JP2001136981A

JP2001136981A - 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ

Info

Publication number: JP2001136981A
Application number: JP2000253667A
Authority: JP
Inventors: Takuya Watanabe; 卓也渡辺; Kuniko Kikuchi; 久仁子菊地; Yasushi Shintani; 靖新谷
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2001-05-22

Abstract

(57)【要約】【課題】アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング
等に有用な新規蛋白質の提供。【解決手段】ヒト由来の蛋白質またはその塩、該蛋白質
をコードするＤＮＡ、該蛋白質に対するリガンドの決定
方法、リガンドと該蛋白質との結合性を変化させる化合
物のスクリーニング方法／スクリーニング用キット、該
スクリーニングで得られる化合物またはその塩など。【効果】本発明のヒト由来の蛋白質またはそれをコード
するＤＮＡは、（１）本発明の蛋白質に対するリガンド
の決定、（２）本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾
患の予防および／または治療剤、（３）本発明の蛋白質
とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニス
ト、アンタゴニストなど）のスクリーニングなどに用い
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト脳由来の新規
蛋白質（Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質）またはその
塩およびそれをコードするＤＮＡなどに関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は、細胞
膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の
機能を調節している。これらのレセプター蛋白質の多く
は共役しているguanine nucleotide-binding protein
（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通
じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また７個の膜貫通
領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセ
プター蛋白質と総称される。Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、
それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば
ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的と
して非常に重要な役割を担っている。各種生体の細胞や
臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レ
セプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓
器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品
開発に非常に重要な手段を提供することとなる。

【０００３】例えば、脳などの中枢神経系の器官では、
多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるい
は生理活性物質などによる調節のもとで脳の生理的な機
能の調節が行なわれている。特に、神経伝達物質は脳内
の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター
蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。脳内
には未だ未知の神経伝達物質も多く、そのレセプター蛋
白質をコードするｃＤＮＡの構造に関しても、これまで
報告されていないものも多いと考えられる。さらに、既
知のレセプター蛋白質のサブタイプが存在するかどうか
についても分かっていなかった。脳における複雑な機能
を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関
係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手
段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニス
ト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬
品を開発するためには、脳内で発現しているレセプター
蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系
で発現させることが必要であった。近年、生体内で発現
している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列
をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、こ
のようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpressed
Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登録さ
れ、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報
のみであり、その機能を推定することは困難である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト脳由来
の新規蛋白質（Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質）、そ
の部分ペプチドまたはそれらの塩、該蛋白質またはその
部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該
ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターで
形質転換された形質転換体、該蛋白質またはその塩の製
造法、該蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に
対する抗体、該蛋白質（Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質）に対するリガンドの決定方法、リガンドと該蛋白質
（Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質）との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、該ス
クリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくは
スクリーニングキットを用いて得られるリガンドと該蛋
白質（Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質）との結合性を
変化させる化合物またはその塩、およびリガンドと該蛋
白質（Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質）との結合性を
変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬など
を提供する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ヒト脳由来の新規な蛋白質（Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質）をコードするｃＤＮＡを単離
し、全塩基配列を解析することに成功した。そして、こ
の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、第１〜第
７膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、これらの
ｃＤＮＡにコードされる蛋白質が７回膜貫通型のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質であることを確認した（図
３）。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに
研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質また
はその塩、（２）上記（１）記載の蛋白質の部分ペプチ
ドまたはその塩、（３）上記（１）記載の蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（４）配列番号：２で
表される塩基配列を有する上記（３）記載のＤＮＡ、
（５）上記（３）記載のＤＮＡを含有する組換えベクタ
ー、（６）上記（５）記載の組換えベクターで形質転換
された形質転換体、（７）上記（６）記載の形質転換体
を培養し、上記（１）記載の蛋白質を生成・蓄積せしめ
ることを特徴とする上記（１）記載の蛋白質またはその
塩の製造法、（８）上記（１）記載の蛋白質もしくは上
記（２）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗
体、（９）上記（１）記載の蛋白質もしくは上記（２）
記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴と
する上記（１）記載の蛋白質またはその塩に対するリガ
ンドの決定方法、

【０００７】（１０）上記（１）記載の蛋白質もしくは
上記（２）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いるこ
とを特徴とするリガンドと上記（１）記載の蛋白質また
はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング方法、（１１）上記（１）記載の蛋白質
もしくは上記（２）記載の部分ペプチドまたはその塩を
含有することを特徴とするリガンドと上記（１）記載の
蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング用キット、（１２）上記（１
０）記載のスクリーニング方法または上記（１１）記載
のスクリーニング用キットを用いて得られうる、リガン
ドと上記（１）記載の蛋白質またはその塩との結合性を
変化させる化合物またはその塩、（１３）上記（１０）
記載のスクリーニング方法または上記（１１）記載のス
クリーニング用キットを用いて得られうる、リガンドと
上記（１）記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化
させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、および
（１４）上記（３）記載のＤＮＡとハイストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡなどを提供す
る。

【０００８】より具体的には、（１５）蛋白質が、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個
以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１
〜９個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））
のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が
付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３
０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ
酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合
わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記（１）
記載の蛋白質またはその塩、（１６）上記（１）記載の
蛋白質もしくはその塩または上記（２）記載の部分ペプ
チドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させること
を特徴とする上記（１０）記載のリガンドの決定方法、
（１７）リガンドがアンギオテンシン、ボンベシン、カ
ナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニ
ン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プ
リン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ、セ
クレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュ
リン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、
ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブインテステ
ィナルアンドリレイテッドポリペプチド）、ソマ
トスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジ
キニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッド
ペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プ
ロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アド
レナリン、αおよびβ−ケモカイン（chemokine）（例
えば、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡ
Ｐ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−
２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、
ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド
またはガラニンである上記（９）記載のリガンドの決定
方法、

【０００９】（１８）（ｉ）上記（１）記載の蛋白質も
しくはその塩または上記（２）記載の部分ペプチドもし
くはその塩と、リガンドとを接触させた場合と、（ii）
上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはその塩と、リガンド
および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なう
ことを特徴とする上記（１１）記載のスクリーニング方
法、（１９）（ｉ）標識したリガンドを上記（１）記載
の蛋白質もしくはその塩または上記（２）記載の部分ペ
プチドもしくはその塩に接触させた場合と、（ii）標識
したリガンドおよび試験化合物を上記（１）記載の蛋白
質もしくはその塩または上記（２）記載の部分ペプチド
またはその塩に接触させた場合における、標識したリガ
ンドの上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上
記（２）記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する結
合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと上
記（１）記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化さ
せる化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２
０）（ｉ）標識したリガンドを上記（１）記載の蛋白質
を含有する細胞に接触させた場合と、（ii）標識したリ
ガンドおよび試験化合物を上記（１）記載の蛋白質を含
有する細胞に接触させた場合における、標識したリガン
ドの該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特
徴とするリガンドと上記（１）記載の蛋白質またはその
塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、（２１）（ｉ）標識したリガンドを上記
（１）記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させ
た場合と、（ii）標識したリガンドおよび試験化合物を
上記（１）記載の蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触
させた場合における、標識したリガンドの該細胞の膜画
分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと上記（１）記載の蛋白質またはその塩との結
合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング
方法、

【００１０】（２２）（ｉ）標識したリガンドを上記
（６）記載の形質転換体を培養することによって該形質
転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合と、
（ii）標識したリガンドおよび試験化合物を上記（６）
記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体
の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合における、
標識したリガンドの該蛋白質に対する結合量を測定し、
比較することを特徴とするリガンドと上記（１）記載の
蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（２３）（ｉ）上記
（１）記載の蛋白質またはその塩を活性化する化合物を
上記（１）記載の蛋白質を含有する細胞に接触させた場
合と、（ii）上記（１）記載の蛋白質またはその塩を活
性化する化合物および試験化合物を上記（１）記載の蛋
白質を含有する細胞に接触させた場合における、蛋白
質を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴
とするリガンドと上記（１）記載の蛋白質またはその塩
との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法、（２４）上記（１）記載の蛋白質またはそ
の塩を活性化する化合物を上記（６）記載の形質転換体
を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現し
た蛋白質に接触させた場合と、上記（１）記載の蛋白質
またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上
記（６）記載の形質転換体を培養することによって該形
質転換体の細胞膜に発現した蛋白質に接触させた場合に
おける、該蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、比較
することを特徴とするリガンドと上記（１）記載の蛋白
質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法、

