなるよう添カ卩し、 16時間後、 細胞を 0 . 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （PH7. 4) (以下、 反応用 バッファーと略記する） で洗浄する。 終濃度 10〃 Mの本発明のリガンドまたは終 濃度 10 μ Μの本発明のリガンドぉよび試験化合物を含む反応用パッファー 500 μ 1 を、 各 wellに添加する。 37°Cで 60分間インキュベートした後、 反応液 をシ ンチレーターに加え、 反応液中に遊離した [¾]ァラキドン酸代謝物の量をシンチ レーションカウンタ一により測定する。
反応用バッファー 500 ^ 1のみを添加した場合 （本発明のリガンド非添加'試 験化合物非添加） の遊離 [¾]ァラキドン酸代謝物の量を 0°/。、 10 Μの本発明のリ ガンドを む反応用バッファーを添加した場合 （試験化合物非添加） の遊離 [¾] ァラキドン酸代謝物の量を 100%として、 試験ィ匕合物を添加した場合の遊離 [¾] ァラキドン酸代謝物の量を算出する。
ァラキドン酸代謝物放出活性が、 例えば 50%以下になる試験ィ匕合物を拮抗阻害 能力のある候補物質として選択することができる。
( 5 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 細胞内の Ca 濃度が上昇する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現 細胞に対する刺激活性を測,定することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容 体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 本努明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、 比較することにより 、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー ニングする。 測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、 本発明のリガンドによる細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制 する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
—方、 試験ィヒ合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってァ ゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。 '
本発明の受容体発現細胞を、 滅菌した顕微鏡用力パーグラス上に播き、 2日後 、 培養液を、 4mM Fura-2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した HBSSに置換し、 室温 で 2時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、 キュベットに力パーグラスをセットし、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を添加し、 励起波長 340nmおよび 380ηηιでの、 505nmの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比 較する。
また、 FLIPR (モレキュラーデバイス社製） を使って行ってもよい。 本発明の 受容体発現細胞縣濁液に Fluo- 3 AM (同仁化学研究所製） を添加し、 細胞に取り 込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 96穴プレートに細胞を播く。 FLIPR 装置にセットし、 Fura-2の場合と同様に、 本発明のリガンドまたは本発明のリガ ンドおよび試験化合物を添加し、 蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比 較する。
さらに、 本発明の受容体発現細胞に、 細胞内 Caイオンの上昇によって発光する ような蛋白質の遺伝子 （例、 aequorinなど） を共努現させておき、 細胞内 Caィォ ン濃度の上昇によって、 該遺伝子蛋白質 （例、 aequorinなど） が Ca結合型となり 発光することを利用して、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化 させる化合物をスクリーニングすることもできる。
細胞内 Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させた 本発明の受容体発現細胞を,、 96穴プレートに播き、 上記と同様に、 本発明のリガ ンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィヒ合物を添加し、 蛍光強度の比の上昇を 蛍光測定器で測定し、 比較する。
本発明のリガンドによる蛍光強度の上昇を、 抑制する試験化合物を拮抗阻害能 力のある候補物質として選択することができる。
( 6 ) 受容体を発現する細胞に、 受容体ァゴニストを添加すると、 細胞内イノシ トール三リン酸濃度は上昇する。 本発明のリガンドの、 本発明の受容体発現細胞 における細胞内ィノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、 本発明の リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする ことができる。
具体的には、 標識したイノシトールの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の 受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 イノシトール三リン酸産生活 性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合 性を変化させる化合^をスクリーニングする。 測定は公知の方法に従って行う。 本方法において、 イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験ィヒ合物を、 拮 抗阻害能力のある侯捕物質として選択することができる。
—方、 試験化合物のみを本 明の受容体発現細胞に接触させ、 イノシトール三 リン酸産生上昇を測定することによってァゴニストのスクリーニングを行なうこ ともできる。 '
スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播き、 1日間培養する。 その後、 my 0- [2- ] inositol (2. 5 μ Ci/well) を添加した培地で 1日間培養し、 細胞を放射 活性を有するイノシトールを無添カ卩の培地でよく洗浄する。 本発明のリガンドま たは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加後、 10%過塩素酸を加え、 反応を 止める。 1. 5M水酸化カリウムおよび 60mM HEPES溶液で中和し、 0. 5mlの AGlx8樹 脂 （Bio - Rad) を詰めたカラムに通し、 5mM四ホウ酸ナトリウム （Na2B407) およ ぴ 60mM ギ酸アンモニゥムで洗浄した後、 1Mギ酸アンモニゥムおよび 0. 1M ギ酸 で溶出した放射活性を、 液体シンチレーシヨンカウンターで測定する。 本発明の リガンドを添加しない場合の放射活性を 0%、 本発明のリガンドを添加した場合 の放射活性を 100%とし、 試験化合物の、 本発明のリガンドと本発明の受容体の 結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、 例えば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻 害能力のある候補物質として選択することができる。
( 7 ) TRE-レポーター遺伝子ベクターを用いて、 本発明のリガンドの本発明の受 容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発 明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
TRE (TPA response element) を含む DNAを、 ベクターのレポーター遺伝子上流 に挿入し、 TRE-レポーター遺伝子ベクターを得る。 TRE-レポーター遺伝子べクタ 一を導入した本発明の受容体努現細胞において、 細胞内カルシウム濃度の上昇を 伴う刺激は、 TREを介したレポーター遺伝子発現と-、 それに引き続くレポーター 遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポーター遺伝子蛋 白質の酵素活性を測定することにより、 TRE-レポーター遺伝子ベクター導入細胞 内のカルシウム量の変動を検出することができる。 具体的には、 本発明のリガンドを、 TRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明 の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 TRE-レポ一タ一遺伝子べクタ一導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合に おける、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較することにより、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニン グする。
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン べィシックベクター、 ピツカジー ン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用いられる。 Ί¾Εを 含む DNAを、 上記ベクターのレポーター遺伝子、 例えばルシフヱラーゼ遺伝子上 流のマルチクローユングサイトに挿入し、 TRE-レポーター遺伝子ベクターとする 本方法において、 本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することがで さる。
—方、 試験ィ匕合物のみを TRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発 現細胞に接触させ、 本発明のリガンドと同様な発光量の増加を測定することによ りァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 このスクリ 一二ング方法の具体例を以下に述べる。
TRE-レポーター遺伝子 (ルシフェラーゼ) を導入した本発明の受容体発現細胞 を、 24穴プレートに 5xl03cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 05% B SAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （pH7. 4) で洗浄した後、 ΙΟηΜの 本発明のリガンドまたは ΙΟηΜの本発明のリガンドぉよび試験化合物を添加し、 37 。Cで 60分間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株 ) ) で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフ エラーゼによる発光は、 ルミノメーター、 液体シンチレーシヨンカウンターまた はトップカウンタ一により測定する。 本発明のリガンドを添加した場合と、 ΙΟηΜ の本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発 光量を測定して、 比較する。
本発明のリガンドによる細胞内カルシウムの上昇によって、 ルシフェラーゼに よる発光量が増加する。 この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物 質として選択することができる。
レポーター遺伝子として、 例えば、 ァ カリフォスファターゼ、 クロラムフエ ニコーノレ ·ァセチノレトフンスフエラーゼ (chloramphenicol acetyltransf erase ) 、 一ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。 これらのレポーター遣 伝子蛋白質の酵素活性は、 公知の方法に従い、 または市販の測定キットを用いて 測定する。 アルカリフォスファターゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530 を用いて、 クロラムフエ二コール'ァセチルトランスフェラーゼ活性は、 例えば 和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiTを用レヽて、 一ガラクトシダーゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Gal - XEを用いて測定す る。
( 8 ) 本発明の受容体発現細胞は、 '本発明のリガンドの刺激により、 MAPキナー ゼが活性化され、 増殖する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の 受容体 現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本 発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー ングすることができる 具体的には、 本発明のリ.ガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本発明の受容体発現細胞の増殖は、 例えば、 MAPキナーゼ活性、 チミジン取り 込み活性、 ATP量、 細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、 MAPキナーゼ活性については、 本発明のリガンドまたは本発 明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に添加した後、 細胞 溶解液から抗 MA Pキナーゼ抗体を用いた免疫沈降により MA Pキナーゼ分画を 得た後、 公知の方法、 例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay Kitおよび γ - [32P]-A TPを使用して MAPキナーゼ活性を測定し、 比較する。
チミジン取り込み活性については、 本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに 播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドぉよび試験化合物を 添加した後、 放射活性により標識したチミジン （例、 [methyl-3!!]-チミジンなど ) を加え、 その後、 細胞を溶解し、 細胞內に取り込まれたチミジンの放射活性を 、 液体シンチレーシヨンカウンターで計数することにより、 チミジン取り込み活 性を測定し、 比較する。
ATP量の測定については、 本発明の受容体発現鉀胞を 96穴プレートに播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を添加した 後、 例えば CellTiter- Glo (Promega) を用いて細胞内の ATP量を測定し、 比較す る。 ' 細胞数の測定については、 本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィヒ合物を添加した 後、 MTT (3- (4, 5- dimethyl - 2 - thiazolyl) - 2， 5-dipheny;L - 2H- tetrazolium bromid e) を添加する。 細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを、 塩酸に て酸性としたィソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、 570nmの吸収によつ て測定し、 比較する。
本方法において、 本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験ィヒ合物を、 拮 抗阻害能力のある侯補物質として選択することができる。
—方、 試験ィ匕合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明のリガン ドと同様な細胞增殖活生を.測定することによりァゴニストのスクリーニングを行 なうこともできる。
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べる 。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレ"トに 5000個/ゥヱル播き、 1日間培養する 。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にする。 本発明のリ ガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を、 細胞に添加して 24時間培養 した後、 [methyl- ]-チミジンをゥヱル当たり 0. 015MBq添加し、 6時間培養する 。 細胞を PBSで洗った後、 メタノールを添加して 10分間放置する。 次に 5%トリク ロロ酢酸を添加して 15分間放置後、 固定された細胞を蒸留水で 4回洗う。 0. 3N水 酸ィ匕ナトリゥム溶液で細胞を溶解し、 溶解液中の放射活性を液体シンチレーショ ンカウンターで測定する。 ·
本発明のリガンドを添カ卩した場合の放射活性の増加を抑制する試験ィヒ合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 ( 9 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 カリウムチ ャネルが活性ィヒし、 細胞内にある Kイオンが、 細胞外に流出する。 この反応を利 用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定す ることにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物をスクリーニングすることができる。
Kイオンと同族元素である Rbイオン （ルビジウムイオン） は、 Kイオンと区別無 く、'カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。 よって、 本発明の受容体発現 細胞に、 放射活性同位体である Rb ( [86Rb] ) を取り込ませておいた後、 本発明の リガンドの刺激によつて流出する86 Rbの流れ （流出活性） を測定することにより 、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定する。 具体的には、 86Rbの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現 細胞に接触させた場合における、 86Rbの流出活性を測定し、 比較することにより 、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー ニングする。
本方法において、 本発明のリガンド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制す る試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接蝕させ、 本発明のリガン ドと同様な86 R bの流出活性の上昇を測定することによりァゴニストのスタリー ユングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播き、 2日間培養する。 その後、 lmC ' i/mlの86 RbClを含む培地中で 2時間保温する。 細胞を培地でよく洗浄し、 外液中 の86 RbClを完全に除く。 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化 合物を細胞に添加し、 '30分後外液を回収し、 γカウンターで放射活性を測定し、 比較する。
本発明のリガンド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制する試験ィ匕合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 '
( 1 0 ) 本発明の受容体宪現細胞が本発明のリガンドに反応し、 細胞外の pHが変 化する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対 する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結 合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合における、 細胞外の p H変化を測定し、 比較することにより、 本発明のリ ガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 細胞外 pH変化は、 例えば、 Cytosensor装置 （モレキュラーデバイス社） を使用 して測定する。
本方法において、 本発明のリガンドによる細胞外 pH変化を抑制する試験化合物 を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、 試験ィ匕合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本究明のリガン ドと同様な細胞外 p H変化を測定することによりァゴニストのスクリーニングを 行なうこともできる。
スクリーユング法の--具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を Cytosensor装置用のカプセル内で終夜培養し、 装置 のチャンパ一にセットして細胞外 pHが安定するまで約 2時間、 0. 1% BSAを含む RP MI 1640培地 （モレキュラーデバイス社製） を灌流させる。 pHが安定した後、 本発 明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を含む培地を細胞上に灌 流させる。 灌流によって生じた培地の pH変化を測定し、 比較する。
本発明のリガンドによる細胞外 p H変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
( 1 丄) 酵母 (Saccharomyces cerevisiae の haploid a -mating type (MAT ) の性フェロモン受容体 Ste2は、 G蛋白質 Gpalと共役しており、 性フェロモン a -m ating factorに応答して MAPキナーゼを活性化し、 これに引き続き、 Farl (cell- cycle arrest) および転写活性化因子 Stel2が活性化される。 Stel2は、 種々の蛋 白質 （例えば、 接合に関与する FUS1) の発現を誘導する。 一方、 制御因子 Sst2は 上記の過程に抑制的に機能する。 この系において、 -受容体遺伝子を導入した酵母 を作製し、 受容体ァゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性ィ匕 し、 その結果生じる増殖などを指標として用いる、 受容体ァゴニストと受容体と の反応の測定系の試みが行なわれている （Trends in Biotechnology, 15卷， 48 7 - 494頁， 1997年） 。 上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、 本発明のリ ガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングするこ とができる。
具体例を以下に示す。
ΜΑΤ α酵母の Ste2および Gpalをコードする遺伝子を除去し、 代わりに、 本発明 の受容体遺伝子おょぴ Gpal- Gai2融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。 Far 1をコードする遺伝子を除去して cell- cycle arrestが生じないようにし、 また、 Sst2をコードする遺伝子を除去して本発明のリガンドに対する応答の感度を向上 させておく。 さらに、 FUS1にヒスチジン生合成遺伝子 HIS3を結合した FUS1- HIS3 遺伝子を導入する。 この遺伝子組換え操作は、 例えば、 Molecular and Cellular Biology, 15卷， 6188 - 6195頁， 1995年に記載の方法において、 ソマトスタチン 受容体タイプ 2 (SSTR2) 遺伝子を、 本発明の受容体に置き換えて実施することが できる。
このように構築された形質変換酵母は、 本発明のリガンドに高感度で反応し、 その結果、 MAPキナーゼの活性化が起き、 ヒスチジン生合成酵素が合成されるよ うになり、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、 上記の本発明の受容体発現酵母 （Ste2遺伝子おょぴ Gpal遺伝子が除去 され、 本発明の受容体遺伝子および Gpal- Gai2融合蛋白質コード遺伝子が導入さ れ、 Far遺伝子および Sst2遺伝子が除去され、 FUS1 - HIS3遺伝子が導入された MAT α酵母） を、 ヒスチジン欠乏培地で培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリ ガンドおよび試験化合物を接触させ、 該酵母の生育を測定し、 比較することによ り、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ 一二ングすることができる。
本方法において、 該酵母の生育を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある 候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、 本発明の リガンドと同様な酵母の生育を測定することによりァゴニストのスクリーニング を行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、 その 後、 ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、 2xl04 cell/mlの濃度になるように加 える。 ついで、 9x9cmの角形シャーレに播く。 寒天が固化した後、 本発明のリガ ンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表 面におき、 30°Cで 3日間培養する。 試験ィ匕合物の影響は、 濾紙の周囲の酵母の生 育を、 本発明のリガンドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。 また、 あらかじめ、 ヒスチジンを除去した寒天培地に本発明のリガンドを添加し ておき、 滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、 シャーレ全面 での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。
酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択するこ とができる。
( 1 2 ) 本発明の受容体遺伝子 RNAをアフリカッメガエル卵母細胞に注入し、 本 発明のリガンドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、 calcium-ac tivated chloride currentが生じる。 これは、 膜電位の変化としてとらえること ができる （Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様） 。 本発明のリガンドによ つて生じる本発明の受容体導入ァフリ力ッメガエル卵母細胞における上記反応を 利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定 することにより、 本発明の.リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化 合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体遺伝子 RNA導入アフリカッ メガエル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよぴ試験化合物を、 本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフリカッメガエル卵母細胞に接触させた場合に おける、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、 細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
一方、 試験ィ匕合物のみを本発明の受容体遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵 母細胞に接触させ、 本発明のリガンドと同様な細胞膜電位変化を測定することに よりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。 ·
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカッメガエルから取り出した、 卵母細胞塊 を、 MBS液 .（88mM NaCl， ImM KC1, 0. 41mM CaCl2, 0. 33mM Ca (N03) 2, 0. 82mM MgSO 4， 2. 4mM NaHC03, lOniM HEPES； pH7. 4) に溶かしたコラーゲ "一ゼ （0. 5mg/ml ) で卵塊がほぐれるまで 19°C、 1〜6時間、 150rpmで処理する。 外液を MBS液に置 換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピュレーターで本発明の受容体遺伝子 pol y A付加 cRNA (50ng/50nl) を卵母細胞にマイクロインジェクションする。
本発明の受容体遺伝子 inRNAは、 組織や細胞から調製してもよく、 プラスミドか ら in vitroで転写してもよい。 本発明の受容体遺伝子 mRNAを MBS液中で 20°Cで 3日 培養し、 これを Ringer液を流している voltage clamp装置のくぼみに置き、 電位 固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、 (― ) 極は細胞外に置く。 電位が安定したら、 本発明のリガンドまたは本発明のリガ ンドおよび試験ィ匕合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録する。 試験化合物 の影響は、 本発明の受容体遺伝子腿導入アフリカッメガエル卵母細胞の細胞膜 電位変化を、 本努明のリガンドのみ含む Ringer液を流した場合と比較することに よって測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択す ることができる。
上記の系において、 電^ εの変化量を増大させると、 測定しやすくなるため、 各 種の G蛋白質遺伝子の poly Α付加 RNAを導入してもよい。 また、 カルシウム存在下 で発光を生じるような蛋白質 （例、 aequorinなど） の遺伝子の poly A付加 R Aを 共インジェクションすることにより、 膜電位変化ではなく発光量を測定すること もできる。
本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその 塩のスクリーニング用キットは、 本発明の受容体または本発明の受容体を含有す る細胞もしくは細胞の膜画分、 およぴ本発明のリガンドを含有する。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1 . スクリーニング用試薬
(i) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 -
Hanks' Balanced Salt Solution (インビト'ロジェン社製） に、 0. 05%のゥシ 血清アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0. 45 μ ηιのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 または用時調製し ても良い。 .
(ii) 本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させた CH0細胞を、 12穴プレートに 5 X105個 Z穴で継代 し、 37°C、 5%C02、 95%airで 2日間培養したもの。
(iii) 標識リガンド
〔¾〕 、 〔1251〕 、 〔14C〕 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 〔3¾〕 などの放射性同位元素で 標識した本発明のリガンドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを、 4°Cま たは- 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 μ Μに希釈する。
