KR101338885B1

KR101338885B1 - Mgc4504의 용도

Info

Publication number: KR101338885B1
Application number: KR1020077020834A
Authority: KR
Inventors: 마르크 디트리히 보스; 게오르그 찬크; 마르쿠스 헤르만 코른
Original assignee: 사노피
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-06
Publication date: 2013-12-12
Also published as: ATE541212T1; IL185806A0; EP1861711A1; JP4960951B2; CA2600209A1; KR20080005185A; DK1861711T3; JP2008532503A; WO2006094735A1; BRPI0609209A2; MX2007010835A; US20080249011A1; AU2006222204B2; IL185806A; CN101147066A; EP1861711B1; AU2006222204A1

Abstract

본 발명은 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질의 동정을 위한, MGC4504 단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편, 또는 상기 단백질, 유도체 또는 단편을 암호화하는 핵산의 용도에 관한 것이다.

MGC4504, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상

Description

MGC4504의 용도{Use of MGC4504}

본 발명은 약제학적 물질의 동정을 위한 MGC4504의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 양태는 상기 물질을 동정하는 방법 및 약제의 제조를 위한 MGC4504의 용도에 관한 것이다.

당뇨병은 빈번한 내분비계의 기능이상이다. 당뇨병이라는 용어는, 공통적으로 인슐린의 상대적 또는 절대적인 결핍뿐만 아니라 인슐린 작용이 손상된 글루코스 및 지질 대사의 여러 형태의 기능이상을 포함한다. 제1형 당뇨병은 자가면역에 의해 췌장 β세포가 파괴되어 인슐린 결핍 및 고혈당이 발생하는 것이다. 가장 흔한 형태인 제2형 당뇨병은, 지질 및 글루코스 대사의 조절이상이 특징이고, 비만, 인슐린 내성 및 대사 증후군과 관련되어 있다. 초기에, 제2형 당뇨병의 발생은 인슐린 내성과 관련되어 있지만, 정상혈당이고 췌장 인슐린이 정상적으로 분비된다. 질병의 진행은 고혈당 및 췌장 β세포 양의 감소와 관련되어 있고, 결국에는 인슐린 결핍 및 고혈당도 발생한다. 미국인구의 6% 이상이 당뇨병을 겪고 있고 (즉, 2004년에 1,800만명 이상) 앞으로 전세계에서 그 수가 증가할 것으로 예상되므로, 삶의 질이 심한 영향을 받는 당뇨병 환자의 인구가 계속 증가할 것임에 틀림없다. 게다가, 당뇨병은 직간접적인 고비용으로 상당한 사회경제적인 부담을 수반한다.

그러므로, 당뇨병과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 새로운 약제학적 물질이 매우 요구된다.

따라서, 본 발명의 목적은 당뇨병의 예방 및/또는 치료에 활성이 있는 물질을 동정하는 새로운 수단을 제공하는 것이다.

이는, 글루코스 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질의 동정을 위한, MGC4504 단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편, 또는 상기 단백질, 유도체 또는 단편을 암호화하는 핵산을 사용하여 달성된다.

본 발명은 당뇨병, 특히 제2형 당뇨병의 기초가 되는 병리학적 과정에서 MGC4504 (Q9BUX1)가 밀접하게 관계하는 증거를 처음으로 제공하는 본 발명자들의 결과에 기초한다. 지금까지는, 탄수화물 또는 지질 대사의 손상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병 상태에서 MGC4504의 가능한 관계에 대해 알려진 것이 없었다. 인슐린 내성 및 제2형 당뇨병의 동물 모델에서 MGC4504 발현 수준이 감소함을 제시하고, MGC4504의 발현이 증가하면 세포의 인슐린 민감성이 증가한다는 실험적 증거를 제공함으로써, 본 발명자들은 이러한 생리학적 배경에서 MGC4504의 기능적 관련성을 처음으로 증명하였다. 따라서, MGC4504 활성을 조절할 수 있는 물질은, 이러한 메커니즘의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병의 병리학적 상태 및 과정에 근본적인 영향을 줄 것이라고 틀림없이 생각된다.

MGC4504 (trEMBL 데이터베이스의 엔트리 Q9BUX1)는, 표준 서열 예측에 따르면, 추정되는 Chac형 도메인 (아미노산 32번 내지 208번)을 포함하지만 막관통 도메인을 포함하지 않는, 222개 아미노산의 단백질이다. MGC4504 아미노산 서열은 사람, 래트 및 마우스 사이에 고도로 보존되어 있다 (>85% 아미노산 동일성). 지금까지는, 문헌에서 MGC4504 분자의 기능을 밝힌 적이 없었다.

MGC4504의 유전자 좌는 염색체 15번이다. MGC4504의 게놈 서열은 공개적으로 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 AC_020661 (서열번호 3)로써 입수할 수 있다. MGC4504의 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열은 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 엔트리 번호 NM_024111 (서열번호 1)로써 입수할 수 있다. 유래된 단백질 서열은 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 동일한 엔트리 번호 NM_024111 (서열번호 2)로써 입수할 수 있다. NCBI는 기관[National Centre for Biotechnology Information] (우편 주소: National Centre for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; 인터넷 주소: www.ncbi.nhm.nih.gov)이다.

본 발명에 따른 용도는 글루코스 또는 지질 대사의 이상과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 새로운 물질의 동정을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 용도는 원하는 특성을 갖는 물질의 동정뿐만 아니라, 글루코스 또는 지질 대사의 손상과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료에 유용한 것으로 이미 동정된 물질의 추가적인 특성규명을 포함한다 (즉, 본 발명에 따른 용도는, 예를 들면, 화합물 스크리닝뿐만 아니라 화합물 프로파일링에도 유용하다).

본 발명의 여러 양태를 위해서 사용될 물질은, 생화학적 또는 분자생물학적 방법에 의해, 정제, 부분정제, 합성 또는 제조된, 임의의 생물학적 또는 화학적 물질 또는 자연 산물의 추출물일 수 있다.

본 발명의 여러 양태의 의미에서 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 것으로 고려되는 물질은, MGC4504의 기능 중의 하나, 또는 세포내 MGC4504의 양 또는 정상상태 수준 (steady state level), 또는 MGC4504 발현에 영항을 주는 임의의 물질일 수 있다.

이를 위해서, 상기 물질은 MGC4504의 기능 중의 하나 (예: 아래에서 정의된 바와 같은 기능)를 조절할 수 있다. MGC4504 단백질 활성은 물질에 의해서 조절될 수 있다 (예: MGC4504 폴리펩티드/단백질 또는 이의 단편의 직접적인 상호작용 및 간섭에 의해서). 상기 물질은, 예를 들면, 전사 (개시, 신장, 가공 등), 전사체 안정성, 해독 수준에서 MGC4504 발현을 조절할 수도 있다. 또한, 상기 물질은 MGC4504의 해독후 변형, 단백질 폴딩 (folding) 등을 조절할 수 있다. 상기 물질은 직접적 또는 간접적으로 위의 효과를 발휘할 수 있다 (간접적이라는 것은, 즉 MGC4504 기능/단백질 활성/발현 등에 영향을 주는 자연적 신호전달 연속단계 (signalling cascade)에 (양성으로 또는 음성으로) 간섭하는 것을 의미한다). 또한, 상기 물질은 MGC4504 활성을 모방할 수도 있다 (즉, 기능/역할을 대신함).

MGC4504의 단편은, 상응하는 야생형보다 더 짧은 임의의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다, 즉, 서열번호 2의 폴리펩티드에 따른 호모 사피엔스 (homo sapiens) (hs) MGC4504 또는, 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 14에 따른 폴리뉴클레오타이드 중의 하나보다 더 짧다.

MGC4504의 또는 MGC4504 단편의 유도체는, MGC4504 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩티드 또는 이들의 단편이 임의로 변형된 것일 수 있다. 유도체는, 예를 들면, 화학적 또는 생물학적 변형[예: 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드가 안정화되게 하는 변형 (예: 포스포로티오에이트 변형 또는 다른 종류의 핵산 골격의 변형 또는 아미노산 사이의 결합의 교환 등), 또는 특정 세포에 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드가 특이적으로 표적화되게 하는 변형 또는 세포 안으로 들어가거나 세포에 의해 흡수되는 것을 용이하게 하는 변형 (예: 세포 투과 포스포펩티드, 세포 투과 펩티드 벡터로의 오르토 연결 (예: 안테나피디아 / 페네트레틴 (antennapedia / penetratin), TAT 및 신호 펩티드 기본 서열에 기초함); 또는 특정 트랜스포터 (transporter) 또는 임포터 (importer)에 대한 리간드의 일부분과의 연결)]과 같은, 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 변형 또는 임의의 다른 종류의 변형을 포함한다.

MGC4504의 기능성 단편은, MGC4504의 기능 중의 적어도 하나의 기능을 나타내는 임의의 단편 (폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드)이다.

MGC4504의 "기능성 유도체"라는 용어는, MGC4504의 기능 중의 적어도 하나의 기능을 갖는, 천연 형태 (폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드)에 대한 MGC4504의 임의의 종류의 변형을 포함한다. 본 발명은 MGC4504의 단편의 기능성 유도체도 포함한다.

MGC4504의 기능은, 췌장 β세포로부터의 인슐린 분비를 향상/증가시키는 능력, 인슐린 자극된 글루코스 처리 (disposal) (예: 글루코스 흡수; 글리코겐 합성 및 인슐린 민감성)를 향상/증가시키는 능력을 포함하고, 이는 세포 신호전달 경로, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인슐린 신호전달 또는 인슐린 작용 (예: Akt 인산화, GLUT4 이동 (translocation), aPKC 활성화; 글루코스 흡수를 향상시키는 하류 신호전달 연속단계의 활성화)에 영향을 준다. MGC4504의 기능은, 다른 분자 (예: 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질, 핵산, 합성 분자)와 상호작용하는 MGC4504 (단백질 또는 핵산) 또는 이의 단편의 능력도 일반적으로 포함하며, 바람직하게는 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 증가시키는 능력에 관한 것이다.

본 발명의 한 양태는,

a. MGC4504 단백질을 시험 물질과 접촉시키는 단계; 및

b. 상기 시험 물질이 상기 MGC4504 단백질의 활성을 조절하는지의 여부를 측정하는 단계

를 포함하는, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질을 동정하는 방법에 관한 것이다.

"MGC4504의 활성"이라는 용어는 MGC4504 단백질, 폴리펩티드 또는 이들의 단편의 단백질 활성에 관한 것이다 (예: 위에서 정의된 기능에 포함된 바와 같은 활성 중의 하나).

이때 MGC4504 활성을 조절할 수 있는 물질은, 본 발명의 문맥에서 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 것으로 생각되는 물질이다.

상기 방법은, 분리된 MGC4504 또는 MGC4504를 포함하는 추출물을 사용하는 생화학 분석이거나, 세포 분석 (celluar assay)일 수 있다.

조절은, MGC4504 활성의 양성 또는 음성 조절일 수 있고, MGC4504 단백질 활성의 (완전한 또는 부분적인) 활성화 (즉, 활성의 증가)뿐만 아니라 (완전한 또는 부분적인) 불활성화를 포함한다. 본 발명의 여러 양태의 바람직한 양태에 있어서, MGC4504의 조절은 활성화 (즉, 활성의 증가)이다.

시험 물질은 위에서 정의된 바와 같은 임의의 물질일 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는,

a. MGC4504의 양 또는 활성이 감소된 세포를 시험 물질과 접촉시키는 단계;

b. 상기 시험 물질이, 세포에 존재하는 상기 MGC4504의 양 또는 활성을 증가시킬 수 있는지의 여부를 측정하는 단계

이때 검출가능하게 MGC4504 양 또는 활성을 증가시킬 수 있는 물질은, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질이라고 생각된다.

한가지 바람직한 양태에 있어서, 물질은 MGC4504의 양 또는 활성을 완전히 회복시킬 수 있다.

MGC4504의 양 또는 활성이 감소된 세포는, 기준 세포, 예를 들면, MGC4504 활성이 완전한 세포 (예: HEK293)와 비교하여 검출가능하게 MGC4504의 양 또는 활성이 더 낮은 임의의 세포 (즉, 기능이 낮은 돌연변이 MGC4504 단백질의 발현, 또는 낮은 수준의 발현 등으로 인한 세포)일 수 있다. 또한, MGC4504 또는 MGC4504 활성이 완전히 없는 세포일 수도 있다 (예: 기능 상실 (loss of function) MGC4504 돌연변이 단백질이 발현되거나 MGC4504가 완전히 발현되지 않는 세포). 이들은 본래 이러한 특성을 갖는 세포뿐만 아니라 이러한 특성을 나타내도록 유전적으로 변형된 세포 (예: 게놈 또는 유도성 MGC4504 녹아웃 (knock out) 세포뿐만 아니라, MGC4504의 우성 음성 (dominant negative) 돌연변이체를 발현하는 세포 등)도 포함한다.

본 발명의 또다른 양태는,

a. 전사 활성 시스템에서, MGC4504 단백질, 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 핵산을 시험 물질과 접촉시키는 단계;

b. 상기 시험 물질의 존재하에, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질, 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 mRNA의 양을 측정하는 단계;

c. 상기 시험 물질의 부재하에, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질, 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 mRNA의 양을 측정하는 단계;

d. 상기 시험 물질이, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 mRNA의 양을 조절할 수 있는지의 여부를 측정하는 단계

이때 상기 시스템에 존재하는 MGC4504 mRNA의 양을 조절할 수 있고 바람직하게는 증가시킬 수 있는 물질은, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질이라고 생각된다.

전사 활성 시스템은, 적어도 전사 단위의 전사 반응을 수행할 수 있는 능력이 있는, 임의의 생화학 시스템 또는 세포 시스템이다. 이러한 시스템은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고, 세포 (예: 보통의 실험실 균주 또는 세포주뿐만 아니라 진핵생물 또는 원핵생물 세포의 일차배양)뿐만 아니라 상업적으로 입수할 수도 있는 시험관내 전사 시스템 또는 키트 (예: 세포 추출물에 기초함)를 포함한다.