【００１１】（２５）上記（１）記載の蛋白質を活性化
する化合物が、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビ
ノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、
メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリ
ン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ、セク
レチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリ
ン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、Ｇ
ＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブインテスティ
ナルアンドリレイテッドポリペプチド）、ソマト
スタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキ
ニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペ
プチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロ
スタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレ
ナリン、αおよびβ−ケモカイン（chemokine）（例え
ば、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ
−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、
ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩ
Ｐ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセ
リン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテン
シン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイドまた
はガラニンである上記（２３）または上記（２４）記載
のスクリーニング方法、（２６）上記（１８）〜（２
５）記載のスクリーニング方法で得られうる、リガンド
と上記（１）記載の蛋白質またはその塩との結合性を変
化させる化合物またはその塩、（２７）上記（１８）〜
（２５）項記載のスクリーニング方法で得られうる、リ
ガンドと上記（１）記載の蛋白質またはその塩との結合
性を変化させるの化合物またはその塩を含有することを
特徴とする医薬、

【００１２】（２８）上記（１）記載の蛋白質を含有す
る細胞を含有することを特徴とする上記（１１）記載の
スクリーニング用キット、（２９）上記（１）記載の蛋
白質を含有する細胞の膜画分を含有することを特徴とす
る上記（１１）記載のスクリーニング用キット、（３
０）上記（６）記載の形質転換体を培養することによっ
て該形質転換体の細胞膜に発現した蛋白質を含有するこ
とを特徴とする上記（１１）記載のスクリーニング用キ
ット、（３１）上記（２８）〜（３０）記載のスクリー
ニング用キットを用いて得られうる、リガンドと上記
（１）記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させ
る化合物またはその塩、（３２）上記（２８）〜（３
０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られう
る、リガンドと上記（１）記載の蛋白質またはその塩と
の結合性を変化させる化合物またはその塩を含有するこ
とを特徴とする医薬、（３３）上記（８）記載の抗体
と、上記（１）記載の蛋白質もしくは上記（２）記載の
部分ペプチドまたはその塩とを接触させることを特徴と
する上記（１）記載の蛋白質もしくは上記（２）記載の
部分ペプチドまたはその塩の定量法、（３４）上記
（８）記載の抗体と、被検液および標識化された上記
（１）記載の蛋白質もしくは上記（２）記載の部分ペプ
チドまたはその塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合
した標識化された上記（１）記載の蛋白質もしくは上記
（２）記載の部分ペプチドまたはその塩の割合を測定す
ることを特徴とする被検液中の上記（１）記載の蛋白質
もしくは上記（２）記載の部分ペプチドまたはその塩の
定量法、および（３５）被検液と担体上に不溶化した上
記（８）記載の抗体および標識化された上記（８）項記
載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不
溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする
被検液中の上記（１）記載の蛋白質もしくは上記（２）
記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法などを提供す
る。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の蛋白質（Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質）は、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列〔図１〜図２中のアミノ酸配列〕と同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋
白質である（以下、本発明の蛋白質（Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質）またはその塩を本発明の蛋白質と略記
する場合がある）。本発明の蛋白質（Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質）は、例えば、ヒトや哺乳動物（例え
ば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細
胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メ
サンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮
細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪
細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基
球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨
細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは
間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしく
はガン細胞など）や血球系の細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ
１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６
０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−
３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥ
Ｍ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−
２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−
１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−
１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）、また
はそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、
脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視
床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭
葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊
髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、
胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大
腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢
血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子
宮、骨、関節、骨格筋など（特に、脳や脳の各部位）に
由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であっ
てもよい。

【００１４】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ま
しくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さ
らに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸
配列などが挙げられる。本発明の配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有
する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質
の活性を有する蛋白質などが好ましい。実質的に同質の
活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情
報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それ
らの活性が性質的に同質であることを示す。したがっ
て、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活
性が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好ましい
が、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要
素は異なっていてもよい。リガンド結合活性やシグナル
情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準
じて行なうことができるが、例えば、後述するリガンド
の決定方法やスクリーニング方法に従って測定すること
ができる。

【００１５】また、本発明の蛋白質としては、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が
付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３
０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ
酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合
わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられ
る。

【００１６】本明細書における蛋白質は、ペプチド標記
の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ
末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする本
発明の蛋白質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯ
ＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ^-）であるが、
Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−Ｃ
ＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲと
しては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ
プロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、
例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8
シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルな
どのＣ_6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル
などのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基もしくはα−ナフチ
ルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキル基などの
Ｃ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用
されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本
発明の蛋白質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカ
ルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基が
アミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋
白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば
上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、
本発明の蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端
のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミ
ル基、アセチル基などのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ
_1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生
体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン
酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例
えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、イ
ンドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例え
ば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_2-6アルカノイル
基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋
白質なども含まれる。本発明の蛋白質の具体例として
は、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を
含有するヒト由来（より好ましくはヒト脳由来）の蛋白
質などがあげられる。

【００１７】本発明の蛋白質の部分ペプチド（以下、部
分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した
本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れのものであ
ってもよいが、例えば、本発明の蛋白質分子のうち、細
胞膜の外に露出している部位であって、レセプター結合
活性を有するものなどが用いられる。具体的には、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質の部
分ペプチドとしては、〔図３〕で示される疎水性プロッ
ト解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部
位）であると分析された部分を含むペプチドである。ま
た、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチド
も同様に用いることができる。個々のドメインを個別に
含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含
む部分のペプチドでも良い。本発明の部分ペプチドの
アミノ酸の数は、前記した本発明の蛋白質の構成アミノ
酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個
以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有
するペプチドなどが好ましい。実質的に同一のアミノ酸
配列とは、これらアミノ酸配列と約５０％以上、好まし
くは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さら
に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以
上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。ここで、「実
質的に同質の活性」とは、前記と同意義を示す。「実質
的に同質の活性」の測定は前記と同様に行なうことがで
きる。

【００１８】また、本発明の部分ペプチドは、上記アミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のア
ミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または
２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２
個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、
より好ましくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個
（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れていてもよい。また、本発明の部分ペプチドはＣ末端
が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシ
レート（−ＣＯＯ^-）であるが、前記した本発明の蛋白
質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエ
ステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明
の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様
に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護
されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したGl
nがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の
側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合
ペプチドなども含まれる。また、本発明の部分ペプチド
はＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカ
ルボキシレート(−ＣＯＯ^-）であるが、前記した本発明
の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）ま
たはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。本発明の
蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、とりわけ
生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩
としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化
水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢
酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、
メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが
用いられる。

【００１９】本発明の蛋白質またはその塩は、前述した
ヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質
の精製方法によって製造することもできるし、後述する
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換
体を培養することによっても製造することができる。ま
た、後述の蛋白質合成法またはこれに準じて製造するこ
ともできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造
する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナ
イズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど
のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単
離することができる。

【００２０】本発明の蛋白質、その部分ペプチドもしく
はそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、通常
市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのよ
うな樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロ
キシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメ
チル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹
脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、
４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチ
ル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメト
キシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４
−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フ
ェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹
脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護した
アミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知
の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最
後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除
去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形
成反応を実施し、目的の蛋白質またはそれらのアミド体
を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、
蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることが
できるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイ
ミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイ
ミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カル
ボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化には
ラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保
護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水
物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあ
らかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添
加することができる。

【００２１】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうるこ
とが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩
化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素
類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメ
チルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジ
オキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセ
トニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸
メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの
適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合
形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適
宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選
択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜
４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテス
トの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行う
ことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行
なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得
られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾー
ルを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができ
る。

【００２２】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキ
シル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、
シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シ
クロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状
もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステ
ル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジル
エステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロ
ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェ
ナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、
トリチルヒドラジド化などによって保護することができ
る。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエー
テル化によって保護することができる。このエステル化
に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl₂
-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチル
などが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基
としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチ
ルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、B
um、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。

【００２３】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ-炭
素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、
また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオ
ロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれら
の混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルア
ミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなど
による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによ
る還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応
は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、
酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、
チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジ
メチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタン
ジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効で
ある。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用
いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理
により除去され、トリプトファンのインドール保護基と
して用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。

【００２４】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。蛋白質のアミド体を得る別の方法
としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα
−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基
側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした
後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみ
を除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみ
を除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記した
ような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細につい
ては上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質
を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去
し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質
は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍
結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることが
できる。蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カル
ボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアル
コール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質の
アミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得
ることができる。

【００２５】本発明の蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することに
よって製造することができる。ペプチドの合成法として
は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによって
も良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部分ペ
プチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成
物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより
目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方
法や保護基の脱離としては、例えば、以下の〜に記
載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白
質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成
広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを
精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペ
プチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。