(iv) リガンド標準液
本発明のリガンドを 0.1%ゥシ血淸アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで lmM となるように溶解し、 - 200Cで保存する。
2. 測定法
(i) 12穴組織培養用プレートにて培養した本楽明の受容体を発現させた細胞を 、 測定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後、 490 μΐの測定用緩衝液を各穴に加える。
(ii) 10— 3〜； 10— 1βΜの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した本努明のリガンド を 5μ1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験ィ匕 合物の代わりに 10— 3Μの本 明のリガンドを 5μ1加えておく。
(iii) 反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識された本発明のリガンドを 0.2N NaOH- 1%SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレ一 ター A (和光純薬製） と混合する。
(iv) 液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。
PMB= [ (B-NSB) / (B0-NS B) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NS B： Non-specific Binding (非特異的結合量）
B。 ：最大結合量 . ■ 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られう る化合物またはその塩は、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合を変化さ せる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進または阻害する化合物であり、 具体的には、 （i) 本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物または その塩 （本発明の受容体ァゴニス ト） 、 （ii) 該刺激活性を有しない化合物 （本 発明の受容体アンタゴニス ト） 、 （iii) 本発明の受容体と本 明のリガンドと の結合力を促進する化合物、 （iv) 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合 力を阻害する化合物などである。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 抗体、 非べプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 糸且織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、 これら化合物は新規 な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物の塩としては、 前記した試験化 合物の塩と同様のものが用いられる。
上記本発明の受容体ァゴニストであるか、 またはアンタゴニストであるかの評 価方法は、 例えば、 以下の （i) ま は （ii) に従えばよい。
(i) 前記 （a) 〜 （c) のスクリーニング方法で示されるバインディング 'アツ セィを行い、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる （特に 、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した本発明の受容体を介す る細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化合物ま たはその塩は本発明の受容体ァゴ-スト （ァゴ二スト） であり、 該活性を有しな い化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニス ト （アンタゴニス ト） であ る。
(ii) (a)試験ィヒ合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、 本発明の受 容体を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその 塩は本発明の受容体ァゴニストである。
(b)本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、 本 発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた 場合における、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する。 本発 明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物または その塩は本発明の受容体アンタゴニス トである。 .
前述したように、 本発明のリガンドは、 消化管機能調節活性、 腸管細胞増殖調 節活性などを有する。 従って、 本発明の受容体ァゴニス トは、 本発明のリガンド が有する生理活性 （例、 消化管機能調節活性、 腸管細胞増殖調節活性など） と同 様の作用を有しており、 安全で低毒性な医薬、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾 患、 糖尿病などの予防 ·治療剤として、 好ましくは消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収 不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸 潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ス ロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などの予防'治療剤として 有用である。
本発明の受容体アンタゴニストは、 本発明のリガンドが有する生理活性 （例、 消化管機能調節活性、 腸管細胞増殖調節活性など） を抑制することができるので 、 安全で低毒性な医薬、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 •治療剤として、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など ) 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性 疾患 （例、 慢' I"生関節リウマチ、 多発性硬ィ匕症、 重症筋無力症、 インスリン依存型 糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血 小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッドパスチュア 症候群など） など〕 、 肥満などの予防 ·治療剤などとして有用である。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物は、 安全で低 毒性な医薬、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 ·治療剤と して、 好ましくは消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 ク ローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger - E1 lison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ス テロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍 など〕 、 II型糖尿病などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物は、 安全で低 毒性な医薬、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 ·治療剤と して、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 .胃 MALTリンパ腫など） 、 免疫疾 患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I 型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性 溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性 紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーグレン症候群、 グッドパスチュア症候群など ) など〕 、 肥満などの予防'治療剤などとして有用である。
また、 本発明は、 本発明の受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドを用 いることを特徴とする本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法なども提供する。
具体的には、 （i) 本楽明の受容体を産生する能力を有する細胞を培養した場 合と （ii) 本発明の受容体を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を 培養した場合との比較を行い、 本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害 する化合物またはその塩をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 (i) と (ii) の場合における 、 本発明の受容体の遺伝子の発現畺 （具体的には、 本発明の受容体量または本努 明の受容体をコードする mRNA量など） を測定して、 比較する。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 抗体、 非ペプチド性化合物 、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物で あってもよい。
該試験ィ匕合物は塩を形成していてもよく、 該試験化合物の塩としては、 前記し た細胞刺激アツセィ系のスクリ一二ング方法などで用いられる試験ィヒ合物の塩と 同様の物が用いられる。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明ポリペプチドまたは本発明 の受容体を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮 遊して調製する。 バッファ一としては、 p t^ 4〜1 0 (望ましくは、 p H約 6 〜8 ) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファーなどの、 本発明の受容体の活性を 阻害しないバッファーであればレ、ずれでもよい。
本発明の受容体を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した本発 明の受容体をコードする D N Aを含有するべクタ ^で形質転換された宿主 （形質 転換体） などが用いられる。 宿主としては、 例えば、 C HO細胞などの動物細胞 が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培養する ことによって、 本発明の受容体を細胞膜上に発現させた形質転換体などが好まし く用いられる。
本発明の受容体の蛋白質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明の抗体を用 いて、 細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドまたは受容体を、 ゥエスタ ン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することが できる。
本発明の受容体の遺伝子の発現量は、 公知の方法、 例えば、 ノーザンブロッテ イングや Reverse transcription - polymerase chain reaction (RT- PCR) 、 リ / ルタイム PCR解析システム （ABI社製、 TaqMan polymerase chain reaction) など の方法あるいはそれに準じる方法にしたがつて測定することができる。
例えば、 '上記 (ii) の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、 上記 （ i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を促進する化合 物またはその塩として選択することができる。
例えば、 上記 （ii) の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、 上記 （ i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験ィヒ合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合 物またはその塩として選択することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を促進 （発現量を增加） する化合物またはその 塩は、 本発明のリガンドと同様に、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病 などの予防 ·治療剤として、 好ましくは消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群 '、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合 部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulce r Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによ る胃酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などの予防 ·治療剤などの医薬として 使用できる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 本発明の受 容体に対する本発明のリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 ·治療剤として、 好まし くは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性 閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウ マチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田 病、 悪性貧血、 シヱーダレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 肥 満などの予防 ·治療剤などとして有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 蛋白、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など から選ばれた化合物であり、 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合性を変 化させるィ匕合物、 本発明の受容体の活性または機能を促進または阻害する化合物
、 本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害 （発現量を増加または減少） する化合物などである。
該化合物の塩としては、 前記した試験ィ匕合物の塩と同様のものが用いられる。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上記の医薬 （予防 ·治療剤など） として使用する場合、 常 套手段に従って実施することができる。
該化合物またはその塩 ίま、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいほ水もしく はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射 剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認 められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などととも に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって 製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当 な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 ァノレギン酸などのような膨 ィ匕剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の捕助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェタノ ールなど） 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコーノレなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0™、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どと併用してもよい。 また、 該ィ匕合'物またはその塩を、 緩衝剤 （例えば、 リン酸 塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 (例えば、 塩ィ匕ベンザルコニ ゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリェチ レングリコールなど) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど ) 、 酸ィ匕防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアン プルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ 、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) に対して投与することができる。 本発明の受容体ァゴニストの投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルー トなどによっても異なるが、 例えば、 II型糖尿病の治療の目的で該ァゴ二ストを 経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該 化合物を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投 与する。 非経口的に投与する場合、 該ァゴ二ストの投与量は、 投与対象、 対象疾 患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 II型糖尿病の治療の目 的で該ァゴ二ストを注射剤の形で投与する場合、 般的に成人 （体重 60kgとして ) においては、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0.：！〜 20mg、 より好ましくは約 0. 1〜： LOmg静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動 物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。 一方、 本発明の受容体アンタゴニストの投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状 、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 大腸癌の治療の目的で該アンタ ゴニストを経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一 日につき該化合物を約 0.：！〜 100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1 . 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合、 該アンタゴニストの投与量は、 投 与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 大腸癌 の治療の目的で該アンタゴニストを注射剤の形で投与する場合、 一般的に成人 （ 体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg、 好ましくは 約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0.：!〜 10mg静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる また、 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進または阻害する化 合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによ つても異なるが、 例えば、 大腸癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜； 100 mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に 投与する場合、 該化合物の.投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートな どによっても異なるが、 例えば、 大腸癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で 投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合 物を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. 1〜： LOmg静脈注 射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算 した量を投与することができる。
〔2〕 本発明の受容体が関与する各種疾病の予防，治療剤
本発明の受容体は、 前述したような活性を有する本発明のリガンドへの結合活 性などを有する。 従って本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) に異常があったり、'欠損している場合には、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病など、 好ましくは消化管疾患 〔例、 吸収不良症候群、 過敏性腸 症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 下痢、' 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰 瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dy spepsia) 、 非ステロイ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃 酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などとなる可能性が高い。 従って、 本発明 の受容体または本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A) は、 例えば、 消化管疾 患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例 、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎 、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因 する潰瘍、 手術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などの 予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として使用することができる。
本発明の受容体または本発明のポリヌクレチドは、 例えば、 生体内において本 発明の受容体が減少あるいは欠損している患者がいる場合に、 ひ） 本発明のポ リヌクレオチドを該患者に投与し、 生体内で本発明の受容体を発現させることに よって、 （ii) 細胞に本発明のポリヌクレオチドを揷入し、 本発明の受容体を発 現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または （iii) 本発明の 受容体を該患者に投与することなどによって、 該患者における本発明の受容体の 役割を十分に、 あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 該ポ リヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ 一、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに 揷入した後、 常套手段に従って、 ヒ トまたは温血動物に投与することができる。 本発明のポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための捕助剤な どの生理学的に認められる担体とともに製剤ィ匕し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテ 一テルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明の受容体を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なくとも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明の受容体は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 ェ リキシル剤、 マイクロカプセノレ剤などとして経口的に、 または水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で 非経口的に使用できる。 例えば、 本発明の受容体を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認めら れた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することが できる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られ るようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解捕助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェタノ ールなど） 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0™、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム 緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば； 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど ) 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保 存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合 してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) が挿入されたベクターも上記と同様 に製剤化され、 通常、 非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、' トリ、 ヒッジ、 ブ タ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することができる。 本発明の受容体の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによ つても異なるが、 例えば、 II型糖尿病の治療の目的で該受容体を経口投与する場 合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該受容体を約 0. 1 〜： I00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経 口的に投与する場合、 該受容体の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ル ートなどによっても異なるが、 例えば、 II型糖尿病の治療の目的で該受容体を注 射剤の形で投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日に つき該受容体を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0.：!〜 10mg静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も'、 体重 60kg当 たりに換算した量を投与することができる。
〔3〕 本発明の受容体の定量
本発明の抗体は、 本発明の受容体を特異的に認識することができるので、 被検 液中の本発明の受容体の定量、 特に'サンドィツチ免疫測定法による定量などに使 用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明の受容体とを競合的に 反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明の受容体の割合を測定すること を特徴とする被検液中の本 明の受容体の定量法、 およぴ
(ii) 被検液と担体上に不溶ィ匕した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法を提供する。 上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明の受容体の N端部を認識 する抗体で、 他方の抗体が本発明の受容体の C端部に反応する抗体であることが 望ましい。
また、 本発明の受容体に対するモノクローナル抗体を用いて本発明の受容体の 定量を行うことができるほ力、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 こ れらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b，、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の受容体の定量法は、 特に制限されるべきもの ではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 ポリペプチド量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これ を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ れば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィム ノメトリック法おょぴサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点 で、 後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 'えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔14c〕 などが用いられる。 上記酵素としては 、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 i3—ガラクトシダーゼ、 β— グノレコシダーゼ、 ァノレカリフォスファターゼ、 パー才キシダーゼ、 リンゴ酸脱水 素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フル ォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチンーアビジン系を用いるこ ともできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常ポ リペプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用レ、 る方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの 不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あ るいはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶ィ匕した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識ィ匕した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶ィヒ担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の受容体量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に 行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 標識 化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドィ ッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体ある 、は標識用抗体に用いられる 抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種 類以上の抗体の混合物を用いてもよ.い。
