BRPI0609209A2 - uso de mgc4504 - Google Patents

Abstract

USO DE MGC4504. A invenção refere-se ao uso da proteína M0C4504, de um derivado ou fragmento funcional da mesma, ou de um código de ácido nucléico para a referida proteína, derivado ou fragmento, para a identificação de substâncias ativas na prevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE MGC4504".

A presente invenção refere-se ao uso de MGC4504 para aidentificação de substâncias farmacêuticas. Características adicionais dapresente invenção referem-se a métodos para a identificação das referidassubstâncias e o uso de MGC4504 para o preparação de um medicamento.

O diabetes mellitus é uma disfunção freqüente do sistemaendócrino. O termo diabetes compreende formas diferentes de disfunçõesdo metabolismo da glicose e de lipídios que possuem em comum a ausênciarelativa ou absoluta de insulina, além de comprometimento da ação dainsulina. O diabetes mellitus tipo 1 é um quadro em que ocorre a destruiçãodas células beta-pancreáticas, mediada pelo sistema imunológico doindivíduo, resultando em deficiência de insulina e hiperglicemia. A formamais comum, o diabetes mellitus tipo 2, é caracterizada por defeitos naregulação do metabolismo de lipídeos e de glicose, associados à obesidade,resistência à insulina e a síndrome metabólica. O desenvolvimento dodiabetes tipo 2 é inicialmente associado à resistência à insulina, porémacompanhada de normoglicemia e secreção pancreática normal de insulina.A progressão da doença é associada à hiperglicemia e perda da massacelular beta-pancreática que resulta finalmente na deficiência de insulina ehiperglicemia. Com mais de 6% da população Norte-americana sofrendo dediabetes (isto é, mais de 18 milhões de pessoas em 2004) e previsõesfuturas de um número cada vez maior em todo o mundo, é preciso serenfrentado o aumento crescente da população de pacientes diabéticos, cujaqualidade de vida é seriamente afetada. Além disso, o diabetes traz consigouma carga sócio-econômica enorme decorrente do alto custo direto eindireto que ele acarreta.

Há, portanto, uma grande necessidade de substânciasfarmacêuticas inovadoras que visem a prevenção e/ou o tratamento dedoenças associadas ou provocadas pelo diabetes.

Dessa forma, o objetivo da presente invenção é prover meiosinovadores para a identificação de substâncias ativas na prevenção e/outratamento do diabetes.

Esse objetivo pode ser atingido pelo uso da proteína MGC4504,um derivado ou fragmento funcional da mesma, ou um código de ácidonucléico para a referida proteína, derivado ou fragmento, utilizado para aidentificação de substâncias ativas na prevenção ou tratamento de umadoença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismo daglicose ou de lipídios.

A presente invenção tem como base resultados dos inventoresque, pela primeira vez, fornecem evidências da implicação da MGC4504(Q9BUX1) nos processos patológicos subjacentes ao diabetes,especialmente o diabetes mellitus tipo 2. Até esta data, não haviaconhecimento de uma possível implicação da MGC4504 em condições dodiabetes, associadas ou provocadas por comprometimento do metabolismode carboidratos ou de lipídios. Ao revelarem que os níveis de expressão daMGC4504 estão diminuídos em um modelo de animal de resistência àinsulina e de diabetes tipo 2 e fornecendo evidência experimental de que umaumento de expressão da MGC4504 leva à elevação da sensibilidadecelular à insulina, os inventores demonstraram pela primeira vez aimplicação funcional da MGC4504 nesse quadro fisiológico. Dessa forma,deverá ser considerado o fato de que substâncias capazes de modular aatividade da MGC4504 exerçam um impacto fundamental sobre o estadopatológico e progressão de doenças, associadas ou provocadas pordisfunções desses mecanismos.

A MGC4504 (registro Q9BUX1 no banco de dados trEMBL) éuma proteína formada por 222 aminoácidos contendo um suposto domíniosemelhante ao Chac (aa 32-208), porém sem domínios transmembrana, deacordo com previsões padrões de seqüências. A seqüência de aminoácidosda MGC4504 é altamente preservada entre seres humanos, rato ecamundongo (identificação de 85% dos aminoácidos). Até esta data, não foiatribuída qualquer função molecular à MGC4504 na literatura.

O locus genético da MGC4504 está situado no cromossomo 15.A seqüência genômica da MGC4504 encontra-se à disposição pública nobanco de dados de nucleotídeos do NCBI em: AC_020661 (SEQ ID NO 3).O código da seqüência de polinucleotídeos da MGC4504 pode serencontrado sob o seguinte número de registro no banco de dados denucleotídeos do NCBI: NM_024111 (Identificação de seqüência ne1). Aseqüência da proteína derivada pode ser encontrada sob o mesmo númerode registro no banco de dados de nucleotídeos do NCBI: NM_024111(Identificação de seqüência n92). O NCBI é o Centro Nacional paraInformação Biotecnológica (endereço para correspondência: National Centrefor Biotechnology Information, National Libray of Medicine, Building 38A,Bethesda, MD 20894, EUA, endereço na Internet: www.ncbi.nhm.nih.gov).

O uso de acordo com a presente invenção possibilita aidentificação de substâncias inovadoras para a prevenção e/ou tratamentode doenças associadas com comprometimento do metabolismo de glicoseou de lipídios. O uso de acordo com a presente invenção compreende aidentificação de substâncias com as características desejadas, bem como acaracterização posterior de substâncias já identificadas como úteis para aprevenção e/ou tratamento de doenças associadas com comprometimentodo metabolismo de glicose ou de lipídios (isto é, o uso de acordo com apresente invenção é útil para, por exemplo, a seleção de compostos, bemcomo para a identificação de perfis de compostos).

Uma substância a ser empregada para as diferentescaracterísticas da presente invenção pode ser qualquer substância biológicaou química ou extrato de produto natural, seja purificada, parcialmentepurificada, sintetizada ou produzida por meio de processos bioquímicos oubiomoleculares.

Uma substância considerada como ativa na prevenção outratamento de uma doença associada ou provocada por uma disfunçao dometabolismo de carboidratos ou de lipídios, no contexto das diferentescaracterísticas da presente invenção, pode ser qualquer substância queexerça a influência de uma das funções da MGC4504 ou sobre a quantidadeou nível do estado de equilíbrio da MGC4504 em uma célula ou sobre aexpressão da MGC4504.Para esse fim, a substância pode modular qualquer uma dasfunções da MGC4504(como, por exemplo, aquelas definidas abaixo). Aatividade da proteína MGC4504 pode ser modulada pela substância por, porexemplo, interação direta e interferência da proteína/polipeptídeo MGC4504ou fragmentos destes. A substância pode também modular a expressão daMGC4504 sobre, por exemplo, o nível de transcrição (iniciação,alongamento, processamento, etc.) e a estabilidade e tradução do transcrito.Ademais, ela pode modular a modificação pós-translacional, enovelamentoprotéico, etc. da MGC4504. A substância pode exercer os efeitos acimadireta ou indiretamente (indiretamente significando por interferência (positivaou negativa) nas cascatas de sinalização naturais que têm influência sobre afunção / atividade protéica / expressão, etc, da MGC4504). Além disso, asubstância pode mimetizar também a atividade da MGC4504 (isto é, assumira sua função / papel).

Um fragmento da MGC4504 pode ser qualquer polipeptídeo oupolinucleotídeo que seja mais curto do que o tipo natural correspondente,por exemplo, mais curto do que a MGC4504 do homo sapiens (hs), deacordo com o polipeptídeo da SEQ ID NO 2 ou um dos polinucleotídeos deacordo com a SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 3 ou Ne 14.

Um derivado da MGC4504 ou de um fragmento da MGC4504pode ser qualquer modificação de um polinucleotídeo ou polipeptídeo daMGC4504, ou um fragmento destes. Derivados compreendem, por exemplo,modificações da seqüência de aminoacidos ou de nucleotídeos, ou qualqueroutro tipo de modificação, como, por exemplo, uma modificação química oubiológica que leve à estabilização do polipeptídeo ou polinucleotídeo (comomodificações envolvendo fosforotioato ou outros tipos de modificações dacadeia principal do ácido nucléico ou de trocas das ligações entreaminoacidos, etc), ou ainda que possibilite que certas células tornem-se oalvo específico do polipeptídeo ou polinucleotídeo ou que facilitem suaentrada ou absorção por células (como células permeáveis a fosfopeptídeos,acoplamento orto de células permeáveis a vetores peptídicos, por exemplo,com base no complexo antennapedia/penetratin, TAT e seqüênciasbaseadas em peptídeo sinal ou acoplamento a partes de ligantes decarreadores ou transportadores).

Um fragmento funcional da MGC4504 é qualquer fragmento(seja polipeptídeo ou nucleotídeo) que exiba pelo menos uma das funçõesda MGC4504.

O termo "derivado funcional" da MGC4504 compreendequalquer modificação da MGC4504, em relação à forma que ocorrenaturalmente (seja polipeptídeo ou polinucleotídeo), que possua pelo menosuma das funções da MGC4504. A presente invenção compreende tambémderivados funcionais de fragmentos da MGC4504.

As funções da MGC4504 compreendem a capacidade demelhorar / aumentar a liberação de insulina das células beta-pancreáticas,melhorar /aumentar a disponibilidade de glicose, estimulada pela insulina(por exemplo, por meio de absorção de glicose, síntese de glicogênio esensibilidade à insulina), influenciar vias de sinalização celular, por exemplo,mas sem restrição, sinalização da insulina ou ação da insulina (por exemplo,fosforilação da Akt, translocação de GLUT4, ativação de aPKC, ativação decascatas de sinalização secundárias que levam à melhora da absorção deglicose). As funções da MGC4504 compreendem também geralmente acapacidade da MGC4504 (proteína ou ácido nucléico), ou fragmentos damesma, de interagir com outras moléculas (compreendendo, mas semrestrição, proteínas, ácidos nucléicos, moléculas sintéticas) e que, depreferência, envolvam a capacidade de aumentar a absorção de glicoseestimulada pela insulina.

Uma característica da presente invenção refere-se a um métodopara identificação de substâncias ativas na prevenção ou tratamento de umadoença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismo decarboidratos ou de lipídios compreendendo:

a. O contato de uma proteína MGC4504 com uma substânciaem teste; e

b. A determinação se a substância modula a atividade daproteína MGC4504.O termo "atividade da MGC4504" refere-se à atividade protéicada proteína MGC4504, de polipeptídeos ou fragmentos da mesma (porexemplo, uma daquelas envolvidas nas funções definidas acima).

Em que uma substância capaz de modular a atividade daMGC4504 é uma substância considerada ativa na prevenção ou tratamentode uma doença associada ou provocada por uma disfunçao do metabolismode carboidratos ou de lipídeos no contexto da presente invenção.

O processo pode ser um ensaio bioquímico utilizando MGC4504isolada ou extratos compreendendo MGC4504 ou pode ser um ensaiocelular.

A modulação pode ser uma modulação positiva ou negativa daatividade da MGC4504 e que compreenda a ativação (completa ou parcial)(isto é, aumento de atividade), bem como a inativação (completa ou parcial)da atividade da proteína MGC4504. De acordo com a modalidade preferidadas diferentes características da presente invenção, a modulação daMGC4504 é uma ativação (isto é, aumento de atividade).

Uma substância em teste pode ser qualquer uma dassubstâncias conforme definidas acima.

Outra característica da presente invenção refere-se a ummétodo para identificação de substâncias ativas na prevenção ou tratamentode uma doença associada ou provocada por uma disfunçao do metabolismode carboidratos ou de lipídios compreendendo:

a. O contato de uma célula que tenha uma quantidade ouatividade diminuída da MGC4504 com uma substância em teste.

b. A determinação se a substância em teste é capaz deaumentar a quantidade ou atividade da MGC4504, presente na célula.

Em que a substância, capaz de detectar aumentos daquantidade ou atividade da MGC4504, é considerada uma substância ativana prevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada poruma disfunçao do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos.

De acordo com uma modalidade preferida, a substância é capazde restaurar completamente a quantidade ou atividade da MGC4504.Uma célula que tenha quantidade ou atividade de MGC4504diminuída pode ser qualquer célula que tenha uma quantidade ou atividadedetectável da MGC4504 inferior (isto é, decorrente da expressão de umaproteína mutante MGC4504 que tenha um nível mais baixo de função ou deexpressão, etc.) quando comparadas as de uma célula de referência, porexemplo, uma célula com atividade total da MGC4504 (como, por exemplo,HEK293). Ela pode ser também uma célula completamente desprovida deMGC4504 ou de atividade de MGC4504 (por exemplo, decorrente da perdada expressão de função da proteína mutante MGC4504 ou decorrente deuma ausência completa de expressão da MGC4504). Elas compreendemcélulas que possuem estas características naturalmente, bem como célulasgeneticamente modificadas para exibir estas características, como, porexemplo, células knockout genômico ou induzido para MGC4504, bem comocélulas que expressam um mutante dominante negativo para MGC4504, etc.

Uma outra característica ainda da presente invenção refere-se aum processo para identificação de substâncias ativas na prevenção outratamento de uma doença associada ou provocada por uma disfunção dometabolismo de carboidratos ou de lipídios compreendendo:

a. O contacto de um ácido nucléico que codifica a proteínaMGC4504, derivado ou fragmento da mesma, com uma substância em testeem sistema com atividade transcricional.

b. A determinação da quantidade de mRNA que codifica aproteína MGC4504, um derivado ou fragmento da mesma, presente noreferido sistema em presença da referida substância.

c. A determinação da quantidade de mRNA que codifica aproteína MGC4504, um derivado ou fragmento da mesma, presente noreferido sistema na ausência da referida substância.

d. A determinação se a substância é capaz de modular aquantidade do mRNA da MGC4504, presente no referido sistema.

Em que a substância, capaz de modular e de preferênciaaumentar a quantidade de mRNA de MGC4504 presente no referidosistema, é considerada uma substância ativa na prevenção ou tratamento deuma doença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismo decarboidratos ou de lipídeos.

Um sistema com atividade transcricional é qualquer sistemabioquímico ou celular que seja capaz pelo menos de efetuar uma reação detranscrição de uma unidade de transcrição. Estes sistemas são bemconhecidos na técnica e compreendem células (por exemplo, cepas oulinhagens celulares habitualmente utilizadas em laboratório, bem comoculturas primárias de células eucarióticas ou de procarióticas), bem comosistemas ou kits de transcrição in vitro (por exemplo, tendo como baseextratos celulares), também estão disponíveis no mercado.

A determinação da quantidade de mRNA presente no sistemapode ser efetuada de acordo com técnicas bem conhecidas no estado datécnica (por exemplo, marcação direta do produto por meio de marcaçãoradioativa ou fluorescente ou detecção do produto pelo uso de iniciadores ousondas específicas, etc).

Outra característica da presente invenção refere-se a ummétodo para identificação de substâncias ativas na prevenção ou tratamentode uma doença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismode carboidratos ou de lipídios compreendendo:

a. O contacto de um ácido nucléico que codifica a proteínaMGC4504, um derivado ou fragmento da mesma, com uma substância emum sistema com atividade transcricional.

b. A determinação da quantidade da proteína MGC4504, de umderivado ou fragmento da mesma, presente no referido sistema em presençada referida substância.

c. A determinação da quantidade da proteína MGC4504, de umderivado ou fragmento da mesma, presente no referido sistema na ausênciada referida substância.

d. A determinação se a substância é capaz de modular aquantidade da proteína MGC4504, de um derivado ou fragmento, presenteno referido sistema.

