JP2002078492A - スクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】肥満症、高血圧症、ストレス性疾患の予防・治
療薬のスクリーニング方法などの提供。 【解決手段】ニューロメジンＵもしくはその誘導体また
はその塩およびＴＧＲ−１またはその塩を用いることを
特徴とするニューロメジンＵまたはその塩とＴＧＲ−１
またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその
塩のスクリーニング方法など。 【効果】本発明のニューロメジンＵもしくはその誘導体
またはその塩およびＴＧＲ−１またはその塩を用いるこ
とを特徴とするニューロメジンＵまたはその塩とＴＧＲ
−１またはその塩との結合性を変化させる化合物または
その塩のスクリーニング方法は、肥満症、高血圧症、ス
トレス性疾患等の予防・治療薬などをスクリーニングす
るために用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト精巣およびラ
ット子宮由来の新規レセプター蛋白質であるＴＧＲ−
１、ＴＧＲ−１をコードするＤＮＡ、ＴＧＲ−１とニュ
ーロメジンＵ（Minamino, N. et al., Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 130, 1078-1085, 1985など）もしくは
その誘導体またはその塩を用いることを特徴とする高血
圧症、ストレス性疾患などの予防・治療薬または食欲調
節剤などのスクリーニング方法などに関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプターを通じて生体の機能を調
節している。これらのレセプターの多くは共役している
guanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質
と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグ
ナル伝達を行い、また７個の膜貫通領域を有する共通し
た構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ーあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。この
ようなホルモンや神経伝達物質とＧ蛋白質共役型レセプ
ターとの相互作用を通じて生体のホメオスタシスの維
持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器
系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの
生体にとって重要な機能調節が行われている。このよう
に生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質に
対するレセプター蛋白質が存在し、その機能調節に重要
な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作
用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対
するレセプターが存在するかどうかについては未だ不明
なことが多い。近年、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
がその構造の一部にアミノ酸配列の類似性を示すことを
利用して、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(Pol
ymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法
によって新規レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを探
索する方法が行われるようになり、数多くの、リガンド
が不明ないわゆるオーファンＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質がクローニングされている(Libert, F., et al.
Science, 244, 569-572, 1989, Welch, S.K., etal., B
iochem. Biophys. Res. Commun., 209, 606-613, 1995,
Marchese, A.,et al., Genomics, 23, 609-618, 1994,
Marchese, A., Genomics, 29, 335-344, 1995)。ま
た、ゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのランダムな配列決
定によっても、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が
次々と見出されている(Nomura, N.,et al., DNA Resear
ch 1巻、27-35頁、1994年）。これらのオーファンＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質のリガンドを決定する一般
的な手段としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
一次構造上の類似性から推定するしかなかった。しか
し、多くのオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
は既知のレセプターとのホモロジーが低いものが多く、
実際は既知リガンドのレセプターサブタイプである場合
を除いては一次構造上の類似性だけでそのリガンドを推
定することは困難であった。一方、遺伝子解析から多く
のオーファンＧ蛋白質共役型レセプターがみつかってい
ることから対応する未知のリガンドがまだ数多く存在し
ていることが推定されているが、これまで実際にオーフ
ァンＧ蛋白質共役型レセプターのリガンドを同定した例
は数少ない。一方、ニューロメジンＵはラットの子宮平
滑筋収縮活性を指標とし、ブタの脊髄より単離・精製さ
れたペプチドで、８アミノ酸残基からなるニューロメジ
ンＵ-８および２５アミノ酸残基からなるニューロメジ
ンＵ-２５の２種が最初に報告されている（Minamino,
N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 130, 107
8-1085, 1985）。ニューロメジンＵ-８の配列はニュー
ロメジンＵ-２５のＣ末端部分に一致し、その上流には
プロセッシングによって切断を受ける部位によく見られ
るような塩基性アミノ酸ペアが存在することから、両者
は共通の前駆体に由来するものと考えられる。平滑筋収
縮作用の他にもニューロメジンＵの生理作用は広く知ら
れており、例えば、血圧上昇（Minamino, N. et a
l.）、内蔵の血流量の低下（Sumi, S. et al., Life Sc
i. 41, 1585-1590, 1987）、腸管におけるイオン輸送の
調節（Brown, D.R. and Quito, F.L., Eur. J. Pharmac
ol. 155, 159-162, 1988）、皮下投与後のACTHおよびそ
れに引き続くコルチコステロンの上昇（Malendowicz,
L.K. et al., In Vivo, 7, 419-422, 1993）などが報告
されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これまでニューロメジ
ンＵのレセプターとして、ＦＭ−３が報告されている
（WO 00/02918）が、ＦＭ−３以外の受容体の存在を探
索し、ニューロメジンＵの生理的役割をさらに多面的に
明らかにし、その機構を活性化、あるいは阻害する化合
物をスクリーニングして新たな医薬を開発する必要があ
った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規オーフ
ァンＧ蛋白質共役型レセプターであるＴＧＲ−１を見出
し、該ＴＧＲ−１発現CHO細胞に対してニューロメジン
Ｕが、予想外にも特異的な細胞刺激活性を有することを
見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた
結果、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）ニューロメジ
ンＵもしくはその誘導体またはその塩および配列番号：
１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質ま
たはその塩を用いることを特徴とするニューロメジンＵ
またはその塩と配列番号：１または配列番号：２１で表
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）ニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその
塩および配列番号：１または配列番号：２１で表される
アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列
を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴と
するニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：１また
は配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはそ
の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク
リーニング用キット、（３）上記（１）記載のスクリー
ニング方法または上記（２）記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる、ニューロメジンＵまたはその
塩と配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合
物またはその塩、（４）上記（３）記載の化合物または
その塩を含有してなる医薬、（５）肥満症、高血圧症ま
たはストレス性疾患の予防・治療薬である上記（４）記
載の医薬、（６）ニューロメジンＵが配列番号：１１で
表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するペプチドである上記（１）記載の
スクリーニング方法または上記（２）記載のスクリーニ
ング用キット、（７）配列番号：１または配列番号：２
１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質ま
たはその塩、（８）上記（７）記載の蛋白質をコードす
るＤＮＡを含有するＤＮＡ、（９）配列番号：２または
配列番号：２２で表される塩基配列を有する上記（８）
記載のＤＮＡ、（１０）上記（８）記載のＤＮＡを含有
する組換えベクター、（１１）上記（１０）記載の組換
えベクターで形質転換させた形質転換体、（１２）上記
（１１）記載の形質転換体を培養し、上記（７）記載の
蛋白質を生成せしめることを特徴とする上記（７）記載
の蛋白質またはその塩の製造法、および（１３）上記
（７）記載の蛋白質またはその塩に対する抗体などを提
供するものである。本発明におけるニューロメジンＵに
関して、具体的には、上述のニューロメジンＵまたはそ
の塩などがあげられるのみならず、（１４）配列番号：
５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列
番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番
号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表わ
されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ポリペプチド）
であるニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその
塩などがあげられる。

【０００６】また、本発明のニューロメジンＵはそのＣ
末端アミノ酸残基のカルボキシル基がアミド体であるこ
とが好ましい。本発明におけるＴＧＲ−１とは上述の配
列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配
列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
蛋白質またはその塩のことを意味するが、（１５）配列
番号：１７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実
質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその
塩、または（１６）配列番号：１、配列番号：１７また
は配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の１個以
上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ
酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１、配列番号：
１７または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列に
１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下の
アミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配
列、あるいは配列番号：１、配列番号：１７または配列
番号：２１で表わされるアミノ酸配列で表わされるアミ
ノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上
１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩などもＴＧＲ−
１の具体例としてあげられる。また、より具体的には、
配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番
目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を
含有する蛋白質、配列番号：１７で表されるアミノ酸配
列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈ
ｒ）のアミノ酸配列を含有する蛋白質などもＴＧＲ−１
の具体例としてあげられる。

【０００７】本発明で用いられるＴＧＲ−１またはその
塩（以下、単にＴＧＲ−１と略称する場合がある）およ
びニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその塩
（以下、単にニューロメジンＵと略称する場合がある）
の製造法を以下にさらに詳細に説明する。本発明で用い
られるＴＧＲ−１およびニューロメジンＵとしては、ヒ
ト、温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、
ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリなど）、両
生類（例えば、カエルなど）および魚類などのあらゆる
組織（たとえば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖
腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消
化管、血管、心臓など）または細胞などに由来する蛋白
質（（ポリ）ペプチド）であって、ＴＧＲ−１として
は、配列番号：１または配列番号：２１、ニューロメジ
ンＵとしては配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
蛋白質（（ポリ）ペプチド）であれば如何なるものであ
ってもよい。例えば、ＴＧＲ−１としては、配列番号：
１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有
する蛋白質などの他に、配列番号：１または配列番号：
２１で表される蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋
白質などがあげられる。該「実質的に同一」とは、例え
ば、リガンド（ニューロメジンＵ）と受容体（ＴＧＲ−
１）の結合活性、生理的な特性などが、実質的に同じこ
とを意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加あるいは挿
入はしばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特
性に大きな変化をもたらさないが、こうした場合その置
換、欠失、付加あるいは挿入を施された蛋白質（（ポ
リ）ペプチド））（いわゆるニューロメジンＵ改変体、
ＴＧＲ−１改変体など）は、そうした置換、欠失、付加
あるいは挿入のされていないものと実質的に同一である
とされる。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一
な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するとこ
ろのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができ
る。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロ
イシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルア
ラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられ
る。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、
スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グ
ルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）ア
ミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどが
あげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、
アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。

【０００８】したがって、受容体結合活性の強さなどの
強弱、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていても
よい。より具体的には、配列番号：１または配列番号：
２１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列としては、例えば、配列番号：１または配列番
号：２１で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、よ
り好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９８％
以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列としては、例えば、部分アミノ酸配
列としてLeu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-Pheまた
はSer-Met-Hisで表されるアミノ酸配列を含有し、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、よ
り好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９８％
以上の相同性を有するアミノ酸配列などが好ましい。本
発明の配列番号：１または配列番号：２１で表わされる
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
タンパク質としては、例えば、配列番号：１または配列
番号：２１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列を有し、配列番号：１または配列番号：２
１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有
するタンパク質などが好ましい。特に、本発明の配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するタンパク質としては、部分アミノ酸配
列としてLeu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-Pheまた
はSer-Met-Hisで表されるアミノ酸配列を含有し、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質が好まし
い。

【０００９】実質的に同質の活性としては、例えば、リ
ガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられ
る。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質で
あることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグ
ナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜
１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましく
は約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの
活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異な
っていてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達
作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行な
うことができるが、例えば、後述するスクリーニング方
法などに従って測定することができる。また、配列番
号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：
１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の
１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より
好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１
〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列
番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配
列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、
より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個
（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたア
ミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。特に、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一
のアミノ酸配列としては、部分アミノ酸配列としてLe
u-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-PheまたはSer-Met-H
isで表されるアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失
したアミノ酸配列、部分アミノ酸配列としてLeu-Phe-
Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-PheまたはSer-Met-Hisで表
されるアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜
３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミ
ノ酸配列、部分アミノ酸配列としてLeu-Phe-Val、Trp
-Ser-Glu、Val-Phe-PheまたはSer-Met-Hisで表されるア
ミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個
程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましく
は数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたア
ミノ酸配列を含有する蛋白質などが好ましく用いられ
る。また、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末
端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：１７で表される
アミノ酸配列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番
目（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を含有する蛋白質などもＴ
ＧＲ−１の具体例としてあげられる。

【００１０】一方、本発明のニューロメジンＵとして
は、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を含有す
る（ポリ）ペプチドなどの他に、配列番号：１１で表わ
されるアミノ酸配列を含有する（ポリ）ペプチドと実質
的に同質の活性を有する（ポリ）ペプチドなどがあげら
れる。実質的に同質の活性としては、例えばレセプター
結合活性などがあげられる。実質的に同質とは、レセプ
ター結合活性などが性質的に同質であることを示す。し
たがって、レセプター結合活性の強さなどの強弱、（ポ
リ）ペプチドの分子量などの量的要素は異なっていても
よい。本明細書におけるＴＧＲ−１およびニューロメジ
ンＵはペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミ
ノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
例えば、配列番号：１もしくは配列番号：２１または配
列番号：１１で表されるアミノ酸配列などを含有する蛋
白質または（ポリ）ペプチドはＣ末端が通常カルボキシ
ル基（-COOH）またはカルボキシレート(-COO^-)である
が、Ｃ末端がアミド（-CONH₂）またはエステル(-COOR)
であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチ
ル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−
ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、シクロペンチル、シク
ロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、フェニル、
α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、ベンジル、フェ
ネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキ
ル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−
Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口
用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基
などがあげられる。本発明で用いられるニューロメジン
ＵとしてはＣ末端のカルボキシル基（-COOH）がアミド
（-CONH₂）であるものが好ましい。

【００１１】本発明で用いられるＴＧＲ−１およびニュ
ーロメジンＵの塩としては、生理学的に許容される塩基
（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）と
の塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸
付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明で
用いられるＴＧＲ−１およびニューロメジンＵは、公知
の方法（例、FEBS Letters 398 (1996) 253-258、WO 96
/18651号公報記載の方法）に準じた方法、即ち、ヒトや
温血動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する
方法によって製造することもできるし、後述の蛋白質
（ペプチド）合成法に準じて製造することもできる。ま
た、後述する蛋白質（ペプチド）をコードするＤＮＡを
含有する形質転換体を培養することによっても製造する
ことができる。

【００１２】ヒト、温血動物、両生類、魚類などの組織
または細胞から製造する場合、ヒト、温血動物、両生
類、魚類などの組織または細胞をホモジナイズした後、
酸、有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透
析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。上記したように本発明で用い
られるＴＧＲ−１およびニューロメジンＵは、自体公知
の蛋白質（（ポリ）ペプチド）の合成法に従って、ある
いはＴＧＲ−１および／またはニューロメジンＵを含有
する蛋白質（（ポリ）ペプチド）を適当なペプチダーゼ
で切断することによって製造することができる。蛋白質
（（ポリ）ペプチド）の合成法としては、例えば固相合
成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、
ＴＧＲ−１および／またはニューロメジンＵを構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的の蛋白質（（ポリ）ペプチド）を製造する
ことができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては
例えば、以下の〜に記載された方法があげられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年)； SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年)； 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年）； 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タ
ンパク質の化学IV、 205、(1977年)； 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合
成 広川書店。