本発明のサンドィツチ法による本発明の受容体の測定法においては、 1次反応 と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明の受容体の結合 する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次 反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明の受容 体の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以 外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ のち、 未反応の標識抗原 (F ) と、 抗体と結合した標識抗原 (B ) とを分離し （ B Z F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する 。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレンダリ コール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体とし て固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリツク法では、 被検液中の抗厚と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体と.を反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメ トリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の受容体の測定系を構築す ればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照 することができる。 .
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 （"Methods in ENZYM0L0GY J Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemica 1 Techniques (Part B) )、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D .' Selected Immunoassays) ) 、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E ： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol, 121 (Immunochemical Techniqu es (Part I ·· Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカ デミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の受容体を感 度良く定量することができる。 '
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の受容体の濃度を定量することによつ て、 本発明の受容体の濃度の増加が検出された場合、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病など、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ 腫など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己 免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬ィ匕症、 重症筋無力症、 インスリン 依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体 腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特 発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シヱーダレン症候群、 グッドパス チユア症候群など） など〕 、 肥満などの疾病である、 または将来罹患する可能性 が高いと診断することができる。 また、 本発明の受容体の濃度の減少が検出され た場合には、 例えば、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群 、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinge r- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 UD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多おょぴ 漬瘍など〕 、 II型糖尿病などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと 診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明の受容体 を検出するために使用することができる。 また、 本努明の受容体を精製するため に使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の受容体の検出、 被検 細胞内における本発明の受容体の挙動の分析などのために使用することができる
〔4〕 遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド （D NA) は、 例えば、 プローブとして使用するこ とにより、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ト リ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明の受 容体をコードする D N Aまたは mR NAの異常 （遺伝子異常） を検出することが できるので、 例えば、 該 D NAまたは mR NAの損傷、 突然変異あるいは発現低 下や、 該 D NAまたは mR NAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬とし て有用である。
本発明の D N Aを用いる上記の it伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブ リダィゼーシヨンや P C R—S S C P法 （Genomics, 第 5卷， 874〜879頁（1989年） 、 Proceedings of the National Academy of sciences of the United States o f America,第 86卷， 2766〜2770頁（1989年）） などにより実施することができる。 例えば、 本発明の受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例えば、 消 化管疾患、 癌、 免疫疾患、 .糖尿病など、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌 、 胃 MALTリンパ腫など) 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化 症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力 症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト 一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆 汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シヱーグレン症候 群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 肥満などの疾病である、 または将来 罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明の受容体の遺伝子 の発現減少が検出された場合は、 例えば、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候 群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻 合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 JD (Non U1 cer Dyspepsia) 、 非ステロイ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスに よる胃酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などの疾病である、 または将来罹患 する可能性が高いと診断することができる。 〔5〕 アンチセンスポリヌクレオチド （例、 D NA) を含有する医薬
本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A) に相補的に結合し、 該ポリヌクレオ チド （例、 D NA) の発現を抑制することができるアンチセンスポリヌクレオチ ド （例、 アンチセンス D N A) は、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病 などの予防 '治療剤として、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリ ンパ腫など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、„粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢 I1生関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インス リン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸 球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変 、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッド パスチユア症候群など） など〕 、 肥満などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な 医薬として有用である。 '
例えば、 上記アンチセンス D N Aを用いる場合、 該アンチセンス D N Aを単独 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァ ソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに揷入した後、 常套手段 に従って実施することができる。 該アンチセンス D N Aは、 そのままで、 あるい は摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 さらに、 該アンチセンス D NAは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用す ることもできる。
上記ァンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明の受容体をコードする R N Aの一部を含有する二重鎖 R NA (本発明の受容体に対する s i R N A (small (short) interfering藤)、 s h R NA (small (.short) hairpin腿)など) 、 本努明の受容体をコードする R NAの一部を含有するリポザィムなども、 本発 明のポリヌクレオチドの発現を抑制することができ、 生体内における本発明の受 容体または本発明のポリヌクレオチドの機能を抑制することができるので、 例え ば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 ·治療剤と'して、 好ましくは 消化器癌 （例、 胃癌、.大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞 性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ 、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症 性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本 病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性 f硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 肥満な どの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷， 494頁， 2001年） に準じて 、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7卷， 221頁 ， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造する ことができる。 例えば、 本発明の受容体をコードする RN Aの一部に公知のリボ ザィムを連結することによつて製造することができる。 本発明の本発明の受容体 をコードする R NAの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され得る本 発明の RNA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げられる。
上記の二重鎖 RN Aまたはリボザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場合 、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる
〔6〕 本努明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、 例えば消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防，治療 剤として、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 免 疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （ 例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病
(I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免 疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減 少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッドパスチュア症候群 など） など〕 、 肥満などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用で あ 。
本発明の抗体を含有する上記医薬は、 そのまま液剤として、 または適当な剤型 の医薬糸且成物として、 ヒトゃ温血動物 （例、 ラット、 ゥサギ、'ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することがで きる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なる I 例えば、 大腸癌患者の治療のために使用する場合には、 本努明の抗体を 1回 量として、 通常 0. 01〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さ らに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1日 1 〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および 経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合 には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口 または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形 、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤など があげられる。 かかる糸且成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において 通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠 剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシゥ ムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮內注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体また はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁また は乳ィ匕することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤 、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレング リコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベー 卜 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduct of nydrogenated casto r oil) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油な どが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを 併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直 腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合す ることによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜： L 0 Omg、 その他の剤形では 10〜25 Omgの上記抗体が含有されていることが 好ましい。
なお前記した各糸且成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
〔7〕 DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明の受容体をコードする DNA (以下、 本発明の外来 性 DN Aと略記する） またはその ¾異DNA (本発明の外来性変異 DN Aと略記 する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （1) 記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ 'る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフヱクシヨン法 、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキ ストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作出することが できる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用する こともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融 合させることにより本発明の DNA転移動物を作出することもできる。 非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ 、 ネコ、 モ/レモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも 、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57 BL/6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F系統， BDFi系 統， B 6D 2 系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラット (例 えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺 動物において発現しうる組'換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DN Aをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 ^の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば
、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への 置換などが生じた DN Aなどが用いられ、 また、 異常 DN Aも含まれる。
該異常 DNAとしては、 異常な本発明の受容体を発現させる DNAを意味し、 例えば、 正常な本発明の受容体の機能を抑制するポリべプチドを発現させる DN
Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DN Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種の'どちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN
Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D
N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の D N Aを有する各種哺乳動 物 (例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モノレモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラク ト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精
#P、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本宪明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明の受容体の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由 来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 ファージなどのバタテリオファージ 、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまたはバ キュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来の プラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好まし く用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （i) ウィル ス (例、 シミアンウイノレス、 サイ トメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモ 一ター、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス ター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 インス リン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン 、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダルタチオン S—トランス フェラーゼ、 血小板由来成長因子 ;3、 ケラチン K l， 1 0ぉょび 1 4、 コラ 一ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ ;3 Iサブュニ ット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウ ム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K一 ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティ ナーゼ 1組織ィンヒビター、 MHCクラス I抗原 (H- 2 L) 、 H— r a s、 レ ニン、 ドーパミン j8—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ポリべ プチド鎖延長因子 l a (EF- 1 α) 、 βァクチン、 αおよび i3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロブリン、 Th y— 1、 免疫グロプリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミ ォグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレプロエンケフアリン A、 バ ソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現する ことが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 a (EF— 1 ） のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ j3ァクチンプロモータ 一などが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネタ一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 D N Aをさらに髙発現させる目的で各 D N Aのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 D NAのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5， 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3， 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明の受容体の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 (例えば、 ゥサ ギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D NAおよび市販の各種ゲノム D NAライブ ラリーよりゲノム D NAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺 細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 D NAを原料 として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D NAは、 上記の細胞または 組織より得られた正常なポリぺプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異 した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D N Aコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D N Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
' 受精卵細胞段階における本発明の外来性 D NAの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来 f生 D N Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞およぴ体細胞の全てに本発明の外来性！） N Aを過 剰に有することを意味する。 本努明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本努明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明の受容体の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として利用 することができる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用いて、 本発明の受 容体の機能亢進症や、 本発明の受容体が関連する疾患の病態機序の解明およびこ れらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 本努明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の 受容体の増加症状を有することから、 本発明の受容体に関連する疾患 〔例、 消化 管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 (例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger-Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド.系抗炎症剤に 起因する潰瘍、 手術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 癌 （例、 消化 器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道 癌、 咽頭癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺 癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 免疫疾患 〔例、 敗血症、 粥状硬 化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患、 慢性関節リウマチ、 多発 性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾 患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰 瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧 血、 シエーグレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 II型糖尿病、 肥満など〕 に対する予防 ·治療剤のスクリ一二ング試験にも利用可能である。 一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物と'して通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラタ卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D NAの転移は、 対象哺轧動物の胚芽細胞おょぴ 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明の受容体の機能不活性型不応症どなることがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本発明 の受容体の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検 討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明の受容体の機能不活性型不応症における本癸明の異常ポリぺプチドまたは本発 明の異常受容体による正常ポリペプチドまたは受容体の機能阻害 （dominant neg ative作用） を解明するモデルとなる。
