JPWO2005100566A1 - 新規サルｇｐｒ１０３及びサルｑｒｆｐ並びにｇｐｒ１０３を用いた化合物の評価方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】ヒト以外の霊長類又はラットのＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質及び当該遺伝子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法を提供すること。また、ＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質の機能解析や、前記化合物の評価において利用価値の高い新規リガンドを提供すること。【解決手段】配列番号１〜４に記載の配列を有する核酸又はタンパク質により、ヒト以外の霊長類又はラットのＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質や、これらの遺伝子及びタンパク質に基づく情報が提供される。また、これらの遺伝子及びタンパク質を用いて化合物の評価が可能となる。さらに、配列番号５及び６に記載の配列を有する核酸又はタンパク質により、ＧＰＲ１０３リガンドが提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、新規サル及びラットＧＰＲ１０３遺伝子、タンパク質に関し、当該遺伝子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法に関する。また、本発明は、ＧＰＲ１０３のリガンドタンパク質に関する。
生体内の機能を調節するホルモン、神経伝達物質又は生理活性物質の多くは、細胞膜上に存在するグアノシン三リン酸結合タンパク質（以下、「Ｇタンパク質」という）共役型レセプターを介して標的細胞にシグナルを伝達し、固有の機能を発揮する。かかるレセプターは、細胞膜を７回貫通するという共通の構造を有し、Ｇタンパク質共役型レセプタースーパーファミリーを形成している。
Ｇタンパク質共役型レセプターは、これまでにすでに数百種が単離されているが、依然、単離されていないものもある。また、そのリガンドが不明である、いわゆるオーファンレセプターも多く存在する。
このようなレセプターやリガンドが単離され、機能が解明されることにより、生体内で生じる生理機能を解明することが可能となるとともに、当該機能をコントロールすることができるアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能となり、医薬品の開発に貢献することが期待されている。
ＧＰＲ１０３（ＳＰ９１５５又はＡＱ２７とも称される）はＧタンパク質共役型レセプターの一種であり、ヒトＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質については、種々のＧタンパク質共役型レセプターのアミノ酸配列を元にＥＳＴ及びゲノムＤＮＡのデータベース検索を行い、得られた配列情報に基づいてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により単離された（非特許文献１）。また、ヒトＧＰＲ１０３タンパク質のアミノ酸配列は、特許文献１にも開示されている。
また、マウスＧＰＲ１０３は、特許文献２及び特許文献３に開示されている。さらに、ラットＧＰＲ１０３は、特許文献３に開示されている。
ＧＰＲ１０３は、オレキシン、神経ペプチドＦＦ、コレシストキニン（Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）レセプターと高い相同性を有し、これらの分子と類似の機能を有することは予想されたが、その機能については未知であった。しかし、その後、Ｙｉｎｇ Ｊｉａｎｇらによって、リガンドとして機能するペプチドが見出され（非特許文献２、特許文献４）、また、ラット副腎の球状帯上において、アルドステロン（Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ）の分泌の誘導に関与することが示唆されている（非特許文献３）。
一方、治療薬や診断薬の開発において、開発候補化合物は、げっ歯類及び霊長類においてその生理学的作用が評価される。これは、候補化合物が動物種によって異なる薬効を示すことがあるためであり、よりヒトに近い霊長類において評価することが毒性の低い治療薬や診断薬の効率的な開発に寄与することとなる。
ＷＯ００１１０１５号公報 ＷＯ２００２０４２４５８号公報 特開２００４−０００１１３号公報 特開２００１−１３６９８１号公報 Ｇｅｎｅ、２７５巻、８３頁（２００１年） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８巻、２７６５２頁（２００３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８巻、４６３８７頁（２００３）
しかしながら、ヒト以外の霊長類ＧＰＲ１０３遺伝子は未だ単離されておらず、かかる遺伝子を用いた治療薬や診断薬の評価は不可能な状況であった。
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒト以外の霊長類のＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質を提供することを目的とする。また、当該遺伝子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法を提供することを目的とする。併せて、ＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質の機能解析や、前記化合物の評価において利用価値の高い新規リガンドを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、新規サル及びラットＧＰＲ１０３遺伝子（配列番号1及び３）を単離すること、及び、サル由来のＧＰＲ１０３リガンドであるｐｒｅｐｒｏＰ５１８／ＱＲＦＰ（配列番号５）を単離することに成功し、さらにサルＱＲＦＰに基づきＧＰＲ１０３リガンド活性を有するタンパク質であるＱＲＦＰ４３（配列番号４９）及びＱＲＦＰ２６（配列番号５０）を設計し合成することに成功するとともに、これらの分子を用いた結合実験によりリガンドの評価を行うことに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の核酸は、配列番号１又は３に記載の塩基配列を含むことを特徴とする。ここで、「配列番号１又は３に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列に、ベクターとのリンカー配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の遺伝子の改変に必要な配列等の、付加的な塩基配列が付加されていることをいう。
また、本発明の核酸は、配列番号１又は３に記載の塩基配列からなることを特徴とする。
さらに、本発明の核酸は、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードすることを特徴とする。
以上述べたような本発明の核酸により、ヒト以外の霊長類及びラットのＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質とこれらの配列に関する情報を得ることが可能となり、主としてヒトの医薬の標的であるＧＰＲ１０３のモデルシステムの構築が可能となる。
また、本発明の遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなることを特徴とする。かかる遺伝子を用いることにより、サルＧＰＲ１０３遺伝子と相同性の高い遺伝子の検出が可能となる。
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなることを特徴とする。かかる遺伝子を用いることにより、ラットＧＰＲ１０３遺伝子と相同性の高い遺伝子の検出や単離が可能となる。
また、本発明は、上記の核酸又は遺伝子を含む発現ベクターをも包含する。かかるベクターを用いることにより、ＧＰＲ１０３の遺伝子レベルでの操作や、組換えタンパク質の発現等が可能となる。
さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞をも包含する。かかる宿主細胞を用いることにより、化合物やペプチド等のリガンドの評価等の細胞レベルでの研究が可能となる。
また、本発明のタンパク質は、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。ここで、「配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を含む」とは、前記アミノ酸配列に、レポータータンパク、その他当該タンパク質の検出及び評価のため等に使用可能な必要なアミノ酸配列等の、付加的なアミノ酸配列が結合されていることをいう。
さらに、本発明のタンパク質は、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
さらに、本発明のタンパク質は、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入があるアミノ酸配列を含有し、ＧＰＲ１０３タンパク質の活性を有することを特徴とする。
以上述べたような本発明のタンパク質により、ヒト以外の霊長類及びラットのＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質とこれらの配列に関する情報を得ることが可能となり、主としてヒトの医薬の標的であるＧＰＲ１０３のモデルシステムの構築が可能となる。
さらに、本発明は、前記のタンパク質に対する抗体をも包含する。かかる抗体を用いることにより、ＧＰＲ１０３タンパク質の抗原抗体反応を生じさせることが可能となり、当該タンパク質の検出や、ＧＰＲ１０３タンパク質を標的とした診断等が可能となる。
また、本発明の化合物の評価方法は、ＧＰＲ１０３遺伝子を導入し、ＧＰＲ１０３タンパク質を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該ＧＰＲ１０３に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
さらに、本発明の化合物の評価方法は、ＧＰＲ１０３遺伝子を導入し、ＧＰＲ１０３タンパク質を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、被検化合物を、ＧＰＲ１０３タンパク質に接触させる工程と、当該接触による該タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
以上述べたような化合物の評価方法により、ＧＰＲ１０３タンパク質に結合する化合物（例えば、アゴニスト又はアンタゴニスト）の評価が可能となる。
