JP4637378B2 - スクリーニング方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト精巣およびラット子宮由来の新規レセプター蛋白質であるＴＧＲ−１、ＴＧＲ−１をコードするＤＮＡ、ＴＧＲ−１とニューロメジンＵ（Minamino, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 130, 1078-1085, 1985など）もしくはその誘導体またはその塩を用いることを特徴とする高血圧症、ストレス性疾患などの予防・治療薬または食欲調節剤などのスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプターを通じて生体の機能を調節している。これらのレセプターの多くは共役しているguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行い、また７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプターあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。
このようなホルモンや神経伝達物質とＧ蛋白質共役型レセプターとの相互作用を通じて生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの生体にとって重要な機能調節が行われている。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質に対するレセプター蛋白質が存在し、その機能調節に重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対するレセプターが存在するかどうかについては未だ不明なことが多い。
近年、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質がその構造の一部にアミノ酸配列の類似性を示すことを利用して、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法によって新規レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを探索する方法が行われるようになり、数多くの、リガンドが不明ないわゆるオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質がクローニングされている(Libert, F., et al. Science, 244, 569-572, 1989, Welch, S.K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 209, 606-613, 1995, Marchese, A., et al., Genomics, 23, 609-618, 1994, Marchese, A., Genomics, 29, 335-344, 1995)。また、ゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡのランダムな配列決定によっても、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が次々と見出されている(Nomura, N., et al., DNA Research 1巻、27-35頁、1994年）。これらのオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドを決定する一般的な手段としては、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一次構造上の類似性から推定するしかなかった。しかし、多くのオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は既知のレセプターとのホモロジーが低いものが多く、実際は既知リガンドのレセプターサブタイプである場合を除いては一次構造上の類似性だけでそのリガンドを推定することは困難であった。一方、遺伝子解析から多くのオーファンＧ蛋白質共役型レセプターがみつかっていることから対応する未知のリガンドがまだ数多く存在していることが推定されているが、これまで実際にオーファンＧ蛋白質共役型レセプターのリガンドを同定した例は数少ない。
一方、ニューロメジンＵはラットの子宮平滑筋収縮活性を指標とし、ブタの脊髄より単離・精製されたペプチドで、８アミノ酸残基からなるニューロメジンＵ-８および２５アミノ酸残基からなるニューロメジンＵ-２５の２種が最初に報告されている（Minamino, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 130, 1078-1085, 1985）。ニューロメジンＵ-８の配列はニューロメジンＵ-２５のＣ末端部分に一致し、その上流にはプロセッシングによって切断を受ける部位によく見られるような塩基性アミノ酸ペアが存在することから、両者は共通の前駆体に由来するものと考えられる。平滑筋収縮作用の他にもニューロメジンＵの生理作用は広く知られており、例えば、血圧上昇（Minamino, N. et al.）、内蔵の血流量の低下（Sumi, S. et al., Life Sci. 41, 1585-1590, 1987）、腸管におけるイオン輸送の調節（Brown, D.R. and Quito, F.L., Eur. J. Pharmacol. 155, 159-162, 1988）、皮下投与後のACTHおよびそれに引き続くコルチコステロンの上昇（Malendowicz, L.K. et al., In Vivo, 7, 419-422, 1993）などが報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これまでニューロメジンＵのレセプターとして、ＦＭ−３が報告されている（WO 00/02918）が、ＦＭ−３以外の受容体の存在を探索し、ニューロメジンＵの生理的役割をさらに多面的に明らかにし、その機構を活性化、あるいは阻害する化合物をスクリーニングして新たな医薬を開発する必要があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規オーファンＧ蛋白質共役型レセプターであるＴＧＲ−１を見出し、該ＴＧＲ−１発現CHO細胞に対してニューロメジンＵが、予想外にも特異的な細胞刺激活性を有することを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）ニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその塩および配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とするニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）ニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその塩および配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴とするニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（３）上記（１）記載のスクリーニング方法または上記（２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、ニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（４）上記（３）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（５）肥満症、高血圧症またはストレス性疾患の予防・治療薬である上記（４）記載の医薬、
（６）ニューロメジンＵが配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである上記（１）記載のスクリーニング方法または上記（２）記載のスクリーニング用キット、
（７）配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩、
（８）上記（７）記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、
（９）配列番号：２または配列番号：２２で表される塩基配列を有する上記（８）記載のＤＮＡ、
（１０）上記（８）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（１１）上記（１０）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
（１２）上記（１１）記載の形質転換体を培養し、上記（７）記載の蛋白質を生成せしめることを特徴とする上記（７）記載の蛋白質またはその塩の製造法、および
（１３）上記（７）記載の蛋白質またはその塩に対する抗体などを提供するものである。
本発明におけるニューロメジンＵに関して、具体的には、上述のニューロメジンＵまたはその塩などがあげられるのみならず、
（１４）配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ポリペプチド）であるニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその塩などがあげられる。
【０００６】
また、本発明のニューロメジンＵはそのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基がアミド体であることが好ましい。
本発明におけるＴＧＲ−１とは上述の配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩のことを意味するが、
（１５）配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩、または
（１６）配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、あるいは配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以下、好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩などもＴＧＲ−１の具体例としてあげられる。また、より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を含有する蛋白質などもＴＧＲ−１の具体例としてあげられる。
【０００７】
本発明で用いられるＴＧＲ−１またはその塩（以下、単にＴＧＲ−１と略称する場合がある）およびニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその塩（以下、単にニューロメジンＵと略称する場合がある）の製造法を以下にさらに詳細に説明する。
本発明で用いられるＴＧＲ−１およびニューロメジンＵとしては、ヒト、温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリなど）、両生類（例えば、カエルなど）および魚類などのあらゆる組織（たとえば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または細胞などに由来する蛋白質（（ポリ）ペプチド）であって、ＴＧＲ−１としては、配列番号：１または配列番号：２１、ニューロメジンＵとしては配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質（（ポリ）ペプチド）であれば如何なるものであってもよい。
例えば、ＴＧＲ−１としては、配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番号：１または配列番号：２１で表される蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などがあげられる。
該「実質的に同一」とは、例えば、リガンド（ニューロメジンＵ）と受容体（ＴＧＲ−１）の結合活性、生理的な特性などが、実質的に同じことを意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加あるいは挿入はしばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をもたらさないが、こうした場合その置換、欠失、付加あるいは挿入を施された蛋白質（（ポリ）ペプチド））（いわゆるニューロメジンＵ改変体、ＴＧＲ−１改変体など）は、そうした置換、欠失、付加あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされる。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
【０００８】
したがって、受容体結合活性の強さなどの強弱、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
より具体的には、配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、部分アミノ酸配列としてLeu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-PheまたはSer-Met-Hisで表されるアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが好ましい。
本発明の配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
