JP2005304438A - 新規スクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】循環器疾患改善の医薬の有効成分として有用な、ＰＡＭＰ受容体の活性を修飾する物質のスクリーニングツールを提供する。
【解決手段】前記スクリーニングツールは、ＭＲＧＸ２又はその機能的等価改変体若しくは相同ポリペプチド、あるいは、これらを発現している細胞からなる。
【選択図】なし

Description

本発明は、循環器疾患を制御する物質のスクリーニング方法に関する。

強力な血圧拡張性の降圧ペプチドであるアドレノメジュリン（ＡＭ）を発現するＡＭ前駆遺伝子からは、ＡＭと全く構造の異なる生理活性ペプチドＰＡＭＰ（Proadrenomedullin N-terminal 20 peptide）が産生される（非特許文献１）。２０アミノ酸からなるペプチドであるＰＡＭＰ（以下、ＰＡＭＰ−２０）のほかに、ＰＡＭＰ−２０のＮ末端側８残基が欠落したＣ末端側１２残基からなるＰＡＭＰ−１２も主要分子型として存在し、ＰＡＭＰ−２０及びＰＡＭＰ−１２（以下、ＰＡＭＰ類）は降圧作用を示すことが知られている（非特許文献２）。ＰＡＭＰ類は副腎クロマフィン細胞においてカルバコール刺激によるカテコラミン分泌を濃度依存的に抑制するとともにカテコラミンの合成も阻害することが観察されており（非特許文献３，４）、このことから、ＰＡＭＰ類の降圧作用は末梢交感神経活動を制御することを機序とするものであり、ＡＭが血管に直接作用する機序とは異なるものであると考えられている（非特許文献５）。また、ＰＡＭＰ類は副腎からのアルドステロン分泌を阻害することも観察されており（非特許文献６）、この結果として降圧作用の発現に関連していることも考えられている。一方、ＰＡＭＰ類と病態との関連では、高血圧（非特許文献７）、鬱血性心不全（非特許文献８）、慢性腎疾患（非特許文献９）において血中ＰＡＭＰ類濃度が増加していることが観察されている。また、慢性糸球体腎炎患者では血中及び尿中ＰＡＭＰ類濃度の低下が観察されている（非特許文献１０）。

しかしながら、これまでＰＡＭＰ受容体が少なくとも副腎に存在し（非特許文献１１）、かつその作用点がＧタンパク質共役型受容体であることを示唆する報告があるものの（非特許文献１２，１３）、その受容体のタンパク質及びそれをコードする遺伝子は同定されておらず、簡便な化合物スクリーニング系の構築が困難であったため、ＰＡＭＰ受容体アゴニスト及びアンタゴニストの開発は進展していなかった。
また、Ｇタンパク質共役型受容体であるＭＲＧＸ２をコードするＤＮＡ及び前記ＤＮＡがコードする推定アミノ酸配列については報告があり、更に内在性リガンドをコルチスタチンとする報告もあるが、ＰＡＭＰ類との関係は知られていない（非特許文献１４）。

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本発明は、ＰＡＭＰ受容体を使用した該受容体の活性を修飾する物質のスクリーニング法、及び、当該受容体の活性を修飾する物質を有効成分とする医薬、特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患改善の医薬の提供を課題としている。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＭＲＧＸ２と称することがある）が、ＰＡＭＰ類に反応する受容体であることを見出し、ＭＲＧＸ２それ自体、若しくはＭＲＧＸ２を発現する細胞を用いて、ＰＡＭＰ受容体活性を修飾する物質、すなわち、ＰＡＭＰ受容体リガンド、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アゴニスト又はアンタゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤をスクリーニングすることができることを明らかにした。また、ＭＲＧＸ２がＧｉ及びＧｑに共役することを明らかにし、ＭＲＧＸ２若しくはＭＲＧＸ２を発現する細胞を用い、試験物質がＰＡＭＰ受容体活性を修飾する物質であるか否かを検出する方法、及び前記検出方法を用いた循環器疾患（特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患）の治療及び／又は予防剤のスクリーニング方法を確立し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、
〔１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド、又は、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド
からなる、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール；
［２］ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］に記載のＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール；
［３］［１］に記載のポリペプチドを発現している細胞からなる、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール；
［４］細胞が、［１］に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、［３］に記載のＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール；
［５］（１）［１］に記載のポリペプチド又は［３］に記載の細胞と、試験物質とを、標識したＰＡＭＰ受容体リガンド存在下で接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチド又は細胞への標識リガンドの結合量を分析する工程
を含む、試験物質がＰＡＭＰ受容体リガンドであるか否かを検出する方法；
［６］（１）［３］に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程、及び
（２）細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化を分析する工程
を含む、試験物質がＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法；
［７］［３］に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程が、ＰＡＭＰ受容体アゴニスト共存下で行われる、［６］に記載の検出する方法；
［８］（１）［３］に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程、及び
（２）細胞内におけるＣａ²⁺濃度の変化を分析する工程
を含む、試験物質がＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法；
［９］［３］に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程が、ＰＡＭＰ受容体アゴニスト共存下で行われる、［８］に記載の検出する方法；
［１０］（１）［３］に記載の細胞と試験物質とを、標識したＧＴＰγＳ存在下で接触させる工程、及び
（２）前記細胞への標識ＧＴＰγＳの結合量を分析する工程
を含む、試験物質がＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法；
［１１］［３］に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程が、ＰＡＭＰ受容体アゴニスト共存下で行われる、［１０］に記載の検出する方法；並びに
［１２］（１）［５］〜［１１］に記載の方法からなる検出する工程、及び
（２）ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アゴニスト、又は、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤を選択する工程
を含む、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患の治療及び／又は予防剤をスクリーニングする方法
に関する。

