WO2006025551A1 - Screening method - Google Patents

Screening method Download PDF

Info

Publication number
WO2006025551A1
WO2006025551A1 PCT/JP2005/016169 JP2005016169W WO2006025551A1 WO 2006025551 A1 WO2006025551 A1 WO 2006025551A1 JP 2005016169 W JP2005016169 W JP 2005016169W WO 2006025551 A1 WO2006025551 A1 WO 2006025551A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
present
salt
receptor
ligand
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/016169
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Yasuaki Ito
Kazunori Nishi
Shoichi Ohkubo
Masataka Harada
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company Limited filed Critical Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority to AT05776830T priority Critical patent/ATE464564T1/en
Priority to US11/661,555 priority patent/US7892755B2/en
Priority to JP2006532011A priority patent/JP4772684B2/en
Priority to EP05776830A priority patent/EP1788390B1/en
Priority to DE602005020646T priority patent/DE602005020646D1/en
Publication of WO2006025551A1 publication Critical patent/WO2006025551A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • kits for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the protein or a salt thereof and the ligand, comprising a ligand having an ability to act
  • test compound When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention.
  • substantially the same activity examples include ligand binding activity and signal signal transduction action.
  • “Substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal signal transduction activity are equivalent (for example, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to It is preferable that it is 2 times) S, but quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Measurement of activities such as ligand binding activity and signal signal transduction can be carried out according to a method known per se, for example, it can be measured according to a ligand determination method or a screening method described later. .
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention. Peptides are preferred.
  • the carboxy is amidated or esterified. And included in the partial peptides of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the labeled ligand is 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione, 6_ditto_7-sulfamoylbenzo [f] quinoxaline-labeled with [3 ⁇ 4] or [ 125 1], respectively. 2, 3-dione, 6-ciano-7-ditroquinoxaline-2,3-dione, or 5,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione. Preferred is 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione labeled with [3 ⁇ 4] or [ 25 1].
  • hosts examples include Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315 ⁇ , 592 (1985)].
  • molecular and general genetics 168 ⁇ , 111 (1979) can be used to convert the genus Bachinores into a transformed form.
  • the target nucleic acid if the target nucleic acid can hybridize with the target region, the target nucleic acid is compared with the polynucleotide of the target region. It can be said that it is “antisense”.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention characterized by measuring and comparing the binding amount to the receptor;
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, the ligand of the present invention and a test compound are expressed in the receptor of the present invention.
  • a compound that changes the binding ability of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring and comparing the intracellular cAMP production inhibitory activity of the cell when contacted with the cell.
  • CRE- reporter gene receptor-expressing cells of the present invention was introduced (luciferase) were seeded at 5xl0 3 cell / well in 24-well plates, and cultured for 48 hours. The cells are washed with Hanks buffer (PH7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in the incubator. After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 2 ⁇ of ⁇ of the ligand of the present invention or 1 ⁇ of the ligand of the present invention and the test compound.
  • Hanks buffer PH7.4
  • reaction buffer containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES
  • the enzyme activity of is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit
  • Alkaline phosphatase activity is measured using, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • chloramphenicol acetyl transferase activity is measured, for example,
  • the 3-galactosidase activity is measured using, for example, Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries, using FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransf erase Assay KiT manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • an agonistist can be screened by measuring the increase in fluorescence intensity due to the addition of the test compound alone.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded at 5,000 cells / tool in a 24-well plate and cultured for 1 day. Next, the cells are cultured for 2 days in a medium not containing serum, and the cells are starved. Alternatively, the ligand of the present invention and the test compound are added to the cells and cultured for 24 hours, and then [methyl-]-thymidine is added at 0.015 MBq per tool and cultured for 6 hours. Then add methanol and let stand for 10 minutes, then add 5% trichloroacetic acid and let stand for 15 minutes, then wash the fixed cells 4 times with distilled water 0. 3N Hydroxy sodium solution Lyse the cells and measure the radioactivity in the lysate with a liquid scintillation counter.
  • the test compound that suppresses the increase in 86 Rb efflux activity by ligand stimulation of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • the agonist can be stared in the test by feeding only the test compound into the receptor-expressing cells of the present invention and measuring the increase in 86 Rb efflux activity similar to the ligand of the present invention.
  • screening of an agonist is performed by contacting only the test compound with the Xenopus laevis oocyte introduced with the receptor gene RNA of the present invention, and measuring a change in cell membrane potential similar to the ligand of the present invention. You can also. ⁇
  • a safe and low-toxic drug such as gastrointestinal tract disease, cancer, immune disease, diabetes, etc., preferably as a preventive or therapeutic agent for gastrointestinal tract diseases (eg, diarrhea, malabsorption syndrome) , Irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia) It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for type II diabetes, etc.) Ulcers caused by inflammatory agents, hyperacidity and ulcers due to postoperative stress.
  • gastrointestinal tract diseases eg, diarrhea, malabsorption syndrome
  • Irritable bowel syndrome e.g, Irritable bowel syndrome, Crohn's disease
  • peptic ulcer eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-
  • Gastrointestinal diseases eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome), gastritis, reflux Used as a prophylactic / therapeutic agent for type II diabetes, etc.), esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, post-surgical stress, acidity and ulcers it can.
  • peptic ulcer eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome
  • NUD Non Ulcer Dyspepsia
  • digestive tract diseases eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenum) Ulcers, anastomotic ulcers, Zollinge r-Ellison syndrome, etc.
  • peptic ulcer eg, gastric ulcer, duodenum
  • Ulcers eg, gastric ulcer, duodenum
  • anastomotic ulcers e.g., Zollinge r-Ellison syndrome, etc.
  • gastritis eg, reflux esophagitis
  • UD Non Ulcer Dyspepsia
  • ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory agents e.g., post-surgical stress hyperacidic acid pickles Etc.
  • the above-described it gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of sciences of The United States of America, 86, 2766-2770 (1989)).
  • the lipozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention in accordance with a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7 ⁇ , 221 pages, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of RNA encoding the receptor of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the receptor of the present invention of the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known ribozyme.
  • a non-human mammal having an exogenous DN A of the present invention or a mutant DN A thereof is an embryo containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a progenitor cell thereof.
  • the calcium phosphate method, electric pulse It can be produced by transferring the target DNA by the method, ribofusion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc.
  • Promoters derived from various mammals such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, Muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dartathione S-transferase, platelet-derived growth factor; 3, keratin K l, 10 0 14 1, collagen type I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase ; 3 I subunit, dystrophin Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor thicine synkinase (commonly abbreviated as Tie 2), sodium thallium adenosine triphosphate (Na, K-one ATP ase), Neurofilament light chain, meta-orchionein I and IIA,
  • cytomegalovirus promoter capable of being highly expressed throughout the body
  • a human polypeptide chain elongation factor 1a (EF-1) promoter a human and chicken j3 lactin promoter, and the like are suitable.
  • the vector preferably has a sequence (generally called terminator 1) that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • terminator 1 a sequence that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • each vector derived from viruses and various mammals The sequence can be used, preferably the SV40 terminator of simian virus etc. Used.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and as the salt of the compound, the same salt as the salt of the test compound described above is used.
  • the GPR35 gene expression level in the rat ileal mucosa layer and muscle layer separated by the microdissection method was measured by TaqMan method, respectively.
  • Eleven week old male SD (IGS) rats were anesthetized with ether, then decapitated and exsanguinated.
  • the excised ileum was cooled and embeded in OCT compound under cooling with liquid nitrogen.
  • a 10 / m fresh frozen section was prepared on a slide glass with a special film (Leica: 90F0IL-SL25) using a cryostat, and then the section was dried in a cryostat chamber (_20 ° C).
  • the expression level of GPR35 gene increased.
  • the number of GPR35 gene expression copies per 25 ng RNA before differentiation and on maintenance days 5, 10, and 15 was 2300, 2200, 110000, and 160000, respectively.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)

Abstract

It is intended to provide a method characterized by comprising using (a) a protein having an amino acid sequence which is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, its partial peptide or its salt and (b)a ligand capable of binding specifically to the above protein or its salt, to thereby screen a compound or its salt altering the binding properties of the above protein or its salt to the above ligand; a screening kit and so on. The above-described screening method and kit are useful in screening a preventive/remedy for, e.g., digestive diseases, cancer, immune diseases, type II diabetes or obesity.

