JP4960951B2 - Mgc4504の使用 - Google Patents
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Description
a.MGC4504タンパク質と、試験物質とを接触させること;および、
b.該物質が、MGC4504タンパク質の活性を調節するかどうかを決定すること。
a.MGC4504の量または活性が減少している細胞と、試験物質とを接触させること;
b.該試験物質が、該細胞中のMGC4504の量または活性を増加させることができるかどうかを決定すること。
a.転写活性を有する系で、MGC4504タンパク質、それらの誘導体またはフラグメントをコードする核酸と、試験物質とを接触させること;
b.該物質の存在下において該系に存在するMGC4504タンパク質、それらの誘導体またはフラグメントをコードするmRNAの量を決定すること;
c.該物質の非存在下において該系に存在するMGC4504タンパク質、それらの誘導体またはフラグメントをコードするmRNAの量を決定すること;
d.該物質が、前記系中に存在するMGC4504のmRNAの量を調節できるかどうかを決定すること。
a.翻訳活性を有する系で、MGC4504タンパク質、それらの誘導体またはフラグメントをコードする核酸と、物質とを接触させること;
b.該物質の存在下において該系に存在するMGC4504タンパク質、誘導体またはフラグメントの量を決定すること;
c.該物質の非存在下において該系に存在するMGC4504タンパク質、誘導体またはフラグメントの量を決定すること;
d.該物質が、該系中に存在するMGC4504タンパク質、誘導体またはフラグメントの量を調節できるかどうかを決定すること。
a.レポーター遺伝子またはそれらの機能的なフラグメントに使用できるようにカップリングされたMGC4505プロモーターまたはそれらの機能的なフラグメントを含む核酸ベクターでトランスフェクションされた細胞を提供すること;
b.機能的なMGC4504プロモーターに使用できるようにカップリングされていないレポーター遺伝子またはそれらの機能的なフラグメントを含むコントロールベクターでトランスフェクションされた細胞を提供すること;
c.物質の非存在下で、a)およびb)に記載の細胞のレポーター遺伝子の活性を決定すること;
d.該物質の存在下においてレポーター遺伝子の活性を決定すること;
を含み、ここにおいて、b)に記載のレポーター遺伝子の活性を有意に増加させないで、a)に記載のレポーター遺伝子の活性を有意に増加させることができる物質(すなわちMGC4504プロモーターの活性を特異的に増加させることができる物質)が、炭水化物または脂質代謝の不全に関連する病気、または、それによって引き起こされる病気の予防または治療において活性な物質とみなされる。
1.単離されたサンプルに存在するMGC4504の量(タンパク質、または、mRNA)の検出;ここにおいて、参照サンプルと比較して量が低いことが、素因または病気を有することを示す。
2.単離されたサンプルに存在するMGC4504の活性の検出;ここにおいて、参照サンプルと比較して活性が低いことが、素因または病気を有することを示す。
3.MGC4504の量を低くしたり、または、活性を低めたり、または、機能不全をもたらす、MGC4504タンパク質/遺伝子/コード配列/プロモーターなどにおける突然変異の検出;ここにおいて、突然変異が検出されることが、素因または病気を有することを示す。
a.配列番号1;
b.MGC4504機能を有するポリペプチドをコードする、低い、中程度の、または、高いストリンジェンシー条件下でa)に記載の配列とハイブリダイズすることができる配列;
c.MGC4504機能を有するポリペプチドをコードする、a)またはb)に記載の配列から遺伝子コードの縮重によって誘導された配列;
d.MGC4504機能を有するポリペプチドをコードし、さらに配列番号2に記載の配列を含む、または、それらからなるポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか一種のフラグメント;
e.MGC4504機能を有するポリペプチドをコードする、a)、b)、c)またはd)に記載の配列のいずれか一種から、1個またはそれ以上のヌクレオチド置換によって誘導された配列(ここにおいて、該ヌクレオチド置換は、遺伝子コードの縮重によるものではないか、または、単にそれだけによるものではない)。
1)標識プローブと、解析される核酸サンプルとが、65℃で、または、オリゴヌクレオチドプローブの場合、オリゴヌクレオチドとサンプルとからなる二重鎖のアニーリングまたは融解温度(アニーリングおよび融解温度は、以下、同義語として理解される)より5℃低い温度で一晩、50mMのトリス(pH7,5)、1MのNaCl、1%SDS、10%硫酸デキストラン、0,5mg/ml変性サケまたはニシン精液DNA中で、ハイブリダイゼーションすること。
2)2×SSC中で、室温で10分間洗浄すること。
3)1×SSC/0.1%SDS中で、65℃(または、オリゴヌクレオチドの場合:
アニーリング温度より5℃低い温度で)で30分間洗浄すること。
4)0,1×SSC/0,1%SDS中で、65℃(または、オリゴヌクレオチドの場合:アニーリング温度より5℃低い温度で)で30分間洗浄すること。
a.配列番号1;
b.MGC4504機能を有するポリペプチドをコードする、低い、中程度の、または、高いストリンジェンシー条件下でa)に記載の配列とハイブリダイゼーションすることができる配列;
c.MGC4504機能を有するポリペプチドをコードする、a)またはb)に記載の配列から遺伝子コードの縮重によって誘導された配列;
d.MGC4504機能を有するポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか一種のフラグメント;
e.MGC4504機能を有するポリペプチドをコードする、a)、b)、c)またはd)に記載の配列のいずれか一種から、1個またはそれ以上のヌクレオチド置換によって誘導された配列(ここにおいて、該ヌクレオチド置換は、遺伝子コードの縮重によるものではないか、または、単にそれだけによるものではない)。
