WO2004084945A1 - 摂食調節剤 - Google Patents

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WO2004084945A1
WO2004084945A1 PCT/JP2004/004186 JP2004004186W WO2004084945A1 WO 2004084945 A1 WO2004084945 A1 WO 2004084945A1 JP 2004004186 W JP2004004186 W JP 2004004186W WO 2004084945 A1 WO2004084945 A1 WO 2004084945A1
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Tetsuya Ohtaki
Satoshi Kumano
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to (1) (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 36 A peptide or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the represented amino acid sequence, and (ii) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, sequence SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52
  • Method for screening a compound or a salt thereof that is useful as an ingestion regulator using a protein or a salt thereof, Z kit (2) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52
  • ZAQ ligand with ileal contractile activity also referred to as ZAQ ligand peptide
  • ZAQ ligand peptide binds to and activates orphan receptors ZAQ and 15E
  • Bv8 peptide having ileal contractile activity and snake venom MIT1 are also orphan receptors. And binds to I5E and activates ZAQ and I5E (eg, WO 02/62944).
  • ZAQ ligands and human Bv8 peptides methods for activating them have also been reported (W002 / 57443).
  • EG-VEGF also referred to as human ZAQ ligand
  • EG-VEGF is physiologically involved in the formation of highly permeable endothelial structures (fenest rates) that characterize endocrine tissues.
  • the transcriptional control region of the gene has a recognition site for hypoxia-inducible lef actor-1 (HIF-1), which is involved in the induction of expression under hypoxia.
  • HIF-1 hypoxia-inducible lef actor-1
  • induction of EG-VEGF gene expression under hypoxia was confirmed.
  • strong expression of EG-VEGF was observed in polycystic ovary syndrome (human polycystic ovary syndrome).
  • Bv8 peptide (PK-2) in the brain is localized in the suprachiasmatic nucleus of the rat, and its expression fluctuates during the day and increases during the light period, and PK-2 administered intracerebroventricularly decreases the activity of the rat. (Nature, 417, 405-410, 2002).
  • the present inventors have found that when a human Bv8 peptide is administered intracerebroventricularly to rats, it has an antifeedant effect and decreases the body temperature of rats.As a result of intensive studies, the present inventors have completed the present invention. Was.
  • a feeding regulator comprising a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the activity of a peptide containing a sequence or a salt thereof,
  • (la) inhibits or promotes the activity of a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 25, or a salt thereof
  • Feeding regulator comprising a compound or a salt thereof
  • (2a) inhibits the activity of a peptide or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 25
  • a prophylactic or therapeutic agent for eating disorders comprising the compound or its salt
  • a prophylactic / therapeutic agent for an eating disorder comprising a compound that inhibits the activity of a protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence or a salt thereof;
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 40 or a salt thereof Prevention and treatment of eating disorders
  • a prophylactic or therapeutic agent for obesity comprising a compound or a salt thereof that promotes the activity of a peptide or a salt thereof
  • a prophylactic / therapeutic agent for obesity comprising a compound or a salt thereof which promotes the activity of a protein or a salt thereof having substantially the same amino acid sequence;
  • (7) Contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 29 Of an eating disorder comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA encoding the peptide or its partial peptide, or an antisense nucleotide containing the same : ⁇ Therapeutic agents,
  • a prophylactic or therapeutic agent for eating disorders comprising an antibody to the contained peptide or its partial peptide or a salt thereof;
  • (12a) (a) a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 36, or a salt thereof, And / or (b) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 40 or a salt thereof is used.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29 or identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, or a peptide having the same amino acid sequence as Prevention of sleep disorders containing a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activating effect of a protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 ⁇ Therapeutic agents,
  • Fig. 1 shows the results of TaqMan PCR assay for pacific ZAQ and pacific I5E mRNA in vascular adrenal capillary endothelial cells (BACE) and vascular aortic vascular endothelial cells (BAE) performed in Reference Example 2. Is shown. In the figure, the mouth indicates the number of copies of the mouse ZAQ mRNA per ng of total RNA, and the solid indicates the copy number of the mouse I5E mRNA similarly.
  • BACE vascular adrenal capillary endothelial cells
  • BAE vascular aortic vascular endothelial cells
  • FIG. 2 shows the results of measurement of intracellular calcium ion concentration increasing activity by FL IPR using BACE performed in Reference Example 3.
  • -Hataichi indicates human ZAQ ligand peptide
  • -Sonoichi indicates MIT1.
  • FIG. 3 shows the results of dose responsiveness of the ZAQ-related peptide on the activation of p42 MAP kinase and p44 MAP kinase in BACE performed in Reference Example 3.
  • C indicates a control to which no ligand (solution) was administered
  • M indicates MIT1
  • L1 indicates human ZAQ ligand peptide
  • L2 indicates human Bv8 peptide was added at the concentrations shown in the figure.
  • P44 MAPK-P indicates a band of phosphorylated p44 MAP kinase
  • p42 MAPK-P indicates a band of phosphorylated p42 MAP kinase.
  • FIG. 4 shows the results of dose response of ZAQ-related peptide on p38 MAP kinase activation in BACE performed in Reference Example 3.
  • C indicates a control to which no ligand (solution) was administered
  • M indicates ⁇
  • L1 indicates human ZAQ ligand peptide
  • L2 indicates human Bv8 peptide at the concentrations shown in the figure.
  • P38 MAPK-P shows a band of phosphorylated p38 MAP kinase.
  • FIG. 5 shows the results of peptide dose-response on [3 ⁇ 4] thymidine incorporation in BACE.
  • 1 C— indicates a human ZAQ ligand peptide
  • 1 A— indicates a human Bv8 peptide
  • Figure 6 shows the effect of human ZAQ ligand peptide and human Bv8 on the growth of BACE. Shows the effect of the peptide.
  • the vertical axis indicates the number of BACE cells per 1 ⁇ l.
  • ZAQL-1 on the horizontal axis indicates a human ZAQ ligand peptide, and
  • ZAQL-2 indicates a human Bv8 peptide.
  • * Indicates that the p-value obtained from the Student 'st test is less than 0.05, and ** indicates that the p-value is also less than 0.001.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 29
  • the contained peptide or a salt thereof (hereinafter may be abbreviated as the peptide of the present invention) is as follows: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 4 6, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52, or a salt thereof (hereinafter referred to as “the present invention”).
  • the ability of the peptide of the present invention to bind to the protein of the present invention and to activate the protein of the present invention can be measured by the methods described below.
  • the peptide of the present invention can be used, for example, in any cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, etc.) of human mammals (eg, guinea pig, rat, mouse, egret, pig, sheep, horse, monkey, etc.).
  • human mammals eg, guinea pig, rat, mouse, egret, pig, sheep, horse, monkey, etc.
  • the peptide of the present invention has a signal sequence, the peptide can be efficiently secreted extracellularly.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 examples include, for example, about 60% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 ( Preferably at least about 70%, more preferably at least about 80%, more preferably at least about 85%, particularly preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95%. Amino acid sequences and the like.
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 include, for example, substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 Peptides having the same amino acid sequence as the above and having substantially the same properties as those having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 are preferred.
  • a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 may be referred to as a humanized ZAQ ligand mature peptide.
  • Examples of the peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • Peptides having the same or substantially the same amino acid sequence and having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 are preferred. Include a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, and the like.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 below Peptides are sometimes described as human Z AQ ligand precursor peptides.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 for example, 95% or more (preferably about 97% or more, more preferably Is about 99% or more).
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 include, for example, a peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9; A peptide having an activity substantially the same as that of the peptide having the amino acid sequence represented by No. 9 is preferred.
  • the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 may be referred to as a mouse-type ZAQ ligand mature peptide.
  • Examples of the peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 And a peptide having substantially the same activity as that of the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and specifically, the amino acid represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. And a peptide having a noic acid sequence.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 may be referred to as a mouse ZAQ ligand precursor peptide.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is, for example, 95% or more (preferably about 97%) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13. And more preferably about 9-9% or more).
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 Peptides having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 are preferred. Specific examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 A peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and the like.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 17 is described as a rat type ZAQ ligand mature peptide.
  • rat ZAQ ligand precursor peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 23 may be referred to as rat ZAQ ligand precursor peptide. .
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 29 is, for example, about the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 29.
  • 60% or more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more
  • amino acid sequences having homology to the same are amino acid sequences having homology to the same.
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 29 include, for example, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 29 Peptides having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 29 and having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 are preferred.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is a human-type BV8 mature peptide
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is a rat-type Bv8 mature peptide
  • it may be described as a mouse type Bv8 mature peptide.
  • Examples of the peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 include, for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 25 A peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, and having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, and the like. Is a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 25, and the like.
  • Examples of the peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 Peptides having the same amino acid sequence and having substantially the same activity as that of the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 are preferable. Specifically, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: : 29 or a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 may be referred to as a human BV8 precursor peptide.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 may be referred to as a rat type Bv8 precursor peptide.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 may be referred to as mouse Bv8 precursor peptide.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 for example, about 60% or more (preferably about 70%) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 Above, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 Peptides having substantially the same activity as the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 are preferred.
  • the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 may be referred to as MI I1.
  • substantially the same activity examples include a binding activity to the protein of the present invention and a signal information transduction action via the protein of the present invention. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, the present invention It is preferable that the activities such as the binding activity to the protein and the activity of signal transduction via the protein of the present invention are the same (eg, about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as may be different.
  • the activity can be measured according to a method known per se.
  • the activity can be measured according to a screening method described below.
  • the peptide of the present invention includes (i) SEQ ID NO: : 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25 or 1 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 (preferably 1-3 An amino acid sequence in which about 0, more preferably about 1 to 20) amino acids have been deleted, (ii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13; No.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 (preferably about 1 to 40, more preferably about 1 to 30, especially preferably 1 to 30) Amino acid sequence (about 20), (iii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, 1 or 2 or more (preferably 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 29
  • SEQ ID NO: 29 An amino acid sequence in which about 40, more preferably about 1 to 30, and particularly preferably about 1 to 20) amino acids have been substituted with another amino acid, or (iv) a combination thereof.
  • a peptide containing an amino acid sequence is also used.
  • peptide of the present invention include, for example, a human-derived peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a human-derived peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a peptide derived from a mouse having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 ; a peptide derived from a rat comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.13; an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • the partial peptide of the peptide of the present invention may be any one as long as it can be used in a screening method for a drug or the like described below. It suffices if it has substantially the same activity as the clear peptide.
  • the number of amino acids in the partial peptide is at least 10 or more, preferably 20 or more amino acids in the constituent amino acid sequence of the peptide of the present invention.
  • substantially the same activity has the same meaning as described above.
  • “Substantially the same activity” can be measured in the same manner as described above.
  • amino acids in the above amino acid sequence are deleted, and aminoii) one or two or more amino acids in the above amino acid sequence are deleted. Or more (preferably about 1 to 20 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably several (1 to 5) amino acids); or
  • One or more (preferably several (1 to 4)) amino acids in the above amino acid sequence may be substituted with another amino acid.
  • the peptide of the present invention and the partial peptide of the peptide of the present invention may be collectively referred to as the peptide of the present invention.
  • the protein of the present invention can be used, for example, in any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial cell, kidney, etc.) of human mammals (eg, guinea pig, lad, mouse, rabbit, pig, sheep, horse, monkey, etc.).
  • human mammals eg, guinea pig, lad, mouse, rabbit, pig, sheep, horse, monkey, etc.
  • bone marrow cells mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells) , Mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells Or progenitor cells of these cells, stem cells or cancer cells, etc.) and blood cells (eg, MEL, Ml, CTLL_2, HT-2, WEHI-3, HL-60, bandits-1, K562, ML- 1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurka CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102,
  • the protein of the present invention has a signal sequence, the peptide or protein can be efficiently secreted extracellularly.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 for example, about 90% or more, preferably about 95%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 Above, more preferably, an amino acid sequence having about 98% or more homology. '
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 However, a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 is preferred.
  • Examples of the protein of the present invention having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37
  • a protein having the same amino acid sequence as the above and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 is preferred.
  • Specific examples include the proteins described in WO 01/16309.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 may be referred to as ZAQ or human ZAQ.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 is, for example, represented by SEQ ID NO: 42.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 is preferred.
  • amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 examples include an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, and substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42. Preferred are proteins having the same activity.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 for example, about 95% or more, preferably about 96%, to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 Above, more preferably about 97% or more, and most preferably about 98% or more amino acid sequences having homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44
  • a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 is preferred.
  • Examples of the protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 And a protein having an activity substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 is, for example, about 90% or more, preferably about 95%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 Above, more preferably, an amino acid sequence having about 98% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 Preferred is a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 And a protein having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40. Specific examples include the protein described in TO 98/46620. .
  • I5E a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 is referred to as I5E or May be described as human type I5E.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 for example, about 95% or more, preferably about 96%, to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 Above, more preferably about 97% or more, most preferably about 98% or more of amino acid sequences having homology of about 98% or more.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 Preferred is a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 And a protein having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46. Specifically, Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1491, pp. 369-375 , 2000, and the like.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 for example, about 95% or more, preferably about 96%, to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 Above, more preferably about 97% or more, most preferably about 98% or more of amino acid sequences having homology of about 98% or more.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48
  • a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 is preferred.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 A protein having an activity substantially the same as that of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, such as the protein described in TO 98/46620. .
  • SEQ ID NO: 50 is substantially the same as the amino acid sequence represented by amino acid sequence.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 However, a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 is preferred.
  • Examples of the protein of the present invention having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50
  • a protein containing the same amino acid sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 is preferred.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 may be referred to as a zebra type ZAQ.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 for example, 95% or more, preferably about 97%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 Above, more preferably, an amino acid sequence having about 99% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 However, a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 is preferred.
  • Examples of the protein of the present invention having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 include, for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 Proteins containing the same amino acid sequence and having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 are preferred.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 may be referred to as "pichi type I5E".
  • substantially equivalent activities include, for example, a binding activity to the peptide of the present invention, a signal transduction effect, and the like. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activity of the peptide of the present invention such as the binding activity to the peptide and the activity of signal transduction is equivalent (eg, about 0.5 to 2 times).
  • the target element may be different.
  • the activity such as the binding activity and the signal transduction action can be measured according to a method known per se.
  • the protein of the present invention includes (i) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: : One or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence represented by 52 Deleted amino acid sequence, (ii) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 One or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 or 2)) amino acids are added to the amino acid sequence represented by Amino acid sequence, (iii) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, arrangement SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO
  • protein of the present invention examples include, for example, a protein of human origin (more preferably from human brain) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 or sequence A protein derived from a rat containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44, a protein derived from a mouse containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 or SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52.
  • Examples include a protein derived from Pashi containing the amino acid sequence represented by 52.
  • the partial peptide of the protein of the present invention may be any peptide as long as it is the partial peptide of the protein of the present invention described above.
  • the protein molecules of the present invention those which are exposed outside the cell membrane and have substantially the same ligand binding activity are used.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is a peptide containing a portion analyzed to be an extracellular region (hydrophilic (hydrophilic) site) in a hydrophobic plot analysis.
  • a peptide partially containing a hydrophobic site can also be used.
  • a peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more amino acids in the amino acid sequence constituting the protein of the present invention. Peptides having a sequence are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably Indicates an amino acid sequence having about 95% or more homology.
  • substantially the same ligand binding activity has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same ligand binding activity” can be measured according to a method known per se.
  • the partial peptides of the present invention are as follows: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 5 0 or 1 or 2 (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 are deleted Or one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) amino acids in the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more in the amino acid sequence (preferably, about 1 to 10, more preferably about 1 to 5, Preferably, several (one or two) amino acids may be replaced by other amino acids. '
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, 'succinic acid) , Tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, 'succinic acid
  • Tartaric acid citric acid, malic acid, oxalic acid
  • benzoic acid methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
  • peptides and proteins have N-terminus (amino terminus) at the left end and C-terminus (aminopropyl terminus) at the right end according to the convention of peptide notation.
  • SEQ ID NO: protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by 7, C-terminal, carboxyl group (-C00H), Karupokishireto (- C00-), ⁇ bromide (- C0Nh 2 ) Or ester (-C00R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, cyclo pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl , shed - ⁇ 6 _ 12 Ariru groups, naphthyl, for example, benzyl, phenethyl, etc. off Eniru C Bok 2 alkyl or flight one naphthylmethyl etc. of - Nafuchiru
  • C 7 _ 14 7 aralkyl group such as 2-alkyl group, such as pin bar opening Iruokishimechiru group commonly used as an oral ester.
  • the lipoxyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the peptide protein of the present invention smell Te
  • Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal e.g., formyl group, C 2 _ 6 Al force Noiru such ⁇ Se ethyl group Group, etc.
  • the daltamyl group generated by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyroglutamine oxidation.
  • the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is a suitable protecting group (eg, formyl group, acetyl group) c 2 _ 6 Al force those protected by Noiru like cw Ashiru group such group), or a so-called glycopeptide sugar chain is bound, such as.
  • a suitable protecting group eg, formyl group, acetyl group
  • c 2 _ 6 Al force those protected by Noiru like cw Ashiru group such group
  • a so-called glycopeptide sugar chain is bound, such as.
  • Complex peptides such as glycoproteins and complex proteins are also included.
  • the C-terminus has a lipoxyl group (-C00H), a propyloxylate (-C00-), an amide (-(; 0 ⁇ 2 ) or an ester (-C00R).
  • the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • the partial peptide of the present invention includes amidoxyl or esterified carbonyl group.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the partial peptide of the present invention includes a peptide in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected by a protecting group, and a peptide formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • a protecting group a peptide formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • n is pyroglutamine-oxidized, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, and those which are complexed with sugar chains such as so-called glycopeptides. It is.
  • the peptide or protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or mammalian cells or tissues by a known method for purifying a peptide or protein.
  • SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or contains DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 It can also be produced by culturing a transformant.
  • a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 or a salt thereof can be produced according to the method described in Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1491, pp. 369-375, 2000.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 48 or a salt thereof can be produced according to the method described in WO 98/46620.
  • a commercially available resin for peptide / protein synthesis can be usually used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl resin (1 Fmoc aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • amino acids having appropriately protected amino groups and side chain functional groups are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide / protein according to various known condensation methods.
  • peptides and proteins are cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the desired peptide, protein or amide thereof.
  • various activating reagents that can be used for peptide / protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • the carbopimides include DCC, N, N'-diisopropyl carbopimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ B t, HOOB t), or as a symmetrical anhydride or HOB t ester or H ⁇ B t ester. It can be added to the resin after the protected amino acid is activated in advance.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin may be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide-protein condensation reactions.
  • solvents known to be usable for peptide-protein condensation reactions For example, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, Acid amides such as N-methylpyrrolidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluoroethanol; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; pyridine, dioxane and tetrahydrofuran Ethers, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, tertiary-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C11Z, Br-Z, 7 Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group can be, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, .4-methoxybenzyl ester, chlorobenzene benzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl ester Benzyloxycarbonyl hydrazide, short-lived butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl,
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarponyl group, and the like are used.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a t-butyl group.
  • a protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz1, C12-Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, Yuichi Shaributyl, etc. are used.
  • protecting groups for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-1,2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like. Is used.
  • Activated carbonyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOBt.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd_carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Is also used.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide chain is extended to a desired chain length on the amino group side. Thereafter, a peptide protein from which only the protecting group for the ⁇ -amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain was removed and a peptide / protein from which only the protecting group for the C-terminal lipoxyl group had been removed were produced.
  • the protein is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude peptide / protein can be purified using various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain the desired peptide / protein amide.
  • an ester of a peptide / protein for example, after condensing the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired amino acid ester is obtained in the same manner as the amide of the peptide / protein.
  • Peptides and protein esters can be obtained.
  • the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se. Further, the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the peptide of the present invention or the partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to thereby remove the desired compound.
  • Peptides can be produced.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following (i) to (V). (i). Bodanszky and MA OndettK Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
  • the peptide of the present invention or the partial peptide of the present invention may be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the peptide or partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method, and conversely, when the peptide or partial peptide is obtained by a salt, it is obtained by a known method. Can be converted to the free form.
  • the peptide of the present invention or the polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention or the protein of the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from cells and tissues described above, cDNA library derived from cells and tissues described above, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of a total RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes, for example, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: Has a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence represented by 2 and has substantially the same activity as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, Invention Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having a protein-binding activity, a signal transduction action via the protein of the present invention, and the like.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under conditions of high stringency include, for example, about 60% or more, and preferably about 70%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. As described above, more preferably, a DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more is used.
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4; Has a DNA that hybridizes under high stringent conditions with the DNA having the nucleotide sequence represented by 4, and has substantially the same activity as the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (eg, Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having a binding activity to the protein of the present invention, a signal transduction action via the protein of the present invention, and the like.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 8.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 under high stringency conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 As described above, more preferably, a DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more is used.
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a sequence An activity substantially equivalent to that of a peptide having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 and containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having (eg, a binding activity to the protein of the present invention, a signal transduction action via the protein of the present invention, and the like).
  • SEQ ID NO: DNAs containing the base sequence represented by 10 or SEQ ID NO: 12 and the like.
  • DNA that hybridizes with DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 under high stringent conditions include, for example, 95% or more, and preferably about 97%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10. As described above, more preferably, a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 99% or more is used.
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by 18 or the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 Having substantially the same activity as a peptide having the DNA and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 17 (eg, a binding activity to the protein of the present invention; Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having the following functions.
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: No .: 16 or DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 include, for example, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 Alternatively, a DNA containing a nucleotide sequence having 95% or more, preferably about 97% or more, more preferably about 99% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 is used.
  • examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 include, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, or DNA represented by SEQ ID NO: 26 A DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the base sequence to be sequenced; SEQ ID NO: DNA encoding a peptide having substantially the same activity as that of the peptide having the amino acid sequence represented by 25 (eg, binding activity to the protein of the present invention, signal transduction via the protein of the present invention, etc.) Any one may be used.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28, and the like. '
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 under high stringency conditions include, for example, 95% or more, preferably 95% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.6.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 97% or more, more preferably about 99% or more is used.
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 includes, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31
  • An amino acid represented by SEQ ID NO: 29, comprising DNA having a base sequence represented by DNA or SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31 and DNA hybridizing under high stringency conditions; Any DNA encoding a peptide having substantially the same activity as the peptide having the sequence (eg, binding activity to the protein of the present invention, signal transduction via the protein of the present invention, etc.) Good.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31 include SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 3Q, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 31 A DNA containing the represented base sequence.
  • Examples of the DNA that hybridizes under high stringent conditions with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31 include, for example, SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 95% or more, preferably about 97% or more, more preferably about 99% or more with the nucleotide sequence represented is used.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 include, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39 , Or SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the base sequence to be expressed, and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 (
  • any DNA can be used as long as it encodes a protein having a ligand binding activity, a signal transduction action, and the like.
  • Examples of the DNA that hybridizes with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39 under eight stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the base sequence represented by 39 is used.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 include, for example, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 43, or SEQ ID NO: 43 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having a base sequence that is substantially identical to the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 (eg, Any DNA may be used as long as it encodes a protein having a binding activity to the peptide of the present invention, a signal transduction action, and the like.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43 under high stringent conditions include, for example, about 90% of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 43 As described above, DNA containing a nucleotide sequence having a homology of preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more is used.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 include, for example, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 45, or DNA represented by SEQ ID NO: 45 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having a base sequence that is substantially identical to the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 (eg, the present invention) Any DNA may be used as long as it encodes a protein having a binding activity to a peptide, a signal transduction action, and the like. ,
  • DNA that hybridizes with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 45 under high stringency conditions include, for example, SEQ ID NO: 45 DNA containing a base sequence having about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more homology with the represented base sequence is used.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 is, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the same, and having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 (eg, a binding activity to the peptide of the present invention) And DNA encoding a protein having a signal transduction action.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41 under high stringency conditions include, for example, about 90% or more, and preferably about 90% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 is, for example, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 47, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 47 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the same amino acid sequence, and having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 (eg, binding to the peptide of the present invention) Any DNA may be used as long as it encodes a protein having activity, signal transduction action, and the like.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 47 under high stringent conditions include, for example, about 95% or more, preferably about 95% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 47.
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 97% or more, more preferably about 98% or more is used.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 is, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the amino acid sequence, and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 (eg, the peptide of the present invention) Encoding a protein that has a binding activity to
  • Any DNA can be used.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49 under high stringency conditions include, for example, about 95% or more, preferably about 95% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 is, for example, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the same amino acid sequence and having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 (eg, binding to the peptide of the present invention) Any DNA can be used as long as it encodes a protein having an activity, a signal transduction action, etc.).
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51 under high stringent conditions include, for example, 95% or more, preferably about 97%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51. % Or more, more preferably about 99% or more.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 include, for example, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53 Having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA having the same, and having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 (eg, binding to the peptide of the present invention) Any DNA can be used as long as it encodes a protein having an activity, a signal transduction action, etc.).
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53 under high stringent conditions include, for example, 95% or more, preferably about 95% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 97% or more, more preferably about 99% or more, is used.
  • Hybridization is performed by a method known per se or a method similar thereto, for example, For example, Molecular cloning (Molecular Cloning) 2nd (J.
  • the conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. Indicates conditions. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable. '
  • examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO:
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by 3 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • Examples of the DNA encoding the peptide include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, and a DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • examples thereof include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • a DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 includes SEQ ID NO: 1.
  • the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is exemplified by the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 14;
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, and the DNA containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17
  • Examples of the DNA encoding the peptide represented by SEQ ID NO: 18 include a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, and the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19
  • a salt represented by SEQ ID NO: 20 Contains base sequence Examples of the DNA encoding the peptide containing the
  • Examples of the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by 23 include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 24, and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25
  • Examples of the DNA encoding the peptide include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 26.
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 include the sequence: Examples include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28, and a DNA encoding a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is represented by SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31.
  • DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 is exemplified by DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33
  • Examples of the DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 35.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39, and SEQ ID NO: Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by 42 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 43, and a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44
  • the DNA encoding the protein comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 45 is exemplified as the DNA encoding SEQ ID NO: 45.
  • the DNA encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 is represented by SEQ ID NO: 41
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 is exemplified by the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 47.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 49.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51.
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 is, for example, a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53. .
  • nucleotide oligonucleotide containing the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA encoding the peptide of the present invention or a part thereof only includes the DNA encoding the peptide of the present invention. Instead, it is used to include RNA.
  • an antisense (oligo) nucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting replication or expression of the gene of the peptide of the present invention is cloned or obtained from a DNA encoding a determined peptide.
  • Such (oligo) nucleotides (nucleic acids) can hybridize with the gene RNA of the peptide of the present invention, inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the peptide-related RNA of the present invention. Through the action, the expression of the gene of the peptide of the present invention can be regulated and controlled.
  • the (oligo) nucleotide complementary to the selected sequence of the peptide-related RNA of the present invention and the (oligo) nucleotide capable of specifically hybridizing with the peptide-related RNA of the present invention are obtained in vivo and in vivo.
  • it is useful for regulating and controlling the expression of the peptide gene of the present invention outside, and also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • corresponding means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. “Corresponding” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide usually refers to the amino acids of the peptide as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • 5'-end hairpin loop of the peptide gene of the present invention 5, end 6-base spare repeat, 5, end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation termination codon,
  • the 3′-end untranslated region, the 3′-end palindrome region, and the 3′-end hairpin loop can be selected as preferable regions of interest, but any region within the gene of the peptide of the present invention can be selected as the region of interest.
  • the relationship between the target nucleic acid and the (oligo) nucleotide complementary to at least a part of the target region means that the relationship with the (oligo) nucleotide that can hybridize with the target is “antisense”. Can be. Antisense ⁇
  • nucleotides can be 2-deoxy D-report containing polydeoxynucleotides, D-report containing polydeoxynucleotides, N-glycosides of purine or pyrimidine bases or other Type of polynucleotide or other polymer having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (where the polymer is D Base pairs found in NA or RNA (contains nucleotides having a configuration permitting base attachment)).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides or unmodified oligonucleotides. , Or with known modifications, e.g., those with a label, cap, methylated, or one or more naturally occurring nucleotides with analogs, as known in the art.
  • an intramolecular nucleotide for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, phosphorothioate , Phosphorodithioate, etc.), such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies) , Signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (for example, monosaccharides), etc., or those having an intercurrent compound (for example, acridine, psoralen, etc.) Containing chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), containing alkylating agents, and having modified bonds (eg, anomeric nucleic acids) Etc.).
  • an uncharged bond eg, methylphosphonate, phosphotriester,
  • nucleoside may include not only those containing purine and dipyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, Alternatively, it may contain another heterocyclic ring. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense nucleic acids of the present invention are RNAs, DNAs or modified nucleic acids.
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, those which are resistant to decomposition of nucleic acid sulfur derivative ⁇ thiophosphoate derivative and polynucleoside amide ⁇ oligonucleoside amide.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to increase the affinity for the target sense strand, and to antisense if toxic. Make nucleic acids less toxic.
  • antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, applied by gene therapy, or added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, and lipids, which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids (
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'or 5' end of the nucleic acid and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or 5' end of nucleic acids, which prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Groups for such caps include polyethylene glycol, tet Examples include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as ethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a protein.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • any DNA may be used as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, cDNA library derived from the above-mentioned cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 or SEQ ID NO: 53, or (ii) SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 or DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 53 and high stringent conditions
  • a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a protein having a DNA that hybridizes below and having substantially the same activity as the protein of the present invention eg, a binding activity to the peptide of the present invention, a signal transduction effect
  • DNA that hybridizes with DNA having a sequence under high stringency conditions include, for example, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47 , It contains a nucleotide sequence having about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 or SEQ ID NO: 53. DNA or the like is used.
  • amplification by the PCR method using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence of the DNA encoding the peptide of the present invention is performed.
  • hybridization of DNA incorporated into an appropriate vector and labeled with a DNA fragment or a synthetic DNA encoding a part or the entire region of the peptide of the present invention. Can be sorted out.
  • the hybridization method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Cloning of a DNA completely encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention) is performed in the same manner as cloning of a DNA completely encoding the peptide of the present invention. be able to.
  • the DNA base sequence can be converted using the ODA-LA PCR method using PCR or a known kit, for example, Mutan TM -Super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM- K (Takara Shuzo) or the like. It can be carried out according to a method known per se, such as the Gupped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned peptide or protein can be used as it is, or after digestion with a restriction enzyme, if desired, to which a linker has been added.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codons and translation termination codons can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the peptide and protein expression vectors of the present invention include, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the peptide / protein of the present invention;
  • the vector examples include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pB325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from a rich mother (Eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
  • Escherichia coli eg, pBR322, pB325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • bacteriophages such as phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
  • XT 1 pRc / CMV, pRc / RSV, pc DNA I Neo, pc DN A3.1, pRc / CMV2, pRc / RSV (Invitrogen) and the like are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRo! Promoter SV40 Promoter, HIV-LTR Promoter, CMV promoter, HSV-TK Promoter, and the like can be mentioned.
  • CMV promoter an SR promoter and the like.
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, lac promoter, re cA promoter Isseki one, AP L promoter one, lpp promoter - evening one, etc.
  • bacteria of the genus Bacillus SPO l promoter
  • yeast such as SP02 promoter and pen P promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may further contain, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene (methotrexate (MTX) resistance), ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 1 ), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance), etc.
  • dh fr gene when used as a selection marker using CH ⁇ (dh fr ") cells, the target gene can also be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal of the protein of the present invention.
  • the host is Escherichia ⁇ , Pho A signal sequence, OmpA signal sequence, etc.
  • the host is Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin, signal sequence, etc.
  • the MF signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. and when the host is an animal cell, the insulin signal sequence, high interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Available for each.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12-DH1 (Proc. Natl. Acad.. Sci. USA, 60, 160 (1968)), JMl 03 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB 101 [Journal of
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI 114 14 61 ⁇ , 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22 R—, ⁇ 87-11 A, DKD—5D, 20 B—12, Schizosaccharomyces pombe N CYC 1913, NCYC2036, Pichia pastoris and the like are used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, Derived cell line (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from Tricoplusia ni midgut, High Five TM cell derived from Trichoplusia ni egg,
  • Sf cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from EsUgmena acrea are used.
  • viruses When the virus is BmNP V, a silkworm-derived cell line (Borabyx niori N; Bm N cell) or the like is used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, J.L., et al., In Vivo (Inc.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Nature, vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter CHO (dhfr_) cell). Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation of the genus Escherichia can be performed, for example, according to the method described in Pro atl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 Q972) or Gene, 17, 107 (1982).
  • -Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells can be performed, for example, according to the method described in Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 2632-67 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). Can be done.
  • a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the G protein-coupled protein is obtained.
  • a liquid medium is suitable as a culture medium, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein. Nitrogen source Inorganic substances and others are contained.
  • Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, Inorganic or organic substances such as potato extract and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] is preferable.
  • a drug such as 3 / 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Burkholder's minimal medium Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] or 0. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)] SD medium containing 5% casamino acid.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually performed for about 24 to 72 hours at about 20 to 35 t, and aeration and stirring are added as necessary.
  • a medium such as 10% serum serum immobilized in Grace's Insert Medium (Nature, 195, 788 (1962)) is added. What added the thing suitably is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM Medium [Virology, Vol. 8, 3960959)], RPMI 1640 medium [The
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the peptide protein of the present invention can be produced in the transformant, inside the cell membrane, or outside the cell.
  • the peptide / protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the peptide or protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and then sonicated, lysozyme and / or frozen. After the cells or cells are destroyed by thawing or the like, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • Purification of the peptide-protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Mainly using differences in molecular weight, methods using charge differences such as ion exchange chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, etc. Methods utilizing the difference in hydrophobicity, methods utilizing the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, etc. are used. ' When the peptide / protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto. It can be converted to a free form or another salt by an analogous method.
  • the peptide or protein produced by the recombinant may be arbitrarily modified, or the peptide or polypeptide may be partially removed before or after purification by the action of an appropriate protein-modifying enzyme.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the thus-produced peptide of the present invention can be measured by a binding experiment between the labeled peptide of the present invention and the protein of the present invention, and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • the activity of the produced protein of the present invention can be measured by a binding experiment with a labeled peptide of the present invention and an enzymimnoassay using a specific antibody.
  • the peptide of the present invention may be produced as an active peptide by expressing it in a prokaryotic host by genetic engineering and refolding it in a redox buffer (W002 / 57443).
  • An antibody against the peptide of the present invention, the protein of the present invention or its partial peptide, or a salt thereof is an antibody that can recognize the peptide of the present invention, the protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof.
  • Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are examples of monoclonal antibodies.
  • Antibodies against the peptide of the present invention, the protein of the present invention or a partial peptide thereof, or a salt thereof can be obtained by using the peptide / protein of the present invention as an antigen. It can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
  • the peptide and protein of the present invention can produce antibodies by administration to mammals It is administered by itself or together with a carrier or diluent to a suitable site.
  • complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered.
  • Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the titer of the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled peptide / protein of the present invention described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antiserum.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • a fusion promoter for example, polyethylene glycol
  • PEG and Sendai virus.
  • PEG is preferably used.
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2Z0 and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at about 20 to 40 ° C, preferably about 30 to 37 for about 1 to 10 minutes.
  • hybridoma culture on a solid phase eg, microplate
  • a carrier e.g., a cell phase
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice
  • the hybridoma culture supernatant is added to the solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, and the peptide and protein of the present invention labeled with a radioactive substance, enzyme, etc. are added to the solid phase.
  • a method for detecting the bound monoclonal antibody is exemplified.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, but is usually carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPM ⁇ 164 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ))
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies.Immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers) (E.g., DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific antibody is obtained by collecting only the antibody using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociating the bond to obtain the antibody Purification method].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers
  • DEAE adsorption / desorption method
  • ultracentrifugation method ultracentrifugation method
  • gel filtration method specific antibody is obtained by collecting only the antibody using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen of the peptide / protein of the present invention) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. The antibody content for the peptide 'protein was collected and the antibody was separated and purified. Can be manufactured more.
  • the type of carrier protein and the mixture ratio of the carrier protein and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier. Any ratio may be used as long as it can be efficiently used.
  • a method of coupling at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to hapten 1 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the peptide of the present invention a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as MIT 1 class) or
  • the protein of the present invention, a polynucleotide encoding the same, or an antibody against the same can be obtained by a simple search method (screening) for obtaining a feeding regulator, obesity [eg, malignant mastocytosis]. is), exogenous obesity (exogenous obesity), hyperinsulin obesity (hyperinsulinar obesity), hyperplasmic obesity, pituitary obesity (hypophyseal adiposity), hypoplasmic obesity (hypoplasmic
  • hypothyroid obesity hypothyroid obesity
  • hypothalamic obesity hypothyroid obesity
  • hypothalamic obesity symptomatic obesity
  • child obesity infantile obesity
  • upper body obesity upper body obesity
  • the protein agonist of the present invention is useful as an excellent prophylactic / therapeutic agent for eating disorders and the like, and the protein agonist of the present invention is useful as an excellent prophylactic / therapeutic agent for obesity.
  • a protein of the present invention a DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter, sometimes abbreviated as the DNA of the present invention), an antisense DNA of the present invention, and an antibody against the peptide of the present invention (hereinafter, the present invention) May be abbreviated as antibody)
  • an agent for preventing or treating various diseases related to the protein of the present invention (i) an agent for preventing or treating various diseases related to the protein of the present invention; (ii) screening of a compound or a salt thereof that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention; (iii) Quantification of the protein of the present invention, (iv) a gene diagnostic, (v) a drug containing an antisense DNA, (vi) a drug and a diagnostic containing the antibody of the present invention, and (vii) a non-drug having the DNA of the present invention. It is useful for the production of human animals, and (viii) the implementation of drug design based on comparison with structurally similar ligands / receptors.
  • a compound that changes the binding property of the ligand to the protein of the present invention which is specific to humans and mammals (for example, ZAQ agonist, ZAQ antagonist, etc.) can be screened, and the agonist or antagonist can be used as an agent for preventing or treating various diseases.
  • a feeding regulator comprising a compound or a salt thereof that inhibits or promotes a chemical action.
  • the compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention may be any compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention. Examples thereof include an antifeedant effect, a hypothermic effect, and a control of intestinal contraction. And a compound that inhibits the activity, the binding activity to the protein of the present invention, the signal transduction action via the protein of the present invention, and the like.
  • the compound that promotes the activity of the peptide of the present invention may be any compound that promotes the activity of the peptide of the present invention.
