WO2006068326A1 - 新規ポリペプチドおよびその用途 - Google Patents

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Kenji Kangawa
Kenji Mori
Mikiya Miyazato
Masayasu Kojima
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Japan As Represented By The President Of National Cardiovascular Center
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide or a salt thereof, a polynucleotide encoding the same, and uses thereof. Background technology.
  • Neuromedin U is an isolated and purified peptide from porcine spinal cord, using rat uterine smooth muscle contractile activity as an index. Neuromedin U— consisting of 8 amino acid residues and neuromedin U— consisting of 8 amino acid residues Two species of 25 were first reported (Mmamino, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 130, 1078-10 85, 1985). The sequence of neuromedin U-8 matches the C-terminal part of neuromedin U_25, and there is a basic amino acid pair that is often found at the site that is cleaved by processing. It is thought to be derived from a common precursor.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 12, and having a specific cell stimulating activity I found.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or its amide or salt thereof;
  • polypeptide according to the above (1) which is a polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the polypeptide according to (11) above or a partial peptide thereof;
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 11 is the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 Containing polypeptide or salt thereof;
  • (22) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12 or a salt thereof;
  • polypeptide of (1) above or a partial peptide thereof Contains an amide or a salt thereof, and (ii) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27
  • SEQ ID NO: 29 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29
  • the above-mentioned protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, or a partial peptide thereof or a salt thereof (34)
  • the screening kit as described;
  • the above-mentioned protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35, or a partial peptide thereof or a salt thereof (34)
  • the screening kit as described;
  • (37) A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide, characterized by using the polypeptide or a salt thereof according to (21) above;
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide comprising the polypeptide according to (21) or a salt thereof;
  • a pharmaceutical comprising the compound according to (1) or (11) above, a partial peptide or amide thereof, or a compound or salt thereof that promotes the activity of the salt;
  • a medicament comprising the polypeptide according to (21) or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • a medicament comprising the compound or salt thereof that promotes the activity of the polypeptide according to (21) or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • (50) The medicament according to any one of (47) to (49) above, which is a prophylactic / therapeutic agent for climacteric disorder or hyperthyroidism;
  • (51) A prophylactic / therapeutic method for climacteric disorder or hyperthyroidism characterized by promoting the activity of the polypeptide according to (21) above or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • a medicament comprising the antibody according to (54) above;
  • the diagnostic agent according to (56) above which is a diagnostic agent for hypertension, anorexia, climacteric disorder, insomnia or immune / inflammatory disease;
  • a pharmaceutical comprising the compound or a salt thereof which inhibits the activity of the polypeptide according to (1) or (11) above or a partial peptide or amide thereof or a salt thereof;
  • an antisense polynucleotide comprising a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the polynucleotide described in (6) or (16) above or a part thereof; or (iii) the above polypeptide or A method of preventing or treating hypertension, anorexia, climacteric disorder or insomnia characterized by administering an effective amount of a compound or salt thereof that inhibits the activity of the partial peptide or its amide or its salt;
  • a diagnostic agent comprising the antibody according to (67) above;
  • the diagnostic agent according to (69) above which is a diagnostic agent for ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder or hyperthyroidism;
  • a medical agent comprising the antisense polynucleotide according to (71) above;
  • a medicine comprising a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the polypeptide of the above (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, or a salt thereof;
  • Infertility or thyroid function characterized by administering an effective amount of a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the polypeptide of the above (21), a partial peptide thereof, an amide thereof, or a salt thereof.
  • SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42
  • a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide characterized by using a polypeptide containing the sequence or a partial peptide or a salt thereof;
  • kits for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide comprising a polypeptide containing the sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • a prophylactic / therapeutic agent for climacteric disorder or hyperthyroidism comprising a compound containing a glycine-containing polypeptide or a partial peptide thereof, or a salt thereof, or a salt thereof;
  • SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42
  • a method for the prevention and treatment of climacteric disorders or hyperthyroidism characterized by promoting the activity of a polypeptide containing the same or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • a method for preventing or treating climacteric disorder or hyperthyroidism which comprises administering an effective amount of a compound or its salt that promotes the activity of a polypeptide containing the amino acid sequence of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • a prophylactic / therapeutic agent for infertility or thyroid dysfunction comprising a compound that inhibits the activity of a polypeptide containing the sequence or a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, or an amino acid sequence substantially the same as or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42
  • a method for preventing or treating infertility or thyroid dysfunction characterized by inhibiting the activity of the contained polypeptide or a partial peptide or a salt thereof;
  • a method for preventing or treating infertility or thyroid dysfunction which comprises administering an effective amount of a compound or its salt that inhibits the activity of a polypeptide comprising the amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or its amide or a salt thereof may be abbreviated as “Euromedin SJ”.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11 or its amide or a salt thereof may be abbreviated as “neuromedin S N-terminal peptide 1 34”.
  • N-terminal peptide 1 3 7 may be abbreviated.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, or its amide or a salt thereof may be abbreviated as “neuromedin S precursor”.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 7, SEQ ID NO: 3 9 or SEQ ID NO: 4 1 or its amide or a salt thereof is abbreviated as “neuromedin UN terminal peptide 1 3 3”. Sometimes.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 42 or its amide or salt thereof is abbreviated as “neuromedin UN terminal peptide 1 6”. There is.
  • T G R 1 A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29 or a salt thereof may be abbreviated as “T G R 1”.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 1, SEQ ID NO: 3 3 or SEQ ID NO: 35 or a salt thereof may be abbreviated as “F M-3”.
  • polypeptide KA A polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 1 2 (hereinafter sometimes abbreviated as “polypeptide KA of the present invention”)
  • SEQ ID NO: 3 8, SEQ ID NO: 3 9, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 or Polypeptides containing substantially the same amino acid sequence include, for example, humans, mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, Pig, hidge, ushi, monkey, inu) Rough cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells
  • SEQ ID NO: 1 As the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 1 2, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 0
  • SEQ ID NO: 1 1 Still amino acids represented by SEQ ID NO: 1 2 About 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 9% or more. Examples include amino acid sequences having 5% or more homology.
  • the homology of amino acid sequences can be calculated using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool).
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 0
  • Examples of the polypeptide containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 1 2 include, for example, the aforementioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1 1 or sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1, comprising substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 2 : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, S
  • substantially the same activity examples include ligand binding activity and signal signal transduction action.
  • “Substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. It shows that. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the polypeptide may be different.
  • Measurement of activities such as ligand binding activity and signal information transmission activity can be performed according to a known method, for example, according to a screening method described later.
  • the polypeptide A of the present invention includes (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 1 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, about 1 to 30, preferably (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1, preferably about 10 to 10, more preferably several (1 to 5)) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 0, SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 1 2 1 or more amino acid sequences (for example, about 1 to 30 pieces, preferably about 1 to 10 pieces, more preferably several pieces (1 to 5 Amino acids are added in)),
  • polypeptide A of the present invention or its amide or a salt thereof include a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or its amide. Or a salt thereof, a polypeptide having an amino ⁇ sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an amide thereof or a salt thereof, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or an amino acid thereof Or a salt thereof, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or an amide thereof, or a salt thereof, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or an amide thereof Or a salt thereof, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or an amide thereof, or a salt thereof, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, or an amide thereof, or a salt thereof Salt, polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, or its amide or salt thereof, and
  • the partial peptide of the polypeptide ⁇ of the present invention or its amide or salt thereof can be used in the screening method for pharmaceuticals and the like described below. As long as it has substantially the same activity as that of polypeptide A.
  • the number of amino acids of the partial peptide is at least 5 or more, preferably 10 or more, preferably 15 or more, preferably 20 or more, among the constituent amino acid sequences of polypeptide A of the present invention. Examples thereof include peptides having an amino acid sequence.
  • substantially the same quality of activity has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same quality of activity” can be measured in the same manner as described above.
  • amino acids in the above amino acid sequence are deleted, and aminoi) 1 or 2 in the above amino acid sequence Or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably several (1 to 5 pieces)), or (iii) the amino acid sequence
  • one or more (preferably several (1 to 4)) amino acids may be substituted with other amino acids.
  • polypeptide A of the present invention and its partial peptide may be collectively referred to as “polypeptide A of the present invention”.
  • SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42 and about 50% or more, preferably about 60%.
  • an amino acid sequence having a homology of preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more can be mentioned.
  • the homology of amino acid sequences can be calculated using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool).
  • polypeptide examples include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, or amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42.
  • polypeptide examples include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, or SEQ ID NO: 42.
  • Amino acid sequence comprising substantially the same amino acid sequence and represented by SEQ ID NO: 3 7, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42
  • a polypeptide having substantially the same activity as that of a polypeptide containing s is preferable.
  • substantially the same activity examples include ligand binding activity and signal signal transduction action. “Substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.0 1 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times) However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the polypeptide may be different.
  • Measurement of activities such as ligand binding activity and signal information transmission activity can be performed according to a known method, for example, according to a screening method described later.
  • polypeptide KB of the present invention is represented by (i) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, or SEQ ID NO: 42. 1 or more (for example, about 1-30, preferably about 1-10, more preferably several (1-5)) amino acids are deleted.
  • Amino acid sequence (ii) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, or 1 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 (For example, about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acid sequences, (iii) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 (eg, about 1 to 30, preferably 1 to: about L 0) More preferably, several (1-5) amino acid sequences are substituted with other amino acids, (iv) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 (For example, about 1 to 30 amino acids, more
  • polypeptide B of the present invention examples include a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, and SEQ ID NO: 39.
  • the partial peptide of polypeptide B of the present invention may be any partial peptide as long as it can be used in a screening method for pharmaceuticals described below, and is substantially the same as polypeptide B of the present invention. As long as it has the activity of.
  • the number of amino acids of the partial peptide is at least 5 or more, preferably 10 or more, preferably 15 or more, preferably 20 or more, among the constituent amino acid coordination of the polypeptide B of the present invention.
  • substantially the same quality of activity has the same meaning as described above. “Substantially the same quality of activity” can be measured in the same manner as ⁇ .
  • amino acids in the above amino acid sequence are deleted, and (ii) 1 or 2 in the above amino acid sequence Or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids, or (iii) above One or more (preferably several (1 to 4).) Amino acids in the amino acid sequence may be substituted with other amino acids.
  • polypeptide B of the present invention and its partial peptide may be collectively referred to as “polypeptide B of the present invention”.
  • polypeptide A of the present invention and “polypeptide B of the present invention” may be collectively referred to as “polypeptide of the present invention”.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as “protein of the present invention”) is, for example, a human mammal (eg, guinea pig, rat, Any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glia cell, knee cell, bone marrow cell, mesangium cell, Langerhans cell, epidermis cell, epithelial cell, endothelial cell) of mouse, usagi, pig, hidge, ushi, monkey, etc.
  • a human mammal eg, guinea pig, rat, Any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glia cell, knee cell, bone marrow cell, mesangium cell, Langerhans cell, epidermis cell, epithelial cell, endothelial cell) of mouse, usagi, pig, hidge, ushi, monkey, etc.
  • Fibroblasts Fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils Monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells or cancer cells) Blood cells (eg, MEL, Ml, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF -CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT- HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, K0-
  • immune cells eg, macrophages, T cells,
  • brain e.g, olfactory bulb, buccal nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, subthalamic nucleus, Cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary gland, stomach, knee, kidney, liver, gonad, thyroid gland, gallbladder, Bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cell, prostate, testicle, testis, ovary, placenta, uterus, It may be a protein derived from bone
  • the sequences are as follows: SEQ ID NO: 2 5, SEQ ID NO: 2 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: No .: 3 1, SEQ ID NO: 3 3 or SEQ ID NO: 35 and about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80%.
  • the amino acid sequences having homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more are particularly preferable.
  • the homology of amino acid sequences can be calculated using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool).
  • the protein containing, for example, the above-mentioned SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 2 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 3 3 or SEQ ID NO: 3 5 It contains an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence, and is represented by SEQ ID NO: 2 5, SEQ ID NO: 2 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35
  • a protein having substantially the same activity as that of the protein containing the amino acid sequence is preferable.
  • the activity of substantially the same quality examples include binding activity to the polypeptide of the present invention, signal information transmission action and the like. “Substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. Therefore, it is preferable that the activity of the peptide of the present invention, such as the binding activity and signal signal transduction activity, is equivalent (eg, about 0.5 to 2 times), but the degree of these activities and the molecular weight of the protein, etc. The quantitative elements of may be different.
  • Measurement of activity such as binding activity and signal signal transduction can be performed according to a method known per se.
  • the protein of the present invention is represented by (i) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 2 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35 Amino acids in which one or more amino acids in the amino acid sequence are deleted (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 or 2)) Sequence (ii) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 2 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 3 3, or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 (Preferably about 1-30, more preferably about 1-10, more preferably several (1 or 2)) In the amino acid sequence represented by the amino acid sequence, (i ii) SEQ ID NO: 2 5, SEQ ID NO: 2 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 3 3 or SEQ ID NO: 35 1 or 2 (preferably about 1 to 30 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably several (1 or 2)
  • protein of the present invention examples include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: A protein containing the amino acid sequence represented by 2 9, SEQ ID NO: 3 A protein containing the amino acid sequence represented by 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 3, SEQ ID NO: 3 And a protein containing the amino acid sequence represented by 5.
  • the partial peptide of the protein of the present invention may be any partial peptide of the protein of the present invention described above.
  • the protein molecules of the invention those that are exposed to the outside of the cell membrane and have substantially the same ligand binding activity are used.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is a peptide containing a portion analyzed to be an extracellular region (hydrophilic site) in hydrophobicity plot analysis.
  • Peptides containing a part of the hydrophobic part can be used as well.
  • Peptides containing individual domains can also be used.
  • Peptides that contain multiple domains simultaneously may be used.
  • the number of amino acids in the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more amino acid sequences of the amino acid sequences constituting the protein of the present invention described above. Peptides having the following are preferred.
  • the substantially identical amino acid sequence is about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about these amino acid sequences.
  • An amino acid sequence having a homology of about 95% or more is shown.
  • “substantially the same ligand binding activity” has the same meaning as described above.
  • the “substantially the same ligand binding activity” can be measured according to a method known per se.
  • the partial peptide of the present invention is represented by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, or SEQ ID NO: 35.
  • One or more amino acids in the amino acid sequence are deleted or 1 in the amino acid sequence
  • the salt of the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention or a partial peptide thereof is particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Salts with acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid), and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid.
  • polypeptide and the protein of the present invention have an N-terminal (amino terminal) at the left end and a C-terminal (carboxyl terminal) at the right end in accordance with the convention of labeling peptides.
  • a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is usually a carboxyl group (-C00H) or carboxylate (-C00-) at the C terminus, but an amide (_C0 H 2 Or an ester (—C00R).
  • R of the ester such as methyl, Echiru, n- propyl, C w alkyl group such as isopropyl or n- heptyl, cyclopentyl, C 3 _ 8 cyclo alkyl group such as cyclohexyl, phenyl, such as ⁇ - naphthyl C 6 - 12 Ariru group, benzyl, phenethyl, Benzuhi phenylene Honoré one C w Anorekiru such Dorinore or ⁇ - Na Fuchirumechiru such as ⁇ - naphthyl - C 7 such as C w alkyl - 14 7 aralkyl group ho force ⁇
  • Examples thereof include a bivalyloxymethyl group that is widely used as an oral ester.
  • polypeptide A of the present invention those in which the C-terminal carboxyl group (—C00H) is an amide (—C0NH 2 ) are preferred.
  • polypeptide of the present invention and the protein of the present invention have a C-terminal to M-carboxyl group (or carboxylate)
  • carboxyl group or carboxylate
  • those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the polypeptide of the present invention.
  • ester in this case, for example, the above C-terminal ester or the like is used.
  • the polypeptide protein of the present invention have you the peptide protein as described above, Amino groups Mechionin residue N-terminal protecting group (e.g., C 2, such as a formyl group, ⁇ Se ethyl group. 6 Arukanoiru That are protected by a C wacyl group such as a group, a glutamyl group that has been cleaved in vivo on the N-terminal side and pyroglutamine oxidized, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (eg,- 0H, - SH, Amino group, imidazole group, indole group, etc.
  • C 2 such as a formyl group, ⁇ Se ethyl group. 6
  • C wacyl group such as a group, a glutamyl group that has been cleaved in vivo on the N-terminal side and pyroglutamine oxidized
  • Guanijino group appropriate protecting groups (e.g., formyl group, etc. C w Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru group) Also included are those that are protected, or complex peptides / proteins such as so-called glycopeptides / glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • protecting groups e.g., formyl group, etc. C w Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru group
  • complex peptides / proteins such as so-called glycopeptides / glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • the C-terminus may be a carboxyl group (—C00H), a carboxylate (—C00—), an amide (_C0NH 2 ) or an ester (—C00R).
  • carboxyl group or carboxylate
  • those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • ester in this case, for example, the above C-terminal ester is used.
  • an amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protective group, and the N-terminal side is cleaved in vivo.
  • a protective group examples include those obtained by pyroglutamine oxidation of Gln, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
  • the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or mammalian cells or tissues by a known method for producing a peptide protein, or SEQ ID NO: : 2 5, SEQ ID NO: 2 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 3 1, SEQ ID NO: 3 3, or DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 It can also be produced by culturing the transformant. Further, it can also be produced according to the peptide 'protein synthesis method described later or a method similar thereto.
  • the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention or a salt thereof is used in humans and mammals.
  • tissue or cells such as humans
  • homogenize tissues such as humans and 1 ⁇ 2 mammals, and then extract with acid, organic solvent, etc., and extract the extracted solution with salting out, permeation, gel filtration, reverse It can be purified and isolated by combining chromatography such as phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography.
  • the polypeptide of the present invention can be produced according to a known method for synthesizing a polypeptide or by cleaving a polypeptide containing the polypeptide of the present invention with an appropriate peptide. can do.
  • a polypeptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the desired polypeptide can be produced by condensing the partial peptide or amino acid that can constitute the polypeptide of the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group.
  • Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in the following (1) to (5).
  • the polypeptide of the present invention can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the polypeptide of the present invention obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method.
  • the free form can be obtained by a known method.
  • Can be converted to As the amide of the polypeptide of the present invention a commercially available peptide synthesis resin suitable for amide formation can be used.
  • Examples of such resins include chloromethylol resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4 monobenzyloxybenzyl alcohol resin, 4_methylbenzhydrylamine tree, PAM resin, 4-hydride.
  • an amino acid in which the amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the desired peptide.
  • the polypeptide is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. If necessary, intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the desired polypeptide.
  • various activating reagents that can be used for polypeptide synthesis can be used, and calpositimides are particularly preferable.
  • the force rubomidides include DCC, ⁇ , ⁇ '-disopropyl carbodiimide, and ⁇ -ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbopositimide.
  • a protected amino acid together with a racemization inhibitor (eg, H0BT, H00BT, etc.) is added directly to the resin, or as a symmetric anhydride, H0BT ester or H00BT ester in advance. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin may be appropriately selected from solvents known to be usable for the polypeptide condensation reaction.
  • acid amides such as ⁇ , ⁇ -dimethylformamide, ⁇ , ⁇ -dimethylacetamide, ⁇ -methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and black mouth form, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols such as dimethyl sulfoxide, tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitryl and propionitryl, esters such as methyl acetate and ethyl acetate Alternatively, an appropriate mixture of these is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually selected appropriately from a range of about 120 ° C. to 50 ° C.
  • Activated amino acid derivatives are usually added in excess of 1.5 to 4 times.
  • the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetyl imidazole so as not to affect the subsequent reaction.
  • protecting groups for amino acid amino groups include Z, Boc, and tertiary.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • groups suitable for esterification include lower alkanol groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, groups derived from carbon such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups.
  • groups suitable for etherolation include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a tertiary butyl group.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, and tertiary butyl.
  • histidine imidazole protecting groups include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • Examples of the activated carboxyl group of the raw material include corresponding acid anhydrides, azides, activated esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol) , Ester with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, H0BT), and the like.
  • Examples of the activated amino group of the raw material include the corresponding phosphate amide.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd black or Pd carbon
  • anhydrous hydrogen fluoride methanesulfonic acid
  • trifluoromethane acid treatment with sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof
  • base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and sodium in liquid ammonia There are also reductions.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of 120 ° C.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine was removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan was the 1,2-ethanedithiol described above, 1, 4- In addition to deprotection by acid treatment in the presence of butanedithiol, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia, etc.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protection group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • the ⁇ -carboxyl group of the carboxyl terminal amino acid is amidated, and then the peptide chain is extended to the desired chain length on the amino group side. And a peptide (or amino acid) from which only the protecting group at the terminal amino group of the peptide chain is removed and a peptide (or amino acid) from which only the protecting group at the C-terminal carboxyl group is removed. Condensation in a mixed solvent. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and the desired crude polypeptide can be obtained. This crude polypeptide can be purified by using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide of the desired polypeptide.
  • ester of the polypeptide of the present invention the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with the desired alcoholate to form an amino acid ester, and then the desired polypeptide of the desired polypeptide is synthesized in the same manner as the polypeptide amide. Esters can be obtained.
  • the partial peptide of the polypeptide of the present invention can be produced by cleaving the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidease, or can be produced according to the above-described method for synthesizing a polypeptide.
  • the amide or ester of the partial peptide of the polypeptide of the present invention can also be produced according to the above-described method for producing an amide or ester.
  • a salt of a partial peptide of the polypeptide of the present invention Are the same as the salts of the polypeptide of the present invention described above.
  • Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence can be selected from, for example, other amino acids in the class to which the amino acid belongs.
  • Nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, triftophan, and methionine.
  • Polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • polypeptide of the present invention is labeled with an isotope labeled or fluorescently labeled by a known method (for example, fluorescent labeling with fluorescein, etc.), piotinated, enzyme labeled, etc.
  • polypeptide of the present invention labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like can be used by a known method.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention includes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and sequence. SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1 2, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, any SEQ ID NO: 33, or any DNA containing DNA that encodes a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 There may be.
  • Genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned tissue-cell-derived cDNA, the above-mentioned tissue-cell-derived cDNA library, and synthetic DNA can be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an RNA fraction prepared from the tissue 'cells.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention can also be produced by the following genetic engineering technique.
  • a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention is used as ffl.
  • a method for amplifying a target DNA from the above-mentioned DNA library by the known PCR method, or a DNA sequence encoding a polypeptide of the present invention or a protein of the present invention is used as ffl.
  • a method for amplifying a target DNA from the above-mentioned DNA library by the known PCR method, or a DNA sequence encoding a polypeptide of the present invention or a protein of the present invention is selected by hybridization with a DNA fragment having a partial or total region or labeled with synthetic DNA.
  • the hybridization method is performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sarabrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When using a commercially available library, follow the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringent conditions.
  • the high stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19-4 OmM, preferably about 19-2 OmM, and a temperature of about 50-70 ° C, preferably about 60-65 ° C. Indicates conditions. In particular, it is most preferable when the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the DNA sequence can be converted using a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co. Ltd.), etc. It can be carried out according to a known method such as the duplex method or the Kunkel method, or a method based thereon.
  • a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co. Ltd.), etc. It can be carried out according to a known method such as the duplex method or the Kunkel method, or a method based thereon.
  • the cloned DNA encoding the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and TA A, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention includes, for example, (i) excising a target DNA fragment from DNA encoding the polypeptide of the present invention or the protein of the present invention, and (ii) The DNA fragment can be produced by ligating downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
  • vectors examples include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR32 5, pUC 12, pUC 13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB 110, pTP 5, p C 1 94), plasmids derived from yeast (eg, p SH 19, p SH 15), Bacteriophages such as L phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus and baculovirus are used.
  • the promoter used may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • the host to be transformed is an animal cell, use SV40-derived promoter, retro vinores promoter, metamouthonein promoter, heat shock promoter, cytomegaloinoles promoter, SRa promoter, etc. it can. Tr p promoter, T7 promoter, lac promoter, recA promoter, LPL promoter, 1 pp promoter, etc. when the host is Escherichia sp. SPO 1 when the host is Bacillus sp When the host is an enzyme such as a promoter, SPO2 promoter, pen P promoter, etc., PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH1 promoter, GAL promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter, etc. are preferred.
  • the expression vector contains an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc.
  • Selectable markers include, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Ampr), neomycin resistance Genes (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) and the like.
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • Ampr ampicillin resistance gene
  • Neo neomycin resistance Genes
  • G418 resistance neomycin resistance Genes
  • the DHFR gene when used as a selection marker using CHO (d h fr-) cells, it can also be selected using a medium not containing thymidine.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide or a partial peptide.
  • the host is Escherichia, phoA. Signal sequence, OmpA ⁇ signal sequence, etc.
  • the host is Bacillus, ⁇ -amylase ⁇ signal sequence, subtilisin ⁇ signal sequence, etc. If there is a mating factor a (MF ⁇ ) 'signal sequence,
  • the host is an animal cell such as an invertase signal sequence, an insulin signal sequence, an ⁇ -interferon signal sequence, an antibody molecule, a signal sequence, etc. can be used.
  • a transformant can be produced using a vector containing a DN that encodes the polypeptide of the present invention thus constructed.
  • Escherichia for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect or insect cell, animal cell and the like are used.
  • Bacillus examples include Bacillus subtilis
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH 22 R—, NA8 7-11 A, DKD-5D, 20 B-12.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cell; S f cells), MG 1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Maraestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNP V, cocoon-derived cell lines (Bombyx mori N; BmN cells) are used. Examples of the S f cells include S f 9 cells (ATCC CRL 1711), S f 21 cells [above, in Vitro, 13 ,, pp. 213-217 (1977)] and the like.
  • S f cells include S f 9 cells (ATCC CRL 1711), S f 21 cells [above, in Vitro, 13 ,, pp. 213-217 (1977)] and the like.
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster cells CHO, DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CHO (dhfr-CHO cells), mouse L cells, mouse 3 T 3 cells, mouse myeloma cells, human ⁇ ⁇ ⁇ 29 3 cells, human FL cells, 293 cells, C 1 27 cells, BALB 3 ⁇ 3 cells, S ⁇ -20 cells, etc. are used.
  • Insect cells or insects are transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6 ⁇ , pp. 47-55 (1988).
  • Animal cells are transformed according to the method described in, for example, Virology, 52 ⁇ , 456 (1973).
  • Examples of methods for introducing an expression vector into cells include the lipofusion method.
  • a cell in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into a chromosome is selected by clone selection.
  • transformants are selected using the above selection marker as an index.
  • stable animal cell lines having a high expression ability of the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention can be obtained by repeatedly selecting clones from the animal cells obtained using the selection marker. Obtainable.
  • the dhfr gene is used as a selection marker, the MTX concentration is gradually increased and cultured, and a resistant strain is selected. Amplify intracellularly to obtain even higher expression animal cell lines.
  • the above transformant is cultured under conditions allowing expression of the protein of the present invention or the DNA encoding the polypeptide of the present invention to produce and accumulate the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention.
  • the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention can be produced.
  • a liquid medium is suitable as the medium used for the cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is included therein.
  • Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included. Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose, and examples of nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, force zein, meat extract, soybean meal, potato extract, etc.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M 9 medium containing glucose and casamino acid For example, M 9 medium containing glucose and casamino acid [Miller; Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]
  • a drug such as 30-indolylacrylic acid can be added.
  • the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours. If necessary, aeration or agitation can be added.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Cultivation is usually carried out at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) What added the thing suitably is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6 ⁇ 2 to 6.4. Incubate at about 27 ° C for about 3-5 days, and add aeration or agitation as necessary.
  • examples of the medium include MEM medium [Science, 122 ⁇ , 501 (1952)] containing about 5 to 20% fetal bovine serum, DM EM medium [Virology , 8 ⁇ , 396 (1959)], RPMI 16 40 medium [The Journal of The American Medical Association 199 ⁇ , 519 (1967)], 1 9 9 medium
  • the pH is preferably about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • C H O (dhfr-) cells and the dhfr gene are used as selection markers, it is preferable to use a DMEM medium containing dialyzed fetal bovine serum that hardly contains thymidine.
  • Separation and purification of the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme.
  • a method of obtaining a crude extract of the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by freeze-thawing or the like can be appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton (registered trademark) X-100.
  • the cells or cells and the supernatant are separated by a method known per se after the completion of the culture, and the supernatant is collected.
  • Purification of the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods that utilize solubility, such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • solubility such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Methods using the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing and chromatofocusing are used.
  • the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, it can be obtained as a salt. In this case, it can be converted to a free form or other salt by a known method or a method similar thereto.
  • the protein of the present invention or the polypeptide of the present invention produced by a recombinant can be modified arbitrarily by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification, or the protein ((poly) peptide ) Can also be partially removed.
  • protein modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase, and the like.
  • Edman method using Edman reagent can be used.
  • the presence of the thus produced protein of the present invention or the polypeptide of the present invention can be measured by, for example, Enzym Immuno assay using a specific antibody.
  • the present invention further provides an antibody against the polypeptide of the present invention.
  • the antibody against the polypeptide of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an antibody that can recognize the polypeptide of the present invention.
  • the antibody against the polypeptide of the present invention can be produced according to a method for producing a known antibody or antiserum using the polypeptide of the present invention as an antigen.
  • the polypeptide of the present invention is administered to a mammal at a site where antibody production is possible by administration, together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, hidges and goats, with mice and rats being preferred. Used.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained in the cells with myeloma cells.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled polypeptide of the present invention with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. .
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Millstein [Nature, 256 ⁇ , 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, and SP 2ZO, and P 3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by incubating at about 20-40 ° C, preferably about 30-37 ° C for about 1-10 minutes.
  • Various methods can be used for screening monoclonal antibodies-producing hybridomas.
  • the supernatant of a hybridoma culture is applied to a solid phase (eg, microplate) on which the antigen of the polypeptide of the present invention is adsorbed directly or together with a carrier.
  • anti-immunoglobulin antibody labeled with radioactive substances or enzymes if the cells used for cell fusion are mice, anti-mouse immunoglobulin antibody is used
  • protein if the cells used for cell fusion are mice, anti-mouse immunoglobulin antibody is used
  • a method for detecting a monoclonal antibody a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, and the polypeptide A of the present invention labeled with a radioactive substance or an enzyme is labeled.
  • a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase can be mentioned.
  • Selection of monoclonal antibodies can be performed according to a known method or a method similar thereto, but can usually be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • Any medium can be used as the selection and breeding medium as long as the hybridoma can grow.
  • GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • serum-free medium for hybridoma culture SFM—101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culture can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same way as conventional polyclonal antibodies.
  • salting out alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger
  • DEAE adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G, and collect only antibody to obtain antibody by dissociating the binding Specific purification method
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (the polypeptide antigen of the present invention) and a carrier protein is prepared, and a mammal is immunized in the same manner as the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting an antibody-containing product against peptide A and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are the antibodies against hapten immunized by cross-linking with carrier.
  • a method of coupling at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, and active aldehyde reagents containing a aldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithiobilidyl group are used.
  • Condensation products can be used in warm-blooded animals at sites where antibodies can be produced. It is administered with a carrier and diluent. In order to enhance antibody production at the time of administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. The administration can be performed about once every 2 to 6 weeks, usually about 3 to 10 times.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc. of mammals immunized by the above method, preferably from blood.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglopurin separation and purification method as that of the monoclonal antibody described above.
  • the present invention provides, for example, (i) a labeled polypeptide of the present invention bound to the antibody by competitively reacting the antibody of the present invention with a test solution and the labeled polypeptide of the present invention.
  • the antibody of the present invention insolubilized on the test solution and the carrier, and the labeled of the present invention, characterized by measuring the ratio of peptide
  • a method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution characterized by measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier after reacting with an antibody simultaneously or continuously.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the polypeptide of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal part of the polypeptide of the present invention.
  • the detection of the polypeptide of the present invention using a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention can be carried out using force / tissue staining.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab,) 2 , F ab ′, or F ab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using an antibody against the polypeptide of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody corresponding to the amount of antigen in the solution to be measured (for example, the amount of polypeptide of the present invention) Any measurement method can be used as long as it is a measurement method that detects the amount of a single antigen complex by chemical or physical means and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. Also good. For example, nephrometry, competition The legal method, the immunometric method, and the sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, and luminescent substances.
  • radioactive isotopes include [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C], and the like.
  • the enzyme is preferably stable and has a large specific activity.
  • monogalactosidase, monodalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • As the fluorescent material for example, fluorescamine, fluoretcene isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a piotin-avidin system can be used for the binding of the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of an antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, silicon, or glass are used.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then labeled on the insolubilized carrier.
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction the labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at different times.
  • the labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. It may be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is an antibody having a different site to which the polypeptide of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminus of the polypeptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is , Prefer For example, an antibody that recognizes the N end other than the C end is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competitive method the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen and (F) are separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • B / F separation Measure the amount of labeled B or F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • a BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the above antibody and a solid-phased antibody is used as the first antibody
  • the first antibody is soluble and the second antibody is a solid phase method using a solid phase antibody.
  • the solid phase and the liquid phase are separated after a competitive reaction between the antigen in the test solution and the solid-phased antigen against a certain amount of labeled antibody, or in the test solution. After reacting the antigen with an excess amount of labeled antibody, and then adding a solid-phased antigen to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured.
  • Laser nephrometry using laser scattering is also preferably used when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
  • the polypeptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the polypeptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue.
  • production of an antibody column used for purifying the polypeptide of the present invention, detection of the polypeptide of the present invention in each fraction during purification, and behavior of the polypeptide of the present invention in a test cell It can be used for analysis, etc.
  • the antisense polynucleotide containing a complementary base sequence contains a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention, and can suppress the expression of the DNA. Any antisense polynucleotide may be used as long as it has a DNA, but antisense DNA is preferred.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about the entire base sequence or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the 'complementary strand of the DNA of the present invention).
  • Examples include nucleotide sequences having homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • the complementary strand of the base sequence encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention for example, the base sequence near the start codon, etc.
  • more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more of an antisense polynucleotide having homology for example, the base sequence near the start codon, etc.
  • J Specifically, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ⁇ Self Column No.
  • SEQ ID NO: 21 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 2.3, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48 or complementary to the nucleotide sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 51 , Or a substantially complementary nucleotide sequence, or an antisense polynucleotide containing a part thereof.
  • the antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • phosphate residues (phosphates) of each nucleotide that constitutes antisense DNA are chemically modified, for example, phosphorylate, methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. It may be substituted with a phosphate residue.
  • phosphate residues phosphates
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention is cloned, or the nucleotide sequence of the DNA encoding the determined polypeptide Can be designed and synthesized based on information.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the gene encoding the polypeptide of the present invention, and can inhibit the synthesis or function of the RNA ⁇ or the polypeptide-related RNA of the present invention. It is possible to regulate / control the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention through this interaction.
  • a polynucleotide complementary to a selected sequence of the polypeptide-related RNA of the present invention, and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with the polypeptide-related RNA of the present invention are: It is useful for regulating / controlling the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention, and for treating or diagnosing diseases.
  • corresponding means homologous to or complementary to a specific sequence of nucleotides, nucleotide sequences or nucleic acids including genes. “Corresponding” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and polypeptide usually refers to the amino acid of the polypeptide under the direction derived from the sequence of the nucleotide (nucleic acid) or its complement. .
  • the end hairpin loop can be selected as the preferred region of interest, but any region within the gene that codes for the polypeptide can be selected as the subject.
  • the relationship between the nucleic acid of interest and a polynucleotide complementary to at least a part of the region of interest can be said to be “antisense”.
  • Antisense polynucleotides are polynucleotides containing 2-deoxy D-ribose, polynucleotides containing D-ribose, and other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Nucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones or other polymers containing special linkages (however, the polymer must be arranged to allow base attachment, such as base pairing as found in DNA or RNA) And the like).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and unmodified polynucleotides (or unmodified oligos).
  • Nucleotides and with known modifications, such as those with labels known in the art, capped, methylated, and one or more natural nucleotides replaced with analogs
  • Those with intramolecular nucleotide modifications such as those with uncharged bonds (eg methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, force rubamates, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg Having phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nuclease, nuclease inhibitors, toxins , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides), etc., side chain
  • nucleoside may include not only purine and pyrimidine bases but also those having other heterocyclic bases modified. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides And modified nucleotides may also have sugar moieties modified, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or converted to functional groups such as ethers, amines, etc. It may be.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is R N A, D N A, or a modified nucleic acid (R N A, D N A).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and polynucleotide nucleoside amides that are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense polynucleotide of the present invention has the following policy: (1) To make the antisense polynucleotide in the cell more stable, (2) Antisense
  • the antisense polynucleotide of the present invention may contain saccharides, bases, or bonds that have been altered or modified, and are specialized in ribosomes and microspheres.
  • lipid 20 can be done. In this way, it can be used in addition form as a polycationic substance such as polylysine that acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, or a lipid that enhances the interaction with the cell membrane or increases the uptake of nucleic acid (for example, hydrophobic substances such as phospholipids and cholesterol).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl).
  • nucleic acids 25 black mouth formate, cholic acid, etc.
  • These can be attached to the 3 'or 5' end of nucleic acids and can be attached via bases, sugars, or intramolecular nucleoside linkages.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. . This way
  • capping group examples include a hydroxyl-protecting group known in the art, such as Daricol such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol. However, it is not limited to this.
  • the inhibitory activity of the antisense polynucleotide should be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the polypeptide of the present invention. Can do.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • a partial peptide thereof, an amide thereof, or a salt thereof may be abbreviated as “polypeptide A1 of the present invention”.
  • polypeptide A2 of the present invention A polypeptide containing an amino acid sequence, a partial peptide thereof, an amide thereof, or a salt thereof may be abbreviated as “polypeptide A2 of the present invention”.
  • polypeptide B of the present invention the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, or SEQ ID NO: 42 is identical or substantially the same.
  • a polypeptide containing the same amino acid sequence, a partial peptide thereof, an amide thereof, or a salt thereof may be abbreviated as “polypeptide B of the present invention”.
  • Screening method and screening kit for pharmaceutical scavenger compounds Screening method for pharmaceutical candidate compounds characterized by using the polypeptide of the present invention and pharmaceutical candidates characterized by containing the polypeptide of the present invention
  • the compound screening kit hereinafter sometimes abbreviated as “the screening method of the present invention” and “the screening kit of the present invention”, respectively) will be described below.
  • the polypeptide of the present invention promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention. It is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof.
  • a screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity (function) of the polypeptide of the present invention which is characterized by using the polypeptide of the present invention (hereinafter may be abbreviated as promoter or inhibitor). Include the following 1) to 3). -
  • the cell is cultured and the amount of prolactin secreted is measured.
  • the cells those in which prolactin secretion is induced are preferably used.
  • rat anterior pituitary cells eg, eosinophilic cells
  • the medium may be any medium as long as it does not inhibit activities such as the prolactin secretion inhibitory activity of the polypeptide A1 of the present invention.
  • DMEM Dulbecco modified Eagle's medium
  • the amount of prolactin secreted can be measured by a known method, for example, a radioimmunoassay method using a RIA (radioimmunoassay) kit (manufactured by Amersham, etc.).
  • test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds May be a novel compound or a known compound.
  • the activity (eg, prolactin secretion inhibitory activity) of the polypeptide A 1 of the present invention in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, compared to the case (i) ′. More preferably, the test compound that promotes about 50% or more can be selected as a compound that promotes the activity of the polypeptide A1 of the present invention or a salt thereof.