당해 기술분야의 수준에서 잘 알려진 기술 (예: 방사성 또는 형광 표지를 사용하여 산물을 직접 표지하는 방법 또는 특이적인 프라이머 또는 프로브를 사용하여 산물을 검출하는 방법 등)에 따라, 시스템에 존재하는 mRNA의 양을 측정할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는,

a. 해독 활성 시스템에서, MGC4504 단백질, 이의 유도체 또는 단편을 암호화하는 핵산을 시험 물질과 접촉시키는 단계;

b. 상기 시험 물질의 존재하에, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질, 유도체 또는 단편의 양을 측정하는 단계;

c. 상기 시험 물질의 부재하에, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질, 유도체 또는 단편의 양을 측정하는 단계;

d. 상기 시험 물질이, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질, 유도체 또는 단편의 양을 조절할 수 있는지의 여부를 측정하는 단계

이때 상기 시스템에 존재하는 MGC4504 단백질, 유도체 또는 단편의 양을 조절할 수 있고 바람직하게는 증가시킬 수 있는 물질은, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질이라고 생각된다.

해독 활성 시스템은, 적어도 전사체의 해독 반응을 수행할 수 있는 능력이 있는, 임의의 생화학 시스템 또는 세포 시스템이다. 이러한 시스템은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고, 세포 (예: 보통의 실험실 균주 또는 세포주뿐만 아니라 진핵생물 또는 원핵생물 세포의 일차배양)뿐만 아니라 시험관내 해독 시스템 (이는 상업적으로 입수할 수도 있음, 예: 키트)을 포함한다. 시험관내에서 폴리뉴클레오타이드를 해독하기 위해서는, 폴리뉴클레오타이드를 적당한 벡터내로 서브클로닝하고, 이어서 적당한 완충액 및 세포 추출물 (예: 망상적혈구 용해물)에서 폴리펩티드를 발현시킨다. 적당한 조건의 벡터, 필요한 시약 및 프로토콜은 당해 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수할 수 있다.

본 발명의 문맥에서, "폴리펩티드"라는 용어는, 펩티드 결합에 의해서 서로 결합된 아미노산을 포함하고 선형 방식으로 서로 연결된 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 분자를 의미한다. 보다 짧은 이러한 종류의 분자는 펩티드라고 한다. "단백질"이라는 용어는 적어도 하나의 폴리펩티드쇄를 포함하는 분자를 의미하지만, 서로 연결되거나 결합된 2개 이상의 폴리펩티드쇄를 포함하는 분자를 의미할 수도 있다. 따라서, "단백질"이라는 용어는 "폴리펩티드"라는 용어를 포함한다.

당해 기술분야에서 잘 알려진 기술 (예: 해독체를 직접 방사성 또는 형광 표지하는 방법 또는 특이적인 항체를 사용하는 방법, 단백질을 태그 (tagging)하고 태그 (tag)를 검출하는 방법 등)에 따라, 상기 시스템에 존재하는 MGC4504 단백질을 검출할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는,

a. 리포터 유전자 또는 이의 기능성 단편에 작동가능하게 연결된 MGC4505 프로모터 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 핵산 벡터로 형질감염 (transfection)된 세포를 제공하는 단계;

b. 기능성 MGC4504 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않은 리포터 유전자 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 대조군 벡터로 형질감염된 세포를 제공하는 단계;

c. 상기 시험 물질의 부재하에, a) 및 b) 단계에 따른 세포의 상기 리포터 유전자 활성을 측정하는 단계;

d. 상기 시험 물질의 존재하에, 리포터 유전자 활성을 측정하는 단계

이때 b) 단계의 리포터 유전자 활성은 현저하게 증가시키지 않으면서 a) 단계에 따른 리포터 유전자 활성을 현저하게 증가시킬 수 있는 물질은, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질로 고려된다.

현저한 증가는 표준편차보다 더 높은 임의의 증가이고, 바람직하게는 적어도 표준편차의 2배이다.

상기한 본 발명의 양태는 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 전형적인 리포터 유전자 분석에 기초한 것이다. 이 목적을 위해서, 선택한 프로모터를, 프로모터가 활성화된 경우 리포터 유전자가 발현되게 하는 방식으로, 선택된 리포터 유전자의 상류에, 선택된 숙주 세포의 종류에 적당한 발현 벡터내로 삽입시킨다. 그 후에 구성체를 선택된 숙주 세포내로 도입시킨다. 세포 배양 조건 및 리포터 유전자 발현의 검출뿐만 아니라 적당한 형질전환 또는 형질감염 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다 (예: 아래에 열거된 표준문헌 참조). 적당한 조건뿐만 아니라 상업적으로 입수할 수도 있는 벡터, 리포터 유전자 및 필요한 시약은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다.

벡터는 원형 또는 선형 폴리뉴클레오타이드 분자 (예: DNA 플라스미드, 박테리오파지 또는 코스미드)이고, 이를 사용하여 폴리뉴클레오타이드 단편이 (예: 다른 벡터로부터 잘려져 나오거나 PCR에 의해서 증폭되어 클로닝 벡터에 삽입된다) 적당한 세포 또는 유기체에서 특이적으로 증폭될 수 있다. 숙주 세포 또는 유기체에서, 발현 벡터를 사용하여 원하는 유전자 (예: 리포터 유전자)를 이종발현 (heterologous expression)시킬 수 있다. 세포 또는 유기체의 유형은 목적 및 숙련자가 알고 있는 범위에서의 선택에 따라서 주로 달라진다. 핵산의 증폭을 위한 적당한 유기체는, 예를 들면, 주로 증식 속도가 높은 단세포 생물 (예: 세균 또는 효모)이다. 적당한 유기체는 다세포 조직로부터 분리되고 배양된 세포[예: 다양한 유기체로부터 만들어진 세포주 (예: 스포돕테라 프루지페르다 (Spodoptera Frugiperda)로부터 만들어진 SF9 세포 등)]일 수도 있다. 적당한 클로닝 벡터는 당해 기술분야에 알려져 있고 다양한 생명공학 공급업자 (예: Roche Diagnostics, New England Biolabs, Promega, Stratagene 등)에서 상업적으로 입수할 수 있다. 적당한 세포주는, 예를 들면, 기관[American Type Culture Collection (ATCC)]에서 상업적으로 입수할 수 있다.

단백질 또는 폴리펩티드의 이종발현을 위한 세포는, 핵산 벡터로 형질감염되어 원하는 유전자 (예: 리포터 유전자)를 발현시킬 수 있는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 이들은, 일차세포 및 세포 배양으로부터 얻은 세포, 바람직하게는 다세포 생물 및 조직 (예: HEK293, RIN-5F, HeLA, CHO, COS, SF9 또는 3T3 세포) 또는 효모[예: 에스. 폼베 (S. pombe) 또는 에스. 세레비시애 (S. cerevisiae)]와 같은 단세포 생물로부터 유래된 세포를 포함하는 진핵생물 세포 배양, 또는 원핵생물 세포 배양, 바람직하게는 피치아 (Pichia)속 또는 이. 콜라이 (E. coli)를 주로 포함한다. 조직으로부터 유래한 세포 및 샘플은 잘 알려진 기술 (예: 채혈, 조직천공 (tissue punction) 또는 외과적 기술)에 의해서 얻을 수 있다.

본 출원의 문맥에서, "형질감염"이라는 용어는 핵산 벡터를 숙주 세포 (원핵세포 또는 진핵세포)내로 도입시키는 것을 의미하고, 따라서 "형질전환"이라는 용어를 포함한다.

형질감염은 안정적이거나 일시적인 형질감염일 수 있다.

MGC4504 프로모터는, 적당한 발현 벡터내로 유전자 산물의 암호화 서열의 상류에 도입되는 경우, 원하는 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 MGC4504 유전자의 일부이다. 바람직하게는, MGC4504 프로모터는, 서열번호 3/NCBI 수탁번호 AC020661에 따른 서열의 뉴클레오타이드 84361번 내지 88681번에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함한다[뉴클레오타이드 84361번 내지 88681번은 뉴클레오타이드 위치 -4377 / +1에 상응함]. MGC4504 프로모터의 기능성 단편은, 적당한 발현 벡터내로 유전자 산물의 암호화 서열의 상류에 도입되는 경우, 원하는 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 MGC4504 프로모터의 임의의 단편이다. 바람직한 단편은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 84361번 내지 88681번에 따른 MGC4504 프로모터의 기능성 단편을 포함한다.

리포터 유전자는 그 유전자 산물을 쉽게 정량할 수 있는 임의의 유전자일 수 있다. 진핵생물 또는 원핵생물 숙주에 대한 매우 다양한 리포터 유전자뿐만 아니라 검출 방법 및 필요한 시약은 당해 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수할 수 있다. 이들은, 예를 들면, β-락타마제 (lacZ), 루시퍼라제, 녹색 또는 청색 형광 단백질 (GFP 또는 BFP), DsRed, HIS3, URA3, TRP1 또는 LEU2 또는 β-갈락토시다제의 유전자를 포함한다. 이들 유전자는, 시각화 (색 또는 발광) 반응에 의해 쉽게 검출될 수 있는 단백질을 암호화한다 (예: lacZ, 루시퍼라제). 이들은, 시각화 (색 또는 발광) 반응에 의해 쉽게 검출될 수 있는 유전자 산물, 또는 발현되는 경우에 앰피실린 또는 카나마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자 산물을 포함한다. 다른 리포터 유전자 산물은 이를 발현하는 세포가 특정 조건하에서 성장할 수 있게 한다 (예: 영양요구성 유전자).

리포터 유전자의 기능성 단편은 그 유전자 산물을 쉽게 정량할 수 있는 소정의 리포터 유전자의 임의의 단편이다.

본 발명의 상기 양태의 문맥에서, 대조군 벡터는, 리포터 유전자 또는 이의 기능성 단편을 포함하고 있지만 리포터 유전자 발현이 (기능성) MGC4504 프로모터에 의해서 일어나지 않는 임의의 적당한 벡터일 수 있다. 이것은, 예를 들면, 리포터 유전자 또는 이의 기능성 단편이 기능성 MGC4504 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않은 것을 의미할 수 있다 (즉, MGC4504 프로모터가 완전히 없거나, 비기능성 MGC4504 프로모터 또는 프로모터 단편을 포함하거나, 프로모터와 리포터 유전자의 연결이 비기능성인 것). 이것은, 리포터 유전자 또는 이의 기능성 단편이 MGC4504 프로모터가 아닌 또다른 프로모터 (예: SV40 또는 또다른 기본 프로모터)에 작동가능하게 연결된 것을 의미할 수도 있다. 기능성 벡터와 대조군 벡터는 동일한 세포에 형질감염될 수도 있지만, 이 경우에는 리포터 유전자가 달라야 할 필요가 있다.

본 발명의 또다른 양태는, 개체의 분리된 샘플에서 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병 또는 질병에 대한 소인 (predisposition)을 진단하기 위한, MGC4504 검출 수단의 용도에 관한 것이다.

상기 진단은, 예를 들면,

1. 분리된 샘플에 존재하는 MGC4504 (단백질 또는 mRNA)의 양의 검출 (이때 기준 샘플과 비교하여 양이 적다는 것은 소인 또는 질병을 나타낸다.)

2. 분리된 샘플에 존재하는 MGC4504의 활성의 검출 (이때 기준 샘플과 비교하여 활성이 낮다는 것은 소인 또는 질병을 나타낸다.)

3. MGC4504의 양이 적어지거나 활성이 낮아지거나 기능이상이 일어나게 하는 MGC4504 단백질/유전자/암호화 서열/프로모터 등에 있는 돌연변이의 검출 (이때 돌연변이의 검출은 소인 또는 질병을 나타낸다.)

을 포함할 수 있다.

이때 상기 기준 샘플은, 예를 들면, MGC4504의 평균 활성 또는 양을 갖는 분리된 샘플 및/또는 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병 또는 질병에 대한 소인이 없는 공여자 (donor)의 샘플일 수 있다.

MGC4504의 검출 수단은, 생물학적 샘플에 존재하는 MGC4504 폴리펩티드/단백질 또는 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 임의의 수단일 수 있다.

MGC4504 단백질 또는 폴리펩티드를 검출하는 수단은, 야생형 MGC4504 단백질/폴리펩티드를 특이적으로 검출할 수 있는 임의의 수단일 수 있고, 또한 야생형 폴리펩티드/단백질과 비교하여 크기 또는 아미노산 서열에 관해서 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 MGC4504 단백질/폴리펩티드를 특이적으로 검출하는 수단일 수도 있다. 이러한 수단의 바람직한 예는, 예를 들면, 면역조직학적 또는 면역조직화학적 기술 (예: 조직학적 조직 절편에 있는 MGC4504 단백질 또는 이의 특정 돌연변이의 검출, 또는 막, 칩, ELISA 플레이트 등과 같은 적당한 운반체상에 고정된 MGC4505 단백질의 검출)에서의 사용을 위한, MGC4504 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 항체이거나 이를 포함한다.

MGC4504 핵산을 검출하는 수단은, 예를 들면, 야생형이거나 또한 야생형 MGC4504 핵산과 비교하여 길이 또는 핵산 서열에 관해서 하나 이상의 돌연변이를 보유하는, MGC4504 mRNA/cDNA 또는 게놈 DNA를 검출하는 수단일 수 있다. 상기 수단은, 예를 들면, MGC4504 mRNA를 특이적으로 검출 및/또는 정량하는 수단일 수 있고, 바람직하게는, 예를 들면, PCR 서열분석에서 사용하기 위해서 (뉴클레오타이드 서열에 있는 돌연변이의 검출을 위해서) MGC4504 DNA를 증폭시킬 수 있거나, 예를 들면, RT PCR에서 사용하기 위해서 (MGC4504 mRNA 발현의 검출 및/또는 정량을 위해서) MGC4504 cDNA를 증폭시킬 수 있는, 특이적인 MGC4504 핵산 프로브 또는 프라이머 세트이거나 이를 포함한다. 또다른 상기 수단은, 예를 들면, 표준조건하에서 MGC4504 mRNA 또는 cDNA와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 핵산 프로브 (예를 들면, 노던 블롯 또는 칩 하이브리드화 기술에서의 사용을 위한)일 수 있다.

야생형이라는 용어는 소정의 생물에 대해 자연에서 또는 표준 실험실 주에서 발견되는 유전자형 또는 표현형을 의미한다. 한가지 바람직한 양태에 있어서, MGC4504의 야생형 서열은 서열번호 1, 2, 3 또는 14에 따른 서열이다.