【００１３】また、反応後は通常の精製法、たとえば、
溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロ
マトグラフィー・再結晶などを組み合わせて蛋白質
（（ポリ）ペプチド）を精製単離することができる。上
記方法で得られる蛋白質（（ポリ）ペプチド）が遊離体
である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換する
ことができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法
によって遊離体に変換することができる。ＴＧＲ−１お
よびニューロメジンＵのアミド体は、アミド形成に適し
た市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そ
のような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒド
ロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノ
メチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹
脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、
４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチ
ル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメ
トキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、
４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチ
ル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このよ
うな樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保
護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、
自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。
反応の最後に樹脂から蛋白質（（ポリ）ペプチド）を切
り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希
釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、
目的の蛋白質（（ポリ）ペプチド）を取得する。上記し
た保護されたアミノ酸の縮合に関しては、蛋白質（（ポ
リ）ペプチド）合成に使用できる各種活性化試薬を用い
ることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カ
ルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカル
ボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドなどがあげられる。これらによる活
性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBT、HOOBTな
ど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加する
かまたは、対称酸無水物またはHOBTエステルあるいはHO
OBTエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活
性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護
されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶
媒としては、蛋白質（（ポリ）ペプチド）縮合反応に使
用しうることが知られている溶媒から適宜選択されう
る。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸
アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン
化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコー
ル類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピ
リジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロ
フランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニ
トリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなど
のエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用い
られる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得
ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−
２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化され
たアミノ酸誘導体は通常１．５ないし４倍過剰で用いら
れる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が
不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応
を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。
反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、
無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応ア
ミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさない
ようにすることができる。原料アミノ酸のアミノ基の保
護基としては、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーペン
チルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニ
ル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br
-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセ
チル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスル
フェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが
あげられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえ
ばＲとして上記したＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアル
キル基、Ｃ_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、
４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロ
ロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボ
ニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒド
ラジド、トリチルヒドラジドなどがあげられる。

【００１４】セリンおよびスレオニンの水酸基は、たと
えばエステル化またはエーテル化によって保護すること
ができる。このエステル化に適する基としては例えばア
セチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基など
のアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシ
カルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげら
れる。また、エーテル化に適する基としては、たとえば
ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブ
チル基などである。チロシンのフェノール性水酸基の保
護基としては、たとえばBzl、Cl₂-Bzl、２−ニトロベン
ジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどがあげられる。ヒ
スチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メ
トキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベ
ンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどがあげ
られる。原料のカルボキシル基の活性化されたものとし
ては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステ
ル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、
2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノー
ル、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、
HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイ
ミド、HOBT）とのエステル］などがあげられる。原料の
アミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応す
るリン酸アミドなどがあげられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、たとえばPd黒あるいはPd炭素などの
触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無
水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタン
スルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液
などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、ト
リエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩
基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元な
どもあげられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−
２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においては
アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾ
ール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタ
ンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン
捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダ
ゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基
はチオフェノール処理により除去され、トリプトファン
のインドール保護基として用いられるホルミル基は上記
の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの
存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウ
ム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除
去される。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護
および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与
する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段
から適宜選択しうる。

【００１５】ＴＧＲ−１およびニューロメジンＵのアミ
ド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端
アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミ
ノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペ
プチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた
ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除い
たペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプ
チドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反
応の詳細については上記と同様である。縮合により得ら
れた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべて
の保護基を除去し、所望の粗蛋白質（（ポリ）ペプチ
ド）を得ることができる。この粗蛋白質（（ポリ）ペプ
チド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画
分を凍結乾燥することで所望の蛋白質（（ポリ）ペプチ
ド）のアミド体を得ることができる。ＴＧＲ−１および
ニューロメジンＵのエステル体を得るにはカルボキシ末
端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類
と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質（（ポリ）
ペプチド）のアミド体と同様にして所望の蛋白質（（ポ
リ）ペプチド）のエステル体を得ることができる。本発
明で用いられるニューロメジンＵの誘導体としては、
ニューロメジンＵの部分ペプチド、ニューロメジンＵ
の構成アミノ酸が欠失したペプチド、構成アミノ酸に他
のアミノ酸が付加したペプチド、構成アミノ酸が他のア
ミノ酸に置換されたペプチド、またはニューロメジン
Ｕ、上記記載の部分ペプチドまたは上記記載のペプ
チドが標識化されたものなど、ＴＧＲ−１との結合能を
有するものであれば何れのものであってもよい。ニュー
ロメジンＵの部分ペプチドとして具体的には、配列番
号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドも
しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩な
どがあげられる。なかでも、配列番号：１６で表わされ
るアミノ酸配列を有するペプチドのＣ末端のカルボキシ
ル基がアミド化されたものまたはその塩が好ましい。

【００１６】該ニューロメジンＵの部分ペプチドは、上
述のニューロメジンＵを適当なペプチダーゼで切断する
ことによって製造することができるし、上記の蛋白質
（（ポリ）ペプチド）の合成法に従って製造することが
できる。ニューロメジンＵの部分ペプチドのアミドまた
はエステルも上述のアミド体またはエステル体の製造方
法に準じて製造することができる。さらにニューロメジ
ンＵの部分ペプチドの塩としては、上記のＴＧＲ−１お
よびニューロメジンＵの塩と同様のものなどがあげられ
る。また、ニューロメジンＵの構成アミノ酸が欠失した
ペプチド、構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加したペプ
チド、構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチ
ドとしては、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中
の１個以上３個以下、好ましくは１個または２個のアミ
ノ酸が欠失したアミノ酸配列、または、配列番号：１１
で表されるアミノ酸配列に１個以上３個以下、好ましく
は１個または２個のアミノ酸が付加した（または挿入さ
れた）アミノ酸配列、あるいは配列番号：１１で表され
るアミノ酸配列中の１個以上３個以下、好ましくは１個
または２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ
ノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。さら
に、構成アミノ酸が欠失したペプチド、構成アミノ酸に
他のアミノ酸が付加したペプチド、構成アミノ酸が他の
アミノ酸に置換されたペプチドとしては、配列番号：
５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列
番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番
号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表わ
されるアミノ酸配列中の１個以上３個以下、好ましくは
１個または２個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配
列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：
８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、
配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５
で表わされるアミノ酸配列に１個以上３個以下、好まし
くは１個または２個のアミノ酸が付加した（または挿入
された）アミノ酸配列、あるいは配列番号：５、配列番
号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、
配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配
列番号：１４または配列番号：１５で表わされるアミノ
酸配列中の１個以上３個以下、好ましくは１個または２
個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列
を含有するペプチドなどもあげられる。

【００１７】該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同
一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属すると
ころのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができ
る。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロ
イシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルア
ラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられ
る。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、
スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グ
ルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）ア
ミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどが
あげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、
アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。ニュ
ーロメジンＵ、上記記載の部分ペプチドまたは上記
記載のペプチドが標識化されたものとしては、自体公知
の方法で、アイソトープラベル化されたもの、蛍光標識
されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標
識）、ビオチン化されたもの、酵素標識されたものなど
があげられる。具体的には、例えば公知の方法によっ
て、〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔 ³⁵Ｓ〕などで標
識されたニューロメジンＵなどを利用することができ
る。ニューロメジンＵの誘導体の塩としては、上記のＴ
ＧＲ−１およびニューロメジンＵの塩と同様のものなど
があげられる。本発明で用いられるＴＧＲ−１をコード
するＤＮＡとしては、配列番号：１または配列番号：２
１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡ、本発明で用いられるニューロメジン
ＵをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１で表わ
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡを含有
するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。ま
た、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記し
た組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来
のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファ
ージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれ
であってもよい。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ
画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptas
e Polymerase Chain Reaction (以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と
略称する)によって増幅することもできる。配列番号：
１で表されるアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば配列番
号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげ
られ、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有す
るＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとし
ては、例えば配列番号：２２で表される塩基配列を含有
するＤＮＡなどがあげられ、配列番号：１７で表される
アミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号：１８で表
される塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられる。

【００１８】さらに、配列番号：１で表されるアミノ酸
配列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈ
ｒ）のアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードする
ＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号：２
で表される塩基配列の５’末端から１０番目（Ａ）〜１
２４５番目（Ｃ）の塩基配列を含有するＤＮＡをなどが
あげられ、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列のＮ
末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のア
ミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを
含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号：１８で表さ
れる塩基配列の５’末端から１０番目（Ａ）〜１２４５
番目（Ｃ）の塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられ
る。特に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有
するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡと
しては、例えば、部分塩基配列として-CTGTTTGTC-（配
列番号：２中の第808番目（C）〜第816番目（C）で表さ
れる部分塩基配列）、-TGGAGTGAA-（配列番号：２中の
第888番目（T）〜第896番目（A）で表される部分塩基配
列）、-GTCTTCTTC-（配列番号：２中の第940番目（G）
〜第948番目（C）で表される部分塩基配列）または-TCC
ATGCAC-（配列番号：２中の第1159番目（T）〜第1167番
目（C）で表される部分塩基配列）で表される塩基配列
を含有し、配列番号：２で表される塩基配列を含有する
ＤＮＡなどが好ましく用いられる。より具体的には、
(1)ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、配列
番号：２１または配列番号：１１で表わされるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
する蛋白質または（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、(2)遺
伝コードの縮重のため、配列番号：１、配列番号：２１
または配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質
または（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡを含有する
ＤＮＡおよび(1)に定められている配列とハイブリッド
形成しないが、同一アミノ酸配列をもつ蛋白質または
（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられ
る。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるい
はそれに準じた方法に従って行うことができる。上記ス
トリンジェントな条件としては、例えば４２℃、５０％
ホルムアミド、４×ＳＳＰＥ(１×ＳＳＰＥ＝150mM NaC
l, 10mM NaH₂PO₄・H₂O, 1mM EDTA pH7.4)、５×デンハー
ト溶液、０．１％ＳＤＳである。

【００１９】本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニュ
ーロメジンＵをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的
手法によっても製造することができる。本発明のＴＧＲ
−１またはニューロメジンＵを完全にコードするＤＮＡ
のクローニングの手段としては、本発明のポリペプチド
の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて
自体公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等
から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベク
ターに組み込んだＤＮＡを例えばＴＧＲ−１またはニュ
ーロメジンＵをコードする塩基配列の一部あるいは全領
域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識
したものとのハイブリダイゼーションによって選別する
ことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例え
ば Molecular Cloning（２nd ed.；J. Sambrook et a
l., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の
方法などに従って行われる。また、市販のライブラリー
を使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従っ
て行う。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例
えば、Mutan^TM-super ExpressKm（宝酒造（株））、Mut
an^TM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法やGa
pped duplex法やKunkel法等の自体公知の方法あるいは
それらに準じる方法に従って行なうことができる。クロ
ーン化された本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニュ
ーロメジンＵをコードするＤＮＡは目的によりそのま
ま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカー
を付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはそ
の５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、
また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、Ｔ
ＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開
始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプ
ターを用いて付加することもできる。本発明で用いられ
るＴＧＲ−１またはニューロメジンＵの発現ベクター
は、例えば、（イ）本発明で用いられるＴＧＲ−１また
はニューロメジンＵをコードするＤＮＡから目的とする
ＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発
現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによ
り製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由
来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐ
ＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド
（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由
来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファ
ージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワク
シニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス
などが用いられる。用いられるプロモーターとしては、
遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。

【００２０】形質転換する際の宿主が動物細胞である場
合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルス
のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒー
トショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモ
ーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主が
エシェリヒア属菌である場合は、Tｒｐプロモーター、
Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロ
モーター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーターな
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロ
モーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモータ
ーなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクター
には、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライ
シングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、
ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称す
る場合がある）などを含有しているものを用いることが
できる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸
還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝
子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン
耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^rと略称する場合がある）、
ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合
がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ＣＨＯ
（ｄｈｆｒ^-）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マー
カーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によ
っても選択できる。また、必要に応じて、宿主に合った
シグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチド
のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である
場合は、phoA・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列な
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラー
ゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列など
が、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクター
α(ＭＦα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル
配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばイン
シュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグ
ナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用
できる。

【００２１】このようにして構築されたＴＧＲ−１また
はニューロメジンＵをコードするＤＮＡを含有するベク
ターを用いて、形質転換体を製造することができる。宿
主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属
菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いら
れる。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ
１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nuclei
c Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ
２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５
１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６
９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３
９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。バチルス
属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus
subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９
８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８
７(１９８４)〕などが用いられる。酵母としては、たと
えばサッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１
Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。昆
虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前
田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９
８５)〕。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃ
ＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodopte
ra frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの
中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHig
h Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEs
tigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルス
がＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori
N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞として
は、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細
胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitr
o），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕など
が用いられる。動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ
−７細胞，Ｖero細胞，チャイニーズハムスター細胞Ｃ
ＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウ
ス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９
３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、Ｂ
ＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられ
る。エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Pro
c. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１
９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)
などに記載の方法に従って行なわれる。バチルス属菌を
形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General G
enetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の
方法に従って行われる。

【００２２】酵母を形質転換するには、たとえばプロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl.Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)に
記載の方法に従って行なわれる。昆虫細胞または昆虫を
形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bi
o/Technology）,６巻, ４７−５５頁（１９８８年）な
どに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転
換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５２
巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれ
る。発現ベクターの細胞への導入方法としては、例え
ば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et al. プロ
シージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Procee
dings of The National Academy of Sciences of The U
nited States of America），８４巻，７４１３頁（１
９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. an
d van der Eb,A. J.ヴィロロジー（Virology），５２
巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法
〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO
J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等があ
げられる。このようにして、本発明で用いられるＴＧＲ
−１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡを含有
する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られ
る。なお、動物細胞を用いて、本発明で用いられるＴＧ
Ｒ−１またはニューロメジンＵを安定に発現させる方法
としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが
染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択
する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指
標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選
択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返
しクローン選択を行なうことにより本発明で用いられる
ＴＧＲ−１またはニューロメジンＵの高発現能を有する
安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ
遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を
徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄ
ｈｆｒ遺伝子とともに、本発明で用いられるＴＧＲ−１
またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡを細胞内で
増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもで
きる。上記の形質転換体を本発明で用いられるＴＧＲ−
１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡが発現可
能な条件下で培養し、本発明で用いられるＴＧＲ−１ま
たはニューロメジンＵを生成、蓄積せしめることによっ
て、本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジ
ンＵを製造することができる。宿主がエシェリヒア属
菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養
に使用される培地としては液体培地が適当であり、その
中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無
機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たと
えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖な
ど、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸
塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、
肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または
有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リ
ン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげら
れる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子な
どを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望まし
い。