  • the activity (eg, prolactin secretion inhibitory activity) of the polypeptide A 1 of the present invention in the case (ii) above is about 20% or more, preferably 3%, compared with the case (i) above.
  • a test compound that inhibits 0% or more, more preferably about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of the polypeptide A1 of the present invention or a salt thereof.
  • the cells are cultured, and the amount of prolactin secreted is measured.
  • the above-mentioned cells those in which prolactin secretion is induced are preferably used.
  • rat anterior pituitary cells eg, eosinophilic cells
  • the medium may be any medium as long as it does not inhibit activities such as prolactin secretion activity of the polypeptide A2 of the present invention, and for example, DEM (Dulbecco modified Eagle's medium) is used.
  • the amount of prolactin secreted can be measured by a known method, for example, a radioimmunoassay method using a RIA (radioimmunoassay) kit (manufactured by Amersham etc.).
  • test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.
  • a compound may be sufficient and a well-known compound may be sufficient.
  • the activity (eg, prolactin secretion activity) of the polypeptide A 2 of the present invention in the case (iv) above is about 20% or more, preferably compared to the case (ii i) above.
  • a test compound that promotes 30% or more, more preferably about 50% or more can be selected as a compound or a salt thereof that promotes the activity of the polypeptide A2 of the present invention.
  • the activity (eg, prolactin secretion activity) of the polypeptide A 2 of the present invention in the case (iv) is about 20% or more, preferably 30% or more, compared to the case (iii). More preferably, a test compound that inhibits about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of the polypeptide A2 of the present invention or a salt thereof.
  • the cells are cultured and the amount of prolactin secreted is measured.
  • those in which prolactin secretion is induced are preferably used.
  • the medium may be any medium as long as it does not inhibit activities such as prolactin secretion activity of the polypeptide B of the present invention.
  • force S such as DMEM (Dulbecco modified Eagle's medium) is used.
  • the amount of prolactin secreted can be measured by a known method, for example, a radioimmunoassay method using a RIA (radioimmunoassay) kit (Araersham, etc.).
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. A compound may be sufficient and a well-known compound may be sufficient.
  • the activity (eg, prolactin secretion activity) of the polypeptide B of the present invention in the case (vi) is about 20% or more, preferably 30% or more, compared to the case (V). More preferably, a test compound that promotes about 50% or more can be selected as a compound that promotes the activity of polypeptide B of the present invention or a salt thereof.
  • the activity (eg, prolactin secretion activity) of the polypeptide B of the present invention in the case (vi) is about 20% or more, preferably 30% or more, compared to the case (V). More preferably, a test compound that inhibits about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of polypeptide B of the present invention or a salt thereof.
  • a screening kit for a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention or a salt thereof contains the polypeptide of the present invention or a salt thereof.
  • it further contains a reagent for measuring the activity of the polypeptide of the present invention, such as a reagent for measuring prolactin (for example, RIA kit).
  • a reagent for measuring prolactin for example, RIA kit.
  • Examples of the screening kit of the present invention include those containing the following (a) and (b). '
  • the polypeptide of the present invention is dissolved to 1 mM in PBS containing 0.1% ushi serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at 120 ° C. (Method for screening compound or salt thereof that changes the binding property of the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention)
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention characterized by using the polypeptide of the present invention
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention which comprises the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention (hereinafter referred to as “ The “screening method of the present invention” and “the screening kit of the present invention” may be abbreviated in some cases.
  • Such compounds have cell-stimulating activity (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P production via the protein of the present invention. , Inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH promoting activity, etc. (ie agonist) and cell stimulating activity Compounds that do not have (ie, antagonists) are included.
  • “changing the binding property between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention” means both the case of inhibiting the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention and the case of promoting the binding. Is included.
  • the present invention comprises: (i) the case where the polypeptide of the present invention is contacted with the protein of the present invention; and (ii) the case where the polypeptide of the present invention and a test compound are contacted with the above-described protein of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention is characterized by being compared with the case.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the tide and the protein of the present invention.
  • the above-described protein of the present invention is contacted with the polypeptide of the present invention; and (ii) the above-described protein of the present invention is contacted with the polypeptide of the present invention.
  • cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular c AM P production, intracellular c Measurement and comparison of GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-f OS activation, pH change, etc.
  • the screening method of the present invention includes:
  • labeled polypeptide of the present invention expressed as a derivative of the polypeptide of the present invention (hereinafter simply referred to as “labeled polypeptide of the present invention”) is contacted with the protein of the present invention and the amount of binding of the polypeptide of the present invention to the protein of the present invention when the labeled polypeptide of the present invention and the test compound are brought into contact with the protein of the present invention.
  • the labeled polypeptide of the present invention When the labeled polypeptide of the present invention is brought into contact with a cell containing the protein of the present invention or a membrane fraction of the cell, the labeled polypeptide of the present invention and the test compound are mixed with the protein of the present invention. The amount of binding of the labeled polypeptide of the present invention to the cell or the membrane fraction when it is brought into contact with the contained cell or the membrane fraction of the cell is measured and compared. A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between the peptide and the protein of the present invention,
  • the labeled polypeptide of the present invention When the labeled polypeptide of the present invention is brought into contact with the protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the protein of the present invention, When the polypeptide of the invention and the test compound are contacted with the protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the protein of the present invention, the labeled of the present invention A compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention, characterized by measuring and comparing the amount of the polypeptide bound to the protein of the present invention or Screening method for the salt,
  • the compound that activates the protein of the present invention for example, the polypeptide of the present invention
  • a cell containing the protein of the present invention e.g, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAM) P production, intracellular c GM P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH promoting activity, etc.
  • a screening method for a compound or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention e.g, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAM
  • a screening method for a compound or a salt thereof that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention
  • Cell stimulation activity via the protein of the present invention when contacted with the protein of the present invention eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP generation, intracellular c Measures and compares GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH promotion activity, etc.
  • the protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any protein as long as it contains the protein of the present invention, such as membrane fractions of organs such as humans and mammals. Is preferred. However, since it is extremely difficult to obtain organs derived from humans, the protein of the present invention expressed in large quantities using a recombinant is suitable for use in screening.
  • the preparation method described below when the cell or the cell membrane fraction containing the protein of the present invention is used, the preparation method described below may be followed.
  • TGR 1 When a cell containing the protein of the present invention, for example, TGR 1, is used, It may be fixed with taraldehyde or formalin.
  • the immobilization method can be performed according to a known method.
  • Examples of cells containing TGR 1 include the force S that refers to host cells expressing TGR 1, and examples of the host cells include the aforementioned E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, and animal cells.
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after disrupting cells.
  • Cell disruption methods include potter- Elvehjem homogenizers, crushing cells, Waring blender polytron
  • Examples include crushing by Kinematica, ultrasonic crushing, and rupturing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press.
  • a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 r pn! To 300 0 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further accelerated (15 000 rpm to 30000 rpm). Centrifuge for 30 minutes to 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in TGR 1 expressed and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of TGR 1 in the TGR 1-containing cells and membrane fractions is preferably 10 3 to 10 8 molecules, more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • the higher the expression level the higher the ligand binding activity per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples with the same mouthpiece. It becomes like this.
  • an appropriate protein fraction of the present invention and A labeled ligand or a compound having ligand activity (such as the polypeptide of the present invention) is used.
  • the protein fraction of the present invention is preferably a natural fraction of the protein of the present invention, or a recombinant protein fraction of the present invention having equivalent activity.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity and the like.
  • a labeled ligand or a compound having ligand activity (such as the polypeptide of the present invention) is used.
  • ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S], etc. labels of the polypeptide of the present invention
  • a cell or a membrane fraction of the cell containing the protein of the present invention is screened.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris monohydrochloride buffer.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas Co., Ltd.), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMS F, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin may be added for the purpose of suppressing the degradation of the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention by protease. it can.
  • a fixed amount (5000 c ⁇ ! To 500000 c ⁇ m) of the labeled polypeptide of the present invention (labeled product of the polypeptide of the present invention) was added to 0.0 lm 1 to 10 ml of the receptor solution. Coexist with 4 to 10 test compounds.
  • NBS non-specific binding
  • the reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° C, preferably 4 ° C to 37 ° C for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • filter with a glass fiber filter paper, etc. wash with an appropriate amount of the same buffer, and then measure the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper with a liquid scintillation counter or ⁇ -counter.
  • the specific binding amount (B—NSB) is For example, a test compound that is 80% or less can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • BI Acore manufactured by Amersham Almacia Biotech
  • BI Acore manufactured by Amersham Almacia Biotech
  • the polypeptide of the present invention is immobilized on a sensor chip by the amino coupling method according to the protocol attached to the apparatus, and a cell containing the protein of the present invention or DNA encoding the protein of the present invention is immobilized.
  • a purified protein of the present invention or a membrane fraction containing the protein of the present invention, or a purified protein of the present invention or a membrane fraction containing the protein of the present invention and a phosphate buffer containing a test compound Pass a buffer, such as a buffer or Tris buffer, over the sensor chip at a flow rate of 2–20 ⁇ 1 per minute.
  • a buffer such as a buffer or Tris buffer
  • cell stimulation via the protein of the present invention is carried out.
  • Activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c
  • activity that promotes fos activation, pH reduction, etc., or the like can be measured using known methods or commercially available measurement kits.
  • Activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c
  • activity that promotes fos activation, pH reduction, etc., or the like can be measured using known methods or commercially available measurement kits.
  • cells containing the protein of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like.
  • cells expressing the protein of the present invention are used.
  • the aforementioned recombinant protein-expressing cell line is desirable.
  • the protein-expressing cell of the present invention which is a transformant may be a stable expression strain or a transient expression strain.
  • the same kind of animal cells as above are used.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds Products, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like.
  • the following ligand system is used for the above-mentioned ligand / receptor assembly system.
  • the stimulating activity of the polypeptide of the present invention on the protein-expressing cell of the present invention can be measured.
  • This method does not use cells containing the protein of the present invention as described in (4) to (5) above, but uses the membrane fraction containing the protein of the present invention as described in (1) to (3).
  • cell stimulating activity is measured as in (4) to (5), and the substance that exhibits GTPy S binding promoting activity to the protein membrane fraction of the present invention in this measurement method is an agonist.
  • the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and a test compound are added, and GTP y S is added to the cell membrane fraction expressing the protein of the present invention compared to the single administration of the polypeptide of the present invention.
  • a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention can be screened.
  • the compound showing the activity of suppressing the GTP ⁇ S binding promoting activity to the cell membrane fraction expressing the protein of the present invention by the polypeptide of the present invention is the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • an agonist can be screened by administering only the test compound and observing the GTPyS binding promoting activity to the cell membrane fraction expressing the protein of the present invention.
  • the radioactivity of the experimental group to which only the polypeptide of the present invention was added was 100%
  • the radioactivity of the experimental group to which the polypeptide of the present invention was not added was 0%
  • the GTP ⁇ S binding promoting activity by the polypeptide of the present invention was Calculate the effect of the test compound.
  • a test compound having a GTP y S binding promoting activity of, for example, 80% or less can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • the amount of cAMP produced by various animal cells in which the protein of the present invention is expressed is an anti-cAMP antibody obtained by immunizing mice, rats, rabbits, goats, tusks, etc. and 125 1-labeled cAMP (both commercially available) Can also be measured in other EIA systems that combine RIA or anti-cAMP antibody with labeled cAMP. Further possible also beads 125 1-labeled cAMP and that by the SPA method using a quantitative scintillant containing the anti-cAMP antibody was fixed by using such antibodies to such protein A or animal IgG used in the anti-cAMP antibody production Yes (uses a kit made by Amersham Almacia Biotech).
  • the intracellular cAMP level is increased by a ligand that increases the cellular level of cAMP, such as forskolin or calcitonin, and the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and a test compound are added.
  • a ligand that increases the cellular level of cAMP such as forskolin or calcitonin
  • screening of the compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention can be performed.
  • the compound showing the activity of inhibiting the cAMP production inhibitory activity of the protein-expressing cell of the present invention by the polypeptide of the present invention is capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • suppression of cAMP production by adding only test compounds By examining the activity, it is possible to screen for a compound exhibiting an agonist activity.
  • CHO cells expressing the protein of the present invention are seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well in a 24-well plate and cultured for 48 hours. Cells are washed with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3 i sobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter 0.2 mM 3-isoptyl-methylxanthine and 0.05% Hanks buffer containing BSA and 20 mM HEPES
  • reaction buffer (PH7.4) is called reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in an incubator. Remove 0.25 ml of reaction buffer, add 0.25 ml of reaction buffer to cells, and then add 2 forskolin. 0.25 ml of reaction buffer contains 1 nM of the polypeptide of the present invention or 1 nM of the present invention. Add the addition of the above polypeptide and test compound to 13 ⁇ 4 and react at 37 ° C for 24 minutes. Stop the reaction by adding 20% perchloric acid of ⁇ , then extract intracellular cAMP by placing it on ice for 1 hour. The amount of cAMP in the extract is measured using the cAMP EIA kit (Amersham Armasia Biotech).
  • Test compound for cAMP production inhibitory activity by the polypeptide of the present invention assuming that the amount of cAMP produced by forskolin stimulation is 100% and the amount of cAMP suppressed by the addition of 1 nM polypeptide of the present invention is 0%. Calculate the impact of.
  • a test compound that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention and has a cAMP production activity of 80% or less, for example, is used as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention. You can choose.
  • cAMP produced by adding a test compound to CHO cells expressing the protein of the present invention without adding forskolin is quantified by the above method.
  • a test compound having a cAMP production activity of, for example, 10% or more should be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention. Can do.
  • DNA containing CRE (cAMP response element) is inserted into the multiple cloning site upstream of the luciferase gene of Pitsukagene Basic Vector or Pitsukagene Enhanser Vector (Toyo Ink Co., Ltd.), and this is inserted into the CRE_reporter.
  • a gene vector is used. In cells transfected with CRE—reporter gene vector, stimulation accompanied by elevated cAMP is mediated by CRE Induced luciferase gene expression and subsequent production of luciferase protein. In other words, by measuring the luciferase activity, it is possible to detect a change in the amount of cAMP in the CRE-reporter gene vector-introduced cell.
  • a cell in which the binding of the polypeptide of the present invention to the protein of the present invention can be screened using a cell in which a CRE-reporter gene vector is transfected into the protein-expressing cell of the present invention. Specific screening methods are described below.
  • the protein-expressing cells of the present invention into which CRE-reporter gene has been introduced are seeded in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / well and cultured for 48 hours. Wash the cells with Hank's buffer (P.H7.4) containing 0.2 mM 3 _isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter 0.2 raM 3-isobutyl monomethylxanthine and 0.05 % Hanks buffer (pH 7.4) containing BSA and 20raM HEPES is called the reaction buffer. Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in an incubator.
  • Hank's buffer P.H7.4
  • BSA and 20 mM HEPES hereinafter 0.2 raM 3-isobutyl monomethylxanthine and 0.05 % Hanks buffer (pH 7.4) containing BSA and 20raM HEPES is called the reaction buffer.
  • reaction buffer After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 1 nM of the polypeptide of the present invention or 1 nM of the polypeptide of the present invention and 2 ⁇ forskolin. Add 0.25 ml of reaction buffer containing to the cells and incubate at 37 ° C for 24 minutes. Cells are lysed with a cytolytic agent for Pitsukagene (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.), and a luminescent substrate (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) is added to the lysate. Luminescence by luciferase is measured with a noreluminometer, liquid scintillation counter or top counter.
  • the influence of the compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention can be measured by comparing the amount of luminescence by luciferase with that when the polypeptide of the present invention is administered alone. At this time, the administration of the polypeptide of the present invention suppresses the increase in the amount of luminescence due to forskolin stimulation, but the compound that restores this suppression changes the binding property of the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention. Can be selected as a candidate substance capable of On the other hand, agonists can be screened by administering only the test compound and observing the suppression of the amount of luminescence increased by stimulation with forskolin, similar to the polypeptide of the present invention.
  • Alkaline phosphatase activity can be determined by, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemicals, and chloramphenicol acetyltransferase activity by, for example, FAST CAT chrolamphenicol acetyltransferase assay kit manufactured by Wako Pure Chemical.
  • Galactosidase activity can be measured by, for example, Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries. .
  • a compound that inhibits the activity of releasing the arachidonic acid metabolite by the polypeptide of the present invention can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention. Further, by adding only the test compound and examining the arachidonic acid metabolite release activity of the protein-expressing cell of the present invention, a compound exhibiting agonist activity can be screened.
  • CHO cells expressing the protein of the present invention are seeded in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well, cultured for 24 hours, and then added with [] arachidonic acid at 0.25 ju Ci / well. [3 ⁇ 4] 16 hours after addition of arachidonic acid, the cells were washed with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, and 0.05% BSA was added to each well.
  • Hank's buffer pH 7.4
  • a buffer containing the polypeptide of the present invention at a final concentration of 10 nM or 10 nM of the polypeptide of the present invention and a test compound dissolved in Hank's buffer (pH 7.4) containing 20 mM HEP.
  • Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20raM HEPES is called the reaction buffer.
  • the reaction buffer After incubation at 37 ° C for 60 minutes, add 400 l of the reaction solution to the scintillator and measure the amount of [] arachidonic acid metabolites released in the reaction solution using a scintillation counter.
  • a test compound having an arachidonic acid metabolite productivity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • the protein-expressing cells of the present invention were seeded on a sterilized microscope cover glass, and two days later, the culture solution was replaced with HBSS suspended in 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories), and at room temperature for 2 hours. Leave for 30 minutes. After washing with HBSS, a cover glass is set in the cuvette, and the excitation wavelength when adding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and the test compound with a fluorometer is 340 nm and 505 nm at 380 nm. Measure the increase in fluorescence intensity ratio.
  • the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and a test compound are added to the FLIPR device, and the polypeptide of the present invention is administered alone, as in the case of Fura-2 AM.
  • a compound that suppresses the increase in fluorescence intensity by the polypeptide of the present invention can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property of the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • agonists can be screened by observing an increase in fluorescence intensity due to the addition of test compound alone.
  • the protein-expressing cell of the present invention is co-expressed with a protein gene such as aequorin that emits light when the intracellular Ca ion increases, and aequorin becomes Ca-binding by increasing the intracellular Ca ion concentration. This is observed by adding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and a test compound, and by adding the test compound as compared to when the polypeptide of the present invention is administered alone. By measuring the change in luminescence intensity, it is possible to screen for compounds that affect the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention. The method is the same as above except that no fluorescent material is incorporated.
  • test compound having an inositol triphosphate production activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • agonist screening can be performed by observing the increase in inositol triphosphate production by adding only the test compound.
  • a DNA containing TRE (TPA response element) is added to a Pitsukagene basic vector or a Pitsukagene enhancer vector (Toyo Ink
  • the TRE-reporter gene-introduced protein-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / well and cultured for 48 hours. After washing the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, add 10 nM of the polypeptide of the present invention or 10 nM of the polypeptide of the present invention and the test compound.
  • Luminescence by luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter.
  • the effect of the compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention can be measured by comparing the amount of luminescence by luciferase with that when the polypeptide of the present invention is administered alone. it can.
  • the administration of the polypeptide of the present invention increases the amount of emitted light due to the increase of intracellular Ca 2+ , but a compound that suppresses this increase changes the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention. It can be selected as a potential candidate substance.
  • an agonist can be screened by administering only the test compound and observing an increase in the amount of luminescence similar to that of the polypeptide of the present invention.
  • alkaline phosphatase for example, alkaline phosphatase, chloramphenicol facyltransferase or 3-galactosidase can be used as the reporter gene.
  • the enzyme activity of the gene products of these reporter genes can be easily measured using a commercially available measurement kit as follows.
  • Alkaline phosphatase activity is measured by, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Tosidase activity can be measured by, for example, Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • MAP kinase activity is obtained by adding a polypeptide of the present invention or a polypeptide of the present invention and a test compound to cells, and then obtaining a MAP kinase fraction from a cell lysate by immunoprecipitation using an anti-MAP kinase antibody.
  • MAP Kinase Assay Kit manufactured by Wako Pure Chemical Industries and ⁇ -[ 32 P]-ATP.
  • Thymidine uptake activity was determined by seeding the protein-expressing cells of the present invention, adding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and a test compound, adding [methyl-3 ⁇ 4] -thymidine, and then taking it into the cells. The radioactivity of the labeled thymidine can be measured by lysing the cells and counting with a liquid scintillation counter.
  • Proliferation of the protein-expressing cell of the present invention can be achieved by seeding the expressing cell and adding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and the test compound, followed by MTT (3- (4, 5-dimethyl- 2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) was added, and the cells were lysed with isopropanol that had been converted into MTT formazan, which had been incorporated into the cells and changed MTT. It can also be measured by measuring absorption.
  • MTT 4- (4, 5-dimethyl- 2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
  • the protein-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate and cultured for 500 days per well. The cells are then starved for 2 days in serum-free medium. After adding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and a test compound to the cells and culturing for 24 hours, [methyl-3 ⁇ 4] -thymidine was added at 0.015 MB per well for 6 hours. Incubate. Wash the cells with PBS (—), add methanol, and let stand for 10 minutes. Next, add 5% trichlorodiacetic acid and let stand for 15 minutes. Wash the fixed cells 4 times with distilled water.
  • the effect of a compound that alters the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention is measured by comparing the increase in radioactivity due to thymidine incorporation with the administration of the polypeptide of the present invention alone. be able to.
  • the polybeptide of the present invention A compound that suppresses the increase in radioactivity due to administration of a peptide can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • an agonist can be screened by administering only the test compound and observing an increase in radioactivity similar to that of the polypeptide of the present invention.
  • a compound that suppresses the increase in radioactivity due to administration of the polypeptide of the present invention can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • an agonist can be screened by administering only the test compound and observing the increase in radioactivity similar to that of the polypeptide of the present invention.
  • the protein-expressing cells of the present invention are cultured overnight in a capsule for a site sensor device, set in the chamber of the device, and 0.1% BSA is added for about 2 hours until the extracellular pH is stabilized.
  • Containing RPMI 1640 medium Perfuse ⁇ manufactured by Molecular Devices. After pH is stabilized, the medium of the present invention or the medium containing the polypeptide of the present invention and a test compound is perfused onto the cells. measuring the [rho Eta change in connexion resulting medium.
  • Poribe peptide of the present invention the extracellular [rho Eta changes in protein expression cells of the invention
  • a compound that suppresses the extracellular pH change caused by administration of the polypeptide of the present invention is compared with the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention. It can be selected as a scavenger capable of changing the binding property to the peptide, whereas only the test compound is administered and the extracellular pH change similar to that of the polypeptide of the present invention is observed. It is also possible to perform the screening Jung Agonisuto by Judging.
  • the sex pheromone receptor STe2 of Saccharomyces cerevi s iae (D haploid a -mating Type (MAT .a)) is coupled to G protein Gpal and responds to the sex phlomon a-mating factor Then, MAP kinase is activated, and Farl (cel l-cycle arrest) and transcriptional activator Ste l2 are activated, which induces the expression of various proteins including FUS1 involved in conjugation.
  • the regulator Sst2 functions in a suppressive manner in the above process
  • a yeast into which a gene encoding the protein of the present invention has been introduced is prepared, and a signal in the yeast cell is stimulated by an agonist to the protein of the present invention.
  • an indicator such as proliferation resulting from activation of the transmission system (Pausch, MH, Trends in Biotechnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997)) Screening of polypeptide and protein compounds that alter the binding of the present invention the protein using yeast system the transfer of a gene coding for the present invention of the invention. Can be performed.
  • the genes encoding Ste2 and Gpal of ⁇ yeast are removed, and the gene encoding the protein of the present invention and the gene encoding the Gpal-Gai2 fusion protein are introduced instead.
  • the gene encoding Far is removed so that cel-cycle arrest does not occur, and the sensitivity of the response to the polypeptide of the present invention is improved by removing the gene encoding Sst.
  • the FUS 1-HIS3 gene in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is linked to FUS 1, is introduced. Examples of the above gene recombination procedures include Price et al. (Price, LA et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp.
  • the transformed yeast thus constructed reacts with high sensitivity to the polypeptide of the present invention, which is a ligand of the protein of the present invention, and as a result, activation of AP kinase occurs and histidine biosynthetic enzyme is synthesized. It becomes possible to grow on histidine deficient medium. By utilizing this, the response of the protein-expressing yeast of the present invention by the polypeptide of the present invention can be observed using the growth of yeast in a histidine-deficient medium as an index.
  • the transformed yeast prepared as described above is cultured overnight in a liquid medium of a completely synthetic medium, added to a dissolved agar medium from which histidine has been removed at a concentration of 2 ⁇ 10 4 cells / ml, and a 9 ⁇ 9 cm square Sowing in a petri dish.
  • a sterile filter paper impregnated with the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and the test compound is placed on the surface of the agar and cultured at 30 ° C. for 3 days.
  • the effect of the compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention can be measured by comparing the growth of the yeast around the filter paper with the case where the polypeptide of the present invention is administered alone. it can.
  • a compound that suppresses the growth of yeast by administration of the polypeptide of the present invention can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property between the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • an agonist can be screened by administering only the test compound and observing the growth of yeast similar to the polypeptide of the present invention.
  • the oocyte mass removed from the female Xenopus laevis that became unable to move due to water cooling was obtained from the MBS solution (88 mM NaCl, lmM KC1, 0.41 mM CaCl 2 , 0. 33raM Ca (N0 3 ) 2 , 0. 82 mM MgS0 Collagenase dissolved in 4 , 2.4M NaHC0 3 , lOmM HEPES, pH 7.4)
  • microRNAs 50 ng / 50 nl
  • the mRNA encoding the protein of the present invention may be prepared from tissues or cells, or may be transcribed in vitro from a plasmid. Incubate this in MBS solution at 20 ° C for 3 days.
  • a Ringer solution containing the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention and a test compound is flowed to record the potential change.
  • the effect of the compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention is that the change in cell membrane potential of Xenopus laevis oocytes into which the gene encoding the protein of the present invention has been introduced. It can be measured by comparing with the case where it is administered alone.
  • a compound that suppresses changes in cell membrane potential due to administration of the polypeptide of the present invention can be selected as a candidate substance capable of changing the binding property of the protein of the present invention and the polypeptide of the present invention.
  • screening of an agonist can be performed by administering only the test compound and observing the change in cell membrane potential similar to that of the polypeptide of the present invention.
  • poly (A) + RNA of various G protein genes can be introduced so that the reaction can be easily measured by increasing the amount of change. It is also possible to measure this reaction by co-injecting poly (A) + RA, a protein gene that produces luminescence in the presence of Ca 2+ , such as aequorin, by observing luminescence rather than changes in membrane potential. it can.
  • the salt screening kit contains the protein of the present invention, a cell containing the protein of the present invention, or a membrane fraction of a cell containing the protein of the present invention, and the polypeptide of the present invention. is there.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CH cells expressing the protein of the present invention were subcultured in 12-well plates with 5 ⁇ 10 5 Z-wells and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% air for 2 days.
  • polypeptide of the present invention labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 Sr or the like.
  • the polypeptide of the present invention is dissolved in ImS with PBS containing 0.1% urine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at 120 ° C.
  • the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound that changes (inhibits or promotes binding) the binding between the polypeptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • a compound having a cell stimulating activity via the protein of the present invention (so-called antagonist) or a compound not having the stimulating activity (so-called antagonist).
  • antagonist a compound having a cell stimulating activity via the protein of the present invention
  • antagonist a compound not having the stimulating activity
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a specific method for evaluating whether the protein is an agonist or antagonist of the protein of the present invention may be according to the following (i) or (ii).
  • a compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist, and a compound having no such activity or a salt thereof is an antagonist.
  • test compound is brought into contact with a cell containing the protein of the present invention, and the cell stimulating activity via the protein of the present invention is measured.
  • a compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist.
  • a compound that activates the protein of the present invention for example, the polypeptide of the present invention or an agonist for the protein of the present invention
  • a cell containing the protein of the present invention When the compound that activates and the test compound are brought into contact with the cell containing the protein of the present invention, the protein mediated by the protein of the present invention is used. Measure and compare blast stimulating activity.
  • the compound or its salt that can reduce the cell stimulating activity of the protein ⁇ -activating compound of the present invention is an antagonist.
  • the agonist has the same action as the physiological activity of the polypeptide of the present invention on the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug like the polypeptide of the present invention.
  • an antagonist can suppress the physiological activity of the polypeptide of the present invention against the protein of the present invention, and thus is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical that suppresses the receptor activity.
  • Polypeptide A1 of the present invention has, for example, gastrointestinal contraction action, smooth muscle contraction action, blood pressure increase action, feeding suppression action, prolactin secretion lowering action, etc., and the phase advance and delay in circadian rhythm Related. Therefore, the polypeptide A1 of the present invention, the polynucleotide encoding the polypeptide A1 of the present invention, and the compound or salt thereof that promotes the activity of the polypeptide A1 of the present invention are low toxic and safe.
  • Low blood pressure obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinism, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamus sexual obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hyposexual obesity, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.), hyperphagia, sleep disorders (example) , Primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition change due to three shifts, time zone change syndrome, etc.)], lethargy, infertility, seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disorders Senile dementia Alzheimer's disease, aging-related disorders, cerebral circulation disorder (eg, stroke, etc.), head injury, spinal cord injury, epilepsy, anxiety, depression, manic depression, schizophrenia, alcoholism, Parkinson's disease, arteriosclerosis, arrhythmia Premenstrual tension syndrome, glaucoma, cancer, AIDS, diabetes, etc.
  • obesity eg, malignant mastocyto
  • the antibody against the polypeptide A1 of the present invention, and the compound or salt thereof that inhibits the activity of the polypeptide A ⁇ of the present invention are low toxic and safe, for example, hypertension, anorexia, climacteric disorder, insomnia It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hypertension, anorexia, menopause, insomnia, etc., such as immune / inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis).
  • immune / inflammatory diseases eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis.
  • the polypeptide A2 of the present invention has a prolactin content, an action, etc.
  • the polypeptide A2 of the present invention, the polynucleotide encoding the polypeptide A2 of the present invention, and the polypeptide of the present invention Compounds that promote the activity of peptide A 2 or their salts are low toxic and safe, such as prolactin secretion deficiency (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development, climacteric disorder, etc.), hyperthyroidism, etc.
  • prolactin secretion deficiency eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development, climacteric disorder, etc.
  • hyperthyroidism e.g, it is useful as a preventive / therapeutic agent for menopause and hyperthyroidism.
  • the antibody against the polypeptide A2 of the present invention and the compound or salt thereof that inhibits the activity of the polypeptide A2 of the present invention are low toxic and safe, for example, pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstruation Abnormal, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari-Flommel syndrome, Argon-der-Casti syndrome, Forbes-Albright syndrome, lymphoma, sheehan syndrome It is useful as a prophylactic / therapeutic agent (preferably a prolactin production inhibitor) such as spermatogenesis abnormality, thyroid dysfunction, preferably infertility, thyroid dysfunction.
  • spermatogenesis abnormality spermatogenesis abnormality
  • thyroid dysfunction preferably infertility, thyroid dysfunction.
  • the polypeptide B of the present invention has a prolactin secretion action and the like, it promotes the activity of the polypeptide B of the present invention, the polynucleotide encoding the polypeptide B of the present invention, and the polypeptide B of the present invention.
  • the compound or salt thereof is low toxic and safe, for example, prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.), hyperthyroidism, etc., preferably menopausal disorder, hyperthyroidism It is useful as a preventive / therapeutic agent for diseases.
  • An antibody against the polypeptide B of the present invention, and a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the polypeptide B of the present invention are low toxic and safe, for example, pituitary gland tumor, mesencephalic tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, Prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari 'Flommel syndrome, Argon' del 'Casti syndrome, Forbes-Albright syndrome, lymphoma, Schihan's syndrome, spermatogenesis disorder It is useful as a prophylactic / therapeutic agent (preferably a prolactin production inhibitor) such as thyroid dysfunction, preferably infertility, thyroid dysfunction.
  • a prophylactic / therapeutic agent preferably a prolactin production inhibitor
  • the protein agonist of the present invention includes, for example, a prophylactic / therapeutic agent for hypotension; a local vasoconstrictor; a uterine contraction accelerator; a weak labor pain; Induction of labor, cessation of delivery, cervical incompetence, uterine varus (symptoms), remnant placenta and remnant ovum, postpartum hemorrhage, female genital prolapse, infertility, maternal care in multiple pregnancies, abnormal position, menstruation Dysfunction, miscarriage, endometriosis, chronic uterine inflammatory disease, child It can be used as an agent for the improvement, prevention or treatment of various diseases related to dysconstriction such as Miyamyoma, uterine malformation, uterine adenomyosis, cervical laceration, post-injury stress syndrome.
  • various diseases related to dysconstriction such as Miyamyoma, uterine malformation, uterine adenomyosis, cervical laceration
  • Antagonists of the protein of the present invention include, for example, hypertension, myocardial infarction, acute renal failure, stress-related diseases [eg, (1) cardiovascular diseases (eg, angina, myocardial infarction, arrhythmia, etc.), (2) Respiratory diseases (eg, bronchial asthma, hyperventilation syndrome, etc.), (3) Musculoskeletal diseases (eg, rheumatoid arthritis, low back pain, migraine, tension headache), (4) Sugar Urine disease, climacteric disorder, hyperthyroidism, chronic pain, decreased immunity, digestive disorders
  • stress-related diseases eg, (1) cardiovascular diseases (eg, angina, myocardial infarction, arrhythmia, etc.), (2) Respiratory diseases (eg, bronchial asthma, hyperventilation syndrome, etc.), (3) Musculoskeletal diseases (eg, rheumatoid arthritis, low back pain, migraine, tension headache), (4) Sugar Urine disease, climacteric disorder, hyperthyroidism,
  • Uterine contraction suppressant Uterine contraction suppressant; excessive labor pain, pseudo labor pain, prolonged pregnancy, tonic uterine contraction, fetal distress, eclampsia rupture, cervical laceration, premature birth Uterine fibroids, uterine malformations, uterine adenomyosis, birth output abnormalities, chronic uterine inflammatory diseases, maternal care in multiple pregnancy, placental abnormalities, Prader-Willi syndrome, dysmenorrhea, etc. It is useful as an improvement / prevention / treatment agent.
  • salts of the polypeptide of the present invention examples include, for example, pharmaceutically acceptable Possible salts and the like are used.
  • a salt with an inorganic base a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a salt with a basic or acidic amino acid, and the like.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and strong salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt and ammonium salt. .
  • the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine. , N, N'—diben ⁇ / ethylenediamine, etc.
  • salt with inorganic acid examples include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid And salt.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ortinine, and preferable examples of acidic amino acids include Examples include salts with paraformic acid and glutamic acid.
  • polypeptide of the present invention when used as the above-mentioned pharmaceutical, it can be carried out according to a conventional procedure. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like as required, with sugar coating or enteric coating as required, or aseptic solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injection such as a suspension.
  • the compound or salt thereof is mixed in physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in a unit dosage form generally required for recognized pharmaceutical practice. Can be manufactured.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • Additives that can be mixed into tablets, force psenoles, etc. include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline senorelose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline senorelose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a leavening agent such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil, or chili is used.
  • the material of the above type can further contain a liquid carrier such as fats and oils.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally produced vegetable oils such as sesame oil,
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). It may be used in combination with an agent such as an alcohol (eg ethanol), a polyalcohol (eg propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant (eg polysorbate 80 TM , HCO-50).
  • alcohol eg ethanol
  • a polyalcohol eg propylene glycol, polyethylene glycol
  • a nonionic surfactant eg polysorbate 80 TM , HCO-50.
  • oily liquids include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing aid.
  • Buffers eg phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents E.g., salted benzalkonium, hydrochloric acid hydrochloride, etc.
  • stabilizers e.g., human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives e.g., benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants etc. You may mix
  • the prepared injection is usually filled into a suitable ampoule.
  • the preparations thus obtained are safe and have low toxicity.
  • warm-blooded animals eg, humans, guinea pigs, rats, mice, pigs, hidges, sushi, monkeys, dogs, chickens. Can be administered.
  • the dose of the compound or its salt that promotes the activity of the polypeptide A 1 of the present invention varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, generally, for example, a hypotension patient (weight 60 kg) In about 0.1 to about L: 000 mg per day, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 50 mg.
  • a hypotension patient weight 60 kg
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptom, administration method, etc.
  • patients with hypotension body weight
  • 60 mg about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg is administered intravenously. Is convenient. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dose of the compound or salt thereof that promotes the activity of the polypeptide A 2 of the present invention varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, for example, generally a patient with climacteric disorder (weight 60 kg) In the case of-about 1.0 to 1000 mg, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 5 Omg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • an amount converted per 6 O kg can be administered.
  • the dose of the compound or its salt that promotes the activity of the polypeptide B of the present invention varies depending on the symptom and the like. Is about 0.1 to 1000 mg per day, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 5 Omg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • it is generally As for administration it is convenient to administer about 0.01-30 mg, preferably about 0.1-2 Omg, more preferably about 0.1-10 mg per day by intravenous injection. is there. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dose of the compound that inhibits the activity of the polypeptide A 1 of the present invention or a salt thereof varies depending on symptoms, but in the case of oral administration, for example, generally in hypertensive patients (with a body weight of 60 kg). Is about 0.:! To 1000 mg per day, preferably about 1.0 to 30 Omg, more preferably about 3.0 to 50 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • it is generally (as kg), about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to: L Omg is administered by intravenous injection. Is convenient. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dose of the compound that inhibits the activity of the polypeptide A 2 of the present invention or a salt thereof varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, for example, generally in infertile patients (with a body weight of 60 kg). Is about 0.1-100 Omg per day, preferably about 1.0-300 mg, more preferably about 3.0-5 Omg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • the form of injections generally, for example, to infertile patients (with a body weight of 60 kg)
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dose of the compound or its salt that inhibits the activity of the polypeptide B of the present invention varies depending on the symptom and the like. Is about 0.1 to 1000 mg, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 5 Omg per day.
  • the single dose varies depending on the administration subject, symptoms, administration method, etc., but in the form of an injection, for example, in general, for example, infertile patients (body weight 6 O k g)) about 0.1 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day is conveniently administered by intravenous injection. is there. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dose of the compound (especially antagonist) or a salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, it is generally an adult hypertensive patient ( (With a body weight of 60 kg), about 0.1 to: L 00 Omg, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 5 Omg per day.
  • L 00 Omg an adult hypertensive patient
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • it is not suitable for administration to adult patients with hypertension (weight 60 kg).
  • an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the pharmaceutical containing the polypeptide of the present invention the pharmaceutical containing the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, and the pharmaceutical containing the antibody against the polypeptide of the present invention will be described more specifically.
  • Polypeptide A1 of the present invention has, for example, gastrointestinal contraction action, smooth muscle contraction action, blood pressure increase action, feeding suppression action, prolactin secretion lowering action, etc., and the phase advance and delay in circadian rhythm Related. Therefore, the polypeptide A1 of the present invention is low toxic and safe, such as hypotension, obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulin obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, Hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hyposexual obesity, systemic mastocytosis, simple obesity, central It is useful as a preventive / therapeutic agent for drowsiness, time zone change syndrome, infertility, etc.
