WO2006118328A1 - 脱顆粒抑制剤 - Google Patents

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amino acid
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Kazuhiro Ogi
Yusuke Kikukawa
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a screening method such as a decondylar granule inhibitor using TGR12 or mast cells and a TGR12 ligand, a screening kit, a degranulation inhibitor obtainable by the screening method or kit, and the like.
  • a screening method such as a decondylar granule inhibitor using TGR12 or mast cells and a TGR12 ligand, a screening kit, a degranulation inhibitor obtainable by the screening method or kit, and the like.
  • Mast cells are sensitized by antibodies and then undergo degranulation when stimulated with an antigen.
  • Chemical mediators such as histamine, leukotrien, and serotonin.
  • Mast cells secrete various cytokines after antigenic stimulation, affect the functions of T cells and eosinophils, and are important as immunoregulatory cells. Mast cells are located close to the peripheral nerve endings, and are directly affected by neurogenic factors such as substance P (substance P) and calcitonin gene-related peptide (CGRP) to cause degranulation.
  • substance P substance P
  • CGRP calcitonin gene-related peptide
  • Mast cells are not limited to allergic diseases, but are thought to be deeply involved in pathological conditions such as irritable bowel syndrome, ulcerative colitis, and interstitial cystitis. It is thought to be involved in exacerbations (Gastroenterology, 126, 693-702, 2004; Scand. J. Gastroentorl., 40, 129-140, 2005; Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 279 ⁇ , G1298-G1306, 2000; Am. J. Physiol. Renal Physiol., 283, F616-F629, 2002).
  • the human TGR12 (SEQ ID NO: 1), which is a G-protein conjugate receptor, is known by other names such as MRGX2 and GPCRxlK GPCR44.
  • MRGX2 consists of cortis is tat in, soma sutin, BAM (bovine adrenal medul 1 pept ide) 13-22, alpha melanocyte stimulating hormone (aMSH), neuropeptide FF, dynorphin A activated by (dynorphin A) and substance P, MRGX2 agonist or antagonist force sleep disorder, pain, cerebral infarction, memory disorder, diabetes, cancer, obesity, heart disease, depression, sexual dysfunction, urine It has been reported that it can be used as a therapeutic drug for tract / bladder diseases, infectious disease treatment, digestive system diseases, etc.
  • MRGX2 is expressed in human umbilical cord blood-derived mast cells, it has been reported that its expression varies with IgE (W0 2005/028667), but the amount of MRGX2 expressed in mast cells There is no report on the quantitative value of LAD2 or its expression in the human mast cell line LAD2.
  • Rabbit peritoneal mast cells or human skin mast cells react with pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) to promote degranulation (Inflamm. Res., 47, 488-492, 1998) Ann. NY Acad. Sci., 865, 14 146 146 (1998), induced dermatitis in mice (Reglul. Pept.
  • PACAP pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide
  • High-affinity receptor NK1 receptor reacts to substance P, low-affinity receptor responsive to substance P NK2 receptor Body, NK3 receptor, and VIP1 receptor that reacts to PACAP, VIP2 receptor and PACAP receptor are almost not expressed in human mast cells, human mast cell line LAD 2 is substance P, cortis Evening Chin- ⁇ , ⁇ -12, PACAP-27, PACAP-38 and VIP stimulate the degranulation reaction, and the substance P-dependent degranulation reaction in LAD 2 is NK1 receptor enzyme From these facts, it was found that TGR12 is involved in neuropeptide-dependent degranulation, including the subunit P of human mast cells. Based on these findings, the present inventors have found that TGR12 enzyme cocoon is a mast cell degranulation inhibitor, and provides a simple screening method for mast cell degranulation inhibitor. As a result of extensive research, the present invention has been completed.
  • the present invention is a.
  • Ligand is substance P, cortisase, pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP), vasoactive intestinal peptide (VIP) Or the screening method according to [1] above, which is proadrenomedul 1 in N-terminal 20 peptide (PAMP),
  • PACAP pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • PAMP proadrenomedul 1 in N-terminal 20 peptide
  • step (iii) The amount of binding of the ligand to the protein or its partial peptide or salt thereof is compared between step (i) and step (ii), and the step is more than the amount of binding in step (i).
  • the screening method according to [1] above which comprises the step of selecting the test compound as a mast cell degranulation inhibitor when the binding amount in (ii) is lower,
  • test compound is selected as an inhibitor of degranulation of mast cells when the binding amount in step (ii) is 50% or less of the binding amount in step (i).
  • step (iii) Compare the binding amount of the ligand to the protein or a partial peptide or salt thereof between step (i) and step (ii), and the step is more than the binding amount in step (i). Selecting a test compound when the amount of binding in (ii) is lower;
  • SEQ ID NO Suppression of degranulation of mast cells comprising an antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1, or a partial peptide or salt thereof Agent
  • SEQ ID NO: 1 An immune disease, an urinary disease, comprising an antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1, or a partial peptide or a salt thereof, Diagnostic agents for digestive or respiratory diseases,
  • SEQ ID NO: 1 is used to remove mast cells comprising an antibody against an agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide or salt thereof.
  • Granule inhibitor
  • SEQ ID NO: comprising a polynucleotide containing a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1, or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof Immunological diseases, urological diseases, gastrointestinal or respiratory diseases,
  • SEQ ID NO: Complementary to a polynucleotide containing a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1 or a polynucleotide encoding the partial peptide, or A polynucleotide comprising a substantially complementary nucleotide sequence or a part thereof, or (ii) siRNA or sh RNA against a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the protein or a partial peptide thereof A mast cell degranulation inhibitor,
  • SEQ ID NO: The activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide or salt thereof, or the ability to specifically bind to the protein
  • a method for inhibiting degranulation of mast cells which comprises inhibiting the activity of the ligand possessed;
  • step (iii) selecting a test compound when the amount of binding in step (ii) is lower than the amount of binding in step (i);
  • a method for inhibiting degranulation of mast cells comprising administering an effective amount of a polynucleotide comprising a part;
  • a mast cell degranulation inhibitor For producing a mast cell degranulation inhibitor, (i) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or the An antagonist against a salt, (ii) an antibody against the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, or (iii) a polynucleotide which is complementary or substantial to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the protein or a partial peptide thereof Use of a polynucleotide comprising a partially complementary base sequence or a part thereof.
  • step (iii) comparing the binding amount of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide to the protein or a partial peptide or salt thereof between step (i) and step (ii);
  • [2 6) (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, and (b) pituitary adenyl A compound that changes the binding property between the protein or its partial peptide or a salt thereof and the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, characterized by comprising an acid cyclase-activating polypeptide Or its salt screening kit,
  • [2 7] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; and (b) specific to the protein.
  • Eicosanoide eg, leukotriene, prostaglandin
  • site force-in production inhibitor e.g, mast cell growth inhibitor or mast cell activation
  • a ligand capable of binding to Screening methods for inhibitors eg, including MAPK activation inhibitors
  • the ligand is substance P, cortisol, pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, vasoactive intestinal peptide or roadrenomeduJ 1 in N-terminal 20 peptide [2.7] Description Screening method,
  • SEQ ID NO: Measure cell stimulating activity via a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1 or a partial peptide or salt thereof, and use it as an index
  • [31] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; and (b) specific to the protein.
  • An eicosanoide eg, leuco-arylene, prostaglandin
  • site-force-in production inhibitor e.g., site-force-in production inhibitor
  • mast cell growth inhibitor or mast cell characterized by containing a ligand capable of binding Kits for screening activation inhibitors (including MAPK activation inhibitors, etc.),
  • SEQ ID NO: Eicosanoide comprising an protein having an amino acid sequence identical to or substantially identical to the amino acid sequence represented by 1 or an antigen to a partial peptide or salt thereof ( E.g., leukotriene, prostaglandin) production inhibitor, site force-in production inhibitor, mast cell proliferation inhibitor or mast cell activation inhibitor (eg, including MAPK activation inhibitor),
  • SEQ ID NO: Eicosanoide comprising an antibody against an agonist of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 or a partial peptide or salt thereof (eg, , Leuco coconut, prostaglandin) production inhibitor, site force-in production inhibitor, mast cell proliferation inhibitor or mast cell activation inhibitor (eg, including MAPK activation inhibitor),
  • SEQ ID NO: 1 The activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide or salt thereof, or the ability to specifically bind to the protein
  • eicosanoide eg, leukotriene, prostaglandin
  • cytokine a method for inhibiting cytokine production
  • mast cell proliferation a method for inhibiting mast cell activation
  • a gonist (ii) an antibody to the protein or a partial peptide or salt thereof, or (iii) a complementary or substantially complementary to a polynucleotide comprising the polynucleotide encoding the protein or the partial peptide
  • eicosanoide eg, leukotriene, prostaglandin
  • a method for inhibiting site-in production characterized by administering an effective amount of a polynucleotide comprising a simple nucleotide sequence or a part thereof
  • a method for inhibiting mast cell proliferation or a method for inhibiting mast cell activation
  • Eicosanoide eg, leukotriene, prostaglandin
  • site force-in production inhibitor eg, mast cell growth inhibitor or fat cell activation inhibitor (eg, MAPK activation inhibitor, etc.)
  • protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide or salt thereof is abbreviated as “receptor of the present invention”.
  • receptor of the present invention protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide or salt thereof.
  • “Book The “ligand having the ability to specifically bind to the receptor of the invention” may be abbreviated as “the ligand of the present invention”.
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a human warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, rabbit Cells (eg, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, knees; 6 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, Endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, simple Spheres), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or progenitor cells, stem cells or Cells) or any tissue in which these
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequences having a homology of about 90% or more include amino acid sequences having a homology of about 90% or more.
  • protein represented by SEQ ID NO: 1 As a protein containing the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example, the protein represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein having substantially the same amino acid sequence as the sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • substantially the same activity examples include ligand binding activity, signal information transmission action, cell stimulation activity and the like. “Substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. Accordingly, activities such as ligand binding activity, signal transduction activity, and cell stimulation activity are equivalent (eg, about 0.01 to: L 0 0 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times) is preferable, but quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • the measurement of activities such as ligand binding activity, signal signal transduction activity, and cell stimulation activity can be performed according to a method known per se.
  • the protein of the present invention includes (i) 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Is an amino acid sequence in which about 1 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably several (1 to 5) amino acids have been deleted.
  • SEQ ID NO: 1 1 or 2 or more for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably Is an amino acid sequence to which several (1 to 5) amino acids are added
  • SEQ ID NO: 1 or 2 or more for example, about 1 to 100 in the amino acid sequence represented by 1, preferably Is about 1 to 50, preferably about 1 to 30 and more preferably about 1 to 10 and more preferably Amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids
  • one or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for example, 1 to 100
  • Partial peptide of receptor of the present invention (hereinafter referred to as partial peptide of the present invention) As long as it is a partial peptide that can be used in a screening method for drugs and the like to be described later. That have substantially the same ligand binding activity or the like are used.
  • the receptor-protein partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was analyzed to be an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis.
  • a peptide containing a part In addition, a peptide partially containing a hydrophobic site can be used as well.
  • a peptide containing individual domains can also be used, but a peptide containing a plurality of domains simultaneously may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequence constituting the protein of the present invention.
  • substantially the same quality of activity has the same meaning as described above. “Substantially the same quality of activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide of the present invention comprises (i) one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence.
  • 1 or 2 preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)
  • amino acids are added to the above amino acid sequence.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably about several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the above amino acid sequence are other amino acids. May be substituted.
  • the partial peptide containing the amino acid sequence of Nos. 209-223, 247-259, and 283-330 is used.
  • the receptor of the present invention and the partial peptide of the present invention have an N-terminal (amino terminal) at the left end and a C-terminal (carboxyl terminal) at the right end in accordance with the convention of peptide labeling.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl or n - C, such as butyl, _ 6 alkyl
  • cyclopentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl such as cyclohexyl, for example if , phenyl, C 6, such as ⁇ - naphthyl - 1 2
  • Ariru for example, benzyl, Fei one naphthyl such as phenylene Lou C Bok 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl such phenethyl - c 1 -2 c such as an alkyl 7 _
  • pivaloyloxymethyl which is widely used as an oral ester, is used.
  • the receptor of the present invention and the partial peptide of the present invention have a carboxy (or carboxylate) other than the C-terminus
  • those in which strong loxy is amidated or esterified can also be used in the present invention.
  • partial peptides of the present invention As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • partial peptide of the receptor of the present invention and of the invention may include amino acid residues (e.g., Mechionin residues) of N-terminal Amino group protecting groups (e.g., E mill, C such Asechiru, _ fi Arukanoiru etc.
  • amino acid residues e.g., Mechionin residues
  • N-terminal Amino group protecting groups e.g., E mill, C such Asechiru, _ fi Arukanoiru etc.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • base eg, alkali metal salt
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferred.
  • salts include inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, odor Salt with hydrofluoric acid, sulfuric acid, etc., or organic acid (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citrate, phosphoric acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfone Salts with acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, odor Salt with hydrofluoric acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acid eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citrate, phosphoric acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfone Salts with acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • the ligand of the present invention may be any one as long as it specifically binds to the receptor of the present invention.
  • the dissociation constant of binding to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof is 10 M or less, preferably 2 M or less, more preferably Is 1 ⁇ ⁇ or less, particularly preferably 20 nM or less, and most preferably 100 nM or less.
  • Examples of the ligand of the present invention include substance P, PACAP (eg, PACAP-27, PACAP-38, etc.), VIP, cortis yutin (eg, cortis yutin-14, cortis yutin-17, etc.)), PAMP (Eg, PAMP-12, PAMP-20, etc.), Somatos Yuchin (eg, Somatos Yuchin 3-14, Somatos Yuchin 3-10, Somatos Yuchin-14, Somatos Yuchin-28, Somatos Yuchin 7 -14, D-Trp-Somatos Yuchin, Cyclosomatos Yuchin, Somatos Yuchin 2-9, etc.), BAM (eg, BAM13-22, BAM-22 etc.), ⁇ -melanocyte stimulating hormone (eg, HS024-aMSH) (3-ll) amide), neuropeptide FF, dynorphin A, oxytocin (eg, (Ser4, Ile8) -oxytocin), vasopress
  • substance P eg., PACAP-27, PACAP-38, etc.
  • VIP e.g., Coltis evening (eg, Cortis evening-17)
  • PAMP eg, PAMP-12, PAMP-20 Etc.
  • Labeled ligands are also included in the ligands of the present invention.
  • Labeling substances include radioisotopes (eg, [ 3 H], [I], [ 14 C],
  • fluorescent substances e.g., such as Furuoresein
  • Luminous substances eg, luminol
  • enzymes eg, peroxidase
  • lanthanide elements etc.
  • radioisotopes are preferred.
  • 25 1] is preferable.
  • melanocyte stimulating hormone neu ropept ti de FF, dynorphin A, oxytocin, vasopressin and the like.
  • Ligand salts are also included in the ligands of the present invention.
  • the salt include a metal salt, an ammonium salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, and a salt with a basic or acidic amino acid.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; aluminum salt and the like.
  • salts with organic bases include, for example, ⁇ methylamine, ⁇ ethylamine, pyridine, picolin, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexamine. And salts with xylamine, N, N′-dibenzylethylenediamine, and the like.
  • salts with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fuuric acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, malic acid, methanesulfone And salts with acid, benzenesulfonic acid, P-toluenesulfonic acid, and the like.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine and the like
  • salts with acidic amino acids include, for example, aspartic acid, glutamic acid and the like. Salt.
  • an alkali metal salt eg, sodium salt, strong rhodium salt, etc.
  • an alkaline earth metal salt eg, calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.
  • Inorganic salts such as ammonium salts, etc.
  • salts with inorganic acids such as hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, Acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, P And salts with organic acids such as ruenesulfonic acid.
  • the receptor of the present invention and the partial peptide of the present invention can be produced from the above-mentioned human warm-blooded animal cells or tissues by a known purification method of the polypeptide, and encode the polypeptide described below. It can also be produced by culturing a transformant transformed with DNA. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below. For example, the method described in Genomics, 56, 12-21, 1999, Biochim. Biophys. Acta, 1446, 57-70, 1999, etc. It can also be manufactured by other methods.
  • a commercially available resin for polypeptide synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-monobenzyloxybenzyl alcohol resin, 4-monomethylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl.
  • an amino acid in which an ⁇ -amino group and a side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target polypeptide.
  • the polypeptide is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution, and the target polypeptide, receptor, partial peptide, or those Acquire the amide body.
  • various activating reagents that can be used for polypeptide synthesis can be used, and calpositimides are particularly preferable.
  • carbodiimides examples include DCC, N, N′-diisopropyl carbodiimide, N-ethyl-N ′ — (3-dimethylaminoprolyl) force positivity.
  • a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t, HOOB t), or the activity of the protected amino acid in advance as a symmetric anhydride, HOB t ester or HOOB t ester It can be added to the resin after conversion.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOB t, HOOB t
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents that are known to be usable in the polypeptide condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroaceanol, Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile, propionitryl, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or appropriate mixtures thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the polypeptide bond-forming reaction, and is usually selected appropriately from the range of about 1 2 O: ⁇ 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isoponyloxycarbonyl, 4-methyloxybenzene. Nzyloxycarbonyl, C 1 -Z, B r — Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2 —nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fm oc, etc. Is used.
  • the carboxyl group is, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc., linear, branched or cyclic Alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzene ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methylbenzoyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzylo It can be protected by xycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopent
  • the hydroxyl group of serine can be protected by, for example, esterification or etherification.
  • groups suitable for esterification are derived from a lower (CH) alkanoyl group such as an acetyl group, an aryl group such as a benzoyl group, a carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group. A group or the like is used.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, and a t-butyl group.
  • protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C l 2 — B zl, 2-nitrobenzyl, B r — Z, t — butyl and the like are used.
  • protecting groups for histidine imidazoles include Tos, 4-methoxy-2,3,6--trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc. Used.
  • activated rupoxyl groups of raw materials include corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pen Mouth phenol, 2, 4, 5 — Triclo mouth phenol, 2, 4 — Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyoxime, HOB t) Esters] and the like are used.
  • active esters eg, pen Mouth phenol, 2, 4, 5 — Triclo mouth phenol, 2, 4 — Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyoxime, HOB t) Esters
  • the corresponding phosphoric acid amide is used as the activated amino group.
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon
  • anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C.
  • a cation scavenger such as 1, 2, 4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • the 2,4-dinitophenyl phenyl group used as an imidazole protecting group for histidine was removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group for triftophan was the above 1,2_ethanedithiol, 1,4
  • it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a strong lpoxyl group of a carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then a peptide (polypeptide) chain is formed on the amino group side. Is extended to the desired chain length, and then only the N-terminal mono-amino protecting group of the peptide chain is removed. And a polypeptide from which only the C-terminal carboxyl-protecting group has been removed are produced, and both of these polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the receptor of the present invention or an ester of a partial peptide or a salt thereof, for example, after condensing the ⁇ -stroxyl group of a carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the receptor or its In the same manner as the amide of the partial peptide, a desired receptor or an ester of the partial peptide can be obtained.
  • the receptor or partial peptide of the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or for a partial peptide of the receptor, by cleaving the receptor with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the receptor or partial peptide of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protective group, the target peptide is produced by removing the protective group. You can. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in the following (i) to (V).
  • the receptor or partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when obtained by a salt, It can be converted into a free form or other salt by a method or a method similar thereto.
  • the polynucleotide encoding the receptor or partial peptide of the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the receptor or partial peptide of the present invention described above.
  • DNA is preferable, and the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA DN derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA A.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, it can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the aforementioned cells / tissues.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • DNA encoding the receptor of the present invention for example, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the stringent conditions are used. Any DNA may be used as long as it encodes a receptor having a base sequence to be primed and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions is, for example, about 70% or more, preferably about 80% of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more of the base sequence having homology.
  • DN A containing the column is used.
  • Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringency conditions.
  • the high-temperature conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60.
  • the conditions at ⁇ 65 are shown. In particular, it is most preferable when the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • DNA encoding the receptor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the partial peptide of the receptor of the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA A may be used.
  • DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions And a DNA having a partial base sequence of a DNA that encodes a receptor having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 has the same significance as described above.
  • a polynucleotide encoding a receptor or partial peptide of the present invention may be labeled by a method known per se.
  • labeling substances include radioisotopes, fluorescent substances (eg, fluorescein), phosphors, enzymes, piotin, and lanthanide elements.
  • DNA that completely encodes the receptor or partial peptide of the present invention As a means of cloning DNA that completely encodes the receptor or partial peptide of the present invention, a known PCR using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the receptor or partial peptide of the present invention is used. DNA labeled with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the receptor or partial peptide of the present invention or synthetic DNA. Sorting can be done by high-pridition.
  • the hybridization method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . When using a commercially available library, it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using known kits such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo) and the like using the ODA-LAPCR method, Gapped duplex
  • the method can be carried out according to a method known per se such as the Kunke 1 method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned receptor can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codons and translation codons can also be added using appropriate synthetic DNA adapters.
  • the receptor or partial peptide expression vector of the present invention can be obtained by, for example, (a) cutting out a target DNA fragment from DNA encoding the receptor or partial peptide of the present invention, and (b) It can be produced by ligating under the promoter in the expression vector.
  • vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pBR 3 2 2, p BR 3 2 5, p UC 1 2, p UC 1 3), and plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUBll O, p TP).
  • yeast-derived plasmids eg, pSH I 9, p SH 15
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
  • pA l—11, pXT l, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, etc. are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • examples include S Ra promoter, S V 40 promoter, HI V ′ L TR promoter, CMV promoter, H S V -TK promoter and the like.
  • CMV cytomegalovirus
  • SR Hipromo Yuichi SR Hipromo Yuichi
  • the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, rec A promoter, promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc.
  • the host is Bacillus, SPO l promoter
  • yeast such as SPO2 promoter and pen P promoter, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • polyhedrin promoter, P10 promoter, etc. are preferable.
  • the expression vector contains an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as A mpf), Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G 4 18 resistance) and the like.
  • dhfr gene dihydrofolate reductase
  • MTX metalhotrexate
  • Neomycin resistance gene hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G 4 18 resistance
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor of the present invention. If the host is a genus Escherichia, Pho A signal sequence, Omp A signal sequence, etc. If the host is a Bacillus species, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. If the host is yeast, MF o; 'signal sequence, S UC 2 ⁇ signal sequence, etc. If the host is an animal cell, insulin signal sequence, ⁇ -in-feron ferron signal sequence, Antibody molecules • Signal sequences can be used.
  • a transformant can be produced using a vector containing a DN that encodes the receptor or partial peptide of the present invention thus constructed.
  • hosts examples include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli 1 2 ⁇ D ⁇ 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 ⁇ , 160 (1968)], J 1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)), JA 2 2 1 [; iournal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)] , C 6 0 0 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus subtilis MI 1 1 4 [Gene, 24, 255 (1983)], 2 0 7-2 1 (Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984) ] Are used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 2 2, AH 2 2 R-, ⁇ A 8 7-1 1 A, DKD-5 D, 2 0 B— 1 2, Schizosaccharomyces bomb (Schizosaccharomyces pombe) NCYCL 9 1 3, NC YC 2 0 3 6, Pichia path tris ( Pichia pastoris) KM 71 is used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, larvae-derived cell lines of Spodoptera frugiperda cells (Sf cells), Trichoplusia ni midgut-derived MG 1 cells, Trichoplusia ni Egg-derived High Five TM cells, Mamestra brassicae-derived cells or Estigmena acrea-derived cells are used.
  • Sf cells include S f 9 cells (AKC CRL 1711), S f 21 cells (above, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like.
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al.,
  • animal cells examples include monkey cells CO S—7 (CO S 7), V ero, Chinese hamster cells CH ⁇ (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells C HO (hereinafter referred to as CHO (dhfr -) Abbreviated as cell), mouse L cell, mouse At T-20, mouse myeloma cell, rat GH 3, and human FL cell. Transformation of Escherichia can be carried out according to the method described in, for example, Pro atl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982).
  • Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding a receptor or partial peptide can be obtained.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is included therein. Nitrogen source, inorganic substances, etc. are contained.
  • Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • Examples of the nitrogen source include ammonium salt, nitrates, corn stee liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal,
  • examples of inorganic or organic substances and inorganic substances such as potato extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M9 medium containing glucose and casamino acids is preferable.
  • a drug such as 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently if necessary.
  • the culture is usually carried out at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • examples of the medium include Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, 4505 (1980) And SD medium containing 0.5% casamino acid (Bitter, G. A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)). It is preferable to adjust to 5-8. Is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 7 to 2 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • the medium used is 10% gusci immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). Those added with additives such as serum as appropriate are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Incubate at about 2 7 for about 3 to 5 days with aeration or agitation if necessary.
  • the medium When cultivating a transformant whose host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Volume 122
  • DMEM medium Virology, 8, 396 (1959)]
  • RPM I 16 40 medium The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)]
  • 1 9 9 Medium Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] is used.
  • the pH is preferably about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • the receptor or partial peptide of the present invention can be produced in the cell, the cell membrane, or extracellularly of the transformant.
  • Separation and purification of the receptor or partial peptide of the present invention from the culture can be carried out, for example, by the following method.
  • the receptor or partial peptide of the present invention is extracted from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and A method of obtaining a crude polypeptide extract by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by freeze-thawing or the like is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X — 100 TM .
  • the thus obtained culture supernatant or the receptor or partial peptide contained in the extract can be purified by appropriately combining known separation / purification methods.
  • known separation and purification methods include methods that utilize solubility, such as salt precipitation and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • solubility such as salt precipitation and solvent precipitation
  • dialysis such as ultrafiltration
  • gel filtration gel filtration
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the method using the difference in molecular weight the method using the difference in charge such as ion exchange chromatography, the method using the specific affinity such as affinity chromatography, the hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography
  • a method using the difference in isoelectric points, a method using the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing, etc. are used.
  • the receptor or partial peptide thus obtained When the receptor or partial peptide thus obtained is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, It can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the receptor or partial peptide produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing an appropriate protein-modifying enzyme to act before or after purification.
  • protein-modifying enzyme examples include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • An antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the antibody of the present invention) is: Any antibody that can recognize an antibody against the receptor of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Examples of the antibody against the receptor of the present invention include an antibody that inactivates receptor signal transduction, an antibody that activates receptor signal transduction, and the like. The antibody against the receptor of the present invention can be produced according to a known antibody or antiserum production method using the receptor of the present invention as an antigen.
  • the receptor of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier or diluent, at a site where antibody production is possible by administration.
  • a carrier or diluent In order to enhance antibody production at the time of administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • the warm-blooded animal used include sal, rabbit, inu, guinea pig, mouse, rat, hidge, goat, and chicken, and mouse and rat are preferably used.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by collecting spleen or lymph nodes 2 to 5 days later and fusing the antibody-producing cells contained therein with the myeloma cells of the same or different species.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled polypeptide described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Köhler and Mills Ein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P 3 U 1, SP 2 NO 0, AP-1, etc., and P 3 U 1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and P EG (preferably PEG 10 00 to PEG 6 0 0 0) Added at a concentration of about 10 to 80%, 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C; ⁇ 10 minutes -Cell fusion can be carried out efficiently by hesitating.
  • polypeptide (protein) antigens can be directly or adsorbed together with a carrier on a solid phase (eg, a microplate) on a hybridoma culture.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a similar method. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with H A T (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • H A T hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hyperprideoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • serum-free medium for high-pridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks.
  • Culture can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)).
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or protein A or protein G A specific purification method in which only the antibody is collected using an active adsorbent such as the above, and the antibody is obtained by dissociating the binding.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a known method or a method analogous thereto.
  • an immunizing antigen polypeptide antigen itself or a complex of the immunizing antigen and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting an antibody-containing substance against the receptor of the above and performing separation and purification of the antibody.
  • any force may be cross-linked at any ratio.
  • urine serum albumin, assithyroglobulin, hemocyanin, etc. by weight ratio of about 0.1 to hapten 1.
  • a method of coupling at a rate of ⁇ 20, preferably about 1-5 is used.
  • various condensing agents can be used for force pulling between the hapten and the carrier, and active aldehyde reagents containing a aldehyde, a carbohydride, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithiobilidyl group are used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at the site where antibody production is possible, or with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production at the time of administration.
  • the administration is usually about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the method described above.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the antiserum. Separation of polyclonal antibody. It can be carried out according to the same method for isolating and purifying immune globulin as the isolation and purification of the monoclonal antibody described above.
  • SEQ ID NO: 1 Complementary or substantially complementary to a polynucleotide (eg, DNA) encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof
  • the polynucleotide (eg, DNA) containing a base sequence complementary to or a part thereof has a base sequence complementary to or substantially complementary to the polynucleotide, or a part thereof.
  • Any polynucleotide (antisense polynucleotide) may be used as long as it has an action capable of suppressing the expression of the polynucleotide.
  • DNA a polynucleotide encoding the receptor of the present invention
  • DNA of the present invention a polynucleotide encoding the receptor of the present invention
  • antisense DNA having a typical nucleotide sequence or a part thereof (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as antisense DNA), and complementary or substantially complementary to the DNA of the present invention.
  • Any antisense DNA may be used as long as it has a typical nucleotide sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 7% of the total or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • Examples include nucleotide sequences having homology of 0% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention about 7 and the complementary strand of the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of the receptor of the present invention (for example, the base sequence near the start codon).
  • Antisense DNA having a homology of 0% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer. Specific examples include an antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a part thereof. It is done. Preferable examples include a base sequence complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an antisense polynucleotide having a part thereof.
  • Antisense polynucleotides are usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide that constitutes the antisense DNA are chemically modified phosphorous such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted with an acid residue.
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the receptor gene of the present invention is cloned, or a DNA nucleotide sequence encoding a protein whose amino acid is determined. Design and synthesize based on information.
  • a polynucleotide can be hybridized with the RNA of the receptor gene of the present invention, can inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the receptor-related RNA of the present invention.
  • the expression of the receptor gene of the present invention can be regulated and controlled via A polynucleotide complementary to a selected sequence of the receptor-related RNA of the present invention, and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with the receptor-related RNA of the present invention, can be obtained in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of receptor genes, and is useful for the treatment or diagnosis of diseases.
  • the term “corresponding” means homologous to or complementary to a specific sequence of nucleotides, nucleotide sequences or nucleic acids including genes.
  • Nucleotide, nucleotide sequence or “corresponding” between nucleic acid and peptide (protein) The term generally refers to the amino acid of a peptide (protein) in a command derived from a nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • the 3'-end palindromic region and the 3'-end hairpin loop can be selected as preferred target regions, but any region within the protein gene can be selected as the target.
  • Antisense polynucleotides are polynucleotides that contain 2-deoxy-D-ribose, polynucleotides that contain D-lipose, or other types of polynucleotides that are N-daricosides of purine or pyrimidine bases.
  • Such base pairing may contain nucleotides having an arrangement that allows base attachment).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, as well as DNA: RNA hybrids, and unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides),
  • caps methylated, one or more natural nucleotides substituted with analogs
  • intramolecular nucleotide modifications such as uncharged bonds (eg methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg phosphorothioate)
  • proteins nucleases, nucleases, inhibitors, etc.
  • Bok Xing antibodies, signal peptides, poly one said - lysine Etc.
  • sugars eg monosaccharides
  • side force groups eg, acridine, psoralen, etc.
  • nucleoside may include not only purine and pyrimidine bases but also those having other heterocyclic bases modified. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced with halogens and forces, aliphatic groups, or functional groups such as ether, amine, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DN DN, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphine derivatives, and polynucleoside amides that are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleotide of the present invention can be preferably designed according to the following policy.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be altered or modified. It may contain decorated sugars, bases, and bonds, and can be donated in specialized forms such as ribosomes, microspheres, applied by gene therapy, or given in added form. In this way, it can be used in addition form as polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, to enhance the interaction with the cell membrane, and to increase the uptake of nuclear acid Hydrophobic lipids (eg, phospholipids, cholesterol, etc.). Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • These can be attached to the 3 'or 5' end of the nuclear acid and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. .
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene dalycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleotide can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the receptor of the present invention. it can.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • a receptor of the present invention (i) a receptor of the present invention, (ii) a polynucleotide encoding the receptor of the present invention (polynucleotide of the present invention), (iii) an antibody against the receptor of the present invention (antibody of the present invention) (Iv) antisense polynucleotides of the receptor of the present invention (eg, antisense DNA of the present invention), (V) ligands capable of specifically binding to the receptor of the present invention (ligands of the present invention), etc.
  • ligands capable of specifically binding to the receptor of the present invention (ligands of the present invention), etc.
  • Ligands of the present invention are effective in promoting degranulation of mast cells, eicosanoid (eg, leukotriene, prostaglandin, etc.) production promoting action, thymus in (eg, TNF-s, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, TGF-j6, etc.) Has production promoting action, mast cell proliferation promoting action, mast cell activation (promoting) action, etc.
  • eicosanoid eg, leukotriene, prostaglandin, etc.
  • thymus in eg, TNF-s, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, TGF-j6, etc.
  • Function and activity of the receptor of the present invention eg, mast cell degranulation promoting effect, eicosanoide production promoting action, site force in production promoting action, mast cell proliferation promoting action, mast cell activation
  • immune diseases eg, inflammatory diseases (eg pituitary abscess, thyroiditis, peritonitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, erythema nodosum) Rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergies (eg, allergic conjunctivitis, allergic rhinitis, hay fever, metal allergies), asthma, exudation Otitis media, Meniere's disease, contact dermatitis, anaphylaxis
  • cardiovascular diseases eg, arteriosclerosis, Acute coronary syndrome, atherosclerotic aortic aneurysm, cardiac anaphylaxis, heart failure, myocardial infarction, angina, arrhythmia, deep vein thrombosis, restenosis after PTCA, etc.
  • ophthalmic diseases eg, pterygium, spring catarrh, Dry eye etc.
  • cancer eg, papillary thyroid cancer, non-small cell lung cancer, endometrial cancer, cervical cancer, stomach cancer, knee cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, ovarian cancer, prostate cancer, bladder cancer Breast cancer, colon cancer, rectal cancer, force positive sarcoma, mast cell type, etc.
  • cerebral infarction scabemia, acute renal failure, diabetes, obesity, edema, granuloma, atopic myelitis, neurofibroma, It can be used as a preventive or therapeutic agent for nasal mucosal hypersensitivity, Hod
  • the mast cell degranulation inhibitor preferably includes preventive / therapeutic agents for immune diseases, urological diseases, gastrointestinal diseases, cardiovascular diseases and the like.
  • a preventive / therapeutic agent for immune diseases is preferable.
  • a preventive / therapeutic agent for immune diseases and the like is preferable.
  • a preventive / therapeutic agent for urological diseases and the like is preferable.
  • a prophylactic / therapeutic agent for gastrointestinal diseases is preferable.
  • the binding of the receptor of the present invention and the ligand of the present invention can be improved.
  • Efficiently screen for compounds to be altered eg, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.
  • compounds to be altered eg, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.
  • the compound or a salt thereof includes (i) cell stimulating activity (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP production inhibition through the receptor of the present invention.
  • cell stimulating activity for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP production inhibition through the receptor of the present invention.
  • MAP kinases eg ERK 1/2 (p42 / 44 MAP kinase), p
  • comparison between the case where the ligand of the present invention is contacted with the receptor of the present invention and (ii) the case where the receptor of the present invention is contacted with the ligand of the present invention and a test compound To do is performed, for example, by measuring the binding amount of the ligand of the present invention to the receptor of the present invention, cell stimulating activity, and the like.
  • Specific examples of the screening method of the present invention include, for example, (a) the case where the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor of the present invention, and the case where the ligand of the present invention and a test compound are combined with the receptor of the present invention.
  • the amount of binding of the ligand of the present invention to the receptor of the present invention is measured when compared with the receptor of the present invention, and the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is altered.
  • the ligand of the present invention When the ligand of the present invention is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention or a membrane fraction of the cell, the ligand of the present invention and a test compound are added to the cell containing the receptor of the present invention or the cell. Binding of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing the cell stimulating activity via the receptor of the present invention when contacted with the membrane fraction of a cell A screening method for a compound or a salt thereof that alters sex, and
  • the receptor of the present invention is the receptor of the present invention expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor of the present invention (such as a screening method for sputum Examples include cell stimulation assembly systems.
  • the receptor of the present invention a membrane fraction of a human warm-blooded animal organ is preferably used.
  • the receptor of the present invention expressed in a large amount using a recombinant is suitable for use in screening.
  • the preparation method described later when the cell containing the receptor of the present invention or the cell membrane fraction is used, the preparation method described later may be followed.
  • the cells containing the receptor of the present invention When cells containing the receptor of the present invention are used, the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a publicly known method.
  • the cell containing the receptor of the present invention refers to a host cell that expresses the receptor of the present invention, and examples of the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like. .
  • the manufacturing method is the same as described above.
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after cell disruption.
  • Cell disruption methods include crushing the cells with a Potter-El vehj em homogenizer, crushing with a ring ring renderer or polytron (manufactured by Ki nema ti ca), crushing with ultrasound, French press Examples include crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure.
  • a fractionation method using centrifugal force such as a differential centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpn! To 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is usually 30 minutes at a higher speed (15000 rpn! To 30000 rpm). Centrifuge for 2 hours and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the receptor of the present invention expressed and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor of the present invention in the cell or membrane fraction containing the receptor of the present invention is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and 10 5 to 10 7 molecules. It is preferable that the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system but also to measure a large number of samples in the same lot. become.
  • the receptor fraction of the present invention and the ligand of the present invention (eg, labeled ligand of the present invention) Etc. are used.
  • the receptor fraction of the present invention is preferably a natural fraction of the receptor of the present invention or a recombinant fraction of the present invention having equivalent activity.
  • Labeled ligands include, for example, radioisotopes (eg, [ 3 H], c i 25 n, [ l4 c], [ 32 P] ,. [ 33 P], [ 35 s]), fluorescent substances (E.g. Fluorese In, etc.), a luminescent substance (eg, luminol, etc.), an enzyme (eg, peroxidase, etc.) or a ligand labeled with a lanthanide element can be used.
  • radioisotopes eg, [ 3 H], c i 25 n, [ l4 c], [ 32 P] ,. [ 33
  • the membrane fraction of cells or cells containing the receptor of the present invention is screened.
  • a suitable buffer any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a squirrel monohydrochloride buffer, may be used.