  • a compound that has a feeding-promoting action and a body temperature-increasing action Compounds that promote intestinal contraction control activity, binding activity to the protein of the present invention, signal transduction action via the protein of the present invention, and the like.
  • the compound that inhibits the activity of the protein of the present invention may be any compound that inhibits the activity of the protein of the present invention. Examples thereof include a binding activity to the peptide of the present invention, a signal transduction action, and the like. And the like.
  • the compound that promotes the activity of the protein of the present invention may be any compound that promotes the activity of the protein of the present invention. Examples thereof include a binding activity to the peptide of the present invention and a signal information transduction action. And the like.
  • the compound that promotes the binding between the peptide or the MIT 1s of the present invention and the protein of the present invention includes the compound that promotes the binding between the peptide or the MIT 1s of the present invention and the protein of the present invention. Any compound may be used.
  • the activity of activating the protein of the present invention, the compound of the present invention or the MIT 1 class can activate the protein of the present invention.
  • Any compound that inhibits, for example, the peptide of the present invention Examples include compounds that inhibit the activity of the protein of the present invention for the peptide of the present invention, the signal transduction activity, and the like, by the tide or MIT 1 class.
  • the compound that promotes the activating action of the peptide or MIT 1 of the present invention on the protein of the present invention includes the activating action of the peptide or MIT 1 of the present invention on the protein of the present invention.
  • Any compound that promotes, for example, a compound that promotes the binding activity of the protein of the present invention to the peptide of the present invention, the signal transduction action, and the like by the peptide of the present invention or MIT 1 class is mentioned.
  • the compound (0 to (iv) or a salt thereof can be obtained, for example, by using a screening method or a screening kit of the present invention described below.
  • a pharmaceutically acceptable salt Salts are used, for example, salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • the salts of the above include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt, ammonium salt and the like.
  • salts of the following are, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, dieethanol.
  • examples thereof include salts with luminamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, ⁇ , ⁇ ′-dibenzylethylenediamine, etc.
  • Preferred examples of the salt with an inorganic acid include, for example, Examples include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.
  • salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, and maleic acid , Succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and salts with benzoic acid.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, and oltinin.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, salts with aspartic acid, dalminic acid, and the like. Is raised.
  • the above compound or a salt thereof is used, for example, as a low-toxic and safe food intake regulator.
  • a compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention or a salt thereof include, for example, eating disorders (eg, anorexia nervosa bulimia), sleep disorders [eg, primary insomnia, circadian Rhythm disorder (eg, modulation of physical condition due to three shifts, time band change syndrome (jet lag), etc.), seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disease, senile dementia, Alzheimer's disease, various disorders associated with aging , Cerebral circulation disorders (eg, stroke), head trauma, spinal cord injury, epilepsy, anxiety, depression, manic depression, schizophrenia
  • a compound or a salt thereof that inhibits or promotes binding to a protein, or (iv) a compound or a salt thereof that promotes the activating action of the peptide or MIT 1 of the present invention on the protein of the present invention includes, for example, obesity ( Examples: malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, pediatric Obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc., eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.), sleep disorders [ Eg, primary insomnia, general Rhythm disorder (eg, modulation of physical condition due to three shifts, time band change syndrome (jet lag), etc.), seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disease, senile dementia, Alzheimer's disease, various disorders associated with aging
  • the screening method of the present invention When used as such a medicament, the screening method of the present invention described below and the like. Alternatively, it can be carried out in the same manner as when a compound obtained by using a screening kit is used as a drug.
  • antisense nucleotide can suppress the function of the peptide of the present invention or its DNA in a living body, for example, as an eating regulator, for example, an eating disorder (eg, It is used safely as a drug for the prevention and treatment of anorexia nervosa, bulimia, etc.
  • the antisense DNA can be administered alone or in a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector or the like, and then administered in a conventional manner.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a gel for Hyde mouth gel.
  • a prophylactic / therapeutic agent for an eating disorder comprising an antibody against the peptide of the present invention or an antibody against the protein of the present invention
  • the above-mentioned antibody is useful for preventing diseases caused by overexpression of the peptide of the present invention or the protein of the present invention, for example, as an eating control agent, for example, for preventing eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.) It is used safely as a drug such as a therapeutic agent.
  • an eating control agent for example, for preventing eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.) It is used safely as a drug such as a therapeutic agent.
  • a diagnostic agent for eating disorders or obesity comprising the peptide of the present invention or the polynucleotide encoding the protein of the present invention
  • the polynucleotide can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, egret, bird, hitch). Diabs, pigs, pests, pomas, cats, dogs, monkeys, etc.) can detect abnormalities (genetic abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the peptide of the present invention or the protein of the present invention in the present invention. For example, it is useful as a diagnostic agent for a gene such as damage, sudden mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, and increase or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • a human or warm-blooded animal eg, rat, mouse, guinea pig, egret, bird, hitch.
  • Diabs, pigs, pests, pomas, cats, dogs, monkeys, etc. can detect abnormalities (genetic abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the peptide of the present
  • the above-mentioned genetic diagnosis can be performed by, for example, the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)), and DNA microarrays.
  • a decrease in expression is detected by a DNA microarray, or when a DNA mutation is detected by PCR-SSCP or DNA microarray, for example, eating disorders (eg, anorexia, Binge eating), obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamus Obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.) Can be diagnosed.
  • eating disorders eg, anorexia, Binge eating
  • obesity eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamus Obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism, systemic mastocytos
  • the screening kit (hereinafter sometimes abbreviated as the screening method of the present invention or the screening kit of the present invention) characterized by using the MIT class 1 and the protein of the present invention provides, for example, the peptide of the present invention.
  • a compound that alters the binding between the MIT 1 class and the protein of the present invention preferably
  • the above-mentioned compound of the present invention that inhibits the activity of the peptide inhibits the activity of the peptide of the present invention.
  • examples thereof include an antifeedant effect, a hypothermia effect, an intestinal contraction control activity, and a binding activity to the protein of the present invention. It inhibits signal transduction via the protein of the present invention.
  • the compound that promotes the activity of the peptide of the present invention promotes the activity of the peptide of the present invention.
  • examples thereof include an antifeedant effect, a hypothermia effect, an intestinal contraction control activity, a binding activity to the protein of the present invention, It promotes signal transduction through the protein of the present invention.
  • the compound that promotes the activity of the protein of the present invention promotes the activity of the protein of the present invention, for example, promotes the binding activity to the peptide of the present invention, the signal transduction action, and the like.
  • the above compound or a salt thereof is used, for example, as a low-toxic and safe food intake regulator.
  • a compound or a salt thereof that inhibits binding to a protein, or (iv) a compound or a salt thereof that inhibits the activity of activating the protein of the present invention, such as the peptide or MIT 1 of the present invention includes, for example, an eating disorder (eg, Anorexia nervosa, bulimia nervosa, etc.), sleep disorders [eg, primary insomnia, circadian rhythm disorder (eg, physical shift due to three shift work, time band change syndrome (jet lag), etc.)], seasonal depression, reproductive Dysfunction, endocrine disease, senile dementia, Alzheimer's disease, aging related disorders, brain Circulatory disorders (eg, stroke), head trauma, spinal cord injury, epilepsy, anxiety, depression, manic depression, schizophrenia, alcoholism, Parkinson's disease, hypertension, arteriosclerosis, arrhythmia, premenstrual syndrome, It is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for glaucoma, cancer, AIDS and diabetes. It is preferably
  • a compound or a salt thereof that inhibits or promotes binding to a protein, or (iv) a compound or a salt thereof that promotes the activating action of the peptide or MIT 1 of the present invention on the protein of the present invention includes, for example, obesity ( Examples: malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, pediatric Obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc., eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.), sleep disorders [ Eg, primary insomnia, general Rhythm disorder (eg, modulation of physical condition due to three shifts, time band change syndrome (jet lag), etc.), seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disease, senile dementia, Alzheimer's disease, various disorders associated with aging
  • the protein of the present invention or constructing a recombinant expression system of the protein of the present invention, and using the peptide-binding assay system (ligand / receptor atsei system) of the present invention using the expression system (E.g., peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof, etc., which alter the binding between the peptides or MITs of the present invention and the proteins of the present invention. Can be screened.
  • the expression system E.g., peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • Such compounds have a cell stimulating activity (for example, a protein) via the protein of the present invention.
  • a cell stimulating activity for example, a protein
  • Compounds having an activity of promoting or suppressing activation, reduction of pH, etc. (agonists) and compounds not having the cell stimulating activity (antagonists) are included.
  • "Altering the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention” includes both cases of inhibiting and promoting the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention. .
  • the present invention relates to (i) the case where the protein of the present invention is brought into contact with the peptide of the present invention, and (ii) the case where the above-mentioned protein of the present invention is brought into contact with the peptide of the present invention and a test compound. It is intended to provide a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention, which is characterized by performing a comparison.
  • MIT1s may be used in the same manner as the peptide of the present invention.
  • the screening method of the present invention (i) when the peptide of the present invention is brought into contact with the protein of the present invention, and (ii) when the peptide of the present invention and a test compound are brought into contact with the protein of the present invention.
  • the amount of the peptide of the present invention bound to the protein of the present invention, the cell stimulating activity and the like are measured and compared.
  • Specific examples of the screening method of the present invention include, for example,
  • a cell-stimulating assay system such as the screening method described in item 0).
  • the protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any protein containing the above-mentioned protein of the present invention.
  • the protein of the present invention and the like which is expressed in a large amount using a recombinant, is suitable for screening.
  • endothelial cells derived from mammals can also be used.
  • the preparation method described later may be followed.
  • the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the protein of the present invention refers to a host cell expressing the protein of the present invention.
  • the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like. '
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after cell disruption.
  • Cell crushing method is Potter-
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short period of time (usually about 1-10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000-30000 rpm) for 30 minutes to 2 hours.
  • the membrane fraction is rich in the expressed protein of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the protein of the present invention in the cells or membrane fraction containing the protein of the present invention is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. It is.
  • endothelial cells derived from mammals include endothelial cells of humans, monkeys, mice, mice, rats, mice, etc. (eg, arterial vascular endothelial cells, capillary endothelial cells, etc.).
  • a capillary endothelial cell which is one of mammalian-derived capillary endothelial cells, can be prepared by the following method.
  • capillary endothelial cells can be prepared from mammalian brain, ovaries, and the like.
  • a protein fraction of the present invention and a peptide of the present invention are used.
  • the protein fraction of the present invention is preferably a natural protein fraction of the present invention, or a recombinant protein fraction of the present invention having an activity equivalent thereto.
  • “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity and the like.
  • Labeled as peptides of the present invention for example, a radioactive isotope (e.g., [125 I], [
  • fluorescent substances e.g., Shianin fluorescent dyes (e.g., Cy2, Cy3, Cy5, Cy5 . 5, Cy7 ( manufactured by Amersham Biosciences), etc.), Furuoresukamin, Furuore Tsu Sen isothiocyanate Xia sulfonates, etc.] , Enzymes' (eg, 3-galactosidase, ⁇ - Books labeled with lucosidase, alkaline phosphatase, oxidase, malate dehydratase, etc., luminescent substances (eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.), piotin, lanthanide, etc.
  • Shianin fluorescent dyes e.g., Cy2, Cy3, Cy5, Cy5 . 5, Cy7 ( manufactured by Amersham Biosciences), etc.
  • Furuoresukamin e.g., Furuore Tsu Sen isothiocyanate
  • the peptide of the present invention preferably the peptide of the present invention labeled with a radioisotope, and the like can be used.
  • a labeled product of the peptide of the present invention prepared by a known method using Bolton-Hunter reagent can also be used.
  • the protein preparation of the present invention is prepared by suspending in a buffer. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding of the peptide of the present invention to the peptide of the present invention, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer. .
  • a surfactant such as CHAPS., Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), or peptidyltin may be added to suppress the degradation of the protein of the present invention or the peptide of the present invention by a protease. it can.
  • the main onset Ming protein solution 0. 01 ⁇ 10ml, added labeled peptide of the present invention a certain amount (5000 ⁇ 500000cpni), coexist simultaneously 10- 4 to 1 (test compound TM.
  • a reaction tube containing a large excess of the unlabeled peptide of the present invention is also prepared to determine (NSB).
  • the reaction is carried out at a temperature of 50 ° C, preferably 4 to 37 ° C, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation gun or an counter.
  • the count (B 0 -NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the force (B.) when no antagonist is present is defined as 100%, the specific binding amount (B-NSB) Can be selected as candidate compounds with competitive inhibition ability
  • BIAcore Analog Pharmacia Biotech
  • a peptide of the present invention is immobilized on a sensor chip by an amino coupling method according to a protocol attached to a device, and a cell containing a protein of the present invention or a trait containing a DNA encoding the protein of the present invention.
  • a protein buffer of the present invention purified from the transformant or a membrane fraction containing the protein of the present invention, or a purified protein membrane of the present invention or a membrane fraction containing the protein of the present invention and a phosphate buffer or Tris buffer containing a test compound.
  • the buffer is passed over the sensor chip at a rate of 2 to 201 per minute.
  • the protein of the present invention and the present invention are observed. Screening of a compound that changes the binding to a peptide can be performed.
  • the protein of the present invention is immobilized on a sensor chip, and a buffer such as a phosphate buffer or a tris buffer containing the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound is passed over the sensor chip.
  • a buffer such as a phosphate buffer or a tris buffer containing the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound is passed over the sensor chip.
  • the same method can be used for the measurement. Examples of the test compound include the same compounds as described above.
  • onset Ming proteins e.g., Arakidon acid release, Asechirukori emissions release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P Production, intracellular c-GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • the measurement can be performed using a method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the protein of the present invention are cultured on a multiwell plate or the like.
  • cells expressing an appropriate protein of the present invention are used.
  • the cells expressing the protein of the present invention are preferably the above-mentioned recombinant cell lines expressing the protein of the present invention.
  • the transformant-expressing cell for expressing the protein of the present invention may be a stable expression strain or a transient expression strain.
  • the same kind of animal cells as those described above are used.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • GTPaS When a receptor-expressing cell is stimulated by a receptor agonist, an intracellular G protein is activated and GTP is bound. This phenomenon is also observed in the membrane fraction of receptor-expressing cells. Normally, GTP is hydrolyzed and changes to GDP.At this time, if GTP rS is added to the reaction solution, GTP rS binds to G protein like GTP, but is hydrolyzed. Instead, it remains bound to the cell membrane containing the G protein. When labeled GTPaS is used, the activity of stimulating the receptor-expressing cells of the receptor agonist can be measured by measuring the labeled GTPaS remaining on the cell membrane.
  • the stimulating activity of the peptide of the present invention on the cell expressing the protein of the present invention is measured, and thereby the compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened. be able to.
  • This method is performed using a membrane fraction containing the protein of the present invention.
  • a substance exhibiting GTP rS binding promoting activity to the protein membrane fraction of the present invention is an agonist.
  • the presence of labeled GTP T S, in the case where the peptides of the present invention is brought into contact with the protein membrane fraction of the present invention, the peptides of the present invention and a test compound to a protein the cell membrane fraction of the present invention The GTP rS binding promoting activity to the protein cell membrane fraction of the present invention upon contact is measured and compared to screen for a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. .
  • G is added to the protein cell membrane fraction of the present invention by the peptide of the present invention.
  • a test compound showing an activity of suppressing the T P rs binding promoting activity can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein cell membrane fraction of the present invention and measuring the activity of promoting GTPrS binding to the protein cell membrane fraction of the present invention.
  • the cell membrane fraction containing the protein of the present invention prepared according to a known method is diluted with a membrane diluent buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCK luM GDP ⁇ 0.1% BSA; pH 7.). .
  • the dilution ratio depends on the expression level of the receptor. This is dispensed to Falcon2053 in an amount of 0.2 ml each, to which the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are added, and [ 3 ] GTPas is added to a final concentration of 200 pM.
  • test for GTP T S binding promoting activity by peptides of the present invention Calculate the effect of the compound.
  • a test compound having a GTP rS binding promoting activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • the production of intracellular cAMP is suppressed by the stimulation of the peptide of the present invention.
  • a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be screened. I can do it.
  • the case where the peptide of the present invention is brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention in the presence of a substance that increases the amount of intracellular cAMP the case where the peptide of the present invention and the test compound are the same as those of the present invention
  • the peptide of the present invention and the present invention are compared. Screen for compounds that alter the binding to the light protein.
  • forskolin, calcitonin, and the like are used as substances that increase the amount of intracellular cAMP.
  • the amount of cAMP produced in the cells expressing the protein of the present invention is determined by using an anti-cAMP antibody obtained by immunizing a mouse, a rat, a rabbit, a goat, a rabbit, and the like, and [ 125 1] -labeled cAMP (both commercially available products). Can be measured using the RIA system or the EIA system combining anti-cAMP antibody and labeled cAMP.
  • the anti-cAMP Bou body, protein A or beads containing scintillant which is secured using such antibodies to such anti-cAMP antibody production in using animals ⁇ G [125 1] -labeled c AMP using the SPA ( Quantification by Scintill at Proximity Assay) is also possible (using a kit from Amersham Pharmacia Biotech).
  • a test compound showing the activity of inhibiting the activity of the peptide of the present invention to inhibit cAMP production of the cell expressing the protein of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • a compound exhibiting agonist activity can be screened by contacting only the test compound with the cell expressing the protein of the present invention and examining cAMP production inhibitory activity.
  • Protein expressing cells of the present invention e.g., animal cells such as CH0 cells); 5XL 0 4 in (eg, ZAQC- B1 cells W0 01/16309 Patent described in Example 3 of JP) 24-well plates cel 1 / wel 1 And incubate for 48 hours. Wash the cells with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate in the incubator for 30 minutes.
  • Hanks buffer pH 7.4
  • reaction buffer containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES
  • reaction buffer 0.25 ml of the reaction buffer is added to the cells, and then contains IM peptide of the present invention or IM peptide of the present invention and forskolin to which a test compound is added.
  • 0.25 ml of reaction buffer to the cells and incubate at 37 for 24 minutes. Stop the reaction by adding 100 1 of 20% perchloric acid, and then place on ice for 1 hour to extract intracellular cAMP. Determine the amount of cAMP in the extract using the cAMP EIA kit (Amersham H) Measure using.
  • a test compound for the cAMP production inhibitory activity of a peptide of the present invention where the amount of cAMP produced by stimulation of forskolin is 100% and the amount of cAMP suppressed by the addition of 1 M of the peptide of the present invention is 0%, Calculate the effect of A test compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention and has cAMP production activity of, for example, 50% or more can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • the protein-expressing cell of the present invention which exhibits the property of increasing the intracellular cAMP level upon stimulation of the peptide of the present invention
  • the peptide of the present invention and a test compound are brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention, the activity of the cell for promoting the production of intracellular cAMP is measured and compared to obtain the peptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • Compounds that alter the binding to can be screened.
  • a test compound showing an activity of inhibiting the cAMP production promoting activity of the protein of the present invention by the peptide of the present invention by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • a compound exhibiting agonist activity can be screened by contacting only the test compound with the protein-expressing cell of the present invention and examining cAMP production promoting activity.
  • the activity of promoting AMP production can be determined by adding the peptide of the present invention or the peptide of the present invention to cells expressing the protein of the present invention (eg, animal cells such as CHO cells) without adding forskolin in the above screening method.
  • CAMP produced by adding the compound is quantified and measured by the method described above.
  • the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be determined by measuring the stimulating activity of the peptide of the present invention on cells expressing the protein of the present invention using the CRE-repo overnight gene vector. Compounds to be altered can be screened.
  • DNA containing CRE (cAMP response element) is inserted into the repo overnight gene upstream of the vector to obtain a CRE-repo overnight gene vector.
  • CRE cAMP response element
  • stimulation with an increase in cAMP is performed.
  • Intensity induces CRE-mediated reporter gene expression and subsequent production of the reporter gene gene product (protein).
  • protein reporter gene gene product
  • the peptide of the present invention is brought into contact with the CRE-repo overnight gene vector-transfected protein-expressing cell of the present invention, Introducing the CRE-repo overnight gene vector into a test compound, the enzyme activity of the reporter gene protein in the case where the cell is expressed with the protein-expressing cell of the present invention is measured and compared with that of the peptide of the present invention.
  • a compound that changes the binding property to the protein of the present invention is screened.
  • a substance that increases the amount of intracellular cAMP for example, forskolin, calcitonin and the like are used.
  • Examples of the vector include Pitka Gene Basic Vector and Pitka Gene Enhansa Vector (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.).
  • the CRE-containing DNA is inserted into the repo overnight gene of the above vector, for example, a multi-cloning site upstream of the luciferase gene, to obtain a CRE-reporter gene vector.
  • a test compound that restores the suppression of the enzymatic activity of the repo overnight gene protein by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cells of the present invention and measuring the same suppression of the amount of luminescence increased by forskolin stimulation as the peptides of the present invention. .
  • the protein-expressing cells of the present invention into which the CRE-reporter gene (luciferase) has been introduced are seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / well and cultured for 48 hours. Wash the cells with Hanks buffer (PH7.4) containing 0.2 mM .3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as 'reaction buffer 1'). That Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate in the incubator for 30 minutes.
  • Hanks buffer PH7.4
  • 'reaction buffer 1' containing 0.2 mM .3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES
  • reaction buffer (1) Except for the reaction buffer (1), 0.25 ml of the reaction buffer was added to the cells, and then 2 M forskolin containing 1 / M of the peptide of the present invention or 1 of the peptide of the present invention and the test compound was added. Add 0.25 ml of reaction buffer containing to the cells and incubate at 37: for 24 minutes. Lyse the cells with a cell lysing agent for Pitka Gene (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) and add a luminescent substrate (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) to the lysate. Luminescence from luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter. The amount of luminescence by luciferase when the peptide of the present invention alone is added and when 1 M of the peptide of the present invention and a test compound are added are measured and compared.
  • a cell lysing agent for Pitka Gene Toy
  • the peptide of the present invention suppresses an increase in light emission by luciferase based on forskolin stimulation.
  • a compound that restores the inhibition can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability. .
  • reporter genes for example, alkaline phosphatase, chloramphenicone,
  • acetyl trans f erase and a gene such as 3-galactosidase may be used.
  • the enzymatic activity of these repo overnight gene proteins is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit.
  • Alkaline phosphatase activity was measured using, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical, and chloramphenicol'acetyltransferase was evaluated using, for example, FAST CAT chrol ampheni col manufactured by Wako Pure Chemical.
  • Acetyl trans erase erase Assay KiT 3) -Galactosidase activity is measured using, for example, Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • the protein-expressing cells of the present invention release arachidonic acid metabolites extracellularly by stimulation of the peptides of the present invention.
  • the stimulating activity of the peptide of the present invention on the cell expressing the protein of the present invention is measured to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. be able to.
  • the arachidonic acid metabolite release activity was released extracellularly by incorporating the labeled arachidonic acid in advance into the protein-expressing cells of the present invention. It can be measured by measuring the labeled arachidonic acid metabolite. Specifically, when the peptide of the present invention is brought into contact with a cell expressing the protein of the present invention containing labeled arachidonic acid, the peptide of the present invention and the test compound are expressed in the present invention containing the labeled arachidonic acid. By measuring and comparing the release activity of arachidonic acid metabolites when contacted with a protein-expressing cell of the present invention, a compound that changes the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screeninin To
  • a test compound that inhibits the arachidonic acid metabolite release activity of the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • test compound is brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention, and the arachidonic acid metabolite releasing activity of the protein-expressing cell of the present invention is examined by a known method to screen for a compound exhibiting agonist activity. You can also.
  • the protein-expressing cells of the present invention are seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 24 hours. Then, the cells are washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as anti-buffer buffer 1). A final concentration of the peptide of the present invention at IOM or a reaction buffer 5001 containing the test compound and the peptide of the present invention at a final concentration of ⁇ ⁇ is added to each well. After incubating at 37 C for 60 minutes,
  • the amount of free [ ⁇ ] arachidonic acid metabolite is 0%, and the reaction contains 10 M of the peptide of the present invention. Calculate the amount of free [3 ⁇ 4] arachidonic acid metabolite when the test compound is added, assuming that the amount of free [3 ⁇ 4] arachidonic acid metabolite when buffer 1 is added (without adding the test compound) is 100%.
  • a test compound having a arachidonic acid metabolite releasing activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability.
  • the intracellular Ca concentration is increased by the stimulation of the peptide of the present invention.
  • the stimulating activity of the peptide of the present invention on the cell expressing the protein of the present invention is measured to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. be able to.
  • a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened. The measurement is performed according to a known method.
  • a test compound that suppresses an increase in intracellular calcium concentration due to the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • agonists can be screened by measuring the increase in fluorescence intensity due to the addition of the test compound alone.
  • the protein-expressing cells of the present invention were seeded on a sterilized cover glass for a microscope. Two days later, the culture solution was replaced with HBSS containing 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories), and incubated at room temperature for 2 hours. Leave for a minute. After washing with HBSS, set a cover glass on the cuvette, add the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound, and measure the increase in the ratio of the fluorescence intensity at 505 nm at the excitation wavelengths of 340 nm and 380 nm using a fluorometer. Measure with and compare.
  • FLIPR Molecular Devices
  • Add Fluo-3 AM manufactured by Dojindo Laboratories
  • the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are added in the same manner as in the case of Fura-2, the increase in the ratio of fluorescence intensity is measured with a fluorimeter and compared.
  • a protein gene (eg, aequor in, etc.) that emits light due to an increase in intracellular Ca ions is co-expressed in the protein-expressing cell of the present invention, and intracellular Ca is expressed.
  • the gene protein eg, aequorin, etc.
  • a protein-expressing cell of the present invention in which a gene of a protein that emits light by increasing intracellular Ca ions, is seeded on a 96-well plate, and the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and Add the test compound, measure the increase in the ratio of fluorescence intensity with a fluorimeter, and compare.
  • a test compound that suppresses an increase in fluorescence intensity due to the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • clone 24 of E0 (endothelin A receptor) -expressing CH0 cell (hereinafter abbreviated as ETA24 cell. Journal of Pharmacology and Experimental
  • Therapeutics Vol. 279, pp. 675-685 (1996)), the activity for increasing the intracellular Ca ion concentration in ZAQC-B1 cells; described in Example 3 of WO01 / 16309) and ETA24 cells. Is measured using FLIPR (manufactured by Molecular Devices). Use both ZAQC-B1 cells and ETA24 cells that have been subcultured in DMEM supplemented with 10% dialyzed fetal bovine serum (hereinafter referred to as dFBS).
  • dFBS dialyzed fetal bovine serum
  • H / HBSS (Nissin Pharmaceuticals 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g, sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, adjusted to pH 7.4 with sodium hydroxide solution, and then filter sterilized) 20 ml Mix 250 lM Probenecid 200 ⁇ , 200 l fetal serum (FBS). Also, 2 vials (50 g) of Fluo 3-AM (Dojindo Research Laboratories) were added to dimethyl sulfoxide 0 u 20% Pluronic acid
  • H / HBSS 150 1 containing 2.5 m Probenec id, 0.1% CHAPS was added to the sample for each assay (each fraction) and diluted, and the plate was diluted to a 96-well plate for FLIPR (V-Bottom plate, Coster). (Hereinafter referred to as sample plate). After dye loading of the cell plate is completed, plate washers (Molecular ar a) are washed with a washing buffer containing 2.5 mM Probenecid and 11/11835.
  • a peptide of the present invention is brought into contact with a protein-expressing cell of the present invention in the presence of labeled inositol, and a peptide and a test compound of the present invention are brought into contact with a protein-expressing cell of the present invention.
  • the inositol triphosphate productivity is measured and compared to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. The measurement is performed according to a known method.
  • a test compound that suppresses inositol triphosphate-producing activity can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the cells expressing the protein of the present invention and measuring the increase in inositol triphosphate production.
  • the cells expressing the protein of the present invention are seeded on a 24-well plate and cultured for one day. After that, the cells are cultured for 1 day in a medium supplemented with rayo- [2-3 ⁇ 4] inositol (2.5 // Ci / well), and the cells are washed well with a medium without inositol, which has radioactive activity. .
  • the petit of the present invention After addition of the peptide or the peptide of the present invention and the test compound, the reaction is stopped by adding 10% perchloric acid. 1. Neutralize with 5M potassium hydroxide and 60mM HEPES solution, pass through a column packed with 0.5ml AGlx8 resin (Bio-Rad), and add 5mM sodium tetraborate
  • the radioactivity when the peptide of the present invention is not added is 0%, and the radioactivity when the peptide of the present invention is added is 100%. Is calculated.
  • test compound having an inositol triphosphate-producing activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is determined by measuring the stimulating activity of the peptide of the present invention on the cells expressing the protein of the present invention using the TRE-repo overnight gene vector. Compounds to be altered can be screened.
  • DNA containing the TRE is inserted into the vector upstream of the repo gene to obtain a TRE-reporter gene vector.
  • TPA response element DNA containing the TRE (TPA response element) is inserted into the vector upstream of the repo gene to obtain a TRE-reporter gene vector.
  • stimulation accompanied by an increase in intracellular calcium concentration is caused by TRE-mediated reporter gene expression and the subsequent repo overnight gene gene Induces the production of products (proteins). That is, by measuring the enzymatic activity of the reporter gene protein, it is possible to detect a change in the amount of calcium in the cell into which the TRE-reporter gene vector has been introduced.
  • the peptide of the present invention when the peptide of the present invention is brought into contact with the TRE-repo overnight gene vector-transfected cell expressing the protein of the present invention, the peptide of the present invention and the test compound are mixed with the TRE-repo allele.
  • the transfer of the peptide of the present invention to the protein of the present invention by measuring and comparing the enzymatic activity of the repo overnight gene protein when the protein of the present invention is brought into contact with the cell expressing the protein of the present invention. Screen compounds that change the temperature.
  • a test compound that suppresses the renal activity of the repo overnight gene protein by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the TRE-repo overnight gene vector-introduced protein-expressing cell of the present invention and measuring an increase in luminescence similar to the peptide of the present invention. .
  • the protein-expressing cells of the present invention into which the TRE-repo overnight gene (luciferase) has been introduced are seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / well and cultured for 48 hours.
  • ⁇ peptide of the present invention or ⁇ ⁇ peptide of the present invention and a test compound After washing with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, add ⁇ peptide of the present invention or ⁇ ⁇ peptide of the present invention and a test compound, and add 37 ° C. Incubate at C for 60 minutes. Lyse the cells with a cell lysing agent for Pikagen (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) and add a luminescent substrate (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) to the lysate. Luminescence from luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter. The amount of luminescence by luciferase when the peptide of the present invention is added and when ⁇ the peptide of the present invention and a test compound are added are measured and compared.
  • Hanks buffer pH 7.4 containing
  • the increase in intracellular calcium by the peptide of the present invention increases the amount of luminescence by luciferase.
  • a compound that suppresses this increase can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • reporter genes for example, alkaline phosphatase, chloramphenicol aceti J retransferase (ch oramphenicol)
  • acetyl trans f erase and a gene such as j8-galactosidase may be used.
  • the enzymatic activity of these repo overnight gene proteins is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit.
  • Al-phosphorase activity is, for example, sum Using Lumi-Phos 530 manufactured by Kojunyaku, chloramphenicylase acetyltransferase activity was measured, for example, by FAST CAT chlo l amphenicol
  • the j3-galactosidase activity is measured using Acetyl transf erase Assay KiT, for example, using Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical.
  • MAP kinase is activated and proliferates in the cells expressing the protein of the present invention by stimulation of the peptide of the present invention.
  • the stimulatory activity of the peptide of the present invention on the cells expressing the protein of the present invention is measured to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. be able to. '
  • the cell proliferation in the case where the peptide of the present invention is brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention and the case in which the peptide of the present invention and the test compound are brought into contact with the protein-expressing cell of the present invention are measured.
  • a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened.
  • the growth of the protein-expressing cell of the present invention may be measured, for example, by measuring MAP kinase activity, thymidine uptake activity, cell number, and the like.
  • MAP kinase activity after adding the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and the test compound to the protein-expressing cells of the present invention, an anti-MAP kinase antibody is used from the cell lysate. After the MAP kinase fraction is obtained by immunoprecipitation, the MAP kinase activity is measured using a known method, for example, MAP Kinase Assay Pobi-]-ATP manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and compared.
  • the protein-expressing cells of the present invention are seeded on a 24-well plate, cultured, and added with the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound, and then thymidine labeled with radioactivity (eg, [methy 3 ⁇ 4] -thymidine), then lyse the cells and measure the thymidine uptake activity by counting the radioactivity of the thymidine incorporated into the cells using a liquid scintillation counter. And compare.
  • radioactivity eg, [methy 3 ⁇ 4] -thymidine
  • the protein-expressing cells of the present invention were seeded on a 24-well plate, cultured, and after adding the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound, MTT (3- (4,5,5) -dime thyl-2-th i azo lyl) -2,5-di henyl -2H-t etrazo lium bromide).
  • MTT (3- (4,5,5) -dime thyl-2-th i azo lyl) -2,5-di henyl -2H-t etrazo lium bromide.
  • MTT formazan in which MTT has been changed by being taken into cells is dissolved in an aqueous solution of isopropanol acidified with hydrochloric acid, and then measured by absorption at 570 nm for comparison. ⁇
  • a test compound that suppresses the growth of the protein-expressing cell of the present invention can be selected as a candidate substance having competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cell of the present invention and measuring the cell proliferation activity similar to that of the peptide of the present invention.
  • the cells expressing the protein of the present invention are seeded at 5,000 cells / well in a 24-well plate and cultured for 1 day. The cells are then starved in a serum-free medium for 2 days.
  • the peptide or peptides of the present invention and a test compound of the present invention after incubation was added to the cells 24 hours, [methy Bok 3 H] - thymidine was added Ueru per 0. 015MBQ, cultured for 6 hours. After washing the cells with PBS, add methanol and let stand for 10 minutes. Then, add 5% acetic acid at the end of trichloride and leave it for 15 minutes, then wash the fixed cells four times with distilled water. Lyse the cells with a 3N sodium hydroxide solution, and measure the radioactivity in the lysate with a liquid scintillation counter.
  • a test compound that suppresses an increase in radioactivity when the peptide of the present invention is added can be selected as a candidate substance having competitive inhibition ability.
  • the stimulation of the peptide of the present invention activates the rheumatoid channel, and the intracellular K ions flow out of the cells. Utilizing this reaction, the stimulatory activity of the peptide of the present invention on the cell expressing the protein of the present invention is measured to screen for a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. be able to.
  • Rb ions rubberidium ions
  • 86 Rb of flow out by stimulation of the peptides of the present invention efflux activity
  • a test compound that suppresses the increase in 86 Rb efflux activity due to peptide stimulation of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the cells expressing the protein of the present invention and measuring the increase in the efflux activity of 86 Rb, which is the same as the peptide of the present invention.
  • the cells expressing the protein of the present invention are seeded on a 24-well plate and cultured for 2 days. Then, it is incubated for 2 hours in a medium containing lmCi / ml of 86 RbCl. Wash cells thoroughly with medium to completely remove 86 RbCI in the external solution.
  • the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are added to the cells, and after 30 minutes, the external solution is collected, and the radioactivity is measured with a ⁇ counter and compared.
  • a test compound that suppresses the increase in the 86 Rb efflux activity due to the peptide stimulation of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • the cells expressing the protein of the present invention react with the peptide of the present invention to change the extracellular pH.
  • the stimulating activity of the peptide of the present invention on the protein-expressing cell of the present invention is measured to screen for a compound that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. can do.
  • the extracellular By measuring and comparing the change in pH, a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened.
  • the extracellular pH change is measured, for example, using a Cytosensor device (Molecular Devices).
  • a test compound that suppresses the extracellular pH change caused by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonist screening can also be performed by bringing only the test compound into contact with the protein-expressing cell of the present invention and measuring the extracellular PH change similar to that of the peptide of the present invention.
  • the protein-expressing cells of the present invention are cultured overnight in a capsule for a Cytosensor device, set in a chamber of the device, and set to an extracellular pH for about 2 hours until the RPMI1640 medium containing 0.1% BSA (Molecular Device Co., Ltd.) Perfusion). After the pH has stabilized, a medium containing a peptide of the invention or a peptide of the invention and a test compound is perfused over the cells. The pH change of the medium caused by perfusion is measured and compared.
  • a compound that suppresses the extracellular pH change caused by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • Sex pheromone receptor STe2 of haploid a-mating type (MAT a) of yeast (Saccharomyces cerevisiae) is coupled to G protein Gpal and activates MAP kinase in response to sex pheromone a-Mating factor Subsequently, Farl '(cell-cycle arrest) and the transcriptional activator Stel2 are activated. Stel2 induces the expression of various proteins (eg, FUS1 involved in conjugation). On the other hand, the control factor Sst2 functions in the above process in a suppressive manner.
  • the genes encoding Ste2 and Gpal of MAT yeast are removed, and And the gene encoding the Gpa2 Gai2 fusion protein.
  • the gene encoding Far is removed so as to prevent eel cycle arrest, and the gene encoding Sst is removed to improve the sensitivity of the response to the peptide of the present invention.
  • the FUS1-HIS3 gene in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is linked to FUS1 is introduced. This genetic recombination operation is performed, for example, by using Molecular and
  • SSTR2 somatosustin receptor type 2
  • the transformed yeast thus constructed reacts with high sensitivity to the peptide of the present invention, resulting in activation of MAP kinase, synthesis of histidine biosynthesis enzyme, and histidine-deficient medium. Be able to grow.
  • the above-described protein-expressing yeast of the present invention (the Ste2 gene and the Gpal gene were deleted, the protein gene of the present invention and the Gpal-Gai2 fusion protein-encoding gene were introduced, the Far gene and the Sst gene were deleted, and the FUS1- IS ⁇ yeast into which the HIS3 gene has been introduced) is cultured in a histidine-deficient medium, the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are brought into contact with each other, and the growth of the yeast is measured and compared.
  • Compounds that alter the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be screened.
  • a test compound that suppresses the growth of the yeast can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonist screening can also be performed by contacting the test compound alone with the above-described protein-expressing yeast of the present invention and measuring the growth of yeast similar to the peptide of the present invention.