本明細書において、「検出用ツール」とは、検出のために用いる物（具体的には、検出のために用いるポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞）を意味する。「ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール」とは、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニストを検出するために、本発明の検出方法又はスクリーニング方法において、試験物質を接触させる対象となるポリペプチド又は細胞である。

［１］若しくは［２］に記載のポリペプチド、又は［３］若しくは［４］に記載の細胞の、ＰＡＭＰ受容体リガンド、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤検出のための使用、並びに、循環器疾患（特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患、例えば、高血圧、心不全、敗血症など）又は慢性腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎など）の治療及び／又は予防剤スクリーニングのための使用も、本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング方法は、循環器疾患の内、特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患、特に好ましくは高血圧の治療及び／又は予防剤をスクリーニングするのに適している。

前記「Ｇｉ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達及び増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制するＧタンパク質である。アデニル酸シクラーゼの活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下する。従って、Ｇｉと共役している受容体のシグナル伝達の有無及び強弱は、細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変動を指標として検出することができる。

また、前記「Ｇｑ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達及び増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧタンパク質である。ホスホリパーゼＣの活性が促進されると、例えば、細胞内Ｃａ²⁺濃度が上昇する。従って、Ｇｑと共役している受容体のシグナル伝達の有無及び強弱は、細胞内におけるＣａ²⁺濃度の変動を指標として検出することができる。

更に、前記「フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２によって抑制される」及び「フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−２０によって抑制される」とは、実施例２に記載のアッセイで、ＰＡＭＰ−１２及びＰＡＭＰ−２０のＥＣ_５０がそれぞれ６０ｎｍｏｌ／Ｌ以下及び２６０ｎｍｏｌ／Ｌ以下であることをいう。

また、或るポリペプチドが「フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制される」か否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、例えば、実施例２に記載の方法によって確認することができる。
具体的には、例えば、判定対象ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現ベクターで宿主細胞［例えば、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株］を形質転換することにより、判定対象ポリペプチドを安定発現する試験用細胞を作製し、得られた試験用細胞を所定期間（例えば、１日間）培養後、αＭＥＭ（核酸非存在）培地／１ｍｍｏｌ／Ｌ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で短時間（例えば、１０分間）処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン／ＰＡＭＰ−１２（０〜１μｍｏｌ／Ｌ）を滴下し、所定期間（例えば、３７℃で３０分間）後に培養上清を除去し、細胞を溶解することによりｃＡＭＰ産生量を測定する。得られた測定値から、ＰＡＭＰ−１２共存下でのｃＡＭＰ量の用量依存曲線を作製し、ＰＡＭＰ−１２のＥＣ_５０が６０ｎｍｏｌ／Ｌ以下である場合、前記判定対象ポリペプチドが「フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２によって抑制される」と判定することができる。
ＰＡＭＰ−１２の代わりにＰＡＭＰ−２０を使用し、ＰＡＭＰ−２０のＥＣ_５０が２６０ｎｍｏｌ／Ｌ以下である場合、前記判定対象ポリペプチドが「フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−２０によって抑制される」と判定することができる。

「ＰＡＭＰ受容体」とは、ＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０の受容体であり、すなわち、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド、又は、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチドをいう。

本発明の検出用ツール又はスクリーニング方法によれば、ＰＡＭＰ受容体リガンド、ＰＡＭＰ類アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤をスクリーニングすることができる。ＰＡＭＰ受容体リガンド、前記アゴニスト又はアンタゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤は、例えば、循環器疾患（特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患、例えば、高血圧、心不全、敗血症など）又は慢性腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎など）の治療及び／又は予防剤として有用な物質である。

１．検出用ツール
本発明のＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツールには、ポリペプチド型検出用ツールと、細胞型検出用ツールとが含まれる。
１）ポリペプチド型検出用ツール
本発明の検出用ツールとして使用することができるポリペプチドには、
（ｉ）ヒトＭＲＧＸ２、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ii）機能的等価改変体、すなわち、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド、あるいは、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド；並びに
（iii）相同タンパク質、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド
が含まれる。

本発明のポリペプチド型検出用ツールとして用いることのできる、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、３３０個のアミノ酸残基からなるＰＡＭＰ受容体ＭＲＧＸ２である。配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一配列は知られていたが、これがＰＡＭＰ受容体のアミノ酸配列であることは開示も示唆もなく、ＰＡＭＰ受容体は、本発明者が今回始めて解明するまで、その実体は同定されていなかった。

本発明のポリペプチド型検出用ツールとして用いることのできる機能的等価改変体として、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及びＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド、あるいは、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個（好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及びＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチドがより好ましい。

また、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチドとして、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制される限り、含まれる。
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。