【００２３】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えるこ
ともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約
３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気
や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転
換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホー
ルダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、
「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５
(１９８０)」や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地
〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），
８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地の
ｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約
２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて
通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞である形質転換体
を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium
（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２４】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２
巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー
（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Journal of The Ame
rican Medical Association）１９９巻，５１９(１９６
７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofThe Society for The Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。特にＣＨＯ（dhfr^-）細胞およびdhfr遺
伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンを
ほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地
を用いるのが好ましい。上記培養物から本発明で用いら
れるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを分離精製する
には、例えば下記の方法により行なうことができる。本
発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを
培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養
後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当
な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または
凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの
ち、遠心分離やろ過により本発明で用いられるＴＧＲ−
１またはニューロメジンＵの粗抽出液を得る方法などが
適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなど
のタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。
以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤
が含まれていてもよい。培養液中に本発明で用いられる
ＴＧＲ−１またはニューロメジンＵが分泌される場合に
は、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と
上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られ
た培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明で用い
られるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵの精製は、自
体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうこと
ができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析
や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限
外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用す
る方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差
を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーな
どの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマ
トグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点
電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差
を利用する方法などが用いられる。かくして得られる本
発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵが
遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそ
れに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に
塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準
じる方法により、遊離体または他の塩に変換することが
できる。なお、組換え体が産生する本発明で用いられる
ＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを、精製前または精
製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任
意に修飾を加えたり、蛋白質（（ポリ）ペプチド）を部
分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、
例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエン
ドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ
などが用いられる。またＮ末端アミノ酸を欠失させるた
めには、エドマン(Edman)試薬（フェニルイソチオシア
ネート）を用いた公知のエドマン法を用いることが可能
である。かくして生成する本発明で用いられるＴＧＲ−
１またはニューロメジンＵの存在は特異抗体を用いたエ
ンザイムイムノアッセイなどにより測定することができ
る。

【００２５】ニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１を用い
ることを特徴とするニューロメジンとＴＧＲ−１との結
合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング
方法またはニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１を含有す
ることを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ用キット（以下、本発明のスクリーニング方法、本発
明のスクリーニング用キットと略記する場合がある）に
ついて以下に詳述する。ＴＧＲ−１を用いるか、または
組換え型ＴＧＲ−１の発現系を構築し、該発現系を用い
たニューロメジンＵとの結合アッセイ系（リガンド・レ
セプターアッセイ系）を用いることによって、ニューロ
メジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物
（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニ
ングすることができる。このような化合物には、ＴＧＲ
−１を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−
ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）
を有する化合物（即ちＴＧＲ−１アゴニスト）と該細胞
刺激活性を有しない化合物（即ちＴＧＲ−１アンタゴニ
スト）などが含まれる。また、「ニューロメジンＵとＴ
ＧＲ−１との結合性を変化させる」とは、ニューロメジ
ンＵとＴＧＲ−１との結合を阻害する場合と結合を促進
する（結合時間を長くする）場合の両方を包含するもの
である。すなわち、本発明は、（ｉ）ＴＧＲ−１に、ニ
ューロメジンＵを接触させた場合と（ii）上記したＴＧ
Ｒ−１に、ニューロメジンＵおよび試験化合物を接触さ
せた場合との比較を行なうことを特徴とするニューロメ
ジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング方法などに関する。本発明の
スクリーニング方法においては、（ｉ）上記したＴＧＲ
−１に、ニューロメジンＵを接触させた場合と（ii）上
記したＴＧＲ−１に、ニューロメジンＵおよび試験化合
物を接触させた場合における、例えば該ＴＧＲ−１に対
するリガンドの結合量、細胞刺激活性（例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活
性など）などを測定して、比較する。

【００２６】本発明のスクリーニング方法は具体的に
は、 上記のニューロメジンの誘導体として表される標識し
たニューロメジンＵ（以下、単に「標識したニューロメ
ジンＵ」とする）を、上記したＴＧＲ−１に接触させた
場合と、標識したニューロメジンＵおよび試験化合物を
ＴＧＲ−１に接触させた場合における、標識したニュー
ロメジンＵの該ＴＧＲ−１に対する結合量を測定し、比
較することを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１
との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法、 標識したニューロメジンＵを、ＴＧＲ−１を含有する
細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識し
たニューロメジンＵおよび試験化合物をＴＧＲ−１を含
有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお
ける、標識したニューロメジンＵの該細胞または該膜画
分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法、 標識したニューロメジンＵを、ＴＧＲ−１をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
細胞膜上に発現したＴＧＲ−１に接触させた場合と、標
識したニューロメジンＵおよび試験化合物をＴＧＲ−１
をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養するこ
とによって細胞膜上に発現したＴＧＲ−１に接触させた
場合における、標識したニューロメジンＵのＴＧＲ−１
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするニ
ューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化
合物またはその塩のスクリーニング方法、 ＴＧＲ−１を活性化する化合物（例えば、ニューロメ
ジンＵ）をＴＧＲ−１を含有する細胞に接触させた場合
と、ＴＧＲ−１を活性化する化合物および試験化合物を
ＴＧＲ−１を含有する細胞に接触させた場合における、
ＴＧＲ−１を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ ²⁺遊離、細胞
内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性な
ど）を測定し、比較することを特徴とするニューロメジ
ンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物または
その塩のスクリーニング方法、および ＴＧＲ−１を活性化する化合物（例えば、ニューロメ
ジンＵなど）をＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し
たＴＧＲ−１に接触させた場合と、ＴＧＲ−１を活性化
する化合物および試験化合物を、ＴＧＲ−１をコードす
るＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって
細胞膜上に発現したＴＧＲ−１に接触させた場合におけ
る、ＴＧＲ−１を介する細胞刺激活性（例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活
性など）を測定し、比較することを特徴とするニューロ
メジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物ま
たはその塩のスクリーニング方法などである。

【００２７】本発明に用いられるニューロメジンＵは、
オーファンレセプター蛋白質であるＦＭ−３（Tan, C.
P. et al., Genomics 52, 223-229, 1998）に対しても
リガンド活性を有することが知られている（WO 00/0291
9）ため、上記〜における活性をＴＧＲ−１の代わ
りにＦＭ−３を用いることによって測定し、ニューロメ
ジンＵとＦＭ−３との結合性を変化させる化合物または
その塩（ＦＭ−３アンタゴニスト、ＦＭ−３アゴニス
ト）をスクリーニングすることが可能である。従って、
本発明に記載のスクリーニング方法によって得られるＴ
ＧＲ−１アンタゴニスト、ＴＧＲ−１アゴニストの活性
と、ＴＧＲ−１の代わりにＦＭ−３を用いることによ
り、本発明の記載のスクリーニング方法またはそれに準
じた方法によって得られるＦＭ−３アンタゴニスト、Ｆ
Ｍ−３アゴニストの活性とを比較することによって、Ｆ
Ｍ−３により選択的な活性を有するアンタゴニストもし
くはアゴニスト、またはＴＧＲ−１により選択的な活性
を有するアンタゴニストもしくはアゴニストを得ること
ができる。ここで、「ＦＭ−３により選択的な作用を有
するアンタゴニスト」とはＦＭ−３に対する活性（受容
体（ＴＧＲ−１、ＦＭ−３）を介する細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生
成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化な
どを促進する活性など）など）がＴＧＲ−１に対する活
性に対して２倍以上、好ましくは１０倍以上弱い化合物
またはその塩のことをいう。「ＦＭ−３により選択的な
作用を有するアゴニスト」とはＦＭ−３に対する活性
（受容体（ＴＧＲ−１、ＦＭ−３）を介する細胞刺激活
性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭ
Ｐ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細
胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変
化などを促進する活性など）など）がＴＧＲ−１に対す
る活性に対して２倍以上、好ましくは１０倍以上強い化
合物またはその塩のことをいう。「ＴＧＲ−１により選
択的な作用を有するアンタゴニスト」とはＴＧＲ−１に
対する活性（受容体（ＴＧＲ−１、ＦＭ−３）を介する
細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコ
リン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＦＭ
−３に対する活性に対して２倍以上、好ましくは１０倍
以上弱い化合物またはその塩のことをいう。「ＴＧＲ−
１により選択的な作用を有するアゴニスト」とはＴＧＲ
−１に対する活性（受容体（ＴＧＲ−１、ＦＭ−３）を
介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセ
チルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）が
ＦＭ−３に対する活性に対して２倍以上、好ましくは１
０倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。

【００２８】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に
用いるＴＧＲ−１としては、上記のＴＧＲ−１を含有す
るものであれば何れのものであってもよいが、ヒト、温
血動物、両生類、魚類などの臓器の膜画分などが好適で
ある。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難
なことから、スクリーニングに用いられるものとして
は、組換え体を用いて大量発現させたＴＧＲ−１などが
適している。ＴＧＲ−１を製造するには、前述の方法な
どが用いられる。本発明のスクリーニング方法におい
て、ＴＧＲ−１を含有する細胞あるいは該細胞膜画分な
どを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。ＴＧＲ−
１を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアル
デヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方
法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。Ｔ
ＧＲ−１を含有する細胞としては、ＴＧＲ−１を発現し
た宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸
菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられ
る。膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知
の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをい
う。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモ
ジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダ
ーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波
による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を
細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげら
れる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠
心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３００
０ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、
上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐ
ｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したＴＧＲ−１と細胞
由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれ
る。該ＴＧＲ−１を含有する細胞や膜画分中のＴＧＲ−
１の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好
ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。な
お、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性
（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構
築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料
を測定できるようになる。ニューロメジンＵとＴＧＲ−
１との結合性を変化させる化合物またはその塩をスクリ
ーニングする前記の〜を実施するためには、適当な
ＴＧＲ−１画分と、標識したリガンドまたはリガンド活
性を有する化合物（ニューロメジンＵ、その誘導体な
ど）が用いられる。ＴＧＲ−１画分としては、天然型の
ＴＧＲ−１画分か、またはそれと同等の活性を有する組
換え型ＴＧＲ−１画分などが望ましい。ここで、同等の
活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識し
たリガンドまたはリガンド活性を有する化合物として
は、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合
物（ニューロメジンＵ、その誘導体など）などが用いら
れる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕
などで標識されたリガンド（ニューロメジンＵ誘導体と
して表されるニューロメジンＵの標識体）などを利用す
ることができる。具体的には、ニューロメジンＵとＴＧ
Ｒ−１との結合性を変化させる化合物のスクリーニング
を行うには、まずＴＧＲ−１を含有する細胞または細胞
の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁
することによりレセプター標品を調製する。バッファー
には、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸
バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドと
レセプターとの結合を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的
で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテア
ーゼによるＴＧＲ−１やニューロメジンＵの分解を抑え
る目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド
研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を
添加することもできる。０.０１ml〜１０ｍｌの該レセ
プター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００
ｃｐｍ）の標識したニューロメジンＵ（ニューロメジン
Ｕ誘導体として表されるニューロメジンＵの標識体）を
添加し、同時に１０^-4〜１０^-1μＭの試験化合物を共存
させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰
の未標識のニューロメジンＵを加えた反応チューブも用
意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３
７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時
間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同
バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放
射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カ
ウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウン
ト(Ｂ₀)から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウン
ト（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量
（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば８０％以下になる試験化合物を
ＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる
能力のある候補物質として選択することができる。

【００２９】また、ＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの
結合を測定する方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマシャ
ムファルマシアバイオテク社製）を用いることもでき
る。この方法では、ニューロメジンＵを装置に添付のプ
ロトコルに従ったアミノカップリング法によってセンサ
ーチップに固定し、ＴＧＲ−１を含有する細胞またはＴ
ＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有する形質変換体から
精製したＴＧＲ−１またはＴＧＲ−１を含む膜画分、あ
るいは精製したＴＧＲ−１またはＴＧＲ−１を含む膜画
分および試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリ
スバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分２
−２０μｌの流量で通過させる。センサーチップ上のニ
ューロメジンＵとＴＧＲ−１とが結合することによって
生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存する試験化合物
が変化させることを観察することによってＴＧＲ−１と
ニューロメジンＵとの結合を変化させる化合物のスクリ
ーニングを行なうことができる。この方法は、ＴＧＲ−
１をセンサーチップに固定し、ニューロメジンＵおよび
試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッフ
ァーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法
を用いても同様に測定することができる。試験化合物と
しては、上記と同様のものなどがあげられる。ニューロ
メジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物を
スクリーニングする前記の〜の方法を実施するため
には、ＴＧＲ−１を介する細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など）を公知の方法または市
販の測定用キットを用いて測定することができる。具体
的には、まず、ＴＧＲ−１を含有する細胞をマルチウェ
ルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあた
っては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さな
い適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加し
て一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは
上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従
って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例え
ば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解
酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻
害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡ
ＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンな
どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対す
る産生抑制作用として検出することができる。細胞刺激
活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＴ
ＧＲ−１を発現した細胞が用いられる。本発明のＴＧＲ
−１を発現した細胞としては、前述の組換え型ＴＧＲ−
１発現細胞株などが望ましい。形質変換体であるＴＧＲ
−１発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わな
い。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いら
れる。