また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の受 容体の増加症状を有することから、 本発明の受容体の機能不活性型不応症に対す る治療薬スクリ一ユング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
(i) 組織培養のための細胞源としての使用、
(ii) 本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは RNAを直接分析する 、 または D NAにより発現されたポリぺプチドまたは受容体組織を分析するこ とによる、 本発明の受容体により特異的に発現あるいは活性化するポリぺプチド または受容体との関連性についての解析、
(iii) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 .一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （iii) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異ポリべプチドまたは受容体を単離精製およびその抗体作製 などが考えられる。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不活性型不 応症などを含む、 本発明の受容体に関連する疾患 〔例、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二 指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症侯群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎 、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術 後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 癌 （例、 消化器癌 （例、 胃癌、 大 腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 咽頭癌、 肝臓癌 、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 腌臓癌、 脳腫瘍 、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬 化症、 AIDS, 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多努性硬ィ匕症、 重症筋無 力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマ トーデス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性 胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シヱーグレン症 候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 π型糖尿病、 肥満など〕 の臨床症 状を調べることができ、 また、 本発明の受容体に関連する疾患モデルの各臓器に おけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該 疾患による二次的疾患の研究およぴ治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どの蛋白質分解酵素により、 遊離した D NA転移細胞の取得、 その培養またはそ の培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の受容体産生細 胞の特定化、 アポトーシス、 分ィ匕あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけ るシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本発明の受 容体およびその作用解明のための有効な研究材料となる。 ·
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不活性型不 応症を含む、 本発明の受容体に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、 上 述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のスクリー- ング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物または本発 明の外来性 D N A発現べクタ一を用いて、 本発明の受容体が関連する疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。
〔8〕 ノックァゥト動物
本努明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞おょぴ本 発明の DN A発現不全非ヒト哺 ¾動物を提供する。
すなわち、 本発明は、 。
(1) 本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺¾動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の] 3 _ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された上記 （1) 記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である上記 (1) 記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （1) 記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである上記 （4) 記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DN Aが不活性ィヒされた該 DN A発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の j3 _ガラクトシダーゼ遣 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記 （6) 記載の非ヒト哺乳動物 (8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 (6) 記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである上記 （8) 記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 上記 （7) 記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポ ター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリ一二ング方法を提供する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 あるいは該 DNAがコードしている本発明の受容体の活性を実 質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に本発明の受容体の発現能を有さ ない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト哺乳動物 の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。 非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壌することに より本発明のノックァゥト DN Aを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z (β—ガラクトシダーゼ遺伝子 ) 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表 とするレポータ一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壌するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列 ( 例えば、 o 1 y A付加シグナルなど) を揷入し、 完全なメッセンジャー RNA を合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壌するように構築した D NA配列を有する DNA鎖， （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について 本発明の D N A上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブ リダイゼーシヨン解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とター ゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配 列をプライマーとした PCR法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を 選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Eva nsと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでも'よい。 例えば、 マウスの ES 細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学 的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が 明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C57BL/6マウスや C5 7 BL/ 6の採卵数の少なさを DBA/ 2との交雑により改善した B D マウ ス （C 57.B LZ6と DBA/2との F を用いて樹立したものなども良好に 用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点 に加えて、 C 57BLノ 6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES 細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57BL/6マウスとパッククロス することでその遺伝的背景を C 57BL/6マウスに代えることが可能である点 で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 P C R法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる 。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要し ていたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数 （約 50個） で済むので、 培養 初期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、'注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S T O繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で L I F (1〜： 10000 U/m 1) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 .5%炭酸ガス、 95%空気または 5 %酸素、 5 %炭酸ガス、 90 %空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で培養 し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001〜0.5%トリプ シン/ 0. 1〜5 mM EDTA、 好ましくは約 0. 1%トリプシン/ /1 mM EDTA) 処理により 単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形 態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる o
E S細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種 々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufm an, Nature第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル'ォプ 'ェ ンブリオ口ジー .アンド .ェクスペリメンタル 'モルフォロジ一、 第 87卷、 27頁
、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の D NA発現不全細 胞は、 インビトロにおける本発明の受容体の細胞生物学的検討において有用であ る。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mR NA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同且換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックァゥトさせることができる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析またはター ゲッティングベクター上の D N A配列と、 ターグ.ッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D NA以外の近傍領域の D NA配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D NA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本楽明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選; ¾することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明の受容体のへテロ発現不全個体であり、 本発 明の受容体のへテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明の受容 体のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に. 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックァゥトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックァゥトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することに—より、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。 ·
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の受容体により誘導 され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明の受容体の生物活性の不活性化 を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及び治療法 の検討に有用である。
〔8 a〕 本発明の D N Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本凳明の D N Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一ユング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本努明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポータ一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポータ一遺伝 子が本発明の D NAに対するプロモータ一の制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験ィ匕合物としては、 前記と同様のものがあげられる。 該試験化合物は塩を形 成していてもよく、 該試験化合物の塩としては、 前記と同様の物が用いられる。 レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ーガラクトシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z ) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
' 例えば、 本発明の受容体をコードする D NA領域の一部を大腸菌由来の j3—ガ ラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明の受容体 の発現する組織で、 本発明の受容体の代わりに j3—ガラタトシダーゼが発現する 。 従って、 例えば、 5—ブロモ一4一クロ口一 3—インドリル一 j3—ガラクトビ ラノシド （X— g a l ) のような —ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用い て染色することにより、 簡便に本発明の受容体の動物生体内における発現状態を 観察することができる。 具体的には、 本発明の受容体欠損マウスまたはその組織 切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （P B S ) で洗 浄後、 X—.g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1 時間反応させた後、 組織標本を I mM E D T A/ P B S溶液で洗浄することに よって、 一ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D NAに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 前記した試験ィ匕合物の塩と同様のものが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明の受容体の発現を促進し、 本発明の受容体の活性または機能を促進するこ とができるので、 例えば、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症 候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zoll inger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia ) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多お よび潰瘍など〕 、 Π型糖尿病などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬とし て有用である。
また、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその 塩は、 本発明の受容体の発現を阻害し、 本発明の受容体の活性または機能を阻害 することができるので、 例えば、 消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫 など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免 疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多努性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依 存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト デス、 糸球体腎 炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発 性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーグレン症候群、 グッドパスチ ユア症候群など） など〕 、 肥満などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬と して有用である。 - さらに、 上記スクリ ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリ一二ング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩を含有する医薬 と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 イヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物化合物またはその 塩の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが 、 例えば、 吸収不良症候群の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的 に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好 ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与す る場合、 該化合物の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによ つても異なるが、 例えば、 吸収不良症候群の治療の目的で該化合物を注射剤の形 で投与する場合、 通常成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物 を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mg静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算し た量を投与することができる。
一方、 例えば、 本発明の D NAに対するプロモーター活性を阻害する化合物の 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例 えば、 大腸癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該ィ匕合物を約 0.：！〜 100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合、 該化 合物の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なる 1 例えば、 大腸癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で投与する場合、 通常 成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg、 好ま しくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0.：！〜 10mg静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O k g当たりに換算した量を投与するこ' とができる。 .
このように、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明ま.たは予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明の受容体のプロモーター領域を含有する D NAを使って、 その下 流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注入して いわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にそ のポリペプチドを合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる。 さ らに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現す るような細胞株を樹立すれば、 本発明の受容体そのものの体内での産生能力を特 異的に促進または阻害 （抑制） する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用 できる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IU PAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野 における' !1用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し 光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
D NA ：デォキシリポ核酸
c D NA ：相捕的デォキシリポ核酸 -
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ： シトシン
I ：イノシン
R ：アデニン (A) またはグァニン （G)
Y ：チミン （T) またはシトシン （C)
M ：アデニン (A) またはシトシン (C)
K ：グァニン (G) またはチミン （T)
S ：グァニン (G) またはシトシン (C)
W ：アデニン (A) またはチミン （T)
B ：グァニン (G) 、 グァニン （G) またはチミン （T)
D ：アデニン (A) 、 グァニン （G) またはチミン （T) ·
V ：アデニン (A) 、 グァニン (G) またはシトシン (C)
N ：アデニン (A) 、 グァニン (G) 、 シトシン (C) もしく はチミン (T) または不明もしくは他の塩基
RNA ： リポ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
d GTP ：デォキシグアノシン三リン酸
d CTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SD S ： ドデシル硫酸ナトリゥム
BHA ：ベンズヒドリルァミン
pMBHA ： p—メチノレベンズヒ ドリルァミン
T o s ： p―トノレエンスノレフォニノレ
B z 1 ：ベンジノレ
B om ：ペンジノレオキシメチル
B o c ： t一プチノレォキシカノレポ二ノレ
DCM ：ジクロロメタン
HOB t ： 1ーヒ ドロキシベンズトリァゾーノレ
DCC ： N, N，一ジシク口へキシルカルポジィミ ド
TF A ： トリフルォロ酢酸
D I EA ：ジィソプロピルェチルァミン
G 1 y又は G ：グリシン
A 1 a又は A ：ァラニン
Va 1又は V ：パリン
L e u又は L ： ロイシン
I 1 e又は I ：ィソロイシン
S e r又は S ：セリン .
Th r又は T ：スレオニン ·
C y s又は C ：システィン
M e t又は M ：メチォニン G 1 u又は E ： グルタミン酸
A s p又は D ：ァスパラギン酸
Ly s又は K ： リジン
Ar g又は R ：アルギニン
H i s又は H ： ヒスチジン
Ph e又は F ： フエニノレアラニン
Ty r又は Y ：チロシン
T r 又は W ： トリブトファン
P r o又は P ：プロリン
A s n又は N ： ァスパラギン
G 1 n又は Q ： グルタミン
p G 1 u - ピログノレタミン酸
Ty r (I) ： 3—ョードチロシン
DMF ： N, N—ジメチルホ
F m o c ： N- 9ーフノレ才レニ
T r t ： トリチル
P b f ： 2, 2， 4， 6， 7
フラン一 5一スルホ
C 1 t ： 2—クロ口トリチノレ
B ： t一ブチル
Me t (O) ： メチォニンスノレフォ 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒト GPR35のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で示されるァミノ酸配列を有するヒ.ト GPR35をコ、 ドする cDNAの塩 基配列を示す。 . -
〔配列番号： 3〕
参考例 1で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号.： 4 ]
参考例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 5で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
実施例 5で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
マウス GPR35 のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で示されるァミノ酸配列を有するマウス GPR35をコードする cDNAの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕 '
実施例 6で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕
実施例 6で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
実施例 6で用いられたプローブ 1の塩基配列を示す。 〔5' 末端にリポーター色 素として FAM (6 - carboxy- fluorescein) を、 3， 末端にはクェンチヤ一として TAM RA (6 - carboxy— tetramethyl— rhodamine) を標識した〕 。
〔配列番号： 1 2〕
実施例 6で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕
実施例 6で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 4〕
実施例 6で用いられたプローブ 2の塩基配列を示す。 〔5' 末端にリポーター色 素として FAM (6- carboxy - fluorescein) を、 3， 末端にはクェンチヤ一として TAM RA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) を標識した〕 。
〔配列番号： 1 5〕
実施例 7で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 6〕 実施例 7で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
実施例 7で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
実施例 7で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 9〕
ヒト GPR35 - L1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 20〕 '
配列番号： 19で示されるァミノ酸配列を有するヒ ト GPR35 - L1をコードする cDNA の塩基配列を示す。
/〔配列番号： 21〕
ヒト GPR35 - L2のアミノ酸配列を示 1"。
〔配列番号： 22〕
配列番号： 21で示されるァミノ酸配列を有するヒト GPR35- L2をコードする cDNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
ヒト GPR35 - L3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 24〕
配列番号： 23で示されるァミノ酸配列を有するヒト GPR35- L3をコードする cDNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕 ·
参考例 2で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕
参考例 2で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕 '
ラット GPR35のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 28〕 .
