WO2007119623A1 - Ｇ蛋白質共役型受容体およびそのリガンドの新規用途 - Google Patents

Ｇ蛋白質共役型受容体およびそのリガンドの新規用途 Download PDF

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Hideyoshi Higashi
Ayako Kohyama
Yoshio Hirabayashi
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    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • the present invention relates to the identification of glucose receptors and their ligands other than glucose, and their uses. More specifically, the present invention relates to a novel pharmaceutical use of a glucose receptor or a ligand thereof, and a method for screening a novel pharmaceutical candidate compound using the receptor (and its ligand).
  • VDC open voltage dependent Ca 2+ channels
  • 1,5-anhydroglucitol in diabetic patients, it is lost in the urine, so the blood concentration decreases significantly, and it recovers with improvement of the disease state.
  • 1,5-AG a useful diabetes marker
  • Production and insulin secretion can be separated from each other and contradicted the fact. It was also inconsistent with the fact that insulin secretion occurs before the increase in glycoproteins in the islet.
  • One hypothesis to explain this contradiction is the existence of receptors that detect blood glucose on the cell surface, but no such receptor has been identified to date.
  • GPCR 7-transmembrane G protein-coupled receptor
  • G Protein-coupled Receptor family C, group 5 (GPRC5), members AD
  • GPRC5A, B, and C are also called Retinoic Acid-Inducible Gene (RIAG) -1, 2, and 3 because their expression is induced by retinoic acid.
  • Each receptor shows about 30-40% homology and is characterized by having a short, N-terminal domain compared to other GPCR members belonging to Family C.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 It has been reported that RAIG2 is expressed mainly in the central nervous system, and RAIG3 and GPRC5D are expressed mainly in peripheral tissues including the spleen.
  • RAIG2 is expressed mainly in the central nervous system
  • RAIG3 and GPRC5D are expressed mainly in peripheral tissues including the spleen.
  • food intake increased and blood glucose levels increased, leading to lifestyles including type 2 diabetes by enhancing the expression or activity of the receptor.
  • Prophylactic treatment of habitual diseases has been proposed (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 International Application Publication No. 03Z055507 pamphlet (full text)
  • Non-Patent Document 1 "(. Brain Res _ ⁇ 1 ⁇ Bra j n Res) Brain '. Research Morekiyura one' Brain • research”. Robbins (MJ Robbins), et al., (The Netherlands), the 106 Certificates, pp 136-144 (2002)
  • Non-Patent Document 2 Broiner-Osborne and P. Krogsgaard-Larsen, “Genomics” (USA), 65th, pp. 121- 128 (2000)
  • Non-patent document 3 M.J. Robbins et al., “Genomics” (USA), 67th pp. 8-18 (2000)
  • Non-Patent Document 4 Broina ⁇ —— Osborne. Brauner- Osborne), et al., “Biochim. Biophys. Acta” (Landland), 1515, pp. 237-248 (2001)
  • An object of the present invention is to identify a sugar receptor on the cell surface, clarify the existence of a blood sugar concentration detection mechanism, and use the receptor and its ligand to agonize the receptor. It is also to provide a screening system for a pharmaceutical candidate compound effective as an antagonist, that is, a prophylactic / therapeutic agent for diabetes, insulin resistance, hypertension, hyperlipidemia and the like.
  • RAIG2 and RAIG3 have been conventionally considered orphan receptors, as cell surface glucose receptors. These receptors caused insulin secretion such as insulin-secreting cell strength in the vicinity of the glucose concentration corresponding to normal blood glucose level.
  • this receptor also reacts with 1,5-AG, which has been conventionally known as a diabetes marker, to induce insulin secretion.
  • these receptors have also been shown to regulate the secretion of adrenocorticotropic hormone (hereinafter referred to as “ACTH”) in the pituitary gland depending on the glucose concentration.
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • the present inventors focused on the fact that the RAIG2 homologue (bride of sevenless (boss)) in Drosophila is expressed in organs corresponding to the spleen and pituitary gland.
  • the former showed an increase in blood glucose compared to the wild type, whereas the latter suppressed the increase. I found out.
  • BOSS also detects blood glucose levels and regulates insulin signals in the same way as RAIG2 and RAIG3.
  • the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention provides:
  • a pharmaceutical or veterinary drug comprising RAIG2 or a partial peptide thereof and Z or RAIG3 or a partial peptide thereof,
  • the pharmaceutical or veterinary drug of the above-mentioned [1] which is a preventive or therapeutic agent for a disease selected from the group consisting of arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia and memory learning impairment
  • a pharmaceutical or veterinary medicine comprising a nucleic acid encoding RAIG2 or a partial peptide thereof and a nucleic acid encoding Z or RAIG3 or a partial peptide thereof,
  • Diabetes impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin disease
  • the pharmaceutical or veterinary drug of the above-mentioned [6] which is a prophylactic / therapeutic agent for a disease selected from the group consisting of arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia and memory learning disability
  • a diagnostic agent comprising a nucleic acid comprising a base sequence encoding RAIG2 or a part thereof and a nucleic acid comprising a base sequence encoding Z or RAIG 3 or a part thereof,
  • Diabetes impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin disease, Arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia, memory learning disorder,
  • a diagnostic agent comprising an antibody against RAIG2 and an antibody against Z or RAIG3,
  • Diabetes impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin disease, Arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia, memory learning disorder, obesity, hypoglycemia, hypertension, edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma,
  • the agent according to the above-mentioned [16] which is used for diagnosis of a disease selected from the group consisting of lipotoxicity and cancer power,
  • a pharmaceutical or veterinary drug comprising a neutralizing antibody against RAIG2 and a neutralizing antibody against Z or RAIG3,
  • Obesity hyperlipidemia, type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes, fat atrophy,
  • nucleic acid comprising a complementary strand sequence of a base sequence encoding RAIG2 or a part thereof
  • a pharmaceutical or veterinary drug comprising a nucleic acid comprising a complementary strand sequence of a base sequence encoding Z or RAIG3 or a part thereof
  • a screening method for a sugar 'lipid metabolism regulator characterized by using RAIG2 or a partial peptide thereof, or RAIG3 or a partial peptide thereof,
  • a screening method for a substance that regulates spleen and Z or pituitary function characterized by using RAIG2 or a partial peptide thereof, or RAIG3 or a partial peptide thereof,
  • a method for screening a regulator of insulin secretion and Z or blood glucose and Z or adrenocorticotropic hormone secretion characterized by using RAIG2 or a partial peptide thereof or RAIG3 or a partial peptide thereof,
  • Diabetes impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, high fat, characterized by using RAIG2 or its partial peptide or RAIG3 or its partial peptide Blood loss, eating disorder, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia, memory learning disorder, obesity, hypoglycemia, hypertension, Edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, lipotoxicity and cancer screening method for prevention and treatment of diseases,
  • RAIG2 or its partial peptide or RAIG3 or its partial peptide strength The method according to any one of [31] to [34] above, wherein the method is provided in the form of a eukaryotic cell producing this,
  • RAIG2 or RAIG3 and glucose or 1,5-anhydro characterized by using RAIG2 or its partial peptide or RAIG3 or its partial peptide and glucose or 1,5-anhydroglucitol Screening method for substances that change the binding property to glucitol,
  • Diabetes impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin disease, Arthritis, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia and memory learning Disability
  • Obesity, hyperlipidemia, type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes, fat atrophy, Insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, eating disorder, depression, Cushing disease, thrombotic disease, lipotoxicity, and cancer power are preventive and therapeutic agents selected from the group [51] or [ 52] the pharmaceutical or animal medicine according to
  • Substances that enhance RAIG2 expression or activity and / or RAIG3 expression or Administration of an effective amount of a substance that enhances activity to a mammal including diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, high Selected from the group consisting of lipemia, eating disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic disease, dyspepsia and memory learning disorder Disease prevention 'treatment methods, and
  • Obesity hyperlipidemia in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a substance that inhibits RAIG2 expression or activity and / or a substance that inhibits RAIG3 expression or activity, Type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, Providing prevention and treatment methods for diseases selected from the group consisting of eating disorders, depression, Cushing disease, thrombotic diseases, lipotoxicity and cancer.
  • RAIG2 and RAIG3 function as receptors for glucose and 1,5-AG and regulate blood glucose levels to regulate insulin secretion in the spleen and ACTH secretion in the pituitary gland, so RAIG2 or RAIG3 (or In addition, glucose (lipid metabolism and spleen) pituitary function (eg, regulation of insulin secretion, blood glucose and ACTH secretion), as well as sugar (lipid metabolism and spleen) pituitary function It is possible to screen for a drug or animal drug candidate compound effective for the prevention and treatment of diseases (for example, diabetes, obesity, etc.) in which the drug is involved.
  • diseases for example, diabetes, obesity, etc.
  • FIG. 1 is a diagram showing insulin secretion in mouse insulinoma MIN6 cells overexpressing RAIG3 under various darcos concentration conditions.
  • ** indicates p ⁇ 0.01
  • *** indicates p ⁇ 0.001.
  • FIG. 2 Insulin secretion under conditions of glucose (2.8 mM and 20 mM) and 2.8 mM gnolecose + 0.6 mM 1,5-AG in mouse insulinoma MIN6 cells overexpressing RAIG2 (a) and RAIG3 (b) FIG. In the figure, * indicates p ⁇ 0.05, ** indicates p ⁇ 0.01, and *** indicates p ⁇ 0.001.
  • FIG. 3 CRF stimulation in mouse pituitary tumor AtT_20 / Dl 6v- F2 cells transfected with siRNA against RAIG2 (or RAIG3) under low glucose (2.8 mM) and high glucose (20 mM) concentration conditions It is a figure which shows ACTH secretion. In the figure, * indicates p ⁇ 0.05, and *** indicates p ⁇ 0.001.
  • FIG. 4 is a graph showing glucose and trehalose concentrations in Hemolympho of wild-type, boss-deficient mutants, and transgeneic (HRP-Boss) Drosophila with forced expression of boss.
  • white bar represents glucose
  • hatched bar represents glucose + trehalus
  • black bar represents trehalose.
  • the RAIG2 and RAIG3 proteins used in the present invention are proteins comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, respectively.
  • RAIG2 and RAIG3 are, for example, mammalian cells (eg, human, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, rush, horse, cat, inu, monkey, chimpanzee, etc.) [eg, hepatocytes, spleen Cells, nerve cells, glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerno cells, epithelial cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibrocytes, myocytes, Adipocytes, immune cells (eg macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone Cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells or cancer cells, etc
  • Adipose tissue may also be a protein that is isolated and purified.
  • it may be a protein synthesized chemically or biochemically by a cell-free translation system! /, Or! Is a trait introduced with a nucleic acid having a base sequence encoding the above amino acid sequence. It may be a recombinant protein produced from the transformant.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4) is approximately 60% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4).
  • the amino acid sequences having homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, and particularly preferably about 90% or more are mentioned above.
  • the term “homology” refers to an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the technical field (preferably, the algorithm is an optimal alignment). The percentage of identical amino acid residues and similar amino acid residues to all overlapping amino acid residues in which one may consider the introduction of gaps into one or both of the sequences).
  • Similar amino acids '' means amino acids that are similar in physical and physical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val) , Polar amino acids (Gln, Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Gl u, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser , Thr, Met) and the like, are included in the same group. It is expected that such substitution with similar amino acids will not change the protein phenotype (ie, is a conservative amino acid substitution). Specific examples of conservative amino acid substitutions are well known in the art and have been described in various references (see, for example, Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)).
  • NCBI BLAST National Center for Biotecnnology Information Basic Local Alignment search ⁇
  • Other algorithms for determining amino acid sequence homology include, for example, Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 ersion 2.0) (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (19 97))], Needleman et al., J. Mol.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4) is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4).
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4) is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4).
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4) include the above-mentioned SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4).
  • the substantially homogeneous activity includes, for example, a ligand (ie, glucose or 1,5-AG) binding activity and a hormone secretion regulating activity such as insulin or ACTH. “Substantially the same quality” indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same. Therefore, it is preferable that the activities such as ligand binding activity and hormone secretion regulating activity are equivalent (for example, about 0.5 to about 2 times), but the degree of these activities differs in quantitative factors such as the molecular weight of the protein. Well, okay.
  • Ligand binding activity and hormone secretion-regulating activity can be measured according to a method that can be performed according to a method known per se, for example, a method used in the screening method for agonists and antagonists described later.
  • RAIG2 (or RAIG3) of the present invention includes, for example, (1) one or more of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4) (preferably, Amino acid sequence in which about 1 to 100, preferably about 1 to 50, more preferably about 1 to 10, and particularly preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids have been deleted.
  • SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4
  • One or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 (preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, more preferably 1 to About 10, especially 1 to number (2, 3, 4 or 5) Amino acid sequence to which amino acids are added, (3) one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4) (preferably about 1 to 50, preferably 1 to An amino acid sequence into which about 10 amino acids, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids are inserted; (4) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids) other amino acids Or (5) a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited as long as the activity of the protein is maintained.
  • RAIG2 of the present invention is preferably a human RA IG2 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (GenBank accession number: NP_057319), or a homolog thereof in other mammals [for example, , Registered with GenBank as accession numbers NP_071865, XP_2 15095 and BAE89480 !, mouse, rat and force-quizal homolog (approximately 85%, 85% and 99.8% identity to human RAIG2, respectively) Etc.)].
  • RAIG3 of the present invention is preferably a human RA IG3 protein (GenBank accession number: NP_061123) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, which is a homologue in other mammals [ For example, mice, rats, and force-quizal homologs registered with GenBank as accession numbers NP_671750, XP_2 13518, and BAE89439, respectively (approximately 89%, 90%, and 95% identity to human RAIG2 respectively) Etc.)].
  • RAIG2 (or RAIG3) of the present invention, including a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, has a C-terminal at the carboxyl group (—COOH), carboxylate (—COO—), amide (— CONH) or ester (-COOR)! / ⁇ .
  • R in the ester is, for example, a C alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, cyclopentyl, cyclohexyl, etc.
  • a C cycloalkyl group for example, a C aryl group such as a phenol or ⁇ -naphthyl;
  • C-alkyl groups such as benzyl, phenethyl; a-naphthylmethyl, etc.
  • a C-aralkyl group such as a-naphthyl-C alkyl group; bivalyloxymethyl group
  • RAIG2 (or RAIG3) of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus
  • the carboxyl group is amidylated or esterified and is also included in the protein of the present invention.
  • ester in this case, for example, the aforementioned C-terminal ester is used.
  • the amino group of the amino acid residue at the N-terminal is a protective group (for example, a C acyl group such as a C alkanoyl such as a formyl group or a acetyl group).
  • a protective group for example, a C acyl group such as a C alkanoyl such as a formyl group or a acetyl group.
  • N-terminal glutamine residues that can be cleaved in vivo, pyroglutamic acid, substituents on the side chain of amino acids in the molecule e.g., -OH,- SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.
  • an appropriate protecting group for example, C alkanoyl group such as formyl group, acetyl group, etc.
  • a partial peptide of RAIG2 (hereinafter sometimes simply referred to as “partial peptide of the present invention”) is a peptide having the partial amino acid sequence of RAIG2 (or RAIG3) described above, and RAIG2 (or Any of them may be used as long as it has substantially the same activity as RAIG3).
  • “substantially the same quality of activity” has the same meaning as described above.
  • “substantially the same quality of activity” can be measured in the same manner as in RAIG2 (or RAIG3).
  • the partial peptide of the present invention for example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4), it is involved in binding to glucose or 1,5-AG as a ligand.
  • a region for example, in the case of human RAIG2, for example, an extracellular region represented by amino acid numbers 28-56, 116-126, 184-196, and 255-271 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Regions involved in signal transduction through interaction with the ligand e.g., regions that have the activity of binding to the a subunit of the trimeric G protein to promote its GDP 'GTP exchange reaction.
  • the partial peptide of the present invention is not particularly limited in size as long as it includes a region involved in the binding to the ligand and a region involved in signal transduction, but preferably contains a partial amino acid sequence of 100 or more. More preferably, those containing 200 or more partial amino acid sequences can be mentioned.
  • the partial amino acid sequence may be a single continuous partial amino acid sequence or may be a concatenation of a plurality of discontinuous partial amino acid sequences.
  • a peptide containing a partial amino acid sequence of RAIG2 (or RAIG3) but not having substantially the same activity as RAIG2 (or RAIG3) for example, represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4)
  • SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4
  • those having a partial amino acid sequence that do not include a region involved in force signal transmission including a region involved in binding to a ligand are not included in the “partial peptide of the present invention”.
  • such a peptide can block the signal transduction action via RAIG2 (or RAIG3) from binding to the ligand, it can be useful in cases where the signal transduction action is suppressed.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO—), an amide (—CONH), or an ester (—COOR).
  • R in the ester examples include those described above for RAIG2 (or RAIG3).
  • R in the ester examples include those described above for RAIG2 (or RAIG3).
  • the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case for example, the same ester as the C-terminal ester is used.
  • the amino acid residue of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group, and the glutamine residue at the N-terminal is pyroglutamic acid. Also included are those in which a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide with a sugar chain attached thereto.
  • RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof used in the present invention may be in the form of a salt.
  • physiologically acceptable acids e.g. inorganic acids, organic acids
  • bases e.g. A salt with a (Lukari metal salt)
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Salts with succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • RAIG2 (or RAIG3) can be produced from the aforementioned mammalian cells or tissues by a known protein purification method. Specifically, after homogenizing mammalian tissues or cells and removing cell debris by low-speed centrifugation, the supernatant is centrifuged at high speed to precipitate cell membrane-containing fractions (if necessary, cell membranes can be separated by density gradient centrifugation, etc.
  • RAIG2 (or R AIG3) or a salt thereof can be prepared by subjecting the fraction to chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. .
  • RAIG2 or RAIG3 or a partial peptide thereof (hereinafter referred to simply as “RAIG2 (or RAIG3)” in the description of these chemical syntheses unless otherwise specified) It can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by removing the protecting group.
  • condensation and the removal of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the method described in the following (1) to (5).
  • RAIG2 (or RAIG3) thus obtained is purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • RAIG2 (or RAIG3) obtained by the above method is a free form
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto
  • RAIG2 (or RAIG3) When obtained as a salt, the salt can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • RAIG2 (or RAIG3)
  • commercially available rosins for protein synthesis can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin.
  • PAM resin 4-hydroxymethylmethyl phenolacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,4, -dimethoxyphenol-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ,, 4, -Dimethoxyphenol-Fmocaminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid with an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is added to the coconut oil according to the sequence of the desired RAIG2 (or RAIG3) according to various known condensation methods. To condense. At the end of the reaction, proteins, etc. are cut out from the coconut resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target RAIG2 (or RAIG3) or its amide. To do.
  • the ability to use various active reagents that can be used for protein synthesis are preferred.
  • the carpositimides include DCC, ⁇ , ⁇ , -diisopropylcarbodiimide, ⁇ -ethyl- ⁇ ,-(3-dimethylaminoprolyl) carbopositimide.
  • a protected amino acid directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt), or a protected amino acid as a symmetric anhydride, HOBt ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after performing the activity.
  • the solvent used for the condensation of the protected amino acid with the active resin can also be appropriately selected from solvent powers known to be usable in protein condensation reactions.
  • acid amides such as ⁇ , ⁇ -dimethylformamide, ⁇ , ⁇ -dimethylacetamide, ⁇ -methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, blackform, alcohol such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitryl, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or appropriate mixtures thereof Is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually selected appropriately from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50 ° C.
  • Activated amino acid derivatives are usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protection group, the removal of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1-Z, Br-Z, and adamantyl.
  • Oxycarbol, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenolsulfuryl, diphenylphosphinochioyl, Fmoc, etc. are used.
  • the carboxyl group is, for example, alkyl esterified (eg, linear, branched, such as methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butinole, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptinole, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified eg, linear, branched, such as methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butinole, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptinole, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester ester, 4-methoxy pentino ester ester, 4-chlorobenzene ester ester, benzhydrino ester ester) ⁇
  • phenacyl esterification benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary benzyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected by, for example, ester or ether.
  • Suitable groups for this ester include, for example, lower alkanol groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups. Carbonic acid-induced groups such as bonyl groups are used. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a tertiary butyl group.
  • Examples of protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, C1-Bzl, 2-
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfol, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfone.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • the activated carboxyl group of the raw material includes, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-di-trophenol, cyanomethyl alcohol, para-trophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt)] and the like.
  • active ester alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-di-trophenol, cyanomethyl alcohol, para-trophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt)] and the like.
  • active ester alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-di-trophenol, cyanomethyl alcohol, para-trophenol, HONB, N-hydroxysuccin
  • RAIG2 As another method for obtaining an amide of RAIG2 (or RAIG3), for example, first, After protecting the ⁇ -carboxyl group of the cis-terminal amino acid by amidation, the peptide chain is extended to the amino group side to the desired chain length, and then only the ⁇ -amino group protecting group at the terminus of the peptide chain is removed.
  • the protein (peptide) and the protein (peptide) from which only the C-terminal carboxyl-protecting group has been removed are produced, and both proteins (peptides) are condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the ester of RAIG2 (or RAIG3) is the same as the amide of RAIG2 (or RAIG3), for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with the desired alcohol to form an amino acid ester. Can be obtained.
  • the partial peptide of the present invention can also be produced by cleaving the RAIG2 (or RAIG3) full-length protein with an appropriate peptidase.
  • RAIG2 (or RAIG3) can also be produced by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding the same, and separating and purifying the resulting culture from RAIG2 (or RAIG3).
  • the nucleic acid encoding RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof may be DNA, RNA, or a DNA / RNA chimera. Preferred is DNA.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. If double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • DNA encoding RAIG2 or its partial peptide includes genomic DNA, mammals (eg, human, ushi, monkey, horse, pig, hidge, goat, inu, cat, guinea pig) , Rats, mice, rabbits, hamsters, etc.) (eg hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langeron cells, epidermal cells, epithelial cells, Goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibroblasts, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg macrophages, T cells, B cells, natural cells) Lull cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells or
  • genomic DNA and cDNA encoding RAIG2 or RAIG3 or its partial peptide
  • PCR method and Reverse Transcriptase-PCR
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase-PCR
  • genomic DNA and cDNA encoding RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide insert genomic DNA and total RNA or mRNA fragments prepared from the cells / tissues described above into an appropriate vector. Cloning can be performed from the prepared genomic DNA library and cDNA library by colony or plaque hybridization method or PCR method, respectively.
  • the vector used for the library may be any of nocteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • DNA encoding RAIG2 examples include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 3), or SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 3). Which contains a base sequence that hybridizes with stringent strands under stringent conditions, and has substantially the same activity as RAIG2 (or RAIG3) described above (eg, to dalcose and 1,5-AG) DNA encoding a protein having a binding activity and a hormone secretion regulating activity such as insulin and ACTH).
  • the DNA that can be hybridized under stringent conditions with the complementary strand sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 3) is, for example, represented by SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 3).
  • NCBI BLAST National and enter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • the above-mentioned homology calculation algorithm for amino acid sequences is also preferably exemplified.
  • the hybridization method is a method known per se or a method similar thereto, for example, Molecular Cloning Second Edition (J. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Lab. Press , 1989).
  • hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can be performed preferably according to stringent conditions.
  • Stringent conditions include, for example, a hybridization reaction at 45 ° C in 6 X SSC (sodium chloride / sodium citrate), and at least once at 65 ° C in 0.2 X SSC / 0.1% SDS. Cleaning.
  • X SSC sodium chloride / sodium citrate
  • the salt concentration of the hybridization solution the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, By appropriately changing the washing temperature and the like, the desired stringency can be easily adjusted.
  • the DNA encoding RAIG2 is preferably a DNA (GenBank accession number: NM_016235) containing a base sequence encoding the human RAIG2 protein represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or other Its homologues in mammals [eg, mouse, rat and force-quizal homologues registered in GenBank as accession numbers NM_022420, XM_215095 and AB172418, respectively (approximately 85% for human RAIG2 cDNA, About 85% and about 98% identity).
  • mammals eg, mouse, rat and force-quizal homologues registered in GenBank as accession numbers NM_022420, XM_215095 and AB172418, respectively (approximately 85% for human RAIG2 cDNA, About 85% and about 98% identity).
  • the DNA encoding RAIG3 is preferably a DNA containing the base sequence encoding the human RAIG3 protein represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 [GenBank accession number : NM_018653], or homologues in other mammals (eg, mouse, rat, and force-quizal homologs registered in GenBank as accession numbers NM_147217, XM_213518, and AB172377, respectively) And about 87%, 86% and 88% identity).
  • DNA encoding the partial peptide of the present invention comprises a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4). As long as it contains the base sequence to be encoded, it may be anything.
  • DNA encoding the partial peptide of the present invention for example, (1) DNA having a partial base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 3), or (2) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 3) and having a nucleotide sequence that can be hybridized under stringent conditions and substantially the same as RAIG2 (or RAIG3) described above
  • DNA encoding a peptide having the same activity eg, binding activity to glucose or 1,5-AG, hormone secretion regulating activity such as insulin or ACTH.
  • DNA encoding RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof is amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the base sequence encoding RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof.
  • DNA that has been incorporated into an appropriate expression vector is cloned by hybridization with a DNA fragment or synthetic DNA labeled that encodes part or all of the RAIG2 (or RAIG3) protein.
  • -You can Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition (described above).
  • the hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual attached to the library.
  • the DNA nucleotide sequence can be determined using a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc.
  • the conversion can be carried out according to a method known per se such as duplex method, Kunkel method or the like, or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA can be used as it is depending on the purpose or, if desired, after digestion with a restriction enzyme and a linker are added.
  • the DNA is translated to its 5 'end. It may have ATG as a translation initiation codon, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • An expression vector containing DNA encoding RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof for example, excising a DNA fragment of interest from DNA encoding RAIG2 (or RAIG3) and expressing the DNA fragment appropriately It can be produced by ligating downstream of the promoter in the vector.
  • Expression vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194); yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15); insect cells Expression plasmids (eg pFast-Bac); animal cell expression plasmids (eg pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo); Bacteriophage such as ⁇ phage; Insect winoles such as baculoinores (Eg BmNPV, AcNPV); animal virus vectors such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus are used.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, p
  • Any promoter can be used as long as it is appropriate for the host used for gene expression! /.
  • the SRa promoter SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Molo-1 murine leukemia virus) LTR ⁇ HSV -TK (simple herpes virus thymidine kinase) promoter is used.
  • CMV promoter, SRa promoter and the like are preferable.
  • trp promoter When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ promoter, lpp promoter, T7 promoter and the like are preferable.
  • SP01 promoter When the host is Bacillus, SP01 promoter, SP02 promoter, penP probe motor, etc. are preferred.
  • the host When the host is yeast, the PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • the polyhedrin promoter, P10 promoter, etc. are preferred. Good.
  • expression vectors include splicing signal, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 origin of replication (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like. What is contained can be used.
  • Selectable markers include, for example, dihydrofolate reductase gene (hereinafter abbreviated as dhfr, methotrexate (MTX) resistance), ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as amp 1 "), ne Thymidin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as neo f , G418 resistance), etc.
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster cells and using the dhfr gene as a selective force, Select the target gene according to the medium that does not contain it.
  • a base sequence that encodes a signal sequence suitable for the host to the 5 'end of DNA encoding RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide (or native signal codon). May be substituted).
  • RAIG2 or RAIG3
  • RAIG3 partial peptide
  • native signal codon or native signal codon
  • the host is Escherichia, PhoA 'signal sequence, OmpA' signal sequence, etc.
  • the host is Bacillus, a-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc .; In the case of yeast, MF o; signal sequence, SUC2 'signal sequence, etc.
  • insulin' signal sequence, ⁇ -interferon 'signal sequence, antibody molecule ⁇ signal sequence, etc. are used.
  • RAIG2 By transforming a host with an expression vector containing DNA encoding RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof, and culturing the resulting transformant, RAIG
  • Escherichia for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K12 'DHl [Procedures ⁇ Ob ⁇ The ⁇ National ⁇ Academia ⁇ Ob ⁇ Sciences ⁇ Ob ⁇ The ⁇ SS Acad. Sci. USA), 60 ⁇ , 160 (1968)], Escherichia coli JM10
  • Bacillus spp. include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24 ⁇ , 255 (1983)], Bacillus subtilis 207-21 [Journal 'Ob' Biochemistry ( Journal of Biochemistry), 95 ⁇ , 87 (1984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae A H22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia Pichia pastoris) K M71 is used.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines derived from night stealing (Spodoptera frugiperda cell; Slla cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, derived from eggs of Trichoplusia ni High Five cells, Mamestra brassicae-derived Itoda vesicles, Estigmen a acrea-derived cells are used.
  • virus power 3 ⁇ 4 mNPV insect-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) and the like are used as insect cells.
  • Slf cells include S19 cells (ATCC CRL 1711), S121 cells (above, Vaughn, J ⁇ . Et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)). Used.
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315 ⁇ , 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster ovary cells (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient CHO cells (hereinafter abbreviated as CHO (dhf ⁇ cells)).
  • CHO cells Chinese hamster ovary cells
  • dhfr gene-deficient CHO cells hereinafter abbreviated as CHO (dhf ⁇ cells)
  • Mouse L cells mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells, and the like.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
  • Eshierihia spp. For example, professional sheathing's 'O Bed-the' National 'Akademi one' O drive. Saienshiizu. O drive. The. USA (p roc. Natl. Acad. Sci. USA), 69 Certificates, 211 0 (1972), Gene, 17 ⁇ , 107 (1982), and the like. Bacillus can be transformed according to the method described in, for example, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Yeasts are, for example, Methods in Enzymology, 194 ⁇ , 182-187 (1991), Proceedings ⁇ The ⁇ National ⁇ Ability ⁇ Ob ⁇ Sciences ⁇ Transformation can be carried out according to the method described in “Proc. Natl. Acad. Sci. USA”, 75 ⁇ , 1929 (1978).
  • Insect cells and insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6 ⁇ , 47-55 (1988).
  • Animal cells can be obtained, for example, according to the method described in Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experimental Protocol, 263-267 (1 995) (published by Shujunsha), Virology, 52 ⁇ , 456 (1973). Can be transformed.
  • the culture of the transformant can be performed according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferable as a medium used for the culture.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for the growth of the transformant.
  • the carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • the nitrogen source for example, ammonium salt, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract.
  • examples include inorganic or organic substances such as soybean meal and potato extract; examples of inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the medium may be supplemented with yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to about 8.
  • Glucose and casamino acid in M9 medium (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] is preferred. If necessary, for example, 3
  • Culturing of the transformant whose host is the genus Escherichia is usually performed at about 15 to about 43 ° C. for about 3 to about 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • the transformant whose host is Bacillus is usually cultured at about 30 to about 40 ° C. for about 6 to about 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • a medium for cultivating a transformant whose host is yeast for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, K ⁇ . Et al., Proceedings' Ob 'The'National' Academic ⁇ ⁇ ⁇ Ob'Sciences'Ob'The'USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77 ⁇ , 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Pro Sighing's the National Academy, The Sciences of the United States ( Proc . Natl. Acad. Sci. USA), 81 5, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably about 5 to about 8. Culturing is usually performed at about 20 ° C. to about 35 ° C. for about 24 to about 72 hours. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • a medium for culturing a transformant whose host is an insect cell or an insect for example, Grace's Insect Medium [Grace, TCC, Nature, 195 ⁇ , 788 (1962)]
  • a material obtained by appropriately adding additives such as sera is used.
  • the pH of the medium is preferably about 6.2 to about 6.4.
  • the culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to about 5 days. You may perform ventilation
  • a minimal essential medium containing about 5 to about 20% fetal sushi serum [Science, 122 ⁇ , 5001 (1952)], Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) [Virology, 8 ⁇ , 39 6 (1959)], RPMI 1640 Medium [Journal 'Ob' The 'American' Medical 'Association (The Journal of the American Medical Association), 199 ⁇ , 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine; 1 (1950)], etc.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to about 8.
  • the culture is usually carried out at about 30 ° C. to about 40 ° C. for about 15 to about 60 hours. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • RAIG2 (or RAIG3) or Can produce the partial peptide.
  • RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof is extracted from cultured cells or cytoplasm of cells
  • the cells or cells collected from the culture by a known method are suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme.
  • a method of suitably obtaining a crude extract of soluble protein by centrifuging or filtering after destroying cells or cells by Z or freeze-thawing is used as appropriate.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride and a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • RAIG2 or RAIG3 or its partial peptide is extracted from the membrane fraction
  • the cells or cells are disrupted in the same manner as described above, and then cell debris is precipitated and removed by low-speed centrifugation, and the supernatant is centrifuged at high speed.
  • a method of precipitating the contained fraction purifying the cell membrane fraction by density gradient centrifugation, etc., if necessary
  • RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide is secreted outside the cells (cells)
  • a method such as separating the culture supernatant from the culture by centrifugation or filtration is used. .
  • Isolation and purification of RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof contained in the thus obtained soluble fraction, membrane fraction or culture supernatant can be performed according to a method known per se.
  • Such methods include the use of solubilities such as salting-out solvent precipitation; mainly the differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method utilizing a difference in charge such as ion exchange chromatography; a method utilizing a specific affinity such as affinity chromatography; a method utilizing a difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography;
  • a method using the difference in isoelectric point, such as isoelectric focusing, is used.
  • the free form can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and the protein or peptide is converted into a salt.
  • the salt can be converted into a free form or other salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • RAIG2 (or RAIG3) produced by the transformant or its partial peptide can be arbitrarily modified by subjecting RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide to an appropriate protein-modifying enzyme before purification or after purification. It can also be removed.
  • the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • RAIG2 or RAIG3
  • RAIG3 partial peptide obtained by force
  • Western blotting or the like using an antibody against RAIG2 (or RAIG3).
  • RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof is a rabbit type reticulocyte lysate, wheat germ lysate, E. coli, or RNA corresponding to the above-mentioned DNA encoding RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof. It can be synthesized in vitro using a cell-free protein translation system that can also be used, such as lysate. Alternatively, DNA encoding RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof can also be synthesized as a saddle using a cell-free transcription Z translation system further containing RNA polymerase.
  • Cell-free protein (transcriptional Z) translation systems can be commercially available, and methods known per se, such as Pratt JM et al., “Transcription and Tranlation”, Hames BD and Hig gins SJ Ed., IRL Press, Oxford 179-209 (1984).
  • Commercially available cell lysates include E. coli S30 extract sy stem (Promega) and RTS 500 Rapid Tranlation System (Roche), etc. derived from E. coli, and Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega) and other wheat germ-derived ones include PROTEIOS TM (TOYOBO). Of these, those using wheat germ lysate are preferred.
  • a method for producing wheat germ lysate for example, the method described in Johnston FB et al., Nature, 179, 160-161 (1957) or Erickson AH et al., Meth. EnzymoL, 96, 38-50 (1996) can be used. it can.
  • the Notch method PratU.M. Et al. (1984) mentioned above
  • a continuous cell-free protein synthesis system that continuously supplies amino acids, energy sources, etc. to the reaction system.
  • a base encoding a RAIG2 (or RAIG3) protein that is, a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4)
  • a nucleic acid containing a sequence or a part thereof, or a part thereof, or a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof is not limited to a nucleic acid encoding the aforementioned RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof.
  • the nucleic acid containing a base sequence complementary to the target region of the target nucleic acid that is, a nucleic acid that can be hybridized with the target nucleic acid is used for the target nucleic acid.
  • nucleic acid containing a base sequence having homology with the target region of the target nucleic acid can be said to be “sense” with respect to the target nucleic acid.
  • “having homology” or “complementary” means about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95%, between nucleotide sequences. Have the above identity or complementarity ⁇
  • a nucleic acid containing a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding RAIG2 (or RAIG3) protein or a part thereof has been cloned.
  • Such nucleic acids can inhibit the replication or expression of the RAIG2 (or RAIG3) gene. That is, the antisense nucleic acid of the present invention can hybridize with RNA to which RAIG2 (or RAIG3) gene force is also transcribed, and can inhibit mRNA synthesis (processing) or function (translation into protein).
  • the length of the target region of the antisense nucleic acid of the present invention is not particularly limited as long as the antisense nucleic acid hybridizes and, as a result, the translation of the RAIG2 (or RAIG3) protein is inhibited.
  • RAIG3 The entire sequence or partial sequence of mRNA may be as short as about 15 bases and as long as the entire sequence of mRNA or initial transcript. Considering the ease of synthesis and antigenicity issues, about 15 ⁇ Oligonucleotides having a strength of about 30 bases are preferred, but not limited thereto.
  • a 5, end hairpin loop of a nucleic acid encoding a RAIG2 (or RAIG3) precursor polypeptide, a 5 ′ end 6-base pair repeat, a 5 ′ end untranslated region, a polypeptide translation initiation codon, Protein coding region, ORF translation initiation codon, 3'-end untranslated region, 3'-end palindromic region, and 3'-end hairpin loop can be selected as the target region Any region within the RAIG2 (or RAIG3) gene You can choose. For example, it is also preferable to use the intron portion of the gene as the target region.
  • the antisense nucleic acid of the present invention binds to the RAIG2 (or RAIG3) gene, which is a double-stranded DNA that only hybridizes with RAIG2 (or RAIG3) mRNA or the initial transcript and inhibits translation into proteins. It may form a triplex and inhibit RNA transcription. Or it may form a DNA: RNA nobled to induce degradation by RNa seH.
  • Antisense nucleic acids are deoxyribonucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, ribonucleotides containing D-ribose, and other types of purine or pyrimidine base N-daricosides.
  • Other polymers with nucleotides or non-nucleotide backbones eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • other polymers containing special linkages provided that the polymer is in DNA or RNA
  • RNA DNA: RNA, hybrids, and unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides),
  • modifications such as those with labels known in the art, those with caps, those that have been methylated, those in which one or more natural nucleotides have been replaced by analogs
  • Intramolecular nucleotide modifications such as those with uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, force rubamates, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates)
  • proteins nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, signals
  • Peptide poly -L- lysine, etc.
  • a sugar e.g., a side chain group, such as monosaccharides, etc.
  • nucleoside may include those having other heterocyclic bases which are modified in addition to containing purine and pyrimidine bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g. one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. May have been converted to
  • An antisense nucleic acid is RNA, DNA, or! /, Is a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives and polynucleoside amides that are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed with the following policy. That is, make the antisense nucleic acid more stable in the cell, increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, increase the affinity for the target sense strand, and if it is toxic, Make sense nucleic acid less toxic. Many such modifications are known in the art, such as J. Kaw akami et al "Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
  • Antisense nucleic acids can be altered, donated in specialized forms such as ribosomes and microspheres that contain modified sugars, bases and bonds, applied by gene therapy, It can be given in an added form.
  • the additional form can be used as a polycation such as polylysine that acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, or a lipid that enhances the interaction with the cell membrane or increases the uptake of nucleic acid.
  • Preferred lipids to be added include cholesterol and derivatives thereof (for example, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached via bases, sugars, or intramolecular nucleoside linkages.
  • groups include cap groups that are specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of nucleic acids, and are intended to prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene dallicol and tetraethylene dallicol.
  • a ribozyme capable of specifically cleaving RAIG2 (or RAIG3) mRNA or an initial transcript within the coding region (including the intron in the case of the initial transcript) is also included in the antisense nucleic acid of the present invention.
  • “Ribozyme” refers to RNA having an enzyme activity that cleaves nucleic acid. Recently, it has been clarified that oligo DNA having the base sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid cleaving activity. In the specification, as long as it has a sequence-specific nucleic acid cleavage activity, it is used as a concept including DNA.
  • RNAs such as viroids and virusoids
  • hammerhead and hairpin types are known.
  • the hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and several bases at both ends adjacent to the part that takes the hammerhead structure (about 10 bases in total) are complementary to the desired cleavage site of mRNA.
  • This type of ribozyme has the additional advantage of not attacking genomic DNA because it uses only RNA as a substrate.
  • RAIG2 (or RAIG3) mRNA has a double-stranded structure by itself, it is possible to use a noisy ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to an RNA helicase.
  • the target sequence can be made single-stranded [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5577 (2001)].
  • the ribozyme is used in the form of an expression vector containing the DNA that encodes it, a hybrid ribosome further linked with a tRNA-modified sequence is added to facilitate the transfer of the transcript to the cytoplasm.
  • RNA interference in which short double-stranded RNA is introduced into a cell and its complementary mRNA is degraded, has long been known for nematodes, insects, plants, etc.
  • siRNA can be designed appropriately using commercially available software (eg, RNAi Designer; Invitrogen) based on the base sequence information of the target mRNA.
  • the antisense oligonucleotide and ribozyme of the present invention determine the target region of mRNA or early transcription product based on RAIG2 (or RAIG3) cDNA sequence or genomic DNA sequence information, and are commercially available DNAZRNA automatic synthesizers ( Applied Biosystems).
  • RNAi activity a sense strand and an antisense strand are synthesized by a DNAZRNA automatic synthesizer, respectively, in an appropriate annealing buffer, for example, about 90 to about 95.
  • siRNA is synthesized as RNA (shRNA) in which a sense strand and an antisense strand are linked via a linker having an appropriate length (for example, about 3 to about 10 bases) and introduced into an enzyme dicer in an animal cell (introduced). dicer) can also be designed to be processed.
  • shRNA RNA
  • the gene expression inhibitory activity of the antisense nucleic acid of the present invention is a transformant containing a nucleic acid encoding RAIG2 (or RAIG3), an RAIG2 (or RAIG3) gene expression system in vivo or in vitro. Alternatively, RAIG2 (or RAIG3) protein can be examined using an in vivo or in vitro translation system.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the present invention also provides an antibody against RAIG2 (or RAIG3).