特に、本発明の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、部分アミノ酸配列としてLeu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-PheまたはSer-Met-Hisで表されるアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質が好ましい。
【０００９】
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後述するスクリーニング方法などに従って測定することができる。
また、配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、▲１▼配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
特に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、▲１▼部分アミノ酸配列としてLeu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-PheまたはSer-Met-Hisで表されるアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼部分アミノ酸配列としてLeu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-PheまたはSer-Met-Hisで表されるアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼部分アミノ酸配列としてLeu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-PheまたはSer-Met-Hisで表されるアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などが好ましく用いられる。
また、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を含有する蛋白質、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を含有する蛋白質などもＴＧＲ−１の具体例としてあげられる。
【００１０】
一方、本発明のニューロメジンＵとしては、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を含有する（ポリ）ペプチドなどの他に、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を含有する（ポリ）ペプチドと実質的に同質の活性を有する（ポリ）ペプチドなどがあげられる。実質的に同質の活性としては、例えばレセプター結合活性などがあげられる。実質的に同質とは、レセプター結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、レセプター結合活性の強さなどの強弱、（ポリ）ペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
本明細書におけるＴＧＲ−１およびニューロメジンＵはペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。例えば、配列番号：１もしくは配列番号：２１または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列などを含有する蛋白質または（ポリ）ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（-COOH）またはカルボキシレート(-COO^-)であるが、Ｃ末端がアミド（-CONH₂）またはエステル(-COOR)であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などがあげられる。
本発明で用いられるニューロメジンＵとしてはＣ末端のカルボキシル基（-COOH）がアミド（-CONH₂）であるものが好ましい。
【００１１】
本発明で用いられるＴＧＲ−１およびニューロメジンＵの塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるＴＧＲ−１およびニューロメジンＵは、公知の方法（例、FEBS Letters 398 (1996) 253-258、WO 96/18651号公報記載の方法）に準じた方法、即ち、ヒトや温血動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する方法によって製造することもできるし、後述の蛋白質（ペプチド）合成法に準じて製造することもできる。また、後述する蛋白質（ペプチド）をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
【００１２】
ヒト、温血動物、両生類、魚類などの組織または細胞から製造する場合、ヒト、温血動物、両生類、魚類などの組織または細胞をホモジナイズした後、酸、有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明で用いられるＴＧＲ−１およびニューロメジンＵは、自体公知の蛋白質（（ポリ）ペプチド）の合成法に従って、あるいはＴＧＲ−１および／またはニューロメジンＵを含有する蛋白質（（ポリ）ペプチド）を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。蛋白質（（ポリ）ペプチド）の合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ＴＧＲ−１および／またはニューロメジンＵを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の蛋白質（（ポリ）ペプチド）を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法があげられる。
▲１▼ M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)；
▲２▼ SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)；
▲３▼ 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）；
▲４▼ 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)；
▲５▼ 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店。
【００１３】
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて蛋白質（（ポリ）ペプチド）を精製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質（（ポリ）ペプチド）が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ＴＧＲ−１およびニューロメジンＵのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質（（ポリ）ペプチド）を切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質（（ポリ）ペプチド）を取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、蛋白質（（ポリ）ペプチド）合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどがあげられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBT、HOOBTなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBTエステルあるいはHOOBTエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質（（ポリ）ペプチド）縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５ないし４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどがあげられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＲとして上記したＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基、Ｃ_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどがあげられる。
【００１４】
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl₂-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBT）とのエステル］などがあげられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドなどがあげられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元などもあげられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
【００１５】
ＴＧＲ−１およびニューロメジンＵのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質（（ポリ）ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（（ポリ）ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質（（ポリ）ペプチド）のアミド体を得ることができる。
ＴＧＲ−１およびニューロメジンＵのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質（（ポリ）ペプチド）のアミド体と同様にして所望の蛋白質（（ポリ）ペプチド）のエステル体を得ることができる。
本発明で用いられるニューロメジンＵの誘導体としては、▲１▼ニューロメジンＵの部分ペプチド、▲２▼ニューロメジンＵの構成アミノ酸が欠失したペプチド、構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加したペプチド、構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチド、または▲３▼ニューロメジンＵ、上記▲１▼記載の部分ペプチドまたは上記▲２▼記載のペプチドが標識化されたものなど、ＴＧＲ−１との結合能を有するものであれば何れのものであってもよい。
ニューロメジンＵの部分ペプチドとして具体的には、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。なかでも、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドのＣ末端のカルボキシル基がアミド化されたものまたはその塩が好ましい。
【００１６】
該ニューロメジンＵの部分ペプチドは、上述のニューロメジンＵを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができるし、上記の蛋白質（（ポリ）ペプチド）の合成法に従って製造することができる。ニューロメジンＵの部分ペプチドのアミドまたはエステルも上述のアミド体またはエステル体の製造方法に準じて製造することができる。さらにニューロメジンＵの部分ペプチドの塩としては、上記のＴＧＲ−１およびニューロメジンＵの塩と同様のものなどがあげられる。
また、ニューロメジンＵの構成アミノ酸が欠失したペプチド、構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加したペプチド、構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチドとしては、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中の１個以上３個以下、好ましくは１個または２個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、または、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列に１個以上３個以下、好ましくは１個または２個のアミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、あるいは配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中の１個以上３個以下、好ましくは１個または２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。
さらに、構成アミノ酸が欠失したペプチド、構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加したペプチド、構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチドとしては、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３個以下、好ましくは１個または２個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列に１個以上３個以下、好ましくは１個または２個のアミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、あるいは配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３個以下、好ましくは１個または２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するペプチドなどもあげられる。