表1:痩せたインスリン感受性コントロール、および、太ったインスリン耐性または糖尿病ZDFラットの組み合わせた複製における、MGC4504遺伝子発現のアフィメトリックス・ジーン・チップ(Affymetrix Gene Chip(R))解析である。
表2:痩せたインスリン感受性コントロール、および、太ったインスリン耐性または糖尿病ZDFラット由来のRNAサンプルの定量リアルタイムPCRである。
表3:
2型糖尿病の食餌誘導性モデルにおけるMGC4504遺伝子発現のアフィメトリックス・ジーン・チップ(R)分析である
図2:L6GLUT4myc筋原細胞におけるHA−MGC4504の安定な発現である。
図3:一時的にトランスフェクションされたL6GLUT4myc(図3A)、および、RIN−5F(図3B)細胞の細胞質および細胞核における、MGC4504の細胞内分配である。
図4:
図4A:2−デオキシグルコース摂取分析、および、L6GLUT4myc HA−MCG4504細胞のインスリン感受性の増加である。
図4B:RIN−5F HA−MGC4504細胞の、インスリン分泌分析、ならびに、基底のインスリン分泌およびグルコース刺激によるインスリン分泌の増加である。
図5:可溶性GST−MGC4504タンパク質の発現および精製の際に採取した様々なサンプルのクーマシー染色である。
図6:
図6A:一時的な96ウェルフォーマットのデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子分析における、異なる細胞系におけるMGC4504の5’−UTR位−4311/+1の活性である。
図6B:HEK293細胞で、一時的な96ウェルフォーマットのデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子分析で異なるトランケーションされたプロモーターフラグメントを分析することによる、MGC4504の5’−UTR位−4311/+1内のMGC4504コアのプロモーターの実験的な決定である。
図7:ヒトMGC4504のコード配列である(配列番号1)。
図8:ヒトMGC4504の誘導されたアミノ酸配列である(配列番号2)。
図9:ヒトMGC4504のゲノム配列である(配列番号3)。
図10:ラットMGC4504のmRNAの特異的な増幅のためのプライマーである(配列番号4および5)。
図11:ラットのベータアクチンのmRNAの特異的な増幅のためのプライマーである(配列番号6および7)。
図12:ヒトMGC4504のmRNAの特異的な増幅のためのプライマー(配列番号8および9)、および、ヒトMGC4504のmRNAの特異的なハイブリダイゼーションのためのプローブである(配列番号10)。
図13:cDNAからヒトMGC4504のORFをクローニングするためのプライマーである(配列番号11〜13)。
図14:コード配列を含むヒトMGC4504のcDNA配列のフラグメントである(配列番号14)。
材料および方法
動物およびサンプルの調製:
太った雄Zucker糖尿病肥満(ZDF)ラット(Gmi,fa/fa)の年齢を適合させた群とそれらの痩せた同腹子(Gmi,+/?)を、ジェネティック・モデルス(Genetic Models)から購入した。輸送から回復させるために到着から1週間、20℃で、12時間の明暗サイクルで、水と、4%脂肪、64%炭水化物、および、19%タンパク質を含む標準的なラット用エサ(アルトロミン(Altromin),ドイツ)を自由に摂取できるようにして、ラットをペアで飼育した。全ての実験手法は、ドイツ動物保護法(German Animal Protection Law)に従って行われた。2時間の飢餓後に、イソフルラン麻酔下で血液サンプルを採取し、頚部脱臼によって動物を死なせた。遺伝子発現解析に用いられた動物の総数は、34匹の動物であった(6週齢[n=12匹の動物]、7週齢[n=12匹の動物]、および、12週齢[n=10匹の動物])。組織プローブを迅速に切り出し、液体窒素中で軽く叩いて凍結させ、−80℃で保存した。
遺伝子発現をモニターするためのオリゴヌクレオチドアレイの一般的な使用は、US6,177,248で説明されている。我々の実際の適用において、用いられたマイクロアレイは、約8000種の既知の遺伝子、または、ESTクラスターを示すデゾキシヌクレオチド配列を含む。遺伝子またはEST配列はそれぞれ20対以下のオリゴヌクレオチドで示され、それぞれの対は、転写セグメントにマッチする1つのオリゴ、および、中心に位置する1bpのミスマッチを含むコントロールオリゴからなる。ラットに関して、既知の遺伝子またはEST配列のデータベースから誘導された総計で約24000種の遺伝子およびEST配列を示す3種のアレイ(RG U34A、RG U34B、および、RG U34C)が、アフィメトリックス(サンタクララ,カリフォルニア州,米国)によって提供された。ウルトラトゥラックス(UtraTurrax)ホモジナイザー(Janke and Kunkel IKA Labortechnik)を用いて、骨格筋プローブ(M.大臀筋)150mgをキアゲン(Qiagen)のRLT緩衝液に溶解させた。組織溶解産物由来のトータルRNAを、キアゲンRNイージー(RNeasy)キットを用いて、製造元(キアゲン)が推奨する通りに、プロテイナーゼK消化、DNアーゼ消化および追加のRNイージー洗浄を含む工程によって単離した。スーパースクリプト(Superscript)SSII RTポリメラーゼシステム(インビトロジェン(Invitrogen))、および、T7RNAポリメラーゼプロモーターに連結したT7(dT)24プライマー、および、オリゴ(デオキシチミジン)24を用いて、それぞれのトータルRNA(10μg)を用いて第一および第二鎖のcDNA合成を行った。二本鎖cDNAをフェノール−クロロホルム抽出し、続いてエタノール沈殿し、RNアーゼ−自由水(12μl)に再懸濁した。エンゾ(Enzo)製のバイオアレイ高収率RNA転写標識キット(エンゾ・ダイアグノースティック(Enzo Diagnostics))を用いて、ビオチン−UPTおよび−CTPで標識したcRNAをインビトロで転写し、RNイージー洗浄とエタノール沈殿によって精製した。UV分光光度法、アガロースゲル電気泳動、および、バイオアナライザーRNAチップ(BioAnalyzer RNA chip,アジレント(Agilent))による各精製工程の前後に、トータルRNAおよびcRNAそれぞれのアリコートをモニターした。