  • the antibody is RAIG2
  • RAIG3 As long as it has specific affinity for (or RAIG3), it may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • An antibody against RAIG2 (or RAIG3) can be produced according to a known method for producing an antibody or antiserum using RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof as an antigen.
  • Antigens used for preparing the antibody of the present invention include the above-mentioned RAIG2 (or R AIG3) protein or a partial peptide thereof (hereinafter, unless otherwise specified, in the description of the antibody, simply including these). Any of them may be used (hereinafter referred to simply as “RAIG2 (or RAIG3)”) or a (synthetic) peptide having one or more of the same antigenic determinants (hereinafter referred to as “synthetic” peptides). Sometimes referred to as the antigen of the present invention).
  • RAIG2 (or RAIG3) is prepared by, for example, (a) mammalian tissue or cell force using a known method or a method equivalent thereto, (b) a known peptide using a peptide 'synthesizer, etc. (C) cultivating a transformant containing DNA encoding RAIG2 (or RAI G3); or (d) a nucleic acid encoding RAIG2 (or RAI G3) It is produced by biochemical synthesis using a cell-free transcription Z translation system.
  • RAIG2 (or RAIG3) from mammalian tissues or cells
  • the crude fraction e.g., membrane fraction, soluble fraction
  • extraction is performed with acid, surfactant, alcohol, etc., and the extract is combined with chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. It can also be purified and isolated from Sakoko.
  • the obtained RAIG2 (or RAIG3) can be used as an immunogen as it is, or a partial peptide can be prepared by limited degradation using peptidase or the like and used as an immunogen.
  • the synthetic peptide has, for example, the same structure as RAIG2 (or RAIG3) purified from natural materials using the method (a) described above.
  • the amino acid sequence of RAIG2 (or RAIG3) contains one or more amino acid sequences that are the same as the amino acid sequence of any position having at least 3 amino acids, preferably 6 amino acids. Peptides are used.
  • the DNA can be obtained by a known cloning method [for example, Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook et al, Co Id Spring And the like as described in Harbor Lab. Press, 1989).
  • the cloning method is as follows: (1) A DNA probe designed based on the gene sequence encoding RAIG2 (or RAIG3) is used, and DNA encoding the antigen is isolated from a human cDNA library by the hybridization method.
  • a DNA primer designed based on the gene sequence encoding RAIG2 (or RAIG3), preparing DNA encoding the antigen by PCR using a mammalian cDNA as a saddle, Examples thereof include a method of inserting the DNA into an expression vector suitable for the host.
  • a desired antigen can be obtained by culturing a transformant obtained by transforming a host with the expression vector in an appropriate medium.
  • an expression vector inserted with a DNA encoding an antigen prepared by the same method as in (c) above (for example, control of the DNA force T7, SP6 promoter, etc.)
  • the expression vector placed below is in a saddle type, and mRNA is synthesized using a transcription reaction solution containing RNA polymerase and substrates (NTPs) compatible with the promoter.
  • NTPs RNA polymerase and substrates
  • Examples thereof include a method in which a translation reaction is performed using a translation system (eg, an extract of Escherichia coli, rabbit reticulocytes, wheat germ, etc.). By appropriately adjusting the salt concentration, etc., the transcription reaction and translation reaction can be carried out in the same reaction solution.
  • the complete RAIG2 (or RAIG3) protein molecule and its partial amino acid sequence as an immunogen can be used.
  • partial amino acid sequences include those having 3 or more consecutive amino acid residue forces, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, and most preferably 6 or more consecutive amino acid residue forces. Is mentioned.
  • the amino acid sequence may have, for example, 20 or less continuous amino acid residue strengths, preferably 18 or less, more preferably 15 or less, and even more preferably 12 or less continuous amino acid residue strengths. The thing which becomes. Some of these amino acid residues (eg, 1 or several) may be substituted with a substitutable group (eg, Cys, hydroxyl group, etc.).
  • a peptide used as an immunogen has an amino acid sequence containing one to several such partial amino acid sequences.
  • mammalian cells that express RAIG2 themselves can also be used directly as the antigen of the present invention.
  • mammalian cells natural cells as described in the above section (a), cells transformed by the method as described in the above section (c), and the like can be used.
  • the host used for transformation may be any cell collected from humans, monkeys, rats, mice, mice, musters, and chickens.
  • HEK293, COS7, CH0-K1, NI H3T3, Balb3T3, FM3A L929, SP2 / 0, P3U1, B16, or P388 is preferably used.
  • Natural mammalian cells or transformed warm-blooded animal cells that express RAIG2 (or RAIG3) are suspended in medium (eg RPMI1640) or buffer (eg Hanks, Balanced Salt Solution) used for tissue culture.
  • the immunized animal can be injected in the conditioned state.
  • any method that can promote antibody production may be used.
  • Intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, or the like is preferably used.
  • the antigen of the present invention has immunogenicity, it can directly immunize insoluble matter, but it has a low molecular weight (only one to several antigenic determinants in the molecule (for example, when using antigens with a molecular weight of about 3,000 or less (ie, partial peptides of RAIG2 (or RAIG3)), these antigens are usually hapten molecules with low immunogenicity, so they bind to an appropriate carrier (one carrier). Alternatively, immunization can be performed as an adsorbed complex. A natural or synthetic polymer can be used as the carrier.
  • Examples of natural polymers include serum albumin of mammals such as rabbits, rabbits, and humans, and thyroglobulins of mammals such as rabbits and rabbits, such as ovalbumins of chickens, such as rabbits, rabbits, humans, and hidges. Such as baby Molybdenum hemoglobin, keyhole limpet mosyanin (KLH), etc. are used.
  • Examples of the synthetic polymer include various latexes such as polymers or copolymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polyvinyls, and polypropylenes.
  • the mixing ratio of the carrier and the hapten may be any ratio that allows the antibody to be bound or adsorbed to the antigen bound to or adsorbed to the carrier at any ratio. It is possible to use the above-mentioned natural or synthetic polymer carrier, which is commonly used for the production of antibodies against normal haptens, bound or adsorbed at a ratio of 0.1 to 100 with respect to nopten 1 by weight. .
  • Various condensing agents can be used for force pulling of the hapten and the carrier.
  • diazo-um compounds such as bis-diazobenzidine that crosslinks tyrosine, histidine, and tryptophan, dialdehyde compounds such as dartal aldebito that bridge amino groups, and diisocyanates such as toluene-2,4-diisocyanate Natei compounds, dimaleimide compounds such as N, N, -o-phenylene dimaleimide, which crosslinks thiol groups, maleimide active ester compounds, which crosslink amino groups and thiol groups, amino groups and carboxyl groups A carpositimide compound that crosslinks is advantageously used.
  • an active ester reagent having a dithiopyridyl group on one amino group for example, 3- (2-pyridyldithio) propionic acid N-succinimidyl (SPDP), etc.
  • SPDP 3- (2-pyridyldithio) propionic acid N-succinimidyl
  • a thiol group can be introduced, and after the maleimide group is introduced into the other amino group by a maleimide active ester reagent, both can be reacted.
  • the antigen of the present invention may be administered to a warm-blooded animal by itself, for example, at a site where antibody production is possible, or a carrier, by administration methods such as intraperitoneal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, and intradermal injection. Administered with diluent. In order to increase the antibody-producing ability upon administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. Administration is usually 1
  • mice and rats are preferably used for the production of monoclonal antibodies.
  • human immunization to humans is ethically difficult, when the antibody of the present invention is to be administered to humans (0, human antibody-producing animals prepared according to the method described below (examples) : Mice) to obtain human antibodies, GO to produce chimeric antibodies, humanized antibodies or fully human antibodies according to the method described later, or (iii) in vitro immunization and virus cell immortalization, human -It is preferable to obtain human antibodies in combination with human (or mouse) hyperpridoma production technology, phage display method, etc.
  • in vitro immunization can obtain antibodies against antigens that suppress antibody production in normal immunization
  • antibodies with antigen amounts on the order of ng to ⁇ g it is possible to obtain antibodies with antigen amounts on the order of ng to ⁇ g, and immunization can be completed within a few days.
  • a method of obtaining antibodies to be used preferably also in the case of preparing antibodies from non-human animals.
  • Animal cells used for in vitro immunization include lymphocytes isolated from humans and the above-mentioned warm-blooded animals (preferably mice and rats), such as peripheral blood, spleen and lymph nodes, preferably B lymphocytes. Examples include spheres.
  • lymphocytes isolated from humans and the above-mentioned warm-blooded animals (preferably mice and rats), such as peripheral blood, spleen and lymph nodes, preferably B lymphocytes.
  • Examples include spheres.
  • the spleen is removed from an animal of about 4-12 weeks of age, and the spleen cells are isolated, and an appropriate medium (eg Dulbecco's modified Eagle medium (D MEM), RPMI 1640 medium, Ham F12 medium, etc. ), And then suspended in a medium supplemented with fetal urine serum (FCS; about 5-20%) containing the antigen for about 4-10 days. CO incubator, etc.
  • D MEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FCS fetal urine serum
  • Incubate with Examples of the antigen concentration include, but are not limited to, 0.05 to 5 g. It is preferable to prepare a thymocyte culture supernatant of an animal of the same strain (preferably about 1 to 2 weeks of age) according to a conventional method and add it to the medium.
  • antibody titers In the production of monoclonal antibodies, there are individuals in which antibody titers have been increased from warm-blooded animals (eg, mice, rats) or animal cells (eg, humans, mice, rats) immunized with the antigen. Or select a cell population and collect spleen or lymph nodes 2-5 days after the final immunization or After culturing for 4 to 10 days after in vitro immunization, the cells are recovered, antibody-producing cells are isolated, and this is fused with myeloma cells to prepare antibody-producing hyperpridoma.
  • the antibody titer in serum can be measured, for example, by reacting a labeled antigen with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the myeloma cells are not particularly limited as long as they can produce a hyperidoma that secretes a large amount of antibody, but cells that themselves do not produce or secrete antibodies are preferred, and cell fusion efficiency is also preferred. A higher one is more preferable.
  • a HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • mouse myeloma cells are NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1 isobaric rat myeloma cells are R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3 isotropic human myeloma cells are SKO-007, GM 1500-6TG-2, LICR-LON-HMy2, UC729-6, etc.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256 ⁇ , 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG), Sendai virus, and the like, preferably PEG.
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited, but PEG1000 to PEG6000 having low toxicity and relatively low viscosity are preferable.
  • Examples of the PEG concentration include about 10 to 80%, preferably about 30 to 50%.
  • Use various buffer solutions such as serum-free medium (eg RPMI16 40), complete medium containing about 5-20% serum, phosphate buffered saline (PBS), Tris buffer, etc. Can do.
  • DMSO eg, about 10 to 20%
  • the pH of the fusion solution is, for example, about 4 to 10, preferably about 6 to 8.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of bone marrow cells is usually about 1: 1-20: 1, usually 20-40 ° C, preferably 30-37 ° C, usually 1-10 minutes. By incubating, cell fusion can be carried out efficiently.
  • Antibody-producing cell lines can also be obtained by infecting antibody-producing cells with a virus capable of transforming lymphocytes to immortalize the cells.
  • viruses include Epstein Barr (EB) virus.
  • EB Epstein Barr
  • Recombinant EB viruses that retain the ability to immortalize B lymphocytes but lack the ability to replicate viral particles (e.g., transition from a latent infection state to a lytic infection state) as an EB system without the possibility of viral contamination It is also preferred to use a deficiency in the switch gene).
  • B lymphocytes can be easily transformed using the culture supernatant. After culturing these cells in serum and a medium supplemented with penicillin Z streptomycin (P / S) (eg, RPMI1640) or a serum-free medium supplemented with cell growth factor, the culture supernatant is separated by filtration or centrifugation, The antibody-producing B lymphocytes are suspended at an appropriate concentration (eg, about 10 7 cells / mL), and incubated at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, usually for about 0.5 to 2 hours. Thus, an antibody-producing B cell line can be obtained.
  • P / S penicillin Z streptomycin
  • a serum-free medium supplemented with cell growth factor
  • T lymphocytes that are toxic to EB virus-infected cells, so in order to increase the frequency of transformation, For example, it is preferable to remove T lymphocytes in advance by forming E rosette with Hedgeh erythrocytes and the like.
  • Hedge erythrocytes bound with a soluble antigen can be mixed with antibody-producing B lymphocytes, and lymphocytes specific for the target antigen can be selected by separating rosettes using a density gradient such as Percoll.
  • antigen-specific B lymphocytes are capped and do not present IgG on the surface, so when mixed with anti-IgG antibody-bound Hedge erythrocytes, antigen-nonspecific B lymphocytes are added. Only the ball forms a rosette. Therefore, antigen-specific B lymphocytes can also be selected by collecting the rosette non-forming layer using a density gradient such as Percoll.
  • Human antibody-secreting cells that have acquired infinite proliferation ability by transformation can be back-fused with mouse or human myeloma cells in order to stably maintain the antibody-secreting ability.
  • myeloma cells the same ones as described above can be used.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • the medium for animal cells containing 5-20% FCS eg RPMI1640
  • cell growth factor eg RPMI1640
  • Hypoxanthine, aminopterin and Examples of the concentration of thymidine include about 0.1 mM, about 0.4 / z M, and about 0.016 mM, respectively.
  • Tubine resistance can be used to select human-mouse hyperpridoma. Since the human cell lines are more sensitive to Uwabain compared to mouse cell line, can be eliminated unfused human cells by adding to the culture medium at about 10 to 10-3 M.
  • feeder cells or a certain type of cell culture supernatant for selection of cells and hybridomas.
  • a feeder cell radiation is applied to a cell line that can produce a large amount of a growth factor useful for the appearance of a hyperidoma, which is a heterogeneous cell type with a limited survival period so that it can die by helping the appearance of the hyperidoma.
  • those with reduced proliferation ability are used.
  • mouse feeder cells include spleen cells, macrophages, blood, thymic cells and the like
  • human feeder cells include peripheral blood mononuclear cells and the like.
  • the cell culture supernatant include primary culture supernatants of various cells described above and culture supernatants of various cell lines.
  • Hypridoma can also be selected by separating the cells that bind to the antigen using a fluorescence activated cell sorter (FACS) after the antigen is fluorescently labeled and reacted with the fused cells.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • aminopterin inhibits many cell functions, it is preferable to remove the medium force as soon as possible. In mice and rats, most myeloma cells die within 10-14 days, so aminopterin can be removed after 2 weeks of fusion. However, human hyperpridoma is usually maintained in a medium supplemented with aminopterin for about 4 to 6 weeks after fusion. It is desirable to remove hypoxanthine and thymidine at least 1 week after aminopterin removal. That is, in the case of mouse cells, for example, after addition or replacement, a complete medium supplemented with hypoxanthine and thymidine (HT) (for example, RPMI1640 supplemented with 10% FCS) is added or replaced 10 days after the fusion. Visible clones appear about 8-14 days after fusion. If the clone has a diameter force of about 1 mm, the amount of antibody in the culture supernatant can be measured.
  • hypoxanthine and thymidine for example, RPMI1640 supplemente
  • Measurement of the amount of antibody is performed by, for example, target antigen or a derivative thereof or a partial peptide thereof ( Hypridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) directly or with a carrier containing a partial amino acid sequence used as an antigenic determinant, and then radioactive material (eg, 125 I, m I, 3 H, 14 C), enzymes (eg, ⁇ -galatatosidase, ⁇ -darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase), fluorescent substances (eg, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate)
  • the limiting dilution method is commonly used. Cloning using soft agar and cloning using FACS (described above) are also possible. Cloning by the limiting dilution method can be performed, for example, by the following procedure, but is not limited thereto.
  • Antibody-positive querca also draws out cells, floats in complete medium (eg 10% FCS and P / S supplemented RMPI1640) to a density of 30 cells / mL, and is fed to feeder cells. Add O.lmL (3 cells / well) to the plate, dilute the remaining cell suspension to 10 cells / mL, and sprinkle in another tube (1 cell / well). Dilute the solution to 3 cells / mL and spread to another well (0.3 cells / well). Incubate for 2 to 3 weeks until a visible clone appears. Measure the amount of antibody. Select positive wells and clone again.
  • complete medium eg 10% FCS and P / S supplemented RMPI1640
  • Nobridoma can be cultured in vitro or in vivo.
  • the culture method in vivo for example, by injecting mineral oil intraperitoneally to mice induced transformed fine cell tumor (MOPC) (Nono hybridoma parent histocompatible mouse), after 5-10 days 10 6
  • MOPC mice induced transformed fine cell tumor
  • a method of intraperitoneally injecting about 10 to 7 cells of hyperidoma and collecting ascites under anesthesia 2 to 5 weeks later is mentioned.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, such as immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE, QEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification by collecting active antibody such as protein A or protein G and dissociating the binding to obtain the antibody Can be done according to law etc.].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE, QEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification by collecting active antibody such as protein A or protein G and dissociating the binding to obtain the antibody Can be done according to law etc.
  • active antibody such as
  • a hybridoma can be produced by culturing the hyperidoma in vivo or in vitro of a warm-blooded animal and collecting the antibody from the body fluid or culture.
  • the antibody of the present invention is used as a pharmaceutical for human administration, and therefore the antibody of the present invention (preferably a monoclonal antibody) has a risk of showing antigenicity when administered to a human.
  • Antibodies having reduced properties specifically, fully human antibodies, humanized antibodies, mouse-human chimeric antibodies, etc., particularly preferably fully human antibodies.
  • Humanized antibodies and chimeric antibodies can be prepared by genetic engineering according to the methods described below.
  • a fully human antibody can be produced from the above-described human-human (or mouse) hyperidoma.
  • a human antibody-producing animal (described later) Example: Mouse) or phage display method is preferred.
  • chimeric antibody refers to the variable region (V and V) of the heavy and light chains.
  • the sequence is derived from one mammalian species and the constant region (C and C) sequences are from other mammalian species Means an antibody derived from
  • the sequence of the variable region is preferably derived from an animal species that can be used to easily produce a hybridoma such as a mouse, and the constant region sequence is preferably derived from the mammalian species to be administered.
  • Examples of the method for producing a chimeric antibody include the method described in US Pat. No. 6,331,415 or a method obtained by partially modifying it. Specifically, first, mRNA or total RNA is prepared from a monoclonal antibody-producing hybridoma (for example, mouse mouse hybridoma) obtained as described above according to a conventional method, and cDNA is synthesized. Using the cDNA as a saddle type, appropriate primers (for example, each of V and V as sense primers)
  • Oligo DNA containing nucleotide sequence encoding N-terminal sequence, oligo DNA hybridizing with nucleotide sequence encoding C and C N-terminal sequence as antisense primer for example,
  • C and C-encoding DNA are amplified by RT-PCR from RNA prepared from other mammalian (eg, human) lymphocytes.
  • chimeric L chain DNA are inserted into appropriate expression vectors (for example, vectors containing promoters (eg, CMV promoter, SV40 promoter, etc.) that have transcriptional activity in CHO cells, COS cells, mouse myeloma cells, etc.) To do. DNAs encoding both strands may be inserted into separate vectors or tandemly inserted into one vector. Host cells are transformed with the resulting chimeric H chain and chimeric L chain expression vectors. Examples of host cells include animal cells such as mouse myeloma cells as described above, Chinese hamster ovary (CHO) cells, monkey-derived COS-7 cells, Vero cells, and rat-derived GHS cells.
  • appropriate expression vectors for example, vectors containing promoters (eg, CMV promoter, SV40 promoter, etc.) that have transcriptional activity in CHO cells, COS cells, mouse myeloma cells, etc.
  • appropriate expression vectors for example, vectors containing promoters (e
  • any method applicable to animal cells may be used, and preferred examples include the electopore position method.
  • the culture supernatant is recovered and purified by the same method as described above to isolate the chimeric monoclonal antibody.
  • germline cells of animals that have established transgenic technologies such as ushi, goats, and chickens as host cells, and have accumulated large-scale breeding knowhow as domestic animals (poultry).
  • To produce chimeric animals easily and in large quantities from the resulting animal milk or eggs.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained.
  • transgene technologies such as corn, rice, wheat, soybean, and bamboo shoots
  • plant cells that are cultivated in large quantities as major crops are used as host cells, microinjection into protoplasts, electo-poration, It is also possible to produce a transgenic plant using a particle gun method for intact cells, a sputum vector method, etc., and obtain a large amount of chimeric monoclonal antibody such as seeds and leaves obtained.
  • DNA encoding mouse V and V is used as an appropriate linker.
  • HL peptides eg 1 to 40 amino acids, preferably 3 to 30 amino acids, more preferably 5 to 20 amino acids (eg: [Ser- (Gly) m] n or [(Gly) m- Ser] n (m Is an integer from 0 to 10, n is an integer from 1 to 5), etc.).
  • DNA encoding such genetically modified (conjugated) antibody molecules can be expressed in microorganisms such as Escherichia coli and yeast under the control of appropriate promoters. Can be produced.
  • V and V FRs When introduced into E. coli, a dimer called Fv is formed by monocistronic gene expression. Also, using molecular modeling, the appropriate amino acids in V and V FRs are
  • dsFv dimer When substituted with s, a dimer called dsFv is formed by an intermolecular disulfide bond between both chains.
  • humanized antibody refers to all regions other than the complementarity determining regions (CDRs) present in the variable region (that is, the constant region and the framework region (FR) in the variable region). It means an antibody in which the sequence is derived from human and only the sequence of CDR is derived from other mammalian species. As other mammalian species, for example, an animal species that can easily produce a hyperidoma such as a mouse is preferred. Examples of a method for producing a humanized antibody include the methods described in US Pat. Nos. 5,225,539, 5,585,089, 5,693,761 and 5,693,762, or methods obtained by partially modifying them. Specifically, in the same manner as in the case of the above chimeric antibody, V and V-encoding DNAs derived from non-human mammal species (eg, mouse) are isolated and then used in a conventional manner.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the base sequence is further divided into fragments of about bases.
  • a sequence complementary to the above fragment is divided into fragments of about 20 to 40 bases so as to alternately overlap with the above fragments, and each fragment is synthesized using a DNA synthesizer, and these are hybridized and ligated according to a conventional method.
  • V and V with human-derived FRs and CDRs from other mammalian species are further divided into fragments of about bases.
  • Examples of such a method include a sequential CDR transplantation method described in JP-A-5-227970. DN that encodes V and V obtained in this way
  • A is a DNA encoding human C and C in the same manner as in the case of the above chimeric antibody.
  • a cell or a transgenic animal or plant producing a human rabbit antibody can be obtained.
  • Humanized antibodies can be modified to scFv, scFv-Fc, minibody, dsFv, Fv, etc. using genetic engineering techniques in the same way as chimeric antibodies, and even in microorganisms such as Escherichia coli and yeast by using an appropriate promoter. Can be produced.
  • Humanized antibody production technology has been established for the production of Hypridoma.
  • the present invention can also be applied to the production of monoclonal antibodies that can be preferably administered to species.
  • animals that are widely bred as domestic animals (poultry) such as rabbits, pigs, hidges, goats, and -birds, and pet animals such as cat cats.
  • a human antibody is used instead of the animal-derived antibody. Produced. Therefore, if an animal with a high-pridoma production technique, such as a mouse, is used, a fully human monoclonal antibody can be obtained by a method similar to the production of a conventional mouse monoclonal antibody.
  • mice in which the H and H chain H and L chain genes have been introduced using conventional transgeneic (Tg) technology, and in which the endogenous mouse Ig gene has been inactivated using normal KO technology
  • Tg transgeneic
  • HAHA anti-Hg human antibody
  • the VDJ exon in which various combinations of about 80 V fragments, about 30 D fragments, and 6 J fragments encode the antigen-binding site.
  • the total length reaches about 1.5 Mb (Chromosome 14) for the H chain, about 2 Mb (Chromosome 2) for the KL chain, and about 1 Mb (Chromosome 22) for the chain.
  • conventional gene transfer vectors plasmids, cosmids, BACs
  • Example: Colcemide to prepare microcells in which one to several chromosomes or fragments thereof are encapsulated in the nuclear membrane, and introduce the chromosomes into mouse ES cells by the micronucleus fusion method.
  • Hybrid ES cells that retain chromosomes containing the Hg gene or fragments thereof are selected using a medium containing the drug, and microinjected into mouse embryos in the same manner as for normal KO mouse production.
  • Chimera mouse power to be obtained Select germline chimera using coat color as an index, etc., and transmit TC mouse strain (TC (hCF14)) that transmits human chromosome 14 fragment and human chromosome 2 fragment Establish TC mouse strain (TC (hCF2)).
  • mice By constructing mice (KO (IgH) and KO (Ig ⁇ )) in which endogenous H chain genes and ⁇ L chain genes were KOed by a conventional method, and repeating these four strains, four types of gene modifications were made. All mouse strains (double TC / KO) can be established.
  • an antigen-specific human monoclonal antibody-producing hyperidoma can be produced.
  • hCF2 containing a KL chain gene is unstable in mouse cells, there is a disadvantage that the efficiency of obtaining a hyperidoma is lower than that in a normal mouse.
  • the Hu-Mab Mouse contains about 50% of the ⁇ L chain gene, but exhibits variable ⁇ chain diversity equivalent to that of the full length because the variable region cluster has a doubled structure. Since the H chain gene is about 10% and does not contain cocoon, the H chain diversity is low and the responsiveness to the antigen is insufficient), and it is inserted into the mouse chromosome by the YAC vector (Ig ⁇ -YAC). Therefore, it is stably maintained in mouse cells.
  • mice normal mice can be produced by cross-breeding TC (hCF14) and Hu-Mab Mouse to create a mouse (trade name: KM mouse) that stably retains hCF14 and Ig ⁇ -YAC.
  • TC cross-breeding TC
  • Hu-Mab Mouse Hu-Mab Mouse
  • a human antibody-producing animal into which a gene is further introduced can also be produced.
  • Such animals produced TC mice (TC (hCF22)) into which human chromosome 22 carrying a chain gene or a fragment thereof was introduced in the same manner as described above, and these were combined with the above-mentioned double TC / KO mice or KM mice. It can be obtained by mating, or can be obtained by constructing a human artificial chromosome (HAC) containing, for example, an H chain locus and a chain locus and introducing it into a mouse cell (Nat. (BiotechnoL, 18: 1086-1090, 2000) 0
  • the antibody of the present invention is used as a pharmaceutical, it is preferably a monoclonal antibody, but may be a polyclonal antibody.
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, it is not necessary to use a hyperidoma. Therefore, a technique for producing a hyperidoma should be established, but a transgenic technique has been established, and animal species, preferably a tumor. Larger amounts of human antibodies can be produced at low cost by producing human antibody-producing animals using ungulates such as rhinoceros by the same method as described above (for example, Nat. BiotechnoL, 20: 889-894, 2002).
  • the obtained human polyclonal antibody can be purified by collecting blood, ascites, milk, eggs, etc., preferably milk and eggs of human antibody-producing animals, and combining the same purification techniques as described above.
  • phage display Another approach to making fully human antibodies is to use phage display.
  • PCR mutations may be introduced in addition to CDRs, so there are few reports of HAHA production in clinical stages, while there is no risk of infection with heterologous viruses derived from host animals. !, And has the advantage that the specificity of the point and antibody is infinite (antibodies against prohibited clones and sugar chains can be easily produced)! /
  • Examples of the method for preparing a phage spray human antibody library include, but are not limited to, the following.
  • the phage to be used is not particularly limited, but usually filamentous phage (Ff pacteriophage) is preferably used.
  • Ff pacteriophage filamentous phage
  • phage display vectors 1) In addition to introducing a coat protein gene into a fusion protein gene in the form of a fusion protein, all coat proteins displayed on the phage surface are presented as fusion proteins with the foreign protein, and 2) a gene encoding the fusion protein. Inserted separately from the wild type coat protein gene to express the fusion protein and the wild type coat protein at the same time. For example, in the case of 1), the ability to infect is lost when a large foreign protein is fused to the phages that simultaneously express the fusion protein and the wild-type coat protein. Therefore, type 2) or 3) is used for the production of antibody libraries.
  • pCESl is a DNA that encodes the ⁇ light chain constant region downstream of the g3p signal peptide under the control of a single ratatose promoter and g3p It is a Fab-expressing phagemid vector in which DNA encoding CH3, His-tag, c-myc tag, and g3p coding sequence are arranged via an amber stop codon (TAG) downstream of the signal peptide.
  • TAG amber stop codon
  • Fab When introduced into Escherichia coli with an amber mutation, Fab is displayed on the g3p coat protein, but when expressed in strain HB2151 without the amber mutation, soluble Fab antibodies are produced.
  • scFv expression type phagemid betater for example, pHENl (J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991) is used.
  • examples of the helper phage include M13-K07, VCSM13 and the like.
  • a sequence containing a codon encoding cysteine is linked to the 3 'end of the antibody gene and the 5' end of the coat protein gene, respectively, and both genes are separated simultaneously (not as a fusion protein).
  • a sequence containing a codon encoding cysteine is linked to the 3 'end of the antibody gene and the 5' end of the coat protein gene, respectively, and both genes are separated simultaneously (not as a fusion protein).
  • human antibody libraries include naive Z non-immune libraries, synthetic libraries, and immune libraries.
  • a naive Z non-immunized library is one of the V and normal human possessed V and
  • V genes by RT-PCR and randomly select them from the above phage display system is a library that can be obtained by cloning in a single box.
  • mRNA derived from lymphocytes such as tonsils is used as a sputum type.
  • a naive library In order to eliminate the V gene bias such as disease history, the amplification of only IgM-derived mRNA that has not undergone class switching due to antigen sensitization is called a naive library.
  • Representative examples include the CAT library (see J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991; Nat. Biotechnol, 14: 309-314, 1996), and the MRC library (Annu. Rev. Immunol, 12: 4 33-455, 1994), Dyax library (J. Biol. Chem., 1999 (supra); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14: 7969-7974, 2000 For example).
  • a synthetic library is a DNA that encodes a random amino acid sequence of an appropriate length, selecting a specific antibody gene that is functional in human B cells, and the portion of the V gene fragment, for example, the antigen binding region such as CDR3. Replaced and made into a library. Since a library can be constructed from a combination of V and V genes that produce functional scFv and Fab from the beginning
  • the immunized library 1 is the above-mentioned naive Z non-immune from lymphocytes collected from humans whose blood antibody titer against the target antigen has increased, or human lymphocytes artificially immunized with the target antigen by the in vitro immunization method.
  • MRNA was prepared in the same way as for the library, and the V and V genes were amplified by RT-PCR and libraryed.
  • the target antibody gene is included in the library from the beginning, the target antibody can be obtained even from a relatively small size library.
  • the phage displaying antigen-specific antibodies is concentrated by repeating a series of operations 3 to 5 times.
  • a carrier for immobilizing an antigen various carriers used in normal antigen-antibody reaction and affinity chromatography, for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon
  • insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose
  • synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon
  • microplates, tubes, membranes, columns, beads, etc. which have power such as glass and metal, and surface plus, sensor chip of Mon Resonance (SPR).
  • SPR sensor chip of Mon Resonance
  • For the immobilization of the antigen physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • a piotin (Strebto) avidin system is preferably used.
  • the target antigen RAIG2 (or RAIG3) is a small molecule such as an oligopeptide
  • special care must be taken that the portion used as the antigenic determinant is not covered by binding to the carrier.
  • blocking solution such as BSA solution (1-2 times), PBS containing surfactant such as Tween (3-5 times), etc. can be used sequentially.
  • PBS containing surfactant such as Tween (3-5 times), etc.
  • acids eg, 0.1M hydrochloric acid
  • proteases eg, gene sequences encoding trypsin cleavage sites at the junctions of antibody genes and coat protein genes
  • the wild type coat protein is displayed on the surface of the eluted phage, so that even if all of the coat protein is expressed as a fusion protein, it is possible to infect 'growth' in E.
  • phages that present antigen-specific antibodies are concentrated by panning, they are infected with colon bacilli and then seeded on a plate to perform cloning. Collect the phage again, Confirm the antigen-binding activity by the above-mentioned antibody titer measurement method (eg ELISA, RIA, FIA, etc.) or measurement using FACS or SPR.
  • antibody titer measurement method eg ELISA, RIA, FIA, etc.
  • Isolation and purification of the antibody from the phage clone displaying the selected antigen-specific antibody is, for example, a vector in which an amber stop codon is introduced at the junction of the antibody gene and the coat protein gene as a phage display vector. If the phage is infected with E. coli that does not have an amber mutation (eg, strain HB2151), soluble antibody molecules are produced and secreted into the periplasm or medium, so that the cell wall is lysed with lysozyme. Then, the extracellular fraction can be recovered and purified using the same purification technique as described above. If His-tag or c-myc tag is introduced, IMAC can be easily purified using an anti-c-myc antibody column.
  • the antibody surface is also separated from the phage surface force by the action of the protease, so that the target antibody can be purified by carrying out the same purification procedure. can do.
  • the fully human antibody production technology using human antibody-producing animals and phage display human antibody libraries can be applied to the production of monoclonal antibodies of other animal species.
  • animals that are widely bred as domestic animals (poultry) such as ushi, pigs, hidges, goats, and -birds, and pet animals such as cats and cats.
  • domestic animals such as ushi, pigs, hidges, goats, and -birds
  • pet animals such as cats and cats.
  • the use of immune libraries is more effective because there are few ethical problems with respect to artificial immunity of the target antigen.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • an immunizing antigen protein or peptide antigen itself, a certain V ⁇ , forms a complex of it and a carrier protein, and immunizes a warm-blooded animal in the same manner as the monoclonal antibody production method described above.
  • it can be produced by collecting an antibody-containing product against RAIG3) and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier protein and hapten were immunized by crosslinking to a carrier protein.
  • Any antibody can be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced against the nopten.
  • a method is used in which thyroglobulin, hemocyanin, etc. are coupled at a weight ratio of about 0.1 to about 20, preferably about 1 to about 5, with respect to hapten 1.
  • various condensing agents can be used for force pulling of the hapten and the carrier protein, and active ester reagents containing dartalaldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, dithiobilidyl group, etc. are used. It is done.
  • the condensation product is administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible, together with the carrier or diluent.
  • complete Freund adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered.
  • Administration is usually performed once every about 1 to about 6 weeks, for a total of about 2 to about 10 times.
  • the polyclonal antibody can be preferably collected from blood, ascites, etc. of warm-blooded animals immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • RAIG2 (or RAIG3) functions as a receptor for glucose and 1,5_AG, and controls hormone secretion such as insulin and ACTH in response to blood glucose concentration. Therefore, RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof, a nucleic acid encoding the same or a part thereof, an antibody against RAI G2 (or RAIG3) (hereinafter referred to as “the antibody of the present invention” t), RAIG2 (or An antisense nucleic acid against a nucleic acid encoding RAIG3) (hereinafter sometimes referred to as “antisense nucleic acid of the present invention” t) has the following uses.
  • RAIG2 detects blood glucose and 1,5_AG concentrations, promotes insulin secretion in the spleen, and promotes ACTH secretion in the pituitary gland at low glucose concentrations.
  • A) RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide b) DNA encoding RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide, 1) sugar 'lipid metabolism regulator, 2) spleen and Z or brain Pituitary function regulators, 3) promoting insulin secretion and lowering Z or blood glucose and Z or ACTH secretion regulators, 4) dyslipidemia, spleen and Z or pituitary dysfunction, or insulin secretion It can also be used as a preventive or therapeutic agent for diseases involving Z or blood glucose levels and abnormal Z or ACTH secretion.
  • RAIG2 or RAIG3
  • RAIG2 or RAIG3 or its partial peptide
  • RAIG2 or RAIG3 or its partial peptide
  • a nucleic acid preferably DNA
  • a nucleic acid preferably DNA
  • a nucleic acid preferably DNA
  • a nucleic acid preferably DNA
  • the amount of RAIG2 (or RAIG3) in the patient's body can be increased by transplanting the cells into the patient, etc., and the effects of glucose and 1,5-AG can be fully exerted. it can.
  • Diseases involving abnormal sugars / lipid metabolism, spleen and Z or pituitary dysfunction, or insulin secretion and Z or blood glucose level and Z or ACTH secretion abnormality include, for example, diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis , Acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorder, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, Examples include, but are not limited to, arteriosclerosis, thrombotic diseases, indigestion, and memory learning disorders.
  • RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof and DNA encoding the same (hereinafter sometimes referred to as "DNA of the present invention") are mixed with a pharmacologically acceptable carrier as necessary. After preparing a pharmaceutical composition, it can be used as the pharmaceutical.
  • the pharmacologically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations; liquid preparations It is formulated as a solvent, solubilizer, suspending agent, isotonic agent, buffering agent, soothing agent, etc. If necessary, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used.
  • excipients include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, denpun, pregelatinized starch, dextrin, crystalline cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethylcellulose sodium, Gum arabic, pullulan, light anhydrous key
  • examples include acids, synthetic aluminum silicates, magnesium aluminate metasilicates, and the like.
  • lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, tar, colloidal silica and the like.
  • binder examples include pregelatinized starch, sucrose, gelatin, gum arabic, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, crystalline cellulose, sucrose, D-manntol, trehalose, dextrin, pullulan, hydroxy
  • examples include cyclopropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone.
  • disintegrant examples include lactose, sucrose, starch, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethylstarch sodium, light anhydrous key acid, and low-substituted hydroxypropylcellulose.
  • the solvent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, sesame oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil and the like.
  • solubilizer examples include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, sodium salicylate.
  • examples include lithium and sodium acetate.
  • suspending agent examples include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalcoyl chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; Hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxy methenoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, hydroxypropinoresenorelose; polysorbates, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalcoyl chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate
  • Hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl
  • Preferable examples of the tonicity agent to be used include sodium chloride salt, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, glucose and the like.
  • Preferable examples of the buffering agent include buffer solutions such as phosphate, acetate, carbonate, citrate and the like.
  • the soothing agent include benzyl alcohol.
  • preservative examples include noroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • antioxidants include sulfite and ascorbate.
  • colorants include water-soluble edible tar dyes (eg, edible red Nos. 2 and 3, edible yellow Nos. 4 and 5, edible blue Nos. 1 and 2, etc., water-insoluble lake dyes ( Examples: Aluminum salts of the aforementioned water-soluble edible tar pigments), natural pigments (eg, j8-carotene, chlorophyll, Bengala, etc.).
  • sweetening agent examples include saccharin sodium, dipotassium glycyrrhizinate, aspanolame, stevia and the like.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include oral preparations such as tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, suspensions; and injections (eg, subcutaneous) Injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.), external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, ointments, etc.), suppositories (eg, rectal suppositories, vaginal seats) And parenteral preparations such as pellets, drops, sustained-release preparations (eg, sustained-release microcapsules).
  • oral preparations such as tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, suspensions
  • injections eg, subcutaneous
  • Injections eg, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.
  • external preparations
  • the pharmaceutical composition can be produced by a method commonly used in the field of pharmaceutical technology, such as the method described in the Japanese Pharmacopoeia. The specific manufacturing method of the preparation is described in detail below.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, the dose of the active ingredient, etc., for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • oral preparations contain active ingredients, excipients (eg, lactose, sucrose, starch, D-manntol etc.), disintegrants (eg: carboxymethylcellulose calcium, etc.), binders (eg: a-modified starch) , Gum arabic, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.) or a lubricant (eg talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000, etc.), etc.
  • excipients eg, lactose, sucrose, starch, D-manntol etc.
  • disintegrants eg: carboxymethylcellulose calcium, etc.
  • binders eg: a-modified starch
  • Gum arabic carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.
  • a lubricant eg talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000, etc.
  • coating base examples include sugar coating base, water-soluble film coating base, enteric film coating base, sustained-release film coating base, etc.
  • sugar coating base sucrose is used.
  • water-soluble film coating bases examples include cellulosic polymers such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropinoremethinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, and methinorehydroxyethylcellulose; Synthetic polymers such as aminoacetate, aminoalkyl metaatacrylate copolymer E [Eudragit E (trade name), Rohm Farma Co., Ltd.], polyvinylpyrrolidone, and polysaccharides such as pullulan.
  • cellulosic polymers such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropinoremethinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, and methinorehydroxyethylcellulose
  • Synthetic polymers such as aminoacetate, aminoalkyl metaatacrylate copolymer E [Eudragit E (trade name), Rohm Farma Co., Ltd.], polyvinylpyrrolidone, and polysaccharides such as pullulan.
  • enteric film coating bases include cellulose polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose, and cellulose acetate phthalate; methacrylic acid copolymer L [Eudragit L (Product name), ROHM FALMA), methacrylic acid copolymer LD [Eudragit L-30D55 (product name), ROHM FALMA], methacrylic acid copolymer S [EUDRAGIT S (product name), ROHM Falma Co., Ltd.] Molecule; natural products such as shellac.
  • cellulose polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose, and cellulose acetate phthalate
  • methacrylic acid copolymer L Eudragit L (Product name), ROHM FALMA
  • methacrylic acid copolymer LD Eudragit L-30D55
  • sustained-release film coating bases include cellulose-based polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl metatalarate copolymer RS [Eudragit RS (trade name), Rohmfarma Co., Ltd.], ethyl acrylate and methyl methacrylate Examples thereof include acrylic acid polymers such as polymer suspensions [Eudragit NE (trade name), Rohm Farma Co., Ltd.].
  • the above-mentioned coating base may be used by mixing two or more of them in an appropriate ratio.
