WO2005121356A1 - 新規スクリーニング方法 - Google Patents

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WO2005121356A1
WO2005121356A1 PCT/JP2005/010180 JP2005010180W WO2005121356A1 WO 2005121356 A1 WO2005121356 A1 WO 2005121356A1 JP 2005010180 W JP2005010180 W JP 2005010180W WO 2005121356 A1 WO2005121356 A1 WO 2005121356A1
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WO
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seq
lysophosphatidylserine
lysops
amino acid
cell
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PCT/JP2005/010180
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takatoshi Soga
Satoshi Kubo
Original Assignee
Astellas Pharma Inc.
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Publication date
Application filed by Astellas Pharma Inc. filed Critical Astellas Pharma Inc.
Publication of WO2005121356A1 publication Critical patent/WO2005121356A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an antiallergic agent and / or an antiinflammatory agent using a lysophosphatidylserine receptor.
  • Lysophosphatidylserine (hereinafter, referred to as LysoPS) is a type of cell membrane component phospholipid, and phosphatidylserine (hereinafter, referred to as PS) is a phospholipase Al (hereinafter, referred to as PLA1). ) Or lysophospholipids produced by hydrolysis by phospholipase A2 (hereinafter referred to as PLA2). It is known that PLA1 or PLA2 is secreted by the activation of inflammatory cells and rises at the site of inflammation!
  • the source of acidic phospholipids, PS is located on the cytoplasmic side of the lipid bilayer of the cell and is not exposed on the cell surface, so that even when PLA1 or PLA2 acts on cells in a steady state, LysoPS Is not produced.
  • PS acidic phospholipids
  • mast cells are immune cells that play an important role in type I (immediate type) allergic reactions.
  • the type I allergic reaction begins with the induction of immunoglobulin E (hereinafter referred to as IgE) antibodies by antigens, and the produced IgE antibodies are expressed on mast cells, basophils, and other high-affinity receptors for IgE antibodies on their cell membranes ( Binds to cells with Fc ⁇ ) and sensitizes those cells.
  • IgE immunoglobulin E
  • LysoPS has been shown to be significantly enhanced (see Non-Patent Documents 2-6).
  • an effect has been observed at the biological level, and it has been reported that intravenous injection of LysoPS into mice increases the amount of histamine in the blood, and induces paw edema when administered to the soles of rats (Non-Patent Document 7, 8).
  • LysoPS has a function as an obesity cell activating factor not only at the cellular level but also in vivo, and LysoPS plays a very important role in inducing and enhancing allergic reactions. It is considered.
  • Mast cell degranulation is an important reaction for allergic diseases and chronic inflammatory diseases, and specific inhibitors for LysoPS that strongly induce or enhance the response include new antiallergic agents and Although its potential as an anti-inflammatory agent has been suggested, the molecule that acts as the first site of action for LysoPS has not yet been identified, and its protein and the gene encoding it have not been identified. It is difficult to construct a simple compound screening system for specific inhibitors. The development of anti-inflammatory drugs has been slow.
  • WO03 / 87364 also discloses that a ligand of a polypeptide having the same amino acid sequence as the LysoPS receptor protein that can be used in the present invention is a lipid peroxidation reaction product such as 4-hydroxy-2-nonenal, Agonists, antagonists, antibodies, etc. of the polypeptide are described as being expected to be effective in treating or preventing diseases such as aging, arteriosclerosis, Parkinson's disease or Alzheimer's disease. No mention is made that antagonists or the like can be a therapeutic and / or prophylactic agent for allergic diseases and / or chronic inflammatory diseases, and no mention is made that the ligand of the polypeptide is LysoPS. Lys oPS is not a lipid peroxidation reaction product.
  • Patent Document 1 US Patent No. US0148465
  • Patent Document 2 WO 00/77256 pamphlet
  • Patent Document 3 European Patent EP1033401
  • Patent Document 4 WO 03/54152 pamphlet
  • Patent Document 5 WO 03/71272 pamphlet
  • Patent Document 6 European Patent EP835933
  • Patent Document 7 International Publication No. 03/87364 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 "Protein Nucleic Acid Enzyme", (Japan), 1991, Vol. 36, p.407-412
  • Non-Patent Document 2 “Nature”, (UK), 1979, Vol. 79, p.250-252
  • Non-Patent Document 3 "FEBS Letters” (Netherlands), 1979, Vol. 105, p.58-62
  • Non-Patent Document 4 “International Archives of Allergy & Immunology”, (Switzerland), 1991, Vol. 96, pp. 156-160
  • Non-Patent Document 5 "FEBS Letters” (Netherlands), 1982, Vol. 138, p.190-192
  • Non-Patent Document 6 "Agents and Actions", (Switzerland), 1984, Vol. 14, P. 613-618
  • Non-Patent Document 7 “Agents and Actions”, (Switzerland), 1998, Vol. 14, p.619-625
  • Non-Patent Document 8 "Agents and Actions", (Switzerland), 1998, Vol. 14, p.606-612
  • Non-Patent Document 9 "Human's Pathology”, (USA), 1980, Vol. 11, P.606-619
  • Non-Patent Document 10 "Gastroenterology”, (USA), 1990, Vol. 98, p.849-854
  • Non-Patent Document 11 "Journal of Korea Medical Science”, (Korea), 2003, Vol. 18, p.204-210
  • Non-Patent Document 12 "American 'journal, O blanking-Fuijioroji eleven Gastro Intel Constitution Nanore' cement 'Reno ⁇ 1 ⁇ ⁇ ' Finoron 1 ⁇ (American Journal of Physiology- uastrointestina 1 and Liver Physiology) ", (the United States) , 1996, Vol.271, p.884-892
  • Non-Patent Document 13 “Arthritis & Rheumatism”, (USA), 1984, Vol. 27, p.852-856
  • Non-patent Document 14 "Arthritis & Rheumatism”, (USA), 1998, Vol. 41, p.233-245
  • Non-Patent Document 15 “Science”, (USA), 2002, Vol. 297, p.1689-1692
  • Non-Patent Document 16 "Journal of Urology", (USA) , 1995, Vol.153, p.629-636
  • Non-Patent Document 17 "Journal of Urology", (USA), 1999 Year, Vol. 161, p.438-442
  • the object of the present invention is to provide allergic diseases (for example, bronchial asthma, allergic bronchial pulmonary aspergillosis, hay fever, allergic rhinitis, allergic sinusitis, allergic otitis media, juniper rash, eczema, atopic Dermatitis, allergic dermatitis, allergic gastroenteritis, allergic conjunctivitis, allergic keratitis, plant allergy, drug allergy, anaphylactic shock, etc.) and / or chronic inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, inflammatory LysoPS receptor that is useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease), irritable bowel syndrome, interstitial cystitis, overactive bladder associated with interstitial cystitis, etc.
  • An object of the present invention is to provide a simple screening method for obtaining an antagonist or a receptor activity attenuator.
  • LysoPS-specific inhibitors that strongly induce or enhance mast cell degranulation, which is important for allergic diseases and chronic inflammatory diseases, are new antiallergic agents and antiinflammatory agents. Until now, the molecule acting as the first action point of LysoPS and the gene encoding it have not been identified.
  • LPSR1 polypeptide that also has the ability to react with LysoPS.
  • Example 1-3 a simple method for searching for an antagonist or activity-attenuating agent of LPSR1 characterized in that a test substance is brought into contact with LPSR1 in the presence of LysoPS.
  • a compound screening system was constructed (Example 3).
  • the anti-allergic agent / anti-inflammatory agent obtained by the Starung-Jung system is a drug that specifically inhibits the interaction between LysoPS and LPSR1, or a drug that specifically reduces the affinity of LysoPS for LPSR1. Therefore, the degranulation reaction of various degranulation stimulating factors enhanced by LysoPS is suppressed by suppressing the action itself of LysoPS, which is the source of mast cells. It is a drug that strongly suppresses the degranulation reaction.
  • LPSR1 or cells expressing LPSR1 can be a tool for detecting LysoPS receptor ligands or antagonists or LysoPS receptor activity-attenuating agents.
  • the present invention relates to the following screening methods, detection methods, detection tools, and the like.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 (a) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or Or (c) an amino acid sequence having an identity of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • a group comprising a selected amino acid sequence and having lysophosphatidylserine receptor activity.
  • test substance is lysophosphatidylserine receptor antagonist or lysophosphatidyl A step of detecting whether or not a lucerin receptor activity attenuator;
  • a method for screening for a lysophosphatidylserine receptor antagonist or lysophosphatidylserine receptor activity reducing agent comprising:
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 (a) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or Or (c) an amino acid sequence having an identity of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • a group comprising a selected amino acid sequence and having lysophosphatidylserine receptor activity.
  • test substance is lysophosphatidylserine receptor antagonist or lysophosphatidylserine receptor activity reducer
  • a method for screening for a lysophosphatidylserine receptor antagonist comprising:
  • the cell is a transformed cell which is transformed with an expression vector containing a DNA encoding the polypeptide of [1] or [2] and expresses the polypeptide, [1] or [2].
  • [4] The step of contacting the cell according to [1] or [2] with a test substance in the presence of lysophosphatidylserine, and the step of analyzing the induction or suppression of the intracellular signal transduction by the test substance.
  • a method for detecting whether a test substance is a lysophosphatidylserine receptor antagonist or a lysophosphatidylserine receptor activity reducer.
  • a detection tool for a lysophosphatidylserine receptor ligand or an antagonist or a lysophosphatidylserine receptor activity-reducing agent which is the polypeptide or cell according to [1] or [2].
  • the term “detection tool” refers to a substance used for detection, specifically, a polypeptide used for detection or a cell expressing the polypeptide.
  • a tool for detecting a lysophosphatidylserine receptor ligand or antagonist or a lysophosphatidylserine receptor activity-attenuating agent refers to a ligand or antagonist of lysophosphatidylserine receptor (hereinafter referred to as LysoPS receptor), or In order to detect the LysoPS receptor activity attenuating agent, the detection method or screening method of the present invention A polypeptide or a cell to be used as a target to be contacted with a substance.
  • Allergic disease and / or chronic inflammatory disease in the method of screening the polypeptide or cell of [1] or [2] for the lysophosphatidylserine receptor antagonist or lysophosphatidylserine receptor activity-reducing agent of the present invention is also included in the present invention.
  • lysophosphatidylserine receptor activity reducing agent binds to a site different from the endogenous ligand to reduce the affinity of the ligand for the receptor.
  • Compound negative allostenc modulator
  • a method for screening a LysoPS receptor antagonist or LysoPS receptor activity-attenuating agent described in the present application, a detection tool and a detection method for a LysoPS receptor ligand or antagonist, or a LysoPS receptor activity-attenuating agent, allergy The method for screening a therapeutic and / or prophylactic agent for a sexual disease and / or a chronic inflammatory disease is an invention first disclosed by the present inventors.
  • LysoPS receptor antagonists or LysoPS receptor activity reducers are used for allergic diseases (for example, bronchial asthma, allergic bronchopulmonary aspergillosis, hay fever, allergic rhinitis, allergic sinusitis, allergic otitis media, Eczema, eczema, atopic dermatitis, allergic dermatitis, allergic gastroenteritis, allergic conjunctivitis, allergic keratitis, botanical allergy, drug allergy, anaphylactic shock, etc.) or chronic inflammatory diseases Treatment (eg, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease), irritable bowel syndrome, interstitial cystitis, and overactive bladder associated with interstitial cystitis) and // It is a substance that is effective as a prophylactic agent.
  • allergic diseases for example, bronchial asthma, allergic bronchopulmonary aspergillosis, hay fever, allergic rhinitis, allergic sinusitis, allergic
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of LysoPS on intracellular signal transduction in cells expressing LysoPS receptor LPSR1.
  • the vertical axis represents luciferase activity (ratio to that without stimulation), which indicates the intensity of signal transmission.
  • the horizontal axis shows the concentration of LysoPS ( ⁇ ).
  • ⁇ indicates cells expressing human LysoPS receptor
  • ⁇ indicates cells expressing rat LysoPS receptor
  • ⁇ indicates cells expressing human and rat LysoPS receptor genes and expressing an empty vector. Is shown.
  • FIG. 2 is a view showing immunostaining images of LysoPS receptor in (A) small intestine of a healthy person, (B) synovium of a rheumatic patient, and (C) bronchi of a bronchitis patient. Arrows indicate mast cells.
  • the LysoPS receptor ligand or antagonist or LysoPS receptor activity attenuator detection tool of the present invention includes a polypeptide type detection tool and a cell type detection tool.
  • the polypeptide type detection tool of the present invention includes:
  • LysoPS receptor ligand or antago which is human LPSR1, that is, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or rat LPSR1, that is, a polypeptide having the amino acid sequence power represented by SEQ ID NO: 4 -Strike or LysoPS receptor activity attenuator detection tool;
  • a functionally equivalent variant that is, (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having a LysoPS receptor activity; or In the amino acid sequence represented by 2 or SEQ ID NO: 4, 1 to 10, preferably 1 to 7, and more preferably 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted amino.
  • Homologous protein that is, an amino acid having an identity of 80% or more, preferably 90% or more, and most preferably 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • a polypeptide comprising a sequence and having LysoPS receptor activity, a LysoPS receptor ligand or antagonist, or a LysoPS receptor activity attenuator detection tool; and
  • the amino acid sequence encoded by the hybrid protein ie, a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or its complementary sequence, and has a LysoPS receptor activity A LysoPS receptor ligand or antagonist, or a LysoPS receptor activity attenuator detection tool.
  • polypeptides that can be used as the polypeptide type detection tool of the present invention, that is, human or rat LPSR1, functionally equivalent variants, homologous proteins, and hybrid proteins are hereinafter referred to as polypeptides for detection tools.
  • a polypeptide having the same amino acid sequence as the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 that can be used as the polypeptide type detection tool of the present invention has been known. However, there is no indication or suggestion that this is the amino acid sequence of the LysoPS receptor. The LysoPS receptor was not identified until the present inventors elucidated it for the first time.
  • the polypeptide for a detection tool that can be used as the polypeptide-type detection tool of the present invention includes a human LysoPS receptor which is a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the human LysoPS receptor is a human-derived G protein-coupled receptor with 339 amino acid residues.
  • the polypeptide for the detection tool is not limited to those derived from humans, and includes those derived from non-human organisms (eg, mouse, rat, rat, muster, or dog).
  • a rat Lyso PS receptor which is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is included.
  • the rat LysoPS receptor is a rat-derived G protein-coupled receptor consisting of 328 amino acid residues.
  • polypeptides for detection tools include polypeptides.
  • LysoPS receptor derived from a non-human organism (eg, mouse, rat, hamster, or dog). And artificially modified proteins based on genetic engineering.
  • identity means a value obtained by a BLAST (Basic local alingment search tool; Altschul et al., J. Mol. Biol, 215, 403-410, 1990) search.
  • the amino acid sequence identity can be determined using the BLAST search algorithm. To be more specific, use the 1) 12369 program (Tatusova and Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999) of the BLAST package (sgi32bit version, version 2.2.10 ⁇ . It can be calculated according to the parameters.
  • hybridization under stringent conditions means conditions under which non-specific binding does not occur.
  • hybridization was performed at 65 ° C. with a probe in a solution containing 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardt and 100 mg / ml-syn sperm DNA, and the washing solution ( (0.2 X SSC, 0.1% SDS), pre-wash as needed, and then wash at 50-60 ° C.
  • lysophosphatidylserine (LysoPS)
  • PS phosphatidylserine
  • PLA1 phospholipase Al
  • PLA2 phospholipase A2
  • PS is a lysophospholipid that is formed by hydrolysis by rice (Hori Yone, Protein Nucleic Acid Enzyme, 36, 407-412, 1991).