【００３０】試験化合物としては、例えばペプチド、タ
ンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあ
げられる。上記のリガンド・レセプターアッセイ系につ
いて、さらに具体的に記載すると以下のようなアッセイ
系が用いられる。 （１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激
されると細胞内のＧタンパクが活性化されてＧＴＰが結
合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても
観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと
変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加して
おくとＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタンパクに結合す
るが、加水分解されずにＧタンパクを含む細胞膜に結合
した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると
細胞膜に残存した放射活性を測定することによって受容
体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定すること
ができる。この反応を利用してニューロメジンＵのＴＧ
Ｒ−１発現細胞に対する刺激活性を測定することができ
る。この方法は、前記〜のようにＴＧＲ−１を含む
細胞を用いるものではなく、〜のようにＴＧＲ−１
を含む膜画分を用いるアッセイ法であるが、〜のよ
うに細胞刺激活性を測定するものであり、本測定法にお
いてＴＧＲ−１膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示
す物質はアゴニストである。ここにおいて、ニューロメ
ジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を添
加し、ニューロメジンＵの単独投与に比べてＴＧＲ−１
細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性に変化が生じる
ことを観察することによってニューロメジンＵとＴＧＲ
−１との結合性を変化させる化合物をスクリーニングす
ることができる。このとき、ニューロメジンＵによるＴ
ＧＲ−１細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制
する活性を示す化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵ
との結合性を変化させる能力のある候補物質として選択
することができる。一方、試験化合物のみを投与し、Ｔ
ＧＲ−１細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を観察
することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこ
ともできる。スクリーニング法の一例についてより具体
的に以下に述べる。上述の方法によって調製したＴＧＲ
−１を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50 mM Tris,
5 mMMgCl₂, 150 mM NaCl, 1 μM GDP, 0.1％ BSA pH 7.
4）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異な
る。これをFalconb 2053に0.2mlずつ分注し、ニューロ
メジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を
加え、さらに終濃度200 pMとなるように[³⁵S]GTPγSを
加える。25℃で1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝
液（50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0.1％ BSA
, 0.05％ CHAPSpH 7.4 1.5ml）を加えて、ガラス繊維
ろ紙GF/Fでろ過する。65℃、30分保温して乾燥後、液体
シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に
結合した[^{3 5}S]GTPγSの放射活性を測定する。ニューロ
メジンＵのみを加えた実験区の放射活性を100％、ニュ
ーロメジンＵを加えなかった実験区の放射活性を0％と
し、ニューロメジンＵによるＧＴＰγＳ結合促進活性に
対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促
進活性が例えば８０％以下になる試験化合物をＴＧＲ−
１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のあ
る候補物質として選択することができる。

【００３１】（２）ＴＧＲ−１発現細胞はニューロメジ
ンＵ刺激によって細胞内cAMP量が減少する場合、この反
応を利用してニューロメジンＵのＴＧＲ−１発現細胞に
対する刺激活性を測定することができる。ＴＧＲ−１を
発現させた種々の動物細胞のcAMP産生量はマウス、ラッ
ト、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗cAMP
抗体と¹²⁵I標識cAMP（ともに市販品）を使用することに
よってRIAあるいは抗cAMP抗体と標識cAMPとを組み合わ
せた他のEIA系でも測定することができる。また抗cAMP
抗体をprotein Aあるいは抗cAMP抗体産生に用いた動物
のIgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチ
ラントを含むビーズと¹²⁵I標識cAMPとを使用するSPA法
による定量も可能である（アマシャムファルマシアバイ
オテク製のキットなどを使用する）。本方法において、
フォルスコリンまたはカルシトニンなど細胞内cAMP量を
増加させるようなリガンドなどによって細胞内cAMP量を
上昇させ、ニューロメジンＵまたはニューロメジンＵお
よび試験化合物を添加することによってニューロメジン
Ｕの単独投与による細胞内cAMP量の抑制が変化すること
を観察し、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化
させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
このとき、ニューロメジンＵによるＴＧＲ−１発現細胞
のcAMP産生抑制活性を阻害する活性を示す化合物をＴＧ
Ｒ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力
のある候補物質として選択することができる。一方、試
験化合物のみを添加してcAMP産生抑制活性を調べること
によりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを
行なうことができる。スクリーニング法をより具体的に
以下に記載する。ＴＧＲ−１受容体を発現させたＣＨＯ
細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、48
時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキ
サンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッ
ファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチ
ル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含む
ハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼
ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分
間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに
0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、2μMフォ
ルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーに1nMのニ
ューロメジンＵあるいは1 nMのニューロメジンＵおよび
試験化合物を添加したものを細胞に加え、３７℃で２４
分間反応させる。100μlの20％過塩素酸を加えて反応を
停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内cAMP
を抽出する。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAキット（ア
マシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。
フォルスコリン刺激によって産生されたcAMP量を100％
とし、1 nMのニューロメジンＵの添加によって抑制され
たcAMP量を0％として、ニューロメジンＵによるcAMP産
生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。ニュ
ーロメジンＵの活性を阻害してcAMP産生活性が例えば８
０％以下になる試験化合物をＴＧＲ−１とニューロメジ
ンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として
選択することができる。cAMP産生促進活性を測定するに
は、フォルスコリンを添加せずにＴＧＲ−１受容体を発
現させたＣＨＯ細胞に試験化合物を添加して産生された
cAMPを上記の方法で定量する。この場合は、ｃＡＭＰの
産生活性が例えば１０％以上の試験化合物をＴＧＲ−１
とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある
候補物質として選択することができる。

【００３２】（３）CRE（cAMP response element）を含
むＤＮＡを、ピッカジーン ベイシックベクターまたは
ピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造
（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニ
ングサイトに挿入し、これをCRE−レポーター遺伝子ベ
クターとする。CRE−レポーター遺伝子ベクターをトラ
ンスフェクションした細胞において、cAMP上昇を伴う刺
激は、 CREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに
引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。
つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 C
RE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のcAMP量の変
動を検出することができる。CRE−レポーター遺伝子ベ
クターをＴＧＲ−１発現細胞にトランスフェクションし
た細胞を利用してニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合
を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことがで
きる。具体的なスクリーニング法を以下に記す。CRE−
レポーター遺伝子導入ＴＧＲ−１発現細胞を24穴プレー
トに5 x 10³ cell/wellで播種し、48時間培養する。細
胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05
％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)
で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキ
サンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバ
ッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その
後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で
保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反
応用バッファーを細胞に加えた後、1 nMのニューロメジ
ンＵあるいは1 nMのニューロメジンＵおよび試験化合物
と2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファー
を細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピ
ッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶
かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添
加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメータ
ー、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウ
ンターにより測定する。 ニューロメジンＵとＴＧＲ−
１の結合を変化させる化合物の影響はルシフェラーゼに
よる発光量をニューロメジンＵを単独で投与した場合と
比較することによって測定することができる。このと
き、ニューロメジンＵの投与によりフォルスコリン刺激
による発光量の増加が抑制されるが、この抑制を回復さ
せる化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性
を変化させる能力のある候補物質として選択することが
できる。一方、試験化合物のみを投与し、フォルスコリ
ン刺激によって上昇した発光量のニューロメジンＵと同
様な抑制を観察することによりアゴニストのスクリーニ
ングを行なうこともできる。レポーター遺伝子として、
ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファター
ゼ、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラー
ゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもでき
る。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性
は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定す
ることができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例
えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、クロラムフェ
ニコール アセチルトランスフェラーゼ（chlorampheni
col acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FA
ST CAT chrolamphenicol acetyltransferase assay kit
によって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純
薬製Aurora Gal-XEによって測定することができる。

【００３３】（４）ＴＧＲ−１発現細胞がニューロメジ
ンＵ刺激によってアラキドン酸代謝物を細胞外に放出す
る場合、あらかじめ、放射活性を有するアラキドン酸を
細胞に取り込ませておくことによって、この活性を細胞
外に放出された放射活性を測定することによって測定す
ることができる。このとき、ニューロメジンＵあるいは
ニューロメジンＵおよび試験化合物を添加して、ニュー
ロメジンＵのアラキドン酸代謝物放出活性に対する影響
を調べることにより、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の
結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうこ
とができる。このとき、ニューロメジンＵによるアラキ
ドン酸代謝物放出活性を阻害する化合物をＴＧＲ−１と
ニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候
補物質として選択することができる。また、試験化合物
のみを添加し、ＴＧＲ−１発現細胞のアラキドン酸代謝
物放出活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化
合物のスクリーニングを行なうこともできる。ニューロ
メジンＵとＴＧＲ−１の結合に影響を与える化合物のス
クリーニング法より具体的に以下に述べる。ＴＧＲ−１
受容体を発現させたＣＨＯ細胞を24穴プレートに5 x 10
⁴ cell/wellで播種し、24時間培養後、[³H]アラキドン
酸を0.25 μCi/wellとなるよう添加する。[³H]アラキド
ン酸添加16時間後、細胞を0.05％ BSAと20mM HEPESを含
むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄し、各wellに0.05
％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)
に溶解した終濃度10 nMのニューロメジンＵあるいは10n
MのニューロメジンＵおよび試験化合物を含むバッファ
ー500 μlを添加する。以降、0.05％ BSAと20mM HEPES
を含むハンクスバッファー(pH7.4)を反応用バッファー
と呼ぶ。37℃で60分間インキュベートした後に、反応液
400 μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[
³H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウン
ターにより測定する。ニューロメジンＵの非添加反応バ
ッファーによる培地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を
0％とし、10 nMのニューロメジンＵを添加したときのた
ときの培地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を100％と
して試験化合物のニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合
に対する影響を算出する。アラキドン酸代謝物産生活性
が例えば５０％以下になる試験化合物をＴＧＲ−１とニ
ューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補
物質として選択することができる。

【００３４】（５）ＴＧＲ−１発現細胞をニューロメジ
ンＵによって刺激することによって細胞内のＣａ²⁺濃度
が上昇する場合、これを利用することによってニューロ
メジンＵとＴＧＲ−１の結合に対する試験化合物の影響
を調べることができる。ＴＧＲ−１発現細胞を、滅菌し
た顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を4
mM Fura-2 AM（同仁化学研究所）を縣濁したHBSSに置換
し、室温で2時間30分おく。HBSSで洗浄した後、キュベ
ットにカバーグラスをセットし、蛍光測定器で、ニュー
ロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物
を加えたときの励起波長340nm及び380nmでの505nmの蛍
光強度の比の上昇を測定する。このとき、ニューロメジ
ンＵを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加に
よって生じる蛍光強度の変化を測定することによりニュ
ーロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に対して影響を与える
化合物のスクリーニングを行なうことができる。また、
以下のようにFLIPR（モレキュラーデバイス社製）を使
うこともできる。すなわち、細胞縣濁液にFluo-3 AM
（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた
後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細
胞を播く。FLIPR装置にセットし、Fura-2 AMの場合と同
様にニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび
試験化合物を加え、ニューロメジンＵを単独で投与した
ときに比べて試験化合物の添加によって観測される蛍光
強度が変化することを測定することにより、ニューロメ
ジンＵとＴＧＲ−１の結合に対して影響を与える化合物
のスクリーニングを行なうことができる。これらにおい
て、ニューロメジンＵによる蛍光強度の上昇を抑制する
化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変
化させる能力のある候補物質として選択することができ
る。一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇
を観察することによってアゴニストのスクリーニングを
行なうこともできる。ＴＧＲ−１発現細胞にaequorinな
どのように細胞内Caイオンの上昇によって発光するよう
なタンパク質の遺伝子を共発現させておき、細胞内Caイ
オン濃度の上昇によってaequorinがCa結合型となり発光
することを利用して、ニューロメジンＵあるいはニュー
ロメジンＵおよび試験化合物を加え、ニューロメジンＵ
を単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によっ
て観測される発光強度が変化することを測定することに
より、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に対して影
響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができ
る。方法は、蛍光物質を取り込ませないこと以外は上記
と同様である。

【００３５】（６）受容体を発現する細胞に受容体アゴ
ニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度
が上昇することが知られている。ニューロメジンＵによ
って生じるＴＧＲ−１細胞におけるこの反応を観察する
ことによりニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に影響
を与える化合物のスクリーニングを行なうことができ
る。２４穴プレートに播いて１日目の細胞にmyo-[2-³H]
inositol (2.5マイクロCi/well)を添加した培地中で１
日培養した細胞を、よく洗浄後、ニューロメジンＵある
いはニューロメジンＵおよび試験化合物を添加した後、
10％過塩素酸を加え反応を止める。1.5 M KOH, 60mM HE
PES溶液で中和し、0.5mlのAG1x8樹脂 (Bio-Rad)を詰め
たカラムに通し、5mM Na₂BO₃ 60mM HCOONH₄で洗浄した
後、１M HCOONH ₄ 0.1M HCOOHで溶出した放射活性を液
体シンチレーションカウンターで測定する。ニューロメ
ジンＵの非添加反応バッファーによる培地中の放射活性
を0％とし、ニューロメジンＵを添加したときの培地中
の放射活性を100％として試験化合物のニューロメジン
ＵとＴＧＲ−１の結合に対する影響を算出する。イノシ
トール三リン酸産生活性が例えば５０％以下になる試験
化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変
化させる能力のある候補物質として選択することができ
る。一方、試験化合物のみの添加によるイノシトール三
リン酸産生上昇を観察することによってアゴニストのス
クリーニングを行なうこともできる。

【００３６】（７）TRE（TPA response element）を含
むＤＮＡを、ピッカジーン ベイシックベクターまたは
ピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造
（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニ
ングサイトに挿入し、これをTRE−レポーター遺伝子ベ
クターとする。TRE−レポーター遺伝子ベクターをトラ
ンスフェクションした細胞において、細胞内Ca²⁺上昇を
伴う刺激は、TREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現と
それに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導
する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することによ
り、TRE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカル
シウム量の変動を検出することができる。 TRE−レポー
ター遺伝子ベクターをＴＧＲ−１発現細胞にトランスフ
ェクションした細胞を利用したニューロメジンＵとＴＧ
Ｒ−１の結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニ
ング法を以下に記す。TRE−レポーター遺伝子導入ＴＧ
Ｒ−１発現細胞を24穴プレートに5 x 10³ cell/wellで
播種し、48時間培養する。細胞を0.05％ BSAと20mM HE
PESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した後、10
nMのニューロメジンＵあるいは10 nMのニューロメジン
Ｕおよび試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応さ
せる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製
造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製
造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、
ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまた
はトップカウンターにより測定する。ニューロメジンＵ
とＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、ルシ
フェラーゼによる発光量をニューロメジンＵを単独で投
与した場合と比較することによって測定することができ
る。このとき、ニューロメジンＵの投与により細胞内Ca
²⁺の上昇によって発光量が増加するが、この増加を抑制
する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性
を変化させる能力のある候補物質として選択することが
できる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジ
ンＵと同様な発光量の増加を観察することによりアゴニ
ストのスクリーニングを行なうこともできる。レポータ
ー遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリ
フォスファターゼ、クロランフェニコール アシルトラ
ンスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いる
こともできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物
の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容
易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ
活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、ク
ロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ch
loramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和
光純薬製FAST CAT Chrolamphenicol Acetyltransferase
Assay Kitによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例
えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することが
できる。