Em que a substância, capaz de modular e, de preferência,aumentar a quantidade da proteína MGC4504, de um derivado ou fragmentopresente no referido sistema, é considerada uma substância ativa naprevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada por umadisfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos.

Um sistema com atividade transcricional é qualquer sistemabioquímico ou celular que seja capaz pelo menos de efetuar uma reação detranscrição de uma unidade de transcrição. Estes sistemas são bemconhecidos na técnica e compreendem células (por exemplo, cepas oulinhagens celulares usualmente utilizadas em laboratório, bem como culturasprimárias de células eucarióticas ou de procarióticas), bem como sistemasde tradução in vitro (que também estão disponíveis no mercado, porexemplo, sob a forma de kits). Para a tradução de um polipeptídeo, opolipeptídeo é subclonado em um vetor adequado, seguido pela expressãodo polipeptídeo em tampões e extratos celulares adequados (por exemplo,lisado de reticulócitos). Os vetores, reagentes e protocolos necessários quetenham as condições adequadas são conhecidos na técnica e disponíveis nomercado.

No contexto da presente invenção, o termo "polipeptídeo" refere-se a uma molécula compreendendo aminoácidos ligados entre si porligações peptídicas e que contenha pelo menos 10 aminoácidos acopladosuns aos outros de modo linear. Moléculas mais curtas desse tipo sãoreferidas como peptídeos. O termo "proteína" refere-se a moléculascompreendendo pelo menos uma cadeia de polipeptídeos, porém pode sereferir também a moléculas compreendendo duas ou mais cadeias depolipeptídeos associadas ou ligadas entre si. Dessa forma, o termo"proteína" compreende o termo "polipeptídeo".

A detecção da proteína MCG4504, presente no referido sistemapode ser conduzida de acordo com técnicas bem conhecidas na arte (porexemplo, marcação direta radioativa ou fluorescente do traduzido ou oemprego de anticorpos específicos, marcação da proteína e detecção damarcação, etc).

Outra característica da presente invenção refere-se a ummétodo para identificação de substâncias ativas na prevenção ou tratamentode uma doença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismode carboidratos ou de lipídios compreendendo:

a. O fornecimento de uma célula transfectada com um vetor deácido nucléico, compreendendo o promotor da MGC4504 ou um fragmentofuncional da mesma, operacionalmente acoplado a um gene repórter ou aum fragmento funcional do mesmo;

b. O fornecimento de uma célula transfectada com um vetor decontrole que compreende um gene repórter, ou fragmento funcional domesmo, o qual não está sendo operacionalmente acoplado a um promotorfuncional da MGC4504;

c. A determinação da atividade do gene repórter da célula, deacordo com a) e b), na ausência de uma substância;

d. A determinação da atividade do gene repórter na presença dareferida substância;

Em que uma substância capaz de aumentar significativamente aatividade do gene, de acordo com a), sem aumentar significativamente aatividade do gene repórter de b) (isto é, capaz de aumentarsignificativamente a atividade do promotor da MGC4504)é considerada umasubstância ativa na prevenção ou tratamento de uma doença associada ouprovocada por uma disfunção do metabolismo de carboidratos ou delipídeos.

Um aumento significante é qualquer aumento acima do desviopadrão, de preferência pelo menos duas vezes tão alto quanto o desviopadrão.

A característica acima da presente invenção tem como base umensaio típico de gene repórter, comumente conhecido na técnica. Para estefim, o promotor de escolha é inserido em um vetor de expressão adequadopara o tipo de célula hospedeira escolhida, em posição acima daquela dogene repórter de escolha de maneira a permitir uma expressão do generepórter, se o promotor estiver ativo. A construção é subseqüentementeintroduzida na célula hospedeira de escolha. Processos adequados paratransformação ou transfecção são bem conhecidos na técnica, bem comocondições para cultivo de células e detecção de expressão de gene repórter(consultar, por exemplo, a literatura padrão listada abaixo). Condiçõesadequadas são bem conhecidas na técnica, bem como vetores, genesrepórter e reagentes necessários, os quais são disponíveis no mercado.

Um vetor é uma molécula circular ou linear de polipeptídeos, porexemplo, plasmídeo de DNA, bacteriófago ou cosmídeo, com auxílio do qualfragmentos de polipeptídeos (por exemplo, retirados de outros vetores ouamplificados por PCR e inseridos no vetor de clonagem) podem serespecificamente amplificados em células ou organismos adequados. Vetoresde expressão possibilitam a expressão heteróloga de um gene de interesse(por exemplo, um gene repórter), na célula ou organismo hospedeiro. O tipode célula ou de organismo depende em grande parte do objetivo e daescolha que fazem parte do conhecimento do artesão especializado.Organismos adequados para amplificação de um ácido nucléico são, porexemplo, a maioria dos organismos unicelulares com taxas altas deproliferação, como por exemplo, bactérias ou leveduras. Organismosadequados podem também ser células isoladas, cultivadas em tecidosmulticelulares, como, por exemplo, linhagens celulares geradas de diferentesorganismos (por exemplo, células SF9 da Spodoptera Frugiperda, etc.)Vetores adequados para clonagem são conhecidos na técnica e estãodisponíveis no mercado em fornecedores diversos de biotecnologia, como,por exemplo, Roche Diagnostics, New England Biolabs, Promega,Strategene e muitos outros. Linhagens celulares adequadas estãodisponíveis no mercado, por exemplo, aquelas procedentes da coleção decultura America Type Culture Collection (ATCC).

Para a expressão heteróloga de uma proteína ou polipeptídeo, acélula pode ser qualquer célula procariotica ou eucariótica capaz de sertransfectada com um vetor de ácido nucléico e de expressar o gene deinteresse, por exemplo, um gene repórter. Elas compreendemprincipalmente células primárias ou células provenientes de uma culturacelular, de preferência de uma cultura de célula eucariótica, compreendendocélulas derivadas de organismos e tecidos multicelulares (como, célulasHEK293, RIN-5F, HeLA, CHO, COS, SF9 ou células 3T3) ou de organismosunicelulares, como levedura (por exemplo, S. pombe ou S. cerevisiae), ou deuma cultura de células procarióticas, de preferência de Pichia ou E. Coli. Ascélulas e amostras derivadas de tecido podem ser obtidas por técnicas bemconhecidas, como coleta de sangue, punção de tecidos ou técnicascirúrgicas.

No contexto da presente invenção, o termo "transfecção" refere-se à introdução de um vetor de ácido nucléico em uma célula hospedeira(procariótica ou eucariótica) e compreende, dessa forma, o termo"transformação".

A transfecção pode ser uma transfecção estável ou transitória.

O promotor da MGC4504 faz parte do gene da MGC4504 écapaz de levar à expressão de um produto genético de interesse seintroduzido em um local ascendente adequado do vetor de expressão daseqüência que codifica o produto genético. De preferência, o promotor daMGC4504 compreende ou consiste na seqüência, de acordo com osnucleotídeos 84361 - 88681 da seqüência de acordo com a SEQ ID NO 3/número de acesso do NCBI AC020661 (nucleotídeos 84361 - 88681,correspondentes às posições de nucleotídeos -4377 / +1). Um fragmentofuncional do promotor da MGC4504 é qualquer fragmento do promotor daMGC4504 capaz de levar à expressão de um produto genético de interessese introduzido em um local ascendente adequado do vetor de expressão daseqüência que codifica o produto genético. Fragmentos de preferênciacompreendem fragmentos funcionais do promotor da MGC4504, de acordocom nucleotídeos 84361 - 88681 da SEQ ID NO 3.

Um gene repórter poder ser qualquer gene que possibilita umaquantificação fácil de seu produto genético. Uma ampla variedade de genesrepórteres para hospedeiros eucarióticos ou procarióticos, bem comoprocessos de detecção e reagentes necessários são conhecidos na técnicae disponíveis no mercado. Eles compreendem, por exemplo, os genes dabeta-Lactamase (lacZ), Luciferase, proteína fluorescente Verde ou Azul(GFP ou BFP), DsRed, HIS3, URA3, TRP1 ou LEU2 ou beta Galactosidase.Estes genes codificam proteínas que podem ser facilmente detectadas pormeio de uma reação visível (colorida ou luminescente) (por exemplo, lacZ,Luciferase). Estes produtos genéticos compreendidos podem ser facilmentedetectados por meio de uma reação visível (colorida ou luminescente) ouresistência conferida pelos produtos genéticos a antibióticos, comoAmpicilina ou Canamicina, quando expressados. Outros produtos do generepórter possibilitam que a expressão celular aumente sob certas condições,como por exemplo, genes auxotróficos.

Um fragmento funcional de um gene repórter é qualquerfragmento de um gene repórter específico que permita uma fácilquantificação de seu produto genético.

Dentro do contexto da característica acima da presenteinvenção, o vetor de controle pode ser qualquer vetor adequado quecompreenda um gene repórter ou fragmento funcional do mesmo, porém emque a expressão do gene repórter não é promovida por um promotor(funcional) da MGC4504. Esse fato pode, por exemplo, significar que o generepórter, ou fragmento funcional do mesmo, não é operacionalmenteacoplado a um promotor funcional da MGC4504 (isto é, totalmentedesprovido de um promotor da MGC4504 ou um fragmento do promotor emque o acoplamento do promotor e do gene repórter não é funcional). Estefato significa também que o gene repórter ou fragmento funcional do mesmoé operacionalmente acoplado a um outro promotor, diferente do promotor daMGC4504 (por exemplo, SV40 ou outro promotor padrão). O vetor funcionale o vetor de controle podem também ser transfectados para a mesma célula,porém neste caso, os genes promotores precisam ser diferentes.

Outra característica da presente invenção refere-se ao uso deum meio para detecção de MGC4504 objetivando o diagnóstico de umadoença ou de uma predisposição para uma doença associada ou provocadapor uma disfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos, em umaamostra isolada de um indivíduo.

O diagnóstico pode, por exemplo, compreender:1. A detecção da quantidade de MGC4504 (proteína ou mRNA),presente na amostra isolada, em que uma quantidade inferior emcomparação a uma amostra de referência indica a predisposição ou adoença.

2. A detecção da atividade da MGC4504, presente na amostraisolada, em que uma atividade inferior em comparação a de uma amostra dereferência é indicativo da predisposição ou da doença.

3. A detecção de uma mutação na proteína/gene/seqüência decodificação/promotor, etc. da MGC4504 que leva a uma diminuição dequantidade ou redução da atividade ou disfunção da MGC4504, em que adetecção da mutação é indicativa da predisposição ou da doença.

Em que a amostra de referência pode ser, por exemplo, umaamostra isolada que tenha uma atividade ou quantidade média de MGC4504e/ou uma amostra de um doador que não tenha uma doença oupredisposição para uma doença associada ou provocada por uma disfunçãodo metabolismo de carboidratos ou de lipídeos.

Os meios para detecção da MGC4504 pode ser qualquer meioque seja capaz de detectar especificamente o polipeptídeo/proteína ou ácidonucléico da MGC4504, presente em uma amostra biológica.

Um meio para detectar a proteína ou polipeptídeo da MGC4504pode ser qualquer meio capaz de detectar especificamente aproteína/polipeptídeo da MGC4504 do tipo natural e pode também ser ummeio para detectar especificamente a proteína/polipeptídeo da MGC4504que abrigue uma ou mais mutações, referentes ao tamanho ou a seqüênciade aminoácidos, em comparação a um polipeptídeo/proteína do tipo natural.Um exemplo de escolha deste meio compreende ou é um anticorpo capazde detectar especificamente a proteína MGC4504, por exemplo, para usoem técnicas imunohistológicas ou imunohistoquímicas (por exemplo,detecção da proteína MGC4504 ou de certas mutações da mesma, emcortes histológicos de tecidos ou proteína MCG4504 imobilizada em veículosadequados como membranas, chips, placas de ELISA, etc).

Os meios para detectar o ácido nucléico da MGC4504 podemser, por exemplo, um meio para detectar o mRNA / cDNA ou DNA genômicoda MGC4504, seja do tipo natural ou a que abrigue também uma ou maismutações, referentes à sua extensão ou sua seqüência de ácido nucléico,em comparação a um ácido nucléico da MGC4504 do tipo natural. Os meiospodem ser, por exemplo, um meio para detectar e/ou quantificarespecificamente o mRNA da MGC4504 e, de preferência, que compreendaou seja uma sonda específica do ácido nucléico de MGC4504 ou umconjunto de iniciador capaz de amplificar o DNA da MGC4504, por exemplo,para uso em seqüenciamento em PCR (para a detecção de Mutações naseqüência de nucleotídeos), ou capaz de amplificar o cDNA da MGC4504,por exemplo, para uso em RT PCR (para a detecção e/ou quantificação daexpressão do mRNA da MGC4504). Outro meio pode ser, por exemplo, umasonda de ácido nucléico capaz de hibridizar especificamente o mRNA oucDNA da MGC4504, sob condições padrões, por exemplo, para uso nastécnicas de hibridização de Northern Blot ou com Chip.

O termo tipo natural refere-se ao genótipo ou fenótipoencontrado na natureza ou no estoque padrão de laboratório para um dadoorganismo. De acordo com uma modalidade preferida, as seqüências do tiponatural da MGC4504 são as seqüências de acordo com a SEQ ID. NO 1,2,3ou 14.

O desenho e síntese de iniciadores adequados são bemconhecidos na técnica. De acordo com uma modalidade preferida dapresente invenção, o meio é um conjunto de iniciadores para a amplificaçãodo ácido nucléico da MGC4504 e, preferencialmente, um conjunto deiniciadores que compreenda pelo menos um dos iniciadores de acordo coma SEQ ID NO 8 e/ou 9.

De acordo com uma outra modalidade preferida da presenteinvenção, o meio é uma sonda para a detecção do ácido nucléico daMGC4504 e, preferencialmente, uma sonda que tenha a seqüência deacordo com a SEQ ID NO 10. O desenho e síntese de sondas adequadassão bem conhecidos na técnica (consultar também a literatura padrãoabaixo).De acordo com ainda uma outra modalidade preferida dapresente invenção, o meio é um anticorpo para a detecção específica daproteína ou polipeptídeo da MGC4504. A preparação de anticorposadequados, ou de fragmentos funcionais dos mesmos, é também bemconhecido na técnica, por exemplo, pela imunização de um mamífero, como,por exemplo, um coelho, com a proteína MGC4504, ou fragmento damesma, quando apropriado em presença de, por exemplo, o adjuvante deFreund e/ou géis de hidróxido de alumínio (consultar, por exemplo, Diamond,B.A. et ai (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Osanticorpos policlonais que são formados no animal, resultantes de umareação imunológica, podem ser subseqüentemente isolados do sangue,utilizando processos bem conhecidos e, por exemplo, purificados por meiode cromatografia em coluna. Anticorpos monoclonais podem, por exemplo,ser preparados de acordo com o processo conhecido de Winter e Milstein(Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299). Procedimentosadequados para produção de anticorpos monoclonais são também bemconhecidos na técnica (consultar, por exemplo, a literatura para processospadrões listados abaixo). No contexto da presente invenção, o termoanticorpo ou fragmento de anticorpo compreende também anticorpos oupartes do mesmo ligadas a antígenos, os quais podem ser preparados porrecombinação e, quando apropriado, modificados, como, por exemplo,anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos multifuncionais,anticorpos di ou oligo-específicos, anticorpos de fita única e fragmentosF(ab) ou F(ab)2 (consultar, por exemplo, EP-B1-0 368 684, US4.816,567, US4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213 ou WO 98/24884).