  • PS is a glycerol phospholipid having a serine phospholipid as a polar group.
  • LysoPS includes 1-oleoyl-LysoPS and 1-palmitoyl-LysoPS, depending on the position of the remaining fatty acid, the number of carbon chains, and the degree of saturation. All of these Collectively, LysoPS. Specifically, for example, it is possible to determine whether or not it is LysoPS by the method of Xiao et al. (Xiao et al., Annals of the New York Academy of Sciences, 905, 242-259, 2000).
  • the term "having LysoPS receptor activity" in the present specification means that the compound has an activity as a receptor that transmits an external stimulus into a cell through a coupled G protein in response to LysoPS. Means Whether or not the compound has the activity can be determined based on the ability to increase the luciferase activity in a LysoPS dose-dependent manner in response to LysoPS, for example, in the assay described in Example 2. In this case, if the luciferase activity is increased, it can be determined that the compound has “LysoPS receptor activity”.
  • the polypeptide for a detection tool of the present invention can be obtained by various known methods.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide for a detection tool may be ligated to a known amino acid sequence or nucleotide sequence according to a known method (Mamatis et al., Molecular loning—A Laboratory Manual, old bpnng Harbor Laboratory, NY, 1982, etc.).
  • PCR and hybridization can be used to screen for isolation from a cDNA library.
  • an appropriate primer or probe is designed based on the information on the nucleotide sequence of the human LysoPS receptor gene, and the primer or probe is combined with the target organism (for example, human, mouse, rat, etc.). , No, muster, or canine) by performing a PCR method or a hybridization method using a sample (for example, genomic DNA, total RNA or mRNA, a cDNA library, or a phage library). A polynucleotide encoding the polypeptide for a tool can be obtained.
  • a desired polypeptide can be obtained by incorporating the obtained polynucleotide into an appropriate expression system and expressing it, and confirming that the expressed protein reacts with LysoPS by, for example, the method described in Example 2. More specifically, the cells described below (that is, cells expressing the polypeptide for a detection tool) are obtained, and the target protein is separated from the culture by a method generally used for separating and purifying a receptor protein. Can be prepared by separating and purifying (see WO02 / 36631).
  • the protein artificially modified by genetic engineering can be prepared by a conventional method, A protein gene is obtained by site-specific mutagenesis (Mark-et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984, etc.), and the gene The desired protein can be obtained by confirming that the expressed protein reacts with LysoPS by, for example, the method described in Example 2 using the expression system.
  • the cell-type LysoPS receptor ligand or antagonist of the present invention or the LysoPS receptor activity-attenuating agent detection tool includes a cell for expressing a polypeptide for the detection tool, which is a LysoPS receptor ligand or antagonist, or LysoPS. Includes receptor activity attenuator detection tools.
  • Cells that can be used as the cell type detection tool of the present invention are not particularly limited as long as they express the polypeptide for the detection tool.
  • Transformed cells in which the polypeptide for expression has been expressed may be natural cells or established cell lines expressing the polypeptide for detection tools. Transformed cells in which is expressed are preferred.
  • transformed cells for the detection tool Polynucleotides used for producing various transformed cells that can be used as the cell type detection tool of the present invention (hereinafter, referred to as transformed cells for the detection tool) are described in "1) Polypeptide type detection. Tools ".
  • Fragments containing the isolated polynucleotides can be transfected into eukaryotic and prokaryotic host cells by incorporating them into appropriate expression vectors, and the polynucleotides transfected in the host cells can be transfected. Can be expressed.
  • the host cell is not particularly limited as long as it can express the polypeptide for a detection tool.
  • a commonly used known microorganism such as Escherichia coli or yeast (S accharomyces Cerevisiae) or a known microorganism can be used.
  • Cultured cells for example, Chinese /, Musta monoovary-derived cell line CHO cells, CHO cell dihydrofolate reductase deficient strain (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • HE K293 human Embryonic kidney 293 (HE K293) cells
  • HEK293 cells into which the EBNA-1 gene of Epstein's bar virus has been introduced
  • 293EBNA cells Invitrogen
  • African green monkey kidney-derived cell line COS cells African green monkey kidney-derived cell line COS cells
  • insect cells eg, S19 cells
  • the expression vector a known expression vector appropriately selected according to the host cell can be used.
  • an appropriate promoter and a sequence related to expression of the vector can be selected from the vector plasmid appropriately selected according to the host cell.
  • the introduced one can be used.
  • a specific sequence was introduced so that tags such as daltathione-S-transferase (GST), Flag, and His were fused when the polypeptide encoded by the incorporated polynucleotide was expressed.
  • GST daltathione-S-transferase
  • Flag Flag
  • His His
  • polynucleotides When transforming one cell with several kinds of polynucleotides at the same time, several kinds of polynucleotides may be constituted so as to be contained in one expression vector, or may be constituted so that each kind is contained in a separate expression vector. Is also good. Alternatively, cells obtained by incorporating such a structure into chromosomal DNA may be obtained and used!
  • An expression vector into which a desired polynucleotide has been introduced is prepared by the DEAE-dextran method (Luthman et al., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), the calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham et al., Virology, 52). 456-457, 1973), a method using commercially available transfection reagents such as Lipofecamine 2000 (Invitrogen) and FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals), and an electric pulse perforation method (Neumann et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982) and the like, and transformed into host cells. As a specific embodiment, it can be carried out, for example, by the method described in Example 2.
  • the transformed cells for the detection tool can be cultured according to a conventional method, and as a medium that can be used for the culture, various media commonly used in accordance with the host cells used can be appropriately selected.
  • a medium that can be used for the culture various media commonly used in accordance with the host cells used can be appropriately selected.
  • Can be for example, in the case of COS cells, use a medium such as RPMI-1640 medium or Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM), and add serum components such as fetal bovine serum (FBS) as necessary.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the membrane fraction of the cell for the detection tool can be specifically prepared, for example, by the following procedure. Wear. After collecting and washing the cells for the detection tool, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 5 mM EDTA and a protease inhibitor (Complete TM protease inhibitor cocktail tablet; Roche Diagnostics, Inc.) is used. ) And homogenize with Polytron. After ultracentrifugation, the precipitate was suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.1% BSA, and a protease inhibitor (Complete TM protease inhibitor cocktail tablet). This can be used as a membrane fraction.
  • the detection method of the present invention comprises the steps of: contacting a cell for a detection tool with a test substance in the presence of LysoPS; and analyzing the induction or suppression of intracellular signal transduction by the test substance.
  • a method for detecting whether or not is a LysoPS receptor antagonist or a LysoPS receptor activity attenuator is included.
  • a ligand for LysoPS receptor activates an intracellular signal transduction pathway
  • detection is performed by utilizing the property of activating transcription via various response elements, for example, a serum response element (SRE).
  • SRE serum response element
  • a cell obtained by co-expressing a fusion gene (eg, pSRE-Luc; CLONTECH) of a response element involved in signal transduction, a promoter, and a reporter gene with a cell for a detection tool (hereinafter, cell for cell signal type detection) ).
  • a fusion gene eg, pSRE-Luc; CLONTECH
  • a reporter gene eg, cell for cell signal type detection
  • Preferred host cells include, for example, 293EBNA cells, a cell line derived from human fetal kidney.
  • the cell for cell signaling detection is brought into contact with the test substance in the presence of LysoPS, and the change in reporter activity in the cell for cell signaling detection is analyzed.
  • Changes in reporter activity can be analyzed using a luminometer, liquid scintillation counter, X-ray film, or the like.
  • a luciferase gene is used as the reporter gene
  • a change in luciferase activity can be measured using a commercially available measurement kit (for example, Pikagene luminescence). Kit; Toyo Ink).
  • the increase in reporter activity in cells for cell signal type detection by LysoPS is inhibited or suppressed by the test substance.
  • the test substance can be determined to be an antagonist for LysoPS receptor or a LysoPS receptor activity attenuator.
  • contact the cell signaling type cell with LysoPS in the absence of the test substance and confirm the degree of increase in reporter activity in the cell signaling type cell by LysoPS. I prefer that.
  • Example 2 it can be carried out under the conditions described in Example 2.
  • test substance is a LysoPS receptor antagonist or a LysoPS receptor activity attenuator
  • a method for screening a LysoPS receptor antagonist or a LysoPS receptor activity-attenuating agent comprising a step of selecting a LysoPS receptor antagonist or a LysoPS-receptor activity-attenuating agent.
  • a method of screening for LysoPS receptor antagonists is more preferable.
  • LysoPS induces mast cell degranulation, and allergic diseases (eg, bronchial asthma, allergic bronchopulmonary aspergillosis, hay fever, allergic rhinitis, allergic sinus) Inflammation, allergic otitis media, juniper rash, eczema, atopic dermatitis, allergic dermatitis, allergic gastroenteritis, allergic conjunctivitis, allergic keratitis, plant allergy, drug allergy, anaphylactic shock, etc.), And chronic inflammatory diseases (eg, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease), irritable bowel syndrome, interstitial cystitis, and overactive bladder associated with interstitial cystitis) LysoPS receptor antagonists or LysoPS receptor activity reducers are known to cause allergic diseases and / or chronic inflammatory diseases. And / or It is thought to be a prophylactic agent. Further, the polypeptide for a
  • Detection methods used in the "step of detecting whether a test substance is a LysoPS receptor antagonist or a LysoPS receptor activity-attenuating agent" included in the screening method of the present invention are roughly classified into the following five methods. However, using any of these detection methods or a combination of these methods, it is detected whether or not a LysoPS receptor antagonist or LysoPS receptor activity attenuator, and the antagonist, Alternatively, a LysoPS receptor antagonist or LysoPS receptor activity reducer can be screened by selecting a receptor activity reducer.
  • a ligand detection method 2) a method for detecting whether or not a ligand is a ligand for the LysoPS receptor (hereinafter, referred to as a ligand detection method);
  • ⁇ S-binding detection method A method for detecting whether or not it is a LysoPS receptor antagonist using the GTP ⁇ S binding method or a LysoPS receptor activity-attenuating agent (hereinafter referred to as ⁇ S-binding detection method);
  • a method for detecting the presence or absence of a LysoPS receptor antagonist or a LysoPS receptor activity-attenuating agent using the change in intracellular Ca 2+ concentration as an index (hereinafter referred to as a Ca 2+ type detection method) );as well as
  • a cAMP-type detection method A method for detecting the presence or absence of a LysoPS receptor antagonist or a LysoPS receptor activity-attenuating agent using the change in the amount of cAMP in cells as an index (hereinafter referred to as a cAMP-type detection method)
  • the “G protein” is a ⁇ trimeric protein composed of ⁇ and ⁇ subunits, and functions as a signal transduction and amplification factor into cells in combination with a receptor.
  • the a subunit (G) has subfamilies such as G13, Gq, Gi, and Gs. Controlling the transmission path.
  • G13 is a G protein that promotes the activation of Rho kinase through stimulation of guanine nucleotide exchange factors such as pi 15Rho-GEF.
  • Rho kinase When the activity of Rho kinase is promoted, it promotes the transcription of downstream genes via, for example, a serum response element (SRE). Therefore, the presence / absence and strength of G13-coupled receptor signaling can be determined by using the cells transfected with an SRE-dependent reporter gene (eg, pSRE-Luc; CLONTEC H) as an indicator of changes in reporter activity. Can be detected as
  • SRE-dependent reporter gene eg, pSRE-Luc; CLONTEC H
  • Gq is a G protein that promotes the activity of phospholipase C.
  • the activity of phospholipase is promoted, for example, intracellular Ca 2+ concentration increases. Therefore, the presence / absence and strength of signal transduction of a receptor coupled to Gq can be detected as an indicator of intracellular Ca 2+ concentration fluctuation.
  • Gi is a G protein that suppresses the activity of adenylate cyclase.
  • the activity of adenylate cyclase is suppressed, for example, the intracellular cAMP concentration decreases. Therefore, the presence / absence and strength of signal transduction of the receptor coupled with Gi can be detected using the fluctuation of cAMP concentration in cells as an index.
  • Gs is a G protein that promotes the activity of adenylate cyclase.
  • the activity of adenylate cyclase is promoted, for example, the intracellular cAMP concentration increases. Therefore, the presence / absence and strength of Gs-coupled receptor signal transmission can be detected using the change in cAMP concentration in cells as an index.
  • G protein chimera is one in which the C-terminal amino acid sequence (for example, 5 amino acid residues) of a G protein is replaced with another G protein sequence, and is intracellularly different from the naturally conjugated G protein.
  • G protein that can function as a signal transduction and amplification factor.
  • a "chimeric protein of Gq and Gi" which is a chimera of a partial polypeptide of Gq having a phospholipase C activity promoting activity and a partial polypeptide having a receptor coupling activity of Gi can be mentioned (Conklin et al., (Nature, 363, 274-276, 1993)
  • PSR1 is clearly a receptor that couples to G13 and transmits signals into cells via G13. Therefore, in the Ca 2+ type detection method, for example, cells expressing a chimeric protein of Gq and G13, and in the cAMP type detection method, for example, cells expressing a chimeric protein of Gs and G13 or Gi and G13 Thus, it was revealed that by detecting an intracellular signal, it is possible to detect an antagonist and a receptor activity reducing agent.
  • the detection method of the present invention is as described in "[2] Detection method of the present invention".
  • the test substance is allowed to act for a certain period of time under the conditions described in Example 2, and its IC is 10 M or less (more preferably 1 ⁇ M
  • test substances can be detected as LysoPS receptor antagonists or LysoPS receptor activity attenuators.
  • the method for detecting the ligand is not particularly limited as long as the detection tool of the present invention and the labeled LysoPS are used.
  • the method can be performed by the following procedure.
  • the detection tool of the present invention is prepared by the method described above. Atsusi conditions (e.g., kind of to use buffer, temperature, and concentration, type and concentration of ions added to the buffer, arranged in P H of Atsusi system) to optimize, optimized in buffer one, the The detection tool and the labeled LysoPS are incubated with the test substance for a certain period of time.
  • the labeled LysoPS for example, [ 3 H] -LysoPS can be used.
  • the reaction solution is filtered with a glass filter or the like, washed with an appropriate amount of a buffer, and the radioactivity remaining on the filter is measured with a liquid scintillation counter or the like.
  • the test substance is a ligand for the LysoPS receptor. That is, if the radioactivity remaining in the filter in the presence of the test substance is lower than the radioactivity remaining in the filter in the absence of the test substance, the test substance is detected as a ligand for LysoPS receptor.
  • the test substance was added to a fixed amount of the membrane fraction of LysoPS receptor-expressing cells, and the test substance was added in an optimized buffer. Is applied for a certain period of time, and based on the inhibition of [ 3 H] —LysoPS binding, its IC is 10 / z M or less (
  • test substance detected as a ligand is further subjected to a detection method of the present invention, a ⁇ S-binding detection method, a Ca 2+ -type detection method, and / or a cAMP-type detection method, to thereby obtain an antagonist or receptor.
  • a detection method of the present invention a ⁇ S-binding detection method, a Ca 2+ -type detection method, and / or a cAMP-type detection method, to thereby obtain an antagonist or receptor.
  • the GTP yS binding type detection method uses the GTP y S binding method (Lazareno and Birdsall, Br. J. Pharma col., 109, 1120-1127, 1993), and the test substance is LysoPS receptor antagonist, Alternatively, the presence or absence of a LysoPS receptor activity attenuator can be detected.