  • hypotension obesity
  • obesity eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulin obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, Hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptom
  • the polypeptide A 2 of the present invention Since the polypeptide A 2 of the present invention has a prolactin secretion action, the polypeptide A 2 of the present invention is a low-toxic and safe agent for preventing and treating menopause, hyperthyroidism, etc. Useful. Since the polypeptide B of the present invention is for prolactin secretion and the like, the polypeptide B of the present invention is low toxic and safe, for example, as a preventive / therapeutic agent for menopause, hyperthyroidism, etc. Useful.
  • Examples of the salt of the polypeptide of the present invention include those described above, and those described above are preferred.
  • polypeptide of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it is purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more. It is preferable to use the same.
  • polypeptide of the present invention when used as the above-mentioned pharmaceutical (such as a prophylactic / therapeutic agent), it can be formulated according to a known method such as the above-described method.
  • the polypeptide of the present invention can be used, for example, orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc. with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as a sterile solution or suspension.
  • the polypeptides of the present invention are mixed in physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in unit dosage forms generally required for the practice of recognized formulations. Can be manufactured according to The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • Additives that can be mixed into tablets, capsenoles, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • swelling agents such as magnesium stearate, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, squid mono oil or tea tree are used.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the material of the above type.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally produced vegetable oils such as sesame oil
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohol (eg ethano ), Polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ⁇ , ⁇ CO-50, etc.).
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizer.
  • Buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, pro-hydrochlorin hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol) Etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • mice e.g mice, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.
  • warm-blooded animals e.g mice, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, horses, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the polypeptide A 1 of the present invention varies depending on symptoms, but in the case of oral administration, generally, for example, in patients with hypotension (with a body weight of 6 O kg): 0.1 to: L 00 Omg, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 5 Omg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • in the form of injections generally, for example, patients with hypotension (body weight 60 kg As for administration, it is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. is there. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dose of the polypeptide A2 of the present invention varies depending on symptoms, but in the case of oral administration, generally, for example, in a climacteric disorder patient (weight 60 kg), about 0. 1 to: L 000 mg, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 5 Omg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • menopausal patients generally, for example, menopausal patients (weight 60 kg)
  • about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day is administered intravenously.
  • an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dose of the polypeptide B of the present invention varies depending on symptoms, but is orally administered.
  • about 0.1 to a day: LOO Omg preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3 0 to 50 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • menopausal patients weight 60 kg
  • the dose converted per 60 kg can be administered.
  • Polypeptide A1 of the present invention includes, for example, gastrointestinal contraction action, smooth muscle contraction action, blood pressure increase action, feeding suppression action, It has a prolactin secretion lowering effect and is related to phase advance and delay in circadian rhythm. Therefore, the polynucleotide encoding the polypeptide A1 of the present invention is useful as a prophylactic / therapeutic agent for low toxicity and safety, such as hypotension, obesity, lethargy, time-zone change syndrome, infertility and the like.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide A 2 of the present invention is low in toxicity and safe, for example, climacteric disorder, hyperthyroidism It is useful as a preventive / therapeutic agent. Since the polypeptide B of the present invention has a prolactin secretion action and the like, the polynucleotide encoding the polypeptide B of the present invention is low in toxicity and safe, such as climacteric disorder and hyperthyroidism. Useful as a preventive / therapeutic agent.
  • the polynucleotide of the present invention can be used, for example, when there is a patient in which the polypeptide of the present invention is reduced or deficient in vivo, (i) the polynucleotide of the present invention is administered to the patient, and the Or (ii) by inserting the polynucleotide of the present invention into a cell and expressing the polypeptide of the present invention, and then transplanting the cell into a patient, etc.
  • the polynucleotide of the present invention as the above-mentioned preventive / therapeutic agent capable of fully or normally exerting the role of the polypeptide of the present invention, it is formulated and administered according to a known method such as the above-described method. be able to.
  • the polynucleotide may be used alone or as a retroviral vector, adeno After being inserted into an appropriate vector such as a viral vector or adenovirus associated virus vector, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the polynucleotide of the present invention can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hard mouth gel catheter.
  • a vector into which the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention has been inserted can be formulated in the same manner as the above-described polypeptide of the present invention, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity. , Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the polynucleotide containing the polynucleotide encoding the polypeptide A 1 of the present invention varies depending on the symptoms, but generally, for example, in patients with hypotension (with a body weight of 6 O kg) About 0.1 to 100 mg per day.
  • the dose of the polynucleotide containing the polynucleotide encoding the polypeptide A2 of the present invention varies depending on symptoms, but generally, for example, in a climacteric disorder patient (weight 60 kg), About 0.1 to 100 mg per day.
  • the dosage of the polynucleotide containing the polynucleotide encoding the polypeptide B of the present invention varies depending on symptoms, but generally, for example, in a climacteric disorder patient (weight 60 kg), Per 0.1 to 100 mg.
  • Polypeptide A1 of the present invention has, for example, gastrointestinal contraction action, smooth muscle contraction action, blood pressure increase action, feeding suppression action, prolactin secretion lowering action, etc., and the phase advance in circadian rhythm Related to delay. Therefore, the antibody against the polypeptide A1 of the present invention is useful as a preventive / therapeutic agent for low toxicity and safe, for example, hypertension, anorexia, climacteric disorder and insomnia.
  • the antibody against the polypeptide A 2 of the present invention is low in toxicity and safe, for example, infertility, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for thyroid dysfunction.
  • the antibody against the polypeptide B of the present invention is low in toxicity and safe, for example, prevention / treatment of infertility, thyroid dysfunction, etc. Useful as an agent.
  • the antibody of the present invention eg, neutralizing antibody
  • the antibody molecule itself may be used, and the antibody molecule F (ab ′) 2 , F ab 'Or the Fab fraction may be used.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has a low toxicity, and it can be used as it is as a solution or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form in humans or mammals (eg, rats, It can be administered orally or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.) to Usagi, Hedge, Pig, Usushi, Cat, Inu, Monkey, etc. Preferably, it can be administered as a vaccine according to a conventional method.
  • the antibody of the present invention may be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition can be prepared according to a known method such as the method described above.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions, etc.
  • Such a composition is produced by a known method and is usually used in the field of pharmaceutical preparations. It may contain a carrier, a diluent or an excipient. Examples of carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate.
  • a composition for parenteral administration for example, injections, suppositories, vaccines, etc.
  • injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, etc. These dosage forms may be included.
  • Such injections can be prepared according to known methods.
  • Such an injection can be prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injection.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, etc. are used.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate 80, HCO—50 (polyoxyethylene (o 0 mol)) adduct of hydrogenated castor oil )] Etc.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled into a suitable ampoule.
  • a suppository used for rectal administration may be prepared by mixing the above-mentioned antibody or a salt thereof with a normal suppository base.
  • parenteral or oral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient.
  • dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the content of the antibody is preferably about 5-50 Omg per dosage unit dosage form, especially about 5-100 mg for injections, and about 10-250 mg for other dosage forms. .
  • the dose of the antibody against the polypeptide A1 of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc.
  • the present invention 1 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to about L OmgZkg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mgZkg body weight per day. It is convenient to administer by intravenous injection about once, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the dose of the antibody against the polypeptide A2 of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., for example, when used for treatment of infertile patients
  • One dose of the antibody of the present invention is usually about 0.01 to 20 mg kg body weight, preferably about 0.1 to 1 OmgZkg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight per day. It is convenient to administer by intravenous injection about -5 times, preferably about 1-3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the dosage of the antibody against the polypeptide B of the present invention is as follows: Depending on the route of administration, etc., for example, when used for the treatment of incurable patients, the antibody of the present invention is usually administered at a dose of about 0.01 to 20 mg Z k body weight, preferably 0.1 to 1 O mg Z kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg Z kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day, by intravenous injection It is convenient to administer. In the case of other parenteral administration and oral administration, the equivalent dose can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • polypeptide of the present invention can be quantified with good sensitivity by using the antibody of the present invention
  • various antibodies related to the polypeptide of the present invention can be used with the antibody of the present invention. Diagnosis can be made.
  • the polypeptide A1 of the present invention has, for example, gastrointestinal contraction action, smooth muscle contraction action, blood pressure increase action, feeding suppression action, prolactin secretion lowering action, etc. Since an increase in the concentration of the polypeptide A1 of the present invention is detected using the antibody of the present invention, for example, hypertension, anorexia, climacteric disorder, insomnia, immunity ⁇ It can be diagnosed as a disease such as inflammatory disease (eg, rheumatoid arthritis, deformed arthritis, etc.) or likely to be affected in the future.
  • inflammatory disease eg., rheumatoid arthritis, deformed arthritis, etc.
  • a decrease in the concentration of the polypeptide A 1 of the present invention is detected, for example, hypotension, obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasma Obesity, pituitary obesity, hypotensive obesity, hypothyroidism obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism obesity, systemic Mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.), hyperphagia, sleep disorders (eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition modulation due to three shifts, time zone change syndrome, etc.) )), Lethargy, infertility, seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disease, senile dementia, Alzheimer's disease, aging disorders associated with aging, cerebral circulation disorders (eg, stroke, etc.), Head injury, spinal cord injury, epilepsy , Anxiety, depression, manic depression, schizophrenia, alcoholism, Parkinson's
  • the polypeptide A 2 of the present invention has a prolactin secretion action and the like
  • an increase in the polypeptide A 2 concentration of the present invention is detected using the antibody of the present invention, for example, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea ,
  • the antibody of the present invention for example, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea ,
  • prolactin secretion failure eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.
  • hyperthyroidism e.g., ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.
  • the polypeptide B of the present invention has a prolactin secretion action and the like, when an increase in the concentration of the polypeptide B of the present invention is detected using the antibody of the present invention, for example, the pituitary gland Tumor, Diencephalic tumor, Menstrual abnormalities, Autoimmune disease, Prolactinoma, Infertility, Impotence, Amenorrhea, Lactation, Acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argon der Casti mouth syndrome, Forbes Albright It can be diagnosed as a symptom group, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis, thyroid dysfunction, or a disease that is likely to be affected in the future.
  • the antibody of the present invention for example, the pituitary gland Tumor, Diencephalic tumor, Menstrual abnormalities, Autoimmune disease, Prolactinoma, Infertility, Impotence, Amenorrhea, Lactation, Acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argon der Casti mouth syndrome
  • prolactin insufficiency eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.
  • hyperthyroidism e.g., ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.
  • the polynucleotide (DNA) of the present invention can be used as, for example, a human warm-blooded animal (for example, rat, mouse, guinea pig, rabbit, trie, hidge, pig, ushi,
  • a DNA or mRNA abnormality (gene abnormality) encoding the polypeptide of the present invention can be detected in, for example, DNA, mRNA, etc. It is useful as a genetic diagnostic agent for mutation or decreased expression, increased DNA or mRNA, or excessive expression.
  • the above gene diagnosis using the DNA of the present invention is, for example, a known Northern hive. Rediscation and PCR—SSCP method (Genomics, 5th, 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86th, 2766-2770 (1989)) Can be implemented.
  • Polypeptide A1 of the present invention has, for example, gastrointestinal contraction action, smooth muscle contraction action, blood pressure increase action, feeding suppression action, prolactin secretion lowering action, etc., and the phase advance and delay in circadian rhythm
  • overexpression of the polypeptide A 1 gene is detected, for example, hypertension, anorexia, climacteric disorder, insomnia, immunity, inflammatory disease (eg, rheumatoid arthritis, deformity)
  • the disease can be diagnosed as having a high possibility of suffering from a disease such as osteoarthritis).
  • a decrease in the expression of the polypeptide A1 gene of the present invention is detected, for example, hypotension, obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, insulin obesity, hyperplasmic) Obesity, Pituitary obesity, Plasma-reducing obesity, Hypothyroidism obesity, Hypothalamic obesity, Symptomatic obesity, Childhood obesity, Upper body obesity, Dietary obesity, Hyposexual obesity, Systemic mast cells Dysphagia, simple obesity, central obesity, etc., hyperphagia, sleep disorders (eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition changes due to three shifts, etc., time zone change syndrome) ))), Somnolence, infertility, seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine disorders, senile dementia, Alzheimer's disease, various disorders associated with aging, cerebral circulation disorders (eg, stroke, etc.), head trauma, Spinal cord injury, Tendon , Anxiety, depression, manic depression, schizophrenia, alcoholism, Parkinson's disease
  • the polypeptide A2 of the present invention has a prolactin secretion action or the like, for example, when overexpression of the gene of the polypeptide A2 is detected, for example, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, Abnormal, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari-Flommel syndrome, Argon ⁇ Del Casti mouth syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, It can be diagnosed as a disease such as Sheehan's syndrome, spermatogenesis abnormality, thyroid dysfunction, or likely to be affected in the future.
  • diseases such as prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.), hyperthyroidism, etc. It can be diagnosed as being ill or likely to be affected in the future.
  • prolactin secretion failure eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.
  • hyperthyroidism etc. It can be diagnosed as being ill or likely to be affected in the future.
  • the polypeptide B of the present invention has a prolactin secretion and the like, for example, when excessive expression of the polypeptide ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ gene is detected, for example, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality Autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari ⁇ Flommel syndrome, Argont del Casti syndrome, Forbes-Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome It can be diagnosed as a disease such as spermatogenesis abnormality, thyroid dysfunction, or a high possibility of suffering in the future.
  • a prolactin secretion and the like for example, when excessive expression of the polypeptide ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ gene is detected, for example, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality Autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amen
  • a decrease in the expression of the gene of the polypeptide IV of the present invention may be caused by diseases such as prolactin secretion failure (eg, ovarian dysfunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.), hyperthyroidism, etc. Can be diagnosed as being or likely to be affected in the future.
  • diseases such as prolactin secretion failure (eg, ovarian dysfunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, etc.), hyperthyroidism, etc. Can be diagnosed as being or likely to be affected in the future.
  • the DNA of the present invention (A1) binds complementarily to the polypeptide A1 of the present invention or the DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter referred to as “the DNA of the present invention (A1)”), and suppresses the expression of the DNA.
  • the antisense polynucleotide of the present invention that has a low toxicity and can suppress the function of the polypeptide A1 of the present invention or the DNA (A1) of the present invention in living organisms.
  • stress disorder eg, (1) cardiovascular disease (eg, angina, myocardial infarction, arrhythmia, etc.),
  • DNA encoding polypeptide A2 of the present invention (hereinafter referred to as ⁇ DNA of the present invention (A 2)
  • a 2 DNA encoding polypeptide A2 of the present invention
  • the antisense polynucleotide of the present invention that binds complementarily to J) and can suppress the expression of the DNA is low toxic, and the polypeptide A2 of the present invention in vivo or the present invention Since the function of DNA (A 2) can be suppressed, it can be used, for example, as a prophylactic / therapeutic agent for infertility and thyroid dysfunction.
  • the antisense polynucleotide of the present invention which binds complementarily to the DNA encoding the polypeptide B of the present invention (hereinafter referred to as “DNA (B) of the present invention)” and can suppress the expression of the DNA, Since it has low toxicity and can suppress the function of the polypeptide B of the present invention or the DNA (B) of the present invention in vivo, for example, prophylactic / therapeutic agents for infertility, thyroid dysfunction, etc. Can be used as
  • the antisense polynucleotide When used as the above-mentioned preventive / therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a known method.
  • the antisense polynucleotide when used, the antisense polynucleotide is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, and the like. Or other mammals (eg, rats, rabbits, hidges, pigs, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally.
  • the antisense polynucleotide can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant to promote ingestion and administered through a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is locally administered to the kidney for the purpose of treating hypertension.
  • the kidney for the purpose of treating hypertension.
  • about 0.1 to 10 O mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells. Diagnosis using the antisense polynucleotide can be carried out in the same manner as the above-described gene diagnostic agent.
  • RNAi ribozyme
  • a medicament comprising the double-stranded RNA according to (5) above;
  • a medicament comprising the ribozyme according to (7) above;
  • RNAi double-stranded RNAs
  • ribozymes ribozymes, and the like
  • RNAi RNA interference method
  • ribozymes ribozymes, and the like
  • RNAi double-stranded RNAs
  • ribozymes ribozymes, and the like
  • RNAi RNA interference method
  • ribozymes ribozymes, and the like
  • the activity or function of the polypeptide of the invention or the polynucleotide (eg, DNA) of the invention can be inhibited.
  • the double-stranded RNA described in (1) and the ribozyme described in (3) are, for example, hypertension, myocardial infarction, acute renal failure, stress disease [eg, (1) cardiovascular system Diseases (eg, angina pectoris, myocardial infarction, arrhythmia, etc.), (2) respiratory diseases (eg, bronchial asthma, hyperventilation syndrome, etc.), (3) musculoskeletal diseases (eg, rheumatoid arthritis, (4) Diabetes, menopause, chronic pain, decreased immunity, gastrointestinal disorders (eg, gastric ulcer, ulcerative colitis, etc.) Anti-therapeutic agent; Uterine contraction suppressor; excessive labor pain, pseudo labor pain, 'prolonged pregnancy, tonic uterine contraction, fetal distress, uterine rupture, cervical laceration, premature birth, uterine fibroid, uterine malformation, uterine adenomyosis, delivery Force abnormalities, chronic uterine inflammatory disease, maternal care in multiple pregnancy, abnormal position
  • the double-stranded RNA described in (5) and the ribozyme described in (7) are used as, for example, a preventive / therapeutic agent (preferably a prolactin production inhibitor) for infertility, thyroid dysfunction, etc. it can.
  • a preventive / therapeutic agent preferably a prolactin production inhibitor
  • the double-stranded RNA described in (9) and the ribozyme described in (1 1) are, for example, as preventive / therapeutic agents (preferably prolactin production inhibitors) for infertility, thyroid dysfunction and the like. Can be used.
  • Double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the ribozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7 ⁇ , 221 pages, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of RNA encoding the peptide of the present invention.
  • RNA encoding the peptide of the present invention examples include a portion (RNA fragment) adjacent to the cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known ribozyme. "When the above double-stranded RNA or ribozyme is used as the prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the present invention relates to a DNA encoding an exogenous polypeptide of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DN A of the present invention) or a mutant DN A (sometimes abbreviated as exogenous mutant DNA of the present invention).
  • exogenous DN A of the present invention an exogenous polypeptide of the present invention
  • mutant DN A sometimes abbreviated as exogenous mutant DNA of the present invention
  • a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in mammals.
  • a non-human mammal having an exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof is an embryo cell containing an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a progenitor cell thereof.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method It can be produced by transferring the target DNA by the ribofusion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc.
  • the exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, living organs, tissue cells, etc. can be transferred and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • non-human mammals examples include ushi, pig, hidge, goat, usagi, inu, cat, guinea pig, hamster, mouse and rat.
  • rodents especially mice (for example, C57B LZ6 strain, DBA 2 strain, etc.
  • Preferred hybrids include B 6 C 3 F 1 strain, BDF 1 strain, B 6D 2 F 1 strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rats (eg Wi star, SD, etc.).
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal, not the DNA of the present invention inherently possessed by non-human mammals.
  • the mutated DNA of the present invention the base sequence of the original DNA of the present invention has been mutated (for example, mutation, etc.), specifically, addition of a base, deletion, replacement with another base Such as DNA is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal polypeptide of the present invention.
  • a polypeptide that suppresses the function of a normal polypeptide of the present invention is expressed.
  • the DNA to be expressed is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be of the same or different species as the target animal (mammalian origin.
  • the target animal mammalian origin.
  • it is generally advantageous to use it as a DNA construct bound downstream of a promoter capable of expressing DNA in animal cells, for example, when the human DNA of the present invention is transferred, the DN A of the present invention having high homology with this.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention by microinjecting a construct (eg, vector, etc.) into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. Can produce dairy animals.
  • Examples of the expression vector for the polypeptide of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, retroviruses such as phages, retroviruses such as Moroni-leukemia quinoles, vaccinia winores. Or animal viruses such as baculovirus are used. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, or plasmids derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate DNA expression include: 1) Promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegaloinoles, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), 2 ) Promoters from various mammals (eg, human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase , Glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor i3, keratin Kl, 1:10 and 1 ⁇ 14, collagen types I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase j3 I subunit Gistrophy Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor thioc
  • the vector preferably has a sequence (generally called terminator 1) that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • terminator 1 a sequence that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • each vector derived from viruses and various mammals A sequence can be used, and a SV40 terminator of simian virus is preferably used.
  • the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. 5 upstream from promoter region, between promoter region and translation region It is possible to connect 3 'downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the polypeptide of the present invention includes human lupus, kidney, thyroid cells, and fibers derived from humans or various mammals (for example, rabbits, dogs, cats, peaches, hamsters, rats, mice, etc.).
  • a raw material use DNA derived from blast cells and commercially available genomic DNA libraries as a whole or part of genomic DN ⁇ , or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblast-derived RNA. Can be acquired.
  • exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal polypeptide translation region obtained from the cells or tissues described above by point mutagenesis.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by a normal DNA engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
  • the transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • Production after DN A metastasis The presence of the exogenous DNA of the present invention in a product germ cell means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has been confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and can be subcultured in a normal breeding environment as the 'DNA-bearing animal. Can be raised.
  • exogenous DNA of the present invention is transferred at the fertilized egg cell stage to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the embryo cells of the produced animal after DNA transfer. All of the progeny of the produced animal have excess of the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. It means having. Descendants of this type of animal that have inherited the foreign DNA of the present invention have an excess of the foreign DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high expression of the normal DNA of the present invention, and finally promotes the function of the endogenous normal DNA, thereby finally accelerating the function of the polynucleotide of the present invention.
  • Peptide hyperfunction may occur and can be used as a model animal for the pathophysiology. For example, by using the normal DNA-transferred animal of the present invention, elucidation of the pathologic mechanism of the hyperfunction of the polypeptide of the present invention or the disease associated with the polypeptide of the present invention. It is possible to examine treatment methods.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred since the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the polypeptide of the present invention, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases related to the polypeptide of the present invention. It can also be used for screening tests.
  • a mammal into which a foreign DNA encoding the polypeptide A 1 of the present invention hereinafter abbreviated as the exogenous DNA (A 1) of the present invention
  • the exogenous DNA (A 1) of the present invention is Since it has an increased symptom, it can also be used in screening tests for prophylactic / therapeutic agents for diseases associated with the polypeptide A1 of the present invention (eg, hypertension, anorexia, climacteric disorder, insomnia, etc.).
  • a mammal to which a DNA encoding the exogenous polypeptide A 2 of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DNA (A 2) of the present invention) is transferred, Since it has an increased symptom of the polypeptide A.2 of the present invention, it is possible to prevent or prevent diseases associated with the polypeptide A2 of the present invention (eg, infertility, thyroid dysfunction). Also available.
  • a mammal to which a DNA encoding the exogenous polypeptide B of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DNA NA (B) of the present invention) is transferred is an increased symptom of the polypeptide B ′ of the present invention. Therefore, it can also be used in screening tests for prophylactic / therapeutic agents for diseases related to the polypeptide B of the present invention (eg, infertility, thyroid dysfunction, etc.).
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. I can do it.
  • the target exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germ cell of the produced animal after the transfer of DNA means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high expression of the abnormal DNA of the present invention, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA, thereby finally inhibiting the polypeptide of the present invention. It may become a functional inactive refractory of peptide, and can be used as a disease model animal. For example, it is possible to elucidate the pathologic mechanism of the functional inactive refractory disease of the polypeptide of the present invention and to examine a treatment method for this disease using the abnormal DNA transfer animal of the present invention.
  • an animal with high abnormal DNA expression according to the present invention is a normal one due to the abnormal polypeptide according to the present invention in the mechanism inactive refractory of the polypeptide according to the present invention. It is a model to elucidate the functional inhibition (dominant negative action) of polypeptides.
  • a mammal to which the exogenous abnormal DNA of the present invention has been transferred may be a polypeptide of the present invention. Since it has a symptom of inactive function of tide, it can also be used in screening tests for prophylactic / therapeutic agents for the functional inactive refractory condition of the polypeptide of the present invention.
  • exogenous abnormal DNA NA (A 1) of the present invention a mammal to which an abnormal DNA DNA encoding the exogenous polypeptide A 1 of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous abnormal DNA NA (A 1) of the present invention) has been transferred is Since the polypeptide A of the present invention has functionally inactive symptoms, the polypeptide A1 of the present invention has a functionally inactive refractory disease (eg, hypotension, obesity, lethargy, time-band change syndrome, infertility) It can also be used in screening tests for preventive / therapeutic agents.
  • a functionally inactive refractory disease eg, hypotension, obesity, lethargy, time-band change syndrome, infertility
  • a mammal having transferred a DNA abnormality DNA encoding the exogenous polypeptide A2 of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous abnormality DNA (A 2) of the present invention) is a mammal of the present invention. Since the polypeptide A 2 of the present invention has an incapable symptom of functional inactivation, the preventive / therapeutic agent for the functional inactive refractory of the polypeptide A 2 of the present invention (eg, climacteric disorder, hyperthyroidism, etc.) It can also be used for screening tests.
  • the preventive / therapeutic agent for the functional inactive refractory of the polypeptide A 2 of the present invention eg, climacteric disorder, hyperthyroidism, etc. It can also be used for screening tests.
  • a mammal having transferred an abnormal DNA DNA (hereinafter abbreviated as an exogenous abnormal DNA (B) of the present invention) used for the exogenous polypeptide B of the present invention is a function of the polypeptide B of the present invention. Because it has inactive inability symptoms, it is also used in screening tests for prophylactic / therapeutic agents for the functional inactive refractory of the polypeptide B of the present invention (eg, climacteric disorder, hyperthyroidism, etc.) Is possible. .
  • each organ is taken out of the DN-metastasized animal of the present invention, and after minced, free DNA-transferred cells are obtained and cultured or the cultured cells are organized by using a polypeptide-degrading enzyme such as trypsin. It is possible. Furthermore, the polypeptide-producing cell of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them can be investigated, and their abnormality can be investigated. It becomes an effective research material for elucidating its action.
  • a therapeutic agent for a disease related to the polypeptide of the present invention including the functionally inactive type refractory of the polypeptide of the present invention
  • using the DNA-transferred animal of the present invention it is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic drug for the disease by using the above-described test method and quantitative method.
  • using the DNA transfer product of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with the polypeptide of the present invention. is there.
  • the present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated, and the non-human mammal deficient in the expression of DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, E. coli-derived] 3-galactosidase gene), and the reporter gene can be expressed under the control of the promoter for DNA of the present invention.
  • a reporter gene eg, E. coli-derived] 3-galactosidase gene
  • a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity against DNA of the present invention comprising administering a test compound to the animal described in item 7) and detecting the expression of a reporter gene.
  • the non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated suppresses the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal. Or by substantially losing the activity of the polypeptide A of the present invention encoded by the DNA, DN A does not substantially have the ability to express the polypeptide A of the present invention (hereinafter referred to as “a”).
  • the term “knockout DNA of the present invention” refers to embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells) of non-human mammals.
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • a part or all of the DNA sequence can be deleted by genetic engineering techniques, or another DNA can be inserted or replaced.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the codon reading frame or destroying the function of the promoter or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, A DNA of the present invention possessed by a non-human mammal, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or 1 ac Z (—galactosidase gene)
  • a DNA of the present invention possessed by a non-human mammal and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or 1 ac Z (—galactosidase gene)
  • the ability to disrupt the function of an essen by inserting a reporter gene or the like represented by cat (chloramphenicol acetyl transferase gene), or a DNA sequence that terminates transcription of the gene in the intron between exons (for example, , Poly A addition signal, etc.), resulting in the inability to synthesize complete mRNA, resulting in
  • the original ES cell for inactivating the DNA of the present invention by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or the known Evans and Kaufman method may be used.
  • a newly established one may be used.
  • 129 ES cells are generally used at present, but the immunological background is unclear, so an alternative purely immunologically genetic background
  • C57BLZ6 mice or BDF 1 mice C 57 B LZ6 and DB A / 2, which were improved by crossing with 1382)
  • the one established using F1 can be used well.
  • BDF1 mice have the advantage of having a large number of eggs collected and strong eggs, and because C57B LZ6 mice are used as background, ES cells obtained using these have created pathological model mice. In some cases, it can be advantageously used in that the genetic background can be changed to C57BLZ6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice.
  • blastocysts at the 3.5th day after fertilization are generally used, but in addition to this, an 8-cell embryo is collected and cultured to the blastocyst for efficient use. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras.
  • One example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • Initial selection of ES cells in the initial stage can be performed by male / female discrimination, and male cells can be selected at an early stage.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative, but it tends to lose its ability to develop on its own, so it needs to be subcultured carefully.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001 -0. 5% trypsin solution 0. 0%
  • cultured at about 37 ° C in 5% oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air 1 to 5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin / ImM EDTA
  • Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, cells should be observed, and if morphologically abnormal cells are found, the cultured cells should be discarded.
  • ES cells can be cultured in various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell agglomeration is formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings ⁇ Ob ⁇ National ⁇ Academy ⁇ Ob 'Science US roc . Natl. Acad. Sci.
  • the DNA expression-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful in the cell biological examination of the polypeptide A of the present invention in the in vitro mouth.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly.
  • non-human mammal As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention for example, introduces the targeting vector prepared as described above into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and inactivates the DNA of the targeting vector of the present invention by introduction.
  • DNA sequence on the chromosome of mouse embryonic stem cell or mouse egg cell by gene homologous recombination
  • the DNA of the present invention can be knocked out.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out are used as a targeting vector and a Southern hybridization analysis using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe or a DNA sequence on a targeting vector. It can be determined by analysis by PCR using primers derived from the DNA sequences in the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse.
  • a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated is cloned by gene homologous recombination, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both normal cells having the DNA locus of the present invention and artificially altered cells having the DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It is obtained by selecting an individual composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by determining the coat color.
  • the individual thus obtained is usually an individual who is deficient in the heterogeneous expression of the polypeptide A of the present invention.
  • an individual who is deficient in homoexpression of the receptor protein of the present invention can be obtained.
  • transgenic non-human mammals into which the targeting vector has been introduced into the chromosome can be obtained by injecting the DNA solution into the nucleus of the egg cell using the microinjection method. Compared to non-human mammals, it can be obtained by selecting those having mutations in the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
  • an individual in which the DNA of the present invention is knocked out should be subcultured in a normal breeding environment after confirming that the animal obtained by mating has also been knocked out. Can do.
  • germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, by mating male and female animals possessing the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained. The resulting homozygous animals are one normal individual and multiple homozygous goats relative to the mother animal. It can be efficiently obtained by rearing in a state. By breeding male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged. .
  • the non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is very useful for producing the non-human mammal having a dna expression deficiency of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the polypeptide A of the present invention
  • the biological activity of the polypeptide A of the present invention is inactive. It can be used as a model for diseases caused by aging, and is useful for investigating the causes of these diseases and for examining treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for compounds having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and observing and measuring changes in the animal, wherein the DNA of the present invention is deficient or damaged.
  • a screening method for a compound having a therapeutic / preventive effect or a salt thereof against a disease caused by the above is provided.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. It may be a novel compound or a known compound.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are indicated.
  • a test compound the therapeutic / preventive effect can be tested.
  • test compound for example, oral administration and intravenous injection are used, and can be appropriately selected according to the symptom of the test animal, the nature of the test compound, and the like.
  • dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the nature of the test compound, and the like.
  • a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention in which DNA encoding the polypeptide A1 of the present invention is inactivated obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity) Hyperinsulin obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic hypertrophy, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, diet Obesity, hypogonadism obesity, systemic mastocytosis, simple obesity, moderate obesity, etc.), hyperphagia, etc.
  • the non-human mammal with deficient expression of DNA of the invention is subjected to glucose tolerance treatment, the test compound is administered before or after the glucose tolerance treatment, and blood glucose level and body weight change of the animal are measured over time. .
  • the blood glucose level of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect against the above-mentioned diseases.
  • prolactin secretion deficiency eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle
  • the test compound is administered to the non-human mammal with dna expression deficiency of the present invention.
  • prolactin secretion failure eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, climacteric disorder, etc.
  • the blood prolactin concentration of the test animal is increased by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect against the above-mentioned diseases.
  • prolactin secretion deficiency eg, ovarian hypofunction, seminal vesicles
  • the test compound is administered to the non-human mammal with dna expression deficiency of the present invention.
  • Non-administration group and prolactin secretion failure eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, menopause
  • thyroid Observe the difference in the degree of onset of hyperfunction and the difference in blood prolactin concentration over time.
  • the blood prolactin concentration of the test animal is increased by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect against the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect on diseases caused by deletion or damage of the polypeptide A of the present invention. Therefore, it can be used as a medicine such as a safe and low-toxic treatment / prevention agent for the disease. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained in the above screen can also be used.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and as a salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid, etc.) or a base (eg, alkali metal, etc.) And the like, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid). And salts with succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid.
  • succinic acid tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing the polypeptide A of the present invention.
  • the preparations thus obtained are safe and low toxic.
  • humans or other mammals eg rats, mice, guinea pigs, rabbits, ledges, pigs, tusks, horses, cats
  • the dose of the compound or its salt varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound is administered orally, it is generally obese in adults (with a body weight of 60 kg).
  • the compound is administered at a dose of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the subject disease, etc.
  • the compound is usually administered in the form of an injection for obesity in adults (60 kg).
  • about 0.0 1 to 3 of the compound per day It is convenient to administer about Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the present invention promotes or inhibits activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and detecting the expression of a reporter gene.
  • a method for screening a compound or a salt thereof is provided.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention includes the above-described non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention by introducing the reporter gene into the DNA of the present invention. Those inactivated and capable of expressing the reporter gene under the control of the promoter for DNA of the present invention are used.
  • test compound examples are the same as described above.
  • reporter gene the same ones as described above are used, and i3-galactosidase gene (1acZ), soluble alkaline phosphatase gene, luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene is present under the control of a promoter for the DNA of the present invention, so that the expression of the substance encoded by the reporter gene is expressed. By tracing, promoter activity can be detected.
  • the expression of the polypeptide A of the present invention is essentially performed.
  • 3-galactosidase is expressed instead of polypeptide A of the present invention.
  • a reagent that is a substrate for / 3-galactosidase such as 5_bromo-4-chloro-mouth-3 fndolyl i3-galactopyranoside (X-ga 1)
  • X-ga 1 5_bromo-4-chloro-mouth-3 fndolyl i3-galactopyranoside
  • the polypeptide A-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartal aldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga 1 staining solution. After reacting at room temperature or around 37 ° C for about 30 minutes to 1 hour, wash the tissue specimen with 1m MEDTA / PBS solution to stop the i3_galactosidase reaction and observe the coloration. Good.
  • mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the above test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and as a salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) etc.
  • physiologically acceptable acid addition salts are preferred.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid).
  • the compound or its salt that promotes the promoter activity for DNA encoding the polypeptide A1 of the present invention can promote the expression of the polypeptide A1 of the present invention and promote the function of the peptide.
  • hypotension obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary hypertrophy, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, Hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hypogonadism obesity, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.), hyperphagia, sleep disorder [Eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition modulation due to three shifts, time zone change syndrome, etc.)], lethargy, infertility, seasonal depression, reproductive dysfunction, endocrine Disease, Human dementia, Alzheimer's disease, various disorders associated with aging, cerebral circulation disorder (eg, stroke), head injury, spinal cord injury, epilepsy, anxiety, depression
  • a compound or a salt thereof that promotes the promoter activity for DNA encoding the polypeptide A2 of the present invention can promote the expression of the polypeptide A2 of the present invention and promote the function of the peptide. So, for example, prolactin secretion insufficiency (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder etc.), hyperthyroidism, etc. It is useful as a medicine for prevention and treatment. '
  • the compound or the salt thereof that promotes the promoter activity for DNA encoding the polypeptide B of the present invention can promote the expression of the polypeptide B of the present invention and promote the function of the peptide,
  • it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for prolactin secretion failure (eg, hypoovulation, seminal vesicle growth failure, climacteric disorder, etc.) and hyperthyroidism.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity for DNA encoding the polypeptide A 1 ′ of the present invention inhibits the expression of the polypeptide A 1 of the present invention and inhibits the function of the peptide.
  • Safe and low-toxic prevention such as hypertension, anorexia, climacteric disorder, insomnia, immune / inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, etc.) ⁇ Useful as pharmaceuticals such as therapeutic agents.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity for DNA encoding the polypeptide A2 of the present invention inhibits the expression of the polypeptide A2 of the present invention and inhibits the function of the peptide.
  • pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, autoimmune diseases, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari 'Flommel syndrome, Argon' Safe and low-toxic preventive / therapeutic agents (preferably inhibitors of prolactin production) such as Del Casti mouth syndrome, Forbes 'Albright' syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis, and thyroid dysfunction It is useful as a pharmaceutical.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity for DNA encoding the polypeptide B of the present invention can inhibit the expression of the polypeptide B of the present invention and inhibit the function of the peptide,
  • pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, autoimmune diseases, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argon del Castello syndrome For It is useful as a medicine for safe and low-toxic preventive / therapeutic agents (preferably prolactin production inhibitors) such as Beth-Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis abnormality, and thyroid dysfunction.
  • a medicament containing a compound obtained by the screening method or a salt thereof is It can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the polypeptide A of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • humans or other mammals eg rats, mice, guinea pigs, rabbits, ledges, pigs, tusks, horses, cats, Inu, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc., for example, when a compound that promotes promoter activity against DNA of the present invention is administered orally, it is generally an adult.
  • the compound is administered about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc.
  • the compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection.
  • the compound When administered to obese patients (as 60 kg), the compound is about 0.01-3 Omg, preferably about 0.1-2 Omg, more preferably about 0.1-1 Omg per day. Is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • a compound that inhibits the promoter activity against DNA of the present invention when administered parenterally, the compound is about 0.1 per day. ⁇ 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc.
  • the compound that inhibits the promoter activity against DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection.
  • the compound When administered to anorexic patients (as 6 O kg), the compound is about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. Is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the cause or prevention / treatment of various diseases caused by deficient DNA expression.
  • DNA containing the promoter region of the polypeptide of the present invention If genes that encode various proteins are linked downstream and injected into egg cells of an animal to create a so-called transgenic animal (transgenic animal), the polypeptide is specifically synthesized. It is also possible to study the action in the living body. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter part and a cell line that expresses it is established, the production of the protein of the present invention itself in the body can be specifically promoted or suppressed. It can be used as a search system for molecular compounds. In the present specification and drawings, when bases, amino acids, etc.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • Y Thymine or cytosine
  • N Thymine, cytosine, adenine or guanine
  • R adenine or guanine
  • RNA Ribonucleic acid
  • mRNA Messenger ribonucleic acid
  • ATP Adenosine triphosphate
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • PAM phenylacetamide methyl Substituents, protecting groups and reagents frequently used in this specification are indicated by the following symbols. ⁇ O s: P—tonoreens nore phoninore
  • NMP N-methylpyrrolidone SEQ ID No. in the sequence listing in the present specification indicates the following sequence.
  • 1 shows the amino acid sequence of rat nieuromezin S.
  • the amino acid sequence of human euromedin S precursor protein is shown.
  • 1 shows the amino acid sequence of rat niuromedin S precursor protein.