  • a surfactant such as CHAP S, Tween-80 TM (Kao-Atlas Co., Ltd.), digitonin, or dioxycholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-6 4 (Peptide Institute) and pepsin can be added to suppress the degradation of the receptor of the present invention by the protease. You can also.
  • N B non-specific binding
  • the mixture is filtered with a glass fiber filter paper, washed with an appropriate amount of the same buffer, and then the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation county or a single county.
  • B Q the count (B Q ) minus the nonspecific binding amount (NSB) minus the specific binding amount (B— NS
  • B A test compound having B) of, for example, 50% or less can be selected as a compound that decreases the binding between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention.
  • compounds that bind to the receptor of the present invention can be screened by utilizing the surface plasmon sensor technology. Specifically, when the receptor of the present invention is immobilized on the sensor chip surface of Biacore 300 (Biacore), and then a test compound dissolved in a phosphate buffer solution (PBS) or the like is allowed to flow on the chip surface. By measuring the change in surface plasmon, the test article that binds to the receptor of the present invention is selected. For example, a test compound that gives a measured value of a change in surface plasmon of 5 resonance units or more is selected as a substance that binds to the receptor of the present invention.
  • Biacore 300 Biacore 300
  • PBS phosphate buffer solution
  • cell stimulation activity for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular c AMP production via the receptor of the present invention
  • Inhibition of intracellular cAMP production Intracellular c GMP generation, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPa S binding activity C Activates AMP-dependent protein kinase, c Activates GMP-dependent protein kinase, Activates phospholipid-dependent protein kinase, Activates mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) (E.g., ERK1 / 2 (p42 / 44 MAP kinase), p38 MAPK, JNK / SAPK, ERK5, etc.) are measured using a method known per se or
  • cells containing the receptor of the present invention are cultured in a multi-well plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to the cells, add test compounds, etc., and incubate for a certain period of time, then extract the cells or collect the supernatant to generate Quantify the resulting product according to the respective method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay. Moreover, activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • the present invention is suitable.
  • Cells expressing the receptors of are required.
  • the above-described receptor-expressing cell line of the present invention is desirable.
  • test compound examples include peptides, proteins, antibodies, non-base petit de compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, such as blood plasma and the like.
  • GTP r S When a receptor-expressing cell is stimulated by the receptor agonist, intracellular G protein is activated and GTP binds. This phenomenon is also observed in the membrane fraction of receptor-expressing cells. Normally, GTP is hydrolyzed to change to GDP, but if GTP r S is added to the reaction solution at this time, GTP r S binds to G protein in the same way as GTP, but is hydrolyzed. Without being bound to the cell membrane containing G protein. When labeled GTP 7 S is used, the receptor-expressing cell stimulating activity of the receptor agonis can be measured by measuring the labeled GTP r S remaining in the cell membrane.
  • the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention is measured, and thereby a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. Can be binned.
  • This method is performed using a membrane fraction containing the receptor of the present invention.
  • the substance that shows GTP r S binding promoting activity to the receptor membrane fraction of the present invention is an agonist.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is brought into contact with the receptor cell membrane fraction of the present invention in the presence of labeled GTP r S, the ligand of the present invention and the test compound are fractionated with the receptor cell membrane fraction of the present invention.
  • a compound that changes the binding ability of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring and comparing the GTP r S binding promoting activity to the receptor cell membrane fraction of the present invention when contacted with Screen.
  • a test compound exhibiting an activity of suppressing the GTP r S binding promoting activity to the receptor cell membrane fraction of the present invention by the ligand of the present invention is added. It can be selected as a nisto candidate compound.
  • a cell membrane fraction containing the receptor of the present invention prepared according to a known method is diluted with a membrane dilution buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCK ⁇ u GDP, 0.1% BSA; pH 7.4).
  • the dilution rate depends on the level of receptor expression. This is dispensed in 0.2 ml each into Falcon2053, the ligand of the present invention or the ligand and test compound of the present invention are added, and [ 35 S] GTPr S is added to a final concentration of 200 pM.
  • the radioactivity of the experimental group to which only the ligand of the present invention was added was 100%
  • the radioactivity of the experimental group to which the ligand of the present invention was not added was 0%
  • the GTPr S binding promoting activity by the ligand of the present invention was tested. Calculate the impact.
  • a test compound having a GTPr S binding promoting activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate compound for Angogonis vulgaris.
  • the compound of the present invention is screened for a compound that changes the binding properties of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cells of the present invention. be able to.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, the ligand of the present invention and the test compound are bound to the receptor of the present invention.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is selected. Re-render.
  • Examples of substances that increase the amount of intracellular cAMP include forskolin and calcitonin.
  • CAMP production amount of receptor expression in the cells of the invention are murine, rat, Usagi, catcher formic, an anti-cAMP antibody obtained by immunizing such ⁇ shea [ '25 1] -labeled cAMP (commercially available co ) Can be used for the RIA system or the EIA system that combines anti-cAMP antibody and labeled cAMP.
  • a test compound showing an activity of inhibiting the cAMP production inhibitory activity of the receptor-expressing cell of the present invention by the ligand of the present invention can be selected as an candidate candidate compound.
  • screening of a compound exhibiting agonist activity can be carried out by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and examining cAMP production inhibitory activity.
  • Receptor-expressing cells of the present invention e.g., animal cells such as CH0 cells
  • Receptor-expressing cells of the present invention were seeded at 5xl0 4 cell / well in 24-well plates, and cultured for 48 hours.
  • the cells are washed with Hanks buffer (PH7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in an incubator.
  • Hanks buffer PH7.4
  • reaction buffer containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES
  • Test for cAMP production inhibitory activity by the ligand of the present invention assuming that the amount of cAMP produced by the stimulation of forskolin is 100% and the amount of cAMP suppressed by addition of 20 / M of the ligand of the present invention is 0%. Calculate the effect of the compound.
  • a test compound that inhibits the activity of the ligand of the present invention and has a cAMP production activity of, for example, 50% or more can be selected as an candidate enzyme compound.
  • the receptor-expressing cell of the present invention which exhibits the property that the amount of intracellular cAMP increases by stimulation of the ligand of the present invention
  • the case of contacting the ligand of the present invention with the receptor-expressing cell of the present invention and When the ligand of the present invention and a test compound are brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention, the intracellular cAMP production promoting activity of the cell is measured and compared, whereby the ligand of the present invention and the present invention are compared. It is possible to screen for compounds that alter the binding properties of these receptors.
  • a test compound showing an activity of inhibiting the cAMP production promoting activity of the receptor-expressing cell of the present invention by the ligand of the present invention can be selected as an candidate candidate compound.
  • screening for a compound exhibiting agonist activity can be performed by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and examining the cAMP production promoting activity.
  • the cAMP production-promoting activity is achieved by the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test in the receptor-expressing cells of the present invention (eg, animal cells such as CH0 cells) without adding forskolin in the above screening method.
  • the cAMP produced by adding the compound is quantified and measured by the above method.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is brought into contact with the CRE-reporter gene vector-introduced receptor-expressing cell in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP, the ligand of the present invention and the test When the compound was brought into contact with the CRE-repot gene vector introduced into the receptor-expressing cell of the present invention, the enzyme activity of the repo protein gene was measured and compared, whereby the present invention A compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened.
  • Examples of substances that increase the amount of intracellular cAMP include forskolin and calcinenin.
  • the vector for example, Pitsuka Gene Basic Vector, Picker Gene Hansar Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) and the like are used.
  • the CRE-containing DNA is inserted into the multi-cloning site upstream of the vector reporter gene, for example, the luciferase gene, to form a CRE-repo overnight gene vector.
  • test compound that recovers the inhibition of the enzyme activity of the repo overnight gene protein by the ligand of the present invention can be selected as the candidate antagonist compound.
  • screening of agonis can be performed. Monkey.
  • a specific example of this screening method is described below using an example of using luciferase as a reporter gene.
  • CRE- receptor expressing cells repo Isseki present invention obtained by introducing a monogenic (luciferase) were seeded at 5xl0 3 cell / well in 24-well play Bok, cultured for 48 hours. The cells are washed with Hanks buffer (PH7.4) containing 0.2 mM 3-isoptyl-methylxanthine, 0.05% BSA, and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in an incubator.
  • Hanks buffer PH7.4
  • reaction buffer containing 0.2 mM 3-isoptyl-methylxanthine, 0.05% BSA, and 20 mM HEPES
  • reaction buffer removes the reaction buffer, add a new 0.25 ml reaction buffer to the cells, and then add 0.25 ml containing 2 ⁇ forskolin containing 100 ligands of the invention or 100 ligands of the invention and the test compound.
  • Luminescence is measured by Luminome, liquid scintillation county evening or top county evening. The amount of luminescence by luciferase when the ligand of the present invention alone is added and when 100 M of the ligand of the present invention and a test compound are added is measured and compared.
  • the ligand of the present invention suppresses the increase in the amount of luminescence caused by luciferase based on the stimulation of forskolin.
  • a compound that restores the inhibition can be selected as an antagonist candidate compound.
  • alkaline phosphatase chloramphenicol acetyl transferase, or / 8-galactosidase can be used as the reporter gene.
  • Enzyme activity of these reporter gene proteins Measure according to a known method or using a commercially available measurement kit.
  • Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries is used for the alkaline phosphatase activity.
  • Fernase activity is measured using, for example, Aurora Ga ⁇ XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • the binding activity of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is measured by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cell of the present invention. It is possible to screen for compounds that change
  • a DNA containing SRE (serum respons e element) is inserted upstream of the reporter gene of the vector to obtain an SRE-repo gene vector.
  • SRE serum respons e element
  • activation of proliferation signals such as MAP kinase activation by serum stimulation is related to the expression of the repo gene via SRE. It induces the production of the gene product (protein) of the subsequent repo gene. That is, by measuring the enzyme activity of the reporter gene protein, activation of the proliferation signal in the SRE-reporter gene vector-introduced cell can be detected.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is brought into contact with the SRE-repo overnight gene vector introduced cell of the receptor of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are combined with the SRE-repo.
  • the ligand of the present invention and the receptor of the present invention By connecting the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring and comparing the enzyme activity of the reporter gene protein when contacted with the receptor-expressing cell of the present invention. Screen for compounds that alter sex.
  • the vector for example, Pitsuka Gene basic vector, Phi-Gen Gene Hansar vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) and the like are used.
  • a DNA containing SRE is inserted into a reporter gene of the above-mentioned vector, for example, a multicloning site upstream of the luciferase gene to obtain an SRE-repo-even gene vector.
  • test compound that suppresses the enzyme activation of the reporter gene protein by the ligand of the present invention can be selected as an candidate antagonist compound.
  • screening of the agonist can be performed by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the increase in the amount of luminescence similar to the ligand of the present invention.
  • a specific example of this screening method is described below using an example of using luciferase as a reporter gene.
  • SRE- reporter gene 0 Reshifera Ichize receptor-expressing cells of the present invention was introduced, it was seeded at 5xl0 3 cell / well in 24-well plates, and cultured for 48 hours. The cells are washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of anti-application buffer and incubate for 30 minutes in the incubator. After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 0.25 ml of reaction buffer to which 100 M of the ligand of the present invention or 100 M of the ligand of the present invention and a test compound were added.
  • Hanks buffer pH 7.4
  • BSA bovine serum
  • reaction buffer 20 mM HEPES
  • Luminescence by luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or glass counter. The amount of luminescence by luciferase when the ligand of the present invention alone is added and when 100 M of the ligand of the present invention and a test compound are added is measured and compared.
  • the ligand of the present invention increases the amount of light emitted by luciferase.
  • a compound that suppresses the increase can be selected as an candidate antagonist compound.
  • genes such as alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyl transferase, and / 3-galactosidase can be used as the reporter genes.
  • Enzyme activity of these reporter gene proteins Is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit.
  • Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries is used for the alkaline phosphatase activity
  • ⁇ -sword lacidase activity is measured using, for example, Aurora Ga ⁇ XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • the receptor-expressing cell of the present invention can stimulate the ligand of the present invention. Releases racidonic acid metabolites out of the cell.
  • the compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cell of the present invention. can do.
  • the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention containing a labeled arachidonic acid, the present invention containing the labeled arachidonic acid with the ligand of the present invention and a test compound.
  • a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. Two.
  • a test compound that inhibits the arachidonic acid metabolite release activity by the ligand of the present invention can be selected as an candidate antagonist compound.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cel / well, cultured for 24 hours, and then [ 3 H] arachidonic acid is added to a concentration of 0.25 Ci / well. After 16 hours, the cells are washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer 1). A final buffer concentration of 20 M of the ligand of the present invention or a reaction buffer containing a final concentration of 20 M of the ligand of the present invention and a test compound is added to each well. After incubation for 60 minutes at 37 ° C, add reaction solution 400 ⁇ 1 to the scintillator. In addition, the amount of [ 3 H] arachidonic acid metabolites released in the reaction solution is measured by scintillation counting.
  • the amount of free [ 3 H] arachidonic acid metabolite is 0% and 20 a M of the ligand of the present invention is added.
  • the amount of free [ 3 H] arachidonic acid metabolite when the reaction buffer is added (no test compound added) is 100%, and the amount of free [ 3 H] arachidonic acid metabolite when the test compound is added Calculate the amount.
  • test compound having an arachidonic acid metabolite-releasing activity of, for example, 50% or less can be selected as an candidate antagonist compound.
  • the Ca concentration in the cell is increased by stimulation with the ligand of the present invention.
  • the compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention. can do.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, By measuring and comparing the intracellular calcium concentration increasing activity, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. The measurement is performed according to a known method.
  • a test compound that suppresses the increase in intracellular calcium concentration by the ligand of the present invention can be selected as an Antonix gonis candidate compound.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded on a sterilized microscope cover glass, and two days later, the culture solution is replaced with HBS S suspended in 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories) and at room temperature. Leave for 2 hours 30 minutes. Cover with cuvette after cleaning with HBSS A glass is set, the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound are added, and the increase in the ratio of the fluorescence intensity at 505 nm at the excitation wavelengths of 340 nm and 380 nm is measured and compared.
  • FL IPR manufactured by Molecular Devices
  • Fluo-3 AM manufactured by Dojindo Laboratories
  • the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound are added, and the increase in the ratio of fluorescence intensities is measured with a fluorometer and compared.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are allowed to co-express a protein gene (eg, ae ciuor in) that emits light when the intracellular Ca ion increases, and when the intracellular Ca ion concentration increases,
  • a protein gene eg, ae ciuor in
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention can be screened using the fact that the gene protein (eg, aeciuo rin) becomes Ca-binding and emits light.
  • Receptor-expressing cells of the present invention co-expressed with a gene for a protein that emits light due to an increase in intracellular Ca ions are seeded in a 96-well plate, and in the same manner as described above, the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and Add the test compound and measure the increase in the ratio of fluorescence intensities using a fluorometer.
  • a test compound that suppresses the increase in fluorescence intensity due to the ligand of the present invention can be selected as an candidate candidate compound.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of labeled inositol, the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention. If you let me By measuring and comparing the activity of producing nositol triphosphate, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. The measurement is performed according to a known method.
  • a test compound that suppresses inositol triphosphate production activity can be selected as an antonigolist candidate compound.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate and cultured for 1 day. After that, myo- [2- 3 H] cultured inositol (2.5 Ci / wel 1) 1 day in medium supplemented with, in the wash well inositol having cell radioactivity in medium without additives. After adding the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound, 10% perchloric acid is added to stop the reaction.
  • test compound having an inositol triphosphate production activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate compound for Angogonis vulgaris.
  • TRE TPA response element
  • TRE-Repo In the receptor-expressing cells of the present invention into which the gene vector is introduced, stimulation accompanied by an increase in intracellular calcium concentration is caused by TRE-mediated reporter gene expression and subsequent repo gene genes. Induces production of products (proteins). That is, by measuring the enzyme activity of the reporter gene protein, it is possible to detect fluctuations in the amount of calcium in the TRE-reporter gene vector-introduced cells.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is brought into contact with the TRE-reporter gene vector-introduced receptor-expressing cell of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are transformed into the TRE-repo gene.
  • the vector By introducing the vector into the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the enzyme activity of the reporter gene protein when compared with the cell, the binding of the ligand of the present invention to the receptor of the present invention is demonstrated. Screen for compounds to be altered.
  • TRE-containing DNA is inserted into a reporter gene of the above vector, for example, a multicloning site upstream of the luciferase gene to obtain a TRE-reporter gene vector.
  • a test compound that suppresses the enzyme activity of the repo overnight gene protein by the ligand of the present invention can be selected as an candidate candidate compound.
  • Receptor-expressing cells of the present invention into which a TRE-reporter gene (Luciferase) has been introduced are seeded in 24-well plates at 5 10 3 6 1 1 / ⁇ 1 1 and cultured for 48 hours. After washing the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, 100 ⁇ M of the ligand of the present invention or 100 / x M of the present invention Add ligand and test compound and incubate at 37 for 60 minutes.
  • a cell lysing agent for Pitsukagene Foryo Ink Manufacturing Co., Ltd.
  • a luminescent substrate Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.
  • Luminescence by luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter. The amount of luminescence by luciferase when the ligand of the present invention is added and when 100 ligands of the present invention and a test compound are added are measured and compared.
  • the increase in intracellular calcium by the ligand of the present invention increases the amount of luminescence by luciferase.
  • a compound that suppresses this increase can be selected as an candidate candidate compound.
  • alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyltransferase, j6_galactosidase, etc. may be used as a reporter gene. Enzymatic activity of these reporter gene proteins is not known.
  • a commercially available measurement kit For example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical is used for alkaline phosphatase activity, and FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiT manufactured by Wako Pure Chemical is used for chloramphenicol acetyltransferase activity.
  • Galac® Sidase activity is measured using, for example, Aurora Ga® XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • MAP kinase is activated and proliferated by stimulation of the ligand of the present invention.
  • the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention is measured to screen for a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention. can do.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, By measuring and comparing cell proliferation, a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened.
  • the proliferation of the receptor-expressing cells of the present invention may be determined, for example, by measuring MAP kinase activity, thymidine uptake activity, ATP amount, cell number, and the like.
  • MAP kinase activity the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound were added to the receptor-expressing cells of the present invention, and then an anti-MAP kinase antibody was used from the cell lysate.
  • an anti-MAP kinase antibody was used from the cell lysate.
  • a known method for example, manufactured by Wako pure Chemical Industries, Ltd.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate, cultured, added with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and then thymidine labeled with radioactivity ( Example,
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 96-well plate, cultured, and after adding the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, for example, CellTiter-Glo ( Promega) is used to measure and compare intracellular ATP levels.
  • a test compound for example, CellTiter-Glo ( Promega) is used to measure and compare intracellular ATP levels.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate, cultured, added with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and then MTT (
  • MTT formazan which has been incorporated into cells and has changed MTT, is measured by comparing absorption of 570 ⁇ after dissolving the cells with an aqueous solution of isopropanol acidified with hydrochloric acid.
  • the test compound that suppresses the proliferation of the receptor-expressing cell of the present invention can be selected as an Antonix gonis sputum candidate compound.
  • test compound is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention, and the cell proliferation activity similar to that of the ligand of the present invention is measured to determine the agonist concentration. Cleaning can also be performed.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate at 5000 cells / well and cultured for 1 day. Next, incubate the cells in serum-free medium for 2 days to starve the cells. After adding the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound to the cells and culturing for 24 hours, [metyl- 3 H] -thymidine is added at 0.015 MBQ per well, and the cells are cultured for 6 hours. To do. Wash the cells with PBS, add methanol, and let stand for 10 minutes. Next, add 5% trichloroacetic acid and let stand for 15 minutes. Wash the fixed cells 4 times with distilled water. 0. Dissolve the cells with 3N sodium hydroxide solution and measure the radioactivity in the solution using a liquid scintillation counter.
  • a test compound that suppresses an increase in radioactivity when the ligand of the present invention is added can be selected as an Angogonis cocoon candidate compound.
  • Receptor-expressing cells of the present invention are activated by the stimulation of the ligand of the present invention, and the force rheum channel is activated and flows out of the K ion force cells inside the cells.
  • the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention is measured, and thereby the compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened.
  • Rb ions rubberidium ions
  • the Rb ([ 86 Rb]) radioisotope is taken into the receptor-expressing cells of the present invention, and then the flow of 86 Rb that flows out by stimulation with the ligand of the present invention (efflux activity).
  • efflux activity By measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of Rb, the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention.
  • Rb efflux activity The compounds that change the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention are screened by comparison and comparison.
  • test compound that suppresses the increase in 86 Rb efflux activity due to ligand stimulation of the present invention can be selected as an candidate antagonist compound.
  • screening of an agonist can be performed by bringing only the test compound into contact with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the increase in 86 Rb efflux activity similar to the ligand of the present invention.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate and cultured for 2 days. After that, incubate in a medium containing lfflC i / inl 86 RbCl for 2 hours. Wash the cells thoroughly with medium and completely remove 86 R 1 in the external solution.
  • the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound are added to the cells, and after 30 minutes, the external solution is collected, and the radioactivity is measured with a counter, and compared.
  • a test compound that suppresses the increase in 86 Rb efflux activity by ligand stimulation of the present invention can be selected as an Angogonis cocoon candidate compound.
  • the receptor-expressing cell of the present invention reacts with the ligand of the present invention, and the extracellular pH changes.
  • a compound that changes the binding property of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, By measuring and comparing extracellular pH changes, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened.
  • the extracellular pH change is measured, for example, using a Cytosensor apparatus (Molecular Device).
  • test for suppressing extracellular PH change by the ligand of the present invention The test compound can be selected as an candidate candidate compound.
  • it is also possible to screen the agonist by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the extracellular PH change similar to that of the ligand of the present invention.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are cultured overnight in a capsule for the Cytosensor device, set in the chamber of the device, and RPMI 1640 medium (Moleculare) containing 0.1% BSA for about 2 hours until the extracellular pH stabilizes. Perfume 1 device). After the pH is stabilized, a medium containing the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound is perfused onto the cells. Measure and compare the media pH change caused by perfusion.
  • a compound that suppresses extracellular pH change by the ligand of the present invention can be selected as an candidate candidate compound.
  • Sex pheromone receptor Ste2 of haploid a-mating type (MAT) of yeast is coupled to G protein Gpal, and MAP kinase is responsive to sex pheromone a-mat ing factor. This is followed by activation of Farl (cell-cycle arrest) and the transcriptional activator S12. Stel2 induces the expression of various proteins (eg, FUS1 involved in conjugation).
  • the control factor Sst2 functions in a suppressive manner in the above process.
  • yeast into which the receptor gene has been introduced is prepared, the signal transduction system in the yeast cell is activated by stimulation of the receptor agonist, and the resulting proliferation is used as an index.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention can be screened using the above receptor gene-introduced yeast system.
  • MAT a removes genes encoding yeast Ste2 and Gpal; instead, genes encoding receptor gene of the present invention and Gpal-Gai2 fusion protein Is introduced.
  • the gene encoding Farl is removed so that cell-cycle arrest does not occur, and the gene encoding Sst2 is removed to improve the sensitivity of the response to the ligand of the present invention.
  • the FUS1-HIS3 gene in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is linked to FUS1 is introduced. This gene recombination operation is, for example, Molecular and Cellular Biology, Volume 15,
  • SSTR2 somatosus yutin receptor type 2
  • the transformed yeast constructed in this way reacts with high sensitivity to the ligand of the present invention.
  • activation of MAP kinase occurs, histidine biosynthetic enzyme is synthesized, and grows in a medium lacking histidine. It becomes possible.
  • the receptor-expressing yeast of the present invention (Ste2 gene and Gpal gene are removed, the receptor gene of the present invention and the Gpal-Gai2 fusion protein coding gene are introduced, the Far gene and the Sst2 gene are removed, and the FUS (1) MATO (yeast) introduced with the HIS3 gene was cultured in a histidine-deficient medium, contacted with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and the growth of the yeast was measured and compared. It is possible to screen for compounds that alter the binding properties of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention.
  • test compound that suppresses the growth of the yeast can be selected as an candidate candidate compound.
  • the receptor expressing yeast of the invention as described above was cultured overnight in liquid culture medium completely synthetic medium, then the dissolution agar medium was removed histidine is added so that the concentration of 2xl0 4 cell / ml. Then, sow in a 9x9cm square petri dish. After the agar has solidified, the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound Place the sterile filter paper soaked on the agar surface and incubate at 30 ° C for 3 days. The effect of the test compound is compared to the growth of the yeast around the filter paper compared to the case of using sterile filter paper soaked with only the ligand of the present invention.
  • the ligand of the present invention is added in advance to an agar medium from which histidine has been removed, the test compound is soaked in a sterile filter paper, and the yeast is cultured. The growth of the yeast on the entire surface of the petri dish affects the surroundings of the filter paper. You may observe receiving.
  • a compound that suppresses the growth of yeast can be selected as an candidate for an antagonist.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor gene RNA-introduced Xenopus oocyte of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are introduced into the receptor gene RNA of the present invention. Screening for compounds that alter the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring and comparing changes in cell membrane potential when contacted with Xenopus laevis oocytes .
  • a test compound that suppresses changes in cell membrane potential can be selected as an candidate candidate compound.
  • screening of agonis can be performed by bringing only the test compound into contact with the receptor gene RNA-introduced Xenopus oocytes of the present invention and measuring changes in cell membrane potential similar to the ligands of the present invention.
  • One specific example of the screening method is described below.
  • the oocyte mass removed from the female Xenopus laevis that became immobile after cooling with ice was prepared using MBS solution (88 mM NaCl, linM KC1, 0.41 mM CaCl 2 , 0.33 mM Ca (N0 3 ) 2 , 0.82 mM MgS0 4 , Treat with collagenase (0.5mg / ml) dissolved in 2.4mM NaHC0 3 , lOmM HEPES (pH 7.4) at 19 until the egg mass is unraveled, 1-6 hours at 150rpm.
  • MBS solution 88 mM NaCl, linM KC1, 0.41 mM CaCl 2 , 0.33 mM Ca (N0 3 ) 2 , 0.82 mM MgS0 4 , Treat with collagenase (0.5mg / ml) dissolved in 2.4mM NaHC0 3 , lOmM HEPES (pH 7.4) at 19 until the egg mass
  • the external solution is washed three times by substituting the MBS solution, and the oRNA is microinjected with the receptor gene poly A-added cRNA (50 ng / 50 nl) of the present invention into the oocyte using a micromanipulator.
  • the receptor gene mRNA of the present invention may be prepared from tissues or cells, or may be transcribed in vitro from brass.
  • the receptor gene mRNA of the present invention is cultured in MBS solution at 20 ° C for 3 days, and this is placed in a recess of a voltage clamp device in which Ringer solution is flowing. Insert the electrode into the cell and (1) place the electrode outside the cell. When the potential is stabilized, the Ringer solution containing the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound is flowed to record the potential change.
  • test compound should be measured by comparing the changes in cell membrane potential of the Xenopus laevis oocytes transfected with the receptor gene RNA of the present invention with a ringer solution containing only the ligand of the present invention. Can do.
  • a compound that suppresses changes in cell membrane potential can be selected as an Antagonis ⁇ candidate compound.
  • poly A-added RNA of various G protein genes may be introduced.
  • poly A-added RNA of a gene that produces luminescence in the presence of calcium eg, aetiuorin
  • the amount of luminescence can be measured instead of membrane potential change.
  • mast cells derived from mammals preferably humans, chimpanzees, monkeys, etc.
  • mast cell lines preferably mast cells derived from skin, bladder, stomach, small intestine, lungs, etc.
  • the decondyles of obesity mortars It is possible to screen for compounds having a grain inhibitory action, an eicosanoide production inhibitory action, a cytokine inhibitory action, a mast cell proliferation inhibitory action, a mast cell activation inhibitory action, and the like.
  • RNA is prepared from the cells, and site force in (eg, TNF-III, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, TGF-iS, etc.) Measure the amount of RNA (eg, by RT-PCR, Quantitative real-time-PCR, etc.) Screening agents (such as compounds that have an inhibitory effect on site force-in production).
  • site force in eg, TNF-III, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, TGF-iS, etc.
  • the ligand of the present invention is contacted with mast cells in the presence and absence of the test compound, and the site force in the culture supernatant (eg, TNF-, IL-4, I-5, IL- 6, IL-8, IL-13, TGF-3, etc.) Measure the amount of protein (eg, EIA, RIA, etc.) and compare it to determine the site force in (eg, TNF-H, IL-4) , IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, TGF- / S, etc.) Screening for production inhibitors (compounds that have a site-in-in production inhibitory effect, etc.).
  • the site force in the culture supernatant eg, TNF-, IL-4, I-5, IL- 6, IL-8, IL-13, TGF-3, etc.
  • Measure the amount of protein eg, EIA, RIA, etc.
  • the site force in eg, TNF-H, IL-4
  • the ligand of the present invention is contacted with mast cells in the presence and absence of a test compound, and site force in (eg, TNF-, IL-4, IL-5, IL-6, I-8) , IL-13, TGF- / 3, etc.)
  • site force in eg, TNF-, IL-4, IL-5, IL-6, I-8) , IL-13, TGF- / 3, etc.
  • site force in eg, TNF-, IL-4, IL-5, IL-6, I-8) , IL-13, TGF- / 3, etc.
  • siRNA vector containing siRNA against the polynucleotide encoding the receptor of the present invention in the presence and absence of the test compound eg, siRNA vector, antisense oligonucleotide, antisense oligonucleotide expression vector) Etc.
  • a siRNA library is prepared, then transferred to mast cells, contacted with the ligand of the present invention, and cytokines (eg, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, TGF- / 3, etc.) expression level (eg, cytokine RNA level, cytokine protein level, etc.) and siRNA base sequence that induces a decrease in the expression level
  • cytokines eg, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, TGF- / 3, etc.
  • expression level eg, cytokine RNA level, cytokine protein level, etc.
  • anti-IgE antibody when contacting with a ligand, for example, when mast cells are activated or passively sensitized, anti-IgE antibody, antibody-specific antigen, etc., otherwise, NGF, Stem Cell Factor (SCF) , Co-stimulation with cytokines, lectins, etc. may be used.
  • SCF Stem Cell Factor
  • the ligand of the present invention is contacted with a mast cell incorporating radiolabeled arachidonic acid, and the radioactivity in the culture supernatant is measured and compared. Screening for compounds that have an eicosanoide production inhibitory effect (such as a compound having an eicosanoide production inhibitory effect).
  • the ligand of the present invention is contacted with obese cells, and the granule content in the culture supernatant (eg, histamine, serotonin, iS—hexosaminidase, /
  • the granule content in the culture supernatant eg, histamine, serotonin, iS—hexosaminidase, /
  • a compound having a degranulation inhibitory action such as a compound having a degranulation inhibitory action
  • the amount of the granule-containing material can be quantified by a known method such as EIA, RIA, HPLC, enzyme activity measurement or the like.
  • mast cells may be visualized (eg, video devices) and degranulated cells counted.
  • the ligand of the present invention is contacted with a mast cell into which a radiolabeled granule-containing material has been incorporated, and the radioactivity in the culture supernatant is measured and compared. Screening for degranulation inhibitors (compounds with degranulation inhibitory action, etc.).
  • the ligand of the present invention is contacted with mast cells in the presence and absence of the test compound, and the amount of annexin V bound to mast cells is measured (eg, FACS) and compared to determine whether Screen for granule inhibitors (compounds that have a degranulation inhibitory effect).
  • the ligand of the present invention is contacted with mast cells in the presence and absence of the test compound, the cell lysate is separated on a polyacrylamide gel, transferred to a membrane, MAP kinase-specific antibody and By using a chemiluminescent reagent to detect with a first-class image analyzer and comparing the intensity of luminescence, obesity Screening for cell activation inhibitors (eg, compounds having an inhibitory effect on mast cell activation, including MAPK activation inhibitors).
  • cell activation inhibitors eg, compounds having an inhibitory effect on mast cell activation, including MAPK activation inhibitors.
  • the ligand of the present invention is contacted with a mast cell (eg, a mast cell cultured after seeding in a 24-well plate), and thymidine labeled with a radioisotope (eg, [methyl- 3 H] - after thymidine etc.) added pressure, the cells were lysed and the radioactivity of the thymidine incorporated into the cells, by counting in a liquid body scintillator one sucrose Nkaun evening one, seen thymidine up write By measuring and comparing the activity, a mast cell proliferation inhibitor (such as a compound having an activity of inhibiting mast cell proliferation) is screened.
  • a mast cell proliferation inhibitor such as a compound having an activity of inhibiting mast cell proliferation
  • the ligand of the present invention is contacted with mast cells (eg, mast cells cultured after seeding in 24-well plates), and MTT (3- (4, 5-dimethyl- 2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazol iuni bromide), and then the cells were lysed with an aqueous isopropanol solution of MTT formazan, which had been taken up into the cells and changed MTT, with acidified with hydrochloric acid Then, a mast cell proliferation inhibitor (compound having an inhibitory effect on the proliferation of proliferation cells) is screened by measuring and comparing by absorption at 570 nm.
  • mast cells eg, mast cells cultured after seeding in 24-well plates
  • MTT 3- (4, 5-dimethyl- 2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazol iuni bromide
  • a screening kit for a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention or a salt thereof is the receptor of the present invention or a cell membrane containing the receptor of the present invention. And a ligand of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • Filter sterilize with a 0.45 m pore diameter and store at 4 ° C or prepare at use.
  • the ligand of the present invention is dissolved to 1 mM in PBS containing 0.1% ushi serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at 120 ° C.
  • the compound obtainable by using the screening method of the present invention or the screening kit or a salt thereof is a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention or the activity of the receptor of the present invention. Specifically, (i) a compound having a cell stimulating activity via the receptor of the present invention or a salt thereof (receptor agonist of the present invention),
  • a compound that promotes the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention (iv) a compound that inhibits the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention;
  • the compound include compounds selected from peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like.
  • the compound may be a new compound or a known compound.
  • salt of the compound the same salts as those of the receptor of the present invention described above can be used.
  • the following i) or i i) may be used as a method for evaluating whether the receptor agonist of the present invention is an antagonist of the present invention.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is the receptor agonist (agonist) of the present invention, and the compound having no activity or a salt thereof is the receptor antagonist of the present invention (angiogonist). )
  • test compound is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention, and the cell stimulating activity via the receptor of the present invention is measured.
  • a compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a receptor agonist of the present invention.
  • the receptor antagonist ⁇ of the present invention is a physiological activity possessed by the receptor of the present invention or the ligand of the present invention (eg, mast cell degranulation promoting action, eicosanoide production promoting action, cytokine production promoting action, mast cell Growth inhibitory action, mast cell activation action, etc.), which is an excellent mast cell degranulation inhibitor, eicosanoide production inhibitor, site force-in production inhibitor, mast cell.
  • a physiological activity possessed by the receptor of the present invention or the ligand of the present invention eg, mast cell degranulation promoting action, eicosanoide production promoting action, cytokine production promoting action, mast cell Growth inhibitory action, mast cell activation action, etc.
  • Examples include anti-proliferative agents, mast cell activation-inhibiting agents, immune diseases [eg, inflammatory diseases (pituitary abscess, thyroiditis, peritonitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, erythema nodosum, rheumatoid arthritis, etc.) Systemic lupus erythematosus), allergies (eg, allergic conjunctivitis, allergic rhinitis, hay fever, metal allergies, etc.), asthma, exudation Otitis media, Meniere's disease, contact dermatitis, anaphylaxis, urticaria, myasthenia gravis, glomerulonephritis, Siedalen syndrome, Basedow's disease, insulin resistance diabetes, atopic dermatitis, leukocyte abnormalities), urological diseases (Eg, renal tubulointerstitial disorder (fibrosis), interstitial cystitis, allergic cystitis, etc.), digestive system diseases (eg, irritable
  • the compound that inhibits the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention is used in the same manner as the receptor antagonist of the present invention.
  • the compound that promotes the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention is used in the same manner as the receptor agonist of the present invention.
  • the present invention provides a script of a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention, which uses the polynucleotide of the present invention encoding the receptor of the present invention.
  • a method for providing a service is also provided. Specifically, (i) when cells having the ability to produce the receptor of the present invention are cultured, and (ii) a mixture of cells having the ability to produce the receptor of the present invention and a test compound is cultured. Comparison with the case is carried out, and a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention is screened.
  • the expression level of the gene of the receptor of the present invention (specifically, the receptor level of the present invention or the receptor of the present invention is encoded). Measure the amount of mRNA etc.) and compare.
  • test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. It may be a novel compound or a known compound.
  • cells having the ability to produce the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention are suspended in a buffer suitable for screening.
  • a buffer any buffer that does not inhibit the activity of the receptor of the present invention, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) or a borate buffer, is used. Also good.
  • a host transformed with a vector containing the above-mentioned DNA encoding the receptor of the present invention is used.
  • the host for example, animal cells such as CHO cells are preferably used.
  • a transformant in which the receptor of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
  • the protein amount of the receptor of the present invention can be measured by a known method, for example, by using the antibody of the present invention, the above-mentioned polypeptide or receptor present in a cell extract or the like by Western analysis, ELISA method or the like. It can be measured according to a method or a similar method.
  • the gene expression level of the receptor of the present invention can be determined by a known method such as Northern blotting, Reverse transcript ion-polymerase chain react ion (RT-PCR), real-time PCR analysis system (ABI, TaciMan polymerase chain react ion). ) Or other similar methods.
  • the expression of the gene of the receptor of the present invention in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50%, compared to the case (i).
  • the test compound that promotes the above can be selected as a compound that promotes the expression of the receptor gene of the present invention or a salt thereof.
  • the expression of the gene of the receptor of the present invention in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50%, compared to the case (i).
  • the test compound that inhibits the above can be selected as a compound that inhibits the expression of the receptor gene of the present invention or a salt thereof.
  • the compound that inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention or a salt thereof is used in the same manner as the receptor antagonist of the present invention.
  • the compound or its salt that promotes (increases the expression level) of the gene of the receptor of the present invention is used in the same manner as the receptor agonist of the present invention.
  • the resulting compound or salt thereof is, for example, a compound selected from peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.
  • a compound that changes the binding between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention a compound that promotes or inhibits the activity or function of the receptor of the present invention; Compounds that inhibit (increase or decrease expression level).
  • the salt of the compound the same salts as those of the receptor of the present invention described above can be used.
  • the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned pharmaceutical (such as a prophylactic / therapeutic agent), it can be carried out according to conventional means.