  • Cell membranes expressing the polypeptide for a detecting tool 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl, 0.1% - ⁇ Shi serum albumin (BSA), 10 M GDP ⁇ 10- 12 M to 1
  • the ability of LysoPS to inhibit the increase in GTP yS binding is 10 M or less (more preferably
  • test substance can be detected as LysoPS receptor antagonist or LysoPS receptor activity attenuator.
  • cells expressing a polypeptide for a detection tool and (ii) a G protein chimera (eg, a chimeric protein of Gq and G13) (hereinafter, referred to as “cells”).
  • Ca 2+ type detection cells the cells are those in which the intracellular Ca 2+ concentration does not increase even when LysoPS is acted on, (i) a polypeptide for a detection tool, and (ii) a G protein chimera.
  • Transformed cells in which is co-expressed are preferred.
  • Preferred host cells include, for example, 293EBNA cells, a cell line derived from human fetal kidney.
  • Ca 2+ type detection methods, and testing the Ca 2+ type detection cell material was come in contact in the presence LysoPS, direct changes in the intracellular Ca 2+ concentration for Ca 2+ type detection Or analyze indirectly.
  • Change in C a 2+ concentration for example, using calcium-binding fluorescent reagent (e.g., such as fora2 or fluo3), it is also possible to analyze changes in direct Ca 2+ concentration.
  • a gene whose transcription amount is regulated depending on the Ca 2+ concentration for example, a gene in which an activator beta-protein 1 (API) response element is inserted upstream of the luciferase gene).
  • changes in Ca 2+ concentration can be analyzed indirectly.
  • the Ca 2+ type detection method uses a LysoPS receptor antagonist or LysPS as an index based on the fact that the increase in Ca 2+ concentration in cells for Ca 2+ type detection by LysoPS is inhibited or suppressed by a test substance.
  • An oPS receptor activity attenuator can be detected.
  • test substance when a chimeric protein of G13 and Gq is co-expressed, the test substance is allowed to act for a certain period of time under the conditions described in Example 3 of WO02 / 36631, and the inhibition of the increase in intracellular Ca 2+ concentration by LysoPS is indicated.
  • tests with an IC of 10 M or less (more preferably 1 / zM or less)
  • the substance can be detected as a LysoPS receptor antagonist or a LysoPS receptor activity reducer.
  • a polypeptide for a detection tool and (ii) a chimeric G protein are used as cells.
  • An expressing cell hereinafter, referred to as a cAMP-type detection cell
  • the cells are preferably transformed cells in which (i) the polypeptide for detection and (ii) the G protein chimera are co-expressed in cells in which the intracellular cAMP concentration does not fluctuate even when LysoPS is acted on.
  • New Preferred host cells include, for example, 293EBNA cells, a cell line derived from human fetal kidney.
  • a cAMP-type detection cell is brought into contact with a test substance in the presence of LysoPS, and a change in cAMP concentration in the cAMP-type detection cell is directly or indirectly analyzed.
  • the change in cAMP concentration can be determined by, for example, directly analyzing the change in cAMP concentration using a commercially available cAMP measurement kit (Amersham, etc.), or controlling the amount of transcription depending on the cAMP concentration.
  • a gene for example, a gene having a cAMP response sequence (CRE) inserted upstream of a luciferase gene
  • CRE cAMP response sequence
  • the cAMP-type detection cell and LysoPS are brought into contact with each other in the absence of a test substance, and the degree of fluctuation of cAMP concentration in the cAMP-type detection cell due to LysoPS is confirmed.
  • the test substance is a LysoPS receptor antagonist or a receptor. It can be detected as an activity attenuator.
  • the test substance when a chimeric protein of G13 and Gi is co-expressed, the test substance is allowed to act for a certain period of time under the conditions described in Example 4 or Example 5 of WO02 / 36631 to inhibit the decrease in intracellular cAMP concentration by LysoPS.
  • the index indicates that the IC is 10 M or less (more preferably, 1 / z M
  • test substances can be detected as LysoPS receptor antagonists or LysoPS receptor activity reducers.
  • an antagonist binds to the same receptor site as the endogenous ligand (LysoP S) and attenuates receptor activity. Agents can be tested for differences in their ability to bind to different receptor sites than LysoPS.
  • test substance is measured by the above-described ligand detection method, and if inhibition of the binding of labeled LysoPS is observed, it is regarded as a LysoPS receptor antagonist, and if inhibition of the binding of the labeled ligand is not observed, Can be determined to be a LysoPS receptor activity attenuator [0056] [4] Test substance
  • test substance used in the screening method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include commercially available compounds (including peptides) and various known compounds (such as peptides) registered in a chemical file. ), Compounds obtained by combinatorial chemistry technology (Terrett et al., J. Steele. Tetrahedron, 51, 8135-8173, 1995), culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants and marine organisms, animal tissue extraction Conjugates (including peptides) obtained by chemically or biologically modifying the conjugates (including peptides) selected by the screening method of the present invention. Further, compounds (including peptides) obtained by chemically or biologically modifying LysoPS or known LysoPS derivatives can be used.
  • the confirmation of the therapeutic and / or prophylactic effect of an allergic disease and / or a chronic inflammatory disease is carried out by using a method known to those skilled in the art or a modified method thereof. be able to.
  • a method known to those skilled in the art or a modified method thereof. be able to.
  • the guinea pig 'asthma model (Aoki et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 297, 165-173, 2001) and the mouse' atopic dermatitis model (Yokozeki et al., Clin. Exp. Immunol, 132, 385- 392, 2003).
  • a preparation containing LysoPS receptor antagonist or LysoPS receptor activity attenuator, for example, DNA, protein (including antibody or antibody fragment), peptide, or other compound as an active ingredient is Depending on the type of the active ingredient, it can be prepared as a pharmaceutical composition using pharmacologically acceptable carriers, excipients, and / or other additives usually used for the preparation thereof. .
  • LPSR1 gene Human Genomic DNA (CLONTECH) and Rat Genomic DNA (Rat Using Genomic DNA (CLONTECH) as a template, full-length cDNAs of the LPSR1 gene, which is a human and rat LysoPS receptor gene, were obtained by PCR.
  • hLPSRl human LPSR1 gene
  • an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 was used as a forward primer
  • SEQ ID NO: 6 an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 was used as a reverse primer.
  • rLPSRl In the rat LPSR1 gene (hereinafter abbreviated as rLPSRl), an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 was used as a forward primer, and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 was used as a reverse primer. .
  • a base sequence containing a restriction enzyme Xbal recognition site is added to the 5 'end of each of the forward primer and the reverse primer.
  • PCR was performed using DNA polymerase (Pyrobest DNA polymerase; Takara Shuzo) in the presence of 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) at 94 ° C (20 seconds) / 56 ° C (20 seconds) / 72 ° C (1.5 seconds).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • This DNA fragment is digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of plasmid pEF-BOS-dhfr (Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990). And pEF-BOS-dhfr-rLPSRl.
  • the nucleotide sequence of the LPSR1 gene was determined by the dideoxy terminator method using a DNA sequencer (ABI377 DNA Sequencer; Applied Biosystems).
  • the nucleotide sequence of the hLPSRl gene was as shown in SEQ ID NO: 1
  • the nucleotide sequence of the rLPSRl gene was as shown in SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an open reading frame (ORF) of 1020 bases, and the predicted amino acid sequence (339 amino acids) of this ORF is represented by SEQ ID NO: 2. Amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 has an ORF of 987 bases, and the ORF power predicted amino acid sequence (328 amino acids) is as shown in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. there were. The identity of these amino acid sequences was 82%.
  • Example 2 Detection of Increased Luciferase Activity by LysoPS in 293EBNA Cells Expressing LPSR1
  • 293EBNA cells Invitrogen
  • expression plasmids for expressing the LPSR1 protein the plasmids pEF-BOS-dhfr-hLPSRl and pEF-BOS-dhfr-rLPSRl obtained in Example 1 were used.
  • 293EBNA cells were placed on a collagen I-coated 96-well plate (IWAKI) at 1.5 x 10 4 cells / well, in a modified Dulbecco's modified Fig. Medium (DMEM) containing 1% fetal calf serum (FCS).
  • IWAKI collagen I-coated 96-well plate
  • DMEM Dulbecco's modified Fig. Medium
  • FCS fetal calf serum
  • the plasmid pEF-BOS-dhfr-hLPSRl (1 ng / well) or plasmid pEF-BOS-dhfr-rLPSRl (1 ng / well) and serum response factor A plasmid pSRE-Luc (CLONTECH) (5 ng / l) for measuring reporter activity of Serum Response Element (hereinafter referred to as “SRE”) was used with a transfection reagent (LipofectAMINE 2000; Invitrogen). The gene was introduced.
  • plasmid pEF-BOS-dhfr-hLPSRl or pEF-BOS-dhfr-rLPSRl was replaced with plasmid pEF-BOS-dhfr (that is, an empty vector not containing the LPSR1 gene) and plasmid pSRE-Luc was used for gene transfer.
  • LysoPS diluted with DMEM medium is cultivated and incubated at 37 ° C for 6 hours in the presence of 5% CO.
  • LPSR1 is a receptor that responds to LysoPS and transmits signals into cells.
  • Example 3 Identification of G protein coupled to LPSR1
  • 293EBNA cells Invitrogen
  • the plasmid pEF-BOS-dhfr-hLPSRl obtained in Example 1 was used as an expression plasmid for expressing the LPSR1 protein.
  • Gq Various human G protein Gq (GenBank accession number NM_002072), Gil (GenBank accession number M69013), G12 (GenBank accession number L01694), G13 (GenBank accession number NM—006572) , G14 (GenBank accession number NM-004297), G16 (GenBank accession number M63904), Gqi chimera, Gqi3 chimera, Gqo chimera, and Gqz chimera. Plasmids in which protein genes were respectively recombined into expression plasmids pEF-BOS-dhfr (for example, GEF expression plasmids were pEF-BOS-dhfr-Gq) were used.
  • the cDNA used for each G protein primer set and template was Gq (forward primer: SEQ ID NO: 9, reverse primer: SEQ ID NO: 10, template: human brain cDNA (CLONTECH)), G11 (forward primer: SEQ ID NO: 11, reverse primer: SEQ ID NO: 12, template: human brain cDNA (CLONTE CH)), G12 (forward primer: SEQ ID NO: 13, reverse primer: SEQ ID NO: 14, template: human brain cDNA (CLONTECH)), G13 (forward primer: SEQ ID NO: 15, reverse primer: SEQ ID NO: 16, template: human kidney cDNA (CLONTECH)), G14 (forward primer: SEQ ID NO: 17, reverse primer: SEQ ID NO: 18, template: human spleen cDNA ( CLONTECH)), G16 (forward primer: SEQ ID NO: 19, reverse primer) : SEQ ID NO: 20, template: human peripheral blood lymphocytes cDNA (Clontech H Corporation)).
  • the expression vector of the G protein chimera can be obtained by replacing the C-terminal 5 amino acid residues (SEQ ID NO: 21) of the Gq protein with other proteins according to the method of Conklin et al. (Nature, 363, 274-276, 1993).
  • the G protein was prepared by substituting it with 5 amino acid residues at the C-terminal of the G protein.
  • the Gi protein subfamily includes the Gil, Gi2, and Gi3 proteins, which contain 5 amino acid residues at the C-terminal of Gil and Gi2.
  • the sequence is the sequence described in SEQ ID NO: 22 in common.
  • the Gqi chimera was prepared by recombining the C-terminal 5 amino acid residues of the Gq protein with the C-terminal 5 amino acid residues of Gil and Gi2 (SEQ ID NO: 22).
  • the Gqi3 chimera, the Gqo chimera, and the Gqz chimera use the C-terminal 5 amino acid residues of Gq as the C-terminal 5 amino acid residues of Gi3 (SEQ ID NO: 23) and the Go C-terminal 5 amino acid residues, respectively. No. 24) and 5 amino acid residues at the C-terminal of Gz (SEQ ID NO: 25).
  • These G protein chimeras function as Gq-mediated signal transduction into cells and amplifying factors when stimulated by a coupled receptor, and thus can transmit signals to SRE. .
  • collagen I coated 96 ⁇ El plate IWAKI Co., Ltd.
  • the 293EBNA cells 1 so that the Ueru per 1.5 X 10 4 cells, Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% FCS (DME M) in After culture, 1) plasmid pEF-BOS-dhfr-hLPSRl (1 ng / l) and 2) plasmid pSRE-Luc (CLONTECH) for measuring SRE reporter activity (1 ⁇ l) Per 10 ng) or the plasmids 1) and 2) plus 3) plasmids pEF-BOS-dhfr-Gq, pEF-BOS-dhfr-Gil, pEF-BOS to investigate the effects of overexpression of various G proteins.
  • plasmid pEF-BOS-dhfr empty vector without LPSRl gene; 1 ng / l
  • plasmid pSRE-Luc 10 ng / l
  • the plasmid of (3) was further transfected with the plasmid of (3).
  • the cells were further cultured, and replaced with a DMEM medium not containing FCS, followed by culturing for 6 hours. After aspirating the medium and lysing with a cell lysate (cell lysate LC
  • LPSR1 is a receptor that couples to G13 and transmits a signal into cells via G13 among various G proteins.
  • Example 2 pEF-BOS-dhfr-G13 was not further transfected, but it was confirmed that G13 was endogenously expressed in the used 293EBNA cells, and LPSR1 was found to be endogenous. It is thought that the agonistic activity of LysoPS was transmitted to SRE via G13.
  • Rats (Wister rat; Charles River Japan, Inc.) were anesthetized with ether and killed by femoral artery transection.Then, 50 ml of solution A (1 unit / ml of parin, 0.1% serum albumin, IX Hanks' Balanced Salt Solution) was administered intraperitoneally. After massaging the abdomen for 3 minutes, ascites was collected and centrifuged at 300 X g for 1 minute. The precipitated cells were resuspended with 2 ml of solution A, layered on 4 ml of 35% serum albumin solution (Sigma) and allowed to stand at room temperature for 25 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 400 ⁇ g for 20 minutes, and the precipitated mast cell layer was collected.
  • solution A 1 unit / ml of parin, 0.1% serum albumin, IX Hanks' Balanced Salt Solution
  • the purity of the prepared enriched cells was confirmed by centrifugation using Cytospin 3 (Shandon Scientific Limited) to prepare a cell smear.
  • the cell smear was stained with a differential blood stain (Diff-Quik; Kokusai Reagent Co., Ltd.) and observed under a microscope to determine the morphological characteristics of the mast cells.
  • a differential blood stain Diff-Quik; Kokusai Reagent Co., Ltd.
  • cDNA synthesis of the prepared rat peritoneal mast cells was performed using a commercially available kit according to the attached manual.
  • RNeasy Qiagen
  • RT—PCR RT—PCR
  • LPSR1 LPSR1-binding protein
  • SEQ ID NO: 26 Oligonucleotides having a base sequence represented by 27 were used as a primer set.
  • PCR was performed by adding 5 parts of SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) with 0.075 1 of each of the primers, 41 of a 10-fold dilution of the cDNA solution, and 41 of water, and 0.85 1 of water. After 10 minutes of incubation, 45 cycles of 95 ° C (15 seconds) / 59 ° C (60 seconds) force were repeated.
  • PCR was performed using rat genomic DNA (CLONTECH) under the same conditions using the primer set described above (Andrew et al., J. Neurosci. Methods., 98, 9—20, 2000).
  • rat c-kit and rat mast cell ease-II (hereinafter abbreviated as RMCP-II), cDNA and rat genome DNA were used.
  • a type II an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 29 were used as a primer set that specifically recognizes rat c-kit.