Amostras isoladas compreendem qualquer tipo de amostrasbiológicas isoladas de um indivíduo, por exemplo, células, preparados,cortes ou partes de tecidos ou órgãos (por exemplo, de músculo, pâncreas,cérebro, sangue, fígado, baço, rim, coração, vasos sangüíneos, etc).Amostras isoladas podem ser obtidas por técnicas bem conhecidas, como,por exemplo, coleta de sangue, punção de tecidos ou técnicas cirúrgicas. Apreparação de extratos celular ou tecidual é bem conhecido para a pessoacom habilidade na técnica (consultar, por exemplo, a literatura padrão listadaabaixo).

Outra característica da presente invenção está relacionada aouso de um meio para a detecção de MGC4504 para a produção de um kit dediagnóstico, utilizado para identificação de uma doença ou umapredisposição para uma doença associada ou provocada por disfunções dometabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos.

Uma outra característica da presente invenção está relacionadaa um processo para o diagnóstico de uma predisposição ou uma disfunçãodo metabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos que compreende a análiseda quantidade de MGC4504 presente em uma amostra isolada de umindivíduo, em que uma quantidade diminuída de MGC4504 em comparaçãoa uma ou mais amostras de referência é indicativa da predisposição oudisfunção.

Dentro do contexto das diferentes características da presenteinvenção, o indivíduo pode ser qualquer ser vivo e é, de preferência, ummamífero, sendo mais preferentemente ainda um ser humano.

A análise da quantidade de MGC4504 pode ser, por exemplo,uma análise da quantidade de mRNA presente na amostra, por exemplo,utilizando a análise de Northern Blot, análise de Chip (como microarranjosde cDNA) ou pela técnica de RT PCR quantitativa. A análise pode sertambém uma análise da quantidade protéica presente na amostra, porexemplo, utilizando técnicas que empregam anticorpos específicos como astécnicas de ELISA, Western Blotting, Chip (como microarranjos deproteínas), etc.

Uma outra característica ainda da presente invenção refere-se aum processo para o diagnóstico de uma doença ou predisposição para umadoença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismo decarboidratos e/ou de lipídeos, compreendendo a análise de uma amostraisolada de um indivíduo para detecção de mutações da MGC4504 emcomparação a uma seqüência de referência da MGC4504, em que apresença de uma mutação é indicativa da doença ou da predisposição.As mutações são desvios do genótipo mais freqüentementeencontrado (também denominados o tipo natural em relação a um gene) esão bem conhecidas na técnica. Elas compreendem, entre outras,polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs, isto é, variantes de umadeterminada seqüência de nucleotídeos com trocas em posições isoladas denucleotídeos). Mutações genéticas podem afetar a expressão de um geneou a função de uma proteína e elas podem, por conseguinte, estarimplicadas no aparecimento e predisposição para certas doenças. Emdecorrência da implicação da MGC4504 em processos patológicos,subjacentes ao diabetes, descoberto pelos inventores, as mutações do geneda MGC4504 e, especialmente, aquelas que afetam a expressão e/oufunção e/ou atividade da MGC4504, obrigatoriamente exercem um grandeimpacto sobre doenças associadas ou provocadas por disfunções dometabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos.

Os processos para diagnóstico podem ser conduzidos de acordocom qualquer processo conhecido para detecção da MGC4504, porexemplo, pelo uso de uma dos meios acima de detecção de MGC4504 emuma amostra. As mutações podem, por exemplo, ser analisadas em nível degenoma, por exemplo, por meio da análise biológica molecular do gene daMGC4504 (como, por exemplo, pelas técnicas de Southern Blotting, deseqüenciamento genômico, análise por espectroscopia de massa daseqüência, por Microarranjos de DNA, etc). As mutações podem seranalisadas também com base no nível de mRNA ou da proteína expressado,por exemplo, por meio do seqüenciamento do cDNA (por exemplo, tendocomo base a técnica de RT PCR) ou por técnicas de seqüenciamento deproteínas ou o uso de anticorpos específicos.

A amostra de referência pode ser uma amostra conformedefinida acima.

Uma seqüência de referência pode ser, por exemplo, aseqüência da MGC4504 do tipo natural (consultar, por exemplo, acima) e/oua seqüência da MGC4504 encontrada na maioria dos indivíduos que nãosofram da doença acima ou tenham predisposição para a mesma (nestecaso, a seqüência de referência pode ser também uma seqüência que nãoesteja presente na maior parte da população, porém na maior parte dapopulação que não sofra a doença acima ou não tenha predisposição para amesma; neste caso, a seqüência do tipo natural está associada a um riscoaumentado para o desenvolvimento da referida doença). De acordo comuma modalidade de preferência, a seqüência de referência é uma dasseqüências do tipo natural da MGC4504 (consultar acima).

De acordo com uma modalidade de preferência da referidacaracterística da presente invenção, as mutações são mutações que levam auma quantidade e/ou atividade diminuída de MGC4504 ou a uma ausênciacompleta da MGC4504 e/ou uma ausência total de atividade.

Uma outra característica da presente invenção está relacionadaa um processo para o diagnóstico de uma predisposição ou uma disfunçãodo metabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos que compreende a análiseda atividade de MGC4504 presente em uma amostra isolada de umindivíduo, em que uma atividade diminuída de MGC4504 em comparação auma ou mais amostras de referência é indicativa da predisposição oudisfunção.

A atividade pode ser qualquer atividade protéica implicada emuma das funções da MGC4504, conforme definidas acima. A atividade podeser determinada direta ou indiretamente (por exemplo, pela análise daintensidade ou extensão de uma ou mais das funções da MGC4504).

Outra característica da presente invenção refere-se àidentificação de uma doença ou predisposição para uma doença associadaou provocada por disfunções do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos,compreendendo pelo menos um meio para a detecção da MGC4504.

No contexto da presente invenção, um kit (também conhecidocomo "kit de peças") é entendido como qualquer combinação de um ou maisdos componentes identificados neste pedido de patente, os quais sãocombinados, coexistindo no mesmo espaço, a uma unidade funcional e quepodem conter componentes adicionais.

No contexto da presente invenção, o kit compreende pelo menosum meio para a detecção de MGC4504, apropriadamente acompanhado detampões e/ou reagentes adequados para a detecção de MGC4504 e/ou apreparação da amostra, e opcionalmente um manual para o manuseio paracondução da técnica de detecção correspondente.

O meio pode ser qualquer meio, definido acima, e de preferênciaque compreenda ou seja uma sonda de ácido nucléico específico paraMGC4504 ou um conjunto de iniciadores capaz de amplificar um ácidonucléico da MGC4504 ou um anticorpo específico contra a MGC4504.

Outra característica da presente invenção refere-se a umprocesso para adaptação da medicação para o tratamento ou prevenção deuma doença associada ou provocada por disfunçoes do metabolismo decarboidratos e/ou de lipídeos, em que uma amostra isolada de um indivíduoé analisada para detecção de uma mutação da MGC4504 em comparação auma seqüência de referência e/ou uma quantidade e/ou atividade diminuídada MGC4504, em comparação a uma amostra de referência, em que adosagem é adaptada se uma mutação e/ou uma quantidade e/ou umaatividade diminuída estiver presente na amostra.

A adaptação da medicação pode ser, por exemplo, a adaptaçãodo tipo de medicação que se aplica ao indivíduo, isto é, por exemplo, adeterminação se o indivíduo não pode receber a administração de maneiranenhuma ou se pode ser efetivamente tratado com uma substância (porexemplo, um agonista, antagonista, peptideomimético, proteína, peptídeo,ácido nucléico, molécula pequena ou outro fármaco candidato) ou umaclasse específica de substâncias (por exemplo, substâncias de um tipo queaumente diretamente a atividade da proteína MGC4504 ou de substânciasque pertençam a um subconjunto de compostos químicos com um motivoestrutural comum) para o tratamento ou prevenção de uma doençaassociada ou provocada por disfunçoes do metabolismo de carboidratose/ou de lipídeos. De acordo com outro exemplo da adaptação da medicaçãopode ser a adaptação da dosagem de um determinado medicamento /substância ou classe de substâncias.

Substâncias que tenham um efeito de estimulação ou de inibição(e, preferencialmente, um efeito de estimulação) sobre a expressão ouatividade da MGC4504 (por exemplo, sobre a expressão do gene daMGC4504), conforme identificadas por um estudo de seleção, podem serutilizadas para a preparação de um produto farmacêutico que seja útil para otratamento ou prevenção de uma doença associada ou provocada pordisfunções do metabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos (por exemplo,distúrbios que envolvam células ou tecidos nos quais ocorre a expressão daMGC4504, como, por exemplo, miócitos associados com atividade anormal,ou ausência, da MGC4504). Junto a este tratamento, a farmacogenômica(isto é, o estudo da relação entre o genótipo de um indivíduo e a respostadeste indivíduo a um composto ou fármaco externo) do indivíduo poderá serconsiderada. Diferenças, em relação a metabolismo, de terapêutica podemlevar à toxicidade grave ou insucesso terapêutico ao ser alterada a relaçãoentre dose e concentração sangüínea do fármaco farmacologicamente ativo.Dessa forma, a farmacogenômica do indivíduo permite a seleção de agentesefetivos (por exemplo, medicamentos) para tratamentos profilático outerapêutico, com base em uma consideração do genótipo do indivíduo. Estafarmacogenômica pode ser ainda utilizada para determinar doses e regimesterapêuticos apropriados. De acordo com o mesmo, a atividade da proteínaMGC4504, expressão do ácido nucléico da MGC4504 ou teor de mutação degenes da MGC4504, em um indivíduo, podem ser determinados para porintermédio destes ser(em) selecionado(s) agente(s) apropriado(s) paratratamento terapêutico ou profilático do indivíduo.

Uma outra característica ainda da presente invenção refere-seao uso de MGC4504, de um fragmento funcional ou derivado da mesma oude uma composição que compreenda a MGC4504 ou um fragmentofuncional ou derivado da mesma para a produção de um medicamento parao tratamento ou prevenção de uma doença associada ou provocada por umadisfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos.

Outras características da presente invenção referem-se ao usode uma substância que modula a atividade da MGC4504 para a produção deum medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença associadaou provocada por uma disfunção do metabolismo de carboidratos e/ou delipídeos com um processo para o tratamento de um indivíduo que sofra deuma doença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismo decarboidratos e/ou de lipídeos, compreendendo a administração de umasubstância que module a atividade da MGC4504 no indivíduo.

Para esse fim, MGC4504 ou fragmentos ou derivados da mesmapodem ser utilizados na forma de um polipeptídeo, peptídeo ou de um oligoou polinucleotídeo. Modificações ou aditivos adequados são aqueles queassegurem ou facilitem o seu direcionamento para o local de necessidade ea sua entrada na célula ou sua estabilidade. Por outro lado, uma aplicaçãolocal, como, por exemplo, uma injeção subcutânea, subdérmica ouintramuscular, etc, ou similar, também é possível para assegurar o seudirecionamento para o local de necessidade. Outros aditivos úteis incluemsais, tampões ou similares para sua estabilização, etc.

O polinucleotídeo ou fragmento funcional ou derivado daMGC4504 pode, por exemplo, ser inserido em um vetor adequado queassegure a sua expressão intracelular ou também o seu direcionamentopara uma célula. Uma expressão específica do tipo de célula pode serassegurada utilizando promotores/reforçadores apropriados de genesespecíficos do tipo de célula ou de tecidos, os quais são conhecidos natécnica. O uso de oligonucleotídeos da MGC4504 também é possível.

Para a produção de um medicamento, os ingredientes ativossão geralmente formulados com aditivos adequados ou substânciasadjuvantes, como, por exemplo, solução tampão fisiológica, por exemplo,solução de cloreto de sódio, água desmineralizada, estabilizantes como, porexemplo, inibidores da protease ou nuclease, preferencialmente, aprotinina,ácido £-aminocapróico ou pepstatina A, agentes seqüestradores como, porexemplo, EDTA, formulações em gel como, por exemplo, vaselina branca,parafina de baixa densidade e/ou cera amarela, etc, na dependência do tipode administração.

Outros aditivos adequados são, por exemplo, detergentes como,por exemplo, Triton X-100 ou desoxicolato de sódio, porém também poliooiscomo, por exemplo, polietileno glicol ou glicerol, açúcares como, porexemplo, sacarose ou glicose, compostos zwiteriônicos como, por exemplo,aminoácidos como, por exemplo, glicina, ou particularmente taurina oubetaína e/ou uma proteína como, por exemplo, albumina sérica bovina ouhumana. Detergentes, polióois e/ou compostos zwiteriônicos são preferidos.

A solução tampão fisiológica de preferência possui um pH deaproximadamente 6,0-8,0, preferivelmente, um pH de aproximadamente 6.8-7.8, particularmente, um pH de aproximadamente 7,4, e/ou umaosmolaridade de aproximadamente 200-400 miliosmol/litro,preferencialmente de aproximadamente 290-310 miliosmol/litro. O pH de ummedicamento é geralmente ajustado utilizando um tampão orgânico ouinorgânico adequado como, por exemplo, preferencialmente utilizando umtampão fosfato, tampão tris (tris (hidroximetil) aminometano), tampãoHEPES (ácido [4-(2-hidroxietil) piperazino] etanossulfônico) ou tampãoMOPS (ácido 3-morfolino-1-propanossulfônico). A escolha do tampãocorrespondente depende geralmente da molaridade desejada do tampão. Otampão fosfato é adequado, por exemplo, para soluções injetáveis e deinfusão (consultar também Pharmaceutical Sciences de Remington, 17§Edição, 1985 (para sais fisiologicamente toleráveis (anorgânico ou orgânico),consultar especialmente a página 1418)).

O medicamento pode ser administrado sob qualquer maneiraconvencional adequada, por exemplo, por meio de formas orais de dosagemcomo, por exemplo, comprimidos ou cápsulas, por meio das membranasmucosas, por exemplo, a cavidade nasal ou a oral, sob a forma dedispositivos implantados sob a pele, por meio de injeções, infusões ou géisque contenham os medicamentos de acordo com a invenção. É aindapossível administrar o medicamento localmente, visando o tratamento dadoença em particular, conforme descrita acima, se apropriado, sob a formade complexos lipossomicos. Ademais, o tratamento pode ser conduzido pormeio de um sistema terapêutico transdérmico (TTS) que torna possível umaliberação temporariamente controlada dos medicamentos. TTS sãoconhecidos, por exemplo, a partir do EP 0 944 398 A1, EP 0 916 336 A1, EPO 889 723 A1 ou EP 0 852 493 A1.

A administração deve ser adequadamente executada demaneira que possibilite o direcionamento da MGC4504 para o local de ação(por exemplo, para tecido muscular, cerebral ou pancreático), por exemplo,por administração sistêmica de derivados da MGC4504 ou formulações quese direcionem para o local de necessidade, ou aplicação local (por exemplo,intramuscular) de fórmulas contendo MGC4504 ou fragmentos ou derivadosda mesma.

Soluções injetáveis são geralmente utilizadas se somentequantidades relativamente pequenas de uma solução ou suspensão, porexemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 ml, tenham que seradministradas ao corpo. Soluções de infusão são geralmente utilizadas seuma quantidade maior de uma solução ou suspensão, por exemplo, um oumais litros, tenha que ser administrada. Uma vez que, ao contrário dasolução de infusão, somente alguns milímetros são administrados em casode soluções injetáveis, diferenças pequenas do pH e da pressão osmóticado sangue ou do tecido e o líquido na injeção não as torna noticiáveis ousomente as torna noticiáveis em uma extensão insignificante, em relação àsensação de dor. A diluição do medicamento, de acordo com a invenção,antes de uso é, por conseguinte, geralmente desnecessária. No caso daadministração de quantidades relativamente grandes, no entanto, omedicamento, de acordo com a invenção, deve ser diluído um pouco antesde ser administrado de forma que seja obtida pelo menos uma soluçãoaproximadamente isotônica. Um exemplo de uma solução isotônica é umasolução de cloreto de sódio com concentração de 0,9%. No caso de infusão,a diluição pode ser conduzida, por exemplo, utilizando água estéril aomesmo tempo em que a administração pode ser conduzida, por exemplo,por meio de um assim chamado bypass.