cRNAサンプル(15μg)を、40mMのトリス/酢酸塩(pH8.1)、100mMのKOAc、および、30mMのMgOAc中で94℃で35分間断片化し、ハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、アフィメトリックス・ジーン・チップ(R) RG−U34 A、BおよびCマイクロアレイに、45℃、60rpmで16時間ハイブリダイズした。アフィメトリックスが説明している方法に従って、マイクロアレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン複合体(モレキュラープローブス(Molecular Probes))、抗ストレプトアビジン抗体で二重に染色し、再度ストレプトアビジン−フィコエリトリン複合体で染色し、シグナル強度を強化した。洗浄の後に、共焦点ジーンアレイ・スキャナー(GeneArray Scanner,HP)で、マイクロアレイ・スート(Micro array Suite)バージョン4.0ソフトウェアを用いてマイクロアレイを解析した。各チップの品質管理は、平均差、測定したままの強度、および、ハウスキーピング遺伝子のベータアクチンとGAPDHとの3’/5’比率などのアフィメトリックスの品質基準に従って行った。全てのマイクロアレイに全般的な標準化を行う社内のソフトウェアツール(GECKO2)を用いて、それぞれの群に関する参照チップと中央数の75パーセンタイル値を用いて、発現のプロファイリングデータを解析した。差異的に発現される遺伝子を決定するための基準は、2倍を超えて高い発現レベルの変化と、0.05未満のp値とした。痩せたインスリン感受性コントロール、および、太ったインスリン耐性(または、12週齢の群として、すでに糖尿病の)ZDFラットの組み合わせて用いられた全ての複製間のMGC4504の遺伝子発現の変化倍数を、RGU−34Aでアフィメトリックス・クオリファイヤーRC_AI170665_ATを用いて解析した。表1に、これらの解析の結果を要約する。
6および7週齢の群の各ラット(n=24匹の動物)から単離されたトータルRNA(1μg)を、反応体積20μlで、AMV−RT第一鎖cDNA合成キット(ロシュ)を用いて逆転写した。逆転写した一本鎖cDNA(2μl)を、製造元の説明書に従ってファストスタートDNAマスターSybrグリーン(FastStart DNA Master Sybr Green,ロシュ)を用いたライトサイクラー(LightCycler(R),ロシュ診断会社)での増幅のためのテンプレートとして用いた。用いられたプライマーは、以下の通りであった:5’−ACTTCGCCTCCTTCTCTGCTCTCC−3’(配列番号4,5’ラットMGC4504)、および、5’−GGCCCTGCTAATCCCACACTACC−3’(配列番号5,3’ラットMGC4504)、5’−AAGTCCCTCACCCTCCCAAAAG−3’(配列番号6,5’ラットベータアクチン)、および、5’−CCTCAACACCTCAAACCACTCC−3’(配列番号7,3’ラットベータアクチン)。得られたフラグメント(それぞれ156および268塩基対)の正確なサイズは、アガロースゲル電気泳動によってモニターした。それぞれの増幅したフラグメントの濃度標準曲線を用いてトータルRNA含量を計算し、ハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの発現レベルに標準化し、これを表2に、痩せたインスリン感受性コントロールと太ったインスリン耐性ZDFラットとの間のMGC4504の遺伝子発現の変化倍数として要約した。
材料および方法
ヒト組織におけるMGC4504遺伝子発現のTaqMan解析:
様々なヒト組織におけるMGC4504発現レベルを、プライマー5’−GGCAGGGAGACACCTTCCAT−3’(5’ヒトMGC4504、配列番号8)、および、5’−TGCAGCCCTCATGATCTTCA−3’(3’ヒトMGC4504,配列番号9)、および、プローブ5’−GCTGCCCCGATGGAA−3’(配列番号10)を用いたTaqMan解析によって決定した。全ての値をヒトベータ−2−ミクログロブリンの発現レベルに標準化し、ローディングが等しくなるように統一した。図1は、試験される様々なヒト組織の選択された部分におけるMGC4504遺伝子発現レベルを要約する。
材料および方法
クローニングおよびプラスミド:
ヒトMGC4504の完全なORFを、5’−プライマーMGC4504−5’:5’−CGGGATCCCGCATGAAGCAGGAGTCTGCAGCC−3’(配列番号11)、または、HA−MGC4504−5’:5’−CGGGATCCCGCATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTATGAAGCAGGAGTCTGCAGCC−3’(配列番号12)、および、MGC4504−3’−STOP:5’−CCGGAATTCCGGTCACACCAGCGCCAGAGCCTG−3’(配列番号13)を用いたPCRでヒト骨格筋のcDNAから増幅した。後者の5’プライマーには、フレーム内にHA−エピトープタグを有するアミノ末端をコードする配列が導入された。得られたフラグメントを、pGEX−6P1およびpcDNA3.1(+)ハイグロ(hygro)ベクター(インビトロジェン)に、BamHI/EcoRIまたはBamHI(5’)、および、平滑末端化された(3’)EcoRI(インサート)、および、NotI(ベクター)部位でクローニングし、それぞれpGEX−6P1MGC4504、または、pcDNA3.1(+)ハイグロHA−MGC4054を得た。配列解析によって全てのコンストラクトの同一性を確認した。