  • a primer set that specifically recognizes RMCP-II was composed of an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31 PCR was performed under the same conditions.
  • LPSR1, c-kit, and RMCP-RM were 13,300 copies, 599,000 copies, and 16,000 copies.
  • DAKO DAKO Autostainer
  • DAKO block with DAKO serum free protein block
  • a primary antibody ⁇ Sagi polyclonal antibody against LPSR1 (LifeSpan)
  • Vector anti-rabbit Biotinylated secondary antibody
  • BA-1000 secondary; Vector Biotinylated secondary antibody
  • Staining was performed after washing the slides, using Vector ABC-AP (Vector) and Vector Red (Vector) as a substrate.
  • FIG. 2 shows the small intestine, (B) shows the synovium of a rheumatic patient, and (C) shows the bronchi of a bronchitis patient (mast cells are indicated by arrows).
  • the degree of mast cell staining in the synovium of rheumatic patients and in the bronchi of asthmatics and bronchitis of patients with bronchitis was increased as compared to normal.
  • the results of this example support that LPSR1 protein is expressed in mast cells of various human tissues, and is involved in inducing and enhancing degranulation of mast cells associated with inflammation.
  • the detection tool which is a polypeptide or a cell of the present invention is useful for detecting a lysophosphatidylserine receptor ligand or antagonist, or a lysophosphatidyl receptor activity-attenuating agent.
  • a lysophosphatidylserine receptor ligand or antagonist or a lysophosphatidyl receptor activity-attenuating agent.
  • therapeutic and / or prophylactic agents for allergic diseases and / or chronic inflammatory diseases can be screened.
  • each base sequence represented by the sequence numbers 5 to 20 in the sequence listing is a primer sequence artificially synthesized.

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Abstract

　リゾホスファチジルセリン受容体タンパク質、機能的等価改変体、相同タンパク質、又はハイブリタンパク質であるアレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療・予防剤のスクリーニングツール、並びに該各種タンパク質を発現している細胞及び該各種タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換され該タンパク質を発現している形質転換細胞であるアレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療・予防剤のスクリーニングツールを開示する。また、該スクリーニングツールを用いたリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴニスト、又はリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤の検出工程を含むリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴニスト、又はリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤のスクリーニング方法を開示する。

Description

明 細 書
新規スクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、リゾホスファチジルセリン受容体を用いた抗アレルギー剤及び/又は抗 炎症剤スクリーニング法に関する。
背景技術
[0002] リゾホスファチジルセリン（lysophosphatidylserine、以下 LysoPSと称する）とは、細胞 膜構成成分のリン脂質の一つであるホスファチジルセリン（phosphatidylserine、以下 P Sと称する）がホスホリパーゼ Al (phospholipase Al、以下 PLA1と称する）或いはホスホ リパーゼ A2 (phospholipase A2、以下 PLA2と称する）によって加水分解されて生成す るリゾリン脂質である。 PLA1或いは PLA2は炎症性細胞の活性ィ匕に伴い分泌され、炎 症部位で上昇して ヽることが知られて!/ヽる。供給源である PSと ヽつた酸性リン脂質は 細胞の脂質二重膜の細胞質側に局在し、細胞表面には露出していないので、定常 状態の細胞に PLA1或いは PLA2が作用しても LysoPSは産生されない。それに対して 、炎症部位では、多くの死滅した好中球、単球が存在し、それら死細胞の脂質二重 膜中の PSが基質となって、 PLA1或いは PLA2により PSから LysoPSが生成され、炎症 局所ではその濃度が上昇して 、ると考えられて 、る (非特許文献 1参照)。
[0003] LysoPSの生理活性としては、顕著な肥満細胞の活性化能を有する肥満細胞活性 化因子であることが有名である。肥満細胞は、 I型 (即時型)アレルギー反応において 重要な働きを担う免疫細胞である。 I型アレルギー反応は抗原による免疫グロブリン E (以下 IgEと称する)抗体の誘導に始まり、産生された IgE抗体は肥満細胞、好塩基球 など、その細胞膜上に IgE抗体に対する高親和性の受容体 (Fc ε )を有する細胞に結 合し、それらの細胞を感作する。次に再び生体が抗原に暴露されると、それら感作さ れた肥満細胞、好塩基球の活性化が引き起こされ、ヒスタミン、ロイコトリェン、セロト ニン、血小板活性ィ匕因子、好酸球遊走因子や好中球遊走因子といった種々のケミカ ルメディエーターや細胞遊走因子を遊離する。これを脱顆粒反応という。その結果、 即時型反応として平滑筋の収縮、毛細血管の拡張による発赤、浮腫、腫脹、気道分 泌促進、アナフィラキシー反応などが生じる (非特許文献 1参照)。
[0004] 肥満細胞の脱顆粒反応の研究に汎用されるラット腹腔由来の肥満細胞を用いた研 究では、コンカナパリン Aや、 IgE受容体を介した刺激、神経成長因子による脱顆粒誘 導反応を、 LysoPSは著しく増強することが示されている (非特許文献 2-6参照)。一方 、生体レベルでも作用は認められており、 LysoPSをマウスへ静脈注射すると、血中ヒ スタミン量が上昇し、ラットの足裏へ投与すると足浮腫を誘導するといつた報告がある (非特許文献 7、 8参照)。つまり LysoPSは細胞レベルのみならず、生体内でも肥満細 胞活性ィ匕因子としての機能を有しており、 LysoPSはアレルギー反応の惹起、及び増 強に非常に重要な働きをして 、ると考えられて 、る。
[0005] 肥満細胞の研究が進むにつれて、肥満細胞は、気管支喘息やアレルギー性鼻炎 t 、つたアレルギー性疾患に限らず、多くの慢性炎症疾患にぉ 、ても重要な働きをし ているという知見が多数報告されている。例えば、炎症性腸疾患の病巣部では、肥 満細胞数の増加、及びヒスタミン濃度の上昇と重症度の相関が確認されており、過敏 性腸症候群の腸神経線維近傍では活性化肥満細胞数が顕著に増加、ストレスゃコ ルチコトロピン放出因子による腸過敏性亢進と肥満細胞の脱顆粒が相関することが 報告されている (非特許文献 9-12参照)。また、慢性関節リウマチでも関与が示唆さ れており、リウマチ患者の滑膜では肥満細胞数の増加と肥満細胞脱顆粒誘導因子（ 神経成長因子や補体 C5aなど)の増加が認められ、肥満細胞欠損マウスが、関節リウ マチモデルに対して抵抗性を示すことが明ら力となっている（非特許文献 13-15参照 )。さらに、間質性膀胱炎患者の膀胱でも肥満細胞数の増カロと約八割の肥満細胞が 活性ィ匕した状態にあり、患者尿中には神経成長因子やトリプターゼの上昇が認めら れることなどが明らかになってきている（非特許文献 16、 17参照)。
[0006] 肥満細胞の脱顆粒反応は、アレルギー性疾患及び慢性炎症疾患にとって重要な 反応であり、その反応を強力に誘導、または増強する LysoPSに対する特異的な阻害 剤は、新しい抗アレルギー剤、及び抗炎症剤としての可能性を示唆されているが、こ れまで LysoPSの第一作用点となる分子は不明であり、そのタンパク質及びそれをコ ードする遺伝子は同定されておらず、 LysoPSに対する特異的な阻害剤の簡便な化 合物スクリーニング系の構築が困難であり、 LysoPS阻害に基づく抗アレルギー剤や 抗炎症剤の開発は進展していな力つた。
[0007] なお、本発明で用いることのできる LysoPS受容体タンパク質と同一のアミノ酸配列 力 なるポリペプチドをコードする DNA、及び該 DNAがコードする推定アミノ酸配列に ついては、種々の報告があり（特許文献 1-6)、 EP835933には該ポリペプチドの活性 阻害化合物や抗体が炎症の治療に用いることができることが記載されている。しかし 、いずれの報告においても該ポリペプチドのリガンドは解明されておらず、該ポリぺプ チドが LysoPS受容体であるとの記載はなぐ LysoPS存在下で試験物質を接触させァ レルギ一や炎症の治療剤をスクリーニングできることにつ 、て、開示も示唆もな ヽ (特 許文献 1-6参照)。
[0008] また WO03/87364には本発明で用いることのできる LysoPS受容体タンパク質と同一 のアミノ酸配列力もなるポリペプチドのリガンドが 4-ヒドロキシ -2-ノネナールなどの脂 質過酸化反応産物であり、該ポリペプチドのァゴ-スト、アンタゴニスト、抗体等は、 老化、動脈硬化、パーキンソン病又はアルツハイマー病等の疾患の治療又は予防に 有効であることが期待されると記載されている力 該ポリペプチドのアンタゴ-スト等 がアレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療及び/又は予防剤となりうるとの 記載はなぐまた該ポリペプチドのリガンドが LysoPSであると 、う記載もな 、。なお Lys oPSは脂質過酸化反応産物ではな ヽ。
[0009] 特許文献 1：米国特許 US0148465号
特許文献 2：国際公開第 00/77256号パンフレット
特許文献 3：欧州特許 EP1033401号
特許文献 4 :国際公開第 03/54152号パンフレット
特許文献 5：国際公開第 03/71272号パンフレット
特許文献 6：欧州特許 EP835933号
特許文献 7 :国際公開第 03/87364号パンフレット
非特許文献 1 :「蛋白質 核酸 酵素」、（日本)、 1991年、第 36卷、 p.407-412 非特許文献 2 :「ネイチヤー（Nature)」、（英国）、 1979年、第 79卷、 p.250-252 非特許文献 3 :「フエブス'レターズ（FEBS Letters)」、（オランダ）、 1979年、第 105卷、 p.58-62 非特許文献 4：「インターナショナノレ ·アーカイブズ ·ォブ ·ァレノレギ一'アンド'ィムノロ ジー（International Archives of Allergy & Immunology)」、（スイス）、 1991年、第 96卷 ゝ P.156- 160
非特許文献 5 :「フエブス'レターズ（FEBS Letters)」、（オランダ）、 1982年、第 138卷、 p.190-192
非特許文献 6 :「ェイジヱンッ'アンド'アクションズ (Agents and Actions)」、 （スイス）、 1 984年、第 14卷、 P.613- 618
非特許文献 7 :「ェイジヱンッ'アンド'アクションズ (Agents and Actions)」、 （スイス）、 1 984年、第 14卷、 p.619-625
非特許文献 8 :「ェイジヱンッ'アンド'アクションズ (Agents and Actions)」、 （スイス）、 1 984年、第 14卷、 p.606-612
非特許文献 9 :「ヒューマン'パソロジー（Human Pathology)」、（米国）、 1980年、第 11 卷、 P.606- 619
非特許文献 10 :「ガストロェンテロロジー（Gastroenterology)」、（米国）、 1990年、第 98 卷、 p.849-854
非特許文献 11 :「ジャーナル'ォブ 'コリアン 'メディカル'サイエンス（Journal of Korea n Medical Science)」、 (韓国）、 2003年、第 18卷、 p.204-210
非特許文献 12：「アメリカン'ジャーナル ·ォブ ·フイジォロジ一一ガストロインテスティ ナノレ' ント 'リノヽ1 ~~ 'フィンォロン1 ~~ (American Journal of Physiology-uastrointestina 1 and Liver Physiology)」、（米国）、 1996年、第 271卷、 p.884- 892
非特許文献 13：「アースライテス ·アンド ·リューマチズム (Arthritis & Rheumatism)」、（ 米国）、 1984年、第 27卷、 p.852-856
非特許文献 14 :「アースライテス 'アンド'リューマチズム（Arthritis & Rheumatism)」、 ( 米国）、 1998年、第 41卷、 p.233-245
非特許文献 15 :「サイエンス（Science)」、（米国）、 2002年、第 297卷、 p.1689-1692 非特許文献 16 :「ジャーナル'ォブ 'ゥロロジー（Journal of Urology)」、（米国）、 1995 年、第 153卷、 p.629-636
非特許文献 17 :「ジャーナル'ォブ 'ゥロロジー（Journal of Urology)」、（米国）、 1999 年、第 161卷、 p.438-442
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の課題は、アレルギー性疾患 (例えば、気管支喘息、アレルギー性気管支 肺ァスペルギルス症、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギ 一性中耳炎、蓴麻疹、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性 胃腸炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性角膜炎、植物アレルギー、薬物アレル ギー、アナフィラキシーショックなど）、及び/又は慢性炎症性疾患 (例えば、関節リウ マチ、炎症性腸疾患 (潰瘍性大腸炎、クローン病)、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎 、間質性膀胱炎に伴う過活動膀胱など)の治療及び/又は予防剤として有用な LysoP S受容体のアンタゴ-スト、或いは受容体活性減弱剤を得るための簡便なスクリー- ング方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0011] アレルギー性疾患及び慢性炎症疾患にとって重要な肥満細胞の脱顆粒反応を強 力に誘導、または増強する LysoPSに対する特異的な阻害剤は、新しい抗アレルギー 剤、及び抗炎症剤となるが、これまで LysoPSの第一作用点となる分子及びそれをコ ードする遺伝子は同定されていな力 た。
そのため、これまで、 LysoPSによる肥満細胞の脱顆粒反応を抑制する物質のスクリ 一ユングは、小動物力 調製した肥満細胞 (汎用されているのは、ラットの腹腔由来 の肥満細胞)の脱顆粒反応の抑制能を指標に行われてきた。このラット腹腔由来肥 満細胞を用いる系では、 LysoPS単独では脱顆粒反応はほとんど惹起できな 、ため、 顕著な脱顆粒反応を惹起するためには LysoPSに加え、 IgEとその特異的抗原又は神 経成長因子等の補助刺激が必要である。従って、この方法を用いて選択された脱顆 粒阻害剤は、その作用標的分子が不明なため、標的分子に由来する副作用の予測 も立たず、ヒトとの種差も判断できない。さらに、この方法では、 LysoPS選択的な阻害 剤の取得は困難であった。
本発明者らは、鋭意研究を行なった結果、配列番号 2及び配列番号 4で表されるァ ミノ酸配列力もなるポリペプチド（以下、 LPSR1と称する）力 LysoPSに反応し、活性化 される受容体であることを見出し (実施例 1-3)、 LysoPS存在下で試験物質を LPSR1に 接触させることを特徴とする LPSR1のアンタゴ-スト若しくは活性減弱剤を探索するた めの簡便な化合物スクリーニング系を構築した (実施例 3)。
該スクリーニング系を用いることで LysoPSと LPSR1の相互作用の阻害に基づぐ種 差を考慮に入れた抗アレルギー剤ゃ抗炎症剤の探索が可能となった。また、該スタリ 一ユング系により得られる抗アレルギー剤ゃ抗炎症剤は、 LysoPSと LPSR1の相互作 用を特異的に阻害する薬剤、又は LysoPSの LPSR1への親和性を特異的に減弱させ る薬剤であることから安全性に優れているといえ、また、 LysoPSによって増強された様 々な脱顆粒刺激因子の脱顆粒反応を、その根源である LysoPSの作用自体を抑制す ることで、肥満細胞の脱顆粒反応を強力に抑制する薬剤である。
さらに、本発明者らは LPSR1、若しくは LPSR1を発現する細胞が LysoPS受容体リガ ンド若しくはアンタゴニスト、又は LysoPS受容体活性減弱剤検出ツールとなることを明 らかにした。
すなわち本発明は、以下のスクリーニング方法、検出方法、及び検出ツール等に関 する。
[1] (1)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド、 又は