【００２６】本発明の蛋白質をコードするＤＮＡとして
は、前述した本発明の蛋白質をコードする塩基配列を含
有するものであればいかなるものであってもよい。ま
た、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記し
た細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来
のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオフ
ァージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいず
れであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtota
lＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直
接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅する
こともできる。具体的には、本発明の蛋白質をコードす
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる
塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表わ
される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェント
な条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、本発明の
蛋白質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、
シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡであれば何れのものでもよい。配列番号：２で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例
えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約７０％以
上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％
以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する
塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００２７】ハイブリダイゼーションは、自体公知の方
法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook
etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記
載の方法などに従って行なうことができる。また、市販
のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記
載の方法に従って行なうことができる。より好ましく
は、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことが
できる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナ
トリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜
２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０
〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９
ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体
的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有
する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
で表わされる塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。本
発明の蛋白質をコードする塩基配列を含有する、または
該塩基配列と相補的な塩基配列の一部を含有してなるヌ
クレオチド（オリゴヌクレオチド）とは、本発明の蛋白
質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含す
るだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられ
る。本発明に従えば、本発明の蛋白質遺伝子の複製又は
発現を阻害することのできるアンチセンス・（オリゴ）
ヌクレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは決定
された蛋白質をコードする塩基配列の塩基配列情報に基
づき設計し、合成しうる。そうした（オリゴ）ヌクレオ
チド（核酸）は、Ｇ蛋白質共役型蛋白質遺伝子のＲＮＡ
とハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成又は
機能を阻害することができるか、あるいはＧ蛋白質共役
型蛋白質関連ＲＮＡとの相互作用を介してＧ蛋白質共役
型蛋白質遺伝子の発現を調節・制御することができる。
Ｇ蛋白質共役型蛋白質関連ＲＮＡの選択された配列に相
補的な（オリゴ）ヌクレオチド、及びＧ蛋白質共役型蛋
白質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることがで
きる（オリゴ）ヌクレオチドは、生体内及び生体外でＧ
蛋白質共役型蛋白質遺伝子の発現を調節・制御するのに
有用であり、また病気などの治療又は診断に有用であ
る。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチ
ド、塩基配列又は核酸の特定の配列に相同性を有するあ
るいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩
基配列又は核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応す
る」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列又はその相補体
から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ
酸を通常指している。Ｇ蛋白質共役型蛋白質遺伝子の
５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピー
ト、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、
蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻
訳領域、３’端パリンドローム領域、及び３’端ヘアピ
ンループは好ましい対象領域として選択しうるが、Ｇ蛋
白質共役型蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として
選択しうる。

【００２８】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的な（オリゴ）ヌクレオチドとの関係は、対象物と
ハイブリダイズすることができる（オリゴ）ヌクレオチ
ドとの関係は、「アンチセンス」であるということがで
きる。アンチセンス・（オリゴ）ヌクレオチドは、２−
デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌ
クレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシ
ヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコ
シドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるい
は非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例え
ば、市販の蛋白質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマ
ー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但
し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような
塩基のペアリナグや塩基の付着を許容する配置をもつヌ
クレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、
２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖Ｒ
ＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることが
でき、さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴ
ヌクレオチド、さらには公知の修飾の付加されたもの、
例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの
付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌ
クレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチ
ド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチ
ルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデ
ート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結
合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質
（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシ
ン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）
や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を
有しているもの、インターカレント化合物（例えば、ア
クリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合
物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化
性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有す
るもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマ
ー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシ
ド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、プリン及び
ピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその
他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。
こうした修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジ
ン、アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはそ
の他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌク
レオチド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修
飾されていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲン
とか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエー
テル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。

【００２９】本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、あるいは修飾された核酸である。修飾された核酸
の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート
誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレ
オシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、そ
れに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核
酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわ
ち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにす
る、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標
とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにす
る、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性
をより小さなものにする。こうして修飾は当該分野で数
多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm
Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395,
1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research
and Applications, CRC Press, 1993 などに開示があ
る。本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられた
り、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リ
ポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与さ
れたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形
態で与えられることができうる。こうして付加形態で用
いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和する
ように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜
との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめる
ような脂質（例えば、ホスホリッピド、コレステロール
など）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに
好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体
（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸な
ど）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端ある
いは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内
ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。
その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特
異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアー
ゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止す
るためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基と
しては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリ
コールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知ら
れた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定される
ものではない。アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明
の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現
系、あるいは蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて
調べることができる。該核酸其れ自体公知の各種の方法
で細胞に適用できる。

【００３０】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ
-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもでき
る。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基
配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、ま
たは配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮ
Ａとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡを有し、本発明の蛋白質ペプチドと実質的に同
質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作
用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基
配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例
えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約７０％以
上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％
以上、さらに好ましくは約９５％以上、なかでも好まし
くは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有する
ＤＮＡなどが用いられる。

【００３１】本発明の蛋白質またはその部分ペプチド
（以下、本発明の蛋白質と略記する）を完全にコードす
るＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明の蛋白
質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用い
てＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクター
に組み込んだＤＮＡを本発明の蛋白質の一部あるいは全
領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用い
て標識したものとのハイブリダイゼーションによって選
別することができる。ハイブリダイゼーションの方法
は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）２nd（J.Sambrook et al., Cold Spring Harb
or Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行な
うことができる。また、市販のライブラリーを使用する
場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ
とができる。

【００３２】ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、Mutan^TM-superExpress Km（宝酒造
（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA
-LAPCR法、Gupped duplex法やKunkel法等の自体公知の
方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことが
できる。クローン化された蛋白質をコードするＤＮＡは
目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化
したり、リンカーを付加したりして使用することができ
る。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとして
のＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンと
してのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよ
い。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当
な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。本発明の蛋白質の発現ベクターは、例えば、（イ）
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮ
Ａ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベ
クター中のプロモーターの下流に連結することにより製
造することができる。

【００３３】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｈ
ＩＶ-ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳ
Ｖ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのう
ち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用
いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合
は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃ
Ａプロモーター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモー
ターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ
１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロ
モーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロ
モーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞で
ある場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモ
ーターなどが好ましい。

【００３４】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明の蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主
がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配
列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌
である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチ
リシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合
は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シ
グナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗
体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。この
ようにして構築された本発明の蛋白質をコードするＤＮ
Ａを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する
ことができる。

【００３５】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０
(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・
リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キアパストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。

【００３６】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞とし
ては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１
細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Viv
o）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫とし
ては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。

【００３７】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１
１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１
９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mo
lecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１
９７９)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９
４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad.
Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記
載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または
昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジ
ー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の
方法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換
するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験
プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発
行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１
９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。こ
のようにして、Ｇ蛋白質共役型蛋白質をコードするＤＮ
Ａを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体
が得られる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、
酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよ
い。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

【００３８】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通
常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により
通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形
質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バーク
ホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、
必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００３９】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜ま
たは細胞外に本発明のＧ蛋白質共役型蛋白質を生成せし
めることができる。

【００４０】上記培養物から本発明の蛋白質を分離精製
するには、例えば、下記の方法により行なうことができ
る。本発明の蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞
を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチ
ームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは
細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗
抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に
尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトン
Ｘ−１００^TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、
それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離
し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、
あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、自体公知
の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができ
る。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒
沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられ
る。

【００４１】かくして得られる蛋白質が遊離体で得られ
た場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法
によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場
合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によ
り、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後
に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に
修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去すること
もできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシ
ン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、
プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられ
る。かくして生成する本発明の蛋白質またはその塩の活
性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を
用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定するこ
とができる。

【００４２】本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたは
それらの塩に対する抗体は、本発明の蛋白質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであっ
てもよい。本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩（以下、本発明の蛋白質等と略記する）に対す
る抗体は、本発明の蛋白質等を抗原として用い、自体公
知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することが
できる。

【００４３】〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製本発明の蛋白質等は、哺乳動物に対して投与により抗体
産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とと
もに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺
乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモ
ット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、
マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクロー
ナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された
温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体
を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を
採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と
融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の
測定は、例えば、後記の標識化した本発明の蛋白質等と
抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活
性を測定することにより行なうことができる。融合操作
は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法
〔ネイチャー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７
５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤とし
ては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセ
ンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧ
が用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−
１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ
１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾
臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜
２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０
００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添
加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で
約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく
細胞融合を実施できる。

【００４４】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、本発明の蛋白質等抗原を直接あるいは担体とともに
吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリド
ーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標
識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細
胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用い
られる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモ
ノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗
体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドー
マ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した
本発明の蛋白質等を加え、固相に結合したモノクローナ
ル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナ
ル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に
従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細
胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用
培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならば
どのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、
好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ
１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培
地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用
無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを
用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、
好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３
週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常
５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ
培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と
同様にして測定できる。