  • a light-shielding agent such as titanium oxide, iron sesquioxide, etc. may be used.
  • Injectables contain active ingredients as dispersants (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.), preservatives (eg, methylparaben, propylparaben, benzyl alcohol) , Chlorobutanol, phenol, etc.) and isotonic agents (eg, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, glucose, etc.) and other aqueous solvents (eg, distilled water, physiological saline, Ringer solution etc.) or oil-based solvents (eg olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil and other vegetable oils, propylene glycol, etc.) etc.
  • dispersants eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.
  • preservatives eg, methylparaben
  • additives such as a solubilizing agent (eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin), a soothing agent (eg, benzyl alcohol, etc.) may be used as desired.
  • a solubilizing agent eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin
  • a soothing agent eg, benzyl alcohol, etc.
  • the injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be used, for example, with mammals (eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent
  • the DNA of the present invention is inserted alone or in an appropriate expression vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, etc. It can also be administered according to means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting intake by a catheter such as a gene gun or a nanomouth gel catheter.
  • the dose of RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the dose of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc.
  • oral administration for example, for diabetic patients (weight 60 kg)
  • it is usually about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but for example, in the case of injections, for example, diabetic patients (weight 60 kg)
  • an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • neutralizing antibodies against RAIG2 inhibit RADC2 (or RAIG2) (or RAIG3) by inhibiting the interaction between DARCOS 1,5- AG It is possible to inactivate (ie neutralize) the signal transduction functions involved in RAIG3), for example, hormone secretion regulating activities such as insulin and ACTH.
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence encoding RAIG2 (or RAIG3) or a part thereof (including ribozyme siRNA as described above; the antisense nucleic acid of the present invention) is RAIG2 (
  • RAIG2 (or RAIG3) expression can be inhibited by blocking gene transcription, transcript processing and translation from Z or mRNA. Accordingly, (a) the neutralizing antibody of the present invention or (b) the antisense nucleic acid of the present invention is converted into 1) sugar 'lipid metabolism and 2) spleen and the reverse of RAIG2 (or RAIG3) or the DNA of the present invention.
  • Z or regulator of pituitary function 3) Suppression of insulin secretion and elevation of Z or blood glucose and Z or ACTH secretion regulator, 4) Abnormal sugar metabolism, spleen and Z or pituitary function, or It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases involving insulin secretion, Z or blood glucose level, and Z or ACTH secretion abnormality.
  • Examples of the above diseases include obesity, hyperlipidemia, type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes Fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, eating disorders, depression, Cushin's disease, thrombotic disease, lipotoxicity, cancer and the like, but are not limited thereto.
  • the antibody of the present invention and the antisense nucleic acid of the present invention can be formulated in the same manner as RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof and the DNA of the present invention, respectively.
  • the antisense nucleic acid remains as it is, and the gene gun has a gel mouth gel strength test. It can also be administered by a catheter such as
  • the dose of the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, for obese patients (with a body weight of 60 kg), it is usually about once a day. 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the dosage of the antisense nucleic acid of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., in the case of oral administration, for example, for obese patients (with a body weight of 60 kg),
  • the daily dose is usually about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc.
  • it is convenient to administer usually about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day.
  • an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the nucleic acid encoding RAIG2 (or RAIG3) or a part thereof (hereinafter sometimes referred to as “sense nucleic acid of the present invention”) and the antisense nucleic acid of the present invention can be used as a probe or primer to produce human. Or detect abnormalities (DNA abnormalities) of DNA or mRNA encoding RAIG2 (or RAIG3) in mammals (eg, rats, mice, rabbits, hidges, pigs, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc.) Therefore, it is useful as a genetic diagnostic agent for, for example, damaging, mutating or reducing expression of the DNA or mRNA, and increasing or overexpressing the DNA or mRNA.
  • mammals eg, rats, mice, rabbits, hidges, pigs, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the above-described genetic diagnosis using the sense or antisense nucleic acid of the present invention can be carried out, for example, by a known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics) , 5th, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, “Ob 'The' National 'Academia 1'Ov'Sciences'Ob' US of America), 86, pp. 2766-2770 (1989)).
  • RAIG2 RAIG3
  • RAIG3 RAIG3
  • diseases involving dysfunction of RAIG2 include, for example, diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, Examples include eating disorders, depression, Cushing's disease, sexual dysfunction, skin diseases, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic diseases, dyspepsia, and memory learning disorders.
  • RAIG2 RAIG3
  • RAIG3 overexpression of RAIG2 (or RAIG3)
  • RAIG3 RAIG3
  • diseases involving overexpression of RAIG2 (or RAIG3) include, for example, obesity, hyperlipidemia, type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, and diabetic retinopathy Edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, eating disorder, depression, Cushing disease, thrombotic disease, lipotoxicity, cancer and the like.
  • the sense and antisense nucleic acids of the present invention can be used for screening compounds that change the expression level of RAIG2 (or RAIG3) by using them as probes or primers.
  • the present invention includes, for example, (i) a non-human mammal (1) blood, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from the organ, or (ii) a transformant.
  • the RAIG2 (or RAIG3) mRNA level is measured as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, obese mice, diabetic mice, high blood pressure
  • Rats, arteriosclerosis rabbits, depression rats, etc. for example, anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, antidepressant drugs
  • physical stress for example, water stress
  • RAIG2 (or RAIG3) mRNA contained in the obtained cells and the like can be quantified by, for example, extracting the cell isotropic mRNA by a conventional method and using a technique such as TaqManPCR, etc. This can be done by performing a Northern plot by means of the above method.
  • a transformant expressing RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide is prepared according to the method described above, and the mRNA of RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide contained in the transformant is quantified in the same manner. Can be analyzed.
  • a certain time before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 Or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or simultaneously with a drug or physical stress RAIG2 (or RAIG3) contained in the cells after administration of the test compound and after a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours)
  • the amount of mRNA can be determined and analyzed.
  • the transformant is cultured according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium and cultured for a certain period of time (after 1 to 7 days. Preferably 1 day To After 3 days, yo Ri preferably after ⁇ 3 days of after 2 days), RAIG2 (or RAIG3) or other contained in the transformant can be carried out by a quantitative analysis to mRNA of its partial peptide.
  • RAIG2 (or R AIG3) is a compound that has the effect of changing the expression level. Specifically, (a) by increasing the expression level of RAIG2 (or RAIG3), RAIG2 (or RAIG3) and glucose, 1, 5 -Cell stimulation activity through interaction with -AG (eg, regulation of intracellular cAMP production, regulation of inositol phosphate production, intracellular Ca 2+ uptake, regulation of cGMP production, insulin secretion promotion, hypoglycemia, regulation of ACTH secretion, appetite regulation And (b) a compound that attenuates the cell-stimulating activity by decreasing the expression level of RAIG2 (or RAIG3).
  • -AG eg, regulation of intracellular cAMP production, regulation of inositol phosphate production, intracellular Ca 2+ uptake, regulation of cGMP production, insulin secretion promotion, hypoglycemia, regulation of ACTH secretion, appetite regulation
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic pharmaceutical for enhancing the physiological activity of RAIG2 (or RAIG3).
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic pharmaceutical for reducing the physiological activity of RAIG2 (or RAIG3).
  • RAIG2 detects blood glucose concentration and promotes insulin secretion from the spleen to lower blood glucose, and also controls ACTH secretion by CRF (corticotropin releasing factor) according to blood glucose concentration Therefore, compounds that change the expression level of RAIG2 (or RAIG3) are: 1) sugar / lipid metabolism regulators, 2) spleen and Z or pituitary function regulators, 3) insulin secretion and Z Or blood sugar and / or ACTH secretion regulators, 4) prevention of diseases involving abnormal glycolipid metabolism, spleen and Z or pituitary dysfunction, or insulin secretion and Z or blood glucose levels and abnormal Z or ACTH secretion 'It can be used as a therapeutic agent.
  • RAIG2 or RAIG3
  • the compounds to be treated are diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin It can be used as a preventive or therapeutic agent for diseases, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic diseases, dyspepsia, memory learning disorders.
  • RAIG2 compounds that reduce the expression level of RAIG2 (or RAIG3) are obesity, hyperlipidemia, type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, sugar Urinary nephropathy, diabetic retinopathy, edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, eating disorder, depression, Cushin g disease, thrombotic disease Can be used as a prophylactic / therapeutic agent for lipotoxicity and cancer, etc.
  • the compound can be formulated in the same manner as RAIG2 (or RAIG3).
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it is administered to, for example, mammals (eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, rushes, cats, dogs, monkeys, etc.) This comes out.
  • mammals eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, rushes, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, for diabetic patients (with a body weight of 60 kg), it is usually daily. About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-2 Omg. When administered parenterally, the single dose may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. For example, in the case of injections, for example, in patients with diabetes (with a body weight of 60 kg) On the other hand, it is convenient to administer usually about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. If the subject is other than a human, the amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • RAIG2 (or RAIG3) has binding properties to glucose and 1,5_AG, the concentration of these sugars in vivo can be quantified with high sensitivity.
  • the quantification method of the present invention can be carried out, for example, in combination with a competitive method. That is, the concentration of glucose or 1,5-AG in the specimen can be measured by contacting the specimen with RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof. Specifically, it can be used, for example, according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • RAIG2 By using RAIG2 (or RAIG3) or its partial peptide, or by constructing an expression system for recombinant RAIG2 (or RAIG3) and using the affinity system using the expression system, RAIG2 (or RAIG3 ) And a ligand (for example, a peptide, a protein, a non-peptide compound, a synthetic compound, a fermentation product, etc.) or a salt thereof that changes the binding property of the ligand.
  • a ligand for example, a peptide, a protein, a non-peptide compound, a synthetic compound, a fermentation product, etc.
  • Such compounds include (a) cell-stimulating activity via RAIG2 (or RAIG3) (for example, promoting GTP-GDP exchange reaction in conjugated Ga, regulating intracellular cAMP production, regulating inositol phosphate production, intracellular ( 2+ ) compounds with Ca 2+ uptake, cGMP production regulation, insulin secretion promotion, hypoglycemia, ACTH secretion regulation, appetite regulation, etc.) ), (C) a compound that increases the binding force between RAIG2 (or RAIG3) and a ligand, or (d) a compound that decreases the binding force between RAIG2 (or RAIG3) and musclin.
  • RAIG2 or RAIG3
  • a compound that increases the binding force between RAIG2 (or RAIG3) and a ligand for example, promoting GTP-GDP exchange reaction in conjugated Ga, regulating intracellular cAMP production, regulating inositol phosphate production, intracellular ( 2+ )
  • the present invention includes (i) when RAIG2 (or RAIG3) is contacted with glucose (or 1,5-AG) and (ii) RAIG2 (or RAIG3) and glucose (or 1,5-AG). ) And a test compound that changes the binding between RAIG2 (or RAIG3) and glucose (or 1,5-AG), or a salt thereof, characterized by comparison with contact with a test compound Provide a method.
  • the amount of glucose (or 1,5-AG) binding to RAIG2 (or RAIG3) in the cases (i) and (ii), the cell stimulating activity, etc. are measured and compared. It is characterized by that.
  • the present invention provides:
  • glucose (or 1,5-AG) When glucose (or 1,5-AG) is brought into contact with cells expressing RAIG2 (or RAIG3) on the cell membrane, glucose (or 1,5-AG) and the test compound are added to RAIG2 (or Is RAIG2 (or RAIG3) -mediated cell-stimulating activity when contacted with cells expressing on the cell membrane (for example, promotion of GTP-GDP exchange reaction in conjugated Ga, regulation of intracellular cAMP production, inositol RAIG2 (or RAIG3) and glucose, which measure and compare phosphate production, intracellular Ca 2+ uptake, cGMP production regulation, insulin secretion promotion, hypoglycemia, ACTH secretion regulation, appetite regulation, etc.) (Or 1,5-AG) or a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property, and
  • Glucose (or 1,5-AG) is brought into contact with RAIG2 (or RAIG3) expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, and darcose ( Or RAIG2 (or RAIG3) when contacted with RAIG2 (or RAIG3) expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between RAIG2 (or RAIG3) and dulcose (or 1,5-AG), which is characterized by comparison.
  • RAIG2 (or RAIG3) used in the screening method of the present invention may be any RAIG2 (or RAIG3) or RAIG2 (or RAIG3) as long as it contains RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof.
  • a cell membrane fraction of a mammalian organ producing (or RAIG3) is preferred.
  • human-derived RAI G2 (or RAIG3) expressed in large quantities using recombinants is suitable for use in screening! /
  • RAIG2 (or RAIG3)
  • the force used in the above method is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells.
  • the ability to use cDNA for the DNA fragment that encodes the target protein is not necessarily limited to this.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment is used in the SV40-derived promoter, retrowinoles.
  • Promoters metamouthonein promoters, human heat shock promoters, cytomegaloinoles promoters, SRa promoters, polyhedrin promoters of nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to baculoviruses hosting insects, etc. It is preferable to incorporate it downstream.
  • NPV nuclear polyhedrosis virus
  • RAIG2 (or RAIG3) used in the screening method of the present invention may be RAIG2 (or RAIG3) purified according to a method known per se, or a cell producing RAIG2 (or RAIG3) or its cell membrane You can use it as a fraction!
  • a cell that produces RAIG2 refers to a host cell that expresses RAIG2 (or RAIG3).
  • Examples of the host cell include yeast, insect cells, and animal cells.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after disrupting cells.
  • Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, disrupting with a Waring blender polytron (manufactured by Kinematic a), disrupting with ultrasonic waves, pressing with a French press, etc., from a thin nozzle. Examples include crushing by jetting.
  • a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500rpn!
  • the membrane fraction is rich in the expressed RAIG2 (or RAIG3) and many membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of RAIG2 (or RAIG3) in RAIG2 (or RAIG3) -producing cells and membrane fractions is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell 10 5 to 10 7 molecules Is more suitable.
  • the higher the expression level the higher the glucose (or 1,5-AG) binding activity (specific activity) per membrane fraction, which not only makes it possible to construct a highly sensitive screening system, but also in the same lot. A large amount of sample can be measured.
  • the RAIG2 (or RAIG3) -containing membrane fraction is preferably a natural RAIG2 (or RAIG3) -containing membrane fraction or a recombinant RAIG2 (or RAIG3) -containing membrane fraction having the same activity.
  • the equivalent activity refers to equivalent glucose (or 1,5-AG) binding activity, signal signal transduction activity, and the like.
  • glucose or 1,5-AG
  • RAIG2 (or RAIG3) is first produced.
  • a RAIG2 (or RAIG3) preparation is prepared by suspending the cells or membrane fraction thereof in a buffer suitable for screening. The nofer can bind to RAIG2 (or RAIG3) and glucose (or 1,5-AG) such as! “[4-10 (preferably 1" [6-8]) phosphate buffer, Tris monohydrochloride buffer, etc. Any buffer that does not inhibit is acceptable.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao Atlas), digitonin, and deoxycholate can be stored in the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Laboratories), and pepstatin can be added for the purpose of suppressing receptor degradation by the protease.
  • test compound having a specific binding amount (B-NSB) of 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • RAIG2 (or RAIG3) -mediated cell stimulating activity e.g., promotion of GTP-GDP exchange reaction in conjugate G, regulation of intracellular cAMP production, regulation of inositol phosphate production, intracellular Ca 2+ uptake, regulation of cGMP production, promotion of insulin secretion, blood glucose level) Reduction, ACTH secretion regulation, appetite regulation, etc.
  • RAIG2 (or RAIG3) -mediated cell stimulating activity e.g., promotion of GTP-GDP exchange reaction in conjugate G, regulation of intracellular cAMP production, regulation of inositol phosphate production, intracellular Ca 2+ uptake, regulation of cGMP production, promotion of insulin secretion, blood glucose level) Reduction, ACTH secretion regulation, appetite regulation, etc.
  • a known method or a commercially available measurement kit e.g., promotion of GTP-GDP exchange reaction in conjugate G, regulation of intracellular cAMP production, regulation of inositol
  • cells that produce RAIG2 are cultured in a multi-wall plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., and incubate for a certain period of time. Then, extract cells or collect supernatant.
  • the generated product Quantify according to each method. Generating ability of a substance used as an index of cell stimulating activity When it is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an assay may be performed with an inhibitor added to the degrading enzyme. Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production inhibitory effect on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
  • RAIG2 In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, appropriate cells expressing RAIG2 (or RAIG3) on the membrane are required.
  • a cell expressing RAIG2 (or RAIG3) As a cell expressing RAIG2 (or RAIG3), a cell line producing natural RAIG2 (or RAIG3), a cell line expressing the above-mentioned recombinant RAIG2 (or RAIG3), etc. are desirable.
  • test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like, which are novel compounds. It may be a known compound.
  • a screening kit for a compound that alters the binding property between RAIG2 (or RAIG3) and glucose (or 1,5-AG) or a salt thereof is a cell that produces RAIG2 (or RAIG3), RAIG2 (or RAI G3) or a membrane thereof It contains fractions and the like.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing RAIG2 (or RAIG3), passaged 5 x 10 5 cells in a 12-well plate using Z-wells and cultured at 37 ° C, 5% CO, 95% air for 2 days.
  • glucose (or 1,5-AG) aqueous solution labeled with [ 3 H], [ 12 3 ⁇ 4, ["C], etc. is stored at 4 ° C or -20 ° C. Dilute to 1 ⁇ with measurement buffer The
  • cells that express RAIG2 (or RAIG3) on the cell membrane further express conjugated Ga.
  • the cell expressing RAIG2 (or RAIG3) and its conjugate G ⁇ includes a transformed cell cotransfected with the DNA of the present invention and the DNA encoding the conjugate Ga.
  • the Ga activation domain of the receptor interacts with the receptor binding region of the conjugated Ga to form a conformation of Ga.
  • GTP / GDP binding region force GDP dissociates and quickly binds GTP.
  • G-GTP acts on the effector to promote or suppress its activity.
  • the antagonist is bound, the conformation of the receptor does not occur, and the G ⁇ -active domain is in an inactive state. The action on the vessel is obstructed.
  • GTP instead of GTP, for example, if a GTP analog that is not hydrolyzed by GTPase activity of Ga such as 3- labeled GTP y S is added to the system, the presence or absence of the test compound is added.
  • the membrane-bound radioactivity at '' it is possible to evaluate the effect of the test compound on the GDP-GTP exchange reaction in G, and the agonist Z antagonist activity of RAIG2 (or RAIG3) Substances possessed can be screened. That is, if radioactivity increases in the presence of a test compound, the test compound has agonist activity against RAIG2 (or RAIG3), and if radioactivity decreases, the test compound becomes an antagonist to RAIG2 (or RAIG3). Has activity.
  • Another preferred embodiment is that in the co-expression system of RAIG2 (or RAIG3) and conjugated Ga, the activity of the effector interacting with Ga is determined by the presence of the test compound.
  • a screening method characterized by comparing in the absence and presence is provided.
  • cells expressing RA IG2 (or RAIG3) and its conjugate Ga also further express effectors that receive signals from the Ga.
  • G a (G a) belonging to the G family promotes its activity using adenylate cyclase as an effector. For example, G a to G
  • G. G a (G a) belonging to G family is adenylate succinate.
  • G a to G a, or i-1 i-3 is G or the like.
  • G a (G a) belonging to the G family uses phospholipase C as an effector and promotes its activity, and examples thereof include G and G.
  • adenylate cyclase hereinafter also referred to as AC
  • the action of G-effector on the effector can be evaluated by directly measuring AC activity.
  • AC activity for example, ATP is added to a membrane fraction containing AC, and the amount of cAMP produced is determined using an anti-cAMP antibody by RI (for example, 1), a method of measuring by competitive immunoassay with cAMP labeled with an enzyme (eg, alkaline phosphatase, peroxidase, etc.), a fluorescent substance (eg, FITC, rhodamine, etc.), or a membrane fraction containing AC [ Examples include, but are not limited to, a method of measuring the radioactivity after adding [ 32 P] cAMP by adding ⁇ - 32 ⁇ ] ⁇ and separating it with an alumina column or the like.
  • the test compound has antagonist activity against RAIG2 (or RAIG3) if it has antigenic activity and conversely AC activity decreases.
  • the conjugated G ⁇ is G ⁇
  • the test compound has an antagonist activity against RAIG2 (or RAIG3), and conversely if the AC activity decreases.
  • the test compound has agonist activity against RAIG2 (or RAIG3).
  • the action of Ga on AC depends on the ability to measure the amount of cAMP in the cells, or the cells produced by labeling cells with [ 3 H] adenine [ 3 H] c It can also be evaluated by measuring the radioactivity of AMP.
  • the amount of intracellular cAMP can be measured by performing the above-described competitive immunoassay on the extract obtained by incubating the cells for an appropriate time in the presence and absence of the test compound and then disrupting the cells. Any other known method can be used.
  • a method for evaluating the amount of cAMP by measuring the expression level of a reporter gene under the control of a cAMP response element (CRE). That is, eukaryotic cells into which a vector containing an expression cassette linked with a DNA encoding a reporter protein (for example, luciferase, GFP, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) is introduced downstream of a promoter containing CRE are tested.
  • a reporter protein for example, luciferase, GFP, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.
  • Evaluate intracellular cAMP levels by measuring and comparing the expression of reporter genes in extracts obtained by culturing cells in the presence and absence of compounds for an appropriate period of time and disrupting the cells using known methods. It is to do. Therefore, when the conjugate G o; is G o ;, the amount of intracellular cAMP (or
  • the test compound If the expression level of the reporter gene under CRE control) increases, the test compound has an antigenic activity against RAI G2 (or RAIG3), and conversely, the cAMP level (or the expression level of the ribota gene) If decreased, the test compound is against RAIG2 (or RAIG3) It has an antagonist activity.
  • the conjugated Ga is G
  • the test compound if the intracellular cAMP level (or the expression level of the reporter gene under the control of CRE) increases in the presence of the test compound, the test compound becomes antagonistic against RAIG2 (or RAIG3). -If it has the strike activity and, on the other hand, the amount of cAMP (or the expression level of the reporter gene) decreases, the test compound will have the agonist activity against RAIG2 (or RAIG3).
  • PLC activity can be evaluated by directly measuring.
  • PLC activity can be measured, for example, by adding [ 3 H] -labeled phosphatidylinositol-4,5-diphosphate to the PLC-containing membrane fraction and measuring the amount of inositol phosphate produced using a known method. Can be evaluated.
  • PLC activity is measured and compared in the presence and absence of the test compound, and if the PLC activity increases in the presence of the test compound, the test compound has agonist activity against RAIG2 (or RAIG3) and If the PLC activity decreases, the test compound has antagonist activity against RAIG2 (or RAIG3).
  • the effect of Ga on PLC is that [ 3 H] -labeled inositol phosphate is produced by adding [ 3 H] -labeled inositol to the cells. It can also be evaluated by measuring sex or measuring intracellular Ca 2+ levels. Intracellular Ca 2+ quantity, the cells were appropriate time Incubate base over preparative presence and absence of the test compound, fluorescent probe (fora- 2, indo- 1, fluor- 3, Calcium-Green I Etc.) or by using equolin, which is a calcium-sensitive photoprotein, or any other known method may be used.
  • An apparatus suitable for spectroscopic measurement using a fluorescent probe is the FLIPR (Molecular Devices) system.
  • the expression level of a reporter gene under the control of a TPA (12-0-tetradecanolholpole-13-acetate) response element (TRE) that is up-regulated by Ca 2+ is measured.
  • a vector comprising an expression cassette in which a DNA encoding a reporter protein (for example, luciferase, GFP, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) is linked downstream of a promoter containing TRE.
  • a vector comprising an expression cassette in which a DNA encoding a reporter protein (for example, luciferase, GFP, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) is linked downstream of a promoter containing TRE.
  • the test compound has agonist activity against RAIG2 (or RAIG3).
  • the test compound has antagonist activity against RAIG2 (or RAIG3).
  • RAIG2 is expressed in eukaryotic cells by expressing a chimeric G o; in which the region that interacts with AC of the G a and G a polypeptides (about 5 amino acids at the C terminus) is replaced with the sequence G o; Regardless of the conjugation Ga of (or RAIG3), phospholipase C can be used as an effector to screen the RAIG2 (or RAIG3) agonist-Z antagonist.
  • a fusion protein in which a conjugate Ga is linked to the C-terminal side of RAI G2 (or RAIG3) is sucked.
  • RAIG2 (or RAIG3) can be constitutively activated by expressing it in host eukaryotic cells such as animal cells and insect cells. In this case, it is possible to screen for agonists and inverse agonists without using ligands such as glucose and 1,5-AG.
  • yeast for example, baker's yeast
  • Yeast has STE2, which is the receptor for mating pheromone a factor, as the only GPCR.
  • GPA1 which is a conjugated Go ;
  • G ⁇ / Gy dissociates from G ⁇ / Gy.
  • FUS1 expression is induced by the kinase cascade signal of dissociated G ⁇ / G y force, and conjugation occurs.
  • RAIG2 detects glucose (or 1,5-AG) concentration, promotes insulin secretion of splenic j8 cell force, and also stimulates CRF stimulation of pituitary cell force. Controls ACTH secretion. Therefore, when insulin-secreting cells or ACTH-secreting cells in which RAIG2 (or RAIG3) is forcibly expressed are cultured in the presence of glucose (or 1,5-AG), glucose (or 1,5-AG) and the test compound RAIG2 (or RAIG3) antigens and antagonists can be screened by comparing insulin secretion or ACTH secretion when cultured in the presence.
  • the test compound When insulin secretion is promoted in the presence of the test compound, the test compound is used as the RA IG2 (or RAIG3) agent, whereas when insulin secretion is inhibited, the test compound is used as the RAIG2 (Or RAIG3) antagonists can be selected respectively.
  • the test compound if ACTH secretion is promoted in the presence of a test compound at a low glucose (or 1,5-AG) concentration, the test compound is used as the RAIG2 (or RAIG3) agonist and, conversely, ACTH secretion Can be selected as an antagonist of RAIG2 (or RAIG3), respectively.
  • test compound if ACTH secretion is inhibited in the presence of a test compound at a high dalcose (or 1,5-AG) concentration, the test compound is used as an RAIG2 (or RAIG3) agonist and, conversely, ACTH secretion In the case of promoting, the test compound can be selected as an antagonist of RAIG2 (or RAIG3), respectively.
  • the compound obtained by using the above screening method or screening kit or a salt thereof is a compound having an action of changing the binding property between RAIG2 (or RAIG3) and glucose (or 1,5-AG).
  • RAIG2 or RAIG3
  • glucose (or 1,5-AG) for example, promotion of GT P-GDP exchange reaction in conjugated Ga, intracellular cAMP production regulation, inositol phosphate production regulation, intracellular Ca 2+ uptake, cGMP production regulation, insulin secretion promotion, hypoglycemia, ACTH secretion regulation, appetite regulation, etc.
  • agonist for example, promotion of GT P-GDP exchange reaction in conjugated Ga, intracellular cAMP production regulation, inositol phosphate production regulation, intracellular Ca 2+ uptake, cGMP production regulation, insulin secretion promotion, hypoglycemia, ACTH secretion regulation, appetite regulation, etc.
  • C a compound that enhances the binding force between RAIG2 (or RAIG3) and glucose (or 1,5-AG
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the agonist for RAIG2 has the same effect as the physiological activity of dalcose (or 1,5-AG) on RAIG2 (or RAIG3), so glucose (or 1,5-AG) It is useful as a safe and low toxic pharmaceutical that enhances the activity.
  • Antagonists to RAIG2 (or RAIG3) can inhibit the biological activity of glucose (or 1,5-AG) against RAIG2 (or RAIG3), and therefore inhibit glucose (or 1,5-AG) activity It is useful as a safe and low toxic pharmaceutical.
  • Prophylactic / therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, antagonist) that changes the binding property between RAIG2 (or RAIG3) and glucose (or 1,5-AG)
  • RAIG2 As mentioned above, RAIG2 (or RAIG3) functions as a glucose (or 1,5-AG) receptor, detects blood glucose levels, promotes insulin secretion in the spleen, and stimulates CRF in the pituitary gland. ACTH secretion is regulated according to glucose concentration.
  • compounds that alter the binding between RAIG2 (or RAIG3) and glucose (or 1,5-AG) (agonist, antagost) are: 1) sugar 'lipid metabolism regulator, 2) spleen and Z or pituitary function regulator, 3) Insulin secretion and Z or blood glucose and Z or ACTH secretion regulator, 4) Glucose 'lipid metabolism abnormality, spleen and Z or pituitary dysfunction, or insulin It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases involving secretion and Z or blood glucose level and Z or ACTH secretion abnormalities.
  • the RAIG2 (or RAIG3) agonist may be diabetic, glucose intolerant, keto Cis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorder, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, artery It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for sclerosis, thrombotic diseases, indigestion, and memory learning disorders.
  • the antagonist of RAIG2 is obesity, hyperlipidemia, type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, edema, insulin resistance It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for syndrome, unstable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, eating disorder, depression, Cushing disease, thrombotic disease, lipotoxicity and cancer.
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it is administered to, for example, mammals (eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, rushes, cats, dogs, monkeys, etc.) This comes out.
  • mammals eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, rushes, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of RAIG2 is different depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, for diabetic patients (weight 60 kg)
  • the daily dose is usually about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • It is convenient to administer usually about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day.
  • the subject is other than a human, the dose converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the dose of RAIG2 (or RAIG3) antagonist varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, for obese patients (with a body weight of 60 kg)
  • the daily dose is usually about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize RAIG2 (or RAIG3), it can be used for quantification of RAIG2 (or RAIG3) in a test solution, especially quantification by sandwich immunoassay.
  • the present invention is characterized by, for example, (i) competitively reacting the antibody of the present invention with a test solution, a labeled protein, etc., and measuring the ratio of the labeled protein, etc. bound to the antibody. (Ii) A method of reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled antibody of the present invention simultaneously or successively. And providing a method for quantifying RAIG2 (or RAIG3) in a test solution, characterized by measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier.
  • the insoluble antibody and the labeled antibody have an antigen recognition site that does not interfere with the binding of RAIG2 (or RAIG3) to each other (for example, One antibody recognizes the N-terminus of RAIG2 (or RAIG3) and the other antibody reacts with the C-terminus of RAIG2 (or RAIG3)).
  • RAIG2 (or RAIG3) using a monoclonal antibody against RAIG2 (or RAIG3) (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention)
  • detection by tissue staining etc.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ′), Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using an antibody against G2 is not particularly limited, and the antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in the solution to be measured (for example, the amount of RAIG2 (or RAIG3))
  • Any measurement method can be used as long as it is a measurement method that detects the amount of the body by a biological or physical means and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. Also good.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, and luminescent substances.
  • the radioisotope e.g., [12 3 ⁇ 4, [131 I], [3 H], [ “C], etc..
  • the enzyme the size of the stable and specific activity
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluoretcene isothiocyanate and the like are used.
  • Examples of the luminescent substance include luminol, luminol derivatives, luciferin, and lucigen.
  • a piotine avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen to a labeling agent.
  • insolubility of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or enzyme or the like may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicone, or glass is used.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and the labeled monoclonal antibody of the present invention is reacted (secondary reaction).
  • primary reaction the amount of RAIG2 (or RAIG3) in the test solution can be quantified.
  • secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times.
  • the labeling agent and the method of insoluble solvent can be the same as those described above.
  • the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction differs in the site that can bind to RAIG2 (or RAIG3).
  • An antibody is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction is preferably the antibody used in the primary reaction, for example, when recognizing the C-terminus of the antibody strength RAIG2 (or RAIG3) used in the secondary reaction. For example, an antibody that recognizes the N-end other than the C-end is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competitive method The antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody (BZF separation). ), Measure the amount of B or F label, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is carried out using polyethylene glycol, a second antibody against the above antibody, etc., and a force using a solid-phased antibody as the first antibody.
  • One antibody is soluble and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
  • the immunometric method the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the test solution in the test solution is separated.
  • the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured.
  • Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
  • RAIG2 or RAIG3
  • the RAIG2 (or RAIG3) measurement system may be constructed by taking into account the usual technical considerations of those skilled in the art in the normal conditions and operation methods of each method.
  • the books, etc. e.g., Irie Hiroshihen "Radio I Takeno mediation Si” (Kodansha, published in 1974 years), Irie Hiroshihen “”Sequential Radio Imno Atssey” (Kodansha, published in 1979), "Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa, et al.
  • RAIG2 (or RAIG3) can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • RAIG2 or RAIG3
  • various diseases associated with RAIG2 (or RAIG3) dysfunction or enhancement can be diagnosed.
  • the antibody of the present invention can also be used to specifically detect RAIG2 (or RAI G3) present in a subject such as a body fluid or tissue.
  • RAIG2 or RAI G3
  • preparation of an antibody column used to purify RAIG2 (or RAIG3), detection of RAIG2 (or RAIG3) in each fraction during purification, and analysis of the behavior of RAIG2 (or RAIG3) in the test cell It can be used for
  • the present invention is, for example,
  • Non-human mammal (1) Blood, (2) Specific organs, (3) Organ strength After destroying isolated tissue or cells, etc., the cell membrane fraction is isolated and contained in the cell membrane fraction
  • Non-human mammals (1) Blood, (2) Specific organs, (3) Organ strength After sectioning isolated tissues or cells, etc., by using immunostaining, RAIG2 (or R A method for screening compounds that change the amount of RAIG2 (or RAIG3) in the cell membrane by confirming RAIG2 (or RAIG3) on the cell membrane by quantitatively determining the degree of staining of AIG3),
  • RAIG2 contained in the cell membrane fraction is quantified as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, obese mice, diabetic mice, high blood pressure
  • Rats, arteriosclerosis rabbits, depression rats, etc. for example, anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, antidepressant drugs
  • physical stress for example, water stress
  • the obtained cells are suspended in an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, etc.), and a surfactant (for example, Triton X-100 TM, Tween) is used. 20 TM etc.) is used to destroy the cells, etc., and a cell membrane fraction is obtained using techniques such as centrifugation, filtration, and column fractionation.
  • an appropriate buffer for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, etc.
  • a surfactant for example, Triton X-100 TM, Tween
  • the cell membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after cell disruption.
  • Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, disrupting with a Waring blender polytron (manufactured by Kinematica), disruption with ultrasonic waves, and pressurizing with a French press. Examples include crushing by ejecting from a nozzle.
  • a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, centrifuge the cell lysate at a low speed (500rpn!
  • the membrane fraction is rich in RAIG2 (or RAIG3) and many membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • RAIG2 contained in the cell membrane fraction can be quantified, for example, by sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western plot analysis, or the like.
  • a powerful sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western plot can be performed by means known per se.
  • a transformant expressing RAIG2 (or RAIG3) or a partial peptide thereof can be prepared according to the method described above, and RAIG2 (or RAIG3) contained in the cell membrane fraction can be quantified.
  • test compound is administered and after a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours) after administration, RAIG2 (or RAIG3) in the cell membrane Can be done by quantifying the amount,
  • test compound is mixed in the medium and cultured for a certain period of time (after 1 day, after 7 days, preferably after 1 day, preferably after 3 days, Preferably, after 2 to 3 days), it can be carried out by quantifying the amount of RAIG2 (or RAIG3) in the cell membrane.
  • RAIG2 (or RAIG3) contained in the cell membrane fraction is confirmed as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc. More specifically, obese mice, diabetic mice, hypertension Pressure rats, arteriosclerosis rabbits, depressed rats, etc.
  • anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, antidepressant drugs or physical stress (for example, water stress)
  • tissue eg, knee islands
  • cells eg, Spleen j8 cells, pituitary gland cells, etc.
  • the obtained cells are made into tissue sections according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention.
  • the RAIG2 (or RAIG3) on the cell membrane can be confirmed quantitatively or qualitatively by confirming RAIG2 (or RAIG3) on the cell membrane. Or the amount of RAIG3) can be confirmed.
  • the compound obtained by using the above screening method or a salt thereof is a compound having an action of changing the amount of RAIG2 (or RAIG3) in the cell membrane.
  • RAIG2 or RAIG3 in the cell membrane
  • RAIG3 By increasing the amount of glucose (or 1,5-AG) —RAIG2 (or RAIG3) interaction (for example, promoting GTP-GDP exchange in synergistic G ⁇ , intracellular cAMP production regulation, inositol phosphate production regulation, intracellular Ca 2+ uptake, cGMP production regulation, insulin secretagogue, hypoglycemic, ACTH secretion regulation, etc. appetite regulation) compound that enhances
  • RAIG2 in the cell membrane (or RAIG3) It is a compound that attenuates the cell-stimulating activity by decreasing the amount of.
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic pharmaceutical for enhancing the physiological activity of RAIG2 (or RAIG3).
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic pharmaceutical for reducing the physiological activity of RAIG2 (or RAIG3).
  • RAIG2 As mentioned above, RAIG2 (or RAIG3) functions as a glucose (or 1,5-AG) receptor, detects blood glucose levels, promotes insulin secretion in the spleen, and stimulates CRF in the pituitary gland. ACTH secretion is regulated according to glucose concentration.
  • compounds that alter the amount of RAIG2 (or RAIG3) in the cell membrane are: 1) a sugar 'lipid metabolism regulator, 2) a spleen and Z or pituitary function regulator, 3) insulin secretion and Z or blood glucose and Z Or ACTH secretion regulator, 4) Glucose 'lipid metabolism abnormality, spleen and Z or pituitary dysfunction, or insulin secretion and Z or blood glucose level as well as diseases involving Z or ACTH secretion abnormality' treatment Can be used as
  • RAIG2 or RAIG3
  • the compounds to be used are diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin
  • RAIG2 or RAIG3
  • the compounds to be used are diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin
  • compounds that reduce the amount of RAIG2 (or RAIG 3) in cell membranes are obesity, hyperlipidemia, type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, glycouria neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retina Disease, edema, insulin resistance syndrome, unstable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, eating disorder, depression, Cushing disease, thrombotic disease, lipotoxicity and cancer prevention, treatment, etc. It can be used as
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it is administered to, for example, mammals (eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, rushes, cats, dogs, monkeys, etc.) This comes out.
  • mammals eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, rushes, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound that increases the amount of RAIG2 (or RAIG3) in the cell membrane varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, for diabetic patients (weight 60 kg) In general, it is usually about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration
  • the dose of the compound that reduces the amount of RAIG2 (or RAIG3) in the cell membrane varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, in obese patients (weight 60 kg) On the other hand, it is usually about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.For example, in the case of an injection, for example, an obese patient (weight 60 kg)
  • an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the present invention is abbreviated as DNA encoding exogenous RAIG2 (or RAIG3) (hereinafter abbreviated as “exogenous DNA of the present invention”) or a mutant DNA thereof (“exogenous mutant DNA of the present invention”).
  • exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (“exogenous mutant DNA of the present invention”).
  • An object of the present invention is to provide a recombinant vector which contains the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and can be expressed in mammals.
  • a non-human mammal having an exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof can be used as an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a germ cell including a primordial cell thereof.
  • a DNA-transferred animal of the present invention can be used as an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a germ cell including a primordial cell thereof.
  • a stage of embryonic development in non-human mammal development preferably at the single cell or fertilized egg cell stage and generally before the 8-cell stage. It can be produced by transferring the target DNA by the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofuxion method, aggregation method, microindi- terion method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc.
  • the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and used for cell culture, tissue culture, etc.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing cells with the above-described embryonic cells by a cell fusion method known per se.
  • mice for example, C57BL / 6 strain, DBA2 strain, etc. as pure strains
  • B6C3F system BDF system
  • B6D2F system BALB / c system
  • ICR system ICR system
  • Examples of the “mammal” in the thread-replaceable vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the non-human mammals described above.
  • the exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by non-human mammals, but the DNA of the present invention once the ability of mammals has been isolated and extracted.
  • the mutated DNA of the present invention includes those in which the base sequence of the original DNA of the present invention has been mutated (for example, sudden mutation), specifically, addition of bases, deletion, substitution with other bases, etc. DNA that has occurred is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means DNA that expresses abnormal RAIG2 (or RAIG3).
  • DNA that expresses a protein or the like that suppresses the function of normal RAIG2 (or RAIG3) is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the target animal.
  • various mammals having the DNA of the present invention having high homology with the human DNA for example, Usagi, Inu, Cat, Various promoters capable of expressing DNA derived from guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • a fertilized egg of a target mammal for example, a DNA construct (eg, vector) bound to the human DNA of the present invention downstream of one
  • a DNA-transfer mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced by microinjection into a mouse fertilized egg.
  • Examples of the expression vector carrying the DNA of the present invention include plasmids derived from E. coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, butteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as mottle-one leukemia virus, vaccinia viruses or Animal viruses such as baculovirus are used.
  • plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, or plasmids derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate the above DNA expression include: (1) DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moro-1 mouse leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) (2) Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle Creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dartathione S-transferase, platelet-derived growth factor
  • a cytomegaloinoles promoter capable of being highly expressed throughout the body a promoter of human peptide chain elongation factor 1a (EF-1 ⁇ ), a human and a chicken ⁇ -actin promoter, and the like are preferable.
  • the vector has a sequence (generally called terminator 1) that terminates transcription of a target messenger RNA in a DNA transfer mammal.
  • terminator 1 a sequence that terminates transcription of a target messenger RNA in a DNA transfer mammal.
  • each vector derived from viruses and various mammals A sequence can be used, and the SV40 terminator of simian virus is preferably used.
  • the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region or for the purpose of further expressing the target foreign DNA. It is possible to connect 3 'downstream of the region depending on the purpose.
  • Normal RAIG2 (or RAIG3) translation regions include DNA from liver, kidney, adipose tissue, and muscle from various mammals (eg, humans, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, mice, musters, rats, mice, etc.)