myc−エピトープタグを有するGLUT4を発現するラットL6GLUT4myc筋原細胞は、A.Klip氏からのある種の寄贈である(The Hospital for Sick Children,トロント,オンタリオ州,カナダ)。L6(ATCC番号:CRL−1458)、および、L6GLUT4mycを、10%FCSゴールド(PAA,A15−609)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA番号P11−010)が添加されたグルタマックス(Glutamax,ギブコ(Gibco)番号32571)を含むアルファ−MEM中で維持した。GLUT4myc発現を選択するために、L6GLUT4mycの培地に、さらに2μg/mlブラストサイジン(カルバイオケム(Calbiochem)番号203350)を添加した。RIN−5Fラットのインスリノーマ細胞(ATCC番号:CRL−2058)を、10%FCSゴールド(PAA,番号A15−609)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA番号P11−010)、および、1mMのピルビン酸ナトリウム(ギブコ番号11360−039)が添加されたHEPES/L−グルタミン/NaHCO3(ギブコ番号52400−025)を含むRPMI1640中で維持した。HEK293細胞(ATCC番号:CRL−1573)を、10%FCSゴールド(PAA,A15−609)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA番号P11−010)、および、1mMのL−グルタミン(ギブコ番号25030−032)が添加されたDMEM(ギブコ番号41965−039)中で維持した。全ての細胞系を、37℃で、5%CO2中で、95%湿度で培養し、週2回継代培養した。タンパク質発現を研究するためのトランスフェクションを、6ウェルプレート中で60%密集度まで増殖させたL6GLUT4mycまたはRIN−5F細胞、プラスミドDNA(2.5μg)、および、フージーン6(Fugene 6)試薬(ロシュ)を用いて製造元が推奨する通りに行った。全ての一過性トランスフェクション、または、安定して選択された細胞クローンにおいて、空のpcDNA3.1(+)ハイグロベクターをネガティブコントロールとして用いた(以下、WT細胞という)。安定な細胞クローンを500μg/mlハイグロマイシンBで選択し、耐性を有する単一の細胞クローンを手動でピックアップし、増殖させた。HA−MGC4504発現レベルを、SDS−PAGE、および、抗HA3F10モノクローナル抗体(ロシュ)、および、抗ラットホースラディッシュペルオキシダーゼ 二次抗体を用いたウェスタンブロッティング(NuPAGE、インビトロジェン)、ならびに、ECL化学ルミネセンス検出(アマシャム(Amersham))によって決定した。説明されている通りに、カバースライド上で70%密集度まで増殖させた安定なL6GLUT4mycもしくはRIN−5F HA−MGC4504細胞、または、pcDNA3.1(+)HA−MGC4504で一時的にトランスフェクションしたL6GLUT4mycもしくはRIN−5F細胞を用いて免疫蛍光分析を行った(Voss等,2001)。抗HA3F10抗体(ロシュ)、および、抗ラット・アレクサ・フルオロ488(alexa fluor 488)抗体(モレキュラープローブス)を用いて、HA−MGC4504発現をモニターした。PBS(モレキュラープローブス)中の1μMのToProヨウ化物を用いて核を可視化した。共焦点像をライカ(Leica)のTCS SP2共焦点レーザー走査型顕微鏡で撮影した。図2は、L6GLUT4myc筋原細胞におけるHA−MGC4504の安定な発現を示す。図3は、一時的にトランスフェクションされたL6GLUT4myc(図3A)、および、RIN−5F(図3B)細胞の細胞質および細胞核におけるMGC4504の細胞内分布を示す。
96ウェルのサイトスター−T(Cytostar−TTM)シンチレーションマイクロプレート(アマシャム)中で、ウェルあたり4.0×104個の生存可能な細胞で、L6GLUT4myc細胞、または、L6GLUT4myc HA−MGC4504、および、WT細胞クローンを平板培養した。32時間後、2%ウシ胎児血清(PAA)、および、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA番号P11−010)が添加されたアルファ−MEMを用いて、細胞を16時間血清飢餓の状態にした。グルコース摂取を解析するために、細胞をpH7.3のクレブスリンガー緩衝液(KRB)で2回洗浄し、所定のインスリン濃度のKRB中で25分間インキュベートした。14C2−デオキシグルコース(0.3μCi/ウェル)を添加し、総体積150μl/ウェルで細胞をさらに25分間インキュベートした。40μMサイトカラシンBを添加することによって摂取を止め、密封し、シンチレーションをワラック(Wallac)のマイクロベータカウンター(パーキン・エルマー)で測定した。非特異的な摂取は、コントロールウェルを20μMサイトカラシンBと共にインキュベートし、それぞれの値から差し引くことによって決定した。インスリン分泌をモニターするために、RIN−5F細胞またはRIN−5F HA−MGC4504、および、WT細胞クローンを12ウェルプレート中で平板培養し、24時間増殖させた。2%ウシ胎児血清(PAA)、および、抗生物質(Pen/Strep)が添加されたアルファ−MEMで16時間、血清飢餓にした後、細胞をKRBで2回洗浄し、様々な量のグルコース(0〜20mM)を含むKRB中で2時間インキュベートした。上清のインスリン含量を、ラット用インスリンELISA(メルコデイア(Mercodia))を製造元のプロトコールに従って用いることによって決定し、タンパク質含量を決定して同等のローディングを確実にするために細胞をさらに溶解させた。図4Aは、典型的なL6GLUT4myc HA−MCG4504細胞の2−デオキシグルコース摂取分析、および、インスリン感受性の増加を示す。図4Bは、典型的なRIN−5F HA−MGC4504細胞のインスリン分泌分析、および、基底の、およびグルコース刺激によるインスリン分泌の増加である。これらの結果によれば、MGC4504の過剰発現により、筋肉細胞系におけるインスリン感受性の増加、および、インスリン刺激性のグルコース摂取の増加、さらに、インスリノーマ細胞系におけるグルコース刺激によるインスリン分泌の増加が生じたことから、MGC4504発現は、インスリン感受性、および、グルコースの処理、加えてインスリン分泌に関連があることが示される。
