JP5317318B2

JP5317318B2 - 新規ポリペプチドおよびその用途

Info

Publication number: JP5317318B2
Application number: JP2006549093A
Authority: JP
Inventors: 賢治寒川; 健二森; 幹也宮里; 将康児島
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; National Cerebral and Cardiovascular Center
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; National Cerebral and Cardiovascular Center
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2025-12-22
Also published as: WO2006068326A1; US20080124335A1; EP1829969A4; US7943580B2; EP1829969B1; ES2399831T3; EP1829969A1; JPWO2006068326A1; CA2592201C; CA2592201A1

Description

本発明は、新規ポリペプチドまたはその塩、これをコードするポリヌクレオチド、これらの用途等に関する。

ニューロメジンＵはラットの子宮平滑筋収縮活性を指標とし、ブタの脊髄より単離・精製されたペプチドで、８アミノ酸残基からなるニューロメジンＵ−８および２５アミノ酸残基からなるニューロメジンＵ−２５の２種が最初に報告されている（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３０，１０７８−１０８５，１９８５）。ニューロメジンＵ−８の配列はニューロメジンＵ−２５のＣ末端部分に一致し、その上流にはプロセッシングによって切断を受ける部位によく見られるような塩基性アミノ酸ペアが存在することから、両者は共通の前駆体に由来するものと考えられる。
平滑筋収縮作用の他にもニューロメジンＵの生理作用は広く知られており、例えば、血圧上昇（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ．ｅｔａｌ．）、内蔵の血流量の低下（Ｓｕｍｉ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＬｉｆｅＳｃｉ．４１，１５８５−１５９０，１９８７）、腸管におけるイオン輸送の調節（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄＱｕｉｔｏ，Ｆ．Ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５５，１５９−１６２，１９８８）、皮下投与後のＡＣＴＨおよびそれに引き続くコルチコステロンの上昇（Ｍａｌｅｎｄｏｗｉｃｚ，Ｌ．Ｋ．ｅｔａｌ．，ＩｎＶｉｖｏ，７，４１９−４２２，１９９３）などが報告されている。また、これまでニューロメジンＵのレセプターとして、ＴＧＲ１（ＷＯ０１／５７５２４）およびＦＭ−３が報告されている（ＷＯ００／０２９１８）。

現在、低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群、更年期障害、甲状腺機能亢進症、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤は幾らか知られているが、より優れた低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群、更年期障害、甲状腺機能亢進症、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤が望まれている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＴＧＲ１およびＦＭ−３の内在性リガンドとして配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを見出し、これが特異的な細胞刺激活性を有することを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩；
（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのアミド体またはその塩；
（３）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのアミド体またはその塩；
（４）配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのアミド体またはその塩；
（５）上記（１）記載のポリペプチドの部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩；
（６）上記（１）記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（７）ＤＮＡである上記（６）記載のポリヌクレオチド；
（８）配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表される塩基配列を含有する上記（７）記載のＤＮＡ；
（９）上記（６）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；
（１０）上記（９）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体；
（１１）配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドである上記（１）記載のポリペプチドまたはそのアミド体またはその塩；
（１２）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；
（１３）配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩；
（１４）配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩；
（１５）上記（１１）記載のポリペプチドの部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩；
（１６）上記（１１）記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（１７）ＤＮＡである上記（１６）記載のポリヌクレオチド；
（１８）配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：１８で表される塩基配列を含有する上記（１３）記載のＤＮＡ；
（１９）上記（１６）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；
（２０）上記（１９）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体；
（２１）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；
（２２）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩；
（２３）上記（２１）記載のポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩；
（２４）上記（２１）記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（２５）ＤＮＡである上記（２４）記載のポリヌクレオチド；
（２６）配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３または配列番号：２４で表される塩基配列を含有する上記（２５）記載のＤＮＡ；
（２７）上記（２４）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；
（２８）上記（２７）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体；
（２９）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（３０）（ｉ）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、および（ｉｉ）配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記（２９）記載のスクリーニング方法；
（３１）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記（３０）記載のスクリーニング方法；
（３２）（ｉ）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、および（ｉｉ）配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記（２９）記載のスクリーニング方法；
（３３）配列番号：３１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記（３２）記載のスクリーニング方法；
（３４）上記（１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（３５）さらに、配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記（３４）記載のスクリーニング用キット；
（３６）さらに、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記（３４）記載のスクリーニング用キット；
（３７）上記（２１）記載のポリペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（３８）上記（２１）記載のポリペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（３９）上記（１）または（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩を含有してなる医薬；
（４０）上記（６）または（１６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（４１）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（４２）低血圧、肥満症、嗜眠症または時間帯域変化症候群の予防・治療剤である上記（３９）〜（４１）記載の医薬；
（４３）不妊症の予防・治療剤である上記（３９）〜（４１）記載の医薬；
（４４）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を促進することを特徴とする低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群または不妊症の予防・治療方法；
（４５）哺乳動物に対し（ｉ）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、（ｉｉ）上記（６）または上記（１６）記載のポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群または不妊症の予防・治療方法；
（４６）低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群または不妊症の予防・治療剤の製造のための（ｉ）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、（ｉｉ）上記（６）または上記（１６）記載のポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用；
（４７）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬；
（４８）上記（２４）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（４９）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（５０）更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防・治療剤である上記（４７）〜（４９）のいずれかに記載の医薬；
（５１）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防・治療方法；
（５２）哺乳動物に対し（ｉ）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩、（ｉｉ）上記（２４）記載のポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防・治療方法；
（５３）更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防・治療剤の製造のための（ｉ）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩、（ｉｉ）上記（２４）記載のポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用；
（５４）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に対する抗体；
（５５）上記（５４）記載の抗体を含有してなる医薬；
（５６）上記（５４）記載の抗体を含有してなる診断薬；
（５７）低血圧、肥満症、嗜眠症または時間帯域変化症候群の診断薬である上記（５６）記載の診断薬；
（５８）不妊症の診断薬である上記（５６）記載の診断薬；
（５８ａ）高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症または免疫・炎症性疾患の診断薬である上記（５６）記載の診断薬；
（５９）上記（６）または上記（１６）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド；
（６０）上記（５９）記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（６１）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（６２）高血圧、拒食症または不眠症の予防・治療剤である上記（５５）、上記（６１）または上記（６１）記載の医薬；
（６３）更年期障害の予防・治療剤である上記（５５）、上記（６０）または上記（６１）記載の医薬；
（６４）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害することを特徴とする高血圧、拒食症、更年期障害または不眠症の予防・治療方法；
（６５）哺乳動物に対し（ｉ）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に対する抗体、（ｉｉ）上記（６）または上記（１６）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする高血圧、拒食症、更年期障害または不眠症の予防・治療方法；
（６６）高血圧、拒食症、更年期障害または不眠症の予防・治療剤の製造のための（ｉ）上記（１）または上記（１１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に対する抗体、（ｉｉ）上記（６）または上記（１６）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用；
（６７）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に対する抗体；
（６８）上記（６７）記載の抗体を含有してなる医薬；
（６９）上記（６７）記載の抗体を含有してなる診断薬；
（７０）不妊症または甲状腺機能不全症の診断薬である上記（６９）記載の診断薬；
（７０ａ）卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害または甲状腺機能亢進症の診断薬である上記（６９）記載の診断薬；
（７１）上記（２４）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド；
（７２）上記（７１）記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（７３）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（７４）不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療剤である上記（６８）、上記（７２）または上記（７３）記載の医薬；
（７５）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害することを特徴とする不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療方法；
（７６）哺乳動物に対し（ｉ）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に対する抗体、（ｉｉ）上記（２４）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療方法；
（７７）不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療剤の製造のための（ｉ）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に対する抗体、（ｉｉ）上記（２４）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）上記（２１）記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用；
（７８）外来性の、上記（６）、上記（１６）または上記（２４）記載のポリヌクレオチドを有する非ヒトトランスジェニック動物；
（７９）外来性の、上記（６）、上記（１６）または上記（２４）記載のポリヌクレオチドを含有し、非ヒト動物において発現しうる組換えベクター；
（８０）上記（６）、上記（１６）または上記（２４）記載のポリヌクレオチドが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞；
（８１）上記（６）、上記（１６）または上記（２４）記載のポリヌクレオチドが不活性化された、該ポリヌクレオチド発現不全非ヒト哺乳動物；
（８２）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（８３）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（８４）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防・治療剤；
（８５）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防・治療方法；
（８６）哺乳動物に対し配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防・治療方法；
（８７）更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防・治療剤の製造のための配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用；
（８８）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療剤；
（８９）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療方法；
（９０）哺乳動物に対し配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療方法；
（９１）不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療剤の製造のための配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用等を提供する。

配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「ニューロメジンＳ」と略称することがある。
配列番号：７、配列番号：９、または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「ニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４」と略称することがある。
配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「ニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７」と略称することがある。
配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「ニューロメジンＳ前駆体」と略称することがある。
配列番号：３７、配列番号：３９または配列番号：４１で表されるアミノ酸配列を有するポリペチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「ニューロメジンＵＮ末ペプチド−３３」と略称することがある。
配列番号：３８、配列番号：４０または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有するポリペチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「ニューロメジンＵＮ末ペプチド−３６」と略称することがある。
配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはその塩を、「ＴＧＲ１」と略称することがある。
配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはその塩を、「ＦＭ−３」と略称することがある。
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチドＡ」と略称する場合がある）および配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチドＢ」と略称する場合がある）は、例えば、ヒト、哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ）などのあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、膵臓ランゲルハンス島、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するポリペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用いて計算することができる。
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後述するスクリーニング方法などに従って測定することができる。
また、本発明のポリペプチドＡとしては、（ｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いられる。
本発明のポリペプチドＡもしくはそのアミド体またはその塩の具体例としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩などがあげられる。
本発明のポリペプチドＡの部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできるものであれば、いかなるものであってもよく、本発明のポリペプチドＡと実質的に同質の活性を有していればよい。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のポリペプチドＡの構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは２０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
以下、本発明のポリペプチドＡとその部分ペプチドとをまとめて「本発明のポリペプチドＡ」と称することがある。
配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用いて計算することができる。
配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後述するスクリーニング方法などに従って測定することができる。
また、本発明のポリペプチドＢとしては、（ｉ）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いられる。