Outra característica da presente invenção refere-se a umprocesso para o tratamento de um indivíduo que sofram ou apresente umapredisposição para uma doença associada ou provocada porcomprometimento do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos,compreendendo a modulação e, de preferência, aumentando a quantidadeou atividade da MGC4504.

Este possível processo pode compreender a administração paraum indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz daproteína MGC4504 ou de seu ácido nucléico, ou o aumento endógeno donível do estado de equilíbrio da MGC4504 (por exemplo, pela aplicação deuma substância capaz de aumentar a quantidade da MGC4504 no local denecessidade ou por terapia somática genética, utilizando vetoresadequados).

Uma outra característica ainda da presente invenção refere-seao uso de uma célula que expressa de modo heterólogo a MGC4504 para aidentificação de substâncias ativas no tratamento ou prevenção de doençasassociadas ou provocadas por disfunções do metabolismo de carboidratosou de lipídeos. De acordo com uma modalidade de preferência, a célula éuma célula transgênica.

De acordo com outra característica da presente invenção, umanimal transgênico não humano que expressa de modo heterólogo aMGC4504 pode ser utilizado para a identificação de substâncias ativas notratamento ou prevenção de doenças associadas ou provocadas pordisfunções do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos.

Uma célula/animal transgênico é uma célula/animal que carregaem seu genoma um transgene além de seu conjunto normal de genes. Aprodução de células e animais transgênicos, bem como as construções dosvetores necessários são bem conhecidas na técnica (para uma visão geral,consultar, por exemplo, Gene targeting: A Practical Approach, 2nd Ed.,Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at Oxford University Press, New York;Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A,Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring HarborPress, New York; Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook,Pinkert CA, ed., 1994, Academic Press., New York) e a produção dosmesmos é oferecida também, por exemplo, sob a forma de serviço comercialpor diversos fornecedores. (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine,EUA).

De acordo com as diferentes características da presenteinvenção, o transgene pode ser a MCG4504 ou um fragmento ou derivadoda mesma, seja funcional ou com uma função comprometida ou abolida.

De acordo com outra modalidade de preferência da presenteinvenção, é utilizada uma célula modificada que tenha uma atividade daMGC4504 inferior quando comparada a seu estado não modificado. Dessamaneira, pode ser testada, se os compostos químicos a serem testadosforem capazes de melhorar ou restaurar a atividade diminuída ou totalmenteabolida da MCG4504.

A modificação pode ser qualquer tipo de modificação (estável outransitória, de preferência estável) que leve a uma diminuição da atividadeda MGC4504 (isto é, sua capacidade para interagir com outras moléculas,sua capacidade para aumentar a sensibilidade à insulina de células, etc), donível do estado de equilíbrio do transcrito da MGC4504 (isto é, pela ativaçãoda transcrição da MGC4504 ou estabilização do transcrito) ou do nível doestado de equilíbrio da proteína MGC4504 (isto é, pela ativação datranslação ou de seu processamento pós-translacional; pela modulação damodificação pós-translacional da MGC4504 ou pela ativação de suaestabilização ou pela inibição de sua degradação). O mesmo pode serobtido, por exemplo, utilizando mutantes dominantes negativos daMGC4504, oligonucleotídeos de anti-sentido, construções de RNAi daMGC4504, pela geração de knockouts funcionais ou genômicos daMGC4504 (os quais pode, por exemplo, ser induzidos) ou por outrastécnicas adequadas, conhecidas no estado da técnica. Para obter uma visãogeral sobre as técnicas acima, consultar, por exemplo: Current protocols inMolecular biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, JohnWiley and Sons, Inc.; Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor:A.L. Joyner, IRL Press; Genetic Manipulation of Receptor Expression andFunction, 2000; Antisense Therapeutics, 1996; Scherr et al, 2003.

De acordo com outra característica, a presente invenção refere-se ao uso de uma célula knockout ou um animal não humano knockout paraMGC4504 para a identificação de substâncias ativas no tratamento ouprevenção de doenças associadas ou provocadas por disfunções dometabolismo de carboidratos ou de lipídeos. O silenciamento pode ser umsilenciamento genômico ou um silenciamento funcional. Linhagens celularesadequadas para a geração de knockouts são bem conhecidas no estado datécnica e os protocolos para a geração de silenciamentos compreendemaqueles que foram revelados em Current protocols In Molecular Biology(2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc;ou Gene targeting: A Practical Approach, 2nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRLPress at Oxford University Press, New York; Manipulating the MouseEmbryo: A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M., Vintersten, K.,Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York; TransgenicAnimal Technology: Ademais, knockouts de genes de interesse sãooferecidos com um serviço por fornecedores comerciais (por exemplo, o TheJackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EUA).

Outra característica da presente invenção refere-se a umaseleção de alto rendimento, com base em um processo, de acordo com umdos processos inovadores acima para a identificação de substâncias ativas(estes processos também denominados "ensaios").

Processos analíticos ou sistemas analíticos, tambémdenominados ensaios, utilizados para determinar a atividade ouconcentração de moléculas-alvo definidas (também chamadas de alvos,principalmente proteínas ou ácidos nucléicos), como parâmetro para aeficiência de um possível composto farmacêutico, são bem conhecidos noestado da técnica. Ensaios compreendem, por exemplo, processosanalíticos bioquímicos ou sistemas, usando componentes isolados ouparcialmente isolados que são colocados juntos a uma mistura de reaçãodentro de um espaço e tempo definidos, nos quais a eficiência dos possíveiscompostos farmacêuticos pode ser testada. Outros exemplos de ensaioscompreendem processos ou sistemas analíticos bioquímicos, nos quais aatividade da molécula-alvo e a eficiência de um potencial para influenciaresta atividade podem ser determinadas dentro de uma célula.Um ensaio pode ser qualquer tipo de processo ou sistemaanalítico usado para monitorar um processo biológico (por exemplo, osprocessos analíticos acima) Cascatas e mecanismos moleculares,representando partes de vias metabólicas fisiológicas, porém também decondições patológicas, são adequadamente reproduzidos em sistemascelulares ou bioquímicos (in vitro). A atividade farmacológica de um possívelcomposto farmacêutico pode, dessa forma, ser determinada de acordo coma sua capacidade para interferir ou modular estas cascatas ou mecanismos.

Para o uso na seleção do fármaco, especialmente a seleção dealto rendimento para compostos farmacêuticos inovadores, o ensaio precisaser reprodutível e ser também, de preferência, representado em escala erobusto. No escopo da presente invenção, seleção de alto rendimentosignifica que um processo, de acordo com a presente invenção, é conduzidoem uma escala muito pequena, por exemplo, sobre placas com 96, 386 ou1536 poços em amostras de volume muito pequeno no intervalo de poucosmilímetros decrescendo para poucos nanolitros ou até menos. Dessa forma,um número muito grande amostras pode ser analisado em um curto espaçode tempo. Seleção de alto rendimento compreende principalmente a seleçãode até aproximadamente 500.000 compostos diferentes, referentes a umacerta capacidade, por meio de um único ensaio. O ensaio é de preferênciaadequado para seleção de alto rendimento de substâncias químicas pelacapacidade que apresentam de modular a atividade da molécula-alvo sobinvestigação. O tipo de ensaio depende, por exemplo, do tipo de molécula-alvo utilizada (por exemplo, polipeptídeo ou polinucleotídeo) e da "leitura",isto é, o parâmetro, de acordo com o qual a atividade da molécula-alvo édeterminada (consultar abaixo).

Tipos diferentes de ensaios são comumente conhecidos noestado da técnica e estão disponíveis no mercado, provenientes defornecedores comerciais.

Ensaios adequados para propósitos diferentes englobamensaios de radioisótopos ou fluorescentes, por exemplo, ensaios depolarização fluorescente (para a determinação da interação de umcomponente marcado com um componente não marcado (por exemplo, ainteração de receptores protéicos marcados com os seus ligantes nãomarcados).

Outros exemplos incluem ensaios à base de células, em queuma linhagem celular expressa estavelmente (induzida ou não;cromossômica ou epissômica) ou transitoriamente uma proteínarecombinante de interesse. Estes ensaios compreendem, por exemplo,ensaios de gene repórter em que a regulação de um certo promotor ou davia de transdução de um sinal de um componente de uma cascata detransdução de sinal é determinada de acordo com a atividade de umaenzima do repórter, a expressão da qual estando sob controle do referidocerto promotor. Para este tipo de ensaio, uma linhagem celular recombinantedeverá ser construída, contendo o gene repórter sob o controle de umpromotor definido a ser ele mesmo investigado ou que é regulado pelacascata de sinalização sob investigação. Enzimas repórteres adequadas sãocomumente conhecidas no estado da técnica e compreendem tiposdiferentes de luciferase ou (3-galactosidase. Linhagens celulares adequadasdependem do objetivo do ensaio, porém compreendem principalmentelinhagens celulares fáceis de serem transfectadas e fáceis de seremcultivadas como, por exemplo, HEK293, HeLA, COS, CHO, NIH-3T3, etc.

Ensaios para determinação de nível do íon intracelularcompreendem, por exemplo, ensaios com FLIPR (leitor de placa de imagemfluorimetrica, disponível no mercado de Dispositivos Moleculares), em queuma fonte luminosa de laser de argônio acoplada a uma câmera resfriada deCCD permite determinações paralelas, em placas com 384 poços, de sinaistransitórios de íons (como, por exemplo, Ca++, etc.) dentro de células (porexemplo, células neuronais) ou em outras células (por exemplo, células quese expressam, por recombinação ou naturalmente, em certos canais deíons). Ensaios com FLIPR permitem, por exemplo, a monitoração de cálciointracelular, utilizando certos fluorocromos ou a detecção de mudanças nopotencial de membranas ou monitoração da polarização da membrana,utilizando kits de ensaio específicos com FLIPR. Para a monitoração deoutros íons intracelulares, por exemplo, zinco ou sódio, outros corantesconhecidos no estado da técnica podem ser utilizados. Outros tipos deensaios e outros tipos de leituras são comumente conhecidos de pessoasversados na técnica.

Para a determinação de níveis de cAMP, são adequados, porexemplo, o ALPHAScreen® e técnicas de polarização fluorescente ou deHTRF (Fluorescência resolvida no tempo).

Para a determinação de atividade do canal do íon (que controla,por exemplo, concentrações intracelulares de íons e pode, dessa forma, serempregada para determinação de concentrações intracelulares de íons),podem ser utilizados, por exemplo, ensaios sensíveis à potencial demembranas e corantes.

Para determinação de atividade de GPCR, por exemplo,determinação de cAMP, por meio de, por exemplo, o sistema de detecção decAMP AlphaScreen®, produzido por Packard Bioscience, ensaios demobilização de Ca2+ ou de genes repórteres são adequados.

Para determinação de fosforilação de proteínas, por exemplo,atividade de quinases, ensaios de polarização fluorescentes são adequados,por exemplo, os comercializados pela Panvera; ademais, os ensaios deHTRF (Fluorescência homogênea resolvida no tempo, Cis Bio), LANCE(Perkin Elmer Life Science) ou o ensaio de proximidade luminescenteamplificada homogênea (ALPHAScreen® pela Packard BioScience) sãotambém aplicáveis. Outros tipos de ensaios e outros tipos de "leitura" sãobem conhecidos no estado da técnica.

De acordo com uma modalidade de preferência das diferentescaracterísticas da presente invenção, a MCG4504, o derivado ou ofragmento da mesma pode ser utilizado como uma molécula isolada.

No contexto desta invenção, o termo "molécula isolada",especialmente a respeito da MGC4504, refere-se a polinucleotídeos oupolipeptídeos da MCG4504, purificados de fontes naturais, bem comomoléculas recombinantes purificadas (em que o termo purificadocompreende uma purificação parcial, além de uma purificação completa).A preparação de moléculas de polipeptídeo ou polinucleotídeorecombinante e a purificação de moléculas que ocorrem naturalmenteprovenientes de células ou tecidos, bem como a preparação de extrato decélulas ou de tecidos são bem conhecidos da pessoa especializada natécnica (consultar também, por exemplo, a literatura padrão listada abaixo).

Eles compreendem, por exemplo, a amplificação depolinucleotídeos da extensão desejada, por meio da reação em cadeia dapolimerase (PCR), tendo como base as seqüências genômicas publicadasou seqüências de codificação de polinucleotídeos e a clonagemsubseqüente dos polinucleotídeos produzidos em células hospedeiras(consultar, por exemplo, a literatura padrão listada abaixo).

A PCR é uma técnica in vitro que possibilita a amplificaçãoespecífica de trechos de seqüência que contenham trechos de nucleotídeosde seqüência conhecida em sua proximidade 5' e 3'. Para amplificação daseqüência de escolha, moléculas curtas com fita única de DNA("iniciadores") são utilizadas, as quais complementam os trechos deseqüência que estrutura a seqüência do polinucleotídeo a ser amplificado. Omodelo de polinucleotídeo pode ser DNA ou RNA. Pela escolha deseqüências definidas de etapas de incubação em temperaturas definidas ecom intervalos de tempo definidos, repetidos periodicamente, opolinucleotídeo de interesse é amplificado exponencialmente.

Iniciadores adequados podem ser gerados por intermédio desíntese química, de acordo com protocolos bem conhecidos. Estesiniciadores são também disponibilizados no mercado por fornecedoresdiferentes como, por exemplo, MWG Biotech, etc.

Os modelos de DNA e RNA, além de modelos de cDNA, podemser gerados por meio de procedimentos padrões bem conhecidos (como, porexemplo, modelos de DNA clonados com o auxílio de vetores de clonagem;a preparação de DNA ou RNA genômico, proveniente de culturas de células,tecido, etc. ou preparação de cDNA destas fontes de RNA, etc, consultar,por exemplo, a literatura padrão abaixo) e podem também ser adquirido defornecedores comerciais como, por exemplo, Promega e Stratagene, etc.Tampões e enzimas adequadas, bem como protocolos de reação paracondução da PCR são conhecidos na técnica, além de disponíveis nomercado. O produto da reação pode ser purificado por procedimentosconhecidos (por exemplo, purificação em gel ou purificação em coluna).

Outro processo para geração de polinucleotídeos isolados é aclonagem de uma seqüência desejada e sua purificação subseqüentecompleta ou parcial, por meio de processos padrões. Para geração depolipeptídeos isolados, os polinucleotíeos são clonados em vetores deexpressão e os polipeptídeos são expressos em organismos hospedeirosadequados, de preferência, organismos unicelulares, como cepasadequadas de bactérias ou leveduras, seguido pela purificação subseqüentecompleta ou parcial do polipeptídeo.

Os processos, de acordo com a presente invenção, podem ser,por exemplo, realizados como um ensaio bioquímico ou celular.

A MGC4504 pode ser derivada de qualquer seqüênciadisponível que permita a sua finalidade específica, de acordo com uma dasdiferentes características da presente invenção. De preferência, a MGC4504é a MGC4504 humana.