적당한 프라이머의 설계 및 합성은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다 (상기 참조). 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 상기 수단은 MGC4504 핵산의 증폭을 위한 프라이머 세트이고, 바람직하게는 서열번호 8 및/또는 9에 따른 프라이머 중의 적어도 하나를 포함하는 프라이머의 세트이다.

본 발명의 추가의 바람직한 양태에 있어서, 상기 수단은 MGC4504 핵산의 검출을 위한 프로브이고, 바람직하게는 서열번호 10에 따른 서열을 갖는 프로브이다. 적당한 프로브의 설계 및 합성은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다 (아래의 표준문헌 참조).

본 발명의 또다른 바람직한 양태에 있어서, 상기 수단은 MGC4504 단백질 또는 폴리펩티드의 특이적인 검출을 위한 항체이다. 적당한 항체 또는 이의 기능성 단편의 제조도 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다[예: 경우에 따라, 프로인트 어쥬번트 (Freund's adjuvant) 및/또는 알루미늄 하이드록사이드 겔의 존재하에, MGC4504 단백질 또는 이의 단편을 사용하여 포유류 (예: 토끼)를 면역시킴으로써 제조함)[참조: Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349]. 면역학적 반응의 결과로서 동물에 형성된 다클론 항체는 잘 알려진 방법을 사용하여 그 후에 혈액으로부터 분리하여, 예들 들면, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 단일클론 항체는, 예를 들면, 윈터와 밀스타인 (Winter & Milstein)의 알려진 방법[참조: Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299]에 따라서 제조될 수 있다. 단일클론 항체를 제조하는 적당한 절차도 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다 (예: 표준 방법에 관한 아래에 열거된 문헌 참조). 본 발명의 문맥에서, 항체 또는 항체 단편이라는 용어는, 재조합에 의해 제조되어, 경우에 따라, 변형된, 항체 또는 이의 항원 결합 부분도 포함한다 (예: 키메라 항체 (chimaeric antibody), 사람화 항체 (humanized antibody), 다기능성 항체, 이중특이적 (bispecific) 또는 다특이적 (oligospecific) 항체, 단일가닥 항체 및 F(ab) 또는 F(ab)₂ 단편) (예: 유럽특허 제EP-B1-O 368684호, 미국특허 제4,816,567호, 제4,816,397호, 국제공개공보 제WO 88/01649호, 제WO 93/06213호 또는 제WO 98/24884호 참조).

분리된 샘플은 개체로부터 분리된 임의의 종류의 생물학적 샘플을 포함한다 (예: 세포, 표본, 절편 또는 조직이나 기관 (예: 근육, 췌장, 뇌, 혈액, 간, 비장, 신장, 심장, 혈관 등)의 일부). 분리된 샘플은 잘 알려진 기술 (예: 채혈, 조직천공 또는 외과적 기술)에 의해서 얻을 수 있다. 세포 추출물 또는 조직 추출물의 제조는 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다 (예: 아래에 열거된 표준문헌 참조).

본 발명의 또다른 양태는, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병 또는 질병에 대한 소인의 동정을 위한 진단 키트를 제조하기 위한, MGC4504 검출 수단의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 양태는, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상 또는 이에 대한 소인을 진단하는 방법에 관한 것이고, 개체의 분리된 샘플에 존재하는 MGC4504의 양을 분석하는 단계를 포함하며, 이때 하나 이상의 기준 샘플과 비교하여 MGC4504 양의 감소는 소인 또는 기능이상을 나타낸다.

본 발명의 여러 양태의 문맥에서, 상기 개체는 임의의 생물일 수 있고 바람직하게는 포유류이며 보다 바람직하게는 사람이다.

MGC4504 양의 분석은, 예를 들면, 샘플에 존재하는 mRNA 양의 분석일 수 있다 (예: 노던 블롯 분석, 칩 분석 (예: cDNA 마이크로어레이) 또는 정량적 RT PCR에 의한 분석). 분석은 샘플에 존재하는 단백질 양의 분석일 수도 있다 (예: ELISA, 웨스턴 블롯, 칩 기술 (예: 단백질 마이크로어레이) 등과 같이 특이적인 항체를 사용하는 기술에 의한 분석).

본 발명의 또다른 양태는, MGC4504의 기준 서열과 비교하여 MGC4504의 돌연변이에 대해서 개체의 분리된 샘플을 분석하는 단계 (이때 돌연변이의 존재는 질병 또는 소인을 나타낸다)를 포함하는, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병 또는 질병에 대한 소인을 진단하는 방법에 관한 것이다.

돌연변이, 즉 가장 흔히 발견되는 유전자형 (유전자에 관해서 야생형이라고도 함)으로부터의 편차는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 이들은, 그 중에서도, 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP, 즉, 단일 뉴클레오타이드 위치에 교환이 있는 소정의 뉴클레오타이드 서열의 변이), 길이, 결실, 역위 등의 다형성을 포함한다. 유전적 돌연변이는 유전자 발현 또는 단백질 기능에 영향을 줄 수 있고 그러므로 특정 질병의 발병 및 소인과 관계될 수 있다. 발명자들이 밝힌 바와 같이 MGC4504는 당뇨병의 기초가 되는 병리학적 과정과 관계가 있기 때문에, MGC4504 유전자의 돌연변이, 및 특히 MGC4504 발현 및/또는 기능 및/또는 활성에 영향을 주는 돌연변이는, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병에 큰 영향을 주게 된다.

진단 방법은 MGC4504를 검출하는 임의의 알려진 방법에 따라서 수행될 수 있다 (예: 샘플에 있는 MGC4504를 검출하는 상기 수단 중의 하나를 사용함). 돌연변이는, 예를 들면, 게놈 수준에서, 예를 들면, MGC4504 유전자의 분자생물학적 분석에 의해서 분석될 수 있다 (예: 서던 블롯, 게놈 서열분석 기술, 서열의 질량 분광법적 분석, DNA 마이크로어레이 등). 돌연변이는 발현된 mRNA 또는 단백질의 수준에서 분석될 수도 있다[예: cDNA의 서열분석 (예: RT PCR에 기초함), 또는 단백질 서열분석 기술 또는 특이적인 항체의 사용에 의한 분석에 의함].

기준 샘플은 위에서 정의된 바와 같은 샘플일 수 있다.

기준 서열은, 예를 들면, MGC4504 야생형 서열 (예: 상기 참조) 및/또는 따라서 상기 질병 또는 소인이 없는 대부분의 개체에서 발견되는 MGC4504 서열일 수 있다 (이 경우에, 기준 서열은 개체군에서 가장 많이 존재하는 서열이 아니라 상기 질병 또는 소인이 없는 개체군에서 가장 많이 존재하는 서열일 수도 있다; 이 경우에는 야생형 서열이 상기 질병의 발생에 대한 위험성 증가와 관련된다). 바람직한 양태에 있어서, 기준 서열은 MGC4504의 야생형 서열 중의 하나이다 (상기 참조).

본 발명의 상기 양태의 바람직한 양태에 있어서, 상기 돌연변이는 MGC4504의 양 및/또는 활성을 감소시키거나 MGC4504 및/또는 활성이 완전히 없어지게 하는 돌연변이이다.

본 발명의 또다른 양태는, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상 또는 이에 대한 소인을 진단하는 방법에 관한 것이고, 개체의 분리된 샘플에 존재하는 MGC4504의 활성을 분석하는 단계를 포함하며, 이때 하나 이상의 기준 샘플과 비교하여 MGC4504 활성의 감소는 소인 또는 기능이상을 나타낸다.

활성은 위에서 정의된 바와 같은 MGC4504의 기능 중의 하나에 포함되는 임의의 단백질 활성일 수 있다. 활성은 직접적 또는 간접적으로 측정될 수 있다 (예: MGC4504의 하나 이상의 기능의 세기 또는 정도를 분석함).

본 발명의 또다른 양태는, 적어도 하나의 MGC4504 검출 수단을 포함하는, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병 또는 질병에 대한 소인을 동정하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명의 문맥에서, 키트 ("부품 키트"로도 알려짐)는 본 출원에서 동정된 하나 이상의 성분의 임의의 조합이라고 이해되며, 이는 기능성 단위와 공간적으로 함께 존재하고 이와 결합된 것이며, 추가의 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 키트는, 적당한 완충액 및/또는 MGC4504를 검출하기 위한 시약 및/또는 샘플 표본과 적당하게 함께, 적어도 MGC4504의 검출 수단을 포함하고, 각각의 검출 기술을 수행하는 것에 관한 필요한 취급 설명서를 선택적으로 포함한다.

수단은, 위에서 정의된 바와 같은 임의의 수단일 수 있고, 바람직하게는 MGC4504 핵산을 증폭시킬 수 있는 특이적인 MGC4504 핵산 프로브 또는 프라이머 세트, 또는 특이적인 MGC4504 항체이거나 이를 포함한다.

본 발명의 또다른 양태는, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 치료하거나 예방하기 위해 투약을 조절하는 방법에 관한 것이고, 이때 기준 서열과 비교하여 MGC4504의 돌연변이에 대해서 및/또는 기준 샘플과 비교하여 MGC4504의 양 및/또는 활성의 감소에 대해서 개체의 분리된 샘플을 분석하여, 이때 샘플에 MGC4504의 돌연변이가 존재하고/하거나 MGC4504의 양 및/또는 활성이 감소하면 투여량을 조절한다.

투약의 조절은, 예를 들면, 개체에 적용할 수 있는 투약 종류의 조절일 수 있다[예: 즉, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 치료하거나 예방하기 위해서 물질 (예: 효능제, 길항제, 펩티드모방체 (peptidomimetic), 단백질, 펩티드, 핵산, 작은 분자 또는 다른 약물 후보) 또는 특정한 계통의 물질 (예: MGC4504 단백질 활성을 직접적으로 증가시키는 유형의 물질 또는 공통적인 구조 모티프가 있는 화학적 화합물의 부분집합에 속하는 물질)이 개체에 투여될 수 있거나 이를 이용하여 효과적으로 치료될 수 있는지의 여부를 결정함]. 또다른 예에 있어서 투약의 조절은 소정의 약제/물질 또는 물질 계통의 투여량의 조절일 수 있다.

스크리닝 분석에 의해서 동정된 바와 같이 MGC4504 발현 또는 활성 (예: MGC4504 유전자 발현)에 대해 자극효과 또는 억제효과 (바람직하게는 자극효과)가 있는 물질은, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병 (예: MGC4504 활성의 이상 또는 결핍과 관련된 근세포와 같이, MGC4504가 발현되는 세포 또는 조직을 포함하는 장애)의 치료 또는 예방에 유용한 약제를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 치료와 함께, 개체의 약리유전학 (즉, 개체의 유전자형과 외래 화합물 또는 약물에 대한 개체의 반응 사이의 관계에 대한 연구)이 고려될 수 있다. 치료제 대사의 차이는 약리학적 활성 약물의 투여량과 혈중 농도 사이의 관계를 변화시킴으로써 심한 독성 또는 치료의 실패로 이어질 수 있다. 따라서, 개체의 약리유전학은 개체의 유전자형의 고려에 기초한 예방적 또는 치료학적 치료를 위한 효과적인 제제 (예: 약물)를 선택할 수 있게 한다. 이러한 약리유전학을 사용하여 적당한 투여량 및 치료 섭생을 추가로 결정할 수 있다. 따라서, 개체의 MGC4504 단백질의 활성, MGC4504 핵산의 발현 또는 MGC4504 유전자의 돌연변이 함량을 측정함으로써 개체의 치료학적 또는 예방적 치료를 위한 적당한 제제를 선택할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제를 제조하기 위한, MGC4504 또는 이의 기능성 단편 또는 유도체, 또는 MGC4504 또는 이의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양태는, 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제를 제조하기 위한, MGC4504의 활성을 조절하는 물질의 용도, 및 MGC4504의 활성을 조절하는 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 탄수화물 및/또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 겪는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

이를 위해서, MGC4504 또는 이의 단편 또는 유도체는 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 형태로 사용될 수 있다. 원하는 부위로의 표적화 및 세포안으로의 유입 또는 안정성을 확실하게 하거나 용이하게 하는데는 적당한 변형 또는 첨가제가 유용하다. 반면에, 원하는 부위로의 표적화를 확실하게 하기 위해서 국부적 적용 (예: 피하, 피부 아래 또는 근육내 주사 등)도 가능하다. 다른 유용한 첨가제는 안정화 등을 위한 염, 완충액 등을 포함한다.

MGC4504 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능성 단편 또는 유도체를, 예를 들면, 세포내 발현 또는 세포안으로의 표적화를 확실하게 하는 적당한 벡터 안으로 넣을 수 있다. 당해 기술분야에 알려진, 세포유형 또는 조직 특이적 유전자의 적당한 프로모터/인핸서를 사용하여 세포유형 특이적 발현을 확실하게 할 수 있다. MGC4504 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것도 가능하다.

약제의 생산을 위해서, 활성 성분은 일반적으로, 투여 종류에 따라, 생리적 완충 용액 (예: 염화나트륨 용액, 탈염수), 안정화제 (예: 프로테아제 또는 뉴클레아제 억제제, 바람직하게는 아프로티닌, ε-아미노카프로산 또는 펩스타틴 A) 또는 격리제 (예: EDTA), 겔 제형 (예: 백색 바셀린, 저점도 파라핀 및/또는 황랍) 등과 같은, 적당한 첨가제 또는 보조 물질과 함께 제형화된다.

적당한 추가의 첨가제는, 예를 들면, 세제 (예: 트리톤 X-100 또는 나트륨 데옥시콜레이트) 외에도, 폴리올 (예: 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세롤), 당 (예: 슈크로스 또는 글루코스), 양쪽성이온 화합물 (예: 글리신과 같은 아미노산 또는 특히 타우린 또는 베타인) 및/또는 단백질 (예: 소 또는 사람 혈청 알부민)이다. 세제, 폴리올 및/또는 양쪽성이온 화합물이 바람직하다.

생리적 완충 용액은 바람직하게는, 대략 6.0 내지 8.0의 pH, 바람직하게는 대략 6.8 내지 7.8의 pH, 특히 대략 7.4의 pH 및/또는 대략 200 내지 400 밀리오스몰/리터, 바람직하게는 대략 290 내지 310 밀리오스몰/리터의 삼투몰농도를 갖는다. 약제의 pH는 일반적으로, 적당한 유기 또는 무기 완충액, 예를 들면, 바람직하게는 인산염 완충액, 트리스 완충액 (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), HEPES 완충액 ([4-(2-하이드록시에틸)피페라지노]에탄설폰산) 또는 MOPS 완충액 (3-모폴리노-1-프로판설폰산)을 사용하여 조절된다. 일반적으로 각각의 완충액의 선택은 원하는 완충액 몰농도에 따라 달라진다. 인산염 완충액은, 예를 들면, 주사 및 주입 용액에 적당하다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th Edition, 1985 (생리학적으로 허용되는 염 (무기염 또는 유기염)은 특히 p.1418을 참조)].