Description

明細書 スクリーニング方法 技術分野  Description Screening Method Technical Field
本努明は、 GPR35受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドと GPR35受容 体とを用いる医薬のスクリーユング方法およびスクリーニング用キット、 該スク リーニング方法またはキットによって得られうる化合物などに関する。 詳細には The present invention relates to a screening method and screening kit for a medicine using a ligand capable of specifically binding to the GPR35 receptor and the GPR35 receptor, a compound obtainable by the screening method or kit, and the like. In detail
、 消化器疾患などの予防 ·治療剤などの クリ一ユング方法おょぴスクリ一ニン グ用キットなどに関する。 背景技術 The present invention relates to cleaning kits for the prevention and treatment of gastrointestinal diseases, etc. Background art
G protein-coupled receptor (GPCR) は、 7回膜貫通型受容体で、 ホノレモン、 神経伝達物質、 サイトカインゃ他の分子のシグナルを細胞膜内へ伝える働きを行 つている。  G protein-coupled receptor (GPCR) is a seven-transmembrane receptor that transmits signals from honolemon, neurotransmitters, cytokines and other molecules into the cell membrane.
ヒト GPR35 (非特許文献 1 Genomics 47卷、 310- 313頁、 1988年） は GPCRの D で、 そのリガンドは報告されていない。 ヒト胃癌から抽出した GPR35の cDNA断片 に、 NIH3T3細胞をトランスフォームさせる活性があることを示唆することが報告 されている （非特許文献 2 Cancer Science 95卷、 131-135頁、 2004年） 。  Human GPR35 (Non-patent Document 1 Genomics 47 卷, 310-313, 1988) is a GPCR D and its ligand has not been reported. It has been reported that a GPR35 cDNA fragment extracted from human gastric cancer has an activity to transform NIH3T3 cells (Non-patent Document 2 Cancer Science 95, 131-135, 2004).
6, 7-ジニトロキノキサリン 2， 3-ジオンは、 グルタミン酸受容体に作用する NMD A拮抗薬として知られている (非特許文献 3 International Review of Neurobio logy 32卷、 281- 303頁、 1990年） 。  6,7-dinitroquinoxaline 2,3-dione is known as an NMD A antagonist that acts on the glutamate receptor (Non-patent Document 3 International Review of Neurobiology 32, 281-303, 1990).
エラグ酸は、 イチゴなどに含まれている天然のポリフエノールで、 抗癌作用 （ 非特許文献 4 Mutation Research 202卷、 429- 446頁、 1988年） 、 抗酸化作用 ( 非特許文献 5 Biochemical Pharmacology 42卷、 1441- 1445頁、 1991年） などの 生理作用を有することが知られている。 発明の開示  Ellagic acid is a natural polyphenol contained in strawberries, etc., which has anticancer activity (Non-patent Document 4 Mutation Research 202 Research, 429-446, 1988), antioxidant activity (Non-patent Document 5 Biochemical Pharmacology 42卷, 1441-1445, 1991). Disclosure of the invention
安全で優れた消化器疾患、 癌、 免疫疾患または糖尿病などの予防 ·治療剤が求 められている。 本発明者たちは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 6, 7-ジ ニトロキノキサリン 2， 3-ジオンなどのキノキサリン -2, 3-ジオン化合物おょぴェ ラグ酸が GPR35のリガンドであることを見出した。 とキノキサリン- 2, 3-ジ オンィ匕合物またはェラグ酸とを用いて、 消化器疾患、 癌、 免疫疾患などに有効な 医薬の探索が可能となると考え、 これらの知見に基づき、 さらに検討を重ねた結 果、 本発明を完成するに至った。 There is a need for safe and excellent preventive and therapeutic agents for gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, and diabetes. As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that quinoxaline-2,3-dione compounds such as 6,7-dinitroquinoxaline 2,3-dione have opellagic acid. It was found to be a ligand for GPR35. And quinoxaline-2,3-dione compound or ellagic acid can be used to search for effective drugs for gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, etc. As a result, the present invention has been completed.
すなわち、 本発明は、  That is, the present invention
〔1〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩おょぴ (b) 該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いる ことを特徴とする、 該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリ一二ング方法、 .  [1] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof (b) the protein or a salt thereof A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the protein or a salt thereof and the ligand, characterized by using a ligand having the ability to specifically bind.
〔2〕 リガンドが、 キノキサリン- 2， 3-ジオン化合物である上記 〔1〕 記載のス クリーニング方法、  [2] The screening method according to [1] above, wherein the ligand is a quinoxaline-2,3-dione compound,
[ 3 J キノキサリン- 2, 3 -ジオン化合物が、 6, 7 ジニトロキノキサリン- 2, 3 -ジ オン、 6 -二トロ- 7-スルファモイルベンゾ [f]キノキサリン- 2, 3 -ジオン、 6 -シァ ノ- 7 -二トロキノキサリン -2, 3 -ジオン、 または 5，トジ トロキノキサリン- 2， 3 - ジオンである上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、  [3 J quinoxaline-2,3-dione compound is 6, 7 dinitroquinoxaline-2,3-dione, 6-ditro-7-sulfamoylbenzo [f] quinoxaline-2,3-dione, 6- The screening method according to the above [1], which is cyan-7-ditroquinoxaline-2,3-dione, or 5, toditroquinoxaline-2,3-dione,
〔4〕 リガンドが、 エラグ酸である上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、 〔5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が 、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列 番号： 2 7で表されるアミノ酸配列である上記 [ 1〕 記載のスクリーニング方法  [4] The screening method according to [1] above, wherein the ligand is ellagic acid, [5] the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1 9. The screening method according to [1] above, which is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 1, SEQ ID NO: 2 3 or SEQ ID NO: 2 7.
〔6〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異 的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に接蝕させた場合と、 （b) 該リガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩に接触させた場合における、 該リガンド の該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、 比 較する、 上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、 [ 7 ] (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしぐは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩と特異 的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 （b) 該リ ガンドおよび試験ィ匕合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 該リガンドの該 細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較する、 上記 〔1〕 記載のスク リーニング方法、 [6] (a) a ligand having the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof, (B) the protein of the ligand when the ligand or test compound is contacted with the protein or its partial peptide or its salt. Alternatively, the screening method according to [1] above, wherein the binding amount to a partial peptide or a salt thereof is measured and compared. [7] (a) A ligand having the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof or a salt thereof In contact with a cell containing the protein or a partial peptide or salt thereof or a membrane fraction of the cell, and (b) the ligand and the test compound are combined with the protein or a portion thereof. The amount of the ligand bound to the cell or the membrane fraction when contacting the cell containing the peptide or a salt thereof or the membrane fraction of the cell is measured and compared. Leaning method,
〔8〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、 該蛋白 質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩をコードする D N Aを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩である上記 〔7〕 記載のスクリーニング方法、 ·  [8] A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, wherein the protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof is The screening method according to [7] above, which is a protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the encoded DNA, or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
〔9〕 リガンドが、 標識したリガンドである上記 〔6〕 〜 〔8〕 記載のスクリ 一二ング方法、  [9] The screening method according to [6] to [8] above, wherein the ligand is a labeled ligand,
〔1 0〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と特 異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガンドの存在下または非存在下、 試 験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合 における、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活 性を測定し、 比較する、 上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、  [1 0] (a) It has the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof or a salt thereof. When a ligand is brought into contact with the protein or a partial peptide or a salt thereof; and (b) in the presence or absence of the ligand, a test compound is added to the protein or a partial peptide or a salt thereof. The screening method according to the above [1], wherein cell stimulation activity via the protein or a partial peptide or salt thereof is measured and compared in the case of contact.
( 1 1〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と特 異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドま たはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 （b) 該 リガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を、 - 該蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお ける、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を 測定し、 比較する、 上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法、 〔1 2〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩が、 該蛋 白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩をコードする D NAを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩である上記 〔1 1〕 記載のスクリーニング方法、 (1 1) (a) The ability to specifically bind to a protein containing an amino acid sequence identical to or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof. A ligand having a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, or a membrane fraction of the cell, and (b) a test compound in the presence or absence of the ligand, -Measure cell stimulating activity via the protein or its partial peptide or its salt when it is brought into contact with a cell containing the protein or its partial peptide or its salt or the membrane fraction of the cell. Comparing the screening method according to [1] above, [1 2] SEQ ID NO: 1. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, wherein the protein, a partial peptide, or a salt thereof is The screening method according to [11] above, which is a protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the encoded DNA or a partial peptide thereof or a salt thereof,
〔1 3〕 細胞刺激活性が、 細胞内 c AM P濃度の低下または上昇である、 上記 [1 3] The cell stimulating activity is a decrease or increase in intracellular cAMP concentration,
〔1 0〕 〜 〔1 2〕 記載のスクリーニング方法、 [1 0] to [1 2] screening method according to the above,
〔1 4〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および （b) 該蛋白質またはそ の塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、 該 蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング用キット、  [14] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, and (b) specifically binding to the protein or the salt thereof A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the protein or a salt thereof and the ligand, comprising a ligand having an ability to act
〔1 4 a〕 上記 〔1〕 記載のスクリーニング方法または上記 〔1 4〕 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、  [14a] A compound or a salt thereof obtainable using the screening method described in [1] above or the screening kit described in [14] above,
〔' 1 4 b〕 化合物が、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩とリガンドとの結合を阻害する化合物またはその塩である上記 〔 1 4 a〕 記 载の化合物またはその塩、  ['14b] Binding of a compound comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof to a ligand Or a salt thereof, which is a compound or a salt thereof that inhibits
〔1 4 c〕 ァゴニストである上記 〔1 4 b〕 記載の化合物またはその塩、 〔1 4 d〕 アンタゴニストである上記 〔1 4 b〕 記載の化合物またはその塩、 C 1 4 e j 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩とリガ ンドとの結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、  [1 4 c] The compound or salt thereof described in [1 4 b] which is an agonist, [1 4 d] The compound or salt thereof described in [1 4 b] which is an antagonist, C 1 4 ej SEQ ID NO: 1 A drug containing a compound containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by the above or a partial peptide thereof or a salt thereof and a ligand, or a salt thereof;
〔1 4 f 〕 上記 〔1 4 c〕 記載の化合物またはその塩を含有してなる消化管疾 患または Π型糖尿病の予防 ·治療剤、  [1 4 f] A prophylactic / therapeutic agent for gastrointestinal diseases or type 2 diabetes comprising the compound or salt thereof according to [1 4 c] above,
〔1 4 g〕 上記 〔1 4 d〕 記載の化合物またはその塩を含有してなる消化器癌 、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療剤、 - [1 4 g] Gastrointestinal cancer comprising the compound or salt thereof according to [1 4 d] above, a preventive or therapeutic agent for immune disease or obesity,-
〔1 5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性を 促進する化合物またはその塩を含有してなる消化管疾患または II型糖尿病の予防 •治療剤、 [15] A compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof Prevention of gastrointestinal disease or type II diabetes • therapeutic agents,
〔1 6〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を 阻害する化合物またはその塩を含有してなる消化器癌、 免疫疾患または肥満の予 防 ·治療剤、  [16] SEQ ID NO: 1 A digest comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a compound that inhibits the activity of the salt thereof, or a salt thereof Preventive or therapeutic agent for organ cancer, immune disease or obesity,
〔1 7〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリ ガンド、  [17] A ligand having the ability to specifically bind to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof,
〔1 8〕 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を 促進することを特徴とする消化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療法、 [18] a gastrointestinal tract disease characterized by promoting the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof; Type II diabetes prevention and treatment,
〔1 9〕 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を 阻害することを特徴とする消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療法、 〔2 0〕 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性を 促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消 化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療法、 [19] Gastrointestinal cancer characterized by inhibiting the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, Prevention or treatment of immune diseases or obesity [20] Activity of a protein containing the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof A method for the prevention / treatment of gastrointestinal diseases or type II diabetes, characterized by administering an effective amount of a compound or a salt thereof that promotes the disease to a mammal,
〔2 1〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸.配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を 阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消 ィ匕器癌、 免疫疾患または肥満の予防、治療法、  [2 1] An amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. An effective amount of a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a protein containing the sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof Prevention, treatment of immune cancer or obesity characterized by administration to mammals,
〔2 2〕 消化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番 号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性を促進する化合物ま たはその塩の使用、  [2 2] A protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for the production of a prophylactic / therapeutic agent for gastrointestinal diseases or type II diabetes or its The use of a compound or its salt that promotes the activity of the partial peptide or its salt,
〔2 3〕 消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療剤の製造のための、 配列 番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同」のァミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物 またはその塩の使用などに関する。 以下、 「配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドもしくはその塩」 を 「本 発明の受容体」 または.「本発明の蛋白質」 と略記する場合がある。 さらに、 「本 発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド」 を 「本発明のリガンド 」 と略記する場合がある。 [2 3] A protein containing an amino acid sequence that is the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for the manufacture of a preventive / therapeutic agent for digestive cancer, immune disease or obesity Or it relates to the use of a compound or its salt which inhibits the activity of its partial peptide or its salt. Hereinafter, “a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof or a salt thereof” or “a receptor of the present invention” or “a protein of the present invention” ”May be abbreviated. Furthermore, “the ligand having the ability to specifically bind to the receptor of the present invention” is sometimes abbreviated as “the ligand of the present invention”.
さらに、 本発明は、  Furthermore, the present invention provides:
(i) 標識した G T P γ Sの存在下、 本発明のリガンドを本発明の受容体細胞膜 画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合 物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の受容体細胞 膜画分への G T P y S結合促進活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発 明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング 方法、  (i) When the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor cell membrane fraction of the present invention in the presence of labeled GTPγS, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is represented by the present invention. The ligand of the present invention and the present invention are characterized by measuring and comparing the GTP y S binding promoting activity to the receptor cell membrane fraction of the present invention when contacted with the receptor cell membrane fraction of the present invention. A method of screening a compound that alters the binding properties of the receptor
(ii) 細胞内 c AMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のリガンドを本発明 の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在 下、 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の 細胞内 c AM Pの産生抑制活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明の リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ユング方法  (ii) When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, A contact between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing the intracellular cAMP production inhibitory activity of the cells when contacted with the receptor-expressing cell of the present invention. Method for screening compounds that change binding properties
(iii) 細胞内 c AMP量を增加させる物質の存在下、 本発明のリガンドを、 C R E—レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を C R E—レ ポータ一遺伝子べクタ一を導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合に おける、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較することを特徴とす る、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ 一二ング方法、 (iii) When the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention into which the CRE-reporter gene vector has been introduced in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, and the presence of the ligand of the present invention Measuring or comparing the enzyme activity of the reporter gene protein when the test compound is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention into which the CRE-reporter gene vector has been introduced in the presence or absence of the test compound. A screening method for a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention,
(iv) 本発明のリガンドを、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験ィ匕 合物を標識したァラキド ^酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場 合における、 ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することを特徴とす る、 本発明のリガンドと本努明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ 一ユング方法、 (iv) When the ligand of the present invention is contacted with a receptor-expressing cell of the present invention containing a labeled arachidonic acid, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is labeled. The ligand of the present invention and the present invention are characterized by measuring and comparing the release activity of arachidonic acid metabolites when contacted with cells expressing the receptor of the present invention containing arachid ^ acid. Of compounds that alter the binding of cerebral receptors One Jung method,
(V) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発 明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、 比較するこ とを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化 合物のスクリーニング方法、  (V) When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention. A method for screening a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing intracellular calcium concentration increasing activity
(vi) 標識したイノシトールの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験ィ匕 合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 イノシトール三リン 酸産生活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の 受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ユング方法、  (vi) When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of labeled inositol, the test compound is prepared in the presence or absence of the ligand of the present invention. A compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing inositol triphosphate production activity when contacted with the receptor-expressing cell of the present invention SCREENING method,
(vii) 本発明のリガンドを、 T R E—レポーター遺伝子ベクターを導入した本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非 存在下、 試験化合物を T R E—レポ一タ一遺伝子べクタ一を導入した本発明の受 容体発現細胞に接触させた場合における、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を 測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結 合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、  (vii) When the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention into which the TRE-reporter gene vector has been introduced, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is The ligand of the present invention and the receptor of the present invention are characterized by measuring and comparing the enzyme activity of the reporter gene protein when contacted with the receptor-expressing cells of the present invention into which the target gene vector has been introduced. Screening methods for compounds that alter the binding properties of the body,
(viii) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本 発明のリガンドの存在下または非存在下、 験化合物を本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することを特徴とする、 本発 明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング 方法、  (viii) When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and when the test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence or absence of the ligand of the present invention A method for screening a compound that alters the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized in that cell proliferation is measured and compared in
(ix) 標識したルビジウムの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現 細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合 物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 標識したルビジウム の流出活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の 受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、  (ix) When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of labeled rubidium, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is A method for screening a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, comprising measuring and comparing the efflux activity of labeled rubidium when contacted with a receptor-expressing cell ,
(X) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発 明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を本努明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞外の p H変化を測定し、 比較することを特徴とす る、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ 一二ング方法、 (X) When the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention. In this case, it is characterized by measuring and comparing extracellular pH changes. A method for screening a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention,
(xi) ヒスチジン合成遺伝子を導入した本発明の受容体発現酵母を、 ヒスチジン 欠乏培地で培養し、 本発明のリガンドを接触させた場合と、 本発明のリガンドの 存在下または非存在下、 試験化合物を接触させた場合の、 該酵母の生育を測定し 、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を 変化させる化合物のスクリーニング方法、  (xi) When the receptor-expressing yeast of the present invention introduced with the histidine synthesis gene is cultured in a histidine-deficient medium and contacted with the ligand of the present invention, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound A method for screening a compound that alters the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, wherein the growth of the yeast when contacted is measured and compared,
(xii) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体遺伝子 RN A導入アフリカッメガ エル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を本発明の受容体遺伝子 RN A導入ァフリカツメガエル卵母細胞に接 触させた場合における、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較することを特徴とする 、 本努明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリー ユング方法なども提供する。 図面の簡単な説明  (xii) When the ligand of the present invention is brought into contact with the Xenopus laevis oocytes introduced with the receptor gene RN A of the present invention, and in the presence or absence of the ligand of the present invention, the test compound is the receptor of the present invention. In the case of contact with the gene RNA-introduced Xenopus oocyte, the change in cell membrane potential is measured and compared, and the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is demonstrated. It also provides methods for screening compounds to be changed. Brief Description of Drawings
図 1は、 GPR 3 5および 1 5を発現する CHO— K 1細胞に DNQXを 添加した時の、 細胞内 C a 2+濃度の変化を調べた結果を表す。 図中、 縦軸は細 胞内 C a 2+濃度を示す蛍光強度を、 横軸は測定開始後の時間経過 （秒） を、 ◊ は DNQX 0. 3 μΜ、 □は DNQX 1. 0 μΜ、 △は DNQX 3. 0 μ Μ、 Xは DNQX . 1 0 μΜの場合をそれぞれ表す。 Figure 1 shows the results of examining changes in intracellular Ca 2+ concentration when DNQX was added to CHO-K 1 cells expressing GPR 35 and 15. In the figure, the vertical axis is the fluorescence intensity indicating the intracellular Ca 2+ concentration, the horizontal axis is the elapsed time (seconds) after the start of measurement, ◊ is DNQX 0.3 μΜ, □ is DNQX 1.0 μΜ, Δ represents DNQX 3.0 μΜ, and X represents DNQX .10 μΜ.
図 2は、 GPR 3 5および G o; 1 5を発現する CHO— K 1細胞にエラグ酸を 添加した時の、 細胞内 C a 2+濃度の変化を調べた結果を表す。 図中、 縦軸は細 胞内 C a 2+濃度を示す蛍光強度を、 横軸は測定開始後の時間経過 （秒） を、 ◊ はェラグ酸 0. 3 Μ、 口はエラグ酸 1. Ο μΜ、 △はェラグ酸 3. 0 μ Μ、 Xはェラグ酸 1 0 μΜの場合をそれぞれ表す。 Fig. 2 shows the results of examining changes in intracellular Ca 2+ concentration when ellagic acid was added to CHO-K 1 cells expressing GPR 3 5 and Go; 15. In the figure, the vertical axis is the fluorescence intensity indicating the intracellular Ca 2+ concentration, the horizontal axis is the elapsed time (seconds) after the start of measurement, ◊ is ellagic acid 0.3 Μ, and the mouth is ellagic acid 1. Ο μΜ, △ is Eragu acid 3. 0 μ Μ, X represents each case Eragu acid 1 0 mu Micromax.
図 3は、 GPR 3 5を安定発現させた CHO細胞における、 ホルスコリン刺激 によって増加させた細胞内 c AMP量の DNQXおよび NB QX添加による抑制 作用を調べた結果を表す。 図中、 縦軸は c AM Pi (pmo l'/w e 1 1 ) を、 横軸はホルスコリン （F SK) 、 0 ぉょぴ 8(3 の各添加量をそれぞれ 表す。 発明を実施するための最良の形態 Figure 3 shows the results of examining the inhibitory effect of DNQX and NB QX on the intracellular cAMP level increased by forskolin stimulation in CHO cells stably expressing GPR35. In the figure, the vertical axis represents c AM Pi (pmol 1 / we 1 1), and the horizontal axis represents forskolin (F SK) and 0 ぉ 8 (3). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸 配列を有する蛋白質は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス 、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細 胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 脾臓 細胞、 骨髄細胞、 メサンギ ゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞 、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核 球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もし くは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もし くはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 網膜 、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎 、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下 腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または 血球系の細胞もしくはその培養細胞 （例、 MEL， Ml, CTLL-2, HT- 2， WEHI- 3， HL - 60， J0SK-1, K562, ML - 1， M0LT-3, MOLT - 4, MOLT - 10， CCRF-CEM, TALL-1, Jurka t， CCRT - HSB— 2， KE-37, SKW— 3， HUT - 78， HUT— 102， H9， U937, THP-1, HEL， JK— 1 ， CMK, K0-812, MEG-01など） に由来する蛋白質であってもよく、 合成蛋白質で あってもよい。  A protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used in human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, hidges, u Cells such as retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, spleen cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibers Blast cells, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes , Synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells or cancer Or any tissue in which those cells exist, such as the brain, brain regions (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum ), Spinal cord, pituitary gland, stomach, knee, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, Submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or blood cell or cultured cells (eg, MEL, Ml, CTLL-2, HT-2, WEHI) -3, HL-60, J0SK-1, K562, ML-1, M0LT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, K0-812, MEG-01, etc.) It may be quality.
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては 、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以 上、 より好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられ る。  As an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably Includes amino acid sequences having about 90% homology or more.
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Cen ter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Γοοΐ) を 用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギヤップを許す；マトリクス=8し031¾62；フィ ルタリング =0FF) にて計算することができる。  The homology of the amino acid sequence was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Γοοΐ) and the following conditions (expected value = 10; allow gap; matrix = 8 and 031¾62; filtering) = 0FF).
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す る蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同質 の活性を有する蛋白質などが好ましい。 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 7で表されるァミノ 酸配列、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列、 配列番号： 2 1で表されるァ ミノ酸配列、 配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列、 配列番号： 2 7で表され るアミノ酸配列などが挙げられる。 Contains the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. For example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Etc. are preferable. The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: : Amino acid sequence represented by 21, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, and the like.
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であること力 S好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の 分子量などの量的要素は異なっていてもよい。  Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal signal transduction action. “Substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal signal transduction activity are equivalent (for example, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to It is preferable that it is 2 times) S, but quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方 法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガンドの決定方法や スクリ一二ング方法に従って測定することができる。  Measurement of activities such as ligand binding activity and signal signal transduction can be carried out according to a method known per se, for example, it can be measured according to a ligand determination method or a screening method described later. .
また、 本発明の受容体と.しては、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番 号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 7で表されるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに 好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列 番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3ま たは配列番号： 2 7で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ま しくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加 したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配 列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1'〜5 0個程度、 好 ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 (iv) 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば ；!〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 よ り好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸 が挿入されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を 含有する蛋白質なども用いられる。 The receptor of the present invention includes (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 2 1, SEQ ID NO: 2 3 or SEQ ID NO: 2 7 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30 and more preferably 1 to 10) (Ii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 21 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably 1 to 3 0) in the amino acid sequence represented by No. 23 or SEQ ID NO: 27 (Iii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: No .: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 (for example, about 1 to 100) Preferably, about 1 'to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids are other amino acids. An amino acid sequence substituted with (iv) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 2 1, SEQ ID NO: 2 3, or SEQ ID NO: 2 7 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (for example,! About 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids. Or (V) a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them.
本発明の受容体の具体例としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含 有する蛋白質、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番 号： 1 9で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 2 1で表される ァミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 2 3で表されるァミノ酸配列を含有 する蛋白質、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質などが挙 げられる。  Specific examples of the receptor of the present invention include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the sequence number: 19 A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 1, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 3, and represented by SEQ ID NO: 27 And proteins containing the amino acid sequence.
本努明の受容体の部分ペプチド （以下、 本努明の部分ペプチドと称する場合が ある） としては、 後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分 ペプチドであれば、 いかなるものであってもよく、 例えば、 本努明の蛋白質分子 のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 実質的に同質のリガンド結合 活性などを有するものなどが用いられる。  Any of the partial peptides that can be used in the screening methods for pharmaceuticals and the like to be described later may be used as the partial peptides of the receptors of the present efforts (hereinafter also referred to as partial peptides of the present efforts). For example, among the protein molecules of this effort, those that are exposed to the outside of the cell membrane and have substantially the same ligand binding activity or the like are used.
配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分べプチ ドとしては、 疎水性プロット解析において細胞外領域 （親水性 （Hydrophilic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 （Hydropho bic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。 個々のドメイン を個別に含むぺプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチ ドでもよい。  SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 27 It is a peptide containing a portion analyzed to be an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis. A peptide partially containing a hydrophobic site can also be used. Peptides that contain individual domains can also be used, but peptides that contain multiple domains simultaneously may also be used.
本発明の部分べプチドのァミノ酸の数は、 本発明の蛋白質の構成ァミノ酸配列 のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個 以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ま-しい。  The number of amino acids of the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention. Peptides are preferred.
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。  Here, “substantially the same quality of activity” has the same meaning as described above. The “substantially the same quality of activity” can be measured in the same manner as described above.
また、 本発明の部分ペプチドは、 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以 上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜 5個） ） のアミ ノ酸が欠失し、 （ii) 上記アミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1 〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜 5個 ) ) のアミノ酸が付カ卩し、 または （iii) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以 上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜 5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。 Further, the partial peptide of the present invention comprises (i) one or two or more of the above amino acid sequences. The above (preferably about 1 to 10 and more preferably several (1 to 5)) amino acids are deleted. (Ii) 1 or 2 or more (preferably 1 ˜20, more preferably about 1-10, more preferably several (1-5)) amino acids, or (iii) 1 or 2 or more of the above amino acid sequences The above amino acids (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) may be substituted with other amino acids.
具体例としては、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列の第 24〜295番目のァ ミノ酸配列を含む部分ペプチド、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列の第 24〜 295番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチド、 配列番号： 1 9で表されるァミノ 酸配列の第 55〜326番目のァミノ酸配列、 配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配 列の第 65〜336番目のアミノ酸配列、 配列番号： 2 3で表されるァミノ酸配列の 第 109〜380番目のァミノ酸配列を含む部分ぺプチド、 配列番号： 2 7で表される ァミノ酸配列の第 23〜294番目のアミノ酸配列を含む部分べプチドなどが用いら れる。  Specific examples include a partial peptide containing amino acid sequences 24 to 295 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and amino acids 24 to 295 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. A partial peptide comprising the sequence; SEQ ID NO: 19 amino acid sequence 55 to 326 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19; amino acid sequence 65 to 336 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 23 Partial peptide containing the 109-380th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence of 23-294th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 Partial peptides containing are used.
本発明の受容体およぴ本努明の部分ペプチドは、 ペプチド標記の慣例に従って 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 C末 端はカルポキシ （- C00H) 、.カルボキシレート （- C00— ) 、 アミ ド （- C0NH2) また はエステル (-C00R) であってもよい。 In the receptor of the present invention and the partial peptide of Tsutomu Akimoto, the left end is the N-terminal (amino terminal) and the right end is the C-terminal (carboxyl terminal) according to the convention of peptide designation. The C terminal may be carboxy (—C00H), carboxylate (—C00—), amide (—C0NH 2 ) or ester (—C00R).
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル、 例えば、 シクロペンチ ノレ、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル、 例えば、 フエニル、 a—ナフチ ルなどの 6_12ァリール、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー アルキルもしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー アルキルなどの C7_14ァラルキルのほ力 経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメ チルなどが用いられる。 Here, as R in the ester, e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl such as isopropyl or n- butyl, cyclopentyl Honoré, C 3 _ 8 cycloalkyl such as cyclohexyl, for example, phenyl, a- 6 _ 12 Ariru such naphthyl le, for example, pivaloyl used frequently benzyl, as ho force oral ester of C 7 _ 14 Ararukiru such phenylene Lou alkyl or α- naphthylmethyl etc. α- Nafuchiru alkyl such phenethyl For example, oxymethyl is used.
本発明の受容体おょぴ本発明の部分ペプチドが C末端以外にカルポキシ （また はカルボキシレート） を有している場合、 カルボキシがアミ ド化またはエステル 化されているものも本発明の受容体およぴ本発明の部分べプチドに含まれる。 こ の場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる 。 さらに、 本楽明の受容体および本発明の部分ペプチドには、 N末端のアミノ酸 残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル、 ァセチル などの CMアルカノィルなどの ァシルなど） で保護されているもの、 生体內 で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 - 0H、 - SH、 アミノ基、 イミダゾー ル基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル、 ァセチルなどの C 6アル力ノィルなどの C wァシルなど） で保護されているものReceptor of the present invention When the partial peptide of the present invention has a carboxy (or carboxylate) other than the C-terminus, the carboxy is amidated or esterified. And included in the partial peptides of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used. Furthermore, the partial peptide of the receptor of the present invention and the present Rakumei comprises amino acid residues (e.g., Mechionin residues) of N-terminal Amino group protecting groups (e.g., formyl, Ashiru such C M Arukanoiru such Asechiru , Etc.), N-terminal glutamine residue produced by cleaving with a living body, pyroglutamine oxidized, substituents on the side chain of amino acids in the molecule (eg, -0H, -SH, Amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are protected with an appropriate protecting group (for example, C wacyl such as C 6 alkyl group such as formyl, acetyl, etc.)
、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。 本発明の受容体または本発明の部分べプチドの塩としては、 生理学的に許容さ れる酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用い られ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩として は、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 ある いは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハ ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベン ゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。 Alternatively, complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound are also included. As the receptor of the present invention or the salt of the partial peptide of the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or base (eg, alkali metal salt) is used. Particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid). , Succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド （本発明のリガンド ) としては、 本発明の受容体と特異的に結合するものであれば、 何れの物であつ てもよい。 例えば、 本発明の受容体との結合の解離定数が 1 0 M以下、 好まし くは 2 μ Μ以下、 さらに好ましくは 1 μ Μ以下、 特に好ましくは 2 0 0 η Μ以下 、 最も好ましくは 1 0 0 ηΜ以下である物などが挙げられる。  The ligand having the ability to specifically bind to the receptor of the present invention (the ligand of the present invention) may be any as long as it specifically binds to the receptor of the present invention. For example, the dissociation constant of binding to the receptor of the present invention is 10 M or less, preferably 2 μ μ or less, more preferably 1 μΜ or less, particularly preferably 2 00 ηΜ or less, and most preferably 1 Examples include those having 0 0 ηΜ or less.
本発明のリガンドとしては、 例えば、 キノキサリン- 2, 3 -ジオン化合物、 エラ グ酸などが用いられる。 ―  As the ligand of the present invention, for example, quinoxaline-2,3-dione compound, ellagic acid and the like are used. -
キノキサリン - 2， 3 -ジオン化合物としては、 キノキサリン- 2， 3 -ジオン骨格を有 する化合物であればいずれでもよく、 例えば 6， 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジ オン、 6-ニトロ- 7 -スルファモイルベンゾ [f]キノキサリン- 2, 3-ジオン、 6-シァ ノ- 7 -二トロキノキサリン- 2, 3 -ジオン、 または 5， 7-ジニトロキノキサリン- 2，3- ジオンなどが挙げられる。 好ましくは、 6， 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジオン などが挙げられる。 ·  The quinoxaline-2,3-dione compound may be any compound having a quinoxaline-2,3-dione skeleton, such as 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione, 6-nitro-7. -Sulfamoylbenzo [f] quinoxaline-2,3-dione, 6-cyan-7-ditroquinoxaline-2,3-dione, or 5,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione . Preferred examples include 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione. ·
標識されたキノキサリン- 2, 3 -ジオン化合物、 標識されたェラグ酸も、 本発明 のリガンドに含まれる。 標識物質としては、 放射性同位元素 （例、 〔¾〕 、 〔125i〕 、 C14c] 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 〔3¾〕 など） 、蛍光物質 （例、 フルォレセインなど） 、発光物質 （ 例、 ルミノールなど） 、 酵素 （例、 ペルォキシダーゼなど） 、 ランタニド元素な どがあげられる。 中でも、 放射性同位元素が好ましい。 A labeled quinoxaline-2,3-dione compound and labeled ellagic acid are also included in the ligand of the present invention. The labeling substance, a radioactive isotope (e.g., [¾], [125 i], C 14 c], [32 P], [33 P], [3 ¾], etc.), fluorescent substances (e.g., such as Furuoresein) , Luminescent materials (eg, luminol), enzymes (eg, peroxidase), lanthanide elements, etc. Among these, a radioisotope is preferable.
標識したリガンドとして好ましくは、 〔¾〕 または 〔1251〕 でそれぞれ標識さ れた 6， 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3-ジオン、 6_二ト口 _7 -スルファモイルべンゾ [f]キノキサリン- 2, 3 -ジオン、 6-シァノ -7 -二トロキノキサリン -2， 3 -ジオン、 ま たは 5, 7 -ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジオンなどが挙げられる。 好ましくは 〔¾ 〕 または ひ251〕 で標識された 6, 7 -ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジオンである。 本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、 前述したヒトゃ温血動物の細 胞または組織から自体公知のポリべプチドの精製方法によって製造することもで きるし、 ポリぺプチドをコ一ドする D N Aで形質転換された形質転換体を培養す ることによつても製造することができる。 また、 ペプチド合成法に準じて製造す ることもできる。 例えば、 Genomics、 56卷、 12- 21頁、 1999年、 Biochim. Biophy s. Acta, 1446卷、 57 - 70頁、 1999年などに記載の方法またはこれに準じた方法に より、 製造することもできる。 Preferably, the labeled ligand is 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione, 6_ditto_7-sulfamoylbenzo [f] quinoxaline-labeled with [¾] or [ 125 1], respectively. 2, 3-dione, 6-ciano-7-ditroquinoxaline-2,3-dione, or 5,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione. Preferred is 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione labeled with [¾] or [ 25 1]. The receptor of the present invention and the partial peptide of the present invention can be produced from the aforementioned human warm-blooded animal cells or tissues by a method known per se for purification of polypeptides. It can also be produced by culturing a transformant transformed with the DNA to be transferred. It can also be produced according to the peptide synthesis method. For example, it can also be produced by the method described in Genomics, 56 卷, 12-21, 1999, Biochim. Biophys. Acta, 1446 卷, 57-70, 1999, etc. it can.
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺轧動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。  When producing from human mammal tissue or cells, homogenize human mammal tissue or cells, extract with acid, etc., and extract the extract using reverse-phase chromatography or ion-exchange chromatography. It can be purified and isolated by combining chromatography.
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩の合成には、 通常、 巿 販のポリぺプチド合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルアミン樹脂 、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチル ベンズヒドリルァミン樹脂、■ P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニル ァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2 ' ， 4， 一ジメ ト キシフエ二ルーヒ ドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2， ， 4， —ジメ ト キシフエニル一F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などをあげることができ る。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したァミノ 酸を、 目的とするポリペプチドの配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からポリぺプチドを切り出すと同時に各 種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実 施し、 目的のポリペプチド、 受容体、 部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取 得する。 For the synthesis of the receptor or partial peptide of the present invention or a salt thereof, a commercially available resin for synthesizing polypeptides can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 —Hydroxymethylmethyl phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4— (2 ′, 4, 1-dimethoxyphenyl dihydroxymethyl) phenoxy resin, 4 -— (2,, 4, —dimethoxyphenyl- 1F moc (Aminoethyl) phenoxy resin and the like. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is subjected to various known condensation methods according to the sequence of the target polypeptide. Condensation on resin. At the end of the reaction, the polypeptide is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution, and the target polypeptide, receptor, partial peptide or their An amide form is obtained.
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリペプチド合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジ イミド類としては、 D C C、 N, N ' ージイソプロピルガルポジイミド、 N—ェ チルー N ' — ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられる 。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t， HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活 性ィ匕を行なった後に樹脂に添加することができる。  For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for polypeptide synthesis can be used, and calpositimides are particularly preferable. Examples of the carpositimides include DCC, N, N'-diisopropylgalposimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carpositimide. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HO B t, HO OB t), or pre-protected as a symmetric anhydride, HOB t ester or HO OB t ester. It can be added to the resin after the amino acid activity.
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ポリべプチ ド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば 、 N, N—ジメチルホ /レムアミ ド， N， N—ジメチルァセトアミ ド， N—メチル ピロリ ドンなどの酸アミ ド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭 化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシド などのスルホキシド癀、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエー テル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢 酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反 応温度はポリぺプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から 適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化され たァミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用 いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合 反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返して も十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用 いて未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えない ようにすることができる。 . ·  The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents that are known to be usable in the polypeptide condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylfo / remamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and black mouth form, trifluoro Alcohols such as ethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate A mixture of these is used. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for a polypeptide bond-forming reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C. to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the subsequent reaction can be prevented from being affected by acetylating the unreacted amino acid with acetic anhydride or acetyl imidazole. .
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t一ペンチルォキシ カノレポ二ノレ、 イソポノレニノレ才キシカノレポ二ノレ、 4ーメ トキシペンジノレオキシカノレ ポ二/レ、 C 1一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフノレオロア セチノレ、 フタロイル、 ホルミノレ、 2—二トロフエニルスノレフエニル、 ジフエ二ル ホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。 Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, B oc, t-pentyloxy canoleponore, isoponoleninore, xicanoreponore, and 4-methoxypendinoreoxycanole. Poni / Le, C 1 1 Z, B r—Z, adamantyloxycarbonyl, trifanololoacetinole, phthaloyl, forminole, 2-nitrophenylsulenyl, diphenyl phosphinoi oil, Fmo c, etc. It is done.
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステノレ化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t—プチノレ、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シクロヘプ チル、 シクロオタチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4一 二トロべンジノレエステル、 4ーメ トキシベンジノレエステノレ、 4—クロ口べンジノレ エステノレ、 ベンズヒ ドリノレエステノレィ匕） 、 フエナシノレエステノレィ匕、 ペンジノレオキ シカルボニルヒドラジド化、 tーブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。  The carboxyl group is, for example, alkylesterolated (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-petitanol, cyclopentinole, cyclohexenole, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc. Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzene ester, 4-methoxybenzenoreestenole, 4-chlorobenzene esterenore, benzhi dorinoresesteno It can be protected by phenathinoreesterolation, penzinoreoxycarbonyl hydrazide, tert-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （Cw) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカ ノレポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロ ピラニル基、 t一ブチル基などである。  The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include low-grade (Cw) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, groups derived from carbonic acid such as benzyloxycanonyl groups and ethoxycarbonyl groups. . Examples of groups suitable for etherification include benzyl group, tetrahydropyranyl group, and t-butyl group.
チロシンのフヱノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12- B z l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。 Examples of protecting groups for Fuwenoru hydroxyl group of tyrosine, for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as t one-butyl is used.
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メ トキシ -2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル 、 Bum, B o c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。  Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc, etc. .
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフヱノール、 2 ， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N —ヒドロキシフタルイミ ド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性ィ匕されたものとしては、 例えば、 対応するリ 'ン酸アミ ドが用い られる。  Examples of the activated lpoxyl group of the raw material include the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2, 4, 5-trichlorodiphenol, 2, 4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t) and the like. For example, the corresponding phosphoric acid amide is used as the activated amino group of the raw material.
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロピノレエチノレアミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、.また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チォァニソール、 メタクレゾーノレ、 パラクレゾーノレ、 ジメチノレスノレ フイド、 1， 4一ブタンジチォ一ノレ、 1， 2—エタンジチォーノレなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され 、 トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2一エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による 脱保護以外に、 希水酸ィ匕ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。 Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include P d—black or P d—carbon. Catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of any catalyst, acid treatment with anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, or diisopropipropyl Base treatment with norethinoreamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia are also used. In general, the elimination reaction by the acid treatment is performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresonole, paracresonole, dimethinolesnoreido, 1, Addition of force thion scavengers such as 4-butanethionole, 1,2-ethanedithionore is effective. In addition, the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the 1,2-ethanedithiol described above, 1,4- In addition to deprotection by acid treatment in the presence of butanedithiol, etc., it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution or dilute ammonia.
原料の反応に閿与すべきでない宫能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性ィヒなどは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。  The protection of the active group that should not be given to the reaction of the raw material, the removal of the protective group, the activity of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means .
本発明の受容体または部分ペプチドを得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミ ノ.基側にペプチド （ポリペプチド） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド 鎖の Ν末端の α—アミノ基の保護基のみを除いたポリべプチドと C末端のカルボ キシル基の保護基のみを除去したポリぺプチドとを製造し、 この両ポリぺプチド を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同 様である。 縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、 上記方法により すべての保護基を除去し、 所望の粗ポリペプチドを得ることができる。 この粗ポ リぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥するこ とで所望の受容体またはその部分べプチドのァミド体を得ることができる。 本発明の受容体または部分べプチドもしくはそれらの塩のエステル体を得るに は、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール 類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 受容体またはその部分ペプチドのアミド 体と同様にして、 所望の受容体またはその部分ぺプチドのエステル体を得ること ができる。 As another method for obtaining the receptor or partial peptide of the present invention, for example, first, the α-streptoxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then a peptide (polypeptide) chain is formed on the amino group side. After extending to the desired chain length, a polypeptide excluding only the α-amino protecting group at the Ν-terminal of the peptide chain and a polypeptide from which only the protecting group at the C-terminal carboxyl group is removed are produced. The both polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected polypeptide obtained by condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain the desired crude polypeptide. This crude polypeptide can be purified using various known purification means, and the desired fraction or its partial peptide can be obtained by lyophilizing the main fraction. In order to obtain the receptor of the present invention or an ester of a partial peptide or a salt thereof, for example, after condensing the α-streptoxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the receptor or its Amides of partial peptides The desired receptor or an ester of its partial peptide can be obtained in the same manner as the body.
本発明の受容体または部分ぺプチドは、 自体公知のぺプチドの合成法に従って 、 あるいは受容体の部分ペプチドについては、 受容体を適当なぺプチダーゼで切 断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば 、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明受容体ま たは部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮 合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプ チドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば 、 以下の （i) 〜 (V) に記載された方法があげられる。  The receptor or partial peptide of the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or for a partial peptide of the receptor, by cleaving the receptor with an appropriate peptidase. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the receptor or partial peptide of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protective group, the target peptide is eliminated by removing the protective group. A peptide can be produced. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in the following (i) to (V).
(i M. Bodanszky■および M. A. 0ndetti、 Peptide Synthesis, Interscience P ublishers, New York (1966年〉  (i M. Bodanszky and M. A. 0ndetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(ii) Schroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965 年）  (ii) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）  (iii) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 20 5、 （1977年）  (iv) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 20 5, (1977)
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ぺプチド合成、 広川書店  (V) Supervised by Haruaki Yajima, Development of follow-up drugs, IV, Peptide synthesis, Hirokawa Shoten
' また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラ フィ一、 液体ク口マトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて本発明の受容体ま たは部分ぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる受容体また は部分べプチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法に よって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方 法あるいはそれに準じる方法によつて遊離体または他の塩に変換することができ る。 ' 'After the reaction, the receptor or partial peptide of the present invention can be purified by a combination of conventional purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. Can be separated. When the receptor or partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method equivalent thereto, and conversely, when obtained by a salt, It can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto. '
本発明の受容体または部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 前述した本発明の受容体または部分べプチドをコ ドする塩基配列を含有するも のであればいかなるものであってもよい。 このうち D N Aが好ましく、 該 D N A は、 ゲノム D N A、 ゲノム D N Aライブラリー、 前記した細胞.組織由来の c D N A、 前記した細胞 ·組織由来の c D N Aライブラリー、 合成 D N Aのいずれで もよい。 The polynucleotide encoding the receptor or partial peptide of the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the receptor or partial peptide of the present invention described above. . Among these, DNA is preferable, and the DNA is any one of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell, tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA. Also good.
ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞，糸且織より total R Aまたは mENA画分.を調製したものを用いて ft接 Revefse Transcriptase P olymerase Chain Reaction (以下、 RT-PCR法と略称する） によって增幅すること もできる。  The vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, it can be amplified by ft-contact Revefse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RA or mENA fraction prepared from the cells, yarn and weave.
本発明の受容体をコードする D N Aとしては、 例えば配列番号： 2、 配列番号 ： 8、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4または配列番号： 2 8 で表される塩基配列を含有する D N A、 または配列番号： 2、 配列番号： 8、 配 列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4または配列番号： 2 8で表され る塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有 し、 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号 ： 2 3または配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的 に同質の活性を有する受容体をコードする D N Aなどであれば何れのものでもよ い。  The DNA encoding the receptor of the present invention is represented by, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 2, 2, SEQ ID NO: 24, or SEQ ID NO: 28. DNA containing the base sequence, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 2 2, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 28 It has a base sequence that hybridizes under stringent conditions, and is represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, or SEQ ID NO: 27. Any DNA may be used so long as it encodes a receptor having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence.
配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4または配列番号： 2 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下 でハイブリダィズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 8 、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4または配列番号： 2 8で表 される塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。  DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 2, 2, SEQ ID NO: 24, or SEQ ID NO: 28 under highly stringent conditions As, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 2, 2, SEQ ID NO: 24, or about 70% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 Preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ばヽ Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Haroor Lao. P ress, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライ ブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことが できる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従つて行なうことがで きる。 .  Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Haroor Lao. Press, 1989). . In addition, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions. .
ハイストリンジヱントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜 4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜65。Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65°Cの 場合が最も好ましい。 High stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60. ~ 65. C conditions are shown. In particular, it is most preferable that the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコ ードする D N Aとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D N Aな どが、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする DN Aとしては、 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番 号： 19で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする DNAとしては 、 配列番号： 20で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、 配列番号： 21 で表されるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする DNAとしては、 配列番 号： 22で表される塩基配列を含有する D N Aなどが、 配列番号： 23で表され るアミノ酸配列を含有する受容体をコードする DNAとしては、 配列番号： 24 で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号： 27で表されるァミノ 酸配列を含有する受容体をコードする DN Aとしては、 配列番号： 28で表され る塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。  More specifically, the DNA encoding the receptor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, such as SEQ ID NO: : DNA encoding the receptor containing the amino acid sequence represented by 7 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19. As a DNA encoding the receptor containing, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20, etc., DNA encoding the receptor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 As a DNA encoding a receptor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, such as a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 22, the base represented by SEQ ID NO: 24 DNA containing the sequence is The DN A encoding a receptor containing Amino acid sequence represented by 27, SEQ ID NO: like DN A comprising the base sequence you express by 28 is used.
本発明の部分ぺプチドをコ一ドする DN Aとしては、 本発明の受容体の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ い。 また、 ゲノム DNA、 .ゲノム DNAライプラリー、 前記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのい ずれでもよい。 具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配 列番号： 22、 配列番号： 24または配列番号： 28で表される塩基配列を有す る D N Aの部分塩基配列を有する D N A、 または配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24または配列番号： 28で表さ れる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を 有し、 配列番号： 1、 配列番号： 7、 配列番号： 19、 配列番号： 21、 配列番 号 ·· 23または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質 的に同質の活性を有する受容体をコードする DN Aの部分塩基配列を有する DN Aなどが用いられる。 - 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号：'22、 配列番号： 24または配列番号： 28で表される塩基配列とハイプリダイズできる D N Aは 、 前記と同意義を示す。 ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。 The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the partial peptide of the receptor of the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used. Specifically, the partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 28 Or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 28 under high stringency conditions And a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 27 In particular, DN A having a partial base sequence of DN A encoding a receptor having the same activity is used. -SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: '22, DNA represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 28, and DNA that can be hybridized have the same significance as described above. . The hybridization method and highly stringent conditions are the same as described above.
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D N A) は、 自体公知の方法で標識化されていてもよい。 標識物質としては、 放射性 同位元素、 蛍光物質 （例、 フルォレセインなど） 、 発光物質、 酵素、 ピオチン、 ランタニド元素などがあげられる。  A polynucleotide (eg, DNA) encoding the receptor or partial peptide of the present invention may be labeled by a method known per se. Examples of labeling substances include radioisotopes, fluorescent substances (eg, fluorescein), luminescent substances, enzymes, piotin, and lanthanide elements.
本発明の受容体または都分ぺプチドを完全にコードする D NAのクローニング の手段としては、 本発明の受容体または部分ペプチドの部分塩基配列を有する合 成 D NAプライマーを用いて自体公知の P C R法によつて増幅する力 または適 当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明の受容体または部分べプチドの一部あ るいは全領域をコードする D NA断片もしくは合成 D NAを用いて標識したもの とのハイブリダイゼーシヨンによつて選別することができる。 ハイブリダイゼー シ 3ンの方法は、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法 に従って行なうことができる。  As a means of cloning DNA which completely encodes the receptor of the present invention or the peptide, a PCR known per se using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the receptor or partial peptide of the present invention is used. Amplification by the method or DNA incorporated into an appropriate vector labeled with a DNA fragment encoding the receptor or partial peptide of the present invention or a partial region or synthetic DNA Can be selected by hybridization. The hybridization method can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). In addition, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
D N Aの塩基配列の変換は、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA- ύ PCR法、 G apped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従 つて行なうことができる。  The DNA base sequence can be converted using a known kit such as Mutan ™ -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan ™ -K (Takara Shuzo), etc. It can be carried out according to a method known per se such as duplex method or Kunkel method or a method analogous thereto.
クローン化された受容体をコードする D NAは目的によりそのまま、 または所 望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することができ る。 該 D NAはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての T AA、 T GAまたは T AGを有していて もよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 D NAァダプ ターを用いて付加することもできる。  The DNA encoding the cloned receptor can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme or added with a linker as desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （a) 本発明 の受容体または部分べプチドをコ一ドする D N Aから目的とする D N A断片を切 り出し、 （b) 該 D NA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連 結することにより製造することができる。 ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR322， p BR 32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110， p TP 5, p C 194) 酵母由来プラスミ ド (例、 p SH19， p SH15) 、 又ファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス ， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 ρΧΤ1、 R c/CMV, pR c/RS V, p c DNA I ZN e oなどが用いられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRo;プロモーター、 SV40プロモーター、 HI V * LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 HS V - ΤΚプロモーターなどがあ げられる。 The receptor or partial peptide expression vector of the present invention includes, for example, (a) cutting out a target DNA fragment from DNA encoding the receptor or partial peptide of the present invention, and (b) the DNA The fragment can be produced by ligating downstream of the promoter in an appropriate expression vector. Examples of the vector include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194) E.g., pSH19, pSH15), bacteriophages such as phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, pAl-11, ρΧΤ1, R c / CMV, pR c / RS V, pc DNA I ZN eo is used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when animal cells are mainly used, examples include SRo; promoter, SV40 promoter, HIV * LTR promoter, CMV promoter, HS V-ΤΚ promoter.
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRひプロモ 一ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a。プロモーター、 r e cAプロモーター、 LPLプロモー ター、 1 p pプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 p e nPプロモータ 一など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター 、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞で ある場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Am と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遣 伝子 （以下、 Ne と'略称する場合がある、 G418耐性） 等があげられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスタ^ "細胞を用いて dh f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。  Of these, it is preferable to use a CMV (cytomegalovirus) promoter, SR promoter and the like. T r p promoter, la, when the host is Escherichia. Promoter, recA promoter, LPL promoter, 1 pp promoter, T7 promoter, etc., if the host is Bacillus, SPOl promoter, SP02 promoter, penP promoter, etc., if the host is yeast PHO 5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable. In addition to the above, the expression vector contains an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. Can be used. Selectable markers include, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Am), neomycin resistance And the like (hereinafter sometimes abbreviated as Ne, G418 resistance). In particular, when a dhfr gene-deficient Chinese hamster cell is used as a selection marker, the target gene can be selected even in a medium not containing thymidine.
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の受容体の N端末 側に付加する。 宿主がェシヱリヒァ属菌である場合は、 P h o A ·シグナル配列 、 Omp A · シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミ ラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン .シグナノレ配列などが、 宿主が酵母である 場合は、 MF a · シグナル配列、 SUC 2 · シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 ィンシュリン ·シグナノレ配列、 c —ィンターフェロン ·シグナ ル配列、 抗体分子'シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 In addition, if necessary, a signal sequence suitable for the host is used for the N terminal of the receptor of the present invention. Add to the side. When the host is Escherichia, Pho A signal sequence, Omp A signal sequence, etc. When the host is Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. If the host is yeast, MF a · signal sequence, SUC 2 · signal sequence, etc. If the host is an animal cell, insulin • signal sequence, c —interferon • signal sequence, antibody molecule 'signal Each array can be used.
このようにして構築された本発明の受容体または部分べプチドをコ一ドする D N Aを含有するべクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。  A transformant can be produced using a vector containing a DNA encoding the receptor or partial peptide of the present invention thus constructed.
宿主としては、 例えば、 ェシヱリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。  Examples of hosts that can be used include Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
ェシェリヒァ属菌の具体例としては、 例えば、 ェシェリヒア .コリ （Escheric hia coli) K 1 2 · DH 1 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 160 (1968)〕 ， JM1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309(1981)〕 ， J A2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120卷， 517(1978)〕 ， HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41卷， 459 (1969)〕 , C 6 00 [Genetics, 39 , 440(1954)] などが用い られる。  Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K 1 2 · DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 卷, 160 (1968)], JM1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9 卷, 309 (1981)], J A2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120 卷, 517 (1978)], HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41 卷, 459 (1969)], C 6 00 [Genetics, 39, 440 (1954)] is used.
バチ^/ス属菌としては、 例えば、 バチノレス ·サブチ^^ス （Bacillus subtilis ) M I 1 1 4 [Gene, 24¾ 255(1983)] , 2 0 7- 2 1 [Journal of Biochemist ry, 95卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。  For example, Bacillus subtilis MI 1 1 4 [Gene, 24¾ 255 (1983)], 2 0 7- 2 1 [Journal of Biochemistry, 95 卷, 87 (1984)].
酵母としては、 例え ίま、 サッカロマイセス セレビシェ (Saccharomyces cere visiae) AH 2 2, AH 2 2 R―， NA8 7- 1 1 A, DKD— 5D， 2 O B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。  Examples of yeasts include ί, Saccharomyces cere visiae AH 2 2, AH 2 2 R―, NA8 7-1 1 A, DKD— 5D, 2 OB— 1 2, Schizosaccharomyces pombe ) NCYC 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6 Pichia pastoris KM 7 1 etc. are used.
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c NPVの場合は、 ョトウガの幼虫 由来株化細胞 （Spodoptera frugiperda cell ； S f細胞） 、 Trichoplusia の 中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来.の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細 胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL17 11) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 In Vivo, 13, 213-217, (1977)) な どが用いられる。 As insect cells, for example, when the virus is Ac NPV, Spodoptera frugiperda cells (Sf cells), Trichoplusia midgut-derived MG 1 cells, Trichoplusia ni eggs. High Five ™ cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNP V, cocoon-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) are used. Examples of the S f cells include S f 9 cells (ATCC CRL17 11) Sf21 cells (above, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) are used.
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 卷， 592 (1985)〕 。  Examples of insects include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315 卷, 592 (1985)].
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7 (COS 7) ， Ve r o, チ ャィニーズハムスター細胞 C HO (以下、 CHO細胞と略記）.， d h f r遺伝子 欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO ( d h f r -) 細胞と略 記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH 3， ヒ ト FL細胞などが用いられる。  Examples of animal cells include monkey cell COS-7 (COS 7), vero, Chinese hamster cell C HO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter CHO ( abbreviated as dhfr-) cells), mouse L cells, mouse At T-20, mouse myeloma cells, rat GH 3, human FL cells, etc.
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 69卷， 2110 (1972)や Gene, 17卷， 107(1982)などに記載の方法に従って行なうこと ができる。  Transformation of Escherichia can be performed according to the method described in, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 卷, 2110 (1972), Gene, 17 卷, 107 (1982).
バチノレス属菌を开質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, 1 68卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。  For example, molecular and general genetics, 168 卷, 111 (1979) can be used to convert the genus Bachinores into a transformed form.
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194卷， 182- 187 (19 91)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75卷， 1929(1978)などに記載の方法に従って 行なうことができる。  For transformation of yeast, for example, the method described in Methods in Enzymology, 194 卷, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 卷, 1929 (1978), etc. Can do.
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) などに記載の方法に従って行なうことができる。  Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263-267(1995) (秀潤社発行） 、 Virology, 52卷， 456(1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。  To transform animal cells, for example, according to the method described in Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52 卷, 456 (1973). Can be done.
このように.して、 受容体または部分べプチドをコ一ドする DN Aを含有する発 現べクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。  In this way, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding the receptor or partial peptide can be obtained.
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 パレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。 When culturing a transformant whose host is Escherichia or Bacillus, a liquid medium is appropriate as the medium used for the cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is included therein. Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salt, nitrates, corn sheep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, etc. Of inorganic or organic substances, Examples of inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
ェシェリヒア属菌を培養する際の培地としては 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetic s, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 力 S好ましレヽ。 こ こに必要によりプロモーターを効率よく働力せるために、 例えば、 3 —インド リルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。  For example, M 9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] Masle. If necessary, a drug such as 3-indrylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently if necessary.