本発明のポリペプチド型検出用ツールとして用いることのできる機能的等価改変体の起源は、ヒトに限定されない。
例えば、前述の（ａ）又は（ｂ）に該当するヒトＰＡＭＰ受容体ＭＲＧＸ２のヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、前述の（ａ）又は（ｂ）に該当するヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来のＰＡＭＰ受容体及びヒトＰＡＭＰ受容体を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質なども含まれる。なお、本明細書において「変異体」（variation）とは、同一種内の同一タンパク質にみられる個体差、あるいは、数種間の相同タンパク質にみられる差異を意味する。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（Maniatis, T. ら, "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982等）に従って実施することが可能である。

例えば、ヒトＭＲＧＸ２遺伝子の塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例２に記載の方法により、ＰＡＭＰ類に反応することを確認することにより、所望のタンパク質を取得することができる。

また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質は、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（site-specific mutagenesis; Mark, D. F. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984等）により、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例２に記載の方法により、ＰＡＭＰ類に反応することを確認することにより、所望のタンパク質を取得することができる。

本発明のポリペプチド型検出用ツールとして用いることのできる相同タンパク質として好ましいポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及びＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチドである。
なお、本明細書における前記「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ（Basic local alingment search tool; Altschul, S. F. ら, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990）検索により得られた同一性の値を意味し、アミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（sgi32bit版，バージョン2.0.12；NCBIより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Tatiana A. Tatusova及びThomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥＧ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。

本発明のポリペプチド型検出用ツールとして用いることのできる各種ポリペプチド（すなわち、ヒトＰＡＭＰ受容体ＭＲＧＸ２、機能的等価改変体、及び相同タンパク質；以下、検出用ツール用ポリペプチドと称する）は、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、目的タンパク質をコードする遺伝子を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述する細胞（すなわち、検出用ツール用ポリペプチドを発現している細胞）を得、受容体タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる（国際公開WO02/36631号パンフレット参照）。
検出用ツール用ポリペプチドを調製する際に、それをコードする遺伝子を取得する方法は、常法を用いればよく特に限定されるものではない（国際公開WO02/36631号パンフレット参照）が、例えば、ヒトＰＡＭＰ受容体ＭＲＧＸ２を調製する場合には、それをコードする遺伝子として、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。

２）細胞型検出用ツール
本発明のＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツールとして使用することができる細胞には、
（ｉ）ヒトＰＡＭＰ受容体ＭＲＧＸ２を発現している細胞；
（ii）機能的等価改変体を発現している細胞；及び
（iii）相同タンパク質を発現している細胞
が含まれる。

本発明の細胞型検出用ツールとして用いることのできる細胞（検出用ツール用ポリペプチドを含む膜画分を含む。以下、検出用ツール用細胞と称する）は、細胞型検出用ツールとして用いる際に前記検出用ツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、人為的に前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であることもできるし、又は、検出用ツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株であることもできるが、人為的に前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞がより好ましい。

本発明の細胞型検出用ツールとして用いることのできる各種形質転換細胞（以下、検出用ツール用形質転換細胞と称する）を作成するために使用することのできる宿主細胞は、検出用ツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Saccharomyces cerevisiae）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を挙げることができる。前記脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Urlaub, G. 及びChasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、あるいは、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen社）を挙げることができる。

検出用ツール用形質転換細胞を作成するために使用することのできる発現ベクターは、検出用ツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選択することができる（国際公開WO02/36631号パンフレット参照）。
例えば、脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. ら, Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Mizushima, S. 及びNagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Invitrogen社）等を挙げることができる。

検出用ツール用形質転換細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞表面に検出用ツール用ポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。

２．ＰＡＭＰ受容体リガンド、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤検出方法
前記検出用ツール用ポリペプチド、又は検出用ツール用細胞（以下、検出用ツール用ポリペプチド及び前記細胞を総称して、リガンド検出用ツールと称する）を検出用ツールに用いて、試験物質がＰＡＭＰ受容体リガンド、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出することができる。

本発明による、試験物質がＰＡＭＰ受容体リガンド、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法には、
１）ＰＡＭＰ受容体に対するリガンドであるか否かを検出する方法（以下、リガンド検出方法と称する）；
２）細胞内におけるＣａ²⁺濃度の変動を指標として、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法（以下、Ｃａ²⁺型検出方法と称する）；
３）細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法（以下、ｃＡＭＰ型検出方法と称する）；及び
４）ＧＴＰγＳ結合法を利用するＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型検出方法と称する）
が含まれる。これらの検出方法について、順次説明する。

１）リガンド検出方法
本発明のリガンド検出方法は、（ｉ）リガンド検出用ツールと、（ii）標識したＰＡＭＰ受容体リガンドとを用いる限り、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により実施することができる。
まず、リガンド検出用ツールを調製する。アッセイ条件（例えば、使用する緩衝液の種類、温度、及び濃度、緩衝液に添加するイオンの種類及び濃度、並びにアッセイ系のｐＨ）を最適化し、最適化したバッファー中で、リガンド検出用ツールと、標識リガンドとを、試験物質と共に一定時間インキュベーションする。前記標識リガンドとしては、例えば、［^１２５Ｉ］−ＰＡＭＰ−１２を用いることができる。標識リガンドは、例えば、フェニックス（Phoenix）社から購入することもできるが、クロラミン−Ｔ法などの一般的なヨウ素標識法により作製することもできる。反応後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性をガンマ線カウンター等で測定する。得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標として、ＰＡＭＰ受容体に対するリガンドであるか否かを検出することができる。すなわち、試験物質不在下の場合のフィルター残存放射活性よりも、試験物質存在下の場合のフィルター残存放射活性が低下した場合には、前記試験物質は、ＰＡＭＰ受容体に対するリガンドであると判定することができる。好ましくは、ＩＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）の場合リガンドと判定する。