本発明のポリペプチドＢの具体例としては、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：３９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：４１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明のポリペプチドＢの部分ペプチドとしては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできるものであれば、いかなるものであってもよく、本発明のポリペプチドＢと実質的に同質の活性を有していればよい。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のポリペプチドＢの構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは２０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
以下、本発明のポリペプチドＢとその部分ペプチドとをまとめて「本発明のポリペプチドＢ」と称することがある。
さらに、「本発明のポリペプチドＡ」と「本発明のポリペプチドＢ」とを、まとめて「本発明のポリペプチド」と称することもある。
配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩（以下、「本発明の蛋白質」と略称することもある）は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞（例えば、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、ＭＥＧ−０１など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など（特に、脳や脳の各部位）に由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）を用いて計算することができる。
配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、本発明のペプチドに対する結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
さらに、本発明の蛋白質としては、（ｉ）配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｉｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本発明の蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：３１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：３３で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：３５で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質などがあげられる。
本発明の蛋白質の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、本発明の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のリガンド結合活性を有するものなどが用いられる。
具体例として、本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、前記した本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のリガンド結合活性」とは、前記と同意義を示す。「実質的に同質のリガンド結合活性」の測定は自体公知の方法に準じて行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本明細書におけるポリペプチドおよび本発明の蛋白質はペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列などを含有するポリペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキルなどのＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などがあげられる。
本発明のポリペプチドＡとしてはＣ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がアミド（−ＣＯＮＨ_２）であるものが好ましい。
本発明のポリペプチドおよび本発明の蛋白質（本発明のポリペプチド・蛋白質）がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチド・蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチド・蛋白質には、上記したペプチド・蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド・糖蛋白質などの複合ペプチド・複合蛋白質なども含まれる。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のポリペプチドもしくは本発明の蛋白質またはその塩は、前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のペプチド・蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド・蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
本発明のポリペプチドもしくは本発明の蛋白質またはその塩をヒト、哺乳動物などの組織または細胞から製造する場合、ヒト、哺乳動物などの組織または細胞をホモジナイズした後、酸、有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明のポリペプチドは、公知のポリペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ポリペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のポリペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、以下の（１）〜（５）に記載された方法があげられる。
（１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチドシンセシス（ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ），ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６６年）；
（２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザペプチド（ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅ），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５年）；
（３）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）；
（４）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）；
（５）矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成広川書店。
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のポリペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチドを取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどがあげられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢＴ、ＨＯＯＢＴなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢＴエステルあるいはＨＯＯＢＴエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５ないし４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどがあげられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＲとして上記したＣ_１−６アルキル基、Ｃ_３−８シクロアルキル基、Ｃ_７−１４アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢＴ）とのエステル］などがあげられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドなどがあげられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ黒あるいはＰｄ炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元などもあげられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
本発明のポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドは、本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができるし、上記のポリペプチドの合成法に従って製造することができる。本発明のポリペプチドの部分ペプチドのアミドまたはエステルも上述のアミド体またはエステル体の製造方法に準じて製造することができる。さらに本発明のポリペプチドの部分ペプチドの塩としては、上記の本発明のポリペプチドの塩と同様のものなどがあげられる。
該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸類から選ぶことができる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
本発明のポリペプチド、上記（１）記載の部分ペプチドまたは上記（２）記載のペプチドが標識化されたものとしては、公知の方法で、アイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたもの、酵素標識されたものなどがあげられる。
具体的には、例えば公知の方法によって、〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３５Ｓ〕などで標識された本発明のポリペプチドなどを利用することができる。
本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、または配列番号：３５で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
（ＤＮＡのクローニング）
本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅する方法、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質をコードする塩基配列の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別する方法があげられる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓＫｍ（宝酒造（株））、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法やＧａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
（発現ベクター）
本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質の発現ベクターは、例えば、（ｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ｉｉ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｐｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα（ＭＦα）・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
（形質転換体）
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ^ＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＮ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、ｉｎＶｉｔｒｏ，１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。
動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ），７５巻，１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６巻，４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔ＥＭＢＯＪ．，１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等があげられる。
このようにして、本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを生成、蓄積せしめることによって、本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆＴｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＴｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
（本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドの分離精製）
上記培養物から本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトン（登録商標）Ｘ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られる本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、蛋白質（（ポリ）ペプチド）を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。またＮ末端アミノ酸を欠失させるためには、エドマン（Ｅｄｍａｎ）試薬（フェニルイソチオシアネート）を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
このようにして生成する本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
（抗体）
本発明は、さらに本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化本発明のポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、本発明のポリペプチドの抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のポリペプチドＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明のポリペプチド抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドＡに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上記の本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記（ｉｉ）においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのＣ端部に反応する抗体であることが好ましい。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のポリペプチドの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明のポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチドＡ量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）」Ｖｏｌ．７０（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＡ））、同書Ｖｏｌ．７３（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．７４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＣ））、同書Ｖｏｌ．８４（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＤ：ＳｅｌｅｃｔｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＥ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＧｅｎｅｒａｌＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＩ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での本発明のポリペプチドを定量することによって、本発明のポリペプチドの機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチドを特異的に検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
（アンチセンスポリヌクレオチド）
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセイスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を含有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明の蛋白質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。
具体的には、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：４５、配列番号：４８または配列番号：５１で表される塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチドを、クローン化した、あるいは決定されたポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。このようなポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のポリペプチド関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のポリペプチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のポリペプチド関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。
用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とポリペプチドとの間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるポリペプチドのアミノ酸を通常指している。ポリペプチドをコードする遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、ポリペプチドコード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ポリペプチドをコードする遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマまたは特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは次のような方針：（１）細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、（２）アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、（３）目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、（４）もし毒性があるならアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする、で好ましく設計されうる。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＴｅｃｈＪａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅｅｔａｌ．ｅｄ．，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のポリペプチドの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「本発明のポリペプチドＡ１」と略記する場合がある。
以下、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「本発明のポリペプチドＡ２」と略記する場合がある。
以下、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩を、「本発明のポリペプチドＢ」と略記する場合がある。
〔１〕医薬候補化合物のスクリーニング方法およびスクリーニングキット
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする医薬候補化合物のスクリーニング方法および本発明のポリペプチドを含有することを特徴とする医薬候補化合物のスクリーニング用キット（以下、「本発明のスクリーニング方法」および「本発明のスクリーニング用キット」とそれぞれ略記する場合がある）について以下に説明する。
（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法）
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性（機能）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、促進剤または阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法としては、以下の１）〜３）などがあげられる。
１）（ｉ）本発明のポリペプチドＡ１を細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のポリペプチドＡ１および試験化合物を細胞に接触させた場合の、本発明のポリペプチドＡ１の活性（例、プロラクチン分泌抑制活性など）を測定、比較し、促進剤または阻害剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、そのプロラクチン分泌量を測定する。上記細胞としては、プロラクチン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。例えば、ラット下垂体前葉細胞（例、好酸性細胞）などが用いられる。培地は、本発明のポリペプチドＡ１の有するプロラクチン分泌抑制活性などの活性を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばＤＭＥＭ（ＤｕｌｂｅｃｃｏｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ）などが用いられる。プロラクチン分泌量は、公知の方法、例えば、ＲＩＡ（放射免疫測定）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ製など）を用いた放射免疫測定法などにより測定することができる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記（ｉｉ）の場合における本発明のポリペプチドＡ１の活性（例、プロラクチン分泌抑制活性）を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドＡ１の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明のポリペプチドＡ１の活性（例、プロラクチン分泌抑制活性）を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドＡ１の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