  • Protein expression yeast of the present invention described above was cultured overnight in liquid culture medium completely synthetic medium, Later, the dissolution agar medium was removed histidine is added to a concentration of 2xl0 4 cel l / ml. Then sow on a 9x9cin square petri dish. After the agar has solidified, a sterile filter paper impregnated with the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound is placed on the agar surface, and cultured at 30 ° C. for 3 days. '' The effect of the test compound is The growth of the mother is compared with the case where a sterilized filter paper impregnated only with the peptide of the present invention is used. In addition, the peptide of the present invention is added in advance to the agar medium from which histidine has been removed, and the test compound is impregnated into sterile filter paper to culture the yeast. You may observe that they are affected.
  • a compound that suppresses the growth of yeast can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • the case where the peptide of the present invention is brought into contact with the protein gene RNA-transfected Xenopus laevis oocytes and the case where the peptide and the test compound of the present invention are brought into contact with the protein gene RNA of the present invention By measuring and comparing the change in cell membrane potential upon contact with the melanogaster oocyte, a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is screened.
  • a test compound that suppresses a change in cell membrane potential can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by bringing only the test compound into contact with the protein gene RNA-transfected Xenopus laevis oocytes and measuring a change in cell membrane potential similar to that of the peptide of the present invention.
  • Stuck ice cooling was removed from Natsuta female African Tsu mega El, oocytes mass, MBS solution (88mM NaCl, ImM KC1, 0. 41mM CaCl 2, 0. 33mM Ca (N0 3) 2, 0 . 82mM MgS0 4, 2. 4mM NaHC0 3, lOmM HEPES; pH7.'4) in dissolved collagenase (0.5 mg / ml) and treat at 150 ° ⁇ ⁇ for 1-6 hours at 19 ° C until the egg mass is loosened.
  • the external solution is washed three times by substituting the MBS solution, and the oocytes are microinjected with the protein gene poly ⁇ -added cRNA (50 ng / 50 nl) of the present invention throughout the micromanipulator.
  • the protein gene! IiRNA of the present invention may be prepared from tissues or cells, or may be transcribed from a plasmid in vitro.
  • the protein gene mRNA of the present invention was cultured in MBS 'solution for 2 days (TC for 3 days, and this was placed in the cavity of the apparatus immediately running the Ringer solution.
  • a glass microelectrode is inserted into the cell, and (1) the electrode is placed outside the fine J3 envelope.When the potential is stabilized, the potential change is caused by flowing a peptide of the present invention or a Ringer solution containing the peptide of the present invention and a test compound.
  • test compound is measured by comparing the change in the cell membrane potential of the Xenopus oocytes transfected with the protein gene RNA of the present invention to that of the Ringer solution containing only the peptide of the present invention. be able to.
  • a compound that suppresses the change in cell membrane potential can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • poly A-added RNA of various G protein genes may be introduced. Also, by co-injecting poly A-added RNA of a gene of a protein (eg, aequorin, etc.) that emits light in the presence of calcium, it is possible to measure the amount of luminescence rather than the change in membrane potential.
  • a protein eg, aequorin, etc.
  • mammalian vascular endothelial cells preferably aortic vascular endothelial cells, more preferably capillary endothelial cells, and more preferably capillary endothelial cells derived from endocrine tissue (eg, adrenal gland, ovary, testis, etc.)
  • endocrine tissue eg, adrenal gland, ovary, testis, etc.
  • the endothelial cells or the membrane fraction derived from the endothelial cells cultured on the culture plate were coated with the peptide of the present invention or the MIT1 radioactive protein.
  • Inhibition of binding of radioactive label to endothelial cells or membrane fraction by measuring and comparing the binding of radioactive label to endothelial cells or membrane fraction Screen compounds.
  • the method of the above 3) may be directly carried out, or the method may be carried out in the order of 1), 2), 3) or in the order of 2), 3) above. . If the above steps 1), 2) and 3) or the steps 2) and 3) are performed in this order, screening can be performed efficiently.
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention, a cell containing the protein of the present invention, or a membrane fraction of a cell containing the protein of the present invention, and the peptide of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • the peptide of the present invention is dissolved in PBS containing 0.1% Pserum serum albumin (manufactured by Sigma) so as to be ImM, and stored at ⁇ 2 (T).
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound that changes the binding (inhibits or promotes the binding) between the peptide of the present invention and the protein of the present invention, Specifically, the protein of the present invention A compound having a cell stimulating activity via a protein or a salt thereof (a so-called agonist of the protein of the present invention), or a compound not having the stimulating activity (a so-called agonite of the protein of the present invention). Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a mellow product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a specific method for evaluating whether the above compound is an agonist of the protein of the present invention or an antagonist may be, for example, according to the following (A) or (B).
  • a compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist of the protein of the present invention, and a compound or a salt thereof having no such activity is an antagonist of the protein of the present invention.
  • test compound is brought into contact with a cell containing the protein of the present invention, and the cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist of the protein of the present invention.
  • the protein antagonist of the present invention can suppress the physiological activity of the peptide of the present invention on the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the receptor activity. .
  • protein antagonist of the present invention for example, a compound that changes the binding of the peptide or MIT1s of the present invention to the protein of the present invention, preferably
  • the protein agonist of the present invention has the same activity as the physiological activity of the peptide of the present invention on the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug like the peptide of the present invention.
  • protein agonist of the present invention for example, a compound that changes the binding property between the peptide or MIT1s of the present invention and the protein of the present invention, preferably
  • agonists of the protein of the present invention include, for example, obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasma).
  • Obesity pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism, whole body Mastocytosis, simple obesity, central hypertrophy, etc., sleep disorder [eg, primary insomnia, circadian rhythm disorder (eg, modulation of physical condition due to three shift work, etc., time zone change syndrome) )], Seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disease, senile dementia, Alzheimer's disease, various aging-related disorders, cerebral circulation disorders (eg, stroke), head trauma, spinal cord injury, epilepsy, anxiety, Preventive / therapeutic agents for diseases, manic depression, schizophrenia, alcoholism, Parkinson's disease, hypertension, arterial stiffness, arrhythmias, premenstrual syndrome, glaucoma, cancer, AIDS, diabetes, etc., preferably obesity It can be used as a medicine such as a preventive and therapeutic agent.
  • sleep disorder eg, primary insomnia, circadian
  • the protein antagonists of the present invention include, for example, eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.), sleep disorders [eg, primary insomnia, 'circadian rhythm disorders (eg, three shift work, etc.) Modulation of physical condition, time-band change syndrome (jet lag, etc.)], seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disease, senile dementia, Alzheimer's disease, various disorders associated with aging, cerebral circulation disorder (eg, stroke, etc.) ), Head trauma, spinal cord injury, epilepsy, anxiety, depression, manic depression, schizophrenia, alcoholism, Parkinson's disease, hypertension, arteriosclerosis, arrhythmia, premenstrual syndrome, glaucoma, cancer, AIDS, It can be used as a drug for preventing and treating diabetes and the like, preferably for preventing and treating eating disorders.
  • eating disorders eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.
  • sleep disorders eg, primary insomnia, '
  • salts of the above compounds for example, pharmaceutically acceptable salts and the like are used.
  • examples thereof include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids.
  • the salt with an inorganic base include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt.
  • salt with an organic base examples include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine. , N, N'—dibenzylethylenediamine and the like.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Preferred examples of the salt with an organic acid include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and benzoic acid And salts with acids and the like.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include salts with, for example, arginine, lysine, and oltinine.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, salts with aspartic acid, glutamic acid, and the like. .
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned medicament, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. which are sugar-coated or enteric-coated as required, orally or Can be used parenterally in the form of injectable solutions, such as sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or suspensions.
  • injectable solutions such as sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or suspensions.
  • they are prepared by mixing the compound or its salts with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like in generally accepted unit dosage forms. can do.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • a liquid carrier such as an oil or fat can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing dextrose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), and nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HC0-50) may be used in combination.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • a preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • an antioxidant eg, an antioxidant, and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the dose of the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention varies depending on the symptoms and the like. It is about 0.1-1000 mg per day, preferably about 1.0-300 mg, more preferably about 3.0-50 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day is administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • a method for screening a feeding regulator using a polynucleotide encoding the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the protein of the present invention Comparison between culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention and (b) culturing a mixture of cells capable of producing the peptide of the present invention or the protein of the present invention and a test compound To screen for food intake regulators.
  • the expression level of the gene of the peptide of the present invention or the protein of the present invention (specifically, the amount of protein or the amount of mRNA encoding the protein) ) Measure and compare.
  • Test compounds include, for example, peptides_, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the peptide of the present invention or the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • a buffer a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) is used.
  • Examples of cells having the ability to produce the peptide of the present invention or the protein of the present invention include, for example, a host transformed with a vector containing the above-described DNA encoding the peptide of the present invention or the protein of the present invention ( Transformant) is used.
  • the host for example, animal cells such as CHO cells are preferably used.
  • a transformant which expresses the peptide of the present invention or the protein of the present invention by culturing by the above-mentioned method is preferably used.
  • the protein amount of the peptide of the present invention or the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, by using an antibody that recognizes the peptide of the present invention or the protein of the present invention, the protein present in a cell extract or the like. Can be measured according to a method such as Western analysis or ELISA method or a method analogous thereto.
  • the gene expression level of the peptide of the present invention or the protein of the present invention can be determined by a method known per se, such as, for example, yeast blotting, reverse transcrip- tion-polymerase chain reaction (RT-PCR), and a real-time PCR analysis system. (Manufactured by ABI, TaqMan polymerase chain react ion) or a method according to the method.
  • a method known per se such as, for example, yeast blotting, reverse transcrip- tion-polymerase chain reaction (RT-PCR), and a real-time PCR analysis system. (Manufactured by ABI, TaqMan polymerase chain react ion) or a method according to the method.
  • the gene expression level of the protein in the case of the above (b) is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (a).
  • the test compound can be selected, for example, as an eating control agent, for example, as a prophylactic or therapeutic agent for eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.).
  • the gene expression level of the protein in the case of the above (b) is promoted by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (a).
  • the test compound may be administered, for example, as a food intake regulator, for example, obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroidism) Prevention of obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, child obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc. It can be selected as a therapeutic agent.
  • obesity eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroidism
  • Prevention of obesity hypothalamic obesity, symptomatic obesity, child obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonad
  • the expression level (specifically, the protein mass) of the peptide of the present invention, MIT 1 class or the protein of the present invention is determined using the above antibody. Measure and compare.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • cells having the ability to produce the peptide, MIT1s or the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening.
  • a buffer suitable for screening.
  • Cells having the ability to produce the peptide of the present invention, MIT 1s or the protein of the present invention include, for example, DNAs encoding the aforementioned peptide of the present invention, MIT 1s or the protein of the present invention.
  • a host (transformant) transformed with the following vector is used.
  • the host for example, animal cells such as CHO cells are preferably used.
  • a transformant expressing the peptide of the present invention, the MIT1s or the protein of the present invention by culturing by the method described above is preferably used.
  • the compound can be selected, for example, as an eating regulator, for example, as a prophylactic or therapeutic agent for eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.).
  • a test compound that promotes about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, for example, as a food intake regulator, for example, obesity (eg, mast mastocytosis, exogenous Obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, diet Obesity, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.).
  • obesity eg, mast mastocytosis, exogenous Obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, diet Obesity, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.
  • a food intake regulator comprising a compound having an endothelial cell growth inhibitory activity or a salt thereof
  • the compound having an endothelial cell growth inhibitory action or a salt thereof may be any compound having an endothelial cell growth inhibitory action or a salt thereof.
  • the compound or a salt thereof is used as a food intake regulator and the like.
  • obesity eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmemia
  • sexual asthma hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, pediatric obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity, central
  • a medicament such as a preventive and therapeutic agent for dysbiosis, etc.
  • eating disorders eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, the protein of the present invention or the peptide of the present invention in the test solution (hereinafter referred to as the protein of the present invention in section (9)) ), Especially for sandwich immunoassay.
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, characterized in that:
  • the monoclonal antibody of the present invention In addition to the quantification of the protein of the present invention using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like is also possible.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , FalD' or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody corresponding to the amount of the antigen (eg, the amount of the peptide of the present invention) in the test solution.
  • the amount of the antigen complex is detected by chemical or physical means, and this is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. Good.
  • nephrometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a lanthanide element and the like are used. Radioactive same position elements, for example, [ '25 1], [131 1], [3 ⁇ 4], [14 C], [32 P],
  • C 33 P C 33 P
  • [] and the like are used.
  • the above-mentioned enzyme those which are stable and have a large specific activity are preferable, and for example, i3-galactosidase, / 3-dalcosidase, allyl phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • a cyanine fluorescent dye eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience), etc.
  • fluorescamine fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system for binding the antibody or antigen to the labeling agent You can also.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose dextran and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution was reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). Thereafter, the amount of the peptide of the present invention in the test solution can be determined by measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily required to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the peptide of the present invention binds.
  • the antibodies used in the primary reaction and the secondary reaction are preferably used, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the peptide of the present invention.
  • an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the Sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the competitive method after the antigen in the test wave and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( B / F separation), measure the amount of B or F label, and quantify the amount of antigen in the test wave.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • the first antibody should be soluble
  • An immobilization method using an immobilized antibody as a body is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, then the immobilized antigen is added, and the unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution. .
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the protein measuring system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and publications.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention. Furthermore, when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the cerebrospinal fluid concentration or blood concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, obesity or eating disorders Can be diagnosed as having, or being likely to become, affected in the future. .
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • a subject such as a body fluid or a tissue.
  • an antibody column used for purifying the protein of the present invention detecting the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analyzing the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. It can be used for
  • the DNA of the present invention can be used as a probe, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, elephants, magpies, cats, dogs, Detecting abnormalities (gene abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or the peptide of the present invention (hereinafter referred to as the protein of the present invention in (10)) in monkeys and the like. Therefore, it is useful as a gene diagnostic agent for, for example, damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, and increase or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, elephants, magpies, cats, dogs.
  • the above-mentioned genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be carried out, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989, Proceedings of the Natal Academy of —Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989), and DNA microarrays.
  • the antisense DNA capable of binding to the DNA of the present invention complementarily and suppressing the expression of the DNA is a protein or a peptide of the present invention in a living body (hereinafter referred to as (11)).
  • a protein or a peptide of the present invention in a living body (hereinafter referred to as (11)).
  • diseases caused by excessive expression of the protein of the present invention such as eating disorders (eg, anorexia nervosa, overeating) It can be used as a preventive and therapeutic agent for illness etc.
  • the above-mentioned antisense DNA can be used as the above-mentioned preventive / therapeutic agent in the same manner as the above-mentioned preventive / therapeutic agents for various diseases containing the DNA of the present invention.
  • the antisense DNA can be administered alone or after insertion into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like, and then administered according to conventional means.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression of the DNA of the present invention in tissues and cells.
  • a medicine comprising the lipozyme is also provided.
  • RNAi double-stranded RNA
  • lipozyme and the like can also suppress the expression of a polynucleotide (eg, DNA) encoding the protein of the present invention.
  • a polynucleotide eg, DNA
  • the function of the protein or DNA of the present invention in the body and the function of the peptide of the present invention depending on the same can be suppressed, for example, an agent for preventing or treating eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.) And so on.
  • the double-stranded RNA can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the lipozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of RNA encoding the protein of the present invention.
  • RNA encoding the protein of the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme.
  • RNA fragment RNA fragment close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention or the peptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the protein of the present invention in the section (12)), is, for example, an expression of the protein of the present invention. It can be used as a medicine such as a prophylactic or therapeutic agent for diseases caused by excess, for example, eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.), or as a diagnostic agent for eating disorders or obesity. .
  • the agent for preventing or treating the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used directly as a liquid preparation or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, rabbit, egret, sheep, bush, pig, etc.). , Cats, dogs, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • the dose varies depending on the subject to which S is administered, the target disease, symptoms, administration route, etc. About 1 to 10 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day, by intravenous injection It is convenient to administer. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered by itself or as a suitable pharmaceutical composition. Wear.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets) and pills. Granules, powders, capsules (soft capsules) Preparations, syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate, and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-mentioned antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used, and suitable dissolution aids, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50mol) adduc t of
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration is prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories and the like. About OOmg, Other dosage forms contain about 10-250mg of the above antibody Is preferred.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • (13) Preparation of non-human animal having DNA of the present invention
  • a transgenic non-human animal expressing the protein of the present invention or the peptide of the present invention can be prepared.
  • Non-human animals include mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, sheep, bush, oysters, cats, dogs, monkeys, etc.) and the like (hereinafter abbreviated as animals). And egrets are preferred.
  • a DNA construct of the present invention having a high homology to the DNA of the present invention can be obtained by, for example, using a gene construct linked downstream of one of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention in animal cells.
  • a DNA-transferred animal that highly produces the protein of the present invention or the peptide of the present invention can be produced by microinjection into a fertilized egg of a heron.
  • a ubiquitous expression promoter such as a virus-derived promoter or meta-mouth thionein can be used, and preferably, an NGF gene promoter or an enolase gene promoter, which is specifically expressed in the brain, is used. Used.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the protein of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the protein of the present invention or the peptide of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. I do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the gene has the protein of the present invention or the peptide of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can be bred in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the gene is stably maintained by crossing. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, all the offspring will have the DNA Breeding can be carried out to have
  • the protein of the present invention or the peptide of the present invention is highly expressed in the animal to which the DNA of the present invention has been transferred, the activity of the agonist or antagonist against the protein of the present invention and the activity of the peptide of the present invention can be reduced. It is useful as an animal for screening for an inhibitory compound.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • tissue culture For example, by directly analyzing the DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred mouse of the present invention, or by analyzing the tissue in which the protein of the present invention expressed by the gene or the peptide of the present invention is present, The protein of the present invention can be analyzed.
  • Cells of a tissue having the protein of the present invention or the peptide of the present invention are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to obtain cells from tissues that are generally difficult to culture, such as those derived from brain or peripheral tissues. Can study functions.
  • a drug that enhances the function of various tissues can be selected.
  • the protein of the present invention or the peptide of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-IUB Communication on Biochemical Features or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • Y thymine or cytosine
  • ⁇ Thymine, cytosine, adenine or gua
  • R adenine or guanine
  • ⁇ cytosine or adenine
  • ⁇ Guanine, thymine or cytosine
  • RNA Liponucleic acid
  • Threonine Thr or T: Threonine ..
  • H is or H: histidine P he or F fenilalanine
  • EIA Enzymimnoassy
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of a human ZAQ ligand mature peptide.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of a mature human ZAQ ligand mature peptide.
  • 1 shows the amino acid sequence of human ZAQ ligand precursor peptide.
  • 1 shows the amino acid sequence of human ZAQ ligand precursor peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a mouse ZAQ ligand precursor peptide.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding rat type ZAQ ligand precursor peptide (Y type).
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of a humanized Bv8 mature peptide.
  • the base sequence of the DNA encoding the human Bv8 precursor peptide is shown.
  • FIG. 2 shows amino acid sequences of mature rat Bv8 and mouse mature Bv8 peptides.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding the rat type Bv8 mature peptide is shown.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the mature mouse Bv8 peptide is shown.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a rat Bv8 precursor peptide.
  • 1 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the rat type Bv8 precursor peptide.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding human ZAQ is shown (ZAQC).
  • ZAQT The nucleotide sequence of DNA encoding human ZAQ is shown (ZAQT).
  • 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding rat-derived rZAQl.
  • 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding rat-derived rZAQ2.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence encoding mouse-derived GPR73.
  • ⁇ ⁇ Shows the nucleotide sequence of DNA encoding ZAQ.
  • Fig. 3 shows the amino acid sequence of Pesi type 15E.
  • FIG. 1 shows a base sequence of a partial sequence of a pouch type I5E obtained in Reference Example 1 described later.
  • 5 shows the nucleotide sequence of the 5 ′ partial sequence (type 2) of the pulmonary ZAQ obtained in Reference Example 1 described below.
  • 3 shows the nucleotide sequence of the 3 "partial sequence (type 2) of the pouch type ZAQ obtained in Reference Example 1 described later.
  • FIG. 3 shows the base sequence of a 2038 bp DNA fragment encoding the full-length ZAQ obtained in Reference Example 1 described later.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the 5 ′ partial sequence of mouse I5E obtained in Reference Example 1 described later.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the 3 ′ partial sequence of Escherichia coli I5E obtained in Reference Example 1 described later.
  • [SEQ ID NO: 76] 7 shows the nucleotide sequence of primer bZAQb-F used in Reference Example 1 described later.
  • FAM indicates 6_carboxy fluorescein, respectively, TAMRA3 ⁇ 46-carboxy-tetramethylrhodamine3 ⁇ 4-3 ⁇ 4-.
  • FAM indicates 6-carboxy fluorescein
  • TAMRA indicates 6-carboxy- ⁇ etrme thylrhodamine.
  • the transformant Escherichia coli DH5 ⁇ / pBZAQ obtained in Reference Example 1 described below was obtained from January 9, 2002 (2002) at 1-1 1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 (Ref. 305-8566) Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Depositary Depositary Center As accession number FERM BP-7845, from December 18, 2001, 2-chome 17 at Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Japan No. 85 (postal code 532-8686) Deposited with the Fermentation Research Institute (IF0) under the accession number IF0 16740.
  • IF0 Fermentation Research Institute
  • human Bv8 peptide The effect of intracerebroventricular administration of human Bv8 peptide on food consumption was examined.
  • the following human Bv8 peptide was prepared according to Example 1 of WO 02/57443.
  • the guide force newre is an instant adhesive and dental cement and anchor.
  • a stainless steel dummy force AD-12 (OD 0.35, Acom) was inserted into the guide cannula and fixed with a cap nut (Acom). After the guide cannula was implanted, the animals were reared for about one week and allowed to recover after surgery (indicating that the post-operative weight loss has been increased appropriately).
  • Administration of acid buffered saline (pH 7.2) or human Bv8 peptide was performed.
  • Teflon tube 0.1 dia inner diameter, 0.35 mm outer diameter, 50 cm length, ecomm stainless steel micro-injection power module.
  • AMI-9 0.17 inside diameter, 0.35 outside diameter, Acom
  • the length of the microinjection force was adjusted so that one thigh was exposed from the guide cannula.
  • a total of 10 1 was administered to the ventricle. After 2 minutes from the end of the injection, the microinjection cannula was removed, and the dummy force cannula was fixed again with the cap nut.
  • Rats were bred with a 12-hour light / dark cycle (light period: 8:00 to 20:00), and feeding experiments were started between 18:00 and 19:00.
  • the microinjection cannula was removed and fed a standard feed ad libitum.
  • the food consumed at 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours and 15 hours after the end of the administration was weighed, and the food consumption was 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours and 15 hours, respectively.
  • the following human Bv8 peptide was prepared according to Example 1 of W02 / 57443.
  • intracerebroventricular administration of human Bv8 peptide was performed on rats, and the effect of intracerebroventricular administration of human Bv8 peptide on body temperature was examined.
  • Rats are bred at a light-dark cycle of 12 hours (light period: 8 to 20 o'clock), and the body temperature is measured using a rectal temperature measurement probe (rectal probe for RET-2 rat, Model BAT-12 digital) under anesthesia in rats.
  • a thermometer (Physitemp) was inserted into the rectum to measure the body temperature before administration of human Bv8 peptide. Thereafter, between 18 o'clock and 19 o'clock, the rats were anesthetized and unrestrained, attached with a microinjection force neuron, and administered with phosphate buffered saline or human Bv8 peptide. .
  • Human Bv8 peptide administration was performed, and body temperature was measured as described above at 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, and 15 hours after the end of the administration. Human Bv8 peptide administration group
  • Body temperature before administration 36.2 ⁇ 0.1 ° C (human Bv8 peptide administration group), 36.4 ⁇ 0.2 ° C (phosphate buffered saline administration group).
  • 34.2 ⁇ 0.2 ° C human Bv8 peptide administration group
  • 36.6 ⁇ 0.2 ° C phosphate buffered saline administration group
  • p ⁇ 0.01 t test.
  • BACE-derived total RNA BACE tRNA
  • BACE tRNA BACE-derived total RNA
  • BAE tRNA BAE-derived total RNA
  • BACE cDNA BACE cDNA
  • BAE cDNA BAE-derived cDNA
  • the BACE cDNA was used as type III, and based on the information of human ZAQ, mouse ZAQ, rat ZAQ, human I5E, mouse I5E and GPR73, degenerate primers ZAQ-B1F (SEQ ID NO: 54) and ZAQ-B1R (SEQ ID NO: 55) ) was prepared, and the PCR reaction described below was performed.
  • the PCR reaction solution was 0.5 ⁇ of AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), 51 ⁇ ⁇ of the attached 10 ⁇ PGR buffer II (100 mM Tris-HCl, 500 mM KC1), 51 of 25 raM MgCl 2 and 41 of dNTP mixture (2.0 mM each). , Applied Biosystems), 51/1, 12.5 ⁇ M primers ZAQ-B1F and ZAQ-B1R, 2.5 / 1, type I cDNA lxl, and distilled water 29.5 il.
  • the reaction conditions were: 95t> 10 minutes initial denaturation, 35 cycles of 95> 20 seconds-66 ° C for 30 seconds, and a final extension reaction of 66 ° C for 10 minutes.
  • the obtained DNA fragment was prepared using the T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen). Cloning was performed according to the method described in the manual. The cloned DNA sequence was read using the ABI3100 DNA sequencer, and the base sequence of the partial sequence of the bovine type ZAQ (SEQ ID NO: 56) and the partial sequence of the bovine type I5E (SEQ ID NO: 57) were obtained. Obtained.
  • ACE BACE-derived total RNA BACE NA was obtained from the adrenal capillary endothelial cells (BACE) using TRIzol Reagent (GiBCO BRL) according to the method described in the attached manual.
  • BACE mRNA BACE-derived mRNA
  • niRNA Purification Kit Amersham Pharmacia biotech
  • BACE AL ds cDNA BACE-derived Library of adapter-1 igated ds cDNA
  • primers bZAQ5-2 SEQ ID NO: 58
  • bZAQ5-3 SEQ ID NO: 59
  • nested PCR was performed using the reaction solution of the PCR reaction as a type III.
  • the reaction mixture was prepared by adding 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH) to the attached 5 ⁇
  • reaction conditions were as follows: 5 cycles of 94 ° 05 seconds-72 ° 04 minutes after initial denaturation at 94 ° 030 seconds, 5 cycles of 9 ° C5 seconds-70> 4 minutes, 94 ° C ⁇ A cycle reaction of 5 seconds-68.4 minutes was performed 25 times.
  • the obtained DNA fragment was cloned using a T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the cloned DNA sequence was decoded using an ABI3100 DNA sequencer to obtain two 5 ′ partial sequences of ZAQ-type ZAQ (typel: SEQ ID NO: 60; type2: SEQ ID NO: 61).
  • primer bZAQa-F1 SEQ ID NO: 62
  • primer bZAQa-F2 SEQ ID NO: 63
  • the PCR reaction solution for 3 'RACE was prepared by adding 1 PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene), 51 x 10x PCR buffer attached, 4 il dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo), 10 M primers bZAQa-Fl and 10 M 2.51 each of iM Primer API (Primer API attached to CLONTECH's Marathon-Ready cDNA Kit), 11 ⁇ type cDNA (50-fold diluted BACE AL ds cDNA), and 34 1 of distilled water It was prepared by mixing. The reaction conditions were: initial denaturation at 94 ° C for 30 seconds, followed by 5 cycles of 94 ° C for 5 seconds-72'4 minutes.
  • a cycle reaction at 94 ° C for 5 seconds-70 ° C for 4 minutes was performed 5 times, and a cycle reaction at 94 ° C for 5 seconds-68C for 4 minutes was performed 25 times.
  • PCR reaction solution PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene), 1. "K attached 1 Ox PCR buffer 51, dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo) 41, IOM primer bZAQa-F2 and IOM primer One API (primer AP2 is attached to CLONTECH's Marathon-Ready cDNA KiU) was prepared by mixing 2.51 each, II type II DNA and 34 zl of distilled water at 94 ° C '.
  • the obtained DNA fragment was cloned using a Zaro Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the cloned DNA sequence was decoded using the ABI3100 DNA sequencer to obtain the base sequence at the 3 'end of the peculiar ZAQ (SEQ ID NO: 64).
  • primer bZAQa-EF1 SEQ ID NO: 65
  • primer bZAQa-IF1 SEQ ID NO: 66
  • primer bZAQa-IR1 SEQ ID NO: 67
  • primer bZAQa-ER1 SEQ ID NO: 68
  • PCR reaction solution is 1x PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene) and attached 10x
  • a PCR buffer was prepared by mixing 5 zl, a 0.5 mM dNTP mixture of 41, IOM primers bZAQa-EF1 and bZAQa-ER1, each of ⁇ -type DNA and 341 of distilled water.
  • the reaction conditions were 95 ° C for 1 minute initial denaturation, 35 cycles of 95C for 30 seconds to 60 ° C for 30 seconds to 72 ° C for 3 minutes, and a final extension reaction for 72> 10 minutes. .
  • the reaction solution of the PCR reaction was diluted 50-fold with distilled water, and nested PCR was performed using the ⁇ type.
  • the PCR reaction solution was ll PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene), 51 of the attached IOX PCR buffer, 41 of 2.5 mM dNTP mixture, and 10 M of primer.
  • BZAQa-IF1 and bZAQa-IR1 were 2.51, each of type ⁇ .
  • DNA was prepared by mixing 11 and distilled water at 34/1.
  • the reaction conditions are: 95 ⁇ ⁇ 1 min initial denaturation, 35 cycles of 95 C C for 30 s-60 C C * 30 s-72 C C for 3 min, and a final extension reaction of 72 C C for 10 min. And '
  • the obtained MA fragment was cloned using Zaro Blunt T0P0 PCR .. Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the cloned DNA sequence was decoded using the ABI3100 DNA sequencer to obtain pBZAQ having a 2038 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 69) encoding the full-length ZAQ full length.
  • E. coli DH5 transformed with the plasmid was named E. coli DH5Q! / PBZAQ.
  • the cDNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 69 encodes a 393 amino acid sequence (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 51).
  • the protein having the sequence was designated as Zac-type ZAQ.
  • primer bI5E5-1 SEQ ID NO: 70
  • primer bI5E5-3 SEQ ID NO: 71
  • 5'RACE PCR reaction solution is 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) with 0.5K attached 5X Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg (0Ac) 2 , 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75jg / ml BSA,
  • nested PCR was performed using the reaction solution of the PCR reaction as a type III.
  • the reaction mixture was added to 0.5X of 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) and attached 5x
  • reaction conditions were as follows: 94 ° C ⁇ 5 seconds-72 ° C ⁇ 4 minutes cycle reaction 5 times after 94 ° C ⁇ 30 seconds initial denaturation, 94 ° C ⁇ 5 seconds-70 ° C '4 minutes cycle reaction 5 times, 25 cycles of 94 ° C / 5 seconds-68 ° C / 4 minutes.
  • the obtained DNA fragment was cloned using T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the cloned marauder sequence was decoded using the ABI3100 DNA sequencer to obtain the 5 'partial sequence (sequence number: 72) of Escherichia coli I5E.
  • primer bI5E3-1 SEQ ID NO: 73
  • primer bI5E3-3 SEQ ID NO: 74
  • 3 'RACE] 3 CR reaction solution is 5 ⁇ Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg (0Ac) with 0.5X 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) attached. 2 , 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 zg / il 'BSA,
  • reaction conditions were as follows: after initial denaturation at 94 ° C for 30 seconds, 5 cycles of 94 ° 05 seconds-72 ° 04 minutes, 5 cycles of 94 ° C'5 seconds-70 ° C'4 minutes, A cycle reaction of 94 ° C ⁇ 5 seconds _68 ° C ⁇ 4 minutes was performed 25 times.
  • reaction solution was 0.51 of 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) and the attached 5x
  • reaction conditions were 94t: .30 sec initial denaturation, 94 ° C ⁇ sec -72 ° C 44 min cycle reaction 5 times, 94 ° C'5 sec -70 ° C'4 min cycle reaction Twenty-five cycles of 94 ° C for 5 seconds to 68 for 4 minutes were performed 25 times.
  • the obtained DNA fragment was cloned using T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the cloned DNA sequence was decoded using the ABI3100 DNA sequencer to obtain the 3 'partial sequence of the sequence I5E (SEQ ID NO: 75).
  • primer bZAQb_F SEQ ID NO: 76
  • a primer bZAQb-F2 SEQ ID NO: 77
  • a primer bZAQb-R SEQ ID NO: 78
  • a primer bZAQb-R2 SEQ ID NO: 79
  • the PCR reaction mixture was 1 ⁇ 1 of PfuTurbo DMA polymerase (Stratagene), 5/1 of the attached 10x PCR buffer, 4 of 2.5 mM dNTP mixture, and 10 zM primers, bZAQb-F and 28 (31) -1, respectively. It was prepared by mixing 2.5 / 1, type I DNA 11 and distilled water 341. The reaction conditions were as follows: initial denaturation at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 30 seconds-58t: 30 seconds-72: 40 cycles of 3 minutes, and final extension at 72 ° C for 10 minutes The reaction was performed.
  • nested PCR was performed using the PCR reaction solution diluted 50-fold with distilled water as type III.
  • the PCR reaction solution was 1 ⁇ l of PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene), 51 of the attached 10x PCR buffer, 1 of 2.5 mM dNTP mixture, and 10 M of primer 28 (11)-? Two pieces of 28 (11) -112 were prepared by mixing 2.5 / 1 each, ⁇ -type DNA, and 341 of distilled water.
  • the reaction conditions are: initial denaturation at 95 ° C for 1 minute, 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds-58 ° C for 30 seconds-72 ° C for 3 minutes, and a final extension reaction at 72 ° C for 10 minutes. And
  • the obtained DNA fragment was cloned using a Zaro Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the cloned DNA sequence was decoded using the ABI3100 DNA sequencer to obtain pBI5E having a 1623 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 80) encoding the full-length I5E.
  • the cDNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 80 encodes a 384 amino acid sequence (SEQ ID NO: 52) (SEQ ID NO: 53). Named I5E.
  • Reference example 2 The cDNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 80 encodes a 384 amino acid sequence (SEQ ID NO: 52) (SEQ ID NO: 53). Named I5E.
  • type bZAQa-IF1 SEQ ID NO: 8 1
  • a primer bZAQa-te immediate IR SEQ ID NO: 82
  • PCR reaction solution 4 PfuTurbo hoistart DNA polymerase (Stratagene), 201 1x attached 10x PCR buffer, dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo) 161, 10 M primers bZAQa-IF1 and bZAQa-te Immediate IR was prepared by mixing each IO I, 4 type II cDNA (pBZAQ) and 136.1 distilled water.
  • the reaction conditions were as follows: After initial denaturation at 95 ° C for 1 minute, the cycle reaction was performed 40 times at 95 ° C for 30 seconds-6 (TC for 30 seconds at 72 ° C for 1 minute. The obtained DNA fragment was obtained. Was used as a standard type DNA fragment for the ZAQ.
  • Primer Express software from the information of the ⁇ -type ZAQ, forward forward and reverse TaqMan primer for primer ⁇ -type ZAQ, primer bZAQa-taqF (SEQ ID NO: 83) and primer bZAQa-taqR (SEQ ID NO: 84), ⁇ TaqMan probe for b-type ZAQ, bZAQa-probe (5′-FAM-CCTCGGAGCCCAAGCTGCTTCTTT-TAMRA-3 ′; SEQ ID NO: 85) was prepared.
  • TaqMan Probe and TaqMan Primer for the peculiar ZAQ gene enables the quantification of the peculiar ZAQ gene transcript by TaqMan PCR analysis using BACE-derived cDNA (BACE cDNA) and BAE-derived cDNA (BAE cDNA) as a form. went.
  • the reaction mixture was 2x TaqMan PCR Master Mix 12.5 1, 5 ⁇ primers bZAQa-taqF and bZAQa-taqR 1.51, each 5 M probe bZAQa-probe 11 each, and standard DNA fragments for dilution type ZAQ with different dilution concentrations.
  • Rupo was prepared by mixing Type II 0 with 41 (derived from 200 ng tRNA) and distilled water with 4.5 1.
  • the TaqMan PCR reaction was performed using the SDS7700 .. (Sequence Detection System, ABI) under the conditions that the initial reaction at 50 ° C for 2 min 95'10 min, and the cycle reaction at 95 ° C for 15 sec to 60 min were performed 50 times. It was carried out using. After the reaction was completed, a standard curve was plotted from the fluorescence intensity for the standard DNA fragment at each dilution concentration on the software, and the transcript of the cis-type ZAQ gene in the ss-type cDNA sample was quantified.
  • SDS7700 .. Sequence Detection System
  • Primers bZAQb_F2 (SEQ ID NO: 86) and primer bZAQb-tempIR (SEQ ID NO: 87) were prepared from PBI5E as type II and information on type I5E, and a standard DNA fragment for ZAQ was prepared by the method described below. .
  • PCR reaction solution was added with PfuTurbo hotstart DNA polymerase (3 & 1 & 8611 ⁇ 2).
  • 10x PCR buffer with 20 xl, dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo) 161, IOM primers bZAQb-F2 and bZAQb-tempIR for each IO I, cDNA cDNA (pBI5E) 4, ul and distilled Water was made by mixing 1361.
  • the reaction conditions were 95 for 1 minute initial denaturation, and 40 cycles of 95 9530 seconds-60 T ⁇ 30 seconds-72 ° C. 11 minute were performed 40 times.
  • the obtained DNA fragment was used as a standard I5E DNA fragment.
  • a TaqMan probe and a probe bZAQb-probe (5, -FAM-CACACACCGCTCACTGGAAAGCTTCA-TAMRA-3, SEQ ID NO: 90) for ⁇ -type I5E were prepared.
  • the combination of TaqMan Probe and TaqMan Primer for ⁇ -type I5E gene enables the quantification of ⁇ -type I5E gene transcripts by TaqMan PCR analysis using BACE-derived cDNA (BACE cDNA) and BAE-derived cDNA (BAE cDNA) as ⁇ -type. went.
  • the reaction mixture is 2xTaqMan PCR Master Mix 12.5 K5 M primers bZAQb-taqF and bZAQb-taqR 1.5 1 each, 5 / ⁇ probe 2 (1 ⁇ 2-] ⁇ 136 11 each, for dilute I5E
  • a standard DNA fragment or type III cDNA was prepared by mixing 4 zl (derived from 200 ng tRNA) and 4.51 of distilled water.