De acordo com uma modalidade preferida, a MGC4504 éutilizada sob a forma de polinucleotídeo. De preferência, o polinucleotídeocompreende ou consiste em

a. SEQ ID NO 1

b. Uma seqüência capaz de se hibridizar com uma seqüência deacordo com a), em condições de baixo, moderado ou alto rigor, e quecodifica um polipeptídeo com função de MCG4504.

c. uma seqüência derivada de uma seqüência de acordo com a)ou b), decorrente da degeneração do código genético e que codifica umpolipeptídeo com função de MGC4504;

d. Um fragmento de uma das seqüências de acordo com a), b)ou c), que codifica um polipeptídeo com função de MGC4504, e que codificaum polipeptídeo compreendendo ou consistindo na seqüência de acordocom a SEQ ID NO 2;e. Uma seqüência derivada de uma das seqüências de acordocom a), b), c) ou d) pela troca de um ou mais nucleotídeos, em que a trocado nucleotídeo não é ou não é exclusivamente decorrente da degeneraçãodo código genético, e que codifica um polipeptídeo com função deMGC4504;

Um fragmento de polinucleotídeos de preferência é o fragmentode acordo com a SEQ ID NO 14.

O termo "rigor" descreve condições da reação que influenciam aespecificidade da hibridização ou anelamento de duas moléculas com fitasúnicas de ácido nucléico.

Uma molécula de ácido nucléico pode se hibridizar com outramolécula de ácido nucléico quando as formas de fitas únicas de ambas asmoléculas podem se anelar sob condições adequadas de reação("anelamento" ou hibridização) (dependente da temperatura e concentraçãoiônica do meio circundante) para formar uma nova molécula de ácidonucléico com fita dupla. A hibridização requer que as duas moléculas deácido nucléico que estão se anelando compreendam seqüênciascomplementares. Na dependência das condições escolhidas de anelamentoe das condições de rigor, é possível que ocorram pareamentos errados{mismatch) entre as bases, sem impedir a formação da dupla fita.

O rigor e, por conseguinte, a especificidade de uma reaçãodepende, inter alia, das condições de temperatura e de tamponamento,utilizadas para uma reação: O rigor e, por conseguinte, a especificidade,pode ser, por exemplo, aumentada pelo aumento da temperatura de reaçãoe/ou pela diminuição da concentração iônica do tampão da reação.Condições adequadas de rigor para a hibridização de ácidos nucleicosdependem da extensão, do tipo de ácido nucléico e do seu nível decomplementaridade. As variáveis são conhecidas no estado da técnica.Quanto mais alto o nível de similaridade ou homologia entre as duasseqüências de nucleotídeos que se anelam, mais alta a temperatura defusão para produtos de hibridização de ácidos nucleicos com aquelasseqüências. A estabilidade relativa da hibridização de ácidos nucleicosdepende, de acordo com o tipo dos ácidos nucléicos de fita única que estãoformando a fita dupla, de: RNA:RNA>DNA:RNA>DNA:DNA. Para produtosde hibridização de mais de 100 nucleotídeos em extensão, as equaçõespara o cálculo da temperatura de fusão são conhecidas na técnica. Paraprodutos mais curtos de hibridização (por exemplo, oligonucleotídeos), ocálculo da temperatura de fusão depende da extensão, em que pareamentoserrados tornam-se mais importantes.

Condições de baixo rigor (e, por conseguinte, pouca reação eespecificidade da hibridização) existem, por exemplo, se uma hibridização foirealizada em temperatura ambiente em solução de 2xSSC. Condições dealto rigor compreendem, por exemplo, uma reação de hibridização a 68 °Cem uma solução de 0,1xSSC e de SDS a 0,1% SDS.

No contexto da presente invenção, o termo "hibridizar sobcondições de rigor" refere-se a condições para a realização da reação dehibridização e o procedimento seguinte de lavagem, em que seqüências denucleotídeos com pelo menos 50, 55, 60, 65, 70 e, de preferência, 75% oumais de complementaridade permanecem tipicamente hibridizadas. Aescolha destas condições para um determinado conjunto de ácidosnucléicos faz parte do conhecimento do artesão médico e protocolosadequados podem ser encontrados em literatura bem conhecida paraprocessos padrões como, por exemplo, "Current Protocols in MolecularBiology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 a 6.3.6 (consultar também aliteratura listada abaixo).

A hibridização, sob condições de rigor, incluída nas diferentescaracterísticas da presente invenção, é de preferência entendida comosendo:

1) Hibrização de uma sonda marcada com uma amostra deácido nucléico a ser analisada a 65°C, ou no caso de sondas deoligopeptídeos, em 5°C, abaixo da temperatura de anelamento ou de fusãodo duplex composto pelo oligopeptídeo e amostra (temperatura deanelamento e de fusão são a seguir entendidas como sinônimos), durante anoite, em Tris a 50 mM, pH 7,5, NaCI a 1 M, SDS a 1%, Sulfato de dextranoa 10%, DNA do esperma de salmão ou de arenque desnaturado a 0,5mg/ml.

2) Lavagem por 10 minutos em 2xSSC em temperatura ambiente.

3) Lavagem por 30 minutos em 1xSSC/SDS a 0,1% a 65 °C (ouno caso de oligonucleotídeos: 5°C abaixo da temperatura de anelamento).

4) Lavagem por 30 minutos em 1xSSC/SDS a 0,1% a 65 °C (ouno caso de oligonucleotídeos: 5 °C abaixo da temperatura de anelamento).

Oligonucleotídeos são polinucleotídeos e, de preferência,fragmentos de DNA que tenham uma extensão de 15 a 30, de preferência,20 nucleotídeos. A temperatura de anelamento é determinada de acordocom a fórmula Tm=2x (número de A+T) + 4x (número de G+C) °C.

Para a preparação de uma solução de 2xSSC ou de 0,1xSSC(ou de qualquer outro tipo de solução), por exemplo, uma solução de 20 xSSC é diluída de acordo. 20xSSC consiste em NaCI a 3M/Citrato de Na a0,3 M x 2H20.

Antes de realizar uma reação de hibridização, ospolinucleotídeos são, se desejado após a realização de uma separação poreletroforese (então: Southern Blot (DNA) ou Northern Blot (RNA)) ou semseparação por eletroforese (então: slot ou dot Blot), transferidos para umamembrana adequada, por exemplo, uma membrana de náilon ou denitrocelulose. A hibridização é realizada utilizando uma sondaadequadamente marcada. Técnicas adequadas para marcação são, porexemplo, marcação radioativa ou marcação utilizando corantesfluorescentes. A sonda é um poliribo ou polidesoxirribonucleotídeo de fitaúnica, sendo de fita única naturalmente ou utilizando, geralmente, de fitadupla que foi tornado de fita única por desnaturação. Esta sonda liga-se aoDNA ou RNA da amostra (o qual está também na forma de fita única), porpareamento de bases.

De acordo com uma modalidade de preferência das diferentescaracterísticas da presente invenção, as condições de rigor são condiçõesde alto rigor.De acordo com uma outra modalidade preferida, a MGC4504 éutilizada sob a forma de polipeptídeo. De preferência, o polipeptídeo écodificado por uma das seguintes seqüências:

a. SEQ ID NO 1;

b. Uma seqüência capaz de se hibridizar com uma seqüência deacordo com a) em condições de baixo, moderado ou alto rigor e que codificaum polipeptídeo com função de MCG4504.

c. uma seqüência derivada de uma seqüência de acordo com a)ou b), decorrente da degeneração do código genético e que codifica umpolipeptídeo com função de MGC4504;

d. Um fragmento de uma das seqüências de acordo com a), b)ou c), que codifica um polipeptídeo com função de MGC4504;

e. Uma seqüência derivada de uma das seqüências de acordocom a), b), c) ou d) pela troca de um ou mais nucleotídeos, em que a trocado nucleotídeo não é ou não é exclusivamente decorrente da degeneraçãodo código genético, e que codifica um polipeptídeo com função deMGC4504;

De acordo com uma outra ainda modalidade de preferência, opolipeptídeo compreende ou consiste em uma das seqüências de acordocom a SEQ ID NO 2.

A doença associada ou provocada por uma disfunção dometabolismo de carboidratos ou de lipídeos é de preferência uma disfunçãodo metabolismo da glicose, obesidade, dislipidemia ou a síndromemetabólica ou qualquer outra disfunção da ação da insulina e, maispreferencialmente, diabetes tipo 1 ou tipo 2 ou resistência à insulina.

A seguir, a invenção é descrita mais detalhadamente por meiode exemplos diferentes, sem significar que esta é limitada por estesexemplos.

Legenda para as figuras

Tabela 1:

Análise genética com o Affymetrix Gene Chip® da expressãogênica da MGC4504 em réplicas de fusão de controles magros sensíveis àinsulina e ratos ZDF obesos resistentes à insulina ou diabéticos.

Tabela 2:

PCR quantitativo em tempo real de amostras de RNA obtidas decontroles magros sensíveis à insulina e ratos ZDF obesos resistentes àinsulina ou diabéticos.

Tabela 3:

Análise genética com Affymetrix Gene Chip® da expressãogênica da MGC4504 em dietas induzida para modelo de diabetes do tipo 2.

Figura 1:

Níveis de expressão gênica da MCG4504 em um subconjuntoselecionado de tecidos humanos diferentes.

Figura 2:

Expressão equilibrada de HA-MGC4504 em mioblastosL6GLUT4myc.

Figura 3:

Distribuição subcelular de MGC4504 em citoplasma e núcleo decélulas L6GLUT4myc (Figura 3A) e RIN-5F (Figura 3B), transitoriamentetransfectadas.

Figura 4:

Figura 4A: Ensaio de absorção de 2-Desoxiglicose esensibilidade aumentada à insulina de células L6GLUT4myc HA-MCG4504.

Figura 4B: Ensaio de secreção de insulina e aumento desecreção basal e de insulina estimulada por glicose de células RIN-5F HA-MGC4504.

Figura 5:

Coloração com Coomassie de amostras diferentes colhidasdurante expressão e purificação da proteína solúvel GST-MGC4504.

Figura 6:

Figura 6A: Atividade da MGC4504 com posições 5'-UTR -4311/+1 em linhagens celulares diferentes em um ensaio de gene repótercom configuração transitória em 96 poços e dupla luciferase.

Figura 6B: Determinação experimental do promotor central daMGC4504 em MGC4504 com posições 5'-UTR - 431/+1 pelo ensaio dediferentes fragmentos truncados do promotor em ensaios de gene repórtercom configuração transitória em 96 poços e dupla luciferase em célulasHEK293.

Figura 7:

Seqüência de codificação da MGC4504 humana (SEQ ID NO 1).

Figura 8:

Seqüência de aminoácidos derivada da MGC4504 humana(SEQ ID NO 2).

Figura 9:

Seqüência Genômica da MGC4504 humana (SEQ ID NO 3).

Figura 10:

Iniciadores para amplificação específica do mRNA da MGC4504de ratos (SEQ ID NO 4 e 5)

Figura 11:

Iniciadores para amplificação específica do mRNA da beta actinade ratos (SEQ ID NO 6 e 7)

Figura 12:

Iniciadores para amplificação específica do mRNA da MGC4504humana (SEQ ID NO 8 e 9) e sonda para hibidrização específica do mRNAda MGC4504 humana (SEQ ID NO 10)

Figura 13:

Iniciadores para clonagem da MGC4504 ORF humanaproveniente de cDNA (SEQ ID NO 11 a 13)

Figura 14:

Fragmento de seqüência de cDNA de MGC4504 humanacompreendendo a seqüência de codificação (SEQ ID NO 14)

Exemplos:

Exemplo 1:

Expressão gênica da MGC4504 em um modelo in vivo deresistência à insulina e diabetes tipo 2

Materiais e MétodosAnimais e preparação de amostras:

Grupos com idades combinadas de ratos obesos machosdiabéticos Zucker (ZDF) (Gmi, fa/fa) e a ninhada magra de suas parceiras(Gmi, +/?) foram adquiridos da Genetic Models. Os ratos foram abrigadosem pares a 20 °C em um ciclo de 12 horas de claro-escuro com livre acessoa água e uma dieta padrão para ratos (Altromin, Alemanha), contendo 4% degordura, 64% de carboidrato e 19% de proteína, por uma semana, desde achegada para permitir que se recuperassem do transporte. Todos osprocedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com a Lei deProteção a Animais da Alemanha. Após 2 horas de jejum, foram coletadasamostras de sangue, sob anestesia com isofluorano, e os animais forammortos por deslocação cervical. No total foram utilizados para análises deexpressão gênica 34 animais (6 semanas de vida (n = 12 animais), 7semanas de vida (n = 12 animais) e 12 semanas de vida [n = 10 animais]).As sondas de tecido foram removidas rapidamente e imediatamentecongeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a - 80 °C.

Análise com Affvmetrix Gene Chip®:

O uso geral de arranjos de oligonucleotídeos para monitoraçãode expressão gênica foi descrito na Patente US 6,177,248. Em nossaaplicação prática, os microarranjos utilizados contêm seqüências dedesoxinucleotídeos que representam aproximadamente 8000 genes ouconhecidos ou agrupamento EST. Cada gene ou seqüência EST érepresentada por até 20 pares de oligonucleotídeos, cada par composto porum oligo que se combina com um segmento do transcrito, e um oligo decontrole que contém um pareamento errado de 1 bp, localizadocentralmente. Para ratos, 3 arranjos (RG U34A, RG U34B e RG U34C),representando aproximadamente 24000 genes e seqüências EST, no total,derivados de um banco de dados de genes ou seqüências EST conhecidos,são fornecidos pela Affymetrix, Santa Clara, EUA. 150 mg de sondas demúsculo esqueléticos (M. glúteo máximo) foram submetidas à lise emtampão RLT da Qiagen com um homogeneizador Ultra Turrax (Janke andKunkel IKA Labortechnick). RNA total dos lisados do tecido foram isoladoscom o kit RNeasy da Qiagen, incluindo digestão de K proteinase, digestãode DNase e uma etapa adicional de limpeza com RNeasy, conformerecomendada pelo fabricante (Qiagen). A primeira e segunda síntese de fitasdo cDNA foram realizadas com 10fig de cada RNA total, utilizando o sistemaSuperScript SSII de RT polimerase (Invitrogen) e uma ligação do iniciadorT7(dT)24 com o promotor da RNA polimerase T7 e um oligo(desoxitimidina)24. O cDNA de fita dupla foi extraído com fenol-clorofórmio,seguido por precipitação com etanol e ressuspensão em 12fil de água livrede RNAse. Uma reação de transcrição in vitro, produzida com o Kit EnzoBioarray High Yield RNA Transcript Labelling (Enzo Diagnostics) foi utilizadapara produzir cRNA amplificado e marcado com Biotina-UPT e CTP epurificado por limpeza com Rneasy e precipitação com etanol. Alíquotas decada RNA total e cRNA foram monitoradas antes e depois de cada etapa depurificação por espectrofotometria por UV, eletroforese em gel agarose echips de BioAnalyser RNA (Agilent). 15|ig de amostras de cRNA foramfragmentadas a 94°C por 35 minutos em Tris / acetato a 40 mM, pH 8,1,KOAc a 100 mM e MGOAc a 30 mM, acrescentados ao tampão dehibridização e hibridizados com os microarranjos RG-U34 A, B e C doAffymetrix GeneChips® por 16 horas a 45°C e 60 rpm. Os microarranjosforam lavados e duplamente corados com o conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Sondas Moleculares), anticorpo anti-estreptavidina e, mais umavez com o conjugato estreptavidina-ficoeritrina para amplificar a intensidadedo sinal, de acordo com os métodos descritos pela Affymetrix. Após alavagem, os microarranjos foram analisados em um Scanner confocalGeneArray (HP) utilizando um programa Microarray Suite Versão 4.0. Ocontrole de cada chip foi realizado de acordo com os critérios de qualidadeda Affymetrix, incluindo média da diferença média, intensidade bruta erelação de 375' dos genes constitutivos de beta-actina e GAPDH. Os dadosde perfil de expressão foram analisados utilizando uma ferramenta doprograma interno (GECKO 2) que efetuou uma normalização global emtodos os microarranjos, utilizando um chip de referência para cada grupo e o759 percentil da mediana. Os critérios para determinação de genesdiferencialmente expressados foram mudanças em níveis de expressãosuperiores a 2 vezes e um valor-p <0,05. Níveis de mudanças da expressãogênica da MGC4504 entre todas as réplicas de fusão de controles magrossensíveis à insulina e ratos ZDF obesos resistentes à insulina (ou jádiabéticos, como o grupo na faixa etária de 12 semanas) foram analisadosutilizando o qualificador da Affymetrix RC_A1170665_AT no RGU-34A. Osresultados destas análises estão resumidos na tabela 1.