  • the compound or a salt thereof is, for example, as a tablet, a capsule, an elixir, a microcapsule or the like with sugar coating as required, or aseptically with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of an injection such as an aqueous solution or suspension.
  • additives examples include gelatin, corn starch, tragacanth, binders such as gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • a swelling agent such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, quail oil or cherry, and the like are used.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection include active substances in vehicles such as water for injection, natural products such as sesame oil, coconut oil, etc. It can be treated according to the usual formulation practice such as dissolving or suspending vegetable oil.
  • aqueous solutions for injection examples include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose, and other adjuvants.
  • isotonic solutions eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • physiological saline glucose, and other adjuvants.
  • alcohol for example, ethanol
  • polyalcohol for example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.
  • nonionic surfactant for example, polysorbate 80 TM , HC 0150, etc.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • the compound or a salt thereof may be added to a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, pro-hydrochlorin hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, pro-hydrochlorin hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, Serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • chicks or warm-blooded animals eg mice, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, birds, cats, dogs
  • Monkeys, chimpanzees, etc. are examples of chicks or warm-blooded animals.
  • the dose of the compound or its salt varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, etc.
  • the daily dose of antagonist is about 0.1 to: L 0 0 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably About 1.0 to 20 mg is orally administered.
  • an evening gonist is administered in the form of an injection to a patient with interstitial cystitis (per 60 kg)
  • an evening evening gonist sputum is about 0.01 to It is convenient to administer 30 mg, preferably about 0.:! To 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 O mg by intravenous injection. Other animal places In this case, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the antibody against the receptor of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the receptor of the present invention, the receptor of the present invention in the test solution It can be used for quantification, especially quantification by sandwich immunoassay.
  • the antibody of the present invention is reacted competitively with the test solution and the labeled receptor of the present invention, and the ratio of the labeled receptor of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the receptor of the present invention in a test solution and
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the receptor of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal part of the receptor of the present invention. desirable.
  • the antibody molecule itself may be used, or the Fb ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the receptor of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody-antigen corresponding to the amount of antigen (eg, amount of polypeptide) in the solution to be measured. Any measurement method may be used as long as the amount of the complex is detected by chemical or physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. .
  • nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described below is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • radioisotopes for example, radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, and the like are used as labeling agents used in measurement methods that use labeled substances.
  • the radioisotope e.g., [125 I], [131 I], [3 H], [14 C] and the like are used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • 6-galactosidase, j8-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a piotin-avidin system can be used for the binding of the antibody or antigen and the labeling agent.
  • insolubilization of an antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a polypeptide or an enzyme may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then on the insolubilized carrier.
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at different times.
  • the labeling agent and the insolubilization method can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be used.
  • the method of measuring the receptor of the present invention by the sandwich method of the present invention the method of measuring the receptor of the present invention by the sandwich method of the present invention,
  • antibodies having different binding sites for the receptor of the present invention are preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is used in the primary reaction, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal part of the receptor of the present invention.
  • the antibody is preferably an antibody that recognizes other than the C end, for example, the N end.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • BZF separation Measure the amount of either B or F label and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody.
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • the antibody may be soluble and the second antibody may be a solid phase method using a solid phase antibody.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or in the test solution.
  • the antigen is reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid-phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in the gel or solution is measured.
  • Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
  • the receptor measurement system of the present invention may be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and procedures in each method. For details on these general technical means, refer to reviews and textbooks.
  • the receptor of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • an increase in the concentration of the receptor of the present invention is detected by quantifying the concentration of the receptor of the present invention using the antibody of the present invention, for example, the action of promoting degranulation of mast cells, eicosanoid, Stimulates production of cells, promotes cytokine production, promotes mast cell proliferation, activates mast cells, etc., and promotes immune diseases [eg, inflammatory diseases (pituitary abscess, thyroiditis, peritonitis, clone disease] Ulcerative colitis, erythema nodosum, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc., allergies (eg, allergic conjunctivitis, allergic rhinitis, hay fever, metal allergy, etc.), asthma, exudative otitis media, meniere Disease, contact dermatitis, anaphylaxis, measles, myasthenia gravis, thread Globe nephritis, Siegren
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the receptor of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the receptor of the present invention, detection of the receptor of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the receptor of the present invention in a test cell, etc. Can be used for.
  • the polynucleotide (DNA) of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a 'hot-blooded animal (eg, rat, mouse', guinea pig). Detection of abnormalities (gene abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the receptor of the present invention in the fish, rabbits, birds, birds, higes, bushes, bushes, horses, cats, dogs, monkeys, etc.) Therefore, it is useful as a genetic diagnostic agent for, for example, damaging, mutating or reducing expression of the DNA or mRNA, or increasing or overexpressing the DNA or mRNA.
  • a 'hot-blooded animal eg, rat, mouse', guinea pig.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention is, for example, a known Northern hybridization PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America, 86, 2766-2770, 1989).
  • mast cell degranulation inhibitory action eicosanoide production inhibitory action
  • cytokine inhibitory action eicosanoide production inhibitory action
  • mast cell proliferation inhibitory action eicosanoide production inhibitory action
  • mast cell Suppression of activation increases, immune diseases [eg, inflammatory diseases (eg, pituitary abscess, thyroiditis, peritonitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, erythema nodosum, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus] Allergies (eg, allergic conjunctivitis, allergic rhinitis, hay fever, metal allergy, etc.), asthma, exudative otitis media, Meniere's disease, contact dermatitis, anaphylaxis, urticaria, myasthenia gravis, thread Sphere nephritis, Siedalen syndrome, Basedow disease, insulin resistant diabetes, atopic dermatiti
  • a pharmaceutical containing an antisense polynucleotide eg, DNA
  • Polynucleotides (eg, antisense DNA) include, for example, mast cell degranulation inhibitor, eicosanoide production inhibitor, cytokine inhibitor, mast cell proliferation inhibitor, mast cell activation inhibitor (eg, MAPK)
  • immune diseases eg, inflammatory diseases (pituitary abscess, thyroiditis, peritonitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, erythema nodosum, chronic rheumatoid arthritis, systemic nature, etc.) Lupus erythematosus), allergies (eg, allergic conjunctivitis, allergic rhinitis, hay fever, metal allergies, etc.), asthma, exudative middle ear
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA is inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. can do.
  • the anti-sense DNA can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting ingestion, and can be administered through a catheter such as a gene gun or a hydrogel force taper.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.
  • double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the receptor of the present invention siRNA (small (short) interfering RNA), sh for the receptor of the present invention
  • RNA small (short) hairpin RNA
  • ribosomes containing a part of the RNA encoding the receptor of the present invention can also suppress the expression of the polynucleotide of the present invention.
  • the double-stranded RNA is produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001). You can.
  • the ribozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, 221 pages, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the receptor of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the receptor of the present invention of the present invention includes a portion (RNA fragment) adjacent to the cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known liposome.
  • RNA or ribozyme When the above double-stranded RNA or ribozyme is used as the prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • Antibodies of the receptor of the present invention are, for example, mast cell degranulation inhibitor, eicosanoide production inhibitor Agents, site force-in production inhibitors, mast cell growth inhibitors, mast cell activation inhibitors (including MAPK activation inhibitors, etc.) such as immune diseases [eg, inflammatory diseases (pituitary gland) Abscess, thyroiditis, peritonitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, erythema nodosum, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc., allergy (eg, allergic conjunctivitis, allergic rhinitis, hay fever, metal) Allergies, etc.), asthma, exudative otitis media, Meniere's disease, contact dermatitis, anaphylaxis, urticaria, myasthenia gravis
  • immune diseases eg, inflammatory diseases (pituitary gland) Abscess, thyroiditis, peritonitis
  • the above-mentioned medicament containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, for example, a human warm-blooded animal (eg, rat, rabbit, hidge, buyu, ushi, cat, Inu, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • a human warm-blooded animal eg, rat, rabbit, hidge, buyu, ushi, cat, Inu, monkeys, etc.
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., but for example, when used for the treatment of patients with interstitial cystitis in adults, the antibody of the present invention is administered once.
  • it is usually about 0.1 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 :!
  • the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration. It is.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft Capsules), syrups, emulsions and suspensions.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • a composition for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc.
  • injections are agents such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous infusions, etc. Includes shape.
  • Such an injection is prepared by a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-mentioned antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (E.g., propylene dallicol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [e.g.
  • polysorbate 80 HCO-5 50 (pol yoxye tyl ene (50mol) adduc tof hyd rogena t ed cas toroil)] etc. You may use together.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • a suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-mentioned antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base.
  • the above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections 5 to 100 mg, and other dosage forms preferably contain 10 to 25 mg of the above antibody.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections 5 to 100 mg, and other dosage forms preferably contain 10 to 25 mg of the above antibody.
  • Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as undesirable interactions are not caused by blending with the antibody.
  • the present invention may be abbreviated as DN A encoding the exogenous receptor of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DNA of the present invention) or its mutant DNA (exogenous mutant DN A of the present invention). ) Having a non-human mammal. That is, the present invention
  • a recombinant vector or the like that contains the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and can be expressed in mammals.
  • a non-human mammal having the exogenous DN A of the present invention or a mutant DN A thereof is an embryo cell containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a progenitor cell thereof.
  • the calcium phosphate method, electric pulse It can be produced by transferring the target DNA by the method, lipofussion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DE AE-dextran method, etc.
  • the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and used for cell culture, tissue culture, etc.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned embryo cells with the above-mentioned germ cells by a known cell fusion method.
  • Non-human mammals include, for example, Ushi, Buuyu, Hedge, Goat, Usa Gi, Inu, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat, etc. are used.
  • rodents that have relatively short ontogeny and biological cycles in terms of creating disease animal model systems, and that are easy to reproduce, especially mice (for example, C 5 7 B LZ6 strain, DBA as a pure strain) 2 lines, etc.
  • mice for example, C 5 7 B LZ6 strain, DBA as a pure strain
  • rat eg, W istar, SD, etc.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in the mammal include rabbits in addition to the non-human mammal described above.
  • the exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by a non-human mammal but the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • the mutated DNA of the present invention has a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of a base, deletion, substitution with another base, etc. DNA etc., in which the occurrence of DNA is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal receptor of the present invention.
  • a DNA that expresses a polypeptide that suppresses the function of a normal receptor of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the target animal.
  • various mammals having the DNA of the present invention having high homology with this for example, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • a DNA construct (eg, Vector 1) conjugated with the human DNA of the present invention downstream of various promoters capable of expressing the derived DNA is applied to a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • Expression vectors for the receptor of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moroni leukemia virus, ⁇ Animal viruses such as Xinnia virus or baculovirus are used. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, or plasmids derived from yeast are preferably used.
  • the promotion of the above DNA expression regulation includes (i) DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) (Ii) Various types of mammals (eg, human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) such as albumin, insulin II, uroplakin II, Elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daryuthione S-transferase, platelet-derived growth factor ⁇ 6, keratin K l, K 10 and ⁇ 14, collagen I and II, Cyclic AMP-dependent protein kinase] SI subunit, Gis Higuchi Fi Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal (generally referred to as “Mineta 1”).
  • Mineta 1 a DNA-transferred mammal
  • virus-derived and various mammals The sequence of each DNA derived therefrom can be used, and preferably Simian virus SV 40 Minneta.
  • the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region or for the purpose of further expressing the target foreign DNA It is also possible to connect 3 'downstream of the translation region.
  • the normal translation region of the receptor of the present invention includes livers, kidneys, thyroid cells derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) Using fibroblast-derived DNA and all or part of genomic DNA from commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblast-derived RNA. You can get it.
  • exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal polypeptide translation region obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by an ordinary DNA engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all of the progeny of the produced animal are in the germ cells and somatic cells. This means that the exogenous DNA of the present invention is retained.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has been confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and can be passed as a DNA-bearing animal in a normal breeding environment. Can be raised.
  • exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • Excessive exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after the transfer of DN A means that all the offspring of the produced animal receive the exogenous DN A of the present invention in all the germ cells and somatic cells. It means having an excess.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DN A of the present invention has a high expression of the normal DN A of the present invention, and finally promotes the function of the endogenous normal DN A, thereby finally accepting the receptor of the present invention.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released receptor of the present invention, for example, mast cell decondyles-promoting animals, eicosanoid production-promoting animals, Tokaine production-promoting animals, mast cell proliferation-promoting animals, mast cell-activated animals (eg, including MAPK-activated (promoted) animals), etc.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention has been confirmed to stably retain exogenous DNA by mating, and is subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. I can do it. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. Of the present invention in the fertilized egg cell stage. Abnormal DNA metastasis is ensured to be present in all germ and somatic cells of the subject mammal.
  • the presence of the abnormal DN A of the present invention in the germ cell of the produced animal after DN A transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DN A of the present invention in all the germ cells and somatic cells. .
  • Descendants of this type of animal that have inherited the foreign DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high expression of the abnormal DNA of the present invention, and eventually inhibits the function of the endogenous normal DNA to cause the function of the receptor of the present invention to fail. It may become active refractory and can be used as a model animal for the disease state. For example, it is possible to elucidate the pathologic mechanism of the functionally inactive refractory of the receptor of the present invention and to examine a method for treating this disease using the abnormal DNA metastasized animal of the present invention. .
  • the abnormally high DNA-expressing animal of the present invention is caused by the abnormal polypeptide of the present invention or the abnormal receptor of the present invention in the functional inactive refractory of the receptor of the present invention. It is a model to elucidate the inhibition of the function of normal polypeptides or receptors (dominant negative action).
  • a therapeutic drug screen for the functional inactive type refractory of the receptor of the present invention can be obtained. It can also be used for pinching tests.
  • two kinds of DNA transfer animals of the present invention for example,
  • each organ can be removed from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, free DNA-transferred cells can be obtained and cultured or the cultured cells can be organized by trypsin or other proteolytic enzymes. It is.
  • the receptor producing cell of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them can be investigated, and their abnormality can be investigated. It becomes an effective research material for elucidating the action.
  • DNA treatment methods for diseases associated with the receptor of the present invention can be studied and developed using the DNA metastasized animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention.
  • the amino acid sequence of human TGR12 is shown.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence encoding the amino acid sequence represented by 1. [SEQ ID NO: 3]
  • TGR12 probe used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • FAM 6-carboxy-fluorescein
  • TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine
  • the base sequence of the standard DNA (synthetic oligo DNA) for NK1 receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • the base sequence of the primer for NK1 receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • the base sequence of the primer for NK1 receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • NK2 receptor standard DNA synthetic oligo DNA
  • the base sequence of the primer for NK2 receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • the base sequence of the primer for NK2 receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • NK3 receptor standard DNA synthetic oligo DNA
  • the base sequence of the primer for NK3 receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • the base sequence of the primer for NK3 receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • the base sequence of the NK3 receptor probe used in the PCR reaction in the examples Show. [FAM (6-carboxy-fluorescein) as a reporter dye at the 5 'end and TAMRA (as a quencher at the 3' end
  • TGR12 standard DNA double-stranded cDNA
  • VIP1 receptor standard DNA synthetic oligo DNA
  • the base sequence of the primer for VIP1 receptor used in the PCR reaction in the example is shown.
  • the base sequence of the primer for VIP1 receptor used in the PCR reaction in the example is shown.
  • the nucleotide sequence of the probe for VIP1 receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • [FAM (6-carboxy-fluorescein) is used as a Ribo evening dye at the 5 'end, and TAMRA (as a quencher is used at the 3' end.
  • the nucleotide sequence of the VIP2 receptor primer used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • PACAP receptor standard DNA synthetic oligo DNA
  • the base sequence of the primer for the PACAP receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • the base sequence of the primer for the PACAP receptor used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the fusion protein of human TGR12 and GFP is shown.
  • the base sequence of the primer for human TNF- ⁇ used in the PCR reaction in the examples is shown.
  • TGR12-dependent intracellular calcium-elevating action of physiologically active peptides CHO / dMr- cells (hereinafter referred to as CH0) were cultured in a-MEM medium (Invitrogen) containing 10% ushi fetal serum.
  • a base sequence in which the base sequence encoding GFP (Wako Pure Chemical Industries) is linked to CH0 after removing the entire codon of the base sequence encoding TGR12 [hereinafter, TGR12-GFP (represented by SEQ ID NO: 31) HpAKKO-lllH (Biochini. Biophys. Acta, Vol. 1219, pages 25 to 259, 1994) is the same vector as pAKKOl.11H.
  • CH0-TGR12 TGR12-GFP expressing CH0 cell line
  • the maximum activity of calcium increase by substance P stimulation was 194 at 0.3 nM, 50 at 3 nM, 206 at 30 nM, 15610 at 300 nM, and 23842 at 3000 nM.
  • the maximum activity of the calcium-elevating effect of Cortis utiltin-17 stimulation was 67 for 0.3 nM, 54 for 3 nM, 94 for 30 nM, 17914 for 300 nM, and 23647 for 3000 nM.
  • the maximum activity of calcium-increasing action by PAMP-12 stimulation was 255 at 0.3 nM, 1617 at 3 nM, 22291 at 30 nM, 24088 at 300 nM, and 23743 at 3000 nM.
  • the maximum activity of calcium increase by PACAP-27 stimulation is 48 for 0.3 nM, 58 for 3 ⁇ , 939 for 30 ⁇ , and 939 for 300 ⁇ . It was 23728 at 23030 and 3000nM.
  • the maximum activity of the calcium-elevating action by PACAP-38 stimulation was 287 at 0.3 nM, 410 at 3 nM, 195 at 30 nM, 23043 at 300 nM, and 23315 at 3000 nM.
  • the maximum calcium-elevating activity by VIP stimulation was 56 at 0.3 nM, 60 at 3 nM, 16 at 30 nM, 11153 at 300 nM, and 24007 at 3000 nM.
  • the EC 5fl value of the calcium-elevating action on CH0-TGR12 is about 237 nM in substance P, about 218 nM in cortisol-17, about 98 nM in PAMP-12, about 93 nM in PACAP-27, and PACAP-38. About 161 nM in VIP and about 305 nM in VIP.
  • Reaction mixture containing the obtained reverse transcription product equivalent to 25 ng of lotal RNA or standard DNA described below, 1 X Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 200 nM each of primers described below, and TaciMan probe 200 ⁇ About PCR using ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems) became. PCR was carried out by repeating 40 cycles of a cycle of 95 ° C ⁇ 15 seconds and 60 ⁇ 60 seconds after treatment at 50t: ⁇ 2 minutes, 95 ° C ⁇ 10 minutes. The expression level was calculated by ABI PRI SM 7700 SDS software.
  • a standard curve was created with the vertical axis representing the number of cycles at the moment when the reporter fluorescence intensity reached the set value and the horizontal axis representing the logarithmic value of the initial concentration of standard DNA. Calculate the initial concentration of each reverse transcript from the standard curve and calculate the expression level of human TGR12, NK1 receptor, NK2 receptor, NK3 receptor, VIP 1 receptor, VIP2 receptor and PACAP receptor gene at each site. Asked.
  • TGR12 standard DNA for TGR12 having a base sequence represented by SEQ ID NO: 17; primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 3
  • the expression amount of the primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 was 687474 copies per 25 ng of total RNA.
  • NK1 receptor standard DNA for NK1 receptor having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5; primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7
  • the expression amount per 25 ng of total RNA of the primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 was 50 copies.
  • NK2 receptor (NK2 receptor standard DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9; primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 1 1
  • the amount of expression per 25 ng of total RNA of the primer having the base sequence represented by (SEQ ID NO: 12) using the TaciMan probe having the base sequence represented by 2) was 1 copy.
  • an NK3 receptor an NK3 receptor standard DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 13; a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15
  • the expression level per 25 ng of total RNA of the primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 was 1 copy.
  • ⁇ ⁇ 1 receptor (SEQ ID NO: 19 A standard DNA for a receptor, a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 20; a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 21; a base sequence represented by SEQ ID NO: 22
  • the expression level per total 25 ng of total RNA is 219 copies
  • VIP2 receptor receptor standard DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, base number represented by SEQ ID NO: 24
  • the expression amount per 25 ng of total RNA of the primer having the sequence, the primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 25, and the TaqMan probe having the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 is 179 It was a copy.
  • a PACAP receptor (receptor standard DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 7; a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 8; and a sequence represented by SEQ ID NO: 29
  • the amount of expression per 25 ng of total RNA was 18 copies using a primer having the nucleotide sequence shown below and a TaaMan probe having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30).
  • TGR12 was highly expressed in LAD 2.
  • NK1, NK2, NK3, VIPK VIP2 and PACAP receptors were found to be underexpressed.
  • the human mast cell line LAD 2 was cultured using StemPro-34 medium (Invitrogen) containing 100 ng / niL of stem cell factor (Immunobiology Laboratories). LAD 2 was washed with evening buffer (126 mM NaCl, 4. OinM KC1, 0.69 mM KH 2 P04, 5.6 mM Glucose, ImM CaCl 2 , ImM MgCl 2 , 0.1% BSA) and 1 well in a 96-well plate Dispense 20 000 LAD 2 at 150 L each and incubate at 37 for 5 minutes.
  • StemPro-34 medium Invitrogen
  • LAD 2 was washed with evening buffer (126 mM NaCl, 4. OinM KC1, 0.69 mM KH 2 P04, 5.6 mM Glucose, ImM CaCl 2 , ImM MgCl 2 , 0.1% BSA) and 1 well in a 96-well plate Dispense 20 000 LA
  • the degree of degranulation was measured by measuring -hexosaminidase activity as follows. Dispense the supernatant into a 96-well plate and add 0.1 M of 5 times the amount of the supernatant. Citrate (pH4.5) / ImM 4 -methyl umbel 1 iferyl-2-acetamido-2 -deoxy-beta-D-glucopyranoside (Wako Pure Chemical Industries) was added and incubated at 37 ° C for 1 hour. Next, 0.1M of the reaction solution is 0.2M
  • the reaction was stopped by adding Glycine / NaC0 3 ( ⁇ .7), and the measurement was performed with Fusion-H (Perkin Elma).
  • the jS-hexosaminidase activity was determined by converting the activity in the supernatant after freezing and thawing LAD 2 four times and centrifuging to total / 3-hexosaminidase activity in LAD 2, and the degree of degranulation was all / The ratio of j3 -hexosamin idase activity in LAD 2 supernatant to 3 -hexosaminidase activity is shown.
  • spontaneous degranulation was about 1.5%.
  • the degranulation by substance P stimulation was 1.8 at 30 ⁇ , 39.2% at 8.75L ⁇ at 30nM, 58. at 300nM, 66.8% at 1M, and 71.0 at 3M.
  • the degranulation induced by Cortis eveningin-17 was 1.6% for ⁇ , 2.8% for 30 nM, 26.5 for ⁇ , 52.8% for 300 nM, and 58.9% for M at 62.3.
  • PAMP-12-stimulated degranulation was 6.3% for 3nM, 30.7% for ⁇ , 52.1 for 30nM, 67.7% for 65H 300nM for ⁇ , and 69.3% for lM.
  • the degranulation by PACAP-27 stimulation was 2.6% for ⁇ , 19.6% for 30 nM, 59.4% for ⁇ , 71.1% for 300 nM, 75.1% for I M, and 69.
  • the degranulation by stimulation with PACAP-38 was 7.4% for ⁇ , 24.83 ⁇ 4 for 30nM, 49. for ⁇ , 65.8% for 300nM, 68.93 ⁇ 4 for 63, and 63.3% for ⁇ .
  • the degranulation by PACAP-38 stimulation was 7.4% for ⁇ , 24.8% for 30 nM, 49.4 for ⁇ , 65.8% for 300 nM, 68.9% for I M, and 63.3% for.
  • the degranulation by VIP stimulation is 1.5% for ⁇ , 4.0 for 30nM, ⁇ was 36.7, 300nM was 61.7 and 71.7%, and 76.1%.
  • the EC 5 value for degranulation to LAD 2 is about 91 nM for Substance P, about 122 nM for Cortis Yutin-17, about 13 nM for PAMP-12, about 51 nM for PACAP-27, about 51 nM for PACAP-38, VIP About 105 nM.
  • the human mast cell line LAD 2 was cultured using StemPro-34 medium (Invitrogen) containing lOOng / mL stem cell factor (Immunobiology Laboratories). Wash LAD 2 with Tyrode's buffer (126 mM NaCl, 4. OmM KCl, 0.69 mM KH 2 P04, 5.6 mM Glucose, lmM CaCl 2 , lmM MgCl 2 , 0.13 ⁇ 4 BSA), 100 L per well in a 96-well plate 20000 LAD 2 were dispensed and incubated at 37 ° C for 5 minutes.
  • Tyrode's buffer 126 mM NaCl, 4. OmM KCl, 0.69 mM KH 2 P04, 5.6 mM Glucose, lmM CaCl 2 , lmM MgCl 2 , 0.13 ⁇ 4 BSA
  • Tyrode buffer containing 50 L of various concentrations of NK1 enzyme gonix GR-82334 (Sigma) or L-703606 (Sigma) was added and incubated at 37 ° C for 5 minutes.
  • GR-82334 was 101.23 ⁇ 4 at ⁇ , 105.7% at 300 nM, 102.7% at 1 M, It was 99.6% at 3M, 95.8% at 10M, and 99.5% at 30M.
  • A23187 stimulated degranulation by adding GR-82334, GR-82334 is 101.1% at ⁇ , 102.0% at 300nM, 102.0% at 1M, 103.2 ° at 3 ⁇ ⁇ , 103.2 at 30M, 102 at 30M ⁇ It was 4%.
  • degranulation with addition of NK1 receptor low molecular weight antagonist L-703606 is 101.1% at 100 nM, 97.93 ⁇ 4 at 300 nM, 98.8 3 ⁇ 4 at 1 M, 98 ⁇ 8, 3 It was 100.0% for M, 39.4% for 10M, and 3.2% for 303 ⁇ 41.
  • L-703606 is 98.4% at 100 nM, 97.2% at 300 nM, 97.4% at 1, 91.5% at 3 M, 37.1% at 10 M, 37.1% at 30 M 2.4%.
  • NK1 receptor peptide antagonist GR-82334 does not inhibit degranulation induced by subunit P and A23187 in the concentration range of 0.1M to 30 / M.
  • NK1 receptor small molecule Angogonis ⁇ L-703606 does not inhibit substance P and A23187-stimulated degranulation in the concentration range of 0.1 M to 3 M, but in the concentration range of 10 M to 30 M. Revealed that TGR12 and NK1 receptors were suppressed nonspecifically.
  • CH0 CHO / dhfr-cells
  • ⁇ -MEM medium Invitrogen
  • Animal plasmid vector plasmid pAKKO-lllH Containing CH0 and a base sequence containing the codon from the start to the end of human TGR12 (DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 32).
  • CH0-TGR12 was cultured using a nucleic acid-free ⁇ - ⁇ medium (Invitrogen) containing 10% urine fetal dialyzed serum.
  • CH0-TGR12 is peeled off with 0.05% Trypsin-EDTA (GIBC0), suspended in medium ( ⁇ - ⁇ (GIBC0), 10% FBS (GIBC0), benicillin / streptomycin (BIOWHITTAKER)), and centrifuged.
  • the precipitated cells were suspended at 2 ⁇ 10 5 cells / ml in a medium and seeded in 1 ml portions in a 12-well cell culture dish.
  • PTX Pertussis toxin
  • Activation of the cells was performed as follows. After aspirating the medium and washing with PBS, 750 ⁇ of Atsy buffer (HBSS (GIBCO), 10 mM HEPES (Dojindo Laboratories)) was added and preincubated for 15 minutes at 37 ° C. After adding 250 L of Substance P solution and positive control ATP solution and incubating at 37, the reaction was stopped by rapid cooling. After cleaning the assembly buffer and washing with PBS, 1'xLDS sample Pull buffer / DTT was added to the cells, recovered, sonicated for 30 seconds, and then rapidly cooled by heating at 70 ° C for 10 minutes.
  • HBSS Atsy buffer
  • HEPES Diojindo Laboratories
  • TGR12 ligand enhances TNF-a, CCL-2, and CCL-5 expression in human mast cells
  • the human mast cell line LAD 2 was cultured using StemPro-34 medium (Invitrogen) containing 100 ng / mL stem cell factor (Immunobiology Laboratories). In an experiment that analyzed changes in the expression level during substance P stimulation, LAD 2 was centrifuged at 300 xg for 5 minutes, the precipitated cells were counted, suspended in 6.67xl0 5 cells / mL in medium, and 750 L each. Sowing in a 24-well plate, It was allowed to stand for 30 minutes in a C0 2 incubator.
  • RNA was extracted from the cells using the RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the attached protocol The total RNA obtained as described above was concentrated using Ethachinmate according to the attached protocol, and RNase Dissolved in -free H 2 0. Next, using 1 pg of total RNA, reverse transcription reaction was performed by Superscript II Reversetranscriptase (Inhibin) to create single-stranded cDNA. Total RNA solution Add Random primer (Invitrogen) 0.
  • Reversetranscriptase 1 L was added, followed by incubation at 42 ° C for 50 minutes, followed by incubation at 70 ° C for 15 minutes and ice-cooling for 5 minutes. Like this The cDNA obtained in this manner was purified using Ethachinmate according to the attached protocol and dissolved in Tris-EDTA Buffer (Furukisha).
  • hTNFalpha-tF (SEQ ID NO: 3 3) and hTNFalpha-tR (SEQ ID NO: 34) are used as primers for human TNF- ⁇ quantification, and hTNFalpha-tP (SEQ ID NO: 3) is used as a probe. 5) was used as a standard and hTNFalpha-standard (SEQ ID NO: 36).
  • primers for human CCL-5 quantification hCCL5-tF (SEQ ID NO: 3 7) and hCCL5-tR
  • hCCL5-tP SEQ ID NO: 39
  • hCCL5 standard SEQ ID NO: 40
  • HCCL2-tF SEQ ID NO: 4 1
  • hCCL2-tR SEQ ID NO: 42
  • hCCL2 standard SEQ ID NO: 44
  • the composition of the reaction solution was as follows: primer 900 ⁇ , probe 250 nM, TaaMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 1/2 volume. Reactions and analyzes were performed using the ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). The reaction cycle was maintained at 50 ° C for 2 minutes, then at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60T for 1 minute. The gene expression level was calculated by performing an analysis so that the Correlation Coeif value of the calibration curve was 0.995 or higher.
  • the results of expression analysis are shown below.
  • the expression level of LAD 2 TNF- ⁇ was 10118 copies.
  • the expression level of TNF-a of LAD 2 was 56065 copies at 0.5 hours after stimulation, 1346293 copies at 2 hours after stimulation, 54313 copies at 8 hours after stimulation, and 24 hours after stimulation. 4332 copies -Met.
  • the expression level of TNF- ⁇ of LAD 2 was 9668 copies at 0.5 hours after stimulation, 6689 copies at 2 hours after stimulation, 6035 copies at 8 hours after stimulation, and 24 hours after stimulation. 4886 copies.
  • the expression level of CCL-5 in LAD 2 was 15721 copies when unstimulated.
  • the expression level of CCL-5 in LAD 2 at substance P stimulation was 38107 copies at 0.5 hours after stimulation, 88872 copies at 2 hours after stimulation, 69921 copies at 8 hours after stimulation, and 53605 at 24 hours after stimulation. It was a copy.
  • the expression level of CCL-5 in LAD 2 when medium alone was added was 14585 copies at 0.5 hours after stimulation, 15625 copies at 2 hours after stimulation, 12538 copies at 8 hours after stimulation, and 24 hours after stimulation. The number of copies was 15003.
  • the expression level of TNF- ⁇ in LAD 2 was 1731 copies.
  • the expression level of TNF-a in LAD 2 after 2 hours of stimulation was 1331 copies when only medium was added, 173462 copies when substance P was stimulated, 163551 copies when cortisin 17 was stimulated, and 163551 copies when PAMP-12 was stimulated 8918 copies, 219597 copies when stimulated with PACAP-27 and 176630 copies when stimulated with VIP.
  • the expression level of CCL-5 in LAD 2 was 30341 copies when unstimulated.
  • the expression level of CCL-5 in LAD 2 after 2 hours of stimulation was 23501 copies when only medium was added, 47117 copies when substance P was stimulated, 47322 copies when coltistin-17 was stimulated, and 47322 copies when PAMP-12 was stimulated 34566 copies, 48242 copies at PACAP-27 stimulation, and 45015 copies at VIP stimulation.
  • the expression level of CCL-2 in LAD 2 was 643224 copies when unstimulated.
  • the expression level of CCL-2 in LAD 2 2 hours after stimulation was 4041 12 copies when only medium was added, and when substance P was stimulated.
  • [I] -rCST14 (Y0) [I] -rCST14 (Y0) used in the competitive binding test was prepared as follows. rCST14 (Y0) (Funakoshi) 3nmol / 6pL, lOpg / mL lactoperoxidase (in 0.1MHEPES (pH7, 4)) 6 ⁇ 0.0013 ⁇ 4 H 2 0 2 6 ⁇ , 37MBQ Nal 6 ⁇ (15mg / 100mL Nal 6pL for cold run The mixture was reacted at room temperature for 20 minutes, and the monosaccharide was separated by HPLC. The fraction around 24 min.
  • CHO / dhfr-cells (hereinafter referred to as CH0) were cultured using ⁇ - ⁇ medium (Invitrogen) containing 10% ushi fetal serum.
  • the base sequence (hereinafter referred to as TGR12-GFP (SEQ ID NO: 45) has the base sequence represented by TGR12-GFP (SEQ ID NO: 45).
  • PAKKO-lllH a vector plasmid for animal cell expression that incorporates DNA)
  • CH0-TGR12GFP was cultured using a nucleic acid-free ⁇ - ⁇ medium (Invitrogen) containing 10% urine fetal dialyzed serum.
  • CH0-TGR12GFP The binding test using CH0-TGR12GFP was performed as follows. Various physiologically active peptides were purchased from Peptide Institute. CH0-TGR12GFP is seeded on a 24-well plate at a cell density of 2xl0 5 cells / well, cultured overnight, and then 3 times with ice-cold assay buffer (MEM-a, 20 mM HEPES (pH7.4), 0.053 ⁇ 4 BSA) Wash, add 250 ⁇ ⁇ Azey buffer, then add [ l25 I] -rCST14 (Y0) / bioactive peptide solution suspended in 250pL Azey buffer.
  • MEM-a 20 mM HEPES (pH7.4)
  • the nonspecific binding activity was estimated as the activity of ⁇ ⁇ ⁇ of rat cortisol 14, and the IC 50 value of each peptide was analyzed from the Hi 11 plot analysis.
  • 2886 nM and human cortisol were determined for substance P. Chin ⁇ ⁇ was 47 nM, human PAMP12 was 18 nM, ⁇ PACAP27 was 264 nM, ⁇ ⁇ PACAP38 was 47 ⁇ , and human VIP was 2039 ⁇
  • TGR12 expression by TGR12 ligand Increases intracellular calcium and promotes degranulation in RBL-2-3 cells
  • RBL-2H3 (hereinafter referred to as RBL2H3) was cultured in ⁇ - ⁇ medium (Invitrogen) containing 10% ushi fetal serum.
  • An animal cell expression vector plasmid pcDNA3.1 in which RBL-2H3 is incorporated with a nucleotide sequence (DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32) including the ⁇ TGR12 start to end codons. was stably expressed to establish a human TGR12-expressing RBL-2H3 cell line (hereinafter RBL2H3-TGR12).
  • RBL2H3-TGR12 was cultured in ⁇ -MEM medium (Invitrogen) containing 10% ushi fetal serum and 200 g / mL Geneticin.
  • the intracellular calcium raising activity was measured as follows.
  • RBUH3 and RBL2H3- TGR12 are seeded in a 96-well plate to a density of 40, OOOcel 1 s / wel 1, and cultured overnight. Then, the medium is discarded and Atsy's buffer containing 4 ⁇ Fluo3-AM (Dojin Chemical) [Hank's Balanced Salt Solution (Invitrogen), 20 mM HEPES (Dojin Chemical), 2.5 mM Probenecid (Sigma)] was added to each well and left at 37 for 1 hour.
  • a variety of TGR12 (Peptide Institute) or calcium ionophore A23187 (Wako Pure Chemical Industries) was diluted with Atsy buffer containing 0.05 CHAPS.
  • the fluorescence associated with intracellular calcium fluctuations was measured using FLIPR (Molecular Device).
  • the sample should be 50 ⁇ 10 seconds after the start of the assembly; 50 ⁇ 7 Added at a rate of seconds. Fluorescence is measured every second for the first 60 seconds and every 6 seconds for the next 120 seconds, with the highest fluorescence intensity during the 3 minutes being the maximum activity under that stimulation condition, and an average of 3 wells I asked for it.
  • the EC 5Q value was calculated using Graphpad PRISM 4 (Graohpad Software).
  • the degranulation promoting action was measured as follows.
  • RBL2H3 and RBL2H3-TGR12 are plated in a 96-well plate to a density of 40, OOOcel ls / well, and cultured overnight, then the medium is discarded and Tyrode buffer (126 mM NaCl, 4. OmM KC1, 0.69 mM KH 2 P04 , 5.6 mM Glucose, ImM CaCl 2 , ImM MgCl 2 , 0.1% BSA), 150 pL per well of Tyrode buffer was added to 96-well pre-wells, and incubated at 37 for 5 minutes. Next, Tyrode buffer containing substance P (peptide laboratory) at various concentrations of 50 ⁇ was added, and further incubated at 37 ° C. for 20 minutes to induce degranulation. Degranulation in the supernatant
  • the degree of degranulation was measured by measuring ⁇ -hexosaminidase activity as follows. Dispense the supernatant into a 96-well plate, 5 times the amount of 0.1M Citrate (pH4.5) / ImM 4-methyl umbel 1 iferyl-2-acetamido-
  • ⁇ -hexo s am inidase activity was also determined by removing the RBL2H3 and RBL2H3- TGR12GFP seeded on the same plate with Trypsin / EDTA, freeze-thawing 4 times, and centrifuging the supernatant in the supernatant.
  • the ⁇ -hexosaminidase activity in the LAD2 supernatant relative to the total ⁇ -hexosaminidase activity was expressed as the ratio of ⁇ -hexosaminidase activity in the LAD2 supernatant.
  • the maximum activity of calcium-elevating effect by addition of the assay buffer was 51, and the maximum activity of calcium-elevating activity by stimulation with ⁇ A23187 was 25338.
  • the maximum activity of calcium-elevating action by ⁇ stimulation is 44 for ⁇ , 51 for IOHM, 50 for ⁇ , and ⁇ . 95 and 41 in ⁇ ⁇ .