  • the TaqMan PCR reaction was performed using the SDS7700 (Sequence Detection System, ABI) under the conditions that the initial reaction at 50 ° C for 2 minutes and 95 ° C for 10 minutes, and the cycle reaction at 95 ° C for 15 seconds-60 t> 1 minute 50 times. It was carried out using. After the reaction was completed, a standard curve was plotted on the software from the fluorescence intensities of the standard DNA fragments at each dilution concentration, and the transcript of the ⁇ -type I5E gene in the ⁇ -type cDNA sample was quantified. ...
  • the human ZAQ ligand peptide, the human Bv8 peptide and the snake venom MIT1 used in this reference example are described in Example 1 of WO 02/57443 and Examples of TO 02/57443. 2, and prepared according to the method described in Example 8 of WO 02/6483.
  • BACE was isolated using the method reported by Gospodarowicz et al. (Journal of Cellular Physiology 127, 121-136, 1986). 3X10 4 cells / 200! BACE dispersed in a growth medium (including 10% fetal serum (FBS), 100 units / ml Penicillin, 100 zg / ml !!! ⁇ !)? ⁇ ! ⁇ 1 / we 11 to become as FL I PR for 96-well plate (Black plate clear bottom, Coster, Inc.) was seeded, were used after overnight culture experiments with 5% C0 2 incubator at in one 37 ° C (Hereinafter referred to as a cell plate).
  • FBS fetal serum
  • FLIPR Atsushi buffer (Nissi Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g, sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, adjust pH 7.4 with 6 M sodium hydroxide solution, fill up to 1 liter and filter 10 ml, 250 mM Probenecid 100 ⁇ , and 100 U of FBS were mixed.
  • human ZAQ ligand peptide, human Bv8 peptide or hepitoxin ⁇ ⁇ was diluted with Hanks' / HBSS containing 2.5 mM Probenecid, 0.2% bovine serum albumin (BSA), and 0.1% CHAPS, and distributed on a 96-well plate. Injected (sample plate). After dye loading of the cell plate, plate wash the cell plate with FLIPR assay buffer (wash buffer) containing 2.5 mM Probenecid.
  • BACE capillary endothelial cells increase intracellular calcium ions in response to human ZAQ ligand peptide, human Bv8 peptide and snake venom MIT1. It is clear that it will happen.
  • the test compound by stimulating human capillary endothelial cells with the peptide of the present invention such as human type ZAQ ligand peptide, human type Bv8 peptide and snake venom MIT1 in the presence or absence of the test compound, in addition, it is possible to know whether or not the test compound has an activity of inhibiting ZAQ or I5E signal signaling, and to obtain an eating regulator, preferably a prophylactic / therapeutic agent for eating disorders.
  • the peptide of the present invention such as human type ZAQ ligand peptide, human type Bv8 peptide and snake venom MIT1 in the presence or absence of the test compound.
  • BACE dispersed in a growth medium was inoculated on a 12-well plate at 2 ⁇ 10 5 ce 11 s ⁇ 1 / we 11 and then cultured at 37 ° C. at 5% ′ C 0 2 and used for the experiment. 10 nM, 100 nM, and 1,000 nM of a ligand solution were added at 10 i 1 and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • ligand solution a solution prepared by dissolving human ZAQ ligand peptide, human Bv8 peptide or snake venom MIT1 in H / HBSS containing 0.2% BSA and 0.1% CHAPS was used.
  • Lysis Buffer 50 iM Tris to remove the supernatant, 150 mM NaCK 1 raM EDTA, 2 mM Na 3 V0 4, 50 mM NaF, 4 mM Na 4 P 2 0 7, 1% NP 40, 1 mM
  • sample buffer for SDS-PAGE 300 mM Tris, 10% sodium dodesylsulfate, 0.025% bromophenolblue ⁇ 50% glycerol, pH 6.8 was added to the supernatant, and the mixture was boiled for 3 minutes. .
  • 181 was separated by SDS-PAGE using a 12.5% gel (BIO-RAD). After electrophoresis, the gel was shaken in a transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 10% MeOH) for 15 minutes, and the proteins in the gel were transferred to a PVDF membrane (MiniProBlot, Applied Biosysteras). .
  • the transferred membrane (blot) was blocked at ⁇ 4 ° C. using a blocking buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCK 0.1% Tween 20, 1% BSA, pH 7.4). After this, 30 ml of primary antibody solution (Phospho p42 / 44 MAP Kinase Antibody from Cell Signaling TECHNOLOGY, diluted 5,000-fold with the above-mentioned blocking buffer) was added to the plot, and the mixture was incubated at room temperature for 2 hours. I did it. After this, the plot was washed with a washing buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCK 0.1% Tween 20, pH 7.4) (X3 for 20 min), and the plot was added to the secondary viable solution (KPL).
  • a washing buffer 50 mM Tris, 150 mM NaCK 0.1% Tween 20, pH 7.4
  • Figure 3 shows that, when human ZAQ ligand peptide, human Bv8 peptide or snake venom MIT1 was added, the phosphorylated MAP kinase (MAPK-P) band was stained compared to the control without ligand. It can be read that the strength has increased.
  • snake venom could show this enhancing effect at a concentration as low as 0.1 InM, and human Bv8 peptide showed this effect from InM, and human ZAQ ligand peptide showed this effect from ⁇ . _
  • BACE activates MAP kinase by the addition of peptides such as human type ZAQ ligand peptide, human type Bv8 peptide and snake venom MIT1. Therefore, by stimulating the pest capillary endothelial cells with the peptide of the present invention such as human type ZAQ ligand peptide, human type Bv8 peptide and snake venom MIT1 in the presence or absence of the test compound, Whether it has an activity of inhibiting ZAQ or I5E signaling, and thus can obtain an eating regulator, preferably a prophylactic / therapeutic agent for eating disorders.
  • This ligand solution was prepared by dissolving a human ZAQ ligand peptide, a human Bv8 peptide or a hepatotoxin MIT1 in H / HBSS containing 0.2% BSA and 0.1% CHAPS.
  • Fig. 4 shows that when a peptide such as human ZAQ ligand peptide, human Bv8 peptide or snake venom MIT1 was added, the phosphorylated P38 MAP kinase (compared to the control without added ligand) It can be seen that the staining intensity of the p38 MAPK-P) band has been enhanced, and that the snake venom MIT1 can exhibit this enhancing effect at a concentration as low as 0.1 InM, indicating that the human Bv8 peptide Showed this effect from InM and human ZAQ ligand peptide from 1 OnM.
  • a peptide such as human ZAQ ligand peptide, human Bv8 peptide or snake venom MIT1
  • BACE is apparently activated by the addition of peptides such as the human ZAQ ligand peptide, the human Bv8 peptide and the snake venom MIT1 to activate p38 MAP kinase. is there.
  • the human capillary ZAQ ligand peptide, the human Bv8 peptide, and the peptide of the present invention such as hepitoxin are stimulated to stimulate the capillary endothelial cells. It is possible to know whether the test compound has an activity of inhibiting ZAQ or ⁇ 5 ⁇ signal information transmission, and to obtain an eating regulator, preferably a prophylactic / therapeutic agent for eating disorders. . +
  • BACE dispersed in a growth medium was seeded on a 48-well plate at 1.5 ⁇ 10 4 cells / 200 1 / wel 1 and cultured overnight.After removing the culture supernatant, the assay buffer (0.5% BSA, 0.1% FBS) was removed. DMEM) 495 1 and 5 l of a ligand solution were added, and the cells were further cultured for 15-18 hours.
  • ligand solution a solution prepared by dissolving human ZAQ ligand peptide, human Bv8 peptide or snake venom MIT1 in H / HBSS containing 0.2% BSA and 0.1% CHAPS was used.
  • Thymidine solution (NEN, NET-027 diluted 100-fold with serum-free DMEM) was added to each well, and the cells were further cultured for 6 hours. Thereafter, the culture supernatant was removed, washing buffer 5001 was added to each well, and after washing, methanol 5001 was added and left on ice for 15 minutes. Thereafter, the supernatant of each well was removed, 5% trifluoroacetic acid (TCA) 5001 was added, and the mixture was left on ice for 15 minutes. TCA was removed, and 500 l of water was added, followed by washing. Finally, after adding and dissolving 200 1 of 0.3 NaOH, 3 ml of liquid scintillation was added, and radioactivity was measured with a liquid scintillation counter. The results are shown in FIG.
  • Figure 5 shows that when human type ZAQ ligand peptide, human type Bv8 peptide or snake venom was added, [3 ⁇ 4] thymidine incorporation was observed in human adrenal capillary endothelial cells compared to control without ligand. It can be seen that the amount has increased.
  • a test compound by stimulating human capillary endothelial cells using the human ZAQ ligand peptide, human human Bv8 peptide and the peptide of the present invention such as snake venom MIT1, It is possible to know whether the test compound has the activity of inhibiting ZAQ or I5E signal signaling, Preferably, a prophylactic / therapeutic agent for eating disorders can be obtained.
  • BACE dispersed in a growth medium was seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / ml / we11 and cultured.
  • a human ZAQ ligand peptide or a human Bv8 peptide dissolved in H / HBSS containing 0.2% BSA and 0.1% CHAPS was added in an amount of 10 x l, and the cells were further cultured for 4 to 5 days. Thereafter, the culture supernatant was removed, PBS lnil was added to the wells, and the cells were washed. Then, 200 ⁇ l of a trypsin solution was added, the cells were collected by pipetting, and the number of cells was measured using a hemocytometer.
  • FIG. 6 shows that the number of adrenal capillary endothelial cells increased when human ZAQ ligand peptide or human Bv8 peptide was added compared to the control without the above peptide. Understand.
  • the test compound in the presence or absence of a test compound, is stimulated with a ZAQ ligand endothelial cell such as a human ZAQ ligand peptide and a human Bv8 peptide to stimulate the ZAQ to the test compound.
  • a ZAQ ligand endothelial cell such as a human ZAQ ligand peptide and a human Bv8 peptide to stimulate the ZAQ to the test compound.
  • an eating control agent preferably a prophylactic / therapeutic agent for eating disorders.
  • the peptide of the present invention is a feeding regulator, preferably an eating disorder or It is useful for a simple search method (screening) to obtain a prophylactic and therapeutic agent for obesity.
  • An antagonist of the protein of the present invention, the above-mentioned antibody, etc. may be used for excellent eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.), sleep disorders [eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition due to three shift work, etc.) Modulation, time-band change syndrome (jet lag, etc.)], seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disease, senile dementia, Alzheimer's disease, aging-related disorders, cerebral circulation disorders (eg, stroke), head Traumatic injury, spinal cord injury, fight Prevention and treatment of cancer, anxiety, depression, manic depression, schizophrenia, alcoholism, Parkinson's disease, hypertension, arteriosclerosis, arrhythmia, premenstrual syndrome, glaucoma, cancer, AIDS, diabetes, etc. Useful as an agent.
  • eating disorders eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.
  • sleep disorders eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition
  • the agonist of the protein of the present invention, the peptide of the present invention, the protein of the present invention, etc. may be used to produce excellent obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity) , Hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamus obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity , Central obesity, etc.), sleep disorders [eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, 'modulation of physical condition due to three shifts, time-band change syndrome (jet lag)', etc.)], seasonal depression, reproductive function Disorders, endocrine disorders, senile dementia, Alzheimer's disease, aging-related disorders, cerebral circulation disorders (eg, stroke), head trauma, spinal cord injury, epilepsy, anxiety, depression, manic depression, schizophrenia, Alcohol addiction, Pas one Parkinson's disease, hypertension, arteriosclerosis,
  • the protein of the present invention, the DNA of the present invention, the antisense DNA of the present invention, and the antibody of the present invention include (i) a preventive / therapeutic agent for various diseases conferred by the protein of the present invention; Screening for a compound or a salt thereof that alters the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention, (iii) quantification of the protein of the present invention, (iv) an agent for genetic diagnosis, and (V) an antisense DNA.
  • a preventive / therapeutic agent for various diseases conferred by the protein of the present invention Screening for a compound or a salt thereof that alters the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention, (iii) quantification of the protein of the present invention, (iv) an agent for genetic diagnosis, and (V) an antisense DNA.
  • a preventive / therapeutic agent for various diseases conferred by the protein of the present invention Screening for a compound or a salt thereof that alters the binding of the

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Abstract

（a）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および（または）（b）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いるスクリーニングで得られる化合物またはその塩は、例えば、摂食調節剤などとして、摂食障害、肥満症などの予防・治療に使用することができる。

Description

明 細 書 摂食調節剤 技術分野
本発明は、 （1 ) (i) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番 号： 1 3、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 9もしくは配列番号： 3 6で表され るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するべプチド またはその塩、 および （i i) 配列番'号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 4 6、 配列番号： 4 8、 配列番号： 5 0もし くは配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを用いる、 摂食調節剤として有用な 化合物またはその塩などのスクリーニング方法 Zキット、 （2 ) 配列番号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 4 6、 配 列番号： 4 8、 配列番号： 5 0もしくは配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の 活性を阻害する摂食障害予防 ·治療剤、 （3 ) 上記蛋白質またはその塩の活性 を促進する肥満症の予防 ·治療剤などに関する。 背景技術
回腸収縮活性を有する ZAQリガンド （ZAQリガンドペプチドとも記載する） は、 ォーファン受容体である ZAQおよび 15Eに結合し、 ZAQおよび 15Eを活性化する
(W0 01/16309号公報、 W0 02/6483号公報、 W0 02/62996号公報など）ことが、 ま た、 回腸収縮活性を有する Bv8ぺプチドおよびへビ毒 MIT1も、 ォーファン受容体 である ZAQおよび I5Eに結合し、 ZAQおよび I 5Eを活性化する (W0 02/62944号公報 など）ことが報告されている。 ヒト型 ZAQリガンドおよびヒト型 Bv8ぺプチドにつ いては、 それらの活性化方法も報告されている (W0 02/57443号公報） 。
一方、 各種の分泌蛋白質を集めたライブラリーからゥシ副腎毛細血管内皮細 胞に対する新たな増殖因子が見出され、 この物質は、 既知の血管内皮細胞増殖 因子 VEGFとは異なり、 内分泌性組織由来の内皮細胞に特異的な増殖因子であり、 この性質から EG- VEGF (ヒト型 ZAQリガンドとも記載する） と名づけられた
(Nature, 412卷、 877-884頁、 2001年） 。 EG- VEGFは生理的には内分泌組織を特 徵づける透過性の高い内皮構造 （fenes t rate) の形成に関与することが示唆さ れている。 また、 その遺伝子の転写制御領域には低酸素下での発現誘導に関わ ¾ hypoxi a- induc ib l e f ac tor - 1 (HIF-1) の認識部位が存在し、 実際に副腎由来 の癌細胞では、 低酸素下での EG- VEGF遺伝子発現誘導が確認された。 さらに、 ヒ ト多嚢胞性卵巣症候群 （po lycys t i c ovary syndrome) では EG- VEGFの強発現が 認められたとの記載がなされている。
また、 脳内の Bv8ペプチド （PK- 2) は、 ラット視交叉上核に局在し、 その発現 は日内変動し明期に増大し、 脳室内投与した PK- 2はラットの行動量を減少させ ることが知られている （Nature、 417巻、 405- 410頁、 2002年） 。
安全で、 優れた摂食障害の予防 ·治療剤および肥満症の予防 ·治療剤が望ま れている。 発明の開示
本発明者らは、 ヒト型 Bv8ペプチドをラット脳室内投与したところ、 摂食抑制 作用を有すること、 ラットの体温が減少することを見出し、 鋭意研究を重ねた 結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列 番号： 2 5もしくは配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害または 促進する化合物またはその塩を含有してなる摂食調節剤、
( l a ) 配列番号： 1、 配列番号： 3もしくは配列番号： 2 5で表されるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまた はその塩の活性を阻害または促進する化合物またはその塩を含有してなる摂食 調節剤、
( 2 ) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列 番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチドまたはその塩の活性を阻害する化 合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防 ·治療剤、
(2 a) 配列番号： 1、 配列番号： 3もしくは配列番号： 25で表されるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチドまた はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予 防 ·治療剤、
( 3 ) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 '配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障 害の予防 ·治療剤、
(3 a) 配列番号： 37もしくは配列番号： 40で表されるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性 を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防 ·治療剤、
(4) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩と （b) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食 障害または肥満症の予防 ·治療剤、
(4 a) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 25もしくは配列番 号： 36で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するペプチドまたはその塩と （b) 配列番号： 37もしくは配列番号： 40 で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する 蛋白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂 食障害または肥満症の予防 ·治療剤、 (5) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列 番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を促進する化 合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防 ·治療剤、
(6) 配列番号： 37、 配列番号： 40 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列畚号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症 の予防 ·治療剤、
(7) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列 番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチドまたはその部分べプチドをコ一ド する DNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその : 一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる摂食障害の予防 ·治 療剤、
( 8 ) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列 番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸.配列を含有するべプチドまたはその部分べプチドまたはそ の塩に対する抗体を含有してなる摂食障害の予防 ·治療剤、
(9) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aの塩基配列に相補的もしくは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチ ドを含有してなる摂食障害の予防 ·治療剤、
(10) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 4 4、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号 .' 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す る蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる摂 食障害の予防 ·治療剤、
(11) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするボ リヌクレオチド、 または （b) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 4 2、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もし くは配列番号： 52で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有 してなる摂食障害または肥満症の診断薬、
(12) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩、 および （または） （b) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは 配列番号： 52で表されるァミノ.酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする摂食調節剤のス クリーニング方法、
(12 a) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 25もしくは配列 番号： 36で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するペプチドまたはその塩、 および （または） （b) 配列番号： 37もし くは配列番号： 40で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする摂食調節剤 のスクリーニング方法、
(13) 摂食調節剤が摂食障害または肥満症の予防 ·治療剤である上記 （ 1 2) 記載のスクリーニング方法、
(14) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩、 および （または） （b) 配列番号： 3'7、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは 配列番号： 52で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴とする摂食調節剤の スクリーニング用キッ卜、
(15) 摂食調節剤が摂食障害または肥満症の予防 ·治療剤である上記 （ 1 4) 記載のスクリーニング用キット、 ·
(16) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポ リヌクレオチド、 および （または） （b) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 酉己 列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番 号： 50もしくは配列番号： 52で表されるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリ一エング方法、
(17) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 および （または） （b) 配列番号： 3 7、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配 列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で表されるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする摂食調節剤のス クリーニング方法、
(17 a) 上記 （12) 、 (16) もしくは （17) 記載のスクリーニング 方法または上記 （14) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる摂食 調節剤、
(18) 哺乳動物に対し、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または （ii) 配列番号： 37、 配列 番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48, 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で表されるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻 害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする摂食障害の予 防 ·治療法、
(19) (i) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のァミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害す る、 または （ii) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番 号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番 号： 52で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害することを特徴とする摂食障害の予 防 ·治療法、
(20) 摂食障害の予防 ·治療剤を製造するための （i) 配列番号： 1、 配列 番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番 号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または (ii) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用などを提供する。 さらに、
(21) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 酉己 列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 の、 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配 列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で表 されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩の活性化作用を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂 食障害の予防 ·治療剤、
(22) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配 列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 の、 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配 列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で表 されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩の活性化作用を促遒する化合物またはその塩を含有してなる肥 満症の予防 ·治療剤、
(23) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩と （b) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩との結合を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満 症の予防 ·治療剤、
(24) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配 列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 の、 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配 列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で表 されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質またはその塩の活性化作用を促進または阻害する化合物またはその塩を含有 してなる睡眠障害の予防 ·治療剤、
(25) (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩および （または） （b) 配列番号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 4 6、 配列番号： 4 8、 配列番号： 5 0もしくは 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする睡眠障害の予 防 ·治療剤のスクリーニング方法なども提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 参考例 2で行われたゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) およびゥシ 大動脈血管内皮細胞 （BAE) におけるゥシ型 ZAQおよびゥシ型 I 5E mRNAの TaqMan PCR法による定量結果を示す。 図中、 口は t o t al RNA 1 ngあたりのゥシ型 ZAQ mRNAのコピー数を、 また、 固は同様にゥシ型 I 5E mRNAのコピー数を示す。
図 2は、 参考例 3で行われた BACEを用いた FL IPRによる細胞内カルシウムィォ ン濃度上昇活性の測定の結果を示す。 図中、 ー秦一は、 ヒト型 ZAQリガンドぺプ チドを、 一▲—はヒト型 Bv8ペプチドを、 —園一は MIT1を示す。
図 3は、 参考例 3で行われた BACEにおける p42 MAPキナーゼおよび p44 MAPキ ナーゼの活性化に及ぼす ZAQ関連ペプチドの用量反応性の結果を示す。 図中、 C はリガンド （溶液） を投与しないコントロールを、 Mは MIT1を、 L1はヒト型 ZAQ リガンドペプチドを、 L2はヒト型 Bv8ペプチドをそれぞれ図中に示した濃度で添 加したことを示す。 また、 p44 MAPK- Pはリン酸化された p44 MAPキナーゼのバン ドを、 また p42 MAPK- Pはリン酸化された p42 MAPキナーゼのバンドを示す。
図 4は、 参考例 3で行われた BACEにおける p38 MAPキナーゼの活性化に及ぼす ZAQ関連ペプチドの用量反応性の結果を示す。 図中、 Cはリガンド （溶液） を投 与しないコントロールを、 Mは ΜΙΠを、 L1はヒト型 ZAQリガンドペプチドを、 L2 はヒト型 Bv8ペプチドをそれぞれ図中に示した濃度で添加したことを示す。 また、 P38 MAPK- Pはリン酸化された p 38 MAPキナ一ゼのバンドを示す。
図 5は、 BACEにおける [¾]チミジン取り込みに及ぼすぺプチドの用量反応性 の結果を示す。 図中、 一 C —は、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドを、 一 A—はヒト 型 Bv8ペプチドを、 一画一は MIT1を示す。
図 6は、 BACEの増殖に及ぼすヒト型 ZAQリガンドぺプチドおよびヒト型 Bv8ぺ プチドの影響を示す。 縦軸は、 1ゥエルあたりの BACEの細胞数を示す。 横軸の ZAQL- 1は、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドを、 ZAQL- 2は、 ヒト型 Bv8ペプチドを示 す。 *は S tudent ' s t tes t 検定から得られた p値が 0. 05より小さいことを、 * *は同様に、 p値が 0. 001より小さいことを示す。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 2 5もしくは配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 (以下、 本発明のペプチド と略記することがある） は、 配列番号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 4 6、 配列番号： 4 8、 配列番号： 5 0もし くは配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩 （以下、 本発明の蛋白質と略記するこ とがある） と結合する能力を有するペプチドまたはその塩であり、 本発明の蛋 白質と結合し、 本発明の蛋白質を活性化する能力を有するペプチドまたはその 塩である。 本発明のペプチドの本発明の蛋白質と結合する能力および本発明の 蛋白質を活性化する能力は、 後述の方法により測定することができる。
本発明のペプチドは、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモット、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど) のあらゆる細胞 (例え ば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 ιδ細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細 胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維 細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核 球、 清膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞も しくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞な ど） や血球系の細胞 (例、 MEL、 Ml、 CTLL- 2、 HT - 2、 WEHト 3、 HL-60、 腿 - 1、 K562、 ML- 1、 MOLT - 3、 MOLT- 4、 MOLT- 10、 CCRF- CEM、 TALL- 1、 Jurkat , CCRT - HSB - 2、 KE - 37、 SKW- 3、 HUT- 78、 HUT- 102、 H9、 U937、 THP - 1、 HEL、 JK - 1、 CMK、 KO-812, MEG- 01など） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視 床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳 染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎齓 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 (例、 大腸 小腸） 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部位） に由来するペプチドであって もよく， また合成ペプチドであってもよい。
本発明のぺプチドがシグナル配列を有している場合は、 該ぺプチドを効率良 <細胞外に分泌させることができる。
配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 1または配列番号： 3で表される アミノ酸配列と約 6 0 %以上 （好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 8 5 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最 も好ましくは約 9 5 %以上） の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1または配列 番号： 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配 列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと 実質的に同質の性質を有するペプチドなどが好ましい。
以下、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有する ぺプチドをヒト型 Z AQリガンド成熟体べプチドと記載することがある。
配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有し、 配列番号： 1または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列 を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましく、 具体的には配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7で 表されるアミノ酸配列を含有するべプチド等が挙げられる。
以下、 配列番号： 5または配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有する ぺプチドをヒト型 Z AQリガンド前駆体べプチドと記載することがある。 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 9で表される ミノ酸配列と 9 5 %以上 （好ましくは 約 9 7 %以上、 さらに好ましくは約 9 9 %以上） の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。
配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列を有 するペプチドと実質的に同質の活 を有するペプチドなどが好ましい。
以下、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型 Z AQリガンド成熟体べプチドと記載することがある。
配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 9で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 9で表さ れるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドな どが好ましく、 具体的には配列番号： 9または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列を有するぺプチド等が挙げられる。
以下、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型 Z AQリガンド前駆体ペプチドと記載することがある。
配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列と 9 5 %以上 （好まし くは約 9 7 %以上、 さらに好ましくは約 9 - 9 %以上） の相同性を有するァミノ 酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配 列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有 るペプチドなどが好ましい。 配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するペプチドとして具体的には、 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含 有するペプチド、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド などが挙げられる。
以下、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 5または配列番号： 1 7で表されるァ ミノ酸配列を有するペプチドをラット型 Z A Qリガンド成熟体べプチドと記載 すること力 Sある。
配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するペプチドとして具体的には配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1または配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列を有するペプチド等も挙げら れる。 '
以下、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1または配列番号： 2 3で表されるァ ミノ酸配列を有するペプチドをラット型 Z A Qリガンド前駆体べプチドと記載 することがある。 .
配列番号： 2 5または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 2 5または配列番号： 2 9で 表されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上 （好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ま しくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 8 5 %以上、 特に好ましくは約 9 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上） の相同性を有するアミノ酸配列などが挙 げられる。
配列番号： 2 5または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 2 5また は配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有し、 配列番号： 2 5または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を有する ペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
以下、 配列番号： 2 5で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをヒト型 B V 8成熟体ペプチド、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を有するぺプチ ドをラット型 B v 8成熟体ペプチドまたはマウス型 B v 8成熟体ペプチドと記 載することがある。
配列番号： 2 5で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 2 5で表されるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 5 で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するぺプ チドなどが好ましく、 具体的には配列番号： 2 7または配列番号： 2 5で表さ れるァミノ酸配列を有するぺプチド等が挙げられる。
配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 2 9で表されるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 9 で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するぺプ チドなどが好ましく、 具体的には配列番号： 3 2、 配列番号： 2 9または配列 番号： 3 4で表されるアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられる。
以下、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをヒト型 B V 8前駆体ペプチドと記載することがある。 配列番号： 3 2で表されるァミノ 酸配列を有するぺプチドをラット型 B v 8前駆体べプチドと記載することがあ る。 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型 B v 8前駆体べプチドと記載することがある。
配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上 （好ま しくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 8 5 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上） の相 同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配 列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。 以下、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを M I Τ 1 と記載することがある。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などが挙げられる。 実質的に同 質とは、 それらの活性が性質的に同質であることを示す。 したがって、 本発明 の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用な どの活性が同等 (例、 約 0 . 5〜2倍) であることが好ましいが、 これらの活 性の程度ゃぺプチドの分子量などの量的要素は異なつていてもよい。
これらの活性の測定は、 自体公知の方法に準じて行なうことができるが、 例 えば、 後述するスクリーニング方法などに従つて測定することができる また、 本発明のペプチドとしては、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列 番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 2 5または配列番号： 2 9で表される アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ま しくは 1〜2 0個程度） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番 号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 2 5また は配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜4 0個程度、 より好ましくは 1〜3 0個程度、 なかでも好ましくは 1〜2 0個程度） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1、 配列番 号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 2 5または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜4 0個程 度、 より好ましくは 1〜3 0個程度、 なかでも好ましくは 1〜2 0個程度） の アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （iv) それらを組 み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなども用いられる。
本発明のペプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列を含有するヒト由来のペプチド、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配 列を含有するヒト由来のペプチド、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列を含 有するマウス由来のペプチド、 配列番号： .1 3で表されるアミノ酸配列を含有 するラット由来のペプチド、 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有す るラット由来のペプチド、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列を含有する ラット由来のペプチド、 配列番号： 2 5で表されるアミノ酸配列を含有するヒ ト由来のペプチド、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を含有するラッ卜 由来またはマウス由来のぺプチドなどがあげられる。
本発明のぺプチドの部分べプチドとしては、 後述の医薬等のスクリ一二ング 方法に用いることのできるものであれば、'いかなるものであってもよく、 本発 明のペプチドと実質的に同質の活性を有していればよい。 該部分ペプチドのァ ミノ酸の数は、 本発明のペプチドの構成アミノ酸配列のうち少なくとも 1 0個 以上-. 好ましくは 2 0個以上のア ノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。 ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同 質の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは数個 （1〜4個） ) のアミノ酸が欠失し、 （i i) 上記アミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個 程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加し、 または
( i i i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは数個 （1〜4 個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
以下、 本発明のペプチドとの本発明のペプチドの部分ペプチドとをまとめて 本発明のぺプチドと称することがある。
本発明の蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモット、 ラッド、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュ ラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑 膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは 間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血 球系の細胞 （例えば、 MEL、 Ml、 CTLL_2、 HT- 2、 WEHI- 3、 HL - 60、 匪- 1、 K562、 ML- 1、 MOLT- 3、 MOLT - 4、 MOLT- 10、 CCRF- CEM、 TALL - 1、 Jurka CCRT- HSB - 2、 KE- 37、 SKW- 3、 HUT- 78、 HUT- 102、 H9、 U937、 THP-K 鼠、 JK - 1、 CMK、 K0- 812、 MEG- 01など） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳 の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒 質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関 節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部位） に由来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であってもよい。
本発明の蛋白質がシグナル配列を有している場合は該ペプチドまたは蛋白質 を効率良く細胞外に分泌させることができる。
配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と約 9 0 %以上、 好ま しくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。 '
配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
本発明の配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 3 7で表され るァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 配列番 号： 3 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが 好ましい。 具体的には W0 01/16309号公報に記載の蛋白質などが挙げられる。
¾下、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を Z A Qまた はヒト Z A Qと記載することがある。
配列番号： 4 2で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 4 2で表される.アミノ酸配列と約 9 7 %以上、 好ま しくは約 9 8 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上、 最も好ましくは約 9 9 . 5 %以上の相同性を有するァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 2で表されるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 2で 表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては, 例えば、 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ま しくは約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 % 以上の相同性を有するァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 4で表されるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 4で 表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 配列番号： 4 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 4 0で表されるアミノ酸配列と約 9 0 %以上、 好ま しくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。
配列番号： 4 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 0で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号-: 4 0で表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 4 0で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 0で表されるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 0で 表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、 具体的には TO 98/46620号公報に記載の蛋白質などが挙げられる。
以下、 配列番号： 4 0で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を I 5 Eまた はヒト型 I 5 Eなどと記載することがある。
配列番号： 4 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 4 6で表されるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ま しくは約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 % 以上の相同性を有するァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 6で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 4 6で表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 4 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 6で表されるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 6で 表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、 具体的には、 Biochem. Biophys. Acta, 1491巻， 369- 375頁， 2000年に記載の蛋 白質などが挙げられる。
配列番号： 4 8で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 4 8で表されるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ま しくは約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 % 以上の相同性を有するァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 8で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 8で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号.： 4 8で表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 4 8で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 4 8で表されるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 8で 表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、 具体的には TO 98/46620号公報に記載の蛋白質などが挙げられる。
. 配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列と 9 5 %以上、 好まし くは約 9 7 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。
配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
本発明の配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 0で表され るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番 号： 5 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが 好ましい。
以下、 配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をゥシ型 Z A Qと記載することがある。
配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と 9 5 %以上、 好まし くは約 9 7 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。
配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
本発明の配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5 2で表され るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番 号： 5 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが 好ましい。
以下、 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をゥシ型 I 5 Eと記載することがある。 実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明のペプチドに対する結合活性、 シグナル情報伝達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が 性質的に同質であることを示す。 したがって、 本発明のぺプチドに対する結合 活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等 （例、 約 0. 5〜2倍） である ことが好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異 なっていてもよい。
結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方法に準 じて行なうことができる。
さらに、 本発明の蛋白質としては、 （i) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番 号： 50または配列番号： 52で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ま しくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配 列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番 号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50または配列番号： 52で表される アミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好まし くは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ) のアミノ酸が 付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50ま たは配列番号： 52で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 (1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 ま たは （iv) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いら れる。
本発明の蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 37または配列番 号： 40で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来 (より好ましくはヒト脳 由来） の蛋白質、 配列番号： 42または配列番号： 44で表されるアミノ酸配 列を含有するラット由来の蛋白質、 配列番号： 46または配列番号： 48で表 されるアミノ酸配列を含有するマウス由来の蛋白質、 配列番号： 50または配 列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列を含有するゥシ由来の蛋白質などがあげ られる。
本発明の蛋白質の部分ペプチド （以下、 本発明の部分ペプチドと略記する場 合がある） としては、 前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れの ものであってもよいが、 例えば、 本発明の蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露 出している部位であって、 実質的に同質のリガンド結合活性を有するものなど が用いられる。
具体例として、 本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロット解 析において細胞外領域 (親水性 (hydrophi l i c) 部位） であると分析された部分 を含むペプチドである。 また、 疎水性 （hydrophobic) 部位を一部に含むぺプチ ドも同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むぺプチドも用い 得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明の蛋白質の構成ァ ミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好まし くは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好 ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。 ここで、 「実質的に同質のリガンド結合活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同質のリガンド結合活性」 の測定は自体公知の方法に準じて行なう ことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 配列番号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配列番 号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 4 6、 配列番号： 4 8、 配列番号： 5 0または配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ま しくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 ( 1または 2個) ) のァミノ 酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1 〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1ま たは 2個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個程度、 さらに 好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されてい てもよい。 '
本発明のぺプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分べプチドの塩とし ては、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩として は、 例えば無機酸 （例、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩 あるいは 有機酸 （例、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、'コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼン スルホン酸) との塩などが用いられる。
本明細書におけるべプチドおよ 蛋白質は、 ぺプチド標記の慣例に従って左 端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列 番号： 3 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする本発明の 蛋白質は、 C末端がカルボキシル基 （-C00H) 、 カルポキシレート（- C00— ) 、 ァ ミド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ—ナフチルなどの〇6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニルー C卜 2アルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどの —ナフチルー
2アルキル基などの C7_147ラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用される ピバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のペプチドおよび本発明の蛋白質 （本発明のペプチド ·蛋白質） が C 末端以外に力ルポキシル基 (またはカルポキシレート） を有している場合、 力 ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のぺプチ ド -蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端 のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のペプチド ·蛋白質には、 上記したペプチド *蛋白質におい て、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセ チル基などの C 2_6アル力ノィル基などの C wァシル基など） で保護されている もの、 N端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸化 したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例、 - 0H、 -SH、 アミノ基、 ィ ミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの c2_6アル力ノィル基などの c wァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド。糖蛋白 質などの複合ペプチド ·複合蛋白質なども含まれる。 . また、 本発明の部分ペプチドは C末端が、 力ルポキシル基 （- C00H) 、 力ルポ キシレ一ト （- C00— ) 、 アミド （- (；0丽2) またはエステル （- C00R) であっても よい。 本発明の部分ペプチドが C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキ シレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化さ れているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルとして は、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明の蛋白質と同様に、 N 末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生 体内で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミ ノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が 結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のペプチドもしくは蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物 の細胞または組織から自体公知のペプチド ·蛋白質の精製方法によって製造す ることもできるし、 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 7、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 9、 配列番号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番 号： 4 6、 配列番号： 4 8、 配列番号： 5 0または配列番号： 5 2で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培 養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド ·蛋白質 合成法またはこれに準じて製造することもできる。 さらに、 配列番号： 4 6で 表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはその塩は、 Bi ochem. Biophys. Ac t a, 1491巻， 369-375頁， 2000年に記載の方法に準じて製造できる。 配列番 号： 4 0または配列番号： 4 8で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または その塩は、 W0 98/46620号公報に記載の方法に準じて製造できる。 ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィ一、 イオン交換ク口マトグラフィ一などのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ れらのアミド体またはそれらの塩の合成には、 通常市販のペプチド ·蛋白質合 成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメ チル樹脂、 ヒドロキシメチル榭脂、 ベンズヒドリルアミン榭脂、 アミノメチル 樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4 _メチルベンズヒドリ ルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 '—ジメトキシフエ二 ル一ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 '， 4 '—ジメトキシフエ二 ル一 Fm o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 この ような樹脂を用い、 ひ一ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチド ·蛋白質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からペプチド ·蛋白質を切り出すと同 時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成 反応を実施し、 目的のペプチド ·蛋白質またはそれらのアミド体を取得する。 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド ·蛋白質合成に使用でき る各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド類としては、 D C C、 N， N'—ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチル— N'— （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用い られる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t , H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水 物または H O B tエステルあるいは H〇〇B tエステルとしてあらかじめ保護 アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ぺプチ ド ·蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されう る。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどの ハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチ ルスルホキシドなどのスルホキシド類., ピリジン， ジォキサン, テトラヒドロ フランなどのェ一テル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル 類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物 などが用いられる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知ら れている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択 される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 二 ンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離 を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができ る。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァ セチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することができる。 原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャリ一ペン チルォキシカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベンジ ルォキシカルポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 7ダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ ニル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 タ一シャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状も しくは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジル エステル、 4一二トロべンジルエステル、 .4—メトキシベンジルエステル、 4 一クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステ ル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 夕一シャリ一ブトキシカルポ ニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。 セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によつて保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカル ポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノ一ル性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12 — B z l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 夕一シャリ一プチルなどが用いら れる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4一メ卜キ シ一 2， 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 B um、 B o c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 H〇NB、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd_炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約— 20°C〜40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフィド、 1,4 -ブタンジチオール、 1, 2一エタンジチオールなど のようなカチォン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一 ル保護基として用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理 により除去され、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミ ル基は上記の 1 , 2一エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチォ一ルなどの存 在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアな どによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
ペプチド ·蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カル ポキシ末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化して保護した後、 ァミノ 基側にぺプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端の α— ァミノ基の保護基のみを除いたペプチド 蛋白質と C末端の力ルポキシル基の 保護基のみを除去したペプチド ·蛋白質とを製造し、 この両ペプチド ·両蛋白 質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記 と同様である。 縮合により得られた保護ペプチド ·保護蛋白質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗ペプチド ·粗蛋白質を得る ことができる。 この粗ペプチド ·粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精 製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチド ·蛋白質のアミド体を得 ることができる。
ペプチド ·蛋白質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ 酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとし た後、 ペプチド ·蛋白質のアミド体と同様にして、 所望のペプチド ·蛋白質の エステル体を得ることができる。
本発明のペプチドおよび本発明の蛋白質は、 自体公知のペプチドの合成法に 従って製造することができる。 また、 本発明の蛋白質の部分ペプチドまたはそ の塩は、 自体公知のペプチドの合成法に従って、 あるいは本発明の蛋白質を適 当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによ つても良い。 すなわち、 本発明のペプチドもしくは本発明の蛋白質を構成し得 る部分べプチドまたはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有 する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができ る。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の （i ) 〜 （V) に 記載された方法が挙げられる。 (i) . Bodanszky および M.A. OndettK ペプチド シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザペプチド (The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマト グラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のぺ プチドまたは本発明の部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で 得られるペプチドまたは部分ペプチドが遊離体である場合は、 公知の方法によ つて適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方 法によつて遊離体に変換することができる。
本発明のぺプチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドとし ては、 前述した本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードする塩基配列 を含有するものであればいかなるものであってもよい。 好ましくは DNAであ る。 DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細 胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するベクターは、 バクテリ オファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用い て直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT - PCR法 と略称する） によって増幅することもできる。
具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ ードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有す る DNA、 または配列番号： 2で表される塩基配列を有する DNAとハイスト リンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 本発明の 蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用な ど） を有するペプチドをコードする DNAであれば何れのものでもよい。 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 2 または配列番号： 6で表される塩基配列を含有する DNA等が挙げられる。 配列番号： 2で表される塩基配列を有する DNAとハイス卜リンジエンドな 条件下でハイブリダィズする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2で表され る塩基配列と約 60 %以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 8 0 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 具体的には、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ —ドする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 4で表される塩基配列を含有す る DNA、 または配列番号： 4で表される塩基配列を有する DNAとハイスト リンジヱントな条件下でハイブリダイズする D N Aを有し、 配列番号： 3で表 されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 本発明の 蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用な ど） を有するペプチドをコードする DNAであれば何れのものでもよい。 配列番号： 4で表される塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 4 または配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNA等が挙げられる。 配列番号： 4で表される塩基配列を有する DNAとハイス卜リンジエンドな 条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 4で表され る塩基配列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 8 0%以上の相同性を有する塩基配列 ¾含有する DN Aなどが用いられる。 具体的には、 配列番号： 9で表されるァ-ミノ酸配列を含有するペプチドをコ —ドする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 10で表される塩基配列を含有 する DNA、 または配列番号： 10で表される塩基配列を有する DNAとハイ ストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DN Aを有し、 配列番号： 9 で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 (例、 本発 明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用 など） を有するペプチドをコードする DNAであれば何れのものでもよい。 配列番号： 10で表される塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 10または配列番号： 12で表される塩基配列を含有する DNA等が挙げられ る。
配列番号： 10で表される塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 10で表 される塩基配列と 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 具体的には、 配列番号： 13 配列番号： 15または配列番号： 17で表さ れるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 14、 配列番号： 16または配列番号： 18で表される塩基配列を 含有する DNA、 または配列番号： 14、 配列番号： 16または配列番号： 1 8で表される塩基配列を有する DNAとハイストリンジェントな条件下で八ィ ブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 13、 配列番号： 15または配列番 号： 17で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 (例、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情 報伝達作用など） を有するペプチドをコードする DNAであれば何れのもので もよい。
配列番号： 14、 配列番号： 16または配列番号： 18で表される塩基配列 を含有する DNAとしては、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 4、 配列番号： 14、 配列番号： 16または配列番号： 18で表される塩基配 列を含有する DN A等が挙げられる。
配列番号： 14、 配列番号： 16または配列番号： 18で表される塩基配列 を含有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 14、 配列番号： 16または配列番号： 18 で表される塩基配列と 95 %以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは 約 99%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 具体的には、 配列番号： 25で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドを コードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 26で表される塩基配列を含 有する DNA、 または配列番号： 26で表される塩基配列を有する DNAとハ イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aを有し、 配列番号： 2 5で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達 作用など） を有するぺプチドをコードする D N Aであれば何れのものでもよい。 配列番号： 2 6で表される塩基配列を含有する D NAとしては、 配列番号： 2 6または配列番号： 2 8で表される塩基配列を含有する D NA等が挙げられ る。 '
配列番号： 2 6で表される塩基配列を有する D N Aとハイストリンジェント な条件下でハイブリダイズする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2. 6で表 される塩基配列と 9 5 %以上、 好ましくは約 9 7 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドを コードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 3 0または配列番号： 3 1で 表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 3 0または配列番号： 3 1で表される塩基配列を有する D N Aとハイストリンジェントな条件下でハ イブリダィズする D N Aを有し、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を含 有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など） を有するペプチドをコー ドする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 3 0または配列番号： 3 1で表される塩基配列を含有する D NA としては、 配列番号： 3 3、 配列番号： 3 Q、 配列番号： 3 5または配列番 号： 3 1で表される塩基配列を含有する D NA等が挙げられる。
配列番号： 3 0または配列番号： 3 1で表される塩基配列を有する D N Aと ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aとしては、 例えば、 配列蕃号： 3 0または配列番号： 3 1で表される塩基配列と 9 5 %以上、 好ま しくは約 9 7 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有する塩基配列 を含有する D N Aなどが用いられる。
また、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードす る D NAとしては、 例えば、 配列番号： 3 8または配列番号： 3 9で表される 塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 3 8または配列番号： 3 9で表 される塩基配列を有する D N Aとハイストリンジヱントな条件下でハイブリダ ィズする D NAを有し、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋 白質と実質的に同質の活性 (例、 リガンド結合活性., シグナル情報伝達作用な ど） を有する蛋白質をコードする D NAであれば何れのものでもよい。
配列番号： 3 8または配列番号： 3 9で表される塩基配列を含有する D NA と八イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aとしては、 例え ば、 配列番号： 3 8または配列番号： 3 9で表される塩基配列と約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有する塩基 配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 4 3で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 4 3で表される塩基配列を有する D NAとハイストリンジェ ン卜な条件下でハイブリダィズする D NAを有し、 配列番号： 4 2で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチド に対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 4 3で表される塩基配列を含有する D NAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 4 3で 表される塩基配列と約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上、 より好ましくは 約 9 8 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 4 5で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 4 5で表される塩基配列を有する D NAとハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする D N Aを有し、 配列番号： 4 4で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチド に対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など) を有する蛋白質をコードする D NAであれば何れのものでもよい。 ,
配列番号： 4 5で表される塩基配列を含有する D NAとハイストリンジェン 卜な条件下でハイプリダイズする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 4 5で 表される塩基配列と約 90%以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは 約 98%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 40で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 41で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 41で表される塩基配列を有する DNAとハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 41で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチド に対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など) を有する蛋白質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 41で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 41で 表される塩基配列と約 90%以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは 約 98%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 46で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 47で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 47で表される塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 47で表される アミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチドに 対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする D NAであれば何れのものでもよい。
配列番号： 47で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 47で 表される塩基配列と約 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは 約 98%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 配列番号： 48で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 49で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 49で表される塩基配列を有する DNAとハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 49で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチド に対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする
D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 49で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 49で 表される塩基配列と約 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは 約 98 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 50で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 51で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 51で表される塩基配列を有する DN Aとハイス卜リンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 50で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチド に対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 51で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 51で 表される塩基配列と 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは約 99 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 52で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 53で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 53で表される塩基配列を有する DNAとハイストリンジェ ン卜な条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 52で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 本発明のペプチド に対する結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有する蛋白質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 53で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダイズする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 53で 表される塩基配列と 95%以上、 好ましくは約 97%以上、 より好ましくは約 99%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 モレキュラー 'クローニング （Mol ecul ar Cloning) 2 n d (J.