２）Ｃａ²⁺型検出方法
本発明のＣａ²⁺型検出方法は、細胞として、検出用ツール用ポリペプチドを発現している細胞を使用する。なお、前記細胞は、ＰＡＭＰ類を作用させても細胞内Ｃａ²⁺濃度が上昇しない細胞に、検出用ツール用ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であることが好ましい。

本発明のＣａ²⁺型検出方法においてアゴニストであるか否かを検出する場合には、前記細胞と試験物質とを接触させ、前記細胞のＣａ²⁺濃度の変化を、直接的又は間接的に分析する。Ｃａ²⁺濃度の変化は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬（例えば、ｆｕｒａ２又はＦｌｕｏ−３，ＡＭ等）を用いて、直接的にＣａ²⁺濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、Ｃａ²⁺濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にアクチベータープロテイン１（ＡＰ１）応答配列を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にＣａ²⁺濃度の変化を分析することもできる。

前記細胞と試験物質とを接触させた場合に、細胞内のＣａ²⁺濃度が上昇すれば、前記試験物質は、ＰＡＭＰ受容体に対するアゴニストであると判定することができる。なお、コントロールとして、検出用ツール用ポリペプチドを発現しているＣａ²⁺型検出用細胞の代わりに、検出用ツール用ポリペプチドが発現していない細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験物質により前記細胞内のＣａ²⁺濃度が上昇しないことを確認することが好ましい。例えば、実施例３に記載の条件で行なうことができ、アゴニストとしては、実施例３に記載の条件でＥＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下の化合物がより好ましい。

本発明のＣａ²⁺型検出方法においてアンタゴニストであるか否かを検出する場合には、前記細胞と試験物質とを、ＰＡＭＰ受容体のアゴニスト（例えば、ＰＡＭＰ−１２）の共存下において接触させ、Ｃａ²⁺型検出用細胞内のＣａ²⁺濃度の変化を、直接的又は間接的に分析する。細胞と試験物質とを、ＰＡＭＰ受容体のアゴニストの共存下において接触させた場合に、前記アゴニストによる細胞内のＣａ²⁺濃度の上昇が、前記試験物質により阻害又は抑制されれば、前記試験物質は、ＰＡＭＰ受容体に対するアンタゴニストであると判定することができる。例えば、実施例３に記載の条件でＰＡＭＰ−１２を共存させ行なうことができ、好ましくは、前記条件でＩＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ以下）の化合物をアンタゴニストと判定する。
なお、コントロールとして、前記細胞とＰＡＭＰ受容体のアゴニストとを、試験物質の不在下において接触させ、前記アゴニストによるＣａ²⁺型検出用細胞内のＣａ²⁺濃度の上昇の程度を確認しておくことが望ましい。

また、ＧＰＣＲには、内在性リガンドとは異なる部位に結合して、リガンドの親和性を亢進させたり（positive allosteric modulator）、リガンドの親和性を減弱させたり（negative allosteric modulator）する受容体活性増強剤又は減弱剤であるアロステリック化合物（allosteric modulator）が存在する（Pharmacological Reviews 54:323-374, 2002）。前述のアンタゴニストであるか否かを検出する場合と同様に、前記細胞と試験物質とを、ＰＡＭＰ受容体のアゴニスト（例えば、ＰＡＭＰ−１２）の共存下において接触させ、Ｃａ²⁺型検出用細胞内のＣａ²⁺濃度の変化を、直接的又は間接的に分析することにより、受容体活性増強剤又は減弱剤を検出することもできる。ＰＡＭＰ受容体のアゴニスト不在下ではＣａ²⁺濃度の変化は生じないが、試験物質とＰＡＭＰ受容体のアゴニスト共存によってＣａ²⁺濃度の上昇が亢進する場合、受容体活性増強剤として判定することができる。また、アンタゴニストとして取得することができた化合物が、上記リガンド検出方法で示す実験において結合阻害が認められなかった場合（non-competitive）、受容体活性減弱剤として判定することができる。

３）ｃＡＭＰ型検出方法
本発明のｃＡＭＰ型検出方法は、細胞として、検出用ツール用ポリペプチドを発現している細胞を使用し、検出用ツール用ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であることが好ましい。通常の細胞ではＧｉが構成的に発現しているので、検出用ツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株を用いるか、あるいは、検出用ツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、前記形質転換細胞を得ることができる。なお、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿主細胞が、ＰＡＭＰ類を作用させても細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下しない細胞であることが好ましい。このような細胞としては、例えば、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）細胞を挙げることができる。

本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてアゴニストであるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用細胞と試験物質とを接触させ、前記細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間接的に分析する。細胞と試験物質とを接触させる際には、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させることが好ましい。

ｃＡＭＰ濃度の変化は、例えば、市販のｃＡＭＰ測定キット（Amersham社等）を用いて、直接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできる。

前記細胞と試験物質とを接触させた場合に、細胞内のｃＡＭＰ濃度が低下すれば、前記試験物質は、ＰＡＭＰ受容体に対するアゴニストであると判定することができる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させておくと、試験物質によるｃＡＭＰ濃度の低下を、より容易に判定することができる。また、コントロールとして、検出用ツール用ポリペプチドを発現している細胞の代わりに、検出用ツール用ポリペプチドが発現されていない細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験物質により前記細胞内のｃＡＭＰ濃度が低下しないことを確認することが好ましい。例えば、実施例２に記載の条件で行なうことができ、好ましくは、実施例２に記載の条件でＥＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ以下）の化合物をアゴニストとして判定する。