【００３７】（８）ニューロメジンＵに応答したＴＧＲ
−１発現細胞についてMAP kinase活性化によって増殖が
観察される場合、この増殖をMAP kinase活性、チミジン
取り込み、細胞数測定（MTTなど）によって測定するこ
とができる。これを利用してニューロメジンＵとＴＧＲ
−１の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行な
うことができる。MAP kinase活性は、ニューロメジンＵ
あるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を細胞に添
加した後、細胞溶解液から抗MAP kinase抗体を用いた免
疫沈降によってMAP kinase分画を得た後、例えば和光純
薬製MAP Kinase Assay Kitとγ-[ ³²P]-ATPを使用して容
易に測定できる。チミジン取り込み活性は、ＴＧＲ−１
発現細胞を播き、ニューロメジンＵあるいはニューロメ
ジンＵおよび試験化合物を添加した後、[methyl-³H]-チ
ミジンを加え、その後、細胞内に取り込まれた標識チミ
ジンの放射活性を細胞を溶解して液体シンチレーション
カウンターで計数することによって測定することができ
る。ＴＧＲ−１発現細胞の増殖は、発現細胞を播き、ニ
ューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化
合物を添加した後にMTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazoly
l)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) を添加し、
細胞内に取り込まれてMTTが変化したMTTホルマザンを塩
酸酸性としたイソプロパノールで細胞を溶解した後、57
0 nmの吸収を測定することによっても測定できる。ニュ
ーロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物
の、標識チミジン取り込み活性を利用した具体的なスク
リーニング法を以下に記す。ＴＧＲ−１発現細胞を２４
穴プレートにウェル当たり５０００個まき一日間培養す
る。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢
餓状態にする。ニューロメジンＵあるいはニューロメジ
ンＵおよび試験化合物を細胞に添加して２４時間培養し
た後、[methyl-³H]-チミジンをウェル当たり０．０１５
ＭＢｑ添加し６時間培養する。細胞をＰＢＳ（−）で洗
った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に
５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定さ
れた細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウ
ム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シン
チレーションカウンターで測定する。ニューロメジンＵ
とＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、チミ
ジン取り込みによる放射活性の上昇をニューロメジンＵ
を単独で投与した場合と比較することによって測定する
ことができる。このとき、ニューロメジンＵの投与によ
る放射活性の増加を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニュ
ーロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物
質として選択することができる。一方、試験化合物のみ
を投与し、ニューロメジンＵと同様な放射活性の増加を
観察することによりアゴニストのスクリーニングを行な
うこともできる。

【００３８】（９）ＴＧＲ−１発現細胞にニューロメジ
ンＵを添加すると、K channelが活性化し、細胞内にあ
るKイオンが、細胞外に流出する場合、Kイオンと同族元
素であるRbイオンは、Kイオンと区別無くK channelを通
って細胞外に流出するので、細胞に標識Rb ([⁸⁶Rb])を
添加して取り込ませておいた後、ニューロメジンＵの刺
激によって流出する[⁸⁶Rb]の流れを測定することでニュ
ーロメジンＵの作用を測定できる。ニューロメジンＵと
ＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の、[⁸⁶Rb]流出活
性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
２４穴にまいて２日後のＴＧＲ−１発現細胞を１mCi/ml
の⁸⁶RbClを含む培地中で２時間保温する。培地をよく
洗浄し、外液中の⁸⁶RbClを完全に除く。ニューロメジン
ＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を細胞に
添加して３０分後の外液を回収し、γカウンターで放射
活性を測定する。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合
を変化させる化合物の影響は、[⁸⁶Rb]流出による放射活
性の上昇をニューロメジンＵを単独で投与した場合と比
較することによって測定することができる。このとき、
ニューロメジンＵの投与による放射活性の上昇を抑制す
る化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を
変化させる能力のある候補物質として選択することがで
きる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジン
Ｕと同様な放射活性の上昇を観察することによりアゴニ
ストのスクリーニングを行なうこともできる。

【００３９】（１０）ＴＧＲ−１発現細胞がニューロメ
ジンＵに反応して変化する細胞外のpH（acidification
rate）をサイトセンサー装置（モレキュラーデバイス
社）を使用して測定することによって、ニューロメジン
Ｕの活性を測定することができる。サイトセンサー装置
を利用した、細胞外ｐＨ変化の測定をすることによるニ
ューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物
の具体的なスクリーニング法を以下に記す。ＴＧＲ−１
発現細胞をサイトセンサー装置用のカプセル内で終夜培
養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定
するまで約2時間0.1％ BSAを含むRPMI1640培地（モレキ
ュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した
後、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび
試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させることによっ
て生じる培地のpH変化を測定する。ニューロメジンＵと
ＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、ＴＧＲ
−１発現細胞の細胞外ｐＨ変化をニューロメジンＵを単
独で投与した場合と比較することによって測定すること
ができる。このとき、ニューロメジンＵの投与による細
胞外ｐＨ変化を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロ
メジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質と
して選択することができる。一方、試験化合物のみを投
与し、ニューロメジンＵと同様な細胞外ｐＨ変化を観察
することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこ
ともできる。

【００４０】（１１）酵母（Saccharomyces cerevisia
e）のhaploidα-mating Type (MATα)の性フェロモン受
容体STe2はG蛋白Gpa1とカップルしており、性フェロモ
ンα-mating factorに応答してMAP kinaseを活性化し、
以下、Far1 (cell-cycle arrest) および転写活性化因
子Ste12が活性化される。Ste12は接合に関与するFUS1を
含む種々の蛋白の発現を誘導する。一方、制御因子Sst2
は以上の過程に抑制的に機能する。この系において、受
容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニスト
刺激によって酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、
その結果生じる増殖などの指標を用いた、受容体アゴニ
ストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている
（Pausch, M. H., Trends in Biotechnology, vol. 15,
pp. 487-494(1997)）。このような受容体遺伝子導入酵
母の系を利用してニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１の
結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうこと
ができる。MATα酵母のSte2およびGpa1をコードする遺
伝子を除去し、代わりにＴＧＲ−１遺伝子およびGpa1-G
ai2融合蛋白をコードする遺伝子を導入する。Farをコー
ドする遺伝子を除去してcell-cycle arrestが生じない
ようにし、また、Sstをコードする遺伝子を除去するこ
とによってニューロメジンＵに対する応答の感度を向上
させておく。さらに、FUS1にヒスチジン生合成遺伝子HI
S3をつなげたFUS1-HIS3遺伝子を導入する。以上の遺伝
子組換え操作は例えば、Priceら（Price, L. A.et al.,
Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188
-6195 (1995)）の報告に記載の方法において、ソマトス
タチン受容体タイプ２（SSTR2）遺伝子をＴＧＲ−１遺
伝子に置き換えて実施することによって容易に行なうこ
とができる。こうして構築された形質転換酵母はＴＧＲ
−１のリガンドであるニューロメジンＵに高感度で反応
し、その結果MAPキナーゼの活性化が起きてヒスチジン
生合成酵素が合成されるようになって、ヒスチジン欠乏
培地で生育可能になる。これを利用して、ヒスチジン欠
乏培地での酵母の生育を指標としてニューロメジンＵに
よるＴＧＲ−１発現酵母の応答を観察することができ
る。以下にニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１の結合を
変化させる化合物のスクリーニング法を述べる。上記の
ようにして作製された形質変換酵母を完全合成培地の液
体培地で終夜培養し、2 x 10⁴ cell/mlの濃度でヒスチ
ジンを除去した溶解寒天培地に加え、9 x9 cmの角形シ
ャーレに播く。寒天が固化した後、ニューロメジンＵあ
るいはニューロメジンＵおよび試験化合物をしみこませ
た滅菌濾紙を寒天表面におき、30℃で３日間培養する。
ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合
物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育をニューロメジン
Ｕを単独で投与した場合と比較することによって測定す
ることができる。このとき、ニューロメジンＵの投与に
よる酵母の生育を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニュー
ロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質
として選択することができる。一方、試験化合物のみを
投与し、ニューロメジンＵと同様な酵母の生育を観察す
ることによりアゴニストのスクリーニングを行なうこと
もできる。また、あらかじめ、寒天培地に ニューロメ
ジンＵを添加しておいて滅菌濾紙に試験化合物のみをし
みこませて培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙
の周囲で影響を受けることを観察することによってもニ
ューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物
の影響を調べることができる。

【００４１】（１２）ＴＧＲ−１遺伝子ＲＮＡをアフリ
カツメガエル卵母細胞に注入し、ニューロメジンＵによ
って刺激すると細胞内Ca²⁺イオン濃度が上昇して、calc
ium-activated chloride currentが生じる。これを膜電
位の変化としてとらえることが出来る（Kイオン濃度勾
配に変化がある場合も同様）。ニューロメジンＵによっ
て生じるＴＧＲ−１導入アフリカツメガエル卵母細胞に
おけるこの反応を観察することによりニューロメジンＵ
とＴＧＲ−１の結合に影響を与える化合物のスクリーニ
ングを行なうことができる。氷冷して動けなくなった雌
のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊をＭ
ＢＳ液（88mM NaCl, 1mM KCl, 0.41mM CaCl₂, 0.33mM C
a(NO₃)₂, 0.82mM MgSO₄, 2.4mM NaHCO₃, 10mM HEPES, p
H7.4）に溶かしたコラーゲナーゼ(0.5mg/ml)で卵塊がほ
ぐれるまで１９℃、１-６時間、150rpmで処理する。外
液をMBS液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニ
ピュレーターでＴＧＲ−１mRNA (50ng/50nl)をマイクロ
インジェクションする。ＴＧＲ−１mRNAは、組織や細胞
から調製しても、plasmidからin vitroで転写してもよ
い。これをMBS液中で２０℃で３日培養する。これをRin
ger液を流しているvoltage clamp装置のくぼみに置き、
電位固定用ガラス微小電極、電位測定用ガラス微小電極
を細胞内に刺入し、(-)極は、細胞外に置く。電位が安
定したら、ニューロメジンＵまたはニューロメジンＵお
よび試験化合物を含むRinger液を流して電位変化を記録
する。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させ
る化合物の影響は、ＴＧＲ−１導入アフリカツメガエル
卵母細胞の細胞膜電位変化をニューロメジンＵを単独で
投与した場合と比較することによって測定することがで
きる。このとき、ニューロメジンＵの投与による細胞膜
電位変化を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジ
ンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として
選択することができる。一方、試験化合物のみを投与
し、ニューロメジンＵと同様な細胞膜電位変化を観察す
ることによりアゴニストのスクリーニングを行なうこと
もできる。この系において、反応を変化量を増大して測
定しやすいように各種のＧタンパク質遺伝子のpoly(A)⁺
RNAを導入することもできる。またaequorinのようなCa
²⁺存在下で発光を生じるようなタンパクの遺伝子のpoly
(A)⁺RNAを共インジェクションすることにより膜電位変
化ではなく発光を観察してこの反応を測定することもで
きる。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット
は、ＴＧＲ−１、ＴＧＲ−１を含有する細胞、あるいは
ＴＧＲ−１を含有する細胞の膜画分、およびニューロメ
ジンＵを含有するものである。

【００４２】本発明のスクリーニング用キットの例とし
ては、次のものがあげられる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 ＴＧＲ−１標品 ＴＧＲ−１を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレート
に５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５
％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識リガンド 〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
たニューロメジンＵ。適当な溶媒または緩衝液に溶解し
たものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定
用緩衝液にて１μＭに希釈する。 リガンド標準液 ニューロメジンＵを０.１％ウシ血清アルブミン（シグ
マ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−
２０℃で保存する。 ２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＴＧＲ−１を
発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した
後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。 １０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識したニューロメジンＵを５μｌ加え、室温にて
１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験
化合物のかわりに１０^-3ＭのニューロメジンＵを５μｌ
加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識したニューロメジンＵを０.２
Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シン
チレーターＡ（和光純薬製）と混合する。液体シンチ
レーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射
活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を
次の式で求める。 式 ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１０
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００４３】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合を変化させ
る（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体
的にはＴＧＲ−１を介して細胞刺激活性を有する化合物
（いわゆるＴＧＲ−１アゴニスト）、あるいは該刺激活
性を有しない化合物（いわゆるＴＧＲ−１アンタゴニス
ト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、
非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあ
げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。上記ＴＧＲ−１アゴ
ニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価
方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。 （ｉ）前記〜のスクリーニング方法で示されるバイ
ンディング・アッセイを行い、ニューロメジンＵとＴＧ
Ｒ−１との結合性を変化させる（特に、結合を阻害す
る）化合物を得た後、該化合物が上記したＴＧＲ−１を
介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細
胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＴＧＲ−１ア
ゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩
はＴＧＲ−１アンタゴニストである。 (ii)(a)試験化合物をＴＧＲ−１を含有する細胞に接触
させ、上記ＴＧＲ−１を介した細胞刺激活性を測定す
る。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＴＧＲ
−１アゴニストである。 (b) ＴＧＲ−１を活性化する化合物（例えば、ニューロ
メジンＵまたはＴＧＲ−１アゴニストなど）をＴＧＲ−
１を含有する細胞に接触させた場合と、ＴＧＲ−１を活
性化する化合物および試験化合物をＴＧＲ−１を含有す
る細胞に接触させた場合における、ＴＧＲ−１を介した
細胞刺激活性を測定し、比較する。 ＴＧＲ−１を活性
化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物
またはその塩はＴＧＲ−１アンタゴニストである。該Ｔ
ＧＲ−１アゴニストは、ＴＧＲ−１に対するニューロメ
ジンＵが有する生理活性と同様の作用を有しているの
で、 ニューロメジンＵと同様に安全で低毒性な医薬と
して有用である。逆に、ＴＧＲ−１アンタゴニストは、
ＴＧＲ−１に対するニューロメジンＵが有する生理活性
を抑制することができるので、該レセプター活性を抑制
する安全で低毒性な医薬として有用である。