Sambrook et al . , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など に従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添 付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従つて行なうことができる。
条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 1 9〜 4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜2 O mMで、 温度が約 5 0〜7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。 '
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド をコードする D NAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D NAがあげられ、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドを コードする D NAとしては、 配列番号： 4で表される塩基配列を含有する D N Aがあげられ、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ ードする D NAとしては、 配列番号： 6で表される塩基配列を含有する D NA があげられ、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコー ドする D NAとしては、 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する D NAが あげられ、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ一ド する D NAとしては、 配列番号： 1 0で表される塩基配列を含有する D NAが あげられ、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコー ドする D NAとしては、 配列番号： 1 2で表される塩基配列を含有する D NA があげられ、 配列番号： 1 3で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ ードする D NAとしては、 配列番号： 1 4で表される塩基配列を含有する D N Aがあげられ、 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドを コードする D NAとしては、 配列番号： 1 6で表される塩基配列を含有する D N Aがあげられ、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド をコードする D NAとしては、 配列番号： 1 8で表される塩基配列を含有する D NAがあげられ、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列を含有するべプチ ドをコードする D NAとしては、 配列番号： 2 0で表される塩基配列を含有す る DNAがあげられ、 配列番号： 21で表されるアミノ酸配列を含有するぺプ チドをコードする DNAとしては、 配列番号： 22で表される塩基配列を含有 する DNAがあげられ、 配列番号： 23で表されるアミノ酸配列を含有するぺ プチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 24で表される塩基配列を含 有する DNAがあげられ、 配列番号： 25で表されるアミノ酸配列を含有する ペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 26で表される塩基配列を 含有する DN Aがあげられ、 配列番号： 27で表されるアミノ酸配列を含有す るペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 28で表される塩基配列 を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 29で表されるアミノ酸配列を含有 するペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 30または配列番号： 31で表される塩基配列を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 32で表さ れるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする DNAとしては、 配列番 号： 33で表される塩基配列を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 34で 表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする DN Aとしては、 配列 番号： 35で表される塩基配列を含有する DNAがあげられる。
また、 配列番号： 37で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 38または配列番号： 39で表される塩基配列 を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 42で表されるアミノ酸配列を含有 する蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 43で表される塩基配列 を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列を含有 する蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 45で表される塩基配列 を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 40で表されるアミノ酸配列を含有 する蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 41で表される塩基配列 を含有する D N Aがあげられ、 配列番号： 46で表されるアミノ酸配列を含有 する蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 47で表される塩基配列 を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 48で表されるアミノ酸配列を含有 する蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 49で表される塩基配列 を含有する DNAがあげられ、 配列番号： 50で表されるアミノ酸配列を含有 する蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 5 1で表される塩基配列 を含有する D NAがあげられ、 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列を含有 する蛋白質をコードする D NAとしては、 配列番号： 5 3で表される塩基配列 を含有する D N Aがあげられる。
本発明のペプチドをコ一ドする D NAの塩基配列と相補的な塩基配列または その一部を含有してなるヌクレオチド (オリゴヌクレオチド) とは、 本発明の ペプチドをコードする D NAを包含するだけではなく、 R N Aをも包含する意 味で用いられる。
本発明に従えば、 本発明のぺプチドの遗伝子の複製又は発現を阻害すること のできるアンチセンス · (オリゴ) ヌクレオチド (核酸) を、 クローン化した あるいは決定されたペプチドをコードする D N Aの塩基 E列の塩基配列情報に 基づき設計し、 合成しうる。 そうした （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） は、 本 発明のぺプチドの遺伝子 R N Aとハイブリダィズすることができ、 該 R N A の合成又は機能を阻害することができるか、 あるいは本発明のペプチド関連 R NAとの相互作用を介して本発明のペプチドの遺伝子の発現を調節 ·制御する ことができる。 本発明のペプチド関連 R N Aの選択された配列に相補的な （ォ リゴ） ヌクレオチド、 及び本発明のペプチド関連 R NAと特異的にハイブリダ ィズすることができる （オリゴ） ヌクレオチドは、 生体内及び生体外で本発明 のべプチドの遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの 治療または診断に有用である。
用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列又は核酸の 特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオ チド、 塩基配列又は核酸とペプチドとの間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド (核酸） の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチドのアミノ酸 を通常指している。 本発明のぺプチドの遗伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5， 端 6—ベ一スペア · リピート、 5， 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コド ン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パ リンドローム領域、 及び 3， 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択 しうるが、 本発明のぺプチドの遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しう る。 目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的な （オリゴ） ヌクレオチド との関係は、 対象物とハイブリダイズすることができる (オリゴ） ヌクレオチ ドとの関係は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·
(オリゴ） ヌクレオチドは、 2—デォキシー D—リポースを含有しているポリ デォキシヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチ ド、 プリン又はピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリ ヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマ一 (例え ば、 市販の蛋白質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を 含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマ一は D NAや R NA中に見出され るような塩基のペアリナグゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを 含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本 鎖 R N A、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： R NAハイブリッドであることがで き、 さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴヌクレオチド、 さらには 公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キ ヤップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを 類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電 結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデー ト、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合又は硫黄含有結合 （例 えば、 ホスホロチォエー卜、 ホスホロジチォエー卜など) を持つもの、 例えば 蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグ ナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドな ど） などの側鎖基を有しているもの、 インターカレント化合物 （例えば、 ァク リジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射 活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤 を含有するもの、 修飾された結合を持つもの (例えば、 ひァノマー型の核酸な ど） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 及び 「核 酸」 とは、 プリン及ぴピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその 他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メ チル化されたプリン及びピリミジン、 ァシル化されたプリン及びピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド及 び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば 1個以 上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエー テル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス核酸は、 R NA、 D NA、 あるいは修飾された核酸で ある。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト 誘導体 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に 抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアン チセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内で のアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性 をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならァンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。 こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば Pharm Tech Japan, 8 巻， 247頁， 1992年、 同 8巻， 395頁, 1992年、 S. T. Crooke et al . ed. , Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開示がある。 本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピッド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加 するに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレス テリルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核 酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレ オシド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレ ァーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙 げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テト ラエチレングリコールなどのグリコ一ルをはじめとした当該分野で知られた水 酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べ ることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明の部分 ぺプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであって もよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 '組 織由来の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の cDNAライブラリ一、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するべクタ一は、 パクテリオファ —ジ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reactionによって増幅することもできる。 具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列番 号： 41、 配列番号： 47、 配列番号： 49、 配列番号： 51または配列番 号： 53で表される塩基配列を含有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 または （ii) 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列番号： 41、 配列番号： 47、 配列番号： 49、 配列番号： 51ま たは配列番号： 53で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DN Aを有し、 本発明の蛋白質と実質的に 同質の活性 （例、 本発明のペプチドに対する結合活性、 シグナル情報伝達作用 など） を有する蛋白質をコードする DNAの部分塩基配列を有する DNAなど が用いられる。
配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列 番号： 41、 配列番号： 47、 配列番号： 49、 配列番号： 51または配列番 号： 53で表される塩基配列を有する DN Aとハイストリンジェントな条件下 でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 43、 配列番号： 45、 配列番号： 41、 配列番号： 47、 配列番号： 49、 配列番号： 51または配列番号： 53で表される塩基配列と 約 90%以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは約 98%以上の相同 性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明のペプチドを完全にコードする DNAのクロ一ニングの手段としては、 本発明のぺプチドをコ一ドする DNAの塩基配列の部分塩基配列を有する合成 DNAプライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ 一に組み込んだ DN Aを本発明のぺプチドの一部あるいは全領域をコ一ドする D N A断片もしくは合成 D NAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシ ョンによって選別することができる。 ハイブリダイゼ一シヨンの方法は、 例え ば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ イブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ とができる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明の蛋白質と略記す る） を完全にコードする DN Aのクローニングも本発明のペプチドを完全にコ ードする DN Aのクローニングと同様にして行うことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 MutanTM-K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gupped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じ る方法に従つて行なうことができる。
クローン化されたペプチド ·蛋白質をコードする DNAほ目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化した 、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適 当な合成 DN Aアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のペプチド，蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のぺプ チド ·蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、
(口） 該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結する ことにより製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， pB 3 25， pUC 12, pUC 1 3) 、 枯草菌由来のプラスミド (例、 pUB 1 1 0, pTP 5, p C 194) 、 醇母由来プラスミド （例、 p SH 1 9, p SH 1 5) 、 えファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 A 1 - 1 1、
XT 1 , pRc/CMV、 pRc/RSV、 p c DNA I N e o, p c DN A3. 1、 pRc/CMV2、 pR c/RS V (Invi trogen社) などが用いら れる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRo!プロモ一夕一、 SV40プロモータ一、 H I V- LTRプロモ一夕一、 CMVプロモーター、 HS V- TKプロモ一夕一な どが挙げられる。
これらのうち、 CMVプロモーター、 S R プロモーターなどを用いるのが 好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモ一夕一、 A PLプロモータ一、 l p pプロモ —夕一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPO lプロモーター、 S P02プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロ モーター、 P 10プロモー夕一などが好ましい。 ， 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一、 S V40複製オリジン (以下、 S V40 o r iと略称する場合がある) などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が 挙げられる。 特に、 CH〇 (dh f r") 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択 マ一カーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって も選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N端 末側に付加する。 宿主がェシェリヒア厲菌である場合は、 P h o A ·シグナル 配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α 一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵 母である場合は、 MF ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主 が動物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 ひ—インターフエ ロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のペプチド ·蛋白質をコードする DNAを 含有するべクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia coli) K 12 - DH 1 (Proc. Natl. Acad. . Sci. USA, 60巻， 160(1968)〕 , J Ml 03 [Nucleic Acids Research, 9巻，309 (1981)〕 ， JA221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517(1978) 〕 , HB 101 [Journal of
Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39巻， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サチルス (Bacillus subtilis) MI 1 14 ½61^,24巻，255 (1983)〕 ， 207-21 [Journal of
Biochemistry, 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22 R— , ΝΑ87- 1 1 A, DKD— 5D, 2 0 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) N CYC 19 13, NCYC2036、 ピキア. パストリス (Pichia pastoris) などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Tric oplusia niの 中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、
Mamestra brassicae由来の細胞または EsUgmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 (Borabyx niori N； Bm N細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 (以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴイボ (In
Vivo) ，13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる [Nature, 315 巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Ve r o, チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤ ィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r_) 細胞と略記） , マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Pro atl. Acad. Sci. USA, 69卷， 2110 Q972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なう ことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。 酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182 -
187 (1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929(1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。 - 昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology，6， 47- 55 (1988) などに記載の方法に従つて行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実験 プロトコール. 2632-67 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記 載の方法に従つて行なうことができる。
このようにして、 G蛋白質共役型蛋白質をコードする DNAを含有する発現 ベクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。 宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コ一ンスチープ' リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナ卜リウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成 長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 [Journal of Experiments in Molecular Genet ics, 431-433, Col d Spring Harbor Laboratory, New York 1972) が好ましい。 ここ に必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 /3—インド リル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェシエリヒア 属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜4 3 °Cで約 3〜2 4時間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜4 0 で約6〜2 4時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー （Burkholder) 最小培地 〔Proc. Nat l . Acad. Sc i. USA, 77 巻， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔Proc. Nat l . Acad. Sci . USA, 81巻， 5330 (1984)〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整する のが好ましい。 培養は通常約 2 0〜 3 5 tで約 2 4〜 7 2時間行ない、 必要に 応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insec t Medium (Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清 等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 で約 3〜 5日間行ない、 必要 に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜 2 0 %の胎児牛血清を含む ME M培地 [Science, 122巻， 501 (1952)〕 , D ME M培地 [Vi rol ogy, 8巻， 3960959)〕 ， R P M I 1 6 4 0培地 〔The
Journal of the Ameri can Medical Assoc i at ion 199巻， 519 (1967)〕 , 1 9 9培 地 [Proceeding of the Soc iety for the Biological Medic ine, 73
巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は 通常約 3 0〜4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加 える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のぺ プチド ·蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のペプチド ·蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下 記の方法により行なうことができる。
本発明のペプチド ·蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を 破壊したのち、 遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜 用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にぺプチ ド ·蛋白質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体ぁ るいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるペプチド - 蛋白質の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことが できる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解 度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリア クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 ィォ ン交換ク口マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフイエティーク 口マトグラフィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマト グラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点 の差を利用する方法などが用いられる。 ' かくして得られるペプチド ·蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知 の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で 得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体ま たは他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するペプチド ·蛋白質を、 精製前または精製後に適当 な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ぺプチ ド ·ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 蛋白質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルェンドぺプチダ一ゼ、 プロ ティンキナーゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のペプチドの活性は、 標識した本発明のペプチドと 本発明の蛋白質との結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセ ィなどにより測定することができる。
また、 生成する本発明の蛋白質の活性は、 標識した本発明のペプチドとの結 合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定する ことができる。
また、 本発明のペプチドは、 遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ、 レ ドックスバッファ一中でリフォールディングして活性型のペプチドとして製造 してもよい (W0 02/57443号公報） 。
本発明のぺプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ れらの塩に対する抗体は、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはそ の部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル 抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ れらの塩 （以下、 本発明のペプチド ·蛋白質と略記することもある） に対する 抗体は、 本発明のペプチド ·蛋白質を抗原として用い、 自体公知の抗体または 抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のペプチド ·蛋白質は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能 な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗 体産生能を高めるため、 完全フロイジトアジュバントや不完全フロイントアジ ュパントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回 程度行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラ ッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に 脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と 融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製するこ とができる。 抗血清中の扰体価の測定は、 例えば、 後記の標識化した本発明の ペプチド ·蛋白質と抗血清とを反応させたのち、 钪体に結合した標識剤の活性 を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔Nature、 256巻、 495頁（1975年）〕 に従い実施 することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコ一ル
( P E G) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用い られる。 - 骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 Z 0などが挙げ られるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細 胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加され、 約 2 0〜 4 0 °C、 好ましくは約 3 0〜 3 7 で約 1〜 1 0分間ィンキュベート することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリド一マのスクリ一ニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 本発明のペプチド ·蛋白質抗原を直接あるいは担体と ともに吸着させた固相 (例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を 添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融 合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられ る） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出す る方法、 抗免疫グ口ブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイブ リドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明のぺプチ ド ·蛋白質を加え、 固相に結合したモノク口一ナル抗体を検出する方法などが 挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チ ミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育 種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるも.のならばどのような培地を 用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を 含む R P M Γ 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光 純薬工業 （株） ） またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週 間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイ プリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして 測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリク口一ナル抗体の分離精製と 同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点 沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心 法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなど の活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精 製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポ ύクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリク口一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に したがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 (本発明のペプチド ·蛋 白質の抗原) とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル 抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のぺプ チド '蛋白質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことに より製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合 体に関し、 キヤリァ一蛋白質の種類およびキヤリァ一蛋白質とハプテンとの混 合比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くで きれば、 どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥ シ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キ一ホール · リンぺット ·へモシ ァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜5の 割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイン卜アジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことが できる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一 ナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこと ができる。 ·. 本発明のペプチド、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 （以下、 M I T 1 類と略記する場合がある） もしくは本発明の蛋白質、 それらをコードするポリ ヌクレオチドまたはそれらに対する抗体は 摂食調節剤を得るための簡便な探 索法 （スクリーニング） 、 さらには、 肥満症 〔例、 悪性肥満細胞症 （mal ignant mas tocytos is) 、 外因性肥満 (exogenous obes i ty) 、 過インシュリン性肥満症 (hyperinsulinar obesity) 、 過血漿性肥満 (hyperplasmic obesity) 、 下垂 体性肥満 (hypophyseal adiposity) 、 減血漿性肥満症 (hypoplasmic
obesity) 、 甲状腺機能低下肥満症 (hypothyroid obesity) 、 視床下部性肥満
(hypothalamic obesity) 、 症候性肥満症 (symptomatic obesity) 、 小児肥満 (infantile obesity) 、 上半身肥満 (upper body obesity) 、 食事性肥満症
(alimentary obesity) 、 性機能低下性肥満 (hypogonadal obesity) 、 全身性 肥満細胞症 (systemic mastocytosis) 、 単純性肥満 (simple obesity) 、 中心 性肥満 （central obesity) など〕 、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） など の予防 ·治療剤を得るための簡便な探索法 (スクリーニング) に有用である。 特に、 本発明の蛋白質のアン夕ゴニストは、 優れた摂食障害のなどの予防 ·治 療剤として、また本発明の蛋白質のァゴニストは、 優れた肥満症の予防 ·治療剤 として有用である。
さらに、 本発明の蛋白質、 本発明の蛋白質をコードする DNA (以下、 本発 明の DNAと略記する場合がある） 、 本発明のアンチセンス DNAおよび本発 明のペプチドに対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） は、
(i) 本発明の蛋白質が関与する各種疾病の予防 ·治療剤、 （ii) 本発明のぺプ チドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー ニング、 （iii) 本発明の蛋白質の定量、 （iv) 遺伝子診断薬、 (v) アンチセ ンス DNAを含有する医薬、 （vi) 本発明の抗体を含有する医薬および診断薬、 (vii) 本発明の DNAを有する非ヒト動物の作製、 （viii) 構造的に類似した リガンド ·受容体との比較にもとづいたドラッグデザィンなどの実施のために 有用である。'特に、 本発明の組換え蛋白質の発現系を用いた受容体結合アツセ ィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な本発明の蛋白質に対す るリガンドの結合性を変化させる化合物 （例、 ZAQァゴニスト、 ZAQアン タゴニス卜など) をスクリ一ニングすることができ、 該ァゴ二ストまたはアン タゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができる。
これら用途について、 以下に具体的に説明する。
(1) (i) 本発明のペプチドの活性を |5且害または促進する化合物またはその塩、 (i i) 本発明の蛋白質の活性を阻害または促進する化合物またはその塩、
(i i i) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害ま たは促進する化合物またはその塩、 または （iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の 本発明の蛋白質の活性化作用を阻害または促進する化合物またはそ の塩を含有してなる摂食調節剤。
(ト 1) 本発明のぺプチドの活性を阻害する化合物としては、 本発明のぺプチ ドの活性を阻害する化合物であればよく、 例えば、 摂食抑制作用、 体温降下作 用、 腸管収縮制御活性、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を 介するシグナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
(i-2) 本発明のペプチドの活性を促進する化合物としては、 本発明のぺプチ ドの活性を促進する化合物であればよく、 例えば、 摂食促進作用、 体温上昇作 用を有する化合物、 腸管収縮制御活性、 本発明の蛋白質に対する結合活性、 本 発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などを促進する化合物などが挙げ られる。
(i i-1) 本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物としては、 本発明の蛋白質 の活性を阻害する化合物であればよく、 例えば、 本発明のペプチドに対する結 合活性、 シグナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
(i i- 2) 本発明の蛋白質の活性を促進する化合物としては、 本発明の蛋白質 の活性を促進する化合物であればよく、 例えば、 本発明のペプチドに対する結 合活性、 シグナル情報伝達作用などを促進する化合物などが挙げられる。
(i i i- 1) 本発明のぺプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻 害する化合物としては、 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質 との結合を阻害する化合物であればよい。
(i i i- 2) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を促 進する化合物としては、 本発明のぺプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質 との結合を促進する化合物であればよい。
(iv- 1) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作 用を阻害する化合物としては、 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明 の蛋白質の活性化作用を阻害する化合物であればよく、 例えば、 本発明のぺプ チドまたは M I T 1類による、 本発明の蛋白質の本発明のペプチドに対する 合活性、 シグナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
(iv-2) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作 用を促進する化合物としては、 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明 の蛋白質の活性化作用を促進する化合物であればよく、 例えば、 本発明のぺプ チドまたは M I T 1類による、 本発明の蛋白質の本発明のペプチドに対する結 合活性、 シグナル情報伝達作用などを促進する化合物などが挙げられる。
上記 (0 〜 (iv) の化合物またはその塩は、 例えば、 後述の本発明のスクリ —ニング方法またはスクリーニング用キットを用いることにより得られうる。 該塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる。 例えば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性また は酸性ァミノ酸との塩などがあげられる。 無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグ ネシゥム塩などのアルカリ土類金属塩、 ならびにアルミニウム塩、 アンモニゥ ム塩などがあげられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチ ルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2, 6—ルチジン、 エタノー ルァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルアミ ン、 ジシクロへキシルァミン、 Ν, Ν' -ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩な どがあげられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸などとの塩があげられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例 えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安 息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 ォ ルチニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えば ァスパラギン酸、 ダル夕ミン酸などとの塩があげられる。
上記化合物またはその塩は、 例えば、 低毒性で安全な摂食調節剤として用い られる。
中でも、 （i) 本発明のペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、 (i i) 本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、 （i i i) 本発明の ペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物または その塩、 （ ) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性 化作用を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 摂食障害 （例、 拒食症 過 食症など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等 による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生 殖機能障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障 害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 統合失調症、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予 防 ·治療剤として用いられる。 好ましくは摂食障害の予防 ·治療剤として用い られる。
(i) 本発明のペプチドの活性を促進する化合物またはその塩、 （i i) 本発明 の蛋白質の活性を促進する化合物またはその塩、 （i i i) 本発明のペプチドまた は M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害または促進する化合物またはそ の塩、 （iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化 作用を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿 性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥 満、 中心性肥満など） 、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域 変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾患、 老 人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中 など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 統合失調症、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊 張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予防 '治療剤として用いられる。 好ましくは肥満症などの予防 ·治療剤として用いられる。
このような医薬として使用する場合、 後述の本発明のスクリーニング方法ま たはスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物を医薬として 実施する場合と同様にして実施することができる。
( 2 ) 本発明のぺプチドをコ一ドする D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質 的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを 含有してなる摂食障害の予防 ·治療剤
上記アンチセンスヌクレオチド （アンチセンス D N A等） は、 生体内におけ る本発明のペプチドまたはその D N Aの機能を抑制することができるので、 例 えば摂食調節剤として、 例えば、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） などの 予防 ·治療剤などの医薬として安全に用いられる。
例えば、 該アンチセンス D NAを単独あるいはレトロウイルスベクター、 ァ デノウィルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクター等 の適当なベクタ一に揷入した後、 常套手段に従って投与することができる。 該 アンチセンス D NAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤等の生 理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲル力テーテ ルのようなカテーテルによって投与できる。
( 3 ) 本発明のペプチドに対する抗体または本発明の蛋白質に対する抗体を含 有してなる摂食障害の予防 ·治療剤
上記抗体は、 例えば、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の発現過多に 起因する疾患、 例えば摂食調節剤として、 例えば、 摂食障害 （例、 拒食症、 過 食症など） などの予防 ·治療剤などの医薬.として安全に用いられる。
このような医薬として使用する場合、 後述の本発明の抗体を含有する医薬を 実施する場合と同様にして実施することができる。
( 4 ) 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド を含有してなる摂食障害または肥満症などの診断薬
上記ポリヌクレオチドは、 例えばプローブとして使用することにより、 ヒト または温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッ ジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） における本発明のペプチドまた は本発明の蛋白質をコードする D NAまたは mR NAの異常 （遺伝子異常） を 検出することができるので、 例えば、 該 D NAまたは mR NAの損傷、 突然変 異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多等の 遺伝子診断薬として有用である。
上記遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼ一シヨンや PCR - SSCP法 (Genomics, 第 5卷， 874〜879頁 (1989年） 、 Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of America, 第 86巻， 2766〜2770頁 （1989年） ） 、 D N Aマイクロアレイ等により実施することがで きる。
例えば、 ノ一ザンハイブリダイゼーションゃ DNAマイクロアレイにより発現低 下が検出された場合や PCR- SSCP法や DNAマイクロアレイにより D N Aの突然変異 が検出された場合は、 例えば、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） 、 肥満症 (例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症 候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身 性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） などに罹患している可能性が高 いと診断することができる。 ( 5 ) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質とを用いるスクリ 一二ング
本発明のペプチド （その部分ペプチドも含む） または M I T 1類および本発 明の蛋白質 （本発明の蛋白質の部分ペプチドも含む） ¾用いることを特徴とす るスクリーニング方法、 または本発明のぺプチドまたは M I T 1類および本発 明の蛋白質を用いることを特徴とするスクリーニング用キット （以下、 本発明 のスクリーニング方法、 本発明のスクリーニング用キットと略記する場合もあ る） により、 例えば、 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質と の結合性を変化させる化合物、 好ましくは、
(0 本発明のぺプチドの活性を阻害または促進する化合物またはその塩、 (i i) 本発明の蛋白質の活性を阻害または促進する化合物またはその塩、
(i i i) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害ま たは促進する化合物またはその塩、
(iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作用を 阻害または促進する化合物またはその塩などが得られる。
上記の本発明のぺプチドの活性を阻害する化合物は、 本発明のペプチドの活 性を阻害し、 例えば、 摂食抑制作用、 体温降下作用、 腸管収縮制御活性、 本発 明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用 などを阻害する。
上記の本発明のペプチドの活性を促進する化合物は、 本発明のペプチドの活 性を促進し、 例えば、 摂食抑制作用、 体温降下作用、 腸管収縮制御活性、 本発 明の蛋白質に対する結合活性、 本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用 などを促進する。
上記の本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物は、 本発明の蛋白質の活性を 阻害し、 例えば、 本発明のペプチドに対する結合活性、 シグナル情報伝達作用 などを阻害する。
上記の本発明の蛋白質の活性を促進する化合物は、 本発明の蛋白質の活性を 促進し、 例えば、 本発明のペプチドに対する結合活性、 シグナル情報伝達作用 などを促進する。
上記化合物またはその塩は、 例えば、 低毒性で安全な摂食調節剤として用い られる。
(i) 本発明のペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、 (i i) 本発明 の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、 （i i i) 本発明のペプチドまた は M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩、 (iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作用を 阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症な ど） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による 体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生殖機能 障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳 循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 統合失調症、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 高血圧症、 動 硬 化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予防，治 瘵剤として用いられる。 好ましくは摂食障害の予防 ·治療剤として用いられる。
(i) 本発明のペプチドの活性を促進する化合物またはその塩、 （i i) 本発明 の蛋白質の活性を促進する化合物またはその塩、 （i i i) 本発明のペプチドまた は M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害または促進する化合物またはそ の塩、 （iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化 作用を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿 性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥 満、 中心性肥満など） 、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域 変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾患、 老 人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中 など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 統合失調症、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊 張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予防 ·治療剤として用いられる。 好ましくは肥満症などの予防 ·治療剤として用いられる。
本発明のスクリーニング方法または本発明のスクリーニング用キットについ て、 以下に詳述する。 ―
本発明の蛋白質を用いるか、 または組換え型本発明の蛋白質の発現系を構築 し、 該発現系を用いた本発明のぺプチドとの結合ァッセィ系 (リガンド ·受容 体アツセィ系） を用いることによって、 本発明のぺプチドまたは M I T 1類と 本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物 （例、 ペプチド、 蛋白質、 非べ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩などをスクリ一 ニングすることができる。
このような化合物には、 本発明の蛋白質を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァ ラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生 成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内 蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性また は抑制する活性など） を有する化合物 （ァゴニス卜） と該細胞刺激活性を有し ない化合物 (アンタゴニス卜) などが含まれる。 「本発明のぺプチドと本発明 の蛋白質との結合性を変化させる」 とは、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質 との結合を阻害する場合と促進する場合の両方を包含するものである。
本発明は、 （i) 本発明の蛋白質に、 本発明のペプチドを接触させた場合と (i i) 上記した本発明の蛋白質に、 '本発明のぺプチドおよび試験化合物を接触 させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペプチドと本発明の蛋 白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供 する。
本スクリーニングにおいては、 M I T 1類は、 本発明のペプチドと同様に使 用すればよい。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i) 上記した本発明の蛋白質に本 発明のペプチドを接触させた場合と （i i) 上記した本発明の蛋白質に本発明の ペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、 例えば該本発明の蛋白 質に対する本発明のペプチドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して比較する。 本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、 例えば、
(a) 本発明のペプチドを本発明の蛋白質に接触させた場合と、 本発明のぺプチ ドおよび試験化合物を本発明の蛋白質に接触させた場合における、 本発明のぺ プチドの本発明の蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその 塩のスクリーニング方法、
(b) 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質 を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 本発明のぺ プチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 較することを特徴 とする、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング方法、 および
(c) 本発明の蛋白質が、 本発明の蛋白質をコードする D NAを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質である上記
(b) 記載のスクリーニング方法、
(d) 本発明のペプチドが、 標識したペプチドである上記 （a) 〜 （c) のスクリ —ニング方法などの受容体結合ァッセィ系、
(e) 本発明のペプチドを本発明の蛋白質に接触させた場合と、 本発明のぺプチ ドおよび試験化合物を本発明の蛋白質に接触させた場合における、 本発明の蛋 白質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のぺ プチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法、 .
(f) 本発明のぺプチドを本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分 に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質を 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 本発明の蛋白 質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のぺプ チドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー ニング方法、 および
(g) 本発明の蛋白質が、 本発明の蛋白質をコードする D NAを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質である上記
(0 のスクリーニング方法などの細胞刺激アツセィ系などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用-いる本発明の蛋白質としては、 上記 の本発明の蛋白質を含有するものであれば何れのものであってもよい。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリ一ニングに用いら れるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させた本発明の蛋白質などが適 している。 また、 哺乳動物由来の内皮細胞も使用できる。
本発明の蛋白質を製造するには、 前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質を含有する細胞ある いは該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。 本発明の蛋白質を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従つ て行うことができる。
本発明の蛋白質を含有する細胞としては、 本発明の蛋白質を発現した宿主細 胞をいうが、 該宿主細胞としては 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などがあげられる。 '
膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜 が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Pot ter—
Elvehj em型ホモジナイザーで細胞 ¾押し潰す方法、 ヮーリングプレンダーゃポ リトロン （Kinemat i ca社製） による破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレス などで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などがあ げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500〜 3000rpm) で短時間 （通常、 約 1〜10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （15000〜 30000rpm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分 中には、 発現した本発明の蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成 分が多く含まれる。
該本発明の蛋白質を含有する細胞や膜画分中の本発明の蛋白質の量は、 1細 胞当たり 103〜 108分子であるのが好ましく、 105〜 107分子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くな り、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロット で大量の試料を測定できるようになる。 ...