本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてアンタゴニスト、又は受容体活性増強剤若しくは減弱剤であるか否かを検出する場合には、前記細胞と試験物質とを、ＰＡＭＰ受容体のアゴニストの共存下において接触させ、細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間接的に分析する。ｃＡＭＰ型検出用細胞と試験物質とを、ＰＡＭＰ受容体のアゴニストの共存下において接触させた場合に、前記アゴニストによるｃＡＭＰ型検出用細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下が、前記試験物質により阻害又は抑制されれば、前記試験物質は、ＰＡＭＰ受容体に対するアンタゴニストであると判定することができる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させておくと、試験物質によるｃＡＭＰ濃度の変動を、より容易に判定することができる。例えば、実施例２記載の条件でＰＡＭＰ−１２を共存させ行なうことができ、好ましくは、前記条件でＩＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ以下）の化合物をアンタゴニストとして判定する。

ＰＡＭＰ受容体のアゴニスト不在下ではｃＡＭＰ濃度の変化は生じないが、試験物質とＰＡＭＰ受容体のアゴニスト共存によってｃＡＭＰ濃度の低下が亢進する場合、受容体活性増強剤として判定する。また、アンタゴニストとして取得することができた化合物が、上記リガンド検出方法で示す実験において結合阻害が認められなかった場合（non-competitive）、受容体活性減弱剤として判定する。
また、コントロールとして、前記細胞とＰＡＭＰ受容体のアゴニストとを、試験物質の不在下において接触させ、前記アゴニストによるｃＡＭＰ型検出用細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下の程度を確認しておくことが望ましい。

４）ＧＴＰγＳ結合型検出方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法は、ＧＴＰγＳ結合法（Lazareno, S. 及びBirdsall, N. J. M., Br. J. Pharmacol., 109, 1120-1127, 1993）を利用して、ＰＡＭＰ受容体に対するアンタゴニスト若しくはアゴニスト、又は受容体活性増強剤若しくは減弱剤であるか否かを検出することができる。本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法では、検出用ツール用細胞を使用し、前記細胞は、検出用ツール用ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であることが好ましい。
例えば、以下の手順により実施することができる。

すなわち、検出用ツール用ポリペプチドを発現させた細胞膜を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び１０μｍｏｌ／Ｌ ＧＤＰ混合溶液中で、^３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（２５０ｐｍｏｌ／Ｌ）と混合する。試験物質存在下と試験物質不在下とでインキュベートした後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。試験物質存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標に、ＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０アゴニストであるか否かを検出することができる。

また、試験物質存在下における、ＰＡＭＰ受容体のアゴニスト（例えば、ＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０）によるＧＴＰγＳ結合上昇の抑制を指標に、ＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト、又は受容体活性増強剤若しくは減弱剤であるか否かを検出することができる。

例えば、実施例４に記載の条件で行なうことができ、好ましくは、実施例４に記載の条件でＥＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ）の化合物をアゴニスト、ＰＡＭＰ−１２共存下でのＩＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ）の化合物をアンタゴニストとして判定する。
ＰＡＭＰ受容体のアゴニスト不在下ではＧＴＰγＳ結合の上昇は生じないが、試験物質とＰＡＭＰ受容体のアゴニスト共存によってＧＴＰγＳ結合の上昇が亢進する場合、受容体活性増強剤として判定する。また、アンタゴニストとして取得できた化合物が、上記リガンド検出方法で示す実験において結合阻害が認められなかった場合、受容体活性減弱剤として判定する。

３．スクリーニング方法
本発明の検出用ツール（ポリペプチド型検出用ツール及び細胞型検出用ツールの両方を含む）を用いると、ＰＡＭＰ受容体に対するリガンド、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤をスクリーニングすることができる。

既に説明したように、ＰＡＭＰ受容体アゴニストであるＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０は、降圧作用を示す（FEBS Letter，1997年，414巻，105-110頁）。また、心血管反射調節系、自律神経系、神経内分泌系に関連した心血管及び交感神経系に対する調節制御機構に深く関わっていると考えられている（Peptide，2001年，22巻，1693-1711頁）。従って、これまで説明した検出用ツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、検出用ツール用細胞それ自体を、循環器疾患（特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患、例えば、高血圧、心不全、敗血症など）又は慢性腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎など）の治療及び／又は予防剤スクリーニングに使用することができる。

本発明の検出用ツールを用いてスクリーニングにかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Terrett, N. K. ら, Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Felici, F. ら, J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。

本発明のスクリーニング方法は、検出方法により、以下の４つに大別されるが、いずれかの方法を用いて、あるいは、これらを組み合わせて、ＰＡＭＰ受容体に対するリガンド、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出し、試験物質の中からアゴニスト又はＰＡＭＰ受容体活性増強剤を選択することにより、循環器疾患（特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患、例えば、高血圧、心不全、敗血症など）又は慢性腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎など）の治療及び／又は予防剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。