配列番号： 27で示されるァミノ酸配列を有するラット GPR35をコードする cDNA の塩基配列を示す。
〔配列番号 29〕 実施例 1 0で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。 ·
〔配列番号 3 0〕
実施例 1 0で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号 3 1〕
実施例 1 0で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号 3 2〕
実施例 1 1で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号 3 3〕
実施例 1 1で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号 3 4〕
実施例 1 1で用いられたプローブの塩基配列を示す。 実施例
以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 本発明 はそれに限定されるものではない。
DNQX は、 6， 7 -ジニト口キノキサリン- 2， 3 -ジオン (6, 7- dinitroquinoxaline- 2 , 3-dione) を表す。
NBQXは、 6-二ト口- 7-スルファモイルベンゾ [f]キノキサリン- 2， 3-ジォン （6- n itro- 7 sulfamoylbenzo [i」quinoxaline-2， 3-dione;を表す。 参考例 1
ヒ ト GPR35発現 CH0細胞株
ヒト GPR35をコードする DNA断片を PCR法により取得した。 2種のプライマー （配 列番号： 3および配列番号： 4 ) 各 20pmol、 10 X Advantage (登録商標） 2 PGR B uffer (CLONTECH) 5 μ 1、 50 X dNTP mix (CLONTECH) l /z l、 50 X Advantage 2 Pol ymerase Mix (CLONTECH) 1 1、 铸型 DNAとしてヒト肝臓 cDNA液 (CLONTECH) Ι μ ΐ を含む混合液 50 1を調製し、 サーマルサイクラ (GeneAmp (登録商標） PCR sy stem model 9700 (Applied Biosystems) ) を用いて 96°C、 1分、 続いて 96。C、 30 秒； 63°C、 40秒； 72°C、 120秒を 35サイクル繰り返し、 さらに 72°C、 10分で伸長 反応させるプログラムで PCR反応を行った。 反応終了液をァガロースゲル電気泳 動することにより単一の生成物を得、 TAクローニングキット （Invitrogen) を用 いてクロ ニングし、 遺伝子配列を確認した。 PCRエラーがないクローンについ て、 制限酵素 Sail (宝酒造） 、 Clal (宝酒造） で二重消化した後、 ァガロースゲ ル電気泳動して、 単一の生成物を切り出した。 得られた断片 （約 lkb) を pAKKO-1 11ベクター [Biochem. Biophys. Acta.， 1219卷， 251 (1994)〕 に導入し、 常法に従 つて CH0細胞にトランスフエクシヨンし、 ヒ ト GPR35発現 CH0細胞株を得た。 参考例 2
ラット GPR35のクローニング
ラット （SD) 小腸 cDNA (Seegene) を歸型として、 プライマー 1 (配列番号： 2 5 ) およびプライマー 2 (配列番号： 2 6 ) を用いて PCR を行なった。 PCR には Pyrobest DNA polymerase ( 酒造） を用い、 （1) 98°C 10秒の後、 （2) 98 。C 10秒、 68°C 60秒を 35回の後、 （3) 68°C 7分の伸長反応を行なった。 増幅 産物を pCR- Blunt2- T0P0 vector (Invitrogen) に挿入し、 これを大月昜菌 JM109 (宝酒造） に導入してクローユングした。 その塩基配列を解析した結果、 配列番 号： 2 8で表されるアミノ酸配列を有するラット GPR35をコードする cDNAの塩基 配列 （配列番号： 2 7 ) を得た。 実施例 1
GPR35に対するリガンド探索
CH0- K1細胞株 （ATCCより購入） は、 特に記載が無い限り 10% 牛胎児血清 （Inv itrogen) を含むハム F- 12培地 （Invitrogen) を用いて培養した。 トランスフエ クションを行う前日に 10cm2あたり 4. 5xl05個の細胞を播き、 5% C02濃度に調整さ れた C02培養器にて 37。Cで 15時間以上培養した。 トランスフエクションは Lipof e ctamine試薬 (Invitrogen) を用い、 試薬添付の方法に準じて操作を行った。 培 養器に 6- wellプレートを使用する場合は、 以下のように行った。 まず、 1. 5ml容 チューブを 2本用意し、 それぞれに Opt i - MEM培地 （Invitrogen) を 100 /z l分注し た。 次に、 片方のチューブに参考例 1で得られた GPR35発現ベクター l /i g、 およ び G a 15発現ベクター （Guthrie cDNA Resource Center) 0. を入れ、 もう片 方のチューブに Lipofectamine試薬を 6 μ 1添加後、 両者を混合し、 20分間室温に 静置した。 この溶液に Opti- MEM培地を 800 μ 1加えたトランスフエクション用混合 液を、 あらかじめ Opti- MEM培地を用いて洗浄した CH0-K1細胞に添加後、 ∞2±咅養 器にて 6時間培養した。 培養後の細胞は、 PBS (Invitrogen) を用いてリンスした 後、 0. 05% トリプシン ' EDTA溶液 （Invitrogen) を用いて剥がし、 遠心操作に て回収した。 得られた細胞の数を測定し、 培地 100 1あたり 5xl04個の細胞が含 まれるように希釈し、 Black walled 96-well plate (Costar) に 1穴あたり 100 1ずつ分注後、 C02培養器にて一晚培養した。 上記トランスフエクション操作にて —過性に受容体を発現した CH0-K1細胞に各種の試験サンプルを添加し、 この際の 細胞内カルシウム濃度の変動を FLIPR (Molecular Device) を用いて測定した。
FLIPRにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、 以下の前処置を施 した。 まず、 細胞に蛍光色素 Fluo- 3AM (D0JIN) を添加するため、 または FLIPRァ ッセィを行う直前に細胞を洗浄するためのアツセィパッファーを作成した。 HBS S (Invitrogen) 1000mlに 1M HEPES (pH7. 4) (D0JIN) 20mlを加えた溶液 (以下 、 HBSS/HEPES溶液） に、 プロぺネシド （Sigma) 710mgを IN NaOH 5mlに溶解後さ らに HBSS/HEPES溶液 5mlを加え混合した溶液 10mlを添加し、 この溶液をアツセィ バッファ一とした。 次に Fluo-3AM を 1 DMS0 (D0JIN) に溶解し、 さら に等量の 20% プルロン酸 （Molecular Device) を加え混合後、 105 ^ 1の牛胎児 血清を添加した 10. 6mlのアツセィバッファーに加え、 蛍光色素溶液を調製した。 トランスフエクション処理を施した CH0- K1細胞の培地を除き、 直ちに蛍光色素溶 液を 1穴あたり ΙΟΟ μ Ιずつ分注後、 C02培養器にて 1時間培養し、 細胞に蛍光色素 を取り込ませた。 培養後の細胞は上記のァッセィバッファーを用いて洗浄した後 、 FLIPRにセットした。 また、 受容体発現 CH0-K1細胞に添加する試験サンプルは 、 アツセィバッファーを用いて調製し、 同時に FLIPRにセットした。
以上の前処置を施した後、 FLIPRにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシ ゥム濃度の変動を測定した。
その結果、 DNQX (図 1) 、 エラグ酸 （図 2) 、 6-シァノ -7 -二トロキノキサリン - 2， 3 -ジオン、 NBQXおよび 5， 7-ジニトロキノキサリン- 2, 3-ジオンを加えたとき、 G PR35および 00；15を同時に発現する( 1!0-]^1細胞が、 用量依存的に応答 （細胞内力 ルシゥム濃度の上昇） した。 発現ベクター pAKKO - 111H (Biochem. Biophys. Acta .， 1219卷， 251頁， 1994年）のみを導入した対照の CH0- K1細胞では、 このような応答 は見られなかった, 実施例 2
ヒト GPR35発現 CH0細胞株における、 フオルスコリン添加による増加細胞内 cAMP 量の DNQXおよぴ NBQXによる抑制
参考例 1で得られたヒ ト GPR35発現 CH0細胞を、 アツセィ用培地 （HBSS (GibcoB RL) に 0. 1%ゥシ血清アルブミンおよび 0. 2mM isobutylmethylxantMneを添加し たもの） にて洗浄した後、 37°C、 5%C02条件下で 30分培養した。 アツセィ用培地 にて希釈した各濃度の DNQXおよぴ NBQXを添加し、 その後フォルスコリン 2 μ Mとな るように添加した。 37°C、 5%C02条件下で 30分培養した。 培養上清を捨てて、 cA MP screen kit (アプライドバイオシステムズ社） のプロトコールに従い、 細胞 内の cAMP量をプレートリーダー （EnVision、 PerkinElmer社） を用いて測定した その結果、 ヒ ト GPR35発現 CH0細胞株にのみ、 フオルスコリン添カ卩によって増カロ させた細胞内 cAMP量の DNQXおよび NBQXによる用量依存的減少かつ特異的な減少が 検出された （図 3) 。
これより、 GPR35がァゴニストにより活性ィ匕されると、 細胞内 cAMP濃度が低下 することがわかる。 細胞内で cAMPは主要なシグナル伝達物質の一つとして働い ており、 細胞に様々な変化をもたらすことが知られている。 従って、 細胞内 cAMP の濃度を、 GPR35のァゴニスト （cAMP濃度を下げる作用を有する） 、 または GPR35 のアンタゴニスト （cAMP濃度を上げる作用を有する） で調節することにより、 種 々の病態を改善させることが可能となる。 実施例 3
MAPKのリン酸化亢進'
参考例 1で得られたヒト GPR35発現 CH0細胞を、 5 X 104 cells/well の濃度で 1 2 - well Plate で 48時間培養した。 培地は 10%透析 FBSを含む MEM α (核酸不含） を使用した。 培地を吸引除去後、 血清を含まない培地 1 ml (x2) で細胞を洗浄後 、 血清を含まない培地 500 / lを添加し、 37°Cで 16時間培養した。 細胞に至適濃度 の DNQXまたは NBQX を添加し、 37°Cで 5分間培養した。 培地を吸引除去後、 直ちに 50 μ ΐの Blue Loading Buffer (BioLabs) を添加し、 ピペッティングにて細胞を 溶解 '分取した。 細胞溶液を sonicator (sono cleaner; KAIJO DENKI)を用いて 破砕後、 95°Cで 5分間熱処理を行なった。 遠心分離 （15，000 rpm， 4°C, 5分間） を行い、 上清を最終サンプルとした。
サンプル 10 1を 10% SDS - PAGEで泳動後、 ウェスタンブロッティング法にて PV DF膜 (BI0-RAD) にトランスファーした。 膜をブロックエース （大日本製薬株式 会社） に浸し、 室温で 1時間振とうした。 一次抗体 （Phospho- P44/42 Map Kinase antibody; Cell Signaling) を含むブロックエース （1/2000希釈） に浸し、 室 温で 1時間振とうした。 膜を TBS - tween20 (50 mM Tris- HC1 (pH7. 6)， 150 mM NaCl ， 0. 05% Tween- 20)に浸し 5分間 （x 2) 振とうし、 洗浄した。 膜を TBS - tween20 で希釈した HRP標識二次抗体 (Goat Anti-Rabbit IgG, HRP- conjugate; upstate) (1/5000希釈）に浸し、 室温で 1時間振とうした。 膜を TBS- tween20に浸し 10分間 (X 3) 振とうし、 洗浄した。 膜を ECLplus ウェスタンプロッティングシステム (Amersham Biosciences) の取り扱い説明書に従い、 蛍光検出器（LAS- 1000 ; FUJI FILM)により検出を行なつた。 1-5 μ.Μの DNQXまたは NBQX刺激により、 ヒ ト GPR35 受容体発現 CH0細胞の MAP- kinase のリン酸化レベルは亢進されていた。 コント口 ール細胞 （公知方法により作製されたヒ ト TGR23発現 CH0細胞）に対しては、 リン 酸化レベルの亢進は観察されなかつた。 実施例 4
CH0細胞に発現させた GPR35— GFP融合タンパク質の DNQX、 NBQX添加による細胞 内移行
ヒ ト GPR35タンパク質の C末端に GFPを融合したタンパク質を安定的に発現させ た CH0細胞株を、 自体公知の方法により動物細胞用発現プラスミドを用いて樹立 した。 該タンパク質の細胞内移行 （インターナリゼーシヨン） の検定には、 増殖 期にある該細胞を、 40000cells/ゥエルの濃度で 96穴プレート （Packard社、 Vie w-Plate™-96, Black) に播種し、 37°C、 5% C02で-一晩培養したものを用いた。 まず、 アツセィ用緩衝液 (HBSS (GibcoBRL) に 0. 1%ゥシ血清アルブミンを添カロ したもの） にてゥエル内の該細胞を洗浄した後、 3 μ Μ、 10 ^ ¾1ぉょぴ30 ¾1の1) および NBQXを含む同アツセィ用緩衝液を各ゥエルに 100 ^ 1ずつ添加し、 37。C、 5 % C02条件下で培養した。 その後細胞固定液 （4%パラホルムアルデヒド含有 PBS (Ca/Mg不含） ） を 100 μ ΐ/ゥエル添加して室温下 30分放置した。 細胞固定液を除 去し、 Ca/Mg不含ー PBSで細胞を洗浄後、 ラベル化溶液 (3. 13 ^ g/ml wheat germ aggulutinin (Molecular Probes社 W- 849) 、 5 μ g/ml Hoechst含有 Ca/Mg不含 P'B S) を 50 μ ΐ/ゥエル添加し、 室温下 20分放置した。 ラベル化溶液を除去後、 細胞 を Ca/Mgフリー PBS (200 μ 1/ゥヱル） で洗浄し、 同液 （200 1/ゥヱル） へ置換し た後、 プレート表面をシーノレして、 直ちに Cellomics ArrayScan System (Cellom ics社）にて解析した。 GPR35-GFP融合タンパク質の細胞内局在性の評価は、 同シ ステムに付属の GPCR Signaling Assay Protocol中のパラメータの一つである Mem Cyto Above Threshold (ゥヱル内の全細胞集団に対し、 タンパク質の膜 Z細胞質 局在比を表す一定のパラメータ値 （MemCyto Intensity Ratio) を超える細胞群 の割合 （単位％) ) で行った。
その結果、 DNQX、 NBQXを添加した場合、 上記濃度域で濃度依存的な GPR35— GFP タンパク質のインターナリゼシヨン誘導活性 (MemCyto Above Threshold値の低 下） が認められた。 実施例 5
マウス GPR35のク口一二ングと種差の検討