Tabela 1:

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Em ratos ZDF obesos resistentes à insulina e diabéticos,comparados aos controles magros sensíveis à insulina, níveissignificativamente mais baixos de níveis de expressão gênica da MGC4504puderam ser detectados pela análise do chip de genes da Affymetrix de RNAisolado obtido de biópsias de músculo esquelético. Esse fato indica queresistência à insulina e diabetes tipo 2 estão associados com níveisdiminuídos da expressão gênica da MGC4504.PCR quantitativo em tempo real:

1 |xg de RNA total, isolado de cada rato dos grupos de 6 e 7semanas de vida (n = 24 animais) foram submetidos à transcrição reversacom o kit de AMV-RT de síntese da primeira fita de cDNA (Roche) em umvolume de reação de 20 ul. Foram utilizados 2 ul de cDNA de fita simples,submetido à transcrição reversa, como modelo para amplificação em umLightCycler® (Roche), utilizando FastStart DNA Master Sybr Green (Roche),de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados foram o5'-ACTTCGCCTCCTTCTCTGCTCTCC-3' (SEQ ID NO 4, 5^ da MGC4504 derato) e 5'-GGCCCTGCTAATCCCACACTACC-3' (SEQ ID NO 5, 3'daMGC4504 de rato), 5'-AAGTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3' (SEQ ID NO 6,5' da beta-actina de rato) e 5'-CCTCAACACCTCAAACCACTCC-3' (SEQ IDNO 7, 3' da beta-actina de rato). O tamanho certo dos fragmentosresultantes (156 e 268 pares de base, respectivamente) foi monitorado poreletroforese em gel agarose. O teor de RNA total foi calculado utilizandouma curva padrão de concentração dos fragmentos amplificadoscorrespondentes, normalizados para níveis de expressão do geneconstitutivo da beta-actina e estão resumidos sob a forma de níveis demudança de expressão gênica da MGC4504 entre controles magrossensíveis à insulina e ratos ZDF obesos resistentes à insulina na Tabela 2.

Tabela 2:

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Em ratos ZDF obesos resistentes à insulina e diabéticos,comparados aos controles magros sensíveis à insulina, níveissignificativamente mais baixos de níveis de expressão gênica da MGC4504puderam ser detectados pela análise de PCR quantitativa em tempo real deRNA isolado procedente de biópsias de músculo esquelético. Esse fatoindica que resistência à insulina e diabetes tipo 2 estão associados comníveis diminuídos da expressão gênica da MGC4504.

Exemplo 2:

Expressão gênica da MGC4504 em tecidos humanos Materiais e Métodos Análise de TaqMan da expressão gênica da MGC4504 em tecidos humanos: Foram determinados níveis de expressão da MGC4504 em diversos tecidos humanos por análise de TaqMan utilizando os iniciadores 5'-GGCAGGGAGACACCTTCCAT-3' (5* da MGC4504 humana, SEQ ID NO8) e 5'-TGCAGCCCTCATGATCTTCA-3' (3' da MGC4504 humana, SEQ IDNO 9) e sonda 5'-GCTGCCCCGATGGAA-3' (SEQ ID N 10). Todos osvalores foram normalizados para níveis de expressão da beta-2-microglobulina a fim de padronizar para cargas equivalentes. A Figura 1resume níveis de expressão gênica da MCG4504 em um subconjuntoselecionado de tecidos humanos diferentes testados.

A análise de TaqMan revelou que a expressão mais alta daMGC4504 é detectada em diferentes partes do cérebro, músculoesquelético, pâncreas e rim. Esse fato indica que a expressão da MGC4504está quase que restrita ao músculo e pâncreas.

Exemplo 3:

Efeitos da superexpressão da MGC4504 sobre metabolismo de glicose e secreção de insulinaMateriais e ProcessosClonagem e plasmídeos:

O ORF completo da MGC4504 humana foi amplificado do cDNAde músculo esquelético humano por PCR utilizando 5'-iniciadoresMGC4504-5': 5'-CGGGATCCCGCATGAAGC AGGAGTCTGCAGCC-3' (SEQID NO 11) ou HA-MGC4504-5': 5'-CGGGATCCC GCATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGAAGCAGGAGTCTGCAGCC-3' (SEQ IDNO 12) e MGC4504-3'-PARADA: 5'- CCGGAATTCCGGTCACACCAGCGCCAGAGCCTG-3' (SEQ ID NO 13). O último 5' iniciadorintroduziu uma seqüência que codificou um tag (seqüência de aminoácidos)de epítopo de HA dentro da estrutura amino terminal. Os fragmentosresultantes foram clonados em pGEX-6P1 e vetor higro pcDNA3.1(+)(Invitrogen) via BamHI / EcoRI ou via BamHI (5') e sítios de extremidadescegas (3') EcoRI (inserido) e Notl (vetor) para obter pGEX-6P1 MGC4504 oupcDNA3.1(+) higro HA-MGC4054, respectivamente. As identidades de todasas construções foram confirmadas por seqüenciamento.

Cultura de células, transfecções e imunofluorescência:Mioblastos L6GLUT4myc de ratos, expressando epítopos demyc com seqüência GLUT4, foram doados por A. Klip (The Hospital for SickChildren, Toronto, Ontario, Canadá). L6 (ATCC#: CRL-1458) e L6GLUT4mycforam conservados em alfa-MEM com Glutamax (Gibco #32571),complementado com ouro FCS a 10% (PAA, A 15-609) e solução depenicilina/estreptomicina (PAA #P11-010). O meio da L6GLUT4myc foiadicionalmente complementado com 2|ig/ml de blasticidina (Calbiochem#203350) para selecionar a expressão de GLUT4myc. Células de insulinomaRIN-5F de rato (ATCC#: CRL-2058) foram mantidas em RPMI 1640 comHEPES/L-glutamina/NaHC03 (GIBCO # 52400-025), complementados comouro FCS a 10% (PAA, #A15-609), solução de penicilina/estreptomicina(PAA #P11-010) e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco #11360-039). CélulasHEK293 (ATCC#: CRL-1573) foram conservadas em DMEM (GIBCO #41965-039), complementado com ouro FCS a 10% FCS gold (PAA, A 15-609), solução de penicilina/estreptomicina (PAA #P11-010) e L-glutamina a 1mM (Gibco #25030-032). Todas as linhagens de células foram cultivadas a37 °C em C02 a 5% e 95% de umidade e destas sendo feitas culturassecundárias duas vezes, semanalmente. As transfecções para expressão daproteína em estudo foram conduzidas com células L6GLUT4myc ou RIN-5F,cultivadas em placas com 6 poços em função de uma confluência de 60%,2,5 -ng de DNA de plasmídeo e reagente Fugene 6 (Roche), conformerecomendado pelo fabricante. Em todos os clones selecionionados detransfecções transitórias ou estáveis, o vetor higro sem pcDNA3.1(+) serviucomo controle negativo (referido como células WT). Clones de célulasestáveis foram selecionados com 500^ig/ml de higromicina B, clones decélulas únicas resistentes foram retirados manualmente e ampliados. Foramdeterminados níveis de expressão da HA-MGC4504 pela técnica de SDS-PAGE e Western blotting (NuPAGE, Invitrogen), utilizando anticorpos anti-HA 3F10 monoclonais (Roche) e anticorpos anti-rato secundários deperoxidase de rábano e detecção quimioluminescente em ECL (Amersham).Ensaios de imunofluorescência foram realizados conforme descritos (Voss etal, 2001), utilizando células L6GLUT4myc ou RIN-5F HA-MGC4504 estáveisou células L6GLUT4myc ou RIN-5F transitoriamente transfectadas compcDNA3.1(+) HA-MGC4504, cultivadas sobre tiras cobertas até 70% deconfluência. A expressão da HA-MGC4504 foi monitorada usando anticorpoanti-HA 3F10 (Roche) e anticorpo anti-rato alexa flúor 488 (SondasMoleculares). Os núcleos foram visualizados utilizando 1u,M de iodo ToProem PBS (Sondas Moleculares). Imagens confocais foram obtidas com ummicroscópio de escaneamento confocal a laser TCS SP2 da Leica. A Figura2 mostra a expressão estável da HA-MGC4504 em mioblastosL6GLUT4myc. A Figura 3 mostra a distribuição subcelular de MGC4504 emcitoplasma e núcleo de células L6GLUT4myc (Figura 3A) e RIN-5F (Figura3B), transitoriamente transfectadas.

O cDNA da MGC4504 pode ser prontamente transfectado e aproteína MGC4504 com epítopo de HA marcado pode ser expressa emmioblasto de ratos e células de insulinoma, onde está localizada nocitoplasma e predominante no núcleo.

Absorção de 2-Desoxiglicose e análise de secreção de insulina:Células L6GLUT4myc ou clones de células HA-MGC4504L6GLUT4myc e WT foram inseridas em microplacas cintiliantes com 96poços Cytostar-T® (Amersham) na razão de 4,0x104 células viáveis porpoço. Depois de 32 horas, as células foram privadas de soro com alfa-MEM,complementado com soro de vitela recém-nascida a 2% (PAA) e solução depenicilina/estreptomicina (PAA #P11-010) for 16 hrs. Para análise deabsorção de glicose, as células foram lavadas duas vezes em TampãoKrebs-Ringer, pH 7,3 (KRB) e incubadas por 25 min com as concentraçõesde insulina determinadas em KRB. Foi efetuado o acréscimo da 14C 2-desoxiglicose (0,3 nCi por poço) e as células foram incubadas por outros 25min em um volume total de 150 ul por poço. A absorção foi interrompida peloacréscimo de 40 \iM e citochalasina B, vedada e a cintilação foi determinadaem um micro beta contador Wallac (Perkin Elmer). A absorção inespecíficafoi determinada por poços de controle de incubação com 20 uM decitochalasina B e subtraída de cada valor. Para monitoração da secreção deinsulina, células RIN-5F ou clones de células HA-MGC4504 RIN-5F e de WTforam colocadas em placas com 12 poços e cultivadas por 24 horas. Apósprivação de soro com alfa-MEM complementado com soro de vitela recémnascida a 2% (PAA) e com antibióticos (Pen/Estrep), durante 16 horas, ascélulas foram lavadas duas vezes e incubadas por 2 horas em KRB comquantidades diferentes de glicose (0-20 mM). O teor de insulina dossobrenadantes foi determinado com a técnica ELISA para Insulina de Rato(Mercodia), de acordo com o protocolo do fabricante, e as células foramainda submetidas à lise para determinação do teor protéico visandoassegurar carga comparável. A Figura 4A mostra uma absorção típica de 2-Desoxiglicose e sensibilidade aumentada à insulina de células HA-MCG4504L6GLUT4myc. A Figura 4B mostra uma secreção de insulina típica eaumento de secreção basal e de insulina estimulada por glicose de célulasHA-MCG4504 RIN-5F. Estes resultados mostram que a expressão daMGC4504 está ligada à sensibilidade à insulina e disponibilidade de glicose,bem como a secreção de insulina, uma vez que a superexpressão daMCG4504 leva a aumento da sensibilidade de insulina e aumento daabsorção de glicose, estimulada pela insulina, em uma linha celular demúsculo, bem como aumento de secreção de insulina, estimulada porglicose em uma linhagem celular de insulinoma.Exemplo 4:

Expressão de recombinante de proteína de fusão recombinanteda MGC4504

Bactérias BL21DE3 com cepas de E. coli (Invitrogen) foramtransformadas com um vetor sem pGEX-6P1 ou MGC4504 pGEX-6P1MGC4504 e cultivadas em LB, induzidas com IPTG a 0,1 mM em um OD 600de 0,6 e cultivas por 4 horas. As células foram submetidas à lise epurificadas por cromatografia por afinidade à GST, de acordo com oprotocolo padrão de microcoluna espiralada com GST, da Amersham, e aexpressão das proteínas GST e GST-MGC4504 monitoradas pela técnica deSDS-PAGE e western blotting, utilizando um anticorpo anti-GST(Amersham). A Figura 5 mostra etapas diferentes de expressão epurificação da proteína solúvel GST-MGC4504, indicando que a proteínasolúvel MGC4504 recombinante pode ser prontamente obtida em umsistema de expressão de E. coli.Exemplo 5:

Ensaio de HTS-receptivo para determinação de compostos quemodulam a expressão de MGC4504Materiais e MétodosA 5'-UTR da MGC4504 humana compreende nucleotídeos -4311 a +1 (em relação ao início transcricional): (nts 84361 - 88681 emseqüência genômica AC020661) foi amplificada por PCR e clonada via Xhole Bglll em pGL3neo básico resultando em pGL3neo básico MGC4504 -4311/+1. Outras construçõe truncadas foram geradas pela digestão dapGL3neo básica MGC4504 -4311/+1 com BfrBI, Xhol ou Avrll, esubseqüente fechamento com o fragmento de Klenow e digestão da Bglll.Os fragmentos resultantes foram ligados ao vetor pGL3neo básico, Kpnldigerido, fechado com fragmento de Klenow e subseqüentemente Bgllldigerido para obter os plasmídeos pGL3neo básico MGC4504 -1944/+1, -847/+1 e -546/+1. As identidades de todas as construções foramconfirmadas pelo seqüenciamento de células RIN-5F de insulinoma de rato eas células foram mantidas em RPMI 1640 com HEPES/L-glutamina/NaHC03(GIBCO # 52400-025), complementado com ouro FCS a 10% FCS gold,(PAA, #A15-609), solução de penicilina/estreptomicina (PAA #P11-010) epiruvato de sódio a 1 mM (Gibco #11360-039). As células HEK293 forammantidas em DMEM (GIBCO # 41965-039), complementado com ouro FCSa 10% (PAA, A 15-609), solução de penicilina/estreptomicina (PAA #P11-010) e L-glutamina a 1 mM (Gibco #25030-032). Todas as linhagens decélulas foram cultivadas a 37 °C em C02 a 5% e 95% de umidade e destasforam feitas culturas secundárias duas vezes, semanalmente. As célulasRIN-5F foram transfectadas transitoriamente com 1ng de pCMV-RL(Promega) e 0,4ng de pBluescript-SK+ (Stratagene), como veículo, equantidades diferentes de construções de vetor sem pGL3.1neo básico oupromotor de pGL3.1neo básico MGC4504-5'-UTR -4311/+1, -1944/+1 -847/+1 ou -546/+1, utilizando Fugene 6 (Roche) em placas de microtitulaçãocom 96 poços (Corning Costar #3610). As células HEK foram transfectadascom Polyfect (Qiagen). As transfecções foram conduzidas de acordo com oprotocolo do fabricante. As concentrações das construções pGL3.1neobásico foram otimizadas até 10ng (HEK) e 40ng (RIN5F) de plasmídeo porpoço para obter a atividade máxima do repórter. Todos os plasmídeosutilizados para transfecções foram isolados utilizando kits EndofreeMaxiPrep da Qiagen, de acordo com o protocolo dos fabricantes. Após 48horas, as células foram submetidas à lise, e as atividades da luciferase dovagalume e renilla determinadas de acordo com o protocolo dos fabricantes(Sistema de luciferase dupla da Promega), pela determinação das atividadescorrespondentes em um contador microbeta Wallac (Perkin Elmer). Osvalores da luciferase do vagalume foram normalizados para atividades daluciferase de renilla e comparados, em função de vezes de indução, acontroles sem pGL3.1neo básico. Uma linhagem de célula HEK293 foigerada com pGL3.1neo básico MGC4504-5'-UTR -4311/+1 e selecionadacom 500 |a.g/ml de geneticina (Gibco) e clones positivos foram selecionadospara atividades da luciferase. As células HEK MGC4504 5'-UTR —4311/+1que resultaram foram colocadas em placas de microtitulação com 96 poços(Corning Costar #3610) e cultivadas por 24 horas. Os compostos foramdissolvidos até uma concentração de 10mM em DMSO e diluídos até asrespectivas concentrações de trabalho (10 uM a 100 pM) em meio DMEM (#41965-039, Invitrogen), complementado com Ultroser a 2 % (#12039-012,Biosepra), solução de Penicilina-Estreptomicina a 1% (#15140-122,Invitrogen) e L-Glutamina a 2 mM (#25030-024, Invitrogen). Para efetuar oensaio para compostos capazes de modular a atividade dopromotor/transcripcional das construções do promotor da MGC4504, o meiopode ser aspirado das células e, por exemplo, 100ul do meio contendo osrespectivos compostos diluídos podem ser acrescentados diretamente.Depois de, por exemplo, 48 horas de incubação, as atividades da luciferasedo vagalume podem ser determinadas conforme descritas acima. Dados nãoprocessados podem ser transferidos para arquivos em excel e a relação deatividades do vagalume/ren/7/a, determinada para cada poço. As relações dedose/atividade podem ser determinadas em um XL-Fit (arranjo em Excel), deacordo com o protocolo dos fabricantes (IDBS). A Figura 6 mostra aatividade da MGC4504 5'-UTR posições -4311/+1 em linhagens celularesdiferentes em um ensaio de gene repórter transitório de luciferase dupla emuma configuração com 96 poços. Estes resultados mostram que a atividadedo promotor da MGC4504 pode ser avaliada em um ensaio de gene repórterreceptivo a HTS, que fornece relações suficientes de sinal para ruído emlinhagens celulares, refletindo o padrão de expressão de MGC4504 queocorre naturalmente.

Ademais, o promotor minimamente necessário para MGC4504está compreendido na MGR4504 5'-UTR posição-546/+1

Exemplo 6:

Hipoteticamente, ensaio celular receptivo a HTS que testa umasubstância em função de sua capacidade para influenciarpositivamente/estimular a atividade da proteína MGC4504

Para analisar a atividade da proteína MGC4504, um dosprocessos de acordo com a presente invenção poderia ser realizadoutilizando uma célula que expressa somente fracamente (por via endógenaou heterólada) a MGC4504 e que tenha uma sensibilidade à insulina fracaou moderada, fazendo o contacto da célula com uma substância em teste etestando se a sensibilidade à insulina é modulada (isto é, aumentada oudiminuída). O emprego de um ou mais células de controle negativo asseguraque a substância não module a sensibilidade à insulina pela modulação daquantidade presente da MGC4504 na referida célula (no transcrito ou emnível protéico), porém pela modulação da atividade da proteína MGC4504.

Uma linhagem celular (por exemplo, HEK293) é transfectadaestavelmente com um vetor de expressão que compreende a MGC4504, deacordo com a SEQ ID NO 1, sob o controle de um promotor como o SV40,conforme em pCDNA3.1 + higro HA-MGC4504 (ou um promotor mais fraco),de acordo com procedimentos padrões. Como um controle, a mesmalinhagem celular (por exemplo, HEK293) é transfectada estavelmente com omesmo vetor de expressão contendo um gene repórter como luciferase derenilla, sob o controle do mesmo promotor (por exemplo,. pCDNA3.1luciferase). Após incubação de ambas as células com a substância em teste,a absorção de glicose, estimulada por insulina, é determinada para as duascélulas, de acordo com procedimentos padrões, na presença e na ausênciada substância em teste. A atividade da luciferase é determinada tambémpara a célula de controle, por procedimentos padrões na presença eausência da substância em teste. Aquelas substâncias que forem capazesde aumentar a absorção de glicose, estimulada pela insulina, na célula queexpressa a MGC4504 e não aumentar a atividade da luciferase ou asensibilidade à insulina das células de controle, que não expressam aMCG4504, são as substâncias que podem ser consideradas para aumentara atividade da MGC4504

Exemplo 7

Expressão gênica de MGC4504 em modelo de diabetes tipo 2 induzido por dieta.

Materiais e Métodos

Animais e preparo de amostras:Fêmeas de ratos (Gmi, fa/fa) obesas, diabétias Zucker (ZDF),com idades combinadas, foram adquiridas da Genetic Models. Emdeterminado momento os ratos foram abrigados a 20°C em um ciclo de 12horas de claro-escuro com livre acesso a água e uma dieta altamentecalórica (Research Diets, USA) por diversas semanas. Todos osprocedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com a Lei deProteção a Animais da Alemanha. Os animais alimentados com a dietaaltamente calórica podem ser divididos em dois subgrupos: o grupo nãoresponsivo não desenvolveu o estado de diabetes tipo 2 (glicose sangüínea« 12mM), enquanto que o grupo responsivo desenvolveu (glicosesangüínea > 12mM). Sete animais do grupo responsivo e seis animais dogrupo não responsivo foram anestesiados com isofluorano e sacrificados pordeslocamento cervical. Amostras de pâncreas foram rapidamente retiradas etransferidas para RNAIater, foi realizada armazenagem de longa duração a -80°C.

Foram conduzidas análise genética com Affymetrix Gene Chip®eisolamento de RNA, conforme Exemplo 1, com duas exceções: não houverealização de digestão de proteinase K durante a preparação do RNA e ahibridização foi realizada utilizando-se arranjos de RAE 230_2representando aproximadamente 28000 genes de rato. Para a hibridização,os RNAs isolados foram combinados ao mesmo tempo em dois pools paracada grupo (não responsivo e responsivo). Foi realizada análise dos dadosutilizando-se Resolver 4.0 (Rosetta Inc, USA) de acordo com o manual dofornecedor do programa.

Os critérios para determinação de genes diferentementeexpressados eram alterações em níveis de expressão maiores do que 1,5vez e um valor de p < 0,001. A alteração de vezes de expressão do gene deMGC4504 entre os grupos responsivos e não responsivos foi analisadautilizando-se o qualificador Affymetrix 1389573_at em RAE 230_2. Oresultado desta análise está resumido na tabela 3.

Tabela 3

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O grupo responsivo que desenvolveu diabetes tipo 2, quandocomparado com os animais não responsivos, diminuiu significativamente osníveis de expressão de genes de MGC4504, que podem ser detectados poranálise de RNA isolado de biópsias de pâncreas por Affymetrix Gene Chip® .Isso indica que o desenvolvimento de diabetes tipo 2 , causado por umadieta altamente calórica, é associado com a diminuição dos níveis deexpressão gênica de MGC4504.

Literatura

Voss, M.D., Hille, A., Barth, S., Spurk, A., Hennrich, F., Holzer,D., Mueller-Lantzsch, N., Kremmer, E., Grasser, F.A. (2001) J. Virol 75,11781-90

Literatura para métodos laboratoriais padrões

Se não indicado de outra forma, os métodos laboratoriais padrão foram, ou podem ser, executados de acordo com os procedimentosrevelados na seguinte literatura padrão:

Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY. 545 pp;

Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g.Volume 2000; Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent,Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, KevinStruhl.

Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated; Wiley& Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R.Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R.Smith.

Current Protocols in Protein Science; regularly updated; Wiley &Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W.Speicher, Paul T. Wingfield.

Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D.,Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. NewYork & London, 1994;

Short Protocols in Molecular Biology, 5th edition, by Frederick M.Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D.Moore (Editor), J.G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl(Editor), October 2002, John Wiley & Sons, Inc., New York"

Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handboook. CA.Pinkert, editor; Academic Press Inc., San Diego, Califórnia, 1994 (ISBN:0125571658)

Gene targeting: A Practical Approach, 2nd Ed., Joyner AL, ed.2000. IRL Press at Oxford University Press, New York;

Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A,Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring HarborPress, New York;Listagem de Seqüência

<110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH

<120> Uso de MGC4504

<130> DE 2005/008

<140> 05005383.4

<141 > 2005-03-11

<160> 14

<170> Versão de Patente 2.1

<210>1

<211>1528

<212>DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

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aatagaggaa agaattgctc acaatcccaa 1380attgttactg tttttaagtt ttaatcatag 1440gccttaatat gcaatcatac acatgtttac 1500tttcccgaga caaactcgtg ctctgttgcc 1560tcactgcaac ctctgcctcc tgggttgaag 1620tgggatttca ggcacctgcc accatgcccg 1680ggggtttcac catgttgccc aggctggtct 1740cttggcctcc catagtgcta agactactgg 1800tattgtttct aatgtctgca caaatttaat 1860ctattgctgg gtatttaggt tgttttcttt 1920ttctgtcatg tgaatggtaa attgacataa 1980tttaagtagt ttttcttctt ttgtttttgc 2040cacgcctgta atctcagcac tttgggaggc 2100tgagatcagc ctggccaata tggcgaaacc 2160aggcgtggtg gcaggtgcct gtagtcccag 2220ttgaacctgg gaggcggagg ttgcagtgag 2280gcaacagaga gagactccac ctcaaaaaaa 2340aacaatgcat tgaaaatctt caggcatatg 2400aggagtattg ggtcaaaggg cagggatatt 2460ctttctcaaa gggttgtttg tgccaattca 2520cccacttccc ggactacaac ccacagctgg 2580gctaccaaca aaggaggtgc tcatatgaac 2640gactgaatgt gggaaatgga gagaaagcga 2700tgctggtaat tttttttttt tcctgattgg 2760agactttttc attactgttt aagtttgata 2820ctaactgttt aggtatattc ttccagatta 2880gaaatagctt tgtactatac acactgttgt 2940tcggaatgaa tatgtgaagt gtgaagatca 3000cgtttagttt aaatattgaa ttagaatcga atgagaagcc atgttgcaca ttgcccctgc 3060cagccatctc ctggccagtt tagagagaag gccttcagct gcctctgttt cccttttaca 3120gtcagtgaca tcccctgagg gcagtccctt gctgcgtatt gggtcaaccc ccggcggcct 3180gtggactcgg ctgggaggcc agaagccgag ggagaagacc agtagctggc catagtcttg 3240tgggggcctc actgggccct ccttgcccgc tgctcccgga accttgtgcc tatggattaa 3300tcattgctgc aaaatctcac gtccaggaag aattaaaccc atcgccttgg gggcaagact 3360agcctggctt ttgcatcttt atagcctttc tccgcaggtg cagccaccac ctccaaagtg 3420actgccggtc ggtccaagcg ctctaacagg ctcttccccg agcctacctg ggctcgaggg 3480gtcccacacc tggtccgggg cgtagcccat gtgaggcctg caagctccgg gcgcctggcc 3540tacctaactc agccccgcag tctctgcaga accccctgca gccccgtggc ccagtttctc 3600catttgctca caatggccaa cggcgtgagg cacttgagcg gaatgcggac ggtgcctccg 3660acagctttcc cgcagtgcat gatctcagga ggggccccag agacggaagt ttacgacgcc 3720cagagcgctc cttctggacg tgccctggac tcgacttggg actgagtctg tgccgcctag 3780gctggcaggg actcggccag atgcactagc ggcaaggctg ggctgacacc gcctgggact 3840cgctcgccgt acctccaagg ggcccaggtc atgagggggc ggctggggag acgcccgccc 3 900ggtgcccgcc ctgggcccgg cgggtgcccc ctgcccgccg cctgacgcaa tccgaggcgc 3 960ccttgctgca tgccggcgct ggagaaacct cccctgccgt tgcatcactc ctgccaggtt 4020tgccacagag gtggagctga accaatcagc gggcgcgctg ggcccgcggc gcggttaagt 4080gagaagcaga atccgaagtt gattggccaa aaggggattt gccccacccc aatcaccgcg 4140gcagctggcc gcggtgggcg tggtctcccg gcaagaaggt ttaaagggcg cctccatggg 4200gggcgctcag ctggagctac cgagcggtgc caggccaggt gtgtgcgtcc gtcggtcttt 4260ccgtgcccac gccggagacc agccccggag gccgcctggg cctatccctg tgccaggcac 4320catg 4324

<210>4

<211>24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 4

acttcgcctc cttctctgct ctcc 24

<210>5<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 5

ggccctgcta atcccacact acc

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 6

aagtccctca ccctcccaaa ag

<210>7

<211>22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 7

cctcaacacc tcaaaccact cc

<210>8

<211>20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 8

ggcagggaga caccttccat<210>9

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 9

tgcagccctc atgatcttca 20

<210> 10

<211>15

<212>DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 10

gctgccccga tggaa 15

<210>11

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 11

cgggatcccg catgaagcag gagtctgcag cc 32

<210>12

<211>62

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 12

cgggatcccg catgtaccca tacgacgtcc cagactacgc tatgaagcag gagtctgcag 60

cc 62<210> 13

<211>33

<212>DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: iniciador

<400> 13

ccggaattcc ggtcacacca gcgccagagc ctg 33

<210>14

<212>DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

atgaagcágg agtctgcagc cccgaacacc ccgcccacct cgeagtcccc tacgccgtcc 60

gctcagttcc cccgaaacga cggcgateet càagcgctgt ggattttcgg gtacggctcc 120

ctggtgtgga ggcccgactt cgcctaeagc gacagccgtg tgggcttcgt gcgcggctac 180

agccgccgtr tcxggcaggg agacaccttc catcggggca gcgacaagat gcctggccgt 240

gtggtgacgc tccttgaaga tcatgagggc tgcacttggg gcgtggcata ccaagtgeaa 300

9gggascagg taagcaaggc cctgaagtac ctgaatgtgc gagaggcagt gcttggtggc 360

tacgatacca aggaggtcac cttctatcce caagatgctc ctgaccaacc actgaaggca 420

xtggcctatg tggccacccc acagaaccct ggttacctgg gccctgcgcc tgaagaggcc 480

afctgcçacgc agatcetggc ctgccggggc ttccccggcc aeaaccttga atacttgetg 540

cgtctgçtag arttcatgca gctctgtggg cctcaggcgc aggacgagca cctggcaacc 600

atcgtggacg ctgtgggcac catgttgccc tgcttetgcc ccaccgagca ggctctggcg 660

ctggtgtgag 670

Claims (57)

1. Uso da proteína MCG4504, um derivado ou fragmentofuncional da mesma, ou um ácido nucléico que codifica a referida proteína,derivado ou fragmento para a identificação de substâncias ativas naprevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada por umadisfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídeos.

2. Processo para identificação de substâncias ativas naprevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada por umadisfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídios compreendendo:a. O contato de uma proteína MGC4504 com uma substância deteste; eb. A determinação se a substância modula a atividade daproteína MGC4504.