以下、本発明のスクリーニング方法である、
１）ＰＡＭＰ受容体に対するリガンドをスクリーニングする方法（以下、リガンドスクリーニング方法と称する）；
２）細胞内におけるＣａ²⁺濃度の変動を指標として、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤をスクリーニングする方法（以下、Ｃａ²⁺型スクリーニング方法と称する）；
３）細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤をスクリーニングする方法（以下、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法と称する）；及び
４）ＧＴＰγＳ結合法を利用するＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤をスクリーニングする方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法と称する）
について、順次説明する。

１）リガンドスクリーニング方法
本発明のリガンドスクリーニング方法は、本発明のリガンド検出方法により、ＰＡＭＰ受容体リガンドであるか否かを検出する工程、及び受容体リガンドを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
例えば、試験物質を一定時間作用させ、［^１２５Ｉ］−ＰＡＭＰ−１２の結合阻害を指標に、好ましくはそのＩＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）の試験物質を、リガンドとして選択することができる。

本発明のリガンドスクリーニング方法でスクリーニングしたリガンドを、更に、以下に説明するＣａ²⁺型スクリーニング方法、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法、及び／又はＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法にかけ、アゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングすることにより、循環器疾患（特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患、例えば、高血圧、心不全、敗血症など）又は慢性腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎など）の治療及び／又は予防剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。

２）Ｃａ²⁺型スクリーニング方法
本発明のＣａ²⁺型スクリーニング方法は、本発明のＣａ²⁺型検出方法により、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する工程、及びＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤を選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。

例えば、実施例３記載の条件で行ったＣａ²⁺型検出方法により、そのＥＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）を、アゴニスト活性を有する物質としてスクリーニングすることができる。
また、前記Ｃａ²⁺型検出方法において、例えば、そのＩＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）の試験物質を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。

３）ｃＡＭＰ型スクリーニング方法
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法は、本発明のｃＡＭＰ型検出方法により、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する工程、及びＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤を選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。

例えば、実施例２に記載の条件で行ったｃＡＭＰ型検出方法により、そのＥＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）を、アゴニスト活性を有する物質としてスクリーニングすることができる。
また、前記ｃＡＭＰ型検出方法において、そのＩＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）の試験物質を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。

４）ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法は、本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法により、ＰＡＭＰ受容体アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する工程、及びＰＡＭＰ受容体アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤を選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。

例えば、実施例４に記載の条件で行ったＧＴＰγＳ結合型検出方法により、そのＥＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）を、アゴニスト活性を有する物質としてスクリーニングすることができ、ＰＡＭＰ−１２共存下、実施例４に記載の条件で行ったＧＴＰγＳ結合型検出方法により、そのＩＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下（更に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）の試験物質を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。

本発明のＣａ²⁺型スクリーニング方法、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法、又はＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法でアゴニスト又はアンタゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤をスクリーニングすることにより、循環器疾患（特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患、例えば、高血圧、心不全、敗血症など）又は慢性腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎など）の治療及び／又は予防剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：ＭＲＧＸ２のクローニング》
本実施例では、以下に示す手順に従って、ヒトゲノムＤＮＡ（genomic DNA；clontech社）をテンプレートとして、ＰＣＲ法により、ＭＲＧＸ２の全長ｃＤＮＡを取得した。
配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いた。なお、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーの各々の５’末端には、ＸｂａＩ認識部位を含む塩基配列が付加されている。ＰＣＲは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ex Taq DNA polymerase；宝酒造社）を用いて、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で、９４℃（２０秒間）／５８℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９４℃（２０秒間）／５５℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、そして、９４℃（２０秒間）／５０℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを２５回、順次繰り返した。その結果、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで消化した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990）のＸｂａＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＭＲＧＸ２を得た。

プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＭＲＧＸ２におけるＭＲＧＸ２遺伝子の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（ABI377 DNA Sequencer; Applied Biosystems社）を用いてジデオキシターミネーター法により決定した。ＭＲＧＸ２遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列のとおりであった。
配列番号１で表される塩基配列は、９９３塩基のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有しており、このＯＲＦから予測されるアミノ酸配列（３３０アミノ酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のとおりであった。

《実施例２：ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞株の樹立とＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０によるｃＡＭＰ産生阻害実験》
実施例１で得られたプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＭＲＧＸ２をＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株に、トランスフェクション試薬（LipofectAMINE 2000; GIBCO BRL社製）を用いて遺伝子導入し、αＭＥＭ（核酸非存在）培地／１００ｎｍｏｌ／Ｌメトトレキセート（和光純薬社製）／１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）にて２週間培養後、出現したコロニーを個別に取得し、ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞とした。

ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞とコントロールプラスミド（ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ）導入ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４細胞で播種した。１日培養後、αＭＥＭ（核酸非存在）培地／１ｍｍｏｌ／Ｌ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Sigma社製）／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）／ＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０（０〜１μｍｏｌ／Ｌ）を滴下した。３７℃で３０分後に培養上清を除去し、０．２％トリトン−Ｘ／リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて細胞を溶解した。