２）（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドＡ２を細胞に接触させた場合と、（ｉｖ）本発明のポリペプチドＡ２および試験化合物を細胞に接触させた場合の、本発明のポリペプチドＡ２の活性（例、プロラクチン分泌活性など）を測定、比較し、促進剤または阻害剤のスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合において、上記細胞を培養し、そのプロラクチン分泌量を測定する。上記細胞としては、プロラクチン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。例えば、ラット下垂体前葉細胞（例、好酸性細胞）などが用いられる。培地は、本発明のポリペプチドＡ２の有するプロラクチン分泌活性などの活性を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばＤＭＥＭ（ＤｕｌｂｅｃｃｏｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ）などが用いられる。プロラクチン分泌量は、公知の方法、例えば、ＲＩＡ（放射免疫測定）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ製など）を用いた放射免疫測定法などにより測定することができる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のポリペプチドＡ２の活性（例、プロラクチン分泌活性）を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドＡ２の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のポリペプチドＡ２の活性（例、プロラクチン分泌活性）を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドＡ２の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
３）（ｖ）本発明のポリペプチドＢを細胞に接触させた場合と、（ｖｉ）本発明のポリペプチドＢおよび試験化合物を細胞に接触させた場合の、本発明のポリペプチドＢの活性（例、プロラクチン分泌活性など）を測定、比較し、促進剤または阻害剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｖ）と（ｖｉ）の場合において、上記細胞を培養し、そのプロラクチン分泌量を測定する。上記細胞としては、プロラクチン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。例えば、ラット下垂体前葉細胞（例、好酸性細胞）などが用いられる。培地は、本発明のポリペプチドＢの有するプロラクチン分泌活性などの活性を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばＤＭＥＭ（ＤｕｌｂｅｃｃｏｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ）などが用いられる。プロラクチン分泌量は、公知の方法、例えば、ＲＩＡ（放射免疫測定）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ製など）を用いた放射免疫測定法などにより測定することができる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のポリペプチドＢの活性（例、プロラクチン分泌活性）を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドＢの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のポリペプチドＢの活性（例、プロラクチン分泌活性）を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドＢの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット）
本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドまたはその塩を含有するものである。好ましくは、さらにプロラクチン測定用試薬（例えば、ＲＩＡキットなど）など、本発明のポリペプチドの活性を測定するための試薬を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次の（ａ）および（ｂ）を含むものがあげられる。
（ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’ ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（ｂ）本発明のポリペプチドの標品
本発明のポリペプチドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
（本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法）
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質（例、ＴＧＲ１またはＦＭ−３）との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法または本発明のポリペプチドおよび本発明の蛋白質を含有することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット（以下、「本発明のスクリーニング方法」、「本発明のスクリーニング用キット」と略記する場合がある）について以下に詳述する。
本発明の蛋白質を用いるか、または組換え型の本発明の蛋白質の発現系を構築し、該発現系を用いた本発明のポリペプチドとの結合アッセイ系（リガンド・レセプターアッセイ系）を用いることによって、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、本発明の蛋白質を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を有する化合物（即ちアゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ちアンタゴニスト）などが含まれる。
また、「本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる」とは、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合を阻害する場合と結合を促進する場合の両方を包含するものである。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明の蛋白質に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）上記した本発明の蛋白質に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などに関する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）上記した本発明の蛋白質に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）上記した本発明の蛋白質に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば本発明の蛋白質に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）などを測定して、比較する。
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
（１）上記の本発明のポリペプチドの誘導体として表される標識した本発明のポリペプチド（以下、単に「標識した本発明のポリペプチド」とする）を、本発明の蛋白質に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質に接触させた場合における、本発明のポリペプチドの本発明の蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）標識した本発明のポリペプチドを、本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３）標識した本発明のポリペプチドを、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質に接触させた場合と、標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質に接触させた場合における、標識した本発明のポリペプチドの本発明の蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（４）本発明の蛋白質を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチド）を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と本発明の蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（５）本発明の蛋白質を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドなど）を本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質に接触させた場合と、本発明の蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質に接触させた場合における、本発明の蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などである。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の蛋白質としては、本発明の蛋白質を含有するものであれば何れのものであってもよいが、ヒト、哺乳動物などの臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の蛋白質などが適している。
本発明の蛋白質を製造するには、前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の蛋白質を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の蛋白質、例えばＴＧＲ１を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。
ＴＧＲ１を含有する細胞としては、ＴＧＲ１を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＴＧＲ１と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＴＧＲ１を含有する細胞や膜画分中のＴＧＲ１の量は、１細胞当たり１０^３〜１０^８分子であるのが好ましく、１０^５〜１０^７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする前記の（１）〜（３）を実施するためには、適当な本発明の蛋白質画分と、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物（本発明のポリペプチドなど）が用いられる。本発明の蛋白質画分としては、天然型の本発明の蛋白質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の蛋白質画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物としては、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物（本発明のポリペプチドなど）などが用いられる。例えば〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３５Ｓ〕などで標識されたリガンド（本発明のポリペプチドの標識体）などを利用することができる。
具体的には、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明の蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の蛋白質や本発明のポリペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のポリペプチド（本発明のポリペプチドの標識体）を添加し、同時に１０^−４〜１０^−１μＭの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ_０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ_０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば８０％以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
また、本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合を測定する方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いることもできる。この方法では、本発明のポリペプチドを装置に添付のプロトコルに従ったアミノカップリング法によってセンサーチップに固定し、本発明の蛋白質を含有する細胞または本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質変換体から精製した本発明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分、あるいは精製した本発明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分２−２０μｌの流量で通過させる。センサーチップ上の本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存する試験化合物が変化させることを観察することによって本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。この方法は、本発明の蛋白質をセンサーチップに固定し、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測定することができる。試験化合物としては、上記と同様のものなどがあげられる。
本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の（４）〜（５）の方法を実施するためには、本発明の蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、本発明の蛋白質を発現した細胞が用いられる。本発明の蛋白質を発現した細胞としては、前述の組換え型蛋白質発現細胞株などが望ましい。形質変換体である本発明の蛋白質発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。
上記のリガンド・レセプターアッセイ系について、さらに具体的に記載すると以下のようなアッセイ系が用いられる。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のＧタンパク質が活性化されてＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくとＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタンパクに結合するが、加水分解されずにＧタンパクを含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞膜に残存した放射活性を測定することによって受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。この反応を利用して本発明のポリペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。この方法は、前記（４）〜（５）のように本発明の蛋白質を含む細胞を用いるものではなく、（１）〜（３）のように本発明の蛋白質を含む膜画分を用いるアッセイ法であるが、（４）〜（５）のように細胞刺激活性を測定するものであり、本測定法において本発明の蛋白質膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストである。ここにおいて、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加し、本発明のポリペプチドの単独投与に比べて本発明の蛋白質を発現する細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性に変化が生じることを観察することによって本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。このとき、本発明のポリペプチドによる本発明の蛋白質を発現する細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を示す化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、本発明の蛋白質を発現する細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。上述の方法によって調製した本発明の蛋白質を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ，５ｍＭＭｇＣｌ_２，１５０ｍＭＮａＣｌ，１μＭＧＤＰ，０．１％ＢＳＡｐＨ７．４）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをＦａｌｃｏｎｂ２０５３に０．２ｍｌずつ分注し、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を加え、さらに終濃度２００ｐＭとなるように［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳを加える。２５℃で１時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ，５ｍＭＭｇＣｌ_２，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳｐＨ７．４１．５ｍｌ）を加えて、ガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｆでろ過する。６５℃、３０分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放射活性を測定する。本発明のポリペプチドのみを加えた実験区の放射活性を１００％、本発明のポリペプチドを加えなかった実験区の放射活性を０％とし、本発明のポリペプチドによるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例えば８０％以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
（２）本発明の蛋白質発現細胞は本発明のポリペプチド刺激によって細胞内ｃＡＭＰ量が減少する場合、この反応を利用して本発明のポリペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。
本発明の蛋白質を発現させた種々の動物細胞のｃＡＭＰ産生量はマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗ｃＡＭＰ抗体と^１２５Ｉ標識ｃＡＭＰ（ともに市販品）を使用することによってＲＩＡあるいは抗ｃＡＭＰ抗体と標識ｃＡＭＰとを組み合わせた他のＥＩＡ系でも測定することができる。また抗ｃＡＭＰ抗体をｐｒｏｔｅｉｎＡあるいは抗ｃＡＭＰ抗体産生に用いた動物のＩｇＧなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと^１２５Ｉ標識ｃＡＭＰとを使用するＳＰＡ法による定量も可能である（アマシャムファルマシアバイオテク製のキットなどを使用する）。
本方法において、フォルスコリンまたはカルシトニンなど細胞内ｃＡＭＰ量を増加させるようなリガンドなどによって細胞内ｃＡＭＰ量を上昇させ、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加することによって本発明のポリペプチドの単独投与による細胞内ｃＡＭＰ量の抑制が変化することを観察し、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。このとき、本発明のポリペプチドによる本発明の蛋白質発現細胞のｃＡＭＰ産生抑制活性を阻害する活性を示す化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを添加してｃＡＭＰ産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法をより具体的に以下に記載する。本発明の蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を２４穴プレートに５ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％ＢＳＡと２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、０．２ｍＭ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％ＢＳＡと２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーに１ｎＭの本発明のポリペプチドあるいは１ｎＭの本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加したものを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。１００μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出する。抽出液中のｃＡＭＰ量は、ｃＡＭＰＥＩＡキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリン刺激によって産生されたｃＡＭＰ量を１００％とし、１ｎＭの本発明のポリペプチドの添加によって抑制されたｃＡＭＰ量を０％として、本発明のポリペプチドによるｃＡＭＰ産生抑制浩性に対する試験化合物の影響を算出する。本発明のポリペプチドの活性を阻害してｃＡＭＰ産生活性が例えば８０％以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
ｃＡＭＰ産生促進活性を測定するには、フォルスコリンを添加せずに本発明の蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞に試験化合物を添加して産生されたｃＡＭＰを上記の方法で定量する。この場合は、ｃＡＭＰの産生活性が例えば１０％以上の試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
（３）ＣＲＥ（ｃＡＭＰｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ピッカジーンベイシックベクターまたはピッカジーンエンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、ｃＡＭＰ上昇を伴う刺激は、ＣＲＥを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のｃＡＭＰ量の変動を検出することができる。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを本発明の蛋白質発現細胞にトランスフェクションした細胞を利用して本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。具体的なスクリーニング法を以下に記す。