  • cDNA can be obtained as a raw material from all or part of genomic DNA from various genomic DNA libraries sold on the market or from RNA prepared from the aforementioned organs or tissues by known methods.
  • exogenous abnormal DNA can be obtained by preparing a translation region obtained by mutating the translation region of normal RAIG2 (or RAIG3) obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastatic animal by a conventional DNA engineering method in which it is linked downstream of the above promoter (and optionally upstream of the transcription termination site).
  • the transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the embryo cells of the produced animal after the DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. I mean. Inheriting the exogenous DNA of the present invention, the offspring of this type of animal have the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. I can do it.
  • the transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is performed in the embryo of the target mammal. It is ensured to be present in excess in all of the cells and somatic cells. Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the germ cells of the produced animal after the DNA transfer. Means that. The offspring of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has an excess of the exogenous DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high expression of the normal DNA of the present invention, and finally enhances the function of the endogenous normal DNA to ultimately function as RAIG2 (or RA IG3). It can develop hypersensitivity and can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the normal DNA-transferred animal of the present invention, elucidation of the pathologic mechanism of RAIG2 (or RAIG3) hyperfunction and the disease related to RAIG2 (or RAIG3) and the examination of treatment methods for these diseases It is possible to do.
  • mammals to which exogenous normal DNA of the present invention has been transferred have an increased symptom of free RAIG2 (or RAIG3), they are used in screening tests for therapeutic agents for diseases associated with RAIG2 (or RAIG3). Is also available.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that it stably retains exogenous DNA by mating. I can do it. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by conventional DNA engineering techniques. Metastasis of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the embryo cell of the produced animal after the DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Obtain a homozygous animal with the introduced DNA in both homologous chromosomes, and cross this male and female animal Thus, all the offspring can be bred and passaged to have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high expression of the abnormal DNA of the present invention, and finally functions as RAIG2 (or RA IG3) by inhibiting the function of the endogenous normal DNA. It can become an inactive refractory disease and can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathologic mechanism of RAIG2 (or RAIG3) functional inactive refractory and to investigate a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA high-expressing animal of the present invention may be a normal RAIG2 (or RAIG3) caused by an abnormal RAIG2 (or RAIG3) in a function inactive refractory disease of RAIG2 (or RAIG3). It becomes a model to elucidate the function inhibition (dominant negative action). Moreover, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention is transferred has an increased symptom of free abnormal RAIG2 (or RAIG3), RAIG2 (or RAIG3 It can also be used in therapeutic drug screening tests for functional inactive refractories.
  • RAIG2 (or RAIG3) by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing the produced RAIG2 (or RAIG3) Analysis of the relationship with proteins
  • mutant RAIG2 or RAIG3
  • production of antibodies thereof can be considered.
  • DNA-transferred animal of the present invention it is possible to examine clinical symptoms of diseases associated with RAIG2 (or RAIG3), including RAIG2 (or RAIG3) functional inactive refractory disease, etc. Or more detailed in each organ of disease model related to RAIG3) Detailed pathological findings can be obtained, which can contribute to the development of new treatment methods and to the study and treatment of secondary diseases caused by the diseases.
  • the DNA-transferred animal force of the present invention can also be obtained by taking out each organ, mincing it, and then obtaining free DNA-transferred cells, culturing them, or organizing the cultured cells using a protease such as trypsin. is there.
  • RAIG2 or RAIG3 producing cells can be examined for their specificities, apoptosis, differentiation or proliferation, or their signal transduction mechanism, and their abnormalities. It is an effective research material for elucidating the action of.
  • a therapeutic agent for a disease related to RAIG2 (or RAIG3), including a functional inactive refractory disease of RAIG2 (or RAIG3), using the DNA-transferred animal of the present invention
  • the above-described test method it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease using a quantitative method and the like.
  • the present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, ⁇ -galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene is The non-human mammal according to item (6), which can be expressed under the control of a motor,
  • a reporter gene eg, ⁇ -galactosidase gene derived from E. coli
  • the non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is the ability to suppress the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, or By substantially losing the activity of RAIG2 (or RAIG3) encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express RAIG2 (or RAIG3) (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • non-human mammal As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
  • a part or all of the DNA sequence can be deleted by using a genetic engineering technique, or another DNA can be inserted or replaced.
  • the knockout DNA of the present invention may be produced by shifting the codon reading frame or destroying the function of the promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include: The DNA of the present invention possessed by the target non-human mammal is isolated, and the neon resistance gene, the drug resistance gene represented by the hygromycin resistance gene, or lacZ (j8-galactosidase gene), cat ( The ability to disrupt exon functions by inserting reporter genes such as chlorambue-cholacetyltransferase gene), or DNA sequences that terminate gene transcription at introns between exons (eg poly A addition signal) ), And as a result, the complete mRNA cannot be synthesized so that the gene is destroyed.
  • DNA strand having a DNA sequence constructed for example, homologous recombination
  • targeting vector DNA strand having a DNA sequence constructed
  • the ES cells obtained by introduction into the chromosome of the animal by the method, Southern hybridization analysis using the DNA sequence of the present invention or the DNA sequence in the vicinity thereof as a probe, or the DNA sequence on the targeting vector and the targeting vector It can be obtained by analyzing by a PCR method using a DNA sequence in a neighboring region other than the DNA of the present invention used for production as a primer, and selecting the knockout ES cell of the present invention.
  • ES cells for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination method for example, those already established as described above may be used, and also known Evans and Kau & ian. It may be newly established according to the method.
  • mouse ES cells currently 129 ES cells are generally used, but the immunological background is unclear, so an alternative purely immunologically genetic
  • C57BL / 6 mice and B57 mice C57BL / 6 and DBA / 2 in which the number of eggs collected from C57BL / 6 was improved by crossing with DBA / 2.
  • F those established using F
  • BDF mice have the advantage of having a large number of eggs and strong eggs.
  • the ES cells obtained using this mouse are backcrossed with the C57BL / 6 mouse when the pathological model mouse is created. It can be advantageously used in that it can be replaced.
  • blastocysts are generally used on day 3.5 after fertilization, but in addition to this, many blastocysts can be efficiently obtained by collecting 8-cell embryos and culturing them to blastocysts. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are usually more convenient for producing germline melanoma.
  • One example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex determination region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • Initial selection of ES cells in the early stage can be performed by male / female discrimination, and male cells can be selected at an early stage.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this manner is usually very proliferative, but it tends to lose its ontogenic ability, so it needs to be subcultured carefully.
  • a suitable feeder cell such as ST 0 fibroblasts in the presence of LIF (l-10000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin Z0.1-5 mM EDTA, preferably about 5% carbon dioxide gas, 90% air.
  • 0.1% trypsin (ZlmM EDTA) treatment is used to convert the cells into single cells and seed them on newly prepared feeder cells.
  • Such passage is usually carried out every 1-3 days. At this time, cells should be observed, and if morphologically abnormal cells are found, the cultured cells should be discarded.
  • ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by suspension culture until the ability to monolayer culture to a high density or to form a cell clump.
  • MJ Evans and MH Kau & ian Nature 292, 154, 1981
  • GR Martin Proceedings' Ob'National 'Academi ⁇ ⁇ Ob'Science' USA] Natl. Acad. Sci. USA) 78, p. 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal 'Ob' Embryolology ⁇ J. Embryol. Exp.
  • the DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are RAIG2 (or RAIG3) or RAIG2 (or RAIG3) in vitro. Useful in cell biological studies.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly.
  • the non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention for example, introduces the targeting vector prepared as described above into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the present invention in the introduced targeting vector.
  • the DNA sequence of the present invention is knocked out by homologous recombination in which the inactivated DNA sequence is replaced with the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by genetic recombination. I can do it.
  • a drug resistance gene such as a neomycin resistance gene is inserted into the DNA of the present invention
  • a targeting vector containing a thymidine kinase (tk) gene in the vicinity of the DNA of the present invention is constructed and introduced into an embryonic stem cell or egg cell, and a drug corresponding to the inserted drug resistance gene (for example, a neomycin resistance gene is used. G418 etc.) and a method of selecting cells that survive in the presence of ganciclovir.
  • the tk gene when the insertion mutant DNA of the present invention is integrated into the chromosome by homologous recombination, the tk gene is excluded, so that it is resistant to gancyclovir. When integrated by non-homologous recombination, the tk gene is also integrated. Therefore, it becomes sensitive to ganciclovir. If a diphtheria toxin gene or the like is used instead of the tk gene, the randomly inserted cells are killed by the production of the toxin, so that selection with a single drug becomes possible.
  • the final confirmation of the S-knocked-out cells of the DNA of the present invention consists of a Southern hybridization analysis using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe or a DNA sequence on a targeting vector,
  • the analysis can be performed by PCR analysis using the DNA sequence of the region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector as a primer.
  • a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated is cloned by gene homologous recombination, and the cells are cloned at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage. It is injected into a non-human mammal embryo or blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the non-human mammal that is pseudopregnant.
  • the produced animal is a chimera composed of both cells having normal DNA locus of the present invention and cells having artificially mutated DNA locus of the present invention. Is an animal.
  • all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It is obtained by selecting an individual composed of added cells having the DNA locus of the present invention, for example, by determining the coat color. Since the individuals thus obtained are usually individuals with heterogeneous expression, the individuals with heterogeneous expression can be mated with each other, and their litter capacity can also be obtained with individuals with deficient homoexpression of the protein of the present invention. it can.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by microinjection. It is obtained by selecting a gene having a mutation at the DNA locus of the present invention from a transgenic non-human mammal by gene homologous recombination.
  • the individual having the DNA strength of the present invention can be subcultured in a normal rearing environment by confirming that the animal individual obtained by mating is also the DNA strength of the individual. .
  • germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, by mating male and female animals possessing the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animals can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are one normal individual and multiple homozygous animals. By breeding male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
  • the non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is very useful in producing the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by RAIG2 (or RAIG3), it is caused by the inactivity of the biological activity of RAIG2 (or RAIG3). Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatments.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening a compound having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by the deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention results from administration of a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, and observing and measuring changes in the animal, resulting from a deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • a method of screening a compound or a salt thereof having a therapeutic or preventive effect against a disease to be treated is provided.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound. Specifically, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is treated with a test compound and compared with an untreated control animal, and changes in each organ, thread and tissue, disease symptoms, etc. of the animal are used as indicators. The therapeutic / preventive effect of the test compound can be tested.
  • test compound for example, oral administration and intravenous injection are used, and can be appropriately selected according to the symptom of the test animal, the nature of the test compound, and the like.
  • the dosage of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the nature of the test compound, and the like.
  • test compound when administered to a test animal, for example, when the blood glucose level of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound Can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases such as impaired glucose tolerance.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by RAIG2 (or RAIG3) deficiency or damage, such as 1) a sugar / lipid metabolism regulator, 2) Modulator of spleen and Z or pituitary gland, 3) Insulin secretion and Z or blood glucose and Z or ACTH secretion regulator, 4) Sugar • It can be used as a therapeutic agent for the prevention of diseases involving lipid metabolism abnormality, spleen and Z or pituitary dysfunction, or insulin secretion and Z or blood glucose level and Z or ACTH secretion abnormality. Further, the compound-induced compound obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid, etc.
  • a salt with a base eg, alkali metal
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • succinic acid tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • the compound or salt thereof obtained by the screening method is used as a medicine, it can be formulated in the same manner as RAIG2 (or RAIG3).
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, mammals (for example, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, cats, dogs, Monkeys, etc.).
  • mammals for example, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, cats, dogs, Monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, for diabetic patients (with a body weight of 60 kg), it is usually daily. About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-2 Omg. When administered parenterally, the single dose may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. For example, in the case of injections, for example, in patients with diabetes (with a body weight of 60 kg) On the other hand, it is convenient to administer usually about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. If the subject is other than a human, the amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a DNA promoter of the present invention, characterized by detecting the expression of a one-ter gene.
  • the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene among the above-mentioned DNA expression-deficient non-human mammals of the present invention.
  • the reporter gene can be expressed under the control of the promoter for DNA of the present invention.
  • test compound examples are the same as described above.
  • reporter gene As the reporter gene, the same ones as described above are used, and / 3 galactosidase gene (lacZ), soluble alkaline phosphatase gene, luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene exists under the control of the promoter for the DNA of the present invention, and therefore the expression of the substance encoded by the reporter gene is suppressed.
  • the activity of the plug motor can be detected by tracing. For example, if a part of the DNA region encoding RAIG2 (or RAIG3) is replaced with the j8-galactosidase gene (lacZ) derived from E. coli, RAIG2 (or RAIG3) ) Instead of
  • a reagent that is a substrate for j8-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-j8-galactopyranoside (X-gal)
  • X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-j8-galactopyranoside
  • the expression state of 2 (or RAIG3) in the animal body can be observed. Specifically, a mouse deficient in RAIG2 (or RAIG3) or a tissue section thereof was fixed with dartal aldehyde, etc., washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal stain solution at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
  • the compound obtained by using the above screening method or a salt thereof is a compound selected from the above test compounds and promotes the promoter activity for the DNA of the present invention. Or a compound that inhibits.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and as a salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid etc.) or base (eg: Salts with organic acids) are used, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid etc.
  • base eg: Salts with organic acids
  • physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, And salts with maleic acid, succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid
  • the compound or its salt that promotes the promoter activity for DNA of the present invention can promote the expression of RAIG 2 (or RAIG3) and promote the function of RAIG2 (or RAIG3).
  • RAIG3 It is useful as a medicine such as a prophylactic-therapeutic drug for diseases related to dysfunction.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity against DNA of the present invention can inhibit the expression of RAIG 2 (or RAIG3) and inhibit the function of RAIG2 (or RAIG3).
  • RAIG2 (or RAIG3 ) Is useful as a medicine such as a prophylactic-therapeutic drug for diseases related to overexpression.
  • Diseases associated with RAIG2 (or RAIG3) dysfunction include, for example, diabetes, impaired glucose tolerance, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, hyperlipidemia, eating Disorders, depression, Cushing disease, sexual dysfunction, skin diseases, arthropathy, osteopenia, arteriosclerosis, thrombotic diseases, dyspepsia, memory learning disorders, etc.
  • diseases associated with excessive expression of RAIG2 (or RAIG3) include, for example, obesity, hyperlipidemia, type 2 diabetes, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retina.
  • the compound-induced compound obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, mammals (for example, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, cats, dogs, Monkeys, etc.).
  • mammals for example, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, cats, dogs, Monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, for diabetic patients (with a body weight of 60 kg), it is usually daily. About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-2 Omg. When administered parenterally, the single dose may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. For example, in the case of injections, for example, in patients with diabetes (with a body weight of 60 kg) On the other hand, it is convenient to administer usually about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. If the subject is other than a human, the amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation or prevention of various diseases caused by deficient DNA expression.
  • DNA containing the promoter region of RAIG2 (or RAIG3) is used to link genes encoding various proteins downstream, and this is injected into animal egg cells. If a (transfected animal) is created, it is possible to synthesize the protein specifically and examine its action in the living body. Furthermore, if an appropriate reporter gene is bound to a portion of the promoter and a cell line that expresses it is established, the ability of RAIG2 (or RAIG3) itself to be produced in vivo is specifically promoted or suppressed. It can be used as a search system for low molecular weight compounds.
  • BOSS a Drosophila homologue of RAIG2
  • RAIG2 Drosophila homologue of RAIG2
  • BOSS a Drosophila homologue of RAIG2
  • the blood glucose level is compared between a mutant mutant lacking the boss gene and a transgene in which the gene is forcibly expressed.
  • the former showed an increase in blood glucose level compared to the wild type, whereas the latter suppressed the increase.
  • BOSS also detects blood glucose levels and regulates insulin signals, like RAIG2 and RAIG3. Therefore, boss gene deletion mutants, boss gene knockout flies, boss gene forced expression transgenic flies in Drosophila, etc. are used in basic research on diseases such as glycolipid metabolism and diabetes in mammals such as humans. It can be a useful tool.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • RNA Ribonucleic acid
  • mRNA Messenger ribonucleic acid
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • Trt Trityl
  • SEQ ID Nos in the sequence listing of the present specification indicate the following sequences.
  • the amino acid sequence of human RAIG2 is shown.
  • RAIG2 and RAIG3 cDNAs were obtained from a human brain or liver cDNA library by PCR according to a conventional method. This was inserted into PIRES2-EGFP (CLON TECH). After 24 hours, the cells were transfected with an expression vector containing RAIG2 or RAIG3 cDNA. The transformation was performed using Lipofectamin 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's manual. After further incubation for 48 hours, KRBB solution containing 2.8 mM dalcose [129 mM NaCl, 4.8 mM KC1, 1.2 mM MgSO, 1.2 mM KH PO
  • Mouse pituitary tumor AtT-20 / D16V-F2 cells (purchased from ATCC) secrete ACT H in response to CRF. This is suppressed by the force high glucose (20 mM) that occurs in low glucose (2.8 mM) solutions.
  • the cells were cultured under air at 37 ° C. One hour later, RAIG2 or RAIG3 siRNA was transfected. Three types of siRNA for AIGION-designed mice RAIG2 and RAIG3 were purchased and used. Transfusion is HiPerFect Transfection Reagent (QI AGEN) and used according to the manufacturer's manual. After each treatment, the cells were cultured for 48 hours and then washed with a KRBB solution containing 2.8 mM glucose at 37 ° C for 15 minutes. After doing this twice, prepare KRBB solution containing glucose at each concentration and purchase 10 nM CRF (Purchased from Peptide Institute. Make 100 M solution with 0.1 M acetic acid and dilute 10 times with water.
  • a regulator of sugar 'lipid metabolism, spleen and Z or pituitary function a regulator of insulin secretion and Z or blood glucose and Z or ACTH secretion, a sugar' lipid abnormality and a spleen Providing tools for screening 'preventive and therapeutic agents for diseases involving Z or abnormal pituitary dysfunction, diagnostic agents, and effective drug or animal drug candidates for treatment of these diseases' Is done.

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Abstract

　本発明は、RAIG2またはRAIG3、およびグルコースまたは1,5-アンヒドログルシトールを用いることを特徴とする、RAIG2またはRAIG3とグルコースまたは1,5-アンヒドログルシトールとの結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、RAIG2もしくはRAIG3アゴニストまたはアンタゴニストを含有してなる、糖・脂質代謝調節剤、膵臓・脳下垂体機能調節剤、インスリン分泌・血糖およびACTH分泌調節剤、並びに該調節異常が関与する疾患の予防・治療剤を提供する。

Description

明 細 書
G蛋白質共役型受容体およびそのリガンドの新規用途
技術分野
[0001] 本発明は、グルコース受容体およびグルコース以外のそのリガンドの同定、並びに それらの用途に関する。より詳細には、本発明は、グルコース受容体またはそのリガ ンドの新規医薬用途、並びに該受容体 (およびそのリガンド)を用いた新規医薬候補 化合物のスクリ一二ング方法等に関する。
背景技術
[0002] 従来、血糖の検知とインスリン分泌は、細胞内に取り込まれたグルコースカ^ン酸ィ匕 を受けて生じたリン酸ダルコースを細胞内で検知することにより行われるとされてきた 。即ち、脾 j8細胞では、 GLUT2によりグルコースが細胞内に取り込まれ、ダルコキナ ーゼにより、グルコース- 6-リン酸 (G6P)になる。 G6Pは、細胞質内（解糖系）やミトコン ドリア内（TCA回路や呼吸鎖)で代謝されて ATPが生成され、 ATP/ADP比が上昇す る。その結果、細胞膜の ATP依存性 K+チャネルが閉口して脱分極が起こり、電位依 存性 Ca2+チャネル (VDC)が開口して、細胞外力も細胞内に Ca2+が取り込まれ、 Ca2+依 存性のインスリン分泌顆粒の放出が引き起こされる。
[0003] しかしながら、そのようなメカニズムでは、 1,5-アンヒドログルシトール (糖尿病患者に ぉ 、て尿中に失われるために血中濃度が顕著に低下し、病態の改善とともに回復す ることから、有用な糖尿病マーカーとして広く用いられている。以下、「1,5-AG」という 場合もある）のように代謝されない糖によるインスリン分泌作用を説明することができ ず、グルコース代謝やエネルギー産生とインスリン分泌作用とは分離させ得ると 、う 事実とも矛盾していた。また、インスリン分泌が脾島内解糖産物の増加以前に起こる という事実とも矛盾があった。このような矛盾を説明する 1つの仮説として、細胞表面 における血糖を検知する受容体の存在が考えられるが、現在までにそのような受容 体は同定されていない。
[0004] 既存の医薬品の約半数が細胞膜上の受容体を介して作用を発現することがわかつ ており、中でも 7回膜貫通型の G蛋白質共役型受容体 (以下、 GPCRともいう）は特に 大きな割合を占めていることから、最も可能性のある創薬ターゲットとして注目されて いる。
配列の相同性に基づ 、て分類されたォーファン GPCRのサブファミリー [G Protein- coupled Receptor, family C, group 5 (GPRC5), members A- D]が報告されている（例 えば、非特許文献 1参照）。これらのうち GPRC5A、 Bおよび Cはレチノイン酸によって 発現が誘導されるので、それぞれ Retinoic Acid-lnducible Gene (RIAG)- 1、 2および 3 とも呼ばれる。各レセプター同士は約 30〜40%の相同性を示し、他のファミリー Cに属 する GPCRメンバーに比べて短 、N末端ドメインを有することで特徴づけられて 、る。 RAIG2は主として中枢神経系で、 RAIG3および GPRC5Dは主として脾臓を含む末梢 組織で、それぞれ発現していることが報告されている (非特許文献 1〜4)。また、 GPR C5Dの発現が抑制された肥満モデルマウスでは摂餌量が増加して血糖値が上昇し たことから、該受容体の発現もしくは活性を増強することによる 2型糖尿病をはじめと する生活習慣病の予防'治療が提案されている (特許文献 1)。
し力しながら、これら受容体の生理的リガンドは依然として不明のままであり、それら の生理学意義は未だ十分に解明されて!、な 、のが現状である。
特許文献 1：国際出願公開第 03Z055507号パンフレット (全文）
非特許文献 1 :ロビンス (M.J. Robbins)ら， 「ブレイン 'リサーチ.モレキユラ一'ブレイン •リサーチ（Brain Res_ Μο1· Brajn Res.)」（蘭国)，第 106卷， pp. 136-144 (2002年） 非特許文献 2 :ブロイナ^——オズボーン（H. Brauner- Osborne)およびクローグスガー ドーラーゼン (P. Krogsgaard-Larsen),「ジエノミクス（Genomics)」（米国)，第 65卷， pp. 121-128 (2000年）
非特許文献 3 :ロビンス (M.J. Robbins)ら，「ジエノミクス（Genomics)」（米国)，第 67卷， pp. 8-18 (2000年）
非特許文献 4 :ブロイナ^——オズボーン . Brauner- Osborne)ら，「ビォキミ力 'ェ'ビ オフイジ力 'ァクタ（Biochim. Biophys. Acta)」（蘭国)，第 1518卷， pp. 237-248 (2001 年）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0005] 本発明の目的は、細胞表面の糖受容体を同定し、血中糖濃度の検出機構の存在 を明らかにするとともに、該受容体とそのリガンドとを用いて、該受容体のァゴニストお よび/またはアンタゴニスト、即ち、糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧、高脂血症など の予防'治療薬として有効な医薬品候補ィ匕合物のスクリーニング系を提供することで ある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、従来ォーファン 受容体とされて 、た 2種類の GPCR、 RAIG2および RAIG3を細胞表面グルコース受容 体として同定した。これらの受容体は、通常の血糖値に相当するグルコース濃度付 近でインスリン分泌細胞力ゝらのインスリン分泌を引き起こした。また、本発明者らは、 本受容体が、従来より糖尿病マーカーとして知られている 1,5-AGとも反応して、イン スリン分泌を誘導することを見出した。さらに、これらの受容体は、グルコース濃度に 依存して脳下垂体における副腎皮質刺激ホルモン（以下、「ACTH」とも 、う）の分泌 を調節することも明らかにした。
また、本発明者らは、ショウジヨウバエにおける RAIG2ホモログ（bride of sevenless (b oss))が脾臓や脳下垂体に相当する臓器で発現していることに着目し、 boss遺伝子の 欠損突然変異体と該遺伝子を強制発現させたトランスジ ニックとで、その血糖値を 比較した結果、前者では野生型と比較して血糖値の上昇が認められたのに対し、後 者ではこの上昇が抑制されることを見出した。このことから、 BOSSも RAIG2や RAIG3と 同様に血糖濃度を検知し、インスリンシグナルを調節して 、ることが示唆された。 本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成 するに至った。
[0007] すなわち、本発明は、
[ 1] RAIG2もしくはその部分ペプチドおよび Zまたは RAIG3もしくはその部分ペプチド を含有してなる医薬または動物薬、
[2]糖'脂質代謝調節剤である、上記 [1]記載の医薬または動物薬、
[3]脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、上記 [1]記載の医薬または動 物薬、 [4]インスリン分泌促進および Zもしくは血糖低下並びに Zまたは副腎皮質刺激ホ ルモン分泌調節剤である、上記 [1]記載の医薬または動物薬、
[5]糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性 腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮 膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障 害力もなる群より選択される疾患の予防 ·治療剤である、上記 [1]記載の医薬または 動物薬、
[6]RAIG2もしくはその部分ペプチドをコードする核酸および Zまたは RAIG3もしくは その部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる医薬または動物薬、
[7]糖 ·脂質代謝調節剤である、上記 [6]記載の医薬または動物薬、
[8]脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、上記 [6]記載の医薬または動 物薬、
[9]インスリン分泌促進および Zもしくは血糖低下並びに Zまたは副腎皮質刺激ホ ルモン分泌調節剤である、上記 [6]記載の医薬または動物薬、
[10]糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、 皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習 障害力 なる群より選択される疾患の予防 ·治療剤である、上記 [6]記載の医薬また は動物薬、
[11]RAIG2をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸および Zまたは RAIG 3をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる診断剤、
[12]糖'脂質代謝異常の診断用である、上記 [11]記載の剤、
[13]脾臓および Zまたは脳下垂体機能異常の診断用である、上記 [11]記載の剤、 [14]インスリン分泌および Zもしくは血糖異常、並びに Zまたは副腎皮質刺激ホル モン分泌異常の診断用である、上記 [11]記載の剤、
[15]糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、 皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、 肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮 、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、脂肪毒性および癌力 なる群より選択される 疾患の診断用である、上記 [11]記載の剤、
[ 16] RAIG2に対する抗体および Zまたは RAIG3に対する抗体を含有してなる診断 剤、
[17]糖'脂質代謝異常の診断用である、上記 [16]記載の剤、
[18]脾臓および Zまたは脳下垂体機能異常の診断用である、上記 [16]記載の剤、 [19]インスリン分泌および Zもしくは血糖異常、並びに Zまたは副腎皮質刺激ホル モン分泌異常の診断用である、上記 [16]記載の剤、
[20]糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、 皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、 肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮 、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、脂肪毒性および癌力 なる群より選択される 疾患の診断用である、上記 [16]記載の剤、
[21]RAIG2に対する中和抗体および Zまたは RAIG3に対する中和抗体を含有して なる医薬または動物薬、
[22]糖'脂質代謝調節剤である、上記 [21]記載の医薬または動物薬、
[23]脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、上記 [21]記載の医薬または 動物薬、
[24]インスリン分泌抑制および Zもしくは血糖上昇並びに Zまたは副腎皮質刺激ホ ルモン分泌調節剤である、上記 [21 ]記載の医薬または動物薬、
[25]肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎 縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、 血栓性疾患、脂肪毒性および癌力 なる群より選択される疾患の予防，治療剤である 、上記 [21]記載の医薬または動物薬、
[26] RAIG2をコードする塩基配列の相補鎖配列もしくはその一部を含む核酸および Zまたは RAIG3をコードする塩基配列の相補鎖配列もしくはその一部を含む核酸を 含有してなる医薬または動物薬、
[27]糖'脂質代謝調節剤である、上記 [26]記載の医薬または動物薬、
[28]脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、上記 [26]記載の医薬または 動物薬、
[29]インスリン分泌抑制および Zもしくは血糖上昇並びに Zまたは副腎皮質刺激ホ ルモン分泌調節剤である、上記 [26]記載の医薬または動物薬、
[30]肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎 縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、 血栓性疾患、脂肪毒性および癌力 なる群より選択される疾患の予防，治療剤である 、上記 [26]記載の医薬または動物薬、
[31] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを用い ることを特徴とする、糖'脂質代謝調節物質のスクリーニング方法、
[32] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを用い ることを特徴とする、脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節物質のスクリーニング方 法、
[33] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを用い ることを特徴とする、インスリン分泌および Zもしくは血糖並びに Zまたは副腎皮質刺 激ホルモン分泌の調節物質のスクリ一ユング方法、
[34] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを用い ることを特徴とする、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経 障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、 性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記 憶学習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿 病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、脂肪毒性および癌力 なる群よ り選択される疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法、
[35] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチド力 そ れを産生する真核細胞の形態で提供されることを特徴とする、上記 [31]〜 [34]のい ずれかに記載の方法、
[36] RAIG2をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸または RAIG3をコード する塩基配列もしくはその一部を含む核酸、あるいは RAIG2に対する抗体もしくは RA IG3に対する抗体をさらに用いることを特徴とする、上記 [35]記載の方法、
[37]インスリンもしくは副腎皮質刺激ホルモンの分泌を指標とすることを特徴とする、 上記 [35]記載の方法、
[38]細胞内の Ca2+濃度もしくは cAMP生成を指標とすることを特徴とする、上記 [35] 記載の方法、
[39]レポーターもしくは選択マーカー遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、 上記 [35]記載の方法、
[40] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチド、およ びグルコースまたは 1,5-アンヒドログルシトールを用いることを特徴とする、 RAIG2また は RAIG3とグルコースまたは 1,5-アンヒドログルシトールとの結合性を変化させる物質 のスクリーニング方法、
[41] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチド力 そ れを産生する細胞の形態で提供されることを特徴とする、上記 [40]記載の方法、 [42]インスリンもしくは副腎皮質刺激ホルモンの分泌を指標とすることを特徴とする、 上記 [41]記載の方法、
[43]細胞内の Ca2+濃度もしくは cAMP生成を指標とすることを特徴とする、上記 [41] 記載の方法、
[44]レポーターもしくは選択マーカー遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、 上記 [41]記載の方法、
[45] RAIG2もしくは RAIG3の発現または活性を増強する物質を含有してなる医薬ま たは動物薬、
[46] RAIG2もしくは RAIG3の発現または活性を増強する物質が RAIG2もしくは RAIG3 のァゴニストである、上記 [45]記載の医薬または動物薬、
[47]糖'脂質代謝調節剤である、上記 [45]または [46]記載の医薬または動物薬、 [48]脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、上記 [45]または [46]記載 の医薬または動物薬、
[49]インスリン分泌促進および Zもしくは血糖低下並びに Zまたは副腎皮質刺激ホ ルモン分泌調節剤である、上記 [45]または [46]記載の医薬または動物薬、
[50]糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、 皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習 障害力 なる群より選択される疾患の予防 ·治療剤である、上記 [45]または [46]記 載の医薬または動物薬、
[51 ] RAIG2もしくは RAIG3の発現または活性を阻害する物質を含有してなる医薬ま たは動物薬、
[52] RAIG2もしくは RAIG3の発現または活性を阻害する物質が RAIG2もしくは RAIG3 のアンタゴ-ストである、上記 [51]記載の医薬または動物薬、
[53]糖'脂質代謝調節剤である、上記 [51]または [52]記載の医薬または動物薬、 [54]脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、上記 [51]または [52]記載 の医薬または動物薬、
[55]インスリン分泌抑制および Zもしくは血糖上昇並びに Zまたは副腎皮質刺激ホ ルモン分泌調節剤である、上記 [51]または [52]記載の医薬または動物薬、
[56]肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎 縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、 血栓性疾患、脂肪毒性および癌力 なる群より選択される疾患の予防，治療剤である 、上記 [51]または [52]記載の医薬または動物薬、
[57]哺乳動物における RAIG2および/もしくは RAIG3の発現または活性を調節するこ とを含む、該動物における糖'脂質代謝、麵能、脳下垂体機能、インスリン分泌、 血糖並びに副腎皮質刺激ホルモン分泌からなる群より選択されるいずれかの調節方 法、
[58] RAIG2の発現もしくは活性を増強する物質および/または RAIG3の発現もしくは 活性を増強する物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物にお ける糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性 腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮 膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障 害からなる群より選択される疾患の予防'治療方法、および
[59] RAIG2の発現もしくは活性を阻害する物質および/または RAIG3の発現もしくは 活性を阻害する物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物にお ける肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎 縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、 血栓性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防，治療方法、 などを提供する。
発明の効果
[0008] RAIG2および RAIG3はグルコースおよび 1,5-AGの受容体として機能し、血糖濃度 を検知して脾臓におけるインスリン分泌や脳下垂体における ACTH分泌を調節して いるので、 RAIG2もしくは RAIG3 (あるいはさらにグルコース）を用いることにより、糖' 脂質代謝および脾臓'脳下垂体機能の調節 (例えば、インスリン分泌や血糖 · ACTH 分泌の調節など)、並びに糖'脂質代謝や脾臓'脳下垂体機能の異常が関与する疾 患 (例えば、糖尿病や肥満など)の予防'治療に有効な医薬もしくは動物薬候補ィ匕合 物をスクリーニングすることができる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]RAIG3を過剰発現させたマウスインスリノーマ MIN6細胞における各種ダルコ一 ス濃度条件下でのインスリン分泌を示す図である。図中、 **は p〈0.01、 ***は p〈0.001 をそれぞれ示す。
[図 2]RAIG2 (a)および RAIG3 (b)を過剰発現させたマウスインスリノーマ MIN6細胞に おけるグルコース（2.8 mMおよび 20 mM)および 2.8 mMグノレコース + 0.6 mM 1,5- A G条件下でのインスリン分泌を示す図である。図中、 *は p〈0.05、 **は p〈0.01、 ***は p 〈0.001をそれぞれ示す。 [図 3]RAIG2 (または RAIG3)に対する siRNAを導入したマウス脳下垂体腫 AtT_20/Dl 6v- F2細胞における、低グルコース（2.8 mM)および高グルコース（20 mM)濃度条件 下での、 CRF刺激による ACTH分泌を示す図である。図中、 *は p〈0.05、 ***は p〈0.00 1をそれぞれ示す。
[図 4]野生型、 boss欠損突然変異体、および bossを強制発現させたトランスジエニック (HRP- Boss)のショウジヨウバエの Hemolympho中グルコースおよびトレハロス濃度を 示す図である。図中、白ヌキバーはグルコース、ハッチ入りバーはグルコース +トレハ ロス、黒塗りバーはトレハロスをそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられる RAIG2および RAIG3蛋白質は、それぞれ配列番号： 2および配 列番号: 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む 蛋白質である。
RAIG2および RAIG3は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッ ジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞 [例えば、肝細胞、 脾細胞、神経細胞、グリア細胞、脾 j8細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルノ、 ンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線 維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例：マクロファージ、 T細胞、 B細胞、ナチユラ ルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、 軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら 細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など]、あるいはそれらの細胞が存在するあ らゆる組織もしくは臓器 [例えば、脳、脳の各部位 (例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、 海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、脾臓、腎臓、肝 臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管 (例:大腸、小腸)、血管、 心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、 脂肪組織 (例:褐色脂肪組織、白色脂肪組織)、骨格筋など]等力も単離 '精製される 蛋白質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成され た蛋白質であってもよ!/、し、ある!、は上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有す る核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。 配列番号： 2 (または配列番号： 4)で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列としては、配列番号： 2 (または配列番号： 4)で表されるアミノ酸配列と約 60% 以上、好ましくは約 70%以上、さらに好ましくは約 80%以上、特に好ましくは約 90% 以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技 術分野にお 、て公知の数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさ せた場合の、最適なアラインメント (好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメント のために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）にお ける、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残 基の割合 (％)を意味する。「類似アミノ酸」とは物理ィ匕学的性質にぉ 、て類似したァ ミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸 (Phe、 Trp、 Tyr)、脂肪族アミノ酸 (Ala、 Leu、 Ile、 Val)、極性アミノ酸 (Gln、 Asn)、塩基性アミノ酸 (Lys、 Arg、 His)、酸性アミノ酸 (Gl u、 Asp)、水酸基を有するアミノ酸（Ser、 Thr)、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met)などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミ ノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない (即ち、保存的アミノ酸置換 である)ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であ り、種々の文献に記載されている（例えば、 Bowieら， Science, 247 : 1306-1310 (1990) を参照)。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotecnnology Information Basic Local Alignment search οοΐ) を用い、以下の条件（期待値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62；フィルタリ ング =OFF)にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他の アルゴリズムとしては、例えば、 Karlinら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 ersion 2.0)に組み込まれている（Altschulら， Nucleic Acids Res., 25 : 3389-3402 (19 97)) ]、 Needlemanら， J. Mol. Biol, 48 : 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム [該ァ ルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の GAPプログラムに組み込まれて!/、る]、 Myersおよび Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズム は CGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である ALIGNプログラム（versi on 2.0)に組み込まれている]、 Pearsonら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-244 8 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の FA STAプログラムに組み込まれている]等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ 得る。