各条件における細胞のｃＡＭＰ産生量の測定はｃＡＭＰ ＨＴＲＦシステム（シェーリング社製）を用いて行い、添付プロトコールに従って実施した。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭＰ産生量を１００％とし、ＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０共存下でのｃＡＭＰ量の用量依存曲線を作製した。ＰＡＭＰ−１２に関する結果を図１に示す。用量依存曲線から、ＭＲＧＸ２に対するＰＡＭＰ−１２の応答性はＥＣ_５０＝５７．２ｎｍｏｌ／Ｌであった。一方、ＰＡＭＰ−２０に対する応答性はＥＣ_５０＝２５１．１ｎｍｏｌ／Ｌであり、コントロールプラスミド導入ＣＨＯ細胞（Ｍｏｃｋ）ではＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０添加によるｃＡＭＰ産生量に変化は見られなかった。また、ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞のフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されたことから、ＭＲＧＸ２が細胞内三量体Ｇタンパク質の内、Ｇｉと共役しており、ＭＲＧＸ２発現細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定することでアゴニスト及び／又はアンタゴニストのスクリーニングが可能であることが解った。

《実施例３：ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞株に対するＰＡＭＰ−１２による細胞内Ｃａ²⁺濃度の変化》
９６ウェルプレート（96well Black/clear bottom plat；BECTON DICKINSON社製）に、実施例２で得られたＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞を１ウェル当たり２×１０^４細胞で播種して２４時間培養後、培地を廃棄し、４μｍｏｌ／Ｌ Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（Molecular Probe社製）、０．００４％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７及び１０％ＦＢＳを含むＨａｎｋｓ ＢＳＳ（GIBCO社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ ＢＳＳで４回洗浄して、１ウェル当たり１００μＬの20ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ ＢＳＳを添加した。細胞内Ｃａ²⁺濃度の変化はＦＬＩＰＲ（Moleucular Device社製）を用いて経時的に測定した。すなわち、測定開始１０秒後にＰＡＭＰ−１２を最終濃度３×１０^−６ｍｏｌ／Ｌから１×１０^−１０ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、添加後、５０秒間は１秒ごとに、更に４分間は６秒ごとに蛍光強度を測定した。

結果を図２に示す。図２において、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＭＲＧＸ２を遺伝子導入した細胞の細胞内Ｃａ²⁺濃度の変化データの蛍光強度の最高値を縦軸に、ＰＡＭＰ−１２の濃度を横軸にプロットした。一方、コントロールプラスミド導入ＣＨＯ細胞（Ｍｏｃｋ）では、ＰＡＭＰ−１２による細胞内Ｃａ²⁺濃度の変化は観察されなかった。ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞のＰＡＭＰ−１２による細胞内Ｃａ²⁺濃度の変化についてロジスティック（Logistic）回帰法により用量依存性を解析した。その結果、ＰＡＭＰ−１２はＥＤ_５０＝４１．０ｎｍｏｌ／Ｌであることがわかった。以上のように、ＭＲＧＸ２は細胞内三量体Ｇタンパク質のＧｑと共役しており、ＭＲＧＸ２発現細胞の細胞内Ｃａ²⁺濃度の変化を測定することでアゴニスト及び／又はアンタゴニストのスクリーニングが可能であることが解った。

《実施例４：ＧＴＰγＳ結合型実験によるＭＲＧＸ２とＰＡＭＰ−１２の結合の検出》
１５ｃｍ培養プレートに２９３−ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen社）を播種して２４時間培養後、実施例１で得られたプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＭＲＧＸ２（１５μｇ）を、トランスフェクション試薬（LipofectAMINE 2000; GIBCO BRL社製）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入から２４時間後に細胞を回収及び洗浄し、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡとプロテアーゼインヒビターカクテルセット（Complete^ＴＭ；ベーリンガーマンハイム社）とを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁して、ホモジナイザー（POLYTRON; KINEMATICA社）にてホモジェナイズした。超遠心を行なった後、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、これをＭＲＧＸ２発現細胞膜画分とした。またｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＭＲＧＸ２の代わりにｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒを遺伝子導入した細胞膜も上記と同様に調製し、これをＭＲＧＸ２非発現細胞膜画分とした。

それぞれの膜画分１０μｇを、反応溶液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２、０．１％ＢＳＡ、３μｍｏｌ／Ｌ ＧＤＰ、^３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（２５０ｐｍｏｌ／Ｌ）、及びＰＡＭＰ−１２（最終濃度＝１×１０^−１０〜３×１０^−５ｍｏｌ／Ｌ）］２００μＬ中で室温で１時間インキュベートした。反応液をセルハーベスターにてグラスフィルターに回収し、そのグラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放射活性をトップカウント（パーキンエルマー社）にて測定した。

結果を図３に示す。図３に示すとおり、ＭＲＧＸ２発現細胞膜画分にはＰＡＭＰ−１２の用量依存的にＧＴＰγＳの結合を検出することができた。そのＥＣ_５０値は２０．８ｎｍｏｌ／Ｌであった。一方、ＭＲＧＸ２非発現細胞膜画分（Ｍｏｃｋ）にはＰＡＭＰ−１２の濃度に関わらず、全くＧＴＰγＳの結合が検出されなかった。以上の結果から、ＭＲＧＸ２は、ＰＡＭＰ−１２に反応し、Ｇタンパク質を活性化する受容体であることが明らかとなった。

《実施例５：ヒト副腎組織におけるＭＲＧＸ２の発現分布解析》
ヒト副腎組織のパラフィンブロックよりマイクロトームを用いて４〜５μｍのスライスを作成し、スライドに張りつけた。キシレン／アルコールにより脱パラフィンを実施した。免疫染色は、染色装置（DAKO Autostainer；DAKO社製）を用いて実施し、ブロッキング剤（DAKO serum free protein block；DAKO社製）にて２０分間ブロックし、続いて、１次抗体［ＭＲＧＸ２に対するポリクローナル抗体（LifeSpan社製）］で４５分間、ビオチン化二次抗体（Vector anti-rabbit BA-1000 secondary；Vector社）で３０分間、インキュベートした。染色は、スライドを洗浄後、市販の染色剤（Vectro ABC-AP；Vector社）を用いて、ベクターレッド（Vector Red；Vector社）を基質として実施した。