E.コリ株BL21DE3細菌(インビトロジェン)を、空のpGEX−6P1ベクター、または、pGEX−6P1 MGC4504で形質転換し、LB中で増殖させ、OD600が0.6の段階で0.1mMのIPTGで誘導し、4時間増殖させた。細胞を溶解させ、GST−アフィニティークロマトグラフィーによって、アマシャムによるGST−マイクロスピンカラムの標準的なプロトコールに従って精製し、抗GST抗体(アマシャム)を用いたSDS−PAGE、および、ウェスタンブロッティングでGSTおよびGST−MGC4504タンパク質の発現をモニターした。図5は、様々な可溶性GST−MGC4504タンパク質の発現および精製工程を示しており、それによれば、組換え可溶性MGC4504タンパク質は、E.コリ発現系で容易に得ることができることが示される。
材料および方法:
ヌクレオチド−4311〜+1(転写開始部位に相対的な位置:ゲノム配列AC020661中のヌクレオチド84361〜88681)を含むヒトMGC4504の5’−UTRを、PCRで増幅し、pGL3ネオベーシック(pGL3neo basic)にXhoIおよびBglIIでクローニングし、pGL3ネオベーシックMGC4504−4311/+1を得た。さらに、pGL3ネオベーシックMGC4504−4311/+1をBfrBI、XhoIまたはAvrIIで消化し、続いてクレノーで平滑化し、BglIIで消化することによってトランケーションされたコンストラクトを作製した。得られたフラグメントを、KpnIで消化し、クレノーで平滑化し、その後BglIIで消化したpGL3ネオベーシックベクターにライゲーションし、pGL3ネオベーシックMGC4504〜1944/+1,−847/+1、および、−546/+1プラスミドを得た。配列解析することによって、全てのコンストラクトの同一性を確認し、RIN−5Fラットインスリノーマ細胞を、10%FCSゴールド(PAA,番号A15−609)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA番号P11−010)、および、1mMのピルビン酸ナトリウム(ギブコ番号11360−039)が添加されたHEPES/L−グルタミン/NaHCO3(ギブコ番号52400−025)を含むRPMI1640中で維持した。HEK293細胞を、10%FCSゴールド(PAA,A15−609)、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA番号P11−010)、および、1mMのL−グルタミン(ギブコ番号25030−032)が添加されたDMEM(ギブコ番号41965−039)中で維持した。全ての細胞系を、37℃で、5%CO2中で、95%湿度で培養し、週2回継代培養した。RIN−5F細胞を、pCMV−RL(プロメガ)1ng、および、キャリアーとしてpBluescript−SK+(ストラタジーン)0.4ng、および、様々な量のpGL3.1ネオベーシックの空のベクター、または、プロモーターコンストラクトのpGL3.1ネオベーシックMGC4504−5’−UTR−4311/+1、−1944/+1,−847/+1、または、−546/+1で、96ウェルのマイクロタイタープレート(コーニング・コースター(Corning costar)番号3610)中で、フージーン6(ロシュ)を用いることによって一時的にトランスフェクションした。HEK細胞を、ポリフェクト(Polyfect,キアゲン)を用いることによってトランスフェクションした。製造元のプロトコールに従ってトランスフェクションを行った。pGL3.1ネオベーシックコンストラクトの濃度を、ウェルあたり10ng(HEK)、および、40ng(RIN5F)プラスミドに最適化し、最大限のレポーター活性を得た。トランスフェクションに用いられた全てのプラスミドを、キアゲンのエンドフリーマキシプレップキット(Endofree MaxiPrep kit)を製造元のプロトコールに従って用いて単離した。48時間後、これら細胞を溶解させ、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、製造元のプロトコール(プロメガのデュアル−ルシフェラーゼシステム)に従って、ワラックマイクロベータカウンター(パーキン・エルマー)でそれぞれの活性を測定することによって決定した。ホタルルシフェラーゼの値をウミシイタケルシフェラーゼ活性に標準化し、空のpGL3.1ネオベーシックコントロールに対する誘導の倍数としてプロットした。安定なHEK293細胞系をpGL3.1ネオベーシックMGC4504−5’−UTR−4311/+1を用いて作製し、500μg/mlゲネチシン(ギブコ)で選択し、ルシフェラーゼ活性に関して陽性のクローンを選択した。得られたHEK MGC4504の5’−UTR−4311/+1細胞を、96ウェルのマイクロタイタープレート(コーニング・コースター番号3610)で平板培養し、24時間増殖させた。化合物を、DMSO中に10mMの濃度になるように溶解させ、2%ウルトロサール(Ultroser,番号12039−012,バイオセプラ(BioSepra))、1%ペニシリン−ストレプトマイシン溶液(番号15140−122、インビトロジェン)、および、2mMのL−グルタミン(番号25030−024、インビトロジェン)が添加されたDMEM培地(番号41965−039、インビトロジェン)でそれぞれの実験濃度に希釈した(10μM〜100pM)。MGC4504プロモーターのコンストラクトのプロモーター/転写活性を調節することができる化合物を分析するために、細胞から培地を吸引し、例えばそれぞれの希釈した化合物を含む培地100μlを直接添加した。例えば48時間インキュベートした後、上述のようにホタルルシフェラーゼ活性を決定した。生データをエクセルファイルに移し、各ウェルあたりのホタル/ウミシイタケ活性の比率を決定することができる。用量/活性の関係は、XL−Fitで製造元(IDBS)のプロトコールに従って決定することができる。図6は、一時的な96ウェルフォーマットのデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子分析において、異なる細胞系におけるMGC4504の5’−UTR位−4311/+1の活性を示す。これらの結果によれば、MGC4504プロモーターの活性は、HTSによるレポーター遺伝子分析で分析することができ、MGC4504の自然に発生する発現パターンを示す細胞系における十分なシグナル/ノイズ比を得ることができることが示される。