【００１７】
該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
ニューロメジンＵ、上記▲１▼記載の部分ペプチドまたは上記▲２▼記載のペプチドが標識化されたものとしては、自体公知の方法で、アイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたもの、酵素標識されたものなどがあげられる。
具体的には、例えば公知の方法によって、〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたニューロメジンＵなどを利用することができる。
ニューロメジンＵの誘導体の塩としては、上記のＴＧＲ−１およびニューロメジンＵの塩と同様のものなどがあげられる。
本発明で用いられるＴＧＲ−１をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、本発明で用いられるニューロメジンＵをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する)によって増幅することもできる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられ、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられ、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられる。
【００１８】
さらに、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号：２で表される塩基配列の５’末端から１０番目（Ａ）〜１２４５番目（Ｃ）の塩基配列を含有するＤＮＡをなどがあげられ、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目（Ｍｅｔ）〜４１５番目（Ｔｈｒ）のアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば配列番号：１８で表される塩基配列の５’末端から１０番目（Ａ）〜１２４５番目（Ｃ）の塩基配列を含有するＤＮＡなどがあげられる。
特に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、例えば、部分塩基配列として-CTGTTTGTC-（配列番号：２中の第808番目（C）〜第816番目（C）で表される部分塩基配列）、-TGGAGTGAA-（配列番号：２中の第888番目（T）〜第896番目（A）で表される部分塩基配列）、-GTCTTCTTC-（配列番号：２中の第940番目（G）〜第948番目（C）で表される部分塩基配列）または-TCCATGCAC-（配列番号：２中の第1159番目（T）〜第1167番目（C）で表される部分塩基配列）で表される塩基配列を含有し、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが好ましく用いられる。
より具体的には、(1)ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、配列番号：２１または配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、(2)遺伝コードの縮重のため、配列番号：１、配列番号：２１または配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質または（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡおよび(1)に定められている配列とハイブリッド形成しないが、同一アミノ酸配列をもつ蛋白質または（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば４２℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＰＥ(１×ＳＳＰＥ＝150mM NaCl, 10mM NaH₂PO₄・H₂O, 1mM EDTA pH7.4)、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳである。
【００１９】
本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを例えばＴＧＲ−１またはニューロメジンＵをコードする塩基配列の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molecular Cloning（２nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、Mutan^TM-super Express Km（宝酒造（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法やGapped duplex法やKunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
【００２０】
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Tｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、phoA・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα(ＭＦα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００２１】
このようにして構築されたＴＧＲ−１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。
動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖero細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行われる。
【００２２】
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,６巻, ４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et al. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America），８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等があげられる。
このようにして、本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを生成、蓄積せしめることによって、本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)」や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２４】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of The American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of The Society for The Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にＣＨＯ（dhfr^-）細胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、蛋白質（（ポリ）ペプチド）を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。またＮ末端アミノ酸を欠失させるためには、エドマン(Edman)試薬（フェニルイソチオシアネート）を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
かくして生成する本発明で用いられるＴＧＲ−１またはニューロメジンＵの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００２５】
ニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１を用いることを特徴とするニューロメジンとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法またはニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１を含有することを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット（以下、本発明のスクリーニング方法、本発明のスクリーニング用キットと略記する場合がある）について以下に詳述する。
ＴＧＲ−１を用いるか、または組換え型ＴＧＲ−１の発現系を構築し、該発現系を用いたニューロメジンＵとの結合アッセイ系（リガンド・レセプターアッセイ系）を用いることによって、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、ＴＧＲ−１を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を有する化合物（即ちＴＧＲ−１アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ちＴＧＲ−１アンタゴニスト）などが含まれる。
また、「ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる」とは、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合を阻害する場合と結合を促進する（結合時間を長くする）場合の両方を包含するものである。
すなわち、本発明は、（ｉ）ＴＧＲ−１に、ニューロメジンＵを接触させた場合と（ii）上記したＴＧＲ−１に、ニューロメジンＵおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などに関する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）上記したＴＧＲ−１に、ニューロメジンＵを接触させた場合と（ii）上記したＴＧＲ−１に、ニューロメジンＵおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該ＴＧＲ−１に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）などを測定して、比較する。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
▲１▼上記のニューロメジンの誘導体として表される標識したニューロメジンＵ（以下、単に「標識したニューロメジンＵ」とする）を、上記したＴＧＲ−１に接触させた場合と、標識したニューロメジンＵおよび試験化合物をＴＧＲ−１に接触させた場合における、標識したニューロメジンＵの該ＴＧＲ−１に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識したニューロメジンＵを、ＴＧＲ−１を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したニューロメジンＵおよび試験化合物をＴＧＲ−１を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したニューロメジンＵの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識したニューロメジンＵを、ＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＴＧＲ−１に接触させた場合と、標識したニューロメジンＵおよび試験化合物をＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＴＧＲ−１に接触させた場合における、標識したニューロメジンＵのＴＧＲ−１に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲４▼ＴＧＲ−１を活性化する化合物（例えば、ニューロメジンＵ）をＴＧＲ−１を含有する細胞に接触させた場合と、ＴＧＲ−１を活性化する化合物および試験化合物をＴＧＲ−１を含有する細胞に接触させた場合における、ＴＧＲ−１を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を測定し、比較することを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼ＴＧＲ−１を活性化する化合物（例えば、ニューロメジンＵなど）をＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＴＧＲ−１に接触させた場合と、ＴＧＲ−１を活性化する化合物および試験化合物を、ＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＴＧＲ−１に接触させた場合における、ＴＧＲ−１を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）を測定し、比較することを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などである。
【００２７】