(a)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列、（b)配列番号 2若しくは配 列番号 4で表されるアミノ酸配列において 1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若 しくは挿入されたアミノ酸配列、（c)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸 配列との同一性が 80%以上であるアミノ酸配列、並びに (d)配列番号 1若しくは配列番 号 3で表されるポリヌクレオチド又はその相補配列にストリンジェントな条件でノヽイブリ ダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列力 なる群力 選択されるァミノ 酸配列を含み、かつリゾホスファチジルセリン受容体活性を有するポリペプチド、或い は
該ポリペプチドを発現して 、る細胞若しくは細胞の膜画分
と、試験物質とを、リゾホスファチジルセリン存在下で接触させる工程、
(2)試験物質がリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジ ルセリン受容体活性減弱剤であるか否かを検出する工程、並びに
(3)リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジルセリン受 容体活性減弱剤を選択する工程
を含む、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジルセリ ン受容体活性減弱剤をスクリーニングする方法。
[2] (1)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド、 又は
(a)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列、（b)配列番号 2若しくは配 列番号 4で表されるアミノ酸配列において 1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若 しくは挿入されたアミノ酸配列、（c)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸 配列との同一性が 80%以上であるアミノ酸配列、並びに (d)配列番号 1若しくは配列番 号 3で表されるポリヌクレオチド又はその相補配列にストリンジェントな条件でノヽイブリ ダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列力 なる群力 選択されるァミノ 酸配列を含み、かつリゾホスファチジルセリン受容体活性を有するポリペプチド、或い は
該ポリペプチドを発現して 、る細胞若しくは細胞の膜画分
と、試験物質とを、リゾホスファチジルセリン存在下で接触させる工程、
(2)試験物質がリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチ ジルセリン受容体活性減弱剤であるカゝ否かを検出する工程、並びに
(3)リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴニストを選択する工程
を含む、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-ストをスクリーニングする方法。
[3]細胞が、 [1]又は [2]に記載のポリペプチドをコードする DNAを含む発現ベクターで 形質転換され、該ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、 [1]又は [2]に記 載のスクリ一ユングする方法。
[4] [1]又は [2]に記載の細胞と、試験物質とを、リゾホスファチジルセリン存在下で接 触させる工程、及び試験物質による該細胞内シグナル伝達の誘導又は抑制を分析 する工程を含む、試験物質がリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくは リゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤であるカゝ否かを検出する方法。 [5] [4]に記載の方法による、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリ ゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤であるか否かを検出する工程、及びリゾホ スファチジルセリン受容体アンタゴニスト若しくはリゾホスファチジルセリン受容体活性 減弱剤を選択する工程を含む、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴニスト若しく はリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤をスクリーニングする方法。
[6]リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジルセリン受 容体活性減弱剤がアレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療剤及び/又は 予防剤である [1]又は [5]に記載のスクリーニングする方法。
[7] [4]に記載の方法による、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリ ゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤であるか否かを検出する工程、及びリゾホ スファチジルセリン受容体アンタゴニストを選択する工程を含む、リゾホスファチジル セリン受容体アンタゴニストをスクリーニングする方法。
[8]リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴニストがアレルギー性疾患及び/又は慢 性炎症疾患の治療剤及び/又は予防剤である [2]又は [7]に記載のスクリーニングする 方法。
[9] [1]又は [2]に記載のポリペプチド又は細胞である、リゾホスファチジルセリン受容 体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又はリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤の 検出ツール。
[10] [1]又は [2]に記載のポリペプチド又は細胞の、リゾホスファチジルセリン受容体リ ガンド若しくはアンタゴニスト、又はリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤である アレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療及び/又は予防剤スクリーニング のための使用。
本明細書において、「検出ツール」とは、検出のために用いる物、具体的には、検 出のために用いるポリペプチド又はポリペプチドを発現して 、る細胞を意味する。「リ ゾホスファチジルセリン受容体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又はリゾホスファチジル セリン受容体活性減弱剤の検出ツール」とは、リゾホスファチジルセリン受容体 (以下 LysoPS受容体と称する）のリガンド若しくはアンタゴ-スト、又は LysoPS受容体活性減 弱剤を検出するために、本発明の検出方法又はスクリーニング方法において、試験 物質を接触させる対象として用いるためのポリペプチド又は細胞である。 [1]又は [2] 記載のポリペプチド又は細胞の、本発明のリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ- スト若しくはリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤をスクリーニングする方法に おけるアレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療及び/又は予防剤スクリー ニングのための使用も、本発明に含まれる。
[0014] 本明細書にぉ 、て、「リゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤」とは内在性リガ ンドとは異なる部位に結合して、リガンドの受容体への親和性を減弱させるァロステリ ックイ匕合物 (negative allostenc modulatorのことを 、つ (Chnstopoulos and Kenakin, Pharmacological Reviews, 54, 323—374, 2002)。
[0015] なお、本願優先日と同日又は優先日後に公開された報告 (WO04/039956、 WO04/ 103293)において、本発明で用いることのできる LysoPS受容体と同一のアミノ酸配列 力 なるポリペプチドに対する抗体がアレルギーや炎症などの免疫障害を改善できる と記載されている力 いずれもリガンドが解明されておらず、 LysoPS受容体であるとの 記載はなく、 LysoPS存在下で試験物質を接触させアレルギーや炎症の治療剤をスク リー-ングできることについて、開示も示唆もない。
[0016] 前述の通り、本願記載の LysoPS受容体アンタゴ-スト若しくは LysoPS受容体活性 減弱剤のスクリーニング方法、 LysoPS受容体リガンド若しくはアンタゴニスト、又は Lys oPS受容体活性減弱剤の検出ツール及び検出方法、アレルギー性疾患及び/又は 慢性炎症疾患の治療及び/又は予防剤スクリーニング方法は本願発明者らが初めて 開示した発明である。
発明の効果
[0017] 本発明のスクリーニング方法によれば、 LysoPS受容体のアンタゴ-スト、或いは Lys oPS受容体活性減弱剤をスクリーニングすることができる。 LysoPS受容体のアンタゴ- スト、或いは LysoPS受容体活性減弱剤は、アレルギー性疾患 (例えば、気管支喘息 、アレルギー性気管支肺ァスペルギルス症、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー 性副鼻腔炎、アレルギー性中耳炎、蓴麻疹、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性 皮膚炎、アレルギー性胃腸炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性角膜炎、植物ァ レルギ一、薬物アレルギー、及びアナフィラキシーショックなど）、又は慢性炎症性疾 患 (例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患 (潰瘍性大腸炎、クローン病）、過敏性腸症 候群、間質性膀胱炎、及び間質性膀胱炎に伴う過活動膀胱など)の治療及び/又は 予防剤として有効な物質である。
図面の簡単な説明
[0018] [図 l]LysoPS受容体 LPSR1を発現させた細胞における LysoPSの細胞内シグナル伝達 への効果を示すグラフである。縦軸はシグナル伝達の強度を表すルシフェラーゼ活 性 (未刺激時との比率)を表して ヽる。横軸は LysoPSの濃度（ μ Μ)を示す。〇はヒト L ysoPS受容体を発現させた細胞、參はラット LysoPS受容体を発現させた細胞、△はヒ ト及びラット LysoPS受容体遺伝子が組み込まれて ヽな 、空ベクターを発現させた細 胞を示す。
[図 2] (A)健常人の小腸、（B)リウマチ患者の滑膜、（C)気管支炎患者の気管支にお ける LysoPS受容体の免疫染色像を示す図である。矢印は肥満細胞を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下に本発明を詳細に説明する。
[1]本発明の検出ツール
本発明の LysoPS受容体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又は LysoPS受容体活性減 弱剤検出ツールには、ポリペプチド型検出ツールと、細胞型検出ツールとが含まれる
1)ポリペプチド型検出ツール
本発明のポリペプチド型検出ツールには、
( 1)ヒト LPSR1、すなわち、配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 又はラット LPSR1、すなわち、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド である、 LysoPS受容体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又は LysoPS受容体活性減弱 剤検出ツール；
(2)機能的等価改変体、すなわち、（a)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミ ノ酸配列を含み、し力も LysoPS受容体活性を有するポリペプチド、或いは (b)配列番 号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個、好ましくは 1〜7 個、さらに好ましくは 1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたァミノ 酸配列を含み、かつ LysoPS受容体活性を有するポリペプチドである、 LysoPS受容体 リガンド若しくはアンタゴ-スト、又は LysoPS受容体活性減弱剤検出ツール；
(3)相同タンパク質、すなわち、配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配 列との同一性が 80%以上、好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の同一性を有 するアミノ酸配列を含み、かつ LysoPS受容体活性を有するポリペプチドである、 Lyso PS受容体リガンド若しくはアンタゴニスト、又は LysoPS受容体活性減弱剤検出ツール ；及び
(4)ハイプリタンパク質、すなわち、配列番号 1若しくは配列番号 3で表されるポリヌク レオチド又はその相補配列にストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオ チドでコードされるアミノ酸配列を含み、かつ LysoPS受容体活性を有するポリべプチ ドである、 LysoPS受容体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又は LysoPS受容体活性減弱 剤検出ツールが含まれる。
本発明のポリペプチド型検出ツールとして用いることのできる各種ポリペプチド、す なわち、ヒト若しくはラット LPSR1、機能的等価改変体、相同タンパク質、ハイプリタン パク質を以下、検出ツール用ポリペプチドと称する。
[0020] 本発明のポリペプチド型検出ツールとして用いることのできる、配列番号 2若しくは 配列番号 4で表されるアミノ酸配列力 なるポリペプチドと同一のアミノ酸配列からな るポリペプチドは知られて 、たが、これが LysoPS受容体のアミノ酸配列であることは開 示も示唆もなぐ LysoPS受容体は、本発明者が今回初めて解明するまで、その実体 は同定されていなかった。
[0021] 本発明のポリペプチド型検出ツールとして用いることのできる検出ツール用ポリぺプ チドには、配列番号 2で表されるアミノ酸配列力 なるポリペプチドであるヒト LysoPS受 容体が含まれる。ヒト LysoPS受容体は、 339個のアミノ酸残基力もなるヒト由来 Gタンパ ク質共役型受容体である。検出ツール用ポリペプチドはヒト由来のものに限定されず 、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、又はィヌ）由来のものも含まれ る。例えば、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチドであるラット Lyso PS受容体が含まれる。ラット LysoPS受容体は、 328個のアミノ酸残基力 なるラット由 来 Gタンパク質共役型受容体である。また、検出ツール用ポリペプチドには、ポリぺプ チドの N末端及び/又は C末端に、適当なマーカー配列等を付加した融合ポリべプチ ドゃヒトゃヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はィヌ）由来の LysoP S受容体を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質なども含まれる。
[0022] 本明細書における前記「同一性」とは、 BLAST (Basic local alingment search tool; A ltschulら、 J. Mol. Biol, 215, 403-410, 1990)検索により得られた値を意味し、ァミノ 酸配列の同一性は、 BLAST検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的 には、 BLASTパッケージ（sgi32bit版、バージョン2.2.10 ^。8はり入手）の1)12369プロ グラム（Tatusova and Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999)を用い、 デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ ·アラインメント ·パ ラメ一ターとして、プログラム名「blastp」を使用し、 Gap挿入 Cost値を「-1」で、 Gap伸 長 cost値を「-1」で、 Query配列のフィルタ一として「SEG」を、 Matrixとして「BLOSUM6 2」をそれぞれ使用する。この bl2seqプログラムによれば、配列番号 2で表されるァミノ 酸配列からなるヒト LysoPS受容体と配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなるラット L ysoPS受容体とは、アミノ酸配列の比較において 82%の同一性を示す。
[0023] 本明細書における前記「ストリンジェントな条件」でのハイブリダィゼ—シヨンとは、非 特異的な結合が起こらない条件を意味し、例えば Sambrookら、 "Molecular Cloning- A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY、 1989年に記載の条件 等が挙げられる。具体的には、ハイブリダィゼーシヨンを 6 X SSC、 0.5%SDS、 5 Xデン ハート及び 100 mg/ml-シン精子 DNAを含む溶液中でプローブとともに 65°Cでー晚 行い、洗浄溶液 (0.2 X SSC、 0.1% SDS)で、必要に応じて予備洗浄を行った後、 50〜 60°Cの温度条件下で洗浄すると!/、う条件である。
[0024] 本明細書における前記「リゾホスファチジルセリン (LysoPS)」とは、細胞膜構成成分 のリン脂質の一つであるホスファチジルセリン（PS)がホスホリパーゼ Al (PLA1)或!ヽ はホスホリパーゼ A2 (PLA2)によって加水分解されて生成するリゾリン脂質である（堀 米，蛋白質核酸酵素， 36, 407-412, 1991)。 PSはセリンリン脂質を極性基として有す るグリセ口リン脂質であり、 PLA1が作用すると 1位、 PLA2が作用すると 2位の脂肪酸が 外れて LysoPSとなる。 LysoPSには、残った脂肪酸の位置、炭素鎖数、及び飽和度に よって、 1-ォレオイル- LysoPSや 1-パルミトイル- LysoPSなどが存在する。これら全て 総称して LysoPSという。具体的には、例えば、 Xiaoらの方法（Xiaoら， Annals of the N ew York Academy of Sciences, 905, 242-259, 2000)によって、それが LysoPSである か否かを判定することができる。
[0025] 本明細書における前記「LysoPS受容体活性を有する」とは、 LysoPSに反応すること により、共役した Gタンパク質を介して、細胞内に外界刺激を伝達する受容体としての 活性を有することを意味する。前記活性を有するか否かは、 LysoPSに反応して、例え ば、実施例 2に記載のアツセィで、 LysoPS用量依存的にルシフェラーゼ活性が上昇 する力否かにより判定することができる。この場合、ルシフェラーゼ活性が上昇すれ ば、「LysoPS受容体活性を有する」と判定することができる。