ＣＲＥ−レポーター遺伝子を導入した本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに５ｘ１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％ＢＳＡと２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、０．２ｍＭ３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％ＢＳＡと２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１ｎＭの本発明のポリペプチドあるいは１ｎＭの本発明のポリペプチドおよび試験化合物と２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響はルシフェラーゼによる発光量を本発明のポリペプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、本発明のポリペプチドの投与によりフォルスコリン刺激による発光量の増加が抑制されるが、この抑制を回復させる化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量の本発明のポリペプチドと同様な抑制を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０によって、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴＣＡＴｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｋｉｔによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製ＡｕｒｏｒａＧａｌ−ＸＥによって測定することができる。
（４）本発明の蛋白質発現細胞が本発明のポリペプチド刺激によってアラキドン酸代謝物を細胞外に放出する場合、あらかじめ、放射活性を有するアラキドン酸を細胞に取り込ませておくことによって、この活性を細胞外に放出された放射活性を測定することによって測定することができる。このとき、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加して、本発明のポリペプチドのアラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。このとき、本発明のポリペプチドによるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。また、試験化合物のみを添加し、本発明の蛋白質発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に影響を与える化合物のスクリーニング法より具体的に以下に述べる。
本発明の蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を２４穴プレートに５ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養後、［^３Ｈ］アラキドン酸を０．２５μＣｉ／Ｗｅｌｌとなるよう添加する。［^３Ｈ］アラキドン酸添加１６時間後、細胞を０．０５％ＢＳＡと２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄し、各ｗｅｌｌに０．０５％ＢＳＡと２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）に溶解した終濃度１０ｎＭの本発明のポリペプチドあるいは１０ｎＭの本発明のポリペプチドおよび試験化合物を含むバッファー５００μｌを添加する。以降、０．０５％ＢＳＡと２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）を反応用バッファーと呼ぶ。３７℃で６０分間インキュベートした後に、反応液４００μｌをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。本発明のポリペプチドの非添加反応バッファーによる培地中の［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を０％とし、１０ｎＭの本発明のポリペプチドを添加したときのたときの培地中の［^３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を１００％として試験化合物の本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に対する影響を算出する。アラキドン酸代謝物産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
（５）本発明の蛋白質発現細胞を本発明のポリペプチドによって刺激することによって細胞内のＣａ^２＋濃度が上昇する場合、これを利用することによって本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に対する試験化合物の影響を調べることができる。
本発明の蛋白質発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を４ｍＭＦｕｒａ−２ＡＭ（同仁化学研究所）を縣濁したＨＢＳＳに置換し、室温で２時間３０分おく。ＨＢＳＳで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、蛍光測定器で、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を加えたときの励起波長３４０ｎｍ及び３８０ｎｍでの５０５ｎｍの蛍光強度の比の上昇を測定する。このとき、本発明のポリペプチドを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって生じる蛍光強度の変化を測定することにより本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。また、以下のようにＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社製）を使うこともできる。すなわち、細胞縣濁液にＦｌｕｏ−３ＡＭ（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。ＦＬＩＰＲ装置にセットし、Ｆｕｒａ−２ＡＭの場合と同様に本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を加え、本発明のポリペプチドを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測される蛍光強度が変化することを測定することにより、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。これらにおいて、本発明のポリペプチドによる蛍光強度の上昇を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
本発明の蛋白質発現細胞にａｅｑｕｏｒｉｎなどのように細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するようなタンパク質の遺伝子を共発現させておき、細胞内Ｃａイオン濃度の上昇によってａｅｑｕｏｒｉｎがＣａ結合型となり発光することを利用して、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を加え、本発明のポリペプチドを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測される発光強度が変化することを測定することにより、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。方法は、蛍光物質を取り込ませないこと以外は上記と同様である。
（６）受容体を発現する細胞に受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度が上昇することが知られている。本発明のポリペプチドによって生じる本発明の蛋白質を発現する細胞におけるこの反応を観察することにより本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。２４穴プレートに播いて１日目の細胞にｍｙｏ−［２−^３Ｈ］ｉｎｏｓｉｔｏｌ（２．５マイクロＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加した培地中で１日培養した細胞を、よく洗浄後、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加した後、１０％過塩素酸を加え反応を止める。１．５ＭＫＯＨ，６０ｍＭＨＥＰＥＳ溶液で中和し、０．５ｍｌのＡＧ１ｘ８樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を詰めたカラムに通し、５ｍＭＮａ_２ＢＯ_３６０ｍＭＨＣＯＯＮＨ_４で洗浄した後、１ＭＨＣＯＯＮＨ_４０．１ＭＨＣＯＯＨで溶出した放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。本発明のポリペプチドの非添加反応バッファーによる培地中の放射活性を０％とし、本発明のポリペプチドを添加したときの培地中の放射活性を１００％として試験化合物の本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に対する影響を算出する。イノシトール三リン酸産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみの添加によるイノシトール三リン酸産生上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
（７）ＴＲＥ（ＴＰＡｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ピッカジーンベイシックベクターまたはピッカジーンエンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、細胞内Ｃａ^２＋上昇を伴う刺激は、ＴＲＥを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを本発明の蛋白質発現細胞にトランスフェクションした細胞を利用した本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
ＴＲＥ−レポーター遺伝子を導入した本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに５ｘ１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．０５％ＢＳＡと２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１０ｎＭの本発明のポリペプチドあるいは１０ｎＭの本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、ルシフェラーゼによる発光量を本発明のポリペプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、本発明のポリペプチドの投与により細胞内Ｃａ^２＋の上昇によって発光量が増加するが、この増加を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、本発明のポリペプチドと同様な発光量の増加を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロランフェニコールアシルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０によって、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴＣＡＴＣｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌＡｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製ＡｕｒｏｒａＧａｌ−ＸＥによって測定することができる。
（８）本発明のポリペプチドに応答した本発明の蛋白質発現細胞についてＭＡＰｋｉｎａｓｅ活性化によって増殖が観察される場合、この増殖をＭＡＰｋｉｎａｓｅ活性、チミジン取り込み、細胞数測定（ＭＴＴなど）によって測定することができる。これを利用して本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
ＭＡＰｋｉｎａｓｅ活性は、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を細胞に添加した後、細胞溶解液から抗ＭＡＰｋｉｎａｓｅ抗体を用いた免疫沈降によってＭＡＰｋｉｎａｓｅ分画を得た後、例えば和光純薬製ＭＡＰＫｉｎａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔとγ−［^３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して容易に測定できる。チミジン取り込み活性は、本発明の蛋白質発現細胞を播き、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加した後、［ｍｅｔｈｙｌ−^３Ｈ］−チミジンを加え、その後、細胞内に取り込まれた標識チミジンの放射活性を細胞を溶解して液体シンチレーションカウンターで計数することによって測定することができる。
本発明の蛋白質発現細胞の増殖は、発現細胞を播き、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加した後にＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）を添加し、細胞内に取り込まれてＭＴＴが変化したＭＴＴホルマザンを塩酸酸性としたイソプロパノールで細胞を溶解した後、５７０ｎｍの吸収を測定することによっても測定できる。
本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の、標識チミジン取り込み活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートにウェル当たり５０００個まき一日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を細胞に添加して２４時間培養した後、［ｍｅｔｈｙｌ−^３Ｈ］−チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し６時間培養する。細胞をＰＢＳ（−）で洗った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、チミジン取り込みによる放射活性の上昇を本発明のポリペプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、本発明のポリペプチドの投与による放射活性の増加を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、本発明のポリペプチドと同様な放射活性の増加を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
（９）本発明の蛋白質発現細胞に本発明のポリペプチドを添加すると、Ｋｃｈａｎｎｅｌが活性化し、細胞内にあるＫイオンが、細胞外に流出する場合、Ｋイオンと同族元素であるＲｂイオンは、Ｋイオンと区別無くＫｃｈａｎｎｅｌを通って細胞外に流出するので、細胞に標識Ｒｂ（［８６Ｒｂ］）を添加して取り込ませておいた後、本発明のポリペプチドＡの刺激によって流出する［８６Ｒｂ］の流れを測定することで本発明のポリペプチドＡの作用を測定できる。本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の、［８６Ｒｂ］流出活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
２４穴にまいて２日後の本発明の蛋白質発現細胞を１ｍＣｉ／ｍｌの８６ＲｂＣｌを含む培地中で２時間保温する。培地をよく洗浄し、外液中の８６ＲｂＣｌを完全に除く。本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を細胞に添加して３０分後の外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定する。本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、［８６Ｒｂ］流出による放射活性の上昇を本発明のポリペプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、本発明のポリペプチドの投与による放射活性の上昇を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、本発明のポリペプチドと同様な放射活性の上昇を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
（１０）本発明の蛋白質発現細胞が本発明のポリペプチドに反応して変化する細胞外のｐＨ（ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅ）をサイトセンサー装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定することによって、本発明のポリペプチドの活性を測定することができる。サイトセンサー装置を利用した、細胞外ｐＨ変化の測定をすることによる本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
本発明の蛋白質発現細胞をサイトセンサー装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約２時間０．１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させることによって生じる培地のｐＨ変化を測定する。本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、本発明の蛋白質発現細胞の細胞外ｐＨ変化を本発明のポリペプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、本発明のポリペプチドの投与による細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、本発明のポリペプチドと同様な細胞外ｐＨ変化を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
（１１）酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｈａｐｌｏｉｄ α−ｍａｔｉｎｇＴｙｐｅ（ＭＡＴ α）の性フェロモン受容体ＳＴｅ２はＧ蛋白Ｇｐａ１とカップルしており、性フェロモンα−ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒに応答してＭＡＰｋｉｎａｓｅを活性化し、以下、Ｆａｒ１（ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅａｒｒｅｓｔ）および転写活性化因子Ｓｔｅ１２が活性化される。Ｓｔｅ１２は接合に関与するＦＵＳ１を含む種々の蛋白の発現を誘導する。一方、制御因子Ｓｓｔ２は以上の過程に抑制的に機能する。この系において、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を導入した酵母を作製し、本発明の蛋白質に対するアゴニスト刺激によって酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などの指標を用いた、アゴニストと本発明の蛋白質との反応の測定系の試みが行なわれている（Ｐａｕｓｃｈ，Ｍ．Ｈ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．４８７−４９４（１９９７））。このような本発明の蛋白質をコードする遺伝子を導入した酵母の系を利用して本発明のポリペプチドおよび本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
ＭＡＴα酵母のＳｔｅ２およびＧｐａ１をコードする遺伝子を除去し、代わりに本発明の蛋白質をコードする遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白をコードする遺伝子を導入する。Ｆａｒをコードする遺伝子を除去してｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅａｒｒｅｓｔが生じないようにし、また、Ｓｓｔをコードする遺伝子を除去することによって本発明のポリペプチドに対する応答の感度を向上させておく。さらに、ＦＵＳ１にヒスチジン生合成遺伝子ＨＩＳ３をつなげたＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子を導入する。以上の遺伝子組換え操作は例えば、Ｐｒｉｃｅら（Ｐｒｉｃｅ，Ｌ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．６１８８−６１９５（１９９５））の報告に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（ＳＳＴＲ２）遺伝子を本発明の蛋白質をコードする遺伝子に置き換えて実施することによって容易に行なうことができる。こうして構築された形質転換酵母は本発明の蛋白質のリガンドである本発明のポリペプチドに高感度で反応し、その結果ＭＡＰキナーゼの活性化が起きてヒスチジン生合成酵素が合成されるようになって、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。これを利用して、ヒスチジン欠乏培地での酵母の生育を指標として本発明のポリペプチドによる本発明の蛋白質発現酵母の応答を観察することができる。以下に本発明のポリペプチドおよび本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物のスクリーニング法を述べる。
上記のようにして作製された形質変換酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、２ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度でヒスチジンを除去した溶解寒天培地に加え、９ｘ９ｃｍの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、３０℃で３日間培養する。本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を本発明のポリペプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、本発明のポリペプチドの投与による酵母の生育を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、本発明のポリペプチドと同様な酵母の生育を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。また、あらかじめ、寒天培地に本発明のポリペプチドを添加しておいて滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察することによっても本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響を調べることができる。
（１２）本発明の蛋白質をコードする遺伝子ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、本発明のポリペプチドによって刺激すると細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度が上昇して、ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｈｌｏｒｉｄｅｃｕｒｒｅｎｔが生じる。これを膜電位の変化としてとらえることが出来る（Ｋイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。本発明のポリペプチドによって生じる本発明の蛋白質をコードする遺伝子を導入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるこの反応を観察することにより本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊をＭＢＳ液（８８ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＫＣｌ，０．４１ｍＭＣａＣｌ_２，０．３３ｍＭＣａ（ＮＯ_３）_２，０．８２ｍＭＭｇＳＯ_４，２．４ｍＭＮａＨＣＯ_３，１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）に溶かしたコラーゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で卵塊がほぐれるまで１９℃、１−６時間、１５０ｒｐｍで処理する。外液をＭＢＳ液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピュレーターで本発明の蛋白質をコードするｍＲＮＡ（５０ｎｇ／５０ｎｌ）をマイクロインジェクションする。本発明の蛋白質をコードするｍＲＮＡは、組織や細胞から調製しても、ｐｌａｓｍｉｄからｉｎｖｉｔｒｏで転写してもよい。これをＭＢＳ液中で２０℃で３日培養する。これをＲｉｎｇｅｒ液を流しているｖｏｌｔａｇｅｃｌａｍｐ装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極、電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、（−）極は、細胞外に置く。電位が安定したら、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を含むＲｉｎｇｅｒ液を流して電位変化を記録する。本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を導入したアフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を本発明のポリペプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、本発明のポリペプチドの投与による細胞膜電位変化を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、本発明のポリペプチドと同様な細胞膜電位変化を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