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5 - 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。  When the host is Escherichia, the culture is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。  When the host is Bacillus, the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 パークホ 一ルダー (Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 77卷， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 （Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330 (1984)〕 があげられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整する が好ましい。 培養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4 〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。  When cultivating a transformant whose host is yeast, as a medium, for example, Parkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 卷, 4505 (1980) And SD medium containing 0.5% casamino acid (Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 卷, 5330 (1984)). The pH of the medium is about 5-8. Cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 7 to 2 hours, with aeration and agitation as necessary.
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜 6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日聞行な い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。  When cultivating transformants whose hosts are insect cells or insects, the medium used is 10% gusci immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). What added suitably additives, such as serum, etc. are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Incubate at about 27 ° C for about 3 to 5 days, with aeration or agitation if necessary.
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 122卷， 501 (1%2)〕 ， DME M培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕 ， R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of the American Medical Association 199卷， 519 (1967)〕 ， 1 9 9培地 〔Proceedi ng of the Society for the Biological Medicine, 73卷， 1 (1950)〕 などが用いら れる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外などに本発明の 受容体または部分べプチドを生成せしめることができる。 When cultivating a transformant whose host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium [Science, 122 (, 501 (1% 2)] containing about 5 to 20% fetal bovine serum, DME M Medium [Virology, 8 卷, 396 (1959)], RPMI 16 40 Medium [The Journal of the American Medical Association 199 卷, 519 (1967)], 1 9 9 Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine , 73 卷, 1 (1950)]. The pH is preferably about 6-8. Cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, with aeration and agitation as necessary. As described above, the receptor or partial peptide of the present invention can be produced in the cell, cell membrane or extracellular region of the transformant.
上記培養物から本発明の受容体または部分ぺプチドを分離精製するには、 例え ば、 下記の方法により行なうことができる。  Separation and purification of the receptor or partial peptide of the present invention from the above culture can be carried out, for example, by the following method.
本発明の受容体または部分べプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際 しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に 懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは 細胞を破壌したのち、 遠心分離+ろ過によりポリべプチドの粗抽出液を得る方法 などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤 や、 トリ トン X— 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に ポリペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体ぁ るいは細胞と上清とを分離し、 上^を集める。  When the receptor or partial peptide of the present invention is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound. For example, a method of obtaining a crude polypeptide extract by centrifuging and filtering after lysozyme and / or freeze-thawing, etc. is used as appropriate. The buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™. When the polypeptide is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells and the supernatant are separated by a method known per se, and the supernatant is collected.
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる受容体または 部分ぺプチドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適宜組み合わせて行なうこと ができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解 度を利用する方法、 透析法、 限外ろ適法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアク リルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交 換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマト グラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ 一などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。  Purification of the receptor or partial peptide contained in the culture supernatant thus obtained or the extract can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights, such as methods that utilize solubility, such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography And a method using the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
かくして得られる受容体または部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、 自 体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に 塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体 または他の塩に変換することができる。  When the receptor or partial peptide thus obtained is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, it is known per se. It can be converted into a free form or other salt by a method or a method similar thereto.
なお、 組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、 精製前または精製後 に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリぺ プチドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリ プシン、 キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロティンキナーゼ 、 グリコシダーゼなどが用いられる。 本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドは、 市販されている 場合には市販品をそのまま用いることもでき、 自体公知の方法またはこれらに準 じた方法に従って抽出または製造することもできる。 The receptor or partial peptide produced by the recombinant may be optionally modified or partially removed by allowing a suitable protein-modifying enzyme to act before or after purification. it can. Examples of protein modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, arginylendopeptidase, protein kinase, glycosidase, and the like. When the ligand having the ability to specifically bind to the receptor of the present invention is commercially available, it can be used as it is, and can be extracted or produced according to a method known per se or a method analogous thereto. You can also.
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以 下、 単に本発明の抗体と称する場合がある） は、 本発明の受容体に対する抗体を 認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであ つてもよい。 本発明の受容体に対する抗体としては、 受容体のシグナル伝達を不 活性化する抗体、 受容体のシグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。 本発明の受容体に対する抗体は、 本発明の受容体を抗原として用い、 公知の抗 体または抗血清の製造法に従って製造することができる。  An antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the antibody of the present invention) As long as it can recognize an antibody against the receptor of the present invention, it may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Examples of the antibody against the receptor of the present invention include an antibody that inactivates receptor signal transduction, an antibody that activates receptor signal transduction, and the like. The antibody against the receptor of the present invention can be produced according to a known method for producing an antibody or antiserum using the receptor of the present invention as an antigen.
〔モノクローナル抗体の作製〕 '  [Production of monoclonal antibodies] ''
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製  (a) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
本発明の受容体は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ 自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高め るため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与し てもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 用い られる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリがあげられるが、 マウスおょぴラットが好まし く用いられる。  The receptor of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier or a diluent, at a site where antibody production is possible by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. Examples of warm-blooded animals that can be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hidges, goats, and chickens, with mouse and rat being preferred.
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマゥスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化ポ リぺプチドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定す ることにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーと ミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature)、 '256、 495 (1975)〕 に従い実施する ことができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G ) やセンダイウィルスなどがあげられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2Z0、 AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80%程度の濃度で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°C で 1〜 10分間ィンキュペートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 ポリペプチド （蛋白質） 抗原を直接あるいは担体とともに 吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いら れる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプ 口ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清 を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、 固相に結合し たモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。 When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, such as a mouse with an antibody titer, and collect the spleen or lymph nodes 2-5 days after the final immunization. Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells to be fused with myeloma cells of the same or different animals. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled polypeptide described below with an antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, '256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used. Examples of myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2Z0, AP-1, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Cell fusion can be carried out efficiently by incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes. Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the supernatant of a hybridoma culture is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a polypeptide (protein) antigen is adsorbed directly or with a carrier. Next, add anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used when the cells used for cell fusion are mice) or protein A labeled with radioactive substances or enzymes, and bind to the solid phase. To detect monoclonal antibodies, anti-immunoglobulin antibody or protein A was adsorbed to the solid phase, and the supernatant of the hybridoma was added to the solid phase, and the polypeptide labeled with a radioactive substance or enzyme was added to the solid phase. Examples thereof include a method for detecting a monoclonal antibody.
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン) を添 加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば 、 1〜 20 %、 好ましくは 10〜 20 %の牛胎児血清を含む R PMI 1640 培地、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ) あるい はハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ） などを 用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ましくは約 37。Cであ る。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は 、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイブリ ドーマ培養上清の抗体価 は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。  The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a similar method. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as it can grow hyperprideoma. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or Hypridorma A serum-free medium for culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. The culture temperature is usually 20-40 ° C, preferably about 37. C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
(b) モノクローナル抗体の精製 - モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例、 DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相 あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを 採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことができ る。 (b) Purification of monoclonal antibodies-Separation and purification of monoclonal antibodies can be performed by known methods such as immunoglobulin separation and purification (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion Adsorption / desorption method with exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase Alternatively, a specific purification method in which only the antibody is collected with an active adsorbent such as protein A or protein G, and the antibody is obtained by dissociating the binding can be performed.
〔ポリク口ーナル抗体の作製〕  [Preparation of polyclonal antibody]
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製造 することができる。 例えば、 免疫抗原 （ポリペプチド抗原） 自体、 あるいはそれ とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に温血動物に免疫を行い、 該免疫動物から本発明の受容体に対する抗体含有 物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリァ一に架橋させて免疫したハヅテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンや ゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1 〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。  The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, an immune antigen (polypeptide antigen) itself or a complex of it and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method. It can be produced by collecting the antibody-containing substance against and purifying and purifying the antibody. Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used to immunize warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are as follows. Any one can be cross-linked at any ratio as long as it is efficient. For example, ushi serum albumin, thythyroglobulin, hemocyanin, etc. are about 0.1 to 2 in weight ratio to hapten 1. A method of coupling at a ratio of 0, preferably about 1 to 5, is used.
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。  In addition, various condensing agents can be used for force pulling of the hapten and the carrier, and active esters such as daltaraldehyde, carpositimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used. The condensation product is administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible, or with a carrier or diluent. In order to enhance antibody production at the time of administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. The administration is usually about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。  Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the method described above.
抗血清中のポリクロ ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ノレ抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで きる。 · '  The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separating and purifying the immunoglobulin as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody. · '
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードするポリ ヌクレオチド （例、 DNA) に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列また はその一部を含有するポリヌクレオチド （例、 DNA) としては、 該ポリヌクレ ォチドに相補的な、 または実質的に相捕的な塩基配列またはその一部を有し、 該 ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのポリ ヌクレオチド (ァンチセンスポリヌクレオチド) であってもよい。 SEQ ID NO: 1. Polyprotein encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof A polynucleotide (eg, DNA) that contains a nucleotide sequence that is complementary to or substantially complementary to a nucleotide (eg, DNA) or a part thereof is complementary to or substantially equivalent to the polynucleotide. Any polynucleotide (antisense polynucleotide) may be used as long as it has a complementary base sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the polynucleotide.
具体的には、 本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド （例、 DNA) ( 以下、 これらの DNAを本発明の DN Aと略記する場合がある） に相補的な、 ま たは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンス DN A (以 下、 これらの DNAをアンチセンス DNAと略記する場合がある） が挙げられ、 本発明の DNAに相補的な、 または実質的に相捕的な塩基配列またはその一部を 有し、 該 DNAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチ センス DN Aであってもよい。  Specifically, it is complementary to or substantially equivalent to a polynucleotide (eg, DNA) encoding the receptor of the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as DNA of the present invention). Antisense DNA having a complementary nucleotide sequence or a part thereof (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as antisense DNA), and complementary or substantially complementary to the DNA of the present invention. Any antisense DNA may be used as long as it has an adaptive base sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA.
本発明の DN Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DN Aに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DN Aの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などがあげられ る。 特に、 本発明の DN Aの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明の受容体の N末端 部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の 相補鎖と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上 、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンス DNAが好適であ る。 これらのアンチセンス DNAは、 公知の DN A合成装置などを用いて製造す ることができる。  The base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire base sequence or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). And about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. In particular, about 70% of the entire base sequence of the complementary DNA strand of the present invention and the complementary strand of the base sequence encoding the N-terminal site of the receptor of the present invention (eg, the base sequence near the start codon). Antisense DNA having a homology of about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is preferable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer.
具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22 、 配列番号： 24または配列番号： 28で表される塩基配列を有する DN Aの塩 基配列に相捕的な、 もしくは実質的に相捕的な塩基配列、 またはその一部分を有 するアンチセンスポリヌクレオチド、 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24または配列番号： 28で表される塩基配 列を有する DNAの塩基配列に相捕的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンス DNAなどが挙げられる。 好ましくは例 えば、 配列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番 号： 2 4または配列番号： 2 8で表される塩基配列を有する D NAの塩基配列に 相補な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、 配 列番号： 2、 配列番号： 8、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4 または配列番号： 2 8で表される塩基配列を有する D N Aの塩基配列に相補な塩 基配列、 またはその一部分を有するアンチセンス D NAなどが挙げられる。 アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。 Specifically, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 28 is compatible with the DNA base sequence having the base sequence represented by SEQ ID NO: 28. An antisense polynucleotide having a captive or substantially complementary base sequence, or a portion thereof, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 Another example is an antisense DNA having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 28, or a part thereof. Preferably, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: No .: 24 or an antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 or a part thereof, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2 0, SEQ ID NO: 2 2, SEQ ID NO: 2 4 or antisense D having a base sequence complementary to the DNA base sequence having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 8 or a part thereof NA etc. are mentioned. An antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホスホ ロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修飾りん 酸残基に置換されていてもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、 公 知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。  In order to prevent degradation by hydrolases such as nucleases, the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide that composes antisense DNA are chemically modified phosphate residues such as phosphoroate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. May be substituted. These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer.
本発明に従えば、 本発明の受容体遺伝子の複製または発現を阻害することので きるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 あるいはアミ ノ酸が決定された蛋白質をコードする D NAの塩基配列情報に基づき設計し、 合 成しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明の受容体遺伝子の RN A とハイブリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害することが できる力、 あるいは本発明の受容体関連 R N Aとの相互作用を介して本発明の受 容体遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明の受容体関連 RN Aの 選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明の受容体関連 RNA と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体内および 生体外で本発明の受容体遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病 気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めた ヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相捕 的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白 質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相捕体 から誘導される指令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 蛋 白質遺伝子の 5，端ヘアピンループ、 5， 端 6'—ベースペア 'リピート、 5， 端 非翻訳領域、 蛋白質翻訳終止コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン 、 3， 端非翻訳領域、 3， 端パリンドローム領域、 および 3， 端ヘアピンループ は好ましい対象領域として選択しうるが、 蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象 として選択しうる。 According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the receptor gene of the present invention is cloned, or the DNA encoding a protein whose amino acid is determined. Design and synthesis based on nucleotide sequence information. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the receptor gene of the present invention, and can inhibit the synthesis or function of the RNA or interact with the receptor-related RNA of the present invention. Through the action, the expression of the receptor gene of the present invention can be regulated and controlled. A polynucleotide complementary to a selected sequence of the receptor-related RNA of the present invention and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with the receptor-related RNA of the present invention are provided in the present invention in vivo and in vitro. It is useful for regulating / controlling the expression of the receptor gene of, and for the treatment or diagnosis of diseases. The term “corresponding” means homologous or complementary to a specific sequence of nucleotides, nucleotide sequences or nucleic acids including genes. “Corresponding” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and peptide (protein) usually refers to the nucleotide (nucleic acid) sequence or the amino acid of the peptide (protein) in the command derived from its counterpart. ing. Protein gene 5, end hairpin loop, 5, end 6'—base pair 'repeat, 5, end untranslated region, protein translation stop codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3, end untranslated region, 3 , Edge palindrome region, and 3, edge hairpin loop Can be selected as a preferred target region, but any region within a protein gene can be selected as a target.
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 については、 目的核酸が対象領域とハイブリダィズすることができる場合は、 そ の目的核酸は、 当該対象領域のポリヌクレオチドに対して 「アンチセンス」 であ るということができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2—デォキシ一 D— リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリヌ クレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその他のタイ プのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー (例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊 な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見 出されるような塩基のペアリング 塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチ ドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 二本鎖 D NA、 一本鎖 D NA、 二 本鎖 R NA、 一本鎖 RNA、 さらに D NA： R NAハイブリッドであることがで き、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さら には公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを 類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結 合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば 、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 (ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルぺプ チド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側 鎖基を有しているもの、 インター力レート化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレ ンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホ ゥ素、 酸ィヒ性の金属など） を含有するもの、 アルキルィヒ剤を含有するもの、 修飾 された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 こ こで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおょぴピ リミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつよ うなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチルイ匕されたプリンおょぴピ リミジン、 ァシルイ匕されたプリンおょぴピリミジン、 あるいはその他の複素環を 含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチド はまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとかRegarding the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region, if the target nucleic acid can hybridize with the target region, the target nucleic acid is compared with the polynucleotide of the target region. It can be said that it is “antisense”. Antisense polynucleotides are polynucleotides containing 2-deoxy-D-lipose, polynucleotides containing D-lipose, other types of polynucleotides that are N-daricosides of purine or pyrimidine bases, Or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special linkages (provided that such polymers are found in DNA and RNA) Base pairing (including a nucleotide having a configuration allowing base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and unmodified polynucleotides (or unmodified oligos). Nucleotides), further known modifications, such as those with labels known in the art, capped, methylated, one or more natural nucleotides in analogs Substituted, intramolecular nucleotide-modified, such as those with uncharged bonds (eg methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, force rubamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds ( For example, those having phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, Toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides, etc.), side force groups, inter force compounds (eg, acridine, psoralen, etc.) Having a chelate compound (eg, metal, radioactive metal, fluorine, acid-rich metal, etc.), containing an alkyl-rich agent, having a modified bond (eg, , Α-anomer nucleic acids, etc.). Here, “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may contain not only purine opipyrimidine base but also those having other heterocyclic bases modified. . These modifications are methylated pudding It may contain limidine, acylated purine opipyrimidine, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also have modified sugar moieties, such as one or more hydroxyl groups such as halogens.
、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に 変換されていてよい。 It may be substituted with an aliphatic group or the like, or may be converted into a functional group such as ether or amine.
本努明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 あるい は修飾された核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例としては 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃ オリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それ 限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンスヌクレオチドは次のような方針で好ま しく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンスヌクレオチドをより安定 なものにする、 アンチセンスヌクレオチドの細胞透過性をより高める、 目標とす るセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるなら アンチセンスヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。  The antisense polynucleotide (nucleic acid) of this effort is RNA, DNA, or modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides that are resistant to degradation of oligonucleoside amides. The antisense nucleotide of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleotide in the cell more stable, to increase the cell permeability of the antisense nucleotide, to increase the affinity for the target sense strand, and if it is toxic Make the toxicity of antisense nucleotides smaller.
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8， pp. 247, 1992； Vol. 8, pp. 395, 1992； S. T. Cro oke et al. ed.， Ant is ens e Research and Applications, し RC Press, 1993 な どに開示がある。  Many such modifications are known in the art, for example J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Cro oke et al. ed., Ant isens Research and Applications, and RC Press, 1993.
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾された 糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊 な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与え られることができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基 骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜と の相互作用を高めたり、 核酸の取込みを增大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロ ルなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加する に好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリル クロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。. こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合 を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 '端あるい は 5 '端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうし たキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコー ルなどのダリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げら れるが、 それに限定されるものではない。 The antisense polynucleotides of the present invention may be altered, contain modified sugars, bases, bonds, donated in special forms such as ribosomes, microspheres, applied by gene therapy, It can be given in an added form. In this way, the additional forms used include polycationic substances such as polylysine that act to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, and lipids that enhance the interaction with cell membranes and increase the uptake of nucleic acids. Hydrophobic substances (for example, phospholipids, cholesterol, etc.) are mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and derivatives thereof (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'or 5' end of nucleic acids and can be attached via bases, sugars, or intramolecular nucleoside linkages. Other groups include capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids, exonuclease, RN a Examples include those for preventing degradation by nucleases such as se. Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as Daricol such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
アンチセンスヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体 內ゃ生体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明の受容体の生体内や生体外の翻訳系 を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。 以下に、 （i) 本発明の受容体、 （ii) 本発明の受容体をコードするポリヌク レオチド （本努明のポリヌクレオチド） 、 （iii) 本発明の受容体に対する抗体 (本発明の抗体） 、 （iv) 本発明の受容体のアンチセンスポリヌクレオチド （例 、 D NA) (例、 本発明のアンチセンス D NA) 、 （V) 本発明の受容体に特異 的に結合する能力を有するリガンド （本発明のリガンド） などの用途を説明する  The inhibitory activity of the antisense nucleotide can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the receptor of the present invention. . The nucleic acid can be applied to cells by various known methods. (I) the receptor of the present invention, (ii) the polynucleotide encoding the receptor of the present invention (the polynucleotide of the present invention), (iii) the antibody against the receptor of the present invention (the antibody of the present invention) (Iv) antisense polynucleotides of the receptor of the present invention (eg, DNA NA) (eg, antisense DNA of the present invention), (V) a ligand having the ability to specifically bind to the receptor of the present invention (Application of the ligand of the present invention)
〔 1〕 疾病に対する医薬候捕化合物のスクリ一二ング [1] Screening of drug scavenging compounds for disease
本発明のリガンドは、 例えば、 消化管機能調節活性、 腸管細胞増殖調節活性な どを有する。  The ligand of the present invention has, for example, gastrointestinal function regulating activity, intestinal cell growth regulating activity and the like.
本楽明の受容体を用い、 または組換え型本発明の受容体の発現系を用いたリガ ンドレセプターアツセィ系を用いることにより、 本発明の受容体と、 本発明のリ ガンドとの結合性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 抗体、 非べ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織 抽出液、 血漿など） またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。 該化合物またはその塩には、 （i) 本発明の受容体を介して細胞刺激活性 （例 、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AMP 生成、 細胞内 c AMP産生抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生 、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下 、 G T P γ S結合活性、 c AMP依存性プロティンキナーゼの活性化、 c GMP 依存性プロティンキナーゼの活性化、 リン脂質依存性プロティンキナーゼの活性 ィ匕、 微小管結合蛋白質リン酸化酵素 （MA Pキナーゼ） の活性化などを促進する 活性、 受容体細胞内移行活性など） を有する化合物 （ァゴ二スト） 、 （ii) 上記 細胞刺激活性を有しない化合物 （アンタゴニスト） 、 （iii) 本発明の受容体と 本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、 （iv) 本発明の受容体と.本発明 のリガンドとの結合力を阻害する化合物などが含まれる。 Binding of the receptor of the present invention and the ligand of the present invention by using the receptor of the present invention or the ligand receptor assembly system using the recombinant expression system of the receptor of the present invention Efficient screening of compounds that change sex (eg, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.) or their salts can do. The compound or salt thereof includes (i) cell stimulating activity via the receptor of the present invention (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP Production suppression, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPγS binding activity, c AMP-dependent protein kinase Activation, c GMP-dependent protein kinase activation, phospholipid-dependent protein kinase activity, activation of microtubule-associated protein kinase (MAP kinase), receptor intracellularization (Ii) the compound having no cell stimulating activity (antagonist), (iii) the receptor of the present invention and A compound that promotes the binding force with the ligand of the present invention, and (iv) a compound that inhibits the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention.
具体的には、 （i) 本発明の受容体に、 本発明のリガンドを接触させた場合と (ii) 本発明の受容体に、 本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させた場合 との比較を行なう。 比較は、 例えば、 本発明の受容体に対する本発明のリガンド の結合量、 細胞刺激活性などを測定して行う。  Specifically, (i) Comparison between the case where the receptor of the present invention is contacted with the ligand of the present invention and (ii) the case where the receptor of the present invention is contacted with the ligand of the present invention and a test compound. To do. The comparison is performed, for example, by measuring the binding amount of the ligand of the present invention to the receptor of the present invention, cell stimulating activity, and the like.
本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、 例えば、  Specific examples of the screening method of the present invention include, for example,
ズ a) 本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明のリガン ドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、 本発明のリガ ンドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法、 ■  A) When the ligand of the present invention is contacted with the receptor of the present invention and when the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor of the present invention, A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing the binding amount to the receptor;
(b) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 本発明のリガン ドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする 、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその 塩のスクリーニング、方法、 および  (b) When the ligand of the present invention is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention or a membrane fraction of the cell, and the ligand of the present invention and a test compound containing the receptor of the present invention or The ligand of the present invention and the receptor of the present invention are characterized by measuring and comparing the amount of binding of the ligand of the present invention to the cell or the membrane fraction when contacted with the membrane fraction of the cell. Screening, methods, and compounds for compounds that alter binding to the body or salts thereof, and
(c) 本発明の受容体が、 本発明の受容体をコードする D N Aを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記 （b (c) The receptor of the present invention, wherein the receptor of the present invention is the receptor of the present invention expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor of the present invention (b)
) 記載のスクリーニング方法、 ) The screening method described,
(d) 本発明のリガンドが、 標識したリガンドである上記 （a) 〜 （c) のスクリ 一二ング方法などのレセプター結合ァッセィ系、  (d) a receptor binding assay system such as the screening method of (a) to (c) above, wherein the ligand of the present invention is a labeled ligand;
(e) 本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明のリガン ドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、 本発明の受容 体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、.本発明のリガン ドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、 ·  (e) Cells mediated by the receptor of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor of the present invention and when the ligand and test compound of the present invention are contacted with the receptor of the present invention A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing the stimulating activity,
(f) 本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分 に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含 有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 本発明の受容体を 介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方 法、 および (f) When the ligand of the present invention is contacted with a cell containing the receptor of the present invention or a membrane fraction of the cell, the ligand of the present invention and a test compound contain the receptor of the present invention. A ligand of the present invention and a receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing the cell stimulating activity via the receptor of the present invention when it is brought into contact with a cell having a cell or a membrane fraction of the cell. Screening methods for compounds or their salts that alter the binding properties of
(g) 本発明の受容体が、 本発明の受容体をコードする D NAを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記 （f ) のスクリーニング方法などの細胞刺激アツセィ系などが挙げられる。  (g) The screening method of (f) above, wherein the receptor of the present invention is the receptor of the present invention expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor of the present invention. And cell stimulation assembly system.
本発明のスクリ一二ング方法の具体的な説明を以下にする。  A specific description of the screening method of the present invention will be given below.
本発明の受容体としては、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適に用いら れる。 しかし、 特にヒ ト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリー二 ングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容 体などが適している。 '  As the receptor of the present invention, a membrane fraction of an organ of a human warm-blooded animal is preferably used. However, since the organs derived from humans are extremely difficult to obtain, the receptor of the present invention expressed in a large amount using a recombinant is suitable for use in screening. '
本発明の受容体を製造するには、 前述の本努明の受容体の製造方法などが用い られる。  In order to produce the receptor of the present invention, the above-described method for producing the receptor of the present invention is used.
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の受容体を含有する細胞あるい は該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。  In the screening method of the present invention, when a cell or a cell membrane fraction containing the receptor of the present invention is used, the preparation method described later may be followed.
本発明の受容体を含有す ¾細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って 行うことができる。  When using a cell containing the receptor of the present invention, the cell may be fixed with dartalaldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
本発明の受容体を含有する細胞としては、 本発明の受容体を発現した宿主細胞 をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物 細胞などが挙げられる。 製造方法は前述と同様である。  The cell containing the receptor of the present invention refers to a host cell that expresses the receptor of the present invention, and examples of the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like. . The manufacturing method is the same as described above.
膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜が 多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破枠方法としては、 Potter— Elvehjem型 ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリ トロン （Ki nematica社製） による破碎、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧しな がら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。 細胞膜 の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が 主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500rpm〜3000rpm) で短時間 (通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （15000rpn！〜 30000rpm) で 通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発 現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含ま れる。 The membrane fraction refers to a fraction containing a lot of cell membranes obtained by a method known per se after disrupting cells. Cell breakage methods include: Potter-Elvehjem type homogenizer crushing cells, Warinda blender polytron (Kinematica) breakage, ultrasonic breakage, French press, etc. Examples include crushing by ejecting from a thin nozzle. For the fractionation of cell membranes, a fractionation method using centrifugal force such as a differential centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further accelerated (15000 rpn! To 30000 rpm). Centrifuge for 30 minutes to 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction. The membrane fraction contains a lot of membrane components such as the expressed receptor of the present invention and cell-derived phospholipids and membrane proteins.
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、 1細胞 当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるのが好適 である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が 高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口 ットで大量の試料を測定できるようになる。 The amount of the receptor of the present invention in the cell or membrane fraction containing the receptor of the present invention is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and 10 5 to 10 7 molecules. Is preferred. In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same mouth. become.
前記のレセプター結合ァッセィ系や細胞审激ァッセィ系などのスクリーニング 方法を実施するためには、 例えば、 本発明の受容体画分と、 本発明のリガンド （ 例、 標識した本発明のリガンド） などが用いられる。 本発明の受容体画分として は、 天然型の本発明の受容体画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型 本発明の受容体画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド 結合活性などを示す。 標識したリガンドとしては、 例えば、 放射性同位元素 （例 、 〔¾〕 、 〔12SI〕 、 〔14C〕 、 〔32P〕 、 ί33ρ] 、 〔35S〕 など） 、 蛍光物質 （例、 フルォレセインなど） 、発光物質 （例、 ノレミノーノレなど） 、酵素 （例、 ペルォキ シダーゼなど） またはランタ二ド元素などで標識されたリガンドなどを用いるこ とができる。 In order to carry out the screening methods such as the receptor binding assay system and the cell stimulation assay system described above, for example, the receptor fraction of the present invention, the ligand of the present invention (eg, the labeled ligand of the present invention), etc. Used. The receptor fraction of the present invention is preferably a natural fraction of the receptor of the present invention, or a recombinant fraction of the present invention having an equivalent activity. Here, equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity and the like. The labeled ligand, e.g., a radioactive isotope (e.g., [¾], [12S I], [14 C], [32 P], ί 33 ρ], such as [35 S]), fluorescent substances (e.g., Fluorescein, etc.), luminescent substances (eg, noreminonore), enzymes (eg, peroxidase, etc.) or ligands labeled with lanthanide elements, etc. can be used.
具体的には、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物のスクリ一ユングを行うには、 本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜 画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標 品を調製する。 バッファーには、 pH4〜： L 0 (望ましくは pH6〜8) のリン 酸バッファー、 トリス一塩酸バッファーなどのリガンドと受容体との結合を阻害 しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目 的で、 CHAPS、 Twe e n-80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デ +ォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチ ン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を 添加することもできる。 0.01〜10m 1の該レセプター溶液に、 一定量 （5 000〜500000 c pm) の標識した本発明のリガンドを添加し、 同時に 1 0一1。〜 10— 7Mの試験ィヒ合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るた めに大過剰の未標識の本発明のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応 は 0°C~50°C、 望ましくは 4°C〜37°Cで 20分〜 24時間、 望ましくは 30 分〜 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗 浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ 一または γ—カウンターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント（Β0) から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント (Β。一 NSB) を 100%と した時、 特異的結合量 （Β— NSB) が例えば 50%以下になる試験化合物を拮 抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 Specifically, in order to screen a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, a cell containing the receptor of the present invention or a membrane fraction of the cell is used. Prepare the receptor preparation by suspending in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to L0 (preferably pH 6 to 8) or a tris monohydrochloride buffer. In order to reduce nonspecific binding, surfactants such as CHAPS, Tween-80 ™ (Kaoichi Atlas), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer. Furthermore, protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor of the present invention by protease. A fixed amount (5 000 to 500000 cpm) of the labeled ligand of the present invention was added to 0.01 to 10 ml of the receptor solution, and 1 0 one one . ~ 10—Met 7 M test compound. In order to know the amount of non-specific binding (NSB), prepare a reaction tube to which a large excess of unlabeled ligand of the present invention is added. The reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° C, preferably 4 ° C to 37 ° C for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, filter with a glass fiber filter, etc., wash with an appropriate amount of the same buffer, and measure the radioactivity remaining on the glass fiber filter with a liquid scintillation counter or γ-counter. When there is no antagonistic substance (Β 0 ), the non-specific binding amount (NSB) minus the non-specific binding amount (NSB) is 100%, and the specific binding amount (Β—NSB) is, for example, 50 % Or less of the test compound can be selected as a candidate substance capable of antagonistic inhibition.
さらに、 表面プラズモンセンサー技術を利用することによって、 本 明の受容 体に結合する化合物をスクリーニングすることもできる。  Furthermore, compounds that bind to the receptor of the present invention can be screened by using surface plasmon sensor technology.
具体的には、 ビアコア 3000 (ビアコア社） のセンサーチップ表面に、 本発 明の受容体を固定化後、 チップ表面にリン酸緩衝液 (PBS) などに溶解した試 験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、 本発明の 受容体に結合する試験化合物を選択する。 例えば、 表面プラズモンの変化の測定 値が 5レゾナンスュニット以上与える試験ィ匕合物を本発明の受容体に結合性を有 する物質として選択する。 .  Specifically, after immobilizing the receptor of the present invention on the surface of Biacore 3000 (Biacore) sensor chip, a test compound dissolved in phosphate buffer (PBS) or the like was flowed to the chip surface. A test compound that binds to the receptor of the present invention is selected by measuring the change in surface plasmon. For example, a test compound that gives a measurement value of a change in surface plasmon of 5 resonance units or more is selected as a substance that binds to the receptor of the present invention. .
前記の細胞刺激アツセィ系のスクリーニング方法を実施するためには、 本努明 の受容体を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊 離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c AMP産生抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン 酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下、 GT P γ S結合活性、 c AMP依存性 プロテインキナーゼの活性化、 c GMP依存性プロテインキナーゼの活性化、 リ ン脂質依存性プロテインキナ^ "ゼの活性化、 微小管結合蛋白質リン酸ィ匕酵素 （M APキナーゼ） の活性化などを促進する活性または抑制する活性、 受容体細胞内 移行活性など） を、 自体公知の方法または市販の測定用キタトを用いて測定する ことができる。 具体的には、 まず、 本発明の受容体を含有する細胞をマルチゥェ ルプレート等に培養する。 スクリーニングを行うにあたっては前もつて新鮮な培 地あるいは細胞に毒性を示さない適当なパッファ一に交換し、 試験化合物などを 添加して一定時間インキュべ^"トした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して 、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする 物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって 検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なっても よい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細 胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出する ことができる。 In order to carry out the screening method for the cell stimulation assay described above, cell stimulation activity (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AMP production via this receptor) Inhibition of intracellular c AMP production, Intracellular c GMP generation, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Phosphorylation of intracellular protein, c-fos activation, pH reduction, GT P γ S binding activity, c AMP-dependent protein kinase activation, c GMP-dependent protein kinase activation, phospholipid-dependent protein kinase activation, microtubule-associated protein phosphate enzyme (MAP kinase) activation Activity or the like, receptor intracellular translocation activity, etc.) can be measured using a method known per se or a commercially available kitato for measurement. Incubate cells containing light receptor on multiwell plates, etc. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate puffer that is not toxic to cells, and add test compounds. And incubate for a certain period of time, then extract the cells or collect the supernatant. The product produced is quantified according to each method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme may be added and assayed. In addition, the activity such as cAMP production inhibition can be detected as a production inhibition effect on cells whose basic production amount of cells has been increased with forskolin or the like.
細胞刺激活性を測定してスクリ一ユングを行なうには、 適当な本発明の受容体 を発現した細胞が必要である。 本発明の受容体を発現した細胞としては、 前述の 本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。  In order to perform cell screening by measuring the cell stimulating activity, a cell expressing an appropriate receptor of the present invention is required. As the cells expressing the receptor of the present invention, the above-described receptor-expressing cell line of the present invention is desirable.
試験ィ匕合物としては、 例えばペプチド、 蛋白質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など があげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよく、 公知の化合物であつ てもよい。 試験ィ匕合物は塩を形成していてもよく、 試験ィ匕合物の塩としては、 金 属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性 または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金属塩の好適な例としては、 例え ばナトリゥム塩、 力リゥム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、 マグネシゥ ム塩、 バリゥム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる 。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァ ミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノー /レアミン、 トリエタノールァミン、 シク口へキシルァミン、 ジシクロへキシルァ ミン、 N, N，一ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸 との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸など との塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 ト リフルォロ酢酸、 プロピオン酸、 安息香酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒 石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼ ンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性ァミノ 酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 - リジン、 オル二チンなどとの 塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン酸 、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。  Examples of test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. The compound may be a known compound or a known compound. The test compound may form a salt. Examples of the salt of the test compound include metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, Examples thereof include salts with basic or acidic amino acids. Preferable examples of the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and strong salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; aluminum salt and the like. Preferable examples of salts with organic bases include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethano / reamine, triethanolamine, hexylamine, dicyclohexene And salts with xylamine, N, N, monodibenzylethylenediamine, and the like. Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like. Preferable examples of salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, benzoic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, apple And salts with acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like. Preferable examples of the salt with basic amino acid include salts with arginine, -lysine, ornithine and the like, and preferable examples of the salt with acidic amino acid include aspartic acid, glutamic acid and the like. Of the salt.
このうち、 生理学的に許容し得る塩が好ましい。 例えば、 化合物内に酸性官能 基を有する場合にはアルカリ金属塩 （例、 ナトリウム塩， カリウム塩など） 、 ァ ルカリ土類金属塩 （例、 カルシウム塩， マグネシウム塩， バリウム塩など） など の無機塩、 アンモニゥム塩など、 また、 化合物内に塩基性官能基を有する場合に は、 例えば臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸など無機酸との塩、 または酢酸、 フ タル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 メタ ンスルホン酸、 p—トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。 上記細胞刺激アツセィ系のスクリーユング方法について、 さらに具体的に以下 ( 1 ) 〜 （1 2 ) に記載する。 Of these, physiologically acceptable salts are preferred. For example, acidic functionality in the compound In the case of having a group, an inorganic salt such as an alkali metal salt (eg, sodium salt, potassium salt, etc.), an alkaline earth metal salt (eg, calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.), an ammonium salt, etc. When the compound has a basic functional group, for example, a salt with an inorganic acid such as hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, or acetic acid, futalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, Examples include salts with organic acids such as succinic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, and p-toluenesulfonic acid. The above-mentioned cell stimulation assembly screening method will be described more specifically in the following (1) to (1 2).
( 1 ) 受容体努現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると細胞内の G蛋白 質が活性ィ匕されて GTPが結合する。 この現象は受容体発現細胞の膜画分において も観察される。 通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化するが、 このとき反応液 中に GTP y Sを添加しておくと、 GTP T/ Sは GTPと同様に G蛋白質に結合するが、 加水 分解されずに G蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維持される。 標識した GTP y Sを用いると細胞膜に残存した標識された GTP 0； Sを測定することにより、 受容体 ァゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。  (1) When a receptor-executed cell is stimulated by a receptor agonist, the intracellular G protein is activated and GTP binds. This phenomenon is also observed in the membrane fraction of receptor-expressing cells. Normally, GTP is hydrolyzed to change to GDP. At this time, if GTP y S is added to the reaction solution, GTP T / S binds to G protein in the same way as GTP, but is hydrolyzed. Without being bound to the cell membrane containing G protein. When labeled GTP y S is used, the receptor-expressing cell stimulating activity of the receptor agonist can be measured by measuring the labeled GTP 0; S remaining in the cell membrane.
この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺 激活性を測定することによ.り、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を 変化させる化合物をスクリーニングすることができる。  A compound that changes the binding activity of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention to the receptor-expressing cell of the present invention by utilizing this reaction. Can be screened.
この方法は、 本努明の受容体を含む膜画分を用いて行う。 本測定法において本 発明の受容体膜画分への GTP y S結合促進活性を示す物質はァゴニストである。 具体的には、 標識した GTP y Sの存在下、 本発明のリガンドを本努明の受容体細 胞膜画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受 容体細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の受容体細胞膜画分への GTP 結合促進活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本努明の 受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 - 本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体細胞膜画分への GTP 7 S結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補 物質として選択することができる。 ' ·  This method is performed using the membrane fraction containing the receptor of this effort. In this measurement method, the substance showing GTP y S binding promoting activity to the receptor membrane fraction of the present invention is an agonist. Specifically, when the ligand of the present invention is contacted with the receptor cell membrane fraction of the present invention in the presence of labeled GTP y S, the ligand of the present invention and the test compound are the receptor of the present invention. The GTP binding-promoting activity to the receptor cell membrane fraction of the present invention when contacted with the cell membrane fraction is measured and compared, thereby changing the binding between the ligand of the present invention and the receptor of this effort. The compound to be screened is screened. -In this method, a test compound exhibiting an activity of suppressing the GTP 7 S binding promoting activity to the receptor cell membrane fraction of the present invention by the ligand of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. '·
—方、 試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、 本発明の受容 体細胞膜画分への GTP / S結合促進活性を測定することにより、 ァゴニストのスク リーユングを行なうこともできる。 -On the other hand, only the test compound is brought into contact with the receptor cell membrane fraction of the present invention, and the GTP / S binding promoting activity to the receptor cell membrane fraction of the present invention is measured. Leeung can also be performed.
スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。  A specific example of the scribing method is described below.
公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、 膜希釈緩衝 液 （50mM Tris、 5mM MgCl2、 150mM NaCl、 Ι μ Μ GDP、 0. 1% BSA； pH7. 4) で希釈 する。 希釈率は、 受容体の発現量により異なる。 これを Falcon2053に 0. 2mlずつ 分注し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を加え、 さ らに終濃度 200pMとなるように [35S] GTP Y Sを加える。 25°Cで 1時間保温した後、 氷冷した洗浄用緩衝液 (50mM Tris, 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 0. 1% BSA, 0. 05 % CHAPS； pH7. 4) 1. 5mlを加えて、 ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。 65°C、 30分 保温して乾燥後、 液体シンチレーシヨンカウンターでろ紙上に残った膜画分に結 合した [35S]GTP y Sの放射活性を測定する。 本発明のリガンドのみを加えた実験 区の放射活性を 100%、 本努明のリ ンドを加えなかつた実験区の放射活性を 0% とし、 本発明のリガンドによる GTP y S結合促進活性に対する試験化合物の影響を 算出する。 GTP y S結合促進活性が例えば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能 力のある候補物質として選択することができる。 Dilute the cell membrane fraction containing the receptor of the present invention prepared according to a known method with membrane dilution buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, Ι μΜ GDP, 0.1% BSA; pH 7.4) To do. The dilution rate depends on the level of receptor expression. Dispense 0.2 ml each into Falcon2053, add the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound, and add [ 35 S] GTP YS to a final concentration of 200 pM. Incubate for 1 hour at 25 ° C, then add 1.5 ml of ice-cold washing buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPS; pH7.4) Filter with glass fiber filter paper GF / F. After holding at 65 ° C for 30 minutes and drying, measure the radioactivity of [ 35 S] GTP y S bound to the membrane fraction remaining on the filter paper using a liquid scintillation counter. Test for the GTP y S binding promoting activity of the ligand of the present invention with 100% of the radioactivity of the experimental group to which only the ligand of the present invention was added and 0% of the experimental group without the Lind of this effort. Calculate the effect of the compound. A test compound having a GTP y S binding promoting activity of 50% or less, for example, can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
( 2 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 細胞内 cAMP の産生が抑制される。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体 発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の 受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。  (2) In the receptor-expressing cells of the present invention, intracellular cAMP production is suppressed by stimulation with the ligand of the present invention. Screening for a compound that changes the binding property of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention using this reaction. Can do.
具体的には、 細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のリガンドを本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物 を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産 生抑制活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体 との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。  Specifically, when the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, the ligand of the present invention and a test compound are expressed in the receptor of the present invention. A compound that changes the binding ability of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring and comparing the intracellular cAMP production inhibitory activity of the cell when contacted with the cell.
細胞内 cAMP量を増加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カルシト ニンなどが用いられる。  Examples of substances that increase the amount of intracellular cAMP include forskolin and calcitonin.
本発明の受容体発現細胞内の cAMP産生量は、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と 2 I〕 標識 cAMP (ともに市販品） を 使用することによる RIA系、 または抗 cAMP抗体と標識 cAMPとを組み合わせた EIA系 で測定することができる。 また、 抗 cAMP抗体を、 protein Aまたは抗 cAMP抗体産 生に用いた動物の IgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを 含むビーズと 〔1251〕 標識 cAMPとを使用する SPA (Scintillation Proximity Assa y) 法による定量、 化学増幅型レミネッセンスプロキシミティーホモジニアスア ッセィ系である AlphaScreen (PerkinElmer社） を応用した競合法 cAMP検出キット (PerkinElmer社） による定量も可能である。 CAMP production amount of receptor expression in the cells of the present invention uses a mouse, rat, Usagi, catcher formic, © anti-cAMP antibody obtained and by immunized with 2 I] -labeled cAMP (both commercially available) The RIA system can be used, or the EIA system can be used in combination with anti-cAMP antibody and labeled cAMP. In addition, anti-cAMP antibodies are produced by protein A or anti-cAMP antibodies. Quantification by SPA (Scintillation Proximity Assa y) method using a beads and [125 1] -labeled cAMP scintillant containing fixed using such antibodies to such raw animal of IgG using chemically amplified Remy net sense Proxy Quantification can also be performed using a competitive cAMP detection kit (PerkinElmer) using AlphaScreen (PerkinElmer), a Mitigous homogeneous assay system.
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞の cAMP産生 抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質とし て選択することができる。  In this method, a test compound showing an activity of inhibiting the cAMP production inhibitory activity of the receptor-expressing cell of the present invention by the ligand of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
—方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 cAMP産生抑制 活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ一ユングを行なう ことができる。  On the other hand, screening of a compound exhibiting agonist activity can be performed by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and examining cAMP production inhibitory activity.
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。  One specific example of the screening method is described below.
本発明の受容体発現細胞 （例、 CH0細胞などの動物細胞） を 24穴プレートに 5x1 04cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2raM 3-ィソプチル-メチルキサ ンチン、 0. 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （pH7. 4) で洗 浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後、 0. 5mlの反応用パッフ ァーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファーを除き、 新たに 0. 25ml の反応用バッファーを細胞に加えた後、 l ^ Mの本発明のリガンドまたは l i Mの本 発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を添カ卩した 2 μ Μ フオルスコリンを含む 0. 25ml の反応用バッファーを、 細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させる。 100 ^ 1の 20%過 塩素酸を加えて反応を停止させ、 その後氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMP を抽出する。 抽出液中の cAMP量を、 cAMP EIAキット （アマシャムフアルマシアパ ィォテク） を用いて測定する。 フオルスコリンの刺激によって産生された cAMP量 を 100%とし、 Ι μ Μの本発明のリガンドの添カ卩によって抑制された cAMP量を 0%と して、 本発明のリガンドによる cAMP産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算 出する。 本努明のリガンドの活性を阻害して、 cAMP産生活性が例えば 50%以上に なる試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候捕物質として選択することができる。 また、 本発明のリガンドの刺激により、 細胞内 cAMP量が増加する性質を示す本 発明の受容体発現細胞を使用する場合、 本発明のリガンドを本発明の受容体発現 細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドぉよぴ試験化合物を本発明の受容体 発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産生促進活性を測定 し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化 させる化合物をスクリーニングすることができる。 The receptor-expressing cells of the present invention (eg, animal cells such as CH0 cells) are seeded in a 24-well plate at 5 × 10 4 cells / well and cultured for 48 hours. The cells are washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.2 raM 3-isoptyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate in the incubator for 30 minutes. After removing the reaction buffer and adding a new 0.25 ml of reaction buffer to the cells, l ^ M ligand of the present invention or li M ligand of the present invention and a test compound were added 2 Add 0.25 ml of reaction buffer containing μΜforskolin to the cells and incubate at 37 ° C for 24 minutes. The reaction is stopped by adding 100 ^ 1 of 20% perchloric acid, and then intracellular cAMP is extracted by placing on ice for 1 hour. Measure the amount of cAMP in the extract using the cAMP EIA kit (Amersham Armashia Piatech). The amount of cAMP produced by the stimulation of forskolin is defined as 100%, and the amount of cAMP inhibited by the addition of ΙμΜ of the ligand of the present invention is defined as 0%. Calculate the effect of the test compound. A test compound that inhibits the activity of the ligand of this effort and has a cAMP production activity of, for example, 50% or more can be selected as a scavenger capable of competitive inhibition. In addition, when using the receptor-expressing cell of the present invention showing the property that the intracellular cAMP amount increases by stimulation of the ligand of the present invention, the case where the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and A ligand test compound of the present invention and a receptor of the present invention Screening for a compound that changes the binding ability of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring and comparing the intracellular cAMP production promoting activity of the cell when it is brought into contact with the expression cell Can do.
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞の cAMP産生 促進活性を阻害する活性を示す試験ィヒ合物を、 拮抗阻害能力のある候捕物質とし て選択することができる。  In this method, a test compound showing an activity of inhibiting the cAMP production promoting activity of the receptor-expressing cell of the present invention by the ligand of the present invention can be selected as a scavenger capable of competitive inhibition.
一方、 試験化合物のみを本努明の受容体発現細胞に接触させて cAMP産生促進活 性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこ とができる。  On the other hand, a compound showing agonist activity can be screened by contacting only the test compound with the receptor-expressing cells of this effort and examining the cAMP production promoting activity.
cAMP産生促進活性は、 上記のスクリ一ユング法においてフオルスコリンを添加 せずに本発明の受容体発現細胞 （例、 CH0細胞などの動物細胞） に本発明のリガ ンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加して産生された cAMPを上記 の方法で定量して測定する。  The cAMP production-promoting activity is achieved by using the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test for the receptor-expressing cells of the present invention (eg, animal cells such as CH0 cells) without adding forskolin in the above-mentioned screening method. The cAMP produced by adding the compound is quantified and measured by the above method.
( 3 ) CRE-レポーター遺伝子ベクターを用いて、 本発明のリガンドの本発明の受 容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発 明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。  (3) Using the CRE-reporter gene vector, the binding activity between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is changed by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cells of the present invention. The compound to be screened can be screened.
CRE (cAMP response element) を含む DNAを、 ベクターのレポーター遺伝子上 流に挿入し、 CRE -レポーター遣伝子ベクターを得る。 CRE-レポーター遺伝子べク ターを導入した本発明の受容体発現細胞において、 cAMPの上昇を伴う刺激は、 CR Eを介したレポーター遺伝子発現と、 それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子 産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 を測定することにより、 CRE-レポーター遺伝子ベクター導入細胞内の cAMP量の変 動を検出することができる。  A DNA containing CRE (cAMP response element) is inserted into the vector reporter gene upstream to obtain a CRE-reporter gene vector. In the receptor-expressing cells of the present invention into which a CRE-reporter gene vector has been introduced, stimulation accompanied by an increase in cAMP results in reporter gene expression via CRE and subsequent production of the gene product (protein) of the reporter gene. Induce. That is, by measuring the enzyme activity of the reporter gene protein, a change in the amount of cAMP in the CRE-reporter gene vector-introduced cell can be detected.
具体的には、 細胞内 cAMP量を增加させる物質の存在下、 本発明のリガンドを、 CRE -レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と 、 本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を、 CRE -レポーター遺伝子ベクター導入本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、. レポーター遺伝子蛋白質の酵 素活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との 結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。  Specifically, in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, the ligand of the present invention is brought into contact with the CRE-reporter gene vector-introduced receptor-expressing cell of the present invention. When the compound is brought into contact with the CRE-reporter gene vector-introduced receptor-expressing cell of the present invention. By measuring and comparing the enzyme activity of the reporter gene protein, the ligand of the present invention and the present invention are compared. Screen for compounds that alter binding to the receptor.
細胞内 cAMP量を增加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カルシト ニンなどが用いられる。 Substances that increase the amount of intracellular cAMP include, for example, forskolin, calcito Nin etc. are used.
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン べィシックベクター、 ピツカジー ン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用いられる。 CREを 含む DNAを、 上記ベクターのレポーター遺伝子、 例えばルシフェラーゼ遺伝子上 流のマルチクローニングサイトに挿入し、 CRE-レポーター遺伝子ベクターとする 本方法において、 本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 抑制を回復させる試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択するこ とができる。  As the vector, for example, Pitsuka Gene Basic Vector, Pitsuka Gene Enhancer Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) and the like are used. In this method, the inhibition of the enzyme activity of the reporter gene protein by the ligand of the present invention is restored by inserting a CRE-containing DNA into the multicloning site on the reporter gene of the vector, for example, the luciferase gene upstream. Can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
一方、 試験ィヒ合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 フオルスコリ ン刺激によって上昇した発光量の本発明のリガンドと同様な抑制を測定すること によりァゴニストのスクリ一二ングを行なうこともできる。  On the other hand, the testist compound was brought into contact with the receptor-expressing cells of the present invention, and the inhibition of agonist screening was measured by measuring the inhibition similar to that of the ligand of the present invention in the amount of luminescence increased by stimulation with phorscorin. It can also be done.
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 このスクリ 一二ング方法の具体例を以下に述べる。  A specific example of this screening method is described below using an example of using luciferase as a reporter gene.
CRE-レポーター遺伝子 （ルシフェラーゼ） を導入した本発明の受容体発現細胞 を、 24穴プレートに 5xl03cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM 3- イソブチル-メチルキサンチン、 0. 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバ ッファー （PH7. 4) で洗浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後 0 . 5mlの反応用パッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用パッファーを 除き、 新たに 0. 25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 Ι μ Μの本発明のリガ ンドまたは 1 μ Μの本発明のリガンドぉよび試験化合物を添加した 2 μ Μ フォルス コリンを含む 0. 25mlの反応用バッファーを、 細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させ る。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶かし、 溶解 液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ) を添加する。 ルシフェラーゼによる発光 は、 ノレミノメーター、 液体シンチレーシヨンカウンターまたはトップカウンター により測定する。 本発明のリガンド単独を添加した場合と、 ： Mの本発明のリガ ンドおよび試験ィ匕合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して 、 比較する。 ' ■ ' CRE- reporter gene receptor-expressing cells of the present invention was introduced (luciferase) were seeded at 5xl0 3 cell / well in 24-well plates, and cultured for 48 hours. The cells are washed with Hanks buffer (PH7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in the incubator. After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 2 μΜ of ΙμΜ of the ligand of the present invention or 1 μΜ of the ligand of the present invention and the test compound. Add 0.25 ml of reaction buffer containing forskolin to the cells and incubate at 37 ° C for 24 minutes. Dissolve the cells with a cytolytic agent for Pitsukagene (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.), and add a luminescent substrate (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) to the lysate. Luminescence by luciferase is measured with a noreluminometer, liquid scintillation counter or top counter. The amount of luminescence by luciferase when the ligand of the present invention alone is added and when the ligand of the present invention and the test compound of M are added is measured and compared. '■'
本発明のリガンドは、 フオルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光 量の增加を抑制する。 該抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候捕物質 として選択することができる。 The ligand of the present invention suppresses an increase in the amount of luminescence by luciferase based on forskolin stimulation. A compound capable of antagonistic inhibition of a compound that restores the suppression Can be selected as
レポーター遣伝子として、 例えば、 ア^^カリフォスファターゼ、 クロラムフヱ ニコーノレ ·ァセテノレトフンスフェラ" ir (chloramphenicol acetyl transferase ) 、 ]3—ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。 これらのレポーター遺 伝子蛋白質の酵素活性は、 公知の方法に従い、 または市販の測定キットを用いて 測定する。 アルカリフォスファターゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530 を用いて、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラーゼ活性は、 例えば 和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransf erase Assay KiTを用いて、 3—ガラクトシダーゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Gal- XEを用いて測定す る。  As reporter gene, for example, genes such as a ^^ kaliphosphatase, chloramf ヱ nikonole / acetenoretofunsfer "ir (chloramphenicol acetyl transferase),] 3-galactosidase, etc. may be used. These reporter gene proteins The enzyme activity of is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit Alkaline phosphatase activity is measured using, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and chloramphenicol acetyl transferase activity is measured, for example, The 3-galactosidase activity is measured using, for example, Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries, using FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransf erase Assay KiT manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
( 4 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 ァラキドン 酸代謝物を細胞外に放出する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明 の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができ る。  (4) The receptor-expressing cell of the present invention releases an arachidonic acid metabolite to the outside of the cell upon stimulation with the ligand of the present invention. Screening for a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cell of the present invention using this reaction. You can.
あらかじめ、 標識したァラキドン酸を、 本発明の受容体発現細胞に取り込ませ ておくことによって、 ァラ.キドン酸代謝物放出活性を、 細胞外に放出された標識 されたァラキドン酸代謝物を測定することによつて測定することができる。 具体的には、 本発明のリガンドを、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の 受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 標 識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合におけ る、 ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリ ガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 本方法において、 本発明のリガンドによるァラキドン酸代謝物放出活性を阻害 する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候捕物質として選択することができる。 また、 試験ィヒ合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明の受容体 発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりァゴニ スト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。  The labeled arachidonic acid metabolites released outside the cells are measured by incorporating the labeled arachidonic acid into the receptor-expressing cells of the present invention in advance. Can be measured. Specifically, when the ligand of the present invention is contacted with a receptor-expressing cell of the present invention containing a labeled arachidonic acid, the present invention contains a labeled arachidonic acid containing the ligand of the present invention and a test compound. A compound that changes the binding activity of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring and comparing the release activity of the arachidonic acid metabolite in contact with the receptor-expressing cell of the invention. To screen. In this method, a test compound that inhibits the arachidonic acid metabolite release activity by the ligand of the present invention can be selected as a scavenger capable of competitive inhibition. In addition, screening of a compound exhibiting agonist activity by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and examining the arachidonic acid metabolite releasing activity of the receptor-expressing cell of the present invention by a known method. Can also be performed.