より好ましくは、配列番号： 2 (または配列番号： 4)で表されるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列とは、配列番号： 2 (または配列番号: 4)で表されるアミノ酸配 列と約 60%以上、好ましくは約 70%以上、さらに好ましくは約 80%以上、特に好ましく は約 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
[0012] 配列番号： 2 (または配列番号: 4)で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号： 2 (または配列番号: 4 )で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号： 2 (または 配列番号: 4)で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質などが好ましい。
[0013] 実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド (即ち、グルコースや 1,5- AG)結合 活性およびインスリンや ACTH等のホルモン分泌調節活性などが挙げられる。「実質 的に同質」とは、それらの活性が定性的 (例えば、生理学的または薬理学的）に同じ であることを示す。したがって、リガンド結合活性やホルモン分泌調節活性などの活 性は同等 (例えば、約 0.5〜約 2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度ゃ蛋 白質の分子量などの量的要素は異なって 、てもよ 、。
リガンド結合活性やホルモン分泌調節活性の測定は、自体公知の方法に準じて行 なうことができる力 例えば、後述するァゴニスト、アンタゴニストのスクリーニング方法 において用いられる方法等に従って行うことができる。
[0014] また、本発明の RAIG2 (または RAIG3)には、例えば、（1)配列番号： 2 (または配列番 号: 4)で表されるアミノ酸配列のうち 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜100個程度、好 ましくは 1〜50個程度、さらに好ましくは 1〜10個程度、特に好ましくは 1〜数 (2、 3、 4 もしくは 5)個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（2)配列番号： 2 (または配列番号： 4 )で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜100個程度、好ましくは 1 〜50個程度、さらに好ましくは 1〜10個程度、特に好ましくは 1〜数 (2、 3、 4もしくは 5) 個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（3)配列番号： 2 (または配列番号： 4)で表され るアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜50個程度、好ましくは 1〜10個程度 、さらに好ましくは 1〜数 (2、 3、 4もしくは 5)個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ 4)配列番号： 2 (または配列番号: 4)で表されるアミノ酸配列のうち 1または 2個以上（ 好ましくは、 1〜50個程度、好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは 1〜数 (2、 3、 4も しくは 5)個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または (5)それらを組 み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠 失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
[0015] 本発明の RAIG2は、好ましくは、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するヒト RA IG2蛋白質（GenBankァクセッション番号： NP_057319)、あるいは他の哺乳動物にお けるそのホモログ [例えば、 GenBankにそれぞれァクセッション番号 NP_071865、 XP_2 15095および BAE89480として登録されて!、るマウス、ラットおよび力-クイザルホモ口 グ（それぞれヒト RAIG2に対して約 85%、約 85%および 99.8%の同一性を有する）等] である。
本発明の RAIG3は、好ましくは、配列番号: 4で表されるアミノ酸配列を有するヒト RA IG3蛋白質（GenBankァクセッション番号： NP_061123)、ある!/、は他の哺乳動物にお けるそのホモログ [例えば、 GenBankにそれぞれァクセッション番号 NP_671750、 XP_2 13518および BAE89439として登録されているマウス、ラットおよび力-クイザルホモ口 グ（それぞれヒト RAIG2に対して約 89%、約 90%および約 95%の同一性を有する）等] である。
[0016] 本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端 が N末端 (ァミノ末端)、右端が C末端 (カルボキシル末端)で記載される。配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明の RAIG2 (または RAIG3)は、 C末端がカルボキシル基（- COOH)、カルボキシレート (- COO— )、アミド（- CONH )またはエステル（- COOR)の何れであってもよ!/ヽ。
2
ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n-プロピル、イソプロピ ル、 n-ブチルなどの C アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロへキシルなどの C シクロアルキル基；例えば、フエ-ル、 α -ナフチルなどの C ァリール基；例えば
3-8 6-12
、ベンジル、フエネチルなどのフエ-ルー C アルキル基； a—ナフチルメチルなどの
1-2
a -ナフチルー C アルキル基などの C ァラルキル基；ビバロイルォキシメチル基な
1-2 7-14
どが用いられる。
本発明の RAIG2 (または RAIG3)が C末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシ レート）を有して 、る場合、カルボキシル基がアミドィ匕またはエステルイ匕されて 、るも のも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末 端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の RAIG2 (または RAIG3)には、 N末端のアミノ酸残基のァミノ基が保 護基 (例えば、ホルミル基、ァセチル基などの C アルカノィルなどの C ァシル基な
1-6 1-6
ど)で保護されて ヽるもの、生体内で切断されて生成し得る N末端のグルタミン残基 がピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば- OH、 -S H、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グァニジノ基など）が適当な保護基 (例え ば、ホルミル基、ァセチル基などの C アルカノィル基などの C ァシル基など）で保
1-6 1-6
護されて!、るもの、あるいは糖鎖が結合した 、わゆる糖蛋白質などの複合蛋白質な ども含まれる。
RAIG2 (または RAIG3)の部分ペプチド (以下、単に「本発明の部分ペプチド」と略称 する場合もある）は、上記した RAIG2 (または RAIG3)の部分アミノ酸配列を有するぺ プチドであり、且つ RAIG2 (または RAIG3)と実質的に同質の活性を有する限り、何れ のものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また 、「実質的に同質の活性」の測定は RAIG2 (または RAIG3)の場合と同様に行なうこと ができる。
具体的には、本発明の部分ペプチドとして、例えば、配列番号: 2 (または配列番号 : 4)で表されるアミノ酸配列のうち、リガンドであるグルコースや 1,5-AGとの結合に関 わる領域 (例えばヒト RAIG2の場合、例えば配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中アミ ノ酸番号 28-56、 116-126、 184-196および 255-271で示される細胞外領域など）およ び該リガンドとの相互作用を介したシグナル伝達に関わる領域 (例えば、三量体 G蛋 白質の aサブユニットと結合してその GDP' GTP交換反応を促進する活性を有する領 域 (以下、「G a活性ィ匕ドメイン」とも!/、う）など）を含む部分アミノ酸配列を有するもの などが用いられる。本発明の部分ペプチドは、上記のリガンドとの結合に関与する領 域とシグナル伝達に関与する領域を含む限りそのサイズに特に制限はないが、好ま しくは 100個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、より好ましくは 200個以上の部分アミ ノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ 酸配列であってもよぐあるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたもの であってもよい。
[0018] 一方、 RAIG2 (または RAIG3)の部分アミノ酸配列を含むが RAIG2 (または RAIG3)と 実質的に同質の活性を有しないペプチド、例えば、配列番号： 2 (または配列番号: 4 )で表されるアミノ酸配列のうち、リガンドとの結合に関与する領域を含む力 シグナ ル伝達に関与する領域を含まな 、部分アミノ酸配列を有するものなどは、「本発明の 部分ペプチド」には含まれない。しかしながら、かかるペプチドは、リガンドと結合する こと〖こより RAIG2 (または RAIG3)を介したシグナル伝達作用を遮断することができるの で、該シグナル伝達作用を抑制した 、場合等に有用であり得る。
[0019] また、本発明の部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 (-COOH)、カルボキシレ ート（- COO— )、アミド（- CONH )またはエステル（- COOR)の何れであってもよい。こ
2
こでエステルにおける Rとしては、 RAIG2 (または RAIG3)について前記したと同様のも のが挙げられる。本発明の部分ペプチドが C末端以外にカルボキシル基 (またはカル ボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステルイ匕されて いるものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、 C末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記した RAIG2 (または RAIG3)と同様に、 N 末端のアミノ酸残基のァミノ基が保護基で保護されて 、るもの、 N末端のグルタミン残 基がピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護 基で保護されて ヽるもの、あるいは糖鎖が結合した 、わゆる糖ペプチドなどの複合べ プチドなども含まれる。
[0020] 本発明で用いられる RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドは塩の形態で あってもよい。例えば、生理学的に許容される酸 (例:無機酸、有機酸)や塩基 (例:ァ ルカリ金属塩)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好 ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫 酸）との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン 酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベン ゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
[0021] RAIG2 (または RAIG3)は、前述した哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋 白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織また は細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠 心して細胞膜含有画分を沈澱させ (必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画 分を精製し）、該画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ 二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより RAIG2 (または R AIG3)またはその塩を調製することができる。
[0022] RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチド（以下、これらの化学合成の説明に おいては、特にことわらない限り、これらを包括して単に「RAIG2 (または RAIG3)」とい う）は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。 R AIG2 (または RAIG3)を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合 し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を 製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の (1)〜(5)に記載 された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszkyおよび M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, N ew York (1966年）
(2) Schroederおよび Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年）
(3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株）（1975年）
(4)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白質の化学 IV 205 (1977年）
(5)矢島治明監修、続医薬品の開発、第 14卷、ペプチド合成、広川書店
[0023] このようにして得られた RAIG2 (または RAIG3)は、公知の精製法により精製単離す ることができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトダラ フィ一、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。 上記方法で得られる RAIG2 (または RAIG3)が遊離体である場合には、該遊離体を 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に RAIG2 (または RAIG3)が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるい はそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
[0024] RAIG2 (または RAIG3)の合成には、通常市販の蛋白質合成用榭脂を用いることが できる。そのような榭脂としては、例えば、クロロメチル榭脂、ヒドロキシメチル榭脂、ベ ンズヒドリルアミン榭脂、アミノメチル榭脂、 4-ベンジルォキシベンジルアルコール榭 脂、 4-メチルベンズヒドリルアミン榭脂、 PAM榭脂、 4-ヒドロキシメチルメチルフエ-ル ァセトアミドメチル榭脂、ポリアクリルアミド榭脂、 4- (2，, 4，-ジメトキシフエ-ル-ヒドロキ シメチル)フエノキシ榭脂、 4-(2， ,4，-ジメトキシフェ-ル-Fmocァミノェチル)フェノキシ 榭脂などを挙げることができる。このような榭脂を用い、 α -アミノ基と側鎖官能基を適 当に保護したアミノ酸を、 目的とする RAIG2 (または RAIG3)の配列通りに、 自体公知 の各種縮合方法に従い、榭脂上で縮合させる。反応の最後に榭脂から蛋白質等を 切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結 合形成反応を実施し、 目的の RAIG2 (または RAIG3)またはそのアミド体を取得する。
[0025] 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性ィ匕試 薬を用いることができる力 特に、カルポジイミド類がよい。カルポジイミド類としては、 DCC、 Ν,Ν，-ジイソプロピルカルボジイミド、 Ν-ェチル -Ν， -(3-ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。これらによる活性ィ匕にはラセミ化抑制添加剤（例え ば、 HOBt、 HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加する力、または、対称酸 無水物または HOBtエステルあるいは HOOBtエステルとしてあら力じめ保護アミノ酸 の活性ィ匕を行なった後に樹脂に添加することができる。
[0026] 保護アミノ酸の活性ィ匕ゃ榭脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使 用しうることが知られている溶媒力も適宜選択されうる。例えば、 Ν,Ν-ジメチルホルム アミド、 Ν,Ν-ジメチルァセトアミド、 Ν-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルォロエタノールなどのアルコール 類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類、ジォキサン 、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ァセトニトリル、プロピオ二トリルなどの二トリル 類、酢酸メチル、酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている 範囲から適宜選択され、通常約- 20°C〜50°Cの範囲から適宜選択される。活性化さ れたアミノ酸誘導体は通常 1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ ストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返 すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得ら れな 、ときには、無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァ セチルイ匕することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護 基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、例えば、 Z、 Boc、ターシャリーペンチルォキシカ ルボニル、イソボルニルォキシカルボニル、 4-メトキシベンジルォキシカルボニル、 C1 - Z、 Br-Z、ァダマンチルォキシカルボ-ル、トリフルォロアセチル、フタロイル、ホルミ ル、 2-ニトロフエ-ルスルフエ-ル、ジフエ-ルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いら れる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、ェチル、プロピ ル、ブチル、ターシャリーブチノレ、シクロペンチル、シクロへキシル、シクロへプチノレ、 シクロォクチル、 2-ァダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステ ル化）、ァラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、 4-ニトロべンジルエステ ノレ、 4-メトキシペンジノレエステノレ、 4-クロ口べンジノレエステノレ、べンズヒドリノレエステノレ ィ匕）、フエナシルエステル化、ベンジルォキシカルボ-ルヒドラジド化、ターシャリーブ トキシカルボ-ルヒドラジド化、トリチルヒドラジドィ匕などによって保護することができる。 セリンの水酸基は、例えば、エステルイ匕またはエーテルィ匕によって保護することが できる。このエステルイ匕に適する基としては、例えば、ァセチル基などの低級アルカノ ィル基、ベンゾィル基などのァロイル基、ベンジルォキシカルボ-ル基、エトキシカル ボニル基などの炭酸力 誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する 基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロビラニル基、ターシャリーブチル基など である。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、例えば、 Bzl、 C1 - Bzl、 2--トロべ
2
ンジル、 Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 Tos、 4-メトキシ -2,3,6-トリメチ ルベンゼンスルホ -ル、 DNP、ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Trt、 Fmocなどが用 いられる。
[0028] 保護基の除去 (脱離)方法としては、例えば、 Pd-黒あるいは Pd-炭素などの触媒の 存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸 処理や、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピぺリジン、ピぺラジンなどに よる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸 処理による脱離反応は、一般に約- 20°C〜40°Cの温度で行なわれる力 酸処理にお いては、例えば、ァ-ソール、フエノール、チオア-ノール、メタクレゾール、ノ ラタレ ゾール、ジメチルスルフイド、 1,4-ブタンジチオール、 1,2-エタンジチオールなどのよう なカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として 用いられる 2,4-ジニトロフエ-ル基はチオフヱノール処理により除去され、トリプトファ ンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1,2-エタンジチオール、 1 ,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸ィ匕ナトリウ ム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
[0029] 原料のカルボキシル基の活性ィ匕されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、 アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフエノール、 2,4,5-トリクロロフ ェノール、 2,4-ジ-トロフエノール、シァノメチルアルコール、パラ-トロフエノール、 H ONB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフタルイミド、 HOBt)とのエステル〕などが 用いられる。原料のァミノ基の活性ィ匕されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミ ドが用いられる。
[0030] RAIG2 (または RAIG3)のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキ シ末端アミノ酸の α _カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖の Ν末端の α -アミノ基の保護基のみ を除 、た蛋白質 (ペプチド）と C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白 質 (ペプチド)とを製造し、この両蛋白質 (ペプチド)を上記したような混合溶媒中で縮 合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋 白質 (保護ペプチド)を精製した後、上記方法によりすベての保護基を除去し、所望 の粗蛋白質 (粗ペプチド)を得ることができる。この粗蛋白質 (粗ペプチド）は既知の 各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の RAIG2 (ま たは RAIG3)のアミド体を得ることができる。
RAIG2 (または RAIG3)のエステル体は、例えば、カルボキシ末端アミノ酸の α -カル ボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、上記 RAIG2 (ま たは RAIG3)のアミド体の場合と同様にして得ることができる。
[0031] 本発明の部分ペプチドは、 RAIG2 (または RAIG3)全長蛋白質を適当なぺプチダー ゼで切断すること〖こよっても製造することができる。
[0032] さらに、 RAIG2 (または RAIG3)は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を 培養し、得られる培養物カゝら RAIG2 (または RAIG3)を分離精製することによって製造 することもできる。 RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする核酸は DNAであっても RNAであってもよぐあるいは DNA/RNAキメラであってもよい。好まし くは DNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二 本鎖の場合は、二本鎖 DNA、二本鎖 RNAまたは DNA:RNAのハイブリッドでもよい。一 本鎖の場合は、センス鎖 (即ち、コード鎖)であっても、アンチセンス鎖 (即ち、非コー ド鎖）であってもよい。
RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする DNAとしては、ゲノム D NA、哺乳動物（例えば、ヒト、ゥシ、サル、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ィヌ、ネコ、モルモ ット、ラット、マウス、ゥサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞 [例えば、肝細胞、脾細 胞、神経細胞、グリア細胞、脾 j8細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルノヽンス 細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細 胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例：マクロファージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキ ラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨 細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞 の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など]もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる 組織 [例えば、脳、脳の各部位 (例：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床 下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状 腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管 (例:大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓 、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織 (例:褐色 脂肪組織、白色脂肪組織)、骨格筋など]由来の cDNA、合成 DNAなどが挙げられる 。 RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび cDN Aは、上記した細胞'組織より調製したゲノム DNA画分および全 RNAもしくは mRNA画 分をそれぞれ铸型として用い、 Polymerase Chain Reaction (以下、「PCR法」と略称す る）および Reverse Transcriptase- PCR (以下、「RT- PCR法」と略称する）によって直接 増幅することもできる。あるいは、 RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコ ードするゲノム DNAおよび cDNAは、上記した細胞 ·組織より調製したゲノム DNAおよ び全 RNAもしくは mRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノム DNA ライブラリーおよび cDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダィゼー シヨン法または PCR法などにより、それぞれクローユングすることもできる。ライブラリー に使用するベクターは、ノ クテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいず れであってもよい。
RAIG2 (または RAIG3)をコードする DNAとしては、例えば、配列番号： 1 (または配列 番号： 3)で表される塩基配列を含有する DNA、または配列番号： 1 (または配列番号： 3)で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 塩基配列を含有し、前記した RAIG2 (または RAIG3)と実質的に同質の活性 (例：ダル コースや 1,5-AGへの結合活性、インスリンや ACTHなどのホルモン分泌調節活性な ど）を有する蛋白質をコードする DNAなどが挙げられる。
配列番号： 1 (または配列番号: 3)で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジ ントな条件下でノヽイブリダィズできる DNAとしては、例えば、配列番号： 1 (または配列 番号： 3)で表される塩基配列と約 60%以上、好ましくは約 70%以上、さらに好ましく は約 80%以上、特に好ましくは約 90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (N ational し enter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を 用い、以下の条件（期待値 =10 ;ギャップを許す；フィルタリング =ON ;マッチスコア =1； ミスマッチスコア =-3)にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するため の他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様 に好ましく例示される。
[0034] ノ、イブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モ レキユラ一.クロー-ング（Molecular Cloning)第 2版（J. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、巿販 のライブラリーを使用する場合、ハイブリダィゼーシヨンは、添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。ハイブリダィゼーシヨンは、好ましくは、ストリンジ ェントな条件に従って行なうことができる。
ストリンジェントな条件としては、例えば、 6 X SSC (sodium chloride/sodium citrate) 中 45°Cでのハイブリダィゼーシヨン反応の後、 0.2 X SSC/0.1% SDS中 65°Cでの一 回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ノ、イブリダィゼーシヨン溶液の塩濃度、 ハイブリダゼーシヨン反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、 ハイブリダィゼーシヨン反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更す ることにより、所望のストリンジエンシーに容易に調節することができる。
[0035] RAIG2をコードする DNAは、好ましくは配列番号： 1で表される塩基配列で示される ヒト RAIG2蛋白質をコードする塩基配列を含有する DNA (GenBankァクセッション番号 ： NM_016235)、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ [例えば、 GenBankにそ れぞれァクセッション番号 NM_022420、 XM_215095および AB172418として登録されて いるマウス、ラットおよび力-クイザルホモログ（それぞれヒト RAIG2 cDNAに対して約 8 5%、約 85%および約 98%の同一性を有する）等]である。
RAIG3をコードする DNAは、好ましくは配列番号： 3で表される塩基配列で示される ヒト RAIG3蛋白質をコードする塩基配列を含有する DNA[GenBankァクセッション番号 ： NM_018653]、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、 GenBankにそ れぞれァクセッション番号 NM_147217、 XM_213518および AB172377として登録されて いるマウス、ラットおよび力-クイザルホモログ（それぞれヒト RAIG3 cDNAに対して約 8 7%、約 86%および約 88%の同一性を有する）等）である。
[0036] 本発明の部分ペプチドをコードする DNAは、配列番号： 2 (または配列番号： 4)で表 されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するぺプ チドをコードする塩基配列を含むものであれば 、かなるものであってもよ 、。具体的 には、本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、例えば、（1)配列番号： 1 (ま たは配列番号： 3)で表される塩基配列の部分塩基配列を有する DNA、または（2)配 列番号： 1 (または配列番号： 3)で表される塩基配列を有する DNAとストリンジェントな 条件下でノ、イブリダィズする塩基配列を有し、前記した RAIG2 (または RAIG3)と実質 的に同質の活性（例：グルコースや 1,5-AGとの結合活性、インスリンや ACTHなどの ホルモン分泌調節活性など）を有するペプチドをコードする DNAなどが用いられる。
[0037] RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする DNAは、該 RAIG2 (また は RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成 DN Aプライマーを用いて PCR法によって増幅する力、または適当な発現ベクターに組み 込んだ DNAを、 RAIG2 (または RAIG3)蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片もしくは合成 DNAを標識したものとハイブリダィゼーシヨンすることによってクロ 一-ングすることができる。ハイブリダィゼーシヨンは、例えば、モレキユラ一'クロー- ング (Molecular Cloning)第 2版 (前述）に記載の方法などに従って行なうことができる 。また、市販のライブラリーを使用する場合、ノ、イブリダィゼーシヨンは、該ライブラリ 一に添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
[0038] DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、 Mutan™-super Express Km (宝酒造（ 株））、 Mutan™- K (宝酒造 (株））等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 K unkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することがで きる。
[0039] クローンィ匕された DNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化す る力、リンカ一を付加した後に、使用することができる。該 DNAはその 5'末端側に翻 訳開始コドンとしての ATGを有し、また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 T GAまたは TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適 当な合成 DNAアダプターを用いて付加することができる。
RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現べクタ 一は、例えば、 RAIG2 (または RAIG3)をコードする DNAから目的とする DNA断片を切 り出し、該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することに より製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例： pBR322、 pBR325、 pUC12、 pU C13)；枯草菌由来のプラスミド (例: pUB110、 pTP5、 pC194)；酵母由来プラスミド (例： pSH19、 pSH15)；昆虫細胞発現プラスミド（例： pFast-Bac)；動物細胞発現プラスミド（ 例： pAl- 11、 pXTl、 pRc/CMV、 pRc/RSV、 pcDNAI/Neo)； λファージなどのバタテリ オファージ；バキュロウイノレスなどの昆虫ウイノレスベタター（例： BmNPV、 AcNPV)；レト ロウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウイルスなどの動物ウィルスベクターなどが用 いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター であれば!/、かなるものでもよ！/、。
例えば、宿主が動物細胞である場合、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 LTR プロモーター、 CMV (サイトメガロウィルス）プロモーター、 RSV (ラウス肉腫ウィルス）プ 口モーター、 MoMuLV (モロ-一マウス白血病ウィルス） LTRゝ HSV- TK (単純へルぺ スウィルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、 CMVプロモ 一ター、 SR aプロモーターなどが好ましい。
宿主がェシエリヒア属菌である場合、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモ 一ター、 λ Ρプロモーター、 lppプロモーター、 T7プロモーターなどが好ましい。
L
宿主がバチルス属菌である場合、 SP01プロモーター、 SP02プロモーター、 penPプ 口モーターなどが好まし 、。 宿主が酵母である場合、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモータ 一、 ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモーターなどが好 ましい。
[0041] 発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりェンノヽンサ一、スプライシングシグ ナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 SV40複製起点（以下、 SV40 oriと略称す る場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、 例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、 dhfrと略称する場合がある、メソトレキセ ート (MTX)耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、 amp1"と略称する場合がある）、ネ ォマイシン耐性遺伝子（以下、 neofと略称する場合がある、 G418耐性)等が挙げられ る。特に、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、 dhfr遺伝子を選択マ 一力一として使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択する ことちでさる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナル コドン）を、 RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする DNAの 5 '末端 側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換)してもよい。例えば、宿主がェシ エリヒア属菌である場合、 PhoA'シグナル配列、 OmpA'シグナル配列など力 宿主が バチルス属菌である場合、 a -アミラーゼ ·シグナル配列、サブチリシン ·シグナル配 列などが；宿主が酵母である場合、 MF o; ·シグナル配列、 SUC2 'シグナル配列など 力 宿主が動物細胞である場合、インスリン'シグナル配列、 α -インターフェロン'シ グナル配列、抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
[0042] 上記した RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発 現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、 RAIG
2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを製造することができる。
宿主としては、例えば、エシ リヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、例えば、ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) K12 ' DHl〔プ ロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ 一エスエー（proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60卷， 160 (1968)〕、ェシエリヒア'コリ JM10
3〔ヌクレイック 'ァシッズ'リサーチ（Nucleic Acids Research) , 9卷， 309 (1981)〕、ェシ エリヒア.コリ JA221〔ジャーナノレ'ォブ'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー（Journal of Molecul ar Biology) , 120卷， 517 (1978)〕、ェシエリヒア'コリ HB101〔ジャーナル'ォブ 'モレキ ユラ一'バイオロジー， 41卷， 459 (1969)〕、ェシエリヒア'コリ C600〔ジェネティックス（Ge netics) , 39卷， 440 (1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス 'サブチルス（Bacillus subtilis) MI114〔ジ ーン（Gene), 24卷， 255 (1983)〕、バチルス 'サブチルス 207- 21〔ジャーナル'ォブ 'バ ィォケミストリー（Journal of Biochemistry) , 95卷， 87 (1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) A H22、 AH22R―、 NA87- 11A、 DKD- 5D、 20B- 12、シゾサッカロマイセス'ボンべ（Schizo saccharomyces pombe) NCYC1913、 NCYC2036、ピキア'パストリス（Pichia pastoris) K M71などが用いられる。
[0043] 昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが AcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細 胞（Spodoptera frugiperda cell;Slla胞）、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、 Tri choplusia niの卵由来の High Five 細胞、 Mamestra brassicae由来の糸田胞、 Estigmen a acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルス力 ¾mNPVの場合、昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞（Bombyx mori N細胞； BmN細胞）などが用いられる。該 Slf田胞とし ては、例えば、 S19細胞（ATCC CRL1711)、 S121細胞（以上、 Vaughn, J丄.ら、イン 'ヴ イボ（In Vivo) , 13, 213-217,(1977))などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチヤー（Nature ) , 315卷， 592 (1985)〕。
[0044] 動物細胞としては、例えば、サル COS-7細胞、サル Vero細胞、チャイニーズハムス ター卵巣細胞（以下、 CHO細胞と略記）、 dhfr遺伝子欠損 CHO細胞（以下、 CHO(dhf ι 細胞と略記）、マウス L細胞、マウス AtT- 20細胞、マウスミエローマ細胞、ラット GH3 細胞、ヒト FL細胞などが用いられる。
[0045] 形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
ェシエリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ 'ォブ ·ザ'ナショナル'ァカデミ一'ォ ブ.サイェンシィズ.ォブ.ザ.ユーエスエー（proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69卷， 211 0 (1972)やジーン (Gene) , 17卷， 107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換す ることがでさる。 バチルス属菌は、例えば、モレキュラ^ ~ ·アンド'ジェネラル 'ジェネティックス（Molec ular & General Genetics) , 168卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って形質転換 することができる。
酵母は、例えば、メソッズ'イン'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology) , 194卷 , 182-187 (1991)、プロシージングズ ·ォブ ·ザ'ナショナル 'ァ力デミ一 ·ォブ 'サイェ ンシィズ 'ォブ 'ザ 'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75卷， 1929 (1978)な どに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ Zテクノロジー（Bio/Technology) ,6卷， 47- 55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール， 263-267 (1 995) (秀潤社発行）、ヴイロロジー（Virology) , 52卷， 456 (1973)に記載の方法に従つ て形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することがで きる。
例えば、宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する 場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換 体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、 炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素 源としては、例えば、アンモ-ゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ'リカー、ペプトン 、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機 物としては、例えば、塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど がそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など を添カ卩してもよい。培地の pHは、好ましくは約 5〜約 8である。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば
、グルコース、カザミノ酸を含む M9培地〔ミラー（Miller) ,ジャーナル'ォブ'ェクスペリ メンッ 'イン'モレキュラー 'ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Gene tics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]が好ましい。必要に より、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、 3 |8 -インドリルアクリル酸のよ うな薬剤を培地に添加してもよ ヽ。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約 15〜約 43°Cで、約 3〜 約 24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約 30〜約 40°Cで、約 6〜約 24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホ 一ルダー (Burkholder)最小培地〔Bostian, K丄.ら，プロシージングズ 'ォブ 'ザ'ナショ ナル 'アカデミ^ ~·ォブ'サイェンシィズ'ォブ'ザ 'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc i. USA) , 77卷， 4505 (1980)〕や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地 [Bitter, G.A.ら， プロシージングズ .ォブ .ザ .ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ユーエスエー（proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81卷， 5330 (1984)〕などが挙げられる。 培地の pHは、好ましくは約 5〜約 8である。培養は、通常約 20°C〜約 35°Cで、約 24〜 約 72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例 えば Grace's Insect Medium [Grace, T.C.C.,ネイチヤー（Nature) , 195卷， 788 (1962 )]に非働化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜カ卩えたものなどが用いられる。培地 の pHは、好ましくは約 6.2〜約 6.4である。培養は、通常約 27°Cで、約 3〜約 5日間行 なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約 5〜 約 20%の胎児ゥシ血清を含む最小必須培地（MEM)〔サイエンス（Science) , 122卷， 5 01 (1952)〕、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM)〔ヴイロロジー（Virology) , 8卷， 39 6 (1959)〕、 RPMI 1640培地〔ジャーナル'ォブ 'ザ'アメリカン'メディカル'ァソシエー シヨン（The Journal of the American Medical Association) , 199卷, 519 (1967)〕、 199 培地〔プロシージング ·ォブ ·ザ ·ソサイエティ 'フォ一'ザ'バイオロジカル ·メディスン（ Proceeding of the Society for the Biological Medicine; , 73卷， 1 (1950)〕など;^ >用 ヽ られる。培地の pHは、好ましくは約 6〜約 8である。培養は、通常約 30°C〜約 40°Cで、 約 15〜約 60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に RAIG2 (または RAIG3)また はその部分ペプチドを製造せしめることができる。
[0047] 前記形質転換体を培養して得られる培養物から RAIG2 (または RAIG3)またはその 部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、 RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞 の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を 適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって 菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を 得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質 変性剤や、トリトン X- 100™などの界面活性剤を含んでいてもよい。一方、膜画分から RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを抽出する場合は、上記と同様に菌 体あるいは細胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速 遠心して細胞膜含有画分を沈澱させる（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞 膜画分を精製する）などの方法が用いられる。また、 RAIG2 (または RAIG3)またはそ の部分ペプチドが菌体 (細胞)外に分泌される場合には、培養物から遠心分離また はろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、膜画分あるいは培養上清中に含まれる RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行 うことができる。このような方法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法;透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの主として分子量の差を利用する方法;イオン交換クロマトグラフィーなど の荷電の差を利用する方法;ァフィユティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を 利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法； 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。これらの方 法は、適宜組み合わせることもできる。
[0048] 力べして得られる蛋白質またはペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、蛋白質ま たはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる 方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。 なお、形質転換体が産生する RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを、精 製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾をカロ えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例 えば、トリプシン、キモトリブシン、アルギニルエンドべプチダーゼ、プロテインキナー ゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
力べして得られる RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドの存在は、 RAIG2 ( または RAIG3)に対する抗体を用いたェンザィムィムノアツセィゃウェスタンブロッティ ングなどにより確認することができる。
さらに、 RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドは、上記の RAIG2 (または R AIG3)またはその部分ペプチドをコードする DNAに対応する RNAを铸型として、ゥサ ギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなど力もなる無細 胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。あるいは、さらに RNAポリメ ラーゼを含む無細胞転写 Z翻訳系を用いて、 RAIG2 (または RAIG3)またはその部分 ペプチドをコードする DNAを铸型としても合成することができる。無細胞蛋白質 (転写 Z)翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には 大腸菌抽出液は Pratt J.M.ら," Transcription and Tranlation", Hames B.D.および Hig gins S.J.編， IRL Press, Oxford 179-209 (1984)に記載の方法等に準じて調製するこ ともできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものは E.coli S30 extract sy stem (Promega社製)や RTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製)等が挙げられ 、ゥサギ網状赤血球由来のものは Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製） 等、さらにコムギ胚芽由来のものは PROTEIOS™ (TOYOBO社製)等が挙げられる。こ のうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製 法としては、例えば Johnston F.B.ら， Nature, 179, 160-161 (1957)あるいは Erickson A.H.ら， Meth. EnzymoL, 96, 38-50 (1996)等に記載の方法を用いることができる。 蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、ノ ツチ法 (PratU.M.ら（1984)前 述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白 質合成システム（Spirin A.S.ら， Science, 242, 1162-1164 (1988))、透析法（木川ら、 第 21回日本分子生物学会、 WID6)、あるいは重層法（PROTEIOS™ Wheat germ cell -free protein synthesis core kit取扱説明書： TOYOBO社製）等が挙げられる。さらに は、合成反応系に、铸型の RNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成 物や分解物を必要時に排出する方法 (特開 2000-333673)等を用いることができる。
[0050] RAIG2 (または RAIG3)蛋白質、即ち配列番号： 2 (または配列番号： 4)で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、をコードす る塩基配列またはその一部、ある ヽは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一 部を含有する核酸とは、前述の RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコ ードする核酸だけではなぐフレームの合わな!/、塩基配列をも含む意味で用いられる 目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイプリ ダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということ ができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該 目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または 「相補的である」とは、塩基配列間で約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好まし くは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の同一性または相補性を有することを ヽ
[0051] RAIG2 (または RAIG3)蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはそ の一部を含有する核酸 (以下、「本発明のアンチセンス核酸」ともいう）は、クローンィ匕 した、ある 、は決定された RAIG2 (または RAIG3)をコードする核酸の塩基配列情報に 基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、 RAIG2 (または RAIG3)遺伝子の複製また は発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンス核酸は、 RAIG2 (または RAIG3)遺伝子力も転写される RNAとハイブリダィズすることができ、 mRNAの合成（プ ロセッシング)または機能 (蛋白質への翻訳)を阻害することができる。
[0052] 本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダィズする ことにより、結果として RAIG2 (または RAIG3)蛋白質の翻訳が阻害されるものであれ ばその長さに特に制限はなぐ RAIG2 (または RAIG3) mRNAの全配列であっても部 分配列であってもよぐ短いもので約 15塩基程度、長いもので mRNAまたは初期転写 産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約 15〜 約 30塩基力もなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、 例えば、 RAIG2 (または RAIG3)前駆ポリペプチドをコードする核酸の 5，端ヘアピンル ープ、 5'端 6-ベースペア'リピート、 5'端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 ORF翻訳開始コドン、 3'端非翻訳領域、 3'端パリンドローム領域 、および 3'端ヘアピンループが標的領域として選択しうる力 RAIG2 (または RAIG3) 遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部 分を標的領域とすることもまた好まし ヽ。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、 RAIG2 (または RAIG3) mRNAもしくは初期 転写産物とハイブリダィズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなぐ二本鎖 DNAで ある RAIG2 (または RAIG3)遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、 RNAの 転写を阻害し得るものであってもよ 、。あるいは DNA:RNAノヽイブリツドを形成して RNa seHによる分解を誘導するものであってもよ 、。
アンチセンス核酸は、 2-デォキシ- D-リボースを含有しているデォキシリボヌクレオ チド、 D-リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基の N-ダリ コシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するそ の他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー )または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーは DNAや RNA中 に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチ ドを含有する）などが挙げられる。それらは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、 2本鎖 RNA、 1 本鎖 RNA、さらに DNA: RNAノ、イブリツドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチ ド (または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば 当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチルイ匕されたもの、 1 個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のさ れたもの、例えば非荷電結合 (例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホス ホルアミデート、力ルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結 合 (例えば、ホスホロチォエート、ホスホロジチォエートなど）を持つもの、例えば蛋白 質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ 'インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ -L-リジンなど)や糖 (例えば、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有して 、るもの、 インターカレント化合物（例えば、アタリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレートイ匕 合物 (例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有するも の、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、 αァノマー 型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」と は、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなぐ修飾されたその他の複素環型 塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチルイ匕されたプリンお よびピリミジン、ァシルイ匕されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含 むものであってよ 、。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖 部分が修飾されていてよぐ例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基な どで置換されていたり、あるいはエーテル、ァミンなどの官能基に変換されていてよい
[0054] アンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、ある!/、は修飾された核酸（RNA、 DNA)である。
修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、そ してポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げら れるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方 針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なもの にする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する 親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性を より小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kaw akami et al" Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. C rooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993などに開 がある。
[0055] アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有してい て良ぐリボゾーム、ミクロスフエアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療に より適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用 いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポ リカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような 脂質 (例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる 。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体 (例えば、コレステ リルクロ口ホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の 3'端あるい は 5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させ ることができうる。その他の基としては、核酸の 3'端あるいは 5'端に特異的に配置さ れたキャップ用の基で、ェキソヌクレアーゼ、 RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を 阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレンダリ コール、テトラエチレンダリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られ た水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
RAIG2 (または RAIG3) mRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転 写産物の場合はイントロン部分を含む)で特異的に切断し得るリボザィムもまた、本発 明のアンチセンス核酸に包含され得る。「リボザィム」とは核酸を切断する酵素活性を 有する RNAを ヽうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴ DNAも 同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特 異的な核酸切断活性を有する限り DNAをも包含する概念として用いるものとする。リ ボザィムとして最も汎用性の高 、ものとしては、ウイロイドやウィルソイド等の感染性 R NAに見られるセルフスプライシング RNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が 知られている。ハンマーヘッド型は約 40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーへ ッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ (合わせて約 10塩基程度)を mRNA の所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的 mRNAのみを特異的に切 断することが可能である。このタイプのリボザィムは、 RNAのみを基質とするので、ゲノ ム DNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。 RAIG2 (または RAIG3) mR NAが自身で二本鎖構造をとる場合には、 RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイ ルス核酸由来の RNAモチーフを連結したノヽイブリツドリボザィムを用いることにより、標 的配列を一本鎖にすることができる [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)]。さら〖こ、リボザィムを、それをコードする DNAを含む発現ベクターの形態で使 用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、 tRNAを改変した 配列をさらに連結したハイブリッドリボザィムとすることもできる [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)]。 [0057] 本明細書においては、 RAIG2 (または RAIG3)の mRNAもしくは初期転写産物のコー ド領域内の部分配列 (初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なオリ ゴ RNAとその相補鎖とからなる二本鎖 RNA、いわゆる siRNAもまた、本発明のアンチ センス核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖 RNAを細胞内に導入する とその RNAに相補的な mRNAが分解される、いわゆる RNA干渉（RNAi)と呼ばれる現 象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていた力 この現象が動物細胞でも広く 起こることが確認されて以来 [Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リボザィムの代替 技術として汎用されて 、る。 siRNAは標的となる mRNAの塩基配列情報に基づ 、て、 市販のソフトウェア（例： RNAi Designer; Invitrogen)を用いて適宜設計することができ る。
[0058] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザィムは、 RAIG2 (または RAIG3) cDNA配列もしくはゲノミック DNA配列情報に基づ 、て mRNAもしくは初期転写産物の 標的領域を決定し、市販の DNAZRNA自動合成機 (アプライド ·バイオシステムズ社
、ベックマン社等)を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製すること ができる。 RNAi活性を有する siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を DNAZRNA自 動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約 90〜約 95
°Cで約 1分程度変性させた後、約 30〜約 70°Cで約 1〜約 8時間アニーリングさせること により調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラ ップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーシヨンする ことにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。あるいは、 siRNA は、センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ（例えば約 3〜約 10塩基)のリンカ一 を介して連結した RNA(shRNA)として合成し、導入する動物細胞内の酵素ダイサー（ dicer)などによってプロセシングされるように設計することもできる。さらには、センス鎖 およびアンチセンス鎖をコードする DNAがそれぞれ別個の U6や HIなどの Pol III系プ 口モーターの制御下におかれた発現ベクター、あるいは上記センス鎖とアンチセンス 鎖とをリンカ一を介して連結した RNA鎖をコードする DNA力Pol III系プロモーターの 制御下におかれた発現ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、 siRNAを形成 させてちょい。 [0059] 本発明のアンチセンス核酸の遺伝子発現阻害活性は、 RAIG2 (または RAIG3)をコ ードする核酸を含有する形質転換体、生体内や生体外の RAIG2 (または RAIG3)遺 伝子発現系または RAIG2 (または RAIG3)蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用い て調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
[0060] 本発明はまた、 RAIG2 (または RAIG3)に対する抗体を提供する。該抗体は、 RAIG2