この系において、反応を変化量を増大して測定しやすいように各種のＧタンパク質遺伝子のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを導入することもできる。またａｅｑｕｏｒｉｎのようなＣａ^２＋存在下で発光を生じるようなタンパクの遺伝子のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを共インジェクションすることにより膜電位変化ではなく発光を観察してこの反応を測定することもできる。
（本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット）
本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の蛋白質、本発明の蛋白質を含有する細胞、あるいは本発明の蛋白質を含有する細胞の膜画分、および本発明のポリペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものがあげられる。
１．スクリーニング用試薬
（ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’ ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（ｂ）本発明の蛋白質の標品
本発明の蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０^５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（ｃ）標識リガンド
〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３５Ｓ〕などで標識した本発明のポリペプチド。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（ｄ）リガンド標準液
本発明のポリペプチドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｂ）１０^−３〜１０^−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のポリペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０^−３Ｍの本発明のポリペプチドを５μｌ加えておく。
（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識した本発明のポリペプチドを０．２ＮＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、ＰｅｒｃｅｎｔＭａｘｉｍｕｍＢｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式で求める。
式
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ_０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：ＰｅｒｃｅｎｔＭａｘｉｍｕｍＢｉｎｄｉｎｇ
Ｂ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＢｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ_０：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体的には本発明の蛋白質を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆるアゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるアンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記本発明の蛋白質のアゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ｉｉ）に従えばよい。
（ｉ）前記（１）〜（３）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の蛋白質を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はアンタゴニストである。
（ｉｉ）（ａ）試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させ、上記本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はアゴニストである。
（ｂ）本発明の蛋白質を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質に対するアゴニストなど）を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の蛋白質を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はアンタゴニストである。
該アゴニストは、本発明の蛋白質に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のポリペプチドと同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、アンタゴニストは、本発明の蛋白質に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
〔２〕本発明のポリペプチド等を含有する医薬
本発明のポリペプチドＡ１は、例えば、消化管収縮作用、平滑筋収縮作用、血圧上昇作用、摂食抑制作用、プロラクチン分泌低下作用などを有し、概日リズムにおける位相の進みおよび遅れに関連している。よって、本発明のポリペプチドＡ１、本発明のポリペプチドＡ１をコードするポリヌクレオチド、および本発明のポリペプチドＡ１の活性を促進する化合物またはその塩は、低毒性で安全な、例えば低血圧、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、嗜眠症、不妊症、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病など、好ましくは低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群、不妊症などの予防・治療剤として有用である。本発明のポリペプチドＡ１に対する抗体、および本発明のポリペプチドＡ１の活性を阻害する化合物またはその塩は、低毒性で安全な、例えば、高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症、免疫・炎症性疾患（例、関節リウマチ、変形性関節炎など）など、好ましくは高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドＡ２は、プロラクチン分泌作用などを有しているため、本発明のポリペプチドＡ２、本発明のポリペプチドＡ２をコードするポリヌクレオチド、および本発明のポリペプチドＡ２の活性を促進する化合物またはその塩は、低毒性で安全な、例えば、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症など、好ましくは更年期障害、甲状腺機能亢進症などの予防・治療剤として有用である。本発明のポリペプチドＡ２に対する抗体、および本発明のポリペプチドＡ２の活性を阻害する化合物またはその塩は、低毒性で安全な、例えば、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、甲状腺機能不全症など、好ましくは不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤（好ましくはプロラクチン産生抑制剤）として有用である。
本発明のポリペプチドＢは、プロラクチン分泌作用などを有しているため、本発明のポリペプチドＢ、本発明のポリペプチドＢをコードするポリヌクレオチド、および本発明のポリペプチドＢの活性を促進する化合物またはその塩は、低毒性で安全な、例えば、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症など、好ましくは更年期障害、甲状腺機能亢進症などの予防・治療剤として有用である。本発明のポリペプチドＢに対する抗体、および本発明のポリペプチドＢの活性を阻害する化合物またはその塩は、低毒性で安全な、例えば、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、甲状腺機能不全症など、好ましくは不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤（好ましくはプロラクチン産生抑制剤）として有用である。
また、本発明の蛋白質のアゴニストは、例えば、低血圧症の予防・治療剤；局所血管収縮剤；子宮収縮促進剤；微弱陣痛、弛緩出血、胎盤娩出前後、子宮復古不全、人工妊娠中絶、分娩誘発、分娩停止、子宮頚管無力症、子宮内反（症）、遺残胎盤および遺残卵膜、分娩後出血、女性性器脱、不妊症、多胎妊娠における母体のケア、胎位異常、月経困難症、流産、子宮内膜症、慢性子宮炎症性疾患、子宮筋腫、子宮奇形、子宮腺筋症、子宮頚部裂傷、外傷後ストレス症候群などの子宮収縮不全に関係する各種疾患の改善、予防・治療剤として用いることができる。本発明の蛋白質のアンタゴニストは、例えば、高血圧症、心筋梗塞、急性腎不全、ストレス性疾患〔例、（１）心血管系の疾患（例、狭心症、心筋梗塞、不整脈など）、（２）呼吸器系の疾患（例、気管支喘息、過呼吸症候群など）、（３）筋骨格系の疾患（例、関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊張性頭痛など）、（４）糖尿病、更年期障害、甲状腺機能亢進症、慢性疼痛、免疫力低下、消化器系疾患（例、胃潰瘍、潰瘍性大腸炎など）〕などの予防・治療剤；子宮収縮抑制剤；過強陣痛、偽陣痛、遷延妊娠、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、頚菅裂傷、早産、子宮筋腫、子宮奇形、子宮腺筋症、娩出力異常、慢性子宮炎症性疾患、多胎妊娠における母体のケア、胎位異常、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、月経困難症など子宮収縮過多に関係する各種疾患の改善、予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物、上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物等の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物、本発明のポリペプチドに対する抗体、上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩等を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物（例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ）などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドＡ１の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、低血圧症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、低血圧症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＡ２の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢの活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＡ１の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、高血圧症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＡ２の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、不妊症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、不妊症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢの活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、不妊症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、不妊症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物（特にアンタゴニスト）またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の高血圧症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の高血圧症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
以下、本発明のポリペプチドを含有する医薬、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬および本発明のポリペプチドに対する抗体を含有する医薬について、より具体的に説明する。
（本発明のポリペプチドを含有する医薬）
本発明のポリペプチドＡ１は、例えば、消化管収縮作用、平滑筋収縮作用、血圧上昇作用、摂食抑制作用、プロラクチン分泌低下作用などを有し、概日リズムにおける位相の進みおよび遅れに関連している。よって、本発明のポリペプチドＡ１は、低毒性で安全な、例えば低血圧、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、嗜眠症、時間帯域変化症候群、不妊症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドＡ２は、プロラクチン分泌作用などを有しているため、本発明のポリペプチドＡ２は、低毒性で安全な、更年期障害、甲状腺機能亢進症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドＢは、プロラクチン分泌作用などを有しているため、本発明のポリペプチドＢは、低毒性で安全な、例えば、更年期障害、甲状腺機能亢進症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドの塩としては、上記したものが挙げられ、上記したものが好ましい。
本発明のポリペプチドを上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドを上記の医薬（予防・治療剤など）として使用する場合、上記した方法など、公知の方法に従って製剤化することができる。
例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、または水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドＡ１の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、低血圧症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、低血圧症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＡ２の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドＢの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬）
本発明のポリペプチドＡ１は、例えば、消化管収縮作用、平滑筋収縮作用、血圧上昇作用、摂食抑制作用、プロラクチン分泌低下作用などを有し、概日リズムにおける位相の進みおよび遅れに関連している。よって、本発明のポリペプチドＡ１をコードするポリヌクレオチドは、低毒性で安全な、例えば低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群、不妊症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドＡ２は、プロラクチン分泌作用などを有しているため、本発明のポリペプチドＡ２をコードするポリヌクレオチドは、低毒性で安全な、例えば、更年期障害、甲状腺機能亢進症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドＢは、プロラクチン分泌作用などを有しているため、本発明のポリペプチドＢをコードするポリヌクレオチドは、低毒性で安全な、例えば、更年期障害、甲状腺機能亢進症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリヌクレチドは、例えば、生体内において本発明のポリペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（ｉ）本発明のポリヌクレオチドを該患者に投与し、生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、または（ｉｉ）細胞に本発明のポリヌクレオチドを挿入し、本発明のポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することなどによって、該患者における本発明のポリペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、上記した方法など、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。また、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）が挿入されたベクターは、上記した本発明のポリペプチドと同様に製剤化することができ、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドＡ１をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、低血圧症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇである。
本発明のポリペプチドＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇである。
本発明のポリペプチドＢをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、更年期障害患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇである。
（本発明のポリペプチドに対する抗体を含有する医薬）
本発明のポリペプチドＡ１は、例えば、消化管収縮作用、平滑筋収縮作用、血圧上昇作用、摂食抑制作用、プロラクチン分泌低下作用などを有し、概日リズムにおける位相の進みおよび遅れに関連している。よって、本発明のポリペプチドＡ１に対する抗体は、低毒性で安全な、例えば、高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドＡ２は、プロラクチン分泌作用などを有しているため、本発明のポリペプチドＡ２に対する抗体は、低毒性で安全な、例えば、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドＢは、プロラクチン分泌作用などを有しているため、本発明のポリペプチドＢに対する抗体は、低毒性で安全な、例えば、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤として有用である。
本発明の抗体（例、中和抗体）を上記医薬（治療・予防剤など）として用いる場合には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。医薬組成物は、上記した方法など、公知の方法に従って調製することができる。例えば、投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、ワクチン等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄｃａｓｔｏｒｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明のポリペプチドＡ１に対する抗体の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、高血圧症患者の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明のポリペプチドＡ２に対する抗体の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、不妊症患者の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明のポリペプチドＢに対する抗体の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、不妊症患者の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
〔３〕本発明の抗体を用いる診断薬
上述のように、本発明の抗体を用いることによって本発明のポリペプチドを感度良く定量することができるので、本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドに関連する各種疾患の診断をすることができる。
具体的には、本発明のポリペプチドＡ１は、例えば、消化管収縮作用、平滑筋収縮作用、血圧上昇作用、摂食抑制作用、プロラクチン分泌低下作用などを有し、概日リズムにおける位相の進みおよび遅れに関連しているので、本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドＡ１の濃度の増加が検出された場合、例えば、高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症、免疫・炎症性疾患（例、関節リウマチ、変形性関節炎など）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のポリペプチドＡ１の濃度の減少が検出された場合には、例えば、低血圧、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、嗜眠症、不妊症、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のポリペプチドＡ２はプロラクチン分泌作用などを有しているので、本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドＡ２の濃度の増加が検出された場合、例えば、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、甲状腺機能不全虚などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のポリペプチドＡ２の濃度の減少が検出された場合には、例えば、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のポリペプチドＢはプロラクチン分泌作用などを有しているので、本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドＢの濃度の増加が検出された場合、例えば、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、甲状腺機能不全症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のポリペプチドＢの濃度の減少が検出された場合には、例えば、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