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。  One specific example of the screening method is described below.
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに 5xl04cell/wellで播種し、 24時間培 養後、 [¾]ァラキドン酸を 0. 25 /x Ci/^llとなるよう添カ卩し、 16時間後、 細胞を 0 . 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （PH7. 4) (以下、 反応用 バッファーと略記する） で洗浄する。 終濃度 10〃 Mの本発明のリガンドまたは終 濃度 10 μ Μの本発明のリガンドぉよび試験化合物を含む反応用パッファー 500 μ 1 を、 各 wellに添加する。 37°Cで 60分間インキュベートした後、 反応液 をシ ンチレーターに加え、 反応液中に遊離した [¾]ァラキドン酸代謝物の量をシンチ レーションカウンタ一により測定する。 The receptor-expressing cells of the present invention were seeded at 5xl0 4 cell / well in 24-well plates, 24-hour culture Yogo, [¾] The Arakidon acid添Ka卩so as to be 0. 25 / x Ci / ^ ll , 16 hours later, the cells 0. 05% BSA, and Hank's buffer containing 20mM HEPES (P H7. 4) Wash with (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Add 500 μl of a reaction buffer containing a final concentration of 10 μM of the ligand of the present invention or a final concentration of 10 μm of the present ligand and a test compound to each well. After incubating at 37 ° C for 60 minutes, the reaction solution is added to a scintillator, and the amount of [¾] arachidonic acid metabolites released in the reaction solution is measured with a scintillation counter.
反応用バッファー 500 ^ 1のみを添加した場合 （本発明のリガンド非添加'試 験化合物非添加） の遊離 [¾]ァラキドン酸代謝物の量を 0°/。、 10 Μの本発明のリ ガンドを む反応用バッファーを添加した場合 （試験化合物非添加） の遊離 [¾] ァラキドン酸代謝物の量を 100%として、 試験ィ匕合物を添加した場合の遊離 [¾] ァラキドン酸代謝物の量を算出する。  The amount of free [¾] arachidonic acid metabolite in the case of adding only the reaction buffer 500 ^ 1 (no addition of the ligand of the present invention and no addition of the test compound) was 0 ° /. , When 10% of the reaction buffer containing the ligand of the present invention is added (no test compound added). [¾] The amount of arachidonic acid metabolite is 100% and the test compound is added. Calculate the amount of free [¾] arachidonic acid metabolite.
ァラキドン酸代謝物放出活性が、 例えば 50%以下になる試験ィ匕合物を拮抗阻害 能力のある候補物質として選択することができる。  For example, a test compound having an arachidonic acid metabolite release activity of 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
( 5 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 細胞内の Ca 濃度が上昇する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現 細胞に対する刺激活性を測,定することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容 体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。  (5) In the receptor-expressing cell of the present invention, intracellular Ca concentration is increased by stimulation with the ligand of the present invention. By using this reaction, the compounds that change the binding properties of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention are screened by measuring and determining the stimulating activity of the ligand of the present invention on the cells expressing the receptor of the present invention. can do.
具体的には、 本努明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、 比較することにより 、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー ニングする。 測定は公知の方法に従って行う。  Specifically, when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, A compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring and comparing the activity of increasing the internal calcium concentration. The measurement is performed according to a known method.
本方法において、 本発明のリガンドによる細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制 する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 In this method, a test compound that suppresses an increase in intracellular calcium concentration by the ligand of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
—方、 試験ィヒ合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってァ ゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。 -On the other hand, an agonistist can be screened by measuring the increase in fluorescence intensity due to the addition of the test compound alone.
スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。 '  A specific example of the scribing method is described below. '
本発明の受容体発現細胞を、 滅菌した顕微鏡用力パーグラス上に播き、 2日後 、 培養液を、 4mM Fura-2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した HBSSに置換し、 室温 で 2時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、 キュベットに力パーグラスをセットし、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を添加し、 励起波長 340nmおよび 380ηηιでの、 505nmの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比 較する。 The receptor-expressing cells of the present invention were seeded on a sterile microscope power microscope glass, and after 2 days, the culture solution was replaced with HBSS suspended in 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories) Leave for 2 hours 30 minutes. After washing with HBSS, force Purgrass is set in the cuvette, and the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound are added to increase the ratio of the fluorescence intensity at 505 nm at the excitation wavelengths of 340 nm and 380 ηηι. Measure with a fluorescence measuring instrument and compare.
また、 FLIPR (モレキュラーデバイス社製） を使って行ってもよい。 本発明の 受容体発現細胞縣濁液に Fluo- 3 AM (同仁化学研究所製） を添加し、 細胞に取り 込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 96穴プレートに細胞を播く。 FLIPR 装置にセットし、 Fura-2の場合と同様に、 本発明のリガンドまたは本発明のリガ ンドおよび試験化合物を添加し、 蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比 較する。  Alternatively, FLIPR (Molecular Device) may be used. Fluo-3 AM (manufactured by Dojindo Laboratories) was added to the receptor-expressing cell suspension of the present invention, and the cells were taken up. The supernatant was washed several times by centrifugation, and the cells were placed in a 96-well plate. Sowing. As in the case of Fura-2, the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound are added, and the increase in the ratio of fluorescence intensity is measured with a fluorometer and compared.
さらに、 本発明の受容体発現細胞に、 細胞内 Caイオンの上昇によって発光する ような蛋白質の遺伝子 （例、 aequorinなど） を共努現させておき、 細胞内 Caィォ ン濃度の上昇によって、 該遺伝子蛋白質 （例、 aequorinなど） が Ca結合型となり 発光することを利用して、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化 させる化合物をスクリーニングすることもできる。  In addition, the receptor-expressing cells of the present invention are co-developed with a protein gene (eg, aequorin) that emits light when the intracellular Ca ion increases, and by increasing the intracellular Ca ion concentration, A compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention can be screened by utilizing the fact that the gene protein (eg, aequorin etc.) becomes Ca-binding and emits light.
細胞内 Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させた 本発明の受容体発現細胞を,、 96穴プレートに播き、 上記と同様に、 本発明のリガ ンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィヒ合物を添加し、 蛍光強度の比の上昇を 蛍光測定器で測定し、 比較する。  The receptor-expressing cells of the present invention co-expressed with a protein gene that emits light when the intracellular Ca ion rises are seeded in a 96-well plate, and in the same manner as above, the ligand of the present invention or the ligand of the present invention Add a test compound and measure the increase in the ratio of fluorescence intensities using a fluorometer.
本発明のリガンドによる蛍光強度の上昇を、 抑制する試験化合物を拮抗阻害能 力のある候補物質として選択することができる。  A test compound that suppresses the increase in fluorescence intensity by the ligand of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
( 6 ) 受容体を発現する細胞に、 受容体ァゴニストを添加すると、 細胞内イノシ トール三リン酸濃度は上昇する。 本発明のリガンドの、 本発明の受容体発現細胞 における細胞内ィノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、 本発明の リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする ことができる。  (6) When a receptor agonist is added to a receptor-expressing cell, the intracellular inositol triphosphate concentration increases. Screening for a compound that changes the binding property of the ligand of the present invention to the receptor of the present invention by utilizing the intracellular inositol triphosphate production activity of the ligand of the present invention in the receptor-expressing cell of the present invention be able to.
具体的には、 標識したイノシトールの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の 受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 イノシトール三リン酸産生活 性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合 性を変化させる化合^をスクリーニングする。 測定は公知の方法に従って行う。 本方法において、 イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験ィヒ合物を、 拮 抗阻害能力のある侯捕物質として選択することができる。 Specifically, when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of labeled inositol, the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention. The inositol triphosphate productivity is measured and compared in the case where the ligand of the present invention is bound to the receptor of the present invention. Screen for compounds that change sex. The measurement is performed according to a known method. In this method, a test compound that suppresses inositol triphosphate production activity can be selected as an trapping substance capable of antagonistic inhibition.
—方、 試験化合物のみを本 明の受容体発現細胞に接触させ、 イノシトール三 リン酸産生上昇を測定することによってァゴニストのスクリーニングを行なうこ ともできる。 '  -On the other hand, it is possible to screen for an agonist by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the increase in inositol triphosphate production. '
スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。  A specific example of the scribing method is described below.
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播き、 1日間培養する。 その後、 my 0- [2- ] inositol (2. 5 μ Ci/well) を添加した培地で 1日間培養し、 細胞を放射 活性を有するイノシトールを無添カ卩の培地でよく洗浄する。 本発明のリガンドま たは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加後、 10%過塩素酸を加え、 反応を 止める。 1. 5M水酸化カリウムおよび 60mM HEPES溶液で中和し、 0. 5mlの AGlx8樹 脂 （Bio - Rad) を詰めたカラムに通し、 5mM四ホウ酸ナトリウム （Na2B407) およ ぴ 60mM ギ酸アンモニゥムで洗浄した後、 1Mギ酸アンモニゥムおよび 0. 1M ギ酸 で溶出した放射活性を、 液体シンチレーシヨンカウンターで測定する。 本発明の リガンドを添加しない場合の放射活性を 0%、 本発明のリガンドを添加した場合 の放射活性を 100%とし、 試験化合物の、 本発明のリガンドと本発明の受容体の 結合に対する影響を算出する。 The receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate and cultured for 1 day. Then, incubate for 1 day in a medium supplemented with my 0- [2-] inositol (2.5 μCi / well), and wash the cells thoroughly with radioactive inositol-free medium. After adding the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound, 10% perchloric acid is added to stop the reaction. 1. Neutralize with 5M potassium hydroxide and 60mM HEPES solution, pass through a column packed with 0.5ml AGlx8 resin (Bio-Rad), and add 5mM sodium tetraborate (Na 2 B 4 0 7 ) and After washing with 60 mM ammonium formate, the radioactivity eluted with 1 M ammonium formate and 0.1 M formic acid is measured with a liquid scintillation counter. When the ligand of the present invention is not added, the radioactivity is 0%, and when the ligand of the present invention is added, the radioactivity is 100%. The effect of the test compound on the binding of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is shown. calculate.
イノシトール三リン酸産生活性が、 例えば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻 害能力のある候補物質として選択することができる。  For example, a test compound with an inositol triphosphate production activity of 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
( 7 ) TRE-レポーター遺伝子ベクターを用いて、 本発明のリガンドの本発明の受 容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発 明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。  (7) Using the TRE-reporter gene vector, the binding activity between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is changed by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cells of the present invention. The compound to be screened can be screened.
TRE (TPA response element) を含む DNAを、 ベクターのレポーター遺伝子上流 に挿入し、 TRE-レポーター遺伝子ベクターを得る。 TRE-レポーター遺伝子べクタ 一を導入した本発明の受容体努現細胞において、 細胞内カルシウム濃度の上昇を 伴う刺激は、 TREを介したレポーター遺伝子発現と-、 それに引き続くレポーター 遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポーター遺伝子蛋 白質の酵素活性を測定することにより、 TRE-レポーター遺伝子ベクター導入細胞 内のカルシウム量の変動を検出することができる。 具体的には、 本発明のリガンドを、 TRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明 の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 TRE-レポ一タ一遺伝子べクタ一導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合に おける、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較することにより、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニン グする。 A DNA containing TRE (TPA response element) is inserted upstream of the reporter gene of the vector to obtain a TRE-reporter gene vector. In a receptor-engineered cell of the present invention into which a TRE-reporter gene vector has been introduced, stimulation accompanied by an increase in intracellular calcium concentration is caused by TRE-mediated reporter gene expression and subsequent reporter gene gene product (protein ) Is induced. That is, by measuring the enzyme activity of the reporter gene protein, it is possible to detect a change in the amount of calcium in the TRE-reporter gene vector-introduced cell. Specifically, when the ligand of the present invention is brought into contact with the TRE-reporter gene vector-introduced receptor-expressing cell of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are mixed with the TRE-reporter gene vector. Introducing a compound that changes the binding activity of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring and comparing the enzyme activity of the reporter gene protein when contacted with the receptor-expressing cell of the present invention Screen.
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン べィシックベクター、 ピツカジー ン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用いられる。 Ί¾Εを 含む DNAを、 上記ベクターのレポーター遺伝子、 例えばルシフヱラーゼ遺伝子上 流のマルチクローユングサイトに挿入し、 TRE-レポーター遺伝子ベクターとする 本方法において、 本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することがで さる。  As the vector, for example, Pitsuka Gene Basic Vector, Pitsuka Gene Enhancer Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) and the like are used. In this method, the enzyme activity of the reporter gene protein by the ligand of the present invention is suppressed by inserting a DNA containing Ί¾Ε into the multicloning site on the reporter gene of the above vector, for example, the luciferase gene upstream. This test compound can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
—方、 試験ィ匕合物のみを TRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発 現細胞に接触させ、 本発明のリガンドと同様な発光量の増加を測定することによ りァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。  -On the other hand, only the test compound is brought into contact with the TRE-reporter gene vector-introduced receptor-expressing cell, and an increase in the amount of luminescence similar to that of the ligand of the present invention is measured to screen for an agonist. It can also be done.
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 このスクリ 一二ング方法の具体例を以下に述べる。  A specific example of this screening method is described below using an example of using luciferase as a reporter gene.
TRE-レポーター遺伝子 (ルシフェラーゼ) を導入した本発明の受容体発現細胞 を、 24穴プレートに 5xl03cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 05% B SAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （pH7. 4) で洗浄した後、 ΙΟηΜの 本発明のリガンドまたは ΙΟηΜの本発明のリガンドぉよび試験化合物を添加し、 37 。Cで 60分間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株 ) ) で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフ エラーゼによる発光は、 ルミノメーター、 液体シンチレーシヨンカウンターまた はトップカウンタ一により測定する。 本発明のリガンドを添加した場合と、 ΙΟηΜ の本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発 光量を測定して、 比較する。 TRE- reporter gene receptor-expressing cells of the present invention was introduced (luciferase) were seeded at 5xl0 3 cell / well in 24-well plates, and cultured for 48 hours. After washing the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound of 37 are added 37. Incubate at C for 60 minutes. Dissolve the cells with a cell lysing agent for Pitsukagene (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.), and add a luminescent substrate (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) to the lysate. Luminescence by luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter. The amount of light emitted by luciferase when the ligand of the present invention is added and when the ligand of the present invention and the test compound of ΙΟηΜ are added are measured and compared.
本発明のリガンドによる細胞内カルシウムの上昇によって、 ルシフェラーゼに よる発光量が増加する。 この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物 質として選択することができる。 Increase of intracellular calcium by the ligand of the present invention leads to luciferase This increases the amount of light emitted. A compound that suppresses this increase can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
レポーター遺伝子として、 例えば、 ァ カリフォスファターゼ、 クロラムフエ ニコーノレ ·ァセチノレトフンスフエラーゼ (chloramphenicol acetyltransf erase ) 、 一ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。 これらのレポーター遣 伝子蛋白質の酵素活性は、 公知の方法に従い、 または市販の測定キットを用いて 測定する。 アルカリフォスファターゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530 を用いて、 クロラムフエ二コール'ァセチルトランスフェラーゼ活性は、 例えば 和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiTを用レヽて、 一ガラクトシダーゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Gal - XEを用いて測定す る。  As the reporter gene, for example, genes such as alkaliphosphatase, chloramphenicol acetyltransfase, galactosidase, and the like may be used. The enzyme activity of these reporter gene proteins is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit. Alkaline phosphatase activity is, for example, using Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., chloramphenicol 'acetyltransferase activity is prepared using, for example, FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiT manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and one galactosidase activity is For example, measurement is performed using Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
( 8 ) 本発明の受容体発現細胞は、 '本発明のリガンドの刺激により、 MAPキナー ゼが活性化され、 増殖する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の 受容体 現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本 発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー ングすることができる 具体的には、 本発明のリ.ガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。  (8) In the receptor-expressing cell of the present invention, MAP kinase is activated and proliferated by stimulation of the ligand of the present invention. Using this reaction, the compound of the present invention is screened for a compound that alters the binding properties of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor present cell of the present invention. Specifically, when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention. In this case, by measuring and comparing cell proliferation, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened.
本発明の受容体発現細胞の増殖は、 例えば、 MAPキナーゼ活性、 チミジン取り 込み活性、 ATP量、 細胞数などを測定すればよい。  The proliferation of the receptor-expressing cells of the present invention may be determined, for example, by measuring MAP kinase activity, thymidine incorporation activity, ATP amount, cell number, and the like.
具体例としては、 MAPキナーゼ活性については、 本発明のリガンドまたは本発 明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に添加した後、 細胞 溶解液から抗 MA Pキナーゼ抗体を用いた免疫沈降により MA Pキナーゼ分画を 得た後、 公知の方法、 例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay Kitおよび γ - [32P]-A TPを使用して MAPキナーゼ活性を測定し、 比較する。 As a specific example, for MAP kinase activity, the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound were added to the receptor-expressing cells of the present invention, and then an anti-MAP kinase antibody was used from the cell lysate. After obtaining the MA P kinase fraction by immunoprecipitation, the MAP kinase activity is measured and compared using a known method such as MAP Kinase Assay Kit and γ- [ 32 P] -A TP manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
チミジン取り込み活性については、 本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに 播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドぉよび試験化合物を 添加した後、 放射活性により標識したチミジン （例、 [methyl-3!!]-チミジンなど ) を加え、 その後、 細胞を溶解し、 細胞內に取り込まれたチミジンの放射活性を 、 液体シンチレーシヨンカウンターで計数することにより、 チミジン取り込み活 性を測定し、 比較する。 Regarding thymidine uptake activity, the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate, cultured, added with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and then thymidine labeled with radioactivity (Example) , [Methyl- 3 !!]-thymidine etc. ), Lysing the cells, and measuring the thymidine incorporation activity by counting the radioactivity of the thymidine incorporated into the cell cage with a liquid scintillation counter, and comparing it.
ATP量の測定については、 本発明の受容体発現鉀胞を 96穴プレートに播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を添加した 後、 例えば CellTiter- Glo (Promega) を用いて細胞内の ATP量を測定し、 比較す る。 ' 細胞数の測定については、 本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィヒ合物を添加した 後、 MTT (3- (4, 5- dimethyl - 2 - thiazolyl) - 2， 5-dipheny;L - 2H- tetrazolium bromid e) を添加する。 細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを、 塩酸に て酸性としたィソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、 570nmの吸収によつ て測定し、 比較する。  For the measurement of the amount of ATP, the receptor-expressing cyst of the present invention is seeded in a 96-well plate, cultured, and after adding the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, for example, CellTiter-Glo Use (Promega) to measure and compare intracellular ATP levels. 'For the cell number measurement, the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate, cultured, added with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and then MTT (3- Add (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-dipheny; L-2H-tetrazolium bromid e). MTT formazan, which has been incorporated into cells and has changed MTT, is lysed with an aqueous solution of isopropanol made acidic with hydrochloric acid, then measured by absorption at 570 nm and compared.
本方法において、 本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験ィヒ合物を、 拮 抗阻害能力のある侯補物質として選択することができる。  In this method, the test compound that suppresses the proliferation of the receptor-expressing cells of the present invention can be selected as a complement that has the ability to inhibit antagonists.
—方、 試験ィ匕合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明のリガン ドと同様な細胞增殖活生を.測定することによりァゴニストのスクリーニングを行 なうこともできる。  On the other hand, an agonistist can be screened by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the cell proliferation activity similar to the ligand of the present invention.
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べる 。  A specific example of a screening method using thymidine incorporation activity is described below.
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレ"トに 5000個/ゥヱル播き、 1日間培養する 。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にする。 本発明のリ ガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を、 細胞に添加して 24時間培養 した後、 [methyl- ]-チミジンをゥヱル当たり 0. 015MBq添加し、 6時間培養する 。 細胞を PBSで洗った後、 メタノールを添加して 10分間放置する。 次に 5%トリク ロロ酢酸を添加して 15分間放置後、 固定された細胞を蒸留水で 4回洗う。 0. 3N水 酸ィ匕ナトリゥム溶液で細胞を溶解し、 溶解液中の放射活性を液体シンチレーショ ンカウンターで測定する。 ·  The receptor-expressing cells of the present invention are seeded at 5,000 cells / tool in a 24-well plate and cultured for 1 day. Next, the cells are cultured for 2 days in a medium not containing serum, and the cells are starved. Alternatively, the ligand of the present invention and the test compound are added to the cells and cultured for 24 hours, and then [methyl-]-thymidine is added at 0.015 MBq per tool and cultured for 6 hours. Then add methanol and let stand for 10 minutes, then add 5% trichloroacetic acid and let stand for 15 minutes, then wash the fixed cells 4 times with distilled water 0. 3N Hydroxy sodium solution Lyse the cells and measure the radioactivity in the lysate with a liquid scintillation counter.
本発明のリガンドを添カ卩した場合の放射活性の増加を抑制する試験ィヒ合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 ( 9 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 カリウムチ ャネルが活性ィヒし、 細胞内にある Kイオンが、 細胞外に流出する。 この反応を利 用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定す ることにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物をスクリーニングすることができる。 A test compound that suppresses an increase in radioactivity when the ligand of the present invention is added can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. (9) In the receptor-expressing cell of the present invention, the potassium channel is activated by the stimulation of the ligand of the present invention, and K ions in the cell flow out of the cell. Using this reaction, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is measured by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cell of the present invention. Can be screened.
Kイオンと同族元素である Rbイオン （ルビジウムイオン） は、 Kイオンと区別無 く、'カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。 よって、 本発明の受容体発現 細胞に、 放射活性同位体である Rb ( [86Rb] ) を取り込ませておいた後、 本発明の リガンドの刺激によつて流出する86 Rbの流れ （流出活性） を測定することにより 、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定する。 具体的には、 86Rbの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現 細胞に接触させた場合における、 86Rbの流出活性を測定し、 比較することにより 、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー ニングする。 Rb ions (rubidium ions), which are homologous to K ions, flow out of cells through potassium channels, indistinguishable from K ions. Therefore, the Rb ([ 86 Rb]) radioisotope is incorporated into the receptor-expressing cells of the present invention, and then the flow of 86 Rb that flows out upon stimulation with the ligand of the present invention (efflux activity). ) To measure the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention. Specifically, when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of 86 Rb, the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention. In this case, 86 Rb efflux activity is measured and compared to screen a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention.
本方法において、 本発明のリガンド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制す る試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接蝕させ、 本発明のリガン ドと同様な86 R bの流出活性の上昇を測定することによりァゴニストのスタリー ユングを行なうこともできる。 In this method, the test compound that suppresses the increase in 86 Rb efflux activity by ligand stimulation of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. On the other hand, the agonist can be stared in the test by feeding only the test compound into the receptor-expressing cells of the present invention and measuring the increase in 86 Rb efflux activity similar to the ligand of the present invention.
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。  One specific example of the screening method is described below.
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播き、 2日間培養する。 その後、 lmC ' i/mlの86 RbClを含む培地中で 2時間保温する。 細胞を培地でよく洗浄し、 外液中 の86 RbClを完全に除く。 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化 合物を細胞に添加し、 '30分後外液を回収し、 γカウンターで放射活性を測定し、 比較する。 The receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate and cultured for 2 days. Then, incubate in a medium containing lmC'i / ml 86 RbCl for 2 hours. Wash the cells thoroughly with medium and completely remove 86 RbCl in the external solution. The ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound are added to the cells, and after 30 minutes, the external solution is collected, and the radioactivity is measured with a γ counter and compared.
本発明のリガンド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制する試験ィ匕合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 ' The test compound that suppresses the increase in 86 Rb efflux activity by ligand stimulation of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition. '
( 1 0 ) 本発明の受容体宪現細胞が本発明のリガンドに反応し、 細胞外の pHが変 化する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対 する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結 合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。 (10) The receptor-expressing cell of the present invention reacts with the ligand of the present invention, and the extracellular pH changes. By utilizing this reaction, the ligand of the present invention is applied to the receptor-expressing cell of the present invention. By measuring the stimulating activity, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention can be screened.
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合における、 細胞外の p H変化を測定し、 比較することにより、 本発明のリ ガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 細胞外 pH変化は、 例えば、 Cytosensor装置 （モレキュラーデバイス社） を使用 して測定する。  Specifically, when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, By measuring and comparing the pH change of these compounds, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. The extracellular pH change is measured using, for example, a Cytosensor device (Molecular Device).
本方法において、 本発明のリガンドによる細胞外 pH変化を抑制する試験化合物 を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。  In this method, a test compound that suppresses extracellular pH change by the ligand of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
一方、 試験ィ匕合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本究明のリガン ドと同様な細胞外 p H変化を測定することによりァゴニストのスクリーニングを 行なうこともできる。  On the other hand, it is possible to screen an agonist by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the extracellular pH change similar to the ligand of the present study.
スクリーユング法の--具体例を以下に述べる。  A specific example of the screening method is described below.
本発明の受容体発現細胞を Cytosensor装置用のカプセル内で終夜培養し、 装置 のチャンパ一にセットして細胞外 pHが安定するまで約 2時間、 0. 1% BSAを含む RP MI 1640培地 （モレキュラーデバイス社製） を灌流させる。 pHが安定した後、 本発 明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物を含む培地を細胞上に灌 流させる。 灌流によって生じた培地の pH変化を測定し、 比較する。  The receptor-expressing cells of the present invention are cultured overnight in a capsule for a Cytosensor device, set in a device chamber, and about 2 hours until the extracellular pH is stabilized. RP MI 1640 medium containing 0.1% BSA ( Perfuse (Molecular Device). After the pH is stabilized, a medium containing the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound is perfused onto the cells. Measure and compare the media pH change caused by perfusion.
本発明のリガンドによる細胞外 p H変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。  A compound that suppresses extracellular pH change by the ligand of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
( 1 丄) 酵母 (Saccharomyces cerevisiae の haploid a -mating type (MAT ) の性フェロモン受容体 Ste2は、 G蛋白質 Gpalと共役しており、 性フェロモン a -m ating factorに応答して MAPキナーゼを活性化し、 これに引き続き、 Farl (cell- cycle arrest) および転写活性化因子 Stel2が活性化される。 Stel2は、 種々の蛋 白質 （例えば、 接合に関与する FUS1) の発現を誘導する。 一方、 制御因子 Sst2は 上記の過程に抑制的に機能する。 この系において、 -受容体遺伝子を導入した酵母 を作製し、 受容体ァゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性ィ匕 し、 その結果生じる増殖などを指標として用いる、 受容体ァゴニストと受容体と の反応の測定系の試みが行なわれている （Trends in Biotechnology, 15卷， 48 7 - 494頁， 1997年） 。 上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、 本発明のリ ガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングするこ とができる。 (1 丄) Saccharomyces cerevisiae haploid a -mating type (MAT) sex pheromone receptor Ste2 is coupled to G protein Gpal and activates MAP kinase in response to sex pheromone a -mating factor Following this, Farl (cell-cycle arrest) and the transcriptional activator Stel2 are activated Stel2 induces the expression of various proteins (eg, FUS1 involved in conjugation). Sst2 functions in a suppressive manner in the above process: In this system, a yeast into which a receptor gene has been introduced is produced, and the signal transduction system in the yeast cell is activated by stimulation of the receptor agonist, resulting in Attempts have been made to measure the reaction between receptor agonists and receptors using growth as an indicator (Trends in Biotechnology, 15 卷, 48 7-494, 1997). A compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention can be screened using the above-described receptor gene-transferred yeast system.
具体例を以下に示す。  Specific examples are shown below.
ΜΑΤ α酵母の Ste2および Gpalをコードする遺伝子を除去し、 代わりに、 本発明 の受容体遺伝子おょぴ Gpal- Gai2融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。 Far 1をコードする遺伝子を除去して cell- cycle arrestが生じないようにし、 また、 Sst2をコードする遺伝子を除去して本発明のリガンドに対する応答の感度を向上 させておく。 さらに、 FUS1にヒスチジン生合成遺伝子 HIS3を結合した FUS1- HIS3 遺伝子を導入する。 この遺伝子組換え操作は、 例えば、 Molecular and Cellular Biology, 15卷， 6188 - 6195頁， 1995年に記載の方法において、 ソマトスタチン 受容体タイプ 2 (SSTR2) 遺伝子を、 本発明の受容体に置き換えて実施することが できる。  (1) The genes encoding Ste2 and Gpal of α yeast are removed, and instead, a gene encoding the receptor gene of the present invention, the Gpal-Gai2 fusion protein, is introduced. The gene encoding Far 1 is removed to prevent cell-cycle arrest, and the gene encoding Sst2 is removed to improve the sensitivity of the response to the ligand of the present invention. In addition, the FUS1-HIS3 gene, in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is linked to FUS1, is introduced. This gene recombination operation is performed by replacing the somatostatin receptor type 2 (SSTR2) gene with the receptor of the present invention in the method described in, for example, Molecular and Cellular Biology, 15 卷, 6188-6195, 1995. can do.
このように構築された形質変換酵母は、 本発明のリガンドに高感度で反応し、 その結果、 MAPキナーゼの活性化が起き、 ヒスチジン生合成酵素が合成されるよ うになり、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。  The transformed yeast thus constructed reacts with high sensitivity to the ligand of the present invention. As a result, activation of MAP kinase occurs, histidine biosynthetic enzyme is synthesized, and grows in a histidine-deficient medium. It becomes possible.
従って、 上記の本発明の受容体発現酵母 （Ste2遺伝子おょぴ Gpal遺伝子が除去 され、 本発明の受容体遺伝子および Gpal- Gai2融合蛋白質コード遺伝子が導入さ れ、 Far遺伝子および Sst2遺伝子が除去され、 FUS1 - HIS3遺伝子が導入された MAT α酵母） を、 ヒスチジン欠乏培地で培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリ ガンドおよび試験化合物を接触させ、 該酵母の生育を測定し、 比較することによ り、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ 一二ングすることができる。  Therefore, the receptor-expressing yeast of the present invention described above (the Ste2 gene and the Gpal gene are removed, the receptor gene of the present invention and the Gpal-Gai2 fusion protein-encoding gene are introduced, and the Far gene and the Sst2 gene are removed. FUS1-HIS3 gene-introduced MAT α yeast) is cultured in a histidine-deficient medium, contacted with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and the growth of the yeast is measured and compared. Thus, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention can be screened.
本方法において、 該酵母の生育を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある 候補物質として選択することができる。  In this method, the test compound that suppresses the growth of the yeast can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
一方、 試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、 本発明の リガンドと同様な酵母の生育を測定することによりァゴニストのスクリーニング を行なうこともできる。  On the other hand, it is possible to screen for an agonist by contacting only the test compound with the receptor-expressing yeast of the present invention and measuring the growth of the same yeast as the ligand of the present invention.
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。  One specific example of the screening method is described below.
上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、 その 後、 ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、 2xl04 cell/mlの濃度になるように加 える。 ついで、 9x9cmの角形シャーレに播く。 寒天が固化した後、 本発明のリガ ンドまたは本発明のリガンドおよび試験ィ匕合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表 面におき、 30°Cで 3日間培養する。 試験ィ匕合物の影響は、 濾紙の周囲の酵母の生 育を、 本発明のリガンドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。 また、 あらかじめ、 ヒスチジンを除去した寒天培地に本発明のリガンドを添加し ておき、 滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、 シャーレ全面 での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。 The receptor-expressing yeast of the present invention is cultured overnight in a completely synthetic liquid medium, After dissolution agar medium was removed histidine, obtain pressure to a concentration of 2xl0 4 ce ll / ml. Then, sow in a 9x9cm square petri dish. After the agar has solidified, a sterile filter paper impregnated with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound is placed on the surface of the agar and cultured at 30 ° C. for 3 days. The effect of the test compound is compared to the growth of yeast around the filter paper compared to the case of using sterile filter paper soaked only with the ligand of the present invention. In addition, the ligand of the present invention is added in advance to an agar medium from which histidine has been removed, the test compound is soaked in sterile filter paper, and the yeast is cultured. You may observe receiving.
酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択するこ とができる。  A compound that suppresses the growth of yeast can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
( 1 2 ) 本発明の受容体遺伝子 RNAをアフリカッメガエル卵母細胞に注入し、 本 発明のリガンドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、 calcium-ac tivated chloride currentが生じる。 これは、 膜電位の変化としてとらえること ができる （Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様） 。 本発明のリガンドによ つて生じる本発明の受容体導入ァフリ力ッメガエル卵母細胞における上記反応を 利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定 することにより、 本発明の.リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化 合物をスクリーニングすることができる。  (12) When the receptor gene RNA of the present invention is injected into Xenopus laevis oocytes and stimulated by the ligand of the present invention, the cellular calcium concentration increases and a calcium-activated chloride current is generated. This can be viewed as a change in membrane potential (even if there is a change in the K ion concentration gradient). By measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention using the above reaction in the receptor-introduced Xenopus oocyte of the present invention generated by the ligand of the present invention, Compounds that alter the binding of the inventive ligand to the receptor of the invention can be screened.
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体遺伝子 RNA導入アフリカッ メガエル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよぴ試験化合物を、 本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフリカッメガエル卵母細胞に接触させた場合に おける、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。  Specifically, when the ligand of the present invention is contacted with the Xenopus oocyte introduced with the receptor gene RNA of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are introduced with the receptor gene RNA of the present invention. A compound that changes the binding property of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring and comparing the change in the cell membrane potential when it is brought into contact with the fluffy megael oocyte. .
本方法において、 細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。  In this method, a test compound that suppresses changes in cell membrane potential can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
一方、 試験ィ匕合物のみを本発明の受容体遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵 母細胞に接触させ、 本発明のリガンドと同様な細胞膜電位変化を測定することに よりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。 ·  On the other hand, screening of an agonist is performed by contacting only the test compound with the Xenopus laevis oocyte introduced with the receptor gene RNA of the present invention, and measuring a change in cell membrane potential similar to the ligand of the present invention. You can also. ·
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。  One specific example of the screening method is described below.
氷冷して動けなくなった雌のアフリカッメガエルから取り出した、 卵母細胞塊 を、 MBS液 .（88mM NaCl， ImM KC1, 0. 41mM CaCl2, 0. 33mM Ca (N03) 2, 0. 82mM MgSO 4， 2. 4mM NaHC03, lOniM HEPES； pH7. 4) に溶かしたコラーゲ "一ゼ （0. 5mg/ml ) で卵塊がほぐれるまで 19°C、 1〜6時間、 150rpmで処理する。 外液を MBS液に置 換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピュレーターで本発明の受容体遺伝子 pol y A付加 cRNA (50ng/50nl) を卵母細胞にマイクロインジェクションする。 Oocyte mass removed from a female Xenopus laevis that became immobile due to ice cooling Was dissolved in MBS solution (88 mM NaCl, ImM KC1, 0.41 mM CaCl 2 , 0.33 mM Ca (N0 3 ) 2 , 0.82 mM MgSO 4 , 2.4 mM NaHC0 3 , lOniM HEPES; pH 7.4) Treat with collagen "Ize (0.5mg / ml) at 19 ° C for 1-6 hours at 150rpm until the egg mass is loosened. Replace the external solution with MBS solution 3 times, and use a micromanipulator The receptor gene pol y A-added cRNA (50 ng / 50 nl) of the invention is microinjected into oocytes.
本発明の受容体遺伝子 inRNAは、 組織や細胞から調製してもよく、 プラスミドか ら in vitroで転写してもよい。 本発明の受容体遺伝子 mRNAを MBS液中で 20°Cで 3日 培養し、 これを Ringer液を流している voltage clamp装置のくぼみに置き、 電位 固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、 (― ) 極は細胞外に置く。 電位が安定したら、 本発明のリガンドまたは本発明のリガ ンドおよび試験ィ匕合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録する。 試験化合物 の影響は、 本発明の受容体遺伝子腿導入アフリカッメガエル卵母細胞の細胞膜 電位変化を、 本努明のリガンドのみ含む Ringer液を流した場合と比較することに よって測定することができる。  The receptor gene inRNA of the present invention may be prepared from tissues or cells, or may be transcribed in vitro from a plasmid. The receptor gene mRNA of the present invention is cultured in MBS solution at 20 ° C. for 3 days, and this is placed in a recess of a voltage clamp device in which Ringer solution is flowing, and a potential fixing glass microelectrode and a potential measuring glass microelectrode Is inserted into the cell, and the (-) pole is placed outside the cell. When the potential is stable, the potential change is recorded by flowing a Ringer solution containing the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound. The effect of the test compound can be measured by comparing the change in cell membrane potential of the Xenopus laevis oocytes introduced with the receptor gene of the present invention with a ringer solution containing only the ligand of the present efforts. it can.
細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択す ることができる。  A compound that suppresses changes in cell membrane potential can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
上記の系において、 電^ εの変化量を増大させると、 測定しやすくなるため、 各 種の G蛋白質遺伝子の poly Α付加 RNAを導入してもよい。 また、 カルシウム存在下 で発光を生じるような蛋白質 （例、 aequorinなど） の遺伝子の poly A付加 R Aを 共インジェクションすることにより、 膜電位変化ではなく発光量を測定すること もできる。  In the above system, increasing the amount of change in the electron ε makes it easier to measure, so poly-added RNA of various G protein genes may be introduced. In addition, by co-injecting poly A-added RA of a gene that produces luminescence in the presence of calcium (eg, aequorin), the amount of luminescence can be measured rather than a change in membrane potential.
本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその 塩のスクリーニング用キットは、 本発明の受容体または本発明の受容体を含有す る細胞もしくは細胞の膜画分、 およぴ本発明のリガンドを含有する。  A kit for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention comprises a receptor of the present invention or a cell membrane fraction containing the receptor of the present invention, And contains the ligand of the present invention.
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。  Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1 . スクリーニング用試薬 1. Screening reagents
(i) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 - (i) Measurement buffer and washing buffer-
Hanks' Balanced Salt Solution (インビト'ロジェン社製） に、 0. 05%のゥシ 血清アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。 Hanks' Balanced Salt Solution (Invito Rogen) plus 0.05% urushi serum albumin (Sigma).
孔径 0. 45 μ ηιのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 または用時調製し ても良い。 . Filter sterilize through a 0.45 μηι filter and store at 4 ° C or use at ready. May be. .
(ii) 本発明の受容体標品  (ii) The receptor preparation of the present invention
本発明の受容体を発現させた CH0細胞を、 12穴プレートに 5 X105個 Z穴で継代 し、 37°C、 5%C02、 95%airで 2日間培養したもの。 CH0 cells expressing the receptor of the present invention were subcultured at 5 × 10 5 Z-wells in a 12-well plate and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% air for 2 days.
(iii) 標識リガンド  (iii) Labeled ligand
〔¾〕 、 〔1251〕 、 〔14C〕 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 〔3¾〕 などの放射性同位元素で 標識した本発明のリガンドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを、 4°Cま たは- 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 μ Μに希釈する。 [¾], [125 1] was dissolved [14 C], [32 P], [33 P], in a suitable solvent or buffer ligands of the present invention labeled with a radioactive isotope such as [3 ¾] Store the product at 4 ° C or -20 ° C, and dilute to 1 μ μ with buffer for measurement.
(iv) リガンド標準液  (iv) Ligand standard solution
本発明のリガンドを 0.1%ゥシ血淸アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで lmM となるように溶解し、 - 200Cで保存する。 The ligands of the present invention is dissolved in and adjusted to lmM with PBS containing 0.1% © Shi Chi淸albumin (Sigma) - stored at 20 0 C.
2. 測定法 2. Measurement method
(i) 12穴組織培養用プレートにて培養した本楽明の受容体を発現させた細胞を 、 測定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後、 490 μΐの測定用緩衝液を各穴に加える。  (i) Cells expressing this Rakumei receptor cultured in a 12-well tissue culture plate were washed twice with 1 ml of measurement buffer, and 490 μΐ of measurement buffer was added to each well. .
(ii) 10— 3〜； 10— 1βΜの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した本努明のリガンド を 5μ1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験ィ匕 合物の代わりに 10— 3Μの本 明のリガンドを 5μ1加えておく。 (ii) 10- 3 ~; after 10- l [beta] test compound solution Μ 5 1 added, the labeled ligand of the present TsutomuAkira 5μ1 added and allowed to react for 1 hour at room temperature. A supplementary 5μ1 a 10-3 present Ming ligand Μ instead of test I spoon compound in order to know the amount of non-specific binding.
(iii) 反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識された本発明のリガンドを 0.2N NaOH- 1%SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレ一 ター A (和光純薬製） と混合する。  (iii) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand of the present invention bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
(iv) 液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。  (iv) Measure the radioactivity using a liquid scintillation counter (Beckman) and calculate the Percent Maximum Binding (PMB) by the following formula.
PMB= [ (B-NSB) / (B0-NS B) ] X 100 PMB = [(B-NSB) / (B 0 -NS B)] X 100
PMB： Percent Maximum Binding  PMB: Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値  B: Value when the sample is added
NS B： Non-specific Binding (非特異的結合量）  NS B: Non-specific binding
B。 ：最大結合量 . ■ 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られう る化合物またはその塩は、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合を変化さ せる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進または阻害する化合物であり、 具体的には、 （i) 本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物または その塩 （本発明の受容体ァゴニス ト） 、 （ii) 該刺激活性を有しない化合物 （本 発明の受容体アンタゴニス ト） 、 （iii) 本発明の受容体と本 明のリガンドと の結合力を促進する化合物、 （iv) 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合 力を阻害する化合物などである。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 抗体、 非べプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 糸且織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、 これら化合物は新規 な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 B. : Maximum binding amount. ■ A compound or a salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention or the salt of the present invention. A compound that promotes or inhibits the activity of a receptor; Specifically, (i) a compound having cell stimulating activity via the receptor of the present invention or a salt thereof (receptor agonist of the present invention), (ii) a compound not having the stimulating activity (receptor of the present invention) (Iii) a compound that promotes the binding power of the receptor of the present invention and the ligand of the present invention, (iv) a compound that inhibits the binding power of the receptor of the present invention and the ligand of the present invention, etc. is there. Examples of the compound include compounds selected from peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal yarn and tissue extracts, plasma, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
該化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物の塩としては、 前記した試験化 合物の塩と同様のものが用いられる。  The compound may form a salt, and as the salt of the compound, the same salts as the salts of the test compound described above are used.
上記本発明の受容体ァゴニストであるか、 またはアンタゴニストであるかの評 価方法は、 例えば、 以下の （i) ま は （ii) に従えばよい。  The method for evaluating whether it is a receptor agonist of the present invention or an antagonist may be according to, for example, the following (i) or (ii).
(i) 前記 （a) 〜 （c) のスクリーニング方法で示されるバインディング 'アツ セィを行い、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる （特に 、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した本発明の受容体を介す る細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化合物ま たはその塩は本発明の受容体ァゴ-スト （ァゴ二スト） であり、 該活性を有しな い化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニス ト （アンタゴニス ト） であ る。  (i) a compound that performs the binding assay shown in the screening method of (a) to (c) and changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention (in particular, inhibits binding) Then, it is determined whether or not the compound has a cell stimulating activity via the receptor of the present invention described above. The compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is the receptor agonist (agonist) of the present invention, and the compound having no activity or a salt thereof is the receptor antagonist ( Antagonist).
(ii) (a)試験ィヒ合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、 本発明の受 容体を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその 塩は本発明の受容体ァゴニストである。  (ii) (a) A test compound is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention, and the cell stimulating activity via the receptor of the present invention is measured. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is the receptor agonist of the present invention.
(b)本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、 本 発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた 場合における、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する。 本発 明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物または その塩は本発明の受容体アンタゴニス トである。 .  (b) The present invention when the ligand of the present invention is contacted with a cell containing the receptor of the present invention and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with a cell containing the receptor of the present invention. Measure and compare cell-stimulating activities via the receptors. The compound or its salt capable of decreasing the cell stimulating activity by the compound that activates the receptor of the present invention is the receptor antagonist of the present invention. .
前述したように、 本発明のリガンドは、 消化管機能調節活性、 腸管細胞増殖調 節活性などを有する。 従って、 本発明の受容体ァゴニス トは、 本発明のリガンド が有する生理活性 （例、 消化管機能調節活性、 腸管細胞増殖調節活性など） と同 様の作用を有しており、 安全で低毒性な医薬、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾 患、 糖尿病などの予防 ·治療剤として、 好ましくは消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収 不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸 潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ス ロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などの予防'治療剤として 有用である。 As described above, the ligand of the present invention has gastrointestinal function regulating activity, intestinal cell proliferation regulating activity and the like. Therefore, the receptor agonist of the present invention has the same physiological activity (eg, gastrointestinal function regulating activity, intestinal cell growth regulating activity, etc.) as the ligand of the present invention. A safe and low-toxic drug, such as gastrointestinal tract disease, cancer, immune disease, diabetes, etc., preferably as a preventive or therapeutic agent for gastrointestinal tract diseases (eg, diarrhea, malabsorption syndrome) , Irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia) It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for type II diabetes, etc.) Ulcers caused by inflammatory agents, hyperacidity and ulcers due to postoperative stress.
本発明の受容体アンタゴニストは、 本発明のリガンドが有する生理活性 （例、 消化管機能調節活性、 腸管細胞増殖調節活性など） を抑制することができるので 、 安全で低毒性な医薬、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 •治療剤として、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など ) 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性 疾患 （例、 慢' I"生関節リウマチ、 多発性硬ィ匕症、 重症筋無力症、 インスリン依存型 糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血 小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッドパスチュア 症候群など） など〕 、 肥満などの予防 ·治療剤などとして有用である。  Since the receptor antagonist of the present invention can suppress the physiological activities (eg, gastrointestinal function regulating activity, intestinal cell growth regulating activity, etc.) possessed by the ligand of the present invention, it is a safe and low toxic pharmaceutical such as digestion. Prevention, treatment of gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, diabetes, etc. • Preferably, digestive cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma), immune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, 粥Atherosclerosis, AIDS, autoimmune disease (eg, arrogant 'I "rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic Eri tomato 1 death, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, siedallen syndrome, g Dopasuchua syndrome, etc.), etc.], which is useful as an agent for the prophylaxis or treatment of obesity.
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物は、 安全で低 毒性な医薬、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 ·治療剤と して、 好ましくは消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 ク ローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger - E1 lison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ス テロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍 など〕 、 II型糖尿病などの予防 ·治療剤として有用である。  The compound that promotes the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention is preferably used as a safe and low-toxic pharmaceutical, for example, a prophylactic / therapeutic agent for gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, diabetes, etc. Gastrointestinal disorders (eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, clone disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-E1 lison syndrome), gastritis, reflux esophagus It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for inflammation, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, gastric hyperacidity and ulcers due to post-operative stress, etc.
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物は、 安全で低 毒性な医薬、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 ·治療剤と して、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 .胃 MALTリンパ腫など） 、 免疫疾 患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I 型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性 溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性 紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーグレン症候群、 グッドパスチュア症候群など ) など〕 、 肥満などの予防'治療剤などとして有用である。 The compound that inhibits the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention is preferably a safe and low-toxic drug, for example, a prophylactic / therapeutic agent for gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, diabetes, etc. Is gastrointestinal cancer (eg, gastric cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.), immune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis, AIDS, autoimmune disease (eg, rheumatoid arthritis) Multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic erythematomatosis, glomerulonephritis, autoimmunity Hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, Siegren's syndrome, Goodpasture's syndrome, etc.) It is useful as an agent.
また、 本発明は、 本発明の受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドを用 いることを特徴とする本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法なども提供する。  The present invention also uses a polynucleotide of the present invention that encodes the receptor of the present invention, and a screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention. Also provide.
具体的には、 （i) 本楽明の受容体を産生する能力を有する細胞を培養した場 合と （ii) 本発明の受容体を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を 培養した場合との比較を行い、 本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害 する化合物またはその塩をスクリーニングする。  Specifically, (i) a cell having the ability to produce the receptor of the present invention was cultured, and (ii) a mixture of a cell having the ability to produce the receptor of the present invention and a test compound was cultured. Comparison with the case is carried out, and a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention is screened.
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 (i) と (ii) の場合における 、 本発明の受容体の遺伝子の発現畺 （具体的には、 本発明の受容体量または本努 明の受容体をコードする mRNA量など） を測定して、 比較する。  In the above screening method, for example, in the cases of (i) and (ii), the gene expression of the receptor of the present invention (specifically, the receptor amount of the present invention or the receptor of the present invention is encoded). Measure the amount of mRNA etc.) and compare.
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 抗体、 非ペプチド性化合物 、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物で あってもよい。  Examples of test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. A compound may be sufficient and a well-known compound may be sufficient.
該試験ィ匕合物は塩を形成していてもよく、 該試験化合物の塩としては、 前記し た細胞刺激アツセィ系のスクリ一二ング方法などで用いられる試験ィヒ合物の塩と 同様の物が用いられる。  The test compound may form a salt, and the salt of the test compound is the same as the salt of the test compound used in the above-described cell-stimulating assay system. The thing of is used.
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明ポリペプチドまたは本発明 の受容体を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮 遊して調製する。 バッファ一としては、 p t^ 4〜1 0 (望ましくは、 p H約 6 〜8 ) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファーなどの、 本発明の受容体の活性を 阻害しないバッファーであればレ、ずれでもよい。  In order to carry out the above screening method, cells having the ability to produce the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention are prepared by floating in a buffer suitable for screening. As a buffer, any buffer that does not inhibit the activity of the receptor of the present invention, such as a phosphate buffer or borate buffer of pt ^ 4 to 10 (preferably, pH of about 6 to 8) can be used. Good.
本発明の受容体を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した本発 明の受容体をコードする D N Aを含有するべクタ ^で形質転換された宿主 （形質 転換体） などが用いられる。 宿主としては、 例えば、 C HO細胞などの動物細胞 が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培養する ことによって、 本発明の受容体を細胞膜上に発現させた形質転換体などが好まし く用いられる。 As the cell having the ability to produce the receptor of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector ^ containing the above-described DNA encoding the receptor of the present invention is used. . As the host, for example, animal cells such as CHO cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the receptor of the present invention is expressed on the cell membrane by culturing by the method described above is preferable. Used frequently.
本発明の受容体の蛋白質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明の抗体を用 いて、 細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドまたは受容体を、 ゥエスタ ン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することが できる。  The protein amount of the receptor of the present invention can be measured by a known method, for example, using the antibody of the present invention, the polypeptide or the receptor present in a cell extract or the like using Western analysis, ELISA method or the like. It can be measured according to a method or a method similar thereto.
本発明の受容体の遺伝子の発現量は、 公知の方法、 例えば、 ノーザンブロッテ イングや Reverse transcription - polymerase chain reaction (RT- PCR) 、 リ / ルタイム PCR解析システム （ABI社製、 TaqMan polymerase chain reaction) など の方法あるいはそれに準じる方法にしたがつて測定することができる。  The gene expression level of the receptor of the present invention can be determined by known methods such as Northern blotting, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR analysis system (Aq, TaqMan polymerase chain reaction). ) Etc. or a method according to it can be measured.
例えば、 '上記 (ii) の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、 上記 （ i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を促進する化合 物またはその塩として選択することができる。  For example, the expression of the gene of the receptor of the present invention in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50%, compared to the case (i). A test compound that promotes at least% can be selected as a compound or a salt thereof that promotes the expression of the gene of the receptor of the present invention.
例えば、 上記 （ii) の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、 上記 （ i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験ィヒ合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合 物またはその塩として選択することができる。  For example, the expression of the gene of the receptor of the present invention in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50%, compared to the case (i). The test compound that inhibits the above can be selected as a compound that inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention or a salt thereof.
本発明の受容体の遺伝子の発現を促進 （発現量を增加） する化合物またはその 塩は、 本発明のリガンドと同様に、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病 などの予防 ·治療剤として、 好ましくは消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群 '、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合 部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulce r Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによ る胃酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などの予防 ·治療剤などの医薬として 使用できる。  In the same manner as the ligand of the present invention, the compound or its salt that promotes the expression of the receptor gene of the present invention (eg, increases its expression level) is, for example, a prophylactic / therapeutic agent for gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, diabetes, etc. Gastrointestinal diseases (eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome), gastritis, reflux Used as a prophylactic / therapeutic agent for type II diabetes, etc.), esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, post-surgical stress, acidity and ulcers it can.
本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 本発明の受 容体に対する本発明のリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 ·治療剤として、 好まし くは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性 閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウ マチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田 病、 悪性貧血、 シヱーダレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 肥 満などの予防 ·治療剤などとして有用である。 Since the compound or its salt that inhibits the expression of the receptor gene of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand of the present invention for the receptor of the present invention, for example, digestive tract disease, cancer, immune disease, etc. As a prophylactic / therapeutic agent for diabetes, etc., preferably digestive cancer (eg, gastric cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.), immune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis, AIDS) Autoimmune diseases (eg, rheumatoid arthritis) Gusset, multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic erythematosus, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative Such as colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, Siddalen syndrome, and Goodpasture syndrome)).
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 蛋白、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など から選ばれた化合物であり、 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合性を変 化させるィ匕合物、 本発明の受容体の活性または機能を促進または阻害する化合物 The compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is, for example, peptide, protein, antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue A compound selected from an extract, plasma, etc., which enhances or inhibits the activity or function of a compound that alters the binding between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention; Compound
、 本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害 （発現量を増加または減少） する化合物などである。 And compounds that promote or inhibit (increase or decrease the expression level) the gene of the receptor of the present invention.
該化合物の塩としては、 前記した試験ィ匕合物の塩と同様のものが用いられる。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上記の医薬 （予防 ·治療剤など） として使用する場合、 常 套手段に従って実施することができる。  As the salt of the compound, the same salts as those of the test compound described above can be used. When the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned pharmaceutical (such as a prophylactic / therapeutic agent), it can be carried out according to conventional means.
該化合物またはその塩 ίま、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいほ水もしく はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射 剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認 められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などととも に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって 製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当 な用量が得られるようにするものである。  This compound or its salts, for example, orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., with sugar coating as necessary, or pharmaceutically acceptable It can be used parenterally in the form of a sterile solution with the liquid obtained or an injection such as a suspension. For example, unit doses required for the practice of a generally accepted formulation with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. of the compound or salt thereof It can be produced by mixing in the form. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 ァノレギン酸などのような膨 ィ匕剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 Additives that can be mixed into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, anoleic acid For example, a flouring agent such as magnesium stearate, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, quail oil or cherry. When the dispensing unit form is a capsule, Furthermore, a liquid carrier such as fats and oils can be contained. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally produced vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. it can.
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の捕助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェタノ ールなど） 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコーノレなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0™、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どと併用してもよい。 また、 該ィ匕合'物またはその塩を、 緩衝剤 （例えば、 リン酸 塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 (例えば、 塩ィ匕ベンザルコニ ゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリェチ レングリコールなど) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど ) 、 酸ィ匕防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアン プルに充填される。  Examples of aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other scavengers (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). Auxiliary agents such as alcohol (eg ethanol), polyalcohol (eg propylene glycol, polyethylene glycolate, etc.), nonionic surfactants (eg polysorbate 80 ™, HCO-50, etc.), etc. You may use together. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like as a solubilizing agent. In addition, the compound or a salt thereof is added to a buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), a soothing agent (for example, salt benzalkonium, pro-hydrochloride, etc.) , Stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), anti-oxidation agents, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ 、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) に対して投与することができる。 本発明の受容体ァゴニストの投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルー トなどによっても異なるが、 例えば、 II型糖尿病の治療の目的で該ァゴ二ストを 経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該 化合物を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投 与する。 非経口的に投与する場合、 該ァゴ二ストの投与量は、 投与対象、 対象疾 患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 II型糖尿病の治療の目 的で該ァゴ二ストを注射剤の形で投与する場合、 般的に成人 （体重 60kgとして ) においては、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0.：！〜 20mg、 より好ましくは約 0. 1〜： LOmg静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動 物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。 一方、 本発明の受容体アンタゴニストの投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状 、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 大腸癌の治療の目的で該アンタ ゴニストを経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一 日につき該化合物を約 0.：！〜 100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1 . 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合、 該アンタゴニストの投与量は、 投 与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 大腸癌 の治療の目的で該アンタゴニストを注射剤の形で投与する場合、 一般的に成人 （ 体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg、 好ましくは 約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0.：!〜 10mg静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる また、 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進または阻害する化 合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによ つても異なるが、 例えば、 大腸癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜； 100 mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に 投与する場合、 該化合物の.投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートな どによっても異なるが、 例えば、 大腸癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で 投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合 物を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. 1〜： LOmg静脈注 射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算 した量を投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and low toxic. Monkeys, chimpanzees, etc.). The dose of the receptor agonist of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc. For example, when the agonist is administered orally for the purpose of treating type II diabetes, For adults (weight 60 kg), the compound is administered at a dose of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the dosage of the agonist varies depending on the subject of administration, target disease, symptom, route of administration, etc., for example, for the purpose of treating type II diabetes. When the strike is administered in the form of an injection, generally in adults (with a body weight of 60 kg) the compound is about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.0 :! ~ 20mg, more preferably about 0.1 ~: Conveniently administered by LOmg intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered. On the other hand, the dose of the receptor antagonist of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., for example, generally when the antagonist is administered orally for the purpose of treating colorectal cancer. In adults (with a body weight of 60 kg ), the compound should be about 0. -100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the dosage of the antagonist varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc. For example, the antagonist is administered in the form of an injection for the purpose of treating colorectal cancer. In general, in adults (assuming a body weight of 60 kg), the compound is administered at about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.:! To 10 mg intravenously per day. It is convenient to administer. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered. Also, the dose of a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention. Depends on the subject of administration, target disease, symptom, route of administration, etc. For example, when the compound is administered orally for the purpose of treating colorectal cancer, it is generally The compound is administered from about 0.1 to about 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the dose of the compound varies depending on the subject of administration, target disease, symptom, route of administration, etc. For example, the compound is administered in the form of an injection for the purpose of treating colorectal cancer. When administered, generally in adults (with a body weight of 60 kg), the compound is about 0.01-30 mg, preferably about 0.1-20 mg, more preferably about 0.1-: LOmg intravenously per day. Conveniently administered by injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg body weight can be administered.
〔2〕 本発明の受容体が関与する各種疾病の予防，治療剤  [2] Preventive and therapeutic agents for various diseases involving the receptor of the present invention
本発明の受容体は、 前述したような活性を有する本発明のリガンドへの結合活 性などを有する。 従って本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) に異常があったり、'欠損している場合には、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病など、 好ましくは消化管疾患 〔例、 吸収不良症候群、 過敏性腸 症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 下痢、' 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰 瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dy spepsia) 、 非ステロイ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃 酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などとなる可能性が高い。 従って、 本発明 の受容体または本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A) は、 例えば、 消化管疾 患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例 、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎 、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因 する潰瘍、 手術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などの 予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として使用することができる。 The receptor of the present invention has a binding activity to the ligand of the present invention having the activity described above. Therefore, when the receptor of the present invention or the polynucleotide of the present invention (eg, DNA) is abnormal or 'deficient, for example, digestive tract disease, cancer, immune disease, diabetes, etc., preferably digestion Vascular diseases (eg, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, diarrhea, 'gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomosis ulcer, Zollinger-Ellison syndrome), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dy spepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, stomach due to postoperative stress Hyperacidity and ulcers, etc.] are likely to result in type II diabetes. Therefore, the receptor of the present invention or the polynucleotide of the present invention (eg, DNA) can be used, for example, for gastrointestinal diseases (eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer) Duodenal ulcers, anastomotic ulcers, Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory agents, post-surgical hyperacidity and ulcers ] Can be used as a low-toxic and safe medicine such as preventive and therapeutic agents for type II diabetes.
本発明の受容体または本発明のポリヌクレチドは、 例えば、 生体内において本 発明の受容体が減少あるいは欠損している患者がいる場合に、 ひ） 本発明のポ リヌクレオチドを該患者に投与し、 生体内で本発明の受容体を発現させることに よって、 （ii) 細胞に本発明のポリヌクレオチドを揷入し、 本発明の受容体を発 現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または （iii) 本発明の 受容体を該患者に投与することなどによって、 該患者における本発明の受容体の 役割を十分に、 あるいは正常に発揮させることができる。  The receptor of the present invention or the polynucleotide of the present invention can be used, for example, when there is a patient in which the receptor of the present invention is reduced or deficient in vivo. By expressing the receptor of the present invention in vivo, (ii) inserting the polynucleotide of the present invention into a cell, expressing the receptor of the present invention, and then transplanting the cell to a patient Or (iii) The role of the receptor of the present invention in the patient can be fully or normally exerted by administering the receptor of the present invention to the patient.
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 該ポ リヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ 一、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに 揷入した後、 常套手段に従って、 ヒ トまたは温血動物に投与することができる。 本発明のポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための捕助剤な どの生理学的に認められる担体とともに製剤ィ匕し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテ 一テルのようなカテーテルによって投与できる。  When the polynucleotide of the present invention is used as the above-mentioned preventive / therapeutic agent, the polynucleotide is inserted alone or in an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector or the like. Thereafter, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means. The polynucleotide of the present invention can be prepared as it is or with a physiologically recognized carrier such as a capturing agent for promoting ingestion, and can be administered through a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
本発明の受容体を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なくとも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。  When the receptor of the present invention is used as the above preventive / therapeutic agent, it is purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more. Is preferably used.
本発明の受容体は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 ェ リキシル剤、 マイクロカプセノレ剤などとして経口的に、 または水もしくはそれ以 外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で 非経口的に使用できる。 例えば、 本発明の受容体を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認めら れた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することが できる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られ るようにするものである。 The receptor of the present invention can be used, for example, orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsenole, etc. with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of a sterile solution or an injection such as a suspension. For example, the receptor of the present invention in a unit dosage form required for the practice of a generally accepted formulation with physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. Can be produced by mixing it can. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。  Additives that can be mixed into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. For example, a swelling agent such as magnesium stearate, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, squid mono oil or cherry are used. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the material of the above type. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally produced vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. it can.