上記の哺乳動物由来の内皮細胞としては、 例えば、 ヒト、 サル、 ゥシ、 ブ夕、 ラット、 マウスなどの内皮細胞 （例、 動脈血管内皮細胞、 毛細血管内皮細胞な ど） が挙げられる。
例えば、 哺乳動物由来の毛細血管内皮細胞の一つであるゥシ毛細血管内皮細 胞は、 以下の方法で調製することができる。 また、 同様の方法で、 哺乳動物の 脳、 卵巣などからも毛細血管内皮細胞を調製することができる。
先ず、 ゥシ副腎の表面についている脂賛をはさみで除去後、 副腎を 20%イソ ジンを含む生理食塩水に 5分間浸し消毒する。 その後、 生理食塩水で副腎を洗浄 してから半分に切断し副腎髄質を除去する。 残った副腎皮質を内側からメスと はさみで採取し細かく切断する。 続いて、 副腎皮質半分を用いて以下の操作を 実施する。 すなわち、 細片に 0. 5 %コラゲナーゼ (和光純薬) と 0. 1 % bovine serum albumin (BSA)を 'ざむ Minimum essent i al med ium (MEM) 20 mlをカロえ、 37でで 30分間インキュベーションする。 その後、 ピペッティングして組織塊を 崩した後、 1〜600 ΠΜで 5分間遠心し、 得られた沈殿に 25 % BSAを含む MEMを 25 ml添加し再度 2, 700n)mで 20分間遠心する。 得られた沈殿に上述のコラゲナ一ゼ を含む MEMを加えて懸濁し 37°Cで 15分間インキュベーションした後、 コラゲナー ゼ消化物をナイロンガーゼ （100ミクロン） で濾過し濾液を回収する。 この濾液 を再度ナイロンガーゼ （50ミクロン） で濾過し、 ガーゼに捕集されたくずを 10 % fetal bovine serum (FBS)を含む MEMを用いてゼラチンコートした 6穴プレ ートに洗いこむ。 4時間後、 10% FBS/MEMでプレートを穏やかに洗浄後、 2 ng/ml bas i c f ibrobl as t growth f ac torと 10 % FBSを含む MEMを添加し 5 %C02下 37°Cで培養する。 以後、 培地は 3日毎に全量交換する。 5〜6日後に目的とする細 胞のコロニーを残して不要細胞を顕微鏡下でパスツールピぺットを用いて除去 する。 9〜10日後に目的コロニーにクロ一ニングリングをかけ、 トリプシン処理 により細胞を回収し 24穴プレ一トに移して培養する。 得られた細胞を適当なス ケールになるまで培養し実験に使用する。
前記の受容体結合ァッセィ系や細胞刺激ァッセィ系などのスクリ一ニング方 法を実施するためには、 例えば、 本発明の蛋白質画分と、 本発明のペプチド (例、 標識した本発明のペプチド） などが用いられる。 本発明の蛋白質画分と しては、 天然型の本発明の蛋白質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組 換え型本発明の蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等の リガンド結合活性などを示す。 標識した本発明のぺプチドとしては、 例えば、 放射性同位元素 (例、 〔125Ί〕 、 〔|3, 1〕 、 〔¾〕 、 〔"C〕 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、
〔35S〕 など） 、 蛍光物質 〔例、 シァニン蛍光色素 (例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス社製) など） 、 フルォレスカミン、 フルォレ ッセンイソチオシァネートなど〕 、 酵素 ' (例、 3—ガラクトシダーゼ、 β—ヴ ルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パ一ォキシダ一ゼ、 リンゴ酸脱水 素酵素など） 、 発光物質 （例、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなど） 、 ピオチン、 ランタ二ド元素などで標識された本発明のぺプ チド、 好ましくは放射性同位元素で標識された本発明のぺプチドなどを用いる ことができる。 また、 ボルトン一ハンター試薬を用いて公知の方法で調製した 本発明のペプチドの標識体を利用することもできる。 '
具体的には、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化 合物のスクリーニングを行うには、 まず本発明の蛋白質を含有する細胞または 細胞の膜画分を、 スクリーニング 適したバッファ一に懸濁することにより本 発明の蛋白質標品を調製する。 バッファ一には、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス—塩酸バッファーなどの本発明のぺプチドと本発 明の蛋白質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS.、 Tween-80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることも できる。 さらに、 プロテアーゼによる本発明の蛋白質や本発明のペプチドの分 解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E- 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕 チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 01〜10mlの該本発 明の蛋白質溶液に、 一定量 （5000〜500000cpni) の標識した本発明のペプチドを 添加し、 同時に 10—4〜1 (T Mの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量
(NSB) を知るために大過剰の未標識の本発明のペプチドを加えた反応チューブ も用意する。 反応は!)〜 50°C、 望ましくは 4〜37°Cで、 20分〜 24時間、 望ましく は 30分〜 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファ一 で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ一ションカ ゥン夕一またはァーカウンタ一で計測する。 拮抗する物質がない場合の力ゥン ト（B。） から非特異的結合量 (NSB) を引いたカウント (B0-NSB) を 100%とした 時、 特異的結合量 （B- NSB) が例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力 のある候補物質として選択することができる
また、 本発明の蛋白質と本発明のペプチドとの結合を測定する方法として、
BIAcore (アマシャム フアルマシア バイオテク社製） を用いることもできる。 この方法では、 本発明のペプチドを装置に添付のプロトコールに従ったァミノ カップリング法によってセンサーチップに固定し、 本発明の蛋白質を含有する 細胞または本発明の蛋白質をコードする D NAを含有する形質変換体から精製 した本発明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分、 あるいは精製した本 発明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分および試験化合物を含むリン 酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分 2 〜 20 1の流量で通過させる。 センサーチップ上の本発明のぺプチドと本発明 の蛋白質とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存す る試験化合物が変化させることを観察することによって本発明の蛋白質と本発 明のぺプチドとの結合を変化させる化合物のスクリ一ニングを行なうことがで きる。 この方法は、 本発明の蛋白質をセンサーチップに固定し、 本発明のぺプ チドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を含むリン酸バッファ一または トリスバッファ一などの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いて も同様に測定することができる。 試験化合物としては、 上記と同様のものなど があげられる。
前記の細胞刺激アツセィ系のスクリーニング方法を実施するためには、 本発 明の蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリ ン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノ シトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o s の活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の 方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 本発明の蛋白質を含有する細胞をマルチウヱルプレート等に培養する。 スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を 示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間ィン キュペートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそ れぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァ ラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合 は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的 産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することがで さる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な本発明の蛋白 質を発現した細胞が用いられる。 本発明の蛋白質を発現した細胞としては、 前 述の組換え型本発明の蛋白質発現細胞株などが望ましい。 形質転換体である本 発明の蛋白質発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。 また、 動 物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 '植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れる。
上記細胞刺激アツセィ系のスクリーニング方法について、 さらに具体的に以 下 〔1〕 〜 〔1 2〕 に記載する。
〔1〕 受容体発現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると細胞内の G蛋 白質が活性化されて GTPが結合する。 この現象は受容体発現細胞の膜画分におい ても観察される。 通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化するが、 このとき反 応液中に GTP r Sを添加しておくと、 GTP r Sは GTPと同様に G蛋白質に結合するが、 加水分解されずに G蛋白質 含む細胞膜に結合した状態が維持される。 標識した GTPァ Sを用いると細胞膜に残存した標識された GTPァ Sを測定することにより、 受容体ァゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。
この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する 刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結合 性を変化させる化合物をスクリ—ニングすることができる。
この方法は、 本発明の蛋白質を含む膜画分を用いて行う。 本測定法において 本発明の蛋白質膜画分への GTP r S結合促進活性を示す物質はァゴニストである。 具体的には、 標識した GTP T Sの存在下、 本発明のペプチドを本発明の蛋白質 細胞膜画分に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を本発明 の蛋白質細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の蛋白質細胞膜画分へ の GTP r S結合促進活性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本 発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 本方法において、 本発明のペプチドによる本発明の蛋白質細胞膜画分への G
T P r s結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質細胞膜画分に接触させ、 本発明の蛋 白質細胞膜画分への GTP r S結合促進活性を測定することにより、 ァゴニストの スクリ一ニングを行なうこともできる。 '
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。
公知の方法に準じて調製した本発明の蛋白質を含む細胞膜画分を、 膜希釈緩 衝液 (50mM Tr i s、 5mM MgCl2、 150mM NaCK l uM GDPゝ 0. 1 % BSA； pH7. ) で 希釈する。 希釈率は、 受容体の発現量により異なる。 これを Falcon2053に 0. 2ml ずつ分注し、 本発明のぺプチドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を加 え、 さらに終濃度 200pMとなるように [3 ] GTPァ Sを加える。 25°Cで 1時間保温し た後、氷冷した洗浄用緩衝液 (50mM Tris, 5mM MgCl2, 150mM NaCl , 0. 1 % BSA, 0. 05 % CHAPS； pH7. 4) 1. 5mlを加えて、 ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。 65°C、 30分保温して乾燥後、 液体シンチレーシヨンカウンターでろ紙上に残った膜画 分に結合した [35s] GTP r sの放射活性を測定する。 本発明のペプチドのみを加え た実験区の放射活性を 100%、 本発明のペプチドを加えなかった実験区の放射活 性を 0%とし、 本発明のぺプチドによる GTP T S結合促進活性に対する試験化合物 の影響を算出する。 GTP r S結合促進活性が例えば 50%以下になる試験化合物を 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
〔2〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 細胞内 cAMPの産生が抑制される。 この反応を利甩して、 本発明のペプチドの本発明の 蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチドと 本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることがで きる。
具体的には、 細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のペプチドを 本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化 合物を本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産生抑制活性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発 明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内 cAMP量を増加させる物質としては、 例えば、 フオルスコリン、 カルシ トニンなどが用いられる。
本発明の蛋白質発現細胞内の cAMP産生量は、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と 〔1251〕 標識 cAMP (ともに市販品） を 使用することによる RIA系、 または抗 cAMP抗体と標識 cAMPとを組み合わせた EIA 系で測定することができる。 また、 抗 cAMP坊体を、 protein Aまたは抗 cAMP抗体 産生に用いた動物の^ Gなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラント を含むビーズと 〔1251〕 標識 c AMPとを使用する SPA (Sc int i l l at i on Proximi ty Assay) 法による定量も可能である （アマシャムフアルマシアバイオテク社製の キットを使用する） 。
本方法において、 本発明のぺプチドによる本発明の蛋白質発現細胞の c AM P産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補 物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて、 cAMP産生抑 制活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ一ニングを行 なうことができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞 （例、 CH0細胞などの動物細胞） （例、 ZAQC- B1細 胞； W0 01/16309号公報の実施例 3記載） を 24穴プレートに 5xl 04cel 1/wel 1で播 種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM 3-イソブチル -メチルキサンチン、 0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （pH7. 4) で洗浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後、 0. 5mlの反応用バッファーを加えて 30 分間培養器で保温する。 反応用バッファ一を除き、 新たに 0. 25mlの反応用バッ ファ一を細胞に加えた後、 I Mの本発明のペプチドまたは I Mの本発明のぺプ チドおよび試験化合物を添加した フオルスコリンを含む 0. 25mlの反応用バ ッファーを、 細胞に加え、 37 で 24分間反応させる。 100 1の 20 %過塩素酸を 加えて反応を停止させ、 その後氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMPを抽出す る。 抽出液中の cAMP量を、 cAMP EIAキット （アマシャムフアルマシアバイオテ ク） を用いて測定する。 フオルスコリンの刺激によって産生された cAMP量を 100 %とし、 1 Mの本発明のペプチドの添加によって抑制された cAMP量を 0 %と して、 本発明のぺプチドによる cAMP産生抑制活性に対する試験化合物の影響を 算出する。 本発明のペプチドの活性を阻害して、 cAMP産生活性が例えば 50 %以 上になる試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することがで きる。 '
また、 本発明のペプチドの刺激により、 細胞内 cAMP量が増加する性質を示す 本発明の蛋白質発現細胞を使用する場合、 本発明のペプチドを本発明の蛋白質 発現細胞に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を本発明の 蛋白質発現細胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産生促進活 性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結 合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、 本発明のペプチドによる本発明の蛋白質発現細胞の cAMP産 生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質 として選択することができる。 .
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて cAMP産生促進 活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ—ニングを行な うことができる。
c AM P産生促進活性は、 上記のスクリ一ニング法においてフォルスコリン を添加せずに本発明の蛋白質発現細胞 （例、 C H O細胞などの動物細胞） に本 発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加して産生され た c AM Pを上記の方法で定量して測定する。
〔3〕 CRE-レポ一夕一遺伝子ベクターを用いて、 本発明のペプチドの本発明 の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチド と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることが できる。
CRE (cAMP response e l emen t) を含む D N Aを、 ベクタ一のレポ一夕一遺伝 子上流に挿入し、 CRE-レポ一夕一遺伝子ベクターを得る。 CRE -レポーター遺伝 子べクタ—を導入した本発明の蛋白質発現細胞において、 cAMPの上昇を伴う剌 - 激は、 CREを介したレポーター遺伝子発現と、 それに引き続くレポーター遺伝子 の遺伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポ一夕一遺伝子蛋白質 の酵素活性を測定することにより、 CRE-レポ一夕一遺伝子べクタ一導入細胞内 の cAMP量の変動を検出することができる。
具体的には、 細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、 本発明のペプチドを、 CRE-レポ一夕一遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 CRE-レポ一夕一遺伝子ベクター導 入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、 レポ一ター遺伝子蛋白 質の酵素活性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋 白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内 cAMP量を増加させる物質としては、 例えば、 フォルスコリン、 カルシ トニンなどが用いられる。
ベクタ一としては、 例えば、 ピツカジーン べィシックべクタ一、 ピツカジ ーン ェンハンサ一ベクター （東洋インキ製造 （株） ) などが用いられる。 CRE を含む DNAを、 上記ベクターのレポ一夕一遺伝子、 例えばルシフェラーゼ遺伝子 上流のマルチクロ一ニングサイトに揷入し、 CRE-レポ一ター遺伝子ベクターと する。
本方法において、 本発明のペプチドによるレポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活 性抑制を回復させる試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択す ることができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて、 フオルスコ リン剌激によって上昇した発光量の本発明のぺプチドと同様な抑制を測定する ことによりァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遗伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 このスク リーニング方法の具体例を以下に述べる。
CRE-レポーター遺伝子 （ルシフェラーゼ） を導入した本発明の蛋白質発現細 胞を、 24穴プレートに 5xl03cel l/wel lで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM . 3 -イソブチル -メチルキサンチン、 0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクス バッファー （PH7. 4) で洗浄する （以下、'反応用バッファ一と略記する） 。 その 後 0. 5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファ 一を除き、 新たに 0. 25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 1 / Mの本発明 のべプチドまたは 1 の本発明のぺプチドおよび試験化合物を添加した 2 Mフ オルスコリンを含む 0. 25mlの反応用バッファ一を、 細胞に加え、 37 :で 24分間 反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶 かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフェラー ゼによる発光は、 ルミノメータ一、 液体シンチレ一シヨンカウンターまたはト ップカウン夕一により測定する。 本発明のペプチド単独を添加した場合と、 1 Mの本発明のぺプチドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラ一ゼによる 発光量を測定して、 比較する。
本発明のぺプチドは、 フオルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発 光量の増加を抑制する。 該抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候補 物質として選択することができる。 .
レポーター遺伝子として、 例えば、 アルカリフォスファタ一ゼ、 クロラムフ ェニコ一レ ·ァセチリレトランスフェラ一セ (chl orampheni col
ace tyl t rans f erase) 、 3—ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。 こ れらのレポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性は、 公知の方法に従い、 または市販 の測定キットを用いて測定する。 アルカリフォスファタ一ゼ活性は、 例えば和 光純薬製 Lumi- Phos 530を用いて、 クロラムフエ二コール'ァセチルトランスフ エラーゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrol ampheni col
Acetyl t rans f erase Assay KiTを用いて、 ）3—ガラクトシダ一ゼ活性は、 例えば 和光純薬製 Aurora Gal- XEを用いて測定する。
〔4〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 ァラキ ドン酸代謝物を細胞外に放出する。 この反応を利用して、 本発明のペプチドの 本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺ プチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニングする ことができる。
あらかじめ、 標識したァラキドン酸を、 本発明の蛋白質発現細胞に取り込ま せておくことによって、 ァラキドン酸代謝物放出活性を、 細胞外に放出された 標識されたァラキドン酸代謝物を測定することによって測定することができる。 具体的には、 本発明のペプチドを、 標識したァラキドン酸を含有する本発明 の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合に おける、 ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することにより、 本発 明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニン グする。
本方法において、 本発明のペプチドによるァラキドン酸代謝物放出活性を阻 害する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ る。
また、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 本発明の蛋白- 質発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりァ ゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに 5xl04cel l/wel lで播種し、 24時間 培養後、 [¾]ァラキドン酸を 0. 25 z Ci/wel lとなるよう添加し、 16時間後、 細胞 を 0. 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （pH7. 4) (以下、 反 応用バッファ一と略記する） で洗浄する。 終濃度 I O Mの本発明のペプチドまた は終濃度 Ι Ο ^ Μの本発明のペプチドおよび試験化合物を含む反応用バッファー 500 1を、 各 wel lに添加する。 37 Cで 60分間インキュベートした後、 反応液
400 1をシンチレ一夕一に加え、 反応液中に遊離した [¾]ァラキドン酸代謝物 の量をシンチレーションカウン夕一により測定する。
反応用バッファー 500 z lのみを添加した場合 （本発明のペプチド非添加 ·試 験化合物非添加) の遊離 [¾]ァラキドン酸代謝物の量を 0%、 10 Mの本発明の ペプチドを含む反応用バッファ一を添加した場合 （試験化合物非添加） の遊離 [¾]ァラキドン酸代謝物の量を 100 %として、 試験化合物を添加した場合の遊離 [¾]ァラキドン酸代謝物の量を算出する。
ァラキドン酸代謝物放出活性が、 例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗阻 害能力のある候補物質として選択することができる。 〔5〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 細胞内 の Ca濃度が上昇する。 この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発明の蛋白 質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチドと本発 明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。 具体的には、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場 合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に接触 させた場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、 比較すること により、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物を スクリーニングする。 測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、 本発明のペプチドによる細胞内カルシウム濃度の上昇を抑 制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ る。
一方、 試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによって ァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を、 滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、 2日後、 培養液を、 4mM Fura- 2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した HBSSに置換し、 室温で 2時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、 キュベットにカバーグラスをセットし、 本 発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、 励起波長 340nmおよび 380nmでの、 505nmの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比 較する。
また、 FLIPR (モレキュラーデバイス社製） を使って行ってもよい。 本発明の 蛋白質発現細胞縣濁液に Fluo- 3 AM (同仁化学研究所製） を添加し、 細胞に取り 込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 96穴プレートに細胞を播く。 FLIPR 装置にセットし、 Fura- 2の場合と同様に、 本発明のペプチドまたは本発明のぺ プチドおよび試験化合物を添加し、 蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
さらに、 本発明の蛋白質発現細胞に、 細胞内 Caイオンの上昇によって発光す るような蛋白質の遺伝子 （例、 aequor inなど） を共発現させておき、 細胞内 Ca イオン濃度の上昇によって、 該遺伝子蛋白質 （例、 aequorinなど） が Ca結合型 となり発光することを利用して、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結合 性を変化させる化合物をスクリ一ニングすることもできる。
細胞内 Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させ た本発明の蛋白質発現細胞を、 96穴プレートに播き、 上記と同様に、 本発明の ぺプチドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を添加し、 蛍光強度の比の 上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
本発明のぺプチドによる蛍光強度の上昇を、 抑制する試験化合物を拮抗阻害 能力のある候補物質として選択することができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
対照として ETA (エンドセリン A受容体） 発現 CH0細胞 24番クローン （以後 ETA24細胞と略称する。 Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics, 279巻、 675- 685頁、 1996年参照) を用い、 アツセィ用サンプル について、 ZAQC- B1細胞； W0 01/16309号公報の実施例 3記載） および ETA24細胞 における細胞内 Caイオン濃度上昇活性の測定を FLIPR (モレキュラーデバイス社 製） を用いて行う。 ZAQC- B1細胞、 ETA24細胞共に 10%透析処理済ゥシ胎児血清 (以後 d FBSとする） を加えた DMEMで継代培養しているものを用いる。 ZAQC-B1 細胞、 ETA24細胞をそれぞれ 15X104cells/mlとなるように培地 （10% d FBS- DMEM) に懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート（Black plate clear bottom, Coster社) に分注器を用いて各ゥエルに 200 1ずつ植え込み （3. OX 104cel 1S/200 1/ゥェ ル） 、 5% C02インキュベータ一中にて 37°Cでー晚培養した後用いる （以後、 細 胞プレートとする） 。 H/HBSS (二ッスィ八.ンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8 g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に 合わせた後、 フィルタ一滅菌処理) 20 ml、 250 niM Probenecid 200 \, ゥシ 胎児血清（FBS) 200 lを混合する。 また、 Fluo 3- AM (同仁化学研究所) 2バ ィアル（50 g)をジメチルスルフオキサイド 0 u 20% Pluronic acid
(Molecular Probes社) 40 1に溶解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥ エル 100 lずつ分注し、 5% C02インキュベータ一中にて 37°Cで 1時間インキ ュペートする （色素ローデイング） 。 アツセィ用サンプル （各フラクション） に、 2. 5 m Probenec i d, 0. 1 % CHAPSを含む H/HBSS 150 1を加えて希釈し、 FLIPR用 96穴プレート (V - Bo t tomプレー卜、 Cos ter社) へ移す (以後、 サンプル プレートとする） 。 細胞プレートの色素ローデイング終了後、 11/11835に2. 5 mM Probenec idを加えた洗?争ノ ッファーでプレートウォッシャ一（Mo l ecul ar
Devi ces社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 1の洗浄バッファ 一を残す。 この細胞プレートとサンプルプレートを FL I PRにセッ卜しアツセィを 行う (FLIPRにより、 サンプルプレートから 50 lのサンプルが細胞プレートへ と移される） 。 '
〔6〕 受容体を発現する細胞に、 受容体ァゴニストを添加すると、 細胞内ィ ノシトール三リン酸濃度は上昇する。 本発明のペプチドの、 本発明の蛋白質発 現細胞における細胞内ィノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリー ニングすることができる。
具体的には、 標識したイノシトールの存在下、 本発明のペプチドを、 本発明 の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、 イノシトール三リン酸産 生活性を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質と の結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 測定は公知の方法に従つ て行う。
本方法において、 イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 イノシトール 三リン酸産生上昇を測定することによつてァゴニストのスクリ一二ングを行な うこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに播き、 1日間培養する。 その後、 rayo- [2-¾] inos i tol (2. 5 // Ci/wel l) を添加した培地で 1日間培養し、 細胞を放 射活性を有するィノシトールを無添加の培地でよく洗浄する。 本発明のぺプチ ドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を添加後、 10%過塩素酸を加え、 反応を止める。 1. 5M水酸化カリウムおよび 60mM HEPES溶液で中和し、 0. 5mlの AGlx8樹脂 （Bio- Rad) を詰めたカラムに通し、 5mM四ホウ酸ナトリウム
(Na2B407) および 60mM ギ酸アンモニゥムで洗浄した後、 1Mギ酸アンモニゥム および 0. 1Mギ酸で溶出した放射活性を、 液体シンチレーシヨンカウンタ一で測 定する。 本発明のペプチドを添加しない場合の放射活性を 0%、 本発明のぺプチ ドを添加した場合の放射活性を 100 %とし、 試験化合物の、 本発明のペプチドと 本発明の蛋白質の結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、 例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗 阻害能力のある候補物質として選択することができる。
〔7〕 TRE-レポ一夕一遺伝子ベクターを用いて、 本発明のペプチドの本発明 の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチド と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることが できる。
TRE (TPA response e lement) を含む DNAを、 ベクターのレポ一夕一遺伝子上 流に挿入し、 TRE -レポーター遺伝子ベクターを得る。 TRE-レポ一夕一遺伝子べ クタ一を導入した本発明の蛋白質発現細胞において、 細胞内カルシウム濃度の 上昇を伴う刺激は、 TREを介したレポーター遺伝子発現と、 それに引き続くレポ 一夕一遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポ一ター 遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、 TRE-レポーター遺伝子べクタ 一導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。
具体的には、 本発明のペプチドを、 TRE -レポ一夕一遺伝子べクタ一導入本発 明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物 を、 TRE-レポ一夕一遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた 場合における、 レポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、 比較することに より、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をス クリーニングする。
ベクタ一としては、 例えば、 ピツカジーン べィシックべクタ一、 ピツカジ ーン ェンハンサ一ベクタ一 （東洋インキ製造 （株） ） などが用いられる。 TRE を含む DNAを、 上記べクタ一のレポーター遺伝子、 例えばルシフェラ一ゼ遺伝子 上流のマルチクロ一ニングサイトに揷入し、 TRE-レポ一夕一遺伝子ベクターと する。
本方法において、 本発明のペプチドによるレポ一夕一遺伝子蛋白質の醇素活 性を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択すること ができる。
一方、 試験化合物のみを TRE-レポ一夕一遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質 発現細胞に接触させ、 本発明のぺプチドと同様な発光量の増加を測定すること によりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポ一夕一遺伝子として、 ルシフェラ一ゼを利用する例を用いて、 このスク リーニング方法の具体例を以下に述べる。
TRE-レポ一夕一遺伝子 （ルシフェラーゼ） を導入しだ本発明の蛋白質発現細 胞を、 24穴プレートに 5xl 03ce l l/wel lで播種し、 48時間培養する。 細胞を
0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一 （pH7. 4) で洗浄した後、 Ι ΟηΜの本発明のぺプチドまたは Ι ΟηΜの本発明のぺプチドおよび試験化合物を添 加し、 37°Cで 60分間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋イン キ製造 （株） ） で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加 する。 ルシフェラーゼによる発光は、 ルミノメーター、 液体シンチレーシヨン カウンターまたはトップカウンタ一により測定する。 本発明のペプチドを添加 した場合と、 Ι ΟηΜの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した場合のルシ フェラ一ゼによる発光量を測定して、 比較する。
本発明のペプチドによる細胞内カルシウムの上昇によって、 ルシフェラーゼ による発光量が増加する。 この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候 補物質として選択することができる。
レポ一ター遺伝子として、 例えば、 アルカリフォスファタ一ゼ、 クロラムフ ェニコール ·ァセチ Jレトランスフェラーセ (ch l orampheni co l
ace tyl t rans f erase) 、 j8—ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。 こ れらのレポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性は、 公知の方法に従い、 または市販 の測定キットを用いて測定する。 アル力リフォスファ夕ーゼ活性は、 例えば和 光純薬製 Lumi- Phos 530を用いて、 クロラムフエニコ一ル 'ァセチル卜ランスフ エラ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chro l ampheni co l
Ace tyl t rans f erase Assay Ki Tを用いて、 j3—ガラクトシダ一ゼ活性は、 例えば 和光純薬製 Aurora Gal- XEを用いて測定する。
〔8〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 MAPキナ ーゼが活性化され、 増殖する。 この反応を利用して、 本発明のペプチドの本発 明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチ ドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすること ができる。 '
具体的には、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場 合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に接触 させた場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することにより、 本発明のぺプ チドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 本発明の蛋白質発現細胞の増殖は、 例えば、 MAPキナーゼ活性、 チミジン取り 込み活性、 細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、 MAPキナ一ゼ活性については、 本発明のペプチドまたは本発 明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に添加した後、 細 胞溶解液から抗 M A Pキナーゼ抗体を用いた免疫沈降により MAPキナーゼ分画を 得た後、 公知の方法、 例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay ぉょびァ- ] - ATPを使用して MAPキナ一ゼ活性を測定し、 比較する。
チミジン取り込み活性については、 本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレート に播種し、 培養し、 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合 物を添加した後、 放射活性により標識したチミジン （例、 [methy卜 ¾] -チミジ ンなど） を加え、 その後、 細胞を溶解し、 細胞内に取り込まれたチミジンの放 射活性を、 液体シンチレ一ションカゥンターで計数することにより、 チミジン 取り込み活性を測定し、 比較する。
細胞数の測定については、 本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに播種し、 培養し、 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し た後、 MTT (3- (4, 5-dime thyl-2-th i azo lyl) -2, 5-di henyl -2H-t etrazo l ium bromide) を添加する。 細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを、 塩酸にて酸性としたィソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、 570nmの吸収 によって測定し、 比較する。 ·
本方法において、 本発明の蛋白質発現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 本発明のぺプ チドと同様な細胞増殖活性を測定することによりァゴニストのスクリーニング を行なうこともできる。
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べ る。
本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに 5000個/ゥエル播き、 1日間培養す る。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にする。 本発明の ぺプチドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を、 細胞に添加して 24時間 培養した後、 [methy卜3 H] -チミジンをゥエル当たり 0. 015MBQ添加し、 6時間培養 する。 細胞を PBSで洗った後、 メタノールを添加して 10分間放置する。 次に 5% トリクロ口酢酸を添加して 15分間放置後、 固定された細胞を蒸留水で 4回洗う。 0. 3N水酸化ナトリゥム溶液で細胞を溶解し、 溶解液中の放射活性を液体シンチ レ一ションカウンタ一で測定する。
本発明のペプチドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
〔9〕 本発明の蛋白質発現細胞は、 本発明のペプチドの刺激により、 力リウ ムチャネルが活性化し、 細胞内にある Kイオンが、 細胞外に流出する。 この反応 を利用して、 本発明のぺプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を 測定することにより、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化さ せる化合物をスクリーニングすることができる。
Kイオンと同族元素である Rbイオン (ルビジウムイオン) は、 Kイオンと区別 無く、 力リゥムチャネルを通って細胞外に流出する。 よって、 本発明の蛋白質 発現細胞に、 放射活性同位体である Rb ( [86Rb] ) を取り込ませておいた後、 本 発明のペプチドの刺激によって流出する86 Rbの流れ （流出活性） を測定するこ とにより、 本発明のぺプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測 定する。
具体的には、 86Rbの存在下、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質発現細胞 に接触させた場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質 発現細胞に接触させた場合における、 8¾bの流出活性を測定し、 比較すること により、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物を スクリ一ニングする。
本方法において、 本発明のぺプチド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制 する試験化合物を、 拮抗阻害能力めある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 本発明のぺプ チドと同様な86 Rbの流出活性の上昇を測定することによりァゴニストのスクリ 一二ングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに播き、 2日間培養する。 その後、 lmCi/mlの86 RbClを含む培地中で 2時間保温する。 細胞を培地でよく洗浄し、 外 液中の86 RbCIを完全に除く。 本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび 試験化合物を細胞に添加し、 30分後外液を回収し、 γカウンタ一で放射活性を 測定し、 比較する。
本発明のペプチド刺激による86 Rbの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
〔1 0〕 本発明の蛋白質発現細胞が本発明のペプチドに反応し、 細胞外の pH が変化する。 この反応を利用して、 本発明^)ペプチドの本発明の蛋白質発現細 胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白 質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場 合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質発現細胞に接触 させた場合における、 細胞外の pH変化を測定し、 比較することにより、 本発明 のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニング する。 細胞外 pH変化は、 例えば、 Cytosensor装置 （モレキュラーデバイス社） を使 用して測定する。
本方法において、 本発明のぺプチドによる細胞外 pH変化を抑制する試験化合 物を、 拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方 試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、 本発明のぺプ チドと同様な細胞外 PH変化を測定することによりァゴニス卜のスクリ—ニング を行なうこともできる。
スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を Cytosensor装置用のカプセル内で終夜培養し、 装 置のチャンバ一にセットして細胞外 pHが安定するまで約 2時間、 0.1% BSAを含 む RPMI1640培地 （モレキュラーデバイス社製） を灌流させる。 pHが安定した後、 本発明のペプチドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を含む培地を細胞 上に灌流させる。 灌流によって生じた培地の pH変化を測定し、 比較する。
本発明のペプチドによる細胞外 pH変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
〔1 1〕 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) の haploid a-mating Type (MAT a) の性フェロモン受容体 STe2は、 G蛋白質 Gpalと共役しており、 性フェロモン a -Mating factorに応答して MAPキナーゼを活性化し、 これに引き続き、 Farl' (cell-cycle arrest) および転写活性化因子 Stel2が活性化される。 Stel2は、 種々の蛋白質 （例えば、 接合に関与する FUS1) の発現を誘導する。 一方、 制御 因子 Sst2は上記の過程に抑制的に機能する。 この系において、 受容体遺伝子を 導入した酵母を作製し、 受容体ァゴニス h.の刺激により酵母細胞内のシグナル 伝達系を活性化し、 その結果生じる増殖などを指標として用いる、 受容体ァゴ ニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている (Trends in
Biotechnology, 15巻， 487- 494頁， 1997年） 。 上記の受容体遺伝子導入酵母の 系を利用して、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化 合物をスクリーニングすることができる。
具体例を以下に示す。
MATひ酵母の Ste2および Gpalをコードする遺伝子を除去し、 代わりに、 本発明 の蛋白質遺伝子および Gpa卜 Gai 2融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。 Farをコードする遺伝子を除去して eel卜 cyc le arres tが生じないようにし、 ま た、 Ss tをコードする遺伝子を除去して本発明のペプチドに対する応答の感度を 向上させておぐ。 さらに、 FUS1にヒスチジン生合成遺伝子 HIS3を結合した FUS1- HIS3遺伝子を導入する。 この遺伝子組換え操作は、 例えば、 Molecular and
Cel lular Bio logy, 15卷， 6188- 6195頁， 1995年に記載の方法において、 ソマト ス夕チン受容体タイプ 2 (SSTR2) 遺伝子を、 本発明の蛋白質に置き換えて実施 することができる。
このように構築された形質変換酵母は、 本発明のペプチドに高感度で反応し、 その結果、 MA Pキナーゼの活性化が起き、 ヒスチジン生合成酵素が合成され るようになり、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、 上記の本発明の蛋白質発現酵母 （Ste2遺伝子および Gpal遺伝子が除 去され、 本発明の蛋白質遺伝子および Gpal-Gai2融合蛋白質コード遺伝子が導入 され、 Far遺伝子および Ss t遺伝子が除去され、 FUS1- HIS3遺伝子が導入された ΜΑΤ α酵母） を、 ヒスチジン欠乏培地で培養し、 本発明のペプチドまたは本発明 のペプチドおよび試験化合物を接触させ、 該酵母の生育を測定し、 比較するこ とにより、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物 をスクリ一二ングすることができる。
本方法において、 該酵母の生育を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを上記の本発明の蛋白質発現酵母に接触させ、 本発明 のべプチドと同様な酵母の生育を測定する„.ことによりァゴニストのスクリ一二 ングを行なうこともできる。
スクリ一ニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の蛋白質発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、 そ の後、 ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、 2xl04cel l/mlの濃度になるよう に加える。 ついで、 9x9cinの角形シャーレに播く。 寒天が固化した後、 本発明の ぺプチドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を 寒天表面におき、 30°Cで 3日間培養する。 '試験化合物の影響は、 濾紙の周囲の酵 母の生育を、 本発明のペプチドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比 較する。 また、 あらかじめ、 ヒスチジンを除去した寒天培地に本発明のぺプチ ドを添加しておき、 滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、 シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよ い。
酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択する ことができる。
〔1 2〕 本発明の蛋白質遺伝子 RMをアフリカッメガエル卵母細胞に注入し、 本発明のペプチドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、 cal c ium- ac t ivated ch lori de currentが生じる。 これは、 膜電位の変化として とらえることができる （Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様） 。 本発明の ペプチドによって生じる本発明の蛋白質導入アフリカッメガエル卵母細胞にお ける上記反応を利用して、 本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対す る刺激活性を測定することにより、 本発明のぺプチドと本発明の蛋白質との結 合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、 本発明のペプチドを、 本発明の蛋白質遺伝子 RNA導入アフリカッ メガエル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のぺプチドおよび試験化合物を、 本発明の蛋白質遺伝子 RNA導入ァフリカッメガエル卵母細胞に接触させた場合に おける、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチド と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、 細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、 拮抗阻害能力の ある候補物質として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の蛋白質遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵 母細胞に接触させ、 本発明のぺプチドと同様な細胞膜電位変化を測定すること によりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなつた雌のアフリカッメガエルから取り出した、 卵母細胞 塊を、 MBS液 (88mM NaCl , ImM KC1 , 0. 41mM CaCl2, 0. 33mM Ca (N03) 2, 0. 82mM MgS04, 2. 4mM NaHC03, lOmM HEPES； pH7.'4) に溶かしたコラゲナーゼ (0. 5mg/ml) で卵塊がほぐれるまで 19°C、 1〜6時間、 150ι·ρηιで処理する。 外液 を MBS液に置換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピュレ一夕一で本発明の蛋 白質遺伝子 poly Α付加 cRNA (50ng/50nl) を卵母細胞にマイクロインジェクショ ンする。
本発明の蛋白質遺伝子! iiRNAは、 組織や細胞から調製してもよく、 プラスミド から in vi troで転写してもよい。 本発明の蛋白質遺伝子 mRNAを MBS'液中で 2(TCで 3日培養し、 これを Ringer液を流している vol tage c la即装置のくぼみに置き、 電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、 (一） 極は細 J3包外に置く。 電位が安定したら、 本発明のペプチドまたは本発明 のペプチドおよび試験化合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録する。 試 験化合物の影響は、 本発明の蛋白質遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵母細胞 の細胞膜電位変化を、 本発明のぺプチドのみ含む Ringer液を流した場合と比較 することによって測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択 することができる。
上記の系において、 電位の変化量を増大させると、 測定しやすくなるため、 各種の G蛋白質遺伝子の poly A付加 RNAを導入してもよい。 また、 カルシウム存 在下で発光を生じるような蛋白質 （例、 aequorinなど） の遺伝子の poly A付加 RNAを共ィンジェクシヨンすることにより、 膜電位変化ではなく発光量を測定す ることもできる。
さらに、 哺乳動物由来の内皮細胞を使用したスクリーニング方法について、 以下に述べる。 ...