〔４〕遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）は、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトや温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
本発明のポリペプチドＡ１は、例えば、消化管収縮作用、平滑筋収縮作用、血圧上昇作用、摂食抑制作用、プロラクチン分泌低下作用などを有し、概日リズムにおける位相の進みおよび遅れに関連しているので、例えば、ポリペプチドＡ１の遺伝子の発現過多が検出された場合は、例えば、高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症、免疫・炎症性疾患（例、関節リウマチ、変形性関節炎など）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のポリペプチドＡ１の遺伝子の発現減少が検出された場合は、例えば、低血圧、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、嗜眠症、不妊症、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のポリペプチドＡ２は、プロラクチン分泌作用などを有しているので、例えば、ポリペプチドＡ２の遺伝子の発現過多が検出された場合は、例えば、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、甲状腺機能不全症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のポリペプチドＡ２の遺伝子の発現減少が検出された場合は、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のポリペプチドＢは、プロラクチン分泌作用などを有しているので、例えば、ポリペプチドＢの遺伝子の発現過多が検出された場合は、例えば、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、甲状腺機能不全症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のポリペプチドＢの遺伝子の発現減少が検出された場合は、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
〔５〕アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬および診断薬
本発明のポリペプチドＡ１または本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（以下「本発明のＤＮＡ（Ａ１）」という）に相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドＡ１または本発明のＤＮＡ（Ａ１）の機能を抑制することができるので、例えば、高血圧症、心筋梗塞、急性腎不全、ストレス性疾患〔例、（１）心血管系の疾患（例、狭心症、心筋梗塞、不整脈など）、（２）呼吸器系の疾患（例、気管支喘息、過呼吸症候群など）、（３）筋骨格系の疾患（例、関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊張性頭痛など）、（４）糖尿病、更年期障害、慢性疼痛、免疫力低下、消化器系疾患（例、胃潰瘍、潰瘍性大腸炎など）〕などの予防・治療剤；子宮収縮抑制剤；過強陣痛、偽陣痛、遷延妊娠、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、頚菅裂傷、早産、子宮筋腫、子宮奇形、子宮腺筋症、娩出力異常、慢性子宮炎症性疾患、多胎妊娠における母体のケア、胎位異常、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、月経困難症など子宮収縮過多に関係する各種疾患の改善、予防・治療剤；摂食（食欲）促進剤；拒食症；不眠症；免疫・炎症性疾患（例、関節リウマチ、変形性関節炎など）など、好ましくは高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症、免疫・炎症性疾患など、より好ましくは高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症の予防・治療剤などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明のポリペプチドＡ２をコードするＤＮＡ（以下「本発明のＤＮＡ（Ａ２）」という）に相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドＡ２または本発明のＤＮＡ（Ａ２）の機能を抑制することができるので、例えば、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明のポリペプチドＢをコードするＤＮＡ（以下「本発明のＤＮＡ（Ｂ）」という）に相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドＢまたは本発明のＤＮＡ（Ｂ）の機能を抑制することができるので、例えば、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤などとして使用できる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
該アンチセンス・ポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、高血圧症の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを腎臓に局所投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。該アンチセンスポリヌクレオチドを用いた診断は、上記の遺伝子診断薬と同様にして実施することができる。
（ＲＮＡｉ、リボザイム）
本発明は、さらに
（１）本発明のポリペプチドＡ１をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ；
（２）前記（１）記載の二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬；
（３）本発明のポリペプチドＡ１をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム；
（４）前記（３）記載のリボザイムを含有してなる医薬；
（５）本発明のポリペプチドＡ２をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ；
（６）前記（５）記載の二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬；
（７）本発明のポリペプチドＡ２をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム；
（８）前記（７）記載のリボザイムを含有してなる医薬；
（９）本発明のポリペプチドＢをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ；
（１０）前記（９）記載の二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬；
（１１）本発明のポリペプチドＢをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム；
（１２）前記（１１）記載のリボザイムを含有してなる医薬；
を提供する。
これらの二重鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ；ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ法）、リボザイムなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができ、生体内における本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の活性や機能を阻害することができる。
したがって、前記（１）記載の二重鎖ＲＮＡおよび前記（３）記載のリボザイムは、例えば、高血圧症、心筋梗塞、急性腎不全、ストレス性疾患〔例、（１）心血管系の疾患（例、狭心症、心筋梗塞、不整脈など）、（２）呼吸器系の疾患（例、気管支喘息、過呼吸症候群など）、（３）筋骨格系の疾患（例、関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊張性頭痛など）、（４）糖尿病、更年期障害、慢性疼痛、免疫力低下、消化器系疾患（例、胃潰瘍、潰瘍性大腸炎など）〕などの予防・治療剤；子宮収縮抑制剤；過強陣痛、偽陣痛、遷延妊娠、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、頚菅裂傷、早産、子宮筋腫、子宮奇形、子宮腺筋症、娩出力異常、慢性子宮炎症性疾患、多胎妊娠における母体のケア、胎位異常、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群、月経困難症など子宮収縮過多に関係する各種疾患の改善、予防・治療剤；摂食（食欲）促進剤；拒食症；不眠症；免疫・炎症性疾患（例、関節リウマチ、変形性関節炎など）など、好ましくは高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症、免疫・炎症性疾患など、より好ましくは高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症の予防・治療剤などの予防・治療剤などとして使用できる。
また、前記（５）記載の二重鎖ＲＮＡおよび前記（７）記載のリボザイムは、例えば、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤（好ましくはプロラクチン産生抑制剤）などとして使用できる。
さらに、前記（９）記載の二重鎖ＲＮＡおよび前記（１１）記載のリボザイムは、例えば、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤（好ましくはプロラクチン産生抑制剤）などとして使用できる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
〔６〕ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、１）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、２）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。例えば、外来性の本発明のポリペプチドＡ１をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡ（Ａ１）と略記する）を転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドＡ１の増加症状を有することから、本発明のポリペプチドＡ１に関連する疾患（例、高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症など）に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。外来性の本発明のポリペプチドＡ２をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡ（Ａ２）と略記する）を転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドＡ２の増加症状を有することから、本発明のポリペプチドＡ２に関連する疾患（例、不妊症、甲状腺機能不全症など）に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。外来性の本発明のポリペプチドＢをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡ（Ｂ）と略記する）を転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドＢの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドＢに関連する疾患（例、不妊症、甲状腺機能不全症など）に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行うことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来性異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不能症状を有することから、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。例えば、外来性の本発明のポリペプチドＡ１をコードするＤＮＡの異常ＤＮＡ（以下、本発明の外来性異常ＤＮＡ（Ａ１）と略記する）を転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドＡ１の機能不活性型不能症状を有することから、本発明のポリペプチドＡ１の機能不活性型不応症（例、低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群、不妊症など）に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。外来性の本発明のポリペプチドＡ２をコードするＤＮＡの異常ＤＮＡ（以下、本発明の外来性異常ＤＮＡ（Ａ２）と略記する）を転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドＡ２の機能不活性型不能症状を有することから、本発明のポリペプチドＡ２の機能不活性型不応症（例、更年期障害、甲状腺機能亢進症など）に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。外来性の本発明のポリペプチドＢをコードするＤＮＡの異常ＤＮＡ（以下、本発明の外来性異常ＤＮＡ（Ｂ）と略記する）を転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドＢの機能不活性型不能症状を有することから、本発明のポリペプチドＢの機能不活性型不応症（例、更年期障害、甲状腺機能亢進症など）に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
１）組織培養のための細胞源としての使用、
２）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
３）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
４）上記３）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
５）本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのポリペプチド分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
〔７〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第１）項記載の胚幹細胞、
３）ネオマイシン耐性である第１）項記載の胚幹細胞、
４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第１）項記載の胚幹細胞、
５）ゲッ歯動物がマウスである第４）項記載の胚幹細胞、
６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第６）項記載の非ヒト哺乳動物、
８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第６）項記載の非ヒト哺乳動物、
９）ゲッ歯動物がマウスである第８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
１０）第７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドＡの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドＡの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎプロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけ本発明のポリペプチドＡの細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドＡのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドＡのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のレセプタータンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドＡにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドＡの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
〔７ａ〕本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、本発明のポリペプチドＡ１をコードするＤＮＡが不活性化された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を用いて、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症等に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上低下した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
また、例えば、本発明のポリペプチドＡ２をコードするＤＮＡが不活性化された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を用いて、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などに対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群とプロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などの発症度合いの違いや血中プロラクチン濃度の違いを経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血中プロラクチン濃度が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上増加した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
また、例えば、本発明のポリペプチドＢをコードするＤＮＡが不活性化された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を用いて、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などに対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群とプロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症の発症度合いの違いや血中プロラクチン濃度の違いを経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血中プロラクチン濃度が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上増加した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドＡの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドＡを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
〔７ｂ〕本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドＡをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドＡの発現する組織で、本発明のポリペプチドＡの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドＡの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチドＡ欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチドＡ１をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドＡ１の発現を促進し、該ペプチドの機能を促進することができるので、例えば、低血圧、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、嗜眠症、不妊症、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
本発明のポリペプチドＡ２をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドＡ２の発現を促進し、該ペプチドの機能を促進することができるので、例えば、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症（精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
本発明のポリペプチドＢをコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドＢの発現を促進し、該ペプチドの機能を促進することができるので、例えば、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害など）、甲状腺機能亢進症などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のポリペプチドＡ１をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドＡ１の発現を阻害し、該ペプチドの機能を阻害することができるので、例えば、摂食（食欲）促進剤；高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症、免疫・炎症性疾患（例、関節リウマチ、変形性関節炎など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のポリペプチドＡ２をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドＡ２の発現を阻害し、該ペプチドの機能を阻害することができるので、例えば、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、甲状腺機能不全症などの安全で低毒性な予防・治療剤（好ましくはプロラクチン産生抑制剤）などの医薬として有用である。
また、本発明のポリペプチドＢをコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドＢの発現を阻害し、該ペプチドの機能を阻害することができるので、例えば、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、甲状腺機能不全症などの安全で低毒性な予防・治療剤（好ましくはプロラクチン産生抑制剤）などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドＡまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子導入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明の蛋白質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
Ｙ：チミンまたはシトシン
Ｎ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
Ｒ：アデニンまたはグアニン
Ｍ：シトシンまたはアデニン
Ｗ：チミンまたはアデニン
Ｓ：シトシンまたはグアニン
ＲＮＡ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＥＩＡ：エンザイムイムノアッセイ
ＧｌｙまたはＧ：グリシン
ＡｌａまたはＡ：アラニン
ＶａｌまたはＶ：バリン