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解捕助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェタノ ールなど） 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0™、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム 緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば； 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど ) 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保 存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合 してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。  Examples of aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). Auxiliary agents such as alcohol (eg ethanol), polyalcohol (eg propylene glycol, polyethylene glycol etc.), nonionic surfactants (eg polysorbate 80 ™, HCO-50 etc.), etc. You may use together. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like as a solubilizing agent. Buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, pro-hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.) , Preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection is usually filled in a suitable ampoule.
本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) が挿入されたベクターも上記と同様 に製剤化され、 通常、 非経口的に使用される。  A vector into which the polynucleotide of the present invention (eg, DNA) is inserted is formulated in the same manner as described above and is usually used parenterally.
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、' トリ、 ヒッジ、 ブ タ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することができる。 本発明の受容体の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによ つても異なるが、 例えば、 II型糖尿病の治療の目的で該受容体を経口投与する場 合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該受容体を約 0. 1 〜： I00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経 口的に投与する場合、 該受容体の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ル ートなどによっても異なるが、 例えば、 II型糖尿病の治療の目的で該受容体を注 射剤の形で投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日に つき該受容体を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0.：!〜 10mg静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も'、 体重 60kg当 たりに換算した量を投与することができる。 The preparations obtained in this way are safe and low toxic. Cats, dogs, monkeys, etc.). The dosage of the receptor of the present invention depends on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc. However, for example, when the receptor is orally administered for the purpose of treating type II diabetes, generally in adults (with a body weight of 60 kg) the receptor is about 0.1 to about: I00 mg, preferably about 1.0-50 mg , more preferably about 1.0-20 mg is administered. When administered parenterally, the dose of the receptor varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc.For example, the receptor is administered for the purpose of treating type II diabetes. When administered in the form of a propellant, generally for adults (with a body weight of 60 kg ), the receptor is about 0.01-30 mg, preferably about 0.1-20 mg, more preferably about It is convenient to administer 0.:! To 10 mg intravenously. In the case of other animals, the dose can be administered per 60 kg body weight.
〔3〕 本発明の受容体の定量  [3] Quantification of the receptor of the present invention
本発明の抗体は、 本発明の受容体を特異的に認識することができるので、 被検 液中の本発明の受容体の定量、 特に'サンドィツチ免疫測定法による定量などに使 用することができる。  Since the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor of the present invention, the antibody of the present invention can be used for quantification of the receptor of the present invention in a test solution, in particular, quantification by a Sandwich immunoassay. it can.
すなわち、 本発明は、  That is, the present invention
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明の受容体とを競合的に 反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明の受容体の割合を測定すること を特徴とする被検液中の本 明の受容体の定量法、 およぴ  (i) Competitively reacting the antibody of the present invention with a test solution and the labeled receptor of the present invention, and measuring the ratio of the labeled receptor of the present invention bound to the antibody Quantitative determination of the receptor of the present invention in a test solution characterized by
(ii) 被検液と担体上に不溶ィ匕した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法を提供する。 上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明の受容体の N端部を認識 する抗体で、 他方の抗体が本発明の受容体の C端部に反応する抗体であることが 望ましい。  (ii) After reacting the test solution with the antibody of the present invention insoluble on the carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or successively, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. There is provided a method for quantifying the receptor of the present invention in a test solution, characterized in that it is measured. In the quantification method (ii) above, one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the receptor of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal part of the receptor of the present invention. desirable.
また、 本発明の受容体に対するモノクローナル抗体を用いて本発明の受容体の 定量を行うことができるほ力、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 こ れらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b，、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 In addition, the detection of the receptor of the present invention can be carried out using a monoclonal antibody against the receptor of the present invention, and detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ′) 2 , Fab, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
本発明の抗体を用いる本発明の受容体の定量法は、 特に制限されるべきもの ではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 ポリペプチド量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これ を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ れば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィム ノメトリック法おょぴサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点 で、 後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。 The method for quantifying the receptor of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody single antigen corresponding to the amount of antigen (eg, amount of polypeptide) in the solution to be measured. The amount of complex is detected by chemical or physical means Any measurement method may be used as long as it is a measurement method that calculates from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method, and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described below is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 'えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔14c〕 などが用いられる。 上記酵素としては 、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 i3—ガラクトシダーゼ、 β— グノレコシダーゼ、 ァノレカリフォスファターゼ、 パー才キシダーゼ、 リンゴ酸脱水 素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フル ォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチンーアビジン系を用いるこ ともできる。 Examples of the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, and luminescent substances. As the radioisotope, for example, [ 125 1], [ 131 1], [¾], [ 14 c] and the like are used. As the above-mentioned enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, i3-galactosidase, β-gnorecosidase, anolecalifosphatase, peroxidase, malate dehydrase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can be used for binding of the antibody or antigen to the labeling agent.
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常ポ リペプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用レ、 る方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの 不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あ るいはガラス等があげられる。  For insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a polypeptide or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
サンドィツチ法においては不溶ィ匕した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識ィ匕した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶ィヒ担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の受容体量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に 行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 標識 化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドィ ッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体ある 、は標識用抗体に用いられる 抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種 類以上の抗体の混合物を用いてもよ.い。  In the Sandwich method, the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent on the insoluble carrier, the amount of receptor in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilization method can be the same as those described above. In addition, in the immunoassay based on the sandwich method, the antibody used for the solid phase or the antibody used for the labeling antibody does not necessarily need to be one, and two or more types are used for the purpose of improving measurement sensitivity. A mixture of antibodies may be used.
本発明のサンドィツチ法による本発明の受容体の測定法においては、 1次反応 と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明の受容体の結合 する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次 反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明の受容 体の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以 外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。 In the method for measuring the receptor of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is bound to the receptor of the present invention. Antibodies with different sites are preferably used. That is, the antibody used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably, for example, when the antibody used for the secondary reaction recognizes the C-terminal part of the receptor of the present invention, the antibody used for the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C end, for example, the N end is used.
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ のち、 未反応の標識抗原 (F ) と、 抗体と結合した標識抗原 (B ) とを分離し （ B Z F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する 。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレンダリ コール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体とし て固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。  The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method, or nephrometry. In the competitive method, an antigen in a test solution and a labeled antigen are used for the antibody. After reacting competitively, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (BZF separation), the amount of either B or F is measured, and the test solution Quantify the amount of antigen in it. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, a BZF separation is made of polyethylene dalitol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid phase antibody is used as the first antibody, or The first antibody is soluble and the solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
ィムノメトリツク法では、 被検液中の抗厚と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体と.を反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。  In the immunometric method, the anti-thickness in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of labeled antibody, and then adding the immobilized antigen to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
また、 ネフロメ トリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーな どが好適に用いられる。  In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の受容体の測定系を構築す ればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照 することができる。 .  In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, it is not necessary to set special conditions and operations. The receptor measurement system of the present invention may be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and procedures in each method. For details on these general technical means, refer to reviews and textbooks. .
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 （"Methods in ENZYM0L0GY J Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemica 1 Techniques (Part B) )、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D .' Selected Immunoassays) ) 、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E ： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol, 121 (Immunochemical Techniqu es (Part I ·· Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカ デミックプレス社発行）などを参照することができる。 For example, Hiroshi Irie “Radio Imno Atsusei” (Kodansha, issued in 1954), Hiroshi Irie “Aki Radio Imno Atsusei” (Kodansha, issued in 1954), Eiji Ishikawa "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, published in 1953), Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunity Assay" (2nd edition) (Medical Shoin, published in 1957), Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (3rd edition) (Medical Shoin, published in 1965), ("Methods in ENZYM0L0GY J Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))", ibid. Vol. 73 (Immunochemica 1 Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibid. Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D. 'Selected Immunoassays)), i. Methods)), Vol. 121 (Immunochemical Technologies (Part I ··· Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))) (published by Academic Press, Inc.).
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の受容体を感 度良く定量することができる。 '  As described above, the receptor of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention. '
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の受容体の濃度を定量することによつ て、 本発明の受容体の濃度の増加が検出された場合、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病など、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ 腫など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己 免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬ィ匕症、 重症筋無力症、 インスリン 依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体 腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特 発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シヱーダレン症候群、 グッドパス チユア症候群など） など〕 、 肥満などの疾病である、 または将来罹患する可能性 が高いと診断することができる。 また、 本発明の受容体の濃度の減少が検出され た場合には、 例えば、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群 、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinge r- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 UD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多おょぴ 漬瘍など〕 、 II型糖尿病などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと 診断することができる。  Further, when an increase in the concentration of the receptor of the present invention is detected by quantifying the concentration of the receptor of the present invention using the antibody of the present invention, for example, gastrointestinal tract disease, cancer, immunity Diseases, diabetes, etc., preferably gastrointestinal cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.), immune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis, AIDS, autoimmune disease ( Examples: Rheumatoid arthritis, Multiple sclerosis, Myasthenia gravis, Insulin-dependent diabetes mellitus (Type I diabetes), Inflammatory bowel disease, Systemic erythematosus, glomerulonephritis, Autoimmune hemolytic anemia , Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, Siddalen syndrome, Goodpath's syndrome, etc.) Disease It can be diagnosed that there is a high possibility of being affected. In addition, when a decrease in the concentration of the receptor of the present invention is detected, for example, digestive tract diseases [eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenum) Ulcers, anastomotic ulcers, Zollinge r-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, UD (Non Ulcer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory agents, post-surgical stress hyperacidic acid pickles Etc.] can be diagnosed as having a disease such as type II diabetes or having a high possibility of suffering in the future.
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明の受容体 を検出するために使用することができる。 また、 本努明の受容体を精製するため に使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の受容体の検出、 被検 細胞内における本発明の受容体の挙動の分析などのために使用することができる In addition, the antibody of the present invention can be used to detect the receptor of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue. In order to purify the receptor of this effort It can be used for the preparation of antibody columns used for detection, detection of the receptor of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the receptor of the present invention in test cells, etc.
〔4〕 遺伝子診断薬 [4] Genetic diagnostic agents
本発明のポリヌクレオチド （D NA) は、 例えば、 プローブとして使用するこ とにより、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ト リ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明の受 容体をコードする D N Aまたは mR NAの異常 （遺伝子異常） を検出することが できるので、 例えば、 該 D NAまたは mR NAの損傷、 突然変異あるいは発現低 下や、 該 D NAまたは mR NAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬とし て有用である。  The polynucleotide (DNA) of the present invention can be used, for example, as a probe to allow human blood warm animals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, tori, hidges, pigs, bushes, horses, An abnormality in the DNA or mRNA encoding the receptor of the present invention (gene abnormality) in cats, dogs, monkeys, etc.), for example, damage, mutation or mutation of the DNA or mRNA It is useful as a gene diagnostic agent for decreasing expression, increasing DNA or mRNA, or overexpressing.
本発明の D N Aを用いる上記の it伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブ リダィゼーシヨンや P C R—S S C P法 （Genomics, 第 5卷， 874〜879頁（1989年） 、 Proceedings of the National Academy of sciences of the United States o f America,第 86卷， 2766〜2770頁（1989年）） などにより実施することができる。 例えば、 本発明の受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例えば、 消 化管疾患、 癌、 免疫疾患、 .糖尿病など、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌 、 胃 MALTリンパ腫など) 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化 症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力 症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト 一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆 汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シヱーグレン症候 群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 肥満などの疾病である、 または将来 罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明の受容体の遺伝子 の発現減少が検出された場合は、 例えば、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候 群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻 合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 JD (Non U1 cer Dyspepsia) 、 非ステロイ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスに よる胃酸過多および潰瘍など〕 、 II型糖尿病などの疾病である、 または将来罹患 する可能性が高いと診断することができる。 〔5〕 アンチセンスポリヌクレオチド （例、 D NA) を含有する医薬 The above-described it gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of sciences of The United States of America, 86, 2766-2770 (1989)). For example, when overexpression of the gene of the receptor of the present invention is detected, for example, gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, diabetes, etc., preferably digestive organ cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, stomach MALT) Lymphoma, etc.), immune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis, AIDS, autoimmune disease (eg, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus) Type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic erythematosus, death, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura , Harada disease, pernicious anemia, Shigren syndrome, Goodpasture syndrome, etc.)] can be diagnosed as having a disease such as obesity or having a high possibility of suffering in the future. In addition, when a decrease in the expression of the receptor gene of the present invention is detected, for example, digestive tract diseases [eg, diarrhea, malabsorption syndrome group, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, Duodenal ulcers, anastomotic ulcers, Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, JD (Non U1 cer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory agents, post-surgical hyperacidity and It can be diagnosed that the disease is such as type II diabetes or is likely to suffer in the future. [5] Pharmaceuticals containing antisense polynucleotides (eg, DNA)
本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A) に相補的に結合し、 該ポリヌクレオ チド （例、 D NA) の発現を抑制することができるアンチセンスポリヌクレオチ ド （例、 アンチセンス D N A) は、 例えば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病 などの予防 '治療剤として、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリ ンパ腫など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、„粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢 I1生関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インス リン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸 球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変 、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッド パスチユア症候群など） など〕 、 肥満などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な 医薬として有用である。 ' An antisense polynucleotide (eg, antisense DNA) that binds complementarily to the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention and can suppress the expression of the polynucleotide (eg, DNA) is, for example, Gastrointestinal diseases, cancers, immune diseases, prevention of diabetes, etc. As a therapeutic agent, preferably digestive organ cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.), immune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, "atherosclerosis, AIDS, autoimmune diseases (e.g., chronic I 1 production rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin dependent diabetes mellitus (I diabetes mellitus), inflammatory bowel disease, Systemic erythematosus 1 Pasuchiyua syndrome, etc.), etc.] and is useful as a safe medicament low toxicity, such as an agent for the prophylaxis or treatment of obesity. '
例えば、 上記アンチセンス D N Aを用いる場合、 該アンチセンス D N Aを単独 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァ ソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに揷入した後、 常套手段 に従って実施することができる。 該アンチセンス D N Aは、 そのままで、 あるい は摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 さらに、 該アンチセンス D NAは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用す ることもできる。  For example, when the above antisense DNA is used, the antisense DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. Can do. The antisense DNA can be used as it is, or can be formulated together with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered through a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter. Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.
上記ァンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明の受容体をコードする R N Aの一部を含有する二重鎖 R NA (本発明の受容体に対する s i R N A (small (short) interfering藤)、 s h R NA (small (.short) hairpin腿)など) 、 本努明の受容体をコードする R NAの一部を含有するリポザィムなども、 本発 明のポリヌクレオチドの発現を抑制することができ、 生体内における本発明の受 容体または本発明のポリヌクレオチドの機能を抑制することができるので、 例え ば、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防 ·治療剤と'して、 好ましくは 消化器癌 （例、 胃癌、.大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞 性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ 、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症 性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本 病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性 f硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 肥満な どの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。 Similar to the antisense polynucleotide described above, a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the receptor of the present invention (si RNA (small (short) interfering wisteria) for the receptor of the present invention, sh RNA) (such as small (.short) hairpin thigh)), lipozymes containing a part of the RNA encoding the receptor of this Takuaki can also suppress the expression of the polynucleotide of the present invention. In the present invention, the function of the receptor of the present invention or the polynucleotide of the present invention can be suppressed. For example, it is preferably used as a prophylactic / therapeutic agent for digestive tract diseases, cancer, immune diseases, diabetes, etc. Cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.), immune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis, AIDS, autoimmune disease (eg, rheumatoid arthritis) Multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic erythematosus, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colon Inflammation, primary biliary f cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, Siedalen syndrome, Goodpasture syndrome, etc.)) and low toxicity and safety such as obesity It is useful as a medicine.
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷， 494頁， 2001年） に準じて 、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。  The double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7卷， 221頁 ， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造する ことができる。 例えば、 本発明の受容体をコードする RN Aの一部に公知のリボ ザィムを連結することによつて製造することができる。 本発明の本発明の受容体 をコードする R NAの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され得る本 発明の RNA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げられる。  The lipozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention in accordance with a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7 卷, 221 pages, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of RNA encoding the receptor of the present invention. A part of the RNA encoding the receptor of the present invention of the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known ribozyme.
上記の二重鎖 RN Aまたはリボザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場合 、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる  When using the above-mentioned double-stranded RNA or ribozyme as the prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
〔6〕 本努明の抗体を含有する医薬 [6] Medicine containing the antibody of this effort
本発明の抗体は、 例えば消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 糖尿病などの予防，治療 剤として、 好ましくは消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 免 疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （ 例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 The antibody of the present invention is, for example, as a preventive or therapeutic agent for gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, diabetes, etc., preferably digestive organ cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.), immune disease [eg, Chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis, AIDS, autoimmune disease (eg, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus)
(I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免 疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減 少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッドパスチュア症候群 など） など〕 、 肥満などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用で あ 。 (Type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic erythematosus, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenia Purpura disease, Harada disease, pernicious anemia, Siedalen syndrome, Goodpasture syndrome, etc.)) and is useful as a low-toxic and safe drug for prevention and treatment of obesity.
本発明の抗体を含有する上記医薬は、 そのまま液剤として、 または適当な剤型 の医薬糸且成物として、 ヒトゃ温血動物 （例、 ラット、 ゥサギ、'ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することがで きる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なる I 例えば、 大腸癌患者の治療のために使用する場合には、 本努明の抗体を 1回 量として、 通常 0. 01〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さ らに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1日 1 〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および 経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合 には、 その症状に応じて増量してもよい。 The above-mentioned medicine containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid, or as a medicinal thread and composition of a suitable dosage form. Inu, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally. The dose varies depending on the subject of administration, target disease, symptoms, route of administration, etc. I For example, when used for the treatment of colorectal cancer patients, the antibody of this effort is usually taken as 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight. , preferably in the et to about 0. l~5m g / kg body weight, about 1 day 1-5 times, preferably conveniently about 1-3 times a day, that is administered by intravenous injection. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口 または非経口投与に適する剤形として提供される。  The antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration comprises the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形 、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤など があげられる。 かかる糸且成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において 通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠 剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシゥ ムなどが用いられる。  That is, for example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions, etc. Such yarns are produced by a known method and contain carriers, diluents or excipients usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate, etc. are used as carriers and excipients for tablets.
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮內注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体また はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁また は乳ィ匕することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤 、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレング リコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベー 卜 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduct of nydrogenated casto r oil) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油な どが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを 併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直 腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合す ることによって調製される。 As a composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories, and the like are used. Injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, skin injections, intramuscular injections, infusions, etc. Is included. Such an injection is prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or milking the above-mentioned antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection. As an aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, etc. are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO—50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of nydrogenated cast oil)), etc. may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil and soybean oil are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. The suppository used for direct bowel administration is a mixture of the above antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base. It is prepared by.
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜： L 0 Omg、 その他の剤形では 10〜25 Omgの上記抗体が含有されていることが 好ましい。  The above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of dosage forms of such dosage units include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections 5 to: L 0 Omg, and other dosage forms preferably contain 10 to 25 Omg of the above antibody.
なお前記した各糸且成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。  In addition, each of the above-described yarns and compounds may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the above antibody.
〔7〕 DNA転移動物  [7] DNA transfer animals
本発明は、 外来性の本発明の受容体をコードする DNA (以下、 本発明の外来 性 DN Aと略記する） またはその ¾異DNA (本発明の外来性変異 DN Aと略記 する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。  The present invention may be abbreviated as DNA encoding a foreign receptor of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DNA of the present invention) or a different DNA (exogenous mutant DNA of the present invention). A non-human mammal having
すなわち、 本発明は、  That is, the present invention
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 (1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （1) 記載の動物、 (2) The animal according to (1) above, wherein the non-human mammal is a rodent
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記 （2) 記載の動物、 および (3) The animal according to (2) above, wherein the rodent is a mouse or a rat, and
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターなどを提供する。 (4) Provided is a recombinant vector that contains the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and can be expressed in mammals.
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ 'る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフヱクシヨン法 、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキ ストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作出することが できる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用する こともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融 合させることにより本発明の DNA転移動物を作出することもできる。 非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ 、 ネコ、 モ/レモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも 、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57 BL/6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F系統， BDFi系 統， B 6D 2 系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラット (例 えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。 A non-human mammal having an exogenous DN A of the present invention or a mutant DN A thereof (hereinafter abbreviated as a DN A-transferred animal of the present invention) is an embryo containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a progenitor cell thereof. Preferably, for cells, etc., at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the single cell or fertilized egg cell stage and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, electric pulse It can be produced by transferring the target DNA by the method, ribofusion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. In addition, by the DNA transfer method, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs, tissue cells, etc., and used for cell culture, tissue culture, etc. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned embryo cells with a known cell fusion method. Examples of non-human mammals include ushi, pig, hidge, goat, usagi, inu, cat, mo / remot, hamster, mouse, rat and the like. Among them, rodents, especially mice (for example, C57 BL / 6 strain, DBA 2 strain, etc. as pure strains) are relatively short in the ontogeny and biological cycle from the aspect of creating disease animal model system, and easy to breed As a hybrid system, B 6 C 3 F system, BDFi system, B 6D 2 system, BALBZc system, ICR system, etc.) or rat (eg, Wi star, SD, etc.) are preferable.
哺 動物において発現しうる組'換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。  Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DN Aをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 ^の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば The exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by a non-human mammal but the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal. As the mutated DNA of the present invention, ^
、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への 置換などが生じた DN Aなどが用いられ、 また、 異常 DN Aも含まれる。 , Mutations, etc.), specifically, DNAs with added bases, deletions, substitutions with other bases, etc. are used, and abnormal DNAs are also included.
該異常 DNAとしては、 異常な本発明の受容体を発現させる DNAを意味し、 例えば、 正常な本発明の受容体の機能を抑制するポリべプチドを発現させる DN The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal receptor of the present invention, for example, a DN that expresses a polypeptide that suppresses the function of a normal receptor of the present invention.
Aなどが用いられる。 A or the like is used.
本発明の外来性 DN Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種の'どちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN The exogenous DNA of the present invention may be derived from any mammal of the same or different species as the subject animal. In order to transfer the DNA of the present invention to the target animal, DN bound downstream of a promoter capable of expressing the DNA in animal cells.
Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト DIt is generally advantageous to use it as an A construct. For example, human D of the present invention
N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の D N Aを有する各種哺乳動 物 (例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モノレモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラク ト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精When transferring NA, various mammals that have high homology with the DNA of the present invention (for example, rabbits, dogs, cats, monoremots, hamsters, rats, mice) can be expressed. The target mammal is fertilized with a DNA construct (eg, vector, etc.) bound to the human DNA of the present invention downstream of the promoter.
#P、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本宪明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。 #P For example, a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of this subject can be produced by microinjection into a fertilized mouse egg.
本発明の受容体の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由 来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 ファージなどのバタテリオファージ 、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまたはバ キュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来の プラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好まし く用いられる。 Examples of the expression vector for the receptor of the present invention include plasmids derived from E. coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, butteriophages such as phages, retroviruses such as Moroni-leukemia virus, vaccinia viruses or viruses. Animal viruses such as culovirus are used. Of these, plasmids derived from E. coli, plasmids derived from Bacillus subtilis or plasmids derived from yeast are preferably used.
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （i) ウィル ス (例、 シミアンウイノレス、 サイ トメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモ 一ター、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス ター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 インス リン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン 、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダルタチオン S—トランス フェラーゼ、 血小板由来成長因子 ;3、 ケラチン K l， 1 0ぉょび 1 4、 コラ 一ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ ;3 Iサブュニ ット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウ ム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K一 ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティ ナーゼ 1組織ィンヒビター、 MHCクラス I抗原 (H- 2 L) 、 H— r a s、 レ ニン、 ドーパミン j8—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ポリべ プチド鎖延長因子 l a (EF- 1 α) 、 βァクチン、 αおよび i3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロブリン、 Th y— 1、 免疫グロプリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミ ォグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレプロエンケフアリン A、 バ ソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現する ことが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 a (EF— 1 ） のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ j3ァクチンプロモータ 一などが好適である。  Examples of promoters that regulate the above DNA expression include, for example, (i) promoters of DNA derived from viruses (eg, simian winoles, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus). (Ii) Promoters derived from various mammals (human, usagi, inu, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, Muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dartathione S-transferase, platelet-derived growth factor; 3, keratin K l, 10 0 14 1, collagen type I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase ; 3 I subunit, dystrophin Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor thicine synkinase (commonly abbreviated as Tie 2), sodium thallium adenosine triphosphate (Na, K-one ATP ase), Neurofilament light chain, meta-orchionein I and IIA, meta-oral proteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine j8-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO) Polypeptide chain elongation factor la (EF-1 α), β-actin, α and i3 myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Th y-1, immunoglobulin, heavy chain variable (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, preproenkephalin A, A promoter such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of being highly expressed throughout the body, a human polypeptide chain elongation factor 1a (EF-1) promoter, a human and chicken j3 lactin promoter, and the like are suitable.
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネタ一などが 用いられる。 The vector preferably has a sequence (generally called terminator 1) that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal. For example, each vector derived from viruses and various mammals The sequence can be used, preferably the SV40 terminator of simian virus etc. Used.
その他、 目的とする外来性 D N Aをさらに髙発現させる目的で各 D N Aのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 D NAのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5， 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3， 下流 に連結することも目的により可能である。  In addition, the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc., 5 upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region or for the purpose of further expressing the desired foreign DNA It is also possible to connect to the translation area 3 or downstream of the translation area.
正常な本発明の受容体の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 (例えば、 ゥサ ギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D NAおよび市販の各種ゲノム D NAライブ ラリーよりゲノム D NAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺 細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 D NAを原料 として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D NAは、 上記の細胞または 組織より得られた正常なポリぺプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異 した翻訳領域を作製することができる。  The normal translation region of the receptor of the present invention is a liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast derived from a human or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) As a raw material, all or part of the genomic DNA from the DNA of various origins and commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblast-derived RNA Can be acquired. In addition, exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal polypeptide translation region obtained from the cells or tissues described above by point mutagenesis.
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D N Aコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。  The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by an ordinary DNA engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。  The transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cell of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the animal that produced it retain the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. It means to do. The offspring of this type of animal that inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
本発明の外来性正常 D N Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。  The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. I can do it.
' 受精卵細胞段階における本発明の外来性 D NAの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来 f生 D N Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞およぴ体細胞の全てに本発明の外来性！） N Aを過 剰に有することを意味する。 本努明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。 'Transfer of exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. Existence of the exogenous f-live DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal are exogenous to the germ cells and somatic cells of the present invention! ) This means having an excess of NA. This kind of animal has inherited the exogenous DNA The offspring obtains homozygous animals having introduced DNA in both homologous chromosomes having the exogenous DNA of the present invention excessively in all of the germ cells and somatic cells, and by mating the male and female animals, It can be propagated and passaged so as to have the DNA in excess.
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本努明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明の受容体の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として利用 することができる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用いて、 本発明の受 容体の機能亢進症や、 本発明の受容体が関連する疾患の病態機序の解明およびこ れらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。  The non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high expression of the normal DNA of the present efforts, and finally the receptor of the present invention is promoted by promoting the function of the endogenous normal DNA. Can develop as a model animal. For example, using the normal DNA-metastasized animal of the present invention, elucidation of the pathologic mechanism of the hypersensitivity of the receptor of the present invention and diseases associated with the receptor of the present invention, and methods for treating these diseases It is possible to study.
また、 本努明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の 受容体の増加症状を有することから、 本発明の受容体に関連する疾患 〔例、 消化 管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 (例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger-Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド.系抗炎症剤に 起因する潰瘍、 手術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 癌 （例、 消化 器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道 癌、 咽頭癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺 癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 免疫疾患 〔例、 敗血症、 粥状硬 化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性閉塞性肺疾患、 慢性関節リウマチ、 多発 性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾 患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰 瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧 血、 シエーグレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 II型糖尿病、 肥満など〕 に対する予防 ·治療剤のスクリ一二ング試験にも利用可能である。 一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物と'して通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラタ卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D NAの転移は、 対象哺轧動物の胚芽細胞おょぴ 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 In addition, since mammals to which exogenous normal DNA of this effort has been transferred have increased symptoms of the released receptor of the present invention, diseases associated with the receptor of the present invention [eg, gastrointestinal diseases [ Examples: Diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia ) Non-steroidal anti-inflammatory drugs caused ulcers, post-operative stress gastric hyperacidity and ulcers, etc.), cancer (eg, gastrointestinal cancer (eg, gastric cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.), breast cancer, lung cancer , Prostate cancer, esophageal cancer, pharyngeal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, triumphal cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.), immune disease [Eg, sepsis, atherosclerosis Illness, AIDS, autoimmune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic Eli tomatoes death, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, malignant anemia, Siegren's syndrome, Good It can also be used in screening tests for prophylactic / therapeutic agents (such as Pasture syndrome)), type II diabetes, obesity, etc.]. On the other hand, the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention confirmed that the exogenous DNA was stably retained by mating, and was subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. I can do it. Furthermore, the desired exogenous DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a source. DNA converter with promoter Strata can be made using conventional DNA engineering techniques. Metastasis of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germ cell of the produced animal after the DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germ cell and somatic cells. . The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous goat animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred to have the DNA.
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明の受容体の機能不活性型不応症どなることがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本発明 の受容体の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検 討を行なうことが可能である。  The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high expression of the abnormal DNA of the present invention, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA, so that the receptor of the present invention is finally expressed. It can be a functional inactive refractory disease and can be used as a model animal for the disease state. For example, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functional inactive refractory of the receptor of the present invention and to examine a method for treating this disease using the abnormal DNA transfer animal of the present invention.
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明の受容体の機能不活性型不応症における本癸明の異常ポリぺプチドまたは本発 明の異常受容体による正常ポリペプチドまたは受容体の機能阻害 （dominant neg ative作用） を解明するモデルとなる。  In addition, as a specific applicability, the abnormal DNA high-expressing animal of the present invention can be used for the abnormal polypeptide of the present invention or the abnormal reception of the present invention in the functional inactive refractory of the receptor of the present invention. It is a model to elucidate the function inhibition (dominant neg ative action) of normal polypeptides or receptors by the body.
また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の受 容体の増加症状を有することから、 本発明の受容体の機能不活性型不応症に対す る治療薬スクリ一ユング試験にも利用可能である。  In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the receptor of the present invention that has been released, the therapeutic drug screen for the functional inactive refractory of the receptor of the present invention It can also be used for the Jung test.
また、 上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、  In addition, as other possible uses of the above two kinds of DNA-transferred animals of the present invention, for example,
(i) 組織培養のための細胞源としての使用、  (i) use as a cell source for tissue culture;
(ii) 本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは RNAを直接分析する 、 または D NAにより発現されたポリぺプチドまたは受容体組織を分析するこ とによる、 本発明の受容体により特異的に発現あるいは活性化するポリぺプチド または受容体との関連性についての解析、  (ii) by the receptor of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention, or by analyzing the polypeptide or receptor tissue expressed by the DNA. Analysis of the relationship to a polypeptide or receptor that is specifically expressed or activated,
(iii) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 .一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、 (iii) Culturing the cells of the tissue with DNA by standard tissue culture techniques, Use to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture,
(iv) 上記 （iii) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および  (iv) Screening for drugs that enhance cell function by using the cells described in (iii) above, and
(V) 本発明の変異ポリべプチドまたは受容体を単離精製およびその抗体作製 などが考えられる。  (V) Isolation and purification of the mutant polypeptide or receptor of the present invention and production of an antibody thereof are conceivable.
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不活性型不 応症などを含む、 本発明の受容体に関連する疾患 〔例、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二 指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症侯群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎 、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術 後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 癌 （例、 消化器癌 （例、 胃癌、 大 腸癌、 胃 MALTリンパ腫など） 、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 咽頭癌、 肝臓癌 、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 腌臓癌、 脳腫瘍 、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬 化症、 AIDS, 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多努性硬ィ匕症、 重症筋無 力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマ トーデス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性 胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シヱーグレン症 候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 π型糖尿病、 肥満など〕 の臨床症 状を調べることができ、 また、 本発明の受容体に関連する疾患モデルの各臓器に おけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該 疾患による二次的疾患の研究およぴ治療に貢献することができる。  Furthermore, using the DNA-metastasized animal of the present invention, diseases associated with the receptor of the present invention, including functionally inactive type of the receptor of the present invention [eg, gastrointestinal diseases [eg, diarrhea, absorption] Bad syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia ), Ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, gastric hyperacidity and ulcers due to postoperative stress, etc., cancer (eg, gastrointestinal cancer (eg, gastric cancer, large intestine cancer, gastric MALT lymphoma), breast cancer, lung cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, pharyngeal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.), immune disease [ E.g. chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, pox Sclerosis, AIDS, autoimmune disease (eg, rheumatoid arthritis, multi-working sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic erythema Todes, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, Schiegren's syndrome, Goodpasture syndrome Etc.), π-type diabetes, obesity, etc.), and more detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the receptor of the present invention are obtained. It is possible to contribute to the development of new treatment methods and further to research and treatment of secondary diseases caused by the diseases.
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どの蛋白質分解酵素により、 遊離した D NA転移細胞の取得、 その培養またはそ の培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の受容体産生細 胞の特定化、 アポトーシス、 分ィ匕あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけ るシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本発明の受 容体およびその作用解明のための有効な研究材料となる。 ·  In addition, each organ is taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, free DNA-transferred cells can be obtained and cultured or systematized by using a protease such as trypsin. Is possible. Furthermore, the receptor-producing cells of the present invention can be specified, their relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them can be investigated, and their abnormalities can be investigated. It is an effective research material for elucidating the receptor and its action. ·
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不活性型不 応症を含む、 本発明の受容体に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、 上 述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のスクリー- ング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物または本発 明の外来性 D N A発現べクタ一を用いて、 本発明の受容体が関連する疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。 Further, in order to develop therapeutic agents for diseases related to the receptor of the present invention, including the functionally inactive type of the receptor of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease by using the test method and the quantitative method described above. In addition, using the DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA therapy for a disease associated with the receptor of the present invention.
〔8〕 ノックァゥト動物  [8] Knockout animals
本努明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞おょぴ本 発明の DN A発現不全非ヒト哺 ¾動物を提供する。  The present invention provides a non-human mammal deficient in DNA expression according to the present invention, wherein the DNA of the present invention is inactivated.
すなわち、 本発明は、 。  That is, the present invention is:
(1) 本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺¾動物胚幹細胞、  (1) a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated,
(2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の] 3 _ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された上記 （1) 記載の胚幹細胞、  (2) The embryonic stem cell according to (1) above, wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, E. coli-derived 3_galactosidase gene),
(3) ネオマイシン耐性である上記 (1) 記載の胚幹細胞、  (3) The embryonic stem cell according to (1), which is neomycin resistant,
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （1) 記載の胚幹細胞、  (4) The embryonic stem cell according to (1) above, wherein the non-human mammal is a rodent
(5) ゲッ歯動物がマウスである上記 （4) 記載の胚幹細胞、  (5) The embryonic stem cell according to (4) above, wherein the rodent is a mouse,
(6) 本発明の DN Aが不活性ィヒされた該 DN A発現不全非ヒト哺乳動物、 (6) the DN A expression deficient non-human mammal in which the DN A of the present invention is inactivated,
(7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の j3 _ガラクトシダーゼ遣 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記 （6) 記載の非ヒト哺乳動物 (8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 (6) 記載の非ヒト哺乳動物、(7) The DNA can be inactivated by introducing a reporter gene (eg, j3 galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for DNA of the present invention. (6) The non-human mammal described in (8) The non-human mammal described in (6) above, wherein the non-human mammal is a rodent.
(9) ゲッ歯動物がマウスである上記 （8) 記載の非ヒト哺乳動物、 および(9) The non-human mammal according to (8) above, wherein the rodent is a mouse, and
(10) 上記 （7) 記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポ ター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリ一二ング方法を提供する。 (10) A test compound administered to the animal described in (7) above and detecting the expression of a reporter gene. A screening method is provided.
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 あるいは該 DNAがコードしている本発明の受容体の活性を実 質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に本発明の受容体の発現能を有さ ない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト哺乳動物 の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。 非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。 The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated refers to suppressing the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, or By substantially losing the activity of the receptor of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the receptor of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention). It is a non-human mammal embryonic stem cell (hereinafter abbreviated as ES cell). As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壌することに より本発明のノックァゥト DN Aを作製すればよい。  As a method for artificially adding mutations to the DNA of the present invention, for example, a part or all of the DNA sequence can be deleted by genetic engineering techniques, or another DNA can be inserted or replaced. With these mutations, for example, the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z (β—ガラクトシダーゼ遺伝子 ) 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表 とするレポータ一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壌するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列 ( 例えば、 o 1 y A付加シグナルなど) を揷入し、 完全なメッセンジャー RNA を合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壌するように構築した D NA配列を有する DNA鎖， （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について 本発明の D N A上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブ リダイゼーシヨン解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とター ゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配 列をプライマーとした PCR法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を 選別することにより得ることができる。  Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA inactivated ES cell of the present invention or the knockout ES cell of the present invention) include: The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene represented by a hygromycin resistance gene, or 1 ac Z (β-galactosidase gene), cat (chloram Insertion of a reporter gene typified by a phenicol acetyl transferase gene) disrupts the function of exons, or terminates transcription of genes in introns between exons (eg, o 1 (e.g. y A addition signal) and the result is that complete messenger RNA cannot be synthesized. A DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt a gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cell PCR using as a primer the DNA sequence of the region other than the DNA of the present invention used for Southern hybridization analysis using the DNA sequence on or near the DNA as a probe or the DNA sequence of the targeting vector and the targeting vector. And can be obtained by selecting the knockout ES cells of the present invention.
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Eva nsと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでも'よい。 例えば、 マウスの ES 細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学 的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が 明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C57BL/6マウスや C5 7 BL/ 6の採卵数の少なさを DBA/ 2との交雑により改善した B D マウ ス （C 57.B LZ6と DBA/2との F を用いて樹立したものなども良好に 用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点 に加えて、 C 57BLノ 6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES 細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57BL/6マウスとパッククロス することでその遺伝的背景を C 57BL/6マウスに代えることが可能である点 で有利に用い得る。 In addition, as the original ES cell that inactivates the DNA of the present invention by homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used. A newly established one may be used. For example, in the case of mouse ES cells, currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, an alternative purely immunologically genetic background For example, BD mice that have improved the number of eggs collected from C57BL / 6 mice and C5 7 BL / 6 by crossing with DBA / 2 for the purpose of obtaining clear ES cells. (C 57.B Established using F of LZ6 and DBA / 2, etc.) can be used well. In addition to the advantage that BDFi mice have a large number of eggs collected and eggs are strong, C Since ES cells obtained using 57BL-6 mice have a background, the genetic background can be transferred to C57BL / 6 mice by pack-crossing with C57BL / 6 mice. It can be advantageously used in that it can be replaced.
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。  In addition, when establishing ES cells, blastocysts at the 3.5th day after fertilization are generally used, but in addition to this, an 8-cell embryo is collected and cultured to the blastocyst for efficient use. Early embryos can be obtained.
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。  Although both male and female ES cells can be used, male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture.
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 P C R法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる 。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要し ていたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数 （約 50個） で済むので、 培養 初期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。 One example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. If this method was used, the number of ES cells (about 50) was only about 1 colony, compared to about 10 6 cells for karyotype analysis. Initial selection of ES cells in the early stage can be performed by male / female discrimination, and male cells can be selected at an early stage, which can greatly reduce labor in the initial stage of culture.
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。  The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cell is preferably 100% of the normal number. However, if it is difficult due to physical operations during establishment, the gene of the ES cell is knocked out and then normal cells (for example, in mice) It is desirable to clone again into cells with 2 n = 40 chromosomes.
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、'注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S T O繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で L I F (1〜： 10000 U/m 1) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 .5%炭酸ガス、 95%空気または 5 %酸素、 5 %炭酸ガス、 90 %空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で培養 し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001〜0.5%トリプ シン/ 0. 1〜5 mM EDTA、 好ましくは約 0. 1%トリプシン/ /1 mM EDTA) 処理により 単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形 態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる o The embryonic stem cell lines obtained in this way are usually very proliferative, but they tend to lose their ability to develop on their own, so they need to be subcultured carefully. For example, in a carbon dioxide incubator (preferably .5% carbon dioxide, 95% air or 5%) in the presence of LIF (1 to 10000 U / m 1) on a suitable feeder cell such as STO fibroblast. For example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin). (Syn / 0.1-5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin // 1 mM EDTA) is used to treat the cells as single cells and seed them on newly prepared feeder cells. Such passage is usually performed every 1 to 3 days, but it is desirable to observe the cells at this time, and to discard the cultured cells if morphologically abnormal cells are found o
E S細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種 々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufm an, Nature第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル'ォプ 'ェ ンブリオ口ジー .アンド .ェクスペリメンタル 'モルフォロジ一、 第 87卷、 27頁 Depending on the appropriate conditions, ES cells can be monolayered to a high density or suspended until a cell agglomeration is formed, and various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, myocardium, etc. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634, 1981; TC Doetschman Et al., Journal 'op' Embryo Koji and Experimental 'Morphology, pp. 87, 27
、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の D NA発現不全細 胞は、 インビトロにおける本発明の受容体の細胞生物学的検討において有用であ る。 1985] The DNA expression-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful for in vitro cell biology of the receptor of the present invention.
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mR NA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。  The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA amount of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly. .
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。  As the non-human mammal, those similar to the above can be used.
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同且換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックァゥトさせることができる。  The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, for example, introduces the targeting vector prepared as described above into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and inactivates the DNA of the present invention of the targeting vector by introduction. The DNA sequence of the present invention can be knocked out by homologous recombination that replaces the DNA sequence of the present invention on the chromosome of a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell by gene homology and exchange.
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析またはター ゲッティングベクター上の D N A配列と、 ターグ.ッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D NA以外の近傍領域の D NA配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D NA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本楽明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選; ¾することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明の受容体のへテロ発現不全個体であり、 本発 明の受容体のへテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明の受容 体のホモ発現不全個体を得ることができる。 A cell in which the DNA of the present invention is knocked out comprises a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and a targeting vector. It can be determined by analysis by PCR using primers derived from the DNA sequences of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used in the above. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated by gene homologous recombination is selected. The cells are roasted, and the cells are injected into a non-human mammal embryo or blastocyst at an appropriate time, for example, 8-cell stage, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the non-human mammal pseudo-pregnant. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having a normal DNA locus of the present invention and cells having an artificially altered DNA locus of the present invention. When some of the germ cells of the chimeric animal have the mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It is obtained by selecting an individual composed of cells having the DNA locus of the present Rakumei with added, for example, by determining the coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual who is deficient in the heterogeneous expression of the receptor of the present invention. Individuals with deficient homo-expression of the receptor of the invention can be obtained.
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に. 変異のあるものを選択することにより得られる。  When egg cells are used, for example, transgenic non-human mammals in which a targeting vector is introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by the microinjection method. Compared to human mammals, it can be obtained by selecting those having mutations in the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
このようにして本発明の D NAがノックァゥトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックァゥトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。  In this way, individuals who are knocked out of the DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment after confirming that the animal obtained by mating is knocked out of the DNA. Can do.
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することに—より、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。  In addition, germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, a homozygous animal having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained by mating male and female animals possessed by the inactivated DNA. The obtained homozygous animals can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are one normal individual and multiple homozygous animals. By breeding male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。 ·  The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful for producing the non-human mammal deficient in the expression of DNA of the present invention. ·
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の受容体により誘導 され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明の受容体の生物活性の不活性化 を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及び治療法 の検討に有用である。 In addition, since the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the receptor of the present invention, the biological activity of the receptor of the present invention is inactivated. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatments.
〔8 a〕 本発明の D N Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法  [8a] Screening method for compounds that promote or inhibit the activity of the promoter for DNA of the present invention
本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本凳明の D N Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一ユング方 法を提供する。  The present invention promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and detecting the expression of a reporter gene. A method for screening a compound or a salt thereof is provided.
上記スクリーニング方法において、 本努明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポータ一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポータ一遺伝 子が本発明の D NAに対するプロモータ一の制御下で発現しうるものが用いられ る。  In the screening method described above, the DNA expression-deficient non-human mammal of the present efforts includes, among the above-mentioned DNA expression-deficient non-human mammals of the present invention, by introducing the reporter gene into the DNA of the present invention. An inactivated gene that can be expressed under the control of a promoter for DNA of the present invention is used.
試験ィ匕合物としては、 前記と同様のものがあげられる。 該試験化合物は塩を形 成していてもよく、 該試験化合物の塩としては、 前記と同様の物が用いられる。 レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ーガラクトシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z ) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。  Examples of the test compound include those described above. The test compound may form a salt, and as the salt of the test compound, the same ones as described above are used. As the reporter gene, the same ones as described above are used, and a -galactosidase gene (1acZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
本発明の D N Aをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。  In the non-human mammal of the present invention in which the DNA of the present invention is substituted with a reporter gene, the reporter gene is present under the control of a promoter for the DNA of the present invention, so that the expression of the substance encoded by the reporter gene is expressed. By tracing, promoter activity can be detected.
' 例えば、 本発明の受容体をコードする D NA領域の一部を大腸菌由来の j3—ガ ラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明の受容体 の発現する組織で、 本発明の受容体の代わりに j3—ガラタトシダーゼが発現する 。 従って、 例えば、 5—ブロモ一4一クロ口一 3—インドリル一 j3—ガラクトビ ラノシド （X— g a l ) のような —ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用い て染色することにより、 簡便に本発明の受容体の動物生体内における発現状態を 観察することができる。 具体的には、 本発明の受容体欠損マウスまたはその組織 切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （P B S ) で洗 浄後、 X—.g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1 時間反応させた後、 組織標本を I mM E D T A/ P B S溶液で洗浄することに よって、 一ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出してもよい。 'For example, when a part of the DNA region encoding the receptor of the present invention is replaced with the j3-galactosidase gene (1 ac Z) derived from Escherichia coli, the tissue that originally expresses the receptor of the present invention Thus, j3-galatatosidase is expressed instead of the receptor of the present invention. Therefore, for example, by staining with a reagent that serves as a substrate for galactosidase such as 5-bromo-1,4,3, 3-indolyl, j3-galactoviranoside (X-gal), the receptor of the present invention can be easily obtained. The expression state of the body in the animal body can be observed. Specifically, the receptor-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, and washed with phosphate buffered saline (PBS). After cleaning, react with staining solution containing X—.ga 1 at room temperature or around 37 ° C for about 30 minutes to 1 hour, and then wash the tissue specimen with I mM EDTA / PBS solution. Stop the single galactosidase reaction and observe the coloration. In addition, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D NAに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。  The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the above test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 前記した試験ィ匕合物の塩と同様のものが用いられる。  The compound obtained by the screening method may form a salt, and as the salt of the compound, the same salt as the salt of the test compound described above is used.
本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明の受容体の発現を促進し、 本発明の受容体の活性または機能を促進するこ とができるので、 例えば、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症 候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zoll inger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia ) 、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多お よび潰瘍など〕 、 Π型糖尿病などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬とし て有用である。  The compound or its salt that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention can promote the expression of the receptor of the present invention and promote the activity or function of the receptor of the present invention. Diseases (eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, gastric acidity and ulcers due to postoperative stress, etc.), useful as a low-toxic and safe medicine such as prophylactic and therapeutic agents for type 2 diabetes It is.
また、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその 塩は、 本発明の受容体の発現を阻害し、 本発明の受容体の活性または機能を阻害 することができるので、 例えば、 消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫 など） 、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免 疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多努性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依 存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマト デス、 糸球体腎 炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発 性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーグレン症候群、 グッドパスチ ユア症候群など） など〕 、 肥満などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬と して有用である。 - さらに、 上記スクリ ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。  In addition, the compound or salt thereof that inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention can inhibit the expression of the receptor of the present invention and the activity or function of the receptor of the present invention. Cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.), immune disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis, AIDS, self-immune disease (eg, rheumatoid arthritis, multi-working) Sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic erythematosus, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, Primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, Siegren's syndrome, Goodpaschi Your syndrome, etc.) It is useful as a medicine. -Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
該スクリ一二ング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩を含有する医薬 と同様にして製造することができる。 A medicament containing a compound obtained by the screening method or a salt thereof is It can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the compound obtained by the screening method of the present invention or a salt thereof.