【００４４】ニューロメジンＵまたはその塩は平滑筋収
縮作用、血圧上昇作用、腸管におけるイオン輸送の調
節、皮下投与後のＡＣＴＨおよびそれに引き続くコルチ
コステロンの上昇などに関与していることから、低血圧
症予防・治療剤や局所血管収縮剤などとして利用できる
ため、上記のスクリーニング方法またはスクリーニング
用キットを用いて得られる化合物のうち、ＴＧＲ−１ア
ゴニストは低血圧症予防・治療剤や局所血管収縮剤など
として用いることができる他、子宮収縮促進剤として、
微弱陣痛、弛緩出血、胎盤娩出前後、子宮復古不全、人
工妊娠中絶、分娩誘発、分娩停止、子宮頚管無力症、子
宮内反(症)、遺残胎盤および遺残卵膜、分娩後出血、女
性性器脱、不妊症、多胎妊娠における母体のケア、胎位
異常、月経困難症、流産、子宮内膜症、慢性子宮炎症性
疾患、子宮筋腫、子宮奇形、子宮腺筋症、子宮頚部裂
傷、外傷後ストレス症候群など、子宮収縮不全に関係す
る各種疾患の改善、予防および治療薬として用いること
ができる。また、ＴＧＲ−１アンタゴニストは高血圧
症、心筋梗塞、急性腎不全、ストレス性疾患（例えば、
心血管系の疾患（狭心症、心筋梗塞、不整脈など）
呼吸器系の疾患（気管支喘息、過呼吸症候群など）筋
骨格系の疾患（慢性関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊
張性頭痛など）、その他（糖尿病、更年期障害、慢性
疼痛、免疫力低下など）、消化器系疾患（胃潰瘍、潰瘍
性大腸炎など）などの予防・治療薬などとして用いるこ
とができる他、子宮収縮抑制剤として、過強陣痛、偽陣
痛、遷延妊娠、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、
頚菅裂傷、早産、子宮筋腫、子宮奇形、子宮腺筋症、娩
出力異常、慢性子宮炎症性疾患、多胎妊娠における母体
のケア、胎位異常、Prader-Willi症候群、月経困難症な
ど子宮収縮過多に関係する各種疾患の改善、予防および
治療薬として有用である。

【００４５】また、ニューロメジンＵまたはその塩は食
欲調節作用を有していることから、その食欲調節作用に
基づいて、上記のスクリーニング方法またはスクリーニ
ング用キットを用いて得られる化合物のうち、ＦＭ−３
アゴニストは食欲抑制剤、抗肥満剤、過食症治療薬、多
食症治療薬などとして、またＦＭ３アンタゴニストは食
欲促進剤などとして用いることができる。上記のスクリ
ーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得
られうる化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可
能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有
機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性ま
たは酸性アミノ酸との塩などがあげられる。無機塩基と
の塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウ
ム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム
塩、アンモニウム塩などがあげられる。有機塩基との塩
の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエ
チルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、
エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノー
ルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルア
ミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの
塩あげられる。無機酸との塩の好適な例としては、例え
ば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげら
れる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、
酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マ
レイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があ
げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、
例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があ
げられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばア
スパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる化合物またはその塩を上述の医
薬として使用する場合には、以下に記載するとおりに使
用することができる。本発明のスクリーニング方法また
はスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物ま
たはその塩を上述の医薬として使用する場合、常套手段
に従って実施することができる。例えば、必要に応じて
糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシ
ル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるい
は水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌
性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に
使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的
に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐
剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬
実施に要求される単位用量形態で混和することによって
製造することができる。これら製剤における有効成分量
は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするも
のである。

【００４６】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結
晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラ
チン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マ
グネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカ
リンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油または
チェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形
態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさら
に油脂のような液状担体を含有することができる。注射
のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活
性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油な
どを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にした
がって処方することができる。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニト
ール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶
解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノー
ル）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤
（たとえばポリソルベート８０（^TM）、ＨＣＯ−５０）
などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油
などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、
ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば温血動物（例えば、ヒ
ト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サル、イヌ、ニワトリなど）、両生類（例えば、カ
エルなど）および魚類などに対して投与することができ
る。

【００４７】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物（特にアンタ
ゴニスト）またはその塩の投与量は、症状などにより差
異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の高血圧症
患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０.１から１０００ｍｇ、好ましくは約１．０から３０
０ｍｇ、より好ましくは約３．０から５０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対
象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば
注射剤の形では成人の高血圧症患者（体重６０ｋｇとし
て）への投与においては、一日につき約０．０１から３
０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、よ
り好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。本発
明は、さらにＴＧＲ−１に対する抗体に関する。ＴＧＲ
−１に対する抗体は、ＴＧＲ−１を認識し得る抗体であ
れば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れ
であってもよい。ＴＧＲ−１に対する抗体は、ＴＧＲ−
１を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製
造法に従って製造することができる。

【００４８】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 ＴＧＲ−１は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全
フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン
トを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ず
つ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物
としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、
マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられるが、マウス
およびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗
体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動
物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択
し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取
し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合
させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定
は、例えば、後記の標識化ＴＧＲ−１と抗血清とを反応
させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定するこ
とにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、
例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー
（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従
い実施することができる。融合促進剤としては、例え
ば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられ
る。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好まし
く用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数
と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程
度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥ
Ｇ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約
２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０
分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を
実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、ＴＧＲ−１の抗原を直接あるいは担体とともに吸着
させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ
培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識し
た抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞が
マウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられ
る）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＴＧ
Ｒ−１を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検
出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選
別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行な
うことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地な
どで行なうことができる。選別および育種用培地として
は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような
培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは
１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培
地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純
薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地
（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いること
ができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは
約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ま
しくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガ
ス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の
抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして
測定できる。

【００４９】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル
抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にした
がって製造することができる。例えば、免疫抗原（ＴＧ
Ｒ−１抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、
上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に
免疫を行ない、該免疫動物からＴＧＲ−１に対する抗体
含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより
製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫
抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー
蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して
抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率
で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、
ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモ
シアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２
０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用
いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルア
ルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、
チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル
試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対し
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２
〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことが
できる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定
できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノ
クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分
離精製法に従って行なうことができる。上記の本発明の
抗体は、ＴＧＲ−１を特異的に認識することができるの
で、被検液中のＴＧＲ−１の定量、特にサンドイッチ免
疫測定法による定量などに使用することができる。すな
わち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明の抗体と、被検
液および標識化ＴＧＲ−１とを競合的に反応させ、該抗
体に結合した標識化ＴＧＲ−１の割合を測定することを
特徴とする被検液中のＴＧＲ−１の定量法、（ii）被検
液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化され
た本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴
とする被検液中のＴＧＲ−１の定量法を提供する。上記
（ii）においては、一方の抗体がＴＧＲ−１のＮ端部を
認識する抗体で、他方の抗体がＴＧＲ−１のＣ端部に反
応する抗体であることが好ましい。ＴＧＲ−１に対する
モノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗
体と称する場合がある）を用いてＴＧＲ−１の測定を行
なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともでき
る。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよ
く、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂、Ｆａｂ'、あるいは
Ｆａｂ画分を用いてもよい。ＴＧＲ−１に対する抗体を
用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被
測定液中の抗原量（例えば、ＴＧＲ−１量）に対応した
抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的また
は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む
標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法で
あれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフ
ロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンド
イッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、
後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標
識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例
えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質など
が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔
¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いら
れる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが
好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質と
しては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイ
ソチオシアネートなどが用いられる。発光物質として
は、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェ
リン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体ある
いは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用
いることもできる。抗原あるいは抗体の不溶化に当って
は、物理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるい
は酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合
を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロ
ース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、
ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成
樹脂、あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法
においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被
検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明
のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、
不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検
液中のＴＧＲ−１量を定量することができる。１次反応
と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法によるＴＧＲ−１の測定法におい
ては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノク
ローナル抗体はＴＧＲ−１の結合する部位が相異なる抗
体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反
応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる
抗体が、ＴＧＲ−１のＣ端部を認識する場合、１次反応
で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ
端部を認識する抗体が用いられる。本発明のモノクロー
ナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例え
ば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリ
ーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の
抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの
ち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗
原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの
標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応
法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポ
リエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体など
を用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を
用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第
２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられ
る。イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化
抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後
固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と
過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加
え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と
液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し
被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロメトリーで
は、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じ
た不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が
僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレー
ザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好
適に用いられる。

【００５０】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＴＧ
Ｒ−１の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技
術手段の詳細については、総説、成書などを参照するこ
とができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ
イ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メ
ソッズ・イン・エンジモノジー（Methods in ENZYMOLOG
Y）」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、
同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、
同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、
同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D: Sel
ected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical
Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and Gener
al Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121(Immunochem
ical Techniques(Part I: Hybridoma Technology and M
onoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社
発行)など参照〕。以上のように、本発明の抗体を用い
ることによって、ＴＧＲ−１を感度良く定量することが
できる。

【００５１】さらに、本発明の抗体を用いて、生体内で
のＴＧＲ−１を定量することによって、ＴＧＲ−１の機
能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存
在するＴＧＲ−１を特異的に検出するために使用するこ
とができる。また、ＴＧＲ−１を精製するために使用す
る抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＴＧＲ−１の
検出、被検細胞内におけるＴＧＲ−１の挙動の分析など
のために使用することができる。

【００５２】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｙ ：チミンまたはシトシン Ｎ ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン Ｒ ：アデニンまたはグアニン Ｍ ：シトシンまたはアデニン Ｗ ：チミンまたはアデニン Ｓ ：シトシンまたはグアニン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅtまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅt ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン ＰＡＭ ：フェニルアセトアミドメチル

【００５３】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＨＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキ シイミド Ｂｚｌ ：ベンジル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロルベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：t−ブチルオキシカルボニル ＨＯＢt ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｂｕｍ ：ターシャリーブトキシメチル Ｔｒt ：トリチル ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン ＣＨＡＰＳ ：３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１ −プロパンスルホナート ＰＭＳＦ ：フェニルメチルスルホニルフルオリド Ｅ６４ ：（Ｌ−３−trans−カルボキオキシラン−２−カルボニル ）Ｌ−ロイシル−アグマチン ＧＤＰ ：グアノシン−５’−二リン酸 ＭＥＭα ：ミニマムエッセンシャルメジウムアルファ Ｆｕｒａ−２ＡＭ ：1-[6-アミノ-2-(5-カルボキシ-2-オキサゾリル)-5-ベンゾ フラニロキシ]-2-(2-アミノ-5メチルフェノキシ)-エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペン タアセトキシメチルエステル ＨＢＳＳ ：ハンクス平衡塩液 Ｆｌｕｏ−３ＡＭ ：1-[2-アミノ-5-(2,7-ジクロロ-6-ヒドロキシ-3-オキシ-9- キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N' -四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル ＨＥＰＥＳ ：２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル] エタンスルホン酸 ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン

【００５４】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕実施例１で得られたＴＧＲ−１のアミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：３〕実施例１に記載のプライマー１の塩基
配列を示す。 〔配列番号：４〕実施例１に記載のプライマー２の塩基
配列を示す。 〔配列番号：５〕ブタ型ニューロメジンＵ−８をコード
するアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：６〕イヌ型ニューロメジンＵ−８をコード
するアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：７〕ニワトリ型ニューロメジンＵ−９をコ
ードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：８〕モルモット型ニューロメジンＵ−９を
コードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：９〕ラット型ニューロメジンＵ−２３をコ
ードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１０〕カエル型ニューロメジンＵ−２３を
コードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１１〕ヒト型ニューロメジンＵ−２５をコ
ードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１２〕ブタ型ニューロメジンＵ−２５をコ
ードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３〕イヌ型ニューロメジンＵ−２５をコ
ードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４〕ニワトリ型ニューロメジンＵ−２５
をコードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５〕カエル型ニューロメジンＵ−２５を
コードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１６〕ニューロメジンＵ−２５の部分ペプ
チドをコードするアミノ酸配列を示す。配列番号：５で
表されるアミノ酸配列の第４番目〜第８番目のアミノ酸
配列を示す。 〔配列番号：１７〕ＴＧＲ−１と実質的に同一のアミノ
酸配列を示す（WO99/55732号に記載のもの）。 〔配列番号：１８〕配列番号：２３で表されるアミノ酸
配列を含有するＤＮＡの塩基配列を示す（WO99/55732号
に記載のもの）。 〔配列番号：１９〕実施例３で用いられたプライマーRT
GRF2の塩基配列を示す。 〔配列番号：２０〕実施例３で用いられたプライマーRT
GRR1の塩基配列を示す。 〔配列番号：２１〕実施例３で得られたラット型ＴＧＲ
-１をコードするアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２２〕ラット型ＴＧＲ−１をコードするＤ
ＮＡの塩基配列を示す。

【００５５】後述の実施例１で得られた配列番号：１で
表されるＴＧＲ−１をコードするｃＤＮＡを有する形質
転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＴＯＰ１
０／ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ＴＧＲ１は、１９９９年１
２月６日から茨城県つくば市東１−１−３、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９６４として、１９９９年１１
月１２日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８
５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６３３６として寄託されている。後述の実施例３で
得られた配列番号：２１で表されるＴＧＲ−１をコード
するｃＤＮＡを有する形質転換体エシェリヒア コリ（E
scherichia coli）ＪＭ１０９／ｐｒＴＧＲ−１は、２
０００年１１月９日から茨城県つくば市東１−１−３、
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ
Ｈ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３５５として、２０
００年１０月２４日から大阪府大阪市淀川区十三本町２
−１７−８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託
番号ＩＦＯ １６４８８として寄託されている。

【００５６】

【発明の実施の形態】以下の実施例によって本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるも
のではない。