【００４５】（ｂ）モノクロナール抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行なうことができる。

【００４６】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法にしたがって製造することができる。例えば、免
疫抗原（本発明の蛋白質等抗原）とキャリアー蛋白質と
の複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法
と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発
明の蛋白質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分
離精製を行なうことにより製造できる。哺乳動物を免疫
するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との
複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリア
ーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免
疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの
様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例え
ば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キー
ホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテ
ン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割
合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンと
キャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いるこ
とができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、
マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル
基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生
成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそ
れ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与
に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジ
ュバントや不完全フロイントアジュバントを投与しても
よい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜
１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体
は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水な
ど、好ましくは血液から採取することができる。抗血清
中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗
体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗
体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製
と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうこ
とができる。

【００４７】本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたは
それらの塩、およびそれらをコードするＤＮＡは、本
発明の蛋白質に対するリガンドの決定方法、抗体およ
び抗血清の入手、組換え型蛋白質の発現系の構築、
同発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医
薬品候補化合物のスクリーニング、構造的に類似した
リガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデ
ザインの実施、遺伝子診断におけるプローブやＰＣＲ
プライマーを作成するための試薬、トランスジェニッ
ク動物の作製または遺伝子予防・治療剤等の医薬など
として用いることができる。特に、本発明の組換え型蛋
白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用い
ることによって、ヒトや哺乳動物に特異的なＧ蛋白質共
役型レセプターに対するリガンドの結合性を変化させる
化合物（例、アゴニスト、アンタゴニストなど）をスク
リーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタ
ゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用する
ことができる。本発明の蛋白質、部分ペプチドまたはそ
れらの塩（以下、本発明の蛋白質等と略記する場合があ
る）、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコード
するＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合があ
る）および本発明の蛋白質等に対する抗体（以下、本発
明の抗体と略記する場合がある）の用途について、以下
に具体的に説明する。

【００４８】（１）本発明の蛋白質に対するリガンド
（アゴニスト）の決定方法本発明の蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプ
チドもしくはその塩は、本発明の蛋白質またはその塩に
対するリガンド（アゴニスト）を探索し、または決定す
るための試薬として有用である。すなわち、本発明は、
本発明の蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプ
チドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させること
を特徴とする本発明の蛋白質に対するリガンドの決定方
法を提供する。試験化合物としては、公知のリガンド
（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイ
ド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラ
トニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バ
ソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ、セクレチ
ン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、
ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲ
Ｐ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブインテスティナ
ルアンドリレイテッドポリペプチド）、ソマトス
タチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニ
ン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプ
チド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロス
タグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナ
リン、αおよびβ−ケモカイン（chemokine）（例え
ば、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ
−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、
ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩ
Ｐ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセ
リン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテン
シン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイドまた
はガラニンなどがあげられ、またその他に、例えば、ヒ
トまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウ
シ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清な
どが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清
などを本発明の蛋白質に添加し、細胞刺激活性などを測
定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ること
ができる。

【００４９】具体的には、本発明のリガンド決定方法
は、本発明の蛋白質、その部分ペプチドもしくはそれら
の塩を用いるか、または組換え型蛋白質の発現系を構築
し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用い
ることによって、本発明の蛋白質に結合して細胞刺激活
性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭ
Ｐ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細
胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下
などを促進する活性または抑制する活性）を有する化合
物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を決定する
方法である。本発明のリガンド決定方法においては、本
発明の蛋白質またはその部分ペプチドと試験化合物とを
接触させた場合の、例えば、該蛋白質または該部分ペプ
チドに対する試験化合物の結合量や、細胞刺激活性など
を測定することを特徴とする。

【００５０】より具体的には、本発明は、標識した試
験化合物を、本発明の蛋白質もしくはその塩または本発
明の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合にお
ける、標識した試験化合物の該蛋白質もしくはその塩、
または該部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を
測定することを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩
に対するリガンドの決定方法、標識した試験化合物を、本発明の蛋白質を含有する細
胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標
識した試験化合物の該細胞または該膜画分に対する結合
量を測定することを特徴とする本発明の蛋白質またはそ
の塩に対するリガンドの決定方法、標識した試験化合物を、本発明の蛋白質をコードする
ＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細
胞膜上に発現した蛋白質に接触させた場合における、標
識した試験化合物の該蛋白質またはその塩に対する結合
量を測定することを特徴とする本発明の蛋白質に対する
リガンドの決定方法、

【００５１】試験化合物を、本発明の蛋白質を含有す
る細胞に接触させた場合における、蛋白質を介した細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を測定することを特徴とする本発明の蛋白質またはその
塩に対するリガンドの決定方法、および試験化合物を、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを
含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に
発現した蛋白質に接触させた場合における、蛋白質を介
する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチ
ルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生
成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細
胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を測定することを特徴とする本発明の蛋白質
またはその塩に対するリガンドの決定方法を提供する。
特に、上記〜の試験を行ない、試験化合物が本発明
の蛋白質に結合することを確認した後に、上記〜の
試験を行なうことが好ましい。

【００５２】まず、リガンド決定方法に用いる蛋白質と
しては、前記した本発明の蛋白質または本発明の部分ペ
プチドを含有するものであれば何れのものであってもよ
いが、動物細胞を用いて大量発現させた蛋白質が適して
いる。本発明の蛋白質を製造するには、前述の発現方法
が用いられるが、該蛋白質をコードするＤＮＡを哺乳動
物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好
ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片
には、通常、相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれ
に制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成
ＤＮＡを用いてもよい。本発明の蛋白質をコードするＤ
ＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発
現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバ
キュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear
polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモー
ター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスの
プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒ
ートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロ
モーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むの
が好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ
自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Na
mbi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559
頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができる。

【００５３】したがって、本発明のリガンド決定方法に
おいて、本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれ
らの塩を含有するものとしては、それ自体公知の方法に
従って精製した蛋白質、その部分ペプチドまたはそれら
の塩であってもよいし、該蛋白質を含有する細胞または
その細胞膜画分を用いてもよい。本発明のリガンド決定
方法において、本発明の蛋白質を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に
従って行なうことができる。本発明の蛋白質を含有する
細胞としては、本発明の蛋白質を発現した宿主細胞をい
うが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆
虫細胞、動物細胞などが用いられる。細胞膜画分として
は、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる
細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方
法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞
を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン
（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フ
レンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから
噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の
分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの
遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細
胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短
時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高
速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０
分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜
画分中には、発現した蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜
蛋白質などの膜成分が多く含まれる。

【００５４】該蛋白質を含有する細胞やその膜画分中の
蛋白質の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるの
が好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。
なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活
性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の
構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試
料を測定できるようになる。本発明の蛋白質またはその
塩に対するリガンドを決定する前記の〜の方法を実
施するためには、適当な蛋白質画分と、標識した試験化
合物が必要である。蛋白質画分としては、天然型のレセ
プター蛋白質画分か、またはそれと同等の活性を有する
組換え型レセプター画分などが望ましい。ここで、同等
の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝
達作用などを示す。標識した試験化合物としては、〔³
Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した
アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシ
ストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニ
ューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシ
ン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、グルカゴ
ン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチ
ン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、Ｖ
ＩＰ（バソアクティブインテスティナルアンドリ
イテッドポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミ
ン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カ
ルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコト
リエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、ト
ロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αおよびβ
−ケモカイン（chemokine）（例えば、ＩＬ−８、ＧＲ
Ｏα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７
８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ
１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−
１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガ
ストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パ
ンクレアティックポリペプタイド、ガラニンなどが好適
である。

【００５５】具体的には、本発明の蛋白質またはその塩
に対するリガンドの決定方法を行なうには、まず本発明
の蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、決定方
法に適したバッファーに懸濁することによりレセプター
標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ま
しくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸
バッファーなどのリガンドと本発明の蛋白質との結合を
阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、
非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅ
ｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオ
キシコレートなどの界面活性剤やウシ血清アルブミンや
ゼラチンなどの各種蛋白質をバッファーに加えることも
できる。さらに、プロテアーゼによるリセプターやリガ
ンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ
−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロ
テアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ
〜１０ｍlの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃ
ｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔
¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した試験化合物を共存させ
る。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未
標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。反
応は約０℃から５０℃、望ましくは約４℃から３７℃
で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３
時間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量
の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存す
る放射活性を液体シンチレーションカウンターあるいは
γ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）から非特異
的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が
０ｃｐｍを越える試験化合物を本発明の蛋白質またはそ
の塩に対するリガンド（アゴニスト）として選択するこ
とができる。