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 イヌ、 サルなど） に対して投与することができる。  The preparations obtained in this way are safe and low toxic. For example, humans or mammals (eg rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, bushes, horses, cats, dogs, monkeys) Etc.) can be administered.
本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物化合物またはその 塩の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが 、 例えば、 吸収不良症候群の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的 に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好 ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与す る場合、 該化合物の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによ つても異なるが、 例えば、 吸収不良症候群の治療の目的で該化合物を注射剤の形 で投与する場合、 通常成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物 を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mg静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算し た量を投与することができる。 The dose of the compound compound or its salt that promotes promoter activity against the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., for example, for the purpose of treatment of malabsorption syndrome When administered orally, generally for adults (with a body weight of 60 kg) the compound is about 0.1-100 mg per day, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0- 20 mg is administered. When administered parenterally, the dose of the compound varies depending on the subject of administration, target disease, symptom, route of administration, etc.For example, for the purpose of treating malabsorption syndrome, the compound is administered as an injection. When administered in the form, usually in adults (with a body weight of 60 kg) the compound is administered at about 0.01-30 mg, preferably about 0.1-20 mg, more preferably about 0.1-10 mg intravenously per day. It is convenient to administer. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
一方、 例えば、 本発明の D NAに対するプロモーター活性を阻害する化合物の 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例 えば、 大腸癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該ィ匕合物を約 0.：！〜 100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合、 該化 合物の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なる 1 例えば、 大腸癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で投与する場合、 通常 成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg、 好ま しくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0.：！〜 10mg静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O k g当たりに換算した量を投与するこ' とができる。 .  On the other hand, for example, the dose of the compound that inhibits the promoter activity against DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc. For example, the compound is used for the purpose of treating colorectal cancer. When administered orally, generally in adults (with a body weight of 60 kg), the compound is about 0. To about 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the dose of the compound varies depending on the subject of administration, target disease, symptom, route of administration, etc. 1 For example, the compound is administered in the form of an injection for the purpose of treating colorectal cancer. In general, in an adult (with a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.:! It is convenient to administer ~ 10 mg intravenously. In the case of other animals, an amount converted per 6 O kg body weight can be administered. .
このように、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明ま.たは予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。 Thus, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. Of various diseases caused by deficient DNA expression Investigating the cause or making a significant contribution to the development of preventive and therapeutic drugs.
また、 本発明の受容体のプロモーター領域を含有する D NAを使って、 その下 流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注入して いわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にそ のポリペプチドを合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる。 さ らに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現す るような細胞株を樹立すれば、 本発明の受容体そのものの体内での産生能力を特 異的に促進または阻害 （抑制） する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用 できる。  In addition, using DNA containing the promoter region of the receptor of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream, and this is injected into the egg cells of animals so-called transgenic animals (genes) If a transfer animal is created, it is possible to specifically synthesize the polypeptide and examine its action in the living body. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter portion and a cell line in which it is expressed is established, the production ability of the receptor of the present invention itself is specifically promoted or inhibited (suppressed). It can be used as a search system for low molecular weight compounds that have
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IU PAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野 における' !1用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し 光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。  In the present specification and drawings, bases, amino acids and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IU PAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviations for! In addition, when there are optical isomers for amino acids, L form is shown unless otherwise specified.
D NA ：デォキシリポ核酸  D NA: Deoxyliponucleic acid
c D NA ：相捕的デォキシリポ核酸 - c D NA: Complementary deoxyliponucleic acid-
A ：アデニン A: Adenine
T ：チミン  T: Thymine
G ：グァニン  G: Guanine
C ： シトシン  C: cytosine
I ：イノシン  I: Inosine
R ：アデニン (A) またはグァニン （G)  R: Adenine (A) or guanine (G)
Y ：チミン （T) またはシトシン （C)  Y: Thymine (T) or cytosine (C)
M ：アデニン (A) またはシトシン (C)  M: Adenine (A) or cytosine (C)
K ：グァニン (G) またはチミン （T)  K: Guanine (G) or thymine (T)
S ：グァニン (G) またはシトシン (C)  S: Guanine (G) or cytosine (C)
W ：アデニン (A) またはチミン （T)  W: Adenine (A) or thymine (T)
B ：グァニン (G) 、 グァニン （G) またはチミン （T)  B: Guanine (G), Guanine (G) or Thymine (T)
D ：アデニン (A) 、 グァニン （G) またはチミン （T) ·  D: Adenine (A), Guanine (G) or Thymine (T) ·
V ：アデニン (A) 、 グァニン (G) またはシトシン (C)  V: Adenine (A), guanine (G) or cytosine (C)
N ：アデニン (A) 、 グァニン (G) 、 シトシン (C) もしく はチミン (T) または不明もしくは他の塩基 N: Adenine (A), guanine (G), cytosine (C) Is thymine (T) or unknown or other base
RNA ： リポ核酸  RNA: Liponucleic acid
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸 mRNA: Messenger ribonucleic acid
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸 d ATP: Deoxyadenosine triphosphate
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸 dTTP: Deoxythymidine triphosphate
d GTP ：デォキシグアノシン三リン酸 d GTP: Deoxyguanosine triphosphate
d CTP ：デォキシシチジン三リン酸 d CTP: Deoxycytidine triphosphate
ATP ：アデノシン三リン酸  ATP: Adenosine triphosphate
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸  EDTA: ethylenediamine tetraacetic acid
SD S ： ドデシル硫酸ナトリゥム  SD S: sodium dodecyl sulfate
BHA ：ベンズヒドリルァミン  BHA: Benzhydrylamine
pMBHA ： p—メチノレベンズヒ ドリルァミン pMBHA: p-methinolebenshi drillamine
T o s ： p―トノレエンスノレフォニノレ  T o s: p-tonoreensnorephoninore
B z 1 ：ベンジノレ  B z 1 Benzenore
B om ：ペンジノレオキシメチル  Bom: Penzinoreoxymethyl
B o c ： t一プチノレォキシカノレポ二ノレ  B o c: t
DCM ：ジクロロメタン  DCM: Dichloromethane
HOB t ： 1ーヒ ドロキシベンズトリァゾーノレ HOB t: 1-Hydroxybenztriazore
DCC ： N, N，一ジシク口へキシルカルポジィミ ドDCC: N, N, one hexyl carboxyl
TF A ： トリフルォロ酢酸 TF A: trifluoroacetic acid
D I EA ：ジィソプロピルェチルァミン  D I EA: Disopropylethylamine
G 1 y又は G ：グリシン  G 1 y or G: Glycine
A 1 a又は A ：ァラニン  A 1 a or A: Alanine
Va 1又は V ：パリン  Va 1 or V: Palin
L e u又は L ： ロイシン  L e u or L: leucine
I 1 e又は I ：ィソロイシン  I 1 e or I: Isoroisin
S e r又は S ：セリン .  S e r or S: serine.
Th r又は T ：スレオニン ·  Th r or T: Threonine ·
C y s又は C ：システィン  C y s or C: Sistine
M e t又は M ：メチォニン G 1 u又は E ： グルタミン酸 M et or M: Methionine G 1 u or E: glutamic acid
A s p又は D ：ァスパラギン酸  A s p or D: Aspartic acid
Ly s又は K ： リジン  Ly s or K: Lysine
Ar g又は R ：アルギニン  Ar g or R: Arginine
H i s又は H ： ヒスチジン  H i s or H: Histidine
Ph e又は F ： フエニノレアラニン  Ph e or F: Phenylenolanine
Ty r又は Y ：チロシン  Tyr or Y: Tyrosine
T r 又は W ： トリブトファン  T r or W: Tribute fan
P r o又は P ：プロリン  P ro or P: proline
A s n又は N ： ァスパラギン  A s n or N: Asparagine
G 1 n又は Q ： グルタミン  G 1 n or Q: glutamine
p G 1 u - ピログノレタミン酸  p G 1 u-Pyrognoretamic acid
Ty r (I) ： 3—ョードチロシン  Ty r (I): 3—Eodotyrosine
DMF ： N, N—ジメチルホ  DMF: N, N—dimethylfo
F m o c ： N- 9ーフノレ才レニ  F m o c: N-9-Funolei Reni
T r t ： トリチル  T r t: Trityl
P b f ： 2, 2， 4， 6， 7  P b f: 2, 2, 4, 6, 7
フラン一 5一スルホ  Franc 1 5 1 Sulfo
C 1 t ： 2—クロ口トリチノレ  C 1 t: 2—Black mouth trichinole
B ： t一ブチル  B: t-butyl
Me t (O) ： メチォニンスノレフォ 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。  Me t (O): Methionine norefo The SEQ ID No. in the sequence listing in the present specification indicates the following sequence.
〔配列番号： 1〕  [SEQ ID NO: 1]
ヒト GPR35のァミノ酸配列を示す。 The amino acid sequence of human GPR35 is shown.
〔配列番号： 2〕  [SEQ ID NO: 2]
配列番号： 1で示されるァミノ酸配列を有するヒ.ト GPR35をコ、 ドする cDNAの塩 基配列を示す。 . -SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of cDNA encoding human GPR35 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1. -
〔配列番号： 3〕 [SEQ ID NO: 3]
参考例 1で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号.： 4 ] The base sequence of the sense strand primer used in Reference Example 1 is shown. [SEQ ID NO: 4]
参考例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。 The base sequence of the antisense strand primer used in Reference Example 1 is shown.
〔配列番号： 5〕  [SEQ ID NO: 5]
実施例 5で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 1 used in Example 5 is shown.
〔配列番号： 6〕  [SEQ ID NO: 6]
実施例 5で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 2 used in Example 5 is shown.
〔配列番号： 7〕  [SEQ ID NO: 7]
マウス GPR35 のァミノ酸配列を示す。 The amino acid sequence of mouse GPR35 is shown.
〔配列番号： 8〕  [SEQ ID NO: 8]
配列番号： 7で示されるァミノ酸配列を有するマウス GPR35をコードする cDNAの 塩基配列を示す。 This shows the base sequence of cDNA encoding mouse GPR35 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7.
〔配列番号： 9〕 '  [SEQ ID NO: 9] '
実施例 6で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 1 used in Example 6 is shown.
〔配列番号： 1 0〕  [SEQ ID NO: 1 0]
実施例 6で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 2 used in Example 6 is shown.
〔配列番号： 1 1〕  [SEQ ID NO: 1 1]
実施例 6で用いられたプローブ 1の塩基配列を示す。 〔5' 末端にリポーター色 素として FAM (6 - carboxy- fluorescein) を、 3， 末端にはクェンチヤ一として TAM RA (6 - carboxy— tetramethyl— rhodamine) を標識した〕 。 2 shows the base sequence of probe 1 used in Example 6. [FAM (6-carboxy-fluorescein) is labeled as the reporter color at the 5 'end, and TAM RA (6-carboxy-tetramethyl- rhodamine) is labeled as the quencher at the 3 end].
〔配列番号： 1 2〕  [SEQ ID NO: 1 2]
実施例 6で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 3 used in Example 6 is shown.
〔配列番号： 1 3〕  [SEQ ID NO: 1 3]
実施例 6で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 4 used in Example 6 is shown.
〔配列番号： 1 4〕  [SEQ ID NO: 1 4]
実施例 6で用いられたプローブ 2の塩基配列を示す。 〔5' 末端にリポーター色 素として FAM (6- carboxy - fluorescein) を、 3， 末端にはクェンチヤ一として TAM RA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) を標識した〕 。 2 shows the base sequence of probe 2 used in Example 6. [FAM (6-carboxy-fluorescein) is labeled at the 5 'end as a reporter color, and TAM RA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) is labeled at the end as a quencher].
〔配列番号： 1 5〕  [SEQ ID NO: 1 5]
実施例 7で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 1 used in Example 7 is shown.
〔配列番号： 1 6〕 実施例 7で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。 [SEQ ID NO: 1 6] The base sequence of primer 2 used in Example 7 is shown.
〔配列番号： 17〕  [SEQ ID NO: 17]
実施例 7で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 3 used in Example 7 is shown.
〔配列番号： 18〕  [SEQ ID NO: 18]
実施例 7で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 4 used in Example 7 is shown.
〔配列番号： 1 9〕  [SEQ ID NO: 1 9]
ヒト GPR35 - L1のアミノ酸配列を示す。 The amino acid sequence of human GPR35-L1 is shown.
〔配列番号： 20〕 '  [SEQ ID NO: 20] '
配列番号： 19で示されるァミノ酸配列を有するヒ ト GPR35 - L1をコードする cDNA の塩基配列を示す。 This shows the base sequence of cDNA encoding human GPR35-L1 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 19.
/〔配列番号： 21〕 / [SEQ ID NO: 21]
ヒト GPR35 - L2のアミノ酸配列を示 1"。 The amino acid sequence of human GPR35-L2 is shown 1 ".
〔配列番号： 22〕  [SEQ ID NO: 22]
配列番号： 21で示されるァミノ酸配列を有するヒト GPR35- L2をコードする cDNA の塩基配列を示す。 This shows the base sequence of cDNA encoding human GPR35-L2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 21.
〔配列番号： 23〕  [SEQ ID NO: 23]
ヒト GPR35 - L3のアミノ酸配列を示す。 The amino acid sequence of human GPR35-L3 is shown.
〔配列番号： 24〕  [SEQ ID NO: 24]
配列番号： 23で示されるァミノ酸配列を有するヒト GPR35- L3をコードする cDNA の塩基配列を示す。 This shows the base sequence of cDNA encoding human GPR35-L3 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 23.
〔配列番号： 25〕 ·  [SEQ ID NO: 25] ·
参考例 2で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 1 used in Reference Example 2 is shown.
〔配列番号： 26〕  [SEQ ID NO: 26]
参考例 2で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。 The base sequence of primer 2 used in Reference Example 2 is shown.
〔配列番号： 27〕 '  [SEQ ID NO: 27] '
ラット GPR35のアミノ酸配列を示す。 The amino acid sequence of rat GPR35 is shown.
〔配列番号： 28〕 .  [SEQ ID NO: 28]
配列番号： 27で示されるァミノ酸配列を有するラット GPR35をコードする cDNA の塩基配列を示す。 This shows the base sequence of cDNA encoding rat GPR35 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 27.
〔配列番号 29〕 実施例 1 0で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。 · (SEQ ID NO: 29) The base sequence of the forward primer used in Example 10 is shown. ·
〔配列番号 3 0〕  (SEQ ID NO: 30)
実施例 1 0で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。 The base sequence of the reverse primer used in Example 10 is shown.
〔配列番号 3 1〕  (SEQ ID NO: 3 1)
実施例 1 0で用いられたプローブの塩基配列を示す。 The base sequence of the probe used in Example 10 is shown.
〔配列番号 3 2〕  (SEQ ID NO: 3 2)
実施例 1 1で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。 Example 11 The base sequence of the forward primer used in Example 1 is shown.
〔配列番号 3 3〕  (SEQ ID NO: 3 3)
実施例 1 1で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。 Example 11 The base sequence of the reverse primer used in Example 1 is shown.
〔配列番号 3 4〕  (SEQ ID NO: 3 4)
実施例 1 1で用いられたプローブの塩基配列を示す。 実施例 Example 11 This shows the base sequence of the probe used in 1. Example
以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 本発明 はそれに限定されるものではない。  The present invention will be described more specifically with reference to the following reference examples and examples, but the present invention is not limited thereto.
DNQX は、 6， 7 -ジニト口キノキサリン- 2， 3 -ジオン (6, 7- dinitroquinoxaline- 2 , 3-dione) を表す。  DNQX represents 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione.
NBQXは、 6-二ト口- 7-スルファモイルベンゾ [f]キノキサリン- 2， 3-ジォン （6- n itro- 7 sulfamoylbenzo [i」quinoxaline-2， 3-dione;を表す。 参考例 1  NBQX represents 6-nitro-7-sulfamoylbenzo [f] quinoxaline-2,3-dione (6-nitro-7sulfamoylbenzo [i] quinoxaline-2,3-dione; Reference Example 1
ヒ ト GPR35発現 CH0細胞株  Human GPR35 expressing CH0 cell line
ヒト GPR35をコードする DNA断片を PCR法により取得した。 2種のプライマー （配 列番号： 3および配列番号： 4 ) 各 20pmol、 10 X Advantage (登録商標） 2 PGR B uffer (CLONTECH) 5 μ 1、 50 X dNTP mix (CLONTECH) l /z l、 50 X Advantage 2 Pol ymerase Mix (CLONTECH) 1 1、 铸型 DNAとしてヒト肝臓 cDNA液 (CLONTECH) Ι μ ΐ を含む混合液 50 1を調製し、 サーマルサイクラ (GeneAmp (登録商標） PCR sy stem model 9700 (Applied Biosystems) ) を用いて 96°C、 1分、 続いて 96。C、 30 秒； 63°C、 40秒； 72°C、 120秒を 35サイクル繰り返し、 さらに 72°C、 10分で伸長 反応させるプログラムで PCR反応を行った。 反応終了液をァガロースゲル電気泳 動することにより単一の生成物を得、 TAクローニングキット （Invitrogen) を用 いてクロ ニングし、 遺伝子配列を確認した。 PCRエラーがないクローンについ て、 制限酵素 Sail (宝酒造） 、 Clal (宝酒造） で二重消化した後、 ァガロースゲ ル電気泳動して、 単一の生成物を切り出した。 得られた断片 （約 lkb) を pAKKO-1 11ベクター [Biochem. Biophys. Acta.， 1219卷， 251 (1994)〕 に導入し、 常法に従 つて CH0細胞にトランスフエクシヨンし、 ヒ ト GPR35発現 CH0細胞株を得た。 参考例 2 A DNA fragment encoding human GPR35 was obtained by PCR. 2 primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) 20 pmol each, 10 X Advantage (registered trademark) 2 PGR Buffer (CLONTECH) 5 μ1, 50 X dNTP mix (CLONTECH) l / zl, 50 X Advantage 2 Pol ymerase mix (CLONTECH) 1 1, a human liver cDNA liquid mixture 5 0 1 comprising (CLONTECH) Ι μ ΐ prepared as铸型DNA, thermal cycler (GeneAmp (R) PCR sy stem model 9700 ( Applied Biosystems))) at 96 ° C for 1 minute followed by 96. C, 30 sec; 63 ° C, 40 seconds; 72 ° C, 35 cycles of 120 seconds, PCR was carried out by further 7 2 ° C, programmed to elongation reaction at 10 minutes. Agarose gel electrophoresis A single product was obtained by running and cloned using a TA cloning kit (Invitrogen) to confirm the gene sequence. Clones without PCR errors were double-digested with restriction enzymes Sail (Takara Shuzo) and Clal (Takara Shuzo), and then subjected to agarose gel electrophoresis to cut out a single product. The obtained fragment (approximately 1 kb) was introduced into the pAKKO-1 11 vector [Biochem. Biophys. Acta., 1219 卷, 251 (1994)], transfected into CH0 cells according to a conventional method, and human GPR35 Expression CH0 cell line was obtained. Reference example 2
ラット GPR35のクローニング  Cloning of rat GPR35
ラット （SD) 小腸 cDNA (Seegene) を歸型として、 プライマー 1 (配列番号： 2 5 ) およびプライマー 2 (配列番号： 2 6 ) を用いて PCR を行なった。 PCR には Pyrobest DNA polymerase ( 酒造） を用い、 （1) 98°C 10秒の後、 （2) 98 。C 10秒、 68°C 60秒を 35回の後、 （3) 68°C 7分の伸長反応を行なった。 増幅 産物を pCR- Blunt2- T0P0 vector (Invitrogen) に挿入し、 これを大月昜菌 JM109 (宝酒造） に導入してクローユングした。 その塩基配列を解析した結果、 配列番 号： 2 8で表されるアミノ酸配列を有するラット GPR35をコードする cDNAの塩基 配列 （配列番号： 2 7 ) を得た。 実施例 1  Rat (SD) small intestine cDNA (Seegene) was used as a saddle type, and PCR was performed using primer 1 (SEQ ID NO: 25) and primer 2 (SEQ ID NO: 26). Pyrobest DNA polymerase (Sake Brewery) was used for PCR. (1) After 98 seconds at 98 ° C, (2) 98. C 10 seconds, 68 ° C 60 seconds 35 times, (3) 68 ° C 7 minutes extension reaction. The amplified product was inserted into pCR-Blunt2-T0P0 vector (Invitrogen) and introduced into Koji Otsuki JM109 (Takara Shuzo) for cloning. As a result of analyzing the nucleotide sequence, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2 7) of cDNA encoding rat GPR35 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 was obtained. Example 1
GPR35に対するリガンド探索  Ligand search for GPR35
CH0- K1細胞株 （ATCCより購入） は、 特に記載が無い限り 10% 牛胎児血清 （Inv itrogen) を含むハム F- 12培地 （Invitrogen) を用いて培養した。 トランスフエ クションを行う前日に 10cm2あたり 4. 5xl05個の細胞を播き、 5% C02濃度に調整さ れた C02培養器にて 37。Cで 15時間以上培養した。 トランスフエクションは Lipof e ctamine試薬 (Invitrogen) を用い、 試薬添付の方法に準じて操作を行った。 培 養器に 6- wellプレートを使用する場合は、 以下のように行った。 まず、 1. 5ml容 チューブを 2本用意し、 それぞれに Opt i - MEM培地 （Invitrogen) を 100 /z l分注し た。 次に、 片方のチューブに参考例 1で得られた GPR35発現ベクター l /i g、 およ び G a 15発現ベクター （Guthrie cDNA Resource Center) 0. を入れ、 もう片 方のチューブに Lipofectamine試薬を 6 μ 1添加後、 両者を混合し、 20分間室温に 静置した。 この溶液に Opti- MEM培地を 800 μ 1加えたトランスフエクション用混合 液を、 あらかじめ Opti- MEM培地を用いて洗浄した CH0-K1細胞に添加後、 ∞2±咅養 器にて 6時間培養した。 培養後の細胞は、 PBS (Invitrogen) を用いてリンスした 後、 0. 05% トリプシン ' EDTA溶液 （Invitrogen) を用いて剥がし、 遠心操作に て回収した。 得られた細胞の数を測定し、 培地 100 1あたり 5xl04個の細胞が含 まれるように希釈し、 Black walled 96-well plate (Costar) に 1穴あたり 100 1ずつ分注後、 C02培養器にて一晚培養した。 上記トランスフエクション操作にて —過性に受容体を発現した CH0-K1細胞に各種の試験サンプルを添加し、 この際の 細胞内カルシウム濃度の変動を FLIPR (Molecular Device) を用いて測定した。 The CH0-K1 cell line (purchased from ATCC) was cultured using Ham's F-12 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (Invitrogen) unless otherwise specified. Plated 4. 5xl0 5 cells per 10 cm 2 day before the transformer Hue transfection at 5% C0 2 concentration was adjusted to C0 2 incubator 37. C. cultured for more than 15 hours. Transfection was performed using Lipofectamine reagent (Invitrogen) according to the method attached to the reagent. When a 6-well plate was used for the incubator, the procedure was as follows. First, two 1.5 ml tubes were prepared and 100 / zl of Opti-MEM medium (Invitrogen) was dispensed into each tube. Next, put the GPR35 expression vector l / ig obtained in Reference Example 1 and the Ga 15 expression vector (Guthrie cDNA Resource Center) 0. into one tube, and add Lipofectamine reagent to the other tube. After addition of μ 1, mix both and keep at room temperature for 20 minutes Left to stand. Add 800 μl of Opti-MEM medium to this solution and add the mixture for transfection to CH0-K1 cells previously washed with Opti-MEM medium, and then incubate for 6 hours in ∞ 2 ± culture apparatus. did. The cultured cells were rinsed with PBS (Invitrogen), detached with 0.05% trypsin 'EDTA solution (Invitrogen), and collected by centrifugation. Count the number of cells obtained, dilute to contain 5xl0 4 cells per 100 1 medium, dispense 100 1 per well into a black walled 96-well plate (Costar), and then add C0 2 The cells were cultured for a while in an incubator. Various test samples were added to CH0-K1 cells that transiently expressed the receptor by the above transfection procedure, and the fluctuation of intracellular calcium concentration was measured using FLIPR (Molecular Device).
FLIPRにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、 以下の前処置を施 した。 まず、 細胞に蛍光色素 Fluo- 3AM (D0JIN) を添加するため、 または FLIPRァ ッセィを行う直前に細胞を洗浄するためのアツセィパッファーを作成した。 HBS S (Invitrogen) 1000mlに 1M HEPES (pH7. 4) (D0JIN) 20mlを加えた溶液 (以下 、 HBSS/HEPES溶液） に、 プロぺネシド （Sigma) 710mgを IN NaOH 5mlに溶解後さ らに HBSS/HEPES溶液 5mlを加え混合した溶液 10mlを添加し、 この溶液をアツセィ バッファ一とした。 次に Fluo-3AM を 1 DMS0 (D0JIN) に溶解し、 さら に等量の 20% プルロン酸 （Molecular Device) を加え混合後、 105 ^ 1の牛胎児 血清を添加した 10. 6mlのアツセィバッファーに加え、 蛍光色素溶液を調製した。 トランスフエクション処理を施した CH0- K1細胞の培地を除き、 直ちに蛍光色素溶 液を 1穴あたり ΙΟΟ μ Ιずつ分注後、 C02培養器にて 1時間培養し、 細胞に蛍光色素 を取り込ませた。 培養後の細胞は上記のァッセィバッファーを用いて洗浄した後 、 FLIPRにセットした。 また、 受容体発現 CH0-K1細胞に添加する試験サンプルは 、 アツセィバッファーを用いて調製し、 同時に FLIPRにセットした。 In order to measure the fluctuation of intracellular calcium concentration by FLIPR, the following pretreatment was performed. First, we prepared an assembly buffer to add the fluorescent dye Fluo-3AM (D0JIN) to the cells or to wash the cells just before the FLIPR assay. HBS S (Invitrogen) 1000ml of 1M HEPES (pH7.4) (D0JIN) 20ml in a solution (hereinafter referred to as HBSS / HEPES solution), propenecid (Sigma) 710mg was dissolved in IN NaOH 5ml and then HBSS 10 ml of a solution mixed with 5 ml of / HEPES solution was added, and this solution was used as an assembly buffer. Next, dissolve Fluo-3AM in 1 DMS0 (D0JIN), add an equal amount of 20% Pluronic acid (Molecular Device), mix, and then add 105 ^ 1 fetal calf serum. In addition, a fluorescent dye solution was prepared. The medium was removed the CH0- K1 cells subjected to trans Hue transfection process, immediately fluorochrome solvent solution after Aliquot ΙΟΟ μ Ι per well, incubated for 1 hour at C0 2 incubator, incorporated a fluorescent dye to the cells Let The cultured cells were washed with the above assay buffer and then set in FLIPR. In addition, a test sample to be added to receptor-expressing CH0-K1 cells was prepared using Atsy buffer and set at the same time in FLIPR.
以上の前処置を施した後、 FLIPRにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシ ゥム濃度の変動を測定した。  After the above pretreatment, the change in intracellular calcium concentration after addition of various test samples was measured by FLIPR.
その結果、 DNQX (図 1) 、 エラグ酸 （図 2) 、 6-シァノ -7 -二トロキノキサリン - 2， 3 -ジオン、 NBQXおよび 5， 7-ジニトロキノキサリン- 2, 3-ジオンを加えたとき、 G PR35および 00；15を同時に発現する( 1!0-]^1細胞が、 用量依存的に応答 （細胞内力 ルシゥム濃度の上昇） した。 発現ベクター pAKKO - 111H (Biochem. Biophys. Acta .， 1219卷， 251頁， 1994年）のみを導入した対照の CH0- K1細胞では、 このような応答 は見られなかった, 実施例 2 As a result, DNQX (Fig. 1), ellagic acid (Fig. 2), 6-cyan-7-ditroquinoxaline-2,3-dione, NBQX and 5,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione were added. (1! 0-] ^ 1 cells that simultaneously express GPR35 and 00; 15 responded in a dose-dependent manner (increased intracellular strength) .Expression vector pAKKO-111H (Biochem. Biophys. Acta., 1219, 251 (1994), the control CH0-K1 cells introduced this response. Not found, Example 2
ヒト GPR35発現 CH0細胞株における、 フオルスコリン添加による増加細胞内 cAMP 量の DNQXおよぴ NBQXによる抑制  Inhibition of increased intracellular cAMP levels by DNQX and NBQX in human GPR35 expressing CH0 cell line
参考例 1で得られたヒ ト GPR35発現 CH0細胞を、 アツセィ用培地 （HBSS (GibcoB RL) に 0. 1%ゥシ血清アルブミンおよび 0. 2mM isobutylmethylxantMneを添加し たもの） にて洗浄した後、 37°C、 5%C02条件下で 30分培養した。 アツセィ用培地 にて希釈した各濃度の DNQXおよぴ NBQXを添加し、 その後フォルスコリン 2 μ Mとな るように添加した。 37°C、 5%C02条件下で 30分培養した。 培養上清を捨てて、 cA MP screen kit (アプライドバイオシステムズ社） のプロトコールに従い、 細胞 内の cAMP量をプレートリーダー （EnVision、 PerkinElmer社） を用いて測定した その結果、 ヒ ト GPR35発現 CH0細胞株にのみ、 フオルスコリン添カ卩によって増カロ させた細胞内 cAMP量の DNQXおよび NBQXによる用量依存的減少かつ特異的な減少が 検出された （図 3) 。 After washing human GPR35-expressing CH0 cells obtained in Reference Example 1 with Atsy's medium (HBSS (GibcoB RL) supplemented with 0.1% ushi serum albumin and 0.2 mM isobutylmethylxantMne), 37 ° C, 5% C0 were incubated for 30 minutes at 2 conditions. DNQX and NBQX at various concentrations diluted with Atsy's medium were added, and then added to 2 μM forskolin. 37 ° C, 5% C0 were incubated for 30 minutes at 2 conditions. The culture supernatant was discarded and the amount of cAMP in the cells was measured using a plate reader (EnVision, PerkinElmer) according to the protocol of cA MP screen kit (Applied Biosystems). As a result, the human GPR35 expressing CH0 cell line In addition, a DNQX and NBQX dose-dependent and specific decrease in intracellular cAMP levels increased by foskolin supplementation was detected (Fig. 3).
これより、 GPR35がァゴニストにより活性ィ匕されると、 細胞内 cAMP濃度が低下 することがわかる。 細胞内で cAMPは主要なシグナル伝達物質の一つとして働い ており、 細胞に様々な変化をもたらすことが知られている。 従って、 細胞内 cAMP の濃度を、 GPR35のァゴニスト （cAMP濃度を下げる作用を有する） 、 または GPR35 のアンタゴニスト （cAMP濃度を上げる作用を有する） で調節することにより、 種 々の病態を改善させることが可能となる。 実施例 3  This indicates that the intracellular cAMP concentration decreases when GPR35 is activated by an agonist. CAMP is known to act as one of the major signaling substances in cells and to cause various changes in cells. Therefore, by adjusting the intracellular cAMP concentration with GPR35 agonist (which has the effect of decreasing cAMP concentration) or GPR35 antagonist (which has the effect of increasing cAMP concentration), various pathological conditions can be improved. It becomes possible. Example 3
MAPKのリン酸化亢進'  Increased phosphorylation of MAPK '
参考例 1で得られたヒト GPR35発現 CH0細胞を、 5 X 104 cells/well の濃度で 1 2 - well Plate で 48時間培養した。 培地は 10%透析 FBSを含む MEM α (核酸不含） を使用した。 培地を吸引除去後、 血清を含まない培地 1 ml (x2) で細胞を洗浄後 、 血清を含まない培地 500 / lを添加し、 37°Cで 16時間培養した。 細胞に至適濃度 の DNQXまたは NBQX を添加し、 37°Cで 5分間培養した。 培地を吸引除去後、 直ちに 50 μ ΐの Blue Loading Buffer (BioLabs) を添加し、 ピペッティングにて細胞を 溶解 '分取した。 細胞溶液を sonicator (sono cleaner; KAIJO DENKI)を用いて 破砕後、 95°Cで 5分間熱処理を行なった。 遠心分離 （15，000 rpm， 4°C, 5分間） を行い、 上清を最終サンプルとした。 The human GPR35-expressing CH0 cells obtained in Reference Example 1 were cultured in a 12-well plate at a concentration of 5 × 10 4 cells / well for 48 hours. The medium used was MEM α (without nucleic acid) containing 10% dialyzed FBS. After removing the medium by aspiration, the cells were washed with 1 ml (x2) of serum-free medium, 500 / l of medium without serum was added, and cultured at 37 ° C for 16 hours. Optimal concentrations of DNQX or NBQX were added to the cells and incubated at 37 ° C for 5 minutes. Immediately after removing the medium by suction 50 μΐ Blue Loading Buffer (BioLabs) was added, and the cells were lysed by pipetting. The cell solution was crushed using a sonicator (sono cleaner; KAIJO DENKI) and then heat treated at 95 ° C for 5 minutes. Centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C, 5 minutes) was performed, and the supernatant was used as the final sample.
サンプル 10 1を 10% SDS - PAGEで泳動後、 ウェスタンブロッティング法にて PV DF膜 (BI0-RAD) にトランスファーした。 膜をブロックエース （大日本製薬株式 会社） に浸し、 室温で 1時間振とうした。 一次抗体 （Phospho- P44/42 Map Kinase antibody; Cell Signaling) を含むブロックエース （1/2000希釈） に浸し、 室 温で 1時間振とうした。 膜を TBS - tween20 (50 mM Tris- HC1 (pH7. 6)， 150 mM NaCl ， 0. 05% Tween- 20)に浸し 5分間 （x 2) 振とうし、 洗浄した。 膜を TBS - tween20 で希釈した HRP標識二次抗体 (Goat Anti-Rabbit IgG, HRP- conjugate; upstate) (1/5000希釈）に浸し、 室温で 1時間振とうした。 膜を TBS- tween20に浸し 10分間 (X 3) 振とうし、 洗浄した。 膜を ECLplus ウェスタンプロッティングシステム (Amersham Biosciences) の取り扱い説明書に従い、 蛍光検出器（LAS- 1000 ; FUJI FILM)により検出を行なつた。 1-5 μ.Μの DNQXまたは NBQX刺激により、 ヒ ト GPR35 受容体発現 CH0細胞の MAP- kinase のリン酸化レベルは亢進されていた。 コント口 ール細胞 （公知方法により作製されたヒ ト TGR23発現 CH0細胞）に対しては、 リン 酸化レベルの亢進は観察されなかつた。 実施例 4 Sample 101 was electrophoresed on 10% SDS-PAGE and then transferred to a PV DF membrane (BI0-RAD) by Western blotting. The membrane was immersed in Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and shaken for 1 hour at room temperature. It was immersed in Block Ace (1/2000 dilution) containing primary antibody (Phospho- P 44/42 Map Kinase antibody; Cell Signaling) and shaken at room temperature for 1 hour. The membrane was soaked in TBS-tween20 (50 mM Tris-HC1 (pH7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20), shaken for 5 minutes (x 2), and washed. The membrane was immersed in an HRP-labeled secondary antibody (Goat Anti-Rabbit IgG, HRP-conjugate; upstate) (1/5000 dilution) diluted with TBS-tween20 and shaken at room temperature for 1 hour. The membrane was soaked in TBS-tween20 and shaken for 10 minutes (X 3) and washed. The membrane was detected with a fluorescence detector (LAS-1000; FUJI FILM) according to the instruction manual of the ECLplus western plotting system (Amersham Biosciences). The phosphorylation level of MAP-kinase in human GPR35 receptor-expressing CH0 cells was enhanced by stimulation with DNQX or NBQX of 1-5 μΜ. No increase in phosphorylation level was observed for control cells (human TGR23-expressing CH0 cells prepared by a known method). Example 4
CH0細胞に発現させた GPR35— GFP融合タンパク質の DNQX、 NBQX添加による細胞 内移行  Translocation of GPR35—GFP fusion protein expressed in CH0 cells into cells by adding DNQX and NBQX
ヒ ト GPR35タンパク質の C末端に GFPを融合したタンパク質を安定的に発現させ た CH0細胞株を、 自体公知の方法により動物細胞用発現プラスミドを用いて樹立 した。 該タンパク質の細胞内移行 （インターナリゼーシヨン） の検定には、 増殖 期にある該細胞を、 40000cells/ゥエルの濃度で 96穴プレート （Packard社、 Vie w-Plate™-96, Black) に播種し、 37°C、 5% C02で-一晩培養したものを用いた。 まず、 アツセィ用緩衝液 (HBSS (GibcoBRL) に 0. 1%ゥシ血清アルブミンを添カロ したもの） にてゥエル内の該細胞を洗浄した後、 3 μ Μ、 10 ^ ¾1ぉょぴ30 ¾1の1) および NBQXを含む同アツセィ用緩衝液を各ゥエルに 100 ^ 1ずつ添加し、 37。C、 5 % C02条件下で培養した。 その後細胞固定液 （4%パラホルムアルデヒド含有 PBS (Ca/Mg不含） ） を 100 μ ΐ/ゥエル添加して室温下 30分放置した。 細胞固定液を除 去し、 Ca/Mg不含ー PBSで細胞を洗浄後、 ラベル化溶液 (3. 13 ^ g/ml wheat germ aggulutinin (Molecular Probes社 W- 849) 、 5 μ g/ml Hoechst含有 Ca/Mg不含 P'B S) を 50 μ ΐ/ゥエル添加し、 室温下 20分放置した。 ラベル化溶液を除去後、 細胞 を Ca/Mgフリー PBS (200 μ 1/ゥヱル） で洗浄し、 同液 （200 1/ゥヱル） へ置換し た後、 プレート表面をシーノレして、 直ちに Cellomics ArrayScan System (Cellom ics社）にて解析した。 GPR35-GFP融合タンパク質の細胞内局在性の評価は、 同シ ステムに付属の GPCR Signaling Assay Protocol中のパラメータの一つである Mem Cyto Above Threshold (ゥヱル内の全細胞集団に対し、 タンパク質の膜 Z細胞質 局在比を表す一定のパラメータ値 （MemCyto Intensity Ratio) を超える細胞群 の割合 （単位％) ) で行った。 A CH0 cell line stably expressing a protein in which GFP was fused to the C-terminus of human GPR35 protein was established using an expression plasmid for animal cells by a method known per se. To assay the protein internalization (internalization), seed the cells in the growth phase in a 96-well plate (Packard, Vie w-Plate ™ -96, Black) at a concentration of 40,000 cells / well. Then, an overnight culture at 37 ° C. and 5% CO 2 was used. First, after washing the cells in the well with Atsey buffer (HBSS (GibcoBRL) supplemented with 0.1% ushi serum albumin), 3 μΜ, 10 ^ ¾1 ぉ 30 30 ¾1 1) and NBQX-containing solution for the same assembly at 100 ^ 1 to each well. C, 5 They were cultured in% C0 2 conditions. Thereafter, a cell fixative (4% paraformaldehyde-containing PBS (Ca / Mg-free)) was added at 100 μΐ / well and left at room temperature for 30 minutes. After removing the cell fixative and washing the cells with Ca / Mg-free PBS, labeling solution (3.13 ^ g / ml wheat germ aggulutinin (Molecular Probes W-849), 5 μg / ml Hoechst Containing Ca / Mg-free P'B S) was added at 50 μ 添加 / well and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. After removing the labeling solution, the cells are washed with Ca / Mg-free PBS (200 μl / tool) and replaced with the same solution (200 1 / tool). (Cellomics). The subcellular localization of the GPR35-GFP fusion protein was evaluated using the Mem Cyto Above Threshold (one of the parameters in the GPCR Signaling Assay Protocol included with the system). The cell group ratio (unit%) exceeding a certain parameter value (MemCyto Intensity Ratio) representing the Z cytoplasm localization ratio was used.
その結果、 DNQX、 NBQXを添加した場合、 上記濃度域で濃度依存的な GPR35— GFP タンパク質のインターナリゼシヨン誘導活性 (MemCyto Above Threshold値の低 下） が認められた。 実施例 5  As a result, when DNQX and NBQX were added, the concentration-dependent internalization-inducing activity of GPR35-GFP protein (decrease in MemCyto Above Threshold value) was observed in the above concentration range. Example 5
マウス GPR35のク口一二ングと種差の検討  Examination of kuguchi and species difference of mouse GPR35
マウス （C57BL/6) の結腸から Isogen (二ツボンジーン） を用いて total RNA 調娱し、 Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) を用いて cDN A合成を行なった。 これを铸型として、 プライマー 1 (配列番号： 5 ) およびプ ライマー 2 (配列番号： 6 ) を用いて PCR を行なった。 PCR には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造） を用い、 （1) 94°C 10秒の後、 （2) 94°C 10秒、 68°C 90 秒を 3 回、 （3) 94°C 10秒、 62°C 30秒、 68。C 60秒を 3 回、 （4) 94°C 10 秒、 56°C 30秒、 68°C 90秒を 35 回の増幅反応後、 （5) 68°C 7分の伸長反応 を行なった。 さらに Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech) を加えて 72°C 1 0分反応後、 増幅産物を PCR2. 1- T0P0 (Invitrogen) に挿入し、 これを大腸菌 J M109 (宝酒造） に導入してクローユングした。'その塩基配列を解析した結果、 配 列番号： 7で表されるァミノ酸配列を有するマウス GPR35をコードする cDNAの塩 基配列 （配列番号： 8 ) を得た。 このプラスミドを制限酵素 Sal Iおよび Spe I で切断した後、 プラスミドベクター pAKKO-lllH [Biochem. Biophys. Acta. , 12 19卷， 251 (1994)〕 に挿入して発現べクタ一を構築した。 この発現ベクターを実施 例 1に記載の方法に準じて CH0- K1細胞に導入し、 FLIPRを用いて DNQXおよびエラ グ酸との反応性を検討した結果、 ヒト GPR35と同様にマウス GPR35は、 これらの化 合物に応答した。 実施例 6 Total RNA was prepared from the mouse (C57BL / 6) colon using Isogen (Tsubbon Gene), and cDNA was synthesized using Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Using this as a saddle type, PCR was performed using primer 1 (SEQ ID NO: 5) and primer 2 (SEQ ID NO: 6). Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) was used for PCR. (1) After 94 ° C for 10 seconds, (2) 94 ° C for 10 seconds, 68 ° C for 90 seconds, (3) 94 ° C for 10 seconds, 62 ° C 30 seconds, 68. C. After 3 amplification reactions for 60 seconds, (4) 94 ° C for 10 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 90 seconds for 35 times, (5) 68 ° C for 7 minutes. Further, Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech) was added and reacted at 72 ° C for 10 minutes, and then the amplified product was inserted into PCR2.1-T0P0 (Invitrogen) and introduced into E. coli JM109 (Takara Shuzo) for cloning. As a result of analyzing the nucleotide sequence, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) of cDNA encoding mouse GPR35 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 was obtained. This plasmid was transformed into restriction enzymes Sal I and Spe I And then inserted into the plasmid vector pAKKO-lllH [Biochem. Biophys. Acta., 12 19 12, 251 (1994)] to construct an expression vector. This expression vector was introduced into CH0-K1 cells according to the method described in Example 1, and the reactivity with DNQX and ellagic acid was examined using FLIPR. As a result, mouse GPR35, like human GPR35, In response to the compound. Example 6
RT-PCRによる GPR35mR Aの組織分布の検討  Examination of tissue distribution of GPR35mR A by RT-PCR
ヒトでの遺伝子発現分布を調べるために使用した錶型となる cDNAには、 ヒト各 種組織由来の polyA+RNA (クロンテック社) から以下の方法で合成したものを使 用した。  The cDNA that was used to examine the distribution of gene expression in humans was a cDNA synthesized from polyA + RNA (Clontech) derived from various human tissues by the following method.
RNA l ^ gからランダムプライマー、 逆転写酵素として SuperScriptll逆転写酵 素 （Invitrogen社） を用い、 添付のマニュアルに従って 42°Cで反応を行い、 反応 終了後にエタノール沈殿して 100 μ 1に溶解した。 RT-PCRは Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosystems社） を用い、 プライマー 1 (配列 番号： 9 ) およぴプライマー 2 (配列番号： 1 0 ) およびプローブ 1 (配列番号 : 1 1 ) (Fam-ctccccgtgctaaggcccacaaa-Tamra) を使用した。 RT- PCR反応液は T aqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems社) 12. 5 1に、 てれて れ 100 のプライマー溶液を 0. 05 1、 5 ¾1のプローブ1を0. 5 1、 およぴ上記 で調製した cDNA溶液を 0. 5 μ 1加え、 蒸留水で総反応液量を 25 μ 1とした。 PCR反応 は 50°C · 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C . 1分のサイクルを 40回繰り返 した。 その結果ヒト GPR35は、 胃、 小腸、 大腸などの消化管、 後根神経節 (DRG) 、 下垂体、 精巣、 Colo201、 Colo205、 SW1417、 SW837、 SW1463、 WiDrなどの大腸 癌細胞株で高発現していることが判明した。 RNA l ^ g was used as a random primer, and SuperScriptll reverse transcriptase (Invitrogen) was used as a reverse transcriptase, and the reaction was performed at 42 ° C according to the attached manual. After completion of the reaction, ethanol precipitation was performed and dissolved in 100 µl . RT-PCR uses Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosystems), Primer 1 (SEQ ID NO: 9), Primer 2 (SEQ ID NO: 1 0) and Probe 1 (SEQ ID NO: 1 1) (Fam- ctccccgtgctaaggcccacaaa-Tamra) was used. The RT-PCR reaction solution was TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 12.51, and 100 primer solutions were added to 0.051, 5¾1 probe 1 to 0.51, and so on. Add 0.5 μ1 of the cDNA solution prepared above, and make the total reaction volume to 25 μ1 with distilled water. The PCR reaction was repeated 50 times at 50 ° C for 2 minutes and 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute. As a result, human GPR35 is highly expressed in gastrointestinal cancer cell lines such as gastrointestinal tract such as stomach, small intestine and large intestine, dorsal root ganglion (DRG), pituitary gland, testis, Colo201, Colo205, SW1417, SW837, SW1463 and WiDr. Turned out to be.
マウスでの発現を調べるために使用した铸型となる cDNAには、 マウス各種組織 由来のトータル R Aから以下の方法で合成したものを使用した。  The cDNA that was used to examine the expression in mice was a cDNA synthesized from total RA derived from various mouse tissues by the following method.
RNA l w gからランダムプライマー、 逆転写酵素として SuperScriptll逆転写酵 素 （Invitrogen社） を用い、 添付のマニュアルに従って 42°Cで反応を行い、 反応 終了後にエタノール沈殿して 100 μ 1に溶解した。 RT-PCRは Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosystems社） を用い、 プライマー 3 (配列番 号： 1 2 ) およびプライマー 4 (配列番号： 1 3 ) およぴプローブ 2 (配列番号 : 1 4 ) (Fam-ctgcccgagacaccttcagccgt-Tamra) を使用した。 RT- PCR反応液は T aqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems社） 12. 5 /^ 1に、 それぞれ 100 μ Mのプライマー溶液を 0. 05 1、 のプローブ 2を 0. 5 μ 1、 および上記で調製 した cDNA溶液を 0. 5 μ 1加え、 蒸留水で総反応液量を 25 μ 1とした。 PCR反応は 50°C • 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。 その結果マウス GPR35 mRNAは、 胃、 小腸、 大腸などの消化管、 後根神経節 （DR G) 、 気管、 脾臓、 骨髄、 精巣、 卵巣、 脂肪細胞分化誘導後の 3T3- Ll、 白色脂肪 細胞、 CE - 2、 BFなどの大腸癌細胞株で高発現していることが判明した。 実施例 7 Random primers from RNA lwg and SuperScriptll reverse transcriptase (Invitrogen) as reverse transcriptase were used, and the reaction was performed at 42 ° C according to the attached manual. After completion of the reaction, ethanol precipitation was performed and dissolved in 100 µl. RT-PCR uses Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosystems) and primer 3 (SEQ ID NO: No. 1 2) and primer 4 (SEQ ID NO: 1 3) and probe 2 (SEQ ID NO: 1 4) (Fam-ctgcccgagacaccttcagccgt-Tamra) were used. RT-PCR reaction solution is TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems) 12.5 / ^ 1 with 100 μM primer solution 0.05 1 each, probe 2 0.5 μ1 and above 0.5 μ1 of the cDNA solution prepared in step 1 was added, and the total reaction volume was adjusted to 25 μ1 with distilled water. The PCR reaction was repeated 50 cycles at 50 ° C for 2 minutes and 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute. As a result, mouse GPR35 mRNA is found in gastrointestinal tract such as stomach, small intestine, large intestine, dorsal root ganglion (DR G), trachea, spleen, bone marrow, testis, ovary, 3T3-Ll after induction of adipocyte differentiation, white fat cells, It was found to be highly expressed in colon cancer cell lines such as CE-2 and BF. Example 7
ヒ ト GPR35のスプライシングバリアントの取得  Obtaining splicing variant of human GPR35
ヒ ト GPR35の 3種類のバリアント GPR35- Ll、 GPR35 - L2ぉょぴ GPR35 - L3のクロー二 ングは、 それぞれの塩基配列に特異的な 2個のプライマーを用いた PCRによって 行なった。 GPR35- L1クローニング用のプライ ーとしては、 プライマー 1 (配列 番号： 1 5 ) およびプライマー 2 (配列番号： 1 6 ) を、 GPR35- L2 クローニン グ用のプライマーとしては、 プライマー 3 (配列番号： 1 7 ) およびプライマー 2 (配列番号： 1 6 ) 、 GPR35- L3クローニング用のプライマーとしては、 プライ マー 4 (配列番号： 1 8 ) およびプライマー 2 (配列番号： 1 6 ) を用いた。 ヒ ト結腸 cDNA (Clontech) を錄型として、 それぞれのプライマーを用いて PCR を 行なった。 PCR には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造） を用い、 （1) 98°C 1. 分の後、 （2) 98°C 10秒、 60°C 30秒、 72°C 90秒を 35 回の増幅反応後、 （3) 72°C 5分の伸長反応を行なった。 反応後、 増幅産物を pCR- Blunt II-TOPO (Ιην itrogen) に揷入し、 これを大腸菌 JM109 (宝酒造） に導入してクローユングし た。 その塩基配列を解析した結果、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列 （ヒ ト GPR35- L1) をコードする CDNAの塩基配列 （配列番号： 2 0 ) 、 配列番号： 2 1 で表されるァミノ酸配列 （ヒト GPR35 - L2) をコー -ドする cDNAの塩基配列 （配列番 号： 2 2 ) 、 および配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列 （ヒト GPR35 - L3) を コードする cDNAの塩基配列 （配列番号： 2 4 ) を得た。 このプラスミドを制限酵 素 Sal I及ぴ Spe I で切断した後、 プラスミドベクター pAKKO- 111H [Biochem . Biophys. . Acta.， 1219卷， 251 (1994)〕 に挿入して発現ベクターを構築した。 The three variants of human GPR35, GPR35-Ll and GPR35-L2 Hoppi GPR35-L3, were cloned by PCR using two primers specific for each nucleotide sequence. Primer 1 (SEQ ID NO: 15) and primer 2 (SEQ ID NO: 16) are used as primers for GPR35-L1 cloning, and primer 3 (SEQ ID NO: 1) is used as a primer for GPR35-L2 cloning. 7) and Primer 2 (SEQ ID NO: 16), Primer 4 (SEQ ID NO: 18) and Primer 2 (SEQ ID NO: 16) were used as primers for GPR35-L3 cloning. PCR was performed using human colon cDNA (Clontech) as a saddle type and each primer. Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) was used for PCR. (1) After 98 ° C for 1 minute, (2) 35 times of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 90 seconds Later, (3) an extension reaction was performed at 72 ° C for 5 minutes. After the reaction, the amplified product was inserted into pCR-Blunt II-TOPO (Ιην itrogen) and introduced into Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) for cloning. As a result of analyzing the base sequence, the base sequence of the CDNA encoding the amino acid sequence (Hit GPR35-L1) represented by SEQ ID NO: 19 (SEQ ID NO: 20), represented by SEQ ID NO: 21 CDNA sequence encoding the amino acid sequence (human GPR35-L2) (SEQ ID NO: 2 2) and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 (human GPR35-L3) The base sequence (SEQ ID NO: 24) was obtained. This plasmid was digested with restriction enzymes Sal I and Spe I, and plasmid vector pAKKO-111H [Biochem Biophys. Acta., 1219 卷, 251 (1994)] to construct an expression vector.
ヒト GPR35 - L1蛋白質は、 ヒト GPR35蛋白質の N末端に 31アミノ酸残基の付力卩がぁ る。 ヒ ト GPR35-L2蛋白質は、 ヒ ト GPR35蛋白質の N末端に 41アミノ酸残基の付加が ある。 ヒ ト GPR35- L3蛋白質は、 ヒ ト GPR35蛋白質の N末端に 85アミノ酸残基の付加 がある。 実施例 8  Human GPR35-L1 protein has 31 amino acid residues at the N-terminus of human GPR35 protein. Human GPR35-L2 protein has 41 amino acid residues added to the N-terminus of human GPR35 protein. Human GPR35-L3 protein has 85 amino acid residues added to the N-terminus of human GPR35 protein. Example 8
G a 16、 GPR35安定共発現細胞の取得及び反応性の確認  Acquisition of G a 16, GPR35 stable co-expressing cells and confirmation of reactivity
宿主細胞の G o; 16の安定発現細胞株 （G a l6/CH0細胞株） は、 G o; 16発現べクタ 一 (Guthrie cDNA Resource Center) を常法に従って CH0糸田月包に導入し、 10% 牛 胎児皿 (Invitrogen; 、 50 units/ ml penicillin/50ug/ml streptomycin (CAM B EX) 、 および Img/ml geneticin (Invitrogen) を含む a MEM培地 （核酸含有： Invitrogen) を用いて、 5% C02、 37°Cで培養した。 トランスブェクシヨンには 、 10% 牛胎児血清のみを含む MEM培地 （核酸含有） で、 75cm2 フラスコにて 2 日間培養した細胞を用いた。 トランスフエクシヨンは Lipofectamine試薬 (Invit rogen) を用い、 試薬添付の方法に準じて操作を行った。 まず、 15ml容遠沈管を 2 本用意し、 それぞれに Opt i- MEM培地 （Invitrogen) を 600 μ 1分注した。 次に、 片 方のチューブに発現ベクターを 4. 8 §、 もう片方に Lipofectamine試薬を 36 μ 1添 加後、 両者を混合し、 20分間室温に静置した。 この溶液に Opti- MEM培地を 6mlカロ えたトランスフエクシヨン用混合液を、 あらかじめ Opti_MEM培地を用いて洗浄し た G a 16/CH0細胞に添加後、 C02培養器 （5% C02、 37°C) にて 5時間培養した。 培 ' 養後の細胞は、 PBS (Invitrogen) を用いてリンスした後、 0. 05% トリプシン · EDTA溶液 （Invitrogen) を用いて剥がし、 遠心操作にて回収した。 得られた細胞 の数を測定し、 培地 100 μ ΐあたり 0. 3個、 1. 5個、 および 7. 5個の細胞が含まれる ように 10%牛胎児透析血清 （Invitrogen) のみを含む α ΜΕΜ培地 （核酸不含： Inv itrogen) で希釈し、 96 - well plate (FALCON) に 1穴あたり 100 μ 1ずつ分注後、 C 02培養器にて一晚培養した。 翌日、 培養上清を除去し、 1穴あたり 200 μ 1の 10% 牛胎¾透析皿 ft" (Invitrogen) 、 50 units/ml penicillin/50ug/ml streptomyci n (CAMBREX) 、 および lmg/ml geneticine (Invitrogen) を含む a MEM培地 （核 酸不含： Invitrogen、 これ以降の培養は同培地を使用） を力 Πえて、 更に約 2週間 培養した。 潁微鏡にて 1穴あたり 1コロエーを形成したものを選択し、 その培養上 清を除去し、 lg/1 EDTA を含む PBSを用いてリンスした後、 剥がした細胞を 1穴あ たり lml の培地の入った 24穴プレートに移した。 細胞の増殖したものから順次、 25cm2フラスコ、 75cm2フラスコへと移し換えた。 The host cell G0; 16 stably expressing cell line (Gal6 / CH0 cell line) was introduced into the CH0 Itoda sachet according to a conventional method. % Bovine fetal dishes (Invitrogen;, 50 units / ml penicillin / 50ug / ml streptomycin (CAM B EX) and Img / ml geneticin (Invitrogen) in a MEM medium (containing nucleic acid: Invitrogen), 5% C0 the 2, 37 ° were cultured in C. trans Bed E click Chillon, in MEM medium containing only 10% fetal bovine serum (nucleic acid-containing), using a two-day culture cells at 7 5 cm 2 flasks. Toransufu For the excision, Lipofectamine reagent (Invitrogen) was used and the procedure was performed according to the method attached to the reagent First, prepare two 15 ml centrifuge tubes, each containing Opti-MEM medium (Invitrogen) at 600 μ1. It was dispensed. Next, the expression vector 4. piece side of the tube 8 §, the Lipofectamine reagent to the other 36 mu 1 after added pressure Were mixed and the mixture was left at room temperature for 20 minutes. After addition of Opti MEM medium to the solution and the mixture for transflector Ekushi Yong that example 6ml Caro, the G a 16 / CH0 cells were washed with pre Opti_MEM medium , C0 2 incubator (5% C0 2, 37 ° C) in cultured for 5 hours. culture 'Yogo cells, rinsed with PBS (Invitrogen), 0. 05% trypsin · EDTA solution ( Invitrogen), and collected by centrifugation, and the number of cells obtained was measured to include 0.3, 1.5, and 7.5 cells per 100 μΐ of medium. 10% fetal bovine dialysis serum (Invitrogen) only in α ΜΕΜ medium (nucleic acid-free: Invitrogen) diluted, and dispensed into a 96-well plate (FALCON) at 100 μl per well, then C 0 2 The next day, the culture supernatant was removed and 200 μl of 10% fetal bovine dialysis dish ft "(Invitrogen), 50 units / ml penicil per well. a MEM medium containing lin / 50ug / ml streptomyci n (CAMBREX) and lmg / ml geneticine (Invitrogen) (nuclear acid-free: Invitrogen; use this medium for subsequent cultures). weekly Cultured. Using a microscopic mirror, select one that formed one coloe per well, remove the culture supernatant, rinse with PBS containing lg / 1 EDTA, and remove 1 ml of detached cells per well. Transferred to a 24-well plate with medium. The grown cells were sequentially transferred to a 25 cm 2 flask and a 75 cm 2 flask.
上記の方法で取得したヒ ト GPR35と G a l6を共発現させた CH0細胞株を 3 x l04個 ΖΐΟΟ μ Ιの細胞が含まれるように希釈し、 Black walled 96- well plate (Costar ) に 1穴あたり 100 μ 1ずつ分注後、 C02培養器にてー晚培養した。 実施例 1に記載 の方法に従い、 細胞内カルシウム濃度の変動を FLIPR (Molecular Device) を用 いて測定したところ、 DNQXおよびェラグ酸を添加することにより、 細胞内カルシ ゥム濃度が上昇することが確認された。 実施例 9 . Diluted to contain the CH0 cell lines of human GPR35 and G a l6 obtained were co-expressed by the above method is 3 x l0 4 pieces ΖΐΟΟ μ Ι cells, the Black walled 96- well plate (Costar) 100 μ 1 each was dispensed per well, it was over晚cultured in a C0 2 incubator. According to the method described in Example 1, the fluctuation of intracellular calcium concentration was measured using FLIPR (Molecular Device), and it was confirmed that the intracellular calcium concentration increased by adding DNQX and ellagic acid. It was done. Example 9.
FIJPRを用いた GPR35ァゴニス トの探索法  GPR35 algorithm search method using FIJPR
上記実施例 8で得られた G a 16、 GPR35安定共発現細胞を、 それぞれ 3 X 105cell s/mlとなるように培地 （10%牛胎児透析血清 （Invitrogen) 、 50 units/ml peni cillin/50ug/ml streptomycin (CA BREX) 、 および lmg/ml geneticin (Invitro gen) を含む MEM培地 （核酸不含： Invitrogen) ) に懸濁し、 FLIPR用96穴プレ ート（Black plate clear bottom, Costar社）に 8連ピぺットを用いて各ゥエルに 1 ΟΟ μ Ιずつ植え込み （3. 0 Χ 104。Θΐΐ3/100 /ί 1/ゥエル） 、 5% C02インキュベータ 一中にて 37°Cでー晚培養した以降のアツセィに用いる （以後、 細胞プレートとす る） 。 H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9. 8g、 炭酸水素ナトリ ゥム 0. 35g、 HEPES 4. 77 g、 6 ΜτΚ酸ィ匕ナトリゥム溶液で ρΗ7. 4に合わせた後、 フィルター滅菌処理） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 μ 1、 ゥシ胎児血清（FBS) 200 μ 1を混合する。 また、 Fluo 3-AM (同仁化学研究所） 2バイアル （50 μ §) を ジメチルスルフォキサイ ド 40 μ 1 20% Pluronic acid (Molecular Probes社 ) 40 1に溶解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連 ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル ΙΟΟ Ιずつ分注し、 5 % C02インキュベータ一中にて 37°Cで 1時間インキュベートする （色素ローディ ング） 。 G a 16 and GPR35 stable co-expressing cells obtained in Example 8 above were cultured in a medium (10% fetal bovine dialysis serum (Invitrogen), 50 units / ml penicillin) so as to be 3 × 10 5 cells / ml. / 50ug / ml streptomycin (CA BREX) and MEM medium containing lmg / ml geneticin (Invitrogen) (Nucleic acid free: Invitrogen)) suspended in FLIPR 96 -well plate (Black plate clear bottom, Costar) ) Implant 1 ΟΟ μ 連 in each well using 8 pipettes (3.0 Χ 10 4 Θΐΐ3 / 100 / ί 1 / well), 5% C0 2 37 ° C in one incubator Use it for assembly after culturing in 晚 (hereinafter referred to as cell plate). H / HBSS (Nissy Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g, sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4. 77 g, 6 ΚτΚ 酸 匕 sodium solution adjusted to ρΗ7.4, filter Sterilization) Mix 20 ml, 250 mM Probenecid 200 μ1, and rabbit fetal serum (FBS) 200 μ1. Further, Fluo 3-AM dissolved in (Dojin Kagaku Kenkyusho) 2 vials (50 mu §) of dimethyl sulphoxide described de 40 μ 1 20% Pluronic acid ( Molecular Probes , Inc.) 40 1, which the H / HBSS Probenecid- addition to FBS, after mixing, dispensed at each Ueru Iotaomikuron'omikuron iota the cell plate except the culture solution using an 8 channel pipette, 1 hour incubation at 37 ° C for at 5% C0 2 incubator in one ( Dye loading).
試験化合物を含有する溶液を 2. 5 mM Probenecid, 0. 1% CHAPSを含む H/HBSS または 2. 5 mM Probenecid, 0. 1% CHAPS, 0. 2% BSAを含む H/HBSS 220 μ 1にカロ えて希釈し、 FLIPR用 96穴プレート （V- Bottomプレート、 Coster社） へ移す （以 後、 サンプルプレートとする） 。 細胞プレートの色素ローデ、イング終了後、 H/HB SSに 2. 5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー （ELX40 5， Bio- Tek Instruments社） を用いて細胞プレートを洗浄し、 洗浄後 ΙΟΟ μ Ιの洗 浄バッファーを残す。 この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセットし (FLIPRにより、 サンプルプレートから 50 i lのサンプルが細胞プレートへと移さ れる） 、 蛍光強度変化を継時的に測定することにより、 細胞内カルシウムイオン 濃度上昇活性を測定する。 GPR35を発現させない CH0細胞、 または、 ヒスタミン HI 受容体、 GPR40受容体、 TGR7受容体などの対照受容体を発現させた CH0細胞株を用 いて上記と同様の試験を実施し、 Gひ 16、 GPR35安定共発現細胞の細胞内カルシゥ ムイオン濃度を特異的に上昇させる化合物を探索する。 実施例 1 0 H / HBSS containing 2.5 mM Probenecid, 0.1% CHAPS Or 2.5 mM Probenecid, 0.1% CHAPS, 0.2% BSA-containing H / HBSS 220 μ1, dilute and transfer to 96-well plate for FLIPR (V-Bottom plate, Coster) After that, it is a sample plate). After completion of dye loading on the cell plate, wash the cell plate with a washing buffer containing 2.5 mM Probenecid in H / HB SS using a plate washer (ELX40 5, Bio-Tek Instruments). Leave the μΙ wash buffer. This cell plate and sample plate are set in FLIPR (with FLIPR, a 50 il sample is transferred from the sample plate to the cell plate), and the concentration of intracellular calcium ions is increased by measuring changes in fluorescence intensity over time. Measure activity. The same test as described above was performed using CH0 cells that do not express GPR35, or CH0 cell lines that expressed control receptors such as histamine HI receptor, GPR40 receptor, and TGR7 receptor. Search for compounds that specifically increase intracellular calcium ion concentration in stable co-expressing cells. Example 1 0
ラット腸管粘膜層での選択的 GPR35遺伝子発現 .  Selective GPR35 gene expression in rat intestinal mucosa layer.
腸管における GPR35遺伝子発現部位が粘膜層であるか筋層であるかを明らかに するために、 マイクロダイセクション法により分離したラット回腸粘膜層と筋層 における GPR35遺伝子発現量を TaqMan法によりそれぞれ測定した。 11週齢の雄性 S D (IGS) ラットをエーテルで麻酔した後、 断頭を行い放血した。 摘出した回腸を 、 液体窒素による冷却下にて、 O. C. T.コンパウンド中に凍結包埋した。 クリオス タツトを用いて専用フィルム付スライドガラス （Leica : 90F0IL- SL25) 上に 10 / m 新鮮凍結切片を作製し、 次に切片をクリオスタツト庫内 (_20°C)で乾燥させた。 軽く室温に馴染ませた後、 5%酢酸を含む永冷エタノール液中で 3分間固定した。 切片を氷冷 RNaseFree水で洗浄した後、 氷冷 0. 05%トルイジンブルーで 20秒間染色 し、 さらに氷冷 RNaseFree水で洗浄した。 ドライヤーの冷風で乾燥した後、 スラ ィドはマイクロダイセクション直前まで 4°Cで保存した。 Leica Laser Microdiss ection System (LMD)を用いて、 1cm2程度の組織切片 4枚分から筋層と粘膜層を、 I S0GENをあらカゝじめ分注したチューブにそれぞれ回収した。 筋層と粘膜層の IS0GE N抽出液から Total RNAを精製し、 最終的にそれぞれ 18 μ ΐ の Total RNA溶液を得 た。 10 μ ΐの R A溶液と 1 1 の 200 ng/ μ 1濃度のランダムプライマーを 70°Cで 1 0分間保温後、 氷冷した。 この溶液に、 1 μ 1の SuperScriptll逆転写酵素 （Invit rogen) 、 4 ^ 1の逆転写酵素に付属のバッファー、 .2 の 0. 1M ジチオスレィト ール溶液、 1 μ 1の 10 ηιΜデォキシヌクレオチド混合液と 1 μ 1の R A分解酵素阻害 剤 RNaseOUT (Invitrogen)を添加して、 総体積を 20 z lとした。 逆転写反応は、 以下の条件で行った。 反応液を順次 25°Cで 10分間、 42°Cで 50分間、 70°Cで 15分間 、 4°Cで 5分間保温し、 逆転写 cDNA溶液を得た。 To clarify whether the GPR35 gene expression site in the intestinal tract is the mucosal layer or the muscle layer, the GPR35 gene expression level in the rat ileal mucosa layer and muscle layer separated by the microdissection method was measured by TaqMan method, respectively. . Eleven week old male SD (IGS) rats were anesthetized with ether, then decapitated and exsanguinated. The excised ileum was cooled and embeded in OCT compound under cooling with liquid nitrogen. A 10 / m fresh frozen section was prepared on a slide glass with a special film (Leica: 90F0IL-SL25) using a cryostat, and then the section was dried in a cryostat chamber (_20 ° C). After lightly acclimating to room temperature, the mixture was fixed in a permanent ethanol solution containing 5% acetic acid for 3 minutes. The sections were washed with ice-cold RNaseFree water, stained with ice-cold 0.05% toluidine blue for 20 seconds, and further washed with ice-cold RNaseFree water. After drying with the cool air of the dryer, the slide was stored at 4 ° C until just before the microdissection. Using the Leica Laser Microdissection System (LMD), the muscle layer and the mucosal layer were collected from 4 tissue sections of about 1 cm 2 into tubes that were dispensed with IS0GEN. Total RNA was purified from the IS0GEN extract of the muscular layer and mucosal layer, and 18 μΐ of total RNA solution was finally obtained. 10 μΐ RA solution and 1 1 200 ng / μ 1 concentration of random primer 1 at 70 ° C After incubating for 0 minutes, the mixture was ice-cooled. To this solution, 1 mu 1 of SuperScriptll reverse transcriptase (Invit rogen), 4 ^ 1 that came with the reverse transcriptase buffer, 0. 1M Jichiosureito Lumpur solution .2, 1 μ 1 of 10 Itaiotamyu de O carboxymethyl nucleotides The mixture and 1 μl of RA-degrading enzyme inhibitor RNaseOUT (Invitrogen) were added to a total volume of 20 zl. The reverse transcription reaction was performed under the following conditions. The reaction solution was sequentially incubated at 25 ° C for 10 minutes, 42 ° C for 50 minutes, 70 ° C for 15 minutes, and 4 ° C for 5 minutes to obtain a reverse transcription cDNA solution.
ラット GPR35遺伝子と内部標準となるラット GAPDH遺伝子発現コピー数は、 TaqM an PCR法により決定された。 ラット GPR35遺伝子測定のための TaqMan PCR反応液 は、 10 1の逆転写 cDNA溶液または 1 ^ 1の各種濃度の標準ラット GPR35 DNA、 0. 2 /ζ Μの合成 DNAフォワードプライマー （配列番号： 2 9 ) 、 0. 2 ^ Mの合成 DNAリ パースプライマー （配列番号： 3 0 ) 、 0. 2 μ Μのラット GPR35 TaqManプローブ (配歹幡号： 3 1 ) t TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosysteras) からなり、 全容量は 25 / lである。 ラット GAPDH遺伝子測定のための TaqMan PCR 反応液は、 10 / lの逆転写 cDNA溶液または 1 μ ΐの各種濃度の標準ラット GAPDH D ΝΑと Rodent GAPDH遺伝子測定キット （Applied Biosystems) に添付の合成 DNAフ ォワードプライマー、 合成 DNAリパースプライマーおよぴラット GAPDHプローブと TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)力 らなり、 全容量は 25 μ ΐである。 PCR反応は、 ABI PRISM 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems)を用い、 順次 50°Cで 2分、 95。Cで 10分保温し、 次に 95°Cで 15秒、 60°C で 60秒のサイクルを 40回繰り返すことにより行なった。 ラット GPR35遺伝子とラ ット GAPDH遺伝子発現コピー数は、 ABI PRISM 7700 SDSソフトウエアによって算 出した。 リポーターの蛍光強度が、 設定された値に達した瞬間のサイクノレ数を縦 軸にとり、 標準 DNAのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。 標 準曲線から、 逆転写 cDNAに含まれる遺伝子発現コピー数を算出し、 ラット GPR35 遺伝子発現コピー数を GAPDH遺伝子発現コピー数で序した値を、 標準化したラッ ト GPR35遺伝子発現量とした。 '  The rat GPR35 gene and the internal standard rat GAPDH gene expression copy number were determined by the TaqMan PCR method. TaqMan PCR reaction solution for rat GPR35 gene measurement is 10 1 reverse transcription cDNA solution or standard rat GPR35 DNA of various concentrations of 1 ^ 1 and 0.2 / ζ 合成 synthesis DNA forward primer (SEQ ID NO: 29) ), 0.2 ^ M synthetic DNA reverse primer (SEQ ID NO: 30), 0.2 μΜ rat GPR35 TaqMan probe (No .: 3 1) t TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosysteras) The total capacity is 25 / l. TaqMan PCR reaction solution for rat GAPDH gene measurement can be prepared using 10 / l reverse transcription cDNA solution or 1 μΐ of standard rat GAPDH D ΝΑ and the synthetic DNA file attached to Rodent GAPDH gene measurement kit (Applied Biosystems). Combining forward primer, synthetic DNA repurse primer, rat GAPDH probe and TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), the total volume is 25 μΐ. The PCR reaction was performed using an ABI PRISM 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems), sequentially at 50 ° C for 2 minutes, 95. The temperature was kept at C for 10 minutes, and then the cycle of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 60 seconds was repeated 40 times. Rat GPR35 gene and rat GAPDH gene expression copy numbers were calculated using ABI PRISM 7700 SDS software. A standard curve was created with the vertical axis representing the number of cyclores at the moment when the fluorescence intensity of the reporter reached the set value, and the horizontal axis representing the logarithm of the copy number of the standard DNA. From the standard curve, the gene expression copy number contained in the reverse transcribed cDNA was calculated, and the value obtained by ordering the rat GPR35 gene expression copy number by the GAPDH gene expression copy number was used as the standardized rat GPR35 gene expression level. '
粘膜層と筋層における標準化したラット GPR35遺伝子発現量は、 それぞれ 0. 004 2と 0. 0002であった。 すなわち、 粘膜層における GPR35遺伝子発現量は、 筋層にお けるそれの約 21倍多かった。  Normalized rat GPR35 gene expression levels in the mucosa and muscle layers were 0.0042 and 0.0002, respectively. That is, the expression level of GPR35 gene in the mucosa layer was about 21 times higher than that in the muscle layer.
GPR35遺伝子は粘膜層で選択的に発現することから、 栄養素の吸収と消化、 腸 管免疫に関与することが示唆された。 例えば、 GPR35のァゴニストで cAMPの産生 を阻害することにより、 胃酸などの消化液の分泌を抑制でき、 消化性潰瘍の予防 •治療などが可能になる。 また、 GPR35のァゴニストにより腸管からの電解質漏 洩を抑制できるため、 下痢や吸収不良症候群の予防 ·治療などが可能になる。 GP R35のアンタゴニストで cAMPの産生を促進させることにより、 大腸粘膜やマクロ ファージからの各種炎症性サイトカインの分泌を抑制できるため、 自己免疫疾患 、 炎症性腸疾患などの免疫疾患の予防 ·治療が可食 こなる。 実施例 1 1 Since the GPR35 gene is selectively expressed in the mucosal layer, absorption and digestion of nutrients, intestines It was suggested to be involved in tube immunity. For example, by inhibiting cAMP production with GPR35 agonist, secretion of gastric acid and other digestive juices can be suppressed, making it possible to prevent and treat peptic ulcers. In addition, GPR35 agonists can suppress electrolyte leakage from the intestinal tract, making it possible to prevent and treat diarrhea and malabsorption syndrome. By promoting the production of cAMP with an antagonist of GP R35, the secretion of various inflammatory cytokines from the colonic mucosa and macrophages can be suppressed, enabling prevention and treatment of immune diseases such as autoimmune diseases and inflammatory bowel diseases. Eating. Example 1 1
脂肪細胞分ィ匕に伴う GPR35遺伝子発現の宂進  Increased GPR35 gene expression associated with adipocyte differentiation
マウス 3T3- L1を脂肪細胞に分ィヒさせ、 分ィヒ前と分化後における GPR35遺伝子発 現量を測定した。 脂肪細胞分化は、 以下の培養条件で行った。 3T3- L1細胞を基本 増殖培地 （DMEM, 10%ゥシ血清， 0. 2 mMァスコルビン酸） で培養した。 細胞がコ ンフルェントに達した後、 分化誘導培地 （DMEM, 10%ゥシ胎児血清， 2. 5 μ Μ Dex amethasone, 0. 5 mM IBMX, 0. 2 mM ァスコノレビン酸， 10 ^ g/ml Insulin) で 48 時間培養した。 次に、 細胞を分化維持培地 （DMEM, 10%ゥシ胎児血清， 0. 2 ァ スコルビン酸， 10 μ g/ml Insulin) で培養した。 分化前と分化維持 5、 10と 15日 目の細胞から IS0GENを用いて、 Total腿を精製した。 50 μ ΐ の Total RNA溶液 に、 1 1の I型 DNA分解酵素 （GenHunter) と 5· 7 μ 1のキットに添付のバッファ 一を添加し、 37°Cで 30分間保温した。 フエノール/クロ口ホルム混液を用いて反 応液から RNAを抽出し、 次いで R A溶液の 5倍容量のエタノールと 8分の 1倍容量の 3 M酢酸ナトリゥム溶液の添カ卩によるエタノール沈殿法により R Aを回収した。 0. 2 μ / μ Ι の RNA溶液 2. 5 jU 1、 10 mMのデォキシヌクレオチド混合液 4 μ 1、 50 p mol/ ΐ のランダムプライマー 0. 5 μ ϊ と蒸留水 6 ^ 1からなる混合液を 65°Cで 5 分間保温後、 氷冷した。 この溶液に、 1 /i lの SuperScriptlll逆転写酵素 （Invi trogen) 、 4 μ 1の逆転写酵素に付属のバッファー、 1 μ 1の 0. 1M ジチオスレィ トール溶液と 1 μ 1の RNA分解酵素阻害剤 R aseOUT - (Invitrogen)を添加して、 総 体積を 20 1とした。 逆転写反応は、 以下の条件で行った。 これら反応液を順次 25°Cで 5分間、 50°Cで 60分間、 70°Cで 15分間、 4°Cで 5分間保温し、 逆転写 cDNA溶 液を得た。 マゥス GPR35遺伝子発現コピー数は、 TaqMan PCR法により決定された。 マウス G PR35遺伝子測定のための TaqMan PCR反応液は、 1 μ 1の逆転写 cDNA溶液または標 準マウス GPR35 D 、 0. 2 ； u Mの合成 MAフォワードプライマー （配列番号： 3 2 ) 、 0. 2 の合成 DNAリバースプライマー （配列番号： 3 3 ) 、 0. 2 のラッ ト GPR35 TaqManプローブ （配列番号： 3 4 ) と TaqMan Universal PCR Master Mi x (Applied Biosystems)からなり、 全容量は 25 である。 PCR反応は、 ABI PRI SM 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems)を用い、 眞次 50。Cで 2 分、 95°Cで 10分保温し、 次に 95°Cで 15秒、 60°Cで 60秒のサイクルを 40回繰り返す ことにより行なった。 マウス GPR35遺伝子発現コピー数は、 ABI PRISM 7700 SDS ソフトゥヱァによって算出した。 リポーターの蛍光強度が、 設定された値に達し た瞬間のサイクル数を縦軸にとり、 標準 DNAのコピー数の対数値を横軸にとって 標準曲線を作成した。 標準曲線から、 逆転写 cDMに含まれる遺伝子発現コピー数 を算出し、 25 ng R Aから逆転写された cDNAに含まれるマウス GPR35遺伝子発現コ ピー数を得た。 Mouse 3T3-L1 was divided into adipocytes, and the amount of GPR35 gene expressed before and after differentiation was measured. Adipocyte differentiation was performed under the following culture conditions. 3T3-L1 cells were cultured in basic growth medium (DMEM, 10% sushi serum, 0.2 mM ascorbic acid). After cells reach confluence, differentiation induction medium (DMEM, 10% urine fetal serum, 2.5 μΜ Dex amethasone, 0.5 mM IBMX, 0.2 mM isconolevic acid, 10 ^ g / ml Insulin) For 48 hours. Next, the cells were cultured in a differentiation maintenance medium (DMEM, 10% urine fetal serum, 0.2 ascorbic acid, 10 μg / ml insulin). Total thighs were purified using IS0GEN from cells on differentiation days 5, 10, and 15 before differentiation. To 50 μΐ of total RNA solution, 11 type I DNA-degrading enzyme (GenHunter) and 5.7 μ1 of the buffer attached to the kit were added and incubated at 37 ° C for 30 minutes. RNA was extracted from the reaction solution using a phenol / chloroform form mixture, and then RA was precipitated by ethanol precipitation using a mixture of 5 volumes of ethanol and 1/8 volume of 3 M sodium acetate solution. Was recovered. 0.2 μ / μΙ RNA solution 2.5 jU 1, 10 mM deoxynucleotide mixture 4 μ1, 50 pmol / ΐ random primer 0.5 μϊ and distilled water 6 ^ 1 The mixture was kept at 65 ° C for 5 minutes and then cooled on ice. In this solution, 1 / il SuperScriptlll reverse transcriptase (Invitrogen), 4 μl reverse transcriptase buffer, 1 μl 0.1M dithiothreitol solution and 1 μl RNase inhibitor R aseOUT-(Invitrogen) was added to make the total volume 20 1. The reverse transcription reaction was performed under the following conditions. These reaction solutions were sequentially incubated at 25 ° C for 5 minutes, 50 ° C for 60 minutes, 70 ° C for 15 minutes, and 4 ° C for 5 minutes to obtain a reverse transcription cDNA solution. The mouse GPR35 gene expression copy number was determined by TaqMan PCR method. TaqMan PCR reaction solution for mouse GPR35 gene measurement is 1 μl reverse transcription cDNA solution or standard mouse GPR35 D, 0.2; u M synthetic MA forward primer (SEQ ID NO: 3 2), 0. 2 synthetic DNA reverse primers (SEQ ID NO: 3 3), 0.2 rat GPR35 TaqMan probe (SEQ ID NO: 3 4) and TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), total volume 25 . PCR is performed using ABI PRI SM 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems). Incubation was carried out for 2 minutes at C, 10 minutes at 95 ° C, and then 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 60 seconds. Mouse GPR35 gene expression copy number was calculated by ABI PRISM 7700 SDS software. A standard curve was prepared with the vertical axis representing the number of cycles at the moment when the fluorescence intensity of the reporter reached the set value and the horizontal axis representing the logarithm of the copy number of the standard DNA. From the standard curve, the number of gene expression copies contained in reverse transcribed cDM was calculated, and the number of mouse GPR35 gene expression copies contained in cDNA reverse transcribed from 25 ng RA was obtained.
脂肪細胞分化に伴い、 GPR35遺伝子発現量は増加した。 分化前と分化維持 5、 10 と 15日目の 25 ng RNAあたりの GPR35遣伝子発現コピー数は、 それぞれ 2300、 2200 0、 110000と 160000であった。  With adipocyte differentiation, the expression level of GPR35 gene increased. The number of GPR35 gene expression copies per 25 ng RNA before differentiation and on maintenance days 5, 10, and 15 was 2300, 2200, 110000, and 160000, respectively.
脂肪細胞分化に伴い GPR35遺伝子発現量が増加することから、 脂肪細胞におい て GPR35は脂肪分解、 糖取り込み、 脂肪分化調節に関与することが示唆された。 G PR35のァゴニストは細胞内 cAMP濃度を下げる作用を有し、 細胞内 cAMPの低下は、 脂肪分解を抑え血中脂肪酸濃度を低下させることより、 GPR35のァゴニストは、 I I型糖尿病の予防 ·治療に有用である。 また、 GPR35のアンタゴニストは細胞内 cA MP濃度を上げる作用を有し、 細胞內 cAMPの上昇は、 脂肪分解を刺激して脂肪合成 を抑えることより、 GPR35のアンタゴニストは肥満の予防 ·治療に有用である。 実施例 1 2  The expression level of GPR35 gene increased with adipocyte differentiation, suggesting that GPR35 is involved in lipolysis, sugar uptake and regulation of adipogenesis in adipocytes. GPR35 agonist has the effect of lowering intracellular cAMP concentration, and the decrease in intracellular cAMP suppresses lipolysis and lowers blood fatty acid concentration, so GPR35 agonist helps prevent and treat type II diabetes. Useful. In addition, GPR35 antagonists have the effect of increasing intracellular cAMP concentration, and the increase in cell cAMP stimulates lipolysis and suppresses fat synthesis, so GPR35 antagonists are useful for the prevention and treatment of obesity. is there. Example 1 2
アルファスクリーンを用いた GPR35ァゴニストの探索法  Search method of GPR35 agonist using alpha screen
150cm2フラスコ一本に参考例 1で得られたヒ ト GPR35発現 CH0細胞を lxl07cells 捲き込み、 ー晚 37°C、 C02インキュベーターで培養する。 培養後、 0. 5mM EDTA/P BSにて細胞をはがし、 PBSで細胞を洗浄後、 lxl07 cells/mlの密度で Buffer 1 (HBS S + 0. 1%BSA、 25mM HEPES pH7. 3、 0. 5mM IBMX)に懸濁する。 この細胞懸濁液 440 μ 1とアルファスクリーン cAMP assay kit (Parkin Elmer)の anti - cAMP acceptor beads 22 ^ 1、 Bufferl 638 を混合し、 白色 96wellプレート（Costar)に 10 ずつ分注する。 次に、 各ゥエルにフォルスコリン （FSK) 2 μ Μを含む Buf f er 1 で希釈した化合物を 10 ずつ加える。 この時、 プレートの一列は細胞懸濁液を 入れず anti- cAMP acceptor beads 9 ^ 1、 Bufferl 441 のみを混ぜた液とし 、 化合物の代わりに cAMPの希釈系列を加え、 スタンダードとする。 細胞懸濁液と 化合物を混ぜたプレートを室温で 30分間振とうした後、 アルフアスクリーン cAMP assay kitの Biotinyl camp 20 μ 1、 Streptavin donor beads 82 1を Buffer2 (HBSS + 0. l°/oBSA, 25mM HEPES PH7. 3、 1. 5% Tween20) 40mlにくわえた液をプ レートの全ゥエルに 30 μ 1ずつ加える。 室温で 3時間プレートを分間振とうし続け 、 Fusion a (Parkin Elmer)にて蛍光強度を測定し、 プレートに加えた cAMPの反応 曲線から各ゥエル内の cAMP濃度を算出する。 実施例 1 3 150cm 2 flasks single Makikomi lxl0 7 cells the human GPR35 expression CH0 cells obtained in Reference Example 1, and cultured at over晚37 ° C, C0 2 incubator. After incubation, 0. 5mM EDTA / P BS peeled off cells in, the cells were washed with PBS, lxl0 7 ce lls / ml in density Buffer 1 (HBS S + 0.1% BSA, 25 mM HEPES pH 7.3, 0.5 mM IBMX). Mix 440 μl of this cell suspension with anti-cAMP acceptor beads 22 ^ 1 from Alphascreen cAMP assay kit (Parkin Elmer) and Bufferl 638, and dispense 10 aliquots into white 96-well plates (Costar). Next, add 10 compounds diluted with Buf fer 1 containing 2 μΜ of forskolin (FSK) to each well. At this time, do not put the cell suspension in one row of the plate, use a mixture of anti-cAMP acceptor beads 9 ^ 1 and Bufferl 441 alone, and add a cAMP dilution series instead of the compound to make a standard. Shake the plate containing the cell suspension and compound for 30 minutes at room temperature, and then add the Alphascreen cAMP assay kit Biotinyl camp 20 μ1, Streptavin donor beads 82 1 to Buffer2 (HBSS + 0.l ° / oBSA, 25 mM) HEPES P H7.3, 1.5% Tween20) Add 40 ml of the solution to all wells of the plate, 30 μl each. Continue shaking the plate for 3 hours at room temperature, measure the fluorescence intensity with Fusion a (Parkin Elmer), and calculate the cAMP concentration in each well from the reaction curve of cAMP added to the plate. Example 1 3
FLIPRを用いた GPR35ァゴニストの探索 Search for GPR 35 agonists using FLIPR
実施例 8で得られた G a 1.6、 GPR35安定共発現細胞を、 それぞれ 3 X 10Bcells/ml となるように培地 〔10%牛胎児透析血清 （Invi rogen) 、 50 units/ml penicill in/50ug/ml streptomycin (CAMBREX) 、 お び lmg/ml geneticin (Invitrogen ) を含む α MEM培地 （核酸不含： Invitrogen) 〕 に懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート (Black plate clear bottom, Costar社）に 8連ピぺットを用いて各ゥエルに 100 1ずつ植え込み （3. 0 Χ 104ο6ΐΐ3/100 μ 1/ゥエル） 、 5% C02インキュベータ一中 にて 37°Cで一晩培養し、 以降のアツセィに用いた （以後、 細胞プレートとする） 。 細胞プレート 2枚当たりに対して、 H/HBSS (HBSS (Invitrogen Hanks ' Balance d Salt Solution without phenol red) 500mlに 1M HEPES/pH7. 4 (同仁化学研究 所）を ΙΟπιΓ添加） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 μ 1、 ゥシ胎児血清（FBS) 200 μ 1を混合した。 また、 Fluo 3- AM (同仁化学研究所） 2パイアル （50 μ §) をジメチ ノレスノレフォキサイド 40 ^ 1、 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 μ 1に溶解し、 これを上記 H/HBSS—Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピぺッ トを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥヱル ΙΟΟ μ Ιずつ分注し、 5% C02 ィンキュベータ一中にて 37°Cで 1時間ィンキュベートした （色素ローディング) 試験化合物を含有する溶液を 2. 5 IBM Probenecidを含む H/HBSS で調製し、 FLIP R用 96穴プレート （V- Bottomプレート、 Coster社） へ 220 μ 1ずつ移した （以後、 サンプルプレートとする） 。 細胞プレートの色素ローデイング終了後、 H/HBSSに 2. 5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファ一でプレートウォッシヤー (ELX405, B io-Tek Instruments社） を用いて細胞プレートを洗浄し、 洗浄後 100 1の洗浄バ ッファーが残るようにした。 この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセ ットし (FLIPRにより、 サンプルプレートから 50 1のサンプルが細胞プレートへ と添加される） 、 蛍光強度変化を継時的に測定することにより、 細胞内カルシゥ ムイオン濃度上昇活性を測定した。 GPR35を発現させない CH0細胞、 または、 ヒス タミン HI受容体などの対照受容体を発現させた CH0細胞株を用いて上記と同様の 試験を実施し、 G a 16、 GPR35安定共発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を特 異的に上昇させる化合物を探索した。 産業上の利用可能性 G a 1.6 obtained in Example 8, the GPR35 stably co-expressing cells, respectively 3 X 10 B cells / ml and made as medium [10% fetal calf dialyzed serum (Invi rogen), 50 units / ml penicill in / Suspend in 50 ug / ml streptomycin (CAMBREX) and lmg / ml geneticin (Invitrogen) in α MEM medium (without nucleic acid: Invitrogen) and transfer to a 96 well plate for FLIPR (Black plate clear bottom, Costar). Implant 100 1 in each well using a pipette (3.0 Χ 10 4 ο6ΐΐ3 / 100 μ 1 / well) and incubate overnight at 37 ° C in a 5% C0 2 incubator. This was used for the assembly (hereinafter referred to as cell plate). For every two cell plates, add H / HBSS (HBSS (Invitrogen Hanks' Balanced Salt Solution without phenol red) to 500 ml with 1M HEPES / pH7.4 (Dojin Chemical Laboratories) ΙΟπιΓ) 20 ml, 250 mM Probenecid 200 μl and ushi fetal serum (FBS) 200 μ1 were mixed. In addition, Fluo 3- AM (Dojindo Laboratories) 2 pial (50 μ § ) was dissolved in dimethenoles norefoxide 40 ^ 1, 20% Pluronic acid (Molecular Probes) 40 μ 1 In addition to H / HBSS—Probenecid—FBS, mix, dispense 8 μl of each cell to the cell plate after removing the culture solution using 8 pipettes, and add 5% C0 2 Incubate for 1 hour at 37 ° C in an incubator (dye loading) Prepare a solution containing the test compound in H / HBSS containing 2.5 IBM Probenecid, and use a 96-well plate for FLIP R (V-Bottom plate, 220 μ1 each (to be referred to as a sample plate). After loading the dye on the cell plate, wash the cell plate using a plate washer (ELX405, Bio-Tek Instruments) with H / HBSS plus 2.5 mM Probenecid. The cleaning buffer was left. This cell plate and sample plate are set in FLIPR (FLIPR adds 50 1 samples from the sample plate to the cell plate), and the intracellular calcium is measured by measuring the change in fluorescence intensity over time. The muon concentration increasing activity was measured. CH0 cells do not express GPR35 or a histamine HI receptor using CH0 cell lines that expressed the control receptor, such as body and performs the same test as above, G a 16, GPR35 intracellular stability co-expressing cells We searched for compounds that specifically increase the calcium ion concentration. Industrial applicability
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットで得られうる化合 物またはその塩 （例、' GPR35ァゴニスト、 GPR35アンタゴニスト） などは、 例えば 、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化 性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群な ど） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非ステロイド系抗炎 症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 癌 （例 、 消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌、 胃 MALTリンパ腫など）'、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌 、 食道癌、 咽頭癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮痛、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 免疫疾患 〔例、 '¾性閉塞 性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 AIDS、 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ 、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症 性腸疾患、 全身性エリ トマト一デス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本 病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエーダレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 II型糖 尿病、 肥満などの予防 ·治療剤などとして有用である。 Compounds that can be obtained by the screening method or screening kit of the present invention or salts thereof (eg, 'GPR35 agonist, GPR35 antagonist) and the like include, for example, gastrointestinal diseases (eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), non-steroidal anti-inflammatory drug Ulcers, gastric hyperacidity and ulcers due to postoperative stress, etc.), cancer (eg, gastrointestinal cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, gastric MALT lymphoma, etc.) ', breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, pharyngeal cancer, liver cancer , Biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine pain, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.), immune disease (eg, '¾ closed) Pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis, AIDS, autoimmune disease (eg, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic Erythematomatodes, glomerulonephritis, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, Siedalen syndrome, Goodpass Chua syndrome, etc.)), type II sugar It is useful as a preventive and therapeutic agent for urine disease and obesity.
本発明の受容体の活性を促進する化合物またはその塩、 GPR35ァゴ-スト、 本 発明の受容体、 本努明の受容体をコードするポリヌクレオチド、 本発明のリガン ドなどは、 例えば、 消化管疾患 〔例、 下痢、 吸収不良症候群、 過敏性腸症候群、 クローン病、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 JD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 非 ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多おょぴ潰 瘍など〕 、 II型糖尿病などの予防 ·治療剤などとして有用である。  The compound or its salt that promotes the activity of the receptor of the present invention, GPR35 agonist, the receptor of the present invention, the polynucleotide encoding the receptor of the present invention, the ligand of the present invention, etc. Tract disease (eg, diarrhea, malabsorption syndrome, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, JD ( Non Ulcer Dyspepsia), ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory agents, hyperacidic ulcers due to postoperative stress, etc.], and it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for type II diabetes.
本発明の受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、 GPR35ァゴ-スト、 本 発明の受容体に対するアンチセンスポリヌクレオチド、 本発明の受容体に対する 抗体などは、 例えば、 免疫疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患、 敗血症、 粥状硬化症、 Compounds that inhibit the activity of the receptor of the present invention or salts thereof, GPR35 agonist, antisense polynucleotides to the receptor of the present invention, antibodies to the receptor of the present invention, etc. include, for example, immune diseases [eg, chronic Obstructive pulmonary disease, sepsis, atherosclerosis,
AIDS, 自己免疫性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化症、 重症筋無力症、 インスリン依存型糖尿病 （I型糖尿病） 、 炎症性腸疾患、 全身性エリ トマトーデ ス、 糸球体腎炎、 自己免疫性溶血性貧血、 橋本病、 潰瘍性大腸炎、 原発性胆汁性 肝硬変、 特発性血小板減少性紫斑病、 原田病、 悪性貧血、 シエー.ダレン症候群、 グッドパスチュア症候群など） など〕 、 消化器癌 （例、 胃癌、 大腸癌など） 、 肥 満などの予防 ·治療剤などとして有用である。 AIDS, autoimmune diseases (eg, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), inflammatory bowel disease, systemic erythematosus, glomerulonephritis, autoimmunity Gastrointestinal hemolysis, Hashimoto's disease, ulcerative colitis, primary biliary cirrhosis, idiopathic thrombocytopenic purpura, Harada disease, pernicious anemia, Sie-Dallen syndrome, Goodpasture syndrome, etc.) (Eg, gastric cancer, colorectal cancer, etc.) It is useful as a preventive / therapeutic agent for fattening.
また、 本努明の受容体 （例、 GPR35など） およびそのリガンド （例、 キノキサ リン- 2， 3-ジオン化合物、 エラグ酸など） は、 消化管疾患、 癌、 免疫疾患、 II型 糖尿病、 肥満などの予防 ·治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニン グに有用である。  In addition, receptors (eg, GPR35, etc.) and ligands (eg, quinoxaline-2,3-dione compounds, ellagic acid, etc.) of this effort are used in gastrointestinal diseases, cancer, immune diseases, type II diabetes, obesity It is useful for screening compounds that have preventive / therapeutic actions such as