  • the maximal activity of the calcime-increasing action by cortisol 17 stimulation was 67 for ⁇ , 78 for ⁇ , 54 for ⁇ , 49 for ⁇ , and 52 for ⁇ .
  • the maximum activity of calcium elevation by PAMP 12 stimulation was 52 for ⁇ , 52 for ⁇ , 35 for ⁇ , 44 for ⁇ and 43 for ⁇ .
  • the maximum activity of calcium-elevating action by PACAP27 stimulation was 47 for ⁇ , 37 for ⁇ , 63 for ⁇ , 59 for ⁇ , and 45 for ⁇ .
  • the maximum activity of calcium increase by substance ⁇ ⁇ ⁇ stimulation was 4 for ⁇ 4, 13 for ⁇ ⁇ ⁇ , 1702 for ⁇ , 10005 for ⁇ , and 12649 for ⁇ .
  • Cortisatin 17 stimulated the maximum calcium-elevating activity to be -2 for ⁇ ⁇ , 33 for ⁇ ⁇ , 1574 for ⁇ ⁇ , 1 1 193 for ⁇ , and 12762 for ⁇ ⁇ .
  • the maximum activity of calcium increase by PAMP 12 stimulation was 41 for lnM, 2088 for ⁇ ⁇ , 1 1 1 10 for ⁇ ⁇ , 12039 for ⁇ , and 12331 for 10 ⁇ .
  • the maximum activity of the force-raising action by PACAP27 stimulation was 40 for ⁇ , 29 for ⁇ , 5300 for ⁇ , 1 1494 for ⁇ , and 12667 for ⁇ .
  • SEQ ID NO: 1 A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1 or a partial peptide or salt thereof (receptor of the present invention) or specifically binding to the receptor of the present invention
  • a compound that inhibits the activity / function of a ligand having the ability to act ligand of the present invention (eg, receptor antagonist of the present invention), antibody to the receptor of the present invention, antisense to the receptor of the present invention
  • the polynucleotide or the like is a physiological activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention (eg, mast cell degranulation promoting action, eicosanoide production promoting action, site force in production promoting action, mast cell proliferation promoting action, Mast cell activation action, etc.), which is an excellent mast cell degranulation inhibitor and eicosanoide production that is low toxicity and safe
  • immune diseases eg, inflammatory diseases (eg, MAPK activation inhibitors), etc., such as an
  • the screening method or screening kit using the receptor or mast cell of the present invention and the ligand of the present invention can be used, for example, to suppress the degranulation of fat cells, suppress the production of eicosanoide, suppress the generation of site force in It is possible to efficiently obtain a compound or a salt thereof having an action, a mast cell proliferation inhibitory action, a mast cell activation inhibitory action or the like.

Abstract

本発明は、（a）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（b）該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法／スクリーニング用キット、該スクリーニングによって得られる肥満細胞の脱顆粒抑制剤などを提供する。

Description

明細書 脱顆粒抑制剤 技術分野
本発明は、 TGR12または肥満細胞と、 TGR12のリガンドとを用いる脱顆 粒抑制剤などのスクリーニング方法およびスクリーニング用キッ ト、 該 スクリーニング方法またはキッ トによって得られうる脱顆粒抑制剤など に関する。 背景技術
肥満細胞は、 抗体に感作された後、 抗原刺激を受けると脱顆粒を起こ し、 ヒスタミン、 ロイコ トリェン、 セロ トニンなどのケミカルメデイエ
—夕一を放出し、 I型アレルギー反応に深く関与している。 肥満細胞は抗 原刺激後、 種々のサイ トカインを分泌し、 T細胞や好酸球の機能に影響を 与え、 免疫調節細胞としても重要である。 肥満細胞は末梢神経終末に近 接して存在しており、 サブスタンス P (substance P) 、 カルシトニン遺 伝子関連ペプチド （CGRP) などの神経性因子の影響を直接的に受けて、 脱顆粒反応を引き起こすと考えられている （Proc. Natl. Acad. Sci.、 84巻、 2975- 2979頁、 1987年； Arch. Dermatol. Res.、 285巻、 34卜 346 頁、 1993年） 。 さらに、 近年、 ストレスや神経性因子とアレルギー性疾 患の発症および増悪には深い相関関係があると考えられている。例えば、 ストレスをかけたマウスの皮膚において神経細胞の移入が起こり、 肥満 細胞の脱顆粒を引き起こすことが報告されている（Brain Behav. Immun.、 19巻。 252- 262頁、 2005年）。 アトピー性皮膚炎患者において、 局所なら びに血中におけるサブスタンス Pおよび神経成長因子 （NGF) 量と、 その 病態の重症度に深い相関関係があることが報告されている （Br. h J. Dermatol.、 147卷、 7卜 79頁、 2002年）。 7トピー性皮膚炎患者において、 病変部位における肥満細胞数が増大していることも知られている（Arch. Dermatol. Res.、 289巻、 256-260頁、 1997年） 。 サブスタンス Pは、 神経 細胞だけでなく肥満細胞においても産生、 放出されるので、 オートクラ イン的にも作用すると考えられる（Arch. Dermatol. Res.、 292巻、 418- 421 頁、 2000年）。 肥満細胞はアレルギー性疾患に限らず、 過敏性腸症候群、 潰瘍性大腸炎、 間質性膀胱炎などの病態に深く関与していると考えられ ており、 神経性因子がこれらの疾患の発症および増悪に関与していると 考えられる (Gastroenterology, 126巻、 693-702頁、 2004年 ； Scand. J. Gastroentorl.、 40巻、 129-140頁、 2005年； Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.、 279卷、 G1298-G1306頁、 2000年； Am. J. Physiol. Renal Physiol.、 283巻、 F616-F629頁、 2002年) 。
G -夕ンパク質共役型受容体であるヒ ト TGR12 (配列番号： 1 )は、 MRGX2 、 GPCRxlK GPCR44などの別名が知られている。 MRGX2は、 コルチス夕チ ン（cor t is tat in)、ソマ卜ス夕チン、 BAM (bovine adrenal medul 1 pept ide ) 13-22、 αメラニン細胞刺激ホルモン （aMSH) 、 neuropeptide FF, ダ ィノルフィ ン A (dynorphin A) およびサブスタンス Pによって活性化され ること、 MRGX2のァゴニストまたはアン夕ゴニスト力 睡眠障害、 疼痛、 脳梗塞、 記憶障害、 糖尿病、 癌、 肥満症、 心疾患、 鬱病、 性機能障害、 尿路 ·膀胱疾患、 感染症治療、 消化器疾患などの治療薬となりうること などが報告されている （W0 03/073107号公報） 。 GPCRxl 1に angiopept in が特異的に反応したことが報告されている （W001/98330号公報） 。 さら に、 MRGX2に、 PAMP-1 (proadrenomedul 1 in N- terminal 20 peptide の 9-20位） がァゴニスト作用を示したこと、 MRGX2が後根神経節 （DRG)の C 繊維に特異的に発現していることが報告されている （Biochem. Biophys. Res. Commun.、 330巻、 1146-1152頁、 2005年） 。 また、 MRGX2が、 ヒト臍 帯血由来肥満細胞において発現していること、 IgEによって発現が変動す ることが報告されている （W0 2005/028667号公報） ものの、 肥満細胞に おける MRGX2の発現量の定量的な値およびヒ ト肥満細胞株である LAD 2に おける発現に関する報告はない。
ヒ ト肥満細胞がサブスタンス P に反応し、 脱顆粒促進作用 （Blood、 97 巻、 2045-2052頁、 2001年）、エイコサノィ ド産生作用（Clin. Exp. Immunol.
、 124巻、 150- 156頁、 2001年） および IL- 4、 IL- 8や TNF αなどのサイ ト力 イン産生作用 (Br. J. Dermatol. 131巻、 348- 353頁、 1994年； Int. Arch.
Allergy Immunol. 117巻、 48- 51頁、 1994年： Exp. Dermatol.、 10巻、 312- 320頁、 2001年） を有することが知られているが、 これらは受容体を 介さない非特異的反応 ( . Mousli et al. , FEBS letし 259巻 (2)、 260-262 頁、 1990年 1月 ； R. Saban et al. , Am J Physiol Renal Physiol 283巻、
F616— F629、 2002年 5月 ； A. H. Y. Lau et al.， European Journal of
Pharmacology 414巻、 295- 303頁、 2001年 ； D. Lorenz et al. , J. Gen. Physiol. 112巻、 577-591頁、 1998年 11月）、 あるいはサブスタンス P高親 和性受容体、 NK-1 受容体を介しているもの （S. Guhl et al. , J.
Neuroimmunology 163巻、 92-101頁、 2005年 4月） と考えられてきた。
ラッ 卜腹腔肥満細胞またはヒ 卜皮膚肥満細胞が、 脳下垂体アデニル酸 シクラーゼ活性化ポリペプチド （PACAP) に反応し、 脱顆粒促進作用 （ Inflamm. Res.、 47巻、 488- 492頁、 1998年； Ann. N. Y. Acad. Sci.、 865 巻、 14卜 146頁、 1998年）を、マウスにおいて皮膚炎惹起作用（Reglul. Pept.
、 82巻、 65-69頁、 1999年） を示すことが知られているが、 肥満細胞にお ける PACAP受容体の発現量に関する報告はない。
ヒ ト皮膚肥満細胞が、 血管作動性腸管ペプチド （VIP) に反応し、 脱顆 粒促進作用 （Br. J. Pharmacol. , 95巻、 12卜 130頁、 1988年） を示す ことが知られているが、 肥満細胞における VIP受容体の発現量に関する 報告はない。 発明の開示
優れた肥満細胞の脱顆粒抑制剤、 さらには優れた免疫疾患、 呼吸器疾 患、泌尿器疾患または循環器疾患の予防'治療剤の開発が望まれていた。 本発明者たちは上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 TGR12発現 CH0細胞株に対して、 サブスタンス Ρ、 コルチス夕チン- 17、 ΡΑΜΡ- 12、 PACAP- 27„ PACAP-38および血管作動性腸管べプチドが細胞内力 ルシゥム上昇作用を示すこと、ヒ ト TGR12がヒ ト肥満細胞において非常に 多く発現しており、サブスタンス Pに反応する高親和性受容体 NK1受容体、 サブスタンス Pに反応する低親和性受容体 NK2受容体ならびに NK3受容体、 および PACAPに反応する VIP1受容体、 VIP2受容体ならびに PACAP受容体が、 ヒト肥満細胞にほとんど発現していないこと、 ヒ トの肥満細胞株である LAD 2をサブスタンス P、コルチス夕チン - Π、ΡΑΜΡ- 12、PACAP-27、PACAP-38 および VIPで刺激することにより脱顆粒反応が促進すること、 また LAD 2 におけるサブスタンス P 依存的脱顆粒反応が NK1受容体アン夕ゴニス ト で阻害されないことを見出し、 これらのことからヒ ト肥満細胞のサブス 夕ンス Pを含む神経ペプチド依存的脱顆粒には TGR12 が関与しているこ とを見出した。 これらの知見に基づいて、 本発明者らは、 TGR12アン夕ゴ ニス卜が肥満細胞の脱顆粒抑制剤となり， 肥満細胞の脱顆粒抑制剤の簡 便なスクリ一ニング法を提供することを見出し、鋭意研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
本発明は、
〔 1〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩および（b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガン ドを用いることを特徴とする、 肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニン グ方法、
〔2〕 リガンドが、 サブスタンス P、 コルチス夕チン、 脳下垂体アデ 二ル酸シクラ一ゼ活性化ポリペプチド （pituitary adenylate cyclase activating polypeptide； PACAP)、 血管作動性腸管ぺプチド (vasoactive intestinal peptide ; VIP) または proadrenomedul 1 in N-terminal 20 peptide (PAMP) である上記 〔 1〕 記載のスクリーニング方法、
〔2 a〕 リガンドが、 脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリぺプ チドである上記 〔2〕 記載のスクリーニング方法、
〔3〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ.ドまたは その塩を介した細胞刺激活性を測定し、 指標とする上記 〔 1〕 記載のス クリーニング方法、
〔4〕 ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩および（b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガン ドを用いことを特徴とする、 ヒ ト肥満細胞における脳下垂体アデニル酸 シクラーゼ活性化ポリぺプチドによる脱顆粒を抑制する作用を有する化 合物またはその塩のスクリ一二ング方法、
〔 5〕 ( i) ( a) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩と、 （b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガ ンドとを、 試験化合物の非存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部 分べプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
( i i) ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩と、 （b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを 、 試験化合物の存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、 および
(i i i)工程（i )と工程（i i)との間で、 前記蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を比較し、工程（i)におけ る結合量よりも工程（i i)における結合量の方が低い場合に、 前記試験化 合物を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として選択する工程を含む上記 〔 1〕 記 載のスクリ一二ング方法、
〔 6〕 工程（i i)における結合量が工程（i)における結合量の 5 0 %以下 の場合に、 前記試験化合物を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として選択する、 上記 〔 5〕 記載のスクリーニング方法、
〔 7〕 ( i) ( a) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩と， （b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有.するリガ ンドとを、 試験化合物の非存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部 分べプチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
(ii) (a)配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩と、 （b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを 、 試験化合物の存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
(iii)工程（i)と工程（ii)との間で、 前記蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を比較し、工程（i)におけ る結合量よりも工程（ii)における結合量の方が低い場合の試験化合物を 選択する工程、 および
(iv)前記（iii)で得られた試験化合物を肥満細胞に接触させ、脱顆粒を抑 制する試験化合物を選択する工程を含む上記 〔1〕 記載のスクリ一ニン グ方法、
[7 a) リガンドカ サブスタンス P、 コルチス夕チン、 脳下垂体ァ デニル酸シクラーゼ活性化ポリぺプチド （pituitary adenylate cyclase activating polypeptide； PACAP)、 血管作動性腸管ぺプチド (vasoactive intestinal peptide ; VIP) または proadrenomedul 1 in N - terminal 20 peptide (PAMP) である上記 〔4〕 〜 〔 7〕 のいずれか記載のスクリー二 ング方法、
〔7 b〕 リガンドが、 脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリぺプ チドである上記 〔7 a〕 記載のスクリーニング方法、
〔8〕 肥満細胞の脱顆粒抑制剤が、 免疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器疾 患または呼吸器疾患の予防 · 治療剤である上記 〔1〕 記載のスクリー二 ング方法、
〔 9〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩および（b)該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガン ドを含有することを特徴とする、 肥満細胞の脱顆粒抑制剤のス.クリー二 ング用キッ ト、
〔 1 0〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に対するアン夕ゴニストを含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制 剤、
〔 1 1〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に対する抗体を含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤、
〔 1 2〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に対する抗体を含有してなる免疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器疾 患または呼吸器疾患の診断薬、
〔 1 3〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩のァゴニストに対する抗体を含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑 制剤、
〔 1 4〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドをコ一 ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる免 疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器疾患または呼吸器疾患の診断薬、
〔 1 5〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドをコ一 ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオ チド、 または （i i)該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチドに対する s i R N Aまたは s h R N Aを含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤、
〔 1 6〕 肥満細胞の脱顆粒抑制剤が、 免疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器 疾患または呼吸器疾患の予防 · 治療剤である上記 〔 1 0〕 、 〔.1 1〕 、 〔 1 3〕 または 〔 1 5〕 記載の抑制剤、
〔 1 7〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩の活性または該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガン ドの活性を阻害することを特徴とする肥満細胞の脱顆粒抑制方法、
〔 1 8〕 肥満細胞および配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合 する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、 肥満細胞の脱顆 粒抑制剤のスクリ一ニング方法、
〔 1 9〕 (i) 肥満細胞と、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結 合する能力を有するリガンドとを、 試験化合物の非存在下接触させ、 前 記肥満細胞に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
(ii) 肥満細胞と、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力 を有するリガンドとを、 試験化合物の存在下接触させ、 前記肥満細胞に 対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
(iii)工程（i)における結合量よりも工程（ii)における結合量の方が低い 場合の試験化合物を選択する工程、 および
(iv)前記（iii)で得られた試験化合物を肥満細胞に接触させ、脱顆粒を抑 制する試験化合物を選択する工程を含む上記 〔 1 8〕 記載のスクリ一二 ング方法、
〔2 0〕 肥満細胞および配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合 する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、 肥満細胞の脱 顆粒抑制剤のスクリーニング用キッ ト、
〔2 1〕 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしく はその部分べプチ.ドまたはその塩に対するアン夕ゴニスト、 Ui) 該蛋 白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体、 または （iii ) 該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含 有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列ま たはその一部を含有してなるポリヌクレオチドの有効量を投与すること を特徴とする肥満細胞の脱顆粒抑制方法、
〔22〕 肥満細胞の脱顆粒抑制剤を製造するための、 （i) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対するアン 夕ゴニスト、 （ii) 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体、 または （iii) 該蛋白質またはその部分べプチドをコードす るポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質 的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド の使用などを提供する。
さらには、
〔23〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩および（b)脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリぺプ チド ituitary adenylate cyclase activating polypeptiae； PACAP ) を用いことを特徴とする、 前記蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩と脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリベプチドとの間の 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法、
〔24〕 (i) (a) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩と、 （b)脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリべ プチドとを、 試験化合物の非存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその 部分べプチドまたはその塩に対する脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性 化ポリぺプチドの結合量を測定する工程、
(ii) (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチ.ドまたは その塩と、 （b) 脳下垂体アデ二ル酸シクラ一ゼ活性化ポリぺプチドとを 、 試験化合物の存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩に対する脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリべプチ ドの結合量を測定する工程、 および
(iii)工程（i)と工程（ii)との間で、 前記蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩に対する脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリぺプ チドの結合量を比較し、工程（i)における結合量から工程（ii)における結 合量が変化している場合に、 前記試験化合物を選択する工程を含む上記 〔2 3〕 記載のスクリーニング方法、
〔2 5〕 前記脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリべプチドが、 ?八〇八？ー 2 7または？八〇八？ー 3 8でぁる上記 〔2 3〕 または 〔 24〕 記載のスクリーニング方法、
〔2 6) (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩および（b)脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリぺプ チドを含有することを特徴とする、 前記蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩と脳下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリベプチドと の間の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キッ 卜、
〔2 7〕 (a) 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩および（b)該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガ ンドを用いることを特徴とする、エイコサノィ ド（例、 ロイコ トリェン、 プロスタグランジン） 産生抑制剤、 サイ ト力イン産生抑制剤、 肥満細胞 増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤なども 含む） のスクリ一二ング方法、
〔2 8〕 リガンドが、 サブスタンス P、 コルチス夕チン、 脳下垂体ァ デニル酸シクラーゼ活性化ポリぺプチド、 血管作動性腸管べプチドまた は roadrenomeduJ 1 in N - terminal 20 pept ideである上記 〔2.7〕 記載 のスクリーニング方法、
( 2 9 ) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩を介した細胞刺激活性を測定し、 指標とする上記 〔2 7〕 記載 のスクリーニング方法、
〔3 0〕 抑制剤が、 免疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器疾患または呼吸器 疾患の予防 · 治療剤である上記 〔2 7〕 記載のスクリーニング方法、
〔 3 1〕 ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩および（b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガ ンドを含有することを特徴とする、 エイコサノイ ド （例、 ロイコ 卜リエ ン、 プロスタグランジン） 産生抑制剤、 サイ ト力イン産生抑制剤、 肥満 細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤な ども含む） のスクリーニング用キッ ト、
〔3 2〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に対するアン夕ゴニス トを含有してなるエイコサノィ ド （例、 ロイコ トリェン、 プロスタグランジン） 産生抑制剤、 サイ ト力イン産生 抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活 性化抑制剤なども含む） 、
〔 3 3〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に対する抗体を含有してなるエイコサノイ ド （例、 ロイコ トリ ェン、 プロスタグランジン） 産生抑制剤、 サイ 卜力イン産生抑制剤、 肥 満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤 なども含む） 、
〔 3 4〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩のァゴニストに対する抗体を含有してなるエイコサノイ ド（例、 ロイコ 卜リエン、 プロスタグランジン） 産生抑制剤、 サイ ト力イン産生 抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活 性化抑制剤なども含む） 、
〔3 5〕 ( i ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドをコ ードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまた は実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレ ォチド、 または （i i)該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対する s i R N Aまたは s h R N Aを含有してなるエイコサノイ ド （例、 ロイコ トリェン、 プロス タグランジン） 産生抑制剤、 サイ ト力イン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑 制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、 MAPK活性化抑制剤なども含む）、
〔 3 6〕 抑制剤が、 免疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器疾患または呼吸器 疾患の予防 · 治療剤である上記 〔3 2〕 、 〔3 3〕 、 〔 3 4〕 または 〔 3 5〕 記載の抑制剤、
〔3 7〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩の活性または該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガン ドの活性を阻害することを特徴とするエイコサノイ ド （例、 ロイコ トリ ェン、プロスタグランジン）産生抑制方法、サイ トカイン産生抑制方法、 肥満細胞増殖抑制方法または肥満細胞活性化抑制方法、
〔 3 8〕 肥満細胞および配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合 する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、 エイコサノイ ド (例、 ロイコ トリェン、 プロスタグランジン） 産生抑制剤、 サイ トカイ ン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤なども含む） のスクリ一二ング方法、
〔 3 9〕 肥満細胞および配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合 する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、 エイコサノィ ド （例、 ロイコ トリェン、 プロスタグランジン） 産生抑制剤、 サイ ト力 ィン産生抑制剤、肥満細胞増殖抑制剤または肥満細胞活性化抑制剤（例、
MAPK活性化抑制剤なども含む） のスクリ一二ング用キッ ト、
〔4 0〕 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしく はその部分ペプチドまたはその塩に対するアン夕ゴニスト、 （i i) 該蛋 白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体、 または（i i i ) 該蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドを含 有するポリヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列ま たはその一部を含有してなるポリヌクレオチドの有効量を投与すること を特徴とするエイコサノイ ド （例、 ロイコ トリェン、 プロスタグランジ ン） 産生抑制方法、 サイ ト力イン産生抑制方法、 肥満細胞増殖抑制方法 または肥満細胞活性化抑制方法、
〔4 1〕 エイコサノイ ド （例、 ロイコ トリェン、 プロスタグランジン ) 産生抑制剤、 サイ ト力イン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤または肥 満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤なども含む） を製造するた めの、 （i ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に対するアン夕ゴニスト、 （i i ) 該蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩に対する抗体、 または （i i i ) 該蛋白質またはその部 分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド と相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有して なるポリヌクレオチドの使用などを提供する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 「配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドもしく はその塩」 を 「本発明の受容体」 と略記する場合がある。 さら.に、 「本 発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド」 を 「本発明の リガンド」 と略記する場合がある。
配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を有する蛋白質は、 ヒ トゃ温血動物（例えば、モルモッ 卜、 ラッ 卜、 マウス、 ニヮ トリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 ;6細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮 細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細 胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間 質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） も しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳 皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小 腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細胞もしくはその 培養細胞 （例、 MEL、 Ml、 CTLL - 2、 HT- 2、 醫 1-3、 HL- 60、 JOSK- K K562、 ML- 1、 MOLT - 3、 MOLT - 4、 MOLT- 10、 CCRF-CEM, TALL- 1、 Jurka t、 CCRT-HSB-2 、 KE - 37、 SKW-3、 HUT-78 , HUT- 102、 H9、 U937 , THP- K HEL、 JK- 1、 CMK、 KO-812 , MEG- 01、 LAD 1、 LAD 2など） に由来する蛋白質であってもよく、 合成蛋白質であってもよい。
配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 としては、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ま しくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列などがあげられる。
配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号 ： 1で表される.アミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号 ： 1で表されるァ ミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル 情報伝達作用、 細胞刺激活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、 そ れらの活性が性質的に同質であることを示す。 したがって、 リガンド結 合活性、 シグナル情報伝達作用、 細胞刺激活性などの活性が同等 （例、 約 0. 0 1〜： L 0 0倍、 好ましくは約 0. 5〜 2 0倍、 より好ましくは 約 0. 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用、 細胞刺激活性などの活性 の測定は、 自体公知の方法に準じて行なうことができる。
また、 本発明の蛋白質としては、 （i) 配列番号： 1で表されるァミノ 酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1 〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個 程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のアミノ酸が欠失したアミ ノ酸配列、 （ii) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列に 1または 2個 以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましく は 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは 数個 （ 1〜 5個） ) のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番 号 ： 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 よ り好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） の アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個 程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好 ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のアミ ノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミ ノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本発明の受容体.の部分ペプチド （以下、 本発明の部分ペプチドと称す る場合がある） としては、 後述の医薬等のスクリーニング方法に用いる ことのできる部分ペプチドであれば、 いかなるものであってもよく、 例 えば、 本発明の蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であ つて、 実質的に同質のリガンド結合活性などを有するものなどが用いら れる。
具体的には、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列を有するレセプ夕 —蛋白質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロッ ト解析において細胞外 領域 （親水性 （Hydrophilic) 部位） であると分析された部分を含むぺプ チドである。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも 同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用 い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチドでもよい。
本発明の部分べプチドのアミノ酸の数は、 本発明の蛋白質の構成アミ ノ酸配列のうち少なくとも 20個以上、 好ましくは 50個以上、 より好 ましくは 1 00個以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましレ ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質 的に同質の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分べプチドは、 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のアミノ酸が欠失し、 （ii) 上記アミノ酸配列に 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜 20個程度、 より好ましくは 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜5個） ) のアミノ酸が付加し、 または （iii ) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程 度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸 が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
具体例としては、 配列番号 ： 1で表される配列の第 1〜 27番目、 第 5 1〜 69番目、 第 9 3〜： L 02番目、 第 1 26〜 144番目、 第 16 8〜 1 85番目、 第 209〜 223番目、 第 247〜 259番目および 第 283〜 330番目のアミノ酸配列を含む部分べプチドなどが用いら れる。 本発明の受容体および本発明の部分べプチドは、 ぺプチド標記の慣例 に従って左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末 端） である。 C末端はカルボキシ （- C00H) 、 カルボキシレート （-C00- ) 、 アミ ド （-C0NH2) またはエステル （- C00R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n— プロピル、 イソプロピルもしくは n —ブチルなどの C ,_6アルキル、 例え ば、 シクロペンチル， シクロへキシルなどの C 3_8シクロアルキル、 例え ば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C 6-1 2ァリール、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C卜2アルキルもしくは α—ナフチルメチル などのひ一ナフチル— c 1 -2アルキルなどの c 7_14ァラルキルのほか、 経口 用エステルとして汎用されるピバロィルォキシメチルなどが用いられる。 本発明の受容体および本発明の部分べプチドが C末端以外にカルボキ シ （またはカルボキシレート） を有している場合、 力ルポキシがアミ ド 化またはエステル化されているものも、 本発明の受容体および本発明の 部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記し た C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の受容体および本発明の部分ペプチドには、 N末端の アミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホ ルミル、 ァセチルなどの C ,_fiアルカノィルなどの〇卜6ァシルなど） で保 護されているもの、 生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残 基がピロダルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、 -0H、 -SH、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 インドール基、 グァ ニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル、 ァセチルなどの C 1 -6アルカノィルなどの C ,_6ァシルなど） で保護されているもの、 あるい は糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。 本発明の受容体または本発明の部分べプチドの塩としては、 生理学的 に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま しい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例、 塩酸、 リ.ン酸、 臭 化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例、 酢酸、 ギ酸、 プロ ピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リン ゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
本発明のリガンドとしては、 本発明の受容体と特異的に結合するもの であれば、 何れの物であってもよい。 例えば、 配列番号 ： 1で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩との結合の解離定数が 1 0 M以下、 好ましくは 2 M以下、さらに好ましくは 1 μ Μ以下、特に好ましくは 2 0 0 n M以下、 最も好ましくは 1 0 0 n M以下である物などが挙げられる。
本発明のリガンドとしては、 例えば、 サブスタンス P、 PACAP (例、 PACAP-27, PACAP- 38など） 、 VIP、 コルチス夕チン （例、 コルチス夕チン -14, コルチス夕チン- 17など） ） 、 PAMP (例、 PAMP-12、 PAMP-20など） 、 ソマトス夕チン （例、 ソマトス夕チン 3-14、 ソマトス夕チン 3- 10、 ソマ トス夕チン- 14、 ソマトス夕チン- 28、 ソマトス夕チン 7-14、 D-Trp-ソマ トス夕チン、 シクロソマトス夕チン、 ソマトス夕チン 2- 9など） 、 BAM ( 例、 BAM13- 22、 BAM-22など） 、 αメラニン細胞刺激ホルモン （例、 HS024 - aMSH(3-ll) amideなど） 、 neuropeptide FF、 ダイノルフィン A、 ォキシ トシン （例、 （Ser4， Ile8)-ォキシトシンなど） 、 バソプレツシン （例、 [Arg8] -バソプレツシンなど） 、 angiopeptinなどが用いられる。 好まし くは、 サブスタンス P、 PACAP (例、 PACAP-27、 PACAP-38など） 、 VIP、 コ ルチス夕チン（例、コルチス夕チン- 17など）、 PAMP (例、 PAMP-12, PAMP- 20 など） などが用いられる。
標識したリガンドも、 本発明のリガンドに含まれる。
標識物質としては、 放射性同位元素 （例、 〔3H〕 、 〔 I〕 、 〔14C〕 、
〔32p〕 、 〔33p〕 、 〕 など） 、 蛍光物質 （例、 フルォレセインなど）
、 発光物質 （例、 ルミノールなど） 、 酵素 （例、 ペルォキシダ一ゼなど ) 、 ラン夕ニド元素などがあげられる。 中でも、 放射性同位元素が好ま しい。 さらに 〔|251〕 が好ましい。 標識したリガンドとして好ましくは、 放射性同位元素 〔1 251〕 などで標 識された [Ty r 8] -サブスタンス P、 [Ty r O] -コルチス夕チン- 14、 PAMP、 ソ マトス夕チン、 BAM、 ひメラニン細胞刺激ホルモン、 neu ropep t i de FF、 ダイノルフィン A、 ォキシトシン、 バソプレツシンなどが挙げられる。
リガンドの塩も、 本発明のリガンドに含まれる。 塩としては、 例えば 金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との 塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金属塩の好適 な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩 ； カルシウム塩、 マグネシウム塩、 バリウム塩などのアルカリ土類金属 塩 ； アルミニウム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例とし ては、 例えば卜リメチルァミン、 卜リエチルァミン、 ピリジン、 ピコリ ン、 2 , 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリ エタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N , N ' —ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸 との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リ ン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例え ばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フ夕ル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒 石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 P —トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、 オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例とし ては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、 薬学的に許容し得る塩が好ましい。 例えば、 化合物内に酸 性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩 （例、 ナトリウム塩， 力リウ ム塩など） 、 アル力リ土類金属塩 （例、 カルシウム塩， マグネシウム塩， バリウム塩など） などの無機塩、 アンモニゥム塩など、 また、 化合物内 に塩基性官能基を有する場合には、 例えば臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リ ン酸など無機酸との塩、 または酢酸、 フ夕ル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 メタンスルホン酸.、 P —ト ルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
本発明の受容体および本発明の部分べプチドは、 前述したヒ トゃ温血 動物の細胞または組織から自体公知のポリべプチドの精製方法によって 製造することもできるし、 後述するポリペプチドをコードする D N Aで 形質転換された形質転換体を培養することによつても製造することがで きる。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。 例 えば、 Genom i c s , 56巻、 12- 2 1頁、 1999年、 B i och i m. B i ophys. Ac t a, 1446 巻、 57-70頁、 1999年などに記載の方法またはこれに準じた方法により、 製造することもできる。
ヒ トゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒ トゃ哺乳動物 の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽 出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどの クロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができ る。
本発明の受容体または部分べプチドもしくはそれらの塩の合成には、 通常、 市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。 そのよう な樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 一ベンジルォキシべ ンジルアルコール樹脂、 4 一メチルベンズヒ ドリルァミン樹脂、 P A M 樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹脂、 4 一 ( 2 ' , 4 'ージメ トキシフエ二ルーヒド 口キシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 ' , 4 'ージメ トキシフエニル 一 F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などをあげることができる。 このような樹脂を用い、 α —ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したァ ミノ酸を、 目的とするポリペプチドの配列通りに、 自体公知の各種縮合 方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からポリペプチド を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内 ジスルフイ ド結合形成反応を実施し、 目的のポリペプチド、 受容体、 部 分べプチドまたはそれらのアミ ド体を取得する。 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリぺプチド合成に使用で きる各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類 がよい。 カルボジィミ ド類としては、 D C C、 N , N 'ージイソプロピル カルボジィミ ド、 N—ェチルー N '— ( 3—ジメチルアミノプロリル） 力 ルポジイミ ドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制 添加剤 （例、 H O B t ， H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂 に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後 に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ポ リベプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択 されうる。 例えば、 N， N —ジメチルホルムアミ ド、 N， N—ジメチル ァセトアミ ド、 N—メチルピロリ ドンなどの酸アミ ド類、塩化メチレン、 クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロェ夕ノールな どのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリ ジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニ卜 リル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルな どのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はポリぺプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範 囲から適宜選択され、 通常約一 2 O ：〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択され る。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護 基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を 行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないとき には、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸を ァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないようにするこ とができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチ ルォキシカルボニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4ーメ.トキシべ ンジルォキシカルボニル、 C 1 一 Z、 B r — Z、 ァダマンチルォキシカ ルポニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2 —ニトロ フエニルスルフエニル、 ジフエ二ルホスフイノチオイル、 Fm o cなど が用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t ーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキ シル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖 状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4一二トロべンジルエステル、 4ーメ ト キシベンジルエステル、 4 _クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリル エステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキシカルポ二ルヒ ド ラジド化、 t 一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド 化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保 護することができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァ セチル基などの低級 （C H) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロ ィル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 エトキシカルボニル基などの炭 酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基と しては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒ ドロビラ二ル基、 t 一ブチル基 などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1 、 C l 2— B z l 、 2—二トロベンジル、 B r — Z、 t —プチルなどが用い られる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 T o s 、 4 - メ トキシ— 2 , 3， 6 — トリメチルベンゼンスルホニル、 DN P、 ベン ジルォキシメチル、 B um、 B o c、 T r t 、 Fm o cなどが用いられ る。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応す る酸無水物、 アジ.ド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ 口フエノール、 2 , 4 , 5 — トリクロ口フエノール、 2 , 4 —ジニトロ フエノール、 シァノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 H O N B、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N—ヒ ドロキシフ夕ルイミ ド、 H O B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化された ものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d 一炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水 フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリ フルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロ ピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどに よる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用い られる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 の温 度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノー ル、 チオアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスル フイ ド、 1， 4 一ブタンジチオール、 1 , 2 —エタンジチオールなどの ようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2 , 4 —ジニト口フエニル基はチォフエ ノール処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として 用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 _エタンジチオール、 1， 4ーブ 夕ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナ トリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去さ れる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 および その保護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基また は公知の手段から適宜選択しうる。
本発明の受容体または部分べプチドを得る別の方法としては、例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸のひ一力ルポキシル基をアミ ド化して保 護した後、 アミノ基側にペプチド （ポリペプチド） 鎖を所望の鎖長まで 延ばした後、 該ぺプチド鎖の N末端のひ 一アミノ基の保護基のみを除い たポリぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリ ペプチドとを製造し、 この両ポリべプチドを上記したような混合溶媒中 で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合によ り得られた保護ポリベプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保 護基を除去し、 所望の粗ポリペプチドを得ることができる。 この粗ポリ ぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥 することで所望の受容体またはその部分べプチドのアミ ド体を得ること ができる。
本発明の受容体または部分べプチドもしくはそれらの塩のエステル体 を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の α _力ルポキシル基を 所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 受容体または その部分ペプチドのアミ ド体と同様にして、 所望の受容体またはその部 分べプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の受容体または部分べプチドは、 自体公知のぺプチドの合成法 に従って、 あるいは受容体の部分ペプチドについては、 受容体を適当な ぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。 ぺプチド の合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによって も良い。 すなわち、 本発明受容体または部分ペプチドを構成し得る部分 ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を 有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造するこ とができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の (i) 〜 （V) に記載された方法があげられる。
(i)M. Bodanszky および Μ· A. Ondet U、ペプチド ·シンセシス （Peptide Synthesis) , Intersc ience Publishers, New York (1966年)