【００５６】本発明の蛋白質またはその塩に対するリガ
ンドを決定する前記の〜の方法を実施するために
は、該蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキド
ン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細
胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトール
リン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活
性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の
測定用キットを用いて測定することができる。具体的に
は、まず、本発明の蛋白質を含有する細胞をマルチウェ
ルプレート等に培養する。リガンド決定を行なうにあた
っては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さな
い適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加し
て一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは
上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従
って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例え
ば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解
酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻
害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡ
ＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンな
どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対す
る産生抑制作用として検出することができる。

【００５７】本発明の蛋白質またはその塩に結合するリ
ガンド決定用キットは、本発明の蛋白質もしくはその
塩、本発明の部分ペプチドもしくはその塩、本発明の蛋
白質を含有する細胞、または本発明の蛋白質を含有する
細胞の膜画分などを含有するものである。本発明のリガ
ンド決定用キットの例としては、次のものが挙げられ
る。１．リガンド決定用試薬測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質標品本発明の蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレ
ートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、
９５％ａｉｒで２日間培養したもの。標識試験化合物市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難
溶性を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミ
ド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。非標識試験化合物標識化合物と同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。

【００５８】２．測定法１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白
質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄し
た後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を５μｌ加えておく。反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を０.２ＮＮａＯ
Ｈ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーター
Ａ（和光純薬製）と混合する。液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定する。

【００５９】本発明の蛋白質またはその塩に結合するこ
とができるリガンドとしては、例えば、脳、下垂体、膵
臓などに特異的に存在する物質などが挙げられ、具体的
には、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、
コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニ
ン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプ
レッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、グ
ルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマト
スタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴ
Ｈ、ＶＩＰ（バソアクティブインテスティナルアン
ドリレイテッドポリペプチド）、ソマトスタチン、
ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧ
ＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、
ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグラン
ジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、α
およびβ−ケモカイン（chemokine）（例えば、ＩＬ−
８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮ
Ａ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−
１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、
ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エ
ンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、Ｔ
ＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニンな
どが用いられる。

【００６０】（２）本発明の蛋白質欠乏症の予防・治療
剤上記（１）の方法において、本発明の蛋白質に対するリ
ガンドが明らかになれば、該リガンドが有する作用に応
じて、本発明の蛋白質または該蛋白質をコードする
ＤＮＡを、本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患の
予防および／または治療剤などの医薬として使用するこ
とができる。例えば、生体内において本発明の蛋白質が
減少しているためにリガンドの生理作用が期待できない
（該蛋白質の欠乏症）患者がいる場合に、本発明の蛋
白質を該患者に投与し該蛋白質の量を補充したり、
（イ）本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを該患者に投
与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象とな
る細胞に本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入し発
現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによ
って、患者の体内における蛋白質の量を増加させ、リガ
ンドの作用を充分に発揮させることができる。したがっ
て、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、安全で低毒
性な本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾
患の予防および／または治療剤などの医薬として有用で
ある。本発明の蛋白質または本発明のＤＮＡは中枢疾患
(例えばアルツハイマー病・痴呆・摂食障害（拒食症）・
てんかんなど)、ホルモン系の疾患（例えば、微弱陣
痛、弛緩出血、胎盤娩出前後、子宮復古不全、帝王切開
術、人工妊娠中絶、乳汁うっ滞など）、肝/胆/膵/内分
泌疾患(例えば糖尿病・摂食障害など)、炎症性疾患(アレ
ルギー・喘息・リュウマチなど)、循環器疾患(例えば高
血圧症・心肥大・狭心症・動脈硬化等)の予防および／ま
たは治療に有用である。本発明の蛋白質を上記予防・治
療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化す
ることができる。一方、本発明の蛋白質をコードするＤ
ＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）を
上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮ
Ａを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイル
スベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手
段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、
そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤ととも
に、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテー
テルによって投与できる。例えば、本発明の蛋白質ま
たは該蛋白質をコードするＤＮＡは、必要に応じて糖
衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロ
カプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそ
れ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または
懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例
えば、本発明の蛋白質または該蛋白質をコードする
ＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦
形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに
一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で
混和することによって製造することができる。これら製
剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が
得られるようにするものである。

【００６１】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。

【００６２】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例
えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）に対して投与することができる。本発明
の蛋白質またはＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者
においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好
ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０
〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１
回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
よっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人
（６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につ
き約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２
０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を
静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の
場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することが
できる。

【００６３】（３）遺伝子診断剤本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することによ
り、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本
発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
ＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出すること
ができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損
傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として
有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断
は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーショ
ンやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），
第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings ofth
e Natinal Academy of Sciences of the United States
of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１
９８９年））などにより実施することができる。

【００６４】（４）本発明の蛋白質に対するリガンドの
定量法本発明の蛋白質等は、リガンドに対して結合性を有して
いるので、生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量
することができる。本発明の定量法は、例えば、競合法
と組み合わせることによって用いることができる。すな
わち、被検体を本発明の蛋白質等と接触させることによ
って被検体中のリガンド濃度を測定することができる。
具体的には、例えば、以下のまたはなどに記載の方
法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができ
る。入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行）入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）

【００６５】（５）本発明の蛋白質とリガンドとの結合
性を変化させる化合物のスクリーニング方法本発明の蛋白質等を用いるか、または組換え型蛋白質等
の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合ア
ッセイ系を用いることによって、リガンドと本発明の蛋
白質等との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチ
ド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生
産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングする
ことができる。このような化合物には、（イ）Ｇ蛋白質
共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など）を有する化合物（いわ
ゆる、本発明の蛋白質に対するアゴニスト）、（ロ）該
細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明の蛋
白質に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドと本発
明の蛋白質との結合力を増強する化合物、あるいは
（ニ）リガンドと本発明の蛋白質との結合力を減少させ
る化合物などが含まれる（なお、上記（イ）の化合物
は、前記したリガンド決定方法によってスクリーニング
することが好ましい）。すなわち、本発明は、（ｉ）本
発明の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩と、
リガンドとを接触させた場合と（ii）本発明の蛋白質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩と、リガンドおよび
試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを
特徴とするリガンドと本発明の蛋白質、その部分ペプチ
ドまたはそれらの塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のス
クリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合に
おける、例えば、該蛋白質等に対するリガンドの結合
量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴
とする。

【００６６】より具体的には、本発明は、標識したリガンドを、本発明の蛋白質等に接触させた
場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明の
蛋白質等に接触させた場合における、標識したリガンド
の該蛋白質等に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変
化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、標識したリガンドを、本発明の蛋白質等を含有する細
胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した
リガンドおよび試験化合物を本発明の蛋白質等を含有す
る細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合におけ
る、標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する
結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと
本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化合物または
その塩のスクリーニング方法、標識したリガンドを、本発明のＤＮＡを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白
質等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験
化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養す
ることによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質等に
接触させた場合における、標識したリガンドの該蛋白質
等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させる化
合物またはその塩のスクリーニング方法、

【００６７】本発明の蛋白質等を活性化する化合物
（例えば、本発明の蛋白質等に対するリガンドなど）を
本発明の蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合と、
本発明の蛋白質等を活性化する化合物および試験化合物
を本発明の蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合に
おける、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、ア
ラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など）を測定し、比較するこ
とを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との結合性
を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、および本発明の蛋白質等を活性化する化合物（例えば、本発
明の蛋白質等に対するリガンドなど）を本発明のＤＮＡ
を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上
に発現した本発明の蛋白質等に接触させた場合と、本発
明の蛋白質等を活性化する化合物および試験化合物を本
発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによ
って細胞膜上に発現した本発明の蛋白質等に接触させた
場合における、レセプターを介する細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを
促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較
することを特徴とするリガンドと本発明の蛋白質等との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法を提供する。

【００６８】本発明の蛋白質等が得られる以前は、Ｇ蛋
白質共役型レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト
をスクリーニングする場合、まずラットなどのＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を含む細胞、組織またはその細
胞膜画分を用いて候補化合物を得て（一次スクリーニン
グ）、その後に該候補化合物が実際にヒトのＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか
否かを確認する試験（二次スクリーニング）が必要であ
った。細胞、組織または細胞膜画分をそのまま用いれば
他のレセプター蛋白質も混在するために、目的とするレ
セプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニス
トを実際にスクリーニングすることは困難であった。し
かしながら、例えば、本発明のヒト由来蛋白質を用いる
ことによって、一次スクリーニングの必要がなくなり、
リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を
阻害する化合物を効率良くスクリーニングすることがで
きる。さらに、スクリーニングされた化合物がアゴニス
トかアンタゴニストかを簡便に評価することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にす
る。まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明
の蛋白質等としては、前記した本発明の蛋白質等を含有
するものであれば何れのものであってもよいが、本発明
の蛋白質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好
適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて
困難なことから、スクリーニングに用いられるものとし
ては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセ
プター蛋白質等などが適している。