さらに、本発明は、本発明の化合物の評価方法によって選択された化合物をも包含する。かかる化合物により、ＧＰＲ１０３に関与する疾病の診断薬や治療薬が提供される。
また、本発明の化合物の評価方法においては、ＧＰＲ１０３がサルＧＰＲ１０３であることが好ましい。サルＧＰＲ１０３を用いることにより、よりヒトの生体内に近い条件下で化合物の評価を行うことが可能となる。
また、本発明の核酸は、配列番号５に記載の塩基配列を含むことを特徴とする。ここで、「配列番号５に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列に、ベクターとのリンカー配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の遺伝子の改変に必要な配列等の、付加的な塩基配列が付加されていることをいう。
また、本発明の核酸は、配列番号５に記載の塩基配列からなることを特徴とする。
さらに、本発明の核酸は、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードすることを特徴とする。
これらの核酸により、ＧＰＲ１０３のリガンドタンパク質（ＱＲＦＰ）をコードする核酸及び当該核酸に係る情報が提供され、併せて、ＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質の機能解析や、本発明の化合物の評価方法において利用価値の高いリガンドが提供される。
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号５に記載の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなることを特徴とする。かかる遺伝子を用いることにより、ＱＲＦＰと相同性の高い遺伝子の検出や単離が可能となる。
また、本発明のタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。ここで、「配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む」とは、前記アミノ酸配列に、レポータータンパク、その他当該タンパク質の検出及び評価のため等に使用可能な必要なアミノ酸配列等の、付加的なアミノ酸配列が結合されていることをいう。
また、本発明のタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
また、本発明のタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入があるアミノ酸配列を含有し、ＧＰＲ１０３のリガンドタンパク質（ＱＲＦＰ）活性を有することを特徴とする。
また、本発明のタンパク質は、配列番号４９又は５０に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
さらに、本発明は、前記のタンパク質に対する抗体をも包含する。かかる抗体を用いることにより、ＱＲＦＰタンパク質の抗原抗体反応を生じさせることが可能となり、当該タンパク質の検出や、当該タンパク質を標的とした診断等が可能となる。
これらの核酸、タンパク質及び抗体により、ＧＰＲ１０３のリガンドタンパク質（ＱＲＦＰ）及び当該タンパク質に係る情報が提供され、併せて、ＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質の機能解析や、本発明の化合物の評価方法において利用価値の高いリガンドが提供される。
本発明の核酸、遺伝子、タンパク質及び抗体によれば、ヒト以外の霊長類及びラットのＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質とこれらの配列に関する情報、並びにＧＰＲ１０３のリガンドタンパク質（ＱＲＦＰ）及び当該タンパク質に係る情報が提供される。また、本発明の化合物の評価方法によれば、ＧＰＲ１０３の生理機能に関与する疾病に対して、治療薬や診断薬となる化合物の評価、開発が可能となる。
種々の動物種におけるＧＰＲ１０３タンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。 種々の動物種におけるＱＲＦＰのアミノ酸配列を比較した図である。 ヒト及びサルＧＰＲ１０３発現２９３Ｔ発現細胞に対する種々の濃度のＱＲＦＰが示す細胞内カルシウムイオン上昇活性を示す図である。 マウス及びラットＧＰＲ１０３ｂ発現２９３Ｔ発現細胞に対する種々の濃度のＱＲＦＰが示す細胞内カルシウムイオン上昇活性を示す図である。 サルＱＲＦＰ４３刺激によるサルＧＰＲ１０３又はヒトＧＰＲ１０３遺伝子発現ＣＨＯ細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を示す図である。 サルＱＲＦＰ２６刺激によるサルＧＰＲ１０３又はヒトＧＰＲ１０３遺伝子発現ＣＨＯ細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を示す図である。 ＱＲＦＰをラットに第３脳室内投与した後、２時間の摂食量を示す図である。 ＱＲＦＰをマウスに側脳室内投与した後、２時間の摂食量を示す図である。 ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＧＰＲ１０３の発現を示す図である。 ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＱＲＦＰの発現を示す図である。
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明における「核酸」とは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくは修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡをいい、好ましくはＤＮＡをいう。また、前記ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡであるかｃＤＮＡであるかを問わず、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
また、本発明における「単離された」とは、組換えＤＮＡ技術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体物質又はその他の物質を実質的に含まない、核酸又はタンパク質をいう。
また、本発明における「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０×ＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば５０℃にて、低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣから、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣまで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで上昇させることができる。
以下、本発明に係るサル（アカゲザル）ＧＰＲ１０３について説明する。
本発明のサルＧＰＲ１０３遺伝子（配列番号１）は、１２９３塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号１に記載の核酸における１０５〜１３９７番目）を有し、４３１アミノ酸のタンパク質（配列番号２）をコードする。
サルＧＰＲ１０３遺伝子のクローニング方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、サルＧＰＲ１０３遺伝子又は当該遺伝子に相同性の高い遺伝子由来の核酸配列情報をもとに５’−ＲＡＣＥ又は３’−ＲＡＣＥで全長ｃＤＮＡを増幅する方法、適切なベクター（プラスミドベクター、バクテリオファージ等）を用いて構築されたｃＤＮＡライブラリーをサルＧＰＲ１０３遺伝子の核酸断片を用いてスクリーニングする方法が挙げられる。
また、サルＧＰＲ１０３遺伝子とヒトＧＰＲ１０３遺伝子との間の相同性は、コーディング領域において約９７％であり、３５塩基が相違する。本発明の核酸には、配列番号１に記載の塩基配列のうち、１又は２以上の塩基において置換、欠失、挿入、付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、１〜３４塩基であることが好ましく、１〜３０塩基であることがより好ましく、１〜２０塩基であることがさらに好ましく、１〜１５塩基であることが特に好ましく、１〜１０塩基であることがさらに好ましい。また、このような核酸は、その相同性に基づけば、配列番号１に記載の塩基配列との相同性が９７％より大きいことが好ましく、９８％以上であることがより好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。また、このような核酸は、生物学的に活性を有するタンパク質をコードすることが好ましく、ＧＰＲ１０３としての活性（例えば、Ｇタンパク質共役型レセプターとしての情報伝達活性）を有するタンパク質をコードすることがより好ましい。
ここで、このような核酸は、本発明に係る配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を単離することにより得ることができる。また、その核酸の由来となる動物種としては特に限定されないが、具体的には、例えば、ヒト以外の霊長類由来のＧＰＲ１０３遺伝子であることが好ましく、より具体的には、例えば、アカゲザル、カニクイザル、ニホンザル、リスザル、ミドリザル、アヌビスヒヒ又はコモンマーモセットのＧＰＲ１０３遺伝子が挙げられる。
また、サルＧＰＲ１０３（配列番号２）とヒトＧＰＲ１０３（配列番号７）との間のアミノ酸レベルでの相同性は９８．１％であり、８アミノ酸が相違する。本発明のタンパク質には、配列番号２の１又は２以上のアミノ酸において、置換、欠失、挿入、付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、１〜７アミノ酸であることが好ましく、１〜５アミノ酸であることがより好ましく、１〜３アミノ酸であることが特に好ましい。また、このようなタンパク質は、その相同性に基づけば、配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が９８．２％以上であることが好ましく、９８．５％以上であることがより好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
サルＧＰＲ１０３の調製方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、単離したサルＧＰＲ１０３遺伝子を発現ベクターに導入し、動物細胞、昆虫細胞又は大腸菌等の宿主細胞に導入して組換えタンパク質を発現させた後、精製する方法が挙げられる。