[0026] 本発明の検出ツール用ポリペプチドは、種々の公知の方法によって得ることができ る。例えば、検出ツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、公知の方法（ Mamatisり, Molecularし loning— A Laboratory Manual , し old bpnng Harbor Laborat ory, NY, 1982等）に従って、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計 し合成したプライマーやプローブを用いて、 PCR法やハイブリダィゼーシヨン法による スクリーニングにより、 cDNAライブラリーから単離することができる。より具体的には、 ヒト LysoPS受容体遺伝子の塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプロ一 ブを設計し、該プライマー又はプローブと、 目的とする生物 (例えば、ヒト、マウス、ラッ ト、ノ、ムスター、又はィヌ）由来の試料（例えば、ゲノム DNA、総 RNA若しくは mRNA、 c DNAライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いて PCR法又はハイブリダィゼー シヨン法を実施することにより、検出ツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドを取得することができる。取得したポリヌクレオチドを適当な発現系に組み込み発現 させ、発現したタンパク質が、例えば実施例 2に記載の方法により LysoPSに反応する ことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。より具体的に は、後述する細胞 (すなわち、検出ツール用ポリペプチドを発現している細胞）を得、 受容体タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物か ら目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる (WO02/36631 参照)。
[0027] また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質は、常法、例えば、部位 特異的突然変異誘発法（site- specific mutagenesis; Markら， Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, 81, 5662-5666, 1984等）により、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適 当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例 2に記載の方 法により、 LysoPSに反応することを確認することにより、所望のタンパク質を取得する ことができる。
[0028] 2)細胞型検出ツール
本発明の細胞型 LysoPS受容体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又は LysoPS受容体 活性減弱剤検出ツールには、検出ツール用ポリペプチドを発現して 、る細胞である、 LysoPS受容体リガンド若しくはアンタゴニスト、又は LysoPS受容体活性減弱剤検出ッ ールが含まれる。
本発明の細胞型検出ツールとして用いることのできる細胞（以下、検出ツール用細 胞と称する）は、検出ツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるもの ではなぐ人為的に検出ツール用ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であっても よぐ検出ツール用ポリペプチドを発現して 、る天然の細胞又は樹立した細胞株であ つてもよいが、人為的に検出ツール用ポリペプチドを発現させた形質転換細胞が好 ましい。
[0029] 本発明の細胞型検出ツールとして用いることのできる各種形質転換細胞（以下、検 出ツール用形質転換細胞と称する）を作製するために使用するポリヌクレオチドは、「 1)ポリペプチド型検出ツール」に記載した方法で単離できる。
単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当な発現ベクターに組み込むことによ り、真核生物及び原核生物の宿主細胞に形質移入することができるようになり、宿主 細胞において形質移入したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現さ せることが可能である。
[0030] 宿主細胞は検出ツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定され るものではなぐ例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母 (S accharomyces Cerevisiae)、或いは公知の培養細胞、例えば、チャイニーズ /、ムスタ 一卵巣由来細胞株 CHO細胞、 CHO細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980)、ヒト胚性腎 293 (HE K293)細胞、 HEK293細胞にェプスタイン'バーウィルスの EBNA-1遺伝子を導入した 293EBNA細胞（Invitrogen社）、アフリカミドリザル腎臓由来細胞株 COS細胞、昆虫細 胞 (例えば、 S19細胞）を挙げることができる。
[0031] 発現ベクターには、宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターを用いるこ とができる他、宿主細胞に応じて適宜選択したベクタープラスミドに適当なプロモータ 一及び形質発現にかかわる配列を導入したものを用いることができる。また組み込ん だポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが発現する際にダルタチオン- S-ト ランスフェラーゼ (GST)や Flag、 Hisなどのタグが融合された状態で発現するように特 定の配列を導入した発現ベクターを用いることもできる。数種類のポリヌクレオチドで 同時に一つの細胞を形質転換する場合は、数種類のポリヌクレオチドが一つの発現 ベクターに含まれるように構成してもよぐまたは各々別々の発現ベクターに含まれる ように構成してもよい。或いは、このような構成が染色体 DNAに組み込まれた細胞を 取得してこれを用いてもよ!、。
[0032] 所望のポリヌクレオチドを導入した発現ベクターは、 DEAE-デキストラン法（Luthman ら， Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983)、リン酸カルシウム- DNA共沈殿法（Gr ahamら， Virology, 52, 456-457, 1973)、市販のトランスフエクシヨン試薬である Lipofec tamine 2000 (Invitrogen社)や FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals社)を用いた 方法、及び電気パルス穿孔法（Neumannら， EMBO J., 1, 841-845, 1982)等により宿 主細胞に取り込ませ、形質転換させることができる。具体的な実施態様として、例え ば実施例 2に記載の方法により実施できる。
[0033] 検出ツール用形質転換細胞は、常法に従って培養することができ、培養に用いるこ とのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選 択することができる。例えば、 COS細胞の場合には、 RPMI-1640培地又はダルベッコ 修正イーグル最小必須培地 (DMEM)等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清 (FBS) 等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、 293EBNA細胞の場合 には、牛胎仔血清 (FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須 培地（DMEM)等の培地に G418をカ卩えた培地を使用することができる。
[0034] 検出ツール用細胞の膜画分は、具体的には例えば以下の手順で調製することがで きる。検出ツール用細胞を回収及び洗浄した後、 5 mM EDTAとプロテアーゼインヒビ ター（Complete™プロテアーゼインヒビターカクテル錠；ロシュ ·ダイァグノスティックス 株式会社）とを含有する 20 mM Tris-HCl (pH7.4)に懸濁して、ポリトロンにてホモジナ ィズする。超遠心処理を行った後、沈殿を 1 mM EDTA、 100 mM NaCl、 0.1% BSA、 及びプロテアーゼインヒビター（Complete™プロテアーゼインヒビターカクテル錠）を含 有する 50 mM Tris-HCl (pH7.4)に懸濁し、これを膜画分として用いることができる。
[0035] [2]本発明の検出方法
本発明の検出方法には、検出ツール用細胞と、試験物質とを、 LysoPS存在下で接 触させる工程、及び試験物質による細胞内シグナル伝達の誘導又は抑制を分析す る工程を含む、試験物質が LysoPS受容体アンタゴニスト若しくは LysoPS受容体活性 減弱剤であるか否かを検出する方法が含まれる。
LysoPS受容体に対するリガンドが細胞内シグナル伝達経路を活性ィ匕する際、各種 応答配列、例えば血清応答配列（serum response element; SRE)を介して転写を活 性化するという特性を利用して、検出ツール用細胞における、 LysoPSにより誘導され た細胞内シグナル伝達の、試験物質による誘導又は抑制を分析することにより、試験 物質が LysoPS受容体に対するアンタゴ-スト、或いは LysoPS受容体活性減弱剤であ る力否かを検出することができる。
[0036] 例えば、以下の手順により実施することができる。
細胞として、検出ツール用細胞に、シグナル伝達に関わる応答配列、プロモーター 、及びレポーター遺伝子の融合遺伝子（例えば、 pSRE-Luc; CLONTECH社）を共発 現させた細胞（以下、細胞シグナル型検出用細胞と称する）を使用する。好ましい宿 主細胞としては、例えば、ヒト胎児腎臓由来の細胞株である 293EBNA細胞を挙げるこ とがでさる。
細胞シグナル型検出用細胞と試験物質とを、 LysoPS存在下において接触させ、細 胞シグナル型検出用細胞内のレポーター活性の変化を分析する。レポーター活性 の変化は、ルミノメーター、液体シンチレーシヨンカウンター、又は X線フィルム等で分 析することができる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた 場合は、ルシフェラーゼ活性の変化を市販の測定キット（例えば、ピツカジーン発光 キット;東洋インキ)を用いて分析することができる。
細胞シグナル型検出用細胞と試験物質とを、 LysoPS存在下にお ヽて接触させた場 合に、 LysoPSによる細胞シグナル型検出用細胞内のレポーター活性の上昇力 該 試験物質により阻害又は抑制されれば、該試験物質は、 LysoPS受容体に対するアン タゴニスト、或いは LysoPS受容体活性減弱剤であると判定することができる。なお、コ ントロールとして、細胞シグナル型検出用細胞と LysoPSとを、試験物質の不在下にお いて接触させ、 LysoPSによる細胞シグナル型検出用細胞内のレポーター活性の上 昇の程度を確認しておくことが好まし 、。
具体的には、例えば、実施例 2に記載の条件で実施することができる。
[0037] [3]本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法には、
(1)本発明の検出ツール (ポリペプチド型検出ツール及び細胞型検出ツールの両方 を含む）と、試験物質とを、 LysoPS存在下で接触させる工程、
(2)試験物質が LysoPS受容体アンタゴニスト若しくは LysoPS受容体活性減弱剤であ るカゝ否かを検出する工程、並びに
(3) LysoPS受容体アンタゴ-スト若しくは LysoPS受容体活性減弱剤を選択する工程 を含む、 LysoPS受容体アンタゴニスト若しくは LysoPS受容体活性減弱剤をスクリー- ングする方法が含まれる。特に、 LysoPS受容体アンタゴ-ストをスクリーニングする方 法がより好ましい。
[0038] 既に説明したように、 LysoPSは肥満細胞の脱顆粒反応を誘導し、アレルギー性疾 患 (例えば、気管支喘息、アレルギー性気管支肺ァスペルギルス症、花粉症、アレル ギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性中耳炎、蓴麻疹、湿疹、アトピー 性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性胃腸炎、アレルギー性結膜炎、ァレ ルギー性角膜炎、植物アレルギー、薬物アレルギー、及びアナフィラキシーショックな ど)、及び慢性炎症性疾患 (例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患 (潰瘍性大腸炎、ク ローン病)、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎、及び間質性膀胱炎に伴う過活動膀胱 など）を引き起こすことが知られており、 LysoPS受容体アンタゴ-スト、或いは LysoPS 受容体活性減弱剤はアレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療及び/又は 予防剤になると考えられる。また、これまで説明した検出ツール用ポリペプチドそれ自 体、或いは、検出ツール用細胞それ自体を、該疾患治療及び/又は予防剤のスクリ 一二ングに使用することができる。
[0039] 本発明のスクリーニング方法に含まれる「試験物質が LysoPS受容体アンタゴニスト 若しくは LysoPS受容体活性減弱剤であるカゝ否かを検出する工程」で用いる検出方法 は、以下の 5つに大別されるが、いずれかの検出方法を用いて、或いは、これらを組 み合わせて、 LysoPS受容体アンタゴニスト、或いは LysoPS受容体活性減弱剤である か否かを検出し、試験物質の中からアンタゴニスト、或いは受容体活性減弱剤を選 択することによって、 LysoPS受容体アンタゴ-スト若しくは LysoPS受容体活性減弱剤 をスクリーニングすることができる。
[0040] 以下、本発明のスクリーニング方法の検出する工程で用いる検出方法である
1)本発明の検出方法；
2) LysoPS受容体に対するリガンドである力否かを検出する方法 (以下、リガンド検出 方法と称する）；
3) GTP γ S結合法を利用する LysoPS受容体アンタゴ-スト、或いは LysoPS受容体活 性減弱剤であるか否かを検出する方法 (以下、 ΟΤΡ γ S結合型検出方法と称する）；
4)細胞内における Ca2+濃度の変動を指標として、 LysoPS受容体アンタゴニスト、或い は LysoPS受容体活性減弱剤であるカゝ否かを検出する方法 (以下、 Ca2+型検出方法と 称する）；及び
5)細胞内における cAMP量の変動を指標として、 LysoPS受容体アンタゴニスト、或い は LysoPS受容体活性減弱剤であるカゝ否かを検出する方法 (以下、 cAMP型検出方法 と称する）
について、順次説明する。
[0041] なお、 Ca2+型検出方法及び cAMP型検出方法で、検出ツール用ポリペプチドと Gタ ンパク質キメラとを共発現している細胞を使用する。ここで「Gタンパク質」とは、 《、 β 及び γサブユニットで構成される三量体のタンパク質であり、受容体と共役して細胞 内へのシグナル伝達及び増幅因子として機能する。 aサブユニット（Gひ）には G13、 Gq、 Gi、 Gs等といったサブファミリーが存在し、その種類によって、異なったシグナル 伝達経路を制御している。
G13は、 pi 15Rho-GEFといったグァニンヌクレオチドエクスチェンジ因子への刺激を 介して、 Rhoキナーゼの活性ィ匕を促進する Gタンパク質である。 Rhoキナーゼの活性 が促進されると、例えば、血清応答配列（serum response element; SRE)を介した下 流遺伝子の転写を促進する。従って、 G13と共役している受容体のシグナル伝達の 有無及び強弱は、 SRE依存的なレポーター遺伝子（例えば、 pSRE-Luc; CLONTEC H社)を導入した細胞を用いて、レポーター活性の変動を指標として検出することが できる。
[0042] Gqは、ホスホリパーゼ Cの活性を促進する Gタンパク質である。ホスホリパーゼじの 活性が促進されると、例えば、細胞内 Ca2+濃度が上昇する。従って、 Gqと共役してい る受容体のシグナル伝達の有無及び強弱は、細胞内における Ca2+濃度の変動を指 標として検出することができる。
Giは、アデ-ル酸シクラーゼの活性を抑制する Gタンパク質である。アデニル酸シク ラーゼの活性が抑制されると、例えば、細胞内 cAMP濃度が低下する。従って、 Giと 共役して!/、る受容体のシグナル伝達の有無及び強弱は、細胞内における cAMP濃度 の変動を指標として検出することができる。
[0043] Gsは、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕を促進する Gタンパク質である。アデニル酸 シクラーゼの活性ィ匕が促進されると、例えば、細胞内 cAMP濃度が上昇する。従って 、 Gsと共役している受容体のシグナル伝達の有無及び強弱は、細胞内における cAM P濃度の変動を指標として検出することができる。
「Gタンパク質キメラ」とは、 Gタンパク質の C末端のアミノ酸配列 (例えば 5アミノ酸残 基)を他の Gタンパク質の配列に置換したものであって、本来、共役する Gタンパク質と は異なった細胞内へのシグナル伝達及び増幅因子として機能することができる Gタン ノ ク質のことである。例えば、ホスホリパーゼ C活性促進活性を有する Gqの部分ポリ ペプチドと、 Giの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラである「Gqと Gi とのキメラタンパク質」を挙げることができる（Conklinら， Nature, 363, 274-276, 1993)
[0044] 実施例 3に記載の方法によって、 LPSR1に共役する Gタンパク質を解析した結果、 L PSR1は各種 Gタンパクのうち、 G13に共役し、 G13を介して細胞内へシグナルを伝達 する受容体であることが明ら力となった。従って、 Ca2+型検出方法では例えば Gqと G1 3とのキメラタンパク質を発現させた細胞で、また cAMP型検出方法では例えば Gsと G 13、或いは Giと G13とのキメラタンパク質を発現させた細胞で、細胞内シグナルを検 出することにより、アンタゴ-スト及び受容体活性減弱剤を検出できることが明らかに なった。
[0045] 1)本発明の検出方法
本発明の検出方法は、「[2]本発明の検出方法」に記載の通りである。この場合は、 例えば、実施例 2に記載の条件で、試験物質を一定時間作用させ、 LysoPSによるレ ポーター活性の上昇の阻害を指標に、その IC が 10 M以下（さらに好ましくは 1 μ
50
Μ以下）の試験物質を LysoPS受容体アンタゴニスト、或いは LysoPS受容体活性減弱 剤として検出することができる。
[0046] 2)リガンド検出方法
リガンド検出方法は、本発明の検出ツールと標識した LysoPSとを用いる限り特に限 定されるものではないが、例えば以下の手順により実施することができる。