3. Processo para identificação de substâncias ativas naprevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada por umadisfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídios compreendendo:a. O contato de uma célula que tenha uma quantidade ouatividade diminuída da MGC4504 com uma substância em teste.b. A determinação se a substância em teste é capaz deaumentar a quantidade ou atividade da MGC4504, presente na célula.

4. Processo para identificação de substâncias ativas naprevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada por umadisfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídios compreendendo:a. O contacto de um ácido nucléico que codifica a proteínaMGC4504, derivado ou fragmento da mesma, com uma substância em testeem sistema com atividade transcricional.b. A determinação da quantidade de mRNA que codifica aproteína MGC4504, um derivado ou fragmento da mesma, presente noreferido sistema em presença da referida substância.c. A determinação da quantidade de mRNA que codifica aproteína MGC4504, um derivado ou fragmento da mesma, presente noreferido sistema na ausência da referida substância.d. A determinação se a substância é capaz de modular aquantidade do mRNA da MGC4504, presente no referido sistema.

5. Processo para identificação de substâncias ativas naprevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada por umadisfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídios compreendendo:a. O contacto de um ácido nucléico que codifica a proteínaMGC4504, um derivado ou fragmento da mesma, com uma substância emum sistema com atividade transcricional.b. A determinação da quantidade da proteína MGC4504, de umderivado ou fragmento da mesma, presente no referido sistema em presençada referida substância.c. A determinação da quantidade da proteína MGC4504, de umderivado ou fragmento da mesma, presente no referido sistema na ausênciada referida substância.d. A determinação se a substância é capaz de modular aquantidade da proteína MGC4504, de um derivado ou fragmento, presenteno referido sistema.

6. Processo para identificação de substâncias ativas naprevenção ou tratamento de uma doença associada ou provocada por umadisfunção do metabolismo de carboidratos ou de lipídios compreendendo:a. O fornecimento de uma célula transfectada com um vetor deácido nucléico, compreendendo o promotor da MGC4504 ou um fragmentofuncional da mesma, operacionalmente acoplado a um gene repórter ou umfragmento funcional do mesmo;b. O fornecimento de uma célula transfectada com um vetor decontrole que compreende um gene repórter, ou fragmento funcional domesmo, o qual não está sendo operacionalmente acoplado a um promotorfuncional da MGC4504;c. A determinação da atividade do gene repórter da célula, deacordo com a) e b), na ausência de uma substância;d. A determinação da atividade do gene repórter na presença dareferida substância;em que uma substância ativa é uma substância capaz deaumentar a atividade do gene repórter, de acordo com a) sem aumentar aatividade do gene repórter de b).

7. Uso de um meio para a detecção da MGC4504 para odiagnóstico de uma doença ou de uma predisposição para uma doençaassociada ou provocada por uma disfunção do metabolismo de carboidratosou de lipídeos em uma amostra isolada de um indivíduo.

8. Uso de um meio para a detecção de MGC4504 para aprodução de um kit diagnóstico, utilizado para identificação de uma doençaou uma predisposição para uma doença associada ou provocada pordisfunções do metabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos.

9. Processo para o diagnóstico de uma doença ou de umapredisposição para uma doença associada ou provocada por uma disfunçãodo metabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos, compreendendo a análiseda quantidade da MGC4504 presente em uma amostra isolada de umindivíduo, em que uma quantidade diminuída de MGC4504, presente nareferida amostra em comparação com uma ou mais amostras de referência,é indicativa da predisposição ou doença.

10. Processo para o diagnóstico de uma doença oupredisposição para uma doença associada ou provocada por uma disfunçãodo metabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos, compreendendo a análisede uma amostra isolada de um indivíduo para detecção de mutações daMGC4504 em comparação a uma seqüência de referência da MGC4504, emque a presença de uma mutação é indicativa da doença ou dapredisposição.

11. Processo para o diagnóstico de uma doença oupredisposição para uma doença associada ou provocada por uma disfunçãodo metabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos, compreendendo a análisede uma amostra isolada de um indivíduo para detecção decomprometimento ou diminição da atividade da MGC4504 em comparação auma seqüência de referência da MGC4504, em que a presença de umcomprometimento ou diminuição da atividade é indicativa da doença ou dapredisposição.

12. Kit para a identificação de uma doença ou predisposiçãopara uma doença associada ou provocada por disfunções do metabolismode carboidratos ou de lipídeos, compreendendo pelo menos um meio para adetecção da MGC4504.

13. Processo para adaptação da medicação para o tratamentoou prevenção de uma doença associada ou provocada por disfunções dometabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos, em que uma amostra isoladade um indivíduo é analisada para detecção de uma mutação da MGC4504em comparação a uma seqüência de referência ou uma quantidade ouatividade diminuída da MGC4504, em comparação a uma amostra dereferência, em que a medicação é adaptada se uma mutação ou umaquantidade ou uma atividade diminuída da MGC4504 estiver presente naamostra.

14. Uso de MGC4504 ou de um fragmento funcional ou derivadoda mesma ou de uma composição de material que compreenda a MGC4504ou um fragmento funcional ou derivado da mesma para a produção de ummedicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença associada ouprovocada por uma disfunção do metabolismo de carboidratos ou delipídeos.

15. Processo para tratamento de um indivíduo que sofra de umadoença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismo decarboidratos ou de lipídeos, compreendendo a modulação e, de preferência,o aumento da quantidade de MGC4504 no indivíduo.

16. Uso de uma substância que module a atividade daMGC4504 para a produção de um medicamento para o tratamento ouprevenção de uma doença associada ou provocada por uma disfunção dometabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos.

17. Processo para tratamento de um indivíduo que sofra de umadoença associada ou provocada por uma disfunção do metabolismo decarboidratos ou de lipídeos, compreendendo a administração de umasubstância que module a atividade da MGC4504 no indivíduo.

18. Uso de uma célula que expressa de modo heterólogo aMGC4504 para a identificação de substâncias ativas no tratamento ouprevenção de doenças associadas ou provocadas por disfunções dometabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos.

19. Uso de um animal não humano que expressa de modoheterólogo a MGC4504 para a identificação de substâncias ativas notratamento ou prevenção de doenças associadas ou provocadas pordisfunções do metabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos.

20. Uso de uma célula em que a MGC4504 está em knockoutpara a identificação de substâncias ativas no tratamento ou prevenção dedoenças associadas ou provocadas por disfunções do metabolismo decarboidratos e/ou de lipídeos.

21. Uso de um animal não humano em que a MGC4504 está emknockout para a identificação de substâncias ativas no tratamento ouprevenção de doenças associadas ou provocadas por disfunções dometabolismo de carboidratos e/ou de lipídeos.

22. Iniciador com uma seqüência de nucleotídeos de acordo coma SEQ ID NO 8 ou 9.

23. Sonda de ácido nucléico com uma seqüência denucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO 10.

24. Seleção de Alto Rendimento (HTS) com base em um comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 2 a 6.

25. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 14, processo deacordo com uma das reivindicações 1, 4 ou 5 ou HTS de acordo com areivindicação 24, em que a MGC4504, o derivado ou fragmento da mesma éutilizado como uma molécula isolada.

26. Uso de acordo com a reivindicação 1, processo de acordocom uma das reivindicações 2, 4 ou 5 ou HTS de acordo com areivindicação 24, em que a MGC4504, o derivado ou fragmento da mesma éutilizado em um ensaio bioquímico ou celular.

27. Uso, processo ou HTS de acordo com a reivindicação 26, emque o ensaio é um ensaio celular e as células são transfectadastransitoriamente ou estavelmente e, de preferência, transfectadasestavelmente para expressar de modo heterólogo a MGC4504.

28. Uso, processo ou HTS de acordo com a reivindicação 27, ouuso de acordo com uma das reivindicações 18 ou 20, em que a célula é umacélula de mamífero.

29. Uso, processo ou HTS de acordo com a reivindicação 28, emque a célula é uma célula de roedor, de preferência, uma célula murina.

30. Uso, processo ou HTS de acordo com a reivindicação 28, emque a célula é uma célula humana.

31. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 21, em que oanimal é vertebrado ou invertebrado, de preferência, um vertebrado, maispreferencialmente um mamífero não humano e ainda maispreferencialmente; um camundongo ou um rato.

32. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que aMGC4504, expressada de modo heterólogo, é um transgene.

33. Uso de acordo com a reivindicação 1, 14 ou 16, processo deacordo com a reivindicação 2 a 6, 15 ou 17, ou HTS de acordo com areivindicação 24, em que a MGC4504 é de mamífero e, de preferência, aMGC4504 humana.

34. Uso de acordo com a reivindicação 7 ou 16 ou processo deacordo com uma das reivindicações de 9 a 11, 13, 15 ou 17, em que oindivíduo é um indivíduo humano.

35. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 14, processo deacordo com a reivindicação 3, 5, 9 ou 10, kit de acordo com a reivindicação 12, ou HTS de acordo com a reivindicação 24, em que a MGC4504 ou oderivado ou fragmento da mesma é um ácido nucléico.

36. Uso, processo ou seleção de alto rendimento de acordo coma reivindicação 35 ou processo de acordo com a reivindicação 4, em que oácido nucléico compreende ou consiste em uma das seguintes seqüências:a. A seqüência de acordo com a SEQ ID NO 1 ou 14;b. Uma seqüência capaz de se hibridizar com uma seqüência deacordo com a) em condições de baixo, moderado ou alto rigor e que codificauma proteína ou polipeptídeo com função de MGC4504;c. Uma seqüência derivada de uma seqüência de acordo com a)ou b), decorrente da degeneração do código genético e que codifica umaproteína ou polipeptídeo com função de MGC4504;d. Um fragmento de uma das seqüências de acordo com a), b)ou c), que codifica um polipeptídeo com função de MGC4504, em que aproteína ou polipeptídeo possui uma seqüência de polipeptídeoscompreendendo ou consistindo na seqüência de acordo com a SEQ ID NO 2;e. Uma seqüência derivada de uma das seqüências de acordocom a), b), c) ou d) por meio de uma troca de um ou mais nucleotídeos, emque a troca do nucleotídeo não é ou não é exclusivamente decorrente dadegeneração do código genético e que codifica uma proteína ou polipeptídeocom função de MGC4504.

37. Uso de acordo com a reivindicação 1, 14 ou 16, processo deacordo com a reivindicação 3, 5, 9, 10 ou 17, kit de acordo com areivindicação 12, ou HTS de acordo com a reivindicação 24, em que aMGC4504 ou o derivado ou fragmento da mesma é uma proteína oupolipeptídeo.

38. Uso, processo, kit ou seleção de alto rendimento de acordocom a reivindicação 37, uso de acordo com a reivindicação 2 ou processo deacordo com uma das reivindicações 2 ou 4, em que o polipeptídeo ouproteína é codificado por uma das seguintes seqüências:a. A seqüência de acordo com a SEQ ID NO 1 o 14;b. Uma seqüência capaz de se hibridizar com a seqüência deacordo com a), em condições de baixo, moderado ou alto rigor e quecodifique uma proteína ou polipeptídeo com função de MGD4504;c. Uma seqüência derivada de uma seqüência de acordo com a)ou b), decorrente da degeneração do código genético e que codifique umpolipeptídeo com função de MGC4504;d. Um fragmento de uma das seqüências de acordo com a), b)ou c), que codifique um polipeptídeo com função de MGC4504;e. Uma seqüência derivada de uma das seqüências de acordocom a), b), c) ou d) pela troca de um ou mais nucleotídeos, em que a trocado nucleotídeo não é ou não é exclusivamente decorrente da degeneraçãodo código genético, e que codifique um polipeptídeo com função deMGC4504;

39. Uso, processo, kit de seleção de alto rendimento, de acordocom a reivindicação 37 ou 38, em que a proteína ou polipeptídeocompreende ou consiste na seqüência de acordo com a SEQ ID NO 2.

40. Uso, processo ou seleção de alto rendimento, de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, em que a doença é síndromemetabólica, obesidade, diabetes mellitus tipo I ou II ou resistência à insulinae, de preferência, resistência à insulina.

41. Uso, processo ou seleção de alto rendimento de acordo comuma das reivindicações anteriores, em que a modulação é uma ativação.

42. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o generepórter é um gene que codifica a luciferase de renilla ou vagalume, proteínafluorescente verde ou azul, beta-galactosidase ou cloranfenicol-acetil-transferase.

43. Processo como definido em uma das reivindicações 3, 6, 18ou 20, em que a célula é uma célula primária ou pertence a uma linhagemcelular.

44. Processo de acordo com a reivindicação 43, em que a célulaé uma célula HEK293, RIN-5F, CHO OU NIH3T3.

45. Uso de acordo com uma das reivindicações 18 ou 30, emque a célula é isolada de um animal transgênico não humano.

46. Uso de acordo com a reivindicação 28, em que a célula éisolada de um animal silenciado não humano.

47. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que atransfecção é uma transfecção transitória ou estável e, de preferência, umatransfecção estável.

48. Processo como definido em uma das reivindicações 11 ou 34, compreendendo a administração para o referido indivíduo de umaquantidade efetiva de MGC4504.

49. Processo de tratamento de acordo com uma dasreivindicações 11 ou 34, compreendendo o aumento endógeno do nível doestado de equilíbrio da MGC4504.

50. Processo de acordo com a reivindicação 9, compreendendoo uso de um meio para analisar especificamente o nível de mRNA daMGC4504 e, de preferência, o uso de uma sonda de ácido nucléicoespecífica da MGC4504 ou um conjunto de iniciador capaz de amplificarespecificamente o cDNA da MGC4504, ou um fragmento do mesmo.

51. Processo de acordo com a reivindicação 9, compreendendoo uso de um meio para analisar especificamente o nível da proteínaMGC4504 e, de preferência, o uso de um anticorpo específico da MGG4504.

52. Uso de acordo com uma das reivindicações 7 ou 8, processode acordo com a reivindicação 9 ou kit de acordo com a reivindicação 12utilizando um meio para detectar o mRNA da MCG4504 e, de preferência,uma sonda de mRNA ou um conjunto de Iniciador capaz de amplificar omRNA ou cDNA da MGC4504.

53. Uso de acordo com uma das reivindicações 7 ou 8, processode acordo com a reivindicação 9 ou kit de acordo com a reivindicação 12utilizando um meio para detectar a proteína MGC4504 e, de preferência, umanticorpo específico da MGC4504.

54. Uso de acordo com uma das reivindicações 7 ou 8, processode acordo com a reivindicação 10 ou kit de acordo com a reivindicação 12utilizando um meio para detectar mutações no ácido nucléico da MCG4504e, de preferência, uma sonda de ácido nucléico ou um conjunto de Iniciadorcapaz de amplificar o ácido nucléico da MGC4504.

55. Uso de acordo com uma das reivindicações 7 ou 8, processode acordo com a reivindicação 10 ou kit de acordo com a reivindicação 12utilizando um meio para detectar mutações na proteína MGC4504 e, depreferência, um anticorpo específico da MGC4504.

56. Uso de acordo com a reivindicação 7 ou kit de peças comodefinido na reivindicação 9, em que o meio é um meio para analisarespecificamente o mRNA ou DNA genômico da MGC4504 e, de preferência,compreendendo ou sendo uma sonda de ácido nucléico específica daMGC4504 ou um conjunto de iniciador capaz de amplificar o genoma daMGC4504 ou cDNA ou um fragmento dos mesmos.

57. Uso de uma célula knockout ou animal de acordo com umadas reivindicações 20 ou 24, em que o knockout é um knockout funcional ougenômico.