また、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む。前記変異体としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は２以上であり且つ７箇所以下のアミノ酸が置換、欠失しているタンパク質や、１又は２以上のアミノ酸の付加、挿入があるタンパク質が挙げられる。このような変異タンパク質は、生物学的に活性を有することが好ましく、ＧＰＲ１０３としての活性（例えば、Ｇタンパク質共役型レセプターとしての情報伝達活性）を有することがより好ましい。
また、本発明は以下の核酸・遺伝子を含む発現ベクターをも含む。
１．配列番号１に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
２．配列番号１に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
３．配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする単離された核酸。
４．配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなるサルＧＰＲ１０３遺伝子。
ここで、前記発現ベクターとしては、当業者に周知のベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
また、前記１．における「配列番号１に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列に、ベクターとのリンカー配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の遺伝子の改変に必要な配列が付加されていることを意味する。
さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞をも含む。当該宿主細胞としては、当業者に周知の細胞であれば特に制限はなく、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれでもよい。かかる細胞としては、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。
また、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体に対する抗体を含む。当該抗体は、前記タンパク質又はその一部のペプチドを抗原として調製することができ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。当該抗体はエピトープとなるアミノ酸配列によってサルＧＰＲ１０３のみならず、異なった動物種のＧＰＲ１０３にも反応する場合があるが、サルＧＰＲ１０３にのみ選択性を有する抗体を調製する場合には、サルと異動物種のＧＰＲ１０３において相同性の低い領域をペプチド抗原として使用してモノクローナル抗体を調製することにより、所望の特異性を有する抗体を調製することができる。
次に、本発明のラットＧＰＲ１０３ｂについて説明する。
本発明のラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子（配列番号３）は、１２４５塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号３に記載の核酸における１〜１２４５番目）を有し、４１５アミノ酸のタンパク質（配列番号４）をコードする。上述したように、ラットＧＰＲ１０３遺伝子は既に単離されているが、本発明のラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子と塩基配列が相違する。便宜上、既知のラットＧＰＲ１０３をラットＧＰＲ１０３又はラットＧＰＲ１０３aと、本発明のラットＧＰＲ１０３をラットＧＰＲ１０３ｂと称する。
ラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子のクローニング方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子又は当該遺伝子に相同性の高い遺伝子由来の核酸配列情報をもとに５’−ＲＡＣＥ又は３’−ＲＡＣＥで全長ｃＤＮＡを増幅する方法、適切なベクター（プラスミドベクター、バクテリオファージ等）を用いて構築されたｃＤＮＡライブラリーをラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子の核酸断片を用いてスクリーニングする方法が挙げられる。
また、ラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子とラットＧＰＲ１０３遺伝子との間の相同性は、コーディング領域において８１％であり、２４０塩基が相違する。
さらに、ラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子とヒトＧＰＲ１０３遺伝子との間の相同性は、コーディング領域において約８４％であり、１９１塩基が相違する。本発明の核酸には、配列番号１に記載の塩基配列において、１又は２以上の塩基において置換、欠失、挿入、付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、１〜１９０塩基であることが好ましく、１〜１５０塩基であることがより好ましく、１〜１００塩基であることがさらに好ましく、１〜５０塩基であることが特に好ましく、１〜３０塩基であることがさらに好ましい。また、このような核酸は、その相同性に基づけば、配列番号１の塩基配列との相同性が８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることが特に好ましい。また、このような核酸は、生物学的に活性を有するタンパク質をコードすることが好ましく、ＧＰＲ１０３としての活性（例えば、Ｇタンパク質共役型レセプターとしての情報伝達活性）を有するタンパク質をコードすることがより好ましい。
ここで、このような核酸は、本発明に係る配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を単離することにより得ることができる。
また、ラットＧＰＲ１０３ｂは、上述したように、４１５アミノ酸からなり、ラットＧＰＲ１０３との間のアミノ酸レベルでの相同性は７９％であり、８８アミノ酸が相違する。
さらに、ラットＧＰＲ１０３ｂとヒトＧＰＲ１０３（配列番号７）との間の相同性は８３％であり、７１アミノ酸が相違する。
本発明のタンパク質には、配列番号４の１又は２以上のアミノ酸において、置換、欠失、挿入、付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、１〜７０アミノ酸であることが好ましく、１〜５０アミノ酸であることがより好ましく、１〜３０アミノ酸であることがさらに好ましく、１〜１０アミノ酸であることが特に好ましい。また、このようなタンパク質は、その相同性に基づけば、配列番号４に記載のアミノ酸配列との相同性が８４％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることが特に好ましい。また、このような変異タンパク質は、生物学的に活性であることが好ましく、ＧＰＲ１０３としての活性（例えば、Ｇタンパク質共役型レセプターとしての情報伝達活性）を有することがより好ましい。
ラットＧＰＲ１０３ｂの調製方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、単離したラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子を発現ベクターに導入し、動物細胞、昆虫細胞又は大腸菌等の宿主細胞に導入して組換えタンパク質を発現させた後、精製する方法が挙げられる。
また、本発明は以下の核酸・遺伝子を含む発現ベクターをも含む。
１．配列番号３に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
２．配列番号３に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
３．配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする単離された核酸。
４．配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなるラットＧＰＲ１０３遺伝子。
ここで、前記発現ベクターとしては、当業者に周知のベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
また、前記１．における「配列番号３に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列に、ベクターとのリンカー配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の遺伝子の改変に必要な配列が付加されていることを意味する。
さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞をも含む。当該宿主細胞としては、当業者に周知の細胞であれば特に制限はなく、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれでもよい。かかる細胞としては、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。
また、本発明は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体に対する抗体を含む。当該抗体は、前記タンパク質又はその一部のペプチドを抗原として調製することができ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。当該抗体はエピトープとなるアミノ酸配列によってラットＧＰＲ１０３ｂのみならず、異なった動物種のＧＰＲ１０３にも反応する場合があるが、ラットＧＰＲ１０３ｂにのみ選択性を有する抗体を調製する場合には、ラットと異動物種のＧＰＲ１０３において相同性の低い領域をペプチド抗原として使用してモノクローナル抗体を調製することにより、所望の特異性を有する抗体を調製することができる。
次に、本発明にかかる、配列番号１又は３に記載の塩基配列を有する核酸若しくは配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の用途について列挙し、それぞれ説明する。
（１）化合物の評価
本発明の核酸又はタンパク質を用いて、ＧＰＲ１０３に作用する化合物の評価をすることができる。ＧＰＲ１０３に対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子又はタンパク質の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じたＧＰＲ１０３を介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。