マウス （C57BL/6) の結腸から Isogen (二ツボンジーン） を用いて total RNA 調娱し、 Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) を用いて cDN A合成を行なった。 これを铸型として、 プライマー 1 (配列番号： 5 ) およびプ ライマー 2 (配列番号： 6 ) を用いて PCR を行なった。 PCR には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造） を用い、 （1) 94°C 10秒の後、 （2) 94°C 10秒、 68°C 90 秒を 3 回、 （3) 94°C 10秒、 62°C 30秒、 68。C 60秒を 3 回、 （4) 94°C 10 秒、 56°C 30秒、 68°C 90秒を 35 回の増幅反応後、 （5) 68°C 7分の伸長反応 を行なった。 さらに Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech) を加えて 72°C 1 0分反応後、 増幅産物を PCR2. 1- T0P0 (Invitrogen) に挿入し、 これを大腸菌 J M109 (宝酒造） に導入してクローユングした。'その塩基配列を解析した結果、 配 列番号： 7で表されるァミノ酸配列を有するマウス GPR35をコードする cDNAの塩 基配列 （配列番号： 8 ) を得た。 このプラスミドを制限酵素 Sal Iおよび Spe I で切断した後、 プラスミドベクター pAKKO-lllH [Biochem. Biophys. Acta. , 12 19卷， 251 (1994)〕 に挿入して発現べクタ一を構築した。 この発現ベクターを実施 例 1に記載の方法に準じて CH0- K1細胞に導入し、 FLIPRを用いて DNQXおよびエラ グ酸との反応性を検討した結果、 ヒト GPR35と同様にマウス GPR35は、 これらの化 合物に応答した。 実施例 6
RT-PCRによる GPR35mR Aの組織分布の検討
ヒトでの遺伝子発現分布を調べるために使用した錶型となる cDNAには、 ヒト各 種組織由来の polyA+RNA (クロンテック社) から以下の方法で合成したものを使 用した。
RNA l ^ gからランダムプライマー、 逆転写酵素として SuperScriptll逆転写酵 素 （Invitrogen社） を用い、 添付のマニュアルに従って 42°Cで反応を行い、 反応 終了後にエタノール沈殿して 100 μ 1に溶解した。 RT-PCRは Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosystems社） を用い、 プライマー 1 (配列 番号： 9 ) およぴプライマー 2 (配列番号： 1 0 ) およびプローブ 1 (配列番号 : 1 1 ) (Fam-ctccccgtgctaaggcccacaaa-Tamra) を使用した。 RT- PCR反応液は T aqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems社) 12. 5 1に、 てれて れ 100 のプライマー溶液を 0. 05 1、 5 ¾1のプローブ1を0. 5 1、 およぴ上記 で調製した cDNA溶液を 0. 5 μ 1加え、 蒸留水で総反応液量を 25 μ 1とした。 PCR反応 は 50°C · 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C . 1分のサイクルを 40回繰り返 した。 その結果ヒト GPR35は、 胃、 小腸、 大腸などの消化管、 後根神経節 (DRG) 、 下垂体、 精巣、 Colo201、 Colo205、 SW1417、 SW837、 SW1463、 WiDrなどの大腸 癌細胞株で高発現していることが判明した。
マウスでの発現を調べるために使用した铸型となる cDNAには、 マウス各種組織 由来のトータル R Aから以下の方法で合成したものを使用した。
RNA l w gからランダムプライマー、 逆転写酵素として SuperScriptll逆転写酵 素 （Invitrogen社） を用い、 添付のマニュアルに従って 42°Cで反応を行い、 反応 終了後にエタノール沈殿して 100 μ 1に溶解した。 RT-PCRは Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosystems社） を用い、 プライマー 3 (配列番 号： 1 2 ) およびプライマー 4 (配列番号： 1 3 ) およぴプローブ 2 (配列番号 : 1 4 ) (Fam-ctgcccgagacaccttcagccgt-Tamra) を使用した。 RT- PCR反応液は T aqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems社） 12. 5 /^ 1に、 それぞれ 100 μ Mのプライマー溶液を 0. 05 1、 のプローブ 2を 0. 5 μ 1、 および上記で調製 した cDNA溶液を 0. 5 μ 1加え、 蒸留水で総反応液量を 25 μ 1とした。 PCR反応は 50°C • 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。 その結果マウス GPR35 mRNAは、 胃、 小腸、 大腸などの消化管、 後根神経節 （DR G) 、 気管、 脾臓、 骨髄、 精巣、 卵巣、 脂肪細胞分化誘導後の 3T3- Ll、 白色脂肪 細胞、 CE - 2、 BFなどの大腸癌細胞株で高発現していることが判明した。 実施例 7
ヒ ト GPR35のスプライシングバリアントの取得
ヒ ト GPR35の 3種類のバリアント GPR35- Ll、 GPR35 - L2ぉょぴ GPR35 - L3のクロー二 ングは、 それぞれの塩基配列に特異的な 2個のプライマーを用いた PCRによって 行なった。 GPR35- L1クローニング用のプライ ーとしては、 プライマー 1 (配列 番号： 1 5 ) およびプライマー 2 (配列番号： 1 6 ) を、 GPR35- L2 クローニン グ用のプライマーとしては、 プライマー 3 (配列番号： 1 7 ) およびプライマー 2 (配列番号： 1 6 ) 、 GPR35- L3クローニング用のプライマーとしては、 プライ マー 4 (配列番号： 1 8 ) およびプライマー 2 (配列番号： 1 6 ) を用いた。 ヒ ト結腸 cDNA (Clontech) を錄型として、 それぞれのプライマーを用いて PCR を 行なった。 PCR には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造） を用い、 （1) 98°C 1. 分の後、 （2) 98°C 10秒、 60°C 30秒、 72°C 90秒を 35 回の増幅反応後、 （3) 72°C 5分の伸長反応を行なった。 反応後、 増幅産物を pCR- Blunt II-TOPO (Ιην itrogen) に揷入し、 これを大腸菌 JM109 (宝酒造） に導入してクローユングし た。 その塩基配列を解析した結果、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列 （ヒ ト GPR35- L1) をコードする CDNAの塩基配列 （配列番号： 2 0 ) 、 配列番号： 2 1 で表されるァミノ酸配列 （ヒト GPR35 - L2) をコー -ドする cDNAの塩基配列 （配列番 号： 2 2 ) 、 および配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列 （ヒト GPR35 - L3) を コードする cDNAの塩基配列 （配列番号： 2 4 ) を得た。 このプラスミドを制限酵 素 Sal I及ぴ Spe I で切断した後、 プラスミドベクター pAKKO- 111H [Biochem . Biophys. . Acta.， 1219卷， 251 (1994)〕 に挿入して発現ベクターを構築した。
ヒト GPR35 - L1蛋白質は、 ヒト GPR35蛋白質の N末端に 31アミノ酸残基の付力卩がぁ る。 ヒ ト GPR35-L2蛋白質は、 ヒ ト GPR35蛋白質の N末端に 41アミノ酸残基の付加が ある。 ヒ ト GPR35- L3蛋白質は、 ヒ ト GPR35蛋白質の N末端に 85アミノ酸残基の付加 がある。 実施例 8
G a 16、 GPR35安定共発現細胞の取得及び反応性の確認
宿主細胞の G o; 16の安定発現細胞株 （G a l6/CH0細胞株） は、 G o; 16発現べクタ 一 (Guthrie cDNA Resource Center) を常法に従って CH0糸田月包に導入し、 10% 牛 胎児皿 (Invitrogen; 、 50 units/ ml penicillin/50ug/ml streptomycin (CAM B EX) 、 および Img/ml geneticin (Invitrogen) を含む a MEM培地 （核酸含有： Invitrogen) を用いて、 5% C02、 37°Cで培養した。 トランスブェクシヨンには 、 10% 牛胎児血清のみを含む MEM培地 （核酸含有） で、 75cm2 フラスコにて 2 日間培養した細胞を用いた。 トランスフエクシヨンは Lipofectamine試薬 (Invit rogen) を用い、 試薬添付の方法に準じて操作を行った。 まず、 15ml容遠沈管を 2 本用意し、 それぞれに Opt i- MEM培地 （Invitrogen) を 600 μ 1分注した。 次に、 片 方のチューブに発現ベクターを 4. 8 §、 もう片方に Lipofectamine試薬を 36 μ 1添 加後、 両者を混合し、 20分間室温に静置した。 この溶液に Opti- MEM培地を 6mlカロ えたトランスフエクシヨン用混合液を、 あらかじめ Opti_MEM培地を用いて洗浄し た G a 16/CH0細胞に添加後、 C02培養器 （5% C02、 37°C) にて 5時間培養した。 培 ' 養後の細胞は、 PBS (Invitrogen) を用いてリンスした後、 0. 05% トリプシン · EDTA溶液 （Invitrogen) を用いて剥がし、 遠心操作にて回収した。 得られた細胞 の数を測定し、 培地 100 μ ΐあたり 0. 3個、 1. 5個、 および 7. 5個の細胞が含まれる ように 10%牛胎児透析血清 （Invitrogen) のみを含む α ΜΕΜ培地 （核酸不含： Inv itrogen) で希釈し、 96 - well plate (FALCON) に 1穴あたり 100 μ 1ずつ分注後、 C 02培養器にて一晚培養した。 翌日、 培養上清を除去し、 1穴あたり 200 μ 1の 10% 牛胎¾透析皿 ft" (Invitrogen) 、 50 units/ml penicillin/50ug/ml streptomyci n (CAMBREX) 、 および lmg/ml geneticine (Invitrogen) を含む a MEM培地 （核 酸不含： Invitrogen、 これ以降の培養は同培地を使用） を力 Πえて、 更に約 2週間 培養した。 潁微鏡にて 1穴あたり 1コロエーを形成したものを選択し、 その培養上 清を除去し、 lg/1 EDTA を含む PBSを用いてリンスした後、 剥がした細胞を 1穴あ たり lml の培地の入った 24穴プレートに移した。 細胞の増殖したものから順次、 25cm2フラスコ、 75cm2フラスコへと移し換えた。
上記の方法で取得したヒ ト GPR35と G a l6を共発現させた CH0細胞株を 3 x l04個 ΖΐΟΟ μ Ιの細胞が含まれるように希釈し、 Black walled 96- well plate (Costar ) に 1穴あたり 100 μ 1ずつ分注後、 C02培養器にてー晚培養した。 実施例 1に記載 の方法に従い、 細胞内カルシウム濃度の変動を FLIPR (Molecular Device) を用 いて測定したところ、 DNQXおよびェラグ酸を添加することにより、 細胞内カルシ ゥム濃度が上昇することが確認された。 実施例 9 .
FIJPRを用いた GPR35ァゴニス トの探索法
上記実施例 8で得られた G a 16、 GPR35安定共発現細胞を、 それぞれ 3 X 105cell s/mlとなるように培地 （10%牛胎児透析血清 （Invitrogen) 、 50 units/ml peni cillin/50ug/ml streptomycin (CA BREX) 、 および lmg/ml geneticin (Invitro gen) を含む MEM培地 （核酸不含： Invitrogen) ) に懸濁し、 FLIPR用96穴プレ ート（Black plate clear bottom, Costar社）に 8連ピぺットを用いて各ゥエルに 1 ΟΟ μ Ιずつ植え込み （3. 0 Χ 104。Θΐΐ3/100 /ί 1/ゥエル） 、 5% C02インキュベータ 一中にて 37°Cでー晚培養した以降のアツセィに用いる （以後、 細胞プレートとす る） 。 H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9. 8g、 炭酸水素ナトリ ゥム 0. 35g、 HEPES 4. 77 g、 6 ΜτΚ酸ィ匕ナトリゥム溶液で ρΗ7. 4に合わせた後、 フィルター滅菌処理） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 μ 1、 ゥシ胎児血清（FBS) 200 μ 1を混合する。 また、 Fluo 3-AM (同仁化学研究所） 2バイアル （50 μ §) を ジメチルスルフォキサイ ド 40 μ 1 20% Pluronic acid (Molecular Probes社 ) 40 1に溶解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連 ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル ΙΟΟ Ιずつ分注し、 5 % C02インキュベータ一中にて 37°Cで 1時間インキュベートする （色素ローディ ング） 。
試験化合物を含有する溶液を 2. 5 mM Probenecid, 0. 1% CHAPSを含む H/HBSS または 2. 5 mM Probenecid, 0. 1% CHAPS, 0. 2% BSAを含む H/HBSS 220 μ 1にカロ えて希釈し、 FLIPR用 96穴プレート （V- Bottomプレート、 Coster社） へ移す （以 後、 サンプルプレートとする） 。 細胞プレートの色素ローデ、イング終了後、 H/HB SSに 2. 5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー （ELX40 5， Bio- Tek Instruments社） を用いて細胞プレートを洗浄し、 洗浄後 ΙΟΟ μ Ιの洗 浄バッファーを残す。 この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセットし (FLIPRにより、 サンプルプレートから 50 i lのサンプルが細胞プレートへと移さ れる） 、 蛍光強度変化を継時的に測定することにより、 細胞内カルシウムイオン 濃度上昇活性を測定する。 GPR35を発現させない CH0細胞、 または、 ヒスタミン HI 受容体、 GPR40受容体、 TGR7受容体などの対照受容体を発現させた CH0細胞株を用 いて上記と同様の試験を実施し、 Gひ 16、 GPR35安定共発現細胞の細胞内カルシゥ ムイオン濃度を特異的に上昇させる化合物を探索する。 実施例 1 0
ラット腸管粘膜層での選択的 GPR35遺伝子発現 .