哺乳動物由来の血管内皮細胞、 好ましくは大動脈血管内皮細胞、 より好まし くは毛細血管内皮細胞、 さらに好ましくは内分泌組織 （例、 副腎、 卵巣、 精巣 など） 由来の毛細血管内皮細胞を用いて以下の方法などにより、 本発明のぺプ チドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングするこ とができる。
1 ) 試験化合物の存在下および非存在下、 培養用プレートに培養した内皮細 胞または内皮細胞由来の膜画分に、 本発明のぺプチドまたは MIT1類の放射性ョ 一ド標識体を接触させ、 放射性ョ一ド標識体の内皮細胞または膜画分への結合 を測定し、 比較することにより、 放射性ョード標識体の内皮細胞または膜画分 への結合を阻害する化合物をスクリーニングする。
2 ) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のペプチドまたは MIT1類で 内皮細胞刺激し、 細胞内カルシウムイオン濃度の上昇反応を測定し、 比較する ことにより、 本発明のペプチドまたは ΜΙΠ類に依存した細胞内カルシウムィォ ン濃度上昇を抑制する化合物をスクリーニングする。
3 ) 試験化合物の存在下および非存在下、 本発明のペプチドまたは MIT1類で 内皮細胞を刺激し、 MAPキナ一ゼ量、 チミジン取り込み反応量または細胞増殖速 度を測定し、 比較することにより、 本発明のペプチドあるいは MIT1類に依存し た MAPキナーゼ量、 チミジン取り込み反応量または細胞増殖速度上昇を抑制する 化合物ををスクリーニングする。
上記化合物をスクリーニングするには、 直接上記 3 ) の方法を実施してもよ く、 上記 1 ) 、 2 )、 3 ) の順に従い、 または上記 2 )、 3 ) の順に従い実施し てもよい。 上記 1 ) 、 2 )、 3 ) の順、 または上記 2 )、 3 ) の順で実施すると、 効率的にスクリーニングを行うことができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明の蛋白質、 本発明の蛋白質を含 有する細胞、 または本発明の蛋白質を含有する細胞の膜画分、 および本発明の ペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものがあげられる。
1 . スクリーニング用試薬
(i) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 一
Hanks' Balanced Sal t Solut ion (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清アルブ ミン （シグマ社製) を加えたもの。
孔径 0. 45 のフィルターで濾過滅菌し、 4でで保存するか、 あるいは用時調 製しても良い。
(i i) 本発明の蛋白質の標品
本発明の蛋白質を発現させた CH0細胞、 または哺乳動物 （例、 ヒト、 サル、 ゥ シ、 ブ夕、 ラット、 マウスなど） 由来の内皮細胞を、 12穴プレートに 5xl05個/ 穴で継代し、 37°C、 5 %C02、 95 % airで 2日間培養したもの。
(i i i) 標識リガンド
〔¾〕 、 〔1251〕 、 〔14C〕 、 〔3 〕 などで標識した本発明のペプチド。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4tあるいは- 2(TCにて保存し、 用 時に測定用緩衝液にて 1 iMに希釈する。
(iv) リガンド標準液
本発明のペプチドを 0. 1 %ゥシ血清アルブミン (シグマ社製) を含む PBSで ImM となるように溶解し、 - 2(T で保存する。
2 . 測定法 '
(i) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質を発現させた細胞ま たは哺乳動物 （例、 ヒト、 サル、 ゥシ、 ブタ、 ラット、 マウスなど） 由来の内 皮細胞を、 測定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に 加える。
(i i) 10一3〜 10— の試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した本発明のぺプチ ドを 加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試 験化合物のかわりに 10— ¾の本発明のぺプチドを 5 1加えておく。
(i i i) 反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識した本発明のペプチドを 0. 2N NaOH-1 % SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレ一 夕一 A (和光純薬製） と混合する。
(iv) 液体シンチレ一シヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性 を測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。
PMB= [ (B-NSB)/(B0-NSB) ] X 100
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB ： Non-speci f ic Binding (非特異的結合量）
B。 ：最大結合量
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合を変化 させる （結合を阻害または促進する） 化合物であり、 具体的には本発明の蛋白 質を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩 （いわゆる本発明の蛋白 質のァゴニスト） 、 または該刺激活性を有しない化合物 （いわゆる本発明の蛋 白質のアン夕ゴニス卜) などである。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発醇生産物などがあげられ、 これら化合物 は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつてもよい。
上記の化合物が、 本発明の蛋白質のァゴニストであるか、 アンタゴニス卜で あるかの具体的な評価方法は、 例えば以下の （A) または （B ) に従えばよい。
(A) 前記のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツセィを行い、 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる （特に、 結合を阻 害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した本発明の蛋白質を介する細胞剌 激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはそ の塩は本発明の蛋白質のァゴニストであり、 該活性を有しない化合物またはそ の塩は本発明の蛋白質のアン夕ゴニストである。
(B ) (a)試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させ、 上記本発明 の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物また はその塩は本発明の蛋白質のァゴニストである。
(b) 本発明の蛋白質を活性化する化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接 触させた場合と、 本発明の蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を本発 明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 本発明の蛋白質を介し た細胞刺激活性を測定し、 比較する。 本発明の蛋白質を活性化する化合物によ る細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の蛋白質のアン夕 ゴニス卜である。 ..
本発明の蛋白質アン夕ゴニストは、 本発明の蛋白質に対する本発明のぺプチ ドが有する生理活性を抑制することができるので、 該受容体活性を抑制する安 全で低毒性な医薬として有用である。
本発明の蛋白質アンタゴニストとして、 例えば、 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物、 好ましくは、
(0 本発明のぺプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、
( i i ) 本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、 (i i i) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害す る化合物またはその塩、
(iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作用を 阻害する化合物またはその塩などが挙げられる。
本発明の蛋白質ァゴニストは、 本発明の蛋白質に対する本発明のペプチドが 有する生理活性と同様の作用を有しているので、 本発明のペプチドと同様に安 全で低毒性な医薬として有用である。
本発明の蛋白質ァゴニストとして、 例えば、 本発明のぺプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物、 好ましくは、
(0 本発明のペプチドの活性を促進する化合物またはその塩、
(i i) 本発明の蛋白質の活性を促進する化合物またはその塩、
(i i i) 本発明のペプチドまたは M I T 1類と本発明の蛋白質との結合を阻害す る化合物またはその塩、
(iv) 本発明のペプチドまたは M I T 1類の、 本発明の蛋白質の活性化作用を 促進する化合物またはその塩などが挙げられる。
本発明のペプチドは摂食抑制作用、 体温降下作用などを有するため、 本発明 の蛋白質のァゴニストは、 例えば、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲 状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥 満など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等に よる体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生殖 機能障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 統合失調症、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 高血圧症、 動脈硬 化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予防 ·治 療剤、 好ましくは肥満症の予防 ·治療剤などの医薬として用いることができる。 また、 本発明の蛋白質のアン夕ゴニストは、 例えば摂食障害 （例、 拒食症、 過 食症など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、'概日リズム障害 （例、 三交替勤務等 による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生 殖機能障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障 害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 統合失調症、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予 防 ·治療剤、 好ましくは摂食障害の予防 ·治療剤などの医薬として用いること ができる。
上記の化合物の塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられ る。 例えば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩など のアルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 ならびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチル ァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノー ルァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシル ァミン、 N， N ' —ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩などがあげられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸 などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタ ンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 ォ ルチニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えば ァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、 常套手段に従って実 施することができる。 例えば、 必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるい は水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液 剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物まだはその塩 を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた単位用量形態で混和することによって製 造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当 な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶 性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などの ような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖また はサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモ /油またはチェリ一のよ うな香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記 タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射の ための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油 などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実 施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D-ソルビトール、 D-マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえばエタ ノール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレング リコール） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルべ一ト 80™、 HC0-50) などと併用してもよい。 油性液としてはゴ.マ油、 大豆油などがあげられ、 溶解 補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化 剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一ルなど) 、 保存剤 (例えば、 ベン ジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製 された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば哺乳動物 (例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の 場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき約 0. l〜1000mg、 好ましくは約 1. 0〜300mg、 より好ましくは約 3. 0〜50mgである。 非'経口的に投与 する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによ つても異なるが、 たとえば注射剤の形では成人の摂食障害患者 （体重 60kgとし て） への投与においては、 一日にづき約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. 1〜10mgを静脈注射により投与する。 他の動物の場合も、 体 重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
( 6 ) 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、 または本発明の蛋白 質をコ一ドするポリヌクレオチドを用いる摂食調節剤のスクリーニング方法 具体的には、 例えば、 （a) 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産生す る能力を有する細胞を培養した場合と （b) 本発明のペプチドまたは本発明の蛋 白質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比 較を行い、 摂食調節剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 (a) と (b) の場合における、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の遺伝子の発現量 （具体的には、 蛋白 質量または該蛋白質をコードする mR NA量） を測定して、 比較する。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド _.、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であつてもよいし、 公知の化合物であって もよい。
本スクリーニング方法を実施するには、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋 白質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファ一に浮遊 して調製する。 バッファーには、 pH約 4〜10 (望ましくは、 pH約 6〜8) のリン酸 バッファー、 ほう酸バッファ一などが用いられる。 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞として は、 例えば、 前述した本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードする D NAを含有するべクタ一で形質転換された宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C H O細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該 スクリーニングには、 例えば., 前述の方法で培養することによって、 本発明の ペプチドまたは本発明の蛋白質を発現させた形質転換体が好まし'く用いられる。 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の蛋白量の測定は、 公知の方法、 例 えば、 本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を認識する抗体を用いて、 細胞 抽出液中などに存在する前記蛋白質を、 ウエスタン解析、 ELISA法などの方法ま たはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明のぺプチドまたは本発明の蛋白質の遺伝子発現量は、 自体公知の方法、 例えば、 ノ一サンブロッテインクや Reverse transcr ipt ion-polymer ase chain reac t ion (RT-PCR) 、 リアルタイム PCR解析システム (ABI社製、 TaqMan polymerase chain react ion) などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがつ て測定することができる。
例えば、 上記 （b) の場合における蛋白質の遺伝子発現量を、 上記 （a) の場 合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 % 以上阻害する試験化合物を、 例えば摂食調節剤として、 例えば摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） などの予防 ·治療剤として選択することができる。
例えば、 上記 （b) の場合における蛋白質の遺伝子発現量を、 上記 （a) の場 合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 % 以上促進する試験化合物を、 例えば摂食調節剤、 例えば肥満症 （例、 悪性肥満 細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小 児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） などの予防 ·治療剤として選択することができ る。
( 7 ) 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質に対する抗体を用 いる摂食調節剤のスクリーニング方法
具体的には、 例えば、 （a) 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋 白質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と （b) 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混 合物を培養した場合との比較を、 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明 の蛋白質に対する抗体を用いて行い、 摂食調節剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 (a) と (b) の場合における、 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質の発現量 （具体的には、 蛋白質量） を上記抗体を用いて測定して、 比較する。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であって もよい。
本スクリーニング方法を実施するには、 本発明のペプチド、 M I T 1類また は本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッ ファーに浮遊して調製する。 バッファーには、 pH約 4〜10 (望ましくは、 pH約 6 〜8) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファーなどが用いられる。
本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質を産生する能力を有す る細胞としては、 例えば、 前述した本発明のペプチド、 M I T 1類または本発 明の蛋白質をコードする D NAを含有するベクターで形質転換された宿主 （形 質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C H O細胞などの動物細胞 が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培養す ることによって、 本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質を発現 させた形質転換体が好ましく用いられる。
例えば、 上記 （b) の場合における蛋白質の発現量を、 上記 （a) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻 害する試験化合物を、 例えば摂食調節剤として、 例えば摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） などの予防 ·治療剤として選択することができる。
例えば、 上記 （b) の場合における蛋白質の発現量を、 上記 （a) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促 進する試験化合物を、 例えば摂食調節剤として、 例えば肥満症 （例、 悪性肥満 細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小 児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など) などの予防 ·治療剤として選択することができ る。 .
( 8 ) 内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなる摂食 調節剤
内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩としては、 内皮細胞増殖 阻害作用を有する化合物またはその塩であれば、 いずれのものでもよい。
該化合物またはその塩は、 摂食調節剤などとして用いられ、 例えば、 肥満症 (例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性 ίΕ満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症 候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身 性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） 、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食 症など） などの予防 ·治療剤などの医薬として安全に用いられる。
このような医薬として使用する場合、 前述の本発明のスクリーニング方法ま たはスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物を医薬として 実施する場合と同様にして実施することができる。 ·
( 9 ) 本発明の蛋白質または本発明のペプチドの定量
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質を特異的に認識することができるので、 被 検液中の本発明の蛋白質または本発明のペプチド （以下、 （9 ) 項では本発明 の蛋白質と略記する） の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量等に使 用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明の蛋白質とを競合的 に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明の蛋白質の割合を測定する ことを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質の定量法、 および
( i i ) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質の定量法を提供す る。
また、 本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体 (以下、 本発明のモノク ローナル抗体と称する場合がある) を用いて本発明の蛋白質の定量を行なえる ほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体 分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F (ab' ) 2 、 FalD'または Fab画分 を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質の定量法は、 特に制限されるべきもの ではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 本発明のペプチド量） に対応した抗 体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出 し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する 測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感 度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質、 ランタニド元素等が用いられる。 放射性同 位元素としては、 例えば、 〔'251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔14C〕 、 〔32P〕 、
C33P) 、 〔 〕 等が用いられる。 上記酵素.としては、 安定で比活性の大きなも のが好ましく、 例えば、 i3—ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アル力 リフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素等が用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 シァニン蛍光色素 (例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイォサイエンス社製) など） 、 フルォレスカミン、 フルォレ ッセンイソチオシァネート等が用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミ ノール、 ルミノール誘導体、 レシフェリン、 ルシゲニン等が用いられる。 さら に、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン—アビジン系を用いること もできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通 常ペプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース デキストラン、 セルロース等 の不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドィッチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液 を反応させ ( 1次反応) 、 さらに標識化した別の本発明のモノク口一ナル抗体 を反応させ ( 2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検液中の本発明のペプチド量を定量することができる。 1次反応と 2 次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして 行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることが できる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるい は標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度 を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明のぺプチドの測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のぺプチ ドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応 および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のペプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好 ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィ.ツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリー等に用いることができる。 競合法では、 被検波中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し (B/F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZ F分離をポリエチレ- ングリコ一ル、 前記抗体に対する第 2抗体等を用いる液相法、 および、 第 1抗 体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2坊体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。 .
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレ一ザ一ネフロメト リ一等が好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の蛋白質の測定系を 構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書等 を参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアッセィ j (講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測 定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol . 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) ) 同書 Vol . 92 (Immunochemical Techniques (Part E :Monocl onal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) ) > 同書 Vol . 121 (Immunochemical
Techniques (Part I :Hybridoma Technology and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 ァカデミックプレス社発行)等を参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の蛋白質を 感度良く定量することができる。 さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の蛋白質の脳脊髄液濃度または血中 濃度を定量することによって、 本発明の蛋白質の濃度の増多が検出された場合、 肥満症や摂食障害などに罹患している、 または将来罹患する可能性が髙いと診 断することができる。 .
また、 本発明の抗体は、 体液や組織等の被検体中に存在する本発明の蛋白質 を検出するために使用することができる。 また、 本発明の蛋白質を精製するた めに使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の蛋白質の検出、 被検細胞内における本発明の蛋白質の挙動の分析等のために使用することがで さる。
( 1 0 ) 遺伝子診断薬
本発明の D N Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） における本発明の蛋白質または本発 明のペプチド （以下、 （1 0 ) 項では本発明の蛋白質と略記する） をコードす る D NAまたは mR N Aの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 D N Aまたは mR NAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断薬として有用であ る。
本発明の D N Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 '自体公知のノーザン ハイブリダィゼ一シヨンや PCR- SSCP法 (Genomi cs , 第 5巻， 874〜879頁， 1989年、 Proceedings of the Nat ional Academy of—Sc i ences of the Uni ted States of Amer ica, 第 86巻， 2766〜2770頁， 1989年） 、 DNAマイクロアレイ等により実施す ることができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンや DNAマイクロアレイにより本発明 の蛋白質発現増大が検出された場合や PCR-SSCP法や DNAマイクロアレイにより D N Aの突然変異が検出された場合は、 例えば、 摂食障害、 肥満症などに罹患し ている可能性が高レ ^と診断することができる。 (1 1) アンチセンス DNAを含有する医薬
本発明の DN Aに相補的に結合し、 該 DN Aの発現を抑制することができる アンチセンス DNAは、 生体内における本発明の蛋白質もしくは本発明のぺプ チド （以下、 （1 1) 項では本発明の蛋白質と略記する） または本発明の DN Aの機能を抑制することができるので、 例えば、 本発明の蛋白質の発現過多に 起因する疾患、 例えば摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） などの予防 ·治療 剤として使用することができる。
上記アンチセンス DNAを上記の予防 ·治療剤として、 前記した本発明の D NAを含有する各種疾病の予防 ·治療剤と同様に使用することができる。 例えば、 該アンチセンス DNAを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 ァ デノウィルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクタ一等 の適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って投与することができる。 該 アンチセンス DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤等の生 理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲル力テーテ ルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、 該アンチセンス DN Aは、 組織や細胞における本発明の DN Aの存 在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使 用することもできる。
さらに、 本発明は、
(0本発明の蛋白質をコードする RNAの一部を含有する二重鎖 RNA、
(ii) 前記二重鎖 RNAを含有してなる医薬、
(iii) 本発明の蛋白質をコードする RNAの一部を含有するリポザィム、
(iv) 前記リポザィムを含有してなる医薬も提供する。
上記アンチセンスヌクレオチドと同様に、 二重鎖 RNA (RNAi； RNA interference法) 、 リポザィムなども、 本発明の蛋白質をコ一ドするポリヌク レオチド （例、 DNA) の発現を抑制することができ、 生体内における本発明 の蛋白質または DNAの機能、 およびそれに依存した本発明のペプチドの機能 を抑制することができるので、 例えば、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） などの予防 ·治療剤などとして使用することができる。 二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 リポザィムは、 公知の方法 (例、 TRENDS in Molecular Med i c ine, 7巻， 221 頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 本発明の蛋白質をコードする R N Aの一部に公知 のリボザィムを連結することによって製造することができる。 本発明の蛋白質 をコ一ドする R NAの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され得る 本発明の R NA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げられる。 上記の二重鎖 R N Aまたはリポザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場 合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することがで さる。
( 1 2 ) 本発明の抗体を含有する医薬および診断薬
本発明の蛋白質または本発明のペプチド （以下、 （1 2 ) 項では本発明の蛋 白質と略記する） の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば、 本 発明の蛋白質の発現過多に起因する疾患、 例えば、 摂食障害 （例、 拒食症、 過 食症など） などの予防 ·治療剤などの医薬として、 あるいは摂食障害や肥満症 などの診断薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は、 そのまま液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） に対して経口的または非経 口的に投与することができる。 投与量は、 S与対象、 対象疾患、 症状、 投与ル ート等によっても異なるが、 例えば、 摂食障害治療の目的で本発明の抗体を 1 回量として、 通常 0. 01〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3 回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経 口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合 には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤 形., 具体的には錠剤 (糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む) 、 丸剤.. 顆粒 剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、'乳剤、 懸濁 剤等があげられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分 野において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤とじては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン 酸マグネシウム等が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗 体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶 解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プ ロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 80、 HCO-50 (polyoxyethyl ene (50mo l) adduc t of
hydrogenated cas tor oi l) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジル アルコール等を併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプル に充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の 坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤等が例示され、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500rag程度、 とりわけ注射剤では 5〜 l OOmg程度、 その他の剤形では 10〜250mg程度の上記抗体が含有されていること が好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。 ( 1 3 ) 本発明の D N Aを有する非ヒ卜動物の作製
本発明の D NAを用いて、 本発明の蛋白質または本発明のペプチドを発現す るトランスジエニック非ヒト動物を作製することができる。 非ヒト動物として は、 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下、 動物と略記する） が挙げられるが、 特に、 マウ ス、 ゥサギなどが好適である。
本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞 で発現させうるプロモータ一の下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用 いるのが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D NAを転移させ る場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させ うる各種プロモータ一の下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥ サギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の蛋白質また は本発明のペプチドを高産生する D NA転移動物を作出できる。 このプロモー ターとしては、 例えば、 ウィルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュ ビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現す る N G F遺伝子プロモータ一やエノラーゼ遺伝子プロモー夕一などが用いられ る。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞およ び体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽 細胞において本発明の蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫が全てその 胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明の蛋白質または本発明のペプチドを有する ことを意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞およ び体細胞の全てに本発明の蛋白質または本発明のペプチドを有する。
本発明の D N A転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認 して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さらに、 目的 D NAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子 を相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交 配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することが できる。
本発明の D N Aが転移された動物は、 本発明の蛋白質または本発明のぺプチ -ドが高発現させられているので、 本発明の蛋白質に対するァゴニストまたはァ ンタゴニスト、 本発明のぺプチドの活性を阻害する化合物のスクリーニング用 の動物などとして有用である。
本発明の D N A転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することも できる。 例えば、 本発明の D NA転移マウスの組織中の D NAもしくは R NA を直接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明の蛋白質または本 発明のぺプチドが存在する組織を分析することにより、 本発明の蛋白質につい て分析することができる。 本発明の蛋白質または本発明のぺプチドを有する組 織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や 末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究すること ができる。 また、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高 めるような医薬の選択も可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明の蛋白質または本発明のぺプチドを単離精製することも可能である。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commiss ion on Biochemi cal Nomenc l ature による略号あるいは当該 分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸 に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとす る。
D NA ：デォキシリポ核酸
c D NA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン C ：シ卜シン
Y ：チミンまたはシ卜シン
Ν ：チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァ
R ：アデニンまたはグァニン
Μ ： シトシンまたはアデ二ン
W ：チミンまたはアデニン
S ：シ卜シンまたはグァニン
Β ：グァニン、 チミンまたはシトシン
RNA ： リポ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
d A T P ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
G 1 yまたは G ：グリシン
A 1 aまたは A ：ァラニン
Va 1または V ：バリン
L e uまたは L ： ロイシン
I 1 eまたは I ：イソロイシン
S e rまたは S ：セリン
Th rまたは T ：スレオニン ..
Cy sまたは C ：システィン
]^16 または]^ ：メチォニン
G 1 uまたは E ：ダル夕ミン酸
As または D ：ァスパラギン酸
Ly sまたは K ： リジン
A r gまたは R ：アルギニン
H i sまたは H ：ヒスチジン P h eまたは F フエ二ルァラニン
Ty rまたは Y チロシン
T r pまたは W トリブトファン
P r oまたは P プロリン
A s nまたは N ァスパラギン
G 1 nまたは Q グル夕ミン
p G 1 u ピログルタミン酸
X a a 未同定アミノ酸残基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬等を下記の記号で 表記する。
Me メチル基
Et ェチル基
Bu ブチル基
Ph フエニル基
Ac ァセチル基
TC チアゾリジン— 4 (R) —カルボキサミド基
Bom ベンジルォキシメチル
B z 1
Z ベンジルォキシカルポニル
B r— Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
C 1— Z 2—ク口ルペンジルォキシカルボニル
C 12B z 1 2 - 6—ジクロ口べ ジル
B o c t―プチルォキシカルポニル
HOBt
HOOB t 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4—ォキソ一
1, 2, 3—べンゾトリアジン
PAM フエニルァセトアミドメチル
To s p—トルエンスルフォニル
Fm o c N— 9一フルォレニルメトキシカルポニル DNP ジニトロフエニル
Bum 夕ーシャリーブトキシメチル
T r t 卜リチル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
M e B z 1 4—メチルベンジル '
DC C N, N'一ジシク口へキシルカルポジィミド ' HONB トヒドロキシ -5-ノルポルネン -2， 3 -ジカルボキシィ ド ， .
NMP N—メチルピロリドン
HONB N -ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2 , 3 -ジカルポキシ
イミド
NMP N—メチルピロリドン
TF A トリフルォロ酢酸
CHAP S
プロパンスルホナー卜
PMS F フエ二ルメチルスルホニルフルオリド
GDP グアノシン一 5'—二リン酸
F u r a - 2 AM 卜 [6-ァミノ - 2 -（5 -力ルポキシ -2-ォキサゾリル) -5- ベンゾフラ二ロキシ ]-2- (2-ァミノ- 5メチルフエノキ シ）-ェタン- N， N， N' , N' -四酢酸べンタァセトキシメチル エステル
F 1 u o- 3 AM 卜 [2-アミノ- 5- (2,7-ジクロロ- 6-ヒドロキシ- 3-ォキ シ -9-キサンテニル)フエノキシ] -2- (2-7ミノ- 5 -メチ ルフエノキシ）エタン- N， N, N' , N' -四酢酸ペン夕ァセト キシメチルエステル
HEPES 2-[4- (2-ヒドロキシェチル) -1-ピペラジニル] ェタン スルホン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 S D S ： ドデシル硫酸ナトリウム
B S A ：ゥシ血清アルブミン
H B S S ：ハンクス平衡塩液
E I A ：ェンザィムィムノアッセィ 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒト型 ZAQリガンド成熟体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕 '
配列番号： 1で表されるヒト型 ZAQリガンド成熟体べプチドをコ一ドする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
ヒト型 ZAQリガンド成熟体べプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
配列番号： 3で表されるヒト型 ZAQリガンド成熟べプチドをコ一ドする DNAの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
配列番号： 5で表されるヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチドをコ一ドする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で表されるヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチドをコ一ドする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
マウス型 ZAQリガンド成熟体べプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕 マウス型 ZAQリガンド成熟体べプチドをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 1〕
マウス型 ZAQリガンド前駆体べプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 12〕
マウス型 ZAQリガンド前駆体べプチドをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 13〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ぺプチド （ノーマルタイプ） のァミノ酸配列を示 す。
〔配列番号： 14〕 '
ラット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （ノーマルタイプ） をコードする DNAの 塩基配列を示す。
'〔配列番号： 15〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ぺプチド （Yタイプ） のァミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 16〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （Yタイプ） をコードする DNAの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 17〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （Qタイプ） のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 18〕
ラット型 ZAQリガンド成熟体ぺプチド （Qタイプ） をコードする DMの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 19〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （ノーマルタイプ） のアミノ酸配列を示 す。 '
〔配列番号： 20〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （ノ一マルタイプ） をコードする DNAの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ぺプチド （Yタイプ） のァミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 22〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド (Yタイプ) をコードする DNAの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 2 3〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体ペプチド (Qタイプ) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 24〕
ラット型 ZAQリガンド前駆体べプチド （Qタイプ） をコ一ドする DNAの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 2 5〕
ヒト型 Bv8成熟体べプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 26〕
ヒ卜型 Bv8成熟体べプチドをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 7〕
ヒト型 Bv8前駆体べプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 28〕
ヒト型 Bv8前駆体べプチドをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 9〕
ラット型 Bv8成熟体べプチドおよびマウス型 Bv8成熟体べプチドのアミノ酸配 列を示す。
〔配列番号： 3 0〕
ラット型 Bv8成熟体べプチドをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 1.〕
マウス型 Bv8成熟体べプチドをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 32〕
ラット型 Bv8前駆体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 3〕
ラット型 Bv8前駆体べプチドをコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 34〕
マウス型 Bv8前駆体べプチドのアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：.35〕
マウス型 Bv8前駆体べプチドをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 36〕
へピ毒 MIT1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 37〕
ヒト型 ZAQのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 38〕
ヒト型 ZAQをコードする DNAの塩基配列を示す （ZAQC) 。
〔配列番号： 39〕 '
ヒト型 ZAQをコードする DNAの塩基配列を示す （ZAQT) 。
〔配列番号： 40〕
ヒト型 I5Eのアミノ酸配列を示す。
'〔配列番号： 41〕
ヒト型 I5Eをコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 42〕
ラット由来 rZAQlのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 43〕
ラット由来 rZAQlをコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 44〕
ラット由来 rZAQ2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 45〕
ラット由来 rZAQ2をコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 46〕
マウス由来 GPR73のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 47〕
マウス由来 GPR73をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 48〕
マウス由来 mI5Eのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 49〕 マウス由来 mI5Eをコ一ドする塩基配列を示す。
〔配列番号： 50〕
ゥシ型 ZAQのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 51〕
ゥシ型 ZAQをコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 52〕
ゥシ型 15Eのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 53〕
ゥシ型 I5Eをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 54〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー ZAQ- B1Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 55〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー ZAQ- B1Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 56〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 ZAQの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号： 57〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 I5Eの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号： 58〕
後述の参考例 1で用いられたプライマ一 bZAQ5-2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 59〕
後述の参考例 1で用いられたプライマ一 bZAQ5- 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 60〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 ZAQの 5'部分配列 （typel) の塩基配列を示 す。 - 〔配列番号： 6 1〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 ZAQの 5'部分配列 （type2) の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 62〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQa- F1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 6 3〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQa- F2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 64〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 ZAQの 3"部分配列 （type2) の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 6 5〕 '
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQa-EFlの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6 6〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQa- IF1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6 7〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQa- IR1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6 8〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQa- ER1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6 9〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 ZAQ全長をコードする 2038bpの DNA断片の塩 基配列を示す。
〔配列番号： 7 0〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bl 5E5-1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 1〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bI5E5- 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 2〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 I5Eの 5_ '部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 3〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー b 15E3- 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 74〕
後述の参考例 1で用いられたプライマ一bI5E3- 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 5〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 I5Eの 3'部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 6〕 後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQb- Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 77〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQb-F2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 78〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQb- Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 79〕
後述の参考例 1で用いられたプライマー bZAQb-R2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 80〕
後述の参考例 1で得られたゥシ型 15E全長をコ一ドする 1623bpの DNA断片の塩 基配列を示す。
〔配列番号： 81〕
後述の参考例 2で用いられたプライマー bZAQa- IF1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 82〕
後述の参考例 2で用いられたプライマー bZAQa- tempIRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 83〕
後述の参考例 2で用いられたプライマー bZAQa- taqFの塩基配列を示す。
〔配列番号： 84〕
後述の参考例 2で用いられたプライマ一 bZAQa- taqRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 85〕
後述の参考例 2で用いられたプローブ bZAQa- probeの塩基配列を示す。 配列中、 FAMは 6_carboxy fluoresce inを、 TAMRA¾6-carboxy-tetramethylrhodamine¾-¾- れぞれ示す。
〔配列番号： 86〕
後述の参考例 2で用いられたプライマー bZAQb- F2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 87〕
後述の参考例 2で用いられたプライマー bZAQb- te即 IRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 88〕
後述の参考例 2で用いられたプライマー bZAQb- taqFの塩基配列を示す。
〔配列番号： 89〕 後述の参考例 2で用いられたプライマー bZAQb- taqRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 90〕
後述の参考例 2で用いられたプロ一ブ bZAQb-probeの塩基配列を示す。 配列中、 FAMは、 6 - carboxy fluoresceinを、 TAMRAは 6 - c a r b oxy- ί e t r me thylrhodamineを それぞれ示す。
後述の参考例 1で得られた形質転換体 Escherichia coli DH5 α/pBZAQは、 平 成 14 (2002) 年 1月 9日から、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵 便番号 305- 8566) 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受 託番号 FERM BP- 7845として、 2001年 12月 18日から、 日本国大阪府大阪市淀川区 十三本町 2丁目 17番 85号 （郵便番号 532-8686) 財団法人 ·発酵研究所 （IF0) に 受託番号 IF0 16740として寄託されている。
後述の参考例 1で得られた形質転換体 Escherichia coli T0P10/pBI5Eは、 平 成 14 (2002) 年 1月 9日から、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ ン夕一に受託番号 FERM BP- 7844として、 2001年 12月 18日から、 財団法人 ·発酵 研究所 （IF0) に受託番号 IF0 16739として寄託されている。 以下に実施例および参考例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これ らは本発明の範囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操 作法は、 モレキュラー .クローニング （Molecular cloning) に記載されている 方法に従った。
実施例 1
ヒト型 Bv8ぺプチド投与による摂餌量に及ぼす影響
ヒト型 Bv8ペプチドの脳室内投与による摂餌量に及ぼす影響を検討した。 以下 のヒト型 Bv8ペプチドは、 W0 02/57443号公報の実施例 1に準じて作成した。
成熟 Wis tar雄性ラット (8週齢） をペントバルビタール 50mg/kgの腹腔内投与 にて麻酔し、 ラット脳定位固定装置に固定した。 切歯用バーはインターオーラ ルラインから 3.3匪低くした。 頭蓋骨を露出し、 側脳室にガイドカニュ一レ AG12 (内径 0.4ιηπι、 外径 0.5匪、 エイコム） を埋め込むために歯科用ドリルを用いて 骨に穴をあけた。 また、 穴の周囲 3箇所にアンカ一ビスを埋め込んだ。 ステンレ ス製ガイド力二ュ一レ （AG- 12) を、 その先端が脳室の上部に位置するように揷 入した。 定位座標は、 ？&^1103 &13011のァトラス5(1.4 (1998) に従い、 ブレダ マから AP:- 0,8、 L:-1.5、 H:4.5nimとした。 ガイド力ニューレは瞬間接着剤と歯 科用セメントおよびアンカ一ビスで頭蓋骨に固定した。 ガイドカニューレには ステンレス製ダミー力二ュ一レ AD-12 (外径 0.35匪、 エイコム） を揷入し., キヤ ップナット （エイコム） で固定した。 術後、 ラットは個別のケージで飼育した。 ガイドカニューレを埋め込んでから約 1週間飼育して術後の回復 （術後に減少し た体重が、 適切に増加していることを指標とする） を待ち、 リン酸緩衝生理的 食塩水 (pH7.2) またはヒト型 Bv8ペプチド投与を実施した。
ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミー力二ュ一レを取り外し、 その代わりにテフロンチューブ （内径 0.1讓、 外径 0.35mm、 長さ 50cm、 エイコ ム） につないだステンレス製マイクロインジェクション力二ュ一レ AMI- 9 (内径 0.17匪、 外径 0.35匪、 エイコム） を挿入した。 マイクロインジェクション力二 ユーレの長さは、 その先端 1腿がガイ.ドカニューレから露出するように調節して おいた。 テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、 リン酸 緩衝生理的食塩水 (pH7.2) またはヒト型 Bv8ペプチド （2 nmol) を溶解させた リン酸緩衝生理的食塩水を 5 1/minの流速で合計 10 1を脳室に投与した。 注 入終了後 2分間待ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外し、 再 びダミー力ニューレをキャップナツ卜で固定した。
ラットの飼育は明暗周期 12時間 （明期： 8時から 20時） で飼育し、 摂食実験は 18時から 19時の間に開始した。
マイクロインジェクションカニューレを.取り外し、 自由に標準飼料を摂食さ せた。 投与終了から 1時間、 2時間、 4時間、 6時間および 15時間に摂食した餌を 計量し、 それぞれ 1時間、 2時間、 4時間、 6時間および 15時間摂餌量とした。
ヒ卜型 Bv8ペプチド投与群 （n=6) では、 リン酸緩衝生理的食塩水投与群
(n=6) に比較して、 投与後 1時間から 6時間経過時点まで徐々に摂餌量の減少が 認められた。 投与後 15時間経過時点では、 14.3±0.7 g (ヒ卜型 Bv8ペプチド投 与群） 、 19.4±1.6 g (リン酸緩衝生理的食塩水投与群） 、 pく 0.05 (t検定） で あり、 統計学的に有意な摂餌量の減少が認められた。 以下に経過時間ごとの各群の摂餌量を列挙する （平均値土 SEM) 。
1時間後： 1.8±0.4 g (ヒト型 Bv8ペプチド投与群） 、 2.1土 0.3 g (リン酸緩 衝生理的食塩水投与群） 。
2時間锬： 3.0±0.4 g (ヒト型 Bv8ペプチド投与群） 、 3.1±0.8 g (リン酸緩 衝生理的食塩水投与群） 。
4時間後： 5.0±0.4 g (ヒト型 Bv8ペプチド投与群） 、 5.6±0.4 g (リン酸緩 衝生理的食塩水投与群） 。
6時間後： 7.1±0.6 g (ヒト型 Bv8ペプチド投与群） 、 8.7±0.7 g (リン酸緩 衝生理的食塩水投与群） 。 実施例 2
ヒト型 Bv8ぺプチド投与による体温に及ぼす影響
以下のヒト型 Bv8ペプチドは、 W 02/57443号公報の実施例 1に準じて作成し た。
実施例 1に記載と同様の操作で、 ラットにヒト型 Bv8ペプチド脳室内投与を行 い、 ヒト型 Bv8ペプチドの脳室内投与による体温に及ぼす影響を検討した。
ラットの飼育は明暗周期 12時間 （明期： 8時から 20時） で飼育し、 体温計測は、 ラットに無麻酔下で直腸温計測プローブ （RET- 2ラット用直腸プローブ、 Model BAT- 12デジタル温度計、 Physitemp社） を直腸に挿入してヒト型 Bv8ペプチド投 与前体温を計測した。 その後、 18時から 19時の間にラットに無麻酔、 無拘束下 でマイクロインジェクション力ニューレを取り付け、 リン酸緩衝生理的食塩水 またはヒト型 Bv8ペプチドの投与を実施した。.