【００６９】本発明の蛋白質等を製造するには、前述の
方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫
細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的
とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮ
Ａが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものでは
ない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよ
い。本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物
細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、
該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属
する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis viru
s；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由
来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メ
タロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロ
モーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲα
プロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現
したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で
行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載
の方法に従って行なうことができる。したがって、本発
明のスクリーニング方法において、本発明の蛋白質等を
含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精
製した蛋白質等であってもよいし、該蛋白質等を含有す
る細胞を用いてもよく、また該蛋白質等を含有する細胞
の膜画分を用いてもよい。

【００７０】本発明のスクリーニング方法において、本
発明の蛋白質等を含有する細胞を用いる場合、該細胞を
グルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよ
い。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうこ
とができる。本発明の蛋白質等を含有する細胞として
は、該蛋白質等を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細
胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細
胞などが好ましい。細胞膜画分としては、細胞を破砕し
た後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含ま
れる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Pott
er−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、
ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）
のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで
加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによ
る破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心
分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法
が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５
００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分
〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐ
ｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、
得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現し
た蛋白質等と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成
分が多く含まれる。該蛋白質等を含有する細胞や膜画分
中の該蛋白質の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子で
あるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適で
ある。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド
結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニン
グ系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大
量の試料を測定できるようになる。

【００７１】リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を
変化させる化合物をスクリーニングする前記の〜を
実施するためには、例えば、適当な蛋白質画分と、標識
したリガンドが必要である。蛋白質画分としては、天然
型のレセプター蛋白質画分か、またはそれと同等の活性
を有する組換え型レセプター蛋白質画分などが望まし
い。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活
性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識したリガン
ドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナ
ログ化合物などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、
〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガ
ンドなどが用いられる。具体的には、リガンドと本発明
の蛋白質等との結合性を変化させる化合物のスクリーニ
ングを行なうには、まず本発明の蛋白質等を含有する細
胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッ
ファーに懸濁することにより蛋白質標品を調製する。バ
ッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）
のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリ
ガンドと蛋白質との結合を阻害しないバッファーであれ
ばいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目
的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラ
ス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性
剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテ
アーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的
でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所
製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加す
ることもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプタ
ー溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐ
ｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０^-4Ｍ〜１
０^-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量
（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加
えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５０
℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２４
時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチ
レーションカウンターまたはγ−カウンターで計測す
る。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀）から非特
異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳ
Ｂ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）
が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能
力のある候補物質として選択することができる。

【００７２】リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を
変化させる化合物スクリーニングする前記の〜の方
法を実施するためには、例えば、蛋白質を介する細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定す
ることができる。具体的には、まず、本発明の蛋白質等
を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。
スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培
地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交
換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベー
トした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成
した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激
活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の
生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場
合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを
行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性に
ついては、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を
増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出
することができる。細胞刺激活性を測定してスクリーニ
ングを行なうには、適当な蛋白質を発現した細胞が必要
である。本発明の蛋白質等を発現した細胞としては、天
然型の本発明の蛋白質等を有する細胞株、前述の組換え
型蛋白質等を発現した細胞株などが望ましい。試験化合
物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド
性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物
抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物
は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっ
てもよい。

【００７３】リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を
変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キッ
トは、本発明の蛋白質等、本発明の蛋白質等を含有する
細胞、または本発明の蛋白質等を含有する細胞の膜画分
を含有するものなどである。本発明のスクリーニング用
キットの例としては、次のものが挙げられる。１．スクリーニング用試薬測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。Ｇ蛋白質共役型レセプター標品本発明の蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレ
ートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、
９５％ａｉｒで２日間培養したもの。標識リガンド市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識したリガンド水溶液の状態のものを４℃あるいは
−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに
希釈する。リガンド標準液リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。

【００７４】２．測定法１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白
質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄し
た後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わ
りに１０^-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２ＮＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。

【００７５】〔数１〕ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１０
０ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ：検体を加えた時の値ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）Ｂ₀ ：最大結合量

【００７６】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドと本発明の蛋白質等との結合性を変化させ
る作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｇ蛋
白質共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ ²⁺
遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノ
シトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質の
リン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進
する活性または抑制する活性など）を有する化合物（い
わゆる、本発明の蛋白質に対するアゴニスト）、（ロ）
該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明の
蛋白質に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドと本
発明のＧ蛋白質共役型蛋白質との結合力を増強する化合
物、あるいは（ニ）リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型
蛋白質との結合力を減少させる化合物である。該化合物
としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物
は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっ
てもよい。本発明の蛋白質等に対するアゴニストは、本
発明の蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性と同
様の作用を有しているので、該リガンド活性に応じて安
全で低毒性な医薬 [例えば、中枢疾患(例えばアルツハ
イマー病・痴呆・摂食障害（拒食症）・てんかんなど)、
ホルモン系の疾患（例えば、微弱陣痛、弛緩出血、胎盤
娩出前後、子宮復古不全、帝王切開術、人工妊娠中絶、
乳汁うっ滞など）、肝/胆/膵/内分泌疾患(例えば糖尿病
・摂食障害など)、炎症性疾患(アレルギー・喘息・リュ
ウマチなど)、循環器疾患(例えば高血圧症・心肥大・狭心
症・動脈硬化等)の予防および／または治療剤など]とし
て有用である。本発明の蛋白質等に対するアンタゴニス
トは、本発明の蛋白質等に対するリガンドが有する生理
活性を抑制することができるので、該リガンド活性を抑
制する安全で低毒性な医薬[例えば、ホルモン分泌調節
薬、本発明の蛋白質等に対するリガンドの過剰な産生に
よって惹起される中枢疾患、ホルモン系の疾患、肝／胆
／膵／内分泌疾患（例えば抗肥満薬・摂食過剰など）、
炎症性疾患、循環器疾患の予防および／または治療薬な
ど]として有用である。リガンドと本発明の蛋白質との
結合力を減少させる化合物は、本発明の蛋白質等に対す
るリガンドが有する生理活性を減少させるための安全で
低毒性な医薬[例えば、ホルモン分泌調節薬、本発明の
蛋白質等に対するリガンドの過剰な産生によって惹起さ
れる中枢疾患、ホルモン系の疾患、肝／胆／膵／内分泌
疾患（例えば抗肥満薬・摂食過剰など）、炎症性疾患、
循環器疾患の予防および／または治療薬など]として有
用である。

【００７７】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従
って実施することができる。例えば、前記した本発明の
蛋白質を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、
懸濁液剤などとすることができる。このようにして得ら
れる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺
乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することがで
きる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対
象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口
投与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
である。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は
投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異
なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（６０ｋｇと
して）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【００７８】（６）本発明の蛋白質、その部分ペプチド
またはそれらの塩の定量本発明の抗体は、本発明の蛋白質等を特異的に認識する
ことができるので、被検液中の本発明の蛋白質等の定
量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用
することができる。すなわち、本発明は、例えば、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化蛋白質等と
を競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化蛋白質等
の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の
蛋白質等の定量法、（ii）被検液と担体上に不溶化した
本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時
あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識
剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明
の蛋白質等の定量法を提供する。上記（ii）において
は、一方の抗体が本発明の蛋白質等のＮ端部を認識する
抗体で、他方の抗体が本発明の蛋白質等のＣ端部に反応
する抗体であることが好ましい。

【００７９】本発明の蛋白質等に対するモノクローナル
抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合
がある）を用いて本発明の蛋白質等の測定を行なえるほ
か、組織染色等による検出を行なうこともできる。これ
らの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、ま
た、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ
画分を用いてもよい。本発明の蛋白質等に対する抗体を
用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被
測定液中の抗原量（例えば、蛋白質量）に対応した抗
体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または
物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標
準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ
れば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロ
メトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイ
ッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後
述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識
物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例え
ば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが
用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵
Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられ
る。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好
ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質と
しては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイ
ソチオシアネートなどが用いられる。発光物質として
は、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェ
リン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体ある
いは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用
いることもできる。

【００８０】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素
等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用い
る方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、
デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリス
チレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、
あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法におい
ては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を
反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明の蛋白質量を定量することができる。１次反応と
２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なっ
てもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤お
よび不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法による本発明の蛋白質等の測定法
においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の
モノクローナル抗体は本発明の蛋白質等の結合する部位
が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応
および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応
で用いられる抗体が、本発明の蛋白質のＣ端部を認識す
る場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端
部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。