MGC4504タンパク質活性に関して分析するために、本発明に係る方法のいずれか1種を行い、MGC4504を(内因的または異種的に)弱くしか発現せず、弱い、または中程度のインスリン感受性を有する細胞を利用し、細胞と試験物質とを接触させ、インスリン感受性が調節されるかどうか(すなわち、増加または減少するかどうか)を試験した。1またはそれ以上のネガティブコントロール細胞を使用して、その物質が、前記細胞に存在するMGC4504の量を(転写またはタンパク質レベルで)調節することによってインスリン感受性を調節しないが、MGC4504タンパク質活性を調節することによって調節することを確認した。
材料及び方法
動物及びサンプルの調製:
年齢を適合させた雌Zucker糖尿病肥満(ZDF)ラット(Gmi、fa/fa)をジェネティックモデルズ社(Genetic Models)から購入した。同時に3匹のラットを20℃で、12時間の明暗サイクルで、水と高脂肪食餌(Research Diets、米国)を自由に摂取できるようにして、数週間飼育した。全ての実験方法は、ドイツ動物保護法(German Animal Protection Law)に従って行った。高脂肪食餌を与えられた動物は以下の2つのサブグループに分類される:II型糖尿病状態を発現しなかった非応答グループ(血液グルコース<<12mM)と発現した応答グループ(>12mM)。応答グループの7匹の動物と非応答グループの6匹の動物をイソフルオランで麻酔をかけ、頚部脱臼により死なせた。膵臓サンプルを手早く切除し、RNAlaterへ移し、−80℃で長期間貯蔵した。
アフィメトリックス・ジーン・チップ(R)解析及びRNA単離を2つの例外を除いて実施例1に記載のとおりに行った:プロテイナーゼK消化を行ったが、RNAの調製及びハイブリダイゼーションは約28000のラット遺伝子を表わすRAE230_2アレイを用いて行った。ハイブリダイゼーションとして、単離したRNAを同時に各グループ2つのプール(非応答及び応答)に組み合わせた。データ解析はResolver4.0(Rosetta社、米国)を用いてソフトウエア製作者の取扱説明書に従って行った。
差異的に発現される遺伝子を決定するための基準は、1.5倍を超えて高い発現レベルの変化と、0.001未満のp値とした。非応答グループと応答グループとのあいだのMGC4504の遺伝子発現の変化倍数を、RAE230_2でアフィメトリックス・クオリファイアー1389573を用いて解析した。この解析結果を表3に要約する。
非応答動物に比較してII型糖尿病発現する応答グループにおいて、MGC4504の遺伝子発現レベルが有意に低いことが膵臓生検から単離されたRNAのアフィメトリックス・ジーン・チップ(R)解析によって検出できた。このことは、II型糖尿病の発現は高脂肪食餌によって惹起され、MGC4504の遺伝子発現レベルの減少に関連するということを示している。
Voss, M.D., Hille, A., Barth, S., Spurk, A., Hennrich, F., Holzer, D., Mueller-Lantzsch, N., Kremmer, E., Grasser, F.A. (2001) J. Virol 75, 11781-90
Literature for standard laboratory methods
If not indicated otherwise, standard laboratory methods were or can be performed according to procedures disclosed in the following standard literature:
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Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated; Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
Current Protocols in Protein Science; regularly updated; Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994;
Short Protocols in Molecular Biology, 5th edition, by Frederick M. Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J.G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), October 2002, John Wiley & Sons, Inc., New York“
Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, editor; Academic Press Inc., San Diego, California, 1994 (ISBN: 0125571658)
Gene targeting: A Practical Approach, 2nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at
Oxford University Press, New York;
Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York;
Claims (32)
- 炭水化物または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気を予防または治療することにおいて活性な物質の同定方法であって、
a.MGC4504タンパク質と、試験物質とを接触させること;および、
b.該試験物質が、MGC4504タンパク質の活性を増加もしくは低下させるかどうかを決定すること、