(または RAIG3)に対して特異的親和性を有するものであれば、モノクローナル抗体 であってもポリクローナル抗体であってもよい。 RAIG2 (または RAIG3)に対する抗体 は、 RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗 体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および該抗体の製造法について説明す る。
[0061] (1)抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記した RAIG2 (または R AIG3)蛋白質またはその部分ペプチド (以下、抗体の説明においては、特にことわら ない限り、これらを包括して単に「RAIG2 (または RAIG3)」という）、あるいはそれと同 一の抗原決定基を 1種ある 、は 2種以上有する (合成)ペプチドなど、何れのものも使 用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある)。
RAIG2 (または RAIG3)は、上記した通り、例えば、（a)哺乳動物の組織または細胞 力 公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b)ペプチド 'シンセサイ ザ一等を使用する公知のペプチド合成方法でィ匕学的に合成、 (c) RAIG2(または RAI G3)をコードする DNAを含有する形質転換体を培養、ある!/、は (d) RAIG2 (または RAI G3)をコードする核酸を铸型として無細胞転写 Z翻訳系を用いて生化学的に合成す ること〖こよって製造される。
(a)哺乳動物の組織または細胞カゝら RAIG2 (または RAIG3)を調製する場合、その組 織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物 (例:膜画分、可溶性画分)をそのまま 抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出 を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わ せること〖こより精製単離することもできる。得られた RAIG2 (または RAIG3)をそのまま 免疫原とすることもできるし、ぺプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチド を調製してそれを免疫原とすることもできる。
(b)化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述 の（a)の方法を用いて天然材料より精製した RAIG2 (または RAIG3)と同一の構造を有 するもの、具体的には、 RAIG2 (または RAIG3)のアミノ酸配列において少なくとも 3個 以上、好ましくは 6個以上のアミノ酸力 なる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のァミノ 酸配列を 1種あるいは 2種以上含有するペプチドなどが用いられる。
(c) DNAを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該 DNAは、 公知のクロー-ング方法〔例えば、 Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook et al, Co Id Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法など〕に従って作製することができ る。該クローニング方法とは、（1) RAIG2 (または RAIG3)をコードする遺伝子配列に基 づきデザインした DNAプローブを用い、ヒト cDNAライブラリーからハイブリダィゼーシ ヨン法により該抗原をコードする DNAを単離する力、 (2) RAIG2 (または RAIG3)をコー ドする遺伝子配列に基づきデザインした DNAプライマーを用い、哺乳動物由来の cD NAを铸型として PCR法により該抗原をコードする DNAを調製し、該 DNAを宿主に適 合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現べクタ一で宿主を形 質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原 を得ることができる。
(d)無細胞転写 Z翻訳系を利用する場合、上記 (c)と同様の方法により調製した抗 原をコードする DNAを挿入した発現ベクター（例えば、該 DNA力T7、 SP6プロモータ 一等の制御下におかれた発現ベクターなど）を铸型とし、該プロモーターに適合する RNAポリメラーゼおよび基質 (NTPs)を含む転写反応液を用いて mRNAを合成した後 、該 mRNAを铸型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ゥサギ網状赤血球、コム ギ胚芽等の抽出液)を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等 を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこ とちでさる。
免疫原としては完全な RAIG2 (または RAIG3)蛋白質分子やその部分アミノ酸配列 を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば 3個以上 の連続するアミノ酸残基力 なるもの、好ましくは 4個以上、より好ましくは 5個以上、い つそう好ましくは 6個以上の連続するアミノ酸残基力もなるものが挙げられる。あるいは 、該アミノ酸配列としては、例えば 20個以下の連続するアミノ酸残基力もなるもの、好 ましくは 18個以下、より好ましくは 15個以下、いっそう好ましくは 12個以下の連続する アミノ酸残基力 なるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例： 1な ヽし数 個）は置換可能な基 (例: Cys、水酸基等）によって置換されていてもよい。免疫原とし て用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を 1ないし数個含むアミノ酸配 列を有する。
[0063] あるいは、 RAIG2 (または RAIG3)を発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原 として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記 (a)項で述べたような天 然の細胞、上記 (c)項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることがで きる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ノ、ムスター、 -ヮトリ などから採取した細胞であれば何れのものでも良ぐ HEK293, COS7、 CH0-K1、 NI H3T3、 Balb3T3、 FM3A、 L929、 SP2/0、 P3U1、 B16、または P388などが好ましく用いら れる。 RAIG2 (または RAIG3)を発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した温 血動物細胞は、組織培養に用いられる培地 (例： RPMI1640)または緩衝液 (例： Hank s， Balanced Salt Solution)に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免 疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良ぐ静 脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
[0064] 本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶ィ匕したものを直接免疫することもで きるが、分子内に 1ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量 (例えば、分子量 約 3,000以下）の抗原 (即ち、 RAIG2 (または RAIG3)の部分ペプチド)を用いる場合に は、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体 (キャリア 一）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然も しくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばゥシ、ゥサギ 、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばゥシ、ゥサギなどの哺乳動物のサイロ グロブリン、例えば-ヮトリのオボアルブミン、例えばゥシ、ゥサギ、ヒト、ヒッジなどの哺 乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットへモシァニン（KLH)などが用いられる。 合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビ- ル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙 げられる。
[0065] 該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対す る抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着 させてもよぐ通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然 もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でノヽプテン 1に対し 0.1〜100の割合で結 合あるいは吸着させたものを使用することができる。
[0066] また、ハプテンとキャリアーの力プリングには、種々の縮合剤を用いることができる。
例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジァゾ化べンジジンなど のジァゾ -ゥム化合物、アミノ基同士を架橋するダルタルアルデビトなどのジアルデヒ ド化合物、トルエン- 2,4-ジイソシァネートなどのジイソシァネートイ匕合物、チオール基 同士を架橋する N,N，-o-フエ-レンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、ァミノ基と チオール基を架橋するマレイミド活性エステルイ匕合物、ァミノ基とカルボキシル基とを 架橋するカルポジイミドィ匕合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋 する際にも、一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬 (例えば、 3-(2-ピリジルジチォ)プロピオン酸 N-スクシンィミジル (SPDP)など）を反応させた後 還元することによりチオール基を導入し、他方のァミノ基にマレイミド活性エステル試 薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
[0067] (2)モノクローナル抗体の作製
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、 皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、ある いは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ 、。投与は通常 1
〜6週毎に 1回ずつ、計 2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば 、サル、ゥサギ、ィヌ、モノレモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒッジ、ャギ、ロノく、ニヮ トリが挙げられる。抗 Ig抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺 乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよび ラットが好ましく用いられる。
[0068] ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒト を投与対象とする場合には、（0後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（ 例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、 GO後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗 体もしくは完全ヒト抗体を作製する、ある 、は (iii)体外免疫法とウィルスによる細胞不 死化、ヒト—ヒト (もしくはマウス)ハイプリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等と を組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では 抗体産生が抑制される抗原に対する抗体を取得できる可能性があることの他、 ng〜 μ gオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了する ことなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒ ト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
[0069] 体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物 (好ましく はマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節など力ゝら単離されるリンパ球、好ましくは B リンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、 4〜12週齢程度の動物 から脾臓を摘出，脾細胞を分離し、適当な培地 (例:ダルベッコ改変イーグル培地 (D MEM)、 RPMI1640培地、ハム F12培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ゥシ血清（ FCS ;5〜20%程度）添加培地に浮遊させて 4〜10日間程度 COインキュベーターなど
2
を用いて培養する。抗原濃度としては、例えば 0.05〜5 gが挙げられるがこれに限定 されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法 に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
[0070] ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、 IL-2、 IL-4 、 IL-5、 IL-6等数種のサイト力インおよび必要に応じてアジュバント物質 (例：ムラミル ジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ま 、。
[0071] モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラ ット)もしくは動物細胞 (例:ヒト、マウス、ラット)から抗体価の上昇が認められた個体も しくは細胞集団を選択し、最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは 体外免疫後 4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと 骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイプリドーマを調製することができる 。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に 結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
[0072] 骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイプリドーマを産生し得るものであれば特 に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましぐまた、細胞融 合効率が高いものがより好ましい。また、ハイプリドーマの選択を容易にするために、 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)感受性の株を用いることが好ましい。 例えばマウス骨髄腫細胞としては NS-1、 P3U1、 SP2/0、 AP-1等力 ラット骨髄腫細胞 としては R210.RCY3、 Y3-Ag 1.2.3等力 ヒト骨髄腫細胞としては SKO- 007、 GM 1500 - 6TG- 2、 LICR- LON- HMy2、 UC729- 6等が挙げられる。
[0073] 融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法 [ネイチヤー（Nature )、 256卷、 495頁 (1975年)]に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリ エチレングリコール（PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられる力 好ましくは PEGな どが用いられる。 PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的 低い PEG1000〜PEG6000が好ましい。 PEG濃度としては例えば 10〜80%程度、好まし くは 30〜50%程度が例示される。 PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例： RPMI16 40)、 5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、トリス緩衝 液等の各種緩衝液を用いることができる。所望により DMSO (例： 10〜20%程度）を添 カロすることもできる。融合液の pHとしては、例えば 4〜10程度、好ましくは 6〜8程度が 挙げられる。
抗体産生細胞 (脾細胞)数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常 1:1〜20:1程度 であり、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cで通常 1〜10分間インキュベートすること により効率よく細胞融合を実施できる。
[0074] 抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウィルスに抗体産生細胞 を感染させて該細胞を不死化することによつても得ることができる。そのようなウィルス としては、例えばェプスタイン バー（EB)ウィルス等が挙げられる。大多数の人は伝 染性単核球症の無症状感染としてこのウィルスに感染した経験があるので免疫を有 しているが、通常の EBウィルスを用いた場合にはウィルス粒子も産生されるので、適 切な精製を行うべきである。ウィルス混入の可能性のない EBシステムとして、 Bリンパ 球を不死化する能力を保持するがウィルス粒子の複製能力を欠損した組換え EBウイ ルス (例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスィッチ遺伝子における 欠損など）を用いることもまた好ま 、。
[0075] マーモセット由来の B95-8細胞は EBウィルスを分泌して!/、るので、その培養上清を 用いれば容易に Bリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血 清及びペニシリン Zストレプトマイシン (P/S)添加培地（例： RPMI1640)もしくは細胞 増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養 上清を分離し、これに抗体産生 Bリンパ球を適当な濃度 (例:約 107細胞/ mL)で浮遊 させて、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cで通常 0.5〜2時間程度インキュベートす ることにより抗体産生 B細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ 球として提供される場合、大部分の人は EBウィルス感染細胞に対して傷害性を示す Tリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えば ヒッジ赤血球等と Eロゼットを形成させることによって Tリンパ球を予め除去しておくこ とが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒッジ赤血球を抗体産生 Bリンパ球と混合 し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異 的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗 原特異的な Bリンパ球はキャップされて表面に IgGを提示しなくなるので、抗 IgG抗体 を結合したヒッジ赤血球と混合すると抗原非特異的な Bリンパ球のみがロゼットを形 成する。従って、この混合物力もパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層 を採取することにより、抗原特異的 Bリンパ球を選別することができる。
[0076] トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体 分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させるこ とができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。
[0077] ハイプリドーマのスクリーニング、育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、 チミジン）を添加して、 5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例： RPMI1640)もしくは細 胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび チミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約 0.1mM、約 0.4 /z Mおよび約 0.016mM等 が挙げられる。ヒト一マウスハイプリドーマの選択にはゥヮバイン耐性を用いることがで きる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてゥヮバインに対する感受性が高いので、 10 〜10—3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
[0078] ノ、イブリドーマの選択にはフィーダ一細胞やある種の細胞培養上清を用いることが 好ましい。フィーダ一細胞としては、ハイプリドーマの出現を助けて自身は死滅するよ うに生存期間が限られた異系の細胞種、ハイプリドーマの出現に有用な増殖因子を 大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる 。例えば、マウスのフィーダ一細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細 胞等が、ヒトのフィーダ一細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養 上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上 清が挙げられる。
また、ハイプリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性 化セルソータ (FACS)を用いて抗原と結合する細胞を分離することによつても選択す ることができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選 択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
[0079] 標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローユングに は種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地力 除去する ことが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は 10〜14日以内に死 滅するので、融合 2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイ プリドーマについては通常融合後 4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持さ れる。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後 1週間以上後に除去するのが 望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合?〜 10日後にヒポキサンチンおよび チミジン（HT)添加完全培地（例： 10% FCS添加 RPMI1640)の添加または交換を行う。 融合後 8〜14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径力 lmm程度 になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
[0080] 抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（ 抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む)を直接あるいは担体とともに吸着 させた固相（例：マイクロプレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物 質 (例：125I,mI,3H,14C)、酵素（例： β—ガラタトシダーゼ、 β—ダルコシダーゼ、アル カリフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質 (例：フル ォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノー ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン)などで標識した抗免疫グロブリン (IgG)抗体 (も との抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来の IgGに対する抗体が用いら れる）またはプロテイン Aを加え、固相に結合した標的抗原 (抗原決定基）に対する抗 体を検出する方法、抗 IgG抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドー マ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あ るいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原 (抗原決定基）に対する 抗体を検出する方法などによって行うことができる。
[0081] クローユング方法としては限界希釈法が通常用いられる力 軟寒天を用いたクロー ユングや FACSを用いたクローユング（上述)も可能である。限界希釈法によるクロー ニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されな 、。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ゥ ルを選択する。適当なフィーダ一細胞 を選択して 96ゥエルプレートに添加しておく。抗体陽性ゥェルカも細胞を吸い出し、 完全培地（例： 10% FCSおよび P/S添カ卩 RMPI1640)中に 30細胞/ mLの密度となるよう に浮遊させ、フィーダ一細胞を添カ卩したゥエルプレートに O.lmL (3細胞/ゥエル)加え 、残りの細胞懸濁液を 10細胞/ mLに希釈して別のゥ ルに同様にまき（1細胞/ゥ ル )、さらに残りの細胞懸濁液を 3細胞/ mLに希釈して別のゥエルにまく（0.3細胞/ゥエル )。 目視可能なクローンが出現するまで 2〜3週間程度培養し、抗体量を測定'陽性ゥ エルを選択し、再度クローユングする。ヒト細胞の場合はクローユングが比較的困難な ので、 10細胞/ゥエルのプレートも調製しておく。通常 2回のサブクローユングでモノク ローナル抗体産生ハイプリドーマを得ることができる力 その安定性を確認するため にさらに数ケ月間定期的に再クローユングを行うことが望ましい。
[0082] ノ、イブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビト口での培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生 ノ、イブリドーマを、細胞密度を例えば 105〜106細胞/ mL程度に保ちながら、また、 FCS 濃度を徐々に減らしながら、ゥヱルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が 挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細 胞腫 (MOPC)を誘導したマウス (ノヽイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、 5 〜10日後に 106〜107細胞程度のハイプリドーマを腹腔内注射し、 2〜5週間後に麻酔 下に腹水を採取する方法が挙げられる。
[0083] (b)モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分 離精製法 [例:塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換 体 (例： DEAE、 QEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相ある いはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など]に従って行うことができる。
[0084] 以上のようにして、ハイプリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その 体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造する ことができる。
[0085] 好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として 使用されることから、本発明の抗体 (好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した 場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗 体、マウス—ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体 およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。 また、完全ヒト抗体は、上記したヒト—ヒト (もしくはマウス)ハイプリドーマより製造する ことも可能ではある力 大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述 するヒト抗体産生動物（例：マウス)またはファージディスプレイ法を用いて製造するこ とが望ましい。
[0086] (i)キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、 H鎖および L鎖の可変領域 (Vおよび V )の
H L
配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域 (Cおよび C )の配列が他の哺乳動物種 に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイプリ ドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましぐ定常領域の配列は 投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第 6,331,415号に記載される方法あ るいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のように して得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス マウスハイブリ ドーマ）から、常法に従って mRNAもしくは全 RNAを調製し、 cDNAを合成する。該 cDN Aを铸型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとして Vおよび Vの各
H L
N末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴ DNA、アンチセンスプライマーとして C および Cの N末端配列をコードする塩基配列とハイブリダィズするオリゴ DNA (例え
H L
ば Bio/Technology, 9: 88-89， 1991参照））を用い、常法に従って PCRで Vおよび V
H L
をコードする DNAを増幅 '精製する。同様の方法により、他の哺乳動物 (例:ヒト）のリ ンパ球等より調製した RNAから RT- PCRにより Cおよび Cをコードする DNAを増幅'
H L
精製する。常法を用いて Vと C、 Vと Cをそれぞれ連結し、得られたキメラ H鎖 DNA
H H L L
およびキメラ L鎖 DNAを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、 CHO細胞、 COS細 胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例： CMVプロモーター、 SV40プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードする DNAは別 個のベクターに挿入してもよいし、 1個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得ら れたキメラ H鎖およびキメラ L鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞 としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスタ 一卵巣（CHO)細胞、サル由来の COS-7細胞、 Vero細胞、ラット由来の GHS細胞など が挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、 好ましくはエレクト口ポレーシヨン法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一 定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラ モノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてゥシ、ャギ、二 ヮトリ等のトランスジヱニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハ ゥが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジヱニック動 物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラ モノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タ ノ コなどのトランスジエニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されてい る植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクト口 ポレーシヨン、無傷細胞へのパーティクルガン法や Ήベクター法などを用いてトランス ジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などカゝら大量にキメラモノクローナル抗体 を得ることも可會である。
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すれば Fab力 ペプシンで分解 すれば F(ab')がそれぞれ得られる。
2
[0088] また、マウス Vおよび Vをコードする DNAを適当なリンカ
H L 一、例えば 1〜40アミノ酸、 好ましくは 3〜30アミノ酸、より好ましくは 5〜20アミノ酸力 なるペプチド（例： [Ser-(Gly )m]nもしくは [(Gly)m- Ser]n (mは 0〜10の整数、 nは 1〜5の整数）等）をコードする DNA を介して連結することにより scFvとすることができ、さらに C をコードする DNAを適当
H3
なリンカ一を介して連結することにより minidodyモノマーとしたり、 C全長をコードする
H
DNAを適当なリンカ一を介して連結することにより scFv-Fcとすることもできる。このよう な遺伝子工学的に修飾 (共役)された抗体分子をコードする DNAは、適当なプロモー ターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、 大量に抗体分子を生産することができる。
[0089] マウス Vおよび Vをコードする DNAを 1つのプロモーターの下流にタンデムに挿入
H L
して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現により Fvと呼ばれる二量体 を形成する。また、分子モデリングを用いて Vおよび Vの FR中の適当なアミノ酸を Cy
H L
sに置換すると、両鎖の分子間ジスルフイド結合により dsFvと呼ばれる二量体が形成さ れる。
[0090] (ii)ヒト化抗体
本明細書にぉ 、て「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域 (CDR) 以外のすべての領域 (即ち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域 (FR) )の配列がヒト由来であり、 CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意 味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイプリドーマを作製す ることができる動物種が好ま 、。 ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第 5,225,539号、第 5,585,089号、第 5 ,693,761号および第 5,693,762号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方 法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺 乳動物種 (例：マウス）由来の Vおよび Vをコードする DNAを単離した後、常法により
H L
自動 DNAシークェンサ一（例： Applied Biosystems社製等）を用いてシークェンスを行 V、、得られる塩基配列もしくはそこ力 推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列デ ~~タべ' ~"ス [f列 _は、 Kabat database (Kabatら,「Sequences of Proteins of Immunoiogi cal InterestJ , US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH編，第 5版， 1991参照）等]を用いて解析し、両鎖の CDRおよび FRを決定する。 決定された FR配列に類似した FR配列を有するヒト抗体の L鎖および H鎖をコードす る塩基配列 [例：ヒト κ型 L鎖サブグループ Iおよびヒト H鎖サブグループ IIもしくは III ( Kabatら， 1991 (上述）を参照）]の CDRコード領域を、決定された異種 CDRをコードす る塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を 20〜40塩基程度のフラグメ ントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバ 一ラップするように 20〜40塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントを DNAシ ンセサイザ一を用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダィズおよびライゲート させることにより、ヒト由来の FRと他の哺乳動物種由来の CDRを有する Vおよび Vを
H L
コードする DNAを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来 CDRをヒト由来 Vおよび Vに移植するには、 PCRによる部位特異的変異誘発を用い
H L
ることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平 5-227970号公報に記載の 逐次 CDR移植法等が挙げられる。このよう〖こして得られる Vおよび Vをコードする DN
H L
Aを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来の Cおよび Cをコードする DNA
H L
とそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒトイ匕抗体を産生する細 胞あるいはトランスジエニック動植物を得ることができる。
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いて scFv、 scFv-Fc, minibo dy、 dsFv、 Fvなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌 や酵母などの微生物でも生産させることができる。
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイプリドーマの作製技術が確立して 、な 、他の動 物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる 。例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、 -ヮトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されてい る動物やィヌゃネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
[0092] (iii)ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン (Ig)遺伝子をノックアウト（KO)した非ヒト温血動物に機能的 なヒ Hg遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒ ト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイプリドーマ作製技術が確立してい る動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって 完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。ヒ Hgの H鎖および L鎖のミ 二遺伝子を通常のトランスジエニック (Tg)技術を用いて導入したマウスと、内因性マ ウス Ig遺伝子を通常の KO技術を用いて不活性ィ匕したマウスとを交配して得られたヒト 抗体産生マウス（Immunol. Today, 17: 391-397, 1996を参照）を用いて作製されたヒト モノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒ Hgヒト抗 体（HAHA)の産生は報告されて!、な！/、。
[0093] その後、 Abgenix社 [商品名：XenoMouose (Nat. Genet., 15: 146-156, 1997;米国 特許第 5, 939,598号等を参照）]や Medarex社 [商品名： Hu- Mab Mouse (Nat. Biotech nol., 14: 845-851, 1996;米国特許第 5,545,806号等を参照）]が酵母人工染色体 (Y AC)ベクターを用いてより大きなヒ Hg遺伝子を導入した Tgマウスを作製し、よりレバー トリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。し力しながら、ヒ Hg遺伝子は、例え ば H鎖の場合、約 80種の V断片、約 30種の D断片および 6種の J断片が様々に組み 合わされた VDJェクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現し ているため、その全長は H鎖が約 1.5Mb (14番染色体）、 K L鎖が約 2Mb (2番染色体 ) , 鎖が約 1Mb (22番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパ 一トリーを他の動物種で再現するためには、各 Ig遺伝子の全長を導入することが望ま しいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、 BAC、 YAC等）に挿入可能 な DNAは通常数 kb〜数百 kbであり、クローユングした DNAを受精卵に注入する従来 のトランスジヱニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
[0094] Tomizukaら（Nat. Genet., 16: 133-143, 1997)は、 Ig遺伝子を担持するヒト染色体の 自然断片 (hCF)をマウスに導入して (染色体導入 (TC)マウス)、完全長ヒ Hg遺伝子 を有するマウスを作製した。即ち、まず、 H鎖遺伝子を含む 14番染色体および κ L鎖 遺伝子を含む 2番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有す るヒトーマウスハイブリッド細胞を 48時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド)で処 理して、 1〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、 微小核融合法によりマウス ES細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒ Hg遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッド ES細胞を選択し、 通常の KOマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られる キメラマウス力 コートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト 14番染 色体断片を伝達する TCマウス系統 (TC(hCF14))およびヒト 2番染色体断片を伝達す る TCマウス系統 (TC(hCF2))を榭立する。常法により内因性 H鎖遺伝子および κ L鎖 遺伝子を KOされたマウス（KO(IgH)および KO(Ig κ ))を作製し、これら 4系統の交配を 繰り返すことにより、 4種の遺伝子改変をすベて有するマウス系統 (ダブル TC/KO)を 樹立することができる。
上記のようにして作製されるダブル TC/KOマウスに、通常のマウスモノクローナル 抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗 体産生ハイプリドーマを作製することができる。しかしながら、 K L鎖遺伝子を含む hC F2がマウス細胞内で不安定なため、ハイプリドーマ取得効率は通常のマウスの場合 に比べて低 、と 、う欠点がある。
[0095] 一方、前記 Hu-Mab Mouseは κ L鎖遺伝子の約 50%を含むが、可変領域クラスター が倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等の κ鎖の多様性を示し (他方 、 H鎖遺伝子は約 10%しカゝ含まないので H鎖の多様性は低ぐ抗原に対する応答性 が不十分である）、且つ YACベクター (Ig κ -YAC)によりマウス染色体中に挿入され ているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、 TC(hCF14)マウ スと Hu-Mab Mouseとを交配して hCF14と Ig κ -YACとを安定に保持するマウス（商品 名： KMマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイプリドーマ取得効率 および抗体の抗原親和性を得ることができる。
[0096] さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、 鎖遺 伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記 と同様の方法で 鎖遺伝子を担持するヒト 22番染色体もしくはその断片を導入した TCマウス（TC(hCF22))を作製し、これと上記ダブル TC/KOマウスや KMマウスとを交 配すること〖こより得ることもできるし、あるいは、例えば H鎖遺伝子座と 鎖遺伝子 座とを含むヒト人工染色体 (HAC)を構築してマウス細胞に導入することにより得ること もできる（Nat. BiotechnoL, 18: 1086-1090, 2000) 0
[0097] 本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが望ま しいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体であ る場合には、ハイプリドーマの利用を要しないので、ハイプリドーマ作製技術は確立 されて ヽな 、がトランスジ ニック技術は確立されて 、る動物種、好ましくはゥシ等の 有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大 量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、 Nat. BiotechnoL, 20: 889- 894, 2002参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水 、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせ ること〖こよって精製することができる。
[0098] (iv)ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう 1つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法 である。この方法は PCRによる変異が CDR以外に導入される場合があり、そのため臨 床段階で少数の HAHA産生の報告例がある力 その一方で宿主動物に由来する異 種間ウィルス感染の危険性がな!、点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや 糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能)等の利点を有して！/、る。
[0099] ファージイスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが 挙げられる力 これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されな 、が、通常繊維状ファージ (Ffパクテリオファ ージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来蛋白質を提示する方法としては、 g3 p、 g6p〜g9pのコート蛋白質のいずれかとの融合蛋白質として該コート蛋白質上で発 現 ·提示させる方法が挙げられるが、よく用 、られるのは g3pもしくは g8pの N末端側に 融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、 1)ファージゲノムのコ ート蛋白質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示さ れるコート蛋白質をすベて外来蛋白質との融合蛋白質として提示させるものの他、 2) 融合蛋白質をコードする遺伝子を野生型コート蛋白質遺伝子とは別に挿入して、融 合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発現させるものや、 3)融合蛋白質をコード する遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コート蛋白質遺伝 子を有するヘルパーファージを感染させて融合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同 時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、 1)の場合は大きな 外来蛋白質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のため には 2)または 3)のタイプが用いられる。
[0100] 具体的なベクターとしては、 Holtら（Curr. Opin. BiotechnoL, 11: 445-449, 2000)に 記載されるものが例示される。例えば、 pCESl (J. Biol. Chem., 274: 18218-18230, 19 99参照）は、 1つのラタトースプロモーターの制御下に g3pのシグナルペプチドの下流 に κ L鎖定常領域をコードする DNAと g3pシグナルペプチドの下流に CH3をコードす る DNA、 His-tag、 c-myc tag,アンバー終止コドン (TAG)を介して g3pコード配列とが 配置された Fab発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に 導入すると g3pコート蛋白質上に Fabを提示するが、アンバー変異を持たな ヽ HB2151 株などで発現させると可溶性 Fab抗体を産生する。また、 scFv発現型ファージミドベタ ターとしては、例えば pHENl (J. Mol. Biol, 222:581-597, 1991)等が用いられる。 一方、ヘルパーファージとしては、例えば M13-K07、 VCSM13等が挙げられる。 また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の 3'末端とコート蛋白 質遺伝子の 5'末端にそれぞれシスティンをコードするコドンを含む配列を連結し、両 遺伝子を同時に別個に (融合蛋白質としてではなく）発現させて、導入されたシスティ ン残基同士による S-S結合を介してファージ表面のコート蛋白質上に抗体を提示し得 るようにデザインされたもの（Morphosys社の CysDisplay™技術）等も挙げられる。
[0101] ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ Z非免疫ライブラリー、合成ライブラリ 一、免疫ライブラリ一等が挙げられる。
ナイーブ Z非免疫（non- immunized)ライブラリ一は、正常なヒトが保有する Vおよび
H
V遺伝子を RT-PCRにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイべ クタ一にクロー-ングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄
、扁桃腺などのリンパ球由来の mRNA等が铸型として用いられる。疾病履歴などの V 遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススィッチが起こっていない IgM 由来の mRNAのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的 なものとしては、 CAT社のライブラリー（J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991; Nat. Biote chnol, 14: 309-314, 1996参照）、 MRC社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol, 12: 4 33-455, 1994参照）、 Dyax社のライブラリー（J. Biol. Chem., 1999 (上述)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14: 7969-7974, 2000参照）等が挙げられる。
合成ライブラリ一は、ヒト B細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、 V遺伝子 断片の、例えば CDR3等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配 列をコードする DNAで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的な scFv や Fabを産生する Vおよび V遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので
H L
、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、 Morphosy s社の HuCALライブラリー（J. Mol. Biol, 296: 57-86, 2000参照）、 Biolnvent社のライ ブラリー（Nat. BiotechnoL, 18: 852, 2000参照）、 Crucell社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938, 1995; J. Immunol. Methods, 272: 219-233, 2003参照） 等が挙げられる。
免疫 (immunized)ライブラリ一は、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから 採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒト リンパ球等から、上記ナイーブ Z非免疫ライブラリーの場合と同様にして mRNAを調 製し、 RT-PCR法によって Vおよび V遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである
H L
。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリ一中に含まれるので、比較的小さなサイズ のライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンユング操作で 取り扱えるファージ数（iou〜io13ファージ）と通常のパンユングでクローンの単離およ び増幅に必要なファージ数（100〜1,000ファージ/クローン）を考慮すれば、 108〜10 11クローン程度が適当であり、約 108クローンのライブラリーで通常 10— 9オーダーの Kd 値を有する抗体をスクリーニングすることができる。 [0103] 標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンユングと!ヽ う。具体的には、例えば、抗原を固定ィ匕した担体とファージライブラリーとを接触させ 、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体力 溶出させ、大腸菌 に感染させて該ファージを増殖させる、 t ヽぅ一連の操作を 3〜5回程度繰り返すこと により抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体とし ては、通常の抗原抗体反応やァフィユティークロマトグラフィーで用いられる各種担 体、例えばァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属など力もなるマイクロ プレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラス、モン共鳴 (S PR)のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定ィ匕には物理的吸着を用いても よぐまた、通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定ィ匕するのに用いられる化学結 合を用いる方法でもよい。例えばピオチン （ストレブト)アビジン系等が好ましく用い られる。標的抗原である RAIG2 (または RAIG3)がオリゴペプチドなどの小分子である 場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されな 、ように特 に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、 BSA溶液などのブロッキング液 (1-2回）、 Tween等の界面活性剤を含む PBS (3-5回）などを順次用いることができる。 クェン酸緩衝液 (PH5)などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出 には、通常酸 (例： 0.1M塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（ 例えば、抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコード する遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生 型コート蛋白質が提示されるので、コート蛋白質のすべてが融合蛋白質として発現し ても大腸菌への感染 '増殖が可能となる)や可溶性抗原による競合的溶出、あるいは S-S結合の還元（例えば、前記した CysDisplay™では、パンユングの後、適当な還元 剤を用いて抗体とコート蛋白質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収 することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和し た後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
[0104] パンユングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸 菌に感染させた後プレート上に播種してクローユングを行う。再度ファージを回収し、 上述の抗体価測定法 (例： ELISA、 RIA、 FIA等）や FACSあるいは SPRを利用した測定 により抗原結合活性を確認する。
[0105] 選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離'精製は 、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子の連 結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをァ ンバー変異を持たない大腸菌 (例: HB2151株）に感染させると、可溶性抗体分子が 産生されペリブラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶 解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。 His-t agや c-myc tagを導入しておけば、 IMACゃ抗 c-myc抗体カラムなどを用いて容易に 精製することができる。また、パンユングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利 用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面力も分離さ れるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。
[0106] ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト 抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用すること ができる。例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、 -ヮトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖 されて ヽる動物やィヌゃネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動 物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライ ブラリーの利用がより有効である。
[0107] (3)ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 製造することができる。例えば、免疫抗原 (蛋白質もしくはペプチド抗原）自体、ある Vヽはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造 法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物力も RAIG2 (または RAIG3)に対する 抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
[0108] 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に 関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアー蛋白質とハプテンとの混合比は、キヤ リア一蛋白質に架橋させて免疫したノヽプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの ようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ゥシ血清アルブミンゃゥシ サイログロブリン、へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、約 0.1〜約 20、好まし くは約 1〜約 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
[0109] また、ハプテンとキャリアー蛋白質の力プリングには、種々の縮合剤を用いることが できるが、ダルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基 、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担 体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイ ントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約 1 〜約 6週毎に 1回ずつ、計約 2〜約 10回程度行われる。
[0110] ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ま しくは血液力 採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体 の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
[0111] RAIG2 (または RAIG3)はグルコースや 1,5_AGに対する受容体として機能し、血糖 濃度に応答してインスリンや ACTHなどのホルモン分泌を制御する。従って、 RAIG2 ( または RAIG3)またはその部分ペプチド、それをコードする核酸またはその一部、 RAI G2 (または RAIG3)に対する抗体 (以下、「本発明の抗体」 t 、う場合がある）、 RAIG2 ( または RAIG3)をコードする核酸に対するアンチセンス核酸 (以下、「本発明のアンチ センス核酸」 t 、う場合がある）は、以下の用途を有して 、る。
[0112] [1]糖 ·脂質代謝調節剤等
RAIG2 (または RAIG3)は血中のグルコースや 1,5_AG濃度を検知して、脾臓におけ るインスリン分泌を促進し、脳下垂体における ACTHの分泌を低グルコース濃度下で 促進 Z高グルコース濃度下で抑制するので、 a) RAIG2 (または RAIG3)またはその部 分ペプチド、 b) RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする DNAを、 1 )糖'脂質代謝調節剤、 2)脾臓および Zまたは脳下垂体の機能調節剤、 3)インスリ ン分泌促進および Zもしくは血糖低下並びに Zまたは ACTH分泌調節剤、 4)糖'脂 質代謝異常、脾臓および Zまたは脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌お よび Zもしくは血糖値並びに Zまたは ACTH分泌異常が関与する疾患の予防，治療 剤などとして使用することができる。
例えば、生体内において RAIG2 (または RAIG3)が減少しているために、リガンドで あるグルコースや 1,5— AGの生理作用が期待できない（即ち、 RAIG2 (または RAIG3) 欠乏症）患者が!/、る場合に、 a) RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを該 患者に投与し RAIG2 (または RAIG3)量を補充したり、 b) (i) RAIG2 (または RAIG3)ま たはその部分ペプチドをコードする核酸 (好ましくは DNA)を該患者に投与し、発現さ せることによって、ある 、は (ii)対象となる細胞に RAIG2 (または RAIG3)またはその部 分ペプチドをコードする核酸 (好ましくは DNA)を導入し、発現させた後に、該細胞を 該患者に移植することなどによって、患者の体内における RAIG2 (または RAIG3)量を 増加させ、グルコースや 1,5— AGの作用を十分に発揮させることができる。
[0113] 糖'脂質代謝異常、脾臓および Zまたは脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン 分泌および Zもしくは血糖値並びに Zまたは ACTH分泌異常が関与する疾患として は、例えば、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖 尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障 害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障 害などが挙げられるが、それらに限定されない。
[0114] RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドおよびそれをコードする DNA (以下 、「本発明の DNA」という場合もある）は、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体と ともに混合して医薬組成物とした後に、上記医薬として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機ある いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤 ；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤な どとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの 製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、 D-マン-トール、 D-ソルビトール、デンプ ン、 α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセル口 ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケィ 酸、合成ケィ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。 滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タ ルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、 α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチル セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結 晶セルロース、白糖、 D-マン-トール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキ シプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど が挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、 カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメ チルスターチナトリウム、軽質無水ケィ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースな どが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロ ピレンダリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、ォリーブ油、綿実 油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D -マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレ ステロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、サリチル酸ナト リウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウ ム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコ-ゥム、塩化べンゼトニゥム 、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビ ニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ メチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロースなどの 親水性高分子;ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる 等張化剤の好適な例としては、塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、 D-マン-トール、 D-ソル ビトール、ブドウ糖などが挙げられる。 緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩などの緩衝液 などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、ノ ラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベ ンジルアルコール、フエネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられ る。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、ァスコルビン酸塩などが挙げられる。 着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素（例:食用赤色 2号および 3号、 食用黄色 4号および 5号、食用青色 1号および 2号などの食用色素、水不溶性レーキ 色素（例：前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、天然色素（例： j8 -カロ チン、クロロフィル、ベンガラなど）などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、ァス パノレテーム、ステビアなどが挙げられる。
前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイク 口カプセルを含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤；および 注射剤 (例:皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など)、外用 剤 (例：経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など)、坐剤 (例：直腸坐剤、膣坐剤など)、 ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例:徐放性マイクロカプセルなど）等の非経口剤が挙 げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の 方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述 する。医薬組成物中の有効成分の含量は、剤形、有効成分の投与量などにより異な る力 例えば約 0.1ないし 100重量％である。
例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤（例：乳糖， 白糖，デンプン， D-マン-トー ルなど）、崩壊剤（例：カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）、結合剤（例： a化 デンプン，アラビアゴム，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース ,ポリビニルピロリドンなど)または滑沢剤（例：タルク，ステアリン酸マグネシウム，ポリ エチレングリコール 6000など）などを添カ卩して圧縮成形し、次いで必要により、味のマ スキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体公知 の方法でコーティングすることにより製造される。
該コーティング基剤としては、例えば糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、 腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤などが挙げられる 糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さら〖こ、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン
、アラビアゴム、プルラン、カルナパロウなど力も選ばれる 1種または 2種以上を併用し てもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒ ドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、メチノレヒドロキシェ チルセルロースなどのセルロース系高分子；ポリビュルァセタールジェチルアミノアセ テート、アミノアルキルメタアタリレートコポリマー E〔オイドラギット E (商品名）、ロームフ アルマ社〕、ポリビニルピロリドンなどの合成高分子;プルランなどの多糖類などが挙 げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロー ス フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース アセテートサクシネート、カルボ キシメチルェチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子； メタアクリル酸コポリマー L〔オイドラギット L (商品名）、ロームフアルマ社〕、メタアクリル 酸コポリマー LD〔オイドラギット L- 30D55 (商品名）、ロームフアルマ社〕、メタアクリル酸 コポリマー S〔オイドラギット S (商品名）、ロームフアルマ社〕などのアクリル酸系高分子； セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えばェチルセルロースなどのセルロー ス系高分子;アミノアルキルメタアタリレートコポリマー RS〔オイドラギット RS (商品名）、 ロームフアルマ社〕、アクリル酸ェチル 'メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラ ギット NE (商品名）、ロームフアルマ社〕などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。 上記したコーティング基剤は、その 2種以上を適宜の割合で混合して用いてもょ ヽ 。また、コーティングの際に、例えば酸ィ匕チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用 いてもよい。 [0117] 注射剤は、有効成分を分散剤（例：ポリソルベート 80,ポリオキシエチレン硬化ヒマ シ油 60,ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウム など）、保存剤（例：メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロロブ タノール，フエノールなど）、等張化剤（例:塩ィ匕ナトリウム，グリセリン， D-マン-トール , D-ソルビトール，ブドウ糖など)などと共に水性溶剤（例:蒸留水，生理的食塩水，リ ンゲル液等)あるいは油性溶剤（例:オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油など の植物油、プロピレングリコール等)などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製 造される。この際、所望により溶解補助剤 (例:サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム等 )、安定剤（例：ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例：ベンジルアルコール等)等の添 加物を用いてもよい。注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