  • 1 shows the amino acid sequence of rat nieuromezin S N-terminal peptide 1 37.
  • the nucleotide sequence of DN A encoding rat niuromedin S is shown.
  • Mouse neuromedin SN terminal peptide Peptide shows the nucleotide sequence of DNA encoded by 37 k.
  • rat TGR1 The amino acid sequence of rat TGR1 is shown.
  • the nucleotide sequence of DN A coding for rat TG R 1 is shown.
  • Cius TGR 1 The amino acid sequence of Cius TGR 1 is shown.
  • ⁇ shows the amino acid sequence of FM-3.
  • [SEQ ID NO: 39] 1 shows the amino acid sequence of rat nieuromedin UN-terminal peptide 1-33.
  • 1 shows the amino acid sequence of rat niuromedin U N-terminal peptide 136.
  • 1 shows the amino acid sequence of mouse neuromedin U N-terminal peptide 1-33.
  • mouse neuromedin U N-terminal peptide-36 The amino acid sequence of mouse neuromedin U N-terminal peptide-36 is shown.
  • Example 11 shows the nucleotide sequence of the oligonucleotide used as a probe in i ns i t u h y b r i i d az t i o in Example 11 below.
  • Neuromedin S may be described as NMS, Neuromedin S N-terminal peptide as NSNP, and Neuromedin U N-terminal peptide as NUNP.
  • Example 1 Neuromedin S N-terminal peptide as NSNP, and Neuromedin U N-terminal peptide as NUNP.
  • the peptide sequence represented by this SEQ ID NO: 1 was converted to human euromedin S (human neuromedin S, sometimes referred to herein as human NMS).
  • the peptide sequences represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 are respectively referred to as human neuromedin SN terminal peptide-34 (human neuromedin SN-terminal peptide-34; herein, human NSNP-34).
  • human neuromedin SN terminal peptide-37 (sometimes referred to herein as human NSNP-37).
  • a rat whole brain-derived Marathon Ready cDNA (Kukuntech Co., Ltd.) is used as a saddle type, and Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) is used. Primer 3 (arrangement number: 4 6) and primer 4 self-row number: 4 7 PCR reaction was performed using. As a result, the base sequence shown in SEQ ID NO: 48 was obtained.
  • SEQ ID NO: 48 In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48, there was a translation frame from ATG as the start codon to TAG as the stop codon. The amino acid sequence of the protein translated from this translation frame is shown in SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 5 contains the Lys-Arg sequence (Rouille, Y. et al., Frontiers in
  • the peptide sequence represented by SEQ ID NO: 2 was named rat neuromedin S (rat neuromedin may be referred to as rat NMS in this specification).
  • the peptide sequences represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 are respectively ratniuromedin SN terminal pepnado-34, rat neuromedin SN-terminal peptide-34, and rat NSNP-34 in this specification.
  • Rat neuromedin SN terminal peptide-37 may be described as rat NSNP-37 in this specification).
  • SEQ ID NO: 51 In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51, there was a translation frame extending from the start codon ATG to the stop codon TAG. The amino acid sequence of the protein translated from this translation frame is shown in SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 6 includes Lys-Arg sequence (Roui lle, Y. et al., Frontiers in Neuroendocrinology, 16 ⁇ , 322, 1995), which is said to have a biologically active peptide cleaved from its precursor protein.
  • the presence of mosquitoes suggested that Asn, the amino acid at the carboxyl terminus of SEQ ID NO: 3, was an amide.
  • the peptide sequence represented by SEQ ID NO: 3 was named mouse neuromedin S (in this specification, sometimes referred to as mouse NMS).
  • the peptide sequences represented by SEQ ID NO: 1 1 and SEQ ID NO: 1 2 are respectively represented as mouse neuromedin SN terminal peptide-34 (mouse NSNP-34 in this specification).
  • mouse neuromedin SN terminal peptide-37 also referred to as mouse NSNP-37 in this specification.
  • NMS is an endogenous ligand for FM-3 or TGR1.
  • Rat NMS prepared by the method described in Example 14 was dissolved in 10 il of physiological saline and administered to the lateral ventricle through a catheter.
  • S was administered at 18:00, and food intake was measured between 19:00 and 7:00.
  • NMS was administered to 14-hour fasted rats at 9:00, and food intake was measured for 2 hours immediately after that.
  • NMS significantly suppressed long-term food intake in a dose-dependent manner, and the effect was greatest at lnmol.
  • NMS significantly suppressed food intake at 0.5 nraol.
  • NMS cDNA was used for standard curve generation.
  • rat GAPDH mRNA expression level was measured and used as an internal standard.
  • rat NMS mRNA was strongly expressed in the central nervous system, spleen, and testis, and at low levels in the pituitary and small intestine. In the central nervous system, it was particularly strongly expressed in the hypothalamus, and it was almost specifically expressed in the suprachiasmatic nucleus.
  • Example 1 1
  • 35 S-labeled oligonucleotide probe (5'-TGAGGAGGGGATCTGTAGCATACAGAAGCA- 3 ′) (SEQ ID NO: 5 4) was used for in situ hybridization. After washing, it was developed by autoradiography. Radioactivity was determined using MCID imaging analyzer (Imaging Research) 3 ⁇ 4r, 14 C as a standard. As a result, we analyzed the expression site of NMS in coronal and sagittal slices using whole rat brain, and found specific expression in the suprachiasmatic nucleus. Matched. Rat NMS mRNA expression was observed in the ventrolateral region of the suprachiasmatic nucleus.
  • the expression rhythm of NMS was quantitatively analyzed.
  • the rats bred under clear conditions showed an expression rhythm of NMS that was strongest with ZT11 and weakened with ZT17 (Zeitgeber time, ⁇ ; ⁇ 0, (Tone on; ⁇ 12, Light off).
  • this expression rhythm disappeared in rats grown for 2 days under constant conditions.
  • Intranuclear administration to the suprachiasmatic nucleus was performed by improving the method of Piggins et al. (Piggins, HD et al., J. Neurosci., 15 ⁇ , 5612, 1995). Rats were kept free of movement under constant conditions for 2 weeks. Each rat then had a 26-gauge stainless steel guide cannula 1 ⁇ l / -3 ⁇ 4r Paxinos and tfatson (Paxinos, and Watson, C., The rat brain in stereotaxic coordinates Academic Press, New York LA, 1998) Attached to reach the suprachiasmatic nucleus according to the coordinates.
  • Rat NMS prepared by the method described in Example 14 was dissolved in ⁇ physiological saline and inserted 1 wake below the end of the guide cannula using a 31 gauge stainless steel injector. Administered. Spontaneous exercise was recorded according to the method of Nakahara et al. (Nakahara, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 318, 156, 156, 2004) for 2 weeks before and after administration. did. The exact force nucleus position was confirmed by histological analysis at the end of the experiment as follows. The rat was decapitated after 1 ⁇ 1 India ink was administered to the rat to mark the administration position.
  • c-Fos protein (a neuronal activation marker) expression increased in the suprachiasmatic nucleus after intracerebroventricular administration of NMS, compared to control rats receiving saline. c-Fos protein was specifically expressed in the ventrolateral part of the suprachiasmatic nucleus.
  • NMS was administered directly to the suprachiasmatic nucleus by microinjection.
  • NMS administered into the nucleus caused phase advance and delay in the circadian rhythm of locomotor activity in CT6 and CT23, respectively, as in the case of ventricular fistula administration. Saline administration had no effect. These data suggested that endogenous NMS has a strong effect on the function of the suprachiasmatic nucleus via the receptor.
  • Example 14 After administration of rat NUNP-36 or rat NSNP-37 prepared in the method described in 4 and dissolved in physiological saline, blood was decapitated in 20 minutes, or after peptide administration, each time from the tail vein Blood was collected. Prolactin was measured using RIA kit (Araersham). In addition, the The contact effect was examined. Anterior pituitary cells were prepared from Wistar rats (5-week-old male), cultured in 96-well plates (5.0 ⁇ 10 4 cells / well) for 2 days, and used for experiments. After the addition of rat NUNP-36 or rat NSNP-37, the culture supernatant was collected 30 minutes later, and the prolactin concentration was measured.
  • rat NUNP-36 Blood was collected 20 minutes after central administration of rat NUNP-36 or rat NSNP-37, and blood hormone levels were measured. As a result, rat NUNP-36 was administered with saline, whereas blood prolactin concentration significantly increased. (Saline, 7.35 soil 1.53 ng / ml; NUNP lnmol, 68.74 soil 10.4 ng / ml). Rat NSNP-37 also had a weak but significant increase (27.34, 5.63 ng / ml).
  • Example 14 Rat NMS 1 nmol prepared by the method described in 4 and dissolved in physiological saline was administered centrally, and blood hormone levels were measured. As a result, the NMS administration group was compared to the saline administration group. The blood prolactin concentration was significantly decreased (saline, 13.1 ⁇ 1.8 ng / ral; NMS lnmol, 3.6 soil 1.2 ng / ml, p 0.0001). NMS has been shown to suppress prolactin secretion by central administration. Industrial applicability
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 0, SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 1 2 is identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 2
  • a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the above polypeptide or a partial peptide thereof and
  • a compound or its salt that promotes the activity of its partial peptide or its salt has a prolactin secretion action and is useful for the prevention and treatment of, for example, climacteric disorder and hyperthyroidism.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by 5 or its partial peptide or a salt thereof is, for example, hypotension, obesity, lethargy, time-zone change syndrome, infertility , High blood pressure, anorexia, are useful for the screening of prevention * Osam
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1 0, SEQ ID NO: 1 1 or SEQ ID NO: 1 2 is identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 2
  • Polypeptides or partial peptides thereof or salts thereof are useful for screening prophylactic / therapeutic agents such as menopause, hyperthyroidism, infertility, and thyroid dysfunction. is there.
  • a polypeptide containing substantially the same amino acid sequence or a partial peptide or salt thereof can be used, for example, for the prevention and treatment of climacteric disorder, hyperthyroidism, infertility, and thyroid dysfunction. Useful.

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Abstract

本発明は種々の有用なポリペプチドなどを提供するもので、特に、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミド体またはその塩は、低血圧症の予防・治療剤；肥満症、摂食亢進症などの予防・治療剤；嗜眠症、時間帯域変化症候群（時差ボケ）などの予防・治療剤；不妊症の予防・治療剤などとして利用することができる。また、配列番号：７～１２及び３７～４２のいずれかの配列で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば更年期障害、甲状腺機能亢進症の予防・治療剤として、上記ポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば不妊症または甲状腺機能不全症の予防・治療剤として有用である。

Description

明細書
新規ポリべプチドおよびその用途 技術分野
本発明は、 新規ポリペプチドまたはその塩、 これをコードするポリヌクレオチ ド、 これらの用途等に関する。 背景技術 .
ニューロメジン Uはラッ卜の子宮平滑筋収縮活性を指標とし、 ブタの脊髄より 単離 '精製されたペプチドで、 8アミノ酸残基からなるニューロメジン U— 8お よび 2 5アミノ酸残基からなるニューロメジン U— 2 5の 2種が最初に報告され ている (Mmamino, N. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 130, 1078-10 85, 1985) 。 ニューロメジン U- 8の配列はニューロメジン U _ 2 5の C末端部 分に一致し、 その上流にはプロセッシングによって切断を受ける部位によく見ら れるような塩基性アミノ酸ペアが存在することから、 両者は共通の前駆体に由来 するものと考えられる。
平滑筋収縮作用の他にもニューロメジン Uの生理作用は広く知られており、 例 えば、 血圧上昇 （Minamino, N. et al. ) 、 内蔵の血流量の低下 （Sumi, S. et a 1. , Life Sci. 41, 1585-1590, 1987) 、 腸管におけるイオン輸送の調節 （Brown , D. R. and Quito, F. L. , Eur. J. Pharmacol. 155, 159-162, 1988) 、 皮下投 与後の A C T Hおよびそれに引き続くコルチコステロンの上昇 （Malendowicz, L . K. et al. , In Vivo, 7, 419-422， 1993) などが報告されている。 また、 これ までニューロメジン Uのレセプターとして、 T G R 1 (W0 01/57524) および F M— 3が報告されている （W0 00/02918) 。 発明の開示
現在、 低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群、 更年期障害、 甲状腺機 能亢進症、 不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療剤は幾らか知られている 力 より優れた低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群、 更年期障害、 甲 状腺機能亢進症、 不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療剤が望まれている 本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 TGR1 および FM— 3の内在性リガンドとして配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号 ： 3、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列番号 ： 11、 または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド を見出し、 これが特異的な細胞刺激活性を有することを見出した。 これらの知見 に基づいてさらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその アミ ド体またはその塩；
(2) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのァ ミ ド体またはその塩；
(3) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのァ ミ ド体またはその塩；
(4) 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのァ ミ ド体またはその塩；
(5) 上記 （1) 記載のポリペプチドの部分ペプチドもしくはそのアミ ド体また はその塩；
(6) 上記 （1) 記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(7) DN Aである上記 （6) 記載のポリヌクレオチド；
(8) 配列番号： 13、 配列番号： 14または配列番号： 15で表される塩基配 列を含有する上記 （7) 記載の DNA ;
(9) 上記 （6) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；
(10) 上記 （9) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体；
(11) 配列番号： 4、 配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリべプチドである上 記 （1) 記載のポリペプチドまたはそのアミ ド体またはその塩；
(12) 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそ の塩；
(13) 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその (14) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその
(15) 上記 （11) 記載のポリペプチドの部分ペプチドもしくはそのアミ ド体 またはその塩；
(16) 上記 （11) 記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードする ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(17) DNAである上記 （16) 記載のポリヌクレオチド；
(18) 配列番号： 16、 配列番号： 17または配列番号： 18で表される塩基 配列を含有する上記 （13) 記載の DNA；
(19) 上記 （16) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター； (20) 上記 （19) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体；
(21) 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列番 号： 11または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩；
(22) 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列番 号： 11または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドま たはその塩；
(23) 上記 （21) 記載のポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩； (24) 上記 （21) 記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有 するポリヌクレオチド；
(25) DNAである上記 （24) 記載のポリヌクレオチド；
(26) 配列番号： 19、 配列番号： 20、 配列番号： 21、 配列番号： 22、 配列番号： 23または配列番号： 24で表される塩基配列を含有する上記 （2 5) 記載の DNA；
(27) 上記 （24) 記載のポリヌクレオチドを含有する糸且換えベクター； (28) 上記 （27) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体； (29) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはその アミ ド体またはその塩を用いることを特徴とする、 該ポリペプチドの活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
(30) (i) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしく はそのアミ ド体またはその塩、 および （ii) 配列番号： 25、 配列番号： 27ま たは配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドまたはその塩を用いる上記
(29) 記載のスクリーニング方法；
(31) 配列番号： 25で表されるアミノ酸配列を含有.する蛋白質またはその部 分ペプチドまたはその塩を用いる上記 （30) 記載のスクリーニング方法；
(32) (i) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしく はそのアミ ド体またはその塩、 および （ii) 配列番号： 31、 配列番号： 33ま たは配列番号： 35で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドまたはその塩を用いる上記
(29) 記載のスクリーニング方法；
(33) 配列番号： 31で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部 分ペプチドまたはその塩を用いる上記 （32) 記載のスクリーニング方法；
(34) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはその アミ ド体またはその塩を含有することを特徴とする、 該ポリペプチドの活性を促 進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット ；
(35) さらに、 配列番号： 25、 配列番号： 27または配列番号： 29で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質 またはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記 （34) 記載のスクリー二 ング用キット ；
(36) さらに、 配列番号： 31、 配列番号： 33または配列番号： 35で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質 またはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記 （34) 記載のスクリー二 ング用キット ；
(37) 上記 （21) 記載のポリペプチドまたはその塩を用いることを特徴とす る、 該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー ニング方法； 、
(38) 上記 （21) 記載のポリペプチドまたはその塩を含有することを特徴と する、 該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ 一二ング用キット ；
(39) 上記 （1) または （1 1) 記載のポリペプチドもしくはその部分べプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩を含有してなる医薬；
(40) 上記 （6) または （16) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医
(41) 上記 （1) または上記 （1 1) 記載のポリペプチドもしくはその部分べ プチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩 を含有してなる医薬；
(42) 低血圧、 肥満症、 嗜眠症または時間帯域変化症候群の予防 ·治療剤であ る上記 （39) 〜 （41) 記載の医薬；
(43) 不妊 の予防 ·治療剤である上記 （39) 〜 （41) 記載の医薬； (44) 上記 （1) または上記 （1 1) 記載のポリペプチドもしくはその部分べ プチドもしぐはそのアミ ド体またはその塩の活性を促進することを特徴とする低 血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群または不妊症の予防 ·治療方法； (45) 哺乳動物に対し （i) 上記 （1) または上記 （1 1) 記載のポリべプチ ドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 （ii) 上記 (6) または上記 （16) 記載のポリヌクレオチド、 または （iii) 上記ポリべ プチドもしくはその部分べプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を促 進する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群または不妊症の予防 ·治療方法；
(46) 低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群または不妊症の予防 ·治 療剤の製造のための （i) 上記 （1) または上記 （1 1) 記載のポリペプチドも しくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 （ii) 上記 （6) または上記 （16) 記載のポリヌクレオチド、 または （iii) 上記ポリペプチド もしくはその部分べプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を促進する 化合物またはその塩の使用；
(47) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその 塩を含有してなる医薬；
(48) 上記 （24) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医藥；
(49) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその 塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬；
(50) 更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 ·治療剤である上記 （47) 〜 （49) のいずれかに記載の医薬； (51) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその 塩の活性を促進することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進症の予 防 ·治療方法；
(52) 哺乳動物に対し （i) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部 分ペプチドまたはその塩、 （ii) 上記 （24) 記載のポリヌクレオチド、 または
(iii) 上記ポリべプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進 する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする更年期障害または 甲状腺機能亢進症の予防 ·治療方法；
(53) 更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 ·治療剤の製造のための (i) 上記 （2 1) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩、
(ii) 上記 （24) 記載のポリヌクレオチド、 または （iii) 上記ポリペプチド もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の 使用；
(54) 上記 （1) または上記 （1 1) 記載のポリペプチドもしくはその部分べ プチドもしくはそのアミ ド体またはその塩に対する抗体；
(55) 上記 （54) 記載の抗体を含有してなる医薬；
(56) 上記 （54) 記載の抗体を含有してなる診断薬；
(57) 低血圧、 肥満症、 嗜眠症または時間帯域変化症候群の診断薬である上記
(56) 記載の診断薬；
(58) 不妊症の診断薬である上記 （56) 記載の診断薬；
(58 a) 高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症または免疫 ·炎症性疾患の診断 薬である上記 （56) 記載の診断薬；
(59) 上記 （6) または上記 （16) 記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相 補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセン スポリヌクレオチド；
(60) 上記 （59) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医 ¾；
(61) 上記 （1) または上記 （1 1) 記載のポリペプチドもしくはその部分べ プチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩 を含有してなる医薬；
(62) 高血圧、 拒食症または不眠症の予防 ·治療剤である上記 （55) 、 上記 (61) または上記 （61) 記載の医薬；
(63) 更年期障害の予防 ·治療剤である上記 （55) 、 上記 （60) または上 記 （61) 記載の医薬；
(64) 上記 （1) または上記 （1 1) 記載のポリペプチドもしくはその部分べ プチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を阻害することを特徴とする高 血圧、 拒食症、 更年期障害または不眠症の予防 ·治療方法；
(65) 哺乳動物に対し （i) 上記 （1) または上記 （1 1) 記載のポリべプチ ドもしくはその部分べプチドもしくはそのアミ.ド体またはその塩に対する抗体、
(ii) 上記 （6) または上記 （16) 記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補 的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンス ポリヌクレオチド、 または （iii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチド もしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効 量を投与することを特徴とする高血圧、 拒食症、 更年期障害または不眠症の予 防 ·治療方法； '
(66) 高血圧、 拒食症、 更年期障害または不眠症の予防 ·治療剤の製造のため の （i) 上記 （1).または上記 （1 1) 記載のポリペプチドもしくはその部分べ プチドもしくはそのアミ ド体またはその塩に対する抗体、 （ii) 上記 （6) また は上記 （16) 記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相 補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 ま たは （iii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体 またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用；
(67) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそ のアミ ド体またはその塩に対する抗体；
(68) 上記 （67) 記載の抗体を含有してなる医薬；
(69) 上記 （67) 記載の抗体を含有してなる診断薬；
(70) 不妊症または甲状腺機能不全症の診断薬である上記 （69) 記載の診断 薬； -
(70 a) 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害または甲状腺機能亢進症 の診断薬である上記 （69) 記載の診断薬；
(71) 上記 （24) 記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質 的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチ ド；
(72) 上記 （71) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医 ¾；
(73) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそ のアミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医 薬；
(74) 不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療剤である上記 （68) 、 上 記 （72) または上記 （73) 記載の医薬；
(75) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそ のアミ ド体またはその塩の活性を阻害することを特徴とする不妊症または甲状腺 機能不全症の予防 ·治療方法；
(76) 埔乳動物に対し （i) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部 分ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩に対する抗体、 （ii) 上記 （2 4 ) 記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基 配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または
(iii) 上記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそ のアミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与す ることを特徴とする不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療方法；
(77) 不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療剤の製造のための （i) 上 記 （21) 記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体 またはその塩に対する抗体、 （ii) 上記 （24) 記載のポリヌクレオチドの塩基 配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するァ ンチセンスポリヌクレオチド、 または （iii) 上記 （21) 記載のポリペプチド もしくはその部分べプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を阻害する 化合物またはその塩の使用；
(78) 外来性の、 上記 （6) 、 上記 （16) または上記 （24) 記載のポリヌ クレオチドを有する非ヒ トトランスジエニック動物；
(79) 外来性の、 上記 （6) 、 上記 （16) または上記 （24) 記載のポリヌ クレオチドを含有し、 非ヒ ト動物において発現しうる組換えベクター；
(80) 上記 （6) 、 上記 （16) または上記 （24) 記載のポリヌクレオチド が不活性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞； (81) 上記 （6) 、 上記 （16) または上記 （24) 記載のポリヌクレオチド が不活性化された、 該ポリヌクレオチド発現不全非ヒ ト哺乳動物；
(82) 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩を用いることを特徴とする、 該ポリべプチドの活性を促進または阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
(83) 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩を含有することを特徴とする、 該ポリべプチドの活性を促進または阻 害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット ；—
(84) 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる更年期障害また は甲状腺機能亢進症の予防 ·治療剤；
(85) 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を促進することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進 症の予防 ·治療方法；
(86) 哺乳動物に対し配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配 列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその 部分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を投与 することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 ·治療方法；
(87) 更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 ·治療剤の製造のための配列 番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 4 1または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩の 活性を促進する化合物またはその塩の使用；
(88) 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有.してなる不妊症または甲 状腺機能不全症の予防 ·治療剤；
(89) 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を阻害することを特徴とする不妊症または甲状腺機能不全症の 予防 ·治療方法；
(90) 哺乳動物に対し配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配 列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその 部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与 することを特徴とする不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療方法；
(91) 不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療剤の製造のための配列番 号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41 または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩の活 性を阻害する化合物またはその塩の使用等を提供する。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有 するポリペチドもしくはそのアミ ド体またはその塩を、 「 ユーロメジン SJ と 略称することがある。
配列番号： 7、 配列番号： 9、 または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列 を有するポリペチドもしくはそのアミ ド体またはその塩を、 「ニューロメジン S N末ペプチド一 34」 と略称することがある。
配列番号： 8、 配列番号： 10または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列 を有するポリペチドもしくはそのアミ ド体またはその塩を、 「ニューロメジン S N末ペプチド一 3 7」 と略称することがある。
配列番号： 4、 配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を有 するポリペチドもしくはそのアミ ド体またはその塩を、 「ニューロメジン S前駆 体」 と略称することがある。
配列番号： 3 7、 配列番号： 3 9またば配列番号： 4 1で表されるアミノ酸配 列を有するポリペチドもしくはそのアミ ド体またはその塩を、 「ニューロメジン U N末ペプチド一 3 3」 と略称することがある。
配列番号： 3 8、 配列番号： 4 0または配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配 列を有するポリペチドもしくはそのアミ ド体またはその塩を、 「ニューロメジン U N末ペプチド一 3 6」 と略称することがある。
配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配 列を有する蛋白質またはその塩を、 「T G R 1」 と略称することがある。
配列番号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配 列を有する蛋白質またはその塩を、 「F M— 3」 と略称することがある。
配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド （以下、 「本発明のポリべプチ KA」 と略称する場合がある） および配列番号： 3 7、 配列番号： 3 8、 配列番 号： 3 9、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 1または配列番号： 4 2で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド (以下、 「本発明のポリペプチド B」 と略称する場合がある） は、 例えば、 ヒ ト、 哺乳動物 （例えば、 モルモッ ト、 ラッ ト、 マウス、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サル、 ィヌ） などのあらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 J3細 胞、 滕臓ランゲルハンス島、 骨髄細胞、 .メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免 疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細 胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の 前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞 が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基 底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭 葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、.胃、 膝臓、 腎臓、 肝 臓、 .生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するポリペプチドであつ てもよく、 合成ペプチドであってもよい。
配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列としては、 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番 号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番 号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 1まだは配列番号： 1 2で表わされるァ ミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好 ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用いて計算することができる。
配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるァミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、 例えば、 前記の配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配 列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1り、 配列番号： 1 1ま たは配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有し、 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列を含有するポ リベプチドと実質的に同質の活性を有するポリべプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げちれる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜 2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やポリぺプ チドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に 準じて行なうことができるが、 例えば、 後述するスクリーニング方法などに従つ て測定することができる。
また、 本発明のポリペプチド Aとしては、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配 列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 3 0個程度、 好 ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠 失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列 番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番 号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミ ノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程 度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番 号： 1 0、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列中の 1 または 2個以上 （例えば 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好 ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配 列、 （iv) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番 号： 1 0、 配列番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列中の 1 または 2個以上 （例えば 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さら に好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配列、 または
(V) それらを組み合わせたァミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いら れる。
本発明のポリペプチド Aもしくはそのアミ ド体またはその塩の具体例としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミ ド 体またはその塩、 配列番号： 2で表されるァミノ ^配列を有するポリペプチドも しくはそのアミ ド体またはその塩、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 配列番号： 4で表されるァ ミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 配列番 号： 5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミ ド体また はその塩、 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは そのアミ ド体またはその塩、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有するポリ ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 配列番号： 8で表されるアミノ酸 配列を有するポリペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 配列番号： 9で 表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列 を有するポリべプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩などがあげられる。 本発明のポリペプチド Αの部分ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩と しては、 後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる.ものであれば、 いかなるものであってもよく、 本発明のポリぺプチド Aと実質的に同質の活性を 有していればよい。 該部分ペプチドのアミノ酸の数は、 本発明のポリペプチド A の構成ァミノ酸配列のうち少なくとも 5個以上、 好ましくは 1 0個以上、 好まし くは 1 5個以上、 好ましくは 2 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが あげられる。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2値以上 （好 ましくは数個 （1〜4個） ） のアミノ酸が欠失し、 （ii) 上記アミノ酸配列に 1 または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付カ卩し、 または （iii) 上記 アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは数個 （1〜4個） ） のアミノ酸 が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
以下、 本発明のポリペプチド Aとその部分ペプチドとをまとめて 「本発明のポ リペプチド A」 と称することがある。 配列番号： 3 7、 配列番号： 38、 配列番号： 3 9、 配列番号： 40、 配列番 号： 4 1または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列としては、 配列番号： 3 7、 配列番号： 38、 配列番号： 3 9、 配列番 号： 40、 配列番号： 4 1または配列番号： 42で表わされるアミノ酸配列と約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 ざらに好ましくは約 70%以上、 より好 ましくは約 80 %以上、 特に好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有するァミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用いて計算することができる。
配列番号： 3 7、 配列番号： 38、 配列番号： 3 9、 配列番号： 40、 配列番 号： 4 1または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するポリペプチドとしては、 例えば、 前記の配列番号： 3 7、 配列 番号： 38、 配列番号： 3 9、 配列番号： 40、 配列番号： 4 1または配列番 号： 42で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列 番号： 3 7、 配列番号： 38、 配列番号： 3 9、 配列番号： 40、 配列番号： 4 1または配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質 的に同質の活性を有するポリぺプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0. 0 1〜1 00倍、 好ましくは約 0. 5〜20倍、 より好まし くは約 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やポリぺプ チドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に 準じて行なうことができるが、 例えば、 後述するスクリーニング方法などに従つ て測定することができる。
また、 本発明のポリべプチ KBとしては、 （i) 配列番号： 3 7、 配列番号： 38、 配列番号： 3 9、 配列番号： 40、 配列番号： 4 1または配列番号： 42 で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 30個程度、 好まし くは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失し たァミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配 列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに 好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配 列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号 : 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例え ば 1〜30個程度、 好ましくは 1〜： L 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5 個） ） のァミノ酸が他のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41また は配列番号： 42で表されるァミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5 個） ） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせ たアミノ酸配列を含有するポリぺプチドなども用いられる。
本発明のポリぺプチド Bの具体例としては、 配列番号： 37で表されるァミノ 酸配列を有するポリべプチド、 配列番号： 38で表されるアミノ酸配列を有する ポリぺプチド、 配列番号： 39で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプチド、 配列番号： 40で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチド、 配列番号： 41 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 42で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明のポリペプチド Bの部分ペプチドとしては、 後述の医薬等のスクリー二 ング方法に用いることのできるものであれば、 いかなるものであってもよく、 本 発明のポリペプチド Bと実質的に同質の活性を有していればよい。 該部分べプチ ドのァミノ酸の数は、 本発明のポリぺプチド Bの構成ァミノ酸配刿のうち少なく とも 5個以上、 好ましくは 10個以上、 好ましくは 15個以上、 好ましくは 20 個以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどがあげられる。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は ±記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは数個 （1〜4個） ） のアミノ酸が欠失し、 （ii) 上記アミノ酸配列に 1 または 2個以上 （好ましくは、 1〜20個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましぐは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加し、 または （iii) 上記 アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは数個 （1〜4個） .） のアミノ酸 が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
以下、 本発明のポリペプチド Bとその部分ペプチドとをまとめて 「本発明のポ リペプチド B」 と称することがある。
さらに、 「本発明のポリペプチド A」 ど 「本発明のポリペプチド B」 とを、 ま とめて 「本発明のポリペプチド」 と称することもある。
配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 2 9、 配列番号： 3 1、 配列番 号： 3 3または配列番号： 3 5で表されるァミノ酸配列で表されるァミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩 （以下、 「本発明の蛋白質」 と略称することもある） は、 例えば、 ヒ トゃ哺乳動物 （例え ば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の あらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維 芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞な ど） や血球系の細胞 （例えば、 MEL、 Ml、 CTLL- 2、 HT- 2、 WEHI- 3、 HL- 60、 JOSK- 1、 K562、 ML- 1、 MOLT- 3、 MOLT- 4、 MOLT- 10、 CCRF- CEM、 TALL- 1、 Jurkat、 CCRT- HSB- 2、 KE- 37、 SKW- 3、 HUT- 78、 HUT- 102、 H9、 U937、 THP- 1、 HEL、 JK- 1、 CMK、 K0 -
812、 MEG-01 など） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋 など （特に、 脳や脳の各部位） に由来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白 質であってもよい。
配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 2 9、 配列番号： 3 1、 配列番 号： 3 3または配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列としては、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 2 9、 配列番 号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表わされるアミノ酸配列と約 50 %以上、 好ましくは約 60 %以上、 さらに好ましくは約 70 %以上、 より好 ましくは約 80 %以上、 特に好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
ァミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用いて計算することができる。
配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 29、 配列番号： 3 1、 配列番 号： 3 3または配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 前記の配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 2 9、 配列番号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5 で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 2 9、 配列番号： 3 1、 配列番号： 33または 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明のポリペプチドに対する結合活 性、 シグナル情報伝達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性 が性質的に同質であることを示す。 した力 sつて、 本発明のペプチドに対する結合 活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等 （例、 約 0. 5〜2倍） であるこ とが好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なつ ていてもよい。
結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方法に準じ て行なうことができる。
さらに、 本発明の蛋白質としては、 （i) 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 2 9、 配列番号： 3 1、 配列番号： 33または配列番号： 3 5で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好 ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸 が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 25、 配列番号： 2 7、 配列番号： 29、 配列番号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 35で表されるアミノ 酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付加したァ ミノ酸配列、 （i ii) 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 2 9、 配列 番号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程 度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換 されたアミノ酸配列、 または （iv) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有す る蛋白質なども用いられる。
本発明の蛋白質の具体例としては、、 例えば、 配列番号： 2 5で表されるァミノ 酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋 白質、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 3 1で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 3 3で表されるァミノ 酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列を含有する蛋 白質などがあげられる。
本発明の蛋白質の部分ペプチド （以下、 本発明の部分ペプチドと略記する場合 がある） としては、 前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れのもの であってもよいが、 例えば、 本発明の蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出して いる部位であって、 実質的に同質のリガンド結合活性を有するものなどが用いら れる。
具体例として、 本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロット解析 において細胞外領域 （親水性 （hydrophilic) 部位） であると分析された部分を 含むペプチドである。 また、 疎水性 （hydrophobic) .部位を一部に含むペプチド も同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得る 力 複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分べプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明の蛋白質の構成アミ ノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。 ここで、 「実質的に同質のリガンド結合活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同質のリガンド結合活性」 の測定は自体公知の方法に準じて行なうこ とができる。 また、 本発明の部分べプチドは、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番 号： 2 9、 配列番号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表されるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好まし くは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程 度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そ のアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ま しくは 1〜5個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他 のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドの塩と しては、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩として は、 例えば無機酸 （例、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有 機酸 （例、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石 酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホ ン酸） との塩などが用いられる。
本明細書におけるポリべプチドおよび本発明の蛋白質はべプチド標記の慣例に 従って左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列などを含有するポリペプチドは C 末端が通常カルボキシル基 （-C00H) またはカルボキシレート（-C00-)であるが、 C末端がアミ ド （_C0 H2) またはエステル（-C00R)であってもよい。 エステルの Rとしては、 例えばメチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n— プチルなどの C wアルキル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シ クロアルキル基、 フエニル、 α—ナフチルなどの C6— 12ァリール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒ ドリノレなどのフエ二ノレ一C wァノレキル、 もしくは α—ナ フチルメチルなどの α—ナフチル— C wアルキルなどの C7-147ラルキル基のほ 力 \ 経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル基などがあげられ る。
本発明のポリペプチド Aとしては C末端のカルボキシル基 （- C00H) がアミ ド (-C0NH2) であるものが好ましい。
本発明のポリペプチドおよび本発明の蛋白質 （本発明のポリペプチド ·蛋白 質） が C末端以^ Mこカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場 合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステル化されているものも本発明のポリ ペプチド '蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C 末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のポリペプチド ·蛋白質には、 上記したペプチド ·蛋白質にお いて、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセ チル基などの C 2.6アルカノィル基などの C wァシル基など） で保護されている もの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化し たもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例、 -0H、 - SH、 ァミノ基、 イミダ ゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミ ル基、 ァセチル基などの C2_6アルカノィル基などの C wァシル基など） で保護 されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺプチド ·糖蛋白質などの 複合べプチド ·複合蛋白質なども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が、 カルボキシル基 （- C00H) 、 カルボ キシレート （- C00- ) 、 アミ ド （_C0NH2) またはエステル （- C00R) であってもよ レ、。 本発明の部分ペプチドが C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレ ート） を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステル化されてい るものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例え ば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明の蛋白質と同様に、 N末 端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内 で切断され生成した G l nがピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の 側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合した いわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のポリペプチドもしくは本発明の蛋白質またはその塩は、 前述したヒ ト や哺乳動物の細胞または組織から自体公知のぺプチド ·蛋白質の精 方法によつ て製造することもできるし、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7、 配列番号： 2 9、 配列番号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列 を含有する蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによ つても製造することができる。 また、 後述のペプチド '蛋白質合成法またはこれ に準じて製造することもできる。
本発明のポリペプチドもしくは本発明の蛋白質またはその塩をヒ ト、 哺乳動物 などの組織または細胞から製造する場合、 ヒト、 ½乳動物などの組織または細胞 をホモジナイズした後、 酸、 有機溶媒などで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透 析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフ ィニティークロマトグラフィ一などのクロマトグラフィーを組み合わせることに より精製単離することができる。
上記したように本発明のポリぺプチドは、 公知のポリぺプチドの合成法に従つ て、 あるいは本発明のポリべプチドを含有するポリべプチドを適当なぺプチダー ゼで切断することによって製造することができる。 ポリペプチドの合成法として は、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明 のポリペプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合 させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のポリべ プチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、 以下の （1 ) 〜 （5 ) に記載された方法があげられる。
( 1 ) M. Bodanszky およぴ M. A. 0ndetti、 ペプチド シンセシス （Peptide Syntnesis) , Interscience Publishers, New York (1966年).；
( 2 ) Schroederおよび Luebke、 ザ ぺプナド (The Peptide) , Academic Press, New York (1965年） ；
( 3 ) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年） ；
( 4 ) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年） ；
( 5 ) 矢島治明監修、 続医薬品の開発 第.14卷.ペプチド合成 広川書店。
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のポリべ プチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる本発明のポリぺプチド が遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。 本発明のポリペプチドのアミ ド体は、 アミ ド形成に適した市販のペプチド合成 用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチノレ樹 脂、 ヒ ドロキシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4 _メチルベンズヒ ドリルアミン樹 月旨、 PAM樹脂、 4—ヒ ドロキシメチルメチルフエニルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹脂、 4— ( 2，， 4 ' -ジメ トキシフエ二ルーヒ ドロキシメチ ノレ） フエノキシ樹脂、 .4— ( 2 ' , 4， -ジメ トキシフエ二ルー Fmocアミノエチ ル） フエノキシ樹脂などをあげることができる。 このような樹脂を用い、 ひ一ァ ミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするぺプチドの配列通 りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から ポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 必要に応じて高希釈溶液 中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のポリペプチドを取得する。 上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ポリペプチド合成に使用でき る各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類がよい。 力 ルボジィミ ド類としては DCC、 Ν, Ν' -ジィソプロピルカルボジィミ ド、 Ν-ェチル- N' - (3-ジメチルァミノプロピル）カルポジイミ ドなどがあげられる。 これらによ る活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H0BT、 H00BTなど） とともに保護さ . れたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H0BTエステ ルあるいは H00BTエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行つ たのちに樹脂に添加することができる。 保護されたァミノ酸の活性化や樹脂との 縮合に用いられる溶媒としては、 ポリぺプチド縮合反応に使用しうることが知ら れている溶媒から適宜選択されうる。 たとえば Ν， Ν—ジメチルホルムアミ ド、 Ν， Ν—ジメチルァセトアミ ド、 Ν—メチルピロリ ドンなどの酸アミ ド類、 塩化 メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノール などのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンな どの三級アミン類、 ジォキサン、 テトラヒ ドロフランなどのエーテル類、 ァセト 二トリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどの エステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はぺプチ ド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常 約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は 通常 1 . 5ないし 4倍過剰で甩いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテストの結 果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すこ とにより十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得ら れないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸 をァセチルイ匕して、 後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 Boc、 ターシャリ ペンチルォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4—メ トキシべ ンジルォキシカルボニル、 CI- Z、 Br_Z、' ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフ ノレオロアセチノレ、 フタロイル、 ホルミル、 2 —二トロフエニルスノレフエ二ノレ、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどがあげられる。 カルボキシル基の保護 基としては、 たとえば Rとして上記した アルキル基、 C3_8シクロアルキル 基、 C7_14ァラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4 一二トロベンジル、 4ーメ トキシベンジル、 4—クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべンジルォキシカル ボニルヒ ドラジド、 ターシャリーブトキシカルボニルヒ ドラジド、 トリチルヒ ド ラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化に よって保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァセチ ル基などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキ シカルボニル基、 ェトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげ られる。 また、 エーテノレ化に適する基としては、 たとえばベンジル基、 テトラヒ ドロビラニル基、 ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば Bzl、 Cl2- Bzl、 2—ニトロベンジル、 Br- Z、 ターシャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 Tos、 4 -メ トキシ- 2, 3， 6-トリ メチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Trt、 Fmoc などがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペンタクロロフエノーノレ、 2, 4, 5-トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコー ノレ、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N -ヒ ドロキシスクシミ ド、 N-ヒ ドロキシフタ ルイミ ド、 H0BT) とのエステル] などがあげられる。 原料のァミノ基の活性化さ れたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミ ドなどがあげられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd黒あるいは Pd炭素などの触 媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスル ホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混 合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピ ペリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムに よる還元などもあげられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に一 2 0 °C〜 4 0 °Cの温度で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール、 チオア二 ソール、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフイ ド、 1, 4 -ブタンジ チオール、 1, 2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエ二 ル基はチオフェノール処理により除去され、 トリプトファンのィンドール保護基 として用いられるホルミル基は上記の 1， 2-エタンジチオール、 1, 4-ブタンジチ オールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム、 希アン モニァなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段か ら適宜選択しうる。