(ii) Schroederおよび Luebke、 ザ · ペプチド （The Pept ide)， Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （ 1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化 学 IV、 205、 （1977年） (v) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロ マトグラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて 本発明の受容体または部分べプチドを精製単離することができる。 上記 方法で得られる受容体または部分ペプチドが遊離体である場合は、 公知 の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することがで きるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方 法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明の受容体または部分べプチドをコードするポリヌクレオチドと しては、 前述した本発明の受容体または部分ペプチドをコードする塩基 配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 このうち D NAが好ましく、 該 DNAは、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ ―、 前記した細胞 ·組織由来の c DN A、 前記した細胞， 組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DN Aのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するべクタ一は、 パクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 前記し た細胞 ·組織より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 RT - PCR法と 略称する） によって増幅することもできる。
本発明の受容体をコードする DN Aとしては、 例えば配列番号 ： 2で 表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号 ： 2で表される塩 基配列と八イストリンジェントな条件下で八ィプリダイズする塩基配列 を有し、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質 的に同質の活性を有する受容体をコードする D N Aなどであれば何れの ものでもよい。
配列番号 ： 2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下で ハイブリダィズできる DN Aとしては、 例えば、 配列番号 ： 2で表され る塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは 約 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配 列を含有する DN Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーションは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方 法、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記 載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリン ジェン卜な条件に従って行なうことができる。
ハイス卜リンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナ卜リゥム濃度が約 1 9 〜 40 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5での条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列を含有する受 容体をコードする DN Aとしては、 配列番号 ： 2で表される塩基配列を 含有する D N Aなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 本発明の受容体 の部分べプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなる ものであってもよい。また、ゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 · 組織由来の c DN Aライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい。 具体的には、 配列番号 ： 2で表される塩基配列を有する DN Aの部分塩基配列を有する DNA、 または配列番号 ： 2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件 下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号 ： 1で表されるアミ ノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコ一 ドする D N Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
配列番号 ： 2で表される塩基配列とハイブリダィズできる DNAは、 前記と同意義を示す。
ハイプリダイゼーションの方法およびハイス トリンジェン卜な条件は 前記と同様のものが用いられる。
本発明の受容体.または部分べプチドをコードするポリヌクレオチド （ 例、 DNA) は、 自体公知の方法で標識化されていてもよい。 標識物質 としては、 放射性同位元素、 蛍光物質 （例、 フルォレセインなど） 、 発 光物質、 酵素、 ピオチン、 ラン夕ニド元素などがあげられる。
本発明の受容体または部分べプチドを完全にコードする DNAのクロ —ニングの手段としては、 本発明の受容体または部分ペプチドの部分塩 基配列を有する合成 DN Aプライマーを用いて自体公知の P C R法によ つて増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明の 受容体または部分べプチドの一部あるいは全領域をコードする DNA断 片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイプリダイゼーショ ンによって選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー · クロ一ニング （Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方 法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用 する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
D N Aの塩基配列の変換は、 公知のキッ ト、 例えば、 MutanTM-super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 MutanTM- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LAPCR法、 Gapped duplex法、 Kunke 1法等の自体公知の方法あるいは それらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された受容体をコードする DNAは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使 用することができる。 該 DN Aはその 5 ' 末端側に翻訳開始コ ドンとし ての ATGを有し、また 3，末端側には翻訳終止コ ドンとしての TAA、 TG Aまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コ ドンや翻 訳終止コ ドンは， 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加することも できる。
本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （a ) 本発明の受容体または部分べプチドをコードする DNAから目的とす る DNA断片を切り出し、 （b) 該 DNA断片を適当な発現ベクター中の プロモーターの下.流に連結することにより製造することができ.る。 ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 p B R 3 2 2 , p B R 3 2 5 , p U C 1 2 , p UC 1 3) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB l l O , p T P δ , p C 1 94 ) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p SH I 9 , p S H 1 5) 、 λファ一ジなどのバクテリオファージ、 レト ロウィルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィル スなどの他、 pA l— 1 1、 p XT l、 p R c /CMV、 p R c /R S V、 p c D N A I /N e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモ一夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿 主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例え ば、 動物細胞を宿主として用いる場合は、 S R aプロモーター、 S V 4 0プロモーター、 H I V ' L TRプロモータ一、 CMVプロモーター、 H S V -T Kプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、 CMV (サイ トメガロウィルス） プロモーター、 S R ひプロモー夕一などを用いるのが好ましい。 宿主がェシェリヒア属菌で ある場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモ一夕一、 r e c Aプロ モーター、 プロモーター、 l p pプロモーター、 T 7プロモー夕 一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S P O lプロモーター、 S PO 2プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵母である 場合は、 PH05プロモーター、 P GKプロモーター、 GAPプロモー 夕一、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合 は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライ シングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 S V40複製ォ リジン （以下、 S V40 o r i と略称する場合がある） などを含有して いるものを用いることができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メ ソ トレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 A mpfと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 N e o と略称する場合がある、 G 4 1 8耐性） 等があげられる。 特に.、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子を選 択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地 によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の受容体 の N端末側に付加する。 宿主がェシエリ ヒア属菌である場合は、 P h o A · シグナル配列、 Omp A · シグナル配列などが、 宿主がバチルス属 菌である場合は、 α—アミラーゼ · シグナル配列、 サブチリシン ' シグ ナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 MF o; ' シグナル配列、 S UC 2 · シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシュ リン · シグナル配列、 α—イン夕一フエロン · シグナル配列、 抗体分子 • シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の受容体または部分べプチドをコ一 ドする DN Αを含有するべクタ一を用いて、 形質転換体を製造すること ができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆 虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア ' コリ （ Escherichia coli) 1 2 · D Η 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 卷， 160 (1968)〕 ， J 1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9巻， 309 (1981) ) , J A 2 2 1 〔； iournal of Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 ， C 6 0 0 [Genetics, 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス · サブチルス （Bacillus subtil is) M I 1 1 4 [Gene, 24巻， 255 (1983)〕 ， 2 0 7 - 2 1 (Journal of Biochemistry, 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレピシェ（Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2 , AH 2 2 R -， Ν A 8 7 - 1 1 A, DKD - 5 D , 2 0 B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) N C Y C L 9 1 3 , NC YC 2 0 3 6 , ピキア パス トリス （ Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c N P Vの場合は、 ョ 卜ゥ ガの幼虫由来株化細胞 （Spodoptera frugiperda cell ； S f 細胞） 、 Trichoplusia niの中腸由来の M G 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea 由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmN P Vの場合は、 蚕由来 株化細胞 （Bombyx mori N 細胞 ； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （AKC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 (以上、 Vaughn, J.L. ら、 In Vivo, 13, 213-217, (1977) ) などが用いら れる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、
Nature, 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 CO S— 7 (CO S 7 ) ， V e r o , チャイニーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO細胞と略記） ， d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 C HO (以下、 CHO (d h f r -) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 2 0， マウ スミエローマ細胞， ラッ 卜 GH 3 , ヒ ト F L細胞などが用いられる。 ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 Pro atl. Acad. Sci. USA, 69巻, 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って 行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができ る。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194卷 , 182-187 (1991) , Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに 記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、 Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学 実験プロトコール 263-267 ( 1995) (秀潤社発行） 、 Virology, 52巻
, 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 受容体または部分べプチドをコードする DNAを含 有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。 宿主がェシエリ ヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する 際、 培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には 該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せし められる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキス トリン、 可溶 性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝 酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大 豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウム などがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリ ヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔Miller， Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせる ために、 例えば、 3 —インドリルアクリル酸のような薬剤を加えるこ とができる。
宿主がェシエリ ヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5~4 3でで約 3〜 24時間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜40°Cで約 6〜 24 時間行ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホールダ一（Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D 培地 (Bitter, G. A, ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81巻， 5330 (1984) 〕 があげられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好まし.い。 培養 は通常約 2 0°C〜 3 5°Cで約 2 4〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気 や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地とし ては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用い られる。 培地の p Hは約 6. 2〜 6. 4に調整するのが好ましい。 培養 は通常約 2 7 で約3〜 5 日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加え る。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例え ば、 約 5〜 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 122巻
, 501 (1952)) ， DMEM培地 〔Vi rology, 8巻， 396 (1959)〕 ， R PM I 1 6 4 0培地 [The Journal of the American Medical Association 199 卷， 519 (1967)〕 ， 1 9 9培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜 4 0でで約 1 5〜 6 0時 間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外などに 本発明の受容体または部分べプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の受容体または部分べプチドを分離精製するに は、 例えば、 下記の方法により行なうことができる。
本発明の受容体または部分べプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出 するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これ を適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解 などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過により ポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中 に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X_ 1 0 0TM などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にポリぺプチドが分 泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細 胞と上清とを分離し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる受容 体または部分べプチドの精製は、 自体公知の分離 · 精製法を適宜組み合 わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩 析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲ ルろ過法、 および S D S —ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主 として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーなど の荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの 特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ一などの 疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かく して得られる受容体または部分べプチドが遊離体で得られた場合 には、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換する ことができ、 逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに 準じる方法により、 遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、 精製前また は精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を 加えたり、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵 素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンド ぺプチダ一ゼ、プロティンキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。 本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドは、 市販さ れている場合には市販品をそのまま用いることもでき、 自体公知の方法 またはこれらに準じた方法に従って抽出または製造することもできる。 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩 に対する抗体 （以下、 単に本発明の抗体と称する場合がある） は、 本発 明の受容体に対する抗体を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗 体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。 本発明の受容体に対す る抗体としては、 受容体のシグナル伝達を不活性化する抗体、 受容体の シグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。 本発明の受容体に対する抗体は、 本発明の受容体を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の受容体は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部 位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して 抗体産生能を高めるため、 完全フロイン卜アジュバントゃ不完全フロイ ントアジュバントを投与してもよい。投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サ ル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラッ ト、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮ トリがあげられるが、 マウスおよびラッ 卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温 血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の
2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生 細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノ クロ一ナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中 の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反 応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行な うことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミルス夕 インの方法 〔ネィチヤ一 （Nature)、 256、 495 (1975)] に従い実施する ことができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール (P E G) やセンダイウィルスなどがあげられるが、 好ましくは P EG が用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2ノ 0、 A P— 1などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、 P 3 U 1が好まし く用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数 との好ましい比率は 1 ： 1〜 2 0 ： 1程度であり、 P EG (好ましくは P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0) 力 1 0〜8 0 %程度の濃度で添加さ れ、 2 0〜 40 °C、 好ましくは 3 0〜 3 7 °Cで；！〜 1 0分間ィ.ンキュベ ―卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリ一ニングには種々の 方法が使用できるが、 例えば、 ポリペプチド （蛋白質） 抗原を直接ある いは担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫 グロブリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス 免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に 結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗体ま たはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、 固相に結合した モノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従つ て行なうことができる。通常 H A T (ヒポキサンチン、アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別およ び育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのよ うな培地を用いても良い。 例えば、 1 〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清 を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイプリ ドーマ培養 用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることが できる。 培養温度は、 通常 2 0〜 4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5 日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養 上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定でき る。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブ リンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電 気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロティン Aあるいはプロテイン G などの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得 る特異的精製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （ポリペプチド抗原） 自 体、 あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつく り、 上記のモノ クローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、 該免疫動物か ら本発明の受容体に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行 なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリア一蛋白質と の複合体に関し、 キヤリア一蛋白質の種類およびキヤリァ一とハプテン との混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体 が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい 力 例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニ ン等を重量比でハプテン 1 に対し、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用い ることができるが、 ダルタルアルデヒ ドやカルポジイミ ド、 マレイミ ド 活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル 試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体 あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバ ントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3 〜 1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹 水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価 の測定と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精.製は、 上 記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製 法に従って行なうことができる。
配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩 をコードするポリヌクレオチド （例、 DNA) に相補的な、 または実質 的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（例、 DN A) としては、 該ポリヌクレオチドに相補的な、 または実質的に相 補的な塩基配列またはその一部を有し、 該ポリヌクレオチドの発現を抑 制し得る作用を有するものであれば、 いずれのポリヌクレオチド （アン チセンスポリヌクレオチド） であってもよい。
具体的には、 本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド （例、 D NA) (以下、 これらの DNAを本発明の DN Aと略記する場合がある ) に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有す るアンチセンス DNA (以下、 これらの DNAをアンチセンス DNAと 略記する場合がある） が挙げられ、 本発明の DNAに相補的な、 または 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該 DN Aの発現を抑 制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンス D N Aであ つてもよい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNAに相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全 塩基配列あるいは部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以 上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同 性を有する塩基配列などがあげられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖 の全塩基配列うち、 本発明の受容体の N末端部位をコードする部分の塩 基配列 （例えば、 開始コ ドン付近の塩基配列など） の相補鎖と約 7 0 % 以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好 ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンス DN Aが好適であ る。 これらのアンチセンス DNAは、 公知の DNA合成装置などを用い て製造することができる。 具体的には、 配列番号 ： 2で表される塩基配列を有する D N Aの塩基 配列に相補的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部 分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。 好ましく は例えば、 配列番号 ： 2で表される塩基配列を有する D N Aの塩基配列 に相補な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜 4 0個程度、 好ましく は 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセ ンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフエ一ト）は、 例えば、 ホスホロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネ 一トなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。 これらのアン チセンスポリヌクレオチドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造 することができる。
本発明に従えば、 本発明の受容体遺伝子の複製または発現を阻害する ことのできるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化し た、 あるいはアミノ酸が決定された蛋白質をコードする D N Aの塩基配 列情報に基づき設計し、 合成しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明の受容体遺伝子の R N Aとハイプリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害することができるか、 あるいは本発明 の受容体関連 R N Aとの相互作用を介して本発明の受容体遺伝子の発現 を調節 · 制御することができる。 本発明の受容体関連 R N Aの選択され た配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明の受容体関連 R N A と特異的にハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体 内および生体外で本発明の受容体遺伝子の発現を調節 · 制御するのに有 用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応す る」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の 配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオ チド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指 令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 蛋白質遺伝 子の 5 '端ヘアピンループ、 5， 端 6—ベ一スペア ' リピート、 5 ' 端非 翻訳領域、 蛋白質翻訳終止コ ドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止 コ ドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端 ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 蛋白質遺伝子 内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド との関係は、 対象物とハイプリダイズすることができるポリヌクレオチ ドとの関係は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセ ンスポリヌクレオチドは、 2—デォキシ一 D—リボースを含有している ポリヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 プ リンまたはピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその他のタイプのポ リヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマ 一 （例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングゃ塩基の付着を許 容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それら は、 二本鎖 D N A、 一本鎖 D N A、 二本鎖 R N A、 一本鎖 R N A、 さら に D N A ： R N Aハイブリ ッ ドであることができ、 さらに非修飾ポリヌ クレオチド （または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾 の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キヤッ プの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチド を類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例え ば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホ スホルアミデート、 カルバメ一卜など） を持つもの、 電荷を有する結合 または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエー卜、 ホスホロジチォェ ートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ · インヒビ夕一、 卜キシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一し—リジン など） や糖 （例えば、 モノサッカライ ドなど） などの側鎖基を有してい るもの、 インター力レート化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど ) を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有する もの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「 核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾 されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こう した修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化され たプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであつ てよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた 糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンと 力、、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなど の官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 RN A、 DN Α、 あるいは修飾された核酸 （RNA、 DNA) である。 修飾された核酸の 具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一卜誘導体、 そしてポ リヌクレオシドアミ ドゃオリゴヌクレオシドアミ ドの分解に抵抗性のも のが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアンチセ ンスヌクレオチドは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、 細胞内でのアンチセンスヌクレオチドをより安定なものにする、 アンチ センスヌクレオチドの細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に 対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアン チセンスヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば L Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8， pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed. , Ant isense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修 飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフ エアのような特殊な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用された り、 付加された形態で与えられることができうる。 こうして付加形態で 用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポ リ リジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を高めたり、 核 酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリ ピド、 コレス テロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好まし い脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリル クロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核 酸の 3 '端あるいは 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌ クレオシド結合を介して付着させることができうる。 その他の基として は、核酸の 3 '端あるいは 5 '端に特異的に配置されたキヤップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレア一ゼによる分解を阻止 するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリ エチレングリコール、 テトラエチレンダリコールなどのグリコールをは じめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに 限定されるものではない。
アンチセンスヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発 明の生体内や生体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明の受容体の生体内 や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の 方法で細胞に適用できる。
以下に、 （i ) 本発明の受容体、 （i i ) 本発明の受容体をコードするポ リヌクレオチド （本発明のポリヌクレオチド） 、 （i i i ) 本発明の受容体 に対する抗体 （本発明の抗体） 、 （i v) 本発明の受容体のアンチセンス ポリヌクレオチド （例、 本発明のアンチセンス D N A ) 、 （V ) 本発明の 受容体に特異的に結合する能力を有するリガンド （本発明のリガンド） などの用途を説明する。
〔 1〕 肥満細胞の脱顆粒抑制作用、 エイコサノイ ド産生抑制作用、 サイ トカイン産生抑制作用、 肥満細胞増殖抑制作用、 肥満細胞活性化抑制作 用などを有する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のリガンドは、 肥満細胞の脱顆粒促進作用、 エイコサノイ ド （ 例、 ロイコ トリェン、 プロスタグランジンなど） 産生促進作用、 サイ 卜 力イン （例、 TNF-ひ、 IL- 4、 IL-5、 IL- 6、 IL-8 , IL- 13、 TGF- j6など） 産 生促進作用、 肥満細胞増殖促進作用、 肥満細胞活性化（促進）作用などを 有する。
本発明のリガンドゃ本発明の受容体の機能 · 活性 （例、 肥満細胞の脱 顆粒促進作用、 エイコサノイ ド産生促進作用、 サイ ト力イン産生促進作 用、 肥満細胞増殖促進作用、 肥満細胞活性化促進作用など） を阻害する 化合物またはその塩は、 例えば、 肥満細胞の脱顆粒抑制剤、 エイコサノ イ ド産生抑制剤、 サイ ト力イン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤、 肥満 細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤なども.含む） などとして有用 であり、 例えば、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下垂体膿瘍、 甲状腺炎、 腹膜炎、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 アレルギー （例、 アレルギー性結膜炎、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど） 、 喘息、 滲出性中耳 炎、 メニエール病、 接触皮膚炎、 アナフィラキシー、 蓴麻疹、 重症筋無 力症、 糸球体腎炎、 シエーダレン症候群、 バセドー病、 インスリン抵抗 性糖尿病、 アトピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿器疾患 （例、 腎 尿細管間質障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 アレルギー性膀胱炎など） 、 消化器疾患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物アレルギー、 ァレ ルギー性腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zo l l i nge r-E l l i son症候群など） 、 胃炎、 逆 流性食道炎、 NUD (Non U l ce r Dyspeps i a) 、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロ イ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手術後ストレスによる胃酸 過多および潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性 気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性線維症、 過敏性肺 炎、 突発性間質性肺炎、 肺線維症など〕 、 循環器疾患 （例、 動脈硬化症、 急性冠状動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓アナフィラキシー、 心 不全、 心筋梗塞、 狭心症、 不整脈、 深部静脈血栓症、 P T C A後再狭窄 など） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライアイなど） 、 癌 （ 例、 甲状腺乳頭癌、 非小細胞性肺癌、 子宮内膜癌、 子宮頸癌、 胃癌、 膝 臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 乳癌、 結腸 癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） 、 脳梗塞、 髙脂血症、 急性 腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アトピー性脊髄炎、 神経線維 腫、 鼻粘膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖症などの予防， 治療剤な どとして使用できる。
肥満細胞の脱顆粒抑制剤として、好ましくは、免疫疾患、泌尿器疾患、 消化器疾患、 循環器疾患などの予防 · 治療剤が挙げられる。
エイコサノイ ド産生抑制剤として、 好ましくは、 免疫疾患などの予防 • 治療剤が挙げられる。
サイ ト力イン産生抑制剤として、 好ましくは、 免疫疾患などの予防 · 治療剤が挙げられる。
肥満細胞増殖抑制剤として、 好ましくは、 泌尿器疾患などの予防 ·治 療剤が挙げられる。
肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤なども含む） として、 好ましくは、 消化器疾患などの予防 · 治療剤が挙げられる。
本発明の受容体を用い、 または組換え型本発明の受容体の発現系を用 いたリガンドレセプ夕一アツセィ系を用いることにより、 本発明の受容 体と、 本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物 （例えば、 ぺプ チド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産 物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） またはその 塩を効率よくスクリーニングすることができる。
該化合物またはその塩には、 （i ) 本発明の受容体を介して細胞刺激活 性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cAMP産生抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C- f o の活性化 、 pHの低下、 GTP T S結合活性、 cAMP依存性プロティンキナーゼの活性化、 cGMP依存性プロティンキナ一ゼの活性化、 リン脂質依存性プロティンキ ナ一ゼの活性化、 マイ トジェン活性化蛋白質リン酸化酵素 （MAPキナーゼ ) (例、 ERK 1/2 ( p42/44 MAP キナーゼ） 、 p38 MAPK、 】NK/SAPK、 ERK5 など） の活性化などを促進する活性など） を有する化合物 （ァゴ二スト ) 、 ( i i ) 上記細胞刺激活性を有しない化合物 （アンタゴニスト） 、 （ i i i ) 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、 ( i v) 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物 などが含まれる。
具体的には、 （i ) 本発明の受容体に、 本発明のリガンドを接触させた 場合と （i i ) 本発明の受容体に、 本発明のリガンドおよび試験化合物を 接触させた場合との比較を行なう。 比較は、 例えば、 本発明の受容体に 対する本発明のリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して行う。 本発明のスクリ一二ング方法としての具体例としては、 例えば、 ( a) 本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明の リガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、 本発明のリガンドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、 比較する ことを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法、
(b) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体を含有する細胞または該細胞 の膜画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本 発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合に おける、 本発明のリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測 定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 お よび
( c) 本発明の受容体が、 本発明の受容体をコ一ドする D N Aを含有する 形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体 である上記 （b) 記載のスクリーニング方法、 ( d) 本発明のリガンドが、 標識したリガンドである上記 （a) 〜 （c) の スクリ一二ング方法などのレセプ夕一結合アツセィ系、
( e) 本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明の リガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴と する、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリ一ニング方法、
( Π本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の 膜画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発 明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお ける、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを 特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および
( g) 本発明の受容体が、 本発明の受容体をコードする D N Aを含有する 形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体 である上記（Π のスクリーニング方法などの細胞刺激アツセィ系などが 挙げられる。
本発明のスクリ一二ング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明の受容体としては、 ヒ トゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適 に用いられる。 しかし、 特にヒ ト由来の臓器は入手が極めて困難なこと から、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大 量発現させた本発明の受容体などが適している。
本発明の受容体を製造するには、 前述の本発明の受容体の製造方法な どが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の受容体を含有する細 胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。 本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をグルタルアル デヒ ド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公 知の方法に従って行うことができる。 本発明の受容体を含有する細胞としては、 本発明の受容体を発現した 宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが挙げられる。 製造方法は前述と同様である。 膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる 細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Po t t e r— E l vehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リング プレンダ一やポリ トロン （K i nema t i ca社製） による破砕、 超音波による 破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出さ せることによる破砕などがあげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分 離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いら れる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 rpn！〜 3000 rpm) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （ 15000 rpn！〜 30000 rpm) で 通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中 には、 発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの 膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、 1細胞当たり 1 0 3〜 1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜 1 0 7分子で あるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド 結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可 能になるばかりでなく、 同一ロッ トで大量の試料を測定できるようにな る。
前記のレセプター結合ァッセィ系や細胞刺激アツセィ系などのスクリ 一二ング方法を実施するためには、 例えば、 本発明の受容体画分と、 本 発明のリガンド （例、 標識した本発明のリガンド） などが用いられる。 本発明の受容体画分としては、 天然型の本発明の受容体画分か、 または それと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましレ ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性などを示す。 標識し たリガンドとしては、 例えば、 放射性同位元素 （例、 〔3H〕 、 c i 25 n 、 〔l4c〕 、 〔32P〕 、 . 〔33P〕 、 〔35s〕 など） 、 蛍光物質 （例、 フルォレセ インなど） 、 発光物質 （例、 ルミノールなど） 、 酵素 （例、 ペルォキシ ダーゼなど） またはラン夕ニド元素などで標識されたリガンドなどを用 いることができる。
具体的には、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化さ せる化合物のスクリーニングを行うには、 本発明の受容体を含有する細 胞または細胞の膜画分を、 スクリ一二ングに適したバッファーに懸濁す ることによりレセプ夕一標品を調製する。 バッファ一には、 p H4〜 l 0 (望ましくは pH 6〜 8) のリン酸バッファ一、 卜リス一塩酸バッフ ァーなどのリガンドと受容体との結合を阻害しないバッファーであれば いずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、 CHAP S、 Twe e n - 8 0™ (花王ーァトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレ 一卜などの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プ 口テアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的で P MS F、 ロイ ぺプチン、 E— 6 4 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテ ァーゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 0 1〜 1 0m lの該レセプ夕 一溶液に、 一定量 （5000〜500000cpm) の標識した本発明のリガンドを添 加し、 同時に 1 0_1ϋ〜 1 0—7Μの試験化合物を共存させる。 非特異的結 合量 （NS B) を知るために大過剰の未標識の本発明のリガンドを加え た反応チューブも用意する。 反応は 0で〜 5 0°C、 望ましくは 4°C〜 3 7でで 2 0分〜 2 4時間、 望ましくは 3 0分〜 3時間行う。 反応後、 ガ ラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊 維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウン夕一またはァ 一カウン夕一で計測する。 拮抗する物質がない場合のカウン卜 （BQ) か ら非特異的結合量 （N S B) を引いたカウント （B。一 N S B) を 1 0 0 %とした時、 特異的結合量 （B— NS B) が例えば 5 0 %以下になる試 験化合物を本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合性を低下させる 化合物として選択することができる。
さらに、 表面プラズモンセンサー技術を利用することによって、 本発 明の受容体に結合する化合物をスクリーニングすることもできる。 具体的には、 ビアコア 3 0 0 0 (ビアコア社） のセンサーチップ表面 に、 本発明の受容体を固定化後、 チップ表面にリン酸緩衝液 （P B S) などに溶解した試験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定 することにより、本発明の受容体に結合する試験籠物を選択る。例えば、 表面プラズモンの変化の測定値が 5レゾナンスユニッ ト以上与える試験 化合物を本発明の受容体に結合性を有する物質として選択する。
前記の細胞刺激アツセィ系のスクリーニング方法を実施するためには、 本発明の受容体を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァ セチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c AMP産生抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低 下、 GT P ァ S結合活性、 c AMP依存性プロティンキナーゼの活性化、 c GMP依存性プロティンキナーゼの活性化、 リン脂質依存性プロティ ンキナーゼの活性化、 マイ トジェン活性化蛋白質リン酸化酵素 （MAP キナーゼ）の活性化などを促進する活性または抑制する活性など） （例、 ERK1/2 (p42/44 MAP キナーゼ） 、 p38 MAPK、 JNK/SAPK, ERK5 など） を 、 自体公知の方法または市販の測定用キッ トを用いて測定することがで きる。 具体的には、 まず、 本発明の受容体を含有する細胞をマルチゥェ ルプレー卜等に培養する。 スクリーニングを行うにあたっては前もって 新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間ィンキュベー卜した後、 細胞を抽出 あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定 量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解 酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c A MP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎 的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出する ことができる。
細胞刺激活性を測定してスクリ一二ングを行なうには、 適当な本発明 の受容体を発現した細胞が必要である。 本発明の受容体を発現した細胞 としては、 前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 抗体、 非べプチ ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿などがあげられる。
上記細胞刺激アツセィ系のスクリーニング方法について、 さらに具体 的に以下 （ 1 ) 〜 （ 1 3 ) に記載する。
( 1 ) 受容体発現細胞が受容体ァゴニス 卜によって刺激されると細胞内 の G蛋白質が活性化されて GTPが結合する。 この現象は受容体発現細胞の 膜画分においても観察される。 通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化 するが、 このとき反応液中に GTP r Sを添加しておくと、 GTP r Sは GTPと同 様に G蛋白質に結合するが、 加水分解されずに G蛋白質を含む細胞膜に結 合した状態が維持される。 標識した GTP 7 Sを用いると細胞膜に残存した 標識された GTP r Sを測定することにより、 受容体ァゴニス 卜の受容体発 現細胞刺激活性を測定することができる。
この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に 対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の受 容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングすることができる。
この方法は、 本発明の受容体を含む膜画分を用いて行う。 本測定法に おいて本発明の受容体膜画分への GTP r S結合促進活性を示す物質はァゴ ニストである。
具体的には、 標識した GTP r Sの存在下、 本発明のリガンドを本発明の 受容体細胞膜画分に接触させた場合と本発明のリガンドおよび試験化合 物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の受 容体細胞膜画分への GTP r S結合促進活性を測定し、比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をス クリーニングする。