本発明に用いられるニューロメジンＵは、オーファンレセプター蛋白質であるＦＭ−３（Tan, C.P. et al., Genomics 52, 223-229, 1998）に対してもリガンド活性を有することが知られている（WO 00/02919）ため、上記▲１▼〜▲５▼における活性をＴＧＲ−１の代わりにＦＭ−３を用いることによって測定し、ニューロメジンＵとＦＭ−３との結合性を変化させる化合物またはその塩（ＦＭ−３アンタゴニスト、ＦＭ−３アゴニスト）をスクリーニングすることが可能である。
従って、本発明に記載のスクリーニング方法によって得られるＴＧＲ−１アンタゴニスト、ＴＧＲ−１アゴニストの活性と、ＴＧＲ−１の代わりにＦＭ−３を用いることにより、本発明の記載のスクリーニング方法またはそれに準じた方法によって得られるＦＭ−３アンタゴニスト、ＦＭ−３アゴニストの活性とを比較することによって、ＦＭ−３により選択的な活性を有するアンタゴニストもしくはアゴニスト、またはＴＧＲ−１により選択的な活性を有するアンタゴニストもしくはアゴニストを得ることができる。
ここで、「ＦＭ−３により選択的な作用を有するアンタゴニスト」とはＦＭ−３に対する活性（受容体（ＴＧＲ−１、ＦＭ−３）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＴＧＲ−１に対する活性に対して２倍以上、好ましくは１０倍以上弱い化合物またはその塩のことをいう。
「ＦＭ−３により選択的な作用を有するアゴニスト」とはＦＭ−３に対する活性（受容体（ＴＧＲ−１、ＦＭ−３）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＴＧＲ−１に対する活性に対して２倍以上、好ましくは１０倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
「ＴＧＲ−１により選択的な作用を有するアンタゴニスト」とはＴＧＲ−１に対する活性（受容体（ＴＧＲ−１、ＦＭ−３）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＦＭ−３に対する活性に対して２倍以上、好ましくは１０倍以上弱い化合物またはその塩のことをいう。
「ＴＧＲ−１により選択的な作用を有するアゴニスト」とはＴＧＲ−１に対する活性（受容体（ＴＧＲ−１、ＦＭ−３）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＦＭ−３に対する活性に対して２倍以上、好ましくは１０倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＴＧＲ−１としては、上記のＴＧＲ−１を含有するものであれば何れのものであってもよいが、ヒト、温血動物、両生類、魚類などの臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＴＧＲ−１などが適している。
ＴＧＲ−１を製造するには、前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、ＴＧＲ−１を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
ＴＧＲ−１を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
ＴＧＲ−１を含有する細胞としては、ＴＧＲ−１を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＴＧＲ−１と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＴＧＲ−１を含有する細胞や膜画分中のＴＧＲ−１の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする前記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、適当なＴＧＲ−１画分と、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物（ニューロメジンＵ、その誘導体など）が用いられる。ＴＧＲ−１画分としては、天然型のＴＧＲ−１画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＴＧＲ−１画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物としては、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物（ニューロメジンＵ、その誘導体など）などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガンド（ニューロメジンＵ誘導体として表されるニューロメジンＵの標識体）などを利用することができる。
具体的には、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずＴＧＲ−１を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＴＧＲ−１やニューロメジンＵの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ml〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したニューロメジンＵ（ニューロメジンＵ誘導体として表されるニューロメジンＵの標識体）を添加し、同時に１０^-4〜１０^-1μＭの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のニューロメジンＵを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀)から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば８０％以下になる試験化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
【００２９】
また、ＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合を測定する方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いることもできる。この方法では、ニューロメジンＵを装置に添付のプロトコルに従ったアミノカップリング法によってセンサーチップに固定し、ＴＧＲ−１を含有する細胞またはＴＧＲ−１をコードするＤＮＡを含有する形質変換体から精製したＴＧＲ−１またはＴＧＲ−１を含む膜画分、あるいは精製したＴＧＲ−１またはＴＧＲ−１を含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分２−２０μｌの流量で通過させる。センサーチップ上のニューロメジンＵとＴＧＲ−１とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存する試験化合物が変化させることを観察することによってＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。この方法は、ＴＧＲ−１をセンサーチップに固定し、ニューロメジンＵおよび試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測定することができる。試験化合物としては、上記と同様のものなどがあげられる。
ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、ＴＧＲ−１を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＴＧＲ−１を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＴＧＲ−１を発現した細胞が用いられる。本発明のＴＧＲ−１を発現した細胞としては、前述の組換え型ＴＧＲ−１発現細胞株などが望ましい。形質変換体であるＴＧＲ−１発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。
【００３０】
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
上記のリガンド・レセプターアッセイ系について、さらに具体的に記載すると以下のようなアッセイ系が用いられる。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のＧタンパクが活性化されてＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくとＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタンパクに結合するが、加水分解されずにＧタンパクを含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞膜に残存した放射活性を測定することによって受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。この反応を利用してニューロメジンＵのＴＧＲ−１発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。この方法は、前記▲４▼〜▲５▼のようにＴＧＲ−１を含む細胞を用いるものではなく、▲１▼〜▲３▼のようにＴＧＲ−１を含む膜画分を用いるアッセイ法であるが、▲４▼〜▲５▼のように細胞刺激活性を測定するものであり、本測定法においてＴＧＲ−１膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストである。ここにおいて、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を添加し、ニューロメジンＵの単独投与に比べてＴＧＲ−１細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性に変化が生じることを観察することによってニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。このとき、ニューロメジンＵによるＴＧＲ−１細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を示す化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＴＧＲ−１細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。上述の方法によって調製したＴＧＲ−１を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 μM GDP, 0.1％ BSA pH 7.4）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをFalconb 2053に0.2mlずつ分注し、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を加え、さらに終濃度200 pMとなるように[³⁵S]GTPγSを加える。25℃で1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0.1％ BSA , 0.05％ CHAPS pH 7.4 1.5ml）を加えて、ガラス繊維ろ紙GF/Fでろ過する。65℃、30分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した[³⁵S]GTPγSの放射活性を測定する。ニューロメジンＵのみを加えた実験区の放射活性を100％、ニューロメジンＵを加えなかった実験区の放射活性を0％とし、ニューロメジンＵによるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例えば８０％以下になる試験化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
【００３１】
（２）ＴＧＲ−１発現細胞はニューロメジンＵ刺激によって細胞内cAMP量が減少する場合、この反応を利用してニューロメジンＵのＴＧＲ−１発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。
ＴＧＲ−１を発現させた種々の動物細胞のcAMP産生量はマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗cAMP抗体と¹²⁵I標識cAMP（ともに市販品）を使用することによってRIAあるいは抗cAMP抗体と標識cAMPとを組み合わせた他のEIA系でも測定することができる。また抗cAMP抗体をprotein Aあるいは抗cAMP抗体産生に用いた動物のIgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと¹²⁵I標識cAMPとを使用するSPA法による定量も可能である（アマシャムファルマシアバイオテク製のキットなどを使用する）。