[0118] このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例え ば、ヒト、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して投与するこ とがでさる。
本発明の DNAを上記予防'治療剤として使用する場合は、本発明の DNAを単独あ るいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター などの適当な発現ベクター中に挿入した後、常套手段に従って投与することもできる 。また、本発明の DNAは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺 伝子銃ゃノヽイド口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
[0119] RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドの投与量は、投与対象、対象臓器 、症状、投与方法などにより差異はある力 経口投与の場合、例えば糖尿病患者 (体 重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg 、より好ましくは約 1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は 投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場 合であれば、例えば糖尿病常患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程度、好ましくは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を 投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算し た量を投与することができる。
本発明の DNAの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異 はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日 にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1.0〜20mgであ る。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投 与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病常患 者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程度、好ましくは約 0 .l〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与 対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
[0120] 一方、 RAIG2 (または RAIG3)に対する中和抗体 (本発明の中和抗体）は、ダルコ一 スゃ 1,5— AGと RAIG2 (または RAIG3)との相互作用を阻害して RAIG2 (または RAIG3) の関与するシグナル伝達機能、例えば、インスリンや ACTHなどのホルモン分泌調節 活性を不活性化 (すなわち中和）することができる。一方、 RAIG2 (または RAIG3)をコ ードする塩基配列に相補的な塩基配列もしくはその一部を含む核酸 (上述のようにリ ボザィムゃ siRNAを含む；本発明のアンチセンス核酸）は、 RAIG2 (または RAIG3)遺 伝子の転写、転写産物のプロセッシングおよび Zまたは mRNAからの翻訳をブロック することにより、 RAIG2 (または RAIG3)の発現を阻害することができる。従って、（a)本 発明の中和抗体または (b)本発明のアンチセンス核酸を、上記 RAIG2 (または RAIG3) または本発明の DNAとは逆向きの 1)糖'脂質代謝並びに 2)脾臓および Zまたは脳 下垂体機能の調節剤、 3)インスリン分泌抑制および Zもしくは血糖上昇並びに Zま たは ACTH分泌調節剤、 4)糖'脂質代謝異常、脾臓および Zまたは脳下垂体の機能 異常、あるいはインスリン分泌および Zもしくは血糖値並びに Zまたは ACTH分泌異 常が関与する疾患の予防'治療剤などとして使用することができる。上記疾患として、 例えば、肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖 尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂 肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushin g病、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などが挙げられるが、それらに限定されない。
[0121] 本発明の抗体および本発明のアンチセンス核酸は、それぞれ前記 RAIG2 (または R AIG3)またはその部分ペプチドおよび本発明の DNAと同様にして製剤化することが できる。また、該アンチセンス核酸は、そのままで、遺伝子銃ゃノヽイド口ゲル力テーテ ルのようなカテーテルによって投与することもできる。
本発明の抗体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異 はあるが、経口投与の場合、例えば肥満症患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日 にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1.0〜20mgであ る。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投 与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれば、例えば肥満症患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程度、好ましくは約 0.1 〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが好都合である。投与対 象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のアンチセンス核酸の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法な どにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば肥満症患者 (体重 60kgとして）に対 しては、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1. 0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓 器、症状、投与方法などによっても異なる力 例えば注射剤の場合であれば、例えば 肥満症患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程度、好ま しくは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが好都合で ある。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することが できる。
[2]遺伝子診断剤
RAIG2 (または RAIG3)をコードする核酸またはその一部（以下、「本発明のセンス核 酸」という場合がある）および本発明のアンチセンス核酸は、プローブやプライマーと して使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ゥサギ、ヒッジ、 ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）における RAIG2 (または RAIG3)をコードする DNAま たは mRNAの異常 (遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該 DNAまたは mRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該 DNAまたは mRNAの増加あるいは 発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のセンスまたはアンチセンス核酸を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼーシヨンや PCR- SSCP法（ゲノミックス（Genomics) ,第 5卷， 874〜879頁（1989年）、プロシージングズ 'ォブ 'ザ'ナショナル'ァカデミ一' ォブ'サイェンシィズ'ォブ'ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of S ciences of the United States of America) ,第 86卷， 2766〜2770頁（1989年））などに より実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダィゼーシヨン等により RAIG2 (または RAIG3)の発現低下 が検出された場合は、例えば、 RAIG2 (または RAIG3)の機能不全が関与する疾患に 罹患して!/、る可能性が高 、か、あるいは将来罹患する可能性が高 、と診断すること ができる。 RAIG2 (または RAIG3)の機能不全が関与する疾患としては、例えば、糖尿 病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖 尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、 関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げら れる。
また、ノーザンノ、イブリダィゼーシヨン等により RAIG2 (または RAIG3)の発現過多が 検出された場合は、例えば、 RAIG2 (または RAIG3)の過剰発現が関与する疾患に罹 患して 、る可能性が高 、か、あるいは将来罹患する可能性が高 、と診断することが できる。 RAIG2 (または RAIG3)の過剰発現が関与する疾患としては、例えば、肥満、 高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖 尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリ ンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、血栓性疾 患、脂肪毒性、癌などが挙げられる。
[3]RAIG2 (または RAIG3)の発現量を変化させる化合物のスクリーニング
本発明のセンスおよびアンチセンス核酸は、プローブまたはプライマーとして用いる ことにより、 RAIG2 (または RAIG3)の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用 いることがでさる。
すなわち本発明は、例えば、（i)非ヒト哺乳動物の (1)血液、（2)特定の臓器、（3)臓器 から単離した組織もしくは細胞、または (ii)形質転換体等に含まれる RAIG2 (または R AIG3) mRNA量を測定することによる、 RAIG2 (または RAIG3)の発現量を変化させる 化合物のスクリーニング方法を提供する。 [0124] RAIG2 (または RAIG3) mRNA量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、 ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血 圧ラット、動脈硬化ゥサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤 (例えば、抗肥満薬、抗 糖尿病薬、降圧薬、血管作用薬、抗うつ薬など)あるいは物理的ストレス (例えば、浸 水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液 、あるいは特定の臓器 (例えば、脾臓、脳下垂体など）、組織 (例えば、脾島、下垂体 腺組織など)ある!ヽは細胞 (例えば、脾 β細胞、下垂体腺細胞など）を得る。
得られた細胞等に含まれる RAIG2 (または RAIG3) mRNAは、例えば、通常の方法に より該細胞等力 mRNAを抽出し、例えば、 TaqManPCRなどの手法を用いることにより 定量することができ、自体公知の手段によりノーザンプロットを行なうことにより解析す ることちでさる。
(ii) RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の 方法に従って作製し、該形質転換体に含まれる RAIG2 (または RAIG3)またはその部 分ペプチドの mRNAを同様にして定量、解析することができる。
[0125] RAIG2 (または RAIG3)の発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスな どを与える一定時間前 (30分前ないし 24時間前、好ましくは 30分前ないし 12時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前)もしくは一定時間後（30分後ないし 3日後、好 ましくは 1時間後ないし 2日後、より好ましくは 1時間後ないし 24時間後）、または薬剤 あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（30 分後ないし 3日後、好ましくは 1時間後ないし 2日後、より好ましくは 1時間後ないし 24 時間後）、細胞に含まれる RAIG2 (または RAIG3) mRNA量を定量、解析することにより 行なうことができ、（ii)形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中 に混合させ、一定時間培養後（1日後ないし 7日後、好ましくは 1日後ないし 3日後、よ り好ましくは 2日後な ヽし 3日後）、該形質転換体に含まれる RAIG2 (または RAIG3)ま たはその部分ペプチドの mRNA量を定量、解析することにより行なうことができる。
[0126] 上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 RAIG2 (または R AIG3)の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（a) RAIG2 (ま たは RAIG3)の発現量を増加させることにより、 RAIG2 (または RAIG3)とグルコースや 1 ,5-AGとの相互作用を介する細胞刺激活性 (例えば、細胞内 cAMP産生調節、イノシ トールリン酸産生調節、細胞内 Ca2+取り込み、 cGMP産生調節、インスリン分泌促進、 血糖低下、 ACTH分泌調節、食欲調節など)を増強させる化合物、（b) RAIG2 (または RAIG3)の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物であ る。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生 産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物 であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 RAIG2 (または RAIG3)の生理活性を増強 するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 RAIG2 (または RAIG3)の生理活性を減少 させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
RAIG2 (または RAIG3)は前述のとおり、血糖濃度を検知して脾臓からのインスリン分 泌を促進して血糖を低下させ、また、血糖濃度に応じて CRF (コルチコトロピン放出因 子）による ACTH分泌を制御しているので、 RAIG2 (または RAIG3)の発現量を変化さ せる化合物は、 1)糖 ·脂質代謝調節剤、 2)脾臓および Zまたは脳下垂体の機能調 節剤、 3)インスリン分泌および Zもしくは血糖並びに/または ACTH分泌調節剤、 4) 糖'脂質代謝異常、脾臓および Zまたは脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分 泌および Zもしくは血糖値並びに Zまたは ACTH分泌異常が関与する疾患の予防' 治療剤などとして使用することができる。
より具体的には、 RAIG2 (または RAIG3)の発現量を増力！]させる化合物は、糖尿病、 耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病 性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節 症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害の予防，治療剤な どとして使用することができる。一方、 RAIG2 (または RAIG3)の発現量を減少させる化 合物は、肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖 尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂 肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushin g病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌の予防 ·治療剤などとして使用することができる 該化合物を上記医薬として使用する場合は、前記 RAIG2 (または RAIG3)と同様に して製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例え ば、ヒト、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して投与するこ とがでさる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに より差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者 (体重 60kgとして）に対して は、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1.0〜2 Omgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、 症状、投与方法などによっても異なる力 例えば注射剤の場合であれば、例えば糖 尿病患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程度、好まし くは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが好都合であ る。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができ る。
[4]グルコース、 1,5- AGの定量
RAIG2 (または RAIG3)は、グルコースや 1,5_AGに対して結合性を有しているので、 生体内におけるこれらの糖濃度を高感度に定量することができる。
本発明の定量法は、例えば、競合法と組み合わせることによって実施することがで きる。すなわち、被検体を RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドと接触させ ることによって被検体中のグルコースや 1,5-AG濃度を測定することができる。具体的 には、例えば、以下の (1)または (2)などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従 つて用いることができる。
(1)入江寛編「ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭和 49年発行）
(2)入江寛編「続ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭和 54年発行） [0129] [5] RAIG2 (または RAIG3)とグルコースや 1,5-AGとの結合性を変化させる化合物（ァ ゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング
RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを用いる力、または組換え RAIG2 ( または RAIG3)の発現系を構築し、該発現系を用いたァフィユティーアツセィ系を用い ることによって、 RAIG2 (または RAIG3)とリガンドの結合性を変化させる化合物（例え ば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など)または その塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（a) RAIG2 (または RAIG3)を介して細胞刺激活性 (例えば、 共役 G aにおける GTP-GDP交換反応促進、細胞内 cAMP産生調節、イノシトールリ ン酸産生調節、細胞内 Ca2+取り込み、 cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低 下、 ACTH分泌調節、食欲調節など)を有する化合物 (ァゴ二スト）、 (b)該細胞刺激 活性を有しな ヽ化合物（アンタゴニスト）、 (c) RAIG2 (または RAIG3)とリガンドとの結 合力を増強する化合物、あるいは (d) RAIG2 (または RAIG3)とマスクリンとの結合力を 減少させる化合物などが含まれる。
すなわち、本発明は、 (i) RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5-AG)とを接 触させた場合と (ii) RAIG2 (または RAIG3)と、グルコース（または 1,5- AG)および試験 化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、 RAIG2 (または RAIG3) とグルコース (または 1,5- AG)との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー ニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法にぉ 、ては、（i)と（ii)の場合における RAIG2 (または RAIG3 )に対するグルコース (または 1,5-AG)の結合量、細胞刺激活性などを測定して、比 較することを特徴とする。
[0130] より具体的には、本発明は、
(1)標識したグルコース（または 1,5-AG)を RAIG2 (または RAIG3)に接触させた場合と 、標識したグルコース（または 1,5-AG)および試験化合物を RAIG2 (または RAIG3)に 接触させた場合における、標識したグルコース（または 1,5- AG)の RAIG2 (または RAI G3)に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする RAIG2 (または RAIG3)とグ ルコース (または 1,5- AG)との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー- ング方法、
(2)標識したグルコース（または 1,5-AG)を、 RAIG2 (または RAIG3)を産生する細胞ま たはその膜画分に接触させた場合と、標識したグルコース (または 1,5-AG)および試 験化合物を RAIG2 (または RAIG3)を産生する細胞またはその膜画分に接触させた場 合における、標識したグルコース (または 1,5-AG)の該細胞または膜画分に対する結 合量を測定し、比較することを特徴とする RAIG2 (または RAIG3)とグルコース (または 1,5-AG)との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(3)標識したグルコース (または 1,5-AG)を、本発明の DNAを含有する形質転換体を 培養することによって細胞膜上に発現した RAIG2 (または RAIG3)に接触させた場合と 、標識したグルコース (または 1,5-AG)および試験化合物を本発明の DNAを含有する 形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した RAIG2 (または RAIG3)に接 触させた場合における、標識したグルコース（または 1,5-AG)の RAIG2 (または RAIG3 )に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする RAIG2 (または RAIG3)とダルコ ース (または 1,5- AG)との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング 方法、
(4)グルコース（または 1,5-AG)を、 RAIG2 (または RAIG3)を細胞膜上に発現する細胞 に接触させた場合と、グルコース (または 1,5- AG)および試験化合物を、 RAIG2 (また は RAIG3)を細胞膜上に発現する細胞に接触させた場合における、 RAIG2 (または R AIG3)を介した細胞刺激活性 (例えば、共役 G aにおける GTP-GDP交換反応促進、 細胞内 cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内 Ca2+取り込み、 cGMP産 生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、 ACTH分泌調節、食欲調節など)を測定し、 比較することを特徴とする RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5-AG)との結 合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
(5)グルコース (または 1,5- AG)を、本発明の DNAを含有する形質転換体を培養する ことによって細胞膜上に発現した RAIG2 (または RAIG3)に接触させた場合と、ダルコ ース (または 1,5-AG)および試験化合物を、本発明の DNAを含有する形質転換体を 培養することによって細胞膜上に発現した RAIG2 (または RAIG3)に接触させた場合 における、 RAIG2 (または RAIG3)を介する細胞刺激活性 (例えば、共役 G aにおける GTP-GDP交換反応促進、細胞内 cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細 胞内 Ca2+取り込み、 cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、 ACTH分泌調 節、食欲調節など）を測定し、比較することを特徴とする RAIG2 (または RAIG3)とダル コース (または 1,5- AG)との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング 方法を提供する。
[0132] 以下に本発明のスクリーニング方法を具体的に説明する。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる RAIG2 (または RAIG3)としては、上記し た RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを含有するものであれば何れのも のであってもよ!/ヽが、 RAIG2 (または RAIG3)を産生する哺乳動物の臓器の細胞膜画 分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリ 一ユングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来の RAI G2 (または RAIG3)などが適して!/、る。
[0133] RAIG2 (または RAIG3)を製造するには、前述の方法が用いられる力 本発明の DN Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現させることにより行なうことが好ましい。 目的とす る蛋白質部分をコードする DNA断片には cDNAが用いられる力 必ずしもこれに制約 されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成 DNAを用いてもよい。 RAIG2 (また は RAIG3)またはその部分ペプチドをコードする DNA断片を宿主動物（昆虫）細胞に 導入し、それらを効率よく発現させるためには、該 DNA断片を、 SV40由来のプロモー ター、レトロウイノレスのプロモーター、メタ口チォネインプロモーター、ヒトヒートショック プロモーター、サイトメガロウイノレスプロモーター、 SR aプロモーター、昆虫を宿主と するバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス（nuclear polyhedrosis virus ;NPV) のポリヘドリンプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。
したがって、本発明のスクリーニング方法において用いられる RAIG2 (または RAIG3 )は、それ自体公知の方法に従って精製した RAIG2 (または RAIG3)であってもよ 、し 、 RAIG2 (または RAIG3)を産生する細胞またはその細胞膜画分として用いてもよ!、。
[0134] 上記スクリーニング方法において、 RAIG2 (または RAIG3)を産生する細胞を用いる 場合、該細胞をダルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定ィ匕してもよい。固定化方法 はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。 RAIG2 (または RAIG3)を産生する細胞とは、 RAIG2 (または RAIG3)を発現した宿主 細胞をいうが、該宿主細胞としては、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。 前記細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細 胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型 ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーゃポリトロン（Kinematic a社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細 いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画 遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ る。例えば、細胞破砕液を低速（500rpn！〜 3000rpm)で短時間（通常、約 1〜10分)遠 心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm)で通常 30分〜 2時間遠心し、得られ る沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した RAIG2 (または RAIG3)と細胞由 来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
[0135] RAIG2 (または RAIG3)を産生する細胞やその膜画分中の RAIG2 (または RAIG3)の 量は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましぐ 105〜107分子であるのがより好 適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのグルコース (または 1,5-AG)結合 活性 (比活性)が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでな く、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
[0136] RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5-AG)との結合性を変化させる化合 物をスクリーニングする上記の (1)〜(3)を実施するためには、例えば、適当な RAIG2 ( または RAIG3)含有膜画分と標識したグルコース (または 1,5-AG)が必要である。
RAIG2 (または RAIG3)含有膜画分としては、天然型の RAIG2 (または RAIG3)含有 膜画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え RAIG2 (または RAIG3)含有膜画 分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のグルコース (または 1,5-AG)結合 活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したグルコース (または 1,5-AG)としては、常法に従って、例えば〔3H〕、〔1251〕、 〔"C〕、などで標識されたものが用いられる。
具体的には、 RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5-AG)との結合性を変 化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まず RAIG2 (または RAIG3)を産生す る細胞またはその膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより R AIG2 (または RAIG3)標品を調製する。ノ ッファーは、 !"[4〜10 (望ましくは 1"[6〜8) のリン酸バッファー、トリス一塩酸バッファーなどの RAIG2 (または RAIG3)とグルコース (または 1,5-AG)との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非 特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Tween-80™ (花王 アトラス社)、ジギトニ ン、デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーにカ卩えることもできる。さらに、プ 口テアーゼによるレセプターの分解を抑える目的で PMSF、ロイぺプチン、 E-64 (ぺプ チド研究所製）、ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0.0 l〜10mlの RAIG2 (または RAIG3)懸濁液に、一定量（5000cpn！〜 500000cpm)の標識 したグルコース（または 1,5-AG)を添カ卩し、同時に 10— 4 ！〜 10— 1QMの試験化合物を共 存させる。非特異的結合量 (NSB)を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた 反応チューブも用意する。反応は約 0°Cから 50°C、望ましくは約 4°Cから 37°Cで、約 20 分力も 24時間、望ましくは約 30分から 3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過 し、適量の同ノ ッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体 シンチレーシヨンカウンターまたは γ -カウンターで計測する。拮抗する物質がない場 合のカウント (Β )から非特異的結合量 (NSB)を引いたカウント（B -NSB)を 100%とし
0 0
た時、特異的結合量 (B-NSB)が、例えば、 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害 能力のある候補物質として選択することができる。
RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5-AG)との結合性を変化させる化合 物をスクリーニングする上記の (4)〜(5)の方法を実施するためには、例えば、 RAIG2 ( または RAIG3)を介する細胞刺激活性 (例えば、共役 Gひにおける GTP-GDP交換反 応促進、細胞内 cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内 Ca2+取り込み、 cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、 ACTH分泌調節、食欲調節など)を 公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、 RAIG2 (または RAIG3)を産生する細胞をマルチウヱルプレート 等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては、前もって新鮮な培地あるいは細 胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時 間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清を回収して、生成した産物をそれ ぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質の生成力 細胞が 含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添カロ してアツセィを行なってもよい。また、 cAMP産生抑制などの活性については、フオル スコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用 として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 RAIG2 (または RAIG3)を膜 上に発現した適当な細胞が必要である。 RAIG2 (または RAIG3)を発現した細胞として は、天然型の RAIG2 (または RAIG3)を産生する細胞株、前述の組換え RAIG2 (または RAIG3)類を発現した細胞株などが望ま ヽ。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合 物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これ ら化合物は新規な化合物であってもよ 、し、公知の化合物であってもよ 、。
RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5-AG)の結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング用キットは、 RAIG2 (または RAIG3)、 RAIG2 (または RAI G3)を産生する細胞またはその膜画分などを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
1.スクリーニング用試薬
(1)測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコネ土製）に、 0.05%のゥシ血清アルブミン（シグ マ社製）をカ卩えたもの。
孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、あるいは用時調製して も良い。
(2) RAIG2 (または RAIG3)標品
RAIG2 (または RAIG3)を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 Z穴で 継代し、 37°C、 5%CO、 95%airで 2日間培養したもの。
2
(3)標識グルコース（または 1,5- AG)
市販の〔3H〕、 〔12¾、〔"C〕などで標識したグルコース (または 1,5- AG) 水溶液の状 態のものを 4°Cあるいは- 20°Cにて保存し、用時に測定用緩衝液にて 1 μ Μに希釈す る。
(4)ダルコース（または 1 ,5-AG)標準液
マスクリンを 0.1%ゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む PBSで ImMとなるように溶 解し、 -20°Cで保存する。
[0139] 2.測定法
(1) 12穴組織培養用プレートにて培養した RAIG2 (または RAIG3)発現 CHO細胞を、測 定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴にカ卩える。
(2) 10— 3〜 10— 1QMの試験化合物溶液を 5 μ 1カ卩えた後、標識マスクリン類を 5 μ 1加え、室 温にて 1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに 10— 3Μのマスクリン標準液を 5 μ 1加えておく。
(3)反応液を除去し、 lmlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。細胞 (またはプレート）に結 合した標識マスクリン類を 0.2N NaOH-1% SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレ一ター A (和光純薬製)と混合する。
(4)液体シンチレーシヨンカウンター（ベックマン社製)を用いて放射活性を測定し、 Pe rcent Maximum Binding (PMB)を次の式〔数 1〕で求める。
[0140] 〔数 1〕
PMB=[(B-NSB)/(B— NSB)] X 100
0
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量）
B ：最大結合量
0
[0141] 別の好ましい一実施態様においては、 RAIG2 (または RAIG3)を細胞膜上に発現す る細胞はさらに共役する G aを発現する。 RAIG2 (または RAIG3)とそれぞれ共役する G o;のファミリ一は、リガンドであるグルコース（または 1,5- AG)を作用させた場合に、 R AIG2 (または RAIG3)のシグナル伝達作用が活性ィ匕されるか否かを検定することによ り、同定することができる。好ましくは、 RAIG2 (または RAIG3)およびその共役 G αを 発現する細胞としては、本発明の DNAおよび該共役 G aをコードする DNAをコトラン スフェクトされた形質転換細胞が挙げられる。 グルコース（または 1,5-AG)が RAIG2 (または RAIG3)に結合すると、該受容体の G a 活性ィ匕ドメインと共役 G aの受容体結合領域とが相互作用して G aのコンフオメーショ ン変化を生じ、 GTP/GDP結合領域力 GDPが解離して速やかに GTPを結合する。 G ひ- GTPは効果器に作用してその活性を促進または抑制する。一方、アンタゴニスト が結合すると、受容体のコンフオメーシヨン変化が起こらず G α活性ィ匕ドメインは不活 性ィ匕状態にあるので、活性ィ匕型の G o; -GTPレベルが減少し、効果器への作用が阻 害される。ここで、 GTPの代わりに、例えば、 3 標識した GTP y S等の G aの GTPase活 性によって加水分解を受けない GTPアナログを系に添加しておけば、試験化合物の 存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定 '比較することにより、 Gひにお ける GDP-GTP交換反応に及ぼす試験化合物の効果を評価することができ、 RAIG2 ( または RAIG3)のァゴニスト Zアンタゴニスト活性を有する物質をスクリーニングするこ とができる。即ち、試験化合物の存在下で放射活性が増加すれば、該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対するァゴニスト活性を有し、放射活性が減少すれば、該試 験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対するアンタゴニスト活性を有する。
[0142] 別の好まし ヽー実施態様にお!ヽては、 RAIG2 (または RAIG3)と共役 G aとの共発現 系において、該 G aと相互作用する効果器の活性を、試験化合物の存在下及び非 存在下で比較することを特徴とするスクリーニング方法が提供される。したがって、 RA IG2 (または RAIG3)およびその共役 G aを発現する細胞はまた、該 G aからのシグナ ルを受容する効果器をさらに発現する。 Gファミリーに属する G a (G a )は、アデ- ル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、 G a 〜Gひ
s— 1 s
、あるいは G 等が挙げられる。 Gファミリーに属する G a (G a )は、アデ-ル酸シク
-4 olf i i
ラーゼを効果器とし、その活性を抑制するものであり、例えば、 G a 〜G a 、あるい i-1 i-3 は G等が挙げられる。 Gファミリーに属する G a (G a )は、ホスホリパーゼ Cを効果器 とし、その活性を促進するものであり、例えば、 Gあるいは G 等が挙げられる。
q 16
[0143] 効果器としてアデ-ル酸シクラーゼ（以下、 ACともいう）を含むスクリーニング系に おいては、 Gひの効果器への作用は、 AC活性を直接測定することにより評価するこ とができる。 AC活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよぐ例えば、 ACを 含む膜画分に ATPを添カ卩し、生成する cAMP量を、抗 cAMP抗体を用いて RI (例えば 、 1)、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ等）、蛍光物質 (例 えば、 FITC、ローダミン等)等で標識した cAMPとの競合ィムノアッセィにより測定す る方法や、 ACを含む膜画分に [ α -32Ρ]ΑΤΡを添加し、生成する [32P] cAMPをアルミ ナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法等が挙げられるが、これに限定 されない。共役 G o;が G o;の場合、試験化合物の存在下及び非存在下で AC活性を 測定'比較し、試験化合物存在下で AC活性が増加すれば該試験化合物は RAIG2 ( または RAIG3)に対するァゴ-スト活性を有し、反対に AC活性が減少すれば、該試 験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対するアンタゴニスト活性を有する。一方、共役 G αが G αの場合は、試験化合物存在下で AC活性が増加すれば該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対するアンタゴ-スト活性を有し、反対に AC活性が減少す れば、該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対するァゴニスト活性を有する。 スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、 G aの ACへの作用は、細胞 内の cAMP量を測定する力、あるいは細胞を [3H]アデニンで標識し、生成した [3H] c AMPの放射活性を測定することによつても評価することができる。細胞内 cAMP量は、 試験化合物の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞 を破砕して得られる抽出液について、上記の競合ィムノアツセィを実施することにより 測定することができる力 公知の他のいかなる方法も使用することができる。
別の態様として、 cAMP量を cAMP応答エレメント（CRE)の制御下にあるリポーター 遺伝子の発現量を測定することにより評価する方法もある。即ち、 CREを含むプロモ 一ターの下流にリポーター蛋白質（例えば、ルシフェラーゼ、 GFP、ペルォキシダー ゼ、アルカリホスファターゼ等）をコードする DNAを連結した発現カセットを含むベクタ 一を導入された真核細胞を、試験化合物の存在下及び非存在下で適当な時間培養 し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法 を用いて測定 ·比較することにより、細胞内 cAMP量を評価するというものである。 従って、共役 G o;が G o;の場合、試験化合物の存在下で細胞内 cAMP量 (もしくは
CRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該試験化合物は RAI G2 (または RAIG3)に対するァゴ-スト活性を有し、反対に cAMP量 (もしくはリボータ 一遺伝子の発現量）が減少すれば、該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対す るアンタゴ-スト活性を有する。一方、共役 G aが G の場合、試験化合物の存在下 で細胞内 cAMP量 (もしくは CRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加す れば、該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対するアンタゴ-スト活性を有し、反 対に cAMP量 (もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対するァゴ-スト活性を有する。
[0145] 一方、効果器としてホスホリパーゼ C (以下、 PLCとも 、う）を含むスクリーニング系（ 即ち、共役 G aポリペプチドが G aの場合）においては、 G aの効果器への作用は、 PLC活性を直接測定することにより評価することができる。 PLC活性は、例えば、 [3H ]標識したホスファチジルイノシトール- 4,5-二リン酸を PLC含有膜画分に添加し、生 成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価すること ができる。試験化合物の存在下及び非存在下で PLC活性を測定 ·比較し、試験化合 物存在下で PLC活性が増加すれば、該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対す るァゴニスト活性を有し、反対に PLC活性が減少すれば、該試験化合物は RAIG2 (ま たは RAIG3)に対するアンタゴニスト活性を有する。
[0146] スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、 G aの PLCへの作用は、細 胞に [3H]標識イノシトールを添加し、生成した [3H]標識イノシトールリン酸の放射活 性を測定したり、細胞内の Ca2+量を測定することによつても評価することができる。細 胞内 Ca2+量は、試験化合物の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュべ ートした後、蛍光プローブ（fora- 2、 indo- 1、 fluor- 3、 Calcium-Green I等）を用いて分 光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるェクオリン等を用いて測 定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを 用いた分光学的測定に適した装置として、 FLIPR (Molecular Devices社)システムが 挙げられる。
[0147] 別の態様として、 Ca2+によりアップレギュレートされる TPA (12-0-テトラデカノィルホ ルポール- 13-アセテート)応答エレメント (TRE)の制御下にあるリポーター遺伝子の 発現量を測定することにより Ca2+量を評価する方法もある。即ち、 TREを含むプロモー ターの下流にリポーター蛋白質（例えば、ルシフェラーゼ、 GFP、ペルォキシダーゼ、 アルカリホスファターゼ等）をコードする DNAを連結した発現カセットを含むベクターを 導入された真核細胞を、試験化合物の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、 細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用 いて測定 ·比較することにより、細胞内 Ca2+量を評価するというものである。
従って、試験化合物の存在下で細胞内 Ca2+量 (もしくは TRE制御下にあるリボータ 一遺伝子の発現量）が増加すれば、該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対す るァゴニスト活性を有し、反対に細胞内 Ca2+量 (もしくはリポーター遺伝子の発現量） が減少すれば、該試験化合物は RAIG2 (または RAIG3)に対するアンタゴニスト活性 を有する。
[0148] G aおよび G aポリペプチドの ACと相互作用する領域 (C末端の約 5アミノ酸程度） を G o;の配列に置換したキメラ G o;を真核細胞で発現させることにより、 RAIG2 (また は RAIG3)の共役 G aにかかわらず、効果器としてホスホリパーゼ Cを用いて、 RAIG2 (または RAIG3)のァゴ-スト Zアンタゴ-ストをスクリーニングすることができる。
[0149] 別の好ま 、一実施態様にぉ 、ては、上記特許文献 1に記載されるようにして、 RAI G2 (または RAIG3)の C末端側に共役 G aを連結した融合蛋白質を、哺乳動物細胞 や昆虫細胞などの宿主真核細胞で発現させることにより、 RAIG2 (または RAIG3)を恒 常的に活性ィ匕することができる。この場合、グルコースや 1,5— AGなどのリガンドを用 いることなぐァゴニスト、インバースァゴニストをスクリーニングすることが可能である。
[0150] また、別の好ま 、一実施態様にぉ 、ては、宿主細胞として酵母 (例えば、パン酵 母など）が用いられる。酵母は唯一の GPCRとして接合フェロモン a因子の受容体で ある STE2を有する。リガンドの刺激を受けると、 STE2は共役 G o;である GPA1を活性 化して G β /G yと解離する。解離した G β /G y力ものキナーゼカスケードシグナルに より FUS1の発現が誘導され、接合が起こる。ここで STE2を破壊して、代わりに RAIG2 ( または RAIG3)を酵母で発現させ、さらに GPA1プロモーターの制御下に RAIG2 (また は RAIG3)の共役 G aを共発現させれば、グルコース（または 1,5— AG)の刺激により R AIG2 (または RAIG3)があた力も STE2と同様に細胞内シグナル伝達を媒介する。ここ で GPA1プロモーターの制御下に RAIG2 (または RAIG3)と共役する G aを共発現させ 、さらに FUS1に栄養要求性変異を相補する遺伝子やレポーター遺伝子 (例えば、 La cZ)などを融合させれば、容易にシグナルの活性ィ匕を検出することができる。この方 法の詳細については、例えば、 Yeast, 16: 11-22 (2000)等に記載されている。
[0151] 上述の通り、 RAIG2 (または RAIG3)はグルコース（または 1,5— AG)濃度を検知して 、脾 j8細胞力 のインスリン分泌を促進し、また、脳下垂体細胞力 の CRF刺激によ る ACTH分泌を制御している。したがって、 RAIG2 (または RAIG3)を強制発現させた インスリン分泌細胞や ACTH分泌細胞をグルコース (または 1,5— AG)存在下で培養 した場合と、グルコース (または 1,5— AG)および試験化合物の存在下で培養した場 合とで、インスリン分泌または ACTH分泌を比較することにより、 RAIG2 (または RAIG3 )のァゴ-ストおよびアンタゴ-ストをスクリーニングすることができる。
試験化合物の存在下にインスリン分泌が促進された場合には、該試験化合物を RA IG2 (または RAIG3)のァゴ-ストとして、反対にインスリン分泌が阻害された場合には 、該試験化合物を RAIG2 (または RAIG3)のアンタゴニストとして、それぞれ選択するこ とができる。一方、低グルコース (または 1,5— AG)濃度において、試験化合物の存在 下で ACTH分泌が促進された場合は、該試験化合物を RAIG2 (または RAIG3)のァゴ 二ストとして、反対に ACTH分泌が阻害された場合は、該試験化合物を RAIG2 (また は RAIG3)のアンタゴニストとして、それぞれ選択することができる。また、高ダルコ一 ス (または 1,5— AG)濃度において、試験化合物の存在下で ACTH分泌が阻害された 場合は、該試験化合物を RAIG2 (または RAIG3)のァゴニストとして、反対に ACTH分 泌が促進された場合は、該試験化合物を RAIG2 (または RAIG3)のアンタゴニストとし て、それぞれ選択することができる。
[0152] 上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物また はその塩は、 RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5— AG)との結合性を変化 させる作用を有する化合物であり、具体的には、（a)グルコース (または 1,5— AG)— R AIG2 (または RAIG3)相互作用を介して細胞刺激活性 (例えば、共役 G aにおける GT P-GDP交換反応促進、細胞内 cAMP産生調節、イノシトールリン酸産生調節、細胞内 Ca2+取り込み、 cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下、 ACTH分泌調節、食 欲調節など)を有する化合物 (ァゴ二スト）、 (b)該細胞刺激活性を有しな!/ヽ化合物（ アンタゴ-スト）、 (c) RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5— AG)との結合力 を増強する化合物、あるいは（d) RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5—AG )との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生 産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物 であってもよい。
RAIG2 (または RAIG3)に対するァゴニストは、 RAIG2 (または RAIG3)に対するダルコ ース (または 1,5— AG)が有する生理活性と同様の作用を有しているので、グルコース (または 1,5— AG)活性を増強する安全で低毒性な医薬として有用である。 RAIG2 (ま たは RAIG3)に対するアンタゴニストは、 RAIG2 (または RAIG3)に対するグルコース（ または 1,5— AG)が有する生理活性を抑制することができるので、グルコース (または 1 ,5— AG)活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。 RAIG2 (または RAI G3)とグルコース（または 1,5— AG)との結合力を増強する化合物は、 RAIG2 (または R AIG3)に対するグルコース (または 1,5— AG)が有する生理活性を増強するための安 全で低毒性な医薬として有用である。 RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5 -AG)との結合力を減少させる化合物は、 RAIG2 (または RAIG3)に対するダルコ一 ス (または 1,5— AG)が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬とし て有用である。
[6] RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1 ,5— AG)との結合性を変化させる化 合物 (ァゴ二スト、アンタゴニスト)を含有する各種疾患の予防'治療剤
RAIG2 (または RAIG3)は前述のとおり、グルコース（または 1,5— AG)の受容体とし て機能し、血糖濃度を検知して脾臓におけるインスリン分泌を促進し、脳下垂体にお ける CRF刺激による ACTH分泌をグルコース濃度に応じて調節して 、る。したがって、 RAIG2 (または RAIG3)とグルコース（または 1,5— AG)との結合性を変化させる化合物 (ァゴ二スト、アンタゴ-スト)は、 1)糖'脂質代謝調節剤、 2)脾臓および Zまたは脳下 垂体の機能調節剤、 3)インスリン分泌および Zもしくは血糖並びに Zまたは ACTH分 泌調節剤、 4)糖'脂質代謝異常、脾臓および Zまたは脳下垂体の機能異常、あるい はインスリン分泌および Zもしくは血糖値並びに Zまたは ACTH分泌異常が関与する 疾患の予防'治療剤などとして使用することができる。
より具体的には、 RAIG2 (または RAIG3)のァゴニストは、糖尿病、耐糖能異常、ケト 一シス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂 血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、 動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害の予防'治療剤などとして使用す ることができる。一方、 RAIG2 (または RAIG3)のアンタゴ-ストは、肥満、高脂血症、 2 型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜 症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー 、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性 および癌の予防 ·治療剤などとして使用することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例え ば、ヒト、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して投与するこ とがでさる。
RAIG2 (または RAIG3)のァゴ-ストの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与 方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者 (体重 60kgとして )に対しては、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好ましく は約 1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、症状、投与方法などによっても異なる力 例えば注射剤の場合であれば、 例えば糖尿病患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程 度、好ましくは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが好 都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与する ことができる。
RAIG2 (または RAIG3)のアンタゴニストの投与量は、、投与対象、対象臓器、症状、 投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば肥満症患者 (体重 60kg として）に対しては、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好 ましくは約 1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対 象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の場合であれ ば、例えば肥満症患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg 程度、好ましくは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが 好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与す ることがでさる。
[0155] [7] RAIG2 (または RAIG3)の定量
本発明の抗体は、 RAIG2 (または RAIG3)を特異的に認識することができるので、被 検液中の RAIG2 (または RAIG3)の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量な どに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、（i)本発明の抗体と、被検 液および標識化蛋白質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化蛋白質 等の割合を測定することを特徴とする被検液中の RAIG2 (または RAIG3)の定量法、 (i i)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体と を同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定する ことを特徴とする被検液中の RAIG2 (または RAIG3)の定量法を提供する。
上記 (ii)にお 、ては、不溶ィ匕抗体と標識ィ匕抗体とが互いに RAIG2 (または RAIG3)と の結合を妨害しな 、ような抗原認識部位を有することが好まし 、（例えば、一方の抗 体が RAIG2 (または RAIG3)の N端部を認識し、他方の抗体が RAIG2 (または RAIG3) の C端部に反応する等)。
[0156] RAIG2 (または RAIG3)に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナ ル抗体と称する場合がある）を用いて RAIG2 (または RAIG3)の測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを 用いてもよぐまた、抗体分子の F(ab')、 Fab'、あるいは Fab画分を用いてもよい。 RAI
2
G2 (または RAIG3)に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではな ぐ被測定液中の抗原量 (例えば、 RAIG2 (または RAIG3)量）に対応した抗体、抗原 もしくは抗体—抗原複合体の量をィ匕学的または物理的手段により検出し、これを既 知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、ィムノメトリック法お よびサンドイッチ法が好適に用いられる力 感度、特異性の点で、後述するサンドイツ チ法を用いるのが特に好ま 、。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、 酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔12 ¾、〔131I〕、 〔3H〕、 〔"C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大き なものが好ましぐ例えば、 j8 -ガラクトシダーゼ、 j8 -ダルコシダーゼ、アルカリフォス ファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質とし ては、例えば、フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる 。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲ- ンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン アビ ジン系を用いることもできる。
[0157] 抗原あるいは抗体の不溶ィ匕に当っては、物理吸着を用いてもよぐまた通常、蛋白 質あるいは酵素等を不溶化、固定ィ匕するのに用いられる化学結合を用いる方法でも よい。担体としては、例えば、ァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖 類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコーン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用 いられる。
サンドイッチ法においては不溶ィ匕した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反 応させ（1次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ (2次 反応)た後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の RAIG2 ( または RAIG3)量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行なって も、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不 溶ィ匕の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなぐ測定感度を向上させる等の目 的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもょ 、。
サンドイッチ法による RAIG2 (または RAIG3)の測定法にぉ 、ては、 1次反応と 2次反 応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は RAIG2 (または RAIG3)との結合にか 力る部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、 1次反応および 2次反応に用 いられる抗体は、例えば、 2次反応で用いられる抗体力 RAIG2 (または RAIG3)の C 端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、好ましくは C端部以外、例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
[0158] 本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合 法、ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標 識抗原と (F)と抗体と結合した標識抗原 (B)とを分離し (BZF分離)、 B, Fいずれカゝ の標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶 性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第 2抗体など を用いる液相法、および、第 1抗体として固相化抗体を用いる力 あるいは、第 1抗体 は可溶性のものを用い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。 ィムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に 対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過 剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固 相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定 し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不 溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか 得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に 用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を RAIG2 (または RAIG3)の定量に適用するにあたつ ては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常 の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮をカ卩えて RAIG2 (または RAIG3)の測 定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書 などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭 和 49年発行)、入江 寛編「続ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭和 54年発行)、石川 栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和 53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫 測定法」（第 2版）（医学書院、昭和 57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 3版）（医学書院、昭和 62年発行）、「メソッズ'イン'ェンジモノジー（Methods in ENZY MOLOGY)」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))ゝ同書 Vol. 73 (Immuno chemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)) 、 |P]書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))^ |PJ 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and Genera 1 Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybr idoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、アカデミックプレス社発行)な ど参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、 RAIG2 (または RAIG3)を高感度 に定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での RAIG2 (または RAIG3)を定量すること によって、 RAIG2 (または RAIG3)の機能不全もしくは亢進に関連する各種疾患の診 断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する RAIG2 (または RAI G3)を特異的に検出するために使用することができる。また、 RAIG2 (または RAIG3) を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の RAIG2 (または R AIG3)の検出、被検細胞内における RAIG2 (または RAIG3)の挙動の分析などに使用 することができる。
[8]細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化合物のスクリーニング 本発明の抗体は、 RAIG2 (または RAIG3)を特異的に認識することができるので、細 胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化合物のスクリーニングに用い ることがでさる。
すなわち本発明は、例えば、
(i)非ヒト哺乳動物の (1)血液、（2)特定の臓器、（3)臓器力 単離した組織もしくは細胞 等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる RAIG2 (または RAIG3 )を定量することによる、細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化 合物のスクリーニング方法、
(ii) RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を破壊 した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる RAIG2 (または RAIG3)を定量 することによる、細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化合物のス クリーニング方法、
(iii)非ヒト哺乳動物の (1)血液、（2)特定の臓器、（3)臓器力 単離した組織もしくは細 胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での RAIG2 (または R AIG3)の染色度合いを定量ィ匕することにより、細胞膜上の RAIG2 (または RAIG3)を確 認することによる、細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化合物の スクリーニング方法、
(iv) RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片 とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での RAIG2 (または RAIG3)の染 色度合いを定量ィ匕することにより、細胞膜上の RAIG2 (または RAIG3)を確認すること による、細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化合物のスクリー- ング方法を提供する。
[0161] 細胞膜画分に含まれる RAIG2 (または RAIG3)の定量は具体的には以下のようにし て行なう。
(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、 ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血 圧ラット、動脈硬化ゥサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤 (例えば、抗肥満薬、抗 糖尿病薬、降圧剤、血管作用薬、抗うつ薬など)あるいは物理的ストレス (例えば、浸 水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液 、あるいは特定の臓器 (例えば、脾臓、脳下垂体など）、組織 (例えば、膝島など)ある いは細胞 (例えば、脾 j8細胞、下垂体腺細胞など）を得る。得られた細胞等を、例え ば、適当な緩衝液 (例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、 HEPES緩衝液など）等 に懸濁し、界面活性剤 (例えば、トリトン X- 100™、ツイーン 20™など)などを用いて該 細胞等を破壊し、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画 分を得る。
[0162] 細胞膜画分とは、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多 く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Potter—Elvehjem型ホモジナ ィザ一で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーゃポリトロン（Kinematica社製）に よる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルか ら噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法 や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、 細胞破砕液を低速 (500rpn！〜 3000rpm)で短時間（通常、約 1〜10分)遠心し、上清を さらに高速（15000rpm〜30000rpm)で通常 30分〜 2時間遠心し、得られる沈澱を膜画 分とする。該膜画分中には、 RAIG2 (または RAIG3)と細胞由来のリン脂質や膜蛋白 質などの膜成分が多く含まれる。
[0163] 細胞膜画分に含まれる RAIG2 (または RAIG3)は、例えば、本発明の抗体を用いた サンドイッチ免疫測定法、ウェスタンプロット解析などにより定量することができる。 力かるサンドイッチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことができ、ウェス タンプロットは自体公知の手段により行なうことができる。
[0164] (ii) RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の 方法に従って作製し、細胞膜画分に含まれる RAIG2 (または RAIG3)を定量すること ができる。
[0165] 細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化合物のスクリーニングは
(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスな どを与える一定時間前 (30分前ないし 24時間前、好ましくは 30分前ないし 12時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前)もしくは一定時間後（30分後ないし 3日後、好 ましくは 1時間後ないし 2日後、より好ましくは 1時間後ないし 24時間後）、または薬剤 あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（30 分後ないし 3日後、好ましくは 1時間後ないし 2日後、より好ましくは 1時間後ないし 24 時間後）、細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を定量することにより行なうこと ができ、
(ii)形質転換体を常法に従 ヽ培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定 時間培養後（1日後な 、し 7日後、好ましくは 1日後な 、し 3日後、より好ましくは 2日後 ないし 3日後）、細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を定量することにより行な うことができる。