前述の方法により本発明の検出ツールを調製する。アツセィ条件 (例えば、使用す る緩衝液の種類、温度、及び濃度、緩衝液に添加するイオンの種類及び濃度、並び にアツセィ系の PH)を最適化し、最適化したバッファ一中で、該検出ツールと、標識し た LysoPSとを、試験物質と共に一定時間インキュベーションする。該標識した LysoPS としては、例えば、 [3H]-LysoPSを用いることができる。反応後、反応液をガラスフィル ター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性を 液体シンチレーシヨンカウンタ一等で測定する。得られた放射活性リガンド [3H]-Lyso PSの結合阻害を指標として、該試験物質が LysoPS受容体に対するリガンドであるか 否かを検出することができる。すなわち、試験物質不在下の場合のフィルター残存放 射活性よりも、試験物質存在下の場合のフィルター残存放射活性が低下した場合に は、該試験物質は、 LysoPS受容体に対するリガンドであると検出することができる。 例えば、 WO02/36631の実施例 6に記載の条件に倣って、一定量の LysoPS受容体 発現細胞の膜画分に、 [ ]— LysoPSを加え、最適化したバッファ一中で、試験物質 を一定時間作用させ、 [3H]— LysoPSの結合阻害を指標に、その IC が 10 /z M以下（
50
さらに好ましくは 1 M以下）の試験物質を、リガンドとして検出することができる。
[0047] リガンドとして検出された試験物質を、さらに、本発明の検出方法、 ΟΤΡ γ S結合型 検出方法、 Ca2+型検出方法、及び/又は cAMP型検出方法にかけ、アンタゴニスト、或 いは受容体活性減弱剤をスクリーニングすることにより、アレルギー性疾患及び/又 は慢性炎症疾患の治療剤及び/又は予防剤として有用な物質をスクリーニングするこ とがでさる。
[0048] 3) GTP y S結合型検出方法
GTP y S結合型検出方法は、 GTP y S結合法（Lazareno and Birdsall, Br. J. Pharma col., 109, 1120-1127, 1993)を利用して、試験物質が LysoPS受容体アンタゴ-スト、 又は LysoPS受容体活性減弱剤であるカゝ否かを検出することができる。
例えば、以下の手順により実施することができる。
検出ツール用ポリペプチドを発現させた細胞膜を、 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、 100 mM NaCl、 10 mM MgCl、 0.1%-ゥシ血清アルブミン（BSA)、 10 M GDPゝ 10— 12 M〜1
2
0"5 M LysoPS,及び試験物質の混合溶液中で、 3 で標識された GTP y S (250 pM)と 混合し、室温で 1時間、インキュベーションし、反応液をガラスフィルタ一等で濾過し、 フィルターに残存する GTP y Sの放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一等で測 定する。 LysoPSによる GTP y S結合上昇の試験物質による抑制を指標に、該試験物 質が LysoPS受容体に対するアンタゴ-スト、又は LysoPS受容体活性減弱剤であるか 否かを検出することができる。
例えば、 LysoPSによる GTP y S結合の上昇の阻害の IC 力 10 M以下（さらに好ま
50
しくは 1 M以下）の試験物質を、 LysoPS受容体アンタゴ-スト、或いは LysoPS受容 体活性減弱剤として検出することができる。
[0049] 4) Ca2+型検出方法
Ca2+型検出方法では、細胞として、（i)検出ツール用ポリペプチドと、（ii) Gタンパク 質キメラ (例えば、 Gqと G13とのキメラタンパク質）とを共発現している細胞（以下、 Ca2+ 型検出用細胞と称する）を使用する。なお、該細胞は、 LysoPSを作用させても細胞内 Ca2+濃度が上昇しない細胞に (i)検出ツール用ポリペプチドと、（ii) Gタンパク質キメラ とを共発現させた形質転換細胞が好ましい。好ましい宿主細胞としては、例えば、ヒト 胎児腎臓由来の細胞株である 293EBNA細胞を挙げることができる。
[0050] Ca2+型検出方法は、 Ca2+型検出用細胞と試験物質とを、 LysoPS存在下において接 触させ、 Ca2+型検出用細胞内の Ca2+濃度の変化を直接的又は間接的に分析する。 C a2+濃度の変化は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬 (例えば、 fora2又は fluo3等） を用いて、直接的に Ca2+濃度の変化を分析することもできる。或いは、 Ca2+濃度に依 存して転写量が調節される遺伝子 (例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にァクチ ベータ一プロテイン 1 (API)応答配列を挿入した遺伝子)の転写活性を分析すること により、間接的に Ca2+濃度の変化を分析することもできる。
[0051] Ca2+型検出方法は、 LysoPSによる Ca2+型検出用細胞内の Ca2+濃度の上昇が、試験 物質により阻害又は抑制されることを指標に、 LysoPS受容体アンタゴニスト、又は Lys oPS受容体活性減弱剤を検出することができる。
例えば、 G13と Gqのキメラタンパク質を共発現させた場合、 WO02/36631の実施例 3 に記載の条件で、試験物質を一定時間作用させ、 LysoPSによる細胞内 Ca2+濃度の 上昇の阻害を指標に、その IC が 10 M以下（さらに好ましくは 1 /z M以下）の試験
50
物質を、 LysoPS受容体アンタゴニスト、或いは LysoPS受容体活性減弱剤として検出 することができる。
なお、コントロールとして、 Ca2+型検出用細胞と LysoPSとを、試験物質の不在下にお V、て接触させ、 LysoPSによる Ca2+型検出用細胞内の Ca2+濃度の上昇の程度を確認し ておくことが好ましい。
[0052] 5) cAMP型検出方法
cAMP型検出方法では、細胞として、（i)検出ツール用ポリペプチドと、（ii) Gタンパク 質キメラ (例えば、 Gsと G13とのキメラタンパク質、若しくは Giと G13とのキメラタンパク 質）とを共発現している細胞（以下、 cAMP型検出用細胞と称する）を使用する。なお 、該細胞は、 LysoPSを作用させても細胞内 cAMP濃度が変動しない細胞に (i)検出ッ ール用ポリペプチドと、 (ii) Gタンパク質キメラとを共発現させた形質転換細胞が好ま しい。好ましい宿主細胞としては、例えば、ヒト胎児腎臓由来の細胞株である 293EBN A細胞を挙げることができる。 [0053] cAMP型検出方法は、 cAMP型検出用細胞と試験物質とを、 LysoPS存在下におい て接触させ、該 cAMP型検出用細胞内の cAMP濃度の変化を直接的又は間接的に 分析する。
cAMP濃度の変化は、例えば、市販の cAMP測定キット (Amersham社等）を用いて直 接的に cAMP濃度の変化を分析することもできるし、或いは cAMP濃度に依存して転 写量が調節される遺伝子 (例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流に cAMP応答配 列 (CRE)を挿入した遺伝子)の転写活性を分析することにより、間接的に cAMP濃度 の変化を分析することもできる。
またコントロールとして、 cAMP型検出用細胞と LysoPSとを試験物質の不在下にお いて接触させ、 LysoPSによる cAMP型検出用細胞内の cAMP濃度の変動の程度を確 認しておくことが好ましい。
[0054] cAMP型検出方法において、 LysoPSによる cAMP型検出用細胞内の cAMP濃度の 変動が、該試験物質により阻害又は抑制されれば、前記試験物質は、 LysoPS受容 体アンタゴニスト、或 、は受容体活性減弱剤であると検出することができる。
例えば、 G13と Giのキメラタンパク質を共発現させた場合、 WO02/36631の実施例 4 又は実施例 5に記載の条件で、試験物質を一定時間作用させ、 LysoPSによる細胞内 cAMP濃度の低下の阻害を指標に、その IC が 10 M以下（さらに好ましくは 1 /z M
50
以下）の試験物質を、 LysoPS受容体アンタゴ-スト、或いは LysoPS受容体活性減弱 剤として検出することができる。
[0055] 前述の本発明の検出方法、 GTP y S結合型検出方法、 Ca2+型検出方法、若しくは c AMP型検出方法によって LysoPS受容体アンタゴニスト又は LysoPS受容体活性減弱 剤として検出された試験物質力 LysoPS受容体アンタゴニストである力、或いは Lyso PS受容体活性減弱剤であるかを調べるには、アンタゴ-ストが内在性リガンド (LysoP S)と同じ受容体の部位に結合し、受容体活性減弱剤は LysoPSとは異なる受容体の 部位に結合するという特性の違いを利用して調べることができる。すなわち、該当す る試験物質を前述のリガンド検出方法により測定し、標識した LysoPSの結合阻害が 認められた場合は LysoPS受容体アンタゴニストであると、また標識リガンドの結合阻 害が認められない場合には LysoPS受容体活性減弱剤であると判定することができる [0056] [4]試験物質
本発明のスクリ一-ング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものでは ないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されてい る種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル ·ケミストリー技術 (Terrettら , J. Steele. Tetrahedron, 51, 8135-8173, 1995)によって得られた化合物群、微生物 の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、或いは本発明の スクリーニング法により選択されたィ匕合物 (ペプチドを含む)を化学的、又は生物学的 に修飾したィ匕合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。さらには、 LysoPS又は公 知の LysoPS誘導体を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を 用!/、ることができる。
[0057] なお、アレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療及び/又は予防効果があ ることの確認は、当業者に公知の方法、或いはそれを改良した方法を用いることによ り実施することができる。例えば、モルモット '喘息モデル (Aokiら、 J. Pharmacol. Exp. Ther., 297, 165-173, 2001)や、マウス'アトピー性皮膚炎モデル (Yokozekiら， Clin. Exp. Immunol, 132, 385-392, 2003)などを用いることにより実施することができる。
[0058] LysoPS受容体アンタゴ-スト、或いは LysoPS受容体活性減弱剤である、例えば、 D NA、蛋白質 (抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物を有効 成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いら れる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び/又はその他の添加剤を用いて、医薬 組成物として調製することができる。
実施例
[0059] 以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定され るものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である 。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従っても実施可能 である。
[0060] [実施例 1]ヒト及びラット LysoPS受容体 LPSR1遺伝子のクローユング
ヒトゲノム DNA (Human Genomic DNA; CLONTECH社）及び、ラットゲノム DNA (Rat Genomic DNA;CLONTECH社）をテンプレートとして、 PCR法により、ヒト及びラットの LysoPS受容体遺伝子である LPSR1遺伝子の全長 cDNAを取得した。ヒト LPSR1遺伝 子（以下 hLPSRlと略す）は配列番号 5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド をフォワードプライマーとして、配列番号 6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオ チドをリバースプライマーとして用いた。また、ラット LPSR1遺伝子（以下 rLPSRlと略す )は配列番号 7で表される塩基配列力 なるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマー として、配列番号 8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマ 一として用いた。
[0061] なお、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーの各々の 5'末端には、制限 酵素 Xbal認識部位を含む塩基配列が付加されている。 PCRは、 DNAポリメラーゼ (Py robest DNA polymerase；宝酒造社）を用いて、 5%ジメチルスルホキシド（DMSO)存 在下で、 94°C (20秒間） /56°C (20秒間） /72°C (1.5分間）力 なるサイクルを 35回繰り 返した。その結果、約 1 kbpの DNA断片が増幅された。この DNA断片を Xbalで消化し た後、プラスミド pEF—BOS—dhfr (Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990)の Xbal部位に挿入することにより、プラスミド pEF- BOS- dhfr- hLPSRl、及 び pEF-BOS-dhfr-rLPSRlを得た。 LPSR1遺伝子の塩基配列は、 DNAシークェンサ 一（ABI377 DNA Sequencer; Applied Biosystems社）を用いてジデォキシターミネ一 ター法により決定した。 hLPSRl遺伝子の塩基配列は、配列番号 1で表される塩基配 列のとおりであり、 rLPSRl遺伝子の塩基配列は配列番号 3で表される塩基配列のと おりであった。
[0062] 配列番号 1で表される塩基配列は、 1020塩基のオープンリーディングフレーム（OR F)を有しており、この ORF力 予測されるアミノ酸配列（339アミノ酸）は、配列番号 2で 表されるアミノ酸配列のとおりであった。また、配列番号 3で表される塩基配列は、 987 塩基の ORFを有しており、この ORF力 予測されるアミノ酸配列（328アミノ酸）は、配 列番号 4で表されるアミノ酸配列のとおりであった。これらのアミノ酸配列の同一性は 8 2%であった。
[0063] [実施例 2] LPSR1を発現させた 293EBNA細胞における、 LysoPSによるルシフェラーゼ 活性上昇の検出 本実施例では、 LPSR1タンパク質を発現させる細胞として 293EBNA細胞（Invitrogen 社)を使用した。また、 LPSR1タンパク質を発現させるための発現プラスミドとして、実 施例 1で得られたプラスミド pEF- BOS- dhfr- hLPSRl、及び pEF- BOS- dhfr- rLPSRlを 用いた。
コラーゲン Iコートされた 96ゥエルプレート（IWAKI社）に、 293EBNA細胞を、 1ゥエル 当たり 1.5 X 104細胞となるように、 1%牛胎児血清 (FCS)を含むダルベッコ変法ィーグ ル培地（DMEM)中で播種してー晚培養後、プラスミド pEF-BOS-dhfr-hLPSRl (1ゥェ ル当たり 1 ng)、またはプラスミド pEF-BOS- dhfr- rLPSRl (1ゥエル当たり 1 ng)と、血清 応答因子（Serum Response Element,以下「SRE」と称する）のレポーター活性を測定 する為のプラスミド pSRE- Luc (CLONTECH社）（1ゥエル当たり 5 ng)を、トランスフエク シヨン試薬（LipofectAMINE 2000; Invitrogen社）を用いて遺伝子導入した。なお、コ ントロールとして、プラスミド pEF-BOS- dhfr- hLPSRl又は pEF-BOS- dhfr- rLPSRlに代 えて、プラスミド pEF-BOS-dhfr (すなわち、 LPSR1遺伝子を含まない空ベクター）、及 びプラスミド pSRE-Lucを用いて遺伝子導入した。その後、さらに 18〜20時間培養し、 DMEM培地で希釈した LysoPSをカ卩え、 5% CO存在下、 37°Cで 6時間インキュベートし
2
た。培地を吸引し、細胞溶解液 (細胞溶解液 LC |8；東洋インキ)で溶解した後、その ルシフェラーゼ活性を、市販の測定キット (ピツカジーン発光キット;東洋インキ)及び !j疋'装像 (ML3000 microtiter plate luminometer; Dynatech Laboratories社)を用い て測定した。
[0064] その結果、図 1に示すように、プラスミド pEF-BOS- dhfr- hLPSRlと pSRE- Lucを遺伝 子導入した細胞、及びプラスミド pEF-BOS-dhfr-rLPSRlと pSRE-Lucを遺伝子導入し た細胞では、 300 nM以上の LysoPS添カ卩において有意に、かつ用量依存的にルシフ エラーゼ活性の上昇が観察された。一方、プラスミド pEF-BOS- dhfr (空ベクター）とプ ラスミド pSRE-Lucを遺伝子導入した細胞では、 LysoPSによるルシフェラーゼ活性の 上昇は全く観察されな力つた。
以上のことから、 LPSR1は LysoPSに反応し、細胞内へシグナルを伝達する受容体で あることが明ら力となった。
[0065] [実施例 3] LPSR1に共役する Gタンパク質の同定 本実施例では、 LPSR1タンパク質を発現させる細胞として 293EBNA細胞（Invitrogen 社)を使用した。また、 LPSR1タンパク質を発現させるための発現プラスミドとして、実 施例 1で得られたプラスミド pEF-BOS-dhfr-hLPSRlを用いた。また、種々のヒト Gタン パク質 Gq (GenBankァクセッション番号 NM_002072)、 Gil (GenBankァクセッション番 号 M69013)、 G12 (GenBankァクセッション番号 L01694)、 G13 (GenBankァクセッショ ン番号 NM— 006572)、 G14 (GenBankァクセッション番号 NM— 004297)、 G16 (GenBank ァクセッション番号 M63904)、 Gqiキメラ、 Gqi3キメラ、 Gqoキメラ、及び Gqzキメラを過 剰発現させるための発現プラスミドとして、種々のヒト Gタンパク質の遺伝子を、それぞ れ発現プラスミド pEF-BOS-dhfrへ組み換えたプラスミド (例えば、 Gq発現プラスミドは pEF-BOS-dhfr-Gq)を使用した。