【００８１】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００８２】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明の蛋白質またはその塩の測定系を構築すればよい。こ
れらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書
などを参照することができる〔例えば、入江寛編「ラ
ジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入
江寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５
４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書
院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定
法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄
治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和
６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー（Me
thods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Immunochemical Tech
niques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Tech
niques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochemical Tech
niques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochemical Tech
niques(Part D:Selected Immunoassays))、同書 Vol.
92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Ant
ibodies and GeneralImmunoassay Methods))、同書 Vo
l. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカ
デミックプレス社発行)など参照〕。以上のように、本
発明の抗体を用いることによって、本発明の蛋白質また
はその塩を感度良く定量することができる。さらに、本
発明の抗体を用いて本発明の蛋白質またはその塩を定量
することによって、各種疾病の診断をすることができ
る。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中
に存在する本発明の蛋白質等を検出するために使用する
ことができる。また、本発明の蛋白質等を精製するため
に使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発
明の蛋白質等の検出、被検細胞内における本発明の蛋白
質の挙動の分析などのために使用することができる。

【００８３】（７）本発明のＧ蛋白質共役型蛋白質をコ
ードするＤＮＡを有する非ヒト動物の作製本発明のＤＮＡを用いて、本発明の蛋白質等を発現する
トランスジェニック非ヒト動物を作製することができ
る。非ヒト動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、
マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サ
ルなど）など（以下、動物と略記する）が挙げれるが、
特に、マウス、ウサギなどが好適である。本発明のＤＮ
Ａを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動
物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺
伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利であ
る。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを転移させる
場合、これと相同性が高い動物由来の本発明のＤＮＡを
動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合
した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ受精卵へ
マイクロインジェクションすることによって本発明の蛋
白質等を高産生するＤＮＡ転移動物を作出できる。この
プロモーターとしては、例えば、ウイルス由来プロモー
ター、メタロチオネイン等のユビキアスな発現プロモー
ターも使用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現する
ＮＧＦ遺伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモー
ターなどが用いられる。

【００８４】受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの
転移は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽
細胞において本発明の蛋白質等が存在することは、作出
動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発
明の蛋白質等を有することを意味する。遺伝子を受け継
いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の
全てに本発明の蛋白質等を有する。本発明のＤＮＡ転移
動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認
して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継
代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する
雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染
色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌
雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡ
を有するように繁殖継代することができる。本発明のＤ
ＮＡが転移された動物は、本発明の蛋白質等が高発現さ
せられているので、本発明の蛋白質等に対するアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニング用の動物など
として有用である。本発明のＤＮＡ転移動物を、組織培
養のための細胞源として使用することもできる。例え
ば、本発明のＤＮＡ転移マウスの組織中のＤＮＡもしく
はＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現
された本発明の蛋白質が存在する組織を分析することに
より、本発明の蛋白質等について分析することができ
る。本発明の蛋白質等を有する組織の細胞を標準組織培
養技術により培養し、これらを使用して、例えば、脳や
末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞
の機能を研究することができる。また、その細胞を用い
ることにより、例えば、各種組織の機能を高めるような
医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれ
ば、そこから、本発明の蛋白質等を単離精製することも
可能である。

【００８５】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００８６】Ｇｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＣＨＯ：ホルミルＢｚｌ：ベンジル Cl₂Bzl ：２，６−ジクロロベンジルＢｏｍ：ベンジルオキシメチルＺ：ベンジルオキシカルボニルＣｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニルＢｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルＢｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニルＤＮＰ：ジニトロフェノールＴｒｔ：トリチルＢｕｍ：ｔ−ブトキシメチルＦｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＨＯＯＢｔ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジンＨＯＮＢ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００８７】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。〔配列番号：１〕本発明のヒト脳由来蛋白質のアミノ酸
配列を示す。〔配列番号：２〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有する本発明のヒト脳由来蛋白質をコードするＤＮ
Ａの塩基配列を示す（ＡＱ２７）。〔配列番号：３〕後述の実施例１および実施例２で用い
られたプライマー１の塩基配列を示す。〔配列番号：４〕後述の実施例１および実施例２で用い
られたプライマー２の塩基配列を示す。〔配列番号：５〕後述の実施例２で用いられたフォワー
ドプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：６〕後述の実施例２で用いられたリバース
プライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：７〕後述の実施例２で用いられたプローブ
の塩基配列を示す。

【００８８】後述の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒアコリ（Escherichia coli)ＤＨ５α／ｐｃＤ
ＮＡ３．１−ＡＱ２７は、平成１１年８月２３日から日
本国茨城県つくば市東１丁目１−３の通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号Ｆ
ＥＲＭＢＰ−６８５４として、平成１１年８月４日か
ら日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７−８５
の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６３０４として寄託されている。

【００８９】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載さ
れている方法に従った。

【００９０】実施例１Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質ＡＱ２７をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基
配列の決定ヒト胎児脳ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型と
し、２個のプライマー、プライマー１（5'-TGT CAG C
AT GCA GGC GCT TAA CAT TAC CCC GGAGCA G -
3'；配列番号：３）及びプライマー２（5'- GAC TAG
TTT AAT GCCCAC TGT CTA AAG GAG AAT TCT C
-3'；配列番号：４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該
反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡの１０分の１
量を鋳型として使用し、Advantage2 Polymerase Mix
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１／５０量、プライマー１及び
プライマー２を各0.2μM, dNTPs 200μM、及び酵素に
添付のバッファーを加え、25μlの液量とした。ＰＣＲ
反応は、９５℃・１分の後、９５℃・３０秒、７２℃・
４分のサイクルを５回、９５℃・３０秒、７０℃・４分
のサイクルを５回、９５℃・３０秒、６８℃・３０秒、
６６℃・４分のサイクルを３０回繰り返し、最後に６８
℃・３分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応産
物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）の処方に
従いプラスミドベクターpcDNA３.１/V５/His（Invitrog
en社）へサブクローニングし、得られたプラスミドをpc
DNA3.1-AQ27と命名した。これを大腸菌ＤＨ５αに導入
し、ｃＤＮＡをもつクローンをアンピシリンを含むＬＢ
寒天培地中で選択した後、個々のクローンの配列を解析
した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡ配列を得た。このｃＤＮＡより導き出さ
れるアミノ酸配列を有する蛋白質をＡＱ２７と命名し、
この形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）DH5α/p
cDNA3.1-AQ27と命名した。

【００９１】実施例２ TaqMan PCRを用いたAQ27 の発
現組織分布の解析まずプライマー及びプローブは Primer Express ver.1.
0 ( PEバイオシステムズジャパン ) を用いてデザイン
し、フォワードプライマー AQ27taqF ( 5'- CAATG CT
AGG TGTGG TCTGG CT - 3' （配列番号：５）) 、リバー
スプライマーAQ27taqR ( 5' - GATCT CAAGT TGTTG CACG
T GC - 3' （配列番号：６）) 、プローブAQ27-515T (
5' - TGGCA GTCAT CGTAG GATCA CCCAT G - 3' （配列番
号：７）) を作製した。プローブのリポーター色素はFA
M ( 6-carboxyfluorescein )を付加した。スタンダード
cDNA は、pcDNA3.1-AQ27を鋳型にしてプライマー１
（配列番号：３)、プライマー２（配列番号：４) を用
いて増幅したPCR断片をQIAquick PCR Purification Kit
[ QIAGEN ( Germany ) ] にて精製し、 10⁰ - 10⁶ コ
ピー/ μl に調製して用いた。各組織の cDNAソースは
Human Tissue cDNA Panel I 及びPanel II [ CLONTECH
Laboratories, Inc. ( CA, USA ) ] を用いた。TaqMa
n PCRの反応はTaqMan Universal PCR Master Mix ( PE
バイオシステムズジャパン ) の試薬を用い、 ABI PRI
SM 7700 Sequence Detection System ( PEバイオシス
テムズジャパン ) にて、添付の説明書に従い反応させ
た。結果を図４および表１に示した。 AQ27 は心臓、肝
臓、精巣に高い発現が見られた。

【表１】

【００９２】実施例３ AQ27のMet-Enkephalin-Arg-Phe
amideに対する反応 AQ27発現CHO細胞およびmock細胞をサイトセンサー用の
カプセルにそれぞれ2.7×10⁵cells/capsuleで播種し、
一晩培養した後、サイトセンサー（モレキュラーデバイ
ス社）にセットした。Acidification rateが安定した
後、Met-Enkephalin-Arg-Phe amide (Bachem社、H-283
5)を10μMの濃度で7分2秒間作用させ、Acidification r
ateの上昇率を指標に細胞の活性化を測定した。その結
果、Met-Enkephalin-Arg-Phe amideはAQ27発現CHO細胞
を特異的に活性化し、AQ27に対して特異的に反応するこ
とが確認された（図５）。