本発明のポリペプチドのアミ ド体を得る別の方法としては、 まず、 カルボキシ ル末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミ ド化した後、 アミノ基側にペプチド 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端のひ—アミノ基の保護基 のみを除いたぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺプチド (またはアミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混^^溶媒中で 縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた 保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗 ポリペプチドを得ることができる。 この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を 駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥す ¾ことで所望のポリペプチドのアミ ド体 を得ることができる。
本発明のポリべプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸の α— カルボキシル基を所望のアルコーノレ類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ポリ ペプチドのアミ ド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることが できる。
本発明のポリぺプチドの部分べプチドは、 本発明のポリぺプチドを適当なぺプ チダーゼで切断することによって製造することができるし、 上記のポリペプチド の合成法に従って製造することができる。 本発明のポリぺプチドの部分べプチド のアミ ドまたはエステルも上述のアミ ド体またはエステル体の製造方法に準じて 製造することができる。 さらに本発明のポリペプチドの部分ペプチドの塩として は、 上記の本発明のポリべプチドの塩と同様のものなどがあげられる。
該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、 たとえばその アミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸類から選ぶことができる。 非極性 （疎水 性） アミノ酸としては、 ァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 バリン、 プロリン、 フエ二ルァラニン、 トリブトファン、 メチォニンなど あげられる。 極性 （中 '性） アミノ酸としてはグリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなどがあげられる。 陽電荷をもつ （塩基性） アミノ酸 としてはアルギニン、 リジン、 ヒスチジンなどがあげられる。 負電荷をもつ （酸 性） アミノ酸としては、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸などがあげられる。
本発明のポリペプチド、 上記 （1) 記載の部分ペプチドまたは上記 （2) 記載 のぺプチドが標識化されたものとしては、 公知の方法で、 アイソトープラベル化 されたもの、 蛍光標識されたもの （例えば、 フルォレセインなどによる蛍光標 識） 、 ピオチン化されたもの、 酵素標識されたものなどがあげられる。
具体的には、 例えば公知の方法によって、 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35 S〕 などで標識された本発明のポリペプチドなどを利用することができる。
本発明のポリべプチドまたは本発明の蛋白質をコードする DNAとしては、 配 列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列 番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列 番号： 1 1、 配列番号： 1 2、 配列番号： 25、 配列番号： 27、 配列番号： 2 9、 配列番号： 31、 配列番号： 33、 または配列番号： 35で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプチドをコ一 ドする DNAを含有する DNAであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲ ノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した組織 ·細胞由来の c DNA、 前記した組織 ·細胞由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよレ、。 ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 前記した組織'細胞より RNA 画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T-P C R法と略称する）によって増幅することもできる。
(DNAのクローニング）
本発明のポリべプチドまたは本発明の蛋白質をコードする DNAは以下の遺伝 子工学的手法によっても製造することができる。 本発明のポリべプチドまたは本発明の蛋白質を完全にコードする DNAのクロ 一ユングの手段としては、 本発明のポリべプチドまたは本発明の蛋白質の部分塩 基配列を有する合成 DN Aプライマーを fflいて公知の PC R法によって前記 DN Aライブラリ一等から目的とする DNAを増幅する方法、 または適当なベクター に組み込んだ DNAを本発明のポリぺプヂドまたは本発明の蛋白質をコードする 塩基配列の一部あるいは全領域を有する DNA断片もしくは合成 DNAを用いて 標識したものとのハイブリダィゼーシヨンによつて選別する方法があげられる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sarabrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに 従って行われる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書 に記載の方法に従って行う。 より好ましくは、 ハイストリンジヱントな条件に従 つて行なうことができる。 該ハイストリンジヱントな条件とは、 例えば、 ナトリ ゥム濃度が約 19〜4 OmM、 好ましくは約 19〜2 OmMで、 温度が約 50〜 70°C、 好ましくは約 60〜65°Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 65 °Cの場合が最も好ましい。
DN Aの塩基配列の変換は、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LA PCR法や Gapped duplex法や Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従 つて行なうことができる。
クローン化された本発明のポリべプチドまたは本発明の蛋白質をコードする D NAは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一 を付加したりして使用することができる。 該 DN Aはその 5'末端側に翻訳開始 コドンとしての AT Gを有し、 また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての TA A、 TGAまたは TAGを有していてもよレ、。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終 止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加することもできる。
(発現ベクター）
本発明のポリべプチドまたは本発明の蛋白質の発現べクタ一は、 例えば、 (i) 本発明のポリペプチドまたは本発明の蛋白質をコードする DNAから目的 とする DNA断片を切り出し、 （ii) 該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプ 口モーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR322， p BR 32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB 1 10， p TP 5, p C 1 94) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p S H 1 9， p SH 1 5) 、 ； Lファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 用いられるプロモータ 一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば いかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、 SV 40由来のプロモータ 一、 レトロウイノレスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートシ ョックプロモーター、 サイ トメガロウイノレスプロモーター、 SRaプロモーター などが利用できる。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 Tr pプロモーター、 T 7プロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 ； L PLプロモ 一ター、 1 p pプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPO 1プロモーター、 S PO 2プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵 母である場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモー ター、 ADH1プロモーター、 GALプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫 細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ま しい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amprと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G418耐性） 等があげられる。 特 に、 CHO ( d h f r -) 細胞を用いて DHFR遺伝子を選択マーカーとして使 用する場合、 チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 ポリペプチドまたはその 部分べプチドの N端末側に付加する。 宿主がェシヱリヒァ属菌である場合は、 phoA.シグナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である 場合は、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 メイティングファクター a (MF α) 'シグナル配列、 インベルターゼ ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 例えばィ ンシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン 'シグナル配列、 抗体分子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
(形質転換体）
このようにして構築された本発明のポリべプチドをコ一ドする DN Αを含有す るべクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 たとえばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫または 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌としては、 ェシェリヒア ' コリ （Escherichia coli) K 1 2 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 160(1968)〕 ， JM1 03
[Nucleic Acids Research, 9卷， 309(1981)〕 ， J A 22 1 [Journal of
Molecular Biology 120卷， 517 (1978)〕 ， HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology 41卷， 459 (1969)〕 , C 600 [Genetics, 39卷， 440(1954)〕 などが用い られる。
バチルス属菌としては、 たとえばバチルス ·サチルス （Bacillus subtilis)
M I 1 14 [Gene, 24卷， 255(1983)〕 ， 20 7— 2 1 [Journal of
Biochemistry, 95卷， 87(1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 たとえばサッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2, AH 22 R―， NA8 7— 1 1 A, DKD— 5D， 20 B— 1 2などが用いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる [Nature, 315
卷， 592(1985)〕 。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f 細胞） 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Maraestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 〔以上、 in Vitro, 13卷， 213- 217頁（1977年）〕 などが用いられる。 動物細胞としては、 たとえばサル COS— 7細胞， Vero細胞， チャイニーズ ハムスター細胞 CHO， DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO ( d h f r - C H O細胞） ， マウス L細胞， マウス 3 T 3細胞、 マウスミエ口 一マ細胞， ヒ ト Η Ε Κ 2 9 3細胞、 ヒ ト F L細胞、 2 9 3細胞、 C 1 2 7細胞、 B A L B 3 Τ 3細胞、 S ρ— 2 0細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 たとえば Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69卷， 2110 (1972)、 Gene, 17卷， 107 (1 82)などに記載の方法に従って行なわ れる。
バチルス属菌を形質転換するには、 たとえば Molecular & General
Genetics, 168卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、 たとえば Proc. Natl. Acad. Sci. US) , 75 卷， 1929 (1978)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 たとえば Bio/Technology, 6卷， 47 - 55頁（1988年）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、 たとえば Virology, 52卷, 456 (1973)に記載の方 法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、 例えば、 リポフエクシヨン法
[Proceedings of The National Academy of Sciences of The United states of America, 84卷， 7413頁（1987年） 〕 、 リン酸カノレシゥム法 [Virology, 52 卷， 456-467頁 (1973年） 〕 、 電気穿孔法 [EMB0 J. , 1卷, 841-845頁 (1982年）〕 等があげられる。
このようにして、 本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドをコードする D N Aを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、 動物細胞を用いて、 本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを安定 に発現させる方法としては、 上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体 に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。 さらに、 このように選 択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選択を行なう ことにより本発明の蛋白質または本発明のポリぺプチドの高発現能を有する安定 な動物細胞株を得ることができる。 また、 d h f r遺伝子を選択マーカーとして 用いた場合、 MT X濃度を徐々に上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 d h f r遺伝子とともに、 本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドをコード する D N Aを細胞内で増幅させて、 さらに高発現の動物細胞株を得ることもでき る。
上記の形質転換体を本発明の蛋白質または本発明のポリべプチドをコ一ドする D N Aが発現可能な条件下で培養し、 本発明の蛋白質または本発明のポリぺプチ ドを生成、 蓄積せしめることによって、 本発明の蛋白質または本発明のポリぺプ チドを製造することができる。
宿主がェシェリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 たとえばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 たとえばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としてはたとえば塩化カルシウム、 リン酸ニ水素ナトリゥム、 塩化マグネシゥ ムなどがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加 してもよい。 培地の p Hは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 〔ミラー (Miller; ， Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 力 S好まし レ、。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 たとえば 3 0— インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシ-リヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行い、.必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な. レ、、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえばバークホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77
卷， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330 (1984)〕 があげられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整する のが好ましい。 培養は通常約 2 0 °C〜3 5 °Cで約 2 4〜7 2時間行い、 必要に応 じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s
Insect Medium (Nature, 195， 788 (1962) ) に非働化した 1 0 %ゥシ血清等の添カロ 物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 · 2〜6 . 4に調整す るのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行い、 必要に応じて通気や 撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえば約 5 〜 2 0 %の胎児牛血清を含む M E M培地 [Science, 122卷， 501 (1952)〕 ， DM E M培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕 ， R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of The American Medical Association 199卷， 519 (1967)〕 ， 1 9 9培地
[Proceeding of The Society for The Biological Medicine, 73卷, 1 (1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜 4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に C H O (dhfr- ) 細胞および dhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合 には、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む D M E M培地を用レヽ るのが好ましい。
(本発明の蛋白質または本発明のポリべプチドの分離精製）
上記培養物から本発明の蛋白質または本発明のポリべプチドを分離精製するに は、 例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出 するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な 緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび または凍結融解などによって菌体 あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過により本発明の蛋白質または本発 明のポリべプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。 緩衝液の中に尿素 や塩酸グァニジンなどのタンパク変性剤や、 トリ トン （登録商標） X— 1 0 0な どの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集め る。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明の蛋白 質または本発明のポリべプチドの精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わ せて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈 澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する 方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二 ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク 口マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法やクロマ トフオーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られる本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドが遊離体 で得られた場合には、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換す ることができ、 逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法 により、 遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドを、 精 製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を 加えたり、 蛋白質 （ （ポリ） ペプチド） を部分的に除去することもできる。 蛋白 修飾酵素としては、. 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべ プチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。 また N末 端アミノ酸を欠失させるためには、 エドマン (Edman)試薬 （フヱ二ルイソチオシ ァネート） を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
このようにして生成する本発明の蛋白質または本発明のポリペプチドの存在は 特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定することができる。
(抗体）
本発明は、 さらに本発明のポリべプチドに対する抗体を提供する。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、 本発明のポリペプチドを認識し得る抗 体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。 本発明のポリペプチドに対する抗体は、 本発明のポリペプチドを抗原として用 レ、、 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリぺプチドは、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位 にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能 を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを 投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行なわれ る。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギがあげられるが、 マウスおよびラットが好ましく 用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化本発明のポリペプチド と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによ り行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタイ ンの方法 〔ネイチヤー （Nature)、 256卷、 495頁 （1975年） 〕 に従い 実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール (PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いら れる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P3U1、 SP 2ZOなどが挙げら れるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添カロ され、 約 20〜40°C、 好ましくは約 30〜37°Cで約 1〜10分間インキュべ ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 本発明のポリペプチドの抗原を直接あるいは担体とともに 吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いら れる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプ 口ティンを加え、 固相に結合しこモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グ ロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を 添カ卩し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明のポリペプチド Aを加え、 固相 に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培地と しては、 ハイブリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の 胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） またはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） な どを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °C である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗 体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクロ一ナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にしたがって 製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明のポリペプチド抗原） とキヤ リア一蛋白質との複合体をつく り、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に 哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のポリペプチド Aに対する抗体 含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類おょぴキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール ' リンペット 'へモシァニン等を重量比でハ プテン 1に対し、 約 0. 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方 法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーのカプリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒ ドゃカルボジイミ ド、 マレイミ ド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。
上記の本発明の抗体は、 本発明のポリペプチドを特異的に認識することができ るので、 被検液中の本発明のポリぺプチドの定量、 特にサンドィツチ免疫測定法 による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、 （ i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化本発明のポリべプチドとを競合的に反応さ せ、 該抗体に結合した標識化本発明のポリぺプチドの割合を測定することを特徴 とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、 （ii) 被検液と担体上に不溶 化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に 反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検 液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記 （ii) においては、 一方の抗体が本発明のポリペプチドの N端部を認識す る抗体で、 他方の抗体が本発明のポリペプチドの C端部に反応する抗体であるこ とが好ましい。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクロ ーナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のポリペプチドの測定を行なえ るほ力 \ 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体 分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b，）2、 F a b '、 あるい は F a b画分を用いてもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 (例えば、 本発明のポリペプチド量） に对応し た抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検 出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する 測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメ トリー、 競 合法、 ィムノメ トリック法おょぴサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔125 I〕 、 〔131 I〕 、 〔3H〕 、 〔14C〕 などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 一ガラク トシダーゼ、 一ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸 脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例え ば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられ る。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用い ることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方 法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミ ド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検 液中の本発明のポリペプチド A量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なつ てもよい。 標識化剤およぴ不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明のポリべプチドの測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明のポリぺプ チドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応およ び 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明 のポリペプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好まし くは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメ トリック法あるいはネフロメ トリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B / F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレングリコ ール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメ トリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメ トリー などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構 築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを 参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4 年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石 川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川 栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソ ッズ .イン 'ェンジモロジ一 （Methods in ENZYMOLOGY) 」 Vol.
70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 I I書 Vol. 73 (Immunochemical
Techniques (Part B) )、 |P]書 oL 74 (Immunochemical Techniques (Part しノノ、 同書. - Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D : Selected Immunoassays) ) 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical
Techniques (Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies (以上 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のポリ^プチドを 感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のポリペプチドを定量する ことによって、 本発明のポリペプチドの機能不全に関連する各種疾患の診断をす ることができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリべ プチドを特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発明のポリべ プチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明 のポリべプチドの検出、 被検細胞内における本発明のポリべプチドの挙動の分析 などのために使用することができる。
(ァンチセンズポリヌクレオチド）
本発明のポリペプチドをコードする D N A (以下、 アンチセンスポリヌクレオ チドの説明においては、 これらの D N Aを本発明の D N Aと略記する場合があ る） の塩基配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチ センスポリヌクレオチドとしては、 本発明の D N Aの塩基配列に相補的な、 また は実質的に相補的な塩基配列を含有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有す るものであれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、 ァ ンチセンス D N Aが好ましい。
本発明の D N Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D N Aに 相補的な塩基配列 （すなわち、 '本発明の D N Aの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げら れる。 特に、 本発明の D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明の蛋白質の N末 端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以 上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチ ドが好適である。 J 具体的には、 配列番号： 13、 配列番号： 14、 配列番号： 15、 配列番号： 16、 配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 19、 配列番号： 20、 酉己 列番号： 21、 配列番号： 22、 配列番号： 2.3、 配列番号： 24、 配列番号： 45、 配列番号： 48または配列番号： 51で表される塩基配列を含有する DN Aの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部 分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 10〜40個程度、 好ましくは 15〜 30個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス DN Aを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホスホ 口チォェ一ト、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修飾リン 酸残基に置換されていてもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、 公 知の DN A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の複製または発現 を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチドを、 クローン化した、 あ るいは決定されたポリペプチドをコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計 し、 合成しうる。 このようなポリヌクレオチドは、 本発明のポリペプチドをコー ドする遺伝子の RNAとハイブリダィズすることができ、 該 RN Aの合成または 機能を阻害することができる力 \ あるいは本発明のポリペプチド関連 RNAとの 相互作用を介して本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節 ·制御 することができる。 本発明のポリぺプチド関連 RN Aの選択された配列に相補的 なポリヌクレオチド、 および本発明のポリペプチド関連 RN Aと特異的にハイブ リダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体内おょぴ生体外で本発明の ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また 病気などの治療または診断に有用である。
用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の 特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチ ド、 塩基配列または核酸とポリペプチドとの間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチ ド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるポリペプチドのァ ミノ酸を通常指している。 ポリペプチドをコードする遺伝子の 5'端ヘアピンル ープ、 5 '端 6 _ベースペア ' リピート、 5 '端非翻訳領域、 翻訳開始コドン、 ポ リペプチドコード領域、 翻訳終止コドン、 3 '端非翻訳領域、 3 '端パリンドロー ム領域、 および 3 '端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 ポリべプチドをコ一ドする遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンスポリヌクレオチ ドは、 2—デォキシー D—リボースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リボ ースを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリ コシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格 を有するその他のポリマまたは特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングゃ塩基の付 着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA : R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非 修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該 分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修 飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリ エステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する 結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエート など） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレアーゼ 'インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L—リジンなど） や糖 （例えば、 モ ノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インター力レート化合物 (例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アル キル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の 核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾された その他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジ ン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド および修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1 個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはェ 一テル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 R N A、 D N A、 あるいは修飾さ 5 れた核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾'された核酸の具体例としては核酸の硫 黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミ ドゃオリゴヌ クレオシドアミ ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定されるもの ではない。 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは次のような方針： （1 ) 細 胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、 （2 ) アンチ
10 センスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、 （3 ) 目標とするセンス鎖 に対する親和性をより大きなものにする、 （4 ) もし毒性があるならアンチセン スポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする、 で好ましく設計されうる。 こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8， pp. 247, 1992； Vol. 8， pp. 395, 1992； S. T.
15 Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾された 糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊
- - な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与え
20 られることができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基 骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜と の相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加する に好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリル
25 クロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいば 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合 を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 '端あるい は 5 '端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうし
30 たキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコー ルなどのダリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げら れるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の 生体内や生体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のポリぺプチドの生体内や生体 外の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の方法で細胞に適 用できる。 以下、 配列番号： 1、 配列番号： .2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドもしくはそのァ ミ ド体またはその塩を、 「本発明のポリペプチド A 1」 と略記する場合がある。 以下、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番 号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドもしくはそ のアミ ド体またはその塩を、 「本発明のポリペプチド A 2」 と略記する場合があ る。
以下、 配列番号： 3 7、 配列番号： 3 8、 配列番号： 3 9、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 1または配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドも しくはそのアミ ド体またはその塩を、 「本発明のポリペプチド B」 と略記する場 合がある。
〔1〕 医薬候捕化合物のスクリーニング方法およびスクリーニングキット 本発明のポリぺプチドを用いることを特徴とする医薬候補化合物のスクリー二 ング方法および本発明のポリペプチドを含有することを特徴とする医薬候補化合 物のスクリーニング用キット （以下、 「本発明のスクリーニング方法」 および 「本発明のスクリーニング用キット」 とそれぞれ略記する場合がある） について 以下に説明する。
(本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス クリーニング方法）
本発明のポリべプチドは、 本発明のポリべプチドの活性を促進または阻害する 化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性 (機能） を促進または阻害する化合物またはその塩 （以下、 促進剤または阻害剤 と略記する場合がある） のスクリーニング方法としては、 以下の 1 ) 〜3 ) など があげられる。 -
1 ) (i) 本発明のポリペプチド A 1を細胞に接触させた場合と、 （i i) 本発 明のポリべプチド A 1および試験化合物を細胞に接触させた場合の、 本発明のポ リペプチド A 1の活性 （例、 プロラクチン分泌抑制活性など） を測定、 比較し、 促進剤または阻害剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i) と （ii) の場合において、 上記細胞を培養し、 そのプロラクチン分泌量を測定する。 上記細胞としては、 プ ロラクチン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。 例えば、 ラット下 垂体前葉細胞 （例、 好酸性細胞） などが用いられる。 培地は、 本発明のポリぺプ チド A 1の有するプロラクチン分泌抑制活性などの活性を阻害しない培地であれ ばいずれのものでもよく、 例えば DMEM (Dulbecco modified Eagle' s medium) などが用いられる。 プロラクチン分泌量は、 公知の方法、 例えば、 RIA (放射免 疫測定） キット （Amersham製など） を用いた放射免疫測定法などにより測定す ることができる。 試験化合物と'しては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非べプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよい し、 公知の化合物であってもよい。
上記 （i i) の場合における本発明のポリペプチド A 1の活性 （例、 プロラクチ ン分泌抑制活性） を、 上記 （i) 'の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を、 本発明のポリべ プチド A 1の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。 例えば、 上記 （ii) の場合における本発明のポリペプチド A 1の活性 （例、 プロ ラクチン分泌抑制活性） を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好まし くは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を、 本発明の ポリペプチド A 1の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することがで きる。
2 ) (i i i) 本発明のポリペプチド A 2を細胞に接触させた場合と、 （iv) 本 発明のポリべプチド A 2および試験化合物を細胞 ίこ接触させた場合の、 本発明の ポリペプチド A 2の活性 （例、 プロラクチン分泌活性など） を測定、 比較し、 促 進剤または阻害剤のスクリ一二ングする。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i i i) と （iv) の場合におい て、 上記細胞を培養し、 そのプロラクチン分泌量を測定する。 '上記細胞としては、 プロラクチン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。 例えば、 ラット 下垂体前葉細胞 （例、 好酸性細胞） などが用いられる。 培地は、 本発明のポリべ プチド A 2の有するプロラクチン分泌活性などの活性を阻害しない培地であれば いずれのものでもよく、 例えば D EM (Dulbecco modified Eagle' s medium) な どが用いられる。 プロラクチン分泌量は、 公知の方法、 例えば、 RIA (放射免疫 測定） キット （Amersham製など） を用いた放射免疫測定法などにより測定する ことができる。 試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非 ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
例えば、 上記 （iv) の場合における本発明のポリペプチド A 2の活性 （例、 プ ロラクチン分泌活性） を、 上記 （ii i) の場合に.比べて、 約 2 0 %以上、 好まし くは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を、 本発明の ポリべプチド A 2の活性を促進する化合物またはその塩として選択することがで きる。 例えば、 上記 （iv) の場合における本発明のポリペプチド A 2の活性 （例、 プロラクチン分泌活性） を、 上記 （i i i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ま しくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を、 本発明 のポリべプチド A 2の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することが できる。
3 ) (v) 本発明のポリペプチド Bを細胞に接触させた場合と、 （vi) 本発明 のポリペプチド Bおよび試験化合物を細胞に接触させた場合の、 本発明のポリべ プチド Bの活性 （例、 プロラクチン分泌活性など） を測定、 比較し、 促進剤また は阻害剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （V) と （vi) の場合において、 上記細胞を培養し、 そのプロラクチン分泌量を測定する。 上記細胞としては、 プ ロラクチン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。 例えば、 ラット下 垂体前葉細胞 （例、 好酸性細胞） などが用いられる。 培地は、 本発明のポリぺプ チド Bの有するプロラクチン分泌活性などの活性を阻害しない培地であればいず れのものでもよく、 例えば DMEM (Dulbecco modified Eagle' s medium) など力 S 用いられる。 プロラクチン分泌量は、 公知の方法、 例えば、 RIA (放射免疫測 定） キット （Araersham製など） を用いた放射免疫測定法などにより測定するこ とができる。 試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ぺ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織 抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
例えば、 上記 （vi) の場合における本発明のポリペプチド Bの活性 （例、 プロ ラクチン分泌活性） を、 上記 （V) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を、 本発明のポリ ぺプチド Bの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。 例えば、 上記 （vi) の場合における本発明のポリペプチド Bの活性 （例、 プロラ クチン分泌活性） を、 上記 （V) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を、 本発明のポリぺ プチド Bの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
(本発明のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス クリーニング用キット）
本発明のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リーニング用キットは、 本発明のポリペプチドまたはその塩を含有するものであ る。 好ましくは、 さらにプロラクチン測定用試薬 （例えば、 RIAキットなど） な ど、 本発明のポリぺプチドの活性を測定するための試薬を含有ずるものである。 本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次の （a ) および （b ) を含 むものがあげられる。'
( a ) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0 . 0 5 %のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0 . 4 5 mのフィルターで濾過滅菌し、 4 °Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。 ( b ) 本発明のポリペプチドの標品
本発明のポリペプチドを 0 . 1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む P B Sで l mMとなるように溶解し、 一 2 0 °Cで保存する。 (本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング方法）
本発明のポリぺプチドを用いることを特徴とする本発明のポリぺプチドと本発 明の蛋白質 （例、 T G R 1または F M— 3 ) との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング方法または本発明のポリべプチドおよび本発明の蛋白 質を含有することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合 性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット （以下、 「本発明 のスクリーニング方法」 、 「本発明のスクリーニング用キット」 と略記する場合 がある） について以下に詳述する。
本発明の蛋白質を用いるか、 または組換え型の本発明の蛋白質の発現系を構築 し、 該発現系を用いた本発明のポリペプチドとの結合アツセィ系 （リガンド ' レ セプターアツセィ系） を用いることによって、 本発明のポリペプチドと本発明の 蛋白質との結合性を変化させる化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ぺ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織 抽出液、 血漿など） またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、 本発明の蛋白質を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの変化などを促進する活性など） を有す る化合物 （即ちァゴニスト） と該細胞刺激活性を有しない化合物 （即ちアンタゴ ニスト） などが含まれる。
また、 「本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる」 と は、 本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合を阻害する場合と結合を促 進する場合の両方を包含するものである。
すなわち、 本発明は、 （i) 本発明の蛋白質に、 本発明のポリペプチドを接触 させた場合と （ii) 上記した本発明の蛋白質に、 本発明のポリペプチドおよび試 験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリぺプ チドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化 4物またはその塩のスクリー二 ング方法などに関する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i) 上記した本発明の蛋白質に、 本発明のポリペプチドを接触させた場合と （ii) 上記した本発明の蛋白質に、 本 発明のポリぺプチドぉよび試験化合物を接触させた場合における、 例えば本発明 の蛋白質に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P 生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c — f O Sの活性化、 p Hの変化などを促進する活性など） などを測定して、 比較 する。
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
( 1 ) 上記の本発明のポリペプチドの誘導体として表される標識した本発明のポ リペプチド （以下、 単に 「標識した本発明のポリペプチド」 とする） を、 本発明 の蛋白質に接触させた場合と、 標識した本発明のポリぺプチドぉよび試験化合物 を本発明の蛋白質に接触させた場合における、 本発明のポリペプチドの本発明の 蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリべプチ ドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法、
( 2 ) 標識した本発明のポリペプチドを、 本発明の蛋白質を含有する細胞または 該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識した本発明のポリペプチドおよび試験 化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合 における、 標識した本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合 量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリべプチドと本発明の蛋白質 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 3 ) 標識した本発明のポリペプチドを、 本発明の蛋白質をコードする D N Aを 含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質 に接触させた場合と、 標識した本発明のポリべプチドおよび試験化合物を本発明 の蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞 膜上に発現した本発明の蛋白質に接触させた場合における、 標識した本発明のポ リペプチドの本発明の蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とす る本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング方法、
( 4 ) 本発明の蛋白質を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチド） を 本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と本発明の蛋白質を活性化する 化合物および試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合にお ける、 本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセ チルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの変化などを促進する活性など） を測定し、 比較することを特 徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング方法、 および
( 5 ) 本発明の蛋白質を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドな ど） を本発明の蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質に接触させた場合と、 本発明の蛋白 質を活性化する化合物および試験化合物を、 本発明の蛋白質をコードする D N A を含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現した本発明の蛋白 質に接触させた場合における、 本発明の蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生 成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋 白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの変化などを促進する活性など） を 測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との 結合性を孪化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などである。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の蛋白質としては、 本発明 の蛋白質を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 ヒ ト、 哺乳動物 などの臓器の膜画分などが好適である。 し力 し、 特にヒ ト由来の臓器は入手が極 めて困難なことから、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用 いて大量発現させた本発明の蛋白質などが適している。
本発明の蛋白質を製造するには、 前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の蛋白質を含有する細胞あるい は該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。
本発明の蛋白質、 例えば T G R 1を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダル タルアルデヒ ド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法は公知の方法 に従って行うことができる。
TGR 1を含有する細胞としては、 TGR 1を発現した宿主細胞をいう力 S、 該 宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などがあ げられる。
膜画分としては、 細胞を破砕した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く含ま れる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジ ナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリングブレンダーゃポリ トロン
(Kinematica社製） による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加 圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などがあげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分 画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500 r pn！〜 300 0 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （15 000 r pm〜30000 r pm)'で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱 を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した TGR 1と細胞由来のリン脂質や膜 蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該 TGR 1を含有する細胞や膜画分中の TGR 1の量は、 1細胞当たり 103 〜 108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるのが好適である。 な お、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性が高くなり、 高感度なス クリ一ユング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口ットで大量の試料を測 定できるようになる。
本発明のポリべプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物または その塩をスクリーニングする前記の （1) 〜 （3) を実施するためには、 適当な 本発明の蛋白質画分と、 標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物 (本発明のポリペプチドなど） が用いられる。 本発明の蛋白質画分としては、 天 然型の本発明の蛋白質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明 の蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活 性などを示す。 標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物としては、 標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物 （本発明のポリペプチドな ど） などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標 識されたリガンド （本発明のポリペプチドの標識体） などを利用することができ る。 '
具体的には、 本発明のポリべプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる 化合物のスクリーニングを行うには、 まず本発明の蛋白質を含有する細胞または 細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセ プター標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜 8) のリン酸バッファー、 トリス一塩酸バッファーなどのリガンドとレセプター との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合 を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n-80™ (花王一ァトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもで きる。 さらに、 プロテアーゼによる本発明の蛋白質や本発明のポリペプチドの分 解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺ プスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0.0 lm 1〜 10mlの該レセプター溶液に、 一定量 （5000 c ρ π！〜 500000 c ρ m) の標識した本発明のポリペプチド （本発明のポリペプチドの標識体） を添加 し、 同時に 10一4〜 10— の試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （N SB) を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チュ一 ブも用意する。 反応は 0°Cから 50°C、 望ましくは 4°Cから 37°Cで 20分から 24時間、 望ましくは 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過 し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液 体シンチレーシヨンカウンターまたは γ—カウンターで計測する。 拮抗する物質 がない場合のカウント（Β。；)から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント (B0-NS Β) を 100%とした時、 特異的結合量 （B— NSB) が例えば 8 0%以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性 を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
また、 本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合を測定する方法として、 B I Ac o r e (アマシャムフアルマシアバイオテク社製） を用いることもでき る。 この方法では、 本発明のポリペプチドを装置に添付のプロトコルに従ったァ ミノカツプリング法によってセンサーチップに固定し、 本発明の蛋白質を含有す る細胞または本発明の蛋白質をコードする DN Aを含有する形質変換体から精製 した本発明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分、 あるいは精製した本発 明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バ ッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分 2— 2 0 μ 1の流量で通過させる。 センサーチップ上の本発明のポリペプチドと本発明 の蛋白質とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存する 試験化合物が変化させることを観察することによつて本発明の蛋白質と本発明の ポリペプチドとの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができ る。 この方法は、 本発明の蛋白質をセンサーチップに固定し、 本発明のポリぺプ チドおよび試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩 衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測定することができ る。 試験化合物としては、 上記と同様のものなどがあげられる。
本発明のポリべプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスク リーニングする前記の （4 ) 〜 （5 ) の方法を実施するためには、 本発明の蛋白 質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 C a 2+遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p H の低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の 測定用キットを用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 本発明の蛋白 質を含有する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 スクリーニングを行う にあたっては前もつて新鮮な培地あるレ、は細胞に毒性を示さない適当なバッファ 一に交換し、 試験ィヒ合物などを添カ卩して一定時間インキュベートした後、 細胞を 抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量す る。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細 胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を 添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性につい ては、 フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対す る産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 本発明の蛋白質を発現 した細胞が用いられる。 本発明の蛋白質を発現した細胞としては、 前述の組換え 型蛋白質発現細胞株などが望ましい。 形質変換体である本発明の蛋白質発現細胞 は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。 また、 動物細胞の種類は上記と同 様のものが用いられる。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物 ίέ出液、 動物組織抽出液、 血漿 などがあげられる。
上記のリガンド · レセプターアツセィ系について、 さらに具体的に記載すると 以下のようなアツセィ系が用いられる。
(1) 受容体発現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると細胞内の Gタ ンパク質が活性化されて GTPが結合する。 この現象は受容体発現細胞の膜画分 においても観察される。 通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化するが、 このとき反応液中に GTP γ Sを添加しておくと GTP τ/ Sは GTPと同様に G タンパクに結合するが、 加水分解されずに Gタンパクを含む細胞膜に結合した状 態が維持される。 標識した GTPy Sを用いると細胞膜に残存した放射活性を測 定することによつて受容体ァゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定すること ができる。 この反応を利用して本発明のポリべプチドの本発明の蛋白質発現細胞 に対する刺激活性を測定することができる。 この方法は、 前記 （4) 〜 （5) の ように本発明の蛋白質を含む細胞を用いるものではなく、 （1) 〜 （3) のよう に本発明の蛋白質を含む膜画分を用いるアツセィ法であるが、 （4) 〜 （5) の ように細胞刺激活性を測定するものであり、 本測定法において本発明の蛋白質膜 画分への GTPy S結合促進活性を示す物質はァゴニストである。 ここにおいて、 本発明のポリべプチドあるいは本発明のポリべプチドおよび試験化合物を添加し、 本発明のポリべプチドの単独投与に比べて本発明の蛋白質を発現する細胞膜画分 への GTP y S結合促進活性に変化が生じることを観察することによって本発明 のポリべプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニン グすることができる。 このとき、 本発明のポリペプチドによる本発明の蛋白質を 発現する細胞膜画分への GTP γ S結合促進活性を抑制する活性を示す化合物を 本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補 物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明の蛋 白質を発現する細胞膜画分への G T P y S結合促進活性を観察することによりァ ゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。 上述の方法によ つて調製した本発明の蛋白質を含む細胞膜画分を、 膜希釈緩衝液 (50 m Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 μΜ GDP, 0.1% BSA pH 7.4) で希釈する。 希釈率 は、 受容体の発現量により異なる。 これを Falconb 2053に 0.2ralずつ分注し、 本発明のポリべプチドあるいは本発明のポリぺプ ドおよび試験ィヒ合物を加え、 さらに終濃度 200 pMとなるように [35S]GTP y Sを加える。 25°Cで 1時間保温した 後、 氷冷した洗浄用緩衝液 (50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 raM NaCl, 0. 1% BSA , 0. 05% CHAPS pH 7. 4 1. 5ml) を加えて、 ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。 65°C、 30分保温して乾燥後、 液体シンチレーシヨンカウンターでろ紙上に残つ た膜画分に結合した [35S]GTP Sの放射活性を測定する。 本発明のポリペプチド のみを加えた実験区の放射活性を 100%、 本発明のポリペプチドを加えなかった 実験区の放射活性を 0%とし、 本発明のポリペプチドによる G T P γ S結合促進 活性に対する試験化合物の影響を算出する。 G T P y S結合促進活性が例えば 8 0 %以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリべプチドとの結合性 を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
( 2 ) 本発明の蛋白質発現細胞は本発明のポリペプチド刺激によって細胞内 cAMP量が減少する場合、 この反応を利用して本発明のポリべプチドの本発明の 蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。
本発明の蛋白質を発現させた種々の動物細胞の cAMP 産生量はマウス、 ラット、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と 1251標識 cAMP (とも に市販品） を使用することによって RIAあるいは抗 cAMP抗体と標識 cAMPとを組 み合わせた他の EIA系でも測定することができる。 また抗 cAMP抗体を protein Aあるいは抗 cAMP抗体産生に用いた動物の IgGなどに対する抗体などを使用し て固定したシンチラントを含むビーズと 1251標識 cAMPとを使用する SPA法によ る定量も可能である （アマシャムフアルマシアバイオテク製のキットなどを使用 する） 。
本方法において、 フオルスコリンまたはカルシトニンなど細胞內 cAMP量を增 加させるようなリガンドなどによって細胞内 cAMP量を上昇させ、 本発明のポリ ぺプチドまたは本発明のポリぺプチドおよび試験化合物を添加することによって 本発明のポリベプチドの単独投与による細胞内 cAMP量の抑制が変化することを 観察し、 本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物のス クリーニングを行なうことができる。 このとき、 本発明のポリペプチドによる本 •発明の蛋白質発現細胞の cAMP産生抑制活性を阻害する活性を示す化合物を本発 明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質 として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを添加して cAMP産生抑制 活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化 物のスクリーニングを行なう ことができる。
スクリーニング法をより具体的に以下に記載する。 本発明の蛋白質を発現させ た C H O細胞を 24穴プレー卜に 5 X 104 cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM 3 iソブチルーメチルキザンチンと 0. 05% BSAと 20mM HEPES を含むハンクスバッファー（pH7. 4)で洗浄する （以下、 0. 2mM 3—イソプチル— メチルキサンチンと 0. 05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー
(PH7. 4)を、 反応用バッファーと呼ぶ） 。 その後 0. 5mlの反応用バッファーを加 えて 3 0分間培養器で保温する。 反応用バッファーを除き、 新たに 0. 25mlの反. 応用バッファーを細胞に加えた後、 2 フォルスコリンを含む 0. 25mlの反応用 バッファーに 1 nMの本発明のポリペプチドあるいは 1 nMの本発明のポリべプチ ドおよび試験化合物を添加したものを細 1¾に加え、 3 7 °Cで 2 4分間反応させる。 ΙΟΟ Ιの 20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、 次に氷上で 1時間置くことに より細胞内 cAMPを抽出する。 抽出液中の cAMP量は、 cAMP EIAキット （アマシ ャムフアルマシアバイオテク） を用いて測定する。 フォルスコリン刺激によって 産生された cAMP量を 100%とし、 1 nMの本発明のポリペプチドの添加によって 抑制された cAMP量を 0%として、 本発明のポリぺプチドによる cAMP産生抑制活 性に対する試験化合物の影響を算出する。 本発明のポリペプチドの活性を阻害し て cAMP産生活性が例えば 8 0 %以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発 明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択するこ とができる。
cAMP産生促進活性を測定するには、 フォルスコリンを添加せずに本発明の蛋 白質を発現させた C H O細胞に試験化合物を添加して産生された cAMPを上記の 方法で定量する。 この場合は、 c AM Pの産生活性が例えば 1 0 %以上の試験化 合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のあ る候補物質として選択することができる。
( 3 ) CRE (cAMP response element) を含む D N Aを、 ピツカジーン ベイシ ックベクターまたはピツカジーン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 (株） ） のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイ トに挿入し、 こ れを CRE_レポーター遺伝子ベクターとする。 CRE—レポーター遺伝子ベクター をトランスフエクシヨンした細胞において、 cAMP上昇を伴う刺激は、 CREを介 したルシフエラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフエラーゼタンパク質の産 生を誘導する。 つまり、 ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 CRE—レポ 一ター遺伝子べクタ一導入細胞内の cAMP量の変動を検出することができる。 CRE —レポーター遺伝子ベクターを本発明の蛋白質発現細胞にトランスフエクシヨン した細胞を利用して本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる 化合物のスクリーニングを行なうことができる。 具体的なスクリーニング法を以 下に記す。
CRE—レポーター遺伝午を導入した本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに 5 X 103 cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM 3 _イソブチル —メチルキサンチンと 0. 05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー (P.H7. 4)で洗浄する （以下、 0. 2raM 3—イソブチル一メチルキサンチンと 0. 05% BSAと 20raM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7. 4)を、 反応用バッフ ァ一と呼ぶ） 。 その後 0. 5mlの反応用バッファーを加えて 3 0分間培養器で保温 する。 反応用バッファーを除き、 新たに 0. 25mlの反応用バッファーを細胞に加 えた後、 1 nMの本発明のポリペプチドあるいは 1 nMの本発明のポリペプチドお ょぴ試験化合物と 2 μ Μフオルスコリンを含む 0. 25mlの反応用バッファーを細胞 に加え、 3 7 °Cで 2 4分間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋 インキ製造 （株） ) で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添 加する。 ルシフェラーゼによる発光は、 ノレミノメーター、 液体シンチレーシヨン カウンターまたはトップカウンタ一により測定する。 本発明のポリペプチドと本 発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響はルシフェラーゼによる発光量を 本発明のポリぺプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定するこ とができる。 このとき、 本発明のポリペプチドの投与によりフォルスコリン刺激 による発光量の増加が抑制されるが、. この抑制を回復させる化合物を本発明の蛋 白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として 選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 フォルスコリン刺激に よって上昇した発光量の本発明のポリぺプチドと同様な抑制を観察することによ りァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフヱラーゼ以外に例えばアル力リフォスファタ ーゼ、 クロラムフエ二コール ァセチルトランスフェラーゼあるいは] 3 _ガラク トシダーゼを用いることもできる。 これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵 素活性は以下のように市販の測定キットを用いて 易に測定することができる。 アルカリフォスファターゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530によって、 クロラムフエニコーノレ ァセチノレトランスフェラーゼ (chloramphenicol acetyltransferase) 活'性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol acetyltransferase assay kitによって、 ' β —ガラク トシダーゼ活性は、 例えば 和光純薬製 Aurora Gal-XEによって測定することができる。 .