本方法において、フォルスコリンまたはカルシトニンなど細胞内cAMP量を増加させるようなリガンドなどによって細胞内cAMP量を上昇させ、ニューロメジンＵまたはニューロメジンＵおよび試験化合物を添加することによってニューロメジンＵの単独投与による細胞内cAMP量の抑制が変化することを観察し、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。このとき、ニューロメジンＵによるＴＧＲ−１発現細胞のcAMP産生抑制活性を阻害する活性を示す化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを添加してcAMP産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法をより具体的に以下に記載する。ＴＧＲ−１受容体を発現させたＣＨＯ細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーに1 nMのニューロメジンＵあるいは1 nMのニューロメジンＵおよび試験化合物を添加したものを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。100μlの20％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内cAMPを抽出する。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリン刺激によって産生されたcAMP量を100％とし、1 nMのニューロメジンＵの添加によって抑制されたcAMP量を0％として、ニューロメジンＵによるcAMP産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。ニューロメジンＵの活性を阻害してcAMP産生活性が例えば８０％以下になる試験化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
cAMP産生促進活性を測定するには、フォルスコリンを添加せずにＴＧＲ−１受容体を発現させたＣＨＯ細胞に試験化合物を添加して産生されたcAMPを上記の方法で定量する。この場合は、ｃＡＭＰの産生活性が例えば１０％以上の試験化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
【００３２】
（３）CRE（cAMP response element）を含むＤＮＡを、ピッカジーン ベイシックベクターまたはピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをCRE−レポーター遺伝子ベクターとする。CRE−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、cAMP上昇を伴う刺激は、 CREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 CRE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のcAMP量の変動を検出することができる。CRE−レポーター遺伝子ベクターをＴＧＲ−１発現細胞にトランスフェクションした細胞を利用してニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。具体的なスクリーニング法を以下に記す。
CRE−レポーター遺伝子導入ＴＧＲ−１発現細胞を24穴プレートに5 x 10³ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、1 nMのニューロメジンＵあるいは1 nMのニューロメジンＵおよび試験化合物と2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。 ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響はルシフェラーゼによる発光量をニューロメジンＵを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ニューロメジンＵの投与によりフォルスコリン刺激による発光量の増加が抑制されるが、この抑制を回復させる化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量のニューロメジンＵと同様な抑制を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol acetyltransferase assay kitによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができる。
【００３３】
（４）ＴＧＲ−１発現細胞がニューロメジンＵ刺激によってアラキドン酸代謝物を細胞外に放出する場合、あらかじめ、放射活性を有するアラキドン酸を細胞に取り込ませておくことによって、この活性を細胞外に放出された放射活性を測定することによって測定することができる。このとき、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を添加して、ニューロメジンＵのアラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。このとき、ニューロメジンＵによるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。また、試験化合物のみを添加し、ＴＧＲ−１発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に影響を与える化合物のスクリーニング法より具体的に以下に述べる。
ＴＧＲ−１受容体を発現させたＣＨＯ細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、24時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25 μCi/wellとなるよう添加する。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞を0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄し、各wellに0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)に溶解した終濃度10 nMのニューロメジンＵあるいは10 nMのニューロメジンＵおよび試験化合物を含むバッファー500 μlを添加する。以降、0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を反応用バッファーと呼ぶ。37℃で60分間インキュベートした後に、反応液400 μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[³H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。ニューロメジンＵの非添加反応バッファーによる培地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を0％とし、10 nMのニューロメジンＵを添加したときのたときの培地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を100％として試験化合物のニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に対する影響を算出する。アラキドン酸代謝物産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
【００３４】
（５）ＴＧＲ−１発現細胞をニューロメジンＵによって刺激することによって細胞内のＣａ²⁺濃度が上昇する場合、これを利用することによってニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に対する試験化合物の影響を調べることができる。
ＴＧＲ−１発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を4 mM Fura-2 AM（同仁化学研究所）を縣濁したHBSSに置換し、室温で2時間30分おく。HBSSで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、蛍光測定器で、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を加えたときの励起波長340nm及び380nmでの505nmの蛍光強度の比の上昇を測定する。このとき、ニューロメジンＵを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって生じる蛍光強度の変化を測定することによりニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。また、以下のようにFLIPR（モレキュラーデバイス社製）を使うこともできる。すなわち、細胞縣濁液にFluo-3 AM（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。FLIPR装置にセットし、Fura-2 AMの場合と同様にニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を加え、ニューロメジンＵを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測される蛍光強度が変化することを測定することにより、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。これらにおいて、ニューロメジンＵによる蛍光強度の上昇を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
ＴＧＲ−１発現細胞にaequorinなどのように細胞内Caイオンの上昇によって発光するようなタンパク質の遺伝子を共発現させておき、細胞内Caイオン濃度の上昇によってaequorinがCa結合型となり発光することを利用して、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を加え、ニューロメジンＵを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測される発光強度が変化することを測定することにより、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。方法は、蛍光物質を取り込ませないこと以外は上記と同様である。
【００３５】
（６）受容体を発現する細胞に受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度が上昇することが知られている。ニューロメジンＵによって生じるＴＧＲ−１細胞におけるこの反応を観察することによりニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。２４穴プレートに播いて１日目の細胞にmyo-[2-³H]inositol (2.5マイクロCi/well)を添加した培地中で１日培養した細胞を、よく洗浄後、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を添加した後、10％過塩素酸を加え反応を止める。1.5 M KOH, 60mM HEPES溶液で中和し、0.5mlのAG1x8樹脂 (Bio-Rad)を詰めたカラムに通し、5mM Na₂BO₃ 60mM HCOONH₄で洗浄した後、１M HCOONH₄ 0.1M HCOOHで溶出した放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。ニューロメジンＵの非添加反応バッファーによる培地中の放射活性を0％とし、ニューロメジンＵを添加したときの培地中の放射活性を100％として試験化合物のニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に対する影響を算出する。イノシトール三リン酸産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみの添加によるイノシトール三リン酸産生上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００３６】
（７）TRE（TPA response element）を含むＤＮＡを、ピッカジーン ベイシックベクターまたはピッカジーン エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをTRE−レポーター遺伝子ベクターとする。TRE−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、細胞内Ca²⁺上昇を伴う刺激は、TREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、TRE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。 TRE−レポーター遺伝子ベクターをＴＧＲ−１発現細胞にトランスフェクションした細胞を利用したニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
TRE−レポーター遺伝子導入ＴＧＲ−１発現細胞を24穴プレートに5 x 10³ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した後、10 nMのニューロメジンＵあるいは10 nMのニューロメジンＵおよび試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、ルシフェラーゼによる発光量をニューロメジンＵを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ニューロメジンＵの投与により細胞内Ca²⁺の上昇によって発光量が増加するが、この増加を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジンＵと同様な発光量の増加を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロランフェニコール アシルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT Chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができる。
【００３７】