【００９３】

【発明の効果】本発明の蛋白質、その部分ペプチドまた
はそれらの塩、およびそれらをコードするＤＮＡは、
リガンド（アゴニスト）の決定、抗体および抗血清の
入手、組み替え型蛋白質の発現系の構築、同発現系
を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補
化合物のスクリーニング、構造的に類似したリガンド
・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインの
実施、遺伝子診断におけるプローブやＰＣＲプライマ
ーの作成のための試薬、トランスジェニック動物の作
製または遺伝子予防・治療剤等の医薬等として用いる
ことができる。

【００９４】

【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel G Protein Coupled Receptor Protein and Its Use <130> B00200 <150> JP 11-241530 <151> 1999-08-27 <160> 7 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg 1 5 10 15 Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Leu Tyr Arg Leu Arg 20 25 30 Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ala Leu 35 40 45 Val Leu Thr Gly Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ala 50 55 60 Leu Val Phe Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr 65 70 75 80 Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Thr Phe 85 90 95 Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Trp Leu 100 105 110 Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala 115 120 125 Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His 130 135 140 Gln Gly Leu Val His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg 145 150 155 160 Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val Ile Val 165 170 175 Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe 180 185 190 Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro 195 200 205 Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu 210 215 220 Leu Pro Leu Met Val Met Leu Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Gly Ser Val Leu Arg Thr Ile 245 250 255 His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val 260 265 270 Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro 275 280 285 Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu 290 295 300 Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe Ala Ile Val Gln Ile Ile 305 310 315 320 Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile Val Tyr Ala Phe Met Asn 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val 340 345 350 Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly Ile Thr 355 360 365 Met Met Arg Lys Lys Ala Lys Phe Ser Leu Arg Glu Asn Pro Val Glu 370 375 380 Glu Thr Lys Gly Glu Ala Phe Ser Asp Gly Asn Ile Glu Val Lys Leu 385 390 395 400 Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys Lys Lys Leu Lys Arg His Leu Ala Leu 405 410 415 Phe Arg Ser Glu Leu Ala Glu Asn Ser Pro Leu Asp Ser Gly His 420 425 430 <210> 2 <211> 1293 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGCAGGCGC TTAACATTAC CCCGGAGCAG TTCTCTCGGC TGCTGCGGGA CCACAACCTG 60 ACGCGGGAGC AGTTCATCGC TCTGTACCGG CTGCGACCGC TCGTCTACAC CCCAGAGCTG 120 CCGGGACGCG CCAAGCTGGC CCTCGTGCTC ACCGGCGTGC TCATCTTCGC CCTGGCGCTC 180 TTTGGCAATG CTCTGGTGTT CTACGTGGTG ACCCGCAGCA AGGCCATGCG CACCGTCACC 240 AACATCTTTA TCTGCTCCTT GGCGCTCAGT GACCTGCTCA TCACCTTCTT CTGCATTCCC 300 GTCACCATGC TCCAGAACAT TTCCGACAAC TGGCTGGGGG GTGCTTTCAT TTGCAAGATG 360 GTGCCATTTG TCCAGTCTAC CGCTGTTGTG ACAGAAATCC TCACTATGAC CTGCATTGCT 420 GTGGAAAGGC ACCAGGGACT TGTGCATCCT TTTAAAATGA AGTGGCAATA CACCAACCGA 480 AGGGCTTTCA CAATGCTAGG TGTGGTCTGG CTGGTGGCAG TCATCGTAGG ATCACCCATG 540 TGGCACGTGC AACAACTTGA GATCAAATAT GACTTCCTAT ATGAAAAGGA ACACATCTGC 600 TGCTTAGAAG AGTGGACCAG CCCTGTGCAC CAGAAGATCT ACACCACCTT CATCCTTGTC 660 ATCCTCTTCC TCCTGCCTCT TATGGTGATG CTTATTCTGT ACAGTAAAAT TGGTTATGAA 720 CTTTGGATAA AGAAAAGAGT TGGGGATGGT TCAGTGCTTC GAACTATTCA TGGAAAAGAA 780 ATGTCCAAAA TAGCCAGGAA GAAGAAACGA GCTGTCATTA TGATGGTGAC AGTGGTGGCT 840 CTCTTTGCTG TGTGCTGGGC ACCATTCCAT GTTGTCCATA TGATGATTGA ATACAGTAAT 900 TTTGAAAAGG AATATGATGA TGTCACAATC AAGATGATTT TTGCTATCGT GCAAATTATT 960 GGATTTTCCA ACTCCATCTG TAATCCCATT GTCTATGCAT TTATGAATGA AAACTTCAAA 1020 AAAAATGTTT TGTCTGCAGT TTGTTATTGC ATAGTAAATA AAACCTTCTC TCCAGCACAA 1080 AGGCATGGAA ATTCAGGAAT TACAATGATG CGGAAGAAAG CAAAGTTTTC CCTCAGAGAG 1140 AATCCAGTGG AGGAAACCAA AGGAGAAGCA TTCAGTGATG GCAACATTGA AGTCAAATTG 1200 TGTGAACAGA CAGAGGAGAA GAAAAAGCTC AAACGACATC TTGCTCTCTT TAGGTCTGAA 1260 CTGGCTGAGA ATTCTCCTTT AGACAGTGGG CAT 1293 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 3 TGTCAGCATG CAGGCGCTTA ACATTACCCC GGAGCAG 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 GACTAGTTTA ATGCCCACTG TCTAAAGGAG AATTCTC 37 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 5 CAATGCTAGG TGTGGTCTGG CT 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 6 GATCTCAAGT TGTTGCACGT GC 22 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 7 TGGCAGTCAT CGTAGGATCA CCCATG 26

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質
をコードするＤＮＡの塩基配列（ＡＱ２７）、およびそ
れから推定されるアミノ酸配列を示す（図２に続く）。

【図２】実施例１で得られた本発明のヒト脳由来蛋白質
をコードするＤＮＡの塩基配列（ＡＱ２７）、およびそ
れから推定されるアミノ酸配列を示す（図１の続き）。

【図３】本発明のヒト脳由来蛋白質の疎水性プロットを
示す。

【図４】実施例２で行われたAQ27 の発現組織分布の解
析結果を示す。

【図５】実施例３で行われたAQ27に対するMet-Enkephal
in-Arg-Phe amideの反応性の解析結果を示す。縦軸はAc
idification rate、横軸は測定サイクルを表わし、●は
受容体発現CHO細胞の、○はmock細胞の反応性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 5/24 Ａ６１Ｐ 9/10 9/00 9/12 9/10 11/06 9/12 15/04 11/06 25/00 １０１ 15/04 25/08 25/00 １０１ 25/28 25/08 29/00 １０１ 25/28 37/08 29/00 １０１Ｃ０７Ｋ 14/705 37/08 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 ＺＣ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/50 Ｃ１２Ｑ 1/02 33/566 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するこ
とを特徴とする蛋白質またはその塩。
【請求項２】請求項１記載の蛋白質の部分ペプチドまた
はその塩。
【請求項３】請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡ。
【請求項４】配列番号：２で表される塩基配列を有する
請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】請求項３記載のＤＮＡを含有する組換えベ
クター。
【請求項６】請求項５記載の組換えベクターで形質転換
された形質転換体。
【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培養し、請求
項１記載の蛋白質を生成・蓄積せしめることを特徴とす
る請求項１記載の蛋白質またはその塩の製造法。
【請求項８】請求項１記載の蛋白質もしくは請求項２記
載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項９】請求項１記載の蛋白質もしくは請求項２記
載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とす
る請求項１記載の蛋白質またはその塩に対するリガンド
の決定方法。
【請求項１０】請求項１記載の蛋白質もしくは請求項２
記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴と
するリガンドと請求項１記載の蛋白質またはその塩との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法。
【請求項１１】請求項１記載の蛋白質もしくは請求項２
記載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴
とするリガンドと請求項１記載の蛋白質またはその塩と
の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニ
ング用キット。
【請求項１２】請求項１０記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１１記載のスクリーニング用キットを用いて
得られうる、リガンドと請求項１記載の蛋白質またはそ
の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項１３】請求項１０記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１１記載のスクリーニング用キットを用いて
得られうる、リガンドと請求項１記載の蛋白質またはそ
の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有
してなる医薬。
【請求項１４】請求項３記載のＤＮＡとハイストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。