ヒト型 Bv8ペプチド投与を実施し、 投与終了後から 1時間、 2時間、 4時間、 6時 間および 15時間に前述の通り体温を計測した。 ヒト型 Bv8ペプチド投与群
(n=6) では、 リン酸緩衝生理的食塩水投与群 （n=6) に比較して、 投与後 1時間 から 2時間経過時点まで統計学的に有意な体温の低下が認められた。
以下に経過時間ごとの各群の体温を列挙する （平均値土 SEM) 。
投与前体温： 36.2±0.1°C (ヒト型 Bv8ペプチド投与群） 、 36.4±0.2°C (リン 酸緩衝生理的食塩水投与群） 。 1時間後： 34.2±0.2°C (ヒト型 Bv8ペプチド投与群） 36.6±0.2°C (リン酸 緩衝生理的食塩水投与群） 、 p〈0.01 (t検定） 。
2時間後： 34.9土0.2。〇 （ヒ卜型 Bv8ペプチド投与群） 36.8±0.2°C (リン酸 緩衝生理的食塩水投与群） pく 0.01 (t検定） 。
4時間後： 36.3±0.3°C (ヒト型 Bv8ペプチド投与群） 36.9±0.2 (リン酸 緩衝生理的食塩水投与群） 。
6時間後： 37.0±0.3°C (ヒト型 Bv8ぺプチド投与群） 37.3±0.2 （リン酸 緩衝生理的食塩水投与群） 。
15時間後： 36.3±0.2°C (ヒト型 Bv8ぺプチド投与群) 36.2±0.2°C (リン酸 緩衝生理的食塩水投与群） 。 参考例 1
ゥシ型 ZAQおよびゥシ型 I5E cDNAのクロ一ニング
ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) およびゥシ大動脈血管内皮細胞 （BAE) より、 RNeasy Mini Kit (QIAGEN社） を用いて添付のマニュアルに記載された方 法に従って BACE 由来 total RNA(BACE tRNA)および BAE由来 total RNA(BAE tRNA) を取得した。 これを錡型として、 SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (GIBCO BRL社） を用いて添付のマニュアルに記載された方法に 従って BACE 由来 cDNA(BACE cDNA)および BAE 由来 cDNA(BAE cDNA)を取得した。 続いて BACE cDNAを铸型としてヒト ZAQ、 マウス ZAQ、 ラット ZAQ、 ヒト I5E、 マウ ス I5Eおよび GPR73の情報より degenerateプライマ一 ZAQ- B1F (配列番号： 5 4) 、 ZAQ-B1R (配列番号： 55) を作成レ、 以下に記した PCR反応を実施した。
PCR反応液は AmpliTaq Gold (Applied Biosystems社）を 0.5 βΙ、 添付の 10χ PGR buffer II (100 mM Tris-HCl, 500 mM KC1)を 5 1、 25 raM MgCl2を 4 1、 dNTP mixture (2.0 mM each, Applied Biosystems社）を 5 1、 12.5^M プライ マー ZAQ-B1Fおよび ZAQ- B1Rを 2.5 /1、 铸型 cDNAを l xl、 および蒸留水を 29.5 i lを混合して作製した。 反応条件は、 95t>10分の初期変性後、 95 >20秒 - 66°C ' 30秒のサイクル反応を 35回、 および 66°C · 10分の最終伸長反応とした。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた DNA配 列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ型 ZAQの部分配列 （配列番 号： 56) およびゥシ型 I 5 Eの部分配列 （配列番号： 57) の塩基配列を得 た。
ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) より、 TRIzol Reagent (GiBCO BRL社） を 用いて添付のマニュアルに記載された方法に従って BACE 由来 total RNA(BACE NA)を取得した。 これを铸型として、 niRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia biotech社） を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従って BACE 由来 mRNA(BACE mRNA)を取得した。 BACE mRNAを铸型として、 Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH社） を用いて添付のマニュアルに記載され た方法に従って BACE 由来 Library of adaptor- 1 igated ds cDNA(BACE AL ds cDNA)を作成した。
配列番号： 56の情報より、 プライマ一 bZAQ5- 2 (配列番号： 58) と bZAQ5-3 (配列番号： 59) を作成し、 BACE AL ds cDNAを铸型として以下に記 した 5' RACE実験を実施した。
5'1½じ6の？0^反応液は5(^ Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0 1、 添付の 5x Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-腿， 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 /ml BSA,
0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet - P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2 し 10/_^プラィマ一&2八(15-2を 0.5 1、 10 Mプライマー API (プ ライマ一 ΑΠは CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの） を 0.5 1、 铸型 cDNA (BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液)..を 2.5 1、 および蒸留水を 14 x Iを 混合して作製した。 反応条件は 94t> 30秒の初期変性後、 94°05秒-72°04分の サイクル反応を 5回、 94°C'5秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°05秒-68 - 4分のサイクル反応を 25回行つた。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CLONTECH社）を 0· 5 し 添付の 5χ
Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-腿， 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025 Tween-20, 0.025% Nonidet - P40)を 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.0 1、 IO Mプライマ一 bZAQ5-3を 0.5 /1、 10 Mプライマー AP2 (プライマ一 AP2は CLONTECH社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付のもの) を 0.5 1、 錶型蘭 A (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 2.5 し および蒸留水を 14 1を混合して作製した。 反応条件は 94°030秒の初期変性後、 94°05秒-72°04分のサィクル反応を5回、 9 °C · 5秒- 70 > 4分のサイクル反応を 5回、 94°C■ 5秒- 68 ·4分のサイクル反応を 25回行った。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクロ一ニングした。 クローニングされた DNA配 列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 2種類のゥシ型 ZAQの 5'部分配列 (typel：配列番号： 60 ; type2：配列番号： 61) の配列を得た。
配列番号： 60の情報より、 プライマー bZAQa- F1 (配列番号： 62) とブラ イマ一 bZAQa- F2 (配列番号： 63) を作成し、 以下に記した 3' RACE実験を実施 した。
3' RACEの PCR反応液は、 PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 し 添 付の 10x PCR bufferを 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 il、 10 Mプライマー bZAQa-Flおよび 10 iMプライマー API (プライマー APIは CLONTECH 社の Marathon- Ready cDNA Kitに添付のもの） を各 2.5 1 、 铸型 cDNA (BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液） を 1 1、 および蒸留水を 34 1を混合して作製した。 反 応条件は 94°C' 30秒の初期変性後、 94°C'5秒 - 72 '4分のサイクル反応を 5回、
94°C .5秒- 70°C '4分のサイクル反応を 5回、 94°C · 5秒- 68C ·4分のサイクル反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものをを铸型として nested PCRを行った。 PCR反応液は、 PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社） を 1." K 添付の 1 Ox PCR bufferを 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造) を 4 1、 IO Mプライマー bZAQa- F2および IO Mプライマ一 API (プライマー AP2 は CLONTECH社の Marathon-Ready cDNA KiUこ添付のもの) を各 2.5 1 、 铸型 DNA を l l、 および蒸留水を 34 zlを混合して作製した。 反応条件は 94°C'30秒の初 期変性後、 94°C'5秒- 72°C'4分のサイクル反応を 5回、 94° 5秒-70°04分のサィ クル反応を 5回、 94°C'5秒- 68°C'4分のサイクル反応を 25回行った。
得られた DNA断片を Zaro Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクロ一ニングした。 クローニン グされた DNA配列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ型 ZAQの 3'端の 塩基配列 （配列番号： 64) を得た。
5' RACEおよび 3' RACEの情報より、 プライマ一 bZAQa- EF1 (配列番号： 65) 、 プライマ一 bZAQa- IF1 (配列番号： 66) 、 プライマー bZAQa- IR1 (配列番号： 67) およびプライマー bZAQa- ER1 (配列番号： 68) を作成し、 BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液を铸型として、 以下に記した PCR反応を実施した。
PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 し 添付の 10x
PCR bufferを 5 zl、 .5 mM dNTP mixtureを 4 1、 IO Mプライマ一 bZAQa- EF1お よび bZAQa- ER1を各 、 錶型 DNAを 1 1、 および蒸留水を 34 1を混合して 作製した。 反応条件は 95°C · 1分の初期変性後、 95C · 30秒- 60°C ·30秒- 72°C · 3分 のサイクル反応を 35回、 および 72 > 10分の最終伸長反応とした。
続いて、 該 PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものを铸型として nested PCRを行った。 PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を l l、 添付の IOX PCR bufferを 5 1、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 1、 10 Mプラ イマ一 bZAQa- IF1および bZAQa- IR1を各 2.5 1 、 錡型 DNAを 1 1、 および蒸留水 を 34 /1を混合して作製した。 反応条件は 95 '1分の初期変性後、 95°C'30秒 - 60°C*30秒- 72°C'3分のサイクル反応を 35回、 および 72°C · 10分の最終伸長反応と した。 '
得られた MA断片を Zaro Blunt T0P0 PCR.. Cloning Kit (Invi trogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クロ一ニン グされた DNA配列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ型 ZAQ全長をコ —ドする 2038 bpの DNA断片 (配列番号： 69) を有する pBZAQを得ることができ た。 該プラスミドによりトランスフォームさせた大腸菌 DH5 を、 大腸菌 DH5Q! /pBZAQと命名した。
配列番号： 69で表される塩基配列を有する cDNA断片には、 393個のアミノ酸 配列 （配列番号： 50) がコードされており （配列番号： 51) 、 該アミノ酸 配列を有する蛋白質をゥシ型 ZAQと命名した。
配列番号： 57の情報より、 プライマー bI5E5- 1 (配列番号： 70) およびプ ライマー bI5E5 - 3 (配列番号： 71) を作成し、 BACE AL ds cDNAを铸型として 以下に記した 5 ' RACE実験を実施した。
5'RACEの PCR反応液は 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0.5 K 添付の 5X Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75j g/ml BSA,
0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet-P40)を 5," 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2 1、 10 Mプライマー bI5E5- 1を 0.5^K 10 Μプライマ一 API (プ ライマ一 APIは CL0NTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの） を 0.5 1、 铸型 cDNA (BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液） を 2.5 1、 および蒸留水を を 混合して作製した。 反応条件は 94°C'30秒の初期変性後、 94で ·5秒- 72°C'4分の サイクル反応を 5回、 94°C'5秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·5秒 -68 - 4分のサイクル反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage-GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0.5 し 添付の 5x
Advantage-GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 g/ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP' mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.0 1、 IO Mプライマ一 bI5E5- 3を 0.5 1、 IO Mプライマ一 AP2 (プライマー AP2は CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA KiUこ添付のもの） を 0.5 1、 铸型 DNA (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 2.5 _il、 および蒸留水を 14 1を混合して作製した。 反応条件は 94°C ·30秒の初期変性後、 94°C ·5秒- 72°C ·4分のサイクル反応を 5回、 94°C · 5秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C · 5秒- 68°C · 4分のサイクル反応を 25回行った。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニングされた匪配 列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ I5Eの 5'部分配列 （配列番 号： 72) を得た。 配列番号： 57の情報より、 プライマー bI5E3- 1 (配列番号： 73) およびプ ライマー bI5E3-3 (配列番号： 74) を作成し、 以下に記した 3' RACE実験を実施 した。
3' RACEの]3 CR反応液は 50X Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0.5 K 添付の 5χ Advantage - GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 zg/il' BSA,
0.025%T een-20, 0.025% Nonidet-P40)を 5 I、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2 1、 IO Mプライマ一 bI5E3-lを 0.5 K 10 Mプライマー API (プ ライマ一 APIは CL0NTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの) を 0 し 铸型 cDNA (BACE AL ds cDNAの 50倍希釈液） を 2.5 1、 および蒸留水を 14 1を 混合して作製した。 反応条件は 94°C' 30秒の初期変性後、 94°05秒-72°04分の サイクル反応を 5回、 94°C'5秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·5秒 _68°C · 4分のサイクル反応を 25回行った。
続いて、 該 PCR反応の反応液を铸型として nested PCRを実施した。 反応液は 50X Advantage- GC 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社）を 0.5 1、 添付の 5x
Advantage - GC 2 PCR buffer (200 mM Tricine-KOH, 75 mM KOAc, 17.5 mM Mg(0Ac)2, 25% Dimethyl Sulfoxide, 18.75 /ml BSA, 0.025%Tween-20, 0.025% Nonidet- P40)を 5 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 2.0 1、 10 Mプライマ一 bI5E3- 3を 0.5 1、 10 Mプライマ一 AP2 (プライマー AP2は CL0NTECH社の Marathon-Ready cDNA Kitに添付のもの） を 0.5 し 铸型 DNA , (該 PCR反応液 50倍希釈液） を 2.5 1、 および蒸留水を 14 1を混合して作製した。 反応条件は 94t: .30秒の初期変性後、 94°C · §秒 -72°C ·4分のサイクル反応を 5回、 94°C'5秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·5秒- 68 ·4分のサイクル反応を 25回行った。
得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invi trogen社）を用いて添付のマ二 ュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クロ一ニングされた DNA配 列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ I5Eの 3'部分配列 （配列番 号： 7 5) を得た。
5' RACEおよび 3' RACEの情報より、 プライマ一 bZAQb_F (配列番号： 76) 、 プ ライマー bZAQb- F2 (配列番号： 77) 、 プライマー bZAQb-R (配列番号： 78) およびプライマー bZAQb- R2 (配列番号： 79) を作成し、 BACE AL ds cDNAの 50 倍希釈液を铸型として、 以下に記した PCR反応を実施した。
PCR反応液は PfuTurbo DMA polymerase (Stratagene社）を 1 ^ 1、 添付の 10x PCR bufferを 5/ 1、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 し 10 zMプライマ一 bZAQb - Fおよび 2八(31)-1を各2.5 /1 、 铸型 DNAを 1 1、 および蒸留水を 34 1を混合して作製し た。 反応条件は 95°C'l分の初期変性後、 95°C · 30秒- 58t: · 30秒- 72 : · 3分のサイ クル反応を 40回、 および 72°C ' 10分の最終伸長反応とした。
続いて、 該； PCR反応の反応液を蒸留水で 50倍に希釈したものを铸型として nested PCRを行った。 PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 μ1、 添付の 10x PCR bufferを 5 1、 2.5 mM dNTP mixtureを 1、 10 Mプラ ィマー 2八(11)-？2ぉょび 2八(11)-112を各2.5/ 1 、 铸型 DNAを 1 し および蒸留水を 34 1を混合して作製した。 反応条件は 95°C'l分の初期変性後、 95°Ο30秒 - 58°C'30秒- 72°C'3分のサイクル反応を 40回、 および 72°C ' 10分の最終伸長反応と した。
得られた DNA断片を Zaro Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invi trogen社）を用い て添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。 クローニン グされた DNA配列を ABI3100 DNA sequencerを用いて解読し、 ゥシ型 I5E全長をコ ードする 1623 bpの DNA断片 （配列番号： 80) を有する pBI5Eを得ることができ た。 該プラスミドによりトランスフォームさせた大腸菌 T0P10を、 大腸菌
T0P10/pBI5Eと命名した。
配列番号： 80で表される塩基配列を有する cDNA断片には、 384個のアミノ酸 配列 （配列番号： 52) がコードされており （配列番号： 53) 、 該アミノ酸 配列を有する蛋白質をゥシ型 I5Eと命名した。 参考例 2
ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) およぴゥシ大動脈血管内皮細胞 （BAE) に 発現しているゥシ型 ZAQおよびゥシ型 15Eの同定
PBZAQを鐯型としてゥシ型 ZAQの情報より、 プライマー bZAQa- IF1 (配列番号： 8 1) およびプライマー bZAQa-te即 IR (配列番号： 8 2) を作成し、 以下に記 した方法で ZAQ用標準 DNA断片を作製した。
PCR反応液は PfuTurbo hoistart DNA polymerase (Stratagene社)を 4 し 添 付の 10x PCR bufferを 20 1、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 16 1、 10 Mプライマー bZAQa- IF1および bZAQa- te即 IRを各 IO I 、 铸型 cDNA (pBZAQ) を 4 し および蒸留水を 136. 1を混合して作製した。 反応条件は 95°C'l分の初 期変性後、 95°C ·30秒- 6(TC ·30秒- 72°C · 1分のサイクル反応を 40回行った。 得ら れた DNA断片をゥシ型 Z AQ用標準 DNA断片とした。
ゥシ型 ZAQの情報より Primer Expressソフトウェアを用いて、 ゥシ型 ZAQ用 forwardおよび reverse TaqMan primer, プライマー bZAQa- taqF (配列番号： 8 3) およびプライマ一 bZAQa- taqR (配列番号： 84) 、 ゥシ型 ZAQ用 TaqMan probe, bZAQa-probe (5'-FAM-CCTCGGAGCCCAAGCTGCTTCTTT-TAMRA-3' ；配列番 号： 8 5) を作製した。
ゥシ型 ZAQ遺伝子に対する TaqMan Probeと TaqMan Primerとの組合せで、 BACE 由来 cDNA(BACE cDNA)および BAE 由来 cDNA(BAE cDNA)を錶型として TaqMan PCR解 析によるゥシ型 ZAQ遺伝子転写産物の定量を行った。 反応液は 2xTaqMan PCR Master Mix 12.5 1、 5μΜプライマ一 bZAQa-taqFおよび bZAQa - taqRを各 1.5 1 、 5 Mプローブ bZAQa-probeを各 1 1 、 希釈濃度の異なるゥシ型 ZAQ用標準 DNA断 片ぁるぃは铸型じ0 を4 1 (200ng tRNA由来）、 および蒸留水を 4.5 1を混合し て作製した。
TaqMan PCR反応は、 50° 2分95 '10分の初期反応、 95°C · 15秒- 60 · 1分のサ ィクル反応を 50回という条件で、 SDS7700 ..(Sequence Detection System, ABI) を用いて行った。 反応終了後、 ソフトウェア上で各希釈濃度の標準 DNA断片に 対する蛍光強度より標準曲線をプロットし、 铸型 cDNAサンプル中のゥシ型 ZAQ遺 伝子転写産物を定量した。
PBI5Eを铸型としてゥシ型 I5Eの情報よりプライマー bZAQb_F2 (配列番号： 86) およびプライマ一 bZAQb- tempIR (配列番号： 87) を作成し、 以下に記し た方法で ZAQ用標準 DNA断片を作製した。
PCR反応液は PfuTurbo hotstart DNA polymerase (3 &1&861½社）を4 1、 添 付の 10x PCR bufferを 20 xl、 dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 16 1、 IO Mプライマー bZAQb- F2および bZAQb- tempIRを各 IO I 、 錶型 cDNA (pBI5E) を 4,ul、 および蒸留水を 136 1を混合して作製した。 反応条件は 95で'1分の初 期変性後、 95 · 30秒- 60T · 30秒- 72°C · 1分のサイクル反応を 40回行った。 得ら れた DNA断片をゥシ型 I5E用標準 DNA断片とした。
ゥシ型 I5Eの情報より Primer Expressソフトウェアを用いて、 ゥシ型 I5E用 forwardおよび reverse TaqMan primer, プライマ一 bZAQb-taqF (配列番号： 8 8) およびプライマ一 bZAQb-taqR (配列番号： 89) 、 ゥシ型 I5E用 TaqMan probe, プローブ bZAQb-probe (5，- FAM-CACACACCGCTCACTGGAAAGCTTCA- TAMRA- 3，；配列番号： 90) を作製した。
ゥシ型 I5E遺伝子に対する TaqMan Probeと TaqMan Primerとの組合せで、 BACE 由来 cDNA(BACE cDNA)および BAE 由来 cDNA(BAE cDNA)を铸型として TaqMan PCR解 析によるゥシ型 I5E遺伝子転写産物の定量を行った。 反応液は 2xTaqMan PCR Master Mix 12.5 K 5 Mプライマ一 bZAQb- taqFおよび bZAQb-taqRを各 1.5 1 、 5/^プローブ 2 (½- ]^136を各1 1 、 希釈濃度の異なるゥシ型 I5E用標準 DNA断 片あるいは铸型 cDNAを 4 zl (200ng tRNA由来）、 および蒸留水を 4.5 1を混合し て作製した。
TaqMan PCR反応は、 50° 2分95°〇'10分の初期反応、 95°C · 15秒- 60t> 1分のサ ィクル反応を 50回という条件で、 SDS7700 (Sequence Detection System, ABI) を用いて行った。 反応終了後、 ソフトウェア上で各希釈濃度の標準 DNA断片に 対する蛍光強度より標準曲線をプロットし、 錡型 cDNAサンプル中のゥシ型 I5E遺 伝子転写産物を定量した。 ...
結果を 〔図 1〕 に示す。 これより、 ゥシ副腎毛細血管内皮細胞にはゥシ型 ZAQ およびゥシ型 I5Eが発現されていることがわかる。 また、 ゥシ大動脈血管内皮細 胞にはゥシ型 15Eが発現されていることがわかる。 参考例 3
本参考例で用いられたヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ペプチドおよ びへビ毒 MIT1は、 W0 02/57443号公報の実施例 1、 TO 02/57443号公報の実施例 2および 0 02/6483号公報の実施例 8に記載の方法に準じて調製した。
(1) ゥシ副腎毛細血管内皮細胞 （BACE) を用いた FLIPRによる細胞内カルシゥ ムイオン濃度上昇活性の測定
BACEは Gospodarowicz等が報告している方法を用いて単離した （Journal of Cellular Physiology 127, 121-136, 1986) 。 増殖用培地（10% ゥシ胎児血清 (FBS) 、 100 units/ml Penicillin, 100 zg/ml ！！^ ！！を含む!)?^^!) に 分散した BACEを 3X104 cells/200 ！丄 1 /we 11になるように FL I PR用 96穴プレート (Black plate clear bottom, Coster社）に播種し、 5% C02インキュベータ一中 にて 37°Cで一晩培養後実験に用いた (以後細胞プレートとする）。 FLIPRアツセィ バッファ一 （二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8 g、 炭酸水素ナト リウム 0.35 g、 HEPES 4.77 g 、 6 M水酸化ナトリウム溶液で pH 7.4に合わせ すこ後、 1リットルにフィルアップ後フィルタ一滅菌） 10 ml、 250 mM Probenecid 100 \, FBS 100 Uを混合した。 また、 Fluo 3- AM (同人化学研究所） 1バイ アル（25 g)に dimethyl sulfoxideを 20 1と 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 20 を添加し溶解後、 これを上記 Hanks '/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 培養上清を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 lずつ分注し、 5% (：02ィンキュベー夕一中にて 37°Cで 1時間ィンキュベー卜した。
一方、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ペプチドまたはへピ毒 ΜΙΠを、 2.5 mM Probenecid, 0.2% bovine serum albumin (BSA) , 0.1% CHAPSを含む Hanks'/HBSSで希釈し、 96穴プレートに分注した (サンプルプレート）。 細胞プレ ートの色素ローデイング終了後、 細胞プレートを 2.5 mM Probenecidを含む FLIPRアツセィバッファ一 （洗浄用バッファー） でプレートウォッシャー
(Molecular Devices社）を用いて 4回洗浄後、 100 1の洗浄バッファーを残し た。 この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセットしアツセィを行った (FLIPRにより、 サンプルプレートから 50 1のサンプルが細胞プレートへと移 される） 。
結果を 〔図 2〕 に示す。
これより、 ゥシ毛細血管内皮細胞 （BACE) はヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒ ト型 Bv8ペプチドおよびへビ毒 MIT1に応答して細胞内カルシウムイオンの上昇を 起こすことが明らかである。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ぺプチドおよびへビ毒 MIT1などの本発明のぺプチドを用いてゥシ毛細 血管内皮細胞を剌激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I5Eのシグナル情 報伝達を阻害する活性があるのか否かを知ることができ、 摂食調節剤、 好まし くは摂食障害の予防 ·治療剤を得ることができる。
(2) リン酸化 p42 MAPキナーゼおよびリン酸化 p44 MAPキナーゼのウエスタン プロッティンブによる検出
増殖用培地に分散した BACEを 2 X 105 c e 11 s Αι 1 /we 11になるように 12穴プレー トに播種しー晚 5%' C02、 37°Cで培養後実験に用いた。 10 nM、 100 nM、 1,000 nMのリガンド溶液を 10 i 1添加し 37°Cで 5分間ィンキュベ一ションした。
このリガンド溶液として、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ペプチド またはへビ毒 MIT1を、 0.2% BSAと 0.1% CHAPSを含む H/HBSSに溶解したものを 用いた。
その後、 培養上清を除去し Lysis Buffer (50 iM Tris、 150 mM NaCK 1 raM EDTA、 2 mM Na3V04、 50 mM NaF、 4 mM Na4P207、 1% NP 40、 1 mM
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)、 20 g/ml、 leupeptin, 10 ^g/ml pepstatin A、 pH 7.4) を 100 添加した。 氷上で 30分間放置後、 上清を
15,000 rpmで 10分間遠心し得られた上清に SDS- PAGE用サンプルバッファ一（300 mM Tris、 10% sodium dodesylsulfate, 0.025% bromophenolblue^ 50% glycerol, pH 6.8)を 20 1添加し 3分間煮沸した。 このうち 18 1を 12.5%の ゲル （BIO- RAD社） を用いて SDS-PAGEで分離した。 電気泳動後、 ゲルをトランス ファー用バッファ一 （25 mM Tris、 192 mM Glycine, 10% MeOH) 中で 15分間し んとうした後、 ゲル中の蛋白質を PVDF膜 (MiniProBlot, Applied Biosysteras) にトランスファーした。 トランスファーした膜 （ブロット） をブロッキングバ ッファー (50 mM Tris、 150 mM NaCK 0.1% Tween 20、 1% BSA、 pH 7.4) を 用いてー晚 4°Cでプロッキングした。 この後、 プロットに一次抗体溶液 (Cell Signaling TECHNOLOGY社の Phospho p42/44 MAP Kinase Antibodyを前述のブロ ッキングバッファ—で 5， 000倍希釈したもの） を 30 ml添加し室温で 2時間インキ ュペートした。 この後、 プロットを洗浄用バッファ一 （50 mM Tris、 150 mM NaCK 0. 1 % Tween 20、 pH 7. 4) で洗浄後 （20分間 X 3) 、 プロットに二次坊体 溶液 (KPL社の Ant i Rabbi t IgG HRP-1 inked (Goat)を前述のブロッキングバッ ファーで 1, 000倍希釈したもの） 30 ml添加し室温で 1時間反応させた。 この後、 プロットを洗浄用バッファーで洗浄し （20分間 X 3) 、 さらにバッファ一 （50 mM Tr i s、 150 mM NaCK pH 7. 4) で洗浄後 (2分間 X 2) 、 ECL P lus (Amersham Pharmac i a Bi otech)を用いてリン酸化 p42/44 MAP Kinaseを検出した。
結果を 〔図 3〕 に示す。
図 3より、 リガンドを添加しないコントロールに比べ、 ヒト型 ZAQリガンドぺ プチド、 ヒト型 Bv8ぺプチドまたはへビ毒 MIT1を添加した場合にはリン酸化され た MAPキナーゼ （MAPK- P) のバンドの染色強度が増強していることを読み取るこ とができる。 また、 へビ毒 ΜΙΠは 0. InMという低濃度からこの増強効果を現すこ とができ、 ヒト型 Bv8ペプチドは InMから、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドは ΙΟηΜ からこの効果を現した。 _
BACEは、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ペプチドおよびへビ毒 MIT1 などのべプチドの添加により MAPキナーゼの活性化が起こることが明らかである。 従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ペプチドおよびへビ毒 MIT1などの本発明のペプチドを用いてゥシ毛細 血管内皮細胞を刺激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I5Eのシグナル情 報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、 摂食調節剤、 好ましくは摂食障害の予防 ·治療剤を得ることができる。
( 3 ) リン酸化 p38 MAPキナーゼのウェスタンブロッテイングによる検出 増殖用培地に分散した BACEを 2 X 105 ce 11 s/ml/we 11になるように 12穴プレー 卜に播種しー晚 5% C02、 37°Cで培養後実験に用いた。 10 nM、 100 nM、 1, 000 nMのリガンド溶液を 10 l添加し 37 で 5分間インキュベーションした。
このリガンド溶液は、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ペプチドまた はへピ毒 MIT1を、 0. 2% BSAと 0. 1 % CHAPSを含む H/HBSS に溶解したものを用い た。
その後、 培養上清を除去し Lys is Buf fer (50 mM Tr i s、 150 mM NaCK 1 mM EDTA、 2 mM Na3V04、 50 mM NaF、 4 mM Na4P207、 1% NP 40、 1 mM PMSF、 20 g/m leupeptin, 10 xg/ml pepstatin A、 pH 7.4) を 100 l添加した。 氷上 で 30分間放置後、 上清を 15， 000 卬 mで 10分間遠心し得られた上清に SDS- PAGE用 サンプルバッファー 20 1添加し 3分間煮沸した。 このうち 18 lを 12.5%のゲ ル （BI0-RAD社） を用いて SDS-PAGEで分離した。 電気泳動後、 ゲルをトランスフ ァ一用バッファー (25 mM Tris、 192 mM Glycine, 10% MeOH) 中で 15分間しん とうした後、 ゲル中の蛋白質を PVDF膜 (MiniProBlot, Applied Biosystems) に トランスファーした。 トランスファーした膜 （プロット） をブロッキングバッ ファー (50 mM Tris、 150 mM NaCK 0.1% Tween 20、 1% BSA、 pH 7.4) を用 いて室温で 1時間ブロッキングした。 この後、 プロットに一次抗体溶液 （Cell Signaling TECHNOLOGY社の Phospho p38 MAP Kinase (Thrl80/Tyrl82) Antibody を前述のブロッキング溶液で 1， 000倍希釈したもの） を 30 ml添加し 4°Cでー晚ィ ンキュベ一トした。 この後、 プロットを洗浄用バッファーで洗浄後 （20分間 X 3) 、 -ブロットに二次抗体溶液 (Cell Signaling TECHNOLOGY社の Ant i Rabbit IgG, HRP- linked Antibodyを前述のブロッキングバッファ一で 1， 000倍希釈し たもの） 30 ml添加し室温で 1時間反応させた。 この後、 プロットを洗浄用バッ ファー （50 mM Tris、 150 mM NaCK 0.1% Tween 20、 pH 7.4) で洗浄し （20分 間 X3) 、 さらにバッファ一 （50 mM Tris、 150 mM NaCK pH 7.4) で洗浄後 (2 分間 X2) 、 ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech)を用いてリン酸化 p38 MAP Kinaseを検出した。
結果を 〔図 4〕 に示す。
図 4より、 リガンドを添加しないコント„ロールに比べてヒ卜型 ZAQリガンドぺ プチド、 ヒト型 Bv8ぺプチドまたはへビ毒 MIT1などのぺプチドを添加した場合に はリン酸化された P38 MAPキナーゼ （p38 MAPK-P) のバンドの染色強度が増強し ていることを読み取ることができる。 また、 へビ毒 MIT1は 0. InMという低濃度か らこの増強効果を現すことができ、 ヒト型 Bv8ペプチドは InMから、 ヒト型 ZAQリ ガンドぺプチドは 1 OnMからこの効果を現した。
BACEは、 ヒト型 ZAQリガンドぺプチド、 ヒト型 Bv8ぺプチドおよびへビ毒 MIT1 などのべプチドの添加により p38 MAPキナ一ゼの活性化が起こることが明らかで ある。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ペプチドおよびへピ毒 Μ〖Πなどの本発明のペプチドを用いてゥシ毛細 血管内皮細胞を剌激することにより、 試験化合物に ZAQまたは Ι5Εのシグナル情 報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、 摂食調節剤、 好ましくは摂食障害の予防 ·治療剤を得ることができる。 +
(4) [¾]チミジン取り込みァッセィ
増殖用培地に分散した BACEを 1.5X104 cells/200 1/wel 1になるように 48ゥ ヱルプレートに播種し一晩培養後、 培養上清を除去しアツセィバッファー (0.5% BSA、 0.1% FBSを含む DMEM) 495 1とリガンド溶液 5 lを添加し、 さらに 15-18時間培養した。
このリガンド溶液としては、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ぺプチ ドまたはへビ毒 MIT1を、 0.2% BSAと 0.1% CHAPSを含む H/HBSS に溶解したもの を用いた。
その後、 各ゥエルに [¾] Thymidine溶液 （NEN社、 NET- 027を血清不含 DMEMで 100倍希釈したもの） を 50 l添加しさらに 6時間培養した。 この後、 培養上清 を除去し各ゥエルに洗浄バッファー 500 1を添加し洗浄後、 メタノール 500 1を添加し氷上で 15分間放置した。 その後、 各ゥエルの上清を除去し 5%トリク ロロ酢酸 （TCA) 500 1を添加し氷上で 15分間放置後、 TCAを除去し水 500 l を添加し洗浄した。 最後に 0.3 NaOHを 200 1添加し溶解後、 液体シンチレ一 夕一を 3 ml添加し放射活性を液体シンチレ一ションカウンターで測定した。 結果を 〔図 5〕 に示す。
図 5より、 リガンドを添加しないコント口ールに比べてヒト型 ZAQリガンドぺ プチド、 ヒト型 Bv8ペプチドまたはへビ毒 ΜΙΠを添加した場合にはゥシ副腎毛細 血管内皮細胞の [¾]チミジン取り込み量が増加していることがわかる。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト型 ZAQリガンドペプチド、 ヒト型 Bv8ぺプチドおよびへビ毒 MIT1などの本発明のぺプチドを用いてゥシ毛細 血管内皮細胞を刺激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I5Eのシグナル情 報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、 摂食調節剤、 好ましくは摂食障害の予防 ·治療剤を得ることができる。
( 5 ) 細胞増殖アツセィ
増殖用培地に分散した BACEを 5 X 103 ce l l s/ml/we 1 1になるように 24穴プレー 卜に播種しー晚培養した後、
ヒト型 ZAQリガンドペプチドまたはヒ卜型 Bv8ペプチドを、 0. 2 % BSAと 0. 1 % CHAPSを含む H/HBSS に溶解したものを 10 x l添加し、 さらに 4〜5日間培養した。 その後、 培養上清を除去し PBS lnilをゥエルに添加し細胞を洗浄後、 トリプシン 溶液 200 x lを添加し細胞をピペッティングで回収し、 細胞数を血球計算版で測 定した。
結果を 〔図 6〕 に示す。
図 6より、 上記べプチドを添加しないコントロールに比べてヒト型 ZAQリガン ドぺプチドまたはヒト型 Bv8ぺプチドを添加した場合にはゥシ副腎毛細血管内皮 細胞の細胞数が増加していることがわかる。
従って、 試験化合物の存在下または非存在下、 ヒト.型 ZAQリガンドペプチドお よびヒト型 Bv8ペプチドなどの本発明のペプチドを用いてゥシ毛細血管内皮細胞 を剌激することにより、 試験化合物に ZAQまたは I5Eのシグナル情報伝達を阻害 する活性を有しているのか否かを知ることができ、 摂食調節剤、 好ましくは摂 食障害の予防 ·治療剤を得ることができる。 産業上の利用可能性
本発明のペプチド、 M I T 1類または本発明の蛋白質、 それらに対する抗体、 および本発明のぺプチドまたは本発明の蛋..白質をコードするポリヌクレオチド は、 摂食調節剤、 好ましくは摂食障害または肥満症の予防 ·治療剤を得るため の簡便な探索法 （スクリーニング） に有用である。
本発明の蛋白質のアンタゴニスト、 上記抗体などは、 優れた摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三 交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季 節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に 伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんか ん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 統合失調症、 アルコール依存症、 パ一キンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿 病などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明の蛋白質のァゴニスト、 本発明のペプチド、 本発明の蛋白質などは、 優れた肥満症'（例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床 下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低 下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 '三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域 変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾患、 老 人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中 など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 統合失調症、 アルコール依存症、 パ一キンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊 張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予防 ·治療剤として有用である。 また、 本発明のスクリーニング方法は、 哺乳動物由来の内皮細胞を用いて行 うことにより、 より生理的な条件下での摂食調節剤のスクリ一二ングが可能と なる。
さらに、 本発明の蛋白質、 本発明の D NA、 本発明のアンチセンス D NAお よび本発明の抗体は、 （i) 本発明の蛋白質が闋与する各種疾病の予防 ·治療剤、 (i i) 本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング、 （i i i) 本発明の蛋白質の定量、 （iv) 遺伝子診断 薬、 （V) アンチセンス D N Aを含有する !§薬、 （vi) 本発明の抗体を含有する 医薬および診断薬、 （vi i) 本発明の D NAを有する非ヒト動物の作製、
(vi i i) 構造的に類似したリガンド ·受容体との比較にもとづいたドラッグデ ザインなどの実施のために有用である。 特に、 本発明の組換え蛋白質の発現系 を用いた受容体結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異 的な本発明の蛋白質に対するリガンドの結合性を変化させる化合物 (例-. ァゴ 二スト、 アン夕ゴニストなど） をスクリ一ニングすることができ、 該ァゴニス 卜またはアン夕ゴニストを各種疾病、 例えば摂食障害、 肥満症などの予防 '洽 療剤などとして安全に使用することができる <

Claims

請求 の 範囲
1. 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番 号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のァミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害または促 進する化合物またはその塩を含有してなる摂食調節剤。
2. 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番 号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合 物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防 ·治療剤。
3. 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障 害の予防 ·治療剤。
4. (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配 列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩 と （b) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号：' 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食 障害または肥満症の予防 ·治療剤。
5. 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番 号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を促進する化合 物またはその塩を含有してなる肥満症の予防 ·治療剤。
6. 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症 の予防 ·治療剤。
7. 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番 号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分べプチドをコードす る D N Aの塩基配列に相捕的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一 部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる摂食障害の予防 ·治療 剤。
8. 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番 号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分べプチドまたはその 塩に対する抗体を含有してなる摂食障害の予防 ·治療剤。
9. 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその部分ペプチドをコードする DN Aの塩基配列に相補的もしくは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチ ドを含有してなる摂食障害の予防 ·治療剤。
10. 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的.に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる摂食障 害の予防 ·治療剤。
1 1. (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポ リヌクレオチド、 または （b) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 4 2、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もし くは配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有 してなる摂食障害または肥満症の診断薬。
1 2 . (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9 , 配列番号： 1 3、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 9もしくは配列番号： 3 6で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩、 および （または） （b) 配列番号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 4 6、 配列番号： 4 8、 配列番号： 5 0もしくは 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする摂食調節剤のス クリーニング方法。
1 3 . 摂食調節剤が摂食障害または肥満症の予防 ·治療剤である請求項 1 2 記載のスクリーニング方法。
1 4. (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 9もしくは配列番号： 3 6で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩、 および （または） （b) 配列番号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 4 6、 配列番号： 4 8、 配列番号： 5 0もしくは 配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴とする摂食調節剤の スクリーニング用キット。
1 5 . 摂食調節剤が摂食障害または肥満症の予防 ·治療剤である請求項 1 4 記載のスクリーニング用キット。
1 6 . (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 2 5もしくは配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポ リヌクレオチド、 および （または） （b) 配列番号： 3 7、 配列番号： 4 0、 配 列番号： 4 2、 配列番号： 4 4、 配列番号： 4 6、 配列番号： 4 8、 配列番 号： 5 0もしくは配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコ一ドするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング方法。
17. (a) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25、 配列番号： 29もしくは配列番号： 36で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 および （または） （b) 配列番号： 3 7、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配 列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で表されるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする摂食調節剤のス クリーニング方法。
18. 哺乳動物に対し、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその 塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または （ii) 配列番号： 37、 配列 番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で表されるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻 害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする摂食障害の予 防 ·治療法。
19. (i) 配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害す る、 または （ii) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番 号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番 号： 52で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害することを特徴とする摂食障害の予 防 ·治療法。
20. 摂食障害の予防 ·治療剤を製造するための （i) 配列番号： 1、 配列番 号： 3、 配列番号： 9、 配列番号： 13、 配列番号： 25もしくは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または (ii) 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 42、 配列番号： 44、 配列番号： 46、 配列番号： 48、 配列番号： 50もしくは配列番号： 52で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列さ含有する蛋 白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
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