약제는 임의의 적당한 통상적인 방법으로 투여될 수 있다[예: 경구 투여 형태로 (예: 정제 또는 캡슐), 점막으로 (예: 비강 또는 구강), 피부 아래에 이식된 형태로, 본 발명에 따른 약제를 포함하는 주사, 주입 또는 겔로]. 상기한 바와 같은 특정 질병을 치료하기 위해서 약제를 국부적으로, 경우에 따라, 리포좀 복합체의 형태로 투여하는 것도 추가로 가능하다. 게다가, 시간적으로 조절되는 약제의 방출을 가능하게 하는, 경피 치료 시스템 (TTS)에 의해서 치료를 수행할 수 있다. TTS는, 예를 들면, 유럽 공개특허공보 제0,944,398 A1호, 제0,916,336 A1호, 제0,889,723 A1호 또는 제0,852,493 A1호로부터 알려져 있다.

MGC4504가 작용 부위 (예: 근육, 뇌 또는 췌장 조직)로 표적화되게 하는 방법으로 적당하게 투여가 이루어져야 한다[예: MGC4504 유도체 또는 제형을 원하는 부위로 표적화시키는 전신투여, 또는 MGC4504 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 제형의 국부 (예: 근육내) 투여에 의해서].

주사액은 일반적으로, 상대적으로 적은 양의 용액 또는 현탁액 (예: 약 1 내지 약 20ml)이 신체에 투여되는 경우에만 사용된다. 주입액은 일반적으로, 많은 양의 용액 또는 현탁액 (예: 1리터 이상)이 투여되는 경우에 사용된다. 주입액과 대조적으로, 주사액의 경우에는 수 밀리리터만 투여되기 때문에, 혈액 또는 조직액의 pH 및 삼투압에서의 작은 차이는 중요하지 않고 통증 감각에 대해서만 무의미한 정도로 중요하다. 그러므로 일반적으로 사용전에 본 발명에 따른 약제를 희석시킬 필요는 없다. 그러나, 상대적으로 많은 양을 투여하는 경우에는, 투여 직전에 본 발명에 따른 약제를 적어도 대략적으로 등장액이 얻어지는 정도까지 희석시켜야 한다. 등장액의 예는 0.9% 농도 염화나트륨 용액이다. 주입의 경우에는, 예를 들면, 이른바 우회를 통해서 투여되는 동안에, 예들 들면, 멸균수를 사용하여 희석시킬 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는, MGC4504의 양 또는 활성을 조절하는 단계, 바람직하게는 증가시키는 단계를 포함하는, 탄수화물 또는 지질 대사의 이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 겪고 있거나 질병에 대한 소인이 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

이 방법은, 유효량의 MGC4504 단백질 또는 핵산을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계 또는 MGC4504의 정상상태 수준을 내생적으로 증가시키는 단계를 포함할 수 있다 (예: MGC4504의 양을 증가시킬 수 있는 물질을 원하는 부위에 투여하거나, 적당한 벡터를 사용하여 체세포 유전자 치료에 의해서).

본 발명의 추가의 양태는, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 치료하거나 예방하는데 활성이 있는 물질의 동정을 위한 MGC4504를 이종발현하는 세포의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에 있어서, 세포는 형질전환 세포 (transgenic cell)이다.

본 발명의 또다른 양태에 있어서, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 치료하거나 예방하는데 활성이 있는 물질의 동정을 위해서, MGC4504를 이종발현하는 사람외 형질전환 동물이 사용될 수 있다.

형질전환 세포/동물은 게놈에 정상적인 유전자 세트 외에도 전이유전자 (transgene)를 보유하고 있는 세포/동물이다. 형질전환 세포 및 동물뿐만 아니라 필요한 벡터 구성체의 생산은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고[참조: Gene targeting: A Practical Approach, 2^nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at Oxford University Press, New York; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York; Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Pinkert CA, ed., 1994, Academic Press., New York], 이들의 생산은 몇몇 공급업자 (예: The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)에 의해서 상업적 서비스로서도 제공된다.

본 발명의 다른 양태에 있어서, 전이유전자는 기능성이거나, 기능이 소실 또는 소멸된, MGC4504 또는 이의 단편 또는 유도체일 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 양태에 있어서, 변형되지 않은 상태와 비교하여 MGC4504 활성이 낮은 변형 세포가 사용된다. 이러한 방법으로, 낮아지거나 완전히 없어진 MGC4504 활성을 화학적 화합물이 향상 또는 회복시킬 수 있는지를 시험할 수 있다.

상기 변형은, MGC4504 활성 (즉, 다른 분자와 상호작용할 수 있는 능력, 세포의 인슐린 민감성을 증가시킬 수 있는 능력 등), MGC4504 전사체의 정상상태 수준 (즉, MGC4504 전사의 활성화 또는 전사체의 안정화에 의함) 또는 MGC4504 단백질의 정상상태 수준 (즉, MGC4504 해독의 활성화 또는 해독후 가공에 의함; MGC4504 해독후 변형의 조절에 의하거나, 단백질의 안정화에 의하거나, 단백질 분해의 억제에 의함)을 감소시키는 임의의 유형의 변형 (안정한 또는 일시적인, 바람직하게는 안정한)일 수 있다. 이는, 예를 들면, MGC4504의 우성 음성 돌연변이체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, MGC4504의 RNAi 구성체를 사용함으로써, 기능성 또는 게놈 MGC4504 녹아웃 (예: 유도성일 수 있음)을 생성시킴으로써, 또는 당업계에 알려진 다른 적당한 기술에 의해서 달성될 수 있다[참조: Current protocols in Molecular biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc.; Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press; Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000; Antisense Therapeutics, 1996; Scherr et al, 2003].

본 발명의 또다른 양태에 있어서, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병을 치료하거나 예방하는데 활성이 있는 물질의 동정을 위한, MGC4504 녹아웃 세포 또는 사람외 녹아웃 동물의 용도에 관한 것이다. 녹아웃은 게놈 녹아웃 또는 기능성 녹아웃일 수 있다. 녹아웃을 생성하기 위한 적당한 세포주는 당업계에 잘 알려져 있고, 녹아웃을 생성하기 위한 프로토콜은, 예를 들면, 문헌[참조: Current protocols in Molecular Biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc; 또는 Gene targeting: A Practical Approach, 2^nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at Oxford University Press, New York; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York]에 공개된 것을 포함한다. 게다가, 원하는 유전자의 녹아웃은 상업적인 공급업자 (예: The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)에 의해서 서비스로서 제공된다.

본 발명의 또다른 양태는, 활성 물질의 동정을 위한 상기의 새로운 방법 중의 하나에 따른 방법에 기초한 고효율 스크리닝 (high throughput screen)에 관한 것이다 (이러한 방법은 "분석"이라고도 함).

잠재적인 약제학적 화합물의 유효성에 대한 파라미터로서, 정해진 표적 분자 (이른바 표적, 주로 단백질 또는 핵산)의 활성 또는 농도를 측정하는데 사용되는, 분석적인 방법 또는 분석적인 시스템, 이른바 분석은, 당해 기술분야의 수준에서 잘 알려져 있다. 분석은, 예를 들면, 정해진 공간 및 시간 안에서 반응 혼합물로 조립되는 분리되거나 부분분리된 성분을 사용하는 생화학적 분석 방법 또는 시스템을 포함하고, 이에 의해서 잠재적인 약제학적 화합물의 유효성을 시험할 수 있다. 분석의 다른 예는, 표적 분자의 활성 및 이 활성에 영향을 주는 잠재력의 유효성을 세포내에서 측정할 수 있는, 생화학적 분석 방법 또는 시스템을 포함한다.

분석은, 생물학적 과정을 모니터링하는 임의의 유형의 분석 방법 또는 시스템일 수 있다 (예: 상기 분석 방법 참조). 적당하게는, 생리학적 대사 경로 외에도 병리학적 증상의 일부를 대표하는 분자적 연속단계 및 메커니즘이 세포 또는 생화학적 (시험관내) 시스템에서 재현된다. 따라서 잠재적인 약제학적 화합물의 약리학적 활성은, 이러한 연속단계 또는 메커니즘을 간섭하거나 조절할 수 있는 능력에 따라서 측정될 수 있다.

새로운 약제학적 화합물을 위한 약물 스크리닝, 특히 고효율 스크리닝에서의 사용을 위해서, 분석은 재현가능할 필요가 있고 바람직하게는 또한 규모가 확대될 수 있고 강력하다. 본 발명의 범위에서, 고효율 스크리닝은 본 발명에 따른 방법이 매우 작은 규모로 (예: 수 밀리리터 내지 수 나노리터 이하의 범위의 매우 작은 부피의 샘플로 96, 386 또는 1536웰 플레이트상에서) 수행되는 것을 의미한다. 따라서, 매우 많은 양의 샘플이 짧은 시간에 분석될 수 있다. 고효율 스크리닝은 주로, 단일 분석에 의해서 특정 능력에 대해 대략 500,000개까지의 다양한 화합물을 스크리닝하는 것을 포함한다. 분석은 바람직하게는, 조사 중에 표적 분자의 활성을 조절할 수 있는 능력에 대한 화학 물질의 고효율 스크리닝에 적당하다. 분석의 유형은, 예를 들면, 사용되는 표적 분자의 유형 (예: 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드) 및 "판독 (read out)", 즉, 이에 따라서 표적 분자의 활성이 측정되는 파라미터에 따라 달라진다 (하기 참조).

여러 유형의 분석이 당해 기술분야의 수준에서 일반적으로 알려져 있고 상업적인 공급업자로부터 상업적으로 입수할 수 있다.

여러 목적을 위한 적당한 분석은 방사성 동위원소 또는 형광 분석, 예를 들면, 형광 편광 분석을 포함한다[표지된 것과 표지되지 않은 것의 상호작용 (예: 표지된 단백질 수용체와 표지되지 않은 리간드와의 상호작용)을 측정하기 위함].

보다 많은 예는, 원하는 재조합 단백질을 세포주가 안정하게 (유도성이거나 아님; 염색체 또는 에피솜) 또는 일시적으로 발현하는, 세포 기반 분석을 포함한다. 이들 분석은, 예를 들면, 리포터 유전자 분석을 포함하고, 특정 프로모터 또는 신호 전달 연속단계의 일원의 신호 전달 경로의 조절은 리포터 효소의 활성에 따라서 측정되는 것이며, 리포터 효소의 발현은 상기 특정 프로모터의 조절하에 있다. 이 유형의 분석을 위해서, 재조합 세포주는, 그 자체가 조사되거나, 조사하에서 신호전달 연속단계에 의해 조절되는, 정해진 프로모터의 조절하에 있는 리포터 유전자를 포함하여 제작되어야 한다. 적당한 리포터 효소는 당업계에서 일반적으로 알려져 있고 여러 유형의 루시퍼라제 또는 β-갈락토시다제를 포함한다. 적당한 세포주는 분석의 목적에 따라 달라지지만 형질감염하기 쉽고 배양하기 쉬운 세포주 (예: HEK293, HeLA, COS, CHO, NIH-3T3 등)를 주로 포함한다.

세포내 이온 수준을 측정하기 위한 분석은, 예를 들면, FLIPR (형광측정 이미지 플레이트 판독기, Molecular Devices로부터 상업적으로 입수할 수 있음) 분석을 포함하고, 이 분석에서는 냉각된 CCD 카메라와 결합된 아르곤 레이저 광원을 사용하여 세포[예: 신경 세포 또는 다른 세포 (예: 재조합에 의해서 또는 자연적으로 특정 이온 통로를 발현하는 세포)]내의 일시적인 이온 신호 (예: Ca²⁺ 등)를 384웰 플레이트에서 동시 측정한다. FLIPR 분석은, 예를 들면, 특정 형광색소를 사용하여 세포내 칼슘을 모니터링하거나 막전위의 변화를 검출하거나 특정 FLIPR 분석 키트를 사용하여 막분극을 모니터링할 수 있게 한다. 세포내 다른 이온 (예: 아연 또는 나트륨)의 모니터링을 위해서, 당업계에서 알려진 다른 염료가 사용될 수 있다. 다른 유형의 분석 및 다른 유형의 판독은 당해 기술분야의 숙련자에게 일반적으로 알려져 있다.

cAMP 수준의 측정을 위해서는, 예를 들면, 알파스크린 (ALPHAScreen™), 형광 편광 또는 HTRF 기술이 적당하다.

이온 통로 활성 (예를 들면, 세포내 이온 농도를 조절하고 따라서 세포내 이온 농도의 측정에 사용될 수 있는)의 측정을 위해서, 예를 들면, 막전위 민감성 분석 및 염료가 사용될 수 있다.

GPCR 활성의 측정을 위해서, 예를 들면, cAMP 측정 (예: Packard Bioscience에서 제공하는 알파스크린 cAMP 검출 시스템에 의함), Ca²⁺ 가동화 (mobilization) 분석 또는 리포터 유전자 분석이 적당하다.

단백질 인산화의 측정을 위해서, 예를 들면, 키나제 활성, 형광 편광 분석이 적당하다 (예를 들면, Panvera에서 상업적으로 입수할 수 있음); 게다가 HTRF[균일 시간 분해 형광 (homogeneous time resolved fluorescence), 구입원: Cis Bio], LANCE 분석[구입원: Perkin Elmer Life Science] 또는 증폭된 발광 근접 균일 분석 (amplified luminescence proximity homogeneous assay; Packard BioScience에서 제공하는 알파스크린)이 적절하다. 다른 유형의 분석 및 다른 유형의 "판독"은 당해 기술분야의 수준에서 잘 알려져 있다.

본 발명의 다른 양태의 한가지 바람직한 양태에 있어서, MGC4504, 이의 유도체 또는 단편은 분리된 분자로서 사용될 수 있다.