（８）ニューロメジンＵに応答したＴＧＲ−１発現細胞についてMAP kinase活性化によって増殖が観察される場合、この増殖をMAP kinase活性、チミジン取り込み、細胞数測定（MTTなど）によって測定することができる。これを利用してニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
MAP kinase活性は、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を細胞に添加した後、細胞溶解液から抗MAP kinase抗体を用いた免疫沈降によってMAP kinase分画を得た後、例えば和光純薬製MAP Kinase Assay Kitとγ-[³²P]-ATPを使用して容易に測定できる。チミジン取り込み活性は、ＴＧＲ−１発現細胞を播き、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を添加した後、[methyl-³H]-チミジンを加え、その後、細胞内に取り込まれた標識チミジンの放射活性を細胞を溶解して液体シンチレーションカウンターで計数することによって測定することができる。
ＴＧＲ−１発現細胞の増殖は、発現細胞を播き、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を添加した後にMTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) を添加し、細胞内に取り込まれてMTTが変化したMTTホルマザンを塩酸酸性としたイソプロパノールで細胞を溶解した後、570 nmの吸収を測定することによっても測定できる。
ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の、標識チミジン取り込み活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
ＴＧＲ−１発現細胞を２４穴プレートにウェル当たり５０００個まき一日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を細胞に添加して２４時間培養した後、[methyl-³H]-チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し６時間培養する。細胞をＰＢＳ（−）で洗った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、チミジン取り込みによる放射活性の上昇をニューロメジンＵを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ニューロメジンＵの投与による放射活性の増加を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジンＵと同様な放射活性の増加を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００３８】
（９）ＴＧＲ−１発現細胞にニューロメジンＵを添加すると、K channelが活性化し、細胞内にあるKイオンが、細胞外に流出する場合、Kイオンと同族元素であるRbイオンは、Kイオンと区別無くK channelを通って細胞外に流出するので、細胞に標識Rb ([⁸⁶Rb])を添加して取り込ませておいた後、ニューロメジンＵの刺激によって流出する[⁸⁶Rb]の流れを測定することでニューロメジンＵの作用を測定できる。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の、[⁸⁶Rb]流出活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
２４穴にまいて２日後のＴＧＲ−１発現細胞を１mCi/ml の⁸⁶RbClを含む培地中で２時間保温する。培地をよく洗浄し、外液中の⁸⁶RbClを完全に除く。ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を細胞に添加して３０分後の外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定する。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、[⁸⁶Rb]流出による放射活性の上昇をニューロメジンＵを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ニューロメジンＵの投与による放射活性の上昇を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジンＵと同様な放射活性の上昇を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００３９】
（１０）ＴＧＲ−１発現細胞がニューロメジンＵに反応して変化する細胞外のpH（acidification rate）をサイトセンサー装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定することによって、ニューロメジンＵの活性を測定することができる。サイトセンサー装置を利用した、細胞外ｐＨ変化の測定をすることによるニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
ＴＧＲ−１発現細胞をサイトセンサー装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約2時間0.1％ BSAを含むRPMI1640培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させることによって生じる培地のpH変化を測定する。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、ＴＧＲ−１発現細胞の細胞外ｐＨ変化をニューロメジンＵを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ニューロメジンＵの投与による細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジンＵと同様な細胞外ｐＨ変化を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００４０】
（１１）酵母（Saccharomyces cerevisiae）のhaploidα-mating Type (MATα) の性フェロモン受容体STe2はG蛋白Gpa1とカップルしており、性フェロモンα-mating factorに応答してMAP kinaseを活性化し、以下、Far1 (cell-cycle arrest) および転写活性化因子Ste12が活性化される。Ste12は接合に関与するFUS1を含む種々の蛋白の発現を誘導する。一方、制御因子Sst2は以上の過程に抑制的に機能する。この系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニスト刺激によって酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などの指標を用いた、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている（Pausch, M. H., Trends in Biotechnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997)）。このような受容体遺伝子導入酵母の系を利用してニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
MATα酵母のSte2およびGpa1をコードする遺伝子を除去し、代わりにＴＧＲ−１遺伝子およびGpa1-Gai2融合蛋白をコードする遺伝子を導入する。Farをコードする遺伝子を除去してcell-cycle arrestが生じないようにし、また、Sstをコードする遺伝子を除去することによってニューロメジンＵに対する応答の感度を向上させておく。さらに、FUS1にヒスチジン生合成遺伝子HIS3をつなげたFUS1-HIS3遺伝子を導入する。以上の遺伝子組換え操作は例えば、Priceら（Price, L. A. et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188-6195 (1995)）の報告に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（SSTR2）遺伝子をＴＧＲ−１遺伝子に置き換えて実施することによって容易に行なうことができる。こうして構築された形質転換酵母はＴＧＲ−１のリガンドであるニューロメジンＵに高感度で反応し、その結果MAPキナーゼの活性化が起きてヒスチジン生合成酵素が合成されるようになって、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。これを利用して、ヒスチジン欠乏培地での酵母の生育を指標としてニューロメジンＵによるＴＧＲ−１発現酵母の応答を観察することができる。以下にニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物のスクリーニング法を述べる。
上記のようにして作製された形質変換酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、2 x 10⁴ cell/mlの濃度でヒスチジンを除去した溶解寒天培地に加え、9 x 9 cmの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、ニューロメジンＵあるいはニューロメジンＵおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、30℃で３日間培養する。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育をニューロメジンＵを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ニューロメジンＵの投与による酵母の生育を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジンＵと同様な酵母の生育を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。また、あらかじめ、寒天培地に ニューロメジンＵを添加しておいて滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察することによってもニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響を調べることができる。
【００４１】
（１２）ＴＧＲ−１遺伝子ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、ニューロメジンＵによって刺激すると細胞内Ca²⁺イオン濃度が上昇して、calcium-activated chloride currentが生じる。これを膜電位の変化としてとらえることが出来る（Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。ニューロメジンＵによって生じるＴＧＲ−１導入アフリカツメガエル卵母細胞におけるこの反応を観察することによりニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊をＭＢＳ液（88mM NaCl, 1mM KCl, 0.41mM CaCl₂, 0.33mM Ca(NO₃)₂, 0.82mM MgSO₄, 2.4mM NaHCO₃, 10mM HEPES, pH7.4）に溶かしたコラーゲナーゼ(0.5mg/ml)で卵塊がほぐれるまで１９℃、１-６時間、150rpmで処理する。外液をMBS液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピュレーターでＴＧＲ−１mRNA (50ng/50nl)をマイクロインジェクションする。ＴＧＲ−１mRNAは、組織や細胞から調製しても、plasmidからin vitroで転写してもよい。これをMBS液中で２０℃で３日培養する。これをRinger液を流しているvoltage clamp装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極、電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、(-)極は、細胞外に置く。電位が安定したら、ニューロメジンＵまたはニューロメジンＵおよび試験化合物を含むRinger液を流して電位変化を記録する。ニューロメジンＵとＴＧＲ−１の結合を変化させる化合物の影響は、ＴＧＲ−１導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化をニューロメジンＵを単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ニューロメジンＵの投与による細胞膜電位変化を抑制する化合物をＴＧＲ−１とニューロメジンＵとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ニューロメジンＵと同様な細胞膜電位変化を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
この系において、反応を変化量を増大して測定しやすいように各種のＧタンパク質遺伝子のpoly(A)⁺ RNAを導入することもできる。またaequorinのようなCa²⁺存在下で発光を生じるようなタンパクの遺伝子のpoly(A)⁺RNAを共インジェクションすることにより膜電位変化ではなく発光を観察してこの反応を測定することもできる。
ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、ＴＧＲ−１、ＴＧＲ−１を含有する細胞、あるいはＴＧＲ−１を含有する細胞の膜画分、およびニューロメジンＵを含有するものである。
【００４２】
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものがあげられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼ＴＧＲ−１標品
ＴＧＲ−１を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識リガンド
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識したニューロメジンＵ。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼リガンド標準液
ニューロメジンＵを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養したＴＧＲ−１を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識したニューロメジンＵを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０^-3ＭのニューロメジンＵを５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識したニューロメジンＵを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式で求める。
式
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ₀ ：最大結合量
【００４３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体的にはＴＧＲ−１を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆるＴＧＲ−１アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＴＧＲ−１アンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記ＴＧＲ−１アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、ニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記したＴＧＲ−１を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＴＧＲ−１アゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＴＧＲ−１アンタゴニストである。
(ii)(a)試験化合物をＴＧＲ−１を含有する細胞に接触させ、上記ＴＧＲ−１を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＴＧＲ−１アゴニストである。
(b) ＴＧＲ−１を活性化する化合物（例えば、ニューロメジンＵまたはＴＧＲ−１アゴニストなど）をＴＧＲ−１を含有する細胞に接触させた場合と、ＴＧＲ−１を活性化する化合物および試験化合物をＴＧＲ−１を含有する細胞に接触させた場合における、ＴＧＲ−１を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。 ＴＧＲ−１を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＴＧＲ−１アンタゴニストである。
該ＴＧＲ−１アゴニストは、ＴＧＲ−１に対するニューロメジンＵが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 ニューロメジンＵと同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、ＴＧＲ−１アンタゴニストは、ＴＧＲ−１に対するニューロメジンＵが有する生理活性を抑制することができるので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
【００４４】
ニューロメジンＵまたはその塩は平滑筋収縮作用、血圧上昇作用、腸管におけるイオン輸送の調節、皮下投与後のＡＣＴＨおよびそれに引き続くコルチコステロンの上昇などに関与していることから、低血圧症予防・治療剤や局所血管収縮剤などとして利用できるため、上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物のうち、ＴＧＲ−１アゴニストは低血圧症予防・治療剤や局所血管収縮剤などとして用いることができる他、子宮収縮促進剤として、微弱陣痛、弛緩出血、胎盤娩出前後、子宮復古不全、人工妊娠中絶、分娩誘発、分娩停止、子宮頚管無力症、子宮内反(症)、遺残胎盤および遺残卵膜、分娩後出血、女性性器脱、不妊症、多胎妊娠における母体のケア、胎位異常、月経困難症、流産、子宮内膜症、慢性子宮炎症性疾患、子宮筋腫、子宮奇形、子宮腺筋症、子宮頚部裂傷、外傷後ストレス症候群など、子宮収縮不全に関係する各種疾患の改善、予防および治療薬として用いることができる。また、ＴＧＲ−１アンタゴニストは高血圧症、心筋梗塞、急性腎不全、ストレス性疾患（例えば、▲１▼心血管系の疾患（狭心症、心筋梗塞、不整脈など）▲２▼呼吸器系の疾患（気管支喘息、過呼吸症候群など）▲３▼筋骨格系の疾患（慢性関節リウマチ、腰痛症、片頭痛、緊張性頭痛など）、▲４▼その他（糖尿病、更年期障害、慢性疼痛、免疫力低下など）、消化器系疾患（胃潰瘍、潰瘍性大腸炎など）などの予防・治療薬などとして用いることができる他、子宮収縮抑制剤として、過強陣痛、偽陣痛、遷延妊娠、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、頚菅裂傷、早産、子宮筋腫、子宮奇形、子宮腺筋症、娩出力異常、慢性子宮炎症性疾患、多胎妊娠における母体のケア、胎位異常、Prader-Willi症候群、月経困難症など子宮収縮過多に関係する各種疾患の改善、予防および治療薬として有用である。
【００４５】
また、ニューロメジンＵまたはその塩は食欲調節作用を有していることから、その食欲調節作用に基づいて、上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物のうち、ＦＭ−３アゴニストは食欲抑制剤、抗肥満剤、過食症治療薬、多食症治療薬などとして、またＦＭ３アンタゴニストは食欲促進剤などとして用いることができる。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合には、以下に記載するとおりに使用することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００４６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（^TM）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物（例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリなど）、両生類（例えば、カエルなど）および魚類などに対して投与することができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物（特にアンタゴニスト）またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の高血圧症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１から１０００ｍｇ、好ましくは約１．０から３００ｍｇ、より好ましくは約３．０から５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の高血圧症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明は、さらにＴＧＲ−１に対する抗体に関する。
ＴＧＲ−１に対する抗体は、ＴＧＲ−１を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
ＴＧＲ−１に対する抗体は、ＴＧＲ−１を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００４８】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
ＴＧＲ−１は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ＴＧＲ−１と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ＴＧＲ−１の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＴＧＲ−１を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４９】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ＴＧＲ−１抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からＴＧＲ−１に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上記の本発明の抗体は、ＴＧＲ−１を特異的に認識することができるので、被検液中のＴＧＲ−１の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化ＴＧＲ−１とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ＴＧＲ−１の割合を測定することを特徴とする被検液中のＴＧＲ−１の定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＴＧＲ−１の定量法を提供する。
上記（ii）においては、一方の抗体がＴＧＲ−１のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がＴＧＲ−１のＣ端部に反応する抗体であることが好ましい。
ＴＧＲ−１に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いてＴＧＲ−１の測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。ＴＧＲ−１に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ＴＧＲ−１量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＴＧＲ−１量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるＴＧＲ−１の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はＴＧＲ−１の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ＴＧＲ−１のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５０】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＴＧＲ−１の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D: Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、ＴＧＲ−１を感度良く定量することができる。
【００５１】
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内でのＴＧＲ−１を定量することによって、ＴＧＲ−１の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＴＧＲ−１を特異的に検出するために使用することができる。また、ＴＧＲ−１を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＴＧＲ−１の検出、被検細胞内におけるＴＧＲ−１の挙動の分析などのために使用することができる。
【００５２】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
Ｙ ：チミンまたはシトシン
Ｎ ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
Ｒ ：アデニンまたはグアニン
Ｍ ：シトシンまたはアデニン
Ｗ ：チミンまたはアデニン
Ｓ ：シトシンまたはグアニン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ
ＧｌｙまたはＧ ：グリシン
ＡｌａまたはＡ ：アラニン
ＶａｌまたはＶ ：バリン
ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ ：セリン
ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ ：システイン
ＭｅtまたはＭ ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ ：リジン
ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｍｅ ：メチル基
Ｅt ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン
ＰＡＭ ：フェニルアセトアミドメチル