を含み、前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である上記方法。 - 炭水化物または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気を予防または治療することにおいて活性な物質の同定方法であって、
a.MGC4504の活性または量が減少した細胞と、試験物質とを接触させること;
b.該物質が、該細胞中に存在するMGC4504の活性または量を増加させることができるかどうかを決定すること、
を含み、前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である上記方法。 - 炭水化物または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気を予防または治療することにおいて活性な物質の同定方法であって、
a.転写活性を有する系で、MGC4504タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸と、試験物質とを接触させること、ここで前記フラグメントは、インスリン刺激性のグルコース摂取を増加させるMGC4504タンパク質のフラグメントであり;
b.該物質の存在下において該系に存在するMGC4504タンパク質またはそのフラグメントをコードするmRNAの量を決定すること;
c.該物質の非存在下において該系に存在するMGC4504タンパク質またはそのフラグメントをコードするmRNAの量を決定すること;
d.該物質が、該系中に存在するMGC4504のmRNAの量を増加もしくは低下できるかどうかを決定すること、
を含み、前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である上記方法。 - 炭水化物または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気の予防または治療において活性な物質の同定方法であって、
a.翻訳活性を有する系で、MGC4504タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸と、試験物質とを接触させること、ここで前記フラグメントは、インスリン刺激性のグルコース摂取を増加させるMGC4504タンパク質のフラグメントであり;
b.該物質の存在下において該系に存在するMGC4504タンパク質またはそのフラグメントの量を決定すること;
c.該物質の非存在下において該系に存在するMGC4504タンパク質またはそのフラグメントの量を決定すること;
d.該物質が、該系中に存在するMGC4504タンパク質またはそのフラグメントの量を増加もしくは低下できるかどうかを決定すること、
を含み、前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である上記方法。 - 炭水化物または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気を予防または治療することにおいて活性な物質の同定方法であって、
a.レポーター遺伝子に使用できるようにカップリングされたMGC4504プロモーターまたはその機能的なフラグメントを含む核酸ベクターでトランスフェクションされた細胞を提供すること;
b.機能的なMGC4504プロモーターに使用できるようにカップリングされていないレポーター遺伝子を含むコントロールベクターでトランスフェクションされた細胞を提供すること;
c.試験物質の存在下で、a)およびb)に記載の細胞のレポーター遺伝子の活性を決定すること;
d.該物質の非存在下で、該レポーター遺伝子の活性を決定すること、
を含み、ここにおいて、活性な物質とは、b)に記載のレポーター遺伝子の活性を増加させることなく、a)に記載のレポーター遺伝子の活性を増加させることができる物質であり、前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である上記方法。 - 炭水化物および/または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気を治療または予防するための医薬品を製造するための、MGC4504またはその機能的なフラグメントまたは、MGC4504またはその機能的なフラグメントを含む物質からなる組成物の使用であって、
前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性であり、前記フラグメントが、インスリン刺激性のグルコース摂取を増加させるMGC4504タンパク質のフラグメントである使用。 - 炭水化物および/または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気の治療または予防において活性な物質を同定するための、MGC4504を異種発現する細胞の使用であって、
前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である使用。 - 炭水化物および/または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気の治療または予防において活性な物質を同定するための、MGC4504を異種発現する非ヒト動物の使用であって、
前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である使用。 - 炭水化物および/または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気の治療または予防において活性な物質を同定するための、MGC4504ノックアウト細胞の使用であって、
前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である使用。 - 炭水化物および/または脂質代謝の不全に関連するか、または、それによって引き起こされる病気の治療または予防において活性な物質を同定するための、非ヒトMGC4504ノックアウト動物の使用であって、
前記病気が代謝症候群、肥満症、I型もしくはII型糖尿病、または、インスリン耐性である使用。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法に基づく、ハイスループットスクリーニング。