본 발명의 문맥에서, "분리된 분자"라는 용어는, 특히 MGC4504에 관하여, 천연 재료로부터 정제된 MGC4504 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드뿐만 아니라 정제된 재조합 분자를 의미한다 (이때 정제된이라는 용어는 부분정제뿐만 아니라 완전정제를 포함함).

재조합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드 분자의 제조 및 세포 또는 조직으로부터의 천연 분자의 정제뿐만 아니라, 세포 추출물 또는 조직 추출물의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다 (예: 아래에 열거된 표준문헌 참조).

이들은, 예를 들면, 발표된 게놈 또는 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열에 기초하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해서 원하는 길이의 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 단계 및 그 후 생산된 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에서 클로닝하는 단계를 포함한다 (예: 아래에 열거된 표준문헌 참조).

PCR은 5' 및 3' 근처의 서열이 알려진 뉴클레오타이드 가닥을 갖는 서열 가닥을 특이적으로 증폭할 수 있게 하는 시험관내 기술이다. 선택된 서열의 증폭을 위해서, 짧은 단일 가닥 DNA 분자 ("프라이머")가 사용되고, 이는 증폭될 폴리뉴클레오타이드 서열의 틀을 잡는 서열 가닥에 상보적이다. 폴리뉴클레오타이드 주형은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 주기적으로 반복되는, 정해진 온도 및 시간 간격의 항온처리 단계들로 이루어진 정해진 순서를 선택함으로써, 원하는 폴리뉴클레오타이드가 기하급수적으로 증폭된다.

적당한 프라이머는 잘 알려진 프로토콜에 따라 화학적 합성에 의해서 생성될 수 있다. 이러한 프라이머는 여러 공급업자 (예: MWG Biotech 등)에 의해서 상업적으로 입수할 수도 있다.

DNA 및 RNA 주형 외에 cDNA 주형도 잘 알려진 표준 절차에 의해서 생성될 수 있고 (예: 클로닝 벡터에 의해서 클로닝된 DNA 주형; 배양 세포, 조직 등으로부터의 게놈 DNA 또는 RNA의 제조 또는 이러한 RNA로부터의 cDNA의 제조 등, 아래의 표준문헌 참조), 상업적인 공급업자 (예: Promega 및 Stratagene 등)로부터 구입될 수도 있다. PCR을 수행하기 위한 적당한 완충액 및 효소뿐만 아니라 반응 프로토콜은 당해 기술분야에서 알려져 있고 상업적으로 입수할 수도 있다. 반응 산물은 알려진 절차에 의해서 정제 (예: 겔 정제 또는 칼럼 정제)될 수 있다.

분리된 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 또다른 방법은 원하는 서열을 클로닝하여 표준 방법에 의해서 완전정제 또는 부분정제하는 것이다. 분리된 폴리펩티드를 생성하기 위해서, 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터내로 클로닝하고 적당한 숙주 생물 (바람직하게는 적당한 세균 또는 효모 균주와 같은 단세포 생물)에서 폴리펩티드를 발현시킨 다음에 폴리펩티드를 완전정제 또는 부분정제한다.

본 발명에 따른 방법은, 예를 들면, 생화학 분석 또는 세포 분석으로서 수행될 수 있다.

MGC4504는 본 발명의 여러 양태 중의 하나에 따른 특정 목적을 가능하게 하는 입수가능한 임의의 서열로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, MGC4504는 사람 MGC4504이다.

한가지 바람직한 양태에 있어서, MGC4504는 폴리뉴클레오타이드로서 사용된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는

a. 서열번호 1

b. 낮은, 보통의 또는 높은 엄중성 (stringency) 조건에서 a)에 따른 서열과 하이브리드화 할 수 있고, MGC4504 기능이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 서열;

c. 유전자 암호의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 a) 또는 b)에 따른 서열로부터 유래되고, MGC4504 기능이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 서열;

d. MGC4504 기능이 있는 폴리펩티드를 암호화하고 서열번호 2에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는, a), b) 또는 c)에 따른 서열 중의 하나의 단편;

e. MGC4504 기능이 있는 폴리펩티드를 암호화하고, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 교환에 의해서 a), b), c) 또는 d)에 따른 서열 중의 하나로부터 유래한 서열 (이때 뉴클레오타이드 치환은 유전자 암호의 축퇴성으로 인한 것이 아니거나 단지 이로 인한 것만이 아님)

로 이루어지거나 이를 포함한다.

바람직한 폴리뉴클레오타이드 단편은 서열번호 14에 따른 단편이다.

"엄중성"이라는 용어는 2개의 단일 가닥 핵산 분자의 하이브리드화 또는 어닐링 (annealing)의 특이성에 영향을 주는 반응 조건을 기술한다.

두 핵산 분자의 단일 가닥 형태가 적당한 반응 ("어닐링" 또는 하이브리드화) 조건 (온도 및 주변 매질의 이온 농도에 의존적임)하에서 어닐링하여 새로운 이중 가닥 핵산 분자를 형성할 수 있을 때, 핵산 분자가 또다른 핵산 분자와 하이브리드화할 수 있다. 하이브리드화는 어닐링하는 2개의 핵산 분자가 상보적인 서열을 포함하는 것이 필요하다. 선택된 어닐링 조건, 엄중성 조건에 따라서, 이중 가닥의 형성을 방해하지 않으면서 염기 사이의 불일치 (mismatch)가 가능하다.

엄중성, 및 그에 따른 반응의 특이성은, 특히 반응에서 사용되는 온도 및 완충액 조건에 따라 달라진다: 엄중성, 및 그에 따른 특이성은, 예를 들면, 반응 온도를 증가시키고/시키거나 반응 완충액의 이온 농도를 낮춤으로써 증가될 수 있다. 핵산의 하이브리드화를 위한 적당한 엄중성의 조건은 핵산의 길이, 유형 및 상보성 정도에 따라 달라진다. 변수들은 당해 기술분야의 수준에서 알려져 있다. 어닐링하는 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 높아질수록, 이러한 서열을 갖는 핵산의 하이브리드화 산물의 변성 온도가 높아진다. 핵산 하이브리드화의 상대적인 안정성은 이중 가닥을 형성하는 단일 가닥 핵산의 유형에 따라 달라진다: RNA:RNA>DNA:RNA>DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오타이드 이상인 하이브리드화 산물의 경우, 변성 온도를 계산하는 식이 당해 기술분야에 알려져 있다. 보다 짧은 하이브리드화 산물 (예: 올리고뉴클레오타이드)에 대해서는, 변성 온도의 계산이 길이에 따라서 달라지고, 이때 불일치가 보다 중요해진다.

낮은 엄중성 조건 (및 그에 따른 낮은 반응 및 하이브리드화 특이성)은, 예를 들면, 하이브리드화가 2×SSC 용액에서 실온에서 수행되는 경우에 존재한다. 높은 엄중성 조건은, 예를 들면, 0.1×SSC 및 0.1% SDS 용액에서 68℃에서의 하이브리드화 반응을 포함한다.

본 발명의 문맥에서, "엄중성 조건하에서 하이브리드화"라는 용어는 하이브리드화 반응 및 이후의 세척 절차를 수행하는 조건을 의미하고, 이때 상보성이 적어도 50, 55, 60, 65, 70 및 바람직하게는 75% 이상인 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 하이브리드화되어 남아있는다. 소정의 핵산 세트에 대해서 이러한 조건을 선택하는 것은 보통의 숙련자의 기술내에 있고, 적당한 프로토콜은, 예를 들면, 문헌[참조: "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 to 6.3.6]과 같이 표준 방법에 관한 잘 알려진 문헌에서 찾을 수 있다 (아래에 열거된 문헌 참조).

본 발명의 여러 양태에서 엄중성 조건하의 하이브리드화는 바람직하게는

1) 표지된 프로브를 분석될 핵산 샘플과 65℃에서, 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 경우에는, 올리고뉴클레오타이드 및 샘플로 이루어진 듀플렉스 (duplex)의 어닐링 또는 변성 온도의 5℃ 아래에서 (어닐링 및 변성 온도는 아래에서 동의어인 것으로 이해됨) 하룻밤 동안 50mM 트리스 (pH 7.5), 1M NaCl, 1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 0.5mg/ml 변성된 연어 또는 청어 정자 DNA에서 하이브리드화시키는 단계,

2) 실온에서 10분 동안 2×SSC에서 세척하는 단계,

3) 65℃에서 30분 동안 1×SSC/0.1%SDS에서 (또는 올리고뉴클레오타이드의 경우에는: 어닐링 온도의 5℃ 아래에서) 세척하는 단계 또는

4) 65℃에서 30분 동안 0.1×SSC/0.1% SDS에서 (또는 올리고뉴클레오타이드의 경우에는: 어닐링 온도의 5℃ 아래에서) 세척하는 단계인 것으로 이해된다.

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올리고뉴클레오타이드는, 15 내지 30, 바람직하게는 20 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 폴리뉴클레오타이드이고 바람직하게는 DNA 단편이다. 어닐링 온도는 Tm=2×(A+T의 수)+4×(G+C의 수)℃의 공식에 따라서 결정된다.

2×SSC 또는 0.1×SSC (또는 임의의 다른 종류의 SSC 용액)을 제조하기 위해서, 예를 들면, 20×SSC 용액을 그에 알맞게 희석시킨다. 20×SSC는 3M NaCl/0.3M Na-시트레이트×2H₂O로 이루어진다.

하이브리드화 반응을 수행하기 전에, 전기영동 분리를 수행한 후에[이어서, 서던 블롯 (DNA) 또는 노던 블롯 (RNA)] 또는 전기영동 분리를 하지 않고서 (이어서, 슬롯 (slot) 또는 점 (dot) 블롯) 원하는 경우에는, 폴리뉴클레오타이드를 적당한 막 (예: 나일론 또는 니트로셀룰로스 막)으로 이동시킨다. 하이브리드화는 적당하게 표지된 프로브를 사용하여 수행한다. 적당한 표지 기술은, 예를 들면, 방사성 표지 또는 형광 염료를 사용한 표지이다. 프로브는, 본래 단일 가닥이거나 보통 이중 가닥인데 변성에 의해서 단일 가닥으로 만들어진, 단일 가닥 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드이다. 이 프로브는 염기 사이의 결합에 의해서 DNA 또는 RNA 샘플 (역시 단일 가닥 상태임)에 결합한다.

본 발명의 여러 양태의 바람직한 양태에 있어서, 엄중성 조건은 높은 엄중성 조건이다.

또다른 양태에 있어서, MGC4504는 폴리펩티드로서 사용된다. 바람직하게는 폴리펩티드는 다음의 서열 중의 하나에 의해서 암호화된다:

a. 서열번호 1;

b. 낮은, 보통의 또는 높은 엄중성 조건에서 a)에 따른 서열과 하이브리드화 할 수 있고, MGC4504 기능이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 서열;

c. 유전자 암호의 축퇴성으로 인해서 a) 또는 b)에 따른 서열로부터 유래되고, MGC4504 기능이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 서열;

d. MGC4504 기능이 있는 폴리펩티드를 암호화하는, a), b) 또는 c)에 따른 서열 중의 하나의 단편 또는

e. MGC4504 기능이 있는 폴리펩티드를 암호화하고, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 교환에 의해서 a), b), c) 또는 d)에 따른 서열 중의 하나로부터 유래한 서열 (이때 뉴클레오타이드 치환은 유전자 암호의 축퇴성으로 인한 것이 아니거나 단지 이로 인한 것만이 아님).

또다른 바람직한 양태에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2에 따른 한 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.

탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병은 바람직하게는 글루코스 대사의 기능이상, 비만, 이상지질혈증 (dislipidemia) 또는 대사 증후군 또는 당뇨병 또는 인슐린 작용의 임의의 다른 기능이상이고, 보다 바람직하게는 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성이다.

아래에서, 여러 실시예에 의해 본 발명이 보다 상세히 설명되지만, 이러한 실시예에 의해 한정하려는 의도가 아니다.

표 1:

마른 인슐린 민감성 대조군 및 비만인 인슐린 내성 또는 당뇨병 ZDF 래트의 융합 복제물에서 MGC4504 유전자 발현의 어피메트릭스 유전자 칩 (Affymetrix Gene Chip^®) 분석.

표 2:

마른 인슐린 민감성 대조군 및 비만인 인슐린 내성 또는 당뇨병 ZDF 래트로부터 얻은 RNA 샘플의 정량적 실시간 PCR.

표 3:

식이 유도된 (diet-induced) 제2형 당뇨병 모델에서 MGC4504 유전자 발현의 어피메트릭스 유전자 칩 분석.

도 1:

여러 사람 조직 중에서 선택된 서브세트에서의 MGC4504 유전자 발현 수준.

도 2:

L6GLUT4myc 근육모세포에서의 HA-MGC4504의 안정적 발현.

도 3:

일시적으로 형질감염된 L6GLUT4myc (도 3A) 및 RIN-5F (도 3B) 세포의 세포질 및 핵에서의 MGC4504의 세포내 분포.

도 4:

도 4A: 2-데옥시글루코스 흡수 분석 및 L6GLUT4myc HA-MGC4504 세포의 인슐린 민감성의 증가.

도 4B: 인슐린 분비 분석 및 RIN-5F HA-MGC4504 세포의 기본적 및 글루코스 자극된 인슐린 분비의 증가.

도 5:

가용성 GST-MGC4504 단백질의 발현 및 정제 동안에 획득된 여러 샘플의 쿠마시 (Coomassie) 염색.

도 6:

도 6A: 일시적인 96웰 형식 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석에서 여러 세포주에서의 MGC4504 5'-UTR 위치 -4311/+1의 활성.

도 6B: HEK293 세포에서의 일시적인 96웰 형식 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석에서 여러 절두된 (truncated) 상이한 프로모터 단편의 분석에 의한 MGC4504 5'-UTR 위치 -4311/+1내의 MGC4504 코어 프로모터의 실험적 측정.