( 4 ) 本発明の蛋白質発現細胞が本発明のポリぺプチド刺激によってァラキド ン酸代謝物を細胞外に放出する場合、 あらかじめ、 放射活性を有するァラキドン 酸を細胞に取り込ませておくことによって、 この活性を細胞外に放出された放射 活性を測定することによって測定することができる。 このとき、 本発明のポリべ プチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加して、 本発明のポ リぺプチドのァラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、 本 発明のポリぺプチドと本発明の蛋白質の結合に影響を与える化合物のスクリ一二 ングを行なうことができる。 このとき、 本発明のポリペプチドによるァラキドン 酸代謝物放出活性を阻害する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドと の結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。 また、 試験化合物のみを添加し、 本発明の蛋白質発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活 性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこ ともできる。
本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に影響を与える化合物のスクリ 一二ング法より具体的に以下に述べる。
本発明の蛋白質を発現させた C H O細胞を 24穴プレートに 5 X 104 cell/wellで播種し、 24時間培養後、 [ ]ァラキドン酸を 0. 25 ju Ci/wellとな るよう添加する。 [¾]ァラキドン酸添加 16時間後、 細胞を 0. 05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7. 4)で洗浄し、 各 wellに 0. 05% BSAと
20mM HEPおを含むハンクスバッファー（pH7. 4)に溶解した終濃度 10 nMの本発明 のポリぺプチドあるいは 10 nMの本発明のポリぺプチドおよび試験化合物を含む バッファー 500 μ 1を添加する。 以降、 0. 05% BSAと 20raM HEPESを含むハンク スバッファー（pH7. 4)を反応用バッファーと呼ぶ。 37°Cで 60分間ィンキュベート した後に、 反応液 400 lをシンチレ一ターに加え、 反応液中に遊離した [ ]ァ ラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンタ一により測定する。 本発明の ポリべプチドの非添加反応バッファーによる培地 の [¾]ァラキドン酸代謝物の 量を 0%とし、 10 ηΜの本発明のポリペプチドを添加したときのたときの培地中 の [¾]ァラキドン酸代謝物の量を 100%として試験化合物の本発明のポリぺプチ ドと本発明の蛋白質の結合に対する影響を算出する。 ァラキドン酸代謝物産生活 性が例えば 5 0 %以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリべプチ ドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。
( 5 ) 本発明の蛋白質発現細胞を本発明のポリぺプチドによって刺激すること によって細胞内の C a 2+濃度が上昇する場合、 これを利用することによって本発 明のポリべプチドと本発明の蛋白質の結合に対する試験化合物の影響を調べるこ とができる。
本発明の蛋白質発現細胞を、 滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に'播き、 2日後、 培養液を 4 mM Fura-2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した HBSSに置換し、 室温で 2時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、 キュベットにカバーグラスをセットし、 蛍光測定器で、 本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリべプチドぉよび試験 化合物を加えたときの励起波長 340nm及ぴ 380nmでの 505nmの蛍光強度の比の上 昇を測定する。 このとき、 本発明のポリペプチドを単独で投与したときに比べて 試験化合物の添加によって生じる蛍光強度の変化を測定することにより本発明の ポリペプチドと本発明の蛋白質の結合に対して影響を与える化合物のスクリー二 ングを行なうことができる。 また、 以下のように FLIPR (モレキュラーデバイス 社製） を使うこともできる。 すなわち、 細胞縣濁液に Fluo-3 AM (同仁化学研究 所製） を添加し、 細胞に取り込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 9 6穴 プレートに細胞を播く。 FLIPR装置にセッ トし、 Fura- 2 AMの場合と同様に本発 明のポリべプチドあるいは本発明のポリべプチドおよび試験化合物を加え、 本発 明のポリべプチドを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測 される蛍光強度が変化することを測定することにより、 本発明のポリペプチドと 本発明の蛋白質の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうこ とができる。 これらにおいて、 本発明のポリペプチドによる蛍光強度の上昇を抑 制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリべプチドとの結合性を変化させる 能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみの添カロ による蛍光強度の上昇を観察することによってァゴニストのスクリーニングを行 なうこともできる。 . 本発明の蛋白質発現細胞に aequorinなどのように細胞内 Caイオンの上昇によ つて発光するようなタンパク質の遺伝子を共発現させておき、 細胞内 Caイオン 濃度の上昇によって aequorinが Ca結合型となり発光することを利用して、 本発 明のポリべプチドあるいは本発明のポリべプチドおよび試験化合物を加え、 本発 明のポリぺプチドを単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測 される発光強度が変化することを測定することにより、 本発明のポリぺプチドと 本発明の蛋白質の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうこ とができる。 方法は、 蛍光物質を取り込ませないこと以外は上記と同様である。
( 6 ) 受容体を発現する細胞に受容体ァゴニストを添加すると、 細胞內イノシ トール三リン酸濃度が上昇することが知られている。 本発明のポリペプチドによ つて生じる本発明の蛋白質を発現する細胞におけるこの反応を観察することによ り本発明のポリべプチドと本発明の蛋白質の結合に影響を与える化合物のスクリ 一ユングを行なうことができる。 2 4穴プレートに播いて 1日目の細胞に myo - [2-¾] inositol (2. 5マイクロ Ci/well)を添加した培地中で 1日培養した細胞を、 よく洗浄後、 本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドおよび試験化 合物を添加した後、 10%過塩素酸を加え反応を止める。 1. 5 M K0H, 60mM HEPES 溶液で中和し、 0. 5ralの AGlx8樹脂 （Bio- Rad)を詰めたカラムに通し、 5mM Na2B03 60raM HC00NH4で洗浄した後、 1 HC00NH4 0. 1M HC00Hで溶出した放射活 性を液体シンチレーシヨンカウンターで測定する。 本発明のポリべプチドの非添 加反応バッファーによる培地中の放射活性を 0%とし、 本発明のポリペプチドを 添加したときの培地中の放射活性を 100%として試験化合物の本発明のポリぺプ チドと本発明の蛋白質の結合に対する影響を算出する。'イノシトール三リン酸産 生活性が例えば 5 0 %以下になる試験化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリべ プチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみの添加によるイノシトール三リン酸産生上昇を観察するこ とによってァゴニストのスクリーユングを行なうこともできる。
( 7 ) TRE (TPA response element) を含む D N Aを、 ピツカジーン ベイシ ックベクターまたはピツカジーン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造
(株） ） のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローユングサイトに挿入し、 こ れを TRE—レポーター遺伝子ベクターとする。 TRE_レポーター遺伝子ベクター をトランスフエクシヨンした細胞において、 細胞内 Ca2+上昇を伴う刺激は、 TRE を介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き^くルシフェラーゼタンパク質 の産生を誘導する。 つまり、 ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 TRE— レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することがで きる。 TRE—レポーター遺伝子ベクターを本発明の蛋白質発現細胞にトランスフ ェクシヨンした細胞を利用した本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を 変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
TRE—レポーター遺伝子を導入した本発明の蛋白質発現細胞を 24穴プレートに 5 X 103 cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7. 4)で洗浄した後、 10 nMの本発明のポリべ プチドあるいは 10 nMの本発明のポリペプチドおよび試験化合物を添加し、 3
7 °Cで 6 0分間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋ィンキ製瑋 (株） ） で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ル シフェラーゼによる発光は、 ルミノメーター、 液体シンチレーシヨンカウンター またはトップカウンタ一により測定する。 本発明のポリべプチドと本発明の蛋白 質の結合を変化させる化合物の影響は、 ルシフェラーゼによる発光量を本発明の ポリぺプチドを単独で投与した場合と比較することによつて測定することができ る。 このとき、 本発明のポリペプチドの投与により細胞内 Ca2+の上昇によって発 光量が増加するが、 この増加を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリ ペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができ る。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のポリペプチドと同様な発光量の増 加を観察することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファタ ーゼ、 クロランフエ二コール ァシルトランスフェラーゼあるいは 3—ガラク ト シダーゼを用いることもできる。 これらのレポーター遣伝子の遺伝子産物の酵素 活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。 ァ ルカリフォスファターゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi-Phos 530によって、 ク 口ラムフエニコーノレ ァセチノレトランスフェラーゼ (chloramphenicol acetyltransferase) 活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT Chrolaraphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって、 β—ガラク トシダーゼ活性は、 例えば 和光純薬製 Aurora Gal- XEによって測定することができる。
( 8 ) 本発明のポリぺプチドに応答した本発明の蛋白質発現細胞について MAP kinase活性化によって増殖が観察される場合、 この増殖を MAP kinase活性、 チ ミジン取り込み、 細胞数測定 （MTTなど） によって測定することができる。 これ を利用して本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の スクリーニングを行なうことができる。
MAP kinase活性は、 本発明のポリペプチドあるいは本発明のポリペプチドお よび試験化合物を細胞に添加した後、 細胞溶解液から抗 MAP kinase抗体を用い た免疫沈降によって MAP kinase分画を得た後、 例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay Kitと γ - [32P] - ATPを使用して容易に測定できる。 チミジン取り込み活性 は、 本発明の蛋白質発現細胞を播き、 本発明のポリペプチドあるいは本発明のポ リペプチドおよび試験化合物を添加した後、 [methyl-¾] -チミジンを加え、 その 後、 細胞内に取り込まれた標識チミジンの放射活性を細胞を溶解して液体シンチ レーシヨンカウンターで計数することによって測定することができる。
本発明の蛋白質発現細胞の増殖は、 発現細胞を播き、 本発明のポリペプチドあ るいは本発明のポリぺプチドおよび試験ィ匕合物を添加した後に MTT (3- (4, 5- dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) を添加し、 細 胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを塩酸酸性としたイソプロパ ノールで細胞を溶解した後、 570 nmの吸収を測定することによつても測定でき る。
本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の、 標識チ ミジン取り込み活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
本発明の蛋白質発現細胞を 2 4穴プレートにゥエル当たり 5 0 0 0個まき一日 間培養する。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にする。 本発明のポリべプチドあるいは本発明のポリべプチドおよび試験化合物を細胞に 添加して 2 4時間培養した後、 [methyl- ¾]-チミジンをゥエル当たり 0 . 0 1 5 M B q添加し 6時間培養する。 細胞を P B S (—） で洗った後、 メタノールを添 加して 1 0分間放置する。 次に 5 %トリクロ口酢酸を添加して 1 5分間放置後、 固定された細胞を蒸留水で 4回洗う。 0 . 3 N水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶 解し、 溶解液中の放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターで測定する。 本発 明のポリべプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、 チミジ ン取り込みによる放射活性の上昇を本発明のポリぺプチドを単独で投与した場合 と比較することによって測定することができる。 このとき、 本発明のポリべプチ ドの投与による放射活性の増加を抑制する化合物 本発明の蛋白質と本発明のポ リぺプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することがで きる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のポリペプチドと同様な放射活性 の増加を観察することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
( 9 ) 本発明の蛋白質発現細胞に本発明のポリペプチドを添加すると、 Κ channelが活性化し、 細胞内にある Kイオンが、 細胞外に流出する場合、 Kィォ ンと同族元素である Rbイオンは、 Kイオンと区別無く K channelを通って細胞 外に流出するので、 細胞に標識 Rb ( [86Rb] )を添加して取り込ませておいた後、 本発明のポリぺプチド Aの刺激によつて流出する [86Rb]の流れを測定することで 本発明のポリペプチド Aの作用を測定できる。 本発明のポリペプチドと本発明の 蛋白質の結合を変化させる化合物の、 [86Rb]流出活性を利用した具体的なスクリ 一ニング法を以下に記す。
2 4穴にまいて 2日後の本発明の蛋白質発現細胞を l mCi/ml の 86RbClを含 む培地中で 2時間保温する。 培地をよく洗浄し、 外液中の 86RbCl を完全に除く。 本発明のポリべプチドあるいは本発明のポリべプチドおよび試験化合物を細胞に 添カ卩して 3 0分後の外液を回収し、 τ/カウンターで放射活性を測定する。 本発明 のポリべプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、 [86Rb]流 出による放射活性の上昇を本発明のポリべプチドを単独で投与した場合と比較す ることによって測定することができる。 このとき、 本発明のポリペプチドの投与 による放射活性の上昇を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリべプチ ドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選択することができる。 一 方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のポリペプチドと同様な放射活性の上昇を 観察することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
( 1 0 ) 本発明の蛋白質発現細胞が本発明のポリペプチドに反応して変化する 細胞外の pH (acidification rate) をサイ トセンサー装置 （モレキュラーデバ イス社） を使用して測定することによって、 本発明のポリペプチドの活性を測定 することができる。 サイ トセンサー装置を利用した、 細胞外 p H変化の測定をす ることによる本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物 の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
本発明の蛋白質発現細胞をサイトセンサー装置用のカプセル内で終夜培養し、 装置のチャンバ一にセットして細胞外 p Hが安定するまで約 2時間 0. 1% BSAを 含む RPMI 1640培地 （モレキュラーデバイス社製 Γを灌流させる。 p Hが安定し た後、 本発明のポリぺプチドあるいは本発明のポリぺプチドおよび試験化合物を 含む培地を細胞上に灌流させることによつて生じる培地の ΡΗ変化を測定する。 本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、 本 発明の蛋白質発現細胞の細胞外 ρ Η変化を本発明のポリべプチドを単独で投与し た場合と比較することによって測定することができる。 このとき、 本発明のポリ ぺプチドの投与による細胞外 p H変化を抑制する化合物を本発明の蛋白質と本発 明のポリべプチドとの結合性を変化させる能力のある候捕物質として選択するこ とができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のポリペプチドと同様な細 胞外 p H変化を観察することによりァゴニストのスクリーユングを行なうことも できる。
( 1 1 ) 酵母 (Saccharomyces cerevi s iae) (D haploid a -mat ing Type (MAT . a ) の性フェロモン受容体 STe2は G蛋白 Gpalとカップルしており、 性フヱロモ ン a - mat ing factorに応答して MAP kinaseを活性化し、 以下、 Farl (cel l- cycle arrest) および転写活性化因子 Ste l2が活性化される。 Ste l2は接合に関 与する FUS1を含む種々の蛋白の発現を誘導する。 一方、 制御因子 Sst2は以上の 過程に抑制的に機能する。 この系において、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子 を導入した酵母を作製し、 本発明の蛋白質に対するァゴニスト刺激によって酵母 細胞内のシグナル伝達系を活性化し、 その結果生じる増殖などの指標を用いた、 ァゴニストと本発明の蛋白質との反応の測定系の試みが行なわれている （Pausch, M. H. , Trends in Biotechnology, vol . 15， pp. 487-494 (1997) ) 。 このよう な本発明の蛋白質をコードする遺伝子を導入した酵母の系を利用して本発明のポ リペプチドおよび本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物のスクリーニングを .行なうことができる。
ΜΑΤ α酵母の Ste2および Gpalをコードする遺伝子を除去し、 代わりに本発明 の蛋白質をコードする遺伝子および Gpal-Gai2融合蛋白をコードする遺伝子を導 入する。 Farをコードする遺伝子を除去して cel l- cyc le arrestが生じないよう にし、 また、 Sstをコードする遺伝子を除去することによって本発明のポリぺプ チドに対する応答の感度を向上させておく。 さらに、 FUS 1にヒスチジン生合成 遺伝子 HIS3をつなげた FUS 1- HIS3遺伝子を導入する。 以上の遺伝子組換え操作 は例 は、 Priceら (Price, L. A. et al. , Molecular and Cel lular Biology, vol. 15， pp. 6188-6195 (1995) ) の報告に記載の方法において、 ソマトスタチ ン受容体タイプ 2 (SSTR2) 遺伝子を本発明の蛋白質をコードする遺伝子に置き 換えて実施することによって容易に行なうことができる。 こうして構築された形 質転換酵母は本発明の蛋白質のリガンドである本発明のポリべプチドに高感度で 反応し、 その結果 APキナーゼの活性化が起きてヒスチジン生合成酵素が合成さ れるようになって、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。 これを利用して、 ヒ スチジン欠乏培地での酵母の生育を指標として本発明のポリペプチドによる本発 明の蛋白質発現酵母の応答を観察することができる。 以下に本発明のポリぺプチ ドぉよび本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物のスクリーニング法を述べる。 上記のようにして作製された形質変換酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培 養し、 2 X 104 cell/mlの濃度でヒスチジンを除去した溶解寒天培地に加え、 9 X 9 cmの角形シャーレに播く。 寒天が固化した後、 本発明のポリペプチドある いは本発明のポリべプチドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面 におき、 30°Cで 3日間培養する。 本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質の結合 を変化させる化合物の影響は、 濾紙の周囲の酵母の生育を本発明のポリペプチド を単独で投与した場合と比較することによつて測定することができる。 このとき、 本発明のポリペプチドの投与による酵母の生育を抑制する化合物を本発明の蛋白 質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能力のある候補物質として選 択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のポリペプチドと 同様な酵母の生育を観察することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこ ともできる。 また、 あらかじめ、 寒天培地に 本発明のポリペプチドを添加して おいて滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて培養し、 シャーレ全面での酵母 の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察することによっても本発明のポリ ぺプチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響を調べることができ る。
( 1 2 ) 本発明の蛋白質をコードする遺伝子 R N Aをアフリカッメガエル卵母 細胞に注入し、 本発明のポリペプチドによって刺激すると細胞内 Ca2+イオン濃度 力 S上昇して、 calcium—activated chloride current力 S生じる。 これを膜電位の 変化としてとらえることが出来る （K イオン濃度勾配に変化がある場合も同様） 。 本発明のポリペプチドによって生じる本発明の蛋白質をコードする遺伝子を導入 したアフリカッメガエル卵母細胞におけるこの反応を観察することにより本発明 のポリべプチドと本発明の蛋白質の結合に影響を 4える化合物のスクリーニング を行なうことができる。
水冷して動けなくなった雌のアフリカッメガエルから取り出した、 卵母細胞塊 を M B S液 （88mM NaCl, lmM KC1, 0. 41mM CaCl2, 0. 33raM Ca (N03) 2, 0. 82mM MgS04， 2. 4raM NaHC03, lOmM HEPES, pH7. 4) に溶かしたコラーゲナーゼ
(0. 5mg/ral)で卵塊がほぐれるまで 1 9 °C、 1 - 6時間、 150rpmで処理する。 外液 を MBS液に置換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピュレーターで本発明の蛋 白質をコードする mR A (50ng/50nl)をマイクロインジェクションする。 本発明 の蛋白質をコードする mRNAは、 組織や細胞から調製しても、 plasmidから in vitroで転写してもよい。 これを MBS液中で 2 0 °Cで 3日培養する。 これを
Ringer液を流している voltage clamp装置のくぼみに置き、 電位固定用ガラス 微小電極、 電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、 （一） 極は、 細胞外に 置く。 電位が安定したら、 本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドお よび試験化合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録する。 本発明のポリぺ プチドと本発明の蛋白質の結合を変化させる化合物の影響は、 本発明の蛋白質を コードする遺伝子を導入したアフリカッメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を本 発明のポリぺプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定すること ができる。 このとき、 本発明のポリペプチドの投与による細胞膜電位変化を抑制 する化合物を本発明の蛋白質と本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる能 力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のポリぺプチドと同様な細胞膜電位変化を観察することによりァゴニスト のスクリ一二ングを行なうこともできる。
この系において、 反応を変化量を増大して測定しやすいように各種の Gタンパ ク質遺伝子の poly (A) + RNAを導入することもできる。 また aequorinのような Ca2+存在下で発光を生じるようなタンパクの遺伝子の poly (A) +R Aを共インジェ クシヨンすることにより膜電位変化ではなく発光を観察してこの反応を測定する こともできる。
(本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング用キット）
本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング用キットは、 本発明の蛋 質、 本発明の蛋白質を含有す る細胞、 あるいは本発明の蛋白質を含有する細胞の膜画分、 および本発明のポリ ぺプチドを含有するものである。
本発明のスクリーユング用キットの例としては、 次のものがあげられる。
1. スクリーニング用試薬
(a) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 0 5%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 μιηのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。 '
(b) 本発明の蛋白質の標品
本発明の蛋白質を発現させた CH〇細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 Z 穴で継代し、 37°C、 5%C02、 95%a i rで 2日間培養したもの。
(c) 標識リガンド
〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35Srなどで標識した本発明のポリペプチド。 適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 μ Μに希釈する。
(d) リガンド標準液
本発明のポリペプチドを 0. 1%ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む P B Sで ImMとなるように溶解し、 一20°Cで保存する。
2. 測定法
(a) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質を発現させた細胞 を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 μ 1の測定用緩衝液を各穴に 加える。
(b) 10— 3〜10— 1βΜの試験化合物溶液を 5 μ 1加えた後、 標識した本発明の ポリペプチドを 5 μ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知る ためには試験化合物のかわりに 10-3Μの本発明のポリペプチドを 5 μ 1加えて おく。
(c) 反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した 標識した本発明のポリペプチドを 0. 2N NaOH— 1%SDSで溶解し、 4 m 1の液体シンチレーター A (和光純薬製） と混合する。 (d) 液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
式
PMB= [ (B—NSB) / (B0— NS B) ] X 1 00
PMB ： Percent Ma imum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB ： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B。 ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合を変化 させる （結合を阻害あるいは促進する） 化合物であり、 具体的には本発明の蛋白 質を介して細胞刺激活性を有する化合物 （いわゆるァゴニス ト） 、 あるいは該刺 激活性を有しない化合物 （いわゆるアンタゴニス ト） である。 該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などがあげ られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。
上記本発明の蛋白質のァゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な 評価方法は以下の （i) または （ii) に従えばよい。
(i) 前記 （1) 〜 （3) のスクリーニング方法で示されるバインディング ·ァ ッセィを行い、 本発明のポリペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる (特に、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した本発明の蛋白質 を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化 合物またはその塩はァゴニストであり、 該活性を有しない化合物またはその塩は アンタゴニストである。
(ii) (a)試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させ、 上記本発明の 蛋白質を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはそ の塩はァゴニストである。
(b) 本発明の蛋白質を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドまたは 本発明の蛋白質に対するァゴニストなど） を本発明の蛋白質を含有する細胞に接 触させた場合と、 本発明の蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を本発明 の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 本発明の蛋白質を介した細 胞刺激活性を測定し、 比較する。 本発明の蛋白質 ^活性化する化合物による細胞 刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はアンタゴニストである。
該ァゴニストは、 本発明の蛋白質に対する本発明のポリペプチドが有する生理 活性と同様の作用を有しているので、 本発明のポリペプチドと同様に安全で低 毒性な医薬として有用である。
逆に、 アンタゴニストは、 本発明の蛋白質に対する本発明のポリペプチドが有 する生理活性を抑制することができるので、 該レセプター活性を抑制する安全で 低毒性な医薬として有用である。 〔2〕 本発明のポリペプチド等を含有する医薬
本発明のポリペプチド A 1は、 例えば、 消化管収縮作用、 平滑筋収縮作用、 血 圧上昇作用、 摂食抑制作用、 プロラクチン分泌低下作用などを有し、 概日リズム における位相の進みおよび遅れに関連している。 よって、 本発明のポリペプチド A l、 本発明のポリペプチド A 1をコードするポリヌクレオチド、 およぴ本発明 のポリぺプチド A 1の活性を促進する化合物またはその塩は、 低毒性で安全な、 例えば低血圧、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥 満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能 低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） 、 摂食亢進症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変 調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 嗜眠症、 不妊症、 季節鬱病、 生 殖機能障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 精神分裂病、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病など、 好ましくは低血圧、 肥満 症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群、 不妊症などの予防 ·治療剤として有用である。 本発明のポリべプチド A 1に対する抗体、 および本発明のポリべプチド A Γの活 性を阻害する化合物またはその塩は、 低毒性で安全な、 例えば、 高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症、 免疫 ·炎症性疾患 （例、 関節リウマチ、 変形性関節炎な ど） など、 好ましくは高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症などの予防 ·治療剤 として有用である。 本発明のポリべプチド A 2は、 プロラクチン分 、作用などを有しているため、 本発明のポリぺプチド A 2、 本発明のポリぺプチド A 2をコードするポリヌクレ ォチド、 および本発明のポリべプチド A 2の活性を促進する化合物またはその塩 は、 低毒性で安全な、 例えば、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精 嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢進症など、 好ましくは更年期障害、 甲状腺機能亢進症などの予防 ·治療剤として有用である。 本発明のポリべプチド A 2に対する抗体、 および本発明のポリべプチド A 2の活性を阻害する化合物ま たはその塩は、 低毒性で安全な、 例えば、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ · フロンメル症候群、 アルゴンッ ·デル ·カスティ口症候群、 フォーべス · アルブライ ト症候群、 リンパ腫、 シーハン症候群、 精子形成異常、 甲状腺機能不全症など、 好ましくは不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療 剤 （好ましくはプロラクチン産生抑制剤） として有用である。
本発明のポリペプチド Bは、 プロラクチン分泌作用などを有しているため、 本 発明のポリペプチド B、 本発明のポリペプチド Bをコードするポリヌクレオチド、 および本発明のポリべプチド Bの活性を促進する化合物またはその塩は、 低毒性 で安全な、 例えば、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢進症など、 好ましくは更年期障害、 甲状腺機能 亢進症などの予防 ·治療剤として有用である。 本発明のポリペプチド Bに対する 抗体、 および本発明のポリペプチド Bの活性を阻害する化合物またはその塩は、 低毒性で安全な、 例えば、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ ' フロンメル症候群、 アルゴンッ 'デル 'カスティ口症候群、 フォーべ ス ·アルブライ ト症候群、 リンパ腫、 シ一ハン症候群、 精子形成異常、 甲状腺機 能不全症など、 好ましくは不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療剤 （好ま しくはプロラクチン産生抑制剤） として有用である。
また、 本発明の蛋白質のァゴニストは、 例えば、 低血圧症の予防 ·治療剤；局 所血管収縮剤；子宮収縮促進剤；微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古 不全、 人工妊娠中絶、 分娩誘発、 分娩停止、 子宮頸管無力症、 子宮内反 (症）、 遺 残胎盤および遺残卵膜、 分娩後出血、 女性性器脱、 不妊症、 多胎妊娠における母 体のケア、 胎位異常、 月経困難症、 流産、 子宮内膜症、 慢性子宮炎症性疾患、 子 宮筋腫、 子宮奇形、 子宮腺筋症、 子宮頸部裂傷、 傷後ス トレス症候群などの子 宮収縮不全に関係する各種疾患の改善、 予防 ·治療剤として用いることができる。 本発明の蛋白質のアンタゴニス トは、 例えば、 高血圧症、 心筋梗塞、 急性腎不全、 ストレス性疾患 〔例、 （1) 心血管系の疾患 （例、 狭心症、 心筋梗塞、 不整脈な ど） 、 （2) 呼吸器系の疾患 （例、 気管支喘息、 過呼吸症候群など） 、 （3) 筋骨 格系の疾患 （例、 関節リウマチ、 腰痛症、 片頭痛、 緊張性頭痛など） 、 （4) 糖 尿病、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症、 慢性疼痛、 免疫力低下、 消化器系疾患
(例、 胃潰瘍、 潰瘍性大腸炎など） 〕 などの予防 ·治療剤；子宮収縮抑制剤；過 強陣痛、 偽陣痛、 遷延妊娠、 強直性子宮収縮、 胎児仮死、 子宫破裂、 頸菅裂傷、 早産、 子宮筋腫、 子宮奇形、 子宮腺筋症、 娩出力異常、 慢性子宮炎症性疾患、 多 胎妊娠における母体のケア、 胎位異常、 Prader-Willi症候群、 月経困難症など 子宮収縮過多に関係する各種疾患の改善、 予防 ·治療剤として有用である。
本発明のポリペプチド、 本発明のポリべプチドの活性を促進または阻害する化 合物、 上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ うる化合物等の塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる。 例えば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基 性または酸性ァミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリゥム塩、 力リゥム塩などの アルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 な らびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァ ミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノー ノレアミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァ ミン、 N， N'—ジベンジ^/エチレンジァミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸な どとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル 酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンス ルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル チニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えばァス パラギン酸、 グルタミン酸などとの塩があげられ 。
本発明のポリべプチド、 本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、 本発明のポリべプチドの活性を促進または阻害する化合物、 本発明のポリべプチ ドに対する抗体、 上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用 いて得られうる化合物またはその塩等を上述の医薬として使用する場合、 常套手 段に従って実施することができる。 例えば、 必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施 した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸 濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物またはその 塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和 することによって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示 された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 力プセノレ剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ノレロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような 膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカ リンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチヱリーのような香味剤 などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料 にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成 物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方 することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえばェタノ ール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコ ール） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶 解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 (例えば、 塩ィヒベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジル アルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば温血動物 （例 えば、 ヒ ト、 モルモット、 ラット、 マウス、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サル、 ィヌ、 ニヮトリ） などに対して投与することができる。
本発明のポリべプチド A 1の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 低血圧症患者 (体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜： L 000mg、 好ま しくは約 1. 0〜300mg、 より好ましくは約 3. 0〜50mgである。 非経 口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 症状、 .投与方法などによつ ても異なるが、 たとえば注射剤の形では、 一般的に例えば、 低血圧症患者 （体重
60 k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 01〜30mg、 好ま しくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜： 10 m gを静脈注射によ り投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
本発明のポリべプチド A 2の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 更年期障害患 者 （体重 60 k gとして） においては、 ー にっき約 0. 1〜： 1000mg、 好 ましくは約 1. 0〜300mg、 より好ましくは約 3. 0〜 5 Omgである。 非 経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 症状、 投与方法などによ つても異なるが、 たとえば注射剤の形では、 一般的に例えば、 更年期障害患者 （ 体重 6 O k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましぐは約 0. 1〜 10 m gを静脈注射 により投与するのが好都合である。 他め動物の場合も、 6 O k g当たりに換算し た量を投与することができる。
本発明のポリべプチド Bの活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、 症 状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 更年期障害患者 (体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜： 1000mg、 好ま しくは約 1. 0〜300mg、 より好ましくは約 3. 0〜 5 Omgである。 非経 口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 たとえば注射剤の形では、 一般的に例えば、 更年期障害患者 （体 重 60 k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 01〜30mg、 好 ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを静脈注射に より投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した 量を投与することができる。
本発明のポリべプチド A 1の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 高血圧症患者 (体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0.：!〜 1000mg、 好ま しくは約 1. 0〜30 Omg、 より好ましくは約 3. 0〜50mgである。 非経 口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 たとえば注射剤の形では、 一般的に例えば、 高血圧症患者 （体重 60 k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 01〜30mg、 好ま しくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omgを静脈注射によ り投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量 を投与することができる。
本発明のポリぺプチド A 2の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 不妊症患者 （ 体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0.1〜100 Omg、 好まし くは約 1. 0〜300mg、 より好ましくは約 3. 0〜 5 Omgである。 非経口 的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 症状、 投与方法などによって も異なるが、 たとえば注射剤の形では、 一般的に例えば、 不妊症患者 （体重 60 k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 01〜30mg、 好ましく は約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投 与することができる。
本発明のポリべプチド Bの活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、 症 状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 不妊症患者 （体 重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. l〜1000mg、 好ましく は約 1. 0〜300mg、 より好ましくは約 3. 0〜 5 Omgである。 非経口的 に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 たどえば注射剤の形では、 一般的に例えば、 不妊症患者 （体重 6 O k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは 約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与 するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与 することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物 （特にアンタゴニス ト） またはその塩の投与量は、 症状などにより差異は あるが、 経口投与の場合、 一般的に成人の高血圧症患者 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0.1〜： L 00 Omg、 好ましくは約 1. 0〜300 mg、 より好ましくは約 3. 0〜 5 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 たとえば 注射剤の形では成人の高血圧症患者 （体重 60 k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好まし くは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物 の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 以下、 本発明のポリペプチドを含有する医薬、 本発明のポリペプチドをコード するポリヌクレオチドを含有する医薬おょぴ本発明のポリべプチドに対する抗体 を含有する医薬について、 より具体的に説明する。
(本発明のポリぺプチドを含有する医薬）
本発明のポリペプチド A 1は、 例えば、 消化管収縮作用、 平滑筋収縮作用、 血 圧上昇作用、 摂食抑制作用、 プロラクチン分泌低下作用などを有し、 概日リズム における位相の進みおよび遅れに関連している。 よって、 本発明のポリペプチド A1は、 低毒性で安全な、 例えば低血圧、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外因性 肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満 など） 、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群、 不妊症などの予防 ·治療剤として有用で ある。
本発明のポリべプチド A 2は、 プロラクチン分泌作用などを有しているため、 本発明のポリペプチド A 2は、 低毒性で安全な、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症 などの予防 ·治療剤として有用である。 本発明のポリペプチド Bは、 プロラクチン分泌 用などを有しているため、 本 発明のポリペプチド Bは、 低毒性で安全な、 例えば、 更年期障害、 甲状腺機能亢 進症などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドの塩としては、 上記したものが挙げられ、 上記したもの が好ましい。
本発明のポリペプチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なくと も 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましく は 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドを上記の医薬 （予防 ·治療剤など） として使用する場合、 上記した方法など、 公知の方法に従って製剤化することができる。
例えば、 本発明のポリペプチドは、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 または水 もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤など の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のポリペプチドを生理学 的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤など とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することに よつて製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲 の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセノレ剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチヱリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェタノ ールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレシグリコール、 ポリエチレング リコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 80ΤΜ、 Η CO— 50など） などと併用してもよレ、。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大 豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール などと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウ ム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インな ど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
こめようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
本発明のポリペプチド A 1の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投 与の場合、 一般的に、 例えば、 低血圧症患者 （体重 6 O k gとして） においては、 —日につき約 0. 1〜： L 00 Omg、 好ましくは約 1. 0〜300mg、 より好 ましくは約 3. 0〜 5 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与 量は投与対象、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 たとえば注射剤の形で は、 一般的に、 例えば、 低血圧症患者 （体重 60 k gとして） への投与において は、 一日につき約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好 ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチド A 2の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投 与の場合、 一般的に、 例えば、 更年期障害患者 （体重 60 k gとして） において は、 一日につき約 0. 1〜： L 000mg、 好ましくは約 1. 0〜300mg、 よ り好ましくは約 3. 0〜5 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回 投与量は投与対象、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 たとえば注射剤の 形では、 一般的に、 例えば、 更年期障害患者 （体重 60 k gとして） への投与に おいては、 一日につき約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチド Bの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与 の場合、 一般的に、 例えば、 更年期障害患者 （体 6 O k gとして） においては、 一日にっき約 0. 1〜： L O O Omg、 好ましくは約 1. 0〜300mg、 より好 ましくは約 3. 0〜50mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与 量は投与対象、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 たとえば注射剤の形で は、 一般的に、 例えば、 更年期障害患者 （体重 60 k gとして） への投与におい ては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より 好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 (本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有する医薬） 本発明のポリペプチド A 1は、 例えば、 消化管収縮作用、 平滑筋収縮作用、 血 圧上昇作用、 摂食抑制作用、 プロラクチン分泌低下作用などを有し、 概日リズム における位相の進みおよび遅れに関連している。 よって、 本発明のポリペプチド A 1をコードするポリヌクレオチドは、 低毒性で安全な、 例えば低血圧、 肥満症 、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群、 不妊症などの予防 ·治療剤として有用である。 本発明のポリぺプチド A 2は、 プロラクチン分泌作用などを有しているため、 本発明のポリペプチド A 2をコードするポリヌクレオチドは、 低毒性で安全な、 例えば、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症などの予防 ·治療剤として有用である。 本発明のポリペプチド Bは、 プロラクチン分泌作用などを有しているため、 本 発明のポリペプチド Bをコードするポリヌクレオチドは、 低毒性で安全な、 例え ば、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明のポリヌクレチドは、 例えば、 生体内において本発明のポリペプチドが 減少あるいは欠損している患者がいる場合に、 （i) 本発明のポリヌクレオチド を該患者に投与し、 生体内で本発明のポリぺプチドを発現させることによって、 または （ii) 細胞に本発明のポリヌクレオチドを挿入し、 本発明のポリペプチド を発現させた後に、 該細胞を患者に移植することなどによって、 該患者における 本発明のポリペプチドの役割を十分に、 あるいは正常に発揮させることができる 本発明のポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合、 上記し た方法など、 公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
例えば、 該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノ ウィルスベクター、 アデノウィルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適 当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒ トまたは温血動物に投与する ことができる。 本発明のポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進の ための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃ゃハ イド口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 また、 本発明の ポリヌクレオチド （例、 D N A) が挿入されたベクターは、 上記した本発明のポ リペプチドと同様に製剤化することができ、 通常、 非経口的に使用される。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ タ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することができる。 本発明のポリべプチド A 1をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク レオチドの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 一般的に例えば、 低血圧症 患者 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0 . l〜1 0 0 m gであ る。
本発明のポリぺプチド A 2をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク レオチドの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 一般的に例えば、 更年期障 害患者 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0 . l〜1 0 0 m gで ある。
本発明のポリべプチド Bをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレ ォチドの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 一般的に例えば、 更年期障害 患者 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0 . l〜1 0 0 m gであ る。
(本発明のポリペプチドに対する抗体を含有する医薬）
本発明のポリペプチド A 1は、 例えば、 消化管収縮作用、 平滑筋収縮作用、 血 圧上昇作用、 摂食抑制作用、 プロラクチン分泌低下作用などを有し、 概日リズム における位相の進みおょぴ遅れに関連している。 よって、 本発明のポリペプチド A 1に対する抗体は、 低毒性で安全な、 例えば、 高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明のポリペプチド A 2は、 プロラクチン分泌作用などを有しているため、 本発明のポリペプチド A 2に対する抗体は、 低毒性で安全な、 例えば、 不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明のポリペプチド Bは、 プロラクチン分泌作用などを有しているため、 本 発明のポリペプチド Bに対する抗体は、 低毒性で安全な、 例えば、 不妊症、 甲状 腺機能不全症などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明の抗体 （例、 中和抗体） を上記医薬 （治療 ·予防剤など） として用いる 場合には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま液 剤とレて、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒ トまたは哺乳動物 （例、 ラ ット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的ま たは非経口的 （例、 血管内投与、 皮下投与など） に投与することができる。 好ま しくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物とし て投与しても良い。 医薬組成物は、 上記した方法など、 公知の方法に従って調製 することができる。 例えば、 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗 体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含む ものであっても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する 剤形として提供される。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 (糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 (ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 この ような組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる. 担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤とし ては、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が用 いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射 剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調製で きる。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記本発明の抗体または その塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁また は乳化することによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食 塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリ コール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 HCO— 5 0 (polyoxyethylene ( o 0 mol ) adduct of hydrogenated castor oil) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油 等が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併 用してもよい。 調製された注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好まし レ、。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に 混合することによって調製されても良い。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤が挙げ られる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜50 Omg程度、 とりわけ注射剤では 5〜 100 m g程度、 その他の剤形では 10〜250mg程 度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