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩おょぴ1. (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof
5 (b) 該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いる ことを特徴とする、 該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリーニング方法。 (B) A screening method for a compound or a salt thereof that changes the binding property of the protein or a salt thereof and the ligand, which comprises using a ligand capable of specifically binding to the protein or a salt thereof.
2 . リガンドが、 キノキサリン- 2， 3-ジオン化合物である請求項 1記載のスク リーニング方法。 2. The screening method according to claim 1, wherein the ligand is a quinoxaline-2,3-dione compound.
0 3 . キノキサリン- 2, 3-ジオン化合物が、 6， 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジォ ン、 6-ニトロ - 7 -スルファモイルペンゾ [f]キノキサリン- 2，3 -ジオン、 6 -シァノー 7-二トロキノキサリン- 2， 3-ジオン、 または 5, 7-ジニトロキノキサリン- 2， 3 -ジォ ンである請求項 1記載のスクリーニング方法。 The quinoxaline-2,3-dione compound is 6, 7-dinitroquinoxaline-2,3-dione, 6-nitro-7-sulfamoyl benzo [f] quinoxaline-2,3-dione, The screening method according to claim 1, wherein the screening method is 6-cyano 7-ditroquinoxaline-2,3-dione or 5,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione.
4 . リガンドが、 エラグ酸である請求項 1記載のスクリーニング方法。 4. The screening method according to claim 1, wherein the ligand is ellagic acid.
5 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 配列番号： 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3または配列番 号： 2 7で表されるアミス酸配列である請求項 1記載のスクリーニング方法。  5 5. An amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, or SEQ ID NO: The screening method according to claim 1, wherein the amino acid sequence is represented by 27.
6 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異 0 的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩に接触させた場合における、 該リガンド の該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、 比 較する、 請求項 1記載のスクリーニング方法。6. (a) a ligand having the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof, (B) when the ligand or test compound is contacted with the protein or its partial peptide or its salt, and The screening method according to claim 1, wherein the amount of binding to the partial peptide or a salt thereof is measured and compared.
5 7 . (a) 配列番号： · 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 • のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と特異 的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分ぺプチドまた はその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 （b) 該リ ガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 0 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 該リガンドの該 細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較する、 請求項 1記載のスクリ 一ユング方法。 5 7. (A) SEQ ID NO: · A ligand having the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof In contact with a cell containing the protein or a partial peptide or salt thereof or a membrane fraction of the cell, and (b) the ligand and the test compound are mixed with the protein or the partial peptide or The ligand of the ligand when contacted with a cell containing the salt or a membrane fraction of the cell. The screening method according to claim 1, wherein the binding amount to the cell or the membrane fraction is measured and compared.
8 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、 該蛋白質 もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードする D NAを含有する形質転換 体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩である請求項 Ί記載のスタリーニング方法。  8. A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, which encodes the protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof D The staining method according to claim 1, which is a protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing NA, a partial peptide thereof or a salt thereof.
9 . リガンドが、 標識したリガンドである請求項 6〜請求項 8記载のスクリー ニング方法。  9. The screening method according to any one of claims 6 to 8, wherein the ligand is a labeled ligand.
1 0 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩と特 異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分ぺプチドま たはその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガンドの存在下または非存在下、 試 験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に接触させた場合 における、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活 性を測定し、 比較する、 請求項 1記載のスクリーニング方法。  1 0. (A) It has the ability to specifically bind to a protein containing the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof. When the ligand is brought into contact with the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof; and (b) in the presence or absence of the ligand, the test compound is added with the protein or the partial peptide thereof or a salt thereof. The screening method according to claim 1, wherein the cell stimulation activity via the protein or a partial peptide or a salt thereof is measured and compared when the protein is brought into contact with.
1 1 . (a) 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩と特 異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 （b) 該 リガンドの存在下または非存在下、 試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分ぺ プチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお ける、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を 測定し、 比較する、 請求項 1記載のスクリーニング方法。  1 1. (a) It has the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof. When a ligand is contacted with a cell containing the protein or a partial peptide or salt thereof, or a membrane fraction of the cell; and (b) in the presence or absence of the ligand, Measuring the cell-stimulating activity via the protein or its partial peptide or its salt when it is brought into contact with a cell containing the protein or its partial peptide or its salt or the membrane fraction of the cell; The screening method according to claim 1 to be compared.
1 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩が、 該蛋白 質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードする D NAを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしぐはその部分ぺプチ ドまたはその塩である請求項 1 1記載のスクリ一ユング方法。 1 2. A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, wherein the protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof 12. The screening method according to claim 11, wherein the protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA coding for is also a partial peptide or a salt thereof.
1 3 . 細胞刺激活性が、 細胞内 c AMP濃度の低下または上昇である、 請求項 1 0〜 1 2記載のスクリ一二ング方法。 1 3. The cell stimulating activity is a decrease or increase in intracellular cAMP concentration. 10. A screening method according to 1 to 12.
1 4 . (a) 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および （b) 該蛋白質またはそ の塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、 該 蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング用キット。  (4) (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, and (b) specifically binding to the protein or the salt thereof A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the protein or a salt thereof and the ligand, comprising a ligand having the ability to act.
1 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促 進する化合物またはその塩を含有してなる消化管疾患または II型糖尿病の予防 · 治療剤。  15 containing a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof. A preventive / therapeutic agent for gastrointestinal diseases or type II diabetes.
1 6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 害する化合物またはその塩を含有してなる消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 .治療剤。  1 6. containing a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof; A preventive or therapeutic agent for digestive organ cancer, immune disease or obesity.
1 7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガ ンド。  1 7. A ligand having the ability to specifically bind to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof.
1 8 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促 進することを特徴とする消化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療法。  1 8. Gastrointestinal tract characterized by promoting the activity of a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof Prevention or treatment of disease or type II diabetes.
1 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 害することを特徴とする消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療法。  1 9. Gastrointestinal cancer characterized by inhibiting the activity of a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof Prevention and treatment of immune diseases or obesity.
2 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促 進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消化 管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療法。 - 2 0. Effective amount of a compound or salt thereof that promotes the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof A method for the prophylaxis or treatment of gastrointestinal tract disease or type II diabetes, characterized by administering to a mammal. -
2 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ： ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする消化 器癌、 免疫疾患または肥満の予防 '治療法。 2 1. Same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. An effective amount of a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a protein containing a mino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof. Digestion characterized by administration to a mammal Prophylactic treatment of organ cancer, immune disease or obesity.
2 2 . 消化管疾患または II型糖尿病の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合物また はその塩の使用。  2 2. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof for the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for gastrointestinal diseases or type II diabetes Or use of a compound or salt thereof that promotes the activity of the salt.
2 3 . 消化器癌、 免疫疾患または肥満の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物ま. たはその塩の使用。  2 3. A protein or part thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for the manufacture of a preventive / therapeutic agent for digestive organ cancer, immune disease or obesity Use of a compound or its salt that inhibits the activity of the peptide or its salt.
PCT/JP2005/016169 2004-08-30 2005-08-29 Screening method WO2006025551A1 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT05776830T ATE464564T1 (en) 2004-08-30 2005-08-29 SCREENING PROCEDURE
US11/661,555 US7892755B2 (en) 2004-08-30 2005-08-29 Screening method
JP2006532011A JP4772684B2 (en) 2004-08-30 2005-08-29 Screening method
EP05776830A EP1788390B1 (en) 2004-08-30 2005-08-29 Screening method
DE602005020646T DE602005020646D1 (en) 2004-08-30 2005-08-29 SCREENING PROCESS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-250786 2004-08-30
JP2004250786 2004-08-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006025551A1 true WO2006025551A1 (en) 2006-03-09