すなわち、本発明の化合物の評価方法は、ＧＰＲ１０３遺伝子を導入し、当該受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該受容体に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明の第２の化合物の評価方法は、ＧＰＲ１０３遺伝子を導入し、当該受容体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物が挙げられる。
また、ＧＰＲ１０３遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、本発明の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、クローニングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。
次に、本発明の核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃が挙げられる。
次に、このようにして調製したＧＰＲ１０３を発現する細胞に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、水溶液や緩衝液のような溶液中で接触させる方法が挙げられる。
細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合による細胞内へのシグナル伝達、例えば、Ｇタンパク質の活性化、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）又はｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、受容体のインターナリゼーションなどを指標に検出することができる。
また、前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達上の分子の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はＤＮＡチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、発現の検出対象が核酸の場合、ＧＰＲ１０３タンパク質を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子及びその転写産物の絶対量又は相対量をいう。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、ＧＰＲ１０３タンパク質を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。
一方、単離されたＧＰＲ１０３タンパク質を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をＧＰＲ１０３タンパク質に接触させ、次に、接触によって生じたＧＰＲ１０３タンパク質の活性の変化を検出する方法である。
かかる接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、ＧＰＲ１０３タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
次に、接触によって生じたＧＰＲ１０３タンパク質の活性の変化を検出する。タンパク質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよく、具体的には、例えば、ＧＰＲ１０３タンパク質に対するリガンド（例えば、ＱＲＦＰ）の結合活性を指標にする方法が挙げられる。
前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ＧＰＲ１０３タンパク質が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、被検化合物と競合してＧＰＲ１０３タンパク質へ結合する放射性同位体で標識したリガンドを検出する方法も挙げられ、係る方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。
以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化合物の存在下におけるリガンドの結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係るＧＰＲ１０３タンパク質とリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）及び当該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）等が含まれる。アゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明に係るＧＰＲ１０３タンパク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、ＧＰＲ１０３タンパク質への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてリガンド及びそのアナログを作用させた場合の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、本発明に係るＧＰＲ１０３への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、本発明に係るＧＰＲ１０３への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物を医薬品として使用する場合には、ＧＰＲ１０３及びそのリガンドが関与する各種疾患、例えば狭心症、急性・うっ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、腎臓病、電解質異常、血管れん縮等の循環器系疾患、例えば過食症、拒食症、うつ病、不安、痙攣、てんかん、痴呆、痛み、アルコール依存症、薬物の断薬に伴う禁断症状、概日リズムの変調、統合失調症、記憶障害、睡眠障害、認知障害等の神経系疾患、例えば肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝等の代謝性疾患、不妊、早産、性機能障害等の生殖系疾患、消化管系疾患、呼吸器系疾患、炎症性疾患、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症又は緑内障等の予防又は治療に有用であると考えられる。
また、上述した本発明の化合物の評価方法により、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）に用いるリガンドの評価を行うことができる。ＰＥＴは、水、酸素、ブドウ糖、アミノ酸といった生体内に存在する物質あるいは目的とする受容体に対するリガンドを放射線標識して体内に投与することにより、非侵襲的に生体機能を観察する方法であり、研究や臨床において利用されている。ＰＥＴの特徴は、トレーサーとして用いるリガンドに依存した機能特異的なイメージングを可能にする点にあり、新たなトレーサーの開発は未知の生体機能の解明や疾患の診断に不可欠である。本発明の化合物の評価方法によれば、被検化合物としてＰＥＴリガンド候補物質を適用することにより、当該物質のインビトロでの評価を行うことが可能となる。
（２）ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
本発明の核酸の一部、又は全部からなる核酸をハイブリダイゼーション用のプローブとして使用することにより、ＧＰＲ１０３遺伝子を検出することが可能である。かかる検出としては、生体由来の組織や細胞を被検体としたＧＰＲ１０３遺伝子の検出のみならず、ＧＰＲ１０３遺伝子又は当該遺伝子と相同性の高い遺伝子のクローニング等にも応用可能である。また、前記核酸をプローブとして使用し、種々の組織における遺伝子発現を調べることにより、遺伝子発現の分布を同定することも可能である。
前記核酸をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションの方法としては特に制限はなく、例えば、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法が挙げられる。
前記核酸をハイブリダイゼーション用のプローブとして使用する場合、少なくとも連続する２０塩基の長さの核酸が必要であり、好ましくは４０塩基、さらに好ましくは６０塩基、特に好ましくは８０塩基以上のものが使用される。また、当該プローブは、必要に応じて検出可能なように標識して用いてもよい。具体的には、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ等の放射性同位体で標識されていてもよく、ビオチン、蛍光色素、酵素、金コロイド等で標識されていてもよい。
また、前記核酸をハイブリダイゼーション用のプローブとして使用する場合のハイブリダイゼーションの条件としては、プローブの長さやハイブリダイゼーションの対象となる遺伝子の種類に応じて当業者が適宜選択すればよいが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１を参照して行うことができる。より具体的には、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０×ＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。
（３）ＰＣＲに使用するプライマー
ＧＰＲ１０３遺伝子を検出する方法として、本発明の配列番号１に記載の塩基配列の一部をプライマーとして使用したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を挙げることができる。
このようなプライマーの長さは、その塩基配列や単離する遺伝子の塩基配列等によって適宜設定することができるが、一般に、連続した１０〜６０塩基であることが好ましく、１５〜３０塩基であることがより好ましい。
最後に、本発明のＧＰＲ１０３リガンド（ＱＲＦＰ：ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌａｔｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ａｍｉｄｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）について説明する。
本発明のＧＰＲ１０３リガンド遺伝子（ｐｒｅｐｒｏＰ５１８／ＱＲＦＰ）（配列番号５）は、４０８塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号５に記載の核酸における３７〜４４４番目）を有し、１３６アミノ酸からなるタンパク質（配列番号６）をコードする。