結果を図４に示す。ヒト副腎組織において、副腎髄質のパラガングリオン細胞（交感神経節細胞）が染色されていることが分かった。ＰＡＭＰ類がカテコラミン分泌又は合成を濃度依存的に抑制することが知られている（Journal of Clinical Investigation，1995年，96巻，1672-1676頁、Molecular Brain Research，2001年，87巻，175-183頁）が、カテコラミン分泌は交感神経の活性化により引き起こされるので、本実施例結果は、ＭＲＧＸ２がカテコラミン分泌に関連していることを裏付けている。

《実施例６：ＭＲＧＸ２受容体安定発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇を引き起こす化合物のスクリーニング》
実施例２で作製したＭＲＧＸ２受容体安定発現ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレート（96well Black/clear bottom plat；BECTON DICKINSON社製）に１ウェル当たり２×１０^４細胞で播種して２４時間培養後、培地を廃棄し、４μｍｏｌ／Ｌ Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（Molecular Probe社製）、０．００４％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７、１％ＦＢＳ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシドを含むＨａｎｋｓ ＢＳＳを１ウェ当たり１００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。一定濃度の候補化合物を添加し、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変化は実施例３と同条件にてＦＬＩＰＲを用いて測定した。このような条件で、ＥＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下の化合物を選択した。

《実施例７：ＭＲＧＸ２受容体安定発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下を引き起こす化合物のスクリーニング》
実施例２で作製したＭＲＧＸ２受容体安定発現ＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４細胞で播種し、２４時間培養後、αＭＥＭ（核酸非存在）培地／１ｍｍｏｌ／Ｌ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Sigma社製）／０．１％ＢＳＡで１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と一定濃度の候補化合物を共添加した。３７℃で３０分後に培養上清を除去し、実施例２と同条件にてｃＡＭＰ濃度を測定した。このような条件で、ＥＣ_５０が１０μｍｏｌ／Ｌ以下の化合物を選択した。

本発明のスクリーニングツール及びスクリーニング方法によれば、循環器疾患（特に、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患、例えば、高血圧、心不全、敗血症など）又は慢性腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎など）の治療及び／又は予防剤に有用な物質をスクリーニングすることができる。

配列表の配列番号３又は４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。

ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞及びコントロール細胞において、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量に対するＰＡＭＰ−１２の作用を示すグラフである。 ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞及びコントロール細胞において、細胞内Ｃａ²⁺濃度に対するＰＡＭＰ−１２の作用を示すグラフである。 ＭＲＧＸ２安定発現ＣＨＯ細胞及びコントロール細胞において、ＧＴＰγＳ結合に対するＰＡＭＰ−１２の作用を示すグラフである。 ヒト副腎組織におけるＭＲＧＸ２の発現を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。

Claims (12)

1. （１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド、
   （２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド、又は、
   （３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量がＰＡＭＰ−１２及び／又はＰＡＭＰ−２０によって抑制されるポリペプチド
   からなる、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール。
2. ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載のＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール。
3. 請求項１に記載のポリペプチドを発現している細胞からなる、ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール。
4. 細胞が、請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、請求項３に記載のＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト検出用ツール。
5. （１）請求項１に記載のポリペプチド又は請求項３に記載の細胞と、試験物質とを、標識したＰＡＭＰ受容体リガンド存在下で接触させる工程、及び
   （２）前記ポリペプチド又は細胞への標識リガンドの結合量を分析する工程
   を含む、試験物質がＰＡＭＰ受容体リガンドであるか否かを検出する方法。
6. （１）請求項３に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程、及び
   （２）細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化を分析する工程
   を含む、試験物質がＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法。
7. 請求項３に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程が、ＰＡＭＰ受容体アゴニスト共存下で行われる、請求項６に記載の検出する方法。
8. （１）請求項３に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程、及び
   （２）細胞内におけるＣａ²⁺濃度の変化を分析する工程
   を含む、試験物質がＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法。
9. 請求項３に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程が、ＰＡＭＰ受容体アゴニスト共存下で行われる、請求項８に記載の検出する方法。
10. （１）請求項３に記載の細胞と試験物質とを、標識したＧＴＰγＳ存在下で接触させる工程、及び
    （２）前記細胞への標識ＧＴＰγＳの結合量を分析する工程
    を含む、試験物質がＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アンタゴニスト又はアゴニスト、あるいは、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤又は減弱剤であるか否かを検出する方法。
11. 請求項３に記載の細胞と試験物質とを接触させる工程が、ＰＡＭＰ受容体アゴニスト共存下で行われる、請求項１０に記載の検出する方法。
12. （１）請求項５〜１１に記載の方法からなる検出する工程、及び
    （２）ＰＡＭＰ−１２若しくはＰＡＭＰ−２０アゴニスト、又は、ＰＡＭＰ受容体活性増強剤を選択する工程
    を含む、カテコラミン及び／又はアルドステロンの関与する循環器疾患の治療及び／又は予防剤をスクリーニングする方法。

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