도 7:

사람 MGC4504의 암호화 서열 (서열번호 1)

도 8:

사람 MGC4504의 유래된 아미노산 서열 (서열번호 2)

도 9:

사람 MGC4504의 게놈 서열 (서열번호 3)

도 10:

래트 MGC4504 mRNA의 특이적 증폭을 위한 프라이머 (서열번호 4 및 5)

도 11:

래트 β-액틴 mRNA의 특이적 증폭을 위한 프라이머 (서열번호 6 및 7)

도 12:

사람 MGC4504 mRNA의 특이적 증폭을 위한 프라이머 (서열번호 8 및 9) 및 사람 MGC4504 mRNA의 특이적 하이브리드화를 위한 프로브 (서열번호 10)

도 13:

cDNA로부터 사람 MGC4504 ORF를 클로닝하기 위한 프라이머 (서열번호 11 내지 13)

도 14:

암호화 서열을 포함하는 사람 MGC4504 cDNA 서열의 단편 (서열번호 14)

실시예 1:

인슐린 내성 및 제2형 당뇨병의 생체내 모델에서의 MGC4504의 유전자 발현

재료 및 방법

동물 및 샘플 제조:

나이가 일치하는 비만인 수컷 Zucker Diabetic Fatty(ZDF) 래트(Gmi, fa/fa) 및 마른 한배 새끼(Gmi, +/?)의 그룹을 구입원[Genetic Models]로부터 구입하였다. 도착하자마자 1주일 동안 4% 지방, 64% 탄수화물 및 19% 단백질을 포함하는 표준 래트 식이[구입원: Altromin, Germany] 및 물을 자유롭게 섭취하게 하면서 12시간의 밤낮 사이클로 20℃에서 두 마리씩 래트를 사육하여 운송으로부터 회복되게 하였다. 모든 실험 절차는 독일 동물보호법에 따라 수행되었다. 2시간 동안 절식시킨 후에, 이소플루란 마취하에서 혈액 샘플을 채취하고 경추 탈골에 의해서 희생시켰다. 유전자 발현 분석을 위해서 사용된 동물의 총 마리수는 34 마리였다(6주령[n=12 마리], 7주령[n=12마리] 및 12주령[n=10마리]). 신속히 조직 시료를 절단하여 즉시 액체 질소에 넣어 동결시킨 후 -80℃에서 보관하였다.

어피메트릭스 유전자 칩 분석:

유전자 발현의 모니터링를 위한 올리고뉴클레오타이드 어레이의 일반적인 사용은 미국특허 제6,177,248호에 기술되었다. 실제적인 본 응용에서, 사용된 마이크로 어레이는 대략 8000개의 알려진 유전자 및 EST 군을 나타내는 데옥시뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 각각의 유전자 또는 EST 서열은 20쌍 이하의 올리고뉴클레오타이드에 의해 나타나있고, 각각의 쌍은 전사체의 절편과 일치하는 하나의 올리고 및 중심에 위치한 1bp 불일치를 포함하는 대조군 올리고로 이루어진다. 래트의 경우, 알려진 유전자 또는 EST 서열의 데이터베이스로부터 유래된, 대략 총 24000개의 유전자 및 EST 서열을 나타내는 3개의 어레이(RG U34A, RG U34B 및 RG U34C)는 구입원[Affymetrix, Santa Clara, CA, US]에 의해 제공된다. UltraTurrax 파쇄기[구입원: Janke and Kunkel IKA Labortechnik]를 사용하여 Qiagen RLT 완충액에 150mg의 골격근 시료(대둔근)를 용해시켰다. 프로테이나제 K 분해, DNase 분해 및 추가적인 RNeasy 정화 단계를 포함하는 Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 제조업자(Qiagen)가 권장하는 바와 같이 조직 용해물로부터 전체 RNA를 분리하였다. SuperScript SSII RT 폴리머라제 시스템[구입원: Invitrogen] 및 T7 RNA 폴리머라제 프로모터와 올리고(데옥시티미딘)₂₄를 연결하는 T7(dT)₂₄ 프라이머를 사용하여 10㎍의 각각의 전체 RNA로 첫번째 및 두번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 이중 가닥 cDNA를 페놀-클로로포름 추출하고 이어서 에탄올 침전시키고 RNAse가 없는 물 12㎕에 재현탁시켰다. 엔조 바이오어레이 고수율 RNA 전사체 표지화 키트(Enzo BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit)[구입원: Enzo Diagnostics]를 사용하여 시험관내에서 비오틴-UPT 및 비오틴-CTP 표지된 cRNA를 전사시키고 RNeasy 정화 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. UV 분광광도법, 아가로스 겔 전기영동 및 생분석기(BioAnalyzer) RNA 칩[구입원: Agilent]으로 각각의 정제 단계 전후에 모든 전체 RNA 및 cRNA의 일정부분을 모니터링하였다. 15㎍의 cRNA 샘플을 94℃에서 35분 동안 40mM 트리스/아세테이트 pH 8.1, 100mM KOAc 및 30mM MgOAc에서 단편화시키고 하이브리드화 완충액에 첨가시킨 후 어피메트릭스 유전자 칩 RG-U34 A, B 및 C 마이크로 어레이에 16시간 동안 45℃ 및 60rpm에서 하이브리드화시켰다. 마이크로 어레이를 세척하고 스트렙타비딘-피코에리트린 접합체[구입원: Molecular Probes], 항 스트렙타비딘 항체로 이중염색하고 스트렙타비딘-피코에리트린 접합체로 다시 염색하여 구입원[Affymetrix]에 의해 기술된 방법론에 따라 신호의 세기를 향상시켰다. 세척 후에 공초점 진어레이 스캐너(GeneArray Scanner)[구입원: HP]에서 마이크로 어레이 슈트 버젼 4.0(Micro array Suite Version 4.0) 소프트웨어로 마이크로 어레이를 분석하였다. 각각의 칩의 품질관리는 어피메트릭스 품질 기준에 따라 수행하였고, 이는 하우스키핑 유전자(house keeping gene)인 β-액틴 및 GAPDH의 평균 차이, 원 세기(raw intensity) 및 3'/5' 비율을 포함한다. 발현 프로파일링 데이터는 사내 소트트웨어 툴(GECKO 2)을 사용하여 분석하였고, 이는 각각의 그룹에 대한 기준 칩 및 중앙값의 제75백분위수를 사용하여 모든 마이크로 어레이에 대하여 전체 정규화를 수행하였다. 차별적으로 발현되는 유전자를 결정하기 위한 기준은, 발현 수준이 2배 이상으로 변화하는 것이었으며, p-값 < 0.05이었다. RGU-34 A 상에서 어피메트릭스 수정자 RC_AI170665_AT를 사용하여 마른 인슐린 민감성 대조군 및 비만인 인슐린 내성(또는 12주령 그룹으로서 이미 당뇨병 존재) ZDF 래트의 모든 융합 복제물간의 MGC4504 유전자 발현의 배수 변화를 분석하였다. 이들 분석의 결과는 표 1에 요약되어 있다.

마른 인슐린 민감성 대조군과 비교하여, 비만인 인슐린 내성 및 당뇨병 ZDF 래트에서, 골격근 생검으로부터 분리된 RNA의 어피메트릭스 유전자 칩 분석에 의해서 현저하게 낮은 수준의 MGC4504 유전자 발현 수준이 검출될 수 있었다. 이는 인슐린 내성 및 제2형 당뇨병이 MGC4504의 유전자 발현 수준의 감소와 관련되어 있음 을 나타낸다.

정량적 실시간 PCR:

6 및 7주령 그룹(n=24 마리)의 각각의 래트로부터 분리된 1㎍의 전체 RNA를 20㎕의 반응 부피에서 AMV-RT 첫번째 가닥 cDNA 합성 키트[구입원: Roche]로 역전사시켰다. 2㎕의 역전사된 단일 가닥 cDNA를 주형으로서 사용하여 제조업자의 사용설명서에 따라 FastStart DNA Master Sybr Green[구입원: Roche]을 사용하여 라이트사이클러(LightCycler^?)[구입원: Roche Diagnostics GmbH]에서 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 5'-ACTTCGCCTCCTTCTCTGCTCTCC-3'(서열번호 4, 5' 래트 MGC4504) 및 5'-GGCCCTGCTAATCCCACACTACC-3'(서열번호 5, 3' 래트 MGC4504), 5'-AAGTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3'(서열번호 6, 5' 래트 β-액틴) 및 5'-CCTCAACACCTCAAACCACTCC-3'(서열번호 7, 3' 래트 β-액틴)이었다. 생성되는 단편의 정확한 크기(각각 156 및 268 염기쌍)는 아가로스 겔 전기영동에 의해서 모니터링되었다. 각각의 증폭된 단편의 농도 표준 곡선을 사용하여 전체 RNA 함량을 계산하고, 하우스키핑 유전자인 β-액틴의 발현 수준에 대해 정규화하였으며, 표 2에 마른 인슐린 민감성 대조군과 비만의 인슐린 내성 ZDF 래트간의 MGC4504 유전자 발현의 배수 변화로서 요약되어 있다.

마른 인슐린 민감성 대조군과 비교하여, 비만인 인슐린 내성 및 당뇨병 ZDF 래트에서, 골격근 생검으로부터 분리된 RNA의 정량적 실시간 PCR 분석에 의해서 현저하게 낮은 수준의 MGC4504 유전자 발현 수준이 검출될 수 있었다. 이는 인슐린 내성 및 제2형 당뇨병이 MGC4504의 유전자 발현 수준의 감소와 관련되어 있음을 나타낸다.

실시예 2:

사람 조직에서의 MGC4504의 유전자 발현

재료 및 방법

사람 조직에서의 MGC4504 유전자 발현의 TaqMan 분석:

다양한 사람 조직에서의 MGC4504 발현 수준은 프라이머 5'-GGCAGGGAGACACCTTCCAT-3'(5' 사람 MGC4504, 서열번호 8) 및 5'-TGCAGCCCTCATGATCTTCA-3'(3' 사람 MGC4504, 서열번호 9) 및 프로브 5'-GCTGCCCCGATGGAA-3'(서열번호 10)를 사용하여 TaqMan 분석에 의해서 측정하였다. 모든 값은 사람 β-2-마이크로글로불린 발현 수준에 대해 정규화하여 동량의 로딩(loading)에 대해 표준화하였다. 도 1에는 시험된 여러 사람 조직 중에서 선택된 서브세트에서의 MGC4504 유전자 발현 수준이 요약되어 있다.

TaqMan 분석으로 뇌, 골격근, 췌장 및 신장의 여러 부분에서 가장 높은 MGC4504 발현이 검출됨이 밝혀졌다. 이는 MGC4504 발현이 거의 근육 및 췌장에 한정됨을 나타낸다.

실시예 3:

MGC4504 과발현이 글루코스 대사 및 인슐린 분비에 미치는 효과

재료 및 방법

클로닝 및 플라스미드:

사람 MGC4504의 완전한 ORF는 5'-프라이머 MGC4504-5': 5'-CGGGATCCCGCATGAAGCAGGAGTCTGCAGCC-3'(서열번호 11) 또는 HA-MGC4504-5': 5'-CGGGATCCCGCATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGAAGCAGGAGTCTGCAGCC-3'(서열번호 12) 및 MGC4504-3'-종료: 5'-CCGGAATTCCGGTCACACCAGCGCCAGAGCCTG-3'(서열번호 13)을 사용하여 PCR에 의해서 사람 골격근 cDNA로부터 증폭시켰다. 두번째 5' 프라이머는 아미노 말단 프레임내 HA 에피토프 태그를 암호화하는 서열을 도입시켰다. 생성되는 단편을, BamHI/EcoRI을 통해서 또는 BamHI(5') 및 평활말단화된(3') EcoRI(삽입체) 및 NotI(벡터) 부위를 통해서 pGEX-6P1 및 pcDNA3.1(+) hygro 벡터[구입원: Invitrogen]내로 클로닝하여 각각 pGEX-6P1 MGC4504 또는 pcDNA3.1(+) hygro HA-MGC4504를 수득하였다. 모든 구성체의 동일성은 서열분석에 의해서 확인되었다.

세포 배양, 형질감염 및 면역형광:

myc 에피토프 태그된 GLUT4를 발현하는 래트 L6GLUT4myc 근육모세포를 A. Klip[The Hospital for Sick Children, Toronto, Ontario, Canada]으로부터 제공받았다. L6(ATCC 번호: CRL-1458) 및 L6GLUT4myc를, 10% FCS gold[구입원: PAA, 제품번호 A 15-609], 페니실린/스트렙토마이신 용액[구입원: PAA, 제품번호 P11-010]이 보충된 Glutamax[구입원: Gibco, 제품번호 32571]가 있는 alpha-MEM에서 배양하였다. L6GLUT4myc 배지에 2㎍/ml 블라스티시딘[구입원: Calbiochem, 제품번호 203350]을 추가적으로 보충하여 GLUT4myc 발현에 대해 선별하였다. RIN-5F 래트 인슐린종 세포(insulinoma cell; ATCC 번호: CRL-2058)를, 10% FCS gold[구입원: PAA, 제품번호 A15-609], 페니실린/스트렙토마이신 용액[구입원: PAA, 제품번호 P11-010] 및 1mM 나트륨 피루베이트[구입원: Gibco, 제품번호 11360-039]가 보충된 HEPES/L-글루타민/NaHCO₃[구입원: GIBCO, 제품번호 52400-025]가 있는 RPMI 1640에서 유지하였다. HEK293 세포(ATCC 번호: CRL-1573)를, 10% FCS gold[구입원: PAA, 제품번호 A 15-609], 페니실린/스트렙토마이신 용액[구입원: PAA, 제품번호 P11-010] 및 1mM L-글루타민[구입원: Gibco, 제품번호 25030-032]이 보충된 DMEM[구입원: GIBCO, 제품번호 41965-039]에서 배양하였다. 모든 세포주는 37℃, 5% CO₂ 및 습도 95%에서 배양하였고 1주일에 두번 계대배양하였다. 단백질 발현 연구를 위해서, 6웰 플레이트에서 60% 컨플루언시(confluency)로 성장한 L6GLUT4myc 또는 RIN-5F 세포, 2.5㎍ 플라스미드 DNA 및 Fugene 6 시약[구입원: Roche]을 사용하여 제조업자가 권장하는 바와 같이 형질감염을 수행하였다. 모든 일시적인 형질감염 또는 안정하게 선별된 세포 클론에서, pcDNA3.1(+) hygro 공벡터는 음성대조군의 역할을 하였다(WT 세포라고 함). 500㎍/ml 하이그로마이신 B를 사용하여 안정한 세포 클론을 선별하고, 내성 단일 세포 클론을 직접 골라내어 확장시켰다. 항 HA 3F10 단일클론[구입원: Roche] 및 항 래트 고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) 이차 항체 및 ECL 화학발광 검출[구입원: Amersham]을 사용하여 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯(NuPAGE, 구입원: Invitrogen)에 의해 HA-MGC4504 발현 수준을 측정하였다. 안정한 L6GLUT4myc 또는 RIN-5F HA-MGC4504 세포, 즉 pcDNA3.1(+) HA-MGC4504로 일시적으로 형질감염되어 덮개유리 상에서 70% 컨플루언시로 성장한 L6GLUT4myc 또는 RIN-5F 세포를 사용하여 기술된 바와 같이[참조: Voss et al, 2001] 면역형광 분석을 수행하였다. 항-HA 3F10 항체[구입원: Roche] 및 항-래트 alexa fluor 488 항체[구입원: Molecular Probes]를 사용하여 HA-MGC4504 발현을 모니터링하였다. PBS 중의 1μM ToPro iodide[구입원: Molecular Probes]를 사용하여 핵을 가시화하였다. Leica TCS SP2 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 얻었다. 도 2에는 L6GLUT4myc 근육모세포에서의 HA-MGC4504의 안정적 발현이 나타나있다. 도 3에는 일시적으로 형질감염된 L6GLUT4myc(도 3A) 및 RIN-5F(도 3B) 세포의 세포질 및 핵에서의 MGC4504의 세포내 분포를 나타냈다.