【００５７】

【実施例】実施例１ ＴＧＲ−１をコードするcDNAのクローニングと塩基配列
の決定 ヒト精巣cDNA（Marathon-Ready^TMcDNA；Clontech社）を
鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番
号：３）及びプライマー２（配列番号：４）を用いてPC
Rを行なった。PCR反応には Advantage 2 Polymerase Mi
xture（Clontech社）を用い、95℃ 1分の後、95℃
30秒、68℃ 2 分を5回、95℃ 30秒、64℃ 30秒、68℃
2分を 5回、95℃ 30秒、62℃ 30秒、68℃ 2分を30回
の後、68℃ 7分の伸長反応を行なった。反応後反応産
物をTAクローニングキット（Invitrogen社）の処方に従
いプラスミドベクター pCR2.1TOPO（Invitrogen 社）へ
クローニングした。これを大腸菌TOP10に導入し、プラ
スミドを持つクローンをampicilinを含むLB寒天培地中
で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、Ｔ
ＧＲ−１（配列番号：１）をコードするcDNAの塩基配列
（配列番号：２）を得た。

【００５８】実施例２ TGR-1発現CHO細胞およびmock C
HO細胞に対するニューロメジンU-8の反応性のサイトセ
ンサーによる比較 実施例１によって得られたTGR-1をコードするｃDNAを用
いて、自体公知の方法に準じて作成したTGR-1発現CHO細
胞およびmock CHO細胞をサイトセンサー用カプセルに2.
7×10⁵cells/wellの密度で播種し、一晩培養した。細胞
の入ったカプセルをサイトセンサーにセットし、0.1％
牛血清アルブミンを添加したlow buffered RPMI1640培
地を還流しながら細胞を順化させた。サイトセンサーに
よってポンプのON(80秒間)・OFF(40秒間)を１サイクル
として繰り返して行ない、ポンプが停止している間の細
胞外ｐHの変化率をacidification rateとして経時的に
測定した。同培地にブタ型ニューロメジンＵ-８（BACHE
M社、H-5505、配列番号：５）を溶解し、段階的に希釈
したものをサイトセンサーの流路系の切り替えによって
細胞に7分2秒間暴露した。反応のピークの値についてサ
ンプルが細胞に暴露される直前の３サイクルの平均値を
100％として換算し、比較したところ、TGR-1発現CHO細
胞は特異的かつ濃度依存的にニューロメジンUに反応す
ることを見出した（図１）。

【００５９】実施例３ ラット型のTGR-1をコードするc
DNAの取得 ラット型のTGR-1をコードするcDNA全長をコードする断
片取得のために以下の２種類のＤＮＡを合成した。 RTGRF2:5’-CTGATGCTATCCTTTCACTCTCTCAGACC-3’ （配
列番号：１９） RTGRR1:5’-TCCTTGCAGTTTTGGCACATAGATGGA-3’ （配列
番号：２０） これらの合成DNA、RTGRF2および RTGRR1をプライマーと
して用い、ラット子宮poly(A)⁺RNAより合成したｃDNAを
鋳型としてPCRを行い、全長をコードする断片を増幅し
た。PCRの反応液はcDNA溶液２μl（８ng poly(A)⁺RNA由
来）、 １μl dNTPs（10mM）、0.5μl Advantage2 DNA
polymerase（Clontech社）、2.5μl Advantage2 DNA
polymeraseに添付されている10 xバッファー、1８μl蒸
留水、さらに合成ＤＮＡRTGRFとRTGRR1（各１０μM）を
0.5μlずつ加え、合計25μlとした。この反応液は9４℃
2分の変性の後、98℃10秒、68℃90秒のサイクルを31回
繰り返すPCR反応を行った。電気泳動で確認された約1.4
kbのPCR産物をQIA quick Gel Extraction Kit（Quiagen
社）を用いて精製し、TA cloning kit (Invitrogen社)
のマニュアルに従い、クローニングベクターpCR2.1 TOP
Oへ挿入、大腸菌JM109に導入して形質転換体E.coli JM1
09/prTGR-1を得た。このプラスミドprTGR-に挿入されて
いる塩基配列を決定し（配列番号：２２）、それにコー
ドされるラット型TGR-1の予測されるアミノ酸配列を配
列番号：２１で示す。また実施例１に示したヒト型配列
（配列番号：１）との比較を図２に示した。

【００６０】

【発明の効果】本発明のニューロメジンＵおよびＴＧＲ
−１を用いることを特徴とするニューロメジンＵとＴＧ
Ｒ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
クリーニング方法は、肥満症、高血圧症、ストレス性疾
患等の予防・治療薬などをスクリーニングするために用
いることができる。ＴＧＲ−１アゴニストは肥満症等の
予防・治療薬として有用であり、ＴＧＲ−１アンタゴニ
ストは高血圧症、ストレス性疾患等の予防・治療薬とし
て有用である。