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体細胞膜画分 への GTP r S結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、 アン夕ゴ ニスト候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、 本発 明の受容体細胞膜画分への GTPr S結合促進活性を測定することにより、 ァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、 膜 希釈緩衝液 （50mM Tris、 5mM MgCl2、 150mM NaCK \u GDP, 0. 1% BSA ； pH7.4) で希釈する。 希釈率は、 受容体の発現量により異なる。 これを Falcon2053に 0.2mlずつ分注し、本発明のリガンドまたは本発明のリガン ドおよび試験化合物を加え、 さらに終濃度 200pMとなるように [35S] GTPr Sを加える。 25°Cで 1時間保温した後、 氷冷した洗浄用緩衝液 （50mMTris , 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 0. 1% BSA, 0.05% CHAPS； pH7.4) 1.5mlを 加えて、 ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。 65 ：、 30分保温して乾燥後、 液体シンチレーションカウン夕一でろ紙上に残った膜画分に結合した [35S]GTPr Sの放射活性を測定する。 本発明のリガンドのみを加えた実験 区の放射活性を 100%、本発明のリガンドを加えなかった実験区の放射活 性を 0%とし、本発明のリガンドによる GTPr S結合促進活性に対する試験 化合物の影響を算出する。 GTPr S結合促進活性が例えば 50%以下になる 試験化合物をアン夕ゴニス 卜候補化合物として選択することができる。 ( 2 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 細 胞内 cAMPの産生が抑制される。 この反応を利用して、 本発明のリガンド の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスク リーニングすることができる。
具体的には、 細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のリガ ンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンド および試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産生抑制活性を測定し、 比較することにより、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスク リ一二ングする。
細胞内 cAMP量を増加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カルシトニンなどが用いられる。
本発明の受容体発現細胞内の cAMP産生量は、マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と 〔'251〕 標識 cAMP (とも に市販品） を使用することによる RIA系、 または抗 cAMP抗体と標識 cAMP とを組み合わせた EIA系で測定することができる。 また、 抗 cAMP抗体を、 protein Aまたは抗 cAMP抗体産生に用いた動物の IgGなどに対する抗体な どを使用して固定したシンチラントを含むビーズと 〔1251〕 標識 cAMPとを 使用する SPA (Scintillation Proximity Assay) 法による定量、 化学増 幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセィ系である AlphaScreen (PerkinElmer社） を応用した競合法 cAMP検出キッ ト （ PerkinElmer社） による定量も可能である。
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞の cAMP産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 アン夕ゴニス ト 候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 cAMP 産生抑制活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ 一二ングを行なうことができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞 （例、 CH0細胞などの動物細胞） を 24穴プレー トに 5xl04cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0.2mM 3-イソブ チル-メチルキサンチン、 0.05% BSAおよび 20mMHEPESを含むハンクスバ ッファー （PH7.4) で洗浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後、 0.5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反 応用バッファーを除き、 新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え た後、 20 zMの本発明のリガンドまたは 20 Mの本発明のリガンドおよび 試験化合物を添加した 2 /ζΜ フオルスコリンを含む 0.25mlの反応用バッ ファーを、 細胞に.加え、 37°Cで 24分間反応させる。 100 1の 20%過塩素 酸を加えて反応を停止させ、 その後氷上で 1時間置く ことにより細胞内 cAMPを抽出する。 抽出液中の cAMP量を、 cAMP E I Aキッ ト （アマシャムフ アルマシアバイオテク） を用いて測定する。 フオルスコリンの刺激によ つて産生された cAMP量を 100 %とし、 20 / Mの本発明のリガンドの添加に よって抑制された cAMP量を 0 %として、本発明のリガンドによる cAMP産生 抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。 本発明のリガンドの活 性を阻害して、 cAMP産生活性が例えば 50 %以上になる試験化合物を、 ァ ン夕ゴニス ト候補化合物として選択することができる。
また、 本発明のリガンドの刺激により、 細胞内 cAMP量が増加する性質 を示す本発明の受容体発現細胞を使用する場合、 本発明のリガンドを本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試 験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 該細胞 の細胞内 cAMPの産生促進活性を測定し、 比較することにより、 本発明の リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二 ングすることができる。
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞の cAMP産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 アン夕ゴニス ト 候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて cAMP産 生促進活性を調べることによりァゴニス ト活性を示す化合物のスクリー ニングを行なうことができる。
cAMP産生促進活性は、 上記のスクリ一二ング法においてフォルスコリ ンを添加せずに本発明の受容体発現細胞 （例、 CH0細胞などの動物細胞） に本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し て産生された cAMPを上記の方法で定量して測定する。
( 3 ) CRE-レポ一夕一遺伝子べクタ一を用いて、 本発明のリガンドの本 発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明 のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一 ニングすることができる。 CRE ( cAMP re spons e e l emen t ) を含む DNAを、 ベクターのレポ一夕一遺 伝子上流に挿入し、 CRE-レポーター遺伝子ベクターを得る。 CRE-レポ一 夕一遺伝子べクタ一を導入した本発明の受容体発現細胞において、 cAMP の上昇を伴う刺激は、 CREを介したレポーター遺伝子発現と、 それに引き 続く レポ一夕一遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つま り、 レポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、 CRE-レ ポーター遺伝子べクタ一導入細胞内の cAMP量の変動を検出することがで さる。
具体的には、 細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のリガ ンドを、 CRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 CRE-レポ一 夕一遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合にお ける、 レポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較することによ り、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 をスクリーニングする。
細胞内 cAMP量を増加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カルシ卜ニンなどが用いられる。
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン べィシックベクター、 ピ ッカジーン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用 いられる。 CREを含む DNAを、 上記べクタ一のレポーター遺伝子、 例えば ルシフェラ一ゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイ トに挿入し、 CRE- レポ一夕一遺伝子ベクターとする。
本方法において、 本発明のリガンドによるレポ一夕一遺伝子蛋白質の 酵素活性抑制を回復させる試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物と して選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 フォ ルスコリン刺激によって上昇した発光量の本発明のリガンドと同様な抑 制を測定することによりァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともで さる。 レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 こ のスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
CRE-レポ一夕一遺伝子 （ルシフェラーゼ） を導入した本発明の受容体 発現細胞を、 24穴プレー卜に 5xl03cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0.2mM 3-イソプチル-メチルキサンチン、 0.05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一 （PH7.4) で洗浄する （以下、 反応用バ ッファーと略記する） 。 その後 0.5mlの反応用バッファーを加えて 30分間 培養器で保温する。 反応用バッファーを除き、 新たに 0.25mlの反応用バ ッファーを細胞に加えた後、 100 の本発明のリガンドまたは 100 の本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した 2 Μ フオルスコリン を含む 0.25mlの反応用バッファ一を、 細胞に加え、 37でで 24分間反応さ せる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶 かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフ エラーゼによる発光は、 ルミノメ一夕一、 液体シンチレーシヨンカウン 夕一またはトップカウン夕一により測定する。 本発明のリガンド単独を 添加した場合と、 100 Mの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し た場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、 比較する。
本発明のリガンドは、 フオルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼに よる発光量の増加を抑制する。 該抑制を回復させる化合物をアンタゴニ スト候補化合物として選択することができる。
レポ一タ一遺伝子として、 例えば、 アルカリフォスファターゼ、 クロ ラムフエニコーリレ ' ァセチリレトランスフェラーゼ (chloramphenicol acetyl transferase) 、 /8—ガラク トシダーゼなどの遺伝子を用いてもよ レ これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、 または市販の測定キッ トを用いて測定する。 アルカリフォスファターゼ 活性は、 例えば和光純薬製 Lumi-Phos 530を用いて、 クロラムフエニコー ル · ァセチルトランスフェラーゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolainpheiiicol Acetyl transferase Assay KiTを用レ て、 j8 -ガラク 卜 シダ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEを用いて測定する。 ( 4 ) SRE-レポ一夕一遺伝子ベクターを用いて、 本発明のリガンドの本 発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明 のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一 ニングすることができる。
SRE ( s e rum re spons e e l emen t ) を含む DNAを、 ベクターのレポーター 遺伝子上流に挿入し、 SRE-レポ一夕一遺伝子ベクターを得る。 SRE-レポ 一夕一遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、 血 清刺激による MAPキナーゼ活性化などの増殖シグナルの活性化は、 SREを 介したレポ一夕一遺伝子発現と、 それに引き続く レポ一夕一遺伝子の遺 伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポーター遺伝子蛋白 質の酵素活性を測定することにより、 SRE-レポ一ター遺伝子ベクター導 入細胞内の増殖シグナルの活性化を検出することができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 SRE-レポ一夕一遺伝子ベクター導 入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよ び試験化合物を、 SRE-レポ一夕一遺伝子べクタ一導入本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体と の結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン べィシックベクター、 ピッ 力ジーン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用いら れる。 SREを含む DNAを、 上記ベクターのレポーター遺伝子、 例えばルシ フェラ一ゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイ 卜に挿入し、 SRE-レポ —夕一遺伝子ベクターとする。
本方法において、 本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の 酵素活性化を抑制させる試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物とし て選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 本発 明のリガンドと同様な発光量の上昇を測定することによりァゴニス トの スクリーニングを行なうこともできる。 レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 こ のスクリ一二ング方法の具体例を以下に述べる。
SRE-レポーター遺伝子 0レシフェラ一ゼ） を導入した本発明の受容体 発現細胞を、 24穴プレートに 5xl03cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0.05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一 （pH7.4 ) で洗浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後 0.5mlの反 応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファーを 除き、 新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 100 Mの本 発明のリガンドまたは 100 Mの本発明のリガンドおよび試験化合物を 添加した 0.25mlの反応用バッファーを、 細胞に加え、 37°Cで 24分間反応 させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で 溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシ フェラーゼによる発光は、 ルミノメーター、 液体シンチレーシヨンカウ ン夕ーまたは卜ップカウン夕一により測定する。 本発明のリガンド単独 を添加した場合と、 100 Mの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加 した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、 比較する。
本発明のリガンドは、 ルシフェラーゼによる発光量を増加させる。 該 増加を抑制させる化合物をアン夕ゴニス ト候補化合物として選択するこ とができる。
レポ一夕一遺伝子として、 例えば、 アルカリフォスファターゼ、 クロ ラムフエ二コール · ァセチルトランスフェラーゼ （chloramphenicol acetyl transferase)、 /3—ガラク トシダ一ゼなどの遺伝子を用いてもよ レ これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、 または市販の測定キッ トを用いて測定する。 アルカリフォスファ夕ーゼ 活性は、 例えば和光純薬製 Lumi-Phos 530を用いて、 クロラムフエニコ一 ル · ァセチルトランスフェラ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiTを用レ て、 β—刀ラク 卜 シダーゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEを用いて測定する。 ( 5 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激に.より、 7 ラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。 この反応を利用して、 本発明の リガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することに より、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物をスクリーニングすることができる。
あらかじめ、 標識したァラキドン酸を、 本発明の受容体発現細胞に取 り込ませておく ことによって、 ァラキドン酸代謝物放出活性を、 細胞外 に放出された標識されたァラキドン酸代謝物を測定することによって測 定することができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 標識したァラキドン酸を含有する 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび 試験化合物を、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細 胞に接触させた場合における、ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を 変化させる化合物をスクリ一二ングする。
本方法において、 本発明のリガンドによるァラキドン酸代謝物放出活 性を阻害する試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択する ことができる。
また、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 の受容体発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べる ことによりァゴニス 卜活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこと もできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに 5x l 04ce l l /we l lで播種し、 24時間培養後、 [3H]ァラキドン酸を 0. 25 C i/we l lとなるよう添加し、 16 時間後、 細胞を 0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー (pH7. 4) (以下、 反応用バッファ一と略記する） で洗浄する。 終濃度 20 Mの本発明のリガンドまたは終濃度 20 Mの本発明のリガンドおよび 試験化合物を含む反応用バッファ一 500 /^ 1を、 各 we l lに添加する。 37 °Cで 60分間ィンキ.ュべ一トした後、 反応液 400 ^ 1をシンチレ一.ターに加 え、 反応液中に遊離した [3H]ァラキドン酸代謝物の量をシンチレ一ショ ンカウン夕一により測定する。
反応用バッファー 500 ^ 1のみを添加した場合（本発明のリガンド非添 加 ·試験化合物非添加） の遊離 [3H]ァラキドン酸代謝物の量を 0 %、 20 a Mの本発明のリガンドを含む反応用バッファーを添加した場合（試験化合 物非添加） の遊離 [3H]ァラキドン酸代謝物の量を 100 %として、 試験化合 物を添加した場合の遊離 [3H]ァラキドン酸代謝物の量を算出する。
ァラキドン酸代謝物放出活性が、 例えば 50 %以下になる試験化合物を アン夕ゴニスト候補化合物として選択することができる。
( 6 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 細 胞内の Ca濃度が上昇する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本 発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明 のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一 ニングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測 定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結 合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。 測定は公知の方法に従 つて行う。
本方法において、 本発明のリガンドによる細胞内カルシウム濃度の上 昇を抑制する試験化合物を、 アン夕ゴニス卜候補化合物として選択する ことができる。
一方、 試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することに よってァゴニス 卜のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、 2日後、 培養液を、 4mM Fu ra-2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した HBS Sに 置換し、 室温で 2時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、 キュべッ ト.にカバー グラスをセッ トし、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試 験化合物を添加し、 励起波長 340nmおよび 380nmでの、 505nmの蛍光強度の 比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
また、 FL IPR (モレキュラーデバイス社製） を使って行ってもよい。 本 発明の受容体発現細胞縣濁液に F l uo- 3 AM (同仁化学研究所製） を添加し 、 細胞に取り込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 96穴プレート に細胞を播く。 FL IPR装置にセッ トし、 Fura- 2の場合と同様に、 本発明の リガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、 蛍光強度 の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
さらに、 本発明の受容体発現細胞に、 細胞内 Caイオンの上昇によって 発光するような蛋白質の遺伝子 （例、 ae ciuor inなど） を共発現させてお き、 細胞内 Caイオン濃度の上昇によって、 該遺伝子蛋白質 （例、 aeciuo r in など） が Ca結合型となり発光することを利用して、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングするこ ともできる。
細胞内 Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発 現させた本発明の受容体発現細胞を、 96穴プレートに播き、 上記と同様 に、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加 し、 蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
本発明のリガンドによる蛍光強度の上昇を、 抑制する試験化合物をァ ン夕ゴニス 卜候補化合物として選択することができる。
( 7 ) 受容体を発現する細胞に、 受容体ァゴニス卜を添加すると、 細胞 内イノシトール三リン酸濃度は上昇する。 本発明のリガンドの、 本発明 の受容体発現細胞における細胞内ィノシトール三リン酸産生活性を利用 することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化 させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 標識したイノシトールの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび 試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合にお ·ける、 ィ ノシトール三リン酸産生活性を測定し、 比較することにより、 本発明の リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー二 ングする。 測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、 ィノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合 物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 イノシ トール三リン酸産生上昇を測定することによってァゴニス トのスクリー ニングを行なうこともできる。
スクリ一ニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播き、 1日間培養する。 その 後、 myo-[2-3H] inositol (2.5 Ci/wel 1) を添加した培地で 1 日間培養 し、 細胞を放射活性を有するイノシトールを無添加の培地でよく洗浄す る。 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加 後、 10%過塩素酸を加え、反応を止める。 1.5M 水酸化力リゥムおよび 60mM HEPES溶液で中和し、 0.5mlの AGlx8樹脂 （Bio-Rad) を詰めたカラムに通 し、 5mM 四ホウ酸ナトリウム （Na2B407) および 60πιΜ ギ酸アンモニゥムで 洗浄した後、 1M ギ酸アンモニゥムおよび 0.1M ギ酸で溶出した放射活性 を、 液体シンチレーシヨンカウン夕一で測定する。 本発明のリガンドを 添加しない場合の放射活性を 0%、本発明のリガンドを添加した場合の放 射活性を 100%とし、 試験化合物の、 本発明のリガンドと本発明の受容体 の結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、 例えば 50%以下になる試験化合物 をアン夕ゴニス 卜候補化合物として選択することができる。
(8) TRE-レポ一夕一遺伝子ベクターを用いて、 本発明のリガンドの本 発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明 のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一 ニングすることができる。
TRE (TPA response element) を含む DNAを、 ベクターのレポ一夕一遺 伝子上流に挿入し TRE-レポーター遺伝子べクタ一を得る。 TRE-レポ一 夕一遺伝子べクタ一を導入した本発明の受容体発現細胞において、 細胞 内カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、 TREを介したレポ一ター遺伝子発 現と、 それに引き続く レポ一夕一遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生 を誘導する。 つまり、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定するこ とにより、 TRE-レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の 変動を検出することができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 TRE-レポーター遺伝子ベクター導 入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよ び試験化合物を、 TRE-レポ一夕一遺伝子ベクター導入本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 レポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性 を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体と の結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン ペイシックべクタ一、 ピ ッカジーン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用 いられる。 TREを含む DNAを、 上記ベクターのレポーター遺伝子、 例えば ルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイ 卜に挿入し、 TRE - レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、 本発明のリガンドによるレポ一夕一遺伝子蛋白質の 酵素活性を抑制する試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選 択することができる。
一方、 試験化合物のみを TRE-レポーター遺伝子べクタ一導入本発明の 受容体発現細胞に接触させ、 本発明のリガンドと同様な発光量の増加を 測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 こ のスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
TRE -レポーター遺伝子 （ルシフェラ一ゼ） を導入した本発明の受容体 発現細胞を、 24穴プレートに5 103じ6 1 1 /^ 1 1で播種し、48時間培養する。 細胞を 0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一 （pH7. 4 ) で洗浄した後、 100 ^ Mの本発明のリガンドまたは 100 /x Mの本発明の リガンドおよび試験化合物を添加し、 37でで 60分間反応させる。 細胞を ピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶かし、 溶解液 に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフェラーゼによ る発光は、 ルミノメーター、 液体シンチレーシヨンカウンターまたはト ップカウンタ一により測定する。 本発明のリガンドを添加した場合と、 100 の本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフ エラーゼによる発光量を測定して、 比較する。
本発明のリガンドによる細胞内カルシウムの上昇によって、 ルシフエ ラーゼによる発光量が増加する。 この増加を抑制する化合物をアン夕ゴ ニスト候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子として、 例えば、 アルカリフォスファターゼ、 クロ ラムフエニコ一ル · ァセチル卜ランスフェラーゼ （chloramphenicol acetyl transferase)、 j6 _ガラク トシダーゼなどの遺伝子を用いてもよ レ これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性はノ 知の方法に従い、 または市販の測定キッ トを用いて測定する。 アルカリフォスファタ一ゼ 活性は、 例えば和光純薬製 Lumi-Phos 530を用いて、 クロラムフエニコー ル · ァセチルトランスフェラーゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiTを用レ て、 —ガラク 卜 シダーゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEを用いて測定する。 ( 9 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 MAP キナーゼが活性化され、 増殖する。 この反応を利用して、 本発明のリガ ンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をス クリーニングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することに より、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物をスクリ一ニン.グする。 本発明の受容体発現細胞の増殖は、 例えば、 MAPキナーゼ活性、 チミジ ン取り込み活性、 ATP量、 細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、 MAPキナーゼ活性については、 本発明のリガンドまた は本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に添 加した後、 細胞溶解液から抗 MAPキナーゼ抗体を用いた免疫沈降によ り MAPキナーゼ分画を得た後、 公知の方法、 例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay Ki tおよびァ- [32P] -ATPを使用して MAPキナーゼ活性を測定 し、 比較する。
チミジン取り込み活性については、 本発明の受容体発現細胞を 24穴プ レートに播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドぉ よび試験化合物を添加した後、 放射活性により標識したチミジン （例、
[methyl-3H]-チミジンなど） を加え、 その後、 細胞を溶解し、 細胞内に 取り込まれたチミジンの放射活性を、 液体シンチレーションカウンター で計数することにより、 チミジン取り込み活性を測定し、 比較する。
ATP量の測定については、本発明の受容体発現細胞を 96穴プレートに播 種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化 合物を添加した後、 例えば CellTiter-Glo (Promega) を用いて細胞内の ATP量を測定し、 比較する。
細胞数の測定については、 本発明の受容体発現細胞を 24穴プレー卜に 播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験 化合物を添加した後、 MTT (
3 - (4， 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazol ium bromide ) を添加する。 細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを、 塩酸にて酸性としたィソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、570ηπι の吸収によって測定し、 比較する。
本方法において、 本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験化合 物を、 アン夕ゴニス卜候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 のリガンドと同様な細胞増殖活性を測定することによりァゴニス トのス クリーニングを行なうこともできる。
チミジン取り込み活性を利用するスクリーエング法の一具体例を以下 に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレー卜に 5000個/ゥエル播き、 1日間 培養する。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にす る。 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を、 細 胞に添加して 24時間培養した後、 [me t hy l -3H] -チミジンをゥエル当たり 0. 0 15MBQ添加し、 6時間培養する。 細胞を PBSで洗った後、 メタノールを 添加して 10分間放置する。次に 5 % トリクロ口酢酸を添加して 15分間放置 後、 固定された細胞を蒸留水で 4回洗う。 0. 3N水酸化ナトリゥム溶液で細 胞を溶解し、 溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウン夕一で 測定する。
本発明のリガンドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化 合物を、 アン夕ゴニス 卜候補化合物として選択することができる。 ( 1 0 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 力リゥムチャネルが活性化し、 細胞内にある Kイオン力 細胞外に流出す る。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞 に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の 受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングすることができ る。
Kイオンと同族元素である Rbイオン （ルビジウムイオン） は、 Kイオン と区別無く、 カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。 よって、 本 発明の受容体発現細胞に、 放射活性同位体である Rb ( [86Rb] ) を取り込 ませておいた後、 本発明のリガンドの刺激によって流出する86 Rbの流れ (流出活性） を測定することにより、 本発明のリガンドの本発明の受容 体発現細胞に対する刺激活性を測定する。
具体的には、 Rbの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 86Rbの流出活性を測 定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結 合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、 本発明のリガンド刺激による86 Rbの流出活性の上昇 を抑制する試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択するこ とができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 のリガンドと同様な86 R bの流出活性の上昇を測定することによりァゴ 二ス トのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレー卜に播き、 2日間培養する。 その 後、 lfflC i/inlの86 RbC lを含む培地中で 2時間保温する。 細胞を培地でよく 洗浄し、 外液中の86 R 1を完全に除く。 本発明のリガンドまたは本発明 のリガンドおよび試験化合物を細胞に添加し、 30分後外液を回収し、 Ύ カウンターで放射活性を測定し、 比較する。
本発明のリガンド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制する試験化 合物を、 アン夕ゴニス 卜候補化合物として選択することができる。
( 1 1 ) 本発明の受容体発現細胞が本発明のリガンドに反応し、 細胞外 の pHが変化する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受 容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガン ドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす ることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 細胞外の p H変化を測定し、 比較す ることにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化さ せる化合物をスクリーニングする。
細胞外 pH変化は、 例えば、 Cy t os ens o r装置 （モレキュラーデバイス社 ) を使用して測定する。
本方法において； 本発明のリガンドによる細胞外 PH変化を抑制する試 験化合物を、 アン夕ゴニス ト候補化合物として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 のリガンドと同様な細胞外 P H変化を測定することによりァゴニス トの スクリ一ニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を Cytosensor装置用のカプセル内で終夜培養 し、装置のチヤンバーにセッ 卜して細胞外 pHが安定するまで約 2時間、 0. 1 % BSAを含む RPMI 1640培地（モレキユラ一デバイス社製）を灌流させる。 pHが安定した後、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験 化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。 灌流によって生じた培地の pH 変化を測定し、 比較する。
本発明のリガンドによる細胞外 p H変化を抑制する化合物をアン夕ゴ ニスト候補化合物として選択することができる。
( 1 2 ) 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) の haploid a -mat ing type (MAT ) の性フェロモン受容体 Ste2は、 G蛋白質 Gpalと共役しており、 性 フェロモン a -mat ing factorに応答して MAPキナーゼを活性化し、 これに 引き続き、 Farl (cell-cycle arrest) および転写活性化因子 S 12が活 性化される。 Stel2は、 種々の蛋白質 （例えば、 接合に関与する FUS1) の 発現を誘導する。一方、制御因子 Sst2は上記の過程に抑制的に機能する。 この系において、 受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、 受容体ァゴニ ストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、 その結果生 じる増殖などを指標として用いる、 受容体ァゴニス トと受容体との反応 の測定系の試みが行なわれている （Trends in Biotechnology, 15巻， 487-494頁， 1997年） 。 上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスク リーニングすることができる。
具体例を以下に示す。
MAT a;酵母の Ste2および Gpalをコードする遺伝子を除去し、 代わりに、 本発明の受容体遺伝子および Gpal-Gai2融合蛋白質をコードする遺伝子 を導入する。 Farlをコードする遺伝子を除去して cell-cycle arrestが生 じないようにし、 また、 Sst2をコードする遺伝子を除去して本発明のリ ガンドに対する応答の感度を向上させておく。 さらに、 FUS1にヒスチジ ン生合成遺伝子 HIS3を結合した FUS1- HIS3遺伝子を導入する。この遺伝子 組換え操作は、 例えば、 Molecular and Cellular Biology, 15巻，
6188- 6195頁， 1995年に記載の方法において、 ソマトス夕チン受容体タイ プ 2 (SSTR2) 遺伝子を、 本発明の受容体に置き換えて実施することがで きる。
このように構築された形質変換酵母は、 本発明のリガンドに高感度で 反応し、 その結果、 MAPキナーゼの活性化が起き、 ヒスチジン生合成酵素 が合成されるようになり、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、 上記の本発明の受容体発現酵母 （Ste2遺伝子および Gpal遺伝 子が除去され、本発明の受容体遺伝子および Gpal-Gai2融合蛋白質コード 遺伝子が導入され、 Far遺伝子および Sst2遺伝子が除去され、 FUS卜 HIS3 遺伝子が導入された MATo;酵母） を、 ヒスチジン欠乏培地で培養し、 本発 明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させ、 該 酵母の生育を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明 の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングすることがで さる。
本方法において、 該酵母の生育を抑制する試験化合物を、 アン夕ゴニ スト候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、 本発明のリガンドと同様な酵母の生育を測定することによりァゴニスト のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養 し、 その後、 ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、 2xl04cell/mlの濃 度になるように加える。 ついで、 9x9cmの角形シャーレに播く。 寒天が固 化した後、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物 をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、 30°Cで 3日間培養する。 試験 化合物の影響は、 濾紙の周囲の酵母の生育を、 本発明のリガンドのみを しみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。 また、 あらかじめ、 ヒ スチジンを除去した寒天培地に本発明のリガンドを添加しておき、 滅菌 濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、 シャーレ全面での 酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。
酵母の生育を抑制する化合物をアン夕ゴニスト候補化合物として選択 することができる。
( 1 3 )本発明の受容体遺伝子 RNAをアフリカッメガエル卵母細胞に注入 し、 本発明のリガンドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇し て、 ca l c i um- ac t i va t e d ch l or i d e cu r ren tが生じる。 これは、 膜電位の 変化としてとらえることができる（Kイオン濃度勾配に変化がある場合も 同様） 。 本発明のリガンドによって生じる本発明の受容体導入アフリカ ッメガエル卵母細胞における上記反応を利用して、 本発明のリガンドの 本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発 明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ 一二ングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフ リカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび 試験化合物を、本発明の受容体遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵母細 胞に接触させた場合における、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較するこ とにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる 化合物をスクリーニングする。
本方法において、 細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、 アン夕ゴ ニスト候補化合物として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体遺伝子 RNA導入アフリカッメガ エル卵母細胞に接触させ、 本発明のリガンドと同様な細胞膜電位変化を 測定することによりァゴニス 卜のスクリ一ニングを行なうこともできる。 スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。 氷冷して動けなくなった雌のアフリカッメガエルから取り出した、 卵 母細胞塊を、 MBS液 （88mMNaCl， linM KC1, 0.41mM CaCl2, 0.33mM Ca (N03) 2, 0.82mM MgS04, 2.4mM NaHC03, lOmM HEPES； pH7.4) に溶かしたコラー ゲナーゼ （0.5mg/ml) で卵塊がほぐれるまで 19で、 1〜6時間、 150rpmで 処理する。 外液を MBS液に置換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピュ レーターで本発明の受容体遺伝子 poly A付加 cRNA (50ng/50nl) を卵母細 胞にマイクロインジェクションする。
本発明の受容体遺伝子 mRNAは、 組織や細胞から調製してもよく、 ブラ スミ ドから invitroで転写してもよい。 本発明の受容体遺伝子 mRNAを MBS 液中で 20°Cで 3日培養し、 これを Ringer液を流している voltage clamp装 置のくぼみに置き、 電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス 微小電極を細胞内に刺入し、 （一） 極は細胞外に置く。 電位が安定した ら、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録する。 試験化合物の影響は、 本発明の 受容体遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を、 本発明のリガンドのみ含む Ringer液を流した場合と比較することによつ て測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物をアンタゴニス 卜候補化合物として 選択することができる。
上記の系において、 電位の変化量を増大させると、 測定しやすくなる ため、 各種の G蛋白質遺伝子の poly A付加 RNAを導入してもよい。 また、 カルシウム存在下で発光を生じるような蛋白質 （例、 aetiuorinなど） の 遺伝子の poly A付加 RNAを共ィンジェクションすることにより、 膜電位変 化ではなく発光量を測定することもできる。
さらに、 哺乳動物由来の肥満細胞を使用したスクリーニング方法につ いて、 以下に述べる。
哺乳動物 （好ましくはヒ ト、 チンパンジー、 サルなど） 由来の肥満細 胞 （肥満細胞株も含む） 、 好ましくは皮膚、 膀胱、 胃、 小腸、 肺などの 由来の肥満細胞を用いて以下の方法などにより、 例えば肥満細砲の脱顆 粒抑制作用、エイコサノィ ド産生抑制作用、サイ トカイン産生抑制作用、 肥満細胞増殖抑制作用、 肥満細胞活性化抑制作用などを有する化合物を スクリーニングすることができる。
(1) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを肥満細胞 に接触させ、 細胞から RNAを調製し、 サイ ト力イン （例、 TNF-ひ 、 IL-4、 IL - 5、 IL-6、 IL - 8、 IL- 13、 TGF- iSなど） RNA量を（例、 RT-PCR, Quantitative rea卜 time- PCRなどにより） 測定し、 比較することにより、 サイ ト力イン 産生抑制剤 （サイ ト力イン産生抑制作用を有する化合物など） をスクリ 一二ングする。
(2) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを肥満細胞 に接触させ、 培養上清中のサイ ト力イン （例、 TNF-ひ 、 IL-4、 Iい 5、 IL-6 、 IL-8、 IL- 13、 TGF- /3など） タンパク質量を （例、 EIA、 RIAなどにより ) 測定し、 比較することにより、 サイ ト力イン （例、 TNF-ひ 、 IL-4、 IL-5 、 IL-6, IL-8、 IL-13、 TGF- /Sなど） 産生抑制剤 （サイ ト力イン産生抑制 作用を有する化合物など） をスクリーニングする。
(3) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを肥満細胞 に接触させ、 サイ ト力イン （例、 TNF-ひ 、 IL-4、 IL-5, IL- 6、 Iい 8、 IL - 13 、 TGF- /3など） 産生細胞数を （例、 ELISP0T法により） 測定し、 比較する ことにより、 サイ ト力イン産生抑制剤 （サイ ト力イン産生抑制作用を有 する化合物など） をスクリーニングする。
(4) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明の受容体をコードする ポリヌクレオチドに対する siRNAを含む siRNAベクター （例、 siRNAベクタ 一、 アンチセンスオリゴヌクレオチド、 アンチセンスオリゴヌクレオチ ド発現べクタ一など） を多数作製し、 siRNAライブラリーを作製後、 肥満 細胞にトランスフエクシヨンし、 本発明のリガンドと接触させ、 細胞に おけるサイ トカイン （例、 TNF- a、 IL-4、 IL-5, IL- 6、 IL-8、 IL- 13、 TGF - /3など） の発現量 （例、 サイ トカイン RNA量、 サイ トカインタンパク質量 など） を測定し、 発現量の低下を誘導する siRNAの塩基配列を調べること により、 サイ ト力イン産生抑制剤 （サイ ト力イン産生抑制作用を有する 化合物など） をスクリーニングする。 リガンドと接触させる際、 例えば 肥満細胞を能動または受動感作した場合は、 抗 I gE 抗体、 抗体特異的抗 原などを、 その他の場合は、 NGF、 S t em Ce l l F ac t o r (SCF) , サイ トカイ ン、 レクチンなどを用いて共刺激してもよい。
( 5) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを、 放射標 識したァラキドン酸を取り込ませた肥満細胞に接触させ、 培養上清中の 放射活性を測定し、 比較することにより、 エイコサノイ ド産生抑制作用 (エイコサノィ ド産生抑制作用を有する化合物など） のある化合物をス クリーニングする。
( 6 a) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを肥満細 胞に接触させ、 培養上清中の顆粒含有物 （例、 ヒスタミン、 セロ トニン、 iS—へキソサミニダ一ゼ、 /3—グルクロニダーゼ、 トリプターゼ、 キマ ーゼ、カルボキシぺプチダーゼなど）量を測定し、比較することにより、 脱顆粒抑制作用 （脱顆粒抑制作用を有する化合物など） のある化合物を スクリ一二ングする。 顆粒含有物の量は、 公知の方法、 例えば E IA、 RI A, HPLC , 酵素活性測定等で定量できる。 あるいは、 肥満細胞を視覚化し （ 例、 ビデオ装置など） 、 脱顆粒した細胞を数えてもよい。
( 6b) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを、 放射 標識した顆粒含有物を取り込ませた肥満細胞に接触させ、 培養上清中の 放射活性を測定し、 比較することにより、 脱顆粒抑制剤 （脱顆粒抑制作 用を有する化合物など） をスクリーニングする。
( 6c) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを肥満細 胞に接触させ、 ァネキシン Vの肥満細胞への結合量を測定 （例、 FACSなど ) し、 比較することにより、 脱顆粒抑制剤 （脱顆粒抑制作用を有する化 合物など） をスクリーニングする。
( 7)試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを肥満細胞 に接触させ、 細胞溶解液をポリアクリルアミ ドゲルで分離し、 フィル夕 —に転写後、 MAPキナーゼ特異的な抗体および化学発光試薬を用いてィメ —ジアナライザ一等で検出し、 発光の強度を比較することにより、 肥満 細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤なども含む、 肥満細胞活性化 抑制作用を有する化合物） をスクリーニングする。
(8)試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを肥満細胞 (例、 24穴プレートに播種後培養された肥満細胞） に接触させ、 放射性 同位元素で標識されたチミジン （例、 [methyl-3H]-チミジンなど） を添 加後、 細胞を溶解し、 細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、 液 体シンチレ一ショ ンカウン夕一で計数することにより、 チミジン取り込 み活性を測定し、 比較することにより、 肥満細胞増殖抑制剤 （肥満細胞 増殖抑制作用を有する化合物など） をスクリーニングする。
(9)試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のリガンドを肥満細胞 (例、 24穴プレートに播種後培養された肥満細胞） に接触させ、 MTT ( 3- (4, 5 - dimethyl -2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazol iuni bromide ) を添加後、 細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを、 塩 酸にて酸性としたィソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、 570nm の吸収によって測定して比較することにより、 肥満細胞増殖抑制剤 （肥 満細胞増殖抑制作用を有する化合物） をスクリーニングする。
本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング用キッ トは、 本発明の受容体または本発明 の受容体を含有する細胞もしくは細胞の膜画分、 および本発明のリガン ドを含有する。
本発明のスクリーニング用キッ 卜の例としては、 次のものが挙げられ る。
1. スクリ一二ング用試薬
(i) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 0 5 %のゥシ 血清アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0. 4 5 mのフィル夕一で濾過滅菌し、 4 °Cで保存するか、 また は用時調製しても良い。
(ii) 本発明の受容体標品 · 本発明の受容体を発現させた CH〇細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 1 05個ノ穴で継代し、 3 7°C、 5 % C〇2、 9 5 % a 〗 rで 2日間培養し たもの。
(iii) 標識リガンド
〔3H〕 、 〔I25I〕 、 〔I4C〕 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 〔35S〕 などの放射性同 位元素で標識した本発明のリガンドを適当な溶媒または緩衝液に溶解し たものを、 4°Cまたは一 2 0でにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 Mに希釈する。
(iv) リガンド標準液
本発明のリガンドを 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む P B Sで 1 mMとなるように溶解し、 一 2 0°Cで保存する。
2. 測定法
(i) 1 2穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させ た細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 49 0 1の測定用 緩衝液を各穴に加える。
(ϋ) 1 0—3〜 1 0— 1ϋΜの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した 本発明のリガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的 結合量を知るためには試験化合物の代わりに 1 0-3Μの本発明のリガン ドを 5 1加えておく。
(iii) 反応液を除去し、 1 m 1 の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に 結合した標識された本発明のリガンドを 0. 2 N N a OH- l % S D S で溶解し、 4m 1 の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
(iv) 液体シンチレ一シヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放 射活性を測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。
PMB= [ (B - N S B ) Z (B。一 NS B) ] X 1 0 0
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
N S B ： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B0 ： 最大結合量 本発明のスクリ一二ング方法またはスクリーニング用キッ トを用いて 得られうる化合物またはその塩は、 本発明のリガンドと本発明の受容体 との結合を変化させる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進また は阻害する化合物であり、 具体的には、 （i ) 本発明の受容体を介して細 胞刺激活性を有する化合物またはその塩（本発明の受容体ァゴニス ト）、
( i i )該刺激活性を有しない化合物（本発明の受容体アン夕ゴニス卜）、
( i i i )本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物 、 ( i v) 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合 物などである。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽 出液、 血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、 これら化合物は新 規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、 前記した本発明の受容体の塩と同様のものが 用いられる。
上記本発明の受容体ァゴニス トであるか、 またはアン夕ゴニストであ るかの評価方法は、 例えば、 以下の i ) または i i ) に従えばよい。
i ) 前記 （i ) 〜 （i i i ) のスクリ一二ング方法で示されるバインディ ング • アツセィを行い、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変 化させる （特に、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記し た本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体ァゴニス ト (ァゴ二ス ト） であり、 該活性を有しない化合物またはその塩は本発明 の受容体アン夕ゴニスト （アン夕ゴニス ト） である。
i i ) (a)試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、 本発明 の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合 物またはその塩は本発明の受容体ァゴニストである。
(b)本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場 合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する 細胞に接触させた場合における、 本発明の受容体を介した細胞.刺激活性 を測定し、 比較する。 本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺 激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アン夕ゴニ ストである。
本発明の受容体アンタゴニス 卜は、 本発明の受容体または本発明のリ ガンドが有する生理活性 （例、 肥満細胞の脱顆粒促進作用、 エイコサノ ィ ド産生促進作用、サイ トカイン産生促進作用、肥満細胞増殖促進作用、 肥満細胞活性化作用など） を抑制することができるので、 低毒性で安全 な優れた肥満細胞の脱顆粒抑制剤、 エイコサノイ ド産生抑制剤、 サイ ト 力イン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤、 肥満細胞活性化抑制作用剤な どとして、 例えば、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下垂体膿瘍、 甲状腺炎、 腹膜炎、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマ卜一デスなど） 、 アレルギー （例、 アレルギー性結膜炎、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど） 、 喘息、 滲出性中耳 炎、 メニエール病、 接触皮膚炎、 アナフィラキシー、 蓴麻疹、 重症筋無 力症、 糸球体腎炎、 シエーダレン症候群、 バセドー病、 インスリン抵抗 性糖尿病、 アトピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿器疾患 （例、 腎 尿細管間質障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 アレルギー性膀胱炎など） 、 消化器疾患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物アレルギー、 ァレ ルギー性腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zo l l i nge r- E l l i son症候群など） 、 胃炎、 逆 流性食道炎、 NUD (Non U l ce r Dyspeps i a) 、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロ イ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手術後ストレスによる胃酸 過多および潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性 気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性線維症、 過敏性肺 炎、 突発性間質性肺炎、 肺線維症など〕 、 循環器疾患 （例、 動脈硬化症、 急性冠状動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓アナフィ ラキシー、 心 不全、 心筋梗塞、 狭心症、 不整脈、 深部静脈血栓症、 P T C A後再狭窄 など） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライアイなど） 、 癌 （ 例、 甲状腺乳頭癌 ¾ 非小細胞性肺癌、 子宮内膜癌、 子宮頸癌、 ·胃癌、 膝 臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 乳癌、 結腸 癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） 、 脳梗塞、 高脂血症、 急性 腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アトピー性脊髄炎、 神経線維 腫、 鼻粘膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖症などの予防 · 治療剤な どとして使用できる。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物は、 本発明の受容体アン夕ゴニス卜と同様に用いられる。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物は、 本発明の受容体ァゴニストと同様に用いられる。