- 本発明のポリペプチド A 1に対する抗体の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症 状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 高血圧症患者の治療のために 使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 01〜20mg/k g体重程度、 好ましくは 0. 1〜： L OmgZk g体重程度、 さらに好ましくは 0 . l〜5mgZk g体重程度を、 1 日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程 度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与 の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 そ の症状に応じて増量してもよい。
本発明のポリペプチド A 2に对する抗体の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症 状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 不妊症患者の治療のために使 用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 01〜20mg k g 体重程度、 好ましくは 0. 1〜1 OmgZk g体重程度、 さらに好ましくは 0. l~5mg/k g体重程度を、 1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度 、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の 場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その 症状に応じて增量してもよい。
本発明のポリペプチド Bに対する抗体の投与量は、 投与对象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 不 症患者の治療のために使用す る場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0 . 0 1〜2 0 m g Z k 体重 程度、 好ましくは 0 . 1〜1 O m g Z k g体重程度、 さらに好ましくは 0 . 1〜 5 m g Z k g体重程度を、 1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1日 1〜 3回程度、 静 脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合 もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状 に応じて増量してもよい。
〔3〕 本発明の抗体を用いる診断薬
上述のように、 本発明の抗体を用いることによって本発明のポリペプチドを感 度良く定量することができるので、 本発明の抗体を用いて、 本発明のポリべプチ ドに関連する各種疾患の診断をすることができる。
具体的には、 本発明のポリペプチド A 1は、 例えば、 消化管収縮作用、 平滑筋 収縮作用、 血圧上昇作用、 摂食抑制作用、 プロラクチン分泌低下作用などを有し、 概日リズムにおける位相の進みおよび遅れに関連しているので、 本発明の抗体を 用いて、 本発明のポリペプチド A 1の濃度の増加が検出された場合、 例えば、 高 血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症、 免疫 ·炎症性疾患 （例、 関節リウマチ、 変 形性関節炎など） などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断す ることができる。 また、 本発明のポリペプチド A 1の濃度の減少が検出された場 合には、 例えば、 低血圧、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシ ュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低 下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満 症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） 、 摂 食亢進症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等によ る体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 嗜眠症、 不妊症、 季 節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴 う各 ¾障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 精神分裂病、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 動脈硬 ィ匕、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明のポリべプチド A 2はプロラクチン分泌作用などを有しているので、 本 発明の抗体を用いて、 本発明のポリペプチド A 2 濃度の増加が検出された場合、 例えば、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ ' フロンメル 症候群、 アルゴンッ ·デル ·カスティ口症候群、 フォーべス ·アルブライ ト症候 群、 リンパ腫、 シーハン症候群、 精子形成異常、 甲状腺機能不全 などの疾病で ある、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明 のポリペプチド A 2の濃度の減少が検出された場合には、 例えば、 プロラクチン 分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能 亢進症などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することがで きる。 ·
本発明のポリべプチド Bはプロラクチン分泌作用などを有しているので、 本発 明の抗体を用いて、 本発明のポリペプチド Bの濃度の増加が検出された場合、 例 えば、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ · フロンメル 症候群、 アルゴンッ ·デル ·カスティ口症候群、 フォーべス ·アルブライ ト症候 群、 リンパ腫、 シーハン症候群、 精子形成異常、 甲状腺機能不全症などの疾病で ある、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明 のポリペプチド Bの濃度の減少が検出された場合には、 例えば、 プロラクチン分 泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢 進症などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができ る。
〔4〕 遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド （D NA) は、 例えば、 プローブとして使用するこ とにより、 ヒ トゃ温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ト リ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明のポ リペプチドをコードする D NAまたは m R NAの異常 （遺伝子異常） を検出する ことができるので、 例えば、 該 D N Aまたは m R NAの損傷、 突然変異あるいは 発現低下や、 該 D N Aまたは mR N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断 薬として有用であ 。
本発明の D N Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブ リダィゼーシヨンや P C R— S S C P法 （Genomics, 第 5卷, 874〜879頁 (1989 年)、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,第 86卷, 2766〜2770頁 (1989年)） などにより実施することができる。 本発明のポリペプチド A 1は、 例えば、 消化管収縮作用、 平滑筋収縮作用、 血 圧上昇作用、 摂食抑制作用、 プロラクチン分泌低下作用などを有し、 概日リズム における位相の進みおよび遅れに関連しているので、 例えば、 ポリペプチド A 1 の遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例えば、 高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症、 免疫 · ,炎症性疾患 （例、 関節リウマチ、 変形性関節炎など） などの疾病 である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発 明のポリペプチド A 1の遺伝子の発現減少が検出された場合は、 例えば、 低血圧、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過ィンシュリン性肥満症、 過血漿性 肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身 性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） 、 摂食亢進症、 睡眠障害 〔例、 原 発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化 症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 嗜眠症、 不妊症、 季節鬱病、 生殖機能障害、 内分 泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 精神分裂 病、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高 いと診断することができる。
本発明のポリべプチド A 2は、 プロラクチン分泌作用などを有しているので、 例えば、 ポリペプチド A 2の遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例えば、 下 垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ · フロンメル症候群、 アルゴンヅ .デル .カスティ口症候群、 フォーべス ·アルブライ ト症候群、 リン パ腫、 シーハン症候群、 精子形成異常、 甲状腺機能不全症などの疾病である、 ま たは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明のポリべ プチド A 2の遺伝子の発現減少が検出された場合は、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢進症などの疾 病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 本発明のポリペプチド Bは、 プロラクチン分泌 用などを有しているので、 例 えば、 ポリペプチド Βの遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例えば、 下垂体 腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 イン ポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ ♦フロンメル症候群、 アル ゴンッ ·デル ·カスティ口症候群、 フォーべス ·アルブライ ト症候群、 リンパ腫、 シーハン症候群、 精子形成異常、 甲状腺機能不全症などの疾病である、 または将 来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明のポリペプチド Βの遺伝子の発現減少が検出された場合は、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機 能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢進症などの疾病であ る、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
〔 5〕 ァンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬およぴ診断薬
本発明のポリべプチド A 1または本発明の蛋白質をコードする D NA (以下 「本発明の D NA (A 1 ) 」 という）に相補的に結合し、 該 D NAの発現を抑制 することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体 內における本発明のポリペプチド A 1または本発明の D N A (A 1 ) の機能を抑 制することができるので、 例えば、 高血圧症、 心筋梗塞、 急性腎不全、 ストレス 性疾患 〔例、 （1) 心血管系の疾患 （例、 狭心症、 心筋梗塞、 不整脈など） 、
(2) 呼吸器系の疾患 （例、 気管支喘息、 過呼吸症候群など） 、 （3) 筋骨格系の 疾患 （例、 関節リウマチ、 腰痛症、 片頭痛、 緊張性頭痛など） 、 （4) 糖尿病、 更年期障害、 慢性疼痛、 免疫力低下、 消化器系疾患 （例、 胃潰瘍、 潰瘍性大腸炎 など） 〕 などの予防 ·治療剤；子宮収縮抑制剤；過強陣痛、 偽陣痛、 遷延妊娠、 強直性子宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 頸菅裂傷、 早産、 子宮筋腫、 子宮奇形、 子宮腺筋症、 娩出力異常、 慢性子宮炎症性疾患、 多胎妊娠における母体のケア、 胎位異常、 Prader-Willi症候群、 月経困難症など子宮収縮過多に関係する各種 疾患の改善、 予防 ·治療剤；摂食 （食欲） 促進剤；拒食症；不眠症；免疫 ·炎症 性疾患 （例、 関節リウマチ、 変形性関節炎など） など、 好ましくは高血圧、 拒食 症、 更年期障害、 不眠症、 免疫 ·炎症性疾患など、 より好ましくは高血圧、 拒食 症、 更年期障害、 不眠症の予防 ·治療剤などの予防 ·治療剤などとして使用でき る。
本発明のポリペプチド A 2をコードする D NA (以下 「本発明の D NA (A 2 ) J という）に相補的に結合し、 該 D N Aの発現'を抑制することができる本発 明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発明のポ リペプチド A 2または本発明の D N A (A 2 ) の機能を抑制することができるの で、 例えば、 不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療剤などとして使用でき る。
本発明のポリペプチド Bをコードする D N A (以下 「本発明の D NA (B ) 」 という）に相補的に結合し、 該 D N Aの発現を抑制することができる本発明のァ ンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発明のポリぺプ チド Bまたは本発明の D N A (B ) の機能を抑制することができるので、 例えば、 不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療剤などとして使用できる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合、 公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
例えば、 該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、 該アンチセンスポリ ヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウィルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに揷入 した後、 常套手段に従って、 ヒ トまたはその他の哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に 投与することができる。 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 そのままで、 ある レ、は摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 該アンチセンス ·ポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 高血圧症の治療の目的で本発明のアンチ センスポリヌクレオチドを腎臓に局所投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 k g ) においては、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0 . 1〜1 0 O m g投与する。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブと して使用することもできる。 該アンチセンスポリヌクレオチドを用いた診断は、 上記の遺伝子診断薬と同様にして実施することができる。
(RNAi、 リボザィム） 本発明は、 さらに
(1) 本発明のポリぺプチド A 1をコードする RN Aの一部を含有する二重鎖 R NA；
(2) 前記 （1) 記載の二重鎖 RNAを含有してなる医薬；
(3) 本発明のポリペプチド A 1をコードする RN Aの一部を含有するリボザィ ム；
(4) 前記 （3) 記載のリボザィムを含有してなる医薬；
(5) 本発明のポリべプチド A 2をコードする RN Aの一部を含有する二重鎖 R NA；
(6) 前記 （5) 記載の二重鎖 RNAを含有してなる医薬；
(7) 本発'明のポリべプチド A 2をコードする RN Aの一部を含有するリボザィ ム；
(8) 前記 （7) 記載のリボザィムを含有してなる医薬；
(9) 本発明のポリべプチド Bをコードする RN Aの一部を含有する二重鎖 RN A；
(10) 前記 （9) 記載の二重鎖 RNAを含有してなる医薬；
(1 1) 本発明のポリペプチド Bをコードする RN Aの一部を含有するリボザィ ム；
(1 2) 前記 （1 1) 記載のリボザィムを含有してなる医薬；
を提供する。
これらの二重鎖 RNA (RNAi； RNA interference法） 、 リボザィムなどは、 上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のポリヌクレオチド （例、 DNA) の発現を抑制することができ、 生体内における本発明のポリペプチドま たは本発明のポリヌクレオチド （例、 DNA) の活性や機能を阻害することがで きる。
したがって、 前記 （1) 記載の二箪鎖 RN Aおよび前記 （3) 記載のリボザィ ムは、 例えば、 高血圧症、 心筋梗塞、 急性腎不全、 ス トレス性疾患 〔例、 （1) 心血管系の疾患 （例、 狭心症、 心筋梗塞、 不整脈など） 、 （2) 呼吸器系の疾患 (例、 気管支喘息、 過呼吸症候群など） 、 （3) 筋骨格系の疾患 （例、 関節リウ マチ、 腰痛症、 片頭痛、 緊張性頭痛など） 、 （4) 糖尿病、 更年期障害、 慢性疼 痛、 免疫力低下、 消化器系疾患 （例、 胃潰瘍、 潰瘍性大腸炎など） 〕 などの予 防 ·治療剤；子宮収縮抑制剤；過強陣痛、 偽陣痛、'遷延妊娠、 強直性子宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 頸菅裂傷、 早産、 子宮筋腫、 子宮奇形、 子宮腺筋症、 娩出 力異常、 慢性子宮炎症性疾患、 多胎妊娠における母体のケア、 胎位異常、
Prader-Willi 症候群、 月経困難症など子宮収縮過多に関係する各種疾患の改善、 予防 ·治療剤；摂食 （食欲） 促進剤；拒食症；不眠症；免疫 ·炎症性疾患 （例、 関節リウマチ、 変形性関節炎など） など、 好ましくは高血圧、 拒食症、 更年期障 害、 不眠症、 免疫 ·炎症性疾患など、 より好ましくは高血圧、 拒食症、 更年期障 害、 不眠症の予防 ·治療剤などの予防 ·治療剤などとして使用できる。
また、 前記 （5) 記載の二重鎖 RN Aおよび前記 （7) 記載のリボザィムは、 例えば、 不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療剤 （好ましくはプロラクチ ン産生抑制剤） などとして使用できる。
さらに、 前記 （9) 記載の二重鎖 RN Aおよび前記 （1 1) 記載のリボザィム は、 例えば、 不妊症、 甲状腺機能不全症などの予防 ·治療剤 （好ましくはプロラ クチン産生抑制剤） などとして使用できる。
二重鎖 RNAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 リボザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7卷， 221 頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 本発明のペプチドをコードする RNAの一部に公知 のリボザィムを連結することによって製造することができる。 本発明のペプチド をコードする RNAの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され得る本 発明の RNA上の切断部位に近接した部分 （RNA断片） が挙げられる。 " 上記の二重鎖 RNAまたはリボザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
〔6〕 DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のポリペプチドをコードする DNA (以下、 本発明 の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DNA と略記する場合がある） を有する非ヒ ト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ ト哺乳動物、 (2) 非ヒ ト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ ト哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒ ト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフヱクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作出することがで きる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により 融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒ ト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57B LZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F 1系統， BDF 1系 統， B 6D 2 F 1系統， BALB/c系統， I CR系統など） またはラット （例 えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒ ト哺乳動物の他にヒ トなどがあげられる。
本発明の外来性 DN Aとは、 非ヒ ト哺乳動物が本来有している本発明の DN A ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DN Aをいう。 . 本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DNAの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置 換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DNAとしては、 異常な本発明のポリペプチドを発現させる DNAを意 味し、 例えば、 正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発 現させる DNAなどが用いられる。 '
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの (^乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DN Aを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒ ト D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒ ト DN Aを結合した DNAコンストラク ト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯 草菌由来のプラスミ ド、 酵母由来のプラスミ ド、 えファージなどのパクテリオフ ァージ、 モロニ一白血病ゥイノレスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウイノレスま たはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌 由来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミ ドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが 好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 1)ウィルス (例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウイノレス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモー ター、 2)各種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋ク レアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 グルタチオン S—トランスフ ヱラーゼ、 血小板由来成長因子 i3、 ケラチン Kl， 1：10ぉょび1^14、 コラー ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ j3 Iサブュ ニッ ト、 ジス トロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリ ゥム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略され る） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタロプ ロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H- r a s、 レニン、 ドーパミン 一水酸化酵素、 甲状腺 ルォキシダーゼ （T PO) 、 ペプチド鎖延長因子 la (E F- 1 α) 、 βァクチン、 ひおよび i3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Th y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 cァクチン、 プレプロエンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現す ることが可能なサイ トメガロウィルスプロモ"ター、 ヒ 卜ペプチド鎖延長因子 1 a (E F- 1 a) のプロモーター、 ヒ トおよびニヮトリ ]3ァクチンプロモーター などが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列 （一般にターミネータ一と呼ばれる） を有していること が好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を 用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV4 0ターミネータ一な どが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5， 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 ' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、 ヒ トまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モ モット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の月干 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAラ イブラリーよりゲノム DN Αの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常なポリべプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により 変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DN Aコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞おょぴ体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが #在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒ ト哺乳動物は、 交配により外来性 D NAを安定に保持することを確認して、 該' D NA保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する。 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒ ト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のポリべプチドの機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物とし て利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 本発 明のポリぺプチドの機能亢進症や、 本宪明のポリぺプチドが関連する疾患の病態 機序の解明おょぴこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 本発明のポリぺプ チドの增加症状を有することから、 本発明のポリべプチドに関連する疾患に対す る予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。 例えば、 外来.性の本 発明のポリペプチド A 1をコードする D N A (以下、 本発明の外来性 D N A (A 1 ) と略記する） を転移させた哺乳動物は、 本発明のポリペプチド A 1の増加症 状を有することから、 本発明のポリペプチド A 1に関連する疾患 （例、 高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症など） に対する予防 ·治療剤のスクリーニング試験 にも利用可能である。 外来性の本発明のポリペプチド A 2をコードする D NA (以下、 本発明の外来性 D N A (A 2 ) と略記する） を転移させた哺乳動物は、 本発明のポリぺプチド A .2の増加症状を有することから、 本発明のポリぺプチド A 2に関連する疾患 （例、 不妊症、 甲状腺機能不全症など） に対する予防 '·治療 剤のスクリーニング試験にも利用可能である。 外来性の本発明のポリペプチド B をコードする D NA (以下、 本発明の外来性 D NA (B ) と略記する） を転移さ せた哺乳動物は、 本発明のポリペプチド B'の増加症状を有することから、 本発明 のポリペプチド Bに関連する疾患 （例、 不妊症、 甲状腺機能不全症など） に対す る予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒ ト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミ ドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラク 卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D NAを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒ ト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のポリぺプチドの機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物 として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本発明のポリべプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を 治療方法の検討を行うことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本 ¾明の異常 D NA高発現動物は、 本発 明のポリべプチドの機锥不活性型不応症における本発明の異常ポリべプチドによ る正常ポリペプチドの機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルと なる。
また、 本発明の外来性異常 D NAを転移させた哺乳動物は、 本発明のポリぺプ チドの機能不活性型不能症状を有することから、 本発明のポリべプチドの機能不 活性型不応症に対する予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。 例えば、 外来性の本発明のポリべプチド A 1をコードする D N Aの異常 D NA (以下、 本発明の外来性異常 D NA (A 1 ) と略記する） を転移させた哺乳動物 は、 本発明のポリペプチド A の機能不活性型不能症状を有することから、 本発 明のポリペプチド A 1の機能不活性型不応症 （例、 低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時 間帯域変化症候群、 不妊症など） に対する予防 ·治療剤のスクリー ング試験に も利用可能である。 外来性の本発明のポリべプチド A 2をコードする D NAの異 常 D NA (以下、 本発明の外来性異常 D NA (A 2 ) と略記する） を転移させた 哺乳動物は、 本発明のポリぺプチド A 2の機能不活性型不能症状を有することか ら、 本発明のポリペプチド A 2の機能不活性型不応症 （例、 更年期障害、 甲状腺 機能亢進症など） に対する予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能であ る。 外来性の本発明のポリペプチド Bをユードする D N Aの異常 D NA (以下、 本発明の外来性異常 D N A (B ) と略記する） を転移させた哺乳動物は、 本発明 のポリペプチド Bの機能不活性型不能症状を有することから、 本発明のポリぺプ チド Bの機能不活性型不応症 （例、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症など） に対す る予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。 .
また、 上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
1) 組織培養のための細胞源としての使用、
2) 本発明の D N A転移動物の組織中の D N Aもしくは R NAを直接分析する力、 または D N Aにより発現されたぺプチド組織を分析することによる、 本発明のポ リペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するぺプチドとの関連性について の解析、
3) D N Aを有する組織の細胞を標準組 培養技術により培養し、 これらを使用 して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
4) 上記 3) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のス クリーユング、 および
5) 本発明の変異ポリべプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D N A転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドの機能不活 性型不応症などを含む、 本発明のポリぺプチドに関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、 本発明のポリペプチドに関 ίする疾患モデル 各臓器にお げるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾 患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の DN Α転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのポリペプチド分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その培養ま たはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のポリべ プチド産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 または それらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本発明のポリべプチドぉよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DN A転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドの機能不活 性型不応症を含む、 本発明のポリぺプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行な うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬 のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動 物または本発明の外来性 DN A発現べクタ一を用いて、 本発明のポリぺプチドが 関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。
〔7〕 ノックァゥト動物
本発明は、 本発明の DN Aが不活性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞および本 発明の DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
1) 本発明の DN Aが不活性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞、
2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の _ガラク トシダーゼ遺伝 子） を導入することにより不活性化された第 1) 項記載の胚幹細胞、
3) ネオマイシン耐性である第 1) 項記載の胚幹細胞、
4) 非ヒ ト哺乳動物がゲッ歯動物である第 1) 項記載の胚幹細胞、
5) ゲッ歯動物がマウスである第 4) 項記載の胚幹細胞、
6) 本発明の DN Aが不活性化された該 DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物、
7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3—ガラク トシダーゼ遺伝 子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN A に対するプロモーターの制御下で発現しうる第 6) 項記載の非ヒ ト哺乳動物、
8) 非ヒ ト哺乳動物がゲッ歯動物である第 6) 項記載の非ヒ ト哺乳動物、 9) ゲッ歯動物がマウスである第 8) 項記載の非ヒ ト哺乳動物、 および
10) 第 7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を 検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進また は阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒ ト'哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒ ト哺乳 動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のポリべプチド Aの 活性を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のポリべプチド Aの発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがあ る） 非ヒ ト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒ ト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DNA配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェクソンの機能を破壊することに より本発明のノックァゥト DN Aを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 E S細胞または本発明のノックァゥト ES細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒ ト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z ( —ガラク トシダーゼ遺伝 子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代 表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりェ ソンの機能を破壊する力、 あるいはェクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 (例えば、 poly A付加シグナルなど） を挿入し、 完全な mRN Aを合成できなく することによ-つて、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DN A配列を有す る DNA鎖 （以下、 タ一ゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換 え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発明の DNA 上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーショ ン解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とターゲッティングべ クタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列をプライマー とした PC R法により解析し、 本発明のノックァゥ'ト E S細胞を選別することに より得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の E S細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知の Evansと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウス の ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の E S細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的 背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C57BLZ6マウス や C 57 B /6の採卵数の少なさを138 2との交雑により改善した B D F 1マウス （C 57 B LZ6と DB A/2との F1) を用いて樹立したものなども 良好に用いうる。 BDF1マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるとい う利点に加えて、 C 57 B LZ6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られ た E S細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C57BL/6マウスとバック クロスすることでその遺伝的背景を C57BLZ6マウスに代えることが可能で ある点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができ,る。
また、 雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初 期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で さる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例 £ば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1- 1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気ま たは 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で 培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001 -0. 5%トリプシンノ 0. 1 - 5mM EDTA, 好ましくは約 0. 1 %トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に 播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1 _ 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養 細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの 種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin プ ロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ 'サイエンス ·ユーェ スエー （proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナノレ 'ォブ ·ェンブリオ口ジー ' アンド 'ェクスぺリメ ンタノレ .モルフォロジ一、 第 87卷、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化 させて得られる本発明の D N A発現不全細胞は、 インビト口におけ本発明のポリ ペプチド Aの細胞生物学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒ ト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクターの本発明の DNAが不活性化された DNA配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックアウトさせることができる。
本発明の D N Aがノックァゥトされた細胞は、 本発明の D N A上またはその近 傍の D NA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析またはター ゲッティングベクター上の D NA配列と、 ターゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D NA以外の近傍領域の D NA配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のポリペプチド Aのへテロ発現不全個体であ り、 本発明のポリペプチド Aのへテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔 カ ら本発明のレセプタータンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。 卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒ ト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックァゥトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D NAを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。 .
本発明の D NAが不活性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒ ト哺乳動物を作出する上で、 '非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 本発明のポリペプチド Aに より誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のポリペプチド Aの生 物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原 因究明及び治療法の検討に有用である。
〔7 a〕 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 '予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷など に起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒ ト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーユング方法において用いられる本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合 物であってもよい。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。 例えば、 本発明のポリペプチド A 1をコードする D NAが不活性化された本発 明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物を用いて、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外 因性肥満、 過ィンシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥 満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半 身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中. 心性肥満など） 、 摂食亢進症等に対して治療 ·予防効果を有する化合物をスクリ 一二ングする場合、 本発明の D NA発現不全非ヒ ト哺乳動物に糖負荷処置を行な レ、、 糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、 該動物の血糖値および体 重変化などを経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の血糖値が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上低下した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効果を有 する化合物として選択することができる。
また、 例えば、 本発明のポリペプチド A 2をコードする D NAが不活性化され た本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物を用いて、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢進症などに対 して治療 ·予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D NA 発現不全非ヒ ト哺乳動物に試験化合物を投与し、 試験化合物非投与群とプロラク チン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺 機能亢進症などの発症度合いの違いや血中プロラクチン濃度の違いを経時的に観 察する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の血中プロラクチン濃度が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より 好ましくは約 5 0 %以上増加した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治 療 ·予防効果を有する化合物として選択することができる。
また、 例えば、 本発明のポリペプチド Bをコードする D NAが不活性化された 本発明の D NA発現不全非ヒ ト哺乳動物を用いて、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢進症などに対 して治療 ·予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D NA 発現不全非ヒ ト哺乳動物に試験化合物を投与し、 試験化合物非投与群とプロラタ チン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺 機能亢進症の発症度合レ、の違レ、や血中プロラクチン濃度の違レ、を経時的に観察す る。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の血中プロラクチン濃度が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より 好ましくは約 5 0 %以上増加した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治 療 ·予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 本発明のポリペプチド Aの欠損や損傷などによって引き起 こされる疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒 性な治療 ·予防剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリ 一ユングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられ る。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のポリぺプチド Aを含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまた はその他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 对象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） の肥満症患者においては、 一日につき該化合物を約 0 . 1〜1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜 5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜 2 0 m g投 与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾 患などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常成人 （6 0 k gとして） の肥満症患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0 . 0 1〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、' より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
〔7 b〕 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝 子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 i3—ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ エラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DNAをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のポリべプチド Aをコードする DN A領域の一部を大腸菌由来 の ]3—ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明 のポリぺプチド Aの発現する組織で、 本発明のポリぺプチド Aの代わりに 3—ガ ラク トシダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5_ブロモ— 4—クロ口 _3 f ンドリル一 i3—ガラクトピラノシド （X— g a 1 ) のような /3—ガラクトシダー ゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のポリべプチド Aの動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明 のポリペプチド A欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒ ドなどで固 定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を 1 m M E D T A/ P B S溶液で洗浄することによって、 i3 _ガラクトシダーゼ反応 を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D NAに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸 など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし い。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
本発明のポリべプチド A 1をコードする D NAに対するプロモーター活性を促 進する化合物またはその塩は、 本発明のポリペプチド A 1の発現を促進し、 該ぺ プチドの機能を促進することができるので、 例えば、 低血圧、 肥満症 （例、 悪性 肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥 満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） 、 摂食亢進症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日 リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボ ケ） など） 〕 、 嗜眠症、 不妊症、 季節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾患、 老人性 痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 精神分裂病、'アルコール 依存症、 パーキンソン病、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
本発明のポリべプチド A 2をコードする D NAに対するプロモーター活性を促 進する化合物またはその塩は、 本発明のポリペプチド A 2の発現を促進し、 該ぺ プチドの機能を促進することができるので、 例えば、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢進症などの予 防 ·治療剤などの医薬として有用である。 '
本発明のポリべプチド Bをコードする D NAに対するプロモーター活性を促進 する化合物またはその塩は、 本発明のポリペプチド Bの発現を促進し、 該ぺプチ ドの機能を促進することができるので、 例えば、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵 巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害など） 、 甲状腺機能亢進症などの予 防 ·治療剤などの医薬として有用である。
また、 本発明のポリペプチド A 1'をコードする D NAに対するプロモーター活 性を阻害する化合物またはその塩は、 本発明の.ポリべプチド A 1の発現を阻害し、 該ペプチドの機能を阻害することができるので、 例えば、 摂食 （食欲） 促進剤； 高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症、 免疫 ·炎症性疾患 （例、 関節リウマチ、 変形性関節炎など） などの安全で低毒性な予防 ·治療剤などの医薬として有用で ある。
また、 本発明のポリぺプチド A 2をコードする D NAに対するプロモーター活 性を阻害する化合物またはその塩は、 本発明のポリべプチド A 2の発現を阻害し、 該ペプチドの機能を阻害することができるので、 例えば、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫 瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 インポテンス、 無月 経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ ' フロンメル症候群、 アルゴンッ 'デル · カスティ口症候群、 フォーべス 'アルブライ ト'症候群、 リンパ腫、 シーハン症候 群、 精子形成異常、 甲状腺機能不全症などの安全で低毒性な予防 ·治療剤 （好ま しくはプロラクチン産生抑制剤） などの医薬として有用である。
また、 本発明のポリべプチド Bをコードする D NAに対するプロモーター活性 を阻害する化合物またはその塩は、 本発明のポリペプチド Bの発現を阻害し、 該 ペプチドの機能を阻害することができるので、 例えば、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ · フロンメル症候群、 アルゴンッ ·デル ·カステ イロ症候群、 フォーべス ·アルブライト症候群、 リンパ腫、 シーハン症候群、 精 子形成異常、 甲状腺機能不全症などの安全で低毒性な予防 ·治療剤 （好ましくは プロラクチン産生抑制剤） などの医薬として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のポリぺプチド Aまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまた はその他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進する 化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 k gとして） の肥満症患者 においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0 〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する 場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物を注射剤の 形で通常成人 （60 k gとして） の肥満症患者に投与する場合、 一日につき該化 合物を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは 約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場 合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
一方、 例えば、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物を 経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） の拒食症患者において は、 一日につき該化合物を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Om g、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常 成人 （6 O k gとして） の拒食症患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0.. 1 〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物は、 本発明の DNAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のポリべプチドのプロモーター領域を含有する DNAを使って、 その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に 注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子導入動物） を作成すれば、 特 異的にそのポリペプチドを合成させ、 その生体での作用を検討することも可能と なる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これ が発現するような細胞株を樹立すれば、 本'発明の蛋白質そのものの体内での産生 能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使 用できる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号めるレヽは当該 分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に 関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリボ核酸
c DNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ： グァニン
C ： シトシン
Y ：チミンまたはシトシン
N ：チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァニン
R ：アデニンまたはグァニン
M ： シトシンまたはアデニン
W ：チミンまたはアデニン
S ： シトシンまたはグァニン
RNA ： リボ核酸
mRNA ： メッセンジャーリボ核酸