サルＧＰＲ１０３リガンド遺伝子のクローニング方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、サルＧＰＲ１０３リガンド遺伝子又は当該遺伝子に相同性の高い遺伝子由来の核酸配列情報をもとに５’−ＲＡＣＥ又は３’−ＲＡＣＥで全長ｃＤＮＡを増幅する方法、適切なベクター（プラスミドベクター、バクテリオファージ等）を用いて構築されたｃＤＮＡライブラリーをサルＧＰＲ１０３リガンド遺伝子の核酸断片を用いてスクリーニングする方法が挙げられる。
また、サルＧＰＲ１０３リガンド遺伝子とヒトＧＰＲ１０３リガンド遺伝子との間の相同性は、コーディング領域において約９２％であり、３２塩基が相違する。本発明の核酸には、配列番号５に記載の塩基配列のうち、１又は２以上の塩基において置換、欠失、挿入、付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、１〜３１塩基であることが好ましく、１〜２０塩基であることがより好ましく、１〜１０塩基であることがさらに好ましく、１〜５塩基であることが特に好ましく、１〜３塩基であることがさらに好ましい。また、このような核酸は、その相同性に基づけば、配列番号５に記載の塩基配列との相同性が９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。また、このような核酸は、生物学的に活性を有するタンパク質をコードすることが好ましく、ＧＰＲ１０３リガンドとしての活性を有するタンパク質をコードすることがより好ましい。
ここで、このような核酸は、本発明に係る配列番号５に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を単離することにより得ることができる。また、その核酸の由来となる動物種としては特に限定されないが、具体的には、例えば、ヒト以外の霊長類由来のＧＰＲ１０３リガンド遺伝子であることが好ましく、より具体的には、例えば、アカゲザル、カニクイザル、ニホンザル、リスザル、ミドリザル、アヌビスヒヒ又はコモンマーモセットのＧＰＲ１０３リガンド遺伝子が挙げられる。
また、サルＧＰＲ１０３リガンドとヒトＧＰＲ１０３リガンド（配列番号１１）との間のアミノ酸レベルでの相同性は８７．５％であり、１７アミノ酸が相違する。本発明のタンパク質には、配列番号６の１又は２以上のアミノ酸において、置換、欠失、挿入、付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、１〜１６アミノ酸であることが好ましく、１〜１０アミノ酸であることがより好ましく、１〜５アミノ酸であることがさらに好ましく、１〜３アミノ酸であることが特に好ましい。また、このようなタンパク質は、その相同性に基づけば、配列番号６に記載のアミノ酸配列との相同性が８８％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることが特に好ましい。また、このようなタンパク質は、生物学的に活性であることが好ましく、ＧＰＲ１０３リガンドとしての活性を有することがより好ましい。
サルＧＰＲ１０３の調製方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、単離したサルＧＰＲ１０３遺伝子を発現ベクターに導入し、動物細胞、昆虫細胞又は大腸菌等の宿主細胞に導入して組換えタンパク質を発現させた後、精製する方法が挙げられる。
また、本発明は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む。前記変異体としては、配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１又は２以上であり且つ１６以下のアミノ酸が置換、欠失しているタンパク質や、１又は２以上のアミノ酸の付加、挿入があるタンパク質が挙げられる。このような変異タンパク質は、生物学的に活性であることが好ましく、ＧＰＲ１０３リガンドとしての活性（例えば、Ｇタンパク質共役型レセプターに対する結合能）を有することがより好ましい。
又、本発明は、配列番号４９又は５０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。当該タンパク質は、前記の方法でタンパク質をコードする核酸を単離し、宿主細胞において発現させることによって精製してもよく、また、市販のペプチド合成機を用いて合成してもよい。
また、本発明は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体、及び配列番号４９又は５０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を含む。当該抗体は、本発明のＧＰＲ１０３リガンドタンパク質又はその一部のペプチドを抗原として調製することができ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。当該抗体はエピトープとなるアミノ酸配列によってサルＧＰＲ１０３リガンドのみならず、異なった動物種のＧＰＲ１０３リガンドにも反応する場合があるが、サルＧＰＲ１０３リガンドにのみ選択性を有する抗体を調製する場合には、サルと異動物種のＧＰＲ１０３において相同性の低い領域をペプチド抗原として使用してモノクローナル抗体を調製することにより、所望の特異性を有する抗体を調製することができる。
本発明のサルＧＰＲ１０３リガンドにより、例えば、生体内においてＧＰＲ１０３の発現が減少しているような疾患において、当該リガンドを投与してＧＰＲ１０３タンパク質の正常な機能を回復させることが可能となる。
本発明のサルＧＰＲ１０３リガンドを医薬として使用する場合には、ＧＰＲ１０３が関与する各種疾患、例えば狭心症、急性・うっ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、腎臓病、電解質異常、血管れん縮等の循環器系疾患、例えば過食症、拒食症、うつ病、不安、痙攣、てんかん、痴呆、痛み、アルコール依存症、薬物の断薬に伴う禁断症状、概日リズムの変調、統合失調症、記憶障害、睡眠障害、認知障害等の神経系疾患、例えば肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝等の代謝性疾患、不妊、早産、性機能障害等の生殖系疾患、消化管系疾患、呼吸器系疾患、炎症性疾患、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症又は緑内障等の予防又は治療に有用であると考えられる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
（アカゲザルＧＰＲ１０３遺伝子の単離）
ヒトＧＰＲ１０３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＤ２７００５１）の５’及び３’非翻訳領域の塩基配列に基づいてｈＢＧ２９Ｆ２（配列番号１５）及びｈＢＧ２９Ｒ１（配列番号１６）の２本のオリゴＤＮＡプライマーを設計した。
アカゲザルの脳組織からファストトラック２．０ｍＲＮＡ分離キット（インビトロジェン社）を用いてｍＲＮＡを精製し、スーパースクリプトＩＩＩファーストストランド合成システム（インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡの合成を行い、そのｃＤＮＡを鋳型にして、これらのプライマーを用い、９４℃１０秒間（変性反応）／６０℃ ３０秒間（アニーリング）／６８℃１分３０秒間（伸長反応）のサイクルを４０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。
独立した５つのＰＣＲ反応より得られたクローンから５クローンを無作為に選び、Ｔ７、ＢＧＨｒｅｖｅｒｓｅ、ｍｏｎＢＧ２９−１、ｍｏｎＢＧ２９−２、ｍｏｎＢＧ２９−３、ｍｏｎＢＧ２９−４、ｍｏｎＢＧ２９−５、ｍｏｎＢＧ２９−６、ｍｏｎＢＧ２９−２１、ｍｏｎＢＧ２９−３１の１０本のプライマー（配列番号１７〜２６）を用いてダイターミネーター法により塩基配列を決定した。これら５クローンの塩基配列の比較により、アカゲザルＧＰＲ１０３遺伝子の塩基配列が明らかとなった。
アカゲザルＧＰＲ１０３遺伝子は、１１２８塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号１に記載の塩基配列において１０５番目から１３９７番目）を有する。各々のオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（４３１残基）を配列番号２に示す。
アカゲザルＧＰＲ１０３とヒトＧＰＲ１０３のアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＣ９８９３８）と比較したところ、９８％（４３１残基中４２３残基が同一）の非常に高い同一性を示し、クローニングした遺伝子の塩基配列はアカゲザルのＧＰＲ１０３受容体をコードしていることが確認できた。
また、ヒトＧＰＲ１０３遺伝子について発現部位を検討した結果、視床下部、橋（Ｐｏｎ）に強い発現が見られ、脳のその他の部位についても比較的強い発現が見られた。
ヒトＧＰＲ１０３（配列番号７）、サルＧＰＲ１０３（配列番号２）、マウスＧＰＲ１０３（配列番号８）、ラットＧＰＲ１０３（配列番号９）、マウスＧＰＲ１０３ｂ（配列番号１０）、ラットＧＰＲ１０３ｂ（配列番号４）のアミノ酸配列を比較した図を図１に示す。
また、以下に、本実施例において使用したプライマーの塩基配列を示す。
ｈＢＧ２９Ｆ２： ATAGGATCCTCCCGCGCGGCTGACTCCAGAGTA（配列番号１５）
ｈＢＧ２９Ｒ１： ACAGCGGCCGCTCTTTGGGTTACAATCTGAAGGGC（配列番号１６）
Ｔ７：TAATACGACTCACTATAGGG（配列番号１７）
ＢＧＨｒｅｖｅｒｓｅ： GGAGCTGACACGGAAGAT（配列番号１８）
ｍｏｎＢＧ２９−１： GGGAGCAGTTCATCGCT（配列番号１９）
ｍｏｎＢＧ２９−２： CTCGTGCTCACCGGCGTGCT（配列番号２０）
ｍｏｎＢＧ２９−３： CAGTCATCGTAGGATCACC（配列番号２１）
ｍｏｎＢＧ２９−４： TTCTCCTCTGTCTGTTCACA（配列番号２２）
ｍｏｎＢＧ２９−５： AATGACAGCTCGTTTCTTCT（配列番号２３）
ｍｏｎＢＧ２９−６： CAATGCAGGTCATAGTGAGG（配列番号２４）
ｍｏｎＢＧ２９−２１： AGCACGCCGGTGAGCACGAG（配列番号２５）
ｍｏｎＢＧ２９−３１： GGTGATCCTACGATGACTG（配列番号２６）
実施例２
（アカゲザルｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ遺伝子の単離）
ヒトｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＴ＿０３５０１４）の５’及び３’非翻訳領域の塩基配列に基づいてｈＱＲＦＰＦ２（配列番号２７）及びｈＱＲＦＰＲ１（配列番号２８）の２本のオリゴＤＮＡプライマーを設計した。