【００６１】

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Screening Method <130> B01053 <150> JP 2000-032773 <151> 2000-02-04 <150> JP 2000-052252 <151> 2000-02-24 <150> JP 2000-097896 <151> 2000-03-30 <150> JP 2000-187536 <151> 2000-06-19 <160> 22 <210> 1 <211> 415 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ser Gly Met Glu Lys Leu Gln Asn Ala Ser Trp Ile Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Lys Leu Glu Asp Pro Phe Gln Lys His Leu Asn Ser Thr Glu Glu Tyr 20 25 30 Leu Ala Phe Leu Cys Gly Pro Arg Arg Ser His Phe Phe Leu Pro Val 35 40 45 Ser Val Val Tyr Val Pro Ile Phe Val Val Gly Val Ile Gly Asn Val 50 55 60 Leu Val Cys Leu Val Ile Leu Gln His Gln Ala Met Lys Thr Pro Thr 65 70 75 80 Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Met Pro Leu Glu Val Tyr Glu Met Trp Arg Asn Tyr Pro Phe 100 105 110 Leu Phe Gly Pro Val Gly Cys Tyr Phe Lys Thr Ala Leu Phe Glu Thr 115 120 125 Val Cys Phe Ala Ser Ile Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Val Glu Arg 130 135 140 Tyr Val Ala Ile Leu His Pro Phe Arg Ala Lys Leu Gln Ser Thr Arg 145 150 155 160 Arg Arg Ala Leu Arg Ile Leu Gly Ile Val Trp Gly Phe Ser Val Leu 165 170 175 Phe Ser Leu Pro Asn Thr Ser Ile His Gly Ile Lys Phe His Tyr Phe 180 185 190 Pro Asn Gly Ser Leu Val Pro Gly Ser Ala Thr Cys Thr Val Ile Lys 195 200 205 Pro Met Trp Ile Tyr Asn Phe Ile Ile Gln Val Thr Ser Phe Leu Phe 210 215 220 Tyr Leu Leu Pro Met Thr Val Ile Ser Val Leu Tyr Tyr Leu Met Ala 225 230 235 240 Leu Arg Leu Lys Lys Asp Lys Ser Leu Glu Ala Asp Glu Gly Asn Ala 245 250 255 Asn Ile Gln Arg Pro Cys Arg Lys Ser Val Asn Lys Met Leu Phe Val 260 265 270 Leu Val Leu Val Phe Ala Ile Cys Trp Ala Pro Phe His Ile Asp Arg 275 280 285 Leu Phe Phe Ser Phe Val Glu Glu Trp Ser Glu Ser Leu Ala Ala Val 290 295 300 Phe Asn Leu Val His Val Val Ser Gly Val Phe Phe Tyr Leu Ser Ser 305 310 315 320 Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Leu Leu Ser Arg Arg Phe Gln Ala 325 330 335 Ala Phe Gln Asn Val Ile Ser Ser Phe His Lys Gln Trp His Ser Gln 340 345 350 His Asp Pro Gln Leu Pro Pro Ala Gln Arg Asn Ile Phe Leu Thr Glu 355 360 365 Cys His Phe Val Glu Leu Thr Glu Asp Ile Gly Pro Gln Phe Pro Cys 370 375 380 Gln Ser Ser Met His Asn Ser His Leu Pro Thr Ala Leu Ser Ser Glu 385 390 395 400 Gln Met Ser Arg Thr Asn Tyr Gln Ser Phe His Phe Asn Lys Thr 405 410 415 <210> 2 <211> 1245 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGTCAGGGA TGGAAAAACT TCAGAATGCT TCCTGGATCT ACCAGCAGAA ACTAGAAGAT 60 CCATTCCAGA AACACCTGAA CAGCACCGAG GAGTATCTGG CCTTCCTCTG CGGACCTCGG 120 CGCAGCCACT TCTTCCTCCC CGTGTCTGTG GTGTATGTGC CAATTTTTGT GGTGGGGGTC 180 ATTGGCAATG TCCTGGTGTG CCTGGTGATT CTGCAGCACC AGGCTATGAA GACGCCCACC 240 AACTACTACC TCTTCAGCCT GGCGGTCTCT GACCTCCTGG TCCTGCTCCT TGGAATGCCC 300 CTGGAGGTCT ATGAGATGTG GCGCAACTAC CCTTTCTTGT TCGGGCCCGT GGGCTGCTAC 360 TTCAAGACGG CCCTCTTTGA GACCGTGTGC TTCGCCTCCA TCCTCAGCAT CACCACCGTC 420 AGCGTGGAGC GCTACGTGGC CATCCTACAC CCGTTCCGCG CCAAACTGCA GAGCACCCGG 480 CGCCGGGCCC TCAGGATCCT CGGCATCGTC TGGGGCTTCT CCGTGCTCTT CTCCCTGCCC 540 AACACCAGCA TCCATGGCAT CAAGTTCCAC TACTTCCCCA ATGGGTCCCT GGTCCCAGGT 600 TCGGCCACCT GTACGGTCAT CAAGCCCATG TGGATCTACA ATTTCATCAT CCAGGTCACC 660 TCCTTCCTAT TCTACCTCCT CCCCATGACT GTCATCAGTG TCCTCTACTA CCTCATGGCA 720 CTCAGACTAA AGAAAGACAA ATCTCTTGAG GCAGATGAAG GGAATGCAAA TATTCAAAGA 780 CCCTGCAGAA AATCAGTCAA CAAGATGCTG TTTGTCTTGG TCTTAGTGTT TGCTATCTGT 840 TGGGCCCCGT TCCACATTGA CCGACTCTTC TTCAGCTTTG TGGAGGAGTG GAGTGAATCC 900 CTGGCTGCTG TGTTCAACCT CGTCCATGTG GTGTCAGGTG TCTTCTTCTA CCTGAGCTCA 960 GCTGTCAACC CCATTATCTA TAACCTACTG TCTCGCCGCT TCCAGGCAGC ATTCCAGAAT 1020 GTGATCTCTT CTTTCCACAA ACAGTGGCAC TCCCAGCATG ACCCACAGTT GCCACCTGCC 1080 CAGCGGAACA TCTTCCTGAC AGAATGCCAC TTTGTGGAGC TGACCGAAGA TATAGGTCCC 1140 CAATTCCCAT GTCAGTCATC CATGCACAAC TCTCACCTCC CAACAGCCCT CTCTAGTGAA 1200 CAGATGTCAA GAACAAACTA TCAAAGCTTC CACTTTAACA AAACC 1245 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 3 GTCGACTTAA TGTCAGGGAT GGAAAAACTT 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 ACTAGTTCAG GTTTTGTTAA AGTGGAAGCT 30 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Pig <400> 5 Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 8 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Dog <400> 6 Glu Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 8 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Chicken <400> 7 Gly Tyr Phe Phe Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 9 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Guinea pig <400> 8 Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 9 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Rat <400> 9 Tyr Lys Val Asn Glu Tyr Gln Gly Pro Val Ala Pro Ser Gly Gly Phe 1 5 10 15 Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 23 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Frog <400> 10 Ser Asp Glu Glu Val Gln Val Pro Gly Gly Val Ile Ser Asn Gly Tyr 1 5 10 15 Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 23 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Human <400> 11 Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Pig <400> 12 Phe Leu Val Asp Glu Glu Phe Gln Gly Pro Ile Val Ser Gln Asn Arg 1 5 10 15 Arg Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Dog <400> 13 Phe Arg Leu Asp Glu Glu Phe Gln Gly Pro Ile Ala Ser Gln Val Arg 1 5 10 15 Arg Gln Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Chicken <400> 14 Tyr Lys Val Asp Glu Asp Leu Gln Gly Ala Gly Gly Ile Gln Ser Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Phe Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 15 <211> 25 <212> PRT <213> Frog <400> 15 Leu Lys Pro Asp Glu Glu Leu Gln Gly Pro Gly Gly Val Leu Ser Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Val Phe Arg Pro Arg Asn 20 25 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 16 Phe Arg Pro Arg Asn 1 5 <210> 17 <211> 415 <212> PRT <213> Human <400> 17 Met Ser Gly Met Glu Lys Leu Gln Asn Ala Ser Trp Ile Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Lys Leu Glu Asp Pro Phe Gln Lys His Leu Asn Ser Thr Glu Glu Tyr 20 25 30 Leu Ala Phe Leu Cys Gly Pro Arg Arg Ser His Phe Phe Leu Pro Val 35 40 45 Ser Val Val Tyr Val Pro Ile Phe Val Val Gly Val Ile Gly Asn Val 50 55 60 Leu Val Cys Leu Val Ile Leu Gln His Gln Ala Met Lys Thr Pro Thr 65 70 75 80 Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu 85 90 95 Leu Gly Met Pro Leu Glu Val Tyr Glu Met Trp Arg Asn Tyr Pro Phe 100 105 110 Leu Phe Gly Pro Val Gly Cys Tyr Phe Lys Thr Ala Leu Phe Glu Thr 115 120 125 Val Cys Phe Ala Ser Ile Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Val Glu Arg 130 135 140 Tyr Val Ala Ile Leu His Pro Phe Arg Ala Lys Leu Gln Ser Thr Arg 145 150 155 160 Arg Arg Ala Leu Arg Ile Leu Gly Ile Val Trp Gly Phe Ser Val Leu 165 170 175 Phe Ser Leu Pro Asn Thr Ser Ile His Gly Ile Lys Phe His Tyr Phe 180 185 190 Pro Asn Gly Ser Leu Val Pro Gly Ser Ala Thr Cys Thr Val Ile Lys 195 200 205 Pro Met Trp Ile Tyr Asn Phe Ile Ile Gln Val Thr Ser Phe Leu Phe 210 215 220 Tyr Leu Leu Pro Met Thr Val Ile Ser Val Leu Tyr Tyr Leu Met Ala 225 230 235 240 Leu Arg Leu Lys Lys Asp Lys Ser Leu Glu Ala Asp Glu Gly Asn Ala 245 250 255 Asn Ile Gln Arg Pro Cys Arg Lys Ser Val Asn Lys Met Leu Leu Val 260 265 270 Leu Val Leu Val Phe Ala Ile Cys Trp Ala Pro Phe His Ile Asp Arg 275 280 285 Leu Phe Phe Ser Phe Val Glu Glu Trp Thr Glu Ser Leu Ala Ala Val 290 295 300 Phe Asn Leu Val His Val Val Ser Gly Val Leu Phe Tyr Leu Ser Ser 305 310 315 320 Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Leu Leu Ser Arg Arg Phe Gln Ala 325 330 335 Ala Phe Gln Asn Val Ile Ser Ser Phe His Lys Gln Trp His Ser Gln 340 345 350 His Asp Pro Gln Leu Pro Pro Ala Gln Arg Asn Ile Phe Leu Thr Glu 355 360 365 Cys His Phe Val Glu Leu Thr Glu Asp Ile Gly Pro Gln Phe Pro Cys 370 375 380 Gln Ser Ser Val His Asn Ser His Leu Pro Thr Ala Leu Ser Ser Glu 385 390 395 400 Gln Met Ser Arg Thr Asn Tyr Gln Ser Phe His Phe Asn Lys Thr 405 410 415 <210> 18 <211> 1245 <212> DNA <213> Human <400> 18 ATGTCAGGGA TGGAAAAACT TCAGAATGCT TCCTGGATCT ACCAGCAGAA ACTAGAAGAT 60 CCATTCCAGA AACACCTGAA CAGCACCGAG GAGTATCTGG CCTTCCTCTG CGGACCTCGG 120 CGCAGCCACT TCTTCCTCCC CGTGTCTGTG GTGTATGTGC CAATTTTTGT GGTGGGGGTC 180 ATTGGCAATG TCCTGGTGTG CCTGGTGATT CTGCAGCACC AGGCTATGAA GACGCCCACC 240 AACTACTACC TCTTCAGCCT GGCGGTCTCT GACCTCCTGG TCCTGCTCCT TGGAATGCCC 300 CTGGAGGTCT ATGAGATGTG GCGCAACTAC CCTTTCTTGT TCGGGCCCGT GGGCTGCTAC 360 TTCAAGACGG CCCTCTTTGA GACCGTGTGC TTCGCCTCCA TCCTCAGCAT CACCACCGTC 420 AGCGTGGAGC GCTACGTGGC CATCCTACAC CCGTTCCGCG CCAAACTGCA GAGCACCCGG 480 CGCCGGGCCC TCAGGATCCT CGGCATCGTC TGGGGCTTCT CCGTGCTCTT CTCCCTGCCC 540 AACACCAGCA TCCATGGCAT CAAGTTCCAC TACTTCCCCA ATGGGTCCCT GGTCCCAGGT 600 TCGGCCACCT GTACGGTCAT CAAGCCCATG TGGATCTACA ATTTCATCAT CCAGGTCACC 660 TCCTTCCTAT TCTACCTCCT CCCCATGACT GTCATCAGTG TCCTCTACTA CCTCATGGCA 720 CTCAGACTAA AGAAAGACAA ATCTCTTGAG GCAGATGAAG GGAATGCAAA TATTCAAAGA 780 CCCTGCAGAA AATCAGTCAA CAAGATGCTG CTTGTCTTGG TCTTAGTGTT TGCTATCTGT 840 TGGGCCCCGT TCCACATTGA CCGACTCTTC TTCAGCTTTG TGGAGGAGTG GACTGAATCC 900 CTGGCTGCTG TGTTCAACCT CGTCCATGTG GTGTCAGGTG TCTTATTCTA CCTGAGCTCA 960 GCTGTCAACC CCATTATCTA TAACCTACTG TCTCGCCGCT TCCAGGCAGC ATTCCAGAAT 1020 GTGATCTCTT CTTTCCACAA ACAGTGGCAC TCCCAGCATG ACCCACAGTT GCCACCTGCC 1080 CAGCGGAACA TCTTCCTGAC AGAATGCCAC TTTGTGGAGC TGACCGAAGA TATAGGTCCC 1140 CAATTCCCAT GTCAGTCATC CGTGCACAAC TCTCACCTCC CAACAGCCCT CTCTAGTGAA 1200 CAGATGTCAA GAACAAACTA TCAAAGCTTC CACTTTAACA AAACC 1245 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 19 CTGATGCTAT CCTTTCACTC TCTCAGACC 29 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 20 TCCTTGCAGT TTTGGCACAT AGATGGA 27 <210> 21 <211> 395 <212> PRT <213> Rat <400> 21 Met Gly Lys Leu Glu Asn Ala Ser Trp Ile His Asp Pro Leu Met Lys 1 5 10 15 Tyr Leu Asn Ser Thr Glu Glu Tyr Leu Ala His Leu Cys Gly Pro Lys 20 25 30 Arg Ser Asp Leu Ser Leu Pro Val Ser Val Ala Tyr Ala Leu Ile Phe 35 40 45 Leu Val Gly Val Met Gly Asn Leu Leu Val Cys Met Val Ile Val Arg 50 55 60 His Gln Thr Leu Lys Thr Pro Thr Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala 65 70 75 80 Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu Leu Gly Met Pro Leu Glu Ile Tyr 85 90 95 Glu Met Trp His Asn Tyr Pro Phe Leu Phe Gly Pro Val Gly Cys Tyr 100 105 110 Phe Lys Thr Ala Leu Phe Glu Thr Val Cys Phe Ala Ser Ile Leu Ser 115 120 125 Val Thr Thr Val Ser Val Glu Arg Tyr Val Ala Ile Val His Pro Phe 130 135 140 Arg Ala Lys Leu Glu Ser Thr Arg Arg Arg Ala Leu Arg Ile Leu Ser 145 150 155 160 Leu Val Trp Ser Phe Ser Val Val Phe Ser Leu Pro Asn Thr Ser Ile 165 170 175 His Gly Ile Lys Phe Gln His Phe Pro Asn Gly Ser Ser Val Pro Gly 180 185 190 Ser Ala Thr Cys Thr Val Thr Lys Pro Met Trp Val Tyr Asn Leu Ile 195 200 205 Ile Gln Ala Thr Ser Phe Leu Phe Tyr Ile Leu Pro Met Thr Leu Ile 210 215 220 Ser Val Leu Tyr Tyr Leu Met Gly Leu Arg Leu Lys Arg Asp Glu Ser 225 230 235 240 Leu Glu Ala Asn Lys Val Ala Val Asn Ile His Arg Pro Ser Arg Lys 245 250 255 Ser Val Thr Lys Met Leu Phe Val Leu Val Leu Val Phe Ala Ile Cys 260 265 270 Trp Thr Pro Phe His Val Asp Arg Leu Phe Phe Ser Phe Val Glu Glu 275 280 285 Trp Thr Glu Ser Leu Ala Ala Val Phe Asn Leu Ile His Val Val Ser 290 295 300 Gly Val Phe Phe Tyr Leu Ser Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Asn 305 310 315 320 Leu Leu Ser Arg Arg Phe Arg Ala Ala Phe Arg Asn Val Val Ser Pro 325 330 335 Thr Cys Lys Trp Cys His Pro Arg His Gln Pro Gln Gly Pro Pro Ala 340 345 350 Gln Lys Ile Ile Phe Leu Thr Glu Cys His Leu Met Glu Leu Thr Glu 355 360 365 Asp Ala Gly Pro Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ser Ile His Asn Thr Asn 370 375 380 Leu Thr Met Ala Pro Cys Ala Gly Glu Val Pro 385 390 395 <210> 22 <211> 1185 <212> DNA <213> Rat <400> 22 ATGGGAAAAC TTGAAAATGC TTCCTGGATC CACGATCCAC TCATGAAGTA CTTGAACAGC 60 ACAGAGGAGT ACTTGGCCCA CCTGTGTGGA CCCAAGCGCA GTGACCTATC CCTTCCGGTG 120 TCTGTGGCCT ATGCGCTGAT CTTCCTGGTG GGGGTAATGG GCAATCTTCT GGTGTGCATG 180 GTGATTGTCC GACATCAGAC TTTGAAGACA CCCACCAACT ACTATCTCTT CAGCTTGGCA 240 GTCTCAGATC TGCTGGTCCT GCTCTTGGGG ATGCCTCTGG AAATCTACGA GATGTGGCAC 300 AATTACCCTT TCCTGTTCGG GCCTGTGGGA TGCTACTTCA AGACAGCCCT CTTCGAGACT 360 GTGTGCTTTG CCTCCATTCT CAGTGTCACC ACGGTTAGCG TAGAGCGCTA TGTGGCCATT 420 GTCCACCCTT TCCGAGCCAA GCTGGAGAGC ACGCGGCGAC GGGCCCTCAG GATCCTCAGC 480 CTAGTCTGGA GCTTCTCTGT GGTCTTTTCT TTGCCCAATA CCAGCATCCA TGGCATCAAG 540 TTCCAGCACT TTCCCAACGG GTCCTCCGTA CCTGGCTCAG CCACCTGCAC AGTCACCAAA 600 CCCATGTGGG TGTATAACTT GATCATCCAA GCTACCAGCT TCCTCTTCTA CATCCTCCCA 660 ATGACCCTCA TCAGCGTCCT CTACTACCTC ATGGGGCTCA GGCTGAAGAG AGATGAATCC 720 CTTGAGGCGA ACAAAGTGGC TGTGAATATT CACAGACCCT CTAGAAAGTC AGTCACCAAG 780 ATGCTGTTTG TCTTGGTCCT CGTGTTTGCC ATCTGCTGGA CCCCCTTCCA TGTGGACCGG 840 CTCTTCTTCA GCTTTGTGGA AGAGTGGACA GAGTCCCTGG CTGCTGTGTT CAACCTCATC 900 CATGTGGTAT CAGGTGTCTT CTTTTATCTG AGCTCCGCGG TCAACCCCAT TATCTATAAC 960 CTCCTGTCTC GGCGCTTCCG GGCGGCCTTT CGAAATGTTG TCTCCCCTAC CTGCAAATGG 1020 TGCCATCCCC GGCATCAGCC ACAGGGACCT CCAGCCCAGA AGATCATCTT CTTGACAGAA 1080 TGTCACCTCA TGGAGCTGAC AGAGGATGCA GGCCCCCAGT TCCCTGGTCA GTCATCCATC 1140 CACAACACCA ACCTTACCAT GGCCCCCTGT GCGGGAGAGG TACCA 1185

【００６２】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で行われたサイトセンサーによるTGR-
1受容体特異的な細胞刺激活性の検出の結果を示す図を
表す。サイトセンサーアッセイにおいて、TGR-1受容体
発現CHO細胞（○）およびmock CHO細胞（●）に対して
図に表示の濃度のブタ型ニューロメジンＵ-８を７分２
秒間作用させ、その間のAcidification Rateの最大値を
プロットしている。

【図２】参考例１で得られたヒト型ＴＧＲ−１と実施例
２で得られたラット型ＴＧＲ−１とのアミノ酸配列の比
較を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:91） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願2000−187536(P2000−187536) (32)優先日 平成12年６月19日(2000．6．19) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 藤井 亮 茨城県つくば市春日１丁目７番地９ 武田 春日ハイツ303号 (72)発明者 守谷 岳郎 大阪府箕面市新稲３−３−10 箕面ブジノ ースＢ−202 (72)発明者 松井 英起 茨城県つくば市並木４丁目16番地１ ガー デンヒルズ並木708号 (72)発明者 大久保 尚一 茨城県牛久市中央１丁目４番地23 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB05 BB10 BB14 BB41 BB51 DA13 DA36 FB01 FB02 FB03 FB07 FB08 GC15 4B024 AA01 AA11 BA01 BA41 BA63 CA04 DA02 EA04 GA03 GA11 GA12 HA01 HA03 HA15 4B064 AG15 AG20 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90X AA90Y AB01 AB04 BA02 BA04 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 CA50 DA30 DA50 DA76 EA20 EA50 FA20 FA72 FA74

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ニューロメジンＵもしくはその誘導体また
   はその塩および配列番号：１または配列番号：２１で表
   されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
   酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特
   徴とするニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：１
   または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一ま
   たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質また
   はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の
   スクリーニング方法。
2. 【請求項２】ニューロメジンＵもしくはその誘導体また
   はその塩および配列番号：１または配列番号：２１で表
   されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
   酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを
   特徴とするニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：
   １または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一
   または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質ま
   たはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩
   のスクリーニング用キット。
3. 【請求項３】請求項１記載のスクリーニング方法または
   請求項２記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
   うる、ニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：１ま
   たは配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一また
   は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または
   その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
4. 【請求項４】請求項３記載の化合物またはその塩を含有
   してなる医薬。
5. 【請求項５】肥満症、高血圧症またはストレス性疾患の
   予防・治療薬である請求項４記載の医薬。
6. 【請求項６】ニューロメジンＵが配列番号：１１で表さ
   れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
   酸配列を含有するペプチドである請求項１記載のスクリ
   ーニング方法または請求項２記載のスクリーニング用キ
   ット。
7. 【請求項７】配列番号：１または配列番号：２１で表わ
   されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
   ノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその
   塩。
8. 【請求項８】請求項７記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
   を含有するＤＮＡ。
9. 【請求項９】配列番号：２または配列番号：２２で表さ
   れる塩基配列を有する請求項８記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】請求項８記載のＤＮＡを含有する組換え
    ベクター。
11. 【請求項１１】請求項１０記載の組換えベクターで形質
    転換させた形質転換体。
12. 【請求項１２】請求項１１記載の形質転換体を培養し、
    請求項７記載の蛋白質を生成せしめることを特徴とする
    請求項７記載の蛋白質またはその塩の製造法。
13. 【請求項１３】請求項７記載の蛋白質またはその塩に対
    する抗体。