[0066] 上記の Gタンパク質発現ベクターのうち、キメラ Gタンパク質以外は各々の 5'末端に 制限酵素 Xbal認識部位を含む塩基配列が付加された下記のプライマーセットを用い て増幅し、 pEF-BOS-dhfrの Xbal部位に挿入することにより作製した。 PCR条件は実 施例 1に記載の条件にて行った。各々の Gタンパク質のプライマーセット及びテンプレ ートに用いた cDNAは、 Gq (フォワードプライマー：配列番号 9、リバースプライマー：配 列番号 10、テンプレート：ヒト脳 cDNA(CLONTECH社））、 G11 (フォワードプライマー： 配列番号 11、リバースプライマー：配列番号 12、テンプレート：ヒト脳 cDNA(CLONTE CH社））、 G12 (フォワードプライマー：配列番号 13、リバースプライマー：配列番号 14 、テンプレート：ヒト脳 cDNA(CLONTECH社））、 G13 (フォワードプライマー：配列番号 15、リバースプライマー：配列番号 16、テンプレート：ヒト腎臓 cDNA(CLONTECH社）） 、 G14 (フォワードプライマー：配列番号 17、リバースプライマー：配列番号 18、テンプ レート：ヒト脾臓 cDNA(CLONTECH社））、 G16 (フォワードプライマー：配列番号 19、リ バースプライマー：配列番号 20、テンプレート：ヒト末梢血リンパ球 cDNA (CLONTEC H社)）である。
[0067] また、 Gタンパク質キメラの発現ベクターは、 Conklinらの方法（Nature, 363, 274-27 6, 1993)に従い、 Gqタンパク質の C末端の 5アミノ酸残基 (配列番号 21)を、他の Gタン ノ ク質の C末端の 5アミノ酸残基に置換したものを作製して用いた。 Giタンパク質サブ ファミリーには、 Gil、 Gi2、 Gi3タンパク質があり、 Gilと Gi2の C末端の 5アミノ酸残基の 配列は共通の配列番号 22に記載の配列である。 Gqiキメラは Gqタンパク質の C末端 の 5アミノ酸残基をこの Gilと Gi2の C末端の 5アミノ酸残基 (配列番号 22)に組み換えて 作製した。 Gqi3キメラ、 Gqoキメラ、及び Gqzキメラは、 Gqの C末端の 5アミノ酸残基を、 それぞれ、 Gi3の C末端の 5アミノ酸残基 (配列番号 23)、 Goの C末端の 5アミノ酸残基（ 配列番号 24)、 Gzの C末端の 5アミノ酸残基 (配列番号 25)に組み換えて作製した。こ れらの Gタンパク質キメラは、共役する受容体から刺激が入った場合、 Gqを介した細 胞内へのシグナル伝達及び増幅因子として機能するので、 SREへシグナルを伝達す ることがでさる。
[0068] コラーゲン Iコートされた 96ゥエルプレート（IWAKI社）に、 293EBNA細胞を、 1ゥエル 当たり 1.5 X 104細胞となるように、 10% FCSを含むダルベッコ変法イーグル培地（DME M)中で播種してー晚培養後、 1)プラスミド pEF- BOS- dhfr- hLPSRl (lゥエル当たり 1 n g)、及び 2) SREのレポーター活性を測定する為のプラスミド pSRE- Luc (CLONTECH 社）（1ゥエル当たり 10 ng)を、或いは 1)及び 2)のプラスミドとさらに 3)各種 Gタンパクの 過剰発現による作用を調べる為のプラスミド pEF- BOS- dhfr- Gq、 pEF- BOS- dhfr- Gil 、 pEF— BOS— dhfr— G12、 pEF— BOS— dhfr— G13、 pEF— BOS— dhfr— G14、 pEF— BOS— dhfr— G16、 pEF— BOS— dhfr— Gqi、 pEF— BOS— dhfr— Gqi3、 pEF— BOS— dhfr— Gqo、または pEF— BOS-dhfr-Gqz (lゥエル当たり 10 ng)をトランスフエクシヨン試薬（LipofectAMINE 2000 ； Invitrogen社）を用いて遺伝子導入した。なお、コントロールとして、 1)プラスミド pEF - BOS-dhfr(LPSRl遺伝子を含まない空ベクター； 1ゥエル当たり 1 ng)及び 2)プラスミ ド pSRE-Luc (lゥエル当たり 10 ng)を、或いは 1)及び 2)のプラスミドにさらに前記 3)のプ ラスミドを遺伝子導入した。
その後、さらにー晚培養し、 FCSを含まない DMEM培地に置換して 6時間培養した。 培地を吸引し、細胞溶解液 (細胞溶解液 LC |8；東洋インキ)で溶解した後、そのルシ フェラーゼ活性を、市販の測定キット (ピツカジーン発光キット;東洋インキ)及び測定 装食 (ML3000 microtiter plate luminometer; Dynatech Laboratories社)を用いて ϋ¾ 定した。
[0069] その結果、コントロールの pEF-BOS-dhfrと pSRE-Lucを遺伝子導入した結果と比べ て、プラスミド pEF- BOS-dhfr-hLPSRlと pSRE- Lucを遺伝子導入した細胞では、 pEF- BOS-dhfr-G13をさらに遺伝子導入した条件でのみ、有意にルシフェラーゼ活性の上 昇が観察された。その他の Gタンパク及び Gタンパク質キメラを発現するプラスミドを遺 伝子導入した条件では、コントロールの pEF-BOS-dhfrと pSRE-Lucを遺伝子導入した 結果と比べて有意な差は認められな力つた。
以上のことから、 LPSR1は各種 Gタンパクのうち、 G13に共役し、 G13を介して細胞内 へシグナルを伝達する受容体であることが明らかとなつた。
なお、実施例 2では pEF-BOS-dhfr-G13をさらに遺伝子導入していないが、使用し た 293EBNA細胞には内在的に G13を発現していることが確認できており、 LPSR1は、 内在性の G13を介して LysoPSによるァゴ-スト活性を SREに伝達したと考えられる。
[0070] [実施例 4]ラット腹腔由来の肥満細胞における LPSR1の発現解析
ラット (Wister rat ;日本チャールズリバ一社)をエーテル麻酔にかけ、大腿部動脈切 断により放出致死させた後、 50 mlの溶液 A (1 unit/mlへパリン、 0.1%ゥシ血清アルブ ミン、 I X Hanks ' Balanced Salt Solution)を腹腔内投与した。 3分間腹部をマッサージ した後、腹水を回収して 300 X gで 1分間遠心した。沈殿した細胞を 2 mlの溶液 Aで再 懸濁し、 4 mlの 35%ゥシ血清アルブミン溶液（Sigma社）上に重層し、 25分間室温で静 置した。その後、 400 X gで 20分遠心し、沈殿した肥満細胞層を回収した。調製した肥 満細胞の純度は Cytospin 3 (Shandon Scientific Limited社）で遠心し、細胞塗沫標本 を作製して確認した。細胞塗沫標本を鑑別用血液染色 (Diff-Quik;国際試薬社)で 染色後、顕微鏡下で観察し、形態的特徴力 肥満細胞の割合を求めたところ、 90%以 上が肥満細胞であった。
[0071] 調製したラット腹腔肥満細胞の cDNA合成は市販のキットを用いて添付のマ-ユア ルに従い行った。全 RNA精製は RNeasy(Qiagen社）を用い、精製した全 RNA 5 gか ら SUPERSCRIPT First-Strand Sybthesis System for RT— PCR (Invitrogen社）を用い て cDNAを合成し、 1 mlの cDNA溶液を得た。
[0072] 作製したラット腹腔肥満細胞由来 cDNAを铸型として、定量的 PCR法にて LPSR1の 発現量を定量した。解析はシークェンスディテクター（Prism7900 Sequence Detector ； Applied Biosystems社）を用いて行なった。 rLPSRlを特異的に認識するプライマー セットとして、配列番号 26で表される塩基配列力 なるオリゴヌクレオチドと、配列番号 27で表される塩基配列力もなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いた。 P CRは、 5 の SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems社）に 40 Mの該 プライマーをそれぞれ 0.075 1と該 cDNA溶液の 10倍希釈液を 4 1と水を 0.85 1カロ えて、 95°Cで 10分間インキュベーションした後、 95°C (15秒間） /59°C (60秒間）力 な るサイクルを 45回繰り返した。また、 mRNA発現量算出の標準曲線を得るために、ラッ トゲノム DNA(CLONTECH社）を铸型として、前記プライマーセットを用いて同条件の PCRを行った（Andrewら， J. Neurosci. Methods., 98, 9—20, 2000)。
[0073] さらに肥満細胞の発現マーカー遺伝子である、ラット c-kit、及びラット mast cell prot ease-II (以下 RMCP-IIと略す）の発現量を算出するために、 cDNA及びラットゲノム DN Aをそれぞれ铸型として、ラット c-kitを特異的に認識するプライマーセットとして、配列 番号 28で表される塩基配列力 なるオリゴヌクレオチドと、配列番号 29で表される塩 基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとし、 RMCP-IIを特異的に認識 するプライマーセットとして、配列番号 30で表される塩基配列力 なるオリゴヌクレオ チドと、配列番号 31で表される塩基配列力 なるオリゴヌクレオチドとをプライマーセッ トとして用い、同条件の PCRを行った。
[0074] その結果、 LPSR1、 c-kit,及び RMCP-Πの mRNA発現量は 13300コピー、 599000コ ピー、及び 16000コピーであった。肥満細胞マーカー遺伝子である c-kit、及び RMCP -IIの発現が確認されたことから、調製した細胞が肥満細胞であることが確認された。 また、その肥満細胞には LPSR1の mRNAが発現していることが判明した。 LysoPSがラ ット腹腔由来の肥満細胞の脱顆粒反応を惹起、促進させることが知られているが、本 実施例の結果は、肥満細胞に発現した LPSR1が脱顆粒反応の惹起、及び増強に関 わることを裏付けている。
[0075] [実施例 5]ヒト組織における LPSR1の免疫組織染色解析
正常ヒト組織（胃、大腸、小腸、胸腺、扁桃、鼻粘膜、滑膜、気管支)、及び病態ヒト 組織 (喘息患者の気管、気管支炎患者の気管支、クローン病患者の小腸、リウマチ 患者の滑膜、アレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜)を、ノ《ラフィンブロックよりマイクロトー ムを用いて 4〜5ミクロンのスライスを作成し、スライドに張りつけた。キシレン/アルコー ルにより脱パラフィンを実施した。免疫染色は DAKO Autostainer(DAKO社）を用い て、 DAKO serum free protein block (DAKO社）にて 20分間ブロックし、続いて、 1次 抗体（LPSR1に対するゥサギポリクローナル抗体（LifeSpan社)）で 45分間、ピオチン化 二次抗体（Vector anti-rabbit BA- 1000 secondary; Vector社）で 30分間、インキュべ ートした。染色は、スライドを洗浄後、 Vector ABC- AP (Vector社）を用いて、 Vector R ed (Vector社)を基質として実施した。
[0076] その結果、正常ヒト組織 (胃、大腸、小腸、胸腺、扁桃、鼻粘膜）にある肥満細胞が 強く染色されていることがわ力つた。また、病態ヒト組織 (喘息患者の気管、気管支炎 患者の気管支、クローン病患者の小腸、リウマチ患者の滑膜、アレルギー性鼻炎患 者の鼻粘膜）にある肥満細胞においても強い染色が認められた。例として、図 2の (A )に小腸、 (B)にリウマチ患者の滑膜、 (C)に気管支炎患者の気管支の染色像を示 す (肥満細胞を矢印で示した)。特に、リウマチ患者の滑膜と、喘息患者の気管及び 気管支炎患者の気管支での肥満細胞の染色度合いは、正常のそれらと比較して上 昇していた。本実施例の結果は、 LPSR1タンパクが種々のヒト組織の肥満細胞に発現 しており、炎症に伴う肥満細胞の脱顆粒反応の惹起、及び増強に関わっていることを 裏付けている。
産業上の利用可能性
[0077] 本発明のポリペプチド又は細胞である検出ツールは、リゾホスファチジルセリン受容 体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又はリゾホスファチジル受容体活性減弱剤の検出 に有用である。本発明のスクリーニング方法により、アレルギー性疾患及び/又は慢 性炎症疾患の治療及び/又は予防薬をスクリーニングすることができる。
配列表フリーテキスト
[0078] 以下の配列表の数字見出し < 223 >には、「Artificial Sequence」の説明を記載する
。具体的には、配列表の配列番号 5-20の配列で表される各塩基配列は、人工的に 合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲
[1] (1)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド、又は (a)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列、（b)配列番号 2若しくは配 列番号 4で表されるアミノ酸配列において 1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若 しくは挿入されたアミノ酸配列、（c)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸 配列との同一性が 80%以上であるアミノ酸配列、並びに (d)配列番号 1若しくは配列番 号 3で表されるポリヌクレオチド又はその相補配列にストリンジェントな条件でノヽイブリ ダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列力 なる群力 選択されるァミノ 酸配列を含み、かつリゾホスファチジルセリン受容体活性を有するポリペプチド、或い は
該ポリペプチドを発現して 、る細胞若しくは細胞の膜画分
と、試験物質とを、リゾホスファチジルセリン存在下で接触させる工程、
(2)試験物質がリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジ ルセリン受容体活性減弱剤であるか否かを検出する工程、並びに
(3)リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジルセリン受 容体活性減弱剤を選択する工程
を含む、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジルセリ ン受容体活性減弱剤をスクリーニングする方法。
[2] (1)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド、又は (a)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列、（b)配列番号 2若しくは配 列番号 4で表されるアミノ酸配列において 1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若 しくは挿入されたアミノ酸配列、（c)配列番号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸 配列との同一性が 80%以上であるアミノ酸配列、並びに (d)配列番号 1若しくは配列番 号 3で表されるポリヌクレオチド又はその相補配列にストリンジェントな条件でノヽイブリ ダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列力 なる群力 選択されるァミノ 酸配列を含み、かつリゾホスファチジルセリン受容体活性を有するポリペプチド、或い は
該ポリペプチドを発現して 、る細胞若しくは細胞の膜画分 と、試験物質とを、リゾホスファチジルセリン存在下で接触させる工程、
(2)試験物質がリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチ ジルセリン受容体活性減弱剤であるカゝ否かを検出する工程、並びに
(3)リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴニストを選択する工程
を含む、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-ストをスクリーニングする方法。
[3] 細胞が、請求の範囲 1又は 2に記載のポリペプチドをコードする DNAを含む発現べク ターで形質転換され、該ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、請求の範 囲 1又は 2に記載のスクリーニングする方法。
[4] 請求の範囲 1又は 2に記載の細胞と、試験物質とを、リゾホスファチジルセリン存在下 で接触させる工程、及び試験物質による該細胞内シグナル伝達の誘導又は抑制を 分析する工程を含む、試験物質がリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若し くはリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤であるカゝ否かを検出する方法。
[5] 請求の範囲 4に記載の方法による、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若 しくはリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤であるか否かを検出する工程、及 びリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジルセリン受 容体活性減弱剤を選択する工程を含む、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ- スト若しくはリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤をスクリーニングする方法。
[6] リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若しくはリゾホスファチジルセリン受容 体活性減弱剤がアレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療剤及び/又は予 防剤である請求の範囲 1又は 5に記載のスクリーニングする方法。
[7] 請求の範囲 4に記載の方法による、リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-スト若 しくはリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤であるか否かを検出する工程、及 びリゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-ストを選択する工程を含む、リゾホスファ チジルセリン受容体アンタゴ-ストをスクリーニングする方法。
[8] リゾホスファチジルセリン受容体アンタゴ-ストがアレルギー性疾患及び/又は慢性炎 症疾患の治療剤及び/又は予防剤である請求の範囲 2又は 7に記載のスクリーニング する方法。
[9] 請求の範囲 1又は 2に記載のポリペプチド又は細胞である、リゾホスファチジルセリン 受容体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又はリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱 剤の検出ツール。
請求の範囲 1又は 2に記載のポリペプチド又は細胞の、リゾホスファチジルセリン受容 体リガンド若しくはアンタゴ-スト、又はリゾホスファチジルセリン受容体活性減弱剤で あるアレルギー性疾患及び/又は慢性炎症疾患の治療及び/又は予防剤スクリー- ングのための使用。
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