アカゲザルの脳組織からファストトラック２．０ｍＲＮＡ分離キット（インビトロジェン社）を用いてｍＲＮＡを精製し、スーパースクリプトＩＩＩファーストストランド合成システム（インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡの合成を行い、そのｃＤＮＡを鋳型にして、これらのプライマーを用い、９４℃１０秒間（変性反応）／６０℃３０秒間（アニーリング）／６８℃１分３０秒間（伸長反応）のサイクルを４０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。独立した８つのＰＣＲ反応より得られたクローンから８クローンを無作為に選び、Ｔ７、ＢＧＨｒｅｖｅｒｓｅ、ｈＱＲＦＰ−１、ｈＱＲＦＰ−２の４本のプライマー（配列番号２９〜３２）を用いてダイターミネーター法により塩基配列を決定した。これら５クローンの塩基配列の比較により、アカゲザルｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ遺伝子の塩基配列が明らかとなった。
アカゲザルｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ遺伝子は、４０８塩基のオープンリーディングフレーム（３７番目から４４４番目）を有する。各々のオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（１３６残基）を配列番号６に示す。
アカゲザルｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰとヒトｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰのアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＣ９８９３４）と比較したところ、８７％（１３６残基中１１９残基が同一）の非常に高い同一性を示し、クローニングした遺伝子の塩基配列はアカゲザルのｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰをコードしていることが確認できた。
サルｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ（配列番号６）、ヒトｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ（配列番号１１）、マウスｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ（配列番号１２）、ラットｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ（配列番号１３）、ウシｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を比較した図を図２に示す。
また、以下に、本実施例において使用したプライマーの塩基配列を示す。
ｈＱＲＦＰＦ２： ATAGGATCCTTGGTGAGTTGCGCTTGGCCACGTGTG（配列番号２７）
ｈＱＲＦＰＲ１： ACAGCGGCCGCGGCTGGGACGACCGAGGCTCCAAGACA（配列番号２８）
Ｔ７：TAATACGACTCACTATAGGG（配列番号２９）
ＢＧＨｒｅｖｅｒｓｅ： GGAGCTGACACGGAAGAT（配列番号３０）
ｈＱＲＦＰ−１： CATGCTGGCTGCAGATTCCG（配列番号３１）
ｈＱＲＦＰ−２： TCACTGCCTTCGTCCTGCCT（配列番号３２）。
実施例３
（アカゲザルＧＰＲ１０３遺伝子発現２９３Ｔ細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性の検出）
６ｃｍ培養シャーレに１×１０６個の２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間後に実施例１で得られたアカゲザルＧＰＲ１０３遺伝子を保持したｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベクター及びインサートを持たない同ベクター（ｍｏｃｋ）を、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いてトランスフェクションした。また、比較のために既知のヒトＧＰＲ１０３ｃＤＮＡを持つ同ベクターをトランスフェクションした細胞も用意した。
それぞれの細胞を２４時間培養後、９６−ｗｅｌｌのポリ−Ｄ−リジン塗布済み黒色培養プレート（べクトンデッキンソン社）に３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種し、一晩培養した。細胞の培地を除去し、１０％Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ハイクローン社）を含むＤＭＥＭ（インビトロジェン社）に４μＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）及び０．０４％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を添加したものを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、インビトロジェン社）、０．５％ウシ血清アルブミン（シグマ社）を添加したものをアッセイバッファーとして用意した。細胞をアッセイバッファーで洗浄して過剰なＦｌｕｏ４を除去し、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）にセットした。アッセイバッファーに溶解した各種濃度のヒトＱＲＦＰ４３（配列番号５１）も同じくＦＬＩＰＲにセットした後、サンプルを細胞に添加し、励起光の照射によって発生する細胞内カルシウムイオン濃度に依存した蛍光量の変化を測定した。
ヒトＱＲＦＰ４３によってペプチド添加直前の蛍光量と添加後の最大値の差を蛍光変化量とし、Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．００（グラフパッド社）を用いて各種濃度のペプチドによる蛍光変化量をグラフ化し、５０％有効濃度を求めた（図３）。
その結果、ヒトＱＲＦＰ４３は濃度依存的にアカゲザルＧＰＲ１０３遺伝子発現２９３Ｔ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが示され、その５０％有効濃度は３９ｎＭであった。また、同時に観測したヒトＧＰＲ１０３発現細胞におけるヒトＱＲＦＰ４３の細胞内カルシウム濃度上昇活性の５０％有効濃度は９７ｎＭであった。一方、ｍｏｃｋベクターをトランスフェクトした細胞ではヒトＱＲＦＰ４３による細胞内カルシウムイオン濃度の変化は見られなかった。
このように、アカゲザルＧＰＲ１０３は既知のヒトＧＰＲ１０３と同様にＱＲＦＰ受容体としての特性を示すことが明らかとなった。
実施例４
（ラットＧＰＲ１０３遺伝子と相同性を持つ遺伝子の単離）
ラットＧＰＲ１０３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１９８１９９）の塩基配列をクエリーとしてＢｌａｓｔアルゴリズムを用いてセレーラ社提供のラットゲノムデータベースに対して相同性検索を行ったところ、ラットＧＰＲ１０３遺伝子と相同性を持つ遺伝子配列を見出し、ＧＰＲ１０３ｂと命名した。
セレーラ社データベース由来の配列を基に、ｒＢＧ２９ＬＦ１（配列番号３３）及びｒＢＧ２９ＬＲ４（配列番号３４）の２本のオリゴＤＮＡプライマーを設計した。ラットの視床下部組織からファストトラック２．０ｍＲＮＡ分離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｍＲＮＡを精製し、スーパースクリプトＩＩＩファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。
次に、そのｃＤＮＡを鋳型にして、これらのプライマーを用い、９４℃１０秒間（変性反応）／６８℃１分３０秒間（アニーリング及び伸長反応）のサイクルを４０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。
独立した４つのＰＣＲ反応より得られたクローンから４クローンを無作為に選び、Ｔ７、ＢＧＨｒｅｖｅｒｓｅ、ｒＱＲＦＰ２Ｒ−１、ｒＱＲＦＰ２Ｒ−２、ｒＱＲＦＰ２Ｒ−３、ｒＱＲＦＰ２Ｒ−４、ｒＱＲＦＰ２Ｒ−５、ｒＱＲＦＰ２Ｒ−６の８本のプライマー（配列番号３５〜４２）を用いてダイターミネーター法により塩基配列を決定した。
これら４クローンの塩基配列の比較によって得られたコンセンサス配列は１００％セレーラ社提供のデータベース由来配列と同一であった。
ラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子は、１２４５塩基のオープンリーディングフレーム（１番目から１２４５番目）を有する。そのオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（４１５残基）を配列番号４に示す。
ラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子のアミノ酸配列とヒトＧＰＲ１０３（ＧｅｎＰｅｐｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＣ９８９３８）と比較したところ、８３％の高い同一性を示し、ラットＧＰＲ１０３ｂはＰ５１８／ＱＲＦＰの受容体であることを確認した（図１）。また、既知の配列を持つマウスＴＧＲ３４６ｂ（ＧｅｎＰｅｐｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＤ８２８９５）は、ラットＧＰＲ１０３ｂとアミノ酸配列が９４％の高い相同性（４１６残基中３９２残基が同一）を有し、ラットＧＰＲ１０３ｂ同様にＱＲＦＰの受容体であることが確認できた。
以下に、使用したプライマーの塩基配列を示す。
ｒＢＧ２９ＬＦ１： ATAGGATCCGGTCAAGGCGCCTACCGAACCCAGCATG（配列番号３３）
ｒＢＧ２９ＬＲ４： ACAGCGGCCGCAACAGGTCCTCATTCTGAAGACAC（配列番号３４）
Ｔ７：TAATACGACT CACTATAGGG（配列番号３５）
ＢＧＨｒｅｖｅｒｓｅ： GGAGCTGACACGGAAGAT（配列番号３６）
ｒＱＲＦＰ２Ｒ−１： TCACCTTCTTCTGCATTCCC（配列番号３７）
ｒＱＲＦＰ２Ｒ−２： AAAATCTACACCACCTTCAT（配列番号３８）
ｒＱＲＦＰ２Ｒ−３： GCATGGAAGCTTGGGAGCCA（配列番号３９）
ｒＱＲＦＰ２Ｒ−４： CCCCCAAATGCTTCCCCTTT（配列番号４０）
ｒＱＲＦＰ２Ｒ−５： AGCTCATAACCGATTTTCCC（配列番号４１）
ｒＱＲＦＰ２Ｒ−６： ATGAGCAGGTCGCTGAGTGCCA（配列番号４２）。
実施例５
（ラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子発現２９３Ｔ細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性の検出）
６ｃｍ培養シャーレに１×１０６個の２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間後に実施例４で得られたラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子を保持したｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベクター及びインサートを持たない同ベクター（ｍｏｃｋ）をリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いてトランスフェクションした。また、マウスＧＰＲ１０３ｂ（図１に示すように、ラットＧＰＲ１０３ｂと高い相同性を有する）ｃＤＮＡを持つ同ベクターをトランスフェクションした細胞も用意した。
２４時間培養後、９６−ｗｅｌｌのポリ−Ｄ−リジン塗布済み黒色培養プレート（べクトンデッキンソン社）に３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種し、一晩培養した。細胞の培地を除去し、１０％Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ハイクローン社）を含むＤＭＥＭ（インビトロジェン社）に４μＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）及び０．０４％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を添加したものを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、 インビトロジェン社）、０．５％ウシ血清アルブミン（シグマ社）を添加したものをアッセイバッファーとして用意した。細胞をアッセイバッファーで洗浄して過剰なＦｌｕｏ４を除去し、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）にセットした。アッセイバッファーに溶解した各種濃度のヒトＱＲＦＰ４３（配列番号５１）も同じくＦＬＩＰＲにセットした後、サンプルを細胞に添加し、励起光の照射によって発生する細胞内カルシウムイオン濃度に依存した蛍光量の変化を測定した。
ヒトＱＲＦＰ４３によってペプチド添加直前の蛍光量と添加後の最大値の差を蛍光変化量とし、Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．００（グラフパッド社）を用いて各種濃度のペプチドによる蛍光変化量をグラフ化し、５０％有効濃度を求めた（図４）。
その結果、ヒトＱＲＦＰ４３は濃度依存的にラットＧＰＲ１０３ｂ遺伝子発現２９３Ｔ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが示され、その５０％有効濃度は２１７ｎＭであった。また、同時に観測したマウスＧＰＲ１０３ｂ発現細胞におけるヒトＱＲＦＰ４３の細胞内カルシウム濃度上昇活性の５０％有効濃度は７６ｎＭであった。一方、ｍｏｃｋベクターをトランスフェクトした細胞ではヒトＱＲＦＰ４３による細胞内カルシウムイオン濃度の変化は見られなかった。このように、ラットＧＰＲ１０３ｂ及びマウスＧＰＲ１０３ｂはＱＲＦＰ受容体としての特性を示すことが明らかとなった。
実施例６
（サルＱＲＦＰ４３及びＱＲＦＰ２６の合成）
公知の事実よりｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰはプロセシング受け、そのＣ−末端がアミド化され、Ｎ−末端がピログルタミル化されることが知られている。サルｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰも他の種のＱＲＦＰに相当する位置でプロセシングを受けることが予想される。配列番号６で示されるサルｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰがプロセシングを受けて生成されるペプチドをサルＱＲＦＰ４３とする（配列番号４９）。また、ヒトＱＲＦＰのＣ−末端から２６アミノ酸に相当する部分のみでＧＰＲ１０３に対する十分なアゴニスト活性を有することが知られている。サルＱＲＦＰにおいてもＣ−末端から２６アミノ酸に相当する部分で十分なアゴニスト活性を発揮できることが予想され、それに相当するペプチドをサルＱＲＦＰ２６とする（配列番号５０）。
前記サルＱＲＦＰ４３及びＱＲＦＰ２６の合成は、それぞれＮｏｖａｂｕｏｃｈｅｍ社より販売されている、ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＲ ｒｅｓｉｎを出発原料とし、ＰｉｏｎｅｅｒＴＭペプチド合成機を用いてＨＡＴＵを縮合試薬としたＦｍｏｃ法によって縮合し、得たｒｅｓｉｎにＴＦＡ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ｅｔｈａｎｄｉｔｈｉｏｌ／ｍ−ｃｒｅｓｏｌ（９５／２．５／１．５／１）を加え室温で１時間３０分振盪した後、樹脂をろ過除去した。このろ液に冷却したエーテルを加え、粗Ｐｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２を（ＱＲＦＰ４３）、及び粗Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＱＲＦＰ２６）を沈殿として得た。さらに、粗ペプチドをＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ、Ｓ−５、１２０Ａカラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた逆相分取ＨＰＬＣ（Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．１％ＴＦＡアセトニトリル、Ａ／Ｂ：９５／５−２ｍｉｎ、７３／２７〜５８／４２−１５ｍｉｎ直線型濃度勾配溶出、流速１０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し目的物を含む分画を回収、凍結乾燥することにより目的物を得た。
実施例７
（サルＱＲＦＰ４３又はＱＲＦＰ２６刺激によるサルＧＰＲ１０３又はヒトＧＰＲ１０３遺伝子発現ＣＨＯ細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性の検出）
実施例１で得られたサルＧＰＲ１０３遺伝子又はヒトＧＰＲ１０３遺伝子を保持したｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベクター及びインサートを持たない同ベクター（ｍｏｃｋ）を、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、その培地に最終濃度が２ｍｇ／ｍｌなるようにＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（インビトロジェン社）を添加し発現細胞を選択した。その後、サル又はヒトＧＰＲ１０３遺伝子発現細胞については限界希釈法にて単一クローン化し、以下の試験に供した。また実施例６で示された方法で合成されたサルＱＲＦＰ４３及びＱＲＦＰ２６を以下の試験に供した。
それぞれの細胞を２４時間培養後、９６−ｗｅｌｌのポリ−Ｄ−リジン塗布済み黒色培養プレート（べクトンデッキンソン社）に２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種し、二晩培養した。細胞の培地を除去し、１０％Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（シグマ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ―１２（インビトロジェン社）に４μＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）、０．０４％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）及び２．５ｍＭのＰｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（シグマ社）を添加したものを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（シグマ社）、２．５ｍＭのＰｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（シグマ社）０．５％ウシ血清アルブミン（シグマ社）を添加したものをｐＨ７．４に水酸化ナトリウム水溶液で調整しアッセイバッファーとして用意した。細胞をアッセイバッファーで洗浄して過剰なＦｌｕｏ４を除去し、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）にセットした。アッセイバッファーに溶解した各種濃度のサルＱＲＦＰ４３又はＱＲＦＰ２６も同じくＦＬＩＰＲにセットした後、サンプルを細胞に添加し、励起光の照射によって発生する細胞内カルシウムイオン濃度に依存した蛍光量の変化を測定した。
サルＱＲＦＰ４３又はＱＲＦＰ２６添加直前の蛍光量と添加後の最大値の差を蛍光変化量とし、Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．００（グラフパッド社）を用いて各種濃度のペプチド（タンパク質）による蛍光変化量をグラフ化し、５０％有効濃度を求めた。
その結果、サルＱＲＦＰ４３は濃度依存的にサル又はヒトＧＰＲ１０３遺伝子発現ＣＨＯ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが示され、その５０％有効濃度はそれぞれ６９ｎＭ、５８ｎＭであった（図５）。また、同時に測定したサルＱＲＦＰ２６の細胞内カルシウム濃度上昇活性の５０％有効濃度はそれぞれサルＧＰＲ１０３遺伝子発現ＣＨＯ細胞に対しては９．２ｎＭ、ヒトＧＰＲ１０３遺伝子発現ＣＨＯ細胞に対しては１．７ｎＭであった（図６）。一方、ｍｏｃｋベクターをトランスフェクトした細胞では各々のサルＱＲＦＰによる細胞内カルシウムイオン濃度の変化は見られなかった（図５及び図６）。
このように、サルＱＲＦＰ４３及びＱＲＦＰ２６はＧＰＲ１０３のアゴニストとしての特性を示すことが明らかとなった。
実施例８
（ラット及びマウスに対するヒトＱＲＦＰ４３の投与）
ＳＤラット、Ｃ５７ＢＬマウスにＱＲＦＰを投与した後、摂食量の測定をした。
ＳＤラット（９−１２週齢）は麻酔下、第３脳室にガイドカニューレ（２６ゲージ）を挿入し、歯科用レジンで固定した。ガイドカニューレの位置はブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）より後方２．２ｍｍ、正中線上、頭蓋表面より深さ８ｍｍとした。