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸 EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SD S ： ドデシル硫酸ナトリウム
TF A ： トリフルォロ酢酸
E I A ：ェンザィムィムノアッセィ
G 1 yまたは G ： グリシン
A 1 aまたは A ：ァラニン
V a 1または V ： ノ リン
L e uまたは; L ： ロイシン
I 1 eまたは I ： イソロイシン
S e rまたは S ： セリン
Th rまたは T ： スレ才ニン
C y sまたは C ： システィン
Metまたは M ：メチォニン
G 1 uまたは E ： グルタミン酸
A s pまたは D ：ァスパラギン酸
L y sまたは K ： リジン
A r gまたは R ： アルギニン
H i sまたは H ： ヒスチジン
P h eまたは F ： フエニノレアラニン
T y rまたは Y ：チロシン
T r pまたは W ： トリブトファン
P r oまたは P ：プロリン
A s nまたは N ：ァスパラギン
G 1 nまたは Q ：グノレタミン
p G 1 u ： ピログノレタミン酸
Me ：メチル基
Et ：ェチル基
B u ：ブチル基
P h ： フエ二ノレ基
TC ：チアゾリジンー4 (R) —カルボキサミ ド基
B om ：ベンジルォキシメチル NMP ： N—メチルピロリ ドン
PAM ： フエ二ルァセトアミ ドメチル また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。 · o s ： P—トノレエンスノレフォニノレ
HONB ： N—ヒ ドロキシ— 5—ノルボルネンー 2， 3—ジカルボキ シィミ ド
B z 1 ベンジル
Z ベンジルォキシカルボニル
B r— Z 2—ブロモペンジノレオキシカノレポ二ノレ
C 1一 Z 2 _クロ
Figure imgf000110_0001
B o c t—ブチノレオキシカノレボニノレ
HOBt 1—ヒ ドロキシベンズトリァゾール
DCC N、 N'—ジシク口へキシルカノレポ'ジィミ ド
TFA トリフルォロ酢酸
l· mo c N— 9—フノレオレニノレメ トキシカノレボニノレ
DNP ジニト口フエ二ノレ
B um ターシャリーブトキシメチル
T r t トリチル
B S A ゥシ血清アルブミン
CHAP S 3 -[ (3—コラミ ドプロピル） ジメチルアンモニォ]— プロパンス ホナート
PMS F ： フエ二ルメチルスルホニルフノレオリ ド
Ε 64 (L - 3— trans—カノレボキォキシラン一 2—力ノレボニ ル） L一口イシル—ァグマチン
GDP グアノシン一 5'—ニリン酸
ΜΕΜα ァ
F u r a - 2 AM 1- [6-ァミノ _2_ (5-力ルポキシ- 2-ォキサゾリノレ） -5 -べンゾ フラニ口キシ] -2- (2-ァミノ- 5メチルフエノキシ） -エタン- N, N, Ν' , N， -四酢酸べ ンタァセトキシメチノレエステノレ HB S S ：ハンクス平衡塩液
F 1 U O— 3AM ： 1- [2 -ァミノ- 5 -（2, 7-ジクロロ- 6-ヒ ドロキシ- 3-ォキシ -9 - キサンテュル）フエノキシ] -2- (2-ァミノ- 5-メチルフエノキシ）エタン- Ν,Ν,Ν'，Ν'-四酢酸ペンタァセトキシメチルエステノレ
HEPES ： 2— [4— (2—ヒ ドロキシェチル） 一 1—ピぺラジュル] エタンスノレホン酸
Me Β ζ 1 ： 4ーメチノレべンジル
NMP ： N—メチルピロリ ドン 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒ トニユーロメジン Sのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ラットニユーロメジン Sのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
マウスニューロメジン Sのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
ヒ トニユーロメジン S前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5〕
ラットニユーロメジン S前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
マウスニューロメジン S前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7〕
ヒ トニユーロメジン S N末ぺプチドー 34のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
ヒ トニユーロメジン S N末ペプチド一 37のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 9〕
ラットニユーロメジン S N末ぺプチド一 3.4のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 10〕
ラットニユーロメジン S N末ペプチド一 37のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕 マウスニューロメジン S N末ぺプチド— 34 アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 12〕
マウスニューロメジン S N末ペプチド一 37のアミノ酸配列を示す。 ■ 〔配列番号： 13〕
5 ヒ トニユーロメジン Sをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
ラットニユーロメジン Sをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
マウスニューロメジン Sをコードする DN Aの塩基配列を示す。
0 〔配列番号： 16〕
ヒ トニユーロメジン S前駆体蛋白質をコードする DN Aの塩基配列を示す。 - 〔配列番号： 17〕
ラットニユーロメジン S前駆体蛋白質をコードする DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 18〕
5 マウスニューロメジン S前駆体蛋白質をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
ヒ トニユーロメジン S N末ペプチド一 34をコードする DNAの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 20〕
0 ヒ トニューロメジン S N末ペプチド一 37をコードする DNAの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 21〕
ラットニユーロメジン S N末ぺプチド— 34をコードする DNAの塩基配列 を示す。
5 〔配列番号： 22〕
· · ラットニユーロメジン S N末ペプチド— 37をコードする DNAの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 23〕
マウスニューロメジン S N末ぺプチド— 34をコードする DNAの塩基配列0 を示す。
〔配列番号： 24〕 マウスニューロメジン S N末ぺプチドー 37 kコードする DNAの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 2 5〕
ヒ 卜 TGR 1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 6〕
ヒ 卜 TGR 1をコードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列審号： 2 7〕
ラッ卜 T G R 1のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 8]
ラッ卜 T G R 1をコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 9〕
ャウス TGR 1のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 0)
マウス TGR 1をコードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 1〕
ヒ 卜 FM— 3のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 2〕
ヒ ト FM— 3をコードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 3〕
ラッド FM— 3のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 4〕
ラット FM— 3をコードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 5〕
マウス FM— 3のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 6]
マウス — 3をコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 7〕
ヒ トニユーロメジン U N末ペプチド一 33のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 38〕
ヒ トニューロメジン U N末ペプチド一 36のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 39〕 ラットニユーロメジン U N末ペプチド一 33のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 40〕
ラットニユーロメジン U N末ペプチド一 36のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 41〕
マウスニューロメジン U N末ペプチド一 33のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 42〕
マウスニューロメジン U N末ぺプチド— 36のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 43〕
以下の実施例 1における P C R反応で使用したプライマー 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 44〕
以下の実施例 1における P CR反応で使用したプライマー 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 45〕
以下の実施例 1における PCR反応で得られたヒ トニユーロメジン S前駆体蛋 白質をコードする DNAを含む DNAの塩基配列を示す。
ほ S列番号： 46〕
以下の実施例 2における P C R反応で使用したプライマー 3の塩基配列を示す。 〔配列番号： 47〕 '
以下の実施例 2における P CR反応で使用したプライマー 4の塩基配列を示す。 〔配列番号： 48〕
以下の実施例 2における PC R反応で得られたラットニユーロメジン S前駆体 蛋白質をコードする DNAを含む DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 49〕
以下の実施例 3における P C R反応で使用したプライマー 5の塩基配列を示す。 〔配列番号： 50〕
以下の実施例 3における P C R反応で使用したプライマー 6の塩基配列を示す。 〔配列番号： 51〕
以下の実施例 3における P CR反応で得られたマウスニューロメジン S前駆体 蛋白質をコードする DN Aを含む DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 52〕
以下の実施例 10における RT— PCRで使用したプライマーの塩基配列を示 す。 〔配列番号： 5 3〕
以下の実施例 1 0における R T— P C Rで使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 5 4〕
以下の実施例 1 1における i n s i t u h y b r i d i z a t i o nでプ ローブとして使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 実施例
以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらに制 限されるものではない。
ニューロメジン Sを NMS、 ニューロメジン S N末ペプチドを NSNP、 ニューロメ ジン U N末ぺプチドを NUNPと記載することがある。 実施例 1
ヒ トニユーロメジン S前駆体蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
ヒ ト全脳由来 Marathon Ready cDNA (クロンテック社）を铸型とし、 Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa)を用い、 プライマー 1 (配列番号： 4 3 ) およびプライ マー 2 (配列番号： 4 4 ) を用いて PCR反応を行なった。 その結果、 配列番号： 4 5に示す塩基配列が得られた。
配列番号： 4 5の塩基配列には、 開始コドンである ATGから終止コドンである TGAに至る翻訳枠が存在した。 この翻訳枠から翻訳される蛋白のアミノ酸配列を 配列番号： 4に示す。 配列番号： 4には、 生理活性ペプチドがその前駆体蛋白か ら切り出されるとされる Lys- Argの配列 （Rouille, Y.ら、 Frontiers in Neuroendocrinology, 16卷、 322頁、 1995年） に続き、 ニューロメジン U
(Minaraino, N.ら、 Biochera. Biophys. Res. Co画 n - 、 130卷、 1078頁、 1985 年） と類似した、 配列番号： 1で表されるペプチド配列、 および配列番号： 7お よび配列番号： 8で表されるペプチド配列が存在した。 配列： 1のカルボキシル 末端側にはアミ ド化シグナルである Gly- Arg配列 （Rouille, Y.ら、 Frontiers in Neuroendocrinology, 16卷、 322頁、 1995年) が存在したことから、 配列番 号： 1のカルボキシル末端のアミノ酸である Asnはアミ ドであることが示唆され た。 この配列番号： 1で表されるぺプチド配列をヒ トニユーロメジン S (human neuromedin S、 本明細書中でヒ ト NMSと記載することがある） と命名した。 また、 配列番号： 7および配列番号： 8で表されるペプチド配列をそれぞれヒ トニユー ロメンン S N末ぺプナド- 34 (human neuromedin S N - terminal peptide - 34、 本 明細書中でヒ ト NSNP-34と記載することがある） およびヒ トニューロメジン S N 末ペプチド- 37 (human neuromedin S N- terminal peptide_37、 本明細書中でヒ ト NSNP-37と記載することがある） と命名した。 実施例 2
ラットニユーロメジン S前駆体蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
ラット全脳由来 Marathon Ready cDNA (ク口ンテック社）を铸型とし、 Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa)を用い、 プライマー 3 (配 !j番号： 4 6 ) およびプライ マー 4 ほ己列番号： 4 7 ) を用いて PCR反応を行なった。 その結果、 配列番号： 4 8に示す塩基配列が得られた。
配列番号： 4 8の塩基配列には、 開始コドンである ATGから終止コドンである TAGに至る翻訳枠が存在した。 この翻訳枠から翻訳される蛋白のアミノ酸配列を 配列番号： 5に示す。 配列番号： 5には、 生理活性ペプチドがその前駆体蛋白か ら切り出されるとされる Lys- Argの配列 （Rouille, Y.ら、 Frontiers in
Neuroendocrinology、 16卷、 322頁、 1995年） に続き、 ニューロメジン U
(Minamino, N.ら、 Biochem. Biophys. Res. Coramun.、 130卷、 1078頁、 1985 年） と類似した、 配列番号： 2で表されるペプチド配列、 および配列番号： 9お よび配列番号： 1 0で表されるペプチド配列が存在した。 配列： 2のカルボキシ ル末端側にはアミ ド化シグナルである Gly- Arg配列 （Rouille, Y.ら、 Frontiers in Neuroendocrinology, 16卷、 322頁、 199 &年） が存在したことから、 配列番 号： 2のカルボキシル末端のアミノ酸である Asnはアミ ドであることが示唆され た。 この配列番号： 2で表されるペプチド配列をラットニユーロメジン S (rat neuromedin 本明細書中でラット NMSと記載することがある） と命名した。 ま た、 配列番号： 9および配列番号： 1 0で表されるペプチド配列をそれぞれラッ トニユーロメジン S N末ぺプナド- 34 、rat neuromedin S N-terminal peptide- 34、 本明細書中でラット NSNP - 34と記載することがある） およぴラットニユーロ メジン S N末ペプチド - 37 (rat neuromedin S N-terminal peptide- 37、 本明細 書中でラット NSNP-37と記載することがある） と命名した。 実施例 3
マウスニューロメジン S前駆体蛋白質をコードする遺伝子のクローニング マウス視床下部由来 mRNAより調製した cDANを铸型とし、 Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa)を用い、 プライマー 5 (配列番号： 4 9 ) およぴプライマー 6 (配列番号： 5 0 ) を用いて PCR反応を行なった。 その結果、 配列番号： 5 1 に示す塩基配列が得られた。
配列番号： 5 1の塩基配列には、 開始コドンである ATGカゝら終止コドンである TAGに至る翻訳枠が存在した。 この翻訳枠から翻訳される蛋白のアミノ酸配列を 配列番号： 6に示す。 配列番号： 6には、 生理活性べプチドがその前駆体蛋白か ら切り出されるとされる Lys - Argの配列 （Roui lle, Y.ら、 Frontiers in Neuroendocrinology、 16卷、 322頁、 1995年） に続き、 ニューロメジン U
(Minaraino, N.ら、 Biochem. Biophys. Res. Commu 、 130卷、 1078頁、 1985 年） と類似した、 配列番号： 3で表されるペプチド配列、 および配列番号： 1 1 および配列番号： 1 2で表されるぺプチド配列が存在した。 配列： 3のカルボキ シル末端側にはアミ ド化シグナルである Gly- Arg配列 （Roui lle, Y.ら、
Frontiers in Neuroendocrinology, 16卷、 322頁、 1995年） カ存在したこと力 ら、 配列番号： 3のカルボキシル末端のアミノ酸である Asnはアミ ドであること が示唆された。 この配列番号： 3で表されるペプチド配列をマウスニューロメジ ン S (mouse neuromedin S、 本明細書中でマウス NMSと記載することがある） と 命名した。 また、 配列番号： 1 1および配列番号： 1 2で表されるペプチド配列 をそれぞれマウスニューロメジン S N末ペプチド- 34 (mouse neuromedin S N- terminal peptide - 34、 本明細書中でマウス NSNP-34と記載することがある） お よびマウスニューロメジン S N末ペプチド- 37 (mouse neuromedin S N- terminal peptide-37、 本明細書中でマウス NSNP-37と記載することがある） と命名した。 実施例 4
ヒ ト FM-3またはヒ ト TGR1を発現する CH0細胞の作製
ヒ 卜 FM- 3 (GenBank accession number BC036543； 209力 ら 1420番目の塩基） および TGR1 (GenBank accession number AF242874； 1から 1240番目の塩基） を pcDNA3. 1ベクター (Invitrogen) にクローユングした後、 CH0細胞へトランスフ エタトした。 ヒ トニユーロメジン Uにより誘導される細胞内 Caイオン濃度の変 化が最も大きかった安定発現細胞株を実験に用いた。 実施例 5
NMSによるヒ ト FM-3またはヒ ト TGR1を発現する CH0細胞の細胞内 Caイオン濃 度上昇活性
FLIPRシステム (Molecular Device) を用レヽて calcium-mobilizationアツセ ィ （Kojima, M.ら、 Nature、 402卷、 656頁、 1999年） を行い、 蛍光量変化の最 大値を活性値とした。 試料は 1% BSAを含むアツセィ用緩衝液に溶解した。 そ の結果、 ヒ ト FM-3またはヒ ト TGR1発現細胞に対して、 ヒ ト NMSは濃度依存的に 特異的な強い細胞内 Caイオン濃度の増加を示し、 その6( 5。はそれぞれ6. 5 X 10"11 M (FM-3) 、 9. 1 X 10"11 M (TGR1) であった。 ラット NMSを用いても同様 の結果が得られた。 実施例 6
放射ラベル化した [125I-Tyr°]-NMSのヒ ト FM- 3またはヒ ト TGR1を発現する CH0細 胞膜画分に対する受容体結合活性
受容体結合実験は、 Gottschallらの方法 （Gottschall, P. E.ら、
Endocrinology, 127卷、 272頁、 1990年） を改良して行った。 ヒ ト FM 3または ヒ ト TGR1を発現させた CH0細胞から粗細胞膜画分を調製した。 また N末に Tyr を付カ卩したヒ ト NMS ( [Tyr°]-NMS) を1251で放射標識し、 HPLCにて精製した。 粗 細胞膜画分 （10 g) と放射標識ペプチド （50 pM) を競合ペプチド存在下、 0. 05% CHAPSおよび 1% BSAを含むバッファ一中で 2時間室温にて反応させ、 ろ 過により結合 ·非結合放射標識ぺプチドを分離した。 放射活性は TopCount液体 シンチレーシヨンカウンター （Packard) で測定した。 その結果、 ヒ ト NMSはヒ ト F M— 3に対して IC50 = 1. 2 X 10"9 Mの親和性を示し、 ヒ ト TGR1に対して IC5。 = 1. 0 X 10"10 Mの親和性を示した。
以上の結果から NMSは FM-3または TGR1の内因性リガンドであることが示され た。 実施例 7 NMSのヒョコ直腸収縮活性 '
Currieらの方法 （Currie, M. G.ら、 Science. 221卷、 71頁、 1983年） に従 レ、、 新鮮なヒョコ直腸を 3mlの Krebs- Henseleit液、 37°Cでプレ ·ィンキュベー シヨンし、 実施例 1 4に記載された方法によって作製し、 生理的食塩水に溶解し たラット NMSを投与後、 直腸の収縮を測定した。 その結果、 NMSはヒョコ直腸に 対して 10 pmolの投与量において有意な収縮活性を示した。 実施例 8
NMSのラッ卜への経静脈投与による血圧上昇活性
Minamino りの方法 (Minamino, N.ら、 Biochem. Biophys. Res. し oramun.、 130 卷、 1078頁、 1985年） に従い、 ペントバルビタール （50 mg/kg) によって麻酔 した Sprague- Dawleyラットの頸動脈にカテーテルを留置し、 継続的に動脈圧を 測定した。 実施例 1 4に記載された方法によって作製したラット NMSは 0. lmlの 生理食塩水に溶解後、 頸静脈に留置したカテーテルより投与した。 その結果、 NMSは経静脈投与によってラットの血圧を 3 nmol/kgの投与量において有意に上 昇させた。 実施例 9
匪 S中枢投与による摂食量への影響
Wistarラット （雄 · 8週令） の側脳室にカテーテルを留置し、 実験操作に慣 らしながら自由摂食のもと一定条件で飼育した （22度、 ライ ト ·オン 7時- 19 時） 。 実施例 1 4に記載された方法によって作製したラット NMSは 10 i lの生理 食塩水に溶解後、 カテーテルより側脳室へ投与した。 （1) 喑期摂食量の測定で は 18時に應 Sの投与を行い、 19時- 7時の間の摂食量を測定した。 また、 （2) 14時間絶食ラットへ 9時に NMSの投与を行い、 直後から 2時間摂食量を測定し た。 その結果、 （1) NMSは用量依存的に有意に喑期摂食量を抑制し、 その効果 は lnmolで最大であった。 （2) 絶食ラットにおける 2時間摂食量について、 NMS は 0. 5nraolで有意に摂食量を抑制した。 実施例 1 0
RT-PCRによるラットにおける NMS組織分布の解析 Total RNAは 8週齢の Wistarラットの各組織より採取した。 また、 脳の各部 位は Murakamiおよび Takahashiの方法 （Murakami, N.およぴ Takahashi, K.、 Brain Res.、 276卷、 297頁、 1983年） に従い、 採取した。 得られた RNAは DNase処理の後、 Superscript II (Invitrogen) により逆転写反応を行った。 定 量 PCRは LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche) と LightCycler System (Roche) を用いて行った。 定量に用いたプライマーは 5' - CTCATCTGTGGTCTGCAAAGAG-3' (配列番号： 5 2 ) および 5' _
GCATACAGAAGCAGTAGATGAC-3' (配列番号： 5 3 ) である。 既知量のラット
NMScDNAを標準曲線作製に用いた。 また、 ラット GAPDHの mRNA発現量を測定し、 内部標準とした。
その結果、 ラット NMS mRNA は中枢神経系と脾臓、 精巣で強い発現が認められ、 下垂体や小腸では低レベルの発現であった。 中枢神経系では視床下部で特に強く 発現しており、 そのなかでも視交叉上核でほぼ特異的に発現していた。 実施例 1 1
In situ ハイブリダィゼーシヨンによる発現分布解析と視交叉上核での発現量変 化
既報 （Ozaki, Y.ら、 Endocrinology、 143卷、 4320頁、 2002年） に従い、 ラ ット全脳の 12 μ πιの冠状断切片について35 S標識したオリゴヌクレオチドプロ一 ブ （5' -TGAGGAGGGGATCTGTAGCATACAGAAGCA-3' ) (配列番号： 5 4 ) を用いて in situハイプリダイゼーシヨンを行った。 洗浄後、 オートラジオグラフィ一によ り現像した。 放射活'性 fま MCID imaging analyzer (Imaging Research) ¾r用レヽ、 14Cを標準として定量した。 その結果、 ラット全脳を用いた冠状切片、 矢状切片 で NMSの発現部位を解析した結果、 視交叉上核での特異的な発現が認められ、 リ アルタイム PCRでの発現解析の結果と一致した。 ラット NMS mRNAの発現は、 視 交叉上核の中でも腹外側部で認められた。
視¾叉上核はサ一力ディアンリズムの調節に関係する神経核であることから、 NMSの発現リズムを定量解析した。 その結果、 明喑条件 （ライ ト ·オン 7時 - 1 9時） で飼育したラットでは、 ZT11で最も強く、 ZT17で弱まる NMSの発現リズ ムが見られた （Zeitgeber time, ΖΤ ; ΖΤ0, ライ ト ·オン； ΖΤ12，ライ ト ·オフ） 。 また、 恒喑条件で 2日間飼育したラッ卜ではこの発現リズムは消失していた。 実施例 1 2
脳室内投与された NMSによる自発運動の概日リズムの位相シフト
概日リズムの位相シフ 卜の実験にはォスの Wistarラット （300- 350g) を使用 した。 脳室内投与は Idaら （Ida, T.ら、 （1999) Brain Res.、 821 .卷、 526頁、 1999年） の方法に従った。 自発運動は Nakaharaら （Nakahara, Κ-ら、 Biochem. Biophys. Res. Commun.、 318卷、 156頁、 2004年） の方法に従って測定した。 自発運動リズムの位相シフトは、 NM Sまたは生理的食塩水の脳室内投与の前お よび後のそれぞれ少なくとも 1 0日間における日々の自発運動開始時刻の遅れを プロットした線の間隔に基づいて計算した。 自発運動開始時刻を CT12
(circadian time 12) とした。 位相応答データは Scheffe' s multiple comparisons testによる one-way AN0VAによって評価した。 c- Fos蛋白質の免疫 染色においては、 ラットを 2週間恒喑条件下で飼育し、 CT6で実施例 1 4に記載 された方法によって作製し、 生理的食塩水に溶解した 1 nmolのラット NMSまた は生理的食塩水を脳室内に投与した。 投与 90分後に、 2 %のパラホルムアルデ ヒ ドを灌流した。 c- Fos蛋白質の免疫染色は Dateら （Date, Y.ら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA、 96卷、 748頁、 1999年） の方法に従って行った。 視交叉上核 への核内投与は、 Pigginsら (Piggins, H. D.ら、 J. Neurosci. 、 15卷、 5612 頁、 1995年） の方法を改良して行った。 ラットを 2週間恒喑条件下で自由に動 ける状態で飼育した。 その後、 各ラットに 26-ゲージのステンレススチール製ガ ィドカニュ1 ~ l/ -¾r Paxinos およひ tfatson (Paxinos, および Watson, C.、 The rat brain in stereotaxic coordinates Academic Press、 New York L A、 1998年） の座標に従って視交叉上核に到達するように装着した。 実施例 1 4に 記載された方法によって作製したラット NMSは Ι μ ΐの生理的食塩水に溶解し、 31ゲージのステンレススチールインジェクターを用いてガイドカニューレの終 末よりさらに 1 醒下方に挿入して投与した。 自発的運動を投与の前および後そ れぞれ 2週間の間、 Nakaharaら (Nakahara, K.ら、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 、 318卷、 156頁、 · 2004年） の方法に従って記録した。 正確な力ニュー レ位置は実験期間終了時に組織学的分析によって以下のようにして確認した。 ラ ットに 1 μ 1の India inkを投与して投与位置を標識した後、 断頭した。 脳を直 ちに凍結した後、 クライオスタツトによって 20 mの冠状切片を採取し、 クリス タノレバイオレットによって染色した。 切片を Paxinos および Watson (Paxinos, G.およひ Watson, C.、 The rat brain in stereotaxic coordinates^ Acaaeraic Press, New York, USA、 1998年） のラット脳アトラスの対応す.る切片と比較し た。 投与位置が視交叉上核の外へ 200 / m以上離れていた場合は得られたデータ を除外した。
視交叉上核では、 TGR1 mRNAは FM-3 mRNAより多く発現してはいるが、 NMS ί: 対する二つの受容体が発現していた。 そこで、 恒暗条件下で飼育したラットにお ける自発運動の概日リズムに対する NMSの脳室内投与の効果について検討した。 ラット NMSを 1 nmol、 CT3-9で投与すると、 自発運動の位相を進め、 CT22-24で の投与は位相の遅れを引き起こした。 それ以外の時間では位相シフトは観察され なかった。 NM Sによる位相応答曲線は有意に変動していた （AN0VA, F (14, 28) = 2. 549， P く 0. 05) 。 これらの結果は位相おょぴ投与量の両方に依存した。 生理 的食塩水の投与は同一条件下において位相に変化を生じなかった。 概日周期の長 さは、 いかなる時間においても NMSの脳室内投与による影響を受けなかった。 さ らに、 生理的食塩水を投与した対照ラットと比較して、 NMSの脳室内投与後に、 c-Fos蛋白質（ニューロンの活性化のマーカー）の発現が視交叉上核で増加した。 c-Fos蛋白質は、 視交叉上核の腹外側部で特に発現していた。 さらに視交叉上核 の機能に対する NMSの効果を試験するために、 視交叉上核へ NMSをマイクロイン -ジヱクシヨンにより直接投与した。 核内に投与された NMSは、 脳室內投与の場合 と同様に CT6と CT23とで自発運動の概日リズムにおける位相の進みおよび遅れ をそれぞれ引き起こした。 生理食塩水投与は効果がなかった。 これらのデータは、 内在性の NMSが受容体を介して視交叉上核の機能に強い効果を示すこと 示唆し た。 実施例 1 3
NUNPおよび NSNPのプロラクチン分泌作用
中枢投与によるプロラクチン血中濃度の変化を調べた。 conscious ratへの中 枢投与は実施例 9と同様に行った。 実施例 1 4に記載された方法によって作製し、 生理的食塩水に溶解したラット NUNP- 36またはラット NSNP- 37を投与後、 20分 で断頭採血、 またはペプチド投与後、 各時間に尾静脈より採血した。 プロラクチ ンの測定は RIA kit (Araersham) を用いて行った。 また、 下垂体前葉細胞への直 接作用を検討した。 下垂体前葉細胞は Wistar ラット （5 週令 ·ォス） から調製、 96 wellプレート （5. 0 X 104 cells/well) で 2日間培養し、 実験に用いた。 ラ ット NUNP-36またはラット NSNP- 37添加後、 30分で培養上清を回収し、 プロラ クチン濃度を測定した。
ラット NUNP- 36またはラット NSNP-37を' lnraol中枢投与 20分後に採血、 血中 ホルモン濃度の測定を行った結果、 ラット NUNP-36は生食投与 こ対じて有意に 血中プロラクチン濃度が上昇していた （saline, 7. 35 土 1. 53 ng/ml； NUNP lnmol, 68. 74 土 10. 4 ng/ml) 。 ラット NSNP- 37でも弱いながらも有意に上昇し ていた （27. 34 士 5. 63 ng/ml) 。 一方、 血中甲状腺刺激ホルモン濃度はラット NUNP-36またはラット NSNP-37の投与によって有意に減少した （saline, 7. 37 土 0. 85 ng/ml ; NUNP lnmol, 4. 92 土 0. 22 ng/ml； NSNP lnmol, 5. 37 土 0. 51 ng/ml) 。 さらに、 ラット UNP- 36投与によって血中濾卵胞刺激ホルモン濃度の 有意な上昇が認められた （saline， 8. 08 士 1. 10 ng/ml； NUNP lnmol, 12. 26 土 0. 95 ng/ml； NSNP lnraol, 10. 64 土 0. 72 ng/ml) 。 他の血中ホルモン （成長ホ ルモン、 黄体形成ホルモン、 コルチコステロン） 濃度には、 成長ホルモン濃度の 上昇傾向が認められたが、 有意な変化は認められなかった。
また、 ラット NUNP-36中枢投与によって顕著な血中プロラクチン濃度を認めた ため、 用量 ·時間依存性について検討した。 その結果、 lnmol、 0. 2nmolで投与 後 1 0分から有意なプロラクチン濃度の上昇が見られ、 20分でピークに達して いた。
さらに、 下垂体への直接もしくは、 間接作用かを下垂体前葉細胞初代培養系を 用いて検討した結果、 培養上淸中のプロラクチンは TRH濃度依存的に増加したが、 ラット NUNP- 36では全く変化が認められなかった。 このため、 ラット NUNP-36中 枢投与による血中プロラクチン濃度の上昇は脳内のプロラクチン分泌調節系に作 用していると推定された。 実施例 1 4··
NMS、 NSNPおよび NUNPの合成
本実施例に記載のヒ ト、 ラットおよびマウスニューロメジン S (配列番号： 1、 2および 3 ) 、 ヒ ト、 ラットおよびマウスニューロメジン S N末ペプチド- 34
(配列番号： 7、 9および 1 1 ) 、 ヒ ト、 ラットおよびマウスニューロメジン S N末ペプチド- 37 (配列番号： 8、 1 0および 1 2)'、 ヒ ト、 ラットおよびマウ スニューロメジン U N末ペプチド -33 (配列番号： 3 7、 3 9および 4 1 ) およ びヒ ト、 ラットおよびマウスニューロメジン U N末ペプチド- 36 (配列番号： 3 8、 4 0および 4 2) の合成は 431A peptide synthesizer (Applied
Biosysteras 社） を用いて添付の説明書に従い、 Fmoc 固相合成法により行なった。 合成終了後、 樹脂をメタノールにて洗浄'乾燥し、 続いて適当量の deblocking mixture (組成：結晶フエノーノレ、 1.5 g；水、' 1 ml ； thioanisole、 1 ml ； 1, 2— ethanedithiol、 0.5 ml ； TFA、 20 ml) 中で 3時間撹拌することにより保護基を 切り離した。 ジェチルエーテルにて合成化合物を洗浄後、 適当量の 0. 1% TFAに 溶解し SPW-C-0DSカラムクロマトグラフィー （ケムコ社） にて夾雑物の除去を行 なった。 粗精製された合成ペプチドは; uBONDASHERE 15 μ C18- 300Αを用いた逆 相 HPLCにより単一ピークに精製した。 MALDI- T0F MS (Voyager- DE Pro、
Applied Biosysteras ¾h) およびペプチドシークェンサ一 （494cLC、 Applied Biosysteras社） を用いて最終的に得られた合成べプチドの構造を確認した。 実施例 1 5
NMSによるプロラクチン分泌抑制作用
NMSの中枢投与によるプロラクチン血中濃度の変化を調べた。 Conscious rat への中枢投与は実施例 9と同様に行った。 採血はペプチド投与 20分後に断頭に よって行った。 プロラクチンの測定は RIA kit (Araersham) を用いて行った。
実施例 1 4に記載された方法によって作製し、 生理的食塩水に溶解したラット NMS 1 nmolを中枢投与した後、 血中ホルモン濃度の測定を行った結果、 NMS投与 群では生食投与群に対して有意に血中プロラクチン濃度が低下していた （saline, 13. 1 ± 1.8 ng/ral； NMS lnmol, 3.6 土 1.2 ng/ml, pく 0.0001) 。 NMSは中枢投 与によってプロラクチンの分泌を抑制することが示された。 産業上の利用可能性
(1) (i) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドもしくはそのァ ミ ド体またはその塩、 （ii) 上記ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコード するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、 および （i ii) 上記ポリべ プチドもしくはその部分ぺプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を促 進する化合物またはその塩は、 例えば、 消化管収縮作用、 平滑筋収縮作用、 血圧 上昇作用、 摂食抑制作用、 プロラクチン分泌低下作用などを有し、 概日リズムに おける位相の進みおよび遅れに関連し、 例えば、 低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間 帯域変化症候群、 不妊症などの予防 ·治療に有用である。
(2) (i) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドもしくはそのァ ミ ド体またはその塩に対する抗体、 （ii) 上記ポリペプチドまたはその部分ぺプ チドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの塩基配列に相 補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセン スポリヌクレオチド、 および （iii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ぺプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症などの予防 ·治療に有用である。
(3) (i) 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列 番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドまたはそ の塩、 （ii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドをコードするポリヌク レオチドを含有するポリヌクレオチド、 および （iii) 上記ポリペプチドもしく はその部分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、 プロ ラクチン分泌作用などを有し、 例えば、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症などの予 防 ·治療に有用である。
(4) (i) 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列 番号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドまたはそ の塩に対する抗体、 （ii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドをコード するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレ ォチド、 および （iii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそ のアミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 不妊 症、 甲状腺機能不全症の予防 ·治療に有用である。'
(5) (i) 配列番号： 3 7、 配列番号： 3 8、 配列番号： 3 9、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 1または配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩、 （ii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドをコードするポ - リヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、 および （iii) 上記ポリペプチド もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、 プロラクチン分泌作用を有し、 例えば、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症の予防 · 治療に有用である。
(6) (i) 配列番号： 3 7、 配列番号： 3 8、 配列番号： 3 9、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 1または配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドもし くはその塩に対する抗体、 （ii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを コードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの塩基配列に相補的も しくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリ ヌクレオチド、 および （ii i) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまた はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 不妊症、 甲状腺機能 不全症の予防 ·治療に有用である。
(7) (i) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドもしくはそのァ ミ ド体またはその塩、 および （または） （ii) 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7 または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩、 および （ま たは） （iii) 配列番号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質ま たはその部分ペプチドまたはその塩は、 例えば、 低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間 帯域変化症候群、 不妊症、 高血圧、 拒食症、 更年期障害、 不眠症などの予防 *治 療剤のスクリーニングに有用である。
(8) 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0、 配列番 号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 —のアミノ酸配列を含有す.るポリべプチドもしくはその部分べプチドまたはその 塩は、 例えば、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症、 不妊症、 甲状腺機能不全症など の予防 ·治療剤のスクリーニングに有用である。
(9) 配列番号： 3 7、 配列番号： 3 8、 配列番号： 3 9、 配列番号： 4 0、 酉己 列番号： 4 1または配列番号： 4 2で表ざれるァミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドまた はその塩は、 例えば、 更年期障害、 甲状腺機能亢進症、 不妊症、 甲状腺機能不全 症の予防 ·治療剤のスクリーニングに有用である。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその アミ ド体またはその塩。
2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのァ ミ ド体またはその塩。
3 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその.ァ ミ ド体またはその塩。
4 . 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのァ ミ ド体またはその塩。
5 . 請求項 1記載のポリペプチドの部分ペプチドもしくはそのアミ ド体または その塩。
6 . 請求項 1記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチド。
7 . D NAである請求項 6記載のポリヌクレオチド。
8 . 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 4または配列番号： 1 5で表される塩基配 列を含有する請求項 7記載の D N A。
9 . 請求項 6記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
1 0 . 請求項 9記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
1 1 . 配列番号： 4、 配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドである請 求項 1記載のポリべプチドまたはそのアミ ド体またはその塩。
1 2 . 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその 塩。
3 . 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその
4 . 配列番号： 6で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドまたはその 。
1 5 . 請求項 β載のポリぺプチドの部分べプチドもしくはそのァミ ド体ま たはその塩。
1 6. 請求項 1 1記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
1 7. DNAである請求項 16記載のポリヌクレオチド。
18. . 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 7または配列番号： 18で表される塩基 配列を含有する請求項 13記載の DNA。
1 9. 請求項 16記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
20. 請求項 19記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
21. 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列番 号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩。
22. 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列番 号： 1 1または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドま たはその塩。
23. 請求項 21記載のポリぺプチドの部分べプチドまたはその塩。
24. 請求項 21記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有す るポリヌクレオチド。
25. DNAである請求項 24記載のポリヌクレオチド。
26. 配列番号： 1 9、 配列番号： 20、 配列番号： 21、 配列番号： 22、 配列番号： 23または配列番号： 24で表される塩基配列を含有する請求項 25 記載の DNA。
27. 請求項 24記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
28. 請求項 27記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
29. 請求項 1記載のポリべプチドもしくはその部分べプチ もしくはそのァ ミ ド体またはその塩を用いることを特徴とする、 該ポリペプチドの活性を促進ま たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
30. (i) 請求項 1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくは そのアミ ド体またはその塩、 および （ii) 配列番号： 25、 配列番号： 27また は配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩を用いる請求項 2 9記載のスクリーニング方法。
31. 配列番号： 25で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部 分ペプチドまたはその塩を用いる請求項 3 0記載のスクリーニング方法。
3 2 . (i) 請求項 1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくは そのアミ ド体またはその塩、 および （ii) 配列番号： 3 1、 配列番号： 3 3また は配列番号： 3 5.で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドまたはその塩を用いる請求項 2 9記載のスクリーニング方法。
3 3 . 配列番号： 3 1で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部 分ぺプチドまたはその塩を用いる請求項 3 2記載のスクリーニング方法。
3 4 . 請求項 1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのァ ミ ド体またはその塩を含有することを特徴とする、 該ポリペプチドの活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
3 5 . さらに、 配列番号： 2 5、 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質 またはその部分ペプチドまたはその塩を含有する請求項 3 4記載のスクリーニン グ用キット。
3 6 . さらに、 配列番号： 3 1、 配列番号： 3 3または配列番号： 3 5で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質 またはその部分ペプチドまたはその塩を含有する請求項 3 4記載のスクリーニン グ用キット。 ―
3 7 . 請求項 2 1記載のポリペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法。
3 8 . 請求項 2 1記載のポリペプチドまたはその塩を含有することを特徴とす る、 該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー ユング用キット。
3 9 . 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドもしくはその部分べプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩を含有してなる医薬。
4 0 . 請求項 6または請求項 1 6記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
4 1 . 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドもしくはその部分べプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含 有してなる医薬。
4 2 . . 低血圧、 肥満症、 嗜眠症または時間帯域変化症候群の予防 ·治療剤であ る請求項 3 9〜 4 1記載の医薬。
4 3 . 不妊症の予防 ·治療剤である請求項 3 9〜4 1記載の医薬。
4 4 . 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドもしくはその部分べプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を促進することを特徴とする低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群または不妊症の予防 ·治療方法。
4 5 . 哺乳動物に対し （i) 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドも しくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 （ii) 請求項 6ま たは請求項 1 6記載のポリヌクレオチド、 または （iii) 上記ポリペプチドもし くはその部分べプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を促進する化合 物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群または不妊症の予防 ·治療方法。
4 6 . 低血圧、 肥満症、 嗜眠症、 時間帯域変化症候群または不妊症の予防 ·治 療剤の製造のための （i) 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドもしく はその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩、 （ii) 請求項 6または 請求項 1 6記載のポリヌクレオチド、 または （iii) 上記ポリペプチドもしくは その部分ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を促進する化合物ま たはその塩の使用。
4 7 . 請求項 2 1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有してなる医薬。
4 8 . 請求項 2 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
4 9 . 請求項 2 1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩 の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
5 0 . 更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 ·治療剤である請求項 4 Ί〜 4 9のいずれかに記載の医薬。
5 1 . 請求項 2 1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩 の活性を促進することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 · 治療方法。
5 2 . 哺乳動物に対し （i) 請求項 2 1記載のポリペプチドもしくはその部分 ペプチドま はその塩、 （ii) 請求項 2 4記載のポリヌクレオチド、 または (iii) 上記ポリぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進 する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徵とする更年期障害または 甲状腺機能亢進症の予防 ·治療方法。
5 3 . 更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 ·治療剤の製造のための
(i) 請求項 2 1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩、 (ii) 請求項 2 4記載のポリヌクレオチド、 または （iii) 上記ポリペプチドも しくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使 用。
5 4 . 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドもしくはその部分べプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩に対する抗体。
5 5 . 請求項 5 4記載の抗体を含有してなる医薬。
5 6 . 請求項 5 4記載の抗体を含有してなる診断薬。
5 7 . 低血圧、 肥満症、 嗜眠症または時間帯域変化症候群の診断薬である請求 項 5 6記載の診断薬。
5 8 . 不妊症の診断薬である請求項 5 6記載の診断薬。
5 9 . 請求項 6または請求項 1 6記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的 もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するァンチセンスポ リヌクレオチド。
6 0 . 請求項 5 9記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含 してなる医薬。
6 1 . 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドもしくはその部分べプチ ドもしくはそのァミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含 有してなる医薬。
6 2 . 高血圧、 拒食症または不眠症の予防 ·治療剤である請求項 5 5、 請求項 6 0または請求項 6 1記載の医薬。
6 3 . 更年期障害の予防 ·治療剤である請求項 5 5、 請求項 6 0または請求項 6 1記載の医薬。
6 4 . 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドもしくはその部分べプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を阻害することを特徴とする高血圧、 拒食症、 更年期障害または不眠症の予防 ·治療方法。
6 5 . 哺乳動物に対し （i) 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドも しくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩に対する抗体、
(ii) 請求項 6または請求項 1 6記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的も しくは実質的に相捕的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリ ヌクレオチド、 または （iii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもし くはそのアミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を 投与することを特徴とする高血圧、 拒食症、 更年期障害または不眠症の予防 ·治 療方法。
6 6 . 高血圧、 拒食症、 更年期障害または不眠症の予防 ·治療剤の製造のため の （i) 請求項 1または請求項 1 1記載のポリペプチドもしくはその部分べプチ ドもしくはそのアミ ド体またはその塩に対する抗体、 （ii) 請求項 6または請求 項 1 6記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩 基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または
(iii) 上記ポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体また はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
6 7 . 請求項 2 1記載のポリべプチドもしくはその部分べプチドもしくはその アミ ド体またはその塩に対する抗体。
6 8 . 請求項 6 7記載の抗体を含有してなる医薬。
6 9 . 請求項 6 7記載の抗体を含有してなる診断薬。
7 0 . 不妊症または甲状腺機能不全症の診断薬である請求項 6 9記載の診断薬。
7 1 . 請求項 2 4記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的 に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
7 2 . 請求項 7 1記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
7 3 . 請求項 2 1記載のポリべプチドもしくはその部分べプチドもしくはその アミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
7 4 . 不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療剤である請求項 6 8、 請求 項 7 2または請求項 7 3記載の医薬。
7 5 . 請求項 2 1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはその アミ ド体またはその塩の活性を阻害することを特徴とする不妊症または甲状腺機 能不全症の予防 ·治療方法。
7 6 . 哺乳動物に対し （i) 請求項 2 1記載のポリペプチドもしくはその部分 ペプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩に对する抗体、 （ii) 請求項 2 4記 載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列ま たはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または （iii) 請求 項 21記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体また はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴と する不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療方法。
77. 不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療剤の製造のための （i) 請 求項 21記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミ ド体ま たはその塩に対する抗体、 （ii).請求項 24記載のポリヌクレオチドの塩基配列 に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチ センスポリヌクレオチド、 または （iii) 請求項 21記載のポリペプチドもしく はその部分べプチドもしくはそのアミ ド体またはその塩の活性を阻害する化合物 またはその塩の使用。
78. 外来性の、 請求項 6、 請求項 16または請求項 24記載のポリヌクレオ チドを有する非ヒ トトランスジエニック動物。
79. 外来性の、 請求項 6、 請求項 16または請求項 24記載のポリヌクレオ チドを含有し、 非ヒ ト動物において発現しうる組換えベクター。
80. 請求項 6、 請求項 1 6または請求項 24記載のポリヌクレオチドが不活 性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞。
81. 請求項 6、 請求項 16または請求項 24記載のポリヌクレオチドが不活 性化された、 該ポリヌクレオチド発現不全非ヒ ト哺乳動物。
82. 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩を用いることを特徴とする、 該ポリペプチドの活性を促進または阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
83. 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩を含有することを特徴とする、 該ポリペプチドの活性を促進または阻 害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
84. 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を促進する化合物またはその塩 ¾r含有してなる更年期障害また は甲状腺機能亢進症の予防 ·治療剤。
85. 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を促進することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進 症の予防 ·治療方法。
86. 哺乳動物に対し配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配 列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその 部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を投与 することを特徴とする更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 ·治療方法。
87. 更年期障害または甲状腺機能亢進症の予防 ·治療剤の製造のための配列 番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 4 1または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩の 活性を促進する化合物またはその塩の使用。
88. 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる不妊症または甲 状腺機能不全症の予防 ·治療剤。
- 89. 配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を阻害することを特徴とする不妊症または甲状腺機能不全症の 予防 ·治療方法。
90. 哺乳動物に対し配列番号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 酉己 列番号： 40、 配列番号： 41または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその 部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与 することを特徴とする不妊症または甲状腺機能不 症の予防 ·治療方法。
9 1. 不妊症または甲状腺機能不全症の予防 ·治療剤の製造のための配列番 号： 37、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 40、 配列番号： 41 または配列番号： 42で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活 性を阻害する化合物またはその塩の使用。
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