ＬｅｕまたはＬ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ：セリン
ＴｈｒまたはＴ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ：システイン
ＭｅｔまたはＭ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ：リジン
ＡｒｇまたはＲ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ：グルタミン
ｐＧｌｕ：ピログルタミン酸
Ｍｅ：メチル基
Ｅｔ：エチル基
Ｂｕ：ブチル基
Ｐｈ：フェニル基
ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ＰＡＭ：フェニルアセトアミドメチル
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
Ｂｚｌ：ベンジル
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ：２−クロルベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＮＰ：ジニトロフェニル
Ｂｕｍ：ターシャリーブトキシメチル
Ｔｒｔ：トリチル
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリド
Ｅ６４：（Ｌ−３−ｔｒａｎｓ−カルボキオキシラン−２−カルボニル）Ｌ−ロイシル−アグマチン
ＧＤＰ：グアノシン−５’−二リン酸
ＭＥＭα ：ミニマムエッセンシャルメジウムアルファ
Ｆｕｒａ−２ＡＭ：１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサゾリル）−５−ベンゾフラニロキシ］−２−（２−アミノ−５メチルフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＢＳＳ：ハンクス平衡塩液
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ：１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸
ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトニューロメジンＳのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ラットニューロメジンＳのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
マウスニューロメジンＳのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトニューロメジンＳ前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ラットニューロメジンＳ前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
マウスニューロメジンＳ前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ヒトニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒトニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
ラットニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ラットニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
マウスニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
マウスニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ヒトニューロメジンＳをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ラットニューロメジンＳをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
マウスニューロメジンＳをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ヒトニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ラットニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
マウスニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
ヒトニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
ヒトニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ラットニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ラットニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
マウスニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
マウスニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ヒトＴＧＲ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
ヒトＴＧＲ１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
ラットＴＧＲ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２８〕
ラットＴＧＲ１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
マウスＴＧＲ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３０〕
マウスＴＧＲ１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
ヒトＦＭ−３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３２〕
ヒトＦＭ−３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
ラットＦＭ−３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３４〕
ラットＦＭ−３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
マウスＦＭ−３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３６〕
マウスＦＭ−３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
ヒトニューロメジンＵＮ末ペプチド−３３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３８〕
ヒトニューロメジンＵＮ末ペプチド−３６のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３９〕
ラットニューロメジンＵＮ末ペプチド−３３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４０〕
ラットニューロメジンＵＮ末ペプチド−３６のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４１〕
マウスニューロメジンＵＮ末ペプチド−３３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４２〕
マウスニューロメジンＵＮ末ペプチド−３６のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で得られたヒトニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
以下の実施例２におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
以下の実施例２におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
以下の実施例２におけるＰＣＲ反応で得られたラットニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
以下の実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
以下の実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
以下の実施例３におけるＰＣＲ反応で得られたマウスニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５２〕
以下の実施例１０におけるＲＴ−ＰＣＲで使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５３〕
以下の実施例１０におけるＲＴ−ＰＣＲで使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
以下の実施例１１におけるｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎでプローブとして使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
ニューロメジンＳをＮＭＳ、ニューロメジンＳＮ末ペプチドをＮＳＮＰ、ニューロメジンＵＮ末ペプチドをＮＵＮＰと記載することがある。
実施例１
ヒトニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
ヒト全脳由来ＭａｒａｔｈｏｎＲｅａｄｙｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型とし、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、プライマー１（配列番号：４３）およびプライマー２（配列番号：４４）を用いてＰＣＲ反応を行なった。その結果、配列番号：４５に示す塩基配列が得られた。
配列番号：４５の塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳される蛋白のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。配列番号：４には、生理活性ペプチドがその前駆体蛋白から切り出されるとされるＬｙｓ−Ａｒｇの配列（Ｒｏｕｉｌｌｅ，Ｙ．ら、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６巻、３２２頁、１９９５年）に続き、ニューロメジンＵ（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１３０巻、１０７８頁、１９８５年）と類似した、配列番号：１で表されるペプチド配列、および配列番号：７および配列番号：８で表されるペプチド配列が存在した。配列：１のカルボキシル末端側にはアミド化シグナルであるＧｌｙ−Ａｒｇ配列（Ｒｏｕｉｌｌｅ，Ｙ．ら、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６巻、３２２頁、１９９５年）が存在したことから、配列番号：１のカルボキシル末端のアミノ酸であるＡｓｎはアミドであることが示唆された。この配列番号：１で表されるペプチド配列をヒトニューロメジンＳ（ｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳ、本明細書中でヒトＮＭＳと記載することがある）と命名した。また、配列番号：７および配列番号：８で表されるペプチド配列をそれぞれヒトニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４（ｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ−３４、本明細書中でヒトＮＳＮＰ−３４と記載することがある）およびヒトニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７（ｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ−３７、本明細書中でヒトＮＳＮＰ−３７と記載することがある）と命名した。
実施例２
ラットニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
ラット全脳由来ＭａｒａｔｈｏｎＲｅａｄｙｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型とし、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、プライマー３（配列番号：４６）およびプライマー４（配列番号：４７）を用いてＰＣＲ反応を行なった。その結果、配列番号：４８に示す塩基配列が得られた。
配列番号：４８の塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＡＧに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳される蛋白のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。配列番号：５には、生理活性ペプチドがその前駆体蛋白から切り出されるとされるＬｙｓ−Ａｒｇの配列（Ｒｏｕｉｌｌｅ，Ｙ．ら、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６巻、３２２頁、１９９５年）に続き、ニューロメジンＵ（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１３０巻、１０７８頁、１９８５年）と類似した、配列番号：２で表されるペプチド配列、および配列番号：９および配列番号：１０で表されるペプチド配列が存在した。配列：２のカルボキシル末端側にはアミド化シグナルであるＧｌｙ−Ａｒｇ配列（Ｒｏｕｉｌｌｅ，Ｙ．ら、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６巻、３２２頁、１９９５年）が存在したことから、配列番号：２のカルボキシル末端のアミノ酸であるＡｓｎはアミドであることが示唆された。この配列番号：２で表されるペプチド配列をラットニューロメジンＳ（ｒａｔｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳ、本明細書中でラットＮＭＳと記載することがある）と命名した。また、配列番号：９および配列番号：１０で表されるペプチド配列をそれぞれラットニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４（ｒａｔｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ−３４、本明細書中でラットＮＳＮＰ−３４と記載することがある）およびラットニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７（ｒａｔｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ−３７、本明細書中でラットＮＳＮＰ−３７と記載することがある）と命名した。
実施例３
マウスニューロメジンＳ前駆体蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
マウス視床下部由来ｍＲＮＡより調製したｃＤＡＮを鋳型とし、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、プライマー５（配列番号：４９）およびプライマー６（配列番号：５０）を用いてＰＣＲ反応を行なった。その結果、配列番号：５１に示す塩基配列が得られた。
配列番号：５１の塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＡＧに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳される蛋白のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。配列番号：６には、生理活性ペプチドがその前駆体蛋白から切り出されるとされるＬｙｓ−Ａｒｇの配列（Ｒｏｕｉｌｌｅ，Ｙ．ら、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６巻、３２２頁、１９９５年）に続き、ニューロメジンＵ（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１３０巻、１０７８頁、１９８５年）と類似した、配列番号：３で表されるペプチド配列、および配列番号：１１および配列番号：１２で表されるペプチド配列が存在した。配列：３のカルボキシル末端側にはアミド化シグナルであるＧｌｙ−Ａｒｇ配列（Ｒｏｕｉｌｌｅ，Ｙ．ら、ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＮｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６巻、３２２頁、１９９５年）が存在したことから、配列番号：３のカルボキシル末端のアミノ酸であるＡｓｎはアミドであることが示唆された。この配列番号：３で表されるペプチド配列をマウスニューロメジンＳ（ｍｏｕｓｅｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳ、本明細書中でマウスＮＭＳと記載することがある）と命名した。また、配列番号：１１および配列番号：１２で表されるペプチド配列をそれぞれマウスニューロメジンＳＮ末ペプチドｎｏｌｏｇｙ３４（ｍｏｕｓｅｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ−３４、本明細書中でマウスＮＳＮＰ−３４と記載することがある）およびマウスニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７（ｍｏｕｓｅｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎＳＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ−３７、本明細書中でマウスＮＳＮＰ−３７と記載することがある）と命名した。
実施例４
ヒトＦＭ−３またはヒトＴＧＲ１を発現するＣＨＯ細胞の作製
ヒトＦＭ−３（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＢＣ０３６５４３；２０９から１４２０番目の塩基）およびＴＧＲ１（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＦ２４２８７４；１から１２４０番目の塩基）をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした後、ＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。ヒトニューロメジンＵにより誘導される細胞内Ｃａイオン濃度の変化が最も大きかった安定発現細胞株を実験に用いた。
実施例５
ＮＭＳによるヒトＦＭ−３またはヒトＴＧＲ１を発現するＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性
ＦＬＩＰＲシステム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）を用いてｃａｌｃｉｕｍ−ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎアッセイ（Ｋｏｊｉｍａ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４０２巻、６５６頁、１９９９年）を行い、蛍光量変化の最大値を活性値とした。試料は１％ＢＳＡを含むアッセイ用緩衝液に溶解した。その結果、ヒトＦＭ−３またはヒトＴＧＲ１発現細胞に対して、ヒトＮＭＳは濃度依存的に特異的な強い細胞内Ｃａイオン濃度の増加を示し、そのＥＣ_５０はそれぞれ６．５×１０^−１１Ｍ（ＦＭ−３）、９．１×１０^−１１Ｍ（ＴＧＲ１）であった。ラットＮＭＳを用いても同様の結果が得られた。
実施例６
放射ラベル化した［^１２５Ｉ−Ｔｙｒ^０］−ＮＭＳのヒトＦＭ−３またはヒトＴＧＲ１を発現するＣＨＯ細胞膜画分に対する受容体結合活性
受容体結合実験は、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｌらの方法（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｌ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２７巻、２７２頁、１９９０年）を改良して行った。ヒトＦＭ−３またはヒトＴＧＲ１を発現させたＣＨＯ細胞から粗細胞膜画分を調製した。またＮ末にＴｙｒを付加したヒトＮＭＳ（［Ｔｙｒ^０］−ＮＭＳ）を^１２５Ｉで放射標識し、ＨＰＬＣにて精製した。粗細胞膜画分（１０μｇ）と放射標識ペプチド（５０ｐＭ）を競合ペプチド存在下、０．０５％ＣＨＡＰＳおよび１％ＢＳＡを含むバッファー中で２時間室温にて反応させ、ろ過により結合・非結合放射標識ペプチドを分離した。放射活性はＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。その結果、ヒトＮＭＳはヒトＦＭ−３に対してＩＣ５０＝１．２Ｘ１０^−９Ｍの親和性を示し、ヒトＴＧＲ１に対してＩＣ_５０＝１．０Ｘ１０^−１０Ｍの親和性を示した。
以上の結果からＮＭＳはＦＭ−３またはＴＧＲ１の内因性リガンドであることが示された。
実施例７
ＮＭＳのヒヨコ直腸収縮活性
Ｃｕｒｒｉｅらの方法（Ｃｕｒｒｉｅ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２１巻、７１頁、１９８３年）に従い、新鮮なヒヨコ直腸を３ｍｌのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ液、３７℃でプレ・インキュベーションし、実施例１４に記載された方法によって作製し、生理的食塩水に溶解したラットＮＭＳを投与後、直腸の収縮を測定した。その結果、ＮＭＳはヒヨコ直腸に対して１０ｐｍｏｌの投与量において有意な収縮活性を示した。
実施例８
ＮＭＳのラットへの経静脈投与による血圧上昇活性
Ｍｉｎａｍｉｎｏらの方法（Ｍｉｎａｍｉｎｏ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１３０巻、１０７８頁、１９８５年）に従い、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの頸動脈にカテーテルを留置し、継続的に動脈圧を測定した。実施例１４に記載された方法によって作製したラットＮＭＳは０．１ｍｌの生理食塩水に溶解後、頸静脈に留置したカテーテルより投与した。その結果、ＮＭＳは経静脈投与によってラットの血圧を３ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量において有意に上昇させた。
実施例９
ＮＭＳ中枢投与による摂食量への影響
Ｗｉｓｔａｒラット（雄・８週令）の側脳室にカテーテルを留置し、実験操作に慣らしながら自由摂食のもと一定条件で飼育した（２２度、ライト・オン７時−１９時）。実施例１４に記載された方法によって作製したラットＮＭＳは１０μｌの生理食塩水に溶解後、カテーテルより側脳室へ投与した。（１）暗期摂食量の測定では１８時にＮＭＳの投与を行い、１９時−７時の間の摂食量を測定した。また、（２）１４時間絶食ラットへ９時にＮＭＳの投与を行い、直後から２時間摂食量を測定した。その結果、（１）ＮＭＳは用量依存的に有意に暗期摂食量を抑制し、その効果は１ｎｍｏｌで最大であった。（２）絶食ラットにおける２時間摂食量について、ＮＭＳは０．５ｎｍｏｌで有意に摂食量を抑制した。
実施例１０
ＲＴ−ＰＣＲによるラットにおけるＮＭＳ組織分布の解析