【００５３】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＨＯＮＢ ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロルベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：t−ブチルオキシカルボニル
ＨＯＢt ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェニル
Ｂｕｍ ：ターシャリーブトキシメチル
Ｔｒt ：トリチル
ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ ：３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート
ＰＭＳＦ ：フェニルメチルスルホニルフルオリド
Ｅ６４ ：（Ｌ−３−trans−カルボキオキシラン−２−カルボニル）Ｌ−ロイシル−アグマチン
ＧＤＰ ：グアノシン−５’−二リン酸
ＭＥＭα ：ミニマムエッセンシャルメジウムアルファ
Ｆｕｒａ−２ＡＭ ：1-[6-アミノ-2-(5-カルボキシ-2-オキサゾリル)-5-ベンゾフラニロキシ]-2-(2-アミノ-5メチルフェノキシ)-エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＢＳＳ ：ハンクス平衡塩液
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ ：1-[2-アミノ-5-(2,7-ジクロロ-6-ヒドロキシ-3-オキシ-9-キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＥＰＥＳ ：２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸
ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル
ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン
【００５４】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例１で得られたＴＧＲ−１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＴＧＲ−１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例１に記載のプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例１に記載のプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ブタ型ニューロメジンＵ−８をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
イヌ型ニューロメジンＵ−８をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ニワトリ型ニューロメジンＵ−９をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
モルモット型ニューロメジンＵ−９をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
ラット型ニューロメジンＵ−２３をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
カエル型ニューロメジンＵ−２３をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ヒト型ニューロメジンＵ−２５をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ブタ型ニューロメジンＵ−２５をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
イヌ型ニューロメジンＵ−２５をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ニワトリ型ニューロメジンＵ−２５をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
カエル型ニューロメジンＵ−２５をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ニューロメジンＵ−２５の部分ペプチドをコードするアミノ酸配列を示す。配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第４番目〜第８番目のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ＴＧＲ−１と実質的に同一のアミノ酸配列を示す（WO99/55732号に記載のもの）。
〔配列番号：１８〕
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するＤＮＡの塩基配列を示す（WO99/55732号に記載のもの）。
〔配列番号：１９〕
実施例３で用いられたプライマーRTGRF2の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例３で用いられたプライマーRTGRR1の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例３で得られたラット型ＴＧＲ-１をコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ラット型ＴＧＲ−１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【００５５】
後述の実施例１で得られた配列番号：１で表されるＴＧＲ−１をコードするｃＤＮＡを有する形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ＴＧＲ１は、１９９９年１２月６日から茨城県つくば市東１−１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９６４として、１９９９年１１月１２日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６３３６として寄託されている。
後述の実施例３で得られた配列番号：２１で表されるＴＧＲ−１をコードするｃＤＮＡを有する形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐｒＴＧＲ−１は、２０００年１１月９日から茨城県つくば市東１−１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３５５として、２０００年１０月２４日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６４８８として寄託されている。
【００５６】
【発明の実施の形態】
以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５７】
【実施例】
実施例１
ＴＧＲ−１をコードするcDNAのクローニングと塩基配列の決定
ヒト精巣cDNA（Marathon-Ready^TMcDNA；Clontech社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：３）及びプライマー２（配列番号：４）を用いてPCRを行なった。PCR反応には Advantage 2 Polymerase Mixture（Clontech社）を用い、▲１▼95℃ 1分の後、▲２▼95℃ 30秒、68℃ 2 分を5回、▲３▼95℃ 30秒、64℃ 30秒、68℃ 2分を 5回、▲４▼95℃ 30秒、62℃ 30秒、68℃ 2分を30回の後、▲５▼68℃ 7分の伸長反応を行なった。反応後反応産物をTAクローニングキット（Invitrogen社）の処方に従いプラスミドベクター pCR2.1TOPO（Invitrogen 社）へクローニングした。これを大腸菌TOP10に導入し、プラスミドを持つクローンをampicilinを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＴＧＲ−１（配列番号：１）をコードするcDNAの塩基配列（配列番号：２）を得た。
【００５８】
実施例２ TGR-1発現CHO細胞およびmock CHO細胞に対するニューロメジンU-8の反応性のサイトセンサーによる比較
実施例１によって得られたTGR-1をコードするｃDNAを用いて、自体公知の方法に準じて作成したTGR-1発現CHO細胞およびmock CHO細胞をサイトセンサー用カプセルに2.7×10⁵cells/wellの密度で播種し、一晩培養した。細胞の入ったカプセルをサイトセンサーにセットし、0.1％牛血清アルブミンを添加したlow buffered RPMI1640培地を還流しながら細胞を順化させた。サイトセンサーによってポンプのON(80秒間)・OFF(40秒間)を１サイクルとして繰り返して行ない、ポンプが停止している間の細胞外ｐHの変化率をacidification rateとして経時的に測定した。同培地にブタ型ニューロメジンＵ-８（BACHEM社、H-5505、配列番号：５）を溶解し、段階的に希釈したものをサイトセンサーの流路系の切り替えによって細胞に7分2秒間暴露した。反応のピークの値についてサンプルが細胞に暴露される直前の３サイクルの平均値を100％として換算し、比較したところ、TGR-1発現CHO細胞は特異的かつ濃度依存的にニューロメジンUに反応することを見出した（図１）。
【００５９】
実施例３ ラット型のTGR-1をコードするcDNAの取得
ラット型のTGR-1をコードするcDNA全長をコードする断片取得のために以下の２種類のＤＮＡを合成した。
RTGRF2:5’-CTGATGCTATCCTTTCACTCTCTCAGACC-3’ （配列番号：１９）
RTGRR1:5’-TCCTTGCAGTTTTGGCACATAGATGGA-3’ （配列番号：２０）
これらの合成DNA、RTGRF2および RTGRR1をプライマーとして用い、ラット子宮poly(A)⁺RNAより合成したｃDNAを鋳型としてPCRを行い、全長をコードする断片を増幅した。PCRの反応液はcDNA溶液２μl（８ng poly(A)⁺RNA由来）、 １μl dNTPs（10mM）、0.5μl Advantage2 DNA polymerase（Clontech社）、2.5μl Advantage2 DNA polymeraseに添付されている10 xバッファー、1８μl蒸留水、さらに合成ＤＮＡRTGRFとRTGRR1（各１０μM）を0.5μlずつ加え、合計25μlとした。この反応液は9４℃2分の変性の後、98℃10秒、68℃90秒のサイクルを31回繰り返すPCR反応を行った。電気泳動で確認された約1.4kbのPCR産物をQIA quick Gel Extraction Kit（Quiagen社）を用いて精製し、TA cloning kit (Invitrogen社)のマニュアルに従い、クローニングベクターpCR2.1 TOPOへ挿入、大腸菌JM109に導入して形質転換体E.coli JM109/prTGR-1を得た。このプラスミドprTGR-に挿入されている塩基配列を決定し（配列番号：２２）、それにコードされるラット型TGR-1の予測されるアミノ酸配列を配列番号：２１で示す。
また実施例１に示したヒト型配列（配列番号：１）との比較を図２に示した。
【００６０】
【発明の効果】
本発明のニューロメジンＵおよびＴＧＲ−１を用いることを特徴とするニューロメジンＵとＴＧＲ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法は、肥満症、高血圧症、ストレス性疾患等の予防・治療薬などをスクリーニングするために用いることができる。ＴＧＲ−１アゴニストは肥満症等の予防・治療薬として有用であり、ＴＧＲ−１アンタゴニストは高血圧症、ストレス性疾患等の予防・治療薬として有用である。
【００６１】
【配列表】

【００６２】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で行われたサイトセンサーによるTGR-1受容体特異的な細胞刺激活性の検出の結果を示す図を表す。サイトセンサーアッセイにおいて、TGR-1受容体発現CHO細胞（○）およびmock CHO細胞（●）に対して図に表示の濃度のブタ型ニューロメジンＵ-８を７分２秒間作用させ、その間のAcidification Rateの最大値をプロットしている。
【図２】参考例１で得られたヒト型ＴＧＲ−１と実施例２で得られたラット型ＴＧＲ−１とのアミノ酸配列の比較を示す図である。

Claims (3)

1. ニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその塩および配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とするニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2. ニューロメジンＵもしくはその誘導体またはその塩および配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴とするニューロメジンＵまたはその塩と配列番号：１または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
3. ニューロメジンＵが配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１記載のスクリーニング方法または請求項２記載のスクリーニング用キット。

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