[0166] 細胞膜画分に含まれる RAIG2 (または RAIG3)の確認は、具体的には以下のように して行なう。
(iii)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、 ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血 圧ラット、動脈硬化ゥサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤 (例えば、抗肥満薬、抗 糖尿病薬、降圧剤、血管作用薬、抗うつ薬など)あるいは物理的ストレス (例えば、浸 水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液 、あるいは特定の臓器 (例えば、脾臓、脳下垂体など）、組織 (例えば、膝島など)ある いは細胞 (例えば、脾 j8細胞、下垂体腺細胞など）を得る。得られた細胞等を、常法 に従って組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での RAIG 2 (または RAIG3)の染色度合!/、を定量ィ匕することによって、細胞膜上の RAIG2 (また は RAIG3)を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜における RAIG2 (ま たは RAIG3)の量を確認することができる。
(iv) RAIG2 (または RAIG3)またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を用い て同様の手段をとることにより確認することもできる。
[0167] 上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（a )細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を増加させることにより、グルコース（また は 1,5— AG)— RAIG2 (または RAIG3)相互作用を介する細胞刺激活性 (例えば、共 役 G αにおける GTP-GDP交換反応促進、細胞内 cAMP産生調節、イノシトールリン 酸産生調節、細胞内 Ca2+取り込み、 cGMP産生調節、インスリン分泌促進、血糖低下 、 ACTH分泌調節、食欲調節など)を増強させる化合物、（b)細胞膜における RAIG2 ( または RAIG3)の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物で ある。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生 産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物 であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 RAIG2 (または RAIG3)の生理活性を増強 するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 RAIG2 (または RAIG3)の生理活性を減少 させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
[0168] [9]細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化合物を含有する各種 疾患の予防'治療剤
RAIG2 (または RAIG3)は前述のとおり、グルコース（または 1,5— AG)の受容体とし て機能し、血糖濃度を検知して脾臓におけるインスリン分泌を促進し、脳下垂体にお ける CRF刺激による ACTH分泌をグルコース濃度に応じて調節して 、る。したがって、 細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を変化させる化合物は、 1)糖'脂質代謝 調節剤、 2)脾臓および Zまたは脳下垂体の機能調節剤、 3)インスリン分泌および Z もしくは血糖並びに Zまたは ACTH分泌調節剤、 4)糖'脂質代謝異常、脾臓および Zまたは脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌および Zもしくは血糖値並び に Zまたは ACTH分泌異常が関与する疾患の予防'治療剤などとして使用することが できる。
より具体的には、細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を増力！]させる化合物は 、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎 症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚 疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害の予防 •治療剤などとして使用することができる。一方、細胞膜における RAIG2 (または RAIG 3)の量を減少させる化合物は、肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖 尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群 、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食 障害、うつ病、 Cushing病、血栓性疾患、脂肪毒性および癌の予防，治療剤などとし て使用することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例え ば、ヒト、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して投与するこ とがでさる。
細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を増加させる化合物の投与量は、投与 対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば 糖尿病患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましく は約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、そ の 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え ば注射剤の場合であれば、例えば糖尿病患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日に つき通常約 0.01〜30mg程度、好ましくは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当た りに換算した量を投与することができる。
細胞膜における RAIG2 (または RAIG3)の量を減少させる化合物の投与量は、投与 対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、例えば 肥満症患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましく は約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、そ の 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え ば注射剤の場合であれば、例えば肥満症患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日に つき通常約 0.01〜30mg程度、好ましくは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当た りに換算した量を投与することができる。
[10]RAIG2 (または RAIG3)をコードする DNAを有する非ヒトトランスジエニック動物の 作製
本発明は、外来性の RAIG2 (または RAIG3)をコードする DNA (以下、「本発明の外 来性 DNA」と略記する）またはその変異 DNA (「本発明の外来性変異 DNA」と略記す る場合がある)を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔1〕本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
〔2〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔1〕記載の動物、
〔3〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔2〕記載の動物、および
〔4〕本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、哺乳動物にお!/、て発現しう る組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明 の DNA転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含 む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階 (さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞期以前）に 、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフエクシヨン法、凝集法、マイクロインジエタ シヨン法、パーティクルガン法、 DEAE-デキストラン法などにより目的とする DNAを転 移することによって作出することができる。また、該 DNA転移方法により、体細胞、生 体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、細胞培養、組 織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知 の細胞融合法により融合させることにより本発明の DNA転移動物を作出することもで きる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モル モット、ノ、ムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の 作成の面力 個体発生および生物サイクルが比較的短ぐまた、繁殖が容易なゲッ 歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、 C57BL/6系統， DBA2系統など、交雑 系として、 B6C3F系統， BDF系統， B6D2F系統， BALB/c系統， ICR系統など）また
1 1 1
はラット（例えば、 Wistar, SDなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる糸且換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の 非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNAではな く、いったん哺乳動物力も単離 '抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、元の本発明の DNAの塩基配列に変異 (例えば、突然 変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠失、他の塩基への置換などが 生じた DNAなどが用いられ、また、異常 DNAも含まれる。
該異常 DNAとしては、異常な RAIG2 (または RAIG3)を発現させる DNAを意味し、例 えば、正常な RAIG2 (または RAIG3)の機能を抑制する蛋白質等を発現させる DNAな どが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物 由来のものであってもよい。本発明の DNAを対象動物に転移させるにあたっては、該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DNAコンストラクトとし て用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒト DNAを転移させる場合、これ と相同性が高い本発明の DNAを有する各種哺乳動物（例えば、ゥサギ、ィヌ、ネコ、 モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の DNAを発現させうる各種プロモータ 一の下流に、本発明のヒト DNAを結合した DNAコンストラクト（例：ベクターなど）を対 象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによ つて本発明の DNAを高発現する DNA転移哺乳動物を作出することができる。
本発明の DNAを担持させる発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草 菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバタテリオファージ、モ 口-一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルス などの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由 来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（1)ウィルス (例：シミア ンウィルス、サイトメガロウィルス、モロ-一マウス白血病ウィルス、 JCウィルス、乳癌ゥ ィルス、ポリオウイルスなど）に由来する DNAのプロモーター、（2)各種哺乳動物（ヒト、 ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、 例えば、アルブミン、インスリン II、ゥロプラキン II、エラスターゼ、エリスロポエチン、ェ ンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、ダルタチオン S-トランス フェラーゼ、血小板由来成長因子 |8、ケラチン Kl , K10および Κ14、コラーゲン I型お よび II型、サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ β Iサブユニット、ジストロフィン、酒石 酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチ口 シンキナーゼ（一般に Tie2と略される）、ナトリウム 'カリウム- ΑΤΡァーゼ（Na, K-ATPa se)、ニューロフィラメント軽鎖、メタ口チォネイン Iおよび ΠΑ、メタ口プロティナーゼ 1組 織インヒビター、 MHCクラス I抗原（Η- 2L)、 Η- ras、レニン、ドーノ ミン j8 -水酸化酵素 、甲状腺ペルォキシダーゼ (TPO)、ペプチド鎖延長因子 1 a (EF-1 α ) βァクチン、 aおよび j8ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖 1および 2、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリ ン、 Thy-1、免疫グロブリン、 H鎖可変部（VNP)、血清アミロイド Pコンポーネント、ミオ グロビン、トロポ-ン C、平滑筋 αァクチン、プレプロエンケフアリン Α、バソプレシンな どのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイト メガロウイノレスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子 1 a (EF-1 α )のプロモーター、 ヒトおよび-ヮトリ βァクチンプロモーターなどが好適である。 上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RNAの転写 を終結する配列（一般にターミネタ一と呼ばれる）を有していることが好ましぐ例えば 、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用いることができ、好まし くは、シミアンウィルスの SV40ターミネタ一などが用いられる。
その他、目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプライシン グシグナル、ェンハンサー領域、真核 DNAのイントロンの一部などをプロモーター領 域の 5'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3'下流に連結する ことも目的により可能である。
正常な RAIG2 (または RAIG3)の翻訳領域は、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ゥサギ、 ィヌ、ネコ、モルモット、ノ、ムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、脂肪組織 、筋肉由来 DNAおよび巿販の各種ゲノム DNAライブラリーよりゲノム DNAの全てある いは一部として、または前記臓器または組織由来の RNAより公知の方法により調製さ れた cDNAを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常 DNAは、上記の 細胞または組織より得られた正常な RAIG2 (または RAIG3)の翻訳領域を点突然変異 誘発法により変異させた翻訳領域を作製することによって得ることができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、前記のプロモ 一ターの下流（および所望により転写終結部位の上流）に連結させる通常の DNAェ 学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細 胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA転移後の作出動物の胚 芽細胞において、本発明の外来性 DNAが存在することは、作出動物の後代がすべ て、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DNAを保持することを意 味する。本発明の外来性 DNAを受け継 、だこの種の動物の子孫はその胚芽細胞お よび体細胞のすべてに本発明の外来性 DNAを有する。
本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性 DNA を安定に保持することを確認して、該 DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼 育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細 胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DNA転移後の作出動物 の胚芽細胞において本発明の外来性 DNAが過剰に存在することは、作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DNAを過剰に有する ことを意味する。本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DNAを過剰に有する。
導入 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動 物を交配することによりすべての子孫が該 DNAを過剰に有するように繁殖継代するこ とがでさる。
本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常 DNAが高発現させら れており、内在性の正常 DNAの機能を増強することにより最終的に RAIG2 (または RA IG3)の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することが できる。例えば、本発明の正常 DNA転移動物を用いて、 RAIG2 (または RAIG3)の機 能亢進症や、 RAIG2 (または RAIG3)が関連する疾患の病態機序の解明およびこれら の疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、遊離した RAIG2 (または RAIG3)の増加症状を有することから、 RAIG2 (または RAIG3)に関連する疾患に対す る治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼 育することが出来る。さら〖こ、目的とする外来 DNAを前述のプラスミドに組み込んで原 科として用いることができる。プロモーターとの DNAコンストラタ卜は、通常の DNAェ 学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常 DN Aの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保さ れる。 DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常 DNAが存在するこ とは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DN Aを有することを意味する。本発明の外来性 DNAを受け継 ヽだこの種の動物の子孫 は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DNAを有する。導入 DNAを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 DNAを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常 DNAが高発現させら れており、内在性の正常 DNAの機能を阻害することにより最終的に RAIG2 (または RA IG3)の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用するこ とができる。例えば、本発明の異常 DNA転移動物を用いて、 RAIG2 (または RAIG3)の 機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患の治療方法の検討を行なう ことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常 DNA高発現動物は、 RAIG2 (ま たは RAIG3)の機能不活性型不応症における異常 RAIG2 (または RAIG3)による正常 RAIG2 (または RAIG3)の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる また、本発明の外来異常 DNAを転移させた哺乳動物は、遊離した異常 RAIG2 (また は RAIG3)の増加症状を有することから、 RAIG2 (または RAIG3)の機能不活性型不応 症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記 2種類の本発明の DNA転移動物のその他の利用可能性として、例えば
(1)組織培養のための細胞源としての使用、
(2)本発明の DNA転移動物の組織中の DNAもしくは RNAを直接分析するカゝ、または 産生された RAIG2 (または RAIG3)を分析することによる、 RAIG2 (または RAIG3)により 特異的に発現あるいは活性化する蛋白質等との関連性についての解析、
(3) DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用しての 、一般に培養困難な組織力 の細胞の機能の研究、
(4)上記 (3)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリー- ング、および
(5)変異 RAIG2 (または RAIG3)の単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、本発明の DNA転移動物を用いて、 RAIG2 (または RAIG3)の機能不活性型 不応症などを含む、 RAIG2 (または RAIG3)に関連する疾患の臨床症状を調べること ができ、また、 RAIG2 (または RAIG3)に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳 細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次 的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明の DNA転移動物力も各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白 質分解酵素により、遊離した DNA転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の 系統化を行なうことが可能である。さらに、 RAIG2 (または RAIG3)産生細胞の特定ィ匕 、アポトーシス、分ィ匕あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達 機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、 RAIG2 (または RAIG3)の作用解 明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明の DNA転移動物を用いて、 RAIG2 (または RAIG3)の機能不活性型 不応症を含む、 RAIG2 (または RAIG3)に関連する疾患の治療薬の開発を行なうため に、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリ 一ニング法を提供することが可能となる。また、本発明の DNA転移動物または本発明 の外来性 DNA発現ベクターを用いて、 RAIG2 (または RAIG3)が関連する疾患の DNA 治療法を検討、開発することが可能である。
[11]RAIG2 (または RAIG3)をコードする遺伝子が不活性ィ匕された非ヒトノックアウト動 物の作製
本発明は、本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明 の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔1〕本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔2〕該 DNAがレポーター遺伝子 (例：大腸菌由来の β ガラクトシダーゼ遺伝子）を 導入することにより不活性化された第〔1〕項記載の胚幹細胞、
〔3〕ネオマイシン耐性である第〔1〕項記載の胚幹細胞、
〔4〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔1〕項記載の胚幹細胞、
[5]ゲッ歯動物がマウスである第〔4〕項記載の胚幹細胞、
〔6〕本発明の DNAが不活性ィ匕された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
〔7〕該 DNAがレポーター遺伝子 (例：大腸菌由来の β ガラクトシダーゼ遺伝子）を 導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロ モーターの制御下で発現しうる第〔6〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔8〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔6〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔9〕ゲッ歯動物がマウスである第〔8〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔10〕第〔7〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検 出することを特徴とする本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進または阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物 が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現能を抑制す る力、もしくは該 DNAがコードしている RAIG2 (または RAIG3)の活性を実質的に喪失 させることにより、 DNAが実質的に RAIG2 (または RAIG3)の発現能を有しない（以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、 ES細 胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法 により該 DNA配列の一部又は全部の削除、他 DNAを挿入または置換させることによ つて行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり 、プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウト DN Aを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性ィ匕された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明の DNA不 活性ィ匕 ES細胞または本発明のノックアウト ES細胞と略記する）の具体例としては、例 えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離し、そのェキソン部分 にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺 伝子、あるいは lacZ ( j8—ガラクトシダーゼ遺伝子）、 cat (クロラムフエ-コールァセチ ルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することにより ェキソンの機能を破壊する力、あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写 を終結させる DNA配列（例えば、 poly A付加シグナルなど）を挿入し、完全な mRNAを 合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA配列 を有する DNA鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え 法により該動物の染色体に導入し、得られた ES細胞について本発明の DNA上あるい はその近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーシヨン解析あるいは ターゲッティングベクター上の DNA配列とターゲッティングベクター作製に使用した本 発明の DNA以外の近傍領域の DNA配列をプライマーとした PCR法により解析し、本 発明のノックアウト ES細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明の DNAを不活ィ匕させる元の ES細胞としては、例 えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよぐまた公知の Evansと Kau&ian の方法に準じて新しく榭立したものでもよい。例えば、マウスの ES細胞の場合、現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていな いので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかな ES細胞を取得する などの目的で例えば、 C57BL/6マウスや C57BL/6の採卵数の少なさを DBA/2との交 雑により改善した BDFマウス（C57BL/6と DBA/2との F )を用いて榭立したものなども
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良好に用いうる。 BDFマウスは、採卵数が多ぐかつ、卵が丈夫であるという利点に
1
カロえて、 C57BL/6マウスを背景に持つので、これを用いて得られた ES細胞は病態モ デルマウスを作出したとき、 C57BL/6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景 を C57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を榭立する場合、一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用するが、こ れ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初 期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、通常雄の ES細胞の方が生殖系列キ メラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできる だけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、 PCR法により Y染色体上の性決定領 域の遺伝子を増幅、検出する方法を、その 1例としてあげることができる。この方法を 使用すれば、従来、核型分析をするのに約 106個の細胞数を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 (約 50個）で済むので、培養初期における ES細胞の第一 次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能 にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。 また、第二次セレクションとしては、例えば、 G-バンデイング法による染色体数の確 認等により行うことができる。得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望まし いが、榭立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺伝子をノックァ ゥトした後、正常細胞 (例えば、マウスでは染色体数力 ¾n=40である細胞）に再びクロ 一-ングすることが望まし 、。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生 できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、 ST 0繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で LIF (l-10000U/ml)存在下に炭酸 ガス培養器内（好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90 %空気)で約 37°Cで培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン ZEDTA溶液（通常 0.001- 0.5%トリプシン Z0.1- 5mM EDTA、好ましくは約 0.1%トリ プシン ZlmM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダ一細胞上に播 種する方法などがとられる。このような継代は、通常 1-3日毎に行なうが、この際に細 胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄 することが望まれる。
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養する力 または細胞集塊 を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプ の細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及び M. H. Kau&ian,ネイチヤー（ Nature)第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin,プロシーディングス 'ォブ 'ナショナ ル 'アカデミ^ ~·ォブ'サイエンス 'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)第 78 卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschmanら、ジャーナル'ォブ'ェンブリオロジ^ ~·アン ド.ェクスペリメンタル.モルフォロジ一（J. Embryol. Exp. Morphol.)、第 87卷、 27頁、 1 985年〕、本発明の ES細胞を分化させて得られる本発明の DNA発現不全細胞は、ィ ンビトロにおける RAIG2 (または RAIG3)または RAIG2 (または RAIG3)の細胞生物学的 検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物の mRNA量を公知方法を用 、て 測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能 である。 該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したター ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入されたタ ーゲッティングベクター中の本発明の DNAが不活性ィ匕された DNA配列が遺伝子相 同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明の DNAと 入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明の DNAをノックアウトさせることがで きる。哺乳動物における組換えの多くは非相同的であるため、相同組換えを起こした 細胞をスクリーニングする手段として、例えば、本発明の DNAの内部にネオマイシン 耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を挿入するとともに、本発明の DNAの近傍にチミ ジンキナーゼ (tk)遺伝子を含むターゲッティングベクターを構築して胚幹細胞または 卵細胞に導入し、挿入された薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤 (例えば、ネオマイシ ン耐性遺伝子であれば G418等）およびガンシクロビル存在下で生存する細胞を選択 する方法が挙げられる。即ち、相同組換えにより本発明の挿入変異 DNAが染色体上 に組み込まれた場合、 tk遺伝子は排除されるのでガンシクロビル耐性である力 非相 同組換えで組み込まれた場合は tk遺伝子も同時に組み込まれるためガンシクロビル 感受性となる。また、 tk遺伝子の代わりにジフテリア毒素遺伝子などを用いれば、ラン ダム挿入された細胞は該毒素の産生により死滅するので、単一の薬剤での選択が可 能となる。
本発明の DNA力 Sノックアウトされた細胞の最終的な確認は、本発明の DNA上または その近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーシヨン解析またはター ゲッティングベクター上の DNA配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由 来の本発明の DNA以外の近傍領域の DNA配列とをプライマーとした PCR法による解 析を用いて行なうことができる。
非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明の DN Aが不活性ィ匕された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、 8細 胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該 非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明の DNA座をもつ 細胞と人為的に変異した本発明の DNA座をもつ細胞との両者カゝら構成されるキメラ 動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の DNA座をもつ場合、このような キメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為 的に変異を加えた本発明の DNA座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート カラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通 常へテロ発現不全個体であるので、当該へテロ発現不全個体同士を交配し、それら の産仔力も本発明の蛋白質のホモ発現不全個体を得ることができる。
[0180] 卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法で DN A溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジ エニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物か ら、遺伝子相同組換えにより本発明の DNA座に変異のあるものを選択することにより 得られる。
このようにして本発明の DNA力 ックアウトされている個体は、交配により得られた動 物個体も該 DNA力 ックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代 を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不 活化 DNAの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化 DNAを相同染色体 の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。得られたホモザィゴート動物は、母親 動物に対して、正常個体 1,ホモザィゴート複数になるような状態で飼育することによ り効率的に得ることができる。ヘテロザィゴート動物の雌雄を交配することにより、該不 活化 DNAを有するホモザィゴートおよびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。 本発明の DNAが不活性ィ匕された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明の DNA発現 不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 RAIG2 (または RAIG3)により誘導 され得る種々の生物活性を欠失するため、 RAIG2 (または RAIG3)の生物活性の不活 性ィ匕を原因とする疾患のモデルとなり得るので、これらの疾患の原因究明及び治療 法の検討に有用である。
[0181] [12a]本発明の DNAの欠損や損傷などに起因する疾患に対して治療 ·予防効果を 有する化合物のスクリーニング方法
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明の DNAの欠損や損傷などに起 因する疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることが できる。
すなわち、本発明は、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与 し、該動物の変化を観察'測定することを特徴とする、本発明の DNAの欠損や損傷な どに起因する疾患に対して治療，予防効果を有する化合物またはその塩のスクリー ニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合 物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ 、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。 具体的には、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無 処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、糸且織、疾患の症状などの変化を指標と して試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射な どが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択するこ とができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわ せて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、例えば、 該試験動物の血糖値が約 10%以上、好ましくは約 30%以上、より好ましくは約 50% 以上低下した場合、該試験化合物を耐糖能異常などの疾患に対して治療 ·予防効 果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれ た化合物であり、 RAIG2 (または RAIG3)の欠損や損傷などによって引き起こされる疾 患、例えば、 1)糖 ·脂質代謝調節剤、 2)脾臓および Zまたは脳下垂体の機能調節 剤、 3)インスリン分泌および Zもしくは血糖並びに Zまたは ACTH分泌調節剤、 4)糖 •脂質代謝異常、脾臓および Zまたは脳下垂体の機能異常、あるいはインスリン分泌 および Zもしくは血糖値並びに Zまたは ACTH分泌異常が関与する疾患の予防 '治 療剤などとして使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物 力 誘導される化合物も同様に用いることができる。
[0183] 該スクリーニング方法で得られたィ匕合物は塩を形成していてもよぐ該化合物の塩と しては、生理学的に許容される酸 (例:無機酸、有機酸など)や塩基 (例:アルカリ金 属など)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など） との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、 コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼン スルホン酸など）との塩などが用いられる。
[0184] 該スクリーニング方法で得られたィ匕合物またはその塩を医薬として使用する場合は 、前記 RAIG2 (または RAIG3)と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例え ば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル など）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに より差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者 (体重 60kgとして）に対して は、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1.0〜2 Omgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、 症状、投与方法などによっても異なる力 例えば注射剤の場合であれば、例えば糖 尿病患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程度、好まし くは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが好都合であ る。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができ る。
[0185] [12b]本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物の スクリーニング方法
本発明は、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポ 一ター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプロモータ 一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供す る。
上記スクリーニング方法において、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物としては 、前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明の DNAがレポ一 ター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、 /3 ガラクトシダーゼ遺 伝子 (lacZ)、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子な どが好適である。
本発明の DNAをレポーター遺伝子で置換された本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳 動物では、レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの支配下に存 在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プ 口モーターの活性を検出することができる。 例えば、 RAIG2 (または RAIG3)をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の j8— ガラクトシダーゼ遺伝子 (lacZ)で置換している場合、本来、 RAIG2 (または RAIG3)の 発現する組織で、 RAIG2 (または RAIG3)の代わりに |8 ガラクトシダーゼが発現する 。従って、例えば、 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル - j8 -ガラクトピラノシド (X-gal)のよ うな j8—ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に RAIG 2 (または RAIG3)の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的に は、 RAIG2 (または RAIG3)を欠損するマウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒ ドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液 (PBS)で洗浄後、 X-galを含む染色液で、室 温または 37°C付近で、約 30分ないし 1時間反応させた後、組織標本を ImM EDTA/ PBS溶液で洗浄することによって、 /3 ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察 すればよい。また、常法に従い、 lacZをコードする mRNAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化 合物から選ばれた化合物であり、本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進ま たは阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られたィ匕合物は塩を形成して ヽてもよく、該化合物の塩と しては、生理学的に許容される酸 (例：無機酸など)や塩基 (例：有機酸など)などとの 塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩とし ては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるい は有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石 酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など )との塩などが用いられる。
[0186] 本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、 RAIG 2 (または RAIG3)の発現を促進し、 RAIG2 (または RAIG3)の機能を促進することがで きるので、例えば、 RAIG2 (または RAIG3)の機能不全に関連する疾患などの予防-治 療薬などの医薬として有用である。
本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、 RAIG 2 (または RAIG3)の発現を阻害し、 RAIG2 (または RAIG3)の機能を阻害することがで きるので、例えば、 RAIG2 (または RAIG3)の発現過多に関連する疾患などの予防-治 療薬などの医薬として有用である。
RAIG2 (または RAIG3)の機能不全に関連する疾患としては、例えば、糖尿病、耐糖 能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網 膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚疾患、関節症、 骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが挙げられる。一 方、 RAIG2 (または RAIG3)の発現過多に関連する疾患としては、例えば、肥満、高脂 血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病 性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンァレ ルギ一、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、血栓性疾患、脂 肪毒性および癌などが挙げられる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物力 誘導される化合物も同様に用いる ことができる。
[0187] 該スクリーニング方法で得られたィ匕合物またはその塩を医薬として使用する場合は 、前記 RAIG2 (または RAIG3)と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例え ば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル など）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに より差異はあるが、経口投与の場合、例えば糖尿病患者 (体重 60kgとして）に対して は、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1.0〜2 Omgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、 症状、投与方法などによっても異なる力 例えば注射剤の場合であれば、例えば糖 尿病患者 (体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程度、好まし くは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが好都合であ る。投与対象がヒト以外の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができ る。
[0188] このように、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明の DNAに対するプロ モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上 で極めて有用であり、本発明の DNA発現不全に起因する各種疾患の原因究明また は予防'治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 RAIG2 (または RAIG3)のプロモーター領域を含有する DNAを使って、その下 流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入してい わゆるトランスジエニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にその蛋白 質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモータ 一部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を榭立 すれば、 RAIG2 (または RAIG3)そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしく は抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
[0189] RAIG2のショウジヨウバエホモログである BOSSは、その N末の細胞外ドメインが複眼 合成に関与することが知られているが、 RAIG2と相同性を有する 7回膜貫通領域の生 理機能については全く未知であった。後記実施例に示されるように、 boss遺伝子の欠 損突然変異体と該遺伝子を強制発現させたトランスジエニックとで、その血糖値を比 較した結果、前者では野生型と比較して血糖値の上昇が認められたのに対し、後者 ではこの上昇が抑制された。このことは、 BOSSも RAIG2や RAIG3と同様に血糖濃度を 検知し、インスリンシグナルを調節していることを強く示唆する。したがって、ショウジョ ゥバエにおける boss遺伝子欠損変異体、 boss遺伝子ノックアウトハエ、 boss遺伝子強 制発現トランスジヱニックハエなどの系は、ヒトなどの哺乳動物における糖'脂質代謝 や糖尿病等の疾患の基礎研究における有用なツールとなり得る。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPA し— IUB Commission on Biochemical Nomenclature【こよる略 あ ヽ ί¾当 分野【こお ける慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリボ核酸
cDNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：ァデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シトシン
RNA ：リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸
dATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ：ドデシル硫酸ナトリウム
Gly ：グリシン
Ala ：ァラニン
Val ：パリン し eu ：ロイシン
He ：ィソロイシン
Ser ：セリン
Thr ：スレ才ニン
Cys :システィン
Met ：メチォニン
Glu ：グルタミン酸
Asp ：ァスパラギン酸
Lys ：リジン
Arg ：ァノレギニン
His ：ヒスチジン
Phe ：フエ-ルァラニン
Tyr ：チロシン
Trp ：トリブトファン
Pro ：プロリン
Asn ：ァスノ ラギン
Gin ：グルタミン
pulu ：ピログルタミン酸
Me ：メチル基
Et ：ェチル基
Bu ：ブチル基
Ph ：フエニル基
TC ：チアゾリジン- 4(R)_カルボキサミド基
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記す る。
Tos ： p—トノレエンスノレフォニノレ
CHO ：ホルミノレ
Bzl ：ベンジル Cl Bzl : 2,6—ジクロロべンジル
2
Bom ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジルォキシカルボニル
C1-Z : 2-クロ口べンジルォキシカルボニル
Br- Z : 2-ブロモベンジルォキシカルボニル
Boc ： t-ブトキシカルボニル
DNP ：ジ-トロフエノール
Trt ：トリチル
Bum ： t-ブトキシメチル
Fmoc ： N- 9-フルォレニルメトキシカルボニル
HOBt ： 1-ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt : 3,4-ジヒドロ- 3-ヒドロキシ- 4-ォキソ -1,2,3-ベンゾトリアジン
HONB ： 1-ヒドロキシ- 5-ノルボルネン -2, 3-ジカルボキシイミド
DCC ： Ν,Ν，-ジシクロへキシノレカノレボジイミド
[0193] 本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
ほ己列番号: 1〕
ヒト RAIG2 cDNAのコード配列の塩基配列を示す。
ほ己列番号: 2〕
ヒト RAIG2のアミノ酸配列を示す。
ほ己列番号: 3〕
ヒト RAIG3 cDNAのコード配列の塩基配列を示す。
ほ己列番号: 4〕
ヒト RAIG3のアミノ酸配列を示す。
[0194] 以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であ つて、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例
[0195] 実施例 1
マウスインスリノーマ MIN6細胞（大阪大学大学院医学系研究科 G6病態制御医学 専攻分子治療学講座幹細胞制御学分野宫崎純一博士より分与された)を、 15%ゥ シ胎仔血清（56°C、 30分処理で非働化）、 5 1/1 |8 -メルカプトエタノールおよび 4.5 g/1グルコースを含む DMEMを加えた 24 well plate中で、 5% CO /95%大気の雰囲気
2
下、 37°Cで低密度で培養した。 RAIG2および RAIG3の cDNAは、ヒト脳または肝臓の c DNAライブラリーより、常法に従って PCR法により得た。これを PIRES2- EGFP (CLON TECH社）に挿入した。 24時間後に上記細胞に RAIG2または RAIG3 cDNAを含む発 現ベクターをトランスフエタトした。トランスフエクシヨンは Lipofectamin 2000 (Invitrogen )を用い、メーカーのマニュアルに従って行った。さらに 48時間培養後、 2.8 mMダル コース含有 KRBB溶液 [129 mM NaCl, 4.8 mM KC1, 1.2 mM MgSO , 1.2 mM KH PO
4 2
, 4.8 mM NaHCO 10 mM HEPES, 2.5 mM CaCl , 0.2%ゥシ血清アルブミン（pHを 7.
4 3， 2
4に調整）]で 37°C、 15分間保持して洗浄した。これを 2回行った後、各濃度のダルコ ースゃ 1,5- AG (和光純薬より購入）を含んだ KRBB液 0.5 mlを加え、 37°C、 1時間保持 した。各 10 1の培養上清を取り、 ELISA法によりインスリン量を測定した。測定には、 Rat/mouse Insulin ELISA Kit (LINCO Research社製、セティカンパ-一リミテッド社 より購入)を用いた。その結果、 2.8 mMグルコースに比べて、 20 mMグルコースでは、 インスリンの放出が増加する力 RAIG3強発現細胞では、さらに増加した（図 1)。また 、 10 mMグルコースでは、コントロールの細胞ではインスリン放出量が 2.8 mMダルコ ースと変らないが、 RAIG3強発現細胞では有意に放出量が増加した（図 1)。 RAIG2, RAIG3強発現細胞においては、 2.8 mMグルコースに 1,5-AGを 0.6 mM添カ卩すること により、 20 mMグルコースに匹敵するインスリン放出を引き起こした（図 2a, b)。
実施例 2
マウス脳下垂体腫 AtT- 20/D16V- F2細胞（ATCCより購入）は、 CRFに反応して ACT Hを分泌する。これは低グルコース (2.8 mM)溶液中で起こる力 高グルコース (20 mM) によって抑制される。この細胞を 10%ゥシ胎仔血清 (56°C30分処理で非働化）および 1 g/1グルコースを含む MEMをカ卩えた 24 well plate中で、 10% CO /95%大気の雰囲
2
気下、 37°Cで培養した。 1時間後に RAIG2または RAIG3の siRNAをトランスフエタトした 。 siRNAは、 Ambion社の設計したマウス RAIG2および RAIG3に対するものをそれぞれ 3種類購入して使用した。トランスフエクシヨンは、 HiPerFect Transfection Reagent (QI AGEN社製)を使用し、メーカーのマニュアルに従って使用した。それぞれの処理後 に 48時間培養後、 2.8 mMグルコース含有 KRBB溶液で 37°C、 15分間保持して洗浄し た。これを 2回行った後、各濃度のグルコースを含んだ KRBB液をカ卩え、 10 nMの CRF (ペプチド研究所より購入。 100 M溶液を 0.1 M酢酸で作製し、水で 10倍に希釈し たものを 1/1000で KRBB液に加えて用いた） 0.5 mlを加えて、 37°C、 1時間保持した。 各 50 1の培養上清を取り、 ELISA法により ACTH量を測定した。測定には、 ACTH ( Rat) EIA Kit (Peninsula Laboratories社製，セティカンパ-一リミテッド社より購入)を 用いた。 RAIG2の発現を抑制すると、低グルコースにおける ACTH放出が抑制された (図 3)。一方、 RAIG3の発現を抑制すると高グルコースによる ACTH放出の抑制が緩 和された（図 3)。これらの結果から、 RAIG2や RAIG3は、グルコースの濃度を検出し、 CRFによる ACTHの放出量を制御していると考えられた。
[0197] 実施例 3
野生型、 boss欠損突然変異体、および bossを強制発現させたトランスジヱニックのシ ョウジヨウバエの 3令幼虫（各 4-5匹）を水洗し、濾紙上で乾燥させた後、 Hemolympho (体腔液 =ヒトの血液'リンパ液に相当） 0.5 1を回収した。これに 14.5 1の PBSを加 え、 13,000xgで遠心して上清を回収した。各 Hemolympho 1 μ 1に 100 μ 1の Infinity Gl ucose Reagent (ThermoDMA)を加え（トレハロス測定の場合は Pig kidny trehalase (Si gma) 0.2 μ 1を加えた）、 37°Cで 12時間インキュベートした後、グルコースおよびトレハ ロス濃度を測定した。その結果、 boss欠損変異体では血糖値が野生型と比較すると 上昇しており（1.3倍）、強発現トランスジエニックではこの上昇が抑えられていた（図 4
) o
[0198] 実施例 4
生後 3日目の雄のハエに飢餓ストレス（0.8% agar/PBS, 25°Cで飼育）を与えて、生 存率を測定した。エネルギー源が無い条件下では、 boss欠損変異体は野生型より早 く死ぬことが明ら力となった。 48時間後の生存率は、野生型は 62%生存していたのに 対し、 boss欠損変異体の生存率は 29%に低下していた。逆に強発現トランスジエニック では 96%に上昇していた。 boss欠損変異体では体内の脂肪の貯蓄が減少しており、こ れが原因と考えられる。 boss欠損変異体で見られる血糖値の上昇、及び、飢餓条件 下での生存率の低下は、ショウジヨウバエでインスリンシグナルを抑えたときに見られ る現象と一致している。このことから、 BOSSもマウスの RAIG2や RAIG3と同様にダルコ ース及び 1,5-AGの濃度を検出し、インスリンシグナルを調節することで糖代謝を制御 していると考えられる。
産業上の利用可能性
[0199] 本発明によれば、糖'脂質代謝や脾臓および Zまたは脳下垂体機能の調節剤、ィ ンスリン分泌および Zもしくは血糖並びに Zまたは ACTH分泌の調節剤、糖'脂質代 謝異常や脾臓および Zまたは脳下垂体機能異常が関与する疾患の予防'治療剤、 診断剤、さらに該疾患の予防'治療に有効な医薬もしくは動物薬候補ィ匕合物のスクリ 一ユングのためのツールが提供される。
[0200] 本出願は、日本で出願された特願 2006— 101057 (出願日：平成 18年 3月 31日） を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含される。

Claims

請求の範囲
[I] RAIG2もしくはその部分ペプチドおよび Zまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを 含有してなる医薬または動物薬。
[2] 糖 ·脂質代謝調節剤である、請求項 1記載の医薬または動物薬。
[3] 脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、請求項 1記載の医薬または動物 薬。
[4] インスリン分泌促進および Zもしくは血糖低下並びに Zまたは副腎皮質刺激ホル モン分泌調節剤である、請求項 1記載の医薬または動物薬。
[5] 糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎 症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚 疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害 力もなる群より選択される疾患の予防 ·治療剤である、請求項 1記載の医薬または動 物薬。
[6] RAIG2もしくはその部分ペプチドをコードする核酸および Zまたは RAIG3もしくはそ の部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる医薬または動物薬。
[7] 糖'脂質代謝調節剤である、請求項 6記載の医薬または動物薬。
[8] 脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、請求項 6記載の医薬または動物 薬。
[9] インスリン分泌促進および Zもしくは血糖低下並びに Zまたは副腎皮質刺激ホル モン分泌調節剤である、請求項 6記載の医薬または動物薬。
[10] 糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎 症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚 疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害 力もなる群より選択される疾患の予防 ·治療剤である、請求項 6記載の医薬または動 物薬。
[I I] RAIG2をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸および Zまたは RAIG3を コードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる診断剤。
[12] 糖'脂質代謝異常の診断用である、請求項 11記載の剤。
[13] 脾臓および Zまたは脳下垂体機能異常の診断用である、請求項 11記載の剤。
[14] インスリン分泌および Zもしくは血糖異常、並びに Zまたは副腎皮質刺激ホルモン 分泌異常の診断用である、請求項 11記載の剤。
[15] 糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎 症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚 疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満 、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、ィ ンスリンアレルギー、インスリノ一マ、脂肪毒性および癌力 なる群より選択される疾患 の診断用である、請求項 11記載の剤。
[16] RAIG2に対する抗体および Zまたは RAIG3に対する抗体を含有してなる診断剤。
[17] 糖'脂質代謝異常の診断用である、請求項 16記載の剤。
[18] 脾臓および Zまたは脳下垂体機能異常の診断用である、請求項 16記載の剤。
[19] インスリン分泌および Zもしくは血糖異常、並びに Zまたは副腎皮質刺激ホルモン 分泌異常の診断用である、請求項 16記載の剤。
[20] 糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎 症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚 疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害、肥満 、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、ィ ンスリンアレルギー、インスリノ一マ、脂肪毒性および癌力 なる群より選択される疾患 の診断用である、請求項 16記載の剤。
[21] RAIG2に対する中和抗体および Zまたは RAIG3に対する中和抗体を含有してなる 医薬または動物薬。
[22] 糖'脂質代謝調節剤である、請求項 21記載の医薬または動物薬。
[23] 脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、請求項 21記載の医薬または動 物薬。
[24] インスリン分泌抑制および Zもしくは血糖上昇並びに Zまたは副腎皮質刺激ホル モン分泌調節剤である、請求項 21記載の医薬または動物薬。
[25] 肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性 腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、 インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、血 栓性疾患、脂肪毒性および癌力もなる群より選択される疾患の予防，治療剤である、 請求項 21記載の医薬または動物薬。
[26] RAIG2をコードする塩基配列の相補鎖配列もしくはその一部を含む核酸および Z または RAIG3をコードする塩基配列の相補鎖配列もしくはその一部を含む核酸を含 有してなる医薬または動物薬。
[27] 糖'脂質代謝調節剤である、請求項 26記載の医薬または動物薬。
[28] 脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、請求項 26記載の医薬または動 物薬。
[29] インスリン分泌抑制および Zもしくは血糖上昇並びに Zまたは副腎皮質刺激ホル モン分泌調節剤である、請求項 26記載の医薬または動物薬。
[30] 肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性 腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、 インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、血 栓性疾患、脂肪毒性および癌力もなる群より選択される疾患の予防，治療剤である、 請求項 26記載の医薬または動物薬。
[31] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを用いるこ とを特徴とする、糖'脂質代謝調節物質のスクリーニング方法。
[32] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを用いるこ とを特徴とする、脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節物質のスクリーニング方法。
[33] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを用いるこ とを特徴とする、インスリン分泌および Zもしくは血糖並びに Zまたは副腎皮質刺激 ホルモン分泌の調節物質のスクリ一ユング方法。
[34] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチドを用いるこ とを特徴とする、糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害 、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機 能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良、記憶学 習障害、肥満、低血糖症、高血圧、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、 脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、脂肪毒性および癌力 なる群より選 択される疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法。
[35] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチド力 それを 産生する真核細胞の形態で提供されることを特徴とする、請求項 31〜34のいずれ かに記載の方法。
[36] RAIG2をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸または RAIG3をコードす る塩基配列もしくはその一部を含む核酸、あるいは RAIG2に対する抗体もしくは RAIG 3に対する抗体をさらに用 、ることを特徴とする、請求項 35記載の方法。
[37] インスリンもしくは副腎皮質刺激ホルモンの分泌を指標とすることを特徴とする、請 求項 35記載の方法。
[38] 細胞内の Ca2+濃度もしくは cAMP生成を指標とすることを特徴とする、請求項 35記 載の方法。
[39] レポーターもしくは選択マーカー遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、請求 項 35記載の方法。
[40] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチド、およびグ ルコースまたは 1,5-アンヒドログルシトールを用いることを特徴とする、 RAIG2または R AIG3とグルコースまたは 1,5-アンヒドログルシトールとの結合性を変化させる物質のス クリーニング方法。
[41] RAIG2もしくはその部分ペプチドまたは RAIG3もしくはその部分ペプチド力 それを 産生する細胞の形態で提供されることを特徴とする、請求項 40記載の方法。
[42] インスリンもしくは副腎皮質刺激ホルモンの分泌を指標とすることを特徴とする、請 求項 41記載の方法。
[43] 細胞内の Ca2+濃度もしくは cAMP生成を指標とすることを特徴とする、請求項 41記 載の方法。
[44] レポーターもしくは選択マーカー遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、請求 項 41記載の方法。
[45] RAIG2もしくは RAIG3の発現または活性を増強する物質を含有してなる医薬または 動物薬。
[46] RAIG2もしくは RAIG3の発現または活性を増強する物質が RAIG2もしくは RAIG3の ァゴ-ストである、請求項 45記載の医薬または動物薬。
[47] 糖'脂質代謝調節剤である、請求項 45または 46記載の医薬または動物薬。
[48] 脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、請求項 45または 46記載の医薬 または動物薬。
[49] インスリン分泌促進および Zもしくは血糖低下並びに Zまたは副腎皮質刺激ホル モン分泌調節剤である、請求項 45または 46記載の医薬または動物薬。
[50] 糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎 症、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚 疾患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害 力もなる群より選択される疾患の予防 ·治療剤である、請求項 45または 46記載の医 薬または動物薬。
[51] RAIG2もしくは RAIG3の発現または活性を阻害する物質を含有してなる医薬または 動物薬。
[52] RAIG2もしくは RAIG3の発現または活性を阻害する物質が RAIG2もしくは RAIG3の アンタゴニストである、請求項 51記載の医薬または動物薬。
[53] 糖'脂質代謝調節剤である、請求項 51または 52記載の医薬または動物薬。
[54] 脾臓および Zまたは脳下垂体機能調節剤である、請求項 51または 52記載の医薬 または動物薬。
[55] インスリン分泌抑制および Zもしくは血糖上昇並びに Zまたは副腎皮質刺激ホル モン分泌調節剤である、請求項 51または 52記載の医薬または動物薬。
[56] 肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性 腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、 インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、血 栓性疾患、脂肪毒性および癌力もなる群より選択される疾患の予防，治療剤である、 請求項 51または 52記載の医薬または動物薬。
[57] 哺乳動物における RAIG2および/もしくは RAIG3の発現または活性を調節することを 含む、該動物における糖 ·脂質代謝、麵能、脳下垂体機能、インスリン分泌、血糖 並びに副腎皮質刺激ホルモン分泌からなる群より選択されるいずれかの調節方法。
[58] RAIG2の発現もしくは活性を増強する物質および/または RAIG3の発現もしくは活 性を増強する物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における 糖尿病、耐糖能異常、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症 、糖尿病性網膜症、高脂血症、摂食障害、うつ病、 Cushing病、性機能障害、皮膚疾 患、関節症、骨減少症、動脈硬化、血栓性疾患、消化不良および記憶学習障害から なる群より選択される疾患の予防'治療方法。
[59] RAIG2の発現もしくは活性を阻害する物質および/または RAIG3の発現もしくは活 性を阻害する物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における 肥満、高脂血症、 2型糖尿病、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎 症、糖尿病性網膜症、浮腫、インスリン抵抗性症候群、不安定糖尿病、脂肪萎縮、ィ ンスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、摂食障害、うつ病、 Cushing病、血栓 性疾患、脂肪毒性および癌からなる群より選択される疾患の予防，治療方法。
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