Family

ID=36000195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/016169 WO2006025551A1 (en) 2004-08-30 2005-08-29 Screening method

Country Status (6)

Country Link
US (1) US7892755B2 (en)
EP (1) EP1788390B1 (en)
JP (1) JP4772684B2 (en)
AT (1) ATE464564T1 (en)
DE (1) DE602005020646D1 (en)
WO (1) WO2006025551A1 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120022116A1 (en) * 2010-07-20 2012-01-26 Huayun Deng Compositions and methods for the treatment of pathological condition(s) related to gpr35 and/or gpr35-herg complex
CN109929805A (en) * 2017-12-15 2019-06-25 中国科学院大连化学物理研究所 The construction method of source of mouse GPR35 high flux screening model and application

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843987A (en) 1996-10-31 1998-12-01 The Procter & Gamble Company Method of stimulating gastrointestinal motility with ellagic acid
DE19728326A1 (en) 1997-06-27 1999-01-07 Schering Ag New quinoxalinedione derivatives, their production and use in pharmaceuticals
WO1999033978A1 (en) * 1997-12-26 1999-07-08 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Novel guanosine triphosphate (gtp)-binding protein conjugate type receptor proteins
WO1999064452A1 (en) 1998-06-11 1999-12-16 Smithkline Beecham Corporation Gpr35a receptor
WO2001046414A1 (en) * 1999-12-20 2001-06-28 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Novel guanosine triphosphate-binding protein-coupled receptor protein, bg26
WO2002068600A2 (en) * 2001-02-26 2002-09-06 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
EP1312374A1 (en) 2000-08-01 2003-05-21 Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd Sugar absorption inhibitors and process for producing the same
WO2004040000A2 (en) * 2002-09-09 2004-05-13 Nura, Inc G protein coupled receptors and uses thereof
WO2004047863A2 (en) 2002-11-22 2004-06-10 Ganymed Pharmaceuticals Ag Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
EP1447413A2 (en) 2003-02-14 2004-08-18 Research Association for Biotechnology Full-length human cDNA
WO2005059546A2 (en) * 2003-12-12 2005-06-30 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled receptor 35 (gpr35)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2832726B2 (en) * 1989-08-03 1998-12-09 日本ケミファ株式会社 Pharmaceutical composition for suppressing gastrointestinal motility
US20020168720A1 (en) * 1997-02-06 2002-11-14 Takeda Chemical Industries Ltd. G protein coupled receptor proteins, their production and use
US7119190B2 (en) * 1997-04-14 2006-10-10 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human G protein-coupled receptors
US7102000B2 (en) * 2002-03-08 2006-09-05 Incyte San Diego Inc. Heterocyclic amide derivatives for the treatment of diabetes and other diseases
US20070048740A1 (en) 2003-02-14 2007-03-01 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
EP1522858A1 (en) * 2003-10-10 2005-04-13 Jean-Christophe Roegel Methods for selecting compounds using antibodies with activity as agonist, antagonist or allosteric modulators

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843987A (en) 1996-10-31 1998-12-01 The Procter & Gamble Company Method of stimulating gastrointestinal motility with ellagic acid
DE19728326A1 (en) 1997-06-27 1999-01-07 Schering Ag New quinoxalinedione derivatives, their production and use in pharmaceuticals
WO1999033978A1 (en) * 1997-12-26 1999-07-08 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Novel guanosine triphosphate (gtp)-binding protein conjugate type receptor proteins
WO1999064452A1 (en) 1998-06-11 1999-12-16 Smithkline Beecham Corporation Gpr35a receptor
WO2001046414A1 (en) * 1999-12-20 2001-06-28 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Novel guanosine triphosphate-binding protein-coupled receptor protein, bg26
EP1312374A1 (en) 2000-08-01 2003-05-21 Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd Sugar absorption inhibitors and process for producing the same
WO2002068600A2 (en) * 2001-02-26 2002-09-06 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
WO2004040000A2 (en) * 2002-09-09 2004-05-13 Nura, Inc G protein coupled receptors and uses thereof
WO2004047863A2 (en) 2002-11-22 2004-06-10 Ganymed Pharmaceuticals Ag Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
EP1447413A2 (en) 2003-02-14 2004-08-18 Research Association for Biotechnology Full-length human cDNA
WO2005059546A2 (en) * 2003-12-12 2005-06-30 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled receptor 35 (gpr35)

Non-Patent Citations (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Antisense Research and Applications", 1993, CRC PRESS
"Enzyme immunoassay", 1978, IGAKUSHOIN
"Immunochemical Techniques (Part A)", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 70
"Immunochemical Techniques (Part B)", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 73
"Immunoenzyme assay", 1982, IGAKUSHOIN
"Immunoenzyme assay", 1987, IGAKUSHOIN
"mmunochemical Techniques (Part C)", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 74
"Part D: Selected Immunoassays", IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 84
"Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods", IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 92
"Peptide Synthesis", vol. 14, HIROKAWA SHOTEN, article "Zoku Iyakuhin no Kaihatsu"
"Radioimmunoassay", 1974, KODANSHA
"Sequel to the Radioimmunoassay", 1979, KODANSHA
"Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol", 1995, SHUJUNSHA, article "Saibo Kogaku", pages: 263 - 267
BIO/TECHNOLOGY, vol. 6, 1988, pages 47 - 55
BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA., vol. 1219, 1994, pages 251
BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY, vol. 42, 1991, pages 1441 - 1445
BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1446, 1999, pages 57 - 70
BITTER, G A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 81, 1984, pages 5330
BITTER, G. A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 81, 1984, pages 5330
BOSTIAN, K. L. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 77, 1980, pages 4505
CANCER SCIENCE, vol. 95, 2004, pages 131 - 135
G. R. MARTIN, PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 78, 1981, pages 7634
GENE, vol. 17, 1982, pages 107
GENETICS, vol. 39, 1954, pages 440
GENOMICS, vol. 47, 1988, pages 310 - 313
GENOMICS, vol. 5, 1989, pages 874 - 879
GRACE, T. C. C., NATURE, vol. 195, 1962, pages 788
INTERNATIONAL REVIEW OF NEUROBIOLOGY, vol. 32, 1990, pages 281 - 303
J. KAWAKAMI ET AL., PHARM. TECH. JAPAN, vol. 8, 1992, pages 247
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 95, 1984, pages 87
KOEHLER; MILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
M. BODANSZKY; M.A. ONDETTI: "Peptide Synthesis", 1966, INTERSCIENCE PUBLISHERS
M. J. EVANS; M. H. KAUFMAN, NATURE, vol. 292, 1981, pages 154
MAEDA ET AL., NATURE, vol. 315, 1985, pages 592
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 194, 1991, pages 182 - 187
MILLER: "Journal of Experiments in Molecular Genetics", 1972, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, pages: 431 - 433
MOLECULAR & GENERAL GENETICS, vol. 168, 1979, pages 111
MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 15, 1995, pages 6188 - 6195
MUTATION RESEARCH, vol. 202, 1988, pages 429 - 446
NATURE, vol. 411, 2001, pages 494
NOBUO IZUMIYA ET AL.: "Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken", 1975, MARUZEN CO.
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 9, 1981, pages 309
O'DOWD B. ET AL.: "Discovery of three novel G-protein-coupled receptor genes.", GENOMICS, vol. 47, no. 2, 1998, pages 310 - 313, XP000863786 *
OKUMURA S. ET AL.: "Cloning of a G-protein-coupled receptor that shows an activity to transform NIH3T3 cells and is expressed in gastric cancer cells.", CANCER SCI., vol. 95, no. 2, February 2004 (2004-02-01), pages 131 - 135, XP002342729 *
PHARM. TECH. JAPAN, vol. 8, 1992, pages 395
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 75, 1978, pages 1929
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 86, 1989, pages 2766 - 2770
SCHROEDER; LUEBKE: "The Peptide", 1965, ACADEMIC PRESS
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
SHUJUNSHA: "Saibo Kogaku", SHIN SAIBO KOGAKU JIKKEN PROTOCOL, 1995, pages 263 - 267
T. C. DOETSCHMAN ET AL., JOURNAL OF EMBRYOLOGY EXPERIMENTAL MORPHOLOGY, vol. 87, 1985, pages 27
TANPAKUSHITSU NO KAGAKU, vol. IV, 1977, pages 205
THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 15, 1997, pages 487 - 494
TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 7, 2001, pages 221
VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396

Also Published As

Publication number Publication date
JP4772684B2 (en) 2011-09-14
US20080103215A1 (en) 2008-05-01
US7892755B2 (en) 2011-02-22
ATE464564T1 (en) 2010-04-15
EP1788390B1 (en) 2010-04-14
DE602005020646D1 (en) 2010-05-27
EP1788390A4 (en) 2008-02-13
EP1788390A1 (en) 2007-05-23
JPWO2006025551A1 (en) 2008-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7354726B2 (en) Screening method
WO2006098520A1 (en) Screening method
WO2005103291A1 (en) Novel ligand of g-protein-conjugated receptor protein and use thereof
JP5317318B2 (en) Novel polypeptides and uses thereof
US7250272B2 (en) G protein-coupled receptor protein and DNA thereof
WO2006118328A1 (en) Degranulation inhibitor
WO2008038394A1 (en) Musclin receptor and use thereof
WO2006025551A1 (en) Screening method
WO2005026728A1 (en) Screening method
WO2004065960A1 (en) Novel screening method
JP2002320496A (en) NEW MOUSE-TYPE KiSS-1 RECEPTOR PROTEIN AND DNA
EP1422524A1 (en) Screening method
JP4188720B2 (en) New screening method
JP4184697B2 (en) Screening method
EP1559721A1 (en) Novel fprl1 ligands and use thereof
JP4574177B2 (en) New screening method
WO2007119623A1 (en) Novel use of g-protein-conjugated receptor and ligand thereof
JP4488720B2 (en) Apoptosis-related proteins and uses thereof
JP4559775B2 (en) New protein
WO2005100987A1 (en) Novel ligand of g protein coupled receptor protein and use thereof
WO2010147117A1 (en) Peptide and use thereof
WO2004111234A1 (en) Novel protein
JP4128030B2 (en) Novel ligand and its DNA
JP4404605B2 (en) Novel FPRL1 ligand and uses thereof
JP4004767B2 (en) Novel G protein-coupled receptor protein and DNA thereof

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005776830

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11661555

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006532011

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005776830

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 11661555

Country of ref document: US