MGC4504 cDNA는 쉽게 형질감염되어 래트 근육모세포 및 인슐린종 세포에서 HA 에피토프 태그된 MGC4504 단백질이 발현될 수 있으며 세포질 및 주로 핵에 위치된다.

2-데옥시글루코스 흡수 및 인슐린 분비 분석:

L6GLUT4myc 세포 또는 L6GLUT4myc HA-MGC4504 및 WT 세포 클론을 96웰 사이토스타 티(Cytostar-T™) 섬광 마이크로 플레이트[구입원: Amersham]에서 웰 1개당 4.0×10⁴개의 생존 세포로 평판배양하였다. 32시간 후, 2% 신생 송아지 혈청[구입원: PAA] 및 페니실린/스트렙토마이신 용액[구입원: PAA, 제품번호 P11-010]이 보충된 alpha-MEM으로 세포를 16시간 동안 무혈청 배양하였다. 글루코스 흡수를 분석하기 위해서, Krebs-Ringer 완충액 pH 7.3(KRB)에서 세포를 두번 세척하고 소정의 KRB 중의 인슐린 농도로 25분 동안 배양하였다. ¹⁴C 2-데옥시글루코스(웰 1개당 0.3 μCi)를 첨가하고 웰 1개당 전체 부피 150㎕로 세포를 25분 동안 더 배양하였다. 40μM 사이토칼라신 B를 첨가함으로써 흡수를 중지시키고 밀봉하여 왈락 마이크로 β 계수기(Wallac micro beta counter)[구입원: Perkin Elmer]에서 섬광을 측정하였다. 20μM 사이토칼라신 B를 사용해서 대조군 웰을 배양하여 비특이적 흡수를 측정하고 이를 각각의 값으로부터 뺐다. 인슐린 분비를 모니터링하기 위해서, RIN-5F 세포 또는 RIN-5F HA-MGC4504 및 WT 세포 클론을 12웰 플레이트에 평판배양하여 24시간 동안 성장하게 하였다. 2% 신생 송아지 혈청[구입원: PAA] 및 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 보충된 alpha-MEM으로 16시간 동안 무혈청 배양한 후에, KRB에서 세포를 두번 세척하고 글루코스의 양을 다르게 하여(0 내지 20mM) KRB에서 2시간 동안 배양하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 래트 인슐린 ELISA[구입원: Mercodia]를 사용하여 상청액의 인슐린 함량을 측정하고, 세포를 추가로 용해시켜 단백질 함량을 측정하여 부하량이 비슷함을 확인하였다. 도 4A에는 일반적인 2-데옥시글루코스 흡수 분석 및 L6GLUT4myc HA-MGC4504 세포의 인슐린 민감성의 증가를 나타냈다. 도 4B에는 일반적인 인슐린 분비 분석 및 RIN-5F HA-MGC4504 세포의 기본적 및 글루코스 자극된 인슐린 분비의 증가를 나타냈다. MGC4504의 과발현으로 인해서 근육 세포주에서 인슐린 민감성이 증가하고 인슐린 자극된 글루코스 흡수가 증가했을뿐만 아니라 인슐린종 세포주에서는 글루코스 자극된 인슐린 분비도 증가했으므로, 이들 결과는 MGC4504 발현이 인슐린 민감성 및 글루코스 처리뿐만 아니라 인슐린 분비와 연관됨을 나타낸다.

실시예 4:

가용성 재조합 MGC4504 융합 단백질의 재조합 발현

이. 콜라이 균주 BL21DE3 세균[구입원: Invitrogen]을 pGEX-6P1 공벡터 또는 pGEX-6P1 MGC4504로 형질전환시켜 LB에서 성장하게 하고, OD₆₀₀ 0.6에서 0.1mM IPTG로 유발시키고 4시간 동안 성장하게 하였다. 세포를 용해시켜 구입원[Amersham]에서 제공한 GST-마이크로 스핀 칼럼 표준 프로토콜에 따라 GST 친화도 크로마토그래피에 의해서 정제하고, SDS PAGE 및 항-GST 항체[구입원: Amersham]를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해서 GST 및 GST-MGC4504 단백질의 발현을 모니터링하였다. 도 5에는 가용성 GST-MGC4504 단백질의 여러 발현 및 정제 단계를 나타냈고, 이는 재조합 가용성 MGC4504 단백질을 이. 콜라이 발현 시스템에서 쉽게 수득할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5:

MGC4504 발현을 조절하는 화합물의 측정을 위한 HTS 처리가능한 분석

재료 및 방법

뉴클레오타이드 -4311 내지 +1(전사 개시점에 상대적으로)(게놈 서열 AC020661에서 뉴클레오타이드 84361번 내지 88681번)을 포함하는 사람 MGC4504의 5'UTR을 PCR로 증폭시키고 XhoI 및 BglII를 통해서 pGL3neo basic내로 클로닝하여 pGL3neo basic MGC4504 -4311/+1이 생성되었다. pGL3neo basic MGC4504 -4311/+1을 BfrBI, XhoI 또는 AvrII로 분해시키고, 그 후에 클레노우 평활화 및 BglII 분해에 의해서 추가로 절두된 구성체가 생성되었다. 생성되는 단편을 KpnI 분해된, 클레노우 평활화된 그리고 그 후에 BglII 분해된 pGL3neo basic 벡터에 연결시켜 pGL3neo basic MGC4504 -1944/+1, -847/+1 및 -546/+1 플라스미드를 수득하였다. 모든 구성체의 동일성은 서열분석에 의해서 확인되었다. RIN-5F 래트 인슐린종 세포를, 10% FCS gold[구입원: PAA, 제품번호 A15-609], 페니실린/스트렙토마이신 용액[구입원: PAA, 제품번호 P11-010] 및 1mM 나트륨 피루베이트[구입원: Gibco, 제품번호 11360-039]가 보충된 HEPES/L-글루타민/NaHCO₃[구입원: GIBCO, 제품번호 52400-025]가 있는 RPMI 1640에서 배양하였다. HEK293 세포를, 10% FCS gold[구입원: PAA, 제품번호 A 15-609], 페니실린/스트렙토마이신 용액[구입원: PAA, 제품번호 P11-010] 및 1mM L-글루타민[구입원: Gibco, 제품번호 25030-032]이 보충된 DMEM[구입원: GIBCO, 제품번호 41965-039]에서 배양하였다. 모든 세포주는 37℃, 5% CO₂ 및 습도 95%에서 배양하였고 1주일에 두번 계대배양하였다. RIN-5F 세포를, 96웰 미세역가 플레이트[구입원: Corning Costar, 제품번호 3610]에서 Fugene6[구입원: Roche]을 사용하고, pGL3.1neo basic 공벡터 또는 프로모터 구성체 pGL3.1neo basic MGC4504-5'-UTR -4311/+1, -1944/+1, -847/+1 또는 -546/+1의 양을 다르게 하여, 운반체로서 1ng pCMV-RL[구입원: Promega] 및 0.4ng pBluescript-SK+[구입원: Stratagene]로 일시적으로 형질감염시켰다. HEK 세포는 Polyfect[구입원: Qiagen]를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염은 제조업자의 프로토콜에 따라서 수행하였다. pGL3.1neo basic 구성체의 농도를 웰 1개당 플라스미드 10ng(HEK) 및 40ng(RIN5F)으로 최적화시켜 최대 리포터 활성을 얻었다. 형질감염을 위해서 사용된 모든 플라스미드를 제조업자의 프로토콜에 따라 Qiagen Endofree MaxiPrep 키트를 사용하여 분리하였다. 48시간 후에, 세포를 용해시키고, 반딧불이(firefly) 및 레닐라(renilla) 루시퍼라제 활성을, 왈락 마이크로 β 계수기(Wallac microbeta counter)[구입원: Perkin Elmer]에서 각각의 활성을 측정함으로써 제조업자의 프로토콜에 따라 측정하였다(Promega Dual-luciferase System). 반딧불이 루시퍼라제 값을 레닐라 루시퍼라제 활성에 대해 정규화시키고 pGL3.1neo basic 공벡터 대조군을 기준으로 배수 유발로서 그래프에 나타내었다. pGL3.1neo basic MGC4504-5'-UTR -4311/+1을 사용하여 안정한 HEK293 세포주가 생성되었고 500㎍/ml 제네티신[구입원: Gibco]으로 선별하여 루시퍼라제 활성에 대한 양성 클론이 선별되었다. 생성되는 HEK MGC4504 5'-UTR -4311/+1 세포를 96웰 미세역가 플레이트[구입원: Corning Costar, 제품번호 3610]에서 평판배양하고 24시간 동안 성장하게 하였다. 화합물을 DMSO 중의 10mM의 농도로 용해시키고 2% Ultroser[구입원: Biosepra, 제품번호 12039-012], 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액[구입원: Invitrogen, 제품번호 15140-122] 및 2mM L-글루타민[구입원: Invitrogen, 제품번호 25030-024]이 보충된 DMEM 배지[구입원: Invitrogen, 제품번호 41965-039] 중의 각각의 작용 농도(10μM 내지 100pM)로 희석시켰다. MGC4504 프로모터 구성체의 프로모터/전사 활성을 조절할 수 있는 화합물에 대해 분석을 하기 위해서, 배지를 세포로부터 흡인시킬 수 있고, 예를 들면, 희석된 각각의 화합물을 포함하는 100㎕의 배지를 직접 첨가할 수 있다. 예를 들면, 48시간 배양 후에, 상기한 바와 같이 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정할 수 있다. 원데이터를 엑셀 파일로 이동시키고 각각의 웰에 대하여 반딧불이/레닐라 활성의 비율을 측정할 수 있다. 제조업자(IDBS)의 프로토콜에 따라 XL-Fit 소프트웨어에서 용량/활성 관계를 측정할 수 있다. 도 6에는 일시적인 96웰 형식 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석에서 여러 세포주에서의 MGC4504 5'-UTR 위치 -4311/+1의 활성이 나타나있다. 이들 결과는 자연적으로 발현되는 MGC4504의 패턴을 반영하는 세포주에서의 신호 대 소음 비율이 충분한 HTS 처리가능한 리포터 유전자 분석에서 MGC4504 프로모터 활성이 분석될 수 있음을 나타낸다.

게다가, MGC4504에 필요한 최소 프로모터가 MGC4504 5'-UTR 위치 -546/+1 내에 포함되어 있다.

실시예 6:

MGC4504 단백질 활성에 양성으로 영향을 주는/자극하는 물질의 능력을 시험하는 가설적, HTS 처리가능한 세포 분석

MGC4504 단백질 활성을 분석하기 위해서, MGC4504를 약하게 발현(내생적 발현 또는 이종발현)하고 인슐린 민감성이 약하거나 보통인 세포를 사용하여, 세포를 시험 물질과 접촉시켜 인슐린 민감성이 조절(즉, 증가 또는 감소)되는지의 여부를 시험하는 본 발명에 따른 방법 중의 하나가 수행될 수 있을 것이다. 하나 이상의 음성대조군 세포를 사용하여, 물질이 인슐린 민감성을 조절하는 것은 상기 세포에 존재하는 MGC4504 양의 조절(전사체 또는 단백질 수준에서)에 의한 것이 아니라 MGC4504 단백질 활성의 조절에 의한 것임을 확인한다.

pCDNA3.1 + hygro HA-MGC4504에서와 같이 SV40과 같은 프로모터(또는 보다 약한 프로모터)의 조절하에 있는 서열번호 1에 따른 MGC4504를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 표준 절차에 따라 세포주(예: HEK293)를 안정적으로 형질감염시킨다. 대조군으로서, 동일한 프로모터의 조절하에 있는 레닐라 루시퍼라제(예: pCDNA3.1 루시퍼라제)와 같은 리포터 유전자를 포함하는 동일한 발현 벡터를 사용하여 동일한 세포주(예: HEK293)를 안정적으로 형질감염시킨다. 시험 물질과 함께 두 세포를 배양한 후에, 시험 물질이 존재 및 부재하에 표준 절차에 따라 두 세포에 대해 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 측정한다. 대조군 세포에 대해서, 시험 물질이 존재 및 부재하에 표준 절차에 의해 또한 루시퍼라제 활성을 측정한다. MGC4504를 발현하는 세포에서 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 증가시킬 수 있고 MGC4504를 발현하지 않는 대조군 세포의 루시퍼라제 활성 또는 인슐린 민감성을 증가시키지 않는 물질은 MGC4504 활성을 증가시킨다고 생각될 수 있다.

실시예 7

식이 유도된 제2형 당뇨병 모델에서의 MGC4504의 유전자 발현

재료 및 방법

동물 및 샘플 준비:

나이가 일치하는 암컷 Zucker Diabetic Fatty(ZDF) 래트(Gmi, fa/fa)를 구입원[Genetic Models]로부터 구입하였다. 물 및 고지방 식이[구입원: Research Diets, USA]를 자유롭게 섭취하게 하면서 12시간의 밤낮 사이클로 20℃에서 몇 주 동안 동시에 3마리씩 래트를 사육하였다. 모든 실험 절차는 독일 동물보호법에 따라 수행되었다. 고지방 식이로 사육된 동물을 2개의 하위군으로 분류할 수 있었다: 비응답동물 그룹은 제2형 당뇨병 상태가 나타나지 않았지만(혈당<<12mM), 응답동물 그룹(혈당>12mM)은 나타났다. 응답동물 그룹 중 7마리 및 비응답동물 그룹 중 6마리를 이소플루란으로 마취시키고 경추 탈골에 의해서 희생시켰다. 신속히 췌장 샘플을 절단하여 RNAlater로 이동시키고 -80℃에서 장기간 보관하였다.