- MGC4504またはそのフラグメントは、単離された分子として用いられる、請求項6に記載の使用、請求項1、3および4のいずれかに記載の方法、または、請求項11に記載のハイスループットスクリーニング。
- MGC4504またはそのフラグメントは、生化学分析、または、細胞レベルの分析で用いられる、請求項1、3および4のいずれかに記載の方法、または、請求項11に記載のハイスループットスクリーニング。
- 分析は細胞レベルの分析であり、細胞は、MGC4504を異種発現するように一時的に、または安定してトランスフェクションされている、請求項13に記載の方法またはハイスループットスクリーニング。
- 細胞は哺乳動物細胞である、請求項14に記載の方法もしくはハイスループットスクリーニング、または、請求項7もしくは9に記載の使用。
- 細胞は、げっ歯類細胞である、請求項15に記載の使用、方法またはハイスループットスクリーニング。
- 細胞は、ヒト細胞である、請求項15に記載の使用、方法またはハイスループットスクリーニング。
- 動物は、脊椎動物または無脊椎動物である、請求項8または10に記載の使用。
- 異種発現されたMGC4504は、導入遺伝子である、請求項7または8に記載の使用。
- MGC4504は、哺乳動物のMGC4504である、請求項6に記載の使用、請求項1〜5のいずれかに記載の方法、または、請求項11に記載のハイスループットスクリーニング。
- MGC4504、またはそのフラグメントは、核酸である、請求項6に記載の使用、請求項2または4に記載の方法、または、請求項11に記載のハイスループットスクリーニング。
- 核酸は、以下の配列:
a.配列番号1または14に記載の配列;
b.MGC4504機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする高いストリンジェンシー条件下でa)に記載の配列とハイブリダイゼーションすることができる配列;
c.MGC4504機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、a)またはb)に記載の配列から遺伝子コードの縮重によって誘導された配列;
d.MGC4504機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか一種のフラグメント、ここにおいて、該タンパク質またはポリペプチドは、配列番号2に記載の配列を含む、または、それらからなるポリペプチド配列を有する;
e.MGC4504機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、a)、b)、c)またはd)に記載の配列のいずれか一種から、1個またはそれ以上のヌクレオチド置換によって誘導された配列(ここにおいて、該ヌクレオチド置換は、遺伝子コードの縮重によるものではないか、または、単にそれだけによるものではない)
のいずれか一種を含むか、または、それらからなる、請求項21に記載の使用、方法もしくはハイスループットスクリーニング、または、請求項3に記載の方法。 - MGC4504、またはそのフラグメントは、タンパク質またはポリペプチドである、請求項6に記載の使用、請求項2または4に記載の方法、または、請求項11に記載のハイスループットスクリーニング。
- ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の配列:
a.配列番号1または14に記載の配列;
b.MGC4504機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、高いストリンジェンシー条件下でa)に記載の配列とハイブリダイズすることができる配列;
c.MGC4504機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、a)またはb)に記載の配列から遺伝子コードの縮重によって誘導された配列;
d.MGC4504機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか一種のフラグメント;
e.MGC4504機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、a)、b)、c)またはd)に記載の配列のいずれか一種から、1個またはそれ以上のヌクレオチド置換によって誘導された配列(ここにおいて、該ヌクレオチド置換は、遺伝子コードの縮重によるものではないか、または、単にそれだけによるものではない)
のいずれか一種によってコードされている、請求項23に記載の使用、方法もしくはハイスループットスクリーニング、請求項6に記載の使用、または、請求項1もしくは3に記載の方法。 - タンパク質またはポリペプチドは、配列番号2に記載の配列を含むか、または、それらからなる、請求項23または24に記載の使用、方法またはハイスループットスクリーニング。
- レポーター遺伝子は、ウミシイタケまたはホタルルシフェラーゼ、緑色または青色蛍光タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼ、または、クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼをコードする遺伝子である、請求項5に記載の方法。
- 細胞は、初代細胞であるか、または、細胞系に属するものである、請求項2または5に記載の方法、または請求項7または9に記載の使用。
- 細胞は、HEK293、RIN−5F、CHO、または、NIH3T3細胞である、請求項27に記載の方法または使用。
- 細胞は、トランスジェニック非ヒト動物から単離される、請求項7に記載の使用。
- 細胞は、ノックアウト非ヒト動物から単離される、請求項15に記載の使用。
- トランスフェクションは、一過性の、または、安定なトランスフェクションである、請求項5に記載の方法。
- ノックアウトは、機能的なノックアウトであるか、または、ゲノムのノックアウトである、請求項9または10に記載のノックアウト細胞または動物の使用。
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