また、 本発明は、 本発明の受容体をコードする本発明のポリヌクレオ チドを用いることを特徴とする本発明の受容体の遺伝子の発現を促進ま たは阻害する化合物またはその塩のスクリ一二ング方法なども提供する。 具体的には、 （i ) 本発明の受容体を産生する能力を有する細胞を培養 した場合と （i i ) 本発明の受容体を産生する能力を有する細胞と試験化 合物の混合物を培養した場合との比較を行い、 本発明の受容体の遺伝子 の発現を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする。 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 U ) と （i i ) の場合に おける、 本発明の受容体の遺伝子の発現量 （具体的には、 本発明の受容 体量または本発明の受容体をコードする m R N A量など） を測定して、 比較する。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ぺプ チド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動 物組織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であ つてもよいし、 公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明ポリペプチドまた は本発明の受容体を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適し たバッファ一に浮遊して調製する。 バッファーには、 p H約 4〜 1 0 ( 望ましくは、 p H約 6〜 8 ) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファーな どの、 本発明の受容体の活性を阻害しないバッファ一であれば'いずれで もよい。
本発明の受容体を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述 した本発明の受容体をコードする DN Aを含有するべクタ一で形質転換 された宿主 （形質転換体） などが用いられる。 宿主としては、 例えば、 CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングに は、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明の受容体を細 胞膜上に発現させた形質転換体などが好ましく用いられる。
本発明の受容体の蛋白質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明の 抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記ポリべプチドまたは受 容体を、 ウェスタン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる 方法に従い測定することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現量は、 公知の方法、 例えば、 ノーザン フロッテイ ンクや Reverse transcript ion- polymerase chain react ion (RT— P C R)、リアルタイム P C R解析システム（A B I社製、 TaciMan polymerase chain react ion) などの方法あるいはそれに準じる方法にし たがって測定することができる。
例えば、上記（ii)の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より 好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子 の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。 例えば、上記（ii)の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より 好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子 の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。 本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 本 発明の受容体アン夕ゴニス 卜と同様に用いられる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を促進 （発現量を増加） する化合物ま たはその塩は、 本発明の受容体ァゴニス 卜と同様に用いられる。
本発明のスクリ「ニング方法またはスクリーニング用キッ 卜.を用いて 得られる化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド 性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物であり、 本発明の受容体と本発 明のリガンドとの結合性を変化させる化合物、 本発明の受容体の活性ま たは機能を促進または阻害する化合物、 本発明の受容体の遺伝子の発現 を促進または阻害 （発現量を増加または減少） する化合物などである。 該化合物の塩としては、 前記した本発明の受容体の塩と同様のものが 用いられる。
本発明のスクリ一二ング方法またはスクリーニング用キッ トを用いて 得られる化合物またはその塩を上記の医薬 （予防 · 治療剤など） として 使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。
該化合物またはその塩は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該 化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 ベ ヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実 施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することがで きる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が 得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例え ば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結 合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアりン酸マグネシウムのような潤 滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。 調剤単位 形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂のよう な液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用 水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処 方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 ァ ルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロ ピレングリコール、 ポリエチレングリコールなど） 、 非イオン性界面活 性剤 （例えば、 ポリソルベー卜 8 0TM、 HC〇一 5 0など） などと併用 してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用し てもよい。 また、 該化合物またはその塩を、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩 緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザ ルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブ ミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアル コール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製さ れた注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ 卜または温血動物 （例えば、 マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投 与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー卜などにより差異はある。
例えば、 間質性膀胱炎患者 （体重 6 0 k g当たり） に、 一日につきァ ン夕ゴニス トを約 0. 1〜： L 0 0mg、 好ましくは約 1. 0〜 5 0 mg、 より好ましくは約 1. 0〜 2 0 mg経口投与する。 非経口的に投与する 場合、 例えば、 アン夕ゴニストを注射剤の形で間質性膀胱炎患者 （ 6 0 k g当たり） に投与する場合、 一日につきアン夕ゴニス卜を約 0. 0 1 〜 3 0 mg、 好ましくは約 0. ：!〜 2 0mg、 より好ましくは約 0. 1 〜 1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場 合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
〔 2〕 本発明の受容体の定量
本発明の受容体に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合が ある） は、 本発明の受容体を特異的に認識することができるので、 被検 液中の本発明の受容体の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量 などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明の受容体とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明の受容体の割合 を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法、 およ び
( i i ) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本 発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体 上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容 体の定量法を提供する。
上記 （i i ) の定量法においては、 一方の抗体が本発明の受容体の N端 部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明の受容体の C端部に反応する 抗体であることが望ましい。
また、 本発明の受容体に対するモノクローナル抗体を用いて本発明の 受容体の定量を行うことができるほか、 組織染色等による検出を行なう こともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F b ' ) 2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いても よい。
本発明の抗体を用いる本発明の受容体の定量法は、 特に制限されるべ きものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 ポリペプチド量） に対 応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的 手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した 標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメ トリー、 競合法、 ィムノメ トリック法およびサンドィ ツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドィ ツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては， 例えば、 放射 性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位 元素としては、 例えば、 〔125I〕 、 〔131 I〕 、 〔3H〕 、 〔14C〕 などが用い られる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例 えば、 ；6—ガラク トシダーゼ、 j8—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスフ ァ夕ーゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチ オシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノー ル、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を 用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 ま た通常ポリぺプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられ る化学結合を用いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキス トラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリル アミ ド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に 被検液を反応させ （ 1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノク ローナル抗体を反応させ （ 2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することにより被検液中の受容体量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよ いし時間をずらして行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前 記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測 定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず しも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類 以上の抗体の混合物を用いてもよい。 本発明のサンドィツチ法による本発明の受容体の測定法においては、
1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発 明の受容体の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すな わち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応 で用いられる抗体が、 本発明の受容体の C端部を認識する場合、 1次反 応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識す る抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメ トリック法あるいはネフロメ トリ一などに用 いることができる。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反 応させたのち、 未反応の標識抗原 （F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （ B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被 検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用 レ B Z F分離をポリエチレングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体 などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として固相化抗体を 用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメ トリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の 標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるい は、 被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗 原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分 離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量 する。
また、 ネフロメ トリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の 結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かで あり、 少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用する レーザーネフロメ トリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたつ ては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法に おける通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明 の受容体の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細 については、 総説、 成書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年 発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年 発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行 ) 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7 年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭 和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunocheniical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D ： Selected Immunoassays) ) , 同 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E ： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me thods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical TechniQues (Part I ： Hybr idoma Technology and Monoclonal
Antibodies)) (以上、 ァカデミックプレス社発行）などを参照することが できる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の受 容体を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の受容体の濃度を定量するこ とによって、 本発明の受容体の濃度の増加が検出された場合、 例えば、 肥満細胞の脱顆粒促進作用、 エイコサノイ ド産生促進作用、 サイ トカイ ン産生促進作用、 肥満細胞増殖促進作用、 肥満細胞活性化作用などが亢 進し、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下垂体膿瘍、 甲状腺炎、 腹膜炎、 ク ローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性関節リウマチ、 全身性エリ テマトーデスなど） 、 アレルギー （例、 アレルギー性結膜炎、 アレルギ 一性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど） 、 喘息、 滲出性中耳炎、 メニ エール病、 接触皮膚炎、 アナフィラキシー、 奪麻疹、 重症筋無 '力症、 糸 球体腎炎、 シエーグレン症候群、バセドー病、ィンスリン抵抗性糖尿病、 アトピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿器疾患 （例、 腎尿細管間質 障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 アレルギー性膀胱炎など） 、 消化器疾 患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物アレルギー、 アレルギー性 腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸 潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zo l l inge r- E l l i son症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道 炎、 NUD (Non Ul ce r Dyspeps i a) 、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイ ド系抗 炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手術後ストレスによる胃酸過多およ び潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性線維症、 過敏性肺炎、 突発性 間質性肺炎、 肺線維症など〕 、 循環器疾患 （例、 動脈硬化症'、 急性冠状 動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓アナフィラキシー、 心不全、 心 筋梗塞、 狭心症， 不整脈、 深部静脈血栓症、 P T C A後再狭窄など） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライアイなど） 、 癌 （例、 甲状 腺乳頭癌、 非小細胞性肺癌、 子宮内膜癌、 子宮頸癌、 胃癌、 膝臓癌、 肺 癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 乳癌、 結腸癌、 直腸 癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） 、 脳梗塞、 高脂血症、 急性腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アトピー性脊髄炎、 神経線維腫、 鼻粘 膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖症などに将来罹患する可能性が高 いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明 の受容体を検出するために使用することができる。 また、 本発明の受容 体を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本 発明の受容体の検出、 被検細胞内における本発明の受容体の挙動の分析 などのために使用することができる。
〔3〕 遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド （D N A ) は、 例えば、 プローブとして使 用することにより、' ヒ トゃ温血動物 （例えば、 ラッ 卜、 マウス'、 モルモ ッ ト、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明の受容体をコードする DNAまたは mR NAの異 常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまた は mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mR N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。 本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザ ンハイブリダイゼーションゃ P C R— S S C P法 （Genomics,第 5巻， 874 〜879頁， 1989年、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,第 86巻， 2766〜2770頁, 1989年） などによ り実施することができる。
例えば、 本発明の受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例 えば、 肥満細胞の脱顆粒抑制作用、 エイコサノイ ド産生抑制作用、 サイ トカイン産生抑制作用、 肥満細胞増殖抑制作用、 肥満細胞活性化抑制作 用が亢進し、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下垂体膿瘍、 甲状腺炎、 腹膜 炎、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性関節リウマチ、 全身 性エリテマ卜一デスなど） 、 アレルギー （例、 アレルギー性結膜炎、 ァ レルギ一性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど） 、 喘息、 滲出性中耳炎、 メニエール病、 接触皮膚炎、 アナフィラキシ一、蓴麻疹、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 シエーダレン症候群、 バセドー病、 インスリン抵抗性糖尿 病、 アトピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿器疾患 （例、 腎尿細管 間質障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 アレルギー性膀胱炎など） 、 消化 器疾患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物アレルギー、 アレルギ 一性腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二 指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger-Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆流性 食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイ ド 系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手術後ストレスによる胃酸過多 および潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性気管 支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性線維症、 過敏性肺炎、 突発性間質性肺炎、 · 肺線維症など〕 、 循環器疾患 （例、 動脈硬化症、 急 性冠状動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓アナフィラキシー、 心不 全、 心筋梗塞、 狭心症、 不整脈、 深部静脈血栓症、 P TCA後再狭窄な ど） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライアイなど） 、 癌 （例、 甲状腺乳頭癌、 非小細胞性肺癌、 子宮内膜癌、 子宮頸癌、 胃癌、 陴臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 乳癌、 結腸癌、 直 腸癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） 、 脳梗塞、 高脂血症、 急性腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アトピー性脊髄炎、 神経線維腫、 鼻粘 膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖症などに将来罹患する可能性が高 いと診断することができる。
〔4〕 アンチセンスポリヌクレオチド （例、 DNA) を含有する医薬 本発明のポリヌクレオチド （例、 DNA) に相補的に結合し、 該ポリ ヌクレオチド （例、 DNA) の発現を抑制することができるアンチセン スポリヌクレオチド （例、 アンチセンス DNA) は、 例えば、 肥満細胞 の脱顆粒抑制剤、エイコサノィ ド産生抑制剤、サイ トカイン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤、 肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤な ども含む） などとして、 例えば、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下垂体膿 瘍、 甲状腺炎、 腹膜炎、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性 関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 アレルギー （例、 ァレ ルギー性結膜炎、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど） 、 喘息、 滲出性中耳炎、 メニエール病、 接触皮膚炎、 アナフィラキシー、 蓴麻疹、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 シエーダレン症候群、 バセドー病、 インスリン抵抗性糖尿病、 アトピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿 器疾患 （例、 腎尿細管間質障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 アレルギー 性膀胱炎など） 、 消化器疾患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物 アレルギー、 アレルギー性腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化性潰 瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群 など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 胃 MALTリ ンパ腫、 非ステロイ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性 肺疾患 （例、 慢性気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性 線維症、 過敏性肺炎、 突発性間質性肺炎、 肺線維症など〕 、 循環器疾患 (例、 動脈硬化症、 急性冠状動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓ァ ナフィラキシ一、心不全、 心筋梗塞、 狭心症、 不整脈、 深部静脈血栓症、 P TCA後再狭窄など） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライ アイなど） 、 癌 （例、 甲状腺乳頭癌、 非小細胞性肺癌、 子宮内膜癌、 子 宮頸癌、 胃癌、 膝臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 膀 胱癌、 乳癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） 、 脳梗塞、 高脂血症、 急性腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アトピー性脊 髄炎、 神経線維腫、 鼻粘膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖症などの 予防 · 治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
例えば、 上記アンチセンス DNAを用いる場合、 該アンチセンス DN Aを単独あるいはレトロウィルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツ ドウィルスベクターなどの適当なベクタ 一に挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 該アンチセ ンス DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生 理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ドロゲル力 テーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 組織や細胞における本発明の DN Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ ーブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明の受容体をコー ドする RN Aの一部を含有する二重鎖 RN A 〔本発明の受容体に対する s i RNA(small (short) interfering RNA) , s h RNA(small (short) hairpin RNA) 、 本発明の受容体をコードする R N Aの一部を含有するリ ボザィムなども、 本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制することがで き、 生体内における本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチドの 機能を抑制するこ，とができるので、 例えば、 肥満細胞の脱顆粒 ·抑制剤、 エイコサノイ ド産生抑制剤、 サイ ト力イン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑 制剤、 肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤なども含む） など として、 例えば、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下垂体膿瘍、 甲状腺炎、 腹膜炎、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 アレルギー （例、 アレルギー性結膜炎、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど） 、 喘息、 渗出性中耳 炎、 メニエール病、 接触皮膚炎、 アナフィラキシー、 蓴麻疹、 重症筋無 力症、 糸球体腎炎、 シエーダレン症候群、 バセドー病、 インスリン抵抗 性糖尿病、 アトピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿器疾患 （例、 腎 尿細管間質障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 ァレルギ一性膀胱炎など） 、 消化器疾患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物アレルギー、 ァレ ルギー性腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群など） 、 胃炎、 逆 流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロ イ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手術後ス トレスによる胃酸 過多および潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性 気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性線維症、 過敏性肺 炎、 突発性間質性肺炎、 肺線維症など〕 、 循環器疾患 （例、 動脈硬化症、 急性冠状動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓アナフィ ラキシー、 心 不全、 心筋梗塞、 狭心症、 不整脈、 深部静脈血栓症、 P T CA後再狭窄 など） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライアイなど） 、 癌 （ 例、 甲状腺乳頭癌、 非小細胞性肺癌、 子宮内膜癌、 子宮頸癌、 胃癌、 膝 臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 乳癌、 結腸 癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） 、 脳梗塞、 高脂血症、 急性 腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アトピー性脊髄炎、 神経線維 腫、 鼻粘膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖症などの予防， 治療剤な どの低毒性で安全な医薬として有用である。
二重鎖 RNAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製.造するこ とができる。
リボザィムは， 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7 巻， 221頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に 設計して製造することができる。 例えば、 本発明の受容体をコードする RN Aの一部に公知のリポザィムを連結することによって製造すること ができる。本発明の本発明の受容体をコードする R N Aの一部としては、 公知のリポザィムによって切断され得る本発明の R N A上の切断部位に 近接した部分 （RNA断片） が挙げられる。
上記の二重鎖 RN Aまたはリボザィムを上記予防 · 治療剤として使用 する場合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与 することができる。
〔5〕 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の受容体の抗体 （例、 本発明の受容体を中和する作用を有する 抗体、 シグナル伝達を不活性化する抗体など） は、 例えば、 肥満細胞の 脱顆粒抑制剤、 エイコサノイ ド産生抑制剤、 サイ ト力イン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤、 肥満細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤な ども含む） などとして、 例えば、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下垂体膿 瘍、 甲状腺炎、 腹膜炎、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性 関節リウマチ、 全身性エリテマト一デスなど） 、 アレルギー （例、 ァレ ルギー性結膜炎、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど） 、 喘息、 滲出性中耳炎、 メニエール病、 接触皮膚炎、 アナフィラキシー、 蓴麻疹、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 シエーダレン症候群、 バセドー病、 インスリン抵抗性糖尿病、 アトピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿 器疾患 （例、 腎尿細管間質障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 アレルギー 性膀胱炎など） 、 消化器疾患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物 アレルギー、 アレルギー性腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化性潰 瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger- Ellison症候群 など） 、 胃炎、 逆'流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 '胃 MALTリ ンパ腫、 非ステロイ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性 肺疾患 （例、 慢性気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性 線維症、 過敏性肺炎、 突発性間質性肺炎、 肺線維症など〕 、 循環器疾患 (例、 動脈硬化症、 急性冠状動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓ァ ナフィラキシ一、 心不全、 心筋梗塞、 狭心症、 不整脈、 深部静脈血栓症、 P T C A後再狭窄など） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライ アイなど） 、 癌 （例、 甲状腺乳頭癌、 非小細胞性肺癌、 子宮内膜癌、 子 宮頸癌、 胃癌、 臈臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 膀 胱癌、 乳癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） 、 脳梗塞、 高脂血症、 急性腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アトピー性脊 髄炎、 神経線維腫、 鼻粘膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖症などの 予防 · 治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
本発明の抗体を含有する上記医薬は、 そのまま液剤として、 または適 当な剤型の医薬組成物として、 ヒトゃ温血動物 （例、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非 経口的に投与することができる。投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の間質性膀胱炎患者 の治療'予防のために使用する場合には、本発明の抗体を 1回量として、 通常 0 . 0 1 〜 2 0 m g / k g体重程度、 好ましくは 0 . ：!〜 1 O m g Z k g体重程度、 さらに好ましくは 0 . l 〜 5 m g Z k g体重程度を、 1 日 1〜 5回程度、 好ましくは 1 日 1〜 3回程度、 静脈注射により投与する のが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ず る量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応 じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与するこ とができる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と 薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであ る。 かかる組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供さ れる。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液 体の剤形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフ トカプセル剤を含む） 、 シロッ プ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられる。 かかる組成物は公知の方法によ つて製造され、 製剤分野において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは 賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用 いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従つ て、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水 性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補 助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコ ール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O - 5 0 ( po l yoxye t hyl ene (50mo l ) adduc t o f hyd rogena t ed cas t o r o i l ) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ 油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベン ジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適 当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体ま たはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。 上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合 するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投 薬単位の剤形としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜 2 5 0 m gの上記抗体が含有されていることが好ましい。 - なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互 作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
〔6〕 DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明の受容体をコードする DN A (以下、 本発 明の外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性 変異 DN Aと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。 すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒ ト哺乳 動物、
(2) 非ヒ ト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （ 1 ) 記載の動物、
( 3) ゲッ歯動物がマウスまたはラッ トである上記 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物 において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒ卜哺乳動物 (以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非 ヒ卜哺乳動物の発生における胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞 または受精卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシ ゥム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジ ェクシヨン法、 パーティクルガン法、 D E AE—デキストラン法などに より目的とする DNAを転移することによって作出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DN Aを転移し、 細胞培養、 組織培養などに 利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細 胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出す ることもできる。
非ヒ ト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサ ギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 マウス、 ラッ トなどが用い られる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生 物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマ ウス （例えば、 純系として、 C 5 7 B LZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F,系統， BD F,系統， B 6 D 2 F,系統， BA L B/ c系統， I C R系統など） またはラッ ト （例えば、 W i s t a r , S Dなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 と しては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒ 卜などがあげられる。
本発明の外来性 DN Aとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明 の DNAではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の D N Aをいう。
本発明の変異 D N Aとしては、 元の本発明の D N Aの塩基配列に変異 (例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠 損、 他の塩基への置換などが生じた DN Aなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DNAとしては、 異常な本発明の受容体を発現させる DN Aを 意味し、 例えば、 正常な本発明の受容体の機能を抑制するポリペプチド を発現させる D N Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどち らの哺乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に 転移させるにあたっては、 該 DN Aを動物細胞で発現させうるプロモー 夕一の下流に結合した DN Aコンストラク トとして用いるのが一般に有 利である。 例えば、 本発明のヒ ト DN Aを転移させる場合、 これと相同 性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動物（例えば、 ゥサギ、ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DNAを 発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒ ト DN Aを結合し た DNAコンス トラク ト （例、ベクタ一など） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることに'よって本 発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。 本発明の受容体の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミ ド、 酵母由来のプラスミ ド、 λファージなどのバ クテリオファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ヮ クシニアウィルスまたはバキュ口ゥィルスなどの動物ゥィルスなどが用 いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミ ドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモー夕一としては、 例えば、 （i ) ウィルス （例、 シミアンウィルス、 サイ トメガロウィルス、 モロニ一 白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモー夕一、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来のプ 口モー夕一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナー ゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダル夕チオン S—トランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子 ι6、 ケラチン K l， K 1 0および Κ 1 4、 コラーゲ ン I型および I I型、 サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ ]S Iサブ ユニッ ト、 ジス 卜口フィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプ夕一チロシンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3 リン酸化酵素 (N a , K - AT P a s e ) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタロチォ ネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビ夕一、 M HCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン ;6— 水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ一ゼ （TP O) 、 ポリペプチド鎖延長 因子 1 ひ (E F - 1 a) 、 jSァクチン、 αおよび /6ミオシン重鎖、 ミオ シン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロブリン、 T h y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VN P) 、 血清アミロイ ド Pコンポ —ネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口 エンケフアリン Α·、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイ 卜メガロウィルスプロモ
—ター、 ヒ トポリペプチド鎖延長因子 1 a ( E F - 1 a ) のプロモー夕 一、 ヒ トおよびニヮトリ /8ァクチンプロモーターなどが好適である。 上記べクタ一は、 D N A転移哺乳動物において目的とするメッセンジ ャ一R N Aの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を 有していることが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物 由来の各 D N Aの配列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウイ ルスの S V 4 0夕一ミネタ一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 D N Aをさらに高発現させる目的で各 D N Aのスプライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 D N Aのイント ロンの一部などをプロモーター領域の 5 ' 上流、 プロモーター領域と翻 訳領域間あるいは翻訳領域の 3 '下流 に連結することも目的により可能 である。
正常な本発明の受容体の翻訳領域は、 ヒ トまたは各種哺乳動物 （例え ば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスな ど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D N Aおよび市販 の各種ゲノム D N Aライブラリーよりゲノム D N Aの全てあるいは一部 として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 R N Aより公 知の方法により調製された相補 D N Aを原料として取得することが出来 る。 また、 外来性の異常 D N Aは、 上記の細胞または組織より得られた 正常なポリべプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳 領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D N Aコンス トラク トとし て、 前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に 連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動 物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在 することは、 作出動物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のす ベてに本発明の外来性 DN Aを保持することを意味する。 本発明の外来 性 DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞 のすべてに本発明の外来性 DN Aを有する。
本発明の外来性正常 DN Aを転移させた非ヒ ト哺乳動物は、 交配によ り外来性 DNAを安定に保持することを確認して、 該 DNA保有動物と して通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動 物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過 剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の外来性 DN Aを過剰に有することを意味する。 本発明 の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および 体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過剰に有する。
導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 DN Aを過剰に 有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常 DN Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 DN A が高発現させられており、 内在性の正常 DN Aの機能を促進することに より最終的に本発明の受容体の機能亢進症を発症することがあり、 その 病態モデル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能亢進症や、 本発明の受容 体が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検 討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、 遊離した 本発明の受容体の増加症状を有することから、 例えば、 肥満細胞の脱顆 粒促進動物、エイコサノィ ド産生促進動物、サイ トカイン産生促進動物、 肥満細胞増殖促進動物、 肥満細胞活性化動物 〔例、 MAPK活性化 （促進） 動物なども含む〕 などとして、 例えば、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下 垂体膿瘍、 甲状腺炎、 腹膜炎、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 アレルギー （例、 アレルギー性結膜炎、 アレルギー性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど ) 、 喘息、 滲出性中耳炎、 メニエール病、 接触皮膚炎、 ァナフイラキシ 一、 蓴麻疹、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 シエーグレン症候群、 バセド —病、 ィンスリン抵抗性糖尿病、 ァ卜ピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿器疾患 （例、 腎尿細管間質障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 アレル ギー性膀胱炎など） 、 消化器疾患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物アレルギー、 アレルギー性腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化 性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zollinger-Ellison 症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspepsia) 、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイ ド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手 術後ス トレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性 閉塞性肺疾患 （例、 慢性気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性線維症、 過敏性肺炎、 突発性間質性肺炎、 肺線維症など〕 、 循環 器疾患 （例、 動脈硬化症、 急性冠状動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓アナフィラキシー、 心不全、 心筋梗塞、 狭心症、 不整脈、 深部静脈 血栓症、 P T CA後再狭窄など） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライアイなど） 、 癌 （例、 甲状腺乳頭癌、 非小細胞性肺癌、 子宮内膜 癌、 子宮頸癌、 胃癌、 膝臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺 癌、 膀胱癌、 乳癌、 結腸癌、 直腸癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） ， 脳梗塞、 高脂血症、 急性腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アト ピー性脊髄炎、 神経線維腫、 鼻粘膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖 症などの予防 ，治療剤のスクリ一二ング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配に より外来性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物と して通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする 外来 D N Aを前述のプラスミ ドに組み込んで原科として用いることがで きる。 プロモーターとの DNAコンス トラク トは、 通常の DNA工学的 手法によって作製することができる。 受精卵細胞段階における本発明の 異常 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存 在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞において 本発明の異常 DN Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DN Aを有することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細 胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 DN Aを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を 交配することによりすべての子孫が該 DN Aを有するように繁殖継代す ることができる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 DNA が高発現させられており、 内在性の正常 DNAの機能を阻害することに より最終的に本発明の受容体の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異 常 DN A転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不活性型不応症の病 態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能であ る。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DN A高発現動物 は、 本発明の受容体の機能不活性型不応症における本発明の異常ポリぺ プチドまたは本発明の異常受容体による正常ポリべプチドまたは受容体 の機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルとなる。
また、 本発明の外来異常 DN Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本 発明の受容体の増加症状を有することから、 本発明の受容体の機能不活 性型不応症に対する治療薬スクリ一二ング試験にも利用可能である。 また、 上記 2種類の本発明の DN A転移動物のその他の利用可能性と して、 例えば、
(i) 組織培養のための細胞源としての使用、
(ii) 本発明の DNA転移動物の組織中の DNAもしくは RNAを直接 分析するか、 または DN Aにより発現されたポリべプチドまたは受容体 組織を分析することによる、 本発明の受容体により特異的に発現あるい は活性化するポリべプチドまたは受容体との関連性についての解析、
(iii) DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 こ れらを使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （iii) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるよ うな薬剤のスクリーニング、 および
(V)本発明の変異ポリぺプチドまたは受容体を単離精製およびその抗体 作製
などが考えられる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不 活性型不応症などを含む、 本発明の受容体に関連する疾患の臨床症状を 調べることができ、 また、 本発明の受容体に関連する疾患モデルの各臓 器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することが できる。
また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリ プシンなどの蛋白質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さら に、 本発明の受容体産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増 殖との関連性、 またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それら の異常を調べることなどができ、 本発明の受容体およびその作用解明の ための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不 活性型不応症を含む、 本発明の受容体に関連する疾患の治療薬の開発を 行なうために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な 該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物または本発明の外来性 DN A発現べクタ一を用 いて、 本発明の受容体が関連する疾患の DNA治療法を検討、 開発する ことが可能である。