腸管における GPR35遺伝子発現部位が粘膜層であるか筋層であるかを明らかに するために、 マイクロダイセクション法により分離したラット回腸粘膜層と筋層 における GPR35遺伝子発現量を TaqMan法によりそれぞれ測定した。 11週齢の雄性 S D (IGS) ラットをエーテルで麻酔した後、 断頭を行い放血した。 摘出した回腸を 、 液体窒素による冷却下にて、 O. C. T.コンパウンド中に凍結包埋した。 クリオス タツトを用いて専用フィルム付スライドガラス （Leica : 90F0IL- SL25) 上に 10 / m 新鮮凍結切片を作製し、 次に切片をクリオスタツト庫内 (_20°C)で乾燥させた。 軽く室温に馴染ませた後、 5%酢酸を含む永冷エタノール液中で 3分間固定した。 切片を氷冷 RNaseFree水で洗浄した後、 氷冷 0. 05%トルイジンブルーで 20秒間染色 し、 さらに氷冷 RNaseFree水で洗浄した。 ドライヤーの冷風で乾燥した後、 スラ ィドはマイクロダイセクション直前まで 4°Cで保存した。 Leica Laser Microdiss ection System (LMD)を用いて、 1cm2程度の組織切片 4枚分から筋層と粘膜層を、 I S0GENをあらカゝじめ分注したチューブにそれぞれ回収した。 筋層と粘膜層の IS0GE N抽出液から Total RNAを精製し、 最終的にそれぞれ 18 μ ΐ の Total RNA溶液を得 た。 10 μ ΐの R A溶液と 1 1 の 200 ng/ μ 1濃度のランダムプライマーを 70°Cで 1 0分間保温後、 氷冷した。 この溶液に、 1 μ 1の SuperScriptll逆転写酵素 （Invit rogen) 、 4 ^ 1の逆転写酵素に付属のバッファー、 .2 の 0. 1M ジチオスレィト ール溶液、 1 μ 1の 10 ηιΜデォキシヌクレオチド混合液と 1 μ 1の R A分解酵素阻害 剤 RNaseOUT (Invitrogen)を添加して、 総体積を 20 z lとした。 逆転写反応は、 以下の条件で行った。 反応液を順次 25°Cで 10分間、 42°Cで 50分間、 70°Cで 15分間 、 4°Cで 5分間保温し、 逆転写 cDNA溶液を得た。
ラット GPR35遺伝子と内部標準となるラット GAPDH遺伝子発現コピー数は、 TaqM an PCR法により決定された。 ラット GPR35遺伝子測定のための TaqMan PCR反応液 は、 10 1の逆転写 cDNA溶液または 1 ^ 1の各種濃度の標準ラット GPR35 DNA、 0. 2 /ζ Μの合成 DNAフォワードプライマー （配列番号： 2 9 ) 、 0. 2 ^ Mの合成 DNAリ パースプライマー （配列番号： 3 0 ) 、 0. 2 μ Μのラット GPR35 TaqManプローブ (配歹幡号： 3 1 ) t TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosysteras) からなり、 全容量は 25 / lである。 ラット GAPDH遺伝子測定のための TaqMan PCR 反応液は、 10 / lの逆転写 cDNA溶液または 1 μ ΐの各種濃度の標準ラット GAPDH D ΝΑと Rodent GAPDH遺伝子測定キット （Applied Biosystems) に添付の合成 DNAフ ォワードプライマー、 合成 DNAリパースプライマーおよぴラット GAPDHプローブと TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)力 らなり、 全容量は 25 μ ΐである。 PCR反応は、 ABI PRISM 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems)を用い、 順次 50°Cで 2分、 95。Cで 10分保温し、 次に 95°Cで 15秒、 60°C で 60秒のサイクルを 40回繰り返すことにより行なった。 ラット GPR35遺伝子とラ ット GAPDH遺伝子発現コピー数は、 ABI PRISM 7700 SDSソフトウエアによって算 出した。 リポーターの蛍光強度が、 設定された値に達した瞬間のサイクノレ数を縦 軸にとり、 標準 DNAのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。 標 準曲線から、 逆転写 cDNAに含まれる遺伝子発現コピー数を算出し、 ラット GPR35 遺伝子発現コピー数を GAPDH遺伝子発現コピー数で序した値を、 標準化したラッ ト GPR35遺伝子発現量とした。 '
粘膜層と筋層における標準化したラット GPR35遺伝子発現量は、 それぞれ 0. 004 2と 0. 0002であった。 すなわち、 粘膜層における GPR35遺伝子発現量は、 筋層にお けるそれの約 21倍多かった。
GPR35遺伝子は粘膜層で選択的に発現することから、 栄養素の吸収と消化、 腸 管免疫に関与することが示唆された。 例えば、 GPR35のァゴニストで cAMPの産生 を阻害することにより、 胃酸などの消化液の分泌を抑制でき、 消化性潰瘍の予防 •治療などが可能になる。 また、 GPR35のァゴニストにより腸管からの電解質漏 洩を抑制できるため、 下痢や吸収不良症候群の予防 ·治療などが可能になる。 GP R35のアンタゴニストで cAMPの産生を促進させることにより、 大腸粘膜やマクロ ファージからの各種炎症性サイトカインの分泌を抑制できるため、 自己免疫疾患 、 炎症性腸疾患などの免疫疾患の予防 ·治療が可食 こなる。 実施例 1 1
脂肪細胞分ィ匕に伴う GPR35遺伝子発現の宂進
マウス 3T3- L1を脂肪細胞に分ィヒさせ、 分ィヒ前と分化後における GPR35遺伝子発 現量を測定した。 脂肪細胞分化は、 以下の培養条件で行った。 3T3- L1細胞を基本 増殖培地 （DMEM, 10%ゥシ血清， 0. 2 mMァスコルビン酸） で培養した。 細胞がコ ンフルェントに達した後、 分化誘導培地 （DMEM, 10%ゥシ胎児血清， 2. 5 μ Μ Dex amethasone, 0. 5 mM IBMX, 0. 2 mM ァスコノレビン酸， 10 ^ g/ml Insulin) で 48 時間培養した。 次に、 細胞を分化維持培地 （DMEM, 10%ゥシ胎児血清， 0. 2 ァ スコルビン酸， 10 μ g/ml Insulin) で培養した。 分化前と分化維持 5、 10と 15日 目の細胞から IS0GENを用いて、 Total腿を精製した。 50 μ ΐ の Total RNA溶液 に、 1 1の I型 DNA分解酵素 （GenHunter) と 5· 7 μ 1のキットに添付のバッファ 一を添加し、 37°Cで 30分間保温した。 フエノール/クロ口ホルム混液を用いて反 応液から RNAを抽出し、 次いで R A溶液の 5倍容量のエタノールと 8分の 1倍容量の 3 M酢酸ナトリゥム溶液の添カ卩によるエタノール沈殿法により R Aを回収した。 0. 2 μ / μ Ι の RNA溶液 2. 5 jU 1、 10 mMのデォキシヌクレオチド混合液 4 μ 1、 50 p mol/ ΐ のランダムプライマー 0. 5 μ ϊ と蒸留水 6 ^ 1からなる混合液を 65°Cで 5 分間保温後、 氷冷した。 この溶液に、 1 /i lの SuperScriptlll逆転写酵素 （Invi trogen) 、 4 μ 1の逆転写酵素に付属のバッファー、 1 μ 1の 0. 1M ジチオスレィ トール溶液と 1 μ 1の RNA分解酵素阻害剤 R aseOUT - (Invitrogen)を添加して、 総 体積を 20 1とした。 逆転写反応は、 以下の条件で行った。 これら反応液を順次 25°Cで 5分間、 50°Cで 60分間、 70°Cで 15分間、 4°Cで 5分間保温し、 逆転写 cDNA溶 液を得た。 マゥス GPR35遺伝子発現コピー数は、 TaqMan PCR法により決定された。 マウス G PR35遺伝子測定のための TaqMan PCR反応液は、 1 μ 1の逆転写 cDNA溶液または標 準マウス GPR35 D 、 0. 2 ； u Mの合成 MAフォワードプライマー （配列番号： 3 2 ) 、 0. 2 の合成 DNAリバースプライマー （配列番号： 3 3 ) 、 0. 2 のラッ ト GPR35 TaqManプローブ （配列番号： 3 4 ) と TaqMan Universal PCR Master Mi x (Applied Biosystems)からなり、 全容量は 25 である。 PCR反応は、 ABI PRI SM 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems)を用い、 眞次 50。Cで 2 分、 95°Cで 10分保温し、 次に 95°Cで 15秒、 60°Cで 60秒のサイクルを 40回繰り返す ことにより行なった。 マウス GPR35遺伝子発現コピー数は、 ABI PRISM 7700 SDS ソフトゥヱァによって算出した。 リポーターの蛍光強度が、 設定された値に達し た瞬間のサイクル数を縦軸にとり、 標準 DNAのコピー数の対数値を横軸にとって 標準曲線を作成した。 標準曲線から、 逆転写 cDMに含まれる遺伝子発現コピー数 を算出し、 25 ng R Aから逆転写された cDNAに含まれるマウス GPR35遺伝子発現コ ピー数を得た。
脂肪細胞分化に伴い、 GPR35遺伝子発現量は増加した。 分化前と分化維持 5、 10 と 15日目の 25 ng RNAあたりの GPR35遣伝子発現コピー数は、 それぞれ 2300、 2200 0、 110000と 160000であった。
脂肪細胞分化に伴い GPR35遺伝子発現量が増加することから、 脂肪細胞におい て GPR35は脂肪分解、 糖取り込み、 脂肪分化調節に関与することが示唆された。 G PR35のァゴニストは細胞内 cAMP濃度を下げる作用を有し、 細胞内 cAMPの低下は、 脂肪分解を抑え血中脂肪酸濃度を低下させることより、 GPR35のァゴニストは、 I I型糖尿病の予防 ·治療に有用である。 また、 GPR35のアンタゴニストは細胞内 cA MP濃度を上げる作用を有し、 細胞內 cAMPの上昇は、 脂肪分解を刺激して脂肪合成 を抑えることより、 GPR35のアンタゴニストは肥満の予防 ·治療に有用である。 実施例 1 2
アルファスクリーンを用いた GPR35ァゴニストの探索法
150cm2フラスコ一本に参考例 1で得られたヒ ト GPR35発現 CH0細胞を lxl07cells 捲き込み、 ー晚 37°C、 C02インキュベーターで培養する。 培養後、 0. 5mM EDTA/P BSにて細胞をはがし、 PBSで細胞を洗浄後、 lxl07 cells/mlの密度で Buffer 1 (HBS S + 0. 1%BSA、 25mM HEPES pH7. 3、 0. 5mM IBMX)に懸濁する。 この細胞懸濁液 440 μ 1とアルファスクリーン cAMP assay kit (Parkin Elmer)の anti - cAMP acceptor beads 22 ^ 1、 Bufferl 638 を混合し、 白色 96wellプレート（Costar)に 10 ずつ分注する。 次に、 各ゥエルにフォルスコリン （FSK) 2 μ Μを含む Buf f er 1 で希釈した化合物を 10 ずつ加える。 この時、 プレートの一列は細胞懸濁液を 入れず anti- cAMP acceptor beads 9 ^ 1、 Bufferl 441 のみを混ぜた液とし 、 化合物の代わりに cAMPの希釈系列を加え、 スタンダードとする。 細胞懸濁液と 化合物を混ぜたプレートを室温で 30分間振とうした後、 アルフアスクリーン cAMP assay kitの Biotinyl camp 20 μ 1、 Streptavin donor beads 82 1を Buffer2 (HBSS + 0. l°/oBSA, 25mM HEPES PH7. 3、 1. 5% Tween20) 40mlにくわえた液をプ レートの全ゥエルに 30 μ 1ずつ加える。 室温で 3時間プレートを分間振とうし続け 、 Fusion a (Parkin Elmer)にて蛍光強度を測定し、 プレートに加えた cAMPの反応 曲線から各ゥエル内の cAMP濃度を算出する。 実施例 1 3
FLIPRを用いた GPR35ァゴニストの探索
実施例 8で得られた G a 1.6、 GPR35安定共発現細胞を、 それぞれ 3 X 10Bcells/ml となるように培地 〔10%牛胎児透析血清 （Invi rogen) 、 50 units/ml penicill in/50ug/ml streptomycin (CAMBREX) 、 お び lmg/ml geneticin (Invitrogen ) を含む α MEM培地 （核酸不含： Invitrogen) 〕 に懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート (Black plate clear bottom, Costar社）に 8連ピぺットを用いて各ゥエルに 100 1ずつ植え込み （3. 0 Χ 104ο6ΐΐ3/100 μ 1/ゥエル） 、 5% C02インキュベータ一中 にて 37°Cで一晩培養し、 以降のアツセィに用いた （以後、 細胞プレートとする） 。 細胞プレート 2枚当たりに対して、 H/HBSS (HBSS (Invitrogen Hanks ' Balance d Salt Solution without phenol red) 500mlに 1M HEPES/pH7. 4 (同仁化学研究 所）を ΙΟπιΓ添加） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 μ 1、 ゥシ胎児血清（FBS) 200 μ 1を混合した。 また、 Fluo 3- AM (同仁化学研究所） 2パイアル （50 μ §) をジメチ ノレスノレフォキサイド 40 ^ 1、 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 μ 1に溶解し、 これを上記 H/HBSS—Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピぺッ トを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥヱル ΙΟΟ μ Ιずつ分注し、 5% C02 ィンキュベータ一中にて 37°Cで 1時間ィンキュベートした （色素ローディング) 試験化合物を含有する溶液を 2. 5 IBM Probenecidを含む H/HBSS で調製し、 FLIP R用 96穴プレート （V- Bottomプレート、 Coster社） へ 220 μ 1ずつ移した （以後、 サンプルプレートとする） 。 細胞プレートの色素ローデイング終了後、 H/HBSSに 2. 5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファ一でプレートウォッシヤー (ELX405, B io-Tek Instruments社） を用いて細胞プレートを洗浄し、 洗浄後 100 1の洗浄バ ッファーが残るようにした。 この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセ ットし (FLIPRにより、 サンプルプレートから 50 1のサンプルが細胞プレートへ と添加される） 、 蛍光強度変化を継時的に測定することにより、 細胞内カルシゥ ムイオン濃度上昇活性を測定した。 GPR35を発現させない CH0細胞、 または、 ヒス タミン HI受容体などの対照受容体を発現させた CH0細胞株を用いて上記と同様の 試験を実施し、 G a 16、 GPR35安定共発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を特 異的に上昇させる化合物を探索した。 産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットで得られうる化合 物またはその塩 （例、' GPR35ァゴニスト、 GPR35アンタゴニスト） などは、 例えば 、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化 性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群な ど） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎 症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 癌 （例 、 消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など）'、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌 、 食道癌、 咽頭癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮痛、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 免疫疾患 〔例、 '¾性閉塞 性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ 、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症 性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本 病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 II型糖 尿病、 肥満などの予防 ·治療剤などとして有用である。
本発明の受容体の活性を促進する化合物またはその塩、 GPR35ァゴ-スト、 本 発明の受容体、 本努明の受容体をコードするポリヌクレオチド、 本発明のリガン ドなどは、 例えば、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 JD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非 ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多おょぴ潰 瘍など〕 、 II型糖尿病などの予防 ·治療剤などとして有用である。
本発明の受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、 GPR35ァゴ-スト、 本 発明の受容体に対するアンチセンスポリヌクレオチド、 本発明の受容体に対する 抗体などは、 例えば、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、
AIDS, 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマトーデ ス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性 肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエー.ダレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌など） 、 肥 満などの予防 ·治療剤などとして有用である。
また、 本努明の受容体 （例、 GPR35など） およびそのリガンド （例、 キノキサ リン- 2， 3-ジオン化合物、 エラグ酸など） は、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 II型 糖尿病、 肥満などの予防 ·治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニン グに有用である。

Claims

請求の範囲
1 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩おょぴ
5 (b) 該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いる ことを特徴とする、 該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2 . リガンドが、 キノキサリン- 2， 3-ジオン化合物である請求項 1記載のスク リーニング方法。
0 3 . キノキサリン- 2, 3-ジオン化合物が、 6， 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジォ ン、 6-ニトロ - 7 -スルファモイルペンゾ [f]キノキサリン- 2，3 -ジオン、 6 -シァノー 7-二トロキノキサリン- 2， 3-ジオン、 または 5, 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジォ ンである請求項 1記載のスクリーニング方法。
4 . リガンドが、 エラグ酸である請求項 1記載のスクリーニング方法。
5 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番 号： 2 7で表されるアミス酸配列である請求項 1記載のスクリーニング方法。
6 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異 0 的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩に接触させた場合における、 該リガンド の該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、 比 較する、 請求項 1記載のスクリーニング方法。
5 7 . (a) 配列番号： · 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 • のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と特異 的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分ぺプチドまた はその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 （b) 該リ ガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 0 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 該リガンドの該 細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較する、 請求項 1記載のスクリ 一ユング方法。
8 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、 該蛋白質 もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードする D NAを含有する形質転換 体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩である請求項 Ί記載のスタリーニング方法。