Ｃ５７ＢＬマウス（９−１２週齢）は麻酔下、側脳室にガイドカニューレ（２７ゲージ）を挿入し、歯科用レジンで固定した。ガイドカニューレの位置は、ブレグマより後方０．４ｍｍ、右へ０．８ｍｍ、頭蓋表面より深さ１ｍｍとした。
２週間程度の回復期間をおいた後、マイクロシリンジに接続した内針（３３ゲージ）をガイドカニューレに挿入し、人工脳脊髄液に溶解したＱＲＦＰ（ラットは１００マイクログラム／ｈｅａｄ、マウスは１０又は３０マイクログラム／ｈｅａｄ、）を脳室内に投与し、２時間の摂食量を測定した。
図７はヒトＱＲＦＰ４３をラットに第３脳室内投与した後、２時間の摂食量を示し、図８はヒトＱＲＦＰ４３をマウスに側脳室内投与した後、２時間の摂食量を示している。図７及び図８に示すとおり、ＱＲＦＰを投与しなかった動物と投与した動物を比較すると、投与後の摂食量が有意に増加した。従って、ＱＲＦＰとその受容体であるＧＰＲ１０３が摂食量の調節に関与することが確認できた。なお、ＱＲＦＰの代わりに人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）のみ投与した場合の摂食量をリファレンスとした。
ラットの試験にはｔ−検定を使用し、有意差があると認められた（ｐ＜０．００１）。マウスの試験にはＡＮＯＶＡ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎを使用し、人工骨髄液投与群と比較しＱＲＦＰ投与のいずれの群も有意差を認めた（ｐ＜０．０１）。
実施例９
（ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＧＰＲ１０３及びＱＲＦＰの発現）
ｏｂ／ｏｂマウス１４匹及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス１０匹から各々、視床下部を摘出し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いトータルＲＮＡを抽出し、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムス社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。１００マイクロリットルの逆転写反応液にはランダムヘキサマー及び２マイクロリットルのトータルＲＮＡを含む。同時に逆転写酵素を除いた他は逆転写反応液と同組成のネガティブコントロールを用意した。
マウスＧＰＲ１０３及びマウスｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰのｍＲＮＡの検出、定量は、リアルタイム定量ＰＣＲ法にて行った（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムス社）を添付のマニュアルに従い使用）。プライマー及びプローブは以下のものを使用した。
ｍＧＰＲ１０３Ｆ：TCTTTGGCAACTCTCTGGTCATC（配列番号４３）
ｍＧＰＲ１０３Ｒ：CAGAAGAAGGCAATGAGCAGATC（配列番号４４）
ｍＧＰＲ１０３Ｔ：TGCGCACCGTCACCAACATCTTC（配列番号４５）
ｍＱＲＦＰＦ：TCTCCCTCTGAGTGCCTGCT（配列番号４６）
ｍＱＲＦＰＲ：GCCTGTGCTGTGGATTTTGA（配列番号４７）
ｍＱＲＦＰＴ：CAGACATCGGTGACATCGGAGCCA（配列番号４８）。
ＧＰＲ１０３ｍＲＮＡの定量にはｍＧＰＲ１０３Ｆ、ｍＧＰＲ１０３Ｒの両プライマー及びＦＡＭで標識したプローブｍＧＰＲ１０３Ｔを使用した。また、ｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰ ｍＲＮＡの定量にはｍＱＲＦＰＦ、ｍＱＲＦＰＲの両プライマー及びＦＡＭで標識したＴａｑＭａｎプローブｍＱＲＦＰＴを使用した。内部標準としてｂｅｔａ−ａｃｔｉｎを採用した（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２００１ Ｓｅｐ ７；５０５（１）：１３６−４０）。
ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（アプライドバイオシステムス社）を用いて各プライマーが９００ｎＭ、各ＴａｑＭａｎプローブが２５０ｎＭ、０．２５マイクロリットルの上記で合成したｃＤＮＡを含む１０マイクロリットルの反応溶液を調製した。上記にはｂｅｔａ−ａｃｔｉｎを定量するためのＴａｑＭａｎプローブとプライマーを含み、さらにＧＰＲ１０３又はｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰを定量するためのＴａｑＭａｎプローブとプライマーが含まれる。アクチンに対する相対量は検量線を用いて算出した。
その結果、図９及び図１０に示すとおり、正常なマウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊと比較してｏｂ／ｏｂマウスの視床下部でＧＰＲ１０３及びｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰのｍＲＮＡの発現の増加が観察された。ｏｂ／ｏｂマウスはレプチン不全であり、肥満及び過食を呈することが広く知られている。つまり、ＧＰＲ１０３及びｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰの発現にレプチンが抑制的に働くことが示唆された。また、ＧＰＲ１０３及びｐｒｅｐｒｏＱＲＦＰがレプチン不全による肥満、過食の病態惹起に強く関与すると結論された。
以上説明したように、本発明のＧＰＲ１０３及びこれを用いた化合物の評価方法によれば、ヒト以外の霊長類及びラットのＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質とこれらの配列に関する情報を得ることが可能となり、ヒトの医薬を標的としたＧＰＲ１０３のモデルシステムの構築が可能となる。また、本発明の化合物の評価方法によれば、ＧＰＲ１０３の生理機能に関与する疾病に対して、治療薬や診断薬となる化合物の評価、開発が可能とな
る。

Claims (25)

  1. 配列番号１又は３に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
  2. 配列番号１又は３に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
  3. 配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする単離された核酸。
  4. 配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなるサルＧＰＲ１０３遺伝子。
  5. 配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなるラットＧＰＲ１０３遺伝子。
  6. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸又は請求項４〜５のいずれか一項に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  8. 配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
  9. 配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質。
  10. 配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入があるアミノ酸配列を含有し、ＧＰＲ１０３タンパク質の活性を有する単離されたタンパク質。
  11. 請求項８〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質に対する抗体。
  12. ＧＰＲ１０３遺伝子を導入し、ＧＰＲ１０３タンパク質を発現する細胞を調製する工程と、
    該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
    該ＧＰＲ１０３タンパク質に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
  13. ＧＰＲ１０３遺伝子を導入し、ＧＰＲ１０３タンパク質を発現する細胞を調製する工程と、
    該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
    該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
    該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
  14. 被検化合物を、ＧＰＲ１０３タンパク質に接触させる工程と、
    該接触による該タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
  15. 請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の化合物の評価方法によって選択されたことを特徴とする化合物。
  16. 前記ＧＰＲ１０３がサルＧＰＲ１０３であることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
  17. 配列番号５に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
  18. 配列番号５に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
  19. 配列番号５に記載の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸からなるサルＱＲＦＰ遺伝子。
  20. 配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする単離された核酸。
  21. 配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
  22. 配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質。
  23. 配列番号６に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入があるアミノ酸配列を含有し、ＧＰＲ１０３のリガンドタンパク質活性を有する単離されたタンパク質。
  24. 配列番号４９又は５０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
  25. 請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質に対する抗体。
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