ＴｏｔａｌＲＮＡは８週齢のＷｉｓｔａｒラットの各組織より採取した。また、脳の各部位はＭｕｒａｋａｍｉおよびＴａｋａｈａｓｈｉの方法（Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｎ．およびＴａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．、ＢｒａｉｎＲｅｓ．、２７６巻、２９７頁、１９８３年）に従い、採取した。得られたＲＮＡはＤＮａｓｅ処理の後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により逆転写反応を行った。定量ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔＤＮＡＭａｓｔｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＳｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。定量に用いたプライマーは５’−ＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：５２）および５’−ＧＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＡＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号：５３）である。既知量のラットＮＭＳｃＤＮＡを標準曲線作製に用いた。また、ラットＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を測定し、内部標準とした。
その結果、ラットＮＭＳｍＲＮＡは中枢神経系と脾臓、精巣で強い発現が認められ、下垂体や小腸では低レベルの発現であった。中枢神経系では視床下部で特に強く発現しており、そのなかでも視交叉上核でほぼ特異的に発現していた。
実施例１１
Ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる発現分布解析と視交叉上核での発現量変化
既報（Ｏｚａｋｉ，Ｙ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４３巻、４３２０頁、２００２年）に従い、ラット全脳の１２μｍの冠状断切片について^３５Ｓ標識したオリゴヌクレオチドプローブ（５’−ＴＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＡ−３’）（配列番号：５４）を用いてｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。洗浄後、オートラジオグラフィーにより現像した。放射活性はＭＣＩＤｉｍａｇｉｎｇａｎａｌｙｚｅｒ（ＩｍａｇｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈ）を用い、^１４Ｃを標準として定量した。その結果、ラット全脳を用いた冠状切片、矢状切片でＮＭＳの発現部位を解析した結果、視交叉上核での特異的な発現が認められ、リアルタイムＰＣＲでの発現解析の結果と一致した。ラットＮＭＳｍＲＮＡの発現は、視交叉上核の中でも腹外側部で認められた。
視交叉上核はサーカディアンリズムの調節に関係する神経核であることから、ＮＭＳの発現リズムを定量解析した。その結果、明暗条件（ライト・オン７時−１９時）で飼育したラットでは、ＺＴ１１で最も強く、ＺＴ１７で弱まるＮＭＳの発現リズムが見られた（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒｔｉｍｅ，ＺＴ；ＺＴ０，ライト・オン；ＺＴ１２，ライト・オフ）。また、恒暗条件で２日間飼育したラットではこの発現リズムは消失していた。
実施例１２
脳室内投与されたＮＭＳによる自発運動の概日リズムの位相シフト
概日リズムの位相シフトの実験にはオスのＷｉｓｔａｒラット（３００−３５０ｇ）を使用した。脳室内投与はＩｄａら（Ｉｄａ，Ｔ．ら、（１９９９）ＢｒａｉｎＲｅｓ．、８２１巻、５２６頁、１９９９年）の方法に従った。自発運動はＮａｋａｈａｒａら（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３１８巻、１５６頁、２００４年）の方法に従って測定した。自発運動リズムの位相シフトは、ＮＭＳまたは生理的食塩水の脳室内投与の前および後のそれぞれ少なくとも１０日間における日々の自発運動開始時刻の遅れをプロットした線の間隔に基づいて計算した。自発運動開始時刻をＣＴ１２（ｃｉｒｃａｄｉａｎｔｉｍｅ１２）とした。位相応答データはＳｃｈｅｆｆｅ’ｓｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｔｅｓｔによるｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡによって評価した。ｃ−Ｆｏｓ蛋白質の免疫染色においては、ラットを２週間恒暗条件下で飼育し、ＣＴ６で実施例１４に記載された方法によって作製し、生理的食塩水に溶解した１ｎｍｏｌのラットＮＭＳまたは生理的食塩水を脳室内に投与した。投与９０分後に、２％のパラホルムアルデヒドを灌流した。ｃ−Ｆｏｓ蛋白質の免疫染色はＤａｔｅら（Ｄａｔｅ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、７４８頁、１９９９年）の方法に従って行った。視交叉上核への核内投与は、Ｐｉｇｇｉｎｓら（Ｐｉｇｇｉｎｓ，Ｈ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１５巻、５６１２頁、１９９５年）の方法を改良して行った。ラットを２週間恒暗条件下で自由に動ける状態で飼育した。その後、各ラットに２６−ゲージのステンレススチール製ガイドカニューレをＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｃ．、Ｔｈｅｒａｔｂｒａｉｎｉｎｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＵＳＡ、１９９８年）の座標に従って視交叉上核に到達するように装着した。実施例１４に記載された方法によって作製したラットＮＭＳは１μｌの生理的食塩水に溶解し、３１ゲージのステンレススチールインジェクターを用いてガイドカニューレの終末よりさらに１ｍｍ下方に挿入して投与した。自発的運動を投与の前および後それぞれ２週間の間、Ｎａｋａｈａｒａら（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３１８巻、１５６頁、２００４年）の方法に従って記録した。正確なカニューレ位置は実験期間終了時に組織学的分析によって以下のようにして確認した。ラットに１μｌのＩｎｄｉａｉｎｋを投与して投与位置を標識した後、断頭した。脳を直ちに凍結した後、クライオスタットによって２０μｍの冠状切片を採取し、クリスタルバイオレットによって染色した。切片をＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｃ．、Ｔｈｅｒａｔｂｒａｉｎｉｎｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＵＳＡ、１９９８年）のラット脳アトラスの対応する切片と比較した。投与位置が視交叉上核の外へ２００μｍ以上離れていた場合は得られたデータを除外した。
視交叉上核では、ＴＧＲ１ｍＲＮＡはＦＭ−３ｍＲＮＡより多く発現してはいるが、ＮＭＳに対する二つの受容体が発現していた。そこで、恒暗条件下で飼育したラットにおける自発運動の概日リズムに対するＮＭＳの脳室内投与の効果について検討した。ラットＮＭＳを１ｎｍｏｌ、ＣＴ３−９で投与すると、自発運動の位相を進め、ＣＴ２２−２４での投与は位相の遅れを引き起こした。それ以外の時間では位相シフトは観察されなかった。ＮＭＳによる位相応答曲線は有意に変動していた（ＡＮＯＶＡ，Ｆ（１４，２８）＝２．５４９，Ｐ＜０．０５）。これらの結果は位相および投与量の両方に依存した。生理的食塩水の投与は同一条件下において位相に変化を生じなかった。概日周期の長さは、いかなる時間においてもＮＭＳの脳室内投与による影響を受けなかった。さらに、生理的食塩水を投与した対照ラットと比較して、ＮＭＳの脳室内投与後に、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質（ニューロンの活性化のマーカー）の発現が視交叉上核で増加した。ｃ−Ｆｏｓ蛋白質は、視交叉上核の腹外側部で特に発現していた。さらに視交叉上核の機能に対するＮＭＳの効果を試験するために、視交叉上核へＮＭＳをマイクロインジェクションにより直接投与した。核内に投与されたＮＭＳは、脳室内投与の場合と同様にＣＴ６とＣＴ２３とで自発運動の概日リズムにおける位相の進みおよび遅れをそれぞれ引き起こした。生理食塩水投与は効果がなかった。これらのデータは、内在性のＮＭＳが受容体を介して視交叉上核の機能に強い効果を示すことを示唆した。
実施例１３
ＮＵＮＰおよびＮＳＮＰのプロラクチン分泌作用
中枢投与によるプロラクチン血中濃度の変化を調べた。ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｒａｔへの中枢投与は実施例９と同様に行った。実施例１４に記載された方法によって作製し、生理的食塩水に溶解したラットＮＵＮＰ−３６またはラットＮＳＮＰ−３７を投与後、２０分で断頭採血、またはペプチド投与後、各時間に尾静脈より採血した。プロラクチンの測定はＲＩＡｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。また、下垂体前葉細胞への直接作用を検討した。下垂体前葉細胞はＷｉｓｔａｒラット（５週令・オス）から調製、９６ｗｅｌｌプレート（５．０Ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で２日間培養し、実験に用いた。ラットＮＵＮＰ−３６またはラットＮＳＮＰ−３７添加後、３０分で培養上清を回収し、プロラクチン濃度を測定した。
ラットＮＵＮＰ−３６またはラットＮＳＮＰ−３７を１ｎｍｏｌ中枢投与２０分後に採血、血中ホルモン濃度の測定を行った結果、ラットＮＵＮＰ−３６は生食投与群に対して有意に血中プロラクチン濃度が上昇していた（ｓａｌｉｎｅ，７．３５±１．５３ｎｇ／ｍｌ；ＮＵＮＰ１ｎｍｏｌ，６８．７４±１０．４ｎｇ／ｍｌ）。ラットＮＳＮＰ−３７でも弱いながらも有意に上昇していた（２７．３４±５．６３ｎｇ／ｍｌ）。一方、血中甲状腺刺激ホルモン濃度はラットＮＵＮＰ−３６またはラットＮＳＮＰ−３７の投与によって有意に減少した（ｓａｌｉｎｅ，７．３７±０．８５ｎｇ／ｍｌ；ＮＵＮＰ１ｎｍｏｌ，４．９２±０．２２ｎｇ／ｍｌ；ＮＳＮＰ１ｎｍｏｌ，５．３７±０．５１ｎｇ／ｍｌ）。さらに、ラットＮＵＮＰ−３６投与によって血中濾卵胞刺激ホルモン濃度の有意な上昇が認められた（ｓａｌｉｎｅ，８．０８±１．１０ｎｇ／ｍｌ；ＮＵＮＰ１ｎｍｏｌ，１２．２６±０．９５ｎｇ／ｍｌ；ＮＳＮＰ１ｎｍｏｌ，１０．６４±０．７２ｎｇ／ｍｌ）。他の血中ホルモン（成長ホルモン、黄体形成ホルモン、コルチコステロン）濃度には、成長ホルモン濃度の上昇傾向が認められたが、有意な変化は認められなかった。
また、ラットＮＵＮＰ−３６中枢投与によって顕著な血中プロラクチン濃度を認めたため、用量・時間依存性について検討した。その結果、１ｎｍｏｌ、０．２ｎｍｏｌで投与後１０分から有意なプロラクチン濃度の上昇が見られ、２０分でピークに達していた。
さらに、下垂体への直接もしくは、間接作用かを下垂体前葉細胞初代培養系を用いて検討した結果、培養上清中のプロラクチンはＴＲＨ濃度依存的に増加したが、ラットＮＵＮＰ−３６では全く変化が認められなかった。このため、ラットＮＵＮＰ−３６中枢投与による血中プロラクチン濃度の上昇は脳内のプロラクチン分泌調節系に作用していると推定された。
実施例１４
ＮＭＳ、ＮＳＮＰおよびＮＵＮＰの合成
本実施例に記載のヒト、ラットおよびマウスニューロメジンＳ（配列番号：１、２および３）、ヒト、ラットおよびマウスニューロメジンＳＮ末ペプチド−３４（配列番号：７、９および１１）、ヒト、ラットおよびマウスニューロメジンＳＮ末ペプチド−３７（配列番号：８、１０および１２）、ヒト、ラットおよびマウスニューロメジンＵＮ末ペプチド−３３（配列番号：３７、３９および４１）およびヒト、ラットおよびマウスニューロメジンＵＮ末ペプチド−３６（配列番号：３８、４０および４２）の合成は４３１Ａｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付の説明書に従い、Ｆｍｏｃ固相合成法により行なった。合成終了後、樹脂をメタノールにて洗浄・乾燥し、続いて適当量のｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇｍｉｘｔｕｒｅ（組成：結晶フェノール、１．５ｇ；水、１ｍｌ；ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ、１ｍｌ；１，２−ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ、０．５ｍｌ；ＴＦＡ、２０ｍｌ）中で３時間撹拌することにより保護基を切り離した。ジエチルエーテルにて合成化合物を洗浄後、適当量の０．１％ＴＦＡに溶解しＳＰＷ−Ｃ−ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ケムコ社）にて夾雑物の除去を行なった。粗精製された合成ペプチドはμＢＯＮＤＡＳＨＥＲＥ１５μ Ｃ_１８−３００Åを用いた逆相ＨＰＬＣにより単一ピークに精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＰｒｏ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびペプチドシークエンサー（４９４ｃＬＣ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて最終的に得られた合成ペプチドの構造を確認した。
実施例１５
ＮＭＳによるプロラクチン分泌抑制作用
ＮＭＳの中枢投与によるプロラクチン血中濃度の変化を調べた。Ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｒａｔへの中枢投与は実施例９と同様に行った。採血はペプチド投与２０分後に断頭によって行った。プロラクチンの測定はＲＩＡｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。
実施例１４に記載された方法によって作製し、生理的食塩水に溶解したラットＮＭＳ１ｎｍｏｌを中枢投与した後、血中ホルモン濃度の測定を行った結果、ＮＭＳ投与群では生食投与群に対して有意に血中プロラクチン濃度が低下していた（ｓａｌｉｎｅ，１３．１±１．８ｎｇ／ｍｌ；ＮＭＳ１ｎｍｏｌ，３．６±１．２ｎｇ／ｍｌ，ｐ＜０．０００１）。ＮＭＳは中枢投与によってプロラクチンの分泌を抑制することが示された。

（１）（ｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、（ｉｉ）上記ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、消化管収縮作用、平滑筋収縮作用、血圧上昇作用、摂食抑制作用、プロラクチン分泌低下作用などを有し、概日リズムにおける位相の進みおよび遅れに関連し、例えば、低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群、不妊症などの予防・治療に有用である。
（２）（ｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に対する抗体、（ｉｉ）上記ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症などの予防・治療に有用である。
（３）（ｉ）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩、（ｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、プロラクチン分泌作用などを有し、例えば、更年期障害、甲状腺機能亢進症などの予防・治療に有用である。
（４）（ｉ）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、不妊症、甲状腺機能不全症の予防・治療に有用である。
（５）（ｉ）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩、（ｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、プロラクチン分泌作用を有し、例えば、更年期障害、甲状腺機能亢進症の予防・治療に有用である。
（６）（ｉ）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体、（ｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、不妊症、甲状腺機能不全症の予防・治療に有用である。
（７）（ｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、および（または）（ｉｉ）配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩、および（または）（ｉｉｉ）配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩は、例えば、低血圧、肥満症、嗜眠症、時間帯域変化症候群、不妊症、高血圧、拒食症、更年期障害、不眠症などの予防・治療剤のスクリーニングに有用である。
（８）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩は、例えば、更年期障害、甲状腺機能亢進症、不妊症、甲状腺機能不全症などの予防・治療剤のスクリーニングに有用である。
（９）配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１または配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩は、例えば、更年期障害、甲状腺機能亢進症、不妊症、甲状腺機能不全症の予防・治療剤のスクリーニングに有用である。

Claims

配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのアミド体またはその塩。
配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのアミド体またはその塩。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのアミド体またはその塩。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞内Caイオン濃度上昇活性、FM-3結合活性、TGR-1結合活性、直腸収縮活性、血圧上昇活性、摂食抑制作用、自発運動の概日リズムの位相シフト作用、およびプロラクチン分泌抑制作用のいずれかから選ばれる作用を有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
ＤＮＡである請求項５記載のポリヌクレオチド。
配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表される塩基配列からなる請求項６記載のＤＮＡ。
請求項５記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
請求項８記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。
配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。
配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。
配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞内Caイオン濃度上昇活性、FM-3結合活性、TGR-1結合活性、直腸収縮活性、血圧上昇活性、摂食抑制作用、自発運動の概日リズムの位相シフト作用、およびプロラクチン分泌抑制作用のいずれかから選ばれる作用を有するポリペプチドまたはそのアミド体またはその塩。
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
ＤＮＡである請求項１４記載のポリヌクレオチド。
配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：１８で表される塩基配列からなる請求項１５記載のＤＮＡ。
請求項１４記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
請求項１７記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩。
配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプロラクチン分泌作用を有するポリペプチドまたはその塩。
請求項１９または２０記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
ＤＮＡである請求項２１記載のポリヌクレオチド。
配列番号：２０、配列番号：２２または配列番号：２４で表される塩基配列からなる請求項２２記載のＤＮＡ。
請求項２１記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
請求項２４記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
請求項１〜４、１０〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの細胞内Caイオン濃度上昇活性、FM-3結合活性、TGR-1結合活性、直腸収縮活性、血圧上昇活性、摂食抑制作用、自発運動の概日リズムの位相シフト作用、およびプロラクチン分泌抑制作用のいずれかから選ばれる作用を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（i）請求項１〜４、１０〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、および（ii）配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその塩を用いる請求項２６記載のスクリーニング方法。
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその塩を用いる請求項２７記載のスクリーニング方法。
（i）請求項１〜４、１０〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩、および（ii）配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその塩を用いる請求項２６記載のスクリーニング方法。
配列番号：３１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその塩を用いる請求項２９記載のスクリーニング方法。
請求項１〜４、１０〜１３のいずれか１項記載のポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの細胞内Caイオン濃度上昇活性、FM-3結合活性、TGR-1結合活性、直腸収縮活性、血圧上昇活性、摂食抑制作用、自発運動の概日リズムの位相シフト作用、およびプロラクチン分泌抑制作用のいずれかから選ばれる作用を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
さらに、配列番号：２５、配列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその塩を含有する請求項３１記載のスクリーニング用キット。
さらに、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質またはその塩を含有する請求項３１記載のスクリーニング用キット。
請求項１９または２０記載のポリペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドのプロラクチン分泌作用を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
請求項１９または２０記載のポリペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドのプロラクチン分泌作用を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
配列番号：１または配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
請求項５または請求項１４記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部分からなるアンチセンスポリヌクレオチド。
請求項１９または２０記載のポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩に対する抗体。
請求項２１記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部分からなるアンチセンスポリヌクレオチド。
外来性の、請求項５、請求項１４または請求項２１記載のポリヌクレオチドを有する非ヒトトランスジェニック動物。
外来性の、請求項５、請求項１４または請求項２１記載のポリヌクレオチドを含有し、非ヒト動物において発現しうる組換えベクター。
請求項５、請求項１４または請求項２１記載のポリヌクレオチドが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞。
請求項５、請求項１４または請求項２１記載のポリヌクレオチドが不活性化された、該ポリヌクレオチド発現不全非ヒト哺乳動物。