두 가지를 예외를 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 같이 어피메트릭스 유전자 칩 분석 및 RNA 분리를 수행하였다: RNA를 제조하는 동안에 프로테이나제 K 분해를 수행하지 않았고 하이브리드화는 약 28000개 래트 유전자를 나타내는 RAE 230_2 어레이를 사용하여 수행되었다. 하이브리드화를 위해서, 분리된 RNA를 각각의 그룹(비응답동물 및 응답동물)에 대한 2개의 풀에 동시에 결합시켰다. Resolver 4.0[구입원: Rosetta Inc, USA]을 사용하여 소프트웨어 제작자의 사용설명서에 따라 데이터 분석을 수행하였다.

차별적으로 발현되는 유전자를 결정하기 위한 기준은, 발현 수준이 1.5배 이상으로 변화하는 것이었으며, p-값 < 0.001이었다. RAE 230_2 상에서 어피메트릭스 수정자 1389573_at를 사용하여 비응답동물 및 응답동물 그룹간의 MGC4504의 유전자 발현의 배수 변화를 분석하였다. 이 분석 결과는 표 3에 요약되어 있다.

비응답동물과 비교하여, 제2형 당뇨병이 나타나는 응답동물 그룹에서, 췌장 생검으로부터 분리된 RNA의 어피메트릭스 유전자 칩 분석에 의해서 현저하게 낮은 수준의 MGC4504 유전자 발현 수준이 검출될 수 있었다. 이는 고지방 식이로 인한 제2형 당뇨병의 발병이 MGC4504 유전자 발현 수준의 감소와 관련되어 있음을 나타낸다.

문헌

Voss, M.D., Hille, A., Barth, S., Spurk, A., Hennrich, F., Holzer, D., Mueller-Lantzsch, N., Kremmer, E., Grasser, F.A. (2001) J. Virol 75, 11781-90

표준 실험 방법에 대한 문헌

달리 지시되어 있지 않으면, 표준 실험 방법은 다음의 표준 문헌에서 공개된 절차이거나 이에 따라서 수행될 수 있다:

Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp;

Current Protocols in Molecular Biology; 정기적으로 개정됨, 예: Volume 2000; Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.

Current Protocols in Human Genetics; 정기적으로 개정됨; Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J. G. Seigman, Douglas R. Smith.

Current Protocols in Protein Science; 정기적으로 개정됨; Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.

Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994;

Short Protocols in Molecular Biology, 5th edition, by Frederick M. Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J.G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), October 2002, John Wiley & Sons, Inc., New York;

Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, editor; Academic Press Inc., San Diego, California, 1994 (ISBN: 0125571658)

Gene targeting: A Practical Approach, 2^nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at Oxford University Press, New York;

Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York;

<110> Sanofi-Aventis <120> Use of MGC4504 <130> DE 2005/008 <150> EP 05005383.4 <151> 2005-03-11 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1528 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcacgaggc aggccaggtg tgtgcgtccg tcggtctttc cgtgcccacg ccggagacca 60 gccccggagg ccgcctgggc ctatccctgt gccaggcacc atgaagcagg agtctgcagc 120 cccgaacacc ccgcccacct cgcagtcccc tacgccgtcc gctcagttcc cccgaaacga 180 cggcgaccct caagcgctgt ggattttcgg gtacggctcc ctggtgtgga ggcccgactt 240 cgcctacagc gacagccgtg tgggcttcgt gcgcggctac agccgccgtt tctggcaggg 300 agacaccttc catcggggca gcgacaagat gcctggccgt gtggtgacgc tccttgaaga 360 tcatgagggc tgcacttggg gcgtggcata ccaagtgcaa ggggagcagg taagcaaggc 420 cctgaagtac ctgaatgtgc gagaggcagt gcttggtggc tacgatacca aggaggtcac 480 cttctatccc caagatgctc ctgaccaacc actgaaggca ttggcctatg tggccacccc 540 acagaaccct ggttacctgg gccctgcgcc tgaagaggcc attgccacgc agatcctggc 600 ctgccggggc ttctccggcc acaaccttga atacttgctg cgtctggcag acttcatgca 660 gctctgtggg cctcaggcgc aggacgagca cctggcagcc 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Claims

a. MGC4504 단백질을 시험 물질과 접촉시키는 단계 및

b. 상기 시험 물질이 상기 MGC4504 단백질의 활성을 증가 또는 감소시키는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하고,

MGC4504 단백질의 활성을 증가시키는 물질이 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질인, 상기 질병을 예방 또는 치료하는데 활성인 물질을 동정하는 방법.
a. MGC4504의 활성 또는 양이 감소된 세포를 시험 물질과 접촉시키는 단계 및

b. 상기 시험 물질이, 세포에 존재하는 상기 MGC4504의 활성 또는 양을 증가시킬 수 있는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하고,

MCG4504의 활성 또는 양을 증가시키는 물질이 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질인, 상기 질병을 예방 또는 치료하는데 활성인 물질을 동정하는 방법.
a. 전사 활성 시스템에서, MGC4504 단백질 또는 췌장 베타 세포로부터 인슐린 분비를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 흡수를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 처리를 증가시킬 수 있는 MGC4504 단백질의 기능성 단편을 암호화하는 핵산을 시험 물질과 접촉시키는 단계;

b. 상기 시험 물질의 존재하에, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 mRNA의 양을 측정하는 단계;

c. 상기 시험 물질의 부재하에, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 mRNA의 양을 측정하는 단계 및

d. 상기 시험 물질이, 상기 시스템에 존재하는 MGC4504 mRNA의 양을 증가 또는 감소시킬 수 있는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하고,

MGC4504 mRNA의 양을 증가시키는 물질이 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질인, 상기 질병을 예방 또는 치료하는데 활성인 물질을 동정하는 방법.
a. 해독 활성 시스템에서, MGC4504 단백질 또는 췌장 베타 세포로부터 인슐린 분비를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 흡수를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 처리를 증가시킬 수 있는 MGC4504 단백질의 기능성 단편을 암호화하는 핵산을 시험 물질과 접촉시키는 단계;

b. 상기 시험 물질의 존재하에, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질 또는 이의 기능성 단편의 양을 측정하는 단계;

c. 상기 시험 물질의 부재하에, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질 또는 이의 기능성 단편의 양을 측정하는 단계 및

d. 상기 시험 물질이, 상기 시스템에 존재하는 상기 MGC4504 단백질 또는 이의 기능성 단편의 양을 증가 또는 감소시킬 수 있는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하고,

MGC4504 단백질의 양을 증가시키는 물질이 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질인, 상기 질병을 예방 또는 치료하는데 활성인 물질을 동정하는 방법.
a. 리포터 유전자 또는 이의 기능성 단편에 작동가능하게 연결된 MGC4505 프로모터 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 핵산 벡터로 형질감염된 세포를 제공하는 단계;

b. 기능성 MGC4504 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않은 리포터 유전자 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 대조군 벡터로 형질감염된 세포를 제공하는 단계;

c. 시험 물질의 존재하에 a) 및 b) 단계에 따른 세포의 상기 리포터 유전자 활성을 측정하는 단계 및

d. 상기 시험 물질의 부재하에 상기 리포터 유전자 활성을 측정하는 단계를 포함하고,

활성 물질이 b) 단계의 리포터 유전자 활성은 증가시키지 않으면서 a) 단계에 따른 리포터 유전자 활성은 증가시킬 수 있는 물질인, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성을 예방하거나 치료하는데 활성이 있는 물질을 동정하는 방법.
탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성 또는 이러한 질병에 대한 소인을 동정하기 위해 개체의 분리된 샘플에 존재하는 MGC4504의 양을 분석하는 단계를 포함하여, 상기 개체의 분리된 샘플에서 MGC4504의 양의 감소를 검출하는 방법.
탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성 또는 이러한 질병에 대한 소인을 동정하기 위해 MGC4504의 기준 서열과 비교하여 MGC4504의 돌연변이에 대해서 개체의 분리된 샘플을 분석하는 단계를 포함하여, 상기 개체의 분리된 샘플에서 MGC4504 돌연변이의 존재를 검출하는 방법.
탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성 또는 이러한 질병에 대한 소인을 동정하기 위해 기준 샘플과 비교하여 MGC4504 활성의 손실 또는 감소에 대해 개체의 분리된 샘플을 분석하는 단계를 포함하여, 상기 개체의 분리된 샘플에서 MGC4504 활성의 손실 또는 감소를 검출하는 방법.
하나 이상의 MGC4504 검출 수단을 포함하는, 탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성 또는 이러한 질병에 대한 소인의 동정을 위한 키트.
탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성의 치료 또는 예방을 위한 투약 조절을 위해 기준 서열과 비교하여 MGC4504의 돌연변이에 대해서 또는 기준 샘플과 비교하여 MGC4504의 양 또는 활성의 감소에 대해서 개체의 분리된 샘플을 분석하는 단계를 포함하여, 상기 개체의 분리된 샘플에서 MGC4504의 돌연변이 또는 MGC4504의 양 또는 활성의 감소를 검출하는 방법.
탄수화물 또는 지질 대사의 기능이상과 관련되거나 이에 의해서 발생하는 질병인 대사 증후군, 비만, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 인슐린 내성의 치료 또는 예방을 위한, MGC4504 단백질, 췌장 베타 세포로부터 인슐린 분비를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 흡수를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 처리를 증가시킬 수 있는 MGC4504 단백질의 기능성 단편, 세포-투과 포스포펩티드에 연결된 MGC4504 단백질 또는 이의 기능성 단편의 유도체, 상기 MGC4504 단백질 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산, 또는 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 변형된 핵산인 상기 핵산의 유도체를 포함하는 약제학적 조성물.
서열번호 8 또는 9에 따른 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머.
서열번호 10에 따른 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 프로브.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 기재된 방법에 기초한 고효율 스크리닝 (HTS) 방법.
제1항, 제3항 및 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 MGC4504 또는 이의 기능성 단편이 분리된 분자로서 사용되는 방법.
제14항에 있어서, 상기 MGC4504 또는 이의 기능성 단편이 분리된 분자로서 사용되는 방법.
제1항, 제3항 및 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 MGC4504 또는 이의 기능성 단편이 생화학 분석 또는 세포 분석에서 사용되는 방법.
제14항에 있어서, 상기 MGC4504 또는 이의 기능성 단편이 생화학 분석 또는 세포 분석에서 사용되는 방법.
제17항에 있어서, 분석이 세포 분석이고, 세포가 MGC4504를 이종발현하도록 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염되는 방법.
제18항에 있어서, 분석이 세포 분석이고, 세포가 MGC4504를 이종발현하도록 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 방법.
제20항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 방법.
제21항에 있어서, 상기 세포가 설치류의 세포인 방법.
제22항에 있어서, 상기 세포가 설치류의 세포인 방법.
제21항에 있어서, 상기 세포가 사람 세포 또는 마우스 세포인 방법.
제22항에 있어서, 상기 세포가 사람 세포 또는 마우스 세포인 방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 MGC4504가 포유류 MGC4504인 방법.
제14항에 있어서, 상기 MGC4504가 포유류 MGC4504인 방법.
제3항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 1 또는 14에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 1 또는 14에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 방법.
제2항, 제4항, 제6항 및 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 MGC4504 또는 이의 기능성 단편이 단백질 또는 폴리펩티드인 방법.
제14항에 있어서, 상기 MGC4504 또는 이의 기능성 단편이 단백질 또는 폴리펩티드인 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호 1 또는 14에 따른 서열에 의해 암호화되는 방법.
제31항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 단백질이 서열번호 1 또는 14에 따른 서열에 의해 암호화되는 방법.
제32항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 단백질이 서열번호 1 또는 14에 따른 서열에 의해 암호화되는 방법.
제31항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 서열번호 2에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 방법.
제32항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 서열번호 2에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 단백질이 서열번호 2에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 서열번호 2에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 서열번호 2에 따른 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 레닐라 (renilla) 또는 반딧불이 루시퍼라제, 녹색 또는 청색 형광 단백질, β-갈락토시다제 또는 클로람페니콜-아세틸-트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자인 방법.
제2항 또는 제5항에 있어서, 상기 세포가 일차세포이거나 세포주에 속하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 세포가 HEK293, RIN-5F, CHO 또는 NIH3T3 세포인 방법.
제25항에 있어서, 상기 세포가 사람외 형질전환 동물로부터 분리되는 방법.
제26항에 있어서, 상기 세포가 사람외 형질전환 동물로부터 분리되는 방법.
제5항에 있어서, 상기 형질감염이 일시적인 또는 안정한 형질감염인 방법.
제6항에 있어서, 특이적인 MGC4504 핵산 프로브, 또는 MGC4504 또는 췌장 베타 세포로부터 인슐린 분비를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 흡수를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 처리를 증가시킬 수 있는 MGC4504의 기능성 단편의 cDNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트가 MGC4504를 검출하거나 MGC4504 mRNA 또는 MGC4504 mRNA 수준을 분석하는데 사용되는 방법.
제6항에 있어서, MGC4504에 특이적인 항체가 MGC4504를 검출하거나 MGC4504 단백질 또는 MGC4504 단백질 수준을 특이적으로 분석하는데 사용되는 방법.
제7항에 있어서, 핵산 프로브 또는 MGC4504 핵산을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트가 MGC4504 핵산에 있는 돌연변이를 검출하는데 사용되는 방법.
제7항에 있어서, MGC4504에 대해 특이적인 항체가 MGC4504 단백질에 있는 돌연변이를 검출하는데 사용되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 수단이 MGC4504 mRNA 또는 게놈 DNA를 특이적으로 분석하는 수단이고, 특이적인 MGC4504 핵산 프로브 또는 MGC4504 또는 췌장 베타 세포로부터 인슐린 분비를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 흡수를 증가시키거나 인슐린-자극된 글루코스 처리를 증가시킬 수 있는 MGC4504의 기능성 단편의 게놈 DNA 또는 cDNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 키트.
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