本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場 ·合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature【こよる略号あるレ は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
デォキシリボ核酸
相補的デォキシリボ核酸
f丁—
チミン
グァニン
シ卜シン
イノシン
リボ核酸
メッセンジャーリボ核酸
デォキシアデノシン三リン酸
デォキシチミジン三リン酸
デォキシグアノシン三リン酸
デォキシシチジン三リン酸
アデノシン三リン酸
エチレンジアミン四酢酸
ドデシル硫酸ナトリウム
ベンズヒ ドリルァミン
P—メチルペンズヒドリルアミン
P - トルエンスルフォニル
ベンジル
ベンジルォキシメチル
t 一ブチルォキシカルボニル
ジクロロメタン
1ーヒドロキシベンズトリアゾール
N, N'—ジシク口へキシルカルボジィミ'ド τ F A トリフルォロ酢酸
D I E A ジィソプロピルェチルァ ノ
G 1 y又は G グリシン
A 1 a又は A ァラニン
V a 1又は V バリン
L e u又は L ロイシン
I 1 e又は I イソロイシン
s e r又は S セリン
T h r又は T スレオニン
c y s又は c システィン
M e t又は M メチォニン
G 1 u又は E ダルタミン酸
A s P又は D
L y s又は K リジン
A r g又は R アルギニン
H i s又は H
P h e又は F フエ二ルァラニン
T y r又は Y チロシン
T r P又は W 卜リブトフアン
P r o又は P プロリン
A s n又は N
G 1 n又は Q ダル夕ミン
P G 1 u ピログルタミン酸
T y r ( I ) 3—ョ一ドチロシン
D M F N , N—ジメチルホルムアミ ド
F m o c N - 9—フルォレニルメ トキシカルボニル
T r t トリチル
P b f 2， 2， 4， 6 , 7 —ペン夕メチルジヒ ドロベン ゾ フラン一 5—スルホニル
C 1 t 2—クロロ トリチル
B u 1 t 一ブチル
M e t (O) メチォニンスルフォキシド
D N P ジニトロフエノール 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号 ： 1〕
ヒ ト TGR12のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号 ： 2〕
配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号 ： 3〕
実施例における PCR反応で使用した TGR12用プライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号 ： 4〕
実施例における PCR反応で使用した TGR12用プローブの塩基配列を示す。 〔5'末端にリポーター色素として FAM (6-carboxy-fluorescein) を、 3' 末端にはクェンチヤ一として TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine ) を標識した〕
〔配列番号 ： 5〕
実施例における PCR反応で使用した NK1受容体用標準 DNA (合成オリゴ DNA) の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6〕
実施例における PCR反応で使用した NK1受容体用プライマ一の塩基配列 を示す。
〔配列番号 ： 7〕
実施例における PCR反応で使用した NK1受容体用プライマ一の塩基配列 を示す。
〔配列番号 ： 8 実施例における PCR反応で使用した NKl受容体用プローブの塩基配列を 示す。 〔5'末端にリポーター色素として FAM (6-carboxy-f luorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA (
6-carboxy-te t ramethyl-rhodainine) を 識した〕
〔配列番号 ： 9〕
実施例における PCR反応で使用した NK2受容体用標準 DNA (合成オリゴ DNA)の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 1 0〕
実施例における PCR反応で使用した NK2受容体用プライマーの塩基配列 を示す。
〔配列番号 ： 1 1〕
実施例における PCR反応で使用した NK2受容体用プライマーの塩基配列 を示す。
〔配列番号 ： 1 2〕
実施例における PCR反応で使用した NK2受容体用プローブの塩基配列を 示す。 〔5'末端にリポーター色素として FAM (6-carboxy-f luorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA (
6-carboxy-telramethyl-rhodamine) を標識した〕
〔配列番号 ： 1 3〕
実施例における PCR反応で使用した NK3受容体用標準 DNA (合成オリゴ DNA)の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 1 4〕
実施例における PCR反応で使用した NK3受容体用プライマーの塩基配列 を示す。
〔配列番号 ： 1 5〕
実施例における PCR反応で使用した NK3受容体用プライマ一の塩基配列 を示す。
〔配列番号 ： 1 6〕
実施例における PCR反応で使用した NK3受容体用プローブの塩基配列を 示す。 〔5'末端にリポーター色素として FAM (6- carboxy- fluorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA (
6-carboxy-tetramethyl-rhodaniine) を標識した〕
〔配列番号 ： 1 7〕
実施例における PCR反応で使用した TGR12用標準 DNA (二本鎖 cDNA) の塩 基配列を示す。
〔配列番号 ： 1 8〕
実施例における PCR反応で使用した TGR12用プライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号 ： 1 9〕
実施例における PCR反応で使用した VIP1受容体用標準 DNA (合成ォリゴ DNA) の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 2 0〕
実施例における PCR反応で使用した VIP1受容体用プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号 ： 2 1〕
実施例における PCR反応で使用した VIP1受容体用プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号 ： 2 2〕
実施例における PCR反応で使用した VIP1受容体用プローブの塩基配列 を示す。 〔5'末端にリボー夕一色素として FAM (6-carboxy- fluorescein ) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA (
6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) を標識した〕
〔配列番号 ： 2 3〕
実施例における PCR反応で使用した VIP2受容体用標準 DNA (合成オリゴ DNA) の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 24〕
実施例における PCR反応で使用した VIP2受容体用プライマ一の塩基配 列を示す。 〔配列番号 ： 2 5〕
実施例における PCR反応で使用した VIP2受容体用プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号 ： 26〕
実施例における PCR反応で使用した VIP2受容体用プローブの塩基配列 を示す。 〔5'末端にリポーター色素として FAM (6-carboxy-fluorescein ) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA (
6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) を標識した〕
〔配列番号 ： 27〕
実施例における PCR反応で使用した PACAP受容体用標準 DNA (合成オリゴ DNA) の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 28〕
実施例における PCR反応で使用した PACAP受容体用プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号 ： 29〕
実施例における PCR反応で使用した PACAP受容体用プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号 ： 30〕
実施例における PCR反応で使用した PACAP受容体用プローブの塩基配列 を示す。 〔5'末端にリボー夕一色素として FAM (6-carboxy-nuorescein ) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA (
6-carboxy-tet ramethyl-rhodamine) を標識した〕
〔配列番号 ： 3 1〕
ヒ ト TGR12と GFPの融合夕ンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配 列を示す。
〔配列番号 ： 32〕
pAKKO-lllHベクターに組み込んだヒ ト TGR12の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 33〕
実施例における P CR反応で使用したヒ ト TNF-α用プライマーの塩'基配列 を示す。
〔配列番号 ： 34〕
実施例における PCR反応で使用したヒ ト TNF- α用プライマーの塩基配列 を示す。
〔配列番号 ： 3 5〕
実施例における PCR反応で使用したヒ ト TNF- α用プローブの塩基配列を 示す。 〔5'末端にリポーター色素として FAM (6-carboxy-f luorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA
(6-carboxy-te t rame thyl-rhodamine) を核識した〕
〔配列番号 ： 3 6〕
実施例における PCR反応で使用したヒ ト TNF- α用標準 DNA (合成オリゴ DNA)の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 3 7〕
実施例における PCR反応で使用したヒ 卜 CCL- 5用プライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号 ： 3 8〕
実施例における PCK反応で使用したヒ ト CCL-5用プライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号 ： 3 9〕
実施例における PCR反応で使用したヒ 卜 CCL-5用プローブの塩基配列を示 す。 〔5'末端にリポーター色素として FAM (6-carboxy-fluorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA
(6-carboxy-te t rame thyl-rhodamine) を標識した〕
〔配列番号 ： 40〕
実施例における PCR反応で使用したヒ ト CCL-5用標準 DNA (合成オリゴ DNA) の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 4 1〕
実施例における PCR反応で使用したヒ ト CCL-2用プライマーの塩基配列を 示す。 〔配列番号 ： 42〕
実施例における PCR反応で使用したヒ ト CCL- 2用プライマーの塩基配列を 示す。
〔配列番号 ： 43〕
実施例における PCR反応で使用したヒ ト CCL-2用プローブの塩基配列を示 す。 〔5'末端にリポーター色素として FAM (6-carboxy-nuorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ一として TAMRA
(6-carboxy-tet ramethyl-rhodamine) を標識した〕
〔配列番号 ： 44〕
実施例における PCR反応で使用したヒ ト CCL- 2用標準 DNA (合成オリゴ DNA) の塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 4 5〕
ヒ ト TGR12と GFPの融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列 を示す。 以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本 発明の範囲を限定するものではない。 実施例
実施例 1
生理活性べプチドによる TGR12依存的な細胞内カルシウム上昇作用 CHO/dMr-細胞 （以下、 CH0) は、 10%ゥシ胎児血清を含む a -MEM培地 (インビトロジェン社） を用いて培養した。 CH0に、 TGR12をコードする 塩基配列の終始コ ドンを除いた後に、 GFP (和光純薬） をコードする塩基 配列を繋いだ塩基配列 〔以下、 TGR12-GFP (配列番号： 3 1に表される塩 基配列を有する DNA) と略する〕 を組み込んだ動物細胞発現用ベクタープ ラスミ HpAKKO-lllH (Biochini. Biophys. Acta, 1219巻、 25卜 259頁、 1994 年記載の pAKKOl.11Hと同一のベクタ一プラスミ ド） を安定的に発現させ ることにより、 TGR12-GFP発現 CH0細胞株 （以下、 CH0-TGR12) を樹立した 。 CHO- TGR12は、 10 %ゥシ胎児透析血清を含む核酸不含 a - MEM培地 （イン ビトロジェン社） を用いて培養した。
CHO- TGR12を 30， OOOce 1 1 s/we l 1の密度となるよう 96穴プレートに播い て一晩培養後、 培地を捨て 4 ^ Mの F l uo3-AM (同仁化学） を含むアツセィ バッファー〔Hank' s Ba l anced Sal t So l ut ion (インビトロジェン社）， 20mM HEPES (同仁化学）、 . 5mM Probenec id (シグマ社） 〕 を 1ゥエルあたり 100 添加し、 1時間、 37 で静置した。 0. 05%の CHAPSを含むアツセィバッ ファーで、 下記に示す生理活性ペプチド （ペプチド研究所） またはカル シゥムィオノフォア A23187 (和光純薬）を希釈した。 アツセィバッファー で細胞を洗浄後、 FLIPR (モレキュラーデバイス社） を用いて、 細胞内力 ルシゥム変動に伴う蛍光の測定を行った。 サンプルは、 アツセィ開始 10 秒後に 50 Lを 50 17秒の速度で添加した。 蛍光の測定は、 最初の 60秒間 は 1秒毎、 次の 120秒間は 6秒間毎に行い、 3分間の間で最も高い蛍光強度 をその刺激条件における最大活性とし、 3ゥエルの平均で求めた。 EC50値 の算出は Graphpad PRI SM 4 (Graphpad Sof tware社） を用いて行った。 その結果、 アツセィバッファ一添加におけるカルシウム上昇作用の最 大活性は 363、 1 Mの A23187による刺激におけるカルシウム上昇作用の最 大活性は 27379であった。
サブスタンス P刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、 0. 3nMに おいては 194、 3nMにおいては 50、 30nMにおいては 206、 300nMにおいては 15610、 3000nMにおいては 23842であった。
コルチス夕チン- 17刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、 0. 3nMにおいては 67、 3nMにおいては 54、 30nMにおいては 94、 300nMにおい ては 17914、 3000nMにおいては 23647であつた。
PAMP-12刺激によるによるカルシウム上昇作用の最大活性は、 0. 3nMに おいては 255、 3nMにおいては 1617、 30nMにおいては 22291、 300nMにおい ては 24088、 3000nMにおいては 23743であった。
PACAP-27刺激によるによるカルシウム上昇作用の最大活性は、 0. 3nM においては 48、 3ηΜ'においては 58、 30ηΜにおいては 939、 300ηΜにおいては 23030、 3000nMにおいては 23728であった。
PACAP- 38刺激によるによるカルシウム上昇作用の最大活性は、 0.3nM においては 287、 3nMにおいては 410、 30nMにおいては 195、 300nMにおいて は 23043、 3000 にぉぃては23315でぁった。
VIP刺激によるによるカルシウム上昇作用の最大活性は、 0.3nMにおい ては 56、 3nMにおいては 60、 30nMにおいては 16、 300nMにおいては 11153、 3000nMにおいては 24007であつた。
また、 CH0- TGR12に対するカルシウム上昇作用の EC5fl値は、 サブスタン ス Pにおいて約 237nM、 コルチス夕チン- 17において約 218nM、 PAMP-12に おいて約 98nM、 PACAP- 27において約 93nM、 PACAP- 38において約 161nM、 VIP において約 305nMであった。
これらの結果より、サブスタンス P、コルチス夕チン- 17および PAMP- 12 、 TGR12のリガンドであることが示された。 また、 PACAP-27、 PACAP- 38 および VIPが、 TGR12のリガンドであることが分かった。 実施例 2
( 1 ) ヒ ト肥満細胞株 LAD 2での TGR12、 NK受容体、 VIP受容体および PACAP 受容体遺伝子の発現量の定量
米国 National Institutes of Healthから購入したヒト肥満細胞株 LAD 2 を、 100ng/mLの stem cell factor (免疫生物研究所） を含む StemPro-34 培地 （インビトロジェン社） を用いて培養した。 LAD 2から RNeasyおよび DNase I kit (キアゲン社） を用いて total RNA画分を調製した。 Total RNA l gを铸型に、 Superscript II reversetranscriptase (インビ卜ロジェ ン社） を用いて、 添付のマニュアルにしたがってランダムプライマーを 用いて逆転写を行い、 cDNAを作製した。 得られた lotal RNA 25ng相当の 逆転写産物または後述の標準 DNA、 1 X Universsal PCR Master Mix (ァ プライ ドバイオシステムズ社） 、 後述のプライマー各 200 nM、 および TaciManプローブ 200 πΜを含む反応混合液 Lについて ABI PRISM 7700 Sequence Detector (アプライ ドバイオシステムズ社） を用いで PCRを行 なった。 PCRは、 50t: · 2分、 95°C · 10分で処理後、 95°C · 15秒、 60 · 60秒のサイクルを 40回繰り返すことにより行なった。 発現量は ABI PRI SM 7700 SDSソフトウェアによって算出した。 リポーターの蛍光強度が設定 された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、また標準 DNAの初期濃 度の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。 標準曲線より各逆転写 産物の初期濃度を算出し、 各部位のヒ ト TGR12、 NK1受容体、 NK2受容体、 NK3受容体、 VIP 1受容体、 VIP2受容体および PACAP受容体遺伝子の発現量 を求めた。
その結果、 LAD 2において、 TGR12 (配列番号 ： 1 7で表される塩基配 列を有する TGR12用標準 DNA、 配列番号 ： 1 8で表される塩基配列を有す るプライマー、 配列番号 ： 3で表される塩基配列を有するプライマ一、 配列番号 ： 4で表される塩基配列を有する TadManプローブを使用） の発 現量は、 t o t a l RNA 25 ngあたり 687474コピーであった。
LAD 2において、 NK1受容体 （配列番号 ： 5で表される塩基配列を有す る NK1受容体用標準 DNA、 配列番号 ： 6で表される塩基配列を有するブラ イマ一、 配列番号 ： 7で表される塩基配列を有するプライマ一、 配列番 号： 8で表される塩基配列を有する TaciManプローブを使用） の t o t a l RNA 25ngあたりの発現量は 50コピーであった。
LAD 2において、 NK2受容体 （配列番号 ： 9で表される塩基配列を有す る NK2受容体標準 DNA、 配列番号 ： 1 0で表される塩基配列を有するブラ イマ一、 配列番号 ： 1 1で表される塩基配列を有するプライマー、 配列 番号： 1 2で表される塩基配列を有する TaciManプローブを使用） の t o t a l RNA 25ngあたりの発現量は 1コピーであった。
LAD 2において、 NK3受容体 （配列番号 ： 1 3で表される塩基配列を有 する NK3受容体標準 DNA、 配列番号 ： 1 4で表される塩基配列を有するプ ライマー、 配列番号 ： 1 5で表される塩基配列を有するプライマ一、 配 列番号 ： 1 6で表される塩基配列を有する TaciManプローブを使用した） の t o t a l RNA 25ngあたりの発現量は 1コピーであった。
LAD 2において、 ·νΐΡ 1受容体 （配列番号 ： 1 9で表される塩基'配列を有 する受容体用標準 DNA、 配列番号： 2 0で表される塩基配列を有するブラ イマ一、 配列番号 ： 2 1で表される塩基配列を有するプライマー、 配列 番号： 2 2で表される塩基配列を有する TaciManプローブを使用） の total RNA25ngあたりの発現量は 219コピー、 VIP2受容体 （配列番号： 2 3で表 される塩基配列を有する受容体標準 DNA、 配列番号： 2 4で表される塩基 配列を有するプライマー、 配列番号 ： 2 5で表される塩基配列を有する プライマー、 配列番号 ： 2 6で表される塩基配列を有する TaqManプロ一 ブを使用） の total RNA 25ngあたりの発現量は 179コピーであった。
LAD 2において、 PACAP受容体 （配列番号 ： 2 7で表される塩基配列を 有する受容体標準 DNA、 配列番号： 2 8で表される塩基配列を有するブラ イマ一、 配列番号 ： 2 9で表される塩基配列を有するプライマー、 配列 番号 ： 3 0で表される塩基配列を有する TaaManプローブを使用した） の total RNA 25ngあたりの発現量は 18コピーであった。
これにより、 LAD 2において、 TGR12が高発現していることが分かった。 また、 LAD 2において、 NK1、 NK2、 NK3、 VIPK VIP2および PACAP受容体が 低発現であることが分かった。 実施例 3
TGR12リガンド依存的なヒ ト肥満細胞の脱顆粒促進
ヒ ト肥満細胞株 LAD 2は、 100ng/niLの stem cell factor (免疫生物研究 所）を含む StemPro-34培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。 LAD 2を夕イロ一ド緩衝液（126mM NaCl, 4. OinM KC1, 0.69mM KH2P04, 5.6mM Glucose, ImM CaCl2, ImM MgCl2, 0.1% BSA)で洗浄し、 96穴プレートに 1 ゥエルあたり 150 Lずつ、 20000個の LAD 2を分注し、 37でで 5分間インキ ュべ一卜した。 次いで、 50 Lの各種濃度の TGR12リガンド （ペプチド研 究所） を含むタイロード緩衝液を加えて、 さらに 37°Cで 20分間インキュ ペートし、 脱顆粒を誘導した。 脱顆粒アツセィ上清中の) 3
-hexosaminidase活性を以下のように測定することにより、脱顆粒の程度 を測定した。 上清を 96穴プレートに分注し、 上清の 5倍量の 0. 1M Citrate (pH4.5) /ImM 4 - methyl umbel 1 iferyl-2-acetamido- 2 - deoxy-beta-D- glucopyranoside (和光純薬） を添加して、 37°Cで 1時間 インキュベートした。 次いで、 反応液の 0.1倍量の 0.2M
Glycine/NaC03 (ρΗΙΟ.7)を添加することにより反応を停止させ、 Fusion- ひ （パーキンエルマ一社）で測定を行った。 jS -hexosaminidase活性は、 ま た、 LAD 2を 4回凍結融解し、 遠心分離を行った後の上清中における活性 を LAD 2中の全 /3- hexosaminidase活性とし、 脱顆粒の程度は全 /3 -hexosaminidase活性に対する LAD 2上清中の j3 - hexosamin idase活性の 割合で示した。
その結果、 自発的脱顆粒は約 1.5%であった。
サブスタンス P刺激による脱顆粒は、 ΙΟηΜにおいては 1.8 、 30nMにおい ては 8.75L ΙΟΟηΜにおいては 39.2%、 300nMにおいては 58. 、 1 Mにおい ては 66.8%、 3 Mにおいては 71.0 であつた。
コルチス夕チン- 17刺激による脱顆粒は、 ΙΟηΜにおいては 1.6%、 30nM においては 2.8%、 ΙΟΟηΜにおいては 26.5 、 300nMにおいては 52.8%、 M においては 62. 3 においては 58.9%であった。
PAMP-12刺激による脱顆粒は、 3nMにおいては 6.3%、 ΙΟηΜにおいては 30.7%、 30nMにおいては 52.1 、 ΙΟΟηΜにおいては 65H 300nMにおいては 67.7%、 l Mにおいては 69.3%であった。
PACAP-27刺激による脱顆粒は、 ΙΟηΜにおいては 2.6%、 30nMにおいては 19.6%、 ΙΟΟηΜにおいては 59.4%、 300nMにおいては 71.1%、 I Mにおいては 75.1%、 においては 69. であった。
PACAP- 38刺激による脱顆粒は、 ΙΟηΜにおいては 7.4%、 30nMにおいては 24.8¾, ΙΟΟηΜにおいては 49. 、 300nMにおいては 65.8%、 においては 68.9¾、 においては 63.3%であった。
PACAP-38刺激による脱顆粒は、 ΙΟηΜにおいては 7.4%、 30nMにおいては 24.8%、 ΙΟΟηΜにおいては 49.4 、 300nMにおいては 65.8%、 I Mにおいては 68.9%、 においては 63.3%であった。
VIP刺激による脱顆粒は、 ΙΟηΜにおいては 1.5%、 30nMにおいでは 4.0 、 ΙΟΟπΜにおいては 36.7 、 300nMにおいては 63.9 1 においては 71.7%、 においては 76.1%であった。
LAD 2に対する脱顆粒反応の EC5„値は、サブスタンス Pにおいて約 91nM、 コルチス夕チン- 17において約 122nM、 PAMP- 12において約 13nM、 PACAP-27 において約 51nM、 PACAP-38において約 51nM、 VIPにおいて約 105nMであつ た。
これより、 サブスタンス P、 コルチス夕チン- 17、 PAMP-12, PACAP-27, PACAP-38および VIP依存的に、 ヒ ト肥満細胞株 LAD 2の脱顆粒が誘導され ることが分かった。 実施例 4
サブスタンス P依存的なヒト肥満細胞の脱顆粒促進に対する NK1受容 体アンタゴニス トの作用
ヒ ト肥満細胞株 LAD 2は、 lOOng/mLの stem cell factor (免疫生物研究 所） を含む StemPro-34培地 （インビトロジェン社） を用いて培養した。 LAD 2をタイロード緩衝液 （126mMNaCl， 4. OmMKCl, 0.69mM KH2P04, 5.6mM Glucose, lmM CaCl2, lmM MgCl2, 0.1¾ BSA) で洗浄し、 96穴プレートに 1ゥエルあたり 100 Lずつ、 20000個の LAD 2を分注し、 37°Cで 5分間イン キュペートした。次いで、 50 Lの各種濃度の NK1アン夕ゴニス 卜 GR-82334 (シグマ社） または L- 703606 (シグマ社） を含むタイロード緩衝液を加 えて、 37°Cで 5分間インキュベートした。 次いで、 50 zLのサブスタンス P 溶液 （終濃度 0.3^M;ペプチド研究所） またはカルシウムィオノフォア A23187溶液 （終濃度 0.3 Μ； 和光純薬） を含むタイロー ド緩衝液を加え て、 さらに 37°Cで 20分間インキュベートし、 脱顆粒を誘導した。 脱顆粒 アツセィ上清中の ]6 -hexosaminidase活性を以下のように測定すること により、 脱顆粒の程度を測定した。 上清を 96穴プレートに分注し、 上清 の 5倍量の 0.1M Citrate (pH4.5) /lmM 4-methyl
umbel 1 i f ery 1-2-acetamido- 2-deoxy-be ta-D-glucopyranos ide (禾ロ光純 薬） を添加して、 37°Cで 1時間インキュベートした。 次いで、 反応液の 0.1 倍量の 0.2M Glycine/NaC03 (ρΗΙΟ.7) を添加することにより反応を停止 させ、 Fusion-α (パーキンエルマ一社） で測定を行った。 LAD 2を 4回凍 結融解し、 遠心分離を行った後の上清中における活性を、 LAD 2中の全) 8 -hexosaminidase活性とした。 NK1受容体アン夕ゴニストによる阻害活性 は、 NK1受容体アン夕ゴニスト非添加における /3 -Hexosaminidase活性に 対する、 各種濃度の NK1アン夕ゴニス ト添加時における β
-hexosaminidase活性の割合 ) で示した。
その結果、 サブスタンス P刺激における、 NK1受容体ペプチド性アン夕 ゴニス ト GR-82334 (シグマ社） 添加による脱顆粒は、 GR-82334が ΙΟΟηΜ において 101.2¾、 300nMにおいて 105.7%、 1 Mにおいて 102.7%、 3 Mにお いて 99.6%、 10 Mにおいて 95.8%、 30 Mにおいて 99.5%であった。
A23187刺激における、 GR-82334添加による脱顆粒は、 GR- 82334が ΙΟΟηΜ において 101.1%、 300nMにおいて 102.0%、 1 Mにおいて 102.0%、 3^Μにお いて 102.8° ΙΟ Μにおいて 103.2 、 30 Mにおいて 102· 4%であった。 サブスタンス P刺激における、 NK1受容体低分子性アン夕ゴニス ト L-703606 (シグマ社） 添加による脱顆粒は、 L- 703606が 100nMにおいて 101.1%, 300nMにおいて 97.9¾、 1 Mにおいて 98· 8 、 3 Mにおいて 100.0% 、 10 Mにおいて 39.4%、 30 ¾1において 3.2%であった。
A23187刺激における、 L-703606添加による脱顆粒は、 L- 703606が 100nM において 98.4%、 300nMにおいて 97.2%、 1 において 97.4%、 3 Mにおい て 91.5%、 10 Mにおいて 37. 1%、 30 Mにおいて 2.4%であった。
これより、 NK1受容体べプチド性アン夕ゴニスト GR-82334は、 サブス夕 ンス Pおよび A23187刺激による脱顆粒を、 0.1Mから 30/ Mの濃度範囲で抑 制しないことが分かった。 また、 NK1受容体低分子性アン夕ゴニス 卜 L- 703606は、 サブスタンス Pおよび A23187刺激による脱顆粒を、 0. 1Mか ら 3 Mの濃度範囲で抑制せず、 10 Mから 30 Mの濃度範囲では TGR12およ び NK1受容体非特異的に抑制することが分かった。
サブスタンス P受容体として知られている NK1受容体のアン夕ゴニス 卜 力 サブスタンス Pによる TGR12依存的な脱顆粒反応を阻害しなかったこ とより、NK1受容体アン夕ゴニス卜ではなく、TGR12のアン夕ゴニス トカ^ サブスタンス Pによる脱顆粒反応の抑制剤になりうると考える。 実施例 5
サブスタンス Pのヒ 卜 TGR12発現 CH0細胞に対する MAPK活性化作用
CHO/dhfr-細胞 （以下、 CH0) は、 10%ゥシ胎児血清を含む α- MEM培地 (インビトロジェン社） を用いて培養した。 CH0に、 ヒト TGR12の開始コ ドンから終始コ ドンを含む塩基配列（配列番号： 32に表される塩基配列 を有する DNA)を組み込んだ動物細胞発現用ベクタープラスミ ド pAKKO-lllH (Biochim. Biophys. Acta, 1219巻、 25卜 259頁、 1994年記載 の pAKKOl.11Hと同一のベクタープラスミ ド） を安定的に発現させること により、 ヒ ト TGR12発現 CH0細胞株 （以下、 CH0-TGR12) を樹立した。 CH0-TGR12は、 10%ゥシ胎児透析血清を含む核酸不含 α-ΜΕΜ培地 （インビ トロジェン社） を用いて培養した。
細胞の調製は以下のように行った。 CH0- TGR12を 0.05% Trypsin-EDTA (GIBC0) で剥がし、 培地 (ΜΕΜ-α (GIBC0) ， 10% FBS (GIBC0) ,ベニシリ ン /ス トレプトマイシン（BIOWHITTAKER) )で懸濁して遠心分離後、 沈殿し た細胞を培地で 2 X 105 cells/mlに懸濁して lmLずつ 12wellの細胞培養用 ディ ッシュに播いた。 一晩 (：02ィンキュベー夕一内で培養後、 培地をァス ビレーシヨンし PBSで洗浄後、 無血清培地 （MEM-a (GIBC0) ，ペニシリン /ストレプトマイシン（BIOWHITTAKER)) を lmL添加し、 C02インキュベータ 一内で培養した。 百日咳毒素 （pertussis toxin ;以下、 PTX) は最終濃 度が 0. lpg/mL になるようにアツセィの 4時間前に添加した。
細胞の活性化は以下のように行った。 培地をァスピレーションし PBS で洗浄後、 アツセィバッファー （HBSS(GIBCO), 10mM HEPES (同仁化学研 究所）） を 750μί添加し、 15分間 37°Cでプレインキュベーションした。 サ ブスタンス P溶液およびポジティブコントロールである ATP溶液を 250 L 添加し、 37ででインキュベーションした後、 急冷により反応を停止させ た。 アツセィバッ.ファーをァスピレ一シヨンし PBSで洗浄後、 1'xLDSサン プルバッファー/ DTTを細胞に添加して回収し、 30秒間超音波処理後、 70°C で 10分間加熱し急冷させた。
SDS- PAGEおよびウエスタンプロッティ ングによる検出は以下のように 行った。 10% Bis- Tris gel (Invitrogen)を用いて分離後、 Immune-Blot PVDF Membrane (BIO- RAD)に転写させた。 メンブレンを Block Ace (大日本 製薬） でブロッキングし、 一次抗体（Phospho-p42/p44 MAP
Kinase (Thr202/Thr204) Ant ibody (CST)または p42/p44 MAP Kinase Antibody (CST) )を用いて室温において 1時間ィンキュベーションした後、 二次抗体（Anti-rabbit IgG (CST) )を用いて室温において 1時間インキュ ベーシヨンした。 抗体反応後のメンブレンを、 ECL PLUS (Amersham
Biosciences) で化学発光させ、 LAS1000 (FUJI FILM) を用いて検出およ び画像解析を行った。
その結果、 CH0-TGR12を、サブスタンス Pで刺激すると、 ERKl/2(p42/p44 MAP Kinase) のリン酸化が認められた。 CH0-TGR12のサブスタンス Pによ る ERK1/2 (p42/p44 MAP Kinase) のリン酸化は、 刺激後 10分前後で最大 反応を示し、 刺激後 30分においてもリン酸化は認められた。 また、 CH0-TGR12のサブスタンス Pによる ERK1/2 (p42/p44 MAP Kinase) のリン 酸化は PTXを前処理することにより減弱したが、 ATPによる ERK1/2 (p42/p44 MAP Kinase) のリン酸化は PTXの前処理による減弱は認められ なかった 実施例 6
TGR12リガンドによるヒ ト肥満細胞の TNF-a、 CCL- 2、 CCL-5の発現亢進 作用
ヒ ト肥満細胞株 LAD 2は、 100ng/mLの stem cell factor (免疫生物研究 所）を含む StemPro- 34培地（インビトロジェン社）を用いて培養した。サブ スタンス P刺激時における発現量の計時変化を解析した実験において、 LAD 2を 300xgで 5分間遠心分離後、 沈殿した細胞を計数し、 培地で 6.67xl05cells/mLに懸濁して 750 Lずつ 24well plateに播いて、' ?>V の C02インキュベーターで 30分間静置した。 次いで、 250pLの最終濃度 ΙμΜ のサブスタンス Ρ (ペプチド研究所） を含む培地あるいは培地のみを加 えて、 さらに 37°Cの C02インキュベータ一で 0.5、 、 8、 24時間インキュ ペートした。アツセィはそれぞれの反応条件について n=3で行った。 0.5、 2、 8、 24時間後に、 プレートを氷冷して LAD 2の活性化を停止させ、 300xg で 5分間遠心分離を行い、沈殿した細胞から RNeasy Mini Kit (キアゲン社） を用いて、 添付のプロ トコールに従って total RNA を抽出した。 また、 種々の TGR12リガンド刺激時における発現量を解析した実験において、 LAD 2を 300xgで 5分間遠心分離後、 沈殿した細胞を計数し、 培地で 1.33xl06cells/mLに懸濁して 750 Lずつ 24well plateに播いて、 37 の C02インキュべ一夕一で 30分間静置した。 次いで、 250 Lの最終濃度 ΙμΜ のコルチス夕チン- 17、 ΡΑΜΡ- 12、 PACAP-27, VIP (ペプチド研究所） を含 む培地あるいは培地のみを加えて、 さらに 37 の (；02ィンキュベータ一で 2時間ィンキュベー卜した。 アツセィはそれぞれの反応条件について π=3 で行った。 2時間後に、 プレートを氷冷して LAD 2の活性化を停止させ、 300xgで 5分間遠心分離を行い、 沈殿した細胞から RNeasy Mini Kit (キア ゲン社）を用いて、 添付のプロ トコールに従って total RNA を抽出した。 上記のように得られた total RNAを、 Ethachinmateを用いて、 添付のプロ トコールに従って濃縮し、 RNase-free H20に溶解した。 次に、 total RNA lpg分を用レ て、 Superscript II Reversetranscriptase (インヒ 卜ロジ ェン社）により、以下の方法で逆転写反応を行い、一本鎖 cDNAを作成した。 Total RNA溶液に Random primer (インビトロジェン社） 0. lpg、 10mM dNTP (インビトロジェン社） lpLを加え、 RNase- free H20を加えて全量を 12μί とした後， 70°Cで 10分間インキュベーションし、 1分間氷冷した。
5xFirst-Strand Buffer (Superscript 11 Reversetranscriptaseに添付） 4μί, 0.1M DTT (Superscript II Reversetranscriptaseに添付） 2μί, RNaseOUT (インビトロジェン社） lpLおよび Superscript II
Reversetranscriptase 1 Lを加えて、 42でで 50分間インキュベーション 後、 70°Cで 15分間インキュベーションし、 5分間氷冷した。 このようにし て得られた cDNAを、 Ethachinmateを用いて、 添付のプロトコールに従つ て精製し、 Tris- EDTA Buffer (フル力社）に溶解した。
以下の TaciMan PCRにおいて、 ヒ ト TNF-α定量用のプライマ一として、 hTNFalpha-tF (配列番号： 3 3) および hTNFalpha- tR (配列番号： 34) を、 プローブとして hTNFalpha- tP (配列番号 ： 3 5 ) を、 スタンダード として hTNFalpha- standard (配列番号 ： 3 6 ) を用いた。 ヒ ト CCL- 5定 量用のプライマーとして、 hCCL5- tF (配列番号 ： 3 7 ) および hCCL5-tR
(配列番号： 3 8) を、 プローブとして hCCL5-tP (配列番号： 3 9 ) を、 スタンダードとして hCCL5 standard (配列番号 ： 4 0 ) を用いた。 ヒ ト CCL- 2定量用のプライマーとして、 hCCL2- tF (配列番号 ： 4 1 ) および hCCL2-tR (配列番号 ： 42 ) を、 プローブとして hCCL2-tP (配列番号 ： 43) を、 スタンダードとして hCCL2 standard (配列番号 ： 44) を用 いた。
TaciManPCRは、 それぞれのサンプルについて n=2で行い、 12.5ng total RNAを铸型に用いて 15μ1の液量で行った。 反応液の組成は、 プライマー 900ηΜ, プローブ 250nM、 TaaMan Universal PCR Master Mix (アプライ ドバイオシステムズ社） 1/2 volumeとした。 反応および解析は ABI PRISM 7900HT Seqence Detection System (アプライ ドバイオシステムズ社）に より行った。 反応サイクルは、 50°Cで 2分間保温し、 次に 95°Cで 10分間保 温した後， 95°C · 15秒間 60T · 1分間のサイクルを 40回行った。 遺伝子 発現量は、 検量線の Correlation Coeif値が 0.995以上になるように解析 を行ない算出した。
発現解析の結果を以下に示す。 発現量の値は標準 DNAを元に算出した mRNAのコピー数として、 n=3の平均値で示した。
サブスタンス P刺激時における発現量の計時変化を解析した実験結果 を以下に示す。 無刺激時において、 LAD 2の TNF-αの発現量は 10118コピ —であった。 サブスタンス P刺激時における、 LAD 2の TNF-aの発現量は、 刺激後 0.5時間において 56065コピー、 刺激後 2時間において 1346293コピ 一、 刺激後 8時間に'おいて 54313コピー、 刺激後 24時間において 4332コピ —であった。 一方、 培地のみ添加時における、 LAD 2の TNF- αの発現量は、 刺激後 0. 5時間において 9668コピー、 刺激後 2時間において 6689コピー、 刺激後 8時間において 6035コピー、刺激後 24時間において 4886コピーであ つた。 また、 無刺激時において、 LAD 2の CCL-5の発現量は 15721コピーで あった。 サブスタンス P刺激時における、 LAD 2の CCL-5の発現量は、 刺激 後 0. 5時間において 38107コピー、 刺激後 2時間において 88872コピー、 刺 激後 8時間において 69921コピー、刺激後 24時間において 53605コピーであ つた。 一方、 培地のみ添加時における、 LAD 2の CCL- 5の発現量は、 刺激 後 0. 5時間において 14585コピー、 刺激後 2時間において 15625コピー、 刺 激後 8時間において 12538コピー、刺激後 24時間において 15003コピーであ つた。
種々の TGR12リガンド刺激時における発現量を解析した実験結果を以 下に示す。 無刺激時において、 LAD 2の TNF-αの発現量は 1731コピーであ つた。 刺激 2時間後の LAD 2の TNF-aの発現量は、 培地のみ添加時におい て 1331コピー、 サブスタンス P刺激時において 173462コピー、 コルチス夕 チン -17刺激時において 163551コピー、 PAMP- 12刺激時において 8918コピ 一、 PACAP- 27刺激時において 219597コピー、 VIP刺激時において 176630 コピーであった。また、無刺激時において、 LAD 2の CCL-5の発現量は 30341 コピーであった。 刺激 2時間後の LAD 2の CCL-5の発現量は、 培地のみ添加 時において 23501コピー、 サブスタンス P刺激時において 47117コピー、 コ ルチス夕チン- 17刺激時において 47322コピー、 PAMP- 12刺激時において 34566コピー、 PACAP- 27刺激時において 48242コピ一、 VIP刺激時において 45015コピーであった。 また、 無刺激時において、 LAD 2の CCL- 2の発現量 は 643224コピーであった。 刺激 2時間後の LAD 2の CCL-2の発現量は、 培地 のみ添加時において 4041 12コピー、 サブスタンス P刺激時において
2694837コピー、 コルチス夕チン- 17刺激時において 2944622コピー、 PAMP-12刺激時において 1 143248コピー、 PACAP- 27刺激時において 3809873 コピー、 VIP刺激時において 3630286コピーであった。 実施例 7
TGR12リガンドによる TGR12に対する競合結合試験
競合結合試験に用いた [|251]標識ラッ トコルチス夕チン 14(TyrO) (以 下、 [ I]-rCST14(Y0))は、 以下のように調製した。 rCST14(Y0) (フナコ シ社） 3nmol/6pL、 lOpg/mL lactoperoxidase (in 0.1MHEPES (pH7, 4)) 6μし 0.001¾ H202 6μί, 37MBQ Nal 6μί (cold runでは 15mg/100mL Nal 6pLを用 いた）を混合後、 室温で 20分間反応し、 HPLCでモノョ一ド体を分取したと ころ、 24min.前後の画分（cold runにおける MS解析で rCST14 (Y0)のモノョ 一ド体と同じ分子量を持つことが確認されている）に放射活性が回収さ れた。分画には TSKgel 0DS-80TMを使用し、 A液として li MeCN/O.1% TFA、 B液として 60% MeCN/0.1¾ TFAを用いて、 gradientは 0-25 (2min. )， 25-27.5 (3min. ), 27.5- 35 (60min. )と設定し、 流速は lmL/min.とした。
CHO/dhfr-細胞 （以下、 CH0) は、 10%ゥシ胎児血清を含む α-ΜΕΜ培地 (インビトロジェン社） を用いて培養した。 CH0に、 TGR12の塩基配列の 終始コ ドンを除いた後に GFP (和光純薬）の塩基配列を繋いだ塩基配列（以 下、 TGR12- GFP (配列番号： 4 5に表される塩基配列を有する DNA) )を組 み込んだ動物細胞発現用ベクタープラスミ ド pAKKO-lllH (Biochim. Biophys. Acta, 1219巻、 25卜 259頁、 1994年記載の pAKKOl.11Hと同一の ベクタープラスミ ド） を安定的に発現させることにより、 TGR12-GFP発現 CH0細胞株 （以下、 CH0-TGR12GFP) を榭立した。 CH0- TGR12GFPは、 10%ゥ シ胎児透析血清を含む核酸不含 α-ΜΕΜ培地 （インビトロジェン社） を用 いて培養した。
CH0-TGR12GFPを用いた結合試験は以下のように行った。 種々の生理活 性ペプチドは、 ペプチド研究所から購入した。 CH0-TGR12GFPを 24well plateに 2xl05cells/wellの細胞密度で播種して一晩培養後、 氷冷したァ ッセィバッファ一（MEM- a， 20mM HEPES (pH7.4), 0.05¾ BSA)で 3回洗浄し、 250μ【のアツセィバッファ一を添加した後、 250pLのアツセィバッファー に懸濁した [l25I]-rCST14(Y0)/生理活性べプチド溶液を添加
([|251]- rCST14(Y0)の最終濃度は 200pM)し、 4°Cで 2時間静置した。 500μί のアツセィバッファーで 3回洗浄後、 250μίの 0.5N NaOHで細胞を溶解し て回収し、 放射活性の測定を行った。
これにより、 非特異的結合活性を ΙΟμΜのラッ 卜コルチス夕チン 14の活 性として見積もり、 Hi 11プロッ ト解析からそれぞれのぺプチドの IC50値 を解析した結果、サブスタンス Pでは 2886nM, ヒ トコルチス夕チン Πでは 47nM, ヒ ト PAMP12では 18nM， ヒ 卜 PACAP27では 264nM, ヒ 卜 PACAP38では 47πΜ, ヒト VIPでは 2039ηΜであった 実施例 8
TGR12リガンドによるヒト TGR12発現 RBL- 2Η3細胞における細胞内カル シゥム上昇作用と脱顆粒促進作用
RBL-2H3(以下、 RBL2H3)は、 10%ゥシ胎児血清を含む α-ΜΕΜ培地 （イン ビトロジェン社） を用いて培養した。 RBL-2H3に、 ヒ 卜 TGR12の開始コ ド ンから終始コ ドンを含む塩基配列（配列番号： 3 2に表される塩基配列を 有する DNA)を組み込んだ動物細胞発現用ベクタープラスミ ド pcDNA3.1を 安定的に発現させることにより、 ヒ 卜 TGR12発現 RBL-2H3細胞株 （以下、 RBL2H3-TGR12) を樹立した。 RBL2H3-TGR12は、 10%ゥシ胎児血清と 200 g/mLの Geneticinを含む α- MEM培地 （インビトロジェン社） を用いて 培養した。
細胞内カルシウム上昇活性は以下のように測定した。 RBUH3および RBL2H3- TGR12を 40, OOOcel 1 s/wel 1の密度となるよう 96穴プレートに播い て一晩培養後、 培地を捨て 4μΜの Fluo3-AM (同仁化学） を含むアツセィ バッファー〔Hank's Balanced Salt Solution (インビトロジェン社）， 20mM HEPES (同仁化学）、 2.5mM Probenecid (シグマ社）〕を 1ゥエルあたり lOOpL 添加し、 1時間、 37 で静置した。 0.05 の CHAPSを含むアツセィバッファ 一で、 種々の TGR12 (ペプチド研究所） またはカルシウムィオノフォア A23187 (和光純薬）を希釈した。 ァッセィバッファーで細胞を洗浄後、 FLIPR (モレキュラーデバイス社） を用いて、 細胞内カルシウム変動に伴 う蛍光の測定を行った。サンプルは、アツセィ開始 10秒後に 50μΙ;を 50μΙ7 秒の速度で添加した。 蛍光の測定は、 最初の 60秒間は 1秒毎、 次の 120秒 間は 6秒間毎に行い、 3分間の間で最も高い蛍光強度をその刺激条件にお ける最大活性とし、 3ゥエルの平均で求めた。 EC5Q値の算出は Graphpad PRISM 4 (Graohpad Software社） を用いて行った。
脱顆粒促進作用は以下のように測定した。 RBL2H3および RBL2H3-TGR12 を 40， OOOcel ls/wellの密度となるよう 96穴プレートに播いて一晩培養後、 培地を捨ててタイロード緩衝液（126mM NaCl, 4. OmM KC1, 0.69mM KH2P04, 5.6mM Glucose, ImM CaCl2, ImM MgCl2, 0.1% BSA)で洗浄後、 96穴プレ —卜に 1ゥエルあたり 150pLずつタイロード緩衝液添加し、 37でで 5分間 インキュベートした。 次いで、 50μίの各種濃度のサブスタンス P (ぺプ チド研究所） を含むタイロード緩衝液を加えて、 さらに 37°Cで 20分間ィ ンキュペートし、 脱顆粒を誘導した。 脱顆粒アツセィ上清中の
β-hexosaminidase活性を以下のように測定することにより、 脱顆粒の程 度を測定した。 上清を 96穴プレー卜に分注し、 上清の 5倍量の 0.1M Ci trate (pH4.5) /ImM 4-methyl umbel 1 iferyl-2-acetamido-
2- deoxy-beta-D-glucopyranoside (和光純薬） を添加して、 37°Cで 1時間 インキュベートした。 次いで、 反応液の 0.1倍量の 0.2M
Glycine/NaC03(pH10.7)を添加することにより反応を停止させ、
Fu s i on- α (パーキンエルマ一社）で測定を行った。 β-hexo s am i n i d a s e活性 は、 また、 同じくプレートに播いた RBL2H3および RBL2H3- TGR12GFPを Trypsin/EDTAで剥がした後、 4回凍結融解し、 遠心分離を行った後の上清 中における活性を LAD2中の全 β-hexosaminidase活性とし、 脱顆粒の程度 は全 β- hexosaminidase活性に対する LAD2上清中の β-hexosaminidase活 性の割合で示した。
RBL2H3における、 細胞内カルシウム上昇活性を測定した結果、 アツセ ィバッファー添加におけるカルシウム上昇作用の最大活性は 51、 ΙμΜの A23187による刺激におけるカルシウム上昇作用の最大活性は 25338であ つた。 サブスタンス Ρ刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、 ΙηΜ においては 44、 IOHMにおいては 51、 ΙΟΟηΜにおいては 50、 ΙμΜにおいては 95、 ΙΟμΜにおいては 41であった。 コルチス夕チン 17刺激によるカルシゥ ム上昇作用の最大活性は、 ΙπΜにおいては 67、 ΙΟηΜにおいては 78、 Ι ΟΟηΜ においては 54、 ΙμΜにおいては 49、 Ι ΟμΜにおいては 52であった。 PAMP 12 刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、 ΙηΜにおいては 52、 Ι ΟηΜ においては 52、 Ι ΟΟηΜにおいては 35、 ΙμΜにおいては 44、 ΙΟμΜにおいては 43であった。 PACAP27刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、 ΙηΜ においては 47、 Ι ΟηΜにおいては 37、 Ι ΟΟηΜにおいては 63、 ΙμΜにおいては 59、 ΙΟμΜにおいては 45であった。
RBL2H3-TGR12における、 細胞内カルシウム上昇活性を測定した結果、 アツセィバッファー添加におけるカルシウム上昇作用の最大活性は- 2、 ΙμΜの A23187による刺激におけるカルシウム上昇作用の最大活性は
25624であった。 サブスタンス Ρ刺激によるカルシウム上昇作用の最大活 性は、 ΙηΜにおいては 4、 Ι ΟηΜにおいては 13、 Ι ΟΟηΜにおいては 1702、 ΙμΜ においては 10005、 Ι ΟμΜにおいては 12649であった。 コルチスタチン 17刺 激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、 Ι πΜにおいては- 2、 Ι ΟηΜにお いては 33、 Ι ΟΟηΜにおいては 1574、 ΙμΜにおいては 1 1 193、 Ι ΟμΜにおいて は 12762であった。 PAMP 12刺激によるカルシウム上昇作用の最大活性は、 lnMにおいては 41、 Ι ΟηΜにおいては 2088、 Ι ΟΟηΜにおいては 1 1 1 10、 ΙμΜに おいては 12039、 10μΜにおいては 12331であった。 PACAP27刺激による力 ルシゥム上昇作用の最大活性は、 ΙηΜにおいては 40、 ΙΟηΜにおいては 29、 ΙΟΟηΜにおいては 5300、 ΙμΜにおいては 1 1494、 Ι ΟμΜにおいては 12667であ つた。
RBL2H3における脱顆粒促進作用を解析した結果、 自発的脱顆粒は 9. 4% であった。 サブスタンス Ρ刺激による脱顆粒は、 Ι ΟηΜにおいては 8. Π、 30ηΜにおいては 8. 9%、 Ι ΟΟηΜにおいては 8. 9SK、 300nMにおいては 8. 5%、 ΙμΜ においては 8. 4%、 3μΜにおいては 7. 9%であった。
RBL2H3-TGR 12における脱顆粒促進作用を解析した結果、 自発的脱顆粒 は 10. 5%であった。 サブスタンス Ρ刺激による脱顆粒は、 10ηΜにおいては 9. 7¾, 30nMにおいては 10. 8¾、 Ι ΟΟηΜにおいては 16. 7%、 300nMにおいては Π%、 ΙμΜにおいては 36. 3%、 3μΜにおいては 42. 0%であった 産業上の利用可能性
配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドもしくはその塩 (本発明の受容体） または本発明の受容体と特異的に結合する能力を有 するリガンド （本発明のリガンド） の活性 ·機能を阻害する化合物 （例、 本発明の受容体アン夕ゴニスト） 、 本発明の受容体に対する抗体、 本発 明の受容体に対するアンチセンスポリヌクレオチドなどは、 本発明の受 容体または本発明のリガンドが有する生理活性 （例、 肥満細胞の脱顆粒 促進作用、 エイコサノイ ド産生促進作用、 サイ ト力イン産生促進作用、 肥満細胞増殖促進作用、 肥満細胞活性化作用など） を抑制することがで きるので、 低毒性で安全な優れた肥満細胞の脱顆粒抑制剤、 エイコサノ イ ド産生抑制剤、 サイ ト力イン産生抑制剤、 肥満細胞増殖抑制剤、 肥満 細胞活性化抑制剤 （例、 MAPK活性化抑制剤なども含む） などとして、 例 えば、 免疫疾患 〔例、 炎症性疾患 （下垂体膿瘍、 甲状腺炎、 腹膜炎、 ク ローン病、 潰瘍性大腸炎、 結節性紅斑、 慢性関節リウマチ、 全身性エリ テマトーデスなど） 、 アレルギー （例、 アレルギー性結膜炎、 アレルギ 一性鼻炎、 花粉症、 金属アレルギーなど） 、 喘息、 滲出性中耳炎、 メニ エール病、 接触皮膚炎、 アナフィラキシー、 蓴麻疹、 重症筋無力症、 糸 球体腎炎、 シエーダレン症候群、バセドー病、インスリン抵抗性糖尿病、 アトピー性皮膚炎、 白血球異常など〕 、 泌尿器疾患 （例、 腎尿細管間質 障害 （繊維化） 、 間質性膀胱炎、 アレルギー性膀胱炎など） 、 消化器疾 患 〔例、 過敏性腸症候群、 慢性肝疾患、 食物アレルギー、 アレルギー性 腸炎、 牛乳タンパク誘発性直腸炎、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸 潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zo l l i nger- E l l i son症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道 炎、 NUD (Non U l ce r Dyspeps i a) 、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイ ド系抗 炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 手術後ストレスによる胃酸過多およ び潰瘍など〕 、 呼吸器疾患 〔例、 慢性閉塞性肺疾患 （例、 慢性気管支炎、 肺気腫） 、 びまん性汎細気管支炎、 嚢胞性線維症、 過敏性肺炎、 突発性 間質性肺炎、 肺線維症など〕 、 循環器疾患 （例、 動脈硬化症、 急性冠状 動脈症候群、 粥状硬化性大動脈瘤、 心臓アナフィラキシー、 心不全、 心 筋梗塞、 狭心症、 不整脈、 深部静脈血栓症、 P T C A後再狭窄など） 、 眼科疾患 （例、 翼状片、 春期カタル、 ドライアイなど） 、 癌 （例、 甲状 腺乳頭癌、 非小細胞性肺癌、 子宮内膜癌、 子宮頸癌、 胃癌、 膝臓癌、 肺 癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 膀胱癌、 乳癌、 結腸癌、 直腸 癌、 力ポジ肉腫、 肥満細胞種など） 、 脳梗塞、 高脂血症、 急性腎不全、 糖尿病、 肥満症、 浮腫、 肉芽種、 アトピー性脊髄炎、 神経線維腫、 鼻粘 膜過敏症、 ホジキン病、 子宮内膜増殖症などの予防 · 治療剤などとして 有用である。
また、 本発明の受容体または肥満細胞と本発明のリガンドとを用いる スクリーニング方法またはスクリーニング用キッ トにより， 例えば、 肥 満細胞の脱顆粒抑制作用、 エイコサノイ ド産生抑制作用、 サイ ト力イン 産生抑制作用、 肥満細胞増殖抑制作用、 肥満細胞活性化抑制作用などを 有する化合物またはその塩が効率よく取得できる。

Claims

請求の範囲
1. (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩および（b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを 用いることを特徴とする、 肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング方 法。
2. リガンドが、 サブスタンス P、 コルチス夕チン、 脳下垂体アデニル 酸シクラーゼ活性化ポリべプチド、 血管作動性腸管べプチドまたは proadrenomedul 1 in N-terminal 20 pept ideである請求項 1記載のスクリ 一二ング方法。
3. 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその 塩を介した細胞刺激活性を測定し、 指標とする請求項 1記載のスクリー ニング方法。
4. (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩および（b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを 用いことを特徴とする、 ヒ ト肥満細胞における脳下垂体アデニル酸シク ラーゼ活性化ポリぺプチドによる脱顆粒を抑制する作用を有する化合物 またはその塩のスクリ一二ング方法。
5. (i) (a) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と、 （b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンド とを、 試験化合物の非存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、 (ii) (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩と、 （b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを 、 試験化合物の存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、 および
(iii)工程（i)と工程（ii)との間で、 前記蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を比較し、工程（i)におけ る結合量よりも工程（ii)における結合量の方が低い場合に、 前記試験化 合物を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として選択する工程を含む請求項 1記載 のスクリ一ニング方法。
6.工程（ii)における結合量が工程（i)における結合量の 5 0 %以下の場 合に、 前記試験化合物を肥満細胞の脱顆粒抑制剤として選択する、 請求 項 5記載のスクリーニング方法。
7. (i) (a) 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド-ま たはその塩と、 （b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンド とを、 試験化合物の非存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
(ii) (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩と、 （b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドとを 、 試験化合物の存在下接触させ、 前記蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
(iii)工程（i)と工程（ii)との間で、 前記蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩に対する前記リガンドの結合量を比較し、工程（i)におけ る結合量よりも工程（ii)における結合量の方が低い場合の試験化合物を 選択する工程、 および
(iv)前記（iii)で得られた試験化合物を肥満細胞に接触させ、脱顆粒を抑 制する試験化合物を選択する工程を含む請求項 1記載のスクリ一ニング 方法。
8. 肥満細胞の脱顆粒抑制剤が、 免疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器疾患ま たは呼吸器疾患の予防 · 治療剤である請求項 1記載のスクリ一ニング方 法。
9 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩および（b) 該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンドを 含有することを特徴とする、 肥満細胞の脱顆粒抑制剤のスクリーニング 用キッ 卜。
1 0 . 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩に対するアン夕ゴニス トを含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
1 1 . 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩に対する抗体を含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
1 2 . 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩に対する抗体を含有してなる免疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器疾患ま たは呼吸器疾患の診断薬。
1 3 . 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩のァゴニス トに対する抗体を含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
1 4 . 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドをコードす るポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる免疫疾 患、 泌尿器疾患、 消化器疾患または呼吸器疾患の診断薬。
1 5 . ( i ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドをコ一 ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的なまたは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオ チド、 または （i i)該蛋白質またはその部分べプチドをコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチドに対する s i R N Aまたは s h RN Aを含有してなる肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
1 6. 肥満細胞の脱顆粒抑制剤が、 免疫疾患、 泌尿器疾患、 消化器疾患 または呼吸器疾患の予防 · 治療剤である請求項 1 0、 1 1、 1 3または 1 5記載の抑制剤。
1 7. 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩の活性、 または該蛋白質と特異的に結合する能力を有するリガンド の活性を阻害することを特徴とする肥満細胞の脱顆粒抑制方法。
1 8. 肥満細胞および配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する 能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、 肥満細胞の脱顆粒抑 制剤のスクリ一二ング方法。
1 9. (i) 肥満細胞と、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合す る能力を有するリガンドとを、 試験化合物の非存在下接触させ、 前記肥 満細胞に対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
(ii) 肥満細胞と、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する能力 を有するリガンドとを、 試験化合物の存在下接触させ、 前記肥満細胞に 対する前記リガンドの結合量を測定する工程、
(iii)工程（i)における結合量よりも工程（ii)における結合量の方が低い 場合の試験化合物を選択する工程、 および
(iv>前記（iii)で得られた試験化合物を肥満細胞に接触させ、脱顆粒を抑 制する試験化合物を選択する工程を含む請求項 1 8記載のスクリーニン グ方法。
2 0. 肥満細胞および配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と特異的に結合する 能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、 肥満細胞の脱顆粒 抑制剤のスクリーニング用キッ 卜。
2 1. 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはそ の部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニス ト、 （ii) 該蛋白質 もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 （iii) 該蛋白質 またはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリ ヌクレオチドと相補的なまたは実質的に相補的な塩基配列またはその一 部を含有してなるポリヌクレオチド、 または （iv) 該蛋白質またはその 部分べプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ ドに対する s i RNAまたは s h RN Aの有効量を投与することを特徴 とする肥満細胞の脱顆粒抑制方法。
2 2. 肥満細胞の脱顆粒抑制剤を製造するための、 （i) 配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対するアン夕ゴ ニス 卜、 （ii) 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体、 （iii) 該蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌク レオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一 部を含有してなるポリヌクレオチド、 または （iv) 該蛋白質またはその 部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ ドに対する s i RNAまたは s h RNAの使用。
PCT/JP2006/309212 2005-04-28 2006-04-27 脱顆粒抑制剤 WO2006118328A1 (ja)

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