9 . リガンドが、 標識したリガンドである請求項 6〜請求項 8記载のスクリー ニング方法。
1 0 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩と特 異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分ぺプチドま たはその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガンドの存在下または非存在下、 試 験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に接触させた場合 における、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活 性を測定し、 比較する、 請求項 1記載のスクリーニング方法。
1 1 . (a) 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩と特 異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 （b) 該 リガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分ぺ プチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお ける、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を 測定し、 比較する、 請求項 1記載のスクリーニング方法。
1 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩が、 該蛋白 質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードする D NAを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしぐはその部分ぺプチ ドまたはその塩である請求項 1 1記載のスクリ一ユング方法。
1 3 . 細胞刺激活性が、 細胞内 c AMP濃度の低下または上昇である、 請求項 1 0〜 1 2記載のスクリ一二ング方法。
1 4 . (a) 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および （b) 該蛋白質またはそ の塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、 該 蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング用キット。
1 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促 進する化合物またはその塩を含有してなる消化管疾患または II型糖尿病の予防 · 治療剤。
1 6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 害する化合物またはその塩を含有してなる消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 .治療剤。
1 7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガ ンド。
1 8 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促 進することを特徴とする消化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療法。
1 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 害することを特徴とする消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療法。
2 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促 進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消化 管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療法。 -
2 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ： ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消化 器癌、 免疫疾患または肥満の予防 '治療法。
2 2 . 消化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合物また はその塩の使用。
2 3 . 消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物ま. たはその塩の使用。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120022116A1 (en) * 2010-07-20 2012-01-26 Huayun Deng Compositions and methods for the treatment of pathological condition(s) related to gpr35 and/or gpr35-herg complex
CN109929805A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 中国科学院大连化学物理研究所 鼠源gpr35高通量筛选模型的构建方法及应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843987A (en) 1996-10-31 1998-12-01 The Procter & Gamble Company Method of stimulating gastrointestinal motility with ellagic acid
DE19728326A1 (de) 1997-06-27 1999-01-07 Schering Ag Neue Chinoxalindionderivate, deren Herstellung und Verwendung in Arzneimitteln
WO1999033978A1 (fr) * 1997-12-26 1999-07-08 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvelles proteines receptrices du type conjugue guanosine triphosphate (gtp)-proteine de liaison
WO1999064452A1 (en) 1998-06-11 1999-12-16 Smithkline Beecham Corporation Gpr35a receptor
WO2001046414A1 (fr) * 1999-12-20 2001-06-28 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine de fixation de guanosine triphosphate, bg26
WO2002068600A2 (en) * 2001-02-26 2002-09-06 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
EP1312374A1 (en) 2000-08-01 2003-05-21 Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd Sugar absorption inhibitors and process for producing the same
WO2004040000A2 (en) * 2002-09-09 2004-05-13 Nura, Inc G protein coupled receptors and uses thereof
WO2004047863A2 (de) 2002-11-22 2004-06-10 Ganymed Pharmaceuticals Ag In tumoren differentiell exprimierte genprodukte und deren verwendung
EP1447413A2 (en) 2003-02-14 2004-08-18 Research Association for Biotechnology Full-length human cDNA
WO2005059546A2 (en) * 2003-12-12 2005-06-30 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled receptor 35 (gpr35)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2832726B2 (ja) * 1989-08-03 1998-12-09 日本ケミファ株式会社 消化管運動抑制用医薬組成物
US20020168720A1 (en) * 1997-02-06 2002-11-14 Takeda Chemical Industries Ltd. G protein coupled receptor proteins, their production and use
US7119190B2 (en) * 1997-04-14 2006-10-10 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human G protein-coupled receptors
US7102000B2 (en) * 2002-03-08 2006-09-05 Incyte San Diego Inc. Heterocyclic amide derivatives for the treatment of diabetes and other diseases
US20070048740A1 (en) 2003-02-14 2007-03-01 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
EP1522858A1 (en) * 2003-10-10 2005-04-13 Jean-Christophe Roegel Methods for selecting compounds using antibodies with activity as agonist, antagonist or allosteric modulators

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843987A (en) 1996-10-31 1998-12-01 The Procter & Gamble Company Method of stimulating gastrointestinal motility with ellagic acid
DE19728326A1 (de) 1997-06-27 1999-01-07 Schering Ag Neue Chinoxalindionderivate, deren Herstellung und Verwendung in Arzneimitteln
WO1999033978A1 (fr) * 1997-12-26 1999-07-08 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvelles proteines receptrices du type conjugue guanosine triphosphate (gtp)-proteine de liaison
WO1999064452A1 (en) 1998-06-11 1999-12-16 Smithkline Beecham Corporation Gpr35a receptor
WO2001046414A1 (fr) * 1999-12-20 2001-06-28 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine de fixation de guanosine triphosphate, bg26
EP1312374A1 (en) 2000-08-01 2003-05-21 Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd Sugar absorption inhibitors and process for producing the same
WO2002068600A2 (en) * 2001-02-26 2002-09-06 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
WO2004040000A2 (en) * 2002-09-09 2004-05-13 Nura, Inc G protein coupled receptors and uses thereof
WO2004047863A2 (de) 2002-11-22 2004-06-10 Ganymed Pharmaceuticals Ag In tumoren differentiell exprimierte genprodukte und deren verwendung
EP1447413A2 (en) 2003-02-14 2004-08-18 Research Association for Biotechnology Full-length human cDNA
WO2005059546A2 (en) * 2003-12-12 2005-06-30 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled receptor 35 (gpr35)

Non-Patent Citations (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Antisense Research and Applications", 1993, CRC PRESS
"Enzyme immunoassay", 1978, IGAKUSHOIN
"Immunochemical Techniques (Part A)", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 70
"Immunochemical Techniques (Part B)", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 73
"Immunoenzyme assay", 1982, IGAKUSHOIN
"Immunoenzyme assay", 1987, IGAKUSHOIN
"mmunochemical Techniques (Part C)", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 74
"Part D: Selected Immunoassays", IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 84
"Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods", IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 92
"Peptide Synthesis", vol. 14, HIROKAWA SHOTEN, article "Zoku Iyakuhin no Kaihatsu"
"Radioimmunoassay", 1974, KODANSHA
"Sequel to the Radioimmunoassay", 1979, KODANSHA
"Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol", 1995, SHUJUNSHA, article "Saibo Kogaku", pages: 263 - 267
BIO/TECHNOLOGY, vol. 6, 1988, pages 47 - 55
BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA., vol. 1219, 1994, pages 251
BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY, vol. 42, 1991, pages 1441 - 1445
BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1446, 1999, pages 57 - 70
BITTER, G A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 81, 1984, pages 5330
BITTER, G. A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 81, 1984, pages 5330
BOSTIAN, K. L. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 77, 1980, pages 4505
CANCER SCIENCE, vol. 95, 2004, pages 131 - 135
G. R. MARTIN, PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 78, 1981, pages 7634
GENE, vol. 17, 1982, pages 107
GENETICS, vol. 39, 1954, pages 440
GENOMICS, vol. 47, 1988, pages 310 - 313
GENOMICS, vol. 5, 1989, pages 874 - 879
GRACE, T. C. C., NATURE, vol. 195, 1962, pages 788
INTERNATIONAL REVIEW OF NEUROBIOLOGY, vol. 32, 1990, pages 281 - 303
J. KAWAKAMI ET AL., PHARM. TECH. JAPAN, vol. 8, 1992, pages 247
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 95, 1984, pages 87
KOEHLER; MILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
M. BODANSZKY; M.A. ONDETTI: "Peptide Synthesis", 1966, INTERSCIENCE PUBLISHERS
M. J. EVANS; M. H. KAUFMAN, NATURE, vol. 292, 1981, pages 154
MAEDA ET AL., NATURE, vol. 315, 1985, pages 592
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 194, 1991, pages 182 - 187
MILLER: "Journal of Experiments in Molecular Genetics", 1972, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, pages: 431 - 433
MOLECULAR & GENERAL GENETICS, vol. 168, 1979, pages 111
MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 15, 1995, pages 6188 - 6195
MUTATION RESEARCH, vol. 202, 1988, pages 429 - 446
NATURE, vol. 411, 2001, pages 494
NOBUO IZUMIYA ET AL.: "Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken", 1975, MARUZEN CO.
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 9, 1981, pages 309
O'DOWD B. ET AL.: "Discovery of three novel G-protein-coupled receptor genes.", GENOMICS, vol. 47, no. 2, 1998, pages 310 - 313, XP000863786 *
OKUMURA S. ET AL.: "Cloning of a G-protein-coupled receptor that shows an activity to transform NIH3T3 cells and is expressed in gastric cancer cells.", CANCER SCI., vol. 95, no. 2, February 2004 (2004-02-01), pages 131 - 135, XP002342729 *
PHARM. TECH. JAPAN, vol. 8, 1992, pages 395
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 75, 1978, pages 1929
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 86, 1989, pages 2766 - 2770
SCHROEDER; LUEBKE: "The Peptide", 1965, ACADEMIC PRESS
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
SHUJUNSHA: "Saibo Kogaku", SHIN SAIBO KOGAKU JIKKEN PROTOCOL, 1995, pages 263 - 267
T. C. DOETSCHMAN ET AL., JOURNAL OF EMBRYOLOGY EXPERIMENTAL MORPHOLOGY, vol. 87, 1985, pages 27
TANPAKUSHITSU NO KAGAKU, vol. IV, 1977, pages 205
THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 15, 1997, pages 487 - 494
TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 7, 2001, pages 221
VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396

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